(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の技術に固有の制限を克服するｐｒｏｔｅｏｍｅ分析において使用され得る方法および試薬を提供する。【解決手段】自動化ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムであって、以下：  （ａ）キャピラリーＨＰＬＣと流体接続するオートサンプラー  （ｂ）該キャピラリーＨＰＬＣと流体接続するエレクトロスプレーイオン化三連四重極ＭＳ／ＭＳ装置；および  （ｃ）該オートサンプラー、キャピラリーＨＰＬＣおよびＭＳ／ＭＳ装置と電気接続する装置制御およびデータ分析システムを備える、システム。【選択図】図１Ａ
2006184290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動化ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムであって、以下：
（ａ）キャピラリーＨＰＬＣと流体接続するオートサンプラー；
（ｂ）該キャピラリーＨＰＬＣと流体接続するエレクトロスプレーイオン化三
連四重極ＭＳ／ＭＳ装置；および
（ｃ）該オートサンプラー、キャピラリーＨＰＬＣおよびＭＳ／ＭＳ装置と電
気接続する装置制御およびデータ分析システム
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の混合物においてタンパク質またはタンパク質の機能の
迅速かつ定量的分析のための、分析試薬およびこれらの試薬を使用する質量分析
に基づく方法を提供する。
【０００２】
本発明は、米国科学財団科学技術センター分子生物工学（補助金５Ｔ３２ＨＧ
およびＢＩＲ９２１４８２１）ならびに国立衛生研究所（ＮＩＨ補助金ＲＲ１１
８２３、Ｔ３２ＨＧ０００３５、ＨＤ−０２２７４およびＧＭ６０１８４）から
の資金援助によってなされた。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有す
る。
【０００３】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９８年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／０９７
，７８８号および１９９８年９月３日に出願された同第６０／０９９，１１３号
から、米国特許法１１９（ｅ）項に基づく優先権を有し、これら両方は、その全
体おいて参照として援用される。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ゲノム技術は、原則として、完全なゲノム配列を決定し、細胞中で発現された
各遺伝子についてｍＲＮＡレベルを定量的に測定することが可能な点まで進んで
いる。いくらかの種について、今や完全なゲノム配列が決定され、酵母Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅの一本の鎖について、各発現された遺
伝子についてのｍＲＮＡレベルが、種々の増殖条件下で正確に定量化された（Ｖ
ｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，１９９７）。比較ｃＤＮＡ配列分析および関連する技術
は、ｍＲＮＡレベルにおける遺伝子発現における誘導される変化を、調査される
細胞または組織によって発現される多数の遺伝子（ある場合では、すべての遺伝
子）の発現レベルを同時にモニターすることによって決定するために使用されて
いる（Ｓｈａｌｏｎら、１９９６）。さらに、生物学的技術およびコンピュータ
ー技術が、特定の機能を遺伝子配列と関連させるために使用されている。生物学
的システムの構造、制御および機構において、これらの技術によって得られたデ
ータの解釈は、かなりの挑戦として認識されている。特に、ゲノム分析のみによ
って生物学的プロセスの機構を説明するのは非常に困難である。
【０００５】
タンパク質は、ほとんどすべての生物学的プロセスの制御および実行に対して
必須である。合成の速度およびタンパク質の半減期ならびに従ってそれらの発現
レベルはまた転写後に制御される。さらに、タンパク質の活性は、しばしば転写
後の修飾（特にタンパク質リン酸化）によって修飾され、ＤＮＡおよびタンパク
質を含む他の分子とそのタンパク質の関係に依存する。従って、タンパク質の発
現のレベルも、タンパク質の活性の状態も両方とも、遺伝子配列からも対応する
ｍＲＮＡ転写の発現レベルさえからも直接的には明らかではない。生物学的シス
テムの完全な記述が、そのシステムを構成するタンパク質の同定、定量および活
性の状態を示す測定を含むことは必須である。細胞または組織中で発現されたタ
ンパク質の大規模な（最終的には全体的な）分析がｐｒｏｔｅｏｍｅ分析と呼ば
れている（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎら、１９９７）。
【０００６】
現在において、タンパク質分析技術は、ゲノム技術の自動化のスループットお
よびレベルに達していない。ｐｒｏｔｅｏｍｅ分析の最も一般的な実施は、最も
一般的に二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）による複合したタンパク質のサンプルの
分離、および引き続く分離されたタンパク質種の配列同定に基づく（Ｄｕｃｒｅ
ｔら、１９９８；Ｇａｒｒｅｌｓら、１９９７；Ｌｉｎｋら、１９９７；Ｓｈｅ
ｖｃｈｅｎｋｏら、１９９６；Ｇｙｇｉら、１９９９；Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅら、
１９９６）。このアプローチは、強力な質量分析技術の発展、ならびタンパク質
およびペプチド質量スペクトルデータと配列データベースとを関連付け、従って
素早く決定的にタンパク質を同定するコンピューターアルゴリズムの発展によっ
て大変革された（Ｅｎｇら、１９９４；ＭａｎｎおよびＷｉｌｍ、１９９４；Ｙ
ａｔｅｓら、１９９５）。この技術は、銀染色を含む従来のタンパク質染色法に
よって検出可能な必須の任意のタンパク質の同定を現在可能にする感度のレベル
に達している（ＦｉｇｅｙｓおよびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、１９９８；Ｆｉｇｅｙ
ら、１９９６；Ｆｉｇｅｙら、１９９７；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、１９９６）
。しかし、サンプルがプロセスされる引き続く方法は、サンプルのスループット
を制限し、最も敏感な方法は、自動化が困難であり、低量のタンパク質（例えば
調節タンパク質）は、前濃縮なしでは検出を逃れ、従って、技術の動的な範囲を
事実上制限する。２ＤＥ／（ＭＳ）Ｎ法において、タンパク質は、２ＤＥゲルの
染色点の濃度測定によって定量化される。
【０００７】
マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィー（μＬＣ）およびデータベース
検索と組み合わせた自動化データ依存電気スプレイイオン化（ＥＳＩ）タンデム
型分子質量分析（ＭＳｎ）のための方法および機器の発展は、ゲル分離されたタ
ンパク質の同定の感度およびスピードを有意に増加した。ｐｒｏｔｅｏｍｅ分析
に対する２ＤＥ／ＭＳｎアプローチの代替として、複合したタンパク質混合物の
消化によって生成されるペプチド混合物のタンデム型分子質量分析による直接分
析が、提案された（Ｄｏｎｇｒ‘ｅら、１９９７）。μＬＣ−Ｍｓ／ＭＳはまた
、ゲル電気泳動分離なしで混合物から直接個々のタンパク質の大規模同定に首尾
よく使用された。（Ｌｉｎｋら、１９９９；Ｏｐｉｔｅｋら１９９７）。これら
のアプローチがタンパク質同定を劇的に加速しながら、分析されたタンパク質の
量は、容易には決定され得ず、これらの方法は、２ＤＥ／ＭＳ／ＭＳアプローチ
によっても遭遇する動的な範囲の問題を実質的に軽減することは示されていない
。従って、複合したサンプルの低量のタンパク質はまた、前の濃縮なしでμＬＣ
／ＭＳ／ＭＳ法によって分析するのは困難である。
【０００８】
従って、現在の技術は、タンパク質混合物の成分を同定するのに適しているが
、混合物中のタンパク質の量も、活性の状態も両方とも測定可能ではないことは
明らかである。現在のアプローチの進展的な改良でさえ、慣用的な定量的および
機能のｐｒｏｔｅｏｍｅ分析を実現するのに十分な性能を進歩させそうでない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来の技術に固有の制限を克服するｐｒｏｔｅｏｍｅ分析において
使用され得る方法および試薬を提供する。記載される基本的なアプローチは、複
合されたサンプル（例えば、細胞、組織およびその機能）におけるタンパク質発
現の定量的分析、複合したサンプルの特異的タンパク質の検出および定量、およ
び複合したサンプルの特異的酵素活性の定量的測定のために使用され得る。
【００１０】
このことについて、正常または疾患状態と関連するタンパク質またはタンパク
質の機能の存在、不在、欠乏または過剰を検出する臨床的および診断的アッセイ
について、複数の分析技術が現在得られる。これらの技術は非常に敏感である一
方で、これらは、産物の化学的種形成を必ずしも提供せず、結果として、単一の
サンプルにおいて同時にいくつかのタンパク質または酵素をアッセイすることに
おいて困難であり得る。現在の方法は、通常のセットの臨床的症状に導く種々の
酵素の異常発現またはそれらの機能不全を区別し得ない。本明細書において、本
方法および試薬は、複数のタンパク質およびタンパク質の反応を同時に（複数）
モニターするための臨床的および診断的アッセイに使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（本発明の要旨）
本発明は、タンパク質の混合物においてタンパク質またはタンパク質の機能の
迅速かつ定量的分析のための、分析試薬およびこれらの試薬を使用する質量分析
に基づく方法を提供する。この分析方法は、定量的に使用され得、特に細胞およ
び組織の全体的なタンパク質発現プロフィールの定量的な分析（すなわち、ｐｒ
ｏｔｅｏｍｅの定量的分析）のために使用され得る。この方法はまた、細胞、組
織または生物学的流体の発現レベルが、サンプルが由来する細胞、組織または生
物についての、刺激（例えば、薬剤の投与、または潜在的に毒性の物質との接触
）によって、環境の変化（例えば、栄養レベル、温度、時間の経過）によって、
あるいは状態または細胞状態の変化（例えば、疾患状態、悪性腫瘍、位置特異的
変異、遺伝子ノックアウト）によって影響されるタンパク質をスクリーニングし
同定するために使用され得る。このようなスクリーニングで同定されたタンパク
質は、変化した状態に対するマーカーとして機能し得る。例えば、正常な細胞お
よび悪性腫瘍細胞のタンパク質発現プロフィールの比較は、存在または不在が、
悪性腫瘍の特徴であり診断であるタンパク質の同定に至り得る。
【００１２】
例示的な実施態様において、本明細書においてこの方法は、特定のタンパク質
の酵素活性の発現または状態の変化をスクリーニングするために使用され得る。
これらの変化は、薬学的アゴニストまたはアンタゴニストあるいは潜在的に有害
または毒性の物質を含む、種々の化学物質によって誘導され得る。このような変
化の知識は、酵素に基づく疾患を診断するため、および細胞の複合調節ネットワ
ークを調査するために有用であり得る。
【００１３】
本明細書においてこの方法は、生物学的流体（例えば、血液）、または細胞ま
たは組織の所定のタンパク質またはタンパク質機能の存在、不在、欠乏、または
過剰を検出するための、種々の臨床的および診断的分析を実行するために使用さ
れ得る。この方法は、タンパク質の複合した混合物（すなわち、５個以上の別個
のタンパク質またはタンパク質機能を含むもの）の分析に特に有用である。
【００１４】
本発明の方法は、親和性標識タンパク質反応性試薬を使用し、これは、複合し
た混合物からペプチドフラグメントまたは所定のタンパク質との反応産物（例え
ば、酵素反応の産物）の選択的単離を可能にする。単離されたペプチドフラグメ
ントまたは反応産物は、それらの混合物においてタンパク質の存在またはタンパ
ク質機能（例えば、酵素活性）の存在それぞれの特徴を有する。単離されたペプ
チドまたは反応産物は、質量分析（ＭＳ）技術によって特徴付けられる。特に、
単離されたペプチドの配列は、タンデム型ＭＳ（ＭＳｎ）技術を使用し、配列デ
ータベース検索技術の適用によって決定され得、配列決定されたペプチドが由来
するタンパク質が同定され得る。この試薬はまた、種々のサンプルにおいてタン
パク質の相対的な量の質量分析による定量的な決定を容易に促進する、単離され
たペプチドまたは反応産物の差次的な同位体標識を提供する。また、内部標準と
して差次的に同位体的に標識化された試薬の使用は、サンプル中に存在する１つ
以上のタンパク質または反応産物の絶対的な量の定量的な決定を容易にする。
【００１５】
一般的に、本発明の親和性標識化タンパク質反応性試薬は、３つの部分を有す
る：リンカー基（Ｌ）によってタンパク質反応性基（ＰＲＧ）に共有結合された
親和性標識（Ａ）：
Ａ−Ｌ−ＰＲＧ
リンカーは、例えば、リンカーの１つ以上の原子をその安定な同位体に置換する
ことによって、差次的に同位体的に標識化され得る。例えば、水素は、重水素で
置換され得、Ｃ１２はＣ１３で置換され得る。
【００１６】
親和性標識Ａは、捕捉試薬（ＣＲ）に共有結合的または非共有結合的に選択的
に結合する分子ハンドルとして機能する。ＣＲへの結合は、Ａでタグ化されたか
または標識化されたペプチド、基質または反応産物の単離を容易にする。特定の
実施態様において、Ａは、ストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）または
アビジンである。親和性タグ化された物質（そのうちのいくらかが同位体的に標
識化される）の親和性単離の後に、Ａおよび捕捉試薬の間の相互作用が、単離さ
れた物質のＭＳ分析を可能にするために分裂または切断される。親和性標識は、
捕捉試薬から、置換リガンド（Ａを含まないかＡの誘導体であり得る）の添加に
よって、あるいは溶媒の条件（例えば溶媒の種類もしくはｐＨ）または温度条件
を変化させることによって置換されえるか、あるいはリンカーが、単離された物
質をＭＳ分析のために放出するために、化学的、酵素的、熱的または光化学的に
切断され得る。
【００１７】
ＰＲＧ基の２つのタイプは、本明細書中で以下で提供される：（ａ）タンパク
質官能基と選択的に反応し、特定の部位にてタンパク質をタグ化する共有結合ま
たは非共有結合を形成する基、および（ｂ）例えば酵素に対する基質である、タ
ンパク質の作用によって形質転換されるもの。特定の実施態様において、ＰＲＧ
は、特定のタンパク質の基に対して特異的反応性（例えば、スルフヒドリル基に
対する特異性）を有する基であり、複合した混合物においてタンパク質を選択的
にタグ化するために一般的に有用である。スルフヒドリルに特異的な試薬は、シ
ステインを含むタンパク質をタグ化する。他の特定の実施態様では、ＰＲＧは、
目的の酵素の作用によって選択的に切断（Ａ−Ｌを残す）または修飾（Ａ−Ｌ−
ＰＲＧ‘を与える）する酵素基質である。
【００１８】
例示的な試薬は、以下の式を有する：
【００１９】
【化１】
2006184290.tif 000003
ここで：
Ａは親和性標識である；
ＰＲＧは、タンパク質反応性基である；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、リンカー基において、互いに独立し、Ｘ２は
他のＸ２から独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、ＮＲＲ’＋、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯ
Ｓ、Ｓ−Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ−ＮＲ’、ＣＳ−ＮＲ’、Ｓｉ−Ｏ、アリール
またはジアリール基から選択され得るか、あるいはＸ１〜Ｘ４は、存在しなくて
もよいが、好ましくは少なくとも１つのＸ１〜Ｘ４は、存在する；
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、ＡまたはＰＲＧ基のリンカーへの結合を
促進し得るかそれらの基のリンカーからの所望でない切断を防ぎ得る任意の部分
であり、そして例えばＣＯＯ、ＣＯ、ＣＯ−ＮＲ’、ＣＳ−ＮＲ’から選択され
得、そして単独または他の基（例えば（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ−ＮＲ’、（ＣＨ２）
ｑ−ＣＳ−ＮＲ’、または（ＣＨ２）ｑ）と組み合わせて、１つ以上のＣＨ２基
を含み得る；
ｎ、ｍ、ｐおよびｑは、０〜約１００までの値を有し得るすべての数であり、
好ましくは、ｎ、ｍ、ｐまたはｑの１つは、０ではなく、そしてｘはまた０〜約
１００までの範囲であり得る整数であり、ここでｎ＋ｘｍ＋ｐ＋ｑは、好ましく
は約１００未満であり、より好ましくは約２０未満である；
Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、またはアリール基で
ある；そして
Ｒ’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、またはアリ
ール基である。
【００２０】
リンカーのＣＨ２基の１つ以上は、小さな（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アルケニ
ル、またはアルコキシ基、アリール基で必要に応じて置換され得、例えば酸性基
または塩基性基または永久的な正の電荷または負の電荷を保持する基のようなイ
オン化を促進する官能基で置換され得る。リンカーのＣＨ２基を接続する１つ以
上の単結合は、２重結合または３重結合で置換され得る。好ましいＲおよびＲ’
アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシ基は、１〜６個の炭素原子
を有する小さなものである。
【００２１】
リンカーの原子の１つ以上は、安定な同位体で置換され得、１つ以上の実質的
に化学的に同一であるが同位体的に区別可能な試薬を生成する。例えば、リンカ
ーの１つ以上の水素は、重水素で置換され得、同位体的に重い試薬を生成する。
【００２２】
例示的な実施態様では、リンカーは、切断されて親和性タグを除き得る基を含
む。切断可能なリンカー基が使用される場合、親和性タグ化されたペプチド、基
質または反応産物がＣＲと一緒に親和性標識化を使用して単離された後に、これ
は典型的に切断される。この場合において、リンカーにおいて標識化する任意の
同位体は、好ましくは、タンパク質、ペプチド、基質または反応産物に結合した
ままである。
【００２３】
リンカー基は、とりわけ以下を含む：エーテル、ポリエーテル、エーテルジア
ミン、ポリエーテルジアミン、ジアミン、アミド、ポリアミン、ポリチオエーテ
ル、ジスルフィド、シリルエーテル、アルキルまたはアルケニル鎖（直鎖または
分枝鎖および環でありえる部分）、アリール、ジアリールまたはアルキル−アリ
ール基。リンカーのアリール基は、１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏまた
はＳ原子）を含み得る。
【００２４】
１つの局面において、本発明は、親和性標識化された試薬を使用する複合した
混合物の１つ以上のタンパク質の同定および定量のための質量分析方法を提供し
、ここで、ＰＲＧは、ペプチドにおいて典型的に見出される特定の基（例えば、
スルフヒドリル、アミノ、カルボキシ、ホモセリンラクトン基）と選択的に反応
する基である。種々のＰＲＧ基を有し、１つ以上の親和性標識化試薬が、タンパ
ク質を含む混合物に導入され、この試薬がこれらと親和性標識とタグ化するため
の特定のタンパク質と反応する。ジスルフィド結合を少なくするためにタンパク
質混合物を前処理するかまたはそれ以外で親和性標識化を容易にすることが必要
であり得る。親和性標識化された試薬との反応の後に、複合した混合物のタンパ
ク質は、例えば酵素的に、多数のペプチドに切断される。この消化工程は、タン
パク質が比較的小さい場合、必要でなくても良い。親和性標識でタグ化されたペ
プチドは、それらのＣＲに対する選択的結合によって、親和性単離法（例えば、
アフィニティークロマトグラフィー）によって単離される。単離されたペプチド
は、Ａの置換またはリンカーの切断によってＣＲから放され、放された物質は、
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって分析される。次いで
、１つ以上のタグ化されたペプチドの配列は、ＭＳｎ技術によって決定される。
タンパク質から誘導される少なくとも１つのペプチド配列は、そのタンパク質に
特徴的であり、混合物中におけるその存在を示す。従って、ペプチドの配列は、
典型的には、混合物中の１つ以上のタンパク質を同定するのに十分な情報を提供
する。
【００２５】
タンパク質混合物を含む１つ以上の異なるサンプル（例えば、生物学的流体、
細胞または組織溶解物など）のタンパク質の定量的な相対量は、化学的に同一で
親和性タグ化され、差次的に同位体的に標識化された試薬を使用して決定され得
、異なるサンプル中のタンパク質を、親和性タグ化し、差次的に同位体的に標識
化する。この方法において、比較されるサンプルは、親和性標識で特定のタンパ
ク質をそこでタグ化するために、同位体的に異なった標識化試薬で処理される。
次いで、処理されたサンプルは、好ましくは等量で組み合わせられ、組み合わせ
られたサンプル中のタンパク質は、必要であれば、酵素的に消化され、ペプチド
を生成する。ペプチドのうちのいくらかは、親和性タグ化され、さらに異なるサ
ンプル由来のタグ化されたペプチドは、差次的に同位体的に標識化される。上記
のように、親和性標識化されたペプチドは、単離され、捕捉試薬から放され、（
ＬＣ／ＭＳ）によって分析される。タンパク質由来のペプチドの特徴は、サンプ
ル中のタンパク質の同定を可能にするＭＳｎ技術を使用して配列決定される。各
サンプル中の所定のタンパク質の相対的量は、そのタンパク質由来の差次的に同
位体的に標識化されたペプチドから生じるイオンの相対的存在比を比較すること
によって決定される。この方法は。異なるサンプル中の既知のタンパク質の相対
的量を評価するために使用され得る。さらに、この方法がサンプルに存在し得る
タンパク質の種類についての任意の先行知識を必要としないので、この方法は、
試験されるサンプル中において異なるレベルで存在するタンパク質を同定するた
めに使用され得る。さらに詳細には、この方法は、細胞、組織または生物学的流
体において異なる発現を示すタンパク質をスクリーニングし、同定するために適
用され得る。複合した混合物中の特定のタンパク質の絶対量を決定することもま
た可能である。この場合、既知の量の内部標準（定量化される混合物中のそれぞ
れのタンパク質について１つ）が、分析されるサンプルに添加される。内部標準
は、内部標準がペプチドまたは親和性タグ部分のいずれかにおいて差次的に同位
体的に標識化され、定量化される親和性タグ化されたペプチドと異なることを除
いて、定量化される親和性タグ化されたペプチドと同一の化学構造である親和性
タグ化されたペプチドである。内部標準は、他の方法で分析されるサンプルで提
供され得る。例えば、特定のタンパク質またはセットのタンパク質は、同位体標
識化された親和性タグ試薬で化学的にタグ化され得る。この物質の既知の量が、
分析されるサンプルに添加され得る。あるいは、特定のタンパク質またはセット
のタンパク質は、重原子同位体で標識化され、次いで、親和性標識化試薬で誘導
され得る。
【００２６】
また、単一の分析で複数のサンプル中の特定のタンパク質のレベルを定量する
こと（多重化）が可能である。この場合、異なるサンプルから異なる親和性タグ
化ペプチドに存在するタンパク質を誘導するために使用される親和性タグ化試薬
は、質量分析によって選択的に定量化され得る。
【００２７】
本発明のこの局面において、この方法は、生物学的流体、細胞または組織中の
