(57)【要約】      （修正有）【課題】プロトロンビンゲノムＤＮＡ中の各イントロンのプロトロンビン発現に及ぼす影響を解析し、高効率でプロトロンビンを発現するためのＤＮＡ断片及び発現ベクターを提供する。 【解決手段】プロトロンビンゲノムＤＮＡのイントロンＫを少なくとも含み、その他のイントロンを組み合わせて、プロトロンビンを高効率で発現できる、ＤＮＡ断片および該断片の塩基配列を有する発現ベクターを構築することからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロトロンビンゲノムＤＮＡのイントロンのうち一以上のイントロンが欠失したＤＮＡ断片であって、少なくともイントロンＫに対応する塩基配列を有することを特徴とする、ＤＮＡ断片。   
【請求項２】
さらに、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ及びイントロンＭから選ばれる少なくとも一種以上のイントロンを有する、請求項１に記載のＤＮＡ断片。  
【請求項３】
さらに、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ及びイントロンＭを有する請求項１に記載のＤＮＡ断片
【請求項４】
さらに、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ、イントロンＬ及びイントロンＭを有する請求項１に記載のＤＮＡ断片。   
【請求項５】
イントロンＦが短縮化されたものである、請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡ断片。 
【請求項６】
イントロンＬが短縮化されたものである請求項４に記載のＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡ断片に対応する塩基配列を有するプロトロンビン発現用ベクター。
【請求項８】
請求項７のプロトロンビン発現用ベクターにより形質転換された細胞。
【請求項９】
請求項８に記載された、形質転換細胞を培地に培養し、得られた培養物からプロトロンビンを採取することを特徴とする、プロトロンビンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトロンビン発現用ＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片の塩基配列を有する発現用ベクター、及び該発現用ベクターにより形質転換された形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
出血時の止血剤として使用されるトロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する作用を有するプロテアーゼの１種であって、生体内ではプロトロンビンの形で存在し、従来、ウシあるいはヒトの血漿から分離、精製されたプロトロンビンを転化して得ているが、これらのトロンビン製剤は、前者では、アナフィラキシーの問題、後者では加熱処理過程においても不活化されないウィルス等の問題が残る。
これに対して、異種動物のタンパク質あるいはウイルスの混入する可能性が低い、遺伝子工学的手法を用いてプロトロンビンの生産を行おうとする試みもなされているが、未だ生産効率の点で満足のいく手法は見いだされていない。
【０００３】
一方、遺伝子工学的手法に基き、血液凝固ＶＩＩＩ因子を高い収率で得るための手段として、ＶＩＩＩ因子のゲノムＤＮＡのイントロン１及び１３（先頭及び最尾部のイントロン）をＶＩＩＩ因子の構造遺伝子に組み込んで発現ベクターを得て、該ベクターを動物細胞に導入して、ＶＩＩＩ因子を生産する方法が知られている（特許文献１）。
しかし、プロトロンビン遺伝子におけるイントロン部分のタンパク質発現に対する作用は未だ明らかにされておらず、上記のようにプロトロンビンのゲノム遺伝子の先頭及び最尾部のイントロン部分を組み込んで発現ベクターを構築し、これを使用しても、プロトロンビン遺伝子はほとんど発現せず、効率的にプロトロンビンを得ることが出来ない。また、プロトロンビン全長遺伝子を用いて発現ベクターを作成することに関しては、長さの問題や多数存在する繰り返し配列のため、遺伝子組み換え操作が行いにくいという遺伝子工学技術上の制約があり、実際に応用するのが困難である。
【特許文献１】特開２００３−７０４９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、遺伝子発現ベクターは、プロモーター、構造遺伝子、転写終結因子で構成されたものが主流である。また最近は先頭、あるいは最尾部のイントロンを組込み、発現効率
を高めている発現ベクターも使用されている。しかし、上記したように、血液凝固因子プロトロンビン遺伝子を従来型のベクターに組込んでも遺伝子発現効率が極めて悪かった。そこで、本発明の課題は、その原因を解析し、高効率でプロトロンビン遺伝子を発現する手段を新たに提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、プロトロンビン遺伝子を発現するためには、従来いわれてきた、プロトロンビンゲノムＤＮＡの先頭のイントロン部分（イントロンＡ）と最尾部のイントロン部分（イントロンＭ）ではなく、少なくともイントロンＫが極めて重要であること、及び該イントロンＫに加え他のイントロン部分を組み合わせれば、さらにプロトロンビンの発現効率が向上できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
