(57)【要約】【課題】本発明は、分離されたレセプター型チロシンキナーゼおよびそれをプログラムしている遺伝子配列を提供することに関する。【解決手段】本発明により提供される、該チロシンキナーゼは、その天然発生形において、モノクローナル抗体III.Ａ４に反応性であること、そのグリコシル形で約１２０−１５０kＤの明白な分子量を有すること、及びＥＬＩＰＱＰを含んでいるＮ末端アミノ酸配列を有することにより特徴付けられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に下記に示すアミノ酸配列を有しており、寄託番号９１０６１９２０としてユーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチュアーズ（European Collection of Animal Cell Cultures）に国際寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体III.Ａ４に対して結合能を示し、かつプレＢ−細胞、Ｂ−細胞および／またはＴ−細胞の産生刺激に含まれている、分離されたレセプター型チロシンキナーゼ：
【表１】
2006187296.tif 000017
【表２】
2006187296.tif 000018
【請求項２】
組換えまたは合成形の、請求項１記載のチロシンキナーゼ。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか記載のチロシンキナーゼをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的なヌクレオチド配列を有している、核酸分離物。
【請求項４】
請求項３記載の核酸分離物を保持している、形質転換細胞または細胞培養物。
【請求項５】
哺乳動物、昆虫、酵母または細菌細胞である、請求項４記載の形質転換細胞または細胞培養物。
【請求項６】
細胞がＣＨＯ、バキュロウイルスまたはエッシェリキア・コリ細胞である、請求項５記載の形質転換細胞または細胞培養物。
【請求項７】
可溶形のレセプター型チロシンキナーゼを含有する医薬組成物であって、当該チロシンキナーゼが請求項１または２のいずれか記載のものである、組成物。
【請求項８】
請求項１のレセプター型チロシンキナーゼの可溶形を含む、プレＢ−細胞、Ｂ−細胞および／またはＴ−細胞の産生を調節するための医薬。
【請求項９】
請求項１のチロシンキナーゼに結合するリガンドに対するアンタゴニストを有効成分とする、哺乳動物中のヒトeph／elk様キナーゼ（ＨＥＫ）とそのリガンドの間の相互作用又は結合の効果を改善する医薬。
【請求項１０】
他の活性化合物を続いて又は同時に投与する、請求項９記載の医薬。
【請求項１１】
他の活性化合物がサイトカインまたは抗癌剤である、請求項１０記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は一般に、新規レセプター型チロシンキナーゼ及びこれをコードしている遺伝配列に関する。
【０００２】
チロシンキナーゼは生長及び分化の調節に関わる重要なクラスの分子を形成する（１）。この役割についての証拠の一つの表れは、既知の可溶性生長因子を結合するレセプターの同定から来た。表皮性生長因子（ＥＧＦ）に対するレセプター（２）、血小板派生生長因子（ＰＤＧＦ）（３）及びコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）（４）は、全てチロシンキナーゼ触媒ドメインをプログラムしている細胞質部分を伴う膜内外分子であることが示された。ＣＳＦ−１レセプターは、触媒及び細胞外の両ドメインでＰＤＧＦレセプターと類似している（１,５）。これらの蛋白の細胞外ドメインは、免疫グロブリン様繰り返し配列の存在により他のチロシンキナーゼと区別される（１,６）。キナーゼドメインの構造的性質に基づき、ｃ−キット蛋白は、このファミリーの他の一員として確認された(７)。ｃ−キット遺伝子座は、先天性貧血Ｗ／Ｗマウスでの欠損を立証するように見える（８−１０）。リガンドは、ＳＩ遺伝子座によりコード化されることが示されるように、今や確認された（１１−１４）。遺伝子座は、スチールマウスでは異常であり（１５）、Ｗ／Ｗマウスに同一欠損を与えるが、正常なｃ−キット遺伝子をコードする。
【０００３】
生長調節でのチロシンキナーゼ蛋白の重要な役割についての他の系の証拠は、ウイルスオンコジンの研究から出た（１６−１７）。これらの遺伝子は、これらの遺伝子を繊維芽細胞にプログラムするＤＮＡの細胞増殖随行導入での変化を観察することにより生長不規則に直接関わることが判った。全てのオンコジンは強い細胞類似体（プロトオンコジン）を有することが明らかになった。最初に確認されたオンコジンの一つはv−srcであり、細胞類似体（c−src）は、続くミリスチル化（myristylation）で細胞膜の内葉と関係するようになる細胞内チロシンキナーゼのファミリー原型の代表である（１８）。造血系内で、多くの系統特定src様キナーゼが明らかにされた（１９）。
【０００４】
Ｔ細胞関連src様キナーゼ、lckは、ＣＤ４及びＣＤ８膜内外グリコプロテインの両者に独立して結合し、信号を送るコンプレックスを形成することが判った（２０,２１）。これに対し、v−erb−Ｂ及びv−fmsは、それらの細胞類似体ＥＧＦレセプター及びＣＳＦ１レセプターの様に、それぞれ単一ポリペプチド中に完全シグナル形質導入機構をプログラムしている膜内外分子でもある（１,１７）。
【０００５】
これらの蛋白のアミノ酸配列の詳細な分析により、触媒ドメイン内の保存構造モチーフが明らかにされた（５）。チロシンキナーゼ及びセリン−スレオニンキナーゼは共に多くのヌクレオチド結合蛋白に見出されるコンセンサスＧＸＧＸＸＧ配列を有する（５）。他の保存配列モチーフは、両タイプのキナーゼに分けられ、これに対し他は、チロシン又はスレオニン−セリンキナーゼサブグループに特異的である（５）。チロシンキナーゼは、このファミリーに特異的な配列保存の部分を有するが、触媒ドメインへの部分５'の構造的特徴に従ってさらに小区分できる（１,４−７）。本発明の新規チロシンキナーゼは既知のチロシンキナーゼと同様の一般的特徴を示す。
【０００６】
