(57)【要約】    【課題】家畜の消化管内でのヒトの食中毒細菌の増殖を防止するのに有効な家畜用抗菌剤を提供すること。    【解決手段】有効成分として乳酸菌由来のプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含むことを特徴とする家畜用抗菌剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として乳酸菌由来のプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含むことを特徴とする家畜用抗菌剤。
【請求項２】
該有効成分が、乳酸菌培養液及び／又は乳酸菌培養上清液であることを特徴とする請求項１に記載の家畜用抗菌剤。
【請求項３】
該乳酸菌がラクトバシラス属、ワイセラ属、ペディオコッカス属およびロイコノストック属からなる群から選ばれる一種又は二種以上の乳酸菌であることを特徴とする請求項１または２に記載の家畜用抗菌剤。
【請求項４】
該ラクトバシラス属乳酸菌が、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・サリバリウスまたは／およびラクトバシラス・ペントサスであることを特徴とする請求項３に記載の家畜用抗菌剤。
【請求項５】
該ワイセラ属に属する乳酸菌が、ワイセラ・エスピー FERM P-19577、ワイセラ・シバリア、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・ヘレニカ、ワイセラ・カンドレリ、ワイセラ・マイナー、ワイセラ・パラメセンテロイデスまたは／およびワイセラ・タイランデンシスであることを特徴とする請求項３に記載の家畜用抗菌剤。
【請求項６】
該ペディオコッカス属乳酸菌が、ペディオコッカス・ペントサセウスであることを特徴とする請求項３に記載の家畜用抗菌剤。
【請求項７】
該ロイコノストック属乳酸菌が、ロイコノストック・シトレウム、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、ロイコノストック・アルジェンティナム、ロイコノストック・カルノサムまたは／およびロイコノストック・メセンテロイデスであることを特徴とする請求項３に記載の家畜用抗菌剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の家畜用抗菌剤を含有することを特徴とする家畜用飼料組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の家畜用飼料組成物を家畜に投与することを特徴とする家畜の胃及び／または腸内でのヒトの食中毒細菌の増殖防止方法。
【請求項１０】
該食中毒細菌が、サルモネラ属細菌、キャンピロバクター属細菌、リステリア属細菌、腸管出血性大腸菌および／またはウェルシュ属細菌であることを特徴とする請求項９に記載のヒトの食中毒細菌の増殖防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は家畜用の抗菌剤および飼料用組成物に関し、さらに詳しくは有効成分として乳酸菌由来のプロテアーゼ耐性バクテリオシン（以下、ＰＲＢと略称することがある）を含むことを特徴とする家畜用抗菌剤および該抗菌剤を含有することを特徴とする家畜用飼料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、サルモネラ属細菌、キャンピロバクター属細菌などが原因とされるヒトの食中毒が急増し、これら食中毒細菌による汚染も養鶏業界、養豚業界に広がっている。この対策として、わが国では、従来、逆性消毒薬等が鶏舎の消毒を目的に使用されてきたが、一方、海外においては、ワクチンを使用している。しかしながら、いずれも、家畜の腸内のヒトの食中毒細菌のヒトへの感染を阻止するまでに到っていない。
【０００３】
サルモネラ抗菌剤として、糖類や有機酸、抗菌剤及び複合製剤が市販されている。サルモネラの感染メカニズムについても研究が行われ、サルモネラにはタイプＩ型線毛があり、家畜の腸管粘膜上皮細胞表面のマンノース類似レセプターと結合し、定着・感染することが知られている。特に、マンノース類をはじめとする機能性糖類は、天然物であるため安全性が高く、サルモネラ菌体に直接作用する抗菌剤として比較的高い効果が期待された（非特許文献１および特許文献１〜３）。しかしながら、マンノースは家畜腸内細菌によって分解されるため、著量投与しないと効果なく、マンノース分解細菌に対する抗菌剤の開発が望まれていた（非特許文献２）。
【０００４】
さらに、乳酸菌の産出する抗菌物質であるNisinについてもサルモネラやキャンピロバクター属細菌に対して様々な検討が実施されている。Nisinは、グラム陽性細菌に対しては幅広い抗菌スペクトルを有しているが、グラム陰性細菌に対する抗菌性は低い（非特許文献５）。そのため抗菌剤としてNisinと併せてキレート剤（非特許文献３）やTSP（非特許文献４）、Lisozyme（特許文献４）、及び有機酸（特許文献４）を併用した例があるが、サルモネラの生息する家畜腸内では、Nisinは消化酵素で分解されるため抗菌活性が持続せず、分解しない抗菌剤の開発が望まれていた。
【非特許文献１】清水幹夫、マンナンオリゴ糖の特徴と有用性、「養鶏の友」６月号、p.14-18 (1996)
【非特許文献２】深田恒夫ら、鶏におけるオリゴ糖のサルモネラ感染抑制効果について、「鶏病研報」Vol.31、p.113-117 (1995)
