(57)【要約】【課題】結核を予防、処置、および検出するための改善されたワクチンおよび方法の提供。【解決手段】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の検出、処置、および予防であって、より詳細には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、またはその部分もしくは他の変異体を含むポリペプチド、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に対する診断およびワクチン接種のためのこのようなポリペプチドの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、
（ｉ）配列番号８８に記載のアミノ酸配列；
（ｉｉ）１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加を有する、配列番号８８に記載のアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号８８に記載の免疫原部分
を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号８８に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号８８に記載のアミノ酸配列またはその免疫原性部分含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換えデオキシリボ核酸分子。
【請求項５】
配列番号８８に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の組換えデオキシリボ核酸分子。
【請求項６】
配列番号４６に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項４〜５のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸分子。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のデオキシリボ核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項９】
配列番号８８のアミノ酸配列、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加を有する、配列番号８８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８８に記載の免疫原部分を含むポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号８８のアミノ酸配列、１個または数個のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加を有する、配列番号８８に記載のアミノ酸配列、または配列番号８８に記載の免疫原部分、ならびに、ペプチド結合を介して結合されている、１以上のさらなる免疫原性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ配列を含む、組合せポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のデオキシリボ核酸分子、請求項９に記載の融合タンパク質または請求項１０に記載の組合せポリペプチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリペプチド、ならびに非特異的免疫応答エンハンサーを含む、ワクチン。
【請求項１４】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のデオキシリボ核酸分子、請求項９に記載の融合タンパク質または請求項１０に記載の組合せポリペプチド、および非特異的免疫応答エンハンサーを含む、ワクチン。
【請求項１５】
前記非特異的免疫応答エンハンサーが、アジュバントである、請求項１３または１４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１６】
患者における防御免疫を誘導するためのワクチンの製造において、請求項１に記載のポリペプチドを使用するための方法。
【請求項１７】
患者における防御免疫を誘導するためのワクチンの製造において、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組換えデオキシリボ核酸、請求項９に記載の融合タンパク質、請求項１０に記載の組合せポリペプチド、あるいは、請求項１１または１２のいずれかに記載の薬学的組成物を使用するための方法。
【請求項１８】
患者における結核を検出するための診断剤の製造において、請求項１に記載のポリペプチドを含む組成物を使用するための方法。
【請求項１９】
診断キットであって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド；および
（ｂ）患者の皮膚細胞を該ポリペプチドに接触させるのに十分な装置
を備える、キット。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
（ａ）該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入する工程；
（ｂ）該発現ベクターで適切な宿主細胞を、形質転換またはトランスフェクションをする工程；および
（ｃ）該宿主細胞において該ポリペプチドを発現する工程
を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、Mycobacterium tuberculosis感染の検出、処置、および予防に関する。本発明は、より詳細には、Mycobacterium tuberculosis抗原、またはその部分もしくは他の変異体を含むポリペプチド、およびMycobacterium tuberculosis感染に対する診断およびワクチン接種のためのこのようなポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
結核は、慢性の、感染性疾患であり、一般にMycobacterium tuberculosisの感染により生じる。結核は発展途上国で主要な疾患であり、そして世界中の先進地域で問題が増大しており、毎年約８百万人が新たに発病し、そして３百万人が死亡する。感染はかなりの期間無症候性であり得るが、この疾患は、最も一般的には、発熱および空咳を生じる肺の急性炎症として発現する。処置しないでおくと、典型的には、重篤な合併症および死をもたらす。
【０００３】
結核は一般には広範な抗生物質治療を用いて制御され得るが、このような処置はこの疾患の蔓延を妨げるには十分でない。感染した個体は無症候性であり得るが、かなり長い間、伝染性である。さらに、処置レジメに従うことが重要であるが、患者の行動を監視することは困難である。何人かの患者は処置過程を完了せず、これは効果のない処置および薬物耐性の発達に通じ得る。
【０００４】
結核の蔓延を阻害するためには、有効なワクチン接種および疾患の正確な初期診断が必要である。現在、生細菌を用いるワクチン接種は、防御免疫を誘導するために最も有効な方法である。この目的のために用いられる最も一般的なMycobacteriumは、Mycobacterium bovisの無発病性株である、Bacillus Calmette-Guerin（BCG）である。しかし、BCGの安全性および効力は論争の源であり、そしてアメリカ合衆国のようないくつかの国は、一般大衆にワクチン接種をおこなわない。診断は、一般に、皮膚テストを用いて達成される。皮膚テストは、ツベルクリンPPD（精製されたタンパク質の誘導体）に対する皮内曝露に関与する。抗原特異的Ｔ細胞応答は、注射後48〜72時間で注射部位に測定可能な潜伏を生じ、これはマイコバクテリアの抗原への曝露を示す。しかし、感度および特異性についてはこのテストでは問題があり、そしてBCGをワクチン接種された個体は感染した個体と区別され得ない。
【０００５】
マクロファージはM. tuberculosis免疫性の主要なエフェクターとして作用することが示されたとはいえ、Ｔ細胞はこのような免疫性の優勢なインデューサーである。M.tuberculosis感染に対する防御におけるＴ細胞の本質的な役割は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感染に関連するCD4 Ｔ細胞の涸渇に起因する、AIDS患者におけるM.tuberculosisの頻繁な発生により例示される。マイクバクテリア応答性CD4 Ｔ細胞はγ-インターフェロン（IFN-γ）の強力なプロデューサーであることが示されており、これは、次に、マウスにおいてマクロファージの抗マイコバクテリア効果を誘発することも示された。ヒトにおけるIFN-γの役割はそれほど明らかでないが、研究により、1,25-ジヒドロキシ-ビタミンD3単独またはこれとIFN-γまたは腫瘍壊死因子-αとの組み合わせのいずれかが、ヒトマクロファージを活性化してM.tuberculosis感染を阻害することが示された。さらに、IFN-γがヒトマクロファージを刺激して1,25-ジヒドロキシ-ビタミンD3を生じることが知られる。同様に、IL-12はM.tuberculosis感染に対する耐性を刺激するのに役割を果たすことが示された。M. tuberculosis感染の免疫学の総説については、非特許文献１を参照のこと。
【非特許文献１】ChanおよびKaufmann、Tuberculosis：Pathogenesis、Protection and Control,Bloom（編）、ASM Press、Washington, DC、1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当該分野において結核を予防、処置、および検出するための改善されたワクチンおよび方法についての要求が存在する。本発明は、これらの要求を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明によって、以下が提供される：
（１）可溶性M.tuberculosis抗原の免疫原性部分、または保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、以下からなる群から選択されるＮ末端配列を有する、ポリペプチド：
（a）  Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-
Val-Ala-Ala-Leu（配列番号120）；
（b）  Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser（配列
番号121）；
（c）  Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-
Glu-Gly-Arg（配列番号122）；
（d）  Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro（配列
番号123）；
（e）  Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val（配列番号
124）；
（f）  Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro（配列番号
125）；
（g）  Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-
Ser（配列番号126）；
（h）  Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly（配列
番号127）；
（i）  Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-
Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn（配列番号
128）；および
（j）  Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly（配列
番号136）
ここでXaaは任意のアミノ酸であり得る。
（２）M.tuberculosis抗原の免疫原性部分、または保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、以下からなる群から選択されるＮ末端配列を有する、ポリペプチド：
（a）  Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-
Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe（配列番号129）；および
（b）   Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-
Asn-Val-His-Leu-Val（配列番号137）、
ここで、Ｘaaは、任意のアミノ酸であり得る。
（３）可溶性M.tuberculosis抗原の免疫原性部分、または保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、配列番号１、２、４−１０、１３−２５、５２、９９および１０１に記載の配列、該配列の相補体、および適度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、４−１０、１３−２５、５２、９９および１０１に記載の配列またはその相補体にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
（４）M.tuberculosis抗原の免疫原性部分、または保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、配列番号２６−５１に記載の配列、該配列の相補体、および適度にストリンジェントな条件下で、配列番号２６−５１に記載の配列またはその相補体にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
（５）項目１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNA分子。
（６）項目５に記載のDNA分子を含有する発現ベクター。
（７）項目６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
８）前記宿主細胞が、E.coli、酵母、および哺乳動物細胞からなる群から選択される、項目７に記載の宿主細胞。
（９）項目１から４のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上のポリペプチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物。
（１０）項目５に記載の１つまたはそれ以上のDNA分子、および生理学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物。
