(57)【要約】      （修正有）【課題】部位特異的エンドヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ触媒分子およびそのＤＮＡ触媒分子を含む組成物、その調製法並びに使用方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡ触媒分子は、基質核酸配列内の一本鎖核酸を含む切断部位を特定するヌクレオチド配列に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を有する。更に、ＤＮＡ触媒分子のビオチン標識物及びそのアビジン結合固体表面への結合による固定化方法、および、ＤＮＡ触媒分子を用いたホスホエノール結合の切断方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的エンドヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ触媒分子。
【請求項２】
前記エンドヌクレアーゼ活性が、基質核酸配列内の一本鎖核酸を含む切断部位を特定するヌクレオチド配列に特異的である請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項３】
前記一本鎖核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ヌクレオチド類縁体、又はその複合物を含む請求項２記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項４】
前記基質核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ヌクレオチド類縁体、又はその複合物を含む請求項２記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項５】
前記エンドヌクレアーゼ活性が前記切断部位でのホスホエステル結合の加水分解切断を含む請求項２記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項６】
前記分子が、一本鎖である請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項７】
前記分子が、１以上のヘアピンループ構造を含む請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項８】
前記基質核酸配列が、前記ＤＮＡ触媒分子に結合される請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項９】
前記基質核酸配列が、前記ＤＮＡ触媒分子に結合されない請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ触媒分子が、配列番号３及び配列番号１４〜２２からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ触媒分子が、配列番号２３〜３０からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ触媒分子が、配列番号３１〜３９からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ触媒分子が、配列番号５２〜１０１からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１４】
前記エンドヌクレアーゼ活性が、Ｍｇ2+の存在によって増強される請求項11、12又は13記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ触媒分子の基質結合親和性が、約１μM 以下である請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ触媒分子が基質にＫD約０.１μM 未満で結合する請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１７】
前記切断部位を特定する前記ヌクレオチド配列が少なくとも１ヌクレオチドを含む請求項２記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１８】
前記エンドヌクレアーゼ活性が、２価カチオンの存在によって増強される請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項１９】
前記２価カチオンが、Ｐｂ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、及びＣａ2+からなる群より選ばれる請求項18記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項２０】
前記エンドヌクレアーゼ活性が、１価カチオンの存在によって増強される請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項２１】
前記１価カチオンが、Ｎａ+及びＫ+からなる群より選ばれる請求項20記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ触媒分子が、第１及び第２基質結合領域が隣接した保存コアを含む請求項１記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項２３】
前記保存コアと前記基質結合領域間に１以上のスペーサーヌクレオチドを更に含む請求項22記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項２４】
前記保存コアが、１以上の保存領域を含む請求項22記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項２５】
前記１以上の保存領域が、下記の配列からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む請求項24記載のＤＮＡ触媒分子。
ＣＧ；
ＣＧＡ；
ＡＧＣＧ；
ＡＧＣＣＧ；
ＣＡＧＣＧＡＴ；
ＣＴＴＧＴＴＴ；及び ＣＴＴＡＴＴＴ。
【請求項２６】
前記保存コア内の前記保存領域間に１以上の可変又はスペーサーヌクレオチドを更に含む請求項24記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項２７】
前記第１基質結合領域が、下記の配列からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む請求項22記載のＤＮＡ触媒分子。
ＣＡＴＣＴＣＴ；
ＧＣＴＣＴ；
ＴＴＧＣＴＴＴＴＴ；
ＴＧＴＣＴＴＣＴＣ；
ＴＴＧＣＴＧＣＴ；
ＧＣＣＡＴＧＣＴＴＴ；
ＣＴＣＴＡＴＴＴＣＴ；
ＧＴＣＧＧＣＡ；
ＣＡＴＣＴＣＴＴＣ；及び ＡＣＴＴＣＴ。
【請求項２８】
前記第２基質結合領域が、下記の配列からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む請求項22記載のＤＮＡ触媒分子。
ＴＡＴＧＴＧＡＣＧＣＴＡ；
ＴＡＴＡＧＴＣＧＴＡ；
ＡＴＡＧＣＧＴＡＴＴＡ；
ＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＴ；
ＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＧＴＴ；
ＴＡＴＡＧＴＧＴＡ；
ＡＴＡＧＴＣＧＧＴ；
ＡＴＡＧＧＣＣＣＧＧＴ；
ＡＡＴＡＧＴＧＡＧＧＣＴＴＧ；及び ＡＴＧＮＴＧ。
【請求項２９】
下記の配列からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む第３基質結合領域を更に含む請求項22記載のＤＮＡ触媒分子。
ＴＧＴＴ；
ＴＧＴＴＡ；及び ＴＧＴＴＡＧ。
【請求項３０】
前記基質結合領域間に１以上のスペーサー領域を更に含む請求項29記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項３１】
ＤＮＡ触媒分子の各集団が基質内の異なるヌクレオチド配列を切断することができる請求項１記載のＤＮＡ触媒分子の２集団以上を含む組成物。
【請求項３２】
ＤＮＡ触媒分子の各集団が、異なる基質を認識することができる請求項１記載のＤＮＡ触媒分子の２集団以上を含む組成物。
【請求項３３】
下記の工程を含む、基質核酸配列を特定部位で切断するＤＮＡ触媒分子の選択方法。
ａ．一本鎖ＤＮＡ分子の集団を得る工程；
ｂ．ヌクレオチド含有基質分子と前記一本鎖ＤＮＡ分子の集団とを混合して混合物をつくる工程；
ｃ．前記集団内の一本鎖ＤＮＡ分子が前記基質配列の切断を引き起こすのに十分な時間及び所定の反応条件下に前記混合物を維持して基質切断産物を作製する工程；
ｄ．前記一本鎖ＤＮＡ分子の集団を前記基質配列と基質切断産物から分離する工程；及び ｅ．ヌクレオチド含有基質を特定部位で切断する一本鎖ＤＮＡ分子を前記集団から単離する工程。
【請求項３４】
前記基質がＲＮＡを含む請求項33記載の方法。
【請求項３５】
前記基質を特定部位で切断する前記ＤＮＡ分子が、固定化物質で標識される請求項33記載の方法。
【請求項３６】
前記物質がビオチンを含む請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記単離工程が、前記標識ＤＮＡ分子をアビジンの結合した固体表面に曝露して前記標識ＤＮＡ分子が前記固体表面に結合される工程を更に含む請求項35記載の方法。
【請求項３８】
下記の工程を含むホスホエステル結合の切断方法。
ａ．基質核酸配列を特定切断部位で切断することができるＤＮＡ触媒分子とホスホエステル結合含有基質とを混合して反応混合物をつくる工程；及び 
ｂ．前記混合物を、前記ＤＮＡ触媒分子が前記ホスホエステル結合を切断することができる所定の反応条件下に維持して基質産物の集団を作製する工程。
【請求項３９】
下記の工程を更に含む請求項38記載の方法。
ａ．前記産物を前記ＤＮＡ触媒分子から分離する工程；及び 
ｂ．追加の基質を前記ＤＮＡ触媒分子に加えて新しい反応混合物をつくる工程。
【請求項４０】
前記基質がＲＮＡを含む請求項38記載の方法。
【請求項４１】
前記所定の反応条件が１価カチオン、２価カチオン、又はその双方の存在を含む請求項38記載の方法。
【請求項４２】
下記の工程を含む、ホスホエステル結合を切断するＤＮＡ触媒分子の操作方法。
ａ．一本鎖ＤＮＡ分子の集団を得る工程；
ｂ．遺伝的変異を前記集団内に導入して変異集団を作製する工程；
ｃ．前記変異集団から所定の選択基準を満たす個体を選択する工程；
ｄ．前記変異集団の残りから前記選択個体を分離する工程；及び 
ｅ．前記選択個体を増幅する工程。
【請求項４３】
１以上の認識ドメイン、可変領域、及びスペーサー領域が隣接した保存コアを特定するヌクレオチド配列を含む天然に存在しないＤＮＡ触媒分子。
【請求項４４】
前記ヌクレオチド配列が、該分子の５′末端に相接又は隣接した第１可変領域、３′末端から該第１可変領域までの位置にある第１認識ドメイン、３′末端から該第１認識ドメインまでの位置にある第１スペーサー領域、３′末端から該第１スペーサー領域までの位置にある第１保存領域、３′末端から該第１保存領域までの位置にある第２スペーサー領域、３′末端から該第２スペーサー領域までの位置にある第２保存領域、３′末端から該第２保存領域までの位置にある第２認識ドメイン、及び３′末端から該第２認識ドメインまでの位置にある第２可変領域を特定する請求項43記載のＤＮＡ触媒分子。
【請求項４５】
前記ヌクレオチド配列が、該分子の５′末端に相接又は隣接した第１可変領域、３′末端から該第１可変領域までの位置にある第１認識ドメイン、３′末端から該第１認識ドメインまでの位置にある第１スペーサー領域、３′末端から該第１スペーサー領域までの位置にある第１保存領域、３′末端から該第１保存領域までの位置にある第２スペーサー領域、３′末端から第２スペーサー領域までの位置にある第２保存領域、３′末端から該第２保存領域までの位置にある第２認識ドメイン、３′末端から該第２認識ドメインまでの位置にある第２可変領域、及び３′末端から該第２可変領域までの位置にある第３認識ドメインを特定する請求項43記載のＤＮＡ触媒分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、他の核酸分子、特にＲＮＡを切断することができる核酸酵素又はＤＮＡ触媒（酵素）分子に関する。本発明は、また、その開示されたＤＮＡ酵素分子を含む組成物及びその酵素及び組成物の作製及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然の場面以外で操作したり、天然には示さない反応を触媒する触媒が求められたことにより、“酵素操作”技術の開発がもたらされた。酵素操作に用いられた通常の経路は、新しい酵素の構築を援助するために天然酵素の理解に頼る“合理的設計”方法であった。残念ながら、タンパク質の構造及び化学の領域における熟達の状態は、新規な生物学的触媒を日常的に作製するには不十分である。
最近、新規な触媒を開発する別の方法が用いられた。その方法には、高分子の不均一プールの構築及び該プールから所望の反応を触媒する分子を単離する試験管内選択方法の適用が必要である。高分子のプールから触媒を選択することは、それらの構造及び化学的性質の包括的理解に依存しない。従って、その方法は、“非合理的設計”と称された（Brenner & Lerner, PNAS USA 89: 5381-5383(1992)）。
【０００３】
ＲＮＡ酵素分子又はリボザイムの合理的設計を含む現在までのたいていの努力は、本質的に新しいか又は改良された触媒作用を有する分子をもたらさなかった。しかしながら、実際に生物のダーウィン的進化後にパターン化される“定方向分子進化”又は“試験管内進化”として我々が記載した方法による合理的設計法を適用すると所望の機能的特性を有するＤＮＡ分子の生産に至る可能性がある。
その手法は、溶液中のＲＮＡ分子（例えば、Mills ら，PNAS USA 58: 217(1967); Green ら，Nature 347: 406(1990); Chowrira ら，Nature 354:320(1991); Joyce，Gene 82: 83(1989); Beaudry & Joyce，Science 257: 635-641(1992); Robertson & Joyce，Nature 344: 467(1990)参照）及び固体支持体に結合されるリガンドに結合したＲＮＡ(Tuerkら，Science 249: 505(1990); Ellington ら，Nature 346: 818(1990))にいろいろな程度の成功で適用された。また、固体支持体に直接結合したペプチド(Lamら，Nature 354: 82(1991));及びウイルスコートタンパク質内で発現したペプチドエピトープ(Scottら，Science 249: 386(1990); Devlinら，Science 249: 249(1990); Cwirlaら，PNAS USA 87:6378(1990))にも適用された。
【０００４】
触媒ＲＮＡの発見から１０年が過ぎた（Krugerら，Cell 31: 147-157(1982); Guerrier-Takada ら，Cell 35: 849-857(1983)）。既知の天然に存在するリボザイムのリストは増えつづけており（Cech, The RNA World, Gesteland & Atkins(eds.)，pp．239-269，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1993); Pyle，Science 261: 709-714(1993); Symons，Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 322-330(1994)参照）、近年、試験管内進化によって得られた合成リボザイムが増加してきた。(例えば、Joyce，Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 331-336(1994); Breaker & Joyce，Trends Biotech．12: 268-275(1994); Chapman & Szostak, Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 618-622(1994) を参照されたい。) ＤＮＡが同様に触媒活性をもつことができることを前提にしてほとんどの官能基がＲＮＡと同じであると考えることは合理的なようである。しかしながら、ある種のウイルスゲノム及び複製中間体を除いて、生物内のほとんど全てのＤＮＡは完全な二重らせんとして存在し、複雑な二次及び三次構造をとることを妨げている。即ち、ＤＮＡ酵素が天然に見られなかったことは驚くことではない。
【０００５】
本発明の出現まで、ヌクレオチド切断能力をもつＤＮＡ触媒分子の設計、合成及び使用は開示又は証明されなかった。従って、本明細書に開示された発見及び発明は、それらが他の核酸、特にＲＮＡを切断するＤＮＡ酵素分子を含むますます効率のよい触媒分子を設計する手段として試験管内進化の可能性を強調している点で特に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、基質核酸（ＮＡ）配列を特定の切断部位で切断することができる合成又は操作した（即ち、天然に存在しない）触媒ＤＮＡ分子（又はＤＮＡ酵素分子）を企図する。本発明は、また、エンドヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ酵素分子を企図する。
【０００７】
１好適態様においては、エンドヌクレアーゼ活性は、基質核酸配列内に一本鎖核酸を含む切断部位を特定するヌクレオチド配列に特異的である。他の好適態様においては、その切断部位は二本鎖核酸である。同様に、基質核酸配列は、一本鎖、二本鎖、部分的一本鎖又は二本鎖、ループ又はその組合わせであってもよい。
企図された別の実施態様においては、基質核酸配列は、１以上のヌクレオチド類縁体を含む。１態様においては、基質核酸配列は、大きな分子の一部であるか又はそれに結合される。
種々の実施態様においては、大きな分子は、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ヌクレオチド類縁体又はその複合物からなる群より選ばれる。他の実施例においては、大きな分子は、核酸配列及び非核酸配列の複合物を含む。
【０００８】
別の実施態様においては、本発明は、基質核酸配列が１以上のヌクレオチド類縁体を含むことを企図する。他の態様は、更に、一本鎖核酸がＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、１以上のヌクレオチド類縁体又はその複合物を含む。開示された発明の１実施態様においては、エンドヌクレアーゼ活性は、切断部位でのホスホエステル結合の加水分解切断を含む。
種々の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ触媒分子は、全部又は一部が一本鎖である。それらのＤＮＡ触媒分子は、好ましくは、その触媒活性と一致したさまざまな形をとることができる。即ち、１態様においては、本発明のＤＮＡ触媒分子は、１以上のヘアピンループ構造を含む。他の態様においては、ＤＮＡ触媒分子は、“ハンマーヘッド”リボザイムと同様の形をとることができる。別の実施態様においては、ＤＮＡ触媒分子は、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)、例えば、グループＩイントロン由来のものと同様のコンホメーションをとることができる。
【０００９】
同様に、本発明の好ましいＤＮＡ触媒分子は、基質分子のもとの配向に無関係に部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を示すことができる。従って、１好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、ＤＮＡ酵素分子から分離する基質核酸配列を切断することができる--即ち、ＤＮＡｚｙｍｅに結合されない。他の好適実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、結合した基質核酸配列を切断することができる--即ち、自己切断と同様の反応を行うことができる。
本発明は、また、エンドヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ酵素分子（ＤＮＡ触媒分子、デオキシリボザイム又はＤＮＡｚｙｍｅ）を企図し、該エンドヌクレアーゼ活性には２価のカチオンの存在が必要である。他の種々の好適実施態様においては、２価のカチオンは、Ｐｂ2+、Ｍｇ2+、Ｚｎ2+及びＣａ2+からなる群より選ばれる。別の態様は、エンドヌクレアーゼ活性には１価のカチオンの存在が必要であることを企図する。そのような他の実施態様においては、１価のカチオンは、好ましくはＮａ+及びＫ+からなる群より選ばれる。
【００１０】
本発明の種々の好適実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、配列番号３、配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；及び配列番号２２からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む。他の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ触媒分子は、配列番号２３、配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；及び配列番号３９からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
別の好適実施態様は、本発明のＤＮＡ触媒分子が配列番号５０及び配列番号５１からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含むことを企図する。他の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ触媒分子は、配列番号５２〜１０１からなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む。本明細書に開示されるように、本明細書に開示されたものと実質的に同様の配列を有するＤＮＡ触媒分子も企図される。即ち、種々の他の有用なＤＮＡ触媒分子を生じるように種々の置換、欠失、挿入、重複及び他の変異が本明細書に記載された分子に行われる。前記分子が本明細書に開示された部位特異的切断活性を示すかぎりは本開示の範囲内である。
【００１２】
本発明の他の態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子の基質結合親和性は好ましくは約１μM 以下である。他の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、ＫD約０.１μM 未満で基質を結合する。
本発明は、また、有用な代謝回転速度を有するＤＮＡ酵素分子開示する。１実施態様においては、代謝回転速度は、５hr-1未満であり、好ましい実施態様においては、約２hr-1未満であり、更に好ましい実施態様においては、約１hr-1未満であり、なお更に好ましい実施態様においては、約０.６hr-1以下である。
別の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、ｋobsが１ min-1未満、好ましくは０.１ min-1未満、更に好ましくは０.０１ min-1未満、なお更に好ましくは０.００５ min-1未満である有用な代謝回転を示す。１態様においては、ｋobs値は、約０.００２ min-1以下である。
