(57)【要約】【課題】  ２型糖尿病を自然発症する遺伝子を有する新規マウスを提供すること。【解決手段】  本発明によれば、下記特性（１）〜（３）の原因遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有し、かつ、前記特性が常染色体性の劣性遺伝形質であることを特徴とする、２型糖尿病モデルマウスが提供される：（１）生後１０〜１４週齢で、正常系統マウスに比べて高血糖であり、かつ、生後１０〜１４週齢またはさらに加齢した状態において、血中の糖化ヘモグロビン濃度が２．５％以上を示す；（２）生後１０〜１４週齢で、尿糖陽性である；かつ、（３）膵島炎は実質的に認められず、かつ、血中インスリン濃度は正常系統マウスに比べて同等であるか、もしくはそれより高い値を示す。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特性（１）〜（３）を発現しうる原因遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有し、かつ、前記特性が常染色体性の劣性遺伝形質であることを特徴とする、２型糖尿病モデルマウス：
（１）  生後１０〜１４週齢で、正常系統マウスに比べて高血糖であり、かつ、生後１０〜１４週齢またはさらに加齢した状態において、血中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度が２．５％以上を示す；
（２）  生後１０〜１４週齢で、尿糖陽性である；かつ
（３）  膵島炎は実質的に認められず、かつ、血中インスリン濃度は正常系統マウスに比べて同等であるか、もしくはそれより高い値を示す。
【請求項２】
前記原因遺伝子が以下の特性をさらに発現しうるものである、請求項１に記載のマウス：
（４）  肥満傾向は実質的に認められない。
【請求項３】
前記原因遺伝子をホモの状態で有する、請求項１または２に記載のマウス。
【請求項４】
近交系ＫＯＲマウスとＮＣマウスの子孫である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項５】
受託番号（受領番号）ＦＲＥＭ ＡＰ−２０１２４として受精卵が寄託されてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のマウスの子孫であって、請求項１または２に記載の特性を示す、マウス。
【請求項７】
任意のラボラトリーマウスに、前記原因遺伝子を戻し交配により導入することにより得られるコンジェニックマウスである、請求項６に記載のマウス。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、２型糖尿病を自然発症する遺伝子を有するマウスに関する。
【０００２】
背景技術
糖尿病、特に２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）は、生活習慣病といわれて久しく、また世界的にみても患者数が急増している疾患の一つである。この患者数急増の原因としては、第一には生活習慣の大きな変化が挙げられ、さらに遺伝的要因も重要な要因となっている。患者数急増により、適切な糖尿病の予防法および治療法の開発、原因遺伝子の解明、発症機構の解明は急務である。この目的のためには、適切な疾患モデル動物が必要不可欠である。特に、自然発症型の疾患モデル動物は、原因遺伝子の解明等の観点から有用である。
【０００３】
従来、自然発症の２型糖尿病モデル動物としては、ＫＫ−Ａｙマウス（Nishimura M., Exp. Anim., 18:147-157., 1969）、ＮＳＹマウス（Ueda H. et al., Diabetologia 38, 503-508., 1995）、ｄｂ／ｄｂマウス（Hummel K P. et al., Science 153, 1127-1128., 1966）、ｏｂ／ｏｂマウス（Herberg L & Coleman DL. Horm Metab Res. 7, 410-5., 1975）、および、ＡＫＩＴＡマウス（Yoshioka M. et al., Diabetes 46, 887-894., 1997）などが報告されている。
【０００４】
この内、ＫＫ−ＡｙマウスおよびＮＳＹマウスは肥満を伴うものであり、また、ｄｂ／ｄｂマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスは、それぞれレプチン受容体異常あるいはレプチン産生異常による肥満に伴うモデルである。一方、ＡＫＩＴＡマウスは、膵β細胞異常により糖尿病を発症するモデルである。
【０００５】
一方で、日本人の糖尿病患者のうち９０数％を占める２型糖尿病患者のほとんどは、肥満を伴わない非肥満型の２型糖尿病患者であるとされている。このため、非肥満型の２型糖尿病の原因究明および治療方法の確立のためには、従来型の２型糖尿病モデル動物では不十分であり、肥満を伴わない２型糖尿病モデル動物が望まれていた。
【０００６】
