(57)【要約】【課題】悪性腫瘍の転移性を抑制する等のＴＭＳ活性を保持するＴＭＳ誘導体を提供する。【解決手段】本発明は、原化合物の活性の一部分又は全てを有するトリメチルスフィンゴシン誘導体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式；
ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ（Ｎ（ＣＨ３）３）−Ｃ≡Ｃ−ＣＨＸＹ
（式中、
（ａ）Ｘはハロゲンであり、
（ｂ）Ｙは末端にカルボキシル基およびメチルエステル基を有さない炭素数１３の脂肪族炭化水素である）
で表され、以下に示す特徴
（i）タンパク質キナーゼ−Ｃ阻害活性を有する
（ii）血小板活性化を抑制する
（iii）悪性腫瘍の転移を抑制する
を有する化合物。
【請求項２】
前記Ｙは末端に置換基を有さない請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記炭素数１３の脂肪族炭化水素が非置換体である、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が下記式で表される５−フルオロ−ＴＭＳである、請求項１記載の化合物。
【化１】
2006169231.tif 000003
【請求項５】
下記の一般式；
ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ（Ｎ（ＣＨ３）３）−ＣＯＨ−Ｃ≡ＣＹ
（式中、
（ａ）Ｙは末端にカルボキシル基およびメチルエステル基を有さない炭素数１３の脂肪族炭化水素である）
で表され、以下に示す特徴
（i）タンパク質キナーゼ−Ｃ阻害活性を有する
（ii）血小板活性化を抑制する
（iii）悪性腫瘍の転移を抑制する
を有する化合物。
【請求項６】
前記Ｙは末端に置換基を有さない請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記炭素数１３の脂肪族炭化水素が非置換体である、請求項５記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物が下記式で表される４−アルキン−ＴＭＳである、請求項５記載の化合物。
【化２】
2006169231.tif 000004
【請求項９】
下記の一般式；
ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ（Ｎ（ＣＨ３）３）−ＣＯＨ―ＣＨ２―ＣＨ２Ｙ
（式中、
（ａ）Ｙは末端にカルボキシル基およびメチルエステル基を有さない炭素数１３の脂肪族炭化水素である）
で表され、以下に示す特徴
（i）タンパク質キナーゼ−Ｃ阻害活性を有する
（ii）血小板活性化を抑制する
（iii）悪性腫瘍の転移を抑制する
を有する化合物。
【請求項１０】
前記Ｙは末端に置換基を有さない請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
前記炭素数１３の脂肪族炭化水素が非置換体である、請求項９記載の化合物。
【請求項１２】
前記化合物が下記式で表されるジヒドロ−トリメチル−ＴＭＳである、請求項９記載の化合物。
【化３】
2006169231.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質キナーゼ−Ｃ（ＰＫ−Ｃ又はＰＫＣ）活性に対して十分な影響を及ぼすＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン（ＴＭＳ）誘導体及び類似体に関する。ＴＭＳ誘導体は、腫瘍細胞の侵入性、転移性、トランスエンドセリアル細胞移動及び血小板活性を阻害する。ＴＭＳ誘導体は、好中球及び他の血液細胞の炎症反応を阻害し、好中球のＯ2-生成、ファゴキネシス及びトランスエンドセリアル細胞移動を阻害する。また、ＴＭＳ誘導体は、細胞、特に血小板に対して保護効果を示し、したがって、保存剤として有用である。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴシン（ＳＰＮ）は、細胞膜や、神経組織において高濃度で見出される式Ｃ18Ｈ37Ｏ2Ｎで表される長鎖不飽和アミノアルコールである。スフィンゴシン及びスフィンゴイド塩基（末端に１，３−ジヒドロキシ−２−アミノ基を含有する長鎖脂肪族塩基及びその誘導体）は、タンパク質キナーゼ−Ｃのインヒビタ及びＥＧＦレセプター関連チロシンキナーゼ（ＥＧＦ−ＲＫ）のモジュレーターとして関与している（Ｈａｎｎｕｎ及びＢｅｌｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、６７０、１９８７年；Ｈａｎｎｕｎ、ＪＢＣ、２６１、１２６０４、１９８６年； Ｋｒｅｕｔｔｅｒ等、ＪＢＣ、２６２、１６３２、１９８７年）。
タンパク質キナーゼ−Ｃ活性は細胞成長と密接に関連しており、最近の研究では、腫瘍形成の増加は、ある種の実験腫瘍においてＰＫ−Ｃβ１及びＰＫ−Ｃγの過発現と相関があることが分かった（Ｈｏｕｓｅｙ等、Ｃｅｌｌ、５２、３４３、１９８８年； Ｐｅｒｓｏｎｓ等、Ｃｅｌｌ、５２、４４７、１９８８年）。
変異体ＰＫ−Ｃαは、転移性が増加した高度に悪性な腫瘍細胞を誘発する（Ｍｅｇｉｄｉｓｈ及びＭａｚｕｒｅｋ、Ｎａｔｕｒｅ、３２４、８０７、１９８９年）。ＰＫ−Ｃの異常発現は、腫瘍の進行と関係があるかもしれないと思われるであろう。
【０００３】
最近の研究では、リン脂質、スフィンゴ脂質及びそれらの代謝生成物がＰＫ−Ｃ並びにＥＧＦレセプター関連チロシンキナーゼ（Ｈａｋｏｍｏｒｉ、ＪＢＣ、２６５、１８７１３、１９９０年）等の他の膜関連キナーゼを介した膜内外シグナリングの変調に重要な役割を果たすことが分かった。例えば、ＰＫ−Ｃ活性は、ジアシルグリセロールにより促進され、スフィンゴシンにより阻害される（上記Ｈａｎｎｕｎ及びＢｅｌｌ；Ｈａｎｎｕｎ及びＢｅｌｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３、５００、１９８９年；Ｍｅｒｒｉｌｌ及びＳｔｅｖｅｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０１０、１３１、１９８９年）。
五十嵐等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８、６７９６、１９８９年）は、スフィンゴシンのＰＫ−Ｃ活性に対する阻害作用は、（１）Ｃ1〜Ｃ3の立体特異配置（Ｄ−エリトロ配置が必要）；（２）長鎖脂肪族基の存在；及び（３）恐らく最も必須なのは、第一アミノ基のＣ2での陰電荷によるものであることを見出した。もしアミノ基がＮアシル化されると、アミノ基の陰電荷がアセチル化により除去されるので、ＰＫ−Ｃ阻害活性がなくなる。しかしながら、もしアミノ基のアニオン性がＮメチル化により増強されるならば、立体特異的ＰＫ−Ｃ阻害活性が増強される。
