(57)【要約】      （修正有）【課題】口腔衛生用酵素として有用なα−１，３−グルカナーゼを見出し、当該α−１，３−グルカナーゼを、単一且つ大量に生産する手段を提供すること。【解決手段】  以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のタンパク質。（ａ）特定のアミノ酸配列を有する２種のタンパク質（ｂ）前記アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質（ｃ）前記の内１種のタンパク質と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質（ｄ）前記のもう１種のタンパク質と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｃ）いずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３又は４で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項４】
請求項３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５又は６記載の形質転換体を培養し、α−１，３−グルカナーゼを採取するα−１，３−グルカナーゼの生産方法。
【請求項８】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ-１９７２２として寄託された微生物（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のα−１，３−グルカナーゼ、及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯科領域の疾患であるウ蝕を効果的に予防できる口腔衛生関連の商品を開発することはきわめて重要なことである。ウ蝕の原因は、歯垢中のストレプトコッカス  ミュータンス等が乳酸を生成することであるとされる。ストレプトコッカス  ミュータンスが食餌中のショ糖からグルコシルトランスフェラーゼにより、高分子のグルカンを合成し、それが歯垢形成の開始に関与すると言われている。合成されるグルカンには水溶性のα-1,6結合を主体とするデキストランと不溶性のα-1,3結合を主体とするムタンがあるが、歯垢形成の開始には粘着性で不溶性のムタンの関与が大きいとされている（非特許文献１、２）。従ってα-１，３グルカンであるムタンを分解すれば歯垢形成を阻止できると共にウ蝕の誘発を抑えられることが充分考えられる。
【０００３】
ムタンを分解できるα-１，３−グルカナーゼの開発は、非常に重要であり、従来から多数の報告がなされている（特許文献１、２、非特許文献３、４）。しかし、安定性や分解力にまだ不足の部分もあり、実際に配合されたことはない。また、α-１，３−グルカナーゼは、真菌類の細胞壁に存在するニゲランをも分解できることから抗真菌剤としての応用や、ニゲラン分解物のエリシター活性を利用することが容易になることが予想される（非特許文献５）。
【特許文献１】特開昭６３−３０１７８８号報
【特許文献２】特表２０００−５０５６４９号報
【非特許文献１】浜田茂幸著、「虫歯はどうしてできるか」、岩波新書、1982年
【非特許文献２】Yamashitaら、"Infect. Immun.", 1993, 61, p.3811-3817
【非特許文献３】Imaiら、"Agric. Biol. Chem.", 1977, 41, p.1889-1895
【非特許文献４】Fuglsangら、"J. Biol. Chem.", 2000, 275, p.2009−2018
【非特許文献５】金ら、「生物工学会誌」, 1996, 74, p.23-27
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、口腔衛生用酵素として有用なα−１，３−グルカナーゼを見出し、当該α−１，３−グルカナーゼを、単一且つ大量に生産する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ムタンを分解できる酵素の生産菌を土壌中より見出し、新規なα−１，３−グルカナーゼを見出した。さらに当該酵素をコードする遺伝子配列を見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のタンパク質及びこれをコードする遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質
【０００７】
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）いずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号３又は４で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０００８】
また、本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００９】
さらにまた、本発明は、上記の形質転換体を培養し、ムタナーゼを採取するムタナーゼの生産方法を提供するものである。
【００１０】
さらにまた、本発明は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ-１９７２２として寄託された微生物（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６）を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で提供する微生物を用いれば、新規なα-１，３−グルカナーゼを生産することができる。本発明のα-１，３−グルカナーゼ遺伝子を用いれば、当該酵素を単一且つ大量に生産することができる。本発明の新規なムタナーゼは、歯垢形成を阻止するため、ウ蝕予防のために用いられる口腔衛生製品や、ガム、キャンディーなどの食品に有用である。また、真菌類の細胞壁中のニゲランも分解できることから抗真菌用酵素としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の（ａ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、α−１，３−グルカンに作用し、そのグルコシド結合の分解活性を有する新規なα-１，３−グルカナーゼである。本発明のタンパク質には、斯かる（ａ）配列番号１又は２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の他、当該タンパク質と等価のタンパク質が包含される。
