(57)【要約】      （修正有）【課題】サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンを検出することが可能な糖化合物およびそれを用いるセンサーチップ、検出方法を提供する。【解決手段】硫酸基含有糖化合物は、下記一般式（１）で表される。2006347909.tif 000052    （１）〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−（ｎが２〜２０）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示し；Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示し；Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す。〕【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
【化１】
2006347909.tif 000035
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−（ｎが２〜２０）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示し；
Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す。〕で表される、硫酸基含有糖化合物。
【請求項２】
下記一般式（２）
【化２】
2006347909.tif 000036
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−（ｎが２〜２０）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示し；
Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す。〕で表される、硫酸基含有糖化合物。
【請求項３】
前記Ｒ１が−ＮＨＣＯＣＨ３である、請求項１または２に記載の硫酸基含有糖化合物。
【請求項４】
前記Ｘ１が芳香族置換基であり、Ｘ２が直鎖もしくは分岐した炭素原子数２〜２０のアルキル基である、請求項１〜３のいずれかに記載の硫酸基含有糖化合物。
【請求項５】
前記Ｘ１が、下記式（３）
【化３】
2006347909.tif 000037
で表される２価の基である、請求項４に記載の硫酸基含有糖化合物。
【請求項６】
前記Ｘ２が、-CnH2n- (n = 2-6)である、請求項４または５に記載の硫酸基含有糖化合物。
【請求項７】
Ｙが、ジスルフィド基である、請求項１〜６のいずれかに記載の硫酸基含有糖化合物。
【請求項８】
下記式（４）
【化４】
2006347909.tif 000038
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す〕で表される、請求項１に記載の硫酸基含有糖化合物。
【請求項９】
下記式（５）
【化５】
2006347909.tif 000039
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す〕で表される、請求項１に記載の硫酸基含有糖化合物。
【請求項１０】
下記一般式（６）または（７）
【化６】
2006347909.tif 000040
【化７】
2006347909.tif 000041
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属基板表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ。
【請求項１１】
下記一般式（６）または（７）
【化８】
2006347909.tif 000042
【化９】
2006347909.tif 000043
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の前記微粒子が、溶液中にコロイドで存在している、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬。
【請求項１３】
下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１） 試験体を、請求項１０に記載のセンサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２） 基板に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
【請求項１４】
下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１） 試験体を、請求項１２に記載の試薬に添加して、前記微粒子と接触させる工程、
（２） 前記微粒子に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
【請求項１５】
下記一般式（６）または（７）
【化１０】
2006347909.tif 000044
【化１１】
2006347909.tif 000045
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物を含有する、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質吸着材。
【請求項１６】
下記一般式（６）または（７）
【化１２】
2006347909.tif 000046
【化１３】
2006347909.tif 000047
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属基板表面に固定されている、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用センサーチップ。
【請求項１７】
下記一般式（６）または（７）
【化１４】
2006347909.tif 000048
【化１５】
2006347909.tif 000049
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の前記微粒子が、溶液中にコロイドで存在している、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用試薬。
【請求項１９】
下記の工程からなる、インフルエンザウイルス検出方法：
（１） 試験体を、請求項１６に記載のセンサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２） 基板に結合したインフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスを検出する工程。
【請求項２０】
下記の工程からなる、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用検出方法：
（１） 試験体を、請求項１８に記載の試薬に添加して、前記微粒子と接触させる工程、
（２） 前記微粒子に結合したインフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスを検出する工程。
【請求項２１】
下記一般式（６）または（７）
【化１６】
2006347909.tif 000050
【化１７】
2006347909.tif 000051
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物を含有する、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用吸着材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸基含有糖化合物、それを用いるサーズウイルスもしくはサーズスパイク蛋白質、またはそれを用いるインフルエンザウイルスもしくはヘマグルチニン検出用センサーチップ、検出用微粒子、吸着材、除染剤、およびサーズウイルスもしくはサーズスパイク蛋白質検出方法、またはインフルエンザウイルスもしくはヘマグルチニン検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新型肺炎（ＳＡＲＳ（サーズ）；Severe Acute Respiratory Syndrome）は、２００３年に中国、台湾、カナダで流行した。この感染症は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）によるもので、死亡率は１０％以上に達する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶの表面には、スパイクタンパク質とよばれるタンパク質が多数存在しており、このスパイクタンパク質がホスト細胞上の特定のレセプターと結合して感染が始まると考えられている。このウイルスは、発見後歴史が新しく、ヒトＳＡＲＳウイルスのレセプターに関しても現段階では不明な点が多い。
【０００３】
これまで、サーズウイルスの検出には、遺伝子診断法（ＲＴ−ＰＣＲ法：非特許文献１）、抗体法（非特許文献２）などが知られている。しかしながら、遺伝子診断法はウイルス以外による汚染の危険性があり、ウイルスの存在を推測する程度に過ぎない。抗体法は、抗体の安定性の問題から２〜８℃といった低温下で抗体を保存する必要があり、温度管理の手間などがあり煩雑な方法であった。このため、精度の高い、簡便なサーズウイルスの検出方法が望まれていた。
【０００４】
近年、バイオテクノロジー、生化学研究、臨床検査、食品検査などの分野においては、ウイルスなどに存在する糖結合性蛋白質を高感度に検出・定量する方法が提案されている。（特許文献１）
しかし、これまで、サーズウイルスがレセプターとなる糖鎖構造は解明されておらず、糖鎖を利用するサーズウイルスの検出、吸着方法の報告もない。
【０００５】
一方、毎年、冬季に流行するインフルエンザは、インフルエンザウイルスの感染に基づくものであり、近年、ザナミビル、タミフルなどの抗ウイルス薬が開発され、その治療法が大幅に進展した。それは、事前に「抗体法」によるインフルエンザウイルスの検出が可能となり、一般のいわゆる「風邪」と識別が可能となったためである。（非特許文献３）しかし、現在、市販されている「抗体法」は、ウイルスの核蛋白質やウイルス表面に存在するヘマグルチニン、シアリダーゼなどを主に検知したり、感染後に生体内に生産される抗体を検知するものであり、いずれも特異的な蛋白質を用いているため、使用直前まで２−８℃の低温下で保存しなければならないといった、安定性、取り扱い上の問題があった。また、その感度も十分高くなく、偽陽性、偽陰性といった信頼性にも問題がある。
【０００６】
また、インフルエンザウイルスに感染した初期のウィンドー期においては、生体内で抗体が生産されていないため、抗体法によって感染初期の状態を判定することは原理的に不可能である。
【０００７】
他のインフルエンザウイルス検出法として、遺伝子診断法（ＰＣＲ）、ウイルスのノイラミニダーゼ（シアリダーゼともいう）活性を測定する方法などが知られている。（非特許文献４、５）しかし、遺伝子診断法では、目的とするウイルス以外によるコンタミネーション（汚染）のリスクがあり、また、遺伝子の断片よりウイルスの存在を推測する程度にすぎない。ノイラミニダーゼ活性測定法は、蛍光法とリンクさせたELISA法として使用するのが一般的でありしばしば感度が十分でなく、また、ノイラミニダーゼ阻害剤に対して耐性を示す変異種では、このノイラミニダーゼ活性を減少させるため感度の面で問題が残されている。
【０００８】
さらに、インフルエンザに罹患することを危惧する人たち（介護施設の老人など）も多く存在することも事実であり、感染防止に関わるマスク、フィルターなどのツールの開発も望まれていた。
【特許文献１】米国特許第３２３１７３３号
【非特許文献１】Journal of Virological Methods, vol. 122, pp. 29-36 (2004).
【非特許文献２】Clinical Immunology, vol. 113, pp. 145-150 (2004).
【非特許文献３】Journal of Clinical Microbiology, vol. 40, pp. 4353-4356 (2002).
【非特許文献４】Journal of Clinical Microbiology, vol. 39, pp. 196-200 (2001).