これまでに非肥満型の２型糖尿病モデル動物としては、例えば、特開２００４−６５１８１号公報（特許文献１）に記載のモデルマウスが報告されている。このマウスはインスリンの分泌異常を伴うものである。
２型糖尿病の発症および病態には、インスリン分泌の低下と、インスリン感受性の低下（インスリン抵抗性）の２要因が密接に関係するとされている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−６５１８１号公報
【発明の概要】
【０００８】
本発明者は今般、２型糖尿病を自然発症するマウスの作出に成功した。このマウスは肥満傾向を実質的に有さないものであった。また、このマウスの膵β細胞は正常であり、マウスのインスリン分泌も正常であった。これらの特徴は、従来の２型糖尿病モデルであるマウスとは異なるものであった。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
よって、本発明は２型糖尿病を自然発症する遺伝子を有する新規なマウスの提供をその目的としている。
【００１０】
そして本発明による２型糖尿病モデルマウスは、下記特性（１）〜（３）を発現しうる原因遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有し、かつ、前記特性が常染色体性の劣性遺伝形質であることを特徴とするものである：
（１）  生後１０〜１４週齢で、正常系統マウスに比べて高血糖であり、かつ、生後１０〜１４週齢またはさらに加齢した状態において、血中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度が２．５％以上を示す；
（２）  生後１０〜１４週齢で、尿糖陽性である；かつ
（３）  膵島炎は実質的に認められず、かつ、血中インスリン濃度は正常系統マウスに比べて同等であるか、もしくはそれより高い値を示す。
【００１１】
本発明の一つの好ましい態様によれば、前記原因遺伝子は以下の特性をさらに発現しうるものである：
（４）  肥満傾向は実質的に認められない。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、本発明による前記マウスの子孫であって、前記特性（１）〜（３）を示すマウスが提供される。
【００１３】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明による前記マウスの子孫であって、前記特性（１）〜（４）を示すマウスであり、かつ、任意のラボラトリーマウスに、原因遺伝子を戻し交配により導入することにより得られるコンジェニックマウスであるものが提供される。
【発明の具体的説明】
【００１４】
受精卵の寄託
本発明によるマウスの受精卵、すなわち前記特性（１）〜（３）の原因遺伝子をヘテロの状態で有するマウスの受精卵は、２型糖尿病マウスの表示で、平成１６（２００４）年７月２１日（受託（受領）日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託された。受託（受領）番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１２４である。
【００１５】
本発明によるマウス
本明細書において、２型糖尿病モデルマウスという場合には、特に記載のない限り、２型糖尿病モデルマウスが有する前記特性（１）〜（３）の原因遺伝子を、遺伝子型としてホモまたはヘテロのいずれの状態で有するものを意味する。したがって、本発明による２型糖尿病モデルマウスは、前記特性の原因遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有する限りにおいて、そのマウスの種類（系統、交雑系など）、すなわちその遺伝的背景としてのマウスの種類自体は、特に制限されない。よって、該マウスの系統としては、本発明による２型糖尿病モデルマウスの由来となった近交系ＫＯＲマウスおよびアトピー性皮膚炎モデルＮＣマウスの他に、例えば、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＡＫＲ／Ｍｓマウス、およびＡ／Ｊマウス等が挙げられる。
【００１６】
本明細書において、「ホモ接合体」とは、前記特性（１）〜（３）の原因遺伝子をホモの状態で有するマウスを意味し、「ヘテロ接合体」とは、該原因遺伝子をヘテロの状態で有するマウスを意味する。
したがって、本発明による２型糖尿病モデルマウスには、２型糖尿病を自然発症するホモ接合体、および２型糖尿病を発症しないヘテロ接合体のいずれもが包含される。なおヘテロ接合体は、正常マウスと同等の寿命を有するため、扱いやすく、継代や運搬等を行う場合に有利となることがある。
よって、本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明による２型糖尿病モデルマウスはその原因遺伝子をホモの状態で有する。また本発明の別の一つの好ましい態様によれば、本発明による２型糖尿病モデルマウスはその原因遺伝子をヘテロの状態で有する。
【００１７】