本発明により、新規なレセプター型チロシンキナーゼが提供され、それはチロシンキナーゼのeph/elkファミリーの一員として同定される（２２,２３）。新規チロシンキナーゼレセプターは、ＨＥＫ（「ヒトeph/elk様キナーゼ」）と名付けられる。本発明者等は、
preＢ-及びＴ細胞系でＨＥＫの発現を確認したので、本発明のレセプター分子及び/又はそのリガンドは、pre-Ｂ及びＴ細胞の産生及び/又は機能のイン・ビボ調節における試薬としての用途に特別の適用性を有するものと理解される。
【０００７】
従って、本発明の一局面は、分離されたレセプター型のチロシンキナーゼを提供することであり、該チロシンキナーゼは、その自然に生じる形において、モノクローナル抗体III.Ａ４に反応性であること、グリコシル形で約１２０−１５０kＤの明らかな分子量を有すること、及び
ＥＬＩＰＱＰ
を含むＮ末端アミノ酸配列を有することにより特徴付けられる。
好ましくは、チロシンキナーゼは、
ＥＬＩＰＱＰＳＮＥＶＮＬＸＤ
（式中、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、好ましくはＬである）
を含むＮ末端アミノ酸配列を有する。
より好ましくは、チロシンキナーゼは、アミノ酸
ＥＬＩＰＱＰＳＮＥＶＮＬＸＤ(Ｓ)ＫＸ１ＩＱ
（式中、Ｘ及びＸ１はいずれかのアミノ酸であり、好ましくは、それぞれＬ及びＴである）
を含むＮ末端アミノ酸配列を有する。
【０００８】
さらにより好ましくは、チロシンキナーゼは、図１に示されるアミノ酸配列或はそのいずれかの部分又は蛋白を含み、或は図１に示されるアミノ酸配列に少なくとも３０％類似するアミノ酸配列を有し、そしてＨＥＫの同一性を示す特徴を有する。より好ましくは類似の程度は少なくとも４０％、もっと好ましくは少なくとも５５％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、そしてさらにより一層好ましくは８０％以上である。
【０００９】
モノクローナル抗体III.Ａ４を産生するハイブリドーマは、１９９１年６月１９日に寄託番号９１０６１９２０としてユーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチュアズ（European Collection of Animal Cell Cultures；ＥＣＡＣＣ）（英国ウイルトシャー・サリスバリイ在）にブダペスト条約に基づく国際寄託されている。
【００１０】
本発明のチロシンキナーゼに関連して用いられる用語「分離された」は、重量、活性又は他の慣用手段により測定された通りの他の分子についての蛋白の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは６０％そしてさらにより好ましくは少なくとも８０％を含む生物学的に純粋な調製品を含む。用語は、又、自然の発生状態でない全ての形の蛋白、例えばこれらに限らないが、蛋白を含んでいる膜の調製品、膜からの蛋白分離物の調製品又は、該蛋白を含んでいる上清溶液を含む。調製品はグリコシル化され、部分的にグリコシル化されない、又は全くグリコシル化されなくてもよく、或は自然に生じているものから変化したグリコシル化様式を有しうる。
【００１１】
本発明のチロシンキナーゼは、多くのヒト起原の腫瘍に現れる。特にここに示されるデータは、ヒトリンパ様細胞系ＬＫ６３、Ｌila−１、ＪＭ、ＭＯＬＴ４及びＨＳＢ−２のＨＥＫ発現並びにヒト上皮腫瘍を現す。しかしながら当業者は、同様の又は類似のキナーゼが非腫瘍細胞上又は非ヒト腫瘍上に現れ、それが本発明のチロシンキナーゼと同様の性質を有しうることを直ちに認識するであろう。例えば、ここで得られた結果は心臓筋肉中でのＨＥＫの幾つかの発現を示す。従って、本発明は、非腫瘍起原のキナーゼを含む本明細書で記載されるチロシンキナーゼにいかなる又は全ての点で機能的に及び構造的に同様であるチロシンキナーゼに及ぶ。
【００１２】
本発明は、その全ての自然発生誘導形を含むチロシンキナーゼ蛋白の自然発生形を含む調製品に、並びにキナーゼのポリペプチド蛋白への全ての単一又は多重アミノ酸置換、削除、及び／又は挿入を含む蛋白の合成及び組換え形に、及びその類似体及び同族体に及ぶ。分子に対するそのようなアミノ酸変化は、キナーゼの組換え又は合成変異体及び誘導体の例である。
【００１３】
挿入は、アミノ酸及び／又はカルボキシル末端溶解並びに単一又は多重アミノ酸の配列内挿入を含む。一般に、アミノ酸配列内での挿入は、いわば１ないし４残基の程度のアミノ又はカルボキシル末端溶解よりも同じであろう。挿入アミノ酸配列変異体は１又はそれ以上のアミノ酸残基が蛋白の予め決定した部位に導入されたものである。削除変異体は、配列から１又はそれ以上のアミノ配列の除去により特徴付けられる。置換変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され異なる残基がそこに挿入されたものである。そのような置換は一般に以下の表Ｉに従ってなされる。
【表１】
2006187296.tif 000002
【００１４】
一般に、アミノ酸は、同様の性質、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、バルキー側鎖等を有する他のアミノ酸により置換される。
【００１５】
アミノ酸置換は、典型的には単一残基のものである。挿入は通常約１−１０アミノ酸残基の程度であろう。そして削除は約１−２０残基に及ぶ。削除又は挿入は好ましくは、隣接対、即ち２残基の削除又は２残基の挿入で行われる。
【００１６】
上で引用したアミノ酸変異体は、当業者に周知のペプチド合成技術、例えば固相ペプチド合成（メリフィールド、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ ８５、2149頁、1964）等を用い、又は組換えＤＮＡ操作により容易に製造しうる。既知の配列を有するＤＮＡの予め決定した部位での置換変異体を作る技術はよく知られており、例えばＭ１３突然変異導入法である。置換、挿入又は削除変異体を表す変異体蛋白を生成するためのＤＮＡ配列の操作は当業者で周知であり、例えばマニアティス等（モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリィ・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ 1982）に記載される。
