(57)【要約】      （修正有）【課題】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）伝染の流行を処置するための材料および方法の提供。【解決手段】少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列からなるポリペプチド中の部位に免疫学的に結合する、抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体であって、ここで、上記部位は、ＨＣＶに対する抗体によって結合され得、そして上記少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列が、アミノ酸配列中に１または数個の欠失、挿入、または置換を有するアミノ酸配列から得られる、抗体の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列からなるポリペプチド中の部位に免疫学的に結合する、抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体であって、
ここで、該部位は、ＨＣＶに対する抗体によって結合され得、そして該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列：
【化１０１】
2006169233.tif 000008
【化１０２】
2006169233.tif 000009
中に１または数個の欠失、挿入、または置換を有するアミノ酸配列から得られる、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）伝染の流行を処置するための材料および方法に関する。さらに詳しくは，本発明は，ＮＡＮＢＶすなわちＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の病原因子のゲノム由来のポリヌクレオチドと，そこにコードされたポリペプチドと，これらポリペプチドに対する抗体とに関する。これらの試薬は，ＨＣＶ  およびその感染に対するスクリーニング剤として，ならびにその疾患に対する保護剤として有用である。
【０００２】
本出願で引用される文献
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引用される特許
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ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０４６６９号
米国特許第４，３４１，７６１号
米国特許第４，３９９，１２１号
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米国特許第４，４９３，８９０号
【背景技術】
【０００３】
非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は，伝染性の疾患であるか，あるいはウイルスが誘発すると考えられている疾患群およびウイルスに関連する他の形態の肝臓疾患とは区別し得る疾患群に属する。これらの疾患には，周知の肝炎ウイルス（すなわち，Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），Δ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ），およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））により引き起こされる肝炎が包含される。ＮＡＮＢＨは輸血した個体において初めて同定された。ヒトからチンパンジーへの伝染およびチンパンジー間における一連の継代は，ＮＡＮＢＨが１種または複数種の伝染性感染因子によるという証拠を与えた。
【０００４】
疫学的証拠によると，ＮＡＮＢＨには次の３つの型があると示唆される：つまり，飲料水媒介の流行型；血液または注射針に関連する型；および散発（集団獲得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙａｃｑｕｉｒｅｄ））型の３つの型である。しかしながら，ＮＡＮＢＨの原因となり得る因子の数は知られていない。
【０００５】
ＮＡＮＢＨの臨床における診断および同定は，他のウイルスマーカーを排除することにより，まず行われてきた。推定されるＮＡＮＢＶ抗原および抗体を検出するために用いられる方法には，寒天ゲル拡散法，対向免疫電気泳動法，免疫蛍光顕微鏡法，免疫電子顕微鏡法，放射性免疫検定法，および酵素結合免疫吸着検定法がある。しかしながら，これらの検定法はいずれも，ＮＡＮＢＨに関する診断検査として用いるのに充分感度が高く，特異的であり，かつ再現性があるとは示されていない。
これまで，ＮＡＮＢＨ因子に関連する抗原抗体系の同一性または特異性に関しては，明確ではなく，しかも一致することはなかった。これは，その少なくとも一部は，以下のことが原因であった：つまり，個体におけるＨＢＶの前感染またはＮＡＮＢＶとの同時感染；ＨＢＶに関連する溶解性の粒子状抗原の周知の複雑さ；および肝臓細胞のゲノムへのＨＢＶ  ＤＮＡの組込みである。さらに，ＮＡＮＢＨが１種より多くの病原因子により引き起こされる可能性，およびＮＡＮＢＨが誤診されてきた可能性がある。また，血漿学的な検定法により，ＮＡＮＢＨ患者の血清中に何が検出されるかは不明である。寒天ゲル拡散法および対向免疫電気泳動法によれば，血清検体間に時々生じる自己免疫反応または非特異的なタンパク相互作用は検出されるが，特異的なＮＡＮＢＶ抗原−抗体反応は示されないと考えられてきた。免疫蛍光法，酵素結合免疫吸着検定法，および放射性免疫検定法によれば，ＮＡＮＢＨ患者の血清中，ならびに他の肝臓疾患および非肝臓疾患を有する患者においても，しばしば存在するリウマチ因子様物質が低レベルで検出されるようである。検出された反応性のいくつかは，宿主により定まる細胞質抗原に対して抗体を表現し得る。
【０００６】
ＮＡＮＢＶの候補となるものが，数多く存在している。例えば，Ｐｒｉｎｃｅ（１９８３），ＦｅｉｎｓｔｏｎｅおよびＨｏｏｆｎａｇｌｅ（１９８４），そしてＯｖｅｒｂｙ（１９８５，１９８６，１９８７）による総説，ならびにＩｗａｒｓｏｎ（１９８７）による論文を参照にされたい。しかしながら，これらの候補がＮＡＮＢＨの病原因子に相当するという証拠はない。
【０００７】
ＮＡＮＢＶのキャリア，およびＮＡＮＢＶで汚染された血液または血液製剤をスクリーニングしかつ同定するための感度が高く特異的な方法が非常に要求されている。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は輸血された患者の約１０％において発生する。この場合，９０％までがＮＡＮＢＨによる。この疾患における大きな問題は，しばしば慢性的な肝臓損傷へ進行することである（２５〜５５％）。
【０００８】
患者を看護し，血液および血液製剤によるＮＡＮＢＨ感染あるいは個体が緊密に接触することにより起こるＮＡＮＢＨ感染を予防するために，ＮＡＮＢＶに関連する核酸，抗原，および抗体を検出する信頼性の高いスクリーニング手段，診断手段，および予診手段が必要とされている。さらに，この疾患を予防および／または処置するための効果的なワクチンおよび免疫療法剤も必要とされている。
【０００９】
出願人は，新しいウイルスであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を発見したが，このウイルスは血液媒介ＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）の主要な病原因子であることが証明されている。原形ＨＣＶ単離体であるＣＤＣ／ＨＣＶ１（ＨＣＶ１とも呼ばれる）の部分ゲノム配列を含む，出願人の最初の研究結果は，欧州特許公開第３１８，２１６号（１９８９年５月３１日付で公開）およびＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０４６６９号（１９８９年６月１日付で公開）に記載されている。これらの特許出願およびこれに対応するすべての国内特許出願の開示内容は，本願で参考文献として採用される。これらの出願は，特に，ＨＣＶ配列をクローン化して発現させる組換えＤＮＡ法，ＨＣＶポリペプチド，ＨＣＶ免疫学的診断法，ＨＣＶプローブ診断法，抗ＨＣＶ抗体，ならびに新しいＨＣＶ単離体の配列を含む新しいＨＣＶ配列を単離する方法について教示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（項目１）
少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列を有するポリペプチドに免疫学的に結合し得る抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）モノクローナル抗体、ここで、上記抗体は、該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列に結合し、そして該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列から得られる：
【００１１】
【化１】
2006169233.tif 000002
【００１２】
【化２】
2006169233.tif 000003
【００１３】
【化３】
2006169233.tif 000004
【００１４】
（項目２）
薬学的に受容可能な賦型剤中に、少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列を含む配列を有するポリペプチドを含有するワクチン組成物、ここで、上記少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は、ＨＣＶに対する抗体によって結合され得る少なくとも１つの部位を有し、そして上記少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列は、以下のアミノ酸配列から得られる：
【００１５】
【化４】
2006169233.tif 000005
【００１６】
【化５】
2006169233.tif 000006
【００１７】
【化６】
2006169233.tif 000007
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は，部分的に，欧州特許出願公開第３１８，２１６号またはＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０４６６９号に開示されていない新しいＨＣＶ配列およびポリペプチドに基づいている。本発明に包含されるのは，特に，免疫学的診断法，プローブ診断法，抗ＨＣＶ抗体の生産，ＰＣＲ法，および組換えＤＮＡ法におけるこれらの新しい配列およびポリペプチドの応用である。さらに，本発明には，本願で開示されるＨＣＶポリペプチドの免疫原性に基づく新しい免疫学的検定法が含まれる。本願で請求される新規事項は，例えば欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載の手法を使用して開発されたが，その公開またはいかなる対応特許にも先行する優先日を有する。従って，本発明は，ＨＣＶ抗原および抗体について試料をスクリーニングするのに有用な，ならびにＨＣＶ感染の処置に有用な，新規な組成物および方法を提供する。
【００１９】
従って，本発明のある局面は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡに由来する配列を有する組換えポリヌクレオチドであって，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは，クローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中にあるか，あるいは該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有する。
【００２０】
本発明の他の局面は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたエピトープを有する精製ポリペプチドであって，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有する。
【００２１】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡに由来するＤＮＡのＯＲＦを有する組換え発現ベクターで形質転換させた細胞により生産された免疫原性ポリペプチドであって，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは，クローンＣＡ２７９ａ，またはクローンＣＡ７４ａ，またはクローン１３ｉ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローン３３Ｃ，またはクローン４０ｂ，またはクローン３３ｂ，またはクローン２５ｃ，またはクローン１４ｃ，またはクローン８ｆ，またはクローン３３ｆ，またはクローン３３ｇ，またはクローン３９ｃ，またはクローン１５ｅの中のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列に由来する配列を有し，該ＯＲＦは所望の宿主と適合し得る制御配列に対して作動可能なように連結されている。
【００２２】
本発明の他の局面は，ＨＣＶエピトープを有するペプチドであって，該ペプチドは次式で表される。
ＡＡｘ−ＡＡｙ  
ここで，ｘおよびｙは図２７〜図３６に示されているアミノ酸番号を表し，該ペプチドは，ＡＡ１−ＡＡ２５，ＡＡ１−ＡＡ５０，ＡＡ１−ＡＡ８４，ＡＡ９−ＡＡ１７７，ＡＡ１−ＡＡ１０，ＡＡ５−ＡＡ２０，
ＡＡ２０−ＡＡ２５，ＡＡ３５−ＡＡ４５，ＡＡ５０−ＡＡ１００，ＡＡ４０−ＡＡ９０，ＡＡ４５−ＡＡ６５，ＡＡ６５−ＡＡ７５，
ＡＡ８０−ＡＡ９０，ＡＡ９９−ＡＡ１２０，ＡＡ９５−ＡＡ１１０，ＡＡ１０５−ＡＡ１２０，ＡＡ１００−ＡＡ１５０，
ＡＡ１５０−ＡＡ２００，ＡＡ１５５−ＡＡ１７０，ＡＡ１９０−ＡＡ２１０，ＡＡ２００−ＡＡ２５０，ＡＡ２２０−ＡＡ２４０，
ＡＡ２４５−ＡＡ２６５，ＡＡ２５０−ＡＡ３００，ＡＡ２９０−ＡＡ３３０，ＡＡ２９０−３０５，ＡＡ３００−ＡＡ３５０，
ＡＡ３１０−ＡＡ３３０，ＡＡ３５０−ＡＡ４００，ＡＡ３８０−ＡＡ３９５，ＡＡ４０５−ＡＡ４９５，ＡＡ４００−ＡＡ４５０，
ＡＡ４０５−ＡＡ４１５，ＡＡ４１５−ＡＡ４２５，ＡＡ４２５−ＡＡ４３５，ＡＡ４３７−ＡＡ５８２，ＡＡ４５０−ＡＡ５００，
ＡＡ４４０−ＡＡ４６０，ＡＡ４６０−ＡＡ４７０，ＡＡ４７５−ＡＡ４９５，ＡＡ５００−ＡＡ５５０，ＡＡ５１１−ＡＡ６９０，
ＡＡ５１５−ＡＡ５５０，ＡＡ５５０−ＡＡ６００，ＡＡ５５０−ＡＡ６２５，ＡＡ５７５−ＡＡ６０５，ＡＡ５８５−ＡＡ６００，
ＡＡ６００−ＡＡ６５０，ＡＡ６００−ＡＡ６２５，ＡＡ６３５−ＡＡ６６５，ＡＡ６５０−ＡＡ７００，ＡＡ６４５−ＡＡ６８０，
ＡＡ７００−ＡＡ７５０，ＡＡ７００−ＡＡ７２５，ＡＡ７００−ＡＡ７５０，ＡＡ７２５−ＡＡ７７５，ＡＡ７７０−ＡＡ７９０，
ＡＡ７５０−ＡＡ８００，ＡＡ８００−ＡＡ８１５，ＡＡ８２５−ＡＡ８５０，ＡＡ８５０−ＡＡ８７５，ＡＡ８００−ＡＡ８５０，
ＡＡ９２０−ＡＡ９９０，ＡＡ８５０−ＡＡ９００，ＡＡ９２０−ＡＡ９４５，ＡＡ９４０−ＡＡ９６５，ＡＡ９７０−ＡＡ９９０，
ＡＡ９５０−ＡＡ１０００，ＡＡ１０００−ＡＡ１０６０，ＡＡ１０００−ＡＡ１０２５，ＡＡ１０００−ＡＡ１０５０，
ＡＡ１０２５−ＡＡ１０４０，ＡＡ１０４０−ＡＡ１０５５，ＡＡ１０７５−ＡＡ１１７５，ＡＡ１０５０−ＡＡ１２００，
ＡＡ１０７０−ＡＡ１１００，ＡＡ１１００−ＡＡ１１３０，ＡＡ１１４０−ＡＡ１１６５，ＡＡ１１９２−ＡＡ１４５７，
ＡＡ１１９５−ＡＡ１２５０，ＡＡ１２００−ＡＡ１２２５，ＡＡ１２２５−ＡＡ１２５０，ＡＡ１２５０−ＡＡ１３００，
ＡＡ１２６０−ＡＡ１３１０，ＡＡ１２６０−ＡＡ１２８０，ＡＡ１２６６−ＡＡ１４２８，ＡＡ１３００−ＡＡ１３５０，
ＡＡ１２９０−ＡＡ１３１０，ＡＡ１３１０−ＡＡ１３４０，ＡＡ１３４５−ＡＡ１４０５，ＡＡ１３４５−ＡＡ１３６５，
ＡＡ１３５０−ＡＡ１４００，ＡＡ１３６５−ＡＡ１３８０，ＡＡ１３８０−ＡＡ１４０５，ＡＡ１４００−ＡＡ１４５０，
ＡＡ１４５０−ＡＡ１５００，ＡＡ１４６０−ＡＡ１４７５，ＡＡ１４７５−ＡＡ１５１５，ＡＡ１４７５−ＡＡ１５００，
ＡＡ１５００−ＡＡ１５５０，ＡＡ１５００−ＡＡ１５１５，ＡＡ１５１５−ＡＡ１５５０，ＡＡ１５５０−ＡＡ１６００，
ＡＡ１５４５−ＡＡ１５６０，ＡＡ１５６９−ＡＡ１９３１，ＡＡ１５７０−ＡＡ１５９０，ＡＡ１５９５−ＡＡ１６１０，
ＡＡ１５９０−ＡＡ１６５０，ＡＡ１６１０−ＡＡ１６４５，ＡＡ１６５０−ＡＡ１６９０，ＡＡ１６８５−ＡＡ１７７０，
ＡＡ１６８９−ＡＡ１８０５，ＡＡ１６９０−ＡＡ１７２０，ＡＡ１６９４−ＡＡ１７３５，ＡＡ１７２０−ＡＡ１７４５，
ＡＡ１７４５−ＡＡ１７７０，ＡＡ１７５０−ＡＡ１８００，ＡＡ１７７５−ＡＡ１８１０，ＡＡ１７９５−ＡＡ１８５０，
ＡＡ１８５０−ＡＡ１９００，ＡＡ１９００−ＡＡ１９５０，ＡＡ１９００−ＡＡ１９２０，ＡＡ１９１６−ＡＡ２０２１，
ＡＡ１９２０−ＡＡ１９４０，ＡＡ１９４９−ＡＡ２１２４，ＡＡ１９５０−ＡＡ２０００，ＡＡ１９５０−ＡＡ１９８５，
ＡＡ１９８０−ＡＡ２０００，ＡＡ２０００−ＡＡ２０５０，ＡＡ２００５−ＡＡ２０２５，ＡＡ２０２０−ＡＡ２０４５，
ＡＡ２０４５−ＡＡ２１００，ＡＡ２０４５−ＡＡ２０７０，ＡＡ２０５４−ＡＡ２２２３，ＡＡ２０７０−ＡＡ２１００，
ＡＡ２１００−ＡＡ２１５０，ＡＡ２１５０−ＡＡ２２００，ＡＡ２２００−ＡＡ２２５０，ＡＡ２２００−ＡＡ２３２５，
ＡＡ２２５０−ＡＡ２３３０，ＡＡ２２５５−ＡＡ２２７０，ＡＡ２２６５−ＡＡ２２８０，ＡＡ２２８０−ＡＡ２２９０，
ＡＡ２２８７−ＡＡ２３８５，ＡＡ２３００−ＡＡ２３５０，ＡＡ２２９０−ＡＡ２３１０，ＡＡ２３１０−ＡＡ２３３０，
ＡＡ２３３０−ＡＡ２３５０，ＡＡ２３５０−ＡＡ２４００，ＡＡ２３４８−ＡＡ２４６４，ＡＡ２３４５−ＡＡ２４１５，
ＡＡ２３４５−ＡＡ２３７５，ＡＡ２３７０−ＡＡ２４１０，ＡＡ２３７１−ＡＡ２５０２，ＡＡ２４００−ＡＡ２４５０，
ＡＡ２４００−ＡＡ２４２５，ＡＡ２４１５−ＡＡ２４５０，ＡＡ２４４５−ＡＡ２５００，ＡＡ２４４５−ＡＡ２４７５，
ＡＡ２４７０−ＡＡ２４９０，ＡＡ２５００−ＡＡ２５５０，ＡＡ２５０５−ＡＡ２５４０，ＡＡ２５３５−ＡＡ２５６０，
ＡＡ２５５０−ＡＡ２６００，ＡＡ２５６０−ＡＡ２５８０，ＡＡ２６００−ＡＡ２６５０，ＡＡ２６０５−ＡＡ２６２０，
ＡＡ２６２０−ＡＡ２６５０，ＡＡ２６４０−ＡＡ２６６０，ＡＡ２６５０−ＡＡ２７００，ＡＡ２６５５−ＡＡ２６７０，
ＡＡ２６７０−ＡＡ２７００，ＡＡ２７００−ＡＡ２７５０，ＡＡ２７４０−ＡＡ２７６０，ＡＡ２７５０−ＡＡ２８００，
ＡＡ２７５５−ＡＡ２７８０，ＡＡ２７８０−ＡＡ２８３０，ＡＡ２７８５−ＡＡ２８１０，ＡＡ２７９６−ＡＡ２８８６，
ＡＡ２８１０−ＡＡ２８２５，ＡＡ２８００−ＡＡ２８５０，ＡＡ２８５０−ＡＡ２９００，ＡＡ２８５０−ＡＡ２８６５，
ＡＡ２８８５−ＡＡ２９０５，ＡＡ２９００−ＡＡ２９５０，ＡＡ２９１０−ＡＡ２９３０，ＡＡ２９２５−ＡＡ２９５０，
ＡＡ２９４５−末端（Ｃ’末端）からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたエピトープに対するモノクローナル抗体であって，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいはクローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中に存在する配列である。本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたエピトープを有するポリペプチドに対する精製ポリクローナル抗体の調製物であって，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいはクローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中に存在する配列である。
【００２４】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶに対するポリヌクレオチドプローブであって，該プローブは，図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示されるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列に由来するか，あるいは該ＨＣＶｃＤＮＡ配列の補体に由来するＨＣＶ配列を有する。
【００２５】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶに由来するポリヌクレオチドの存在について試料を分析するためのキットであって，該キットは約８個またはそれ以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを有し，該ヌクレオチド配列は図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するＨＣＶ  ｃＤＮＡに由来し，該ポリヌクレオチドプローブは適当な容器内にある。本発明の他の局面は，ＨＣＶ抗原の存在について試料を分析するためのキットであって，該キットはＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体を有し，該抗原はＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたエピトープを含み，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいは該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは，クローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中にある。
【００２６】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶ抗体の存在について試料を分析するキットであって，該キットはＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたＨＣＶエピトープを含む抗原性ポリペプチドを有し，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは，図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいはクローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中にある。
【００２７】
本発明の他の局面は，ＨＣＶ抗体の存在について試料を分析するキットであって，該キットはＨＣＶ  ｃＤＮＡから発現された抗原性ポリペプチドを有し，該ＨＣＶｃＤＮＡは，クローンＣＡ２７９ａ，またはクローンＣＡ７４ａ，またはクローン１３ｉ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローン３３Ｃまたはクローン４０ｂ，またはクローン３３ｂ，またはクローン２５ｃ，またはクローン１４ｃ，またはクローン８ｆ，またはクローン３３ｆ，またはクローン３３ｇ，またはクローン３９ｃ，またはクローン１５ｅの中にあり，該抗原性ポリペプチドは適当な容器内に存在する。
【００２８】
本発明のさらに他の局面は，試料中のＨＣＶ核酸を検出する方法であって，該検出方法は，（ａ）該試料の核酸を，ＨＣＶに対するポリヌクレオチドプローブと反応させること；ここで，該プローブはＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列由来のＨＣＶ配列を有し，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有し，かつ該反応は該プローブと該試料由来のＨＣＶ核酸との間にポリヌクレオチド二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成させ得る条件下で行われる；および（ｂ）工程（ａ）で形成された，該プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を検出すること，を包含する。
【００２９】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶ抗原を検出するための免疫学的検定法であって，該免疫学的検定法は，（ａ）ＨＣＶ抗原を含んでいる疑いのある試料を，ＨＣＶｃＤＮＡ内にコードされたＨＣＶエピトープに対する抗体と共にインキュベートすること；ここで，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいはクローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中に存在する配列であり，かつ該インキュベーションは抗原−抗体複合体を形成させ得る条件下で行われる；および（ｂ）工程（ａ）で形成された，該抗体を含む抗体−抗原複合体を検出すること，
を包含する。
【００３０】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶ抗原に対する抗体を検出するための免疫学的検定法であって，該免疫学的検定法は，（ａ）抗ＨＣＶ抗体を含んでいる疑いのある試料を，ＨＣＶｃＤＮＡ内にコードされたエピトープを含む抗原ポリペプチドと共にインキュベートすること；ここで，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいはクローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中に存在する配列であり，かつ該インキュベーションは抗原−抗体複合体を形成させ得る条件下で行われる；および工程（ａ）で形成された，該抗原ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体を検出すること，
を包含する。
【００３１】
本発明の他の局面は，ＨＣＶ感染を処置するためのワクチンであって，該ワクチンはＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたＨＣＶエピトープを含む免疫原性ポリペプチドを含有し，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいはクローン１３ｉ，またはクローン２６ｊ，またはクローン５９ａ，またはクローン８４ａ，またはクローンＣＡ１５６ｅ，またはクローン１６７ｂ，またはクローンｐｉ１４ａ，またはクローンＣＡ２１６ａ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローンａｇ３０ａ，またはクローン２０５ａ，またはクローン１８ｇ，またはクローン１６ｊｈの中に存在する配列であり，かつ該免疫原性ポリペプチドは薬学的に容認し得る賦形剤中に，薬理学的に効果的な用量で存在する。
