(57)【要約】      （修正有）【課題】  複数のヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子を含むＤＮＡ断片、また、新規なヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子を提供する。さらに、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む形質転換細胞を提供する。【解決手段】  新規なヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子及びそれを含むＤＮＡ断片を開示した該ＤＮＡ断片は、特定の核酸配列を有する約８００ｋｂｐの断片である。このヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子は、この８００ｋｂｐの断片中に含まれるものであり、新規なものが５０個存在する。本発明はまた、これらのＶＨ 遺伝子を２つ以上含むＤＮＡ断片も提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）乃至（ｉ）のいずれかのクローン：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4271で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY6；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4274で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY24；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4273で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY21；
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4278で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118；
（ｅ）国際寄託番号FERM BP-4277で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM84；
（ｆ）国際寄託番号FERM BP-4279で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM131；
（ｇ）国際寄託番号FERM BP-4276で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローン3-31；
（ｈ）国際寄託番号FERM BP-4275で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY103；または
（ｉ）国際寄託番号FERM BP-4272で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY20
から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ（ここで、該クローンY6、Y24、Y21、M118、M84、M131、3-31、Y103及びY20の各々から得られる該ヒトゲノム由来のＤＮＡ配列の各々は、ヒトゲノムにおいて図１に示されるような相対的な位置を有する。）。
【請求項２】
該クローンY6から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
該クローンY24から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
該クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号15乃至配列番号34に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
該クローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号14及び配列番号15に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
該クローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
該クローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
該クローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号６乃至配列番号８に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
該クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号５に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
該クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号４に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
下記（ａ）乃至（ｉ）のいずれかのクローン：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4271で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY6；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4274で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY24；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4273で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY21；
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4278で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118；
（ｅ）国際寄託番号FERM BP-4277で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM84；
（ｆ）国際寄託番号FERM BP-4279で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM131；
（ｇ）国際寄託番号FERM BP-4276で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローン3-31；
（ｈ）国際寄託番号FERM BP-4275で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY103；または
（ｉ）国際寄託番号FERM BP-4272で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY20
から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列に含まれる少なくとも下記（１）及び（２）の遺伝子：
（１）任意の２つの機能的ＶH遺伝子；及び
（２）前記（１）の遺伝子とは異なる他の２つの任意の２つの機能的ＶH遺伝子
を含んでなるＤＮＡ（ここで、該クローンY6、Y24、Y21、M118、M84、M131、3-31、Y103及びY20の各々から得られる該ヒトゲノム由来のＤＮＡ配列の各々は、ヒトゲノムにおいて図１に示されるような相対的な位置を有する。）。
【請求項１２】
該クローンY6から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
該クローンY24から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
該クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号15乃至配列番号34に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
該クローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号14及び配列番号15に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
該クローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
該クローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
該クローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号６乃至配列番号８に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
該クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号５に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
該クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号４に記載されるＤＮＡ配列を含んでなることを特徴とする請求項１１に記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
ヒトＶH遺伝子に由来する可変領域を含んでなる免疫グロブリン重鎖を産生する非ヒト哺乳動物を製造するためのＤＮＡであって、該ＤＮＡが、請求項１乃至請求項２０のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２２】
下記（ａ）乃至（ｆ）のＤＮＡ配列：
（ａ）下記(i)または(ii)：
(i)国際寄託番号FERM BP-4271で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY6、または
(ii)国際寄託番号FERM BP-4274で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY24のいずれかから得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4273で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列（ここで、該クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列の5'末端配列であって、前記（ａ）のＤＮＡ配列の3'末端配列と重複している配列を除くＤＮＡ配列である。）；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4278で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列（ここで、該クローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列の5'末端配列であって、前記（ｂ）のＤＮＡ配列の3'末端配列と重複している配列を除くＤＮＡ配列である。）；
