(57)【要約】      （修正有）【課題】肥満になりやすいかどうかの判定方法及び肥満を処置する薬剤をスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】被験者のESRRA23ポリモルフィズムを決定し、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型によって、被験者の太りやすさを判別する方法。決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.3型である場合、被験者は、太りやすい、と判定し、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.2型である場合、被験者は、太りにくい、と判定する。ESRRA23 DNAに候補物質を作用させ、ESRRA23 DNAと結合する候補物質を選択する、抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のESRRA23ポリモルフィズムを決定し、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型によって、被験者の太りやすさを判別する方法。
【請求項２】
決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.3型である場合、被験者は、太りやすい、と判定する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.2型である場合、被験者は、太りにくい、と判定する請求項1に記載の方法。
【請求項４】
ESRRA23がERR遺伝子プロモーターに存在する23bpのDNAである請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ESRRA23 DNAに候補物質を作用させ、ESRRA23 DNAと結合する候補物質を選択することを特徴とする抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
ESRRA23 DNAと候補物質との結合の有無をゲルシフトアッセイ法により検出する請求項5に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子診断法による太りやすさの判定方法、および抗肥満薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国では飽食により肥満が増加している。肥満は糖尿病、高血圧、高脂血症などの様々な合併症をともなう。これらはいずれも慢性疾患であるために長期間にわたり個人の生活に影響する。またこのような慢性疾患の増加は、日本で問題となっている医療費の高騰の原因のひとつとなっている。
【０００３】
肥満は、脂肪組織質量の増加と定義されるが、先進国では最も一般的な栄養障害であり途上国では現在大きくなりつつある問題である。ヒトの肥満は遺伝因子と生活習慣関連因子の両方によって影響される(BMI、身体活動、喫煙、エネルギー摂取)。Bouchardらは、体脂肪蓄積の遺伝性はその個人間変動の約25%に達すると推定した。注目すべきことに、一卵性双生児に関するコホート研究は、遺伝的因子が内臓脂肪組織の蓄積に強く関与することを示した。
【０００４】
ある人が肥満になりやすいかどうか判定できれば、肥満を予防する処置をとることが可能である。さらに、肥満を処置する薬剤の開発は重要である。
【０００５】
肥満形成と関連するいくつかの肥満候補遺伝子が、既に、見いだされている。単一遺伝子変異としては、レプチン、レプチン受容体、メラノコルチン(MC)‐4受容体、プロオピオンメラノコルチン(POMC)及びプロホルモン変換酵素(PC1)などである。また、遺伝子多型としては、β3アドレナリン受容体、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体(PPAR)γ、PPARγ-coactivator-1(PGC-1)、アディポネクチンがある。これらは、肥満患者との相関がある程度見いだされ、創薬ターゲットとしての可能性が追求されている。（非特許文献1)
【０００６】
創薬ターゲット遺伝子は、中枢の摂食調節に関わる創薬ターゲット遺伝子、脂肪合成に関わる創薬ターゲット遺伝子、脂肪組織における創薬ターゲット遺伝子及び消化管ホルモンに関わる創薬ターゲット遺伝子に大別される。そして、各創薬ターゲット遺伝子について種々の検討がされ、例えば、セロトニン受容体欠損マウスは肥満を呈し、セロトニンの再取り込みを阻害するシブトラミンは欧米で抗肥満薬として承認され、国内でも臨床試験が行われている。（非特許文献1)