【非特許文献５】Journal of Virological Methods, vol. 122, pp. 9-15 (2004).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質を検出することが可能な糖化合物を提供することを課題とする。また本発明は、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンを検出することが可能な糖化合物を提供することを課題とする。
【００１０】
さらに本発明は、高感度で簡便かつ迅速にサーズウイルスまたはインフルエンザウイルスを検出できるバイオセンサーチップ、検出用試薬、検出用微粒子、吸着材およびこれらウイルスの検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、上記課題に鑑み、本願発明者らが合成した新規な糖鎖について、まずサーズウイルスとの結合可能な糖鎖について研究した。具体的には、サーズウイルス表面に存在するスパイク蛋白質と呼ばれるタンパク質と結合しうる糖鎖について鋭意研究し、特定の糖鎖構造が、極めて効果的にサーズウイルスのスパイク蛋白質と結合することを初めて見出した。
また、本発明に係る糖鎖構造は、インフルエンザウイルス表面に存在するヘマグルチニンとよばれるタンパク質と極めて効果的に結合することを見出した。
この糖鎖構造を有する化合物を用いることにより、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の迅速な検出、吸着材、検出方法を提供することができることを見出し、本願発明を完成した。
この糖鎖構造を有する化合物を用いることにより、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンの迅速な検出、吸着材、検出方法を提供することができることを見出し、本願発明を完成した。
【００１２】
サーズウイルスまたはインフルエンザウイルスに対し、本発明に係る糖鎖構造をそれぞれの存在可能性の高い環境中で用いることにより、選択的にサーズウイルスまたはインフルエンザウイルスを検出あるいは吸着することができる。
【００１３】
すなわち本件発明は以下を含む。
〔１〕下記一般式（１）：
【化１８】
2006347909.tif 000002
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−（ｎが２〜２０）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示し；
Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す。〕で表される、硫酸基含有糖化合物。
〔２〕下記一般式（２）
【化１９】
2006347909.tif 000003
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−（ｎが２〜２０）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示し；
Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す。〕で表される、硫酸基含有糖化合物。
〔３〕  前記Ｒ１が−ＮＨＣＯＣＨ３である、〔１〕または〔２〕に記載の硫酸基含有糖化合物。
〔４〕  前記Ｘ１が芳香族置換基であり、Ｘ２が直鎖もしくは分岐した炭素原子数２〜２０のアルキル基である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の硫酸基含有糖化合物。
〔５〕  前記Ｘ１が、下記式（３）
【化２０】
2006347909.tif 000004
で表される２価の基である、〔４〕に記載の硫酸基含有糖化合物。
〔６〕  前記Ｘ２が、-CnH2n- (n = 2-6)である、〔４〕または〔５〕に記載の硫酸基含有糖化合物。
〔７〕  Ｙが、ジスルフィド基である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の硫酸基含有糖化合物。
〔８〕  下記式（４）
【化２１】
2006347909.tif 000005
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す〕で表される、〔１〕に記載の硫酸基含有糖化合物。
〔９〕  下記式（５）
【化２２】
2006347909.tif 000006
〔式中、Ｒ１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す〕で表される、〔１〕に記載の硫酸基含有糖化合物。
〔１０〕  下記一般式（６）または（７）
【化２３】
2006347909.tif 000007
【化２４】
2006347909.tif 000008
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属基板表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ。
〔１１〕  下記一般式（６）または（７）
【化２５】
2006347909.tif 000009
【化２６】
2006347909.tif 000010
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子。
〔１２〕  〔１１〕に記載の前記微粒子が、溶液中にコロイドで存在している、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬。
〔１３〕  下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１） 試験体を、〔１０〕に記載のセンサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２） 基板に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
〔１４〕  下記の工程からなる、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出方法：
（１） 試験体を、〔１２〕に記載の試薬に添加して、前記微粒子と接触させる工程、
（２） 前記微粒子に結合したサーズウイルスのスパイク蛋白質またはサーズウイルスを検出する工程。
〔１５〕  下記一般式（６）または（７）
【化２７】
2006347909.tif 000011
【化２８】
2006347909.tif 000012
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物を含有する、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質吸着材。
〔１６〕  下記一般式（６）または（７）
【化２９】
2006347909.tif 000013
【化３０】
2006347909.tif 000014
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属基板表面に固定されている、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用センサーチップ。
〔１７〕  下記一般式（６）または（７）
【化３１】
2006347909.tif 000015
【化３２】
2006347909.tif 000016
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子。
〔１８〕  〔１７〕に記載の前記微粒子が、溶液中にコロイドで存在している、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用試薬。
〔１９〕  下記の工程からなる、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出方法：
（１） 試験体を、〔１６〕に記載のセンサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２）基板に結合したインフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスを検出する工程。
〔２０〕  下記の工程からなる、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出方法：
（１）試験体を、〔１８〕に記載の試薬に添加して、前記微粒子と接触させる工程、
（２） 前記微粒子に結合したインフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスを検出する工程。
〔２１〕  下記一般式（６）または（７）
【化３３】
2006347909.tif 000017
【化３４】
2006347909.tif 000018
〔式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示し；
Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味し、前記置換基は下記Ａ群から選ばれるいずれかの基である：
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基〕で表される硫酸基含有糖化合物を含有する、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン吸着材。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、硫酸基含有糖化合物、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質およびインフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンのセンサーチップ、検出試薬、検出方法、吸着材について具体的に説明する。
【００１５】
＜硫酸基含有糖化合物＞
本発明のサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンの検出、吸着に好ましく用いることのできる硫酸基含有糖化合物は、下記一般式（６）または（７）で表される。
【化３５】
2006347909.tif 000019
【化３６】
2006347909.tif 000020
【００１６】
式中、Ｒ１は、−ＯＨ、または、−ＮＨＣＯＣＨ３を示す。これらのうちでは、−ＮＨＣＯＣＨ３が好ましい。−ＮＨＣＯＣＨ３の場合、−ＯＨよりも、サーズウイルスとの結合、より具体的にはサーズウイルス表面に存在するスパイクタンパク質との結合が強い。
また、−ＮＨＣＯＣＨ３の場合、−ＯＨよりも、インフルエンザウイルスとの結合、より具体的にはインフルエンザウイルス表面に存在するヘマグルチニンとの結合が強い。
【００１７】
ここで、スパイク蛋白質とは、コロナウイルスに特徴的で、このスパイク蛋白質はサーズウイルス（サーズウイルスは、コロナウイルスに属する）の膜表面に存在する突起状の蛋白質である。これは、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットから構成される（Clinical Immunology, 113, 145-150 (2004))。また、ホスト細胞に感染する（結合する）ために必要な蛋白質である。感染機構の詳細は、Trends in Microbiology, 12, 466-472 (2004)に掲載されている。なお、これまでホスト細胞上の糖鎖に結合するという事実はない。
【００１８】
また、ヘマグルチニンは、インフルエンザウィルス表面に存在する蛋白質で３量体を形成している。このヘマグルチニンも、ウィルス表面に突起状に存在しており、ホスト細胞に存在する糖鎖に結合して感染がはじまる（たとえば、文献（Taubenberger JK, Reid AH, Fanning TG. "Capturing a killer flu virus", Scientific American.,292(1):48-57 (2005).））。
【００１９】
前記式（６）、（７）中、硫酸基が導入された単糖部分（式（６））、二糖部分（式（７））が、サーズウイルスのスパイクタンパク質と特異的に結合する。
また、前記式（６）、（７）中、硫酸基が導入された単糖部分（式（６））、二糖部分（式（７））が、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンと特異的に結合する。
【００２０】
前記−ＳＯ3Ｍは、−ＳＯ3Ｈ、または生理的に許容される塩である。生理的に許容される塩の場合、その塩の形態は特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。
【００２１】
無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などがあげられる。
【００２２】
無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、トリメチルアミン塩、ピリジニウム塩などがあげられ、これらのうち、さらに好ましくはトリメチルアミン塩、ピリジニウム塩である。
【００２３】
酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。
【００２４】
式中、Ｘ３は、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ２〜10アルケニル基、置換基を有していてもよいＣ２〜20アルキニル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基を意味する。
前記置換基は下記Ａ群から選択することができる。
Ａ群：
ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基；
−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ（式中、Ｘ2は、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−で表されるアルキレン基、または下記Ｂ群から選ばれる置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０の２価の芳香族基を示す。）；
