(57)【要約】      （修正有）【課題】少量の核酸プローブにより高感度で実施でき、ラジオアイソトープを使用しないことから安全且つ簡便に実施できる遺伝子発現を解析する方法を提供する。【解決手段】ターゲット遺伝子に対して相補的で且つ第一標識物質を含むプローブを、キャピラリアレイに固相化する工程と；細胞より単離した核に、第二標識物質を取り込ませる伸長反応溶液により伸長反応を再開させ、標識化核酸を作出する工程と；前記標識化核酸を抽出する工程と；前記標識化核酸を前記キャピラリアレイに導入して、前記プローブと前記標識化核酸とをハイブリダイズさせる工程と；ハイブリダイズしない前記プローブを、一本鎖特異的な核酸分解酵素で分解する工程と；分解産物をキャピラリアレイから除去する工程と；残存する前記第一および／または第二標識物質を検出する工程とを含む方法を提供する。【選択図】図１
2006262797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現を測定する対象細胞中で発現されつつある遺伝子を、キャピラリアレイを用いて検出する方法であって、
特定のターゲット遺伝子に対して相補的で且つ第一標識物質を結合されたプローブを、キャピラリアレイが具備する複数のキャピラリ構造内の反応部に固相化する固相化工程と；
前記細胞より単離した核に、第二標識物質を結合させたヌクレオチドが伸長鎖中に取り込まれるように調製された伸長反応溶液を反応させて、前記核の単離の際に伸長途中であったＲＮＡの伸長反応を行うことにより、第二標識物質で標識した標識化核酸を作出する核酸標識工程と；
上記工程処理後、前記標識化核酸を適切な溶液中に抽出する抽出工程と；
上記工程処理後、前記標識化核酸を前記キャピラリアレイ中の前記反応部に導入することによって、前記プローブと、前記ターゲット遺伝子に対応する標識化核酸とをハイブリダイズさせて、相補的な二本鎖核酸を形成させるハイブリダイゼーション工程と；
上記工程処理後、相補的な二本鎖核酸を形成しなかった前記プローブを、塩基対を形成していない一本鎖核酸の部分に特異的に作用する核酸分解酵素を含む酵素処理溶液で、適切な反応条件下において特異的に分解反応させる分解工程と；
上記工程処理後、前記第一標識物質を含む前記プローブの分解産物を、前記反応部から除去する分解後洗浄工程と；
上記工程処理後、前記第一標識物質および／または前記第二標識物質を検出できる検出手段によって、前記反応部に残存する前記第一標識物質および／または前記第二標識物質を検出する検出工程とを具備し、
キャピラリー毎に異なる条件制御下で、複数の試料について並行して上記工程を進行させることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記固相化工程に続き更に、上記工程においてキャピラリアレイが具備する複数のキャピラリ構造内の反応部に固相化されたプローブの固相化状態を、前記第一標識物質を検出できる検出手段によって検定する検定工程、をも具備する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記抽出工程に続き更に、前記標識化核酸を適切な精製手段で精製する精製工程、をも具備する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記精製工程に続き更に、前記標識化核酸を逆転写する逆転写工程、をも具備する方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーション工程に続き更に、上記工程で結合しなかった核酸を洗浄する非結合核酸洗浄工程、をも具備する方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記分解工程に続き更に、前記核酸分解酵素に適切な反応停止処理を施すことによって、前記分解反応を停止させる反応停止工程、をも具備する方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記第一標識物質が、Ｃｙ３またはＣｙ５である方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の方法であって、前記第二標識物質を結合させたヌクレオチドが、５−ブロモウリジンである方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記核酸分解酵素が、Ｓ１ヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、ヌクレアーゼ P1からなる群から選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を測定すべき対象細胞中で発現されつつある遺伝子を解析する核run onアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の転写量を測定する方法として核run onアッセイが知られている。この方法は、単離した核を用いてインビトロで転写を継続させた場合には、新たな転写開始は起こらないとの現象に基づいている。即ち、これは核の単離前にすでに転写の始まっていたＲＮＡ鎖のみが伸長することを意味している。従って、単離核での転写産物を32Ｐで標識し、標識されたＲＮＡを特定のプローブで検出すれば、核を細胞から単離した瞬間にその遺伝子がどの程度転写されていたかなどの情報を知ることができる。より具体的な適用例としては、薬剤、ホルモン、サイトカイン、環境汚染物質などの刺激に対する細胞の遺伝子発現への影響を知ることができる。
【０００３】
