(57)【要約】【課題】蛋白質工学的手法を用いキチナーゼ触媒活性を増強するため必要となるキチン結合ドメインの結晶と溶液および結晶中での本ドメインの構造情報を提供する。【解決手段】キチン結合ドメインの結晶であって、単位格子定数が、ａ＝ｂ＝４８．８Å、ｃ＝８５．０Åであるキチン結合ドメインの結晶。【選択図】図１
2006262702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチン結合ドメインの結晶であって、単位格子定数が、ａ＝ｂ＝４８．８Å、ｃ＝８５．０Åであるキチン結合ドメインの結晶。
【請求項２】
下記のいずれかのポリペプチド
(1) 配列番号１のSer266からIle358位の９３アミノ酸からなるポリペプチド
(2) 配列番号１のSer266からIle358位の９３アミノ酸において、１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、Trp274、Trp308、Trp326に対応するアミノ酸は不変であり、かつ、キチン結合ドメイン活性を有するポリペプチド、
【請求項３】
以下のいずれかを含むＤＮＡ：
(1) 配列番号２の１〜２７９番目の核酸配列に対応するＤＮＡ；
(2)上記(1)の相補鎖、
(3) 配列番号２の１〜２７９に対応するＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ、Trp274、Trp308、Trp326に対応するヌクレオチドがトリプトファンをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチン結合ドメインとその結晶、キチン結合ドメインをコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
キチナーゼは、植物や微生物などから得られる酵素であり、キチンを加水分解してN-アセチルグルコサミンを得るための工業的利用において非常に重要な役割を果たす酵素である。キチナーゼは、種々の由来のものが単離され、耐熱性キチナーゼについても知られている（特許文献１〜２）。
【０００３】
キチナーゼのキチン結合ドメインは、キチナーゼの活性向上に重要なドメインであるだけでなく、加水分解が難しい不溶性キチンに直接結合することで、キチン分子間の水素結合をより効率的に破壊することが可能になる。キチンへの結合能が向上したキチナーゼを得るために、キチン結合ドメインの構造情報は非常に重要であるが、このような構造情報はほとんど知られていなかった。
【特許文献１】特開2004-357620
【特許文献２】特開2004-344160
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、蛋白質工学的手法を用いキチナーゼ触媒活性を増強するため必要となるキチン結合ドメインの構造情報を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、超好熱菌Pyrococcus furiosus由来のキチナーゼ遺伝子よりキチン結合ド
メイン（以下ChBDと略すことがある）を単離、精製し、結晶化に成功した。さらに、溶液中での立体構造をNMRで、結晶中での立体構造をX線結晶解析で決定し、結晶中と溶液中で立体構造が同一であること、すなわち、その立体構造が溶液中でのキチン認識に重要である事を明らかにした。さらに、キチン結合に重要なアミノ酸残基を特定し、その立体配置を明らかにした。
【０００６】
本発明は、以下の発明に関する。
１．  キチン結合ドメインの結晶であって、単位格子定数が、ａ＝ｂ＝４８．８Å、ｃ＝８５．０Åであるキチン結合ドメインの結晶。
２．  下記のいずれかのポリペプチド
(1) 配列番号１のSer266からIle358位の９３アミノ酸からなるポリペプチド
(2) 配列番号１のSer266からIle358位の９３アミノ酸において、１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、Trp274、Trp308、Trp326に対応するアミノ酸は不変であり、かつ、キチン結合ドメイン活性を有するポリペプチド、
３．  以下のいずれかを含むＤＮＡ：
(1) 配列番号２の１〜２７９番目の核酸配列に対応するＤＮＡ；
(2)上記(1)の相補鎖、
(3) 配列番号２の１〜２７９に対応するＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつ、Trp274、Trp308、Trp326に対応するヌクレオチドがトリプトファンをコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、キチン結合ドメインの溶液および結晶中での構造情報、並びにキチン結合ドメインが、Ser266からIle358位の９３アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号３に示す）であることを明らかにした。さらに、Trp274、Trp308、Trp326がキチンへの結合能に必須のアミノ酸であることを明らかにした。