（１１）配列番号３、１１および１２に記載の１つまたはそれ以上のDNA配列、および生理学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物。
（１２）項目１から４のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上のポリペプチド、および非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチン。
（１３）配列番号１３４および１３５に記載の配列からなる群から選択されるＮ末端配列を有するポリペプチド、および非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチン。
（１４）配列番号３、１１および１２からなる群から選択されるDNA配列、該配列の相補体、および配列番号３、１１および１２に記載の配列にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされる１つまたはそれ以上のポリペプチド；および非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチン。
（１５）前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである、項目１２〜１４に記載のワクチン。
（１６）項目５に記載の１つまたはそれ以上のDNA分子および非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチン。
（１７）配列番号３、１１および１２に記載の１つまたはそれ以上のDNA配列および非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチン。
（１８）前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである、項目１６または１７に記載のワクチン。
（１９）項目９から１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、患者の防御免疫を誘導するための方法。
（２０）項目１２から１８のいずれか一項に記載のワクチンを患者に投与する工程を包含する、患者の防御免疫を誘導するための方法。
（２１）項目１から４のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上のポリペプチドを含有する融合タンパク質。
（２２）項目１から４のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上のポリペプチド、およびESAT-6を含有する融合タンパク質。
（２３）項目２１または２２に記載の融合タンパク質、および生理学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物。
（２４）項目２１または２２に記載の融合タンパク質、および非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチン。
（２５）前記非特異的免疫応答エンハンサーがアジュバントである、項目２４に記載のワクチン。
（２６）項目２３に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、患者の防御免疫を誘導するための方法。
（２７）項目２４または２５に記載のワクチンを患者に投与する工程を包含する、患者の防御免疫を誘導するための方法。
（２８）患者の結核を検出するための方法であって、
（a）項目１〜４のいずれか一項に記載の１つまたはそれ以上のポリペプチドと、患者の皮膚細胞を接触させる工程；および
（b）該患者の皮膚上での免疫応答を検出し、それから該患者の結核を検出する工程
を包含する、方法。
（２９）患者の結核を検出するための方法であって、
（a）配列番号１３４および１３５に記載の配列からなる群から選択されるＮ末端配列を有するポリペプチドと、患者の皮膚細胞を接触させる工程；および
（b）該患者の皮膚上での免疫応答を検出し、それから該患者の結核を検出する工程
を包含する、方法。
（３０）患者の結核を検出するための方法であって、
（a）配列番号３、１１および１２、該配列の相補体、および配列番号３、１１および１２に記載の配列にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされる１つまたはそれ以上のポリペプチドと、患者の皮膚細胞を接触させる工程；および
（b）該患者の皮膚上での免疫応答を検出し、それから該患者の結核を検出する工程
を包含する、方法。
（３１）前記免疫応答が硬化である、項目２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
（３２）以下を含む診断キット：
（a）項目１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド；および
（b）該ポリペプチドを患者の皮膚細胞と接触させるに十分な器具。
（３３）以下を含む診断キット：
（a）配列番号１３４および１３５に記載の配列からなる群から選択されるＮ末端配列を有するポリペプチド；および
（b）該ポリペプチドを患者の皮膚細胞と接触させるに十分な器具。
（３４）以下を含む診断キット：
（a）配列番号３、１１および１２、該配列の相補体、および配列番号３、１１および１２に記載の配列にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされるポリペプチド；および
（b）該ポリペプチドを患者の皮膚細胞と接触させるに十分な器具。
簡潔に述べると、本発明は結核を予防および診断するための化合物および方法を提供する。１つの局面において、可溶性M. tuberculosis抗原の抗原性部分、または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるこのような抗原の変異体を含むポリペプチドが提供される。この局面の１つの実施態様において、可溶性抗原は以下のＮ末端配列の１つを有する：
（a）  Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-
Val-Ala-Ala-Leu（配列番号120）；
（b）  Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser（配列
番号121）；
（c）  Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-
Glu-Gly-Arg（配列番号122）；
（d）  Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro（配列
番号123）；
（e）  Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val（配列番号
124）；
（f）  Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro（配列番号
125）；
（g）  Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-
Ser（配列番号126）；
（h）  Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly（配列
番号127）；
（i）  Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-
Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn（配列番号
128）；
（j）  Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser（配列
番号134）；
（k）  Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp（配列
番号135）；または
（l）  Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly（配列
番号136）、
ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得る。
【０００８】
関連する局面では、M. tuberculosis抗原の免疫原性部分または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるこのような抗原の変異体を含むポリペプチドが提供され、この抗原は以下のＮ末端配列の１つを有する：
（m）  Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-
Asn-Val-His-Leu-Val（配列番号137）；または
（n）  Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-
Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe（配列番号129）、
ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得る。
【０００９】
別の実施態様では、抗原は、配列番号１、２、４〜10、13〜25、52、99および101に列挙される配列から成る群から選択されるDNA配列、この配列の相補体、ならびに配列番号１、２、４〜10、13〜25、52、99および101に列挙される配列またはそれらの相補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
関連する局面では、ポリペプチドは、M. tuberculosis抗原の抗原性部分または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるこのような抗原の変異体を含む。ここで、抗原は配列番号26〜51に列挙される配列から成る群から選択されるDNA配列、これらの配列の相補体、および配列番号26〜51に列挙される配列またはそれらの相補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
関連する局面では、上記のポリペプチドをコードするDNA配列、これらのDNA配列を含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。
【００１２】
別の局面では、本発明は第１および第２の本発明のポリペプチド、またはあるいは、本発明のポリペプチドおよび公知のM. tuberculosis抗原を含む融合タンパク質を提供する。
【００１３】
他の局面では、本発明は、上記の１つ以上のポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするDNA分子、および生理学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を提供する。本発明はまた、上記の１つ以上のポリペプチドおよび非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチンを、１つ以上のこのようなポリペプチドをコードするDNA配列および非特異的免疫応答エンハンサーを含有するワクチンとともに提供する。
【００１４】
なお別の局面では、患者での防御免疫を誘導するための方法が提供される。この方法は、１つ以上の上記ポリペプチドの有効量を、患者に投与する工程を包含する。
【００１５】
本発明のさらなる局面では、患者における結核を検出するための方法および診断キットが提供される。この方法は、患者の表皮細胞と上記の１つ以上のポリペプチドとを接触させる工程、および患者の皮膚上の免疫応答を検出する工程を包含する。診断キットは、患者の表皮細胞とポリペプチドを接触させるに充分な装置と組み合わせた上記の１つ以上のポリペプチドを含む。
【００１６】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。本明細書中に開示されるすべての文献は、この結果、各々が個々に組み込まれたかのように、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、一般に、結核を予防、処置、および診断するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、M. tuberculosis抗原、または保存的置換および／または改変でのみ異なるこのような抗原の変異体の、少なくとも１つの免疫原性部分を含むポリペプチドを含む。本発明の範囲内のポリペプチドとしては、免疫原性の可溶性M.tuberculosis抗原が挙げられるが、これらに限定されない。「可溶性M. tuberculosis抗原」は、M. tuberculosis培養濾液中に存在するM.tuberculosis起源のタンパク質である。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結されている。従って、上記の抗原の１つの免疫原性部分を含むポリペプチドは、全体が免疫原性部分からなり得るか、またはさらなる配列を含み得る。さらなる配列は、天然のM.tuberculosis抗原に由来し得るか、または異種のものであり得、そしてこのような配列は、免疫原性であり得る（そうである必要はない）。
【００１８】
本明細書で使用する「免疫原性」は、患者（例えばヒト）および／または生物学的サンプルにおいて免疫応答（例えば、細胞性）を誘発する能力をいう。特に、免疫原性である抗原（および免疫原性部分またはこのような抗原の他の変異体）は、Ｔ細胞、NK細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ（ここで、細胞はM. tuberculosis免疫個体由来である）からなる群より選択される１つ以上の細胞を含む生物学的サンプルにおいて、細胞増殖、インターロイキン12産生、および／またはインターフェロンγ産生を刺激し得る。１つ以上のM.tuberculosis抗原の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドが、一般に、結核を検出するため、または患者において結核に対して防御免疫を誘導するために使用され得る。
【００１９】
本発明の組成物および方法はまた、上記のポリペプチドの変異体を包含する。本明細書で使用する「変異体」は、保存的置換および／または改変のみが天然の抗原と異なり、その結果、ポリペプチドの免疫応答を誘導する能力が保持されているポリペプチドである。このような変異体は、一般に、例えば本明細書中に記載する代表的な手順を使用して、上記のポリペプチド配列の１つを改変し、そして改変されたポリペプチドの免疫原性特性を評価することによって、同定され得る。
【００２０】
