(57)【要約】【課題】  葯の裂開が抑制された植物体の生産方法を提供する。【解決手段】  葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であってＭＹＢドメインを有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させる。該キメラタンパク質が葯の裂開に関与する遺伝子の発現を抑制し、葯の裂開が抑制された植物体が生産される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、ＭＹＢドメインを有する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させ、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を抑制することを特徴とする葯の裂開が抑制された植物体の生産方法。
【請求項２】
上記植物体は、さらに、雌性器官が稔性を有していることを特徴とする請求項１に記載の植物体の生産方法。
【請求項３】
上記植物体は、さらに、花粉自体が稔性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の植物体の生産方法。
【請求項４】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項５】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項４に記載の植物体の生産方法。
【請求項６】
上記転写因子が、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の植物体の生産方法、
（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質。
【請求項７】
上記タンパク質をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項４または５に記載の植物体の生産方法、
（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるぺプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有するペプチド。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列からなるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１３】
上記機能性ペプチドが、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９又は６０に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１４】
上記機能性ペプチドが、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、葯の裂開が抑制された植物体。
【請求項１６】
植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１５に記載の植物体。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有する転写因子であって、ＭＹＢドメインを有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体の葯の裂開抑制キット。
【請求項１８】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項１７に記載の植物体の葯の裂開抑制キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葯の裂開が抑制された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものであり、特に葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとのキメラタンパク質を生産させることによる葯の裂開が抑制された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物を異なる品種間で交配させ、農産物をハイブリッド化して優良品種を作出することが、現在一般的に行なわれている。これは、植物を異なる品種間で交配させ雑種を作ると、両親より優れた形質が子供に現れる雑種強勢を利用するものである。雑種強勢の利益を受けるためには、互いに異なった品種間で交配させる必要がある。このため、交配を行う品種において、自家受粉が行われないようにする必要がある。このような方法としては、雄性器官を人為的に除去する方法、人為的に交配する方法、花粉の成熟を阻害する化学物質を用いる方法等があるが、これらはその方法を利用できる植物が限られ、また、多大な人的労力を要し手間のかかる作業である。このため、雄性配偶子（花粉）の形成が不完全なため種子形成の不能により稔性を喪失した雄性不稔体を利用する方法が、広く用いられている。これまで、種々の植物において、突然変異により得られた雄性不稔体が品種改良に利用されている。また、雄性不稔体が確立されていない植物品種も多く、遺伝子組換え技術を利用して、人為的に雄性不稔体を確立する試みも報告されている（例えば、特許文献１、２参照）。特許文献１では、葯の裂開および花粉の成熟を制御する遺伝子ＤＡＤ１の発現を制御することによる雄性不稔植物の作出方法が開示されている。
【０００３】
一方、葯の裂開を抑制する試みとしては、細胞毒性を有するバルナーゼを、葯特異的に遺伝子を発現させるＴＡ５６プロモーターに結合し、タバコに導入することによって、口辺細胞を人為的に殺したタバコの葯では、葯の裂開が起きなくなることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、葯の裂開が異常な突然変異体として、delayed-dehiscence 1〜delayed-dehiscence ５、non-dehiscence １等比較的多数の突然変異体が知られている（例えば、非特許文献２参照）。これらの突然変異体の一部においては、葯の裂開を制御する原因遺伝子は明らかにされているが、その多くは未だに原因遺伝子が明らかにされていない。
【０００４】
さらに、トウモロコシのトランスポゾンＥｎ−１／Ｓｐｍで突然変異を誘発したシロイヌナズナ集団から葯の裂開に異常が見られる突然変異体を単離し、原因遺伝子の同定を行ったことが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。非特許文献３では、得られた突然変異体の表現型は、ＡｔＭＹＢ２６にトランスポゾンが挿入されることにより引き起こされるものであることが報告されている。
【０００５】
ここで、本発明者は、転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献３〜９、非特許文献４、５参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【特許文献１】特開２０００−３００２７３公報（平成１２年（２０００）１０月３１日公開）
【特許文献２】特開２００４−２４１０８公報（平成１６年（２００４）１月２９日公開）
【特許文献３】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献５】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献７】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献８】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献９】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】Beals,T.P.,Goldberg,R.B., The Plant Cell, Vol.9,1527-1545,September,1997
【非特許文献２】日向康吉編著，「花−性と生殖の分子生物学−」，学会出版センター，ｐ116−ｐ117
