(57)【要約】【課題】ＣＡＰ１１（１１ｋＤａの塩基性抗菌ポリペプチド）を有効成分とする新規な剤を提供すること。【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのダイマーを有効成分とする、アナンダミド生成の抑制剤。「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのダイマー」は、配列番号１におけるアミノ酸番号４１のシステイン残基間でジスルフィド結合が形成されているものであることが望ましい。またアナンダミド生成は、細胞によるアナンダミド生成であること望ましい。またアナンダミド生成は、リポポリサッカライドにより惹起されるアナンダミド生成であることが望ましい。この剤は、医学・細胞生物学等の試験試薬のみならず、エンドトキシンショックの予防剤、悪化防止剤、軽減（症状の改善）剤、治療剤等としても利用しうる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのダイマーを有効成分とする、アナンダミド生成の抑制剤。
【請求項２】
「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのダイマー」が、配列番号１におけるアミノ酸番号４１のシステイン残基間でジスルフィド結合が形成されているものであることを特徴とする、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
アナンダミド生成が、細胞によるアナンダミド生成である、請求項１又は２に記載の抑制剤。
【請求項４】
アナンダミド生成が、リポポリサッカライドにより惹起されるアナンダミド生成である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアナンダミドの生成を抑制する新規な剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書中で用いた略号について説明する。
ＣＡＰ１１：１１ｋＤａの塩基性抗菌ポリペプチド（cationic antibacterial polypeptide of 11kDa）
ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーター（fluorescence-activated cell sorter）
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清（fetal calf serum）
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography）
ＬＰＳ：リポ多糖（lipopolysaccharide）。エンドトキシン（endotoxin）ともいう。
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline）
Ｓ−Ｓ結合：ジスルフィド結合（disulfide bond）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）
ＣＡＰ１１はモルモットの好中球から見いだされた抗菌性ポリペプチドであり、アミノ酸４３個からなるペプチド同士がＳ−Ｓ結合で繋がったホモダイマーである（非特許文献１）。そしてＣＡＰ１１は、グラム陽性菌、陰性菌に対して強い殺菌作用を示すだけでなく、グラム陰性菌ＬＰＳの生物活性を中和することが知られている（非特許文献２及び３）。
【０００３】
【非特許文献１】ヨモギダ、Ｓ．（Yomogida, S.）ら，１９９６年，Archives of Biochemistry and Biophysics，第３２８巻, p.２１９−２２６
【非特許文献２】ナガオカ、Ｉ．（Nagaoka, I）ら，２０００年，Inflammation Research，第４９巻，ｐ７３−７９
【非特許文献３】ナガオカ、Ｉ．（Nagaoka, I）ら，２００１年，Journal of Immunology，第１６７巻，ｐ３３２９−３３３８  またアナンダミド（anandamide）は不飽和脂肪酸のエタノールアミドであり、脳、精巣、脾臓等に存在する「マリファナの有効成分のカンナビノイド受容体」の内因性リガンドとして単離同定されたものである。この物質は、電気刺激による輸精管収縮を阻害したり、全身投与により体温降下、運動低下、カタレプシー等が認められることが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＣＡＰ１１を有効成分とする新規な剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＣＡＰ１１がアナンダミドの生成を抑制する作用を有することを見い出し、本発明に至った。
【０００６】
