(57)【要約】【課題】  感作性物質の新規は評価方法の提供。【解決手段】  本発明は、CCR7、IL-23及び／又はATF-3を発現する細胞と、感作性物質を含有すると予想される被験試料とをインキュベートし、該細胞によるCCR7、IL-23及び／又はATF-3の発現を検出することを特徴とする感作性物質のインビトロ評価方法またはスクリーニング方法を提供する。本発明はさらに、CCR7、IL-23及び／又はATF-3を発現する細胞と、感作性物質と被験物質とを一緒にインキュベートし、該細胞によるCCR7、IL-23及び／又はATF-3の発現を検出することを特徴とする、該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト単核球細胞と、感作性を含有すると予想される被験試料とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞によるCCR7、IL-23及び／又はATF-3の発現を検出することを特徴とする、感作性物質のインビトロ評価方法又は、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記被験試料とインキュベートされた前記細胞によるCD86分子の発現を検出する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト単核球細胞がTHP-1細胞である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ヒト単核球細胞と、感作性物質と被験物質とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞によるCCR7、IL-23及び／又はATF-3の発現を検出することを特徴とする、該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法。
【請求項５】
前記被験試料とインキュベートされた前記細胞によるCD86分子の発現を検出する工程をさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト単核球細胞がTHP-1細胞である、請求項４又は５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感作性物質のインビトロ評価法、及び感作性物質を活性化又は抑制する物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体においてアレルギー等を誘発する物質（感作性物質）を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、そして該実験動物の皮膚などに生ずる反応を視察しる方法が行われている。しかしながら、この方法は動物愛護等の見地から見直しがせまられている。
【０００３】
外来物質によりアレルギー反応が惹起される最初の段階では、抗原提示細胞が感作性物質に暴露されると、抗原は該細胞により従属リンパ節に運ばれる。そこで、該細胞は、その細胞表面に抗原を担持したMHCクラスIIタンパク質や、CD86分子などを発現し、T細胞に抗原提示を行う。これにより、抗原特異的な獲得性免疫応答が成立する。この一連の過程では、該細胞は多くのサイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-12など）やケモカイン（MIP-1αやMIP-1β、RANTESなど）を産生することで、活性化し、従属リンパ節への遊走が可能になる。このような抗原提示細胞としては樹状細胞やヒト単核球細胞株が知られている。しかしながら、樹状細胞の性質には個人差があり、また再現性に問題があり、一定の特性を有する樹状細胞を安定的に入手することが困難である。また、樹状細胞はその調製に困難さが伴う。
【０００４】
他方、ヒト単核球細胞株は細胞の取扱いは、比較的容易であり、現時点ではヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、該細胞表面に感作性物質の量や特性を反映してCD86分子が発現されることが明らかとなっている。特開特開２００１−２２１７９６号公報はCD86の発現を指標とする感作性物質のインビトロ評価方法を開示する。しかしながら、アレルギー物質の中には、例えば金属ニッケルやコバルトのように、ヒト単核球細胞株に作用させてもCD86の発現を亢進させないものもあり、CD86の発現を指標とするインビトロ評価方法による判定結果は、インビボ評価法の結果と必ずしも一致しない場合がある。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−２２１７９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、取扱いが容易であり、安定して入手可能な培養細胞を用いて感作性物質をインビトロで評価する方法であって、CD86分子以外の分子の発現を指標とし、任意的にCD86分子を用いたインビトロ感作性物質評価方法と併用して用いることで、インビトロにおける感作性物質評価方法の精度を向上させる手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、種々検討した結果、ヒト単核球細胞株に感作性物質を作用させた場合、感作性物質の量や特性に反映してCCR7、IL-23及び／又はATF-3分子が発現されることを見出し、本発明を完成させた。CCR7は、ケモカインレセプターの一つであり、活性化した樹状細胞表面に発現しているタンパク質であり、樹状細胞の所属リンパ節への遊走に関与している。IL-23は、樹状細胞などで発現しているサイトカインの一種であり、メモリーT細胞やナイーブT細胞の増殖に関与している。ATF-3は、多くの細胞でUVなどのストレスに応答して発現する転写因子である。