【００１３】
ここで、等価のタンパク質としては、（ｂ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つα−１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００１４】
ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましい。また、上記の付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１５】
本発明の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（以下Ｃ１と称する）について、同一性を検索した結果、バチルス  エスピー  ＲＭ１株の生産するムタナーゼ（特開平１０−２０１４８３号報）と８２．０％と比較的高い同一性を示した。一方、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（以下Ｃ２と称する）について同一性を検索した結果、バチルス  エスピー  ＲＭ１株の生産するムタナーゼと４６．４％、ストレプトマイセス  コエリコラーＡ３（２）株の生産するｐｕｔａｔｉｖｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＬ９３９１３０．１  遺伝子  ＳＣＯ７０１５）と５６．８％、ストレプロマイセス  リビダンスの生産するｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ（ＰＩＲ  Ｔ３０２６１）と５６．６％と低い同一性を示すにすぎなかった。また、α-１，３−グルカナーゼ（Ｃ１）とα-１，３−グルカナーゼ（Ｃ２）との同一性は４４％の同一性を示すにすぎなかった。以上のように両配列のα-１，３−グルカナーゼは他の公知のタンパク質との同一性も極めて低いことから、本発明のα−１，３−グルカナーゼは新規な酵素であることが示唆された。
【００１６】
すなわち、本発明で提供するα−１，３−グルカナーゼと等価なタンパク質には、配列番号１に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα-１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質、および（ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα-１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質が包含される。
【００１７】
上記のアミノ酸配列の同一性とは、あるアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより計算されるものをいう。ここで用いるアルゴリズムとしては、特に限定されないが、公知のアルゴリズムが好ましく、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 227,1435,1985参照）がより好ましい。また、上記の計算は、例えば、ＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジーやマキシマムマッチングプログラムを用いて行うことができる。
【００１８】
ここで、α−１，３−グルカナーゼ活性を有するとは、α−１，３−グルカンに作用し、そのグルコシド結合を分解する活性を意味するが、その活性の程度は、その機能を発揮する限り配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度のもののみならず、これより高いもの、或いは低いものであってもよい。
【００１９】
また、上記α−１，３−グルカナーゼと等価なタンパク質は、α−１，３−グルカナーゼ活性を有していれば、さらに付加的な性質を有していてもよい。斯かる性質としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、低温及び／又は高温においてのみ異なる機能を有する性質、最適ｐＨが異なるという性質などが挙げられる。
【００２０】
また、本発明のα-１，３−グルカナーゼは、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。ここで、融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが挙げられる。
【００２１】
本発明で提供するα-１，３−グルカナーゼは、例えば、本発明で提供するα-１，３−グルカナーゼを有する生物から取得することができる。本発明で提供するα-１，３−グルカナーゼを有する生物としては、例えばバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株が挙げられる。
【００２２】
当該菌の菌学的性質並びに生理学的性質を以下に示す。
〔ＫＳＭ−Ｍ１２６株の性質〕
Ａ．形態学的性質
（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．６〜０．７Ｘ１．３〜３．５μｍ）
（ｂ）細胞の多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子：有り、準端、膨潤無し（０．３〜０．７Ｘ０．３〜０．８μｍ）
（ｅ）グラム染色：陽性
Ｂ．生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元：陰性
（ｂ）カタラーゼ：陽性
（ｃ）ＶＰテスト：陽性
（ｄ）インドールの生成：陰性
（ｅ）澱粉の加水分解：陽性
（ｆ）ジヒドロキシアセトンの生成：陽性
（ｇ）オキシダーゼ：陽性
（ｈ）グルコースからの酸産生：陽性
（ｉ）アラビノースからの酸産生：陽性
（ｊ）キシロースからの酸産生：陽性
（ｋ）マンニットからの酸産生：陰性
（ｌ）グルコースからのガス産生：陰性
（ｍ）レシチナーゼ：陰性
（ｎ）クエン酸の利用：陽性
（ｏ）プロピオン酸の利用：陽性
（ｐ）チロシンの分解：陰性
（ｑ）フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性
（ｒ）カゼインの分解：陽性
（ｓ）ゼラチンの分解：陽性
（ｔ）嫌気性下での生育：生育する
（ｕ）食塩耐性：２％以下