【非特許文献３】Catherine N. Cutter et al, Journal of Food Protection, Vol.58(9), p.977-93 (1995)
【非特許文献４】Alexandra M. S. et al, Journal of Food Protection, Vol.61(7), p.839-844 (1998)
【非特許文献５】Helene Morency, et al., Can. J. Microbiol., Vol.47, p.322-331 (2001)
【特許文献１】特開平１０−２１５７９０号公報
【特許文献２】ＷＯ９９／０８５４４パンフレット
【特許文献３】特開平２００１−２３８６０８号公報
【特許文献４】ＷＯ０３／００５９６３パンフレット
【特許文献５】特開平４−１５４７２７号公報
【特許文献６】特開平８−２６８８９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、家畜の消化管内でのヒトの食中毒細菌の増殖を防止するのに有効な家畜用抗菌剤を提供し、延いては、このような家畜用抗菌剤を配合した家畜用飼料組成物を家畜に投与することにより、家畜の胃及び／または腸内でのヒトの食中毒細菌の増殖防止する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、家畜の胃（液）や腸（液中）に乳酸菌由来のプロテアーゼ耐性バクテリオシンを有効成分とする抗菌剤を投与することによって、家畜消化管内でのヒトの食中毒細菌の増殖を防止出来ることを見出し、このような知見に基いて本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
（１）有効成分として乳酸菌由来のプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含むことを特徴とする家畜用抗菌剤。
（２）該有効成分が、乳酸菌培養液及び／又は乳酸菌培養上清液であることを特徴とする上記（１）に記載の家畜用抗菌剤。
（３）該乳酸菌がラクトバシラス属、ワイセラ属、ペディオコッカス属およびロイコノストック属からなる群から選ばれる一種又は二種以上の乳酸菌であることを特徴とする前記（１）または（２）の家畜用抗菌剤。
（４）該ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・サリバリウスまたは／およびラクトバシラス・ペントサスであることを特徴とする上記（３）に記載の家畜用抗菌剤。
（５）該ワイセラ属に属する乳酸菌が、ワイセラ・エスピー FERM P-19577、ワイセラ・シバリア、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・ヘレニカ、ワイセラ・カンドレリ、ワイセラ・マイナー、ワイセラ・パラメセンテロイデスまたは／およびワイセラ・タイランデンシスであることを特徴とする上記（３）に記載の家畜用抗菌剤。
（６）該ペディオコッカス属乳酸菌が、ペディオコッカス・ペントサセウスであることを特徴とする前記（３）に記載の家畜用抗菌剤。
（７）該ロイコノストック属乳酸菌が、ロイコノストック・シトレウム、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、ロイコノストック・アルジェンティナム、ロイコノストック・カルノサムまたは／およびロイコノストック・メセンテロイデスである前記（３）に記載の家畜用抗菌剤。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の家畜用抗菌剤を含有することを特徴とする家畜用飼料組成物。
（９）上記（８）に記載の家畜用飼料組成物を家畜に投与することを特徴とする家畜の胃及び／または腸内でのヒトの食中毒細菌の増殖防止方法。
（１０）該食中毒細菌が、サルモネラ属細菌、キャンピロバクター属細菌、リステリア属細菌、腸管出血性大腸菌および／またはウェルシュ属細菌であることを特徴とする上記（９）に記載の食中毒細菌の増殖防止方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の家畜用抗菌剤の投与により、家畜の胃及び／又は腸（消化管）内でのヒトの食中毒細菌の増殖が抑えられる。また、本発明の抗菌剤あるいは本発明の抗菌剤を含有する飼料用組成物を投与した家畜由来の食肉や卵を提供することにより、ヒトの食中毒発生を防止することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明の家畜用抗菌剤は、有効成分として乳酸菌由来のプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含むことを特徴とする家畜用抗菌剤である。
【００１１】
また、本発明における家畜とは、豚などの狭義の家畜（家畜動物）及び鶏、ウズラ、ほろほろ鳥、アヒル、マガモ、七面鳥、烏骨鶏などの家禽を含む。
【００１２】
一般にバクテリオシンとは、タンパク質性の抗菌性物質であるが（Klaenhammer, T. R., Biochemie 60(3): 337-349 (1988)）、本発明のプロテアーゼ耐性バクテリオシンとは、従来のナイシン等のバクテリオシンと異なり、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）により分解されないバクテリオシンを意味し、本発明においては、家畜の胃や腸内に存在する消化酵素の代表例であるプロテアーゼによって分解を受けないバクテリオシンを意味する。このようなプロテアーゼとしては、例えば、ペプシン（EC3.4.23.1, EC3.4.23.2, EC34.4.23.3）、トリプシン（EC3.4.21.4）等が挙げられる。