「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者がこのポリペプチドの２次構造およびのヒドロパシー性質が実質的に変化していないことを予測するように、アミノ酸を類似する特性を有する別のアミノ酸で置換する置換である。一般に、以下の群のアミノ酸は、保存的変化を示す：（1）ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；（2）cys、ser、tyr、thr；（3）val、ile、leu、met、ala、phe；（4）lys、arg、his；および（5）phe、tyr、trp、his。
【００２１】
変異体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性特性、２次構造、およびヒドロパシー性質に最小の影響しか及ぼさないアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質の転移を導くタンパク質のＮ末端でシグナル（またはリーダー）配列に結合され得る。このポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、ポリ-His）の合成、精製、または同定を容易にするために、または固体支持体ヘのこのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に結合され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンFc領域に結合され得る。
【００２２】
関連する局面において、組合せポリペプチドが開示される。「組合せポリペプチド」は、少なくとも１つの上記の免疫原性部分および１つ以上のさらなる免疫原性M. tuberculosis配列を含むポリペプチドであり、これは、ペプチド結合によって単一のアミノ酸鎖に接合されている。この配列は、直接接合される（すなわち、介入アミノ酸なしに）か、または成分ポリペプチドの免疫原性特性を顕著に消失させないリンカー配列（例えば、Gly-Cys-Gly）によって接合され得る。
【００２３】
一般に、M. tuberculosis抗原、およびこのような抗原をコードするDNA配列は、任意の種々の手順を使用して調製され得る。例えば、可溶性抗原を、当業者に公知の手順（陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含む）によってM.tuberculosis培養濾液から単離し得る。次いで、精製された抗原を、例えば、本明細書中に記載する代表的な方法を使用して、適切な免疫応答（例えば、細胞性）を誘発する能力について評価し得る。次いで、免疫原性抗原を、例えば伝統的なエドマン化学のような技法を使用して部分的に配列決定し得る。EdmanおよびBerg,Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967を参照のこと。
【００２４】
免疫原性抗原はまた、この抗原をコードするDNA配列を使用して組換え的に産生され得る。このDNA配列は発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主内で発現される。可溶性抗原をコードするDNA分子を、可溶性M.tuberculosis抗原に対して特異的に惹起された抗血清（例えば、ウサギ）を用いて、適切なM. tuberculosis発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離し得る。可溶性であるかもしれないしそうでないかもしれない抗原をコードするDNA配列を、M.tuberculosisに感染した患者から得られた血清を用いて、適切なM. tuberculosisゲノムライブラリーまたはcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定し得る。このようなスクリーニングは、一般に、当業者に周知の技術（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載される技術）を使用して行われ得る。
【００２５】
可溶性抗原をコードするDNA配列はまた、単離された可溶性抗原の部分アミノ酸配列に由来する縮重オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするDNA配列について、適切なM.tuberculosis cDNAまたはゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、得られ得る。このようなスクリーニングで使用するための縮重オリゴヌクレオチド配列を設計および合成し得、そしてスクリーニングは、（例えば）Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY 1989（および本明細書中で援用された参考文献）に記載されるように行い得る。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）もまた、当該分野で周知の方法において上記のオリゴヌクレオチドを使用して、cDNAまたはゲノムライブラリーから核酸プローブを単離するために用い得る。次いで、ライブラリースクリーニングを、単離されたプローブを使用して行い得る。
【００２６】
あるいは、M.tuberculosisに由来するゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーは、１つ以上のM.tuberculosisで免疫した個体に由来する末梢血単核細胞（PBMS）またはＴ細胞株もしくはクローンを用いて直接的にスクリーニングされ得る。一般に、このようなスクリーニングにおける使用のためのPBMSおよび／またはＴ細胞は、以下に記載のように調製され得る。直接的ライブラリースクリーニングは、一般に、発現された組換えタンパク質のプールを、M.tuberculosisで免疫した個体に由来するＴ細胞における増殖および／またはインターフェロン-γ産生を誘導する能力についてアッセイすることにより行われ得る。あるいは、潜在的なＴ細胞抗原は、第１に、上記のように、抗体反応性に基づいて選択され得る。
【００２７】
調製の方法にかかわらず、本明細書中に記載の抗原（およびその免疫原性部分）（これは、可溶性であってもそうでなくてもよい）は、免疫原性応答を誘導する能力を有する。より詳細には、抗原は、M.tuberculosisで免疫した個体に由来するＴ細胞、NK細胞、Ｂ細胞、および／またはマクロファージにおける増殖および／またはサイトカイン産生（すなわち、インターフェロンγおよび／またはインターロイキン-12産生）を誘導する能力を有する。抗原に対する免疫原性応答を評価する際に使用するための細胞型の選択は、もちろん、所望の応答に依存する。例えば、インターロイキン-12産生は、Ｂ細胞および／またはマクロファージを含有する調製物を用いて最も容易に評価される。M.tuberculosisで免疫した個体は、M.tuberculosisに対する有効なＴ細胞応答が惹起されたことにより、結核の進行に耐性である（すなわち、実質的に疾患の症状がない）と考えられる個体である。このような個体は、結核タンパク質（PPD）に対する強力に陽性な皮内皮膚試験応答（すなわち、約10mmより大きな硬結直径）および結核病の徴候または症状が無いことに基づいて同定され得る。M.tuberculosisで免疫した個体に由来するＴ細胞、NK細胞、Ｂ細胞およびマクロファージは、当業者に公知の方法を用いて調製され得る。例えば、PBMC（例えば、末梢血単核細胞）の調製は、構成細胞のさらなる調製を伴わずに行なわれ得る。PBMCは、一般に例えば、FicollTMを通しての密度勾配遠心分離を用いて調製され得る（Winthrop Laboratories, NY）。本明細書中に記載されるアッセイにおける使用のためのＴ細胞はまた、PBMCから直接精製され得る。あるいは、マイコバクテリアタンパク質に対して反応性の富化Ｔ細胞株、または個々のマイコバクテリアタンパク質に対して反応性なＴ細胞クローンが用いられ得る。このようなＴ細胞クローンは、例えば、マイコバクテリアタンパク質を有する、M.tuberculosisで免疫した個体由来のPBMCを２〜４週間の期間培養することにより作製され得る。これは、マイコバクテリアタンパク質特異的Ｔ細胞のみの拡大を可能にし、このような細胞のみでなる株をもたらす。次いで、これらの細胞は、個々のＴ細胞特異性をより正確に規定するために、当業者に周知の方法を用いてクローン化および個々のタンパク質で試験され得る。一般に、M.tuberculosisで免疫した個体に由来するＴ細胞、NK細胞、Ｂ細胞、および／またはマクロファージを用いて行われた、増殖および／またはサイトカイン産生（すなわち、インターフェロン-γおよび／またはインターロイキン-12産生）についてのアッセイで陽性である抗原は、免疫原性であると考えられる。このようなアッセイは、例えば、下記の代表的な手順を用いて行われ得る。このような抗原の免疫原性部分は、同様のアッセイを用いて同定され得、そして本明細書中に記載のポリペプチド内に存在し得る。
【００２８】
ポリペプチド（例えば、免疫原性抗原、またはその部分もしくは他の変異体）が細胞増殖を誘導する能力は、細胞（例えば、Ｔ細胞および／またはNK細胞）を、ポリペプチドと接触させ、そして細胞の増殖を測定することにより評価される。一般に、約10５個の細胞を評価するために充分であるポリペプチドの量は、約10ng/mL〜約100μg/mLの範囲であり、そして好ましくは約10μg/mLである。ポリペプチドと細胞とのインキュベーションは、代表的には37℃で約６日間行われる。ポリペプチドとのインキュベーション後、細胞を増殖応答についてアッセイする。増殖応答は、当業者に公知の方法（例えば、放射標識したチミジンのパルスに細胞を曝露し、そして細胞DNAへの標識の取り込みを測定すること）により評価され得る。一般に、バックグラウンドを超えて少なくとも３倍の増殖増加（すなわち、ポリペプチドなしで培養した細胞について観察された増殖）をもたらすポリペプチドは、増殖を誘導し得ると考えられる。
【００２９】
ポリペプチドが、細胞におけるインターフェロン-γおよび／またはインターフェロンー12の産生を刺激する能力は、細胞をポリペプチドと接触させ、そして細胞により産生されるインターフェロン-γまたはインターロイキン-12のレベルを測定することにより評価され得る。一般に、約10５個の細胞の評価に充分であるポリペプチドの量は、約10ng/mL〜約100μg/mLの範囲であり、好ましくは約10μg/mLである。ポリペプチドは、その必要はないが、固体支持体（例えば、米国特許第4,897,268号および同第5,075,109号に記載されるような、ビーズまたは生分解性マイクロスフェア）に固定化され得る。ポリペプチドと細胞とのインキュベーションは、代表的には37℃で約６日間行われる。ポリペプチドとのインキュベーションの後、細胞を、インターフェロン-γおよび／またはインターロイキン-12（またはそれらの１つ以上のサブユニット）についてアッセイする。インターフェロン-γおよび／またはインターロイキン-12（またはそれらの１つ以上のサブユニット）は、当業者に公知の方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）またはIL-12P70サブユニットの場合はＴ細胞の増殖を測定するアッセイのようなバイオアッセイ）により評価され得る。一般に、培養上清１mL（１mLあたり10４〜10５Ｔ細胞を含む）あたり少なくとも50pgのインターフェロン-γの産生をもたらすポリペプチドは、インターフェロン-γの産生を刺激し得ると考えられる。10５個のマクロファージまたはＢ細胞あたり（または３×10５PMBCあたり）、少なくとも10pg/mLのIL-12P70サブユニット、および／または少なくとも100pg/mLのIL-12 P40サブユニットの産生を刺激するポリペプチドは、IL-12の産生を刺激し得ると考えられる。
【００３０】
一般に、免疫原性抗原は、M.tuberulosisで免疫した個体の少なくとも約25％に由来するＴ細胞、NK細胞、Ｂ細胞、および／またはマクロファージにおける増殖および／またはサイトカイン産生（すなわち、インターフェロン-γおよび／またはインターロイキン-12産生）を刺激する抗原である。これらの免疫原性抗原の中でも、優れた治療的特性を有するポリペプチドは、上記のアッセイにおける応答の大きさに基づいて、そして応答が観察された個体の％に基づいて区別され得る。さらに、優れた治療的特性を有する抗原は、M.tuberulosisで免疫していない個体の約25％より多くに由来する細胞におけるインビトロでの増殖および／またはサイトカイン産生を刺激しない。その結果、M.tuberulosis応答性細胞に特異的に起因しない応答を排除する。M.tuberulosisで免疫した個体に由来するＴ細胞、NK細胞、Ｂ細胞、および／またはマクロファージ調製物の高い％において応答を誘導する抗原（他の個体からの細胞調製物における応答の低出現率を有する）は、優れた治療的特性を有する。
【００３１】
優れた治療的特性を有する抗原はまた、ワクチンとして投与した場合に、実験動物におけるM.tuberulosis感染の重篤度を減少させる能力に基づいて同定され得る。実験動物における使用のために適切なワクチン調製物は、以下に詳細に記載される。効率は、細菌数の少なくとも約50％減少および／または実験的感染後の死亡率を少なくとも約40％減少を提供する抗原の能力に基づいて決定され得る。適切な実験動物は、マウス、モルモット、および霊長類を包含する。
【００３２】
優れた診断的特性を有する抗原は、一般に、進行中の結核を有する個体で行なった皮内皮膚試験における応答を惹起するが、M.tuberulosisに感染していない個体において行なった試験においては惹起しないという能力に基づいて同定され得る。皮膚試験は、一般に、陽性と考えられる少なくとも５mm硬結の応答で、以下に記載のように行われ得る。
【００３３】
本明細書中に記載の抗原の免疫原性部分は、Paul, Fundamental Immunology, 第３版, Raven Press, 1993, 243-247頁およびその中に引用される文献において要約されるような周知の技術を用いて調製および同定され得る。このような技術は、免疫原性特性についての天然抗原のポリペプチド部分のスクリーニングを包含する。本明細書中に記載される代表的な増殖およびサイトカイン産生アッセイは、一般に、これらのスクリーニングに用いられ得る。ポリペプチドの免疫原性部分は、このような代表的なアッセイにおいて、完全長抗原により生じる免疫応答と実質的に同様である免疫応答（例えば、増殖、インターフェロン-γ産生および／またはインターロイキン-12産生）を生じる部分である。言い換えれば、抗原の免疫原性部分は、本明細書中に記載のモデル増殖アッセイにおいて完全長抗原により誘導される増殖の少なくとも約20％、そして好ましくは約100％を生じ得る。免疫原性部分はまた、あるいは、本明細書中に記載のモデルアッセイにおいて完全長抗原により誘導されるインターフェロンーγおよび／またはインターロイキンー12の産生の少なくとも約20％、そして好ましくは約100％を刺激し得る。
【００３４】
