(57)【要約】      （修正有）【課題】シュードモナス・アエルギノザによる感染を検出するための手段を提供する。【解決手段】特定のＤＮＡ配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外部膜タンパク質Ｆ（ＯＭＰＦ）をコードするヌクレオチド、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞に対して毒性である免疫原性ポリペプチドをコードするそのフラグメント、このヌクレオチドおよびヌクレオチドフラグメントによってコードされるタンパク質およびポリペプチド、およびそれに対する抗体、ならびにそれらを含む診断助剤および組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示したＤＮＡ配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外部膜タンパク質Ｆ（ＯＭＰＦ）をコードするヌクレオチド、またはＥ．ｃｏｌｉ細胞に対して毒性である免疫原性ポリペプチドをコードするそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質Ｆ、それをコードするＤＮＡ、およびそれに対する抗体、ならびにそれらを含む診断助剤および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュードモナス・アエルギノザ(Pseudomonas aeruginosa)は至る所に存在する微生物であり、人医学における「問題微生物」として知られている。それは主として衰弱した患者に感染し、しばしば抗生物質治療による抑制が困難である。これが、集中介護装置(intensivecare units)及び対麻痺にある患者及び火傷にあった或いは火傷の危険に曝された人々例えば消防士及び鉄鋼労働者が特別の危険にあることの理由である。
【０００３】
Ｗ．Ａ．ウッドラフ等（W.A.Woodruff et a1., J. Bacterio1, 167(1986)473-479)は詳細には規定されてないＰ．アエルギノザＰＡ０１を出発菌株として用いるＥ．コリ(E.co1i)中における外部膜タンパク質Ｆ（ＯＭＰＦ、ポリンＦ）の発現を記載している。クローン化されたＤＮＡ配列は極めて大雑把な制限酵素地図によってのみ特性化されているにすぎず、ＤＮＡ配列或はアミノ酸部分配列は述べられておらず、又クローン化物質の認められた寄託所における寄託について何も述べられていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質Ｆ、それをコードするＤＮＡ、およびそれに対する抗体、ならびにそれらを含む診断助剤および組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、表１に示したアミノ酸配列を有するシュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginosa）の外部膜タンパク質Ｆ（ＯＭＰＦ）が提供される。
【０００６】
本発明によれば、上記のＯＭＰＦの免疫原性部分配列が提供される。
【０００７】
本発明によれば、ＯＭＰＦをコード化し、表１に示されたＤＮＡ配列（コード化鎖）を有するＤＮＡが提供される。
【０００８】
本発明によれば、上記のＤＮＡ或いはその免疫原性部分を含有するベクター及びＤＮＡ構造体が提供される。
【０００９】
本発明によれば、上記のベクター或いはＤＮＡ構造体を含有する原核或いは真核細胞が提供される。
【００１０】
本発明によれば、上記のＯＭＰＦ及びタンパク質の免疫原性部分配列を抗原として用いて得られたポリクローナル及びモノクローナル抗体並びに対応する血清が提供される。
【００１１】
本発明によれば、上記の抗体を含有する、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginosa）の感染を検出するための診断助剤が提供される。
【００１２】
本発明によれば、上記のヌクレオチド配列を全部或いは部分的に或いはそれから得られるヌクレオチド配列を含有する、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonasaeruginosa）の感染を検出するための診断助剤が提供される。
【００１３】
本発明によれば、リンパ球を誘発して抗体を産生するための上記のタンパク質を含有する組成物が提供される。
【００１４】
本発明によれば、上記のタンパク質に対する抗体の産生に対してリンパ球を試験するための上記のタンパク質を含有する組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質Ｆ、それをコードするＤＮＡ、およびそれに対する抗体、ならびにそれらを含む診断助剤および組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明はＰ．アエルギノザ、セロタイプ６、ＡＴＣＣ３３３５４からのＯＭＰＦに対する遺伝子の完全な特性化に基づくものである。ＤＮＡ配列及びそれに由来するアミノ酸配列は表１に示されており、アミノ酸配列は関連トリプレットの下の１文字暗号の下に配列されており、シグナルペプチドはイタリック文字で強調されている。
