(57)【要約】    【課題】  被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる、新規の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法を提供する。    【解決手段】  表皮細胞に接触させた被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用と、表皮細胞のＶＲ１活性とを関連付けて、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮細胞に接触させた被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用と、表皮細胞のＶＲ１活性とを関連付けて、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を検出することを特徴とする表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法。
【請求項２】
被験物質の接触により表皮細胞のＶＲ１活性が認められた場合に、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用があるものと判定することを特徴とする表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法。
【請求項３】
被験物質による表皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の変動を指標として、表皮細胞のＶＲ１活性を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法を用いて、ケミカルピーリング剤の候補となる物質を選定する工程を含むことを特徴とするケミカルピーリング剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項４記載のスクリーニング方法で選定されたケミカルピーリング剤を用いることを特徴とする表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法。
【請求項６】
表皮細胞にＶＲ１活性を与えることを特徴とする表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法。
【請求項７】
表皮細胞にＶＲ１活性を与える成分を含有することを特徴とするケミカルピーリング剤。
【請求項８】
表皮細胞におけるＶＲ１活性を検出する検出手段を備えたことを特徴とする表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置。
【請求項９】
前記検出手段は表皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の変動を検出するものであることを特徴とする請求項８記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置。
【請求項１０】
前記検出手段が検出したカルシウムイオン濃度の変動が所定の値を超えた場合に表皮細胞がＶＲ１活性を有すると判定する判定手段を備えたことを特徴とする請求項９記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法に関し、さらに、皮膚のシワ、シミ、クスミ、ニキビ等の改善を図ることができるケミカルピーリング剤のスクリーニング方法、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケミカルピーリングとは、薬剤を皮膚に塗布し、その作用により表面を剥離させることである。ケミカルピーリングの薬剤（ケミカルピーリング剤）としては、例えば、グリコール酸、サリチル酸、トリクロール酢酸及び乳酸などが知られている。そして、ケミカルピーリングを利用して、その後の創傷治療やそれに伴う炎症反応によって皮膚の再生を促すことで、シワ、シミ、クスミ、ニキビ等の肌の治療が行われている。
【０００３】
ケミカルピーリングは、その作用がわかっているものの、メカニズムについて得られている知見はまだ少ない。非特許文献１は、α−ヒドロキシ酢酸（グリコール酸）を用いたケミカルピーリングにおいて、ケラチノサイトから放出されるサイトカインＩＬ−１αが真皮線維芽細胞のコラーゲン合成を促進することを開示している。また、特許文献１では、α−ヒドロキシ酢酸が真皮線維芽細胞を増殖させることを開示しているが、ケミカルピーリングとの関連及びそのメカニズムに関しては開示していない。
【０００４】
ところで、哺乳動物の皮膚細胞膜には、神経細胞膜において認められる各種神経系情報伝達物質の受容体と同等のものが存在することが近年見出されている。しかし、神経系情報伝達のメカニズムについてはかなり解明されるに至っているものの、皮膚細胞におけるそれら受容体の働きについてはほとんど研究されていなかった。
【０００５】
例えば、１９９７年、Ｃａｔｅｒｉｎａらにより神経細胞受容体であるＶＲ１受容体（ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  １：以下、ＶＲ１という）がクローニングされた（非特許文献２）。ＶＲ１は別名カプサイシン受容体とも呼ばれ、構造的にＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャンネルファミリーに属する６個の膜貫通ドメインを有するカチオンチャンネルＴＲＰＶ１である。ＶＲ１は、トウガラシ莢果の成分であるカプサイシンや、組織損傷の結果として生じる熱及びプロトンなどにより活性化され、カチオン、主としてカルシウムイオンの輸送を起こす。前記イオンは濃度勾配の低い方へ流れ、最初に脱分極、そして神経末端からの神経伝達物質の遊離を引き起こす。このＶＲ１は表皮細胞にも存在し、ＶＲ１刺激により表皮細胞内のカルシウムイオン濃度が変動することが明らかにされている（特許文献２）。しかし、表皮細胞のＶＲ１が表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖と関連するという知見は得られていなかった。
【特許文献１】特開平５−１１２４２２号公報
【特許文献２】特開２００２−３７２５３０号公報
【非特許文献１】Exp Dermatol, 12(Supply 2), 57-63, 2003. Okano Y, Funasaka Y. et al.
