(57)【要約】【課題】微生物計測において、精密にかつ迅速に計測でき、かつ使いやすい微生物計測装置を提供することを目的とする。【解決手段】蛍光染色検体１０１を蛍光させる励起光照射手段１と、照射光により発生する蛍光と照射光の反射光分離する蛍光分離手段３と、倍率可変機構を有する可変結像手段４と、撮影手段５と、撮影された画像の光点の個数を数える光点計測手段７を備えことにより、視野面積を自由に拡大縮小できることで、微生物の迅速計測または精密計測の選択ができ、また、多くの蛍光試薬に対応できることで微生物と異物の区別をより正確にできる微生物計測装置が得られる。【選択図】図１
2006262776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光照射手段と、励起光により発生する蛍光と励起光成分を分離する蛍光分離手段と、倍率可変機構を有する可変結像手段と、可変結像手段により結像された像を画像化する撮影手段と、撮影された画像の光点の個数を数える光点計測手段を備えた微生物計測装置。
【請求項２】
可変結像手段をズームレンズとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項３】
可変結像手段を倍率の違う複数個のレンズとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項４】
励起光照射手段をＬＥＤとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項５】
励起光照射手段に用いる光源を複数色とした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項６】
蛍光分離手段を青い波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項７】
蛍光分離手段を青い波長の光のみを通過する分光フィルターとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項８】
蛍光分離手段を緑の波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項９】
蛍光分離手段を緑の波長の光のみを通過する分光フィルターとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項１０】
蛍光分離手段を赤い波長の光のみを通過する分光フィルターとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項１１】
請求項７乃至１０記載のいずれかに記載の蛍光分離手段を複数個搭載した請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項１２】
微生物計測手段に発光点の形状を判定手段する形状判定手段を備えた請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項１３】
撮影手段をモノクロＣＣＤとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項１４】
撮影手段をカラーＣＣＤとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項１５】
撮影手段を冷却ＣＣＤとした請求項１記載の微生物計測装置。
【請求項１６】
撮影手段をＣＭＯＳとした請求項１記載の微生物計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を蛍光染色し、励起光を照射し蛍光させ、その蛍光の個数を計測することによって微生物の個数を計測する微生物計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来この種の微生物計測装置としては、特許文献１に示されたものが知られている。
【０００３】
以下、この種の微生物計測装置について図２を参照しながら説明する。
【０００４】
微生物計測装置１１０としては、微生物を蛍光染色検体１０１に励起光照射手段１０２より励起光を励起光分光フィルター１０５、光の方向を変えるプリズム１０４を介して蛍光染色検体１０１に照射し、蛍光染色検体１０１上の染色された微生物が前記励起光により発生する蛍光をプリズム１０４および、蛍光のみを分離する蛍光分光フィルター１０６を介して撮影手段１０７内に伝達し、撮影手段１０７内で蛍光画像を撮影し、その撮影画像を通信ケーブル１０８を介して微生物計測手段１０９におくり微生物の個数を計測する微生物計測装置が記載されている。