【０００８】
従って、本発明は第一の観点において、ヒト単核球細胞と、感作性を含有すると予想される被験試料とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞によるCCR7、IL-23及び／又はATF-3の発現を検出することを特徴とする、感作性物質のインビトロ評価方法又は、スクリーニング方法を提供する。好適な態様において、かかる感作性物質のインビトロ評価方法またはスクリーニング方法は、上記被験試料とインキュベートされた前記細胞によるCD86分子の発現を検出する工程をさらに含む。
【０００９】
本発明は第二の観点において、ヒト単核球細胞と、感作性物質と被験物質とを一緒にインキュベートし、該ヒト単核球細胞によるCCR7、IL-23及び／又はATF-3の発現を検出することを特徴とする、該被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法を提供する。好適な態様において、かかる被験物質が該感作性物質に対する活性化剤又は抑制剤であるか否かを評価する方法又はスクリーニング方法は、該感作性物質及び被験物質とインキュベートされた上記細胞によるCD86分子の発現を検出する工程をさらに含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、インビトロによる感作性物質評価方法の精度を一層向上させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のCCR7、IL-23及び／又はATF-3を発現する細胞としては、感作性物質の特性を反映して該細胞からCCR7、IL-23及び／又はATF-3物質を発現するものであれば特に限定されないが、好適な具体例としてTHP-1細胞が挙げられる。この細胞は樹立された培養細胞であって、当業界の研究者により広く用いられており、容易に入手することができる。具体的には、THP-1細胞は公的な細胞バンクまたは民間企業より入手することができる。より好適な態様において、本発明に係る細胞は感作性物質の特性を反映して該細胞からCCR7、IL-23及び／又はATF-3を発現し、しかも、その細胞表面にCD86分子を発現する細胞を使用する。
【００１２】
本発明のヒト単核球細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を使用することができるが、例えば具体例としてRPMI1640培地、DMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ１０％程度のウシ胎児血清を添加することが必要である。
【００１３】
感作性物質の評価又はスクリーニングにおいては、培地中の上記ヒト単核球細胞に被験物質を加え、例えばCO2インキュベーター中で、３７℃にて２〜７２時間、例えば２〜１８時間培養（インキュベーション）を行う。CCR7、IL-23及び／又はATF-3を発現する細胞の初期濃度は１×105〜1×106細胞／mLが好ましい。この場合、好ましくは、被験物質を加えないで、上記の同様の培養を行い、対照とする。また、感作性物質を阻害又は活性化する物質の評価又はスクリーニングにおいては、培地中のCCR7、IL-23及び／又はATF-3を発現する細胞に、既知の感作性物質と被験物質とを加えて、上記条件で培養（インキュベーション）を行う。この場合も、好ましくは、被験物質を加えないで上記と同様の培養を行い、対照とする。
【００１４】
培養（インキュベーション）が終了した後、CCR7、IL-23及び／又はATF-3を検出又は測定する。CCR7、IL-23及び／又はATF-3の検出又は測定方法は、CCR7、IL-23及び／又はATF-3分子を発現する細胞における遺伝発現を検出する定量的又は定性的RT-PCR法、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の方法を用いることができる。また、CCR7については、CCR7に対する抗体との反応性に基づくフローサイトメトリー法等の方法を用いることができ、IL-23については、IL-23に対する抗体との反応性に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング等の方法を用いることができる。測定については、操作の簡便性、感度、設備等の点からCCR7、IL-23、ATF-3を発現する細胞から発現されるCCR7、IL-23、ATF-3をコードする遺伝子、例えば、対応のmRNAをRT-PCR法で測定するのが好ましい。
【００１５】
CCR7、IL-23、ATF-3の発現の測定においては、上記の細胞を常法に従って破壊し、常法に従ってＲＮＡを調製し、このＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、CCR7、IL-23、ATF-3をコードする遺伝子、並びに内部標準として、GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子、またはβ-アクチン遺伝子に対して特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅の検出を行えばよい。