M. tuberculosis抗原の部分および他の変異体は、合成手段または組換え手段により生成され得る。約100より少ないアミノ酸、および一般には約50より少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドを、当業者に周知の技術を用いて生成し得る。例えば、このようなポリペプチドを、伸長するアミノ酸鎖にアミノ酸が連続的に添加される、Merrifield固相合成法のような、任意の市販の固相技術を用いて合成し得る。Merrifield、J.Am. Chem. Soc. 85：2149-2146、1963を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Applied BioSystems,Inc., Foster City, CAのような供給者から市販されており、そしてこれを製造者の指示に従って操作し得る。天然の抗原の変異体を、一般に、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発のような、標準的な変異誘発技術を用いて調製し得る。DNA配列の断片もまた、短縮型のポリペプチドの調製を可能にする標準的な技術を用いて取り除き得る。
【００３５】
天然の抗原の部分および／または変異体を含む組換えポリペプチドを、当業者に周知の種々の技術を用いてポリペプチドをコードするDNA配列から容易に調製し得る。例えば、培地に組換えタンパク質を分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清を、市販のフィルターを用いて最初に濃縮し得る。濃縮の後、濃縮物を、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂のような適切な精製マトリクスに適用し得る。最後に、１以上の逆相HPLC工程を用いて組換えタンパク質をさらに精製し得る。
【００３６】
当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、本発明の組換えポリペプチドを発現し得る。発現を、組換えポリペプチドをコードするDNA分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞で達成し得る。適切な宿主細胞は、原核生物、酵母および高等真核生物の細胞を含む。好ましくは、使用される宿主細胞は、E.coli、酵母もしくはCOSまたはCHOのような哺乳動物細胞株である。この様式で発現されるDNA配列は、天然に存在する抗原、天然に存在する抗原の部分、またはそれらの他の変異体をコードし得る。
【００３７】
一般に、調製方法によらず、本明細書中に開示されるポリペプチドは実質的に純粋な形態で調製される。好ましくは、ポリペプチドは少なくとも約80％純粋であり、より好ましくは少なくとも約90％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも約99％純粋である。以下に詳細に記載される特定の好ましい実施態様では、実質的に純粋なポリペプチドは、本明細書中に開示される１以上の方法での使用のために薬学的組成物またはワクチンに組み込まれる。
【００３８】
ある特定の実施態様では、本発明は、以下のＮ末端配列の１つを有する可溶性M. tuberculosis抗原の少なくとも免疫原性部分、または保存的置換および／または改変のみが異なるその変異体を含むポリペプチドを開示する：
（a）  Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-
Val-Ala-Ala-Leu（配列番号120）；
（b）  Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser（配列
番号121）；
（c）  Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-
Glu-Gly-Arg（配列番号122）；
（d）  Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro（配列
番号123）；
（e）  Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val（配列番号
124）；
（f）  Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro（配列番号
125）；
（g）  Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser
（配列番号126）；
（h）  Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly（配列
番号127）；
（i）  Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-
Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn（配列番号
128）；
（j）  Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser（配列
番号134）；
（k）   Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp（配列
番号135）；または
（l）  Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly（配列
番号136）、
ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得、好ましくはシステイン残基である。上記の（g）として同定された抗原をコードするDNA配列を配列番号52に提供し、そして配列番号52によりコードされるポリペプチドを配列番号53に提供する。上記の（a）として定義された抗原をコードするDNA配列を配列番号101に提供する；その推定のアミノ酸配列を配列番号102に提供する。上記の抗原（d）に対応するDNA配列を配列番号24に提供し、抗原（c）に対応するDNA配列を配列番号25に提供し、そして抗原（i）に対応するDNA配列を配列番号99に提供し；その推定のアミノ酸配列を配列番号100に提供する。
【００３９】
さらなる特定の実施態様では、本発明は、以下のＮ末端配列の１つを有するM. tuberculosis抗原の少なくとも１つの免疫原性部分、または保存的置換および／または改変のみが異なるその変異体を含むポリペプチドを開示する。
【００４０】
（m）   Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-
Asn-Val-His-Leu-Val（配列番号137）；または
（n）  Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-
Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe（配列番号129）、
ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得、好ましくはシステイン残基である。
【００４１】
他の特定の実施態様では、本発明は、（a）配列番号１、２、４〜10、13〜25および52のDNA配列；（b）このようなDNA配列の相補物、または（c）（a）または（b）の配列に実質的に相同なDNA配列によりコードされる１以上のアミノ酸配列を含む、可溶性M.tuberculosis抗原（またはこのような抗原の変異体）の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドを開示する。
【００４２】
さらなる特定の実施態様では、本発明は、（a）配列番号26〜51のDNA配列、（b）このようなDNA配列の相補物、あるいは（c）（a）または（b）の配列に実質的に相同なDNA配列によりコードされる１以上のアミノ酸配列を含む、可溶性であり得るかまたは可溶性でなくてもよい、M.tuberculosis抗原（またはこのような抗原の変異体）の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドを開示する。
【００４３】
上述の特定の実施態様では、M. tuberculosis抗原は、特に本明細書中に列挙される１以上のDNA配列に実質的に相同なDNA配列によりコードされる変異体を含む。本明細書中で使用される「実質的な相同性」は、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNA配列を言う。適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA（pH 8.0）での予備洗浄；50℃〜65℃での、５×SSC、一晩、または交差-種相同性の場合、45℃、0.5×SSCでのハイブリダイズ；続く0.1％SDSを含む２×、0.5×および0.2×SSCの各々を用いる65℃での20分間の２回の洗浄を含む。このようなハイブリダイズするDNA配列はまた本発明の範囲内であり、コードの縮重のため、ハイブリダイズするDNA配列によりコードされる免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も同様である。
【００４４】
関連する局面では、本発明は、第１と第２の本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質または、あるいは、本発明のポリペプチドと上述の38kDの抗原またはESAT-6（配列番号103および104）のような公知のM. tuberculosis抗原とを含む融合タンパク質を、このような融合タンパク質の変異体とともに提供する。本発明の融合タンパク質はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間にリンカーペプチドを含み得る。
【００４５】
本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列を、公知の組換えDNA技術を用いて構築して、第１および第２のポリペプチドをコードする別々のDNA配列を、適切な発現ベクターに集める。第１のポリペプチドをコードするDNA配列の３'末端をペプチドリンカーを用いてまたは用いずに第２のポリペプチドをコードするDNA配列の５'末端に連結し、その結果配列のリーディングフレームは、第１および第２の両方のポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質へ２つのDNA配列のmRNA翻訳を許容する相中に存在する。
【００４６】
ペプチドリンカー配列を用いて、各々のポリペプチドをその二次構造および三次構造に折り畳むことを確実にするのに十分な間隔を置いて第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを分離し得る。このようなペプチドリンカー配列を、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に組み込む。適切なペプチドリンカー配列を以下の要因に基づいて選択し得る：（1）可撓性の伸長した構造を採用するそれらの能力；（2）第１および第２のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採用するそれらの能力のなさ；および（3）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠失。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、AsnおよびSer残基を含む。ThrおよびAlaのような、他の中性に近いアミノ酸をまたリンカー配列で用い得る。リンカーとして通常に用いられ得るアミノ酸配列は、Marateaら、Gene40：39-46、1985；Murphyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83：8258-8262、1986；米国特許第4,935,233号および米国特許第4,751,180号に開示されるものを含む。リンカー配列は、１〜約50アミノ酸長であり得る。ペプチド配列は、第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離しかつ立体障害を妨げるために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には必要でない。
【００４７】
連結されたDNA配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に結合される。DNAの発現を担う調節エレメントは、第１のポリペプチドをコードするDNA配列の5'末端にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終止シグナルを終止させるために必要とされる終止コドンは、第２のポリペプチドをコードするDNA配列の3'末端にのみ存在する。
【００４８】
別の局面では、本発明は、１つまたはそれ以上の上記ポリペプチドまたは融合タンパク質（あるいはこのようなポリペプチドをコードするDNA分子）を用いて患者において結核に対して防御免疫を誘導するための方法を提供する。本明細書中で使用されるように、「患者」とは、任意の温血動物、好ましくはヒトを意味する。患者は、疾患で苦しんでいる状態かもしれないし、または検出可能な疾患および／または感染に罹っていない状態かもしれない。換言すれば、防御免疫は、結核を予防または処置するために誘導され得る。
【００４９】
この局面において、ポリペプチド、融合タンパク質、またはDNA分子は、一般に薬学的組成物および／またはワクチン中に存在する。薬学的組成物は、１つまたはそれ以上のポリペプチド（これらのそれぞれは、１つ以上の上記配列（またはその変異体）を含有し得る）、および生理的に受容可能なキャリアを含み得る。ワクチンは、１つまたはそれ以上の上記ポリペプチド、およびアジュバントまたはリポソームのような非特異的免疫応答エンハンサー（それには、ポリペプチドが取り込まれている）を含み得る。このような薬学的組成物およびワクチンはまた、組み合わせポリペプチドに取り込まれているかまたは別のポリペプチド中に存在するかのいずれかの、他のM.tuberculosis抗原を含有し得る。
【００５０】
あるいは、ワクチンは、１つまたはそれ以上の上記ポリペプチドをコードするDNAを含有し得、これによって、ポリペプチドをインサイチュで生じさせる。このようなワクチンにおいて、DNAは、核酸発現系、細菌およびウイルスの発現系を含む、当業者に公知の種々の送達系のいずれかに存在し得る。適切な核酸発現系には、患者での発現に必要なDNA配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止シグナル）が含まれる。細菌送達系には、ポリペプチドの免疫原性部分をその細胞表面上で発現する細菌（例えば、Bacillus-Calmette-Guerrin）の投与が含まれる。好ましい実施態様では、DNAは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、あるいはアデノウイルス）を用いて導入され得、これには、非病原性の（欠損）複製コンピテントウイルスの使用が含まれ得る。このような発現系にDNAを取り込むための技術は、当業者に周知である。DNAはまた、例えば、Ulmerら,Science 259:1745-1749, 1993に記載され、かつCohen, Science 259:1691-1692, 1993によって総説されるように、「裸」であり得る。裸のDNAの取り込みは、生分解性のビーズ（これは、細胞に効率的に運搬される）上にDNAをコーティングすることにより増大され得る。
