(57)【要約】      （修正有）【課題】  薬剤候補のスクリーニングなどに利用可能な新たな評価方法を提供する。【解決手段】  以下のステップを含む、鳥類の発生初期に形成される卵黄心血管系の状態を指標として外部刺激の作用を評価する。（１）鳥類の受精卵を用意するステップ、（２）前記受精卵に対して被験対象の外部刺激を与えるステップ、（３）前記受精卵の卵黄心血管系の状態を測定するステップ、（４）測定結果より、前記外部刺激の卵黄心血管系への作用を評価するステップ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、外部刺激の作用を評価する方法、
(1)鳥類の受精卵を用意するステップ、
(2)前記受精卵に対して被験対象の外部刺激を与えるステップ、
(3)前記受精卵の卵黄心血管系の状態を測定するステップ、
(4)測定結果より、前記外部刺激の卵黄心血管系への作用を評価するステップ。
【請求項２】
前記受精卵が胚の発生ステージ１５〜２２のときにステップ(2)を実施する、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記受精卵が胚の発生ステージ１５〜１８のときにステップ(2)を実施する、請求項１に記載の評価方法。
【請求項４】
尿漿膜血管系が卵黄血管系よりも優勢になる前にステップ(3)を実施する、請求項１〜３のいずれかに記載の評価方法。
【請求項５】
ステップ(3)において、卵黄心血管系の状態を経時的に測定する、請求項１〜４のいずれかに記載の評価方法。
【請求項６】
前記外部刺激が、被験物質の添加、光の照射、電磁波の照射、放射線の照射、音波の照射、電気刺激、振動の付加、及び圧力の付加からなる群より選択される一以上の外部刺激である、請求項１〜５のいずれかに記載の評価方法。
【請求項７】
前記卵黄心血管系の状態として、血管の面積、血管の数、血管の幅又は径、血管の枝分かれの状態、血管の伸長速度、血液量、血液の流速、血球移動速度、及び胚の心拍数からなる群より選択される一以上の項目をステップ(3)において測定する、請求項１〜６のいずれかに記載の評価方法。
【請求項８】
前記卵黄心血管系の状態として、血管の面積、血管の数、血管の幅又は径、血管の枝分かれの状態、及び血管の伸長速度からなる群より選択される一以上の項目をステップ(3)において測定する、請求項１〜６のいずれかに記載の評価方法。
【請求項９】
前記鳥類がニワトリ又はウズラである、請求項１〜８のいずれかに記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外部刺激の作用・影響をin vitroで評価する方法に関する。例えば薬剤候補の検索、又は薬剤の毒性や副作用の評価などに本発明の評価方法を利用できる。
【背景技術】
【０００２】
２０００年には高血圧ガイドラインが引き下げられ、日本の高血圧患者は約３，７００万人に上る。また、生活習慣病はその多くが血管病を併発し、悪化すれば致死性の疾患に陥る。代表的な致死性疾患の脳卒中では、動脈硬化を起こす前に薬物療法を施せば発症率が減るという報告がある。生活習慣病に伴う心臓病の治療薬として数種類が既に使われているが、世界中の患者数を考えるとより副作用の少ない効果的な治療薬の開発が急がれる。
新薬の開発において未だに多くの労力と時間を必要としている部分が、薬剤候補の有効性と有害性を実験的に見極めるスクリーニング及び臨床の段階であるといわれている。そのスクリーニング作業のコストを大幅に削減し、より多くの薬剤候補の可能性についてより詳細に検討できるスクリーニングシステムを開発することは新薬開発の競争力を向上させることになる。
尚、薬剤のスクリーニング方法の一例が特許公報１に開示されている。
【０００３】
【特許文献１】特表平９−５０９８２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現状の薬剤開発においては、培養細胞などを用いたin vitroスクリーニングの後、マウス、ラット、ウサギなどの実験動物を用いたin vivo検証を実施するのが通常の手順である。マウスなどの哺乳類は小さく取り扱いが容易であるが、同一条件で複数のサンプルを扱うためには大掛かりな設備が必要となる。さらに、実験動物の安定供給や飼育コストなどの問題も大きい。