従来の核run onアッセイは、一般的には次のような工程をへて解析されるものである。即ち、測定したい遺伝子の配列を含むプラスミドＤＮＡ（５〜１０μｇ程度）などをアルカリ処理して一重鎖ＤＮＡとし、それを中和させてからニトロセルロースフィルターなど核酸を吸着するフィルターに吸着させる。このフィルターを、８０℃で３時間乾熱処理し固定化する。このフィルターに吸着したＤＮＡが試験する対象を検出するプローブとなる。次に、試験対象である細胞から核を単離し、単離した核に32Ｐ−ＵＴＰなどのラジオアイソトープを添加して標識ＲＮＡを合成させる。次に標識したＲＮＡを調製し、それを前記プラスミドＤＮＡを吸着したフィルターと反応させて特異的なハイブリダイゼーションを生じせしめ、洗浄後オートラジオグラフィーでハイブリダイゼーションを検出する。
【０００４】
以上のように従来の核run onアッセイは、大量の核酸を必要とする。また、標識には、32Ｐなどのラジオアイソトープが一般的に用いられており、被爆等の健康や環境への影響が懸念される。また、ラジオアイソトープの取り扱いには特別な施設を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、少量の核酸プローブにより高感度で実施でき、ラジオアイソトープを使用しないことから安全且つ簡便に実施できる遺伝子発現を解析するための核run onアッセイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の手段によって、本発明の課題を解決するものである。即ち、  
遺伝子発現を測定すべき対象細胞中で発現されつつある遺伝子を、キャピラリアレイを用いて検出する方法であって、  
特定のターゲット遺伝子に対して相補的で且つ第一標識物質を結合されたプローブを、キャピラリアレイが具備する複数のキャピラリ構造内の反応部に固相化する固相化工程と；  
前記細胞より単離した核に、第二標識物質を結合させたヌクレオチドが伸長鎖中に取り込まれるように調製された伸長反応溶液を反応させて、前記核の単離の際に伸長途中であったＲＮＡの伸長反応を行うことにより、第二標識物質で標識した標識化核酸を作出する核酸標識工程と；  
上記工程処理後、前記標識化核酸を適切な溶液中に抽出する抽出工程と；  
上記工程処理後、前記標識化核酸を前記キャピラリアレイ中の前記反応部に導入することによって、前記プローブと、前記ターゲット遺伝子に対応する標識化核酸とをハイブリダイズさせて、相補的な二本鎖核酸を形成させるハイブリダイゼーション工程と；  
上記工程処理後、相補的な二本鎖核酸を形成しなかった前記プローブを、塩基対を形成していない一本鎖核酸の部分に特異的に作用する核酸分解酵素を含む酵素処理溶液で、適切な反応条件下において特異的に分解反応させる分解工程と；  
上記工程処理後、前記第一標識物質を含む前記プローブの分解産物を、前記反応部から除去する分解後洗浄工程と；  
上記工程処理後、前記第一標識物質および／または前記第二標識物質を検出できる検出手段によって、前記反応部に残存する前記第一標識物質および／または前記第二標識物質を検出する検出工程とを具備し、  
キャピラリー毎に異なる条件制御下で、複数の試料について並行して上記工程を進行させることを特徴とする方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
遺伝子発現を解析するための核run onアッセイを、少量の核酸プローブにより高感度で実施でき、ラジオアイソトープを使用しないことから安全且つ簡便に実施できる。また、前記アッセイを、複数の試験対象の試料について同時に、しかも各種の反応条件を制御して処理可能で、更に大量の結果を同時に検出可能で、これらの処理および検出を単一の構造体中で行うことができる。
【０００８】
更に、遺伝子発現を解析するための核run onアッセイに使用する反応前のプローブに関して、その品質に影響する担体への固相化状態を容易に検定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ（Nuclease Protection Assay）に類似した手法をキャピラリアレイを使用して実施することにより本発明の課題を解決するものである。
【００１０】
本発明を図１を参照して簡単に説明する。図１のプローブＡおよびプローブＢは、それぞれ異なるターゲット遺伝子に含まれる配列と相補的な配列を有しているプローブである。また、図中のターゲットはプローブＡと相補的な配列を有する核酸を意味している。図中の（ａ）は、キャピラリアレイ中にプローブＡおよびプローブＢが固相化された状況を示している。（ｂ）では、プローブＡに相補的なターゲット核酸が、プローブＡとハイブリダイズした状況を示している。（ｃ）では、ターゲット核酸とハイブリダイズしないプローブＢが分解されて、プローブＢ中に含まれていた標識ヌクレオチドが遊離した状況を示している。本発明は、このようにターゲット核酸とハイブリダイズしたプローブのみがキャピラリアレイ中に残ることを利用して標的となる核酸が試料中に存在するか否かを検出する方法である。
【００１１】
以下に本発明の詳細を説明する。  
［キャピラリアレイ］  
ＤＮＡマイクロアレイは、大量解析、検出感度の向上、マイクロ化によるサンプルの節約、データ取得の自動化、およびデータ処理による簡便化などが達成されると期待されている技術である。現在ＤＮＡマイクロアレイを用いて行われている遺伝子発現解析法は、２つのサンプル中に存在する特定遺伝子の発現比率の差異を比較するような解析法が主流である。この解析法は、２つのｍＲＮＡサンプル各々を異なる波長の蛍光を発する蛍光物質で標識したヌクレオチド（Cy3-dUTPまたはCy5-dUTPなどの）の存在下で逆転写することにより異なる蛍光物質で標識し、それらを前記アレイ上に固相化されたＤＮＡプローブに競合的にハイブリダイゼーションさせ、両者の蛍光を測定するものである。
【００１２】
キャピラリアレイ（ＤＮＡキャピラリ、ＤＮＡキャピラリアレイなどとも呼称される）は、前記ＤＮＡマイクロアレイに改良をくわえたものであり、例えば特開平１１−７５８１２号公報、特開２００１−１３６９６３号公報などに開示されている。
