(57)【要約】【課題】  内分泌撹乱物質、病因分子、ガン細胞等と特異的に結合し、かつ光触媒作用によりそれらを分解可能な、分子識別能を有する光触媒性二酸化チタン複合微粒子を提供する。【解決手段】  二酸化チタン微粒子表面が親水性高分子により修飾され、該親水性高分子のアミンと二酸化チタンは強く結合しているとともに、前記親水性高分子のアミンに目的分子に対して特異的な結合能を有する分子を固定化して、分子識別能を有する光触媒性二酸化チタン複合微粒子を得る。【選択図】  図１
2006150344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面の一部に光触媒性二酸化チタンが存在する微粒子の表面が、親水性高分子アミンにより表面を修飾された光触媒性二酸化チタン複合微粒子であって、該親水性高分子と光触媒性二酸化チタンが結合しているとともに、該親水性高分子のアミンに生体分子を固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含んでなることを特徴とする、分散液。
【請求項２】
前記微粒子は、光触媒性二酸化チタンの粒径が２〜２００ｎｍの光触媒性二酸化チタンであることを特徴とする、請求項１記載の分散液。
【請求項３】
生体への導入が許容される水溶液中に、請求項１または２に記載の二酸化チタン複合微粒子を含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の分散液。
【請求項４】
前記水溶液がｐＨ３〜９であることを特徴とする、請求項３に記載の分散液。
【請求項５】
前記水溶液がｐＨ緩衝液であることを特徴とする、請求項４に記載の分散液。
【請求項６】
前記水溶液が塩濃度１Ｍ以下であることを特徴とする、請求項３〜５いずれか一項に記載の分散液。
【請求項７】
前記水溶液が生理食塩水であることを特徴とする、請求項６に記載の分散液。
【請求項８】
生体への導入が許容される包括体に、該光触媒性二酸化チタン複合微粒子が包括されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項９】
前記包括体が、リポソーム、ウイルス粒子、中空ナノ粒子のいずれかであることを特徴とする、請求項８に記載の分散液。
【請求項１０】
前記微粒子は、磁性粒子と光触媒性二酸化チタンからなる複合微粒子であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１１】
前記光触媒性二酸化チタンがアナターゼ型であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１２】
前記親水性高分子が水溶性高分子であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１３】
前記水溶性高分子がポリエチレンイミンであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１４】
前記生体分子がアミノ酸、ペプチド、単純タンパク質、および複合タンパク質のいずれかであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１５】
前記単純タンパク質がレクチンであることを特徴とする、請求項１４に記載の分散液。
【請求項１６】
前記生体分子がヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１７】
前記生体分子が単糖、糖鎖、多糖、および複合糖質であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１８】
前記生体分子が単純脂質、複合脂質、リポソームであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１９】
前記生体分子の代わりに、前記親水性高分子のアミンに蛍光色素を固定化したことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項２０】
前記分散液が、前記光触媒性二酸化チタン複合微粒子を重量百分率で０．０００１〜０．１％含んでなることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の分散液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞、内分泌撹乱物質などに対する分子認識能を有する抗体などの生体分子を固定化し、紫外線の照射などによってこれらの分解作用を示す光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、内分泌撹乱物質の分子認識能を有するＤＮＡなどの生体分子を支持体上に固定化した選択的吸着性を有する材料が環境浄化材料として提案されている（例えば、特許文献１参照）。一方、アナターゼ型二酸化チタンには光触媒作用があり、その強い酸化力により微生物、汚れ、悪臭物質等の有機物を分解することが知られている。現在では、二酸化チタンと活性炭やゼオライトなどの無機吸着剤を複合化することにより、二酸化チタンの分解効率を高めるような工夫がなされている（例えば特許文献２参照）。二酸化チタンの表面処理においても、パラジウムなどの還元反応促進触媒金属を二酸化チタン等の光触媒表面に析出させることで、光触媒の酸化、還元反応を促進することが考案されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００３】