【００１３】
本発明は、また、開示されたＤＮＡ酵素の触媒速度が十分に最適化される実施態様を企図する。即ち、種々の好適実施態様においては、Ｍｇ2+の存在によって増強された反応のＫm は約０.５〜２０mM、好ましくは約１〜１０mM、更に好ましくは約２〜５mMである。
本発明は、また、切断部位を特定するヌクレオチド配列が少なくとも１ヌクレオチドを含む実施態様を企図する。他の種々の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ触媒分子は、２以上のヌクレオチドの切断部位を特定するヌクレオチド配列を認識及び切断することができる。
【００１４】
種々の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、１以上の基質結合領域が隣接した保存コアを含む。１実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、第１及び第２基質結合領域を含む。他の実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、２以上の基質結合領域を含む。
前述のように、本発明の好ましいＤＮＡ触媒分子は保存コアを含むことができる。１好適実施態様においては、保存コアは１以上の保存領域を含む。他の好適態様においては、１以上の保存領域は、CG; CGA; AGCG; AGCCG; CAGCGAT; CTTGTTT;及び CTTATTTからなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む（例えば、図３参照）。
本発明の１実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、更に、保存コア内の保存領域間に１以上の可変又はスペーサーヌクレオチドを含む。他の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、更に、保存コアと基質結合領域間に１以上の可変又はスペーサーヌクレオチドを含む。
【００１５】
１態様においては、第１基質結合領域は、好ましくは、CATCTCT; GCTCT; TTGCTTTTT; TGTCTTCTC; TTGCTGCT; GCCATGCTTT(配列番号40); CTCTATTTCT(配列番号41); GTCGGCA; CATCTCTTC;及びACTTCTからなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む。他の好適態様においては、第２基質結合領域は、TATGTGACGCTA(配列番号42); TATAGTCGTA(配列番号43); ATAGCGTATTA(配列番号44); ATAGTTACGTCAT(配列番号45); AATAGTGAAGTGTT(配列番号46); TATAGTGTA; ATAGTCGGT; ATAGGCCCGGT(配列番号47); AATAGTGAGGCTTG(配列番号48);及びATGNTGからなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本発明の種々の実施態様においては、基質結合領域は長さが異なる。従って、例えば、基質結合領域は単一ヌクレオチドから数十個のヌクレオチドを含むことができる。しかしながら、長さが約３〜２５ヌクレオチド、好ましくは約３〜１５ヌクレオチド、更に好ましくは約３〜１０ヌクレオチドの基質結合領域が特に好ましいことが理解される。種々の実施態様においては、基質結合領域における個々のヌクレオチドは基質分子のヌクレオチドと相補的塩基対を形成することができ、他の実施態様においては、非相補的塩基対が形成される。相補的及び非相補的塩基対合の混合物も、本発明の開示された実施態様の範囲内に包含するものとして企図される。
【００１７】
他の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ触媒分子は、更に、第３基質結合領域を含むことができる。ある好適実施態様においては、第３領域は、TGTT; TGTTA;及びTGTTAGからなる群より選ばれたヌクレオチド配列を含む。本発明の別の好適実施態様は、基質結合領域間に１以上の可変又は“スペーサー”領域を更に含むＤＮＡ酵素分子を開示する。
他の開示された実施態様においては、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性をもつ、他のＤＮＡ分子から分離された精製合成ＤＮＡ酵素分子を企図し、該エンドヌクレアーゼ活性は基質核酸配列内に一本鎖又は二本鎖核酸を含む切断部位を特定するヌクレオチド配列に特異的である。１態様においては、エンドヌクレアーゼ活性をもつ合成（又は操作）ＤＮＡ酵素分子が開示され、該エンドヌクレアーゼ活性は実質的に基質核酸配列の一本鎖又は二本鎖領域からなる切断部位を特定するヌクレオチド配列に特異的である。
【００１８】
別の実施態様においては、本発明は、核酸含有基質を加水分解して基質切断産物を作製する触媒活性をもつデオキシリボヌクレオチドポリマーを含むＤＮＡ酵素分子を企図する。１態様においては、加水分解は部位特異的方法で行われる。
前述のように、該ポリマーは一本鎖、二本鎖、又は双方の組合わせとすることができる。
本発明は、更に、基質が核酸配列を含むことを企図する。種々の実施態様においては、核酸配列基質は、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、１以上のヌクレオチド類縁体、又はそれらの複合物を含む。１実施態様は、基質が一本鎖セグメントを含むことを企図し、他の実施態様は、基質が二本鎖であることを企図する。
【００１９】
本発明は、また、核酸含有基質を加水分解して切断産物を作製する触媒活性をもつデオキシリボヌクレオチドポリマーを含むＤＮＡ酵素分子を企図する。１態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、基質に効果的な結合親和性があり、切断産物に効果的な結合親和性がない。
１好適実施態様においては、本発明は、認識ドメイン、可変領域、及びスペーサー領域が隣接した保存コアを特定するヌクレオチド配列を含む天然に存在しないＤＮＡ酵素分子を開示する。即ち、１好適実施態様においては、ヌクレオチド配列は、該分子の５′末端に相接又は隣接した第１可変領域、３′末端から該第１可変領域までの位置にある第１認識ドメイン、３′末端から該第１認識ドメインまでの位置にある第１スペーサー領域、３′末端から該第１スペーサー領域までの位置にある第１保存領域、３′末端から該第１保存領域までの位置にある第２スペーサー領域、３′末端から該第２スペーサー領域までの位置にある第２保存領域、３′末端から該第２保存領域までの位置にある第２認識ドメイン、及び３′末端から該第２認識ドメインまでの位置にある第２可変領域を特定する。
【００２０】
他の実施態様においては、ヌクレオチド配列は、該分子の５′末端に相接又は隣接する第１可変領域、３′末端から該第１可変領域までの位置にある第１認識ドメイン、３′末端から該第１認識ドメインまでの位置にある第１スペーサー領域、３′末端から該第１スペーサー領域までの位置にある第１保存領域、３′末端から該第１保存領域までの位置にある第２スペーサー領域、３′末端から該第２スペーサー領域までの位置にある第２保存領域、３′末端から該第２保存領域までの位置にある第２認識ドメイン、３′末端から該第２認識ドメインまでの位置にある第２可変領域、及び３′末端から該第２認識ドメインまでの位置にある第３認識ドメインを特定する。
上記分子の１態様においては、該分子は、２つの基質結合ドメインが隣接した保存コア領域を含み、他の態様においては、保存コア領域は、１以上の保存ドメインを含む。他の好適実施態様においては、保存コア領域は、更に、１以上の可変又はスペーサーヌクレオチドを含む。別の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、更に、１以上のスペーサー領域を含む。
本発明は、更に、種々の組成物を企図する。例えば、上記のＤＮＡ酵素分子を含む組成物が本明細書に開示及び企図される。他の実施態様においては、本発明の組成物は、上記のＤＮＡ酵素分子の２集団以上を含み、ＤＮＡ酵素分子の各集団は基質内の異なる配列を切断することができる。他の態様においては、組成物は、上記のＤＮＡ酵素分子の２集団以上を含み、ＤＮＡ酵素分子の各集団は異なる基質を認識することができる。種々の実施態様においては、組成物は１価又は２価のカチオンを含むことも好ましい。
【００２１】
本発明は、更に、本発明のＤＮＡ酵素分子を作成、選択及び単離する方法を企図する。１態様においては、核酸配列（例えば、ＲＮＡ）を特定部位で切断するＤＮＡ酵素分子を選択する方法は、次の工程を含む。（ａ）推定ＤＮＡ酵素分子の１集団--配列は天然に存在するものか或いは合成のもののいずれか--好ましくは、一本鎖ＤＮＡ分子を得る工程、（ｂ）ヌクレオチド含有基質配列を前述のＤＮＡ分子の集団と混合して混合物をつくる工程;（ｃ）該集団内の推定ＤＮＡ酵素分子が該基質配列の切断を引き起こすのに十分な時間及び所定の反応条件下に該混合物を維持して基質切断産物を作製する工程;（ｄ）該ＤＮＡ分子の集団を該基質配列と基質切断産物から分離する工程；及び（ｅ）基質核酸配列（例えば、ＲＮＡ）を特定部位で切断するＤＮＡ分子を該集団から単離する工程。
上記方法の１態様においては、基質核酸配列を特定部位で切断するＤＮＡ分子は、固定化物質で標識される。１実施例においては、該物質はビオチンを含む。
【００２２】
前述の方法の他の態様においては、そのために操作されたＤＮＡ酵素分子を用いて切断したい配列--例えば、所定の“標的”ヌクレオチド配列--を選択することにより開始する。従って、１実施態様においては、予め選択された(又は所定の)“標的”配列を用いてそれを１以上のランダム化配列又はセグメントを含むデオキシリボ核酸配列に結合又は“標識”することにより基質核酸配列を特定部位で切断することができるＤＮＡ分子の集団を作成する。１態様においては、ランダム化配列の長さは約４０ヌクレオチドであり、他の態様においては、ランダム化配列の長さは約５０ヌクレオチドである。長さが１〜４０、４０〜５０、及び５０〜１００ヌクレオチドであるランダム化配列も本発明によって企図される。
【００２３】
本発明の１実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子の集団を作成するために用いられるヌクレオチド配列は、配列番号４、２３、５０及び５１からなる群より選ばれる。他の実施態様においては、“標的”又は“基質”ヌクレオチド配列は、１以上のリボヌクレオチドの配列を含む--例えば、配列番号４及び２３及び配列番号４９の適切な部分参照。また、有用な“標的”又は“基質”ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその複合物を含むことができることも本発明によって企図される。
【００２４】
本発明は、また、単離工程が、更に、標識ＤＮＡ分子をアビジンの結合した固体表面に曝露して標識ＤＮＡ分子が該固体表面に結合される上記の方法を企図する。前のように、基質は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、双方の複合物又はヌクレオチド配列を含む分子とすることができる。
本発明は、また、下記の工程を含む、基質核酸配列を特定の切断部位で特異的に切断する方法を企図する。（ａ）基質核酸配列を特定の切断部位で切断することができるＤＮＡ酵素分子を供給する工程；及び（ｂ）該ＤＮＡ酵素分子を該基質核酸配列と接触させて特定部位での該核酸配列の特異的切断を引き起こす工程。１態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、天然に存在する（又は合成）ＤＮＡ分子である。他の態様においては、ＤＮＡ酵素分子は一本鎖である。
【００２５】
上記方法の他の態様においては、基質は核酸を含む。種々の実施態様においては、基質核酸は、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、１以上のヌクレオチド類縁体、又はそれらの複合物を含む。別の実施態様においては、特異的切断は、ＤＮＡ酵素分子のエンドヌクレアーゼ活性による。反応条件の変化--例えば、ｐＨの調整、温度、カチオン％、酵素％、基質％、及び産物％--も本明細書中に企図される。
本発明は、また、下記の工程を含む、ホスホエステル結合の切断方法を企図する。（ａ）基質核酸配列を特定の切断部位で切断することができるＤＮＡ触媒分子とホスホエステル結合含有基質とを混合して反応混合物をつくる工程；及び（ｂ）該ＤＮＡ酵素分子が該ホスホエステル結合を切断することができる所定の反応条件下に該混合物を維持して基質産物の集団を作製する工程。１実施態様においては、該ＤＮＡ酵素分子は、部位特異的方法でホスホエステル結合を切断することができる。他の実施態様においては、該方法は、更に、（ｃ）該産物を該ＤＮＡ触媒分子から分離する工程；及び（ｄ）追加の基質を該ＤＮＡ酵素分子に加えて新しい反応混合物をつくる工程を含む。
【００２６】
本発明は、また、ホスホエステル結合を切断するＤＮＡ酵素分子を操作する方法を企図する。具体的な１方法は次の工程を含む。（ａ）一本鎖ＤＮＡ分子の集団を得る工程;(ｂ)遺伝的変化を該集団に導入して変異集団を作製する工程;(ｃ)所定の選択基準を満たす該変異集団から個体を選択する工程;(ｄ)該選択した個体を該変異集団の残りから分離する工程；及び（ｅ）該選択した個体を増幅する工程。
【００２７】
ここで、図１は、標的ＲＮＡホスホエステルを切断するＤＮＡを単離する選択的増幅スキームを示す図である。図示されるように、５０ランダムヌクレオチドの伸長物を含む二本鎖ＤＮＡ（“Ｎ50”を有する分子は上で示した）は、アデノシンリボヌクレオチド（ｒＡ）によって３′端で終わる５′ビオチニル化ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲで増幅される。（ビオチン標識は丸で囲まれた文字“Ｂ”で示される。） そのプライマーは、Ｔａｑポリメラーゼで伸長されてはめ込み単一リボヌクレオチドを含むＤＮＡ産物を得る。得られた二本鎖ＤＮＡは、ストレプトアビジンマトリックスに固定化され、非ビオチニル化ＤＮＡ鎖は０.２N ＮａＯＨで洗浄することにより除去される。カラムを緩衝化溶液で再平衡化した後、カラムは１mMＰｂＯＡｃを加えた同様の溶液で洗浄される。Ｐｂ2+依存性自己切断を行うＤＮＡがカラムから遊離し、溶離液に集められ、ＰＣＲで増幅される。次に、次のラウンドの選択的増幅を開始するためにそのＰＣＲ産物が用いられる。
【００２８】
図２は、出発ＤＮＡプール（Ｇ０）及び鉛カチオン（Ｐｂ2+）存在下に１〜５ラウンドの選択（Ｇ１〜Ｇ５）後に得られた集団の自己切断活性を示す写真である。記号Ｐｒｅは、１０８ヌクレオチド前駆体ＤＮＡ(配列番号４);Ｃｌｖは、２８ヌクレオチド５′切断産物(配列番号５);及びＭは長さが５′切断産物に対応するプライマー３ａ（配列番号６）を表す。
【００２９】
図３は、５ラウンドの選択後の集団から単離した個々の変異体の配列アラインメントを示す図である。固定した基質ドメインは、上方に示され、標的リボアデニレートは逆三角で確認される。推定塩基対合相互作用に共通して関係する基質ヌクレオチドは、垂直の棒で示される。５０個の初期ランダム化ヌクレオチドに対応する配列は、基質ドメインに逆平行で配列される。変異体は、全て固定した配列５′-CGGTAAGCTTGGCAC-3′（図示されず；配列番号１）の３′で終わる。基質ドメインを有する塩基対をつくると考えられる初期ランダム化領域内のヌクレオチドは、図の左右側に示され、ＤＮＡ酵素分子の推定塩基対形成領域は示された各配列において個々にボックスで仕切られる。保存領域は、２つの大きな中央に位置したボックスで示される。
【００３０】
図４Ａ及び図４Ｂは、触媒代謝回転で進行する分子間反応におけるＲＮＡホスホエステルのＤＮＡ触媒切断を示す図である。
図４Ａは、１９量体基質(3′-TCACTATrAGGAAGAGATGG -5′、配列番号２)及び３８量体ＤＮＡ酵素(5′-ACACATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGACGCTA -3′、配列番号３)間に形成された複合体の図式である。基質は、デオキシリボヌクレオチドが隣接した単一アデノシンリボヌクレオチド(“ｒＡ”、矢印に隣接した)を含有する。ＤＮＡ合成酵素は、図３に示された最も頻繁に生じる変異体の３８ヌクレオチド部分である。推定触媒ドメイン内に位置した高度保存ヌクレオチドは“ボックス”で仕切られる。示されるように、一方の保存配列は“AGCG”であり、もう一方は“CG”である（５′−３′方向で読み取る）。
【００３１】
図４Ｂは、試験管内選択で用いたものと同じ条件下の［５′−32Ｐ］標識基質のＤＮＡ触媒切断についてＫm（負の勾配）及びＶmax（y切片）を求めるために用いられるイーディー・ホフステープロットを示すグラフである。初期切断速度は、５nMＤＡＮ酵素及び０.１２５、０.５、１、２、或いは４μM 基質を含む反応について求めた。
【００３２】
図５は、選択触媒ＤＮＡの４ファミリーの特異的エンドヌクレアーゼ活性を証明するポリアクリルアミドゲルを示す写真である。分子のＰｂ2+依存性ファミリーの選択を、対照として関連様式で繰り返した（第１グループ）。第２グループにおいては、Ｚｎ2+をカチオンとして用い、第３グループにおいては、カチオンはＭｎ2+であり、第４グループにおいては、カチオンはＭｇ2+である。ゲル上の第５の位置は、マーカーとして切断産物のみからなる。
わかるように、上記４グループの各々に３レーンがある。３レーンの各グループにおいて、第１レーンは、金属カチオンの存在しないときの選択集団の活性のないことを示し、第２レーンは、金属カチオンの存在するときの実測活性を示し、第３レーンは、出発プール（Ｇ０）の活性のないことを示す。
【００３３】
図６Ａ及び図６Ｂは、各々“前駆体”触媒ＤＮＡ分子及び本明細書に開示された選択的増幅法で得られた数種の触媒ＤＮＡ分子の１種の２次元図を示す。図６Ａは、出発プールからの具体的な分子であり、配列番号２３で示される分子の全体配置を示す。示されるように、種々の相補的ヌクレオチドは、ランダム（Ｎ40）領域を隣接する。図６Ｂは、本明細書に記載された手順によって作成されたＭｇ2+依存性触媒ＤＮＡ分子(又は“ＤＮＡｚｙｍｅ”)の１種の図式である。基質核酸におけるリボヌクレオチドの位置は、図６Ａ及び図６Ｂ共に矢印で示される。
【００３４】
図７は、実質的に下記の実施例５に記載されるように行われた１０ラウンドの試験管内選択的増幅の結果のいくつかを示すグラフである。示されるように、２つの位置と触媒の２ファミリーが標的配列の最も効率のよい切断を示すものとしてはめ込まれた。切断条件は、実質的に図７に示される通り、即ち、１０mM Ｍｇ2+、ｐＨ７.５、及び３７℃であり、反応を２時間行った後に集めたデータが示されている。切断（％）は、世代数（ここでは０〜１０）に対してプロットしたものが示される。基質内の指示された部位で標的配列を切断することができるＤＮＡ触媒分子の数／有効性は垂直のバーで示され、G↓UAACUAGAGAU での切断は縞のバーで示され、GUAACUA↓GAGAU での切断は白い（輪郭の）バーで示される。
【００３５】
図８は、本発明の２つのＤＮＡ触媒分子、クローン８〜１７及び１０〜２３のヌクレオチド配列、切断部位及び代謝回転速度を示す図である。反応条件は、示されるとおり、即ち、１０mMＭｇ2+、ｐＨ７.５、及び３７℃とした。クローン８〜１７として同定されたＤＮＡｚｙｍｅは左側に示され、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示される。基質配列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG -3′)--ＤＮＡｚｙｍｅから分離する（即ち、分子間切断が示される）--はそれだけで標識される。同様に、１０〜２３として同定されたＤＮＡｚｙｍｅは右側に示され、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示される。また、基質配列も示される。８〜１７酵素については、代謝回転速度は約０.６hr-1であり、１０〜２３酵素については、代謝回転速度は約１hr-1であった。非相補的対合は黒い丸（・）で示され、相補的対合は縦の線（｜）で示される。
【００３６】
図９は、更に、本発明の２つのＤＮＡ触媒分子、クローン８〜１７及び１０〜２３のヌクレオチド配列、切断部位及び代謝回転速度を示す図である。反応条件は、示されるとおり、即ち、１０mMＭｇ2+、ｐＨ７.５、及び３７℃とした。図８のように、クローン８〜１７として同定されたＤＮＡｚｙｍｅは左側に示され、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示される。基質配列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG -3′)--ＤＮＡｚｙｍｅから分離する（即ち、分子間切断が示される）--はそれだけで標識される。同様に、１０〜２３として同定されたＤＮＡｚｙｍｅは右側に示され、ＲＮＡ基質の切断部位は矢印で示される。また、基質配列も示される。８〜１７酵素については、ｋobsは約０.００２ min-1であり、１０〜２３酵素については、ｋobs値は約０.０１ min-1であった。非相補的対合は黒い丸（・）で示され、相補的対合は縦の線（｜）で示される。
【００３７】
Ａ．定義 
本明細書に用いられる“デオキシリボザイム”という語は、酵素として機能することができるＤＮＡ含有核酸を記載するために用いられる。本開示においては、“デオキシリボザイム”という語は、エンドリボヌクレアーゼ及びエンドデオキシリボヌクレアーゼを含むが、エンドリボヌクレアーゼ活性をもつデオキシリボザイムが特に好ましい。本明細書にデオキシリボザイムと同じ意味で用いられる他の語は、“ＤＮＡ酵素分子”、“ＤＮＡｚｙｍｅ”、又は“ＤＮＡ触媒分子”であり、合成で作製されても生物又は他の供給源由来であっても全てその酵素的に活性な部分を含むことを理解されなければならない。
“ＤＮＡ酵素分子”という語は、また、指定されたオリゴヌクレオチド標的又は基質に対して基質結合領域内に相補性を有するＤＮＡ分子を含み、かかる分子も、オリゴヌクレオチド基質を特異的に切断するのに活性な酵素活性を有する。
【００３８】
他の言い方で述べると、ＤＮＡ酵素分子は、オリゴヌクレオチド基質を分子間で切断することができる。その相補性は、基質の分子間切断を引き起こすことができる基質オリゴヌクレオチドに対するＤＮＡ酵素分子の十分なハイブリッド形成を可能にするように機能する。１００パーセント（１００％）相補性が好ましいが、７５〜１００％の範囲の相補性も有効であり本発明によって企図される。
本発明のＤＮＡ酵素分子は、また、ヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼ活性を有するものとして記載される。それらの用語は、本明細書においては同じ意味で用いられる。
本明細書に用いられる“酵素核酸”という語は、酵素ＲＮＡ又はＤＮＡ分子、酵素ＲＮＡ−ＤＮＡポリマー、及びその酵素的に活性な部分又は誘導体を包含するが、ＤＮＡ酵素分子が本発明の酵素的に活性な分子の特に好ましい種類である。
【００３９】
本明細書に用いられる“エンドデオキシリボヌクレアーゼ”という語は、主としてＤＮＡを含む基質を切断することができる酵素である。本明細書い用いられる“エンドリボヌクレアーゼ”という語は、主としてＲＮＡを含む基質を切断することができる酵素である。