【０００６】
（１）  プロトロンビンゲノムＤＮＡのイントロンのうち一以上のイントロンが欠失したＤＮＡ断片であって、少なくともイントロンＫに対応する塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ断片。   
（２）  さらに、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ及びイントロンＭから選ばれる少なくとも一種以上のイントロンを有する、上記（１）に記載のＤＮＡ断片。  
（３）  さらに、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ及びイントロンＭを有する上記（１）に記載のＤＮＡ断片
（４）  さらに、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ、イントロンＬ及びイントロンＭを有する上記（１）に記載のＤＮＡ断片。   
（５）  イントロンＦが短縮化されたものである、上記（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡ断片。 
（６）  イントロンＬが短縮化されたものである上記（４）に記載のＤＮＡ断片。
（７）  上記（１）〜（６）のいずれかに記載のＤＮＡ断片に対応する塩基配列を有するプロトロンビン発現用ベクター。
（８）  上記（７）のプロトロンビン発現用ベクターにより形質転換された細胞。
（９）  上記（８）に記載された、形質転換細胞を培地に培養し、得られた培養物からプロトロンビンを採取することを特徴とする、プロトロンビンの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、プロトロンビンゲノム遺伝子のイントロンのうちどのイントロンがプロトロンビンの発現に重要であるかを明らかにしたものである。また、このような知見に基づき構築された、プロトロンビン発現用ベクターであるInAdFJKdLMは極めて高いプロトロンビン発現効率を有し、プロトロンビンの生産に大いに資するものである。一方、本発明のプロトロンビン発現用ベクターに組み込まれた特定のイントロン部分を有するプロトロンビン遺伝子ＤＮＡ断片は、それ自体他のベクターに組み込むことにより、プロトロンビンのより効率的な生産を可能にするものである。したがって、本発明は、医薬生産の分野において大いに貢献するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
プロトロンビンのゲノムＤＮＡは、27kｂｐsの塩基対からなり、図１０（Ａ）に示されるように、１４個のエクソンと、イントロンＡ〜Ｍの１３個のイントロンからなる。ヒトプロトロンビンの全長ゲノムＤＮＡの塩基配列は、配列番号1〜26928に示される（GenBank:g558069)。
この塩基配列において、エクソン１〜１４は、それぞれエクソン１:6544〜6653番目、エクソン２:7040〜7200番目、エクソン３:7860番目〜7884番目、エクソン４:8127〜8177番目、エクソン５:10504〜10609番目、エクソン６:10706〜10842番目、エクソン７:13181〜13495番目、エクソン８:13820〜13948番目、エクソン９:14033〜14159番目、エクソン１０:15317〜15484番目、エクソン１１:15982〜16155番目、エクソン１２:16698〜16879番目、エクソン１３:26327〜26397番目、エクソン１４:26544〜26687番目に位置し、また、イントロンＡ〜Ｍは、それぞれイントロンA：6654〜7039番目、イントロンB：7201〜7859番目、イントロンC：7885〜8126番目、イントロンD：8178〜10503番目、イントロンE：10610〜10705番目、イントロンF：10843〜13180番目、イントロンG：13496〜13819番目、イントロンH：13949〜14032番目、イントロンI：14160〜15316番目、イントロンJ：15485〜15981番目、イントロンK：16156〜16697番目、イントロンL：16880〜26326番目、イントロンM：26398〜26543番目に位置する。
【０００９】
本発明におけるプロトロンビンを発現するためのＤＮＡ断片は、プロトロンビンゲノムＤＮＡにおけるイントロンの一部を削除したものであるが、少なくともイントロンＫを有する。
さらに、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ及びイントロンＭから選ばれる少なくとも一種以上のイントロンを有する。
これらのＤＮＡのうち最もプロトロンビンの発現効率が高いものは、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ、イントロンＫ、イントロンＬ及びイントロンＭを有するものである。また、イントロンＡ、イントロンＦ、イントロンＪ、イントロンＫ、及びイントロンＭを含むもの、イントロンＡ、イントロンＪ、イントロンＫ、及びイントロンＭを含むものも発現効率が高い（図１０（Ｂ））。