【００１７】
本発明のチロシンキナーゼ蛋白の組み換え又は合成変異体及び誘導体の例は、キナーゼに結合した全ての分子についての単一又は多重置換、削除及び／又は付加、例えば炭水化物、脂質及び／又は蛋白又はポリペプチドを含む。さらに、本発明のチロシンキナーゼ蛋白は正常細胞上の同様の蛋白の一般的変容バージョンであることが可能である。従って、本発明は腫瘍又は非腫瘍起原からのチロシンキナーゼ蛋白に、及びその遺伝的に変化した形に及ぶ。
【００１８】
用語「類似体」及び「誘導体」は、その増強された安定性及び／又はインビボ又はインビトロ効力により特徴付けられるチロシンキナーゼ蛋白の全ての機能的化学的均等物に及ぶ。用語「類似体」及び「誘導体」は、又、上述したチロシンキナーゼ蛋白の全てのアミノ酸誘導体にも及ぶ。
【００１９】
本明細書で意図するＨＥＫの類似体は、側鎖への修飾、人為的アミノ酸の取り込み及び／又は分子の誘導化及び架橋剤の使用並びにペプチド又はその類似体にコンフォーメイションの強制を課する他の方法を含むが、これに限定されない。本発明により意図される側鎖修飾の例は、アミノ基の修飾、例えばアルデヒドとの反応に続くＮaＢＨ４による還元による還元的アルキル化；メチルアセトイミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化、シアナートによるアミノ基のカルバモイル化；２,４,６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸と無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；及びピリドキサール−５'−リン酸によるリジンのピリドキシル化に続くＮaＢＨ４による還元を含む。
【００２０】
アルギニン残基のグアニジノ基は、２,３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールのような試薬との異項環縮合生成物の形成により修飾しうる。
【００２１】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成、続く例えば対応するアミドへの誘導化（derivitisation）を経るカルボジイミド活性化により修飾しうる。
【００２２】
スルヒドリル基は、例えばヨード酢酸又はヨードアセタミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸又は他の置換マレイミドとの反応；４−クロロメルクリ安息香酸エステル、４−クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール及び他の水銀化合物を用いる水銀誘導体の形成；アルカリpＨでのシアナートとのカルボモイル化のような方法により修飾しうる。
【００２３】
トリプトファン残基は、例えばＮ−ブロモコハク酸イミドによる酸化又は２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド又はスルフェニルハロゲン化物によるインドール環のアルキル化により修飾しうる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により変化させ３−ニトロチロシン誘導体を形成しうる。
【００２４】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化又はジエチルピロカルボナートによるＮ−カルブエトキシル化によって達成しうる。
【００２５】
蛋白合成の間に人為的アミノ酸及び誘導体を取り込む例は、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルペンタン酸、２−チエニルアニリン及び／又はアミノ酸のＤ−異性体の使用を含むがこれに限定されない。
【００２６】
ホモ−二官能性架橋剤、例えば（ＣＨ２）ｎスペーサー基（ｎ＝１ないし６）を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒドＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル及びアミノ反応性部分、例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド及び例えばマレイド又はジチオ部分（ＳＨ）又はカルボジイミド（ＣＯＯＨ）等の他の特異的反応性部分の基を含むヘテロ二官能性試薬を用い３Ｄコンフォーメイションを安定化する架橋剤を用いることができる。さらに、ペプチドは、Ｃα及びＮα−メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のＣαとＣβの間の二重結合の導入及び例えば末端Ｎ及びＣ間、二つの側鎖間或は側鎖と末端Ｎ又はＣ間のアミド結合の形成のような共有結合を導入することによる環状ペプチド又は類似体の形成によって、コンフォーメイション的に拘束することができる。
【００２７】
従って、本発明は、ペプチド又はポリペプチド及び本明細書で広く記載した通りのＨＥＫを確認する特徴を有するそのアミノ酸及び／又は化学的類似体に、及び／又はシグナルを形質導入し又は細胞応答、例えば生長及び／又は分化を促進するのに、その作用を可能にし、又は、それに関与しうる。
【００２８】
従って、本発明のレセプター型チロシンキナーゼへの本明細書での引用は、自然発生分子、組み換え体、その合成及び類似形並びに全ての変異体、誘導体並びにそのヒト及び非ヒト同族体を含む。全てのそのようなキナーゼは用語「ＨＥＫ」に含まれる。
【００２９】