本明細書に用いられる“塩基対”(ｂｐ)という語は、一般的には、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の組合わせを記載するために用いられるが、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ（及びＵ）の共通というほどでない類縁体がときおり塩基対合に関与することは理解されなければならない。ＤＮＡ又はＲＮＡが二本鎖配置をとる場合に通常対になるヌクレオチドも、本明細書で“相補的塩基”と呼ばれる。
【００４０】
“相補的ヌクレオチド配列”は、一般的には、結果として生じる水素結合で特異的にハイブリッド形成する他の単一オリゴヌクレオチド鎖に十分相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖分子又はセグメント内のヌクレオチド配列を意味する。
“ヌクレオチド”は、一般的には、糖部分（ペントース）、リン酸基、及び含窒素複素環塩基からなるＤＮＡ又はＲＮＡのモノマー単位を意味する。塩基は、グリコシド炭素（ペントースの１′炭素）で糖部分に結合され、塩基及び糖のその組合わせが“ヌクレオシド”である。ヌクレオシドがペントースの３′又は５′位に結合したリン酸基を含む場合、ヌクレオチドと呼ばれる。作用上結合したヌクレオチドの配列は、典型的には、本明細書で“塩基配列”又は“ヌクレオチド配列”及び分法上の等価物と呼ばれ、本明細書では特にことわらない限り、左から右への向きが５′末端から３′末端への慣用の向きである式で示される。
【００４１】
“ヌクレオチド類縁体”は、一般的には、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵと構造上異なるが核酸分子内の正規のヌクレオチドを置き換えるのに十分に同じであるプリン又はピリミジンヌクレオチドを意味する。本明細書に用いられる“ヌクレオチド類縁体”という語は、改変塩基、異種又は特異糖（即ち、“通常の”ペントース以外の糖）、又はその２つの組あわせを包含する。塩基が変わった具体的な類縁体の表は、下記のＣの項で示される。
“オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド”は、一般的には、一本鎖又は二本鎖ヌクレオチドのポリマーを意味する。本明細書に用いられる“オリゴヌクレオチド”及びその文法上の等価物は、全範囲の核酸を含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチドの線状鎖を含む核酸分子を意味する。正確なサイズは、多くの要因に左右され、当該技術において周知であるように最後の使用条件に左右される。
【００４２】
本明細書に用いられる“生理的条件”という語は、哺乳類生物、特にヒトに見られるものに匹敵する反応条件を示すことを意味する。温度、カチオンの有効性及びｐＨ範囲のような可変部分が下記に詳細に記載されるように変動させることができるが、“生理的条件”は、一般的には、約３５〜４０℃の温度を含み、３７℃が特に好ましく、ｐＨは約７.０〜８.０であり、７.５が特に好ましく、更に、カチオンの有効性、好ましくは２価及び／又は１価のカチオンを含み、約２〜１５mMＭｇ2+及び０〜１.０M Ｎａ+の濃度が特に好ましい。本明細書に用いられる“生理的条件”は、ヌクレオシド補助因子の存在を任意に含んでもよい。前に述べたように、好ましい条件は下記に詳細に記載される。
【００４３】
Ｂ．ＤＮＡ酵素分子 
種々の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、付加、欠失及び置換を含む１以上の修飾又は突然変異を合わせることができる。別の実施態様においては、かかる突然変異又は修飾は、ランダム又は特定の突然変異又は修飾を生じる方法を用いて作成される。それらの突然変異は、例えば、ループ、スペーサー領域又は認識配列（又はドメイン）の長さを変えるか又はそのヌクレオチド配列を変えることができる。１つの触媒的に活性なＤＮＡ酵素分子内の１以上の突然変異を第２の触媒的に活性なＤＮＡ酵素分子内の１以上の突然変異と合わせて双方の分子の突然変異を含む新しいＤＮＡ酵素分子を作製することができる。
【００４４】
他の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、当業者に周知の種々の方法を用いて導入されたランダム突然変異をもつことができる。例えば、カドウェル＆ジョイス(PCR Methods and Applications 2: 28-33(1992))によって記載された方法は、変更して下記の実施例に記載されるように本明細書に開示された使用に特に好ましい。(Cadwell & Joyce，PCR Methods and Applications 3(Suppl.): S136-S140(1994)も参照されたい。) その修飾ＰＣＲ法に従って、ランダム点突然変異はクローン化遺伝子に導入される。
上述の方法は、例えば、配列分析で求めた位置あたりの突然変異率０.６６％±０.１３％（９５％信頼間隔）でリボザイムをコード化する遺伝子に突然変異を誘発させるために用いられ、塩基置換の種類に強い優先は認められなかった。
【００４５】
これにより、本発明のＤＮＡ酵素分子内のいずれの位置でもランダム突然変異の導入が可能である。
特定又はランダム突然変異を導入するのに有効な他の方法は、Joyce & Inoue, Nucleic Acids Research 17: 711-722(1989)に開示されている。その後者の方法は、二本鎖ＤＮＡの鋳型（コーディング）鎖の切出し、突然変異原性オリゴヌクレオチドの封入による鋳型鎖の再構築、及び引き続き部分的ミスマッチ鋳型の転写が必要である。これにより、選択された位置に既知の又はランダムヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれることにより分子内のいずれかの位置に特定又はランダム突然変異の導入が可能である。
本発明のＤＮＡ酵素分子は、適切なように種々の長さ及び折りたたみパターンを有し、分子の種類及び機能に左右される。例えば、ＤＮＡ酵素分子は長さが約１５〜約４００以上のヌクレオチドとすることができるが、約２５０を超えるヌクレオチドは大き過ぎるか又は扱いにくくすることにより分子の治療上の有用性を制限することを避けるために好ましくない。種々の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は長さが少なくとも約２０ヌクレオチドであり、有用な分子は長さが１００ヌクレオチドを超えてもよいが、好ましい分子は長さが通常約１００ヌクレオチドを超えない。
【００４６】
種々の治療用途においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、酵素的に活性な部分のデオキシリボザイムを含む。種々の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、好ましくは約２００ヌクレオチドを超えない。他の実施態様においては、本発明のデオキシリボザイムは、約１００ヌクレオチドを超えない。別の好適実施態様においては、本発明のデオキシリボザイムは長さが約２０〜７５ヌクレオチド、更に好ましくは約２０〜６５ヌクレオチドである。他の好ましいＤＮＡ酵素分子は、長さが約１０〜５０ヌクレオチドである。
他の用途においては、ＤＮＡ酵素分子は、“ハンマーヘッド”リボザイムと同様の配置をとることができる。かかるＤＮＡ酵素分子は、長さが約７５〜１００ヌクレオチドを超えないことが好ましく、約２０〜５０ヌクレオチドの長さが特に好ましい。
【００４７】
通常、本明細書に開示された有用な分子を合成するものである場合には、核酸酵素分子が大きいほど、合成が困難になる。当業者は、それらの設計拘束を確かに理解するであろう。しかし、かかる大きな分子も本発明の範囲内である。
また、本発明のＤＮＡ酵素分子がデオキシリボザイムの酵素的に活性な部分を含むことができ、１以上の突然変異、例えば、１以上の塩基対形成配列を含むか又はスペーサーが存在しないか又は修飾されたデオキシリボザイムを含むことができることも、かかる欠失、付加又は修飾が酵素として分子の性能に大きな逆影響を及ばさない限り理解されるべきである。
【００４８】
本発明のＤＮＡ酵素分子の認識ドメインは、典型的には、触媒ドメインを隣接する２つのヌクレオチド配列を含み、典型的には、ＤＮＡ酵素分子に高配列特異性を与える基質核酸内の塩基の相補的配列に対してハイブリッド形成することができる少なくとも約３〜約３０塩基、好ましくは約６〜約１５塩基の配列を含む。周知の方法による認識部位の修飾又は突然変異は、核酸酵素分子の配列特異性を変えることができる。（例えば、Jolyceら，Nucleic Acids Research 17: 711-712(1989)を参照されたい。）
本発明の核酸酵素分子は、また、認識部位又はドメインの変化したものも含まれる。種々の実施態様においては、これらの変化した認識ドメインは、かかる認識ドメインを含む核酸酵素分子についてユニークな配列特異性を与える。認識ドメインに存在する正確な塩基は、切断が行われる塩基配列を決定する。基質核酸の切断は、認識ドメイン内で起こる。その切断により、基質切断配列の２′、３′又は２′，３′−環状リン酸基及びもとの基質でははじめはすぐに３′の基質切断配列であったヌクレオチドの５′ヒドロキシルが残る。切断は、認識部位に存在する塩基を変えることにより選択部位に特定される（内部ガイド配列）。Murphyら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 9218-9222(1989)を参照されたい。
【００４９】
更に、ＤＮＡ酵素分子とその基質間の認識及び結合を容易にするためにポリアミンを加えることも有効である。有効なポリアミンの例としては、スペルミジン、プトレッシン又はスペルミンが挙げられる。個々の実施態様においては、約１mMのスペルミジン濃度が有効であるが、約０.１〜約１０mMの範囲の濃度が有効である。
他の種々の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、核酸基質、好ましくはＲＮＡ基質の切断能が増強又は最適化される。当業者が理解するように、酵素触媒反応の速度は、基質と酵素の濃度によって変動し、通常、高基質又は酵素濃度で一様になる。かかる効果を考慮すると、酵素触媒反応の速度論は、反応を定義する次の条件で記載される。
ＲＮＡ基質を切断する本発明のＤＮＡ酵素分子の増強又は最適化は、ＤＮＡ酵素分子の存在下に種々の量の標識ＲＮＡ基質との切断反応で求められる。基質の切断能は、一般的には、ミカエリス定数（ＫM）で除した触媒速度（ｋcat）で定義される。記号ｋcatは、基質が飽和値に近づく場合の酵素反応の最大速度を表す。ＫMは、反応速度が最大の１／２である基質濃度を表す。
例えば、ＫMとｋcatの値は、本発明においては基質濃度［Ｓ］がＤＮＡ酵素分子濃度［Ｅ］より過剰にある実験で求められる。基質濃度範囲にわたる反応の初速度(Ｖ0)は、初期直線相、通常、反応の最初の５％以下から推定される。データの点は、次式で示された理論的直線の最小方格法にあてはまる：ｖ＝−ＫM(Ｖ0／[Ｓ])＋Ｖmax。 即ち、ｋcat及びＫMは、反応の初速度、Ｖ0及び基質濃度［Ｓ］で求められる。
【００５０】
他の種々の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、核酸基質、好ましくはＲＮＡ基質の切断能力が増強又は最適化される。好適実施態様においては、ＲＮＡ基質を切断するＤＮＡ酵素分子の増強又は最適化能力は、非触媒速度より約１０〜１０9倍の改良を示している。更に好適な実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、“前駆体”のものより約１０3〜１０7倍改良された速度でＲＮＡ基質を切断することができる。更に好適な実施態様においては、ＲＮＡ基質の切断能力の増強又は最適化は、前駆体のものより１０4〜１０6倍の改良として示される。当業者は、ＤＮＡ酵素分子の核酸基質を切断する能力の増強又は最適化が本発明の試験管内進化手順で加えられた選択拘束によって変動することができることを理解するであろう。
本発明のデオキシリボザイム及び他のＤＮＡ酵素分子及びヌクレアーゼを修飾する種々の好ましい方法は、更に、下記の実施例１〜３に記載される。
【００５１】
Ｃ．ヌクレオチド類縁体 
上で述べたように、本明細書に用いられる“ヌクレオチド類縁体”という語は、一般的には、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵと構造上異なるが核酸分子内のそのような“正規の”ヌクレオチドを置換するのに十分に類似したプリン又はピリミジンヌクレオチドを意味する。本明細書に用いられる“ヌクレオチド類縁体”という語は、改変塩基、異種（又は特異）糖、改変リン酸塩骨格又はそれらの改変の組み合わせを包含する。本発明に有用なヌクレオチド類縁体の例は下記の表に示されるものが含まれ、ほとんどが３７ＣＦＲ§１.８２２の修飾塩基の承認された表に見られる（参考として本明細書に引用する）。
【００５２】
2006136333.tif 000002
【００５３】
2006136333.tif 000003
【００５４】
他の有用な類縁体は、公開された国際出願第WO92/20823号（その開示を参考として本明細書に引用する）、又はその中に開示された方法に従って作製された類縁体が含まれる。DeMesmaekerら，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 226-229(1994); DeMesmaekerら，Synlett: 733-736(Oct．1993); Nielsenら, Science 254: 1497-1500(1991); 及びIdziakら, Tetrahedron Letters 34: 5417-5420(1993)に記載された類縁体も本明細書に開示された発明によれば有用であり、前記開示も参考として本明細書に引用する。
【００５５】
Ｄ．ＤＮＡ酵素分子の操作方法 
本発明は、また、所定の活性をもつ核酸分子の作製方法を企図する。１好適実施態様においては、核酸分子はＤＮＡ酵素分子である。他の態様においては、所望の活性は触媒活性である。
１実施態様においては、本発明は、特定の又は所定の反応を触媒するように“操作”されるＤＮＡ酵素分子の合成法を企図する。ＤＮＡ酵素分子の調製方法は、本明細書に記載される。例えば、下記実施例１〜３を参照されたい。他の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のような小分子又はリガンドを結合するように操作される。（例えば、Sassanfar ら，Nature 364: 550-553(1993)を参照されたい。）
他の実施態様においては、本発明は、ＤＮＡ酵素分子の集団が突然変異ＤＮＡ酵素分子(“デオキシリボザイム”又は“ＤＮＡｚｙｍｅ”とも言われる)の異種集団を作製する突然変異誘発条件に供されることを企図する。その後、所望の特性を有するＤＮＡ酵素分子が該集団から選択及び／又は分離され、引き続いて増幅される。
【００５６】
また、突然変異は、ＤＮＡ酵素分子の認識ドメインの長さを変えることによりＤＮＡ酵素分子に導入される。ＤＮＡ酵素分子の認識ドメインは、基質核酸配列内の塩基の相補的配列と会合する。認識ドメインの長さを変える方法は、当該技術において既知であり、例えば、ＰＣＲを含み、有効な手法は下記実施例に記載される。
ＤＮＡ酵素分子の認識ドメインの長さを変えると、ＤＮＡ酵素分子の結合特異性に望ましい効果を与えることができる。例えば、認識ドメインの長さが増加すると、ＤＮＡ酵素分子と基質内のオリゴヌクレオチドの相補的塩基配列間の結合特異性が増大し、ハイブリッド基質内の特定の配列の認識も促進される。更に、認識ドメインの長さが増加すると、基質に結合する親和性も高められる。種々の実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子内のそれらの改変認識ドメインが、ＤＮＡ酵素分子とその基質間の結合特異性及び親和性の増大を与える。
【００５７】
最近、ある種のオリゴヌクレオチドが相補的配列を有するオリゴヌクレオチド以外の分子を認識及び結合することができることがわかった。それらのオリゴヌクレオチドは、よく“アプタマー”という名で示される。例えば、Ellington & Szostak は、種々の有機染料を結合することができるＲＮＡ分子を記載し（Nature, 346: 818-822(1990)）、Bockらは、ヒトトロンビンを結合するｓｓＤＮＡ分子を記載している(Nature 355: 564-566(1992))。同様に、Jellinekらは、塩基性線維芽細胞成長因子に対するＲＮＡリガンドを記載している(PNAS USA 90: 11227-11231(1993))。即ち、本発明の触媒的に活性なＤＮＡ酵素が本明細書に記載された方法に従って操作されてアプタマーと典型的に会合した種々の能力を示すことも本明細書に企図される。
従って、当業者は、本発明のＤＮＡ酵素分子がＰＣＲ及び３ＳＲを含む本明細書に開示された種々の方法で認識ドメインのようなヌクレオチド配列で変えられることも理解しなければならない（自己維持配列の複製--下記実施例１参照）。
【００５８】
例えば、追加のヌクレオチドが、プライマーに追加のヌクレオチドを含めることによりＤＮＡ酵素分子の５′端に付加される。
本発明のＤＮＡ酵素分子は、また、部位特定変異誘発のような方法の使用による非ランダム様式で調製又は操作される。例えば、部位特定変異誘発は、実質的にMorinagaら，Biotechnology 2: 636(1984)に記載されるように行われ、デオキシリボザイムに用いるために本明細書に記載されるように変更される。ＤＮＡ酵素分子を操作する有効な方法は、下記実施例に記載される。
開示された実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、塩基対合相互作用によって基質と相互作用する２つの基質結合（又は認識）ドメイン又は配列が隣接した保存コアを含む。種々の実施態様においては、該保存コアは、１以上の保存ドメイン又は配列を含む。他の態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、更に、塩基対合に関係した領域（又は配列）間に“スペーサー”領域（又は配列）を含む。別の実施態様においては、該保存コアは、１以上の保存されない可変又は“スペーサー”ヌクレオチドによって種々の間隔で“分断”される。
【００５９】
種々の実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子の集団は、少なくとも２種類の異なるデオキシリボザイム分子から調製される。例えば、１態様においては、該分子は異なる配列を有する。他の実施態様においては、デオキシリボザイムは、ヌクレオチド配列の５′末端に相接又は隣接する認識ドメインを特定する核酸配列を有する核酸分子である。他の種々の実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、更に、３′末端から認識ドメインまでの位置にある１以上のスペーサー領域、３′末端から認識ドメインまでの位置にある１以上のループ及び／又はスペーサー領域を含む。他の態様においては、本発明のデオキシリボザイムは、同じ分子の他の領域に対してハイブリッド形成することができる１以上の領域を含むことができる。現在開示されている方法に従って作製されたＤＮＡ酵素分子の他の特性は、本明細書の別の所に記載される。
【００６０】
他の実施態様においては、突然変異を誘発させる条件は、ＤＮＡ酵素分子内に特定或いはランダムヌクレオチド置換を導入する条件が含まれる。典型的な突然変異誘発条件の例は、本明細書の他の部分に開示された条件及び Joyceら，Nucl. Acids Res．17: 711-722(1989); Joyce，Gene 82: 83-87(1989); 及び Beaudry & Joyce, Science 257: 635-41(1992)に記載された方法が含まれる。
別の実施態様においては、本発明の突然変異核酸酵素分子の異種集団は、ヌクレオチド配列が厳密に同じでない少なくとも２つの核酸分子を有するものである。他の態様においては、かかる異種集団から所定の活性をもつＤＮＡ酵素分子又は他の酵素核酸が所定の活性の性能に基づいて選ばれる。種々の実施態様においては、所定の活性は、触媒活性の増大、ＫMの低下、基質結合能力の増強、基質特異性の変化等を含むが限定されない。
【００６１】
酵素性能の態様を考慮することができる他のパラメーターは、触媒活性又は能力、基質結合能、酵素代謝回転速度、フィードバック機構に対する酵素感受性等が含まれる。ある態様においては、基質特異性は、酵素性能の態様を、特に、各々が他の基質に関して酵素性能に影響する２つ以上の競合基質を酵素が認識及び結合することができる状態で考慮することができる。
本明細書に用いられる基質特異性は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ又は双方の複合物を含むもののような個々の基質に対する本明細書に記載される核酸酵素分子の特異性を意味するものである。基質分子は、また、ヌクレオチド類縁体を含むことができる。種々の実施態様においては、本発明の核酸酵素分子は、ハイブリッド又は非ハイブリッド基質の特定領域に優先的に結合することができる。
“基質特異性”として本明細書で確認された用語又はパラメーターも配列特異性が含まれる。即ち、本発明の核酸酵素分子は、特定の核酸配列を有する核酸基質を“認識”及びそれに結合することができる。例えば、本発明の核酸酵素分子の基質認識ドメインが１列に一連の１又は２リボヌクレオチド（例えば、ｒＡ）を有する基質分子にのみ結合する場合には、核酸酵素分子はかかる配列を欠く核酸基質分子を認識又は結合しない傾向にする。
【００６２】
選択工程に関して、種々の実施態様においては、選択は突然変異酵素核酸の異種集団から所定の活性をもつ突然変異酵素核酸を物理的に分離する手段を含む。
たいてい、選択は、サイズ、触媒活性の存在、又は変異核酸を他の核酸、ペプチド、又は溶液中の又は固体マトリックスに結合される他の分子に対してハイブリッド形成することによる分離を含む。
種々の実施態様においては、所定の活性は、所定の活性をもつ突然変異酵素核酸が活性によってある方法で標識されるようなものである。例えば、所定の活性は、ＤＮＡ酵素分子活性であり、基質上の突然変異酵素核酸の活性が突然変異酵素核酸を共有結合で結合するようにさせる。次に、突然変異酵素核酸は、共有結合によって選択される。
他の実施態様においては、所定の活性をもつ突然変異酵素核酸の選択は、変異酵素核酸の増幅が含まれる（例えば、Joyce，Gene 82: 83-87(1989); Beaudry & Joyce，Science 257: 635-41(1992)参照）。所定の特性又は活性をもつ核酸酵素分子を選択する他の方法は、実施例の項に記載される。
【００６３】
Ｅ．組成物 
本発明は、また、本発明のＤＮＡ酵素分子の１以上の種類又は集団を含む組成物を企図する。例えば、異なる種類又は集団は、異なるヌクレオチドハイブリッド形成を認識及び切断することができる。組成物は、更に、リボ核酸含有基質が含まれる。本発明の組成物は、更に、鉛イオン、マグネシウムイオン、又は本明細書に述べられる他の２価又は１価のカチオンを含むことができる。
好ましくは、ＤＮＡ酵素分子は、約０.０５〜約２μM の濃度で存在する。典型的には、ＤＮＡ酵素分子は、ＤＮＡ酵素分子の基質に対する濃度比約１：５〜約１：５０で存在する。更に好ましくは、ＤＮＡ酵素分子は、組成物中に約０.１〜約１μM の濃度で存在する。更に好ましくは、組成物は、ＤＮＡ酵素分子を約０.１〜約０.５μM の濃度で含む。好ましくは、基質は、組成物中に約０.５〜約１０００μM の濃度で存在する。