【０００４】
白血球と活性化血小板及び内皮細胞との相互作用は、炎症プロセスの最初の工程であり、部分的にセレクチンとして知られている種類の付着分子が介在している。セレクチンには、マウスにおけるＭＥＬ−１４並びにヒトにおけるＥＬＡＭ−１、ＬＡＭ−１及びＧＭＰ−１４０（ＣＤ６２／ＰＡＤＧＥＭ）などがある。
セレクチン科に属するものは、炭水化物リガンドを結合する（例えば、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３４６、４２５、１９９０年； Ｂｒａｎｄｌｅｙ等、Ｃｅｌｌ、６３、８６１、１９９０年； Ｌｏｗｅ等、Ｃｅｌｌ、６３、４７５、１９９０年； Ｗａｌｚ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０、１１３２、１９９０年参照）。
多種多様のグリコスフィンゴリピドリポソームを用いた阻害についての研究に基づいて、ＨＬ６０（ヒト前骨髄細胞系）細胞で発現したＥＬＡＭ−１とＧＭＰ−１４０の両方の結合エピトープが、シアロシル−Ｌｅxとして同定された（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０、１１３０、１９９０年）。
【０００５】
セレクチンの発現は、リンホカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、バクテリアリポ多糖類フォルボールエステル、トロンビン及びおそらく数多くの他の化合物の誘起効果により完全に調節される。白血球は、血小板とともに、炎症部位へ集められる。
腫瘍細胞は、血小板を活性化できるので（例えば、Ｕｇｅｎ等、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．、８０、１４６１、１９８８年；Ｗａｔａｎａｂｅ等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、４８、６４１１、１９８８年；並びにＧｒｉｇｎａｎｉ及びＪａｍｉｅｓｏｎ、Ｂｌｏｏｄ、７１、８４４、１９８８年参照）、同様のプロセスが微小血管内皮への腫瘍細胞付着中に生じることが予測される。したがって、腫瘍細胞の転移は、セレクチン依存性腫瘍細胞付着により開始されるかもしれない。腫瘍細胞による内皮細胞が活性化される直接の根拠はないが、ＩＬ−１又はＴＮＦα活性化内皮細胞が種々の腫瘍細胞に付着することが示された（上記Ｗａｌｚ等）。
セレクチンの発現についての調節機構はよく理解されていないが、明らかにタンパク質キナーゼ−Ｃ、Ｇ−タンパク質に属するもの（例えば、ｒａｓ、Ｇs、Ｇi、Ｇo等）及び４７ＫＤａリンタンパク質を含む膜内外シグナリングトランスデューサの複雑な配列が関与している。これらの全ては、グリコスフィンゴリピド及びスフィンゴシン誘導体により変調されることが示された。血小板凝集及び関連ＡＴＰ分泌は、トリメチルスフィンゴシン（ＴＭＳ）により強力に阻害される。この現象は、４７ＫＤａタンパク質リン酸化の阻害又は血小板における膜シグナリング経路としてのホスホイノシチド回転置換の阻害から生じさせることができた。
米国特許第５１３７９１９号は、ＴＭＳ、その製造方法及びその使用を教示している。米国特許第５１５１３６０号は、ＴＭＳの別の使用を教示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の一つの目的は、悪性腫瘍の転移性を抑制する等のＴＭＳ活性を保持するＴＭＳ誘導体を提供することである。
本発明の別の目的は、タンパク質キナーゼ−Ｃを抑制するＴＭＳ誘導体及びその組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、血小板凝集を抑制するＴＭＳ誘導体及びその組成物を提供することである。
本発明の第四の目的は、炎症を抑制するＴＭＳ誘導体及びその組成物を提供することである。
本発明の第五の目的は、細胞付着分子発現を変調させるＴＭＳ誘導体を提供することである。
本発明の第六の目的は、血栓症治療用ＴＭＳ誘導体を提供することである。
本発明の第七の目的は、細胞及び組織保存剤としての役割を果たすＴＭＳ誘導体を提供することである。
上記及び他の目的は、ＴＭＳの種々の活性に影響するＴＭＳ分子部分を同定することにより達成された。本発明により、公知のＴＭＳ活性の一部分又は全てを高めるＴＭＳ誘導体及びＴＭＳを治療用途に使用するのがより適当となるＴＭＳの他の特性を高めるＴＭＳ誘導体を調製できる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
下記の一般式；
ＣＨ２ＯＨ−ＣＨ（Ｎ（ＣＨ３）３）−Ｃ≡Ｃ−ＣＨＸＹ
（式中、
（ａ）Ｘはハロゲンであり、
（ｂ）Ｙは末端にカルボキシル基およびメチルエステル基を有さない炭素数１３の脂肪族炭化水素である）
で表され、以下に示す特徴
（i）タンパク質キナーゼ−Ｃ阻害活性を有する
（ii）血小板活性化を抑制する
（iii）悪性腫瘍の転移を抑制する
を有する化合物。
【発明の効果】
【０００８】
原化合物の活性のうち、意図するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシンは、他のスフィンゴシン誘導体よりもタンパク質キナーゼＣ及び腫瘍細胞転移性に対する抑制活性が高く；血小板凝集及び腫瘍誘発血小板相互作用を抑制し；炎症プロセスを抑制し；細胞間付着分子の発現に影響を及ぼし；組織又は細胞保存剤として使用でき；そして水溶性である。ＴＭＳの公知の特性は、本発明のＴＭＳ誘導体の特性を定義するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン（ＴＭＳ）は、特に生理的ｐＨで非常に水溶性である。したがって、この化合物は、細胞プロセスのモジュレーターとして、水への溶解度が低いスフィンゴシン、Ｎ−モノメチルスフィンゴシン（ＭＭＳ）及びＮ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）、に対して明確な利点がある。
【００１０】
本明細書で使用される用語「スフィンゴシン」とは、Ｄ−若しくはＬ−又はエリトロ若しくはトレオ配置であるかどうかとは無関係にスフィンゴシンを示す。
