(57)【要約】      （修正有）【課題】  バチルス属細菌において、胞子形成関連遺伝子を解明し、胞子関連遺伝子の削除、不活性化あるいは強化することで、工業的生産に有利な宿主菌を提供する。【解決手段】  以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供する。  （ａ）ＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。  （ｂ）上記該ポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つそれぞれ該ポリヌクレオチドと機能的に等価であるポリヌクレオチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１または２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１または２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つそれぞれＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチド。
（ａ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つそれぞれＳｉｇＥまたはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるポリペプチド。
（ｃ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つそれぞれＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子が改変された微生物。
【請求項４】
請求項１記載の遺伝子の機能が欠損した微生物。
【請求項５】
請求項１記載の遺伝子の発現産物であるＲＮＡの発現量または請求項２記載のポリペプチドの発現量が低下している、または請求項１記載の遺伝子の発現産物であるＲＮＡまたは請求項２記載のポリペプチドが発現しない請求項３または４記載の微生物。
【請求項６】
胞子形成能に欠損がある請求項３〜５のいずれか１項記載の微生物。
【請求項７】
微生物がバチルス属細菌である請求項３〜６のいずれか１項記載の微生物。
【請求項８】
バチルス属細菌がバチルス  エスピー KSM-KP43（FERM BP-6532）、バチルス  エスピー KSM-KP1086（FERM P-15864）、バチルス  エスピーKSM-KP1790（FERM BP-6533）、バチルス  エスピー  KSM-KP9860 (FERM BP-6534)またはバチルス  エスピー  KSM-9865 (FERM P-18566)である請求項７項記載のバチルス属細菌。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれか１項記載の微生物を用いることを特徴とするタンパク質またはポリペプチドの生産方法。
【請求項１０】
生産するタンパク質が、以下の（１）から（３）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子によってコードされるアルカリプロテアーゼである請求項９記載の生産方法。
（１）配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列番号３３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（３）配列番号３３で示される塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加され、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は胞子形成関連遺伝子およびこれを改変させた微生物を用いたタンパク質等の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が挙げられる（特許文献１）。最近では、遺伝子組換え技術を用いたより効率的な生産が行われるようになっており、さらに高生産させるための宿主微生物の開発が進められている。また、一部の微生物においては染色体の全塩基配列の決定がなされ、その情報をもとに菌株の改良が成されている。
【０００３】
バチルス属細菌は有用物質の工業生産用の宿主として好適に用いられている。しかし、バチルス属細菌は胞子を形成するために、バチルス属細菌を遺伝子組換えの宿主菌とした有用物質の生産では、培養終了後に高濃度の殺菌剤、高温条件、高アルカリ性条件下などの組み合わせによる滅菌処理を要し、また、宿主菌の系外への漏洩阻止の為に多段階の防止設備が必要とされる。そのため、胞子形成関連遺伝子を解明し、胞子形成能をもたないバチルス属細菌の取得が重要な課題となっており、これまでに、一部のバチルス属細菌においては、胞子を形成することができない宿主菌株を用いるタンパク質の生産（特許文献２）、胞子形成にかかわるｓｉｇＧ遺伝子の一部を欠損させた枯草菌による非胞子生産（特許文献３）などが報告されている。また、バチルス属細菌は胞子形成することが知られており、胞子は通常の細胞に比べて安定であることから、この胞子形成と通常用いられている保存条件との組み合わせで、より確実な菌株保存が期待される。しかし、胞子形成能が低い菌株においては、組み合わせ効果は期待できず、より確実に保存できる微生物が求められている。
【０００４】
しかしながら、その他の多くのバチルス属細菌は、そのゲノム配列が解明されておらず、上記のような胞子形成関連遺伝子に対応する遺伝子の存在は確認されていなかった。さらにまた、既知の当該胞子形成関連遺伝子間の保存性に幅があることから、その他の菌において対応する遺伝子配列を予測することも困難であった。
【特許文献１】特表平１１−５０９０９６号公報
【特許文献２】国際公開第０３／０４０３５２号パンフレット