一方、入手が容易なニワトリの卵を利用したスクリーニング系が提案されている。即ち、尿漿膜血管系を利用して血管新生の定量を行うことによって、血管新生に作用する物質をスクリーニングする試みが報告されている。尿漿膜血管系は、胚の発生ステージ１８頃に発生し、比較的孔径の大きい血管を軸とした安定した血管網を形成する。このように血管が比較的太く、また安定していることから、尿漿膜血管系は状態変化を観察する目的に適したものと考えられてきた。しかしながら尿漿膜血管系では卵の表層近くだけでなく内部へも多くの血管が伸展するため実際は観察し難く、血管の数や量などを正確に把握することが困難である。また、尿漿膜血管系が形成される発生段階では胚が活発に動くことから、胚の動きに伴う血管の揺れや移動を考慮した測定が必要となる。従って測定が困難となり、また得られるデータの信頼性も低い。
【０００５】
一方、血管新生の評価方法としてウサギ網膜血管系を利用した方法や、培養細胞レベルでの血管形成を指標とした方法なども過去に提案されているが、血管の数の増減若しくは血管の太さ又は血球の流れていない管のみの極微形成面積の変移過程を撮影及び解析するのみであり、真の血管新生の定量的観察法は確立されていない。また、特にウサギ網膜血管系を利用した方法では血管の観察も困難であるという問題が付随する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の背景の下、本発明者らは薬剤候補の検索や評価などに利用できる新たな評価系の構築を目指して鋭意検討した。その結果、鳥類の卵の発生初期に形成される卵黄血管系を利用すれば、血管新生の定量的観察が容易であることをはじめ、以下に示す多くの利点を有する評価系（測定系）を構築できるとの知見を得た。
(1)卵黄血管系は感受性が高く、外部刺激を与えたときの応答性に優れる。また、卵黄血管系では血管新生、血管の伸長、及び血管の肥大が盛んである。これらの特徴によって迅速な評価が可能となる。また、微量の試料での測定・評価が可能となる。このことは例えば、大量に調製することが困難な物質の作用を評価する場合に特に有効な評価系になることを意味する。
(2)卵黄血管系は発生段階ではじめに形成される血管系であり、しかも卵の表層近くに形成されることからその観察及び測定が容易である。また、単純な構造であることも、卵黄血管系の観察及び測定に対して有利に働く。
(3)動物個体に比較して鳥類の卵は個体差が小さいことから、得られるデータの信頼性が高く、再現性もよい。
(4)同じ個体（卵）で経時的な観察・測定が可能である。
(5)卵黄血管系の形成時期は胚がほぼ静止した状態である。従って、胚の動きに伴う血管の揺れや移動がほとんどなく、血管の観察・測定が容易且つ高精度に行える。尚、尿漿膜血管系の形成時期では胚の動きが活発であり、血管の揺れ等が激しい。
(6)例えばニワトリの卵などを用いれば安定供給が比較的容易であり、飼育コスト面でも有利である。
(7)卵黄血管の形成時期の卵では心臓の拍動も肉眼で確認できる。また毛細血管を流れる血球を観察することも可能である。
(8)以上の多くの利点から、鳥類の卵黄血管系を利用した評価系は、測定の自動化が容易であり、高速なスクリーニングシステムを実現するのに最適な系といえる。
【０００７】
本発明は以上の成果及び知見に基づき、以下のステップを含んで構成される、外部刺激の作用を評価する方法を提供する。
(1)鳥類の受精卵を用意するステップ、
(2)前記受精卵に対して被験対象の外部刺激を与えるステップ、
(3)前記受精卵の卵黄心血管系の状態を測定するステップ、
(4)測定結果より、前記外部刺激の卵黄心血管系への作用を評価するステップ。
【０００８】