【０００８】
この情報に基づき、キチナーゼの触媒活性をさらに増強されることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で使用したキチン結合ドメイン(ChBD)は、Pyrococcus furiosus由来のキチナー
ゼのキチン結合ドメインである。本発明で得られたキチン結合ドメインの結晶構造などの構造情報は、Pyrococcus furiosusなどの耐熱性古細菌由来のキチナーゼのキチン結合ド
メインに好適に適用できるが、他の微生物、植物、動物由来のキチナーゼにも有用である。
【００１０】
本発明者は、キチン結合ドメインがSer266からIle358位の９３アミノ酸からなるポリペプチドであることを実証した。キチン結合ドメインがこの９３アミノ酸からなることは本発明者により初めて得られた知見である。
【００１１】
また、該９３アミノ酸のうち、Trp274、Trp308、Trp326はキチン結合活性の維持に非常に重要であり、これらのトリプトファンがAlaに置換されるとキチン結合活性は大きく低
下した。従って、キチン結合能を向上した変異型ドメインを製造する場合、Trp274、Trp308、Trp326は維持するのが望ましい。変異型キチン結合ドメインの固体キチンに対する結合能が向上すると、固体キチンをそのまま分解することができ、キトサン等の有用物質の製造に非常に有利である。
【００１２】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中、６０℃の条件が例示される。
【００１３】
キチン結合ドメインの置換、付加、欠失、挿入などの変異を導入する方法としては、該ドメインをコードするＤＮＡにおいて、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス（Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic
Acids Res., 12, 9441 (1984)）などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段（例えばＤＮＡ合成機を使用する）（J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 1859 (1981)）などが挙げられる。コドンの選択は、宿主のコドンユーセージを考慮して決定できる。
【００１４】
キチン結合ドメインに導入されるアミノ酸変異は、１個〜数個、例えば１〜７個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、特に１〜２個である。但し、Trp274、Trp308、Trp326は変異しないのが好ましい。
【００１５】
本発明において、キチン結合ドメインの結晶化及び得られた結晶の構造解析は公知の方法を広く適用できる。例えば結晶化は、クリスタルスクリーニングＫｉｔ（Hampton research社）などを使用して好適に行うことができる。また、結晶構造は、Ｘ線解析により行うことができる。
【００１６】
本発明では、キチン結合ドメインの結晶構造を、Ｘ線解析及び溶液中のＮＭＲによる構造解析を組み合わせて決定した。本発明で得られた構造情報は、結晶中だけでなく、溶液中の構造も反映しており、非常に有用である。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明する。
実施例１
（１）実験方法
サンプル調整
・ChBDに対応する遺伝子の増幅
キチン結合ドメインと推定されるポリペプチド（当該遺伝子中アミノ酸番号では258番
のスレオニンから358番のイソロイシンに対応）を大腸菌内で大量に発現させるために、PreScission  Protease認識配列をコードする塩基配列を含む合成DNAを用いPCR法により増幅した。発現ベクターへの組み込みはLICクローニングキット（NOVAGEN社）を用い大腸菌（XL-1Blue）（NOVAGEN社）に形質転換し、ChBD発現ベクターを作成した。
形質転換体は、（0.05 mg/ml アンピシリン）を含むLB寒天プレート上でのコロニー形成
を指標に選択した。形質転換体からChBD遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
・ChBD遺伝子を含有する形質転換体の作製