特定のタンパク質の定量的測定を提供し、異なる細胞および組織中の全体的なタ
ンパク質発現プロファイルを決定するために適用され得る。同じ一般的戦略が、
タンパク質との反応性について異なる特異性を有する親和性試薬を使用すること
によって、タンパク質の修飾の状態の、ｐｒｏｔｅｏｍｅワイドな、定性的なそ
して定量的な分析を達成するために拡張され得る。本発明の方法および試薬は、
複合した混合物中の低存在比タンパク質を同定するために使用され得、膜、細胞
表面タンパク質のような特定の群またはクラスのタンパク質、あるいは小器官、
亜細胞（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）画分、または免疫沈降のような生化学的画
分内に含まれるタンパク質を選択的に分析するために使用され得る。さらに、こ
れらの方法は、異なる細胞状態において発現されたタンパク質の差を分析するた
めに適用され得る。例えば、本明細書中でこの方法および試薬は、癌のような疾
患状態を示す１つ以上のタンパク質の存在または不在の検出のための診断的アッ
セイにおいて使用され得る。
【００２８】
第２の局面において、本発明は、サンプルにおいてタンパク質の機能（例えば
，酵素活性）の存在または不在の検出のためのＭＳ方法を提供する。この方法は
また、サンプルにおけるタンパク質の機能の欠乏または過剰（通常のレベルを超
える）を検出するために使用され得る。分析され得るサンプルには、組織および
細胞を含む、種々の生物学的流体および物質が挙げられる。この場合、親和性標
識化試薬のＰＲＧは、目的の酵素に対する基質である。親和性標識化基質は、目
的のそれぞれの酵素に提供され、目的の酵素がサンプルに存在する場合、それら
が反応して親和性標識化生成物を生成するサンプルに導入される。親和性標識で
タグ化された未反応の基質または生成物は、ＣＲに対する選択的結合を介して、
親和性単離方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）によって単離さ
れる。単離されたタグ化基質および生成物は、質量分析法によって分析される。
親和標識化生成物には、基質がリンカーから完全に切断されるもの、または基質
が目的のタンパク質との反応によって修飾されるものが挙げられる。親和性標識
化生成物の検出は、タンパク質機能がサンプルに存在することを示す。親和性標
識化生成物の検出がほとんど無いかまたは無いことは、サンプルにおけるタンパ
ク質の機能が、それぞれ欠乏または不在であることを示す。
【００２９】
サンプル中に存在する、例えば酵素的活性に関して測定される、選ばれたタン
パク質の量は、試薬基質の酵素反応の期待される生成物の同位体的に標識化され
たアナログである内部標準の既知量を導入することによって測定され得る。内部
標準は、期待される酵素反応生成物に対して実質的に化学的に同一であるが、同
位体的に区別可能である。与えられたサンプルにおけるタンパク質機能（例えば
、酵素活性）のレベルは、他のサンプルまたはコントロール（ネガティブコント
ロールまたはポジティブコントロールのいずれか）での活性レベルと比較され得
る。従って、この手順は、サンプルにおけるタンパク質機能の存在、不在、欠乏
または過剰を検出し得る。この方法は、既知時間に渡って形成される生成物の量
を測定し得るので、酵素反応の速度を定量化することができる。この反応は、種
々のタンパク質の機能に対して選択的な複数の親和性標識化基質の同時使用によ
って、そして定量化が望ましいならば、単一のサンプル中の複数のタンパク質の
機能に対して分析するために、期待される生成物に対する対応する内部標準を含
むことによって、多重化され得る。
【００３０】
１つの局面において、本発明は、タンパク質の混合物を含む１つまたはそれ以
上のサンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質またはタンパク質機能を同定
するための方法であって、該方法は以下：
（ａ）各サンプルに対して、親和性タグ化し、実質的に化学的に同一かつ差次
的に同位体的に標識したタンパク質反応試薬を提供する工程であって、ここで該
試薬は以下の式を有し：
Ａ−Ｌ−ＰＲＧ
ここで、Ａは、捕捉試薬に選択的に結合する親和性標識であり、Ｌは１つまたは
それ以上の原子が、１つまたはそれ以上の安定同位体で差次的に標識され得るリ
ンカー基であり、そしてＰＲＧは特定のタンパク質官能基と選択的に反応するか
、または酵素に対する基質であるタンパク質反応基である、工程；
（ｂ）各サンプルを１つの該タンパク質反応試薬と反応させ、サンプル中に親
和性タグ化タンパク質または親和性タグ化酵素生成物を提供する工程であって、
それによって異なるサンプル中の親和性タグ化タンパク質および酵素生成物が、
安定同位体で差次的に標識される、工程；
（ｃ）選択的にＡと結合する該捕捉試薬を使用して該サンプルの親和性タグ化
成分を捕捉する工程；
（ｄ）該親和性タグ化成分と該捕捉試薬との間の相互作用を中断することによ
って、該捕捉試薬から捕捉された親和性タグ化成分を放出する工程；および
（ｅ）質量分析計によって該放出した親和性タグ化成分を検出しそして同定す
る工程、
を包含する、方法を提供する。
【００３１】
１つの実施形態において、サンプル中の前記親和性タグ化タンパク質が、該親
和性タグ化タンパク質を親和性タグ化ペプチドに転化するために、該親和性タグ
化タンパク質の捕捉前または後に、酵素学的にまたは化学的に処理される。
【００３２】
別の実施形態において、１つまたはそれ以上の前記親和性タグ化タンパク質の
タンパク質部分が、タンデム型質量分析計によって配列決定され、前記ペプチド
が由来する該親和性タグ化タンパク質を同定する。
【００３３】
１つの実施形態において、１つまたはそれ以上の前記親和性タグ化タンパク質
のタンパク質部分が、タンデム型質量分析計によって配列決定され、該タンパク
質を同定する。
【００３４】
１つの実施形態において、サンプル中の１つまたはそれ以上の前記タンパク質
の量がまた、質量分析計によって決定され、定量されるべき該タンパク質のそれ
ぞれに対して既知の量の１つまたはそれ以上の内部標準をサンプル中に導入する
工程をさらに包含する。
【００３５】
１つの実施形態において、ＰＲＧが酵素基質であり、そしてサンプル中の１つ
またはそれ以上の酵素の酵素学的速度が、親和性タグ化酵素生成物の定量によっ
て決定され、該速度が定量される酵素の該親和性タグ化酵素生成物のそれぞれに
対して、既知の量の１つまたはそれ以上の内部標準をサンプル中に導入する工程
をさらに包含する。
【００３６】
１つの実施形態において、前記放出される親和性タグ化成分が、質量分析計に
よって該成分を検出されそして同定する前に、クロマトグラフィーによって分離
される。
【００３７】
１つの実施形態において、１つのサンプル中の複数のタンパク質またはタンパ
ク質機能が検出されそして同定される。
【００３８】
１つの実施形態において、サンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質が、
親和性タグと反応し得る官能基を露出させるために化学的にまたは酵素学的に処
理される工程をさらに包含する。
【００３９】
１つの実施形態において、前記ＰＲＧが１つまたはそれ以上の酵素に対する酵
素基質であり、この欠乏が疾患状態に連結される。
【００４０】
１つの実施形態において、親和性タグ化し、実質的に化学的に同一でかつ差次
的に同位体的に標識した酵素基質が、サンプル中で検出されそして同定されるべ
き各酵素に対して提供される。
【００４１】
１つの実施形態において、ＰＲＧが、特定のタンパク質官能基と選択的に反応
するタンパク質反応基であり、そして複数のタンパク質が単一のサンプル中で検
出されそして同定される。
【００４２】
１つの実施形態において、タンパク質との反応について異なる特異性を有し、
２つまたはそれ以上の親和性タグ化し、実質的に化学的に同一であり、そして差
次的に同位体的に標識したタンパク質反応試薬が提供され、そして分析されるべ
き各サンプルと反応される。
【００４３】
別の実施形態において、サンプル中の前記タンパク質の全てが検出されそして
同定される。
【００４４】
１つの実施形態において、２つまたはそれ以上の異なるサンプル中の１つまた
はそれ以上のタンパク質の相対量が決定され、前記差次的に標識したサンプルを
合わせる工程、該合わせたサンプルから親和性タグ化成分を捕捉する工程、およ
び前記親和性タグ化し差次的に標識したタンパク質、または該タンパク質に由来
する、該親和性タグ化し差次的に標識したペプチドの相対存在度を測定する工程
をさらに包含する。
【００４５】
１つの実施形態において、１つまたはそれ以上の異なるサンプル中の膜タンパ
ク質の前記相対量を測定する。
【００４６】
別の実施形態において、異なるサンプルが、異なるオルガネラまたは異なる細
胞成分画分に由来タンパク質を含む。
【００４７】
別の実施形態において、異なるサンプルが、異なる環境状態もしくは栄養状態
、異なる化学的刺激もしくは物理的刺激、または異なる時間に応答して発現され
るタンパク質を表す。
【００４８】
別の局面において、本発明は、タンパク質を含む２つまたはそれ以上のサンプ
ル中のタンパク質の相対的発現レベルを測定するための方法であって、該方法は
以下：
（ａ）各サンプルに対して、親和性タグ化し、実質的に化学的に同一かつ差次
的に同位体的に標識したタンパク質反応試薬を提供する工程であって、ここで該
試薬は以下の式を有し：
Ａ−Ｌ−ＰＲＧ
ここで、Ａは、捕捉試薬に選択的に結合する親和性標識であり、Ｌは安定同位体
で差次的に標識され得るリンカー基であり、そしてＰＲＧは特定のタンパク質官
能基と選択的に反応するタンパク質反応基である、工程；
（ｂ）各サンプルを１つのタンパク質反応試薬と反応させ、サンプル中に親和
性タグ化タンパク質を提供する工程であって、それによって異なるサンプル中の
親和性タグ化タンパク質が、安定同位体で差次的に標識される、工程；
（ｃ）該差次的に標識したサンプルを合わせ、そしてその中で該タンパク質を
切断しそしてペプチドを生成させるために該合わせたサンプルを処理する工程；
（ｄ）選択的にＡと結合する該捕捉試薬を使用して該合わせたサンプルの親和
性タグ化した差次的に標識したペプチドを捕捉する工程；
（ｅ）該親和性タグ化ペプチドと該捕捉試薬との間の相互作用を中断すること
によって、該捕捉試薬から該捕捉した親和性タグ化した差次的に標識したペプチ
ドを放出する工程；および
（ｆ）質量分析計によって該放出した親和性タグ化した差次的に標識したペプ
チドを検出しそして同定する工程；
（ｇ）該親和性タグ化した差次的に標識したペプチドが由来する該タンパク質
の相対発現レベルを決定するために、親和性タグ化した差次的に標識したペプチ
ドから発生した同位体的に異なるイオンピークの相対存在度を測定する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００４９】
別の局面において、本発明は、以下の一般式：
Ａ−Ｌ−ＰＲＧ
を有するタンパク質の質量分析計分析のための試薬であり、ここで、Ａは、捕捉
試薬に選択的に結合する親和性標識であり、Ｌは、安定同位体で差次的に標識さ
れ得るリンカー基であり、そしてＰＲＧは特定のタンパク質官能基と選択的に反
応するタンパク質反応基である、試薬を提供する。
【００５０】
１つの実施形態において、ＰＲＧが、スルフヒドリル反応基またはアミン反応
基である。
【００５１】
１つの実施形態において、ＰＲＧが、酵素基質である。
【００５２】
１つの実施形態において、前記Ａ−Ｌ−ＰＲＧが、分析されるべきサンプル液
体に可溶である。
【００５３】
１つの実施形態において、前記リンカーが切断可能なリンカーである。
【００５４】
１つの実施形態において、この試薬は、以下の一般式：
【００５５】
【化２】
2006184290.tif 000004
を有し：
Ａは、親和性標識であり；
ＰＲＧは、タンパク質反応基であり；そして
【００５６】
【化３】
2006184290.tif 000005
は、リンカー基であり、ここで：
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、そしてＸ２が他のＸ２と独
立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、ＮＲＲ’＋、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＳ、Ｓ−Ｓ、Ｓ
Ｏ、ＳＯ２、ＣＯ−ＮＲ’、ＣＳ−ＮＲ’、Ｓｉ−Ｏ、アリールまたはジアリー
ル基から選択され得るか、あるいはＸ１−Ｘ４が存在しなくてもよく；
Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、ＣＯＯ、ＣＯ、ＣＯ−ＮＲ’、ＣＳ−Ｎ
Ｒ’、（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮＲ’、（ＣＨ２）ｑ−ＣＳ−ＮＲ’、または（ＣＨ
２）ｑから選択される任意の基であり；
ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｘは、０〜約１００の値を取り得る整数であり、ここで
、ｎ＋ｘｍ＋ｐ＋ｑが約１００未満であり；
Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル、または必要に応じ
て１つまたはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルキニル、もしくはアルコキ
シ基で置換されるアリール基であり；そして、
Ｒ’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシル、または必
要に応じて１つまたはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルキニル、もしくは
アルコキシ基で置換されるアリール基であり、
ここで、該リンカー中の１つまたはそれ以上のＣＨ２基は、アルキル、アルケ
ニル、アルコキシ基、必要に応じて１つまたはそれ以上のアルキル、アルケニル
、アルキニル、もしくはアルコキシ基で置換されるアリール基、酸性基、塩基性
基または持続性の正もしくは負の電荷を有する基で必要に応じて置換され得；こ
こで該リンカー中の非隣接ＣＨ２基を連結する１つまたはそれ以上の単結合は、
二重または三重結合で置き換えられ得、ここで該リンカー中の１つ以上の原子が
安定同位体で置換され得る。
【００５７】
１つの実施形態において、前記親和性標識がビオチンまたは改変ビオチンであ
る。
【００５８】
１つの実施形態において、前記親和性標識が、１，２−ジオール、グルタチオ
ン、マルトース、ニトリロ三酢酸基、またはオリゴヒスチジンからなる群から選
択される。
【００５９】
１つの実施形態において、前記親和性標識がハプテンである。
【００６０】
１つの実施形態において、ＰＲＧがスルフヒドリル反応基である。
【００６１】
１つの実施形態において、ＰＲＧがヨードアセチルアミド基、エポキシド、α
−ハロアシル基、ニトリル、スルホン化アルキル、アリールチオールまたはマレ
イミドである。
【００６２】
１つの実施形態において、ＰＲＧがアミン反応基、ホモセリンラクトンと反応
する基またはカルボン酸基と反応する基である。
【００６３】
１つの実施形態において、ＰＲＧが、アミン反応性ペンタフルオロフェニルエ
ステル基、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、スルホニル
ハライド、イソシナネート、イソチオシアネート、活性エステル、テトラフルオ
ロフェニルエステル、酸ハライド、および酸無水物；ホモセリンラクトン反応性
第１アミン基、ならびにカルボン酸反応性アミン、アルコールまたは２，３，５
，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートからなる群から選択され
る。
【００６４】
１つの実施形態において、ＰＲＧが酵素に対する基質である。
【００６５】
１つの実施形態において、ＰＲＧが、酵素の欠乏が出生時欠損と関連する該酵
素に対する基質である。
【００６６】
１つの実施形態において、ＰＲＧが、酵素の欠乏がリソソーム蓄積病と関連す
る該酵素に対する基質である。
【００６７】
１つの実施形態において、ＰＲＧが、β−ガラクトシダーゼ、アセチル−α−
Ｄ−グルコサミニダーゼ、へパランスルファミダーゼ、アセチル−ＣｏＡ−α−
Ｄ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼまたはＮ−アセチルグルコ
サミン−６−スルファターゼに対する基質である。
【００６８】
１つの実施形態において、Ｂ１またはＢ２の少なくとも１つがＣＯ−ＮＲ’ま
たはＣＳ−ＮＲである。
【００６９】
１つの実施形態において、Ｘ１およびＸ４がＮＨ、ＮＲ、およびＮＲＲ’＋か
ら選択され、Ｘ３がＯであり、そして全てのＸ２基がＯである。
【００７０】
１つの実施形態において、前記リンカーがジスルフィド基を含む。
【００７１】
１つの実施形態において、前記リンカーの任意の原子が重同位体で置換され得
る。
【００７２】
別の局面において、本発明は、上記試薬を含む、質量分析計分析によるタンパ
ク質の分析のための試薬キットを提供する。
【００７３】
１つの実施形態において、このキットは、上記の１つまたはそれ以上の試薬を
含む。
【００７４】
１つの実施形態において、このキットは、親和性タグ化タンパク質の消化にお
ける使用のための１つまたはそれ以上のタンパク質分解酵素をさらに含む。
【００７５】
１つの実施形態において、このキットは、１セットの、実質的に化学的に同一
かつ差次的に標識した親和性タグ化試薬を含む。
【００７６】
１つの実施形態において、前記試薬が親和性タグ化酵素基質試薬である。
【００７７】
１つの実施形態において、このキットは、１セットの、実質的に化学的に同一
かつ差次的に標識した親和性タグ化酵素基質を含む。
【００７８】
１つの実施形態において、このキットは、１セットの、実質的に化学的に同一
かつ差次的に標識した親和性タグ化酵素生成物をさらに含む。
（発明の効果）
本発明は、従来の技術に固有の制限を克服するｐｒｏｔｅｏｍｅ分析において
使用され得る方法および試薬を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、親和性タグ化されたタンパク質反応性試薬を使用し、ここで
、この親和性タグは、タンパク質反応性基にリンカーによって共有結合される。
このリンカーは、実質的に化学的に同一であるが、質量によって区別可能な試薬
の対またはセットを作製するために同位体的に標識され得る。例えば、一対の試
薬（このうちの１つは、同位体的に重く、そしてこのうちの他方は、同位体的に
軽い）は、２つのサンプル（これらのうちの一方は、１種以上の公知のタンパク
質を既知の量で含有する参照サンプルであり得る）の比較のために使用され得る
。例えば、リンカー中の水素、窒素、酸素またはイオウ原子のうちの任意の１つ
以上は、それらの同位体的に安定なアイソトープ：２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７
Ｏ、１８Ｏまたは３４Ｓと置換され得る。
【００８０】
適切な親和性タグは、共有的または非共有的のいずれか、および高い親和性で
選択的に捕捉試薬（ＣＲ）に結合する。ＣＲ−Ａ相互作用または結合は、非特異
的結合成分を除去するために、種々の溶液による大規模および多数回、洗浄した
後、インタクトなままであるべきである。親和性タグは、ＣＲを除いては、最小
限に結合するか、または好ましくはアッセイ系中の成分に全く結合せず、そして
反応容器の表面に著しく結合はしない。親和性タグの他の成分または表面との任
意の非特異的相互作用は、ＣＲ−Ａをインタクトにしておく多数回洗浄によって
破壊されるべきである。さらに、例えば置換リガンドの添加によってまたは温度
または溶媒条件の変化によって、ＡおよびＣＲの相互作用を破壊し、ペプチド、
基質または反応生成物を放出することは可能でなければならない。好ましくは、
ＣＲもＡもいずれもこのアッセイ系における他の成分と化学的に反応せず、そし
て両方の基は、アッセイまたは実験の期間にわたって化学的に安定であるべきで
ある。親和性タグは好ましくは、（ＭＳ）ｎ分析の間、ペプチド様フラグメント
化を起こさない。親和性標識は、好ましくは、分析されるべきサンプル液中に可
溶性であり、そしてＣＲは、アガロースのような不溶性樹脂に結合される場合で
あっても、サンプル溶液中に可溶性のままであるべきである。用語、可溶性ＣＲ
とは、ＣＲが十分に水和されるかまたは溶媒和され、その結果、これがＡに結合
するために適切に機能することを意味する。ＣＲまたはＣＲ含有結合体は、Ａを
捕獲するために添加される場合を除いては、分析されるべきサンプル中に存在す
るべきではない。
【００８１】
ＡおよびＣＲの対の例としては以下が挙げられる：
ｄ−ビオチンまたは構造的に改変されたビオチンベースの試薬（ｄ−イミノビ
オチンを含み、これは、アビジン／ストレプトアビジンのタンパク質に結合され
、例えば、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎｅ）−アガロース、オ
リゴマー−アビジン−アガロース、またはモノマー−アビジン−アガロースの形
態で使用され得る）；
任意の１，２−ジオール（例えば、１，２−ジヒドロキシエタン（ＨＯ−ＣＨ
２−ＣＨ２−ＯＨ））および他の１，２−ジヒドロキシアルカン（環式アルカン
のもの（例えば、１，２−ジヒドロキシシクロヘキサン）を含み、これは、アル
キルまたはアリールのボロン酸またはボロン酸エステル（例えば、フェニル−Ｂ
（ＯＨ）２またはヘキシル−Ｂ（Ｏエチル）２）に結合し、これは、アルキルま
たはアリール基を介して固体支持体物質（例えば、アガロース）に結合され得る
）；
マルトース結合タンパク質に結合するマルトース（および任意の他の糖／糖結
合タンパク質対またはより一般的には任意のリガンド／リガンド結合タンパク質
対（上記で議論される特性を有する））；
任意の抗体のためのハプテン（例えば、ジニトロフェニル基）（ここで、ハプ
テンは、ハプテンを認識する抗ハプテン抗体に結合し、例えば、ジニトロフェニ
ル基は、抗ジニトロフェニル−ＩｇＧに結合する）；
遷移金属に結合するリガンド（例えば、オリゴマーヒスチジンは、Ｎｉ（ＩＩ
）に結合し、遷移金属ＣＲは、樹脂結合キレート化遷移金属の形態（例えば、ニ
トリロ三酢酸−キレート化Ｎｉ（ＩＩ）またはイミノ二酢酸−キレート化Ｎｉ（
ＩＩ））で使用され得る）；
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに結合するグルタチオン。
【００８２】
一般に、上記で議論される適合性基準に合う親和性富化のために任意のＡ−Ｃ
Ｒ対が通常使用される。ビオチンおよびビオチンベースの親和性タグが好ましい
。特に関心があるのは、構造的に改変されたビオチン（例えば、ｄ−イミノビオ
チン）であり、これは、１０〜２０％の有機溶媒を含有する希釈酸のようなＥＳ
Ｉ−ＭＳ分析に適合の溶媒条件下でアビジンまたはストレプトアビジン（ｓｔｒ
ｅｐａｖｉｄｉｎ）カラムから溶出する。ｄ−イミノビオチンタグ化化合物がｐ
Ｈ４未満の溶媒中で溶出することは予測される。ｄ−イミノビオチンタグ化タン
パク質反応性試薬は、対応するビオチンタグ化試薬に関して本明細書中に記載さ
れる方法によって合成され得る。
【００８３】
置換リガンドであるＤＬは、ＣＲからＡを置換するために必要に応じて使用さ
れる。適切なＤＬは、典型的には、添加されなければサンプル中に存在しない。
ＤＬは、分析されるべきサンプル中で化学的および酵素的に安定であり、そして
サンプル中の化合物（ＣＲ以外）と反応しないか、またはサンプル中の化合物（
ＣＲ以外）に結合するべきではないか、あるいは反応容器壁に非特異的に結合す
るべきではない。ＤＬは、好ましくは、ＭＳ分析の間、ペプチド様フラグメント
化を起こさず、そしてサンプル中のその存在は、タグ化ペプチド、基質または反
応生成物結合体のイオン化を著しく阻止するべきではない。
【００８４】
ＤＬそれ自体は、好ましくは、質量分析の間、最小限にイオン化され、そして