−ＮＨ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ；
−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙ；
（Ａ群中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙはチオール基またはジスルフィド基を有する基を示す。）
Ｂ群：ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜６アルコキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アミノ基、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、ニトロ基。
【００２５】
「Ｃ２〜２０アルキル基」とは、炭素原子数２〜２０のアルキル基であり、直鎖状、分岐状アルキル基のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキル基である。炭素原子数は、好ましくは４〜２０、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１３〜１８である。
【００２６】
「Ｃ２〜２０アルケニル基」とは、炭素原子数２〜２０のアルケニル基であり、直鎖状、分岐状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルケニル基である。炭素原子数は、好ましくは４〜２０、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１３〜１８である。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。複数の不飽和結合を含む場合には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−のような配置を含んでいてもよい。
【００２７】
「Ｃ２〜２０アルキニル基」とは、炭素原子数２〜２０のアルキニル基であり、直鎖状、分岐状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキニル基である。炭素原子数は、好ましくは４〜２０、より好ましくは１０〜２０、特に好ましくは１３〜１８である。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。
【００２８】
「Ｃ６〜10アリール基」とは、炭素数６〜１０の芳香族性の炭化水素環式基をいい、具体的には例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基などが挙げられる。
【００２９】
「Ｃ１〜２０アルキルカルボニルオキシプロピル基」とは、Ｃ１〜２０アルキル基−ＣＯ−Ｏ−Ｃ3Ｈ6−で表される基であり、Ｃ１〜２０アルキル基は直鎖状、分岐状アルキル基のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキル基である。
【００３０】
「Ｃ2〜２１アルキルオキシプロピル基」とは、Ｃ２〜２１アルキル基−Ｏ−Ｃ3Ｈ6−で表される基であり、Ｃ２〜２１アルキル基は直鎖状、分岐状アルキル基のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状アルキル基である。
【００３１】
「Ｃ２〜２０アルケニルカルボニルオキシプロピル基」とは、Ｃ２〜２０アルケニル基−ＣＯ−Ｏ−Ｃ3Ｈ6−で表される基であり、Ｃ２〜２０アルケニル基は直鎖状、分岐状のいずれでもよい。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。複数の不飽和結合を含む場合には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−のような配置を含んでいてもよい。
【００３２】
「Ｃ2〜２１アルケニルオキシプロピル基」とは、Ｃ２〜２１アルケニル基−Ｏ−Ｃ3Ｈ6−で表される基であり、Ｃ２〜２１アルケニル基は直鎖状、分岐状のいずれでもよい。不飽和結合は１つまたは２以上含んでいてもよい。複数の不飽和結合を含む場合には、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−のような配置を含んでいてもよい。
【００３３】
「置換基を有していてもよい」とは、置換可能な部位に、任意に組み合わせて１または複数個の置換基を有してもよいことを意味する。
【００３４】
これらＸ3のうち、好ましくは、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基、置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基である。
【００３５】
これらにおいて、置換基としては、好ましくは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙ、または−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙである。
【００３６】
このうち、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルキル基、置換基を有していてもよいＣ６〜10アリール基が置換基を有する場合その置換基としては、前記−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙで表される基が好ましい。
【００３７】
置換基を有していてもよいＣ1〜20アルキルカルボニルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜21アルキルオキシプロピル基、置換基を有していてもよいＣ2〜20アルケニルカルボニルオキシプロピル基、または置換基を有していてもよいＣ2〜21アルケニルオキシプロピル基が置換基を有する場合その置換基としては、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｘ2Ｙ、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙまたは−Ｏ−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙが好ましい。
【００３８】
式（６）、（７）においてＸ3としては、より具体的には、たとえば下記式（８）〜（１２）で表される基がより好ましい。
【化３７】
2006347909.tif 000021
【００３９】
式（８）〜（１２）中、ｎは好ましくは２〜２０の整数を示し、より好ましくは２〜１０、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは３〜５である。前記ｐは、好ましくは１〜１７の整数を示し、より好ましくは７〜１７、さらに好ましくは１０〜１５である。ｑは、好ましくは１〜２０の整数を示し、より好ましくは１０〜２０、さらに好ましくは１３〜１８である。
【００４０】
このような式（８）〜（１２）で表されるような、リンカー部位（−ＣＯＣnＨ2nYまたは−ＣＨ2ＣnＨ2nY）と側鎖部位（−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣpＨ2pＣＨ3、−ＣＨ2Ｏ（ＣＯ）ＣqＨ2qＣＨ3または−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣqＨ2qＣＨ3）とを有すると、硫酸基含有化合物をセンサーに適した配向性で高密度に基板や微粒子に固定することができるとともに、硫酸基含有糖化合物を含有するバイオセンサーあるいは糖脂質含有微粒子を含有する検出試薬を用いると、極微量のサーズウイルスあるいはインフルエンザウイルスでも高感度に検出・定量できる。
【００４１】
特に、式（８）〜（１２）において、ｎが上記範囲にあると、硫酸基含有糖化合物を、基板表面あるいは微粒子表面に結合したときのセンサーの感度が向上するとともに、サーズウイルスあるいはインフルエンザウイルスとの結合に適した密度・配向性をもって基板表面または微粒子表面に効果的に結合させることができる。
【００４２】
前記式中、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示す。本明細書において「チオール基」とは−ＳＨで表される基であり、「ジスルフィド基」とは、−Ｓ−Ｓ−で表される構造を有する基である。
【００４３】
ジスルフィド基としては、好ましくは環状ジスルフィド基が挙げられ、このうち５員環のジチオラニル基、たとえば１，２−ジチオラン−３−イル基、１，２−ジチオラン−４−イル基など、６員環のジチアニル基、たとえば１，２−ジチアン−３−イル基、１，２−ジチアン−４−イル基などが挙げられる。これらのうちでは、５員環のジチオラニル基が好ましく、１，２−ジチオラン−３−イル基がより好ましい。また、チオオクト酸（リポ酸）から誘導される基を用いることもできる。
【００４４】
これらのうちでは、ジスルフィド基が好ましい。ジスルフィド基の場合、硫酸基含有糖化合物を基板表面又は微粒子表面に強固に安定に固定化することができる。特に、前記式（８）〜（１２）で表される基では、硫酸基含有糖部位、リンカー部位、および側鎖部位の立体障害が予測され、結合密度の低下、感度低下などが考えられるが、本発明のように特定のリンカーと側鎖とジスルフィド基の組み合わせにより、強固で安定な固定化が可能となり、立体障害の影響がなく高感度のセンサーとすることができる。
【００４５】
さらに、式（８）において、前記−ＣＯＣnＨ2nYの主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ１）と、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣpＨ2pＣＨ3の主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ２）とは、好ましくはＮ１：Ｎ２＝１：１．５〜１：５、さらに好ましくは１：２〜１：３の範囲にある。
また、式（９）〜（１２）において、前記−ＣＯＣnＨ2nYまたは−ＣＨ2ＣnＨ2nYの主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ１）と、前記−ＣＨ2Ｏ（ＣＯ）ＣqＨ2qＣＨ3または−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣqＨ2qＣＨ3の主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ２）とは、好ましくはＮ１：Ｎ２＝１：１．５〜１：５、さらに好ましくは１：２〜１：３の範囲にある。
【００４６】
なお、Ｎ１においては、前記−ＣＯＣnＨ2nYにおいてＹ中の硫黄原子と−ＣＯとを最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とし、Ｙがジスルフィド基の場合はそのうちの−ＣＯに近い硫黄原子側を主鎖上の原子とし、合計数Ｎ１には硫黄原子を含まない。また、Ｎ２においては、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣpＨ2pＣＨ3、−ＣＨ2Ｏ（ＣＯ）ＣqＨ2qＣＨ3または−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣqＨ2qＣＨ3において末端の−ＣＨ3と−ＣＨ（ＯＨ）または−ＣＨ2Ｏとを最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とする。
【００４７】
このような式（８）〜（１２）の側鎖部位が含まれていると、側鎖部位が存在しない場合と比較して、検出感度を格段に向上させることができる。さらに、このような炭素数あるいは原子数で側鎖部位が構成され、側鎖部位が前記リンカー部位の長さよりも大きい長さとなる場合、硫酸基含有糖化合物をより高度な配向性で基板や微粒子に固定することができるとともに、該硫酸基含有糖化合物を含有するバイオセンサーあるいは糖脂質含有微粒子を含有する検出試薬を用いると、より微量のサーズウイルスあるいはインフルエンザウイルスでも高感度に検出・定量できる。
【００４８】
このような式（８）〜（１２）で表される化合物は、細胞二重層膜の表側に多く存在するグリセロ糖脂質（親水性基として糖、脂溶性基としてグリセリド部位又はジアシルグリセロール部位を有する糖脂質）などから誘導することができ、原料入手の容易性からも好適である。
【００４９】
また、Ｘ3は、任意のポリマーに結合していてもよい。
【００５０】
前記式（６）、（７）において、Ｘ3が−Ｘ1ＮＨ−（ＣＯ）−Ｘ2Ｙで表される基（１３）の場合、具体的にはそれぞれ下記式（１）、（２）で表される硫酸基含有糖化合物が好ましい。
【化３８】
2006347909.tif 000022
【化３９】
2006347909.tif 000023
【００５１】
式中、Ｒ１は前述と同じである。糖鎖末端の、−Ｘ１−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｘ２−Ｙは、センサーチップを基板表面あるいは金属微粒子表面に固定化する部分である。
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−（ｎが２〜２０、好ましくは２〜６）で表されるアルキル基、または置換基を有していてもよい炭素原子数６〜１０、好ましくは６〜８の２価の芳香族基を示す。
【００５２】
これらのうち、Ｘ１としては芳香族基が好ましく、芳香族基としては下記式（３）
【化４０】
2006347909.tif 000024
で表される基がさらに好ましい。
【００５３】
Ｘ２としては、直鎖もしくは分岐した−ＣnＨ2n−（ｎが２〜２０、好ましくは２〜６）で表されるアルキル基が好ましく、これらのうちではさらに好ましくは直鎖であり、ｎ＝４である場合が特に好ましい。
