(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的で正確なＲＮＡの標識および遺伝子発現をモニターするために使用され得る、ＲＮＡ標識合物の提供。【解決手段】ＲＮＡを含むサンプルを提供する工程；ＲＮＡを構造：2006136322.tif 000066を有する標識試薬に連結する工程（Ｂは、ヘテロ環部分であり；Ｘは、フラグメントの３’ＯＨ基へ核酸標識化合物を連結可能にする官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲまたはハロゲンからなる群より選択され；Ｌは、リンカー基であり；Ｓｉｇは、標識されたＲＮＡを提供する検出可能な部分である）；プローブを有する核酸アレイを提供する工程；ハイブリダイズする工程；ハイブリダイゼーションの程度を決定する工程を含む、ＲＮＡの存在を検出する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とするＲＮＡの存在を検出する方法であって、以下の工程：
目的とする該ＲＮＡを有し得るか、または有し得ない、ＲＮＡを含むサンプルを提供する工程；
該ＲＮＡを下記の構造：
【化１】
2006136322.tif 000045
を有する標識試薬に連結する工程であって、ここでＢは、ヘテロ環部分であり；Ｘは、該フラグメントの３’ＯＨ基へ核酸標識化合物を連結可能にする官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲまたはハロゲンからなる群より選択され；Ｌは、リンカー基であり；Ｓｉｇは、標識されたＲＮＡを提供する検出可能な部分である、工程；
目的とする該ＲＮＡに指向されたプローブを有する核酸アレイを提供する工程；
標識されたＲＮＡを、該核酸アレイにハイブリダイズする工程；ならびに
目的とする該ＲＮＡの存在を決定する該プローブに対するハイブリダイゼーションの程度を、決定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡが、ミクロＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡフラグメントを提供するフラグメント化試薬を用いて前記サンプルを処理する工程；および該サンプルを提供した後で、前記連結する工程の前に、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために該フラグメントからリン酸基を除去する工程を、さらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フラグメント化試薬が、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）ＩＩＩならびにＭｇ２＋のような２価金属イオンおよび中性からアルカリ性の範囲のｐＨを有する緩衝液からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
３’ヒドロキシル基からリン酸基を除去する前記工程が、アルカリホスファターゼにより行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｘが、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋またはＫ＋からなる群より選択される適切な対イオンを有する、ＨＯ−、ＰＯ４２−−、Ｐ２Ｏ７３−−、Ｐ３Ｏ１０４−−、ＯＰ（Ｓ）Ｏ２２−およびアデノシン−（５’）−Ｐ２Ｏ７＝−からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｙが、Ｆである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡが、ｃＲＮＡを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガーゼが、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｙが、−ＯＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸アレイが、オリゴヌクレオチドアレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドアレイが、フォトリソグラフにより作製される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカー基が、下記：
【化２】
2006136322.tif 000046
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｌが、下記：
【化３】
2006136322.tif 000047
である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｘが、ＰＯ４＝である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂが、ピリミジン塩基、プリン塩基、天然塩基アナログおよび非天然アナログからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｂが、アデニンおよびシトシンからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｂが、シトシンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識試薬が、下記の構造：
【化４】
2006136322.tif 000048
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒが、Ｈである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標識試薬が、下記の構造：
【化５】
2006136322.tif 000049
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｒが、Ｈである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識試薬が、以下の構造：
【化６】
2006136322.tif 000050
ここで、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され；Ｒは、ＨまたはＰＯ３＝である；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂは、アデニンおよびシトシンの群より選択され、ＲはＨである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｂが、アデニンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｂが、シトシンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
目的とするＲＮＡの存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
目的とする該ＲＮＡを有し得るか、または有し得ない、ＲＮＡを含むサンプルを提供する工程；
該ＲＮＡを下記の構造：
【化７】
2006136322.tif 000051
を有する標識試薬に連結する工程であって、ここでＢは、ヘテロ環部分である；Ｒは、ＨおよびＰＯ３＝からなる群より選択され、ｎは、１から６までである工程；
目的とする該遺伝子に対応するプローブを有する、核酸アレイを提供する工程；
該核酸アレイに標識された核酸フラグメントを、ハイブリダイズする工程；ならびに
目的とする該ＲＮＡの存在を決定するために該プローブに対するハイブリダイゼーションの程度を、決定する工程を含む、方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡが、ミクロＲＮＡを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＮＡフラグメントを提供するためにフラグメント化試薬を用いる前記サンプルを処理する工程；および該サンプルを提供した後で、そして前記連結する工程の前に、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために、該フラグメントからリン酸基を除去する工程を、さらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記フラグメント化試薬が、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）ＩＩＩならびにＭｇ２＋のような２価金属イオンおよび中性からアルカリ性の範囲のｐＨを有する、緩衝液からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
３’ヒドロキシ基からリン酸基を除去する前記工程が、アルカリホスファターゼにより行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡが、ミクロＲＮＡを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＮＡフラグメントを提供するためにフラグメント化試薬を用いる前記サンプルを処理する工程；および該サンプルを提供した後で、前記連結する工程の前に、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために該フラグメントからリン酸基を除去する工程を、さらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記フラグメント化試薬が、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）ＩＩＩならびにＭｇ２＋のような２価金属イオンおよび中性からアルカリ性の範囲のｐＨを有する緩衝液からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
３’ヒドロキシル基からリン酸基を除去する前記工程が、アルカリホスファターゼにより行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
Ｂが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され、ｎが２〜４である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｂが、アデニンおよびシトシンからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
Ｂがシトシンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
ｎが３である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記標識試薬が、下記：
【化８】
2006136322.tif 000052
【化９】
2006136322.tif 000053
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標識試薬が、下記：
【化１０】
2006136322.tif 000054
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である；
である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
下記：
【化１１】
2006136322.tif 000055
ここでＢは、ヘテロ環塩基部分であり；Ｘは、該フラグメントの３’ＯＨ基へ核酸標識化合物を連結可能にする官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲまたはハロゲンからなる群より選択され；Ｌは、リンカー基であり；Ｓｉｇは、検出可能な部分である；
の構造を有する核酸標識化合物。
【請求項４５】
Ｌが、下記：
【化１２】
2006136322.tif 000056
からなる群より選択される、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｌが、下記：
【化１３】
2006136322.tif 000057
である、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｘが、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋またはＫ＋からなる群より選択される適切な対イオンを有する、ＨＯ−、ＰＯ４２−−、Ｐ２Ｏ７３−−、Ｐ３Ｏ１０４−−、ＯＰ（Ｓ）Ｏ２２−およびアデノシン−（５’）−Ｐ２Ｏ７＝−からなる群より選択される、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｙが、Ｆである請求項４４に記載の化合物。
【請求項４９】
Ｂが、ピリミジン塩基、プリン塩基、天然塩基アナログおよび非天然アナログからなる群より選択される、請求項４４に記載の化合物。
【請求項５０】
Ｂが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される、請求項４５に記載の化合物。
【請求項５１】
Ｂが、アデニンおよびシトシンからなる群より選択される、請求項５０に記載の化合物。
【請求項５２】
Ｂが、シトシンである、請求項４７に記載の化合物。
【請求項５３】
下記の構造：
【化１４】
2006136322.tif 000058
ここで、Ｌは、リンカーであり、そしてＳｉｇは、検出可能な部分であり；Ｂ１は、アデニンであり、そしてＢは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される；
を有する、請求項４４に記載の核酸標識化合物。
【請求項５４】
下記の構造：
【化１５】
2006136322.tif 000059
ここで、Ｂ１は、アデニンであり、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され；Ｒは、ＨまたはＰＯ３＝である；
を有する、請求項４４に記載の核酸標識化合物。
【請求項５５】
下記の構造：
【化１６】
2006136322.tif 000060
による、請求項４４に記載の核酸標識化合物。
【請求項５６】
下記の構造：
【化１７】
2006136322.tif 000061
ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり、Ｌ１は、第１リンカーであり、Ｌ２は、第２リンカーであり、Ｓｉｇは、検出可能な部分であり、そしてｎは、１〜６までの整数である、核酸標識化合物。
【請求項５７】
下記の構造：
【化１８】
2006136322.tif 000062
ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり；ｎは、１〜６までの整数；およびＲは、ＨおよびＰＯ３＝からなる群より選択される；
を有する、請求項５６に記載の核酸標識化合物。
【請求項５８】
下記の構造：
【化１９】
2006136322.tif 000063
を有する、請求項５６に記載の核酸標識化合物。
【請求項５９】
下記の構造：
【化２０】
2006136322.tif 000064
を有する、請求項５６に記載の核酸標識化合物。
【請求項６０】
下記の構造：
【化２１】
2006136322.tif 000065
を有する、請求項５６に記載の核酸標識化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