【特許文献３】特許第３４９０４３５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ゲノム配列が解明されていないバチルス属細菌において、未知の胞子形成関連遺伝子を見出し、そして、その遺伝子を削除、不活性化あるいは強化等した組換え微生物を作製し、工業的生産または保存に有利な宿主菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、各種胞子形成関連タンパク質の配列情報をもとにプライマーをデザインし、ゲノム配列が未知のバチルス属細菌より胞子形成関連タンパク質であるＳｉｇＥおよびＳｉｇＧをコードする新規遺伝子をクローニングすることに成功した。そして、当該遺伝子の機能を欠損させた微生物が胞子形成能に欠損を有するため容易に滅菌でき、タンパク質生産のための宿主として有用であることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号１または２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１または２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つそれぞれＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０００８】
また、本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドを提供するものである。
（ａ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つそれぞれＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるポリペプチド。
（ｃ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つそれぞれＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるポリペプチド。
【０００９】
さらにまた、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む遺伝子が改変された微生物を提供するものである。
【００１０】
さらにまた、本発明は、上記遺伝子の機能が欠損した微生物を提供するものである。
【００１１】
さらにまた、本発明は、上記の微生物を用いることを特徴とするタンパク質またはポリペプチドの生産方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子を削除した組換え微生物を用いれば、胞子が形成されないことから、目的のタンパク質を生産した後に、容易に滅菌できる宿主菌が提供される。また、本発明の遺伝子を強化した組み換え微生物を用いることにより、保存安定性に優れた宿主菌が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の配列番号１または２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、実施例１〜３に示すように、各種胞子形成関連タンパク質の配列情報をもとに縮重プライマーをデザインし、配列が未知のバチルス属細菌よりクローニングされたものである。当該ポリヌクレオチドは、配列が公知のバチルス属細菌との相同性比較から、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドはｓｉｇＥ遺伝子であり、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドはｓｉｇＧ遺伝子であり、それぞれ、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＳｉｇＥポリペプチド、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるＳｉｇＧポリペプチドをコードするものである。
【００１４】
ｓｉｇＥ遺伝子およびｓｉｇＧ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットの一員であるシグマ因子をコードする遺伝子であることが知られている。ＲＮＡポリメラーゼはシグマ因子が置き換わることで、その認識する配列を変化させることが知られている。
【００１５】
本発明の遺伝子は、上記のａ）配列番号１または２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであるのが好ましいが、（ｂ）配列番号１または２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つそれぞれＳｉｇＥまたはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドと考えられ、本発明の遺伝子に包含される（以下、これらを「ｓｉｇＥ遺伝子」、「ｓｉｇＧ遺伝子」という）。
【００１６】
ここで、８０％以上の同一性うち、９０％以上の同一性が好ましく、９５％以上の同一性がより好ましく、９８％以上の同一性がさらに好ましい。
【００１７】
塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 227, 1435, (1985)）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発)のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to complete(ktup)を２として解析を行うことにより計算される。
【００１８】