しかしながら、ＤＮＡ等による内分泌攪乱物質の選択的吸着材料については、吸着した内分泌攪乱物質等の確実な除去・分解手段が無く、かつ吸着飽和の問題から浄化能力にも限界がある。また、前記の二酸化チタンの光触媒としての能力を高めようとする考案についても、特定物質の吸着や分解を指向していない。したがって、例えば内分泌攪乱物質のみを選択的に吸着し分解することは不可能である。このように、生体分子により特定の物質を選択的に吸着してこれを光触媒の強い酸化力によって分解する、すなわち「選択的吸着能と光触媒能との組み合わせ」については知られていない。
【特許文献１】特開２００１−８１０９８号公報
【特許文献２】特開平１−１８９３２２号公報
【特許文献３】特開昭６０−１４９４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、選択的吸着能生体内での中性な生理的条件下においても安定して分散し、存在することが可能な、光触媒性二酸化チタン複合微粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行い、二酸化チタン表面を親水性高分子で修飾した後に生体分子を固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子が、選択的吸着能と光触媒能を両立できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液はアナターゼ型二酸化チタン表面に親水性高分子アミンを有し、該親水性高分子のアミンと二酸化チタンはが強く結合しているとともに、前記親水性高分子のアミンに生体分子を固定化することを可能とし、さらに、分散剤等の他物質の添加無しに、分散性が極めて良好で安定な分散液である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、、選択的吸着能生体内での中性な生理的条件下においても安定して分散し、存在することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の実施の形態を図面に基づいて具体的に説明する。図１は本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を示す模式図である。本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液はアナターゼ型二酸化チタン（１）と、生体分子と結合する親水性高分子アミン（２）を非プロトン性極性溶媒に分散させて、９０〜１８０℃で１〜１２時間水熱反応を行い、親水性高分子と二酸化チタンとの間で共有結合を生成させた後、水溶液に分散し、親水性高分子のアミンに生体分子（３）を固定化させたものである。これにより、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子のみで分散剤等の他物質の添加無しに、水溶液中において安定して分散可能であることを特徴とするものである。生体分子の固定化には、光触媒性二酸化チタン複合微粒子表面の二酸化チタンと親水性高分子の結合に関与していないフリーのアミンを用いることができる。生体分子側は、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、糖鎖に由来するアルデヒド基等を持つ為、適切な架橋剤を用いることにより両者を共有結合させることが可能である。
【０００９】
生体分子としては多種多様なものが考えられるが、最も利用されているものとしてタンパク質が挙げられる。本発明によれば、タンパク質として抗体、レセプターから低分子ペプチドまで好適に固定化が可能である。また、タンパク質の化学組成から光触媒性二酸化チタン複合微粒子への固定化にはアミノ基、カルボキシル基やチオール基、糖タンパクの場合ではアルデヒド基を固定化の際の標的官能基にすることが可能である。更には両者間をビオチンとアビジンの相互作用を利用して固定化することも可能である。
【００１０】
このような場合、ニ官能性のリンカー試薬を用いることで、光触媒性二酸化チタン複合微粒子と生体分子間の結合は達成される。ニ官能性のリンカー試薬としてホモ官能基のものを用いれば、光触媒性二酸化チタン複合微粒子表面のアミンと生体分子に由来するアミノ基間に容易に共有結合を導入することが可能である。また、ヘテロ官能基を持つものを用いれば、生体分子側にチオール基、カルボキシル基を持つ生体分子が導入可能である。
【００１１】
また、生体分子に限らず、蛍光色素や検出用プローブ物質等も適当な官能基の導入により光触媒性二酸化チタン複合微粒子への固定化が可能である。
【００１２】
アミノ基同士のホモリンカー試薬としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを持つもの、具体的にはＤｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅやＢｉｓ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）  ｓｕｂｅｒａｔａｔｅ等およびイミドエステルを持つもの、具体的にはＤｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｐｉｍｉｄａｔｅやＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ等があり、好適に用いることができる。
【００１３】
また、ヘテロ官能基の組み合わせは、光触媒性二酸化チタン複合微粒子表面のアミンに対しては上述のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステルが、生体物質側のチオール基に対しては、マレイミド基を有するもの、具体的にはＮ−（ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ等を用いることができる。
【００１４】