【００１３】
本発明における乳酸菌由来のプロテアーゼ耐性バクテリオシンは、消化酵素由来のプロテアーゼ以外にも、醸造発酵の際に用いられるアスペルギウス属由来であるプロテアーゼや食品加工分野に用いられる食肉由来プロテアーゼにも耐性を有し、分解されないものもある。そのようなプロテアーゼとしては、例えば、醸造発酵の際に用いられるアスペルギウス属由来のプロテアーゼである天野エンザイム（株）製「ウマミザイムＧ」や食品加工分野に用いられる食肉由来のプロテアーゼであるカセプシン（cathepsin）を挙げることができる。
【００１４】
本発明のプロテアーゼ耐性バクテリオシンは、その生産菌が乳酸菌であり、安全性が高い。このプロテアーゼ耐性バクテリオシンは、家畜の胃や腸に存在し、ヒトに対して食中毒細菌として機能する微生物に対して静菌作用や、殺菌作用を有する。その為、このプロテアーゼ耐性バクテリオシン又はそのバクテリオシンを含む乳酸菌の培養液若しくは培養上清液をそのまままたはこれらを配合した飼料用組成物として投与してもプロテアーゼによる分解を受けることがなく、そのまま残存するので、胃や腸に存在するヒトの食中毒細菌の増殖を抑えることが出来、食肉加工工程で家畜が処分されたときに腸から肉に食中毒細菌が転移することを防ぐことが出来る。更に、このバクテリオシンは、乳酸菌に由来しており、従来の化学合成されたもの等と比べ、大量に摂取しても安全性の上で心配がなく、家畜の健康面から好ましいものである。
【００１５】
本発明における食中毒細菌とは、家畜の胃や腸に常在しており、食肉や卵を介してヒトに対して食中毒作用を引き起こす細菌を意味し、具体的には、サルモネラ属細菌、キャンピロバクター属細菌、リステリア属細菌、腸管出血性大腸菌、ウェルシュ属細菌、エルシニア属細菌（Yersinia enterocolitica）、緑濃菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブトウ球菌（Staphylococcus aureus）、クロストリジウム属細菌などが該当し、特にサルモネラ属細菌およびキャンピロバクター属細菌が該当する。
【００１６】
サルモネラ属細菌は、豚等の家畜動物やニワトリ等の家禽の腸に常在し、家畜処理工程で、食肉や卵に付着し、付着した食肉や卵を加熱不十分な状態で食べてしまう場合、ヒトに激しい胃腸炎、悪心、嘔吐などを引き起こすヒトの食中毒細菌である。キャンピロバクター属細菌は、ニワトリ等の鳥類の腸に常在し、食肉処理の際に鶏肉が汚染され、下痢、腹痛、発熱、悪心、嘔吐などを引き起こすヒトの食中毒細菌である。
【００１７】
このプロテアーゼ耐性バクテリオシンは、以下に例示する乳酸菌を培養することにより効率よく製造することができる。
【００１８】
本発明で使用されるプロテアーゼ耐性を有するバクテリオシンを生産する乳酸菌は発酵食品等から分離された乳酸菌である。勿論、発酵食品等以外からでも、後述するスクリーニング法を用いて抗菌活性のある乳酸菌をスクリーニングし、使用してもかまわない。即ち、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌であれば何でも使用でき、分離源には特にこだわらない。
【００１９】
本発明に用いられる乳酸菌は、ラクトバシラス属、ワイセラ属、ペディオコッカス属またはロイコノストック属に属する乳酸菌が好適であり、特に、ラクトバシラス属に属する乳酸菌のなかでは、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・サリバリウスおよびラクトバシラス・ペントサスを、ワイセラ属に属する乳酸菌のなかでは、ワイセラ・エスピー FERM P-19577、ワイセラ・シバリア、ワイセラ・コンフューサ、ワイセラ・ヘレニカ、ワイセラ・カンドレリ、ワイセラ・マイナー、ワイセラ・バラメセンテロイデスおよびワイセラ・タイランデンシスを、ペディオコッカス属に属する乳酸菌のなかでは、ペディオコッカス・ペントサセウスを、そしてロイコノストック属に属する乳酸菌のなかでは、ロイコノストック・シトレウム、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス、ロイコノストック・アルジェンティナム、ロイコノストック・カルノサムおよびロイコノストック・メセンテロイデスを好適なものとして挙げることができる。
【００２０】
これらの種に属する乳酸菌の中でも、ラクトバシラス・プランタラム JCM1149株、ラクトバシラス・サリバリウス JCM1231株、ラクトバシラス・ペントサス JCM1558、ペディオコッカス・ペントサセウス JCM5885株およびJCM5890株、ワィセラ・エスピー FERM P19577、ワイセラ・シバリア JCM12495、ワイセラ・コンフューサ JCM1093、ワイセラ・ヘレニカ JCM10103、ワイセラ・カンドレリ JCM5817、ワイセラ・マイナー JCM1168、ワイセラ・パラメセンテロイデス JCM9890、ワイセラ・タイランデンシス JCM10694、ロイコノストック・シトレウム JCM9696、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス JCM11945、ロイコノストック・アルジェンティナム JCM11052、ロイコノストック・カルノサム JCM9695、ロイコノストック・メセンテロイデス JCM6124などが本発明の乳酸菌として特に好適である。ここに、JCMの寄託番号が記載されている菌株は、日本国埼玉県和光市広沢２−１（独立行政法人）理化学研究所「微生物系統保存施設」に保管されている。また、ワィセラ・エスピーFERM P19577は、平成１５年１０月３１日付で  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（独立行政法人）産業技術総合研究所「特許生物寄託センター」に受託番号FERM P-19577として寄託されている。