本明細書において、「自然発症」とは、突然変異等の天然由来の形質を引き継ぐことにより、２型糖尿病を発症することができるか、または２型糖尿病を潜在的に発症し得る状態にあることをいう。ここで「２型糖尿病を潜在的に発症し得る状態にある」とは、原因遺伝子をヘテロの状態で有する場合をいう。したがって、本発明によるマウスは、２型糖尿病を自然発症するか、また自然発症を潜在的にし得るものであり、遺伝子工学的技術を用いて遺伝子を人為的に操作したマウス、例えばノックアウト型マウスおよびトランスジェニック型マウスとは区別されるものである。
【００１８】
マウスの由来
本発明者は、１９８８年および１９８９年に福島県郡山市で捕獲した日本産野生マウス（Mus musculus molossinus）由来の近交系ＫＯＲマウスと、アトピー性皮膚炎モデルマウスであるＮＣマウス（ＮＣ／Ｊｉｃマウス、日本クレア株式会社より入手可能）との交配により作出されたＦ２マウス中に、２型糖尿病を自然発症するマウスを見出した。
【００１９】
よって、本発明による２型糖尿病モデルマウスは、典型的には、近交系ＫＯＲマウスとアトピー性皮膚炎モデルＮＣマウスの子孫である。
【００２０】
マウスの特性
本発明による２型糖尿病モデルマウスは、下記特性１）〜５）を発現する原因遺伝子をヘテロまたはホモの状態で有するものである。
【００２１】
１）  生理学的特徴
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）は、以下の生理学的特徴、典型的には少なくとも下記(i)〜(iv)の特徴、を具備するものである。
【００２２】
(i)  血糖
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）は、生後１０〜１４週齢で、正常系統マウスに比べて高血糖である。
ここで「正常系統マウス」は、血糖値、尿糖、およびインスリン分泌などについて異常を示さないマウスであれば特に制限はなく、いずれのマウスであってよい。「正常系統マウス」としては、好ましくは、ＫＯＲマウス、ＮＣマウス、および、コンジェニック系マウス作出において反復親として使用されるラボラトリーマウス（例えば、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス等）等が挙げられる。
【００２３】
「正常系統マウスに比べて高血糖」であるとは、絶食時における血糖値（血中グルコース濃度）が、正常系統マウスの絶食時の値に比べて高いことをいい、好ましくは、血糖値が１３０ｍｇ／ｄｌ以上、より好ましくは、血糖値が１４０ｍｇ／ｄｌ以上、さらに好ましくは、血糖値が２００ｍｇ／ｄｌ以上、さらにより好ましくは、血糖値が３００ｍｇ／ｄｌ以上であることをいう。またここで「絶食時」とは、１２時間程度マウスを絶食させた後の状態をいう。
【００２４】
本発明において「血糖値」は、慣用の方法により測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって、市販の測定機（メディセーフ・リーダー、株式会社テルモ製）を用いて測定することができる。
【００２５】
(ii)  糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）濃度
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）は、生後１０〜１４週齢またはさらに加齢した状態において、血中の糖化ヘモグロビン濃度が２．５％以上、好ましくは２．６％以上、より好ましくは２．８％以上、さらに好ましくは３．０％以上を示す。
ここで「糖化ヘモグロビン濃度」とは、血中において、赤血球中のヘモグロビンの内で、グルコースと結合しているヘモグロビンの割合を意味する。糖化ヘモグロビン濃度は、糖尿病患者の治療コントロールの良否判定の指標として用いられるものであり、現時点の血糖値よりも１〜２ヶ月前の血糖値と相関することが知られている。
【００２６】
「糖化ヘモグロビン濃度」は、慣用の方法により測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって、市販の測定機（ＤＣＡ２０００システム、バイエルンメディカル社製）を用いて測定することができる。具体的には、例えば、測定機として前記ＤＣＡ２０００システムを使用する場合、ここでは、総ヘモグロビン量はチオシアンメトヘモグロビン法に従い測定され、また、糖化ヘモグロビン量はラテックス凝集阻止反応により測定される。
【００２７】
(iii)  尿糖
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）は、生後１０〜１４週齢で、尿糖陽性である。
ここで「尿糖陽性」とは、マウスの排出する尿中のブドウ糖濃度が１００ｍｇ／ｄｌ以上であるこという。ここで尿中ブドウ糖濃度は、慣用の方法により測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって、市販のキット（プレテスト、和光純薬工業株式会社製）を用いて測定することができる。具体的には例えば、測定キットとして前記プレテストを使用する場合、まず検体であるマウスの尿を前記プレテストの試験紙につけ、３０秒後に該キット所定の色調表にしたがって判定することにより、−〜＋４までの５段階に分類することができる。この内、判定結果が＋１の場合には、尿中ブドウ糖濃度は、１００〜２５０ｍｇ／ｄｌであり、＋２の場合には２５０〜５００ｍｇ／ｄｌ、＋３の場合には５００〜２０００ｍｇ／ｄｌ、＋４の場合には２０００ｍｇ／ｄｌ以上であることを示す。このとき、判定結果が＋１以上である場合を「尿糖陽性」であるとする。