【００３２】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶに対する抗体を生産する方法であって，該生産方法はＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたＨＣＶエピトープを含む単離された免疫原性ポリペプチドを個体に投与することを包含し，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図２８または図３６のヌクレオチド番号−３１９〜１３４８または８６５９〜８８６６によって示される配列を有するか，あるいはクローンＣＡ２７９ａ，またはクローンＣＡ７４ａ，クローン１３ｉ，またはクローンＣＡ２９０ａ，またはクローン３３ｃ，またはクローン４０ｂ，またはクローン３３ｂ，またはクローン２５ｃ，またはクローン１４ｃ，またはクローン８ｆ，またはクローン３３ｆ，またはクローン３３ｇ，またはクローン３９ｃ，またはクローン１５ｅの中に存在する配列を有し，かつ該免疫原性ポリペプチドは薬学的に容認し得る賦形剤中に，薬理学的に効果的な用量で存在する。
【００３３】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡに由来するアンチセンスポリヌクレオチドであって，該ＨＣＶ  ｃＤＮＡは図２７〜図３６に示されるものである。
【００３４】
本発明のさらに他の局面は，精製された融合ポリペプチドＣ１００−３を調製する方法であって，該調製方法は，（ａ）ポリペプチドＣ１００−３を含む粗製の細胞溶解産物を用意すること，（ｂ）該ポリペプチドを沈澱させる量のアセトンで，該粗製の細胞溶解産物を処理すること，（ｃ）沈澱物を単離して可溶化すること，
（ｄ）アニオン交換クロマトグラフィーによって，該Ｃ１００−３ポリペプチドを単離すること，および（ｅ）ゲル濾過法によって，工程（ｄ）のＣ１００−３ポリペプチドをさらに単離すること，を包含する。
【００３５】
（発明の実施の形態）
Ｉ．定義
「Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃｖｉｒｕｓ）」という用語は，非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の従来知られていなかった病原因子に対して，この分野の研究者が保留していた用語である。従って，本願で用いる場合，「Ｃ型肝炎ウイルス」（ＨＣＶ）という用語はＮＡＮＢＨの病原因子を意味し，またこのＮＡＮＢＨは，以前にはＮＡＮＢＶおよび／またはＢＢ−ＮＡＮＢＶと呼ばれていたものである。本願では，ＨＣＶ，ＮＡＮＢＶ，およびＢＢ−ＮＡＮＢＶという用語を互換性のある語として使用する。この用語法を拡張して，以前はＮＡＮＢ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼んでいたＨＣＶによって発病する疾患をＣ型肝炎と呼ぶ。本願では，ＮＡＮＢＨとＣ型肝炎という用語を互換性のある語として使用してもよい。
【００３６】
「ＨＣＶ」という用語は，本願で用いる場合，その病原株がＮＡＮＢＨを発病させるウイルス種，および弱毒化されたウイルス株または後者由来の欠損干渉粒子を意味する。後に述べるように，ＨＣＶゲノムは，ＲＮＡで構成されている。ＲＮＡを含有するウイルスの偶発変異率が比較的高いということが知られており，すなわち組込まれたヌクレオチドあたり１０−３〜１０−４のオーダーであると報告されている〔フィールズとナイプ（Ｆｉｅｌｄｓ＆  Ｋｎｉｐｅ）１９８６年〕。それ故，後に述べるＨＣＶ種の中には，毒性または無毒性であり得る多くのウイルス株がある。本願記載の組成物と方法とによって，種々のＨＣＶ株または単離体の増殖，同定，検出，および単離を行うことができる。さらに本開示内容によれば，各種ウイルス株に対する診断薬およびワクチンを調製することができ，またＨＣＶの複製を阻害する薬剤のような薬理学的用途の抗ウイルス剤をスクリーニングする手法に有用な組成物および方法が得られる。
【００３７】
本願が提供する情報は，ＨＣＶの原形株またはＨＣＶ単離体〔以後，ＣＤＣ／ＨＣＶ１（ＨＣＶ１とも呼ばれる）と呼ぶ〕に由来するものであり，ウイルス分離学者がこの種に属する他のウイルス株を同定するのに充分なものである。本願が提供する情報によれば，ＨＣＶがフラビ様ウイルス（Ｆｌａｖｉ−ｌｉｋｅｖｉｒｕｓ）であることが確認できる。フラビウイルス粒子の形態および組成は公知であり，ブリントン（Ｂｒｉｎｔｏｎ，１９８６年）が考察している。形態については，一般に，フラビウイルス類は，脂質二重層で覆われた中心ヌクレオカプシドを有している。ビリオンは球形であり，その直径は約４０〜５０ｎｍである。そのコアは直径が約２５〜３０ｎｍである。ビリオンのエンベロープの外面には，直径が約２ｎｍの末端ノブ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｎｏｂ）を有する約５〜１０ｎｍ長の突起を有する。
【００３８】
ＨＣＶの異なるウイスル株または単離体は，原形単離体ＨＣＶ１と比較すると，アミノ酸および核酸の変異を含むことが予想される。多くの単離体は，ＨＣＶ１と比較すると，全アミノ酸配列において高い（すなわち，約４０％より高い）相同性を示すことが予想される。しかし，相同性の少ない他のＨＣＶ単離体も発見され得る。これらは，サイズがＨＣＶ１と類似するポリタンパクをコードする約９，０００個のヌクレオチドから約１２，０００個のヌクレオチドからなるＯＲＦ，ＨＣＶ１と類似する疎水性および抗原性を有するコードされたポリタンパク，およびＨＣＶ１で保存されている共直線ペプチド配列の存在などの様々な基準に従って，ＨＣＶ株として同定される。さらに，ゲノムは正鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＲＮＡであろう。
【００３９】
ＨＣＶは，本願に記載のｃＤＮＡが誘導されるＨＣＶゲノム内のエピトープとして免疫学的に同定可能な少なくとも１つのエピトープをコードするが，このエピトープは本願に記載のアミノ酸配列に含まれることが好ましい。このエピトープは，他の公知のフラビウイルス類と比較した場合，ＨＣＶに特有のものである。このエピトープの独自性は，抗ＨＣＶ抗体との免疫学的反応性と，他のフラビウイルス種に対する抗体との免疫学的反応性の欠如とによって決定することができる。免疫学的反応性を決定する方法は当該技術分野では公知であり，例えば，放射性免疫検定法，ＥＬＩＳＡ法，血球凝集反応法などがあり，分析技術の適切ないくつかの例を本願に示す。
【００４０】
上記に加えて，ウイルス株または単離体をＨＣＶとして同定する際に，単独もしくは組合わせて，核酸相同性およびアミノ酸相同性に関する下記のパラメータを利用することができる。ＨＣＶ株および単離体は，進化論的に関連しているので，ヌクレオチドレベルでのゲノムの全相同性は，おそらく約４０％以上であり，おそらく約６０％以上で，さらにおそらく約８０％以上であり，さらに少なくとも約１３個のヌクレオチドからなる対応の連続配列があると考えられる。推定上のＨＣＶ株のゲノム配列とＣＤＣ／ＨＣＶ１のｃＤＮＡ配列との同一性は，当該技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば，推定上のＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの配列情報と，本願に記載のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列とを直接比較することによって決定することができる。また例えば，相同領域間に安定な二本鎖を形成する条件下（例えば，Ｓ１消化の前に用いられる条件下）でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせ，次いで一本鎖に特異的なヌクレアーゼの一種もしくは複数種で切断し，さらに切断によって生成した断片の大きさを測定することによって決定することができる。
【００４１】
ＨＣＶのウイスル株または単離体には進化的類縁関係があるので，推定上のＨＣＶ株または単離体は，ポリペプチドレベルにおける，その相同性によって同定可能である。一般に，ＨＣＶ株または単離体は，ポリペプチドレベルで，約４０％を越える相同性を，おそらくは約７０％を越える相同性を，さらにおそらくは８０％を越える相同性を，さらに場合によっては約９０％を越える相同性を有すると考えられる。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は，当該技術分野で公知である。例えば，アミノ酸配列を直接決定して，本願に示した配列と比較することができる。あるいは，推定上のＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列を（通常，ｃＤＮＡ中間体を介して）決定してもよく，これにコードされているアミノ酸配列は決定可能であり，そして対応する領域を比較することができる。
【００４２】
本願で使用される場合，指定された配列「由来」のポリヌクレオチドとは，指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する少なくとも約６個のヌクレオチド，好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド，さらに好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド，さらに好ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチド配列を意味する。「対応する」とは，指定された配列に相同的または相補的であることを意味する。上記ポリヌクレオチドが誘導される領域の配列は，ＨＣＶゲノムに特有の配列に相同的または相補的であるのが好ましい。ある配列がＨＣＶゲノムに特有のものであるか否かは当業者に公知の技術で決定することができる。例えば，その配列を，データバンク，例えばジーンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）の配列と比較して，未感染の宿主または他の生物に存在するか否かを決定することができる。また，その配列は，他のウイルス因子（肝炎，例えば，ＨＡＶ，ＨＢＶ，およびＨＤＶを誘発することが知られているウイルス因子を含む）の既知配列，ならびにフラビウイルス科のウイルス（Ｆｒａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）の他のメンバーと比較することもできる。また，誘導された配列が他の配列と一致しているかまたは一致していないかは，適切な厳密条件下でハイブリダズさせることによって決定することができる。核酸配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は，当該技術分野で公知であり，後に検討する。例えば，マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ  ａｌ，１９８２年）の文献を参照されたい。さらに，ハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖ポリヌクレオチドの不整合も，公知の方法で決定することができる。この方法には，例えば，Ｓ１のようなヌクレアーゼによって，二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖領域を特異的に切断する方法がある。代表的なＤＮＡ配列が「誘導される」領域は，例えば，特異的なエピトープをコードする領域，ならびに転写されない領域および／または翻訳されない領域を含むが，これに限定されるものではない。
【００４３】
誘導されたポリヌクレオチドは，必らずしも，提示されたヌクレオチド配列から物理的に誘導されている必要はなく，いずれの方法により生じてもよい。例えば，化学合成法，ＤＮＡ複製法，逆転写法，または転写法が挙げられる。さらに，指定された配列の領域に対応する領域の組み合わせは，当該技術分野で公知の方法で改変され，意図する用途に合致させることができる。
【００４４】
同様に，指定された核酸の配列「から誘導された（由来の）」ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は，上記の配列にコードされているポリペプチドのアミノ酸配列もしくはその一部分（少なくとも３〜５個のアミノ酸，より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸，さらに好ましくは少なくとも１１〜１５個のアミノ酸で構成されている部分）の配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド，または上記の配列にコードされているポリペプチドとして免疫学的に同定し得るポリペプチドを意味する。
【００４５】
組換え体ポリペプチドもしくは誘導されたポリペプチドは，指定された核酸配列，例えば本願で示されるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列から，またはＨＣＶゲノムから必らずしも翻訳される必要はなく，例えば化学合成法，もしくは組換え体発現系の発現，もしくは変異ＨＣＶからの単離を含むいずれの方法でも生成し得る。組換え体ポリペプチドもしくは誘導されたポリペプチドは，その配列内にアミノ酸または非天然アミノ酸の１つまたはそれ以上の類似体を含み得る。アミノ酸の類似体を配列の中に挿入する方法は，当該技術分野で公知である。また，組換え体ポリペプチドもしくは誘導されたポリペプチドは，１つまたはそれ以上の標識を含み得，このことは，当該技術者に公知である。
【００４６】
本願で用いる「組換え体ポリヌクレオチド」という用語は，ゲノム，ｃＤＮＡ，半合成，もしくは合成起源のポリヌクレオチドを意味し，その起源もしくは操作によって，（１）このポリヌクレオチドが天然で関連しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と関連していないもの，（２）このポリヌクレオチドが天然で連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているもの，または（３）天然に存在しないものを意味する。
【００４７】
本願で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は，任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）を意味する。この用語は，分子の一次構造のみを意味する。したがって，この用語には，二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ，ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡが含まれる。また，この用語には，既知の改変，例えば当該技術において既知の標識，メチル化，「キャップ」，類似体による１つまたはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換，ヌクレオチド間の改変，例えば非荷電結合を有するもの（例えば，メチルホスホネート，ホスホトリエステル，ホスホアミデート，カルバメートなど），および荷電結合を有するもの（例えば，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートなど），例えばタンパク（例えば，ヌクレアーゼ，トキシン，抗体，シグナルペプチド，ポリ−Ｌ−リジンなど）のようなペンダント部分を含むもの，インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）（例えば，アクリジン，ソラレンなど）を有するもの，キレート化剤（例えば，金属，放射性金属，ホウ素，酸化性金属など）を含むもの，アルキル化剤を含むもの，修飾された結合（例えば，アルファアノマー核酸など），ならびに未修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。
【００４８】
「精製されたウイルスポリヌクレオチド」という用語は，ウイルスのポリヌクレオチドが天然で関連するポリペプチドを実質的に含まない，すなわち約５０％未満，好ましくは約７０％未満，さらに好ましくは約９０％未満しか含有しないようなＨＣＶゲノムもしくはその断片を意味する。ウイルス粒子からウイルスポリヌクレオチドを精製する方法は，当該技術分野で公知であり，例えば，ウイルス粒子をカオトロピック剤で破壊する方法，およびイオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，および密度による遠心沈降法によってポリヌクレオチドとポリペプチドを分別抽出および分離する方法がある。
【００４９】
「精製されたウイルスポリペプチド」という用語は，ウイルスポリペプチドが天然で関連する細胞成分を実質的に含まない，すなわち約５０％未満，好ましくは約７０％未満，さらに好ましくは約９０％未満しか含有してないようなＨＣＶポリペプチドもしくはその断片を意味する。ウイルスポリペプチドを精製する方法は，当該技術分野で公知であり，これらの方法の例については後に考察する。「精製されたウイルスポリヌクレオチド」という用語は，ウイルスのポリヌクレオチドが天然で関連するポリペプチドを実質的に含まない，すなわち約２０％未満，好ましくは約５０％未満，さらに好ましくは約７０％未満しか含有しないような，ＨＣＶゲノムもしくはその断片を意味する。ウイルス粒子からウイルスポリヌクレオチドを精製する方法は，当該技術分野で公知であり，例えば，ウイルス粒子をカオトロピック剤で破壊する方法，およびイオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，および密度による遠心沈降法によってポリヌクレオチドとポリペプチドを分離する方法がある。
【００５０】
単細胞因子として培養される微生物もしくは高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」，「宿主細胞」，「細胞」，「細胞系」，「細胞培養物」などの用語は，組換え体ベクターもしくは他の転移ＤＮＡの受容体として使用可能か，または使用されてきた細胞を意味し，トランスフェクトされた元の細胞の後代が含まれる。単一の親細胞の後代は，天然の，偶発的または計画的な変異によって，形態，またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性が元の親細胞と，必らずしも完全に同一でなくてもよい。
【００５１】
「レプリコン」には，例えばプラスミド，染色体，ウイルス，コスミッドなどの遺伝子構成成分などが含まれ，細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として挙動する，すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる，あらゆる遺伝要素である。
【００５２】
「ベクター」は，他のポリヌクレオチドのセグメントが結合しているレプリコンであって，複製を行い，および／または結合しているセグメントを発現する。「制御配列」は，ある種のポリヌクレオチド配列を意味し，この配列が連結しているコード配列を発現させるのに必要なものである。このような制御配列の性質は，宿主の生物によって異なる。このような制御配列としては，原核細胞内では，一般に，プロモーター，リボソーム結合部位，およびターミネーターが含まれ，真核細胞内では，一般に，プロモーター，ターミネーター，および場合によってはエンハンサーが含まれる。「制御配列」という用語は，最小限発現に必要なすべての要素を包含し，さらに発現に有利な追加の要素，例えばリーダー配列を包含し得る。
【００５３】
「作動可能に連結された」という用語は，上記のような要素が，意図した方式で機能し得るような関係に並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は，制御配列に適合した条件下でこのコード配列の発現が達成されるように，連結される。
【００５４】
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は，ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり，この領域は，コード配列の一部またはコード配列全体を意味する。
【００５５】
「コード配列」は，適切な調節配列の制御下に置かれた場合に，ｍＲＮＡに転写され，および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は，５’末端の翻訳開始コドンと，３’末端の翻訳停止コドンとによって決定される。コード配列は，ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ，および組換え体ポリヌクレオチド配列を包含し得るが，これらに限定されるものではない。
【００５６】
「免疫学的に…として同定可能な」という用語は，指定されたポリペプチド，通常はＨＣＶタンパク内に存在するエピトープおよびポリペプチドが存在することを意味する。免疫学的な同一性は，抗体の結合および／または競合的結合によって決定され得るが，これらの方法は当業者には公知であり，後述する。
【００５７】
本願で用いる「エピトープ」という用語は，ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは，このエピトープに特有の立体配座で３個のアミノ酸を有し得るが，エピトープは，一般に少なくとも５個のこのようなアミノ酸で構成され，より一般的には少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸で構成されている。アミノ酸の立体配座の決定法は，当該技術分野では公知であり，例えば，Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴法がある。
【００５８】
ポリペプチドは，このポリペプチドに含まれている特異的なエピトープが抗体を認識することによって，この抗体と結合する場合に，抗体と「免疫学的に反応性がある」という。免疫学的反応性は，抗体結合反応，特に抗体結合反応の速度論，および／または抗体に対するエピトープを含む公知のポリペプチドを，競合物として用いる競合的結合法によって決定される。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応性であるか否かを決定する方法は，当該技術分野で公知である。
【００５９】
本願で用いる，「免疫原性を有するポリペプチド」という用語には，アジュバンドの存在下または不存在下で，単独でまたは担体に連結して細胞性応答および／または体液性応答を誘導するポリペプチドが包含される。
【００６０】
「ポリペプチド」という用語は，アミノ酸の重合体を意味し，特定の長さの生産物を意味しない。したがって，ポリペプチドの定義には，ペプチド，オリゴペプチド，およびタンパクが包含される。また，この用語は，ポリペプチドの発現後修飾物，例えば，グリコシル化物，アセチル化物，リン酸化物などを意味しないか，あるいは除外する。この定義に包含されるものは，例えば，アミノ酸（例えば，非天然のアミノ酸などを含む）の１つかまたはそれ以上の類似体を含むポリペプチド，置換された結合ならびに当該技術分野で公知の天然に存在するおよび天然に存在しない他の改変を有するポリペプチドである。
【００６１】
本願で用いる「形質転換」という用語は，外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意味する。なお，挿入法は，どんな方法でもよく，例えば，直接取込み法，形質導入法，ｆ−交配法，またはエレクトロポレーション法がある。外因性ポリヌクレオチドは，組込まれていないベクター，例えば，プラスミドとして保持されていても，あるいは宿主ゲノムに組込まれていてもよい。
【００６２】
本願で用いる「処置」という用語は，予防および／または治療を意味する。
【００６３】
本願で用いる「個体」という用語は，脊椎動物，特に哺乳動物種のメンバーを意味し，家畜，競技用動物，およびヒトを含む霊長動物を包含するが，これに限定されるものではない。
【００６４】
本願で用いる，核酸の「センス鎖」は，ｍＲＮＡに相同的な配列を有する配列を含む。「アンチセンス鎖」は，「センス鎖」と相補的な配列を含む。
【００６５】
本願で用いる，ウイルスの「正鎖ゲノム」は，ＲＮＡまたはＤＮＡにかかわらず，一本鎖のゲノムであり，ウイルスのポリペプチドをコードする。正鎖ＲＮＡウイルスの例としては，トガウイルス科ウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ），コロナウイルス科ウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ），レトロウイルス科ウイルス  （Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ），ピコルナウイルス科ウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａ−ｖｉｒｉｄａｅ），およびカリチウイルス科ウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）がある。また，フラビウイルス科ウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）も含まれるが，これは以前にはトガウイルス科に分類されていた〔フィールドとナイプの文献（１９８６年）を参照されたい〕。
【００６６】
本願で用いる「抗体を含有する身体成分」は，問題の抗体の起源である個体の身体の成分を意味する。抗体を含有する身体成分は，当該技術分野で公知であり，例えば，血漿，血清，脊髄液，リンパ液，呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外側部分，涙，唾液，乳，白血球，および骨髄腫細胞が含まれるが，これに限定されるものではない。
【００６７】
本願で用いる「精製されたＨＣＶ」は，ウイルスが通常関連する細胞構成要素から単離された，および感染組織中に存在する他の種のウイルスから単離されたＨＣＶ調製物を意味する。ウイルスを単離する技術は，当業者には公知であり，例えば，遠心分離法およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが，精製ＨＣＶの調製方法については後述する。
【００６８】
本願で用いる「ＨＣＶ粒子」という用語には，全ビリオンおよびビリオン形成時に中間体となる粒子が包含される。ＨＣＶ粒子は，一般に，ＨＣＶ核酸に関連する１つまたはそれ以上のＨＣＶタンパクを有する。
【００６９】
本願で用いる「プローブ」という用語は，このプローブにおける少なくとも１つの配列が標的領域の配列に対して相補性を有するので，この標的領域の配列とハイブリッド構築物を形成するポリヌクレオチドを意味する。しかし，このプローブは，ポリメラーゼ鎖反応のプライマーとして使用される配列に相補的な配列を含まない。
【００７０】
本願で用いる「標的領域」という用語は，増幅および／または検出されるべき核酸の領域を意味する。
【００７１】
本願で用いる，ＨＣＶ  ＲＮＡを含む「ウイルスＲＮＡ」という用語は，ウイルスゲノム，その断片，その転写物，およびそれに由来する変異配列由来のＲＮＡを意味する。本願で用いる「生物学的試料」は，個体から単離された組織または体液の試料を意味し，それには，例えば血漿，血清，脊髄液，リンパ液，皮膚と呼吸器官と腸管と尿生殖器官の外側部分，涙，唾液，乳，血液細胞，腫瘍，器官，およびインビトロでの細胞培養構成物（細胞培養培地で細胞を増殖させて得られる馴化培地，ウイルス感染したと推定される細胞，組換え細胞，および細胞成分を包含するが，それに限定されない）の試料を包含するが，それに限定されない。