ＤＬクラスターから構成されるイオンの形成は、好ましくは、最小限である。Ｄ
Ｌの選択は、使用されるＡおよびＣＲに依存する。一般に、ＤＬは、その添加の
せいぜい１週間以内（しかし、より好ましくは、数分以内または１時間まで）で
、合理的タイムスケールにおいて、ＣＲからＡを置換するために、選択される。
ＣＲに関するＤＬの親和性は、ＣＲに関してＡを含有するタグ化化合物の親和性
よりも匹敵するかまたは強いはずである。さらに、ＤＬは、ＣＲからのＡを含有
するタグ化化合物の溶出の間に使用される溶媒中に可溶性であるべきである。Ｄ
Ｌは、好ましくは、ＡあるいはＡの誘導体または構造的改変体を含まない。ＤＬ
の例としては、ｄ−ビオチンまたはｄ−ビオチン誘導体、特に、ＭＳ中のクラス
ター形成を抑制するかまたはイオン化を抑制する基を含有するｄ−ビオチン誘導
体が挙げられる。
【００８５】
リンカー基（Ｌ）は、分析されるべきサンプル液体中に可溶性であるべきであ
り、そしてそれは、化学反応に対して安定性（例えば、サンプルの成分ならびに
ＡおよびＣＲ基と、実質的に化学的に不活性）であるべきである。リンカーは、
Ａに結合する場合、リガンドの置換によってか、あるいは温度または溶媒におけ
る変化によって、ＡのＣＲとの特異的相互作用を干渉しないか、またはＣＲから
のＡの置換を干渉するべきではない。リンカーは、反応容器表面またはＣＲに対
して、その系中の他の成分に、最小限に、または好ましくは少しも、結合するべ
きではない。リンカーの任意の非特異的相互作用は、多回洗浄の後、破壊される
べきであり、これは、Ａ−ＣＲ複合体をインタクトのままにする。リンカーは、
好ましくは、（ＭＳ）ｎ分析の間、ペプチド様フラグメント化を起こさない。リ
ンカー基中の原子の少なくともいくつかは、安定な重原子同位体と容易に置換可
能であるべきである。リンカーは、好ましくは、親和性タグ化試薬、ペプチド、
基質または反応生成物のイオン化を容易にする、基あるいは部分を含む。
【００８６】
イオン化を促進するために、このリンカーは、酸性または塩基性基（例えば、
ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、１級、２級または３級アミノ基、窒素−複素環、エーテル
、あるいはこれらの基の組み合わせ）を含み得る。リンカーはまた、永久的電荷
（例えば、ホスホニウム基、４級アンモニウム基、スルホニウム基、キレート化
金属イオン、テトラアルキル（ｔｅｔｒａｌｋｙ）またはテトラアリール（ｔｅ
ｔｒａｒｙｌ）ボレートあるいは安定なカルボアニオン）を有する基を含み得る
。
【００８７】
リンカーのＡまたはＰＲＧへの共有結合は、典型的に、アッセイの間、化学的
または酵素的反応によって意図的でなく切断されるべきではない。ある場合にお
いて、例えば、アフィニティーカラムからの放出を容易にするために、リンカー
を、親和性タグＡからまたはＰＲＧから切断することは、望ましくあり得る。従
って、リンカーは、例えば化学的、熱的または光化学的反応によって、切断可能
であり得る。リンカー中の光切断可能な基は、１−（２−ニトロフェニル）−エ
チル基を含み得る。熱的に不安定なリンカーは、例えば、核酸の２つの相補体ス
トランドから形成される二重ストランド化二重鎖、ペプチド核酸の相補的ストラ
ンドを有する核酸のストランド、または加熱すると解離する２つの相補的ペプチ
ド核酸（ｎｕｃｅｌｉｃ）ストランドであり得る。切断可能リンカーはまた、ジ
スルフィド結合、酸または塩基不安定性基（とりわけ、ジアリールメチルまたは
トリメチルアリールメチル基を含む）、シリルエーテル、カルバメート、オキシ
エステル、チオエステル（ｔｈｉｅｓｔｅｒ）、チオノエステル、ならびにα−
フッ素化アミドおよびエステルを含むものを含む。酵素的に切断可能なリンカー
は、例えば、プロテアーゼ感受性アミドまたはエステル、β−ラクタマーゼ感受
性β−ラクタムアナログおよびリンカー（これはヌクレアーゼ切断可能またはグ
リコシダーゼ切断可能である）を含み得る。
【００８８】
タンパク質反応性基（ＰＲＧ）は、特定のタンパク質官能性基と選択的に反応
するか、または目的の酵素の基質である基であり得る。任意の選択的に反応性の
タンパク質反応性基は、サンプル中のタンパク質の少なくとも一部に存在する目
的の官能性基と反応するべきである。ＰＲＧと、タンパク質上の官能性基との反
応は、分析されるべきサンプル中の化合物の実質的な分解へとは導かない条件下
で、起こるべきである。本発明の親和性タグ化試薬における使用のために適切な
、選択的反応性のＰＲＧの例は、システインを含むタグタンパク質に対してスル
フヒドリル基と反応するもの、アミノ基、カルボキシレート基、エステル基、ホ
スフェート反応性基、ならびにアルデヒドおよび／またはケトン反応性基と反応
するもの、あるいはＣＨＢｒとのフラグメント化の後にホモセリンラクトンと反
応するものを含む。
【００８９】
チオール反応性基としては、エポキシド、α−ハロアシル基、ニトリル、スル
ホン化アルキルまたはアリールチオールおよびマレイミドが挙げられる。アミノ
反応性基は、タンパク質中のアミノ基をタグ化し、そしてハロゲン化スルホニル
、イソシアネート、イソチオシアネート、活性エステル（テトラフルオロフェニ
ルエステル、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含む）、酸ハラ
イド、ならびに酸無水物が挙げられる。さらに、アミノ反応性基としては、Ｎａ
ＢＨ４またはＮａＣＮＢＨ３の存在または非存在でのアルデヒドまたはケトンが
挙げられる。
【００９０】
カルボン酸反応性基としては、カップリング剤（例えば、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドまたは２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセ
テート）の存在下での、およびカップリング触媒（例えば、４−ジメチルアミノ
ピリジン）の存在または非存在下での、アミンまたはアルコール；ならびにＣｕ
（ＩＩ）フェナントロリンを含む遷移金属−ジアミン複合体が挙げられる。
【００９１】
エステル反応性基としてはアミンが挙げられ、これは、例えば、ホモセリンラ
クトンと反応する。
【００９２】
ホスフェート反応性基としてはキレート化金属が挙げられ、ここで、この金属
は、例えばニトリロ三酢酸またはイミノ二酢酸にキレート化される、例えばＦｅ
（ＩＩＩ）またはＧａ（ＩＩＩ）である。
【００９３】
アルデヒドまたはケトン反応性基としてはアミンおよびＮａＢＨ４またはＮａ
ＣＨＢＨ３、あるいはまず炭水化物を過ヨウ素酸塩で処理した後、アルデヒドま
たはケトンを生成するこれらの試薬が挙げられる。
【００９４】
ＰＲＧ基はまた、目的の選択された酵素に対する基質であり得る。目的の酵素
は、例えば、疾患状態または奇形児に関連する酵素、あるいは医療目的で慣用的
にアッセイされる酵素であり得る。本発明の方法を用いて使用するための目的の
酵素基質は、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトラ
ンスフェラーゼ、アミラーゼ、アンギオテンシン転換酵素、アスパルテートアミ
ノトランスフェラーゼ、クレアチンキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラー
ゼ、リパーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（これらは、他の方法によって、現在、慣用的にアッセイ
される）が挙げられる。
【００９５】
Ａ、Ｌ、ＰＲＧのための上記に議論された必要性は、Ａ−Ｌ−ＰＲＧのセグメ
ントおよびこの試薬を用いて生成される反応生成物の対応物にまで広がる。
【００９６】
内部標準（適切に同位体的に標識される）は、サンプル中のタンパク質の絶対
的な定量的量を測定するために、本発明の方法において使用され得る。内部標準
は、酵素反応の親和性タグ化生成物を定量することを意図するアッセイにおいて
特に使用される。この適用において、内部標準は、親和性タグ化酵素基質上の酵
素の作用によって生成されるタグ化酵素生成物に化学的に同一であるが、２Ｈ、
１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏまたは３４Ｓ（これらはＭＳ技術によって独立
して検出されることが可能である）を含み得る同位体標識を有する。サンプル中
の１つまたはいくつかのタンパク質を定量化するための本明細書中の方法におけ
る使用のための内部標準は、タグ化タンパク質の消化から生成される親和性タグ
化ペプチドを生成するための、親和性標識化タンパク質反応性試薬と公知のタン
パク質との反応によって調製される。親和性タグ化ペプチド内部標準は、実質的
に、親和性タグ化タンパク質の消化から生成される対応する親和性タグ化ペプチ
ドに実質的に化学的に同一である（これらがＭＳ技術によるそれらの独立的検出
を可能にするように差次的に同位体的に標識化されることを除いては）。
【００９７】
本発明の方法はまた、２つ以上のタンパク質サンプル中の１つ以上のタンパク
質（各サンプル中のタンパク質は、実質的に化学的に同一であるが、差次的に同
位体的に標識化される、親和性タグ化試薬と、反応される）の相対量を決定する
ために適用され得る。このサンプルは、組み合わされ、そして一体としてプロセ
スされる。そのペプチドが由来するタンパク質の相対量を反映する各タグ化ペプ
チドの相対量は、質量分析によるそれぞれの同位体ピークの測定によって決定さ
れる。
【００９８】
本発明の方法は、多数の異なるサンプルの分析または比較に適用され得る。本
発明の方法によって分析され得るサンプルとしては、細胞ホモジネート；細胞フ
ラクション；生物流体（尿、血液および脳脊髄液を含む）；組織ホモジネート；
涙；糞；唾液；洗浄液（例えば、肺または腹膜の洗浄液）；生物学的分子の混合
物（タンパク質、脂質、炭水化物および核酸を含む）（細胞または組織ホモジネ
ートの部分または完全フラクション化によって生成される）が挙げられる。
【００９９】
本発明の方法は、ＭＳおよび（ＭＳ）ｎ法を使用する。種々のＭＳおよび（Ｍ
Ｓ）ｎ法が利用可能であり、そしてこれらの方法において使用され得るが、マト
リックスアシストレーザ脱離イオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）およびエレクト
ロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ／ＭＳ）法が好ましい。
【実施例】
【０１００】
（定量タンパク質（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）分析）
本方法は、サンプルタンパク質混合物および参照タンパク質混合物中の定量的
タンパク質プロフィール測定のためのビオチン標識化スルフヒドリル−反応性試
薬を使用するスキーム１に概略的に例示される。本方法は、以下の工程を包含す
る：
還元。サンプルおよび参照混合物中のタンパク質のジスルフィド結合は、遊離
ＳＨ基に還元される。好ましい還元剤は、トリ−ｎ−ブチルホスフィンであり、
これは標準条件下で使用される。あるいは、還元剤としては、メルカプトエチル
アミンおよびジチオスレイトールが挙げられる。必要ならば、この反応は、タン
パク質溶解性を維持するための高濃度の界面活性剤およびウレアを含む可溶化剤
の存在下で行われ得る。比較されるべき参照およびサンプルタンパク質混合物は
、同じ反応条件を適用して、別個にプロセスされる；
ＳＨ基の親和性タグを用いる誘導体化。遊離ＳＨ基は、ビオチン化試薬である
ビオチニル−ヨードアセチルアミジル−４，７，１０トリオキサトリデカンジア
ミンを用いて誘導体化され、この合成は、以下に記載される。この試薬は、安定
な同位体によるリンカー原子の置換によって、異なる同位体的に標識化された形
態で調製され、そして各サンプルは、この試薬の異なる同位体的に標識化された
形態で標識化される。ＳＨ基の誘導体化は、好ましくは、僅かに塩基性の条件（
ｐＨ８．５）下、室温で９０分間行われる。２つのサンプルの定量的比較分析の
ために、各々１つのサンプル（参照サンプルおよびサンプルと呼ばれる）は、そ
れぞれ、この試薬の同位体的に軽い形態および同位体的に重い形態を用いて、ス
キーム１に例示されるように誘導体化される。いくつかのサンプルの比較分析の
ために、１つのサンプルは、他のサンプルが関連するものに対する参照として設
計される。典型的に、参照サンプルは、同位体的に重い試薬を用いて標識化され
、そして実験サンプルは、この試薬の同位体的に軽い形態を用いて標識化される
が、試薬のこの選択は、任意である。これらの反応はまた、高濃度の可溶化剤の
存在と適合性である；
標識化サンプルの組み合わせ。親和性タグ化反応の完了後、同位体的に異なる
試薬（例えば、重い試薬および軽い試薬）を用いて標識化されたサンプルの定義
されたアリコートは、組み合わせられ、そしてすべての引き続く工程は、プール
されたサンプルで行われる。この手順の初期段階にて異なって標識化されたサン
プルの組み合わせは、引き続く反応および操作に起因する可変性を排除する。好
ましくは、各サンプルの等しい量が組み合わせられる；
過剰な親和性タグ化試薬の除去。過剰な試薬は、例えば、タンパク質ＳＨ基が
完全に誘導体化された後、過剰のＳＨ−含有ビーズをこの反応混合物に添加する
ことによって吸着される。ビーズは、加えられる試薬に対して約５倍モル過剰の
ＳＨ基を達成するために、この溶液に添加され、そして室温で３０分間インキュ
ベートされる。反応後、このビーズは、遠心分離によって除去される；
タンパク質消化。サンプル混合物中のタンパク質は、典型的にトリプシンを用
いて消化される。代替のプロテアーゼはまた、事実、化学的フラグメント化手順
のような、この手順に適合性である。先行工程が高濃度の変性可溶化剤の存在下
で行われた場合、このサンプル混合物は、変性濃度が使用されるプロテアーゼの
活性と適合性となるまで、希釈される。この工程は、小さなタンパク質の分析に
おいては省略され得る；
捕捉試薬との相互作用による親和性タグ化ペプチドの親和性単離。ビオチン化
ペプチドは、アビジン−アガロース上で単離される。消化後、ペプチドサンプル
のｐＨは、６．５に下げられ、そしてビオチン化ペプチドはモノマーアビジン（
Ｐｉｅｒｃｅ）でコーティングされたビーズ上に固定される。このビーズは、大
規模洗浄される。最後の洗浄溶媒は、残りのＳＤＳを除去するために、１０％メ
タノールを含む。ビオチン化ペプチドは、アビジン−アガロースから、例えば０
．３％ギ酸（ｐＨ２）を用いて溶出される；
データ依存性フラグメント化によるμＬＣ−ＭＳｎまたはＣＥ−ＭＳｎによる
、単離され、誘導体化されたペプチドの分析。当該分野で周知であり、そして例
えばＤｕｃｒｅｔら、１９９８；ＦｉｇｅｙｓおよびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、１９
９８；Ｆｉｇｅｙｓら、１９９６；またはＨａｙｎｅｓら、１９９８に記載され
る方法および機器制御プロトコルが使用される。
【０１０１】
この最後の工程において、タンパク質（そこからタグ化ペプチドが由来する）
の定量および引き続く同定の両方は、自動化多段階ＭＳによって決定され得る。
これは、二重モードの質量分析の操作によって達成され、ここで、これは、キャ
ピラリーカラムから溶出する相対量ペプチドの測定と、選択されたペプチドの配
列情報の記録との間の連続スキャンにおいて交替する。ペプチドは、ＭＳモード
において、それぞれ試薬の同位体的に軽いまたは重い形態によってタグ化された
、（それゆえ、親和性タグ化試薬内のコードされた質量差によって質量に差があ
る）同一配列のペプチドイオンの対に関して相対シグナル強度を測定することに
よって定量化される。ペプチド配列情報は、ＭＳｎモードでの質量分析操作にお
ける衝突誘導分離（ＣＩＤ）に関する特定の質量対荷電（ｍ／ｚ）比のペプチド
イオンを選択することによって自動的に生成される。（Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ら（
１９９７）、Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）、およびＧｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら
（１９９９））。次いで、得られたＣＩＤスペクトルは、配列データベースと自
動的に相関させ、配列決定されたペプチドが由来するタンパク質を同定する。親
和性タグ化され、そして差次的に標識化されたペプチドサンプルのＭＳおよびＭ
Ｓｎ分析によって作製された結果を組み合わせることによって、従って、単一の
自動化操作でのタンパク質混合物の成分の相対量および配列同一性が決定される
。
【０１０２】
ビオチン化スルフヒドリル試薬を使用する、合成ペプチドサンプルの定量分析
への、タンパク質中のペプチドの相対量への、本方法のこの適用の結果は、それ
ぞれ、図１、表１および図２に示されるような誘導体化ペプチドのタンデム質量
スペクトル分析を要約する。
【０１０３】
本方法はまた、他の親和性タグおよび他のタンパク質反応性基（アミノ反応性
基、カルボキシル反応性基、またはホモセリンラクトンと反応する基を含む）を
使用して行われ得る。
【０１０４】
定量的タンパク質分析のための本明細書中で使用されるアプローチは、２つの
原理に基づく。第１に、タンパク質からの連続するアミノ酸の短い配列（５〜２
５の残基）は、このタンパク質を独自に同定するために十分な情報を含む。ＭＳ
ｎによるタンパク質同定は、高性能コンピュータ検索アルゴリズムを使用して、
ＣＩＤ質量スペクトルに含まれる配列情報を、配列データベースと相関させるこ
とによって達成される（Ｅｎｇ，Ｊ．ら（１９９４）；Ｍａｎｎ，Ｍ．ら（１９
９４）；Ｑｉｎ，Ｊ．ら（１９９７）；Ｃｌａｕｓｅｒ，Ｋ．Ｒ．ら（１９９５
））。第２に、それぞれ軽いおよび重い親和性タグ化試薬でタグ化された同一ペ
プチドの対（または２つより多くのサンプル、同一タグ化ペプチドのセット（各
セットのメンバーは差次的に同位体的に標識化される）において）は、化学的に
同一であり、そしてそれゆえ、正確な定量のための相互の内部標準として働く。
ＭＳ測定は、例えば異なる細胞状態を示す異なるサンプルに由来するペプチド間
で容易に区別する。なぜならば、ペプチドに結合される同位体的に別個の試薬間
に差異があるからである。ピークのこれらの対またはセットの異なる重量の成分
の強度間の比は、もともとの細胞プール中のペプチド（そしてそれゆえ、タンパ
ク質）の相対存在比の正確な測定を提供する。なぜならば、所定のペプチドに対
するＭＳ強度応答性は、この試薬の同位体組成に無関係であるからである（Ｄｅ
Ｌｅｅｎｈｅｅｒ，Ａ．Ｐ．ら（１９９２））。同位体的に標識化された内部
標準の使用は、定量質量分析法における標準実行であり、そして例えば体液中の
薬物および代謝物の正確な定量において利点を大きくすることが開発されてきた
（Ｄｅ  Ｌｅｅｎｈｅｅｒ，Ａ．Ｐ．ら（１９９２）。
【０１０５】
本方法の別の例示において、既知であるが異なる濃度の同じ６個のタンパク質
からなる２つの混合物が調製され、そして分析された。このタンパク質混合物は
標識化され、組み合わせられ、そしてスキーム１に概略的に例示されるように処
理された。単離され、タグ化されたペプチドは、定量され、そしてＥＳＩイオン
トラップ質量分析計で単一組み合わせのμＬＣ−ＭＳおよびμＬＣ−ＭＳｎ実験
で配列決定された。すべての６個のタンパク質は、明白に同定され、そして正確
に計量された（表２）。多数のタグ化ペプチドは、各タンパク質に関して遭遇（
ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ）した。６個のタンパク質に関する観察された量と予測され
た量との間の差は、２％と１２％との間の範囲であった。
【０１０６】
本プロセスは、図３Ａ〜Ｃに単一のペプチド対（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｅｐｔｉｄ
ｅ  ｐａｉｒ）について、さらに例示される。ＭＳモードで操作した質量分析計
の単回スキャンを図３Ａに示す。親和性タグ化された試薬にコードされた質量差
によって特徴付けられた４対のペプチドイオンは、このスキャンにおいて検出さ
れ、そして、それらそれぞれのｍ／ｚ値と共に示される。示したスキャンは、１
．３秒で得られた。１時間のクロマトグラフィー溶出勾配の過程にわたって、１
２００回を超えるこのようなスキャンを自動的に記録した。図３Ｂは、それぞれ
９９３．８および９７７．７のｍ／ｚ比を有する、イオン対の周囲の質量スペク
トルの拡大図を示す。４つのユニットの同時溶出および検出された質量差によっ
て、同一配列を有する、２電荷の親和性タグ化されたペプチドの対としてイオン
が潜在的に同定される（８の質量差および２つの１電荷状態）。図３Ｃは、これ
ら２種について再構成されたイオンクロマトグラムを示す。それぞれのピークの
輪郭を積分することによって相対量を決定した。比（軽い／重い）を０．５４と
して決定した（表１）。再構成されたイオンクロマトグラムにおけるピークは、
鋸歯状のように見える。なぜなら、毎秒のスキャンにおいて、質量分析計をＭＳ
とＭＳｎモードとの間で切り替え、選択されたペプチドイオンの配列情報（ＣＩ
Ｄ質量スペクトル）を収集した。これらのＣＩＤスペクトルを使用して、タグ化
されたペプチドの起源となったタンパク質を同定した。図４Ａは、ｍ／ｚ＝９９
８を有するペプチドイオンから記録されたＣＩＤスペクトルをを示す（図３Ａに
おける矢印に注目）。このＣＩＤスペクトルとともにデータベース検索によって
、タンパク質をグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（これは、タ
ンパク質の混合物の１メンバーであった）（図４Ｂ）と同定した。
【０１０７】
本方法のいくつかの有益な特徴を示す。第１に、少なくとも２つのペプチドを
、混合物中の各タンパク質から検出した。従って、定量およびタンパク質同定は
ともに重複し得る。第２に、同定したペプチドは全て、少なくとも１つのタグ化
されたシステイニル残基を含んだ。ペプチドにおいて、比較的稀有であるシステ
イン残基が存在することによって、データベース検索に関するさらに強力な拘束
が追加される（Ｓｅｃｈｉ，Ｓ．ら、１９９８）。第３に、システイン含有ペプ
チドのタグ化および選択的富化（ｓｅｌｅｎｔｉｃｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）
は、６つのタンパク質の同時消化によって生成されるペプチド混合物が有する複
雑性を有意に減少させる。このタンパク質の混合物に関して、この複雑性は、２
９３の強力なトリプシンのペプチドから４４のトリプシンのペプチド（少なくと
も１つのシステイン残基を含む）まで減少された。第４に、アビジンアフィニテ
ィーカラムから溶出されたペプチドサンプルは、μＬＣ−ＭＳｎによる分析に直
接適合可能である。
【０１０８】
（種々の細胞状態におけるタンパク質発現の定量分析）
タンパク質の反応性親和性試薬戦略を、２つの非グルコース抑制状態での酵母
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における定常状態のタンパク質発現の差異を研究
するために適用した（表３）。細胞を、炭素源として２％ガラクトースまたは２
％エタノールのいずれかを使用して、対数酵母増殖期から収集した。各細胞状態
由来の、１００μｇの溶解性酵母タンパク質を、異性体が異なる親和性タグ化さ
れた試薬を用いて、独立して標識した。これらの標識されたサンプルを合せ、そ
して図１に記載される戦略に当てた。サンプルの１／５０（各細胞の状態由来の
タンパク質、約２０μｇ当量）を分析した。
【０１０９】
グルコース抑制によって、他の炭素源で増殖するに十分な代謝機能によって多
数のタンパク質が最低限発現される（Ｒｏｎｎ，Ｈ（１９９５；Ｈｏｄｇｅ，Ｐ
．Ｅ．ら（１９９９）））。グルコースが存在しない、ガラクトースまたはエタ
ノールでの増殖によって、グルコース抑制遺伝子が発現する。表３は、分析中に
遭遇した、３４の酵母遺伝子の選択を示すが、この表は、同定されたすべて公知