２００３年７月１１日に出願した米国特許出願第１０／６１７，９９２号、および２００２年７月１２日に出願した米国仮出願６０／３９５，５８０は、その全体が、全ての目的のために参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、核酸標識化合物に関する。これらの標識化合物は、一つの検出可能部分または複数の検出可能部分を有し、それは、その部分を有するＲＮＡまたはフラグメントが適切な装置もしくは試験で感知されることを可能にする分子もしくは複合体である。より詳細には、本発明は、ＲＮＡ分子またはフラグメントの３’末端を標識するために使用され得る核酸標識化合物に関する。本発明の核酸標識化合物は、ＲＮＡリガーゼと呼ばれる酵素の使用により、ＲＮＡと連結され得る。そのような標識は、上記ＲＮＡをＤＮＡに変換することが必要な他の操作と区別するように、指向されたといわれる。本発明はまた、核酸マイクロアレイを使用する標識ＲＮＡの分析に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
病変細胞および健康な細胞ならびに異なる発生段階での細胞における遺伝子発現は、しばしば異なり、そして特徴づけられ得る。そのような場合における遺伝子発現をモニターする能力は、研究者および医学の専門家に強力な診断手段を提供する。
【０００４】
例えば、目的とする遺伝子の転写産物である核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の存在または非存在を測定することにより、遺伝子発現を、モニターし得る。核酸をモニターすることは、検出可能部分でｍＲＮＡを化学的または生化学的に標識し、引き続きその遺伝子のための核酸プローブにハイブリダイズすることにより達成され得る。プローブ位置で標識された核酸の検出は、標的遺伝子が発現したことを示す。
【０００５】
ＲＮＡ検出の種々の方法が、開発されてきた。これらとしては、ノーザンブロッティング操作、３２Ｐのような放射性同位体の使用が挙げられる。非放射性検出技術もまた、開発されてきた。Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８１、７８、６６３３〜６６３７、は、例えば、特定のビオチン標識のヌクレオシドを開示した。Ｌｏｃｋｈａｒｔらは、米国特許第６，３４４，３１６号は、非放射性ヌクレオシドで、酵素による末端標識の方法を開示した。これらの参考文献は、本明細書に参考として全ての目的のために援用される。
【０００６】
しかしながら、効率的で正確なＲＮＡの標識および遺伝子発現をモニターするために使用され得る、ＲＮＡ標識合物の需要は、依然残っている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する：
（項目１）目的とするＲＮＡの存在を検出する方法であって、以下の工程：
目的とする該ＲＮＡを有し得るか、または有し得ない、ＲＮＡを含むサンプルを提供する工程；
該ＲＮＡを下記の構造：
【０００８】
【化１】
2006136322.tif 000002
を有する標識試薬に連結する工程であって、ここでＢは、ヘテロ環部分であり；Ｘは、該フラグメントの３’ＯＨ基へ核酸標識化合物を連結可能にする官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲまたはハロゲンからなる群より選択され；Ｌは、リンカー基であり；Ｓｉｇは、標識されたＲＮＡを提供する検出可能な部分である、工程；
目的とする該ＲＮＡに指向されたプローブを有する核酸アレイを提供する工程；
標識されたＲＮＡを、該核酸アレイにハイブリダイズする工程；ならびに
目的とする該ＲＮＡの存在を決定する該プローブに対するハイブリダイゼーションの程度を、決定する工程を含む、方法。
（項目２）前記ＲＮＡが、ミクロＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）ＲＮＡフラグメントを提供するフラグメント化試薬を用いて前記サンプルを処理する工程；および該サンプルを提供した後で、前記連結する工程の前に、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために該フラグメントからリン酸基を除去する工程を、さらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）前記フラグメント化試薬が、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）ＩＩＩならびにＭｇ２＋のような２価金属イオンおよび中性からアルカリ性の範囲のｐＨを有する緩衝液からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）３’ヒドロキシル基からリン酸基を除去する前記工程が、アルカリホスファターゼにより行われる、項目３に記載の方法。
（項目６）Ｘが、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋またはＫ＋からなる群より選択される適切な対イオンを有する、ＨＯ−、ＰＯ４２−−、Ｐ２Ｏ７３−−、Ｐ３Ｏ１０４−−、ＯＰ（Ｓ）Ｏ２２−およびアデノシン−（５’）−Ｐ２Ｏ７＝−からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）Ｙが、Ｆである項目１に記載の方法。
（項目８）前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡを含む、項目３に記載の方法。
（項目９）前記ＲＮＡが、ｃＲＮＡを含む、項目３に記載の方法。
（項目１０）前記リガーゼが、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１１）Ｙが、−ＯＨである、項目１に記載の方法。
（項目１２）前記核酸アレイが、オリゴヌクレオチドアレイである、項目１に記載の方法。
（項目１３）前記オリゴヌクレオチドアレイが、フォトリソグラフにより作製される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）前記リンカー基が、下記：
【０００９】
【化２】
2006136322.tif 000003
からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１５）Ｌが、下記：
【００１０】
【化３】
2006136322.tif 000004
である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）Ｘが、ＰＯ４＝である、項目１に記載の方法。
（項目１７）Ｂが、ピリミジン塩基、プリン塩基、天然塩基アナログおよび非天然アナログからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１８）Ｂが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）Ｂが、アデニンおよびシトシンからなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）Ｂが、シトシンである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）前記標識試薬が、下記の構造：
【００１１】
【化４】
2006136322.tif 000005
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である；
を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）Ｒが、Ｈである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）前記標識試薬が、下記の構造：
【００１２】
【化５】
2006136322.tif 000006
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である；
を含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）Ｒが、Ｈである、項目２１に記載の方法。
（項目２５）前記標識試薬が、以下の構造：
【００１３】
【化６】
2006136322.tif 000007
ここで、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され；Ｒは、ＨまたはＰＯ３＝である；
を含む、項目１に記載の方法。
（項目２６）Ｂは、アデニンおよびシトシンの群より選択され、ＲはＨである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）Ｂが、アデニンである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）Ｂが、シトシンである、項目２６に記載の方法。
（項目２９）目的とするＲＮＡの存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
目的とする該ＲＮＡを有し得るか、または有し得ない、ＲＮＡを含むサンプルを提供する工程；
該ＲＮＡを下記の構造：
【００１４】
【化７】
2006136322.tif 000008
を有する標識試薬に連結する工程であって、ここでＢは、ヘテロ環部分である；Ｒは、ＨおよびＰＯ３＝からなる群より選択され、ｎは、１から６までである工程；
目的とする該遺伝子に対応するプローブを有する、核酸アレイを提供する工程；
該核酸アレイに標識された核酸フラグメントを、ハイブリダイズする工程；ならびに
目的とする該ＲＮＡの存在を決定するために該プローブに対するハイブリダイゼーションの程度を、決定する工程を含む、方法。
（項目３０）前記ＲＮＡが、ミクロＲＮＡを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）ＲＮＡフラグメントを提供するためにフラグメント化試薬を用いる前記サンプルを処理する工程；および該サンプルを提供した後で、そして前記連結する工程の前に、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために、該フラグメントからリン酸基を除去する工程を、さらに含む項目２９に記載の方法。
（項目３２）前記フラグメント化試薬が、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）ＩＩＩならびにＭｇ２＋のような２価金属イオンおよび中性からアルカリ性の範囲のｐＨを有する、緩衝液からなる群より選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）３’ヒドロキシ基からリン酸基を除去する前記工程が、アルカリホスファターゼにより行われる、項目３１に記載の方法。
（項目３４）前記ＲＮＡが、ミクロＲＮＡを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３５）ＲＮＡフラグメントを提供するためにフラグメント化試薬を用いる前記サンプルを処理する工程；および該サンプルを提供した後で、前記連結する工程の前に、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために該フラグメントからリン酸基を除去する工程を、さらに含む項目２９に記載の方法。
（項目３６）前記フラグメント化試薬が、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）ＩＩＩならびにＭｇ２＋のような２価金属イオンおよび中性からアルカリ性の範囲のｐＨを有する緩衝液からなる群より選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３７）３’ヒドロキシル基からリン酸基を除去する前記工程が、アルカリホスファターゼにより行われる、項目３１に記載の方法。
（項目３８）Ｂが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され、ｎが２〜４である、項目２７に記載の方法。
（項目３９）Ｂが、アデニンおよびシトシンからなる群より選択される、項目３４に記載の方法。
（項目４０）Ｂがシトシンである、項目３５に記載の方法。
（項目４１）ｎが３である、項目３４に記載の方法。
（項目４２）前記標識試薬が、下記：
【００１５】
【化８】
2006136322.tif 000009
【００１６】
【化９】
2006136322.tif 000010
からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目４３）前記標識試薬が、下記：
【００１７】
【化１０】
2006136322.tif 000011
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である；
である、項目２９に記載の方法。
（項目４４）下記：
【００１８】
【化１１】
2006136322.tif 000012
ここでＢは、ヘテロ環塩基部分であり；Ｘは、該フラグメントの３’ＯＨ基へ核酸標識化合物を連結可能にする官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲまたはハロゲンからなる群より選択され；Ｌは、リンカー基であり；Ｓｉｇは、検出可能な部分である；
の構造を有する核酸標識化合物。
（項目４５）Ｌが、下記：
【００１９】
【化１２】
2006136322.tif 000013
からなる群より選択される、項目４４に記載の化合物。
（項目４６）Ｌが、下記：
【００２０】
【化１３】
2006136322.tif 000014
である、項目４５に記載の化合物。
（項目４７）Ｘが、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋またはＫ＋からなる群より選択される適切な対イオンを有する、ＨＯ−、ＰＯ４２−−、Ｐ２Ｏ７３−−、Ｐ３Ｏ１０４−−、ＯＰ（Ｓ）Ｏ２２−およびアデノシン−（５’）−Ｐ２Ｏ７＝−からなる群より選択される、項目４４に記載の化合物。
（項目４８）Ｙが、Ｆである項目４４に記載の化合物。
（項目４９）Ｂが、ピリミジン塩基、プリン塩基、天然塩基アナログおよび非天然アナログからなる群より選択される、項目４４に記載の化合物。
（項目５０）Ｂが、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される、項目４５に記載の化合物。
（項目５１）Ｂが、アデニンおよびシトシンからなる群より選択される、項目５０に記載の化合物。
（項目５２）Ｂが、シトシンである、項目４７に記載の化合物。
（項目５３）下記の構造：
【００２１】
【化１４】
2006136322.tif 000015
ここで、Ｌは、リンカーであり、そしてＳｉｇは、検出可能な部分であり；Ｂ１は、アデニンであり、そしてＢは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される；
を有する、項目４４に記載の核酸標識化合物。
（項目５４）下記の構造：
【００２２】
【化１５】
2006136322.tif 000016
ここで、Ｂ１は、アデニンであり、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され；Ｒは、ＨまたはＰＯ３＝である；
を有する、項目４４に記載の核酸標識化合物。
（項目５５）下記の構造：
【００２３】
【化１６】
2006136322.tif 000017
による、項目４４に記載の核酸標識化合物。
（項目５６）下記の構造：
【００２４】
【化１７】
2006136322.tif 000018
ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり、Ｌ１は、第１リンカーであり、Ｌ２は、第２リンカーであり、Ｓｉｇは、検出可能な部分であり、そしてｎは、１〜６までの整数である、核酸標識化合物。
（項目５７）下記の構造：
【００２５】
【化１８】
2006136322.tif 000019
ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり；ｎは、１〜６までの整数；およびＲは、ＨおよびＰＯ３＝からなる群より選択される；
を有する、項目５６に記載の核酸標識化合物。
（項目５８）下記の構造：
【００２６】
【化１９】
2006136322.tif 000020
を有する、項目５６に記載の核酸標識化合物。
（項目５９）下記の構造：
【００２７】
【化２０】
2006136322.tif 000021
を有する、項目５６に記載の核酸標識化合物。
（項目６０）下記の構造：
【００２８】
【化２１】
