(57)【要約】【課題】  簡易な構成により反応領域に対する電界印加を効率的、効果的に行うこと、特に、反応領域に臨む電極の特定部位に電界を効果的に集中させること。【解決手段】  物質間の相互作用の場となる反応領域Ｒと、該反応領域Ｒに対して電界Ｅを印加するときに用いる電極層１２，１３と、該電極の表面を覆う絶縁層１４と、を有する検出部において、この絶縁層１４には、誘電率の高い特定絶縁部１４１を設けるようにし、この特定絶縁部１４１に電界を集中させる。例えば、特定絶縁部１４１は、周囲の絶縁層１４２よりも誘電率の高い材料で形成した部位とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質間の相互作用の場となる反応領域と、該反応領域に対する電界印加に用いられる電極と、該電極の表面を覆う絶縁層と、を備え、
前記絶縁層には、誘電率の高い特定絶縁部が設けられている相互作用検出部。
【請求項２】
前記特定絶縁部は、周囲の絶縁層よりも誘電率の高い材料で形成された部位であることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項３】
前記特定絶縁部は、周囲の絶縁層よりも薄膜に形成された部位であることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項４】
前記特定絶縁部には、プローブ物質が固定されていること特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項５】
前記相互作用は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項６】
請求項１記載の相互作用検出部が設けられたセンサーチップ。
【請求項７】
物質間の相互作用の場となる反応領域と、該反応領域に対する電界印加に用いられる電極と、該電極の表面を覆う絶縁層と、を備える検出部を用いて、
前記絶縁層に設けておいた誘電率の高い特定絶縁部に電界を集中させることによって、プローブ物質の固定化促進又は前記相互作用の促進を行うことを特徴とするバイオアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用を検出するときに有用な技術に関する。より詳しくは、電気力学的作用を有効に利用して、プローブ物質の固定化や相互作用の促進を達成するときに有用な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等のヌクレオチド鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。その他、核酸分子以外の生体分子間の相互作用を検出するセンサーチップ（例えば、プロテインチップ）や検出装置が種々開発されている。
【０００４】
ここで、所定の反応領域において、物質間の相互作用を進行させてこれを検出するアッセイ系において、電気泳動や誘電泳動などの電気的力学的効果を利用する技術が近年提案され始めている。以下、当該技術を例示する。
【０００５】
まず、特許文献１には、鋳型基板上に固定された核酸プローブ鋳型鎖を用い、該鋳型鎖に沿って核酸プローブ鎖を合成し、この合成されたプローブを、電界を利用して別のアレイ基板上に固定することにより、簡易かつ低コストで核酸鎖固定化アレイを製造する技術が開示されている。
【０００６】
特許文献２には、互いに着脱可能な本体部とフレームとから構成され、本体部の内側にはマトリックス状に多数のピン電極が突出され、このピン電極には異なる遺伝子配列から成るオリゴヌクレオチドを固定し、このピン電極と接触しないようにフレームの窪みに共通電極が配設し、共通電極とピン電極間に電圧を印加し、電流を検出して前記オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより得られた二本鎖ＤＮＡを検出する技術が開示されている。
【０００７】
特許文献３には、検出用ヌクレオチド鎖と該検出用ヌクレオチド鎖と相補性のある塩基配列を備える標的ヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの場となる反応領域が、前記検出用ヌクレオチド鎖を電界により伸長させながら、誘電泳動の作用によって走査電極の端部に固定できる構成とされたハイブリダイゼーション検出部が開示されている。
【特許文献１】特開２００１−３３０６０８号公報。
【特許文献２】特開２００１−２４２１３５号公報。
【特許文献３】特開２００４−１３５５１２号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上掲した先行技術では、いずれも反応領域に対向配置された電極又は電極群を利用するものであるが、このような技術では、反応領域中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止する必要性があり、また、電極と溶媒との間の電子授受を防いで電極の腐食を防止する必要もあるため、反応領域に臨む電極面を絶縁層（絶縁膜）で覆うことが望ましい。さらには、絶縁層は、電気分解による気泡の発生によって起こり得る電極の剥離を防止することもできる。
