(57)【要約】   【課題】微生物を捕集しその粘着性シート上で微生物を生育し、増殖した微生物を検出することを特徴とする微生物検査用キットを提供する。【解決手段】基材上に粘着剤層を積層してなる粘着性シートの該粘着剤層を被験体の表面に圧着、剥離して該粘着剤層の表面に微生物または細胞を捕集後、該粘着性シート上で微生物を培養、しかる後、前記捕集培養した微生物の検出を行うことを含む、被験体中に存在する微生物検査用粘着性シート及び微生物検査キット。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体の少なくとも片面に設けた非水溶性粘着剤からなる粘着剤層に微生物の栄養素を含有させてなることを特徴とする、微生物検査用粘着性シート。
【請求項２】
非水溶性粘着剤がアクリル系粘着剤である、請求項１記載の微生物検査用粘着性シート。
【請求項３】
粘着剤層に検査対象の微生物を選択し得る選択剤をさらに含有させた請求項１または２記載の微生物検査用粘着性シート。
【請求項４】
粘着剤層に微生物の着色剤をさらに含有させた、請求項１〜３のいずれか一項記載の微生物検査用粘着性シート。
【請求項５】
微生物の着色剤が蛍光染料である、請求項４記載の微生物検査用粘着性シート。
【請求項６】
エマルジョン系非水溶性粘着剤に少なくとも微生物の栄養素を添加・混合して調製した粘着剤組成物を支持体上に塗布、乾燥して粘着剤層を形成することを特徴とする、微生物検査用粘着性シートの製造方法。
【請求項７】
粘着剤組成物がエマルジョン系非水溶性粘着剤に微生物の栄養素とともに、検査対象の微生物を選択し得る選択剤を添加・混合して調製したものである、請求項６記載の微生物検査用粘着性シートの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項記載の微生物検査用粘着性シートの粘着剤層を被験体に圧着して微生物を捕集し、該粘着剤層上に捕集された微生物を培養して増殖させること、及び該増殖させた微生物の検出を行うことを含む、被験体中に存在する微生物の検査方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項記載の微生物検査用粘着性シートの粘着剤層上に検査対象の微生物を含む溶液を滴下し、該粘着剤層上の微生物を培養して増殖させること、及び該増殖させた微生物の検出を行うことを含む、被験体中に存在する微生物の検査方法。
【請求項１０】
生育させた微生物の検出を、目視、増感装置又は自動検出装置によって行うことを特徴とする、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項記載の微生物検査用粘着性シートと、検査対象の微生物を着色し得る着色剤及び／又は検査対象の微生物を選択し得る選択剤を含むことを特徴とする、微生物検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は粘着剤層上に捕集した微生物を培養して増殖させることができる微生物検査用粘着性シート及びその製造方法に関する。また、該粘着性シートを用いた微生物検査方法及び検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、被験材料中の菌数を推定するには、例えば市販のフードスタンプ等を使用したアガースタンプ法のように、１個の菌が１個のコロニーを形成することを応用し、寒天等の固形培地を被験材料に押し当てて菌を培養し、寒天平板上に発現したコロニーを肉眼で見定めながら計測する方法がある。また、例えば市販の微生物／微粒子検査用メンブレンフィルター等を使用したメンブレンフィルター法のように、被験材料を生理食塩水等で洗いだし、メンブレンフィルターで捕集し、液体培地を吸収させることによりフィルター上でコロニーを形成させる方法もある。さらに下記非特許文献１には、フィルムに培地をコートし、これを被験面に接触培養するだけで検体採取が可能なフィルムコート培地を作成した例が報告されている。
【０００３】
しかしながら、アガースタンプ法では、寒天培地の大きさ（面積）が限られているとともに、通常一被験面に対して一度しか使用できないので、寒天培地の含水率によって捕集効率が変化し、再現性に劣る等、細菌の捕集効率において不都合をきたすことが多かった。さらに、寒天培地中の水分によって被験面が汚染されるといった問題もある。
【０００４】
さらに、下記非特許文献１に発表されたフィルムコート培地は、アガースタンプ法と同様に、水分によって被験面が汚染されるといった問題がある。また、使用されている寒天培地の曲げ強度が小さい為に、シートとしての利用が制限され、培地とフィルムとの接着力不足等の諸欠点がある。