【００７２】
ＩＩ．発明の構成
本発明の実施においては，特に指示されない限り，当該分野の技術範囲内にある分子生物学，微生物学，組換えＤＮＡ，および免疫学における従来の手法が採用される。このような手法は，文献中に詳しく説明されている。例えば，次の文献を参照されたい：Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９８２）；ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編集，１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  編集，１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩ−ＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集，１９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮＡＮＤＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓおよび  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集，１９８４）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集，１９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ；Ｗｕ編集），ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集（１９８７）；ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ），Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）；
ＰＲＯＴＥＩＮＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．），およびＨＡＮＤＢＯＯＫＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）。ここで述べられる前出および後述の全ての特許，特許出願および刊行物は参考文献としてここに取り入れられている。
【００７３】
本発明の有用な材料および方法は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡライブラリーから単離されたヌクレオチド配列群の供給により可能になる。これらのｃＤＮＡライブラリーは，ＨＣＶ感染チンパンジーの血漿中に存在する核酸配列に由来する。これらのライブラリーの１つ，「ｃ」ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）の構築は欧州特
許出願公開第３１８，２１６号に報告された。ここに報告されているＨＣＶｃＤＮＡを含むクローンのいくつかは「ｃ」ライブラリーから得られた。ここに報告されている他のクローンは他のＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーから得られたが，これらの配列を含むクローンが「ｃ」ライブラリーに存在することが確認された。欧州特許出願公開第３１８，２１６号で考察されているように，「ｃ」ライブラリーから単離されたＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列群は，ヒトあるいはチンパンジーを起源とするものではなく，ＨＢＶゲノム内に含まれる配列に有意な相同性を示さない。
【００７４】
ここに記載されているＨＣＶ  ｃＤＮＡが入手可能であるので，供給血液を含む生物学的試料におけるウイルス性のポリヌクレオチドを検出するのに有用な試薬であるポリヌクレオチドプローブの構築を行うことが可能となる。例えば，これらの配列から，約８〜１０個あるいはそれより長いヌクレオチドを有するＤＮＡオリゴマーを合成することが可能である。これらのＤＮＡオリゴマーは，例えば供給血液，ウイルスを保有している疑いがある被験者血清，あるいはウイルスが複製している細胞培養組織におけるＨＣＶ  ＲＮＡ  の存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。さらに，ｃＤＮＡ配列により，ＨＣＶ感染において生じる抗体の存在を検出する診断用試薬として有用なＨＣＶに特異的なポリペプチドの設計および生産が可能となる。ｃＤＮＡ由来の精製ポリペプチドに対する抗体は，例えば，供給血液の試料，ＮＡＮＢＨ患者からの血清を含む生物学的試料における，ＨＣＶｃＤＮＡの複製に使用される組織培養系におけるウイルス抗原を検出するためにも用いられ得る。さらに，図２７〜図３６に示されているＨＣＶ  ｃＤＮＡのＯＲＦの一部分にコードされた免疫原性ポリペプチドであって，ここに開示されている免疫原性ポリペプチドも，ＨＣＶスクリーニング，診断，および処置のために，またこれらの目的に有用な抗体を産生させるのに役立つ。
【００７５】
さらに，ここに記載された新しいｃＤＮＡ配列は，ＨＣＶゲノムをより特徴づけることを可能にする。これらの配列から得られたポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは，ｃＤＮＡライブラリーに存在する配列を増幅するのに，および／または重複している付加的なｃＤＮＡ配列についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。このｃＤＮＡ配列はさらに重複している別の配列を得るためにも用いられ得る。以下に述べるように，および欧州特許出願公開第３１８，２１６号において述べられているように，ＨＣＶゲノムは，大きいポリタンパクをコードする大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から主としてなるＲＮＡであるようである。
【００７６】
ここに与えられているＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列群，これらの配列に由来するポリペプチド，ここに記載されている免疫原性ポリペプチド，そして，これらポリペプチドに対する抗体は，血液媒介ＮＡＢＶ（ＢＢ−ＮＡＮＢＶ）因子の単離および同定にも有用である。例えば，ｃＤＮＡ由来のポリペプチドに含まれるＨＣＶエピトープに対する抗体は，アフィニティークロマトグラフィーに基づく方法によってウイルスを単離するために用いられ得る。あるいは，これらの抗体は他の手法により単離されたウイルス粒子を同定するために用いられ得る。単離されたウイルス粒子内のウイルス抗原およびゲノム物質が，さらに特徴づけられ得る。
【００７７】
上記のことに加えて，以下に与えられている情報により，付加的なＨＣＶ株あるいは単離体の同定が行われる。付加的なＨＣＶ株あるいは単離体の単離および特徴付けは，ウイルス分子および／またはウイルスＲＮＡを含む身体成分から核酸を単離し，後述のＨＣＶ  ｃＤＮＡプローブに基づくポリヌクレオチドプローブを使用してｃＤＮＡライブラリーを作成し，後述のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を含むクローンについてライブラリーをスクリーニングし，そして新しい単離体からのＨＣＶ  ｃＤＮＡを後述のｃＤＮＡと比較することにより，達成され得る。そこにあるいはウイルスゲノム内にコードされたポリペプチドは，上記したポリペプチドおよび抗体を使用して，免疫学的交差反応についてモニターされ得る。ＨＣＶのパラメーターに適合する株および単離体は，上記の定義部分に記載されているように，容易に同定することができる。ここに与えられている情報に基づき，ＨＣＶ株を同定する他の方法は，当業者に明らかである。
【００７８】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の単離
以下に述べる新しいＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，ｃＤＮＡの配列を，欧州特許出願公開第３１８，２１６号で報告されているＨＣＶゲノムにまで拡張した。クローンｂ１１４ａ，１８ｇ，ａｇ３０ａ，ＣＡ２０５ａ，ＣＡ２９０ａ，ＣＡ２１６ａ，ｐｉ１４ａ，ＣＡ１６７ｂ，ＣＡ１５６ｅ，ＣＡ８４ａ，およびＣＡ５９ａに存在する配列は，報告された配列の上流にあり，合わせると，ヌクレオチド番号−３１９〜１３４８の複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列となる。（ヌクレオチド上の負の数字は，推定されるＭＥＴ開始コドンから始まるヌクレオチドの上流側の距離を示す）クローンｂ５ａおよびクローン１６ｊｈに存在する配列は報告された配列の下流にあり，複合配列のヌクレオチド番号８６５９〜８８６６を与える。上記クローンにおける配列を含む複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，図２７〜図３６に示されている。
【００７９】
ここに記載された新しいＨＣＶ  ｃＤＮＡは，λｇｔｌｌ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）に存在する「ｃ」ライブラリーを含む多くのＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーは，慢性ＨＣＶ感染チンパンジーから，高力価のウイルスを，つまり少なくとも１０６チンパンジー感染量／ｍｌ（ＣＩＤ／ｍｌ）のウイスルを有するプール血清を使用して構築された。プール血清はウイルス粒子を単離するために使用された。これらの粒子から単離された核酸は，ウイルスゲノムに対するｃＤＮＡライブラリーの構築において鋳型として使用された。推定されるＨＣＶ粒子の単離および「ｃ」ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリー構築のための手法は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されている。ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーを構築する他の方法は当技術分野で公知であり，これらの方法のいくつかは以下の実施例に記載されている。配列の単離は合成ポリヌクレオチドプローブを使用してライブラリーをスクリーニングすることによって行われた。その配列は既知のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の５’領域および３’領域から誘導された。ｃＤＮＡ配列を得るための方法の記述は，歴史的に最も興味深い。得られた配列（およびその相補配列）は，ここに与えられており，その配列あるいはその部分的な配列は，合成法を用いて，あるいは合成法とここに記載したのと同様の方法を用いた部分配列を得る方法とを組み合わせて調製され得る。
【００８０】
ウイルス性ポリペプチドおよび断片の調製
ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列あるいはそれらに由来するヌクレオチド配列（この配列のセグメントおよび修飾配列を含む）を利用することにより，いずれかの鎖にコードされているポリペプチドの抗原的に活性な領域をコードする発現ベクターの構築が可能となる。これらの抗原的に活性な領域は，コートまたはエンベロープ（外被）抗原，あるいはコア抗原，または非構造的な抗原由来であり得，それには例えば，ポリヌクレオチド結合タンパク，ポリヌクレオチドポリメラーゼ，およびウイルス粒子の複製および／または構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に必要とされる他のウイルス性タンパクが包含される。所望のポリペプチドをコードする断片は，従来の制限消化法を用いて，あるいは合成法により，ｃＤＮＡクローンから誘導され，例えばβ−ガラクトシダーゼあるいはスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）（好ましくは，ＳＯＤ）のような融合配列の一部を有するベクター中に連結される。ＳＯＤの融合配列を有するポリペプチドの生産に有用な方法およびベクターは，１９８６年１０月１日付でに公開された欧州特許出願公開番号第０１９６０５６号に記載されている。多くのＨＣＶクローンにコードされているＳＯＤおよびＨＣＶポリペプチドからなる融合ポリペプチドを発現させるためのベクターは以下の実施例に記載されている。どちらのセンス鎖においても，オープンリーディングフレームを有するＨＣＶｃＤＮＡの所望部分は，成熟タンパクあるいは融合タンパクのような組換えポリペプチドとして得られる。あるいは，このｃＤＮＡにコードされているポリペプチドは，化学合成により与えられ得る。
【００８１】
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは，融合型であっても成熟型であっても，分泌を可能にするシグナル配列を有していてもいなくても，適当な宿主に適した発現ベクターに組み込まれ得る。真核生物および原核生物の両宿主系が，組換えポリペプチドを形成するために現在用いられている。より一般的な制御系および宿主細胞系を，後にまとめて示す。このポリペプチドは，次に，溶解した細胞あるいは培養培地から単離され，意図された使用に必要な程度にまで精製される。精製には，当該技術分野で公知の手法が用いられ得，それには例えば，分別抽出，塩分画，イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー，アフィニティクロマトグラフィー，遠心分離などがある。例えば，種々のタンパク精製法に関するＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙを参照されたい。このようなポリペプチドは，診断用薬として用いられ得るか，あるいは中和抗体を生じるようなポリペプチドはワクチンに処方され得る。これらのポリペプチドに対して生じた抗体もまた，診断用薬として，あるいは受動免疫治療に用いられ得る。さらに，後述するように，これらポリペプチドに対する抗体は，ＨＣＶ粒子の単離および同定に有用である。
【００８２】
抗原性ポリペプチドの調製および担体との結合
ポリペプチドの抗原性領域は，通常は比較的小さく，代表的には８〜１０個あるいはそれを下まわる長さのアミノ酸である。５個程度のアミノ酸からなる断片が抗原性領域を特徴付けている。これらのセグメントは，ＨＣＶ抗原領域に対応している。従って，このＨＣＶのｃＤＮＡを基礎として用いると，ＨＣＶポリペプチドの短いセグメントをコードするＤＮＡを，融合タンパクとして，あるいは単離ポリペプチドとして，組換え手法により発現させることができる。さらに，短いアミノ酸配列は，化学合成によって都合よく得ることができる。合成ポリペプチドが正しいエピトープを与えるように正しく形成されているが，小さすぎて免疫原性がない場合には，このポリペプチドを，適当な担体に結合させればよい。
【００８３】
このような結合を得るための多くの方法が当該分野で公知であり，それには，ＰｉｅｒｃｅＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手されるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いてジスルフィド結合を形成する方法が包含される（このペプチドがスルフヒドリル基を欠いていれば，システイン残基を付加することにより，この基が与えられ得る）。これらの試薬は，その試薬自身と，一方のタンパクのペプチドシステイン残基との間のジスルフィド結合を形成し，かつリジンのε−アミノあるいは他方の他の遊離アミノ基によるアミド結合を形成する。このような様々なジスルフィド／アミド形成試薬は公知である。例えば，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９８２）６２：１８５を参照されたい。他の二官能性カップリング試薬は，ジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成試薬の多くは市販されており，それには６−マレイミドカプロン酸，２−ブロモ酢酸，２−ヨード酢酸，４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルが包含される。これらのカルボキシル基は，そのカルボキシル基とコハク酸イミドとを，あるいは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによって活性化され得る。抗原を結合する付加的な方法は欧州特許出願公開第２５９，１４９号に記載されたロタウイルス／「結合ペプチド」システムを使用しており，その開示内容は参照としてここに記載されている。上に列挙したものは，それが全てであることを意味せず，列挙した化合物の修飾物もまた明らかに用いられ得る。
【００８４】
担体としては，それ自身が宿主に対して有害な抗体の生産を誘導しないものであれば，いずれの担体も用いられ得る。適当な担体は，典型的には，大きく，ゆっくり代謝される高分子物質であり，それには例えば，タンパク；ラテックス機能付与セファロース，アガロース，セルロース，セルロースビーズなどの多糖体；ポリグルタミン酸，ポリリジンなどのような重合アミノ酸；アミノ酸共重合体；および不活性ウイルス粒子がある。特に有用なタンパク基質には，血清アルブミン，キーホールリンペットヘモシアニン，免疫グロブリン分子，チログロブリン，卵アルブミン，テタヌス毒素，および当業者に公知の他のタンパクがある。
【００８５】
全長のウイルス性タンパクの他に，少なくとも１つのウイルス性エピトープをコードする切形のＨＣＶアミノ酸配列を有するポリペプチドは有用な免疫学的試薬である。例えば，このような切形配列を有するポリペプチドは免疫学的検定法の試薬として使用され得る。これらのポリペプチドは，抗血清を生産するための組成物あるいはワクチンにおけるサブユニット抗原の候補である。これらの切形配列は，天然のウイルス性タンパクについて知られている様々な処理を施すことにより調製され得るが，一般的には，ＨＣＶ配列を有する合成あるいは組換えポリペプチドを作成するのが好ましい。これらの切形ＨＣＶ配列を有するポリペプチドは，完全にＨＣＶ配列（連続のあるいは不連続の１つまたはそれ以上のエピトープ）あるいは融合タンパクにおけるＨＣＶ配列および異種配列から構成され得る。有用な異種配列には，組換え宿主からの分泌，ＨＣＶエピトープの免疫学的な反応を高める配列，あるいは免疫学的検定用支持体あるいはワクチン担体へのポリペプチドの結合を促進する配列がある。例えば，欧州特許出願公開第１１６，２０１号，米国特許第４，７２２，８４０号，欧州特許出願公開第２５９，１４９号，米国特許第４，６２９，７８３号を参照されたい。その開示内容は参考として，ここに取り入れられている。
【００８６】
切形のＨＣＶ配列を有するポリペプチドのサイズは，非常に様々であり，最大サイズは重要ではないが，最小サイズはＨＣＶエピトープを与えるのに充分なサイズの配列である。便宜的には，最大サイズは，通常，所望のＨＣＶエピトープと，もしあるなら異種配列の機能とを与えるのに必要とされるサイズを実質的に越えることはない。典型的には，切形のＨＣＶアミノ酸配列は約５〜約１００の範囲内のアミノ酸長になる。しかし，さらに典型的には，ＨＣＶ配列は，最大約５０のアミノ酸長になり，最大約３０のアミノ酸長が好ましい。通常，少なくとも約１０，１２，あるいは１５個のアミノ酸，最大約２０〜２５個のアミノ酸からなるＨＣＶ配列を選択するのが望ましい。
【００８７】
エピトープを有する切形のＨＣＶアミノ酸配列は多くの方法で同定され得る。例えば，全ウイルスタンパク配列は全タンパク配列を互いに補完する一連の短かいペプチドを調製することによってスクリーニングされ得る。ＨＣＶポリタンパク領域を抗原性によってスクリーニングする例が後に示されている。さらに，例えば１００ｍｅｒのポリペプチドから始めることにより，所望の反応性を示すエピトープの存在について各ポリペプチドを調べ，次いで，問題のエピトープの位置を決定するために，同定された１００ｍｅｒ由来の次第に小さくなり重複している断片を調べることは通常の操作である。免疫学的検定法において，このようなペプチドをスクリーニングすることは，当該分野の技術範囲内である。タンパク配列のコンピュータ分析を行って，可能性のあるエピトープを同定し，次いでスクリーニング用の同定領域を含むオリゴヌクレオチドを調製することも知られている。このようなＨＣＶアミノ酸配列のコンピュータ分析は図４３〜図４８に示されている。この図において，親水性／疎水性は，抗原指数の上部に示されている。アミノ酸は，図２７〜図３６に示すように，開始ＭＥＴ（１位）から番号付けされている。このような抗原性のコンピューター分析により，必ずしも実際に存在しているエピトープを同定することはできず，エピトープを有しているものとしてタンパク領域を間違って同定することも有り得ることは，当業者により認められている。
【００８８】
有用で有り得るＨＣＶアミノ酸配列の例は，クローン５−１−１，８１，ＣＡ７４ａ，３５ｆ，２７９ａ，Ｃ３６，Ｃ３３ｂ，ＣＡ２９０ａ，Ｃ８ｆ，Ｃ１２ｆ，１４ｃ，１５ｅ，Ｃ２５ｃ，Ｃ３３ｃ，Ｃ３３ｆ，３３ｇ，Ｃ３９ｃ，Ｃ４０ｂ，ＣＡ１６７ｂからなる発現ベクターから発現されるものであり，以下に説明されている。ここに記載されているように，有用で有り得るＨＣＶアミノ酸配列の他の例については，以下で説明する。これらのペプチドは，１つのエピトープを必ずしも正確に位置づけるとは限らないし，免疫原性ではないＨＣＶ配列を含有し得ると理解されるべきである。この配列の免疫原性を有さないこれらの部分は，上記のように従来の方法を使用して特定され，記載した配列から削除され得る。さらに，エピトープを含むかあるいは免疫原性を有する付加的な切形のＨＣＶアミノ酸配列は，上記のように同定され得る。以下の配列はアミノ酸番号（すなわち，「ＡＡｎ」）によって与えられる。ここで，図２７〜図３６に示すように，ｎはアミノ酸番号である：
ＡＡ１−ＡＡ２５；ＡＡ１−ＡＡ５０；  ＡＡ１−ＡＡ８４；  ＡＡ９−ＡＡ１７７；  ＡＡ１−ＡＡ１０；ＡＡ５−  ＡＡ２０；  ＡＡ２０−ＡＡ２５；
ＡＡ３５−ＡＡ４５；ＡＡ５０−ＡＡ１００；  ＡＡ４０−ＡＡ９０；  ＡＡ４５−ＡＡ６５；  ＡＡ６５−ＡＡ７５；  ＡＡ８０−ＡＡ９０；  
ＡＡ９９−ＡＡ１２０；ＡＡ９５−ＡＡ１１０；  ＡＡ１０５−ＡＡ１２０；  ＡＡ１００−ＡＡ１５０；  ＡＡ１５０−ＡＡ２００；  
ＡＡ１５５−ＡＡ１７０；ＡＡ１９０−ＡＡ２１０；  ＡＡ２００−ＡＡ２５０；  ＡＡ２２０−ＡＡ２４０；  ＡＡ２４５−ＡＡ２６５；  
ＡＡ２５０−ＡＡ３００；ＡＡ２９０−ＡＡ３３０；  ＡＡ２９０−３０５；  ＡＡ３００−ＡＡ３５０；  ＡＡ３１０−ＡＡ３３０；  
ＡＡ３５０−ＡＡ４００；ＡＡ３８０−ＡＡ３９５；  ＡＡ４０５−ＡＡ４９５；  ＡＡ４００−ＡＡ４５０；  ＡＡ４０５−ＡＡ４１５；  
ＡＡ４１５−ＡＡ４２５；ＡＡ４２５−ＡＡ４３５；  ＡＡ４３７−ＡＡ５８２；  ＡＡ４５０−ＡＡ５００；  ＡＡ４４０−ＡＡ４６０；  
ＡＡ４６０−ＡＡ４７０；ＡＡ４７５−ＡＡ４９５；  ＡＡ５００−ＡＡ５５０；  ＡＡ５１１−ＡＡ６９０；  ＡＡ５１５−ＡＡ５５０；  
ＡＡ５５０−ＡＡ６００；ＡＡ５５０−ＡＡ６２５；  ＡＡ５７５−ＡＡ６０５；  ＡＡ５８５−ＡＡ６００；  ＡＡ６００−ＡＡ６５０；  
ＡＡ６００−ＡＡ６２５；ＡＡ６３５−ＡＡ６６５；  ＡＡ６５０−ＡＡ７００；  ＡＡ６４５−ＡＡ６８０；  ＡＡ７００−ＡＡ７５０；  
ＡＡ７００−ＡＡ７２５；ＡＡ７００−ＡＡ７５０；  ＡＡ７２５−ＡＡ７７５；  ＡＡ７７０−ＡＡ７９０；  ＡＡ７５０−ＡＡ８００；  
ＡＡ８００−ＡＡ８１５；ＡＡ８２５−ＡＡ８５０；  ＡＡ８５０−ＡＡ８７５；  ＡＡ８００−ＡＡ８５０；  ＡＡ９２０−ＡＡ９９０；  
ＡＡ８５０−ＡＡ９００；ＡＡ９２０−ＡＡ９４５；  ＡＡ９４０−ＡＡ９６５；  ＡＡ９７０−ＡＡ９９０；  ＡＡ９５０−ＡＡ１０００；  
ＡＡ１０００−ＡＡ１０６０；ＡＡ１０００−ＡＡ１０２５；  ＡＡ１０００−ＡＡ１０５０；  ＡＡ１０２５−ＡＡ１０４０；  
ＡＡ１０４０−ＡＡ１０５５；ＡＡ１０７５−ＡＡ１１７５；  ＡＡ１０５０−ＡＡ１２００；  ＡＡ１０７０−ＡＡ１１００；  
ＡＡ１１００−ＡＡ１１３０；ＡＡ１１４０−ＡＡ１１６５；  ＡＡ１１９２−ＡＡ１４５７；  ＡＡ１１９５−ＡＡ１２５０；  
ＡＡ１２００−ＡＡ１２２５；ＡＡ１２２５−ＡＡ１２５０；  ＡＡ１２５０−ＡＡ１３００；  ＡＡ１２６０−ＡＡ１３１０；  
ＡＡ１２６０−ＡＡ１２８０；ＡＡ１２６６−ＡＡ１４２８；  ＡＡ１３００−ＡＡ１３５０；  ＡＡ１２９０−ＡＡ１３１０；  
ＡＡ１３１０−ＡＡ１３４０；ＡＡ１３４５−ＡＡ１４０５；  ＡＡ１３４５−ＡＡ１３６５；  ＡＡ１３５０−ＡＡ１４００；  
ＡＡ１３６５−ＡＡ１３８０；ＡＡ１３８０−ＡＡ１４０５；  ＡＡ１４００−ＡＡ１４５０；  ＡＡ１４５０−ＡＡ１５００；  
ＡＡ１４６０−ＡＡ１４７５；ＡＡ１４７５−ＡＡ１５１５；  ＡＡ１４７５−ＡＡ１５００；  ＡＡ１５００−ＡＡ１５５０；  
ＡＡ１５００−ＡＡ１５１５；ＡＡ１５１５−ＡＡ１５５０；  ＡＡ１５５０−ＡＡ１６００；  ＡＡ１５４５−ＡＡ１５６０；  
ＡＡ１５６９−ＡＡ１９３１；ＡＡ１５７０−ＡＡ１５９０；  ＡＡ１５９５−ＡＡ１６１０；  ＡＡ１５９０−ＡＡ１６５０；  
ＡＡ１６１０−ＡＡ１６４５；ＡＡ１６５０−ＡＡ１６９０；  ＡＡ１６８５−ＡＡ１７７０；  ＡＡ１６８９−ＡＡ１８０５；  
ＡＡ１６９０−ＡＡ１７２０；ＡＡ１６９４−ＡＡ１７３５；  ＡＡ１７２０−ＡＡ１７４５；  ＡＡ１７４５−ＡＡ１７７０；  
ＡＡ１７５０−ＡＡ１８００；ＡＡ１７７５−ＡＡ１８１０；  ＡＡ１７９５−ＡＡ１８５０；  ＡＡ１８５０−ＡＡ１９００；  
ＡＡ１９００−ＡＡ１９５０；ＡＡ１９００−ＡＡ１９２０；  ＡＡ１９１６−ＡＡ２０２１；  ＡＡ１９２０−ＡＡ１９４０；  
ＡＡ１９４９−ＡＡ２１２４；ＡＡ１９５０−ＡＡ２０００；  ＡＡ１９５０−ＡＡ１９８５；  ＡＡ１９８０−ＡＡ２０００；  
ＡＡ２０００−ＡＡ２０５０；ＡＡ２００５−ＡＡ２０２５；  ＡＡ２０２０−ＡＡ２０４５；  ＡＡ２０４５−ＡＡ２１００；  
ＡＡ２０４５−ＡＡ２０７０；ＡＡ２０５４−ＡＡ２２２３；  ＡＡ２０７０−ＡＡ２１００；  ＡＡ２１００−ＡＡ２１５０；  
ＡＡ２１５０−ＡＡ２２００；ＡＡ２２００−ＡＡ２２５０；  ＡＡ２２００−ＡＡ２３２５；  ＡＡ２２５０−ＡＡ２３３０；  
ＡＡ２２５５−ＡＡ２２７０；ＡＡ２２６５−ＡＡ２２８０；  ＡＡ２２８０−ＡＡ２２９０；  ＡＡ２２８７−ＡＡ２３８５；  
ＡＡ２３００−ＡＡ２３５０；ＡＡ２２９０−ＡＡ２３１０；  ＡＡ２３１０−ＡＡ２３３０；  ＡＡ２３３０−ＡＡ２３５０；  
ＡＡ２３５０−ＡＡ２４００；ＡＡ２３４８−ＡＡ２４６４；  ＡＡ２３４５−ＡＡ２４１５；  ＡＡ２３４５−ＡＡ２３７５；  
ＡＡ２３７０−ＡＡ２４１０；ＡＡ２３７１−ＡＡ２５０２；  ＡＡ２４００−ＡＡ２４５０；  ＡＡ２４００−ＡＡ２４２５；  
ＡＡ２４１５−ＡＡ２４５０；ＡＡ２４４５−ＡＡ２５００；  ＡＡ２４４５−ＡＡ２４７５；  ＡＡ２４７０−ＡＡ２４９０；  
ＡＡ２５００−ＡＡ２５５０；ＡＡ２５０５−ＡＡ２５４０；  ＡＡ２５３５−ＡＡ２５６０；  ＡＡ２５５０−ＡＡ２６００；  
