(57)【要約】【課題】ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ１０９１６のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に関連する技術を提供する。【解決手段】ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ１０９１６のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体５ｃ８により特異的に認識されるタンパク質に結合することが可能なモノクローナル抗体を提供する。この発明はまたＡＴＣＣ受付番号ＨＢ１０９１６のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体５ｃ８により特異的に認識される単離タンパク質を提供する。この発明は、さらに、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ１０９１６のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体５ｃ８により特異的に認識されるタンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。この発明はまたＢ細胞に接触依存性ヘルパー機能を本質的に付与し得るＤ１．１と呼ばれるＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ１０９１５のヒトＣＤ４-Ｔ細胞白血病細胞を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ受付番号１０９１６を有するハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体５ｃ８が特異的に結合し、活性化Ｔ細胞及び／又はＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ１０９１５を有するJurkatＤ１．１細胞株によって発現できる、細胞膜及び他の細胞成分を含まないタンパク質。
【請求項２】
活性化Ｔ細胞の表面から単離でき、且つＢ細胞のＴ細胞活性化に必要な請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる見かけの分子量が３０，０００である請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ＡＴＣＣ受けＴけ番号ＣＲＬ１０１９５を有するJurkatＤ１．１細胞株によって発現される請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｂ細胞の末端分化を誘発し得る請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
検出できるマーカーで標識された請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項７】
検出できるマーカーが放射性同位体、酵素、色素又はビオチンである請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項９】
該核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡである請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ＲＮＡ転写のプロモーターに作動可能に連結した請求項８又は９に記載の核酸分子を包含する遺伝子トランスファーベクター。
【請求項１１】
該ベクターがプラスミド又はウイルスベクターである請求項１０に記載の遺伝子トランスファーベクター。
【請求項１２】
適当なホスト細胞内に請求項１０〜１１のいずれかに記載の遺伝子トランスファーベクターを包含するホストベクター系。
【請求項１３】
該ホスト細胞が真核細胞である請求項１２に記載のホストベクター系。
【請求項１４】
該ホスト細胞がイースト細胞又は哺乳類細胞である請求項１２又は１３に記載のホストベクター系。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ１０９１５を有するヒト細胞株Ｄ１．１。
【請求項１６】
遺伝子トランスファーベクターによってコードされるタンパク質の産生を許容する条件下で請求項１２〜１４のいずれかに記載のホストベクター系を培養し、該タンパク質を回収することを包含するタンパク質の製造方法。
【請求項１７】
該細胞株によるタンパク質の産生を許容する条件下で請求項１５に記載の細胞株を培養することを包含する請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質又はポリペプチドを包含する薬学的組成物。
【請求項１９】
(i)動物からのＢ細胞を含む試料をＢ細胞の末端分化の誘導を許容する条件下で培養し、
(ii)試料を請求項１５に記載の細胞株で発現できるタンパク質又はポリペプチドを発現する細胞と接触させてＢ細胞の末端分化を誘導し、
(iii)試料を、薬学的化合物がＢ細胞の末端分化のＴ細胞誘導を阻害することができるかどうか、Ｂ細胞の末端分化のＴ細胞誘導を抑制する薬学的化合物の有効量と接触させ、かつ
(iv)Ｔ細胞株が薬学的化合物の存在下でＢ細胞の末端分化を誘導するかどうかを定める
ことを包含する活性化Ｔ細胞によってＴ細胞ヘルパー機能を抑制する能力について薬学的化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質を、低ガンマグロブリン血症に罹患した動物の治療用薬学的組成物の製造に使用する方法。
【請求項２１】
動物が哺乳類である請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳類がヒトである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該Ｂ細胞が感作Ｂ細胞又は休止Ｂ細胞である請求項１９、２１又は２２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の属する技術分野］
ここで開示される発明は、国立衛生研究所からの助成金第P01-AI-26886、RO-1-AI-14969、RO-1-CA-55713、及び免疫学養成助成金（Immunology Training Grant）AI-07132による研究でなされたものである。従って、合衆国政府は、この発明に一定の権利を有する。
【従来の技術】
【０００２】
［本発明の背景］
この出願の全体を通じて、種々の報告が、括弧内の著者の名字及びこれに続く報告年によって参照されている。これらの報告に対する全参照文献は、明細書の最後、即ち請求の範囲のすぐ前にある。本出願で開示され、クレームされた本発明の期日における当分野の状態をより完全に説明するために、これらの報告の開示内容は、参照文献によって本出願中に含まれる。
【０００３】
［背景技術］
「Ｔ細胞ヘルパー機能」といわれる接触依存性プロセスにおいて、ＣＤ４+ Ｔリンパ球は、Ｂ細胞を活性化及び分化させ、これによって抗体分子の特異性、分泌及びアイソタイプエンコード機能を調節することにより体液性免疫応答を認識している（Mitcheら，1968；Michison，1971；Whiteら，1978；Reinherzら，1979；Janewayら，1988；O’Brienら，1988；Rahemtullaら，1991；及びGrusbyら，1991）。Ｔ細胞ヘルパー機能の接触依存性要素を媒介するＴ細胞表面分子はまだ完全にはわかっていない（Noelleら，1991）。
【０００４】
Ｔ細胞がＢ細胞を補助し、分化させるプロセスは、２つの異なったフェーズ、即ち誘導フェーズ及びエフェクターフェーズに分けられる（Vitettaら，1989；Noelleら，1990）。誘導フェーズにおいて、増殖していないＴ細胞は、抗原感作されたＢ細胞に接触し、この結合は、クローン型のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）−ＣＤ４複合体をＢ細胞上のＩａ／Ａｇ複合体と相互作用させる（Janewayら，1988；Kaizら，1973；Zinkernagel，1976；Sprent，1978a；Sprent，1978b；Jonesら，1981；Juliusら，1982；Chestnutら，1981；Rogozinskiら，1984）。Ｉａ／ＡｇのＴＣＲ／ＣＤ４認識は、安定なＴ−Ｂ連結相互作用対（cognate pairs）の形成並びに両方向のＴ及びＢ細胞活性化で起こる（Sandersら，1986；Snowら，1983；Krusemeierら，1988；Noelleら，1989；Bartlettら，1989；Kupferら，1987）。エフェクターフェーズにおいて、活性化されたＴ細胞は、リンフォカインを分泌することによって（Noelleら，1983；Thompsonら，1985）、及び接触依存性の刺激によって（Noelleら，1989；Clementら，1984；Crowら，1986；Brianら，1988；Hirohataら，1988；Joverら，1989；Whalenら，1988；Pollokら，1991；Bartlettら，1990）Ｂ細胞を分化させる。これらは両方とも、Ｔ細胞が小さな増殖していないＢ細胞を最終的にＩｇ分泌細胞に分化させるのに必要である（Clementら，1984；Martinezら，1981；Anderssonら，1980）
Ｔ細胞が補助する誘導フェーズはＡｇ−依存性及びＭＨＣ−制限性であるが（Janewayら，1988；Katzら，1973；Zinkernagle，1978a；Sprent，1978a；Jonesら，1981；Juliusら，1982；Chestnutら，1981；Anderssonら，1980）Ｔ細胞ヘルパー機能のエフェクターフェーズは、Ａｇ−独立性及びＭＨＣ−非制限性であり得る（Clementら，1984；Hirohataら，1988；Whalenら，1988；Anderssonら，1980；DeFrancoら，1984；Juliusら，1988a；Juliusら，1988b；Riedelら，1988；Owens，1988；Cambierら，1988；Tohmaら，1991；Lohoffら，1977）。追加の対照的な性質は、Ｔ細胞が補助する誘導フェーズが、しばしばＣＤ４分子を必要とし、抗−ＣＤ４ ｍＡｂによって阻害されることである（Rogozinskyら，1984）。これに対して、ヘルパーエフェクター機能は、ＣＤ４分子を必要とせず（Friedmanら，1986）、抗−ＣＤ４ ｍＡｂによって阻害されない（Brian，1988；Hirohataら，1988；Whalenら，1988；Tohmaら，1991）。非特異的なヘルパーエフェクター機能は、抗原特異的な連結相互作用対を伴ったＴ−Ｂ細胞相互作用の局剤化する性質によって、特異的なＢ細胞標的上に集められると信じられている（Bartlettら，1989；Kupferら，1987；Pooら，1988）。
【０００５】
Ｂ細胞分化の終末は、接触及びリンフォカインの両方で媒介されたＴ細胞からの刺激を必要とするが、Ｂ細胞分化の中間段階は、分泌されるファクターを欠いた状態で活性化されたＴ細胞表面によって誘導されうる（Crowら，1986；Brianら，1988；Sekitaら，1988；Hodgkinら，1990；Noelleら，1991；Kubotaら，1991）。Ｂ細胞に関するこれらの中間体効果には、表面ＣＤ２３発現の誘導（Crowら，Joverら，1989；Crowら，1989）、細胞分裂の進行に伴った酵素の誘導（Pollokら，1991）及びリンフォカインに対する応答性の誘導（Noelleら，1989；Pollokら，1991；Tphmaら，Hodgkinら，1990；Noelleら，1991；Kubotaら，1991）が含まれる。Ｂ細胞を活性化させる活性化誘導Ｔ細胞表面分子は同定されていないが、機能性の研究は、これらの誘導及び生化学の幾つかの特徴を示している。第一に、Ｔ細胞は、Ｂ細胞を４〜８時間刺激し、ついで活性化する能力を身につけている（Bartlettら，1990；Tohmaら，1991）。第二に、活性化されたＴ細胞の表面に関連づけられるＢ細胞刺激活性は、パラホルムアルデヒド固定細胞上（Noelleら，1989；Crowら，1986；Pollokら，1991；Tohmaら，1991； Kubotaら，1991）、及び精製された膜フラグメント上（Hodgkinら，1990；Martinezら，1981）で保持される。第三に、Ｂ細胞刺激活性は、プロテアーゼ処理に対して敏感である（Noelleら，1989；Sekitaら，1988；Hodgkinら，1990）。第四に、これらの表面活性構造を取得し、次いでＴ細胞活性化を起こすプロセスは、シクロヘキサミドによって阻害される（Tohmaら，1991；Hodgkinら，1990）。これらの研究は、Ｂ細胞に接触依存性刺激を伝達する活性化誘導Ｔ細胞表面タンパク質の存在を強く示唆しているが、このような構造の分子の同一性は、まだ不明のままである。
【０００６】
表面ＣＤ２３分子を発現し、レクチンの存在下でＢ細胞の終末分化を補助するようにＢ細胞を活性化するというユニークで機能的な可能性を有するＣＤ４-1Jurkatサブクローン（Ｄ１．１）の単離は、以前に報告されている（Yeilinら，1991）。JurkatＤ１．１は、多数の関連のないドナーからのＢ細胞を活性化し、このＤ１．１の効果が、Ａｇ独立性であり、ＭＨＣ非制限性であることを示唆した。JurkatＤ１．１で媒介されるＢ細胞の活性化のメカニズムは、細胞−細胞接触か、又は細胞がかなり近接することに依存することが見い出されている。これは、パラホルムアルデヒド固定Ｄ１．１細胞であるがファクターを分泌しないものが、Ｂ細胞ＣＤ２３を誘導する能力を有しているためである。加えて、Ｂ細胞上のＤ１．１の効果は、抗−ＩＬ４抗体によって阻害されない。更に、Ｂ細胞上のＤ１．１の効果は、ＩＬ−４の効果から明瞭である。これは、Ｄ１．１２ではなく、ｒＩＬ−４からＢ細胞表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）の上方調節を誘導するからである（Yellinら，1991；Shieldsら，1989）。まとめて考えると、これらのデータは、JurkatＤ１．１及び活性化されたＣＤ４+ Ｔ細胞が、Ｔ細胞によって補助される接触依存性要素をＢ細胞に与える表面構造を分担していることを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本出願において、ネズミＩｇＧ２ａ ２ｍＡｂ（５ｃ８）が生成され、これは、Ｄ１．１で媒介されたＢ細胞活性化を阻害し、及びＤ１．１の表面からの、新規な３０キロダルトン（ｋＤ）の非スルフィド結合性タンパク質をイムノプレシピテーションさせる。通常のＴ細胞では、５ｃ８抗原は、活性化されたＣＤ４+ Ｔ細胞上で、ｍＲＮＡ及びタンパク質合成に要求されるよりも幾分過渡的に発現される。機能性の研究では、ｍＡｂ ５ｃ８はＢ細胞の活性化及び終末分化を媒介するＴ細胞の能力を阻害する。まとめて考えると、これらのデータは、５ｃ８ Ａｇが、Ｂ細胞分化のための接触依存性刺激を媒介する活性化誘導Ｔ細胞表面構造の重要な成分であることを示している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
〔本発明の概要〕
本発明は、ハイブリドーマ（ATCCアクセス番号HB10916）から生産されるモノクローナル抗体５ｃ８によって特異的に認識されるタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。本発明は、またハイブリドーマ（ATCCアクセス番号HB10916）によって生産されるモノクローナル抗体５ｃ８も提供する。
【０００９】
本発明は、Ｄ１．１（ATCCアクセス番号HBCRL10915）と称されるヒトＣＤ４Ｔ細胞白血病細胞株であって、接触依存性ヘルパー機能を構造的にＢ細胞に与えるものを提供する。本発明はまた、活性化されたＴ表面から単離されたタンパク質も提供する。ここで、該タンパク質は、Ｔ細胞がＢ細胞を活性化するために必要なものである。本発明は、更に活性化されたＴ細胞表面から単離された安定なタンパク質を提供する。ここで、該タンパク質は、Ｔ細胞がＢ細胞を活性化するために必要なものである。
【００１０】
本発明は、更にハイブリドーマ（ATCCアクセス番号HB10916）から生産されるモノクローナル抗体５ｃ８によって特異的に認識されるタンパク質をエンコーディングする単離された核酸分子を提供する。このハイブリドーマについてのＡＴＣＣアクセス番号ＨＢ１０９１６及びＤ１．１についてのＡＴＣＣアクセス番号ＨＢＣＲＬ１０９１５は、いずれもブダペスト条約に基づくＡＴＣＣへの国際寄託の受託番号である。
【発明の実施の形態】
【００１１】
〔図面の説明〕
図１．ＣＤ４-Jurkat Ｄ１．１.の細胞表面の表現型。ＣＤ４-Jurkat Ｄ１．１.とＣＤ４+Ｂ2.7 の蛍光ヒストグラム（ＦＡＣＳ）分析の結果を示した。Ｙ軸は細胞数を、Ｘ軸は相対蛍光強度を表す。使用したｍＡｂは：ＯＫＴ3（抗ＣＤ3）、ＯＫＴ4（抗ＣＤ4）、Ｗ6/32（抗ＭＨＣ Ｉ）である。“コントロール”は一次ｍＡｂ非存在下でのバックグラウンド染色（強度）を示す。
【００１２】
図２．Jurkat Ｄ１．１は休止Ｂリンパ球上でＣＥ23の発現を誘導する。単独で、あるいはＣＤ４-Jurkat（Ｄ１．１）、もしくはＣＤ４+Jurkat（Ｂ2.7）と共に24時間培養した後の、粘性を失った高密度Ｂ細胞の２色ＦＡＣＳ分析の結果を示す。分析には抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣもしくは抗ＣＤ20（Leu-16）−ＦＩＴＣ（Ｘ軸上）と抗ＣＤ23−ＰＥ（Ｙ軸上）（Becton-Dickinson）を用いた。各ヒストグラムの右上に示した数値は、両分子を発現するゲートされた（gated）全細胞の割合を表す。JurkatＤ１．１で培養したＢ細胞ポピュレーションは、Ｂ2.7（16％のＩｇＭ+細胞と16％のＣＤ20+細胞）で培養したＢ細胞と比較してＩｇＭ+細胞の66％、ＣＤ20+細胞の69％でＣＤ23を発現した。本実験では、単色ＦＡＣＳは、ＣＤ3（ＯＫＴ3）+ 2％、ＩｇＭ+ 84％、ＣＲ2（ＨＢ-5）+ 84％およびＣＤ（Leu-16）+ 87％となる小さな高密度Ｂ細胞のポピュレーションを示した。
【００１３】
図３．Ｄ１．１に誘導されたＣＤ23発現の投与応答。種々の割合のＤ１．１、Ｂ2.7細胞または細胞上清と共に24時間培養した後に、ＣＤ23を発現するＩｇＭ+細胞の割合を示す。実験の条件と２色ＦＡＣＳ分析は、図２に示す通りである。凡例では、2×105細胞に添加されるJurkatsの比率を図示するように変化させたことを除いた。上清は、1×105 Ｄ１．１もしくはＢ2.7細胞を Iscove's 改良 Dulbecco 培地／10％ＦＣＳ 1ｍＬ中で培養し、48時間後に採取した。またその後Ｂ細胞へ添加する前に 0.2ｍμのフィルターを通した。ＩｇＭ+細胞のＣＤ23発現のバックグラウンドの値（Ｂ細胞のみ）は、12％であった。Ｂ細胞ポピュレーションは、本実験ではＩｇＭ+ が65％であった。
【００１４】
図４．この図は、ＰＨＡ存在下でJurkatＤ１．１がＢ細胞の増殖を誘導することを示す。ｒＩＬ-2（25Ｕ／ｍＬ）、ｒＩＬ-4（25Ｕ／ｍＬ）、ＰＨＡ（ 5ｕｇ／ｍＬ）またはコントロール培地の指示された組み合わせの存在下で、マイトマイシン−Ｃ処理されたJurkat細胞と共に培養したＢ細胞の［Ｈ3］チミジンの取り込みを示す。エラーバーは、３回の培養の平均値の標準偏差を示す。
【００１５】
図５．JurkatＤ１．１は、Ｉｇ分泌細胞へのＢ細胞の分化を誘導する。Ａ．ＰＷＭ欠乏下で、Ｂ細胞に対して指示された割合のJurkatＤ１．１もしくはＢ2.7 により誘導されるＢ細胞105個当りのプラーク形成コロニーの数。Ｂ．1Ａ）と同様の実験から得られた上清中のＩｇＧ。Ｅ-細胞は、Ｅロセッタ（rosette）がなく、粘着性がない高密度のパーコールポピュレーションであり、それは優勢なＢ細胞である。Ｅ+細胞は、Ｅロセッタがポジティブで、マイトマイシンＣ処理した休止Ｔ細胞である。Ｉｇの測定は定量サンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。エラーバーはは標準曲線を基に計算された標準偏差を表す。
【００１６】
図６．Ｄ１．１ではなくｒＩＬ-4がＢ細胞のsigM発現を増加させた。図３と同様の実験の結果得られた２色ＦＡＣＳ分析を示す。示された抗ＩＬ-4の濃度は1.25μｇ／ｍＬであり、ｒＩＬ-4は50Ｕ／ｍＬである。ＩｇＭのメジアンチャンネル蛍光(median channel fluorescence) は右のカラムで示す。
【００１７】
図７．ｍＡｂ 5ｃ8 のJurkatＤ１．１細胞への結合。ＣＤ４-Jurkat Ｄ１．１とＣＤ４+Jurkat Ｂ2.7細胞の蛍光ヒストグラム分析（ＦＡＣＳ）を示す。Ｙ軸は細胞数を示し、Ｘ軸は相対蛍光強度を示す。用いたｍＡｂは：ＯＫＴ3（抗ＣＤ3）、ＯＫＴ4（抗ＣＤ4）、ＯＫＴ8（抗ＣＤ8）、Ｗ6/32（抗ＭＨＣ Ｉ）およびｍＡｂ 5ｃ8 である。ＦＩＴＣはコントロールｍＡｂとマッチしたアイソタイプのバックグラウンド染色（強度）を表す。
【００１８】
図８．ｍＡｂ 5ｃ8 は、Ｂリンパ球によりＣＤ23の発現を誘導するJurkatＤ１．１を阻害する。培地のみ、Ｂ2.7 もしくはＤ１．１Jurkat クローンを加えた培地を２４時間培養し、粘性を失った高密度Ｂ細胞の２色ＦＡＣＳ分析を示す。そしてここでは、抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ（Ｘ軸）または抗ＣＤ23−ＰＥ（Ｙ軸）を用いた。ＦＡＣＳトレーシング(tracing) の右上の数値は、ＣＤ23を発現するＩｇＭ+細胞の割合を表す。ｍＡｂ Ｗ6/32は 1μｇ／ｍＬ存在し、ｍＡｂ 5ｃ8 はハイブリドーマの上清を200 倍希釈したものである。ネズミのＩｇＧ２ａ ｍＡｂ Ｗ6/32は、クラスＩ  ＭＨＣ分子上の同一構造決定基（monomorphic determinant）を認識する。
【００１９】
図９．ｍＡｂ 5ｃ8 とコントロールｍＡｂにより免疫沈降した表面蛋白のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析。2-ＭＥの存在下（還元基、Ｒ）または非存在下（非還元基、ＮＲ）において12.5％のポリアクリルアミドにて分離された、表面をヨウ素処理したJurkatＤ１．１、JurkatＢ2.7細胞の細胞溶解物由来のｍＡｂ 5ｃ8 またはコントロールのｍＡｂとの免疫沈降物のオートラジオグラムを示す。示されたｍＡｂは、抗ＣＤ28（ＫＯＬＴ-4）と抗ＭＨＣクラスＩ（Ｗ6/32）である。分子量マーカーは、ラベル処理前のスタンダードの移動度を表す。ＮＭＳ：正常マウス血清。
【００２０】
図１０．Ｔ細胞の活性化と活性化されたＴ細胞の抗原 5ｃ8 の発現における代謝的阻害因子の影響。示されているようにｍＡｂ 5ｃ8 もしくは抗ＣＤ69を用い、休止状態または活性化状態のＴ細胞のＦＡＣＳヒストグラムを表す。Ｔ細胞の活性は、アクチノマイシンＤ（10μＭ）もしくはシクロヘキサミド（ 100μＭ）存在下に５時間放置後、ＰＭＡ（10ｎｇ／ｍＬ）、ＰＨＡ（10μｇ／ｍＬ）により測定した。
【００２１】
図１１．単離されたＣＤ４+ 、ＣＤ８+Ｔ細胞サブセット上での 5ｃ8 の発現のカイネティクス。直前に精製調製したＴ細胞サブセットをＰＨＡ（10μｇ／ｍＬ）、ＰＭＡ（10ｎｇ／ｍＬ）で活性化した後の、ＣＤ４+細胞（ａ，ｂ，ｃ）またはＣＤ８+細胞（ｄ，ｅ，ｆ）の示された時間毎蛍光ヒストグラムを示す。実線：5ｃ8 の結合；破線：ＩｇＧ２ａコントロール； 点線：抗ＣＤ69。
【００２２】
図１２．Ｄ１．１は、Ｂ細胞上での表面ＣＤ23の発現を誘導し、ＲＡＭＯＳ266 でも幾分か発現を誘導する。それはｍＡｂ 5ｃ8（抗Ｔ−ＢＡＭ）またはｍＡｂ Ｇ28-5（抗ＣＤ40）により阻害される。図示されるようにJurkatクローンＤ１．１もしくはＢ2.7 との培養後の、Ｂ細胞（左のカラム）もしくはＲＡＭＯＳ266（右のカラム）のＹ軸上の抗ＣＤ23ＰＥとＸ軸上の抗ＩｇＭ  ＦＩＴＣの２色のＦＡＣＳヒストグラムを示す。右上の数値は、Ｂ細胞を含む実験における表面ＣＤ23を発現するＩｇＭ+ Ｂ細胞の割合、またはＲＡＭＯＳ266 実験におけるＲＡＭＯＳ266 上でのＣＤ23のメジアン蛍光強度（測定）を示す。
【００２３】
図１３．扁桃のＢ細胞に対するＤ１．１の影響。２色ＦＡＣＳ分析によるＣＤ23を発現するＩｇＭ+ Ｂ細胞の割合を表す。ここではＤ１．１またはＢ2.7細胞は、ｍＡｂ 5ｃ8（ＩｇＧ２ａ抗Ｔ−ＢＡＭ）、Ｗ6/32（ＩｇＧ２ａ抗クラスＩ  ＭＨＣ）、抗ＬＦAla（ＩｇＧ1）およびＢ−Ｂ20（ＩｇＧ1 抗ＣＤ40）存在下で、18時間、扁桃Ｂ細胞と培養した後に用いた。
【００２４】
図１４．Ｄ１．１−Ｂ細胞活性化におけるＴ−ＢＡＭとＣＤ40の役割。JurkatクローンＤ１．１もしくはＢ2.7 と共に、あるいは図示されるリンホカインの存在下で18時間培養した後の、表面ＣＤ23を発現するＩｇＭ+ Ｂ細胞の割合（左側  Ｙ軸、縞模様バー）とＲＡＭＯＳ266 のＣＤ23メジアン蛍光強度（右側  Ｙ軸、網目模様バー）を示す２色ＦＡＣＳの棒グラフを示す。（a.）ｒＩＬ4 とｒＩＫ-2は10ユニット／ｍＬ、抗ＩＬ-4と抗ＧＭ−ＣＳＦ（“ＣＳＦ”）は10μｇ／ｍＬ存在する。（b.）示されたｍＡｂは飽和濃度まで培養開始時に添加された。
【００２５】
図１５．末梢性Ｂ細胞のＤ１．１活性化に対する抗ＣＤ40ｍＡｂの影響。図示されたｍＡｂの存在下で18時間、Ｄ１．１細胞と培養したＩｇＭ+ Ｂ細胞の２色ＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【００２６】
図１６．Ｂ細胞ＣＤ23発現に対する抗ＣＤ40のＣＤ32+ Ｌ細胞へ及ぼす影響。図示されたｍＡｂもしくはコントロール培地存在下で、Ｉ−Ａ+ Ｌ細胞（Ｌ細胞）もしくはＦｃＲｇII+ Ｌ細胞（ＣＤ32+ Ｌ細胞）の単層と共に18時間培養を行なった後の、（a.）末梢性Ｂ細胞またはＲＡＭＯＳ266 、および（b.）扁桃と脾臓のＢ細胞の２色ＦＡＣＳ分析の結果を示す。（a.）では左側のＹ軸はＣＤ23を発現するＩｇＭ+ Ｂ細胞の割合を示し、右側のＹ軸はＲＡＭＯＳ上でのＣＤ23のＭＦＩを示す（図１で凡例に示されてる）。（b.）では“コントロール”とは扁桃を用いた実験の抗ＬＦAla および脾臓を用いた実験の抗ＣＲ2（ＴＨＢ-5）を意味する。
【００２７】
図１７．ヒト正常リンパ球組織でのＴ−ＢＡＭ発現。Ｔ−ＢＡＭ発現は、（A.、B.）正常な扁桃（A.×25、B.×40）と（c.）正常なリンパ節（×25）並びに正常な脾臓（D.×25；E.×63）の凍結した組織断片で評価した。ここではｍＡｂ 5ｃ8 と改変ＡＢＣ技術（材料と方法参照）を用いた。Ｔ−ＢＡＭ陽性は、膜の染色として現われる。
【００２８】
図１８．Ｔ−Ｂ分子の相互作用モデル。
【００２９】
図１９．慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現。活性型、細胞性の慢性関節リューマチの患者に由来する滑膜パンヌスでの１つのリンパ小節における免疫化学的な染色区分を示す。（a,b）抗ＣＤ3 ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色（a.ローパワー、b.ハイパワー）。（c）抗ＣＤ4（ブルーフシン、ＡＰＡＰ染色）と抗Ｔ−ＢＡＭ（ｍＡｂ 5ｃ8 、褐色、ＤＡＢ）による二重染色。（d）抗ＣＤ8（ブルーフシン、ＡＰＡＰ染色）および抗Ｔ−ＢＡＭ（ｍＡｂ 5ｃ8 、褐色、ＤＡＢ）。これらの標本は全て、慢性関節リューマチの滑膜の炎症に関わるＣＤ４+Ｔ細胞上でＴ−ＢＡＭが発現すること示す。
【００３０】
図２０Ａ．浸潤性乾癬損傷のＴリンパ球でのＴ−ＢＡＭの発現。乾癬損傷由来皮膚生検標本の免疫化学的な染色（a.ローパワー）、（b.ハイパワー）−皮膚でのＴ細胞の浸潤を示す。Ｔ−ＢＡＭ発現は、ｍＡｂ 5ｃ8 とジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（褐色）により検出された。
【００３１】
図２１．非ホジキンリンパ腫細胞でのＴ−ＢＡＭの発現。Ｔ−ＢＡＭ+Ｔ細胞（褐色、ＤＡＢ）を示す非ホジキンリンパ腫を保持する患者２人のリンパ節に由来する免疫化学的な標本を示す（a.630×およびb.400×）。
【００３２】
〔発明の詳細な説明〕
この発明は、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 によって特異的に認識されるタンパク質と結合可能なモノクローナル抗体を提供する。
【００３３】
この発明は、活性化Ｔ細胞の表面に位置するタンパク質を特異的に認識し、かつこのタンパク質と複合体を形成し、それによりＢ細胞のＴ細胞活性化を阻害するモノクローナル抗体を提供する。活性化Ｔ細胞は、通常、動物のリンパ節の胚中心にのみ見出される。しかしながら、活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞腫瘍、例えば、Ｔ細胞白血病およびリンパ腫に罹患した動物の末梢血または慢性間接リウマチおよび乾癬のような疾患の浸潤組織に見出される。
【００３４】
