(57)【要約】【課題】有用微生物の酸耐性に直接的に関与している新規な酸耐性遺伝子を提供すること。また酸ストレスや熱ストレスのような負荷の容易なストレスによって連結遺伝子の発現を強く誘導することのできる新規なストレス誘導プロモーターを提供すること。【解決手段】酸耐性が強いラクトバチルス・ガッセリOLL2716株（Lactobacillus gasseri :LG21）の酸適応時における短時間での酸ストレス遺伝子応答をDNAアレイ法で網羅的に解析し、見出された新規遺伝子の表現型を確認することで酸耐性に関与する新規な遺伝子領域と該遺伝子の領域の誘導に関わる新規な酸及び／または熱ストレス誘導プロモーターを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の遺伝子からなる、酸耐性に関与する遺伝子領域。
１）  配列表配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子（＃1290）
２）  配列表配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子（＃475）
３）  配列表配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子（＃476）
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子領域を導入して作成され、酸耐性が向上した微生物の形質転換体。
【請求項３】
請求項１に示される遺伝子の内、1つ以上の遺伝子が失活した微生物株。
【請求項４】
請求項１に示される配列番号１から３の塩基配列を用いた酸耐性度の高い微生物のスクリーニング方法。
【請求項５】
配列表配列番号４に記載の塩基配列内に存在する、請求項１に記載の遺伝子領域の転写を制御する酸及び／または熱ストレス誘導プロモーター領域。
【請求項６】
配列表配列番号４に記載の塩基配列を含む、酸及び／または熱ストレス誘導遺伝子発現系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵食品の製造やプロバイオティックス活性などに関わる乳酸菌・酢酸菌・酵母などの食品微生物、及び、乳酸・アミノ酸・核酸など有用物質を生産する微生物、環境浄化に関わる微生物の酸耐性の評価及び強化に関する。さらに詳しくは、Lactobacillus
gasseri 菌のゲノムに存在し、本菌の酸耐性機構発現に関わる遺伝子の応用に関する。また、該酸耐性遺伝子等の転写を制御している酸及び／または熱ストレスで誘導されるプロモーターとその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は地球上の様々な場所に生育し多様な働きをしているが、中には酸性の環境に耐えて生育するものがある。例えば、酸性土壌中や酸性の水圏にいる微生物、あるいは、乳酸菌や酢酸菌、プロピオン酸菌をはじめとする微生物は、生育の際に代謝産物として酸を生成するため環境の酸性化が進む。また、食品中の有用な微生物やプロバイオティクス菌などが口から入った場合には、ヒトや家畜などの胃内が酸性であるため酸性環境にさらされる。したがって、このような微生物を産業的に応用する場合、酸性環境に対する抵抗性（酸耐性）はきわめて重要な形質である。
【０００３】
そのため、各種の酸を生成する菌では、その酸耐性に関わる遺伝子やタンパク質について検討が加えられてきた。例えば酢酸菌については、その酢酸耐性遺伝子やその遺伝子を用いて微生物の酢酸耐性を向上させて高濃度の酢酸を得る方法等が既に報告されている。（例えば、特許文献１）
また、乳酸菌においても酸耐性に関わる遺伝子がいくつか報告され、それに伴い乳酸菌の酸耐性機構もいくつか報告されている。（例えば非特許文献１、特許文献２）さらに、本発明者らは網羅的転写解析を利用した研究の結果、Lactobacillus
gasseri 菌の酸耐性に関わる新たな遺伝子（#474遺伝子）を発見し報告している。（非特許文献２）
【０００４】
酸耐性に関する従来の報告の多くは、ランダムな変異によって遺伝子を失活させ、得られた変異株の中から酸耐性が弱くなったものを見つけてその遺伝子を解明するか、あるいは、「酸適応:対数増殖期の細胞を致死的でない比較的穏やかな酸性条件におく事によって酸耐性メカニズムが誘導され菌の酸耐性が増加する現象」を利用して、酸耐性に関わるタンパク質を検討するものであった。
【０００５】
これらの場合に問題となるのは、突然変異の誘起法では目的の酸耐性に関わる変異を得る効率がきわめて低いこと、また、二次元電気泳動法を用いたタンパク質の解析法（プロテオーム解析）では、「酸適応」が数分間で起きる現象であるにも拘わらず、発現に時間を要するタンパク質を指標として解析が行われてきたことである。従って、これまで報告されている遺伝子は「酸適応」時に短時間で発現量が増大する本来の酸耐性遺伝子を正確に反映したものとは言えない。
【０００６】
また、微生物の酸耐性遺伝子自体の検討だけではなく、「酸適応」時に遺伝子発現量を増大させる仕組み、すなわち、酸ストレスで誘導されるプロモーターについても検討が行われている。
【０００７】