【非特許文献２】Nature 389, 816-824, 1997. Caterina MJ, Schumacher MA, TominaGA M, Rosen TA, Levine JD, Juius D.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、ケミカルピーリングのメカニズムに関して得られている知見はまだ少ない。本発明者らは、表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖のメカニズムを明らかにすることができれば、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができると考えた。
【０００７】
そこで、本発明は、ケミカルピーリング剤による表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖のメカニズムを明らかにするとともに、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる、新規の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法と、ケミカルピーリング剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、代表的なケミカルピーリング剤であるグリコール酸（以下、ＧＡという）による表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖のメカニズムを解明するのに成功した。そのメカニズムは、「ＧＡが表皮細胞のＶＲ１を刺激→表皮細胞内へＣａ2+が流入→表皮からＡＴＰが遊離→表皮細胞が増殖・表皮からＩＬ−１αが遊離→真皮線維芽細胞が増殖」というものである。酸などの刺激によりＶＲ１が活性化することにより、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖が促進されるということはこれまで報告されておらず、ＶＲ１と表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖との関連を見出したことは、上記メカニズムを解明する上で特に重要であった。
【０００９】
そして、このメカニズムの解明により、表皮細胞内のＶＲ１の活性を評価し、ケミカルピーリング剤の候補となる物質を選定できることを見出し、本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は、以下の通りである。
【００１０】
本発明の請求項１記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法は、表皮細胞に接触させた被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用と、表皮細胞のＶＲ１活性とを関連付けて、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を検出することを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項２記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法は、被験物質の接触により表皮細胞のＶＲ１活性が認められた場合に、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用があるものと判定することを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項３記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法は、被験物質による表皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の変動を指標として、表皮細胞のＶＲ１活性を評価することを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項４記載のケミカルピーリング剤のスクリーニング方法は、請求項１〜３のいずれか１項記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法を用いて、ケミカルピーリング剤の候補となる物質を選定する工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項５記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法は、請求項４記載のスクリーニング方法で選定されたケミカルピーリング剤を用いることを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項６記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法は、表皮細胞にＶＲ１活性を与えることを