(57)【要約】【課題】植物試料の品種を迅速、正確、低コストで、かつ高度な測定スキルを要せずに判別する。特に、現在ブランド化が指向されている米、芝へ適用することで、非常に簡単な操作でかつ安価で、信頼性が高く、品種の識別を可能にする植物種判定方法の提供。【解決手段】植物あるいはその構成部分の微少片を加熱してその細胞壁構成成分であるリグニンを流出させ、該リグニンを高温でガス化させ検知して植物の品種あるいはその構成部分を判定する植物の品種判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の微少片を加熱してその細胞壁構成成分であるリグニンを流出させ、該リグニンを高熱でガス化させ検知して植物の品種を判定することを特徴とする植物の品種判定方法。
【請求項２】
植物を構成する部分の微少片を加熱してその細胞壁構成成分であるリグニンを流出させ、該リグニンを高熱でガス化させ検知して植物の構成部分を判定することを特徴とする植物の品種判定方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載される植物の品種判定方法において、細胞壁構成成分であるリグニン成分量のスペクトラムの時間的推移データから植物品種を特徴付けることを特徴とする植物の品種判定方法。
【請求項４】
前記データの取得装置として熱分解ガスクロマトグラフ分析装置を用いることを特徴とする請求項３に記載される植物の品種判定方法。
【請求項５】
前記スペクトラムをデータ処理し、植物品種固定のデータベースに基づく判定を行うことを特徴とする請求項３に記載される植物の品種判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、植物の品種判定方法に関し、詳しくは米、芝等の試料について、ガスクロマトグラフィーによる測定、及び試料の作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、日本においては、食料の安全重視、農産物のブランド保証、消費者のグルメ指向等により農産物の選択基準が注目されてきている。選択基準としては、その品種や産地を基にした、いわゆる「産地・品種が明らかな農産物」が主である。
【０００３】
例えば、米について言えば、食糧法の施行により精米の品種、産地及び産年が包装資材に表示されることになり、内容物の表示が問われてきている。これは米に限らず他の農産物や芝、花等についても、近い将来要求されてくると考えられる。
【０００４】
このような背景から、低コストで、科学的に正確に且つ簡易迅速に品種を判別することができる技術の開発が急務である。
【０００５】
従来の技術としては、農産物（植物）の品種判定は植物体の形、葉の色、果樹の粒型、酵素発現の多型（アイソザイムパターン）などが用いられてきたが、類似品種間識別を行うことは、現実的に困難であった。
【０００６】
これに代わる技術として、非検査物からＤＮＡを検出し適正なランダムプライマーの存在下で、ＰＣＲ法によって増幅したＤＮＡの分子量の相違を電気泳動によって検出する技術、ＲＡＰＤ（Random  amplified  polymorphic  DNA  method）が開発された（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００１−９５５８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記方法では、(1)ＰＣＲ法による増幅を使用プライマーの種類だけ多数回実施する必要があり、操作が複雑で時間がかかりコスト高になる。(2)識別に用いるバンド以外にも多数の共通バンドが存在するため多数のプライマーの混合を要し、ＰＣＲによる増幅も難しい。(3)多数のＤＮＡバンドから選ばれた識別バンドの中には増幅反応温度やＤＮＡ濃度の影響を受けやすいものも多く、再現性に問題があるなどいくつかの欠点があった。
【０００８】
この発明の目的は、植物試料の品種を迅速、正確、低コストで、かつ高度な測定スキルを要せずに判別する技術の提供することである。特に、現在ブランド化が指向されている米、芝へ適用することで、非常に簡単な操作でかつ安価で、信頼性が高く、品種の識別を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明は上述の課題を解決すべく、鋭意研究の結果、非検査試料（微少片）を加熱することで、細胞壁から発生する成分量は時間経過と密接な関係があることを発見し、これを熱分解ガスクロマトグラフィーで検出することにより、上述の課題を解決できることを見出し、この発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、この発明の構成は以下の事項からなる。
【００１１】
（１）植物の微少片を加熱してその細胞壁構成成分であるリグニンを流出させ、該リグニンを高熱でガス化させ検知して植物の品種を判定する植物の品種判定方法。
【００１２】
（２）植物を構成する部分の微少片を加熱してその細胞壁構成成分であるリグニンを流出させ、該リグニンを高温でガス化させ検知して植物の構成部分を判定する植物の品種判定方法。