のグルコース抑制遺伝子を含む（Ｍａｎｎ，Ｍ．ら（１９９４））。これらの遺
伝子の各々は、グルコースでの酵母増殖において最小限発現した。ガラクトース
での増殖（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０）ならびにエタノールにでの増殖（ＡＤＨ２、
ＡＣＨ１）の両方に特異的な遺伝子を検出および定量した。
【０１１０】
本方法の定量的性質は、相対タンパク質レベルにおける小さな変化を正確に測
定する能力において明らかである。測定精度の証拠は、複数のペプチドが定量さ
れた、タンパク質の比を研究することによって発見された優良な一致によって見
受けられ得る。例えば、ＰＣＫ１から発見された５つのペプチドは、平均比（ｍ
ｅａｎ  ｒａｔｉｏ）±９５％、１．５７±０．１５の信頼区間を有し、そして
パーセント誤差は、１０％未満であった。さらに、観測された変化は、文献（Ｒ
ｏｎｎｅ，Ｈ．１９９５；Ｈｏｄｇｅｓ，Ｐ．Ｅ．ら（１９９９））から予測さ
れる変化に一致する。最終的に、観測された変化は、二次元ゲル電気泳動の後に
試験したこれらの同一タンパク質に関する染色強度（データは示さない）におけ
る変化と一致する。
【０１１１】
酵母におけるイソチームのアルコールデヒドロゲナーゼファミリーは、六炭糖
（ＡＤＨ１）およびエタノール（ＡＤＨ２）のいずれも増殖を促進する。遺伝子
ＡＤＨ２は、ともにグルコース抑制され、そしてガラクトース抑制され、ＴＣＡ
サイクル（図５Ａ）に入るアセトアルデヒドへとそれを転換することによって酵
母細胞がエタノールで完全に増殖することを可能とする酵素をコードする。糖存
在下、ＡＤＨ１は、アセトアルデヒドをエタノールへと変換する、その逆反応を
実施する。これらのイソチームの調節は、酵母における炭素利用にとって重要で
ある（Ｒｏｎｎｅ，Ｈ（１９９５））。イソチームのファミリーにわたる遺伝子
発現における差異を正確に測定する能力は、ｃＤＮＡ配列（ａｒｒａｙ）技術を
使用して、クロスハイブリダイゼーションが原因で時折困難となる（ＤｅＲｉｓ
ｉ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９７））。図１に例示されるように適用された本発明の方
法は、たとえＡＤＨ１およびＡＤＨ２が９３％のアミノ酸（８８％のヌクレオチ
ド）配列の類似性を共有しても、各イソチームに関する遺伝子発現の測定に成功
した。この原因は、各酵素由来の親和性タグ化されたペプチドが単一のアミノ酸
残基（バリンとスレオニン）（これは、２分より多くだけ保持時間がシフトし、
そしてＡＤＨ２ペプチドに関して２ダルトンだけ質量がシフトした（図５Ｂ））
によって区別されるからであった。ガラクトースがエタノールに匹敵する炭素源
である場合、ＡＤＨ１を約２倍の高レベルで発現させた。ＡＤＨ２発現のエタノ
ール誘発によって、グルコース誘発と比較して２００倍より多くの増加が生じた
。
【０１１２】
上記の結果は、本発明の方法によって、一回の自動操作で、タンパク質混合物
の定量分析およびその中のタンパク質成分の同定が提供されることを示す。
【０１１３】
スルフヒドリル反応剤を使用して適用される本方法は、ペプチド混合物が有す
る複雑性を有意に減少させる。なぜなら、親和性タグ化されたシステイン含有ペ
プチドが選択的に単離されるからである。例えば、全酵母タンパク（ｐｒｏｔｅ
ｏｍｅ）（６１１３タンパク質）の理論的なトリプシン消化によって、３４４，
８５５ペプチドが産生されるが、これらのパンパク質のうち３０，６１９だけが
システイニル残基を含む。従って、この混合物が有する複雑性が減少されると同
時に、タンパク質定量および同定がさらに達成される。スルフヒドリル試薬とタ
ンパク質との化学反応は、尿素、ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、
塩、ならびに反応性チオール基を含まない他の薬品の存在下で実施され得る。従
って、タンパク質は、それらが酵素的に消化されるまで、溶液中に強力な安定化
剤と共に維持され得る。μＬＣ−ＭＳｎシステムの感度はサンプルの質に依存す
る。特に、通常使用されるタンパク質安定化剤は、ＭＳとの適合性に乏しいか、
またはＭＳと不適合性である。タグ化されたペプチドの親和性精製によって、Ｍ
Ｓに不適合性の混入物が完全に除去される。低アバンダンスのタンパク質の従来
の方法による定量および同定は、大量（ミリグラム）の出発タンパク質溶解産物
を必要とし、そしてこれらの低アバンダンスのタンパク質に関して富化のいくつ
かの型を包含する。
【０１１４】
上記アッセイは、約１００μｇのタンパク質を使用し、そして分別技術を使用
せずに開始する。このために、タンパク質の約１／５０を単一のμＬＣ−ＭＳｎ
機器で分析した。このシステムは、１ペプチドあたり１０〜２０ｆｍｏｌの検出
限界を有する（Ｇｙｇｉ、Ｓ．Ｐ．ら（１９９９））。この原因のために、μＬ
Ｃ−ＭＳｎのみを使用する記載のアッセイにおいて、多数のタンパク質が検出さ
れる。しかし、本発明の方法は、生化学的、免疫学的または細胞生物学的分別方
法のいずれとも適合可能であり、これらの方法によって、混合物の複雑性が減少
され、そして低アバンダンスのタンパク質が富化され、同時に、定量が維持され
る。この方法は、複数のシステインが検出される場合、定量および同定の両方が
冗長され得る。親和性タグ化されたペプチドの発現レベルにおける差異を同定す
るこの方法の能力に関連したダイナミックレンジが存在し、これは、ペプチド対
（またはセット）に対応するピークの強度、および混合物の全体的な複雑性の両
方に依存する。さらに、このダイナミックレンジは、使用する質量分析計のそれ
ぞれのタイプによって異なる。本明細書中に記載されるアッセイにおいてイオン
トラップが使用された。なぜなら、イオントラップの能力は、たとえイオントラ
ップがさらに制限されたダイナミック定量レンジを提供しても、データ依存様式
で有効量の配列情報（数千のタンパク質が潜在的に同定され得る）を収集するか
らである。イオントラップのダイナミックレンジ（シグナル対ノイズ比に基づく
）は、ペプチド対のシグナル強度および混合物の複雑性に依存して変化したが、
１００倍までの較差が一般的に検出され得、そしてさらに大きな較差が、よりア
バンダンスの高いペプチドに関して決定され得る。さらに、１００〜２００倍よ
り多くのタンパク質発現レベルの変化によってさらに、最初の２つの細胞状態の
間における表現型の差異に対する主な強力な要因としてこれらのタンパク質を同
定する。この方法は、他の官能基に対する反応性を含むとして拡張され得る。低
いパーセンテージのタンパク質（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して８％）は、
システイニル残基を全く含まず、従って、スルフヒドロリル基特異性（すなわち
、チオール特異性）を有する試薬を用いた分析では見逃される。スルフヒドリル
基以外の官能基に対する特異性を有する親和性タグ化された試薬によって、また
、システインなしのタンパク質が分析に対して感受性となる。
【０１１５】
本発明の方法は、低アバンダンスのタンパク質、ならびに特定の物理化学的特
性（低溶解度、ラージサイズまたはスモールサイズおよび、極端なｐ／値を含む
）を有するタンパク質のクラスの分析に適用され得る。
【０１１６】
この化学および方法のプロトタイプ的な適用は、複合タンパク質サンプルおよ
び最終的には上記の好ましい用法に従う細胞および組織の全溶解産物の定量的な
プロフィールの確立である。これらの試薬に加えて、本発明の方法は、タンパク
質発現プロフィールの決定をはるかに越える適用を有する。このような適用には
以下が挙げる：
アミノ反応性またはスルフヒドリル反応性の異なる同位体で標識された親和性
タグ化された試薬の、免疫沈降した（ｉｍｍｕｎｏ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ
）複合体におけるタンパク質の定量分析のための適用。この技術の好ましい改変
において、種々の状態（例えば、活性化の種々の状態、種々の疾患状態、分化の
種々の状態）を抑制する細胞由来のタンパク質複合体は、特異的な試薬、好まし
くは抗体を使用して沈降される。沈降した複合体（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ  
ｃｏｍｐｌｅｘ）におけるタンパク質は、次いで、誘導体化され、そして上記の
ように分析される。
【０１１７】
誘発されたタンパク質リン酸化の部位を決定するための、アミノ反応性の、差
次的に同位体で標識された親和性タグ化された試薬の適用。この方法の好ましい
改変において、精製したタンパク質（例えば、種々の刺激条件下での細胞由来の
免疫沈降したタンパク質）はフラグメント化され、そして上記のように誘導体化
される。ホスホペプチドは、ＥＳＩ−ＭＳ機器のイオン源におけるフラグメンテ
ーションによって、生じたペプチド混合物において同定され、そしてそれらの相
対アバンダンスは、実験サンプルのイオンシグナル強度を、含まれる同位体で標
識した基準の強度と比較することによって決定される。
【０１１８】
アミノ反応性の差次的に同位体で標識された親和性タグ化された試薬を使用し
て、Ｎ−末端イオンセリンをＭＳｎスペクトルで同定する。この適用の好ましい
改変において、分析されるペプチドを、アミノ基に対して特異的である、軽い同
位体の試薬（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）および
重い同位体の試薬（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｈｅａｖｙ  ｒｅａｇｅｎｔ）
の５０：５０混合物で誘導体化する。従って、ＣＩＤによるペプチドのフラグメ
ンテーションによって、２つのＮ−末端イオンセリンが生成され、これらは、使
用した試薬の種類の質量差によって、質量が正確に異なる。この適用によって、
誘導体化したペプチドのアミノ酸配列決定の際の困難が劇的に減少する。
【０１１９】
（細胞および組織における表面タンパク質の定量分析）
細胞外部膜およびその結合したタンパク質（細胞表面タンパク質）は、外部シ
グナルを感知し、環境のキューに応答する際に沈降する。細胞表面タンパク質の
アバンダンスの変化は、特定の細胞の状態またはその変化する環境に応答する細
胞の能力を反映し得る。従って、細胞表面のタンパク質成分の包括的な定量的特
徴付けは、マーカータンパク質、または特定の細胞状態に特徴的なマーカータン
パク質の型（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）を同定し得るか、あるいは外部刺激
に対する細胞応答に関する分子基底（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ）を説明
し得る。実際、多数の細胞表面レセプター（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｅｒｂ
Ｂ、ＩＧＦＩレセプター、およびＥＧＦレセプター）発現における変化は発癌が
意図されており、そして乳癌に対する現代の免疫学的な治療アプローチは、特異
的にＨｅｒ２／ｎｅｕレセプターを認識する抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｇｅｎ
ｅｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）の注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）に基づ
く。
【０１２０】
細胞表面タンパク質はまた、実験的にアクセス可能である。細胞分類、および
細胞識別またはパニングなどの方法による特定細胞の分取単離のための診断アッ
セイは、細胞表面タンパク質に基づく。従って、正常な細胞と疾患（例えば、癌
）細胞との間の細胞表面タンパク質の種々の分析によって、重要な診断標的また
は治療標的が同定され得る。癌の診断および治療のための細胞表面タンパク質の
重要性が認識されてはいるが、膜タンパク質の分析は困難であった。それらの一
般的に低い溶解性に起因して、これらは、標準的な２Ｄゲル電気泳動パターンに
おいて表される傾向にあり、そして、Ｄ２電気泳動条件を膜タンパク質の分離に
適応させる試みは、制限した成功を満たす。本発明の方法は、従来技術における
原理的な制限を克服し得る。
【０１２１】
膜タンパク質の分析は挑戦である。なぜなら、それらは、高感度分析機器（例
えば、質量分析計）に適合性である条件下において、溶液中に維持することが一
般的に困難であるからである。本発明の方法を膜タンパク質の分析に適用するこ
とは、膜タンパク質標識および抽出のためのヒトＴ細胞リンパ腫細胞系統Ｊｕｒ
ｋａｔ、ならびに十分に特徴付けられたヒト前立腺上皮細胞系統Ｐ６９ＳＶ４０
Ｔおよび２つのＰ６９ＳＶ４０Ｔ亜系統（これらは、１０の因子によるＩＧＦ−
１レセプター発現が異なるを使用して例証され、膜タンパク質の定量的な種々の
分析を例証する。
【０１２２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞は、適切なモデルシステムである。なぜなら、これらの細胞
は容易に数多く増殖するからであり、そして種々の刺激および実験条件に応答す
る細胞表面タンパク質の調節が、Ｔリンパ球において十分に特徴付けされている
からである。市販のビオチン化試薬、またはより一般的な親和性タグ化試薬が用
いられ、リシン残基および遊離Ｎ−末端を誘導体化する。水溶性ビオチン化試薬
（例えば、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）ビオチン）、およ
び細胞表面タンパク質を標識するために広く使用されているアナログ（スルホス
クシンイミジル−６−（ビオチンアミド）−ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））が使用され得る。ＮＨＳエステルと一級アミンとの反
応は、中性のｐＨ値およびそれを超すｐＨが最適であり、そしてＤＭＳＯまたは
ＤＭＦなどの有機溶媒の存在に適合性である。Ｊｕｒｋａｔ細胞由来の細胞表面
タンパク質のビオチン化は、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中で実施される。細胞（
１×１０７）をＰＢＳ緩衝液で洗浄して、培養培地から、汚染血清および他のタ
ンパク質を除去する。細胞を２５×１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、そして０．５
ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ
Ｌ）と３０分間室温で反応させる。標識化した細胞を、冷ＰＢＳで２度洗浄し、
未反応のビオチン化試薬を除去する。ビオチン化した細胞を、１％のＴｒｉｔｏ
ｎ  Ｘ−１１４を含有するリシン緩衝液中、５×１０７細胞／ｍｌで可溶化する
。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４は、３０℃で、界面活性相および水相への相分配特
性を有する。相分配に続いて、界面活性相を３００×ｇでの遠心分離によって水
相から除去する。相分配は、細胞膜を富化するために使用して以前に成功してい
る。また、この技術は、Ｊｕｒｋａｔ細胞溶解産物からの膜タンパク質を富化す
るために見出された。Ｔｒｉｔｏｎ相を、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム緩衝
液（ｐＨ８．５）を使用して１：５（ｖ／ｖ）に希釈し、そして高純度に改変し
たブタトリプシンを１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、タンパク質を３７℃で
一晩かけて消化する。トリプシンをセリンプロテアーゼインヒビターのカクテル
の添加によって中和し、そしてトリプシンペプチドを、アビジン親和性クロマト
グラフィー技術によって単離する。溶出したぺプチドを例えばμＬＣ法によって
分離し、そして、例えば、Ｓｅｑｕｅｓｔプログラムを使用して、ペプチド配列
データベースを検索することによって同定する。
【０１２３】
ＳＶ４０Ｔ抗原を使用して不朽化したヒトプロテアーゼ上皮細胞株Ｐ６９ＳＶ
４０Ｔは十分に特徴付けられている。この細胞株は不死であるが、腫瘍形成性で
はなく、そして１型インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）を、２×
１０４レセプター／細胞で発現する。Ｍ１２と呼ばれる亜系統を、雄性の胸腺欠
陥ヌードマウスにおいて、逐次継代によってＰ６９ＳＶ４０Ｔから誘導した。こ
の細株は非常に腫瘍形成性であり、かつ転位性であり、そして１細胞あたり１．
１×１０３ＩＧＦ−１Ｒを発現する。細胞株Ｐ６９ＳＶ４０ＴおよびＭ１２での
ＧＩＦ−１Ｒのアバンダンスにおける相対的な差異は、膜タンパク質への適用に
適した本発明の方法を使用して定量的に決定され得る。これらの細胞株に関する
ＩＧＦ−１Ｒの数は既に決定されているので、この十分に特徴付けられたシステ
ムは、本発明の定量的方法の効率を確証するための基準を提供し得る。
【０１２４】
Ｐ６９ＳＶ４０Ｔ細胞（１×１０７）は、重い同位体のビオチンタグ化された
アミノ反応性試薬を使用してビオチン化され、そしてＭ１２細胞（１×１０７）
は、対応する、軽い同位体のアミン反応性ビオチンタグ化されたアミノ反応性試
薬を用いてビオチン化される。ＩＧＦ−１Ｒを次いで、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対す
る抗原を使用して両方の細胞株の合わせた溶解産物から免疫沈降され、そして免
疫沈降したパンパク質の全ての塊をトリプシンで消化する。トリプシンを次いで
、例えば、インヒビターの添加によって中和し、そしてタグ化されたパプチドを
ビオチンアビジンアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。上記に
記載されるように、ペプチド定量および同定のためそれぞれＬＣ−ＭＳおよびＬ
Ｃ−ＭＳＮによって、溶出したペプチドを分析する。この実験における定量は、
ＭＳにおける選択的イオンモニタリングを使用するオプションによって容易とな
る。このモードにおいて、ＩＧＦ−１Ｒから誘導されると予測される、タグ化さ
れたペプチドイオンの質量のみがモニタリングされるべきである。
【０１２５】
記載した技術は、親の前立腺細胞株（Ｐ６９ＳＶ４０Ｔ）とＭ１２細胞との間
の細胞表面タンパク質の相対アバンダンスにおける差異を比較するために適用さ
れ得、これらの細胞表面タンパク質（これらの発現レベルは２つの細胞株におい
て異なり、そして種々の細胞状態が有する特徴であり得る）を検出かつ同定する
。本明細書中に記載される方法を使用して、任意の２つ以上の細胞株における細
胞表面タンパク質の一般的な相対的な定量が分析され得、種々の細胞状態のこれ
らの細胞表面タンパク質特性を検出し、そして同定する。結果は、（適切であれ
ば）１Ｄまたは２Ｄゲルなどの手順、または定量ウエスタンブロットを使用し、
独立して確認され得、定量結果を確認する。
【０１２６】
細胞表面タンパク質の定量の実験的変動性は、現在入手可能なｃＤＮＡ配列技
術によって達成される定量の精度よりもオンサイドで（ｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｙ
）良好であることが期待される。相対的なタンパク質の量および同一性に加えて
、この方法はまた、インタクトな生細胞がビオチン化試薬を除外するという推論
に基づき、膜内のタンパク質の配向を明らかにするために使用され得る。
【０１２７】
細胞表面タンパク質から誘導体化されたタグ化されたペプチドに対する選択性
を高めるための代替の方法が適用され得る。例えば、タグ化された細胞表面タン
パク質は、インタクトな細胞上で直接チロシン化され得、タグ化されたペプチド
を生成し、これは、議論したように、精製され、そして分析される。さらに、伝
統的な細胞膜調製は、細胞表面タンパク質を富化する最初の工程として使用され
得る。これらの方法は、タンパク質分解の前に膜タンパク質を単離するために、
ダンス型ホモジナイザーおよび一連の密度勾配遠心分離を用いた、穏やかな細胞
溶解を包含し得る。この方法は、細胞表面タンパク質が高度に富化された調製物
を提供し得る。親和性タグ化されたタンパク質はまた、タンパク質分解の前、な
らびにタンパク質分解の後に、親和性クロマトグラフィーによって単離され得る
。このクロマトグラフィーは、タンパク質の溶解度を維持するために界面活性剤
（例えば、ＴＸ−１００、ＮＰ−４０またはＴｗｅｅｎ−２０）の存在下で実施
され得る。アフィニティークロマトグラフィー工程（インタクトなタンパク質の
ための工程、およびタグ化されたペプチドフラグメントのための工程）の逐次適
用によって、高度の選択性が提供される。これらの代替の方法は、低アバンダン
スの膜タンパク質の検出に関して容易に測定可能（ｓｃａｌａｂｌｅ）であり、
そしてタグ化された、タグ化されたペプチドの相対量は、選択的な富化工程によ
って維持される。
【０１２８】
本発明の方法の細胞表面タンパク質への適用において、一旦、タグ化されたタ
ンパク質がフラグメント化されると、これらのタグ化されたぺプチドは、より可
溶性のサンプルから生成したペプチドとは相違なく挙動する。
【０１２９】
（特定のタンパク質群に選択的である、親和性タグ化されたタンパク質反応性
試薬の合成）
本発明の方法の使用において適切である、例示的な親和性タグ化された薬剤の
合成経路をスキーム２〜３に示す（ここで、周知の合成技術は、重水素化されて
いない試薬および重水素化された試薬の合成に使用される）。
【０１３０】
ビオチニル−ヨードアセチルアミジル−４，７，１０トリオキサトリデカンジ
アミン４（スキーム３）は、それぞれ、ビオチン基、適切な同位体で同位体標識
され得る化学的に不活性なスぺーサー、およびヨードアセトアミジル基からなる
。このビオチン基は、試薬を使用して誘導体化したペプチドの親和性富化（ａｆ
ｆｉｎｉｔｙ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）に使用され、エチレングリコールリンカ
ーは、質量スペクトル分析のために差次的に同位体で標識され、そしてヨードア
セトアミジル基は、スルフヒドリル含有ペプチドに対する試薬の特性を提供する
。この試薬は、全ての水素の形態（軽い同位体の形態）、リンカーにおいて１〜
２０個、好ましくは４〜８個の重水素原子を有する形態（重い同位体の形態）に
合成され得る。
【０１３１】
（細胞可溶化物における複数の酵素の速度の分析）
生化学アッセイによる酵素機能のモニタリングは、多数の分析技術（生成物の
分光光度検出、蛍光検出および放射検出を含む）を用いる不可欠な診断ツールで
ある。しかし、現在の方法は、単一のサンプル中のいくつかの酵素を同時にアッ
セイするのに使用しにくい。生物学的流体中の代謝産物のコレクションを定量化
するための質量分光法は、出生時欠損の分析のための有力なアプローチとして現
れた（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９４）が、この分析技術は、個々の酵素的段階の速
度の直接分析のために開発されていない。細胞ホモジネートおよび他の生物学的
サンプル中の酵素活性のモニタリングおよび定量化のための、本明細書中に記載
される分析方法により、複合反応の同時（複合）モニタリングが可能になり、そ
してこれは容易に自動化され得る。
【０１３２】
酵素アッセイに適用されるような本発明の方法の特徴は、酵素産物および化学
的に同一の内部標準（これらは、安定同位体（重水素）標識により識別される）
を同時に検出するための、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−Ｍ
Ｓ）（Ｃｏｌｅら、１９９７）の使用である。第２の特徴は、親和性精製と組み
合わせた場合に、粗生体学的流体からの酵素産物の容易な捕捉を提供する、酵素
基質を含む親和性標識試薬の使用である。この親和性標識試薬は、リンカーを介
して親和性標識に共有結合した、目的の酵素の標的基質を含むように設計される
