(57)【要約】【課題】レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株等の納豆菌株を用いて納豆を製造する方法及びその納豆製品を提供する。【解決手段】レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造する大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法、及び、ショ糖、ラフィノース及びスタキオースの発酵過程における分解を抑制して、それらを高含有させた大豆オリゴ糖高含有納豆。【選択図】図５
2006262895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したショ糖を含むオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させたことを特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆。
【請求項２】
オリゴ糖が、ショ糖、ラフィノース及びスタキオースのうち、少なくともショ糖である、請求項１に記載の納豆。
【請求項３】
レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素（ＳａｃＢ）の活性及びショ糖取り込みタンパク質（ＳａｃＰ）の発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造することを特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
【請求項４】
ショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造することを特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
【請求項５】
納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するショ糖、ラフィノース及びスタキオースのうち、少なくともショ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造する、請求項３又は４に記載の大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
【請求項６】
任意の手段で変異をかけて得られた、レバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造する、請求項３又は４に記載の大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
【請求項７】
納豆菌において、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下したことを特徴とする納豆菌株。
【請求項８】
納豆菌ゲノム由来のｓａｃＢ遺伝子及びｓａｃＰ遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて破壊して作製したレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株である、請求項７に記載の納豆菌株。
【請求項９】
レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２８である、請求項８に記載の納豆菌株。
【請求項１０】
自然界からのスクリーニング、紫外線若しくはガンマ線、又はニトロソグアニジンなどの変異剤を用いて育種又は作製した、レバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株である、請求項７に記載の納豆菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原料大豆に由来する特定のオリゴ糖成分を高含有させた大豆オリゴ糖高含有納豆製品に関するものであり、更に詳しくは、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素（ＳａｃＢ）の活性及びショ糖取り込みタンパク質（ＳａｃＰ）の発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて、納豆の発酵過程における上記特定のオリゴ糖成分の分解を抑制して、ショ糖を含むそれらの大豆オリゴ糖成分を高含有させた大豆オリゴ糖高含有納豆を製造する方法及びその製品に関するものである。本発明は、有用な生理活性を有するショ糖、ラフィノース、スタキオース等の大豆オリゴ糖の含有量の高い機能性と甘さを有する納豆製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、大豆発酵食品である納豆は、植物性蛋白質、食物繊維、カルシウム、鉄、ビタミン類等を豊富に含む栄養価の高い伝統的な栄養食品として広く利用されている。この納豆は、その発酵過程で原料大豆に由来する成分が分解されているため、例えば、蛋白質の消化吸収率が煮豆に比べて高いこと、また、有用な発酵産生物を多く含有していること等から、健康食品としても注目され、広く利用されている。
【０００３】
従来、このような納豆製品は、一般に、洗浄した原料大豆を水に浸漬した後、蒸煮し、これに納豆菌を接種した後、これを所定の容器に充填し、所定の発酵工程を経て製品化されている。その際に、納豆菌は、原料大豆中に含まれる糖類を炭素源として資化するため、例えば、ラフィノース及びスタキオース等の有用な生理活性を有する大豆オリゴ糖が、その発酵過程において、非常に減少してしまい、得られた納豆製品は、それらの有用な生理活性効果を有していないことが指摘されている。