さらに本発明は、本明細書に記載される新規なレセプター型チロシンキナーゼに、並びに酵素の全てのアゴニスト及びアンタゴニスト（例えばレセプターの可溶形）に及ぶ。チロシンキナーゼはオンコジン蛋白であるので、レセプターに対するアンタゴニストは、特に適当であり、本発明の範囲に入る。そのようなアンタゴニストは、抗体（モノクローナル及びポリクローナル）、可溶形又はその酵素自体、特異的ペプチド、ポリペプチド又はとりわけ蛋白及び炭水化物を含む。これらの型のアンタゴニストは、腫瘍自体の生長又は維持が本発明のチロシンキナーゼにより支持される抗腫瘍剤を開発するのに有用である。従って、腫瘍関連レセプター型チロシンキナーゼに有効量のアンタゴニストを添加することにより、蛋白のレセプター活性を阻害し、減少させ又はさもなければ妨げ、従って腫瘍生育を防止し、減少させ及び／又は阻止する。それゆえ本発明は、本明細書に記載したチロシンキナーゼに対する一又はそれ以上のアンタゴニスト及び一又はそれ以上の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物に及ぶ。
【００３０】
ＨＥＫのリガンドは多くの方法でスクリーンすることが可能である。一つのプロトコールで、アルカリホスターゼのような適当なレセプター分子に融合したＨＥＫの完全な細胞外部分をコード化する発現ベクター（例えばＡＰ−ＴＡＧ−ＨＥＫ）を選択する。細胞に発現した融合蛋白は、細胞上清から回収しフラガン及びレダー（３９）により記載される方法、この開示を引用して明細書記載の一部とする、を用い組織部分を染色する（レセプター分子を用いる）のに用いる。リガンドの細胞起原が確認されると、これらの細胞は発現ライブラリィを構築するのに用いられる。リガンドが細胞結合（例えば膜結合）であると、発現ベクター（例えばＡＰ−ＴＡＧ−ＨＥＫ）は、陽性クローンを調べるためプールを染色するのに用いられる。ＨＥＫリガンドが分泌されると、他の方法が必要であろう。この場合は、プールの上清をＬＫ６３又はＨＥＫ形質転換体（transfectant）でのＨＥＫリン酸化の誘導をスクリーンするのに用いることができる。
【００３１】
別法として、ＨＥＫリンを生成する組織からの上清を、カラム上の親和性精製に起原として用いることができ、例えばＰＥＥ１４−ＨＥＫの生成物はカラムに特異的吸着物として結合する。精製リガンドの配列は測定されてこの情報はcＤＮＡライブラリィからＨＥＫをクローンするのに用いられる。
【００３２】
本発明の他の局面は、新規レセプター型チロシンキナーゼ（その組み換え体、合成、変異体、誘導体、類似及び同族形を含む）をプログラムしているヌクレオチドの配列を含む核酸の分離物に向けられる。核酸配列は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含み、一本又は二本側鎖形で、単独或はベクター又は発現ベクター分子との組合せで存在しうる。核酸は天然発生ＲＮＲ又はＤＮＡであり得るし、又はそのcＤＮＡ誘導相補形でありうる。核酸分子は、又、蛋白の自然発生又は組み換え形をプログラムしているヌクレオチド配列に関する単一又は多重ヌクレオチド配列に関する単一又は多重ヌクレオチド置換、削除及び／又は付加を含みうる。本発明の核酸配列を含んでいるベクターは、真核生物及び／又は原核生物で複製しうるし、これらの型の細胞の一方又は両方で発現可能なプロモーター配列を含みうる。適当な細胞は、哺乳動物、昆虫、酵母及び／又は細菌の細胞を含む。特に好ましい細胞型は、ＣＨＯ、バキュロウイルス及びＥ.コリ細胞を含む。ＨＥＫを含んでいる好ましいヌクレオチド配列を図１に示す。組み換え蛋白の分離を含む、組み換えＤＮＡ工学の一般的技術はよく知られており、例えばマリアティス等（上述）に記載される。
【００３３】
本発明は、又、上記したような核酸分離物を保持する遺伝子導入細胞又は細胞培養を提供する。
【００３４】
他の局面では、本発明は、本明細書で広く記載した通りの可溶形のレセプター型チロシンキナーゼを含む医薬物を提供し、該組成物は、さらに一又はそれ以上の製薬上許容しうる担体及び／又は希釈剤を含む。
【００３５】
本発明は、又、本発明の新規レセプター型チロシンキナーゼの使用法及び本チロシンキナーゼに結合しているリガンドに対するアンタゴニストの使用法に及ぶ。
【００３６】
一つの局面では、本発明は、本発明のチロシンキナーゼに結合しているリガンドに対するアンタゴニストの有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＨＥＫ及びそのリガンドの間の相互作用又は結合の効果を改善する方法に及ぶ。
【００３７】
本発明は、又、蛋白の調製品と本発明のレセプター型チロシンキナーゼの有効量とを、蛋白のリン酸化をもたらすのに十分な時間及び条件下、接触させることを含む、蛋白のリン酸化方法に及ぶ。
【００３８】
さらに他の局面では、本発明は、検出しうるシグナルを生成することが可能なレセプター分子に融合したチロシンキナーゼを試験すべき組織又は細胞試料に、融合チロシンキナーゼを該組織又は細胞のリガンドに結合するのに十分な時間及び条件下、接触させること、次いでレセプター分子を検出することを含む、本発明のレセプター型チロシンキナーゼに対する組織又は細胞に融合したリガンドのスクリーニング方法を提供する。
【００３９】
さらに本発明は、試験すべき試料をチロシンキナーゼを発現することができる細胞系と接触させること、及び該細胞系のリン酸化をスクリーニングすることを含む、本発明のレセプター型チロシンキナーゼに対する可溶性リガンドをスクリーニングする方法を提供する。
【００４０】
しかしながら、当業者は、種々の変異体、誘導体又は化学変化を配列になし、例えば上記した類似体及び誘導体をコードできることを直ちに認識するであろう。本発明は、又、ＨＥＫ遺伝子又はその変異体の存在をスクリーニングするため核酸プローブとして使用することができる核酸分子をショートすることに及ぶ。
【００４１】
本発明を以下の非限定な図面及び実施例を引用してさらに記述する。
図面において、
図１は、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。右側の数字はヌクレオチドの位置を示し、アミノ酸上の数字はアミノ酸配列を引用する。単一の下線は推定されるシグナルペプチドを示す。二重下線は推定される膜内外部分を示す。ダッシュした上線は予言したアミノ酸配列と精製ＨＥＫ蛋白から得た配列との間の同一性を示す。三角形は細胞外ドメイン内のＮ−結合グリコシル化についての潜在的部位を示す。点は推定ＡＴＰ結合部位を示す。ダイアモンド形は推定自己リン酸化部位を示す。星印は停止コドンを示す。
【００４２】