1.5ml容チューブ内に、大腸菌（E. coli ）Rosetta (DE3)株（ Novagen社製）のコンピテントセル0.04ｍl（2,000,0000cfu/mg）と、上記調製したChBD遺伝子含有プラスミドDNA溶液0.003ｍl（プラスミドDNA 8.4ng）を加え氷中に30分間放置した後、42℃で３０秒間ヒ
ートショックを与えた。次いで、チューブ内にＳＯＣmedium を0.25mｌ加え、37℃で1時
間振とう培養した。次いで、アンピシリンを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
・ChBDの精製
得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が0.5に達するまで、３７℃で培養した後、ChBDの発現量を高めるためにＩＰＴＧ（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を加えさらに19時間培養した。培養液を8,000rpmで10min遠心分離することにより集菌した。集菌した菌体１０gに、BugBuster溶液（NOVAGEN社
）１０0mlを加え、菌体を90Wの出力で３０分間超音波破砕した。破砕した菌液を 15,000rpmで30分間遠心分離し、上清を採取した。同緩衝液で平衡化した金属キレートカラムHiTrap−Cleating（アマシャム  バイオサイエンス社製）カラム（事前に１００ｍM  NiCl2を添加しNiを結合）を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。溶出は0.5Mイミダゾールを含む２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、  ５００ｍM  NaCl（pH8.5）の直
線グラジエントを用いた。得られた目的分画にPreScission  Protease  （アマシャム  
バイオサイエンス社）を添加し、透析チューブ（分画サイズMw.3500）に入れ、２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミン、２５ｍM  NaCl  （pH8.5）溶液で４℃、１６時間、透析をおこなった。
透析終了後、再び、２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、２５ｍM  NaCl（pH8.5）溶液で平衡化した金属キレートカラムHiTrap−Cleating（アマシャム  バイオサイエ
ンス社）カラム（事前に１００ｍM  NiCl2を添加しNiを結合）に添加し、カラムを素通りした分画を回収し、２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン, ２５ｍM  NaCl（pH8.5）緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂のHiTrapQ（アマシャム  バイオサイエンス社）カラムに回収した分画を添加し、イオン交換クロマトグラフィーを行った。目的タンパク質を含む分画にはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一
標品が含まれていた。
結晶化条件の検索
クリスタルスクリーニングＫｉｔ（Hampton research社）に含まれている各種の結晶化剤のスクリーニングを行った。サンプル溶液1.5μl（1mM以上の蛋白質を含む２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、２５ｍM  NaCl  （pH8.5））と結晶化剤1.5μｌを混合
し、ハンギングドロップ法で結晶化条件を検索した。
NMRを用いた溶液中での立体構造
・多核多次元NMR測定のための安定同位体標識ChBDの調製
大腸菌（E. coli ）BL21-pLys (DE3)株（Novagen社製）を用いた以外は「ChBD遺伝子を含有する形質転換体の作製」において記述した方法で形質転換体を作製した。また培養は液体培地を15N標識された塩化アンモニウム（１ｇ／Ｌ）あるいは15N標識された塩化アンモニウム（１ｇ／Ｌ）と13Ｃ標識されたグルコース（１ｇ／Ｌ）を唯一の窒素源、あるいは炭素元とするＭ９最小培地を用いた。「ChBDの精製」の項で述べた同様の方法で発現と精製を行った。
・ＮＭＲを用いた溶液状態での構造解析
NMRの測定は２０ｍMカリウムリン酸塩、25mM NaCl（pH5.6）の緩衝液で蛋白質濃度がおよそ1mMの溶液を用いた。
Bruker 社製DRX500, DRX600を用い1H-15N HSQC, 1H-13C HSQC, 3D 1H-15N TOCSY-HSQC、CBCACOHN, CBCANH, HNCO, CCONH, HCCONH, HCCH-TOCSY、同種核２次元NOESY, three-dimensional 、異種核1H-15N NOESY-HSQC, 1H-13C NOESY-HSQCの測定を行い、構造解析を行っ