ＡＡ２５６０−ＡＡ２５８０；ＡＡ２６００−ＡＡ２６５０；  ＡＡ２６０５−ＡＡ２６２０；  ＡＡ２６２０−ＡＡ２６５０；  
ＡＡ２６４０−ＡＡ２６６０；ＡＡ２６５０−ＡＡ２７００；  ＡＡ２６５５−ＡＡ２６７０；  ＡＡ２６７０−ＡＡ２７００；  
ＡＡ２７００−ＡＡ２７５０；ＡＡ２７４０−ＡＡ２７６０；  ＡＡ２７５０−ＡＡ２８００；  ＡＡ２７５５−ＡＡ２７８０；  
ＡＡ２７８０−ＡＡ２８３０；ＡＡ２７８５−ＡＡ２８１０；  ＡＡ２７９６−ＡＡ２８８６；  ＡＡ２８１０−ＡＡ２８２５；  
ＡＡ２８００−ＡＡ２８５０；ＡＡ２８５０−ＡＡ２９００；  ＡＡ２８５０−ＡＡ２８６５；  ＡＡ２８８５−ＡＡ２９０５；  
ＡＡ２９００−ＡＡ２９５０；ＡＡ２９１０−ＡＡ２９３０；  ＡＡ２９２５−ＡＡ２９５０；  ＡＡ２９４５−末端（Ｃ’末端）
上記ＨＣＶアミノ酸配列は，別々のペプチドとして調製されるが，あるいはより大きなペプチドに合体させ得る。そして，これらのＨＣＶアミノ酸配列については，ここに記載したような用途が見い出される。切形のＨＣＶ配列を有する付加的なポリペプチドは，実施例に記載されている。
【００８９】
ＨＣＶの推定ポリタンパクおよびフラビウイルスとの間に見られる関係により，ＨＣＶ「非構造」（ＮＳ）タンパクの推定領域にについて，ある示唆が与えられる。推定フラビウイルス前駆体ポリタンパクにおける個々のＮＳタンパクの位置は，かなりよく知られている。さらに，これらはまた，ポリタンパクの疎水性プロファイルにおいて観察された全体の変動と一致する。フラビウイルスのＮＳ５が，ビリオンポリメラーゼをコードすること，およびＮＳ１が，動物の効果的なワクチンであると示されている補体結合抗原と一致することは確立されている。最近，フラビウイルス性のタンパク分解酵素機能がＮＳ３にあることが示された。ＨＣＶとフラビウイルスとの間には，以下に述べるように，類似性が認められるので，ＨＣＶポリタンパクにおいて，対応するタンパク領域の大体の位置および機能を推理することが可能である。例えば，細菌，酵母，昆虫，および脊椎動物の細胞を包含する様々な組換え宿主細胞において，このような領域を有するポリペプチドを発現させることにより，診断，検出，およびワクチンに使用され得る重要な免疫学的試薬が得られるはずである。
【００９０】
ここに記載されたＨＣＶ単離体およびフラビウイルスの推定ポリタンパクの非構造タンパク領域には，ある程度の類似性が見られるが、Ｎ末端に向かう推定の構造領域間には，類似性が少ない。この領域では，配列により多くの相違が存在し，さらに，これら２つの領域の疎水性プロファイルには類似性が少ない。このような「相違」は，ＨＣＶにおける推定ＮＳ１領域のＮ末端領域に始まり，推定Ｎ末端まで延びている。それにもかかわらず，ＨＣＶポリタンパク内の推定ヌクレオカプシド（Ｎ末端基本領域）およびＥ（一般的に疎水性の）領域の大体の位置を予想することができる。実施例では，これらの予想は，ＨＣＶポリタンパクの疎水性プロファイルに見られる変化と，フラビウイルスタンパクの位置および特性に関する知識とに基づいている。このような予想から，有用な免疫学的試薬となり得るＨＣＶポリタンパクの大体の領域を同定し得る。例えば，フラビノウイルスのＥおよびＮＳ１タンパクが保護ワクチンとして効力があることが知られている。ここに記載されたＨＣＶ単離体において抗原性を有することが示されている領域，例えば推定ＮＳ３，Ｃ，およびＮＳ５などの領域だけでなく，これらの領域も，診断試薬を与えるはずである。さらに，ウイルスにコードされた酵素の位置付けおよび発現により，抗ウイルス酵素阻害剤，すなわち，例えば，酵素自体との相互作用により酵素活性を妨げる阻害剤，あるいは酵素の発現を妨げ得る物質（例えば，アンチセンスＲＮＡ，または発現を妨げ得る他の薬剤）を評価し得る。
【００９１】
ＨＣＶエピトープを有するハイブリッド粒子免疫原の調製
ＨＣＶのエピトープの免疫原性は，また，これらのエピトープを，粒子形成タンパク（例えば，Ｂ型肝炎の表面抗原に関連するタンパク）と融合もしくは結合させるように，哺乳動物系あるいは酵母系で調製することによって増強される。ＮＡＮＢＶエピトープが粒子形成タンパクのコード配列に直接結合している構築物は，ＨＣＶエピトープに関して免疫原性のハイブリッドを産生する。さらに，調製したすべてのベクターは，ＨＢＶに特異的なエピトープを有し，例えばプレＳペプチドのように様々な度合の免疫原性を有するエピトープを含む。このように，粒子形成タンパクから構築され，ＨＣＶ配列を有する粒子は，ＨＣＶおよびＨＢＶに関して免疫原性である。
【００９２】
肝炎の表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８２）），および例えば哺乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｐ．ら（１９８４））において形成され，結合して粒子となることが示されている。このような粒子の形成は，単量体のサブユニットの免疫原性を増強することが示されている。これらの構築物は，また，ＨＢＳＡｇの免疫的に優性なエピトープを有し，それはプレ表面（プレＳ）領域の５５アミノ酸を含有する。Ｎｅｕｒａｔｈら（１９８４）。酵母中で発現され得るプレＳ−ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は，欧州特許出願公開第１７４，４４４号（１９８６年３月１９日付で公開）に開示されている。酵母での発現のための異種ウイルス配列を有するハイブリッドは，欧州特許出願公開第１７５，２６１号（１９６６年３月２６日付で公開）に開示されている。これらの構築物もまた，ＳＶ４０のジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞中で発現させることができる（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。
【００９３】
さらに，粒子形成タンパクをコードする配列の一部は，ＨＣＶエピトープをコードするコドンで置き換えられ得る。このような置換えよって，酵母あるいは哺乳動物中で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介するのに必要とされない領域を削除することができる。このようにして，ＨＣＶエピトープと競合する部分から付加的なＨＢＶ抗原性部位が除去される。
【００９４】
ワクチンの調製
ワクチンは，実施例に記載されているｃＤＮＡ配列を含む，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の免疫原性ポリペプチドの１種あるいはそれ以上から調製され得る。ＨＣＶとフラビウイルスとの間に見られる相同性は，ワクチンとして最も有効であり得るポリペプチドと，それらがコードされているゲノム領域とに関する情報を提供する。フラビウイルスゲノムの一般的な構造は，Ｒｉｃｅら（１９８６）により考察されている。フラビウイルスのゲノムＲＮＡは，唯一のウイルス特異的ｍＲＮＡ種であると考えられ，これは，３つのウイルス構造タンパク（つまり，Ｃ，Ｍ，およびＥ），２つの大きい非構造タンパク（ＮＳ４およびＮＳ５），およびより小さい非構造タンパクの複合対に翻訳される。フラビウイルスの主要な中和エピトープがＥ（外被）タンパクに属することは公知である（Ｒｏｅｈｒｉｇ（１９８６））。このように，ワクチンは，ＨＣＶ  Ｅのエピトープを有する組換えポリペプチドを含有し得る。これらのポリペプチドは，細菌，酵母，または哺乳動物細胞において発現されるか，あるいはウイルス調製物から単離され得る。他の構造タンパクが，保護抗ＨＣＶ抗体を生じるエピトープを有し得ることも予期される。このように，Ｅ，Ｃ，およびＭのエピトープを有するポリペプチドもまた，単独で，あるいは組み合わせて，ＨＣＶワクチンに用いられ得る。
【００９５】
上記に加えて，ＮＳ１（非構造タンパク１）で免疫すると黄熱病から保護されることが示されている（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら（１９８６））。たとえ，その免疫により中和抗体が生じないとしても，このことは正しい。このように，特に，このタンパクはフラビウイルスの間で高い割合で保存されるようなので，ＨＣＶ  ＮＳ１もまた，ＨＣＶの感染に対して保護作用を有するようである。さらに，たとえ非構造タンパクが中和抗体の産生を行わないとしても，非構造タンパクがウイルスの病原性に対して保護作用を与え得ることもまた示される。
【００９６】
ＨＣＶ  ＯＲＦの様々な領域に及ぶクローン化されたＨＣＶｃＤＮＡから発現されたポリペプチドの免疫原性に関して実施例で与えられた情報により，ワクチンへの用途に関して予想することもできる。
【００９７】
上記のことから，ＨＣＶに対する多価ワクチンは，１あるいはそれ以上の構造タンパクに由来する１あるいはそれ以上のエピトープ，および／または１あるいはそれ以上の非構造タンパクに由来する１あるいはそれ以上のエピトープを含有し得る。これらのワクチンは，例えば，組換えＨＣＶポリペプチド，および／またはビリオンから単離されたポリペプチドを含有し得る。特に，ワクチンは，１つあるいはそれ以上の次のタンパク：Ｅ，ＮＳ１，Ｃ，ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４およびＮＳ５，あるいはそれから誘導されたサブユニット抗原を含有すると考えられる。特に好ましいのは，Ｅおよび／またはＮＳ１，あるいはそのサブユニットを含有するワクチンである。
【００９８】
活性成分として免疫原性のポリペプチドを含有するワクチンの調製は，当業者に公知である。代表的には，このようなワクチンは，液体溶液あるいは懸濁液のいずれかとして，注射可能なように調製される。注射前に液体に溶解あるいは懸濁させるのに適当な固形物の形態としても調製され得る。この調製物はまた，乳化することもでき，あるいは，リポソームにカプセル化されたタンパクであってもよい。この活性免疫原性成分は，薬学的に受容され得る賦形剤であって，この活性成分と適合し得る賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤としては，例えば，水，生理食塩水，デキストロース，グリセロール，エタノールなど，およびこれらの組み合わせがある。さらに必要に応じて，このワクチンには，少量の補助物質が含有され得る。このような補助物質としては，補湿剤あるいは乳化剤，ｐＨ緩衝剤，および／またはワクチンの効果を増強するアジュバントがある。効果的なアジュバントの例としては，以下の物質が挙げられるが，これらには限定されない：水酸化アルミニウム，Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ），Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７，ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる），Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ，ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる），およびＲＩＢＩ。ここで，ＲＩＢＩは，細菌から抽出された３つの成分，すなわちモノホスホリル脂質Ａ，トレハロースジミコール酸，および細胞壁の骨格成分（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を，２％スクアレン／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０エマルジョン中に含んでいる。アジュバントの効力は，ＨＣＶ抗原配列を有する免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することによって決定され得る。なお，この抗体は，種々のアジュバントを含有する，ワクチン中に存在するこのポリペプチドを投与することにより生じる。
【００９９】
このワクチンは，通常，非経口的に注射で投与され，その形態は，例えば，皮下注射であっても筋肉注射であってもよい。他の投与形態に適当な処方物には座薬があり，場合によっては経口処方物もある。座薬に用いられる従来のバインダーおよび担体には，例えばポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリドがある。このような座薬は，活性成分を０．５％〜１０％，好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成される。経口処方物には，通常使用される賦形剤が含有される。このような賦形剤には，例えば，製剤グレードのマンニトール，ラクトース，デンプン，ステアリン酸マグネシウム，サッカリンナトリウム，セルロース，炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は，溶液，懸濁液，錠剤，丸剤，カプセル剤，放出を維持するような処方物，あるいは粉剤の形態を有し，活性成分を１０％〜９５％，好ましくは２５％〜７０％の割合で含有する。
【０１００】
このタンパクは，そのままで，あるいは塩の形で，ワクチンに処方され得る。薬学的に受容され得る塩には，酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基により形成される）が包含され，この塩は，無機酸（例えば，塩酸あるいはリン酸）あるいは有機酸（例えば酢酸，シュウ酸，酒石酸，マレイン酸など）を用いて形成される。遊離のカルボキシル基により形成される塩は，無機塩基（例えば，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，アンモニア，水酸化カルシウム，あるいは水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば，イソプロピルアミン，トリメチルアミン，２−エチルアミノエタノール，ヒスチジン，プロカインなど）からも誘導され得る。
【０１０１】
ワクチンの用量および投与
ワクチンは，投薬処方に適合する様式で，そして予防効果および／または治療効果が得られる量で，投与される。投与される量は，一般に１回の投与あたり抗原が５μｇ  〜２５０μｇの範囲内であり，この投与量は処置される個体，この個体の免疫系が抗体を合成する能力，および所望する保護の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は，医師の判断によるものであり，各個体に特有であり得る。
【０１０２】
ワクチンは，１回の投与形式で与えられるか，あるいは好ましくは複数回の投与形式で与えられ得る。複数回の投与形式では，最初のワクチン投与は１〜１０回に分けて行なわれ，以後の投与は引き続き免疫応答を維持もしくは強化するのに必要な時間間隔で，例えば第２回目の投与では１〜４ヶ月で行われ，そして必要であれば数ヶ月後に引き続き投与が行われる。この投与形態はまた，少なくとも部分的には，個人の必要量によって決定され，医師の判断による。
【０１０３】
さらに，免疫原性のＨＣＶ抗原を有するワクチンは，他の免疫調節因子，例えば免疫グロブリンと組み合わせて投与され得る。
【０１０４】
ＨＣＶエピトープに対する抗体の調製
上述のようにして調製される免疫原性ポリペプチドは，ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体を生産するのに用いられる。ポリクローナル抗体が所望であれば，ＨＣＶエピトープを有する免疫原性ポリペプチドを用いて，選択された哺乳動物（例えば，マウス，ウサギ，ヤギ，ウマなど）を免疫する。免疫された動物から得られた血清を回収し，公知の方法によって処理する。ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含んでいる場合には，このポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナルな抗血清を生産し，加工処理する方法は，当該分野では公知であり，例えばＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（１９８７）を参照されたい。あるいは，ポリクローナル抗体は，あらかじめＨＣＶ  に感染させておいた哺乳動物から単離され得る。感染個体の血清から得られるＨＣＶエピトープに対する抗体を精製する方法の例は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に述べられている，これは，アフィニティークロマトグラフィーに基づき，ＳＯＤ  とｃＤＮＡクローン５−１−１内にコードされたポリペプチドとの融合ポリペプチドを利用する方法である。
【０１０５】
ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体もまた，当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を調製する一般的な方法は公知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞融合によって調製することができ，さらに，腫瘍原性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換，あるいはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用いたトランスフェクションのような他の方法によってもまた調製することができる。例えば，Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）の文献を参照されたい。さらに，米国特許第４，３４１，７６１号；第４，３３９，１２１号；第４，４２７，７８３号；第４，４４４，８８７号；第４，４６６，９１７号；第４，４７２，５００号；第４，４９１，６３２号および第４，４９３，８９０号もまた，参照されたい。ＨＣＶエピトープに対して調製されたモノクローナル抗体のパネルは，種々の目的（例えば，アイソタイプ，エピトープ親和性など）に応じてスクリーニングされ得る。
【０１０６】
ＨＣＶエピトープに対して形成されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は，いずれも特に診断において有用であり，中和抗体は受動免疫治療に有用である。特にモノクローナル抗体は抗イディオタイプの抗体を生じさせるために用いられ得る。
【０１０７】
抗イディオタイプ抗体は，それに対して保護が望まれる感染因子の抗原の「内的イメージ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｍａｇｅ）」を伴う免疫グロブリンである。例えば，Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．ら（１９８１）およびＤｒｅｅｓｍａｎら（１９８５）を参照されたい。
【０１０８】
抗イディオタイプの抗体を生じさせるための方法は，当該分野で公知である。例えば，Ｇｒｚｙｃｈ（１９８５），ＭａｃＮａｍａｒａら（１９８４），およびＵｙｔｄｅｈａａｇら（１９８５）を参照されたい。これらの抗イディオタイプ抗体は，ＮＡＮＢＨの処置および／または診断に有用であり，またＨＣＶ抗原の免疫原性領域を解明するのにも有用である。
【０１０９】
ＨＣＶエピトープに対する様々なタイプの抗体を調製し得ることも，当業者によって認められる。本願で用いる「抗体」という用語は，ポリペプチド，あるいは少なくとも１つの抗体結合部位を有するポリペプチド群を意味する。「抗体結合部位」あるいは「抗体結合領域」は，抗原のエピトープの特徴を相補する内部表面形状および電荷分布を有する３次元結合空間を形成するために，抗体分子の可変領域の折りたたみから形成され，抗原との免疫学的な反応を可能にする。抗体結合部位は，抗体結合に寄与する超可変ループを形成する，重鎖領域および／または軽鎖領域（それぞれ，ＶＨおよびＶＬ）から形成され得る。「抗体」という用語には，例えば脊椎動物抗体，ハイブリッド抗体，キメラ抗体，変容抗体，一価抗体，Ｆａｂタンパク，および単一領域抗体が含まれる。
【０１１０】
「単一領域抗体」（ｄＡｂ）はＶＨ領域を有する抗体であって，指定の抗原と免疫学的に反応する。ｄＡＢはＶＬ領域を含有していないが，抗体に存在していることが知られている他の抗原結合領域，例えばκ領域およびλ領域を有し得る。ｄＡＢを調製する方法は当技術分野で公知である。例えば，Ｗａｒｄら（１９８９）を参照されたい。
【０１１１】
抗体は，また，他の既知の抗体結合領域だけでなく，ＶＨ領域およびＶＬ領域を有し得る。これらのタイプの抗体およびそれらを調製する方法の例は当技術分野で公知（例えば，米国特許第４，８１６，４６７号を参照されたい。この米国特許は，参考文献として，ここに採用される。）であり，以下のものを包含する。例えば，「脊椎動物の抗体」とは，四量体あるいはその集合体である抗体を意味し，通常「Ｙ」字形に集合し，必ずしも鎖間に共有結合を有さない軽鎖および重鎖を有する。脊椎動物の抗体では，特定の抗体のあらゆる鎖のアミノ酸配列は，その場で，あるいはインビトロ（例えば，ハイブリドーマにおいて）抗体を産生するリンパ球によって産生されるある抗体に見られる鎖と相同である。脊椎動物の抗体は，典型的には，天然の抗体，例えば精製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。このような抗体を調製する方法の例は以下に述べられている。
【０１１２】
「ハイブリッド抗体」は，一方の対の重鎖および軽鎖が最初の抗体におけるそれと相同であり，他方の対の重鎖および軽鎖が異なる第２の抗体におけるそれと相同であるような抗体である。典型的には，これら二対の各々は，特に，異なる抗原上の異なるエピトープに結合する。これにより，「二価」の性質，すなわち同時に２つの抗原を結合する能力が得られる。このようなハイブリッドは，以下に述べるように，キメラ鎖を用いても形成され得る。
【０１１３】
「キメラ抗体」は，重鎖および／または軽鎖が融合タンパクであるような抗体である。典型的には，これらの鎖の不変領域はある特定の種および／またはクラスに由来し，可変領域は異なる種および／またはクラスに由来する。源が異なるクラスであろうと，起源の異なる種であろうと，また融合点が可変／不変領域の境界にあろうとなかろうと，重鎖または軽鎖のいずれか，あるいは両方が，異なる源の抗体における配列を凝似した配列の組み合せから構成されるような，いかなる抗体も含まれる。従って，不変領域あるいは可変領域のいずれもが既知の抗体配列を凝似していない抗体を調製することもできる。そのため，例えば，可変領域が特定の抗原に対してさらに高い特異的親和性を有する抗体，あるいは不変領域が増強された補体結合を引き出し得る抗体を構築するか，あるいは特定の不変領域が有する性質を改善することが可能になる。
【０１１４】
他の例は「変容抗体」であり，これは天然に存在する脊椎動物抗体のアミノ酸配列が変化しているような抗体を意味する。組換えＤＮＡ技術を利用すれば，所望の特性が得られるように抗体を再設計し得る。可能な変化は多く，１つまたはそれ以上のアミノ酸を変化させることから，１つの領域（例えば，不変領域）を完全に再設計するに至るまで様々である。一般に所望の細胞過程特性を得るための不変領域における変化は，例えば，補体結合，膜との相互作用，および他のエフェクター機能である。可変領域における変化は，抗原結合特性を変化させるようになされ得る。抗体はまた，特定の細胞あるいは組織部位への分子あるいは物質の特異的な供給を助けるように設計され得る。所望の変化は，分子生物学で公知の方法，例えば組換え技術，部位特異的変異処理などによって起こし得る。
【０１１５】
さらに他の例は，「一価抗体」であり，これは第２の重鎖のＦｃ領域（すなわち，不変領域）に結合した重鎖／軽鎖二量体を含む集合体である。このタイプの抗体は抗原変質を免れる。例えば，Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８２）を参照されたい。
【０１１６】
抗体の定義内には，抗体の「Ｆａｂ」フラグメントも含まれる。「Ｆａｂ」領域は，重鎖および軽鎖の枝部分を含む配列と大体等価あるいは類似しており，特定の抗原に対する免疫学的な結合を示すとされているが，エフェクターＦｃ部分を欠いているような，重鎖および軽鎖の部分を意味する。「Ｆａｂ」には，２Ｈ鎖および２Ｌ鎖を有する四量体（Ｆ（ａｂ）２と呼ばれる）だけでなく，１本の重鎖と１本の軽鎖との集合体（通常，Ｆａｂ’として知られている）が包含され，それらは指定された抗原あるいは抗原群と選択的に反応し得る。「Ｆａｂ」抗体は，上記のものに類似したサブセット，すなわち「脊椎動物Ｆａｂ」，「ハイブリッドＦａｂ」，「キメラＦａｂ」，および「変容Ｆａｂ」に分類され得る。抗体の「Ｆａｂ」フラグメントを調製する方法は，当該技術分野の範囲内で公知であり，例えばタンパク分解，および組換え技術による合成が含まれる。
【０１１７】
ＩＩ．Ｈ．診断用オリゴヌクレオチドプローブおよびキット
単離されたＨＣＶ  ｃＤＮＡの開示部分を基本として用いて，約８個あるいはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴマーが切断あるいは合成によって調製され得る。このオリゴマーは，ＨＣＶゲノムとハイブリダイズし，このウイルス性因子の同定，さらにこのウイルス性ゲノムの特性決定，および個々の患者のウイルスの検出に有用である。ＨＣＶポリヌクレオチドプローブ（天然あるいは誘導された）は，ハイブリダイゼーションによって独特のウイルス配列を検出し得る長さである。６〜８個のヌクレオチドが，その機能を果たし得る長さであるが，１０〜１２個のヌクレオチド配列が好適であり，約２０のヌクレオチドが最適であると考えられる。これらの配列は異種性を欠いている領域に由来するのが好ましいであろう。これらプローブは自動化オリゴヌクレオチド合成法を含む，定型的な方法を用いて調製され得る。有用なプローブには，例えば，本明細書で開示された新たに単離されたクローン，そして，ｃＤＮＡライブラリーをプローブする際に有用な後述の種々のオリゴマーがある。ＨＣＶゲノムのどの独特な部分の相補鎖も充分使用され得る。フラグメントの長さが長くなるにつれ完全に相補性を有する必要はなくなるのであるが，プローブとして使用するには完全な相補性が望ましい。
【０１１８】
診断用薬としてこのようなプローブを使用するには，血液あるいは血清のような分析されるべき生物学的試料は，必要であれば，そこに含有されている核酸を抽出するために処理される。この試料から得られた核酸は，ゲル電気泳動あるいは他のサイズ分離手段にかけられ得る。あるいは，この核酸試料は，サイズ分離を行うことなくドットブロットされ得る。次に，このプローブは標識化される。プローブを標識するための適当な標識物および方法は，当該技術分野では公知であり，それには例えば，ニックトランスレーションあるいはキナーゼ処理で取り込まれた放射性標識物，ビオチン，螢光プローブ，および化学発光プローブが含まれる。試料から抽出された核酸は，次に，適当な厳密さのハイブリダイゼーション条件下で，標識されたプローブと共に処理され，そして，プローブを有するポリヌクレオチド二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）が検出される。
【０１１９】