【非特許文献３】Steiner-Lange,S.,Unte,U.S.,Eckstein,L.,Yang,C.,Wilson,Z.A.,Schmelzer,E.,Dekker,K.,Saedler,H., The Plant Journal(2003)34,519-528
【非特許文献４】Ohta,M.,Matsui,K.,Hiratsu,K.,Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M.,The Plant Cell, Vol.13,1959-1968,August,2001
【非特許文献５】Hiratsu,K.,Ohta,M.,Matsui,K.,Ohme-Takagi,M.,FEBS Letters 514(2002)351-354
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１では、葯の裂開が起こらないことと、花粉が稔性を有しないことは同時に起こっている。しかし、花粉の稔性の有無にかかわらず、葯の裂開が起こらなければ、雑種強勢を利用した交配において、自家受粉を避けることができる。
【０００７】
また、従来より用いられている花粉が稔性を有さない雄性不稔体を利用する方法は、結実すると自動的に雑種になるので、雑種第１代を作成するのに有効な方法である。しかし、次世代でも不稔であると結実しないので、次世代では稔性を回復しなければならない。これに対して、葯の裂開は抑制されるが、花粉は稔性を有しているような場合は、花粉自体に生殖能を残しつつ、自家受粉が起きない植物を作成することができ、育種上非常に有用である。このような葯の裂開の抑制を、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとのキメラタンパク質を生産させることによって行なう技術は知られていない。
【０００８】
本発明の目的は、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとのキメラタンパク質を生産させることによって、葯の裂開が抑制された植物体を生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、ＭＹＢドメインを有する転写因子の１つであるＭＹＢ２６タンパク質に、転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを融合させて、植物体内で発現させると、葯の裂開が完全に起こらなくなるか、または、不完全にしか起こらなくなることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明にかかる葯の裂開が抑制された植物体の生産方法は、上記課題を解決すべく、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、ＭＹＢドメインを有する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させ、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を抑制することを特徴としている。上記植物体は、さらに、雌性器官が稔性を有していることが好ましい。また、上記植物体はさらに花粉自体が稔性を有することが好ましい。
【００１１】
これにより、上記キメラタンパク質は、上記転写因子が標的とする遺伝子の転写を効果的に抑制することができる。それゆえ、上記キメラタンパク質が生産された植物体の葯の裂開が抑制されるという効果を奏する。
【００１２】
上記生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることが好ましい。
【００１３】
また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００１４】
これにより、上記キメラタンパク質を形質転換された上記植物細胞内で発現させることができる。それゆえ、該キメラタンパク質が標的遺伝子の転写を抑制し、葯の裂開が抑制されるという効果を奏する。
【００１５】
上記転写因子は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることが好ましい。（ａ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有するタンパク質。
【００１６】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｃ）配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｄ）配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【００１７】
上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。
【００１８】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるぺプチドであってもよい。
【００１９】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであってもよい。（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、転写因子を転写抑制因子に転換する機能を有するペプチド。
【００２０】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２１】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２２】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９、又は６０に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドであってもよい。
【００２３】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドであってもよい。
【００２４】
上記機能性ペプチドが、上記式のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド又は上記配列番号に示されるいずれかのペプチドであり、その多くは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、標的遺伝子の転写抑制を効率的に行うことができる。また、上記機能性ペプチドは、機能的に重複（リダンダント）する他の転写因子の活性に優先して標的遺伝子の転写（発現）を抑制する機能を有している。それゆえ、標的遺伝子の発現を効果的に抑制できるという効果を奏する。
【００２５】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、葯の裂開が抑制されていることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００２６】
また、本発明にかかる植物体の葯の裂開抑制キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、ＭＹＢドメインを有する転写因子をコードする遺伝子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記葯の裂開抑制キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る葯の裂開が抑制された植物体の生産方法は、以上のように、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であってＭＹＢドメインを有する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させる構成を備えているので、葯の裂開に関与する遺伝子の発現が抑制され、葯の裂開が抑制された植物体を生産することが可能となる。したがって、上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子で目的の植物を形質転換すれば葯の裂開が抑制された植物を生産することができ、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、非常に簡便に目的の植物の葯の裂開を抑制することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