【０００７】
このように、創薬ターゲット遺伝子に注目した抗肥満薬のスクリーニングが活発に行われているが、国内で承認されている肥満治療薬は、マンジドールのみであり、さらに多くの研究が必要である。
【０００８】
ところで、ERR1（ERR: Estrogen-related receptor）はオーファン核内受容体であり、エネルギー消費の高い能力をもつ組織で傑出して発現しており、エネルギー代謝と肥満に関係することが示唆されている。
【０００９】
ERR1はDNAに結合し標的遺伝子の転写を調節する、リガンド未知の核内受容体である。近年、ERR1完全欠失マウスが低い体重および末梢脂肪蓄積を示し高脂肪食誘導性肥満に抵抗性であることが示されている。観察された表現型と合致して、遺伝子マイクロアレイ実験はエネルギー代謝に関与する遺伝子の発現の変化を示した（非特許文献２）。
【００１０】
ERR1遺伝子プロモーターの遺伝子のポリモルフィズム（多様性）が、ラガニエラ(Laganiere)らグループにより同定されている。ESRRA23と名付けられた２３bpのシーケンスがERR1遺伝子プロモーターに存在し、ESRRA23は、ERR1遺伝子の5'隣接領域の-682位に位置する23塩基対の配列であり、ヒト染色体に１〜４コピーあることが示されている (非特許文献３)。注目すべきことに、この配列は、ERR1発現のレベルを支配する、PGC-1αの存在に応答する機能性ERR応答配列を有する。
【００１１】
しかしながら、ERR1遺伝子プロモーターの遺伝子のポリモルフィズム（多様性）と肥満との直接的な関係は全く明らかにはなっていない。
【非特許文献１】現代医療Vol.36, No.9, 169-173
【非特許文献２】Luo J, Sladek R, Carrier J, Bader JA, Richard D, Giguere V. Reduced fat mass in mice lacking orphan nuclear receptor estrogen-related receptor alpha. Mol Cell Biol 2003; 23: 7947-7956.
【非特許文献３】Laganiere J, Tremblay GB, Dufour CR, Giroux S, Rousseau F, Giguere VA polymorphic autoregulatory hormone response element in the human estrogen related receptor・(ERR・) promoter dictates PGC-1・control of ERR・expression. J Biol Chem 2004; 279: 18504-18510.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、ある人が肥満になりやすいかどうか判定できれば、肥満を予防する処置をとることが可能である。さらに、肥満を処置する薬剤の開発も進められているが、まだまだ途上にある。
【００１３】
そこで本発明の目的は、ある人が肥満になりやすいかどうかの判定方法を提供することにある。さらに本発明は、肥満を処置する薬剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
【００１４】
上述のように、ERR1遺伝子プロモーターの遺伝子のポリモルフィズム（多様性）と肥満との直接的な関係は明らかにはなっていなかった。そこで本発明者らは、日本人のサンプル(n=700)で肥満に及ぼすESRRA23ポリモルフィズムの影響を調べた。その結果、ESRRA23の2,3型を有する人のグループは2,2遺伝子型を有するグループに比べ、有意に太っていることを見いだした。即ち、Body mass index(BMI)の値が大きかった。ある人がESRRA23の2,3型であること判定されれば、2,2遺伝子型を有する場合に比べ、太りやすいことが強く示唆された。この結果から、ESRRA23はヒト肥満の遺伝的要因のひとつであると結論づけられ、ESRRA23の型を調べることにより、ある人が太りやすいか、そうでないかの判定することが可能であることを見いだし、本発明を完成させた。
【００１５】
さらに、ESRRA23に結合する物質は人の肥満に影響を及ぼすこと、及びESRRA23と物質とが結合したものを検出できることを見いだし、抗肥満薬など、新規の創薬の標的となり得る物質のスクリーニング方法を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決する本発明は以下の通である。
