(57)【要約】【課題】本発明の課題はＵＧＴ１の核酸配列のプロモーター領域及びその上流のエンハンサー領域の変異を組み合わせて検出することによるＵＧＴ１核酸配列の検査方法を提供するとともに、本検査方法を用いて薬剤代謝の判定、予測又は検査方法、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法を提供することである。【解決手段】ＵＧＴ１の核酸配列のエンハンサー領域とプロモーター領域の変異を組み合わせて調べることにより、ＵＧＴ１活性の予測が可能であること、さらにこの2つの領域の複合変異が薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症に深く関与していることから、エンハンサー領域の変異、T-3263G変異とプロモーター領域のTATA  boxのTAリピート数の増減を検出する。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１）の核酸配列のうち、配列番号１で表したエンハンサー領域に含まれる変異を検出する工程及び配列番号2で表したプロモーター領域のＴＡＴＡｂｏｘに含まれるTAリピート数の増加または減少の変異を検出する工程を組み合わせてなることを特徴とするＵＧＴ１核酸配列の検査方法。
【請求項２】
ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１の核酸配列のうち、配列番号１で表したエンハンサー領域に含まれる変異を検出する工程及び配列番号2で表したプロモーター領域のＴＡＴＡｂｏｘに含まれるTAリピート数の増加または減少の変異を検出する工程を組み合わせてなることを特徴とするＵＧＴ１核酸配列の検査による薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法。
【請求項３】
ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１）の核酸配列のうち、配列番号１で表したエンハンサー領域に含まれる変異を検出する工程が配列番号３で表した配列の9番目のｔからｇへの変異を検出する工程である請求項1または２に記載の検査方法。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブであって配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ及び該オリゴヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
請求項４に記載のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列の末端が、官能基を介して不溶性支持体に結合して固定化されている核酸チップ、核酸アレイまたは核酸プレートである検出装置。
【請求項６】
請求項５に記載の装置を用いて薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症を判定、予測または検査する方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１に記載の方法に用い、または請求項５または６に記載の装置を組み込んだ検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床検査の分野で用いられ、とりわけグルクロン酸抱合に関与する酵素の核酸配列検査の方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１）は種々の薬剤のグルクロン酸抱合を触媒する酵素である。その核酸配列変異により，間接（非抱合型）ビリルビンが上昇するＣｒｉｇｌｅｒ-Ｎａｊｊａｒ症候群I型，同II型およびＧｉｌｂｅｒｔ症候群のような体質性黄疸症が引き起こされることが知られている（非特許文献１）。Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群は、軽度から比較的重度な高ビリルビン血症を示し、その発症の頻度は３−１０％といわれている。プロモーター領域のTAリピートが通常の６個から7個への変異［（TA）7変異］及びエキソン１のG２１１Aの変異が多く認められることが知られている（非特許文献２及び非特許文献３））。Ｇｉｌｂｅｒｔ症候群では酵素活性が正常の３０％以下になることが知られている。
【０００３】
しかしながら、（TA）7変異だけで引き起こされるＵＧＴ１活性の低下度合いが臨床的に認められるＵＧＴ１活性の低下度合いと乖離することから、他の領域の変異も調べられている。その一つとして、エンハンサー領域の変異、配列番号３で示した配列の９番目のTからGへの変異（T-3263G）が見いだされている（非特許文献４）。非特許文献４によれば、T-3263G変異がGilbert症候群の軽度高ビリルビン血症のリスクファクターとしてあげられることが示されている。そしてエキソン１のG211A変異とT-3263G変異との複合変異またはG211A変異と（TA）7変異との複合変異により、ＵＧＴ１活性の有意な低下をきたすことが本症例の原因の一つであることが示されている。しかしながら、現在まで、エンハンサー領域とプロモーター領域の複合変異の関係については明らかでない。
【非特許文献１】日本内科学会雑誌（１９９７）８６、１３４−１３９
【非特許文献２】N.Eng.J.Med.（１９９５）３３３、１１７１−１１７５
【非特許文献３】Pediatrics（１９９９）103、１２２４−１２２７
【非特許文献４】Biochem..Biophys.Res.Commun．（２００２）２９２、492-497
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題はＵＧＴ１の核酸配列のプロモーター領域及びその上流のエンハンサー領域の変異を組み合わせて検出することによるＵＧＴ１核酸配列の検査方法を提供するとともに、本検査方法を用いて薬剤代謝の判定、予測又は検査方法、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはＵＧＴ１の核酸配列のエンハンサー領域とプロモーター領域の変異を組み合わせて調べることにより、ＵＧＴ１活性の予測が可能であること、さらにこの2つの領域の複合変異が薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症に深く関与していることを見出し、エンハンサー領域の変異、T-3263G変異とプロモーター領域のTATA  boxのTAリピート数の増減を検出することにより本発明を完成させた。