例えば特許文献２では  Lactobacillus acidophilusのF1F0-ATPase プロモーターが記載されている。この検討の趣旨は、酸性条件で誘導される該プロモーターを用いることによって目的遺伝子の発現量を増大させて、有用タンパク質などの大量生産や特定の形質を向上させて有用微生物を得ることを狙ったものである。培地を酸性にするには、乳酸や酢酸、クエン酸などを添加するか、あるいは、微生物が自然に作るこれらの酸を利用すれば良いので、この方法は食品製造に適するものであると言える。しかしながら特許文献２記載の報告では、酸性条件での遺伝子発現量増加が高々２倍程度であり、遺伝子産物の発現量をさらに増大することができる酸ストレス誘導プロモーターが望まれる状況にあった。
【０００８】
【特許文献１】特開2003-289868号公報
【特許文献２】US 6,242,194号公報
【非特許文献１】Rallu F ,Gruss A ,Ehrlich SD ,Maguin E ,Molecular Microbiology 2000 35(3)517-528
【非特許文献２】佐々木泰子 バイオサイエンスとインダストリー 2004 62(7) 17-20
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明の課題は、酸性の発酵食品製造に関わる乳酸菌などの微生物からより効果の高い酸耐性遺伝子を探索し、その機構を応用して有用微生物に酸耐性を賦与、あるいは増強、あるいは検出するなどの応用をはかることである。また、もう一つの課題は、食品などへの応用に適する方法、例えば、培地を酸性にするなどによって有用なタンパク質をコードする遺伝子の発現量を確実に増大することができる強い発現誘導プロモーターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、先の２つの課題を解決するにあたり、乳酸菌の中でも酸耐性が強いことが知られているLactobacilus gasseri OLL2716株（以下LG21株；寄託番号 FERM BP-6999）に注目して検討を開始した。LG21株の酸耐性が強いことは、培養液の最終pH
がLG21株では約3.8であり、例えばチーズ製造乳酸菌Lactococcus lactisの約4.5と比べて低いこと、また、食品製造に用いられている他の乳酸菌株と比べて、人工胃液を用いた生残性の検討結果などからLG21株の生残性が高かったことなどから明確である。
【００１１】
すなわち本発明は、LG21株に強い酸耐性機構が複数存在すると予想して、これまで知られていない酸耐性機構に関わる有用遺伝子を見出し、その応用を図ることを狙ったものである。しかも、「酸適応」時に転写量が大きく増加する酸耐性に関わる遺伝子を捉えようとしたものである。その為、まず酸に対するLG21株の挙動を検討し、定常期の細胞ではpH2.5においても生残菌数は減少しないが、対数増殖期の細胞ではpH2.5におくと生残菌数が漸減することを確認した。
【００１２】
そこで、酸に対する感受性の高い対数増殖期のLG21株細胞を用いることに加えて、「酸適応」によって短時間に発現量が増大する本来の酸耐性遺伝子を検出するため、網羅的転写解析が可能なDNAマイクロアレイ技術を用いてLG21株の酸耐性遺伝子を解析することを企画した。この方法を用いると、従来行われてきたプロテオーム解析などの手法では捉えることが出来ない短時間での遺伝子転写量変化の解析が可能となる。
【００１３】
つまり、菌株として新規な酸耐性遺伝子を有する可能性が高いLG21株を用い、且つ、検出方法としても従来の方法では捉えることが出来なかった遺伝子の転写変動を把握出来るDNAマイクロアレイ技術を用いることで、新規で有用な酸耐性遺伝子と、酸ストレスによって誘導される遺伝子発現プロモーターの両方を見出すことを狙ったものである。そして、LG21株の酸適応の際に転写が促進あるは抑制される遺伝子をゲノム・スケールで網羅的に解析した。その結果、「酸適応」時に強く誘導される遺伝子の中で、乳酸菌の酸耐性発現に関わると考えられる新規遺伝子（＃474）を見出すことに既に成功している。（非特許文献２）
さらにDNAマイクロアレイ技術を用いて詳細に検討を加えた結果、＃474遺伝子と同様に「酸適応」時に強く誘導され、乳酸菌の酸耐性に関わる遺伝子として、新たに３つの遺伝子（以下、#1296,
#475, #476遺伝子と呼ぶ）を見出す事に成功した。これら3つの遺伝子はオペロンを構成していると推定されるが、LG21株ゲノム上の＃474遺伝子と隣接して存在し、＃474遺伝子とは転写方向が逆である。
【００１４】
また、アレイ解析の結果から、「酸適応」時の#1296, #475, #476遺伝子の転写量は未処理区の約１０倍に増加することが確認され、#1296,
#475, #476遺伝子の転写調節機構は、＃474遺伝子と同様に酸ストレスによって非常に強く誘導されることが判明した。したがって、#1296, #475,
#476遺伝子の上流にある転写調節に関わる塩基配列を利用すれば、培地への酸添加という簡単な方法で特定の遺伝子を大量に発現させる、いわゆる有用遺伝子の大量および誘導発現系の構築が期待できるのである。
【００１５】
このようにして得られた酸耐性遺伝子#1296, #475, #476遺伝子の塩基配列とそれから演繹されるタンパク質のアミノ酸配列をデータベースで比較した結果、該タンパク質と相同なタンパク質がいくつか見出された。BLASTPでの相同検索で高い相同性を示したのは以下の遺伝子であった。
まず#1296および#475遺伝子では、ともにLactobacillus acidophilus NCFMのoxalyl-CoA
decarboxylase(oxalyl-CoA = formyl-CoA + CO2) と推定されるLBA0396タンパクと最も相同性が高く、#1296タンパクでは84.8%