【０００５】
一方、本出願人は、粘着性シートの粘着剤層を圧着、剥離して、該粘着剤層上に微生物を捕集（集積）した後、微生物を染色し得る一種以上の発色性物資を含有する水溶液を粘着剤層表面に接触させ、染色された菌体を観察・計数（画像解析）することで、被験体中に存在する微生物を検出できる検査方法を提案した（下記特許文献１）。この検査方法は、粘着性シートの粘着剤層を微生物の捕集手段及び被験面として用いることによって、特に固形状の被験体の表面（固体表面）に存在する微生物を簡便に検出できるようにしたものである。しかしながら、例えば、被験体の表面が比較的清浄なものである場合、微生物捕集量が少ないために、十分に高い検出精度が得られないという問題があった。また、下記特許文献１の方法では、捕集された微生物と微小なごみとの識別がし難いという問題もあった。
【特許文献１】特開２００２−１４２７９７号公報
【非特許文献１】医学検査、１９９２年、第４１巻、第３号、p３５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に艦みなされたもので、その目的は、被験体に圧着、剥離して粘着剤層上に捕集した微生物（検体）を培養して増殖させることができる微生物検査用粘着性シート及びその製造方法、並びに、そのような粘着性シートを用いた微生物の検査方法及び検査用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、一般に水溶性物質からなる微生物の栄養素をエマルジョン系粘着剤（以下、「エマルジョン粘着剤」ともいう。）に添加・混合すると、該栄養素はエマルジョン粘着剤の水性溶媒に溶解し、こうして得られる粘着剤組成物を塗工、乾燥して得られる粘着剤層は粘着剤が非水溶性でありながら、微生物の生育が可能な培地様の粘着剤層となり得ることを見出し、かかる知見に基づきさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）支持体の少なくとも片面に設けた非水溶性粘着剤からなる粘着剤層に微生物の栄養素を含有させてなることを特徴とする、微生物検査用粘着性シート、
（２）非水溶性粘着剤がアクリル系粘着剤である、（１）記載の微生物検査用粘着性シート、
（３）粘着剤層に検査対象の微生物を選択し得る選択剤をさらに含有させた（１）または（２）記載の微生物検査用粘着性シート、
（４）粘着剤層に微生物の着色剤をさらに含有させた、（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物検査用粘着性シート、
（５）微生物の着色剤が蛍光染料である、（４）記載の微生物検査用粘着性シート、
（６）エマルジョン系非水溶性粘着剤に少なくとも微生物の栄養素を添加・混合して調製した粘着剤組成物を支持体上に塗布、乾燥して粘着剤層を形成することを特徴とする、微生物検査用粘着性シートの製造方法、
（７）粘着剤組成物がエマルジョン系非水溶性粘着剤に微生物の栄養素とともに、検査対象の微生物を選択し得る選択剤を添加・混合して調製したものである、（６）記載の微生物検査用粘着性シートの製造方法、
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物検査用粘着性シートの粘着剤層を被験体に圧着して微生物を捕集し、該粘着剤層上に捕集された微生物を培養して増殖させること、及び該増殖させた微生物の検出を行うことを含む、被験体中に存在する微生物の検査方法、
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物検査用粘着性シートの粘着剤層上に検査対象の微生物を含む溶液を滴下し、該粘着剤層上の微生物を培養して増殖させること、及び該増殖させた微生物の検出を行うことを含む、被験体中に存在する微生物の検査方法、
（１０）生育させた微生物の検出を、目視、増感装置又は自動検出装置によって行うことを特徴とする、（８）または（９）記載の方法、
（１１）（１）〜（５）のいずれかに記載の微生物検査用粘着性シートと、検査対象の微生物を着色し得る着色剤及び／又は検査対象の微生物を選択し得る選択剤を含むことを特徴とする、微生物検査用キット、
に関する。
【０００９】