上記および本明細書の以下において「ＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と機能的に等価である」とは、ＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質と実質的に類似する活性を示すことをいう。ＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質が有する活性としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットの一つとしての機能が挙げられ、また、適当な方法を用いれば、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子が削除されたバチルス属細菌の胞子形成能における欠損を、抑圧することができる機能などが挙げられる。ここで、適当な方法としては、当該ポリペプチドを適当な発現ベクターを用いて、当該細菌内に適量発現させる方法が挙げられる。上記の実質的に類似とは、ＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質が有する機能の大部分を保持していることを意味し、必ずしも全ての機能を保持することを意味しない。
【００１９】
なお、このポリペプチドをコードする遺伝子には、その両端に遺伝子調節配列などが付加されることが可能である。ここで、遺伝子調節配列としては、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、アクチベーター配列、リプレッサー配列等が挙げられる。
【００２０】
上述のような本発明の遺伝子は、それぞれ化学合成によって、または標準的なクローニングおよびスクリーニングにより得ることができ、例えば、クローニングされたＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイズさせることによって、取得することもできる。ここで、ＰＣＲ法に用いるプライマーの設計としては、例えば、枯草菌、バチルス  ハロデュランス、クロストリジウムパーフリンゲンス、クロストリジウム  アセトブチリカム等のｓｉｇＥまたはｓｉｇＧの相同性領域からミックスプライマーを構築することにより行うことができる。ＤＮＡライブラリー等が由来する生物は、限定されるものではないが、バチルス属細菌であることが好ましく、バチルス属細菌としては、バチルス  エスピー KSM-KP43（FERM BP-6532）、バチルス  エスピー KSM-KP1086（FERM P-15864）、バチルス  エスピーKSM-KP1790（FERM BP-6533）、バチルス  エスピー  KSM-KP9860 (FERM BP-6534) 、 バチルス  エスピー  KSM-9865 (FERM P-18566)株が最も好ましい。
【００２１】
配列番号１または２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５（FERM P-18566）から抽出したＤＮＡを鋳型として、配列番号２２および２４または２５および２６に示される塩基配列からなるセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲによって目的のＤＮＡ断片を増幅することにより、各々取得することができる。また、配列番号１３および１２に示される塩基配列からなるセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲによって目的のＤＮＡ断片を増幅することにより、配列番号１及び２に記載のＤＮＡを一度に取得することもできる。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、ａ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるのが好ましいが、ｂ）配列番号３または４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つそれぞれ配列番号３または４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドもまた本発明のポリペプチドに包含される。
ここで、配列番号３または４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号３または４のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然として配列番号３または４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に等価である配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２３】
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、自然界から取得すること以外にも部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（タカラ）]等を用いて変異を導入し調製することができる。
また、本発明においては、ｃ）配列番号３または４に示すアミノ酸配列において、相当する配列を適切にアライメントした時、９５％以上の同一性を有するポリペプチドであって、且つそれぞれ配列番号３または４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に等価であるポリペプチドを包含するものである。ここで、当該同一性は、好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上であることが望ましい。
【００２４】