/ 145 aa,  #475タンパクでは67.9% / 389 aaだった。 そして２番目に高い相同性を示したのは大腸菌のoxalyl-CoA
decarboxylase(Formyl-CoA + oxalate= formate + oxalyl-CoA)と推定されるb2373(yfdU) タンパクであった。#476遺伝子で相同性が高いのは、Lactobacillus
acidophilus NCFMのLBA0395タンパクで、formyl-CoA transferaseと推定されるタンパクで、相同性は84.1%/440aa
であった。この次に高い相同性を示すのは大腸菌のformyl-CoA transferaseと推定されるb2374(yfdW) タンパクであった。
【００１６】
しかし、これらのタンパク質の機能はタンパク質の相同性から推定されるだけで実際の機能は明確になっておらず、酸耐性との関連性を示す証拠は全く認められない。したがって、本発明で見出されたLG21株由来の遺伝子#1296, #475,
#476遺伝子は、タンパク質の相同性からはシュウ酸を蟻酸に変換する代謝活性に関わると類推できるが、これまでに酸耐性との関連が証明されたことはない。
【００１７】
さらに、これらの遺伝子#1296, #475, #476をノックアウトした株（以後、ΔDC3株と呼ぶ）を作成し、得られた株の性質を種々の試験で野生株（LG21株）と比較した。その結果、ΔDC3株は通常の培養条件では野生株と生育の差が認められなかったのに対して、酸性培地では両株の生残性に差が認められた。  乳酸でpH3.0〜pH3.5に調整したMRS培地で両株の生残性を比較すると、ΔDC3株は野生株の1/30 〜1/50に生残率が低下した（図１）。また、pH4.2に調整したMRS培地の生育では24時間後にOD660の値は野生株の約半分であった（図２）。
これらに加えて同様に検討した他の結果（省略）も併せて判断すると、ΔDC3株の酸耐性が低下していることは明確であったので、遺伝子#1296, #475, #476が本菌の酸耐性に関与していると結論した。
【００１８】
また、タンパク質相同性の結果から判断すると、#1296, #475, #476遺伝子は、シュウ酸（oxalate）を蟻酸（formate）に転換する代謝系に関わる活性を持つと推定される。シュウ酸は人の体内で高濃度になると、例えば腎臓結石などの原因となる。したがって、腸管内で生存する例えばLactobacillus
gasseri  などの乳酸菌で#1296, #475, #476遺伝子を強く発現させることによって、食物等に由来する腸管内のシュウ酸を効率よく変換・除去することが期待できる。実際、大腸に生育するグラム陰性細菌Oxalobacter
formigens  は、腸管内でシュウ酸を取り込み蟻酸に変換してエネルギーを作り出し、人の体内シュウ酸濃度を低下させ、その結果、腎臓結石などの危険性を低下させることが報告されている［Colin
S. Stewart et al., FEMS Microbiology Letters, 230(2004) 1-7］。すなわち、LG21株に存在する#1296, #475,
#476 遺伝子の発現によって、乳酸菌の酸耐性の向上が期待されるのみならず、ヒト腸管内で働かせるとシュウ酸濃度の低下を通じて腎臓結石などの予防・治療ができる可能性が考えられる。
【００１９】
なお、LG21株では#1296と#475遺伝子は別々のORF (open reading frame)になっているが、Lactobacillus
acidophilus LBA0396 や大腸菌では一つのORF b2373(yfdU)がoxalyl-CoA decarboxylase遺伝子をコードしていると報告されている。LG21株と同じLactobacillus
gasseri種の基準株であるATCC 33323株にも#1296, #475, #476遺伝子ときわめて相同性の高い配列が知られている。このように、LG21株ではoxalyl-CoA
decarboxylase遺伝子をコードしている遺伝子は2つになっているが、重要なのはシュウ酸を蟻酸に変換する酵素活性でありORFの数ではない。
【００２０】
この酸耐性に関与する新規遺伝子#1296, #475, #476が大量に発現されると、該遺伝子を有する微生物（または、該遺伝子が導入された形質転換体）の酸耐性が向上すると考えられる。したがって、遺伝子#1296,
#475, #476の存否、あるいはその転写量、または最終産物であるタンパク質の量を測定することによって、微生物の酸耐性度の推定ができる可能性がある。遺伝子#1296,
#475, #476の存否、転写量、および該タンパク質の量は公知の方法で容易に測定可能である。例えば遺伝子#1296, #475, #476の存否はPCR法などで、転写量は遺伝子#1296,
#475, #476の塩基配列をもとにしたノーザンブロッティング法や定量的PCR法など、またタンパク質量は、例えばウエスターンブロッティング法など、それぞれ公知の方法で定量できる。これらのいずれかの方法を用いて測定対象微生物における遺伝子#1296,
#475, #476の存否、転写量、および発現量の少なくとも一つを測定することで、食品製造やプロバイオティックスなどの分野で有用に用いることのできる酸耐性度の高い微生物株をスクリーニングすることが可能となるものと考えられる。
【００２１】
本発明は以上の知見を元に完成するに至ったものである。すなわち本発明は以下の（１）〜（６）からなるものである。
（１）  以下の遺伝子からなる、酸耐性に関与する遺伝子領域。