本明細書で使用される用語「細胞」とは、有核及び無核構造を含む。したがって、リンパ球及び内皮細胞等の「古典的」細胞の他に、赤血球及び血小板等の生物学的構造体も、この用語の範囲内である。
用語「類似体」と「誘導体」は、同義語とみなす。
さらに、「合成した」とは、市販の試薬及び構成単位から調製し、生体外化学反応によりスフィンゴシン及びその誘導体に構築した生成物を意味する。さもなければ、スフィンゴシンは、天然のスフィンゴリピドから調製される。
【００１１】
原分子スフィンゴシンが多機能性であるので、イグゾースティブメチル化（Ｓｏｍｍｅｒ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３６、８２４、１９７１年）又はホルムアルデヒド水（ＣＨ2Ｏ／ＮａＣＮＢＨ3）を用いた還元性メチル化による直接４級化は、必ずしも再現性がない。
また、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシンは、化学合成されたか市販の非置換試薬から合成できる。例えば、非置換スフィンゴシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ製、又はＧａｒｍｅｒ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２５、２３６１、１９８７年の方法により合成された）を公知の方法（五十嵐等、ＪＢＣ、２６５、５３８５、１９９０年）により誘導化して、（４Ｅ）−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｄ−エリトロ−スフィンゴシンを形成できる。このようにして得られたＮ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシンは、ほとんど定量的収率で４級化される（米国特許第５１３７９１９号及び第５１５１３６０号を参照）。
【００１２】
簡単に説明すると、３７％ホルムアルデヒド水溶液（約２０当量）を、Ｄ−エリトロ−スフィンゴシンを酢酸緩衝液（ＮａＯＡｃ−ＡｃＯＨ−Ｈ2Ｏ、ｐＨ４．５）に添加して調製した溶液に添加する。この溶液を、室温で約１０分間混合後、ソジウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ3）を３回（それぞれ約３．０、２．０及び１．０当量）添加する。過剰のメタノール又はより長鎖のアルコールを、５分間隔で順次添加する。この溶液を、「Ｎ−ＥＶＡＰ」（Ｏｒｇａｎｏｍａｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃ．社製、マサチューセッツ州サウスバーリン）において窒素流下で濃縮し、化合物をクロロホルムで抽出する。
抽出物を、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ4ＯＨ（７：１：０．１）を含有する溶媒を用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより精製できる。メタノールを用いて上記のようにして調製したＮ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシンは、無色シロップとして約８０％の収率で得られる。この分子は、式量３２９．３２８１であり、高分解能質量分析から演繹された式Ｃ20Ｈ40ＨＮＯ2で表される。
【００１３】
もう一度ＤＭＳについて言及すると、ＤＭＳは無水クロロホルムに溶解する。
新鮮な蒸留ヨードメタン（容積約１７０μｌ、２．７３ｍ／ｍｏｌ）又はより長鎖のヨードアルカンをＤＭＳ溶液に添加し、混合物を周囲温度で暗所で攪拌する。（ヨードメタンの過剰量は重要ではなく、２５〜１００％過剰であれば満足のいく結果が得られる。）
便宜上混合物を一晩放置するが、反応は一般的に数時間で完了する。反応の進行は、上記した溶媒を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により監視できる。インキュベーション後、析出した４級アンモニウム塩を水で稀釈後、クロロホルムで繰り返し抽出する（３ｍｌｘ４）。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、真空濃縮する。上記方法を実施したところ、化合物３７ｍｇ（収率８６％）が黄色結晶として得られた。
【００１４】
黄色結晶を、攪拌しながら予備中和（ｐＨ＝７．００）アニオン交換樹脂（塩化物型、Ｄｏｗｅｘ １ｘ２−４００、５００ｍｇ）の水性懸濁液に、室温で３時間溶解する。次に、混合物を焼結ガラス漏斗によりろ過した後、凍結乾燥する（８ミリトルで２日間）。ろ液は、水で洗浄したＣ１８カラム等の疎水性相互作用カラムを用いてさらに精製し、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（３：１）溶剤で溶離できる。
上記の方法を実施したところ、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン塩化物塩２６．５ｍｇ（収率９３％）が得られた。生成物の構造は、プロトン核磁気共鳴（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）で確認され、９個の水素基とトリメチル誘導化アミノ基を含有することが判明した。1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）δ０．８８（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、ＣＨ3）、１．３１（ｂｒ ｓ、１１ｘＣＨ2）、２．０８（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２ｘＨ−６）、３．２９（ｓ、９Ｎ+（ＣＨ3）3）、３．３８（ｂｒ ｓ、１ｘＨ−３）、４．１３（ｂｒ ｓ、２ｘＨ−１）、４．８６（ｂｒ ｓ、１ｘＨ−２）５．５７（ｄｄ、Ｊ＝３．１及び３．４ Ｈｚ、１ｘＨ−４）並びに５．９０（ｍ、１ｘＨ−５）。化合物の予測分子式は、予測分子量３４２．３３７２を有するＣ21Ｈ44ＮＯ2であり、質量分析から、式量が３４２．３３７１（Ｃ21Ｈ44ＮＯ2、Δ−０．０００３）であることが判明した。
【００１５】
細胞増殖に対するＴＭＳ誘導体の影響は、部分的には、種々の腫瘍細胞を生体外及び生体内で意図する化合物に暴露することにより明らかにすることができる。