。基質結合における目的の酵素の作用により、その分子量を変化させる開裂また
は他の改変が起こる（スキーム４）。質量変化は、ＥＳＩ−ＭＳにより検出され
る。好ましくは、使用されるリンカーおよび親和性標識は、ＥＳＩによるイオン
化を容易にし、生物学的流体中の他の酵素の作用を阻害し、そして容易な精製の
ために複合体マトリクスからの高い選択性の捕捉を可能にする。
【０１３３】
このアプローチの例は、それぞれ、リソソームβ−ガラクトシダーゼおよびＮ
−アセチル−α−Ｄ−グルコシミニダーゼを同時アッセイするための、親和性標
識酵素基質試薬１および２の設計および合成（スキーム５）である。前者の酵素
の不足により、リソソーム蓄積症の１つである、ＧＭ１−ガングリオシドーシス
が生じ、この状態は約５０，０００分の１の頻度で母集団において生じ、そして
発症した子供の早死をもたらす。Ｎ−アセチル−Ｒ−Ｄ−グルコサミニダーゼの
不足により、稀なリソソーム蓄積症であるＢ型サンフィリポ症候群が生じる。こ
の例は、Ｇｅｒｂｅｒら、（１９９９）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１
２１：１１０２〜１１０３（これはその全体が本明細書中で参考として援用され
る）に記載されている。
【０１３４】
結合体１および２は、親和性標識としてのビオチンからなり、ビオチンはサル
コシンに結合される。ビオチンは、アガロースビーズに固定されたストレプトア
ビジンへの非共有結合によって、基質結合体を、高い特異性で捕捉し得る（Ｂａ
ｙｅｒら、１９９０）。サルコシンは、ビオチンへのＮ−メチル化アミド結合を
提供し、酵素ビオチナーゼ（これはしばしば、細胞流体中に存在し、アッセイ中
に結合体分子の開裂を引き起こし得る）を阻害する（Ｗｉｌｂｕｒら、１９９７
）。さらに、ビオチニル−サルコシン結合体は、ビオチンの付加によってストレ
プトアビジンから脱離し得ることが見出された。Ｎ−ビオチニルサルコシンブロ
ックは、ポリエーテルジアミンに結合され、このポリエーテルジアミンの長さは
、産物と内部標準の質量／電荷重複を避けるように変えられ得る。このリンカー
はまた、複数の重水素原子（すなわち、スキーム５、５における８個の重水素お
よび６における４個の重水素）の導入を容易にし、内部標準の合成を可能にし得
る。ｄ８−リンカーを、触媒のＮａＯＤを含むベンゼン中で、ＤＯＣＨ２ＣＨ２
ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＤをＣＤ２ｄＣＤＣＮと反応させることによって作製し（Ａｓ
ｈｉｋａｇａ，Ｋ．；Ｉｔｏ，Ｓ．；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ；Ｎｉｓｈｉｊｉｍ
ａ，Ｙ．Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．１９８８，６１，２４４３〜２
４５０）、そして得られたジニトリルを、Ｒａ−Ｎｉでジアミンに還元した。ｄ
４−リンカーを、エチレングリコール、ＣＨ３ＣＮ中のＣＤ２ｄＣＤＣＮおよび
触媒のＮａＯＨを使用して、同様に作製した。
【０１３５】
さらに、リンカーは親水性であり、基質結合体の良好な水溶性を保証し、そし
てこれは、ＥＳＩによって効果的にプロトン化される塩基性基を有し、従って、
質量分析法による高感度の検出を保証する。標的炭水化物基質は、β−アラニン
単位によってポリエーテルリンカーに結合される（スキーム５）。酵素産物結合
体３および４をまたスキーム５に示す。結合体１および２を、スキーム５に示さ
れるように調製した。全ての試薬を、逆相ＨＰＬＣにより均質性になるまで精製
し、そして高磁場１Ｈ  ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳによって同定した。基質は、
後者のｐ−アクリロイルアミドフェニルグリコシドへのマイケル付加によってジ
アミンスペーサーに結合され（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａｅｔら、１９９４）、その
中間体は、Ｎ−ビオチニルサルコシンのテトラフルオロフェニルエステルと結合
された（Ｗｉｌｂｕｒら、１９９７）。
【０１３６】
β−ガラクトシダーゼおよびＮ−アセチル−Ｒ−Ｄ−グルコサミニダーゼのＥ
ＳＩ−ＭＳアッセイは結合グリコシドの酵素的開裂に基づき、モノサッカリド、
ならびに結合体３および４（質量差は、それぞれ、１６２Ｄａおよび２０３Ｄａ
である）を放出する。代表的な手順において、０．２ｍＭの１および０．３ｍＭ
の２を、β−ガラクトシダーゼ欠乏症の別個の患者由来の超音波処理培養した線
維芽細胞、および羅患していないヒト由来の培養した線維芽細胞と共にインキュ
ベートした。インキュベーション後、標識化された内部標準５および６を添加し
、そしてビオチン化成分をストレプトアビジン−アガロースビーズ上に捕捉した
。細胞ホモジネートからの定量的なストレプトアビジン捕捉効率をモデル試薬で
観察した。複数回の洗浄により精製して非特異的に結合した成分を除去した後、
チオビニル化産物を遊離ビオチンにより放出し、そして溶離液をＥＳＩ−ＭＳに
より分析した。ビオチン化産物の約８５％放出が、過剰のビオチンで９０分間イ
ンキュベートした後に観察された。時間０に存在する全ての成分でアッセイをク
エンチすることにより、ブランクを得た。
【０１３７】
代表的な手順において、水（１５μＬ）中の細胞タンパク質（７５μｇ）を、
２（０．３ｍＭ）および１（０．２ｍＭ、細胞タンパク質の添加した５時間後に
添加した）を含む１５μＬの緩衝液（０．１Ｍ  クエン酸Ｎａ、ｐＨ４．２５）
に添加した。３７℃で５．５時間インキュベートした後、この反応を、０．２Ｍ
のグリシンカルボン酸緩衝液（２００μＬ、ｐＨ１０．３）を添加してクエンチ
し、そして５および６（それぞれ１ｎｍｏｌ）を添加した。遠心分離して細胞片
を除去した後、上清を、小さな濾過装置（ｍｉｃｒｏ  ＢｉｏＳｐｉｎ，Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）中のストレプトアビジン−アルガロース床（７ｎｍｏｌのビオチン結
合能力、Ｐｉｅｒｃｅ）に充填した。５分後、遠心分離により濾過を行い、そし
てゲル床を０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（約１分のインキュベーション、
次いでスピン）で洗浄し、次いで精製水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）で６回洗浄した。５６ｎｍｏｌの遊離ビオチン（１〜１０時間のインキュベー
ション、次いでスピン）を含む５０％メタノール（２５μＬ）で、溶離した。濾
液を５０％メタノール／水で４倍に希釈し、そして１μＬをＥＳＩ−ＭＳによっ
て分析した。
【０１３８】
ブランクのＥＳＩ−ＭＳスペクトル（図ＸＡ）は、非常に単純であり、これは
試薬１および２（ｍ／ｚ８４３および８４０）からの（Ｍ＋Ｈ）＋イオンのピー
ク、内部標準５および６（ｍ／ｚ６８９および６４１）のピーク、および微量の
産物３および４（ｍ／ｚ６８１および６３７）のピークを示す。ビオチンのクラ
スターによるイオンもまたスペクトル中に現れるが、分析を妨げなかった。ブラ
ンク中の非重水素化産物の存在は、サンプルの後処理中の非酵素的基質試薬の加
水分解、または気相中の基質イオンの衝突誘導解離が原因であり得る。ｍ／ｚ８
４３における（結合体１＋Ｈ）＋イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ６８
１における（結合体３＋Ｈ）＋（スペクトルは示されず）の顕著なフラグメント
を与える。健康な個体由来の細胞ホモジネートと共にインキュベートしたサンプ
ルのＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ６８１において、β−ガラクトシダーゼ
産物、そしてｍ／ｚ６３７においてＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ
産物をはっきりと示す（図ＸＢ）。健康な患者由来の細胞を使用する３回の酵素
反応は、５１±３ｎｍｏｌ／ｈ（ｍｇ細胞タンパク質）のβ−ガラクトシダーゼ
比活性、および１．４±０．３ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇのＮ−アセチル−α−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼ比活性を生じた。時間経過の研究は、初期の反応速度が測定さ
れたことを保証した。６人の健康な個体由来の細胞を用いて得られた値は、β−
ガラクトシダーゼの場合、３６±４〜６８±３ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇの範囲であり
、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼの場合、０．９±０．０５〜２．
３±０．４ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇの範囲であった。反対に、β−ガラクトシダーゼ
欠乏症の２人の患者由来の細胞を使用した場合、ブランクレベル（０．９±０．
９および０．８±０．６ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ）より上の酵素産物は、ほんのわず
かしか観察されず、一方、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性は、
はっきりと検出される（図ＸＣ）。これらのスペクトルは、０．７５μｇの細胞
タンパク質（約１０００個の線維芽細胞に相当する）を用いて得られた。従って
、ＥＳＩ−ＭＳ法は、医用用途に非常に高い感度を有する。
【０１３９】
ＥＳＩ−ＭＳを、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ機器で行った。デ
ータを、１．５μＬ／分での直接注入によって、ｍ／ｚ６２５〜８７５の全スキ
ャンモードで収集した。比活性を、産物対内部標準のイオンピーク面積の比から
得た（３０回のスキャンを平均化した）。
【０１４０】
基質試薬およびＥＳＩ−ＭＳを使用して酵素をアッセイするための記載された
アプローチは広く適用され得る。複合技術は、単一の反応における数十個以上の
酵素を同時にアッセイするために広がり得、希な障害の診断の確認を助ける複数
のアッセイの必要性を排除する。この方法は、特異的な生化学的経路を通る化学
的流動の速度を評価する場合に、いくつかの酵素を同時に測定するために、また
は生化学的なシグナル伝達経路をモニタリングするために、使用され得る。特に
ビオチン−ストレプトアビジンが用いられる場合、親和性標識した反応産物およ
び基質を複合体混合物から単離するための親和性標識捕捉試薬方法は、技術的に
単純であり、そして容易に自動化され得る。用いられるＥＳＩ−ＭＳ検出が高感
度であるため、これはアッセイにつき、サブマイクログラム量の基質試薬を必要
とするのみであり、少ないグラムスケールでの数百個の基質試薬の合成が実用的
および経済的になる。ほとんどの酵素活性部位は溶媒に曝されているため、酵素
活性を維持したまま、親和性標識リンカーをほとんどの酵素基質に結合すること
が可能である。スキーム６は、この方法における使用に適切ないくつかのさらな
る酵素基質の構造を提供し、標識結合部位に許容な位置を矢印で示している。さ
らなる酵素基質に許容な標的部位は、酵素−基質または酵素−基質アナログ構造
のＸ線結晶構造を調べることによって決定され得る。標準的なコンピューターグ
ラフィックプログラムおよび有効なＸ線データを使用し、そして伸長した鎖のブ
チル基（親和性標識リンカーのためのモデルとして）を潜在的な標識結合部位に
結合することによって、モデル標識とのファンデルワールスオーバーラップ中に
酵素原子が存在しないことを示す適切な結合部位が予測され得る。
【０１４１】
上記の方法と類似した方法が、他のサンフィリポ症候群（Ａ、ＣおよびＤ）と
関連する酵素の分析に適用され得る。ＳＦＡはヘパランスルファミダーゼと関係
し、ＳＦＣはアセチル−ＣｏＡ−α−グルコサミニド（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉ
ｄｅ）Ｎ−アセチルトランスフェラーゼと関係しそしてＳＦＤはＮ−アセチルグ
ルコサミン６−スルファターゼと関係する。これらの酵素およびこれらの障害の
診断の分析に有用な代表的な親和性標識酵素基質試薬は、以下で提供される。こ
れらの方法はまた、酸スフィンゴミエリナーゼについてアッセイすることによっ
て、Ａ型およびＢ型ニーマン−ピック病の診断に適用され得、そしてガラクトセ
レブロシドβ−ガラクトシダーゼについてアッセイすることによって、クラッベ
病の診断に適用され得る。これらの酵素は、現在、スキーム７に記載されるよう
に、蛍光団誘導体化試薬を使用してアッセイされる。本明細書中の方法でこれら
の試薬をアッセイするための酵素基質試薬は、蛍光団を本明細書中のＡ−Ｌ基で
置換することによって容易に調製され得る。親和性標識酵素基質を調製するため
のこのアプローチは、一般に、任意の公知の蛍光団誘導体化酵素基質または基質
アナログに適用可能である。
【０１４２】
表４は、特定の出生児欠損または疾患状態に関与する代表的な酵素を示す。こ
れらの酵素は、本明細書中に記載される方法によってアッセイされ得る。
【０１４３】
（炭水化物−欠乏性糖蛋白質症候群（ＣＤＧＳ）についての酵素的経路のアッ
セイ）
本発明の方法および試薬は、ＣＤＧＳ疾患の診断に適切な複数の酵素の速度を
定量化するために用いられ得る。
【０１４４】
Ｉａ型およびＩｂ型ＣＤＧＳは、酵素、ホスホマンノイソメラーゼ（ＰＭＩｂ
）（Ｉｂ型）およびホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ２）（Ｉａ型）（これらは、
グルコースからマンノース−１−ホスフェートへの変換のための多段階経路（ス
キーム８）（Ｆｒｅｅｚｅ、１９９８）の一部である）の不足または欠如によっ
て生じる。この経路に関与する単糖類基質は、フルクトース−６−ホスフェート
、マンノース−６−ホスフェート、およびマンノース−１−ホスフェートである
。これらの単糖類は、基質結合体に変換することがいくぶん困難であり得る。な
ぜなら、糖上のどの原子が、酵素活性を損なうことなくリンカーと結合するかべ
きが推測的に明らかではないからである。しかし、ＰＭＩｂおよびＰＭＭ２は、
間接的にアッセイされ得る。哺乳動物細胞のミクロソームは、ドリコール−Ｐ−
マンノースシンターゼを含み、このドリコール−Ｐ−マンノースシンターゼは、
ドリコールホスフェートとＧＤＰ−マンノースとの反応を触媒してドリコール−
Ｐ−マンノースおよびＧＤＰを形成する（スキーム８，Ｃｈａｐｍａｎら、１９
８０）。このシンターゼは、本発明の方法を使用し、特にビオチン−リンカー基
質を使用してアッセイされ得る。微生物ＰＭＭ、およびＧＴＰとマンノース−１
−ＰからＧＤＰ−マンノースを作製する酵素である、ＧＤＰ−マンノースピロホ
スホリラーゼは、細菌および酵母から容易に精製され（Ｇｌａｓｅｒ、１９６６
、Ｐｒｅｉｓｓ、１９６６）、そしてこれらの酵素は、外因的に酵素アッセイに
供給され得る。ＰＭＩｂ活性が不十分である場合、マンノース−６−Ｐはほとん
どまたは全く作られず、その場合、この反応順序は、フルクトース−６−Ｐの添
加によって開始される。マンノース−６−Ｐがない場合、マンノース−１−Ｐお
よびＧＤＰ−マンノースは作られず、その結果、結合したドリコール−Ｐ−マン
ノースはＥＳＩ−ＭＳで検出されない。外因性ＧＴＰは、必要ならば、ＧＤＰ−
マンノースピロホスホリラーゼ工程に供給され、そしてＡＴＰは省かれ、その結
果、マンノース−６−Ｐはマンノースからは作られ得ない。ＰＭＭ２をアッセイ
するために、反応順序はマンノース−６−Ｐで開始され、そしてＰＭＭ２の欠乏
の結果として、結合したドリコール−Ｐ−マンノースは作られない。
【０１４５】
キャリアドリコールは、約６０〜１０５炭素イソプレノイドである。ドリコー
ル鎖に結合した炭水化物で作用する多くの酵素は、ドリコール鎖の有意な短縮に
対して耐性である；１０および１５炭素ドリコールでさえ耐性である、という証
拠が集められている（ＲｕｓｈおよびＷａｃｈｔｅｒ、１９９５）。このような
酵素は、ドリコール結合体の水溶性炭水化物部分で作用し、従ってドリコールア
ンカーを結合する必要性はほとんどまたは全くないようである。このことに基づ
いて、ドリコール−Ｐ−マンノースシンターゼの直接アッセイ、ならびにＰＭＩ
ｂおよびＰＭＭ２の関節アッセイのための親和性標識基質は、親和性標識リンカ
ーをショートドリコール（例えば、１０−炭素ドリコールアナログのシトロネロ
ール）の非極性末端に結合することによって調製される。
【０１４６】
サルコシニルリンカーを含有するビオチン化ドリコール１０−基質結合体（Ｂ
−Ｓ−Ｄｏｌ１０−Ｐ）の合成は、スキーム９に示される。保護されたシトロネ
ロール（Ｒ＝ｔ−ＢｕＳｉＭｅ２）は、末端アリルメチル基で位置選択的に酸化
され（ＭｃＭｕｒｒｙおよびＫｏｃｏｖｓｋｙ、１９８４）、そしてアリルアル
コールはビオチンサルコシン活性エステル（Ｒ＝ＣＨ３）と結合される。シトロ
ネロールの１−ヒドロキシ基は、ＰＯＣｌ３で連続的に脱保護およびリン酸化さ
れる（ＲｕｓｈおよびＷａｃｈｔｅｒ、１９９５）。パラレル合成において、ｄ
５−サルコシン（ＣＤ３ＮＨＣＤ２ＤＯＯＨ）は、内部標準として使用するため
同位体標識（重）試薬を調製するために使用される。ｄ５−サルコシンは、市販
の物質（ＢｒＣＤ２ＣＯＯＤおよびＣＤ３ＮＨ２）から、標準的な合成技術を使
用して容易に調製される。
【０１４７】
重水素化内部標準である、Ｂ−ｄ５−Ｓ−Ｄｏｌ１０−Ｐ−マンノースは、雌
鳥の卵管ミクロソームを、ＧＤＰ−マンノースおよび合成Ｂ−ｄ５−Ｓ−Ｄｏｌ
１０−Ｐ基質結合体と共にインキュベートすることによって酵素的に合成される
（ＲｕｓｈおよびＷｅａｃｈｌｅｒ、１９９５）。Ｂ−Ｓ−結合体のさらなる利
点は、アガロース−ストレプトアビジンビーズ上での特異的な捕捉、続いて遊離
ビオチンでの溶離によって、ミクロソームのマンノシル化産物の親和性精製が容
易になり得ることである。
【０１４８】
親和性標識ショートドリコールアナログを使用するこの方法は、一般に、炭水
化物に固定されたドリコールで作用する他の酵素をアッセイするのに適用可能で
ある。このようなアプローチは、まだ同定されていない他のタイプのＣＤＧＳ中
に存在する酵素欠乏症の後に続く同定に有用である。
【０１４９】
ＩＩ型ＣＤＧＳは欠陥のあるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮ
Ａｃ−Ｔ  ＩＩ）から生じ、このＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩは、ジシ
アロ−２アンテナ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）鎖の構築プロセス中、ＧｌｃＮＡ
ｃを、中間体の分枝オリゴ糖中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからマンノース残基の２
位（コア領域（Ｃｏｒｅ  Ｒｅｇｉｏｎ）に移動させる（スキーム１０）（Ｓｃ
ｈａｃｈｔｅｒ、１９８６、Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎら、１９８９）。ＧｌｃＮ
ＡｃトランスフェラーゼＩＩは、コア領域中のマンノース残基の高い位置特異的
なグリコシル化を媒介する６種の公知の酵素のうちの１つである。コア領域は、
還元末端でチトビオシルアスパラギンに固定され、ここでアスパラギン残基は、
グリコシル化タンパク質のペプチド鎖の一部である。基質中の後者の構造単位は
、酵素活性を損失することなく、疎水性鎖によって置換され得る（Ｋａｕｒら、
１９９１）。従って、ＩＩ型ＣＤＧＳのための基質結合体は、親和性標識リンカ
ー基をチトビオシルアスパラギンの還元末端（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｎｄ）に結
合され、ここで、アスパラギン残基は、グリコシル化タンパク質のペプチド鎖の
一部である。基質における後者の構造ユニットは、酵素活性を損失することなく
、疎水性基によって置換され得る（Ｋａｕｒら、１９９１）。従って、ＩＩ型Ｃ
ＤＧＳの基質結合体は、親和性標識リンカー基をキトビオシルアスパラギンの還
元末端に結合することによって構築される。しかし、この基質の後者の構造単位
は、酵素活性を損失することなく、疎水性鎖によって置換され得る（Ｋａｕｒら
、１９９１）。例えば、市販のα−Ｄ−マンノ−ピラノシルフェニルイソチオシ
アネートは、ビオチン−標識リンカーに結合され得、そして５，６−ヒドロキシ
ルは、スキーム１１に例示されるように選択的に保護される（Ｐａｕｌｓｅｎお
よびＭｅｉｎｊｏｈａｎｎｓ、１９９２）。エクアトリアルな３−ＯＨとペル−
Ｏ−アセチルマンノシル−１−トリクロロアセトアミダート（ａｍｉｄａｔｅ）
の結合（Ｐａｕｌｓｅｎら、１９９３）は、二糖類結合体を与える（スキーム１
２）。少量の結合がアキシアルな２−ＯＨ基で起こる場合、その生成物はＨＰＬ
Ｃで分離され得る。脱保護の後、１級６−ＯＨは、１／２当量のペル−Ｏ−アセ
チルマンノシル−１−トリクロロアセトアミドと結合し、コア領域結合体が生成
する。Ｏ−アセチル基の脱保護により、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩのた
めの基質結合体が生成し、このＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩは、Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００  ウサギ肝臓抽出物を使用する酵素的グリコシル移動によって、
ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ  ＩＩ基質に変換され得、この反応は、調製用スケールで行わ
れた（Ｋａｕｒら、１９８１）。
【０１５０】
内部標識に必要な重水素標識した誘導体の合成は、標識ＰＥＧ−ジアミンビル
ディングブロックを使用することによって、並行して行われる（Ｇｅｒｂｅｒら
、１９９９）。ビオチン化三糖類は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよびトランスフェ
ラーゼＩＩと共にインキュベートし（ＫａｕｒおよびＨｉｎｄｓｇａｕｌ、１９
９１、Ｔａｎら、１９９６）、そして酵素産物の親和性精製用のＢ−Ｓハンドル
を利用することによって、四糖類（ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ  ＩＩの産物）に変換され
る。
【０１５１】
（Ｖ型ＣＤＧＳ）
グリコシル化タンパク質のＡｓｎ残基に転移される脂質結合オリゴ糖（ＬＬＯ
）は、２個のＧｌｃＮＡｃ、９個のマンノースおよび３個のグルコースからなる
。最近、Ｖ型ＣＤＧＳ患者由来のミクロソームは、ＬＬＯ生合成の間、１つ以上
のグルコース残基を転移させる酵素が非常に欠乏しているということが示された
（Ｋｏｒｎｅｒら、１９９８）。ＬＬＯの炭水化物単位をＡｓｎ残基に結合する
トランスフェラーゼは、グルコース欠乏ＬＬＯを識別するため、Ｖ型ＣＤＧＳ患
者は、糖タンパク質（例えば、トランスフェリン）に結合した少数の炭水化物単
位を有する（Ｋｏｒｎｅｒら、１９９８）。しかし、存在する少数の炭水化物単
位は全長であり、これは残りのグリコシル転移は、Ｖ型ＣＤＧＳ患者において起
こることを示す（Ｋｏｒｎｅｒら、１９９８）。従って、ＥＳＩ−ＭＳによるＡ
ｓｎグリコシル化の速度の定量化は、Ｖ型ＣＤＧＳ症候群の実行可能なアッセイ
を構成する。
【０１５２】
Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列を含む、３−７アミノ酸残基を有する合
成ペプチドは、グリコシル化に良好な基質であることが示された（Ｒｏｎｉｎら
、１９８１）。オリゴ糖トランスフェラーゼのＥＳＩ−ＭＳアッセイのための戦