図２eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。線列はＧＡＰプログラムを用い完成させた。アミノ酸位置は右に数字を付ける。配列での点は線列を至適するため導入されたギャップを示す。ダッシュはアミノ酸間の同一性を示す。星印は停止コドンを示す。アミノ酸の線上の点は、細胞外のドメインのＣ末端部位内のフイブロネクチン型IIIと類似の二つの繰り返し配列に貢献している残基を示す。アミノ酸の線上の三角形は、Ｎ末端部位での変換システイン残基を強調する。
【００４３】
図３は、ＣＯＳ細胞中ＨＥＫの発現を示す写真描写である。ＨＥＫ４.５kb cＤＮＡクローンを発現ベクターＣＤＭ８にサブクローンした。ＣＯＳ細胞はＤＥＡＥ−デキストラン／クロロキン及びＤＭＳＯを用いこの構造物を移入した。形質転換の二日後、細胞をIIIＡ４ＭＡbで、続いてＦＩＴＣ接合ヒツジ抗−マウスＩgで本来の位置で染色し、光学顕微鏡（パネルＡ）又は顕微鏡（パネルＢ）下で写真を撮った。拡大Ｘ４００。
【００４４】
図４は、細胞系でのＨＥＫ発現のノーザンブロット分析の写真描写である。ヒト細胞系からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、アガロース／ホルムアルデヒドゲル上で分画されるハイボンド−Ｃ外膜上に移した。フィルターをＨＥＫ４.５kb cＤＮＡとハイブリダイズした（上方パネル）。同じフィルターを定量コントロールとしてＧＡＰＤＨとハイブリダイズした（下方パネル）。ＲＥＨ、ＮＡＬＭ−及びＦＥＫＥＭはpre−Ｂ白血病細胞系である。ＢＡＬＬ−１は初期Ｂ白血病細胞系である。ＲＡＭＯＳは成熟Ｂ白血病細胞系であり、ＨＳＢ−２、ＨＰＢ−ＡＬＬ及びＪＭはＴ白血病細胞系である。
【００４５】
図５は、細胞系でのＨＥＫ発現のノーザンブロット分析を示す写真描写である。ヒト細胞系からのポリＡ＋ＲＮＡは上のようにＨＥＫ発現をプローブした。モルト４は未成熟Ｔ細胞である。ＲＣ２a、ＨＬ６０及びＵ９３７は骨髄性単球細胞系である。この実験では、ＲＮＡは、デカノールホルボールミリスチックアセタート（ＴＰＡ）による細胞の処理後、ＨＬ６０及びＵ９３７から抽出し、蛋白キナーゼＣ、Ｕ２６６は成熟Ｂ細胞である。
【００４６】
図６は、大人の死後組織でのＨＥＫ発現のノーザン分析を示す写真描写である。多重組織ノーザンブロットは商業的に購入し、製造者（クロンテック）により提案された条件下にＨＥＫ発現をプローブした。膵臓中の１.３kbバンドは小さすぎてＨＥＫの分泌型についての転写物を表現することができず、多分交叉ハイブリダイゼーションに依る。
【００４７】
図７は、細胞系及び正常ヒト抹消血細胞ＤＮＡでのＨＥＫのノーザンブロット分析を示す写真描写である。試料をＨindIII（レーン１−３）又はＢamＨＩ（レーン４−６）で消化し、１％アガロースゲル上を泳動させ、ゼパプローブ膜に移した。膜をヌクレオチド1,109−2,241から延びているＨＥＫの１.１kb断片とハイブリッド形成させた（図１参照）。レーン１及び４、正常抹消血；レーン２及び５、ＬＫ６３細胞；レーン３及び６、ＬＫ６３／ＣＤ２０＋細胞。
【００４８】
図８はインサイチューハイブリダイゼーションを示す写真描写である。上で引用されるＨＥＫＰＣＲ生成物はビオチン−１４−dＡＴＰでニック翻訳し、二人の正常男子から中期に５ng／μlのプローブ濃度でインサイチューハイブリッド形成した。クロモゾームを分析前にプロリジウムヨージド（対比染色として）及びＤＡＰＩ（クロモゾーム確認用）で染色した。
【００４９】
図９は、ＨＥＫ４.５cＤＮＡの予報された翻訳生成物の水治法分析（間隙長：２５）を示す写真描写である。Ｙ軸は元の及び下の親水性残基上に現れる疎水性基と共に水治法指数を示す。ＨＥＫcＤＮＡの翻訳生成物を含むＡＡsは、Ｘ軸に沿って、１−９８３を数える。
【００５０】
実施例１  材料及び方法
細胞系、ＭabIII４蛋白構造及び機能
ＬＫ６３及びＬＫ６３／ＣＤ２０＋細胞系は、急性リンパ芽球白血病の子供に由来した。ＬＫ６３／ＣＤ２０＋はＬＫ６３の四倍体変異体で、インビトロで自然に現れ、ＨＥＫ発現を促進した。親細胞系と異なり、ＬＫ６３／ＣＤ２０＋はＣＤ２０を発現する。これらの系はpre−Ｂ細胞白血病の細胞遺伝的特徴を有し、エブスタイン・バーウイルスで形質転換されなかった（２４）。ＪＭ及びＨＳＢ−２はＣＤ８＋、ヒトＴ細胞白血病細胞系である。
【００５１】
IIIＬＡ４ＭabはＬＫ６３細胞系に対して産生され、ＬＫ６３、ＬＫ６３／ＣＤ２０＋及びＪＭにより発現されるインビボキナーゼ活性を有する細胞表面分子（ＨＥＫ）、１３５kＤを認識した（２５）。
【００５２】
IIIＬＡ４Ｍabを、アミノ酸配列用のＨＥＫ抗原を精製するのに用いた（２５）。得られたアミノ酸配列は以下の通りであり、式中、あいまいな残基はかっこで囲み、未確認の残基はＸで示す：Ｎ末端−ＥＬＩＰＱＰＳＮＥＶＮＬＸＤ(Ｓ)ＫＸＩＱ；内部−ＧＹＲＬＰＰＰＭＤＣＰＡＡＬＹＱＬＭＬＤＣ。
【００５３】
ＬＫ６３cＤＮＡライブラリィ構築及びスクリーニング
ランダム初回cＤＮＡライブラリィをＬＫ６３／ＣＤ２０＋細胞からのポリＡ＋選択mＲＮＡ５μgを用いλgt１０（アマーシャム）中に構築した。変性オリゴヌクレオチドを内部（３'）ＨＥＫ蛋白配列を基に設計した。中性塩基イノシンを高コドンデジェネラシーの位置に含んだ（２６）。５１mer：
【表２】
2006187296.tif 000003