すなわち本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのダイマー（ＣＡＰ１１）を有効成分とする、アナンダミド生成の抑制剤（以下、「本発明抑制剤」という。）を提供する。
このＣＡＰ１１は、配列番号１におけるアミノ酸番号４１のシステイン残基間でＳ−Ｓ結合が形成されているものが好ましい。また、このアナンダミド生成は、細胞によるアナンダミド生成であることが好ましい。またこのアナンダミド生成は、ＬＰＳにより惹起されるアナンダミド生成であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明抑制剤は、これによりアナンダミドの生成を抑制できることから、医学・細胞生物学等の試験試薬のみならず、エンドトキシンショックの予防剤、悪化防止剤、軽減（症状の改善）剤、治療剤等としても利用することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
【０００９】
本発明抑制剤は、ＣＡＰ１１を有効成分とする、アナンダミド生成の抑制剤である。ＣＡＰ１１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのダイマーである。
【００１０】
本発明抑制剤の有効成分である「ＣＡＰ１１」の製造方法は特に限定されず、例えば、モルモットの好中球から抽出されたものを用いてもよく、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡやＲＮＡ）を用いて遺伝子工学的に製造したものをベースにしてもよく、また、配列番号１に記載のアミノ酸配列に従って化学的に合成したものをベースにしてもよい。
【００１１】
そして、配列番号１で示されるペプチド鎖（ＣＡＰ１１を構成するペプチドの単量体（モノマー））が得られた場合には、そのモノマーを酸化して二量体化することで、ＣＡＰ１１を得ることができる。このＣＡＰ１１は、配列番号１で示されるアミノ酸４３個からなるペプチドが、アミノ酸番号４１のシステイン残基においてＳ−Ｓ結合を形成しているホモダイマーであることが好ましい。
ここにいう「ＣＡＰ１１を構成するペプチドのモノマー」の化学合成は、例えば液相合成法や固相合成法等（泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇  道典、「ペプチド合成の基礎と実験」1985、丸善（株）参照）により製造することができる。
【００１２】
製造された「ＣＡＰ１１を構成するペプチドのモノマー」や、ＣＡＰ１１は、タンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって精製することができる。具体的には、例えば抽出、再結晶、硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配等や、これらの組合せ等の処理操作が挙げられる。
【００１３】
製造された「ＣＡＰ１１を構成するペプチドのモノマー」や、ＣＡＰ１１は、例えば塩酸やメタンスルホン酸等の酸で加水分解して公知の方法でアミノ酸組成を調べることができ、これによって「ＣＡＰ１１を構成するペプチドのモノマー」やＣＡＰ１１が正しく製造されたか否かを確認することができる。
【００１４】
より厳密には、製造されたペプチドのアミノ酸配列を、公知のアミノ酸配列決定法（例えばエドマン分解法等）で決定することにより、「ＣＡＰ１１を構成するペプチドのモノマー」や、ＣＡＰ１１が正しく製造されたか否かを確認することができる。
【００１５】
なお、本発明抑制剤の有効成分であるＣＡＰ１１には、塩の形態も包含される。本発明抑制剤を医薬用途として用いる場合には、この塩は、薬学的に許容される塩であることが好ましい。
【００１６】
ＣＡＰ１１は、酸付加により塩を形成しうる。このような塩としては、例えば無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）または有機カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸など）、グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸等の酸性糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩類、アルギン酸等の酸性多糖、または有機スルホン酸（メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸など）等が例示される。これらの塩のうち、薬学的に許容される塩が好ましい。
【００１７】