【特許文献１】特開２００１−３４００７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような従来の微生物検出方法では、計測面積が固定されているため、蛍光染色検体上の全面積の微生物を計測するためには、規定回数の撮影が必要で、撮影回数計測処理は何回もあることで、迅速に微生物の存在を知ることができないとと、蛍光を発する物体の蛍光分離できないため、微生物の蛍光と、異物の自家蛍光を区別することが難しいという課題があり、計測の迅速性、微生物と異物の分離による計測精度を向上させることが要求されている。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、迅速な計測および精密な計測が選択可能で、微生物と異物の分離を精度よく行い計測精度の高い微生物計測装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の微生物計測装置は、上記目的を達成するために、励起光照射手段と、励起光により発生する蛍光と励起光成分を分離する蛍光分離手段と、倍率可変機構を有する可変結像手段と、撮影手段と、撮影された画像の光点の個数を数える光点計測手段とを備えた構成としたものである。
【０００８】
この手段により、低倍率時には、計測面積を上げることで短時間計測ができ、高倍率時には拡大撮影することで精密計測ができる。
【０００９】
また、他の手段は、可変結像手段をズームレンズとする構成としたものである。
【００１０】
これにより、連続的に倍率を変化させることが可能なため、検体中の対象微生物の大きさに最適な倍率の調整ができる。
【００１１】
また、他の手段は、可変結像手段を倍率の違う複数個のレンズを備えた構成としたものである。
【００１２】
これにより、視野面積の可変範囲の広くできる。
【００１３】
また、他の手段は、光照射手段をＬＥＤとする構成としたものである。
【００１４】
これにより、小型で安価にできる。
【００１５】
また、他の手段は、光照射手段に用いる光源を複数色とする構成としたものである。
【００１６】
これにより、励起波長の異なる複数の蛍光試薬で多重染色した検体や、励起波長の異なる蛍光試薬で染色した検体を蛍光させることができる。
【００１７】
また、他の手段は、蛍光分離手段を青い波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとする構成としたものである。
【００１８】
これにより、検体から発生する青色の蛍光より長い波長の発光点を計測できる。
【００１９】
また、他の手段は、蛍光分離手段を青い波長の光のみを通過する分光フィルターとする構成としたものである。
【００２０】
これにより、検体から発生する青色の蛍光波長の発光点を計測できる。
【００２１】
また、他の手段は、蛍光分離手段を緑の波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとする構成としたものである。
【００２２】
これにより、検体から発生する緑色の蛍光より長い波長の発光点を計測できる。
【００２３】
また、他の手段は、蛍光分離手段を緑の波長の光のみを通過する分光フィルターとする構成としたものである。
【００２４】
これにより、緑色の蛍光波長の発光点を計測できる。
【００２５】
また、他の手段は、蛍光分離手段を赤い波長の光のみを通過する分光フィルターとする構成としたものである。
【００２６】
これにより、赤色の蛍光波長の発光点を計測できる。
【００２７】
また、他の手段は、請求項７乃至１０記載のいずれかに記載の蛍光分離手段を複数個搭載する構成としたものである。
【００２８】
これにより、検体から発生する蛍光波長を染色した蛍光試薬特有の蛍光波長とその他の蛍光波長とを分光フィルターを切り替えることで分離して撮影できる。
【００２９】
また、他の手段は、微生物計測手段に発光点の形状を認識する形状認識手段する形状判定手段を備えた構成としたものである。
【００３０】
これにより、検体中の微生物の発光と異物の発光を分離検出できるようになる。
【００３１】
また、他の手段は、撮影手段をモノクロＣＣＤとする構成としたものである。
【００３２】
これにより、撮影画像をデジタル処理ができる。
【００３３】
また、他の手段は、撮影手段をカラーＣＣＤとする構成としたものである。
【００３４】
これにより、撮影画像をデジタル処理ができ、発光点の色をデータとして処理できるため蛍光分離手段としての分光フィルターを励起光をカットするための分光フィルターのみに削減できる。
【００３５】
また、他の手段は、撮影手段を冷却ＣＣＤとする構成としたものである。
【００３６】
これにより、画像撮影においてノイズが少ない長時間露光撮影ができる。