【００１３】
（３）前項（１）または（２）に記載される植物の品種判定方法において、細胞壁構成成分であるリグニン成分量のスペクトラムの時間的推移データから植物品種を特徴付ける植物の品種判定方法。
【００１４】
（４）データの取得装置として熱分解ガスクロマトグラフ分析装置を用いる前項（３）に記載される植物の品種判定方法。
【００１５】
（５）スペクトラムをデータ処理し、植物品種固定のデータベースに基づく判定を行う前項（３）に記載される植物の品種判定方法。
【発明の効果】
【００１６】
この発明によれば、植物試料の品種を迅速、正確、低コストで、かつ高度な測定スキルを要せずに判定することが可能となる。特に、現在ブランド化が指向されている米、芝へ適用することで、非常に簡単な操作でかつ安価で、信頼性が高く、品種の識別を可能にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、この発明において用いることができる、植物試料の微少片の加熱技術、細胞壁構成成分であるリグニンの流出技術、リグニンの高温ガス化技術、ならびに検知して植物の品種あるいはその構成成分を判定する技術等について詳細に説明する。
【００１８】
この発明においては、植物試料の微少片を加熱することで結合の弱い部分が熱エネルギーによって切断し、それに応じた分解物を生成させる。この場合、設定温度まで急速に加熱し、生成した分解物を急速に熱分解装置から離脱させ、該熱分解装置に連結させた分析装置に送り込むことによって、分解生成物の二次的分解や再縮合を抑え、元のサンプルの化学構造をよく反映させることが重要である。
【００１９】
熱分解ガスクロマトグラフィーで検知される成分は、熱分解／ガスクロマトグラム／質量分析によって同定できる。その成分は、メチルグアイヤコール、バニリン、イソオイゲノール、コニフェリルアルコールである。これらは既往の文献から、いずれも植物の細胞壁を構成しているリグニンに由来するものと考えられる。
【００２０】
リグニンは、フェニルプロパンを基本骨格とした極めて複雑・不規則な構造を有する高分子化合物で、その構造が植物品種によって異なることは知られているがその詳細は不明である。すなわち、リグニンの構成核をパラヒドロキシフェニル、グアイヤシル、シリンギルの３つに大きく区分すると、この比率から針葉樹、広葉樹およびイネ科草本を判別できるが、これ以上の分類は現在不可能である。
【００２１】
しかるに、リグニンは植物の二次代謝、主にシキミ酸経由によって合成されるが、この経路で生成したリグニン構成単位となるフェニル化合物は多種多様であることが知られている。
【００２２】
また、二次代謝は進化の過程で修飾や改変を受けてきたと考えられているが、リグニンの構成の様相は品種の進化を反映し、その特性パターンは植物品種によって異なると考えられる。
【００２３】
そこで、この発明は、リグニンを構成する成分量の離脱パターンの違いが品種によって異なることに着目し、その特性を検知することで品種の識別をすることを特徴とするものである。
【００２４】
検知する例としては、熱分解ガスクロマトグラフィーを用いる方法がある。この熱分解ガスクロマトグラフを用いると従来のような特殊な解析を行わなくとも容易に植物の品種判定を行うことができる。
【００２５】
（１）この発明においては試料の作成、特に加熱が非常に重要である。先に述べたように、加熱時に二次的に発生する生成物の二次的分解、再結合は防がねばならない。このときの加熱温度が重要である。植物の種類によってその最適温度は異なっているが大きくは１５０℃〜１９０℃の範囲にあればよい。例えば、芝の場合は１７０℃である。
【００２６】
（２）植物の細胞壁内には多くの化学物質が含まれているが、それらの中の特定成分であるリグニンを加熱することで細胞壁外に取り出し、時間経過に従って、熱分解ガスクロマトグラフで検出する。
【００２７】
この発明において用いることができる植物としては、細胞壁を有する公知の植物すべてを用いることができる。この発明の植物の品種判定方法に用いる植物の状態は、乾燥植物片、乾燥植物粉末等であり、その使用量は１試料当たり１０〜１００ｍｇ程度である。また、この発明において用いることができる植物の構成部分としては、葉、茎および根等を挙げることができる。
【００２８】
この発明においては試料の作成には、特に加熱が重要であるが、加熱の条件は温度だけでよく、その他の条件は任意に採用することができ、何ら限定されない。
【００２９】
この発明における試料の作成方法について説明する。試料とする植物体の採取後、以下の工程を経ることにより試料の作成を行う。
１．試料を６０℃、風乾で２４時間乾燥させる（水分１０％以下に）。
２．乾燥した試料は、切断機で切断して２〜３ｍｍ程度の断片にするか、またはミルで粉末状にする。
３．試料を薄いフィルム化する（試料重量約０．００１ｇ）。
４．該フィルム化試料を熱分解にかける。
５．得られたデータの分析を行う。
【００３０】