（ｖ）生育温度：１０℃〜３５℃
（ｗ）ＹＭ寒天培地：生育しない
（ｘ）ニュートリエント寒天培地：生育する
【００２３】
上記のＫＳＭ−Ｍ１２６株の菌学的性質並びに生理学的性質についてBergey's Mannual of Systematic Bacteriology (Williams & Wilkins社、1984年)の記載に準じ検討した結果、バチルス属細菌に属することは明白であったが、種については既知のバチルス属細菌とは完全に一致するものではなかった。そこで新規な微生物として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６（ＦＥＲＭ  Ｐ-１９７２２）として寄託した。
【００２４】
上記の微生物を用いて本発明のα−１，３−グルカナーゼを取得するには、培地に微生物を接種し、常法に従って培養すればよい。ここで、培地としては、０．００５％〜１０％(ｗ/ｖ)のムタンを添加した培地が好ましい。斯くして得られた培養物中から目的のα−１，３−グルカナーゼを採取することができる。この培養上清液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、精製するのが好ましい。培養液からのα-１，３−グルカナーゼの精製は、常法に従って行うことができる。すなわち、培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、上清から硫安添加により酵素を沈殿させたり、あるいは限外ろ過膜などを用いて濃縮することができる。さらに噴霧乾燥、凍結乾燥、結晶化などにより様々な形態として調製することができる。
【００２５】
斯くして得られる本発明のα-１，３−グルカナーゼの分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による定量で約１２０ｋＤａであると測定される。
【００２６】
本発明の遺伝子は、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであり、好適には、（ａ）配列番号３又は４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子、及びこれと等価な遺伝子が挙げられる。ここで、等価な遺伝子には、（ｂ）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つα-１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）配列番号３又は４で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つα-１，３−グルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００２７】
ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular cloning −a laboratory manual, 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：0.15 M塩化ナトリウム、0.015 Mクエン酸ナトリウム、pH 7.0）、0.5% ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び100 mg/mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００２８】
また、上記の塩基配列の同一性とは、あるアルゴリズムを用いて塩基配列を比較することにより計算されるものをいう。ここで用いるアルゴリズムとしては、特に限定されないが、公知のアルゴリズムが好ましく、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 227,1435,1985参照）がより好ましい。また、上記の計算は、例えば、ＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジーやマキシマムマッチングプログラムを用いて行うことができる。
【００２９】
また、上記（ａ）で示される遺伝子と等価な遺伝子には、（ａ）で示される遺伝子に比べて、ｍＲＮＡの発現量が多い及び／又は安定性が高い、翻訳されるタンパク質の安定性が優れているなどの性質を有していてもよい。
【００３０】
本発明のα-１，３−グルカナーゼ遺伝子は、例えばバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株等からクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う方法が挙げられる。
【００３１】
また、本発明で提供する遺伝子は、例えば、計画的なもしくはランダムな変異導入法などの方法により、配列番号３又は４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子を改変することにより作製することもできる。
【００３２】
ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、遺伝子配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。ここで特徴的な配列の参酌は、例えば、そのタンパク質の立体構造予測、既知のタンパク質との相同性を考慮することにより行うことができる。ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット（タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることもできる。
【００３３】
また、本発明の遺伝子は、本発明の遺伝子の一部又は全部を含む又はからなるポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより取得することもできる。この適当な原理には、例えば、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うＰＣＲ法、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が含まれる。
【００３４】
なお、配列番号３又は４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子の有さない性質を有する遺伝子の取得を試みる場合、遺伝子の性質を利用した選択を併せて行うのが好ましい。このような選択は、公知の方法により容易に行うことができる。