ここにおいて、アミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 227, 1435, (1985)）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発)のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to complete(ktup)を２として解析を行うことにより計算される。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、その機能を失わない限り、「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。また、その機能を失わない限り、当該ポリペプチドには追加のアミノ酸配列の付加が可能であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などがある。
【００２６】
本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができ、たとえば、天然に存在するポリペプチドを単離する方法、組換え的な生産方法、合成的な製造方法、またはこれらの方法の組合せた方法により製造することができる。
【００２７】
本発明の（ａ）または（ｂ）で示されるポリヌクレオチドを含む遺伝子が改変された微生物を作製することにより、胞子形成能が改変された微生物を提供することができる。ここで、（ａ）または（ｂ）で示されるポリヌクレオチドを含む遺伝子とは、（ａ）または（ｂ）で示されるポリヌクレオチド、および遺伝子調節機能を発揮しうるポリヌクレオチドからなる遺伝子をいい、具体的には、ｓｉｇＥ遺伝子領域及びｓｉｇＥ遺伝子のプロモーター領域からなる遺伝子や、ｓｉｇＧ遺伝子領域、ｓｉｇＧ遺伝子のプロモーター領域及びｓｉｇＧ遺伝子のターミネーター領域からなる遺伝子が挙げられる。ｓｉｇＥ遺伝子のプロモーター領域としては、例えば、その上流の遺伝子であるｓｐｏＩＩＧＡのプロモーターを用いることができる。また、遺伝子が改変された微生物とは、遺伝子の一部または全部を利用し加工することで、本来のものとは異なることとなった微生物をいう。ここで、本来のものと異なることとは、適当な対照と比較して、好ましくは加工前の微生物と比較して異なることをいい、異なることとしては、例えば、有しているＤＮＡの配列が異なること、胞子形成能に欠損があること、胞子の保存安定性が優れていることなどが挙げられるが、滅菌容易化の観点からは、胞子形成能に欠損があることが好ましい。
【００２８】
ここで、遺伝子を利用し加工することは、例えば、（１）遺伝子に計画的にまたはランダムに変異を導入すること、または（２）遺伝子由来の断片を導入することにより行うことができる。
【００２９】
（１）遺伝子への変異の導入としては、例えば、１または複数個の塩基を削除、置換、若しくは挿入すること、遺伝子領域の全部を削除すること、遺伝子の一部領域を削除することが挙げられる。ここで、１または複数個の塩基を削除、置換、若しくは挿入としては、例えば、１または数個の塩基の置換および／または削除によりコドンの読み枠をずらすこと、遺伝子の一部領域への任意の配列の導入によりコドンの読み枠をずらすことが挙げられる。また上記の削除する一部領域としては、遺伝子の機能が欠損した微生物を作製する観点からは、ＯＲＦ領域の全部または一部、プロモーター領域の全部または一部が好ましく、ＯＲＦ領域の全部がさらに好ましい。なお、ランダムに変異を導入した場合、遺伝子の機能の適当な方法による確認を合わせて行うことが好ましい。
【００３０】
（２）上記の遺伝子由来の断片とは、当該遺伝子をもとに作製されうる断片をいい、例えば、遺伝子全長を含む断片、遺伝子の一部を含む断片、および遺伝子に変異を導入した断片が挙げられる。ここで、断片には、プロモーター等の配列を含めることが可能であり、プロモーターとしては、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子のプロモーター、またはその他の公知のプロモーターが挙げられる。また上記の変異としては、天然に存在するアレル変異、天然に存在しない変異、または、改変（欠失、置換、付加および挿入）のなされた変異が挙げられ、具体的には、実質的に遺伝子の機能を抑制する変異、および遺伝子の機能を強化する変異が挙げられるが、遺伝子の機能を欠損させ、滅菌が容易な微生物を提供する観点からは、抑制する変異が好ましい。
【００３１】
また、上記の当該遺伝子をもとに作製されうる断片とは、当該遺伝子の塩基配列を参酌することにより公知の方法により作製することが可能な断片をいうが、計画的に作製された断片に限定されず、意図せずに取得された断片であってもよい。ここでの断片としては、例えば、ｓｉｇＧ遺伝子を含む断片、またはｓｉｇＧ遺伝子のプロモーターを含む断片が挙げられる。ｓｉｇＧ遺伝子のプロモーターは、胞子形成期に機能しうるプロモーターであるため、例えば、生産目的のタンパク質をコードする他の遺伝子の本来のプロモーターと置換して用いることにより、当該タンパク質の生産時期を調節することができる。
【００３２】
また、遺伝子断片の導入としては、例えば、相同組換えにより宿主の染色体上の本来の位置とは異なる位置への導入すること、またはプラスミドへの導入したのち、当該プラスミドを公知の形質転換法により宿主に保持させることが挙げられる。
【００３３】
上記変異の導入または断片の導入は、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の塩基配列、またはそれらに隣接する領域の塩基配列を参酌することにより、例えば、ＰＣＲ法、制限酵素を用いた方法、変異原を用いる方法、相同組換えを利用した方法等の公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００３４】
たとえば、ｓｉｇＥまたはｓｉｇＧ遺伝子を削除または不活性化した微生物の作製は、相同組換えによる方法を用いて行うことができる。すなわち、当該遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することにより行うことができる。或いは、塩基置換や塩基挿入等による不活性化変異を導入した当該遺伝子、または当該遺伝子の外側領域を含むが当該遺伝子は含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの当該遺伝子外側の２ヶ所の領域で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を削除或いは不活性化した遺伝子断片と置換することにより行うことができる。