【００１３】
《キャピラリアレイの特長》  
キャピラリアレイは、単一の基板上でキャピラリーの数と同数の試料（例えば、各個体の細胞から抽出した核酸）を測定することが可能であり、多検体を同時に比較することが出来る。また、分注操作、洗浄操作等の送液などを自動化することが容易である。さらに、キャピラリー内の温度を各キャピラリ毎に制御することも可能である。
【００１４】
キャピラリアレイは、例えば図２に例示されるような特徴を有する。図２のキャピラリアレイは、一端に溶液注入口６を他端に溶液排出口７を、さらにその内部にプローブ５を有するキャピラリ形状の空間４（以後、キャピラリ空間と称する）が、基板本体３上に複数（７本）備えられ、それらを覆うように基板上部２を配置し、注入口連結部８と排出口連結部９とで一体構造に連結してキャピラリアレイ１を構成している。更に、キャピラリアレイ１の下部には、基板の温度を制御するためのヒータ１０が配置されている。図２の（Ａ）は、キャピラリアレイ１を上面から見た図である。図２の（Ｂ）は、キャピラリアレイ１を横からみた図である。また、図２にはヒータがキャピラリアレイと別体である一例を示したが、ヒータおよびセンサ並びに必要な配線等がキャピラリアレイ中に組み込まれていてもよい。また、温度制御を必要としない場合には、これらを具備していないキャピラリアレイであってもよい。
【００１５】
実験に用いられる試料は、溶液注入口６からキャピラリ空間４の内部に注入され、溶液排出口７から排出されるが、逆であってもよい。また、複数の溶液排出口７がお互い連結されて１つの共通出入口を形成していてもよい。この場合、それぞれ異なる試料を溶液注入口６から導入して、所要時間ヒータ１０の温度制御下でインキュ−ベションして生物学的反応をさせた後に、共通出入口から一括して試料を回収除去できる。また、同様に共通出入口から洗浄溶液などの同じ組成からなる溶液を一つの流路から全てのキャピラリ空間４に注入することもできる。このようにして洗浄液や測定用試薬などの全ての溶液を処理できるので自動化し易く、測定処理能力の高い装置を構成することが出来る。また、一方向の溶液置換のみで反応工程の全てが終了することから全自動化が可能であり、反応時間の大幅な短縮につながる。
【００１６】
このように、キャピラリアレイは、複数のキャピラリ空間を備え、それぞれのキャピラリ空間に存在する１以上の反応部にプローブが固相化されているようなマイクロアレイである。通常、キャピラリ空間中には複数の前記反応部が設けられ、それぞれにプローブが固相化されている。また、前記反応部は、キャピラリ空間内の一定領域にプローブを直接固相化して形成してもよいが、ビーズなどの粒体にプローブを固相化して、それがキャピラリ空間内の一定領域に固定されるような間接的な固相化により形成されてもよい。前記粒体は、それに固相化されたプローブとキャピラリ構造を流通する試料溶液とが接触することができ、キャピラリ空間内の一定領域に固定できるものであればよい。例えば、磁性ビーズなどが好適に使用され、これはキャピラリアレイの外部から磁石などの磁力を作用させてキャピラリ空間内の一定領域にビーズ自身を保持できる。この場合、各種のプローブを固相化した各種の磁性ビーズを、例えば適切な順番でそれぞれをキャピラリ空間内に充填し、磁石等の磁力により前記一定領域に固定して反応部として機能させることができる。
【００１７】
キャピラリ空間は、その両端に開口部を有し、且つ該空間に溶液を流せるように適切な部材を適切に組み合わせて形成すればよい。従って、キャピラリ空間は、例えば一体型の管状構造体の内部空間であってもよいが、複数の部材を接合して形成してもよい。複数の部材を接合して形成されるキャピラリ空間は、例えば通常のスライドグラス上に以下に説明する蓋体をかぶせることによって形成できる。即ち、蓋体とスライドグラスとが接合された際に、蓋体の底面に存在する複数の溝部と、スライドグラスの上面とからキャピラリ空間が形成される。そして、プローブはキャピラリ空間内のスライドグラス面に固相化される。蓋体は、上面の一端において溶液をキャピラリ空間に導入するための複数の溶液注入口と、他端において溶液注入口に対応する位置に対となる溶液排出口とを備え、この注入口および排出口は蓋体を貫通して底面にも開口している。蓋体の底面には、スライドグラスと蓋体とが接合される際に、溶液注入口と溶液排出口とをキャピラリ空間に連結し、且つキャピラリ空間の複数を形成する複数の溝部、およびスライドグラスと蓋体とが接合される接合部、を備えた構造体を使用できる。キャピラリ空間のサイズは用途に合わせ種々の大きさに設定されるが、実用的には幅が１０μｍ〜数ｍｍ、深さ１μｍ〜５００μｍ、長さが数ｍｍ〜１００ｍｍ、キャピラリ空間の間隔は１０μｍ〜数ｍｍ程度が使用される。以上のようなキャピラリ空間の流路形状は、直線や曲線等の種々の形状で有り得、必要に応じて、複雑に折れ曲がったり、折り返したり、分岐したり、合流したり、テーパ状に幅広（または幅狭）になったり、突起（または微小孔）を経由したり、上り坂（または下り坂）になっていてもよい。複数のキャピラリが、並列的に配置していれば、並列的な液体ハンドリングが容易である。特に、直線状に平行に配置（２次元的でも３次元的でも良い）していれば、並列的な処理を任意の撮像手段によりモニタリングし易くなる点で好ましい。
【００１８】
