(57)【要約】【課題】            効率良く抗原提示細胞（ＡＰＣ：Antigen-Presenting Cell）の一種であるヒト樹状細胞（ＤＣ：Dendritic Cells）またはマクロファージを分化・培養させる方法を提供すること。【解決手段】        ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場、特に多孔性ポリマーからなるシート状物を使用し、サイトカインの添加のもとに培養することを特徴とする効率良くヒト樹状細胞またはマクロファージに分化・培養する方法。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、サイトカインの添加のもとに培養することを特徴とする効率良くヒト樹状細胞またはマクロファージに分化・培養する方法。
【請求項２】
添加するサイトカインがＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＧＳＦである請求項１に記載の分化・培養方法。
【請求項３】
ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、ＩＬ−４及び／又はＧＭ−ＣＳＦの添加のもとに培養することを特徴とする効率良くヒト樹状細胞に分化・培養する方法。
【請求項４】
ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、Ｍ−ＣＳＦの添加のもとに培養することを特徴とする効率良くマクロファージに分化・培養する方法。
【請求項５】
生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場が、多孔性ポリマーからなるシート状物であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の分化・培養方法。
【請求項６】
多孔性ポリマーにおける孔径が２〜２０μｍであることを特徴とする請求項５に記載の分化・培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示細胞の一種である樹状細胞ならびにマクロファージを効率良く分化・培養させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤に頼ることがなく、人間の本来の防御的免疫機能を人為的に強化して疾病に対抗しようとする免疫療法が古くから検討されている。そのなかでも、抗原提示細胞（ＡＰＣ：Antigen-Presenting Cell）の一種である樹状細胞（Dendritic Cells：以下、ＤＣと記す場合もある）を用いた新たな免疫療法が、最近種々試みられている。
ＤＣは、感染症や癌において防御的免疫応答を発動させる最も重要な抗原提示細胞であり、１０数年前にマウス腫瘍モデルにおいて、ＤＣが強力な抗腫瘍免疫誘導作用を有し、癌の治療効果を有効に発揮することが初めて証明されて以来、癌あるいは種々の感染症の予防、治療を目的としたＤＣ免疫療法に強い期待がかけられてきている。
【０００３】
このＤＣは、自然免疫と獲得免疫の両者の協力体制を、強力に始動させる免疫担当細胞である。すなわち、ＤＣを起点とする免疫監視システムは、病原性微生物による感染や腫瘍発生を制御するために重要であり、所属リンパ節組織でのＤＣの働きは、外来抗原や腫瘍抗原を自己の担当するＴ細胞（Ｔリンパ球）へ提示し、獲得免疫応答を始動させ、維持させているものと考えられている。したがって、ＤＣを体外で大量に分化・培養し、培養したＤＣに腫瘍抗原を感作させたのち人体に戻すことにより、免疫機能が低下した微弱な免疫応答を増幅強化させ、腫瘍治療を行う試みが、既に癌患者において行われている。
【０００４】
また、その詳細なメカニズムは解明されていないが、ＨＩＶ−１（エイズウイルス）感染者では、ＡＩＤＳ（acquired immunodeficiency syndrome：後天性免疫不全症候群）発症前からＤＣの減少とそれに伴う機能異常が認められている。そこでＤＣを用いた新たな免疫療法がＡＩＤＳ患者やＨＩＶ−１感染者おいて、実際に予防治療効果を発揮すると期待されている。
【０００５】
すなわち、皮膚組織のランゲルハンス細胞に代表される未熟樹状細胞（ＤＣ）は、抗原の取り込み能に優れ、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ：腫瘍壊死因子、ＩＬ−１：インターロイキン１）やバクテリアの刺激により成熟し、Ｔ細胞刺激分子の高発現性と、所属リンパ節への移動能を獲得する。したがって、所属リンパ節へ移動したＤＣは、組織に定着し、循環するＴ細胞のなかで対応するＴ細胞受容体を持つ特異的Ｔ細胞と接触し、刺激する。刺激されたＴ細胞は速やかに活性化され増殖・分化する。