［請求項１］被験者のESRRA23ポリモルフィズムを決定し、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型によって、被験者の太りやすさを判別する方法。
［請求項2］決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.3型である場合、被験者は、太りやすい、と判定する請求項1に記載の方法。
［請求項3］決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.2型である場合、被験者は、太りにくい、と判定する請求項1に記載の方法。
［請求項4］ESRRA23がERR遺伝子プロモーターに存在する23bpのDNAである請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
［請求項5］ESRRA23 DNAに候補物質を作用させ、ESRRA23 DNAと結合する候補物質を選択することを特徴とする抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法。
［請求項6］ESRRA23 DNAと候補物質との結合の有無をゲルシフトアッセイ法により検出する請求項5に記載の方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、遺伝子診断法による太りやすさの新規な判定方法、および抗肥満薬の新規なスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
[被験者の太りやすさ判別方法]
本発明の判別方法では、被験者のESRRA23ポリモルフィズムを決定し、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型によって、被験者の太りやすさ及び太りにくさを判別する。決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.3型である場合、被験者は、太りやすい、と判定する。また、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.2型である場合、被験者は、太りにくい、と判定する。
【００１９】
ESRRA23とは、ヒトERR1遺伝子(プロモーター領域)にある23bpの配列であり、ERR応答配列を有する(図1参照)。この遺伝子は、in vitroでは、ERR1/PGC1α(peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1α)によって活性化する。ESRRA23は、人により、1〜4リピート存在し、大半の人のポリモルフィズムの型は、2.3型または2.2型である。2.3型は、染色体に2リピートと3リピートの組がある場合であり、2.2型は、染色体に2リピートと2リピートの組がある場合である。図1には、2リピートのESRRA23を示す。2.3型及び2.2型以外では、1.2型、1.3型、2.4型、3.3型、3.4型もあるが、いずれも2.3型及び2.2型に比べれば稀である(非特許文献3のTable 1参照)。また、後述の実施例では、2.3型及び2.2型以外に2.4型、3.3型が見いだされた(表１)。
【００２０】
被験者のESRRA23ポリモルフィズムは、ESRRA23をPCR法により増幅し、PCR産物を電気泳動させ、2.3型は、2リピートと3リピートの組であるので、2つのバンドが観察されるのに対し、2.2型では、2リピートと2リピートの組であるので、バンドは1つしか観察されない。また、2.3型及び2.2型以外の型も、バンドの泳動距離とバントの数で判別できる。図2に電気泳動写真を示す。図2には、2.2型(レーン1、4、5、7、10、11)、2.3型(レーン2、3、6、8)及び3.3型(レーン9)が現れている。
【００２１】
尚、ESRRA23のポリモルフィズムの判別は、PCR（増幅）産物の電気泳動法以外に、例えば、DNAシーケンス解析法等により行なうこともできる。また、DNAシーケンス解析法としては、例えば、Current Protocol in Molecular Biology（米国Wiley社）記載のDNAシーケンス解析法がある。
【００２２】
日本人のサンプル(n=700)について、上記方法によりESRRA23ポリモルフィズムを調べ、ESRRA23ポリモルフィズムと肥満との関係を調べた。その結果、後述の実施例で詳細は説明するが、ESRRA23の2.3型を有する人のグループは2.2遺伝子型を有するグループに比べ、有意に太っていた。この結果に基づいて、本発明においては、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.3型である場合、被験者は、太りやすい、と判定し、決定したESRRA23ポリモルフィズムの型が2.2型である場合、被験者は、太りにくい、と判定する。