本体部分となるスライドガラスは、マイクロアレイにおけるプローブの固相化に通常用いられる手法により作成できる。例えば、スライドグラスをアルカリや酸などで洗浄して前処理法を行う。次に、プローブとする核酸の固相に必要な処理を行う。表面処理としては、ポリＬリジンによりアレイ基板をプラス電荷にさせ、マイナスに帯電したＤＮＡを吸着させる方法や、アミノシラン化剤等を用いて基板にアミノ基を導入し、必要に応じて架橋剤を使用することにより、プローブとスライドガラスとの共有結合を実現することもできる。また、ストレプトアビジンでコートしたスライド（グライナー・ジャパン社）に、特異的に結合するビオチンで標識したプローブを反応させることによっても作出することができる。スライドガラスの表面処理後は、市販のピンタイプアレイヤーまたは、インクジェットアレイヤー等の装置を用いて、プローブとする核酸を基板上に配する。次に蓋体を取り付けて、キャピラリ空間を形成する。このようなスライドグラスと蓋体とから作成されるキャピラリアレイは、分解してスライドグラス部分のみを通常のマイクロアレイの測定機器を用いて測定できるなどの利点を有している。
【００１９】
キャピラリアレイとは以上説明したような特長を具備するものであり、本発明の、キャピラリー毎に異なる条件制御下で、複数の試料について並行して工程を進行させるとの特長は、キャピラリアレイの効果に基づくものである。
【００２０】
《キャピラリアレイ中に固相化されるプローブ》  
本発明は、本発明の第一標識物質を結合させたプローブが、上記で説明したキャピラリアレイ中の反応部に固相化されて存在するようなキャピラリアレイを使用することが好ましい。
【００２１】
前記プローブは少なくとも以下のような条件を具備するものであればよい。即ち、前記プローブは、  
検出すべき特定のターゲット遺伝子に対して相補的な配列を有し、該配列と特異的にハイブリダイズして相補的な二本鎖を形成できる；  
第一標識物質で適切に標識されたヌクレオチドを、前記プローブ中の適切な位置に含む；  
本発明で使用される核酸分解酵素で分解できる；  
などの条件である。
【００２２】
ここで「適切に標識されたヌクレオチド」という用語は、ハイブリダイゼーションによる相補鎖の形成および核酸分解酵素による一本鎖核酸の消化などが、この標識の存在によって影響されないことを意味する。例えばハイブリダイゼーションに関しては、通常の塩基対形成を妨げないことが必要とされる。また「適切な位置」とは、前記プローブが固相化される側と逆側の端から該プローブの全長の１／３程度の長さ固相面側の位置である。即ち、例えば３０ヌクレオチドのプローブの５’端を固相面に結合した場合、３’端から１０番目の部位付近のヌクレオチドが第一標識物質で標識されていることが好ましい。
【００２３】
また、前記プローブの鎖長は、上記条件を満たす範囲内で適宜目的に応じて選択されるが、好ましくは１０〜５０ヌクレオチドの範囲、より好ましくは２０〜４０ヌクレオチドの範囲、最も好ましくは３０ヌクレオチド前後の鎖長が使用される。前記プローブは、第一標識物質で適切に標識されたヌクレオチドが含有されるように合成して作出することができる。第一標識物質で適切に標識されたヌクレオチドとしては、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、シチジン（Ｃ）、アデニン（Ａ）などに蛍光試薬を結合させたヌクレオチドを使用することができる。前記蛍光試薬としては、例えばＣｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、ローダミンなどを使用することができる。このように本発明のプローブは前記第一標識物質で標識されているので、固相化工程後に前記第一標識物質を検出することにより固相化の状態を確認する事が出来る。従って、プローブの固相化に関して固相化量や固相化部の均質性などを検査することによって、キャピラリアレイの精度管理が可能となる。また、所定の反応の前に固相化プローブの量や点着したスポットの状態を知ることが出来るため、従来のＤＮＡマイクロアレイ全般が抱える精度管理上の課題を克服できる。なお、本発明において、蛍光試薬以外の各種計測可能な標識物質（例えば、化学発光用、生物発光用、電気化学発光用、電磁エネルギー用、共鳴エネルギー用、ナノ半導体発光用）を使用するように適宜変更してもよい。
【００２４】
［核run onアッセイ］  
本発明において、第二標識物質で標識した標識化核酸の作出は、従来技術である核run onアッセイを参照して実施できる。以下に標識化核酸の作出する方法を説明する。
【００２５】
最初に非イオン性界面活性剤（ＮＰ−４０）を含む溶解緩衝液中で形質膜を溶解して核を単離する。次に、第二標識物質を結合させたヌクレオチドとその他のＲＮＡを構成するヌクレオチドとを、それらヌクレオチドの５’部位にリン酸基を３つ有するヌクレオチド３リン酸の形態で含有する伸長反応溶液を加える。例えば５−ブロモウリジンの場合は、5-ブロモウリジン  5'-三リン酸 （5-Bromouridin 5'-triphosphate）として前記伸長反応溶液中に含まれていればよい。伸長反応溶液を添加してインキュベーションすることによって、前記核の単離の際に伸長途中であったＲＮＡの伸長反応が再度開始される。次に、DNaseＩを加えてＤＮＡを分解する。次に、ＳＤＳなどを含む停止液を加えることによって酵素反応を停止させる。次に、ＡＧＰＣ法などの従来技術のＲＮＡ抽出方法によってＲＮＡを抽出するが、RNeasy キット（キアゲン社）などのキットを使用してもよい。更に、第二標識物質を特異的に結合する物質によるアフィニティー精製を用いて精製してもよい。このような操作によって、第二標識物質で標識された標識化核酸が作出される。第二標識物質を結合させたヌクレオチドは、第一標識物質と区別して検出されるものであればよいが、好ましくは５−ブロモウリジンなどが使用される。或いは、第二標識物質を結合させたヌクレオチドは、第一標識物質と異なる波長で検出できる蛍光色素を結合させたヌクレオチドであってもよい。例えば、第一標識物質がＣｙ３であれば、Ｃｙ５を結合させたヌクレオチドを使用して転写中のＲＮＡ鎖にＣｙ５を取り込ませることが可能である。結合させたヌクレオチドが５−ブロモウリジンの場合は、例えば抗BrdU抗体により特異的に検出することができる。また、この抗体を用いた免疫沈降法で５−ブロモウリジンを取り込んだ前記標識化核酸を精製することもできる。