Ｙは、−ＳＨまたはジスルフィド基を有する基を示し；
Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す。
【００５４】
このような化合物として、より具体的にはたとえば下記式（４）、（５）で表される化合物が挙げられる。
【００５５】
【化４１】
2006347909.tif 000025
【００５６】
【化４２】
2006347909.tif 000026
式中、Ｒ１は、−ＮＨＡｃまたは−ＯＨであり、Ｍは、水素原子またはその生理的に許容される塩を形成する基を示す。
【００５７】
このような本発明に係る化合物は、極めて効果的にサーズウイルス、特に、サーズウイルスのスパイク蛋白質と結合する。
また、このような本発明に係る化合物は、極めて効果的にインフルエンザウイルス、特に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと結合する。
【００５８】
硫酸基含有糖化合物の製造方法
本発明に係る硫酸基含有糖化合物の製造方法に限定はないが、たとえば、下記スキーム１および２に示すような方法により、本発明で用いる化合物の硫酸基含有糖部分を有する化合物を製造することができる。なお、還元末側の配糖体部位は、一例として、ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）基を有する糖を出発物質として示すが、配糖体部位は、これに限定されない。
＜硫酸基含有糖化合物の合成方法（１）＞
【００５９】
スキーム１
【化４３】
2006347909.tif 000027
【００６０】
市販の化合物１ａ（ｐ−ニトロフェニル  Ｎ−アセチルグルコサミニド（シグマ社等））の６位を選択的に硫酸化し（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13, 2821-2823 (2003).）化合物２ａを得ることができる。
この反応は、乾燥ＤＭＦ中、過剰量（３−６モル当量）の三酸化硫黄錯体と室温〜６０℃で反応させることができる。反応時間は、３０分〜１０日で、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【００６１】
次に、配糖体部位がｐ−ニトロフェニル基である化合物２ａをｐ−アミノフェニル基へと還元して、化合物３ａを得ることができる。
この反応は、水素気流下、パラジウム、パラジウム−活性炭、水酸化パラジウムなどの触媒の存在下で行う。パラジウムの代わりに、ギ酸アンモニウムなどを使用してもよい。
溶媒は、水、メタノール、エタノール、これらの混液を使用することができる。反応温度は、好ましくは１０−８０℃で、さらに好ましくは２０−４０℃である。圧力は、好ましくは１気圧〜１００気圧、さらに好ましくは１気圧である。反応時間は、好ましくは３０分〜３日、さらに好ましくは１時間―２４時間である。
【００６２】
次に、化合物３ａを、4-(4,6-dimethoxy-1,3,5- triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM)の存在下、リポ酸と反応させ、化合物４ａへと変換することができる。
溶媒は、エタノール、メタノール、水、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、またはこれらの混液を用いることができ、これらのうち好ましくは、エタノール、水、またはメタノールである。反応温度は、好ましくは１０℃−８０℃、さらに好ましくは２０−４０℃である。化合物３ａに対して、リポ酸は、好ましくは０．９−１０当量、さらに好ましくは０．９−２当量である。また、DMT-MMは、好ましくは０．９−１０当量、さらに好ましくは０．９−２当量である。
【００６３】
＜硫酸基含有糖化合物の合成方法（２）＞
スキーム２
【化４４】
2006347909.tif 000028
【００６４】
５ａの合成
スキーム２に示すように、市販のｐＮＰ  Ｎ−アセチルグルコサミン１ａをアクセプターに用い、ラクトース、ｐＮＰ  ラクトースなどをドナーとして共存させ、ガラクトシダーゼのような加水分解酵素を用いて、Ｎ−アセチルグルコサミンの４位にガラクトースを選択的に転位させ、化合物５ａを得ることができる。
【００６５】
該酵素反応においては、ガラクトシルトランスフェラーゼのような転位酵素を用いてもよい。この場合のドナーには、たとえば、ＵＤＰ−ガラクトースを使用することができる。この２糖の結合様式は、β１−４結合である。加水分解酵素の起源によっては、β１−３結合の２糖も合成することが可能であるが、これらも、非還元末端側にさらに硫酸基を導入すれば、サーズウイルスと結合可能であり、検出用センサーや吸着剤の開発に有効である。
【００６６】
前記酵素反応は、たとえば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、または酢酸緩衝液中、好ましくは２０−８０℃、さらに好ましくは３０−４５℃で実施できる。緩衝液のｐＨは、好ましくはｐＨ１−１０、さらに好ましくはｐＨ３−８である。反応時間は、好ましくは３０分−３０日、さらに好ましくは３時間−７日である。緩衝液に、アセトニトリル、メタノールなどの有機溶媒を加えてもよい。有機溶媒を加える割合は、好ましくは１−８０％、さらに好ましくは１０−５０％である。アクセプター（ｐＮＰ  Ｎ−アセチルグルコサミン）とドナー（ラクトース、ｐＮＰ  ラクトースなど）の割合は、好ましくは１：９９〜９９：１、さらに好ましくは１：１０程度である。なお、市販の加水分解酵素には、夾雑するＮ−アセチルヘキソサミニダーゼが混入しており、これがアクセプターを加水分解することがあるので、予め必要に応じ、フェニルセファロースなどのカラムで酵素を粗精製することが好ましい。用いる酵素のユニット数は、好ましくは０．１〜１００ユニット、さらに好ましくは０．２〜１０ユニットである。
６ａ、７ａおよび８ａの合成
公知の方法（Chem.Commun.1998,2311-2312）にしたがって、ラクトサミン２糖構造の３’位に選択的に硫酸基を導入して化合物６ａを得ることができる。具体的には、乾燥トルエンまたは、ベンゼン中で、５ａおよび酸化ジブチルスズあるいはビストリブチルスズオキシドで、還流しながら脱水し（３０分〜２４時間、好ましくは、３時間〜８時間）、スタニレンアセタール中間体を形成後、DMF中で三酸化硫黄錯体で処理して３'位に選択的に硫酸基が１つ導入された６ａへと誘導する。三酸化硫黄錯体の処理は、室温〜８０℃で、反応時間は、５分〜５日で好ましくは、１０分〜２４時間である。
次に、スキーム１と同様の方法により、配糖体部位がｐ−ニトロフェニル基である化合物６ａをｐ−アミノフェニル基へと還元して、化合物７ａを得ることができる。
さらに、化合物７ａを、4-(4,6-dimethoxy-1,3,5- triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM)の存在下、リポ酸と反応させ、化合物８ａへと変換することができる。
【００６７】
＜配糖体部位の変換方法：式（８）の配糖体部位を有する化合物の合成＞
式（８）の配糖体部位を有する硫酸基含有糖化合物は、下記スキーム３に示すように、出発原料として天然に由来するスフィンゴ糖脂質を用いる方法が挙げられる。
【００６８】
スキーム３
【化４５】
2006347909.tif 000029
【００６９】
スフィンゴ糖脂質（１ｂ）（式中、ＧNは糖鎖部位を示し、たとえば、グルコース単位であり、Ｒ3’は−Ｃ10〜18Ｈ20〜30−ＣＨ3であり、Ｒ’は−Ｃ10〜20Ｈ20〜40−ＣＨ3である。）は、１個以上の糖が直鎖あるいは分岐鎖で共有結合している糖鎖部位と、スフィンゴシン塩基に脂肪酸がN-アシル結合したセラミドと呼ばれる脂質を骨格としている。該スフィンゴ糖脂質は、脊椎動物、無脊椎動物、植物などに広く存在する化合物である。これらは、タカラバイオ、Sigma社などの市販品を用いることができる。
【００７０】
たとえば、該スフィンゴ糖脂質（１ｂ）を公知の方法を用いて酵素処理することにより（J. Biol. Chem.、Vol.250、P.24370、1995年）、セラミド部位にあるアミド結合を選択的に加水分解し、アミノ基をもつスフィンゴシン塩基が疎水性部となる一本鎖糖脂質である化合物（２ｂ）（リゾ体）を得ることができる。該酵素反応は、スフィンゴ糖脂質やスフィンゴミエリンに特異的作用することのできる酵素、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼ(Sphingolipid ceramide N-deacylase: SCDase, E.C. 3.5.1.69)を用いる。当該酵素はすべてのスフィンゴ糖脂質とスフィンゴミエリンに作用する。
【００７１】
前記SCDaseは、反応液のpHや界面活性剤濃度により、加水分解以外に、縮合反応と脂肪酸交換反応も効率よく触媒することができる（J. Lipid Res.、Vol.38、P.1923、1997年）。
【００７２】
前記酵素による加水分解反応は、スフィンゴ糖脂質10μmolに対してSCDaseを好ましくは1〜5U添加し、好ましくはpH5.5〜6.5の酢酸緩衝液中で、界面活性剤としてたとえばタウロデオキシコール酸ナトリウム0.5%〜2.0%の存在下に、30〜40℃で実施することが好ましい。さらに反応液の上層部に、好ましくは反応液の１０倍量に相当する炭素数１０〜１８の炭化水素溶媒を加えることにより高い収率で化合物（２ｂ）を得ることができる。
【００７３】
次に、得られた化合物（２ｂ）のアミノ基に、金属基板または金属微粒子表面と化学的固定及び／又は物理的な吸着による固定が可能なリンカー部位となる化合物（３ｂ）を化学結合により結合させて化合物（４ｂ）を得ることができる。このような化合物としてはたとえば、ＨＯＯＣ−ＣnＨ2nＹ（３ｂ）（式中、ｎ、Ｙは前記式（８）〜（１２）中のｎ、Ｙと同意義である。）で表される、チオオクト酸、チオール基を末端に有する脂肪酸、ジスルフィド基を有する脂肪酸が挙げられる。
【００７４】
また、リンカー部位を誘導する化合物（３ｂ）は、あらかじめカルボキシル基をN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）などで活性化したものを用いてもよい。
リゾ体（２ｂ）のアミノ基と化合物（３ｂ）のカルボキシル基との反応は、溶媒中、必要に応じ脱水縮合剤の存在下に実施する。化合物（３ｂ）の使用量は、リゾ体（２ｂ）に対して、１〜３当量の範囲にあることが好ましい。
前記溶媒としては、たとえば、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトニトリル、エタノールなどの有機溶媒、水などが挙げられる。溶媒は、１種単独であるいは２種以上を混合して用いることができる。
【００７５】
脱水縮合剤を用いる場合、たとえば、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩（DMT-MM）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはWSC）などが挙げられる。また、N-メチルモルホリン（NMP）、NHS等の活性化剤を上記脱水縮合剤を併用して用いることもできる。
反応は、好ましくは０℃から４０℃の範囲の温度で、好ましくは１〜４８時間程度行う。
【００７６】
スキーム４
スキーム４に示すように、さらに側鎖部分の２重結合に、エポキシ基、水酸基を導入したり、アルデヒドに変換することにより、側鎖部分の炭素数を変換することができる。
【化４６】
2006347909.tif 000030
【００７７】
上記スキーム４において、Ｒ5は−ＣnＨ2n−Ｙである。Ｒ4は、−ＣpＨ2p−ＣＨ3で表される基である。Ｒ4’は、Ｒ4と異なる−ＣpＨ2p−ＣＨ3で表される基である。
ＧN、ｎ、ｐは、前記と同義である。
【００７８】
オレフィン部分にエポキシ基を導入するには、アルカリ性過酸化水素（Ｐｒｉｌｅｚｈａｅｖエポキシ化反応）、m-クロロ過安息香酸(m-chloro perbenzoic acid；MCPBA酸化)、Ti(O-i-Pr)4と酒石酸ジエチルメタノールの存在下tert-ブチルヒドロペルオキシド（香月−Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ不斉酸化）などを用いて行うことができる。
【００７９】
オレフィンに水酸基を導入するには、カンファースルホン酸(CSA)やｐ−トルエンスルホン酸(pTsOH)のような酸、もしくは、水酸化ナトリウム(NaOH)や水酸化カリウム(KOH)のような塩基の存在下、先のエポキシ基を開裂させ水酸基（ジオール）を導入できる。
【００８０】
また、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaBH3CN）により、還元的に開裂させてもよい。あるいは、オレフィンにBH3を作用させ、その後、過酸化水素水で処理して、モノオール（モノアルコール）に変換できる（ヒドロボレーション）。
【００８１】
さらに、オレフィンをオゾン気流下でオゾン酸化すると、アルデヒドが得られる。エポキシ基を開裂させて得られる水酸基（ジオール）を、過ヨウ素酸酸化して同様の誘導体を得ることもできる（但し、糖水酸基は、例えば、アセチル基などのアシル系保護基で保護しておく必要がある）。
【００８２】
得られるアルデヒドは、その後、Wittig反応により、任意の長さの炭化水素を有するリンイリドと反応させて、式（８）中の側鎖の長さを任意に変換することができる。
【００８３】
このようにして得られる式（８）の側鎖を有する化合物４ｂ等は、たとえばグルコース単位を有しているが、たとえば、スキーム１で示したのと同様の方法により、グルコース単位を硫酸基含有糖単位に変換することができる。
【００８４】
＜配糖体部位の変換方法：式（９）〜（１２）の配糖体部位を有する化合物の合成＞
スキーム５
さらにスキーム５に示すような、出発原料として天然に由来するグリセロ糖脂質を用いる方法により、式（９）〜（１２）の配糖体部位を有する硫酸基含有糖化合物を合成することができる。
【化４７】
2006347909.tif 000031
【００８５】
式中、ＧNは糖鎖部位であり、たとえば、グルコース単位である。Ｒ6、Ｒ7は、互いに独立に−ＣrＨ2r−ＣＨ3（式中、ｒは、１〜２０の整数を示す。）である。これらは、Sigma社などの市販品を用いることができる。