【００１０】
これらＤＮＡにおけるイントロン部分は、発現効率を低下させない限り、短縮化して用いることができる。例えば、図１０（Ｂ）中ｄＦはイントロンＦの両端を5’側で109 bps、 3’側で278 bpsずつ残し、中央部1945 bpsを欠失させたものである。ｄＬはイントロンＬの両端を5’側で333 bps、 3’側で268 bpsずつ残し、中央部8839 bpsを欠失させたものである。
本発明のプロトロンビンを発現するための上記各イントロン部分を含むＤＮＡ断片は、例えば、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとし、各エクソン及びイントロン部分の塩基配列をもとに作成したプライマーを使用してＰＣＲ増幅して、各エクソン及びイントロン部分に対応するＤＮＡを作成し、これをクローニングしながら順次結合せしめて作成してもよいが、以下に示す手法により作成したプロトロンビン発現用ベクターから、適当な制限酵素を用いて直接切り出すことにより、簡便に得ることができる。
【００１１】
本発明のプロトロンビン発現用ベクターは、上記したイントロン部分を含むプロトロンビンＤＮＡ断片の塩基配列を有するベクターである。
本発明のプロトロンビン発現用ベクターを得るには、Ｄｅｇａｎらがクローニングしたヒトプロトロンビンの構造遺伝子部分のｃＤＮＡ（Ｋ３０） (参考文献 Degen, S.J.,
MacGillivray, R.T. & Davie, E.W. Characterization of the complementary deoxyribonucleic acid and gene coding  for human prothrombin. Biochemistry 22, 2087-97 1983 )を、例えば、マルチクローニングサイトを有するプラスミドに導入し、該プラスミドに各エクソン及びイントロン部分その他のフラグメントを常法により順次組み込むことにより得られる。各エクソン及びイントロン部分に対応するＤＮＡは、例えばヒト白血球ゲノムＤＮＡあるいは上記プロトロンビン構造遺伝子等をテンプレートとし、各エクソン及びイントロン部分の塩基配列をもとに作成したプライマーを使用してＰＣＲ増幅することにより得られる。また、この際、両端に上記プラスミドに組み込むための制限酵素部位を設ける。本発明で使用するプラスミドを例示すると、ＰＵＣ１９、ＰＵＣ１８、pBluescript、pCMV等が挙げられる。
【００１２】
本発明において各エクソン及びイントロン部分その他のフラグメントの作成に用いた、ＰＣＲのテンプレート及び各プライマーは表１に示される。
なお、上記ヒトプロトロンビン構造遺伝子については、Ｄｅｇａｎによりリリースされており、第三者において入手可能である。
プロトロンビンを生産するには、このようにして得られた本発明のプロトロンビン発現用ベクターを宿主細胞に導入するか、あるいは上記DNA断片をCMV、SV４０、EF1-alpha、UbC等の高発現プロモーターを有する発現用ベクターに組込み、宿主細胞に導入して形質転換し、この形質転換体を培地に培養し、培養物からプロトロンビンを採取することにより得られる。使用する宿主細胞としては、例えば、COS細胞、BHK細胞、3T3細胞、CHO細胞、２９３細胞、TLR−２細胞等が挙げられる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１３】
〔実施例１〕プロトロンビン発現用ベクターの作製
（１）K30/pUC19の作成（図１参照）
以下の手法によりDeganから供与されたcDNA(K30)をプラスミドpUC19にEcoRIサイトからBamHIサ イトまで挿入し、K30/pUC19を作成した。
挿入断片の切り出しとしてK30 2μg を制限酵素EcoRI及びBamHIを各20単位で37℃２時間反応させた（バッファー条件： Tris-HCl 10mM、MgCl2 5 mM、NaCl 100 mM、2-Mercaptoethanol 1 mM、BSA100μg/ml、pH 8.0、反応液量20μl）。pUC19 1.2μgも同様にマルチクローニングサイトをEcoRI 及びBamHIで処理した。各反応液を0.6%アガロースゲルで電気泳動にかけ、ゲルを切り出し、Ultrafree-MC Filter Unit (Millipore)により各DNA断片を分離し、以後phenol、phenol/chloroform/isoamylalcohol抽出、エタノール沈澱を通常法に従い行った。各DNA 断片のぺレットを30μlのTris- EDTAバッファーに溶解し、切出し精製処理された K30 pUC19各DNA断片約10 ngずつをT4DNAリガーゼ  200単位で16℃、1時間30 分反応させ結合させた（バッファー条件：Tris-HCl 50mM、MgCl2 10 mM、dithiothreitol 10 mM、ATP 1mM、BSA 25μg/ml、pH 7.5、反応液量20μl）。反応液5μlをコンピテントセルOne Shot TOP10F’ ( Invitrogen )を用い大腸菌に遺伝子を導入し、LBプレートに生えて来たコロニーを拾い2mlのLB培地で小規模培養し、CONCERT Rapid Plasmid Purification System (旧GibcoBRL、現Marligen)でミニプレップを行い、各コロニー由来のプラスミドを制限酵素処理でスクリーニングすることにより、目的断片の挿入された大腸菌クローンを同定した。