【００２３】
[スクリーニング方法]
本発明の抗肥満作用を有する物質のスクリーニング方法は、上記ESRRA23 DNAに候補物質を作用させ、ESRRA23 DNAと結合する候補物質を選択することを特徴とする。
【００２４】
ESRRA23 DNAと候補物質との結合の有無は、例えば、ゲルシフトアッセイ法により検出することができる。ゲルシフトアッセイ法では、候補物質と結合したESRRA23 DNAと結合していないESRRA23 DNAとの電気泳動速度の違いにより、両者を判別する。
【００２５】
より具体的には、ESRRA23 DNAを同位元素で標識し、この標識したESRRA23 DNAと候補物質とを混合した後に、ゲルシフトアッセイ法にかけると、候補物質と結合したESRRA23 DNAと結合していないESRRA23 DNAとを同位元素標識により判別できる。同位元素標識以外に、蛍光標識等の公知の標識技術を用いることもできる。
【００２６】
ESRRA23 DNAと候補物質との結合の有無は、ゲルシフトアッセイ法以外の方法によっても、検出することができる。ゲルシフトアッセイ法以外の方法としては、例えば、酵母ワンハイブリッドアッセイ（Current Protocol in Molecular Biology（米国Wiley社）参照）等を挙げることができる。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法に使用するESRRA23 DNAは、1〜4リピートの何れでも良いが、1リピートであることが好ましい。
【００２８】
ESRRA23 DNAには転写因子が結合することが知られており、ESRRA23 DNAと結合した候補物質は、ESRRA23 DNAへの転写因子の結合を阻害、促進する可能性がある。従って、ESRRA23 DNAと結合した候補物質は、肥満に影響を及ぼすことが予想され、抗肥満作用を有する物質のスクリーニングを可能にする。
【００２９】
候補物質については、特に制限はない。候補物質は、公知の物質であっても、本発明完成時に未知の物質であっても良く、合成物質、半合成物質、天然物質のいずれであっても良い。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例1
［被験者］
患者は1999年および2000年に、兵庫県北西部の農村部である宍粟郡の40〜69歳の全住民から無作為に選択した(Lwin H, Yokoyama T, Date C, Yoshiike N, Kokubo Y, Tanaka H, J Epidemiol 2002; 12: 126-135; Saito K, Yokoyama T, Yoshiike N, Date C, Yamamoto A, Muramatsu M, Tanaka H., J Hypertens 2003; 21: 1097-1105)。全参加者は地域の公民館で検診を受けた。生活習慣評価、血液検査、およびDNA分析を下記の通り実施した。本研究は国立健康・栄養研究所および東京医科歯科大学の倫理審査委員会によって承認された。すべての被験者は書面によりインフォームド・コンセントを与えた。
【００３１】
［生活様式因子の評価］
本研究のために特に訓練を受けた看護師または栄養士の監督下で、各参加者は食事摂取、身体活動、喫煙、および飲酒習慣に関する項目を含む標準化したアンケートを完成させた。
【００３２】
通常の身体活動の程度を評価するため、我々は代謝当量(MET)スコアで測定した身体活動強度を用いた。被験者に質問してさまざまな形の労働および家事活動を含む他の作業活動の頻度および平均継続時間を直近12ヶ月以内の2ヶ月毎について判定した(Iwai N, Yoshiike N, Saitoh S, Nose T, Kushiro T, Tanaka H, J Epidemiol 2000; 10: 226-233)。この研究で我々は、日常生活における個人の身体活動の程度の評価のために、睡眠時間を除くMETの平均値である「生活活動強度指数」を用いた。被験者は３群に分類された(不活発、中等度、活発)。
【００３３】
食事摂取を評価するために、我々は24時間食品想起法を用いた。各被験者は試験前１日間の食事摂取の簡単な記録を取り、その前日の間に食べた食品について試験者が詳細に質問した。この面接で、食品スケールと実物大の食品写真冊子の両方を用いて、分量もまた判定した。その後、エネルギー摂取を五訂日本食品標準成分表に基づいて計算した。