【００５１】
関連する局面では、上記のDNAワクチンは、本発明のポリペプチドまたは公知のM. tuberculosis抗原（例えば、上記の38kD抗原）のいずれかと同時にまたは連続的に投与され得る。例えば、ワクチンの防御免疫効果を高めるために、本発明のポリペプチドをコードするDNA（「裸」または上記の送達系中でのいずれか）の投与に続き、抗原を投与し得る。
【００５２】
投与の経路および頻度、ならびに用量は、個体によって変化し、そして現在BCGを用いる免疫化に使用されているものと平行し得る。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内（例えば、吸入により）、または経口によって投与され得る。１回と３回との間の用量は、１〜36週間で投与される。好ましくは、３回の用量を３〜４月の間隔で投与し、そして追加ワクチン接種をその後周期的に行い得る。別のプロトコルは、個別の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与される場合、免疫化された患者においてM.tuberculosis感染から患者を少なくとも１〜２年間防御するのに充分な免疫応答を生じ得る量の、ポリペプチドまたはDNAである。一般に、単回用量中に存在する（または単回用量中のDNAによってインサイチュで産生される）ポリペプチドの量は、宿主１kgあたり約１pg〜約100mg、代表的には、約10pg〜約１mg、そして好ましくは約100pg〜約１μgの範囲である。適切な用量の容積は、患者の体積によって変化するが、代表的には、約0.1mL〜約５mLの範囲である。
【００５３】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物に使用され得るが、キャリアのタイプは、投与の様式に依存して変化する。非経口投与（例えば、皮下注射）の場合、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、油脂、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与の場合、上記のキャリアのいずれかまたは固形キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム）が使用され得る。生分解性のマイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（polylactic garactide））もまた、本発明の薬学的組成物のキャリアとして使用され得る。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号および同第5,075,109号に開示されている。
【００５４】
任意の種々のアジュバントは、免疫応答を非特異的に高めるために本発明のワクチンに使用され得る。ほとんどのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するために設計された基質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）、および非特異的な免疫応答の刺激剤（例えば、リピドＡ、Bortadella pertussisまたはMycobacterium tuberculosis）を含有する。適切なアジュバントが、市販されており、例えば、Freund'sIncomplete AdjuvantとFreund's Complete Adjuvant（Difco Laboratories）、およびMerckAdjuvant 65（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）がある。他の適切なアジュバントには、ミョウバン、生分解性のマイクロスフェア、モノホスホリルリピドＡおよびキルＡ（quilA）が挙げられる。
【００５５】
別の局面では、本発明は、１つまたはそれ以上の上記ポリペプチドを用いて、皮膚試験を用いる結核を診断するための方法を提供する。本明細書中で使用されるように、「皮膚試験」とは、１つまたはそれ以上の上記ポリペプチドの皮内注射の後に遅延型過敏症（DTH）反応（例えば、腫脹、発赤または皮膚炎）が測定される、患者で直接行われるアッセイである。このような注射は、ポリペプチドを患者の皮膚細胞と接触させるのに充分に適切な任意のデバイス（例えば、ツベルクリン注射器または１mL注射器）を用いて達成され得る。好ましくは、反応は、注射後少なくとも48時間、より好ましくは48〜72時間に測定される。
【００５６】
DTH反応は、細胞媒介性免疫応答であり、これは、先に試験抗原（すなわち、使用されたポリペプチドの免疫原性部分、またはその変異体）に曝された患者では、より大きくなる。応答は、定規を用いて視覚的に測定される。一般に、直径約0.5cm以上、好ましくは、直径約1.0cm以上の応答は、陽性応答であり、結核感染を示す。これは、進行中の疾患として顕著であるかもしれないしそうでばないかもしれない。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、皮膚試験で使用するための、上記のポリペプチドおよび生理的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物として処方される。このような組成物は、代表的には、１つまたはそれ以上の上記ポリペプチドを0.1mLの容積中に約１μg〜約100μg、好ましくは約10μg〜約50μgの範囲の量で含有する。好ましくは、このような薬学的組成物に使用されるキャリアは、適切な保存剤（例えば、フェノールおよび／またはTween80TM）を含む生理食塩水である。
【００５８】
好ましい実施態様では、皮膚試験に使用されるポリペプチドは、これが反応期間中注射の部位に存続するような十分な大きさである。一般に、長さが少なくとも９アミノ酸のポリペプチドは充分である。ポリペプチドはまた、好ましくは、注射の数時間内にマクロファージによって破壊されて、Ｔ細胞に提示される。このようなポリペプチドは、１つまたはそれ以上の上記配列および／または他の免疫原性または非免疫原性配列の反複を含み得る。
【００５９】
以下の実施例は、限定のためでなく、例示のために提供される。
【実施例】
【００６０】
実施例１
M.tuberculosis培養濾過物由来のポリペプチドの精製および特徴付け
本実施例は、培養濾過物からのM.tuberculosis可溶性ポリペプチドの調製を例示する。他に言及されない限り、以下の実施例における全てのパーセントは、容量あたりの重量である。
【００６１】
M.tuberculosis（H37Ra,ATCC No.25177、またはH37Rv,ATCC No.25618のいずれか）を、滅菌GAS培地で37℃で14日間培養した。次いで、培地を、0.45μフィルターに通して吸引濾過して（大部分の細胞を残す）滅菌2.5Lボトルに入れた。次いで、培地を、0.2μフィルターに通して濾過して滅菌４Lボトルに入れた。NaN3を培養濾過物に0.04％の濃度に添加した。次いで、ボトルを４℃の低温室に置いた。
【００６２】
濾過物をオートクレーブした12Lリザーバーに入れ、エタノールでリンスし、10,000kDa MWCO膜を含む400ml Amicon stir cellに濾過物を送り込むことより、培養濾過物を濃縮した。圧力を、窒素ガスを用いて60psiで維持した。この手順により、12L容量を約50mlに減少させた。
【００６３】
培養濾過物を、重炭酸アンモニウム溶液を２回交換して、8,000kDa MWCOセルロースエステル膜を用いて0.1％重炭酸アンモニウム中に透析した。次いで、タンパク質濃度を、市販のBCAアッセイ（Pierce,Rockford,IL）により決定した。
【００６４】
次いで、透析した培養濾過物を凍結乾燥し、そしてポリペプチドを蒸留水に再懸濁した。ポリペプチドを、陰イオン交換クロマトグラフィーの初期条件である、0.01mM 1,3ビス[トリス（ヒドロキシメチル）-メチルアミノ]プロパン、pH7.5（Bis-Trisプロパン緩衝液）に対して透析した。分画を、0.01mM Bis-Trisプロパン緩衝液（pH7.5）で平衡化したPOROS 146 II Q/M陰イオン交換カラム4.6mm×100mm（Perseptive BioSystems, Framingham,MA）でのゲルプロフュージョンクロマトグラフィーを用いて行った。ポリペプチドを、上記の緩衝液系での線形０〜0.5MNaClグラジエントで溶出した。カラムの溶出液を220nmの波長でモニターした。
【００６５】
イオン交換カラムから溶出したポリペプチドのプールを、蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥した。得られた物質を、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）pH1.9を含む水に溶解し、そしてポリペプチドを、Delta-Pak C18カラム（Waters,Milford,MA）300オングストローム孔サイズ、５ミクロン粒子サイズ（3.9×150mm）で精製した。ポリペプチドを、０〜60％希釈緩衝液（アセトニトリル中の0.1％TFA）の線形グラジエントでカラムから溶出した。流速は0.75ml/分であり、そしてHPLC溶出液を214nmでモニターした。溶出されたポリペプチドを含む画分を回収し、個々のサンプルの純度を最大にした。約200個の精製されたポリペプチドを得た。
【００６６】
次いで、精製ポリペプチドを、PBMC調製物においてＴ細胞増殖を誘導する能力についてスクリーニングした。PPD皮膚試験ポジティブであることが知られ、そしてそのＴ細胞がPPDおよびMTB由来の粗可溶性タンパク質に応答して増殖することが示されているドナー由来のPBMCを、10％プールヒト血清および50μg/mlゲンタマイシンを補充したRPMI1640を含む培地で培養した。精製ポリペプチドを、0.5〜10μg/mLの濃度で２連で添加した。200μlの容量の96ウェル丸底プレート中で６日間培養した後、培地の50μlを、以下の記載のようにIFN-γレベルの決定のために各ウェルから取り出した。次いで、プレートを、さらに18時間トリチウム化チミジンの１μCi/ウェルでパルスし、採集し、そしてトリチウムの取り込みをガスシンチレーションカウンターを用いて決定した。両方のレプリカで、培地のみで培養された細胞において観察された増殖よりも３倍大きな増殖をもたらす画分を、ポジティブとみなした。
【００６７】
IFN-γを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定した。ELISAプレートを、室温で４時間、PBS中のヒトIFN-γ（Phar Mingen, SanDiego,CA）に対するマウスモノクローナル抗体でコートした。次いで、ウェルを、室温で１時間、５％（W/V）脱脂粉乳を含むPBSでブロックした。次いで、プレートを、PBS/0.2％TWEEN-20中で６回洗浄し、そしてELISAプレート中で培養培地で1:2に希釈したサンプルを、室温で一晩インキュベートした。プレートを再度洗浄し、そしてPBS/10％正常ヤギ血清で1:3000に希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトIFN-γ血清を各ウェルに添加した。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG（SigmaChemical So.,St Louis,MO）を、PBS/５％脱脂粉乳中の1:2000希釈で添加した。さらに室温で２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、そしてTMB基質を添加した。反応を、1N硫酸で20分後に停止させた。光学密度を、参照波長として570nmを用いて450nmで測定した。両方のレプリカで、培地のみで培養した細胞からの平均ODよりも２倍大きなOD＋３標準偏差を示す画分を、ポジティブとみなした。
【００６８】
配列決定のために、ポリペプチドを個々に、BiobreneTM（Perkin Elmer/Applied BioSystems Division,Foster City,CA）処理したガラスファイバーフィルター上で乾燥した。ポリペプチドを有するフィルターを、Perkin Elmer/Applied BioSystems Division Procise 492 タンパク質配列決定機にロードした。ポリペプチドをアミノ末端から、従来のEdman化学を使用して配列決定した。アミノ酸配列を、適切なPTH誘導体標準に対するPTHアミノ酸誘導体の保持時間を比較することより、各ポリペプチドについて決定した。
【００６９】
上記の手順を用いて、以下のＮ末端配列を有する抗原が単離された：
（a）  Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Xaa-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-
Val-Ala-Ala-Leu（配列番号54）；
（b）  Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser（配列
番号55）；
（c）  Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-
Glu-Gly-Arg（配列番号56）；
（d）  Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro（配列
番号57）；
（e）  Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val（配列番号
58）；
（f）  Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro（配列番号59）；
（g）  Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Pro-
Ala（配列番号60）；および
（h）  Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly（配列
番号61）；
ここでXaaは任意のアミノ酸であり得る。
【００７０】