【００８６】
化合物６ｂは、化合物５ｂのアシル基部分を通常の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ナトリウムメチラート、水酸化リチウムなどで処理して、脱アシル化を行うことにより得ることができる。
また、アシル部分の２位に選択的に作用するリパーゼを使用すると、化合物６ｃへと変換できる。同様に、1,3−特異的リパーゼを作用させると、化合物６ｄに変換できる。これらの反応は、緩衝液中で行うことが好ましい。
【００８７】
次に、ＨＯＯＣ−ＣnＨ2nＹ(7ｂ)、またはこのビニールエステル、トリクロロアセチルのエステル（活性エステル）体を用い、有機溶媒（エーテル、クロロホルム、トルエン、塩化メチレン、アセトニトリル、ＴＨＦ、ＤＭＦなど）中で、リパーゼを作用させると、エステル交換反応が生じ、対応する化合物８ｂ〜８ｄを得ることができる。
【００８８】
なお、以上の反応は、特に糖中の水酸基を保護しなくてもよい。また、必要に応じ、糖の６位を、シリル系保護基（ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基）、トリチル基のようなエーテル系保護基、４位と６位をイソプロピリデン基やベンジリデン基のようなアセタール系保護基、あるいは、レブリロイル基などで選択的に保護してもよい。
【００８９】
シリル系保護基は、酢酸の共存下、テトラブチルアンモニウムフルオリドで、トリチル基は、CSAやp-TsOHあるいは、接触水添により除去できる。アセタール系保護基も、酸処理で除去できる。側鎖に飽和炭化水素基を含む場合には、ベンジリデン基は、接触水添によっても脱保護が可能である。レブリロイル基は、ヒドラジン−酢酸で選択的に除去できる。これらの脱保護の条件はいずれも、グリセロール部位のアシル基に何ら影響を及ぼすことなく、除去できる。
【００９０】
さらに側鎖部分のＲ6が、二重結合などを有するときには、前記と同様にして別の置換基を導入できる。
【００９１】
このようにして得られる化合物は、たとえばスキーム１、２で示したのと同様の方法により、グルコース単位を硫酸基含有糖単位に変換する。
【００９２】
＜サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用センサーチップ＞
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用センサーチップ、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用センサーチップは、前記硫酸基含有糖化合物が金属基板表面に固定されている。
【００９３】
金属基板の素材としては、たとえば、好ましくは金、銀、白金、銅、パラジウムなどが挙げられ、これらのうちさらに好ましくは金または白金、特に好ましくは金が挙げられる。基板の形状は限定されず、板状、管状、球状などの形状が挙げられる。このうち板状の形状を有する基板を好ましく用いることができる。
【００９４】
金属基板への固定化は、好ましくは、金属表面と、チオール基（-SH）あるいはジスルフィド基（-S-S-）との直接的な共有結合や吸着により行うことができる。
したがって、この場合、硫酸基含有糖化合物のうち、配糖体の末端に、−ＳＨまたはジスルフィド基を末端に有する化合物が好ましい。すなわち前記式（１）、（２）、あるいは式（６）、（７）においてＸ3が式（８）〜（１２）で表される化合物を用いることが好ましい。
【００９５】
前記式（６）、（７）において、Ｘ3が式（８）〜（１２）で表される基である場合、側鎖部位の自己組織化による相乗効果により、より高度な配向性と高密度な固定が可能となる。さらに、この自己組織化は、スフィンゴシン塩基のような天然由来の側鎖を有することが望ましい。これは、センサーチップなどの基板表面が、細胞膜の表面状態に近似した状態にあるためではないかと推測される。
【００９６】
基板との結合は、自己組織化単分子膜(SAM：Self-Assembled Monolayer)法などを用いて行うことができる。すなわち、チオール基あるいはジスルフィド基を有する化合物が、金などと特異的に吸着し、アルキル鎖間のvan der Waals 力によりＳＡＭを形成させる方法である。
硫酸基含有糖化合物が−ＳＨまたはジスルフィド基を末端に有する場合、硫酸基含有糖化合物による金属基板表面への単分子膜の構築は、特殊な装置を必要とせず、これら誘導体の溶液中に基板を浸漬するだけで容易に実施できる。浸漬条件（溶媒、濃度、温度、時間）によって構造、配向の制御も可能である。ここで用いられる溶媒は特に限定されるものではないが、固定化させる誘導体が溶解する有機溶媒であることが好ましい。
【００９７】
通常、金属基板表面における硫酸基含有糖化合物の結合割合は、好ましくは0.1〜10個／nm2、さらに好ましくは1〜10個／nm2の範囲である。このような結合割合であると、優れた検出感度を発揮することができる。
特に、式（８）〜（１２）において、側鎖部位が前記リンカー部位よりも長くなると、側鎖部位がリンカー部位の長さに応じて折り畳み構造をとり、折りたたまれた側鎖部位によって、硫酸基含有糖化合物同士がサーズウイルスあるいはインフルエンザウイルスとの結合に適した配向性をもって基板表面や微粒子表面に効果的に結合するためではないかと推測される。それにより、上記のような好ましい結合割合が達成されたものと推測される。
【００９８】
＜サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法（１）、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンの検出方法（１）＞
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法は、下記の工程からなる。
（１）試験化合物を、前記センサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２）基板に結合したサーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスを検出する工程。
【００９９】
本発明に係るインフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出方法は、下記の工程からなる。
（１）試験化合物を、前記センサーチップの基板表面に接触させる工程、
（２）基板に結合したインフルエンザのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスを検出する工程。
【０１００】
前記硫酸基含有糖化合物を金属基板に固定化したセンサーチップと、試験化合物との接触は通常、溶媒の存在下で行うことが好ましい。前記センサーチップを用いるウイルスの検出においては、これらが変性しない溶媒を選択することが必要であり、たとえば水または緩衝液などを用いる。
溶媒のｐHは、好ましくは６〜８の範囲であり、温度は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲である。
【０１０１】
緩衝液は、たとえば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）などが挙げられる。
【０１０２】
以下に、本発明に係るセンサーチップのうち、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：SPR）による、ウイルスの検出方法の一例を示す。ＳＰＲによる検出方法では、標識物質を用いることなく試験化合物（アナライト、分析対象化合物ともいう）の変化を検出することができる。このＳＰＲの現象は、表面プラズモンが金属／液体界面で励起した場合に起こる光学現象を利用するもので、センサーチップ表面で生じる微少なプラズモン共鳴角（ＳＰＲシグナル）を検出して、たとえば、金属表面に固定化した物質と検体との間の二分子間結合および解離の変化を定量的に得ることができる。
【０１０３】
ウイルスの検出は、温度を好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲で一定に保持し、好ましくはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液で行う。
【０１０４】
これに試験化合物の溶液をゆっくりと注入する。アフィニティー定数を求める場合には、試験化合物の濃度を変化させ、２〜８回の測定をすることが望ましい。反応時間は結合・解離反応ともに３〜３０分程度が好ましいが、目的の相互作用によっては測定時間を変更する場合がある。
【０１０５】
また、緩衝液の流速は好ましくは３〜５０μｌ/minで、検体量はnM〜mMを1回の測定につき５〜１０００μｌ程度にするのが好ましい。アフィニティー定数は２〜８点の測定濃度をとり、各濃度のセンサーグラムにおいて、平衡状態よりスキャッチャードプロットを作成してアフィニティー定数（KdおよびKa）を算定する。
【０１０６】
このような、本発明のセンサーチップを用いる、表面プラズモン共鳴バイオセンサーは極微量（＜0.01nM）のサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質、あるいはインフルエンザのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスでも、前処理あるいは標識物質を用いないで、高感度に検出できることができる。
すなわちセンサーチップとサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質との結合速度定数（Ka）および解離定数（KD）は、前記式（１）で表される硫酸基含有糖化合物においてそれぞれ、高い値および小さい（低い）値を示す。また、センサーチップとインフルエンザのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスとの結合速度定数（Ka）および解離定数（KD）は、前記式（１）で表される硫酸基含有糖化合物においてそれぞれ、高い値および小さい（低い）値を示す。
【０１０７】
前記式（６）、（７）において、Ｘ3が式（８）〜（１２）で表される基である場合、さらに高い値を示す。このような効果はスフィンゴシン塩基などの側鎖部位の自己組織化機能により、高度な配向性と高密度な固定化が行われ、複数の近接する糖鎖部位が効率よくセンサーチップとサーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質、あるいはヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスを強く結合させるためである。
【０１０８】
＜サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子、検出試薬＞
＜インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子、検出試薬＞
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子は、前記硫酸基含有糖化合物が、金属微粒子表面に固定されている微粒子である。
【０１０９】
金属微粒子の素材としては、好ましくは金、銀、白金、銅、パラジウムなどが挙げられ、これらのうちより好ましくは金または白金、特に好ましくは金である。
【０１１０】
このような金属微粒子は、平均粒子径が、好ましくは１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは１〜５０ｎｍの範囲にある。また、金属微粒子は、単分散な粒子径であることが好ましい。この範囲の金属微粒子を用いることで、視覚的に検出可能なシグナル色（オレンジ〜赤）が得られ、かつ溶媒中における分散安定性が良好になり、高感度で検出時間の短縮が図ることができる。
【０１１１】
本発明で用いる金属微粒子は、公知の方法により製造することができる。たとえば、金微粒子は、Frensの方法を用いることにより、種々の大きさの微粒子を容易に製造することができる（Nature Phys. Sci.、Vol.241、P.20、1973年）。
【０１１２】
具体的には、たとえば金微粒子の製造方法としては、塩化金の溶液を加熱沸騰させ、ついで、クエン酸ナトリウムの溶液と混合して塩化金を還元する方法により行うことができる。上記二つの溶液を混合するとすぐに沸騰溶液は薄い青色に変色して核生成が開始される。ついで、すぐに青色から赤色に変わって単一分散微粒子の生成が起こり、塩化金の還元は沸騰をさらに続けることで完了する。
得られる微粒子の粒子径は、クエン酸ナトリウム溶液の濃度を変化させることにより調整することができる。このような金微粒子は溶液中に分散して存在できることが好ましく、その状態は特に限定されないが、金微粒子が安定な分散状態で存在していることが好ましい。例えば、コロイド状態（分散コロイド状態）となることがより好ましい。
【０１１３】
金属微粒子に、硫酸基含有糖化合物を固定化する方法としては、抗原−抗体反応等に代表される免疫反応に係る物質の固定方法（例えばJ. Histochem. Cytochem.,Vol.30、P.691、1982年）、前記センサーチップに硫酸基含有糖化合物を固定化した方法を応用することが可能である。すなわち、金属微粒子を分散させた溶液と該硫酸基含有糖化合物の溶液を5分以上混合する。この時、金属微粒子に対して十分量の硫酸基含有糖化合物が固定されれば、金属コロイドは安定に分散され、ウイルス検出用微粒子を得ることができる。ここで、金属微粒子表面における硫酸基含有糖化合物の結合割合は、溶液中の硫酸基含有糖化合物の濃度やその他条件（例えば、溶媒、温度、時間など）でコントロールすることができる。
【０１１４】
通常、金属微粒子表面における硫酸基含有糖化合物の結合割合は、好ましくは0.1〜10個／nm2、さらに好ましくは1〜10個／nm2の範囲である。このような結合割合であると、優れた検出感度を発揮することができる。