ここに記載され、請求されるモノクローナル抗体は、リンパ節の胚中心においてＢ細胞と相互作用するＴ細胞に結合し、健常個体の他のＴ細胞には結合しない。Ｔ細胞表面上のタンパク質を特異的に認識し、かつこのタンパク質と結合して、それによりＢ細胞の活性化を阻害することが当業者に知られているモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ28モノクローナル抗体および抗ＬＦＡ-1モノクローナル抗体は、活性化Ｔ細胞を区別しない。
【００３５】
この発明の目的のためには、“活性化Ｔ細胞”は、休止Ｂ細胞にＴ細胞ヘルパー機能を付与し得るＴ細胞である。この発明の目的のためには、“リンパ節の胚中心”は、Ｔ細胞がＢ細胞にＴ細胞ヘルパー機能を付与するリンパ節の領域である。
【００３６】
この発明に目的のためには、“モノクローナル抗体”は、ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体合成ハイブリドーマ細胞の作製方法は当業者に公知であり、例えば、抗体産生Ｂリンパ球と不死化Ｂリンパ球細胞株との融合による。
【００３７】
この発明の一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞である。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ細胞である。この発明の目的のためには、“休止”Ｂ細胞は、非活性化Ｂ細胞、すなわち抗体分子を合成しない未文化Ｂ細胞である。この発明の目的のためには、“感作”Ｂ細胞は、抗原と接触し、それにより部分的に活性化してはいるが、いまだ抗体分子を合成しないＢ細胞である。
【００３８】
この発明の一態様においては、モノクローナル抗体はネズミモノクローナル抗体である。この発明の他の態様においては、モノクローナル抗体はキメラモノクローナル抗体である。この発明のさらに別の態様においては、モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体である。しかしながら、この発明の好ましい態様においては、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体である。
【００３９】
この発明の目的のためには、“キメラ”モノクローナル抗体は、異なる動物からの定常領域フラグメント（Ｆc）を有するネズミモノクローナル抗体である。この発明の好ましい態様においては、キメラモノクローナル抗体はヒトＦcおよびネズミＦabを有する。この発明の目的のためには、“ヒト化”モノクローナル抗体は、軽鎖および重鎖両者のネズミ相補性決定領域（ＣＤＲ）を除いて全てのネズミタンパク質配列がヒトタンパク質配列に置き換えられているネズミモノクローナル抗体である。
【００４０】
この発明の一態様においては、モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるエピトープに向けられている。この発明のさらに別の態様においては、モノクローナル抗体はモノクローナル抗体 5ｃ8 である。
【００４１】
この発明は、さらに、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。この発明の目的のためには、“ハイブリドーマ細胞”は、不死化細胞と抗体産生細胞とを融合し、それによりモノクローナル抗体を産生する細胞を形成することにより作製された細胞である。一態様においては、ハイブリドーマ細胞は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、1991年11月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.S. に寄託されたＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916に一致した。
【００４２】
この発明の１つにおいて、モノクローナル抗体は検出可能なマーカー、例えば放射性同位体、酵素、染料またはビオチンで標識されている。この発明の他の態様においては、モノクローナル抗体は治療剤、例えば放射性同位体、トキシン、トキソイドまたは化学療法剤に結合している。この発明のさらに別の態様においては、モノクローナル抗体は画像形成剤（imaging agent）、例えば放射性同位体に結合している。
【００４３】
この発明は、このモノクローナル抗体と薬剤学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を提供する。この発明の目的のためには、“薬剤学的に許容し得る担体”は標準的な医薬担体のいかなるものをも意味する。適切な担体の例はこの分野において公知であり、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、ポリソルブ（Polysorb）80を含有するリン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤を含み得るが、これに限定されるものではない。
【００４４】
典型的には、このような担体は賦形剤、例えばスターチ、ミルク、砂糖、特定のタイプのクレイ、ゼラチン、ステアリン酸もしくはそれらの塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは油、ゴム、グリコールまたは他の公知の賦形剤を含有する。このような担体はフレーバーおよび着色添加物または他の成分を含有してもよい。このような担体を含有する組成物は、よく知られた通常の方法により処方される。
【００４５】
このような担体はこの分野において公知であり、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、および種々のタイプ湿潤剤のいかなるものをも含み得るが、これらに限定されるものではない。他の担体には、無菌溶液、錠剤、コート錠、およびカプセルが含まれ得る。
【００４６】
ここに記述され、請求されるモノクローナル抗体は、このモノクローナル抗体が結合するタンパク質の単離に有用である。このモノクローナル抗体はまた、新規かつ有用な；動物における免疫応答の阻害方法；自己免疫疾患のような免疫不全またはライム病、梅毒、結核およびＨＩＶ感染のような自己免疫発現を伴う感染症により特徴付けられる疾患における免疫応答の緩和方法；動物における腫瘍もしくは新生物の像形成方法；動物における腫瘍もしくは新生物の存在を検出する方法；動物が腫瘍細胞を宿しているかどうかを決定する方法であって、Ｔ細胞ガンに罹患した動物におけるＴ細胞腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む方法；および動物Ｔ細胞のウイルス感染を阻害する方法においても有益である。
【００４７】
この発明は、このモノクローナル抗体の軽鎖タンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。この発明の一態様においては、この核酸分子はＤＮＡ分子である。好ましくは、このＤＮＡ分子はｃＤＮＡ分子である。
【００４８】
この出願を通して、特定のヌクレオチドに対する言及は核酸のコード鎖上に存在するヌクレオチドに対するものである。この明細書を通して、特定のヌクレオチドを示すために、以下の標準的な略語が用いられる：
Ｃ＝シトシン      Ａ＝アデニン
Ｔ＝チミジン      Ｇ＝グアノシン
この発明のＤＮＡ分子は、１以上のアミノ酸残基の同一性および位置が天然の形態とは異なり（タンパク質について特定される全ての残基よりも少ない残基を有する欠損アナログ、特定される残基の１以上が他の残基によって置換されている置換アナログおよび１以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端もしくは中間部に追加されている付加アナログ）、かつ天然型の性質の幾つかもしくは全てを共有する、抗原性ポリペプチドのポリペプチド・アナログ、断片または誘導体をも含む。これらには、選択された非哺乳動物ホストによる発現に好ましいコドンの組み込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂のための部位の提供；および容易に発現するベクターの構築を容易にする、さらなる先頭、末端もしくは中間ＤＮＡ配列を提供することが含まれる。
【００４９】
ここに記述され、請求される核酸は、以下に記載する新規ウイルスもしくは環状プラスミドベクターの産生に有用である。この核酸分子はまた、遺伝子治療の新規かつ有用な方法、すなわち動物から単離した細胞を核酸分子で安定に形質転換し、次いで安定に形質転換した細胞を動物に再投与することによる方法に有益でもある。細胞を単離する方法には、動物から細胞を抜き取るいかなる標準法もが含まれる。適切な単離細胞には骨髄細胞が含まれるが、これに限定されるものではない。細胞の再投与方法には、動物に細胞を再投与するいかなる標準法もが含まれる。
【００５０】
この発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに作働可能に連結する、モノクローナル抗体の軽鎖タンパク質をコードする核酸分子を含む遺伝子運搬ベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスベクターを提供する。この発明はまた、ＲＮＡ転写のプロモーターに作働可能に連結する、モノクローナル抗体の重鎖タンパク質をコードする核酸分子を含む遺伝子運搬ベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスベクターをも提供する。
【００５１】
ここに記載され、請求される遺伝子運搬ベクターは、安定に形質転換された真核ホスト細胞の産生に有用であり、それ故にそのようなホスト細胞をタンパク質産生に適した条件下で増殖させる新規かつ有用な方法において有益な生成物としての価値を有する。
【００５２】
この発明は、ここに記載され、請求される遺伝子運搬ベクターを適切なホスト細胞中に有するホストベクター系を提供する。この発明の一態様においては、適切なホスト細胞は、安定に形質転換された真核細胞、例えば安定に形質転換された酵母もしくは哺乳動物細胞である。この発明の好ましい態様においては、安定に形質転換された真核細胞は、安定に形質転換された哺乳動物細胞である。
【００５３】
ここに記載され、請求されるホストベクター系は、このホストベクター系をモノクローナル抗体の産生に適した条件下で増殖させることを包含する、モノクローナル抗体の新規かつ有用な合成方法に有益である。
【００５４】
この発明は、Ｂ細胞に接触依存性ヘルパー機能を本質的に付与することが可能な、Ｄ１．１と呼ばれるＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ 10915のＣＤ４-ヒトＴ細胞白血病細胞株を提供する。このＤ１．１細胞は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、1991年11月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.S. に寄託された。この発明の一態様においては、このＢ細胞は休止Ｂ細胞である。この発明の他の態様においては、このＢ細胞は感作Ｂ細胞である。
【００５５】
ここに記載され、請求される細胞株は、ＡＴＣＣ受付番号 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識される単離タンパク質の源として有益である。この単離タンパク質は、それ自身をコードするヌクレオチド配列に関する事項を提供する情報にとって有益である。この核酸配列は、ここに記載され、請求される可溶性活性化Ｔ細胞表面タンパク質の新規かつ有用な産生方法に有益である。この細胞株はまた、タンパク質抗原に対して動物を免疫する新規かつ有用な方法、および医薬化合物をＢ細胞のＴ細胞活性化を阻害するそれらの能力についてスクリーニングする新規かつ有用な方法に有益である。
【００５６】
この発明は、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識される単離タンパク質を提供する。
【００５７】
この発明はさらに、ＡＴＣＣ受付番号 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識される単離タンパク質を提供する。ここで、この単離タンパク質は、活性化Ｔ細胞の表面からのものであり、Ｂ細胞最終分化のＴ細胞誘発に必要なものである。この出願において、“最終分化（terminal differntiation）”はその細胞の特定のＩｇ分泌が明らかにされていることを意味し、この用語は当業者には公知である。
【００５８】
この発明の一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞である。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ細胞である。
【００５９】
この発明はまた、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識され、Ｎ末端に配列 Xaa-Ile-Glu-Xaa-Tyr-Asn-Gln-Xaa-Ser-Pro-（配列番号11）を有する単離タンパク質を提供する。この出願においては、“Ｘａａ”はいかなるアミノ酸残基でもよい。
【００６０】
この発明は、Ｔ細胞表面タンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。この発明の一態様においては、核酸分子はＤＮＡ分子である。好ましくは、このＤＮＡ分子はｃＤＮＡ分子である。この核酸分子は、以下に記載の新規ウイルスまたは環状プラスミドベクターを生成するための生成物として有益である。この核酸分子はまた、遺伝子治療の新規かつ有用な方法、すなわち、動物から単離した細胞をこの核酸分子で安定に形質転換し、次いで安定に形質転換した細胞を動物に再投与することによる方法に有益である。細胞の単離方法には、動物から細胞を取り出すいかなる標準法もが含まれる。適切な単離細胞には骨髄細胞が含まれるが、これに限定されるものではない。細胞の再投与方法には、動物に細胞を再投与するいかなる標準法もが含まれる。
【００６１】
この発明はまた、活性化Ｔ細胞表面タンパク質をコードする単離核酸分子を含む遺伝子運搬ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを提供する。
【００６２】
ここに記載され、請求される遺伝子運搬ベクターは、安定に形質転換された真核ホスト細胞を産生し、それ故にそのホスト細胞をタンパク質の産生に適した条件下で増殖させる新規かつ有用な方法に有益な生成物として価値がある。
【００６３】
この発明は、さらに、適切なホスト細胞中に遺伝子運搬ベクターを含むホストベクター系を提供する。この発明の一態様においては、この適切なホスト細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞である。
【００６４】
このホストベクター系は、このホストベクター系をタンパク質の産生に適した条件下で増殖させることによる活性化Ｔ細胞表面タンパク質の大規模合成に有用な生成物として有益である。したがって、活性化Ｔ細胞表面タンパク質の産生方法もまた提供される。この発明は、さらに、この方法により産生されたタンパク質を提供する。
【００６５】
この発明は、Ｂ細胞のＴ細胞活性化に必要な、活性化Ｔ細胞の表面から単離された可溶性タンパク質を提供する。この発明の一態様においては、このＢ細胞は休止Ｂ細胞である。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ細胞である。
【００６６】
この発明の目的のためには、“可溶性タンパク質”は、細胞膜および他の細胞成分を含有しないタンパク質である。好ましくは、この可溶性タンパク質は、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質である。この発明の一態様においては、この可溶性タンパク質は検出可能なマーカー、例えば、放射性同位体、酵素、染料またはビオチンで標識されている。この可溶性タンパク質は、新規かつ有用な医薬組成物を作製するための生成物として有益である。
【００６７】
したがって、この可溶性タンパク質および薬剤学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物もまた提供される。“薬剤学的に許容し得る担体”は標準的な薬剤学的に許容し得る担体のいかなるものをも意味する。例として、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、水および油／水エマルジョンのようなエマルジョンを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
この発明は、この可溶性タンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。この発明の一態様においては、核酸分枝はＤＮＡ分子である。好ましくは、このＤＮＡ分子はｃＤＮＡ分子である。
【００６９】
ここに記載され、請求される核酸配列は、以下に記載される新規ウイルスおよび環状プラスミドベクターの産生に有用である。この核酸分子はまた、遺伝子治療の新規かつ有用な方法、すなわち、動物から単離した細胞をこの核酸分子で安定に形質転換し、次いで安定に形質転換された細胞を動物に再投与することによる方法に有益である。細胞を単離する方法には、動物から細胞を取り出す標準法のいかなるものも含まれる。適切な単離細胞には骨髄細胞が含まれるが、これに限定されるものではない。細胞の再投与方法には、動物に細胞を再投与する標準法のいかなるものも含まれる。
【００７０】
この発明はまた、ＲＮＡ転写プロモーターに作働可能に連結した単離核酸分子を有する遺伝子運搬ベクター、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターをも提供する。ここに記載され、請求される遺伝子運搬ベクターは、安定に形質転換された真核ホスト細胞を生成し、それ故にそのようなホスト細胞をタンパク質産生に適した条件下で増殖させる新規かつ有用な方法に有益な生成物として価値がある。
【００７１】
この発明は、さらに、適切なホスト細胞中にこの遺伝子運搬ベクターを有するホストベクター系を提供する。この発明の一態様においては、適切なホスト細胞は安定に形質転化された真核細胞、例えば、安定に形質転換された真核酵母もしくは哺乳動物細胞である。好ましくは、安定に形質転換された細胞は、哺乳動物細胞である。
【００７２】
このホストベクター系は、このホストベクター系をタンパク質の産生に適した条件下で増殖させ、産生されたタンパク質を回収することによる、可溶性活性Ｔ細胞表面タンパク質の大規模合成に有用な生成物として有益である。したがって、この可溶性タンパク質の産生方法もまた提供される。この発明は、さらに、この方法により産生された可溶性タンパク質を提供する。
【００７３】
この発明は、活性Ｔ細胞表面タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体および薬剤学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物の有効阻害量を動物に投与することを具備する、動物においてＢ細胞活性化を阻害する方法を提供する。この発明の目的のためには、医薬組成物の“有効阻害量”は、活性Ｔ細胞表面上のタンパク質に結合し、それによりＢ細胞のＴ細胞活性化を阻害するに有効な医薬組成物の量である。この有効阻害量は、この分野において公知の実験を用いて、当業者が容易に決定することができる。そのような実験的アプローチの１つはタイトレーションによるものである。この発明の一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞である。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ細胞である。
【００７４】
“有効阻害量”を決定する方法は当業者には公知であり、関連する動物のタイプおよび動物の体重（これらに限られるものではないが）を含む因子に依存するであろう。この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例えばマウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７５】
この発明の目的のためには、“投与”は当業者に公知の医薬組成物の標準投与方法のいかなるものをも意味する。例として、静脈内、腹腔内または筋肉内投与を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
Ｂ細胞活性化を阻害する方法は、動物の免疫応答を阻害する新規かつ有用な方法に有益である。この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例えば、マウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７７】
この発明の一態様においては、動物の免疫応答の阻害は、動物による移植臓器、例えば、心臓、腎臓または肝臓の拒絶を阻害する方法として有益である。
【００７８】
この発明の他の態様においては、動物の免疫応答の阻害は、突発性自己免疫疾患に罹患している動物における自己免疫応答を阻害する方法として有益である。突発性自己免疫疾患の例には、乾癬、慢性関節リューマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、突発性血小板減少紫斑病、溶血性貧血、ＩｇＥ増加症候群（hyper IgE syndrome）、真性糖尿病および薬物誘発自己免疫疾患、例えば薬物誘発ループスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
他の態様においては、この発明は、感染症の自己免疫発現に罹患しているヒトにおける自己免疫応答を阻害する方法を提供する。自己免疫発現は、ライター症候群、脊椎関節炎（spondyloarthritis）、ライム病、ＨＩＶ感染、梅毒または結核に由来することがある。
【００８０】
この発明のさらに別の態様においては、動物における免疫応答の阻害は、動物におけるアレルギー応答、例えば、枯草熱またはペニシリンに対するアレルギーを阻害する方法として有益である。
【００８１】
この発明は、ＡＴＣＣ受付番号 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生物細胞の像を形成する方法であって、(i)抗体が像形成剤と結合している、モノクローナル抗体 5ｃ8 の医薬組成物の有効量を、モノクローナル抗体とタンパク質との複合体の形成を許容する条件下で患者に投与し、かつ (ii)形成されるモノクローナル抗体／タンパク質複合体の像を形成し、それにより患者における腫瘍細胞または新生物細胞の像を形成することを具備する方法を提供する。
【００８２】
このような腫瘍細胞または新生物細胞は、Ｔ細胞腫瘍、例えば、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫由来であってもよい。好ましくは、患者はヒト患者である。
【００８３】
“投与”は、当業者に公知の医薬組成物投与の標準法のいかなるものをも意味する。例として、筋肉内または腹腔内投与を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。モノクローナル抗体／タンパク質複合体の形成を検出する方法、例えばＸ線フィルムの露光による方法は、当業者には公知である。
【００８４】
医薬組成物の“有効像形成量”は、複合体の像を形成し得るように、モノクローナル抗体と細胞表面タンパク質との複合体を形成するに有効な量である。“有効像形成量”を決定する方法は当業者に公知であり、関係する動物のタイプ、動物の大きさおよび用いられる像形成剤を含む（これらに限られるものではない）要素に依存する。そして、正確な有効像形成量は、当業者に公知の、タイタレーションのような実際の実験により決定することができる。この発明の一態様においては、像形成剤は放射性同位体である。
【００８５】
この発明は、動物において、ＡＴＣＣ受付番号 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生物細胞の存在を検出する方法であって、検出し得るマーカーに結合したモノクローナル抗体を含有する医薬組成物の、腫瘍細胞または新生物細胞の表面上のタンパク質に結合するに有効な量を、モノクローナル抗体とタンパク質との複合体の形成を許容する条件下で動物に投与し；未結合の像形成剤を動物から除去し；および形成されるモノクローナル抗体／タンパク質複合体の存在を検出することを具備する方法を提供する。複合体の存在は、動物における腫瘍細胞または新生物細胞の存在を示す。この腫瘍細胞は、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫由来であってもよい。好ましい態様においては、この腫瘍は非ホジキンリンパ腫である。この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例えば、マウスまたはヒトである。好ましくは、動物はヒトである。
【００８６】
“投与”は、当業者に公知の、医薬組成物のあらゆる標準投与方法を意味する。例として、静脈内、筋肉内または腹腔内投与を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。例えばＸ線フィルムの露光または顕微鏡下での試験により、モノクローナル抗体／タンパク質複合体の形成を検出する方法は当業者に公知である。
【００８７】
医薬組成物の“有効量”は、動物において腫瘍細胞または新生物細胞の存在を検出するに有効な医薬組成物の量である。“有効量”を決定する方法は当業者に公知であり、関連する動物のタイプ、接触する血液試料のサイズおよび用いる検出可能なマーカーを含む（これらに限られるものではない）多くの要素に依存する。この発明の一態様において、検出可能なマーカーは、放射性同位体、酵素、染料またはビオチンである。
【００８８】
この発明は、ＡＴＣＣ受付番号 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生物細胞を動物が有しているかどうかを決定する方法であって、動物から血液試料を単離し；この試料を、可溶性タンパク質に結合するに有効な量の、検出可能なマーカーで標識されたモノクローナル抗体を含有する医薬組成物と、モノクローナル抗体とタンパク質との複合体の形成を許容する条件下で接触させ；および形成されるモノクローナル抗体／タンパク質複合体の存在を検出する（このような複合体の存在は、患者における腫瘍細胞または新生物細胞の存在を示す）ことを具備する方法を提供する。
【００８９】
一態様において、腫瘍細胞はＴ細胞腫瘍、例えば、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫に由来する。好ましい態様において、Ｔ細胞リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である。
【００９０】
この発明によって提供される方法は、腫瘍細胞それ自身の存在が検出され得る前に、動物の血液中のＴ細胞腫瘍細胞の存在を検出する新規かつ有用な方法として有益である。この発明によって提供される方法はまた、抗Ｔ細胞腫瘍剤を用いる動物の治療の有効性を決定する新規かつ有用な方法、すなわち、動物の血液中の可溶性タンパク質のレベル（そのようなレベルは治療の有効性を示す）を決定することによる方法として有益である。
【００９１】
Ｔ細胞腫瘍に罹患している患者の血液がＴ細胞腫瘍細胞表面から脱落した可溶性タンパク質、例えばtac 抗原、を含むことは当業者には公知である。したがって、動物の血液中における可溶性Ｔ細胞表面タンパク質の存在は、動物におけるＴ細胞腫瘍の存在を示している。
【００９２】
この発明の目的のためには、“可溶性タンパク質”は、細胞膜および他の細胞成分を含有しないタンパク質である。この発明の好ましい態様においては、可溶性タンパク質は、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質である。
【００９３】
動物からの血液の“単離”は、血液を抜き取り、この血液を、抗凝集剤、例えばヘパリン、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩を入れた容器に直ちに収容する、一般的に許容し得るあらゆる方法を意味する。モノクローナル抗体／タンパク質複合体の検出方法は当業者には公知である。例としてＸ線フィルムの露光およびＥＬＩＳＡを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
医薬組成物の“有効量”は、動物の血液中において可溶性タンパク質の存在を検出するに有効な医薬組成物の量である。“有効量”を決定する方法は当業者には公知であり、関連する動物のタイプ、接触する血液試料のサイズおよび用いられる検出可能なマーカーを含む（これらに限られるものではない）多くの要素に依存する。
【００９５】
この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例えばマウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９６】