核酸の固定化を行う場合にはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅の際に、アミノ化プライマー、チオール化プライマー、ビオチン化プライマーを用いて修飾ＤＮＡを合成することにより、同様の方法で光触媒性二酸化チタン複合微粒子へ固定化することが可能である。例えば、アミノ化ＤＮＡを固定化に用いる場合、光触媒性二酸化チタン複合微粒子表面のアミンとの間に二官能性ホモリンカーを用いれば、両者を混合するだけで固定化を行うことができる。また、チオール化ＤＮＡを用いる場合、上述のニ官能性ヘテロリンカーを用いれば、アミン−チオール間を結合することができる。
ビオチン化ＤＮＡを用いる場合には、光触媒性二酸化チタン複合微粒子にストレプトアビジンを導入することが必要であるが、この場合には、上述のアミノ基に対する二官能性ホモリンカーを用いることで容易に導入が可能である。
【００１５】
複合タンパク質や糖質などに由来する糖鎖の固定を行う場合は、シス−ジオールを過ヨウ素酸などによりアルデヒドに酸化し、光触媒性二酸化チタン複合微粒子のアミンとＳｏｄｉｕｍ  ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅの存在下でシッフ塩基を形成させることにより固定化が可能であるが、二官能性リンカーを用いて架橋形成することも可能である。
【００１６】
タンパク質や糖質の一部など、生体分子側がカルボキシル基を持つ場合、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）により活性化を行い、光触媒性二酸化チタン複合微粒子と混合することにより両者間の架橋が可能である。
【００１７】
本発明で用いる親水性高分子としては水溶液中での分散性の観点から水溶性高分子が望ましい。水溶性高分子としては、重量平均分子量が１０００〜１０００００の範囲にあるアミンであればいずれも使用可能であるが、例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用される。
【００１８】
また、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子の材料として用いる二酸化チタンとしては、癌治療用として体内への適用の場合など、その使用形態の自由度の観点から分散粒経が２〜２００ｎｍであることが望ましい。さらに、本発明で用いる二酸化チタンとしては、光触媒活性の観点からアナターゼ型であることが望ましい。
【００１９】
また、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子は、分散性の観点から分散粒経が２〜５００ｎｍであることが好ましい。癌治療用として体内への適用の場合、腫瘍細胞への蓄積効果の観点から分散粒経が５０〜２００ｎｍであることがより好ましい。このような範囲とすることで、生理的条件下で２４時間以上にわたって、安定した分散が可能となる。尚、ここでいう分散粒径とは、動的光散乱法によって測定を行い、キュムラント法解析から算出される平均値のことを示している。また、ここでいう生理的条件下とは２５℃、１気圧で
（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，２．６８ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）の組成であるリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）存在下のことを示す。
【００２０】
さらに、上述した二酸化チタンが少なくとも表面に存在すれば、たとえば磁性粒子と二酸化チタンとの複合体のようなものであっても、水溶液中での特性は近似し、親水性高分子アミンにより表面を修飾することで、アミンを介した生体分子の固定化は可能であるため、同様の製造法、精製法を適用することができる。
【００２１】
また、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子は、表面上に存在するアミンにより、粒子間に電気的斥力が働くために凝集することなく、少なくとも２４時間以上にわたって安定に存在することによる。しかも、基本的にｐＨの変動や無機塩類の添加に対しても極めて安定である。さらに、表面上に存在するアミンによって表面電荷が正に帯電していることから、一般的に負の表面電荷をもつ細胞への親和性、取込み性が著しく高く、癌細胞の破壊を目的とした医療用材料として極めて有用である。これらの観点から、表面電位の最適範囲としては、良好な分散性と細胞取込み性を達成できる範囲にあればよく、＋２０ｍＶ以上あればよい。さらに望ましくは、一般に自主分散（粒子が沈殿しない状態）が十分に達成できる電位として＋４０ｍＶ以上あればよい。
【００２２】
また、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子は、光触媒性二酸化チタン複合微粒子間に電気的斥力が働くために凝集することなく、少なくとも２４時間以上にわたって安定することができ、これを達成できる塩濃度の範囲として、１Ｍ以下であればよい。さらに望ましくは、生体への適用を考えた場合に生体内での中性な生理的条件下においても安定して分散し、存在することができればよく、塩濃度として１００ｍＭ〜３００ｍＭ程度であればよい。
【００２３】
また、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子は、光触媒性二酸化チタン複合微粒子間に電気的斥力が働くために凝集することなく、少なくとも２４時間以上にわたって安定することができ、これを達成できる光触媒性二酸化チタン粒子濃度の範囲として、重量百分率で２０％以下であればよい。さらに望ましくは、生体への適用を考えた場合に細胞に対する安全性の観点から、重量百分率で０．１％〜０．０００１％であればよい。
【００２４】