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項７記載のケミカルピーリング剤は、表皮細胞にＶＲ１活性を与える成分を含有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項８記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置は、表皮細胞におけるＶＲ１活性を検出する検出手段を備えたことを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項９記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置は、前記検出手段は表皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の変動を検出するものであることを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項１０記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置は、前記検出手段が検出したカルシウムイオン濃度の変動が所定の値を超えた場合に表皮細胞がＶＲ１活性を有すると判定する判定手段を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の請求項１記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法によれば、表皮細胞に接触させた被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用と、表皮細胞のＶＲ１活性とを関連付けることにより、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる。表皮細胞内のＶＲ１活性が高いほど、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用が大きくなり、表皮細胞内のＶＲ１活性が低いほど、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用が小さくなる。
【００２１】
本発明の請求項２記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法によれば、被験物質の接触により表皮細胞のＶＲ１活性が認められた場合に、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用があるものと判定することにより、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる。
【００２２】
本発明の請求項３記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法によれば、被験物質による表皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の変動を指標として、表皮細胞のＶＲ１活性を評価することにより、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる。
【００２３】
本発明の請求項４記載のケミカルピーリング剤のスクリーニング方法によれば、ＶＲ１活性を評価し、ケミカルピーリング剤の候補となる物質を選定することにより、膨大な数の化合物から選定していくという従来の手法に比べて、有効な作用を有するケミカルピーリング剤を迅速、かつ的確に見つけることができる。また、高いＶＲ１活性を与える物質からは、ケミカルピーリング作用が強い物質を、低いＶＲ１活性を与える物質からは、ケミカルピーリング作用が弱い物質を選定することができる。このため、ＶＲ１活性を評価することにより、ケミカルピーリング作用を強くする、又はケミカルピーリング剤による皮膚刺激・ピリピリ感・痛みを抑えるためにケミカルピーリング作用を弱める等の目的に応じたケミカルピーリング剤をスクリーニングできる。
【００２４】
本発明の請求項５記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法によれば、ＶＲ１活性の評価により選定されたケミカルピーリング剤を用いて、表皮細胞及び真皮線維芽細胞を賦活化させることができる。目的に適したケミカルピーリング剤を選定することにより、その表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活化を調節できる。
【００２５】
本発明の請求項６記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法によれば、表皮細胞にＶＲ１活性を与えることで、確実に表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活化が達成でき、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖に寄与できる。
【００２６】