【００１７】
この目的のために、外部膜のタンパク質は核菌株から得られ、それらからＯＭＰＦがＨＰＬＣにより濃縮された。初期配列はアミノ末端のものであり、トリプシンによる切断により得られたタンパク質断片のものであった。各種これらのオリゴペプチド類とコード化するＤＮＡ配列が演繹され、これらのオリゴデキシヌクレオチドが化学的に合成された。更にゲノムＤＮＡを菌株から単離し、生成し、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化した。約１５〜２０ｋｂのＤＮＡ断片を濃縮し、λファージＥＭＢＬ３［Ａ．−Ｍ．フリッシャウフ等(A.M.Frischauf eta1.)J. Mol. Bio1. 170(1983)827-842；Ｒ．Ｗ．ヘンドリックス等（R.W. Hendrix etal.)（編）Lambda II、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1983)］中にクローン化した。この様にして得られた遺伝子バンクを合成オリゴデオキシヌクレオチド類を用いて相補的配列のスクリーニングを行った。ＯＭＰＦに対する遺伝子は陽性反応を用いて見出されたファージクローンの一つからの１５ｋｂ断片上に見出された。遺伝子を２．５ｋｂ  ＰｓｔＩ断片に局所化することはこの断片及び見出されたその他の断片上に行うことが可能であった。しかしながら、この断片は遺伝子生成物が明らかに宿主細胞に対して毒性を有するために高コピー数のベクターにクローニングすることができなかった。従って遺伝子を、約５００ｂｐの重複領域を有する二つの重複断片にサブクローン化した。ＯＭＰＦ遺伝子と隣接領域のＤＮＡ配列をこれらの二つのサブクローンから決定した。遺伝子の両ＤＮＡ鎖を完全に配列決定した（Sanger法による）。得られたＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を推定した。タンパク質のトリプシン切断により得られた全てのオリゴペプチド類のアミノ酸配列を割当てることが明確に可能であった。ＯＭＰＦ  ｍＲＮＡの５’末端はｍＲＮＡのＳ１より分析及び逆転写により決定された。
【００１８】
この遺伝子の特性化は今やＯＭＰＦ及びこのタンパク質の免疫原性部分配列をワクチンの製造に使用するために必要な量及び純度で調製することを可能にする。  従って、本発明は表１に示されたアミノ酸配列を有するＯＭＰＦ、それをコード化するＤＮＡ、表１に示されたタンパク質コード化鎖、ＯＭＰＦの免疫原性部分配列、ＯＭＰＦ及びタンパク質の免疫原性部分配列を用いて得られたポリクローナル及びモノクローナル抗体及び対応する血清、並びにその様な抗体或いは対応するヌクレオチド配列を含有する診断助剤及びその様な診断剤を用いる診断方法に関する。
【００１９】
更に、本発明は人モノクローナル抗体を用いる受動的免疫化方法を開示するものである。従って、本発明は又リンパ球を誘発して対応するモノクローナル抗体を産生するための及びリンパ球をその様な抗体の産生に試験するための本発明により得られた抗原の使用にも関するものである。
【００２０】
血清或いは抗体の処理、精製、免疫化及び取得はそれ自体公知の方法により行うことができる。例えば、Ｍ．Ｅ．ギレランド等（M.E. Gilleland eta1.)、Infection and Immunity 44 No.1(1984年４月)49-54；Ｒ．Ｅ．Ｗ．ハンコック等(R.E.W. Hancocket a1.)、J. Infectious Diseases 149 No.２(1984年２月)、220-226；Ｓ．サワダ等、J. InfectiousDiseases 150 No.4(1984年10月)570-576を参照。
【００２１】
以下の例により本発明を詳細に説明する。
特に断りのない限り、部数及びパーセントデータは重量基準である。
【実施例】
【００２２】
例１：
ＯＭＰＦ及びトリプシン処理断片の単離