【００１４】
（２）K30+3’UTR/pUC19の作成（図１参照）
以下の手法で、K30+3’UTR/pUC19を作製した。
BamHIサイトから3’UTRまでの部分を、２つのフラグメント (BamHI 2049-NsiI
2297 及びNsiI 2298-SphI 2510)をPCRで増幅し、各断片を制限酵素処理した。上記（１）で作製したベクター K30/pUC19も同様に制限酵素処理し、前記（１）と同様にT4DNAリガーゼを用いてPCR断片をベクターに挿入した（図１、K30+3’UTR/pUC19）。PCRで用いたプライマー、テンプレートは表１の通りである。PCR反応の温度条件は94℃ 3分→（94℃ 15秒→50℃ 30秒→72℃ 45秒）X10cycle→（94℃ 15秒→50℃ 30秒→72℃ 50秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃7分→4℃ hold、 機器としてはEppendorf Master Cycler Gradient を使用した。使用したテンプレートはゲノムDNAの場合400ng、プラスミドDNAの場合10ngを用いた。  反応試薬はExpand High Fidelity PCR System（旧Boehringer Mannheim 現Rche）を用い、附属の酵素を2.6単位、バッファーは附属のものを使用、MgCl2は終濃度1.5 mM、dNTPの終濃度400 mM、プライマーの終濃度500 mM、反応液50μl の条件でPCRを行った。
【００１５】
PCRプロダクトの精製はUltrafree-MC Filter Unit (Millipore)により各DNA断片を分離後phenol、phenol/chloroform/isoamylalcohol抽出を行い、エタノール沈澱の通常法に従い行った。BamHI処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 5 mM、NaCl 100 mM、2-Mercaptoethanol 1 mM、pH 8.0、反応液量20μl）。NsiI処理はDNA約1μgに対し 酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 50mM、MgCl2 5  mM、NaCl 100 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.5 、反応液量20μl）。SphI処理はDNA 約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl  10mM、MgCl2 5 mM、NaCl 50 mM、dithiothreitol
1 mM、pH 7.5 、反応液量20μl）。
以後電気泳動による、ゲルの切り出し、精製、ライゲーション反応、大腸菌の形質転換、クローンのスクリーニングは前記（１）と同様に行った。
【００１６】
（３）InAの作製（図１、表１参照）
以下の手法により、5’flanking 領域、5’UTR及びイントロンAの追加を、２つのPCRフラグメント（表１中、ＥcorI 396-NheI 1825及びNheI 1826-StuI 2088)をベクターK30+3’UTR/pUC19に挿入することにより行い、InAを作成した。
EcoRI 396-NheI 1825のフラグメントは一度のPCRでは得られなかったので、表１にあるプライマーAとプライマーF （配列GTCTCCTCCACGCACTCTCGCTCTAG）で1st PCRを行い、これをテンプレートにして目的のフラグメントをNested PCRで増幅させた。PCR反応の条件は94℃3分→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 60秒）X10cycle→（94℃ 15 秒→55℃ 30秒→72℃65秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ hold。NheI 処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で24時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 5 mM、NaCl 50 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.5 、反応液量20μl）。StuI I処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で3時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 5 mM、NaCl 50 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.9 、反応液量20μl）。EcoRI処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で3時 間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 50mM、MgCl2 5 mM、NaCl 100 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.5 、反応液量20μl）。他の処理は前記（２）までの工程と同様である。但しStuI は平滑末端であるため、ライゲーション反応を２４時間に延長した。