略は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｆ配列を含む適切なペプチドのＢ−Ｓ結合
体に依存する（スキーム１３）。ヘプタペプチド、ＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−ＮＨ２は、以前の研究において高い活
性を示した（Ｒｏｎｉｎら、１９８１）。ペプチドは、社内の自動合成装置を使
用する標準的なペプチド合成によって容易に入手可能である。ヘプタペプチドお
よびその糖結合体は、ＥＳＩによってイオン化され、安定な一価のイオンを与え
得る。ＢＳ−テトラフルオロフェニルエステルとＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅ
ｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−ＮＨ２との結合により、このトランスフ
ェラーゼの基質が直接得られる。いくつかの産物は、オリゴ糖アンテナの酵素的
グリコシル化および続く改変から予想される。この産物は、甲状腺のラフ（ｒｏ
ｕｇｈ）ミクロソームを、ＢＳ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｍｅｔ−ＮＨ２およびＤｏｌ−Ｐ−Ｇｌｕと共にインキュベートし（Ｒｏ
ｎｉｎら、１９８１ａ）、続いてビオチン化産物を親和性精製することによって
、酵素的に調製され得る。グリコシル化の程度の違いによる産物の分布は、ＥＳ
Ｉ−ＭＳによってモニタリングされ得、主成分はＨＰＬＣによって精製され得る
。Ｂ−Ｎ（ＣＤ３）ＣＤ２ＣＯ−結合体を使用する類似の手順が、重水素化内部
標準を調製するために使用される。
【０１５３】
Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＶ型ＣＤＧＳ症候群についてアッセイされた酵素のセ
ットのための、イオン化された基質結合体、ならびに産物および内部標準の分子
量は、表５に集められ、これは（Ｍ＋Ｈ）＋種の中で電荷の重なり（ｉｓｏｂａ
ｒｉｃ  ｏｖｅｒｌａｐ）は起こらないことを示す。Ｉａ、ｂ型産物の（Ｍ＋Ｎ
ａ）＋イオンと脱マンノシル化Ｂ−（Ｎ−Ｃ２Ｄ５）−２，２−Ｄ２−Ｇｌｙ−
Ｄｏｌ１０−Ｐ内部標準の（Ｍ＋Ｈ）＋イオンとの間の接近した間隔は、Ｎａ＋
イオンの付加によりＮａ付加体として気相イオンを生成することにより、ＥＳＩ
−ＭＳ条件を調節することによって、容易に回避され得る。
【０１５４】
単一の生物学的サンプル（例えば、細胞溶解産物）において、３つの標的酵素
の全てが同時に分析され得る。ＰＭＭ２およびＰＭＩｂは同時にアッセイされ得
ない。なぜなら、これらは異なる外因性基質の添加を必要とするからである。そ
れにもかかわらず、同一のＥＳＩ−ＭＳ技術を使用する２つのアッセイが、一連
の種々の方法に依存する代わりに、様々なＣＤＧＳ型を診断するために使用され
得る。
【０１５５】
（臨床酵素学的アッセイ）
線維芽細胞ペレットを氷上で解凍する。十分な０．９％ＮａＣｌを添加して、
溶解産物中の最終タンパク質濃度が約５ｍｇ／ｍＬ（典型的には、１００ｍｃＬ
）を得、そしてこの細胞ペレットを、氷水中で５回、適度な電力で、それぞれ２
秒間超音波処理する。全タンパク質を、ＢＣＡ試薬（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  
Ａｓｓａｙキット、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して分光光学的に決定した。
【０１５６】
全酵素反応容量は、２０〜３０ｍｃＬである。基質ストック溶液は、３ｍＭ（
ＳＦＢ）および２ｍＭ（ＧＭ１）の濃度に維持する。これらの濃度は、１Ｈ−Ｎ
ＭＲシグナルの積分比対内部標準（ＤＭＦのホルムアミドプロトン）により測定
した。基質の最終濃度は、それぞれ、０．３ｍＭおよび０．２ｍＭである。２０
〜３０ｍｃＬ−（（基質の追加分（２〜３ｍｃＬ）＋（５０〜７０ｍｃｇの全タ
ンパク質に等しくなるのに十分な細胞サンプル容量））に等しい容量の反応緩衝
液（例えば、２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を、０．５ｍＬエ
ッペンドルフチューブに添加し、続いて基質を添加する。サンプルを氷で冷却し
、そして患者の細胞サンプルを添加する。この反応を、３７℃でインキュベート
することによって開始する。
【０１５７】
ＳＦＢについて：この反応系を、４．５〜６時間進行させ、この後、ＧＭ１基
質を添加し得るか、またはこの反応は、１００ｍｃＬの２００ｍＭグリシンカル
ボン酸緩衝液（ｐＨ１０．５）でクエンチし得る。
【０１５８】
ＧＭ１について：この反応を０．５時間進行させる。ＳＦＢの場合と同様にク
エンチする。
【０１５９】
クエンチした後、これらのサンプルを氷上に置く。内部標準を添加する（それ
ぞれ１ｎｍｏｌ、すなわち５０ｍｃＬの０．０２ｍＭ溶液）。これらのサンプル
を、約１５，０００ｒｐｍ、２分間、室温で、ペレット細胞片に対して微量遠心
する。ストレプトアビジン−アガロースビーズ（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  ｉｍｍ
ｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ）を、ミクロバイ
オスピンクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れる。十分なビーズ
を添加して５ｎｍｏｌの全ビオチン結合能力のビーズ（典型的な結合能力は、Ｐ
ｉｅｒｃｅにより決定した場合、１００ｐｍｏｌ／ｍｃＬ）を得る。サンプルの
上清をバイオスピンチューブに移し、そして室温で１０分間結合させる。このサ
ンプルを約３，０００ｒｐｍでスピンして、過剰の上清を除去し、次いで、０．
０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１回、精製水で少なくとも５回洗浄し、中程
度にチューブをスピンして溶液を除去する。それぞれ洗浄するために、十分な洗
浄溶液を添加して、バイオスピンチューブを満たす。
【０１６０】
次いで、精製ビーズを３０ｍｃＬの精製水で処理し、続いて、１０ｍｃＬの４
ｍＭビオチン溶液で処理する。これらのチューブの底をキャップして、漏れを防
ぎ、そして２〜８℃で２〜１２時間インキュベートさせる。これらのサンプルを
、約３，０００ｒｐｍでスピンして、サンプルをきれいなエッペンドルフチュー
ブに溶離する。
【０１６１】
次いで、サンプルを、６０ｍｃＬの５０％メタノール／水で希釈し、そしてイ
オントラップ質量分光計に注入する。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを調整して、まず
ブランクサンプル（反応をクエンチした後に添加される細胞溶解物）を分析する
ことによって、サンプルの非特異的な切断を減らす。注入したサンプルを、産物
および内部標準の（Ｍ＋Ｈ＋）＋イオンについて、１ａｍｕ幅のウインドーのイ
オンクロマトグラムの積分によって分析する。
【０１６２】
結果を、形成された生成物ｎｍｏｌ／インキュベーションの時間／反応混合物
中の全タンパク質ミリグラムで報告する。
【０１６３】
（ＧＭ１およびＳＦＢについての、患者サンプルの臨床的分析）
患者皮膚線維芽細胞を、凍結ペレットとして得、そして使用まで−２０℃で保
存した。ＧＭ１罹患した２つのサンプルおよび６つの正常なコントロールを分析
した。
【０１６４】
５０ｍｃＬの０．９％ＮａＣｌを、各患者細胞ペレットへ添加した。これらの
ペレットを、氷水中、各中程度の超音波パワーで２秒間×５回超音波処理によっ
て溶解させ、超音波処理の間において氷水中でマイクロチップを冷凍した。
【０１６５】
サンプルを、以下のようにＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）アッセイによって定量した
：
試薬ＡおよびＢを、上述のように５０：１の比で混合した。タンパク質標準曲
線を、ウシ血清アルブミンを、標準として、２、１、０．５、０．２、および０
．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用して調製した。患者超音波処理物の一部を、水中
１：１５で希釈し、そして各希釈した親サンプルの５ｍｃＬおよび標準曲線ポイ
ントを、２連で、２００ｍｃＬの水を含む個々のガラス培養チューブへ添加した
。次いで、これらのサンプルを、１ｍＬの混合ＢＣＡ試薬で希釈し、ボルテック
スして混合し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。これらのサンプル
を、室温まで冷却し、そして２００ｍｃＬの水のみを含有するブランクに対して
分析した。これらのサンプルを、ポリスチレンキュベット中、５６２ｎｍでの吸
光度をモニターすることによって分析した。平均患者吸光度値を、ブランク補正
し（ｂｌａｎｋ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）、そして線形回帰によって標準と比較し
た。
【０１６６】
患者タンパク質濃度は、以下であると測定された：
１．（罹患）１２．２ｍｇ／ｍＬ、２．（正常）１０．８ｍｇ／ｍＬ、３．（正
常）１１．９ｍｇ／ｍＬ、４．（正常）１２．１ｍｇ／ｍＬ、５．（正常）１０
．３ｍｇ／ｍＬ、６．（正常）７．７９ｍｇ／ｍＬ、７．（正常）１５．７ｍｇ
／ｍＬ、８．（罹患）１１．４ｍｇ／ｍＬ。
【０１６７】
インキュベーションを、総計３０ｍｃＬの総容量で実施した。ブランクＥｐｐ
ｅｎｄｏｒｆ管へ添加した反応緩衝液（２００ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ
４．２５）の量は、基質容量（３ｍｃＬの各基質ストック溶液、ＧＭ１について
２ｍＭおよびＳＦＢについて３ｍＭ、６ｍｃＬの総量）＋７５ｍｃｇの総タンパ
ク質に等しくなるために要求される細胞溶解物の容量の、３０ｍｃＬからの、差
であった。例えば、患者１．のインキュベーション混合物は、最初に３ｍｃＬの
ＳＦＢ基質溶液、６．１４ｍｃＬの患者細胞溶解物、および１７．８６ｍｃＬの
反応緩衝液を含んだ。ＧＭ１基質を、後で、このインキュベーションに添加した
（以下を参照のこと）。
【０１６８】
各患者サンプルを、３連で分析した。反応混合物を、調製の間、氷上に維持し
、そしてこの反応を３７℃の水浴へ移すことによって開始した。５．５時間イン
キューベーションし、３ｍｃＬのＧＭ１基質を、各反応物に添加し、そしてさら
に０．５時間後、これらの反応物を、氷上に配置し、そして２００ｍｃＬの２０
０ｍＭグリシン−カーボネート緩衝液（ｐＨ１０．２５）でクエンチした。
【０１６９】
精製手順および分析手順は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ａｓ
ｓａｙ（Ｔｙｐｉｃａｌ）に記載の通りである。
【０１７０】
得られた酵素活性は、平均標準偏差ｎｍｏｌ生成物／時間インキュベーション
／ｍｇ全タンパク質である：
【０１７１】
【化４】
2006184290.tif 000006
以下の合成方法は、スキーム１４〜２３を言及する。ＧＭ１−ガングリオシドー
シス（β−Ｄ−ガングリオシド欠乏）についての合成。
【０１７２】
（１．２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１
））
２５ｇ（０．１５ｍｏｌ）の２，３，５，６−テトラフルオロフェノール、３
５ｍＬ（０．２ｍｏｌ）の無水トリフルオロ酢酸および０．５ｍＬの三フッ化ホ
ウ素エーテラートを、アルゴン下で、１８時間還流した。無水トリフルオロ酢酸
およびトリフルオロ酢酸を、室温での蒸留によって除去した。この無水トリフル
オロ酢酸の画分を、この混合物に戻し、そしてこの反応系を２４時間還流した。
これを、２回繰り返した。室温での最後の蒸留の後、所望の生成物１を、減圧下
（６２℃／４５ｍｍｇ）で蒸留し、無色液体（３０ｇ、８２％）が生成した。１
Ｈ−ＮＭＲ．（Ｇａｍｐｅｒ，Ｈ．Ｂ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，第
２１巻  第１４５〜第１５０頁を参照）。
【０１７３】
（２．ビオチン−２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル（２））
２０ｍＬの無水ＤＭＦ中の２．５ｇ（１０．３ｍｍｏｌ）量のｄ−ビオチンを
、アルゴン雰囲気下で、攪拌しながら６０℃まで加温して、溶解した。１．７ｍ
Ｌ（１２．５ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン、続いて３．４ｇ（１２．５ｍｍｏ
ｌ）の１を添加した。この混合物を、２時間攪拌し、この後、溶媒をロータリー
エバポレーションによって除去した。得られた半固体を、１５ｍＬのエーテルで
２回粉末化し、白色固体を生成した（２．６ｇ、６５％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｗ
ｉｌｂｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，第８巻、第５７２〜第５
８４頁を参照）。
【０１７４】
（３．Ｎ−メチルグリシルビオチンアミド−メチルエステル（３））
３０ｍＬの無水ＤＭＦ中の２．５ｇ（６．４ｍｍｏｌ）量のビオチンテトラフ
ルオロフェニルエステルを、アルゴン雰囲気下で、１０ｍＬの無水ＤＭＦおよび
１．２５ｍＬ（９．０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン中に溶解した１．１ｇ（７
．７ｍｍｏｌ）のＮ−メチルグリシンメチルエステルヒドロクロリドの混合物へ
添加した。この反応混合物を、室温で２時間攪拌し、次いで、溶媒をロターリー
エバポレーションによって除去した。残渣をクロロホルム（２×１００ｍＬ）で
抽出し、水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
溶媒を、真空下で除去し、Ｎ−メチルグリシンビオチンアミドのメチルエステル
をオイルとして得た（２．１ｇ、９８％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｗｉｂｕｒ，Ｄ．
Ｓ．、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，第８巻、第５７２〜第５８４頁を参照）。
【０１７５】
（４．Ｎ−メチルグリシルビオチンアミド酸（４））
Ｎ−メチルグリシルビオチンアミドメチルエステルを、１時間攪拌しながら室
温で、３１ｍＬのＭｅＯＨおよび１０ｍＬの１Ｎ  ＮａＯＨの混合液中で加水分
解した。この混合物を、５０ｍＬ  ５０％  ＭｅＯＨ／水で希釈し、そして陽イ
オン交換樹脂水素型（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｆｏｒｍ）（ＡＧ  ＭＰ−５０，Ｂｉ
ｏＲａｄ）で中和した。この溶液を濾過し、この樹脂を５０％  ＭｅＯＨ／水で
洗浄し（３×５０ｍＬ）、そして溶媒をロターリーエバポレーションによって除
去して、Ｎ−メチルグリシルビオチンアミド酸をオフホワイト固体として得た（
１．６ｇ、９０％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｃｏｎ
ｊ．Ｃｈｅｍ．，第８巻、第５７２〜第５８４頁を参照）。
【０１７６】
（５．ｐ−アクリルアミドフェニル−  −Ｄ−ガラクトピラノシド（５））
４０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のｐ−アミノフェニル  −Ｄ−ガラクトピラノ
シドを、攪拌しながら、２５ｍＬのメタノールおよび２００ｍｃＬのトリエチル
アミンに添加した。この溶液を、氷浴中で冷凍した。５３．３ｍｇ（０．６ｍｍ
ｏｌ）のアクリロイルクロリドを、５ｍＬの乾燥塩化メチレンへ溶解し、そして
この攪拌溶液へ５分間にわたって滴下した。この反応系を、室温に戻し、続いて
２時間攪拌した。次いで、この溶液を、中性ｐＨが湿性ｐＨ紙（ｍｏｉｓｔ  ｐ
Ｈ  ｐａｐｅｒ）で得られるまで、連続の陰イオン交換樹脂および陽イオン交換
樹脂（それぞれ、ＡＧ  ＭＰ−１およびＡＧ  ＭＰ−５０、ＢｉｏＲａｄ）で処
理した。溶媒をロターリーエバポレーションによって除去し、固体を得た（４３
ｍｇ、９０％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａ，Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２４２巻、第９０〜第１０１頁を参照）。
【０１７７】
（６．４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンおよび５の
マイケル付加生成物（６））
２０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）の５を、５ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム中の
８０ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）の４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデ
カンジアミンの攪拌溶液（ｐＨ１０．５、３７℃で）へ添加した。この反応を、
３日間進行させ、この後、この溶液を希トリフルオロ酢酸で中和し、そして逆相
ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分取スケール（ｐｒｅｐ−ｓｃａｌｅ）カラ
ム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％Ｔ
ＦＡ））によって精製し、７．３ｍｇの生成物を得た。（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａ
，Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２４２巻、第９０〜第１０１頁
を参照）。
【０１７８】
（７．４および６のＧＭ１基質結合体（７））
２．５ｍｇ（７．４ｍｃｍｏｌ）量の４を、１．５ｍＬの無水ＤＭＦに、アル
ゴン雰囲気下で、攪拌しながら溶解した。５ｍｃＬのトリエチルアミン、続いて
２．３ｍｇ（８．８ｍｃｍｏｌ）の１を添加した。活性エステルの形成を、シリ
カＴＬＣ（５：１  ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ，Ｒｆ０．５，ＵＶ）によって、ス
ポットしたＴＬＣプレートを空気流で簡単に乾燥することによってモニターした
。２５分後、この混合物を、１ｍＬの無水ＤＭＦ中の３．２ｍｇ（５．９ｍｃｍ
ｏｌ）の６へ添加した。２時間後、溶媒を真空遠心分離によって除去し、そして
最終生成物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分取スケールカラム、６ｍ
Ｌ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））
によって精製した。収量４．６ｍｇ。（Ａｎａｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，第８巻、第５７２
〜第５８４頁を参照）。
【０１７９】
（８．１，２，１０，１１−オクタジューテロ（ｏｃｔａｄｅｕｔｅｒｏ）−
３，６，９−トリオキサ−１，１１−ウンデカンジニトリル（８））
１ｇ（９．４ｍｍｏｌ）のジエチレングリコールを、窒素雰囲気下、１０ｍＬ
の丸底フラスコ中で、２ｍＬのＤ２Ｏに溶解した。Ｄ２Ｏをロターリーエバポレ
ーションによって除去し、そしてこのプロセスを４回繰り返した。ｄ−２ジエチ
レングリコールを、２５ｍＬの乾燥ベンゼンと共に添加し、続いて１．６ｇ（２
８．２ｍｍｏｌ）のｄ−３アクリロニトリルを、攪拌しながら、アルゴン雰囲気
下で添加した。１２時間後、この溶媒を減圧下で除去し、そして得られた半個体
を、クロロホルム（２×２５ｍＬ）で抽出した。溶媒をロターリーエバポレーシ
ョンによって除去し、生成物を得た（１．８５ｇ、８９％）。（Ａｓｈｉｋａｇ
ａ，Ｋ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、第６１巻、第２４４３〜第
２４５０頁を参照）。
【０１８０】
（９．２，３，１１，１２−オクタジューテロ−４，７，１０−トリオキサ−
１，１３−トリデカンジアミン（９））
ラネーニッケル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、無水メタノールで、反転およびデカン
テーションによって、５回洗浄した。５０ｍｇのこの洗浄した触媒を、２０ｍＬ
の無水メタノール中に静置し、続いてテフロン（登録商標）ラインゴム隔壁（Ｔ
ｅｆｌｏｎ−ｌｉｎｅｄ  ｒｕｂｂｅｒ  ｓｅｐｔｕｍ）を取り付けた５０ｍＬ
のスクリューキャップバイアル中で１ｇ（４．６ｍｍｏｌ）の８中に静置した。
このバイアルのヘッドスペースを、数分間、この隔壁を貫通する１８ゲージ針を
介して、Ｈ２でフラッシュした。このキャップを密接にネジで締め、そしてこの
全体のアセンブリを、４０ｐｓｉ  Ｈ２まで充填し、４時間、熱水浴（８０℃）
中に配置し、その後、この固体触媒を、濾過によって除去し、そしてメタノール
をエバポレートした。この最終生成物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  
分取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣ
Ｎ（０．０８％ＴＦＡ）））によって精製した。収量１８０ｍｇ。（Ａｓｈｉｋ
ａｇａ，Ｋ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、第６１巻、第２４４３
〜第２４５０頁を参照）。
【０１８１】
（１０．６の重水素化アナログ（１０））
２５ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）の５を、５ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム中の
９０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）の９の攪拌溶液（ｐＨ１０．５  ３７℃で）へ添
加した。この反応を、３日間進行させ、この後、この溶液を希トリフルオロ酢酸
で中和し、そして逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分取スケールカラム、
６ｍＬ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ
））によって精製した。収量６ｍｇ。
【０１８２】
（１１．７の重水素化アナログ（１１））
３ｍｇ（８．４ｍｃｍｏｌ）量の４を、アルゴン雰囲気下で、攪拌しながら、
０．７ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。５ｍｃＬのトリエチルアミン、続いて２．
４ｍｇ（８．９ｍｍｃｍｏｌ）の１を添加した。活性エステルの形成を、シリカ
ＴＬＣ（５：１  ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ，Ｒｆ０．５，ＵＶ）によって、スポ
ットしたＴＬＣプレートを空気流で簡単に乾燥することによってモニターした。
２５分後、この混合物を、１ｍＬの無水ＤＭＦ中の６ｍｇ（１１ｍｃｍｏｌ）の
１０に添加した。２時間後、この溶媒を、真空遠心分離によって除去し、そして
最終生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分取スケールカラム、６
ｍＬ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ）
）によって精製した。収量１．８ｍｇ。
【０１８３】