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4277で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列（ここで、該クローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列の5'末端配列であって、前記（ｃ）のＤＮＡ配列の3'末端配列と重複している配列を除くＤＮＡ配列である。）；
（ｅ）国際寄託番号FERM BP-4279で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列（ここで、該クローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列の5'末端配列であって、前記（ｄ）のＤＮＡ配列の3'末端配列と重複している配列を除くＤＮＡ配列である。）；及び
（ｆ）国際寄託番号FERM BP-4276で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列（ここで、該クローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列の5'末端配列であって、前記（ｅ）のＤＮＡ配列の3'末端配列と重複している配列を除くＤＮＡ配列である。）
を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクター（ここで、該クローンY6、Y24、Y21、M118、M84、M131及び3-31の各々から得られる該ヒトゲノム由来のＤＮＡ配列の各々は、ヒトゲノムにおいて図１に示されるような相対的な位置を有する。）。
【請求項２３】
該ＤＮＡが、図１に示されるような制限酵素認識部位のパターンを有するＤＮＡであることを特徴とする請求２２に記載のベクター。
【請求項２４】
該ＤＮＡが、下記（１）乃至（７）の特徴：
（１）該クローンY6から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含む；
（２）該クローンY24から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含む；
（３）該クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号15乃至配列番号34に記載されるＤＮＡ配列を含む；
（４）該クローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号14及び配列番号15に記載されるＤＮＡ配列を含む；
（５）該クローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含む；
（６）該クローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号８及び配列番号９に記載されるＤＮＡ配列を含む；及び
（７）該クローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号６乃至配列番号８に記載されるＤＮＡ配列を含む
を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項２２または請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
下記（ａ）及び（ｂ）のＤＮＡ配列：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4275で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；及び
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4272で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列（ここで、該クローンM20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列の5'末端配列であって、前記（ａ）のＤＮＡ配列の3'末端配列と重複している配列を除くＤＮＡ配列である。）
を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクター（ここで、該クローンY103及びY20の各々から得られる該ヒトゲノム由来のＤＮＡ配列の各々は、ヒトゲノムにおいて図１に示されるような相対的な位置を有する。）。
【請求項２６】
該ＤＮＡが、図１に示されるような制限酵素認識部位のパターンを有するＤＮＡであることを特徴とする請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
該ＤＮＡが、下記（１）及び（２）の特徴：
（１）該クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号５に記載されるＤＮＡ配列を含む；及び
（２）該クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号４に記載されるＤＮＡ配列を含む；
を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項２５または請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
下記（１）乃至（28）のＤＮＡ配列：
（１）配列番号64に記載されるＤＮＡ配列；
（２）配列番号61に記載されるＤＮＡ配列；
（３）配列番号59に記載されるＤＮＡ配列；
（４）配列番号53に記載されるＤＮＡ配列；
（５）配列番号51に記載されるＤＮＡ配列；
（６）配列番号49に記載されるＤＮＡ配列；
（７）配列番号48に記載されるＤＮＡ配列；
（８）配列番号46に記載されるＤＮＡ配列；
（９）配列番号45に記載されるＤＮＡ配列；
（10）配列番号43に記載されるＤＮＡ配列；
（11）配列番号39に記載されるＤＮＡ配列；
（12）配列番号35に記載されるＤＮＡ配列；
（13）配列番号34に記載されるＤＮＡ配列；
（14）配列番号33に記載されるＤＮＡ配列；
（15）配列番号31に記載されるＤＮＡ配列；
（16）配列番号30に記載されるＤＮＡ配列；
（17）配列番号28に記載されるＤＮＡ配列；
（18）配列番号26に記載されるＤＮＡ配列；
（19）配列番号23に記載されるＤＮＡ配列；
（20）配列番号21に記載されるＤＮＡ配列；
（21）配列番号20に記載されるＤＮＡ配列；
（22）配列番号18に記載されるＤＮＡ配列；
（23）配列番号15に記載されるＤＮＡ配列；
（24）配列番号13に記載されるＤＮＡ配列；
（25）配列番号11に記載されるＤＮＡ配列；
（26）配列番号９に記載されるＤＮＡ配列；
（27）配列番号８に記載されるＤＮＡ配列；及び
（28）配列番号７に記載されるＤＮＡ配列
を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクター（ここで、該ＤＮＡは、前記（１）乃至（28）の各々隣り合う２つのＤＮＡ配列の間の各々に、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのクローン：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4271、FERM BP-4273またはFERM BP-4274のいずれかで識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローン；または
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4276、FERM BP-4277、FERM BP-4278またはFERM BP-4279のいずれかで識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローン
から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列の一部を有する）。
【請求項２９】
下記（１）乃至（５）のＤＮＡ配列：
（１）配列番号５に記載されるＤＮＡ配列；
（２）配列番号４に記載されるＤＮＡ配列；
（３）配列番号３に記載されるＤＮＡ配列；
（４）配列番号２に記載されるＤＮＡ配列；及び
（５）配列番号１に記載されるＤＮＡ配列
を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクター（ここで、該ＤＮＡは、前記（１）乃至（５）の各々隣り合う２つのＤＮＡ配列の間の各々に、国際寄託番号FERM BP-4272またはFERM BP-4275のいずれかで識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンから得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列の一部を有する）。
【請求項３０】
下記（ａ）乃至（ｅ）のいずれかのクローン：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4271で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y6；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4274で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y24；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4273で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y21；
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4275で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y103；または
（ｅ）国際寄託番号FERM BP-4272で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y20
から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
【請求項３１】
該ベクターが、下記（ａ）乃至（ｅ）のいずれかのクローン：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4271で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y6；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4274で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y24；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4273で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y21；
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4275で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y103；または
（ｅ）国際寄託番号FERM BP-4272で識別される形質転換体から得られる酵母人工染色体Y20