【００３７】
また、他の手段は、撮影手段をＣＭＯＳとする構成としたものである。
【００３８】
これにより、画像撮影において低消費電力かつ、高速画像撮影ができる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、視野面積を可変できるといことで、迅速もしくは精密に微生物を計測できるという効果と、複数の励起光複数の蛍光分離手段を備えたことで多種の蛍光波長を分離検出でき、微生物の蛍光と異物の自家蛍光を区別でき、結果として微生物と異物を分離できるという効果と、蛍光発光点の形状を判定できることで微生物と異物の区別がより正確にできるという効果のある微生物計測装置を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の請求項１記載の発明は、励起光照射手段と、励起光により発生する蛍光と照射光波長成分を分離する蛍光分離手段と、倍率可変機構を有する可変結像手段と、撮影手段と、撮影された画像の光点の個数を数える光点計測手段を備えた微生物計測装置としたことで撮影面積を可変して微生物の計測ができるという作用を有する。
【００４１】
本発明の請求項２記載の発明は、請求項１の発明の可変結像手段をズームレンズとしたことで連続的に撮影面積を変えることができるという作用を有する。
【００４２】
本発明の請求項３記載の発明は、請求項１の発明の可変結増手段を倍率の違う複数個のレンズとしたことで、撮影面積の可変範囲が広くできるという作用を有する。
【００４３】
本発明の請求項４記載の発明は、請求項１の発明の光照射手段をＬＥＤとしたことで安価な構成とできるという作用を有する。
【００４４】
本発明の請求項５記載の発明は、請求項１の発明の光照射手段を複数色としたことで、より多くの蛍光試薬の蛍光を発生させることができるという作用を有する。
【００４５】
本発明の請求項６記載の発明は、請求項１記載の蛍光分離手段を青い波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとしたことで、複数の色の蛍光を撮影できるという作用を有する。
【００４６】
本発明の請求項７記載の発明は、請求項１記載の発明の蛍光分離手段を青い波長の光のみを通過する分光フィルターとしたことで、青い蛍光のみを撮影できるという作用を有する。
【００４７】
本発明の請求項８記載の発明は、請求項１記載の発明の蛍光分離手段を緑の波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとしたことで、複数の色の蛍光を撮影できるという作用を有する。
【００４８】
本発明の請求項９記載の発明は、請求項１記載の発明の蛍光分離手段を緑の波長の光のみを通過する分光フィルターとしたことで、緑色の蛍光のみを撮影できるという作用を有する。
【００４９】
本発明の請求項１０記載の発明は、請求項１記載の発明の蛍光分離手段を赤い波長の光のみを通過する分光フィルターとしたことで、赤色の蛍光のみを撮影できるという作用を有する。
【００５０】
本発明の請求項１１記載の発明は、請求項１記載の発明に請求項７乃至１０記載のいずれかに記載の蛍光分離手段を複数個搭載したことで、検体から発光する蛍光を複数色に分離できるという作用を有する。
【００５１】
本発明の請求項１２記載の発明は、請求項１記載の発明の微生物計測手段に発光点の形状を認識する形状認識手段を備えたことで、画像上で発光形状による発光点の分類ができるという作用を有する。
【００５２】
本発明の請求項１３記載の発明は、撮影手段をモノクロＣＣＤとしたことで、画像をデジタル化できるという作用を有する。
【００５３】
本発明の請求項１４記載の発明は、撮影手段をカラーＣＣＤとしたことで、画像をデジタル化でき、発光点の色情報を直接えられるという作用を有する。
【００５４】
本発明の請求項１５記載の発明は、撮影手段を冷却ＣＣＤとしたことで、ＣＣＤに発生する画像上のノイズ源となる暗電流をおさえられるという作用を有する。
【００５５】
本発明の請求項１６記載の発明は、撮影手段をＣＭＯＳとしたことで、低消費電力で、ＣＣＤよりも高速画像撮影が可能になるという作用を有する。
【００５６】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００５７】
（実施の形態１）