【００２１】
所与の乳酸菌が本発明のプロテアーゼに耐性であるバクテリオシン（以下、PRBと略称することがある）を産生するか否かは、例えば、以下の方法で確認出来る。すなわち、下記方法にて、検定菌の増殖阻止円を形成する乳酸菌培養物中にPRBが産生されていることが分る。
（１）乳酸菌従来の培養の常法（あるいは当該乳酸菌を分離したその培養方法）にて乳酸菌培養液を調製する。乳酸菌培養液はNaOHを用いてpH5.5-6.0に調整した後、12,000rpm×10minで遠心分離し、Disposable Syringe Filter Unit（ADVANTEC社製「Dismic-25cs」）でCellulose Acetate 0.45μmにてフィルター濾過したものをサンプルとする。抗菌活性が低い場合は、室温で減圧にて４倍に濃縮を行う。さらに必要ならば、１０倍まで濃縮を行う。
（２）検定菌としてListeria innocua ATCC33090T、Bacillus circulans JCM2504T、Bacillus coagulans JCM2257、Micrococcus luteus IFO12708、Bacillus subtilis JCM1465T、Bacillus subtilis IAM1381、Lactococcus lactis sub sp. Lactis ATCC19435、Enterococcus faecium JCM5804T、Enterococcus faecium JCM5803T、Pediococcus pentosaceus JCM5855、Lactobacillus plantarum ATCC14917TおよびLactobacillus sakei JCM1157Tを用いて、後述するspot-on-lawn methodあるいは生菌数測定にて抗菌活性を測定し、最も強く抗菌活性を示す検定菌を選定する。
（３）酵素にはアスペルギルス由来プロテアーゼ（天野エンザイム（株）製「ウマミザイムＧ」等）を用いる。
（４）（１）記載のサンプルに（３）記載の酵素を10〜100 Unit/mlを添加し、３０℃で１時間以上保持することにより反応させる。
（５）（２）の最も強く抗菌活性を示した検定菌を塗抹した、検定菌が増殖可能な培地、例えばMRS培地等に（４）の酵素処理したサンプルを0.01ml滴下し、検定菌の増殖最適温度（Listeria innocua、Bacillus coagulans、Enterococcus faeciumおよびPediococcus pentosaceusは３７℃、それ以外は３０℃）で２０〜２４時間培養後、検定菌の増殖阻止円を確認する。
【００２２】
本発明のプロテアーゼ耐性バクテリオシンを含むことを特徴とする家畜用抗菌剤は、PRB産生乳酸菌の培養液をそのまま含むものでもよく、また培養液を乾燥させた菌体、また菌体を除いた培養上清液でもよく、これから分離精製されたバクテリオシンでも構わないことはいうまでもない。あるいはこれらに、後記のように適宜の賦形剤などを使用して抗菌組成物の形態としたものでもよいことはもちろんである。要するに、乳酸菌由来のPRB活性を示すものであればよい。因みに、プロデアーゼ耐性バクテリオシン生産性乳酸菌によって産生したＰＲＢ（の活性）は生産菌の菌体内に存在し、また菌体外へも分泌される。
【００２３】
なお、乳酸菌培養液から生成したバクテリオシンを必要に応じて分離精製するには、この分野の常法に従い、ＰＲＢ活性を有する画分を追求して硫安沈殿、カラムクロマトグラフィー、エタノール沈殿等によることができる。また、本発明で用いる乳酸菌は、使用する菌株、及びPRB生成に合わせた培地成分を用いて培養することができ、培養液は適宜濃縮した状態で用いた方がより効率的に精製処理を進めることができる。
【００２４】
乳酸菌の培養は例えば以下のようなこの分野の通常の方法で行うことができる。
【００２５】
培地としては、炭素源として乳清、デンプン糖化液、食品用グルコース等が使用でき、窒素源として乳清タンパク濃縮物の加水分解産物、コーンペプチド、大豆ペプチド、業務用調味液原料、焼酎粕、食品用酵母エキス等が使用できる。その他、乳酸菌の生育、及び酵素生産に必要な各種の有機物や無機物またはこれを含有するもの、例えばリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩等の塩類や、ビタミン類、酵母エキス等を適時追加することも出来る。培養温度や培養時間は通常の乳酸菌の培養方法、例えば静置培養で、３０〜３７℃における１２〜３６時間の培養とすることができる。
【００２６】
本発明において、家畜の胃や腸内でヒトの食中毒細菌に対する抗菌作用の効果は、トリプシン、ペプシン等を含む人工胃液処理液中での、検定菌や食中毒細菌の増殖が抑えられることによって確認出来るが、in vivoで実際に家禽動物に経口投与して、胃や腸内のヒトの食中毒細菌が減少するかどうかを確認してもよい。
【００２７】