【００３４】
日常の喫煙および飲酒状況は各人毎に面接したアンケートで評価した。次いで我々は日常の喫煙状況を、非喫煙者(元喫煙者を含む)、たばこ1〜19本、20本以上／日の３群に分類した。アルコール摂取は飲酒の頻度と通常飲む量および種類として記録した。我々は非飲酒者(元飲酒者を含む)、1〜2杯、3杯以上/日の３群に分類した。ここで１杯はエタノール約12gに相当する。
【００３５】
身長および体重を薄着で測定し、肥満度指数（body mass index、BMI)を（体重）/（身長）2(kg/m2)として計算した。
【００３６】
［実験方法］
静脈血検体をEDTA管および血清管に採取した。血清は次いで3000rpmで10分間4℃にて遠心分離で得られ、その後生化学分析に用いた。血球は凍結し、DNA抽出まで-20℃にて保存した。
【００３７】
生化学変数(血清総コレステロール(TC)、HDLコレステロール(HDL-C)、トリグリセリド(TG)、HBA1C、および血糖)値は自動分析装置(Hitachi7170)で酵素法によって測定した(Lwin H, Yokoyama T, Date C, Yoshiike N, Kokubo Y, Tanaka H, J Epidemiol 2002; 12: 126-135; Saito K, Yokoyama T, Yoshiike N, Date C, Yamamoto A, Muramatsu M, Tanaka H., J Hypertens 2003; 21: 1097-1105)。
【００３８】
DNAを白血球から標準法(GentraSystem,Inc)によって抽出した。遺伝子型決定は非特許文献3に記載の通り一部改変して実施した。
【００３９】
即ち、ゲノミックDNAをキアゲン製96穴プレートの全血精製キットを用いて抹消血白血球200μｌから精製した。収集したDNAをさらに56.3μMの不活性蛍光色素、MOX(Molecular Probes, C-1309)を含む10mMTris-HCl, pH7.5溶液で5倍に希釈した。MOXの最終濃度は、各DNA試料について45μMであり、平均DNA濃度は5ng/μlであった。DNA濃度に関わらず、各PCRについて、5μｌの反応混合物を用いた。ESRRAプロモーター中のESRRA23ミニサテライトの遺伝子型決定は、以下のプライマーを用いて行った。
5'-cgtggccccgcccttcc-3'
5'-gtagacccagtagccccacag-3'
【００４０】
PCRは、5μｌ(25ng)のゲノミックDNAと2.5μｌの10xbuffer(Qiagen)、200μM濃度の各dNTP、7.5pmolの各プライマー、1xQ-solution(Qiagen)、2%Me2SO及び1ユニットのHotStart Taq DNA ポリメラーゼを含むPCRプレミックスを用いて、96穴マイクロプレート(Axygen)中で行った。PCRは、95℃、15分間の後、95℃、45秒、58℃、45秒、72℃、45秒を30サイクル行い、最終の伸長を72℃で7分間行った。PCR産物は、2%アガロースゲル上で、TBE1xbuffer(0.089M Tris, 0.089M ホウ酸、2mM EDTA)中で、10V/cmで2時間泳動させた。PCR反応では、2リピートの198bp産物、3リピートの221bp産物、4リピートの244bp産物、1リピートの175bp産物を得た。
【００４１】
［統計解析］
対立遺伝子頻度は直接計数によって判定した。遺伝子型の頻度はパーセンテージで示した。ハーディ・ワインベルグ平衡からの遺伝子型分布の逸脱はフィッシャー正確性検定によって検定した。ERR遺伝子型群とBMIおよびその他の生活習慣関係因子との関連を、年齢および性別補正、ならびに多変量補正(年齢、性別、喫煙、身体活動、エネルギー摂取)を行って共分散分析(ANCOVA)によって分析する際に、被験者729名のうち2.4および3.3の標本サイズが小さかったため、我々はESRRA23遺伝子型の２つの群すなわち2.2および2.3(計n=718)を選択した。すべての統計解析はSAS8.2ソフトウェア(SAS Institute Inc., 米国ノースカロライナ州ケリー（Cary）)によって行った。
【００４２】
【表１】
2006136267.tif 000003
【００４３】
【表２】
2006136267.tif 000004
【００４４】
［結果］