【００１７】
（４）InAMの作成（図２、表１参照）
イントロンMの追加を、２つのPCRフラグメント（BamHI 3505-BspHI 3600及びBspHI 3601-NsiI 3897）をベクターInAに挿入することにより行い、ベクターInAMを作製した。
PCR反応の条件は94℃ 3分→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 45秒）X10cycle→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 50秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ hold。PCRプロダクトの精製は前工程までとは異なり、 CONCERT Rapid PCR Purification System (旧GibcoBRL、現Marligen)で行った。最終的にDNAは50μlのTris-EDTAバッファーに溶解される。以後のPCRプロダクトの精製はこの方法による。BamHI NsiIの制限酵素処理条件は前述通り、但し反応時間は1 時間30分、反応液は60μlの系に変更した。  BspHI処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を37℃で1時間30分反応させた（バッファー条件：potassium acetate 50mM、magnesium acetate 10 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.9 、反応液量60μl）。電気泳動後のゲル切り出し処理に続く精製は前工程までとは異なり、CONCERT Gel Extraction System (旧GibcoBRL、現Marligen)で行った。最終的にDNAは50μlのTris-EDTAバッファーに溶解される。以後の工程においての制限酵素処理済みのDNA断片の精製はこの方法による。
【００１８】
以後の工程においては、この先頭のイントロンAおよび最尾部のイントロンMが存在するベクターInAMを基本ベクターとして、他のイントロン（群）を追加していった。
（５）InABCMの作製（図３、表１参照）
以下に示す手法により、イントロンBおよびCの追加を１つのPCRフラグメント（NheI 1826-XphoI 3070）をベクターInAMに挿入することにより行い、ベクターInABCMを作製した。
PCR反応の条件は94℃ 3分→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 2分）X10cycle→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 2分5 秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ hold。NheI及びXhoIの処理はDNA約1 μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl10mM、MgCl2 10 mM、NaCl 50 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.9 、BSA100μg/ml）。他の処理は前記（４）までの操作と同様である。
【００１９】
（６）InADEMの作製（図４、表１及び表２参照）
以下に示す手法により、イントロンDおよびイントロンEの追加を、3ステップにわけて行い、ベクター InADEMを作製した。
表１のInAdDEMの欄に記載のテンプレート及びプライマーを用いて、２つのＰＣＲフラグメント(XphoI2170-KpnI3534及びKpnI3535-BsmI3832)を作成し、該２つのPCRフラグメントをベクターInAMに挿入して、イントロンDおよび次に続くエクソン５が欠失したベクターInAdDEMを作製した。
次にこの欠失部分を、表１のInADEMの欄記載のテンプレート及びプライマーを用いて作成したPCRフラグメント(KpnI3535-KpnI4556)の挿入により埋めて、ベクターInADEMを作成した。最後にアダプターとして使用したエクソン５部分のKpnIをsite directed mutagenesisにより取り除いて（表２及び図４）、ベクターInADEM-KpnIを得た。
【００２０】
PCR反応の条件は94℃ 3分→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 2分）X10cycle→（94℃ 15秒 →55℃ 30秒→72℃2分5秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ holdであり、KpnI の除去処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Bis Tris Propane-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.0 、BSA100 μg/ml）。XhoIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Bis Tris Propane-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、NaCl 50 mM、 dithiothreitol