本発明の一態様では受精卵が胚の発生ステージ１５〜２２のときにステップ(2)を実施する。更に好ましくは受精卵が胚の発生ステージ１５〜１８のときにステップ(2)を実施する。更に更に好ましくは受精卵が胚の発生ステージ１７〜１８のときにステップ(2)を実施する。外部刺激を与える時期が早すぎると胚が損傷を受け、卵黄血管系の形成に影響を及ぼし、卵黄血管系の状態を指標として評価することが困難となるからである。
一方、尿漿膜血管系が卵黄血管系よりも優勢になる前にステップ(3)を実施することが好ましい。尿漿膜血管系が優勢になると卵黄血管の状態又は胚の状態を観察し難くなるからである。例えば、受精卵が胚の発生ステージ１７〜２２のときにステップ(3)を実施することが好ましい。
【０００９】
本発明の一態様ではステップ(3)において卵黄心血管系の状態を経時的に測定する。これによって、外部刺激が卵黄心血管系に及ぼす作用・影響の経時的変化を評価できる。
【００１０】
被験対象となる外部刺激は例えば、被験物質の添加、光の照射、電磁波の照射、放射線の照射、音波の照射、電気刺激、振動の付加、及び圧力の付加からなる群より選択される一以上の外部刺激である。
一方、卵黄心血管系の状態は例えば、血管の面積、血管の数、血管の幅又は径、血管の枝分かれの状態、血管の伸長速度、血液量、血液の流速、血球移動速度、及び胚の心拍数からなる群より選択される一以上の項目である。本発明の好ましい一態様では血管の面積、血管の数、血管の幅又は径、血管の枝分かれの状態、及び血管の伸長速度からなる群より選択される一以上を測定項目とする。
鳥類の種類として好ましくはニワトリ又はウズラが選択される。これらの受精卵は比較的入手が容易だからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（用語）
本明細書では、卵黄血管と、卵黄血管形成時期の心臓とを包括的に表現する用語として「卵黄心血管系」を用いる。従って、本明細書において「卵黄心血管系の状態」には、卵黄血管の状態と、卵黄血管形成時期の心臓の状態（例えば心拍数）とが含まれる。
【００１２】
本発明は外部刺激の作用を評価する方法に関する。本発明による評価結果に基づいて、細胞又は生体に対して有効な外部刺激をスクリーニングすることができる。また、ある外部刺激が細胞に及ぼす悪影響（例えば毒性、副作用）の程度を評価することにも本発明を利用できる。
本明細書において「外部刺激」とは(1)薬剤候補など被験物質の添加、(2)光、電磁波、放射線、音波などの照射、(3)電気刺激、(4)振動、及び(5)圧力の付加などである。
【００１３】
本発明の評価方法は次の各ステップを含む。
(1)鳥類の受精卵を用意するステップ。
(2)前記受精卵に対して被験対象の外部刺激を与えるステップ。
(3)前記受精卵の卵黄心血管系の状態を測定するステップ。
(4)測定結果より、前記外部刺激の卵黄心血管系への作用を評価するステップ。
以下、各ステップについて詳細に説明する。
【００１４】
１．ステップ(1)
ステップ(1)では鳥類の受精卵を用意する。ここでの鳥類は例えばニワトリ、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、チャボ、鳩である。ニワトリ又はウズラの受精卵を用いることが好ましい。受精卵の入手が比較的容易だからである。ニワトリの受精卵を用いることが最も好ましい。受精卵の供給及び流通の体制が最も整っているからである。また、ウズラに比較して卵が大きいため取り扱い易く、卵黄心血管系の観察・測定も容易だからである。
【００１５】
後述のように本発明の評価方法では、卵黄心血管系の状態を観察・測定対象とする。従って、後に卵黄心血管系の観察・測定が可能な状態の受精卵を用意する必要がある。好ましくは尿漿膜血管系形成開始前の受精卵を使用する。