試験集団で、全体（男女）でのESRRA23の2.2、2.3、2.4、および3.3遺伝子型の頻度はそれぞれ、80.0%、18.5%、0.1%、および1.4%であった。2.2遺伝子型の全体、男性、女性における頻度は他の遺伝子型の頻度のうちで最高であった。2.4、および3.3遺伝子型の頻度はそれより非常に少なかった(表1)。遺伝子型の分布はハーディ・ワインベルグについて期待される値と差が無かった。
【００４５】
表2に示す通り、2.3遺伝子型全体の体重の最小二乗平均(LSM)(59.8kg)は、肥満についての既知の交絡因子(年齢、性別、喫煙、身体活動、エネルギー摂取)の多変量補正後でさえも、2.2遺伝子型の値(58kg)よりも有意に高かった。2.3遺伝子型全体のBMIのLSM(23.7kg/m2)もまた、多変量補正後でさえ、2.2遺伝子型の値(23kg/m2)より有意に高かった(P=0.009)。男性では、二つの遺伝子型の間の他のパラメータは、多変量補正後に示唆的にBMIが有意差があった以外は、有意差が無かった。女性では、2.3遺伝子型における体重のLSM、およびBMIが、年齢および性別補正、ならびに多変量補正の場合、2.2遺伝子型の値より有意に高かった。2.3遺伝子型における血糖値のLSMもまた示唆的に2.2遺伝子型の値より有意に高かったが、その関連は、多変量モデルにおいて体重およびBMIの追加の補正後には有意でなかった(P=0.12)。
【００４６】
［考察］
ESRRA23は、ERR1遺伝子の5'隣接領域に位置する23塩基対配列で、機能性ERR-応答配列であるが、ヒト染色体中に1〜4コピー存在する。肥満関係パラメータについての多変量補正の後でさえ、2.3遺伝子型は2.2遺伝子型よりも高いBMIと有意に関連していたことを見出した。2.3遺伝子型群における体重の補正した最小二乗平均は、2.2遺伝子型群の値より1.8kg有意に高かった(p=0.031)。2.2および2.3遺伝子型群間で、調べた他のパラメータに有意差は無かった。これらの結果は、ESRRA23リピート数の増加はヒトの肥満の独立した遺伝的因子であることを示唆する。
【００４７】
実施例2
ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイは、以下のように行った。
ERR1タンパク質をin vitro 転写及び翻訳キット(Promega)を用いて発現させた。ESRRA23 (センス及びアンチセンス)オリゴヌクレオチド類は、T4 ボリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolab)を用いて、32Pラベルした。ゲルシフトアッセイを4.1% Ficoll, 25 mM Hepes (pH7.8), 0.1M KCl, 1 mM DTT 及び 0.01% NP-40を含有する緩衝液中で実施した。タンパク質は、氷上で30分間プレインキュベートし、次いで、各反応に標識したオリゴヌクレオチド(105 cpm)を加えた。さらに室温で20分間インキュベートした後、0.5x TBE buffer中で5% ネイティブ・ポリアクリルアミド・ゲル上でDNA-タンパク質複合体を分析した。ゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーにかけた。結果を図3に示す。
【００４８】
図3に示すように、32Pで標識したESRRA23を電気泳動すると、レーン１のように下の方（分子サイズが小さい）ところに32P由来のバンドが出る。これにERR1蛋白を混ぜ合わせるとESRRA23とERR1蛋白の複合体が出来て、バンドがシフトした。（ERR1が泳動される分子サイズの大きい場所に32Pのシグナルがシフトする）（レーン２）。
【００４９】
レーン１、ERR1蛋白を入れないもの（32Pで標識したESRRA23のみ）。
レーン２、32Pで標識したESRRA23にERR1蛋白を加えたもの。矢印の部分がESRRA23とERR1蛋白の複合体。
レーン３、32Pで標識したESRRA23にERR1蛋白を加えたもの。そこに32Pで標識しないESRRA23を過剰量加えたもの。それによりバンドの濃さが減っている。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、肥満に関する遺伝子診断法及び抗肥満薬のスクリーニング方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ESRRA23の配列(2リピート)を示す。
【図２】ESRRA23ポリモルフィズムを示す電気泳動写真。
【図３】実施例2で得られた電気泳動写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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