【００２８】
(iv)  血中インスリン濃度
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）の血中インスリン濃度は、正常系統マウスに比べてそれと同等であるか、もしくはそれより高い値を示す。
血中インスリン濃度が「正常系統マウスに比べてそれと同等であるか、もしくはそれより高い値を示す」とは、絶食時における血中のインスリン濃度が、正常系統マウスの絶食時の値に比べて同等であるかまたはそれより高いことをいい、好ましくは、血中インスリン濃度が９０ｐｇ／ｍｌ以上、より好ましくは、血中インスリン濃度が１１０ｐｇ／ｍｌ以上であることをいう。
【００２９】
本発明において「血中インスリン濃度」は、慣用の方法により測定することができ、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって、レビスインスリン測定キットＵ−タイプ（株式会社シバヤギ製）を用いて測定することができる。具体的には、例えば、プレートに抗インスリンモノクローナル抗体（マウス）を固相化しておき、検体中のインスリンをこれに結合させた後、インスリンの別な部位を認識するビオチン標識抗インスリンモノクローナルを反応させ、ここにさらに、ペルオキシダーゼ−アビジン結合物を加えてビオチンに結合させ、最後に色原性基質を加えて発色させることによって、インスリンを測定する。
【００３０】
(v)  耐糖能
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）は、耐糖能異常が認められる。
マウスの耐糖能が正常であるか異常であるかは糖負荷試験により確認することができる。糖負荷試験は、慣用の手順により実施することができ、例えば、絶食時のマウスに、体重１ｇ当たり１ｍｇのブドウ糖を腹腔内投与し、所定の糖負荷経過時間について（例えば、１８０分間にわたって３０分毎に）、そのマウスの血糖値を測定することにより行うことができる。測定の結果、時間の経過に伴って血糖値が、正常系統マウスと比較して、減少する傾向が認めらない場合には、耐糖能は異常であると判断される。
【００３１】
(vi)  その他
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）は、糖尿病発症後、典型的には、生後１０〜１４週齢以降において、水の多飲傾向、および、多尿傾向が認められる。多飲傾向は、例えば、飼育用のケージに設置した給水瓶中の水の減少速度に着目し、正常系統マウスと比較することにより、確認することができる。また、多尿傾向は、例えば、飼育用のケージ内の床敷きの濡れ具合を観察し、正常系統マウスと比較することにより、確認することができる。
【００３２】
２）  病理学的特徴
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）においては、膵島（ランゲルハンス島）炎は実質的に認められない。
ここで、「膵島炎が実質的に認められない」とは、病理学的検索を行った場合に、膵島β細胞の一部に萎縮が見られる等の軽微な変異が見られることがある以外は、膵島β細胞の損傷または破壊が認められない状態をいう。ここでいう病理学的検索は、例えば、後述する実施例に記載の方法にしたがって行うことができる。
本発明によるマウスにおいては、膵島炎が実質的に認められないため、インスリン分泌は正常であると言える。インスリン分泌が正常であることは、上記したように、血中インスリン濃度を測定し、正常系統マウスのものと比較することにより、確認することができる。
【００３３】
３）  肥満
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）には、肥満傾向は実質的に認められない。
本発明において、マウスの肥満傾向の有無は、マウスの体重を、同週齡の正常系統マウスのものと比較することにより、判定することができる。判定するにあたっては、複数のサンプルを用いて、統計学的な手法（例えば有意差検定）を適用することができる。
【００３４】
４）  遺伝様式
本発明による２型糖尿病モデルマウスの特性は、常染色体性の劣性遺伝形質である。すなわち、本発明によるマウスの交配実験によれば、２型糖尿病は、常染色体劣性遺伝様式によって発症し、単純なメンデル遺伝に従った。本発明によるマウスの２型糖尿病は、その原因遺伝子をホモの状態で有する場合（ホモ接合体の場合）において発症する。一方、ヘテロ接合体の血糖値、糖化ヘモグロビン濃度、尿糖などの糖尿病に関する指標は正常である。
【００３５】