ニワトリの卵では通常、胚の発生ステージ１５頃（受精後約２日）に卵黄血管が発生し始め、発生ステージ１７頃（受精後約２日〜３日）には肉眼で容易に観察される程度に血管網を形成する。そして、発生ステージ２２〜２４頃（受精後約３〜４日）に卵黄血管の一部が消失し始め、発生ステージ３０頃（受精後約７日〜８日）には卵黄血管のほぼ完全な消失に至る。一方、尿漿膜血管は通常、胚の発生ステージ１８頃（受精後約３日）に発生し始める。従って、ニワトリの卵を用いる場合には通常、胚の発生ステージ２８前、好ましくは胚の発生ステージ２２前、更に好ましくは胚の発生ステージ１７前、更に更に好ましくは胚の発生ステージ１５前の段階にある受精卵を用意する。このように比較的発生初期の段階にある受精卵を使用することによって、タイミングよく且つ十分な時間的余裕をもって、更には尿漿膜血管の影響の少ない状態で、後述の外部刺激の付加及びその後の測定を実施することができる。
ニワトリ以外の鳥類の卵を用いる場合にも、上記の発生ステージと同等の発生ステージの受精卵が用いられる。
尚、ニワトリ胚の発生段階は、Hamburger V. and Hamilton H.L.(1951) J. Morphol. 88: 49-92に準ずる（「発生生物学の必須テクニック（Essential Developmetal Biology, A Practical Approach,ed. C.C. Stein ＆ P.W.H. Holland）」八杉貞夫監修、メディカル・サイエンス・インターナショナル社を参照）。
【００１６】
発生を促すために受精卵は転卵培養される。例えば約３７℃、相対湿度約６０％に調整した恒温槽内で１時間に１〜２回、転卵する（９０°）条件下で転卵培養する。
【００１７】
２．ステップ(2)
ステップ(2)では、用意した受精卵に外部刺激を与える。即ち、このステップでは被験対象の外部刺激が受精卵に加えられる。上記の通り、本発明における外部刺激は(1)薬剤候補など被験物質の添加、(2)光、電磁波、放射線、音波などの照射、(3)電気刺激、(4)振動の付加、及び(5)圧力の付加などである。
本発明の好ましい一態様では被験物質の添加による外部刺激を受精卵に与える。この態様の評価方法では被験物質の作用が評価されることになる。このような評価系は薬剤候補の検索や薬剤の毒性・副作用の評価に有効である。特に、ある物質の血管系に対する作用（影響）を評価するために本発明の方法を好適に利用できる。具体的には、血管系に作用する化合物（血管新生を阻害又は促進する化合物。例えば抗癌剤の候補）のスクリーニングに本発明を利用することができる。
【００１８】
二つ以上の外部刺激を組み合わせて与えることにしてもよい。例えば被験物質の添加と光照射の併用、被験物質の添加と電気刺激の併用などである。かかる態様によれば、種類の異なる外部刺激を組み合わせたときの血管系に対する作用を評価できる。例えば、ある薬剤の添加と電気刺激とを併用したことによって薬効が増強されるとの結果が得られれば、電気刺激を与えながら当該薬剤を投与することが高い治療効果の発揮に有効であると判断することができる。
同種の外部刺激を組み合わせて与えることにしてもよい。例えば、二つ以上の被験物質を同時に添加する場合がこれに該当する。ここでの「同時」は時間的に厳密な同時性を意味するのではなく、二つ以上の被験物質の添加が間隔を置いて行われても良い。
【００１９】
典型的には、予め卵殻の一部を除去して卵の内部を観察できる状態にした後に外部刺激を加える。卵殻の一部の除去は例えば次の手順で行う。
(1)受精卵の卵殻鈍端部（気質側）を上にする。
(2)殻の一部に孔をあけ、この孔を利用して卵白を少量（例えば約１５ml）抜きとる。これによって、卵の液面が下がる。
(3)卵の液面の若干上の位置で卵殻を切断し、殻の鈍端部（気質側）を取り除く。尚、卵殻の一部を除去した後は、転卵培養から静置培養に切り替える。
【００２０】
卵の一部又は全体に対して外部刺激が与えられる。外部刺激として被験物質の添加を行う態様では、以下の手順で卵の一部に外部刺激を与えることができる。
(1)卵殻の一部を除去することで露呈した卵の表面に、一部が開口した小板（例えばドーナツ状の小板）を載せる。
(2)小板の開口部を介して被験物質を卵表面に添加する。これによって、卵表面において小板の開口部に対応する部分のみが被験物質に直接曝露される。
【００２１】