本発明に係る家畜用抗菌剤は様々な形態で用いることが可能であり、例えば粉末、顆粒、錠剤等の各種の形態が挙げられ、必要に応じて賦形剤、増量剤等を適宜添加することもできる。この抗菌剤の有効成分として乳酸菌培養液などを使用する場合、同抗菌剤における本発明の乳酸菌の割合は、家畜の胃、腸内の食中毒細菌の量や、季節等を考慮して決定すればよく、プロテアーゼ耐性バクテリオシンの純度が高い場合、比活性が高い場合等には少量で、培地をそのまま投与する場合、比活性が低い場合等には、高い割合で投与する。
【００２８】
本発明の家畜用抗菌剤の投与時期は、本発明の抗菌効果の奏される限りは特に制限されるものではなく、何れの時期に投与しても良いが、家畜動物や家禽が食肉加工に出荷される前の給餌時に投与することが望ましい。特に飼料に配合することで効率よく投与することができる。
【００２９】
本発明の抗菌剤の投与量についても、本発明の抗菌効果の奏される限りは特に制限はないが、例えば、使用した乳酸菌や投与動物によって本発明の効果の奏されるように適宜調整する。
【００３０】
次に、本発明に係る家畜用飼料組成物は、上記本発明の家畜用抗菌剤が添加されている飼料組成物であり、該飼料組成物における家畜用抗菌剤の配合割合は、通常0.１〜１０重量％、好ましくは２〜１０重量％である。なお、家畜用飼料組成物については特に制限がなく、市販品をそのまま使用してもよく、あるいは必要に応じて市販品に対して適宜、トウモロコシ、小麦、大麦、大豆粕等の植物性原料の他、ミート・ボーン・ミール（ＭＢＭ）、チキンミール、魚粉等の動物性原料を加えてもよい。また、必要に応じて、炭水化物、脂肪、タンパク質、無機質（例えば、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リン等）、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｄ）等の各種栄養素を加えてもよい。
【実施例】
【００３１】
以下に参考例と実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらのものによって限定されるものではない。
【００３２】
＜参考例１＞
以下に本発明の重要な点であるプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産する乳酸菌のスクリーニング法について、発酵食品マトゥーン(Matsoon)からの分離を例にとって説明する。
【００３３】
発酵食品の１つである発酵乳マトゥーン(Matsoon)から分取した乳酸菌分離用の試料を乳酸菌の生育できる培地、例えばMRS培地(下記表１)やM17培地(下記表２)などの液体培地に０．５％添加し、３０〜３７℃で培養した（前培養）。培養日数は、１日、５日及び１０日とした。培養終了後、０．５％の炭酸カルシウムを含む前述の寒天培地（Agar 1.2%）に塗抹培養し、生じた乳酸菌のコロニーを採取した。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
【表２】
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【００３６】
採取した乳酸菌は、前述の液体培地及び培養条件で同様に培養した（本培養）。次に、予めフィルター濾過したアスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼである「ウマミザイムＧ」（天野エンザイム（株）製）を添加したMRS寒天培地プレートに、これらの乳酸菌を植菌し３０℃で２４時間培養した。次いで、このプレートに検定菌を混釈したLactobacilli AOAC培地（下記表３）を重層し、そのプレートを３０℃で２４時間培養し、検定菌の生育阻止円が形成させた。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
尚、プロテアーゼを添加する方法としては、寒天培地に混釈する上記方法以外の、次に挙げる方法を用いても構わない。すなわち、例えば、１）検定菌とともにプロテアーゼを混釈する方法；２）寒天培地にプロテアーゼを塗布する方法；３）乳酸菌コロニーを培養する際に、プロテアーゼを添加する方法（この際に、プロテアーゼは、培養開始時や培養途中さらには培養終了時に添加してもよい）；および４）乳酸菌コロニーを培養した後、培養液中の菌体を除菌もしくは死滅させた後プロテアーゼを添加したサンプルの適量を、検定菌を混釈したプレートに滴下し、阻止円の形成を確認する方法；によることができる。繰り返し述べるが、上記１）から４）方法に限定されるものではない。また、プロテアーゼも「ウマミザイムＧ」に限定されるものではない。
【００３９】
次に、抗菌スペクトル解析によるＰＲＢ活性の評価を行なった。後述する抗菌活性プレート上に、抗菌活性のみられた乳酸菌の培養液上清を順次希釈してスポットするspot-on-lawn methodを用いて抗菌スペクトルを調べた。
【００４０】
まず、抗菌活性サンプルを調製した。前述の方法で取得した抗菌活性を有する菌株の培養液を１０，０００rpmで１０分間遠心分離し、培養上清を得、さらに上清液をフィルター濾過し、無菌サンプルとした。本サンプルを２倍ずつ希釈し、段階的に２１１の希釈液を作成した。また、活性が低い場合は必要に応じて、２倍ずつ減圧濃縮し、段階的に２−３希釈液を作成した。
【００４１】
次に、抗菌活性プレートに混釈する検定菌の培養を行う。下記表４に記載した検定菌をTSBYE培地(下記表５)もしくはＴＳＢ培地（下記表６）またはMRS培地にて培養した。Bacillus属及びMicrococcus属は振盪培養を行ったが、それ以外は静置にて培養した。また、Bacillus coagulans, Listeria, PediococcusおよびEnterococcusは３７℃で、それ以外は３０℃で培養した。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