【０００４】
そのために、従来法では、納豆製品におけるオリゴ糖の含有量を高める目的で、例えば、ガラクトオリゴ糖及びキシロオリゴ糖等のオリゴ糖を最終の納豆製品に添加したり、あるいは原料大豆にこれらのオリゴ糖を添加して発酵させる方法が提案されており（特許文献１参照）、また、納豆用のタレにイソマルトオリゴ糖を添加する方法も提案されている（特許文献２参照）。
【０００５】
このように、従来、原料大豆に含まれる有用な生理活性を有する大豆オリゴ糖に着目して、これらのオリゴ糖を納豆に添加することが種々試みられているが、いずれの製品も、原料大豆に由来する大豆オリゴ糖を利用するものではなく、単なるオリゴ糖添加食品の域を出るものではなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２３５４９２号公報
【特許文献２】特開平５−１３７５３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、原料大豆に由来する大豆オリゴ糖をその有用な生理活性を生かして納豆に移行させることを可能とする新しい納豆製造技術を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、原料大豆中又は添加したオリゴ糖に含まれるラフィノース、スタキオース等の有用な生理活性を有する大豆オリゴ糖を高含有させた納豆を製造することを可能とする新規な納豆の製造方法を提供することを目的とするものである。また、本発明は、納豆の発酵過程で、上記大豆オリゴ糖成分が分解されることを抑制することを可能とするレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株及びその構築方法を提供することを目的とするものである。更に、本発明は、上記大豆オリゴ糖を高含有し、大豆オリゴ糖に基づく高い生理活性を有する高い機能性と甘さを有する納豆製品を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したショ糖を含むオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させたことを特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆。
（２）オリゴ糖が、ショ糖、ラフィノース及びスタキオースのうち、少なくともショ糖である、前記（１）に記載の納豆。
（３）レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素（ＳａｃＢ）の活性及びショ糖取り込みタンパク質（ＳａｃＰ）の発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造することを特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
（４）ショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造することを特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
（５）納豆の発酵過程における原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するショ糖、ラフィノース及びスタキオースのうち、少なくともショ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造する、前記（３）又は（４）に記載の大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
（６）任意の手段で変異をかけて得られた、レバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造する、前記（３）又は（４）に記載の大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
（７）納豆菌において、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下したことを特徴とする納豆菌株。
（８）納豆菌ゲノム由来のｓａｃＢ遺伝子及びｓａｃＰ遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて破壊して作製したレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株である、前記（７）に記載の納豆菌株。
（９）レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株が、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２８である、前記（８）に記載の納豆菌株。
（１０）自然界からのスクリーニング、紫外線若しくはガンマ線、又はニトロソグアニジンなどの変異剤を用いて育種又は作製した、レバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株である、前記（７）に記載の納豆菌株。