トリチウム標識チミジン取込みによる生体外アッセイを使用して、種々の化合物の細胞増殖に対する影響を確認できる。簡単に述べれば、腫瘍細胞を、９６ウエルプレート（ニューヨークにあるコーニング社製）の平底に、細胞２ｘ１０4個／ウェルの濃度で接種する。細胞を、スフィンゴイドを種々の濃度で含有（ＰＢＳ溶液として添加）するＤＭＥＭ中で２日間培養した。次に、培地に、トリチウム標識チミジンを濃度０．５μＣｉ／ウェルで添加した。６時間インキュベーションした後、細胞を、ＰＨＤ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（マサチューセッツ州ケンブリッジにあるＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて採取し、取り込まれた放射能の量を、適当な細胞溶解剤及びシンチレーションカクテル、例えばＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ ＢＤ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州フェアローン）（両方の役割を果たす）を添加後に測定した。
【００１６】
別の生体外アッセイでは、種々の化合物のＰＫ−Ｃ活性に対する影響を監視した。ある種の腫瘍細胞は、高レベルのＰＫ−Ｃ活性を示す。ヒト類表皮癌細胞系Ａ−４３１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １５５５）を、上記五十嵐等に記載されているようにしてＰＫ−Ｃ活性に関するバイオアッセイに使用した。簡単に述べれば、ホスファチジルセリン（５μｇ／管）及び１，２−ジオレイン（０．０５μｇ／管）を、適当量のスフィンゴシン誘導体試料と共にか、スフィンゴシン誘導体試料なしで、１．５ｍｌ管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ製）に入っている有機溶剤（エタノール又はエタノール／クロロホルム）に添加し、混合物をＮ2流下で蒸発させた。脂質混合物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）約３０μｌに添加し、３０分間音波処理した。
【００１７】
得られたリポソームに、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、４００μＭ ＥＤＴＡ、５０μＭ ＥＧＴＡ、５００μＭ ＣａＣｌ2、２００μｇ／ｍｌヒストンＩＩＩ−Ｓ又はミエリン塩基性タンパク質及び２０μＭγ〔32Ｐ〕−ＡＴＰ（２ｘ１０6ｃｐｍ）を含有する緩衝液混合物を添加して、最終容積約９０μｌとした。上記五十嵐等に記載のようにしてＡ４３１から調製するか、吉川等（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１３５、６３６、１９８６年）に記載のようにしてマウス脳から調製し且つタンパク質約１〜２μｇを含有するＰＫ−Ｃ約１０μｌを添加することにより反応を開始し、この混合物を、３０℃で約１０分間インキュベーションした。
２５％ＴＣＡ及び１％ＢＳＡを含有する１ｍＭ ＡＴＰ溶液（ｐＨ７．５）１ｍｌを添加することにより、反応を停止させた。
【００１８】
リポソームは、例えば米国特許第４５８８５７８号及び第４６１０８６８号においても教示されている。
析出物を遠心分離により集め、２５％ＴＣＡ１ｍｌで２回洗浄した後、わずかに加熱しながら（８０℃、１０分間）、０．１％デオキシコール酸塩含有１Ｍ ＮａＯＨ１ｍｌに溶解し、シンチレーションカウンターでカウントした。ホスファチジルセリン、１，２−ジオレイン又はＣａ2+なしの反応混合物を、対照として使用した。バイオアッセイでは、２種の基質（ヒストンＩＩＩ−Ｓ及びミエリン塩基性タンパク質）を使用した。
ある種の癌細胞は、他のものよりも高い転移性及び侵入能を示す。例えば、マウスにおいて、ＢＬ６及びＦ１０メラノーマ細胞系は、非常に転移性があり且つ侵入能が高い。一方、Ｆ１変異体は、転移性及び侵入性がはるかに小さい（Ｉ．Ｒ．Ｈａｒｔ等、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、９７、５８７−５９２（１９７９年）；Ｇ．Ｐｏｏｔｅ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４２、２７７０−２７７８（１９８２年）；ＡＴＣＣ ＣＲＬ６３２３及びＣＲＬ６４７５からそれぞれ得たＦ１並びにＦ１０クローン）。ＢＬ６及びＦ１細胞を、上記に記載したようにして生体外で試験した。ＴＭＳは、ＤＭＳ及びスフィンゴシンよりも細胞成長抑制において効果的であった。また、ＢＬ６細胞は、必要ＴＭＳ濃度がより低いことから明らかなように、ＴＭＳ処理に対してより感受性が大きかった。
【００１９】
ＢＬ６細胞をマウスに注射し、肺における転移性沈着物を、投与の経路及びタイミングを含む種々の処置後に評価した。ＴＭＳは、経路及びタイミングとは無関係に、肺での集落形成及び腫瘍の発生を抑制するのに効果的であるが、初期段階での治療が好ましく且つ治療を反復することがより効果的である。
別の面では、ＴＭＳ誘導体は、血小板凝集（本発明では、血小板を細胞とみなす）に対して非常に大きな影響を及ぼす。ＴＭＳ誘導体は、血小板凝集を抑制する。
トロンビンを刺激すると、４０ｋＤ（又は４７ｋＤ）血小板タンパク質がリン酸化される。ＴＭＳに暴露させると、４０ｋＤ（又は４７ｋＤ）血小板タンパク質のリン酸化が抑制される。記述により縛られることは望まないが、本発明者等が考えるところでは、リン酸化４０ｋＤ（又は４７ｋＤ）タンパク質がないと、血小板凝集が防止される。
血小板の活性化は、止血、炎症、創傷治癒並びに腫瘍細胞転移及び侵入に関連した数多くの生物学的プロセスの開始に中心的な役割を果たす。血小板活性に影響する数多くの因子及び機構並びに数多くの活性化の結果がある。セレクチンＧＭＰ−１４０は、好中球、シアロシル−Ｌｅxを発現するＨＬ６０細胞又は腫瘍細胞に結合する。ＧＭＰ−１４０の発現の機構及び続いて生じるシアロシル−Ｌｅxへの結合は、炎症プロセスの開始だけでなく腫瘍細胞転移に中心的な役割を果たす。ＧＭＰ−１４０発現は、ＴＭＳとともにプレインキュベーションすることにより抑制されるかブロックされる。
【００２０】
ＴＭＳ誘導体の有用性は、悪性細胞成長の抑制に限らない。炎症は、部分的には、リンパ球及び骨髄細胞の増殖を特徴としている。一般的に、増殖は、外来抗原の隔離や障害後の回復能の増強等の有益な目的に役立つが、時々、例えば自己免疫機能障害の結果異常に生じることがある。