【表６】
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【００４５】
更に、抗菌活性プレートの作成を行なった。即ち、MRS寒天培地(agar 1.2%)１０ｍｌ及びLactobacilli AOAC寒天培地(agar 1.2%)５ｍｌを、それぞれ別途に１２１℃で１５分加熱殺菌し、５５℃にて保温した。滅菌シャーレに上記殺菌したMRS寒天培地を撒き、１時間クリーンベンチ内に置いておいた。次に、５５℃で保温しておいたLactobacilli AOAC寒天培地に検定菌培養液５０μｌを添加して混釈し、MRSプレートに重層した。クリーンベンチ内でプレートの蓋を約１５分開けておいて表面を乾燥させた。
【００４６】
上記で作成した抗菌活性含有サンプルを１０μｌずつ滴下し、蓋をして１時間ほど置いて乾燥させ、プレートを各検定菌の培養温度にて２０時間培養し、生育阻止円の形成を調べた。なお、抗菌活性(AU/ml)は、以下のように定義した。すなわち、抗菌活性(AU/ml)=(阻止円を形成した最大の希釈率)×1000／10。
【００４７】
このように抗菌スペクトルを解析したサンプルは、プロテアーゼ耐性を有しており、かつ幅広い抗菌スペクトルを示すものであった。
【００４８】
上記の手法で選択した乳酸菌AJ110263株の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）塩基配列の相同性解析（Altschul, S. F., Madden, T. F., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang Z., Miller, W., and Lipman, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.）によりワイセラ・コンフューサ(Weissella confusa) ATCC 10881株と９８.２２%の相同性(下記表７)を示した。なお、相同性評価はATCCに寄託されている基準株(type culture)を用いた。
【００４９】
【表７】
2006169197.tif 000009
【００５０】
AJ110263株の基本特性（下記表８）が乳酸菌の一般性状に一致し、糖質の発酵性（下記表９）は、ワイセラ・コンフューサの発酵性に類似すると考えられた。しかしながら、L-アラビノースの発酵性が異なること及び１６ＳｒＤＮＡにおいて１００％のホモロジーを示さなかったことから、公知菌とは明らかに異なる新規な菌株と認め、本菌をワイセラ・エスピー(Weissella sp.)AJ１１０２６３株と命名した。本菌は、（独立法人）産業技術総合研究所「特許生物寄託センター」に受託されており、その寄託番号は前述のFERM P-19577である。
【００５１】
【表８】
2006169197.tif 000010
【００５２】
【表９】
2006169197.tif 000011
【００５３】
以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００５４】
＜実施例１＞
発酵乳マトゥーン(Matsoon)から分離した乳酸菌Weissella sp. AJ110263 (FERM P-19577)、ならびにタイプカルチャーから入手した乳酸菌Pediococcus pentosaceus JCM5885、Pediococcus pentosaceus JCM5890、Lactobacillus plantarum JCM1149およびLactobacillus salivarius JCM1231をMRS液体培地（前記表１）で前培養及び本培養を行った。培養温度はWeissella sp. は30℃、それ以外の菌株は37℃とした。前記アスペルギルス由来プロテアーゼ「ウマミザイムG」を0U/ml(不添加)、200U/ml及び400U/mlそれぞれ 添加したMRS寒天培地プレートに先の乳酸菌を植菌し24時間培養した。尚、培養は５００ｍｌの坂口フラスコにＭＲＳ培地１００ｍｌを張込み、前培養液１００μｌを植菌し、振盪数１００回／分にて培養した。
【００５５】
次いで、バクテリオシンを産生しないラクトバチラス・サケイ（Lactobacillus sakei）JCM1157株を検定菌として混釈したLactobacilli AOAC培地を重層した。これらプレートを３０℃で24時間培養した結果、検定菌の生育阻止円が形成された（下記表１０）。この結果から、いずれの株もプロテアーゼ耐性バクテリオシンを産生していることが分かった。
【００５６】
【表１０】
2006169197.tif 000012
【００５７】
＜実施例２＞
Lactococcus lactis NCDO497 (NisinA生産菌)およびLactococcus lactis  NCIMB702054 (NisinZ生産菌) をそれぞれMRS液体培地で３０℃にて培養を行った。実施例１と同様にラクトバチラス・サケイ（Lactobacillus sakei）JCM1157株を検定菌として抗菌評価を実施した。また、Nisin生産菌株を用いる代わりにICN Biomedical社製「NisinA1000 IU/ml液」１０μｌをMRS寒天培地プレート上にスポットし、上記抗菌評価を実施した（菌体不使用）。
【００５８】