【００１０】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の大豆オリゴ糖高含有納豆は、納豆の発酵過程における、原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するラフィノース及びスタキオース等の大豆オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させたことを特徴とするものである。また、本発明の大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法は、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における、原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造することを特徴とするものである。
【００１１】
即ち、本発明は、洗浄した原料大豆を水に浸漬した後、これを蒸煮し、これに納豆菌を接種し、所定の容器に充填し、所定の発酵をさせる、通常の納豆の製造方法において、納豆菌として、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、納豆の発酵過程における、原料大豆又は添加した大豆オリゴ糖に由来する大豆オリゴ糖の分解を抑制して、大豆オリゴ糖を高含有する納豆を製造し、提供するものである。
【００１２】
ここで、レバン合成酵素について説明すると、レバン合成酵素（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ；ＳａｃＢ、別名：ｓｕｃｒｏｓｅ  ６−ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、下記の反応式により、ショ糖、ラフィノースなどのフラクトシルアルドースからβ−フルクトシル基を受容体に転移させ、β−２，６−結合のフルクタン（レバン）を可逆的に作る作用を有する。
（反応式）
sucrose + (2, 6-β-D-fructosyl) n = glucose + (2, 6-β-fructosyl) n+1 
フルクトシル基の供与体は、ショ糖のほか、ラフィノース、galsucrose、xylsucrose、スタキオースなどで、これらは、受容体にもなる。水も受容体となり、遊離フルクトースを生ずる。
【００１３】
次に、ショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）について説明すると、ＳａｃＰは膜蛋白質であり、ＰＴＳシステムの中でショ糖に特異的な輸送に関与することが知られている（Journal of Bacteriology Vol.172, No.7 Page. 3966）。このｓａｃＰ遺伝子に変異を持つ細胞では、ショ糖を細胞内に取り込むことができなくなるが、その他の糖については影響がないことが知られている（Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA Vol. 84, Page. 8773）。
【００１４】
納豆の製造工程における原料大豆ないし納豆に含まれる糖成分の動向については、生大豆、浸漬大豆、蒸煮大豆及び納豆に含まれる大豆オリゴ糖（サッカロース、ラフィノース、スタキオース、メリビオース及びマンニノトリオース）の含有量を調べた研究報告（日本食品工業学会誌、２９巻２号、１０５〜１１０（１９８２−２））によると、特に、納豆では、原料大豆に比べて、サッカロース、スタキオース及びラフィノースが減少していることが知られている（図３参照）。本発明は、原料大豆に含まれる大豆オリゴ糖を納豆に移行させて、その有用な生理活性を活用できるようにするために、これらの大豆オリゴ糖を納豆の発酵過程で分解する作用を有するレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌を用いて納豆を製造することにより、大豆オリゴ糖の分解を抑制して、大豆オリゴ糖を高含有させた納豆を製造するものである。
【００１５】
本発明では、上記大豆オリゴ糖は、基本的には、納豆の発酵過程でレバン合成酵素及びＳａｃＰの発現活性により分解される、原料大豆に由来するショ糖、ラフィノース、スタキオース等のフルクトシル基含有オリゴ糖を意味するが、該大豆オリゴ糖には、これらのオリゴ糖を別に添加したものも包含される。本発明において、上記大豆オリゴ糖とは、原料大豆由来の大豆オリゴ糖及び別に添加したオリゴ糖の両者を意味している。即ち、本発明の大豆オリゴ糖高含有納豆は、納豆の発酵過程における、原料大豆及び／又は添加したオリゴ糖に由来するショ糖、ラフィノース、スタキオース等のフラクトシル基含有オリゴ糖の分解を抑制して、それらを高含有させた納豆を意味するものである。
【００１６】
本発明では、好適には、上記レバン合成遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株等を用いて納豆を製造する方法及びその製品が対象とされるが、これらに制限されるものではなく、上記ショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造する方法、及び該方法によりショ糖の含有量を向上させて甘さを付与した納豆製品も本発明の対象とされる。
【００１７】