なお、本明細書中、「微生物の検査」とは「微生物の検出検査」を意味する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微生物検査用粘着性シートによれば、粘着剤層が微生物の栄養素を含むことから、粘着剤層上に捕集した微生物はそのまま培養して増殖させることができる。よって、粘着剤層上に捕集した微生物（検体）量が少ない場合でも、粘着剤層上に捕集した微生物を他の媒体に転写して培養する等の煩わしい作業を行うことなく、粘着性シート上で微生物（検体）の濃度を高めて、粘着剤層表面を被験面として精度の高い検出作業を行うことができる。また、比較的清浄度が高い被験体を検査対象とするときには同一粘着面で検査範囲を拡げることができるので、経済的かつ省力的に微生物の検出を行うことができる。また、微生物の捕集は非水溶性粘着剤の粘着力によることから、比較的高い捕集効率が安定的に得られ、しかも、従来の検査用培地で問題となっていた、水分による被験面汚染の問題も解消することができる。
また、本発明の微生物検査用粘着性シートは、シートとしての操作性、取扱い性、安定性、保存性に優れるので、微生物の生育及び／又は検出のために必要な他の試薬、材料、器具等と組み合わせて、微生物検査のためのキットを構成することができ、該キットによって、検査作業者は、微生物検査をより簡単に実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
図１は本発明の微生物検査用粘着性シート（以下、単に「粘着性シート」と略称する場合がある。）の一例を簡略化して示した断面図である。本発明の微生物検査用粘着性シートは、該一例の微生物検査用粘着性シート１０に示されるように、支持体２の少なくとも片面に非水溶性粘着剤からなる粘着剤層１が形成され、該粘着剤層１に少なくとも微生物の生育に必要な栄養素を含有させたものである。
【００１２】
該一例の粘着性シート１０は、支持体２の一方の片面に粘着剤層１を設けたものであるが、本発明の粘着性シートにおいて、粘着剤層１は支持体２の両面（一方と他方の片面）に設けてもよい。
【００１３】
後述するように、本発明の粘着性シートにおいて、粘着剤層１は、エマルジョン粘着剤の水性溶媒に少なくとも微生物の栄養素を溶解乃至分散させた粘着剤組成物を塗布、乾燥することで形成される。よって、粘着剤層１はその粘着剤（粘着性高分子化合物）が非水溶性でありながら、微生物の生育に必要な栄養素を含む培地様の層を形成し得、微生物を付着（捕集）し得る粘着性と微生物を生育できる培地としての機能を有する。
【００１４】
本発明で使用するエマルジョン粘着剤とは、水性溶媒に非水溶性粘着剤（粘着性高分子化合物）が微粒子状に分散したエマルジョンであり、非水溶性粘着剤には、例えば、アクリル系粘着剤、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤、エチレン−酢酸ビニル共重合物、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル等が使用される。中でも、微生物を染色して顕微鏡等でその画像取得を行う場合の光学特性に影響が少ないという点で、透明性が高いアクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤等が好ましく、アクリル系粘着剤が特に好ましい。また、微生物等を蛍光標識してその検出を行う場合には、透明性が高く、しかも無蛍光性である点から、アクリル系粘着剤やシリコーン系粘着剤が好ましく、アクリル系粘着剤が特に好ましい。
【００１５】
エマルジョン粘着剤は粘着剤の公知の形態であり、自体公知の方法で調製できるが、粘着剤（粘着性高分子化合物）のモノマーを乳化重合することによって製造するのが好ましい。該乳化重合においては、水性溶媒中でモノマーとともに乳化剤（界面活性剤）、連鎖移動剤および重合開始剤とを配合し、加湿、乳化重合反応により水分散型の重合体（エマルジョン）が得られる。かかる乳化重合方法は特に限定されないが、一括仕込み法、モノマー逐次追加法、シード重合法、乳化モノマー逐次追加法などの既知の乳化重合方法を制限なく用いることができる。
【００１６】
また、乳化重合に際し、水媒体中でのモノマーの分散安定性の維持や重合安定性を考慮し、界面活性剤、すなわちアニオン性乳化剤（スルホコハク酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸ナトリウム等）、非イオン性乳化剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキルフェニルエーテル等）、カチオン性乳化剤（アルキルトリメチルアンモニウムクロライド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等）や、これらの不飽和基（例えば、プロペニル基やアリル基などのラジカル重合性基）が付与された反応性乳化剤などが用いられ、これら１種もしくは２種以上併用して用いることができる。これらのうち安定性の点から、アニオン性乳化剤や非イオン性乳化剤、反応性乳化剤を用いることが好ましい。