であることを特徴とする請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかのクローン：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4278で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4277で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM84；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4279で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM131；または
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4276で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローン3-31；
から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列を含んでなるベクター。
【請求項３３】
該ベクターが、下記（ａ）乃至（ｄ）のいずれかのクローン：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4278で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4277で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM84；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4279で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM131；または
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4276で識別される形質転換体から得られるコスミドベクタークローン3-31；
であることを特徴とする請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項１乃至請求項２１のいずれかに記載のＤＮＡ若しくは該ＤＮＡの一部、または請求項２２乃至請求項３３のいずれかに記載のベクターのいずれかにより形質転換された細胞。
【請求項３５】
該細胞が、下記（ａ）乃至（ｉ）のいずれか：
（ａ）国際寄託番号FERM BP-4271で識別される形質転換細胞；
（ｂ）国際寄託番号FERM BP-4272で識別される形質転換細胞；
（ｃ）国際寄託番号FERM BP-4273で識別される形質転換細胞；
（ｄ）国際寄託番号FERM BP-4274で識別される形質転換細胞；
（ｅ）国際寄託番号FERM BP-4275で識別される形質転換細胞；
（ｆ）国際寄託番号FERM BP-4276で識別される形質転換細胞；
（ｇ）国際寄託番号FERM BP-4277で識別される形質転換細胞；
（ｈ）国際寄託番号FERM BP-4278で識別される形質転換細胞；または
（ｉ）国際寄託番号FERM BP-4279で識別される形質転換細胞
であることを特徴とする請求項３４に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子及びそれを含むＤＮＡ断片、それらを含むベクター、並びに該ベクターを含む形質転換細胞に関する。本発明の遺伝子及びＤＮＡ断片は、哺乳動物の宿主を用いて遺伝子工学的にヒト抗体を産生させるために有用である。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンはＬ鎖とＨ鎖とからなり、各鎖は免疫グロブリン分子ごとに構造が異なる可変領域（Ｖ領域）と免疫グロブリン分子間で共通の構造を有する定常領域（Ｃ領域）とから成る。抗体の抗原特異性を決定するものはＶ領域である。Ｈ鎖のＶ領域は、Ｖ、Ｄ（diversity）及びＪ(joining)の各遺伝子によリコードされている（Ｈ鎖の遺伝子はＶＨ のように添え字のＨを付して示される）。免疫グロブリンのＶ領域が、非常に多様性に富み、無数の抗原に対して特異的に反応できる抗体を与えることができる重要な理由の1つに、Ｖ、Ｄ、Ｊの再構成が挙げられる。すなわち、Ｖ、Ｄ、Ｊの各遺伝子はそれぞれ複数存在しており、それらが体細胞中でランダムに組み合わされて一本のｍＲＮＡをコードする遺伝子となり、この組合せがランダムに起きることにより、多様な免疫グロブリンＶ領域がもたらされる。
【０００３】
一方、現在、種々の疾病の治療に用いられている抗体はマウス等のヒト以外の動物由来の抗体である。しかしながら、これをヒトに投与すると、抗体が異種動物起源のものであるので、投与された抗体に対する免疫応答反応がヒト体内で起き、アレルギー症状等を呈することがあり、さらには、動物由来の抗体が中和不活性化される等の問題が生じる。この問題を回避するために、ヒトの治療にはヒ卜由来の抗体を投与することが望ましい。また、ヒトを宿主としてヒト由来の抗原からヒト型抗体を工業的に生産することは免疫寛容の問題が生じ、既存の方法を用いても極めて難しい。そこで、動物を宿主として、遺伝子工学的にヒト免疫グロブリンを生産させる研究が進んでいる（例えば、特許出願公表平４−５０４３６５号 ：Proc．Natl．Acad．Sci．USA，V01．86，pp．5898−5902，August 1989；Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．87，pp．5109−5113，July 1990；Genomics 8，742−750（1991））。
【０００４】
しかしながら、ヒト免疫グロブリン遺伝子をヒト以外の宿主動物中で発現させる従来の方法では、遺伝子組換えに供されるヒトＶＨ 遺伝子の数が非常に少なく、発現されるヒト免疫グロブリンの多様性が限定されるという問題がある。Ｈ鎖は、組み込まれるＶＨ 遺伝子が１つしかなくても、Ｄ．Ｊ遺伝子の組合せにより免疫グロブリンの多様性はある程度は確保される。しかしながら、上述のように、基本的にはＶ遺伝子の再構成（ランダムな組合せ）が免疫グロブリンの多様性を決定するので、組み込まれるヒトＶＨ 遺伝子の数が多いほど発現される免疫グロブリンの多様性が増す。免疫グロブリンの多様性が増すと、多数の抗原に対応できるだけでなく、 1つの抗原に対して非常に高い親和性を有する抗体が産生される可能性もそれだけ高くなり、抗体を治療目的や診断目的で用いようとする場合には重要である。
【非特許文献１】Ravetch,J.V．et al,(1981）Cell，Vol．27，pp.583−591
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、複数のヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子を含むＤＮＡ断片を提供することである。また、本発明の目的は、新規なヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子を提供することである。さらなる、本発明の目的は、該ＤＮＡ断片または該遺伝子を含むベクター、および該ベクターを含む形質転換細胞を提供することである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、新規なヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子及びそれを含むＤＮＡ断片が提供された。本発明の約８００ｋｂのＤＮＡ断片は、６４個もの多数のヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子を含んでおり、これを用いて遺伝子工学的にヒト免疫グロブリンを宿主動物に生産させれば、従来に比べて生産されるヒト免疫グロブリンの多様性が大幅に高められる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、約８００ｋｂにわたるヒトＨ鎖Ｖ領域遺伝子群の構造を決定することに成功し、かつ、その中に含まれる６４個のヒトＶＨ 遺伝子の塩基配列を決定することに成功した。これにより、この８００ｋｂのＤＮＡ断片及びその中に含まれる種々のＤＮＡ断片を提供することが可能になり本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY6、Y24、Y21、M118、M84、M131、3-31、Y103、またはY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡを提供する。
【０００９】
好ましい形態においては、該クローンY6から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY24から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号15乃至配列番号34に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号14及び配列番号15に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号６乃至配列番号８に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号５に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号４に記載されるＤＮＡ配列を含むことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明は、寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY6、Y24、Y21、M118、M84、M131、3-31、Y103、またはY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列に含まれる少なくとも（１）任意の２つの機能的ＶH遺伝子；及び（２）前記（１）の遺伝子とは異なる他の２つの任意の２つの機能的ＶH遺伝子を含んでなるＤＮＡを提供する。
【００１１】
好ましい形態においては、該クローンY6から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY24から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号15乃至配列番号34に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号14及び配列番号15に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号６乃至配列番号８に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号５に記載されるＤＮＡ配列を含み、該クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号４に記載されるＤＮＡ配列を含むことを特徴とする。
【００１２】
また、本発明は、ヒトＶH遺伝子に由来する可変領域を含んでなる免疫グロブリン重鎖を産生する非ヒト哺乳動物を製造するためのＤＮＡであって、該ＤＮＡが、上記のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とするＤＮＡを提供する。
【００１３】
また、本発明は、下記（ａ）乃至（ｆ）のＤＮＡ配列：