【０００９】
しかし、電極に絶縁層を設けると、該絶縁層の蓄電作用（キャパシタとしての作用）により、反応領域に実投入できる電界強度が低下してしまうので、この実電圧ロスを予め見込んで投入電圧を高くしておく必要がある。このため、エネルギー効率が悪化し、高電圧投入のための装置的工夫が必要になってしまうという技術的課題があった。また、反応領域において、例えば、物質の双極子に対する不均一電場の駆動力を利用する誘電泳動という電気力学的効果を用いる場合を想定すると、電極近傍に不均一電界を形成するために電極形状に電界が集中し易いエッジ部分を形成する方法が有効であるが、このような電極の微細加工は煩雑である。
【００１０】
そこで、本発明は、簡易な構成により反応領域に対する電界印加を効率的、効果的に行うことができる相互作用検出部、特に、反応領域に臨む電極の特定部位に電界を効果的に集中させることができる相互作用検出部などを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、まず、物質間の相互作用の場となる反応領域と、該反応領域に対する電界印加に用いられる電極と、該電極の表面を覆う絶縁層と、を備え、前記絶縁層に、誘電率（比誘電率）の高い特定絶縁部を設けた相互作用検出部、並びに該相互作用検出部が設けられたセンサーチップを提供する。なお、本発明において「特定絶縁部」とは、周囲に比して電界強度を高めたり、電界を集中させたりする目的で形成した絶縁層の所定部位を意味する。
【００１２】
ここで、特定絶縁部は、周囲の絶縁層よりも誘電率の高い材料で形成した部位や周囲の絶縁層よりも薄膜に形成した部位が好適である。この特定絶縁部には、周囲の絶縁層領域よりも電界強度を高めたり、あるいは電界を集中させて不均一電場を局所的に形成したりできる。
【００１３】
そこで、本発明では、物質間の相互作用の場となる反応領域と、該反応領域に対する電界印加に用いられる電極と、該電極の表面を覆う絶縁層と、を備える検出部を用いて、前記絶縁層に設けた誘電率の高い特定絶縁部に電界を集中させて、プローブ物質の固定化促進又は前記相互作用の促進を行うバイオアッセイ方法を提供する。
【００１４】
この方法によれば、電界が集中し易い特定絶縁部には、電気力学的に、電荷や双極子を形成するプローブ物質を周辺から泳動させて引き寄せたり、当該プローブ物質が存在する場所にターゲット物質を泳動させて引き寄せて濃度を高めたりすることができる。あるいは、物質の高次構造や配向（トランスフォーメーション）を、電気力学的作用を利用して調整できる。
【００１５】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１６】
「相互作用」とは、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸分子間のハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応などの物質間の化学的結合あるいは解離を広く含む。なお、「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００１７】
「核酸鎖」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００１８】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションなどの相互作用の場を提供できる領域であり、一例を挙げるなら、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場である。
【００１９】
「誘電泳動」は、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象である。交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。特に、高周波交流電界中においては、時間的平均電場の自乗の勾配に比例して双極子に力が働き、泳動する。
【００２０】
例えば、核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られている。その原理は、骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周囲にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、不均一電界が印加された場合、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichi Tazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)）。