さらなる抗原を、上記の手順に加えて、微細孔HPLC精製工程を用いて単離した。詳細には、上記のクロマトグラフィーの精製工程による抗原の混合物を含む20μlの画分を、Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Model 172 HPLCにおいて、７ミクロンの孔サイズ、カラムサイズ１mm×100mmを有するAquapore C18カラム（Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA）上で精製した。画分を、水（0.05％TFA）中のアセトニトリル（0.05％ TFAを含む）の１％／分の線形グラジエントを用いて、80μl／分の流速でカラムから溶出した。溶出液を250nmでモニターした。元の画分を、４つの主要なピークと他の小さな成分とに分離し、そして12.054Kdの分子量（質量スペクトル測定による）および以下のＮ末端配列を有することが示されたポリペプチドを得た：
（i）  Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Gln-Thr-Ser-
Leu-Leu-Asn-Asn-Leu-Ala-Asp-Pro-Asp-Val-Ser-Phe-Ala-Asp（配列番号
62）
このポリペプチドは、上記のアッセイを用いるPBMC調製物において増殖およびIFN-γ産生の誘発を示した。
【００７１】
さらなる可溶性抗原を、M. tuberculosis培養濾過物から以下のように単離した。M. tuberculosis培養濾過物を上記のように調製した。Bis-Trisプロパン緩衝液（pH5.5）に対する透析後、Bis-Trisプロパン緩衝液（pH5.5）で平衡化したPorosQEカラム4.6×100mm（Perseptive Biosystems）での陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画を行った。ポリペプチドを、10ml／分の流速で、先の緩衝液系中での０〜1.5MのNaCl線形グラジエントを用いて溶出した。カラム溶出液を214nmの波長でモニターした。
【００７２】
イオン交換カラムから溶出した画分をプールし、そしてPoros R2カラム4.6×100mm（Perseptive Biosystems）を用いる逆相クロマトグラフィーに供した。ポリペプチドを、５ml／分の流速で、０〜100％のアセトニトリル（0.1％TFA）の線形グラジエントを用いて、カラムから溶出した。溶出液を214nmでモニターした。
【００７３】
溶出したポリペプチドを含む画分を凍結乾燥し、そして80μlの水性の0.1％のTFAに再懸濁し、そしてさらに２ml／分の流速で、０〜100％のアセトニトリル（0.1％のTFA）の線形グラジエントを用いて、VydacC4カラム4.6×150mm（Western Analytical, Temecula, CA）での逆相クロマトグラフィーに供した。溶出液を214nmでモニターした。
【００７４】
生物学的活性を有する画分を、１つの主要なピークと他の小さな成分に分離した。PVDF膜上でのこのピークのウェスタンブロットは、分子量14Kd、20Kd、および26Kdの３つの主要なバンドを明らかにした。これらのポリペプチドが、それぞれ以下のＮ末端配列を有することを決定した：
（j）  Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser（配列番号134）；
（k）  Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp（配列番号135）；および
（l）  Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly（配列番号136）、ここでXaaは任意のアミノ酸であり得る。
上記のアッセイを用いて、これらのポリペプチドがPBMC調製物において増殖およびIFN-γ産生を誘発することを示した。図1AおよびＢは、それぞれ、最初の、および２番目のドナー由来のPBMC調製物を用いるこのようなアッセイの結果を示す。
【００７５】
上記の（a）、（c）、（d）、および（g）と称される抗原をコードするDNA配列を、Ｎ末端配列に対応し、そしてM．tuberculosisコドン偏向を含む32P末端標識された変性オリゴヌクレオチドを用いて、M．tuberculosisゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得た。配列番号101で提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原（a）に対応するプローブを用いてスクリーニングを行った。配列番号101によりコードされるポリペプチドは配列番号102に提供される。配列番号52で提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原（g）に対応するプローブを用いてスクリーニングを行った。配列番号52によりコードされるポリペプチドは配列番号53に提供される。配列番号24に提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原（d）に対応するプローブを用いてスクリーニングを行い、そして配列番号25に提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原（c）に対応するプローブを用いてスクリーニングを行った。
【００７６】
先のアミノ酸配列を、DNA STARシステムを用いてgen bank中の公知のアミノ酸配列と比較した。検索したデータベースは約173,000タンパク質を含み、そしてこれは、翻訳されたタンパク質配列とSwiss,PIRデータベースの組み合わせである（Version 87）。抗原（a）〜（h）および（l）についてのアミノ酸配列との有意な相同性がないことを検出した。
【００７７】
抗原（i）のアミノ酸配列は、M．leprae由来の配列に相同であることを見出した。全長のM．leprae配列を、GENBANKから得られた配列を用いてゲノムDNAから増幅した。次いで、この配列を用いて、以下の実施例２に記載のM．tuberculosisライブラリーをスクリーニングし、そしてM．tuberculosisホモログの全長のコピーを得た（配列番号99）。
【００７８】
抗原（j）のアミノ酸配列は、DNA配列から翻訳された既知のM．tuberculosisタンパク質に対して相同であることを見出した。本発明者らの知識の限りでは、このタンパク質がＴ細胞刺激活性を有することは、これまでに示されていなかった。抗原（k）のアミノ酸配列が、M．leprae由来の配列に関連することを見出した。
【００７９】
上記の、３つのPPDポジティブドナーを用いる、増殖およびIFN-γアッセイにおいて、先に提供された代表的な抗原についての結果を表１に示す：
【００８０】
【表１】
2006187292.tif 000002
【００８１】
表１において、２から４の間の刺激指標（SI）（培地のみで培養した細胞と比較した）を与える応答を、＋で評点をつけ、１μg以下の濃度で４〜８または２〜４のSIを＋＋で評点をつけ、そして８より大きいSIを＋＋＋で評点をつけた。配列（i）の抗原は、増殖およびIFN-γアッセイの両方において、１つのドナーについては高いSI（＋＋＋）、および２つの他のドナーについては低いSI（＋＋および＋）を有することを見出した。これらの結果は、これらの抗原が増殖および／またはインターフェロン-γ産生を誘発し得ることを示す。
【００８２】
実施例２
M．tuberculosis抗原の単離のための患者の血清の使用
この実施例は、M．tuberculosis感染個体由来の血清を用いてスクリーニングすることにより、M．tuberculosis溶解物から抗原を単離することを説明する。
【００８３】
乾燥させたM．tuberculosis H37Ra（Difco Laboratories）を２％ NP40溶液に添加し、そしてあるいは、３回ホモジネートおよび超音波処理した。得られた懸濁物を微量遠心チューブで13,000rpmで遠心分離し、そして上清を0.2ミクロンのシリンジフィルターに通した。濾液をMacroPrep DEAEビーズ（BioRad, Hercules, CA）に結合させた。ビーズを20mMのTris（pH7.5）で大規模に洗浄し、そして結合したタンパク質を１MのNaClを用いて溶出した。１M NaCl溶出液を10mMのTris（pH7.5）に対して一晩透析した。透析した溶液を、DNaseおよびRNaseを用いて、0.05mg/mlで30分間室温で処理し、ついでα-D-マンノシダーゼ0.5U／mgを用いてpH4.5で３〜４時間室温で処理した。pH7.5に戻した後、材料をFPLCで、Bio Scale-Q-20カラム（BioRad）を通して分画した。画分を９つのプールと組み合わせ、Centriprep10（Amicon, Beverley, MA）で濃縮し、次いで本発明の他の抗原と免疫反応性でないM．tuberculosis感染患者由来の血清プールを用いて、血清学的活性についてウェスタンブロットによりスクリーニングした。
【００８４】
ほとんどの反応性画分をSDS-PAGEで泳動し、そしてPVDFに転移させた。以下の配列を生じる約85Kdのバンドを切り出した：
（m）Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-
Ile-Asn-Val-His-Leu-Val （配列番号137）、ここで、Xaaは任意のアミノ
酸であり得る。
【００８５】
上記のようなこの配列と遺伝子バンクの配列との比較は、既知の配列に対して有意な相同性がないことを明らかにした。
実施例３
M．tuberculosis抗原をコードするDNA配列の調製
この実施例は、M．tuberculosisで感染させた患者から得た血清、または可溶性M．tuberculosis抗原に対して惹起した抗血清を用いてM．tuberculosis発現ライブラリーをスクリーニングすることによる、M．tuberculosis抗原をコードするDNA配列の調製を説明する。
【００８６】
Ａ．ウサギ抗血清を用いるM．tuberculosis可溶性抗原の調製
ゲノムDNAをM．tuberculosis株H37Raから単離した。DNAをランダムに切断し、そしてLambda ZAP発現系（Stratagene，LaJolla, CA）を用いて発現ライブラリーを構築した。ウサギ抗血清を、M．tuberculosis培養物の濃縮した上清でウサギを免疫することにより、M．tuberculosis株H37Ra、H37Rv、およびErdmanの分泌タンパク質に対して生成させた。詳細には、最初にウサギを、10μgのムラミルジペプチド（Calbiochem,La Jolla, CA）および１mlの不完全フロイントアジュバントを含む２mlの全容量中の200μgのタンパク質抗原で皮下免疫した。４週間後、ウサギを不完全フロイントアジュバント中の100μgの抗原で皮下的に追加免疫した。最後に、ウサギを、４週間後に50μgのタンパク質抗原で静脈内免疫した。抗血清を用いて、Sambrookら、MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold SpringHarbor, NY, 1989に記載のように発現ライブラリーをスクリーニングした。免疫反応性抗原を発現するバクテリオファージプラークを精製した。プラーク由来のファージミドをレスキューし、そしてM．tuberculosisクローンのヌクレオチド配列を推定した。
【００８７】
32個のクローンを精製した。これらのうち25個がヒトM．tuberculosisにおいて以前に同定されていない配列を示した。組換え抗原を発現させ、そして精製した抗原を実施例１に記載のような免疫学的分析に用いた。Skeikyら、J.Exp. Med. 181: 1527-1537, 1995に記載のように、タンパク質をIPTGにより誘導し、そしてゲル溶出により精製した。このスクリーニングで同定されたDNA分子の代表的な配列を配列番号１〜25に提供する。対応する推定アミノ酸配列を、配列番号63〜87に示す。
【００８８】
上記のデータベースを用いる遺伝子バンク中の既知の配列とこれらの配列との比較において、TbRA2A、TbRA16、TbRA18、およびTbRA29（配列番号76、68、70、75）として本明細書中以下で参照されるクローンが、Mycobacteriumlepraeの既に同定された配列に対していくらかの相同性を示したが、M．tuberculosisにおいては示さなかったことを見出した。TbRA11、TbRA26、TbRA28、およびTbDPEP（配列番号65、73、74、53）は、M．tuberculosisにおいて以前に同定された配列であった。TbRA1、TbRA3、TbRA4、TbRA9、TbRA10、TbRA13、TbRA17、TbRA19、TbRA29、TbRA32、TbRA36、ならびにオーバーラップするクローンTbRA35およびTbRA12（それぞれ、配列番号63、77、81、82、64、67、69、71、75、78、80、79、66）に対して有意な相同性がないことを見出した。クローンTbRa24はクローンTbRa29とオーバーラップしている。
【００８９】
代表的な組換え抗原について行われ、そしていくつかの異なるM. tuberculosis免疫患者由来のＴ細胞調製物を用いたPBMC増殖およびインターフェロン-γアッセイの結果を、それぞれ表２および３に示す。
【００９０】
【表２】
2006187292.tif 000003
【００９１】
【表３】
2006187292.tif 000004
【００９２】
表２および３において、1.2〜２の間の刺激指標（SI）（培地のみで培養した細胞と比較した）を与える応答を±で評点をつけ、２〜４のSIを＋で評点をつけ、１μg以下の濃度で４〜８または２〜４のSIを＋＋で評点をつけ、そして８より大きいSIを＋＋＋で評点をつけした。さらに、増殖およびイFN-γ産生における濃縮の効果を添付の図において先の抗原の２つについて示す。増殖およびインターフェロン-γ産生の両方について、TbRa3は++で評点をつけられ、そしてTbRa9は＋で評点をつけられた。
【００９３】
これらの結果は、これらの可溶性抗原がM．tuberculosis免疫個体由来のＴ細胞において増殖および／またはインターフェロン-γ産生を誘発し得ることを示す。
【００９４】
Ｂ．M.tuberculosis抗原をコードするDNA配列を同定するための患者血清の使用
上記のゲノムDNAライブラリー、およびさらなるH37Rvライブラリーを、進行性の結核の患者から得た血清プールを用いてスクリーニングした。H37Rvライブラリーを調製するために、M.tuberculosisH37Rv株のゲノムDNAを単離し、部分的なSau3A消化にかけ、そしてこれを用いて、ラムダZap発現系（Stratagene, La Jolla, Ca）を用いて発現ライブラリーを構築した。３つの異なる血清プール（それぞれ、進行性の肺疾患または胸膜疾患の３個体から得た血清を含有する）を、発現スクリーニングにおいて用いた。プールをTbL、TbM、およびTbHと称し、ELISAおよび免疫ブロットフォーマットの両方におけるH37Ra溶解物との相対的反応性（すなわち、TbL＝低反応性、TbM＝中反応性、およびTbH＝高反応性）に注目した。７人の進行性肺結核の患者由来の第４の血清プールもまた用いた。どの血清にも、組換え38kDM.tuberculosis H37Raリン酸結合タンパク質との増大した反応性はなかった。