（ａ）寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY6またはY24のいずれかから得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；（ｂ）寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；（ｃ）寄託された形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；（ｄ）寄託された形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；（ｅ）寄託された形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；及び（ｆ）寄託された形質転換体から得られるコスミドベクタークローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列、を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクターを提供する。
【００１４】
好ましい態様において、該ＤＮＡが、図１に示されるような制限酵素認識部位のパターンを有するＤＮＡであることを特徴とするベクターを提供する。
【００１５】
他の好ましい態様において、該ＤＮＡが、下記（１）乃至（７）の特徴：
（１）該クローンY6から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含む；（２）該クローンY24から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号32乃至配列番号64に記載されるＤＮＡ配列を含む；（３）該クローンY21から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号15乃至配列番号34に記載されるＤＮＡ配列を含む；（４）該クローンM118から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号14及び配列番号15に記載されるＤＮＡ配列を含む；（５）該クローンM84から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号９乃至配列番号13に記載されるＤＮＡ配列を含む；（６）該クローンM131から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号８及び配列番号９に記載されるＤＮＡ配列を含む；及び（７）該クローン3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号６乃至配列番号８に記載されるＤＮＡ配列を含む、を有するＤＮＡであることを特徴とするベクターを提供する。
【００１６】
また、本発明は、（ａ）寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列；及び（ｂ）寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクターを提供する。
【００１７】
好ましい態様において、該ＤＮＡが、図１に示されるような制限酵素認識部位のパターンを有するＤＮＡであることを特徴とするベクターを提供する。
【００１８】
他の好ましい態様において、該ＤＮＡが、下記（１）及び（２）の特徴：
（１）該クローンY103から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号５に記載されるＤＮＡ配列を含む；及び
（２）該クローンY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列が、配列番号１乃至配列番号４に記載されるＤＮＡ配列を含む；
を有するＤＮＡであることを特徴とするベクターを提供する。
【００１９】
また、本発明は、配列番号64、61、59、53、51、49、48、46、45、43、39、35、34、33、31、30、28、26、23、21、20、18、15、13、11、９、８、７に記載されるＤＮＡ配列を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクターを提供する。
【００２０】
また、本発明は、配列番号５、４、３、２、１に記載されるＤＮＡ配列を5'から3'の順序で含んでなるＤＮＡを有するベクターを提供する。
【００２１】
また、本発明は、寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体Y6、Y24、Y21、Y103、またはY20から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列を含んでなるベクターを提供する。
【００２２】
好ましい態様において、該ベクターは、寄託された形質転換体から得られる酵母人工染色体Y6、Y24、Y21、Y103、またはY20であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明は、寄託された形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118、M84、M131、または3-31から得られるヒトゲノム由来のＤＮＡ配列を含んでなるベクターを提供する。
【００２４】
好ましい態様において、該ベクターは、寄託された形質転換体から得られるコスミドベクタークローンM118、M84、M131、または3-31であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明は、上記のいずれかに記載のＤＮＡ若しくは該ＤＮＡの一部、または上記のいずれかに記載のベクターのいずれかにより形質転換された細胞を提供する。
【００２６】
好ましい態様において、該細胞は、国際寄託番号FERM BP-4271、FERM BP-4272、FERM BP-4273、FERM BP-4274、FERM BP-4275、FERM BP-4276、FERM BP-4277、FERM BP-4278またはFERM BP-4279で識別される形質転換細胞であることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本願発明者らは、下記実施例において詳述する方法により、ＥＢウィルスでトランスフォームされたヒトリンパ芽球様（lyｍphoblastoid）細胞株のDNAをEcoRIで部分消化してＹＡＣに組み込んだライブラリーを用い、約８００ｋｂｐにわたるヒトのＶＨ 遺伝子群領域の構造を決定することに成功した。これを図１に示す。図1中、遺伝子地図は、４本の太い実線上に示されている。各実線は右側が３’側で、一番上の実線の左端が2番目の実線の右端につながる。図1に示すＤＮＡ断片には、３’側からＣ遺伝子、ついでＪＨ 遺伝子、さらにＤ遺伝子があり、それに続いて６４個のＶＨ 遺伝子がある。これら６４個のＶＨ 遺伝子の塩基配列は下記実施例に示すように全て決定されており、下流側から順に配列番号１、２、・・・６３、６４の順に示されている。
【００２８】
これらのＶＨ 遺伝子のうち、ポリペプチドをコードすると考えられる機能的（functional）なＶＨ は黒塗りの長方形で示してある。一方、従来から知られているＶＨ 遺伝子の一般的な特徴を有してはいるが、中に停止コドンが含まれていて現状ではポリペプチドをコードしていないもの、すなわち偽（pseudo）ＶＨ 遺伝子は白ぬきの長方形で示してある。この遺伝子マップの直下にはEco RIとHind IIIによる切断マップが示されている。制限酵素切断部位は、垂直方向の短い線により示されている。短い線の端に丸がついているものは、その順番が決定されていないものであり、また、点点を付した箱で示した領域は、Eco RI切断部位を決定していない領域である。図１中、 「Ｙ」のように見えるものは、 ２つの制限酵素部位が近接していることを示している。また、図1にはMul I切断部位が白ぬきの三角で示され、Not I切断部位が黒ぬきの三角で示されている。この構造を決定するために用いた各クローン中の挿入断片がさらにその下に示されている。なお、図１よりも３’側の構造は公知であり、Ravetch,J.V．et al,(1981）Cell，Vol．27，pp.583−591に記載されている。
【００２９】
図１に示される、クローン中の挿入ＤＮＡ断片のうち、ＹＡＣ中に挿入されたＹ２０、Ｙ１０３、Ｙ２１、Ｙ６、及びＹ２４をそれぞれ含む酵母が生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ４２７２、 ＦＥＲＭ−ＢＰ４２７５、ＦＥＲＭ−ＢＰ４２７３、ＦＥＲＭ−ＢＰ４２７１及びＦＥＲＭ−ＢＰ４２７４である。また、コスミド中に挿入されたＭ１３１、Ｍ１１８、Ｍ８４及び３−３１を含む大腸菌も生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はそれぞれＦＥＲＭ−ＢＰ４２７９、ＦＥＲＭ−ＢＰ４２７８、ＦＥＲＭ−ＢＰ４２２７及びＦＥＲＭ−ＢＰ４２７６である。
【００３０】
図１に示される約８００ｋｂｐのＤＮＡ断片は、これらの寄託されたＤＮＡ断片を公知の方法でつなぎ合わせることにより製造することができる。すなわち、ＤＮＡ断片Ａと、このＤＮＡ断片Ａと末端の塩基配列が重複しているＤＮＡ断片Ｂ（すなわち、ＤＮＡ断片Ａの３’領域とＤＮＡ断片Ｂの５’領域の塩基配列が同一）は酵母中での遺伝的組換えを利用した方法により容易に連結することができる。すなわち、ＤＮＡ断片Ａ及びＢをそれぞれ別々のＹＡＣベクターに挿入し、該組換えＹＡＣをそれぞれ別のmating typeの酵母に入れ、これらを細胞融合させることにより、酵母宿主内で遺伝的組換えが起き、ＤＮＡ断片ＡとＤＮＡ断片Ｂとが、それぞれの未端の重複部分を1つだけ共有してつながったＤＮＡ断片を有するＹＡＣが得られる。
【００３１】
このような組換えＹＡＣは、使用したＹＡＣベクター中にコードされる栄養要求性をマーカーとして容易に選択できる。この方法は、常法であり、例えば特許出願公表平４−５０４３６５号、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．87，pp.9913-9917，December 1990、Science Vol.250，p.94， Proc. Natl. Acad. Sci．USA，Vol．89，pp．5296-5300，June 1992 及びNucleic Acid Research，Vol.20，No．12，3135-3138に記載されている。
【００３２】
寄託した上記８個のＤＮＡ断片は、隣接するものと未端が重複しているので、この方法により、順次つないでいくことができる。なお、３−３１、Ｍ８４、Ｍ１１８、Ｍ−１３１はコスミドベクター中にクローニングされているものであるが、コスミドクローンをベクターにしか認識部位が存在しない制限酵素で切断ののち、両端にＹＡＣベクターをつなぐことにより、酵母内で人工染色体として維持することが可能である。さらに上記の方法によって、他の領域のＹＡＣクローンとつなぎ合わせることができる。なお、上記寄託した9つの断片をつなぎ合わせても、Ｙ１０３と３−３１の間に約４ｋｂのギャップが存在するが、このギヤップを埋めるＤＮＡ断片も、以下に示す方法により容易に調製することができる。すなわち、図1に示されるように、この部分のHind III断片は比較的サイズが大きいので、まず、ヒトゲノムをHind IIIで完全消化し、これを電気泳動で分けた後、分子量１５ｋｂ程度のものを選択し、プローブで検出し、回収することにより得ることができる。ここで用いるプローブは、以下のようにして単離することが可能である。
【００３３】
すなわち、ギャップの両端のＤＮＡ断片をプラスミドを用いてサブクローンし、その中から反復配列を含まないＤＮＡ断片を調製し、これらをライブラリーのスクリーニングに用いる。両端のプローブでシグナルが検出されたもののみを単離する。
【００３４】