特に、式（８）〜（１２）の前記硫酸基含有糖化合物においては、特定の原子数で側鎖部位、リンカー部位が構成される。この場合、特に、側鎖部位が前記リンカー部位よりも長い場合、側鎖部位がリンカー部位の長さに応じて折り畳み構造をとり、折りたたまれた側鎖部位によって、硫酸基含有糖化合物同士がサーズウイルスあるいはインフルエンザウイルスとの結合に適した配向性をもって基板表面や微粒子表面に効果的に結合するためではないかと推測される。それにより、上記のような好ましい結合割合が達成されたものと推測される。
このような本発明の微粒子は、溶液形態で保存することが、該微粒子の保存安定性の観点から好ましい。
この場合、前記式（８）〜（１２）で表される硫酸基含有糖化合物が結合した微粒子は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙまたは−ＣＨ2−ＣnＨ2n−Ｙで表されるリンカー部位において、ｎが好ましくは２〜１０の整数、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは３〜５であるとおり、リンカー部位の長さが特定範囲以内にあるため、溶液中での分散安定性に極めて優れている。したがって、本発明の硫酸基含有糖化合物が結合した微粒子を含む試薬は、特に溶液中での使用に優れる。
【０１１５】
前記硫酸基含有糖化合物の金属微粒子への固定化においては、硫酸基含有糖化合物の高度な配向性と高密度な固定を目的にしていることから、必要十分量の硫酸基含有糖化合物を混合して固定化を図ることが好ましいが、過剰量の硫酸基含有糖化合物を混合すると、混合溶液中からの除去作業が必要となる。
【０１１６】
たとえば、金微粒子の場合、硫酸基含有糖化合物を固定化した金微粒子の分散溶液の分散安定性、および試験化合物の添加量と色調変化の関係から、硫酸基含有糖化合物の最適な混合量を決定することができる。
すなわち、添加した化合物が最適量以下の場合、硫酸基含有糖化合物を自己組織化するための十分な量に達しないため、金微粒子表面の疎水性が増加して分散安定性の低下し、色調の変化および凝集−沈殿を生じる。
また、添加した化合物が最適量以上の場合、試験化合物を添加した後、凝集反応が過剰に添加した化合物によって阻害され、色調変化が小さくなる。したがって、色調変化や凝集が発生せず、かつ試験化合物を添加したときに色調変化が大きい範囲内に制御することにより、最適な固定化を行うことができる。
【０１１７】
＜サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用試薬＞
前記金属微粒子への硫酸基含有糖化合物の固定化により、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子を得ることができるが、該微粒子を含む溶液は、そのまま本発明のサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用試薬、あるいは、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用試薬として使用することができる。
このため、前記固定化に使用する溶媒は、検出対象となる試験化合物が変性しないことが必要であり、たとえば水または緩衝液などを用いる。
溶媒のｐHは、好ましくは６〜８の範囲であり、温度は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲である。
【０１１８】
緩衝液は、たとえば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）などが挙げられる。
【０１１９】
このようにして、検出用微粒子の合成に伴って、該検出用微粒子を溶媒中に含有するサーズウイルス検出用試薬あるいはインフルエンザウイルス検出用試薬が得られることとなる。このような検出用試薬においては、溶液中に微粒子がコロイドになって存在していることが好ましく、該コロイドは分散して存在していることがより好ましい。
【０１２０】
微粒子の金属コロイドが安定化されたかの確認は、たとえば、金コロイドの場合、混合溶液に等量の１０％塩化ナトリウム水溶液を加えて、金コロイドの色調に変化がなければ安定化されていると認定することができる。
検出用試薬中の検出用微粒子の濃度は、好ましくは１．０×１０5〜１．０×１０15個／Ｌ、さらに好ましくは１．０×１０7〜１．０×１０13個／Ｌの範囲である。
このような濃度範囲であると、検出用微粒子のコロイドが分散して安定に存在し、保存安定性を向上させることができるとともに、サーズウイルスまたはそのスパイクタンパク質、あるいはヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスの検出感度を向上させることができる。
【０１２１】
＜サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法（２）、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンの検出方法（２）＞
本発明に係るサーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質の検出方法は下記の工程からなる。
（１）試験化合物を、前記サーズウイルス検出用試薬に添加して、サーズウイルス検出用微粒子に接触させる工程、
（２）サーズウイルス検出用微粒子に結合したサーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスを検出する工程。
【０１２２】
本発明に係るインフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンの検出方法は下記の工程からなる。
（１）試験化合物を、前記インフルエンザウイルス検出用試薬に添加して、インフルエンザウイルス検出用微粒子に接触させる工程、
（２）インフルエンザウイルス検出用微粒子に結合したヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスを検出する工程。
【０１２３】
サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子に結合した、サーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスの検出手段としては、たとえば、サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質検出用微粒子のコロイド溶液において、該微粒子がサーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスと結合する際の色調変化から該サーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスの検出を行う方法が挙げられる。
具体的には、たとえば、金微粒子の場合、サーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスがサーズウイルス検出用微粒子と結合していない状態において、前記微粒子のコロイド粒子が分散した状態で溶液は赤色を示すが、サーズウイルスのスパイクタンパク質またはサーズウイルスが結合すると前記微粒子が凝集して赤色が薄れるあるいは無色透明に変化する、または、凝集体（沈殿物）が生じる。
【０１２４】
同様に、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子に結合した、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスの検出手段としては、たとえば、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子のコロイド溶液において、該微粒子がインフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスと結合する際の色調変化から該インフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスの検出を行う方法が挙げられる。
具体的には、たとえば、金微粒子の場合インフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスが、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン検出用微粒子と結合していない状態において、前記微粒子のコロイド粒子が分散した状態で溶液は赤色を示すが、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンまたはインフルエンザウイルスが結合すると前記微粒子が凝集して赤色が薄れるあるいは無色透明に変化する、または、凝集体（沈殿物）が生じる。
【０１２５】
色調変化の計測手法としては、目視により観測し、その結果に基づいて測定対象物質の存在を簡便に半定量することができる。
【０１２６】
また、色調変化を分光光度計により高感度検出することも可能である。その場合、色調変化を測定するための波長としては、色調変化を測定可能な波長であれば、特に限定されないが、たとえば、金微粒子の場合、金微粒子の極大吸収波長付近500〜550nm付近が測定感度を高くすることができるので望ましい。多波長による吸光度測定を行うことで、精度の高い検出が可能であることは言うまでもない。
色調変化の測定を行える装置としては、比色計、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析機等が挙げられる。
【０１２７】
このような色調変化を計測することにより、高感度に対象化合物を検出することができる。
【０１２８】
＜サーズウイルスまたはサーズスパイク蛋白質吸着材、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニン吸着材＞
前記硫酸基含有糖化合物は、硫酸化された単糖部分または二糖部分が、サーズウイルスのスパイクタンパク質と特異的に結合するので、サーズウイルスの吸着材として用いることができる。
また、前記硫酸基含有糖化合物は、硫酸化された単糖部分または二糖部分が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと特異的に結合するので、インフルエンザウイルスの吸着材として用いることができる。
【０１２９】
吸着材としては、不織布、織布などのシート状のもの、溶液に含有させて噴霧した噴霧状のものが挙げられる。
【０１３０】
たとえば、生理食塩水等の水溶液中に前記硫酸基含有糖化合物を含有する溶液を、うがい薬やエアロゾール状のスプレー液として使用すれば、感染予防効果も高く、院内感染予防試薬として用いることもできる。
【０１３１】
また、硫酸基含有糖化合物を含む溶液を不織布、あるいは織布などに膨潤させ、水分を乾燥させることにより、ウイルスを除去する吸着シートを得ることもできる。
たとえば、サーズウイルスの感染を防止するには、不織布のマスク、例えば、米国国立労働安全衛生研究所で認可したＮ９５マスク（住友３Ｍ、米国）が知られているが、息苦しいのが難点である。そこで、硫酸基含有糖化合物を通常のマスクなどに吸着させることにより、息苦しさを感じず、サーズウイルスをトラップすることもできる。また、エアコン用フィルター、空気清浄機のフィルターなどに、硫酸基含有糖化合物を吸着させることにより、サーズウイルスの除去も可能である。
【０１３２】
なお、前述のとおり、サーズウイルスまたはインフルエンザウイルスに対し、本発明に係る糖鎖構造をそれぞれの存在可能性の高い環境中で用いることにより、選択的にサーズウイルスまたはインフルエンザウイルスを検出あるいは吸着することができる。
【実施例】
【０１３３】
以下に、本発明の実施例を挙げ、具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
なお、下記の実施例においては、サーズスパイクタンパク質およびインフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニンは、Protein Sciences Corporation社 (Connecticut, Meriden)より購入した。インフルエンザウイルスは、コスモバイオ社から購入した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置、および、センサーチップは、BIAcore 3000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)を使用した。1H-NMRは、JEOL LA-600 spectrometerを用いて重水中で測定した。酵素は、Sigma社、または、Glycoscience社のものを使用した。
〔実施例１〕
【化４８】
2006347909.tif 000032
【０１３４】
（１） 化合物４ａ（６ＳＧＮ）の合成
400ｍｇ（1.7 mmol）の化合物１ａ（ｐ−ニトロフェニル  Ｎ−アセチルグルコサミニド（シグマ社等））を、40℃の条件下、三酸化硫黄トリメチルアミンコンプレックスを用いて、６位を選択的に硫酸化した（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13, 2821-2823 (2003).）。その結果、化合物２ａを280mg（収率５４％）得た。
【０１３５】
次に、水中、化合物２ａを４４ｍｇ（０．１mmol）、触媒としてＰｄ／Ｃ（Sigma社製）を２mg用い、水素の存在下、室温で、３時間反応させた。触媒をセライトでろ過して、化合物３ａを２９mg（収率７２％）得た。
【０１３６】
次に、化合物３ａを、4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM)  の４．５ｍｇの存在下、リポ酸２mg（９６mmol）とを、ＤＭＦ中、２５℃で１４時間反応させ、化合物４ａを３．２mg（収率５１％）得た。
【０１３７】
化合物４ａ： 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 7.317 (d, J = 9.6 Hz, 2H, o-Ph), 7.033 (d, J = 9.6 Hz, 2H, m-Ph), 5.086 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H-1), and 1.996 (s, 3H, NHAc).