本発明の請求項７記載のケミカルピーリング剤によれば、表皮細胞にＶＲ１活性を与える成分を含有することで、確実に表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活化が達成でき、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖に寄与でき、皮膚のシワ、シミ、クスミ、ニキビ等の改善を図ることができる。
【００２７】
本発明の請求項８記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置によれば、表皮細胞におけるＶＲ１活性を検出することで、表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる。
【００２８】
本発明の請求項９記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置によれば、表皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の変動を検出することで、表皮細胞におけるＶＲ１活性を簡便、かつ迅速に検出することができる。
【００２９】
本発明の請求項１０記載の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置によれば、検出手段が検出したカルシウムイオン濃度の変動が所定の値を超えた場合に表皮細胞がＶＲ１活性を有すると判定することで、表皮細胞がＶＲ１活性を有することを簡便に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３１】
本発明は、発明者らが解明した、ＧＡによる表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖のメカニズムに基づくものである。そのメカニズムは、「ＧＡが表皮細胞のＶＲ１を刺激→表皮細胞内へＣａ2+が流入→表皮からＡＴＰが遊離→表皮細胞が増殖・表皮からＩＬ−１αが遊離→真皮線維芽細胞が増殖」という、一連のステップで、ＧＡの刺激によりＶＲ１が活性化することにより、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖が促進されるというものである。
【００３２】
本発明の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法は、上記のＶＲ１を介した表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖メカニズムを利用するものであり、表皮細胞に接触させた被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用と、表皮細胞のＶＲ１活性とを関連付けて、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を検出するものである。あるいは、被験物質の接触により表皮細胞のＶＲ１活性が認められた場合に、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用があるものと判定するものである。
【００３３】
ここで、表皮細胞とは、皮膚の表皮部分を形成する細胞である。表皮細胞は培養表皮細胞でもよい。表皮細胞の一つであるケラチノサイトは、培養細胞の入手が容易であるため本発明において好適である。また、表皮細胞の由来は限定されず、人、マウスなど幅広い動物を適用可能である。また、真皮線維芽細胞についても特定のものに限定されるものではない。
【００３４】
本発明におけるＶＲ１活性を評価する方法については特定の方法に限定されるものではないが、例えば、細胞内のカルシウムイオンの濃度の変動を指標としてＶＲ１の活性を評価することができる。カルシウムイオン濃度の変動を検出するための方法については、従来から知られている方法を用いることができ、例えば、カルシウムイオン濃度に応じて呈色が認められる試薬（カルシウム指示薬）と表皮細胞を接触させて、その色の変化を評価することにより、カルシウムイオン濃度の変動を検出することができる。カルシウム指示薬としては、カルシウムとの結合により蛍光強度が変化するＦｕｒａ−２ＡＭ、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３、Ｒｈｏｄ−２等が知られている。また、カルシウム指示薬として、エクオリン等のカルシウム感受性発光タンパク質を用いることもできる。
【００３５】
このように、カルシウムイオン濃度の変動を検出する方法によって、表皮細胞内のカルシウムイオン濃度と、ＶＲ１活性を結びつけることで、表皮細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇した場合に、ＶＲ１活性があると判定することができる。また、表皮細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇が大きいほど、ＶＲ１の活性が高く、表皮細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇が少ないほど、ＶＲ１の活性が低いと判定することができる。