この発明の植物の品種判定方法におけるリグニンとしては、植物細胞壁の構成成分および細胞壁にある成分を用いることができる。世界で２番目に多い有機化合物で植物構成成分の２５％を占めるリグニンは、フェニールプロパンを基本骨格とした極めて複雑・不規則な構造を有する高分子化合物で、それぞれ植物固有の代謝系で生成され、その化学的多様性は種の進化とともに構築されたものである。
【００３１】
そこでこの発明では、植物細胞壁の構成成分のうちリグニン成分に着目し、その種特異性を利用した植物の品種判定方法を開発した。
【００３２】
この発明の植物の品種判定方法において、リグニンを高温でガス化させるための方法、装置の一例を示す。
【００３３】
上述した試料の作成方法により作成した試料０．００１４ｇをキュリーポイント型熱分解装置（ＳＨＩＭＡＺＵ製作所ＧＣ−１７Ａ）を使用し、次の検出条件で分析を行った。カラムオーブン５０℃、試料気化室１７０℃、検出器２８０℃、カラム入口圧３０ＫＰａ、気化時間７０分で、熱分解ガスクロマトグラフィー分析によりリグニン成分を検出する。
【００３４】
次に、この発明の植物の品種判定方法における、品種の判定の仕方について説明する。測定データとデータベースとの比較方法は以下の通りである。
１．熱分解により得られたデータをデジタル変換する。
２．変換されたデータの数値を（＊２）のデータベースに検索入力を行う。
３．検索については入力されたデータに最も近い値から出力される。
（＊２）ここで謳われているデータベースは植物固体の数値を管理するものである。
【００３５】
次に、この発明の植物の品種判定方法に用いることができる上述のデータベースの作成方法について詳細に説明する。
【００３６】
熱分解により得られたデータのデータベース作成方法は以下の要領で行う。
１．個々の植物毎に抽出されたデータを熱分解ガスクロマトグラフィーの付帯ＰＣよりデータを読み込む。
２．読み込まれたデータの各項目は、ＩＮＤＥＸ・Ｒ−Ｔｉｍｅ・ＡＲＥＡ・ＨＥＩＧＨＴ・Ｉ−Ｔｉｍｅ・Ｆ−Ｔｉｍｅ・Ｆ−ＨＥＩＧＨＴ・ＭＫ・ＩＮＤＯ・ＣＯＮＣ・ＮＡＭＥとなっている。
３．定量パラメータ設定でＨＥＩＧＨＴの値の最小値を１５０，０００に設定する。１５０，０００より小さい値については品種特定上、管理不要である。
４．パラメータ設定で変換されたデータをフレキシブルディスクに保管する。
５．保管されたデータを分析用のＰＣで読み込みデータベースを作成する。
【００３７】
また、データベースの詳細について説明する。
１．分析用のＰＣで読み込まれたデータベース（＊１）の管理は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社のＯｆｆｉｃｅにより個々の植物毎にデータ管理を行う。
２．管理するデータ項目は読み込まれたデータのＲ−Ｔｉｍｅ・ＡＲＥＡ・ＨＥＩＧＨＴの３項目を使用する。
【００３８】
それ以外の項目については、品種特定上、管理不要である。
（＊１）ここで謳われているデータベースはリグニン成分流出量を管理するものである。
【００３９】
また、データベースからのデジタル変換への方法について説明する。
１．各植物毎のデータベースからＲ−Ｔｉｍｅを基準にリグニン成分流出量を出力する。
２．該流出量とＲ−Ｔｉｍｅの関係を導き、それを植物固有の数値としてデジタル化する。
３．デジタル化されたデータは、専用のデータベースへ（＊２）登録する。
（＊２）ここで謳われているデータベースは植物固有の数値を管理するものである。
【００４０】
また、測定データとの比較方法について説明する。
１．サンプルとして熱分解により得られたデータをデジタル変換する。
２．該変換されたデータの数値を（＊２）のデータベースに検索入力を行う。
３．検索については入力されたデータに最も近い値から出力される。
（＊２）ここで謳われているデータベースは植物固有の数値を管理するものである。
【００４１】
したがって、この発明においては、植物の各品種について、上記リグニン成分の流出の時間依存をデジタル的に数値加工し、各品種毎にデータベース化することで迅速、且つ容易に実測結果についての品種の判定が可能である。
【００４２】
以下、この発明の植物の品種判定方法の最良の実施の形態について、実施例を用いて具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではないことは勿論のことである。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
粉末貯蔵サンプルについてこの発明を適用した例を示す。試料として宮崎大学農学部で得られたイタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、オーチャードグラス、ギニアグラス、ローズグラス、アカクローバ、およびシロクローバを用いて分析検知を行った。
【００４４】
分析に使用した装置は、キュリーポイント型熱分解装置（ＳＨＩＭＡＺＵ製作所ＧＣ−１７Ａ）であり、その測定条件を下記に示す。
【００４５】
（１）温度
１．カラムオープン：５０℃
２．試料気化室：１７０℃
３．検出器：２８０℃
（２）圧力