したがって、本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）と任意のラボラトリーマウスとの交配によって得られたＦ１個体は、ヘテロ接合体であるため、病変は認められない。Ｆ１個体同士の交配により得られるＦ２個体は、その約１／４はホモ接合体となるため、この個体は２型糖尿病を発症する。
【００３６】
５）  性差による発症頻度
本発明による２型糖尿病モデルマウスは、性差による発症頻度の違いがほとんど見られない。
すなわち、日本人では、１型および２型糖尿病のいずれも発症に性差はないとされている。しかしながら、２型糖尿病モデルＫＫマウスでは、雄は、一般飼料でも生後１７〜１８週齢で８０％前後が尿糖陽性を示すが、雌では、雄よりも肥満が軽度で糖尿病症状も軽度であることが報告されている（Nishimura, M., Exp. Anim., 18:147-157, 1969)。また、２型糖尿病モデルＡｋｉｔａマウスでも発症に性差が存在し、雄は雌よりも糖尿病の程度が重く１年生存率も５０％程度と悪いが、雌はほぼ１００％と正常同胞と変わらないことが報告されている（Yoshioka, M., et al. Diabetes, 46:887-894,1997）。さらに、同じく２型糖尿病モデルであるＮＳＹ（Nagoya Shibata Yasuda）マウスでは、８週齢以降糖尿病を発症するが、４８週齢までの累積発症率は雄でほぼ１００％、雌で２０％程度であることが報告されている（Ueda, H., et al. Diabetologia, 38:503-508,1995）。このように、これらマウスでは、性差による発症の差異が認められいずれも雄の頻度が高く、重症である。一方、１型糖尿病モデルであるＮＯＤマウスでも、その発症率に性差が認められている。前記したＫＫマウス等のモデルマウスとは逆に、雌の発症頻度の方が高く、生後３０週齢までの累計で雌は９０％、雄では５０％であることが報告されている（Hattori, M., et al. Science, 231:733-763, 1986）。
【００３７】
これらに対して、本発明による２型糖尿病マウスは、系統樹立過程ではあるが、これまでの観察から発症率に実質的な性差は認められない。このため、本発明によるマウスは、モデル動物実験に両性を使用することができ、十分な匹数を得ることができる。また、ヒト糖尿病の場合と同様に、発症の差異が認められないため、優れたモデルといえる。
【００３８】
マウスの継代
本発明による２型糖尿病マウス（ホモ接合体）は、雄の生殖能力が加齢に伴い低下する傾向がある。したがって、継代維持は若齢時よりホモ接合体雌雄を同居させ、繁殖を行うことが望ましい。あるいは、ヘテロ接合雄個体とホモ接合雌個体の交配によって行うこともできる。このような交配によって得られる子のうち、２型糖尿病の発症個体は雌雄共にすべてホモ接合体であり、正常個体は雌雄共にすべてヘテロ接合体個体である。
さらに次世代を得たい場合には、例えば、同様にヘテロ接合雄個体とホモ接合雌個体とによる交配により得ることができる。
【００３９】
ホモ接合体とヘテロ接合体との判別は、８から１０週齢時に血糖値および尿糖を測定することによって容易に行うことができる。最終的には、糖化ヘモグロビン値を１０から１４週齢時に測定して判定することにより、より正確に判別を行うことができる。
【００４０】
マウスの繁殖
本発明によるマウスの繁殖は、近交系動物の繁殖に通常用いられているように、兄妹交配によって増殖を行って、必要なマウス数を確保することができる。
例えば、雄のヘテロ接合個体と雌のホモ接合個体とを用いて交配させ、生まれる子の中から、前記したような判別手段を用いてホモ接合個体を選択することによって、目的とする多くの個体を得ることができる。
よって本発明の別の態様によれば、本発明による２型糖尿病モデルマウス同士を交配させ、発症する特性の原因遺伝子をホモの状態で有するマウスを選択することを含んでなる、２型糖尿病を自然発症するモデルマウスの作出方法が提供される。
【００４１】
マウスの飼育条件
本発明による２型糖尿病モデルマウスの飼育条件は、特に制限はなく慣用のマウス飼育法にしたがって飼育することができる。例えば、飼育条件は、室温２２±２℃で、湿度６５±５％のＳＰＦ環境で、飼料として、普通飼料（船橋農場製、Ｆ２）を不断給餌し、水は水道水を自由摂取させることである。またマウスは、木製チップを床敷きにしたアルミケージ内で飼育することができる。
【００４２】
本発明によるマウスは、任意のラボラトリーマウスとを交配させて得られる交雑マウスや、後述するコンジェニック系マウスを包含する。
【００４３】
本発明の別の態様によれば、前記した２型糖尿病モデルマウスの子孫であって、前記した特性を示すマウスが提供される。
ここでいう子孫には、本発明による２型糖尿病モデルマウスと、任意のラボラトリーマウスとを交配させて得られる交雑マウスや、後述するコンジェニック系マウスが包含される。
【００４４】
コンジェニック系マウス
本発明によれば、任意のラボラトリーマウスに、前記特性（１）〜（３）を発現する原因遺伝子を戻し交配により導入することによって得られるコンジェニックマウスである２型糖尿病モデルマウス、すなわちコンジェニック系マウスが提供される。このコンジェニック系マウスは、前記原因遺伝子以外についての遺伝的背景が、任意のラボラトリーマウスとなっているものである。このコンジェニック系マウスも前記原因遺伝子を有するため、２型糖尿病を発症する。