【００９５】
全プールをE.coli溶解物に予め吸着させ、そしてこれを用いて、Sambrookら、Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載のようにH37RaおよびH37Rv発現ライブラリーをスクリーニングした。免疫反応性抗原を発現するバクテリオファージプラークを精製した。プラーク由来のファージミドをレスキューし、そしてM.tuberculosisクローンのヌクレオチド配列を推定した。
【００９６】
32個のクローンを精製した。これらのうち31個が、ヒトM.tuberculosisにおいて以前に同定されていない配列を示した。同定したDNA分子の代表的な配列を、配列番号26〜51および105に提供する。これらのうち、TbH-8およびTbH-8-2（配列番号105）が、同一のクローン由来の連続していないDNA配列であり、そしてTbH-4（配列番号43）およびTbH-4-FWD（配列番号44）が、同一のクローン由来の連続していない配列である。本明細書中以降でTb38-1、TbH-4、TbH-8、TbH-9、およびTbH-12と同定した抗原のアミノ酸配列を配列番号88〜92に示す。先に特定したデータベースを用いた、これらの配列と遺伝子バンクにおける既知の配列との比較は、TbH-4、TbH-8、TbH-9、およびTbM-3に対して有意な相同性がないことを明らかにした。一方、弱い相同性をTbH-9に対して見出した。TbH-12が、M.paratuberculosis（受託番号第S28515号）において以前に同定された34kD抗原性タンパク質に対して相同であることを見出した。Tb38-1が、M.bovis（受託番号第U34848号）およびM.tuberculosis（Sorensenら、Infec.Immun. 63:1710-1717, 1995）において以前に同定された抗原ESAT-6のオープンリーディングフレームの34塩基対上流に位置することを見出した。
【００９７】
Tb38-1およびTbH-9（ともにH37Raライブラリーから単離された）由来のプローブを用いて、H37Rvライブラリーにおいてクローンを同定した。Tb38-1は、Tb38-1-1F2、Tb38-1F3、Tb38-1F5およびTb38-1F6（配列番号112、113、116、118、および119）にハイブリダイズした。（配列番号112および113は、クローンTb38-1F2由来の連続していない配列である）。Tb38-1F2において、２つのオープンリーディングフレームを推定した；１つは、Tb37FL（配列番号114）に相当し、２番目の配列（部分配列）は、Tb38-1のホモログであり得、そしてTb38-IN（配列番号115）と呼ぶ。Tb38-1F3の推定アミノ酸配列を配列番号117に示す。TbH-9プローブは、H37Rvライブラリーにおいて３つのクローンを同定した：TbH-9-FL（配列番号106）、これは、TbH-9（R37Ra）のホモログであり得る、TbH-9-1（配列番号108）、およびTbH-9-4（配列番号110）、これらの全ては、TbH-9に対して高度に関連した配列である。これらの３つのクローンの推定アミノ酸配列を配列番号107、109、および111に示す。
【００９８】
Tb38-1、ESAT-6および他の代表的な組換え抗原で行ったＴ細胞アッセイの結果を、以下の表４Ａ、Ｂおよび５にそれぞれ示す：
表４Ａ
代表的な抗原に対するPBMC増殖の結果
【００９９】
【表４Ａ】
2006187292.tif 000005
【０１００】
表４Ｂ
代表的な抗原に対するPBMCインターフェロンγ産生の結果
【０１０１】
【表４Ｂ】
2006187292.tif 000006
【０１０２】
表５
代表的な抗原に対するＴ細胞応答の概要
【０１０３】
【表５】
2006187292.tif 000007
【０１０４】
これらの結果は、本発明のM.tuberculosis抗原およびESAT-6は共に、増殖および／またはM.tuberculosis免疫個体由来のＴ細胞におけるインターフェロンγ産生を誘発し得ることを示す。発明者が知る限りでは、ESAT-6は、ヒト免疫応答を刺激することは以前には示されていなかった。
【０１０５】
抗原Tb38-1のアミノ酸配列をカバーする６個のオーバーラップするペプチドのセットを、実施例４に記載の方法を用いて構築した。これらのペプチドの配列（本明細書中以降でpep1-6と称する）をそれぞれ、配列番号93〜98に提供する。これらのペプチドを用いたＴ細胞アッセイの結果を表６および７に示す。これらの結果は、増殖およびM.tuberculosis免疫個体由来のＴ細胞におけるインターフェロンγ産生を誘発し得るTb38-1内のＴ細胞エピトープの存在を確認し、そしてその位置決めを助ける。
表６
Tb38-1ペプチドに対するPBMC増殖の結果
【０１０６】
【表６】
2006187292.tif 000008
【０１０７】
表７
Tb38-1ペプチドに対するPBMCインターフェロンγ産生の結果
【０１０８】
【表７】
2006187292.tif 000009
【０１０９】
実施例４
ツベルクリン精製タンパク質誘導体由来のポリペプチドの精製および特徴付け
M.tuberculosisポリペプチドを、ツベルクリン精製タンパク質誘導体（PPD）から以下のように単離した。
【０１１０】
PPDを、いくらかの改変を加えて公開されたとおりに調製した（Seibert, F.ら、Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard.The American Review of Tuberculosis 44:9-25, 1941）。
【０１１１】
M.tuberculosis Rv株をローラーボトル中で合成培地において37℃で６週間増殖させた。次いで、増殖させた細菌を含むボトルを、３時間、水蒸気中で100℃まで加熱した。培養物を0.22μフィルターを用いて滅菌濾過し、そして液相を3kDカットオフメンブレンを用いて20回濃縮した。タンパク質を、50％硫酸アンモニウム溶液で１回および25％硫酸アンモニウム溶液で８回、沈澱させた。得られたタンパク質（PPD）を、BiocadHPLCシステム（Perseptive Biosystems, Framingham, MA）においてC18カラム（7.8×300mM；Waters,Milford, MA）を用いる逆相液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）により分画した。画分を、０〜100％緩衝液（アセトニトリル中0.1％ TFA）からの線形グラジエントを用いてカラムから溶出した。流速は10ml／分であり、そして溶出液を214nmおよび280nmでモニターした。
【０１１２】
６つの画分を採集し、乾燥し、PBS中に懸濁し、そしてM.tuberculosis感染モルモットにおいて、遅延型過敏（DTH）反応の誘発について個々に試験した。１つの画分が、強いDTH反応を誘発することを見出し、そしてこれを、PerkinElmer/Applied Biosystems Division Model 172 HPLCの微細孔Vydac C18カラム（カタログ番号218TP5115）においてさらにRP-HPLCにより続けて分画した。画分を、80μl／分の流速を有する５〜100％緩衝液（アセトニトリル中0.05％TFA）からの線形グラジエントを用いて溶出した。溶出液を215nmでモニターした。８つの画分を採集し、そしてM.tuberculosis感染モルモットにおいてDTHの誘発について試験した。１つの画分が、約16mmの硬結の強いDTHを誘発することが見出された。他の画分は、検出可能なDTHを誘導しなかった。陽性画分をSDS-PAGEゲル電気泳動にかけ、そして約12kD分子量の単一のタンパク質バンドを含有することを見出した。
【０１１３】
このポリペプチド（本明細書中以降でDPPDと称する）を、上記のようにPerkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise492タンパク質配列決定装置を用いてアミノ末端から配列決定し、そしてこれが配列番号129に示すＮ末端配列を有することを見出した。上記のような、この配列と遺伝子バンクにおける既知の配列との比較は、公知のホモロジーがないことを明らかにした。DPPDの４つの臭化シアンフラグメントを単離し、そしてこれが配列番号130〜133に示す配列を有することを見出した。
【０１１４】
抗原DPPDがヒトPBMCを刺激して、増殖およびIFN-γを産生する能力を実施例１に記載のようにアッセイした。表８に示すように、DPPDは増殖を刺激し、そして大量のIFN-γの産生を惹起することを見出した；市販のPPDにより惹起されるよりも高程度である。
表８
DPPDに対する増殖およびインターフェロンγアッセイの結果
【０１１５】
【表８】
2006187292.tif 000010
【０１１６】
実施例５
合成ポリペプチドの合成
ポリペプチドを、HPTU（O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化と共にFMOC化学を用いて、Millipore9050ペプチド合成機で合成し得る。Gly-Cys-Gly配列をペプチドのアミノ末端に結合して、ペプチドの結合または標識化の方法を提供し得る。固体支持体からのペプチドの開裂を、以下の開裂混合物を用いて実施し得る：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（40：１：２：２：３）。２時間の開裂後、ペプチドを冷メチル-t-ブチル-エーテル中で沈殿させ得る。次いで、ペプチドペレットを、Ｃ18逆相HPLCによる精製の前に、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含有する水中に溶解し、そして凍結乾燥し得る。水（0.1％TFAを含有する）中の０〜60％アセトニトリル（0.1％TFAを含有する）のグラジエントを用いて、ペプチドを溶出し得る。純画分の凍結乾燥後、ペプチドをエレクトロスプレー質量分析法を用いて、およびアミノ酸分析により特徴付け得る。
【０１１７】
上述から、本発明の特定の実施態様を説明の目的のために本明細書中に記載してきたが、種々の改変が、本発明の意図および範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ】図1AおよびＢは、それぞれ、実施例１に記載の14Kd、20Kd、および26Kdの抗原による、第１および第２のM. tuberculosis免疫ドナー由来のＴ細胞での増殖およびインターフェロン-γ産生の刺激を例示する。
【図１Ｂ】図1AおよびＢは、それぞれ、実施例１に記載の14Kd、20Kd、および26Kdの抗原による、第１および第２のM. tuberculosis免疫ドナー由来のＴ細胞での増殖およびインターフェロン-γ産生の刺激を例示する。
【図２】図２は、２つの代表的なポリペプチドTbRa3およびTbRa9による、M. tuberculosis免疫個体由来のＴ細胞での増殖およびインターフェロン-γの産生の刺激を例示する。
【０１１９】
（配列の識別名）
配列番号１は、TbRa１のDNA配列である。
配列番号２は、TbRa10のDNA配列である。
配列番号３は、TbRa11のDNA配列である。
配列番号４は、TbRa12のDNA配列である。
配列番号５は、TbRa13のDNA配列である。
配列番号６は、TbRa16のDNA配列である。
配列番号７は、TbRa17のDNA配列である。  
配列番号８は、TbRa18のDNA配列である。
配列番号９は、TbRa19のDNA配列である。
配列番号１０は、TbRa24のDNA配列である。
配列番号１１は、TbRa26のDNA配列である。
配列番号１２は、TbRa28のDNA配列である。
配列番号１３は、TbRa29のDNA配列である。
配列番号１４は、TbRa2AのDNA配列である。
配列番号１５は、TbRa3のDNA配列である。
配列番号１６は、TbRa32のDNA配列である。
配列番号１７は、TbRa35のDNA配列である。
配列番号１８は、TbRa36のDNA配列である。
配列番号１９は、TbRa４のDNA配列である。
配列番号２０は、TbRa９のDNA配列である。
配列番号２１は、TbRaＢのDNA配列である。
配列番号２２は、TbRaＣのDNA配列である。
配列番号２３は、TbRaＤのDNA配列である。
配列番号２４は、YYWCPGのDNA配列である。
配列番号２５は、AAMKのDNA配列である。
配列番号２６は、TbL-23のDNA配列である。
配列番号２７は、TbL-24のDNA配列である。
配列番号２８は、TbL-25のDNA配列である。
配列番号２９は、TbL-28のDNA配列である。
配列番号３０は、TbL-29のDNA配列である。
配列番号３１は、TbH-5のDNA配列である。
配列番号３２は、TbH-8のDNA配列である。
配列番号３３は、TbH-9のDNA配列である。
配列番号３４は、TbM-1のDNA配列である。
配列番号３５は、TbM-3のDNA配列である。
配列番号３６は、TbM-6のDNA配列である。
配列番号３７は、TbM-7のDNA配列である。
配列番号３８は、TbM-9のDNA配列である。
配列番号３９は、TbM-12のDNA配列である。
配列番号４０は、TbM-13のDNA配列である。
配列番号４１は、TbM-14のDNA配列である。
配列番号４２は、TbM-15のDNA配列である。
配列番号４３は、TbH-4のDNA配列である。
配列番号４４は、TbH-4-FWDのDNA配列である。
配列番号４５は、TbH-12のDNA配列である。
配列番号４６は、Tb38-1のDNA配列である。
配列番号４７は、TbH38-4のDNA配列である。
配列番号４８は、TbL-17のDNA配列である。
配列番号４９は、TbL-20のDNA配列である。
配列番号５０は、TbL-21のDNA配列である。
配列番号５１は、TbH-16のDNA配列である。
配列番号５２は、DPEPのDNA配列である。
配列番号５３は、DPEPの推定アミノ酸配列である。
配列番号５４は、DVP Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号５５は、AVGS Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号５６は、AAMK Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号５７は、YYWC Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号５８は、DIGS Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号５９は、AEES Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号６０は、DPEP Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号６１は、APKT Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号６２は、DPAS Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号６３は、TbRa１の推定アミノ酸配列である。