【００１７】
ラウリルメルカプタンなどの連鎖移動剤を用いて共重合体の分子量を調節することができるが、連鎖移動剤のみの調整に限定するものではなく、その量と重合温度などによっても調節できる。また、重合開始剤は、乳化重合用の重合開始剤として知られている公知の化合物を使用することができるが、例えば、過硫酸塩や有機過酸化合物、レドックス系開始剤およびアゾ系開始剤などが好適である。
【００１８】
エマルジョン粘着剤がアクリル系粘着剤のエマルジョンである場合、通常、２種以上の (メタ）アクリル酸系モノマーを乳化重合して共重合体を得ることによって作製される。(メタ）アクリル酸系モノマーとしては、(メタ）アクリル酸、(メタ）アクリル酸アルキルエステルが好適であり、（メタ）アクリル酸アルキルエステルのアルキル基（アルキルアルコール残基）は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、炭素数が４〜１２程度が好ましく、例えば、ブチル基、ペンチル基、ドデシル基、ヘキシル基、ノニル基等が挙げられ、好適な具体例としては、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸イソオクチル、メタクリル酸メチルが挙げられる。本発明において、アクリル系粘着剤は特にアクリル酸とアクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸イソオクチル及びメタクリル酸メチルから選ばれる少なくとも１種との共重合体が好ましく、その共重合比は好ましくはアクリル酸が１〜２０重量％、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸イソオクチル及びメタクリル酸メチルから選ばれる少なくとも１種が８０〜９９重量％であり、特に好ましくはアクリル酸が２〜１０重量％、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸イソオクチル及びメタクリル酸メチルから選ばれる少なくとも１種が９０〜９８重量％である
【００１９】
また、アクリル系粘着剤の分子量は特に限定はされないが、微生物の捕集効率向上の点から、ゾル分の重量平均分子量が１０万〜１００万の範囲が好ましく、２０万〜５０万の範囲がより好ましい。ゾル分の重量平均分子量が１０万未満の場合、粘着剤層の凝集力が低下して、微生物の捕集効率が低下すると共に、被験面から剥離した場合に被験面を汚染する恐れがある。また、ゾル分の重量平均分子量が１００万を超える場合、粘着剤層の凝集力が高すぎて、粘着剤層表面のタック（粘着力）が低下し、微生物の捕集効率が低下する傾向を示すため、好ましくない。
【００２０】
本発明の粘着性シートにおいて、粘着剤層１に含有させる微生物の栄養素は特に限定されず、検出目的の微生物に応じて、種々の栄養素を選択でき、例えば、標準寒天培地、ＬＢ培地、ＳＣＤＡ培地（一般細菌用）、Ｒ２Ａ培地（水質検査用）、マンニット食塩培地（ブトウ球菌用）等が挙げられる。該栄養素の配合量は特に限定されないが、微生物の増殖性の点から、粘着剤（固形分）に対し０．５〜２０重量％程度が好ましく、１〜１０重量％程度がより好ましい。
【００２１】
また、粘着剤層１には微生物の栄養素以外に、微生物の検出に好適に作用する機能物質（添加剤）を添加することができる。該機能物質（添加剤）としては、例えば、特定の微生物を検出するための選択剤、微生物を着色し得る着色剤等が挙げられる。
【００２２】
選択剤の具体例としては、選択培地、抗菌剤、抗生物質等が挙げられる。特定の微生物としては、食中毒菌として問題となっている、大腸菌や腸管出血性大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ、腸炎ビブリオ、リステリア、院内感染問題で注目を浴びている薬剤耐性菌のMRSA、ナチュラルウォーター中に存在する微生物、医薬用水中に存在する微生物、酵母、真菌などが挙げられる。耐性菌検出のために添加する抗菌剤の具体例としては、例えば、アルコール類、グルタルアルデヒド、ヨードホール、ポピドンヨード、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、アルキルポリアミノエチルグリシン、グルコン酸シクロヘキシジン、ベンズイソチアゾリン、有機窒素含有環式化合物、有機窒素硫黄系化合物、有機窒素硫黄ハロゲン化合物、ピリジンオキサイド系化合物等が挙げられ、抗生物質の具体例としては、例えば、セフェム系、第二世代セフェム系、第三世代セフェム系抗生物質（セファロシン、セファロリジン等）、ペニシリン系抗生物質（メチシリン、アンピシリン、ペニシリンＧ等）、テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン等）、ペプチド系抗生物質（バンコマイシン等）、アミノグリコシド系抗生物質（アルベカシン、スプレプトマイシン、カナマイシン等）が挙げられる。これら抗菌剤及び／又は抗生物質の配合量は特に限定されないが、粘着剤（固形分）に対し１×１０−６〜１×１０−１重量％程度が好ましく、２×１０−５〜４×１０−３重量％がより好ましい。