したがって、ＴＭＳ誘導体は、明らかに正常な細胞の細胞増殖を制御するのに有用である。マウスＣＴＬＬ−２細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ ２１４）、Ｔリンパ球細胞系を、細胞１．５×１０4個／ウエルで平板培養した。細胞増殖を、チミジン取込みにより監視する。
ＴＭＳ誘導体の細胞付着分子に及ぼす影響は、血小板による付着分子発現の阻害により明らかとなる。例えば、トロンビンは、血小板においてＧＭＰ−１４０の発現を誘発する。しかしながら、血小板をＴＭＳに暴露すると、ＧＭＰ−１４０発現が抑制される。したがって、ＴＭＳ誘導体は、細胞付着分子依存型プロセスによる疾患に有用であろう。
上記したように、ＧＭＰ−１４０は、ＥＬＡＭ−１と同様に、シアロシル−Ｌｅxを結合する。したがって、ＴＭＳ誘導体は、リンパ球−内皮細胞付着及びそれに続く障害部位での炎症状態の発生等の細胞間の相互作用を防止するのに有用であろう。
【００２１】
ＴＭＳ分子の主要部が同定された。ＴＭＳのこれらの主要部は、上記した活性の一つ以上に影響を及ぼす。種々の変更をこのような主要部位に行って特異的活性又はいくつかの活性を高めることができる。例えば、炭素２及び３（ナンバリングは、窒素を有する分子の側から開始する）でのＤ−エリトロ配置が、Ｄ−トレロ、Ｌ−トレロ及びＬ−エリトロ配置よりも好ましい。しかしながら、３ヒドロキシル基の影響は、５Ｆ−ＴＭＳに見られるように、５位にハロゲン等の官能基を担持する化合物によく似ている。
アミン基でのトリメチル置換は、ＴＭＳ分子の別の重要な部分である。ＴＭＳのメチル基の疎水性は、正に帯電した窒素のイオン特性に影響を及ぼす。したがって、窒素原子のカチオン特性が維持される限りは、メチル基を他の適当な実質的に疎水性な基で置換できる。即ち、例えば、一つ以上のメチル基を、脂肪族炭化水素、例えばエチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等の炭化水素基か、アルケン又はアルキン等の不飽和炭化水素により置換できる。但し、疎水性基は分子量が１を超え、且つ２以下の基がメチル基である。
【００２２】
原ＴＭＳ分子は、Ｃ4位に二重結合を有する。二重結合の存在はＰＫＣ活性の抑制には必須でないが、Ｃ4二重結合により提供される特定の立体配置が、転移及び血小板凝集の抑制に影響を及ぼす。
Ｃ4での三重結合は、ＰＫ−Ｃ抑制に有効であるが、転移抑制には有効でない。
したがって、一つ以上の二重結合の位置決定が、一つ又はいくつかのＴＭＳ活性に影響を与える。
二重結合の数及び位置とともに、脂肪族主鎖のサイズ及び形状は、本明細書で開示されるＴＭＳ活性に役割を果たす。したがって、脂肪族鎖は、単一鎖、分岐鎖でよく、又は２つの鎖がＣ4位置から誘導されたものでもよい。
脂肪族鎖末端でのカルボキシル又はエステル基はある種のＴＭＳ活性を消滅させることが知られているので、好ましくは脂肪族鎖は非極性又は疎水性である。
【００２３】
表１並びに第１図及び第２図にいくつかのＴＭＳ誘導体及びそれらの活性を示すが、それらのデータは、部分的にはＴＭＳ分子の主要部を明らかにしている。したがって、二重結合の除去により、活性が分離される。脂肪族鎖末端にカルボキシル又はメチルエステル基が存在したり、脂肪族鎖の欠如すると、ある種のＴＭＳ活性が消滅する。
【００２４】
【表１】
2006169231.tif 000002
【００２５】
ＴＭＳ分子に対して種々の修正を行って、一つ以上のＴＭＳ活性を実質的に保持する誘導体を得ることができる。このようないずれの誘導体も、本発明の範囲内であることが意図される。特に、原活性の一部分のみを保持するか、活性の高まった誘導体が重要である。
ある種の修正により、血清半減期、水性媒体への溶解度、化合物の安定性、副作用の減少、細胞透過性等の本明細書に記載の特異的活性のいずれでもない他の特性に影響を及ぼすことがある。したがって、他の誘導体は、補助的な特徴及び特性に関するより所望の使用特性を提供することがある。
【００２６】
本発明のＴＭＳ誘導体は、上記したＴＭＳの合成スキームに基づくか合成スキームから開始し、且つＴＭＳ分子の活性を高めたり分離するためにＴＭＳ分子のこれらの主要部に指向するか、補助的な特徴を高めたり望ましくない補助的な特徴を除去するために他の部分に指向する有機合成の公知の方法により製造することができる。
例えば、ＤＨＴＭＳは、出発物質が、例えば、Ｓｉｇｍａ社から市販されているジヒドロスフィンゴシンであること以外は、本明細書に記載されているＴＭＳ製造用の合成スキームにより調製できる。
ＴＭＰＳは、上記Ｓｏｍｍｅｒに記載の方法によりフェニルセリン（Ｓｉｇｍａ製）から得ることができる。
ＤＭＥＳ及びＤＥＭＳの合成スキームは、第３図に記載されている。Ｎ，Ｎ−ジエチルスフィンゴシンは、ＤＭＳの合成と類似の方法で調製した。ＤＥＭＳ及びＤＭＥＳは、それぞれＤＥＳをＣＨ3Ｉで及びＤＭＳをＣ2Ｈ5Ｉで処理することにより得ることができる。反応条件は、ＴＭＳに関して上記したのと実質的に同じであるが、反応をより高い温度でより長時間行って適当な収量を得ることができる。
【００２７】
ＴＭＳ誘導体はタンパク質キナーゼＣ及び他のキナーゼに対して阻害活性を有するので、ＴＭＳ誘導体は、細胞内ＡＴＰ保存消費を防止し、したがって、本明細書に記載の血小板凝集阻害及び細胞付着阻害活性の他に、代謝活性を減少させる傾向がある。このように、ＴＭＳ誘導体を、血液製剤等の生体物質の保存又は保存寿命を長くするのに使用できる。
例えば、ＴＭＳは、赤血球酵素活性が減少することにより確認できるように、通常の血液保存条件下での生体外での赤血球代謝活性を阻害する。白血球及び血小板に関して、同様の結果が予測できる。
したがって、ＴＭＳ誘導体を、血液、血液成分及び移植をまっている臓器等の生体物質の貯蔵又は保存に現在使用されている方法及び製剤に対するアジュバントとして使用できる。細胞成長抑制量のＴＭＳ誘導体を、保存培地に添加できる。
【００２８】
好中球（多形核白血球）は、３つの主要な作用である３つの主要なアゴニスト依存応答を示す：（i）超酸化物（Ｏ2-）を生成するイグゾデーティフバースト；（ii）ファゴカイネティック移動活性；及び（iii）活性化内皮細胞（ＥＣ）及び血小板と相互作用する能力。機構（ii）及び（iii）は、ＥＣへの付着及びＥＣ単層を介した血管又は血管外マトリックスへの移動を生じる。通常、これらの作用は、一緒になって、微生物を炎症型応答させる有用な機構を提供する。しかしながら、炎症疾患中に好中球が累積したり過剰作用したりすると、組織の損傷及び循環障害を生じることがある。