【００２６】
［核酸分解酵素の利用］  
本発明は、ヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ（Nuclease Protection Assay）の原理をも利用する。このアッセイは、一本鎖特異的な核酸分解酵素を利用することによって、特定の核酸の存在を検査する方法である。即ち、このアッセイにおいて、ターゲット遺伝子に由来する核酸とハイブリダイゼーションしたプローブは、二本鎖核酸を形成し、その結果、この二本鎖核酸は、ヌクレアーゼの分解を逃れプローブが分解から保護される。これに対し、ハイブリダイゼーションしなかった未反応のプローブ（一本鎖ＤＮＡ）は、分解され第一標識物質を結合されたヌクレオチドが溶液中に遊離する。そしてヌクレアーゼの分解から保護されたプローブの第一標識物質を検出することでターゲット遺伝子の存在頻度を測定する方法である。したがって、逆転写酵素によるｃＤＮＡの調製や、検体ごとの標識が不要であり、且つ、ｍＲＮＡの状態でのアッセイを実行できるので定量性が向上し、試薬コストを削減することも可能となる。
【００２７】
本発明に使用することができる核酸分解酵素(nuclease；ヌクレアーゼ) について以下に説明する。S1  ヌクレアーゼは、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（endonuclease）であり、ＤＮＡ、ＲＮＡともに５’−Ｐのヌクレオチド（糖の５’位にリン酸を保持したヌクレオチド一リン酸）に分解し最終的には、９０％以上５’−Ｐのヌクレオチドに分解する酵素である。また、前記酵素は、二本鎖中の一本鎖部分にも作用し、この部分を分解する。更に、前記酵素は、ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の一本鎖部分の除去などにも用いられる。また、エクソヌクレアーゼＩは、一本鎖特異的エクソヌクレアーゼ（exonuclease）であり、一本鎖ＤＮＡの３’端から順番に加水分解し、５’−Ｐのヌクレオチドに分解する酵素である。この酵素は、ＰＣＲ後のプライマーの除去などに用いられる。その他の一本鎖特異的に反応するヌクレアーゼとしてヌクレアーゼ P1などもある。当業者であれば、これらの酵素の各々の特異性や反応条件を考慮して適切な条件を設定することができる。
【００２８】
［各工程の説明］  
本発明の方法は、以下に記載され説明される各工程から目的に応じて適宜選択される工程を複数含む方法である。なお各工程の前に付与される数字は、参照時の利便性から付与されるものである。選択される工程および各工程の順序は、本発明の範囲において適宜変更することができる。
【００２９】
１：特定のターゲット遺伝子に対して相補的で且つ第一標識物質を結合されたプローブを、キャピラリアレイが具備する複数のキャピラリ構造内の反応部に固相化する固相化工程。本工程は、調査する対象であるターゲット遺伝子を検出するためのプローブを、キャピラリアレイの反応部に固相化する工程である。本工程は、上述の「キャピラリアレイ」に関する記載を参照して実施される。
【００３０】
２：上記工程においてキャピラリアレイが具備する複数のキャピラリ構造内の反応部に固相化されたプローブの固相化状態を、前記第一標識物質を検出できる検出手段によって検定する検定工程。この工程では上記工程の処理が適切に実施されたかを検定する工程である。具体的には、第一標識物質を検出できる検出手段により、反応部を測定して固相化の状態を検定する。前記固相化の状態には、例えばプローブ固相化の有無、均質性などの反応部の状態、または反応部以外の領域から発せられるバックグラウンドシグナルの状態なども含まれる。一般的には、本工程によりプローブ固相化状態を確認した上で、次ぎの工程の処理に移行することが好ましい。
【００３１】
３：前記細胞より単離した核に、第二標識物質を結合させたヌクレオチドが伸長鎖中に取り込まれるように調製された伸長反応溶液を反応させて、前記核の単離の際に伸長途中であったＲＮＡの伸長反応を行うことにより、第二標識物質で標識した標識化核酸を作出する核酸標識工程。本工程は、検出すべき対象であるターゲット遺伝子をコードするＲＮＡを標識する工程であり、上述の「核run onアッセイ」に関する記載を参照して実施される。
【００３２】
４：前記標識化核酸を適切な溶液中に抽出する抽出工程。本工程は、上記工程で標識されたＲＮＡの抽出を行う工程であり、上述の「核run onアッセイ」に関する記載を参照して実施される。なお前記適切な溶液とは、次ぎの工程に依存して適宜選択される。次に、例えばハイブリダイゼーション工程に移行する場合は、ハイブリダイゼーション溶液〔例えば、５ｘＳＳＣ溶液（１ｘＳＳＣは、0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）、50％ホルムアミド、0.1％SDSを含む〕であることが好ましい。
【００３３】
５：前記標識化核酸を適切な精製手段で精製する精製工程。本工程は、ＲＮＡの精製を行う工程であり、上述の「核run onアッセイ」に関する記載を参照して実施される。本工程により、前記標識化核酸が高度に精製される。前記精製手段は、結果として標識化核酸が高度に精製されればよく、単独精製法による手段であってもよく、または複数の精製法の組み合わせによる手段であってもよい。好ましくは、第二標識物質に特異的に結合する抗体を用いたアフィニティ精製が使用される。次の工程として、以下の逆転写工程に移る場合は、本工程により高度に精製することが好ましい。
【００３４】