【０００６】
本発明は、以下の構成からなる。
１、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１）の核酸配列のうち、配列番号１で表したエンハンサー領域に含まれる変異を検出する工程及び配列番号2で表したプロモーター領域のＴＡＴＡｂｏｘに含まれるTAリピート数の増加または減少の変異を検出する工程を組み合わせてなることを特徴とするＵＧＴ１核酸配列の検査方法。
２、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１）の核酸配列のうち、配列番号１で表したエンハンサー領域に含まれる変異を検出する工程及び配列番号2で表したプロモーター領域のＴＡＴＡｂｏｘに含まれるTAリピート数の増加または減少の変異を検出する工程を組み合わせてなることを特徴とするＵＧＴ１核酸配列の検査による薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症の検査方法。
３、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ１）の核酸配列のうち、配列番号１で表したエンハンサー領域に含まれる変異を検出する工程が配列番号３で表した配列の9番目のｔがｇに変換されている変異を検出する工程である前記1または２に記載の検査方法。
４、前記１〜３に記載の検査方法に用いるオリゴヌクレオチドプローブであって配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ及び該オリゴヌクレオチドプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
５、前記４に記載のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列の末端が、官能基を介して不溶性支持体に結合して固定化されている核酸チップ、核酸アレイまたは核酸プレートである検出装置。
６、前記５に記載の装置を用いて薬剤代謝、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症を判定、予測または検査する方法。
７、前記１〜３のいずれか１に記載の方法に用い、または請求項５または６に記載の装置を組み込んだ検査キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、これまで説明ができなかった Gilbert の患者の核酸配列レベルでの原因が明確になり、さらに重篤な薬剤代謝不良、癌、黄疸、冠動脈疾患、骨粗鬆症 の検査、予測が可能になるといった格段の効果をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明をさらに詳細に説明するため、実施態様を例示して説明する。
（検査対象）
本発明により検査対象は薬物代謝能、黄疸、癌、冠動脈疾患又は骨粗鬆症があげられる。
薬物代謝はチトクロームP450による代謝経路に加えて、ＵＧＴ１によるグルクロン酸抱合による代謝経路も重要であり、本発明の検査方法を用いることによりグルクロン酸抱合されて代謝される薬物の薬効と副作用の予測が可能になる。本発明の方法によって検査されうる対象となる薬剤の例として、スピロノラクトン等の利尿剤、アセトアミノフェン、アスピリン、フロクタフェニン、インドメタシン等の鎮痛剤、ハロペリドール、カルピプラミン、ロラゼパム、アモキサン等の向精神薬、モルヒネ、プロポフォール、アヘン等の麻酔鎮痛剤、抗癌剤の塩酸ドキソルピジン、鎮咳剤のリン酸コデイン、喘息治療薬の硫酸オルシプレナリン、抗てんかん剤のフェニトイン、抗ヒスタミン剤のフマル酸ケトチフェン、降圧及び狭心症治療薬のカルベジロール、塩酸プロプラノロール等、脂質代謝改善剤のクロフィブラートアルミニウム、アルツハイマー治療薬の塩酸ドネペジル等が挙げられる。
【０００９】
ビリルビンの肝臓からの排出には、ＵＧＴ１が必須であり、黄疸の原因を検査するために本発明は有効である。本発明は、さらに乳がん、大腸がんをはじめとする種々の癌との関連を検査する方法としても有用であり、冠動脈疾患や骨粗鬆症の発症を理解、予測する上においても有用な検査方法である。
【００１０】
（検査試料）
検査しようとするＵＧＴ１A1核酸配列のゲノムDNAは肝臓、腎臓、白血球、毛髪等の臓器、組織等特に限定されることなく得ること可能である。白血球からゲノムDNAを得る方法の一つに市販のキット、例えばキアゲン社のQuiagen Blood DNAキットを用いることができる。得られたゲノムDNAを用いて、配列番号1に記載のエンハンサー領域を含むゲノムDNAを、例えば配列番号４及び５に示すプライマー対を用いてPCRにより増幅させる。TATA  boxを含むプロモーター領域（配列番号２）についても、例えば配列番号６及び７に示したプライマー対を用いてPCRにより増幅させる。ゲノムDNAを増幅する手段はPCRに限られたものではなく、ＬＡＭＰ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ等の適当な増幅工程により増幅させることも可能である。
【００１１】
（変異検出）
得られた増幅産物の変異を検出する方法は直接シーケンス法を初め、種々の公知の方法が適用され特に限定されるものではない。例えば制限酵素による断片化試料の電気泳動分析やＤＮＡ試料を溶液内ハイブリザイズさせるＦＩＳＨ法等により、検査することも可能である。その他サザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975等参照）、ジデオキシ塩基配列決定法、ＤＮＡの増幅手法を組合せた各種の検出法［例えばＰＣＲ−制限酵素断片長多型分析法（RFLP: Restriction fragment length polymorphism），ＰＣＲ−単鎖高次構造多型分析法（Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:
2766-2770, 1989等参照），ＰＣＲ−特異的配列オリゴヌクレオチド法（SSO: Specific sequence oligonucleotide），ＰＣＲ−ＳＳＯとドットハイブリダイゼーション法を用いる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド法（Nature, 324: 163-166, 1986等参照）］等を例示することができる。さらにオリゴヌクレオチドプローブを用いる核酸チップ又は核酸アレイによって簡便に検出することも可能である。
【００１２】
（プローブ）
本発明を実施するための一つのツールとしてエンハンサー領域の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを調製することが可能である。AGTTCAGTNTGAACAの配列中のNを含むオリゴヌクレオチドにストリンゲントな条件でハイブリダイズする相補的配列を有するプローブを合成して用いることができる。これらの配列中Ｎで表した塩基は全て、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれかに置換されたものである。これらのプローブ用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも８個、通常１０〜５０個、好ましくは１５〜３５個の範囲にあるのがよい。プローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００１３】
上記本発明で用いるプローブのオリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）等を用いて容易に合成することができ、得られるオリゴヌクレオチドは更に必要に応じて、市販の精製用カートリッジ等を用いて精製することもできる。合成オリゴヌクレオチドはスライドグラス表面に固定化した核酸アレイやマイクロタイタープレート固相へ応用する場合には５´末端または
３´末端をアミノ標識或いはビオチン標識しておくことも好適である。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。
【実施例１】
【００１４】
（検査対象）
プロモーター領域に（TA）７の変異を有するGilbert症候群の白人症例11例、日本人症例１３例、対照群として健常の白人10例及び日本人30例を検査対象とした。それぞれの
血清ビリルビンを測定した。対照群では白人及び日本人で基準値の１７．１マイクロモル濃度以下であったのに対して、Gilbert症候群での白人では２３．９−４６．１マイクロモル濃度、日本人では２７．３−１０４．３マイクロモル濃度であった。
【実施例２】
【００１５】
（PCR増幅）
各検査対象の血液からQiagen  Blood  DNAキットを用いて、白血球中のゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAから配列番号４及び５に示すプライマー対を用いてPCRにより増幅させ、配列番号1に記載のエンハンサー領域を含むゲノムDNAを増幅させた。TATA  boxを含むプロモーター領域（配列番号２）については、配列番号６及び７に示したプライマー対を用いてPCRにより増幅させた。各増幅させたPCR産物を直接シーケンス法で配列を確認し変異を検査した。
【実施例３】
【００１６】
（対立遺伝子解析）
実施例１に記載の検査対象について、実施例２に記載の方法で得た配列を基に対立遺伝子の解析を行った。対象とした全例でプロモーター領域及びエンハンサー領域以外の他のイントロン及びエキソン領域に変異は認められなかった。プロモーター領域及びエンハンサー領域での対立遺伝子解析結果を表１に示した。白人及び日本人ともにGilbert症候群では全例が（TA）7のホモ接合体の変異とT-3263Gのホモ接合体の変異の両方を有していた。一方対照群において、白人では10例中4例の（TA）7ヘテロ接合体の変異と10例６例のT-3263Gヘテロ接合体変異が認められ、2例のT-3263Gヘテロ接合体変異例を除き4例とも（TA）７ヘテロ接合体変異とT-3263Gヘテロ接合体変異の両方が認められた。日本人では３０例中10例の（TA）７ヘテロ接合体変異が観察され、白人同様にその全てがT-3263Gヘテロ接合体変異を有していた。この10例以外に（TA）７ヘテロ接合体変異を持たない2例のT-3263Gヘテロ接合体変異及び１例のT-3263Gホモ接合体変異が確認された。以上の結果T-3263Gと（TA）7の両方の変異を検査することにより、これまで説明ができなかった Gilbert の患者の遺伝子レベルでの原因を明確にできることがわかった。すなわち、Gilbert症候群の原因として、エキソン１領域のG71Rホモ接合体変異及びG７１Rへテロ接合体変異とT-3263Gヘテロ接合体の関与が指摘されていたが、これ以外のGilbert症候群の原因の一つに（TA）7のホモ接合体の変異とT-3263Gのホモ接合体の変異による、複合変異があることがわかった。したがって、体質性黄疸の検査に本発明の方法が格別有用であることが示された。また臨床的に高ビリルビン血症の症状を示さないために、正常と診断されている場合においても、血清ビリルビン値が正常上限付近を示す例や、薬剤投与により過敏な副作用を示す場合があることは既によく知られている。このようなケースを含めて、対照群で得られたT-3263Gホモ接合体変異又はヘテロ接合体変異を有する群で必ずしも（TA）７ヘテロ接合体ホモ接合体又はヘテロ接合体を有しないケースが存在することから、本発明のT-3263Gの変異と（TA）7変異の両方を組み合わせて検査することで、ＵＧＴ１分子の性状を理解、予測することが可能となった。
【００１７】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明は、新薬開発における、薬効や副作用の予測に利用されるほか、診断・治療のために必要な臨床検査の分野で用いられる診断薬キットとして製造される。
【配列表】
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