１）配列表配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子（＃1290）
２）配列表配列番号２に記載の塩基配列を有する遺伝子（＃475）
３）配列表配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子（＃476）
（２）（１）に記載の遺伝子領域を導入して作成され、酸耐性が向上した微生物の形質転換体。
（３）（１）に示される遺伝子の内、1つ以上の遺伝子が失活した微生物株。
（４）（１）に示される配列番号１から３の塩基配列を用いた酸耐性度の高い微生物のスクリーニング方法。
（５）配列表配列番号４に記載の塩基配列内に存在する、請求項１に記載の遺伝子領域の転写を制御する酸及び／または熱ストレス誘導プロモーター領域。
（６）配列表配列番号４に記載の塩基配列を含む、酸及び／または熱ストレス誘導遺伝子発現系。
【００２２】
また、本発明は（１）に記載の配列番号１から３の中から選ばれる少なくとも一つの塩基配列の１個もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有している遺伝子であっても、その機能が酸耐性に関与する遺伝子であればそれを含むことは言うまでもない。さらに（６）の配列番号４に記載の塩基配列の１個もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有しているプロモーター領域であっても、その機能が酸ストレスによって誘導される遺伝子発現に関与するものであればそれを含むことは言うまでもないことである。
【発明の効果】
【００２３】
今回発見された遺伝子はこれまで酸耐性との関連が知られていない遺伝子であり、酸によって短時間に強く誘導される酸耐性遺伝子であるため、新たな酸耐性機構として有用微生物、特に、乳酸菌などの食品製造やプロバイオティックスに用いられる微生物に酸耐性を賦与あるいは増強することが期待できる。また、#1296,
#475, #476 遺伝子は、弱酸処理のみならず致死的ではない加熱処理によっても急激に転写量が増大する。したがって、例えば発酵乳製品を製造する際、あるいは、製造直後にこのような加熱処理を行うことによって乳酸菌やプロバイオティックス株などの酸耐性を向上させることが可能である。この加熱処理による方法を用いると、培地や製品のpHを低下させる必要がないため最終製品の風味の低下（酸っぱさが増す等）を避ける事ができる。
【００２４】
また遺伝子#1296, #475, #476の存否および発現量を測定することで、食品製造やプロバイオティックスなどの分野で有用に用いることのできる酸耐性度の高い微生物をスクリーニングすることも可能となると考えられる。
【００２５】
次に、酸耐性は生存に極めて重要であるため、細胞には複数の酸耐性機構が存在すると考えられるが、種によって異なると推定される酸耐性機構全体を解明して産業的応用を行うには、既知の機構以外の耐性機構解明が不可欠である。その際、既知の酸耐性機構に係わる遺伝子の他に本発明の遺伝子の欠失株を作成することによって、新規の酸耐性機構および関連遺伝子を新たに発見することが期待できる。
【００２６】
さらに、本発明の遺伝子は培地pHを低下させる（弱酸処理）、あるいは、比較的弱い加熱処理を加えるという簡便な方法によって転写量が急激に増大するので、本遺伝子の転写制御機構を利用すれば、酸添加あるいは加熱処理によって誘導可能な有用タンパク質の発現系が構築できる可能性がある。  また、本発明の遺伝子を強く発現させることによって、乳酸菌の酸耐性の向上が期待されるのみならず、ヒト腸管内で働かせるとシュウ酸濃度の低下を通じて腎臓結石などの予防・治療ができる可能性も考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の配列番号１から３に記載の#1296, #475, #476遺伝子は、LG21株から単離されたものであり、各々、441塩基対、1188塩基対、
1539塩基対からなる。目的の有用遺伝子を発現させるためには、配列番号１から３よりなる遺伝子領域をベクターに導入すればよい。ベクターは宿主に適する公知のプラスミドやファージ、コスミド等を用いることができる。  組換えプラスミドによる形質転換体の作製は常法によって行えばよい。宿主細胞は、細胞内に挿入された遺伝子を維持、増殖、発現させ得るものであればいずれの宿主も使用可能である。宿主には、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、大腸菌、枯草菌などが挙げられる。
【００２８】
#1296, #475, #476 遺伝子を失活した微生物を作製するには、突然変異による方法の他に、相同組換えを応用した染色体への遺伝子組込みなどによる方法など、常法によって行えばよい。  配列番号１から３に記載の塩基配列を用いた酸耐性度の高い微生物をスクリーニングするには、配列番号１から３に記載の配列の一部分から調製したプライマーを用いて該遺伝子にハイブリダイズする微生物株をスクリーニングすればよい。また、本発明の配列番号４記載の塩基配列は、LG21株から単離されたものであり、#1296,
#475, #476遺伝子の上流に位置するプロモーター領域内に存在する354 bpの塩基対からなる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を元に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１］  LG21株の遺伝子を載せたDNAアレイ作成と解析条件の検討