６：前記標識化核酸を逆転写する逆転写工程。本工程は、標識化核酸を逆転写してｃＤＮＡにする工程である。本工程は必須ではないがこの工程によってＲＮＡをＤＮＡに転換してから次の工程に移ってもよい。この逆転写の際にも前記核酸標識工程と同様の操作によって、第二標識物質で標識することが好ましい。本工程で逆転写を行った場合は、以下のハイブリダイゼーション工程で形成される相補的な二本鎖核酸は二本鎖ＤＮＡとなる。逆に本工程を実施せず逆転写を行わなかった場合は、ＲＮＡとＤＮＡとが塩基対を形成したヘテロ二本鎖核酸が形成されることとなる。このような２本鎖核酸の種類をも考慮にして、以下の工程の条件が考慮されることが好ましい。例えば、このような２本鎖核酸の種類は、分解工程で使用される核酸分解酵素などの選択にも影響する可能性があることを考慮すべきである。
【００３５】
７：前記標識化核酸を前記キャピラリアレイ中の前記反応部に導入することによって、前記プローブと、前記ターゲット遺伝子に対応する標識化核酸とをハイブリダイズさせて、相補的な二本鎖核酸を形成させるハイブリダイゼーション工程。本工程は、プローブとターゲット遺伝子に由来する核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程である。本工程は、特異的なハイブリダイゼーションを達成させるために、使用するプローブに応じてキャピラリアレイの温度を制御して行うことが好ましい。ハイブリダイゼーション時の温度を含む種々の条件は、当業者であれば適切に設定することができる。
【００３６】
８：上記工程で結合しなかった核酸を洗浄する非結合核酸洗浄工程。本工程は、ハイブリダイゼーション工程で相補的な二本鎖核酸を形成しなかった核酸を洗浄して除去する工程である。本工程も、非特異的な結合を抑える目的などから適切な温度で行うことが好ましい。洗浄時の温度を含む種々の条件も、当業者であれば適切に設定することができる。
【００３７】
９：相補的な二本鎖核酸を形成しなかった前記プローブを、塩基対を形成していない一本鎖核酸の部分に特異的に作用する核酸分解酵素を含む酵素処理溶液で、適切な反応条件下において特異的に分解反応させる分解工程。本工程は、キャピラリアレイ内に存在する一本鎖核酸を、或いは一本鎖核酸および２本鎖核酸中で塩基対形成していない１本鎖部分を、分解する工程である。本工程は、「核酸分解酵素の利用」に関する記載を参照して実施される。
【００３８】
１０：前記核酸分解酵素に適切な反応停止処理を施すことによって、前記分解反応を停止させる反応停止工程。本工程は、前記分解工程を適切に停止して更なる分解反応を停止するために実施される。この反応停止処理には、使用する前記酵素に応じて適切な方法が選択されることが好ましい。例えば、前記酵素の阻害物質の添加などの方法で前記酵素を不活性化することができる。また、ハイブリダイゼーション工程で形成された二本鎖を維持する必要がない場合は、変性剤の添加、熱変性などの方法を用いてもよい。本工程を実施せず、下記の分解後洗浄工程によって前記酵素を取り除くことでも本工程の目的を達成することができる。
【００３９】
１１：前記第一標識物質を含む前記プローブの分解産物を、前記反応部から除去する分解後洗浄工程。本工程は、上記工程処理後にキャピラリアレイ内に残存する溶液を除去し、反応部を洗浄する工程である。本工程では、上記工程による処理によって少なくとも分解したプローブに含まれていた第一標識物質がキャピラリアレイ内から排除され、以下の検出工程に影響を及ぼさなければよい。
【００４０】
１２：前記第一標識物質および／または前記第二標識物質を検出できる検出手段によって、前記反応部に残存する前記第一標識物質および／または前記第二標識物質を検出する検出工程。本工程は、相補的な二本鎖核酸を形成し、結果として核酸分解酵素による分解から保護されたプローブおよび標識化核酸を、第一標識物質および／または第二標識物質に基づいた検出方法によって検出する工程である。前記検出手段は、第一標識物質および第二標識物質を検出することができる測定手段なので、２つの標識物質の種類によって適宜選択されることが好ましい。第一標識物質および第二標識物質として双方とも蛍光試薬を使用する場合、第一標識物質および第二標識物質は互いに区別できる波長の蛍光を発する異なる蛍光試薬であることが好ましい。これは、第一標識物質および第二標識物質として、例えばそれぞれＣｙ３およびＣｙ５を使用すれば両者に由来する蛍光シグナルを各々独立して検出することができる。或いは、第一標識物質および第二標識物質に特異的に結合する親和性物質を、それぞれＣｙ３およびＣｙ５で標識すれば両者に由来する蛍光シグナルを各々独立して検出することができる。前記親和性物質は、第一標識物質または第二標識物質に特異的に結合する抗体などが好適に使用される。適切な第一標識物質と第二標識物質との組み合わせは、当業者であれば実施の目的などの様々な要件を考慮して選択することができる。
【００４１】
以上の工程を含む本発明の方法によって検出された結果から、以下Ａ〜Ｃの何れかの結果が生じる可能性がある。Ａ〜Ｃの各々について、以下に説明する。
【００４２】
Ａ：前記第一標識物質または前記第二標識物質のうち何れか一方のみが検出される：
通常はこの状況は生じない。  
Ｂ：前記第一標識物質および前記第二標識物質の双方が検出される：
この状態は、核を単離する際にターゲット遺伝子が転写されていたことを示す状態である。即ち、前記プローブと、前記ターゲット遺伝子に対応する標識化核酸とが適切にハイブリしたため両者が分解されなかった状況を示している。  
Ｃ：双方とも検出されない：
この状態は、核を単離する際にターゲット遺伝子が転写されていなかったことを示す状態である。即ち、適切なハイブリダイゼーションが生じなかったためにプローブが分解されたことを示している。
【００４３】
測定の結果から以上のような情報を取得することができる。  