【００６４】
当業者は、天然に存在する供給源及び合成供給源を含む核酸含有基質の多くの供給源があることを理解するであろう。適切な基質の供給源としては、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＬＶ−１、及びＨＩＬＶ−２を含む種々のウイルス及びレトロウイルス性物質が含まれるが限定されない。
他の適切な基質としては、ピコルナウイルス、ヘパドナウイルス科（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、γヘルペスウイルス科（例えば、ＥＢＶ）、リンフォクリプトウイルス、白血病ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−１及びＩＩ）、フラビウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス（αヘルペスウイルス及びβヘルペスウイルスを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス及び免疫不全症及び症候群の原因となるウイルス及びレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１及び２）を含むか又は作製されたものを含むウイルス及びレトロウイルス性物質が挙げられるが限定されない。
更に、適切な基質は、サル及びネコ免疫不全症及びウシ白血病ウイルスを限定せずに含む非ヒト霊長類及び他の動物に感染するウイルス及びレトロウイルス性物質が含まれる。
【００６５】
前述したように、マグネシウムイオン、鉛イオン、又は他の適切な１価又は２価カチオンも組成物中に約１〜１００mMの範囲の濃度で存在させることができる。更に好ましくは、予め選択されたイオンは、組成物中に約２〜約５０mMの濃度で存在し、約５mMの濃度が特に好ましい。当業者は、イオン濃度がその原料（例えば、マグネシウム）の水溶液中の溶解度限度及び同じ組成物中に存在するＤＮＡ酵素分子を活性コンホメーションに保つ希望でのみ拘束されることを理解するであろう。
本発明は、また、本発明のＤＮＡ酵素分子、ハイブリッドデオキシリボヌクレオチド−リボヌクレオチド分子、及び上記濃度のマグネシウム又は鉛イオンを含む組成物を企図する。前述のように、マグネシウムの代わりに他の１価又は２価のイオン（例えば、Ｃａ2+）も用いられる。
【００６６】
また、本発明のＤＮＡ酵素分子、核酸含有基質（例えば、ＲＮＡ）、及び約１ミリモルより大きい濃度の予め選択されたイオンを含む組成物であって、前記基質の長さがＤＮＡ酵素分子上に存在する認識ドメインより大きい組成物も本発明によって企図される。
１態様においては、組成物は、ＤＮＡ酵素分子とその基質間の塩基対合が相接しているＤＮＡ酵素分子−基質複合体を含む。他の実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子とその基質間の塩基対合は１以上の非相補対で分断される。他の種々の実施態様においては、本発明の組成物は、更に、１価カチオン、２価カチオン又は双方を含むことができる。
他の態様では、本発明のＤＮＡ酵素分子は、２価カチオンの存在又は不在下に効率よく機能することができる。１態様においては、２価カチオンが存在し、Ｐｂ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、又はＣａ2+を含む。また、本発明のＤＮＡ酵素分子は、１価カチオンの存在又は不在下に効率よく機能することができる。Ｐｂ2+又はＭｇ2+について本明細書に記載されたものと同様の１価又は２価カチオン濃度が本明細書に開示されるように有効であることが予想される。
【００６７】
任意により、１価カチオンが２価カチオンの他に又はそれの“代替物”として存在してもよい。例えば、ナトリウム（Ｎａ+）又はカリウム（Ｋ+）のような１価カチオンが解離イオン或いはＮａＣｌ又はＫＣｌのような解離可能化合物として存在することができる。
１実施態様においては、組成物内に存在する１価カチオンの濃度は０〜１.０Mの範囲である。他の実施態様においては、１価カチオンは約０〜２００mMの範囲にある濃度で存在する。別の実施態様においては、１価カチオンは約１〜１００mMの範囲にある濃度で存在する。また、１価カチオンの濃度は約２〜５０mMの範囲にある。また別の実施態様においては、濃度は約２〜２５mMの範囲にある。
【００６８】
Ｆ．ＤＮＡ酵素分子の使用方法 
本明細書に開示されるようにＤＮＡ酵素分子の使用方法は実に多い。前述のように、隣接核酸を連結する結合（例えば、ホスホエステル結合）を切断することができる分子は、種々の用途を包含する多数の使用がある。例えば、本明細書に開示された能力、構造及び／又は機能を有するＤＮＡ酵素分子は、医薬品（例えば、創傷清拭、血餅溶解用等）及び家庭用品（例えば、清浄剤、歯科衛生用品、肉軟化剤）に有効である。本明細書に開示される化合物、組成物及び方法の工業用途も企図され十分に本発明の範囲内である。
【００６９】
本発明は、また、一本鎖核酸、ループ核酸、部分的又は完全な二本鎖核酸を切断する有効な方法を記載し、それらの方法の大多数は本発明の新規な酵素的に活性な核酸分子を使用する。種々の実施態様においては、基質の一本鎖核酸セグメント又は部分（又は基質全体）は、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、又はその複合物を含む。好ましくは、核酸基質は、基質切断配列で又はその近傍で１本鎖のみであることを必要とするので、本発明の核酸酵素分子は酵素の認識配列によって基質切断配列に対してハイブリッド形成することができる。
本発明の方法によって切断される核酸基質は、化学的に合成されるか又は酵素的に作製され、動物細胞、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞を含むファージ、ウイルス、原核細胞又は真核細胞のような種々の供給源からも単離される。化学的に合成された一本鎖及び二本鎖核酸は、Research Genetics(アラバマ州ハンツビル)を含むが限定しない多くの製造元から市販されている。
【００７０】
ＲＮＡ基質は、また、Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティ)オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて製造業者の説明書に従って合成される。一本鎖ファージも、核酸基質の供給源である。（例えば、Messingら，PNAS USA 74: 3642-3646(1977)及びYanisch-Perronら，Gene 33: 103-119(1985)を参照されたい。）一本鎖ファージを含む細菌細胞も、適切な一本鎖核酸配列のすぐに間に合う供給源である。
本発明の方法によって切断可能な一本鎖ＲＮＡは、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、コロナウイルス、アレナウイルス又はレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスのいずれかによって供給される。前述のように、種々の原核細胞及び真核細胞も適切な核酸基質の優れた供給原とすることができる。
【００７１】
本発明の方法は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、動物細胞、酵母細胞又は細菌細胞を含む細胞内部に存在する一本鎖核酸又はループ又は二本鎖核酸の一本鎖部分に用いられる。それらの条件下に本発明の核酸酵素分子（例えば、ＤＮＡ酵素分子又はデオキシリボザイム）は、抗ウイルス剤又は遺伝子発現の調節剤として作用することができる。本発明のＤＮＡ酵素分子のかかる使用の実施例は、下記に記載される。
本発明の方法の大多数においては、一本鎖核酸の切断が所定の塩基配列の３′末端で生じる。その所定の塩基配列又は基質切断配列は、典型的には、１〜約１０ヌクレオチドを含む。他の好適実施態様においては、本発明のＤＮＡ酵素分子は、切断部位の上流或いは上流と下流のヌクレオチドを認識することができる。
種々の実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、切断部位の上流の約２〜１０ヌクレオチドを認識することができる。他の実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子は、切断部位の上流の約２〜１０ヌクレオチド及び下流の約２〜１０ヌクレオチドを認識することができる。他の好適実施態様は、長さが約３０ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を認識することができるＤＮＡ酵素分子を企図し、約２０ヌクレオチドまでの長さが更に好ましい。
本明細書に開示される方法は、ＤＮＡ酵素分子の認識ドメインのヌクレオチド配列を変えることにより任意のヌクレオチド配列で切断することができる。これにより、選択された位置の制限エンドヌクレアーゼの不在下に一本鎖核酸の切断が可能である。
【００７２】
本発明のＤＮＡ酵素分子は、適切な切断部位の部位特異的加水分解によりＤＮＡ酵素分子に結合したままである一本鎖核酸基質の任意の部分から分離される。
ＤＮＡ酵素分子を基質(又は“切断産物”)から分離するとＤＮＡ酵素分子が他の切断反応を行うことを可能にする。
一般的には、核酸基質は、適切な核酸切断条件下に--好ましくは生理的条件下に--本発明のＤＮＡ酵素分子の有効量で処理される。核酸基質がＤＮＡを含む場合には、切断条件は、２価カチオンの存在が約２〜１０mMの濃度で含まれる。
【００７３】
ＤＮＡ酵素分子の有効量は、一本鎖核酸内に存在する所定の塩基配列を切断するのに要する量である。好ましくは、ＤＮＡ酵素分子は、基質切断部位に対するＤＮＡ分子のモル比１〜２０で存在する。その比は、使用される個々の核酸切断条件下に個々のＤＮＡ酵素分子の処理の長さ及び効率によって変動させることができる。
従って、１好適実施態様においては、処理は、典型的には、ＲＮＡ含有基質と酵素を水溶液中で混合して切断混合液をつくる工程及びそのようにしてつくった混合液をＲＮＡ切断条件下にＤＮＡ酵素分子がＲＮＡ基質をＲＮＡ内に存在する所定のヌクレオチド配列のいずれかで切断するのに十分な時間維持する工程を含む。種々の実施態様においては、イオン源、即ち、１価又は２価カチオン又はその双方も供給される。
本発明の１実施態様においては、ＤＮＡ酵素分子が一本鎖核酸を切断するのに要する時間量は予め決められた。時間量は約１分〜約２４時間であり、反応成分の濃度及び反応の温度によって変動する。通常、その時間は、ＤＮＡ酵素分子が存在する所定のヌクレオチド反応のいずれかで一本鎖核酸を切断する約１０分〜約２時間である。
【００７４】
本発明は、更に、核酸切断条件が約２〜１００mM濃度の２価カチオンの供給源（例えば、ＰｂＯＡｃ）の存在を含むことを企図する。典型的には、核酸切断条件は、約２〜約１０mM濃度の２価カチオンを含み、約５mM濃度が特に好ましい。
核酸切断条件に含まれる最適カチオン濃度は、一定のカチオン濃度で切断した一本鎖核酸の量を定量することにより容易に求められる。当業者は、最適濃度が使用される個々のＤＮＡ酵素分子によって変動することを理解するであろう。
本発明は、更に、核酸切断条件がｐＨ約６.０〜約９.０を含むことを企図する。他の好適実施態様においては、ｐＨは生理的条件に匹敵する。即ち、ｐＨは約７.０〜７.８であり、ｐＨ約７.５が特に好ましい。
当業者は、ＤＮＡ酵素分子が活性コンホメーションに保たれるような核酸切断に用いられるｐＨである限り本発明の方法は広いｐＨ範囲にわたって適用することを理解するであろう。活性コンホメーションでのＤＮＡ酵素分子は、一本鎖核酸を所定のヌクレオチド配列で切断する能力によって容易に検出される。
【００７５】
種々の態様においては、核酸切断条件は、種々の温度範囲も含まれる。前述したように、生理的条件と一致した温度範囲が好ましいが、工業用途と一致した温度範囲も本明細書に企図される。１実施態様においては、温度は約１５〜約６０℃の範囲にある。他の態様においては、核酸切断条件は、約３０〜約５６℃の範囲にある温度が含まれる。別の態様においては、核酸切断条件は、約３５〜約５０℃の温度が含まれる。好適実施態様においては、核酸切断条件は、約３７〜約４２℃の温度範囲を含む。核酸切断条件と一致した温度範囲は、所望の切断速度及びその個々の温度におけるその個々のＤＮＡ酵素分子の安定性によってのみ拘束される。
種々の方法においては、本発明は、ポリアミンの存在を含む核酸切断条件を企図する。本発明を実施するのに有効なポリアミンとしては、スペルミジン、プトレッシン、スペルミン等が挙げられる。１態様においては、ポリアミンは、約０.０１〜約１０mMの濃度で存在する。他の態様においては、ポリアミンは、約１〜約１０mMの濃度で存在する。核酸切断条件は、また、約２〜約５mMの濃度でポリアミンの存在を含むことができる。種々の好適実施態様においては、ポリアミンはスペルミジンである。
【００７６】
Ｇ．ベクター 
本発明は、また、ベクター内に位置した本発明のＤＮＡ酵素分子をコード化する核酸セグメントを、好ましくは標的細胞（例えば、植物又は動物細胞）内でそのＤＮＡ酵素分子の発現を可能にする方法で含む発現ベクターを特徴とする。
従って、一般的には、本発明のベクターは、好ましくはプラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス又はファージベクターが含まれる。好ましくは、適切なベクターは、一本細胞ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）--例えば、環状ファージミドｓｓＤＮＡを含む。また、本発明の有効なベクターが環状である必要がないことも理解されなければならない。
１態様においては、追加のＤＮＡ酵素分子コード化配列の各々を隣接するヌクレオチド配列が供給されることが好ましく、それらの配列は最初のＤＮＡ酵素分子によって認識される。介在配列又は隣接配列の長さは、好ましくは少なくとも１ヌクレオチドを含み、更に好ましくは約２〜２０ヌクレオチドであり、長さが約５〜１０ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【００７７】
ポリヌクレオチド尾部の付加も、本発明のＤＮＡ酵素分子の３′端を保護するために有効となる。それらは、酵素末端トランスフェラーゼを用いて高分子配列を結合することにより供給される。
本発明のベクターは、２種以上のＤＮＡ酵素分子を含む。１実施態様においては、第１ＤＮＡ酵素分子は分子内切断活性をもちかつヌクレオチド配列を認識及び切断して他のＤＮＡ酵素配列を遊離することができる。即ち、他のＤＮＡ酵素分子をベクターから“遊離”するために機能することができる。例えば、ベクターは、第１ＤＮＡ酵素分子が発現される場合にその第１分子が第２ＤＮＡ酵素分子、第３ＤＮＡ酵素分子等をコード化する追加のヌクレオチド配列を隣接するヌクレオチド配列を切断することができるように構築されることが好ましい。前記第１ＤＮＡ酵素分子（即ち、“遊離している”分子）がオリゴヌクレオチド配列を分子内で切断することができると仮定すると、追加の（例えば、第２、第３等）ＤＮＡ酵素分子（即ち、“遊離した”分子）は“遊離している”分子と同じ特性をもつ必要がない。例えば、１実施態様においては、“遊離した”(即ち、第２、第３等)ＤＮＡ酵素分子は特定のＲＮＡ配列を切断することができるが、第１(“遊離している”)ＤＮＡ酵素分子は“遊離した”分子を遊離させることができるヌクレアーゼ活性をもつ。他の実施態様においては、“遊離した”ＤＮＡ酵素分子は、アミド結合切断活性をもつが、第１(“遊離している”)ＤＮＡ酵素分子はヌクレアーゼ活性をもつ。
【００７８】
また、第１ＤＮＡ酵素分子は、第２（及び第３、第４等）ＤＮＡ酵素分子からの別個のベクターにコード化することができ、分子内活性をもつことができる。
本明細書に述べられるように、第１ＤＮＡ酵素分子は、自己切断ＤＮＡ酵素分子（例えば、デオキシリボザイム）とすることができ、第２ＤＮＡ酵素分子は、所望の種類のＤＮＡ酵素分子とすることができる。ベクターがそれらの核酸配列からＤＮＡを発現させる場合、そのＤＮＡは、隣接領域の各々を切断するのに適切な条件で能力があり、第２ＤＮＡ酵素分子の１コピー以上を遊離する。所望される場合には、数種の異なる第２ＤＮＡ酵素分子を異なるデオキシリボザイムを生じるように同じ細胞又はキャリヤーに入れることができる。また、１種以上のベクターが１種以上のリボザイム又はデオキシリボザイムを“遊離している”及び“遊離した”核酸酵素分子の組合わせで、かかる組合わせが所望の結果、即ち、所定の核酸配列を切断することができる核酸酵素分子の遊離を得る限り含むことができる。
【００７９】
本発明のＤＮＡ酵素分子の単離及び精製方法も企図される。本明細書に記載される方法のほかに、種々の精製法（例えば、ＨＰＬＣを用いる方法）及びクロマトグラフィー単離法が当該技術において有効である。例えば、公開された国際出願第WO93/23569号に記載された方法を参照されたい。その出願の開示を参考として本明細書に引用する。
また、本明細書に記載された実施態様の種々の組合わせが本発明の範囲内に含まれることも理解されなければならない。本発明の他の特徴及び利点は、上記の説明、下記の実施例及び請求の範囲から明らかになるであろう。
【００８０】
実施例
下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、限定するものではない。
実施例１ 
ＤＮＡ酵素分子の試験管内進化： 
総説 
試験管内選択及び試験管内進化手法は、新しい触媒をその組成又は構造の前知識なしに単離することができる。かかる方法は、新規な触媒特性をもつＲＮＡ酵素を得るために用いられた。例えば、鉛カチオンで自己分解的切断を行うリボザイムは、ｔＲＮＡphe分子のランダム化プールから誘導された(Pan & Uhlenbeck, Biochemistry 31: 3887-3895(1992))。ＤＮＡを切断することができ(Beaudry & Joyce, Science 257: 635-641(1992))、金属依存性が変わった(Lehman & Joyce，Nature 361: 182-185(1993))グループＩリボザイム変異体が単離された。ランダムＲＮＡ配列のプールから開始すると、ポリメラーゼ様配列を触媒する分子が得られた（Bartel & Szostak，Science 261: 1411-1418(1993)）。本実施例においては、試験管内進化手順で選択拘束の変化により進化した酵素の特定の触媒特性の精製が記載される。
【００８１】
ダーウィン的進化には、次の３種類の工程の反復操作が必要である。（ａ）遺伝的変異の導入;(ｂ)適合度基準に基づく個体の選択；及び（ｃ）選択した個体の増幅。これらの工程の各々は、試験管内で実現される(Joyce，Gene 82: 83(1989))。遺伝子は、化学的修飾、突然変異原性ランダム化オリゴデオキシヌクレオチド、又はポリメラーゼによる不正確なコピーによって突然変異が誘発される。（例えば、Cadwell & Joyce，PCR Methods and Applications 2: 28-33(1992); Cadwell & Joyce, PCR Methods and Applications 3(Suppl.): S136-S140(1994); Chuら, Virology 98: 168(1979); Shortle ら，Meth．Enzymol．100:457(1983); Myersら，Science 229: 242(1985); Matteucci ら, Nucleic Acids Res. 11: 3113(1983); Wellsら，Gene 34: 315(1985); McNeilら, Mol. Cell. Biol. 5: 3545(1985); Hutchisonら，PNAS USA 83: 710(1986); Derbyshireら，Gene 46: 145(1986); Zakourら, Nature 295: 708(1982); Lehtovaara ら，Protein Eng．2: 63(1988); Leung ら，Technique 1: 11(1989); Zhou ら，Nucl. Acids Res．19: 6052(1991)を参照されたい。）
【００８２】
遺伝子産物は、例えば、リガンドの結合能力又は化学反応の実施能力によって選択される。（例えば、Joyce，同書(1989); Robertson & Joyce，Nature 344: 467(1990); Tuerkら，Science 249: 505(1990)を参照されたい。）選択された遺伝子産物に対応する遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような相互プライマー法によって増幅される。（例えば、Saikiら，Science 230: 1350-54(1985); Saiki ら，Science 239: 487-491(1988)を参照されたい。）
また、核酸増幅は、自己維持配列複製（３ＳＲ）を用いて行われる。（例えば、Guatelliら，PNAS USA 87: 1874(1990)を参照されたい。その文献の開示を参考として本明細書に引用する。）３ＳＲ法によれば、標的核酸配列は、レトロウイルス複製に必須な３種類の酵素活性:(１)逆転写酵素、（２）ＲＮａｓｅＨ、及び（３）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いることにより等温条件下に試験管内で指数的に増幅（複製）される。ｃＤＮＡ中間体によるＲＮＡ複製のレトロウイルス戦略をまねることにより、その反応はもとの標的のｃＤＮＡ及びＲＮＡコピーを蓄積する。
【００８３】
要するに、ＤＮＡ酵素分子の集団の進化を企図している場合には、連続系の逆転写及び転写反応がｃＤＮＡ中間体によってＲＮＡ標的配列を複製する。その設計の重要な要素は、（ａ）オリゴヌクレオチドプライマーが共に標的を指定しかつＴ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位をコード化する５′拡張を含むので、得られたｃＤＮＡは応答能のある転写鋳型である;(ｂ)ＲＮａｓｅＨによる中間体ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド内の鋳型ＲＮＡの分解のためにｃＤＮＡ合成が両鎖の完結まで進行することができる；及び（ｃ）反応産物（ｃＤＮＡ及びＲＮＡ）が次の工程の鋳型として機能することができ、指数的複製が可能であることである。
ＤＮＡ酵素分子を進化している場合には、その設計の種々の重要な要素は、それらの実施例に開示されるようにいくらか異なる。例えば、（１）オリゴヌクレオチドプライマーは、標的を指定し、好ましくはある方法--例えば、ビオチニル化--で“マーク”又は標識されるので、得られた応答能のある鋳型鎖は容易に同定され；（２）使用される試験管内選択手順は、最も有利な遊離機構の確認によることが好ましい。
試験管内ダーウィン的進化実現に対する主な障害は、突然変異及び増幅を組込む要求であり、共に遺伝子型に関係し、選択は表現型に関係する。遺伝子型及び表現型が同一分子で具体化される核酸酵素の場合には、仕事は単純化される。
【００８４】
Ａ．ＤＮＡ酵素分子の設計 