【００３６】
そして、表皮細胞に接触させた被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用と、表皮細胞のＶＲ１活性とを関連付けることにより、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる。なお、表皮細胞内のＶＲ１活性が高いほど、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用が大きくなり、表皮細胞内のＶＲ１活性が低いほど、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用が小さくなる。
【００３７】
つぎに、本発明のケミカルピーリング剤のスクリーニング方法について説明する。なお、本発明のケミカルピーリング剤のスクリーニング方法は、上記表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出方法を用いるものであり、ケミカルピーリング剤の候補となる物質を選定する工程を含んでいる。
【００３８】
まず、被験物質を表皮細胞に接触させる。つぎに、表皮細胞のＶＲ１活性を評価する。ＶＲ１活性の評価には、細胞内のカルシウムイオンの濃度の変動を指標とすることができる。そして、前述のように、表皮細胞内のＶＲ１の活性が高いほど、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用が大きくなり、表皮細胞内のＶＲ１の活性が低いほど、被験物質の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用が小さくなる。そして、表皮細胞のＶＲ１活性に基づき、ケミカルピーリング剤の候補となる物質を選定する。
【００３９】
ここで、ＶＲ１の活性が高いときは、ケミカルピーリング作用が強い物質であり、ＶＲ１の活性が低いときはケミカルピーリング作用が弱い物質である。このため、ＶＲ１の活性を評価することにより、ケミカルピーリング作用を強くする、又はケミカルピーリング剤による皮膚刺激・ピリピリ感・痛みを抑えるためにケミカルピーリング作用を弱める等の目的に応じたケミカルピーリング剤をスクリーニングできる。
【００４０】
さらに、本発明の表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法は、本発明のケミカルピーリング剤のスクリーニング方法で選定されたケミカルピーリング剤を用いるものであり、表皮細胞及び真皮線維芽細胞を賦活化させることができる。そして、目的に適したケミカルピーリング剤を選定することにより、その表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活化を調節できる。
【００４１】
また、本発明の表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活方法は、表皮細胞にＶＲ１活性を与えるものである。表皮細胞にＶＲ１活性を与えることで、確実に表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活化が達成でき、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖に寄与できる。なお、表皮細胞にＶＲ１活性を与える手段については、特定の手段に限定されない。
【００４２】
本発明のケミカルピーリング剤は、ＶＲ１を介した表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖メカニズムを利用するものであり、表皮細胞にＶＲ１活性を与える成分を含有している。表皮細胞にＶＲ１活性を与える成分を含有することによって、確実に表皮細胞及び真皮線維芽細胞の賦活化が達成できる。そして、本発明のケミカルピーリング剤を皮膚に塗布することによって、表皮細胞及び真皮線維芽細胞が増殖し、皮膚のシワ、シミ、クスミ、ニキビ等の改善を図ることができる。
【００４３】
さらに本発明では、表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置（図示せず）を提供する。その検出装置は、表皮細胞におけるＶＲ１活性を検出する検出手段を備えたものである。この検出手段としては、ＶＲ１活性を検出できるものであればよく、特定のものに限定されるものではないが、ＶＲ１活性とカルシウムイオン濃度の変動が関連していることから、検出手段としては表皮細胞におけるカルシウムイオン濃度の変動を検出するものが好ましい。
【００４４】
より具体的には、例えば、蛍光強度比を測定できる装置で検出手段を構成することができる。この場合、既知のカルシウム指示薬と表皮細胞を接触させて、その蛍光強度比の変化を測定することにより、簡便にカルシウムイオン濃度の変動を検出することができる。
【００４５】