【００１６】
本発明の具体例としては、例えば、CCR7の発現を測定するためには、CCR7をコードするＤＮＡの５′−末端側領域である図１（配列番号１）に示す塩基配列において、□で囲った部位（配列番号２：5'-gattacatcggagacaacacc-3'  ）に対応するオリゴヌクレオチドをフォーワードプライマーとして用い、一本下線を付した部位（5'-cgactcttctgcctggacta-3'）に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号３：5'-tagtccaggcagaagagtcg-3'）をリバースプライマーとして用いることができる。
【００１７】
また、IL-23の発現の測定のためには、IL-23をコードするＤＮＡの５′−末端側の領域である図２（配列番号４）に示す塩基配列において、□で囲った部位（配列番号５：5'-aagtggaagtgggcagagattc-3'）に対応するオリゴヌクレオチドをフォーワードプライマーとして用い、一本下線を付した部位（5'-agactcagcagattccaagcct-3'）に示す塩基配列に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号６：5'-aggcttggaatctgctgagtct-3'）をリバースプライマーとして用いた。
【００１８】
また、ATF-3の発現の測定のためには、ATF-3をコードするＤＮＡの５′−末端側の領域である図３（配列番号７）に示す塩基配列において、□で囲った部位（配列番号８：5'-gattttgctaacctgacgccct-3'）に対応するオリゴヌクレオチドをフォーワードプライマーとして用い、一本下線を付した部位（5'-gtgtattgtccgggctcagaat-3'）に示す塩基配列に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号９：5'-attctgagcccggacaatacac-3'）をリバースプライマーとして用いることができる。
【００１９】
また、GAPDHの発現の測定のためには、GAPDHをコードするＤＮＡの５'−末端側の領域である図４（配列番号：１０）に示す塩基配列において、□で囲った部位（配列番号１１：5'-gaaggtgaaggtcggagtc-3'）に対応するオリゴヌクレオチドをフォーワードプライマーとして用い、一本下線を付した部位（5'-gaaatcccatcaccatcttc-3'）に示す塩基配列に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号１２：5'-gaagatggtgatgggatttc-3'）をリバースプライマーとして用いた。
【００２０】
培養（インキュベーション）が終了した後のCCR7、IL-23、ATF-3を発現する細胞によるCD86の発現の検出又は測定を併用する本発明の好適な態様において、CD86の検出又は測定方法は特に限定されないが、抗−ヒトCD86抗体を用いた免疫測定が好ましく、フローサイトメトリー法が特に好ましい。抗−ヒトCD86抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、CD86を表面に発現している細胞を免疫原として用いた常法に従って調製することができる。フローサイトメトリー法も常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて5×105細胞/ｍLに調製し、6穴プレートに2mL/wellずつ播種した。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈した。被験物質で処理した細胞はCO2インキュベーター中で2及び18時間培養し、培養後の培養液を遠心分離し、遠心分離後の細胞をＰＢＳ（−）により洗浄し、１mlのイソゲン（Ｉｓｏｇｅｎ）（ニッポンジーン社）により細胞を破壊し、プラスチックチューブに回収した。この細胞破壊物を用いて、次のようにしてＲＮＡを調製し、さらにｃＤＮＡを合成した。
細胞破壊物に０．２mlのクロロホルムを加え、撹拌後、室温に２〜３分間静置したのち、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。上部の水層にＲＮＡが含まれるのでこれを採取し、０．５mlのイソプロパノールを加え室温に５〜１０分間静置した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。生じた沈殿に１mlの７５％エタノールを加え撹拌後１２，０００×ｇで５分間遠心した。沈殿を風乾し、滅菌水に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
【００２２】
ＲＮＡ試料１μｇ、GeneAmp RNA PCR kit（Applied Biosystems社）に付属された試薬（ランダムヘキサマー、RNaseインヒビター、逆転写酵素（ＭｕＭＬＶ−ＲＴ）、10×PCRバッファーII、dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を３７℃、１時間反応させることにより、ｃＤＮＡを合成する。
【００２３】