一本鎖ＤＮＡが興味深い３次構造をとることができることは周知である。“ｔＤＮＡ”の構造は、例えば、対応するｔＲＮＡに極めて似ている。（Paquetteら，Eur. J. Biochem. 189: 259-265(1990)を参照されたい。） 更に、ハンマーリボザイム内の３１〜３５リボヌクレオチド程度を少なくともいくらか触媒活性を保持しつつ置き換えることが可能である。（Perreaultら, Nature 344: 565-567(1990); Williams ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 918-921(1992); Yangら, Biochemistry 31: 5005-5009(1992)を参照されたい。）
試験管内選択法は、ランダム配列ＤＮＡの大集団に適用されており、高親和性で標的リガンドを結合する特異的ＤＮＡ“アプタマー”の回収をもたらした(Bock ら，Nature 355: 564-566(1992); Ellington & Szostak，Nature 355: 850-852(1992); Wyatt & Ecker，PNAS USA 91: 1356-1360(1994))。最近、２つのグループがアプタマー、Ｇ四分子構造を形成しかつ高親和性でタンパク質トロンビンを結合する１５量体ＤＮＡのＮＭＲ一次構造決定を行った（Wangら，Biochemistry 32: 1899-1904(1993); Macayaら，PNAS USA 90: 3745-3749(1993)）。これらの知見は、Ｘ線結晶学的分析によって確証された(Padmanabhanら，J．Biol. Chem. 268: 17651-17654(1993))。
【００８５】
高い親和性と特異性で基質分子に結合する能力は、良好な酵素の必要条件である。更に、酵素は、個々の化学的形質転換を促進するためにそれ自体或いは補助因子内のよい位置にある官能基を利用しなければならない。更に、該酵素は、反応の過程で一定のままでありかつ触媒代謝回転により操作することができなければならない。特定の順序が触媒活性に関与するサブユニットを含む情報高分子であることを要求に加えるものがある。それらの基準は、意味論及び化学的根拠双方を討論中であり、簡単な溶媒効果から基質拡散限度で操作する生物学的酵素までの範囲にある化学速度増強現象を区別するのに役立つ（Albery & Knowles，Biochemistry 15: 5631-5640(1976)）。
下記に詳細に記載されるように、我々は、ランダム配列から出発するＤＮＡ触媒及びＤＮＡ酵素を迅速に得る一般法を開発することを探究した。最初の標的として、我々は、ＤＮＡの能力の範囲内で良好であると感じた反応：２価金属補助因子によって援助されたＲＮＡホスホジエステルの加水分解切断を選んだ。これは、ハンマーヘッド及びヘアピンモチーフを含む種々の天然に存在するＲＮＡ酵素によって行われる同様の反応である。（例えば、Foster A.C. & Symons R.H., Cell 49: 211-220(1987); Uhlenbeck，Nature 328: 596-600(1987); Hampel & Tritz，Biochemistry 28: 4929-4933(1989)を参照されたい。）
【００８６】
ｔＲＮＡ分子のランダム化ライブラリーから始めて、中性ｐＨでＰｂ2+依存性部位特異的ＲＮＡホスホエステラーゼ活性をもつリボザイムを得ることができることがわかった(Pan & Uhlenbeck，Biochemistry 31: 3887-3895(1992); Pan & Uhlenbeck，Nature 358: 560-563(1992))。これは、酵母ｔＲＮＡPheの偶然の自己切断反応に類似しており（Dirheimer & Werner，Biochimie 54: 127-144(1972)）、ｔＲＮＡ内の特定部位でのＰｂ2+イオンの特異的配位に左右される。(Rubin & Sundaralingam, J. Biomol. Struct. Dyn. 1: 639-646(1983); Brownら，Biochemistry 24: 4785-4801(1985)を参照されたい。）
本明細書に開示されるように、我々の目標は、始めはＤＮＡの５′端に結合した短いリーダー反応内に存在し、最後は急速な触媒代謝回転で分子内様式で切断される別個の分子内に位置する特定のＲＮＡホスホエステルのＰｂ2+イオン依存性切断を行うことができるＤＮＡの開発が含まれた。これらの目標は、下記のように巧く達成された。
【００８７】
ＤＮＡが標的ホスホエステル及び周囲のヌクレオチドとどのように相互作用するかについては想定されなかった。約１０14ランダム５０量体配列のプールから始めて、試験管内選択はその過程を行うことを可能にした。５ラウンドの選択が４日間かけて行われた後、集団は全体として１mMＰｂ2+の存在下に約０.２ min-1の速度で標的ホスホエステルを切断する能力を得た。これは、同様の反応条件下の自然切断速度と比べて約１０5倍増加した。
個体を集団から単離し、配列を決定し、触媒活性を分析した。その情報に基づいて、反応を分子間形式に変え、３８量体ＤＮＡ酵素による１９量体基質の部位特異的切断を１mMＰｂＯＡｃの存在下に代謝回転速度１ min-1、２３℃及びｐＨ７.０で進行する反応で可能になるように単純化した。
【００８８】
Ｂ．試験管内選択スキーム 
約１０14一本鎖ＤＮＡ分子の出発プールに続いて、全てが５′ビオチン部分を含む、単一リボヌクレオチドを含む固定ドメイン、５０ランダムデオキシリボヌクレオチドを含む潜在的触媒ドメイン、及び３′末端にある第２固定ドメインを順次作成した（図１）。
プライマー結合部位が隣接した５０ランダムヌクレオチドを含む合成ＤＮＡから開始する繰込みＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術によってプールを構築した。繰込みＰＣＲプライマーは、３′末端アデノシンリボヌクレオチドを含む５′ビオチニル化合成オリゴデオキシヌクレオチドとした。リボヌクレオチド末端オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの組合わせにおいては鋳型特定伸長を効率よく開始し（L.E．Orgel、個人的論文）、この場合にははめ込み単一リボヌクレオチドを含む拡張産物を生じた。
図１は、標的ＲＮＡホスホエステルを切断するＤＮＡ単離の選択的増幅スキームを示す図である。５０ランダムヌクレオチドの伸長物を含む二本鎖ＤＮＡを、３′端のアデノシンリボヌクレオチド（記号“Ｎ”又は“ｒＮ”で示され、Ｎ及びｒＮは共にアデノシンリボヌクレオチドを表す）で終わる５′ビオチニル化ＤＮＡプライマー（例えば、プライマー３--３ａ又は３ｂ）を用いるＰＣＲで増幅される。このプライマーをＴａｑポリメラーゼで伸長してはめ込み単一リボヌクレオチドを含むＤＮＡ産物を得る。得られた二本鎖ＤＮＡをストレプトアビジンマトリックスに固定化し、０.２ＮａＯＨで洗浄して非ビオチニル化ＤＮＡ鎖が除去される。カラムを緩衝化溶液で再び平衡化した後、カラムを１mMＰｂＯＡｃを加えた同じ溶液で洗浄する。Ｐｂ2+依存性自己切断を行うＤＮＡをカラムから遊離し、溶離液に集め、ＰＣＲで増幅する。次に、ＰＣＲ産物を用いて次のラウンドの選択的増幅を開始する。
【００８９】
ＰＣＲ産物をストレプトアビジン親和性マトリックスを通過し、二重らせんＤＮＡの５′ビオチニル化鎖の非共有結合付着物を得た。非ビオチニル化鎖を０.２ＮＮａＯＨで簡単に洗浄して除去し、結合鎖を０.５M ＮａＣｌ、０.５M ＫＣｌ、５０mMＭｇＣｌ2、及び５０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０）、２３℃を含むバッファーで平衡化した。次に、同じバッファーに１mMＰｂＯＡｃを加え、Ｐｂ2+依存性切断を標的ホスホエステルで生じることを可能にし、ストレプトアビジンマトリックスからＤＮＡサブセットを遊離した。主に、個々のＤＮＡは、ビオチンとストレプトアビジン間の相互作用の破壊又はデオキシリボヌクレオチド結合の１つの切断のような種々の手段によってそれ自体の遊離を促進することができた。リボヌクレオチド３′−Ｏ−Ｐ結合の切断がおそらくその結合の相対的不安定性に基づく遊離機構であると共にＰｂ2+依存性加水分解切断が遊離を最も速く起こすことを可能にすると思われた。しかしながら、主に、試験管内選択的手順は、最も好ましい遊離機構及びその機構を行うことができる最良の個体を確認しなければならない。
Ｐｂ2+添加時にマトリックスから遊離したＤＮＡ分子を溶離液に集め、エタノールで沈殿して濃縮し、繰込みＰＣＲ増幅に供した。出発分子プールの構築でのように、最初のＰＣＲ増幅はランダム領域を隣接するプライマー（プライマー１及び２）を使用し、次に３′末端リボアデニル化をもつ５′ビオチニル化プライマー（プライマー３ｂ）を使用して標的ＲＮＡホスホエステルを再び導入した。
選択的増幅手順全体には３〜４時間が必要である。
【００９０】
その手順の各ラウンドでは３つの方法で分子を精製する。第１に、ＰＣＲ増幅後にはフェノールで２回及びクロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出し、エタノールで沈殿する；第２に、ＤＮＡをストレプトアビジンに付着した後に強い変性条件下に非ビオチニル化分子全てを洗い流す；第３に、Ｐｂ2+で溶離した後にはエタノールで沈殿する。ゲル電気泳動精製工程がないので、分子を特定の長さに拘束する選択的強制がない。
【００９１】
Ｃ．触媒ＤＮＡの選択 
我々は、５連続ラウンドの試験管内選択を行い、Ｐｂ2+の添加後の反応時間を次第に減らして選択の緊縮性を次第に増した。１〜３ラウンドでの反応時間は１時間とし、４ラウンドでの反応時間は２０分とし、５ラウンドでは１分とした。
一本鎖ＤＮＡの出発プールを各ラウンドの選択後に得られた分子の集団と共に試験管内選択で使用したものと同じ条件下に自己切断活性を分析した（図２参照）。
【００９２】
その分析については、５′ビオチン部分ではなくて５′−32Ｐを含む分子を調製し、出発材料と５′切断産物の双方の検出を可能にした。５分インキュベートした後に、最初のプール（Ｇ０）に検出可能な活性がなく、集団では第１及び第２ラウンドの選択後に得られた。第３ラウンド（Ｇ３）後に得られたＤＮＡは、適度なレベルの活性を示し、その活性は着実に増え、第５ラウンドの選択（Ｇ５）後に得られたＤＮＡについては約５０％自己切断に達した。長時間のインキュベーション後でさえ、標的ホスホエステルでのみ切断が検出された。その活性は、Ｐｂ2+を反応混合液から取り除いた場合に消失した。
図２は、出発ＤＮＡプール（Ｇ０）及び第１〜第５ラウンドの選択（Ｇ１〜Ｇ５）後に得られた集団の自己切断活性を示す図である。反応混合液は、５０mM ＭｇＣｌ2、０.５M ＮａＣｌ、０.５M ＫＣｌ、５０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０、２３℃）、及び３nM［５′−32Ｐ］標識ＤＮＡを含有し、１mMＰｂＯＡｃの存在或いは不在下に２３℃で５分間インキュベートした。記号Ｐｒｅは１０８ヌクレオチド前駆体ＤＮＡ(配列番号４);Ｃｌｖは２８ヌクレオチド５′切断産物(配列番号５);Ｍは長さが５′切断産物に相当するプライマー３ａ（配列番号６）を表す。
２８ヌクレオチド５′切断産物（Ｃｌｖ）は、好ましくは配列
5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN- 3′を有し、“Ｎ”は３′端に２′、３′−環状リン酸を付加したアデノシンリボヌクレオチドを表す（配列番号５）。他の実施態様においては、“Ｎ”は分子の３′端に２′又は３′リン酸を付加したアデノシンリボヌクレオチドを表す。
【００９３】
図２においては、“Ｇ０”レーン“Ｐｒｅ”バンドは、各々が５０ランダムヌクレオチドを含む１０８ヌクレオチド前駆体ＤＮＡの試料を含む。従って、ある“Ｐｒｅ”試料は、種々の前駆体ＤＮＡを含み、各試料は、前後の試料と異なると思われる。“Ｇ１”〜“Ｇ５”レーンは、“Ｐｒｅ”バンドを有し、ＤＮＡ触媒分子が著しく豊富であるが、まだ多数の異種ＤＮＡ配列を有する（即ち、５０ヌクレオチドランダム化ドメインが異なる）。“Ｇ５Ｐｒｅ”ＤＮＡからのそれらの異種配列の試料を図３に示す。
Ｇ５集団から個体を単離するためにショットガンクローニング技術を用い、次に、２０のこれらのサブクローンの完全ヌクレオチド配列を求めた（図３参照）。（例えば、Cadwell & Joyce，PCR Methods and Applications 2: 28-33(1992); Cadwell & Joyce, PCR Methods and Applications 3(Suppl.): S136-S140(1994)も参照されたい。）２０配列のうち、５つはユニークであり、２つは２回あり、１つは３回あり、１つは８回あった。個々の変異体は、全て出発ＤＮＡプールにおいてランダム化された５０ヌクレオチド領域内に共通配列要素を共有する。全て２つの推定鋳型領域を有し、一方は切断部位からすぐ上流にあるヌクレオチドの伸長物に相補性であり、他方は少なくとも４ヌクレオチド下流にあるヌクレオチドの伸長物に相補性である。それらの２つの推定鋳型領域間に１〜１１ヌクレオチドの可変ドメインがあり、続いて固定配列 5′-AGCG -3′、次に、３〜８ヌクレオチドの第２可変ドメイン、最後に固定配列 5′-CG -3′又は 5′-CGA-3′がある。２つの推定鋳型領域の外部にあるヌクレオチドは、配列及び長さ共にかなり変化しうる。全ての配列決定したサブクローンにおいては、最初にランダム化した５０ヌクレオチドに相当する領域は長さが全体の５０ヌクレオチドのままである。
【００９４】
図３は、５ラウンドの選択後の集団から単離した個々の変異体の配列アラインメントを示す図である。固定基質ドメイン
(5′- GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrAGGAAGAGATGGCGAC- 3′
又は5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATNGGAAGAGATGGCGAC-3′、
Ｎはアデノシンリボヌクレオチドを表す)(配列番号１３)を上方に示し、標的リボアデニル化は逆三角で確認される。推定塩基対合相互作用に共通して関係する基質ヌクレオチドを縦の棒で示す。最初にランダム化された５０ヌクレオチドに対応する配列を基質ドメインに逆平行に並べる。変異体は、全て固定配列5′-CGGTAAGCTTGGCAC-3′(配列番号１)（“プライマー部位”;図示されていない）の3′で終わる。基質ドメインと塩基対をつくるものと推定される最初にランダム化された領域内のヌクレオチドを図の左右側に示す。ＤＮＡ酵素分子の推定塩基対形成（又は基質結合）領域は、示された各配列において個々にボックスに仕切られる。推定触媒ドメイン内の高度に保存されたヌクレオチドを２つのボックスに仕切られた縦列に示す。
【００９５】
追加データは触媒ドメインの意味のある二次構造モデルを構築するのに有効であると予想されるが、ハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムと同様に、ＤＮＡ酵素分子の触媒ドメインが塩基対合相互作用によって基質と相互作用する２つの基質結合領域（又は認識ドメイン）が隣接した保存コアを含むと考えられることを我々は指摘する。ハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムと同様に、触媒ＤＮＡも塩基対合に関係する２つの領域間に不対基質ヌクレオチドの短い伸長物--この場合には 5′-GGA-3′が必要であると考えられる。
また、９個の異なる変異体の各々が基質ドメインと推定相補性の異なるパターンを示すことがわかったことも興味深いことである。ある場合には、塩基対合は相接していたが、他のものでは１以上の非相補的対で分断された。一般的傾向は、下流にあるものと比べて切断部位から上流にあるヌクレオチドとしっかりした相互作用を形成することになると考えられる。結合実験及び部位特定突然変異誘発分析により、我々は更に洞察しかつこの推測を更に実証することを可能にしなければならない。
【００９６】
触媒機能に要求される配列を更に洞察するために、９種の変異体のうち６種の自己切断活性を本明細書に記載される選択条件下に試験及び評価した(図３参照)。驚くことではないが、２０のうちの８サブクローンに存在した配列は、一次速度定数１.４ min-1で最も反応性であることがわかった。実験した変異体は、全て自己切断分析に活性であり、全て標的ＲＮＡホスホエステルでの切断に対応する単一５′標識産物を生じた。
優性サブクローンを、更に、種々の反応条件下に分析した。その自己切断活性は、Ｐｂ2+に依存性であるが、反応混合液からＭｇ2+を取り除いた場合には影響されなかった。１価のカチオンが同様に要求され、Ｎａ+或いはＫ+で適合される。反応速度は、０〜１.０M の範囲にわたる１価カチオンの濃度が増大すると共に直線的に増加した（ｒ＝０.９９８）。ｐＨ、温度、及び他の２価金属の存在のような反応に影響することがある他の変数は評価中である。
【００９７】
実施例２
材料及び方法
Ａ．オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類縁体 合成ＤＮＡ及びＤＮＡ類縁体を Operon Technologiesから購入した。１９ヌクレオチド基質、
5′-pTCACTATrAGGAAGAGATGG-3′(又は 5′-pTCACTATNGGAAGAGATGG- 3′、
“Ｎ”はアデノシンリボヌクレオチドを表す)(配列番号７)を、鋳型 5′-CCATCTCTTCCTATAGTGAGTCCGGCTGCA- 3′（配列番号９）
を用いて以前に記載されたように(Breaker，Banerji，& Joyce，Biochemistry 33: 11980-11986(1994))5′-pTCACTATrA- 3′(又は 5′-pTCACTATN-3′、“Ｎ”はアデノシンリボヌクレオチドを表す)(配列番号８)の逆転写酵素触媒拡張によって調製した。プライマー3、
【００９８】
5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrA-3′
(又は5′-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN- 3′、
“Ｎ”はアデノシンリボヌクレオチドを表す)(配列番号６)を［Ｙ−32Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（プライマー３ａ）で５′標識するか或いは［Ｙ−Ｓ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５′チオリン酸化し、引き続きＮ−ヨードアセチル−Ｎ′−ビオチニルヘキシレンジアミン（プライマー３ｂ）でビオチニル化した。
【００９９】
Ｂ．ＤＮＡプール標品 
出発ＤＮＡプールを合成オリゴマー
5′- GTGCCAAGCTTACCG-N50-GTCGCCATCTCTTCC-3′(配列番号４)(ＮはＧ、Ａ、Ｔ及びＣの等モル混合物である)を用いてＰＣＲで調製した。５００ピコモルのランダム化オリゴマー、１,０００ピコモルのプライマー1(5′-GTGCCAAGCTTACCG-3′、配列番号１０)、５００ピコモルのプライマー２
（5′- CTGCAGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGAGATGGCGAC-3′、配列番号１１）、５００ピコモルのプライマー３ｂ、１０μCi［α−32Ｐ］ｄＡＴＰ、及び０.２Uμl-1ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する２mlのＰＣＲを５０mMＫＣｌ、１.５mMＭｇＣｌ2、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３、２３℃）、０.０１％ゼラチン、及び０.２mMの各ｄＮＴＰの存在下に９２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で２分間、次に５サイクルの９２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１分間インキュベートした。得られた混合液をフェノールで２回及びクロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出し、そのＤＮＡをエタノールで沈殿することにより単離した。
【０１００】
Ｃ．試験管内選択 
出発ＤＮＡプールを５００μl のバッファーＡ（１M ＮａＣｌ及び５０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０、２３℃）に再懸濁し、ストレプトアビジンカラム(AffiniTipStrep 20，Genosys,テキサス州ウッドランド)を繰り返し通過させた。カラムを、１００μl 量のバッファーＡで５回、次に、１００μl 量の０.２N ＮａＯＨで５回洗浄し、１００μl 量のバッファーＢ(０.５M ＮａＣｌ、０.５M ＫＣｌ、５０mMＭｇＣｌ2、及び５０mMＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.０、２３℃))で５回平衡化した。固定化一本鎖ＤＮＡを１mMＰｂＯＡｃを添加した２０μl 量のバッファーＢで３回１時間かけて溶離した。固定化及び溶離全工程を２３℃で行った。溶離液を同量のバッファーＣ(５０mMＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.０、２３℃）及び８０mMＥＤＴＡ)に集め、そのＤＮＡをエタノールで沈殿した。
【０１０１】
得られたＤＮＡを、２０ピコモルのプライマー１、２０ピコモルのプライマー２、０.０５U μl-1ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、５０mMＫＣｌ、１.５mMＭｇＣｌ2、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３、２３℃）、０.０１％ゼラチン、及び０.２mMの各ｄＮＴＰを含有する１００μl ＰＣＲに３０サイクルの９２℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間増幅した。反応産物をフェノールで２回及びクロロホルム／イソアミルアルコールで１回抽出し、そのＤＮＡをエタノールで沈殿することにより回収した。約４ピコモルの増幅ＤＮＡを、１００ピコモルのプライマー１、１００ピコモルのプライマー３ｂ、２０μCi［α−32Ｐ］ｄＡＴＰ、及び０.１U μl-1ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する第２繰込みＰＣＲに全量２００μl で加え、１０サイクルの９２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１分間増幅した。ＰＣＲ産物を１回以上抽出し、沈殿し、得られたＤＮＡを５０μl のバッファーＡに再懸濁し、これを用いて次のラウンドの選択を開始した。
【０１０２】
第３ラウンドの終わりの繰込みＰＣＲを１００μl 量で行った以外は上記のように第２及び第３ラウンドを行った。第４ラウンドで、Ｐｂ2+の添加後の溶離時間を２０分に短縮し（２０μl の溶離量で２回）、回収ＤＮＡの１／２だけを１５温度サイクルのみ含む最初のＰＣＲに用いた。第１５ラウンドで、溶離時間を１分に短縮し（２０μl 溶離量で２回）、回収したＤＮＡの１／４だけを１５温度サイクルを含む最初のＰＣＲに用いた。第１５ラウンドの選択後に得られたＤＮＡを以前に記載されたようにサブクローン化及び配列決定した(Tsang & Joyce ,Biochemistry 33: 5966-5973(1994))。
【０１０３】
Ｄ．触媒ＤＮＡの速度論的分析 