さらに、本発明の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置は、検出手段が検出したカルシウムイオン濃度の変動が所定の値を超えた場合に表皮細胞がＶＲ１活性を有すると判定する判定手段を備えたものである。この判定手段は、検出手段からの検出信号を受けて、その検出信号の変動の大きさ等に基づいて表皮細胞のＶＲ１活性の有無を判定するものであり、コンピュータプログラムで構成することができる。なお、この判定手段による判定結果を表示する、ディスプレイ等の表示手段をさらに設けてもよい。
【００４６】
このように、本発明の表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用の検出装置によれば、表皮細胞におけるＶＲ１活性を検出することで、表皮細胞及び真皮線維芽細胞増殖作用を簡便、かつ迅速に検出することができる。また、検出手段が検出したカルシウムイオン濃度の変動が所定の値を超えた場合に表皮細胞がＶＲ１活性を有すると判定することで、表皮細胞がＶＲ１活性を有することを簡便に判定することができる。
【００４７】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
（実験１）マウス皮膚へのＧＡの塗布実験
目的：ＧＡ塗布による表皮増殖活性の変化および皮膚組織形態の変化を調べる。
【００４９】
方法：正常ヘアレスマウス（ＨＲ−１）の背面を正中線で左右に分け、片側のみに４０％（ｗ／ｖ）ＧＡ溶液５０μｌを１０分間塗布後、温水で洗い流した。ＧＡのｐＨは１．３，２．０，２．４，２．８の４種類を用いた。この塗布を３〜４日おきに繰り返し、合計３回行った。最後の塗布から４８時間後に皮膚を採取した。また、人為的な皮膚バリア機能破壊モデルとして別のマウスにテープストリッピング（セロハンテープを貼ってはがす作業を４回繰り返し行ったもの）を行い２時間後に皮膚を採取した。各マウスのコントロールとして、塗布しなかった側の皮膚を採取した。これらの皮膚組織は定法に従いパラフィンブロックに包埋し、薄切切片を作製した。この切片でＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色を行い組織の形態を比較した。
【００５０】
結果：図１は、ＧＡ３回塗布４８時間後のＨＥ染色像である。なお、この各ＨＥ染色像中、上方のやや色の濃い帯状の部分が表皮であり、その下の部分が真皮である。実験１により、炎症を惹起するテープストリッピングとＧＡによるケミカルピーリングの違いが明らかになった。どちらも表皮肥厚が見られ、表皮細胞の増殖活性を増加させるが、ＧＡの作用の方が弱かった。ＧＡはｐＨが低いほど表皮肥厚の作用が強かった。ＧＡ（ｐＨ２．８〜２．０）により炎症は生じなかった。また、テープストリッピングは皮膚バリアを破壊するが、ＧＡは角層水分蒸発量の変化が少なく、ほとんど皮膚バリアを破壊しなかった。以上の結果より、ＧＡは炎症や皮膚バリア破壊を起こさず、マイルドな表皮細胞の増殖を促す作用があることが確認された。
【００５１】
（実験２）テストスキンへのＧＡ塗布実験
目的：テストスキンへのＧＡ塗布後の細胞増殖活性の変化及びそのメカニズムを解析する。
【００５２】
方法：テストスキンは、ヒト由来表皮ケラチノサイト（表皮細胞の一つである表皮角化細胞）から成る表皮層と真皮線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲルから成る３次元皮膚モデルであり、特に表皮層はマウスよりもヒトの皮膚に近い厚さをもち、培養しながら情報伝達物質などの測定が容易である。表皮の上には角質層も形成されており、薬剤の塗布と除去が可能である。
【００５３】
そこで、東洋紡製のテストスキン（ＬＳＥ−Ｈｉｇｈ）を添付プロトコールに従って培養した。添付のシリコンリングを表皮上に装着し、２００μｌの４０％ＧＡ溶液（ｐＨ１．３，２．０，２．４，２．８）をリングの中央に入れ一定時間後（１．５分，３分，５分）、ＧＡを吸引除去した。さらに培養液で３回表面を洗浄し完全に水分を吸引除去し、培養を続けた。このＧＡ処理の１０分後および１時間後に培養液を回収し、新しい培養液に交換した。
【００５４】
続いて２４時間後または４８時間後に培養液とテストスキンを回収した。回収の２時間前にＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン）を培養液に添加し（終濃度５０μＭ）、複製中の細胞のＤＮＡを標識した。回収した培養液はＡＴＰおよびサイトカインの測定に用いた。ＡＴＰは、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のＡＴＰ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＣＬＳ  II，シグマ社製のＡＴＰ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製のＡＴＰ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔなどを用い、各社のプロトコールに従ってルシフェラーゼ発光法によって定量した。ＩＬ―１αおよびＦＧＦ―７はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔなどを用いてＥＬＩＳＡ法で定量した。テストスキンは中央部を直径８ｍｍのバイオプシーパンチで採取し、定法に従いパラフィンブロックに包埋し、薄切切片を作製した。この切片を抗ＢｒｄＵ抗体で免疫染色し、ＢｒｄＵで標識された細胞核の数をカウントし、細胞増殖活性の指標とした。