2006136322.tif 000022
を有する、項目５６に記載の核酸標識化合物。
【００２９】
本発明の一つの局面では、末端標識ＲＮＡ（全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはフラグメント化ＲＮＡ）のための方法が提供される。本発明の一つの局面では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼが、３’標識ＡＭＰまたはＣＭＰドナーをＲＮＡ受容分子に連結するために使用される。他の実施形態では、ピロリン酸分子３’−ＡｐｐＮ３’−リンカー検出可能部分が、ドナー分子として使用される。
【００３０】
本発明の他の局面では、サンプル中の目的とするＲＮＡの存在を検出する方法が提供されるが、その方法は、以下の工程：
目的とする上記ＲＮＡを有し得るか、または有し得ない、ＲＮＡを含むサンプルを提供する工程；
ＲＮＡフラグメントを提供するためにフラグメント化試薬を用い、上記サンプルを処理する工程；遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために該フラグメントからリン酸基を除去する工程；本発明に従って、上記フラグメントを標識試薬と連結する工程；目的とする上記ＲＮＡに指向されたプローブを有する核酸アレイを提供する工程；上記核酸アレイに標識された核酸フラグメントをハイブリダイズする工程；ならびに
目的とする該ＲＮＡの存在を決定するために該プローブに対するハイブリダイゼーションの程度を決定する工程を含む。
【００３１】
本発明の一局面では、ＲＮＡ分子の３’末端またはそれらのフラグメントの３’末端に、検出可能な部分と連結するために使用され得る化合物が提供される。本発明の一局面では、下記式：
【００３２】
【化２２】
2006136322.tif 000023
ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり；Ｘは、ＲＮＡ分子の３’ＯＨ基もしくはＲＮＡフラグメントの３’ＯＨ基に、核酸標識化合物を連結し得る官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲもしくはハロゲンからなる群より選択され；Ｌは、リンカー基であり；およびＳｉｇは検出可能な標識もしくは部分である、化合物が提供される。
【００３３】
本発明の別の局面にしたがって、下記式：
【００３４】
【化２３】
2006136322.tif 000024
ここで、Ｌは、リンカーであり、そしてＳｉｇは、検出可能な部分であり；Ｂ１は、アデニンであり、そしてＢは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される、核酸標識化合物が提供される。
【００３５】
本発明のさらに別の局面に従って、下記式：
【００３６】
【化２４】
2006136322.tif 000025
ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり、Ｌ１は、第１リンカーであり，Ｌ２は、第２リンカーであり、Ｓｉｇは検出可能部分であり、そしてｎは、１〜６の整数である、ような複数のシグナル源を有する、化合物が提示される。
【００３７】
本発明の別の局面では、ＲＮＡ（全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡまたはフラグメントＲＮＡ）の末端標識のための方法が提供される。一つの実施形態では、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼが、３’ビオチニル化ＡＭＰドナーまたはビオチニル化ＣＭＰドナーを、ＲＮＡ受容分子に連結するために使用される。別の実施形態では、形態３’−ＡｐｐＮ−３’−リンカー−ビオチンのピロリン酸が、ＲＮＡ受容分子へ連結されるべきドナー分子として使用される。
【００３８】
本発明の別の局面では、核酸群を提供する工程、核酸群を核酸フラグメントに変換する工程；リガーゼを使用して、標識核酸群もしくは標識フラグメントを生成するために核酸群またはフラグメントを、核酸標識分子に連結する工程；標識核酸群または標識フラグメントを核酸プローブのアレイにハイブリダイズする工程；ならびに核酸群における核酸レベルの指標としてプローブのハイブリダイゼーションシグナルを決定する工程を含む、核酸マイクロアレイ上の核酸群を分析する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、多くの好ましい実施形態を有し、そして当業者に公知の詳細に関する多くの特許、出願および他の参考文献に依存している。従って、特許、出願または他の参考文献を以下で引用または繰り返される場合、それは全ての目的のためにおよび復唱される命題のために全体が参考として援用されていると理解されるべきである。
【００４０】
本出願で使用されるように、単数形の「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」は、それらの混合物を含む、複数の薬剤を含む。
【００４１】
個体は、ヒトに限定されず、哺乳動物、植物、細菌またはそれらのうちの任意のものからの細胞も含む、他の生物体であり得るが、これらに限定されない。
【００４２】
本開示のいたるところで、本発明の種々の局面が、一連の構成で提示され得る。一連の構成の記載は、単に便宜的および簡潔性のためであって、本発明の範囲に関する柔軟性のない限定と解釈されるべきではない。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲およびその範囲内の個別の数値を、詳細に開示するものと考えられるべきである。例えば、１〜６へのような範囲の記載は、詳細には、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲、ならびに例えば、１、２、３、４、５および６の範囲内の個別の数字もまた、詳細に開示すると考えられるべきである。これはその範囲の広さに係わらず適用される。
【００４３】
本発明の実践は、他で示されない限り、当該分野の技術範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術および説明を使用し得る。そのような従来技術としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、連結反応および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適切な技術の詳細な説明は、以下の実施例を参考にされ得る。しかしながら、当然、他の等価な従来操作もまた、使用され得る。そのような従来技術および記載は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，および  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ）、Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎのような標準的実験取扱説明書において見出され、全ての目的のために、その全体が、参考として本明細書に援用される。
【００４４】
本発明は、いくつかの好ましい実施形態でのアレイを含む、固体の基質を、使用し得る。ポリマー（タンパク質を含む）アレイ合成に適切な方法および技術は、米国特許出願番号０９／５３６，８４１、ＷＯ  ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５、４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、および同第６，１３６，２６９号ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０（国際公開番号ＷＯ  ９９／３６７６０）およびＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５、および米国特許出願番号０９／５０１，０９９および同０９／１２２，２１６に記載されており、その全体が、本明細書に参考として全ての目的のために援用されている。好ましいアレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から市販されている。ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍを参照のこと。
【００４５】
特定の実施形態における合成技術を記載している特許としては、米国特許第５，４１２，０８７号、同第６，１４７，２０５号、同第６，２６２，２１６号、同第６，３１０，１８９号、同第５，８８９，１６５号および同第５，９５９，０９８号が挙げられる。核酸アレイは、上記の特許の多くに記載されているが、同じ技術がポリペプチドアレイに適用される。
【００４６】
本発明はまた、固体の基質に連結されたポリマーの多くの使用を、企図している。これらの使用としては、遺伝子発現モニタリング、プロフィール化、ライブラリースクリーニング、遺伝子型分類および診断が挙げられる。遺伝子発現モニタリング、およびプロフィール化方法は、米国特許第５，８００，９９２号、同第６，０１３，４４９号、同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１３８号、同第６，１７７，２４８号および同第６，３０９，８２２号に示され得る。従って、遺伝子型分類およびそれらの用途は、米国特許出願番号１０／０１３，５９８および米国特許第５，８５６，０９２号、同第６，３００，０６３号、同第５，８５８，６５９号、同第６，２８４，４６０号および同第６，３３３，１７９号に示される。他の用途は、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，９０２，７２３号、同第６，０４５，９９６号、同第５，５４１，０６１号および同第６，１９７，５０６号に具体化される。
【００４７】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態での試料調製方法を企図する。例えば、上記の遺伝子発現特許、プロフィール化特許、遺伝子型分類特許および他の用途特許ならびに米国特許出願番号０９／８５４，３１７、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４、５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１、１０７７（１９８８）、Ｂｕｒｇ、米国特許第５，４３７，９９０号、同第５，２１５，８９９号、同第５，４６６，５８６号、同第４，３５７，４２１号、Ｇｕｂｌｅｒら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｏｂｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６、１１７３（１９８９）、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、１８７４（１９９０）、ＷＯ  ８８／１０３１５、ＷＯ  ９０／０６９９５、および６，３６１，９４７を参照のこと。
【００４８】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるリガンド間のハイブリダイゼーションの検出を企図する。米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号；同第５，８３４，７５８号；同第５，９３６，３２４；同第５，９８１，９５６；同第６，０２５，６０１号；同第６，１４１，０９６号；同第６，１８５，０３０号；同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号ならびにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開されている）を参照のこと。これらの各々はまた、その全体が本明細書に参考として、全ての目的のために援用される。
【００４９】
本発明はまた、プローブデザイン、データ管理、分析および装置の運転などのような、種々の目的のための、種々のコンピュータプログラム製品ならびにソフトウエアを使用し得る。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号、および同第６，３０８，１７０号を参照のこと。
【００５０】
さらに、本発明は、遺伝子情報をインターネットで提供する方法を含む好ましい実施形態を有し得る。仮出願６０／３４９，５４６を参照のこと。
【００５１】
（定義）
「核酸アレイ」は、１以上の固体支持体に連結された（好ましくは、単一の末端共有結合により）異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの多重度をいい、支持体の多重度がある場合、各支持体はオリゴヌクレオチドまたはポリオリゴヌクレオチドの多重度を保持する。用語「アレイ」は、支持体上のオリゴヌクレオチドまたはポリオリゴヌクレオチドの全体的な集合体、またはそれらの部分集合体を言い得る。上記オリゴヌクレオチド種またはポリオリゴヌクレオチド種の空間的な分布は、二つのアレイで異なり得るが、好ましい実施形態では、それは実質的には同じである。同一であるように二つのアレイが設計され、合成される場合、オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブの存在量、組成および分布における変動が存在する。これらの変動は、好ましくは、実体が無く、そして／または本明細書で記載のように、コントロールの使用により補正される。用語オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、本出願において相互に使用され得、一つの用語の使用は、本発明の限定として考えられるべきでない。
【００５２】
用語「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖もしくは２本鎖のうちのいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、他で限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様な様式で機能し得る、天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含する。
【００５３】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、長さが２〜約１０００ヌクレオチド、より代表的には２〜約５００ヌクレオチドの範囲の、一本鎖核酸である。
【００５４】
本明細書で使用されるように、「プローブ」は、相補的配列の標的核酸に連結し得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとして定義され、これらのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、１以上の型の化学結合により、通常相補的塩基対により、通常は、水素結合形成により、標的核酸に結合し得る。本明細書で使用されるように、オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブは、天然の塩基（即ちＡ、Ｇ、ＣもしくはＴ）または改変塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブにおける上記塩基は、ハイブリダイゼーションを干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の他の結合で結合され得る。従って、オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブは、構成塩基がホスホジエステル結合であるよりもむしろペプチド結合で結合されているペプチド核酸であり得る。オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブはまた、一般的に核酸プローブとも呼ばれ得る。
【００５５】