この発明は、腫瘍または新生物、例えば、Ｔ細胞白血病またはリンパ腫に罹患している動物において、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生物細胞の増殖を阻害する方法であって、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生物細胞の増殖を阻害するに有効な量の、治療剤と結合した、もしくは結合していないモノクローナル抗体を含有する医薬組成物を患者に投与することを具備する方法を提供する。この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例えばマウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９７】
“投与”は、医薬組成物を投与する、当業者に公知のあらゆる標準法を意味する。例として、筋肉内または腹腔内投与を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
医薬組成物の“有効量”は、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識されるタンパク質を発現する腫瘍細胞または新生物細胞の増殖を阻害するに有効な医薬組成物の量である。“有効量”を決定する方法は当業者には公知であり、関連する動物のタイプ、動物の大きさおよび用いられる治療剤を含む（これらに限られるものでない）要素に依存する。この発明の一態様においては、治療剤は放射性同位体、毒素、トキソイドまたは化学療法剤である。
【００９９】
この発明は、ＨＴＬＶ Ｉウイルスによる動物Ｔ細胞のウイルス感染を阻害する方法であって、ＨＴＬＶ ＩウイルスによるＴ細胞の感染を阻害するに有効な量の、活性Ｔ細胞表面のタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体を含有する医薬組成物を動物に投与することを具備する方法を提供する。この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例えば、マウスまたはヒトである。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【０１００】
ＨＴＬＶ Ｉウイルスが結合する細胞性タンパク質がＣＤ４タンパクであることは当業者には公知である。このように、ＨＴＬＶ Ｉウイルスは、ＣＤ８+ ではなくＣＤ４+Ｔ細胞に優先的に感染する。この発明は、モノクローナル抗体 5ｃ8 が結合し、またＣＤ４+Ｔ細胞に特異的なタンパク質を提供する。
【０１０１】
この発明は、医薬化合物、例えば、シクロスポリン、シクロホスファミドまたはアゾチオプリンを、そのＴ細胞ヘルパー機能を阻害する能力についてスクリーニングする方法であって：動物から血液試料を単離し；この試料を、そこに含まれるＢ細胞の活性化を許容する条件下で培養し；試料を、Ｂ細胞を活性化するに有効な量のＤ１．１細胞株またはＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識される単離タンパク質を発現する細胞と接触させ；医薬化合物がＴ細胞活性化を阻害することが可能であるならば、Ｂ細胞の最終分化のＴ細胞誘発を阻害するに有効な量の医薬化合物と試料を接触させ；および医薬化合物の存在下において、Ｔ細胞株がＢ細胞を活性化するかどうかを決定することを具備する方法を提供する。
【０１０２】
この発明の一態様においては、Ｂ細胞は休止Ｂ細胞である。この発明の他の態様においては、Ｂ細胞は感作Ｂ細胞である。
【０１０３】
この発明の一態様においては、血液は哺乳動物、例えば、マウスまたはヒトから単離される。
【０１０４】
動物からの血液の“単離”は、血液を抜き取り、この血液を、抗凝集剤、例えば、ヘパリン、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩を入れた容器に直ちに収容する、一般に許容可能なあらゆる方法を意味する。“Ｂ細胞の活性化を許容する条件下”でのＢ細胞の培養には、リンホカイン類の存在下でのＢ細胞の培養が含まれる。Ｄ１．１細胞株“の有効活性化量”は、培養物中におけるこの細胞の、培養物中のＢ細胞を活性化するに有効な濃度である。“有効活性化量”を決定する方法は、当業者に公知である。
【０１０５】
タンパク質抗原に対して動物を免疫する方法であって：動物から休止Ｂリンパ球を含有する血液試料を単離し；この試料から休止Ｂ細胞を回収し；この休止Ｂ細胞を、Ｂ細胞を刺激して分化させる量の細胞株Ｄ１．１またはＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識される単離タンパク質を発現する細胞と共に、Ｂ細胞の分化を許容する条件下で共培養（coculturing）し；この分化Ｂ細胞を、分化Ｂ細胞にタンパク質抗原を認識する抗体を産生させるに有効な量のタンパク質抗原と接触させ；およびこの抗体産生Ｂリンパ球を、血液試料を単離した動物に投与することを具備する方法。
【０１０６】
この発明の目的のためには、“休止Ｂ細胞”は、未分化の非抗体合成Ｂ細胞または記憶Ｂ細胞のいずれかである。
【０１０７】
動物からの血液の“分離”は、血液を抜き取り、この血液を、抗凝集剤、例えば、ヘパリン、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩を入れた容器に直ちに収容する、一般に許容可能なあらゆる方法を意味する。“Ｂ細胞の活性化を許容する条件下”でのＢ細胞の培養には、リンホカイン類の存在下でのＢ細胞の培養が含まれる。Ｂリンパ球を動物に投与する方法には、細胞を動物に投与する、一般に許容可能なあらゆる方法が含まれる。
【０１０８】
Ｄ１．１細胞株または可溶性活性Ｔ細胞表面タンパク質の“有効量”は、細胞株または可溶性タンパク質の、Ｂ細胞の分化を誘発するに有効な量である。“有効量”を決定する方法は当業者には公知である。
【０１０９】
タンパク質抗原の“有効分化量”は、抗原の、分化Ｂ細胞に抗原を特異的に認識する抗体を産生させるに有効な量である。
【０１１０】
この発明の一態様においては、動物は哺乳動物、例えば、マウスまたはヒトである。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１１１】
この発明の一態様においては、抗原はウイルス性タンパク質抗原、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質抗原、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタンパク質抗原またはヒト免疫不全症ウイルスタンパク質抗原である。この発明の他の態様においては、抗原は自己抗原または腫瘍抗原である。当業者に公知のＲｏ、Ｌａ、ＲＮＰおよびリューマチ様因子（ＩｇＧ）は、そのような自己抗原の例である。
【０１１２】
この発明は、さらに、抗体産生細胞のイソタイプの切替えを誘発する方法であって、(i)抗体産生細胞を、Ｂ細胞の分化を許容する条件下で、イソタイプの切替えを誘発するに有効な量の細胞株Ｄ１．１またはＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識される単離タンパク質を発現する細胞と接触させ；および (ii)抗体産生細胞のイソタイプを検出することを具備する方法を提供する。一態様においては、抗体産生細胞はハイブリドーマ細胞である。他の態様においては、抗体産生細胞はＥＢＶ形質転換細胞株である。
【０１１３】
この発明はまた、抗体産生細胞によって産生される抗体の親和性を増大する方法であって、抗体産生細胞を、細胞の接触を許容する条件下で、有効量の細胞株Ｄ１．１あるいはＡＴＣＣ受付番号ＨＢ 10916のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 5ｃ8 により特異的に認識される単離タンパク質を発現する細胞と接触させ；および抗体産生細胞によって産生される抗体の結合親和性を決定することを具備する方法を提供する。
【０１１４】
この発明は、低ガンマグロブリン血症に罹患した患者を治療する方法であって、低ガンマグロブリン血症について患者を治療するに有効な量の可溶性活性Ｔ細胞表面タンパク質を患者に投与することを具備する方法を提供する。“有効量”を決定する方法は当業者に公知である。タイトレーションによる方法は、そのような方法の一例である。
【０１１５】
この発明は、以下の実験の詳細を参照することによりさらに理解されるであろう。しかしながら、詳細に述べられる特定の実験は単に説明に過ぎず、ここに記載され、その後に続く請求の範囲によって定義されるこの発明を限定することを意味するものではないことは、当業者には容易に理解されるであろう。
【０１１６】
実験の第１シリーズ
材料および方法
５Ｃ８モノクローナル抗体の産生および特徴  ５匹のＢａｌｂ／ｃマウスは、生理食塩水中で２ｘ１０6のＤ１．１細胞で静脈内免疫感作し、次ぎに腹腔内で約２週間間隔での５回のブーストがなされた。これらのマウスの血清は、Ｂ２．７細胞に対してジャーカットＤ１．１に優先的に結合する抗体が存在するかどうかについてテストするために、ＦＡＣＳによって滴定された。最も差異のある滴定を示した一匹のマウスは、融合する三日前に、静脈下、２ｘ１０6のＤ１．１細胞のブーストを受けた。該マウス由来の脾蔵細胞は、前記記載(Kirchevsky et al., 1988)のように、７ｘ１０7のマウスＳＰ２／０骨髄融合パートナー細胞と融合させた。融合産生物を8-mmの360 ウエルに播種する前に、細胞混合物は、１５％ ＦＣＳを含むDulbecco's Modified Eagle's 培地(ＤＭＥＭ）中で一晩培養された。２２０ウエルに出現したコロニーおよびすべてについて、Ｄ１．１およびＢ２．７細胞を識別して結合するかどうかを、ＦＡＣＳによってスクリーニングした。５ｃ８と名付けられたｍＡｂがＤ１．１細胞と結合し、Ｂ２．７細胞には結合しないことがわかった。５ｃ８クローンは、モノクローナル性が達成されるまで何回もサブクローンされた。５ｃ８ ｍＡｂは、エリサ法 (Hyclone, Logan, UT)でＩｇＧ２ａであることがわかった。
【０１１７】
モノクローナル抗体：下記のｍＡｂｓ：OKT 11(抗-CD2), OKT 10(抗-38), OKT 8(anti-CD8), OKT 6(抗-CD1a), OKT 4(anti-CD4), OKT 3(抗-CD3), OKT 1(抗 -CD5), 3A1(抗-CD7),tac(抗-CD25), T-HB5(抗-CD21, CR2), W6/32 (抗-MHC class I), AB2.06(抗-MHCclass II),L243 (抗-MHC class II), 93F10(抗-MHC class II), TS1/22.1.13(抗-LFA-1a), TS1/18.1.2.11.4(抗-LFA-1β), TS2/9.1.4.3 (抗-LFA-3),および 187.1(抗-human Ig(Fab))は、American Type Culture Collection（Rockville,MD)から入手可能なハイブリドーマによって製造された。これらのｍＡｂは、飽和濃度のハイブリドーマ上澄液で使用されるか、またはタンパクＡカラム(Biorad, Rockville Center, NY)で腹腔液から精製されるかのいづれかであった。抗-ジャーカットTCR Clonotypic mAb (抗-vβ8 )mAb 16G8および抗-TCR mAbのような他のパネルは、Diversi-T, T cell Science (Cambridge, MA)から購入した。mAb OKT4A は、Ortho Pharmaceutical (Raritan, NJ）から購入し、TCR δ-1はDr. Michael Brenner,ハーバード医学学校(Boston, MA)からの贈呈された。M241(anti-CD1c)はDr. Cox Terhorst of ハーバード医科大学からの贈呈であった。FITC標識抗-CD23-PE mAbおよび無標識の抗-CD69 は、Becton Dickinson (Mountainview, CA)より購入した。FITC標識抗IgM はTago (Burlingame, CA)より購入した。Kolt-4 (抗-CD28)、および抗-CD27 は Accurate Scientific(Westbury,NY）から購入した。
【０１１８】
組換蛋白ｒＩＬ−４はGenzyme(Cambridge, MA)より購入した。ｒＩＬ−２はHoffmann-LaRoche(Nutley,N.J.)の贈呈であった。
【０１１９】
細胞フルオログラフィー分析  約１０5細胞を、表示のｍＡｂｓの飽和濃度により、４５分間４℃で、８０μｇ／ｍＬの熱凝集したヒトＩｇＧ(International Enzyme, Fallbrook, CA)の存在下でインキュベートした。細胞は、洗浄されて未結合のｍＡｂを除去した後、蛍光体(Cappel, Cochranville, PA)と結合されたヤギ抗-マウスＩｇ二次抗体でインキュベーションされた。
【０１２０】
二色分析のため、細胞を表示のように直接連結されたＦＩＴＣまたはｍＡｂに接合し、４５分４℃で、凝集ヒトＩｇＧ存在下で、フィコエリスリン(PE)と反応させた。分析に先立ち、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。蛍光強度は、consort-30 ソフトウエアー(Becton-Dickinson, Mountainview, CA)付きＦＡＣＳＣＡＮ細胞フルオグラフィーで測定した。Ｂ細胞とジャーカットクローンとの共培養に関する実験では、弱い前方および側方の光分散によって異種細胞集団をゲーチングすることによって、ジャーカット細胞をＢ細胞蛍光分析から除外した。ＰＭＡおよびＰＨＡ活性化細胞による実験においては、死細胞は、ヨウ化プロピリデイウムおよび電子ＦＡＣＳゲーテイングによる処理によって分析から除外された。
【０１２１】
細胞系  下記の細胞系：HPB-ALL, Jurkat, CEM, PEER, MOLT-IV, K562, Ramos, Raji, およびU937は、American Type Culture Collection（Rockville, MD)から入手できる。ＢＡは以前報告されている(Bank, et al., 1986)ようにEpstein Barr ウイルスで形質転換されたＢ細胞系である。Ｈ９は、HIV Repository (Rockville, MD)から入手できる。ＨＬＡの分類は、コロンビア大学(One Lambda, Los Angeles, CA)の病理課Dr. Elaine Reed によって行われた。ジャーカットＤ１．１およびＢ２．７は、Mycotect キット(GIBCO, Grand Island, NY）およびＤＮＡハイブリデイゼーション法(Genprobe, La Jolla,CA)ではマイコプラズマに対して陰性であった。
【０１２２】
細胞集団の単離  末梢血液リンパ球は、健康な志願者より取り出された新鮮な血液を、Ficoll-Hypaque (Sigma, St. Louis, MO)またはLeukoprep（Becton-Dickson)で遠心分離することで得られた。Ｔ細胞は、ノイラミニダーゼ処理されたヒツジ赤血球によって実質的に選別された。ＣＤ４+ＣＤ８-およびＣＤ４-ＣＤ８+細胞のサブセットが、それぞれ抗ＣＤ８または抗ＣＤ４ｍＡｂ処理によって単離された後、以前(Rogozinksi, et al., 1984)に記載されているように、補体の仲介によって溶菌された。Ｂ細胞は、ノイラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球によるロゼット形成を二回行った後、Ficoll-Hypaque遠心分離ではペレット化されなかった細胞集団から得られた。
【０１２３】
Ｂ細胞は、更に密度遠心分離あるいは抗Ｉｇカラムでのポシテイブ選別によって精製された。最初の方法では、消耗したマクロファージを固定させるため、Ｅー細胞をポリスチレンフラスコ(３７℃、５％ＣＯ２）中で一晩培養した。これらの非Ｔ細胞および非マクロファージ細胞が不連続の３０％／５０％／１００％のパーコール勾配中で、２３００ｒｐｍ、１２分の遠心分離で、高および低密度の分画に分画された。高密度細胞が５０／１００％の界面から、低密度細胞が３０／５０％の界面から得られた(Crow, et al., 1985)。高密度（静止）細胞は、主に６０−８０％ＣＤ２０+，５５−８０％ＩｇＭ+、および＜５％ＣＤ３+および＜５％ＣＤ２３+（バックグラウンド）であった。（表示されている）他の実験では、Ｂ細胞が、記載(Rogozinksi et al., 1984； Friedman, et al., 1976)されているように、Sephadex G-200 抗Ｆ（ａｂ）２  Ｉｇ親和性クロマトグラフィで精製された。ＦＡＣＳで分析すると、ｓＩｇ+細胞集団は、主に＜５％ＣＤ３+、＜１０  ＣＤ２+、および＞９０％ＣＤ２０+であった。
【０１２４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動  ジャーカットクローンは、ラクトペルオキシダーゼ法でヨウ素化し、１％のＮＰ４０，ヨードアセトアミドを含む２５ｍＭトリスで緩衝化されたＰＢＳおよび１０μｍＰＭＳＦ中に溶解された。細胞溶解物を、ｍＡｂ１８７．１(抗ヒトＦ（ａｂ）Ｉｇ）と約１０μｇの表示ｍＡｂで被覆された蛋白Ａ−４Ｂセファロースビーズ(Pharmacia, Uppsula, Sweden)と反応させた。ビーズを洗浄して非特異的に結合した蛋白を除去後、沈殿した蛋白をＳＤＳ中で２−ＭＥ存在下または無存在下で、熱変性させた。変性蛋白および予め染色してある分子量マーカー(Biorad, Rockville Center, NY)を、１２ｃｍのゲル中で１２％ポリアクリルアミドを通して電気泳動にかけ、乾燥ゲルを使用してＸ線フィルム(Kodak, Rochester, NY)を感光させた。
【０１２５】
マイトマイシンＣおよびパラフォルムアルデヒド処理  ジャーカット細胞(１０7）を、５０μｇ／ｍＬのマイトマイシン−Ｃ（Sigma, St. Louis, MO)で、６０分３７℃で処理した。マイトマイシン処理されたジャーカット細胞を二回洗浄し、無マイトマイシン培地に再懸濁してから、４５−６０分３７℃で培養した。該細胞を更に二回洗浄してからＢ細胞培養中に添加した。固定化実験では、Ｔ細胞を新たに作成した０．５％のパラフォルムアルデヒドで５−１０分処理し、０．２ＭのＬ−リジンで抑制し、５回洗浄しＢ細胞培養中に添加した。
【０１２６】
Ｔ細胞活性化  ５ｃ８ Ａｇの発現を研究する実験では、静止Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍＬのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（Sigma, St. Louis, MO)および１０μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Sigma)の存在下または無存在下で培養した。５ｃ８ Ａｇ発現の代謝要求を研究する実験では、Ｔ細胞が１００μｍシクロヘキサアミド（Sigma)または１０μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤ（Sigma)の存在下で活性化された。
【０１２７】
活性化したＴ細胞によって高密度のＢ細胞でのＣＤ２３の発現の誘発を研究する実験では、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂをＰＢＳ中で１時間培養することで、ｍＡｂｓＯＫＴ３またはＯＫＴ４を２４ウエル培養プレートの表面に固定化した。対照のウエルは、ｍＡｂを含まないＰＢＳ中で培養した。未結合ｍＡｂを洗浄した後、１０ｎｇ／ｍＬのホルボールジブチレート（ＰＤＢ）（Sigma)の存在下、６時間で２ｘ１０6細胞／ウエルでプレートが被覆された。細胞を激しいピペット操作で除去し、洗浄し、培養前に、細胞と２ｘ１０5の高密度で、パーコールで単離された静止Ｂ細胞との割合を１：１にして、０．５％のパラフォルムアルデヒドで上記記載通りに固定化した。Ｂ細胞ＣＤ２３の発現が上記記載のように２色ＦＡＣＳで測定された。
【０１２８】
Ｂ細胞活性化および分化  Ｂ細胞表面ＣＤ２３の発現誘発を測定する実験では、２ｘ１０5高密度細胞を、２００μＬのIsocove's Modified Dulbecco培地（ＩＭＤＭ）１０％  ＦＣＳ丸底マイクロタイターウエル（Nunc)中の表示数のジャーカット細胞またはＴ細胞に添加し、１８−２４時間たってＣＤ２３の発現について分析した。ミリポア(Bedford, MA)からの４５μｍ培養プレート挿入物によって１ｘ１０6細胞から分離された１ｘ１０6のＢ細胞の存在下または無存在下で、１ｘ１０6ジャーカット細胞による二つのチェンバー実験が行なわれた。
【０１２９】
Ｂ細胞増殖は、平底マイクロタイターウエル（NUNC)中で、ＰＨＡ（５μｇ／ｍＬ）の存在下または無存在下で、１０5Ｂ細胞と、マイトマイシン−Ｃ−で処理した同数のＥ+細胞またはジャーカットクローンを共に培養することによって測定された。培養物は、６０時間後に、１μＣＩ（Ｈ3）チミン(New England Nuclear,Boston, MA）でパルス標識され、１６時間後にグラスファイバーフィルターペーパー(Cambridge Technology Watertown, MA)上で採取された。ベータシンチレーションｃｐｍをベータ計測器(LKB Rackbeta counter、1209型）で測定した。
【０１３０】
プラーク形成体(ＰＦＣ）は、イエルネ溶血プラーク分析の改変法で測定された（Rogozinski, et al., 1984)。つまり、２．５ｘ１０5Ｂ細胞をマイトシンＣ処理された様々な数のジャーカット細胞と共に培養するか、または未処理の新たに単離された自己に由来するＴ細胞と共に、６日間１：４００の希釈率のＰＷＭ(Gibco, Grand Island, NY)の存在下あるいは無存在下で培養した。細胞を二回洗浄し、ハンクス平衡塩類溶液中に再懸濁した。適宜希釈から、培養された細胞懸濁液の５０μＬを、塩化第二クロムによってラビット抗ヒトＩｇで被覆されたＳＲＢＣの１１％溶液１０μＬ、希釈されたラビット抗ヒトＩｇ１０μＬ、およびギアナピッグ補体１０μＬと混合した。これらの混合物を二つ対になったガラス室に入れ、２時間３７℃で培養した。プラークを解剖用顕微鏡を使用して計測し、プラーク形成コロニー(ＰＦＣ）１０6Ｂ細胞として表示した。
【０１３１】
Ｉｇアイソトープ定量のためのエリサ法が、炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中で、ポリスチレン９６ウエル(immunion II, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA9)を、ヤギ抗ヒトＩｇＡ，ＩｇＧ，またはＩｇＭ（Tago, Burligname, CA)の希釈物で、１８時間４℃で被覆することで行なわれた。そのプレートをＰＢＳ中０．０５％トウイーンで洗浄し、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで２時間のインキュベーションすることで非特異的部位を封鎖した。洗浄後、５０μＬの細胞培養上澄液またはＩｇアイソトープ標準液(Rockland, Gilbertsville, PA)を該ウエルに添加し、２時間結合させた。次ぎに、結合したヒトＩｇを検出するために、アルカリフォスファターゼ(Tago）と結合したヤギ抗ヒトＩｇを添加した。２時間後、ウエルを洗浄し、ｐ−ニトロフェニルフォスフェートを添加した。Molecular Devices VMAX器(Palo Alto, CA)で４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。サンプルは３回分析した。エラーバーは曲線当てはめ法および内挿法(Delta-Soft, BioMetallics, Inc. Princeton, NJ)から計算された標準偏差を示す。
【０１３２】
Ｔ細胞の作用におけるＣＤ４の役割
Ｔ細胞の作用におけるＣＤ４の役割を研究するために、ＣＤ４-ジャーカットクローン（Ｄ１．１）をＣＤ４-のサブ細胞集団自然発生させた培養液から単離し、ＦＡＣＳ分析でのマイナスピークで確認した。ＣＤ４の表面発現が見られなかったことは、ジャーカットＤ１．１細胞表面の表現型が、多くのｍＡｂ類の結合についてのＣＤ４+クローン、すなわちジャーカットＢ２．７（図１、および表１）と同様であった事が、比較的特異的であった。ＣＤ４の異なる発現は、これらのサブクローン間での定量的差異に過ぎないけれども、研究された他の分子構造はのうち幾つかは、定量的に異なるレベルで発現された。例えばジャーカットＤ１．１は、ジャーカットＢ２．７よりもＣＤ２およびＭＨＣクラス(ＨＬＡ）の分子を多く発現した。しかしながら、ジャーカットＤ１．１はジャーカットＢ２．７よりもＣＤ２８分子、およびTCR -α／β(Vβ８）／CD3 複合体の発現が少なかった（図１、および表１）。これらのclonotypic  抗-TCR mAbとの反応性が共通しているのに加えて、ジャーカットＤ１．１およびＢ２．７はＨＬＡと同一(Ａ３，３４、２、１６）であり、無関連Ｔ細胞白血病系、ＨＰＢ−ＡＬＬ（Ａ９）とははっきり相違していた。これらのデータをまとめると、ジャーカットＤ１．１はジャーカットのＣＤ４-サブクローンであり、ＣＤ４分子がないことは表面表現型における比較的特異的な変化であることが実証された。
【表１】
2006034293.tif 000002
【０１３３】
ａ数字は，ＦＡＣＳ平均で測定した蛍光強度（任意単位）を示す。バックグラウンドはマイナスされ、数字は約１０単位で四捨五入されている。
【０１３４】
作用性研究では、ＣＤ４+(Ｂ２．７）および（Ｄ１．１）ジャーカット細胞が静止Ｂ細胞を誘発してＣＤ２３を発現させる能力、Ｂ細胞活性化のマーカーを比較した(Crow, et al., 1986； Jover, et al., 1989； Crow, et al., 1989)。驚いたことに、Ｂ細胞と、ＣＤ４+ジャーカット細胞（Ｂ２．７）ではなくＣＤ４-ジャーカット（Ｄ１．１）と共培養すると、ＣＤ２３の発現が、６０％を越えるＢ細胞で誘導された。(図２）。ジャーカットＤ１．１によるＢ細胞表面のＣＤ２３発現の誘導は、Ｄ１．１とＢ細胞との比率が１：１では、２０−２４時間で最大となった（図３）。反対に、Ｂ２．７ジャーカットサブクローンは、高比率のＢ細胞、または長期間共培養(最高４８時間、表示せず）したＢ細胞を活性化しなかった（図３）。更に、ジャーカットＤ１．１は他のＴ細胞（Ｈ９，ＨＰＢ−ＡＬＬ，ＭＯＬＴ−ＩＶ，ＣＥＭ）および非Ｔ細胞（Ｕ９３７）白血病系（表示せず）と比較すると、該能力に特異性をもっていた。ジャーカットＤ１．１は、ＩｇＭ（図２）、ＣＤ２０（図２）またはクラスＩＭＨＣ等の他のＢ細胞表面分子の量が影響を受けないので、Ｂ細胞のＣＤ２３の発現を選択的に誘発した。Ｂ細胞活性化におけるジャーカットＤ１．１の効果は、２５以上の関連性のない提供者由来のＢ細胞に一定に観察された。これは、該影響がＡｇにもＭＨＣにも制限されない事を示唆する。
【０１３５】
Ｂ細胞ＣＤ２３は、Ｉｇの分泌細胞に至る最終Ｂ細胞分化において、初期、および、もしかすると中間の段階で発現される。活性化されたＴ細胞表面に与えられる刺激とは別の刺激が、実質的なＢ細胞の増殖および分化を行うには必要である。Ｂ細胞増殖または分化を測定するには、数日の培養が必要であるので、ジャーカットクローンの増殖を、マイトシンＣによる前処理で阻害した。マイトシンＣは、Ｂ細胞を活性化する能力を奪うことはしない(表２）。
【表２】
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【０１３６】
二色ＦＡＣＳ分析によって、抗ＣＤ２０（ｌｅｕ−１６）−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ２３  ＰＥで測定されたＣＤ２３を発現するＣＤ２０（Ｌｅｕ−１６）+Ｂ細胞のパーセンテージを示す。高密度のパーコールで分画されたＢ細胞（２ｘ１０５）は単独で培養されるか、または同数のジャーカットＢ２．７またはＤ１．１細胞と共に、表示されたように２０時間培養された。表示のように、精製されたポリクローナルラビットの抗ＩＬ−４または抗ＩＬ−２Ｉｇは、実験開始時に最終濃度１・２５μｇ／ｍＬになるまで添加された。表示のように、ｒＩＬ−２またはｒＩＬ−４は、最終濃度２５Ｕ／ｍＬになるまで表示された培養液に添加された。分析された細胞は、前方および側方の光分散によって該分析からゲートされ、大きなＤ１．１またはＢ２．７細胞(もしあれば）が除かれた。Ｃ：対照；Ｄ１．１／Ｍ：マイトシンＣで処理されたＤ１．１細胞；Ｂ２．７／Ｍ：マイトシンＣで処理されたＢ２．７；ＮＤ：測定せず。
【０１３７】
マイトマイシンＣ処理されたＣＤ４-ジャーカットＤ１．１およびＣＤ４+ジャーカットＢ２．７は、そのＢ細胞増殖またはＩｇ分泌細胞へ至る最終Ｂ細胞分化へ誘導する能力について調査された。Ｔ細胞依存Ｂ細胞マイトジェン(Doech, et al., 1980)の存在下、ジャーカットＢ２．７ではなく、ジャーカットＤ１．１に誘導されたＢ細胞の増殖は、ＤＮＡ分析（図４）によって測定され、Ｉｇ分泌細胞の分化は、逆溶血プラーク分析（図５Ａ）によって測定された。更に、分泌された抗体のアイソタイプは定量エリサ法で定性された。ジャーカットＢ２．７ではなく、ジャーカットＤ１．１は、培養上澄液中へＩｇＧおよび少量ではあるがＩｇＭの分泌を誘発した(図５ＢおよびＣ）。これらのデータは、まとめると、ジャーカットＢ２．７ではなく、ジャーカットＤ１．１がＢ細胞の分化およびＩｇＭおよびＩｇＧの分泌を援助する機能的能力を活性化Ｔ細胞と共有していることを示す。