【０１３８】
〔実施例２〕
【化４９】
2006347909.tif 000033
【０１３９】
（３）化合物８ａ（３ＳＬＮ）の合成：  
加水分解酵素としてBacillus circulans由来のβ-galactosidase (Sigma社)を用いた。通常、加水分解酵素β-galactosidaseには、夾雑酵素としてβ-N-acetylhexosaminidase (以下、NAHaseという)が含まれており、この夾雑酵素が基質のアクセプターであるｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン  １ａ（以下、GlcNAcβ-pNPという）を加水分解する可能性があるので、あらかじめ精製して夾雑酵素を除く必要がある。Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences社）を用い、NAHase活性を除去した。
【０１４０】
次に、GlcNAcβ-pNP (1.0 g、１ａ) および lactose (4.0 g)を、５０％のアセトニトリルを含むsodium phosphate buffer (20 mM, pH6.8) 35 mLに溶解させ、上記の精製したβ-galactosidase (3.2 U)を加えた。３０℃で反応させ、Amide-80 column（東ソー製）を用いて、HPLCによってモニタリングした。
化合物５ａが最大となる２４時間後に反応を止め、ODS−C18（メルク製）、 Toyopearl HW-40S（東ソー製）、およびBioGel P2（バイオラッド製）により精製し、化合物５ａを265 mg得た。
このシンプルで簡便な方法により、β-galactosidaseを使用して、化合物５ａを大量に合成することができた。
【０１４１】
化合物５a: 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.205 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 7.149 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.303 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H-1), 4.476 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H’-1), and 1.987 (s, 3H, NHAc).
【０１４２】
次に、５ａ（25 ｍｇ、0.05 ｍｍｏｌ）、Bu2SnO (0.013 g, 0.05mmol)とを乾燥メタノール( 200 ml), toluene (200 ml) に加え、環流(reflux)しながら、3 時間  脱水・共沸した。さらに、トルエンのみで2時間  脱水・共沸し、その後、減圧濃縮した。残さに乾燥ＤＭＦ（3ｍｌ）加え、SO3Me3N (8 mg, 0.05 mmol)を加え、４０℃で、3時間反応させ、６ａを（17 ｍｇ、60 ％）得た。
化合物６a: 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 8.233 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 7.175 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.326 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.613 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H’-1), 4.331 (dd, J=3.0 and 9.9, H-3’), and 2.003 (s, 3H, NHAc).
【０１４３】
次に、前述の化合物２ａ→化合物３ａと同様にして、水素の存在下、６ａ（17 ｍｇ、0.029ｍｍｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ  （2 ｍｇ）を水中で還元して、化合物７ａを得た（12 ｍｇ、75％）。
化合物７a: 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 6.908 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 6.768 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.314 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.621 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H’-1), and 2.013 (s, 3H, NHAc).
【０１４４】
次に、化合物７ａ（12 ｍｇ、0.022 ｍｍｏｌ）と、ＤＭＴ−ＭＭ（4.3 ｍｇ、0.016 ｍｍｏｌ）、および、リポ酸（2 ｍｇ、0.09 ｍｍｏｌ）とを乾燥ＤＭＦ（1 ｍｌ）に溶解し、２５℃で２４時間反応させた。そして、化合物８ａを（2.6ｍｇ、１６．３％）で得た。
【０１４５】
化合物８ａ： 1H NMR (600 MHz, D2O) δ 7.318 (d, J = 9.0 Hz, 2H, o-Ph), 7.040 (d, J = 9.0 Hz, 2H, m-Ph), 5.122 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-1), 4.586 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H’-1), and 1.996 (s, 3H, NHAc).
【０１４６】
〔実施例３〕
硫酸基含有糖化合物４ａが結合したセンサーチップ１の調製
シアリルコンジュゲートの固定化のための金表面として、SIA kit Au (BIAcore製)を用いた。オゾンクリーナーで洗浄したSIA kit Auプレートを、化合物４ａを含むメタノール溶液(2 mL, 60 μM)に浸した。室温下で、２４時間放置後、その金プレートを反応溶液から取り出し、メタノールおよび水で洗浄し、窒素気流下で乾燥させ、センサーチップ１を得た。
【０１４７】
〔実施例４〕
硫酸基含有糖化合物８ａが結合したセンサーチップ２の調製
実施例３で示した、表面に化合物４ａを結合したセンサーチップと同様の方法により、表面に化合物８ａを結合したセンサーチップ２を得た。
【０１４８】
〔実施例５〕
ヘマグルチニンと、化合物４ａが表面に結合したセンサーチップ１との相互作用解析
1μg/mLの濃度に希釈した４種のインフルエンザウイルス（ＨＡ：インフルエンザＡ型ウイルス, Panama； インフルエンザＡ型ウイルス New Caledonia；インフルエンザＡ型ウイルス Vietnam；インフルエンザＢ型ウイルス, Hong Kong）のヘマグルチニンを、化合物４ａを表面に結合したセンサーチップを装着したＳＰＲ装置にインジェクトした。その結果、化合物４ａと結合している表面に対して、ＨＡが結合することがわかった。
結果を図１に示す。
【０１４９】
〔実施例６〕
ヘマグルチニンと、化合物８ａが表面に結合したセンサーチップ２との相互作用解析
1μg/mLの濃度に希釈した２種のインフルエンザウイルス（ＨＡ：インフルエンザＡ型ウイルス, Panama；インフルエンザＡ型ウイルス Vietnam）のヘマグルチニンを、化合物８ａを表面に結合したセンサーチップを装着したＳＰＲ装置にインジェクトした。その結果、化合物８ａと結合している表面に対して、ＨＡが結合することがわかった。
結果を図２に示す。
【０１５０】
〔実施例７〕
インフルエンザウイルスとセンサーチップ１との相互作用解析
２種のインフルエンザウイルス(インフルエンザＡ型ウイルス, Panama/H3N2, 1.4μg/mL； インフルエンザＢ型ウイルス Victoria, 3.2μg/mL)を、化合物４ａを表面に結合したセンサーチップ１を装着したＳＰＲ装置にインジェクトした。その結果、化合物４ａと結合している表面に対して、これらのインフルエンザウイルスが結合することがわかった。
結果を図３に示す。
【０１５１】
〔実施例８〕
インフルエンザウイルスとセンサーチップ２との相互作用解析
インフルエンザウイルス(インフルエンザＡ型ウイルス, Panama/H3N2, 1.4μg/mL; インフルエンザＢ型ウイルス, Victoria, 3.2μg/mL)を、化合物８ａを表面に結合したセンサーチップ２を装着したＳＰＲ装置にインジェクトした。その結果、化合物８ａと結合している表面に対して、これらのインフルエンザウイルスが結合することがわかった。
結果を図４に示す。
【０１５２】
〔実施例９〕
サーズのスパイクタンパク質とセンサーチップ１との相互作用解析
1μg/mLのSARSスパイクタンパク質を、化合物４ａを表面に結合したセンサーチップ１を装着したＳＰＲ装置にインジェクトした。その結果、化合物４ａと結合している表面に対して、スパイクタンパク質が結合することがわかった。
結果を図５に示す。
【０１５３】
〔実施例１０〕
サーズのスパイクタンパク質とセンサーチップ２との相互作用解析
1μg/mLのSARSスパイクタンパク質を、化合物８ａを表面に結合したセンサーチップ２を装着したＳＰＲ装置にインジェクトした。その結果、化合物８ａと結合している表面に対して、スパイクタンパク質が結合することがわかった。
結果を図５に示す。
【０１５４】
〔比較例１〕
【化５０】
2006347909.tif 000034
【０１５５】
市販のp-nitrophenyl α-D-glucopyranoside（化合物９）（250mg）を水に溶解し、パラジウムブラック（10mg）を加え、１気圧、常温下で水素の存在下、還元を行った。セライトろ過して、触媒を除き、減圧濃縮して、化合物１０を225mg（99%）得た。続いて、化合物１０（225mg、0.83mmol）およびsuccinimidyl 1,2-dithiolane-3-pentanoate（300 mg、0.99mmol）を乾燥ＤＭＦ5mlに溶解し、25℃で48時間反応させた。そして、化合物１１を得た（200mg、59％）。
【０１５６】
化合物１１の1H NMR (400 MHz, CD3OD) ：δ 7.45 (d, aromatics, J = 9.0 Hz), 7.119 (d, aromatics, J = 9.0 Hz), 5.416 (d, H-1, J = 3.6 Hz), 3.829 (t, H-3, J = 9.4 Hz), 3.542 (dd, H-2, J=3.6 and 9.6 Hz), 3.404 (t, H-4, J=9.2Hz), 3.21-3.05 (m, dithiolane of lipoic acid, 2H), 2.50-2.41 (m, dithiolane of lipoic acid, 1H), 2.353 (t, -CH2-CONH-, J=7.4Hz), 1.94-1.84 (m, dithiolane of lipoic acid, 1H), 1.80-1.62 (m, -CH2-, 4H) and 1.56-1.45 (m, -CH2-, 2H).