プロテアーゼ非存在下では検定菌の生育阻止円が形成されたが、プロテアーゼ存在下ではプロテアーゼ濃度が高くなるほどNisinによる抗菌活性が低下した（下記表１１）。
【００５９】
【表１１】
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【００６０】
＜実施例３＞
Weissella sp. AJ110263（FERM P-19577）、Pediococcus pentosaceus JCM5885、Lactococcus lactis NCDO497(NisinA生産菌)及びLactobacillus sakei JCM1157株を、それぞれ、培養し、培養液を10,000rpmで１０分遠心分離し、培養上清を得た。「ウマミザイムＧ」200U/mlを培養上清に添加し24時間プロテアーゼ処理した後に、上清液をフィルター(ADVANTEC社製「DISMIC25CS」)でCellulose Acetate 0.45μmにて濾過し、無菌サンプルとした。spot-on-lawn methodを用いて抗菌スペクトルを調べた結果、Nisin生産菌培養液やバクテリオシンを生産しない乳酸菌Lactobacillus sakei JCM1157に比べ、Weissella sp. AJ110263（FERM P-19577）およびPediococcus pentosaceus JCM5885はプロテアーゼ処理しても抗菌活性が観られた（下記表１２）。これより、Weissella sp. AJ110263（FERM P-19577）、Pediococcus pentosaceus JCM5885はプロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることが分かった。
【００６１】
【表１２】
2006169197.tif 000014
【００６２】
＜実施例４＞
表１３に示したWeisella sp.AJ110263（FERM P-19577）、Pediococcus pentosaceus JCM5885、Lactobacillus plantarum JCM1149、Lactobacillus salivarius JCM1231、Leuconostoc citreum JCM9698、Leuconostoc pseudomesenteroides JCM9696, JCM11045、Lactococcus lactis  NCIMB702054 (NisinZ 生産菌)等各種乳酸菌の培養液を実施例３と同様に酵素にて処理した後、Bacillus subtilis IAM1381を検定菌とし、spot-on-lawn method にて抗菌活性を測定した。酵素は実施例３同様アスペルギルス・オリゼ由来のプロテアーゼである「ウマミザイムＧ」を使用した。また、バチルス・ズブチルス由来のα―アミラーゼ(和光純薬社製) を乳酸菌培養液に100  Unit/ml を添加し、３０℃で1時間以上保持することで反応させた後、同様にBacillus subtilis IAM1381を検定菌とし、spot-on-lawn method にて抗菌活性を測定し、α−アミラーゼによる抗菌活性への影響も調べた。
【００６３】
表１３に示したようにWeisella sp.AJ110263（FERM P-19577）、Weissella cibaria JCM12495、Weissella confuse JCM1093、Weissella hellenica JCM10103、Weissella kandleri JCM5817、Weissella minor JCM1168、Weissella paramesenteroides JCM9890、Weissella thailandensis JCM10694、Pediococcus pentosaceus JCM5885、Lactobacillus plantarum JCM1149、Lactobacillus salivarius JCM1231、Lactobacillus pentosus JCM1558、 Leuconostoc citreum JCM9698、Leuconostoc pseudomesenteroides JCM9696, JCM11045、Leuconostoc argentinum JCM11052、Leuconostoc carnosum JCM9695およびLeuconostoc mesenteroides JCM6124の培養液はプロテアーゼ処理をしても抗菌活性が観られたことから各株は、プロテアーゼ耐性バクテリオシンを生産していることが確認された。また、これらの培養液はα−アミラーゼ処理により、抗菌活性が低下することも確認された。尚、表１３の残存活性は、抗菌活性(AU/ml)＝阻止円を形成した最大の希釈率×1000/10×(酵素処理サンプルの阻止円径/コントロールの阻止円径)として算出した。
【００６４】
【表１３】
2006169197.tif 000015
【００６５】
＜実施例５：人工胃液・腸液処理後の抗菌活性評価＞
（ａ）  乳酸菌の培養
MRS培地を用いて、Lactococcus lactis NCIMB8780 （NisinA 生産株）、Lactococcus lactis NCIMB702054 （NisinZ 生産株）、Weissella sp. AJ110263 （PRB 生産株）、Lactobacillus salivarius JCM1231（PRB 生産株）およびLactobacillus plantarum ATCC14917（検定菌）を30℃で、そしてLactobacillus gasseriJCM1131(バクテリオシン非産生株)およびPediococcus pentosaceus JCM5885（PRB 生産株）を37℃でそれぞれ24時間静置培養した。