次に、本発明で用いるレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株について具体的に説明すると、本発明では、納豆菌として、（１）納豆菌ゲノム由来のｓａｃＢ遺伝子及びｓａｃＰ遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて破壊して作製したレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、（２）遺伝子操作以外の人為的な手段により、レバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性を失活させた納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性を低下させた納豆菌株、又は、（３）野生株からスクリーニングにより入手し、育種したレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性が失活した納豆菌株又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性が低下している納豆菌株、あるいは、上記方法により、作製又は入手した、ショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株又はＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株が用いられる。
【００１８】
即ち、本発明では、納豆菌として、例えば、遺伝子組換え手法でｓａｃＢ及びｓａｃＰ遺伝子を欠損させた納豆菌株、遺伝子操作以外の手法でレバン合成酵素及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性を失活又はその活性を低下させた納豆菌株、又は、野生株からスクリーニングしたレバン合成酵素及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活した納豆菌株又はその活性が低下している納豆菌株が用いられる。これらのうち、ｓａｃＢ遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて破壊する方法を説明すると、好適には、例えば、納豆菌ゲノムから得られるｓａｃＢ遺伝子をＰＣＲ増幅したもの（約１ｋｂｐ）を、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃIIサイトに導入した後、ＪＭ１０９に形質転換させ、次に、ｓａｃＢ遺伝子のＨｉｎｃIIサイトにｐＣＭのＨｉｎｃII−Ｓｍａ  Ｉサイトで切断したｃａｔ遺伝子（約１ｋｂｐ）を挿入し、ｐＵＣＳａｃＢｃａｔを作製し、次いで、これをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｎａｔｔｏに導入して、形質転換させ、sａｃＢ遺伝子破壊株を構築する方法が例示される。ｓａｃＰ遺伝子についても、同様の方法により、ｓａｃＰ遺伝子破壊株を構築することができる。
【００１９】
遺伝子組換え手法は、ｓａｃＢ遺伝子及びｓａｃＰ遺伝子が破壊できれば、制限酵素サイトや抗生物質耐性遺伝子はこれらに制限されるものではなく、適宜の手法を使用することができる。また、遺伝子組換え技術以外の手法でも、レバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性が欠損又は低下した納豆菌を、例えば、自然界から野生株をスクリーニングする方法や、紫外線やガンマ線、ニトロソグアニジン等の変異剤を用いる方法で入手ないし育種して使用することが可能である。このように、本発明では、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株であれば、その入手ないし育種又は作製の過程の如何にかかわらず、使用することが可能である。
【００２０】
本発明では、納豆の製造方法において、納豆菌として、上記方法で構築したレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造するが、納豆の製造方法及び条件は、上記納豆菌株を用いる他は、特に制限されるものではなく、適宜の方法及び条件を任意に使用することができる。本発明により、原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の発酵過程における分解を抑制して、原料大豆に由来する大豆オリゴ糖のうち、特に、ショ糖、スタキオース及びラフィノースを高含有する納豆を製造し、提供することができる。大豆オリゴ糖の有する有用な生理活性として、例えば、スタキオースは、整腸作用を有することが知られているが、本発明の大豆オリゴ糖高含有納豆は、原料大豆に由来する大豆オリゴ糖成分の発酵過程における分解を抑制して、それらの成分を高含有させた機能性納豆製品を提供することを可能とするものである。また、本発明は、大豆オリゴ糖を添加した場合でも発酵過程におけるそれらの分解を抑制して、それらの成分を高含有する納豆を製造することが可能である。
【００２１】
従来の納豆製品では、納豆の発酵過程で、納豆菌が、原料大豆中に含まれる糖類を炭素源として資化するために、例えば、ショ糖、ラフィノース、スタキオース等の有用な生理活性を有する大豆オリゴ糖の含有量が著しく減少してしまい、それらの大豆オリゴ糖を高含有する納豆製品を製造することを可能とすることは困難であった。これに対し、本発明では、納豆菌として、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性を失活ないし低下した納豆菌株を用いて納豆を製造することにより、原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフルクトシル基含有オリゴ糖の発酵過程における分解を抑制して、それらのオリゴ糖を高含有させた納豆を製造するものである。本発明の大豆オリゴ糖を高含有させた納豆は、原料大豆に由来するショ糖、スタキオース及びラフィノース等の大豆オリゴ糖の含有量が高いので、それらの生理活性を有効に発揮することが可能な高い機能性と甘さを有する納豆製品として有用である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来する大豆オリゴ糖を高含有する大豆オリゴ糖高含有納豆を製造することができる。