本発明は、植物体の葯の裂開を抑制する技術であって、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であってＭＹＢドメインを有する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させる。これによって得られる植物体では、葯の裂開に関与する遺伝子の転写が抑制され、葯の裂開が抑制された植物体を生産することができる。
【００３０】
ここで、葯の裂開は次のように抑制される。すなわち、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、葯の裂開に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。上記転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより葯の裂開に関与すると推定されるタンパク質の生成が減少し、その結果、得られる植物体の葯の裂開を抑制することができる。
【００３１】
上述したように、シロイヌナズナでは、転写因子ＭＹＢ２６タンパク質がトランスポゾンの挿入により破壊されることによって、葯の裂開に異常を示す突然変異が引き起こされることが報告されている。しかし、例えば、ＭＹＢ２６タンパク質が、葯の裂開を制御する原因遺伝子であることがわかっていても、一般的に、植物の二次代謝物質を遺伝子操作を用いて増強または低減させようとする場合、期待どおりの効果を得ることが難しいことが知られている（PNAS 2001,vol.19,367-372）。その理由として遺伝子操作の対象となる酵素および制御因子にアイソザイムや重複因子が存在していることや、別の代謝経路（バイパスの存在）にて補足されてしまうことが挙げられる。
【００３２】
従って、例えばＭＹＢ２６タンパク質が促進する転写を抑制するのみでは、葯の裂開を抑制することは通常困難である。本発明にかかる方法では、上記機能性ペプチドを例えばＭＹＢ２６タンパク質と融合させることにより、かかる困難性を克服することに成功した。
【００３３】
また、例えば現在遺伝子の働きを抑える方法として一般的なＲＮＡｉ法の場合、細胞によってはトランスフェクションの効率が低く、効果が限定される場合もある。従って、ＲＮＡｉ法を用いる場合、ターゲットとする部位の決定が難しく試行錯誤が必要である。また、コンストラクトの構築が難しい。本発明にかかる方法では、上記転写因子をコードする遺伝子に上記機能性ペプチドをコードする遺伝子を結合したキメラ遺伝子を植物体に導入することによって、非常に簡便に目的の植物の葯の裂開を抑制することが可能となる。
【００３４】
本発明にかかる生産方法で生産される葯の裂開が抑制された植物体には、葯の裂開が完全に起こらない植物体及び葯の裂開が不完全にしか起こらない植物体が含まれる。ここで葯とは雄蕊（おしべ）の一部で、花粉をつくる袋状の部分である。閉花受精をするもの（例：マメ科）では、花粉が葯内で発芽し、繊維状細胞層の発達をみない柔らかな葯壁を通して花粉管を伸長させるが、一般に葯は裂開して花粉を葯の外に放出する。葯の裂開は、口辺細胞が細胞死を起こし、そこで葯壁が切れることによって起こる。また、口辺細胞が切れただけでは葯は口を開かず、花粉が放出されるためには葯壁が収縮して反りかえることが必要である。本発明でいう葯の裂開が抑制された植物体とは、口辺細胞が切れただけで葯壁の収縮が起こらないため葯の裂開が抑制される植物体であってもよいし、口辺細胞が切れないために葯の裂開が抑制される植物体であってもよいし、口辺細胞が切れず且つ葯壁が反りかえらないために葯の裂開が抑制される植物体であってもよい。なお、口辺細胞とは、葯が口を開く部分にあたる、一層の小さな細胞からなる組織である。
【００３５】
なお、本発明の葯の裂開が抑制された植物体では、雌性器官（めしべ）は、稔性を有している。これにより、本発明の葯の裂開が抑制された植物体に他種の花粉を受粉できる。したがって、雄性器官を人為的に除去したり、人為的に交配させるという手間をかけずに、雑種強勢を利用した交配により、雑種第１代（Ｆ１）品種を得ることができる。
【００３６】
また、本発明の葯の裂開が抑制された植物体では、葯の裂開が抑制されていればよく、花粉自体は稔性を有していてもよいし、稔性を有していなくてもよいが、花粉自体が稔性を有していることがより好ましい。これにより、花粉自体には生殖能を残しつつ、自家受粉が起きない植物体を生産することが可能となり、育種等に有用である。すなわち、花粉自体が稔性を有していない雄性不稔体では、それ自身の花粉が利用できないので、自殖によるホモ接合性の個体を作出、維持することができない。ヘテロ接合性の個体を自家受粉することにより、ホモ接合性の個体を作出することはできるが、かかる場合もホモ接合性の個体は１／４しか得られない。これに対し、花粉自体には生殖能を残すことにより、ホモ接合性の個体を作出、維持することが可能となり、育種への応用が考えられる。
【００３７】
以降の説明では、本発明にかかる葯の裂開が抑制された植物体の生産方法に用いられるキメラタンパク質、本発明にかかる植物体の生産方法の一例、これにより得られる植物体とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。
【００３８】
（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であってＭＹＢドメインを有する転写因子と、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。
【００３９】
また、本発明で用いられるキメラタンパク質は、内在性の遺伝子に対して、優性に作用するものである。すなわち、本発明にかかるキメラタンパク質は、植物が二倍体や複二倍体であったり、あるいは植物に機能重複遺伝子が存在したりしても、葯の裂開に関わる遺伝子の発現を一様に抑制できる。それゆえ、上記するキメラタンパク質をコードする遺伝子が導入された植物体を、効果的に葯の裂開が抑制された植物体に質転換することが可能となる。
【００４０】
以下に、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００４１】
（Ｉ−１）葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であってＭＹＢドメインを有する転写因子
本発明で用いられる転写因子は、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であって、ＭＹＢドメインを有する転写因子であれば特に限定されるものではない。ここで、ＭＹＢドメインとは、がん遺伝子の１つであるｍｙｂ遺伝子の産物と相同性を有する約５０アミノ酸残基を１つの単位とするドメインをいう。かかるＭＹＢドメインを持つ転写因子はＭＹＢ転写因子ファミリーとよばれ、ＭＹＢドメインは動物及び植物の多くの種において保存されている。本発明で用いられる転写因子は、かかるＭＹＢ転写因子ファミリーに属する転写因子であって、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であればよい。一般に葯は裂開して花粉を葯の外に放出する。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能及び同様のドメインを有する転写因子が含まれる。
【００４２】
このような転写因子としてはシロイヌナズナＭＹＢ２６タンパク質、イネＮＰ＿９１６５７６．１（GenBankアクセッション番号）によりコードされるタンパク質等を挙げることができるが、上記転写因子はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、シロイヌナズナＭＹＢ２６タンパク質を挙げることができる。ＭＹＢ２６タンパク質は、例えば、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができ、上述したように、シロイヌナズナのＭＹＢ転写因子ファミリーの１つである。なお、特に高等生物では、可変スプライシングの結果生じるスプライシングバリアントが複数存在することが知られており、ＭＹＢ２６タンパク質でも、複数のスプライシングバリアントが存在する。従って、上記ＭＹＢ２６タンパク質には、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に限られず、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する機能を有する転写因子である限り、かかるスプライシングバリアントも含まれる。本発明では、例えば、このＭＹＢ２６タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるＭＹＢ２６タンパク質を転写抑制因子に転換させる。