【００４５】
このようなコンジェニック系マウスは、本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）と、任意のラボラトリーマウスとを公知の戻し交雑育種法にしたがって戻し交配を進めることにより、作出することができる。このとき、供与親を本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）とし、反復親を任意のラボラトリーマウスとする。また通常戻し交配によりコンジェニック系マウスを確立する場合には、交配世代は少なくとも８世代、典型的には１２世代程度経る必要がある。
またここで用いられる任意のラボラトリーマウスとしては、例えば、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＮＣ／Ｊｉｃマウス、ＡＫＲ／Ｍｓマウス、およびＡ／Ｊマウスが挙げられる。好ましくは、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウスである。
【００４６】
具体例として本発明者は、ラボラトリーマウスとして、耐糖能に劣るＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスと、耐糖能に優れるＣ３Ｈ／Ｈｅマウスとを用いて、遺伝的背景の異なる３系統のコンジェニック系マウスの作出を行っている。
例えば後述する実施例にあるように、ＢＡＬＢ／ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、およびＣ３Ｈ／Ｈｅ系のすべての系の作出過程のものにおいて、正常系統マウスに比べて表現型に差異があることが本発明者により確認されている。このような状況から、当業者であれば、コンジェニック系マウスの作出が可能であることが理解できよう。
【００４７】
原因遺伝子をラボラトリーマウスに導入したコンジェニック系マウスは、前記した供与親である本発明による２型糖尿病モデルマウスと異なる遺伝的背景を持つ。このため、供与親である本発明による２型糖尿病モデルマウスと、コンジェニック系マウスとは、遺伝的背景の差異が２型糖尿病の病態に及ぼす影響を解析するのに有用である。
【００４８】
モデル動物としての有用性
（ａ）  本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）は、膵β細胞異常によるインスリン分泌異常が見られないものである。また本発明によるマウスには、肥満傾向がほとんど見られないものであることができる。既知の非肥満型の２型糖尿病モデルマウスは、インスリン分泌異常を伴うものである。このため、本発明によるマウスは、２型糖尿病に関する新たなモデルマウスの系統ということができ、２型糖尿病の発症機序、その予防および治療、創薬研究の分野において有用な研究用モデルマウスになると考えられる。
【００４９】
（ｂ）  本発明による２型糖尿病モデルマウスを用いることにより、そのコンジェニック系マウスの系統を構築することができる。このようなコンジェニック系マウスの系統の構築は、未だ不明な点が多い２型糖尿病の発症機序の解明、新しい治療戦略と創薬研究、オーダーメイド治療の開発、予防法の確立等に有用であると考えられる。またコンジェニック系マウスにおいて、遺伝的背景としたラボラトリーマウスを、比較対象となる正常コントロールマウスとして使用することができる。さらにコンジェニック系マウスとすることにより、マウスの繁殖性を向上させ、寿命を延ばすことが可能となる。そして、本発明においては、本発明による糖尿病マウスを、３系統の近交系マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス）にそれぞれ戻し交配手法を適用して、それぞれのコンジェニック系マウスを作出している。近交系マウスの系統間には耐糖能に差異のあることが知られており、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスより耐糖能が良いことが知られている。このように本発明によれば、耐糖能に系統間差異のある複数系統のモデルマウスを樹立することができるため、糖尿病の発症機構に関与する遺伝要因および環境要因の相互作用を解明することが可能となり、画期的な疾患モデルセットを構築できる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００５１】
作出の経緯
本発明の２型糖尿病モデルマウスは、福島県郡山市で捕獲した日本産野生マウス（Mus musculus molossinus）由来の近交系ＫＯＲマウスと、市販のアトピー性皮膚炎モデルマウスであるＮＣマウス（ＮＣ／Ｊｉｃマウス、日本クレア株式会社より入手可能）との交配により作出されたＦ２マウス中に、２００３年に見出された。前記Ｆ２マウスを収容していたケージ内床敷きに異常な水ぬれと汚れがあり、観察の結果、これらの異常な水ぬれと汚れは、多尿によることが判した。また、給水瓶の水の減り具合から多飲であることを確認し、糖尿病発症であることが疑われた。前記Ｆ２マウスの血糖値および尿糖を検査した結果、高血糖でかつ尿糖陽性であった。このようにして２型糖尿病を自然発症するマウスを見出した。