【００２１】
「センサーチップ」は、基板上の所定の反応領域において、物質間の相互作用を進行させ、該相互作用を検出するための基板を意味し、前記物質の種類に関係なく広く包含し、前記相互作用の検出原理は問わない。このセンサーチップには、ＤＮＡプローブなどの核酸鎖が固定化されて微細配列された状態とされたＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）やタンパク質間の相互作用や抗原抗体反応などの検出に適するたんぱくチップなどを少なくとも含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、反応領域における絶縁層において、周囲よりも誘電率の高い特定絶縁層を形成する簡易な基板構成によって、反応領域内に電界（電気力線）が特に集中する部位や領域を形成できるため、不均一電場の形成及びこの不均一電場を利用する誘電泳動などの電気力学的効果を簡単に得ることができる。
【００２３】
この効果によって、電界が特に集中し易い特定絶縁部に向けて、電荷や双極子を形成するプローブ物質を周辺から引き寄せて固定することができ、さらには、当該プローブ物質が存在する場所にターゲット物質を引き寄せて、ハイブリダイゼーションなどの相互作用効率を高めることができる。あるいは、物質の高次構造や配向を、電気力学的作用を利用して調整し、ハイブリダイゼーションなどの相互作用時の立体障害の影響を軽減することができる。ひいては、ハイブリダイゼーションなどの相互作用の精度向上も達成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２５】
図１は、本発明に係る相互作用検出部（以下、「検出部」と略称。）として好適な第一実施形態の基本構成を説明する断面図である。
【００２６】
まず、この図１に示された符号１ａは、本発明に係る検出部の好適な第一実施形態を示している。この検出部１ａは、支持基板１１と、この上に積層された導電材料からなる第１電極層１２と、この第１電極層１２に対向配置された導電材料からなる第２電極層１３と、を備えており、第１電極層１２と第２電極層１３に挟まれた場所（領域）には、溶液やゲルなどの媒体を貯留又は保持できるウエル形状（凹部形状）の反応領域Ｒが設けられている。
【００２７】
この反応領域２は、ハイブリダイゼーション、タンパク質間の相互作用、抗原抗体反応等の種々の物質間の相互作用の場を提供する領域又は空間として機能する。この反応領域２には、該反応領域２に臨むように対向配置されている電極層１２−１３を介して、電界が印加される。なお、図１中の符号Ｇは電源（電圧発生源）、符号Ｇは電界印加のオンオフを操作するスイッチである（他の図でも同様）。
【００２８】
ここで第１電極層１２は、アルミニウムや金などの金属、あるいはＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）等の透明な導体で形成されており、本実施形態の例では、ガラスや光透過性の合成樹脂材料で形成されている支持基板１１の上に積層されている。
【００２９】
第１電極層１２を光透過性のＩＴＯなどで形成すれば、支持基板１１の下方から進行してくる所定波長の蛍光励起光Ｐを反応領域Ｒ内へ導くとともに、反応領域Ｒ内で励起されて発生した蛍光Ｆを支持基板１１の下側へ導出させることができる（図１参照）。
【００３０】
なお、ここで言う蛍光励起光Ｐは、反応領域Ｒ内に存在する物質に標識された蛍光物質やハイブリダイゼーション（相互作用の一例）によって生成した相補鎖に挿入結合する蛍光インターカレーターを励起させるための光である。第２電極層１３に反射層（図示せず。）をさらに形成することによって、蛍光Ｆを反射させて下方へ導出させることができるので、測定できる蛍光量を増加させることができる。
【００３１】
第１電極層１２の反応領域Ｒに臨む電極表面１２ａは、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２等から選択される材料によって形成された絶縁層１４で覆われている。この絶縁層１４は、反応領域Ｒ中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止する役割や電極の腐食や剥離を防止する役割などを担っている。なお、特に図示しないが、第２電極層１３の反応領域Ｒを臨む電極面にも絶縁層を設けた方が望ましい。
【００３２】
絶縁層１４は、誘電率が周囲よりも高い絶縁部（「特定絶縁部」と称する）１４１とその周囲の絶縁部１４２が所定間隔で設けられている。特定絶縁部１４１の配置数、密度、形状、配置パターンは特に限定されず、また、一つの反応領域Ｒ内に複数形成するのも、単独で形成するのも、目的に応じて適宜決定すればよい（他の実施形態でも同様）。