【００２３】
微生物の着色剤としては、微生物の検出検査（試験）において微生物を着色するために使用されている公知の材料を用いることができる。例えば、微生物の着色に汎用されている蛍光染料や、生育する微生物に特異的な酵素基質、ｐＨ指示薬のような着色料等が挙げられる。蛍光染料は、検査対象である微生物または細胞に作用して蛍光を発する物質（蛍光性物質）であれば特に限定されないが、それ自身は発光しないが、微生物の作用により変換され、発光するようになる物質を用いるのが好ましく、具体例としては、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold、SYTOX Green、DAPI、6-Carboxyfluorescein Diacetate(CFDA)、TOTO-1 Iodide、 YOYO-1 Iodide、SYTO 62、SYTO 63、SYTO 64（いずれもMolecular Probes社製）などが挙げられ、なかでも、SYBR Goldが微生物の染色性が良好で、しかも、微生物の増殖を阻害しにくい点でより好ましい。添加する蛍光染料の濃度は、粘着剤層中、好ましくは０．０１〜１００ｐｐｍ、より好ましくは０．１〜１０ｐｐｍである。すなわち、濃度が０．０１ｐｐｍより小さい場合、微生物の着色が弱くて、検出が困難となり、濃度が１００ｐｐｍを超える場合、バックグラウンド発色が生じて、検出が困難となってしまい、好ましくない。また、着色剤として酵素基質を使用する場合、添加する酵素基質の濃度は、粘着剤層中、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである。すなわち、濃度が１０μｇ／ｍｌより小さい場合、微生物の着色が弱くて、検出が困難となり、濃度が１０ｍｇ／ｍｌを超える場合、バックグラウンド発色が生じて、検出が困難となってしまい、好ましくない。さらに、着色剤としてｐＨ指示薬を使用する場合、添加するｐＨ指示薬の濃度は、粘着剤層中、好ましくは１μｇ／ｇ〜１ｍｇ／ｇ、より好ましくは５μｇ／ｇ〜２００μｇ／ｇである。すなわち、濃度が１μｇ／ｇより小さい場合、微生物の着色が弱くて、検出が困難となり、濃度が１ｍｇ／ｇを超える場合、バックグラウンド発色が生じて、検出が困難となってしまい、好ましくない。
【００２４】
本発明の微生物検査用粘着性シートにおいて、粘着剤層１の厚みは、捕集効率や、微生物の生育に必要な栄養素の供給量維持等の観点から、５〜２０００μｍが好ましく、特に好ましくは２０〜５００μｍである。すなわち、厚みが２０００μｍを超える場合は、粘着剤層が凝集破壊しやすくなり、捕集効率が低下すると共に、被験面を汚染しやすくなる。また、厚みが５μｍより小さい場合、微生物の生育に必要な栄養素を充分に供給しにくくなるので好ましくない。
【００２５】
本発明の微生物検査用粘着性シートにおける支持体２には、粘着テープ用の支持体として使用されている公知のシート(フィルム）類を適用できるが、粘着剤層表面に大きな凹凸を形成させず、また、曲面や狭所表面にも自在に圧着させ得る柔軟な材質からなるものが好適であり、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ウレタン−アクリルハイブリッド樹脂等からなるプラスチックシート、布、不織布、紙、ポリエチレンラミネート紙等が挙げられる。これらの中でも、柔軟性や機械的強度の点からポリエステルフィルムやポリカーボネートフィルムが好ましい。
【００２６】
また、支持体２の厚みは粘着性シートの支持体としての十分な強度が得られる厚みであれば特に制限されるものではないが、一般的には５〜５０００μｍ程度であり、好ましくは５〜２００μｍ程度である。
【００２７】
本発明の微生物検査用粘着性シートには、支持体２の粘着剤層と接する面とは反対面に、基材の強度を上げたり、光学的な散乱防止や発色性物質を用いて発色した微生物の視認性を向上させるバックグランド色を形成するために、さらにバッキング層を設けてもよい。
【００２８】