次に、CCR7の発現については、フォーワードプライマーとして配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲにより遺伝子の発現量を測定した。
【００２４】
また、IL-23の発現量の測定については、フォーワードプライマーとして配列番号５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、CCR7と同様にＰＣＲ法により行った。
【００２５】
さらに、ATF-3の発現量の測定については、フォーワードプライマーとして配列番号８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた、CCR7と同様にＰＣＲ法により行った。
CCR7、IL-23、ATF-3の発現量の結果を図５に示す。
【００２６】
実施例２
本発明の方法と従来技術の方法との比較をいくつかの被験物質について、実施例1に記載した本発明の方法（CCR7法）、（IL-23法）、（ATF-3法）と従来技術である（CD86法）、文献によるGunea Pig Maximaization法（GPMT法）、Local Lymph Node Assay法（LLNA法）、さらにヒトアレルギーに関する文献データと比較した。結果を表１に示した。
【表１】
2006136215.tif 000002
【００２７】
実施例３
本発明の方法（CCR7法）、（IL-23法）、（ATF-3法）、従来技術である方法（CD86法）、またはCCR7法、IL-23法、ATF-3法とCD86法を組合せた方法（CCR7＋IL-23＋ATF-3＋CD86法）についてヒトアレルギーに関する文献データとの相関をそれぞれ比較した。CCR7＋IL-23＋ATF-3＋CD86法は、いずれかが陽性となれば、陽性と判断する方法であり、表２に示す結果が得られた。表中、インビトロ結果とインビボデータとが一致しているものを○で囲った。
【表２】
2006136215.tif 000003
【００２８】
CD86（CD86法）に関しては、試験した９種の化合物のうち、５種がインビボデータと一致した。詳しくは、CD86 インビトロ評価法によれば、インビボデータで陽性とされた化合物８種のうち４種（DCNB、pPD、ホルムアルデヒド、HgCl2）が同様に陽性と判定され、インビボデータで陰性とされた化合物（SDS）については、同様に陰性と判定された。
CCR-7（CCR7法）に関しては、試験した９種の化合物のうち、インビボデータで陽性とされた化合物８種のうち５種（DCNB、Ni、Co、HgCl2、o-アミノフェノール）の化合物が同様に陽性と判定され、インビボデータで陰性とされた化合物（SDS）については、同様に陰性と判定された。
Il-23（IL-23法）に関しては、試験した９種の化合物のうち、インビボデータで陽性とされた化合物８種のうち４種（pPD、Ni、Co、HgCl2）が同様に陽性と判定され、インビボデータで陰性とされた化合物（SDS）については、同様に陰性と判定された。
ATF-3（ATF-3法）に関しては、試験した９種の化合物のうち、インビボデータで陽性とされた化合物８種のうち６種（DCNB、pPD、Ni、Co、HgCl2、o-アミノフェノール）が同様に陽性と判定され、インビボデータで陰性とされた化合物（SDS）については、同様に陰性と判定された。
従って、CCR-7、IL-23及びATF-3のいずれかを指標とすることで、CD86を指標とするインビトロ評価方法とほぼ同程度のレベルで、感作性物質を評価・スクリーニングできることが明らかとなった。
【００２９】
CCR-7、IL-23、ATF‐3及びCD86の結果の組合せによる判定（CCR7＋IL-23＋ATF-3＋CD86法）に関しては、試験した９種の化合物のうち、８種がインビボデータと一致した。詳しくは、組合せインビトロ評価法によれば、インビボデータで陽性とされた化合物のうちペニシリンＧを除く８種の化合物が同様に陽性と判定され、またインビボデータで陰性とされた化合物（SDS）については、同様に陰性と判定された。従って、CD86を指標とするインビトロ評価法にCCR-7、IL-23、ATF‐3を指標とする評価法を組合せることで、精度の一層向上された感作性物質の評価・スクリーニングができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヒトCCR7 mRNA 遺伝子配列(配列番号1) （GenBank ACCESSION No. NM_001838）。
【図２】ヒトIL‐23  mRNA 遺伝子配列(配列番号４)（GenBank ACCESSION No. AY359083）。
【図３】ヒトATF‐3  mRNA 遺伝子配列(配列番号７) （GenBank ACCESSION No. L19871）。
【図４】ヒトGAPDH mRNA 遺伝子配列(配列番号１０) （GenBank ACCESSION No. BC025925）。
【図５】RT-PCRによるCCR7、IL-23、ATF-3の発現量の結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2006136215.tif 000007
【図５】
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【配列表】
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