【００５５】
ＶＲ１アンタゴニストの影響を調べる実験ではカプサゼピンを、ＶＲ１アゴニストの影響を調べる実験ではカプサイシンを、それぞれ１０μＭになるよう予め培養液に添加してからＧＡ処理を行った。各薬剤の添加のみの影響を調べるため、薬剤を培養液に添加しＧＡ処理をしないものについても同様に実験を行った。
【００５６】
なお、この実験では、細胞増殖の評価の方法として、ＢｒｄＵ陽性の表皮細胞及び真皮繊維芽細胞数を計測する方法を用いた。ＢｒｄＵは、チミジンの類似体として複製中のＤＮＡに取り込まれ、増殖中の細胞の識別に用いられる。ＢｒｄＵを添加して１〜２時間後に組織を採取しＢｒｄＵに対する抗体で染色すると、増殖中の細胞の核が染まる。この核が多いほど増殖活性が高い。
【００５７】
結果：
（１）ＧＡ（ｐＨ２．８）による細胞増殖活性（ＢｒｄＵ陽性細胞数）
図２に、ＧＡ（ｐH２．８）塗布２４時間後の抗ＢｒｄＵ染色画像を示し、図３に、ＧＡ（ｐH２．８）塗布２４時間後のＢｒｄＵ陽性細胞数を示す。図４には、表皮増殖活性に対するＶＲ１アンタゴニストの影響を示す。
【００５８】
図２に示すように、ＧＡ塗布によってＢｒｄＵを取り込み染色された細胞数が増加した。なお、この図２において、各抗ＢｒｄＵ染色画像中、上方の帯状の部分が表皮、その下の部分が真皮に相当する部分であり、染色された細胞は矢印で示されるように濃色の点として現れている。また、図３に示すように、ＧＡ塗布によって表皮のＢｒｄＵ陽性細胞数が増加した。特に、ＧＡ１．５分処理で有意（ｐ＜０．０５)に増加した。また、真皮線維芽細胞でもＧＡによりＢｒｄＵ陽性細胞数が増加した。これらの結果より、ＧＡによって表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖活性が高められることが確認された。さらに、図４に示すように、ＶＲ１アンタゴニストであるカプサゼピンにより、ＢｒｄＵ陽性細胞数の増加が抑制された。
【００５９】
（２）培地中の遊離ＡＴＰの定量
図５に、ＧＡ塗布による培地中へのＡＴＰ遊離を示し、図６には、ＡＴＰ遊離に対するＶＲ１アンタゴニスト及びアゴニストの影響について示す。図５に示すように、ＧＡ塗布により培地中へＡＴＰが遊離されることがわかった。ＧＡ処理１０分後までに最も多くＡＴＰが遊離され、ＡＴＰ量はｐＨ１．３では高レベルになった。また、図６に示すように、ＶＲ１アンタゴニストであるカプサゼピン及びＶＲ１アゴニストであるカプサイシンにより、ＧＡによるＡＴＰ遊離が阻害されることがわかった。
【００６０】
（３）培地中の遊離ＩＬ−１αおよびＦＧＦ−７の定量
図７に、ＧＡ塗布による培地中へのＩＬ−１α遊離及びＦＧＦ−７遊離を示す。図７に示すように、ＧＡ塗布により培地中へのＩＬ−１α及びＦＧＦ−７が遊離されることが確認された。ＩＬ−１α及びＦＧＦ−７の遊離はＧＡ添加直後ではなく、２４時間経過後に増加した。
【００６１】
なお、ケラチノサイトにＡＴＰを与えるとＰ２レセプターを介してＩＬ−１αなどのサイトカイン産生を促進することが報告されており（特願２００４−０７４６３８）、表皮−真皮相互作用にＩＬ−１α、ＦＧＦ−７が互いの増殖を促進していることが報告されている（Szabowski A et al., Cell 103, 745-755, 2000）。さらに、ケラチノサイトにおいて低濃度ＡＴＰは細胞増殖作用を有することが報告されている（Aina V. H. Grcig et al., J.Invest.Dermatol. 120, 1007-15, 2003）。したがって、ＡＴＰの遊離後、表皮からＩＬ−１α、真皮からＦＧＦ−７が遊離し、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖を促進していると考えられる。
【００６２】
（４）まとめ
上記の結果（１）、（２）、（３）及び公知文献より、ＧＡはＶＲ１を介して表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖を促進していることが確認された。また、その作用にはＡＴＰが関与しており、ＡＴＰの遊離によって、表皮からＩＬ−１α、真皮からＦＧＦ−７が遊離し、表皮細胞及び真皮線維芽細胞の増殖を促進していることがわかった。
【００６３】
なお、図６に示すようにＶＲ１アゴニストであるカプサイシンによりＧＡによるＡＴＰ遊離が阻害されるのは、脱感作のためであると考えられる。脱感作はカプサイシンに長くさらされた神経においても見られ、これを利用して筋肉の塗り薬が開発されている。
【００６４】
（実験３）ＧＡによる表皮ケラチノサイトの細胞内カルシウム流入
目的：細胞レベルでカルシウム流入を指標として、カルシウムチャネルであるＶＲ１が開くかどうかを調べる。
【００６５】