ＤＮＡ集団及び種々のサブクローン化個体を１０ピコモルのプライマー３ａ、０.５ピコモルの導入ＤＮＡ、及び０.１U μl-1ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する２５μl の反応混合液中非対称的ＰＣＲによる５′−32Ｐ標識を用いて上記の条件下に１０サイクルの９２℃で１分間、５０℃で１分間、及び７２℃で１分間調製した。得られた［５′−32Ｐ］標識増幅産物を１０％ポリアクリルアミド／８M ゲル中の電気泳動で精製した。
そのＤＮＡをバッファーＢ中で１０分間プレインキュベートした後、自己切断分析を行った。ＰｂＯＡｃを１mMの最終濃度まで添加することにより反応を開始し、同量のバッファーＣを添加することにより終結させた。反応産物を１０％ポリアクリルアミド／８M ゲル中の電気泳動で分離した。重複代謝回転条件下に速度論的分析を、容器壁への材料の付着を防止するために５０μg ml-1ＢＳＡを含むバッファーＢ中で行った。基質及び酵素分子を、Ｐｂ2+を欠く反応バッファー中で５分間別個にプレインキュベートし、合わせ、ＰｂＯＡｃを１mMの最終濃度まで添加することにより反応を開始した。
【０１０４】
実施例３ 
分子間で切断するデオキシリボザイムの進化
Ａ．分子間形式への変換 
実験した変異体の触媒ドメインと基質ドメイン間の推定塩基対合相互作用の可変パターンに基づき、ＤＮＡ触媒反応を分子間形式に変換することはかなり端的であると考えられた。そのようにするにあたり、我々は、各々が基質と７〜８塩基対の分断されない伸長物を形成するように触媒の２つの基質結合領域を単純化したいと考えた。更に、我々は、２つの塩基対合領域に限定された最小基質及び介在配列 5′-GGA-3′を得たいと考えた（図４Ａ）。
図４Ａ及び図４Ｂは、触媒代謝回転で進行する分子間反応におけるＲＮＡホスホエステルのＤＮＡ触媒切断を示す図である。図４Ａは、１９量体基質と３８量体ＤＮＡ酵素間に形成された複合体の図式である。基質は、デオキシリボヌクレオチドが隣接した単一アデノシンリボヌクレオチド(矢印に隣接した“ｒＡ”又は“Ｎ”)を有する。合成ＤＮＡ酵素は、図３に示された最もよく出てくる変異体の３８ヌクレオチド部分である。推定触媒ドメイン内に位置した高度に保存されたヌクレオチドは、“ボックス”に仕切られている。示されるように、１つの保存配列は“ＡＧＣＧ”であり、もう１つは“ＣＧ”である（５′−３′方向で読み取る）。
【０１０５】
図４http://www6.ipdl.ncipi.go.jp/Tokujitu/tjitemdrw.ipdl?N0000=231&N0500=1E_N/;>?:>?>9:///&N0001=246&N0552=9&N0553=000059Ｂは、試験管内選択で用いられたものと同じ条件下に［５′−32Ｐ］標識基質のＤＮＡ触媒切断についてＫm（負の勾配）及びＶmax（ｙ切片）を求めるために用いたイーディー・ホステープロットを示すグラフである。初期切断速度は、５nMＤＮＡ酵素及び０.１２５、０.５、１、２、或いは４μM 基質を含む反応について求めた。
触媒ドメインを設計するにあたり、我々は、最も反応性のある変異体の組成物を強くあてにし、５′端の２ヌクレオチド及び３′端の１１ヌクレオチドだけ端を切り取った。２つの鋳型領域間にある１５ヌクレオチドは不変のままにし、単一ヌクレオチドを３′鋳型領域に挿入して基質と塩基対を形成することができるヌクレオチドの連続伸長物をつくった。基質は、配列５′−ＴＣＡＣＴＡＴｒＡ・ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３′(又は５′−ＴＣＡＣＴＡＴＮ・ＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３′、“Ｎ”はアデノシンリボヌクレオチドを表す)(配列番号１２)に単純化され、ここで、下線のヌクレオチドはＤＮＡ触媒分子との塩基対合に関係する２つの領域に対応する。
【０１０６】
デオキシヌクレオチドを全部含む３８量体ＤＮＡ触媒分子（触媒）及び別の全ＤＮＡ配列内にはめ込まれた単一リボヌクレオチドを有する１９量体基質を用いる単純化反応系は、代謝回転の速い効率のよいＤＮＡ触媒ホスホエステル切断を可能にする。０.０１μM 触媒及び１μM 基質の存在下の９０分インキュベーションを用いて、触媒の４６代謝回転に相当する基質の４６％が切断される。この反応の予備的速度論的分析を行い、重複代謝回転条件下に評価した。ＤＮＡ触媒は、ミカエリス・メンテン速度論を示し、ｋcat及びＫm値は各々１ min-1及び２μM である（図４Ｂ参照）。Ｋm値は、ワトソン・クリック相互作用に基づき触媒と基質間の予想された解離定数よりかなり大きい。基質を同じ反応条件下に（触媒を存在させないで）インキュベートし、ｋuncat値４×１０-6 min-1が得られた。これは、ｐＨ７.０及び３７℃において０.５mMＰｂ2+の存在下の不安定な１−ニトロフェニル−１,２−プロパンジオールの加水分解の文献値５×１０-3 min-1と一致している(Breslow & Huang，PNAS USA 88: 4080-4083(1991))。
【０１０７】
ここで、ホスホエステル切断反応が隣接リン酸についてリボヌクレオチド２′ヒドロキシルによる攻撃を含み、末端２′（３′）−環状リン酸を有する５′産物及び末端５′ヒドキシルを有する３′産物を生じる加水分解機構によって進行することが推測される。この機構の支持として、３′切断産物がＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び［Y-32Ｐ］ＡＴＰで効率よくリン酸化され、遊離の５′ヒドロキシルの利用可能性と一致する（データは示されていない）。
【０１０８】
Ｂ．検討
５ラウンドの試験管内選択後、標的ＲＮＡホスホエステルの効率のよいＰｂ2+依存性切断を触媒する１本鎖ＤＮＡ分子の集団が得られた。この集団から単離した代表的個体の共通の特徴に基づき、触媒ドメイン及び基質ドメイン双方の単純化した転換が構築され、分子間組合わせにおいて急速な触媒代謝回転の証明をもたらした。即ち、３８量体触媒ドメインは、ＤＮＡ酵素、又は“デオキシリボザイム”と呼ばれるものの一例である。
速い代謝回転で進行しかつミカエリス・メンテン速度論に従う反応において化学的転換を促進することができる情報高分子である事実に基づいてこの分子を酵素と呼ぶことは、酵素を構成するものの概念を満足させるものではない。当然、酵素はポリペプチドでなければならないと主張するものがいる。しかしながら、ＲＮＡ酵素の概念を容認する場合には、ＤＮＡ酵素に関する同様の見解を採用することは合理的であると思われる。我々がどのように速やかにこの分子をランダム配列ＤＮＡのプールから作成することができたかを考慮すると、合成ＤＮＡ酵素の多くの他の例が近い将来出現するであろうことが予想される。
【０１０９】
ＲＮＡホスホエステルのＰｂ2+依存性切断がＤＮＡ触媒作用の最初の標的として選ばれたのは、切断部位に隣接してある２′ヒドロキシルの脱プロトン化を促進するために配位Ｐｂ2+ヒドロキシルの適切な位置が単に必要であるという端的反応であるからである。（例えば、Panら，The RNA World, Gesteland & Atkins(eds.)，pp.271-302，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1993)を参照されたい。）Ｐｂ2+は、プリンのＮ７位、グアニンの０６位、ウラシルの０４位、及びシトシンのＮ３位に配位することが既知である(Brownら，Nature 303: 543-546(1993))。従って、ＲＮＡと比べてＤＮＡの糖組成及びコンホメーションの違いは、ＤＮＡがはっきりしたＰｂ2+結合ポケットを形成することを防止しないように思われた。
別の全ＤＮＡ配列内に単一リボヌクレオチドを有する基質が、切断にユニークな好ましい位置を与えかつ得られた触媒活性がＤＮＡのみによるものであることを保証することから選ばれた。基質認識は、触媒と基質間の塩基対合相互作用の２つの領域によると考えられる。しかしながら、これらの２つの領域にある不対基質ヌクレオチド、５′−ＧＧＡ−３′は、基質認識、金属配位、又は触媒作用の他の態様に重要な役割を果たすことができる。
【０１１０】
更に、全ＲＮＡ分子、他のＲＮＡ−ＤＮＡ複合物、及び１以上のヌクレオチド類縁体を有する分子が許容しうる基質であることも予想される。本明細書に開示されるように、本明細書に記載された試験管内進化手順は、所望の特異性を有するＤＮＡ酵素分子を作成するために巧く用いられ、更に、これらのラインに沿った分析は現在進行中である。
更に、酵素と基質間の推定塩基対相互作用が配列について一般化可能であるかを求める実験は、現在記載している方法を用いて進行中である。本明細書に開示されたＰｂ2+依存性デオキシリボザイムもＤＮＡの構造及び酵素特性を調べるモデル化合物と考えられる。
ＤＮＡ触媒の速やかな開発について本開示に用いられる方法は、かなり普遍性があり、潜在的触媒ドメインに結合した標的結合の切断の引き金となる他の補助因子を使用することを可能にする。この点で、標的ＲＮＡを生理的条件下に特異的に切断するＭｇ2+依存性ＤＮＡ酵素の開発は、他のカチオンの存在下に機能するＤＮＡ酵素の開発であるように興味深い（実施例４参照）。かかる分子は、標的ｍＲＮＡの特定不活性化の伝統的アンチセンス及びリボザイム方法の代わりとなる。
【０１１１】
このようにして、ＤＮＡは、酵素活性を示すことができる生物学的高分子の表のＲＮＡ及びタンパク質に加えられる。完全なＤＮＡ触媒能力は、依然として調べられているが、これらの調査は、本実験に用いられたもののような試験管内選択法に基づいて速やかに続けなければならない。
ＤＮＡ酵素は、他の高分子触媒に比べていくつかの重要な利点を与える。第１に、たいていの実験が自動ＤＮＡシンセサイザーにアセクセスする時代で調製が容易であり、ＤＮＡホスホルアミダイトの価格がかなり下がった。第２に、特にＲＮＡに比べて非常に安定な化合物であり、生物物理実験での使用に容易である。第３に、現在ＲＮＡ切断活性を欠くアンチセンスＤＮＡを利用している治療用途に適応されることが予想される。試験管内選択は、ホスホロチオエート含有ＤＮＡのようなヌクレアーゼ耐性のある化合物を含むＤＮＡ類縁体を用いて、これらの類縁体がデオキシヌクレオシド５′三リン酸として調製されかつＤＮＡ依存性ポリメラーゼにより基質として受容される限り行われる。更に、ＤＮＡ酵素は、触媒機能の高分子に基づく理解に新しい窓を開く。例えば、同様の化学転換を触媒するタンパク質系、ＲＮＡ系、及びＤＮＡ系酵素の比較分析を行うことは興味深いことである。
【０１１２】
実施例４
他の触媒ＤＮＡファミリー 
出発ＤＮＡプールを、出発ＤＮＡプールが４０ランダムヌクレオチドを有する分子を含む以外は実質的に上記実施例2.B.に記載されたように調製した。即ち、ここに記載される出発ＤＮＡプールを、合成オリゴマー 5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rAGG AAG AGA TGG CGA CAT CTC N40GT GAC GGT AAG CTT GGC AC 3′(配列番号23)(ＮはＧ、Ａ、Ｔ及びＣの等モル混合物であり、ＤＮＡ分子内の標的ｒＡの次のホスホエステルを切断する能力を選択した)を用いてＰＣＲにより調製した。（図６Ａも参照。）
選択的増幅を、Ｐｂ2+、Ｚｎ2+、Ｍｎ2+、又はＭｇ2+の存在下に行い、ＤＮＡ触媒分子の少なくとも４“ファミリー”を生成した。図５に示されるように、比活性を示すＤＮＡ触媒分子は種々のカチオンの存在下に作成した。
図５は、選択した触媒ＤＮＡの４ファミリーの特定のエンドリボヌクレアーゼ活性を証明するポリアクリルアミドゲルを示す写真である。Ｐｂ2+依存性ファミリーの分子の選択を、対照として同様の方法で繰り返した。各グループの３レーンにおいては、第１レーンは金属カチオンの不在下に選択集団の活性のないことを示し、第２レーンは金属カチオンの存在下の実測活性を示し、第３レーンは出発プール（Ｇ０）の活性のないことを示す。現在、反応性の順序はＰｂ2+＞Ｚｎ2+＞Ｍｎ2+＞Ｍｇ2+であることが認められ、対応する金属酸化物のｐＫaを反映している。
【０１１３】
予め選択された２価カチオンの存在下の５（Ｇ５）或いは６（Ｇ６）ラウンドの選択的増幅後に、所望のエンドヌクレアーゼ活性が得られた。Ｍｇ2+の存在下の選択的増幅の下記の説明は例示である。
６ラウンドの試験管内選択的増幅を、使用した２価金属が１mMＰｂ2+ではなくＭｇ2+である以外は上記実施例２に記載される方法に従って行った。（実質的に同様の手順を記載している Breaker & Joyce，Chem. & Biol. 1: 223-229(1994)も参照されたい。この文献を参考として本明細書に引用する。）
第６ラウンド後に個々のクローンを単離し、これらのクローンの２４のヌクレオチド配列を求めた。配列は、全て 5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CA（配列番号２３位置１〜４４）から開始し、CGG TAA GCT TGG CAC 3′（配列番号２３位置９３〜１０７）で終わる。
出発プールにおいて TCTC N40 GTGA（配列番号２３位置４５〜９２）に対応する中央のセグメントは下記のように変動する。
【０１１４】
2006136333.tif 000004
【０１１５】
始めの括弧内の数字は、その特定配列をもつクローン数を示す。ある突然変異（太文字で強調された）は最初にランダム化されたもの以外の位置のヌクレオチドに存在することに留意されたい。
２４クローンのうちの５つに存在した上記の２番目の配列（即ち、配列番号２５）を次の実験のリード（即ち、最初の）化合物として選んだ。その切断活性を種々の２価金属の１mM濃度及び１M ＮａＣｌ、ｐＨ７.０及び２３℃の存在下に測定した。
【０１１６】
金属                                     ｋobs（min-1）
なし                                     n.d. 
Ｍｇ2+                                   2.3×10-3 
Ｍｎ2+                                   6.8×10-3 
Ｚｎ2+                                   4.2×10-2 
Ｐｂ2+                                   1.1×10-2
【０１１７】
従って、リード化合物は、Ｍｇ2+の存在下での活性を選択したとしても４種の２価金属全ての存在下に活性である。逆に、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、又はＰｂ2+の存在下での活性を選択したＤＮＡ分子は、Ｍｇ2+の存在下に活性を示さなかった 更に、全ホスホロチオエート含有ＤＮＡ類縁体として調製した場合、Ｍｇ2+の存在下に６ラウンドの試験管内選択後に得られたＤＮＡの集団は、実測速度〜10-3 min-1でＭｇ2+依存性切断活性を示した。ホスホロチオエート含有類縁体を、各立体中心にＲp配置を有するように酵素的に調製した。かかる化合物は、非修飾ＤＮＡに比べて細胞ヌクレアーゼによる分解に比較的耐性がある。
【０１１８】
リード化合物を、４０ヌクレオチドの位置（下線部分）で再びランダム化し、１５％の頻度で突然変異を導入した（３ヵ所の可能な塩基置換の各々が５％の確率）。再ランダム化集団を更に７ラウンドの試験管内選択に供した。最後の４ラウンドで、１mMＰｂ2+の存在下に反応性のある分子を集団から取り出し、その後、残りを攻撃して１mMＭｇ2+の存在下に反応させた。第７ラウンドの後に個々のクローンを単離し、これらのクローンの１４のヌクレオチド配列を求めた。配列は、全て 5′GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC(配列番号23、位置１〜４８)から始まり、GTG ACG GTA AGC TTG GCA C 3′（配列番号23、位置８９〜１０７）で終わる。
４０の部分的ランダム化位置に対応する中央のセグメント（Ｎ40、配列番号２３、位置４９〜８８）は下記のように変動する。
【０１１９】
2006136333.tif 000005
【０１２０】
括弧内の数字は、その特定の配列を有するクローン数を示す。太字で示されたヌクレオチドは、リード化合物と比べて異なるものである。
これらのクローンの切断活性の形式分析は進行中である。集団は、全体としてＰｂ2+の存在下の活性と匹敵しうるレベルで実測速度〜１０-2 min-1のＭｇ2+依存性切断活性を示す。
図６Ａ及び図６Ｂは、各々本明細書に開示された選択的増幅法で得られた“前駆体”ＤＮＡ触媒分子及び数種のＤＮＡ触媒分子の１つを示す２次元図である。
図６Ａは、出発プールからの具体的な分子を示し、配列番号２３で示される分子の全配置を示す。示されるように、種々の相補的ヌクレオチドがランダム(Ｎ40)領域に隣接する。
図６Ｂは、本明細書に記載された手順で作成したＭｇ2+依存性ＤＮＡ触媒分子(又は“ＤＮＡｚｙｍｅ”)の１種の図式である。基質核酸におけるリボヌクレオチドの位置を矢印で示す。（図示した分子は、配列番号２５として同定した配列、及び配列番号２３の“開始”及び“最終”配列を含む。）
【０１２１】
エンドヌクレアーゼ活性は、本明細書に開示される試験管内進化により上記“ファミリー”の各々において増強され続けているので、ますます望ましい特異性を有するＤＮＡ酵素分子が本明細書に開示されたガイドラインを用いて巧く作成されることが期待される。
【０１２２】
実施例５
大きなＲＮＡ配列の切断 
前述の拡張として、我々は、上記で証明された別の全ＤＮＡ基質内にはめ込まれた単一リボヌクレオチドではなくて全ＲＮＡ基質を切断するＤＮＡ酵素を開発した。（R.R．Breaker & G.F．Joyce，Chem. &  Biol. 1: 223-229(1994);R. R. Breaker & G.F．Joyce，Chem. & Biol. 2: 655-660 (1995)も参照されたい）。標的配列として、我々は、配列 5′GUAACUAGAGAU 3′（配列番号４９）を有するＨＩＶ−１ＲＮＡのＵ５ＬＴＲ領域内の１２の高度に保存されたヌクレオチドの伸長物を選択した。
前の実施例に記載された方法に従って、我々は、下記の組成を有する１０１４ＤＮＡ分子のプールを作成した。
【０１２３】
2006136333.tif 000006
【０１２４】
ここで、ＮはデオキシリボヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ、及びＣの等モル混合物であり、“r(GUAACUAGAGAU)”として同定された配列はリボヌクレオチドを含む。（任意により、例えば、追加のｄＡ残基を５′端のリボヌクレオチド部分の前にある配列に付加することにより最初の５′ヌクレオチド配列を変えることができ、最初の配列を“GGAAAAA”と読み、配列番号５０の長さを９９残基とする。これは、本明細書に詳細に開示された特定のＤＮＡ酵素分子を操作するために行われる修飾の１例に過ぎないことは明らかである。）
このように作製されたＤＮＡ酵素分子について、はめ込みＲＮＡ標的配列内にあるホスホエステルを切断する能力を選択した。１０mMＭｇ2+、ｐＨ７.５及び３７℃の存在下にＤＮＡ酵素分子の活性に基づき１０ラウンドの試験管内選択的増幅を行った。選択工程で、“好適”切断部位及びかかる各々の好適部位で切断する“最良”触媒が競合した。２つの部位及び触媒の２つのファミリーが最も効率のよい切断能力をもつものとして出てきた（図７参照）。
【０１２５】
図７は、実質的に本明細書に記載されたように行われた試験管内選択的増幅の１０ラウンドの結果を示すグラフである。示されるように、２つの部位と触媒の２つのファミリーが標的配列の最も効率のよい切断を示すものとして出てきた。
切断条件は、実質的に図７に示されるとおり、即ち、Ｍｇ2+、ｐＨ７.５、及び３７℃とした。反応を２時間行った後に集めたデータを示す。世代数（ここでは０〜１０）に対してプロットした切断（％）を示す。標的配列を基質内の指示した位置で切断することができるＤＮＡ触媒分子の数／有効性を縦のバーで示し、 G↓UAACUAGAGAU での切断を縞のバーで示し、GUAACUA↓GAGAU での切断を白い（輪郭の）バーで示す。ここでのように、図７では、矢印（↓）は切断が生じる２つの隣接ヌクレオチド間の位置を示す。
【０１２６】
第８及び第１０ラウンドの選択的増幅後に得られた集団からの種々の個体をクローン化した。次に、第８ラウンドからの２９個体及び第１０ラウンドからの３２個体を求めた（各々表２及び表３参照）。
表２及び表３の各々の項目“ヌクレオチド配列”の下に出発プールでランダム化された５０ヌクレオチド（即ち、Ｎ50）に対応する各同定クローン部分を示す。即ち、示したクローンの全ヌクレオチド配列は、一般的には、“Ｎ50”セグメントの前後及びそれを含むヌクレオチド配列を含み、基質配列が結合すると推測され、その自己切断は生じない。例えば、（非自己切断）クローンの全配列は、一般的には、配列番号５０の残基 No.１〜３３、続いてランダム化Ｎ50領域を示す残基、続いて配列番号５０の残基 No.８４〜９８又は配列番号５１の残基 No.１〜３４、続いてランダム化Ｎ50領域を示す残基、続いて配列番号５１の残基 No.８５〜９９を含むことができる。しかしながら、各クローンのＮ50（又はＮ40）領域--又はその一部--が特定のＤＮＡ酵素分子の特異性及び／又は活性を求めるのに特に重要であると思われる。これは、基質及びＤＮＡｚｙｍｅが別個の分子である反応において特に明らかである（例えば、図８及び図９参照）。
クローン数は、第８又は第１０ラウンド後に得られた個体について各々８×又は１０×と示す。配列番号も示され、各クローンの“Ｎ50”領域に対応する。
【０１２７】
2006136333.tif 000007
【０１２８】
2006136333.tif 000008
【０１２９】
2006136333.tif 000009
【０１３０】
2006136333.tif 000010
【０１３１】
引き続き、種々のクローンの自己切断活性を測定した。クローン８−５、８−１７、及び１０−３は位置 5′GUAACU↓AGAGAU 3′で効率よく切断することがわかり、クローン１０−１４、１０−１９及び１０−２７は位置 5′ G↓UAACUAGAGAU 3′で効率よく切断することがわかった。分子のＲＮＡ部分が配列 5′GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG 3′（配列番号５１の残基 No.１−２４）まで拡張される場合、クローン８−１７、１０−１４、及び１０−２７は十分な活性を保持し、クローン８−５、１０−３、及び１０−１９は活性の消失を示した。引き続き、クローン１０−２３は伸長したＲＮＡドメインを含む自己切断配列において高レベルの活性を示すことがわかった。
【０１３２】
当業者が上のことを理解しない場合には、本発明の開示の教示に従って操作したポリヌクレオチド分子の“Ｎ50”のセグメントの前後のヌクレオチド配列を種々の方法で変えて個々の特異性を有するＤＮＡ酵素分子を作成することができることも留意されなければならない。例えば、配列番号５１の残基 No.１〜２４は本明細書にはＲＮＡヌクレオチドとして記載されるが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその複合物を含むこともできる。（従って、例えば、配列番号５１は核酸残基 No.１〜７がＤＮＡを含み、残基 No.８〜１９がＲＮＡを含み、残基 No.２０〜９９がＤＮＡを含む等のように容易に変えることができる。） 同様に、“Ｎ50”領域の後のヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はその複合物を含むことができる。“Ｎ50”（又は“Ｎ50”--実施例４参照）の前後の長さも本明細書に開示されるように変えることができる。更に、Ｎ50又はＮ40領域の前及び／又は後の配列は。そのままで縮小、拡大又は削除することができる。