LG21株の酸適応の際にどのような遺伝子が関与しているかを網羅的に解析するため、本株ゲノムに存在する遺伝子を載せたDNAアレイを以下のように作製し解析を行った。
A) DNAアレイの作製
LG21株ゲノムの大きさは約2.1 Mbと推定されるが、現在までにその約９割の塩基配列を決定したところ、200 bp以上のORF（遺伝子候補）が約2900個あった。これらを通常の解析プログラム（BLASTPとCOG）を用いて各々のORFの機能推定を行い、機能未知遺伝子を含む1597個のORFを選択してLG21株用のDNAマイクロアレイ（以下、アレイと呼ぶ）を作製した。
アレイに載せるDNAをPCRで増幅するため、プライマーの設計を設計ソフトprimer3で行った。各ORFの内側の500 bpから800 bpの配列をPCRで増幅して各ORFのDNA断片を得た。Human
TFR などの対照遺伝子DNAを加え、duplicateとして合計3456スポットから成る、いわゆるStanfordタイプのマイクロアレイを作製した。DNA断片のスライドグラスへのスポッティングは（株）宝酒造に依頼した。
B) 試料調製および解析条件の検討
アレイ解析は、次の1)から6)の手順に従って行った。すなわち、1) 菌体サンプルの採取、2) RNA調製、3) 逆転写酵素によるRNAからcDNAの調製と蛍光標識、4)
得られた蛍光標識cDNAとアレイ上のDNAスポットとのハイブリダイゼーション、5) 各スポット蛍光強度の測定、6) シグナル解析、である。
最初に全体的条件を検討した。実験条件を検討する基準として、同一RNAから逆転写されたcDNAを蛍光色素Cy5およびCy3（ともに、Amersham
Pharmacia Biotech）で標識してglobal normalizationした後、LG21株由来の約1,600遺伝子の蛍光強度の比、すなわち、Cy5/Cy3
が最も1.0に近づく条件を最適とした。まず、ハイブリダイゼーションに用いるRNA量を検討した結果、100 μgもしくはそれ以上が適当であることが判明した。また、primerとしてrandom
primerとspecific primerを比較した結果、specific primerを用いた場合には低いバックグランドで良好な画像が得られたので、プライマーには約1,600遺伝子各々固有の3'末端配列（22〜24
mer）から成るspecific primer（ミクスチャー）を用いた。
【００３１】
以下、各工程の具体的な条件について検討した結果を示す。
＜菌体のサンプリング＞
細菌mRNAの半減期は短いためサンプリングは迅速に行なう事が重要である。瞬時にRNaseを失活させるため、菌体を含む培養液10 mlにstop
solution（エタノールにDEPC水飽和フェノール5 %を加えたもの）1.25 mlを素早く添加・混合してmRNAの分解を止める。これを室温、10,000
rpmで1分間遠心して上清液を捨て、菌体を液体窒素を用いて凍結した。この処理は全体で数分以内にし、凍結菌体サンプルはマイナス80℃で保存した。
＜RNA調製、cDNA化、蛍光標識とハイブリダイゼーション＞
菌体サンプリング以降の実験操作は、一部の試薬メーカーの違いを除き基本的に以下の枯草菌アレイ実験方法に関する文献｛Yoshida, K., et al.,
Nucleic Acids Res., (2001), 29 (3), 683-692.  Ogura, M., et al., Nucleic Acids
Res., (2001), 29 (18), 3804-3813｝に準じて行った。
なお、アレイスキャナーはAffymetrix428（Affymetrix社）を、シグナル解析ソフトはImaGene（BioDiscovery社）を使用した。
以上の方法を用いてLG21株の対数増殖期あるいは定常期細胞から調製した同一のRNAを各々Cy5、および、Cy3標識してアレイ解析した結果、Cy5/Cy3 のシグナル比は約1,600遺伝子のほとんどで約1.0であった。また、この結果は再現性があったため本株でのアレイ解析がこの方法で精度良く進められると結論した。
【００３２】
［実施例２］  DNAアレイによるLG21株酸ストレス応答解析。
実施例１で確立した方法を用いて、LG21株の酸適応の際に起こる約1,600個の遺伝子の転写変化をアレイで解析した。「酸適応」とは、対数増殖期の細胞を致死的でない比較的緩やかな酸性条件におく事（弱酸処理）によって酸耐性メカニズムが誘導され、酸耐性が増加する現象をいう。予備検討の結果、pH4.8での弱処理が最も酸適応効果が高く、生残性は無処理区と比較して百倍以上増加した。また、弱酸処理時間についてpH4.8の培地で15分から３時間まで検討した結果、弱酸処理が長いほど強酸処理での生残性は高かった。しかし15分処理でも無処理区と比較して生残性が数十倍以上増加したので、以後の実験では弱酸処理時間を30分とした。pH4.8のMRS培地で弱酸処理（酸適応）を行うと、LG21株の生残率は無処理区と比較して１０の２乗から５乗倍も高かった。（非特許文献２）
MRS培地で３７℃１５時間培養したLG21株の前培養液を、pH緩衝剤であるMOPS （3-morpholinopropanesulfonic acid, 和光純薬）を200 mM添加してpHを6.5
に調整したMRS培地（MRS+MOPS pH6.5）800 mlに２％植菌して、さらに２時間静置培養した。培養液の濁度（OD660）が約0.4になった培養液を２分し、各々遠心（6000rpm、１分、室温）した。試験区では、沈殿（LG21株細胞）を乳酸でpH4.8に調整したMRS培地400