好中球応答は、走化ペプチド、例えばホルミル−ｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）、アラキドネート、ＩＬ−８、短鎖ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びホルボールエステル（例えば、ＰＭＡ）等のリンホカインを含む非常に数多くの刺激により引き起こされる。
チトクロームＣの減少により測定される当該技術分野において認識されている方法（例えば、野尻等、Ｂｌｏｏｄ、６４、５３４、１９８４年参照）を用いて得られる好中球における超酸化物の生成は、投与量依存法においてＴＭＳにより阻害される。チトクロームＣの減少は、Ｃｌｉｆｆｏｒｄ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１０５、３９３、１９８１年の方法等の公知の方法を用いて監視される。酸素モニター及びミクロＯ2チャンバーアセンブリー（オハイオ州イエロースプリングスにあるＹ．Ｓ．Ｉ．社製）を用いて電気伝導度により測定される好中球のＯ2消費量は、ＰＭＡにより顕著に高められる。ＰＭＡに依存するＯ2消費量の増加は、ＴＭＳにより強力に阻害される。
好中球の金ゾル塗膜プレートに対するファゴカイネティック活性は、実質的にＡｌｂｒｅｃｈｔ−Ｂｕｅｈｌｅｒ（Ｃｅｌｌ、１１、３９５、１９７７年）に教示されている手法により測定できる。ファゴカイネティック活性は、ＴＭＳにより顕著に抑制される。ＴＭＳ依存阻害作用は、培地を、ＴＭＳ非含有培地と交換すると完全に逆になる。したがって、ＴＭＳのファゴカイネティック活性に対する阻害活性は、細胞毒性作用には依存しない。
【００２９】
好中球の一つの特徴は、活性化ＥＣに付着し且つＥＣ単層を介して血管又は血管外マトリックスに移行する能力にある。好中球とＥＣとの相互作用及びその後の内皮内外移行に及ぼすＴＭＳの影響は、ヒトさい内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ等、Ｊ．Ｉｍｍ．、１４６、１６１７、１９９１年）を用いて、生体外で監視できる。好中球はＨＵＶＥＣ単層に添加され、好中球−ＨＵＶＥＣ相互作用は、単層断片の定着、包埋及び染色に続いて顕微鏡により評価される。
生理条件下では、好中球は、ＥＣ単層を介してこう原マトリックスに移動できる。ＥＣをＩＬ−１βでＭ１９９媒体中で４時間活性化すると、好中球は、９０分内にこう原マトリックスに移行する。好中球の移行は、好中球をＴＭＳで予備処理することにより強力に阻害される。
【００３０】
〔32Ｐ〕リン酸ナトリウム（２ｍＣｉ）で１時間代謝的に標識して細胞内ＡＴＰを濃縮した好中球を１．５μＭ ＰＭＡで刺激した時、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の２つのタンパク質バンドは、リン酸化が大きく高まる。タンパク質は、分子量約４７ｋＤａ及び６５ｋＤａである。好中球を、１５〜４５μＭ ＳＰＮ、ＤＭＳ又はＴＭＳで予備インキュベーション後ＰＭＡで刺激すると、両方のタンパク質のリン酸化が顕著に減少する。リン酸化に対する阻害作用は、インキュベーションの２分以内に観察される。リン酸化４７ｋＤａ及び６５ｋＤａタンパク質はＰＫ−Ｃの直接基質であると思われるので、ＳＰＮ、ＤＭＳ及びＴＭＳの阻害作用は、ＰＫ−Ｃへの阻害作用を介して生じるのかもしれない。
〔32Ｐ〕リン酸ナトリウム（４ｍＣｉ）のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェート（ＰＩＰ）及びホスファチジルイノシトール−４、５−ビス−ジホスフェート（ＰＩＰ２）代謝取込みは、走化ペプチドｆＭＬＰ（１μＭ）により高められる。ｆＭＬＰ依存増強は、好中球をＴＭＳとともにプレインキュベーションすることにより強力に抑制される。
【００３１】
さらに、本発明によれば、
（１）治療に効果的な量のＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン誘導体又はその薬学的に許容される塩と；
（２）薬学的に許容されるキャリア、稀釈剤又は賦形剤と、を含んでなる、ヒト及び動物細胞の成長並びにヒト及び動物血小板の凝集に影響を及ぼすための薬剤及び治療が提供される。
【００３２】
薬剤及び方法は、生体外及び生体内用途の両方に適用できる。特定の用途としては、悪性腫瘍、良性腫瘍成長、炎症、他の免疫系機能不善の発現及び免疫系が刺激に対して不適当又は過剰に反応する時の治療などがある。
薬剤は、効果的な量のＴＭＳ誘導体と、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤又は賦形剤とを含んでなる。ＴＭＳ誘導体の効果的な量は、当該技術分野で認識されている方法、例えば本明細書に記載されているような適当な動物モデル又は非ヒト霊長類における投与量−応答曲線を作製し、そしてヒトに外挿すること；
例えば本明細書に記載されている適当な生体外データから外挿すること；又は臨床試験において有効性を測定すること等の方法により決定できる。
【００３３】
本発明の薬剤の適当な投与量は、疾病の程度、個人の体重、個人の年齢、循環半減期等の個々の医学的用途に依存し、当業者により容易に決定できる。投与回数、１日当りの投与量及び治療クールは、個人ごとにより異なってよい。
ＴＭＳ誘導体は、経口、非経口及び局所等の種々の方法で投与できる。本発明の薬剤に適当な薬学的に許容されるキャリア、稀釈剤又は賦形剤は、薬剤の個々の医学的使用に依存し、当業者により容易に決定できる。また、ＴＭＳ誘導体は、ホスファチジルコリン及びコレステロール製であることができるリポソーム等の微小球内にカプセル化してデリバリーできる。
【００３４】
薬剤は、錠剤、カプセル、バルク又は単位投与量粉末若しくは顆粒等の種々の形態をとることができ；又は液剤、乳剤、懸濁剤、軟膏剤、ペースト、クリーム、ゲル、泡沫剤又はゼリーに製剤できる。非経口剤形には、液剤、懸濁剤などがある。薬剤は、種々の当該技術分野において認識されている賦形剤、稀釈剤、充填剤等のいずれかを含有する傾向がある。このような補助成分には、崩壊剤、バインダー、滑剤、界面活性剤、乳化剤、緩衝液、湿潤剤、可溶化剤及び保存剤などがある。当業者は、非常に数多くの専門家並びにＧｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ等、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」（第６版、Ｇｏｏｄｍａｎ等編、ニューヨーク州にあるＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌ．社、１９８０年）等の文献を参考にしながら適当な製剤を構成できる。