を既に記載されるように（２７）、γ32Ｐ−デオキシアデノシンミリン酸（ＡＴＰ）及びポリヌクレオチドキナーゼを用い、続いてＧ２５セファデクスカラム上で分離して末端標識化した。約250,000プラクを記述の通りに３７℃で２xＳＳＣ（ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣl、０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム）ハイブリダイゼーション緩衝液中でふるい分けた（２７）。洗浄は、２xＳＳＣ／０.１％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中４２−５５℃で実施した。一つの重複プラクからのシグナルは以下の５５℃洗浄を繰り返した。本プラクからのＤＮＡは２.５kbの挿入体（ＨＥＫ２.５）を含有した。ＨＥＫ２.５を、ＬＫ６３細胞のノーザンブロット分析用にα３２Ｐ−ＡＴＰ（アマーシャム・ランダム・プライマー・キット）で標識化した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を記述のように（２８）、ＨＥＫ２.５並びにＰＴＫの触媒ドメイン及び３'アミノ酸ＨＥＫ配列内の変換モチーフに基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用い実施した。ＨＥＫをα３２Ｐ−ＡＴＰ（上記の通り）で標識化し、２xＳＳＣハイブリダイゼーション緩衝液中、６５℃でランダム初回ＬＫ６３cＤＮＡライブラリィを再びふるい分けるのに用いた。３２の重複陽性を分離し、Ｎ末端蛋白配列に基づく変性をオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによりふるい分けた。Ｎ末端オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したＡ４.５kbＨＥＫクローン（ＨＥＫ４.５）を完全な特徴づけ用に選んだ。
【００５４】
ＨＥＫcＤＮＡのＤＮＡ配列決定及び分析
ＥcoＲＩで消化し、仔ウシ腸内ホスファターゼで処置したpＧＥＭ７にＨＥＫ４.５をサブクローンした。二本鎖ＤＮＡを塩化セシウム公配で精製し、ジデオキシ連鎖停止配列反応（２９）で鋳型として用いた。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドブライマーをＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）による配列決定を完了するのに用いた。蛋白配列線列をＧＡＰプログラム（ユニバーシティー・オブ・ウィスコンシン、ジェネティクス・コンピューター・グループ）を用い達成した。
【００５５】
ＣＯＳ細胞中ＨＥＫの発現
ＨＥＫ４.５ＥcoＲＩ挿入体は、クレノウＤＮＡポリメラーゼ１及びdＡＴＰプラスdＴＴＰで終了させたブラントであり、続いてＢstＸＩアダプターに連結した。接着した挿入体を、ＢstＸＩ消化ＣＤＭ８（３０）に連結した。センス及びアンチセンス構造物を調製し、ＤＥＡＥ−デキストラン／クロロキン及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いＣＯＳ細胞に移入した（１７）。形質転換の二日後に、ＣＯＳ細胞をIIIＡ４で、続いてフルオレセインイソチオシアネート接合（ＦＩＴＣ）−接合ヒツジ抗マウスイムノグロブリン（Ｉg）(サイルナス）で染色し、蛍光顕微鏡下で試験した。
【００５６】
細胞系のノーザン及びサウザンブロット分析
ポリＡ＋選択mＲＮＡを記述（３１）のように分離し、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画し、ハイボンドＣ外側（アマーシアム）上に移した。フィルターをＨＥＫ４.５で、続いてコントロールとしてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）でプローブした。ＤＮＡをグアニジン塩酸塩で溶解することにより調製し（３２）、ゼタプローブ膜に移し、製造者（バイオ−ラド）により提案された条件下でハイブリッド形成させた。ゲノムＤＮＡのサザン分析で他のチロシンキナーゼによる交叉ハイブリダイゼーションを最少にするため、ＰＣＲを分子（ヌクレオチド1,109ないし2,241図１）のそう高度に保持されない部分に及ぶ１.１kbＨＥＫプローブを産生するのに用いた。サザンブロットのオートラジオグラムを、マシントシュIIxコンピュータでマクスキャンプログラムを用いデシタル化した。
【００５７】
細胞系に結合しているIIIＡ４の分散分析
細胞系への１２５Ｉ標識IIIＡ４の結合を記述（３３）のように未標識IIIＡ４と競合で実施した。
【００５８】
蛋白分析
ＨＥＫ蛋白を、カイト及びドーリトムにより記載される（４０）ように疎水性分析に付した。結果を図９に示す。
【００５９】
ＨＥＫの細胞外ドメインの変異体をプログラムしている構造物発現ベクターに対するオリゴス
プライマーＨＥＫ５'／９２は以下の配列を有する：
【表３】
2006187296.tif 000004
【００６０】
ＢamＨ１及びＥcoＲＩ部位は上に示され、配列及び配列の位置８６ないし１０２に対応する下線部分を図１に示す。
プライマーＨＥＫ／ＥＥ１４／９２は配列
【表４】
2006187296.tif 000005
を有する。
【００６１】
停止コドンの後の下線部分は、図１のヌクレオチド1710−1725の逆及び相補配列である。
【表５】
2006187296.tif 000006
【００６２】
下線配列は、逆にされそして相補されると、図１の配列の1708−1723に対応し、ＢamＨ１部位から読み取ることを可能にしている停止コドンを含まない。
【００６３】
ＰＣＲ条件
ＰＣＲは、鋳型として全長のＨＥＫcＤＮＡを含むＣsＣl精製pＧＥＭ７−ＨＥＫを用い標準的条件下にＴaqポリメラーゼで実施した。サイクル時間及び温度：
６０'  ９７℃
６０'  ５５℃
９０'  ７３℃
反応は１０サイクル実施した。
【００６４】
１．ＨＥＫ５'／９２及びＨＥＫ／ＥＥ１４／９２の１.７kb ＰＣＲ生成物をＥcoＲ１及びＢamＨ１で消化したジェネクリーンを用い精製し、（セルテック、英国バークシャーから得た）pＥＥ１４のＥcoＲ１及びＢcl部位間でクローンした。
分析は「pＥＥ１４−ＨＥＫ」と名付けられたクローンの予め定めた１.７kb挿入体を示した。
【００６５】
２．５'ＨＥＫ５'／９２及びＨＥＫ／ＴＡＧ／３'の１.７kb ＰＣＲをＢamＨＩで消化し、ＡＰ−Ｔag−１のＢgIIIにクローンした、クラガナン及びレーダー（３９）。
ＳnaＢ１を用い、クローンのセンスを正しい定位で融合クローンに測定できた。得られたクローンをＡＰ−ＴＡＧ−ＨＥＫと命名した。
【００６６】
発現
pＥＥ１４−ＨＥＫをＣＨＯ細胞に移入し、系をメチオニンスルホキシドで選択した。
ＡＰ−ＴＡＧ−ＨＥＫをpＳＶ２neo及びＧ４１８で選択したクローンと３Ｔ３細胞に移入した。
【００６７】
実施例２  ＨＥＫ
ＨＥＫについてのcＤＮＡクローンの分離及び特徴付け