以上のことから、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を水、種々のｐＨ緩衝液、輸液、あるいは生理食塩水を用いた、均一で安定な分散液として提供することが可能となる。また、本分散液を含む軟膏やスプレー剤等も製造が可能である。この特性は、特に二酸化チタンを体内外のＤＤＳに応用する際に極めて有用である。すなわち、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液は中性付近の生理的条件においても凝集することがないために、患部組織に直接注射したり静脈に注射してターゲティングを行うことが可能となる。また、本分散液を含む軟膏やスプレー剤を皮膚等の患部に直接塗布し、太陽光や紫外線ランプ等により治療を施すことが可能となる。
【００２５】
本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子を励起、活性化させるための光源装置は特別である必要はないが、二酸化チタンのバンドギャップの関係上その波長は４００ｎｍ以下であることが望ましい。皮膚等の外用用途では、太陽光や通常の紫外線ランプ、あるいはブラックライトを好適に使用できる。また、体内の患部に対しては内視鏡に紫外線ファイバーを装着することにより紫外線を照射すれば良い。さらに、特に２８０ｎｍ付近の紫外線を局所的に患部に照射して病変部を破壊しようとする光療法を想定した場合では、その作用増強剤として本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を適用することも可能である。
【００２６】
さらに、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子は、表面上に存在するアミンによって表面電荷が正に帯電していることから、一般的に負の表面電荷をもつ細胞への親和性、取込み性が著しく高く、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子と細胞とが接触すると直ちに細胞への結合や取込みが始まる。このことから、特に生体の皮膚表面や、あるいは気管、消化器などのあるいは生体内部の表層部や、生体内に存在する様々な患部への適用が非常に有効であり、さらに、生体分子を固定化させることで癌細胞内での局在化を可能にする。例えば、核内への移行シグナルを結合することで、核内DNAへの接近を容易にし、より高い治療効果を得ることができる。例えば、本発明の光触媒性二酸化チタン微粒子を含む分散液を含む軟膏やスプレー剤を皮膚癌や喉頭癌といった癌患部に直接塗布したり、あるいは注射により固形ガンに局所投与した後に、太陽光や紫外線ランプ等により治療を施すことにより簡便でかつ高い治療効果を得ることができるものである。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に従って詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
二酸化チタンへのポリエチレンイミンの導入
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性二酸化チタンゾルを調製した。この分散液を１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行う前後の平均分散粒経はそれぞれ、３６．４ｎｍ、２０．２ｎｍであった。超音波処理後、溶液を濃縮して固形成分２０％の二酸化チタンゾルを調製した。得られた二酸化チタンゾル０．７５ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)に分散させ、ポリエチレンイミン（平均分子量：１００００、和光純薬社製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器（ＨＵ−５０、三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で６時間合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、２倍量のイソプロパノールを添加し、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を沈殿させ、遠心後に上清を除去することにより未反応のポリエチレンイミンを分離した。７０％エタノールを添加して洗浄を行い、遠心後にエタノールを除去した。蒸留水を１０ｍｌ添加後、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行い、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を分散させた。超音波処理後、０．４５μｍのフィルターで濾過して、固形成分１．５％のポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。作製したポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液０．7５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の平均粒径は６７．７ｎｍであった。
【００２９】
（実施例２）
ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子へのタンパク質の固定化