このプローブは，ＨＣＶゲノムに完全に相補的に作成され得る。従って，偽陽性を防ぐために，通常，厳密性の高い条件が望まれる。しかし，プローブが異種性を欠くウイルスゲノム領域と相補性を有する場合のみに，厳密性の高い条件が使用される。ハイブリダイゼーションの厳密さは，ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程中の多くの因子（温度，イオン強度，時間の長さおよびホルムアルデヒドの濃度を含む）により決定される。これらの因子は，例えば〔マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）（１９８２年）〕により概説されている。
【０１２０】
一般に，このＨＣＶゲノム配列は，感染個体の血清中に比較的低レベル（つまり，１ｍｌあたり約１０２〜１０３個の対チンパンジー感染用量）で，存在する。このレベルでは，ハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅法を用いる必要があるかもしれない。そのような方法は当該技術分野では公知である。例えば，Ｅｎｚｏ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの「Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ」システムでは，ＤＮＡプローブに未修飾の３’−ポリ−ｄＴテールを付加するために，末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いている。ポリｄＴテールを付加したプローブは標的となるヌクレオチド配列にハイブリダイズされ，次いで，ビオチン修飾ポリＡにハイブリダイズされる。ＰＣＴ出願８４／０３５２０およびＥＰＡ１２４２２１には，次のような方法のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記述されている：１）被分析物を，酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的な単鎖ＤＮＡ  プローブにアニールする；および２）得られたテール付加二本鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。ＥＰＡ  ２０４５１０には，次のような方法のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記述されている。この方法では，分析すべきＤＮＡを，例えば，ポリｄＴテールのようなテールを有するプローブと接触させ，次に増幅鎖と接触させる。この増幅鎖は，プローブのテールとハイブリダイズするポリＡ配列のような配列を有し，標識された複数の鎖を結合することが可能である。特に望ましい方法では，まず血清中の標的ＨＣＶ配列が約１０，０００倍，つまり約１０６配列／ｍｌとなるように，標的ＨＣＶ配列の増幅が行われる。これは，例えば，サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８６），マリス（Ｍｕｌｌｉｓ），米国特許第４，６８３，１９５号，そしてマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らの米国特許第４，６８３，２０２号により記載されたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法によって行なわれ得る。この増幅された配列は，ハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて検出され得る。このハイブリダイゼーションアッセイ法は，１９８９年５月２４日付で発行された欧州特許第３１７，０７７号中に記載されている。１０６／ｍｌのレベルで配列を検出するこのハイブリダイゼーションアッセイ法は，単鎖の分析すべき核酸に結合し，多数の単鎖標識オリゴヌクレオチドにも結合する核酸多量体を利用する。標識されたポリヌクレオチドプローブを用いる，適当な溶液相のサンドイッチアッセイ，およびプローブの調製法は，１９８７年６月１６日付で発行された欧州特許出願公開第２２５，８０７号に記載されている。
【０１２１】
このプローブは診断用キット中に組み入れることができる。診断用キットは，プローブＤＮＡを有し，このプローブＤＮＡは標識されているか，あるいはこのプローブＤＮＡは標識されておらず，標識用の成分がこのキットの別の容器中に入っている。このキットにはまた，特定のハイブリダイゼーションのプロトコルに必要な他の試薬および材料（例えば，標準品，およびこのテストを行なうための指示書）が適当に包装されて含まれる。
【０１２２】
イムノアッセイおよび診断用キット
ＨＣＶ抗体を含有する血清と免疫的に反応するポリペプチド，およびこれらのポリペプチドのＨＣＶ特異的エピトープに対して生じる抗体は，イムノアッセイにおいて，生物学的試料におけるＨＣＶ抗体の存在，あるいはウイルスおよび／またはウイルス抗原の存在を検出するために有用である。上記ＨＣＶ抗体は，例えば，後述の実施例に記載された抗原スクリーニング法により検出される抗体であり，そして，実施例に記載の単離されたクローンに由来するか，あるいはこのクローン内にコードされた抗体であり，そしてそれらの複合体である。このイムノアッセイの設計は多くの変更を行うことが可能であり，これらアッセイの多様性については当該技術分野では既知である。例えば，このイムノアッセイでは，１種のウイルスエピトープが利用され得る。あるいは，このイムノアッセイには，これらの源由来のウイルスエピトープの組合せが用いられ得る。これらのエピトープは，同一のもしくは異なったウイルスポリペプチド由来であり得，そして，それは異なった組み換えあるいは天然ポリペプチド内に存在し得，もしくはいずれも同一の組換え体ポリペプチド内に存在し得る。例えば，ウイルスのエピトープに対する１種のモノクローナル抗体，あるウイルス抗原のエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ，異なるウイルス抗原に対する複数のモノクローナル抗体，同一のウイルス抗原のエピトープに対するポリクローナル抗体，あるいは異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。プロトコルは，例えば，競合分析法，直接反応タイプ分析法，あるいはサンドイッチタイプ分析法を基本とすることができる。このプロトコルではまた，例えば，固体支持体を用いるか，あるいはこのプロトコルは，免疫沈澱法であり得る。ほとんどのアッセイは標識化抗体あるいはポリペプチドの使用を含む。この標識物には，例えば，螢光分子，化学発光分子，放射性分子，あるいは色素分子がある。このプローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である。その例としては，ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ，および酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば，ＥＬＩＳＡ  アッセイ）がある。
【０１２３】
推定ポリタンパクの抗原性領域の一部は，地図化され，このポリタンパクの一部をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡの細菌発現産物の抗原性をスクリーニングすることにより同定されている。実施例を参照されたい。ＨＣＶの他の抗原性領域は，他の発現系（これは，酵母の発現系と，昆虫および脊椎動物に由来する細胞の発現系とを含む）においてＨＣＶ  ｃＤＮＡのこれらの部分を発現させることにより検出され得る。さらに，抗原指数および疎水性／親水性プロファイルが得られるような研究により，ある領域が抗原性を有する可能性に関する情報が得られる。
【０１２４】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡの発現による抗原性マッピングの研究により，これらのｃＤＮＡを有する多くのクローンが，ＮＡＮＢＨを持つ個体に由来する血清との免疫学的な反応性を有するポリペプチドを発現することが示された。すべての血清と免疫学的な反応性を有する単一のポリペプチドは存在しなかった。これらのポリペプチドのうちの５つは，次の点において非常に免疫原性を有していた。つまり，これらのポリペプチドのＨＣＶエピトープに対する抗原が，検出時に重複が完全ではなかったにもかかわらず，多くの異なる患者の血清中に検出された点において，免疫原性を有していた。したがって，これら種々のクローンにおいてコードされているポリペプチドが免疫原性を有するということから，効果的な検出システムは，エピトープのパネルを有し得るということが示唆される。このパネルのエピトープは，１種もしくは複数のポリペプチドに構築され得る。
【０１２５】
免疫診断に適し，適切に標識された試薬を有するキットは，適切な材料を適当な容器中に包装することによって得られる。この適切な材料には，ＨＣＶエピトープを有する本発明のポリペプチド，あるいはＨＣＶエピトープに対する抗体が含まれる。このキットは，アッセイを実施するのに必要な残りの試薬および材料と，さらにアッセイの指示書の適当なセットとを含む。
【０１２６】
ウイルスゲノムに対するｃＤＮＡ由来のプローブを用いた，ＨＣＶゲノム，ビリオンおよびウイルス抗原の他の特性決定
実施例に記載した，新たに単離されたクローンのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の情報は，ＨＣＶゲノムの配列とＨＣＶ因子の同定と単離とについての情報をさらに得るために用いられ得，その結果，ゲノムの性質，ウイルス粒子の構造，およびウイルスが有する抗原の性質を含めたウイルスの特性決定の助けになる。さらに，この情報によって，付加的なポリヌクレオチドプローブ，ＨＣＶゲノム由来のポリペプチド，およびＨＣＶが原因のＮＡＮＢＨの診断および／または治療に有用なＨＣＶエピトープに対する抗体が得られるようになる。
【０１２７】
上記クローンのｃＤＮＡ配列の情報は，本明細書および欧州特許第３１６，２１８号に記載されたクローンのｃＤＮＡの起源であるＨＣＶゲノムの未確定領域由来の他のｃＤＮＡ配列を単離するためのプローブを設計するのに有用である。例えば，約８個またはそれ以上，好ましくは２０個またはそれ以上のヌクレオチドの配列を有する標識化プローブは，図２７〜図３６に示すＨＣＶ複合ｃＤＮＡ配列の５’末端または３’末端に近い領域由来のものであり，ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーから重複ｃＤＮＡ配列を単離するのに用いられ得る。あるいは，ゲノムセグメントの特性決定は，精製されたＨＣＶ粒子から単離されたウイルスゲノムで行うことができる。ＨＣＶ粒子を精製し，精製工程において粒子を検出する方法は後述する。ポリヌクレオチドのゲノムのウイルス粒子からの単離工程は，当該技術分野では公知であり，利用され得る一方法が欧州特許第２１８，３１６号に開示されている。単離されたゲノムのセグメントは，次に，クローン化され配列決定され得る。クローン化されるべき配列の増幅工程を含む方法の例が，後述されており，これによりクローン１６ｊｈが得られる。
【０１２８】
ｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は，当該技術分野では公知であり，すでに記載し，あるいは後で述べられる。λｇｔ１１内にＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に述べられている。しかし，核酸プローブでスクリーニングするのに有用なｃＤＮＡライブラリーもまた，当該技術分野で公知の他のベクター内，例えばλｇｔ１０〔ヒューンら（Ｈｕｙｎｈ  ｅｔ  ａｌ  ），１９８５年〕内で構築することができる。
【０１２９】
ＨＣＶに対する抗ウイルス剤のスクリーニング
ＨＣＶの細胞培養物と動物モデル系とを利用することによって，ＨＣＶの複製を阻害する抗ウイルス剤，特に優先的に細胞を生育・増殖させる一方でウイルスの複製を阻害する抗ウイルス剤をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニング法は，当業者には知られている。一般に，抗ウイルス剤は，ウイルスの複製を維持する細胞培養系でウイルスの複製を阻害する効果と，動物モデル系での感染性もしくはウイルス病原性を阻害する効果（および低レベルの毒性）について種々の濃度で試験される。
【０１３０】
ＨＣＶ抗原とＨＣＶポリヌクレオチドを検出するためのここに記載された方法と組成物は，ウイルス複製に対する抗ウイルス剤の効果を検出する方法として，細胞プラーク検定法もしくはＩＤ５０検定法の代わりにこれらの方法よりもおそらく高感度の方法を提供することから，抗ウイルス剤のスクリーニングに有用である。例えば，ここに記載したＨＣＶポリヌクレオチドプローブは，細胞培養で産生されたウイルス核酸を定量するのに利用できる。このことは，例えば感染した細胞の核酸と標識したＨＣＶポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションまたは競合ハイブリダイゼーションによって達成することができた。例えば，また抗ＨＣＶ抗体は，本明細書に記載の免疫検定法を利用して細胞培養物中のＨＣＶ抗原を同定および定量するのに利用できる。さらに，感染細胞の培養物中のＨＣＶ抗原を競合検定法で定量することは望ましいことであるから，本明細書に記載したＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたポリペプチドは，これらの競合検定法に有用である。一般に，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の組換え体ＨＣＶポリペプチドに標識化し，この標識化ポリペプチドとＨＣＶポリペプチドとの結合が細胞培養系内に産生された抗原によって阻害されるのを監視する。さらに，これらの方法は，ＨＣＶが細胞系内で細胞死を起こすことなく複製できる場合，特に有用である。
【０１３１】
これらの方法により有効性を試験し得る抗ウイルス剤は，当該技術分野では公知であり，例えば，ウイルスの結合および／または複製に必要なビリオン成分および／または細胞成分と相互作用する物質を含む。典型的な抗ウイルス剤は，例えば，前駆体ポリペプチドの切断に必要なビリオンポリメラーゼおよび／またはプロテアーゼの阻害剤を含み得る。他の抗ウイルス剤は，例えば，抗感受性ポリヌクレオチドなどの，核酸と反応してウイルス複製を妨げる物質を含み得る。
【０１３２】
アンチセンスポリヌクレオチド分子は，ゲノムまたはＲＮＡの設計された領域に該ポリヌクレオチド分子を特異的にハイブリダイズさせ得る，相補的ヌクレオチド配列を含む。アンチセンスポリヌクレオチドは，例えば，ｍＲＮＡに結合することにより蛋白翻訳を妨げる分子を含み得，あるいは，転写酵素によりウイルスＲＮＡの複製を阻害する分子であり得る。さらにそれらは，例えば，ウイルスＲＮＡ内の切断を引き起こすことによりウイルスＲＮＡを不活化する薬剤（非共有結合的に付着または共有結合している）を有する分子を含み得る。さらにそれらは，ウイルスの感染性または複製能力あるいは慢性化能力を増強し，および／またはそれらに必要とされる細胞ポリヌクレオチドに結合し得る。ＨＣＶ由来のＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス分子は，ここで提供されるＨＣＶｃＤＮＡの配列情報に基づいて設計され得る。ＨＣＶのアンチセンスポリヌクレオチドに基づく抗ウイルス剤は，高度な特異性で結合し，かつ溶解度が高く，安定であり，かつ低毒性であるように設計され得る。このように，それらは，特殊な系，例えばリポソームにより，もしくは遺伝子治療により，送達され得る。さらに，それらは，アナログ，結合タンパク，塩基間の置換もしくは変化した結合を包含し得る。
【０１３３】
他のタイプの薬剤は，ＨＣＶゲノムの重要な制御領域に類似したポリヌクレオチド，およびウイルスの感染性または複製の原因となる系の主要成分との相互作用により治療がなされ得るようなポリヌクレオチドに基づいたものであり得る。
【０１３４】
一般的方法
ウイルスからのゲノムの抽出，ｃＤＮＡライブラリーの調製とプロービング，クローンの配列決定，発現ベクターの構築，細胞の形質転換，ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡ測定法のような免疫測定の実施，培地での細胞の培養などに用いられる一般的な方法は，当該技術分野で公知であり，これらの方法を記載した実験室のマニュアルを入手することができる。しかし，一般的な指針として，上記の方法およびこれを実施するのに有用な材料を現在入手できるいくつかの出所を以下に述べる。
【０１３５】
原核および真核の宿主細胞が，指定された宿主に適合する適切な制御配列が用いられた場合に，所望のコード配列の発現に用いることができる。原核細胞宿主のうち，大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が最も汎用される。原核細胞の発現制御配列には，必要に応じてオペレーター部分を有するプロモーター，およびリボソーム結合部位が含まれている。原核細胞の宿主に適合するトランスファーベクターは，通常，例えば次のようなものに由来する。つまり，アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を与えるオペロンを有するプラスミドであるｐＢＲ３２２および抗生物質耐性のマーカーを与える配列を有する種々のｐＵＣベクター由来である。これらのマーカーは，適宜選択することによって，好適な形質転換細胞を得るのに利用できる。通常用いられる原核細胞の制御配列には，β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系〔チャンら（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ），１９７７年〕，トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゴーデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌｅｔ  ａｌ），１９８０年〕およびλ由来ＰｌプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位〔シマタケら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ），１９８１年〕，およびｔｒｐ    およびｌａｃ  ＵＶ５プロモーターの配列由来のハイブリッドｔａｃプロモーター〔ド  ボールら（Ｄｅ  Ｂｏｅｒｅｔ  ａｌ），１９８３年〕がある。上記の系は，特にＥ．ｃｏｌｉに適合する。必要であれば，バシラスもしくはシュードモナス属の菌株のような他の原核宿主を，対応する制御配列とともに用いてもよい。
【０１３６】
真核宿主としては，酵母および培養系内の哺乳動物の細胞がある。サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびサッカロミセスカールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）が最も普通に用いられる酵母宿主であり，便利な真菌宿主である。酵母に適合するベクターは，栄養要求突然変異体に原栄養性を与えるかまたは野生型菌株に重金属に対する耐性を与えることによって成功裏に形質転換された形質転換体を選択することができるようにするマーカーを保有する。酵母に適合するベクターとしては，２ミクロンの複製起源〔ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ），１９８３年〕，ＣＥＮ３およびＡＲＳ１の組み合わせ，または確実に複製を行わせる他の手段（例えば，適切なフラグメントを宿主細胞のゲノムに組込ませるような配列）を採用することができる。酵母ベクターの制御配列は，当該技術分野で公知であり，解糖酵素合成のプロモーター〔ヘスら（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ），１９６８年；ホーランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ），１９７８年〕を含み，このようなプロモーターには，３−ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ハイツマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ），１９８０年〕に対するプロモーターが含まれる。ターミネーターには，例えばエノラーゼ遺伝子由来のターミネーター〔ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ），１９８１年〕が含まれ得る。特に有用な制御系は，グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターもしくはアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）調節性プロモーター，ＧＡＰＤＨ由来のターミネーター，および分泌が所望の場合には，酵母α因子由来のリーダー配列を含む系である。さらに，作動可能に連結されている転写調節領域および転写開始領域は，野生型生物に本来関係しないものであってもよい。これらの系については，欧州特許出願公開第１２０，５５１号（１９８４年１０月３日付で公開）；同第１１６，２０１号（１９８４年８月２２日付で公開）；および同第１６４，５５６号）（１９８５年１２月１８日付で公開）に詳細に記載されており，これらはすべて本発明の出願人によるものであり，本願に引用文献として記載する。
【０１３７】
発現のために宿主として利用可能な哺乳類の細胞系は当該技術分野で知られており，ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの永久増殖化細胞系がある。それには，Ｈｅｌａ細胞，チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞，ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞および多くの他の細胞系がある。哺乳類の細胞に対する適切なプロモーターも当該技術分野では公知であり，それには，シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）（ＳＶ４０）〔フィアース（Ｆｉｅｒｓ），１９７８年〕，ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ），アデノウイルス（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）由来のプロモーターのようなウイルスプロモーターが含まれる。哺乳類細胞はまた，ターミネーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし，発現を増大させるエンハンサー配列も含まれ，そして，遺伝子の増幅を引き起こす配列も望ましい。これらの配列は当該技術分野で公知である。哺乳類の細胞で複製させるのに適切なベクターには，ウイルスレプリコン，またはＮＡＮＢＶエピトープをコードする適当な配列を宿主ゲノムに確実に組込む配列が含まれる。
【０１３８】
形質転換は，ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知のいずれの方法によっても行なわれ得る。それには例えば，ポリヌクレオチドをウイルスにパッケージングし，次いでそのウイルスを宿主細胞に形質導入する方法およびポリヌクレオチドを直接取込む方法がある。使用される形質転換法は，形質転換すべき宿主に依存する。例えば，Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を，ＢＢ−ＮＡＮＢＶ配列を有するλｇｔ１１で形質転換することが後述の実施例の項で述べられている。直接取込み法による細菌の形質転換には，一般に，塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理が用いられる〔コーヘン（Ｃｏｈｅｎ），１９７２年；マニアティス，１９８２年〕。直接取込み法による酵母の形質転換は，ヒネンら（Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ），１９７８年，の方法を用いて行われ得る。直接取込み法による哺乳類の形質転換は，グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファンデルエプ（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ）１９７８年，のリン酸カルシウム沈澱法またはこの方法の種々の公知の改変法を用いて行われ得る。
【０１３９】
ベクターの構築には，当該技術分野で公知の技術が用いられる。部位特異的なＤＮＡ  の切断が，適切な制御酵素を用い，これら市販の酵素のメーカーによって一般に規定されている条件下で処理することによって，実施される。一般に，約１μｇのプラスミドもしくはＤＮＡ配列は，約２０μｌ緩衝溶液中で１単位の酵素を用いて３７℃の条件下で１〜２時間インキュベートすることにより切断される。制限酵素とともにインキュベートした後，タンパクを，フェノール／クロロホルムによって抽出して除去し，エタノールで沈澱させてＤＮＡ  が回収される。切断断片は，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５巻，４９９〜５６０頁，１９８０年，に記載された一般的な方法に従って，ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルを用いた電気泳動法により分離することができる。
【０１４０】
粘着末端を有する切断断片は，混合物に存在する適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）を用いて平滑末端とされ得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理も行なわれ得，一本鎖ＤＮＡ部分の加水分解が行われる。
【０１４１】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼとＡＴＰとを用いて標準の緩衝液および温度条件下で連結反応が行われる。粘着末端の連結には，平滑末端の連結よりも，ＡＴＰおよびリガーゼの必要量が少い。ベクター断片が連結混合物の一部として用いられる場合には，ベクター断片は，細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理され，５’末端のリン酸を除去して，ベクターの再連結を防止することが多い。あるいは，不必要な断片の制限酵素による切断を利用して連結を防止するのに利用することができる。
【０１４２】
連結混合物は，Ｅ．ｃｏｌｉのような適切なクローニング宿主に形質転換され，次いで，例えば，抗生物質耐性によって成功裏に形質転換された形質転換体が選択され，そして正しい構築物がスクリーニングされる。
【０１４３】
合成オリゴヌクレオチドは，ワーナー（Ｗａｒｎｅｒ）（１９８４年）が発表した自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得る。必要に応じて，合成ＤＮＡ鎖は，反応の標準条件を用いて，３２Ｐ−ＡＴＰの存在下，ポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって３２Ｐ  で標識化され得る。
【０１４４】