変性５１merオリゴヌクレオチドで、緩和な条件下、ＬＫ６３誘導λgt１０cＤＮＡライブラリィの約250,000プラクをスクリーニングすることから一つの重複シグナルを得た。このプラクは、ＨＥＫを発現する細胞系、即ちＬＫ６３及びＪＭのノーザンブロット分析で単一５.５−６.０kb mＲＮＡ種とハイブリッド形成した２.５kb挿入体（ＨＥＫ２.５）を含有した。ＨＥＫ２.５及びチロシンキナーゼ（２８）の触媒ドメイン内の保存モチーフに基づくオリゴヌクレオチドキナーゼを用いるＰＣＲは、適当な大きさのＤＮＡ生成物を与えた。これらの結果は、ＨＥＫ２.５が５'末端で先を取られたことを示す。ＨＥＫ２.５をより厳格な条件下、ライブラリィを再びふるい分けするのに用い、４.５kb ＨＥＫ（ＨＥＫ４.５）クローンを分離した。このクローンはＮ末端蛋白配列に基づく変性オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成し、上で引用したプライマーを用いるＰＣＲ反応で予め定めた大きさのＤＮＡバンドを生成した。これらのデータは、４.５kbクローンかつ多分、完全ＨＥＫコードづけ部分を含むことを示す。
【００６８】
ＨＥＫについてのコードづけ部分の配列並びに部分３'及び５'未翻訳配列を図１に示す。2,952ヌクレオチドの開いた読み枠は、位置１００の開始メチオニンから位置3051の最初の終止コドンに及ぶ。cＤＮＡの翻訳の結果、９８３アミノ酸（ＡＡs）の予め定めた蛋白となる。精製ＨＥＫ蛋白の配列決定により得られるＡＡsとcＤＮＡクローンの予め定めたＡＡ生成物の間には同一性がある（図１参照）。翻訳蛋白（推定シグナルペプチドを引く）の予め定めた分子量は９２.８kＤである。これは、ツニカマイシン処理及びエンドグリコシダーゼ処理の各ＬＫ６３細胞での約９５kＤのコア蛋白を示しているこれまでの結果（２５）とよく一致する。ＨＥＫcＤＮＡクローンの予め定めた蛋白生成物は型la細胞膜内蛋白（３５）の性質を有する。二つの主な疎水性部分は推定シグナルペプチド（ＡＡs１−２０）及び膜内外切片（ＡＡs542−562）を示す。521ＡＡsの細胞外ドメインはＮ結合グリシル化についての５つの可能な部位を含む。細胞外ドメインのＮ末端部分（ＡＡs２１−376）はシステイン残基に富んでいる。細胞外ドメインのＣ末端部分（ＡＡs326−511）は、フィブロネクチン型III（３６）に見られるこれらに対する反覆類似体を含む。ＨＥＫの細胞質ドメイン（ＡＡs566−983）はＡＡ位置628−633に典型的ＡＴＰ結果部位（ＧＸＧＸＸＧ）及び位置779に推定自己リン酸化部位（Ｅ／ＤＸＸＹＸＸ）を含む。
【００６９】
蛋白配列線列は、ＨＥＫと触媒ドメイン内のeph、elk、eck、eek及びerkとの間に高程度の類似性を示す。ＨＥＫは、ephＲＴＫファミリー；（ニワトリ）ＣＥＫ５６.４％、（ラット）elk５６.１％；（ラット）eck５０.６％；（ヒト）eph４２.３％の三つの配列を決定したメンバーの各々と以下の全体蛋白配列類似体を有する。ＨＥＫと密接に相関するＥＬＫとの間の蛋白配列線列を図２に示す。これらの分子の間の類似性は、触媒ドメイン内で最大である。触媒ドメインの外部で、構造又は機能有意差のものでありうる多くの短いモチーフはＨＥＫ、eph、elk及びeck間に、特にＮ末端に向けて保存される。ＨＥＫ、eph、elk及びeck内にシステイン残基の数及び空間配置の偏性保存がある（３４）。これらのサイトカイン残基は細胞外ドメインのＮ末端部分内に群がる（３６）。細胞外ドメインのＣ末端部分は、フィブロネクチン型IIIに見られるもの（３６）と類似である反覆を含む。ＨＥＫは、ＥＰＨ／ＥＬＫファミリーの他のメンバー間のこの位置に保存されるチロシンよりもむしろＣ末端テール（ＡＡ９２８）にシステインを有する。これは、Ｃ末端シロチン残基のリン酸化がチロシンキナーゼ活性を制御できることに有意でありうる。しかしながら、ＨＥＫは位置９３７にＣ末端チロシンを有し、これも自己リン酸化により良好な関係であるように見える（３８)。
【００７０】
ＣＯＳ細胞でのＨＥＫの形質転換及び発現
分離されたcＤＮＡクローンが、IIIＡ４Ｍabにより認識された分子を本当にプログラムしたことを示すために、ＨＥＫ４.５を発現ベクターＣＤＭ８にサブクローンし、センス及びアンチセンスの両配位でＣＯＳ細胞に移入した。図３に示すように、センス配位でＨＥＫを移入し、特にIIIＡ４で染色したＣＯＳ細胞は、cＤＮＡクローンが完全コード配列を含み、IIIＡ４により認識された分子と同一であることを確認した。アンチセンス配位でＨＥＫを移入したＣＯＳ細胞はIIIＡ４で染色しなかった。
【００７１】
ヒトリンパ様細胞系でのＨＥＫの発現
IIIＡ４で染色している細胞表面は、ＬＫ６３−preＢ細胞系及びＪＭ−Ｔ細胞系上のＨＥＫ発現の高度な特殊パターンを明らかにした。ＨＥＫの発現をさらに調べるため、ノーザンブロット分析をＨＥＫ４.５で実施した(図４ないし６）。単一５.５−６.０kbバンドがＬＫ６３及びＪＭ細胞に見られた。しかしながら、IIIＡ４で染色しなかった他のＴ細胞−ＨＳＢ−２では、同じ大きさの弱い強さのバンドが存在した。ＨＥＫ転写物が検出された他の細胞系は、Ｌila−１、ＭＯＩＴ４及びＨeＬaを含む。弱いバンドが心臓筋肉に見られたが、他の細胞系の範囲で検出されたＨＥＫ転写物はなかった（図６）。IIIＡ４ＭＡb結合のスキヤチャード分析を用い、ＨＳＢ−２、ＬＫ６３／ＣＤ２０＋及び他の細胞上に多くのＨＥＫ分子を測定した。ＬＫ６３／ＣＤ２０＋細胞は細胞当り約15,000部位を有し、ＪＭ細胞は細胞当り約9,500部位を有する。これに対し、ＨＳＢ−２は細胞当り約1,070部位を有し、これは、この細胞系の自己蛍光バックグラウンドに対する免疫蛍光による検出では非常に低い。抗体結合についての親和定数は２.５−４.０×１０９の範囲であった。Ｒaji及びＫ５６２細胞は上記バックグラウンドを結合する検出可能な抗体を示さなかった。表１及び２はＨＥＫ発現細胞系の表現型を要約する。
【００７２】
サザンブロット分析
リンパ様腫瘍細胞系ＬＫ６３でのＨＥＫの過剰発現についての基礎を研究するため、ゲノムＤＮＡのサザン分析を実施した（図７）。ＨＥＫの少し保存された部分を覆っている１.１kb断片（上記参照）を、関連チロシンキナーゼ分子の触媒ドメインの保存部分から生じるバックグラウンドを最少にするためにプローブとして用いた。正常未梢血液単該球ＤＮＡに比べ、ＬＫ６３又はＬＫ６３／ＣＤ２０＋腫瘍細胞系でのＨＥＫ遺伝子の明らかな増幅又は再配列はない。