【００３５】
また、機能を獲得したｓｉｇＥまたはｓｉｇＧ遺伝子を有する微生物の作製は、相同組換えによる方法を用いて行うことができる。すなわち、公知の強力なプロモーターの両端にｓｉｇＧ遺伝子のプロモーターの一部を付加して作製したＤＮＡ断片を宿主微生物にとりこませると、ｓｉｇＧ遺伝子プロモーターにおける相同組換えがおこる。これにより、宿主微生物のｓｉｇＧプロモーターを強力なプロモーターに置換させることができる。そして、これによりｓｉｇＧ遺伝子の発現量が多い微生物を得ることができる。
【００３６】
またｓｉｇＧ遺伝子のコピー数の多い微生物の作製は、相同組換えによって、標的遺伝子の一部領域と、ｓｉｇＧ遺伝子とを置換することにより作製することができる。すなわち、ｓｉｇＧ遺伝子の全長の両端に標的遺伝子としてのその他の遺伝子における配列の一部を付加した断片を含むプラスミドを作製し、これを宿主微生物内に取り込ませ、宿主内の標的遺伝子の一部領域において相同組換えを起こさせることによって、標的遺伝子の一部とｓｉｇＧ遺伝子が置換された宿主を作製することができる。
【００３７】
また、ｓｉｇＧ遺伝子の機能が強化された微生物の作製は、相同組換えを用いた方法により行うことができる。すなわち、宿主にとって有利な機能を新たに獲得したｓｉｇＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主に導入し、相同組換えにより標的遺伝子と置換させることにより、ｓｉｇＧ遺伝子の機能が強化された微生物を作製することができる。宿主にとって有利な機能を新たに獲得したｓｉｇＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片の取得は、公知の方法によりランダムに変異を導入したｓｉｇＧ遺伝子を多種類含む集団の中から、機能を獲得したものを得る適当なスクリーニングをすることにより行うことができる。
【００３８】
上記方法により遺伝子が改変された微生物としては、例えば、（Ａ）ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の機能が欠損した微生物、（Ｂ）ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の機能が強化された微生物が挙げられるが、滅菌容易性の観点からは、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の機能が欠損した微生物が好ましく、ｓｉｇＧ遺伝子の機能が欠損した微生物がより好ましく、保存安定性の観点からは、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の機能が強化された微生物が好ましく、ｓｉｇＧ遺伝子の機能が強化された微生物がより好ましい。
【００３９】
（Ａ）ここで、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の機能が欠損した微生物には、例えば、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の発現産物の発現量が低下している微生物、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子が発現しない微生物、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の発現産物の発現が検出されない微生物、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の発現産物であるｍＲＮＡの安定性が低下している微生物、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の発現産物であるタンパク質が野生型タンパク質を有する活性の全部または一部を欠損している微生物、トランケート型のＳｉｇＥタンパク質またはＳｉｇＧタンパク質のみを発現する微生物などが挙げられるが、滅菌容易性の観点からは、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子が発現しない微生物、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の発現産物の発現が検出されない微生物、またはｓｉｇＧ遺伝子が全長にわたって削除された微生物が好ましく、ｓｉｇＧ遺伝子のＯＲＦの全長が削除された微生物がより好ましい。また、ｓｉｇＧ遺伝子のＯＲＦの全長が削除された微生物の由来の株としては、バチルス  エスピー  KSM-9865株が好ましい。
【００４０】
なお、遺伝子の機能が欠損した微生物の作製は、前述のように公知の工学的な手法を用いて、遺伝子を改変することにより行うことができるのみならず、自然界にある微生物から公知の方法により単離することにより行うこともできる。ここで単離は、例えば、自然界に存在する微生物から、適当なスクリーニング方法により胞子形成能に欠損を有する微生物を獲得し、その微生物における当該遺伝子配列などを調べる、または公知の遺伝学的手法を用いて検討する等の方法により、胞子形成能の欠損がｓｉｇＥまたはｓｉｇＧ遺伝子の欠損に起因することを確かめることによって行うことができる。
【００４１】
（Ｂ）遺伝子の機能が強化された微生物としては、例えば、当該遺伝子の発現量が増大している微生物、当該遺伝子の発現産物であるタンパク質が野生型タンパク質の有しない活性を有する微生物が挙げられるが、微生物の保存安定性の観点からであれば、対照となる微生物に比較して、ｓｉｇＥ遺伝子またはｓｉｇＧ遺伝子の発現産物であるタンパク質またはｍＲＮＡの発現量が増加している微生物が好ましく、ｓｉｇＥ遺伝子を２つ有する微生物、またはｓｉｇＧ遺伝子を２つ有する微生物がより好ましい。
【００４２】