上述のように、本願発明により、図1に示す約８００ｋｂｐのＤＮＡ断片が提供されたが、このＤＮＡ断片中に含まれるＤＮＡ領域からなる断片も、遺伝子工学的にヒト免疫グロブリンを産生させるために用いることができる。すなわち、遺伝子工学的に生産されるヒト免疫グロブリンの多様性を高めるためには、できるだけ多くのヒトＶＨ 遺伝子を含む断片を組み込むことが好ましいが、少なくとも2つのヒトＶＨ 遺伝子が含まれていれば、再構成の際にある程度の多様性が与えられるので利用可能である。従って、図1に示される約８００ｋｂのＤＮＡ断片中に含まれ、少なくとも２つの連続する機能的ＶＨ 遺伝子を含む領域からなるＤＮＡ断片も用いることができ、有用である。
【００３５】
このようなＤＮＡ断片中に含まれる機能的ＶＨ  遺伝子の数は少なくとも２個であるが、６個以上であることが好ましく、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個と数が増えるほど生産されるヒト免疫グロブリンの多様性が増し、好ましい。なお、このような断片は、分子量が大きいものはＹＡＣベクターでクローニングされるが、分子量が約５０ｋｂ以下の比較的小さなものは、必ずしもＹＡＣベクターでクローニングする必要はなく、コスミドベクターやプラスミドベクターでクローニングすることもできる。
【００３６】
このようなＤＮＡ断片は、図１及び配列番号１〜６４に示される情報がわかっているので製造することができる。すなわち、例えば、ヒトゲノムをEco RIやHind IIIのような適当な制限酵素で部分消化し、得られた断片を電気泳動で分離した後、所望の２個以上の機能的ＶＨ とそれぞれハブリダイズする２個以上のプローブを用いて、機能的ＶＨ 遺伝子を２個以上含むＤＮＡ断片を得ることができる。あるいは、プローブによる検出に代えて、ＰＣＲによる増幅を用いることもできる。この場合も、機能的ＶＨ 遺伝子の塩基配列が全てわかっているので、用いるべきプライマーの塩基配列もわかっており、容易に行うことができる。
【００３７】
本発明は、さらに、このような、機能的ＶＨ 遺伝子を２個以上含むＤＮＡ断片が任意に結合されたＤＮＡ断片をも提供する。すなわち、このようなＤＮＡ断片を複数結合することにより、それらを単独で用いる場合に比べてＤＮＡ断片中のＶＨ 遺伝子の数を増やすことができ、それによって生産されるヒト免疫グロブリンの多様性を増すことができる。ＤＮＡ断片は必ずしも連続したものである必要はなく、任意のＤＮＡ断片を任意の順序に結合したものであってよい。連結するＤＮＡ断片同志に重複部分がない場合には、上記した、重複部分を有するＤＮＡ断片同志の連結方法を適用することができないが、重複部分のないＤＮＡ断片同志を結合することも可能であり、次のようにして行うことができる。
【００３８】
機能的ＶＨ 遺伝子を２個以上含むＹＡＣクローンの左腕ベクター部分および右腕ベクター部分をHermansonら（1991）(Nucleic Acids．Res., 19；4943−4948)の方法用いて回収する。この場合、ＹＡＣ左腕ベクター部分のアンピシリン耐性マーカー部分（ＡＭＰ）の相同配列と、リジン要求性を原要求性に復帰させるマ―カー（Ｌｙｓ）を持ち、Ｌｙｓの下流直下にマルチプルクローニングサイトを持つようなプラスミド（ｐＩＣＬ）とＹＡＣ右腕ベクター部分のＹＡＣ４部分の相同配列と上記Ｌｙｓおよびカナマイシン耐性マーカー（ＫＡＮ）を持ち、ＫＡＮの下流直下にマルチプルクローニングサイトを持つようなプラスミド（ｐＬＵＳ）を線状化した後にＹＡＣを持つ酵母に常法を用いて導入する。ｐＩＣＬおよびｐＬＵＳは適当な頻度で酵母内で組み換えを起し、ＹＡＣの左腕、右腕ベクター部分に組み込まれる。これらのＹＡＣを保持する酵母を適当な選択培地で選抜し、マルチプルクローニングサイトに含まれる制限酵素の認識部位と同一の制限酵素の内適当な1種用いて、切断する。
【００３９】
この方法により当該ＹＡＣに含まれたヒ卜由来ＤＮＡ断片の左端または右端を含むＤＮＡ断片がプラスミドとして回収される。このプラスミドを常法を用いて大腸菌で増やした後に、回収した両プラスミドを制限酵素で切断し、ライゲースで接続する。この様な接続ＤＮＡ断片をさらにＹＡＣの左腕または右腕のベクター部分に接続し、ＹＡＣを保持する酵母に導入する。これらのＹＡＣベクターは一定の頻度で本来あるＹＡＣの左腕、右腕ベクター部分と、ヒト由来当該ＤＮＡ断片の左端または右端断片部で組み換えを起す。これを適当なマーカーで選抜すればヒト由来ＤＮＡ左端に別のヒト由来ＤＮＡ右端の断片あるいはヒト由来ＤＮＡ右端に別のヒト由来ＤＮＡ左端が接続したＹＡＣクローンが回収される。これらのＹＡＣクローンは、ヒト由来ＤＮＡの左端、右端にそれぞれ別のヒト由来ＤＮＡの右端、左端のＤＮＡの断片が接続した構造とっているため、この接続された配列を持つＹＡＣクローンと前記の方法を用いて組み換えることができる。
また、実際に寄託した上記８つのＤＮＡ断片を任意に結合することにより、ＶＨ 遺伝子を多数含む大きな断片を作製することもできる。
【００４０】
また、本発明により、図１に示す約８００ｋｂｐの断片中に含まれる６４個のＶＨ 遺伝子の塩基配列が決定された。下記実施例において詳述するように、これらのうち５０個は従来より知られていない塩基配列を有する新規な遺伝子であった。これらの新規なヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子の中には、ポリペプチドをコードしない偽遺伝子も含まれているが、偽遺伝子であっても、体細胞レベルでの遺伝子変換のドナーとして機能する可能性があるので有用性は存在する。
【００４１】
本発明のヒト免疫グロブリンＶＨ 遺伝子及びそれを含むＤＮＡ断片は、例えば特許出願公表平４−５０４３６５号に記載されているように、哺乳動物宿主にヒ卜の免疫グロブリンを生産させるために用いることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例1  約８００ｋｂのＤＮＡ断片の構造決定
（1）スクリーニングに用いたライブラリー
スクリーニングに用いたヒトＹＡＣライブラリーは、エプシュタイン−バールウイルスでトランスフォームされたヒトリンパ芽球様細胞株ＣＧＭ１（T．Imaiand M.V.0lson，genomics，8，297-303（1990））である．ＣＧＭ１ＤＮＡのEcoRI部分消化物をｐＹＡＣ４ベクター（D．Burke and M．V．Olson，in"Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology"（C.guthrie and G．R．Fink，eds）, p．253，Academic Press，Orland，1991）に連結し、ＡＢ１３８０酵母宿主菌株（D． Burke and M．V． 0lson， in "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology"（C．guthrie and G．R．Fink，eds）, p.253，Academic Press，Orland， 1991）に導入した。ライブラリーは、挿入ＤＮＡ断片のサイズが平均約３６０ｋｂの１５０００個の独立したクローンから成っていた。従って、このライブラリーは、ヒトハプロイドゲノムの約１．８倍に相当する。免疫グロプリンＨ（ＩｇＨ）遺伝子座におけるＤＮＡ再構成をまずヒトＤプローブ及びＪＨ プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションによリチェックした。その結果、対立遺伝子の１つはが生殖系列の構成を保持していたが、他のものはＶＨ 、Ｄ、ＪＨ が再構成したものであった。
【００４４】
（2）ＰＣＲに基づくスクリーニングに用いたプライマー
ＰＣＲに基づくヒトＶＨ ＹＡＣクローンのスクリーニングのために、最大及び２番目に大きなＶＨ ファミリーであるＶＨ−III 及びＶＨ−I ファミリーに対するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。免疫グロブリンのＶＨ 領域は２つの超可変部（ＣＤＲ１及びＣＤＲ２）及び３つのフレームワーク部（ＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３）を有する（E.A．Kabat et al．，Sequences of Proteins of immunological interest， Fifth edition， NIH publications， Washington D.C. （1991))。フレームワーク部の塩基配列は同一のファミリー内では非常に保存性が高い。従って、フレームワーク部に対応する共通のオリゴヌクレオチドプライマーを合成することが示唆される。この目的のために、全ての公知のＶＨ 配列のＦＲ１、 ＦＲ２及びＦＲ３領域の塩基配列を並べて比較した。ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸残基に対応する塩基配列は、同一のファミリー内だけでなく、ＶＨ−Ｉ とＶＨ−III ファミリーの間においても非常に類似していた。これにより、これら２つのファミリーに共通な、表１に示す順方向のプライマーであるＦ−ｕｎｉｖを合成することが可能となった。ファミリー特異的な逆方向のプライマーは、プライマー配列の３’側の半分が公知のＶＨ  遺伝子と１００％同じ配列を有し、特に最も３’末端のヌクレオチドが、多数のＶＨ  断片間で共通するアミノ酸残基に対応するように、ＦＲ２領域中の保存性の高い配列からそれぞれ独立に選択した。具体的には、Ｆ−univとＩ−Ｒ、およびＦ−univとIII−Ｒをスクリーニング用プライマーとして用いた。各プライマーの塩基配列を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2006262911.tif 000002
【００４６】
（3）至適ＰＣＲ条件の検討
特異的増幅の至適条件を決定するために予備実験を行った。Perkin-Elmer/Cetus社のプロトコールに従って反応液（５μｌ）を調製した．反応はＤＮＡ Thermal Cycler（Perkin−Elmer/Cetus社）を用い、２５ｎｇの鋳型ヒトＤＮＡを用いて種々のアニーリング温度（５５℃、５８℃、６０℃及び６２℃）及びサイクル数（２５、３０及び３５サイクル）で行った。その結果、高いアニーリング温度、すなわち、９４℃１分−６２℃２分−７２℃２分の温度条件がサイクル数に関係なく、ヒトＤＮＡ試料を特異的に増幅させるが酵母菌株ＡＢ１３８０ＤＮＡを増幅しないことを見出した。より低いアニーリング温度では、ネガティブコントロール（−コントロール）において擬陽性のシグナルが時々出るので、採用することができなかった。よって、以下のＰＣＲは上記した条件で行った。
【００４７】
（4）ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）
ＰＣＲに基づく第１のスクリーニングは、それぞれが１９２０個のコロニー（２０ｘ９６ウェル）からのＤＮＡに相当する、７つのマルチフィルターＤＮＡプール(E.D. Green and M.V．Olson，Proc．Natl. Acad．Sci．USA，87，1213-1217（1990）)に対して上記合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。陽性のマルチフィルタープールを、３８４コロニー（４ｘ９６ウェル）からそれぞれ成る５つのプールに分割し、同じ操作によってさらにスクリーニングした。各２５ｎｇのＹＡＣプールＤＮＡを反応に用いた。ＹＡＣライブラリーを構築するために用いたＣＧＭ１のＤＮＡ及び酵母菌株ＡＢ３８０のＤＮＡをＰＣＲ分析中に加え、それぞれポジティブ（＋）及びネガティブコントロール（−コントロール）とした。増幅後、全試料を、 １５％グリセロール含有１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、臭化エチジウム染色して分析した。
【００４８】