０．１ｍgのストレプトアビジン（ピアース社製）を含む５０ｍＭの２[４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と５ｍＭのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）の混合液０．１ｍｌを添加して５分間攪拌を行い、ストレプトアビジンのもつカルボキシル基を活性化した。攪拌終了後、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した脱塩カラムＮＡＰ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いてゲル濾過を行い、未反応のＥＤＣおよびＮＨＳを除去した。ストレプトアビジンを含む溶液０．１ｍｌを実施例１で得られたポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子を含む分散液２ｍｌに添加し、１０分間、４℃にて穏やかに攪拌した。この溶液を透析チューブ(分画分子量：１０００００、ピアース社製)に移し、２０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して１２時間透析を行った。透析チューブ内の溶液を回収し、２倍量のイソプロパノールを添加し、１０分間、４０００ｇにて遠心分離し、沈殿を７０％エタノールで洗浄後、１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５、日本ジーン社製）１ｍｌに溶解した。これにより、ストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子の分散液を得た。この分散液の粒径を、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、ゼータ電位測定セルにこの分散液０．7５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製した光触媒性二酸化チタン複合微粒子の平均粒径は６８．２ｎｍであった。
【００３０】
（実施例３）
ストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子の生体分子機能性の確認
実施例２で得られたストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子の分散液０．１ｍｌに対し、それぞれ１ｍＭから１００ｎＭまで１０倍刻みで希釈した異なる濃度のビオチンダイマー（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＰＥＯ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｄｉｍｅｒ、ピアース社製）を０．０１ｍｌ添加し、３７℃にて１０分間静置し、５９５ｎｍの吸光度をマイクロタイタープレートリーダー（Ｂｅｎｃｈ  Ｍａｒｋ、バイオラッド社製）にて測定した。結果を図２に示す。明らかにビオチンダイマーの濃度に応じて溶液の濁度が上昇しており、光触媒性二酸化チタン複合微粒子にストレプトアビジンが効率的に固定化されていることが判明した。
【００３１】
（実施例４）
蛍光色素標識を行った光触媒性二酸化チタン複合微粒子の作製
実施例１で得られたポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液５００μｌを１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）で平衡化した脱塩カラムＮＡＰ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、そこへ、最終濃度が０．８ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解したフルオレセインイソチオシアネート（ピアース社製）を加え、３０分間室温で穏やかに攪拌した。反応終了後、あらかじめ蒸留水にて平衡化したＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）により脱塩を行い、その後、溶液を２ｍｌにまで濃縮した。この蛍光色素標識を行った光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の液滴をガラスプレート上にのせ、蛍光顕微鏡で観察したところ、液滴と空気の境界面で明確に差が見られるようなフルオレセインに起因する蛍光が観察された（図３）。
【００３２】
（実施例５）
光触媒性二酸化チタン複合微粒子の細胞取込み性の評価  実施例１で得られた二酸化チタンゾル０．７５ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、ポリアクリル酸（平均分子量：５０００、和光純薬社製）０．２ｇを溶解したＤＭＦを１０ｍｌ添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器に溶液を移し変え、１８０℃で６時間水熱合成を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、溶液を取り出した後に水８０ｍｌを添加して攪拌混合した。エバポレータでＤＭＦおよび水を除去した後に、再度、水２０ｍｌを添加してポリアクリル酸結合二酸化チタン微粒子の水溶液とした。２Ｎ塩酸１ｍｌを添加して二酸化チタン粒子を沈殿させて、遠心後に上清を除去することにより未反応のポリアクリル酸を分離した。再度水を添加して洗浄を行い、遠心後に水を除去した。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍｌ添加後、２００Ｈｚで３０分間超音波処理を行い、二酸化チタン粒子を分散させた。超音波処理後、０．４５μｍのフィルターで濾過し、重量百分率で０．２５％のポリアクリル酸結合二酸化チタン微粒子の分散液を得た。ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて動的光散乱法により測定したところ、作製したポリアクリル酸結合二酸化チタン微粒子の平均粒径は４５．９ｎｍであった。