【０１３８】
Ｂ細胞活性化の汎用要素の役割
Ｄ１．１上澄液はＢ細胞ＣＤ２３の発現を誘発しなかった（図３）。静止Ｂ細胞を、Ｂ細胞存在下、無存在下で、Ｄ１．１細胞の培養培地を含むリンフォカインまたは培養液と、浸透膜によって分離されたチェンバーで培養する二室実験が行われた。ある実験では、Ｂ細胞（６６％ＩｇＭ）が０．４５ｍμ膜の付いたチェンバー中で培養された。二色ＦＡＣＳ分析によると、ｒＩＬ−４（２５Ｕ／ｍＬ）が、ＩｇＭ+Ｂ細胞の２８％でＣＤ２３の発現を誘発した。反対に、もう一つのチェンバーでは、Ｄ１．１細胞がＣＤ２３（バックグランド４．０％に対してＤ１．１は４．７％）を発現するためのＢ細胞を活性化しなかった。更に、Ｄ１．１細胞とＢ細胞を一つのチェンバーで共培養したものは、もう一方のチェンバー中のＣｄ２３（４．９％）を発現するためのＢ細胞を活性化しなかった。しかしながら、Ｂ細胞と直接接触を達成できれば、Ｄ１．１細胞は、Ｂ細胞によるＣＤ２３の発現を誘発することができた（Ｂ２．７細胞に対して７６％体８．４％）。まとめると、これらのデータによって、Ｂ細胞におけるＤ１．１の効果を生じる汎用要素としての役割を裏づける事はできなかった。
【０１３９】
ｒＩＬ−４は、ＣＤ２３を発現するＢ細胞を活性化する事が知られていた（Rabin, et al., 1985)ので、この効果を果たす際のＩＬ−４の潜在的役割を、Ｂ細胞でのＣＤ２３発現誘発の役割とは別に、更に調査した。ｒＩＬはＢ細胞ｓＩｇＭ+の発現のアップレギュレーションをすることが知られていた(Shields, et al., 1989)。ｒＩＬ−４は、ＣＤ２３の発現およびｓＩｇＭ+のアップレギュレーションを投与量に依存したかたちで誘発したけれども、Ｄ１．１細胞はＣＤ２３の発現を誘発したが、Ｂ細胞ｓＩｇＭのアップレギュレーションはしなかった（図６）。Ｂ細胞の増殖におけるＤ１．１細胞の効果もまた、ｒＩＬ−４（図４）効果とは異なっていた。ｒＩＬ−４ではなくＤ１．１細胞は、ＰＨＡ存在下でＢ細胞増殖を誘発した。おもしろいことに、ｒＩＬ−４およびＤ１．１細胞は共同して、ＰＨＡ無存在下ではＢ細胞増殖を誘発し、ＰＨＡ存在下ではＤ１．１に誘発された増殖を増大させた。これらのデータは、まとめると、Ｂ細胞におけるＤ１．１細胞の効果が、ＩＬ−４によって誘発される効果とははっきりと異なる事を示唆している。しかしながら、Ｂ細胞に対するＤ１．１細胞の影響におけるＩｌ−４の役割を直接調べるために、Ｉｌ−４に対する中和抗体を使用した。ｒＩＬ−４（図６）によって行われる抗ＣＤ２３の誘発およびｓＩｇＭのアップレギュレーションの両方を阻害する抗ＩＬ−４抗体の濃度では、Ｄ１．１が介在するＢ細胞ＣＤ２３発現は阻害されなかった（表II）。これらのデータにより、ＩＬ−４単独ではＤ１．１のＢ細胞における効果が説明できない事が実証された。これらの結果を、まとめると、分泌要素ではなく、細胞−細胞接触がＢ細胞活性化におけるＤ１．１の効果を説明することが示唆された。
【０１４０】
細胞−細胞接触がＢ細胞におけるＤ１．１効果を生じるというアイデアを実証するために、ジャーカットＤ１．１および対照のＢ２．７細胞を１％のパラフォルムアルデヒドで固定化した。パラフォルムアルデヒド固定化は、ジャーカットＤ１．１のＢ細胞を活性化する能力を低下させたけれども、固定化されたＤ１．１細胞は、Ｂ細胞ＣＤ２３の発現を誘発する能力を残していた。しかしながら固定化されたＢ２．７細胞は、ＣＤ２３の発現をバックグランドレベルから変えはしなかった。固定化されたＤ１．１細胞：Ｂ細胞の割合が５：１の時、無固定化Ｄ１．１細胞では８０％であったのに比べて、６３％のＢ細胞が誘発されてＣＤ２３を発現した。これらのデータは、まとめると、ジャーカットＤ１．１上の表面構造が、Ｂ細胞の活性化を誘発するには十分であることを示唆している。
【０１４１】
ヘルパーエフェクター作用を与える活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞の細胞表面蛋白の特徴
ヘルパーエフェクター作用を与える活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞の細胞表面蛋白の特徴付けを行うために、マウスを接触依存性ヘルパーエフェクター作用を有するジャーカットＤ１．１クローンで免疫感作した(Yellin et al., 1991)。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が産生され、Ｄ１．１クローンおよび非ヘルパージャーカットクローンＢ２．７に識別して結合するかどうかに対して、ハイブリドーマ上澄液をスクリーニングする。
【０１４２】
非ヘルパーＢ２．７細胞の表面ではなく、Ｄ１．１細胞表面に特異的に結合した５ｃ８と名付けられたマウスＩｇＧ２ａ ｍＡｂが確認された(図７）。ｍＡｂ ５ｃ８は、他の様々な細胞系：Ｔ細胞白血病系、ＣＥＭ，Ｈ９，Ｍｏｌｔ−４，およびＰｅｅｒ；Ｂ細胞由来細胞系、ＢＡ，Ｒａｊｉ，またはＲａｍｏｓ；骨髄単球細胞系、Ｕ９３７；または赤血球細胞系、Ｋ５６２とは結合しなかった(下記表３参照）。
【表３】
2006034293.tif 000004
【０１４３】
これらのデータは、表示細胞系または細胞集団に結合しているｍＡｂ ５ｃ８のＦＡＣＳ分析から得られた。ｍＡｂ ５ｃ８の結合は、各々の細胞系または細胞集団に対する適切な陽性および陰性対照ｍＡｂｓのＦＡＣＳ染色と比較して決定された。ＮＤ：測定されなかった。
【０１４４】
ｍＡｂ ５ｃ８がジャーカットクローンＤ１．１のヘルパー能力と作用的に関連のある分子と反応するかどうかを評価するために、ｍＡｂ ５ｃ８の効果を、Ｂ細胞でのＤ１．１に誘発されるＣＤ２３発現の分析で調査した。ｍＡｂ ５ｃ８はジャーカットＤ１．１誘発細胞活性化（図８）を阻害した可能性がある。反対に、アイソタイプの対照ｍＡｂ、Ｗ６／３２は、Ｄ１．１が介在するＢ細胞活性化を阻止しなかった。ここに提示したデータにより、５ｃ８ ＡｇがＤ１．１細胞のヘルパーエフェクター作用に重要な役割を果たしていることが示唆される。
【０１４５】
ｍＡｂ ５ｃ８によって認識される抗原の生化学的特質
ｍＡｂ ５ｃ８によって認識される抗原を生化学的に特質化するために、免疫沈殿を，ｍＡｂ ５ｃ８または対照ｍＡｂｓによっておこなわれる。対照ｍＡｂｓは、表面ヨウ素化されたジャーカットＤ１．１細胞および対照、つまり表面ｍＡｂ ５ｃ８結合を欠く非ヘルパージャーカットＢ２．７細胞の細胞溶融物上のクラスＩ  ＭＨＣ（Ｗ６／３２）またはＣＤ２８（ｋｏｌｔ−４）抗原を認識する。ｍＡｂ ５ｃ８は、対照のＢ２．７溶融物からでなく、ヘルパークローンＤ１．１の溶融物から、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上の３０ｋＤａに移動する蛋白を免疫沈殿した（図９）。
【０１４６】
ｍＡｂ ５ｃ８によって免疫沈殿された蛋白種は、２−メルカプトエタノール(２−ＭＥ）による還元による影響は受けなかった。これは、３０ｋＤａのバンドが、ホモダイマーに連結した二硫化物でも、ヨウ素化が容易にできない他の蛋白に連結した二硫化物でもないことを示唆している。反対に、対照、抗−ＣＤ２８ｍＡｂ、ＫＯＬＴ−４は、２−ＭＥが存在しない場合は８８ｋＤａバンドを、２−ＭＥが存在する場合は４４ｋＤａバンドを免疫沈殿した（図９）。これは公開のレポート(Martin, et al., 1986)およびこの構造が二硫化物が結合したホモダイマーであるという解釈と一致する。対照のｍＡｂ Ｗ６／３２は、４３と１２ｋＤａ  ＭＷの蛋白の非硫化物が結合したヘテロダイマーを沈殿させた（図９）。これらのデータにより、ｍＡｂ ５ｃ８が、３０ｋＤａ  ＭＷの非硫化物に結合した蛋白種を、Ｄ１．１細胞の表面から認識したことが示唆された。
【０１４７】
通常リンパ細胞による５ｃ８ Ａｇ発現の特徴
ｍＡｂ ５ｃ８または様々な対照ｍＡｂｓの結合について、新たに単離されたＴおよびＢリンパ球、単球、および、ＰＭＡおよびＰＨＡに刺激されたＴ細胞についてのＦＡＣＳによって調査される。静止ＴまたはＢリンパ球または単球は、５ｃ８ Ａｇを発現しなかった(上記表３、および図１０参照）けれドンも、活性化されたＴ細胞のサブセットは、ＰＭＡおよびＰＨＡで活性化された後５時間して、５ｃ８ Ａｇを発現した事がわかった（図１０）。
【０１４８】
５ｃ８ Ａｇの発現のカイネチクスおよび細胞分布を特徴づけるために、ｍＡｂ ５ｃ８のＴ細胞への結合が、Ｔ細胞活性化後、様々な間隔をおいてＦＡＣＳで調査された。Ｔ細胞活性化後、実質的に全てのＴ細胞に上に急速に誘導される事が知られている(Bjorndahl, et al., 1988)ので、３２／３８ＫＤａの二硫化物結合ヘテロダイマーであるＣＤ６９分子を、対照として選択した。５ｃ８が静止Ｔ細胞には無く、活性化後Ｔ細胞のサブセット上で発現されるけれども、対照的に、低レベルのＣＤ６９発現が静止Ｔ細胞上でみられ、高レベルのＣＤ６９の発現が全Ｔ細胞集団の活性化によって誘導された(図１０）。ｍＡｂ ５ｃ８の結合が活性化後３時間(Bjorndahl, et al., 1988)に著じるしく、２４時間(図１１）を越えて持続したので、発現のカイネテクスにより、さらにＣＤ６９と５ｃ８ Ａｇは区別された。ここに示されたデータによって、ＣＤ６９と５ｃ８ Ａｇが、それらの発現の細胞分布によっても、それらの活性化後のアップレギュレーションのカイネテクスによっても識別されることが提示された。
【０１４９】
ｍＲＮＡまたは蛋白の合成が、５ｃ８ Ａｇ発現に必要とされるかどうかを決定するために、アクチノマイシンＤまたはシクロヘキサアミドの存在または非存在下で、Ｔ細胞をＰＭＡおよびＰＨＡで刺激し、５ｃ８およびＣＤ６９の発現を比較した。５ｃ８の発現は、アクチノマイシンＤまたはシクロヘキサミドのいづれかの処理によって阻害された(図１０）。反対に、ＣＤ６９は、アクチノマイシンＤまたはシクロヘキサミドのいづれかの存在下にもかかわらず、活性化によって、以前に報告されている(Bjourndahl, et al., 1988)ようにアップレギュレーションされた(図１１）。これらのデータにより、Ｔ細胞活性化後に５ｃ８の抗原の発現が、ｍＲＮＡの転写および蛋白の新生（de novo）合成に依存している事が示唆された。
【０１５０】
活性化後に５ｃ８ Ａｇを発現するＴ細胞サブセットの特徴
活性化後５ｃ８ Ａｇを発現するＴ細胞サブセットの特徴付けを行うために、ＣＤ４+ＣＤ８-またはＣＤ４-ＣＤ８+Ｔ細胞集団を抗ＣＤ８または抗ＣＤ４ｍＡｂ処理によってそれぞれ単離し、その後、補体depletion を行なった。ＣＤ４+ＣＤ８-またはＣＤ４-ＣＤ８+集団を、ＰＨＡおよびＰＭＡで活性化し、ＦＡＣＳによる５ｃ８ ＡｇまたはＣＤ６９の発現について調査した。ＣＤ８+細胞が活性化後、類似量のＣＤ６９を発現したという事実にもかかわらず（図１１）、活性化後、５ｃ８の発現は、ＣＤ８+ではなくＣＤ４+細胞上において排他的に誘発された。これらのデータをまとめると、５ｃ８ Ａｇの発現がＣＤ４+細胞に限られる事が実証された。
【０１５１】
通常Ｔ細胞の介在するＴヘルパー機能における５ｃ８ Ａｇの役割の評価
通常Ｔ細胞の介在するＴヘルパー機能における５ｃ８ Ａｇの役割の評価するために、表面ＣＤ２３分子と発現するための小量の静止Ｂ細胞を誘発する活性化Ｔ細胞の能力におけるｍＡｂ ５ｃ８の効果を調査した。ホルボールジブチレート（ＰＢＤ）の存在下、抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）または対照の抗−ＣＤ４（ＯＫＴ４）ｍＡｂｓで被覆された表面で、Ｔ細胞を培養しそしてパラフォルムアルデヒドで固定化した。これらの固定化されたＴ細胞の、溶解性ｍＡｂ ５ｃ８またはＯＴＫ４の存在下でのＢ細胞活性化能力について調査した。ＯＴＫ４は、Ｔ細胞表面ＣＤ４分子と反応するが、Ｔ−Ｂ細胞相互作用と阻害しない(Rogozinksi, et al., 1984)から、ｍＡｂ ＯＴＫ４は、これらの実験でアイソタイプと適合した対照として選択された。ＯＴＫ４ではなくｍＡｂ ５ｃ８は、活性化されたＴ細胞のＢ細胞ＣＤ２３発現を誘導する能力を阻害した(下記表４参照）。
【表４】
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【０１５２】
表示したように、Ｂ細胞を単独で培養した後、または同数のジャーカットｄ１．１細胞存在下で培養した後、二色ＦＡＣＳ分析によってＣＤ２３を発現するＩｇＭ+Ｂ細胞のパーセンテージ、あるいはＰＢＤ単独で刺激されたか、または固定化された抗−ＣＤ３(ＯＫＴ３）または抗−ＣＤ４（ＯＫＴ４）ｍＡｂのいづれかの存在下で刺激されたパラフォルムアルデヒドで固定化されたＴ細胞のパーセンテージを示す。ＩｇＧ２ａ ｍＡｂｓ、５ｃ８、およびＯＫＴ４は、並行の用量−反応実験において、９０％のＣＤ２３誘導を阻害したｍＡｂ ５ｃ８の濃度の二倍の５００ｎｇ／ｍＬあった。ＮＤ：測定せず。
【０１５３】
次に、ｍＡｂ ５ｃ８およびＯＫＴ４の、通常のヒトＴ細胞によって起こされる最終Ｂ細胞分化を阻害する能力にたいする効果を比較した。これらの実験では、ＣＤ４+Ｔ細胞をＰＷＭの存在下、自己由来の、カラム単離Ｂ細胞と共に培養し、Ｉｇを分泌するＢ細胞プラーク形成コロニー（ＰＦＣＳ）の数を逆溶血プラーク分析によって測定した。ＯＫＴ４ではなく、ｍＡｂ ５ｃ８が、ＣＤ４+細胞起動ＰＦＣ反応を阻害した（表５参照）。これらのデータをまとめると、５ｃ８ Ａｇが活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞のヘルパーエフェクター機能の接触依存性面に関わっている事が実証される。
【表５】
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【０１５４】
ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＰＷＭの存在下または無存在下で、自己由来の、抗Ｉｇカラム単離Ｂ細胞との比率０．６：１で培養した、無関連のドナーについての３つの別個の実験の結果を示す。１０６Ｂ細胞につきプラーク形成コロニー（ＰＦＣ）の数を逆溶血プラーク分析によって測定した。ＯＫＴ４が１μｇ／ｍＬである実験１以外では、ｍＡｂｓ ５ｃ８およびＯＫＴ４は、５００ｎｇ／ｍＬであった。ＮＤ：測定せず。
【０１５５】
考察
ジャーカットＤ１．１クローンは、関連のない種々の患者由来のＢ細胞に対して、表面ＣＤ23分子（Ｂ細胞活性化のマーカー）の発現を誘導し、またＴ依存性Ｂ細胞マイトジェンの存在下で増殖およびＩＳＣへの最終分化を誘導する点において、ＣＤ４+ジャーカット細胞ライン及び他の種々の白血病Ｔ細胞ラインとは機能的に異なっている。Ｂ細胞活性化に対するこのＤ１．１の作用は、親密な細胞接触を必要とし、分泌された因子（または特にＩＬ−４）によっては説明できなかった。
【０１５６】
ジャーカットＤ１．１が接触依存性Ｂ細胞の活性化および分化を誘導できるという事実は、ジャーカットＤ１．１が、補助(help)の接触依存性エフェクター相を媒介する活性化Ｔ細胞と共通した、表面構造を有していることを示唆している。
【０１５７】
活性化されたＴ細胞と、Ｔヘルパー機能のエフェクター相を媒介するＢ細胞との間の分子的相互作用は複雑であり、殆ど理解されていない。Ｔヘルパー・エフェクター機能の機構を詳細に吟味するために、幾つかの研究によってＢ細胞分化の初期現象が測定された。第一に、細胞サイクル過程に関連したＲＮＡ、ＤＮＡおよび酵素のＢ細胞合成が、活性化された休止していないＴ細胞によって誘導される（O'Brien, et al., 1988； Grusby, et al., 1991； Noelle, et al,.1991； Noelle, et al,.1990； Zinkernagle, 1977； Sprent, 1978； Sprent, 1978； Jones, et al., 1981； Julius, et al., 1982； Chestnut et al., 1981）。第二に、Ｂ細胞表面ＣＤ23の誘導により測定されるＢ細胞の活性化が、活性化された休止していないＴ細胞によって誘導される（Zinkernagle, 1976）。第三に、Ｂ細胞の活性化および増殖が、パラホルムアルデヒドで固定された活性化Ｔ細胞によって誘導され得る（Zinkernagle, 1977； Julius, et al., 1982）。第四に、Ｂ細胞の増殖が、活性化された休止していないＴ細胞由来の膜プレパレーションによって誘導される（Noelle, et al,.1991； Katz, et al., 1973； Brian, 1988）。最後に、活性化Ｔ細胞または活性化Ｔ細胞膜がＢ細胞の活性化または増殖を誘導する能力は、プロテアーゼ処理によって喪失される（Katz, et al., 1973； Jones, et al., 1981）。総合すると、これら所見は、Ｔ細胞の活性化が、Ｂ細胞と相互作用する表面構造の誘導に付随し、Ｂ細胞の活性化および増殖のための接触依存性信号を提供するするという思想に合致している。活性化Ｔ細胞と同様であるが、他の白血病細胞ラインとは異なり、ジャーカットＤ１．１は、細胞／細胞の接触に依存するがリンホカイン、Ａｇ特異性またはＭＨＣ制限には依存せずに、Ｂ細胞ＣＤ23の発現を誘導する能力を有している。Ｂ細胞表面ＣＤ23の発現の誘導は、Ｔ指令されたＢ細胞のＩｇ分泌細胞への分化（固定された活性化Ｔ細胞の表面によって駆動され得る）の初期段階または中間段階で生じると思われる（Zinkernagle, 1976； Sprent, 1978）。Ｂ細胞ＣＤ23の発現の誘導に加えて、ジャーカットＤ１．１は、ＰＷＭの存在下でのＤ１．１に誘導された最終Ｂ細胞分化において、ＣＤ４+ジャーカットクローンとは機能的に異なっている。これらの点において、ジャーカットＤ１．１は活性化されたＴ細胞と共通した、Ｂ細胞を刺激する後天的な表面特性を有していると思われる。
【０１５８】
ヘルパー機能を説明するジャーカットＤ１．１の表面構造の性質は、今回の研究においては同定されなかった。Ｔ細胞上のＣＤ28分子はＢ細胞リガンドを結合するから（Hirohata, et al.,）、特に興味深いのは、ヘルパーＤ１．１およびＢ２．７クローン上のＣＤ28の発現を比較することである。しかし、ジャーカットＤ１．１およびＢ２．７がＣＤ28分子を発現したという事実によって、ＣＤ28だけではジャーカットＤ１．１の独特の機能的性質を説明できないことが示された。更に、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＥ38、ＬＦＡ−１ａ、ＬＦＡ−１ｂおよびＬＦＡ−３に特異的なｍＡｂを用いたｍＡｂ阻害研究においては、何れのｍＡｂも、Ｄ１．１に媒介されたＢ細胞の活性化を阻害するものとして同定され得なかった。ヘルパーエフェクター機能を媒介するＤ１．１の異なった細胞表面特性を同定するために、Ｄ１．１と反応し、Ｄ１．１のＢ細胞を補助する能力を阻害するｍＡｂを創製する試みが開始された。
【０１５９】
ヘルパー機能を媒介する表面構造は同定されていないが、Ｄ１．１系は、ヘルパーエフェクター機能におけるＣＤ４分子の役割を暗示している。ＣＤ４-であるものとして単離されたジャーカットサブクローンが、ヘルパー機能（通常はＣＤ４分子を発現するＴ細胞のサブセットに付随する）を有していたことは奇妙なことである。幾つかの系統の研究によって、ＣＤ４分子はヘルパーエフェクター機能において直接の役割を果たさないことが示唆されている（Mitchison, 1971； Gusby, et al., 1991； Noelle, et al., 1991； Vitetta, et al., 1989； Katz, et al., 1973； Zinkernagle, 1976）。ＴＣＲおよびＣＤ４の両者がＭＨＣクラスIIの分子（Ｉａ）と相互作用するという事実（Whalen, et al., 1988）は、Ｉａ分子のライゲーションがヘルパーエフェクター機能のモデルになり得ることを示唆している。加えて、Ｂ細胞上のＩａ分子のライゲーションがＢ細胞に信号を発するという所見は、このモデルによって更に支持される（Pollok, et al., 1991； Bartlett, et al., 1990； Martinez, et al., 1981）。ジャーカットＤ１．１はヘルパー機能を有するがＣＤ４-ではないという事実は、ＣＤ４分子がヘルパー機能のエフェクター相には必要とされないことを強力に示唆する。これとは対称的に、ジャーカットのＣＤ４-クローンが後天的なヘルパー機能を有することは、ＣＤ４分子がＣＤ４-ジャーカット細胞のヘルパーエフェクター機能を阻害し得ることを示唆する。ジャーカットＤ１．１がＤＣ４分子を欠失していることと、その独特のヘルパー機能との間の関係を直接測定するために、異種プロモータによって駆動されるＣＤ４・ｃＤＮＡ構築物の電気穿孔法によって、Ｄ１．１の安定なＣＤ４+形質導入体が創製された。
【０１６０】
最近、ネズミ系において、活性化されているが休止していないＴリンパ球から誘導された膜プレパレーションが、Ｂ細胞の増殖を誘導するがＩｇ分泌を誘導しないことが示された（Noelle, et al., 1991； Katz, et al., 1973； Brian, 1988）。これら研究のＤ１．１系に対する関係は現在は明らかでないが、Ｄ１．１細胞から単離された膜が、Ｂ細胞に対してＣＤ23の発現、増殖および最終分化を誘導するか否かを決定することは興味深いことである。何れにしても、ジャーカットＤ１．１は、接触依存性ヘルパー機能の媒介において重要な表面分子の同定および特徴付けを行なうために有用であるらしい。
【０１６１】
接触依存性ヘルパー機能をもった機能的に独特なジャーカット白血病ライン（Ｄ１．１）が、Ｄ１．１に誘導されたＢ細胞の活性化を阻害するネズミ抗体（５ｃ８と命名）を創製するために用いられた。抗体５ｃ８は、Ｄ１．１表面の独特な蛋白種（ジスルフィド結合されておらず、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上では30kDaの分子量で移動する）を認識した。正常なリンパ球においては、５ｃ８・Ａｇの発現は活性化後のＴ細胞サブセットに限定されていた。Ｔ細胞上における５ｃ８・Ａｇの該活性化に誘導された発現は、ｍＲＮＡの転写およびノボタンパク(novo protein)合成を必要とした。該５ｃ８・Ａｇは活性化されたＴ細胞表面に一時的に発現されるが、この発現は６時間でピークに達し、２４時間で消失する。正常Ｔ細胞表面での機能的研究において、ｍＡｂ・５ｃ８は、固定化された活性化Ｔ細胞のＢ細胞ＣＤ23の発現を誘導する能力を阻害した。加えて、ｍＡｂ・５ｃ８は、正常Ｔ細胞のＢ細胞分化を指令する能力を阻害した。総合すると、これらのデータは、５ｃ８・Ａｇが活性化ＣＤ４+Ｔ細胞（Ｔヘルパー機能の接触依存性因子を媒介すること含まれる）に専ら発現される、活性化に誘導された新規な表面タンパクであることを示している。
【０１６２】
５ｃ８・Ａｇの組織分布、発現の速度論、誘導のための代謝要求性および生化学によって、５ｃ８・Ａｇは、Ｔ細胞活性化によって誘導される他の公知の表面タンパクから区別される。第一に、他の公知のＴ細胞活性化マーカーは全て、ＣＤ４+で且つＣＤ８+のＴ細胞によって発現されるのに対して、５ｃ８・Ａｇは専らＣＤ４+Ｔ細胞によって発現される。第二に、Ｔ細胞の活性化に続く５ｃ８・Ａｇ発現の速度論は、他のＴ細胞活性化分子とは異なっていた。５ｃ８・Ａｇは活性化後６時間で最大に発現され、２４時間で消失するのに対し、ＣＤ25（Doech, et al., 1980）、Ｉａ（Rabin, et al., 1985）およびＣＤ28の 32 kD形は、活性化後１８時間以上誘導される。加えて、ＣＤ69は５ｃ８・Ａｇよりも迅速に発現され、また（５ｃ８・Ａｇとは異なって）２４時間以上持続する。第三に、５ｃ８・Ａｇ発現の誘導はｍＲＮＡ転写およびタンパク合成に依存したが、ＣＤ69は依存しなかったので、５ｃ８・Ａｇは、その誘導の代謝要求性によってＣＤ69から区別された。第四に、５ｃ８・Ａｇは 30 kDのジスルフィド結合されていない種であった。これに対して、初期活性化分子であるＣＤ69は、28/32 kDのジスルフィド結合されたヘテロダイマーである（Bjorndahl, et al., 1988）。総合すると、これらのデータは、５ｃ８・Ａｇが他の公知のＴ細胞活性化分子とは異なっていることを示唆している。
【０１６３】
また、５ｃ８・Ａｇは、その組織分布および生化学の幾つかの側面によって、Ｔ−Ｂ相互作用において役割を果たすことが知られている他のＴ細胞表面分子からも区別された。第一に、５ｃ８・ＡｇはＴ細胞活性化によって誘導されたが、休止細胞出は発現されなかった。これに対して、Ｂ細胞表面リガンドと相互作用するＣＤ４，ＣＤ２，ＣＤ５，ＣＤ28，ＬＦＡ−１，ＩＣＡＭ−１，ＣＤ45ＲＯ及び６Ｃ２（Doyle, et al., 1987； Van de Velde, 1991； Tohma, et al., 1991； Sanders, et al., 1991； Linsley, et al., 1990； Stamenkovic, et al., 1991； Rothlein, et al., 1986； Tanimoto et al., 1991）は、休止Ｔ細胞表面に発現する（Rothlein, et al., 1986； Tanimoto et al., 1991； Sanchez Madrid, et al., 1982； Smith, et al., 1986； Yamada et al., 1985）。第二に、５ｃ８・Ａｇは活性化Ｔリンパ球に特異的に発現され、Ｂ細胞、単球または細胞ラインのパネル（表１）には発現されないことによって、５ｃ８・Ａｇは、Ｂ細胞または一定の細胞ライン（例示せず）にも発現されるＩＣＡＭ−１，ＣＤ４，ＣＤ５，ＩＦＡ−１，ＣＤ２および６Ｃ２分子から区別される。第三に、ＣＤ２，ＣＤ５，ＣＤ28，ＬＦＡ−１，ＩＣＡＭ−１，ＣＤ45ＲＯ及び６Ｃ２は、ＣＤ４+Ｔ細胞と同様にＣＤ８+にも発現される（Rothlein, et al., 1986； Tanimoto et al., 1991； Sanchez Madrid, et al., 1982； Smith, et al., 1986； Yamada et al., 1985）のに対して、５ｃ８・Ａｇの発現はＣＤ４+Ｔ細胞に限定されていた。第四に、ｍＡｂ・５ｃ８で沈殿された30 kD タンパクは、これら他のタンパク（Rothlein, et al., 1986； Tanimoto et al., 1991； Sanchez Madrid, et al., 1982； Smith, et al., 1986； Yamada et al., 1985）の何れとも似ていなかった）。最後に、ｍＡｂ・５ｃ８はジャーカットＤ１．１に媒介されるヘルパーエフェクター機能を阻害する能力によって同定されたから、５ｃ８・Ａｇはこれら他の分子とは異なっていた。
【０１６４】
ｍＡｂ・５ｃ８はジャーカットＤ１．１および固定された活性化Ｔリンパ球の接触依存性ヘルパー作用を阻害するから、５ｃ８・Ａｇは、Ｂ細胞表面のリガンド（または「カウンターレセプター」）と相互作用することによって、Ｂ細胞活性化機能を媒介すると思われる。この５ｃ８・ＡｇのＢ細胞カウンターレセプターとの相互作用は、Ｔ−Ｂ対に追加の付着力を提供すること、Ｂ細胞原形質への刺激信号を変換することまたはこれら機構の組み合わせによって、ヘルパー機能を媒介し得る。正確な機構には関係なく、５ｃ８・Ａｇの一時的な発現は、非特異的なＢ細胞活性化を制限するための分子的な解決を提供し得る。抗原特異的な同起源のＴ−Ｂ対の局在化された環境における５ｃ８・Ａｇの一時的発現は、５ｃ８・Ａｇの抗原／ＭＨＣに制限されない活性化機能を、適切なＢ細胞標的へチャンネルし得る。５ｃ８・Ａｇの発現および下方調節の速度論は、内皮細胞、活性化誘導されたリンパ球の細胞表面メディエータおよびリンパ球結合性ＥＬＡＭ−１（Bevilacqua, et al., 1987）と共通している。この類似性は、局在化された細胞間相互作用を生じさせるために一時的発現を利用する戦略が、５ｃ８・Ａｇ、ＥＬＡＭ−１、並びに可能性としては、直接接触によって他の細胞に強力な信号を伝達する未だ特徴付けられていない他の表面分子によって共有され得ることを示し得るかも知れない。
【０１６５】
ＣＤ４分子は、ヘルパー機能をもったＴ細胞前駆体を包含するＴ細胞ポピュレーションを同定する（Reinherz, et al., 1979）。しかし、ＣＤ４+サブセットは機能的に不均一であり、またヘルパー細胞に加えて、細胞毒性のサプレッサー細胞を含んでいる（Krensky, et al., 1982； Thomas, et al., 1981）。５ｃ８・Ａｇがヘルパー機能に含まれるという事実は、５ｃ８・Ａｇが、ＣＤ４発現よりも密接にヘルパー発現型と関連し得ることを示唆している。活性化ＣＤ４+細胞における５ｃ８発現の不均一な分布は、ＣＤ４+Ｔ細胞の機能的サブセット類が、その５ｃ８発現レベルによって区別される得るかもしれないことを示唆する。例えば、ヘルパー活性または細胞毒性に関連して、５ｃ８-ＣＤ４+細胞および５ｃ８+ＣＤ４+細胞の機能的可能性を測定することは興味深いことであろう。
【０１６６】