外部刺激を与える前又は測定（ステップ(3)）の前に殻から卵を取り出し、別容器に移すことにしてもよい。但し、操作が煩雑となること、胚を測定に好ましい位置にするのが困難なこと等の理由から、操作の全過程を通して卵を卵殻内に維持することが好ましい。
【００２２】
本発明の評価方法では卵黄心血管系の状態を指標として外部刺激の作用を評価する。従って卵黄心血管系が形成される前又は卵黄心血管系の形成段階で外部刺激を与える。好ましくは外部刺激を与える時期を、胚が形態的に完成された段階（ニワトリ胚では発生ステージ１５〜１６）以降とする。これによって胚への外部刺激の影響が低減され、卵黄血管を比較的長期に亘って観察することが可能となる（外部刺激を与える時期が早すぎると胚が損傷を受け、卵黄心血管系の形成に影響を及ぼし、長期的な観察が困難となる）。一方、上記の通り卵黄心血管系は短期間で消失する運命にあることから、卵黄心血管系の状態を指標として外部刺激の作用を評価するためには卵黄血管系が形成される前の時期、又は卵黄血管系の形成段階のできるだけ早い時期に外部刺激を与えることが好ましいといえる。以上の事情を考慮すれば、ニワトリの卵を用いる場合、本発明における外部刺激を与える時期は例えば胚の発生ステージ１５〜２８（受精後約２日〜６日）、好ましくは胚の発生ステージ１５〜２２（受精後約２日〜４日）、更に好ましくは胚の発生ステージ１５〜１８（受精後約２日〜３日）、更に更に好ましくは胚の発生ステージ１７〜１８（受精後約２日〜３日）である。
【００２３】
３．ステップ(3)
ステップ(3)では、外部刺激を与えた後の受精卵において卵黄心血管系の状態を測定する。卵黄血管の形成開始時から卵黄血管が消失するまでの間に測定が実施される。ここで、卵黄血管が形成される段階の卵は透明性が高く、胚の状態を外部から把握することが容易である。また、この段階の胚はほとんど静止した状態であることから観察し易い。従って、卵黄血管が形成される時期に測定を実施することによって、血管の状態のみならず胚の状態（例えば心臓の拍動）をも良好な条件で観察し、評価することが可能となる。
上記の通り、ニワトリの卵では通常、胚の発生ステージ１５頃（受精後約２日）に卵黄血管が発生し始め、発生ステージ１７頃（受精後約２日〜３日）には肉眼で容易に観察される程度に血管網を形成する。そして、発生ステージ２２〜２４頃（受精後約３〜４日）に卵黄血管の一部が消失し始め、発生ステージ３０頃（受精後約７日〜８日）には卵黄血管のほぼ完全な消失に至る。一方、尿漿膜血管は通常、胚の発生ステージ１８頃（受精後約３日）に発生し始め、発生ステージ２３頃（受精後約４日）には肉眼で観察できる程度となり、発生ステージ２８頃（受精後約６日目）には卵黄血管よりも優勢となる。尿漿膜血管が優勢になると、尿漿膜血管が障害となって卵黄心血管系の状態を観察し難くなることから、尿漿膜血管が優勢になる前の段階に測定することが好ましい。
以上の卵黄血管及び尿漿膜血管の形成時期を考慮すれば、ニワトリ卵を用いる場合の本発明における測定時期は、例えば胚の発生ステージの１５〜３０（受精後約２日〜８日）であり、好ましくは胚の発生ステージ１５〜２７（受精後約２日〜５日）であり、更に好ましくは胚の発生ステージ１７〜２７（受精後約３日〜５日）であり、更に更に好ましくは胚の発生ステージ１７〜２２（受精後約３日〜４日）である。胚の発生ステージ１７〜２２では、肉眼でも観察できる程度に卵黄血管が形成されており、しかも尿漿膜血管はほとんど認められないことから、卵黄心血管系の状態を容易且つ良好に観察・測定可能である。
尚、ニワトリ以外の鳥類の卵を用いる場合にも、上記の発生ステージと同等の発生ステージに測定を実施することが好ましい。
【００２４】
本発明では卵黄心血管系の状態、即ち卵黄血管の状態及び／又は卵黄血管形成時期の心臓の状態が測定対象となる。具体的には「卵黄心血管系の状態」は、卵黄血管形成時期の血管の面積（例えば、測定領域における総面積）、血管の数（例えば、測定領域における総数）、血管の幅又は径（例えば、注目する血管のもの、又は測定領域における平均）、血管の枝分かれの状態（例えば、注目する血管のもの、又は測定領域における枝分かれの総数や総血管長）、血管の伸長速度、血液量、血液の流速、血球移動速度、及び胚の心拍数を含む。従って本発明では、以上の中から選択される一つ以上が測定項目となる。