１．カラム入口圧：３０Ｋｐａ
（３）時間
１．気化時間：７０分
試料としては、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、オーチャードグラス、ギニアグラス、ローズグラス、アカクローバ、およびシロクローバを粉末状態で０．００１４ｇを用いた。
【００４６】
上記各試料の粉末貯蔵サンプルによる分析結果を図１〜図４に示す。図１〜図４から分かるように、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、オーチャードグラス、ギニアグラス、ローズグラス、アカクローバ、およびシロクローバそれぞれにその種の細胞壁を構成しているリグニンの種特異的波形パターンを示している。
【００４７】
以上のように、実施例１によれば、粉末貯蔵サンプルの形態であっても、この発明の植物の品種判定方法を用いれば、各品種に特徴的なスペクトラムを再現性良く検出し、あらかじめ作成されたデータベース（例えば、図８〜図１２参照）に照らし合わせて容易に品種の同定が可能となる。
【００４８】
（実施例２）
乾燥組織（葉）試料について、この発明を適用した例を説明する。
【００４９】
試料は宮崎大学農学部で得られたイネ、チガヤ、ノシバ、コウライシバおよびヒメコウライシバであり、実施例１と同様の分析、検知を行った。その乾燥組織（葉）からの検出結果を図５〜図７に示す。また、イネ、チガヤ、ノシバ、コウライシバおよびヒメコウライシバのデジタル処理化したデータベースを図８〜図１２に示す。
【００５０】
その結果、以下のことが分かる。
【００５１】
１）イネは成葉に特徴的なスペクトルを有する。
【００５２】
２）チガヤは成葉に特徴的なスペクトルを有する。
【００５３】
また、芝については
３）ノシバは成葉に特徴的なスペクトルを有する。
【００５４】
４）コウライシバは成葉に特徴的なスペクトルを有する。
【００５５】
５）ヒメコウライシバは成葉に特徴的なスペクトルを有する。
【００５６】
以上のように、実施例２によれば、新鮮な試料は必要としない、すなわち乾燥した古い試料においても品種特有のスペクトルを得ることが可能であり、実施例１と同様に容易に品種の同定化が可能であった。
【００５７】
（実施例３）
組織別（葉・茎）試料について、この発明を適用した例を説明する。
【００５８】
試料は宮崎大学農学部で得られたローズグラスの葉の部分と茎の部分であり、実施例１と同様の分析、検知を行った。その分析結果を図１３（組織別サンプルによる検出度の違い）に示す。
【００５９】
その結果、以下のことが分かる。
【００６０】
１）ローズグラスの成葉及び茎の乾燥粉末混合サンプルでは、図１３に示すようなスペクトラムパターンを示しており、このパターンは成葉及び茎とも品種に特異的なものであった。
【００６１】
以上のように、実施例３によれば、同一品種において植物を構成する異なった組織、及びサンプル形態（粉末など）においても検出したスペクトラムは同じであったことから、本発明の植物の品種判定方法は従来のＤＮＡを用いた同定法と同様に信頼性があり、しかも、非常に簡単な操作で、迅速、かつ低コストで、植物の品種を判別することが可能であった。
【００６２】
以上、この実施例１〜３では、試料として粉末貯蔵サンプル、あるいは乾燥粉末サンプルを用いて説明したが、すべての試料は、熱分解により乾燥させて使用するため、生の試料も乾燥させて使用することができる。更に古代遺跡で発見された植物片についても、その品種の同定が可能といえる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】イタリアンライグラス及びペレニアルライグラスの粉末貯蔵サンプルによる分析結果を示す図である。
【図２】オーチャードグラス及びギニアグラスの粉末貯蔵サンプルによる分析結果を示す図である。
【図３】ローズグラス及びアカクローバの粉末貯蔵サンプルによる分析結果を示す図である。
【図４】シロクローバの粉末貯蔵サンプルによる分析結果を示す図である。
【図５】イネ及びチガヤの乾燥組織（葉）からの検出結果を示す図である。
【図６】ノシバ及びコウライシバの乾燥組織（葉）からの検出結果を示す図である。
【図７】ヒメコウライシバの乾燥組織（葉）からの検出結果を示す図である。
【図８】イネのデジタル処理化したデータベースを示す図である。
【図９】チガヤのデジタル処理化したデータベースを示す図である。
【図１０】ノシバのデジタル処理化したデータベースを示す図である。
【図１１】コウライシバのデジタル処理化したデータベースを示す図である。
【図１２】ヒメコウライシバのデジタル処理化したデータベースを示す図である。
【図１３】ローズグラスの葉と茎の部分の組織別サンプルによる検出度の違いを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2006119017.tif 000012
【図１２】
2006119017.tif 000013
【図１３】
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