用語「標的核酸」は、上記オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブが特異的にハイブリダイズする核酸（しばしば生物学的サンプル由来のもので、従ってサンプル核酸ともいう）をいう。上記標的核酸は、本質的に核酸の任意の供給源（例えば、化学合成、増幅反応、司法サンプルなどが挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得ることが認識される。検出されるべきは、１以上の標的核酸の存在もしくは非存在で、または定量されるべきは、１以上の標的核酸の量である。好ましく検出される、上記標的核酸は、それらが特異的に結合する（ハイブリダイズする）、対応するプローブの核酸配列に相補的な核酸配列を有する。用語標的核酸は、上記プローブが特異的にハイブリダイズする、より大きな核酸の特定の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはその存在量（濃度）および／もしくは発現レベルを検出されることが望まれる全体の配列（例えば遺伝子もしくはｍＲＮＡ）をいう。使用の差は、文脈から明らかである。
【００５６】
句「支持体へ結合された」は、支持体に直接的にまたは間接的に結合されることを意味し、この結合としては、共有結合、水素結合、イオン相互作用、疎水性相互作用その他による連結が挙げられる。
【００５７】
「検出可能部分」または「標識部分」は、種々の装置および／もしくは試験方法（物理的方法、化学的方法、電気的方法および／もしくはコンピュータベースによる方法を含む）、例えば核酸に連結された場合にその部分を検出する方法により検出され得る、分子もしくは分子の複合体および／または粒子を意味する。
【００５８】
「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的なハイブリダイゼーションをいい、標的オリゴヌクレオチド配列もしくは標的ポリヌクレオチド配列の望ましい検出を達成するために、ハイブリダイゼーションの媒体のストリンジェンシーを減少させて適応され得る僅かのミスマッチをも受容する。
【００５９】
句「特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が複合体混合物（例えば全細胞性）ＤＮＡもしくはＲＮＡで存在する場合、ストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列に好ましく分子を結合させるか、二本鎖にするか、またはハイブリダイズすることをいう。
【００６０】
用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブが、優先的にその標的部分配列にハイブリダイズし、他の配列にはより少ない程度か、または全くハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であって、異なる環境では異なる。より長い配列は、特異的に高温でハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、限定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列のために、熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。上記Ｔｍは、標的配列に対して相補的なプローブの５０％が、上記標的配列に、平衡でハイブリダイズする温度（限定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度で）である。（標的配列は、一般的に過剰に存在するので、Ｔｍで、上記プローブの５０％が平衡で占められる）。代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（もしくは他の塩）であり、ｐＨが、７．０〜８．３であり、そして短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して温度が少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成し得る。
【００６１】
用語「バックグランド」または「バックグランドシグナル強度」とは、標識標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイもしくはポリヌクレオチドアレイ（例えば、上記オリゴヌクレオチドプローブもしくはポリヌクレオチドプローブ、コントロールプローブ、上記アレイ基質など）の成分との間の非特異的結合、もしくは他の相互作用より生じるハイブリダイゼーションシグナルをいう。バックグランドシグナルはまた、アレイ成分それら自身の固有の蛍光により生じ得る。単一のバックグランドシグナルは、アレイ全体分を計算され得るし、または異なるバックグランドシグナルは、そのアレイの各領域ごとに計算され得る。好ましい実施形態では、バックグランドは、上記アレイまたはアレイの領域のプローブの最も低い１％〜１０％の平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算される。発現をモニターするアレイにおいて（即ち、プローブが特定の核酸（遺伝子）とハイブリダイズするように予め選択される場合）、異なるバックグランドシグナルは、各標的核酸に対して計算され得る。異なるバックグランドシグナルが、各標的遺伝子に対して計算される場合、そのバックグランドシグナルは、各遺伝子のプローブの最低１％〜１０％に対して計算される。もちろん当業者は、特定の遺伝子に対するプローブが、よくハイブリダイズし、そしてこのように標的配列に特異的に結合するらしい場合、それらはバックグランドシグナルの計算に使用されるべきでないことを理解する。あるいは、バックグランドは、上記サンプル中に見出されるいかなる配列とも相補的でないプローブ（例えば、アンチセンス（ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｅｎｓｅ）の核酸または哺乳類起源のサンプルの場合、細菌遺伝子のような、サンプル中では見出されない遺伝子に指向したプローブ）に対するハイブリダイゼーションにより生じる、平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として、計算され得る。バックグランドはまた、プローブの全く無いアレイの領域により生じる平均シグナル強度として計算され得る。
【００６２】
核酸の存在量もしくは濃度（例えば、遺伝子の転写レベル）を定量化するという文脈で使用される場合、用語「定量化すること」とは、絶対的定量化または相対的定量化をいう。絶対的定量化は、１以上の標的核酸（例えば、ＢｉｏＢのようなコントロール核酸もしくは既知量の標的核酸それら自身）の既知の濃度を算入し、そして未知のハイブリダイゼーション強度を既知の標的核酸で較正することにより（例えば、標準曲線の作成により）達成され得る。あるいは、相対的定量化は、２以上の遺伝子の間のハイブリダイゼーションシグナルの比較またはハイブリダイゼーション強度の変化を定量化する２以上の処理の間の比較、および連関、転写レベルにより達成され得る。
【００６３】
（核酸標識）
本発明の一つの局面では、ハイブリダイズした核酸は、サンプル核酸に連結された１以上の標識を検出することにより、検出される。上記標識は、当業者に周知の多くの手段のうちの任意の手段により取り込まれ得る。しかしながら、好ましい実施形態では、上記標識は、サンプル核酸の調製における増幅工程の間で、同時に取り込まれ得る。例えば、標識プライマーおよび標識ヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識増幅生成物を提供する。上記核酸（例えば、ＤＮＡ）は、標識デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で増幅される。上記増幅された核酸は、フラグメント化され得、オリゴヌクレオチドアレイに曝され得、そしてハイブリダイゼーションの程度が、アレイに関連する標識の量により決定され得る。好ましい実施形態では、上述のように、標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／もしくはフルオレセイン標識ＣＴＰ）を使用する転写増幅は、転写された核酸の中に標識または部分を取り込む。
【００６４】
あるいは、標識は、直接的に元の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に付加され得るか、または増幅終了後の増幅産物に付加され得る。そのような標識は、増幅産物の収率を増加し、そして増幅反応に必要な時間を減少させ得る。核酸に標識を連結する手段としては、例えば、ニックトランスレーション、または核酸のリン酸化に続いてサンプル核酸を標識（例えばフルオロフォア）に結びつける核酸リンカーの連結（結合）による末端標識（例えば、標識ＲＮＡで）が挙げられる。
【００６５】
多くの応用において、増幅、転写または他の核酸への変換工程無しで、核酸サンプルを直接標識することは有用である。細胞から全細胞質ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、この物質を何ら中間工程も無しにハイブリダイズする場合、これはｍＲＮＡレベルをモニタリングするために特に真実である。米国特許第６，３４４，３１６号を参照のこと。これは、本明細書により全ての目的のために、全体として参考に援用されている。
【００６６】
末端標識は、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を使用して達成され得る。末端標識はまた、標識ヌクレオチドもしくは標識オリゴヌクレオチドもしくは標識ポリヌクレオチドもしくはそれらの標識アナログを、標的核酸またはプローブの末端に連結することにより達成され得る。米国特許第６，３４４，３１６号を参照のこと。
【００６７】
本発明の一つの局面によると、核酸を末端標識する方法およびそのために（ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ）有用な試薬が記載される。本発明の一つの好ましい局面では、その方法は、核酸を提供する工程、標識ヌクレオチドもしくは標識オリゴヌクレオチドもしくは標識ポリヌクレオチドを提供する工程および上記ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを、上記核酸に酵素的に連結する工程を包含する。このように、本発明の一つの局面によると、核酸がＲＮＡである場合、標識リボヌクレオチドはＲＮＡリガーゼを使用して上記ＲＮＡに連結され得る。ＲＮＡリガーゼは、５’リン酸基を有する一本鎖ＲＮＡ（またはＤＮＡ、しかしＲＮＡとの反応がより効率的である）を、ＲＮＡ（またはＤＮＡ）の別の断片の３’−ＯＨ末端に共有結合を作る触媒をする。この酵素の使用について特定の要件が、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＸＶ巻、Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ、ＵｈｌｅｎｂｅｃｋおよびＧｒｅｅｎｓｐｏｒｔ、３１〜５８頁；および５．６６〜５．６９，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されており、これらの全ては、本明細書に全部参考に援用されている。
【００６８】
本発明の一つの局面によると、核酸重合工程の間に、標識ヌクレオチドを取り込むよりはむしろ、直接的に標識を核酸（例えば、抽出されたＲＮＡ）に付加する方法を提供する。本発明の一つの局面によると、一本鎖核酸の末端に、標識リボヌクレオチドまたは短い標識オリゴリボヌクレオチドを付加することにより達成され得る。
【００６９】
本発明の一つの局面によると、ＲＮＡ標識化合物は、この分子をプロセシングすることなくＲＮＡ分子の３’−ＯＨ基に直接結合され得る。例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、短い非コーディングＲＮＡ（ほぼ１５〜２５ヌクレオチド）の広義の分類である。これらのＲＮＡは、遺伝子発現の制御において役割を果たしていると考えられている。例えば、シーエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）において、ｌｉｎ−４  ｍｉＲＮＡおよびｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡは、幼虫の発達の間に神経細胞および皮下細胞の運命特定のタイミングを調節する。Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  Ｍ、Ｒａｕｈｕｔ  Ｒ、  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ  Ｗ、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＲＮＡｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１、２９４：８５３〜８５８。植物および動物における、ｍｉＲＮＡの生物発生に関連する酵素的装置は、大々的に研究された。ＲＮアーゼＩＩＩ型様Ｄｉｃｅｒは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質と共に、ｍｉＲＮＡヘアピン前駆体を切断して、上記ヘアピンの１腕から安定な約２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡを生じる。ＫｅＸＳ、Ｌｉｕ  ＣＭ、Ｌｉｕ  ＤＰ、Ｌｉａｎｇ  ＣＣ：ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｋｅｙ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００３、７：５１６〜５２３。
【００７０】
ｍｉＲＮＡは遊離の３’−ＯＨ基を有することは、当業者により理解されている。そこで、本発明の核酸標識分子は、ｍＲＮＡもしくはｃＲＮＡに要求されるような予備的フラグメント化または脱リン酸化無しで、そのようなＲＮＡの末端上に直接、連結され得る。
【００７１】
ＲＮＡは、Ｍｇ２＋の存在下に熱でランダムにフラグメント化され得る。これは、一般的に、５’−ＯＨ基およびリン酸化３’末端を有するＲＮＡフラグメントを産生する。本発明の一つの局面によると、アルカリホスファターゼが、そのＲＮＡフラグメントの３’末端からリン酸基を除去するために使用される。本発明の一つの局面によると、検出部分を有し、そして５’末端リン酸を有するリボヌクレオチドを含むドナーは、次いでＴ４  ＲＮＡリガーゼを使用してＲＮＡフラグメントの３’ＯＨ基に連結され、標識ＲＮＡを提供する。発明によると、上記ドナーはまた、本核酸標識化合物と呼ばれる。
【００７２】
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは、ＡＴＰのＡＭＰおよびＰＰｉへの加水分解を伴う３’と５’のホスホジエステル結合の形成により、５’リン酸末端核酸ドナーの３’ヒドロキシル末端核酸アクセプターへの連結反応を触媒する。最小アクセプターは、トリヌクレオシド二リン酸でなければならないが、ジヌクレオシドピロリン酸（ＮｐｐＮ）およびモノヌクレオシド３’，５’−二リン酸（ｐＮｐ）は分子間反応において有効なドナーである。ＨｏｆｆｍａｎｎおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１５、５２８９〜５３０３（１９８７）を参照のこと。これは本明細書に、その全体が、全ての目的のために参考として援用されている。
【００７３】
本発明の使用に適切な検出可能な標識としては、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段が、挙げられる。本発明における有用な標識としては、標識されたストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡを参照のこと）、放射性同位元素標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３２Ｐ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで通常使用される他のもの）、金粒子コロイドのような比色標識（例えば、直径サイズ４０〜８０ｎｍの範囲で、高効率の散乱緑色光の金コロイド）または着色ガラスもしくは着色プラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【００７４】