（5）コロニーハイブリダイゼーション
ＰＣＲに基づく第１及び第２のスクリーニングの後、３８４クローン中の陽性クローンの位置を従来のコロニーハイブリダイゼーションで決定した。 ３８４ＹＡＣクローンから成るナイロンフィルターの調製方法は、公知の方法により行った （D．Burke and M.V. Olson，in"Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology"（C．guthrie and G．R. Fink，eds）,p.253，Academic Press, Orland，1991）。 Ｖ２６６ＢＬ（Y．Nishida，et al.,Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79，3833−3837（1982））及びＶＨＢＶ（M．kodaira et al.,J. Mol．Biol., 190，529−541（1986））を、ヒトＶＨ−Ｉ 及びＶＨ−III ファミリーのためのプローブとしてそれぞれ用いた。これらのプローブはオリゴラベリングキット（ファルマシア社製）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし（５ｘ１０５ｃｐｍ）、常法（D．Burkeら、上掲）に基づきコロニーハイブリダイゼーションに供した。６５℃で１２時間ハイブリダイズさせた後、フィルターを２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ−１５ｍＭクエン酸ナトリウム）で２回、室温で１０分間洗浄し、０．２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで６５℃で３０分間洗浄した。フィルターは一晩Ｘ線フィルムに露光させ、対応する陽性ＹＡＣクローンをさらなる分析のためにピックアップした。
【００４９】
（6）コロニーＰＣＲによる挿入チェック
単離したＹＡＣ中に特定のＤＮＡ配列が存在するか否かを調べるために、ＤＮＡを精製することなくＰＣＲを用いてコロニー−精製クローンの単純で迅速な再スクリーニングを行った（E.D．Green and M.V．Olson，Proc．Natl．Acad．Sci.USA，87，1213-1217（1990））。すなわち、陽性の酵母クローンをＡＨＣプレート上に撤き培養した。それぞれのクローンからのそれぞれの４つずつ単一コロニーをつまようじで上述した５μｌのＰＣＲ混合物に移した。スクリーニングで用いたのと同じ条件下でＰＣＲ及びそれに続くゲル電気泳動を行って増幅したバンドを同定した。ほとんどのクローンにおいて、全ての４つのコロニーともＤＮＡ断片の特異的増幅を示した。
【００５０】
（7）ＰＦＧＥを用いたＹＡＣクローンのサイズの決定
いくつかのＹＡＣは、培養中に染色体間で再構成を起すために不安定であり、ヒト由来の挿入ＤＮＡサイズにばらつきをもたらすことが研究者の間で問題にされている。このアーティファクトは、挿入ＤＮＡ中の相同ＤＮＡ配列の繰り返し配列すなわちタンデムリピートによりしばしば媒介されるものと考えられる。ＶＨ 遺伝子座はＶＨ 遺伝子及びその周辺領域から成る多数の相同ＤＮＡ断片を含んでいるので、このような再構成はかなりの頻度で発生し得る。さらに問題なことに、単一の酵母が2個以上のＹＡＣを有している場合もある。次の分析からアーテファクトクローンを除き、複数の挿入ＤＮＡを有するＹＡＣクローンを同定するために、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によってまずＹＡＣクローンのサイズを判定した。
【００５１】
ＰＣＲによリチェックしたＶＨ  に対して陽性を示す１７個の単一ウェル由来のコロニーから4個のコロニーを選択し、ＡＨＣ培養液中の５ｍｌの培養物から少量調製して公知の方法に基づき（D．Burke et al.,上掲）低融点アガロースでブロックを調製した。適当な大きさにしたアガロースブロック断片を用いて、ＰＦＧＥによりＹＡＣのサイズの決定を行った。ＰＦＧＥはPulsaphor（ファルマシア社製）又はクロスフィールド（ＡＴＴＯ社（東京）製）のゲル電気泳動装置を用い、６０秒のパルス時間で行った。コンカテマー化したラムダＤＮＡを分子量マーカーとして加えた。泳動後、ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに転写し、ｐＢＲ３２２プラスミドをプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
【００５２】
典型的な結果を図2に示す。挿入ＤＮＡの大きさがそれぞれ３００ｋｂ、３３０ｋｂ及び３１０ｋｂであるクローンＹ２１、Ｙ２２及びＹ２４から選択されたコロニーは４個のコロニー共同一のサイズを示すために組換えを有していないように思われた。一方、クローンＹ２３の挿入ＤＮＡは、４個のコロニー間にサイズの違いがあるために、組換えを起しかなり不安定であるように思われた。従って、組換を起こしていないコロニーを以下の分析にために選択した。分析したＶＨ を含む１７個のＹＡＣクローンのうちクロ−ンＹ２３を含む３個以外はヒト挿入物は非常に不安定であった。後の分析により、このような組換えは、挿入ＤＮＡ中のＶＨ 遺伝子の数にかかわらず起きることが示された。このことは、他の何らかの因子が相同組換えに関与しているかもしれないことを示している。ＶＨ を含む１７個のＹＡＣクローンの内の安定な１４個のＹＡＣクローンの内から、Ｙ２０、Ｙ１０３、Ｙ２１、Ｙ６およびＹ２４を選択し、以下の物理的マップ構築のために用いた。
【００５３】
（8）レアサイト制限酵素によるＹＡＣクローンの物理的マップ構築
サイズ決定後のＹＡＣクローンのゲルブロックを調製し、ＰＦＧＥによる物理的マップ構築のために用いた。長いＹＡＣを分析するためには、通常、いくつかの酵素を用いることが必要である。 しかしながら、この実施例では、２つのレアサイト制限酵素（切断部位が比較的稀にしか存在しない制限酵素）、すなわち、Not IとMlu IのみをＹＡＣクローンの重複分析に用いた。これは主に次の２つの理由による。 1）ＶＨ を有するＹＡＣクローンは、ＶＨ を有するコスミドクローンから単離されたＶＨ プローブ又は非繰り返しプローブとハイブリダイズする断片の大きさ又はパターンのような数種類の他の情報によって並べることができる。２）一般的な制限酵素を用いた詳細な物理的マップの構築のために、ＹＡＣをコスミドにサブクローニングする必要がある。
【００５４】
Not I及びMlu Iで完全分解したゲルブロックを、ＹＡＣの長さに応じて３０秒ないし６０秒のパルス時間でＰＦＧＥ装置を用いて電気泳動した。ラムダファージＤＮＡ、その他Xho I分解物及びHind III分解物の混合物もまた低分子量マーカーとして用いた。全ての制限酵素切断断片を検出するために、サザンフィルターをまずヒト高分子ＤＮＡとハイブリダイズさせた。検出されたバンドのサイズの合計から、未消化のＹＡＣの長さを計算した。引き続きフィルターを、ｐＹＡＣ４アームのそれぞれに対応するｐＢＲ３２２ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ｐＢＲ３２２をPvu IIとBam HIで二重分解することにより、ＹＡＣベクターの左端（trp側）及び右端（ura側）にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２．６７ｋｂと１．９６ｋｂの断片が得られた。フィルターはまた、 ６つのＶＨ ファミリー特異的プローブとハイブリダイズさせ、切断されたＤＮＡ断片中にＶＨ 遺伝子が存在するか否かを調べた。ＶＨ−II、ＶＨ−IV、ＶＨ−V 及びＶＨ−VI のためのＶＨ 特異的プローブの起源は、それぞれＶＣＥ−１（N．Takahashi  et  al.,Proc．Natl．Acad. Sci．USA，81，5194-5198（1984））、Ｖ７１−２（K．H．Lee et al．，Ｊ．Mol．Biol．，195，761-768（1987））、５−１Ｒ１（J．E．Berman et al.,EMBO J．7，727-1051（1988））及び６−１Ｒ１（J．E．Berman et al.,EMBO J．7，727-1051 （1988））であった。
【００５５】
完全分解実験によって検出された、Not I及びMlu I断片を並べるために、部分分解したＹＡＣＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション実験を行った。部分分解の至適条件を決定するための予備試験が必要であった。なぜなら、制限酵素反応の効率はＤＮＡの純度に大きく依存するからである。本実施例における調整ＤＮＡでは、ほとんどの場合、ゲルブロック（〜５００ｎｇＤＮＡ）の完全分解のために、 １ユニットの制限酵素で６時間反応させることで十分であった。ＤＮＡの部分切断は、反応時間を以下のように変えることにより達成した。
【００５６】
１．３つのゲルブロック（それぞれ約５０μｌの体積を有し、約１μｇのＤＮＡを含み０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で貯蔵）を５０ｍｌの蒸留水に対して、緩やかな攪拌下、室温で１時間透析する。ＥＤＴＡを完全に除去するためにこの操作を繰り返す。
２．ブロックを、１０ｍｌの酵素の至適バッファー中で３７℃で３０分間平衡化させる。
３．１ｘ反応バッファー中にそれぞれ１ユニットの制限酵素を含む２５０μｌの反応溶液中にそれぞれのブロックを移す。
４．３つのチューブを３７℃でそれぞれ１０分間、３０分間及び１時間反応させる。
５． １００μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えることにより反応を停止する。
６．ゲルブロックを適当なゲル電気泳動バッファーで１時間ずつ２〜３回平衡化させ、適当なパルス時間を用いてＰＦＧＥを直ちに行う。
【００５７】
フィルターをＹＡＣベクターの上記左端プローブ及び右端プローブとハイブリダイズさせ、分子量マーカーと比較することによってハイブリダイズした制限酵素断片のサイズを決定した（図３Ａ）。完全分解及び部分分解実験の結果を組合せて図３Ｂに示すＹＡＣクローンの物理的マップを構築した。マッピングされたクローンはこのように結合され、数個の島状の領域に分類された。
【００５８】
（9）ＹＡＣからの挿入ＤＮＡ末端配列の単離
単離したクローンを制限酵素地図に基づいて数個の領域に分類した後、それぞれの領域の両端から挿入ＤＮＡ未端配列を単離してオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。しばしば指摘されるように、ライブラリー中のかなりのパーセンテージ（３０％程度）のＹＡＣクローンが、複数のＤＮＡ断片がライゲーションされたキメラクローンと呼ばれる非連続的（noncontiguous）なＤＮＡ領域を含んでいる。このようなアーテファクトＤＮＡをライブラリーの構築中に排除する有効な方法が開発されていないので、ＹＡＣクローンを単離した後適当な方法でこの可能性をチェックする必要がある。本実施例では、合成挿入ＤＮＡ末端プライマーを用いたＰＣＲを利用してこの可能性を調べる方法をとった。なぜなら、合成プライマーはキメラクローンを調べるために有用であるのみならず、得られた配列を、ＰＣＲによるＹＡＣライブラリーの再スクリーニングのための配列が決定された部位（ＳＴＳ）として登録することにも有用であるからである。さらに、制限酵素地図を比較することによっては見出すことができないコンティグ間の重複を探すためにも用いることができる。
【００５９】