但し、この情報は全ての工程が適切に処理されたとの前提で記載されるものである。従って、いくつかの工程を含まないで実施された場合、以下の記載とは異なることもある。例えば、前記精製工程を実施しない場合は、第一標識物質のみ検出されることも考えられる。これは前記プローブと、標識されていない核酸とが特異的にハイブリする場合に生じることが予想されるからである。この場合においてもプローブは分解されない。この場合、標識されていない核酸はターゲット遺伝子に相補的な核酸であるが、核の単離前から存在していた可能性が考えられる。当業者であれば選択された工程を含む本発明の方法を実施した際に、予想される結果を推定することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に記載される実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。
【００４５】
［実施例１］  
本実施例は、前記第一標識物質としてＣｙ３、前記第二標識物質として5-ブロモウリジン、前記核酸分解酵素としてS1 ヌクレアーゼを使用した。  
本実施例では、Ｃｙ３の波長の蛍光を測定することによって、ハイブリダイゼーションしたプローブのみが適切に保護されるかが検定される。
【００４６】
＜材料および方法＞  
《ＲＮＡの調製》  
培養細胞株としてのＨｅＬａ細胞を0.05%トリプシン―0.53mM  EDTAで剥がし、その細胞を冷ＰＢＳで２度洗浄し、0.5ｍＬの溶解緩衝液（10mM Tris-HCl pH7.4、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.5％NP-40）で懸濁し、氷中で１０分放置した。次に、細胞を遠心して核画分（ペレット）を分離し、それを１００μＬの懸濁用緩衝液（50mM Tris-HCl pH8.3、40％グリセロール、5mM MgCl2、0.1mM EDTA）中に懸濁した。次に１００μＬの伸長反応溶液〔10mM Tris-HCl pH8.0、5mM MgCl2、300mM KCl、各0.5mM ATP、CTP、GTPおよび0.1mM 5-ブロモウリジン  5'-三リン酸（シグマ社）〕を加え、30℃で30分反応させた。DNaseＩを20μg/mLになるように加え、さらに30℃で30分反応させた。その後、200μＬの停止液（20mM Tris-HCl、2％SDS、10mM EDTA、200μｇ/mLプロテナーゼＫ）を加え42℃で30分反応させた。この停止液処理後の溶液をRNeasy キット（キアゲン社）で使用法に従い処理し、ＲＮＡを回収した。その後、抗BrdU抗体（ベーリンガーマンハイム社）とプロテインＧ  ビーズ（アマシャム社）を用いて5-ブロモウリジンで標識された標識化ＲＮＡを免疫沈降法で精製した。次に、前記抗体に結合したＲＮＡをハイブリダイゼーション溶液〔５ｘＳＳＣ溶液（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）、50％ホルムアミド、0.1％SDS〕中に回収して、ＲＮＡ溶液とした。
【００４７】
《キャピラリアレイの調製》  
一方、ストレプトアビジンコートスライド（グライナー・ジャパン社）に、５’端をビオチン標識し３’端から１０番目のＴをＣｙ３標識したＤＮＡプローブであるPRH-HPRT1M.BD｛biotin-GGGGGCTATAAATTCTTTGC(T-Cy3)GACCTGCTG｝を１０ｎＭで点着装置を用いてスポッティングし、ビオチン−アビジン反応で固相化した。このＤＮＡプローブが有する配列は、前記ＨｅＬａ細胞中で発現していることが確認されているＨＰＲＴ遺伝子の一部分と相補的な配列である。このスライドに上述の蓋体（両端に溶液を出し入れ出来る穴を有した長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍのキャピラリー形状の溝を複数有する）をかぶせ、キャピラリアレイとした。
【００４８】
《ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理》  
次に、前記キャピラリアレイのキャピラリー内に前記ＲＮＡ溶液を入れ、４２℃で１時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、１ｘＳＳＣ溶液で十分洗浄して未反応のＲＮＡをキャピラリー内から取り除いた。その後、酵素処理溶液〔30mM 酢酸ナトリウム(pH4.6)、280mM NaCl、1mM ZnSO4、1200units／ml  Ｓ１ヌクレアーゼ（ここで1unitは、熱変性仔牛胸腺由来DNAを基質として用い、３７℃、ｐＨ４．６において１分間に１μｇの酸可溶性物質を生成するような酵素活性とする）〕をキャピラリー内に入れ３７℃で１時間反応させた。反応後、０．１ｘＳＳＣで十分洗浄して未反応物質を取り除き蛍光を測定した。
【００４９】
＜結果および考察＞  
キャピラリアレイの蛍光を測定した結果を表１に示す（表１は、一番強い蛍光強度を１とした相対値で示す）。  
表１から明らかなように、キャピラリアレイ中の蛍光強度は、ＲＮＡ試料が存在しない条件下で非常に低くかった。この結果は、前記ＤＮＡプローブが１本鎖のままだったので分解され、その後の洗浄操作で除去されたことを示している。これと対照的に、ＲＮＡ試料で処理した場合は、Ｃｙ３の波長の蛍光が観察された。この結果は、適切に二本鎖が形成された結果、Ｃｙ３標識塩基がヌクレアーゼの分解を免れてキャピラリアレイ中に保持されたことを示している。
【００５０】
【表１】
2006262797.tif 000003
【００５１】
［実施例２］  
本実施例は、前記第一標識物質としてＣｙ３、前記第二標識物質として5-ブロモウリジン、前記核酸分解酵素としてS1 ヌクレアーゼを使用した。  
本実施例では、Ｃｙ３の波長の蛍光を測定することによって、ハイブリダイゼーションしたプローブのみが適切に保護されるかが検定される。また、5-ブロモウリジンにＣｙ５標識した抗BrdU抗体を反応させＣｙ５の波長の蛍光を測定することによって、前記標識化核酸の存在が検定される。更に両者の測定結果（Ｃｙ３およびＣｙ５の検出結果）から、キャピラリアレイ内の反応部におけるプローブと前記標識化核酸との関係が推定される。