また、上記方法により遺伝子が改変された微生物としては、例えば、対照となる微生物に比較して、胞子形成能に欠損がある微生物、胞子の安定性が優れた微生物が挙げられるが、滅菌容易性の観点からは、対照となる微生物に比較して、胞子形成能に欠損がある微生物が好ましい。胞子形成能における欠損がある微生物としては、胞子形成効率における異常がある微生物、胞子生存率における異常がある微生物が挙げられるが、滅菌容易性の観点からは、胞子形成効率における低下がある微生物が好ましく、胞子を全く形成しない微生物がより好ましい。
【００４３】
また、上記方法により遺伝子が改変された微生物としては、復帰変異等が起こらないため、ｓｉｇＧ遺伝子の全長が除去された微生物が好ましく、ｓｉｇＧ遺伝子の全長が除去された微生物の由来の株としては、バチルス  エスピー  KSM-9865株が好ましい。
【００４４】
本発明の微生物としては、あらゆる微生物由来のものを含むが、バチルス属細菌由来のものが好ましい。ここで、バチルス属細菌としては、バチルス  エスピー KSM-KP43（FERM BP-6532）、バチルス  エスピー KSM-KP1086（FERM P-15864）、バチルス  エスピー  KSM-KP1790（FERM BP-6533）、バチルス  エスピー KSM-KP9860 (FERM BP-6534) 、またはバチルス  エスピー KSM-9865 (FERM P-18566)株が好ましい。
【００４５】
ｓｉｇＥまたはｓｉｇＧ遺伝子の機能に欠損を有し胞子形成能に欠損がある微生物は、胞子の失活のために必要であった高濃度の殺菌剤、恒温条件、高アルカリ性条件などの厳しい滅菌処理条件を緩和した条件下で、滅菌処理を行うことができる。また、ｓｉｇＧ遺伝子のＯＲＦの全長が削除された微生物は、復帰変異等が起こらないためさらに有利である。
【００４６】
したがって、当該微生物を用いることによりタンパク質、またはポリペプチドを効率よく生産することができる。当該タンパク質等の生産は、本発明の微生物を公知の方法により培養し、培養物から公知の方法によりタンパク質等を抽出することにより行うことができる。ここで、当該微生物には、目的物を発現させるためのＤＮＡ、好ましくは目的物を発現させるためのプラスミドＤＮＡを有していることが好ましい。また、生産する目的物としては、バチルス属細菌由来のものに限定されず、あらゆる生物由来のものでかまわないが、プロテアーゼであることが好ましい。プロテアーゼとしては、例えば、特開２００４−１５４００６号公報記載のプロテアーゼが挙げられる。特開２００４−１５４００６号公報記載のプロテアーゼとしては、例えば、配列番号３３〜３６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子によってコードされるアルカリプロテアーゼタンパク質や、これらと等価なタンパク質が挙げられるが、配列番号３３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子によってコードされるバチルス  エスピー  ＫＰ−４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼが好ましい。ここで、等価なタンパク質としては、例えば、配列番号３３〜３６、好ましくは配列番号３３で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列や、配列番号３３〜３６、好ましくは配列番号３３で示される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加され、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子によってコードされるタンパク質が挙げられる。
【実施例】
【００４７】
実施例１  胞子形成関連タンパク質中の高度保存領域の探索
インターネット（www.genome.ad.jp/kegg/）上で公開されているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ，Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，  Ｃ．  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のＳｉｇＥおよびＳｉｇＧアミノ酸配列を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウエア開発、ｖｅｒ５）を用いて相同性検索を行った。見出された相同性領域を基にプライマー１（配列番号５）、プライマー２（配列番号６）、プライマー３（配列番号７）、プライマー４（配列番号８）をデザインした。
【００４８】
実施例２  バチルス属における胞子形成関連遺伝子の探索および塩基配列の決定
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５（FERM P-18566）からＧｅｎトルくん（タカラバイオ）を用いて抽出したＤＮＡを鋳型とし、プライマー３とプライマー４を用いて、ゲノム上のｓｉｇＧ遺伝子内部の約０．６ｋｂ断片をＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲはTaKaRa LA Taq（タカラバイオ）を用いて行い、反応は、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃３０秒間、７２℃１分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃２分間保温した。増幅したＤＮＡ断片のシーケンスをプライマー３とプライマー４を用いて行い、本菌株のｓｉｇＧ遺伝子部分配列情報を取得した。得られた配列を基にプライマーを構築し、インバースＰＣＲによりｓｉｇＧ遺伝子を含む配列７７７ｂｐを決定した。次に上記と同様にバチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー１とプライマー２を用いて、ゲノム上のｓｉｇＥ遺伝子内部の約０．４ｋｂ断片をＰＣＲにより増幅させた。増幅したＤＮＡ断片のシーケンスをプライマー１とプライマー２を用いて行い、本菌株のｓｉｇＥ遺伝子部分配列情報を取得した。得られた配列を基にプライマーを構築し、インバースＰＣＲによりｓｉｇＥ遺伝子を含む配列７１７ｂｐを決定した。さらにバチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、インバースＰＣＲを行い、ｓｉｇＧ遺伝子およびｓｉｇＥ遺伝子近傍の遺伝子情報を取得した。その結果、ｓｉｇＧ遺伝子およびｓｉｇＥ両遺伝子を含む配列約６ｋｂを決定した。