た。スペクトルの解析にはSPARKYプログラムを用い、NMRスペクトルの解析から得られた2600の距離制限および120の角度制限の情報を用いXPLORプログラムを用い構造計算を行っ
た。
X線結晶解析を用いた結晶中での構造解析
X線回折データは播磨SPring-8のJupiter CCD detector を有するBL38B1ビームラインを使用した。回折像はHKL2000プログラムを用い解析を行った。上記ＮＭＲによって得られた
構造をモデルとし、MolＲepプログラムを用いて分子置換法を行い、初期位相をつけた。
ＣＮＳプログラムによる構造精密化により結晶中でのChBDの構造を決定した。
ＮＭＲを用いた基質認識に関与するアミノ酸の同定
「多核多次元NMR測定のための安定同位体標識ChBDの調整」の項で述べた方法により調整
した15Ｎ安定同位体標識したChBD溶液（0.4mM蛋白質濃度、20mMカリウムリン酸塩、25mM
NaCl、pH 6.0）にhexa - N - acetylchitohexaose（６糖からなるキチン）を順次添加
し、15N-1H  HSQCスペクトルを測定し、このスペクトル中に観測されるNMRシグナルの変
化を解析した。
部位特異的変異体の作成
「・ChBDに対応する遺伝子の増幅」で述べたChBD発現ベクターを鋳型としてQＵICK-CHANGE  MUTAGENESIS KIT（STARTAGENE社）を用い部位特異的変異体の作成を行った。プロトコールはキットに添付されているマニュアルに従った。作成した変異体はトリプトファン274番、トリプトファン308番、トリプトファン326番をそれぞれアラニン変換したものを作
製した（以下W274A、W308A、W326Aと略す）。変異体蛋白質の発現及び精製は「サンプル
調製」の項で述べた方法に準じて行った。
キチン粉末と変異体蛋白質の相互作用の解析
蟹の甲羅の微粉末（水に不溶性）１ｍｇを20mMカリウムリン酸塩、25mM  NaCl、pH 6.8、数μＭ〜数十μＭの各変異体蛋白質を含む溶液に加え、1時間、室温で放置した。その後
、10000ｇで10分遠心することで、不溶性キチン及び不溶性キチンに結合した蛋白質を除
き、上澄みに残った蛋白質を定量し、上清に残った蛋白質濃度に対し、結合した蛋白質の量をプロットした。
結果と考察
蛋白質結晶化条件の検索と結晶学的パラメーターの解析
結晶化条件の検討を行ったところ、２０％PEG8000,0.1M  カコジル酸、ｐH6.5、０．２M
酢酸マグネシウム溶液を結晶化剤として用いたときに図-１に示す棒状の結晶を得た。
得られた結晶を用いX線結晶解析を行い、その結晶学的パラメーターを決定した（表１）
。
【００１８】
【表１】
2006262702.tif 000003
【００１９】
溶液中の構造と結晶中での構造比較
溶液中での構造決定にはＮＭＲを用い、計算に用いたパラメーター、および得られた溶液中での構造の物理化学的パラメーターを表２に示す。
【００２０】
【表２】
2006262702.tif 000004
【００２１】
与えた距離制限、角度制限に対し、0.2Å以上の距離侵犯、3度以上の角度侵犯のない構造を最も確からしい構造として溶液中での構造として採用した。図-２にＮＭＲから得ら
れた最も確からしい構造の内の一つ（図-２a）とＸ線構造解析から得られた結晶中での構造（図-２ｂ）の比較図を示す。簡略化のため主鎖（Ｎ，Ｃα、ＣＯ原子）および、溶液
構造に立体構造を保持するために必要と思われるアミノ酸のみを示す。これらの立体構造を保持するために必要と思われるアミノ酸は全て疎水的な性質を持ち、実際、本蛋白質内部で疎水性コアを形成している。溶液中、結晶中にかかわらず、本蛋白質の大まかな構造（グローバルフォールド）は４本のβストランドからなるβシートと５本のβストランドからなるβシートが向き合う、βサンドイッチ構造である。また、溶液中の構造ではN末
端から７番目のプロリンまで、構造の収束が悪く、溶液中ではフレキシブルであることが予想されたが、X線結晶解析においてもこの部分の電子密度が薄く、解析することができ
なかった。このことから、N末端部分についても溶液中と結晶中でも同様の性質(大きな揺らぎを有する)をもつことがわかった。したがって、立体構造解析により本ドメインの構
造形成に必須の領域は266番目のセリンから358番のイソロイシンの92アミノ酸領域と考えられる。これはアミノ酸配列から予想されていた結合ドメインと異なり、更に小さいすなわち、この構造は溶液においてもキチンを認識できる機能的かつ有用な構造になる新たな知見である。溶液中と結晶中の構造の類似性を示す主鎖間のｒｍｓｄ値は1.34Åであり、蛋白質の揺らぎ等を考慮に入れると、溶液状態と結晶状態でのその立体構造は同一であると結論づけられる。
キチン認識に重要なアミノ酸