更に、上記のように、我々は、本実施例に記載された方法における標的配列としてＨＩＶ−１ＲＮＡの特定領域を選択した。かかる配列は、標的として使用することができる唯一の配列ではない。当業者が我々の教示に従って他の標的配列の特異性を有するＤＮＡ酵素分子を操作及び設計することができることは明らかである。本明細書に開示されるように、かかる標的配列は、配列番号５０及び５１で示されるようにＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその複合物を含む大きな配列に構築又は挿入することができる。
【０１３３】
自己切断反応を、酵素ドメイン及び基質ドメインを別個の分子に分けることにより分子間切断反応に容易に変換した。始原型分子としてクローン８−１７及び１０−２３を選んだ。共に重複代謝回転で進行する反応において別々の全ＲＮＡ基質の切断においてＤＮＡ酵素として作用することを示した（図８）。引き続き、基質結合アームを、切断部位を分離する各不対ヌクレオチド側の塩基対を７に減じた（図９）。
図８は、本発明の２つのＤＮＡ触媒分子、クローン８−１７及び１０−２３のヌクレオチド配列、切断部位、及び代謝回転速度を示す図である。反応条件は、示されるとおり、即ち１０mMＭｇ2+、ｐＨ７.５、及び３７℃とした。クローン８−１７として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを左側に示し、ＲＮＡ基質の切断部位を矢印で示す。基質配列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG -3′)--ＤＮＡｚｙｍｅから分離する（即ち、分子間切断を示す）--はそれだけで標識される。同様に、１０−２３として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを右側に示し、ＲＮＡ基質の切断部位を矢印で示す。また、基質配列も示す。８−１７酵素については代謝回転速度は約０.６hr-1であり、１０−２３酵素については代謝回転速度は約１hr-1であった。
【０１３４】
図８に示されるとおり、別個の基質分子を切断することができるクローン８−１７ＤＮＡ触媒分子のヌクレオチド配列は次のとおりであった：
5′-CTTCCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACTTTTT- 3′(配列番号５６の残基 No.１〜３４)。同図においては、別個の基質分子を切断することができるクローン１０〜２３ＤＮＡ触媒分子のヌクレオチド配列は次のとおりであった：
5′-CTTTGGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3′（配列番号８５の残基 No.３〜３３）。
【０１３５】
図９は、本発明の２つのＤＮＡ触媒分子、クローン８−１７及び１０−２３のヌクレオチド配列、切断部位、及び代謝回転速度を示す図である。反応条件は、示されるとおり、即ち１０mMＭｇ2+、ｐＨ７.５、及び３７℃とした。図８のように、クローン８−１７として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを左側に示し、ＲＮＡ基質の切断部位を矢印で示す。基質配列(5′-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG- 3′)--ＤＮＡｚｙｍｅから分離する（即ち、分子間切断を示す）--はそれだけで標識される。同様に、１０−２３として同定されたＤＮＡｚｙｍｅを右側に示し、ＲＮＡ基質の切断部位を矢印で示す。また、基質配列を示す。８−１７酵素についてはｋobsは約０.００２ min-1であり、１０−２３酵素についてはｋobs値は約０.０１hr-1であった。
【０１３６】
図９に示されるとおり、別個の基質分子を切断することができるクローン８−１７ＤＮＡ触媒分子のヌクレオチド配列は次のとおりであった：
5′-CCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACT- 3′（配列番号５６の残基 No.４〜３０）。同図においては、別個の基質分子を切断することができるクローン１０−２３ＤＮＡ触媒分子のヌクレオチド配列は次のとおりであった：
5′-CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3′（配列番号８５の残基 No.５〜３３、５′端の“ＴＴＧ”が“ＣＴＡ”に置き換わった）。
ＲＮＡ切断ＤＮＡ酵素の触媒速度はなお完全に最適化されなければならない。
上記に開示されたように及び前の実験に報告されたように、我々は、始原型分子を部分的にランダム化しかつ追加ラウンドの選択的増幅を行うことにより触媒速度を改善することができた。しかしながら、ｐＨ７.５及び３７℃で測定したＭｇ2+のＫmは８−１７及び１０−２３ＤＮＡ酵素について各々約５mM及び２mMであることがわかった。その測定条件は、確かに細胞内条件と一致する。
個々の実施態様と実施例を含む上記の説明は、本発明を具体的に説明するものであり限定するものではない。他の多くの変更及び修正が本発明の真意及び範囲を逸脱することなく行われる。
【０１３７】
配列表 
配列番号:1:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 15
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CGGTAAGCTT GGCAC                                                       15
配列番号:2:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 20
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(8, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンリボヌクレオチド
(xi) 配列:
TCACTATNAG GAAGAGATGG                                                  20
配列番号:3:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 38
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ACACATCTCT GAAGTAGCGC CGCCGTATAG TGACGCTA                              38
配列番号:4:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 80
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
GTGCCAAGCT TACCGNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN      60
NNNNNGTCGC CATCTCTTCC                                                  80
配列番号:5:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 28
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な特徴(misc_feature)
(B) 存在位置: 28
(D) 他の情報: 標準名＝ 2'3' 環状リン酸塩
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(28, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンリボヌクレオチド
(xi) 配列:
GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN                                         28
配列番号:6:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 28
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(28, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンリボヌクレオチド
(xi) 配列:
GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATN                                         28
配列番号:7:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 19
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(8, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンリボヌクレオチド
(xi) 配列:
TCACTATNGG AAGAGATGG                                                   19
配列番号:8:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 8
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(8, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンヌクレオチド
(xi) 配列:
TCACTATN                                                                8
配列番号:9:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 30
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CCATCTCTTC CTATAGTGAG TCCGGCTGCA                                       30
配列番号:10:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 15
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
GTGCCAAGCT TACCG                                                       15
配列番号:11:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 43
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CTGCAGAATT CTAATACGAC TCACTATAGG AAGAGATGGC GAC                        43
配列番号:12:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 19
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(8, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンリボヌクレオチド
(xi) 配列:
TCACTATNGG AAGAGATGG                                                   19
配列番号:13:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 43
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(28, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンリボヌクレオチド
(xi) 配列:
GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GAC                       43
配列番号:14:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TCACACATCT CTGAAGTAGC GCCGCCGTAT GTGACGCTAG GGGTTCGCCT                50
配列番号:15:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
GGGGGGAACG CCGTAACAAG CTCTGAACTA GCGGTTGCGA TATAGTCGTA                50
配列番号:16:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CGGGACTCCG TAGCCCATTG CTTTTTGCAG CGTCAACGAA TAGCGTATTA                50
配列番号:17:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CCACCATGTC TTCTCGAGCC GAACCGATAG TTACGTCATA CCTCCCGTAT                50
配列番号:18:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
GCCAGATTGC TGCTACCAGC GGTACGAAAT AGTGAAGTGT TCGTGACTAT                50
配列番号:19:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATAGGCCATG CTTTGGCTAG CGGCACCGTA TAGTGTACCT GCCCTTATCG                50
配列番号:20:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TCTGCTCTCC TCTATTCTAG CAGTGCAGCG AAATATGTCG AATAGTCGGT                50
配列番号:21:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TTGCCCAGCA TAGTCGGCAG ACGTGGTGTT AGCGACACGA TAGGCCCGGT                50
配列番号:22:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TTGCTAGCTC GGCTGAACTT CTGTAGCGCA ACCGAAATAG TGAGGCTTGA                50
配列番号:23:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 107
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な差異(misc_difference)
(B) 存在位置: 置換(28, "")
(D) 他の情報: 標準名＝ アデノシンリボヌクレオチド
標識＝ rA
(xi) 配列:
GGGACGAATT CTAATACGAC TCACTATNGG AAGAGATGGC GACATCTCNN NNNNNNNNNN      60
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNGT GACGGTAAGC TTGGCAC                   107
配列番号:24:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT TGTTAGTAT                 49
配列番号:25:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 48
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TCTCTTCAGC GATGCACGCT TGTTTTAATG TTGCACCCAT GTTAGTGA                  48
配列番号:26:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 46
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TCTCATCAGC GATTGAACCA CTTGGTGGAC AGACCCATGT TAGTGA                    46
配列番号:27:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGTTCT TGTTAGTAT                 49
配列番号:28:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CCGCCCACCT CTTTTACGAG CCTGTACGAA ATAGTGCTCT CGTTAGTAT                 49
配列番号:29:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 48
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TCTCAGACTT AGTCCATCAC ACTCTGTGCA TATGCCTGCT TGATGTGA                  48
配列番号:30:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 42
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CTCTCATCTG CTAGCACGCT CGAATAGTGT CAGTCGATGT GA                         42
配列番号:31:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TACAGCGATT CACCCTTGTT TAAGGGTTAC ACCCATGTTA                            40
配列番号:32:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATCAGCGATT AACGCTTGTT TCAATGTTAC ACCCATGTTA                            40
配列番号:33:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TTCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA                            40
配列番号:34:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTGC ACCCATGTTA                            40
配列番号:35:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATCAGCGATT CACCCTTGTT TAAGCGTTAC ACCCATGTTG                            40
配列番号:36:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATCAGCGATT CACCCTTGTT TTAAGGTTAC ACCCATGTTA                            40
配列番号:37:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCGTTAC ACCCATGTTA                            40
配列番号:38:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATCAGCGATT AACGCTTGTT TTAGTGTTGC ACCCATGTTA                            40
配列番号:39:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 40
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATCAGCGATT AACGCTTATT TTAGCATTAC ACCCATGTTA                            40
配列番号:40:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 10
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
GCCATGCTTT                                                             10
配列番号:41:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 10
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
CTCTATTTCT                                                             10
配列番号:42:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 12
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TATGTGACGC TA                                                          12
配列番号:43:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 10
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
TATAGTCGTA                                                             10
配列番号:44:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 11
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATAGCGTATT A                                                           11
配列番号:45:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 13