このポリアクリル酸結合二酸化チタン微粒子の分散液２ｍｌに対して、０．８Ｍ  １−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを２５０μｌおよびＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを２５０μｌ加えて、撹拌しながら室温で１時間反応させた。１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した脱塩カラムＮＡＰ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、その後に１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて全量を９．５ｍｌとした。そこへ、ＤＭＦに溶解させた１００ｍＭ  ５−ａｍｉｎｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＮＣＩ社製）を５μｌ加え、遮光下で撹拌しながら室温で１時間反応させた。次に、０．１Ｍのエタノールアミン（和光純薬工業社製）水溶液を５００μｌ加え、遮光下で撹拌しながら室温で３０分間反応させた。この溶液を１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）で平衡化した脱塩カラムＰＤ−１０を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、未反応の５−ａｍｉｎｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを分離し、その後、溶液を２ｍｌにまで濃縮した。これを蛍光色素標識ポリアクリル酸結合二酸化チタン複合微粒子の分散液とした。
また、実施例１で得られたポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液を５００μｌを、１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）で平衡化した脱塩カラムＮＡＰ−１０を用いてゲル濾過を行って溶液交換し、そこへ、最終濃度が０．８ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解したフルオレセインイソチオシアネート（ピアース社製）を加え、３０分間室温で穏やかに攪拌した。反応終了後、あらかじめＰＢＳにて平衡化したＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）により溶液交換を行い、その後、溶液を２ｍｌにまで濃縮した。これを蛍光色素標識光触媒性二酸化チタン複合微粒子の分散液とした。
次に、メラノーマ細胞株Ｔ−２４を１０％血清を含むＦ１２培地（ギブコ社製）で１００％コンフルエントにになるまで培養し、フラスコを１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１００ｍＭトリプシン−エチレンジアミン三酢酸溶液を１ｍｌ添加し、１０分静置後、フラスコ壁面より剥離した細胞を回収し、９ｍｌの１０％血清を含むＦ１２培地で希釈した。細胞数を血球計算盤により計測し、５×１０４個の細胞を含む培地５００μｌをそれぞれ２４穴マイクロタイタープレートに接種し、最終濃度０．０１％になるように分注した。そこに、先の蛍光色素標識ポリアクリル酸結合二酸化チタン複合微粒子の分散液および蛍光色素標識光触媒性二酸化チタン複合微粒子の分散液をそれぞれ最終濃度０．０１％となるよう１００μｌ加え、２４時間ＣＯ２インキュベータ内で培養した。その後、細胞のフラスコへの接着を確認し、フラスコを１００ｍＭリン酸緩衝食塩水にて洗浄し、２００μｌの１０％血清を含むＦ１２培地を添加し、蛍光顕微鏡により観察を行った（図４）。蛍光視野像を観察した結果、蛍光色素標識ポリアクリル酸結合二酸化チタン複合微粒子よりも蛍光色素標識ポ光触媒性二酸化チタン複合微粒子のほうが明らかに細胞に対して高い親和性と細胞取込み性をもつことが確認された。
【００３３】
（実施例６）
光触媒性二酸化チタン複合微粒子のｐＨ安定性の評価
５０ｍＭの異なるｐＨを持つ緩衝液（ｐＨ３＝グリシン塩酸緩衝液、ｐＨ４および５＝酢酸緩衝液、ｐＨ６＝２−モルフォリノエタンスルホン酸緩衝液）、ｐＨ７および８＝２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液、ｐＨ９＝ホウ酸緩衝液、ｐＨ１０＝グリシン水酸化ナトリウム緩衝液）を作成し、終濃度０．０２５（ｗ／ｖ）％になるように実施例２で得られたストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を添加し、1時間室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて実施例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図５に示す。ｐＨが３から１０の間で粒径の変化は認められるものの７０から８５ｎｍ程度であり、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子は安定した分散性を示した。
【００３４】
（実施例７）
光触媒性二酸化チタン複合微粒子の塩強度安定性の評価
０．０５〜５Ｍの異なる塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液に実施例２で得られたストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を終濃度０．０２５％になるように添加し、１時間室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて実施例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を図６に示す。