まず、NMRを用い、hexa - N - acetylchitohexaoseとの相互作用を調べた。本実験は基質（hexa - N - acetylchitohexaose）と結合することで特定のアミノ酸周辺の環境が変
化するため引き起こされるアミド水素由来のNMRシグナル（化学シフト）の変化を追跡し
、相互作用に関与するアミノ酸残基を推定することができる。図-３aは基質と結合することにより引き起こされるアミド水素の化学シフトの変化量をまとめたものである。また図-3bは大きなケミカルシフト変化を示したアミノ酸を立体構造上どこに位置しているかを
示したものである。これらの図からわかるように大きな変化（すなわち、基質が結合することにより周りの環境が大きく変化）を示したアミノ酸は蛋白質の立体構造上特定の面に集中していることが明らかとなった。すなわち基質の認識にはこの面にあるアミノ酸の空間配置が重要であると考えることができる。この基質認識面には図-3bに示すように3つのトリプトファン残基がおよそ11.7と18.5Åの間隔（α炭素原子間）でほぼ一直線に並んでいるのが最大の特徴である。
【００２２】
この特徴はもちろん溶液中、結晶中のいずれの構造においても同様であった。
図-4は基質を添加したときのトリプトファン側鎖の窒素原子と窒素原子に結合する水素のケミカルシフトの変化の様子を示している。上述したように基質結合面に位置する3つの
トリプトファンが非常に大きな変化を示し、この3つのトリプトファンの基質結合に対す
る重要性を示唆した。
【００２３】
そこで、次にこれらのトリプトファンをアラニンに変化させた部位特異的変異体を作製し、キチンとの結合を調べた。図-５は野生型と変異体の基質結合に対する親和性を示し
ている。この図から明らかなように野生型に比べ変異体W326Aでは全く結合が見られない
、またW274A、W308Aにおいても大きく結合力が落ちていることが判った。NMRの解析結果
とともに本実験結果は予想される結合面に位置する3つのトリプトファンが基質結合に大
きな役割を担っていることを示す重要なデータである。基質結合面を構成するアミノ酸とともに、特に、３つのトリプトファンを本蛋白質で見られるような空間配置に置くことができれば、キチンを基質として認識できる分子を設計することができることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
キチン結合ドメインはキチナーゼにとって必須のドメインである。それは、キチンを加水分解するためには触媒部位をキチンに接近させなければならないからである。現在では、それだけにとどまらず、このキチン結合ドメインは加水分解が難しい不溶性キチンにおい
て見られるキチン分子間の水素結合を破壊することで触媒効率を上げているとも考えられだしている。したがって、産業的にキチナーゼを利用しようとするならば、触媒活性の向上だけでなく、キチンに対する結合力を増強する方法も有効なアプローチと言える。本発明はこのように廃棄されたキチンの有効利用につながるキチンの処理に重要な材料かつ構造情報を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】キチン結合ドメインの結晶を示す写真。
【図２】ＮＭＲから得られた最も確からしい構造のうちの一つ（a）とＸ線構造解析から得られた結晶中での構造（ｂ）の比較図を示す。（ａ）ＮＭＲの解析から得られた溶液中での立体構造主鎖のワイヤー表示モデル。水色の部分がβストランドを示す。疎水性コアを形成するアミノ酸も合わせて表示する。（ｂ）Ｘ線結晶解析から得られた結晶中での立体構造主鎖のワイヤー表示モデル。水色の部分がβストランドを示す。Ｎ末端から７番目のプロリンまでは電子密度が薄いため主鎖の追跡ができなかったので表示からはずしている。
【図３】（ａ）基質（キチン）と結合することにより引き起こされるアミド水素の化学シフトの変化量を示す。蛋白質：基質の比は１：１４（ｂ）大きなケミカルシフト変化を示したアミノ酸の立体構造上の位置を示す。立体構造上に色分け赤で示している部分が大きな変化量を示したアミノ酸。構造は、ワイヤーモデルで示している。
【図４】基質を添加したときのトリプトファン側鎖の窒素原子と窒素原子に結合する水素のケミカルシフトの変化を示す。基質（hexa-N- acetylchititohexaose）を蛋白質に滴定していったときのトリプトファン側鎖のアミドプロトンの変化の様子。緑色は基質がないときのシグナル。赤色は滴定途中のシグナル。青色は基質を蛋白質に対し１４等量加えたときのシグナル。
【図５】野生型と変異体の基質結合に対する親和性を示す。横軸は上清に残った蛋白質濃度を示し、縦軸は１ｇ当たりのキチンに対し何モル結合したかを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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