フルオレセイン標識は、低いバックグランドと非常に強いシグナルを提供するので好ましい。それはまた、速いスキャニング操作により、光学的に高分解能かつ高感度で検出され得る。上記核酸サンプルは、全て単一標識、例えば、単一蛍光標識で標識され得る。あるいは、別の実施形態では、異なる核酸サンプルは、各核酸サンプルが、異なる標識を有する場合、同時にハイブリダイズされ得る。例えば、一つの標的は、緑色蛍光標識を有し得、そして第２標的は、赤色蛍光を有し得る。上記スキャニングの工程は、赤色蛍光標識部位（ｃｉｔｅｓ）を、緑色蛍光標識部位から識別する。各核酸サンプル（標的核酸）は、相互に独立して分析され得る。
【００７５】
（ハイブリダイゼーション）
核酸ハイブリダイゼーションは、変性したプローブおよび標的核酸を、そのプローブとそれに相補的な標的が相補的塩基対により安定なハイブリッド二本鎖を形成し得る条件下で提供する工程を、単に包含する。ハイブリッド二本鎖を形成しない核酸は、洗い流され、検出されるべきハイブリダイズした核酸が残る。代表的には、連結された検出可能な標識または部分の検出による。核酸は、温度を上昇させるか、もしくは核酸を含む緩衝液の塩濃度を減少させるか、もしくは化学的薬剤を添加するか、もしくはｐＨを上げるかにより、変性されることは、一般的に認められている。低いストリンジェンシーの条件（例えば、低い温度および／または高塩濃度および／または高い標的濃度）下で、ハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡ）は、アニールした配列が完全に相補的でない場合でも、形成する。このようにハイブリダイゼーションの特異性は、より低いストリンジェンシーでは減少する。反対に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高い温度、より低い塩）では、ハイブリダイゼーションが成功するためには、殆どミスマッチがないことが要求される。
【００７６】
当業者は、ハイブリダイゼーション条件が、必要に応じた程度のストリンジェンシーを提供するように選択され得る。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、この場合は、ハイブリダイゼーションを確実にするために、約４０℃〜約５０℃で６Ｘ  ＳＳＰＥ−Ｔ（０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で低いストリンジェンシーで行い、その後、引き続く洗浄は、ミスマッチしたハイブリッド二本鎖を除去するために、高いストリンジェンシーで（例えば、３７℃で１Ｘ  ＳＳＰＥ−Ｔ）行う。引き続く洗浄は所望のレベルのハイブリダイエーションの特異性が得られるまで、ストリンジェンシーをより高く増加させて（例えば、３７℃〜５０℃で、０．２５Ｘ  ＳＳＰＥ−Ｔの低さまで下げる）行い得る。ストリンジェンシーはまた、ホルムアミドのような薬剤の添加によっても増加され得る。ハイブリダイゼーションの特異性は、存在し得る種々のコントロール（例えば、発現レベルコントロール、正規化コントロール、ミスマッチコントロールなど）に対するハイブリダイゼーションと試験プローブに対するハイブリダイゼーションとを比較することにより評価され得る。
【００７７】
一般に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナル強度の間には、兼ね合いがある。従って、好ましい実施形態では、上記洗浄は、一貫性のある結果を生じ、そしてバックグランド強度のほぼ１０％のより大きなシグナル強度を提供する高ストリンジェンシーで行われる。従って、好ましい実施形態では、上記のハイブリダイズしたアレイは、連続的により高いストリンジェンシー溶液で洗浄され、そして各洗浄間でアレイは、読み取られ得る。このようにして得られた一連のデータの分析は、上記ハイブリダイゼーションパターンが、認めうるほど変化せず、目的とする特定のオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブに対する適切なシグナルを提供する、洗浄ストリンジェンシーを、明らかにする。
【００７８】
好ましい実施形態では、バックグランドシグナルは、非特異的結合を減少させるハイブリダイゼーションの間に、界面活性剤（例えば、Ｃ−ＴＡＢ）またはブロッキング剤（例えば、精子ＤＮＡ，ｃｏｔ−１  ＤＮＡなど）の使用により減少する。特定の好ましい実施形態では、上記ハイブリダイゼーションは、約０．１〜約０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ（例えば、ニシンの精子ＤＮＡ）の存在下で行われる。ハイブリダイゼーションにおいて、ブロッキング剤の使用は、当業者には、周知のことである（例えば、前述Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎの８章を参照のこと）。
【００７９】
ＲＮＡまたはＤＮＡ間で形成される二本鎖の安定性は、一般に溶液中ではＲＮＡ：ＲＮＡ＞ＲＮＡ：ＤＮＡ＞ＤＮＡ：ＤＮＡの順である。長いプローブは、短いプローブより、標的とより良い二本鎖安定性を有するが、ミスマッチの識別（ミスマッチ識別とは、完全マッチプローブと単一塩基ミスマッチプローブとの間の、測定されたハイブリダイゼーションシグナル比をいう）は弱い。より短いプローブ（例えば、８マー）は、ミスマッチを非常によく識別するが、全体として二本鎖安定性は低い。
【００８０】
オリゴヌクレオチドアナログプローブもしくはポリヌクレオチドアナログプローブを使用することにより与えられた、変化した二本鎖安定性は、例えば、経時的に、標的オリゴヌクレオチドもしくは標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドアナログアレイもしくはポリヌクレオチドアナログアレイの蛍光シグナル強度を追跡することにより、確認され得る。上記データは、特定のハイブリダイゼーション条件、例えば室温での最適化を可能にする（将来の単純化された診断応用のために）。
【００８１】
変化した二本鎖安定性を証明する別の方法は、経時的にハイブリダイゼーション時に発生するシグナル強度を追跡することである。ＤＮＡ標的およびＤＮＡチップを使用する以前の実験は、シグナル強度が経時的に増加し、そしてより安定な二本鎖が、より不安定な二本鎖より、より高いシグナル強度を、より早く発生することを示した。そのシグナルは、ある特定の時間後、結合部位が全て占められることに起因して、平らまたは「飽和」に達する。これらのデータは、ハイブリダイゼーションの最適化および特定の温度での最良の条件の決定を可能にする。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４巻：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９９３）を参照のこと）。
【００８２】
（標識ヌクレオチド）
本発明の一つの局面によると、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは、核酸標識化合物を，ＲＮＡまたはフラグメント化されたＲＮＡ群に酵素的に取り込むのに使用される。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは、ＡＴＰのＡＭＰおよびＰＰｉへの加水分解を伴い、３’と５’のホスホジエステル結合の形成により、５’リン酸末端核酸ドナーを、３’ヒドロキシル基末端核酸アクセプターに連結するのを触媒する。最小アクセプターは、トリヌクレオシド二リン酸であるが、ジヌクレオシドピロリン酸（ＮｐｐＮ）およびモノヌクレオシド３’，５’−二リン酸（ｄｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＮｐ）は、分子間反応において有効なドナーであるべきである。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｒ．Ｗ．およびＧｕｍｐｏｒｔ、Ｒ．Ｉ．（１９８３）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ：１１、６１６７〜６１６８およびＥｎｇｌａｎｄ、Ｔ．Ｅ．，Ｂｒｕｃｅ、Ａ．Ｇ．およびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｏ．Ｃ．（１９８０）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６５、６５〜７４、全ての目的のために、全体が、参考として援用されている。
【００８３】
本発明の一つの局面によると、ＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズする前に、フラグメント化したＲＮＡ（全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＲＮＡ）の末端標識化方法が、開示される。上記系は、３’−ビオチニル化ＡＭＰ（またはＣＭＰ）ドナーをＲＮＡアクセプター分子の３’末端へ連結するＴ４  ＲＮＡリガーゼを、使用する。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは、５’末端リン酸を有する、オリゴヌクレオチドドナー分子またはポリヌクレオチドドナー分子と、３’末端ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドアクセプター分子またはポリヌクレオチドアクセプター分子との間の、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒する。最小アクセプターは、トリヌクレオシド二リン酸でなければならないが、ジヌクレオシドピロリン酸（ＮｐｐＮ）およびモノヌクレオシド３’，５’−二リン酸（ｐＮｐ）は分子間反応において有効なドナーである。
【００８４】
この技術は、ＲＮＡ標的を標識するのに使用され得、そして通常入手可能な標識部分および酵素を使用する。ｃＲＮＡは、現在のＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）発現プロトコル（インビトロ転写を除いては標準ヌクレオチドで実施される）を使用し、続いて脱リン酸化および本発明に関して開示された適切な核酸標識化合物に連結して、産生し得る。
【００８５】
（検出可能な分子）
検出可能な部分は、直接的にか、または間接的にかのいずれかで、シグナルを提供する。直接的なシグナルは、標識基が、自発的にシグナルを放出するか、または適切な刺激の導入時にシグナルを発生する場合に、生成される。３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐのような放射性同位元素標識およびＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭのような磁性粒子は、直接的におよび自発的にシグナルを提供する群の、非限定例である。刺激の存在下でシグナルを直接的に提供する標識基としては、以下の非限定例：金コロイド（直径４０〜８０ｍｍ）、これは高効率で緑色光を散乱する；フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、および緑色蛍光タンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）などの蛍光標識、これらは光を吸収し、続いて光を放出する；ルミノール、ロフィン、アクリジン塩およびルシフェリンのような化学発光標識もしくは生物発光標識、これらは、化学的反応もしくは生物学的反応の結果として、電気的に励起され、続いて光を放出する；バナジウム、銅、鉄、マンガンおよびニトロキシドフリーラジカルのようなスピン標識、これらは、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法により検出される；キノリン色素、トリアリールメタン色素およびアクリジン色素のような色素、これらは、光の特定の波長を吸収する；ならびに着色ガラスもしくは着色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を参照のこと。
【００８６】
検出部分は、自発的にシグナルを放出するか、または適切な刺激の導入時にシグナルを発生する第２化合物と相互作用する場合、間接的なシグナルを提供する。
【００８７】
ビオチンは、特に好ましい検出部分である。ビオチンは、ストレプトアビジンと結合体を形成することによりシグナルを産生し、次いでそれが検出される。Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；２４巻中のＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓを参照のこと。西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素はまた、ＥＬＩＳＡアッセイのように標識−抗体−抗体の抗体に連結されており、間接的シグナルを産生する。好ましい実施形態では、複数のＳｉｇ基が、核酸標識化合物に取り込まれる。本発明の特に好ましい実施形態では、複数のビオチン基が、Ｓｉｇ基の検出される能力を、増強または亢進するよう作用し得る。
【００８８】
好ましい検出可能部分は、蛍光基である。蛍光基は、代表的には、高い信号／ノイズ比を生じ、それにより検出操作において分解能および感度を増加させている。好ましくは、蛍光基は、約３００ｎｍより上、より好ましくは約３５０ｎｍより上、さらに最も好ましくは約４１０ｎｍより上の波長の光を吸収する。蛍光基により放出される光の波長は、好ましくは約３１０ｎｍより上、より好ましくは約３６０ｎｍより上、さらに最も好ましくは４１０ｎｍより上の波長である。
【００８９】
蛍光検出可能部分は、以下：１−アミノナフタレン、２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’−ジアミノスチルベン、ピレン、フェナントリジン４級塩、９−アミノアクリジン、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンゾオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン（ｈｅｌｌｅｂｒｉｇｅｎｉｎ）、テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチラト（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、フラビン、キサンテン色素（例えばフルオレセイン色素およびローダミン色素）；シアニン色素；４，４−ジフルオロ−４−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ）色素および蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、フィコビリタンパク質（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ））
の非限定例を含む、種々の構造クラスから選択される。
【００９０】