系中の塩濃度が０．０５から１Ｍの間はほとんど平均分散粒径の変化は認められず、本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子安定した分散性を示すことが明らかになった。
【００３５】
（実施例８）
ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子へのレクチンの固定化
実施例１で得られたポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液を３０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に懸濁し、１（ｗ／ｖ）％になるようにした。この溶液１０ｍｌに、５００ｍＭのＥＤＣ水溶液２５０μｌと１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  Ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）−ＦＩＴＣ（ＶＥＣ社製：ＦＩＴＣのＤＢＡに対するモル結合比２．５)を加え、室温にて２時間攪拌を行った。反応後、２０ｍｌのイソプロパノールを加え、室温で３０分静置後、４０００ｇにて２０分間遠心分離を行った。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、ＰＢＳ緩衝液に懸濁しＤＢＡ−ＦＩＴＣ固定化ポリエチレンイミン結合二酸化チタン微粒子の分散液を作成した。この複合体微粒子の平均分散粒子径は６８．３ｎｍであった。フルオレセイン（和光純薬工業社製）をＰＢＳ緩衝液で希釈し、励起波長５９５ｎｍ蛍光波長６２５ｎｍにて蛍光光度計で測定し、検量線を作成した。分散液の蛍光強度から６００ｎｇ／ｍｌのＦＩＴＣが結合していることが明らかになった。さらに本分散液を４００℃に加熱し、酸化チタン含量を測定したところ、１（ｗ／ｖ）％の濃度であった。ＤＢＡ：ＦＩＴＣの結合比が１：２．５であることから２．５×１０−７（ＤＢＡ−ＦＩＴＣ）ｍｏｌ／ＴｉＯ２（ｇ）であることが判明した。
【００３６】
（実施例９）
光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の均一性（透明度）の評価
０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、実施例２で得られたストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を終濃度０．１％になるように調整し、１時間室温にて静置した。また、二酸化チタン微粒子としてＰ２５（日本アエロジル）を０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて、同様に終濃度０．１％になるように調整し、１時間室温にて静置した。その後、シャーレに５ｍｌ移し上方から撮影し、確認した。その結果を図７に示す。Ｐ２５水溶液に対してストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液は明らかに透明度が高く、均一に分散していることが確認された。また、分光光度計（ＵＶ−１６００、島津製作所）を用いて波長６６０ｎｍにおける吸光度の測定を行った結果、Ｐ２５水溶液は吸光度が１を大きく上回り測定不能であったのに対して、ストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液は吸光度が０．０４４であり、また沈殿の形成は起きていなかった。更に、これらの溶液を室温暗所にて２週間静置した後に、同様に波長６６０ｎｍにおける吸光度の測定を行った結果、Ｐ２５水溶液は吸光度が１を大きく上回り測定不能であったのに対して、ストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液は吸光度が０．０５１であった。このことから、水溶液中においてストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液が透明度の高い、均一な分散性を示し、かつ安定していることが明らかになった。
【００３７】
（実施例１０）
光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の細胞毒性評価
実施例２で得られたストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を、固形分が１．０％になるように１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で調整した。培養ガン細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で培養し、５．０×１０４  細胞数／ｍｌとなるように調製した。これを再度２０時間同条件で培養した。この細胞培養液に、上記ストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を終濃度で０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％になるように９６穴プレート上で調整し、２００μｌの試験用細胞培養液とした。この試験用細胞培養液を３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で２０時間培養した後、それぞれ１００μｌを用いてＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により生細胞由来の発光反応を行い、イメージアナライザＬＡＳ−３０００ＵＶｍｉｎｉ（富士フィルム社製）を用いてその発光量測定を行うことで細胞毒性の評価を行った。その結果を図８に示す。何も添加していないコントロールの培養細胞における発光量に比べ、どの分散液濃度においても同等の発光量を確認したことから、この濃度域のストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液は細胞毒性が認められないことが明らかになった。