【００３３】
一例を挙げると、図２に示すように、絶縁層１４に上方視円形の特定絶縁部１４１ａを所定間隔で整列配置する構成や、図３に示すように、絶縁層１４に上方視四角形の特定絶縁部１４１ｂを所定間隔で整列配置する構成を採用するのも、目的に応じて自由である。
【００３４】
特定絶縁部１４１（１４１ａ、１４１ｂ）の材料は、例えば、誘電率（ε）が４０である二酸化チタン（ＴｉＯ２）のように誘電率の高い材料で形成し、他の絶縁層１４２部分は、例えば、誘電率（ε）が４である二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）で形成することができる。
【００３５】
ここで、図１を再び参照すると、この図１には、符号Ｅによって示された電界が特定絶縁層１４１，１４１に集中して形成されている様子が模式的に示されている。また、特定絶縁層１４１，１４１には、オリゴＤＮＡのようなプローブ物質Ｘが整列固定されている様子が示されている。
【００３６】
これらのプローブ物質Ｘは、反応領域Ｒ内へ導入された直後は、ブラウン運動等によって反応領域Ｒに遊離散在しているが、高周波交流電界などの電界Ｅが印加されると、特定絶縁層１４１，１４１に向けて泳動して寄せ集められ、その末端部位が該特定絶縁層１４１，１４１の表面に化学結合して固定される。
【００３７】
なお、プローブ物質Ｘの固定は、例えば、特定絶縁層１４１，１４１に覆われた電極層１２の表面とプローブ物質の末端をカップリング反応等の反応によって行うことができる。例えば、ストレプトアビジンによって絶縁層が表面処理されておる場合には、ビオチン化されたプローブ物質Ｘの末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理されている場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブ物質をジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）で固定することに適している。
【００３８】
図４は、本発明に係る相互作用検出部の第二実施形態の基本構成を説明する断面図である。
【００３９】
この図４に示された第二実施形態と図１に示された第一実施形態では、絶縁層１４の構成が異なっているのみであって、この第二実施形態である検出部１ｂの絶縁層１４には、膜厚が周囲の絶縁層１４４よりも薄い特定絶縁部１４３が設けられていることが特徴である。
【００４０】
このような膜厚が薄い特定絶縁部１４３，１４３は、周囲の絶縁層１４４よりも誘電率が高くなるので、検出部１ａの特定絶縁部１４１同様に電界Ｅが集中し、その表面近傍に不均一電場が形成され易い。このため、プローブ物質Ｘの固定箇所として適している。
【００４１】
反応領域Ｒ内へ、例えば核酸鎖のようなターゲット物質Ｙが導入された後、あるいは導入と同時に、電界Ｅが印加されると、既にプローブ物質Ｘが整列固定されている特定絶縁部１４３，１４３に向かって前記ターゲット物質Ｙが泳動し、該特定絶縁部１４３，１４３近傍でのターゲット物質Ｙの濃度が高まるので、この結果、相互作用効率が高まる（検出部１ａの特定絶縁部１４１でも同様）。あるいは、プローブ物質Ｘやターゲット物質Ｙの高次構造が電界によって調整されて、相互作用時の立体障害が軽減される。例えば、ランダムコイル状に絡まっている核酸鎖は電界Ｅの作用によって伸張し、相補結合する塩基が露出し、ハイブリダイゼーションが促進される（検出部１ａでも同様）。
【００４２】
続いて、図５は、本発明に係る検出部の第三実施形態を示す図である。
【００４３】
図５に示された第三実施形態である検出部１ｃは、計二対の対向電極を有している。詳しくは、上下の対向電極１２−１３と、反応領域Ｒの図面向かって左右に振り分けられた対向電極１５−１６と、備え、対向電極１２−１３とへの電界印加手段としての電源Ｇ１とスイッチＳ１、対向電極１５−１６への電界印加手段としての電源Ｇ２とスイッチＳ２がそれぞれ設けられている。
【００４４】
電極層１２を覆う絶縁層１４の一部には、特定絶縁層１４１（又は１４３）が形成されており、プローブ物質Ｘの固定箇所や相互作用促進の場として機能している（図５参照）。一方の電極層１５と１６をそれぞれ覆う絶縁層１７，１８には、それぞれの一部に誘電率の高い特定絶縁層１７１，１８１が形成されている。
【００４５】
ここで、対向電極１２−１３は、プローブ物質Ｘを特定絶縁層１４１（又は１４３）に覆われた電極部位へ固定したり、ターゲット物質Ｙを固定されたプローブ物質Ｘに向けて泳動させたりするために用いられる。
【００４６】
一方の対向電極１５−１６は、反応領域Ｒ内に存在して、相互作用検出時の弊害となり得るような物質、例えば、相互作用することなく反応領域Ｒ内に遊離しているターゲット物質などをプローブ物質Ｘの固定箇所周辺から除去するときに用いることができる。