1 mM、pH 7.0 、BSA100μg/ml）。BsmIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 65℃で２時間反応させた（バッファー条件：Bis Tris Propane-HCl 10mM、 MgCl2 10 mM、NaCl 50 mM、 dithiothreitol 1 mM、pH 7.0 、BSA100μg/ml）。他の処理は前述の操作と同様。またInADEMを作製するためにInAdDEMをKpnIで切断したものををベクターとして用いたが、この時ベクターのセルフライゲーションを防ぐために、アルカリフスファターゼ処理を行っている。  DNA約1μgに対しCIAP（仔ウシ小腸由来アルカリ性フォスファターゼ、Roche）を2単位（60μlの反応系）使用し、37℃ で1時間30分反応させた。反応バッファーは酵素に附属されているものを使用した。site directed mutagenesisはQuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用い、 プロトコールに従い行った。ただし附属のQuikSolutionは反応液には使用せず、またアニーリングの温度もプロトコールでは60℃になっているが、実際は55℃で行った。
【００２１】
（７）InAdFMの作製（図５、表１参照）
イントロンdF（イントロンFの中央部分が欠失）の追加を２つのPCRフラグメント(BsmI 2421-KpnI 2551 及び KpnI 2552-BstEII 2953)をベクターInAMに挿入することにより行い、InAdFMを作製した。
PCR反応の条件は94℃ 3分→（94℃ 15秒→50℃ 30秒→72℃ 60秒）X10cycle→（94℃ 15 秒→50℃30秒→72℃ 65秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ hold。  KpnI の処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Bis Tris
Propane-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.0 、BSA100
μg/ml）。BsmIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 65℃で２時間反応させた
（バッファー条件：Bis Tris Propane-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、NaCl 50 mM、
dithiothreitol 1 mM、pH 7.0 、BSA100μg/ml）。BstEIIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 60℃で２時間反応させた（バッファー条件：Bis Tris Propane-HCl 10mM、 MgCl2 10 mM、NaCl 100 mM、 dithiothreitol 1 mM、pH 7.0 、BSA100μg/ml）。他の処理は前工程までの操作と同様である。
【００２２】
（８）InAGHIMの作製（図６、表１参照）
以下に示す手法イントロンGおよびイントロンHおよびイントロンIの追加を２つのPCRフラグメント（BstEII 2561-BstUI 4225及びBstUI 4226-BspEI 4848)をベクターInAMに挿入することにより行い、ベクターInAGHIMを作製した。
PCR反応の条件は94℃ 3分→（94℃ 15秒→60℃ 30秒→72℃ 120秒）X10cycle→（94℃15秒→60℃ 30秒→72℃ 125秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ hold。
BstEIIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 60℃で２時間反応させた（バッフ ァー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、NaCl 100 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.9）。 BspEIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッフ ァー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、NaCl 100 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.9）。
BstUIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 60℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、NaCl 50 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.9）。 他の処理は前工程までの述の操作と同様である。
【００２３】
（９）InAJKMの作製（図７、表１参照）
イントロンJおよびイントロンKの追加を、１つのPCRフラグメント（BspEI 3028-BamHI 4543）をベクターInAM に挿入することにより行い、InAJKMを作製した。  PCR反応の条件は94℃ 3 分→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 2分）X10cycle→（94℃ 15秒→55℃ 30秒→72℃ 2分5秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ hold。BspEIの処理はDNA約1 μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 50mM、MgCl2 10 mM、NaCl 100 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.9）。
BamHIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた。（バッファー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、 NaCl 150 mM、dithiothreitol  1 mM、BSA100 μg/ml、pH 7.9 ）。他の処理は前工程までの操作と同様である。
【００２４】
（１０）InAdLM の作製（図８、表１参照）
イントロンdL（イントロンLの中央部分が欠失）の追加を２つのPCRフラグメント（BamHI 3505-KpnI 3807及びKpnI3871-XbaI 4281)をベクターInAMに挿入することにより行い、ベクターInAdLMを作製した。
PCR反応の条件は94℃ 3分→（94℃ 15秒→50℃ 30秒→72℃ 2分）X10cycle→（94℃ 15 秒→50℃30秒→72℃ 2分5秒＋5秒／cycle）X18cycle→72℃ 7分→4℃ hold。 KpnIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件： Tris-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、dithiothreitol
1 mM、pH 7.5 、BSA100μg/ml）。XbaIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 50mM、MgCl2 10 mM、NaCl 100 mM、dithiothreitol 1 mM、pH 7.5 、BSA100 μg/ml）。 BamHIの処理はDNA約1μgに対し酵素10単位を 37℃で２時間反応させた（バッファー条件：Tris-HCl 10mM、MgCl2 10 mM、 NaCl 150
mM、dithiothreitol 1 mM、BSA100μg/ml、pH 7.9 ）。他の処理は前工程までの操作と同様である。
【００２５】
以上の各ベクターを作製するために使用した各フラグメント、及びその作製のために使用したＰＣＲテンプレート及びプライマーを以下の表１、２にまとめて示す。
【表１】
2006136260.tif 000002
【表２】
2006136260.tif 000003
【００２６】
（１１） 高効率発現ベクターInAdFJKdLMの作製（図９参照）
上記のようにイントロンを種々組み合わせて作製した各発現ベクターにより、培養細胞をそれぞれ形質転換し、細胞培養上清中の蛋白レベル(ELISA)を測定した結果のデータをもとに、発現に関与していると考えられるイントロンdFを、ベクターInAJKMに追加して、ベクターInAdFJKMを作製した。また、このベクターInAdFJKMに、さらにイントロンdLを追加して、ベクターInAdFJKdLMを作製した。
このプロトロンビン遺伝子発現ベクターInAdFJKdLMの配列データは以下のとおりである。
5'flanking region & UTR: 401-1491, Exon1: 1492-1570, Intron A: 1571-1962, Exon2- Exon6: 1963-2442, Intron dF: 2443-2835,
Exon7- Exon10: 2836-3574, Intron J: 3575-4071, Exon11: 4072-4245, Intron K:
4246-4787, Exon12: 4788-4969, Intron dL: 4970-5577, Exon13: 5578-5648, Intron
M: 5649-5792, Exon14: 5793-5936, 3'UTR & flanking region: 5937-6150
【００２７】
〔実施例２〕  各発現ベクターのプロトロンビン発現レベルの測定
実施例１で得られた各発現ベクターを培養細胞に遺伝子導入し培養上清中のプロトロンビン蛋白レベルをELISAで測定した。