【００４４】
なお、ＭＹＢ２６タンパク質が標的とする、葯の裂開に関与する遺伝子については明らかにされていないが、この転写因子ＭＹＢ２６が標的とする遺伝子は、葯におけるリグニン合成を担う酵素等の遺伝子であることが予想されている。すなわちＭＹＢ２６転写因子は、葯におけるリグニン合成を担う酵素等の遺伝子発現を正に制御していることが予想される。リグニン合成と葯の開裂との関係については、葯壁の内被細胞がリグニン化と脱水とによって収縮することにより、葯はストミウムを中心に左右に開くことが考えられる。従って、本発明で用いられる転写因子が標的とする遺伝子が、リグニン合成を担う酵素等の遺伝子である場合には、本発明で用いられる転写因子は、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であり、且つ、リグニン合成を担う酵素等の遺伝子発現を正に制御している転写因子であるということができる。
【００４５】
本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列からなるＭＹＢ２６タンパク質に限定されるものではなく、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進するＭＹＢファミリー転写因子であればよい。具体的には、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能及びＭＹＢドメインを有していれば本発明にて用いることができる。なお、上記の「配列番号１３４に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００４６】
また上記転写因子としては、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列に対して、２０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％または７０％以上の相同性を有するタンパク質であって、且つ、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する機能及びＭＹＢドメインを有するタンパク質も含まれる。なおここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合であり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。
【００４７】
また、本発明で用いられる、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であってＭＹＢドメインを有する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。そのため、葯の裂開を抑制したい個々の植物体において、かかる転写因子やかかる転写因子をコードする遺伝子を必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナで構築したキメラタンパク質をコードする遺伝子を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に葯の裂開が抑制された植物体を生産することができる。
【００４８】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産させる際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００４９】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写因子のアミノ酸配列に対応するものであればよい。具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＭＹＢ２６タンパク質を用いる場合には、このＭＹＢ２６タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＭＹＢ２６遺伝子と称する）を挙げることができる。ＭＹＢ２６遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号１３５に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５０】
もちろん、本発明で用いられるＭＹＢ２６遺伝子、または、転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号１３５に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号１３５に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。
【００５１】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。
【００５２】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００５３】
（Ｉ−２）転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチドであればよい。具体的には、例えば、本発明者によって見出された転写抑制転換ペプチド（特許文献３〜９、非特許文献４、５等参照）を挙げることができる。
【００５４】
本発明者は、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、ＡｔＥＲＦ４タンパク質、ＡｔＥＲＦ７タンパク質、ＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子およびこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献３〜６参照）。また、Class II ＥＲＦ遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献７参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質（例えば特許文献８参照）をコードする遺伝子、及び、ジンクフィンガータンパク質の遺伝子群の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についても上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。さらに本発明者は、これらタンパク質は、カルボキシル基末端領域に、アスパラギン酸−ロイシン−アスパラギン（ＤＬＮ）を含む共通のモチーフを有することを明らかにした。そして、この共通モチーフを有するタンパク質について検討した結果、遺伝子の転写を抑制するタンパク質は極めて単純な構造のペプチドであってもよく、これら単純な構造を有するペプチドが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有することを見出している。
【００５５】
また、本発明者は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質は、上記の共通のモチーフと一致しないモチーフを有するが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有すること、また該ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質をコードする遺伝子を、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子をコードする遺伝子に結合させたキメラ遺伝子は、強力な転写抑制能を有するタンパク質を産生することも見出している。
【００５６】