（２）大豆オリゴ糖の有する有用な生理活性を納豆に移行させた新規納豆製品を提供することができる。
（３）レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株、又はレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株及びそれらの構築方法を提供することができる。
（４）納豆の発酵過程における上記大豆オリゴ糖の分解を抑制して、その生理活性の活用を図ることを可能とする新しい高機能性と甘さを有する納豆の製造方法及びその製品を提供することができる。
（５）上記大豆オリゴ糖高含有納豆を摂取することで、有用な生理活性を有するスタキオース及びラフィノース等の大豆オリゴ糖を同時摂取することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
本実施例では、納豆菌ｓａｃＢ遺伝子破壊株を作製した。
（１）ｓａｃＢ遺伝子破壊株の作製方法
１）ｐＵＣｓａｃＢの作製
納豆菌ゲノムからのｓａｃＢ遺伝子をＰＣＲ増幅したｓａｃＢ  ＰＣＲ産物（約１ｋｂｐ）を、アガロースゲル電気泳動により確認した後、ＤＥＡＥペーパーを用いて、ゲルからＤＮＡ断片を回収し、キナーゼ処理したものを、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃIIサイトに導入してｐＵＣｓａｃＢとした後、これをＪＭ１０９に導入して形質転換させた。ブルーホワイトセレクション、制限酵素処理、及びシーケンスにより、ｓａｃＢ遺伝子が挿入されたことを確認した。
【００２５】
２）ｐＵＣｓａｃＢｃａｔの作製
ｓａｃＢ遺伝子のＨｉｎｃIIサイトに、ｐＣＭのＨｉｎｃII−Ｓｍａ Iサイトで切断したｃａｔ遺伝子（約１ｋｂｐ）を挿入し、ｐＵＣｓａｃＢｃａｔとした。制限酵素処理により、ｃａｔ遺伝子の挿入を確認した。図１に、sａｃＢ遺伝子破壊株の構築方法の概要の説明図を示す。
【００２６】
上記方法において、ＰＣＲは、以下の条件で行った。                                                （ｓａｃＢ遺伝子の増幅）
ＰｒｉｍｅｒＦ；  ５’−ＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＴＣ
ＰｒｉｍｅｒＲ；  ５’−ＴＡＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＴＧＡＧＴＡＡＧ
１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
１ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．３μＭ  ｅａｃｈ  Ｐｒｉｍｅｒ
Ｔｅｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ（１０−２００ｎｇ）
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．０ｕｎｉｔ）
Ｓｔｅｐ  １；９４℃，２ｍｉｎ
Ｓｔｅｐ  ２；Ｄｅｎａｔｕｒｅ  ：９４℃，１５ｓｅｃ
Ａｎｎｅａｌ      ：５４℃，３０ｓｅｃ
Ｅｘｔｅｎｄ      ：６８℃，１ｍｉｎ１０ｓｅｃ
２５ｃｙｃｌｅ
【００２７】
３）ｓａｃＢ遺伝子破壊株の構築
上記方法で作製したｐＵＣｓａｃＢｃａｔを、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｎａｔｔｏに導入し、形質転換させる方法は、以下の手順に従った。即ち、納豆菌の形質転換は、枯草菌の相同組換え能を利用した２段階形質転換法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ｐ．２７−７４（１９９０））を改変した方法を用いた。
【００２８】
（２）結果
図１に示した遺伝子破壊法に従って、納豆菌のｓａｃＢ遺伝子を破壊して、遺伝子破壊株を作製した。ｓａｃＢ遺伝子が破壊されていることは、次のようにして確認した。破壊株からゲノムＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡのｓａｃＢ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅断片のアガロース電気泳動により、増幅ＤＮＡ断片を未破壊の菌株からＰＣＲ増幅したものと比較した。その結果、図２に示すように、ｓａｃＢ遺伝子破壊株のＰＣＲ増幅断片は、約１ｋｂｐ長かった。この１ｋｂｐの長さは、挿入したｃａｔ遺伝子の長さに相当した。上記方法で構築されたレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）欠損株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに、微生物の識別のための表示：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＴＴＣＣ  Ｇ１、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２００として、２００４年９月２日に寄託された。
【実施例２】
【００２９】
本実施例では、納豆菌ｓａｃＰ、ｓａｃＢ遺伝子二重破壊株を作製した。
（１）ｓａｃＰ遺伝子破壊株の作製
１）ｐＵＣｓａｃＰの作製