本発明の微生物検査用粘着性シートは、エマルジョン粘着剤に微生物の栄養素、さらに必要に応じて目的に応じた種々の機能物質（添加剤）を添加、混合して粘着剤組成物を調製し、かかる粘着剤組成物をアプリケータ等の公知の塗工手段を用いて支持体上に塗布し、次いで、１００〜１３０℃程度で乾燥することによって製造することができる。かくして得られた粘着性シートは任意の形状に裁断して、使用することができる。
【００２９】
こうして作製された粘着性シートは滅菌した状態で細菌遮断性包材に封入する等により、無菌状態を保持した形態をとることができる。なお滅菌法はγ線滅菌などを用いるのが好ましい。即ち、粘着性シートを細菌遮断性包材に封入する等により、無菌状態を保持し得る形態とした後、γ線滅菌処理を施すことにより、本発明の粘着性シートを流通に供することができる。なお、粘着剤層に、微生物の着色剤として、蛍光性色素を含有させる場合、蛍光性色素の減退を防ぐために、作製した粘着性シートは遮光保存するのが好ましい。
【００３０】
以下、本発明の微生物検査用粘着性シートを用いて、微生物を検出する方法について説明する。まず、粘着性シートの粘着剤層を被験体に押し当て、被験体に付着している微生物を粘着剤層上に捕集する。また、水溶液状の被験物質（即ち、検査対象の微生物を含む水性溶液、例えば、飲料水や食品懸濁液、拭き取り法などにより捕集した微生物含有液等）を粘着性シートの粘着剤層上に直接接種する。次に、粘着剤層上の微生物を培養して増殖させる。粘着剤層は微生物の生育に必要な栄養素を含んでいるため、粘着剤層上の微生物は培地に転写（培地に接触）させる必要なく、粘着剤層上で増殖させることができる。
【００３１】
なお、人体や設備機器の二次汚染を防ぐ目的で本発明の粘着性シートはこれらの汚染源となる物品、環境から遮断された状態を保つのが好ましく、例えば、微生物を捕集した粘着性シートを直ちにシャーレに入れる、粘着性シートの粘着剤層を微生物が透過することのできないフィルムで覆う等の手段を講じるのが好ましい。図２は微生物を捕集した粘着性シートをシャーレに入れて微生物の培養を行う実施態様の一例を示している。また、図３は、シャーレに入れる代わりに、微生物が透過することのできないフィルムで覆う実施態様の一例を示している。なお、ここでいう「微生物が透過することのできないフィルム」とは、微生物が移動可能な大きさの孔を有しないフィルムのことであり、例えば、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレンなどのプラスチックフィルムや、孔径０．２μｍ以下のメンブレンフィルタ等が挙げられる。
【００３２】
本発明において、微生物の培養は、微生物がその粘着剤層上に捕集された（付着した）粘着性シートをそのまま微生物が培養され得る環境下、すなわち、微生物が生育し得る温・湿度環境下に置くことによって行うことができる。粘着性シートを微生物が生育し得る温・湿度環境下とは、例えば、恒温インキュベーターや湿潤箱によって得られる環境である。また、孵卵器等のインキュベーターを使用してもよい。粘着剤層に含有させた栄養素、さらに種々の機能物質（添加剤）が、微生物に取り込まれ、微生物の増殖が進む。なお、適当な水分存在下で微生物を培養することが好ましく、例えば、インキュベートに用いる機器（孵卵器等）内を湿潤にする方法、微生物が付着した粘着剤層表面に滅菌水や滅菌生理食塩水等を滴下する方法等が挙げられる。なお、滅菌水や滅菌生理食塩水等を滴下する場合、該滅菌水等に特定の微生物を検出するための選択剤を含んでも良く、その場合選択剤の量は１×１０−６〜１×１０−１重量％程度が好ましく、２×１０−５〜４×１０−３重量％がより好ましい。
【００３３】
本発明の粘着性シートで検出する微生物は特に限定されない。前記したように、選択培地や抗生物質を添加することで、特定の菌のみについて検出することも可能である。
【００３４】
本発明における検出対象となる微生物には、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類などが含まれる。また、微生物にはコロニー、マイクロコロニーも含まれる。
【００３５】
本発明の粘着性シートで増殖した微生物の集合体（コロニー）を検知する手段は特に限定されない。目視で観察しても良いし、光学顕微鏡や位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、レーザー顕微鏡等で観察しても良い。また、市販のコロニーカウンターや、各種画像の自動検出装置（例えば、簡易顕微鏡にオートスキャン装置を組み合わせたもので、該粘着性シートをステージに乗せるだけで、自動で画像を取り込み、微生物を検出するもの）を用いても良い。