【００３８】
（実施例１１）
光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の細胞殺傷性の評価
メラノーマ細胞株Ｔ−２４を１０％血清を含むＦ１２培地（ギブコ社製）で１００％コンフルエントにになるまで培養し、フラスコを１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１００ｍＭトリプシン−エチレンジアミン三酢酸溶液を１ｍｌ添加し、１０分静置後、フラスコ壁面より剥離した細胞を回収し、９ｍｌの１０％血清を含むＦ１２培地で希釈した。細胞数を血球計算盤により計測し、５×１０４個の細胞を含む培地５００μｌをそれぞれ２４穴マイクロタイタープレートに接種した。そこに、実施例２で得られたストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を１００ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で調整し、最終濃度０％および０．０１％となるよう１００μｌ加え、ブラックライト（東芝社製）により波長３４０ｎｍの紫外光を２．５ｍＷ／ｃｍ２で０分間および６０分間照射し、２４時間ＣＯ２インキュベータ内で培養した。Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同人化学社製）を試薬のマニュアルに従い調整して加え、９６穴プレート上にて吸光度計Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、波長４５０ｎｍの吸光度測定を行った。その結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
2006150344.tif 000003
【００４０】
バックグラウンドの値を差し引いた紫外線照射０分間、ストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子濃度０％における生細胞由来の吸光度を１として相対生存率を示した。この結果から、ストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子が０．０１％存在下で紫外線照射６０分間の実験条件における場合のみ、相対生存率が減少しており、これによりストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液は細胞殺傷性が高いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、癌細胞、内分泌撹乱物質などに対する分子認識能を有するタンパク質、抗体、DNAなどの生体分子を、水溶性高分子で修飾したアナターゼ型二酸化チタンに固定することにより、これらに対する分子認識能を有し、かつ紫外線の照射などの光触媒作用によりこれら物質の分解反応を示す光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を提供する。本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液における光触媒性二酸化チタン複合微粒子は水、または水溶液中で目的とする物質を特異的に認識捕捉し、紫外線照射などにより目的物質を強力に分解する能力を有する。特に水系で使用できること、目的物質を正確に捕捉できること、強力な光触媒能を有することは、例えば水系の内分泌攪乱物質の分解処理や癌細胞の破壊などの医療への応用に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液を示す模式図である。
【図２】本発明のストレプトアビジンを固定化した光触媒性二酸化チタン複合微粒子のビオチンダイマーによる凝集（吸光度の増加として表示）の結果を示す図である。
【図３】本発明のフルオレセインイソチオシアネートで蛍光色素標識を行った光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の液滴の透過および蛍光による顕微鏡画像である。
【図４】細胞内に導入された本発明のフルオレセインイソチオシアネートで蛍光色素標識を行った光触媒性二酸化チタン複合微粒子の細胞取込み性を確認した結果を示す写真図である。
【図５】本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子の各ｐＨにおける平均分散粒径を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子の各塩濃度における平均分散粒径を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の均一性（透明度）を確認した結果を示す写真図である。
【図８】本発明の光触媒性二酸化チタン複合微粒子を含む分散液の各濃度における細胞毒性を測定した結果を示す図である。
【図１】
2006150344.tif 000004
【図２】
2006150344.tif 000005
【図３】
2006150344.tif 000006
【図４】
2006150344.tif 000007
【図５】
2006150344.tif 000008
【図６】
2006150344.tif 000009
【図７】
2006150344.tif 000010
【図８】
2006150344.tif 000011