Ｔ細胞ヘルパーエフェクター機能は、Ｂ細胞応答性（Krusemeier, et al., 1988； Hodgkin, et al., 1990； Noelle, et al., 1991； Kubota, et al., 1991）、アイソタイプスイッチングの調節（Tesch, et al., 1984）及び体細胞超突然変異（Weigert, et al., 1970）をもたらす複雑なプロセスである。多くの細胞／細胞相互作用によって、並びに種々のリンホカインを分泌することによって、Ｔ細胞がＢ細胞と相互作用するという事実は、個々の信号または信号の一定の組み合わせによって、Ｂ細胞分化の特定の側面が調節されるであろうことを示唆する。ｍＡｂ・５ｃ８がＴ細胞ヘルパー機能の接触依存性の側面を阻害するという事実によって、ＣＤ４+Ｔ細胞が液性免疫反応を調節するプロセスを更に詳細に検討する手段が提供される。
【０１６７】
実験の第２シリーズ
ヒトリンパ瀘胞内でＴ−Ｂリンパ球の共働を媒介する分子的相互作用
Ｔヘルパー機能と称する過程では、ＣＤ４+のＴリンパ球は、体液での（抗体が媒介する）免疫反応を媒介する抗原特異的Ｂ細胞の分化を選択、誘発する（Mitchell, et al.；1968；Mitchison, 1971；White, et al, 1978；Reinhertz, et al., 1979；Janeway, et al., 1988；Rehemtulla, et al., 1991；Grusby.et al.1991）。リンパ瀘胞内では生理学的なＴ−Ｂ反応が起こっているが、様々なインビトロ系において、Ｔヘルパーの信号の機構的解明が可能になっている。ヘルプの誘導相は抗体とＭＨＣに限定されているが、エフェクター相は非特異的であり、リンホカインと接触依存性信号の両方に媒介されている（Martinez, et al., 1981；Anderson, et al., 1980；Clement, et al., 1984；Crow, et al., 1986；Brian, 1988；Hirohata, et al., 1988；Noelle, et al., 1989；Whalen, et al.1988）。
【０１６８】
接触依存性信号の解明は、不活性な末梢Ｂ細胞を本質的に活性化する、機能的にユニークなジャーカットＴ細胞白血病細胞系Ｄ１．１のサブクローンが最近同定されたことにより進歩した（Yellin, 1991）。Ｄ１．１クローンは、以前から、不活性なＢ細胞を誘発して表面のＣＤ２３分子を発現させ、Ｂ細胞を増殖させて、抗体産性細胞に分化させることがわかっている（Yellin, 1991）。Ｄ１．１のＢ細胞活性化能力は細胞の表面に局在している。これはパラホルムアルデヒドで固定されたＤ１．１が、Ｂ細胞を活性化する能力を保持していたが、Ｄ１．１の上清は不活性だったからである（Yellin, 1991）。これらのデータを一緒に考慮すると、Ｄ１．１は、接触依存性のヘルパー機能を媒介する活性化されたＴ細胞と表面構造を共有していることを示している。
【０１６９】
実験の第１シリーズでは、Ｄ１．１と特異的に反応してＤ１．１によるＢ細胞の機能的活性化を阻害するｍＡｂ（Lederman, et al., 1992）について、ハイブリドーマをスクリーニングすることにより、このような一つの構造（５ｃ８・Ａｇと称する）が同定された。ｍＡｂ・５ｃ８によって、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現するが、ＣＤ8+Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球には発現しない３０キロダルトンの新規な表面構造が同定された（Lederman, et al., 1992）。ＰＨＡ、ＰＭＡで刺激した後の、細胞表面での５ｃ８抗原の発現の速度論は比較的ユニークであり、最大の発現は６時間後に起こるが、その後は下方調節されて２４時間後にはまったく発現しなくなる（Lederman, et al., 1992）。機能的アッセイにおいて、ｍＡｂ・５ｃ８は、正常なＣＤ４+Ｔ細胞のＢ細胞を抗体産生細胞に分化させる能力を阻害する（Lederman, et al., 1992）。以上のことを総合すると、これらのデータは、５ｃ８抗原が、接触依存性ヘルパー機能を媒介するＣＤ４+Ｔ細胞の表面構造の一つの構成部分であることを示している。従って、この５ｃ８・Ａｇを「Ｔ細胞−Ｂ細胞活性化分子（Ｔ−ＢＡＭ）」と命名する。
【０１７０】
Ｔ−ＢＡＭはインビトロで接触依存性ヘルパー機能を誘起するＴ細胞分子の一つであるが、そのリガンド及びＢ細胞上の「カウンターレセプター」、即ち、インビボのリンパ系組織内で接触依存性ヘルパー機能を媒介するのに他のＴ細胞分子とＢ細胞分子がどのような役割を果たしているかは殆どわかっていない。幾つかの興味深いＢ細胞の表面分子が、リンパ系組織内において接触依存性信号を受容する役割をしているだろうといわれている。ＣＤ４０分子、ＣＲ２分子および接着分子がそれである。ヒトＢ細胞表面上のＣＤ４０分子は、リンパ節Ｂ細胞分化に関係する興味深い信号機能を持っている（Clark, et al., 1986；Clark, et al., 1988；Ledbetter, et al., 1987；Ledbetter, et al., 1986）。何故なら、抗ＣＤ４０（mAb G28-5(Clark, et al., 1986)）はプログラムされた胚中心Ｂ細胞の死（アポプトーシス）（Lim, et al., 1989）を阻害し、ヒトＢ細胞の増殖、分化および長期の成長を誘起することがわかっているからである（Banchereau, et al., 1991a；Banchereau, et al., 1991b）。ＣＲ２はＢ細胞の補助レセプターで、抗体による誘発の後にＢ細胞に細胞分裂誘起信号を送ることができ、またはＥＢウイルスの細胞表面レセプターとしての役割を果たす（Nemerow, et al., 1985；Carter, 1988）。最後に、接着レセプターＬＦＡ１、ＬＦＡ３およびＩＣＡＭ−１は、多くの細胞の相互作用の中の接着相互作用において役割を果たしていることが知られていて、これらの構造と反応するｍＡｂは、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞の過程を阻害する（Tohma, et al., 1991a；Tohma, et al., 1991b）。しかし、ヘルパー相互作用におけるこれら分子の正確な役割はまだはっきりしていない。
【０１７１】
この第２シリーズの実験では、これらの発見を３つの方向に拡大した。第一に、Ｂ細胞リンパ腫クローンＲＡＭＯＳ２６６（Seigel, et al., 1990）が、抗Ｔ−ＢＡＭ（ｍＡｂ・５ｃ８）に阻害される仕方で、Ｄ１．１細胞の接触に応答するものとして同定された。第二に、Ｔ−ＢＡＭと共に接触依存性Ｔ−Ｂ活性化の媒介に関与するＢ細胞の表面構造（ＣＤ４０）が同定された。第三に、Ｔ−ＢＡＭは、インビボでは主に、リンパ節の外套部と中心部（Ｔ細胞とＣＤ４０を発現するＢ細胞との相互作用が起こる解剖学的部位）において、Ｔ細胞によって発現されることがわかった。
【０１７２】
材料と方法
細胞系：ジャーカット・クローンＤ１．１とＢ２．７については既述されている（Yellin, et al., 1991；Lederman, et al., 1992）。ＲＡＭＯＳ２６６、４ＣＮ・３Ｆ１０（ＲＡＭＯＳ２６６）クローン（Siegel, et al.1990）は、食品医薬品局（ＦＤＡ）のセンター・フォー・バイオロジックス・エバリュエーション・アンド・リサーチ（Bethesda，ＭＤ）の Jay P. Siegel博士の好意により寄贈された。ヒトＦｃＲｇＩＩ（ＣＤ３２）を発現しているＬ細胞は、Schering-Plough(Dardilly Cedex,France)のJacques Banchereau博士から贈られた（２４）。また、マウスＩａを発現しているＬ細胞は、コロンビア大学のNed Braunstein博士から贈られた。
【０１７３】
モノクローナル抗体：ｍＡｂ・５ｃ８（ＩｇＧ２ａ）については記述されている（Lederman, et al., 1992）。次のｍＡｂは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Rocdville ，ＭＤ）から入手可能なハイブリドーマから作製された；ＯＫＴ４（抗ＣＤ４）、ＯＫＴ８（抗ＣＤ８）、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）、Ｗ６／３２（抗ＭＨＣクラスＩｘ）、ＴＨＢ−５（抗ＣＲ２（ＣＤ２１））、ＴＳ１／２２．１．１３（抗ＬＦＡｌａ（ＣＤ１１ａ））、ＴＳ１／１８．１．２．１１．４（抗ＬＦＡ１ｂ（ＣＤ１８））、ＴＳ２／９．１．４．３（抗ＬＦＡ３（ＣＤ５８））。これらのｍＡｂは、ハイブリドーマの上清の飽和濃度もしくは腹水の希釈濃度で使用され、又はプロテインＡカラム（Biorad,Rockville Center ，ＮＹ）若しくはプロテインＧカラム（Pharmacia,Upsula,Sweden）で腹水液から精製して使用された。抗ＬＦＡ３（７Ａ６）はバイオジーン社（Cambridge ，ＭＡ）のVicki Sato博士から贈られた。抗ＣＤ２３ーＰＥ、ｌｅｕ１６（ＣＤ２０）、ｌｅｕＭ５（ＩｇＧ２ｂ・抗ＣＤ１１ｃ）ｍＡｂは、ベクトン・ディクソン社（Mountainview，ＣＡ）から購入した。ｍＡｂ・Ｇ２８−５（１９）は、ワシントン大学（シアトル，ＷＡ）のEdward A.Clark博士から贈られた。ｍＡｂ・ＲＲ１／１．１．１（抗ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４））は、テキサス大学サウスウエスタン・メディカル・センター（ダラス，ＴＸ）の Peter Lipsky 博士から贈られた。抗ＣＤ４０・ｍＡｂであるＢ−Ｂ２０（ＩｇＧ１）は、バイオソース・インターナショナル社（Camarillo ，ＣＡ）から購入した。ｍＡｂ・３２．２（抗ＦｃＲｇＩＩ（ＣＤ３２））は、Medarex、West Lebanon、NH から購入した。ＦＩＴＣでラベルした抗ＩｇＭは、Ｔａｇｏ社（Burlingame，ＣＡ）から購入した。イソタイプに適合した関連のないコントロールｍＡｂ・ＵＰＣ−１０（ＩｇＧ２ａ）とＭＯＰＣ１４１（ＩｇＧ２ｂ）は、シグマ社（セントルイス，ＭＯ）から購入した。抗ＩＬ−４と抗ＧＭ−ＣＳＦは、Genzyme 社（ケンブリッジ，ＭＡ）から購入した。
【０１７４】
細胞蛍光グラフィック分析；略１０５の細胞を、飽和濃度の指示されたｍＡｂと共に、８０ｍｇ／ｍＬの熱凝集ヒトＩｇＧ（インターナショナル・エンザイム社，Falbrook，ＣＡ）の存在下において、４℃で４５分間培養した。蛍光物質と結合したＦ（ａｂ）２  ヤギ抗マウス免疫グロブリン二次抗体（Cappel,Cochranville ，ＰＡ）と共にインキュベートする前に、結合しなかったｍＡｂを除去するために細胞を洗浄した。２色分析のために、指示した直接結合ＦＩＴＣまたはフィコエリトリン（ＰＥ）結合ｍＡｂと細胞とを、４℃で４５分間、凝集したヒトＩｇＧ存在下で反応させた。分析に先だって細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。蛍光強度は、ＦＡＣＳＣＡＮ細胞蛍光グラフ（ベクトン・ディッキンソン社、Mountainview，ＣＡ）で測定した。Ｂ細胞とジャーカットクローンとの共培養を伴う実験において、ジャーカット細胞は、前方および側方の低い光散乱をもつ細胞の異なったポピュレーション上にゲートを設けることによって、Ｂ細胞の蛍光分析から除去された。
【０１７５】
リンホカイン：ｒＩＬ−４はRobert Coffman博士から贈られ、ＤＮＡＸとｒＩＬ−２はホフマン・ラ・ロッシュ社から得た。
【０１７６】
細胞群の単離：抹消血液リンパ球は、健康なボランティアから採った新鮮な血液から、ficoll-hypaque（シグマ社、セントルイス，ＭＯ）上の遠心分離によって得た。脾臓Ｂ細胞も同様に、臓器提供者の新鮮なバイオプシー標本（コロンビア大学外科の Mark Barr博士から提供された）から得た。扁桃腺Ｂ細胞は、扁桃削除術後の新鮮な手術標本（コロンビア大学ＥＮＴ課の Joseph Hadad 博士から提供された）から得た。リンパ系組織Ｂ細胞は、細かく砕いた組織標本をメタルスクリーンを通し、続いて ficoll-hypaque 遠心分離をすることによって得た。
【０１７７】
Ｔ細胞は、ノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球とで陽性が選択された。Ｂ細胞は、ノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球で２回ローゼッティング(rosetting)した後に、ficoll-hypaqueで沈殿しなかった細胞群から得た。
【０１７８】
Ｂ細胞は密度遠心法によってさらに精製された。Ｅー細胞は一晩ポリスチレンフラスコのなかで培養され（３７℃、５％ＣＯ２）、接着によってマクロファージが除去された。これらの非Ｔ細胞、非マクロファージは、２３００ｒｐｍでの１２分間の遠心分離により、３０％／５０％／１００％パーコール(percoll)非連続勾配中の、高密度フラクションおよび低密度フラクションに分別された。高密度細胞は５０％と１００％の界面から得られ、低密度細胞は３０％と５０％の界面から得られた（Crow, et al., 1985）。抹消血液からの高密度（休止）細胞は、典型的には６０−９０％がＣＤ２０+であり、５５−９０％がＩｇＭ+、ＣＤ３+が５％未満、ＣＤ２３+が５％未満（バックグラウンド）であった。扁桃腺と脾臓からの高密度Ｂ細胞は、９５％以上がＣＤ２０+であった。
【０１７９】
Ｌ細胞の培養実験：ヒトＦｃＲｇＩＩ（ＣＤ３２）またはマウスＩａを表示しているＬ細胞が、１２ウェルプレート（Costar,Cambridge，ＭＡ）内のＤＭＥＭ・１０％ＦＣＳ中において、集密になるまで増殖された。この単層を培地で一回洗浄し、２×１０６のＢ細胞を含む１ｍＬのＩＭＤＭ・１０％ＦＣＳをこの単層に加え、対でコントロール培地、或いは２mgのＧ２８−５・ｍＡｂ、Ｂ−Ｂ２０・ｍＡｂ若しくはコントロールｍＡｂを加えた。１８時間の培養後、温和に撹拌しながらピペットでＢ細胞を回収し、一度洗浄して、上記のようにしてＦＡＣＳでＣＤ２３の発現を分析した。
【０１８０】
Ｂ細胞の活性化と分化のアッセイ：Ｂ細胞表面のＣＤ２３発現の誘起を測定する実験では、１−２×１０5の高密度Ｂ細胞か又はＲＡＭＯＳ・２６６細胞が、２００mL ＩＭＤＭ・１０％ＦＣＳ中の同数のジャーカット細胞（丸底マイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ）内）に添加され、１８−２４時間後にＣＤ２３の発現が分析された。
【０１８１】
ヒト組織標本：バイオプシー標本を通常の診断過程か検死で集め、すぐ研究室に運んだ。それぞれの組織標本の代表的な一部を、最適切断温度（OCT compound,Miles,Elkhart，ＩＤ）でイソペンタンとドライアイス混合物の中の丸いコルクのディスク上で急速冷凍し、−７０℃で種々の期間保存した。夫々の標本の代表部分をホルマリン緩衝液、Ｂ５またはブーアン液中で常法により固定し、パラフィンに埋め込み、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された切片を調製した。
【０１８２】
多数の良性の組織検体の代表的な一部は、任意の患者から日常の治療の間に集められ、免疫組織化学的にｍＡｂ・５ｃ８の結合が検査された。これら検体には以下のものが含まれる：食道２、胃２、小腸３、結腸６、膵臓２、肝臓３、腎臓３、子宮３、卵巣２、精巣２、前立腺１、肺４、心臓２、皮膚３、胸２、脳２、扁桃腺１４、胸腺７、リンパ節４、脾臓１０、虫垂５。
【０１８３】
免疫組織化学的染色：一連の４ミクロンの冷凍切片が、低温保存した組織ブロックから切り出され、以前に詳細に記述されたようにして（Inghirami, et al., 1990）、固定、染色された。概略を説明すれば次の通りである。切片を、適切に滴定されたｍＡｂと共に、またＦ（ａｂ'）２  ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃガンマ特異的、１：200 ，Organon Teknika,Malvern,ＰＡ）及びアルカリ性ホスファターゼ・抗アルカリホスファターゼ複合体（APAAP,Dako,Santa Barbara，ＣＡ）と共に連続的に培養した。次いで、基質として New Fuschin及びＢ−ナフトール−ＡＳ−ビホスフェートで現像した。或いは、一次ｍＡｂ又はイソタイプ適合性の非関連ｍＡｂの何れかと共に切片をインキュベートし、３回洗浄し、ビオチニル化されたウマ・抗マウスＩｇＧ（Vector,San Diego，ＣＡ）と共にインキュベートした。パーオキシダーゼを結合したアビジン−ビオチン複合体を適用し、ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）で現像し、場合によっては塩化ニッケルで増幅した。クライオスタット組織切片に対し、先に既述されたようにして（Inghirami, et al., 1991）、二色免疫組織化学的染色もまた実施された。簡単に説明すると、先ず、ＡＢＣ技術（Ｖｅｃｔｏｒ）を用いて、切片を一つのｍＡｂ（ｍＡｂ・５ｃ８、又はイソタイプ適合性の非関連ｍＡｂ（UPC-10、IgG2a）で染色し、ＤＡＢで現像した。次いで、切片をｍＡｂ（Leu M5，ＣＤ１１ｃ）か、又はイソタイプ適合性の非関連ｍＡｂと共にインキュベートし、３回洗浄し、ＡＰＡＡＰ複合体と共にインキュベートした後、前述したようにして現像した。
【０１８４】
結果
Ｄ１．１による誘発に反応するＢリンパ腫細胞系の同定：
我々は以前、５ｃ８・Ａｇ（Ｔ−ＢＡＭ）が、活性化したＣＤ４+Ｔ細胞の表面上のタンパクであり、接触依存性ヘルパー機能に関与していることを示した（Lederman, et al., 1992）。この過程をより詳細に調べるために、Ｔ−ＢＡＭや他の分子の役割の分子分析を可能とする、均質なクローン化されたリンパ腫細胞系の同定を研究した。この目的のために、我々はＴ−ＢＡＭ発現リンパ腫細胞系Ｄ１．１を利用して、ＣＤ２３の上方調節によりＤ１．１接触に反応するＢ細胞リンパ腫を同定した。候補細胞系はＲＡＭＯＳ・２６６クローンであり、これはＣＤ２３をあまり発現しないが、ＩＬ−４に誘起されると多く発現する（Siegel, et al., 1990）。
【０１８５】
ＲＡＭＯＳ・２６６が、Ｄ１．１細胞に媒介された接触に反応するかどうかを知るために、ＲＡＭＯＳ・２６６細胞をＤ１．１細胞と共にインキュベートして、ＲＡＭＯＳ・２６６の細胞表面に発現したＣＤ２３を２色ＦＡＣＳ分析によって測定した（図１２）。これらの実験において、陽性コントロールとして末梢Ｂ細胞をＤ１．１と共にインキュベートしたが、これは、Ｂ細胞がＤ１．１接触に反応して表面のＣＤ２３を増加することが知られているからである（図１２）。陰性コントロールとして、ＲＡＭＯＳ・２６６又は末梢Ｂ細胞を、Ｔ−ＢＡＭを発現せずＢ細胞を活性化しないジャーカットのＢ２．７クローンと共にインキュベート（Lederman, et al., 1992）。予想どおり、１８時間のインキュベーション後に、ジャーカットＤ１．１は末梢Ｂ細胞に表面ＣＤ２３分子の発現を誘起したが、ジャーカットＢ２．７は誘起しなかった（図１２）。重要なことに、末梢Ｂ細胞に対するこの効果と同じように、Ｄ１．１細胞はＲＡＭＯＳ・２６６に対して、１８時間の共培養の後にＣＤ２３の発現を誘起したが、Ｂ２．７は誘起しなかった（図１２）。ＲＡＭＯＳ・２６６と末梢Ｂ細胞との明白な反応の違いは、ＲＡＭＯＳ・２６６は全てのポピュレーションがＣＤ２３を均質なピークに上方調節したが、末梢Ｂ細胞は典型的に、明瞭に反応した細胞ポピュレーション（８０％がＣＤ２３を発現した）と、全く反応しなかった細胞ポピュレーション（２０％がＣＤ２３を発現しなかった）とにわかれたことである。この相違のために、ＲＡＭＯＳ・２６６の反応を、ＣＤ２３発現の単一のピークをもった中間の蛍光強度（ＭＦＩ）として定量し、また末梢Ｂ細胞の反応を、反応細胞の比率として定量することが必要となった（図１２）。異なる量のＤ１．１細胞を一定量のＲＡＭＯＳ・２６６またはＢ細胞に加えた分量反応実験(dose response experiments)によって、これらの方法が正しいことがわかる。何故なら、Ｄ１．１細胞の数が減少すると、ＲＡＭＯＳ・２６６のＭＦＩも減少し（示していない）、ＣＤ２３＋Ｂ細胞の割合も減少するからである（Yellin, et al., 1991）。これらのデータは、ＲＡＭＯＳ・２６６が末梢Ｂ細胞の反応と同じ様に、Ｄ１．１との共培養に反応することを示している。
【０１８６】
ＲＡＭＯＳに対するＤ１．１の効果がＴ−ＢＡＭ依存性であるかを調べるために、Ｄ１．１に媒介性された活性化に対する抗Ｔ−ＢＡＭ・ｍＡｂ・５ｃ８の効果を研究した。これらの実験では、ｍＡｂ・５ｃ８またはイソタイプのコントロールｍＡｂを、Ｄ１．１が入っているＲＡＭＯＳ・２６６または末梢Ｂ細胞の培養倍に加えた（図１２）。末梢Ｂ細胞のＤ１．１による活性化を阻害するｍＡｂ・５ｃ８の公知の効果と同様に、ｍＡｂ・５ｃ８は、ＲＡＭＯＳ・２６６のＤ１．１による活性化を阻害する（図１２）。対照的に、イソタイプのコントロールｍＡｂは、Ｄ１．１の効果を阻害しなかった。以上を総合すると、これらのデータは、Ｂリンパ腫細胞系（ＲＡＭＯＳ・２６６）が、Ｄ１．１で活性化された後にＣＤ２３を発現する細胞機構を有しており、またＤ１．１とＲＡＭＯＳ・２６６との相互作用がｍＡｂ・５ｃ８によって阻害されることを示している。これらのデータは更に、Ｄ１．１とＲＡＭＯＳ・２６６との相互作用が、同質のリンパ腫細胞系における接触依存性Ｔ−Ｂ信号をさらに詳しく調べるための有力なモデル系になり得ることを示している。
【０１８７】
この研究における我々の最終的な興味は、リンパ系Ｂ細胞の分化におけるＴ−ＢＡＭの役割を定義することであったので、次に、リンパ系器官から単離したＢ細胞に対するＤ１．１の効果を研究した。従って、前述したのと同じような実験において、ｍＡｂ・５ｃ８及びコントロール抗体の存在下および非存在下で、リンパ系器官から単離したＢ細胞をＤ１．１と共に培養した。末梢Ｂ細胞およびリンパ腫クローン（ＲＡＭＯＳ・２６６）に対するＤ１．１の効果と同様に、扁桃腺由来のＢ細胞（図１３）も脾臓由来のＢ細胞（示していない）も、Ｄ１．１細胞によって活性化されてＣＤ２３分子を発現することが分かった。さらに、Ｄ１．１細胞のリンパ腫Ｂ細胞に対する効果は、ｍＡｂ・５ｃ８によって阻害されるが、コントロールｍＡｂによっては阻害されない（図１３）。これらのデータは、Ｄ１．１細胞とＲＡＭＯＳ・２６６の分子的相互作用が、リンパ系器官内のＴ細胞とＢ細胞の相互作用に類似していることを示している。
【０１８８】
Ｂ細胞に対するＤ１．１の増強効果は、分泌因子とは関係ないことが以前に示された。Ｄ１．１細胞がどのようにしてＲＡＭＯＳ・２６６を活性化するのかを調べるために、次の一連の実験では、リンホカインの放出（特にＩＬ−４の役割）に関連した、ＲＡＭＯＳに対するＤ１．１の効果を研究した。これらの実験において、ＲＡＭＯＳ・２６６はＤ１．１の上清液、Ｄ１．１細胞、ｒＩＬ−２またはＩＬ−４のいずれかと共に培養され、１８時間後に表面ＣＤ２３の発現のレベルをＦＡＣＳで測定した。図１４ａに示したように、Ｄ１．１細胞またはＩＬ−４は、ＲＡＭＯＳ・２６６と末梢Ｂ細胞上にＣＤ２３を誘起した。対照的に、Ｄ１．１上清液またはｒＩＬ−２は効果がなかった（図１４ａ）。更に、ｒＩＬ−４の効果は抗ＩＬ−４によって阻害されたが、Ｄ１．１の効果は阻害されなかった（図１４ａ）。最後に、ｍＡｂ・５ｃ８は、ｒＩＬ−４の効果を阻害しなかった（図１４ａ）。以上を総合すると、これらのデータによって、Ｄ１．１のＲＡＭＯＳ・２６６に対する効果はリンホカインの放出と関係ないことが示唆され、Ｄ１．１は活性ＩＬ−４を分泌しないという以前の見解が確認された（図１４ａ）。
【０１８９】
Ｔ−ＢＡＭの誘発に関連するＢ細胞の表面分子の同定：
接触依存性Ｔ−Ｂ相互作用に役割を果しているＢ細胞表面分子を同定するために、Ｄ１．１−ＲＡＭＯＳ・２６６系を活用した。我々は、特徴のあるＢ細胞表面分子のうちで、ＣＤ４０、ＣＲ２および接着受容体が接触依存性信号に役割を果たしている候補物質であると考えた。その理由は、これらがＢ細胞活性化（特に接触依存性相互作用）において役割を果していることが知られているからである（Banchereau, et al., 1991a；Nemerow, et al., 1985；Carter, et al., 1988；Tohma, et al., 1991a；Tohma, et al., 1991b；Emilie, et al., 1988；Sen, et al., 1992）。それゆえ、我々は、Ｄ１．１に媒介されたＲＡＭＯＳ・２６６および末梢Ｂ細胞の活性化に対する、これらのＢ細胞分子に向けられたｍＡｂの効果について研究した。これらの実験において、Ｄ１．１細胞は、Ｂ細胞表面分子と反応するｍＡｂの存在下において、ＲＡＭＯＳ・２６６または末梢Ｂ細胞と共に培養され、１８時間後にＲＡＭＯＳ・２６６またはＢ細胞のＣＤ２３の発現を測定した。これらの実験における陽性コントロースとして、ｍＡｂ・５ｃ８が用いられた（図１２）。重要なことに、抗ＣＤ４０・ｍＡｂであるＧ２８−５（Clark, et al., 1986）は、Ｄ１．１に媒介されるＲＡＭＯＳ・２６６またはＢ細胞の活性化を阻害した（図１２、１４ｂ）が、ＣＲ２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１に対するｍＡｂはほとんど効果がなかった（図１２、１４ｂ）。Ｇ２８−５（ＩｇＧ１）に加えて、抗ＣＤ４０・ｍＡｂであるＢ−Ｂ２０（ＩｇＧ１）もまた、Ｄ１．１効果を阻害した（図１５）。これらの実験では、Ｂ細胞およびＲＡＭＯＳ・２６６の両方の表面と反応する抗ＬＦＡ１ａ・ｍＡｂであるＴＳ１／２２（ＩｇＧ１）を、イソタイプ適合性の陰性コントロールとして使用した（図１４ｂ，１５）。同様の実験において、我々は、抗ＣＤ４０がリンパ系器官から単離したＢ細胞に対するＤ１．１の効果を阻害することを発見した（図１３）。以上を総合すると、これらのデータは、Ｄ１．１に媒介されるＢ細胞ＣＤ２３の上方調節を阻害するという点において、抗ＣＤ４０・ｍＡｂが調査した抗Ｂ細胞抗体のうちで特にユニークであることを示している。
【０１９０】
抗ＣＤ４０・ｍＡｂは、ｒＩＬ−４に誘起されたＢ細胞のＣＤ２３発現を増大することが知られている（Clark, et al.1989）ので、抗ＣＤ４０・ｍＡｂがＣＤ２３の発現を阻害するというのは幾分驚きである。従って、この結果を再び検討することによって、Ｇ２８−５がＤ１．１に誘起されるＣＤ２３の発現を阻害する効果をもつのとは対照的に、Ｇ２８−５は、ｒＩＬ−４に誘起されるＢ細胞およびＲＡＭＯＳ・２６６の指示クローンの両方に対して、ＣＤ２３の上方調節を強化することが分かった（図１４ａ）。以上のデータを総合すると、抗ＣＤ４０・ｍＡｂはＢ細胞に対するＤ１．１の効果を阻害するが、これらのｍＡｂのＢ細胞に対する効果は、活性化の全般的な阻害ではないことが示される。何故なら、抗ＣＤ４０はｒＩＬ−４効果を増大するからである。
【０１９１】
抗ＣＤ４０が如何にして接触介助相互作用を阻害し、他のＢ細胞活性化信号を増大するかは、現在のところ分かっていない。一つの可能性は、Ｄ１．１がＣＤ４０と相互作用する表面分子を発現することである。我々は、Ｄ１．１の表面分子がＣＤ４０と相互作用してＢ細胞を刺激するならば、多量体の立体配置(multimeric configuration)の抗ＣＤ４０抗体はＤ１．１の効果に似ているだろうし、またＢ細胞のＣＤ２３を上方調節するだろうと推測した。従って、ＦｃｇＲＩＩを発現しているＬ細胞の存在下において、ＲＡＭＯＳ・２６６とＢ細胞ＣＤ２３に対するＧ２８−５の効果を研究した。なお、ＦｃｇＲＩＩ発現Ｌ細胞は、末梢Ｂ細胞の増殖を誘起する立体配置になっている（Banchereau, et al., 1991a）。従って我々は、Ｂ細胞を、Ｇ２８−５、Ｂ−Ｂ２０またはコントロールｍＡｂの存在下において、ＦｃｇＲＩＩ発現Ｌ細胞またはコントロールＬ細胞と共に培養し、１８時間後にＢ細胞のＣＤ２３発現を調べた。多価の抗ＣＤ４０は、扁桃腺および脾臓のＢ細胞（図１６ｂ）と同様に、末梢Ｂ細胞およびＲＡＭＯＳ（図１６ａ）のＣＤ２３発現を誘起したが、単価のものは誘起しなかった。以上を総合すると、これらのデータは、多量体の抗ＣＤ４０・ｍＡｂがＢ細胞を活性化してＣＤ２３を発現することを示している。また、Ｄ１．１系における抗ＣＤ４０・ｍＡｂの阻害効果は、単価の抗ＣＤ４０・ｍＡｂが、Ｄ１．１の表面の架橋リガンドとＣＤ４０分子との相互作用を阻害した結果であろうことを示唆する。
【０１９２】
Ｔ−Ｂ相互作用に含まれるリンパ系組織の領域における、Ｔ−ＢＡＭの発現：
ＣＤ４+Ｔ細胞は、卵胞や胚中心と呼ばれるリンパ系組織内において、一時的に抗原が誘起された構造でヘルパー機能を媒介するので、リンパ瀘胞内でＴ細胞上にＴ−ＢＡＭが発現しているかを調べるために、Ｔ−ＢＡＭの組織分布が免疫組織化学によって研究された。正常なヒト組織から調製された凍結組織切片をアセトンで固定し、ｍＡｂ・５ｃ８および種々のコントロールｍＡｂを用いて免疫組織化学的に染色した。Ｔ−ＢＡＭの発現は、リンパ組織内の比較的小さい単核細胞に限定されており（図１６）、筋肉、脳、腎臓、腸、卵巣、子宮、睾丸、皮膚、肺、または肝臓を含む他の組織には見られなかった（材料と方法の項を参照のこと）。
【０１９３】