【００３６】
本発明の粘着性シートで増殖した微生物のコロニーの大きさは、特に限定されない。目視で観察できる大きさまで増殖させても良い。また、少なくとも４個以上の集合体であれば、増殖したコロニーとして判定できる。
【００３７】
本発明の粘着性シートで増殖した微生物を検知する場合、直接観察しても良いし、観察前に微生物を着色してもよい。また、前記したように、本発明の粘着性シートにおいては、粘着剤層に予め微生物の着色剤を含有させることができるが、粘着剤層に微生物の着色剤を含有させて微生物を増殖させた後、さらに微生物の観察前に粘着剤層を着色剤に付して微生物を着色してもよい。このような微生物の観察前に行う微生物の着色に使用する着色剤には、粘着剤層に含有させる着色剤と同様のものを使用することができ、その具体例も前記と同様のものが挙げられる。なお、あらかじめ粘着剤中に着色剤を添加することで、増殖した微生物を十分に着色できる場合、観察前の微生物の着色作業の手間を省くことができる。
【００３８】
本発明の粘着性シートを適用して微生物検査を行う被験体は特に限定されない。例えば、床や壁、食品や医薬品の製造装置、肉や魚や野菜の表面、ホモジナイズした食品、調理器具、医療器具、水などが挙げられる。
【００３９】
本発明の粘着性シートの応用の一例として、該粘着性シートをローラーとして使用すれば、細菌を粘着捕獲したシートの粘着面にコロニーを発現させることができ、被験物質の清浄度を簡便に測定する院内環境調査用などに利用できる。また、粘着剤の培地にメチシリン等の特定の抗菌剤や抗生物質を含有させることによりMRSA等の耐性菌の検出用途にも使用できる。
【００４０】
本発明の粘着性シートを用いた微生物検査用キットの内容は、微生物を着色し得る着色剤、微生物を選択し得る添加剤、微生物を捕集後培養するためのシャーレ、微生物を捕集後培養する際に粘着性シートを覆う微生物が透過することのできないフィルム、小型インキュベーター等が考えられ、誰でも何処でもできる環境調査器具一式を提供することができる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明するが、これは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４２】
〔実施例１〕
（１）粘着性シートの作製
冷却管、窒素導入管、温度計および攪拌装置を備えた反応容器内に、蒸留水９４重量部、乳化剤（界面活性剤、花王：商品名ラテムルＳ１８０Ａ）を０．８８重量部、アクリル酸２−エチルヘキシル９３重量部、アクリル酸２重量部、メタクリル酸メチル１０重量部、連鎖移動剤量としてラウリルメルカプタン０．０５重量部、重合開始剤として過硫酸アンモニウム０．１重量部の配合にて、重合温度７０℃、乳化モノマー逐次追加法により約４．５時間反応させ、その後８６℃で２時間の熟成により反応を完結させ、粘着組成物（ゾル分重量平均分子量３３万）を得た。ゾル分の重合平均分子量は、約１０ｍｇの粘着組成物を１０ｍｌのＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に１２時間以上浸漬、溶解させ、０．２μｍのメンブレンフィルターにて濾過した濾液をＧＰＣ法にてポリスチレン換算値として算出することにより測定した。なお、分析装置はＴＯＳＨＯ製ＨＬＣ８１２０ＧＰＣを用いた。
【００４３】
上記のようにして得られた粘着組成物８１．３５ｇ（固形分３８％）にSCD Broth（日水製薬（株）製）０．９２７ｇを添加し、混合した。この混合物を自体既知の方法で製造された３８μｍ厚ＰＥＴフィルムの片面に、粘着剤層の厚みが２０μｍとなるように塗布し、１１０℃で３分乾燥させた。これを適当な大きさに切り取り、培地添加粘着性シートとした。
【００４４】
（２）微生物の捕集および染色
滅菌生理食塩水で６．３×１０５cells／ｍｌに希釈した大腸菌（Escherichia coli  K-12株）１ｍｌを、ポリカーボネート製の濾過フィルター（ワットマン社製、Nuclepore、孔径０．２μｍ）で濾過し、濾過面に（１）で作製した培養添加粘着性シートの粘着剤面を指で軽く押し当て、すぐに剥離した。前記の方法により集菌した粘着性シートをシャーレに入れて蓋をし、インキュベーター内にて３７℃で１６時間静置培養した。培養後、リン酸緩衝液で１ｐｐｍに調整した６−ＣＦＤＡ溶液（Molecular Probes社製）３００μlを粘着剤面に滴下し、３分間室温で放置して染色した後、粘着剤面をリン酸緩衝液で洗浄した。
【００４５】
（３）検出（計測）