したがって、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドの一例として、本実施の形態では、Class II ＥＲＦタンパク質であるシロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３タンパク質、同ＡｔＥＲＦ４タンパク質、同ＡｔＥＲＦ７タンパク質、同ＡｔＥＲＦ８タンパク質、タバコＥＲＦ３タンパク質、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質、ジンクフィンガータンパク質の一つであるシロイヌナズナＺＡＴ１０タンパク質、同ＺＡＴ１１タンパク質等のタンパク質、同ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質、これらから切り出したペプチドや、上記機能を有する合成ペプチド等を挙げることができる。
【００５７】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００５８】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００５９】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６０】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４０、４１に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列である。
【００６１】
（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６２】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００６３】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００６４】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４２、４３に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４４に示す。
【００６５】
（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００６６】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６７】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときに容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定される物ではない。
【００６８】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときに容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００６９】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４５〜５３に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４５、４６または４７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４８、４９または５０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５１、５２または５３に示すアミノ酸配列である。
【００７０】
（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号７、１６、５４に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５４に示すアミノ酸配列である。
【００７１】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００７２】
（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献９参照）。
【００７３】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｅ）又は（ｆ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００７４】
上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００７５】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。
【００７６】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全長配列からなるペプチドに限られず、その部分配列からなるペプチドであってもよい。
【００７７】
その部分配列からなるペプチドとしては、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）からなるペプチドが挙げられ、その部分配列からなるペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００７８】
（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００７９】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β3は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ2は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。
【００８０】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列からなる転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、１３３、５９、又は６０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２９、３０、３２、３４、１３３、５９、又は６０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２５、３５、３６又は３７のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２６、２７、２８、３１、又は３３のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２３又は２４のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００８１】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３８または３９で表されるアミノ酸配列からなる転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００８２】
（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００８３】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（２）の項で詳細に説明する。
【００８４】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００８５】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１、５５又は５７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、２、５６、又は５８に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号３〜３９、１３３、５９、６０に示されるアミノ酸配列に対応するものである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９５、９６に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号２０、２１に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００８８】