多くの蛍光化合物が本発明に組込まれるのに適切である。そのような化合物の非限定例として、以下：ダンシルクロリド；３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール（３，６−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｐｈｅｎｙｌｘａｎｔｈｙｒｏｌ）のようなフルオレセイン；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル−１−アミノ−８−スルホナトナフタレン（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌ−１−ａｍｉｎｏ−８−ｓｕｌｆｏｎａｔｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）；Ｎ−フェニル−２−アミノ−６−スルホナトナフタレン；４−アセトアミド−４−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（４−ａｃｅｔａｍｉｄｅ−４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；ピレン−３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルホネート；Ｎ−フェニル，Ｎ−メチル−２−アミノナフタレン−６−スルホネート；臭化エチジウム；ステブリン；オーラミン（ａｕｒｏｍｉｎｅ）−０，２−（９’−アンスロイル）パルミチン酸；ダンシルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン；Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン，４−（３’ピレニル）酪酸；ｄ−３−アミノデソキシエキレニン；１２−（９’−アンスロイル）ステアリン酸；２−メチルアントラセン；９−ビニルアントラセン；２，２’−（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンゾオキサゾール；ｐ−ビス[２−（４−メチル−５−フェニルオキサゾリル）]ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェンジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）−１，１０−デカンジイルジヨード（ｄｅｃａｎｄｉｙｌ  ｄｉｉｏｄｉｄｅ）；ヘリブリエニンのスルホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド；Ｎ−[ｐ−（２−ベンゾイミダゾリル）フェニル]マレイミド；Ｎ−（４−フルオランチル)マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レサザリン（ｒｅｓａｚａｒｉｎ）；４−クロロ−７−ニトロー２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（ｂｅｎｚｏｏｘａｄｉｚｏｌｅ）；メロシアニン５４０；レゾルフィン；ローズベンガルおよび２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノンが挙げられる。好ましくは、上記蛍光検出可能部分は、フルオレセインまたはローダミン色素である。
【００９１】
別の好ましい検出可能部分は、金コロイドである。上記金コロイド粒子は、代表的には直径４０〜８０ｍｍである。上記金コロイドは、種々の方法で、標識化合物に連結され得る。一つの実施形態では、核酸標識化合物のリンカー部分は、末端がチオール基（−ＳＨ）であって、そのチオール基が配位結合により、金コロイドと直接結合される。Ｍｉｒｋｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６、３８２、６０７〜６０９を参照のこと。別の実施形態では、例えば、金コロイド−抗ビオチンの結合体とビオチニル化標識化合物との相互作用により、間接的に連結される。金標識化合物の検出は、銀増強方法の使用により、増強され得る。Ｄａｎｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈ  １９９３、１６、２０１〜２０７を参照のこと。
【００９２】
本発明によると、目的とするＲＮＡの存在を検出する方法が提示され、その方法は、以下の工程：目的とするＲＮＡを有し得るかまたは有し得ないＲＮＡのサンプルを提供する工程；そのＲＮＡを下記式：
【００９３】
【化２５】
2006136322.tif 000026
を有する標識試薬に結合する工程であって、ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり；Ｘは、核酸標識化合物が、上記フラグメントの３’ＯＨ基に連結するのを可能にする官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲもしくはハロゲンからなる群より選択される；Ｌは、リンカー基；およびＳｉｇは、標識ＲＮＡを提供する検出可能部分である、工程；目的とする上記ＲＮＡに指向されたプローブを有する核酸アレイを提供する工程；標識ＲＮＡを上記核酸アレイとハイブリダイズする工程；ならびに目的とする上記ＲＮＡの存在を決定するために、上記プローブに対するハイブリダイゼーションの程度を決定する工程を、有する。
【００９４】
本発明の上記局面に従って、ＲＮＡはマイクロＲＮＡを含む。ｃＲＮＡまたはｍＲＮＡのようなより長いＲＮＡのために、上記方法は、ＲＮＡフラグメントを提供するために、上記サンプルを、フラグメント試薬で処理をする工程；および上記サンプルを提供する工程の後であって、上記連結する工程の前に、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供するために、上記フラグメントからリン酸基を除去する工程をさらに有し得る。３’リン酸基は、ＭｇまたはＲＮＡｓｅＩＩＩのようなフラグメント化試薬の通常の生成物である。上記リン酸基は、リガーゼが核酸標識化合物を付加することを可能にするために除去されなければならない。従って、本発明のこの局面に関して、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡが好ましい。しかしながらマイクロＲＮＡは、３’リン酸基を有しないので、それらは元々短く，２５未満のヌクレオチドであることは、理解される。従って、それらは、フラグメント化またはホスファターゼ処理は必要としない。
【００９５】
好ましいフラグメント化試薬は、ＲＮＡｓｅＩＩＩ、およびＭｇ２＋のような２価金属イオンを含み、そして中性からアルカリの範囲のｐＨを有する緩衝液からなる群より選択される。リン酸基は、アルカリホスファターゼにより３’ヒドロキシル基から除去され得る。
【００９６】
Ｘは、好ましくは、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、またはＫ＋からなる群より選択される適切な対イオンを有する、ＨＯ−、ＰＯ４２−−、Ｐ２Ｏ７３−−、Ｐ３Ｏ１０４−−、ＯＰ（Ｓ）Ｏ２２−およびアデノシン−（５’）−Ｐ２Ｏ７＝−からなる群より選択される。Ｙは、好ましくはＯＨである。リガーゼ（Ｌｉｓａｓｅ）は、好ましくは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼである。核酸アレイは、オリゴヌクレオチドアレイであることが好ましい。より好ましくは、オリゴヌクレオチドアレイは、フォトリソグラフィーで調製される。
【００９７】
上記リンカー基は、好ましくは、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、およびＣＨ２−ＣＨ（ＯＰＯ３＝）−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−からなる群より選択される。より好ましくは、Ｌは、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−である。
【００９８】
本発明の一つの局面によると、Ｘは、ＰＯ４２−である。Ｂは、ピリミジン塩基、プリン塩基、天然塩基アナログおよび非天然アナログからなる群より選択される。より好ましくは，Ｂは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される。より好ましくは、Ｂは、アデニンおよびシトシンの群より選択される。最も好ましくは、Ｂは、シトシンである。
【００９９】
好ましい標識試薬は、以下：
【０１００】
【化２６】
2006136322.tif 000027
であり、
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である。好ましくは、Ｒは、Ｈである。別の好ましい標識試薬は、以下：
【０１０１】
【化２７】
2006136322.tif 000028
ここで、Ｒは、ＨまたはＰＯ３２−である。好ましくは、Ｒは、Ｈである。
【０１０２】
別の好ましい標識試薬は、以下の構造：
【０１０３】
【化２８】
2006136322.tif 000029
であり、
ここで、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され；Ｒは、ＨまたはＰＯ３＝である。好ましくは，Ｂは、アデニンおよびシトシンの群より選択され、そしてＲは、Ｈである。より好ましくは，Ｂはアデニンである。別の好ましい実施形態では、Ｂはシトシンであり、そしてＲは、Ｈである。
【０１０４】
目的とするＲＮＡの存在を検出する好ましい方法は、以下の工程を有する；目的とするＲＮＡを有し得るか、または有し得ない、ＲＮＡを含むサンプルを提供する工程；および下記式：
【０１０５】
【化２９】
2006136322.tif 000030
であり、
ここで、Ｂは、ヘテロ環部分であり；およびＲは、ＨおよびＰＯ３＝からなる群より選択され、そしてｎは、１〜６である、
式を有する標識試薬と上記ＲＮＡを連結する工程；目的とする上記遺伝子に対応するプローブを有する核酸アレイを提供する工程；上記標識核酸フラグメントを核酸アレイにハイブリダイズする工程；ならびに上記プローブに対するハイブリダイゼーションの程度を決定して、上記目的とするＲＮＡの存在を決定する工程。上記方法に関して、マイクロＲＮＡが、好ましい。
【０１０６】
好ましい実施形態では、上記方法は、フラグメント化試薬でサンプルを処理して、ＲＮＡフラグメントを提供する工程；および上記サンプルを提供する工程の後で、そして上記連結する工程の前に、上記フラグメントからリン酸基を除いて、遊離の３’ＯＨ基を有するフラグメントを提供する工程を、さらに包含する。この操作に関して、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡは、テンプレートとして好ましい。
【０１０７】
好ましくは、フラグメント化試薬は、ＲＮＡｓｅＩＩＩ、およびＭｇ２＋のような２価の金属イオンを含有し、そして中性からアルカリ範囲のｐＨを有するＡ緩衝液からなる群より選択される。３’ヒドロキシル基からリン酸基を除去する工程は、好ましくは、アルカリホスファターゼにより行われる。
【０１０８】
Ｂは、好ましくはアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され、そしてｎは、２〜４である。より好ましくは、Ｂは、アデニンおよびシトシンの群より選択される。最も好ましくは、Ｂはシトシンである。ｎは、好ましくは２〜４である。より好ましくは、ｎは、３である。
【０１０９】
好ましい標識試薬は、以下：
【０１１０】
【化３０】
2006136322.tif 000031
である。
他の好ましい標識化試薬は、以下：
【０１１１】
【化３１】
2006136322.tif 000032
である。
本発明はまた、核酸標識化合物を提供する。一つの好ましい化合物は下記：
【０１１２】
【化３２】
2006136322.tif 000033
であり、
ここでＢは、ヘテロ環塩基部分であり；Ｘは、上記フラグメントの３’ＯＨ基へ核酸標識化合物を連結可能にする官能基であり；Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨＲまたはハロゲンからなる群より選択され；Ｌは、リンカー基であり；そしてＳｉｇは、検出可能な部分である。
【０１１３】
Ｌは、好ましくは、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−およびＣＨ２−ＣＨ（ＯＰＯ３＝）−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−からなる群より選択される。
【０１１４】
より好ましくは、Ｌは、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）３−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−である。
【０１１５】
Ｘは、好ましくは、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、またはＫ＋からなる群より選択される適切な対イオンを有する、ＨＯ−、ＰＯ４２−−、Ｐ２Ｏ７３−−、Ｐ３Ｏ１０４−−、ＯＰ（Ｓ）Ｏ２２−およびアデノシン−（５’）−Ｐ２Ｏ７＝−からなる群より選択される。Ｙは、好ましくはＯＨである。Ｂは、ピリミジン塩基、プリン塩基、天然塩基アナログおよび非天然アナログからなる群より選択される。Ｂは、より好ましくは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される。より好ましくは，Ｂは、アデニンおよびシトシンの群より選択される。さらに、より好ましくは，Ｂは、シトシンである。
【０１１６】
本発明の好ましい核酸標識化合物において、上記化合物は下記の構造：
【０１１７】
【化３３】
2006136322.tif 000034
を有し、
ここで、Ｌはリンカーであり、Ｓｉｇは、検出可能部分であり；Ｂ１はアデニンであり，そしてＢは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択される。
【０１１８】
５０．以下の式：
【０１１９】
【化３４】
2006136322.tif 000035
であり、
ここで、Ｂ１はアデニンであり，Ｂは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルからなる群より選択され；Ｒは、ＨまたはＰＯ３＝である、
構造を有する請求項４４に記載の核酸標識化合物。
【０１２０】
上の式による好ましい化合物は、以下：
【０１２１】
【化３５】
2006136322.tif 000036
の構造を有する。
【０１２２】
本発明のさらに別の好ましい化合物は以下の式：
【０１２３】
【化３６】
2006136322.tif 000037
を有し、
ここで、Ｂは、へテロ環塩基部分であり、Ｌ１は、第一リンカーであり、Ｌ２は、第２リンカーであり、Ｓｉｇは、検出可能部分であり、そしてｎは、１〜６の整数である。
【０１２４】
本発明のこの局面による好ましい化合物は、以下の式：
【０１２５】
【化３７】
2006136322.tif 000038
であり、
ここで、Ｂは、ヘテロ環塩基部分であり；そしてＲは、ＨおよびＰＯ３＝からなる群より選択される。
【０１２６】
本発明は、以下の非限定実施例により、さらに理解される。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１）
（５’−ｐＣｐ−３’−リンカー−ビオチンおよび５’−ｐＡｐ−３’−リンカー−ビオチンの合成のための手順）
本化合物を、市販の試薬を使用して固相ホスホアミダイト化学法により作製した。例えば、米国特許第４，４１５，７３２号；ＭｃＢｒｉｄｅ、Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２４：２４５〜２４８（１９８３）；およびＳｉｎｈａ、Ｎ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４５３９〜４５５７（１９８４）を参照のこと（両方とも本明細書に参考として援用されている）。上記３’ビオチニル化リンカー誘導体は、市販のＢｉｏｔｉｎＴＥＧ固体支持体から誘導する（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）。上記試薬の構造は以下：
【０１２８】
【化３８】
2006136322.tif 000039
に示される。
【０１２９】
（実施例２）
（３’−ＡｐｐＣ−３’−リンカー−ビオチンドナー分子の合成の手順）