リンパ系組織におけるＴ−ＢＡＭをもった細胞の正確な位置を知るために、扁桃腺、リンパ節、ＧＩ関連リンパ系組織、脾臓および胸腺を分析した。Ｔ−ＢＡＭ発現細胞は、全ての末梢リンパ組織の二次瀘胞の外套ゾーンと胚中心明領域に優先的に局在化しており、その局在パターンはこれらの部位におけるＣＤ４+Ｔリンパ球の分布と非常に類似している（図１７）。扁桃腺においては、ｍＡｂ・５ｃ８及び抗ＣＤ４または抗ＣＤ８の何れかを用いた２色免疫組織化学分析によって、Ｔ−ＢＡＭ発現がＣＤ３＋ＣＤ４+Ｔリンパ球に限られおり、ＣＤ8+Ｔ細胞には見られないことが示された（図示せず）。更に、二重染色によって、二次瀘胞内のＣＤ４+Ｔリンパ球の大部分（５０％以上）はＴ−ＢＡＭを発現していることが示唆された。
【０１９４】
インビトロのデータは、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０の両方が接触依存性相互作用に関係していることを示しているので、我々は、Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０発現細胞とのインビボでの関係を研究することに興味を持った。単色および二色免疫組織化学分析において抗ＣＤ４０・ｍＡｂを用いることにより、Ｂ細胞と瀘胞樹状細胞がＣＤ４０を強く発現するとの公知の所見が確認された（Clark., et al., 1986；Hart, et al., 1988）（データは省略する）。Ｔ−ＢＡＭ発現Ｔ細胞は多くのＣＤ４０＋Ｂ細胞に囲まれているので、我々は、Ｔ−ＢＡＭ発現Ｔ細胞と瀘胞樹状細胞との関係を測定することができなかった（Ｂ細胞濃度が高いからである）。瀘胞胚中心内のＴ−ＢＡＭ発現細胞と樹状細胞との関係を正確に決定するために、ｍＡｂ・５ｃ８および瀘胞樹状細胞を認識することが知られている抗ＣＤ１１ｃ・ｍＡｂを使って、二色免疫組織化学分析をおこなった。この方法を使用することにより、Ｔ−ＢＡＭ細胞は屡々、瀘胞樹状細胞および／またはその細胞質突起の近くに存在するか、またはこれらに直接接していることが示された。これは多分、Ｔ−ＢＡＭ発現Ｔ細胞はＣＤ４０＋Ｂ細胞との相互作用に加えて、ＣＤ４０を発現している瀘胞樹状細胞と相互作用しているであろうことを示している（データは省略する）。
【０１９５】
Ｔ−ＢＡＭ発現細胞が瀘胞内において明瞭に局在していたことに加えて、比較的少ない（１％未満）Ｔ−ＢＡＭ発現細胞が、末梢リンパ組織の瀘胞間領域、脾臓のＴ細胞部位および正常な胸腺皮質においても同定され得た。胸腺においては、ＣＤ４発現細胞が多く存在するのに、Ｔ−ＢＡＭ発現Ｔ細胞がほとんど無いことは興味深い。以上を総合すると、インビトロの機能的データ、並びにＴ−ＢＡＭ保有細胞がＴ−Ｂ相互作用に関連した生理学的な解剖学的部位に局在することは、Ｔ−ＢＡＭがインビボでのＴ細胞補助において重要であるという考えを強く支持している。
【０１９６】
考察
特異的な抗体反応をもたらすＴ細胞とＢ細胞との間の相互作用は、Ｔヘルパー機能のエフェクター相における重要な接触依存性相互作用を含んでいる。最近になって、ＣＤ４+Ｔ細胞に限定された表面活性化タンパク質、即ちＴ−ＢＡＭはＢ細胞への接触依存性ヘルパー信号の構成物であることが示された（Lederman, et al., 1992）。Ｔ−Ｂ接触依存性信号を媒介する分子的相互作用は、Ｔ−ＢＡＭ発現細胞系（Ｄ１．１）およびＴ−ＢＡＭに媒介されるＢ細胞活性化を阻害する抗Ｔ−ＢＡＭ・ｍＡｂ（５ｃ８）を用いることによって、更に研究された（Lederman, et al, 1992）。この第二シリーズの実験においては次のことが示された。即ち、１）末梢血液からのＢ細胞に加えて、リンパ系のＢ細胞およびＢリンパ腫クローン（ＲＡＭＯＳ・２６６）が、抗Ｔ−ＢＡＭ（ｍＡｂ・５ｃ８）に阻害されるような態様で、Ｄ１．１細胞接触に対して反応すること；２）ＣＤ４０は、Ｔ−ＢＡＭと共に、接触依存性Ｔ−Ｂ活性化の媒介に関係しているＢ細胞の表面構造であること；３）Ｔ−ＢＡＭは、主に、インビボのリンパ節の外套と細胞質の中心部分（これらはＴ細胞がＣＤ４０発現Ｂ細胞と相互作用する解剖学的な部位である）に多く存在するＴ細胞によって発現されることである。これらデータによって、Ｔ−ＢＡＭは、リンパ節Ｂ細胞の分化の過程でＴ細胞からＢ細胞に送られる関連信号であり得るとの考えを強く支持している。
【０１９７】
更に、Ｔ−ＢＡＭリガンドを発現していると思われるＲＡＭＯＳ・２６６が入手可能であることは、接触依存性ヘルパー信号に役割を果たしている他のＢ細胞表面構造の抗体、並びにＴ依存性Ｂ細胞分化を媒介する分子メッセンジャーを生化学的に特徴づける抗体を、作製およびスクリーニングする際に有用であろう。
【０１９８】
この研究においては、Ｄ１．１−ＲＡＭＯＳ・２６６系を使用することにより、接触依存性の補助におけるＢ細胞表面分子の役割が分析された。我々は、抗ＣＤ４０・ｍＡｂであるＧ２８−５およびＢ−２０が、何れも末梢血液とリンパ系器官から得られたＲＡＭＯＳ・２６６およびＢ細胞に対するＤ１．１細胞の効果を阻害するのことを観察した。対照的に、ＣＲ２、ＬＦＡ１、ＬＦＡ３、ＩＣＡＭ−１に対するｍＡｂは、Ｂ細胞に対するＤ１．１の効果を阻害しなかった。これらのデータは、Ｔ−Ｂ細胞接触と同時に起こり且つこれと強く関連しているＴ細胞信号の受容における、ＣＤ４０の正確な役割を示している。しかしながら、我々の系は、Ｔ−Ｂ相互作用における、ＬＦＡ１及びＩＣＡＭ−１の正しい役割を示していない。ｍＡｂ・抗ＩＣＡＭ−１（ＲＲ１／１．１．１．）は、Ｄ１．１が媒介するＲＡＭＯＳ・２６６またはＢ細胞の活性化を阻害しないが、このｍＡｂは、活性Ｔ細胞を固定することによって部分的に接触依存性Ｂ細胞増殖を阻害することが知られている（Tohma, et al., 1991a）。我々が述べてきたＴ−ＢＡＭ、並びにＣＤ４０依存性相互作用は、その後に引き続いて起こるＬＦＡ１−ＩＣＡＭ相互作用に依存した相互作用を誘起し得ると推測したい。何故なら、抗ＣＤ４０が引き金となって、ＬＦＡ１−ＩＣＡＭ−１の相互作用に依存したＴ−Ｂ接着が刺激されることが知られているからである（Barett, et al., 1991）。
【０１９９】
Ｄ１．１の引き金に対する抗ＣＤ４０・ｍＡｂの阻害効果は、それらがｒＩＬ−４に誘起されるＣＤ２３の発現を強める効果を有することとは対照的である。これらのデータは、抗ＣＤ４０ｍＡｂによるＤ１．１効果の阻害が、Ｂ細胞の反応の一般的な阻害の結果ではないことを示している。加えて、抗ＣＤ４０・ｍＡｂであるＧ２８．５およびＢ−Ｂ２０は、ＦｃｒｇＩＩ＋のＬ細胞の表面上にクロスリンクした形で存在しているときに、ＲＡＭＯＳ・２６６並びに末梢およびリンパ節Ｂ細胞上のＣＤ２３発現を誘起した。以上を総合すると、これらの研究は、多価の抗ＣＤ４０がＤ１．１細胞の効果と同じ効果を有し得ることを示しており、またＣＤ４０のリガンドはＤ１．１の表面構造であり得るとの考えと一致している。
【０２００】
Ｄ１．１系におけるｍＡｂ・５ｃ８と抗ＣＤ４０・ｍＡｂの阻害効果は、インビボのリンパ節の中で、Ｔ細胞が送るＢ細胞の接触依存性信号に、Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０の両方が、役割を果たしていることを示唆している。生理学的なＴ−Ｂ相互作用におけるＴ−ＢＡＭの役割を調べるために、インビボでのＴ−ＢＡＭの発現を免疫組織化学的に研究した。リンパ系組織の中で、Ｔ−ＢＡＭ発現は、ＣＤ４+Ｔリンパ球に限られていた。これらのデータは、インビトロと同様にインビボでも、Ｔ−ＢＡＭ発現がＣＤ４+Ｔ細胞に限定されており、ＣＤ8+Ｔ細胞には発現しないことを示している。以上を総合すると、これらのデータは、ＣＤ４+Ｔ細胞ポピュレーション及びＣＤ8+Ｔ細胞ポピュレーションが、ＣＤ４及びＣＤ８の発現だけでなく、少なくとも一つの別の分子（Ｔ−ＢＡＭ）の発現に関しても異なっている別個のＴ細胞系であることを示唆している。また、ＣＤ４+細胞のＴ−ＢＡＭ発現がＣＤ４+細胞に限定されていることは、ヘルパー機能がＣＤ４+細胞に限定されることの分子根拠であることを示唆している。
【０２０１】
Ｔ−ＢＡＭは、ＣＤ４+Ｔ細胞に限定されていることに加えて、インビボのリンパ系器官において、その発現がＴ細胞に限られている点で、今までにわかっているヒト表面Ｔ細胞活性化分子の中でも独特であると思われる。ラットにおいては、インビトロでの活性化の後に、ＯＸ−４０という分子量５０キロダルトンのタンパク質だけがＣＤ４+Ｔ細胞によって発現されるが、報告された脾臓内でのＯＸ−４０の発現様式（Paterson, et al., 1987）は、我々が観察した外套と細胞中心部分でのＴ−ＢＡＭの発現とは異なっているように思える。しかし、これらの分子の関係（もし存在するとすれば）を理解するには、両者の種において、これらの構造の関連した相同性を同定することが必要になるだろう。以上を総合すると、インビトロの機能的データおよび免疫組織化学的分析は、Ｔ−ＢＡＭ発現ＣＤ４+Ｔ細胞が、リンパ節の胚中心で生じていることが分かっているヘルパー機能に関係していることを示唆している。
【０２０２】
この研究によって提供された新しいデータは、Ｔ細胞がリンパ瀘胞Ｂ細胞分化の過程で果たしている役割を解明するための助けとなるだろう（Liu, et al., 1992；Nossal, 1992 で再検討されている）。リンパ瀘胞において、抗原に刺激されたＢリンパ球は、胚中心のセントロブラスティック（暗）ゾーン（centroblastic (dark)zone）内で急激な細胞増殖と体細胞分裂をおこす。その後、セントロブラスティックＢ細胞は、セントロサイティック（明）ゾーンに入る。ここで、Ｂ細胞は、その抗原レセプターの親和性に基づいて、生きるべきか死ぬべき（アポプトーシス）かをＴ細胞によって選択される。次いで、肯定的に選択されたＢ細胞はＴ細胞に指令されて、記憶Ｂ細胞か又は抗体産生プラズマ細胞に分化される。抗体産生プラズマ細胞は、ある場合には更に、機能的に異なる免疫グロブリンのイソタイプを作るために遺伝子を再配列される。従って、Ｂ細胞の分化を指示する信号は完全には分からないが、リンパ節でのＢ細胞の分化において、Ｔ細胞は少なくとも３つの異なる決定に関与すると思われる。その３つとは、生きるか死ぬか；記憶系かプラズマ細胞系；および抗体のイソタイプの選択である。セントロサイティックゾーン内のＴ細胞がＴ−ＢＡＭを発現するとの観察は、一定のこれら決定に関して、Ｂ細胞の運命の決定においてＴ−ＢＡＭが役割を果たし得ることを示唆している。今後の研究は、リンパ節Ｂ細胞分化におけるこれらＴ細胞依存性の過程において、Ｔ−ＢＡＭが果たす具体的な役割に向けられるであろう。
【０２０３】
抗ＣＤ４０ｍＡｂが、Ｄ１．１細胞とのＴ細胞接触に媒介された周到な相互作用を阻害するという結果によって、同様なＣＤ４０依存性の相互作用が、既に報告されているもっと複雑な生理学的反応に対する抗ＣＤ４０の幾つかの効果の基礎であり得ることが示唆される。抗ＣＤ４０（Ｇ２８−５）は、培養された胚中心Ｂ細胞のプログラムされた細胞死（アポップトーシス）を強力に阻害する（Liu, et al., 1989）。更に、Ｇ２８−５は、溶解性のｒＣＤ２３及びＩＬ−１ａによってインビトロで誘起される、形質芽球およびスイッチされた胚中心Ｂ細胞の生成を阻害する（Liu, et al., 1991）。これらＣＤ４０に依存した現象におけるＴ細胞接触の役割は、現在のところわかっていないが、ここに提示したデータは、ＣＤ４０がＴ−Ｂ接触相互作用において特殊な役割を果たしており、またＣＤ４０リガンドを同定する手段およびＣＤ４０の信号機能をより正確に定義する手段を提供することを示している。
【０２０４】
これらの研究によって、Ｔ−Ｂの相互反応におけるＴ−ＢＡＭのＴ細胞に対する重要な役割、およびＣＤ４０のＢ細胞に対する重要な役割が同定されたから、これら分子の可能な関係について探求することが適切である。我々はこのデータを説明できる２つのモデルを提案する。Ｔ−ＢＡＭが直接ＣＤ４０と反応するという仮定は、全てのデータを説明する最も簡単なモデルである（図７、モデル＃１）。しかしながら、Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０との相互作用を示すはっきりした生化学的結合のデータがないので、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０が異なるリガンドと相互作用するという、他の可能性に目を向けることが大切である（図７、モデル＃２）。もし、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０が異なるリガンドと相互作用するとしたら、上記の機能的データは、ＣＤ４０−Ｘ相互作用およびＴ−ＢＡＭ−Ｙ相互作用の両方がＢ細胞ＣＤ２３誘起のために必要であるが、これで十分ではないことを示唆する。
【０２０５】
Ｔ−ＢＡＭの“カウンターレセプター”（“Ｘ”）とＣＤ４０のカウンターレセプター（“Ｙ”）とは夫々、Ｂ細胞とＴ細胞の表面分子であるらしいが（図７、モデル＃２．ａ）が、我々のデータによれば、ＣＤ４０はＢ細胞が分泌（自己分泌）する因子のレセプターである可能性を除外できない（図７、モデル２ｂ）。ＣＤ４０は、以前はサイトカインレセプターであると考えられたが、ＮＧＦレセプター（Stamenkovic, et al., 1989；Clark, 1990）との構造的同質性に基づけば、これがヘルパー機能に関与するＴ細胞表面タンパクのカウンターレセプターであるとの可能性は、ＦｃＲｇＩＩ＋のＬ細胞にクロスリンクした抗ＣＤ４０・ｍＡｂと、Ｄ１．１細胞の表面を活性化する性質とがよく似ているという事実と合致する。
【０２０６】
Ｂ細胞に加えて、瀘胞樹状細胞がＣＤ４０を発現しており、我々は、瀘胞樹状細胞ときわめて接近し且つ恐らくこれと関係していると思われる、Ｔ−ＢＡＭ発現Ｔ細胞を発見した。Ｔ細胞とＣＤ４０との相互作用は、Ｔ細胞の瀘胞樹状細胞との機能的な相互作用において重要かもしれない。なお、瀘胞樹状細胞はリンパ節での抗原のプロセッシングに役割を果たしていることが知られている（Gray, et al., 1988； Askonas, et al., 1972；Gray, et al., 1991）。更に、ＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ４０＋瀘胞樹状細胞との相互作用は、ＡＩＤＳにおける特別な病原性の重要性を有しているかもしれない。ＡＩＤＳにおいて、瀘胞樹状細胞はＨＩＶの貯蔵場所となっている（Spiegel, et al., 1992）。
【０２０７】
もし、モデル＃２が正しくて、Ｔ−ＢＡＭがＣＤ４０以外のリガンドと相互作用するならば、Ｔ−ＢＡＭはＣＤ４０を発現しない細胞に対して信号を与える役割を果たしているであろう。この点に関して、ＣＤ４+のＴ細胞は他のＴ細胞（ＣＤ４+及びＣＤ8+）と相互作用し、細胞毒性の誘導（Bennick, et al., 1978； Ashman, et al., 1979； Kast, et al., 1986； Zinkernagle, et al., 1978； Leist, et al., 1989）、並びに抑制（Thomas, et al., 1980；Thomas, et al., 1982）を媒介する。更に、ＣＤ４+Ｔ細胞はマクロファージと相互作用して、活性化信号を媒介する（Zimecki, et al., 1988；Zimecki et al., 1989；Weaer, et al., 1989；Wasik, et al., 1988；Fau, et al., 1990；Fau, et al., 1988）。将来の研究の重要なゴールは、Ｔ−ＢＡＭが他の細胞の活性化に関係しているか否か、或いは他の、おそらく関連のある分子がそういった役割を果たすか否かを決定することである。
【０２０８】
実験の第３シリーズ
モノクローナル抗体５ｃ８の前臨床実験；Ｔ−ＢＡＭに対して向けられたネズミモノクローナル抗体
実験の全体の目的は、炎症および腫瘍疾患の診断と治療に於ける新規モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の有用性を評価することである。これらの実験の中心は、最近産生され特徴付けられた５ｃ８と呼ばれるネズミｍＡｂで、活性化されたヒトＣＤ４+Ｔヘルパーリンパ球細胞上に存在する新規表面タンパク（Ｔ−ＢＡＭ）を認識する。
【０２０９】
重要なことに、ｍＡｂ ５ｃ８はＣＤ４+Ｔ細胞のエフェクター機能を阻止し、それはＢ細胞が特異的抗体を産生する先駆けとなる過程を含んでいる。健常人組織中では、Ｔ−ＢＡＭはリンパ組織中の胚中心と呼ばれる、一時的に抗原誘導される構造中に存在するＣＤ４+Ｔ細胞上で独占的に発現される。しかしながら、種々の感染症疾患由来組織での予備実験により、Ｔ−ＢＡＭは疾患組織に浸潤しているＣＤ４+Ｔリンパ球細胞によって発現されることが示されている。現在まで、Ｔ−ＢＡＭを発現しているＣＤ４+Ｔ細胞の浸潤は、リュウマチ様および変形性関節症に冒された関節組織中に、そして、乾せん、接触皮膚炎、および高ＩｇＥ症候群に冒された皮膚中で観察された。Ｔ−ＢＡＭはインビトロでＣＤ４+Ｔ細胞エフェクター機能の重要な役割を果たしていると思われるため、インビボでの感染部位でのＴ−ＢＡＭ発現ＣＤ４+Ｔ細胞の存在は、Ｔ−ＢＡＭがこれらの疾患の免疫性の病理発生に参画しているかもしれないということを示唆している。抗Ｔ−ＢＡＭ ｍＡｂ ５ｃ８を得たことにより、Ｔ−ＢＡＭを持っているＣＤ４+Ｔ細胞、あるいはＴ−ＢＡＭ分子それ自体がこれらの仮定で重要な役割を果たしているか否かということを尋ねる機会を与える。もしＴ−ＢＡＭ＋ＣＤ４+Ｔ細胞が特定の疾患で決定的な役割をすることが発見されるとすると、Ｔ−ＢＡＭ＋ＣＤ４+Ｔ細胞を溶解または中毒させるか、あるいは機能を阻止するためにｍＡｂ ５ｃ８を使用して、攻撃的で、病原性のＣＤ４+Ｔ細胞を特異的に標的とすることが可能かもしれない。さらに、Ｔ−ＢＡＭ分子の変異発現は多くのリンパ腫瘍で観察されており、ｍＡｂ ５ｃ８がリンパ腫瘍の診断および治療に適用される可能性を示唆している。まとめると、これらの観察は炎症疾患およびリンパ腫瘍の診断および治療におけるｍＡｂ ５ｃ８の有用性を示唆している。
【０２１０】
次に示す範囲が探究あるいは評価される：
１．炎症、自己免疫、アレルギーおよび腫瘍疾患の患者からの冒された組織中でのＴ−ＢＡＭ発現、およびＴ−ＢＡＭ発現は病気の範囲と関係しているか否かを決定すること。
【０２１１】
２．炎症、自己免疫あるいはアレルギー疾患を持つ個体からの細胞を使用するインビトロ系でのリンパ機能に対するｍＡｂ ５ｃ８の効果。
【０２１２】
３．最終的にそのような動物で安全性試験と薬物動態実験とを実施するために、ヒト以外の霊長類（ルサスマカクーrhesusmacaques）からのＴリンパ球機能に於けるｍＡｂ ５ｃ８の効果。
【０２１３】
４．炎症疾患および白血病／リンパ腫の臨床評価での診断様式としての５ｃ８ ｍＡｂの利用の可能性。
【０２１４】
理論的根拠：
ＣＤ４+Ｔリンパ球細胞は炎症反応において中心的な役割を果たしている、なぜならばＣＤ４+Ｔ細胞の活性化は体液性（抗体が関与した）免疫反応と細胞毒性（キラー）ＣＤ8+Ｔ細胞反応の両方の生成に対して必要とされるからである。この重要な役割にふさわしく、ＣＤ４+Ｔ細胞は正常な免疫反応および幾つかの突発性炎症疾患に於ける炎症反応の間、組織に最も早く浸潤している細胞である。
【０２１５】
組織中で炎症反応を支配することに加えて、ＣＤ４+Ｔ細胞は体液性の（抗体）関与した免疫反応の特異性およびエフェクター機能（アイソタイプＩＳＯＴＹＰＥ）の両方を支配する重要な役割（“ヘルパー機能”と呼ばれている）を果たしている。ヘルパー機能はＣＤ４+Ｔ細胞によって媒介され、それはリンパ組織に移行し、胚中心と呼ばれる一時的な構造の種を播き、抗原特異的（コグネイトＣＯＧＮＡＴＥ）Ｂ細胞が集まってくる。リュウマチ様関節炎および自己抗体産生によって特徴づけられた確定した他の自己免疫疾患（全身性の狼そう）において、ＣＤ４+Ｔ細胞は自己抗体の産生に病原性の役割を果たしている。アレルギーでは、ＣＤ４+Ｔ細胞はＩｇＥ抗体の産生に重要な役割を果たしており、従ってアレルギー状態の維持に重要な役割を果たしている。
【０２１６】
ＣＤ４+Ｔ細胞は単一に分布した抗原レセプターを持っており、Ｂ細胞およびマクロファージによって自己クラスIIＭＨＣ分子上で提示される外来性の消化された抗原を認識する。ＣＤ４+Ｔ細胞クローンは“活性化”と呼ばれる変換をする事によって、その様な認識に対応する特異的抗原／ＭＨＣクラスIIリガンドを認識し、それは幾つかの表面分子の新たな発現およびリンフォカインの分泌を含んでいる。
【０２１７】
最近開発されたｍＡｂ ５ｃ８と呼ばれるモノクローナル抗体は、新規な３０ｋＤａの構造（５ｃ８ ＡｇあるいはＴ−ＢＡＭと呼ばれる）が同定し、静止期ではなく活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞上で独占的に発現されるが、しかしＣＤ8+Ｔ細胞によっては発現されない（イェリン、ら、１９９１；リーダーマン、ら１９９１）。重要なことに、Ｔ−ＢＡＭと相互作用する性質によって、ｍＡｂ ５ｃ８は抗体を産生するＢ細胞を誘導するＣＤ４+Ｔ細胞の能力を阻止することである（リーダーマン、ら、１９９２）。それゆえに、インビボでＴ−ＢＡＭはインビボでリンパ節のマントルおよびセントロシティックゾーンに優先的に存在するＣＤ４+Ｔ細胞によって主に発現されて、その部位は生理的にＴ細胞がＢ細胞と相互作用する解剖学的部位である（リーダーマン、ら、１９９２ｂ）。５ｃ８ ＡｇはＣＤ４+Ｔ細胞上の表面構造の成分であり、Ｂリンパ球の接触依存性活性化を仲介するという発見により、５ｃ８ Ａｇを“Ｔ細胞−Ｂ細胞活性化分子”（Ｔ−ＢＡＭ）と改名することにした。Ｔ−ＢＡＭは活性化されているＣＤ４+Ｔ細胞によってのみ発現されるという事実により、ｍＡｂ ５ｃ８は炎症反応に関与するＣＤ４+Ｔ細胞に対して特異的かもしれないということが示唆された。
【０２１８】
従って、予備実験において、自己免疫および炎症疾患患者からの炎症組織中における５ｃ８ Ａｇの発現が調べられた。リュウマチ様関節炎ではＴ−ＢＡＭ発現ＣＤ４+Ｔ細胞はリュウマチ滑液性関節パンヌスに局在し、周辺の炎症組織中とこの状態を特徴付ける胚中心との両方に局在化されていた。炎症性関節炎の症例では、Ｔ−ＢＡＭ発現細胞は浸潤している炎症細胞中で明確に一成分となっている事が発見された。乾せん、アトピー性皮膚炎および高−ＩｇＥ症候群において、Ｔ−ＢＡＭ発現Ｔ細胞は真皮中に浸潤しているリンパ球中で顕著に存在した。炎症性疾患を持つ個体からの標本とは対称的に、Ｔ−ＢＡＭ発現細胞は正常組織では初期のリンパ小節の外側には存在しなかった。
【０２１９】
Ｔ−ＢＡＭ発現細胞は疾患組織に浸潤しており、そして正常組織では一時的に再生している解剖学的構造に存在するという発見により、ｍＡｂ ５ｃ８療法は治療に有用であるかもしれない、なぜならば１．）ｍＡｂ ５ｃ８は静止期の循環しているＴ細胞に影響を与えずに病原性のあるＴリンパ球を標的とするかもしれない、そして２．）５ｃ８を持つＴ細胞の枯渇はＴ−ＢＡＭ発現Ｔ細胞の持続的全身性の枯渇には至らないであろう、なぜなら細胞の活性化されたプールは循環している静止期のプールによって補充されるかもしれないからである。ｍＡｂ ５ｃ８療法が病原性のあるＣＤ４+Ｔ細胞を取り除くかあるいは免疫固定し、一時的に免疫抑制状態の結果をもたらす（胚中心Ｔ細胞の枯渇から）かもしれない可能性により、その様な治療は広範囲に使用されている、あるいは開発中の既存の免疫抑制剤を越えるほど重要な利益を持たらすかもしれない。
【０２２０】
自己免疫疾患、突発性炎症疾患、およびアレルギー患者治療に現在使用されている免疫抑制剤は、ＣＤ４+Ｔ細胞の機能を阻害する事によって一次的な治療効果を持つ。しかし、サイクロスポリンＡ（サンヂムン）、アザトプリン（イムラン）およびサイクロフォスファミド（サイトキサン）のような現存する療法は、ＣＤ４+Ｔ細胞機能を全体に渡って阻害し、その結果全身性の免疫抑制となる。従って、その様な薬剤の限界のため、我々自身を含む多くの研究室の目標は、特異的にＣＤ４+Ｔ細胞に作用する薬剤を開発することである。例えば、臨床試験はＣＤ４+Ｔ細胞の全身的な枯渇を媒介するＣＤ４分子に対して向けられたネズミモノクローナル抗体を使用してヨーロッパおよびＵ．Ｓ．で実施されている。症例の大部分は、ＣＤ４+Ｔ細胞の欠乏は一時的なものであるが、しかし、観察されている厄介な副作用は治療後に数か月、ＣＤ４+Ｔ細胞の枯渇が長く続く場合があることである。その様なＣＤ４+細胞枯渇の臨床作用は観察されていないけれども、ＣＤ４+Ｔ細胞の不在はＡＩＤＳに於ける主な病態生理学的出来事である。まとめると、これらの考察により、ｍＡｂ ５ｃ８、抗−Ｔ−ＢＡＭはすべてのリンパ球の活性化を阻害する治療剤（例えば免疫抑制剤）あるいはすべてのＣＤ４+Ｔ細胞の活性を阻害するｍＡｂｓ（例えば抗−ＣＤ４ｍＡｂｓ）あるいは活性化されたＴ細胞を標的とする薬剤（例えばＩＬ−２のような活性化分子）をこえて、浸潤するＣＤ４+Ｔ細胞に媒介された疾患において、重要な治療有利性を持つかもしれないということが示唆された。
【０２２１】
その様な全身性の免疫抑制とは対称的に、多くの努力が、特殊な民族の背景を持つ個体での特異的な病気に対して開発された特殊な免疫学的治療法に向けられている。特定のＭＨＣクラスIIハプロタイプはリュウマチ様関節炎およびインスリン依存型糖尿病に対する遺伝的感受性が授けられることが知られている。これらの発見により多くの研究者が、クラスIIＭＨＣ分子および／あるいはペプチド抗原の関与を研究することによって、これらの疾患に対する診断および治療の戦略を追求している。この様に比較的均質の条件下においてさえも、結局は個々の患者に対し独特な治療を工夫する必要があるかもしれない。さらに、一般的なＣＤ４+Ｔ細胞ーＭＨＣクラスII／抗原相互作用に起因すると推測される疾患とは対称的に、乾せん、全身性狼そう、炎症性変形関節炎の様な幾つかの重要な特発性炎症疾患は、まだＭＨＣクラスIIハプロタイプとの関連があまり明確ではないが、初期のＣＤ４+Ｔ細胞浸潤が重要な病原性の特徴であるという点で、ＲＡや糖尿病と共通している。抗−Ｔ−ＢＡＭ療法のようなＣＤ４+Ｔ細胞を標的とする治療戦略の追求に都合の良いことは、主として、炎症反応を調節するために適切なＭＨＣ分子あるいは抗原を同定することは必要ではないという事実のためである。さらに進んだ戦略は、ｍＡｂ ５ｃ８療法のように、疾患組織において活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞を主要に標的とする条件は、Ｔ細胞を除去あるいは機能調節する目的で選択するために各々の個々の免疫系の認識機能を利用しているかもしれない。これらの疑問を調べるために、次に示す実験を提案する：
方法：提案された研究目的は、広く種々にわたる免疫性疾患を持つ患者から外科あるいは針生検を行ない臨床的標本を得るという、研究者の能力に非常に依存している。Ｐ．Ｉ．はその様な標本を得るための理想的な立場にあり、事実、我々の予備的研究はこの能力を示している。Ｐ．Ｉ．は医学部のリュウマチ学部門のメンバーであり、そして研究者はプレスビテリアン病院にあるエドワードダニール関節炎診療所で自己免疫疾患を持つ患者に対し精力的に治療している。さらに、関節標本を我々に提供してくれる整形外科学部の何人かのメンバーと共同的な関係が進行中である。従って、Ｐ．Ｉ．は、自己免疫疾患および変型性関節炎を持つ個体からの末梢血液および関節組織から得たリンパ球のインビトロ機能に対し、ｍＡｂ ５ｃ８の評価を追求するのに適切な臨床標本を得るための良い立場に置かれている。さらに、アレスサンドラペルニス博士は、我々の研究チームの一員であり、かつアレルギーと免疫部門の精力的な臨床医でもある。ペルニス博士はアレルギー疾患を患う個体からの臨床標本を固定し、提供することで我々を援助してくれることになっている。さらに、我々はレオナルド  チェス博士の“人に於ける免疫学研究”研究許可審議機構の研究者であり、その様な個体からのリンパ球を得ることが許可されている。さらに関節症疾患に於ける我々の研究は、皮膚学部のジャネット  リストスキー博士と関係しており、最近、乾せんを研究する方法“乾せんおよび他の皮膚疾患に於ける皮膚のＴリンパ球分析”の認可を得た。
【０２２２】
１．疾患組織中のＴ−ＢＡＭ発現の特徴付け
炎症、自己免疫およびアレルギー状態でのＴ−ＢＡＭの役割をさらに分析するために、疾患組織の免疫組織学的分析が、病気の状態および進行が種々の段階にあるリュウマチおよび変型性関節炎および乾せんの追加症例患者におけるスナップ凍結組織標本上のＴ−ＢＡＭの局在を研究することが拡大されるだろう。さらに、これらの分析は、全身性狼そう、アレルギー性喘息、糖尿病性膵臓、炎症性腸疾患および臓器移植の患者に拡大されるだろう。これらの分析は、Ｔ−ＢＡＭ、ＣＤ４および様々な他のリンパ球表面分子のような特殊な表面構造の発現パターンが、病気および病気の状態と互いに関係があるかどうかを試みるだろう。
【０２２３】
２．炎症、自己免疫およびアレルギー疾患を持つ個体からの細胞を使用したリンパ球のインビトロ系に於けるｍＡｂ ５ｃ８の作用の評価
炎症疾患患者のＴ−ＢＡＭ＋ＣＤ４+Ｔ細胞浸潤組織が、これらの疾患において重要な病態生理学的出来事を仲介する役割を果たしているか否かは現在のところ明らかではない。特定の疾患はインビトロで研究できる病理学的免疫学的活性を持っている。それゆえに、リュウマチ性関節炎、全身性狼そう、アレルギー性喘息のようなアレルギー状態を持つ個体からの末梢血液および炎症組織のリンパ球が単離されるだろう。インビトロ実験においては、リュウマチ性関節炎のリュウマチ性因子（ＩｇＭ抗−ＩｇＧ）、全身性狼そうの抗−ＤＮＡ抗体産生、あるいはアレルギーでのＩｇＥ産生をｍＡｂ ５ｃ８が阻害するか否かを提案するだろう。これらの実験において、末梢血液あるいは損傷を受けた組織からのＴおよびＢ細胞が単離されて、成長因子の存在下および５ｃ８あるいはコントロールｍＡｂｓの存在下で共培養されて、そして自己抗体あるいはＩｇＥの産生が特殊なＥＬＩＳＡによって測定されるだろう。