mlに懸濁して３７℃で弱酸処理を行った。弱酸処理開始後３分，８分、３０分後に10 mlずつ菌懸濁液を採取して実施例１に示した方法でRNAを調製し、得られたcDNAを蛍光色素Cy5で標識した。対照サンプルでは、上記と同様に遠心処理を行ったが、上清液を用いて沈殿を再懸濁し３７℃で培養した。そして上記と同じ時間に10
mlずつ菌懸濁液を採取してサンプルを調製し、得られたcDNAを蛍光色素Cy3で標識した。
なお、酸適応が起こったことを確認するため、弱酸処理（または無処理）開始後30分の培養液を遠心（6000rpm, １分、室温）し、沈澱した細胞をpH2.5のMRS培地に懸濁して生残率を測定した。その結果、処理区での生残性が対照より充分高かったので、本実験サンプルでも酸適応が起こったことが確認された。
【００３３】
上記の様にして得られた標識サンプルをアレイ解析して蛍光強度の比（すなわち、Cy5/Cy3比）を調べた結果、弱酸処理３分後には既に菌体内でダイナミックな転写変化が起こっていることが推測された（図３）。すなわち、約1,600遺伝子のうち約60個の遺伝子では転写が３倍以上に促進されておりこれらの中に酸耐性に関わる重要な遺伝子が含まれていると推定された。一方、約40個の遺伝子では転写が３分の１以下に抑制されていた。
酸適応で転写量が増大する遺伝子が酸耐性発現に主に関与していると考えられるが、転写促進が認められた約60個の遺伝子の中には、アルギニン・オルニチン・アンタイポーター、オルニチン脱炭酸酵素、陽イオン輸送関連遺伝子、糖輸送関連遺伝子群など、酸耐性との関連が報告ないし推定されている遺伝子があった。  と同時に、転写量が増大した遺伝子には機能未知遺伝子もあった。その中で、短時間でも転写量の増加が顕著で３０分後も高い転写が続いている遺伝子として#474遺伝子（非特許文献２）の他に、本発明者らは図４(図３の太線部分のみ示す)#1296,
#475, #476遺伝子を新たに発見した。遺伝子#1296, #475, #476は、pH 4.8の培地での酸適応処理後３分から３０分にわたって対照の約１０倍の転写促進が認められた。しかも、酸適応がほとんど認められないpH
5.3の培地で弱酸処理した場合と比べても、遺伝子#1296, #475, #476の転写はpH4.8の処理で３倍以上促進された。したがって、酸適応の初期から高い転写量を示す遺伝子#1296,
#475, #476が、LG21株の酸耐性に関わる重要な遺伝子の一つである可能性が考えられた。
【００３４】
［実施例３］  酸耐性との関連が推定された遺伝子#1296, #475, #476の相同性検索
実施例２に示す結果から、遺伝子#1296, #475, #476を選択してその機能を検討した。
まず、このようにして得られた酸耐性遺伝子#1296, #475, #476の塩基配列（配列表配列番号１，２，３）とそれから演繹されるタンパク質のアミノ酸配列（配列表配列番号５，６，７）をデータベースで比較した結果、該タンパク質と相同なタンパク質がいくつか見出された。
BLASTPでの相同検索で高い相同性を示したのは以下の遺伝子であった。
まず、#1296および#475遺伝子では、ともにLactobacillus acidophilus NCFMのoxalyl-CoA
decarboxylase(oxalyl-CoA = formyl-CoA + CO2) と推定されるLBA0396タンパクと最も相同性が高く、#1296タンパクでは
84.8% / 145 aa,  #475タンパクでは 67.9% / 389 aaであった。 そして２番目に高い相同性を示したのは大腸菌のoxalyl-CoA
decarboxylase(Formyl-CoA + oxalate= formate + oxalyl-CoA)と推定されるb2373(yfdU) タンパクであった。#476遺伝子で相同性が高いのは、Lactobacillus
acidophilus NCFMのLBA0395タンパクで、formyl-CoA transferaseと推定されるタンパクで、相同性は84.1%/440aa
であった。この次に高い相同性を示すのは大腸菌のformyl-CoA transferaseと推定されるb2374(yfdW) タンパクであった。
また、大腸菌では本発明と同様にアレイを用いて酸耐性について解析した報告［Tucker, D.L, et al., J. Bacteriol., 2002,
184(23) 6551-6558.］があり、酸耐性に関連すると考えられる多くの遺伝子が示されているが、遺伝子#1296, #475, #476と相同性のあるb2373,
b2374などはその中には含まれておらず大腸菌のb2373, b2374遺伝子は酸耐性への関与は知られていなかった。
以上の塩基配列およびアミノ酸配列による相同性検索結果から、ガセリ菌LG21株の遺伝子#1296, #475, #476は酸耐性との関連が示唆されたことはないことが確認された。
【００３５】
［実施例４］  遺伝子#1296, #475, #476ノックアウト株の作製
次に、遺伝子#1296, #475, #476の機能を検討するために、本遺伝子を欠失した株（遺伝子#1296, #475, #476ノックアウト株）を相同組換えによる二重交叉によって作製した。
まず、遺伝子#1296, #475, #476の内部配列3174bpを欠失したDNA断片を、常法によりLG21株ゲノムDNAを鋳型にしてPCR反応で増幅した。この断片を温度感受性複製ベクターpSG+E2（Y.