【００３５】
連続細胞成長を特徴とするか、機能不全のために細胞成長阻害を必要とし且つ相対的にアクセスしにくい身体の部位に、ＴＭＳ誘導体を適当な方法で投与して、確実に効果的な局所濃縮することができる。例えば、ＴＭＳ誘導体をデポー剤又はアジュバントに添加して注射し、外科的に位置させた移植組織又はレザーバに運び、ゆっくりと所定量のＴＭＳ誘導体を一定時間にわたって放出するか、異常細胞成長を提供する部位に結合できる能力を有する認識分子に複合できる。このような意図するシナリオの例としては、骨髄特異的抗原に対して結合特異性を有する抗体であり、前記骨髄特異的抗体はＴＭＳ誘導体に複合化し、前記複合体を白血病患者に投与する。
【実施例】
【００３６】
本発明の一定の態様を、以下の非限定的実施例により説明する。
【００３７】
実施例１
血小板を、高血小板血漿（オレゴン州ポートランドにあるオレゴン赤十字社から購入）から分離した。混入赤血球を、遠心分離（８０ｘｇ、１０分間）により除去した。血小板を遠心分離（３００ｘｇ、１０分間）により得て、２２ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．３５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有しているタイロード緩衝液（ｐＨ６．５）で１回洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁して濃度１〜２ｘ１０9血小板／ｍｌとした。全ての操作は、室温で行った。
血小板（約３．５ｘ１０8／ｍｌ）のタイロード緩衝液懸濁液を、インヒビタ化合物（Ｈ−７〔１−（５−イソキノリニルスルホニル）−２−メチルピペラジン、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ社、セントピーターズバーグ、ＦＬから購入した合成タンパク質キナーゼ−Ｃインヒビタ、Ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ−Ｃ〔協和醗酵株式会社から入手した合成タンパク質キナーゼ−Ｃ〕、スフィンゴシン〔ミズーリ州セントルイスにあるＳｉｇｍａ社から購入〕並びにジメチルスフィンゴシン及びトリメチルスフィンゴシン〔Ｉｇａｒａｓｈｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８、６７９６、１９８９年に準じて合成〕〕とともにプレインキュベーションした後、トロンビン又はＡＤＰ（両方ともＳｉｇｍａ社から購入）を添加した。
血小板凝集を、コンピュータアナライザーを備えた血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ社、ハーバータウン、ＰＡ）を用いて透過度変化により評価した。
【００３８】
実施例２
ＧＭＰ−１４０発現を、（i）ｍＡｂ ＡＣ１．２（ＧＭＰ−１４０に指向し、Ｆｕｒｉｅ博士（マサチューセッツ州、ボストンにあるＴｕｆｔｓＵｎｉｖ．
Ｓｃｈ．Ｍｅｄ．）から入手したもの）を用いたフロータイトメトリー及び（ii）血小板塗布固相へのＨＬ６０細胞の付着により測定した。
血小板（１ｘ１０8／ｍｌ）タイロード緩衝液懸濁液を、インヒビタとともに、ｐＨ７．２、３７℃で５分間プレインキュベーションした後、活性剤としてトロンビン（最終濃度１Ｕ／ｍｌ）又はフォルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（最終濃度１０-7Ｍ）を添加し、その後混合物を３７℃で１０分間インキュベーションした。血小板を、２％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドをＰＢＳに添加したものを等容積で固定し、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。
パラホルムアルデヒド固定血小板を、ｍＡｂ ＡＣ１．２（２．５μｇ／ｍｌ）５０μｌとともに、室温で３０分間インキュベーションした。血小板を、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート標識ヤギ抗マウスＩｇ（カリフォルニア州、バーリンゲームにあるＴａｇｏ社から購入）５０μｌを添加し、室温で３０分間インキュベーションし、再び１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。陰性対照として、パラフォルムアルデヒド固定血小板を、ｍＡｂ ＡＣ１．２の代わりにマウスＩｇＧとともにインキュベーションし、上記のようにして処理した。
血小板を、適当なゲートを備えたＥｐｉｃｓフローサイトメータ（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で分析した。種々の試薬の阻害効果を算出するために、休止血小板の平均蛍光強度（活性剤なしでの血小板のインキュベーションで得られた）を、活性化血小板試料に関する値から減じた。
この誘導体は、ＧＭＰ−１４０発現を強力に阻害した。
【００３９】
実施例３
ＨＬ６０（ＡＴＣＣ（受け入れ番号ＣＣＬ２４０）から入手できるヒト前骨髄細胞系）の休止又は活性化血小板塗布固相への付着を、以下のようにして評価した。４８ウエルプレート（マサチューセッツ州ケンブリッジにあるＣｏｓｔａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウエルを、ポリ−Ｌ−リシン溶液（ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ）で満たし、１時間インキュベーションした。次に、各ウエルを、ＰＢＳで洗浄後、休止又は活性化血小板６×１０7個含有ＰＢＳ１５０μｌを各ウエルに添加し、プレートを１時間インキュベーションした。プレートを遠心分離（３００ｘｇ、７分間）、室温でさらに３０分間インキュベーションした。結合血小板を、４℃で２分間、０．１％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液を添加することにより固定した。１０ｍＭグリシンをＰＢＳ溶液に添加したもので各ウエルを洗浄し、プレートを、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、１０ｍＭグリシンのＰＢＳ溶液を含有している５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡとともに、室温で１時間インキュベーションした。