（ＩＩ）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、葯の裂開を抑制する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００８９】
（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００９０】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００９１】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。これらのプロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００９２】
また、上記プロモーターは、葯特異的に遺伝子を発現させることができるプロモーターであってもよい。かかるプロモーターとしては、例えばＴＡ５６プロモーター、ＡｔＭＹＢ２６プロモーター、ＤＡＤ１プロモーター等を挙げることができる。このようなプロモーターを用いることにより、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を葯でのみ発現させて、他の組織に影響を与えることなく、葯の裂開を抑制することが可能となる。かかるプロモーターを用いることにより、当該遺伝子の発現の時期及び組織に特異的に遺伝子を発現させることが可能となり、葯の裂開をより効果的に抑制することができる。
【００９３】
また、広い範囲の植物組織で機能するプロモーターの中でも、本発明で用いられるキメラ遺伝子を発現させることによって、葯の裂開にかかる形質のみが変化し、他の形質は変化しないようなプロモーターは、本発明において非常に好適に用いることができる。例えば、後述する実施例で示されるように、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いる場合には、葯以外には異常は見られない。
【００９４】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００９５】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００９６】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【００９７】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００９８】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００９９】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【０１００】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【０１０１】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【０１０２】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【０１０３】
（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【０１０４】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。
【０１０５】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【０１０６】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【０１０７】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１０８】
（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１０９】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、葯の裂開の状況から選抜してもよい。例えば、葯の裂開の状況から選抜する例としては、電子顕微鏡、実体顕微鏡等を用いて、葯の形状を観察する方法を挙げることができる（後述の実施例参照）。
【０１１０】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により葯の裂開が抑制された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１１１】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１１２】
また、本発明にかかる植物体の生産方法は、組換え発現ベクターで形質転換する方法に限定されるものではなく、他の方法を用いてもよい。具体的には、例えば、上記キメラタンパク質そのものを植物体に投与してもよい。この場合、最終的に利用する植物体の部位において葯の裂開を抑制できるように、若年期の植物体にキメラタンパク質を投与すればよい。またキメラタンパク質の投与方法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を用いればよい。
【０１１３】
（ＩＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、葯の裂開に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより葯の裂開を抑制することができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【０１１４】
（ＩＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
ここで、本発明にかかる葯の裂開が抑制された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、葯の裂開の抑制によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。裸子植物としては、例えば、スギ目のスギ科、マツ科、ヒノキ科の植物やマキ科の植物を挙げることができる。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科、ツバキ科等の植物を挙げることができる。また、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、ムギ等のイネ科、ホシクサ科等の植物を挙げることができる。
【０１１５】
また、本発明にかかる葯の裂開が抑制された植物体は、果実や種子を商品とする植物、花や植物体そのものを商品とする観葉植物（花卉植物）であってもよい。したがって、本発明にかかる葯の裂開が制限された植物体の具体例をさらに挙げると、ナタネ、ジャガイモ、ホウレンソウ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワー、さやいんげん、かぶ、めかぶ、大根、ブロッコリー、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウなどの各種の食用植物、あるいはバラ、キク、あじさい、カーネーションなどの観葉植物がある。
【０１１６】
（ＩＩＩ−２）本発明の有用性
本発明は、植物体の葯の裂開を抑制することにより一定の効果がある分野に有用性がある。具体例を以下にいくつか挙げるが、本発明の有用性は、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
まず、本発明の技術により、葯の裂開が抑制された植物体を作出でき、雑種強勢を利用した交配による品種改良に利用できる。本発明の葯の裂開が抑制された植物体では、花粉が葯の外に放出されないため、イネ等の自殖性植物であっても、自家受粉が行われない。そのため、他種の花粉を授粉することで、種間の交配を簡便に行える。これにより、雑種強勢を利用した、優良品種の一代雑種の探索を簡便かつ効率的に行うことができる。
【０１１８】
また、本発明の技術は、トウモロコシ等の他殖性植物にも適用できる。他殖性植物では、現在、人力で雄しべを刈り取る作業（除雄作業）により自家受粉を回避し、他品種の花粉を授粉して品種改良を行っている。これに対し、本発明の技術で葯の裂開が抑制された植物体を生産すれば、このような労力を必要としなくなるため、品種改良に必要な時間やコスト、あるいは優良品種の栽培に必要な手間を、現状に比較して大幅に低減することができる。