納豆菌ゲノムからのｓａｃＰ遺伝子をＰＣＲで増幅したｓａｃＰ  ＰＣＲ産物  （１．５ｋｂｐ）を、アガロース電気泳動により確認した後、エタノール沈殿で精製し、平滑末端化処理したものを、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃＩＩサイトに導入してｐＵＣｓａｃＰとした。これをＪＭ１０９に導入して形質転換させ、ブルーホワイトセレクション、制限酵素処理によって、ｓａｃＰ遺伝子が挿入されたことを確認した。
【００３０】
２）ｐＵＣｓａｃＰ  Ｓｐｒの作製
ｐＵＣｓａｃＰをｓａｃＰ遺伝子のＮｄｅＩ、ＨｐａＩサイトで切断し、平滑末端化処理したものに、ｐＤＧ１７２６のＨｉｎｃＩＩ、ＥｃｏＲＶで切り出したＳｐｒ遺伝子を挿入し、ｐＵＣｓａｃＰ  Ｓｐｒとした。Ｓｐｒ遺伝子の挿入は、制限酵素処理、ＰＣＲにより確認した。
上記方法において、ＰＣＲは、以下の条件で行った。
（ｓａｃＰ遺伝子の増幅）
ＰｒｉｍｅｒＦ；  ５’−ＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡ
ＰｒｉｍｅｒＲ；  ３’−ＴＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＧＴ
１×ＥＸ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ
１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ
１０ｎＭ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ （１０−２００ｎｇ）
ＥＸ Ｔａｑ （２．５Ｕｎｉｔ）
Ｓｔｅｐ１； ９４℃， ５ｍｉｎ
Ｓｔｅｐ２； Ｄｅｎａｔｕｒｅ  ：９４℃， ４５ｓｅｃ
Ａｎｎｅａｌ      ：６０℃， ４５ｓｅｃ
Ｅｘｔｅｎｄ      ：７２℃， ４５ｓｅｃ
２５ｃｙｃｌｅ
Ｓｔｅｐ３； ７２℃， 7ｍｉｎ
【００３１】
３）ｓａｃＰ遺伝子破壊株の構築
上記方法で作製したｐＵＣｓａｃＰ  Ｓｐｒを用いて納豆菌を形質転換させた。形質転換株の選択は、スペクチノマイシン濃度が３００μｇ／ｍｌになるように添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することで行った。
【００３２】
（２）結果
図４、図５に示した遺伝子破壊法にしたがって、納豆菌のｓａｃＰ遺伝子を破壊して、遺伝子破壊株を作製した。Ｓｐｒ遺伝子の挿入によるｓａｃＰ遺伝子破壊の確認は、サザンハイブリダイゼーション及びｓａｃＰ遺伝子の領域をＰＣＲで増幅することによって行った。ＰＣＲ増幅断片のアガロースゲル電気泳動により、増幅ＤＮＡ断片を未破壊の菌株からＰＣＲ増幅したものと比較した。その結果、図６に示すように、ｓａｃＰ遺伝子破壊株のＰＣＲ増幅断片は、約１．２ｋｂｐ長かった。この１．２ｋｂｐの長さは、挿入したスペクチノマイシン耐性遺伝子の長さに相当した。
【００３３】
（３）ｓａｃＰ、ｓａｃＢ二重破壊株の作製
１）ｐＵＣｓａｃＢの作製
上記実施例１の方法と同様にして、ｐＵＣｓａｃＢを作製した。即ち、納豆菌ゲノムからのｓａｃＢ遺伝子をＰＣＲ増幅したｓａｃＢ  ＰＣＲ産物（約１ｋｂｐ）を、アガロースゲル電気泳動により確認した後、ＤＥＡＥペーパーを用いて、ゲルからＤＮＡ断片を回収し、キナーゼ処理したものを、ｐＵＣ１９のＨｉｎｃIIサイトに導入してｐＵＣｓａｃＢとした後、これをＪＭ１０９に導入して形質転換させた。ブルーホワイトセレクション、制限酵素処理、及びシーケンスにより、ｓａｃＢ遺伝子が挿入されたことを確認した。
【００３４】
２）ｐＵＣｓａｃＢｃａｔの作製
次に、実施例１の方法と同様にして、ｐＵＣｓａｃＢｃａｔを作製した。即ち、ｓａｃＢ遺伝子のＨｉｎｃIIサイトに、ｐＣＭのＨｉｎｃII−Ｓｍａ Iサイトで切断したｃａｔ遺伝子（約１ｋｂｐ）を挿入し、ｐＵＣｓａｃＢｃａｔとした。制限酵素処理により、ｃａｔ遺伝子の挿入を確認した。
【００３５】
上記方法において、ＰＣＲは、以下の条件で行った。                                                
（ｓａｃＢ遺伝子の増幅）
ＰｒｉｍｅｒＦ；  ５’−ＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＣＧＴＣ
ＰｒｉｍｅｒＲ；  ５’−ＴＡＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＴＧＡＧＴＡＡＧ
１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
１ｍＭ  ＭｇＳＯ４
０．３μＭ  ｅａｃｈ  Ｐｒｉｍｅｒ
Ｔｅｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ（１０−２００ｎｇ）
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１．０ｕｎｉｔ）
Ｓｔｅｐ  １；９４℃，２ｍｉｎ
Ｓｔｅｐ  ２；Ｄｅｎａｔｕｒｅ  ：９４℃，１５ｓｅｃ
Ａｎｎｅａｌ      ：５４℃，３０ｓｅｃ
Ｅｘｔｅｎｄ      ：６８℃，１ｍｉｎ１０ｓｅｃ
２５ｃｙｃｌｅ
【００３６】
３）ｓａｃＰ、ｓａｃＢ遺伝子二重破壊株の構築
上記方法で作製したｐＵＣｓａｃＢｃａｔを用いて納豆菌ｓａｃＰ遺伝子破壊株を形質転換させた。形質転換株の選択は、クロラムフェニコール濃度が５μｇ／ｍｌになるように添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することで行った。
【００３７】
（４）結果