上記予めアデニル化されているピロリン酸ドナー、Ａ（５’）ｐｐ（５’）Ｃｐ（ビオチン−ＴＥＧ）−３’を、文献（７）の手順に従って、ｐ（５’）Ｃｐ（ビオチン−ＴＥＧ）−３’とアデノシン−５’−モノホスホルモルホリデート（Ｓｉｇｍａ）との液相縮合（図２）により調製した。その生成物を、逆相ＨＰＬＣ、続いてイオン交換ＨＰＬＣにより９５％より高い純度まで精製し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより特性を調べた。
【０１３０】
【化３９】
2006136322.tif 000040
（実施例３）
（コントロールおよびサンプルの調製）
非標識のｃＲＮＡを、非標識リボヌクレオチドが、インビトロ転写で使用される場合を除いて、推奨されるＧｅｎｅＣｈｉｐ発現プロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ，、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従って、全ＲＮＡ（これらのデータにおいて出発物質として１μｇのヒト心臓ＲＮＡ）から調製した。代表的な反応において、１０マイクログラムの上記ｃＲＮＡを、標準的フラグメント化緩衝液（４０ｍＭ  トリス−酢酸塩、３０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１００ｍＭ  酢酸カリウム）中においてフラグメント化し，Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、最終濃度０．０１Ｕ／μｌで、脱リン酸化した。次いで、６５℃、１５分間で、上記Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを熱不活化し、そしてこの反応物を、エタノール沈殿により精製した。上記フラグメント化したｃＲＮＡを、上記推奨緩衝液中２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）と共に１００μＭ  ３’ビオチン−ＣＭＰおよび１６％ＰＥＧを含有する、連結反応に３７℃、２時間入れた。上記連結反応物を、次いで、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、０．１ｍｇ／ｍｌのＨｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、５０ｐＭ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）および１ＸＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．）を含有するハイブリダイゼーションカクテルへ添加し、全容量を２２０μｌにした。２２０μｌの標識ｃＲＮＡ標的をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨｕＵ９５Ａｖ２アレイに、４５℃、１６時間、ハイブリダイズした。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ技術マニュアルに推奨されている標準的洗浄および染色プロトコルを使用した。分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０を使用して、行った。
【０１３１】
図１は、末端標識ＲＮＡおよび内部標識ＲＮＡの存在コール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）％および平均−平均差を示す。上記平均−平均差は、マイクロアレイ上の全体のプローブ群にわたって平均化された、完全マッチプローブの強度からミスマッチプローブの強度を差引いたもので、全体のシグナル強度の尺度である。上記存在コール％は、遺伝子プローブ群強度を基礎にしたＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）ソフトウエアの出力である。両者とも、標識効率およびＲＮＡ完全性の基準であると考えられる。内部標識ＲＮＡを使用するより、連結反応法を使用する方が、より多くの遺伝子が存在コールされる。さらに蛍光シグナル（平均−平均差で測定される場合）は、上記連結反応法の方がより高い。
【０１３２】
連結反応標識方法の再現性を試験するために、４つの独立した反応を、非標識リボヌクレオチドが、インビトロ転写で使用される場合を除いて、推奨されるＧｅｎｅＣｈｉｐ発現プロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ，、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従って、全ヒト心臓ＲＮＡから出発して行った。４５μｇの得られたｃＲＮＡを、フラグメント化し，２連の５１μｌ反応物中で最終濃度０．０１Ｕ／μｌのＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅになるようにし、３７℃、１時間処理した。次いで、６５℃、１５分間で、上記Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを熱不活化し、その反応物を、エタノール沈殿により精製した。１１μｇのフラグメント化した、脱リン酸化したｃＲＮＡを、２連の３３μｌの反応物中で、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび１６％ＰＥＧで、３７℃、２時間、１００μＭ  ３’ビオチンーＣＭＰに連結させた。各３３μｌの連結反応物を、次いで、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍｇ／ｍｌのＨｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ、５０ｐＭ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２および１Ｘ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓを含有するハイブリダイゼーションカクテルへ添加し、全容量を２２０μｌにした。２００μｌの標識ｃＲＮＡ標的をＨｕＵ９５Ａｖ２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ，、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に、４５℃、１６時間、ハイブリダイズした。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ技術マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ，、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に推奨されている標準的洗浄および染色プロトコルを使用した。分析は、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ，、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、行った。
【０１３３】
２連の反応物からの発現データの定量的な比較により、２連の間の相関係数（Ｒ２）は、０．９８〜０．９９であり、末端標識方法の高い再現性を強調する。末端標識の２連と内部標識の２連と比較すると、Ｒ２は、０．８８〜０．９４である。
【０１３４】
（実施例４）
表１は本発明の核酸標識試薬（また、さらなる詳細は、上に記載されている）を要約し、そしてまた便利な略号を提供する。
【０１３５】
【表１】
2006136322.tif 000041
（実施例５）
（ＲＬＲ−４ａおよびＲＬＲ−４ｂの連結効率）
これらの実験の目的は、連結媒介標識の概念を示し、そして二つの異なるＲＮＡ標識試薬（ＲＬＲ）：ＲＬＲ−４ａ、（５’ｐＡｐ−ＴＥＧ−ビオチン−３’）およびＲＬＲ−４ｂ，（５’−ｐＡ５ｐ−ＴＥＧ−ビオチン−３’）[１０]の標識効率を決定することにある。ＲＬＲ濃度（１μＭ〜２５０μＭ）およびＴ４  ＲＮＡリガーゼ濃度（１Ｕ／μｌ〜４Ｕ／μｌ）ならびに連結反応時間（４時間および８時間）を試験した。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使用しない１反応を、陰性コントロールとした。別の連結反応を、脱リン酸化の必要性を試験するためにｃＲＮＡ脱リン酸化工程を省略した。全ての反応は、ヒト心臓ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）で実施し、標準的条件（１０μｇ標識ｃＲＮＡを、１Ｘ  ハイブリダイゼーション溶液[１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  Ｎａ＋、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０，０１％Ｔｗｅｅｎ２０]中で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間ハイブリダイズした）下で、Ｈｕｍａｎ  Ｕ９５Ａｖ２アレイに、ハイブリダイズした。上記アレイを洗浄し、（単一染色プロトコルを使用して）染色し、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃｓプロトコルに従って、スキャンした。
【０１３６】
各ＲＬＲ化合物について、以下の濃度を試験した：５０μＭ、１０μＭおよび１μＭ。連結反応を２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３０℃、４時間行った。一つのＲＥＬＡサンプルを、比較のためにＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで処理しないで、５０μＭの濃度でＲＬＲ−４ａと連結した。
【０１３７】
上記シグナル（ＡｖｇＡｖｇ差）およびプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率（％Ｐ）の両方は、ＲＬＲ濃度およびＴ４  ＲＮＡリガーゼ濃度を、独立して増加させることにより改善された。最良の成績を、酵素濃度とあわせてＲＬＲ濃度を増加した時に達成した。上記モノヌクレオチドＲＬＲ−４ａは、同じ濃度では５マーのペンタヌクレオチドＲＬＲ−４ｂよりも良い結果を一貫して得た。４時間のインキュベーションと８時間のインキュベーションとの間では、有意な差は観察されなかった。５０μＭ  ＲＬＲ−４ａ  非ＳＡＰ処理サンプルにおける低いシグナルおよびプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）の数に示されるように、ｃＲＮＡの脱リン酸化が、効率的な連結反応に必要である。バックグランド強度は、全てのアレイにわたり、同等であった。この段階で、３０℃、４時間での最適反応条件は、２５０μＭ  ＲＬＲ−４ａ、４Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼであった。これらの実験は、ＤＮＡマイクロアレイでの使用のための末端標識ＲＮＡの実行可能性を例証する。
【０１３８】
（実施例６）
（ＲＬＲ−５の連結効率）
本発明者らは、次に、連結反応において一定範囲のＲＬＲ−５（５’−ｐＣｐ−ＴＥＧ−ビオチン−３’）濃度について試験した。文献では、５’−[３２Ｐ]ｐＣｐ−３’は、殆どの放射能標識条件下では、好ましいドナーと推定される［５］。本発明者らは、２０℃で、以下のＲＬＲ−５の濃度範囲について試験した：５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ。さらに、二つの２５０μＭ  ＲＬＲ−５反応を、２０℃の反応温度との比較のために３０℃および３７℃でインキュベートした。上記連結反応を、ヒト心臓ＲＮＡ、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび１６％ＰＥＧを使用して２時間行った。
【０１３９】
全てのＲＬＲ−５サンプルについて、標準と比較して等価またはより良いシグナルを得た。上記１００μＭ  ＲＬＲ−５サンプルは、最高のシグナルを生じたが、この差は実験誤差範囲内であり得る。２５０μＭ  ＲＬＲ−５サンプルの、インキュベーション温度が、２０℃、３０℃、および３７℃での間でシグナルについて有意差はなかった。しかしながら、３７℃での２５０μＭ  ＲＬＲ−５のインキュベーションは、試験した全ての条件の中では、最良のプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率を生じた。５０μＭ〜２５０μＭの間のＲＬＲ−５の濃度は、標準と比較すると等価またはより良いプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率を生じた；５００μＭ以上のＲＬＲ−５濃度は、シグナル強度は高いままであったが、僅かに低いプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）で示されるように、僅かに阻害的であり得る。これらの実験結果は、ＲＬＲ−５は、ＲＬＲ−４ａよりも僅かに性能が優れていることを例証する；５０μＭ  ＲＬＲ濃度、１６％ＰＥＧおよび２０℃で、ＲＬＲ−５は、ＲＬＲ−４ａ（５０μＭ  ＲＬＲ−４ａ、１６％ＰＥＧ、２０℃、３２％Ｐ、１０４未補正シグナル；９３補正シグナル）よりも、僅かに高いシグナルおよびプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）を有する。
【０１４０】
標準法とＲＥＬＡ法とのＲ２相関は、０．９３〜０．９４の範囲であった。異なる連結反応間のＲ２相関は、０．９７〜０．９９の範囲であった。これは標準標識法の分散に匹敵する。
【０１４１】
（実施例７）
（ＲＬＲ−６の連結効率）
この実験では、本発明者らは、上記連結反応において種々の濃度のＲＬＲ−６（Ａ（５’）ｐｐ（５’）Ｃｐ−ＴＥＧ−ビオチン−３’）アデニル化ドナー中間体の性能を試験した。本発明者らはまた、上記反応の速度論を測定し、アレイ性能に対する、連結時間、ＲＬＲ濃度および酵素濃度の効果を比較した。以下の７つの反応を、Ｕ９５Ａｖ２アレイ上で、ヒト心臓ＲＮＡを使用して行った：
【０１４２】
【表２】
2006136322.tif 000042
ほんの２０分間後、１００μＭ濃度および２００μＭ濃度のＲＬＲ−６を、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼと一緒にすると、標準と比較して等価またはより良いシグナルを得た。シグナルは、１００μＭ  ＲＬＲ−６反応において、反応時間が５分間から２０分間〜１００分間へ増加するにつれて増加する。同様に、シグナルは、２０分間の連結時間でＲＬＲ−６濃度が５０μＭから１００μＭ〜２００μＭに増加するにつれて、増加する。最高のシグナルを、１００μＭ  ＲＬＲ−６、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、１２０分間の反応で、達成した；上記シグナルは、標準のシグナルとよく相関し、Ｒ２相関は、０．９３であった。次に高かったシグナルを、２００μＭ、２０分間の連結反応で達成した。これは標準と比較してＲ２相関０．９４を有した。
【０１４３】
酵素濃度に関しては、０．５Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（すなわち、正常量の４分の１）を使用すると、シグナルは、半分に減少した。上記プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）結果は、シグナル結果と同じ傾向になった。５分間の反応および０．５Ｕ／μｌのリガーゼ反応を除いては、全ての反応は、標準と比較して、等価またはそれより良い数のプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）を生じた。全体として最良の結果になった条件は、１００μＭ  ＲＬＲ−６、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、２時間の反応であった。次に良い結果は、２００μＭ、２０分間の反応であって、これは、プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）がほぼ同等であったが、シグナルが僅かに低かった。