【０１１９】
特に、本発明の技術により、花粉は稔性を有するが、葯の裂開が抑制された植物体を作出できるため、花粉自体には生殖能を残しつつ、自家受粉が起きない植物体を生産することが可能となり、育種等に有用である。すなわち、花粉自体には生殖能を残すことにより、ホモ接合性の個体を作出、維持することが可能となる。このような純系植物を自家交配することによって、均一な種子繁殖集団を得ることが可能となり、選抜作業を行なう手間や時間を低減することができる。
【０１２０】
また、本発明の技術は、タマネギやジャガイモなど、地下茎を商品とする植物にも応用できる。この種の植物では、受粉が起こると、地下茎の成長が著しく阻害され、商品価値が下がることが知られている。そのため、現在、受粉を回避するために除雄作業が必要となり、そのための手間やコストが非常に大きい。本発明の技術により、地下茎を商品とする植物の葯の裂開が抑制された植物体が得られるため、除雄作業を必要とせず、受粉を回避できる。そのため、植物体を育成して商品を生産する際のコストや時間を、現状に比較して大幅に低減できる。
【０１２１】
本発明の技術は、果実や花を商品としない植物体にも好適に応用できる。その一例を挙げると、花粉症の予防がある。すなわち、花粉症の原因となる花粉を大量に撒き散らす植物、例えば、スギ、ヒノキ、サワラなどの樹木、カモガヤ、オオアワガエリ、ナガハグサなどのイネ科植物、ブタクサ、ヨモギ、カナムグラなどの雑草類において、本発明の技術により葯の裂開が抑制された植物体を生産すれば、これらの植物体から花粉が飛散する恐れがない。そのため、これらの葯の裂開が抑制された植物体を、自然界の野生型植物体と置き換えてやれば、花粉症の原因となる花粉の飛散が抑えられるため、花粉症を予防できる。
【０１２２】
本発明の技術により、遺伝子改変植物体の花粉の自然界への望ましくない拡散を防止できる。一例を挙げると、パルプの原料であるユーカリでは、遺伝子操作により、耐塩性や耐寒性に優れ、樹木が巨大化するなどの、より優れた形質を導入された遺伝子改変植物体が創出され、野外環境下における導入形質の検証実験が行われている。しかし、このような遺伝子改変植物体を野外環境下で育てると、風や昆虫等を媒体とした花粉の拡散を通じて、遺伝子改変植物体が自然界へ広く拡散していき、自然環境が改変される恐れがある。そのため、かかる問題に対処するために、遺伝子改変植物の検証実験を、外界から完全に隔離された、特殊な環境下で行う必要がある。
【０１２３】
しかし、本発明の技術を用いて、遺伝子改変植物体を、葯の裂開が抑制された植物体に形質転換させておけば、花粉の撒布による遺伝子改変植物体の自然界への拡散は起こらない。そのため、現状に比較して、実際の野外環境下により近い条件で、遺伝子改変植物体の検証試験を行うことができる。これにより、遺伝子改変植物体に導入した形質を、より自然な環境下で検証できる。
【０１２４】
（ＩＩＩ−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち葯の裂開抑制キットを挙げることができる。
【０１２５】
この葯の裂開抑制キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子と上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【実施例】
【０１２６】
以下、実施例及び図１ないし図５に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２７】
本実施例においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドをシロイヌナズナＭＹＢ２６遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１２８】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１２９】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１３８）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１３９）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１４０）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１４１）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１３０】
（２）クローンテック社製（Clontech社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１３１】
（３）以下の配列番号１４２、１４３の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１４２、１４３の配列からなるＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'（配列番号１４２）
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'（配列番号１４３）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１３２】
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図２に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
【０１３３】
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンTAAを持つように設計した、以下の配列からなるＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5'-gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag-3'（配列番号１４４）
5'-tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc-3'（配列番号１４５）
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。
【０１３４】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図３に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１３５】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１３６】
（２）インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標）ベクターコンバージョンシステムのFragmentＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、FragmentＡ断片を回収した。
【０１３７】
（３）回収したFragmentＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１３８】
＜構築用ベクターへのＭＹＢ２６遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＭＹＢ２６タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
【０１３９】
（１）シロイヌナズナ葉から調整したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くＭＹＢ２６遺伝子のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＭＹＢ２６−Ｆ）5'-GATGGGTCATCACTCATGCTGCAACAAGCA-3'（配列番号１３６）
プライマー２（ＭＹＢ２６−Ｒ）5'-AGTTATGACGTACTGTCCACAAGAGATTGG-3'（配列番号１３７）
ＭＹＢ２６遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３５および１３４に示す。