このマウスについてさらに検索を行うと同時に、この異常が遺伝的疾患であることを想定して、両親および同腹の兄妹の交配実験によって２型糖尿病のマウスを分離、継代し、本発明によるマウスを得た。
すなわち、本発明による２型糖尿病モデルマウスは、そのＫＯＲ系と市販のＮＣ系の雑種中に突然変異として見出されたものを、突然変異系統の２型糖尿病モデルマウスとして確立したものである。なお、最初に見出された背景の一方となるＫＯＲ系は、すでにＦ２４世代以上の近交系となっている。
【００５２】
本発明による２型糖尿病モデルマウスは、室温は２２±２℃，湿度６５±５％のＳＰＦ環境で飼育した。飼料は普通飼料（船橋農場製、Ｆ２）を不断給餌した。水は水道水を給水瓶から自由摂取させ、木製チップを床敷きにしてアルミケージで飼育した。
【００５３】
血糖値の測定
検体マウスの血糖値（血中グルコース濃度）は、市販の測定機（メディセーフ・リーダー、株式会社テルモ製）を用いて測定した。この測定機の原理を説明すると以下のとおりである。測定法は比色法によるものである。測定用チップを用意し、この測定用チップに、触媒としてのグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼと、発色剤としての４−アミノアンチピリンおよびＮ−エチルーＮ（２−ヒドロキシー３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンとをセットしておく。毛細管現象により吸引された血液を、このチップ上にのせると、血中のグルコースがグルコースオキシダーゼによって酸化される。そして、この時に発生した過酸化水素とペルオキシダーゼとによりチップ上の発色剤が酸化され、赤紫色に発色する。血中のグルコース量は、この色調の度合いを測定して算出される。
ここでは、検体マウスから血液サンプルとして、全血４μＬを得、これを、測定時間を１８秒間として測定した。
【００５４】
本発明による２型糖尿病マウス（ホモ接合体）として、サンプル個体＃１および＃３を用意し、これらについて、血糖値を測定した。また、比較例として、正常系統マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスの血糖値も併せて測定した。
結果は、表１に示される通りであった。
【００５５】
表１：
サンプル個体      血糖値（mg/dl）   尿糖    血中インスリン濃度(pg/ml)
＃１            ５２９            ＋４          ４０              
＃３            ４７０            ＋４          ９０              
比較例        １００−１１０      −          １１０               
【００５６】
尿糖の測定
検体マウスの尿中ブドウ糖（尿糖）は、市販のキット（プレテスト、和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。測定は、まず検体であるマウスの尿を前記プレテストの試験紙に染み込ませ、３０秒後に該キット所定の色調表にしたがって試験紙を判定することにより、尿糖レベルを−〜＋４までの５段階に分類した。ここで、判定結果が＋１の場合には、尿中ブドウ糖濃度は、１００〜２５０ｍｇ／ｄｌであり、＋２の場合には２５０〜５００ｍｇ／ｄｌ、＋３の場合には５００〜２,０００ｍｇ／ｄｌ、＋４の場合には２,０００ｍｇ／ｄｌ以上であることを意味する。この内、判定結果が＋１以上である場合を「尿糖陽性」であるとした。
【００５７】
本発明による２型糖尿病マウス（ホモ接合体）として、サンプル個体＃１および＃３を用意し、これらについて尿糖を測定した。また、比較例として、正常系統マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスの尿糖も併せて測定した。
結果は、表１に示される通りであった。
【００５８】
血中インスリン濃度の測定
検体マウスの血中インスリン濃度は、市販のキット（レビスインスリン測定キットＵ−タイプ、株式会社シバヤギ製）を用いて測定した。測定は、プレートに抗インスリンモノクローナル抗体（マウス）を固相化しておき、検体中のインスリンをこれに結合させた後、インスリンの別な部位を認識するビオチン標識抗インスリンモノクローナルを反応させ、ここにさらに、ペルオキシダーゼ−アビジン結合物を加えてビオチンに結合させ、最後に色原性基質を加えて発色させることによって、インスリンを測定した。なお測定範囲は、通常マウスで３９〜２,５００ｐｇ／ｍｌである。
【００５９】
本発明による２型糖尿病マウス（ホモ接合体）として、サンプル個体＃１および＃３を用意し、これらについて血中インスリン濃度を測定した。また、比較例として、正常系統マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスの血中インスリン濃度も併せて測定した。