【０１４４】
本発明者らはまた、ＲＬＲ−６との連結反応におけるＡＴＰの必要性について試験した。ＲＬＲ６は、予めアデニル化されたドナー分子であるので、ＡＴＰは、連結反応には必要ではないはずであり、阻害性の可能性があり得る[７]。実際に、上記反応を、ＡＴＰ無しで実施すると、ＡＴＰは、ＲＬＲ−６との効率的な連結には必要でないことが例証された。本発明者らは、ＡＴＰの存在は、僅かに阻害効果を有することを見出した。
【０１４５】
（実施例８）
（連結反応添加剤）
本実験において、本発明者らは、核酸を含む、種々の酵素反能を亢進することが公知であり物質を添加することにより、連結効率を増加させるように努めた。文献の報告では、ＢＳＡ、ＤＭＳＯ、およびＰＥＧのような添加剤が、いくつかの物質について連結効率を改善し得ること示唆する［１１、１２］。フラグメント化され脱リン酸化されたヒト心臓ｃＲＮＡから出発して、本発明者らは以下の添加剤を用いる連結について試験した：１）１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２）１０％  ＤＭＳＯ、３）１６％ＰＥＧ  ８０００、４）または、添加剤無し（コントロール）。上記４つの反応を、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＢから）、および５０μＭ  ＲＬＲ−４ａ（第２最適連結条件）で行った。添加剤無しでＰｒｏｍｅｇａＴ４  ＲＮＡリガーゼを使用した５番目の反応を、業者の比較のために含めた。上記連結反応物を、標準的な条件下で、Ｕ９５Ａｖ２アレイにハイブリダイズさせた。
【０１４６】
３つの添加剤のうち、ＰＥＧのみが、アレイ性能に関して、連結効率に対する有意な効果を有した。１６％のＰＥＧの添加は、非添加コントロールと比較して、全体のシグナル強度およびプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）％を劇的に増加させた。ＢＳＡは、より低いシグナル強度およびより低いプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率により示されるように、連結を阻害するようであった。上記ＤＭＳＯは、シグナルにもプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率にも影響しなかった。酵素の性能に関しては、上記ＮＥＢ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａバージョンよりもずっと効果的であり、試験した全ての条件で最低のシグナルおよび最低のプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率であった。
【０１４７】
本発明者らは、連結反応における最適ＰＥＧ濃度の同定をすることにした。以前の最適化実験で、本発明者らは、試験した種々の条件の間の僅かの差を識別するために、２番目に最適な条件下で連結反応を試験した。上記連結反応を、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび５０μＭ  ＲＬＲ−４ａ、２０℃、２時間にて、以下のＰＥＧ濃度を用いて行った：０％、１０％、１６％および２５％。本発明者らはまた、より高濃度のＲＬＲ−４ａ、１７９μＭ±１６％ＰＥＧで試験した。上記連結は、標準的条件下でＵ９５Ａｖ２アレイにハイブリダイズした。
【０１４８】
連結反応においてＰＥＧ濃度が増加すると、上記シグナルおよびプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）％の両方が増加した。５０μＭ  ＲＬＲ−４ａサブセット内で、最良のシグナルを、２５％ＰＥＧ連結反応で達成した。プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）に関しては、１６％ＰＥＧおよび２５％ＰＥＧの連結反応は、同じ結果を生じ、標準より約２％プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）％が、高かった。ＰＥＧの添加は、試験した最高濃度のＲＬＲ−４ａ（１７９μＭ）においてさえ、有益であることを証明した。１６％のＰＥＧの添加は、「ＰＥＧ無し」コントロールと比較して、シグナルが１．３倍増加し、プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）がほぼ６％増加した。ＰＥＧ溶液の高い粘度に起因して、最終濃度１６％のＰＥＧは、アレイ性能を高め、方法論的に御しやすいことを、本発明者らは見出した。
【０１４９】
（実施例９）
（ＲＮＡフラグメント化：Ｍｇ２＋加水分解パラメータの試験）
アレイ性能を最適化するために、本発明者らは、種々のフラグメント化緩衝液を試験し、アレイ性能に対するフラグメント長の効果を調べた。ＲＥＬＡ法に関して、本発明者らは、フラグメント長と、アレイ強度と、検出感度との関係を試験した。
【０１５０】
下流連結反応は、フラグメント化緩衝液に影響を受けるので、本発明者らは、より低い１価イオン濃度および代替的カチオン組成を有する緩衝液を調べた。標識ｃＲＮＡおよび非標識ｃＲＮＡを、標準発現プロトコルに従って、ＨｅＬａ全ＲＮＡより調製した。標識ｃＲＮＡと非標識ｃＲＮＡとの両方を、以下の緩衝液中でＭｇ２＋および高熱を使用してフラグメント化した：ａ）５Ｘ＝２００ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ８．１）、１５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、５００ｍＭ  ＫＯＡｃ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ標準）  ｂ）５Ｘ＝２００ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ（ｐＨ８．２）、ｃ）５Ｘ＝２００ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ８．２）。上記フラグメント化非標識ｃＲＮＡを、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを３７℃にて１時間用いて脱リン酸化し、続いて６５℃で１５分間、熱失活した。上記脱リン酸化されフラグメント化されたｃＲＮＡを、１００μＭ  ＲＬＲ−６を用いて、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、１６％ＰＥＧを含有する反応液中で、３７℃にて２時間、末端標識した。全ての反応について、１０μｇの標識ｃＲＮＡを、Ｕ１３３Ａアレイにハイブリダイズし、そして標準抗体増幅プロトコルに従って進めた。
【０１５１】
ＲＥＬＡおよびＳＴＤの両方に関して、ＭｇＯＡｃは、最高全体シグナル強度およびプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）数については、ＭｇＣｌ２より好ましい。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの市販の緩衝液でフラグメント化された標準ｃＲＮＡは、これまでは最良の性能であった。改変緩衝液でのｃＲＮＡのフラグメント化は、プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）の数およびシグナル強度の両方を有意に減少させた。上記ＲＥＬＡサンプルに関して、プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率は、試験した異なるフラグメント化緩衝液間では有意な変化は無かった。しかしながら、ＭｇＯＡｃ含有緩衝液でフラグメント化されたＲＥＬＡサンプルは、ＭｇＣｌ２緩衝液でフラグメント化されたサンプルより高いシグナルを有した。
【０１５２】
（実施例１０）
（複数のビオチンによる末端標識：ＲＬＲ−７、ＲＬＲ−８およびＲＬＲ−９）
本発明の一つの局面によると、Ｓｉｇ部分は、複数のビオチン残基を有し得る。本発明によると、ＲＮＡを末端標識する複数のビオチン残基を有する核酸標識化合物の使用は、標的ＲＮＡシグナルおよび検出感度を増強する可能性を有することが発見された。しかしながら、予備的データは、本発明に従って記載されるようにＳｉｇ部分へ取り込まれ得、かつ検出を目的のとするＲＮＡの末端標識に有用に使用され得るビオチン残基の数には、制限があることを示す。
【０１５３】
ドナー分子に有用に取り込まれ得るビオチン部分の数に対して存在し得る制限に関して、リボースの３’位に連結された５つのＴＥＧビオチンを有するドナー分子（５’−ｐＣｐ−（ＴＥＧ−ビオチン）５−３’）（ＲＬＲ−７と呼ばれる）を合成した。予備的実験で、ＲＮＡをＲＬＲ−７で標識し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイにハイブリダイズし、この実験において、異常なハイブリダイゼーションの結果を得た。ＲＬＲ−７で標識したＲＮＡのハイブリダイゼーションの全体的パターンは、一つのビオチンを有する標準およびＲＬＲ−５のハイブリダイゼーションパターンと、いくらか類似している。しかしながら、多くの場合、ＲＬＲ−７ハイブリダイゼーションは、シグナルが存在するはずの領域を欠き、標準には存在しない領域を発色させた。ＲＬＲ−７を使用したこの予備的データの重要性は、仮にあるとしても、現在は不明である。
【０１５４】
ビオチン部分が５つより少ないドナー分子を調製した：ＲＬＲ−８（２ビオチン）およびＲＬＲ−９（３ビオチン）。ＲＬＲ−９は、未補正では最高のシグナル強度を示した。しかしながら、バックグランド強度は、シグナルの増加に従って、比例的に増加する。実施された上記予備的実験において、ＲＬＲ−９は、試験された他のＲＮＡ標識試薬と比較して性能が良かった。最高のバックグランドを有するにもかかわらず、ＲＬＲ−９は、ＲＬＲ−５およびＲＬＲ−８と比較して、全体として最高のプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）数を有した。
【０１５５】
（実施例１１）
（ＰＥＧ最適化）
本実験では、本発明者らは、連結反応における最適のＰＥＧ濃度を同定することにした。以前の最適化実験に関しては、本発明者らは、試験された種々の条件間での僅かな差を識別するために２番目に最適な条件下で連結を試験した。上記連結反応を、２Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、５０μＭ  ＲＬＲ−４ａを用いて、２０℃にて２時間、以下の濃度のＰＥＧを用いて行った：０％、１０％、１６％および２５％。本発明者らはまた、より高濃度のＲＬＲ−４ａ（１７９μＭ）±１６％ＰＥＧを試験した。その連結物を、Ｕ９５Ａｖ２アレイに対して標準条件下でハイブリダイズさせた。
【０１５６】
上記連結反応においてＰＥＧ濃度が増加すると、上記シグナルおよびプレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）％の両方が増加した。５０μＭ  ＲＬＲ−４ａサブセット内で、最良のシグナルを、２５％ＰＥＧ連結反応で達成した。プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）に関しては、１６％ＰＥＧおよび２５％ＰＥＧでの連結反応では、同じ結果が得られ、標準より約２％プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）％が、高かった。ＰＥＧの添加は、試験した最高濃度のＲＬＲ−４ａ（１７９μＭ）においてさえ有益であることが、証明された。１６％のＰＥＧの添加は、「ＰＥＧ無し」コントロールと比較して、シグナルが１．３倍増加し、プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）がほぼ６％増加した。ＰＥＧ溶液の高い粘度に起因して、最終濃度１６％のＰＥＧは、アレイ性能を高め、方法論的に御しやすいことを、本発明者らは見出した。
【０１５７】
（実施例１２）
（ＲＮａｓｅＩＩＩでフラグメント化したｃＲＮＡのアレイ性能）
本実験において、本発明者らは、標準法との比較のために、ＲＥＬＡプロトコル（ＲＮＡ末端標識分析）内で二つの異なるＲＮＡフラグメント化法を試験した。以前に、ゲルシフトアッセイにより、Ｍｇ２＋で加水分解したＲＮＡが、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使用して効率的には連結されないことが、明らかになった。従って、本発明者らは、消化のためにＲＮａｓｅＩＩＩを使用する、別のフラグメント化法に変えた。本発明者らは、ＲＮＡを、１０μｇのｃＲＮＡにつき１単位の酵素を用いて、３７℃にて３５分間消化した。そのＲＮａｓｅＩＩＩ酵素を、その後、６５℃にて２０分間、熱失化させた。次いで、そのフラグメント化されたＲＮＡを、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを使用して脱リン酸化し、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いてＲＬＲ−５に連結した。
【０１５８】
【表３】
2006136322.tif 000043
三つの反応に関して、本発明者らは、上記アッセイの長さを低減するために、ＲＮａｓｅ消化と脱リン酸化工程を一体化して試験した。これ以降、本発明者らは、これらの反応を「２工程」という。なぜなら、ＲＥＬＡプロトコルが、実質上２工程（１）フラグメント化および脱リン酸化、２）連結）に減少されたからである。これらの反応に関して、フラグメント化および脱リン酸化は、３５分間または４０分間、同時に起こり、続いて両方の酵素の熱失活を６５℃にて２０分間行った。いくつかの標的を、高温により識別が改善されるという以前の発見を基礎にして、５０℃でハイブリダイズさせた。全ての反応を二連で行い、標準プロトコルに従って、Ｕ１３３Ａにハイブリダイズさせた。
【０１５９】
ＲＮａｓｅフラグメント化は、シグナル強度を有意に改善する。ＲＥＬＡプロトコル内で、ＲＮａｓｅ消化は、Ｍｇ２＋で加水分解したｃＲＮＡの２倍、強度を改善する。これは、ＲＮａｓｅ消化したＲＮＡが、Ｍｇ２＋で加水分解したＲＮＡよりも効率的に連結されることを示すゲルシフト結果と一致する。標準プロトコルと比較して、ＲＮａｓｅフラグメント化は、シグナルをほぼ１．２倍に増加する。ＲＮａｓｅ消化した標的を５０℃でハイブリダイゼーションすると、４５℃でのハイブリダイゼーションに対してシグナル強度が５〜１０％低下するが、これらのシグナルは、４５℃でハイブリダイズする標準のシグナルよりも依然として高かった。上記２工程反応は、ＲＥＬＡプロトコルの標準バージョンを使用して調製されるものと同じく、性能が良く、シグナルは２４０以上であった。
【０１６０】
【表４】
2006136322.tif 000044
前述の参考文献は、本明細書に参考として援用されている。
【０１６１】
本明細書で記載されている実施例および実施の形態は、単に説明の目的であり、その見地における種々の改変または変化は、当業者に示唆され、かつ本出願の趣旨および本文ならびに添付の請求項の範囲内に包含されるべきものと理解される。本明細書で引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、本明細書に参考として全ての目的のために援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１。それぞれ４連の内部標識ｃＲＮＡ（標準平均（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ））に対する末端標識ｃＲＮＡ（連結平均（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ））の比較。連結反応による末端標識は、結果的に内部標識ｃＲＮＡと比較して、より多数の存在コール、そしてより高い標的強度（平均−平均差（ａｖｅｒａｇｅ  ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ））により測定）を得る。
【図１】
2006136322.tif 000067
【外国語明細書】
2006136322000001.pdf