【００４７】
電極層１５と１６をそれぞれ覆う絶縁層１７，１８には、誘電率の高い前記特定絶縁層１７１，１８１が形成されており、この特定絶縁層１７１，１８１部分に電界を集中させて不均一な電場を形成し、誘電泳動などの電気力学的作用を利用して物質を移動させることができる。
【００４８】
ここで、図１に示すような検出部１ａと同様の基板構成に設計し、反応領域Ｒの垂直方向（上下方向）に５μｍの間隔を持って電極層１２−１３を配置させた検出部を想定し、１ＭＨｚ，２０Ｖｐｐの交流電圧を印加した場合に、絶縁層１４の誘電率（ε）が１．０，４．０（例えば、ＳｉＯ２の絶縁層），１０．０，４０．０（例えば、ＴｉＯ２の絶縁層）のそれぞれの上部電界強度をシュミュレーション計算した結果を図６に示す。この図６に示すように、絶縁層の誘電率が高くなるほど、絶縁層上部での電界強度が高まることがわかる。
【００４９】
例えば、誘電率ε＝４０のＴｉＯ２で形成された絶縁層（特定絶縁部）では、誘電率ε＝４．０のＳｉＯ２で形成された一般の絶縁層（特定絶縁部）の２倍弱の電界強度が得られている。誘電泳動時には電界の二乗の勾配に比例して対象物質に駆動力が発生するため、電界印加時には、核酸鎖などの物質は、ＴｉＯ２で形成された絶縁層（特定絶縁部）の近傍に集中的に移動することになる。
【００５０】
次に、図７は、膜厚が異なるＳｉＯ２で形成した絶縁層で電極を覆ったときの電界強度を計算した結果を示す図（図面代用グラフ）である。絶縁層１４の膜厚Ｗは、２５０ｎｍと２０ｎｍの二種類を想定した。また、この計算シミュレーションでは、図８に示すように、特定絶縁部１４１の中心軸Ｃ上（Ｄ＝０）と、この中心軸から水平方向に５μｍ離れた位置（Ｄ＝５）において、絶縁層表面からの高さ（Ｚ）方向に電界強度を計算した。
【００５１】
この計算の結果、絶縁層の膜厚が薄い２０ｎｍの絶縁層の方が電界強度が大きいことが明らかになり、さらに、このような効果は、絶縁層表面からの高さや水平方向の距離によってあまり差がないことがわかった。これにより、絶縁層の膜厚を薄くすることによって、周囲よりも電界強度の大きい電極表面を形成できることを検証できた。また、膜厚の薄い絶縁層（特定異絶縁部）の近傍では、水平、垂直の方向にあまり関係なく一定の電界強度を得ることができることも検証できた。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、電気力学的作用を利用して、物質間の相互作用を効率良く、短時間で、高精度に検出するための技術として利用できる。例えば、ＤＮＡチップやたんぱくチップなどに代表されるセンサーチップ技術や前記相互作用を検出するための技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明に係る相互作用検出部の好適な第一実施形態の基本構成を説明するための断面図ある。
【図２】絶縁層（１４）における特定絶縁部（１４１ａ）の配置構成の一例を示す平面図である。
【図３】絶縁層（１４）における特定絶縁部（１４１ａ）の他の配置構成の一例を示す平面図である。
【図４】本発明に係る相互作用検出部の好適な第二実施形態の基本構成を説明するための断面図ある。
【図５】本発明に係る相互作用検出部の好適な第三実施形態の基本構成を説明するための断面図ある。
【図６】本発明の効果を検証したシュミュレーション計算（誘電率の異なる材料で絶縁層を形成した場合）の結果を示す図面代用グラフである
【図７】本発明の効果を検証したシュミュレーション計算（膜厚の異なる絶縁層の場合）の結果を示す図面代用グラフである。
【図８】図７のシュミュレーション計算の実施方法の補強説明図である。
【符号の説明】
【００５４】
１ａ，１ｂ，１ｃ  相互作用検出部（検出部）
１２，１３，１５，１６  電極層
１４，１７，１８，１３１  絶縁層
１４１（１４１ａ，１４１ｂ），１４３  特定絶縁部
Ｅ  電界
Ｇ  電源
Ｒ  反応領域
Ｓ  スイッチ
Ｘ  プローブ物質
Ｙ  ターゲット物質
【図１】
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【図２】
2006329763.tif 000004
【図３】
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【図４】
2006329763.tif 000006
【図５】
2006329763.tif 000007
【図６】
2006329763.tif 000008
【図７】
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【図８】
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