Sasaki et al. , Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70(3), 1858-1864）に挿入してプラスミドpTERM298687（図５）を構築した。このプラスミドを用いエレクトロポレーション法でガセリ菌LG21株を形質転換した。低温（３２℃）で培養しエリスロマイシン（Em）耐性で選択した形質転換体を、Em存在下高温（４２℃）で培養して、該プラスミドが染色体に組み込まれた株（組み込み株）を得た。
次に、この組み込み株をEm無添加培地を用い低温（３２℃）で培養した後、単一コロニーを50個分離して調べた。その結果、Em耐性を失った感受性コロニーが15個得られたので、これら感受性コロニーをPCRにかけて各々のゲノム上の遺伝子#1296,
#475, #476の構造を推定した。まず15個中8個のコロニーでは、遺伝子#1296, #475, #476を挟むプライマー（primer
ysk252:AGCCTTCGTAGTCACCTTGAGC、primer G477R: GCCCATCCTTACACTTCTTG）によるPCR反応で、約5.3
kbのDNA断片が得られた。これらは二重交叉の際に元と同じ遺伝子構成に戻った株と考えられた。
しかしながら、残りの7株では、約2.1kbのDNA断片が得られた。すなわち、これらの７株では遺伝子#1296, #475, #476を含む配列約3.2kbが欠失していることが推定された。その内の１株をΔDC3と名付けた。本株染色体の塩基配列を決定した結果、遺伝子#1296、#475、#476を含む3174bpが欠失していることを確認した。以上によりΔDC3が「遺伝子#1296, #475,
#476ノックアウト株」であると結論した（図６）。
【００３６】
［実施例５］  遺伝子#1296, #475, #476ノックアウト株の酸ストレスに対する耐性の検討
実施例４で得られたΔDC3の表現型をLG21株（野生株）と比較した。
まず、ΔDC3株とLG21株の生育を通常のMRS培地で培養して培養液の濁度を比較した。その結果、ΔDC3株は野生株のLG21とほぼ完全に同じ生育曲線を示し（結果は省略）、最終到達pHは両株とも約3.8であった。したがって、ΔDC3株はMRS培地での生育曲線と培養液の最終pHで判断する限り、LG21株と比べて明確に酸耐性が低下しているとは言えなかった。そこで、酸耐性度を以下二つの方法でさらに詳細に比較した。    第１は、酸性培地中での「生残性」の比較、第２は、酸性培地中での「生育」の比較である。これらの結果から、ΔDC3株とLG21株には以下のような酸耐性に関わる形質の差が認められた。以下に具体的な結果を示す。
まず、実施例３と同様に、前培養液をMRS+MOPS pH6.5培地で２時間培養したLG21株とΔDC3株細胞を乳酸でpH3.0,pH3.2,pH3.5に調整したMRS培地に懸濁して生残性を比較した。その結果、両株とも生残率は減少するがその減少の割合がΔDC3株では大きく、生残率は野生株の３０分の１であった（図１）。  このように、酸性培地での生残性を比べるとΔDC3株の生残率がLG21株より低下していたので、遺伝子#1296,
#475, #476が酸耐性に関わる遺伝子であることが判明した。
【００３７】
次に、pHを酸性に調整したMRS培地で両株の生育を比較した。
LG21株はpH 4.0以下のMRS培地ではほとんど生育しないため、乳酸でpHを4.2に調整しフィルターで無菌濾過した培地で生育を比較した。培地はMRSを用い、対照としてpHを特に調整しないMRS培地を用いた。  まず、pH無調整MRS培地で３７℃２４時間培養したLG21株とΔDC3株の生育を調べた。生育は培養液の濁度（OD660）で比較したが、この実験では両菌株で明確な差は認められなかった。しかし、pH 4.2の培地でΔDC3株の生育がLG21株より悪く、OD値は野生株の約1/2であることが判明した（図２）。
以上から、ΔDC3株はLG21株と比べて、低pHでの生残性と生育能が劣っていることが明確になった。したがって、遺伝子#1296,
#475, #476が本菌の酸耐性に関与していると結論した。 しかし、この差が明確に再現されるのは上述のように、前培養を中性付近で行った場合であり、通常の培地で一晩培養し培地のpHが４付近になる条件では差が明確ではなかった。これは、ノックアウト株（ΔDC3株）にも存在している他の複数の酸耐性機構が酸性条件で作動し、遺伝子#1296, #475, #476の欠損を相補したため差が検出しにくいためと解釈される。実際にアレイ解析で検討した結果、ΔDC3株では弱酸処理によって酸耐性に係わると推定される複数の遺伝子が、LG21株と比べると数倍多く転写されることが判明した（データ省略）。つまり、中性付近の培地で培養し酸耐性機構全般が十分に作動していない条件でこそ、遺伝子#1296, #475, #476による酸耐性機構の効果が検出できたと推定される。
【００３８】
［実施例６］酸および熱ストレスによる遺伝子#1296,#475,#476の転写増大
RT-PCR（SYBR Green蛍光色素使用）により、LG21株にストレスを加えた場合の#1296,#475,#476遺伝子の転写変化を調べた。用いたprimerは以下の通りである。
#1296遺伝子測定用  G1296L: AGCCTTCGTAGTCACCTTGAGC / ysk270: CCTGGTGTAGCAATGACTGT
#475遺伝子測定用  G475L: GCAACCCAATTTGATTCTGCAC /ysk271: GCGAACTTAGCGTCATTCTT
#476遺伝子測定用  G476L: CATCTGCAACAGGTTGGAACAA /ysk272: GGTTAAGAACAGCATCTTGC
酸処理 (乳酸でpH4.5に調整したMRS培地中で１０分間処理)では、対照区（pH6.5のMRS培地）に比べて、#1296では6.2倍、#475では8.5 倍、#476では7.4倍に転写量が増大した。塩酸でpH3.5に調整したMRS培地で１０分間処理した場合も、上記と同様に、#1296では7.1倍、#475では8.1