【００５２】
＜材料および方法＞  
《ＲＮＡの調製》  
培養細胞株としてのＨｅＬａ細胞を0.05%トリプシン―0.53mM  EDTAで剥がし、その細胞を冷ＰＢＳで２度洗浄し、0.5ｍＬの緩衝液（10mM Tris-HCl pH7.4、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.5％NP-40）で懸濁し、氷中で１０分放置した。次に、細胞を遠心して核画分（ペレット）を分離し、それを１００μＬの懸濁用緩衝液（50mM Tris-HCl pH8.3、40％グリセロール、5mM MgCl2、0.1mM EDTA）に懸濁した。次に１００μＬの反応液〔10mM Tris-HCl pH8.0、5mM MgCl2、300mM KCl、各0.5mM ATP、CTP、GTPおよび0.1mM 5-ブロモウリジン  5'-三リン酸（シグマ社）〕を加え、30℃で30分反応させた。DNaseＩを20μg/mLになるように加え、さらに30℃で30分反応させた。その後、200μＬの停止液（20mM Tris-HCl、2％SDS、10mM EDTA、200μｇ/mLプロテナーゼＫ）を加え42℃で30分反応させた。それをRNeasy キット（キアゲン社）で使用法に従い処理し、ＲＮＡを回収した。その後、抗BrdU抗体（ベーリンガーマンハイム社）とプロテインＧ  ビーズ（アマシャム社）を用いて5-ブロモウリジンで標識された標識化ＲＮＡを免疫沈降法で精製した。次に、前記抗体に結合したＲＮＡをハイブリダイゼーション溶液〔５ｘＳＳＣ溶液（0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）、50％ホルムアミド、0.1％SDS〕中に回収して、ＲＮＡ溶液とした。
【００５３】
《キャピラリアレイの調製》  
一方、ストレプトアビジンコートスライド（グライナー・ジャパン社）に５’端をビオチン標識し３’端から１０番目のＴをＣｙ３標識したＤＮＡプローブであるPRH-HPRT1M.BD｛biotin-GGGGGCTATAAATTCTTTGC(T-Cy3)GACCTGCTG｝を１０ｎＭで点着装置を用いてスポッティングし、ビオチン−アビジン反応で固相化した。このＤＮＡプローブが有する配列は、前記ＨｅＬａ細胞中で発現していることが確認されているＨＰＲＴ遺伝子の一部分と相補的な配列である。このスライドに上述の蓋体（両端に溶液を出し入れ出来る穴を有した長さ３〜４ｃｍ、幅１ｍｍ、高さ０．１〜０．２ｍｍのキャピラリー形状の溝を複数有する）をかぶせ、キャピラリアレイとした。
【００５４】
《ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ処理》  
次に、前記キャピラリアレイのキャピラリー内に前記ＲＮＡ溶液を入れ４２℃で１時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、１ｘＳＳＣ溶液で十分洗浄して未反応のＲＮＡをキャピラリー内から取り除いた。その後、酵素処理溶液〔30mM 酢酸ナトリウム (pH4.6)、280mM NaCl、1mM ZnSO4、1200units／ml  Ｓ１ヌクレアーゼ（ここで1unitは、熱変性仔牛胸腺由来DNAを基質として用い、３７℃、ｐＨ４．６において１分間に１μｇの酸可溶性物質を生成するような酵素活性とする）〕をキャピラリー内に入れ３７℃で１時間反応させた。反応後、０．１ｘSSCで十分洗浄して未反応物質を取り除いた。その後、5-ブロモウリジンを含むＲＮＡを抗BrdU抗体（ベーリンガーマンハイム社）で反応させ、洗浄した後に抗BrdU抗体に対するＣｙ５標識抗体を反応させ再び洗浄しＣｙ３およびＣｙ５の波長の蛍光を測定した（表２）。
【００５５】
＜結果および考察＞  
キャピラリアレイの蛍光を測定した結果を表２に示す（表２は、一番強い蛍光強度を１とした相対値で示す）。  
表２から明らかなように、キャピラリアレイ中の蛍光強度は、ＲＮＡ試料が存在しない条件下で非常に低くかった。この結果は、前記ＤＮＡプローブが１本鎖のままだったので分解され、その後の洗浄操作で除去されたことを示している。これと対照的に、ＲＮＡ試料で処理した場合は、Ｃｙ３の波長の蛍光が観察された。この結果は、適切に二本鎖が形成された結果、Ｃｙ３標識塩基がヌクレアーゼの分解を免れキャピラリアレイ中に保持されたことを示している。
【００５６】
更に、Ｃｙ３の波長の蛍光が観察された反応部においてＣｙ５の蛍光も測定された。この結果は、ＲＮＡ試料の5-ブロモウリジン  5'-三リン酸を取り込んだＲＮＡが、前記ＤＮＡプローブと適切に二本鎖を形成したために両核酸が分解されずに残ったことを示している。このように、本発明の実現性は、ｍＲＮＡレベルの実験において十分な定量性、感度および再現性が確認された。したがって、本発明の方法は、発現頻度解析のみならず、ＳＮＰ（一分子多型）解析や、分子計算機（ＤＮＡコンピューター）への応用等に有効なユニバーサルアレイ（特開２００２−３１８９９２、特開２００２−３３５９９９参照）にも適用できるといった汎用性も期待できる。
【００５７】
【表２】
2006262797.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の概要を説明する図である。
【図２】キャピラリアレイの代表例を説明する図である。
【符号の説明】
【００５９】
１…キャピラリアレイ基板
２…基板上部
３…基板本体
４…キャピラリ構造
５…プローブ
６…溶液注入口
７…溶液排出口
８…注入口連結部
９…排出口連結部
１０…ヒータ
【図１】
2006262797.tif 000005
【図２】
2006262797.tif 000006