（１２．ＧＭ１内部標準結合体（１２））
１．８ｍｇの１１を、攪拌しながら、２ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍ
Ｍ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ２．３緩衝液へ添加した。１５ユニット組換え  −Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして１２時間後、この混合物を、逆
相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相
：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））によって精製し
た。収量１．５ｍｇ。
【０１８４】
（ポリエーテルジアミンリンカー合成（第２生成））
合成は、以前に記載された化学（Ｋａｔａｋｙ，Ｒ．ら、Ｊ  ＣＨＥＭ  ＳＯ
Ｃ  ＰＥＲＫ  Ｔ  ２（２）  ３２１−３２７  ＦＥＢ  １９９０）に基づき、
少しの改変および追加の２工程を伴う。例として、確立された手順からの逸脱、
ならびに追加の工程についての正確な細部を、出発物質のジエチレングリコール
について以下に概要を述べる。
【０１８５】
（１，１１−ジシアノ−３，６，９−トリオキサウンデカン（１３））
２％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム（５ｍＬ）およびジエチレングリコール（５
．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液へ、アクリロニトリル（７．９５ｇ、１５０
ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、そして５０ｍＬのジク
ロロメタンを添加した。この有機層を、ブラインで２回洗浄し、そして乾燥した
（ＭｇＳＯ４）。この溶媒を、ロターリーエバポレーションによって除去した。
油状残渣を、２００プルーフのエタノールで処理し、そして溶媒をロータリーエ
バポレーションによって除去した。これを２回繰り返して、過剰な未反応のアク
リロニトリルを除去した。生成物をさらなる精製なしに使用した。
【０１８６】
（ジエチル４，７，１０−トリオキサトリデカン−１，１３−ジオエート（１
４））
２ｇ（９．４ｍｍｏｌ）の１３を、５ｍＬのエタノールに溶解した。１ｇの濃
硫酸を、５分間にわたって徐々に添加した。この反応系を一晩加熱還流した。こ
の反応物を、４０ｍＬの塩化メチレンで抽出し、１０ｍＬの水で１回、そして１
０ｍＬの希ブライン溶液で洗浄した。この有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、そし
て溶媒を除去して、オイルを得た。この最終生成物を、シリカクロマトグラフィ
ー（塩化メチレン／酢酸エチル）によって精製した。
【０１８７】
（１，１３−ジヒドロキシ−４，７，１０−トリオキサトリデカン（１５））
テトラヒドロフランを溶媒として使用して、記載のように正確に調製した（１
．７ｇ、５．５ｍｍｏｌの１４、５０ｍＬの希［ＣａＨ２］ＴＨＦ、０．６６ｇ
，１６．５ｍｍｏｌの水素化アルミニウムリチウム）。一旦添加が完了すると、
過剰のＬＡＨをエタノールでクエンチし、そしてこれらの塩を、白色沈殿が形成
されるまで飽和硫酸ナトリウム溶液を滴下することによって、沈殿させた。溶媒
を除去し、この沈殿物を、３０ｍＬのＴＨＦで６回洗浄し、そして合わせた有機
抽出物を、エバポレートして、オイルを得た。最終生成物を、シリカクロマトグ
ラフィー（最初に、塩化メチレンで、次いで酢酸エチルで、最後にアセトンで）
よって精製した。
【０１８８】
（１，１３−ジクロロ−４，７、１０−トリオキサトリデカン（Ｐ２を使用す
るアナログ）（１６））
１．１．ｇ（４．９ｍｍｏｌ）の１５を、３０ｍＬの乾燥ベンゼン中の１．１
５ｇ（１４．６ｍｍｏｌ）の希ピリジンへ、攪拌しながら添加し、続いて１．８
ｇ（１４．６ｍｍｏｌ）の塩化チオニルを添加した。この混合物を、６時間加熱
還流した。氷浴中で冷却した後、５ｍＬの３Ｍ  ＨＣＬを、激しく攪拌しながら
添加した。有機層を分離し、希ブライン溶液で３回洗浄し、そして乾燥し（Ｎａ
ＳＯ４）、黄色がかったオイルを得た。洗浄および溶媒の除去後、このジクロリ
ドをさらなる精製なしで使用した。
【０１８９】
（追加の工程）
（１，１３−ジシアノ−４，７，１０−トリオキサドデカン（１７））
４ｍＬのジメチルスルホキシド中の０．７８ｇ（１５．５ｍｍｏｌ）のシアン
化ナトリウムの攪拌溶液へ、８０℃で、１ｇ（３．９ｍｍｏｌ）の１６を添加し
た。２時間後、この反応物に、１０ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液、５ｍＬの水
、および５０ｍＬの酢酸エチルを添加した。前述のように、この有機層をブライ
ン溶液で３回洗浄し、その後、この有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして溶
媒を除去した。最終生成物を、シリカクロマトグラフィー（塩化メチレン／酢酸
エチル）によって精製した。ＥＳＩ−ＭＳ：予測値、２４０．１；実測値、２４
１．１（Ｍ＋Ｈ＋）＋。
【０１９０】
（１，１５−ジアミノ−５，８，１１−トリオキサペンタデカン（１８））
０．４２ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）の新鮮なＬＡＨを含有する５０ｍＬの乾燥Ｔ
ＨＦの攪拌溶液を、アルゴン下で、１５分間、穏やかに加熱還流した。１５ｍＬ
の乾燥ＴＨＦ中の０．５ｇ（２ｍｍｏｌ）の１７を、２０分間にわたって滴下し
、穏やかな還流を維持した。未反応のＬＡＨを、エタノールでクエンチし、そし
てこの混合物を、効率的に攪拌しながら、白色沈殿物が形成するまで、飽和硫酸
ナトリウムの滴下で処理した。この混合物を濾過し、そしてこの沈殿物を３０ｍ
ＬのＴＨＦで６回洗浄した。有機抽出物を合わせ、そして溶媒をロターリーエバ
ポレーションによって除去し、オイルを得た。ＥＳＩ−ＭＳ：予測値、２４８．
１；実測値、２４９．１（Ｍ＋Ｈ＋）＋。
【０１９１】
（重水素化）
重水素を、重水素化アルミニウムリチウム（９８％Ｄ）を使用する１４および
１７の還元によって、このジアミンリンカーに組み込み、ｄ−８重水素化ジアミ
ンを達成した。この合成の他の局面は、この手順について変更されなかった。こ
れらのジオールを、後述のようにＳＦＤ結合体の構築において使用した。
【０１９２】
（サンフィリポ症候群Ｂ型（Ｎ−  −Ｄ−グルコサミニダーゼ欠乏）について
の重要な基質合成）
（１３．ｐ−アミノフェニル−  −Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（１９））
２０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニル−  −Ｄ−Ｎ−アセチル
グルコサミン（Ｓｉｇｍａ）を、５ｍＬの隔壁ラインバイアル（ｓｅｐｔａ−ｌ
ｉｎｅｄ  ｖｉａｌ）中、３ｍＬのメタノール中の５ｍｇの洗浄した活性炭担持
パラジウム触媒へ、攪拌しながら添加した。この隔壁を、１６ゲージ針によって
貫通し、そしてこのバイアルのヘッドスペースを、Ｈ２ガスでフラッシュした。
Ｈ２ガスを、溶液を通してゆっくりと２時間バブルさせ、この後、触媒を、ケイ
藻土（セライト）で濾過することによって除去した。溶媒をロターリーエバポレ
ーションによって除去し、半固体を得た（１８ｍｇ、９０％）。
【０１９３】
（１４．ｐ−アクリルアミドフェニル−  −Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（
２０））
１０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）の１９を、１５ｍＬのメタノールおよび１００
ｍｃＬのトリエチルアミンへ、攪拌しながら添加した。この溶液を、氷浴中で冷
蔵した。１５ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）のアクリロイルクロリドを、２ｍＬの乾
燥塩化メチレンに溶解し、そして５分間にわたってこの攪拌溶液に滴下した。こ
の反応系を、室温まで戻し、続いて２時間攪拌した。次いで、溶液を、中性ｐＨ
が湿性ｐＨ紙で得られるまで、連続の陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂
（それぞれ、ＡＧ  ＭＰ−１およびＡＧ  ＭＰ−５０、ＢｉｏＲａｄ）で処理し
た。溶媒をロターリーエバポレーションで除去し、固体（１１ｍｇ、９５％）を
得た。１Ｈ−ＮＭＲ．収量１１ｍｇ。
【０１９４】
（１５．３，６−ジオキサ−１，９−ノナンジニトリル（２１））
２ｇ（０．０３２ｍｍｏｌ）のエチレングリコールを、３０ｍＬの乾燥ベンゼ
ン中の０．５ｇの乾燥水酸化カリウムへ、続いて５ｇ（０．０９６ｍｍｏｌ）の
アクリロニトリルを添加し、室温で一晩攪拌した。この反応物を濾過し、そして
溶媒をロターリーエバポレーションによって除去して、オイルを得た。最終産物
を、シリカクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール）によって精製し、
無色オイルを得た（３．２ｇ、６０％）。
【０１９５】
（１６．４，７−ジオキサ−１，１０−デカンジアミン（２２））
ラネーニッケル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、反転およびデカンテーションによって
、無水メタノールで５回洗浄した。５０ｍｇのこの洗浄した触媒を、２０ｍＬの
無水メタノールに静置し、続いてテフロン（登録商標）ラインゴム隔壁を取り付
けた５０ｍＬのスクリューキャップバイアル中で１ｇ（６ｍｍｏｌ）の２１に静
置した。このバイアルのヘッドスペースを、この隔壁を貫通する１６ゲージ針を
介して、Ｈ２でフラッシュした。このキャップを密接にネジで締め、そしてこの
全体のアセンブリを、４０ｐｓｉ  Ｈ２まで充填し、熱水浴（８０℃）中に４時
間配置し、その後、この固体触媒を、濾過によって除去し、そしてメタノールを
エバポレートした。この最終生成物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分
取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ
（０．０８％ＴＦＡ））によって精製した。
【０１９６】
（１７．２０および２２のマイケル付加生成物（２３））
５ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の２０を、５ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム中
の１３ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）の２２の攪拌溶液（ｐＨ１０．５、３７℃で）
へ添加した。この反応を、３日間進行させ、この後、この溶液を希トリフルオロ
酢酸で中和し、そして逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分取スケールカラ
ム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％Ｔ
ＦＡ））によって精製した。収量６ｍｇ。
【０１９７】
（１８．４および２３のＳＦＢ基質結合体（２４））
４ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）量の４を、攪拌しながら、アルゴン雰囲気下で
１．５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。１０ｍｃＬの乾燥トリエチルアミン、続い
て４ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の１を添加した。活性エステルの形成を、シリ
カＴＬＣ（５：１  ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ，Ｒｆ０．５，ＵＶ）によって、ス
ポットしたＴＬＣプレートを空気流で簡単に乾燥することによってモニターした
。２５分後、この混合物を、１ｍＬの無水ＤＭＦ中の６ｍｇ（０．０１２ｍｍｏ
ｌ）の２３へ添加した。２時間後、溶媒を真空遠心分離によって除去し、そして
最終生成物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８  分取スケールカラム、６ｍ
Ｌ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））
によって精製した。収量４．２ｍｇ。
【０１９８】
（１９．１，９−テトラジューテロ−３，６−ジオキサ−１，９−ノナンジニ
トリル（２５））
０．５ｇ（８ｍｍｏｌ）のエチレングリコールを、０．１ｇの乾燥水酸化カリ
ウム（２０ｍＬのアセトニトリル中）に添加し、次いで１．４ｇ（２４ｍｍｏｌ
）ｄ−３アクリロニトリルを室温で一晩攪拌しながら添加した。この反応物を濾
過し、そして溶媒をロタリーエバポレートにより除去し、オイル状物を得た。最
終生成物をシリカクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール）により精製
し、無色のオイル状物０．９ｇ（６５％）を得た。
【０１９９】
（２０．１，９−テトラジューテロ−３，６−ジオキサ−１，９−ノナンジア
ミン（２６））
Ｒｅｎｅｙニッケル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、インバージョンおよびデカンテー
ションにより無水メタノールで５回洗浄した。２０ｍｇの洗浄した触媒を無水メ
タノール（３０ｍＬ）中に配置し、続いて、０．５ｇ（３ｍｍｏｌ）の２５（Ｔ
ｅｆｌｏｎラインラバーセプタムを備えた５０ｍＬスクリューキャップバイアル
中）を配置した。このバイアルの頭隙を、セプタムを貫通する１８−ゲイジ針を
介してＨ２ガスで排除した。このキャップをしっかりとねじで取り付け、そして
全アセンブリを、４０ｐｓｉ  Ｈ２でチャージし、そして温水浴（８０℃）に４
時間配置し、その後、この固体触媒を濾過によって取り除き、そしてメタノール
をエバポレートした。この最終生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８
分取−スケールカラム、６ｍＬ／分  移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／Ａ
ＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製した。
【０２００】
（２１．２３の重水素化したアナログ（２７））
２０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）のｐ−アクリルアミドフェニル  −Ｄ−ガラク
トシドを、攪拌した２６（９０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）（０．５ｍＬの０．２Ｍ
炭酸ナトリウム中）の溶液に、ｐＨ１０．５、３７℃で添加した。この反応を３
日進行させ、この後、溶液を希釈トリフルオロ酢酸で中和し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖ
ｙｄａｃ  Ｃ−１８分取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ２Ｏ（０．０
８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製した。収量２ｍｇ。
【０２０１】
（２２．２４の重水素化したアナログ（２８））
２ｍｇ（６．３ｍｃｍｏｌ）量の４を、攪拌しながら無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ
）中に、アルゴン雰囲気下で溶解した。５ｍｃＬのトリエチルアミンを添加し、
続いて２．１ｍｇ（７．６ｍｃｍｏｌ）の１を添加した。活性エステルの形成は
、シリカＴＬＣ（５：１ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ、Ｒｆ０．５、ＵＶ）（空気流
でスポットしたＴＬＣプレートを簡単に乾燥する）によりモニターした。３５分
後、この混合物を４ｍｇ（７ｍｃｍｏｌ）の２７（１ｍＬの無水ＤＭＦ中）に添
加した。２時間後、溶媒を真空遠心分離により除去し、そして最終生成物を、逆
相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８分取−スケールカラム、６ｍＬ／分  移動相
：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製した
。収量１．２ｍｇ。
【０２０２】
（２３．ＳＦＢ内部標準結合体（２９））
１．２ｍｇの２８を２ｍＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
ｐＨ７．３緩衝液に攪拌しながら添加した。１５単位の組換え型  −Ｄ−ガラク
トシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして１２時間後に、混合物を逆相ＨＰＬ
Ｃ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８分取−スケールカラム、６ｍＬ／分  移動相：Ｈ２Ｏ
（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製した。収量０
．７ｍｇ。
【０２０３】
（Ｄ型サンフィリポ症候群（スルファターゼ欠乏症）のための臨床的基質の合
成）
（２４．ｐ−アクリルアミドフェニル−  −Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン−
６−スルフェート（３０））  １００ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）の２０を、１０
ｍＬの乾燥ＤＭＦに、アルゴン雰囲気下で室温で攪拌させながら添加した。８９
ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）の硫黄トリオキシドピリジン錯体を、２ｍＬの乾燥Ｄ
ＭＦ中に溶解し、そして０．７×、１．１×、１．３×および１．９×当量（＋
７００ｍｃＬ、＋４００ｍｃＬ、＋２００ｍｃＬ、および＋６００ｍｃＬ）で反
応物に添加した。反応の進行を、硫酸化剤の各量の添加１時間後に１５ｍｃＬの
溶液を除去することにより、５．２９ｐｐｍから５．２４ｐｐｍへのアノマー（
Ｃ１）プロトン化学シフトの１Ｈ−ＮＭＲシフトによってモニターした。除去し
た混合物を真空遠心分離により乾燥し、ｄ−６ＤＭＳＯに再溶解し、そして分析
した。Ｃ１アノマープロトンの２形態（出発物質およびＣ−６スルフェート）以
上が出現すると、この反応物を−２０℃で取り出し、そして保存した。この生成
物を真空遠心分離により溶媒を除去し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８分
取−スケールカラム、６ｍＬ／分  移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣ
Ｎ（０．０８％ＴＦＡ））により精製した。収率７２％。
【０２０４】
（２５．１８および３０のマイケル付加生成物（３１））
２５ｍｇ（０．０５８ｍｍｏｌ）の３０を、攪拌した８３ｍｇ（０．３５ｍｍ
ｏｌ）の１８（５ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム中）の溶液に、ｐＨ１０．５、
３７℃で添加した。この反応を３日間進行させ、この後、この溶液を希釈トリフ
ルオロ酢酸で中和し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８分取−スケールカラ
ム、６ｍＬ／分  移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％Ｔ
ＦＡ））により精製した。収量１０ｍｇ。
【０２０５】
（２６．４および３１のＳＦＤ基質結合体（３２））
５．７ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）量の４を、１．０ｍＬの無水ＤＭＦ中にア
ルゴン雰囲気下で攪拌しながら溶解した。２０ｍｃＬの乾燥トリエチルアミンを
添加し、続いて５．５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）の１を添加した。活性エステ
ルの形成を、シリカＴＬＣ（５：１ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ、Ｒｆ０．５、ＵＶ
）（空気流でスポットしたＴＬＣプレートを簡単に乾燥する）によりモニターし
た。２５分後、この混合物を１０ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の３１（１ｍＬの
無水ＤＭＦ中）に添加した。２時間後、溶媒を真空遠心分離により除去し、そし
て最終生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８分取−スケールカラム、
６ｍＬ／分  移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ
））により精製した。収量５．４ｍｇ。
【０２０６】
（２７．１，２，１４，１５−オクタジューテロ−１，１５−ジアミノ−５，
８，１１−トリオキサペンタデカン（３３））
ポリエーテルジアミンリンカーの合成、第２生成において参照される。
【０２０７】
（２８．３１の重水素化アナログ（３４））
２５ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）の２０を、攪拌した１００ｍｇ（０．４ｍｍｏ
ｌ）の１１（５ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム中）の溶液に、ｐＨ１０．５、３
７℃で添加した。反応を３日間進行させ、この後、この溶液を希釈トリフルオロ
酢酸で中和し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８分取−スケールカラム、６
ｍＬ／分  移動相：Ｈ２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ）
）により精製した。収量７ｍｇ。
【０２０８】
（２９．ＳＦＤ内部標準結合体（３５））
４ｍｇ（１２．６ｍｃｍｏｌ）量の４を、攪拌しながら無水ＤＭＦ（１ｍＬ）
中に、アルゴン雰囲気下で溶解した。２０ｍｃＬのトリエチルアミンを添加し、
続いて４ｍｇ（１４ｍｃｍｏｌ）の１を添加した。活性エステルの形成は、シリ
カＴＬＣ（５：１ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ、Ｒｆ０．５、ＵＶ）（空気流でスポ
ットしたＴＬＣプレートを簡単に乾燥する）によりモニターした。２０分後、こ
の混合物を７ｍｇ（１１ｍｃｍｏｌ）の３４（１ｍＬの無水ＤＭＦ中）に添加し
た。４時間後、溶媒を真空遠心分離により除去し、そして最終生成物を、逆相Ｈ
ＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ−１８分取−スケールカラム、６ｍＬ／分  移動相：Ｈ
２Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製した。収
量２．７ｍｇ。
【０２０９】
（Ｎ−（ｄ−ビオチニル−サルコシニル）−１２−アミノドデカン酸（３６）
）
化合物４（３２．２ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）を、減圧下（Ｐ２Ｏ５で）で
一晩乾燥した。乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）を添加し、そして混合物を窒素下で溶解に