【００６６】
（ｂ）  人工胃液・腸液処理
乳酸菌培養液に0.2% NaClおよび0.2% pepsin（1:5,000）を加え pH2に調整後、４１℃で２時間プロテアーゼ処理した（人工胃液処理）。また、0.2% tripsin（1:5,000）を加え、pH6に調整後、４１℃で２時間プロテアーゼ処理した（人工腸液処理）。その際、pH調整剤には乳酸と苛性ソーダを使用した。
以上の消化酵素処理をして、次のサンプルを作成した。すなわち、MRSにて培養した乳酸菌の菌体を含む培養液（Broth A）、Broth Aを10,000rpmで10分遠心分離後、フィルター(ADVANTEC社製「DISMIC25CS」)でCellulose Acetate 0.45μmにて濾過した無菌上清液（sup. A）、消化酵素処理液（Broth B）、およびBroth Bの無菌上清液（sup. B）。
【００６７】
（ｃ）  抗菌活性テスト
検定菌には、乳酸の影響を受けない、Lactobacillus plantarum ATCC14917を用い、50μLを「GAM」寒天培地（日水製薬社製）プレートに塗りつけた。本プレート表面をよく乾燥した後、前項(ｂ）記載の調製サンプルを10μLづつspotし24時間30℃で培養後、阻止円の形成を確認した。結果を下記表１４に示す。表中の数字は、阻止円径の直径(mm)を示す。人工胃液・腸液処理した場合には、ナイシンの抗菌活性は失活するが、PRBは抗菌活性を維持できることを確認した。
【００６８】
【表１４】
2006169197.tif 000016
【００６９】
＜実施例６：サルモネラ増殖抑制テスト（生菌数評価）＞
（ａ）  サンプル調製
前実施例５の（ａ）および（ｂ）記載の方法で、乳酸菌の培養及び人工胃液・腸液処理を行い、無菌上清液サンプルを調製した。
【００７０】
（ｂ）  サルモネラ増殖抑制テスト（生菌数評価）
Trypticase Soybean Casein（BBL社製）を用いて予め培養しておいたSalmonella Enteritidis NBRC3313 株をTSBYE培地に105個/mlになるように懸濁し、乳酸菌の培養上清液を10%添加し、サルモネラの増殖抑制効果を評価した。不添加系及びバクテリオシン非生産菌培養上清液に比べ、PRB生産菌上清液は、顕著にサルモネラの増殖を抑制した。下記表１５参照。
【００７１】
【表１５】
2006169197.tif 000017
【００７２】
＜実施例７：飼料中のサルモネラ殺菌効果＞
（ａ）  乳酸菌の培養
Weissella sp.AJ110263 （PRB生産株）を、MRS培地にL-Cys 0.1%及びL-Met 0.1%を加えた培地を用い、30℃で24時間培養し、この培養液をPRB含有液として以下の試験に使用した。
【００７３】
（ｂ）  サルモネラ人工感染飼料の作成
Salmonella enteritidis (SE) KTE-61 株（リファンピシン耐性）を、Brain Heart Infusion培地（Difco社製）を用い、37℃で24時間培養し、この培養液300ml（生菌数10^9cfu/ml）を、市販配合飼料（コマーシャルブロイラー休薬用飼料「ブロエースF2」）6kgに添加しミキサーで混合してSE汚染飼料を調製した。
【００７４】
（ｃ）  抗菌剤の添加
前項（ｂ）で調製したサルモネラ人工感染飼料に、市販抗菌剤「バイオアッド（Bio-Add）」（蟻酸+フ゜ロヒ゜オン酸0.2％）0.2％添加区、PRB含有液2%添加区および抗菌剤不添加区（control）の計４区をそれぞれ調製した。
【００７５】
（ｄ）  抗菌性評価
経時的に各区の飼料をサンプリングしリン酸緩衝食塩水で希釈して、生菌数を測定した。生菌数は0.1mg/mlリファンピシン添加MLCB寒天培地（日水製薬社製）に希釈液を塗抹し37℃で24時間培養した。後掲図１に示すようにPRB含有乳酸菌液は、飼料中のサルモネラに対して、即効的・持続的・安定的かつ良好な殺菌効果が認められ、30時間以降、市販抗菌剤バイオアッドを上回る抗菌作用を維持した。
【００７６】
＜実施例８：カンピロバクター増殖抑制テスト（生菌数評価）＞
（ａ）  サンプル調製
実施例５の（ａ）記載の方法で、乳酸菌を培養し、フィルター濾過して無菌上清液を調製した。
【００７７】
（ｂ）  カンピロバクター増殖抑制テスト（生菌数評価）
予め培養しておいたCampylobacter jejuni 702株をBrucella培地に10^6個/mlとなるように懸濁し、乳酸菌の培養上清液を1%添加した。Campylobacterの生菌数は、CCDA培地を用いて評価した。不添加系（control）と比較し、下記表１６に示すように、PRB生産菌上清液は、顕著にCampylobacterの増殖を抑制した。
【００７８】
【表１６】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の家畜用抗菌剤、家畜用飼料組成物を投与することにより、家畜の胃及び/または腸内でのヒトの食中毒細菌の増殖を防止することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】飼料中のサルモネラに対する、種々の薬剤の殺菌効果における差異を示す（実施例７）。
【図１】
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