【００４９】
実施例３  胞子形成関連遺伝子削除株作製に用いるＤＮＡ断片の単離
実施例１で決定した塩基配列を基に、ｓｉｇＧ遺伝子約１．１ｋｂ上流配列、約１．１ｋｂ下流配列からプライマー５（配列番号９）およびプライマー８（配列番号１２）を、ｓｉｇＧ遺伝子上流と下流を直接繋げるようにプライマー６（配列番号１０）およびプライマー７（配列番号１１）をデザインした。ＫＳＭ−９８６５株から抽出したＤＮＡを鋳型とし、プライマー５とプライマー６およびプライマー７とプライマー８の組み合わせにより、ｓｉｇＧ遺伝子上流および下流領域各々約１．１ｋｂ断片を増幅させた。増幅した上流および下流のＤＮＡ断片の精製を行い、両断片を用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行い、更に引き続きプライマー５とプライマー８を添加したＰＣＲを行い、ゲノム上のｓｉｇＧ遺伝子上下流を結合させた約２．２ｋｂ断片を取得した。また、ｓｉｇＥ遺伝子約１．１ｋｂ上流配列、約１．１ｋｂ下流配列からプライマー９（配列番号１３）およびプライマー１２（配列番号１６）を、ｓｉｇＥ遺伝子上流と下流を直接繋げるようにプライマー１０（配列番号１４）およびプライマー１１（配列番号１５）をデザインし、ｓｉｇＥ遺伝子上流および下流領域各々約１．１ｋｂ断片を増幅させた。増幅した上流および下流のＤＮＡ断片の精製を行い、両断片を用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行い、更に引き続きプライマー９とプライマー１２を添加したＰＣＲを行い、ゲノ上のｓｉｇＧ遺伝子上下流を結合させた約２．２ｋｂ断片を取得した。
【００５０】
さらにｓｉｇＥ遺伝子上流とｓｉｇＧ遺伝子下流を直接繋げるようにプライマー１３（配列番号１７）およびプライマー１４（配列番号１８）をデザインし、ｓｉｇＥ遺伝子上流およびｓｉｇＧ遺伝子下流領域各々約１．１ｋｂ断片を増幅させた。増幅した上流および下流のＤＮＡ断片の精製を行い、両断片を用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行い、更に引き続きプライマー８とプライマー９を添加したＰＣＲを行い、ゲノ上のｓｉｇＥ遺伝子上流とｓｉｇＧ遺伝子下流を結合させた約２．２ｋｂ断片を取得した。
【００５１】
実施例４  胞子形成関連遺伝子削除株作製にもちいるプラスミドの作製
プラスミドｐＥ１９４（J. Bacteriol. 150, 804-814, 1982）を鋳型にプライマー１５（配列番号１９）とプライマー１６（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、ｐＥ１９４を増幅させた。ＰＣＲは実施例１と同様に行ったが、７２℃伸長反応を１分間から３分間に変更した。増幅させたｐＥ１９４および実施例２で取得した２．２ｋｂＰＣＲ断片を各々制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ処理後、結合反応を行った。得られた反応溶液をエタノール沈殿し、５μＬの滅菌脱イオン水に溶解し、形質転換用のＤＮＡとした。形質転換法はエレクトロポレーション法により行い、ＳＳＨ−１０（島津製作所）およびジーンパルサーキュベット（バイオラッド）を用いて行った。
【００５２】
溶解した反応液を用いて、バチルス  エスピー  KSM-9865株を形質転換し、エリスロマイシン耐性菌からｓｉｇＧ遺伝子上流および下流２．２ｋｂを導入したプラスミドｐＥ１９４−ΔＧ、ｓｉｇＥ遺伝子上流および下流２．２ｋｂを導入したプラスミドｐＥ１９４−ΔＥ、およびｓｉｇＥ遺伝子上流およびｓｉｇＧ遺伝子下流２．２ｋｂを導入したプラスミドｐＥ１９４−ΔＥＧを取得した（図１）。
【００５３】
実施例５  胞子形成関連遺伝子削除株の取得
エレクトロポレーション法を用いて、プラスミドｐＥ１９４−ΔＧをバチルス  エスピー KSM-9865株に導入した。形質転換体をエリスロマイシン含有（５μｇ／ｍＬ）ＬＢ液体培地に植菌し、４２℃で数回植えついた後に、エリスロマイシン含有（１０μｇ／ｍＬ）ＬＢ寒天培地に塗沫した。生育してきた菌から染色体にｐＥ１９４−ΔＧが組み込まれた株を選抜し、ＬＢ液体培地に植菌し、４２℃で数回植えついた後にＬＢ寒天培地に塗沫した。染色体からプラスミドと同時にｓｉｇＧ遺伝子が削除された株を選抜した。同様にプラスミドｐＥ１９４−ΔＥおよびプラスミドｐＥ１９４−ΔＥＧをバチルス  エスピーKSM-9865株変異育種株に導入ｓｉｇＥ遺伝子およびｓｉｇＥＧ遺伝子が削除された株を選抜した。ここにおいて、ｓｉｇＥＧ遺伝子が削除された株とは、ｓｉｇＥ遺伝子およびｓｉｇＧ遺伝子が同時に削除された株をいう（以下も同じ）。
【００５４】
実施例６  胞子形成関連遺伝子強化株の取得