またＣＡＰ１１は、塩基性物質との塩を形成しうる。このような塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、又はジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩等の有機塩基との塩等が例示される。これらの塩のうち、薬学的に許容される塩が好ましい。
本発明抑制剤は、細胞、なかでも血球系の細胞（特に、マクロファージ）によるアナンダミド生成を抑制する。この抑制対象となるアナンダミド生成は、ＬＰＳにより惹起されるアナンダミド生成であることが好ましい。
【００１８】
本発明抑制剤は少なくともＣＡＰ１１が含有されていればよい。例えば本発明抑制剤は、ＣＡＰ１１のみから構成されていてもよく、またＣＡＰ１１及びその他の成分とからなる組成物の形態であってもよい。
【００１９】
本発明抑制剤は、実験用試薬として使用することができるほか、アナンダミド生成の抑制を目的とした医薬等としても使用することができる。例えば、エンドトキシンショックにおけるアナンダミド生成抑制等を目的としてもよい。
本発明抑制剤を医薬として用いる場合、ＣＡＰ１１に加え、医薬分野で用いることができる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等を含有させることもできる。また本発明抑制剤を医薬として用いる場合には、その処置の目的に応じて、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）、点眼、点入、経皮、経口、吸入等、適宜投与方法を選択することができる。また投与方法に応じて注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、眼軟膏剤、座剤、ペッサリー等の剤形を適宜選択し、製剤化することができる。
【００２０】
本発明抑制剤を医薬として用いる場合の投与量は、投与の目的（予防、維持(悪化防止)、軽減(症状の改善)または治療）、アナンダミド生成の抑制を意図する疾患の種類、患者の症状、性別、年令、投与方法等によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、例えば、エンドトキシンショックにおけるアナンダミド生成の抑制を目的とする静脈内注射剤とする場合、成人１人１回あたり、ＣＡＰ１１の量として１ｍｇ〜１０ｍｇを目安とすることができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜１＞ＣＡＰ１１等の調製
順天堂大学医学部中央機器分析室に委託して、配列番号１に示される「ＣＡＰ１１を構成するペプチドのモノマー」（アミノ酸４３個からなり、Ｓ−Ｓ結合を有しないもの）を、固相合成法（Fmoc／PyBop（benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate）法）により製造した。以下、この物質を単に「モノマー」と表記する。
【００２２】
ＣＡＰ１１は、モノマーを0.5Ｍグアニジン塩酸塩を含有するトリス緩衝液に溶解し、これに400μＭの酸化型グルタチオンを添加して２〜３日間室温で静置して酸化誘導を行い二量体化することにより製造した。これをカプセルパックC18カラム（資生堂ファインケミカル社製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、水とアセトニトリルによる直線濃度勾配によって溶出、精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量が約１１ｋＤａであることを確認してから、以下の薬効薬理試験に用いた。この方法で調製されたＣＡＰ１１は、配列番号１で示されるアミノ酸４３個からなるペプチドが、アミノ酸番号４１のシステイン残基においてＳ−Ｓ結合を形成しているホモダイマーである。
＜２＞薬効薬理試験
１．細胞及び培養液中におけるアナンダミド量の測定
マクロファージ系細胞RAW264.7を、直径150mmのディッシュで２日間培養した。その後細胞を無血清のRPMI-1640培地（SIGMA-ALDRICH社製）で洗浄し、次いで以下の物質を含有するRPMI-1640培地（２％  ＦＣＳを含有する）中、３７℃で２時間培養した。
（１）無処理（n=3）
（２）終濃度10 ng/mlのLPS（n=6）
（３）終濃度10 ng/mlのLPS及び終濃度100 ng/mlのＣＡＰ１１（n=3）
（４）終濃度10 ng/mlのLPS及び終濃度1 μg/mlのＣＡＰ１１（n=3）
細胞と培養液を回収し、各サンプルについて５ｍｌの懸濁液を各４本ずつ作成した。これらそれぞれに１８．７５ｍｌのクロロホルム／メタノール混合液（１：２（ｖ／ｖ））を添加した後３０秒間撹拌し、次いでさらにそれぞれ６．２５ｍｌのクロロホルムを添加して３０秒間撹拌した。次いでこれらそれぞれに６．２５ｍｌの水を添加して、４℃下、１０００ｘｇで１５分間遠心分離した。