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATAGTTACGT CAT                                                         13
配列番号:46:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 14
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
AATAGTGAAG TGTT                                                        14
配列番号:47:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 11
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
ATAGGCCCGG T                                                           11
配列番号:48:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 14
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(xi) 配列:
AATAGTGAGG CTTG                                                        14
配列番号:49:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 12
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic RNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
GUAACUAGAG AU                                                          12
配列番号:50:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 98
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な特徴(misc_feature)
(B) 存在位置: 7..18
(D) 他の情報: 注意＝部位７〜１８はＲＮＡであり、残りはＤＮＡである。
(xi) 配列:
GGAAAAGUAA CUAGAGAUGG AAGAGATGGC GACNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN      60
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNCGGTAAG CTTGGCAC                              98
配列番号:51:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 99
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(ix) 配列の特徴:
(A) 特徴を表す記号: 雑多な特徴(misc_feature)
(B) 存在位置: 1..24
(D) 他の情報: 注意＝部位１〜２４はＲＮＡであり、残りはＤＮＡである。
(xi) 配列:
GGAAAAAGUA ACUAGAGAUG GAAGAGATGG CGACNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN      60
NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNCGGTAA GCTTGGCAC                             99
配列番号:52:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCAATAGTGC TACTGTGTAT CTCAATGCTG GAAACACGGG TTATCTCCCG                50
配列番号:53:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCAAAACAGT GGAGCATTAT ATCTACTCCA CAAAGACCAC TTTTCTCCCG                50
配列番号:54:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
ATCCGTACTA GCATGCAGAC AGTCTGTCTG CTTTTTCATT ACTCACTCCC                50
配列番号:55:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAATTCATGA TGACCAACTC TGTCAACACG CGAACTTTTA ACACTGGCA                 49
配列番号:56:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CTTCCACCTT CCGAGCCGGA CGAAGTTACT TTTTATCACA CTACGTATTG                50
配列番号:57:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
GGCAAGAGAT GGCATATATT CAGGTAACTG TGGAGATACC CTGTCTGCCA                50
配列番号:58:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CTAGACCATT CACGTTTACC AAGCTATGGT AAGAACTAGA ATCACGCGTA                50
配列番号:59:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CGTACACGTG GAAAAGCTAT AAGTCAAGTT CTCATCATGT ACCTGACCGC                50
配列番号:60:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAGTGATACA TGAGTGCACC GCTACGACTA AGTCTGTAAC TTATTCTACC                50
配列番号:61:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
ACCGAATTAA ACTACCGAAT AGTGTGGTTT CTATGCTTCT TCTTCCCTGA                50
配列番号:62:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAGGTAGATA TAATGCGTCA CCGTGCTTAC ACTCGTTTTA TTAGTATGTC                50
配列番号:63:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCCTACAACA CCACTGGGCC CAATTAGATT AACGCTATTT TATAACTCG                 49
配列番号:64:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCAAACGGTT ATAAGACTGA AAACTCAATC AATAGCCCAA TCCTCGCCC                 49
配列番号:65:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CACATGTATA CCTAAGAAAT TGGTCCCGTA GACGTCACAG ACTTACGCCA                50
配列番号:66:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CACAACGAAA ACAATCTTCC TTGGCATACT GGGGAGAAAG TCTGTTGTCC                50
配列番号:67:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CACACGAACA TGTCCATTAA ATGGCATTCC GTTTTTCGTT CTACATATGC                50
配列番号:68:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAGAACGAGG GTCTTGTAAG ACTACACCTC CTCAGTGACA ATAATCCTG                 49
配列番号:69:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CACTACAGCC TGATATATAT GAAGAACAGG CAACAAGCTT ATGCACTGG                 49
配列番号:70:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
GGGTACATTT ATGATTCTCT TATAAAGAGA ATATCGTACT CTTTTCCCCA                50
配列番号:71:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCAAAGTACA TTCCAACCCC TTATACGTGA AACTTCCAGT AGTTTCCTA                 49
配列番号:72:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CTTGAAGATC CTCATAAGAC GATTAAACAA TCCACTGGAT ATAATCCGGA                50
配列番号:73:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CGAATAGTGT CCATGATTAC ACCAATAACT GCCTGCCTAT CATGTTTATG                50
配列番号:74:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCAAGAGAGT ATCGGATACA CTTGGAACAT AGCTAACTCG AACTGTACCA                50
配列番号:75:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 48
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCACTGATAA ATAGGTAACT GTCTCATATC TGCCAATCAT ATGCCGTA                  48
配列番号:76:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCCAAATTAT AAACAATTTA ACACAAGCAA AAGGAGGTTC ATTGCTCCGC                50
配列番号:77:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAATAAACTG GTGCTAAACC TAATACCTTG TATCCAAGTT ATCCTCCCCC                50
配列番号:78:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCGAATGACA TCCGTAGTGG AACCTTGCTT TTGACACTAA GAAGCTACAC                50
配列番号:79:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCATAACAAA TACCATAGTA AAGATCTGCA TTATATTATA TCGGTCCACC                50
配列番号:80:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAGAACAAAG ATCAGTAGCT AAACATATGG TACAAACATA CCATCTCGCA                50
配列番号:81:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG CAACGACAC                 49
配列番号:82:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CTCCCTACGT TACACCAGCG GTACGAATTT TCCACGAGAG GTAATCCGCA                50
配列番号:83:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 36
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TTCCCC                                36
配列番号:84:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CGGCACCTCT AGTTAGACAC TCCGGAATTT TAGCCTACCA TAGTCCGGT                 49
配列番号:85:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 47
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG AATTGTA                   47
配列番号:86:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 51
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCCTTTGGTT AGGCTAGCTA CAACGATTTT TCCCTGCTTG ACCTGTTACG A              51
配列番号:87:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 48
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCTTTAGTTA GGCTAGCTAC AACGATTTTT CCCTGCTTGG AACGACAC                  48
配列番号:88:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CATGGCTTAA TCATCCTCAA TAGAAGACTA CAAGTCGAAT ATGTCCCCCC                50
配列番号:89:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAACAGAGCG AGTATCACCC CCTGTCAATA GTCGTATGAA ACATTGGGCC                50
配列番号:90:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
TACCGACAAG GGGAATTAAA AGCTAGCTGG TTATGCAACC CTTTTCGCA                 49
配列番号:91:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CTCGAAACAG TGATATTCTG AACAAACGGG TACTACGTGT TCAGCCCCC                 49
配列番号:92:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCAATAACGT AACCCGGTTA GATAAGCACT TAGCTAAGAT GTTTATCCTG                50
配列番号:93:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAATACAATC GGTACGAATC CAGAAACATA ACGTTGTTTC AGAATGGTCC                50
配列番号:94:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
GCAACAACAA GAACCAAGTT ACATACACGT TCATCTATAC TGAACCCCCA                50
配列番号:95:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCTTTGAGTT CCTAAATGCC GCACGGTAAG CTTGGCACAC TTTGACTGTA                50
配列番号:96:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 49
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAAAGATCTC ACTTTGGAAA TGCGAAATAT GTATATTCGC CCTGTCTGC                 49
配列番号:97:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CCACGTAGAA TTATCTGATT TATAACATAA CGCAGGATAA CTCTCGCCCA                50
配列番号:98:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 48
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CACAAGAAAG TGTCGTCTCC AGATATTTGA GTACAAGGAA CTACGCCC                  48
配列番号:99:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CATGAAGAAA TAGGACATTC TACAGGCTGG ACCGTTACTA TGCCTGTAGG                50
配列番号:100:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 46
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CATAGGATAA TCATGGCGAT GCTTATGACG TGTACATCTA TACCTT                    46
配列番号:101:
(i) 配列の特徴:
(A) 配列の長さ: 50
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: Genomic DNA 
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(xi) 配列:
CAGATGATCT TCCTTTAAAG ACTACCCTTT AAAGAAACAT AAGGTACCCC                50
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】標的ＲＮＡホスホエステルを切断するＤＮＡを単離する選択的増幅スキームを示す図である。
【図２】出発ＤＮＡプール（Ｇ０）及び鉛カチオン（Ｐｂ2+）存在下に１〜５ラウンドの選択（Ｇ１〜Ｇ５）後に得られた集団の自己切断活性を示す写真である。
【図３】５ラウンドの選択後の集団から単離した個々の変異体の配列アラインメントを示す図である。
【図４Ａ】触媒代謝回転で進行する分子間反応におけるＲＮＡホスホエステルのＤＮＡ触媒切断を示す図である。
【図４Ｂ】触媒代謝回転で進行する分子間反応におけるＲＮＡホスホエステルのＤＮＡ触媒切断を示す図である。
【図５】選択触媒ＤＮＡの４ファミリーの特異的エンドヌクレアーゼ活性を証明するポリアクリルアミドゲルを示す写真である。
【図６Ａ】各々“前駆体”触媒ＤＮＡ分子及び本明細書に開示された選択的増幅法で得られた数種の触媒ＤＮＡ分子の１種の２次元図を示す。
【図６Ｂ】各々“前駆体”触媒ＤＮＡ分子及び本明細書に開示された選択的増幅法で得られた数種の触媒ＤＮＡ分子の１種の２次元図を示す。
【図７】実質的に下記の実施例５に記載されるように行われた１０ラウンドの試験管内選択的増幅の結果のいくつかを示すグラフである。
【図８】本発明の２つのＤＮＡ触媒分子、クローン８〜１７及び１０〜２３のヌクレオチド配列、切断部位及び代謝回転速度を示す図である。
【図９】本発明の２つのＤＮＡ触媒分子、クローン８〜１７及び１０〜２３のヌクレオチド配列、切断部位及び代謝回転速度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月20日(2006.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的エンドヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡ触媒分子。
【請求項２】
ＤＮＡ触媒分子の各集団が基質内の異なるヌクレオチド配列を切断することができる請求項１記載のＤＮＡ触媒分子の２集団以上を含む組成物。
【請求項３】
ＤＮＡ触媒分子の各集団が、異なる基質を認識することができる請求項１記載のＤＮＡ触媒分子の２集団以上を含む組成物。
【請求項４】
下記の工程を含む、基質核酸配列を特定部位で切断するＤＮＡ触媒分子の選択方法。
ａ．一本鎖ＤＮＡ分子の集団を得る工程；
ｂ．ヌクレオチド含有基質分子と前記一本鎖ＤＮＡ分子の集団とを混合して混合物をつくる工程；
ｃ．前記集団内の一本鎖ＤＮＡ分子が前記基質配列の切断を引き起こすのに十分な時間及び所定の反応条件下に前記混合物を維持して基質切断産物を作製する工程；
ｄ．前記一本鎖ＤＮＡ分子の集団を前記基質配列と基質切断産物から分離する工程；及び ｅ．ヌクレオチド含有基質を特定部位で切断する一本鎖ＤＮＡ分子を前記集団から単離する工程。
【請求項５】
下記の工程を含むホスホエステル結合の切断方法。
ａ．基質核酸配列を特定切断部位で切断することができるＤＮＡ触媒分子とホスホエステル結合含有基質とを混合して反応混合物をつくる工程；及び 
ｂ．前記混合物を、前記ＤＮＡ触媒分子が前記ホスホエステル結合を切断することができる所定の反応条件下に維持して基質産物の集団を作製する工程。
【請求項６】
下記の工程を含む、ホスホエステル結合を切断するＤＮＡ触媒分子の操作方法。
ａ．一本鎖ＤＮＡ分子の集団を得る工程；
ｂ．遺伝的変異を前記集団内に導入して変異集団を作製する工程；
ｃ．前記変異集団から所定の選択基準を満たす個体を選択する工程；
ｄ．前記変異集団の残りから前記選択個体を分離する工程；及び 
ｅ．前記選択個体を増幅する工程。
【請求項７】
１以上の認識ドメイン、可変領域、及びスペーサー領域が隣接した保存コアを特定するヌクレオチド配列を含む天然に存在しないＤＮＡ触媒分子。