ｓｉｇＧ遺伝子またはｓｉｇＥ遺伝子近傍の遺伝子情報を用いて、ｓｉｇＧ遺伝子またはｓｉｇＥ遺伝子導入用プラスミドを作製した。即ち、ｓｉｇＧ遺伝子導入用プラスミドの構築は、先ずプライマー２１（配列番号２５）、プライマー２２（配列番号２６）を用い、プロモーター領域を含むｓｉｇＧ遺伝子１．０ｋｂを、プライマー２３（配列番号２７）、プライマー２７（配列番号３１）およびプライマー２８（配列番号３２）、プライマー２６（配列番号３０）を用い、導入標的遺伝子箇所（この場合は、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５株の生産する高分子アルカリプロテアーゼ遺伝子を利用）の上流１．１ｋｂおよび下流１．１ｋｂとを増幅後、ＳＯＥ−ＰＣＲにより導入標的遺伝子上下流領域間にｓｉｇＧ遺伝子を結合した断片３．２ｋｂを取得した。一方、ｓｉｇＥ遺伝子導入用プラスミドの構築は、先ずプライマー１７（配列番号２１）、プライマー１９（配列番号２３）を用いプロモーター領域を、プライマー１８（配列番号２２）、プライマー２０（配列番号２４）を用いｓｉｇＥ領域を増幅後、ＳＯＥ−ＰＣＲにより１．０ｂｐの増幅断片を取得した。プライマー２３（配列番号２７）、プライマー２４（配列番号２８）およびプライマー２５（配列番号２９）、プライマー２６（配列番号３０）を用い、増幅させた導入標的遺伝子箇所の上流１．１ｋｂおよび下流１．１ｋｂと、プロモーター領域を含むｓｉｇＥ遺伝子１．０ｋｂ増幅断片とを用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲを行い、導入標的遺伝子上下流領域間にｓｉｇＥ遺伝子を結合した断片３．２ｋｂを取得した。
【００５５】
プラスミドｐＥ１９４を鋳型にＰＣＲを行い増幅した約３ｋｂのＤＮＡ断片と、ＳＯＥ−ＰＣＲにより増幅した３．２ｋｂＤＮＡ断片を、実施例３同様に制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ処理、結合反応および形質転換を行い、ｓｉｇＧ遺伝子遺伝子またはｓｉｇＥ遺伝子強化用プラスミドを構築した。次いでエリスロマイシンで液体培養を行い、エリスロマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、プラスミドが染色体上の標的遺伝子上流または下流に挿入された株を、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法によって選抜した。挿入が認められた株を液体培養し、寒天培地上に塗沫、エリスロマイシン感受性株からプラスミドが除去され、標的遺伝子にｓｉｇＧ遺伝子またはｓｉｇＥ遺伝子が導入された株を選抜し、当該遺伝子強化株を取得することができた。
【００５６】
実施例７  胞子形成能確認試験
本発明にて得られたｓｉｇＧ遺伝子削除株、および対照としてその元株をSchaeffer培地に画線し、３０℃、２週間保温後、グラム染色し、検鏡にて胞子形成の有無を確認した。元株では胞子形成が確認されたが、ｓｉｇＧ遺伝子削除株では胞子形成が確認されなかった（表１）。
【表１】
2006136221.tif 000002
【００５７】
実施例８  耐熱性試験
また、得られた培養液を集菌し、生菌数を１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬになるように調製した。この菌液を６０℃にて保温し、３０分間保温後の菌液を適宜希釈後ＬＢ寒天培地に塗沫した。ｓｉｇＧ遺伝子削除株での生菌は確認されなかったが、元株では３０分処理後においても生菌が確認された（表２）。
【表２】
2006136221.tif 000003
【００５８】
実施例９  プロテアーゼ産生
バチルス  エスピー KSM-9865株のｓｉｇＧ遺伝子削除株、ｓｉｇＥ遺伝子削除株、ｓｉｇＥＧ遺伝子削除株、および対照としてKSM-9865株に、プラスミドｐＡＳＰ６４（特許第3492935）高発現領域下流ＳＤ配列と一致させるように配列番号３３記載のバチルス  エスピー KSM-KP43株由来のプロテアーゼ遺伝子を結合したプラスミド（図２）をエレクトロポレーション法にて導入した。得られた形質転換体を、試験管中の５ｍＬ種母培地［ポリペプトンＳ（日本製薬）６．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％、マルトース１．０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、りん酸２水素カリウム０．１％、無水炭酸ナトリウム０．３％テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に植菌し、３０℃、３２０ｒｐｍで一晩前培養した。この種母培養液を５００ｍＬ容坂口フラスコ中の２０ｍＬ主培地［ポリペプトンＳ８．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．３％、マルトース１０％、硫酸マグネシウム７水和物０．０４％、りん酸２水素カリウム０．２％、無水炭酸ナトリウム１．５％テトラサイクリン３０ｐｐｍ］に１％植菌（ｖ／ｖ）し、３０℃、１２１ｒｐｍで３日間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し、培養上清中のプロテアーゼ活性を測定した。プロテアーゼ活性はカゼインを基質とした活性測定法により、タンパク質量はプロテインアッセイキット（和光純薬）を用いて測定した。
【００５９】
プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミド導入したｓｉｇＧ遺伝子削除株、ｓｉｇＥ遺伝子削除株、ｓｉｇＥＧ遺伝子削除株を宿主とした培養と元株を宿主とした培養上清のプロテアーゼ生産性を比較した（表３）。培養上清中のプロテアーゼ生産性には活性、タンパク質量ともに差は認められなかったことから、ｓｉｇＧ遺伝子削除株、ｓｉｇＥ遺伝子削除株、ｓｉｇＥＧ遺伝子削除株においてもプロテアーゼが良好に生産されることが確認された。
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ｓｉｇＧ遺伝子および／またはｓｉｇＥ遺伝子除去用プラスミドを模式的に示したものである。
【００６１】
【図２】プロテアーゼ生産用プラスミドを模式的に示したものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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