配列番号６４は、TbRa10の推定アミノ酸配列である。
配列番号６５は、TbRa11の推定アミノ酸配列である。
配列番号６６は、TbRa12の推定アミノ酸配列である。
配列番号６７は、TbRa13の推定アミノ酸配列である。
配列番号６８は、TbRa16の推定アミノ酸配列である。
配列番号６９は、TbRa17の推定アミノ酸配列である。
配列番号７０は、TbRa18の推定アミノ酸配列である。
配列番号７１は、TbRa19の推定アミノ酸配列である。
配列番号７２は、TbRa24の推定アミノ酸配列である。
配列番号７３は、TbRa26の推定アミノ酸配列である。
配列番号７４は、TbRa28の推定アミノ酸配列である。
配列番号７５は、TbRa29の推定アミノ酸配列である。
配列番号７６は、TbRa2Aの推定アミノ酸配列である。
配列番号７７は、TbRa3の推定アミノ酸配列である。
配列番号７８は、TbRa32の推定アミノ酸配列である。
配列番号７９は、TbRa35の推定アミノ酸配列である。
配列番号８０は、TbRa36の推定アミノ酸配列である。
配列番号８１は、TbRa4の推定アミノ酸配列である。
配列番号８２は、TbRa9の推定アミノ酸配列である。
配列番号８３は、TbRaＢの推定アミノ酸配列である。
配列番号８４は、TbRaＣの推定アミノ酸配列である。
配列番号８５は、TbRaＤの推定アミノ酸配列である。
配列番号８６は、YYWCPGの推定アミノ酸配列である。
配列番号８７は、TbAAMKの推定アミノ酸配列である。
配列番号８８は、Tb38-1の推定アミノ酸配列である。
配列番号８９は、TbH-4の推定アミノ酸配列である。
配列番号９０は、TbH-8の推定アミノ酸配列である。
配列番号９１は、TbH-9の推定アミノ酸配列である。
配列番号９２は、TbH-12の推定アミノ酸配列である。
配列番号９３は、Tb38-1ペプチド１のアミノ酸配列である。
配列番号９４は、Tb38-1ペプチド２のアミノ酸配列である。
配列番号９５は、Tb38-1ペプチド３のアミノ酸配列である。
配列番号９６は、Tb38-1ペプチド４のアミノ酸配列である。
配列番号９７は、Tb38-1ペプチド５のアミノ酸配列である。
配列番号９８は、Tb38-1ペプチド６のアミノ酸配列である。
配列番号９９は、DPASのDNA配列である。
配列番号１００は、DPASの推定アミノ酸配列である。
配列番号１０１は、DPVのDNA配列である。
配列番号１０２は、DPVの推定アミノ酸配列である。
配列番号１０３は、ESAT-6のDNA配列である。
配列番号１０４は、ESAT-6の推定アミノ酸配列である。
配列番号１０５は、TbH-8-2のDNA配列である。
配列番号１０６は、TbH-9FLのDNA配列である。
配列番号１０７は、TbH-9FLの推定アミノ酸配列である。
配列番号１０８は、TbH-9-1のDNA配列である。
配列番号１０９は、TbH-9-1の推定アミノ酸配列である。
配列番号１１０は、TbH-9-4のDNA配列である。
配列番号１１１は、TbH-9-4の推定アミノ酸配列である。
配列番号１１２は、Tb38-1F2 INのDNA配列である。
配列番号１１３は、Tb38-2F2 RPのDNA配列である。
配列番号１１４は、Tb37-FLの推定アミノ酸配列である。  
配列番号１１５は、Tb38-INの推定アミノ酸配列である。
配列番号１１６は、Tb38-1F3のDNA配列である。
配列番号１１７は、Tb38-1F3の推定アミノ酸配列である。
配列番号１１８は、Tb38-1F5のDNA配列である。
配列番号１１９は、Tb38-1F6のDNA配列である。
配列番号１２０は、DVPの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２１は、AVGSの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２２は、AAMKの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２３は、YYWCの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２４は、DIGSの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２５は、AEESの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２６は、DPEPの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２７は、APKTの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。
配列番号１２８は、DPASの推定アミノ酸配列である。
配列番号１２９は、DPPD N末端抗原のタンパク質配列である。
配列番号１３０〜１３３は、４つのDPPD臭化シアンフラグメントのタンパク質配列である。  
配列番号１３４は、XDS抗原のＮ末端タンパク質配列である。
配列番号１３５は、AGD抗原のＮ末端タンパク質配列である。
配列番号１３６は、APE抗原のＮ末端タンパク質配列である。
配列番号１３７は、XYI抗原のＮ末端タンパク質配列である。
【０１２０】
（配列表）
【数１−１】
2006187292.tif 000011
【０１２１】
【数１−２】
2006187292.tif 000012
【０１２２】
【数１−３】
2006187292.tif 000013
【０１２３】
【数１−４】
2006187292.tif 000014
【０１２４】
【数１−５】
2006187292.tif 000015
【０１２５】
【数１−６】
2006187292.tif 000016
【０１２６】
【数１−７】
2006187292.tif 000017
【０１２７】
【数１−８】
2006187292.tif 000018
【０１２８】
【数１−９】
2006187292.tif 000019
【０１２９】
【数１−１０】
2006187292.tif 000020
【０１３０】
【数１−１１】
2006187292.tif 000021
【０１３１】
【数１−１２】
2006187292.tif 000022
【０１３２】
【数１−１３】
2006187292.tif 000023
【０１３３】
【数１−１４】
2006187292.tif 000024
【０１３４】
【数１−１５】
2006187292.tif 000025
【０１３５】
【数１−１６】
2006187292.tif 000026
【０１３６】
【数１−１７】
2006187292.tif 000027
【０１３７】
【数１−１８】
2006187292.tif 000028
【０１３８】
【数１−１９】
2006187292.tif 000029
【０１３９】
【数１−２０】
2006187292.tif 000030
【０１４０】
【数１−２１】
2006187292.tif 000031
【０１４１】
【数１−２２】
2006187292.tif 000032
【０１４２】
【数１−２３】
2006187292.tif 000033
【０１４３】
【数１−２４】
2006187292.tif 000034
【０１４４】
【数１−２５】
2006187292.tif 000035
【０１４５】
【数１−２６】
2006187292.tif 000036
【０１４６】
【数１−２７】
2006187292.tif 000037
【０１４７】
【数１−２８】
2006187292.tif 000038
【０１４８】
【数１−２９】
2006187292.tif 000039
【０１４９】
【数１−３０】
2006187292.tif 000040
【０１５０】
【数１−３１】
2006187292.tif 000041
【０１５１】
【数１−３２】
2006187292.tif 000042
【０１５２】
【数１−３３】
2006187292.tif 000043
【０１５３】
【数１−３４】
2006187292.tif 000044
【０１５４】
【数１−３５】
2006187292.tif 000045
【０１５５】
2006187292.tif 000046
【０１５６】
【数１−３６】
2006187292.tif 000047
【０１５７】
【数１−３７】
2006187292.tif 000048
【０１５８】
【数１−３８】
2006187292.tif 000049
【０１５９】
【数１−３９】
2006187292.tif 000050
【０１６０】
【数１−４０】
2006187292.tif 000051
【０１６１】
【数１−４１】
2006187292.tif 000052
【０１６２】
【数１−４２】
2006187292.tif 000053
【０１６３】
【数１−４３】
2006187292.tif 000054
【０１６４】
【数１−４４】
2006187292.tif 000055
【０１６５】
【数１−４５】
2006187292.tif 000056
【０１６６】
【数１−４６】
2006187292.tif 000057
【０１６７】
【数１−４６】
2006187292.tif 000058
【０１６８】
【数１−４７】
2006187292.tif 000059
【０１６９】
【数１−４８】
2006187292.tif 000060
【０１７０】
【数１−４９】
2006187292.tif 000061
【０１７１】
【数１−５０】
2006187292.tif 000062
【０１７２】
【数１−５１】
2006187292.tif 000063
【０１７３】
【数１−５２】
2006187292.tif 000064
【０１７４】
【数１−５３】
2006187292.tif 000065
【０１７５】
【数１−５４】
2006187292.tif 000066
【０１７６】
【数１−５５】
2006187292.tif 000067
【０１７７】
【数１−５６】
2006187292.tif 000068
【０１７８】
【数１−５７】
2006187292.tif 000069
【０１７９】
【数１−５８】
2006187292.tif 000070
【０１８０】
【数１−５９】
2006187292.tif 000071
【０１８１】
【数１−６０】
2006187292.tif 000072
【０１８２】
【数１−６１】
2006187292.tif 000073
【０１８３】
【数１−６２】
2006187292.tif 000074
【０１８４】
【数１−６３】
2006187292.tif 000075
【０１８５】
【数１−６４】
2006187292.tif 000076
【０１８６】
【数１−６５】
2006187292.tif 000077
【０１８７】
【数１−６６】
2006187292.tif 000078
【０１８８】
【数１−６７】
2006187292.tif 000079
【０１８９】
【数１−６８】
2006187292.tif 000080
【０１９０】
【数１−６９】
2006187292.tif 000081
【０１９１】
【数１−７０】
2006187292.tif 000082
【０１９２】
【数１−７１】
2006187292.tif 000083
【０１９３】
【数１−７２】
2006187292.tif 000084
【０１９４】
【数１−７３】
2006187292.tif 000085
【０１９５】
【数１−７４】
2006187292.tif 000086
【０１９６】
【数１−７５】
2006187292.tif 000087
【０１９７】
【数１−７６】
2006187292.tif 000088
【０１９８】
【数１−７７】
2006187292.tif 000089
【０１９９】
【数１−７８】
2006187292.tif 000090
【０２００】
【数１−７９】
2006187292.tif 000091
【０２０１】
【数１−８０】
2006187292.tif 000092
【０２０２】
【数１−８１】
2006187292.tif 000093
【０２０３】
【数１−８２】
2006187292.tif 000094
【０２０４】
【数１−８３】
2006187292.tif 000095
【０２０５】
【数１−８４】
2006187292.tif 000096
【０２０６】
【数１−８５】
2006187292.tif 000097
【０２０７】
【数１−８６】
2006187292.tif 000098
【０２０８】
【数１−８７】
2006187292.tif 000099
【０２０９】
【数１−８８】
2006187292.tif 000100
【０２１０】
【数１−８９】
2006187292.tif 000101
【０２１１】
【数１−９０】
2006187292.tif 000102
【０２１２】
【数１−９１】
2006187292.tif 000103
【０２１３】
【数１−９２】
2006187292.tif 000104
【０２１４】
【数１−９３】
2006187292.tif 000105
【０２１５】
【数１−９４】
2006187292.tif 000106
【０２１６】
【数１−９５】
2006187292.tif 000107
【０２１７】
【数１−９６】
2006187292.tif 000108
【０２１８】
【数１−９７】
2006187292.tif 000109
【０２１９】
【数１−９８】
2006187292.tif 000110
【０２２０】
【数１−９９】
2006187292.tif 000111
【０２２１】
【数１−１００】
2006187292.tif 000112
【０２２２】
【数１−１０１】
2006187292.tif 000113
【０２２３】
【数１−１０２】
2006187292.tif 000114
【０２２４】
【数１−１０３】
2006187292.tif 000115
【０２２５】
【数１−１０４】
2006187292.tif 000116
【０２２６】
【数１−１０５】
2006187292.tif 000117
【０２２７】
【数１−１０６】
2006187292.tif 000118
【０２２８】
【数１−１０７】
2006187292.tif 000119
【０２２９】
【数１−１０８】
2006187292.tif 000120
【０２３０】
【数１−１０９】
2006187292.tif 000121
【０２３１】
【数１−１１０】
2006187292.tif 000122
【図１Ａ】
2006187292.tif 000123
【図１Ｂ】
2006187292.tif 000124
【図２】
2006187292.tif 000125