【０１４０】
（２）得られたＭＹＢ２６コード領域のＤＮＡ断片を、図２に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１４１】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
【０１４２】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway（登録商標）ＬＲ clonase（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１４３】
（１）まず、ＭＹＢ２６のコード領域が順方向に挿入されたｐ３５ＳＭＹＢ２６ＳＲＤＸＧ１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ buffer ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ TrisCl pH7.0、１ｍＭ EDTA）５．５μＬを加えた。
【０１４４】
（２）この溶液にＬＲ clonase４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、proteinaseＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１４５】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１４６】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
【０１４７】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸを、土壌細菌（（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell  １９８６))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、下表２）に懸濁した。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。なお、アグロバクテリウムを感染させた世代では、胚珠の生存を妨げる場合を除き、一般に形質転換遺伝子の影響は出ない。そのため、葯の裂開の抑制は起こらず結種した。回収した種子を２５％ブリーチ、０．０２％Triton Ｘ-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表３）に蒔種した。
【０１５０】
【表３】
2006034218.tif 000004
【０１５１】
（３）蒔種した約５０００粒の種子から平均して６０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＭＹＢ２６ＳＲＤＸの遺伝子が導入されていることを確認した。
【０１５２】
ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換された植物体の数個体について、葯の形状を走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−６３３０Ｆ、日本電子データ社製）で観察した。その結果を図４（ｂ）に示す。図４（ａ）は野生型のシロイヌナズナの葯の形状を同様に走査型電子顕微鏡で観察した結果を示している。図４（ｂ）に示されているように、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナでは葯の裂開が起こっていない。このように、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換されたシロイヌナズナでは、殆どの場合葯の裂開は完全に起こっていなかった。或いは、図には示していないが、葯の裂開が起こっている場合でも不完全にしか起こっていなかった。
【０１５３】
また、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換された２２個体の植物体について、各個体で結実したさやの数の、開花した花の数に対する割合を調べ、正常に結実する全く別のシロイヌナズナ植物体群と比較した。図５にその結果を示す。図５（ａ）、（ｂ）のグラフにおいて、縦軸は個体数、横軸は（結実したさやの数／開花した花の数）×１００の階級値を示す。例えば横軸の２０は、（結実したさやの数／開花した花の数）×１００の計算値が１０より大きく２０以下の階級であることを意味する。図５に示されているように、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換された植物体群（図５（ｂ））では、正常に結実する植物体群（図５（ａ））に比べて各個体で結実したさやの数の、開花した花の数に対する割合が低下した個体が数多く観察された。結実したさやの数の、開花した花の数に対する割合が０より大きく１０以下である植物体が２２個体中１１個体あり、種子が殆ど形成されなかった個体の割合が高いことを示している。これは、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換された植物体群は自然状態では葯の裂開が抑えられるので、種子が殆どできなかったことを示している。また、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換された植物体群において得られた種子は、不完全に裂開した葯から放出された花粉を自家受粉したことにより得られたものである。なお、「結実したさやの数」とは、１個体全体において、種子が形成されたさや（長角果）の総数をいう。
【０１５４】
さらに、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換され、葯の裂開が抑制された植物体において、葯内の花粉を取り出して受粉させた場合に結実するかを調べた。その結果、葯の裂開が完全に抑制された場合においても、花粉を取り出して受粉させたところ結実したことから、花粉自体は稔性を有していることが確認された。この結果より、ｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸで形質転換された植物体は、花粉自体には稔性があるが、葯が裂開しないため受粉できず、結果として結実しないことがわかった。また、葯が裂開しない花に受粉させたところ、結実したことから、雌性器官（めしべ）は稔性を有していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
このように、本発明では、葯の裂開に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとのキメラタンパク質を生産させることによって葯の裂開が抑制された植物体を得ることができる。それゆえ、本発明は、各種農業や林業、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】実施例において用いる組換え発現ベクターを構築するための構築用ベクターの構築方法を示す工程図である。
【図２】実施例において用いる構築用ベクターｐ３５ＳＧに、転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸをコードする遺伝子とＭＹＢ２６遺伝子とを組み込む工程図である。
【図３】形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図４】（ａ）は野生型のシロイヌナズナの葯の形状を示す図であり、（ｂ）は実施例で組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの葯の形状を示す図である。
【図５】（ａ）は野生型のシロイヌナズナの「（結実したさやの数／開花した花の数）×１００」の階級値に対し、個体数をプロットしたグラフであり、（ｂ）は実施例で組換え発現ベクターｐＢＩＧ−ＭＹＢ２６ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの「（結実したさやの数／開花した花の数）×１００」をプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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