ＤＮＡ配列は，ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものも含めて，公知の方法で修飾することができる。そのような方法としては，例えば，ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）（１９８２年）が発表した部位特異的変異誘発法がある。概略を述べると，修飾すべきＤＮＡを，一本鎖配列としてファージにパッケージングし，次にプライマーとして，修飾すべきＤＮＡの部分に相補的であり，それ自体の配列内に所望の修飾が含まれている合成オリゴヌクレオチドを用いて，ＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＤＮＡに変換する。得られた二本鎖ＤＮＡは，ファージを保持する宿主細菌に形質転換される。形質転換された細菌の培養物（ファージの各鎖の複製物を含む）は，寒天にプレートされてプラークが得られる。理論的には，新しいプラークの５０％が，変異した配列を有するファージを含有し，残りの５０％はもとの配列を有する。プラークのレプリカは，正しいストランドとハイブリダイゼーション可能であり，かつ未修飾の配列とはハイブリダイゼーションを行わない温度および条件下で，標識化された合成プローブとハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダイゼーションにより同定された配列は，回収されクローン化される。
【０１４５】
ＤＮＡライブラリーは，グリンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）およびホッグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）（１９７５年）の方法を用いてプローブ化され得る。簡単にのべれば，この方法においては，プローブ化されるべきＤＮＡは，ニトロセルロースフィルタ上に固定され，変性され，そして，０〜５０％ホルムアミド，０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム，各々０．０２％（ｗｔ／Ｖ）のウシ血清アルブミン，ポリビニルピロリドンおよびフィコール，５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５），０．１％  ＳＤＳ，そして１００μｇ／ｍｌキャリヤーの変性ＤＮＡを含有する緩衝液で，プレハイブリダイゼーションが行われる。緩衝液中のホルムアミドの濃度（％），およびプレハイブリダイゼーションおよびこれに続くハイブリダイゼーション工程の時間と温度条件は，必要とされる厳密さに依存する。厳密さがそれほど必要ではない条件下でのオリゴマーのプローブは，一般に，ホルムアミドが低い濃度であり，低温および長いハイブリダイゼーションの時間で用いられる。ｃＤＮＡもしくはゲノムの配列由来のような３０もしくは４０を越えるヌクレオチドを有するプローブを用いるときには，一般に，例えば，約４０〜４２℃のような高温，および５０％ホルムアミドのような高濃度が採用される。プレハイブリダイゼーションに続いて，５’末端３２Ｐで標識したオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し，この混合物中で，ハイブリダイゼーションの条件下にて，上記フィルターをインキュベートする。洗浄後，処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに付すとハイブリダイズしたプローブの位置が示される。もとの寒天プレート上の，対応する位置のＤＮＡを所望のＤＮＡの起源として利用する。
【０１４６】
常套手段により，ベクターを構築する際には，連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株もしくは他の適当な宿主を形質転換し，成功裏に形質転換された形質転換体は，抗生物質耐性もしくは他のマーカーによって選択される。次に，得られた形質転換体から，プラスミドが，クレウェルら（Ｃｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（１９６９年）の方法により調製され，通常，さらに，クロラムフェニコールによる増幅（クレウェル，１９７２年）が行なわれる。そのＤＮＡは，単離され，通常，制限酵素分析法および／または配列決定法により分析される。配列決定は，サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９７７）の，そしてさらにメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら（１９８１年）により述べられたジデオキシ法，あるいはマキシムら（１９８０年）の方法により実施され得る。ＧＣに富んだ領域において時おり観察される，バンドが接近しすぎているという問題は，バールら（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ）（１９８６年）の方法に従って，Ｔ−デアゾグアノシン（ｄｅａｚｏ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を用いることによって克服された。
【０１４７】
ＥＬＩＳＡ法は，抗原もしくは抗体のいずれかの濃度を測定するのに利用され得る。この方法は，酵素と，抗原もしくは抗体との結合に依存し，定量の標識として，結合した酵素の活性を用いる。抗体を測定するには，既知の抗原を固相（例えば，マイクロプレートまたはプラスチック製カップ）に固定し，被検血清の希釈物とともにインキュベートし，洗浄し，酵素で標識した抗免疫グロブリンとともにインキュベートし，再び洗浄する。標識化するために好適な酵素は，当該技術分野で公知であり，例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼがある。固相に結合した酵素活性は，特異的な基質を添加し，そして生成物の生成または基質の利用率を比色法で測定することによって測定される。結合した酵素の活性は，結合した抗体の量の一次関数である。
【０１４８】
抗原を測定するには，既知の特異的抗体を固相に固定し，抗原を含む被検物質を添加し，インキュベートした後，固相を洗浄し，第２の酵素で標識した抗体を添加する。洗浄後，基質を添加し，次いで酵素活性を比色法で測定し，抗原濃度に換算する。
【実施例】
【０１４９】
次に本発明の実施例を示す。この実施例は例示の目的のために記載されるものであり，本発明の範囲を限定するものではない。この記載にもとづき，請求の範囲に包含される種々の態様が当業者に明らかとなる。
【０１５０】
重複ＨＣＶｃＤＮＡクローン１３ｉ，２６ｊ，ＣＡ５９ａ，ＣＡ８４ａ，ＣＡ１５６ｅおよびＣＡ１６７ｂの単離および配列決定
クローン１３ｉ，２６ｉ，ＣＡ５９ａ，ＣＡ８４ａ，ＣＡ１５６ｅおよびＣＡ１６７ｂは，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）を含むλ−ｇｔ１１ライブラリーから単離される。その調製法は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号（１９８９年５月３１日付で公開）および第ＷＯ８９／０４６６９号（１９８９年６月１日付で公開）に記載されている。ライブラリーのスクリーニングは，後述のプローブにより，ヒューン（Ｈｕｙｎｈ）（１９８５年）により記載された方法を用いて行なった。各プローブにより陽性のクローンが出現する頻度は，約５０，０００分の１であった。
【０１５１】
クローン１３ｉの単離は，クローン１２ｆａ配列に由来する合成プローブを用いて達成された。このプローブの配列は次のとおりである（配列番号１）。
５’  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ３’
クローン２６ｊの単離は，クローンＫ９−１の５’領域に由来するプローブを用いて達成された。このプローブの配列は次のとおりである（配列番号２）。
５’  ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＴＴＡ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ３’
クローン１２ｆおよびクローンＫ９−１（Ｋ９−１とも呼ばれる）の単離方法は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されており，それらの配列をそれぞれ図１および図２〜図３に示す。クローン１３ｉおよび２６ｊのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列も，ぞれぞれ図５および図６に示す。さらにそこにコードされたアミノ酸，およびクローン１３ｉとクローン１２ｆの重複およびクローン２６ｊとクローン１３ｉの重複が示される。これらのクローンの配列により，クローンＫ９−１の配列が確認された。クローンＫ９−１は，異なるＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーから既に単離されている（欧州特許第２１８，３１６号を参照されたい）。
【０１５２】
クローンＣＡ５９ａは，クローン２６ｊの５’領域の配列に基づいたプローブを利用して単離された。このプローブの配列は次のとおりである（配列番号３）。
５’  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ３’
クローンＣＡ５９ａの配列に由来するプローブは，クローンＣＡ８４ａの単離に用いられた。この単離に用いたプローブの配列は次のとおりである（配列番号４）。
５’  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ３’
クローンＣＡ１５６ｅは，クローンＣＡ８４ａの配列に由来するプローブを用いて単離された。このプローブの配列は次のとおりである（配列番号５）。
５’  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＣＧＣ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ３’
クローンＣＡ１６７ｂは，クローン１５６ｅの配列に由来するプローブを用いて単離された。このプローブの配列は次のとおりである（配列番号６）。
５’  ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ３’
クローンＣＡ５９ａ，ＣＡ８４ａ，ＣＡ１５６ｅおよびＣＡ１６７ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を，それぞれ図７，図８，図９および図１０に示す。そこにコードされるアミノ酸，および対応するクローンの配列の重複もまた，図に示す。
【０１５３】
「Ｐｉ」ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーの創製
ＨＣＶ  ｃＤＮＡのライブラリーである「ｐｉ」ライブラリーは，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されているλ−ｇｔ１１  ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）の構築に用いられた，感染したチンパンジーの血漿の同一バッチから，実質的に同一の手法を用いて，構築された。しかし，ｐｉライブラリーの構築には，プライマー延長法を利用し，該方法において，逆転写酵素のプライマーはクローンＣＡ５９Ａの配列に基づいたプライマーを使用した。このプライマーの配列は次のとおりである（配列番号７）。
５’  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ３’
クローンｐｉ１４ａの単離および配列決定
クローンＣＡ１６７ｂの単離に用いたプローブ（前出参照）を用いた，前述の「ｐｉ」ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより，クローンｐｉ１４ａが得られた。このクローンは，λｇｔ−１１  ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）から単離されたクローンＣＡ１６７ｂ，ＣＡ１５６ｅ，ＣＡ８４ａおよびＣＡ５９ａと重複する，約８００塩基対のＤＮＡを含む。さらに，ｐｉ１４ａもまた，クローンＣＡ１６７ｂ中のＨＣＶ  ｃＤＮＡの上流にあるＤＮＡ約２５０塩基対を含む。
【０１５４】
クローンＣＡ２１６ａ，ＣＡ２９０ａおよびａｇ３０ａの単離および配列決定
クローンＣＡ１６７ｂの配列に基づいて，次の配列を有する合成プローブが調製された（配列番号８）：
５’  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＣＴＡ  ３’
上記プローブは，スクリーニングの目的のために使用され，クローンＣＡ２１６ａが得られた。そのＨＣＶ配列を図１１に示す。
【０１５５】
クローンＣＡ２１６ａの配列に基づいて，次の配列を有する別のプローブが調製された（配列番号９）：
５’  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ３’
λ−ｇｔ１１ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）をこのプローブでスクリーニングすることにより，クローンＣＡ２９０ａが得られた。そのＨＣＶ配列を図１２に示す。
【０１５６】
これと平行して，上記最初のλｇｔ−１１ｃＤＮＡライブラリーにおいて使用したのと同じ感染血漿から抽出した核酸を用いて，プライマー伸張ｃＤＮＡライブラリーを調製した。使用したプライマーは，クローンＣＡ２１６ａおよびＣＡ２９０ａの配列に基づいている（配列番号１０）：
５’  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ３’
このｃＤＮＡライブラリーは，クローンｐｉ１４ａおよびｋ９−１の単離において使用したライブラリーについて使用したのと同様の前述の方法を用いて調製した。このライブラリーのスクリーニングに使用したプローブは，クローンＣＡ２９０ａの配列に基づいている（配列番号１１）。
５’  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＴＡＧ  ＧＴＣ  ＧＣＧ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ３’
クローンａｇ３０ａは，上記プローブを用いて新しいライブラリーから単離され，これは，ＨＣＶ配列の約６７０塩基対を含んでいた。図１３〜図１４を参照されたい。この配列の一部は，クローン２１６ａおよびＣＡ２９０ａのＨＣＶ配列と重複している。しかし，ａｇ３０ａの配列の約３００塩基対は，クローン２９０ａ由来の配列の上流にある。非重複配列では，ＨＣＶ  ＯＲＦの開始を示し得る開始コドン（＊），および終止コドンが示されている。図１３〜図１４には，さらに，翻訳の調節にある役割を果たし得る，コードされている小さい推定ペプチド（＃），および推定ポリペプチド（／）の推定第１アミノ酸，そして，そこにコードされる下流アミノ酸が示されている。
【０１５７】
クローンＣＡ２０５ａの単離および配列決定
クローンＣＡ２０５ａは，もとのλｇｔ−１１ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ４０３９４）から，クローンＣＡ２９０ａ  （図１２）  の中のＨＣＶ配列に由来する合成プローブを用いて単離された。このプローブの配列は次のとおりである（配列番号１２）。
５’  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ３’
ＣＡ２０５ａの中のＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列を図１５に示す。この配列は，クローンａｇ３０ａおよびＣＡ２９０ａの両者のｃＤＮＡ配列と重複する。ＣＡ２９０ａとの配列の重複を，配列上の点線で示す（この図には，この断片中にコードされる推定のアミノ酸もまた，示されている）。
【０１５８】
クローンＣＡ２０５ａおよびａｇ３０ａの中のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列から認められるように，推定ＨＣＶポリプロテインは，ＡＴＧ開始コドンから始まると考えられる。これら両クローンのＨＣＶ配列は，フレーム内に，このＡＴＧから４２ヌクレオチド上流に，隣接する２つの終止コドン（ＴＧＡＴＡＧ）を含んでいる。ＨＣＶのＯＲＦは，これらの終止コドンのあとから始まり，少なくとも８９０７ヌクレオチドにわたり延長していると考えられる（図２７〜図３６に示す複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡを参照されたい）。
【０１５９】
クローン１８ｇの単離および配列決定
クローンａｇ３０ａ（図１３〜図１４参照）の配列およびもとのλｇｔ−１１ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）由来の重複するクローンＣＡ２３０ａの配列に基づいて，次の配列を有する合成プローブを調製した（配列番号１３）：
５’  ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ３’
もとのλｇｔ−１１  ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーをこのプローブでスクリーニングしたところ，クローン１８ａが得られた。そのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を図１６に示す。この図にはまた，クローンａｇ３０ａと重複する配列，およびＨＣＶ  ｃＤＮＡにコードされている推定ポリペプチドが示されている。
【０１６０】
クローン１８ｇ（Ｃ１８ｇまたは１８ｇ）中のｃＤＮＡは，前述のクローンａｇ３０ａおよびＣＡ２０５ａの配列とも重複している。Ｃ１８ｇの配列はまた，クローンａｇ３０ａに認められる二重の終止コドン領域を含んでいる。これらの終止コドンの上流のポリヌクレオチド領域は，おそらく，ＨＣＶゲノムの５’領域の一部を示していると考えられる。このポリヌクレオチドは，短いＯＲＦを有し得る。このことは，精製ＨＣＶゲノムを直接配列決定することにより確認することができる。これらのコードされた推定小ペプチドは，翻訳調節の役目を果たし得る。Ｃ１８ｇで示されるＨＣＶゲノムの上流領域は，実質的に，クローン１２ｆにおいてＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の上流のｃＤＮＡ配列を単離するために用いた，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載された手法を用いて単離され，配列分析に用いられ得る。本質的には，Ｃ１８ｇの配列に基づいた逆転写酵素の小さな合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し，ＨＣＶゲノムＲＮＡの対応配列と結合させて用いた。このプライマー配列は，Ｃ１８ｇの既知の５’末端の近位に存在するが，このプライマー配列の上流のプローブ配列を設計するためには，十分下流に存在する。プライミングおよびクローニングの既知の標準的な方法が用いられる。得られたｃＤＮＡライブラリーは，プライミング部位の上流の配列を用いてスクリーニングされる（Ｃ１８ｇの解明された配列から推定）。ＨＣＶゲノムＲＮＡは，ＮＡＮＢＨを用いて個体の血漿または肝試料のいずれかから得られる。ＨＣＶがフラビ様ウイルスであると考えられるため，ゲノムの５’末端は，「キャップ」構造により修飾されている可能性がある。フラビウイルスゲノムが５’末端に「キャップ」構造を含むことは公知である（黄熱ウイルス，ライス（Ｒｉｃｅ）ら，（１９８８年）；デングウイルス，ハーン（Ｈａｈｎ）ら，（１９８８年）；日本脳炎ウイルス（１９８７年））。
【０１６１】
β−ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーからのクローンの単離および配列決定
ＨＣＶゲノムの３’末端領域を示すｃＤＮＡを含むクローンは，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載された，ＨＣＶ  ｃＤＮＡλｇｔ１１ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）の調製に用いられた感染チンパンジーのもとの血漿プールから構築されたｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＤＮＡライブラリーを調製するために，血漿から抽出されたＲＮＡに，ポリ（ｒＡ）ポリメラーゼを用いてポリｒＡを「付加」し，そしてｃＤＮＡを，逆転写酵素のプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）１２−１８を用いて，合成した。得られたＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドは，ＲＮＡａｓｅＨにより分解され，二本鎖ＨＣＶ  ｃＤＮＡに変換された。得られたＨＣＶ  ｃＤＮＡは，実質的にヒューン（Ｈｕｙｎｈ）（１９８５年）が記載した方法を用いて，λｇｔ１０ａの中へクローン化され，β（またはｂ）ＨＣＶｃＤＮＡライブラリーが得られた。使用した方法は次に示す通りである。
【０１６２】
血漿の一部（１２ｍｌ）をプロテイナーゼＫで処理し，０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ７．５，０．０５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール，０．１％（Ｗ／Ｖ）ヒドロキシキノロン，１ｍＭ  ＥＤＴＡで飽和させたフェノール（等量）により抽出した。得られた水層を，このフェノール混合液で再度抽出し，その後，フェノールと，クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）との１：１混合液で３回，次いで，クロロホルムとイソアミルアルコールとの混合液（１：１）で２回抽出した。この水層のＮａＣｌが２００ｍＭとなるよう調整した後，２．５倍量の冷無水エタノールにより水層相の核酸を−２０℃で一晩沈澱させた。この沈澱物を，１０，０００ＲＰＭにて４０分間の遠心分離にかけて集め，２０ｍＭ  ＮａＣｌ含有７０％エタノールおよび１００％冷エタノールで洗浄後，デシケーター内で５分間乾燥させ，そして，水に溶解させた。
【０１６３】
感染したチンパンジーの血漿プールから単離された核酸に，ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（ＨＰＲＩ）（アメルシャム社から購入）の存在下で，キャリアーとしてＭＳ２  ＲＮＡを利用して，ポリＡポリメラーゼを用いてポリｒＡを付加した。血漿２ｍｌ中の核酸と等量の単離された核酸を，ＴＭＮ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ７．９，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２，２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））と，４０μＭ  α−〔３２Ｐ〕ＡＴＰ，ＨＰＲＩ（アメルシャム社）２０単位と，ポリＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を含まないＲＮａｓｅの約９〜１０単位とを含有する溶液中でインキュベートした。インキュベーションは１０分間，３７℃にて行い，反応は，ＥＤＴＡ（最終濃度約２５０ｍＭ）で停止させた。この溶液を，等量のフェノール−クロロホルム液，および等量のクロロホルムにより抽出し，核酸を，２００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で，２．５倍容量のエタノールにより，−２０℃にて一晩沈澱させた。
【０１６４】
クローンｂ５ａの単離
β−ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーを，クローン１５ｅ中のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列に基づく配列を有する合成プローブを用いて，ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。クローン１５ｅの単離は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されており，その配列は図４に示されている。この合成プローブの配列は次のとおりである（配列番号１４）：
５’  ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＣＧ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ３’
ライブラリーのスクリーニングにより，約１０００塩基対のＨＣＶ  ｃＤＮＡ領域を含むクローンβ−５ａ（ｂ５ａ）が得られた。このｃＤＮＡの５’領域は，クローン３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，および１５ｅと重複している（これらのクローンは前出）。３’末端ポリＡ配列およびクローン１５ｅと重複する３’配列は，約２００塩基対を含む。このクローンにより，ＨＣＶゲノムの３’末端配列の領域を同定し得る。
【０１６５】
ｂ５ａの配列は，クーロン１６ｊｈにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列内に含まれている（後述する）。さらに，この配列は，もとのλｇｔ１１ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）から単離されたＣＣ３４ａにも存在する（もとのλｇｔ１１ライブラリーを，以下，「Ｃ」ライブラリーと呼ぶ）。
【０１６６】
ＨＣＶ  ゲノムの３’領域のＰＣＲ増幅により生じたクローンの単離および配列決定
ＨＣＶゲノムの３’領域由来のヌクレオチド配列を含む複数のｃＤＮＡクローンが調製されている。これは，サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８６年）およびサイキ（Ｓａｉｋｉ）ら（１９８８年）に記載されたポリメラーゼ鎖反応法によってゲノムの目標領域を増幅することにより達成され，そしてこれは次のように修飾された。増幅されたＨＣＶ  ＲＮＡは，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載された，ＨＣＶ  ｃＤＮＡλｇｔ１１ライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）の調製に用いられた，もとの感染されたチンパンジーの血漿プールから得られた。ＨＣＶ  ＲＮＡの単離は上述のとおりであった。単離されたＲＮＡには，チンパンジー血清から単離された核酸が核酸基質に置換されたことを除いて，シッペル（Ｓｉｐｐｅｌ）（１９７３年）に記載された方法により，その３’末端に，エセリヒアコリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼを用いてＡＴＰを付加した。付加されたＲＮＡは，次に，実質的にハン（Ｈａｎ）（１９８７年）が記載した方法により，オリゴｄＴプライマーアダプターを用いて，逆転写酵素によりｃＤＮＡに逆転写された。ただし，プライマー−アダプターの成分および配列は次のとおりであった（ＳＰ６プロモーター：配列番号１５）。