粘着剤層表面（微生物捕集培養面）を落射型蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＢＸ５１）（１０００倍、青色励起：４６０ｎｍ〜４９０ｎｍの励起波長）で観察したところ、培地を添加した粘着剤上で該大腸菌が増殖し、形成されたマイクロコロニーを観察することができた（図４）。
【００４６】
本発明の粘着性シートを用いてブドウ球菌（Staphylococcus  ATCC  strain  No.155）の検出を行い、従来行われている拭き取り法との比較を行った。
【００４７】
〔実施例２〕
（１）微生物の捕集および染色
実施例１と同様の方法で粘着性シートを作製し、滅菌生理食塩水で１．８×１０６ cells／ｍｌに希釈したブドウ球菌（Staphylococcus  ATCC  strain  No.155）１ｍｌを、フィルター（ワットマン社製、Nucleopore、孔径０．２μｍ）で濾過し、濾過面に培地添加粘着性シートの粘着剤面を指で軽く押し当て、すぐに剥離した。前記の方法により集菌した粘着性シートをシャーレに入れて蓋をし、３７℃で１６時間培養した。培養後、リン酸緩衝液で１ｐｐｍに調整した６−ＣＦＤＡ溶液（Molecular Probe社製）３００μｌを粘着剤面に滴下し、３分間室温で放置して染色した後、粘着剤面をリン酸緩衝液で洗浄した。
【００４８】
（３）検出（計測）
粘着剤層表面（微生物捕集培養面）を落射型蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＢＸ５１）（１０００倍、青色励起：４６０ｎｍ〜４９０ｎｍの励起波長）で観察したところ、培地を添加した粘着剤上で該ブドウ球菌が増殖し、形成されたマイクロコロニーを観察することができた（図５）。また、形成されたマイクロコロニーから検出菌数を計測した。
【００４９】
（４）初期菌数及び回収菌数の計測
フィルターで濾過により捕集した菌数を初期菌数とし、６−ＣＦＤＡ染色による直顕法で計測した。また、粘着性シートで集菌した菌数を回収菌数とし、６−ＣＦＤＡ染色による直顕法で計測した。
【００５０】
〔比較例１〕
（１）微生物の捕集及び検出（計測）
実施例２と同条件で同ブドウ球菌をフィルター濾過し、濾過面を綿棒拭き取りキット（エルメックス社製、Pro-media AT-25）で拭き取り、綿棒上に集菌したブドウ球菌を滅菌生理食塩水中に懸濁させた。この懸濁液０．１ｍｌをＳＣＤＡ培地（ＢＢＬ社製、トリプチケースソイ寒天培地）に塗沫し、３７℃で４０時間培養した後に、目視にて形成されたコロニーを観察した。また、形成されたコロニーから検出菌数を計測した。
【００５１】
（２）初期菌数及び回収菌数の計測
フィルターで濾過により捕集した菌数を初期菌数とし、６−ＣＦＤＡ染色による直顕法で計測した。また、綿棒拭き取りで集菌した菌数を回収菌数とし、６−ＣＦＤＡ染色による直顕法で計測した。
【００５２】
実施例２と比較例１の結果を表に示す。表中の、回収率、コロニー形成率、最終検出率はそれぞれ、回収率＝１００×回収菌数／初期菌数、コロニー形成率＝１００×検出菌数／回収菌数、最終検出率＝１００×検出菌数／初期菌数、の各式より導き出された。
【００５３】
【表１】
2006136299.tif 000002
【００５４】
実施例２において培地を添加した粘着剤上でブドウ球菌の増殖が見られ、マイクロコロニーとして検出することができた。また比較例１に比べ、回収菌数ならびに検出菌数が多い結果となった（図６）。検出時間も短く、本発明の粘着性シートとそれを用いた微生物検出方法の有用性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の粘着性シートの一実施態様を示す横断面図である。
【図２】本発明の粘着性シートを培養する際の、一実施態様例を示す横断面図である。
【図３】本発明の粘着性シートを培養する際の、他の一実施態様例を示す横断面図である。
【図４】実施例１で観察された、大腸菌のマイクロコロニーを示す図である。
【図５】実施例２で観察された、ブドウ球菌のマイクロコロニーを示す図である。
【図６】実施例２で測定した初期菌数、回収菌数、検出菌数と、比較例１で測定した初期菌数、回収菌数、検出菌数を比較する図である。
【符号の説明】
【００５６】
１  粘着剤
２  支持体
３  シャーレ
４  フィルム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図４】
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【図５】
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