シュードモナス・アエルギノザＡＴＣＣ  ３３３５４の外部膜タンパク質をミズノ及びカゲヤマの方法（J.Biochem. 86, 979-989, 1987年）により単離する。細菌培養物を成長の後期対数期に採取し、１０ｍＭ  Ｎａリン酸（ｐＨ７．２；「崩壊緩衝液」）に懸濁し、ホモジナイザー（RWoringblender）中でガラスビーズにより４℃で５分間崩壊する。細胞壁を１００，０００×ｇの遠心分離により４℃で６０分間ペレット化し、次いで崩壊緩衝液で２回洗浄する。４００ｍｌのＳＤＳ緩衝液（２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．８）をシュードモナス各１５０ｇ湿潤重量に対してペレットに添加し、混合物を３０℃で６０分間撹絆する。それを次いで１００，０００×ｇで６０分間遠心分離する。沈澱を再びＳＤＳ緩衝液の半量で抽出し、再び遠心分離する。可溶性画分を廃棄する。不溶性沈澱を３００ｍｌのＮａＣｌ／ＳＤＳ緩衝液（２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．８）と３０℃で６０分間撹拌する。混合物を次いで１００，０００×ｇで２５℃において６０分間遠心分離する。ペレットを４℃で二重蒸溜Ｈ2Ｏで２回洗浄する。不溶画分は主としてタンパク質Ｆ及びＨ2、及び少量のタンパク質Ｉを含有する。
【００２３】
１ｍｇの外部膜タンパク質を１ｍｌの２０％蟻酸／６Ｍ尿素中に溶解し、２０％蟻酸中の１５０μｌ部分内のＴＳＫ３０００（ＬＫＢ）上でクロマトグラフィを行なう（流速１ｍｌ／分）。これらの条件下においてタンパク質画分中に得られた物質をプールし、ＳＤＳゲル電気泳動中において分子量でＯＭＰＦに対応する単一バンドを示す。
【００２４】
この物質を凍結乾燥し、２００μｌの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に取り、２０μｇのトリプシン−ＴＲＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトンで処理）(CooperBischemica1 GmbH)により３７℃で１８時間切断する。切断混合物を蟻酸でｐＨ３．５に調整し、逆相高圧液体クロマトグラフィにより分別する。
クロマトグラフィ条件：
カラム：RＶｙｄａｃ  ＴＰＲＰ−１８（１０μｍ）、
２５０×４ｍｍ(Chrompack)
溶媒系：
溶媒Ａ：水中０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸
（Ｆ１ｕｋａ、配列分析用）
溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸（E.Merck,RLi ckrosolv)
流速：1．５ｍl／分
室温
得られたペプチド断片のいくつかをアミノ酸分析及び配列分析において特性化する。幾つかの得られたピーク画分を０．１％トリフルオロ酢酸中においてＴＳＫ２０００上で再クロマトグラフ化し、次いで気相配列決定器(AppliedBiosystems ４７０Ａ）中で分析する。アミノ酸のフェニルヒダントイン誘導体をアイソクラチックＨＰＬＣシステム(Lottspeich, J.Chromatography 326, 321-327, 1985年)を用いて同定した。
【００２５】
例２：
ＯＭＰＦ  ＤＮＡの単離及び特性化
シュードモナス・アエルギノザ遺伝子バンクの構築：
λＥＭＢＬ３アームをマニアティス等(Maniatis et e1., Mo1ecular C1oning, Cold Spring HarborPub1ications 1982)により記載されているようにして調整する。Ｐ．アエルギノザＤＮＡを５００ｍｌの培養液［ロドリゲス及びテイト（Rodriguezand Tait），組換えＤＮＡ技術、Addison-Wesley，１９８３］から単離する。２０×３０μｇのＤＮＡを部分的に制限酵素Ｓａｕ３Ａで切断し、スクロース勾配遠心分離（マニアティス等、上記参照）により分別する。１５〜２０ｋｂの大きさの断片をλＥＭＢＬ３アームで連結する（マニアティス等、上記参照）。この連結ＤＮＡをファージ粒子(Amersham)中に包装する。２×１０6個の組換えファージがＤＮＡのμｇ当り得られる。
【００２６】
遺伝子バンクのＯＭＰＦ配列のスクリーニング：
組換えファージをＮＭ５３９細菌芝地上に５００ｐｆｕの密度で培養する。ファージプラークをベントン及びデービス(Benton and Davis)の方法（Science196,180-182, 1977年）によりナイロン膜に移す。ペプチド配列ＮＬＡＤＦＭＫ及びＮＭＫＮＡＤに従って合成されたオリゴヌクレオチド類５’ＡＡＣ／ＴＣ／ＴＴＡ／ＧＧＣＣ／ＴＧＡＣ／ＴＴＴＣ／ＴＡＴＧＡＡ３’及び５’ＴＣＮＧＣＡ／ＧＴＴＣ／ＴＴＴＣＡＴＡ／ＧＡＡ３’によるハイブリダイゼーションの結果２５００個の組換えファージプラークから単離された６個の陽性の候補者が得られた。
【００２７】
ＯＭＰＦ遺伝子及びその隣接領域の配列分析：単離ファージの一つを大規模（１ｌ）培養し、ＤＮＡをこれから調製する（マニアティス等、上記参照）。後者を制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｕ３Ａで切断する（部分的）。得られた制限酵索断片をｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９にショットガンサブクローニングする［ヤニッシュ−ペロン等（Yanisch-Perronet a1.)、Gene 33,103-119, 1985年］。プラスミドＤＮＡをハイブリダイゼーション−陽性クローンから単離し、及び更にサブクローニング及びＥｘｏIII及びＥｘｏＶII消化（ヤニッシュ−ペロン等、上記参照）後、チェン及びシーブルグ(Chenand Seeburg, DNA 4, 165-170, 1985年）の方法により配列決定する。