【０１５７】
〔比較例２〕
化合物１１が結合したセンサーチップ３の調製
実施例３で示した、表面に化合物４ａを結合したセンサーチップと同様の方法により、表面に比較例１で製造した化合物１１を結合したセンサーチップ３を得た。
【０１５８】
〔比較例３〕
比較例２のセンサーチップ３に対して、インフルエンザウイルスA/H3N2/PanamaおよびB/Hong KongのヘマグルチニンをインジェクトしたときのＳＰＲを図１に示す。図１には、硫酸基含有糖化合物４ａが結合したセンサーチップ１に対する、４種類のヘマグルチニン（A/H3N2/Panama, A/H1N1/New Caledonia, A/H5N1/Vietnam, B/Hong Kong/）のＳＰＲ結果が同時に示されているが、化合物１１が結合したセンサーチップ３では、これらのヘマグルチニンは全く結合しなかった。このことは、これらのヘマグルチニンが、化合物４ａの結合したセンサーチップ１に、特異的に結合していることを示している。
【０１５９】
〔比較例４〕
比較例３と同様にして、比較例２のセンサーチップ３に対して、SARSスパイクタンパク質をインジェクトしたときのＳＰＲを図５に示す。図５には、硫酸基含有糖化合物４ａまたは８ａがそれぞれ結合したセンサーチップ１およびセンサーチップ２に対する、SARSスパイクタンパク質のＳＰＲ結果が同時に示されているが、化合物１１が結合したセンサーチップ３では、SARSスパイクタンパク質は全く結合しなかった。このことは、SARSスパイクタンパク質が、化合物４ａまたは８ａがそれぞれ結合したセンサーチップ１またはセンサーチップ２に、特異的に結合していることを示している。
【０１６０】
〔調製例１〕阻害剤、poly(p-aminophenyl α-N-acetyl neuraminic acid-(2-3)-β- D - galactopyranosyl - (1-4) - 2 - acetamido - 2 - deoxy - β- D - glucopyranosaminyl - L - glutamine-co-glutamic acidの合成およびpoly (p-aminophenylα- N-acetyl neuraminicacid- (2-6) -β- D - galactopyranosyl - (1-4) - 2 - acetamido-2-deoxy -β- D - glucopyranosaminyl - L - glutamine-co-glutamic acidの合成
上記２つの阻害剤（ポリマー）を、既知の方法(Carbohydrate Research, 312, 209-217 (1998),; Archives Biochem. Biophys., 383, 28-37 (2000).)に従って合成した。即ち、まず、Carbohydrate Research, 312, 209-217 (1998)に従い、poly(L-glutamic acid)s sodium salt (30mg, Sigma社、分子量15,000-50,000)からpoly(L-glutamic acid)sを調製した。
【０１６１】
次に、このpoly(L-glutamic acid)s (30mg)をジメチルスルフォキシド(DMSO, 0.5ml)に溶解し、これにbenzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate  (BOP、230mg)およびhydroxybenzotriazole  (HOBt、25mg)のDMSO(0.4ml)溶液を加えた。この混合物を室温下で３０分撹拌した。実施例２の化合物7aの合成と同様にして、化合物5aのp-nitrophenyl基をp-aminophenyl基に変換したp-aminophenyl β -D - galactopyranosyl - (1-4) - 2 - acetamido  - 2 - deoxy - β- D - glucopyranosaminide (pAP)  β-LacNAc)をあらかじめ用意した。
【０１６２】
このpAP β-LacNAc(80mg)をDMSO(0.4ml)に溶解し、これを先の反応液に加え７時間反応させた。反応液をSephadex G-75で精製した（溶離液：0.02Mリン酸緩衝液(pH7.4)、流速：1ml/min）。ポリマー画分を減圧濃縮して、poly(p-aminophenyl β-D-galactopyranosyl-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosaminyl-L-glutamine-co-glutamic acid)を38mg得た。
【０１６３】
次に、上記のpoly(p-aminophenyl β-D-galactopyranosyl-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosaminyl-L-glutamine-co-glutamic acid)の12mgとCMP-Neu5Ac（ヤマサ醤油製、17mg）を0.5mlのMES緩衝液（pH6.4,  50mM）に溶解した。アルカリフォスファターゼ(31U)とrecombinant α2,3-sialyltransferase(Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA) (30U)を加えた。反応液を30℃で48時間インキュベートした。反応液をSephadex G-75で精製し、poly(p-aminophenyl α-N-acetyl neuraminic acid-(2-3)-β-D-galactopyranosyl-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosaminyl-L-glutamine-co-glutamic acid)を16mg得た。以下、このポリマーをポリマー１ａ（α2,3-polymer）とする。
【０１６４】
1H NMR (600 MHz, D2O) ：δ 7.25 (d, 2H, o-Ph), 7.00 (d, 2H, m-Ph), 5.13 (d, 1H, H-1), 4.49 (d, 1H, H’-1), 4.32 (peptide α-methine), 2.76 (dd, 1H, H-3" eq), 2.32 (peptide γ-methine), 2.04 (peptide β-methine and NHCOCH3), and 1.79 (d, 1H, H-3" ax).
【０１６５】
同様にして、poly(p-aminophenyl α-N-acetyl neuraminic acid-(2-6)-β-D-galactopyranosyl-(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosaminyl-L-glutamine-co-glutamic acid)も合成した。以下、このポリマーをポリマー２ａ（α2,6-polymer）とする。
【０１６６】
1H NMR (600 MHz, D2O) δ 7.27 (d, 2H, o-Ph), 7.05 (d, 2H, m-Ph), 5.15 (d, 1H, H-1), 4.48 (d, 1H, H’-1), 4.31 (peptide α-methine), 2.71 (dd, 1H, H-3" eq), 2.31 (peptide γ-methine), 2.05 (peptide β-methine and NHCOCH3), and 1.74 (d, 1H, H-3" ax).
【０１６７】
〔比較例５〕
上記のポリマー１ａ（α2,3-polymer）(10mg)を（HEPES）緩衝液(pH 7.4, 10 mM, 1mL)に溶解し、実施例８に示すウイルス(A/H3N2/Panama)と混合し60分、20℃で静置させた。つぎに、この試料を、〔実施例４〕の硫酸基含有糖化合物８ａが結合したセンサーチップ２に対してＳＰＲ装置にインジェクトし、図４に示す結果が得られた。この結果は、実施例８に示すデータが、センサーチップ２に固定化した硫酸化糖８ａと、ウイルス(A/H3N2/Panama)とが、特異的に結合していることを示す。
【０１６８】
〔比較例６〕
上記のポリマー１ａ（α2,3-polymer）(10mg)を（HEPES）緩衝液(pH 7.4, 10 mM, 1mL)に溶解し、SARSスパイクタンパク質と混合し60分、20℃で静置させた。つぎに、この試料を、〔実施例４〕の硫酸基含有糖化合物８ａが結合したセンサーチップ２に対してＳＰＲ装置にインジェクトし、図５に示す結果が得られた。この結果は、実施例１０に示すデータが、センサーチップ２に固定化した硫酸化糖８ａと、SARSスパイクタンパク質とが、特異的に結合していることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明に係る硫酸基含有糖化合物を基板あるいは微粒子表面に固定化した、センサーチップまたは金属微粒子含有試薬は、極微量のサーズウイルスもしくはサーズスパイクタンパク質、または極微量のインフルエンザウイルスもしくはヘマグルチニンを高感度かつ迅速に検出できる。また、
【０１７０】
前記センサーチップは、標識物質を用いることなくリガンドの変化を高感度に検出することのできる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：SPR）あるいは水晶振動子（Quartz Crystal Microbalance: QCM）に適用することにより、サーズウイルスもしくはサーズスパイクタンパク質、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンの微量検出が可能である。
【０１７１】
また、前記金属微粒子によるコロイド検出方法、たとえば金微粒子による金コロイド凝集法は、迅速で簡便に行えるサーズウイルスもしくはサーズスパイクタンパク質、インフルエンザウイルスまたはヘマグルチニンのセンシング方法である。
【０１７２】
前記硫酸基含有糖化合物を含む吸着材は、マスク、フィルターなどの吸着シートとして用いることができるほか、吸着材を含む溶液をスプレーとして使用することでサーズウイルスあるいはインフルエンザウイルスの感染予防にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は化合物４ａを固定化したセンサーチップ１の表面または化合物１１を固定化したセンサーチップ３の表面と、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンとの相互作用のSPRセンサーグラムである。
【図２】図２は化合物８ａを固定化したセンサーチップ２の表面とインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとの相互作用のSPRセンサーグラムである。
【図３】図３は化合物４ａを固定化したセンサーチップ１の表面とインフルエンザウイルスとの相互作用のSPRセンサーグラムである。
【図４】図４は化合物８ａを固定化したセンサーチップ２の表面とインフルエンザウイルスとの相互作用のSPRセンサーグラムである。また、インフルエンザウイルスとセンサーチップ２と、相互作用阻害剤ポリマー１ａとを混合したときの相互作用のSPRセンサーグラムである。
【図５】図５は化合物４ａを固定化したセンサーチップ１の表面、化合物８ａを固定化したセンサーチップ２の表面、化合物１１を固定化したセンサーチップ３の表面と、サーズウイルスのスパイクタンパク質との相互作用のSPRセンサーグラムである。また、サーズスパイク蛋白質とセンサーチップ２と、相互作用阻害剤ポリマー１ａとを混合したときの相互作用のSPRセンサーグラムである。さらに、化合物１１を固定化したセンサーチップ３の表面とサーズスパイクタンパク質との相互作用のＳＰＲセンサーグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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