【０２２４】
３．その様な動物での、最終的に安全性および薬物動態試験を実施することを目的とする、ヒト以外の霊長類（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）からのＴリンパ球の機能に於けるｍＡｂ ５ｃ８の作用の評価
ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓリンパ球とｍＡｂ ５ｃ８の相互作用は研究されて（生殖生物学部のミッシェル  フェリン博士の方法にしたがって）そしてｍＡｂ ５ｃ８はＲｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓのＴ−ＢＡＭ相同部分と相互作用することが発見された。将来的な実験は、ｒｈｅｓｕｓはｍＡｂ ５ｃ８の投薬のインビボでの最終的な研究に対する適切な動物モデル可か否かを決定するために、ｍＡｂ ５ｃ８はｍａｃａｑｕｅｓからのＣＤ４+Ｔ細胞の機能を阻害するかどうかを提示することだろう（現在の計画には入っていない）ｒｈｅｓｕｓリンパ球の機能的研究とそれらの機能に於けるｍＡｂ ５ｃ８の作用は、ヒトリンパ球サブプピュレイションですでに実施した機能的研究と密接に並立的に位置するだろう。
【０２２５】
４．白血病／リンパ腫の臨床的評価に於ける診断様式としてのｍＡｂ ５ｃ８の潜在的な使用を評価する
病理学部のジオロジオ  インギラム博士及びダニエルノウレス博士との共同研究において、白血病／リンパ腫の１００の以上の症例でのＴ−ＢＡＭ発現が研究された。Ｔ細胞リンパ腫の約３０％がリンパ節の凍結切片中でＴ−ＢＡＭを発現する。末梢血液中の白血病Ｔ細胞はその様な症例においてＴ−ＢＡＭを発現するか否かは現在のところ知られていない。従って、Ｔ−ＢＡＭ発現が存在するか否か、および末梢Ｔ−ＢＡＭ発現はリンパ節Ｔ−ＢＡＭ発現とどの様な関係があるかを決定するために、白血病の症例の末梢血液を実験する予定である。これらの実験は白血病を持つ個体の評価において、ｍＡｂ ５ｃ８が有効な診断抗体であることを示すだろう。さらに、これらの研究はその様な腫瘍の治療においてｍＡｂ ５ｃ８による治療試験を正当化するかもしれない。
【０２２６】
将来の進展：
将来の研究は提案された予備的な前臨床探索の結果に異存するだろう。免疫組織学的研究の結果により、病気のあるセットに我々の注意を向けることになるだろう。インビトロ実験はその様な病気のあるサブセットにおいて臨床的な研究を正当化するだろう。結局、予備実験は臨床試験の正当な理由となるので、ヒト以外の霊長類での動物実験を実施するだろう、なぜならば、ｍＡｂ ５ｃ８はＲｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅの活性化されたＴ細胞上でＴ−ＢＡＭ相同部分と反応することが知られているからである（上記参照）。動物実験はＴ−ＢＡＭを発現している細胞は一時的に存在し、そしてＴ−ＢＡＭを発現している細胞は静止期のＴ細胞の循環プールから再配置されるだろうという仮説を試験すると共に、ｍＡｂ ５ｃ８の毒性および薬物動態様式を決定するために考案されるだろう。この疑問はｍＡｂ ５ｃ８処理の前後の正常動物のリンパ節針生検を免疫組織学によって研究することにより明確に試験されるだろう。最終的には、インビボで阻害されている免疫反応での５ｃ８の役割は、５ｃ８処理を行った場合と行わない場合で、および抗体の評価および実験動物の皮膚試験反応において、免疫された動物によって試験されるだろう。その様な実験を実施するために、別のＩＲＢ認可を得る必要があるだろう、なぜならば、我々の現在の方法中には提示されていないからである。しかしながら、その様な認可を得るためにはその様な研究に適した形態で５ｃ８を得ることが重要であろう、そしてその様な試薬を得るための費用は現在申し出ている予算の一部である。
【０２２７】
これらの研究は、ｍＡｂ ５ｃ８の現在の形が（ネズミＩｇＧ２ａ−ヒト補体結合）ＣＤ４+Ｔ細胞機能の期待された特殊な調節を得るためには最適ではないことを示しているかもしれない。このことに関しては、補体結合機能および／あるいは組織標的を決定する抗体のＦｃ領域を変化させるためにｍＡｂ ５ｃ８を遺伝的修飾することが必要となるかもしれない。これにより、抗体のＦｃ領域をヒトのＦｃ領域に入れ替えた形を得るか、あるいはヒト抗体に密接に類似した結合部分を持つ抗体に変化させることができる、この過程は基礎研究社がかなり経験を持っている“ヒューマニゼイション”と呼ばれる技術であり、ヒト抗体をＣＤ４分子のアミノ酸配列を含むものに劇的に変化させることも可能となっている（未発表）。抗体の機能的性質を正常抗体の異なるエフェクター機能を持つものに変化させることに加えて、ｍＡｂ ５ｃ８のＦｃ領域に対して毒を遺伝的に付着することが望ましいかもしれない、それは我々が現在交渉している幾つかの会社によって利用されている共通の方法である。
【０２２８】
動物実験の成功的な終了に続いて、ヒトでのｍＡｂ ５ｃ８の安全性および薬物動態の性質を決定するためにヒトの臨床第Ｉ相試験が行われるだろう。
【０２２９】
実験の第４シリーズ
Ｂ細胞に対する接触依存性ヘルパー機能を仲介するＣＤ４+Ｔ細胞上の表面糖タンパクＴ−ＢＡＭをコードするｃＤＮＡの単離：ＴＮＦアルファ遺伝子スーパーファミリーの新規メンバー
Ｔ−ＢＡＭは、Ｂ細胞分化および分泌に対する接触依存性シグナルを仲介する、ＣＤ４+Ｔ細胞上の活性化誘起表面タンパクである。Ｔ−ＢＡＭは、表面Ｔ−ＢＡＭを構成的に表現する機能的にユニークなジャーカット（Jurkat）サブクローンＤ１．１上にＴ−ＢＡＭを結合するｍＡｂ ５ｃ８によって同定された。このシリーズの実験において、Ｔ−ＢＡＭの構造が規定される。Ｔ−ＢＡＭタンパクをｍＡｂ ５ｃ８を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＤ１．１細胞溶解産物から精製した。単離したＴ−ＢＡＭタンパクのＮＨ2末端アミノ酸配列を自動マイクロ配列決定法により決定し、この配列を退化オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔ−ＢＡＭ．２）を設計するために用いた。アンチセンス配位において、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｔ−ＢＡＭを表現するＤ１．１細胞から単離された２ｋＢ ｍＲＮＡを認識したが、Ｔ−ＢＡＭを表現しない対照の非ヘルパージャーカット細胞Ｂ２．７から単離されたｍＲＮＡを認識しなかった。ＮＨ2末端配列は、関連機能のタイプIIネズミＴ細胞表面分子ＣＤ４０−Ｌのそれと関連していることが見い出された。Ｄ１．１ｍＲＮＡのＲＮＡ−ＰＣＲは、サイズおよび配列がネズミＣＤ−４０Ｌの対応する領域、すなわち分子の細胞質および膜の近位部分をコードする領域と相同であるＤＮＡの断片を増幅した。約３３０ｂｐであるこの断片をサブクローン化し、λｇｔ−１１におけるＤ１．１ｃＤＮＡライブラリーをプローブするために用いた。１．８−２．２ｋＢ挿入物を含有する９種のクローンを得た。
【０２３０】
クローンの配列分析は、ネズミＣＤ４０−Ｌと相同性を有するタイプII表面膜糖タンパク、すなわちＩｇＥ分泌を誘発させる活性化ネズミＴ細胞上の分子を解明した。これらタンパクの両方は、広範種の免疫学的および他の機能を有するサイトカインおよび細胞表面エフェクターを含むＴＮＦαスーパーファミリーのメンバーである。Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０−Ｌに加えて、少なくとも１つの他の関連分子の存在がＴ−ＢＡＭプローブを用いたヒトＤＮＡのサザン分析により示唆される。これらは機能的に別のものであるが、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０−Ｌは同族体である可能性がなお存在し、その場合、Ｔ−ＢＡＭに関係する２つの新規分子が存在することとなる。
【０２３１】
導入
接触依存性シグナルの解明の進展は、休止末梢Ｂ細胞を構成的に活性化するジャーカットＴ細胞白血病系Ｄ１．１の機能的にユニークなサブクローンの最近の同定（イェリン（Yellin）ら、１９９１）により達成された。Ｄ１．１クローンは、休止Ｂ細胞を誘起して表面ＣＤ２３分子を表現させ、Ｂ細胞を増殖させ、Ｂ細胞のＡｂ形成細胞への分化を誘起するものであることが以前に示された（イェリンら、１９９１）。パラホルムアルデヒド固定化Ｄ１．１はＢ細胞を活性化する能力を保持したが、Ｄ１．１上澄は不活性であったので、Ｄ１．１のＢ細胞活性化能は細胞表面に局在化された（イェリンら、１９９１）。併せてこれらデータは、Ｄ１．１が、接触依存性ヘルパー機能を仲介する活性化Ｔ細胞と表面構造を共有することを示唆した。
【０２３２】
前のシリーズの実験において、Ｔ−ＢＡＭ（５ｃ８ Ａｇ）と名付けたそのような１つの構造がＤ１．１と特異的に反応し、Ｄ１．１によるＢ細胞の機能的活性化を阻害するｍＡｂに対するハイブリドーマをスクリーニングすることによって同定された。ｍＡｂは、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞（ＣＤ8+Ｔ細胞、Ｂ細胞または単核細胞ではない）上に表現された新規３０ｋＤａ構造を同定した。ＰＨＡおよびＰＭＡ刺激後のＴ−ＢＡＭの細胞表面表現の動態は、最大の表現が６ｈ後に生じるが２４ｈによりベースライン（無）表現をもたらすダウンレギュレーションが続いて生じるという点で比較的ユニークである（レダーマン（Lederman）ら、１９９２）。機能アッセイにおいて、抗Ｔ−ＢＡＭ ｍＡｂ ５ｃ８は正常ＣＤ４+Ｔ細胞が抗体生成性細胞へのＢ細胞の分化を誘発する能力を阻害する（レダーマンら、１９９２）。加えて、Ｔ−ＢＡＭを表現するリンパ腫Ｔ細胞ジャーカットＤ１．１は、リンパ器官からのＢ細胞、およびＢ細胞リンパ腫クローンＲＡＭＯＳ２６６（シーゲル（Siegel）ら、１９９０）を、抗Ｔ−ＢＡＭ（ｍＡｂ ５ｃ８）によって阻害され、われわれが末梢Ｂ細胞について以前に記述した効果と同様である様態で活性化する。インビボで、Ｔ−ＢＡＭは、Ｔ細胞のＢ細胞との相互作用の解剖学的部位であるリンパ節の外套および中心細胞領域において主に、Ｔ細胞によって表現される（レダーマンら、１９９２）。併せてこれらデータは、Ｔ−ＢＡＭが接触依存性ヘルパー機能を仲介するＣＤ４+Ｔ細胞上の表面構造の一成分であることを立証している。
【０２３３】
Ｂ細胞に対するＴ−ＢＡＭ特異的効果は、ＣＤ４０に対しｍＡｂによってブロックされることが見い出され、それほど多くはない他のＢ細胞分子がリンパ組織における接触依存性シグナルを受け取る上で役割をなしていると考えられている。ヒトＢ細胞表面上のＣＤ４０分子はリンパ節Ｂ細胞分化に関連した興味のあるシグナル機能を有する（クラーク（Clark）ら、１９８６；クラークら、１９８８；レッドベター（Ledbetter）ら、１９８７；レッドベターら、１９８６）。抗ＣＤ４０（ｍＡｂＧ２８−５（クラークら、１９８６））はプログラムされた胚中心Ｂ細胞壊死（アポプトシス）を防止し（リュー（Liu）ら、１９８９）、またヒトＢ細胞の増殖、分化および長期成長を誘起することが示されている（バンチャロー（Banchereau）ら、１９９１ａ；バンチャローら、１９９１ｂ）からである。ＣＤ２３表現に対する抗ＣＤ４０の効果がｒＩＬ−４の最大下投与で相加的であることが見い出されたので、Ｔ−ＢＡＭ特異的ヘルプに対する抗ＣＤ４０ｍＡｂの効果は、Ｂ細胞の応答性の一般的な阻害からは生じなかった。加えて、ｍＡｂないしＣＤ４０は、形質移入ネズミ線維芽細胞の層上のＦｃ受容体上に存在したとき、Ｄ１．１の効果を模倣するようであった。併せてこれら知見は、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０が、おそらく受容体−反受容体（counter-anti-counter）関係で、相互に作用しあっているかもしれないという考えと一致した。
【０２３４】
続いて、ＣＤ４０分子に対するネズミリガンドは、キメラヒトＣＤ４０−Ｉｇ鎖分子を用いたネズミｃＤＮＡライブラリーの表現クローン化により同定されている。ＣＤ４０−ＬｃＤＮＡは、３３ｋＤａタイプ−II表面膜タンパクをコードする（アーミテージ（Armitage）ら、１９９２）。初めは新規遺伝子として報告されたが、われわれの研究室による後の分析（発表せず）および著者らによる後の分析（ファラー（Farrah）ら、１９９２）によりＣＤ４０−Ｌはｔｎｆαと関係していることが明らかにされた。ＣＤ４０−Ｌがｔｎｆαと相同であるという考えは、それらの受容体ｔｎｆαＲＩおよびＩＩがＣＤ４０に関連していれば、興味のあるものである。ＣＤ４０−ＬのＣＤ４０との結合相互作用は、Ｔ−ＢＡＭをＣＤ４０特異的シグナリングと結び付ける機能的証拠と考え併せると、Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０−Ｌとは関連する分子でありえることを示唆している。さらに、ＣＤ４０−ＬとＴ−ＢＡＭとの関連性は、Ｂ細胞トリガリングにおけるそれらの関連する機能と、それらの類似する見かけの分子量の双方により示唆される。しかしながら、ＣＤ４０−ＬのＴ−ＢＡＭとの正確な関係は、未知のままである。
【０２３５】
それ故、このシリーズの実験では、Ｔ−ＢＡＭの構造を調べ、ＰＣＲ断片と部分ｃＤＮＡを単離し、これらがＣＤ４０−Ｌとの有意の相同をもってタイプII表面膜タンパクをコードすることを見い出した（アーミテージら、１９９２）。機能的証拠はＴ−ＢＡＭとＣＤ４０−Ｌとは異なるものであることを示唆しているが、Ｔ−ＢＡＭがＣＤ４０−Ｌのヒト同族体であるという可能性がなお存在する。Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０−Ｌに加えて、このファミリーの少なくとも他の関連メンバーの存在は、Ｔ−ＢＡＭを用いたヒトゲノミックＤＮＡのサザンブロット分析により示唆される。Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０−Ｌが相同であることが見い出された場合は、サザンデータは、そのような形態の他の２つのメンバーが存在し得ることを示唆する。構造の情報は、Ｔ−ヘルパー機能のいくつかの分子的姿に光を当てるものであり、Ｔ細胞上の少なくとも２つの分子がＣＤ４０細胞を経由するシグナリングを含む相互作用において異なるＢ細胞応答を指向させるということを示唆している。
【０２３６】
材料および方法
細胞系。ジャーカットクローンＤ１．１およびＢ２．７は、記述されている（イェリンら、１９９１；レダーマンら、１９９２）。
【０２３７】
Ｔ−ＢＡＭペプチドの単離
精製Ｔ−ＢＡＭタンパクを得るために、ジャーカットＤ１．１細胞を、「細胞工場」（ＮＵＮＣ）と１０個のフラスコ（６００ｍＬフラスコ）の双方において、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（Hyclone））中のイスコブ（Iscove）の変性ダルベッコ培地（ギブコ（Gibco））において成長させた。これら培養は、併せて１４×１０9個の細胞を得た。細胞ペレットを氷冷分解緩衝液（１％ＮＰ４０、１３ｍＭトリス、１５ｍＭＮａＣｌ、１０μｇ／ｍＬフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬヨードアセトアミド（ＩＡＡ））１２５ｍＬ中で分解した。溶解産物を渦動処理に供し、回転シェーカーで１時間混合し、７０００ｒｐｍで２０分間遠心して不溶物をペレット化した。溶解産物の上澄を順次０．４５および０．２ｍフィルター（ナルジーン（Nalgene））を通してろ過した。ろ過した溶解産物（８０ｍＬ）を０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で１：１で希釈した後、アフィニティークロマトグラフィーに供した。
【０２３８】
アフィニティークロマトグラフィーによるＴ−ＢＡＭの精製
ｍＡｂ ５ｃ８およびＯＫＴ４をタンパクＧカラム（ファルマシア（Pharmacia））で精製した。各ｍＡｂ当たり０．１４２グラムのＣＮＢｒ活性化セフアロース４Ｂビーズ（ファルマシア、アップサラ、スウェーデン）とともに結合用緩衝液（０．２５Ｍ重炭酸塩緩衝液、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．７５）中でｍＡｂ（３．８８ｍｇ／２ｍＬの５ｃ８、および３．０ｍｇ／１．５ｍＬのＯＫＴ４）をインキュベートすることにより、精製されたｍＡｂはビーズに共有結合された。ｍＡｂ溶液を室温で３時間ビーズと反応させ、０．３Ｍトリス中ｐＨ８．０で３時間クエンチングした。ｍＡｂで被覆されたビーズを用いて短いカラム（シュライチャーおよびシュエル）中で０．５ｍＬゲルを作り、結合用重炭酸塩緩衝液および溶出緩衝液（アセテート緩衝液、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）で交互に洗浄した。
【０２３９】
Ｔ−ＢＡＭを精製するために、Ｄ１．１溶解産物を、５ｃ８カラムに通じる前に、ＯＫＴ４カラムに通じて予備精製した。溶解産物を両方のカラムに通じた後、ｍＡｂカラムを重炭酸塩緩衝液２００ｍＬで洗浄してから、０．１Ｍアセテート、ｐＨ４．０で溶出させ、１５ｍＬのポリプロピレン製のコニカルチューブ（サースタット、プリンストン、ＮＪ）中で０．５ｍＬずつの分画を得た。各分画中のタンパクを−２０゜のアセトン５ｍＬで一晩沈殿させた。ついで、沈殿物を３０００Ｇでの遠心により集め、空気乾燥した。
【０２４０】
Ｔ−ＢＡＭペプチドのＮＨ2末端配列決定
各カラム分画からのアセトンによる沈殿物を６０ｍＬのゲル充填用緩衝液中に再懸濁させ（バイオラッドの指示）、バイオラッド縦型電気泳動装置中の２０ｃｍ１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填し、約６時間１００Ｖに供した後、（バイオラッドトランスプロット装置においてＣＡＰＳ緩衝液中７０ボルトで９０分間プロブロット（Problott）ＰＶＤＦペーパー（アドバンスト・バイオシステムズ、シアトルＷＡ）へ移植した。移植は、予備染色したタンパク標準（低分子量および高分子量標準（バイオラッド、ロックビルセンター、ＮＹ））を用いて最適化した。
【０２４１】
移植後、タンパクバンドをコマジーブルー（comassieblue）Ｒ−４５０で染色し、膜を空気乾燥した。Ｔ−ＢＡＭの相対移動に対応する３１ＫＤバンド（ｐ３１Ｋ）を剃刀の刃で切除し、コロンビア大学ハワード・ヒューズ・メディカル・インスチチュート、プロテイン・コア・ファシリティのメアリー−アン・ガビノビッチ博士により、アプライド・バイオシステムズ４７０Ａ気相シーケンサー／１２０Ａ  ＰＴＨアナライザー上での２０サイクルの配列決定に供した。決定されたＮＨ2末端配列は、（Ｍ）ＩＥ（Ｔ）ＹＮＱ（Ｑ）ＳＰ（ＰＸＡＡＳ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）であった。
【０２４２】
ｃＤＮＡライブラリーの構成およびスクリーニング
Ｄ１．１ポリＡ+ＲＮＡをＦＡＳＴ−ＴＲＡＣＫ（インビトロゲン（Invitrogen））により単離し、ファルマシアのプロトコールによりストラテゲン（Strategene）（サンジエゴ、ＣＡ）からのλアームを用い、約４×１０6個の独立クローンを含有するオリゴ−ｄＴ感作λ−ｇｔ１１ライブラリーを生成した。
【０２４３】
増幅されたライブラリーから、約１×１０6個のプラークをスクリーニングし、８個の独立クローンを同定し、各プラークをＹＴ１０９０（インビトロゲン、サンジエゴ、ＣＡ）上での４回のクローン化により精製した。
【０２４４】
オリゴ合成
コロンビア大学ハワード・ヒューズ・メディカル・インスチチュート、プロテイン・コア・ファシリティによりアプライド・バイオシステムズＤＮＡシンセサイザーモデル３８０Ｂ上で以下のオリゴデオキシヌクレオチドが合成された。
【化１】
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【０２４５】
ＲＮＡポリメラーゼ連鎖反応
５×１０8個のＤ１．１細胞からポリ−Ａ+ＲＮＡを単離し、２００単位のモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ベセスダ・リサーチ・ラプズ（ＢＲＬ（商品名））を用い、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴおよび２０単位のＲＮＡｓｉｎ（ファルマシア（商品名））を含有する緩衝液２０ｍＬ中５ｐＭのプライマーＣＤ４０Ｌ（３６９−３４８）を含有する反応液において４２℃で３０分間にわたる約１．０μｇの全ＲＮＡの転写によりｃＤＮＡを調製した。反応混合物を５分間９５℃に熱して酵素を失活させた。
【０２４６】
第１の鎖を以下の条件下でＰＣＲにより増幅した：初めのテンプレート変性工程（９４℃で８分）、ついで、５５℃での３分間（アニーリング）、２．５単位のＤＮＡＴａｑ−ポリメラーゼ（パーキン−エルマーセタス、ニューウォーク、ＣＴ）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰおよびｄＧＴＰそれぞれ２００ｍＭ（パーキン−エルマーセタス、およびＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．００１％のゼラチン）１００ｍＬ最終容量中の５０ｐＭのプライマーＣＤ４０Ｌ（１１−３１）およびＣＤ４０Ｌ（３６９−３４８））を用いた７２℃での２分間（変性）の３０倍繰り返しサイクル。増幅後、試料を、１．０％寒天ゲル上での電気泳動により分析し、エチジウムプロミドで染色した。
【０２４７】
サブクローニング
ＥｃｏＲ５消化ブルースクリプト（プロメガ（Promega））へのＰＣＲ生成物の鈍端結さつによりブルースクリプト／ｐ３．１を生成した。予め子ウシ腸ホスファターゼで処理したＥｃｏＲ１消化ブルースクリプト１１ＳＫ＋（プロメガ）へのλｇｔ−１１ファージＤＮＡマキシプレプス（maxipreps）の一晩のＥｃｏＲ１消化の結さつによりブルースクリプト／ｐ５−１を生成した。ブルースクリプト中への結さつは、コンピテントＥ．Ｃｏｌｉ中へのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行い、アンピシリン（２５μ９／ｍＬ）プレート上に成長させた。
【０２４８】
λｇｔ−１１ライブラリーのスクリーニング
ＰＣＲ生成プローブをランダムヘキサマー法により放射線標識し、λｇｔ−１１プラークをスクリーニングするために用いた。
【０２４９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、アプライド・バイオシステムズの自動ＤＮＡシーケンサー上でコロンビア大学のコンプリヘンシブ・キャンサー・センター・コア・ファシリティにより行われた。
【０２５０】
２９３細胞の形質移入
形質移入の４８時間前に、２×１０6個の２９３細胞を１００ｍｍのペトリ皿上で平板培養する。形質移入の１時間前に、細胞に新鮮な培地を供給する。１皿につき２０ｍｇのプラスミドＤＮＡを用いてリン酸カルシウム沈殿物を調製する。５％ＣＯ2中３７℃で１５時間後、細胞に新鮮な培地を供給する。形質移入の３６時間後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡでの処理により収穫し、ＦＡＣＳにより調べる。
【０２５１】
単一クローン性抗体。ｍＡｂ ５ｃ８（ＩｇＧ２ａ）については、記述されている（レダーマンら、１９９２）。ｍＡｂ ５ｃ８は、記述されている。ｍＡｂＯＫＴ４（抗ＣＤ４）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、ＭＤ）から入手できる。全てのｍＡｂは、タンパクＡ（バイオラッド、ロックビル・センター、ＮＹ）またはタンパクＧカラム上で腹水から精製した。
【０２５２】
結果
Ｔ−ＢＡＭは、Ｂ細胞分化およびＩｇＧ分泌のための接触依存性シグナルを仲介する、ＣＤ４+Ｔ細胞上の活性化誘起表面タンパクである。Ｔ−ＢＡＭは、構成的にＴ−ＢＡＭを表現する機能的にユニークなジャーカットサブクローンＤ１．１上にＴ−ＢＡＭを結合するｍＡｂ ５ｃ８により同定された。
【０２５３】
本報告では、Ｔ−ＢＡＭの構造は、タンパク化学による、またＴ−ＢＡＭをコードするｃＤＮＡの単離による研究であった。
【０２５４】
Ｔ−ＢＡＭタンパクは、Ｄ１．１細胞溶解産物からＴ−ＢＡＭを親和精製するためにｍＡｂ ５ｃ８を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。単離されたＴ−ＢＡＭタンパクのＮＨ2末端アミノ酸配列は、自動マイクロ配列決定法により決定され、この配列を退化オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔ−ＢＡＭ．２）を設計するために用いた。アンチセンス配位において、末端標識退化オリゴヌクレオチドプローブは、Ｔ−ＢＡＭ＋Ｄ１．１細胞からのノーザンブロットおよびコントロールＴ−ＢＡＭ−ジャーカットＢ２．７細胞系をプローブするために用いた。アンチセンスプローブは、Ｔ−ＢＡＭを表現するＤ１．１細胞中で特異的にほぼ２ｋＢ ｍＲＮＡ種と交雑したが、Ｔ−ＢＡＭ−コントロール、非ヘルパージャーカット細胞Ｂ２．７とはしなかった。
【０２５５】
この時点で、ネズミＣＤ４０分子のためのリガンドの配列が、アーミテージら（１９９２）により発表された。この分子は、関連する機能を有し、また興味のあることに、非常に相同のＮＨ2末端配列を持っていたことに注目される。２つの配列を比較して以下に示す。
【化２】
2006034293.tif 000008
【０２５６】
Ｔ−ＢＡＭのクローン化の初期の研究は、λｇｔ−１１中のＤ１．１ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために退化オリゴヌクレオチド（Ｔ−ＢＡＭ．２）を用いることを含んでいたが、Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０−Ｌの配列の関係は、それらの配列関係がより長い２本鎖ＤＮＡプローブを精製するために利用できることを示唆した。この考えを支持して、ＣＤ４０−ＬのＮＨ2末端がタイプII細胞膜内タンパクの細胞質尾部をコードすること、および類推により、Ｔ−ＢＡＭの高度相同性ＮＨ2末端が、関連するタンパクのアイソフォーム（isoform）間で高度に維持された細胞質尾部であり得るということがある。
【０２５７】
それ故、次のシリーズの実験は、ネズミ配列のＣＤ４０−ＬｃＤＮＡ（細胞質および膜近位領域から）由来の対のオリゴヌクレオチドプロープが、Ｔ−ＢＡＭｃＤＮＡの相同配列を増幅するかどうかに向けられた。したがって、Ｄ１．１からのｍＲＮＡのＲＮＡ−ＰＣＲは、まずＣＤ４０Ｌ（３６９−３４８）で感作されたｃＤＮＡを合成することによって行い、ついでプライマーＣＤ４０Ｌ（１１−３１）およびＣＤ４０Ｌ（３６９−３４８）で増幅した。この反応は、Ｄ１．１ＤＮＡからの約３３０ｂｐの断片を増幅した。ＰＣＲ生成物は、ブルースクリプトヘの鈍端結さつによりサブクローン化し、一方向に配列した４つの挿入物のうち１つのクローンを同定した。これは、３３０ｋＢ挿入物であり、ネズミＣＤ４０−Ｌと約８５％相同であった。
【０２５８】
プラスミドｐ３−１／ブルースクリプトIIＳＫ+は、特許出願手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下に、米国メリーランド２０８５２、ロックビル、１２３０１パークローン．ドライブ所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。プラスミドｐ３−１／ブルースクリプトIIＳＫ+は、ＡＴＣＣ受託番号（    ）を与えられた。
【０２５９】
ＣＤ４０−Ｌ配列と増幅されたＰＣＲ生成物ｐ３−１を比較して以下に示す。
【化３】
2006034293.tif 000009
【０２６０】
さらに、Ｄ１．１からのＲＮＡ、Ｔ−ＢＡＭ−ジャーカットクローンＢ２．７およびＲＡＭＯＳ Ｂ細胞系からのコントロールＲＮＡを比較するノーザン分析により、ｐ３．１プローブは、Ｄ１．１細胞系中で排他的に２ｋＢ ｍＲＮＡ種に交雑した。アンチセンスＴ−ＢＡＭ．２プローブのノーザン分析、およびＴ−ＢＡＭがＤ１．１中で排他的に表現されるが、Ｂ２．７ジャーカット細胞にはされないというタンパクデータと考え併せると、これらデータは、３３０ｂｐ挿入物がＴ−ＢＡＭｃＤＮＡから由来し得ることを示唆した。
【０２６１】
したがって、この約３３０ｂｐの挿入物を、Ｄ１．１ｃＤＮＡライブラリーからλｇｔ−１１をスクリーニングするためのプローブとして用いた。ランダムヘキサマー標識プローブとして３３０ｂｐ挿入物を用いたそのようなスクリーニングは、サイズが１．８から２．４ｋＢにわたる挿入物を含有する９個の独立λｇｔ−１１クローンを同定した。
【０２６２】
ファージＤＮＡのＰＣＲは、挿入物をフランク（flank）する、ファージＤＮＡの領域に交雑するプローブを用いて行い、クローンが、サイズが１．８〜２．１ｋＢの範囲の挿入物を含有していることを明らかにした。ノーザン分析によるＮＨ2末端配列から由来するアンチセンスオリゴを用いた、Ｔ−ＢＡＭのｍＲＮＡのサイズが約２ｋＢであるという観察があれば、これらクローンの最も大きなものは、Ｔ−ＢＡＭをコードするｍＲＮＡの全長ｃＤＮＡまたはほぼ全長ｃＤＮＡのいずれかを表わすということが有望である。
【０２６３】