【００２３】
遠心分離後、有機溶媒相を回収し、窒素流下で乾燥させた。乾燥後の残存物を１ｍｌのクロロホルムに再溶解させ、新しい１．５ｍｌのチューブに移した後、再度窒素流下で乾燥させた。
【００２４】
乾燥後の残存物を４０μｌのアセトニトリルに溶解させ、逆相クロマトグラフィー（８０％アセトニトリル、イソクラティック）に付した。アナンダミドのリテンションタイム（既に確認済み）に対応する画分を回収し、窒素流下で乾燥させた。乾燥後の残存物を50μlのアセトニトリルに再溶解させ、等量の4-(N-chloroformylmethyl-N-methyl) amino-7-N,N-dimethylaminosulphonyl-2,1 ,3- benzoxadiazole (DBD-COCl)のアセトニトリル溶液（10mM）を加え60℃で2時間インキュベーションし、蛍光誘導体化した。      
誘導体化したアナンダミドをTSK-GEL ODS-80Ts（東ソー社製）を用いた逆相HPLCに付し、励起:450nm、検出:560nmに設定した蛍光検出器で分析を行った。
測定されたアナンダミド量は、無刺激の細胞（前記（１）のサンプル）の生成量に対する比として算出した。結果を図１に示す。なお図１中の「resting」は前記（１）のサンプル、「LPS」は前記（２）のサンプル、「＋ＣＡＰ１１  １００ ng/ml」は前記（３）のサンプル、「＋ＣＡＰ１１  １μg/ml」は前記（４）のサンプルをそれぞれ示す。図１より、ＣＡＰ１１は、ＬＰＳによって惹起されるアナンダミドの生成量を抑制することが示された。またこの抑制は、ＣＡＰ１１の用量に依存するものであることも示された。
２．細胞上のＣＤ１４に対するＬＰＳの結合量の測定
マクロファージ系細胞RAW264.7を、直径100mmのディッシュで２日間培養した。その後、細胞を氷冷したＰＢＳで剥がし、回収した。次いで細胞を以下の物質を含有するRPMI-1640培地（SIGMA-ALDRICH社製、10％  ＦＣＳを含有する）に1×１０６個の濃度で懸濁し、３７℃で１０分間前処理した。
(1)無処理
(2)無処理
(3)終濃度100 ng/mlのＣＡＰ１１
(4)終濃度1μg/mlのＣＡＰ１１
(5)終濃度4μg/mlの抗ＣＤ１４中和抗体（BD PharMingens社製）
処理後、上記（１）を除く各サンプルに終濃度100 ng/mlのAlexa標識されたＬＰＳ（Molecular Probes社製）を添加し、さらに３７℃で１５分間処理した。その後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳで解析した。解析に用いた細胞のポピュレーションを図２に（図２中の丸で囲ったもの）、解析結果を図３に示す。図３中の横軸はＡｌｅｘａの蛍光強度を、縦軸は細胞数を示す。
【００２５】
図３より、ＣＡＰ１１は、細胞上のＣＤ１４に対するＬＰＳの結合を抑制することが示された（図２中の（２）と（４）の対比）。また、この抑制は、ＣＡＰ１１の用量に依存するものであることも示された（図２中の（３）と（４）の対比）。さらに、観察されたＬＰＳの結合はＣＤ１４を介していることが示された（図２中の（２）と（５）の対比）。
【００２６】
以上の結果から、エンドトキシンショックに対するＣＡＰ１１の防御メカニズムの一つとして、ＣＤ１４へのＬＰＳの結合阻害と、これによるアナンダミドの生成抑制が関与することが示唆された。
＜５＞製剤例
以下に本発明抑制剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、これらに限定されるものではない。
（１）注射剤
ＣＡＰ１１                   １０ｍｇ
上記成分を５％マンニトール水溶液２ｍＬに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプルに入れて密封した。
（２）用時溶解用注射剤
(A)ＣＡＰ１１（凍結乾燥体）  １０ｍｇ（アンプルに封入した）
(B)無菌濾過したＰＢＳ   ２ｍＬ（アンプルに封入した）
上記(A)および(B)を１セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には(A)を(B)で溶解して用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＣＡＰ１１による、細胞のアナンダミド生成（ＬＰＳにより惹起）の抑制を示す図である。
【図２】ＦＡＣＳ解析に用いた細胞のポピュレーションを示す図である。
【図３】ＣＡＰ１１による、細胞上のＣＤ１４に対するＬＰＳの結合抑制を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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