【００３５】
本発明で提供する遺伝子を用いれば、本発明で提供するタンパク質を大量に生産することができ有用である。
【００３６】
本発明の遺伝子を用いてα-１，３−グルカナーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記α-１，３−グルカナーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からα-１，３−グルカナーゼを採取すればよい。培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００３７】
本発明α-１，３−グルカナーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにα-１，３−グルカナーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００３８】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されず、あらゆるものを用いることができ、例えば、動物、動物由来の細胞、植物、植物由来の細胞、微生物などを用いることができるが、微生物が好ましく、微生物としては、Bacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌などが好ましく、枯草菌がより好ましく、枯草菌ＩＳＷ１２１４株がより好ましい。動物由来の細胞、植物由来の細胞としては、培養細胞として確立しているものが好ましい。また、宿主株としては、アルカリプロテアーゼが欠損している株が好ましい。
【００３９】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００４０】
かくして得られた培養物中からのα-１，３−グルカナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。すなわち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明する。
実施例１  α-１，３−グルカナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌サンプル０．５ｇを生理食塩水（５ｍＬ）に懸濁し、８０℃で２０分間処理を行った。その後、以下の表１に示す組成からなる液体培地（４ｍＬ）に０．１ｍＬの熱処理上清液を添加し、３０℃で７日間振盪培養を行った。菌が生育した培養液は、新たな同組成の培地へ０．１ｍＬ接種し、さらに７日間振盪培養を行った。この操作をさらに１回繰り返した後、菌液をトリプティケースソイ寒天培地へ塗抹し、３０℃で３日間、静置培養を行った。生育した菌を選抜し、純化した後に液体培地へ接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行い、上清液中のα-１，３−グルカナーゼ活性を測定した。α-１，３−グルカナーゼ生産量の高い菌株の中からバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株を選抜した。
【表１】
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【００４２】
実施例２  α-１，３−グルカナーゼの生産並びに精製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株を０．１％(w/v) リン酸１カリウム、０．２％リン酸２カリウム、０．５％酵母エキス（ディフコ）、０．７５％魚肉エキス（和光）、０．３％バクトソイトン（ディフコ）、０．０１％硫酸マグネシウム７水塩、０．００１％硫酸マンガン、０．１％ムタンからなる７５ｍＬの液体培地に接種し、３０℃、３日間振盪培養を行った。
培養液（０．０５Ｕ／Ｌ）を遠心分離（８，０００ｘｇ、１０分間、４℃）し、得られた上清液１Ｌに対し、硫安を７０％飽和になるように徐々に加え遠心分離（８，０００ｘｇ、１５分間、４℃）し、沈殿を集め、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し１昼夜透析を行った。透析内液を予め５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたSuperQ Toyopearlカラム(東ソー)へ添着させた。α−１，３−グルカナーゼ活性は非吸着画分に得られ、次いで予め０．８Ｍ硫安を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいたButyl Toyopearlカラム(東ソー)へ添着させた後、０．８Ｍ〜０Ｍ硫安の直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。α−１，３−グルカナーゼ活性画分を集め、限外ろ過にて濃縮脱塩を行った。次に１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６）にて平衡化しておいたMacro-Prep DEAE support カラム(バイオラッド)へ添着した。α−１，３−グルカナーゼ活性は非吸着画分に溶出され、これを集めて濃縮を行った。濃縮液のＳＤＳ電気泳動を行ったところ、分子量１２０ｋＤａ付近にタンパク質バンドが確認され、このバンドのアミノ末端配列を解析した。その結果、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒの２１アミノ酸配列が決定された。
【００４３】
実施例３  α-１，３−グルカナーゼ（Ｃ１）遺伝子のクローニング
実施例２で得られた２１アミノ酸配列を基にプライマー１（配列番号５）、プライマー２（配列番号６）をデザインした。