培地（５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）で洗浄後、〔3Ｈ〕チミジン標識ＨＬ６０細胞１ｘ１０6個を、各ウエルに添加した。ＨＬ６０を、１０％ＦＣＳ（ユタ州ローガンにあるＨｙｃｌｏｎｅ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（カリフォルニア州サンタアナにあるＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）に保持した。細胞付着アッセイに使用するＨＬ６０細胞の放射標識は、細胞を２μＣｉ／ｍｌの〔3Ｈ〕チミジンとともに一晩インキュベーションすることにより行った。室温で４５分間インキュベーション後、未結合細胞を吸引し、培地（５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）で一回洗浄し、結合細胞を、ＰＢＳに０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン−０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したもので分離し、各ウエルにおける放射活性レベルを液体シンチレーションカウンターで測定した。
トロンビン−刺激及びＰＭＡ刺激血小板の両方に関して、ＨＬ６０細胞が、ＴＭＳ及びＤＭＳにより強力に阻害されたが、ＳＰＮによる阻害はごくわずかであった。結合はシアロシル−Ｌｅx含有リポソームにより特異的に阻害され、その他のグリコスフィンゴリピド含有リポソームによっては阻害されないので、ＨＬ６０細胞の活性化血小板への結合は、ＨＬ６０細胞で発現されるシアロシル−ＬｅxのＧＭＰ−１４０による認識にのみに依存するものと考えられる。
【００４０】
実施例４
ヒト好中球を正常な成人男性から得た。ヘパリン化抹消血を、６０ｍｌ注射器で、１％デキストランのＰＢＳ溶液とともに穏やかに混合した。混合物を、垂直にして３７℃で６０〜９０分間放置した。白血球に富んだ上相を、Ｆｉｌｃｏｎ ２０９５プラスチック試験管（ニュージャージー州リンカーンパークにあるＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）に入れた同容積のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（スウェーデンのウプサラにあるＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）上にそっと配置した。４５０ｇで４℃、３０分間遠心分離して、好中球を試験管の底に位置させた。上相と、リンパ球を含有する界面を、吸引により慎重に除去した。
細胞ペレットを氷冷蒸留水に３０秒間再懸濁した後、等容積の氷冷１．８％ＮａＣｌ溶液を添加することにより、混入赤血球を、細胞ペレットから低張性溶菌により除去した。８０ｇで１０分間遠心分離後、細胞を、適当な緩衝液又は培地により再懸濁した。
最終試料をＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色により測定したところ、好中球９８％以上であった。懸濁液を４℃で保存し、３時間以内に使用した。
【００４１】
実施例５
新たに精製した好中球（ほぼ８×１０7細胞）を、０．１％脂質非含有ＢＳＡ−ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ ｐＨ７．４、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、４．９ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭグルコース、０．３３ｍＭ ＣａＣｌ2）を含む緩衝液にＮａ2Ｈ〔32Ｐ〕Ｏ4 ２ｍＣｉを添加したものとともに、震盪水浴中で、３７℃、６０分間プレインキュベーションした。過剰の未結合成分を遠心分離により除去し、血小板を同じ緩衝液に再懸濁し、この操作を二回反復した。次に、細胞を、７処理グループ（各グループは、総容積０．４ｍｌに細胞ほぼ１×１０7個含有）に分割した。ＴＭＳ、ＳＰＮ又はＤＭＳを懸濁液に添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした後、ＰＭＡを最終濃度１．５μＭまで添加した。２分後、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液０．１ｍｌ及び２０ｍＭＥＤＴＡを加えることにより反応を停止させた後、１００℃で５分間加熱した。公知の方法を用いて、１０％ドデシル硫酸ナトリウムゲルによりアリコットを分離した。32Ｐの含有は、オートラジオグラフィーにより視覚化することにより確認された。
ＴＭＳは、タンパク質キナーゼＣ代謝及び活性に関連する特異的タンパク質のリン酸化に影響した。
【００４２】
本明細書で引用した全ての文献は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
本発明を一定の実施態様により詳細に説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の変更及び修正が可能であることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】第１図は、トリメチルスフィンゴシン及びいくつかのそれらの誘導体を示す。
【図２】第２図は、さらなるＴＭＳ誘導体を示す。
【図３】第３図は、ＤＭＥＳ及びＤＥＭＳの合成スキームを示す。
【図４】第４〜６図は、カルボキシＴＭＳ及びメチルカルボキシＴＭＳの合成スキームを示す。第４図は、中間体構造の一つの製造スキームである。
【図５】第４〜６図は、カルボキシＴＭＳ及びメチルカルボキシＴＭＳの合成スキームを示す。第５図は、第４図の中間体３ａを使用して別の中間体（構造６ｂ）を製造するスキームを示す。
【図６】第４〜６図は、カルボキシＴＭＳ及びメチルカルボキシＴＭＳの合成スキームを示す。第６図は、構造６ｂを用いて目的とする化合物を製造するスキームを示す。
【図７】第７図は、５Ｆ−ＴＭＳ及び４−アルキン−ＴＭＳを製造するための合成スキームである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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