図１は、実施の形態１の構成図の一例である。図１に示すように、微生物計測装置８は、蛍光染色検体１０１中の微生物を蛍光させるための励起光を照射する励起光照射手段１と、前記励起光の蛍光発光に有効な波長のみを分離する励起光分光フィルター２と、前記励起光により蛍光染色検体１０１中の微生物の発する蛍光と検体から反射してくる励起光成分を分離する蛍光分離手段３と、蛍光染色検体１０１の１計測視野および微生物の観察倍率を可変し撮影手段５上に結像する可変倍率結像手段４と、前記微生物から発生する蛍光を可変倍率結増手段４を介して結像された像を画像化する撮影手段５と、撮影手段５で撮影された電子データを伝送する通信ケーブル１０８とケーブルで伝送されてきたデータを画像化表示、前記データをもとに１計測視野内の前記微生物の蛍光発光箇所の個数を計測し、視野が複数ある場合にはそれらを積算し、蛍光染色検体１０１内の微生物の個数を表示する微生物計測手段６と、計測視野を移動させるためのＸＹステージ７で構成される。
【００５８】
ここでいう微生物とは大腸菌、黄色ブドウ球菌などをさす。
【００５９】
上記構成において、蛍光染色検体１０１上の観察視野を可変できるようにしたことと、蛍光染色検体１０１上の微生物を倍率可変で観察できるようにしたことで、視野面積を小さくし微生物の形状を拡大して計測した場合には、微生物か異物かが形状で判断しやすくなり、精密で正確な計測ができ、前記視野面積大きくしだ場合には、撮影回数を減らすことができ、迅速な計測が可能となる。
【００６０】
ここで、可変倍率決像手段４をズームレンズとすることで、連続的に観察視野および、微生物の観察倍率をあげ、最適観察視野、最適観察倍率で蛍光染色検体１０１を観察することが可能になる。
【００６１】
また、可変倍率決像手段４を倍率の違う複数個の対物レンズとすることで、前記ズームレンズでは、対応できない倍率を実現できるようになり、観察視野面積の可変範囲の広い計測が可能となる。
【００６２】
また、励起光照射手段１をＬＥＤとすることで、励起光照射手段を安価で小型なものにでき、微生物計測装置内部に組み込むことも可能となる。
【００６３】
また、複数色の励起光照射手段１取り付けることにより、励起波長の異なる複数の蛍光試薬で多重染色した検体や、励起波長の異なる蛍光試薬で染色した検体を同じ装置を用いて蛍光させたことで多様な形態での染色に対応できる応用範囲の広い微生物の計測が可能となる。
【００６４】
ここで、使用する蛍光染色試薬の一例として、励起光が紫外線で青色の蛍光を発する４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドールや、励起光が青色光で緑色の蛍光を発するＳＹＴＯ２４、励起光が緑色で赤色の蛍光を発するプロピディウムイオダイドなどがある。
【００６５】
また、蛍光分離手段３を青い波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとする構成とすることで、検体から発生する青色の蛍光より長い波長の発光点を計測できるようになり、励起光が同じで、蛍光発光色が違う複数種類の試薬による多重染色時の蛍光を同時に撮影計測、それぞれ単独に染色した場合の蛍光を一つの分光フィルターで撮影計測することができ、多種の蛍光試薬に対応できる微生物計測装置が提供できる。
【００６６】
ここで、使用する蛍光染色試薬の一例として、青色の蛍光を発する４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドールまたは、蛍光染色試薬の代わりとして、蛍光性タンパク質である緑色の蛍光を発するＧＦＰなどがある。この場合の励起光は、青よりも波長の短い光である必要がある。
【００６７】
また、蛍光分離手段３を青い波長の光のみを通過する分光フィルターとすることで、検体から発生する青い光の蛍光のみを撮影計測することができ、挟雑物等の自家蛍光の分離をしやすい微生物計測装置の提供が可能となる。
【００６８】
ここで使用する蛍光試薬の一例としては、青色の蛍光を発する４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドールなどがある。この場合の励起光は、青よりも波長の短い光である必要がある。
【００６９】
また、蛍光分離手段３を緑の波長の光より長い波長の光を通過する分光フィルターとすることで、緑色より長い波長の蛍光を観察、撮影することができ、検体から発生する緑色の蛍光より長い波長の発光点を計測できるようになり、励起光が同じで、蛍光発光色が違う複数種類の試薬の蛍光を同時に観察、撮影することができ、多種の蛍光試薬に対応できる微生物計測装置が提供できる。
【００７０】
ここで使用する蛍光試薬の一例としては、緑の蛍光を発するＳＹＴＯ２４や、赤の蛍光を発するＦｕｒａ  Ｒｅｄなどがある。この場合の励起光は、緑よりも波長の短い光である必要がある。
【００７１】
また、蛍光分離手段３を緑の波長の光のみを通過する分光フィルターとする構成とすることで、検体から発生する緑の光の蛍光のみを観察、撮影することができ、挟雑物等の自家蛍光の分離をしやすい微生物計測装置の提供が可能となる。