方法：井上らの方法（Inoue K., et.al.,BBRC 291, 124-129, 2002）に従って行った。ここでは概略を述べる。正常ヒト表皮ケラチノサイトはクラボウ社より購入し、添付プロトコールに従って培養した。８−ｗｅｌｌ−ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅにケラチノサイトを播種し、８０〜９０％コンフルエントになったときにカルシウム指示薬（Ｆｕｒａ−２ＡＭ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）１０μＭを含む培養液で平衡化し、緩衝液ＢＳＳ（Ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；  ＮａＣｌ  １５０ｍＭ，  ＫＣｌ  ５ｍＭ，  ＣａＣｌ2  １．８ｍＭ，  ＮａＨ2ＰＯ4  １．２ｍＭ，  ＭｇＣｌ2  １．２ｍＭ，  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｍＭ，  ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ，  ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）で洗浄後、倒立蛍光顕微鏡下で潅流しながら経時的に蛍光画像（波長３４０ｎｍ、３８０ｎｍ）を記録し、蛍光強度比を計算した。ＧＡなどの酸溶液は、ＢＳＳの組成からＨＥＰＥＳを除いたものに酸を１００〜５００ｍＭ溶かしＮａＯＨでｐＨを調整したものを用いた。酸による刺激は酸溶液を５〜１０秒間流すことにより行い、同じ細胞に対して２回刺激を行った。ＶＲ１アンタゴニストの影響をみる実験ではカプサゼピン１０μＭを含むＢＳＳであらかじめ潅流した後、同様にカプサゼピン１０μＭを含む酸溶液で刺激を行った。
【００６６】
結果：図８は、細胞内カルシウムイオンの変化（蛍光強度比）の時間変化を表すグラフである。ケラチノサイトに直接ＧＡを作用させた直後にカルシウムイオンの流入が起こり、その流入はＶＲ１アンタゴニストであるカプサゼピンで阻害されることがわかった。この結果より、ケラチノサイト上のＧＡに対するレセプターチャネルはＶＲ１であることが確認された。
【００６７】
（実験４）ヒト皮膚からのＡＴＰ遊離の検出
目的：ヒト皮膚にＧＡを塗布した直後にＡＴＰが放出されることをＥｘ  ｖｉｖｏで確認する。
【００６８】
方法：顔面の形成外科手術の際の余剰皮膚を用いた。皮膚は切除後１×１．５ｃｍの四角形に切り分け、コントロール（ＧＡ塗布せず洗浄操作のみ）群とＧＡ塗布群に分けた。ＧＡ塗布群には表皮角層上に４０％ＧＡ溶液（ｐＨ２．８）を３分間塗布した。その後ＧＡ溶液を拭き取り、ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＳを入れたシャーレに角層を上にして浮かべ、１０分および２５分後にＢＳＳ中のＡＴＰを測定した。測定方法は実験２で述べた方法と同様にした。
【００６９】
結果：図９は、ＧＡ塗布によるヒト皮膚からのＡＴＰ遊離を示したグラフである。ヒト皮膚でも、ＧＡ塗布直後１０分以内にＡＴＰが放出された。
【００７０】
実験１〜実験４の結果より、「ＧＡが表皮細胞のＶＲ１を刺激→表皮細胞内へＣａ2+が流入→表皮からＡＴＰが遊離→表皮細胞が増殖・表皮からＩＬ−１αが遊離→真皮線維芽細胞が増殖」というメカニズムによって、表皮細胞及び真皮線維芽細胞が増殖することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】実験１におけるＧＡ３回塗布４８時間後のＨＥ染色像である。ＮＴはコントロールを、ＴはＧＡで処理されたことを示す。
【図２】実験２におけるＧＡ（ｐH２．８）塗布２４時間後の抗ＢｒｄＵ染色像である。
【図３】実験２におけるＧＡ（ｐH２．８）塗布２４時間後のＢｒｄＵ陽性細胞数を示すグラフである。
【図４】実験２における表皮増殖活性に対するＶＲ１アンタゴニストの影響を示すグラフである。ＧＡの処理時間３分、ｐＨ２．８。
【図５】実験２におけるＧＡ塗布による培地中へのＡＴＰ遊離を示すグラフである。左側の図はｐＨ２．８のＧＡ、右側の図は処理時間３分。
【図６】実験２におけるＡＴＰ遊離に対するＶＲ１アンタゴニスト及びアゴニストの影響を示すグラフである。ＧＡの処理時間３分、ｐＨ２．４。
【図７】実験２におけるＧＡ塗布による培地中へのＩＬ−１α及びＦＧＦ−７遊離を示すグラフである。
【図８】実験３におけるＧＡ（ｐＨ２．８）添加によるケラチノサイト内へのカルシウムイオンの流入の変化を示すグラフである。横軸が時間、縦軸が蛍光強度比を表し、蛍光強度比が大きいほど、ケラチノサイト内へのカルシウムの流入が大きい。矢印で示した時間でＧＡを作用させた。
【図９】実験４におけるＧＡ塗布によるヒト皮膚からのＡＴＰ遊離を示すグラフである。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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