挿入ＤＮＡ未端ＹＡＣ部分を単離するために、逆ＰＣＲ及びベクトレットシステム（J.H．Riley et al., Nucleic Acids Res.,18，2887-1890（1990））を用いるより洗練された迅速な方法を含む数種類の異なる方法がある。しかしながら、本実施例では、断片をプラスミド又はラムダファージベクターでサブクローニングするというかなり伝統的な方法を採用した。右腕配列及び左腕配列の両方に認識部位を有する制限酵素でＹＡＣクローンからの高分子量ＤＮＡを分解した。０．７％アガロース中でゲル電気泳動を行い、ｐＹＡＣ４ベクターの挿入物―べクター境界配列と特異的にハイブリダイズする、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（TetR）の０．６２ｋｂのHind III―Sal I断片とサザンフィルターとをハイブリダイズさせた。ＤＥ８１ペーパーを用いて問題のＤＮＡ断片を回収し、挿入物の大きさに応じてＥＭＢＬ４又はｐＵＣ１９ベクターと連結した。ＥＭＢＬ４ベクターに連結した単離断片は次いで塩基配列決定のためにｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。これらのプラスミドクローンの塩基配列を決定するために、Ｍ１３順方向又は逆方向プライマーを用いたチェインターミネーション法を用いた。挿入ＤＮＡ未端プライマーのための配列は、得られた配列中の反復配列以外の部分から得た。
【００６０】
ヒトＩｇＨ遺伝子座の存在するヒト第14番染色体のみを持つヒトマウス体細胞ハイブリッド細胞ＧＭ１０４７９株（コリエルインスティテュート）のＤＮＡに対してＹＡＣ−ＤＮＡの両端のプライマーを用いて、ＰＣＲ実験により上述のアーティファクトを検討した。ＣＧＭ１細胞からのＤＮＡ（ＹＡＣライブラリーの起源）及びＲａｇ細胞（マウス細胞）からのＤＮＡをそれぞれ＋及び−コントロールとして用いた。ＰＣＲは２５μｌの反応溶液中で、公知の方法（H.S．Kim and O．Smithies，Nucleic Acids res.,16，88870-8903（1988））に基づいて行った。ＤＮＡの２００ｎｇずつを反応に供した。ＣＧＭ１ＤＮＡを用いた分祈実験による至道条件の、９５℃１分−５５〜６２℃２分−７２℃２分の３５〜４０サイクルでＧＭ１０４７９、CGM1，RagのＤＮＡに対し、ＰＣＲを行った。２つの挿入ＤＮＡ末端プライマーのどちらかを用いた時ＧＭ１０４７９において特異的にＤＮＡが増幅されないものがキメラクローンであると結論した。プライマーのいずれもが増幅バンドを与えない１つのコンティグのみが第１６染色体上に転座した（orphon）ＶＨ 遺伝子座をカバーするものであることがわかった。
【００６１】
（10）コスミドサブクローニング及び物理的マップの構築
ＹＡＣ系を用いた大きな染色体領域の単離は物理的マップ構築の最初の段階には有利である。しかしながら、外来性ＤＮＡは酵母染色体ＤＮＡから容易に分離することができず、数百ｋｂに達する断片は機械的剪断なしには取扱が困難であるので、ＹＡＣ中の大きなＤＮＡ断片をより詳細に分析するには種々の問題が伴う。ＶＨ 遺伝子を含有した長大なＤＮＡ断片のＶＨ 遺伝子をマッピングするためには、一般的な６ｂｐ部位認識制限酵素を用いた詳細な制限酵素マップが必要である。この目的のために、ＹＡＣクローンをコスミドにサブクローニングした。
コスミドライブラリーは、予めクローン化したＤＮＡをＹＡＣから分離することなく、ＹＡＣを含む全酵母ＤＮＡから構築した。これには次のような２つの大きな理由がある。 1）完全な挿入ＤＮＡ部分の分離及びその操作は困難である。２）酵母のゲノムサイズが約1.5ｘ１０４ｂｐであってヒトの１/２００であるので、ＹＡＣ挿入ＤＮＡを完全にカバーするために４０００個の独立のコロニーで十分である。
【００６２】
一般的に、コスミドライブラリーを構築するには２つの大きな困難が存在する。第1の困難は、ベクターＤＮＡの自己連結であり、これは外来性ＤＮＡが挿入されないクローンを発生させる。第2の困難は単一のベクターに2個以上のＤＮＡ断片が挿入されること、すなわち、非連続性の連結アーテファクトである。これらの問題を克服するために、２つのｃｏｓ部位を有するより良く設計されたベクターの構築及びベクター及び挿入ＤＮＡの部分的充填（partial filling）のような修飾された連結方法を含む、多大の努力がなされている（J.Sambrook et al．， A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold spring harbor, N.Y.（1989））。
【００６３】
サイズ分画したＤＮＡは、特に過剰量のＤＮＡを分離用ゲルにかけた場合に、通常、より大きなＤＮＡ分子の分画に小さなＤＮＡ分子が混入する。ＤＮＡ間での非連続性の連結を排除するために、ＤＮＡ断片をアルカリフォスファターゼで処理することは有効である。しかしながら、これにより、ライゲーション中にベクターＤＮＡの重合を生じ、これは抗生物質により選択する場合に挿入ＤＮＡを含まないコロニーを選択する。しかしながら、本実施例では、５μｇ未満のＹＡＣ ＤＮＡで十分であるので、電気泳動により目的の分画中に小さなＤＮＡ断片の混入なしにＤＮＡの分離を行うことができた。ほとんどのコスミドライブラリーは、このように、アルカリフォスファターゼ処理コスミドベクターと、３５ｋｂ〜４５ｋｂのサイズ範囲に調製した部分分解ＤＮＡとの組合せを用いて構築した。
【００６４】
〔１〕ＹＡＣを含む酵母ＤＮＡの調製
ＤＮＡを調製するために長大なＤＮＡ断片が出発材料として必要であるので、最小の剪断損傷でＤＮＡを酵母細胞から抽出することは最も重要な工程の１つである。明らかに、最良の方法はＤＮＡをゲル中で取り扱うことである。なぜなら、ＤＮＡは剪断損傷から完全に保護されるからである。しかしながら、本発明者らは、酵母細胞から液体中でＤＮＡを穏やかに抽出することによって、部分分解及びその後のサイズ分画のために十分な長さのＤＮＡ（＞２００ｋｂ）が得られることを見出した。さらに、溶液状のＤＮＡは、ゲルブロック内に充てんしたＤＮＡよりも部分消化の条件が制御しやすい。下記の単純で迅速(全操作が６時間)な方法により、１００ｍｌの酵母培養物から約５０μｇの大きなサイズのＤＮＡ（＞２００ｋｂ）をルーチンに精製できる。
【００６５】
（i）酵母細胞を遠沈させ、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄する。
（ii）細胞を２０ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、１Ｍソルビトール、０．２ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌｙａｓｅ １００Ｔ（ＩＣＮカタログ＃１５２２７０）、 １５ｍＭ ２−メルカプトエタノールに再懸濁し、 ３７℃で１時間インキュベートし、スフェロプラスト化する。
（iii）スフェロプラストを遠沈させ、９ｍｌの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）に再懸濁する。
（iv）１０％ＳＤＳを１ｍｌ（最終濃度１/１０）加え、緩やかに攪拌する。６０℃で１０〜２０分間インキユベートする。
（v）１/３倍量の４Ｍ酢酸カリウムを加え、緩やかに混合し、氷上に３０分間放置する。
（vi）2000xgで30分間遠心分離し、上清を新たなチユーブに移す。3倍量のイソプロパノールを加え、緩やかに攪拌する．室温に１０〜２０分間放置してＤＮＡを洗殿させる。
（vii）2000xgで再び３０分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを１０ｍｌの水に溶解する。
【００６６】
これより後の工程では、ＤＮＡに剪断損傷を与えない注意が必要である。
（viii）フェノールで２回、ＣＩＡＡ（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）で２回抽出し、室温で１０〜２０分間エタノール洗殿を行う。
（ix）2000xgで30分間遠心分離する。ペレットを70％エタノールですすぎ、完全に乾燥させる。
（x） １ｍｌのＴＥに溶解する。
【００６７】
〔２〕ベクターＤＮＡの調製
Lorist ２ＤＮＡをHind III又はBam HIで消化して線状化し、細菌アルカリフォスファターゼで処理することにより脱リン酸化した。フォスファターゼ処理前後のＤＮＡの少量を、公知の方法（J．Sambrook et al.,上掲）に基づきフォスファターゼ処理のチェックのための試験ライゲーションに用いた。
【００６８】
〔３〕挿入ＤＮＡの調製
酵母ＤＮＡの部分分解の予備実験を常法（J.Sambrook et al．，上掲）に基づいて行い、至適酵素濃度及び反応時間を決定した。ゲルからのサイズ分画したＤＮＡの調製はＬＧＴアガロース及びβアガラーゼIを用いて達成された。この非常に緩やかな方法により、高い収率（＞９０％）で分画したＤＮＡを剪断することなく回収することができた。スケールアップした切断反応を、５μｇのＤＮＡを用い、至適酵素濃度で行った。分解した試料を０．５％ＬＧＴアガロース（バイオラッド社製、プレパラティブグレード）に泳動し約１Ｖ／ｃｍの条件で一晩電気泳動を行った。線状化したλＤＮＡと、３５ｋｂと１５ｋｂのバンドを与えるそのXho I消化物もまた、サイズマーカーとして泳動した。ＤＮＡを紫外線トランスイルミネーター下で可視化した後、３５ｋｂ〜４５ｋｂの範囲の断片を含むアガロースの小きな切片を切り出した。ゲル切片からのＤＮＡの回収は、βアガラーゼI （ＮＥＢ）を以下の方法に従い用いた。
【００６９】
(i)ゲル電気泳動バッファーを完全に除去するためにゲルブロックを蒸留水で平衡化する。
(ii)ブロックを新たなチューブに移し、 １／９量の１０xβアガラーゼIバッファーを加える。
(iii)ゲルを６８℃、１０分間で溶解させる。４０℃に冷却後、溶融アガロースを、至適な酵素単位量のβアガラーゼIと共に４０℃、１時間インキュベートする。
(iv)溶液の塩濃度を、エタノール沈殿のために０．５Ｍ ＮａＣｌに調整し、氷上で１０分間冷却する。
(v)15000xgで１５分間遠心分離し、残留する未消化炭水化物をペレット化する。
(vi)ＤＮＡ含有上清を新たなチューブに移す。ＤＮＡを３倍量のエタノールで−８０℃で１０分間洗殿させる。
(vii)15000xgで１５分間遠心分離し、上清を除去する。ペレットを７０％エタノールですすぎ、ペレットを乾燥させる。
(viii)次の操作のために、ペレットを適当な量の蒸留水に再懸濁する。
この方法により、平均１００〜３００ｎｇのサイズ分画されたＤＮＡを回収することができる。
【００７０】
〔４〕ライゲーション、インビトロパッケージング及び大腸菌への感染
この操作は常法（J．Sambrook et al.,上掲）により行った。λインパッケージングキット（日本ジーン社製）及びＥＤ８７６８宿主菌株を用いることにより、２５ｎｇの連結ＤＮＡから約１００００個のコロニーが得られた。
【００７１】
〔５〕コスミドライブラリーのスクリーニング
最初のスクリーニングはHind IIIによる部分消化ＤＮＡのコスミドライブラリーを用いて行った。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢプレート上に約１００００個のコロニー（直径１０ｃｍプレート当たり５００コロニーｘ２０）をプレートし、最初のスクリーニング後に単一コロニーがピックアップできるようにした。次いでコロニーを直径８．２ｃｍの界面活性剤を含まないニトロセルロース膜（アドバンテックトーヨーメンブラン社製）でとり、コロニーハイブリダイゼーションに供した。3つの異なる種類のプローブ、すなわち、ＶＨ  含有コスミドクローンを単離するための、6個のＶＨファミリー特異的プローブの混合物、挿入ＤＮＡ未端コスミドクローンを単離するためのＹＡＣベクタープローブ（ｐＢＲ３２２のＴｅｔＲ部分、上述）、及び残存するあらゆるコスミドクローンのための全ヒトＤＮＡをスクリーニングのために用いた。平均して、1つのＹＡＣクローンから、約３００ｋｂの挿入ＤＮＡに対応する５０〜１００個のクローンがこれらのプローブにより得られた。