【００２８】
【表１】
2006187286.tif 000002
【００２９】
例３：
ＯＭＰＦの発現
ＯＭＰＦのＥ．コリにおける発現は、構造遺伝子がその自らのプロモータの制御下の中−コピー（ｐＢＲ３２２）或いは高−コピー（ｐＵＣプラスミド）上に存在する場合には細菌に対して毒性を示すため、構造遺伝子は先ず誘導性プロモータの制御下におかれる。プロモータ及び構造遺伝子の５’−末端部分を含有するＯＭＰＦ遺伝子の部分断片はＳａｌ−切断Ｍ１３ｍｐ１９二本鎖ＤＮＡ（ヤニッシュ−ぺロン、上記参照）におけるＳａｌ  Ｉ制限酵素断片として連結され、標準条件下に用いられて［ハナーン(Hanahan)、J.Mol. Biol. 166, 557-580, 1983年］、Ｅ．コリＪＭ１０９を形質転換する（ヤニッシュ−ペロン等、上記参照）。ファージが形質転換細菌の５ｍｌ液体培養機からの上澄液から単離され、一本鎖ＤＮＡを調製するために用いられる。ニューマン等（Newmanet a1., Ce11 42, 335-344, 1985年）の方法をオリゴデオキシヌクレオチドの助けにより使用して、ＡＴＧ翻訳開始コドンの直前にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を導入するためにこの一本鎖ＤＮＡ上に目標とする突然変異誘発を行う、即ち配列ＡＴＴＴＡＡＣＧＧＡＴＧ（表１のヌクレオチド類５５〜６６）を配列ＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧに形質転換する。この構造遺伝子の５’末端部分を今度はこの新しい構築物から切出し、誘発性ｔａｃプロモータ［ドボワール等(deBoer et a1.)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 21以降、1983年］の制御下におく。この目的のために、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片をベクターｐｋｋ２２３−３(Pharmacia)のＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩの断片部位中に連結する。このクローン化された中問体をＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断し、ターミネータ領域を含むＯＭＰＦ構造遺伝子の残存部分をＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片としてこれらの切断部位中に挿入する。このＯＭＰＦ構造遺伝子は今や誘発性ｔａｃプロモータの制御下にある。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を形質転換細胞の培養液（ＪＭ１０５，ヤニッシュ−ペロン等、上記参照）に添加すると、ｔａｃプロモータの抑制解除となり、従ってＯＭＰＦの発現の誘発を生ずる。
【００３０】
例４：
抗血清の調製
その医学履歴がアレルギー、糖尿病、免疫不全病、貧血或いは皮膚病を示さない健康な成人を異種的に発現されたＯＭＰＦ或いはその部分配列により免疫化する。ワクチン化は１日目、８日目及び１５日目に行なう。最終注射後、３週間後に血液をボランティアの候補者から採取し、Ｂ型肝炎表面抗原及びＨＩＶ抗原の試験を行なう。陰性反応の供与プラズマのみがプールに入り、それは画分に分割され、制御された殺菌条件下に包装される。
【００３１】
例５：
モノクローナル抗体の調製
フロイントのアジュバント或いはＡｌ（ＯＨ）3中の精製ＯＭＰＦ或いはＯＭＰＦ部分−ペプチドをＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射する。６週間後、溶解抗原の「ブースター」を与えた。抗体力価をＥＬＩＳＡにより１週間後に検定する。免疫応答が不十分な場合には更に注射を与える。細胞融合の３日前に１０μｇの溶解抗原の静脈内「ブースター」をマウスに与える。脾臓細胞をＮＳ１細胞と標準的方法［ケーラー及びミルシュタイン(Kohlerand Mi1stein)］により融合した。ＨＡＴ培地中で選択後、個々のコロニーはマイクロウェル中で育成し、それらの培養上澄液を次いでＥＬＩＳＡにおけるＯＭＰＦに対する抗体の検定を行なう。陽性のコロニーをサブクローニングする。培養上澄液及びＢａｌｂ／ｃマウス内に誘発された腹水から得られた抗体を通常の生化学的方法により精製し、特性化する。
【配列表】
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