倍、#476では9.5倍に転写量が増大した。しかし、酸適応が観察されないpH2.5のMRS培地10分間処理では、#1296では0.7倍、#475では0.4 倍、#476では0.3倍と転写量は減少した。
【００３９】
次に、熱ストレスの効果についても調べた。これはLG21株に各種ストレスを負荷して検討した結果、酸処理の他に弱い加熱処理によっても本株の酸耐性（低ｐＨ培地での生残性）が向上することが判明したためである（結果は省略）。すなわち、LG21株細胞を弱い加熱処理（４５℃３０分間、あるいは、５０℃１０分間）を行うと、pH2.5に調整したMRS培地で2.5時間後の本株の生残率は、対照（加熱処理無し）に比べて、各々、300倍、450倍高かった。そこで、５０℃１０分間加熱処理したLG21株細胞をRT-PCRによって検討した結果、転写量は対照（加熱処理無し）と比べて#1296では7.3倍、#475では8.1
倍、#476では10.0倍に増大した。すなわち、加熱処理によって酸耐性の誘導が認められるLG21株では実際に、熱処理によって#1296,#475,#476遺伝子の大幅な転写促進が認められ、その増大量は３遺伝子ともほぼ同様の値であった。
【００４０】
［実施例７］プロモーター領域付加プラスミドを用いた転写量の測定
LG21株では、β-glucuronidase遺伝子（以下 gusA）が失活している。そこで、活性のあるgusA（塩基配列1773bp）をLactobacillus
gasseri 2728株（明治乳業（株）食機能科学研究所保有株）からPCRによって調製した。この遺伝子をレポーター遺伝子として用い、その上流に配列番号４に記載のプロモーター領域（354
bp：以下、PAAプロモーターと呼ぶ）をつないだ発現解析用ベクターpSgPA15（図７）を構築した。このプラスミドを乳酸菌に形質転換して、得られた形質転換体で遺伝子転写量を推定した。
（１）酵素活性による転写量の推定
ガセリ菌LG21株での転写量を推定するために、形質転換体を用いてPAAプロモーター領域下流につないだgusA の酵素活性を比色法で測定した。なお、プロモーターの比較対照として、酸による誘導がないStreptococcus
bovis由来αアミラーゼのプロモーターを上記のgusA上流に結合したプラスミドpSgPamyを別途構築し、ガセリ菌LG21株に形質転換して比較を行なった。その結果、PAAプロモーターを付加したプラスミドpSgPA15を保持するLG21株形質転換体のβ-glucuronidase活性は、酸処理（pH4.8に調整したMRS培地で３０分処理、３７℃）、あるいは、pH6.5のMRS培地で４５℃３０分間加熱処理したところ、どちらの場合でも対照のプラスミドpSgPamyを保持するLG21株形質転換体に比較して３倍から４倍以上のβ-glucuronidase活性を示した。したがって、PAAプロモーターは、酸あるいは熱によって転写が誘導されることが強く推定された。
（２）RT-PCRによる転写量の測定
次に、PAAプロモーターを付加したプラスミドpSgPA15をチーズ乳酸菌Lactococcus lactisに形質転換し、得られた形質転換体を用いて、PAAプロモーター領域下流につないだgusAの転写量をRT-PCR（SYBR
Green蛍光色素使用）で測定した。なお、対照として上記のpSgPamyを保持するLactococcus lactisの形質転換体を用いた。  Lactococcus
lactisの形質転換体を、酸処理(pH5.0、３０分、３２℃)、あるいは、熱処理(４５℃、３０分、pH6.5)してgusA遺伝子の転写変化を調べた。（なお、ストレスの負荷条件はLactococcus
lactisに適するものを用いたためガセリ菌の条件とは異なる）RT-PCR のprimerは、gusA測定用として（ysk307:
ACCATTTGTCTTTACTGAGTT / ysk309: TTCTTGGCTCCACATTTCATCT）を用いた。
RT-PCRによる測定の結果、pSgPA15の形質転換体では、無処理と比較して、上記の酸処理では3.0倍、熱処理では9.0倍に転写量が増大し、酸および熱による転写誘導が認められた。一方、対照であるpSgPamyの形質転換体では、熱処理では0.7倍,
酸処理では1.5倍であり転写の増加は認められなかった。
したがって、PAAプロモーターが酸あるいは熱によって強く転写誘導されることがmRNAレベルでも示された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の#1296, #475, #476遺伝子からなる遺伝子領域は、微生物の酸耐性に深く寄与しており、微生物を用いた食品製造、プロバイオティックス等において重要な性質となっている酸耐性に優れた微生物の創出、スクリーニングを可能とすることができる。また、本遺伝子領域の発現に関わる酸あるいは熱ストレスによって誘導されるプロモーターは２〜１０倍もの遺伝子発現を誘導することができるため、有用遺伝子に連結することで簡便な酸あるいは熱刺激によって目的の有用遺伝子の発現を増大させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】LG21株、ΔDC3(#1296,#475,#476欠失)株の酸耐性能の比較。
【図２】LG21株、ΔDC3(#1296,#475,#476欠失)株のpH4.2における生育比較。
【図３】LG21株の酸適応時に転写促進が認められた遺伝子群。
【図４】酸適応時の#1296,#475,#476各遺伝子の示す転写促進のタイムコース。
【図５】温度感受性組込プラスミドpTERM28687(#1296,#475,#476ノックアウト用)。
【図６】#1296、#475、#476を含む染色体構造。
【図７】乳酸菌発現解析用ベクターpSgPA15。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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