【００７２】
〔６〕コスミドコンティグの構築
コスミドクローンからＤＮＡを常法であるアルカリ溶解法（J．Sambrook et al.,上掲）によって単離した。精製コスミドＤＮＡをEco RI又はHind IIIで分解し、制限酵素マップ構築のためにアガロースゲル電気泳動に供した。クローン間の重複は、コスミドクローン間の制限酵素パターンを比較することにより容易に見出すことができた。順序を決定したコスミドクローンを次いでEco RI又はHindIIIで切断し、０．７％アガロースゲルで泳動した。コスミドクローン中のＶＨ遺伝子の位置及び数を同定するために、サザンフィルターを６個のＶＨ  −ファミリー特異的プローブとハイブリダイズさせた。フィルターを標準条件（５０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中）で３０分間３回洗浄し、次いでより厳密な条件（６５℃、０．１ｘＳＳＣ、 ０．１％ＳＤＳ中）で洗浄した。ＶＨ 遺伝子の位置は、コスミドのハイブリダイゼーションパターン及びそれらの物理的マップを比較することにより決定した。
【００７３】
理論的には、３００ｋｂの長さの全ＹＡＣ挿入ＤＮＡをカバーするのに約５０個の独立したコスミドクローン（全ＹＡＣ挿入ＤＮＡの約７倍）で十分である。しかしながら、コスミドクローンのばらつきは不均一であり、いくつかのギャップがまだ残った。これらのギャップに対応するクローンは、Ｓａｕ３ＡＩ部分分解ライブラリー又はそれぞれのコンティグから単離したプローブを用いることによる染色体歩行法によっても単離することができなかった。コスミドライブラリー中に存在しない領域は、図４に示すように、ＹＡＣ  ＤＮＡから必要なサイズのＤＮＡ断片を単離し、ファージ又はプラスミドにサブクローニングすることによリカバーした。完全な物理的マップを構築した後で、このようなコスミドクローンの不均一な分布はＹＡＣ挿入ＤＮＡ中での制限酵素部位のかたまりに起因するものではないことを本願発明者らは見出した。これらの領域がコスミド系においてクローニング不能又は実際よりも出現率が少ない理由はパリンドローム又はタンデムリピートＤＮＡのような配列に起因しているのかもしれない。本実施例において構築された０．８Ｍｂの領域は、上述のように図１に示されている。また、図1中に示される各ＶＨ  遺伝子のＪＨ  からの距離並びにEco RI及びHind III断片の大きさを表３、４にまとめた。
【００７４】
実施例２ コスミドクローンの作製
ヒト高分子ＤＮＡからのコスミドライブラリーの作製に関しては以下のように行った。
３−３１：ヒト胎盤より得られた高分子ＤＮＡを制限酵素Taq Iで部分消化し、０．５％アガロースゲルで電気泳動の後３５〜４５ｋｂの分画をＤＥＡＥペーパーを用いて回収した。回収したＤＮＡをアルカリフォスファターゼを用いて処理した後、制限酵素Cla Iで完全消化したコスミドベクターｐＪＢ８にライゲーションした。ライゲーション産物をイン・ビトロ・パッケージングし、宿主大腸菌４９０Ａに感染させ、その後は通常の方法でコロニーハイブリダイゼーションによるスクリーニングでクローンを得た。
【００７５】
Ｍ１３１、Ｍ８４、Ｍ１１８：基本的には３−３１と同じ方法であるが、用いたＤＮＡはヒトプロＢ細胞株ＦＬＥＢ１４−１４、ベクター、宿主大腸菌はそれぞれＬｏｒｉｓｔ２、ＥＤ８７６７、制限酵素の組合せはXbaIとHind IIIを用い、断端を部分修復法を用いて作製した。なお、部分修飾法は公知の方法（Ｊ．Sambrook， E．F． Fritsch and T． Maniatis， 1989， Molecular Cloning； a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y．）により行った。
【００７６】
実施例３ ＶＨ 遺伝子の塩基配列決定
サブクローニングしたＶＨ 含有断片をベクタープライマーを用いてシーケンシングする代わりに、ＶＨ ファミリー特異的オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。上述のように、ＶＨ 遺伝子のＦＲ領域の塩基配列は同一ファミリー内で非常に類似している。そこで、本願発明者らは、この保存性の高い部分からコンセンサス配列を選択し、配列分析のためのファミリー特異的オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。この目的にアプライドバイオシステムズ社により開発された自動蛍光シーケンシングシステムモデル３７３Ａを用いた。蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを用いる、同社から供給されるダイ−デオキシターミネーターシーケンシングキットは、この目的のために適当であった。なぜなら、合成ＶＨ−特異的プライマーを蛍光標識することなく直接用いることができたからである。
【００７７】
（1）ＶＨ 含有制限酵素断片のサブクローニング
塩基配列決定にＶＨ ファミリー特異的プライマーを用いるために、それぞれのプラスミドが1つのＶＨ 遺伝子のみを含むようにＶＨ含有ＤＮＡ断片をサブクローニングすることが必要である。単一のＶＨ を含有するＤＮＡ断片を単離するために、Eco RI及びHind III以外の数種の６塩基部位認識制限酵素を用いた。サブクローニングした断片のプラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法により単離し、次いで２回超遠心分離を行って、正確な配列決定のための高純度のＤＮＡ試料を得た。
【００７８】
（2）塩基配列決定のためのオリゴヌクレオチド合成
ＶＨ ファミリー特異的オリゴヌクレオチドプライマー合成のためのコンセンサス配列を選択するために、公知のＶＨ 遺伝子のフレームワーク領域及びエクソン−イントロン境界のヌクレオチド配列をファミリー毎に並べた。３’側の半分が標準配列と１００％同一になり、かつ、最も３’未端のヌクレオチドが、高度に保存された（普遍的な）アミノ酸残基の第１又は第２番目の塩基に対応するように注意した。５つのＶＨファミリーのために、表１に示すようにさらに１９個のプライマーを設計した（後述）。
【００７９】
（3）シーケンシング反応及びゲル電気泳動
シーケンシング反応は、ダイ−デオキシターミネーターシーケンシングキット（ＡＢＩ）を用い、製造者の指示に基づいてＰＣＲにより行った。シーケンシング装置において、装置のユーザーマニュアルに従って、ゲル電気泳動及びシグナルの検出を行った。平均して、それぞれの反応から３５０塩基を超える配列を決定することができた。
【００８０】
（4）合成ＶＨ ファミリー特異的プライマーの評価
プライマーＦ−ｕｎｉｖ及びＩ−ＲをまずＶＨ−Ｉ 遺伝子の配列を決定するために選んだ．表２に示すように、これらは分析した１２個のＶＨ−Ｉ遺伝子のうち１１個とアニールした。なお、全ての６個の機能的ＶＨ−Ｉ遺伝子は、これら２つのプライマーによりシーケンスすることができた。 I−ＮＦ１及びI−ＮＲ１は、Ｖ１−１４ＰとＶ１−２７Ｐの２つの遺伝子のために設計された。これら２つのプライマーはまた、最初の２つのプライマーを用いて決定された配列を確認するために、他のＶＨ 遺伝子にも用いた（表２）。
【００８１】
【表２】
2006262911.tif 000003
【００８２】
ＶＨ−III ファミリー遺伝子のシーケンシングのために８つのプライマーを設計し、用いた。それぞれのＶＨ 遺伝子の最初のシーケンシング反応はＦ−ｕｎｉｖ及びIII−Rプライマーを用いて行った。これらは分析したＶＨ−III 遺伝子の８０％を超えるものとアニールした（Ｆ−ｕｎｉｖが２５／３０、III−Rが２４／３０）（表２）。重要なことに、また、 １つの例外を除き全ての機能的ＶＨ−III 遺伝子がこのプライマーの組合せによりシーケンシングすることができた。このことは、これらがほとんどのＶＨ−III ｃＤＮＡに有効であることを示唆している。
【００８３】
最初の実験で決定されたヌクレオチド配列に基づき、さらに６個のプライマー（III―F3、III―R3、III―F4、III―R4、III―NFl及びIII−F2)を設計し、これらの適当な組合せをさらなる分析のために用いた。これらのうち、III-R3及びIII-F4は、それぞれ５’側調節領域及び３’側の周辺領域の配列を決定するために用いた。Ｖ３−２９Ｐ及びＶ３−３２Ｐは、配列が非常にくずれた偽遺伝子であり、従って、III−NFl以外の全てのものはこれら２つのＶＨ 遺伝子とアニールしなかった。Ｖ３−２５Ｐ、Ｖ３−４４Ｐ及びＶ３−６３Ｐは、Ｍ１３ベクターを用い、遺伝子の内部の制限酵素認識部位から決定された。
【００８４】
ＶＨ−II、ＶＨ−IV及びＶＨ−Vファミリーに属するＶＨ 遺伝子の配列を決定するために、それぞれ５個の合成プライマーを用いた。これら３つのファミリーに属するＶＨ 遺伝子は互いに非常に相同的であるので、これらの小さなＶＨ ファミリーに属するＶＨ 遺伝子のほとんどのものは、それぞれ４つのプライマーでシーケンシングできると考えた。実際、全ての４つのＶＨ−IIファミリー特異的プライマーは３つのＶＨ−II遺伝子（Ｖ２−５、Ｖ２−１０Ｐ及びＶ２−２６）とアニールした。
【００８５】
まとめると、合計１１個のプライマー（ＶＨ−I のためにＦ−ｕｎｉｖとI−Ｒ；ＶＨ−IIのためにII-R1、II-F2及びII-R2；ＶＨ−III のためにＦ−ｕｎｉｖ及びIII−R ；ＶＨ−IVのためにIV−Ｒ１、IV−Ｆ２及びIV−Ｒ２、ＶＨ−V のためにV−Ｒ２及びV−Ｒ３）が、５つのＶＨファミリーに属するＶＨ遺伝子のほとんどをシーケンシングするために十分である。 II−Ｆ１、III−NF2及びIV−Ｆ１プライマーはイントロン配列を有しており、従って、ｃＤＮＡのシーケンシングには用いることができない。
【００８６】
この方法により、６４個のＶＨ 遺伝子の塩基配列が決定され、これは上述のように配列番号１〜６４に示されている。各ＶＨ 遺伝子のＪＨ からの距離並びにEco RI及びHind III断片の大きさを表３、４にまとめた。
【００８７】
【表３】
2006262911.tif 000004
【００８８】
【表４】
2006262911.tif 000005
【００８９】
（5）ＶＨ遺伝子の転写方向
ファミリー特異的プライマーを用いてＶＨ 遺伝子の塩基配列を決定する方法は、ＶＨ 遺伝子の転写方向を決定するためには適当ではない。なぜなら、この方法では、単一のＶＨ を含むサブクローニングされた断片の制限酵素マップが必要とはされないからである。このため、本願発明者らは、全てのＶＨ 遺伝子の方向性を決定できたわけではない。 しかしながら、２１個のＶＨ 遺伝子を含む８つの領域がコスミド又はファージで既に単離されている。なぜなら、対応するＶＨ 遺伝子間の配列及びそれらの制限酵素地図が互いに同一であるからである。これらのクローン中でのこれら２１個のＶＨ 遺伝子の相対的順序が０．８Ｍｂの領域中での相対的順序と同じであるので、これらの２１個のＶＨ 遺伝子の転写方向はＪＨ 遺伝子の転写方向と同じであると結論づけられた。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明の約０．８ＭｂのＤＮＡ断片の遺伝子地図である。
【図２】代表的なＹＡＣ挿入ＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図３】Ａは制限酵素Mlu I及びNot Iで消化した断片のサザンハイブリダイゼ−シヨンの結果を示す図である。ＢはＡの結果に基づいて構築したＹＡＣクローンの物理的マップを示す図である。
【図４】ＹＡＣクローンＹ６の遺伝子地図である。
【図１】
2006262911.tif 000006
【図２】
2006262911.tif 000007
【図３】
2006262911.tif 000008
【図４】
2006262911.tif 000009
【配列表】
2006262911000001.app