これらの中でも血管の面積、血管の数、血管の 血管の幅又は径、血管の枝分かれの状態、及び血管の伸長速度は測定が容易であり、また血管新生の状態を把握するための指標として特に有効であると考えられる。従って本発明の好ましい一態様では測定項目つとして血管の数、血管の面積、血管の幅又は径、血管の枝分かれの状態、及び／又は血管の伸長速度が採用される。
本発明の特に好ましい一態様では測定項目の一つとして血管の総面積が採用される。
【００２５】
卵黄心血管系の状態に加えて、胚の状態を観察・測定することにしてもよい。例えば胚の大きさ、胚の組織の状態（目の大きさなど）を測定対象にすることができる。
【００２６】
肉眼観察、顕微鏡下での観察、カメラ撮影、ビデオ撮影などによって測定が実施される。具体的には例えば、後述の実施例に示すように、デジタルカメラで一定光度下、卵黄上の任意の場所の血管部分（各々の卵黄における血管系の座標位置は各々について予め定義しておくとよい）を、接写角度90°で、薬剤添加後から経時的に撮影する。
【００２７】
卵黄血管を測定する場合（例えば血管の面積、血管の数などの測定）の測定領域は特に限定されず、殻の一部除去によって露呈している卵表面の一部又は全部を測定領域とする。但し、外部刺激を卵の一部領域のみに与えた場合には、当該領域を測定領域とすること、又は当該領域を測定領域に含めることが好ましい。外部刺激を与えた領域は外部刺激の直接的な作用・影響を受ける領域であり、当該領域を測定対象とすれば外部刺激の作用・影響を高感度に測定できるからである。
外部刺激を与えた領域と測定領域とが異なっていてもよい。また、卵の全体に対して外部刺激を与えた場合（例えば卵の露呈部全体に対して被験物質を添加した場合）、露呈部全体を測定領域としても、露呈部の一部のみを測定領域としてもよい。
【００２８】
本ステップにおける測定を複数の時点で実施してもよい。例えば、ある時点から所定時間、連続して測定する。このような経時的な測定によれば卵黄心血管系の状態をモニターすることができる。従って、外部刺激が卵黄心血管系に及ぼす作用・影響の経時的変化を評価できる。卵黄心血管系を測定対象とする本発明の評価方法の一つの特徴は、同個体（卵）を用いてこのような経時的な測定を行えることである。即ち本発明の評価方法によれば複数の測定時点のデータを同個体から得ることができる。従って、測定時点毎に異なる個体が用いられる評価系において問題とされる、個体差に起因する誤差やデータの信頼性の低下のない評価系となる。
【００２９】
４．ステップ(4)
ステップ(4)では、ステップ(3)の測定結果より、外部刺激の卵黄心血管系への作用を評価する。このステップではステップ(3)で得たデータをデータの性質に応じた解析に供する。例えば、デジタルカメラなどによって画像データを得た場合、適当なソフトウエアで画像解析を行う。
【００３０】
通常、外部刺激を与えた卵（試験群）より得たデータと、外部刺激を与えないこと以外は同条件とした卵（対照群）より得たデータとを比較することによって外部刺激の作用を評価する。
例えば、測定項目として血管面積（測定領域における血管の総面積）を採用した場合に試験群の測定値が対照群の測定値よりも小さいとき（即ち外部刺激の結果として測定値の減少が認められるとき）、外部刺激（例えば被験物質）に血管新生抑制作用があると判定できる。これとは逆に試験群の測定値が対照群の測定値よりも大きいとき、外部刺激に血管新生促進作用があると判定できる。
同様に、測定項目として血管数を採用した場合では、血管数の増減に基いて被験物質の血管新生に対する作用を判定できる。
ステップ３で経時的測定を実施した場合には、測定結果（データ）の時間的変化量（速度）に基づいて評価してもよい。
【実施例】
【００３１】
＜ニワトリ初期胚卵黄心血管系を利用した血管新生の定量＞