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株を１．０％(w/v) バクトトリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１．０％ＮａＣｌ、から成る１０ｍＬの液体培地に接種し、３０℃、１日間振盪培養で得られた培養液から、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（タカラバイオ）を用いて染色体を抽出した。ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  キット（タカラバイオ）に従い、得られた染色体５μｇをEcoRＩ制限酵素処理した後、カセット（キット添付）と結合させ、プライマー１とプライマーＣ１（キット添付）を用いたＰＣＲを行った。得られた増幅断片を鋳型とし、さらにプライマー２とプライマーＣ２（キット添付）を用いたＰＣＲを行い、約０．５ｋｂのＰＣＲ増幅断片を取得した。増幅したＤＮＡ断片のシーケンスをプライマー２とプライマーＣ２を用いて行い、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子の部分配列を解析した。得られた塩基配列を基にプライマーを構築し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  キットによりα−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子を含む５５３６ｂｐの塩基配列を決定した。
【００４４】
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、決定した塩基配列を基にデザインしたプライマー３（配列番号７）及びプライマー４（配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはLA Taq（タカラバイオ）を用い、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で３分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で２分間保温した。増幅した４．０ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素SpeＩ及びSalＩ処理し、同様にXbaＩ及びSalＩ処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）と結合反応を行い、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）を形質転換した。形質転換体から抽出したα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を含むプラスミドを用いて、アルカリプロテアーゼを欠損させた枯草菌ＩＳＷ１２１４株（ヤクルト本社）を形質転換した。
【００４５】
実施例４  α-１，３−グルカナーゼ（Ｃ２）遺伝子のクローニング
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ３５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２０）の生産するムタナーゼ、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２１）の生産するムタナーゼ、及びバチルス  エスピー  ＲＭ１株の生産するムタナーゼ（特開平１０−２０１４８３号報）との同一性領域を基にプライマー５（配列番号９）、プライマー６（配列番号１０）をデザインした。
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株の染色体を鋳型に、デザインしたプライマー５及びプライマー６を用いてＰＣＲを行い、約１．３ｋｂの増幅断片を取得した。ＰＣＲはLA Taqを用い、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で３分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で２分間保温した。増幅したＤＮＡ断片のシーケンスをプライマー５及びプライマー６を用いて行い、α−１，３−グルカナーゼ遺伝子の部分配列を解析した。得られた塩基配列を基にプライマーを構築し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  キットによりα−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子を含む５４５２ｂｐの塩基配列を決定した。
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ１２６株染色体ＤＮＡを鋳型とし、決定した塩基配列を基にデザインしたプライマー７（配列番号１１）及び８（配列番号１２）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で４分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で２分間保温した。増幅した４．５ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素BamHＩ 及びSalＩ処理し、同様にBglII及びSalＩ処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫと結合反応を行い、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体から抽出したα−１，３−グルカナーゼ遺伝子を含むプラスミドを用いて、アルカリプロテアーゼを欠損させた枯草菌ＩＳＷ１２１４株を形質転換した。
【００４６】
実施例５  組換えα-１，３−グルカナーゼの生産
実施例３，４で得られた形質転換株を８％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、１％魚肉エキス、０．５％酵母エキス、０．２％リン酸カリウム、０．０４％硫酸マグネシウムからなる培地（５０ｍＬ）に接種し３０℃、３日間振盪培養を行った。そのときのα−１，３−グルカナーゼＣ１及びＣ２の生産量は、それぞれ０．０２Ｕ／ｍＬ、０．０１６Ｕ／ｍＬであった。
【００４７】
参考例  α-１，３−グルカナーゼ活性測定法
５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．５ｍＭ  塩化マンガン、０．２％ムタンからなる反応液に適当に希釈した酵素液を添加し、４０℃、１時間恒温した（全量１ｍＬ）。１ｍＬのＤＮＳ試薬[０．５％(w/v)ジニトロサリチル酸、０．４Ｎ  水酸化ナトリウム、３０％酒石酸ナトリウム・カリウム]を添加した後、１００℃で５分間恒温し、生成された還元糖を定量した。本実施例におけるα−１，３−グルカナーゼ１単位（ユニット）は、特に記載のない限り、上記反応条件下で１分間に１μmoLのグルコースに相当する還元糖を生成する量とした。
【配列表】
2006136283000001.app