【０１６７】
スタッファー
（Ｓｔｕｆｆｅｒ）      ＡＡＴＴＣ
ＮｏｔＩ                  ＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＳＰ６  プロモーター      ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ
プライマー                Ｔ  １５
得られたｃＤＮＡは，次の２種のプライマーを用いて，ＰＣＲによる増幅を行った：
プライマー 配列 
ＪＨ３２（３０ｍｅｒ）      ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＧＣＧＡＧＡＴ
ＣＴＡＣ  （配列番号１６）
ＪＨ１１（２０ｍｅｒ）  ＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣＧＡ  （配列番号
１７）
ＪＨ３２プライマーは，ｃＤＮＡ中の目標領域の５’末端にハイブリダイズ可能な２０個のヌクレオチオドを有する配列を含んでおり，推定Ｔｍは６６℃であった。ＪＨ１１は，オリゴｄＴプライマーアダプターの一部に由来する。つまり，ｃＤＮＡの３’末端に特異的であり，Ｔｍが６４℃である。両プライマーは，増幅されたＨＣＶ  ｃＤＮＡのその後のクローニングに使用するために，その５’末端に，制限酵素ＮｏｔＩの認識部位を有するように設計された。
【０１６８】
このＰＣＲ反応は，次の反応混合液１００μｌ中に，ｃＤＮＡとプライマーとを懸濁することにより行われた。この反応混合液は，４種のデオキシヌクレオシド三リン酸，バッファーの塩および金属イオンと，サーマスアクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）より単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）とを含む。これらの混合液中の各成分は，パーキンエルマーのシータスＰＣＲキット（Ｃｅｔｕｓ  ＰＣＲＫｉｔ）（Ｎ８０１−００４３またはＮ８０１−００５５）に入っている。ＰＣＲ反応は，パーキンエルマーのシータスＤＮＡサーマルサイクラー中で３５サイクルにわたり行った。各サイクルは，９４℃における１．５分間の変性工程と，６０℃における２分間のアニーリング工程と，７２℃における３分間のプライマー延伸工程とからなる。このＰＣＲ産物について，クローン１５ｅの３’末端領域の配列に基づく配列の３０ヌクレオチドのプローブＪＨ３４を用いて，サザンブロット分析を行なった。ＪＨ３４の配列は次のとおりである（配列番号１８）：
５’  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＴＣ３’  
ＨＣＶ  ｃＤＮＡにより検出されたＰＣＲ産物のサイズ範囲は，約５０から約４００塩基対であった。
【０１６９】
増幅されたＨＣＶ  ｃＤＮＡをクローン化するために，ＰＣＲ産物をＮｏｔＩで切断し，ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によりサイズ選択した。３００塩基対を上まわる長さのＤＮＡは，ｐＵＣ１８ＳのＮｏｔＩ部位にクローン化された。このベクターｐＵＣ１８Ｓは，ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位との間にクローン化されたＮｏｔＩポリリンカーを含めるようにして構築された。このクローンは，ＪＨ３４プローブを用いて，ＨＣＶ  ｃＤＮＡについてスクリーニングされた。多数の陽性クローンが得られ，配列決定された。これらのクローンのうちの１つでにある１６ｊｈ中のＨＣＶ  ｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列と，そこにコードされたアミノ酸とを，図１７に示す。クローン１６ｊｈ中のＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列を，他のクローンと，この領域について比較することにより見い出されたヌクレオチド異質性もまた，この図に示す。
【０１７０】
集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列
ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，上で述べた種々のＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーに由来する一連の重複したクローンから集積されている。この配列において，クローンｂ１１４ａ，１８ｇ，ａｇ３０ａ，ＣＡ２０５ａ，ＣＡ２９０ａ，ＣＡ２１６ａ，ｐｉ１４ａ，ＣＡ１６７ｂ，ＣＡ１５６ｅ，ＣＡ８４ａ，およびＣＡ５９ａから得られた集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に開示されている集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の上流にあり，これは図１８〜図２６に示されている。クローンｂ５ａおよび１６ｊｈ由来の集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に開示されている集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の下流にある。
【０１７１】
図２７〜図３６は，上記クローン由来の集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列と，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に開示されている集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列とを示す。この配列の由来となるクローンは，ｂ１１４ａ，１８ｇ，ａｇ３０ａ，ＣＡ２０５ａ，ＣＡ２９０ａ，ＣＡ２１６ａ，ｐｉ１４ａ，ＣＡ１６７ｂ，ＣＡ１５６ｅ，ＣＡ８４ａ，ＣＡ５９ａ，Ｋ９−１（ｋ９−１とも呼ばれる），２６ｊ，１３ｉ，１２ｆ，１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，３９ｃ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，１５ｅ，ｂ５ａ，および１６ｊｈである。この図において，配列の上にある３つのダッシュ記号は，推定の開始メチオニンコドンの位置を示している。
【０１７２】
クローンｂ１１４ａは，前述のクローンｂ５ａについて記載されたクローニング法を用いて得られた。ただし，プローブは，前出のクローン１８ｇを検出するために使用された合成プローブであった。クローンｂ１１４ａは，クローン１８ｇ中に存在する配列（つまり，５’−ＣＡ）の上流にさらに２つのヌクレオチドを含んでいること以外は，クローン１８ｇ，ａｇ３０ａ，およびＣＡ２０５ａと重複している。これらのさらに２つのヌクレオチドは，図２７〜図３６に示すＨＣＶゲノム配列に含まれている。
【０１７３】
前述のいくつかのクローンが，もとのＨＣＶｃＤＮＡλｇｔ１１  Ｃライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）以外の他のライブラリーから得られているにもかかわらず，これらのクローンがもとのライブラリーのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列と重複するＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を含むことは，注目すべきことである。このように，実質的にすべてのＨＣＶ配列は，最初のＨＣＶ  ｃＤＮＡクローン（５−１−１）の単離に用いられたもとのλｇｔ１１  Ｃライブラリー（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４０３９４）から得られる。クローン５−１−１の単離は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されている。
【０１７４】
融合ポリペプチドＣ１００−３の精製（別法）
融合ポリペプチドであるＣ１００−３（ＨＣＶ  ｃ１００−３もしくはｃ１００−３とも呼ばれる）は，Ｎ末端付近にスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ），そしてＣ末端付近のフレーム内にＣ１００ＨＣＶポリペプチドを有する。酵母での発現によるポリペプチド調製方法，および宿主酵母細胞抽出物の不溶性画分の分別抽出は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されている。この融合ポリペプチドを調製する別の方法を，次に示す。この方法では，アセトンを用いて抗原を粗製の細胞溶解産物から沈澱させ，次いで，アセトンにより沈澱した抗原をイオン交換クロマトグラフィーにかけ，さらにゲル濾過により精製する。
【０１７５】
融合ポリペプチドＣ１００−３（ＨＣＶｃ１００−３）は，ｐＡＢ２４Ｃ１００−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６７９７６）により形質転換された酵母ＪＳＣ３０８株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０８７９）で発現する。この形質転換された酵母を，発現可能な条件下で増殖させる（つまり，１％のグルコースを含有するＹＥＰ中で増殖させる；欧州特許出願公開第３１８，２１６号参照）。細胞溶解産物は，この細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭＰＭＳＦ）に懸濁することにより調製される。この細胞は，ダイノミル（Ｄｙｎｏｍｉｌｌ）型ホモジナイザーもしくはそれと同様のホモジナイザーのガラスビーズで粉砕されることにより破壊される。細胞破壊の度合は，位相差顕微鏡により細胞を計数することによりモニターする。破壊された細胞は暗く見え，生存細胞は，明るい色に見える。破壊された細胞の割合（％）を算出する。
【０１７６】
破壊細胞の割合が約９０％またはそれ以上になったら，破壊細胞残屑を遠心分離によりガラスビーズから分離し，ガラスビーズを緩衝液Ａで洗浄する。洗浄液とホモジネートとを合わせた後，溶解産物中の不溶性物質を遠心分離により得る。ペレット中の物質は，溶解性タンパクを取り除くために，緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  グリシン，ｐＨ１２．０，１ｍＭ  ＤＴＴ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ），次いで，緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  グリシン，ｐＨ１０．０，１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁することにより洗浄される。不溶性物質は，遠心分離により回収され，ＳＤＳを含む緩衝液Ｃに懸濁することにより溶解する。抽出溶液は，β−メルカプトエタノール存在下で加熱され，そして，限外濾過により濃縮され得る。抽出物中のＨＣＶ  ｃ１００−３は，冷アセトンにより沈澱する。必要に応じて，この沈澱物は，約−１５℃またはそれ以下の温度で保存され得る。
【０１７７】
イオン交換クロマトグラフィーにかける前に，アセトン沈澱物は遠心分離により回収され，そして窒素下で乾燥され得る。この沈澱物は，緩衝液Ｄ（５０ｍＭ  グリシン，ｐＨ１０．０，１ｍＭ  ＤＴＴ，７Ｍ  尿素）中に懸濁され，そして，不溶性物質をペレット化するため遠心分離が行われる。上清物質は，あらかじめ緩衝液Ｄで平衡化した陰イオン交換カラムにかけられる。画分を採取し，紫外吸収あるいはＳＤＳポリアクリルアミドゲルによるゲル電気泳動により分析する。ＨＣＶ  ｃ１００−３ポリペプチドを含む画分をプールする。
【０１７８】
ＨＣＶ  ｃ１００−３ポリペプチドをゲル濾過により精製する目的で，イオン交換カラムからのプール画分を，β−メルカプトエタノールおよびＳＤＳの存在下で加熱し，溶出液を限外濾過により濃縮する。濃縮物は，あらかじめ緩衝液Ｅ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ７．０，１ｍＭＤＴＴ，０．１％  ＳＤＳ）で平衡化したゲル濾過カラムにかけられる。溶出画分中のＨＣＶ  ｃ１００−３および不純物の存在は，ＳＤＳ存在下におけるポリアクリルアミドゲルによるゲル電気泳動，およびポリペプチドの視覚化により測定される。精製ＨＣＶ  ｃ１００−３を含む画分をプールする。ＨＣＶ  ｃ１００−３含量の高い画分は，ゲル濾過工程を繰り返すことによりさらに精製され得る。微粒子物質を取り除きたい場合には，ＨＣＶ  ｃ１００−３を含む物質は，０．２２μのフィルターで濾過され得る。
【０１７９】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡをコードするポリペプチドの発現および抗原性
エセリヒア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現するポリペプチド
ＨＣＶゲノムＯＲＦにわたる数多くのＨＣＶ  ｃＤＮＡ中にコードされるポリペプチドは，Ｅ．ｃｏｌｉで発現され，ＮＡＮＢＨを有する種々の個体から得られた血清を用いてその抗原性が試験された。クローン化されたＨＣＶ  ｃＤＮＡを含む発現ベクターは，ｐＳＯＤｃｆ１から構築された（スタイマー（Ｓｔｅｉｍｅｒ）ら，１９８６年）。正確なリーディングフレームが得られていることを確認する目的で，３種の異なる発現ベクターｐｃｆ１ＡＢ，ｐｃｆ１ＣＤ，およびｐｃｆ１ＥＦを，次の方法で調製した。つまり，３種のリンカーＡＢ，ＣＤ，およびＥＦのいずれかと，ベクターｐＳＯＤｃｆ１をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより完全に切断してアルカリフォスファターゼ処理することにより得られるＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片とを結合させることにより，調製した。これらのリンカーは，６種のオリゴマー，Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，およびＦから調製された。各オリゴマーは，その相補的オリゴマーとアニールする前に，ＡＴＰ存在下でキナーゼ処理することによりリン酸化された。この合成リンカーの配列は次のとおりである。
名称        ＤＮＡ配列  （５’から３’へ）  
Ａ      ＧＡＴＣ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＴＡＡ    （配列番号１９）
Ｂ            ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  Ａ    （配列番号２０）
Ｃ      ＧＡＴＣ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＴＡＡ  （配列番号２１）
Ｄ            ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  Ａ    （配列番号２２）
Ｅ      ＧＡＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＡＡ            （配列番号２３）
Ｆ            ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  Ａ    （配列番号２４）    
３種のリンカーにおいては，それぞれもとのＥｃｏＲＩ部位がなくなり，リンカー内ではあるが異なるリーディングフレーム内に新しいＥｃｏＲＩ  部位が形成されている。従って，これらのクローンから単離されたＨＣＶ  ｃＤＮＡ  ＥｃｏＲＩ断片は，発現ベクター内に挿入されたときには，３つの異なるリーディングフレーム内にあった。指定されたλｇｔ１１クローン中のＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片は，ＥｃｏＲＩ  で切断することにより切り出され，各断片はｐｃｆ１ＡＢ，ｐｃｆ１ＣＤ，およびｐｃｆ１ＥＦに挿入された。次に，これらの発現構築物は，Ｄ１２１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内に導入され，その形質転換物をクローン化し，各クローン由来の組換え細菌は，ＩＰＴＧ存在下で増殖させることにより融合ポリペプチドを発現するように誘導された。
【０１８０】
前述のＨＣＶ  ｃＤＮＡの発現産物は，ヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ）ら（１９８３年）に記載された方法の変法を用いて，コロニーを直接，免疫学的にスクリーニングすることにより，抗原性について試験された。簡単に言えば，図３７に示すように，アンピシリンプレート上にのせられたニトロセルロースフィルター上に細菌をプレートし，フィルターあたり約１，０００個のコロニーを形成させる。コロニーを，ニトロセルロースフィルター上にレプリカし，このレプリカを，２ｍＭ  ＩＰＴＧおよびアンピシリンの存在下で一晩再増殖させた。細菌コロニーは，ニトロセルロースフィルターを飽和ＣＨＣｌ３蒸気中に約１５〜２０分間つり下げることにより溶菌した。次に，各フィルターを，５０ｍＭＴｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭＭｇＣｌ２３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，４０μｇ／ｍｌリゾチーム，および０．１μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅを１０ｍｌ含む直径１００ｍｍのペトリ皿にそれぞれ載置した。これらのペトリ皿は，室温で少なくとも８時間，静かに振とうした。このフィルターを，ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）  中ですすいだ。インキュベーションの後，細胞残渣をすすぎ，１０％ヒツジ血清を含むＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎを除いたＴＢＳＴ）中で１時間インキュベートした。次に，このフィルターをＮＡＮＢＨの個体由来でありＴＢＳ中で前処理した血清とともにインキュベートした。そのＮＡＮＢＨの個体とは次の個体を含む：チンパンジー３個体；ＨＣＶ  ｃ１００−３ポリペプチド（欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載および前出）（Ｃ１００とも呼ばれる）に対する抗体について血清が陽性である慢性ＮＡＮＢＨ患者８個体；抗Ｃ１００抗体について血清が陰性である慢性ＮＡＮＢＨ患者８個体；抗Ｃ１００抗体について血清が陰性である回復期の患者１個体；および集団獲得型ＮＡＮＢＨ患者６個体（抗Ｃ１００抗体について血清が強陽性である患者１個体および抗Ｃ１００抗体について血清がかすかに陽性である１個体を含む）。ＴＢＳ中に希釈した血清は，ｈＳＯＤをあらかじめ吸収させることにより，前処理が行われた。フィルターを血清とともにインキュベートするのは，少なくとも２時間行われた。インキュベーション後，フィルターをＴＢＳＴで３０分間にわたり２回洗浄した。発現タンパク（これに，血清中の抗体が結合する）の標識化は，１２５Ｉ−標識ヒツジ抗ヒト抗体と２時間インキュベートすることにより達成された。洗浄後，フィルターをＴＢＳＴで３０分間にわたり２回洗浄し，乾燥し，そしてオートラジオグラフィーにかけた。
【０１８１】
多くのクローン（後述する）が，ＮＡＮＢＨ個体の血清と免疫学的に反応するＨＣＶ  エピトープを含むポリペプチドを発現した。これらのポリペプチドのうちの５つは，これらのポリペプチド中のＨＣＶエピトープに対する抗体が多くの異なる患者の血清において検出されたという点で，非常に免疫原性であった。これらのポリペプチドをコードするクローン，および推定ＨＣＶポリタンパク中のこのポリペプチドの位置（アミノ酸番号は，推定開始コドンから数える）は次のとおりである：クローン５−１−１，アミノ酸１６９４−１７３５；クローンＣ１００，アミノ酸１５６９−１９３１；クローン３３ｃ，アミノ酸１１９２−１４５７；クローンＣＡ２７９ａ，アミノ酸１−８４；およびクローンＣＡ２９０ａ，アミノ酸９−１７７。推定ＨＣＶポリタンパク中の免疫原性ポリペプチドの位置は，すぐ後で示す。
ＮＡＮＢＨ  患者の血清との反応性が確認されたポリペプチドをコードするクローン
クローン ＨＣＶ  ポリタンパク中の位置
（推定開始メチオニンから数えたアミノ酸番号）
ＣＡ２７９ａ          １−８４
ＣＡ７４ａ            ４３７−５８２            
１３ｉ                ５１１−６９０            
ＣＡ２９０ａ          ９−１７７            
３３ｃ                １１９２−１４５７          
４０ｂ                １２６６−１４２８          
５−１−１            １６９４−１７３５  
８１                  １６８９−１８０５          
３３ｂ                １９１６−２０２１          
２５ｃ                １９４９−２１２４          
１４ｃ                ２０５４−２２２３          
８ｆ                  ２２００−３３２５          
３３ｆ                ２２８７−２３８５          
３３ｇ                ２３４８−２４６４          
３９ｃ                ２３７１−２５０２          
１５ｅ                ２７９６−２８８６          
Ｃ１００              １５６９−１９３１          
試験した種々のクローン内に，コードされたポリペプチドの抗原性についての結果から，有効な検出および免疫化系は，ＨＣＶポリペプチド／エピトープのパネルを含み得ることが示唆される。
【０１８２】
酵母でのＨＣＶ  エピトープの発現
３つの異なるリーディングフレームにＨＣＶｃＤＮＡを挿入し得る３つの異なる酵母発現ベクターが構築される。これらのベクターの１つであるｐＡＢ２４Ｃ１００−３  の構築は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載されている。以下の研究においては，Ｅ．ｃｏｌｉ発現産物を用いた抗原性マッピングの研究における前述の表のクローン由来のＨＣＶ  ｃＤＮＡを，Ｃ１００ＨＣＶ  ｃＤＮＡの代わりに用いる。他のベクターの構築では，上記Ｅ．ｃｏｌｉの研究に記載されたアダプターが，次のアダプターのうちの１つに置き換えられる：
アダプター１
ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  Ｇ        （配列番号２５）
ＡＣ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴ    （配列番号２６）
アダプター２
ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  Ｇ          （配列番号２７）
ＡＣ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴ    （配列番号２８）
挿入されたＨＣＶ  ｃＤＮＡは，ベクターにより形質転換された酵母において，融合ポリペプチドＣ１００−３の発現について上述したのと同様の発現条件により発現する。得られたポリペプチドは，Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされた免疫原性ポリペプチドのスクリーニングについて上述した，ＮＡＮＢＨ  個体由来の血清を用いてスクリーニングされる。
【０１８３】
ＨＣＶポリタンパクと西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）ポリタンパクおよびデングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ）ＮＳ１との疎水性プロファイルについての比較
ＨＣＶポリタンパクセグメントの疎水性プロファイルを，典型的なフラビウイルスである西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ）のそれと比較した。西ナイルウイルスポリタンパクのポリペプチド配列は，このウイルスの非構造タンパクをコードする既知のポリヌクレオチド配列から推測された。ＨＣＶポリタンパク配列は，重複するｃＤＮＡクローン配列から推測された。このプロファイルは，与えられたアミノ酸残基周辺の平均的な疎水性を調べるために，７個のアミノ酸（問題のアミノ酸，およびその両側に各３残基）からなる長さのウインドーを使用する抗原プログラムを用いて決定された。各アミノ酸残基の反応疎水性（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を与えるパラメーターは，カイトおよびドリトル（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）（１９８２年）に示されている。図３８〜図４２は，この２つのポリタンパクの疎水性プロファイルを示す。西ナイルウイルスの非構造タンパク，ｎｓ１からｎｓ５に対応する部分をこの図に示す。この図からわかるように，ＨＣＶポリタンパクおよび西ナイルウイルスポリタンパクのプロファイルは，全体として類似している。
【０１８４】
図１８〜図２６に示されるＨＣＶ  ｃＤＮＡの５’領域にコードされているアミノ酸の配列を，その疎水性および親水性の領域のプロファイルについて，前述のデングウイルスのうちの１つの株の対応領域と比較した（データは示されていない）。この比較により，この領域にコードされるＨＣＶおよびデング由来のポリペプチド（ＮＳ１（またはその一部）をコードする領域に対応する）は，同様の疎水性／親水性プロファイルを有することが示された。
【０１８５】
疎水性プロファイルが類似していることと，ＨＣＶおよびデングフラビウイルスのアミノ酸配列が相同性を有することが既にわかっている（欧州特許第２１８，３１６号に開示）こととを組み合わせると，ＨＣＶがフラビウイルス科のこれらメンバーと関連性のあることが示唆される。
【０１８６】
ＨＣＶ  ＯＲＦ内にコードされた推定ポリペプチドの特性決定