【００７２】
ここで使用する試薬は、ＳＹＴＯ２４、ＦＩＴＣなどがある。この場合の励起光は、緑よりも波長の短い光である必要がある。
【００７３】
また、蛍光分離手段を赤い波長の光のみを通過する分光フィルターとする構成とすることで検体から発生する緑の光の蛍光のみを撮影計測することができ、挟雑物等の自家蛍光の分離をしやすい微生物計測装置の提供が可能となる。
【００７４】
ここで使用する蛍光試薬は、緑の励起光により赤い蛍光を発するプロピディウムイオダイド、赤い励起光によりさらに波長の長い赤い励起光を発するＳＹＴＯ１７などがある。前記プロピディウムイオダイドを使う場合の励起光は、赤よりも波長の短い光である必要がある。前記ＳＹＴＯ１７を使う場合は、励起光が赤色で蛍光も赤色であるため、この場合蛍光分利用分光フィルターは、励起波長が通過しない波長に設定する必要がある。
【００７５】
また、蛍光分離手段３としての分光フィルターを通過波長の違うものを複数個搭載することで、各種蛍光試薬に対応可能となり、微生物と異物の蛍光色を使った区別をより正確にできる微生物計測装置が提供可能となる。
【００７６】
ここで使用する蛍光試薬の一例としては、前記４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドールと前記プロピディウムイオダイドがあり、これらを混合し検体を２重染色し、前記４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドールは全微生物を蛍光させることができるため、青い光のみを通過する分光フィルターで前記４’，６―ジアミジノ―２―フェニルインドールで蛍光した全微生物を計測し、前記プロピディウムイオダイドは、死んだ微生物のみを蛍光させることができるため赤い光を通過させることができる分光フィルターにて前記プロピディウムイオダイドで蛍光した死んだ微生物を計測し、全微生物から死んだ微生物を差し引くことで、生きた微生物を計測することも可能とできる。
【００７７】
また、本発明の微生物計測装置８に撮影された蛍光画像上の光点の集合体の形状から菌の蛍光か異物の蛍光かを判定する形状認識手段を備えた構成とすることで、微生物と異物の区別がより正確にできることとなる。
【００７８】
微生物と異物の区別の例としては、微生物の光点の集合体は長円か円で、異物の光点集合体は、角張った形状といったものあげられる。
【００７９】
また、撮影手段をモノクロＣＣＤとすることで、感度のよい画像を撮影できかつ、画像をデジタル処理できる微生物計測装置を提供できる。
【００８０】
また、撮影手段を、カラーＣＣＤとすることで、撮影した画像を直接蛍光色による解析が可能となり蛍光分離手段３に使用する分光フィルターの種類を削減できる。
【００８１】
また、撮影手段を冷却ＣＣＤとすることで、長時間露光時にノイズの少ない画像を得ることができ微生物計測の精度アップが可能となる。
【００８２】
また、撮影手段をＣＭＯＳとすることで、低消費電力かつ高速画像転送が可能となり、微生物計測装置８の低消費電力化、計測の迅速化が可能となる。
【００８３】
ここでいう検体の一例としては、河川水や、ミネラルウォーターなどがあげられる。
【００８４】
また、前記検体には、微生物が含まれる場合と微生物が含まれない場合両方あり、微生物が含まれない場合は、微生物が存在しないという判定になる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の微生物計測装置は、検体に蛍光染色を行い、微生物の蛍光発光を用いて微生物の個数を計測する場合において、検体の撮影視野を自由に調整できるようにしたことで、迅速な計測または、精密な計測の選択ができ、かつ、微生物と異物をより正確に区別できる微生物計測装置として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明の実施の形態１の微生物計測装置の一例の構成図
【図２】従来の微生物計測装置の構成図
【符号の説明】
【００８７】
１  励起光照射手段
２  励起光分光フィルター
３  蛍光分離手段
４  可変結増手段
５  撮影手段
６  微生物計測手段
７  ＸＹステージ
８  微生物計測装置
１０１  蛍光染色検体
１０２  励起光照射手段
１０３  対物レンズ
１０４  プリズム
１０５  励起光分光フィルター
１０６  蛍光分光フィルター
１０７  撮影手段
１０８  通信ケーブル
１０９  微生物計測手段
１１０  微生物計測装置
【図１】
2006262776.tif 000003
【図２】
2006262776.tif 000004