影響を与えるために加温しながら攪拌した。トリエチルアミン（３４ｍｃＬ）を
添加し、続いて１（２０．４ｍｃＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を２つの１０．２ｍ
ｃＬ部分にわけて、５分の間隔で添加した。この混合物を、１時間室温で、窒素
下で攪拌した。１２−アミノドデカン酸（２４．１ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ、
Ｓｉｇｍａ）を、１度に添加し、そしてこの混合物を、２時間室温で、窒素下で
攪拌した。ＣＨＣｌ３（８０ｍＬ）を添加し、そして有機溶液を、１ＭのＨＣｌ
の２つの１０ｍＬ部分で洗浄した。ＣＨＣｌ３を、ロタリーエバポレーターによ
り取り除いた。この化合物をメタノールに溶解し、そして残渣のＤＭＦを真空遠
心分離によって除去し、そしてＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ、分取カラム
）によって精製した。溶媒プログラムは：０〜１０分（０．０６％のＴＦＡを有
する水）；１０〜５５分（０．０６％のＴＦＡを有する０〜１００％メタノール
）であり、流速が、６ｍＬ／分である。収量３１．７ｍｇ。１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳ
Ｉ−ＭＳ、計算値５１３．４、実測値５３１．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２１０】
（３６のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（３７））
化合物３６（９．８ｍｇ、１９ｍｃｍｏｌ）を窒素下で１００ｍｃＬの乾燥Ｄ
ＭＦ中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．２ｍｇ、１９ｍｃｍｏ
ｌ）を添加し、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド（３．９ｍｇ、１９ｍｃ
ｍｏｌ）を添加した。この混合物を、暗闇で６０時間室温で攪拌した。溶媒を、
真空遠心分離により除去し、そして残渣をＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（１５／１）
〜ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（１２／１）の勾配を用いるシリカゲルのフラッシュ
クロマトグラフィーに供した。収量９．８ｍｇ。１Ｈ−ＮＭＲ。ＥＳＩ−ＭＳ、
計算値６１０．８、実測置６０９．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２１１】
（Ｎ−（Ｎ−（ｄ−ビオチニル−サルコシニル）−１２−アミノドデカノイル
）−プシコシン（ｐｙｓｃｈｏｓｉｎｅ）（３８））
化合物３７（６．２ｍｇ、１０ｍｃｍｏｌ）およびプシコシン（（ｐｙｓｃｈ
ｏｓｉｎｅ）（４．７ｍｇ、１０ｍｃｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ）を窒素下で２００ｍ
ｃＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（５ｍｃＬ）を添
加し、そして、この混合物を、暗闇で２日間窒素下で攪拌した。化合物を直接Ｈ
ＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰセミ−分取）に注入し、そしてこのカラム
を２ｍＬ／分で０〜２０分（０．０６％ＴＦＡを有する水）、次いで２０〜８０
分（０．０６％ＴＦＡを有する０〜１００％のメタノール）で展開した。収量３
．８ｍｇ。１Ｈ−ＮＭＲ。ＥＳＩ−ＭＳ、計算値９５７．３、実測置９５６．８
（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２１２】
（Ｎ−（Ｎ−（ｄ−ビオチニル−サルコシニル）−１２−アミノドデカノイル
）−スフィンゴシルホスホリルコリン（３９））
スフィンゴシルホスホリルコリン（４．０ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を１ｍＬの乾燥
ＤＭＦと共に混合し、そして溶媒を真空遠心分離によって除去した。これをさら
に２回繰り返した。最終の乾燥した残渣の重量は、２．５ｍｇ（５．４ｍｃｍｏ
ｌ）であった。この残渣に、３．３ｍｇの３７（５．４ｍｃＬ）、１５０ｍｃＬ
の乾燥ＤＭＦ、および２．５ｍｃＬのジイソプロピルエチルアミンを添加した。
この混合物を、暗闇で３日間窒素下で攪拌した。化合物を直接ＨＰＬＣカラム（
Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰセミ−分取）に注入し、そしてこのカラムを２ｍＬ／分で
０〜２０分（０．０６％ＴＦＡを有する水）、次いで２０〜８０分（０．０６％
を有する０〜１００％のメタノール）で展開した。収量３．８ｍｇ。１Ｈ−ＮＭ
Ｒ。ＥＳＩ−ＭＳ、計算値９６０．３、実測置９５８．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０２１３】
（１，１３−ジアミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカンとのｄ−ビオチ
ンの結合体（４０））
化合物２を、基本的に３の合成のために記載したように、１，１３−ジアミノ
−４，７，１０−トリオキサトリデカン（Ｆｌｕｋａ）と反応させた。この生成
物を、１．５ｍＬ／分で３０分かけて０．０６％のＴＦＡを有する０〜１００％
のメタノールを使用するＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ、セミ−分取）により
精製した。
【０２１４】
（ヨードアセチル化した４０（４１））
化合物４０を、室温で４時間窒素下で攪拌しながら、５当量のヨード無水酢酸
（Ａｌｄｒｉｃｈ）（乾燥ＤＭＦ中）で処理した。この生成物を、４０について
のようにＨＰＬＣで精製した。この構造は、ＥＳＩ−ＭＳによって同定した。
【０２１５】
（オクタジューテロ化した４１（４２））
この表題化合物を、４０についてのように、１３−ジアミノ−４，７，１０−
トリオキサトリデカンの代わりに９を使用して調製した。
【０２１６】
（オクタジューテロ化した４２（４３））
表題化合物を、４１についてのように、４２から調製した。この構造をＥＳＩ
−ＭＳによって同定した。
【０２１７】
（例示的ＭＳＮ技術および計測）
アミノ酸配列によるタンパク質の同定のための自動化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステ
ムが、開発されている。略図を図７に示す。オートサンプル、ＥＳＩ三重極−四
重極ＭＳ／ＭＳ装置にオンライン接続されたキャピラリーＨＰＬＣシステムおよ
びデータシステムからなる、このシステムを以下の方法で操作する：タンパク質
（典型的に１Ｄまたは２Ｄゲル電気泳動により分離される）を、特定のプロテア
ーゼ（通常、トリプシン）を用いて切断し、得られた切断フラグメントをオート
サンプラーに配置する。３７分おきに、オートサンプラーは、１サンプルをＨＰ
ＬＣシステムに注入し、そしてペプチドはキャピラリー逆相クロマトグラフィー
によって分離される。クロマトグラフィーカラムから分離されたペプチドが溶出
すると、これらのペプチドはＥＳＩプロセスによりイオン化され、ＭＳに入り、
電荷比（ｍ／ｚ）に対する質量が測定される。ペプチドの強度が予め測定した強
度閾値（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超える任意のペプチドイ
オンが、自動的にこの装置によって選択され、不活性ガスを含む衝突セル内で衝
突される。これらの衝突により、主にペプチド骨格の結合でのペプチドフラグメ
ント化（衝突誘発される解離（ＣＩＤ））が生じる。このＣＩＤフラグメントの
質量が測定され、そしてデータシステムに記録される。ペプチドのＣＩＤスペク
トルは、連続ＭＳ／ＭＳスペクトルを有する配列データベースを調査することに
よって、タンパク質を同定する十分な情報を含む。このことは、Ｓｅｑｕｅｎｔ
プログラムで達成される。このプログラムにより、ＣＩＤに対してＭＳで選択さ
れたペプチドと同じ質量を有する配列データベースで各ペプチドを同定し、同重
核の（ｉｓｏｂａｒｉｃ）ペプチドの各々に対するＭＳ／ＭＳスペクトルを予想
する。実験的に測定されたＣＩＤスペクトルを、コンピュータにより得られる理
論的ＣＩＤスペクトルと対応させることで、観測したペプチドが由来するタンパ
ク質を同定する。このシステムにより、十分に自動化した様式で、１サンプル当
たり４０分未満のペースで、タンパク質サンプルを分析することが可能である。
各ペプチドは、独立したタンパク質の同定を意味し、そして通常多種のペプチド
が１種のタンパク質から導かれるので、この方法によるタンパク質の同定は、余
分であり、ゲル中で共遊走する（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｎｇ）タンパク質に対し
て寛容である。このシステムは、ペプチド鎖の修飾された残基の検出および特徴
づけのために十分に適している。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術および得られたＣＩＤス
ペクトルの自動化分析は、本発明の方法のために使用され得る。
【０２１８】
（固相抽出キャピラリー電気泳動タンデム質量スペクトル（ＳＰＥ−ＣＥ−Ｍ
Ｓ／ＭＳ）によるサブ−フェムトモル感度でのタンパク質の同定）
この方法によるタンパク質の同定は、ペプチドの分離およびイオン化が著しく
高感度で実施されることを除いて、上記と同じ原理に基づく。図８は、キーとな
るデザイン要素の略図を示す。このシステムのデザインおよび操作の方法は公表
される。タンパク質消化物から誘導されるペプチドは、ＳＰＥにより濃縮され、
ＣＥにより分離され、そしてＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより分析される。得られる連
続ＣＩＤスペクトルを使用して、Ｓｅｑｕｅｓｔソフトウエアシステムで配列デ
ータベースを調査した。ＳＰＥ抽出デバイスは、融合したシリカ分離キャピラリ
ーに直接パックされた寸法０．１８×１ｍｍの小さな逆相クロマトグラフィーカ
ラムである。サンプル溶液中に含まれるペプチドは、ＳＰＥデバイスにおいて吸
着され、濃縮され、見積もられた１００〜３００ｎｌの有機溶媒で溶出され、そ
して５〜３０ｎｌの見積り体積まで電気泳動スタッキングおよび／または等速電
気泳動によりさらに濃縮される。次いで、これらのペプチドは、ＣＥにより２０
μｍまたは５０μｍのｉ．ｄ．キャピラリーにより分離され、ペプチドがキャピ
ラリーを離れるとき直接ＥＳＩによりイオン化される（このミクロスプレイイオ
ン化源のデザインについては参照文献１３を参照のこと）。このシステムを用い
て、ペプチドの質量を、６６０アットモル（ａｔｔｏｍｏｌｅ）（２０個の残基
ペプチドに対して約５００ｆｇ）の感度で、３３ａｍｏｌ／μｌの濃度限度で測
定され得、そしてこのタンパク質は、３００ａｍｏｌ／μｌ未満の濃度限度で１
０ｆｍｏｌ（５０ｋＤａのタンパク質につき０．５ｎｇ）未満の自動的に選択し
たペプチドのＣＩＤスペクトルにより同定され得る。この技術は、実験により得
られるペプチドの非常に高感度の分析のために使用される。自動化ＣＩＤ実験に
利用可能な分析時間が、ＣＥ電圧のデータ依存性調節により十分に延ばされ得る
ことも実証されている。いくつかのペプチドイオンが同時にＭＳで検出される場
合、このＣＥ電圧は、自動的にドロップされる。このことで、キャピラリーの電
気浸透流が減少し、これによりペプチドイオンをＣＩＤ用に選択するための利用
可能な時間の延長する結果となる。このピークパーキング（ｐｅａｋ  ｐａｒｋ
ｉｎｇ）技術の正味の効果は、技術の動的範囲の延長である。なぜなら、この利
用可能な増加した時間が、低イオン電流を有するイオンのＣＩＤに使用されるか
らである。いったん、全てのペプチドイオンが分析されると、ＣＥ電圧が元々の
値まで増加することによって、電気泳動が自動的に再加速される。
【０２１９】
表１．  α−ラクトアルブミン存在率の相対的な、余剰の定量（システインが
重い同位体のビオチン化剤により修飾された既知量の同じタンパク質との混合後
）
【０２２０】
【表１】
2006184290.tif 000007
ａ  ４−ペプチドでは、重イオンと軽イオンとの２ａｍｕのみの差に起因して、
同位体パターンが高度にオーバーラップしたため、同位体比を分析しなかった。
【０２２１】
表２．  単一の分析におけるタンパク質混合物の成分の、配列同定および定量
【０２２２】
【表２】
2006184290.tif 000008
＊  遺伝子名は、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ命名法に従う（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．
ｃｈ）。
†  各ペプチドについて、図３に示すように、比を計算した。
＝  予測した比を、各混合物に存在する既知量のタンパク質から計算した。
＃  ＩＣＡＴ標識化システイニル残基。
【０２２３】
表３．  炭素源としてガラクトースまたはエタノール上で増殖するイーストか
らの、タンパク質プロフィール。
【０２２４】
【表３】
2006184290.tif 000009
＊  遺伝子名は、Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＹＰＤ）
に従う（１９）。
＃  システイニル残基はＩＣＡＴ標識化される。
†  タンパク質発現比を、図３に記載のように計算した。
＝  イースト増殖のための炭素源は、２％エタノール（Ｅｔｈ）または２％ガラ
クトース（ＧＡＬ）であった。
§  遺伝子は、ガラクトースまたはグルコースにより抑圧されることが公知であ
る（１９）。
¶  他の８つのリボソームタンパク質を、類似の遺伝子発現レベルで検出した。
【０２２５】
【表４】
2006184290.tif 000010
2006184290.tif 000011
2006184290.tif 000012
2006184290.tif 000013
2006184290.tif 000014
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2006184290.tif 000019
2006184290.tif 000020
表５．プロトン化およびナトリウム化（ｓｏｄｉａｔｅｄ）基質結合体、生成物
、およびＣＤＧＳ酵素に対する内部標準の、分子量
【０２２６】
【表５】
2006184290.tif 000021
ａ  ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−マンノース−（マンノース−ＧｌｕＮＡｃ）
２残基を含むＣｌｃＮＡｃ−Ｔ  ＩＩ生成物および内部標準について算出した。
【０２２７】
【化５】
2006184290.tif 000022
【０２２８】
【化６】
2006184290.tif 000023
【０２２９】
【化７】
2006184290.tif 000024
【０２３０】
【化８】
2006184290.tif 000025
【０２３１】
【化９】
2006184290.tif 000026
【０２３２】
【化１０】
2006184290.tif 000027
【０２３３】
【化１１】
2006184290.tif 000028
【０２３４】
【化１２】
2006184290.tif 000029
【０２３５】
【化１３】
2006184290.tif 000030
【０２３６】
【化１４】
2006184290.tif 000031
【０２３７】
【化１５】
2006184290.tif 000032
【０２３８】
【化１６】
2006184290.tif 000033
【０２３９】
【化１７】
2006184290.tif 000034
【０２４０】
【化１８】
2006184290.tif 000035
【０２４１】
【化１９】
2006184290.tif 000036
【０２４２】
【化２０】
2006184290.tif 000037
【０２４３】
【化２１】
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【０２４４】
【化２２】
2006184290.tif 000039
【０２４５】
【化２３】
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【０２４６】
【化２４】
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【０２４７】
【化２５】
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【０２４８】
【化２６】
2006184290.tif 000043
【０２４９】
【表６】
2006184290.tif 000044
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2006184290.tif 000046
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タンパク質の混合物中のタンパク質またはタンパク質機能の迅速な定量的分析
のための、分析試薬およびこれらの試薬を使用する質量分析計に基づく方法。本
方法は、３つの部分：リンカー基（Ｌ）を介してタンパク質反応基（ＰＲＧ）に
共有結合した親和性標識（Ａ）を有する親和性標識タンパク質反応試薬を使用す
る。このリンカーは例えば、そのリンカー中の１つまたはそれ以上の原子をそれ
らの安定な同位体と置換することによって差次的に同位体的に標識され得る。こ
れらの試薬は、複合混合物からのペプチドフラグメントまたは所定のタンパク質
との反応の生成物（例えば、酵素反応の生成物）の選択的単離を可能にする。単
離されたペプチドフラグメントまたは反応生成物は、それらの混合物中のタンパ
ク質の存在またはタンパク質機能の存在を特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１Ａ】図１Ａは、同位体的に軽い（１４５７．９ｕ）および重い（１４６１．８）ビオチン化試薬で改変したペプチドの［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンの４ａｍｕ同位体分布を示すイオン捕捉質量分析計からのズームスキャンを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、同位体的に重い試薬で標識した既知の量のペプチドの存在下で測定した５つの異なる濃度のｄ０標識ペプチドのズームスキャンからの同位体比の分析から得た曲線を示す。
【図２】図２は、α−ラクトアルブミンからのシステイン修飾ペプチドのタンデム型質量スペクトルを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、単一のペプチド対について、ＭＳモードで操作した質量分析計の単回スキャンを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、単一のペプチド対について、それぞれ９９３．８および９７７．７のｍ／ｚ比を有する、イオン対の周囲の質量スペクトルの拡大図を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、９９３．８および９７７．７のｍ／ｚ比を有する、イオン対について再構成されたイオンクロマトグラムを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｍ／ｚ＝９９８を有するペプチドイオンから記録されたＣＩＤスペクトルを示す
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４ＡのＣＩＤスペクトルとともに行ったデータベース検索の結果を示す。これによって、タンパク質をグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（これは、タンパク質の混合物の１メンバーであった）と同定した。
【図５Ａ】図５Ａは、酵母におけるイソチームのアルコールデヒドロゲナーゼファミリーが、六炭糖（ＡＤＨ１）およびエタノール（ＡＤＨ２）のいずれも増殖を促進し、遺伝子ＡＤＨ２が、ともにグルコース抑制され、そしてガラクトース抑制され、ＴＣＡサイクルに入るアセトアルデヒドへとそれを転換することによって酵母細胞がエタノールで完全に増殖することを可能とする酵素をコードし、糖存在下、ＡＤＨ１が、アセトアルデヒドをエタノールへと変換する、その逆反応を実施することを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＤＨ１ペプチドの質量分析結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＡＤＨ２ペプチドの質量分析結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ブランクのＥＳＩ−ＭＳスペクトルであり、これは試薬１および２（ｍ／ｚ８４３および８４０）からの（Ｍ＋Ｈ）＋イオンのピーク、内部標準５および６（ｍ／ｚ６８９および６４１）のピーク、および微量の産物３および４（ｍ／ｚ６８１および６３７）のピークを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、健康な個体由来の細胞ホモジネートと共にインキュベートしたサンプルのＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示し、ｍ／ｚ６８１において、β−ガラクトシダーゼ産物、そしてｍ／ｚ６３７においてＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ産物をはっきりと示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、β−ガラクトシダーゼ欠乏症の２人の患者由来の細胞を使用した場合のＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示し、ブランクレベル（０．９±０．９および０．８±０．６ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ）より上の酵素産物は、ほんのわずかしか観察されず、一方、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性は、はっきりと検出されることがわかる。
【図７】図７は、自動化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムの概略図である。
【図８】図８は、ＳＰＥ−ＣＥ−ＭＳ／ＭＳシステムの概略図である。
【図１Ａ】
2006184290.tif 000049
【図１Ｂ】
2006184290.tif 000050
【図２】
2006184290.tif 000051
【図３Ａ】
2006184290.tif 000052
【図３Ｂ】
2006184290.tif 000053
【図３Ｃ】
2006184290.tif 000054
【図４Ａ】
2006184290.tif 000055
【図４Ｂ】
2006184290.tif 000056
【図５Ａ】
2006184290.tif 000057
【図５Ｂ】
2006184290.tif 000058
【図５Ｃ】
2006184290.tif 000059
【図６Ａ】
2006184290.tif 000060
【図６Ｂ】
2006184290.tif 000061
【図６Ｃ】
2006184290.tif 000062
【図７】
2006184290.tif 000063
【図８】
2006184290.tif 000064