【００７３】
ＨＥＫの染色体指定
正常ヒト染色体補体内にＨＥＫ遺伝子の位置を示すためにＨＥＫcＤＮＡをプローブとして用いた。染色体指定を二つの方法−インサイチューハイブリダイゼーションにより、及び体細胞ハイブリッドのサザン分析により実施した。３０の正常雄中期を蛍光シグナルについて試験した。これらの中期の２４は３cen→３pl２.１の部分の染色体３の１又は両染色分体上にシグナルを示した。このシグナルの８５％は３pl１.２に存在した（図８）。これらの３０中期に見られた全計９の非特異的バックグラウンドがあった。同様の結果が第二雄に対するハイブリダイゼーションから得られた。ハイブリッド細胞パネルのサザンブロット分析は、ヒト染色３からの材料を含んでいるハイブリッドだけに対するＨＥＫプローブのハイブリダイゼーションを示した。５.２、４.８、４.３、２.４及び１.９kbのバンドがＨind III消化物から得られ、４.３、３.２及び１.９kbのバンドがＴaq１消化物から得られた。用いたハイブリッド細胞パネルは染色体２、６q、８、１１p及びＹを除く全ヒトゲノムを示す。両技術からの結果は、従って、染色体３にＨＥＫ遺伝子を局在し、インサイチューハイブリダイゼーション分析はこれをより正確に３pl１.２に位置させた。この部分はＨＥＫ陽性腫瘍では、細胞遺伝学的に異常ではなかった。同様に、ＨＥＫ陽性細胞系には染色体３のコピー数での単離変化はなく、染色体３を含んでいるイソ染色体形成はなかった。
【００７４】
表Ｉ  ＨＥＫ陽性ヒトリンパ様細胞系の表現型
ＨＥＫ陽性細胞系の表現型は、Ｔ及びＢ細胞のマーカーについての染色続くＦＡＣＳ分析により測定した。＋弱く陽性、＋＋陽性、＋＋＋強く陽性。
【表６】
2006187296.tif 000007
【００７５】
表II  ヒト細胞系でのＨＥＫ発現の要約
ＨＥＫ陽性細胞系を、細胞表面染色、ノーザンブロット分析及びスキャタード分析の組合せを用い特徴付けした。＋弱く陽性、＋＋陽性、＋＋＋強く陽性、ＮＴ試験しなかった。
【表７】
2006187296.tif 000008
【００７６】
当業者は、本明細書に記載された発明が特に記載されたもの以外の変形及び修飾を受けることを識別するであろう。本発明がそのような変形及び修飾を含むことを理解すべきである。本発明は又、本明細書に於いて引用した又は示した全ての段階、特徴、組成物及び化合物、並びに全ての二又はそれ以上の該段階又は特徴の如何な且つ全ての組合せを含む。
【００７７】
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2006187296.tif 000009
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ａ】図１ａは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｂ】図１ｂは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｃ】図１ｃは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｄ】図１ｄは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｅ】図１ｅは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｆ】図１ｆは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｇ】図１ｇは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｈ】図１ｈは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図１ｉ】図１ｉは、ヌクレオチド配列を示す描写であり部分的３'及び５'未翻訳配列を伴うＨＥＫコード付け配列のアミノ酸配列を推定する。
【図２】図２は、eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。
【図２ａ】図２ａは、eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。
【図２ｂ】図２ｂは、eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。
【図２ｃ】図２ｃは、eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。
【図２ｄ】図２ｄは、eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。
【図２ｅ】図２ｅは、eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。
【図２ｆ】図２ｆは、eph／elkファミリー内の関連遺伝子、elkを伴うＨＥＫの蛋白配列線列を示す描写である。
【図３】図３は、ＣＯＳ細胞中ＨＥＫの発現を示す写真描写である。
【図４】図４は、細胞系でのＨＥＫ発現のノーザンブロット分析の写真描写である。
【図５】図５は、細胞系でのＨＥＫ発現のノーザンブロット分析を示す写真描写である。
【図６】図６は、大人の死後組織でのＨＥＫ発現のノーザン分析を示す写真描写である。
【図７】図７は、細胞系及び正常ヒト抹消血細胞ＤＮＡでのＨＥＫのノーザンブロット分析を示す写真描写である。
【図８】図８はインサイチューハイブリダイゼーションを示す写真描写である。
【図９】図９は、ＨＥＫ４.５cＤＮＡの予報された翻訳生成物の水治法分析（間隙長：２５）を示す写真描写である。
【図１】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図２】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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