９個のクローンの各々において、ＥｃｏＲ１挿入物の離脱（ＥｃｏＲ１による消化による）は、すべての場合に２つの断片が得られたので、すべての８つの挿入物が内部ＥｃｏＲ１部位を含有していたことを明らかにした。λｇｔ−１１クローン１−１ｂ（これは、ＰＣＲによる最も大きな２．１ｋＢの挿入物を持つものであった）の場合には、生成した２つのＥｃｏＲ１断片は、１．３ｋＢおよび０．８ｋＢであった。これら２つの断片を消化したＥｃｏＲ１中にクローン化した。子ウシ腸ホスファターゼ処理ブルースクリプトIIＳＫ+は、ｐ１−１ｂ（１．３ｋＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+およびｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+を生成した。
【０２６４】
プラスミドＰ１−１Ｂ（１．３ＫＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+およびｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+は、特許出願手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下に、米国メリーランド２０８５２、ロックビル、１２３０１パークローン・ドライブ所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。プラスミドＰ１−１Ｂ（１．３ＫＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+は、ＡＴＣＣ受託番号（    ）を与えられ、およびプラスミドｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+は、ＡＴＣＣ受託番号（    ）を与えられた。
【０２６５】
０．８ｋＢ挿入物の部分ＤＮＡ配列決定は、それが、クローン化された生成物ｐ３−１と約１５０ｂｐだけ有意のオーバーラップを持つことを明らかにした。比較を以下に示す。
【化４】
2006034293.tif 000010
【０２６６】
加えて、ｐ１−１ｂ（０．８）ｋＢの５’末端は、成熟タンパクの、最初のコドンへ向けて、約２００ｂｐ３’である。このことは、全長ｃＤＮＡに関して以下のクローンの配列を与える。
【化５】
2006034293.tif 000011
【０２６７】
このマップは、ｐ１−１ｂ（１．３ｋＢ）が３’−ＵＴ（翻訳されない領域）中の配列に由来する、その理由は、メッセージがそのように長い５’ＵＴ領域をもつくとはあまり普通ではないからである、という仮定に基づいている。この仮定をさらに支持するものとして、ＣＤ４０−Ｌに対する関連するｃＤＮＡが類似の大きさの３’ＵＴ（約１ｋＢ）を有するという観察がある。
【０２６８】
したがって、全長ｃＤＮＡは、成熟タンパク（３０ｋＤａ）のサイズが与えられれば、そしてＰＣＲ生成物がＮＨ2末端配列から誘導されたので、おそらく共にＴ−ＢＡＭｃＤＮＡの全コード化領域を含むところのクローン化ＰＣＲ生成物（Ｐ３−１）およびクローン化ｃＤＮＡ（ｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ））の組み合わせにより得ることができる。加えて、我々が提供したクローン化ＤＮＡは、当該分子の可溶性組み替え体に使用される全てのアミノ酸をコードするようである。
【０２６９】
Ｔ−ＢＡＭの表現のために、Ｐ１−１ｂ（１．３ｋＢ）は、それがｄＤＮＡの３’−ＵＴ領域をコードするので、おそらく必要ではない。しかしながら、ｃＤＮＡの３’−ＵＴ領域は、他の３’−ＵＴと同様に、Ｔ−ＢＡＭ表現の調節に関与するようであり、それ故、ｐ１−１ｂ（１．３）は、将来の研究において、調節機能における３’ＵＴの役割を確立するために重要であろう。
【０２７０】
Ｔ−ＢＡＭ表現を指示するクローンを生成するために、ｐ３−１に類似しているが、さらにプライマーｍｕ１２／Ｔ−ＢＡＭ．２および３’Ｔ−ＢＡＭ配列を用いたＰＣＲによりアニールされたｍｕＣＤ４０−Ｌのネズミリーダー配列を有するクローン化ＰＣＲ断片を生成する。ネズミＣＤ４０−Ｌへのリーダー配列は、Ｔ−ＢＡＭクローンの表現を生じさせるに充分であることが予期される。そのような断片は、ｐ１−１ｂ（０．８）から欠落した（５’−２００ｂｐ）断片を含み、ｐ１−１ｂ（０．８）およびＰＣＲ生成物のオーバーラップ領域においてＢｓｔＹＩ部位をフランクするＮＨ2末端のほぼ６０ａａをコードするものである。このＢｓｔＹＩ部位が両方の断片の制限マッピング（および配列決定）後にユニークではないようであれば、他の６つの部位が近くに存在する。
【化６】
2006034293.tif 000012
【０２７１】
この断片は、ついで、ＢｓｔＹＩによるｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）の消化、および指向性（鈍端）クローン化のためのＢｓｔＹＩおよびＥｃｏＲ５によるＰＣＲ断片の消化によってｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）へ結さつされる。得られた挿入物（１５ｂｐネズミリーダー−２００ｂｐＰＣＲ断片−および６００ｂｐＢｓｔＹＩ／ｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）断片を含む）は、中間体ベクターから表現ベクター中に指向的にクローン化されてＴ−ＢＡＭタンパク合成を誘発する。
【０２７２】
全長クローンがそのような表現ベクター中に結さつされると、線維芽細胞系（２９３細胞のような）中に一時的に形質移入され得、ついでＦＡＣＳによりＴ−ＢＡＭ表現についてアッセイされる。さらに、Ｔ−ＢＡＭを表現する線維芽細胞は、休止ヒトＢリンパ球で培養することができ、またはＲＡＭＯＳ２６６クローンおよびついでＢ細胞を表面ＣＤ２３表現の誘起にかんして研究することができる。
【０２７３】
Ｔ−ＢＡＭの全長ｃＤＮＡ配列を決定するために、最終的には、Ｄ１．１ｍＲＮＡを用いて新規λｇｔ１１ライブラリーが構築されるであろう。Ｔ−ＢＡＭライブラリーは、ｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）断片由来のＴ−ＢＡＭ配列に特異的なオリゴヌクレオチドで感作される。このライブラリーは、ｐ３−１からの挿入物でスクリーニングして、Ｔ−ＢＡＭｃＤＮＡの５’領域をコードするλｇｔ１１クローンを得る。この新しい挿入物のＤＮＡ配列とｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）およびｐ１−１ｂ（１．３ｋＢ）からの配列を決定する。新規配列５’ｃＤＮＡの分析は、ＮＨ2末端ペプチド配列を明らかにするにちがいない。
【０２７４】
ｐ１−１ｂ（１．３）ｋＢを含む全長挿入物の構造は、また、クローン１−１ｂのλｇｔ−１１ＤＮＡのＰＣＲを行い、ついでこの断片のブルースクリプトヘの鈍端クローニングを行うことによっても決定することができる。このクローン化されたＰＣＲ断片の全長配列のＤＮＡ配列を決定する。この配列とｐ１−１ｂ（１．３ｋＢ）およびｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）の１．３および０．８ｋＢ挿入物のそれとの比較は、それらの正確なｐ１−１ｂ（１．３ｋＢ）の５’−３’配位の決定を容易にする。これらの断片から全長ｃＤＮＡクローンを生成させるために、１．３ｋＢ挿入物をｐ１−１ｂ（１．３ｋＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+クローンのＥｃｏＲ１消化により遊離させ、ゲル精製する。ついで、ｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）／ブルースクリプトIIＳＫ+プラスミドの部分ＥｃｏＲ１消化を行い、線形体をゲル精製する。次に、１．３ｋＢＥｃｏＲ１挿入物を部分的に消化された（線形化）ｐ１−１ｂ（０．８ｋＢ）／ブルースクリプトＳＫ＋プラスミド中に結さつし、コンピテントバクテリアを形質転換する。この形質転換からのクローンの詳細な制限マップは、正しい配位に結さつされた１．３および０．８ｋＢ挿入物を共に有する全長ｃＤＮＡ挿入物の同定を可能にする。ついで、この全長挿入物（ｐＴ−ＢＡＭ／ブルースクリプトIIＳＫ+）の配列決定を行い、それが正しい配位に２つの挿入物を有していることを確認する。次に、ブルースクリプト上のポリ−リンカーによりこれら断片をｐＣＤＮＡ−１のような真核性表現ベクター中に指向的にクローン化することが可能になる。ついで、このｐＣＤＮＡ−１／ｐＴ−ＢＡＭ２９３細胞のような線維芽細胞中に形質移入し、これを表面Ｔ−ＢＡＭタンパクの表現について研究することができる。
【０２７５】
このクローンを表現するに当たり、予知されない問題があるかもしれない。５’または３’非翻訳配列のいくつかが除去されて表現を許容する場合がある。これは、得られた配列情報を用いて容易に達成できる。加えて、ｐＴ−ＢＡＭ／ｐＣＤＮＡ−１のようなｃＤＮＡクローンがライブラリーのオリジナルな発生から派生する配列中でエラーを有するという場合がまれにある（典型的に、逆転写酵素反応）。この場合は、他の８つのλｇｔ−１１クローンを上に述べたと同様に研究し、これらクローンを再構築してＴ−ＢＡＭのための表現プラスミドを生成させる。
【０２７６】
クローンの配列分析は、ＩｇＥ分泌を誘発する、活性化ネズミＴ細胞上の分子であるネズミＣＤ４０−Ｌと相同を有するタイプII表面膜糖タンパクをすでに明らかにしている。これらタンパクの両方は、広範な免疫学的および他の機能を有するサイトカインおよび細胞表面エフェクター分子を含むＴＮＦαスーパーファミリーのメンバーである。
【０２７７】
他の関連する遺伝子が存在するかどうかを決定するために、クローンｐ３−１／ブルースクリプトIIＳＫ+の３３０ｂｐ挿入物を用いてヒトＤＮＡ（ヘラ・セルズ（Hela Cellsから）のサザンブロットをプローブした。興味のあることに、３つのバンドが観察された。Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０−Ｌがこれらバンドの２つを説明するようであることを考え併せると、これらデータは、「Ｔ−ヘルパー−エフェクター」分子のこのファミリーの少なくとも１つの他のメンバーが存在することを示唆している。あるいは、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０−Ｌの機能的性質は別のものであるが、Ｔ−ＢＡＭがＣＤ４０−Ｌのヒト同族体であるという可能性がなお存在する。Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０−Ｌが同族であることが見い出されたら、サザンデータは、そのような形態のヘルパー分子の他の２つのメンバーが存在し得ることを示唆する。
【０２７８】
考察
本研究において、Ｂ細胞分化を指示する、ＣＤ４+Ｔリンパ球上の細胞表面タンパクＴ−ＢＡＭを共にコードするＰＣＲ生成物およびｃＤＮＡクローン
Ｔ−ＢＡＭは、ｔｎｆα遺伝子スーパーファミリーのメンバーであることがわかった。非常に有意であることに、Ｔ−ＢＡＭは、マウス中で（アーミテージら、１９９２）、特にヒトＴ−ＢＡＭとネズミＣＤ４０−Ｌとの間の配列同一性が約８５％であった細胞質膜内外および茎領域において最近同定されたＣＤ４０−Ｌと関連している。これらの新しいデータは、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞誘起Ｔ細胞表面分子の構造的に異なるアイソフォームであることを示唆している。もっとも、そのような概念の直接的な確認には、両アイソフォームのネズミおよびヒト同族体の同定と、特に、ｐ１−１（０．８ｋＢ）クローンの残燈におけるコード領域の配列決定を要するであろう。
【０２７９】
従前のデータは、Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０−Ｌとは関連しているが、機能的には別のものであることを示唆している。Ｔ−ＢＡＭはＩｇＧ合成を指示するが、ＣＤ４０−ＬはＩｇＥの合成を指示する（アーミテージら、１９９２）。ＩｇＧに体するＴ−ＢＡＭヘルパー機能の制限は、最近、Ｄ１．１がｒＩＬ４の存在下にＲＡＭＯＳ Ｂ細胞のＩｇＭ+クローンを誘発してＩｇＥおよび他の異性タイプではなく排他的にＩｇＧ１ヘクラススイッチさせる（未公表）という観察により強化された。これらの実験において、Ｒａｍｏｓ細胞（１ウェル当たり３０細胞）を１００のミトマイシン−Ｃ−処理Ｄ１．１細胞のフィーダそう上で２ないし３週間培養し、培養した上澄をアイソタイプおよびサプクラス特異的ＥＬＩＳＡにより、Ｉｇ分泌について研究した。Ｄ１．１細胞およびｒＩＬ−４の存在下でのみ、Ｒａｍｏｓ細胞はＩｇＧ１を分泌する細胞系（実験１における４／１５クローンおよび実験２における１９／５９クローン）に分化した。これに対し、Ｂ２．７細胞は分化およびアイソタイプスイッチングを誘起しなかった。さらに組み換え体１Ｌ−４はアイソタイプスイッチングに必要であった。これらデータは、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０が別のアイソタイプの１９の表現を指示するＢ細胞誘起Ｔ細胞表面分子のアイソフォームであることを示唆している。
【０２８０】
この点に関し、ｍＡｂ抗ＣＤ４０が増殖、分化および全てのアイソタイプ１９を含むポリクローン性Ｉｇ生産を誘起することが示された（バンチェローら、１９９１ａ；バンチェローら、１９９１ｂ）ことは、興味のあることである。さらに、両分子がＢ細胞上のＣＤ４分子を含む重要な相互作用を有するらしいことは、興味のあることである。ＣＤ４０−Ｌの場合には、ＣＤ４０−ＬおよびＣＤ４０は、受容体−ｃｏ−受容体関係を含むようである（アーミテージら、１９９２）。Ｔ−ＢＡＭの場合には、そのような関係は、２つの異なる構造に対するｍＡｂによるそれらの機能のレシプロカル遮断により示唆されるが、受容体リガンド関係の直接の証拠は存在しない。それらの機能的差異と考え併せると、これらデータは、ＣＤ４０−ＬとＴ−ＢＡＭは、両者がＢ細胞上のＣＤ４０分子と相互作用するらしいという事実にもかかわらず、異なる機能的重要性を持つことを示唆する。
【０２８１】
抗体アイソタイプに対する異なる効果に加えて、Ｔ−ＢＡＭおよびＣＤ４０−Ｌは、異なるパターンの表現とＢ細胞増殖についての要求を持つ。ＰＨＡおよびＰＭＡ刺激後の５ｃ８ Ａｇの細胞表面表現の動態は、最適表現が６時間後に生じるが、２４時間までにベースライン（無）表現をもたらすダウンレグレーションが起こるという点（デダーマンら、１９９２）で比較的ユニークである。これに対し、ＣＤ４０−Ｌは、同様の刺激により、＞７２時間持続されるようである。さらに、Ｔ−ＢＡＭ＋Ｄ１．１細胞は、ｒＩＬ４またはＰＨＡの文脈においてのみＢ細胞表現を誘起するが、ＣＤ４０−Ｌ＋トランスフェクトーマは、加えたサイトカインまたはレクチンの不存在下でＢ細胞増殖を誘起する（アーミテージら、１９９２）。これらデータは、ＣＤ４０−ＬとＴ−ＢＡＭによりＢ細胞に提供されたシグナルは異なるものであり、それゆえ、これら分子が関連はするが別の機能を有する異なるアイソフォームであるという構造的示唆と一致する。
【０２８２】
Ｂ細胞表面上のＣＤ４０分子は、リンパ節Ｂ細胞分化に関連した興味のあるシグナリング機能を有する（クラークら、１９８６；クラークら、１９８８；レドベターら、１９８７；レドベターら１９８６）。何故なら、抗ＣＤ４０（ｍＡｂＧ２８−５（クラークら、１９８６））は、プログラムされた胚中心Ｂ細胞壊死（アポプトシス）を防止するからである（リューら、１９８９）。この点で、ＣＤ４０がアポプトシシに体するＴおよびＢ細胞表面受容体であるＦＡＳ（イトーら、１９９１）と同族であることは興味のあることである。リンパ器官中のＴ−Ｂ相互作用がアポプトシスを含むという程度まで、これらデータは、ＣＤ４０分子との相互作用に加えてＴ−ＢＡＭはＦＡＳ（イトーら、１９９１）と相互作用し得ることを示唆する。事実、我々は、最近、ｍＡｂ抗ＦＡＳ（Ａｐｏ−１）（エームら、１９９２；イトーら、１９９１）がＣＤ２３のＲＡＭＯＳ２６６およびＢ細胞誘起に対するＤ１．１効果を部分的に疎外することを観察した（未公表観察）。Ｔ−ＢＡＭがＣＤ４０とＦＡＳ双方と相互作用し得るという考えは、ＣＤ４０ｔｏＦＡＳが異なる受容対構造であり得るか、またはヘテロ二量体受容体を形成し得るという考えを示唆する。ある種のＴＮＦαＲ様分子は、多量体として、ＣＤ２７の場合にはおそらくホモ二量体として存在することが知られている（カメリニら、１９９１）。ｔｎｆα様分子の多量体受容体との相互作用は、また、このファミリーの唯一の結晶化メンバーであるｔｎｆ（ハコシマら、１９８８；スミスら、１９８７）およびｎｇｆ（マクドナルドら、１９９１）の分配された三量体構造によっても示唆される。ＦＡＳおよびＴＮＦαがヘテロ二量体を形成し得るという証拠がある。これら分子は、リンパ球表面上の抗ＦＡＳ抗体により共に調節されるからである（ヨネハラら、１９８９）。単一ｔｎｆα様リガンドがＴＮＦαＲ様分子の混合ヘテロ二量体を含む多重リガンドと相互作用し得るということは、また、ｔｎｆα様分子の他の例によっても示唆される。たとえば、ｔｎｆαおよびｔｎｆβ（リンフォトキシン）は、両方ともＴＮＦαＲの２つの別の鎖（ＩおよびＩＩ）と反応する（グッドウィンら、１９９１；ローズら、１９９１；ノファーら、１９９０；エンゲルマンら、１９９０；ルイスら、１９９１；ヒムラーら、１９９０；ウミエルら、１９８７；ヘラーら、１９９０；グレーら、１９９０；スミスら、１９９０；レッチャーら、１９９０；デムビックら、１９９０）。加えて、これら鎖のヘテロ二量体組み合わせが、バイオ化学的分析により示唆されている（ノファーら、１９９０；エンゲルマンら、１９９０）。共に、これら観察は、ｔｎｆαおよびＴＮＦαＲファミリーのメンバーは、一般に、ことなる様態でＢ細胞をシグナルするために関連した受容体の組み合わせと相互作用し得るということを示唆する。ｔｎｆαファミリーのメンバーの共有特徴と思われる他の性質は、ＴＦＮαＲ、ＣＤ４０およびＦＡＳ（ワタナベら、１９９２）が全てアポプトシスシグナルのための受容体であるということである。
【０２８３】
ＴおよびＢ細胞間で作用するｔｎｆα様およびＴＦＮα様相互作用の多くの例が以下の表６に示されている。ｔｎｆα様分子の性質および機能に関し、正確な機能ＣＤ３８（ジャクソンら、１９９０）は未知であり、ｎｇｆはがＢ細胞分化に効果を有することは報告されている（キマタら、１９９１；オッテンら、１９８９）が、Ｂ細胞生理学におけるｎｇｆ−ＮＧＦＲ（セーガルら、１９８９；チャオら、１９８６；ジョンソンら、１９８６）相互作用の役割は、現在、わかっていない。ＴＮＦαＲ様分子の中で、ＣＤ２７およびＯｘ４０の機能は現在未知であるが、ＣＤ２７（マレットら、１９９１）が２つの形態として表現され、Ｏｘ４０（マレットら、１９９０）表現がＣＤ8+Ｔ細胞ではなくＣＤ４+に制限されるということは、興味深い。これら両方の分子は、Ｔ細胞活性化により誘起される。「ホジキン（Hodgkm）の抗原」ＣＤ３０（ダーコプら、１９９２）の生理学的役割は未知である。
【表６】
2006034293.tif 000013
【０２８４】
ｔｎｆα科のいくつかの部分の重要な特徴は、ｔｎｆαのプロサイトカイン表面品種の蛋白分解の分裂がｔｎｆαの溶解サイトカイン品種を生じることである。将来の研究は、Ｔ−ＢＡＭがプロテアーゼで分解されならば、かつ溶液Ｔ−ＢＡＭの役割はもし同定されるならば、Ｔ−Ｂセル相互作用で働くならかもしないことが決定するはずである。ＴＮＦαＲｓ（ウミールら、１９８７；ヒーラーら、１９９０；グラィら、１９９０）およびＣＤ２７（ローエンら、１９９２；ディヨングら、１９９１）分子は溶液形態を有することが重要であり、ＣＤ４０分子の溶液形態が存在し、かつＴ−Ｂ相互作用で役割を果たすであろうことを示唆する。
【０２８５】
その上に、ＣＤ４０のＢセルとのＴセル表面分子の相互作用の複雑さは、ＣＤ４０−Ｌ（３９ｋＤａ対３３ｋＤａ）に比べてかなり大きな分子量を有する他のねずみ科のＣＤ４０−Ｌの最近リポートによって示唆されている（アーミテージら、１９９２；ノエルら、１９９２）。しかしながら、その正確な構成またはＴ−ＢＡＭまたはＣＤ４０−Ｌの関係は正確には知られていない。
【０２８６】
けれども、いくつかの他のＢセル表面分子はリンパ組織中で従属信号を受けることで役割を果たすかもしれないことが述べられている。しかしながら、阻害するＤ１．１−Ｂセル相互作用のｍＡｂ ５ｃ８の効果は、ＢセルとのＤ１．１相互作用で効果のない抗ＣＲ２、抗ＬＦＡＩ、抗ＬＦＡ３または抗ＩＣＡＭで試験される抗体間で比較的独特のであることが明らかである。したがって、Ｔ−Ｂ相互作用の前記Ｔ−ＢＡＭ従属段階は促進効果因子の分別する工程であることが明らかである。
【０２８７】
Ｔ−ＢＡＭ発現の瞬間的性質は、そのＴ−Ｂ“同源対”を安定にする役割をなすかもしれないことを示唆する。“同源”天然のままのプロテイン特異Ｂセルとの活性ペプチド特異ＣＤ４+Ｔセルの物理的関連は、“抗原ブリッジ”として生理学的に規定の分子基本であることが明らかである。
【０２８８】
Ｔ−ＢＡＭとＣＤ４０−Ｌ間の関係を明らかにすることに加えて、Ｔ−ＢＡＭを暗号化するｃＤＮＡの有益さは、別の一種、特にＴ−ＢＡＭ因子の生理学的様子が過発現（遷移因子中）によるかまたは標的にされる因子分裂によって宛名書きされることができるねずみ、の中の同種の遺伝子を確認することを許容する。さらに、Ｔ−ＢＡＭ特異ｃＤＮＡプローブの有益さは、組み換えレベルでＴ−ＢＡＭ発現の規則の分析を促進し、同様に遺伝子操作によってＴ−ＢＡＭ因子性状の構造決定を研究するための手段を供する。
【０２８９】
免疫性生理機能のそれら役割に加えて、いくつかのＴＮＦαＲ科員はウイルス性病原体によって利用されていることが明らかである。粘液種ウイルスはウイルス病毒性を伴うＴＮＦαＲに対して同種の分泌タンパク質を発現する（アプトンら、１９９１）。さらに、シープフィブロマウイルスからの読取り枠によって暗号化されたタンパク質はＴＮＦαＲに対して同種である（スミスら、１９９０）。したがって、これら分子を理解することの付加的な特徴は免疫性病原体、例えば自己免疫疾患を誘発するＴ−ＢＡＭのような分子の機能範囲を利用する新規なウイルスの識別化または特徴付けであるかもしれない。
【参考文献】
【０２９０】
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【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】ＣＤ４-Jurkat Ｄ１．１.の細胞表面の表現型を示す図。
【図２】Ｂ細胞単独で、あるいはＣＤ４-Jurkat（Ｄ１．１）、又はＣＤ４+Jurkat（Ｂ2.7）と共に24時間培養した後の、粘性を失った高密度Ｂ細胞の２色ＦＡＣＳ分析の結果を示す図。
【図３】Ｄ１．１に誘導されたＣＤ23発現の投与応答を示す図。
【図４】ＰＨＡ存在下でJurkatＤ１．１がＢ細胞の増殖を誘導することを示す図。
【図５−１】JurkatＤ１．１の、Ｉｇ分泌細胞へのＢ細胞分化の誘導を示す図。
【図５−２】JurkatＤ１．１の、Ｉｇ分泌細胞へのＢ細胞分化の誘導を示す図。
【図６】Ｄ１．１ではなくｒＩＬ-4のＢ細胞のsigM発現の増加を示す図。
【図７】ｍＡｂ 5ｃ8 のJurkatＤ１．１細胞への結合を示す図。
【図８】ｍＡｂ 5ｃ8 が、Ｂリンパ球によるＣＤ23の発現を誘導するJurkatＤ１．１を阻害することを示す24時間培養後の粘性を失った高密度Ｂ細胞の２色ＦＡＣＳ分析を示す図。
【図９】ｍＡｂ 5ｃ8 とコントロールｍＡｂにより免疫沈降した表面蛋白のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す図。
【図１０】Ｔ細胞の活性化と活性化されたＴ細胞の抗原 5ｃ8 の発現における代謝的阻害因子の影響を示す図。
【図１１】単離されたＣＤ４+ 、ＣＤ８+Ｔ細胞サブセット上での 5ｃ8 の発現のカイネティクスを示す図。
【図１２】Ｄ１．１が、Ｂ細胞又はＲＡＭＯＳ266 上での表面ＣＤ23発現を誘導することを示す図。
【図１３】扁桃のＢ細胞に対するＤ１．１の影響を示す図。
【図１４Ａ】Ｄ１．１−Ｂ細胞活性化におけるＴ−ＢＡＭとＣＤ40の役割を示す図。
【図１４Ｂ】Ｄ１．１−Ｂ細胞活性化におけるＴ−ＢＡＭとＣＤ40の役割を示す図。
【図１５】末梢性Ｂ細胞のＤ１．１活性化に対する抗ＣＤ40ｍＡｂの影響を示す図。
【図１６Ａ】Ｂ細胞ＣＤ23発現に対する抗ＣＤ40のＣＤ32+ Ｌ細胞へ及ぼす影響を示す図。
【図１６Ｂ】Ｂ細胞ＣＤ23発現に対する抗ＣＤ40のＣＤ32+ Ｌ細胞へ及ぼす影響を示す図。
【図１７−１】ヒト正常リンパ球組織でのＴ−ＢＡＭ発現を示す図。
【図１７−２】ヒト正常リンパ球組織でのＴ−ＢＡＭ発現を示す図。
【図１７−３】ヒト正常リンパ球組織でのＴ−ＢＡＭ発現を示す図。
【図１８】Ｔ−Ｂ分子の相互作用モデルを示す図。
【図１９Ａ−１】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１９Ａ−２】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１９Ｂ−１】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１９Ｂ−２】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１９Ｃ−１】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１９Ｃ−２】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１９Ｄ−１】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１９Ｄ−２】慢性関節リューマチの滑膜パンヌスにおけるＣＤ４+Ｔリンパ球上でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２０Ａ−１】浸潤性乾癬損傷のＴリンパ球でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２０Ａ−２】浸潤性乾癬損傷のＴリンパ球でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２０Ｂ−１】浸潤性乾癬損傷のＴリンパ球でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２０Ｂ−２】浸潤性乾癬損傷のＴリンパ球でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２１Ａ−１】非ホジキンリンパ腫細胞でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２１Ａ−２】非ホジキンリンパ腫細胞でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２１Ｂ−１】非ホジキンリンパ腫細胞でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図２１Ｂ−２】非ホジキンリンパ腫細胞でのＴ−ＢＡＭの発現を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９Ａ−１】
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【図１９Ａ−２】
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【図１９Ｂ−１】
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【図１９Ｂ−２】
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【図１９Ｃ−１】
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【図１９Ｃ−２】
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【図１９Ｄ−１】
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【図１９Ｄ−２】
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【図２０Ａ−１】
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【図２０Ａ−２】
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【図２０Ｂ−１】
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【図２０Ｂ−２】
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【図２１Ａ−１】
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【図２１Ａ−２】
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【図２１Ｂ−１】
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【図２１Ｂ−２】
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【配列表】
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