結果は、表１に示される通りであった。
【００６０】
耐糖能の評価
検体マウスの耐糖能を、以下のような糖負荷試験にしたがって評価した。
糖負荷試験は、まず１２時間絶食状態にしたマウスに、体重１ｇ当たり１ｍｇのブドウ糖を腹腔内投与し、その後１８０分間にわたって３０分毎に、そのマウスの血糖値（末梢血）を測定することにより行った。なお血糖値は、前記した測定法にしたがって測定した。測定の結果、時間の経過に伴って血糖値が、正常系統マウスの場合のように減少する傾向が認めらない場合には、耐糖能は異常であると判断した。
【００６１】
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）としてサンプル個体＃３（６ヶ月齢）と、比較例として正常系統マウスであるＫＯＲマウス（３ヶ月齢）およびＮＣマウス（３ヶ月齢）とを用意し、これらについて糖負荷試験を行った。
結果は、図１に示される通りであった。
【００６２】
病理学的検索
本発明による２型糖尿病マウス（ホモ接合体）の膵臓組織と、正常マウス（ＫＯＲマウス）の膵臓組織とをそれぞれ、１０％フォルマリン固定後パラフィン包埋し、常法に従ってヘマトキシリン・エオジン（Ｈ−Ｅ）染色を行い、これを顕微鏡（倍率４００倍）により観察した。
その結果、本発明によるマウスでは、膵臓組織、特に膵島β細胞の一部に正常マウスと比べると若干の萎縮が見られたものの、膵島β細胞の損傷または破壊は認められなかった。
【００６３】
マウスの肥満傾向の有無の判定
コンジェニック系作出途中のＦ２マウスにおいて、発症マウス（ホモ接合体）と非発症マウス（ヘテロ接合体および正常ホモ接合体）間の体重を測定し、それらを比較した。
Ｃ５７ＢＬ／６系の雄について体重を比較したところ、発症マウスでは３５．６±８．３ｇ（ｎ＝２８（ここでｎは測定個体数を表す））であり、非発症マウスでは３６．７±９．７ｇ（ｎ＝４２）であった。したがって、発症マウス（ホモ接合体）と非発症マウスとの間には、体重に有意の差は認められなかった。
【００６４】
コンジェニックマウスの作出
本発明による２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）と、ラボラトリーマウスとを公知の戻し交雑育種法にしたがって戻し交配を進めることにより、コンジェニック系マウスの作出を行った。戻し交配では、供与親を２型糖尿病モデルマウス（ホモ接合体）とし、反復親を所定のラボラトリーマウスとした。
ラボラトリーマウスとしては、耐糖能に劣るＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスと、耐糖能に優れるＣ３Ｈ／Ｈｅマウスとを用いた。これにより、遺伝的背景の異なる３系統のコンジェニック系マウスが作出される。
【００６５】
コンジェニック系マウスを確立する過程で得られたＢＡＬＢ／ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、およびＣ３Ｈ／Ｈｅ系の３つの系統の交配マウス（Ｆ２の発症個体）について、それぞれ血糖値および糖化ヘモグロビン濃度を測定した。血糖値の測定は、前述の測定法に従って行った。
血中の糖化ヘモグロビン濃度は、市販の測定機（ＤＣＡ２０００システム、バイエルンメディカル社製）を用いて測定した。この測定原理は、総ヘモグロビン量はチオシアンメトヘモグロビン法に従い測定し、また、糖化ヘモグロビン量はラテックス凝集阻止反応により測定するものであった。ここでは、測定範囲は２．５％〜１４．０％であり、２．５％未満の場合は＜２．５％と表示することとした。まず、検出サンプルとして全血１μｌをキャピラリーに充填して本体にセットした。測定時間を６分間とした。
【００６６】
また、比較例として、正常系統マウスであるＣ５７ＢＬ／６マウスについても併せて測定した。
結果は、表２に示される通りであった。
【００６７】
表２：
血糖値(mg/dl)     ＳＤ      ＨｂＡ１ｃ(%)    ＳＤ     
Ｃ３Ｈ／Ｈｅ (n=8)    １４６．５    ４４．９      ２．５      ０．１    
Ｃ５７ＢＬ／６ (n=16) １５１．３    ３１．２      ３．０      ０．２    
ＢＡＬＢ／ｃ (n=7)    １４３．６    ２３．７      ３．１      ０．４    
比較例   (n=9)      １００−１１０  １９．３    ＜２．５      ０．１    
なお表中ＳＤは標準偏差を意味し、ｎは、測定に使用した個体数であり、血糖値および糖化ヘモグロビン濃度は、測定個体数の平均値である。
【００６８】
表から明らかなように、糖化ヘモグロビン濃度については、遺伝的背景の差異によると推定される有意差が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】実施例における糖負荷試験の結果を示す図である。
【図１】
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