図２７〜図３６に示すＨＣＶ  ｃＤＮＡのセンス鎖の配列は，欧州特許出願公開第３１８，２１６号に記載された種々のクローンおよび前述のクローンにおける重複ＨＣＶ  ｃＤＮＡから推定された。ＨＣＶゲノムが，ポリタンパクをコードする１つの長い連続したＯＲＦを主に含んでいることは，この配列から推測することできる。この配列において，番号１のヌクレオチドは，開始ＭＥＴコドンの第１ヌクレオチドに対応し，負の番号は，ヌクレオチドが５’方向（上流）にそれだけの距離で存在することを示し，正の番号は，ヌクレオチドが３’方向（下流）にそれだけの距離で存在することを示す。この複合配列は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡの「センス」鎖を示す。
【０１８７】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡセンス鎖配列から推定さた推定ＨＣＶ  ポリタンパクのアミノ酸配列もまた，図２７〜図３６に示されており，１番は推定開始メチオニンから始まる。
【０１８８】
コードされたＨＣＶポリタンパクの可能なタンパク領域およびそのおよその境界は次のとおりである（括弧内に示されたポリペプチドは，フラビウイルスの領域内にコードされているポリペプチドである）：
推定ドメイン およその境界
（アミノ酸番号）
「Ｃ」（ヌクレオカプシドタンパク）                １−１２０
「Ｅ」（ビリオンエンベロープタンパク              １２０−４００
（Ｓ）および推定のマトリックス（Ｍ）
タンパク）
「ＮＳ１」（補体結合抗原？）                      ４００−６６０
「ＮＳ２」（機能不明）                            ６６０−１０５０
「ＮＳ３」（プロテアーゼ？）                      １０５０−１６４０
「ＮＳ４」（機能不明）                            １６４０−２０００
「ＮＳ５」（ポリメラーゼ）                        ２０００−？末端
しかし，この疎水性プロファイル（後述する）が，特にＮＳ２の上流領域に関して，ＨＣＶがフラビウイルスモデルと異なることを示しているのは注目すべきである。さらに，示された境界は，推定ポリペプチド間の正確な境界を示すものではない。
【０１８９】
さらに，図２７〜図３６に示す配列から大きなポリタンパクの推定開始ＭＥＴの上流に存在する，ＡＴＧを含む小さなＯＲＦが４つあることが，推測され得る。これらのＯＲＦのＡＴＧは，ヌクレオチド番号−３１０，−２５７，−２４６，および−１２７に存在する。
【０１９０】
ポリペプチドの親水性および抗原性プロファイル
図１８〜図２６に示すＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列にコードされる推定ポリタンパクの，親水性／疎水性プロファイルおよび抗原指数（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｎｄｅｘ）は，コンピューター解析により決定された。親水性／疎水性についてのプログラムは上述のとおりである。抗原指数は次の基準をもとにしたコンピュータープログラムにより決定される：１）表面抗原である確率（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）；２）２つの異なる方法によるα−ヘリックスを有するか否かの予測；３）２つの異なる方法によるβ−シート領域を有するか否かの予測；４）２つの異なる方法によるＵ字形折り返し構造を有するか否かの予測；５）親水性／疎水性；および可撓性。コンピューター解析により得られたプロファイルの記録を図４３〜図４８に示す。親水性プロファイルでは，横軸より上側への片寄りが親水性を示し，横軸より下側への片寄りが疎水性を示す。ポリペプチド領域が抗原性である可能性は，親水性および／または抗原性プロファイルにおいて横軸より上側への片寄りがある場合に，通常，増加すると考えられている。しかし，これらのプロファイルは，ポリペプチドの免疫原性の強さを必ずしも示すものではないことを注意すべきである。
【０１９１】
ＨＣＶおよびフラビウイルスにおける共直線ペプチド（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の同定
ＨＣＶ  ｃＤＮＡセンス鎖内にコードされた推定ポリタンパクのアミノ酸配列を，フラビウイルスのいくつかのメンバーの既知のアミノ酸配列と比較した。この比較によると，相同性は少ないが，相同性が見い出された領域から判断して，おそらくこの相同性は有意である。この保持された共直線性領域を図４９に示す。配列の下に記されたアミノ酸番号は，推定ＨＣＶポリタンパクの番号である（図２７〜図３６参照）。
【０１９２】
これらの保持されたモチーフの間隔は，フラビウイルスとＨＣＶとで類似しており，ＨＣＶとこれらフラビウイルス試薬との間にもある程度の類似性のあることを意味している。
【０１９３】
以下の表に示す物質は，アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１  ＰａｒｋｌａｗｎＤｒ．Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，にブダペスト条約に基づいて寄託され，次の受託番号が付与されている。
【０１９４】
λｇｔ１１ ＡＴＣＣ  Ｎｏ． 寄託日
ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリー    ４０３９４        １９８７年１２月１日
クローン８１                    ４０３８８        １９８７年１１月１７日
クローン９１                    ４０３８９        １９８７年１１月１７日
クローン１−２                  ４０３９０        １９８７年１１月１７日
クローン５−１−１              ４０３９１        １９８７年１１月１８日
クローン１２ｆ                  ４０５１４        １９８８年１１月１０日
クローン３５ｆ                  ４０５１１        １９８８年１１月１０日
クローン１５ｅ                  ４０５１３        １９８８年１１月１０日
クローンＫ９−１                ４０５１２        １９８８年１１月１０日
ＪＳＣ  ３０８                  ２０８７９        １９８８年５月５日
ｐＳ３５６                      ６７６８３        １９８８年４月２９日
さらに，次の寄託が１９８９年５月１１日になされた。
【０１９５】
菌株 リンカー ＡＴＣＣ  Ｎｏ．
Ｄ１２１０（Ｃｆ１／５−１−１）    ＥＦ              ６７９６７
Ｄ１２１０（Ｃｆ１／８１）          ＥＦ              ６７９６８
Ｄ１２１０（Ｃｆ１／ＣＡ７４ａ）    ＥＦ              ６７９６９
Ｄ１２１０（Ｃｆ１／３５ｆ）        ＡＢ              ６７９７０
Ｄ１２１０（Ｃｆ１／２７９ａ）      ＥＦ              ６７９７１
Ｄ１２１０  （Ｃｆ１／Ｃ３６）      ＣＤ              ６７９７２
Ｄ１２１０（ＣＦ１／１３ｉ）        ＡＢ              ６７９７３
Ｄ１２１０（Ｃｆ１／Ｃ３３ｂ）      ＥＦ              ６７９７４
Ｄ１２１０（Ｃｆ１／ＣＡ２９０ａ）  ＡＢ              ６７９７５
ＨＢ１０１（ＡＢ２４／Ｃ１００  ＃３Ｒ）              ６７９７６
以下のＤ１２１０株の誘導株は，１９８９年５月３日に寄託された。
【０１９６】
誘導株 ＡＴＣＣ  Ｎｏ．
ｐＣＦ１ＣＳ／Ｃ８ｆ          ６７９５６
ｐＣＦ１ＡＢ／Ｃ１２ｆ        ６７９５２
ｐＣＦ１ＥＦ／１４ｃ          ６７９４９
ｐＣＦ１ＥＦ／１５ｅ          ６７９５４
ｐＣＦ１ＡＢ／Ｃ２５ｃ        ６７９５８
ｐＣＦ１ＥＦ／Ｃ３３ｃ        ６７９５３
ｐＣＦ１ＥＦ／Ｃ３３ｆ        ６７９５０
ｐＣＦ１ＣＤ／３３ｇ          ６７９５１
ｐＣＦ１ＣＤ／Ｃ３９ｃ        ６７９５５
ｐＣＦ１ＥＦ／Ｃ４０ｂ        ６７９５７
ｐＣＦ１ＥＦ／ＣＡ１６７ｂ    ６７９５９
以下の菌株は，１９８９年５月１２日に寄託された。
【０１９７】
菌株 ＡＴＣＣ  Ｎｏ．
λｇｔ１１（Ｃ３５）            ４０６０３
λｇｔ１０（β−５ａ）          ４０６０２
Ｄ１２１０（Ｃ４０ｂ）          ６７９８０
Ｄ１２１０（Ｍ１６）            ６７９８１
本出願が米国特許として許可され発行されると，これら寄託物を利用することに関する制限はすべて最終的に取り除かれる。そして上記命名された寄託物は，米国特許法施行規則  １．１４および米国特許法１．２２により，上記出願が係属している間に特許商標庁長官によって権利を与えられた者が，入手可能である。さらに，その寄託物は，寄託日から３０年間，あるいは寄託物の最終分譲請求から５年間；あるいは，米国特許の有効期間のいずれか長い方の期間にわたって，維持される。
【０１９８】
ここで述べられている寄託物は便宜のためにのみ寄託されたものであり，ここに記載された内容により本発明を実施するのに必要ではない。さらに，これらの寄託物は，参考として，ここに述べられている。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
産業上の利用可能性
本発明は，ここに開示された種々の事柄について，多くの産業上の用途があり、そのうちのいくつかは以下のとおりである。ＨＣＶ  ｃＤＮＡは，試料中のＨＣＶ核酸を検出するためのプローブの設計に使用され得る。ｃＤＮＡ由来のプローブは，例えば化学的な合成反応におけるＨＣＶ核酸の検出に使用され得る。それらはまた，細胞培養系および動物モデル系におけるウイルスの複製を阻害する薬剤の効果を判定するために，抗ウイウルス剤についてのスクリーニングプログラムにも使用され得る。ＨＣＶポリヌクレオチドプローブはまた，ヒトにおけるウイルス核酸を検出するのに有用であり，従ってヒトにおけるＨＣＶ感染の診断の基準として使用され得る。
【０２００】
上記に加え，ここに示されたｃＤＮＡは，ＨＣＶのエピトープを含むポリペプチドの合成についての情報および手段を提供する。これらのポリペプチドは，ＨＣＶ抗原に対する抗体を検出するのに有用である。ＨＣＶエピトープを含む組換えポリペプチドに基づく，ＨＣＶ感染の一連の免疫学的検定法がここに記載されており，ＨＣＶにより引き起こされたＮＡＮＢＨの診断，ＨＣＶによる感染性肝炎について，血液バンク供血者のスクリーニングを行なうこと，および感染血液の供血者からの汚染血液の検出において，商業上の用途が見い出される。ウイルス抗原もまた，動物モデル系における抗ウイルス剤の有効性をモニターする上で有用性がある。さらに，ここに開示されているＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来のポリペプチドは，ＨＣＶ感染を処置するためのワクチンとして有効性がある。
【０２０１】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来のポリペプチドは，上記用途以外に，抗ＨＣＶ抗体を増加させるのにも有用である。このように，これらは，抗ＨＣＶワクチンとして使用され得る。しかし，ＨＣＶポリペプチドで免疫することにより生成する抗体は，試料中のウイルス抗原の存在を検出するためにも有用である。従って，これは，化学的な系におけるＨＣＶポリペプチド生成のアッセイに使用され得る。抗ＨＣＶ抗体はまた，抗ウイルス剤のスクリーニングプログラム（ここで，これらの試薬は組織培養系で試験される）において，抗ウイルス剤の有効性をモニターするために使用され得る。それらはまた，受動免疫療法にも使用され得，そして，供血者および受血者の両方についてウイルス抗原を検出することにより，ＨＣＶにより引き起こされるＮＡＮＢＨを診断するためにも使用され得る。抗ＨＣＶ抗体の他の重要な用途は，ウイルスおよびウイルスポリペプチドの精製のためのアフィニティークロマトグラフィーにおける用途である。精製されたウイルスおよびウイルスポリペプチド調製物は，ワクチンに使用され得る。しかし，精製されたウイルスは，また，ＨＣＶが複製される細胞培養系の開発にも有用であり得る。
【０２０２】
アンチセンスポリヌクレオチドは，ウイルス複製の阻害剤として使用され得る。
【０２０３】
便宜上，抗ＨＣＶ抗体およびＨＣＶポリペプチドは，天然物であっても組換え体であっても，キットのなかへ組み込まれ得る。
【０２０４】
［配列表］
（配列番号１）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＧＣＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ３０
（配列番号２）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＴＡＴ  ＣＡＧ  ＴＴＡＴＧＣ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ３０
（配列番号３）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＡＧＣＡＧＧ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ３０
（配列番号４）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＣＴＧＧＴＡ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ３０
（配列番号５）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＣＧＡＣＧＣ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ３０
（配列番号６）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＣＡＣＡ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ３０
（配列番号７）
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＴＧＧＧＴ  ＴＴＣ  １５
（配列番号８）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＡＣＣＡＣＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＣＴＡ  ３０
（配列番号９）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＡＡＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＴＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ３０
（配列番号１０）
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＧＴＡＡＧ  １５
（配列番号１１）
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＴＡＧＧＴＣ  ＧＣＧ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ２７
（配列番号１２）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＣＧＴＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ３０
（配列番号１３）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＴＧＧＴＣＴ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ３０
（配列番号１４）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＡＧＡＴＣＴ  ＡＣＧ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ３０
（配列番号１５）
配列の長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴ  ＡＴＡＧＡＡ  ２６
（配列番号１６）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＧ  ＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣ    ３０
（配列番号１７）
配列の長さ：２２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＣ  ＧＡ  ２２
（配列番号１８）
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＡＣＣＴ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ３０
（配列番号１９）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＡＴＣ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＴＡＡ  １９
（配列番号２０）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＡＣ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  Ａ  １９
（配列番号２１）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＡＴＣ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＴＡＡ  １９
（配列番号２２）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  Ａ  １９
（配列番号２３）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＡＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＡＡ  １９
（配列番号２４）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  Ａ          １９
（配列番号２５）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＡＴＴ  ＴＴＧ  ＡＡＴＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  Ｇ  １９
（配列番号２６）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡ  １９
（配列番号２７）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＧＡＡＴＴＣ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  Ｇ  １９
（配列番号２８）
配列の長さ：１９
配列の型：核酸
鎖の数：両形態
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ配列
ＴＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＴＴＡＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡ  １９
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は，クローン１２ｆにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２】図２は，クローンｋ９−１におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列およびこの配列内にコードされたアミノ酸の一部を示す。
【図３】図３は，図２の続きである。
【図４】図４は，クローン１５ｅの配列およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図５】図５は，クローン１３ｉにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列内にコードされたアミノ酸，およびクローン１２ｆと重複する配列を示す。
【図６】図６は，クローン２６ｊにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列内にコードされたアミノ酸，およびクローン１３ｉと重複する配列を示す。
【図７】図７は，クローンＣＡ５９ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列内にコードされたアミノ酸，およびクローン２６ｊおよびｋ９−１と重複する配列を示す。
【図８】図８は，クローンＣＡ８４ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列内にコードされたアミノ酸，およびクローンＣＡ５９ａと重複する配列を示す。
【図９】図９は，クローンＣＡ１５６ｅにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列内にコードされたアミノ酸，およびＣＡ８４ａと重複する配列を示す。
【図１０】図１０は，クローンＣＡ１６７ｂにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列内にコードされたアミノ酸，およびＣＡ１５６ｅと重複する配列を示す。
【図１１】図１１は，クローンＣＡ２１６ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列内にコードされたアミノ酸，およびクローンＣＡ１６７ｂと重複するものを示す。
【図１２】図１２は，クローンＣＡ２９０ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列にコードされたアミノ酸，およびクローンＣＡ２１６ａと重複するものを示す。
【図１３】図１３は，クローンａｇ３０ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびクローンＣＡ２９０ａと重複するものの一部を示す。
【図１４】図１４は，図１３の続きである。
【図１５】図１５は，クローンＣＡ２０５ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，およびクローンＣＡ２９０ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列と重複するものを示す。
【図１６】図１６は，クローン１８ｇにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，およびクローンａｇ３０ａにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列と重複するものを示す。
【図１７】図１７は，クローン１６ｊｈにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，この配列にコードされたアミノ酸，およびクローン１５ｅ  におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列と重複するヌクレオチドを示す。
【図１８】図１８は，クローンｐｉ１４ａ，ＣＡ１６７ｂ，ＣＡ１５６ｅ，ＣＡ８４ａ，ＣＡ５９ａ，Ｋ９−１，１２ｆ，１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，３９ｃ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，および１５ｅに由来するＨＣＶ  ｃＤＮＡのＯＲＦの一部を示す。
【図１９】図１９は，図１８の続きである。
【図２０】図２０は，図１９の続きである。
【図２１】図２１は，図２０の続きである。
【図２２】図２２は，図２１の続きである。
【図２３】図２３は，図２２の続きである。
【図２４】図２４は，図２３の続きである。
【図２５】図２５は，図２４の続きである。
【図２６】図２６は，図２５の続きである。
【図２７】図２７は，上記クローン由来の集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列および欧州特許出願公開第３１８，２１６号において公開された集積ＨＣＶ  ｃＤＮＡのセンス鎖の一部を示す。配列の由来となるクローンは，ｂ１１４ａ，１８ｇ，ａｇ３０ａ，ＣＡ２０５ａ，ＣＡ２９０ａ，ＣＡ２１６ａ，ｐｉ１４ａ，ＣＡ１６７ｂ，ＣＡ１５６ｅ，ＣＡ８４ａ，ＣＡ５９ａ，Ｋ９−１（ｋ９−１とも呼ばれる），２６ｊ，１３ｉ，１２ｆ，１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，３９ｃ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，１５ｅ，ｂ５ａ，および１６ｊｈである。この図において，配列の上の３つのダッシュ記号は，推定されるメチオニン開始コドンの位置を示す。また，複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされた推定ポリタンパクのアミノ酸配列も，この図に示されている。
【図２８】図２８は，図２７の続きである。
【図２９】図２９は，図２８の続きである。
【図３０】図３０は，図２９の続きである。
【図３１】図３１は，図３０の続きである。
【図３２】図３２は，図３１の続きである。
【図３３】図３３は，図３２の続きである。
【図３４】図３４は，図３３の続きである。
【図３５】図３５は，図３４の続きである。
【図３６】図３６は，図３５の続きである。
【図３７】図３７は，抗原マッピング研究において使用された免疫学的コロニースクリーニング法の図である。
【図３８】図３８は，ＨＣＶおよび西ナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス内にコードされたポリタンパクの疎水性プロファイルの一部を示す。
【図３９】図３９は，図３８の続きである。
【図４０】図４０は，図３９の続きである。
【図４１】図４１は，図４０の続きである。
【図４２】図４２は，図４１の続きである。
【図４３】図４３は，推定ＨＣＶポリタンパクの親水性／疎水性プロファイルおよび抗原指数の記録の一部である。
【図４４】図４４は，図４３の続きである。
【図４５】図４５は，図４４の続きである。
【図４６】図４６は，図４５の続きである。
【図４７】図４７は，図４８の続きである。
【図４８】図４８は，図４７の続きである。
【図４９】図４９は，ＨＣＶおよびフラビウイルスにおいて保存されている共直線ペプチドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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