培養細胞はマウス肝臓TLR-2細胞を用い、該細胞を6-well plateで培養し、FuGENZE6
(Roche社)で添付マニュアルに従い遺伝子導入し、24時間後に培養液にビタミンK1を終
濃度20μg/mlになるように加え、遺伝子導入から48時間後に培養上清を回収し、培養上清中のプロトロンビンタンパク質の量をELISAで測定した（参考文献Yanai, N.,
Suzuki, M. & Obinata, M. Hepatocyte cell lines established from  transgenic mice harboring temperature-sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Exp  Cell Res 197, 50-6 1991）。
該ELISAに用いた一次抗体はHaematologic Technologies Inc.のAnti-Human Prothrombin (AHP-5013)を終濃度10μg/mlで使用した。また二次抗体はAffinity Biologicals Inc.のSheep anti-human ThrombinigG-Peroxidase conjugate (SAHT-HRP)を終濃度2μg/mlで使用した。測定法は通常法に従った。
【００２８】
結果を図１０（Ｂ）に示す。これによれば、細胞発現ベクターInAdFJKdLMは極めて効率良く蛋白を発現することが分かる。また、発現ベクターInAdFJKM及びInAJKMも高い発現効率を示している。これに対して、プロトロンビンの先頭と最後のイントロン（イントロンＡ、M）のみ有するもの、及びさらにイントロンＢ、Ｃ、Ｄ，Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉを追加しても、これらは、プロトロンビン蛋白の発現は全くないか、極めて低い。一方、イントロンＡ、MにイントロンｄＦ、Ｋ、ＪあるいはｄＬを追加したものはプロトロンビン蛋白の発現を有するようになる。この中ではイントロンＫの発現活性が一番高い。
【００２９】
さらに、 RT-PCRによりRNAレベルを以下のように測定した。常法にしたがい、Stable
Cell Lineを作製し、total  RNAをQIAGENのRNeasy Mini Kitで回収した。逆転写反応に用いたプライマーはmRNA 検出用の配列がTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCTGAGAGT、premature RNA検出用の配列がGCACTGGGAGCATTGAGGCTである。逆転写反応に用いた酵素はTaKaRa High Fidelity RNA PCR kitに含まれるBca PLUS RT aseを添付のマニュアルどおり使用した。ただし、逆転写反応の反応温度は60℃ 30分→98℃ 5分→4℃ holdを使用した。PCR反応はInvitrogenのAccuPrime Taq DNA Polymerase Systemを使用し、反応温度条件は95℃ 2 分→（95℃ 15秒→55℃ 30秒→68℃  1分）X28cycle→4℃ holdで行った。プライマーの組み合わせはforward primerがGAGCCCCTTTAACAACCGCTGGT reverse primer がGAGCCCAGAATATGAGTGGCCCである。結果を図１１に示す。
図１１によれば、イントロン部分を全く有しないもの、イントロンＡのみあるいはイントロンＡ，Ｍを有するものでは、poly(A) tailが付加された成熟ｍＲＮＡの産生が低い。これに対して、InAdFJKdLMの場合はpoly(A) tailが付加された成熟ｍＲＮＡの産生が顕著
に増加していることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】発現ベクターK30/pUC19、 K30+3’UTR/pUC19、 InAの作製工程の概略を示す図である。
【図２】発現ベクターInAMの作製工程の概略を示す図である。
【図３】発現ベクターInABCMの作製工程の概略を示す図である。
【図４】発現ベクターInADEMの作製工程の概略を示す図である。
【図５】発現ベクターInAdFMの作製工程の概略を示す図である。
【図６】発現ベクターInAGHIMの作製工程の概略を示す図である
【図７】発現ベクターInAJKMの作製工程の概略を示す図である
【図８】発現ベクターInAdLMの作製工程の概略を示す図である
【図９】発現ベクターInAdFJKM、InAdFJKdLMの作製工程の概略を示す図である
【図１０】各発現ベクター導入細胞培養上清中のプロトロンビン蛋白レベルをＥＬＩＳＡにより測定した結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の発現ベクターInAdFJKdLMと、他の発現ベクターInA、InAMとにおいて、RT-PCRによりmRNAレベルを測定した結果を示す写真である。
【図１】
2006136260.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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