血管新生は多くの疾患と関係しており、血管新生を調節する方法や薬剤の開発が精力的に行われている。血管新生が関与する疾患として、糖尿病の合併症としての網膜症、炎症性疾患（例えば、リウマチ様関節炎）、高脂血症、腫瘍等がある。血管新生は創傷の治療過程においても重要な役割を果たす。
血管新生は、発生段階における管芽細胞からの全く新しい脈管系の発生と、すでに組織に存在する血管系からの内皮細胞増殖を基本とした新しい血管枝の形成（狭義の血管新生）とに大別される。
【００３２】
ニワトリ初期胚卵黄心血管系を利用した血管新生の定量実験を以下の手順で実施した。尚、図１に実験手順の概要を図解する。
１．転卵培養（孵卵後数日間）
産卵直後の受精卵を温度37.5℃、相対湿度60％の条件下、2.8日間転卵培養した（転卵角度９０°で１時間に２回）。
２．卵殻切断と静置培養（孵卵後数日間経過後）
転卵培養後、鈍端部側の卵殻横面円周を切断し、観察用開口部を卵殻上部に設けた。卵表面にリング状のプラスチック小板（内径約5mm）を載せた後、卵表面が乾燥しないように蓋をし、温度37.5℃、相対湿度60％の条件下、静置培養した。
３．静置培養開始から２４時間後に、プラスチック小板の中央開口部位置（測定領域）の卵表面にPBSで溶解した薬剤（血管新生阻害剤カプトプリル）を以下の通り添加した。尚、薬剤添加後は静置培養を継続した。
実験区１：5 mg/ml(in PBS)のカプトプリル（アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤、シグマ・アルドリッチ社製）を100μl添加
実験区２：0.5 mg/ml(in PBS）のカプトプリルを100μl添加
対照区：PBSを100μl添加
無添加区：添加なし
４．撮影
添加０分後から添加１２０分後まで１０分間隔で測定領域を写真撮影することで（デジタルカメラ）卵黄心血管系の状態を経時的に観察した。
５．画像解析
得られた画像データを次の手順で解析し、測定領域に存在する卵黄血管の総面積を算出した（図２）。
(1)画像データのグレースケール変換
(2)黒点の検出
(3)黒点数と全点数から黒比率の算出
(4)黒比率を血管面積に換算
画像解析結果（血管面積変化率）のグラフを図３に示す。添加６０分後から、薬剤添加区（実験区１、実験区２）と、溶媒添加区又は無添加区との間に有意差が認められる（危険率0.5%）。このようにわずか６０分という短時間で薬剤の作用を明確に判定可能であった。尚、ニワトリ受精卵の尿漿膜血管系を利用して同様の実験を行えば、結果を得るまでに通常１０日以上を要する。その上、血管が多くの場所で重なりあっているので測定データにばらつきが大きくなる。一方、培養細胞を利用した評価系であっても結果を得るまでに通常７日以上を要する。また、測定データは細胞の状態に大きく依存し、信頼性の高い結果を得ることは困難である。
【００３３】
以上の実験例で明らかなように、卵黄血管を利用した評価方法によれば非常に短時間で評価結果が得られる。従って当該方法はハイスループット化に適した評価系である。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、薬剤の添加など外部刺激の作用を短時間で評価することが可能である。例えば以下の目的において本発明の評価方法を利用することができる。
(1)薬剤候補の検索、特に血管新生、血管の伸長・肥大等に作用（抑制又は促進）する薬剤候補の検索
(2)被験物質（例えば薬剤）の血管新生、血管の伸長・肥大等に及ぼす影響（毒性、副作用）の評価
(3)細胞又は組織の培養条件として好ましい外部刺激の検索
【００３５】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ニワトリ卵黄心血管系を利用した評価系を示す図である。
【図２】画像データの解析手順（一例）を示す図である。
【図３】ニワトリ卵黄心血管系を利用した評価系で得られた実験結果のグラフ（血管面積変化率）である。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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