ｃａｔ遺伝子の挿入によるｓａｃＢ遺伝子破壊、及びｓａｃＰ遺伝子破壊の維持の確認は、サザンハイブリダイゼーション及びｓａｃＢ、ｓａｃＰ遺伝子の領域をＰＣＲで増幅することによって行った。ＰＣＲ増幅片のアガロースゲル電気泳動により、増幅ＤＮＡ断片を未破壊の菌株からＰＣＲ増幅したものと比較した。その結果、図7に示すように、ｓａｃＢ及びｓａｃＰ遺伝子破壊株のＰＣＲ増幅断片は、ｓaｃＢ領域について、約１．０ｋｂｐ長かった。この１．０ｋｂｐの長さは、挿入したｃａｔ遺伝子の長さに相当した。またｓａｃＰ遺伝子の領域について、約１．２ｋｂｐ長かった。この１．２ｋｂｐの長さは、挿入したスペクチノマイシン耐性遺伝子の長さに相当した。上記方法で構築されたｓａｃＢ、ｓａｃＰ遺伝子二重破壊株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに、微生物の識別のための表示：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＴＴＣＣ  Ｇ２、受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２８として、２００５年１２月１日に寄託された。
【実施例３】
【００３８】
本実施例では、本発明のＳａｃＢ及びＳａｃＰ破壊納豆菌株を用いて納豆を製造した。また、比較のために、通常の納豆菌（Ａ菌）、ＳａｃＢ破壊納豆菌株、及びＳａｃＰ破壊納豆菌株を用いて納豆を製造した。
（１）納豆の製造方法
吸水した原料大豆を高圧で蒸し、納豆菌を接種した煮豆を発酵させるという工程で製造した。１５〜２０℃で１８〜２４時間浸漬した浸漬大豆を、加圧釜に入れ、２０分前後で蒸煮した。菌の接種は、納豆菌ＳａｃＢ及びＳａｃＰ破壊株の細胞又は胞子を使用し、１０３〜１０４個／蒸煮大豆ｇになるように接種した。これを、納豆用ＰＳＰ容器に充填した後、表面を有孔ポリエチレンフィルムで覆い、蓋をかぶせ、温度３８〜４２℃で１４〜２０時間発酵させた。同様にして、通常の納豆菌（Ａ菌）、納豆菌ＳａｃＢ破壊株、及び納豆菌ＳａｃＰ破壊株を用いて納豆を製造した。
【００３９】
（２）結果
納豆菌ＳａｃＢ及びＳａｃＰ破壊株を用いて製造した納豆の品質は、官能試験の結果、市販納豆菌で試作した納豆品質と同様に良好であり、粘り、香り、外観について差は見られなかった。得られた納豆及び比較製品に含まれるオリゴ糖の測定結果を表１に示す。これより、本発明のレバン合成酵素（ＳａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子欠損納豆菌株を用いて製造した納豆は、比較製品に比べて、ショ糖、ラフィノース及びスタキオースの含有量がきわめて高く、大豆オリゴ糖高含有納豆が得られることが分かった。
【００４０】
【表１】
2006262895.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４１】
以上詳述したように、本発明は、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株等を用いて納豆を製造する方法及びその製品等に係るものであり、本発明により、例えば、レバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損納豆菌株の構築方法及び該方法によって構築されたレバン合成酵素遺伝子（ｓａｃＢ）及びショ糖取り込みタンパク質遺伝子（ｓａｃＰ）欠損株、遺伝子組換え以外の手法、例えば、自然界からのスクリーニングや、紫外線やガンマ線、ニトロソグアニジンなどの変異剤を用いてレバン合成酵素の活性及びＳａｃＰの発現活性、あるいは少なくともＳａｃＰの発現活性が失活ないし低下した納豆菌株を提供することができる。また、本発明により、上記納豆菌株を用いて、原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来するフラクトシル基含有オリゴ糖の発酵過程における分解を抑制して、それらの成分を高含有させた納豆を製造することができる。本発明は、通常の納豆製造過程で分解されてしまう、原料大豆又は添加したオリゴ糖に由来する特定のオリゴ糖成分を、その分解を抑制して安定に残存させ、大豆オリゴ糖を納豆製品中に高含有させた高い機能性と甘さを有する納豆製品を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】納豆菌ｓａｃＢ遺伝子破壊株の構築方法の説明図である。
【図２】ｓａｃＢ遺伝子破壊株の確認を示す図である。
【図３】納豆の製造工程における糖成分（サッカロース、ラフィノース、スタキオース、メリビオース、及びマンニノトリオーズ）の動向を示す。
【図４】納豆菌ｓａｃＰ遺伝子破壊のためのベクター構築方法の説明図である。
【図５】納豆菌ｓａｃＢ及びｓａｃＰ遺伝子二重破壊株の構築方法の説明図である。
【図６】ｓａｃＰ遺伝子破壊株の確認を示す図である。
【図７】ｓａｃＢ及びｓａｃＰ遺伝子二重破壊株の確認を示す図である。
【図４】
2006262895.tif 000004
【図５】
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【図１】
2006262895.tif 000006
【図２】
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【図３】
2006262895.tif 000008
【図６】
2006262895.tif 000009
【図７】
2006262895.tif 000010
【配列表】
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