【０００６】
さらに活性化Ｔ細胞上に誘導されたＣＤ４０リガンドは、ＤＣ上のＣＤ４０に結合し、ＤＣを逆に刺激することにより、ケモカインを含めた、細胞の増殖・分化・機能発現を担う種々のサイトカインの産生を促すことで、免疫応答をさらに強化する。
【０００７】
このようにして病原微生物に対する免疫が発動されるが、ＨＩＶ−１は未熟ＤＣのリンパ節への移動とＴ細胞刺激能を利用して全身感染を成立させる。つまりＤＣがＨＩＶ−１の感染初期における爆発的な増殖をサポートするのである。ＤＣは分化段階や周囲の環境にもよるが、ＨＩＶ−１に感染しウイルスを産生する。また、侵入サイトである粘膜においてＨＩＶ−１に感染しなくとも、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０分子がＤＣ表面のＤＣ−ＳＩＧＮ（ＤＣ特異的細胞間接着分子−捕捉性非インテグリン）という細胞接着に関与する蛋白と結合することにより、Ｔ細胞が豊富なリンパ節へ感染性のＨＩＶ−１の移動を可能にさせる。
【０００８】
このようなＨＩＶ−１患者の免疫機構の脆弱性を解決するためには、抗原を感作した十分量のＤＣを用いる免疫養子療法が考えられる。しかしながら、移植するＤＣは分化段階初期（未成熟ＤＣ）においてはＨＩＶ−１に感染するので、最終成熟したＤＣを大量に培養・調製する必要がある。さらに、未成熟ＤＣは抗原取り込み能があるが、成熟ＤＣには抗原取り込み能がないため、人為的に抗原をＤＣに取り込ませるには、成熟の最終過程で抗原に暴露させ、抗原感作ＤＣとすることが必要である。
【０００９】
すなわち、ＤＣ免疫療法の成功の鍵を握るものは、ＤＣの分化・培養の成否である。現在行われているＤＣの標準的な培養方法としては、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からヒト末梢血由来単球を、プラスチック付着性あるいはＣＤ１４陽性細胞のnegative selectionによって分画し、高濃度のＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を用いて分化・増殖させる方法が用いられている。しかしながら、未だ種々の問題点が存在する。
【００１０】
例えば、一番の問題点は、同じ条件、同じ培養方法を用いても、ドナーによって得られるＤＣ数が大きく異なることである。このような個体差が生じる原因はどこにあるのか、未だよく判明していない。しかしながら、どの患者にとっても、できるだけ少ない採血量で大量のＤＣの分化・培養を可能にしてもらいたいはずである。したがって、大量のＤＣの分化・培養を可能にするための優れた方法の確立は、今後のＤＣ免疫療法の発展に不可欠である。
【００１１】
本発明者らは先に、ヒトの免疫応答をマウス個体で誘導する系を独自に立ち上げ、培養ＤＣを用いることで、ＨＩＶ−１抗原に対する感染防御免疫応答を誘導できることを公表した（非特許文献１）。しかしながら、ＤＣ培養における個体差には頭を痛めた。ＤＣ数が少ないと顕著な免疫応答は起きないのである。培養に何か不足する因子（栄養、増殖因子、環境等）があるのか、あるいはＤＣの増殖を阻害する因子が原因なのか未だ判明していないのが現状である。これまでの経験からいえば、ＤＣ増殖の成否の要因は、増殖因子よりも内在性の阻害因子の影響が強いと考えており、これまで増殖因子としてＩ型インターフェロンや腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）による樹状細胞への分化促進作用による増殖阻害が知られている。
【非特許文献１】J. Virol., vol.77, 8719-8723 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって本発明は、効率良く抗原提示細胞（ＡＰＣ）の一種であるヒト樹状細胞（ＤＣ）またはマクロファージを分化・培養させる方法を提供することを課題とする。
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明者等は、細胞培養系の構築において、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場の利用に着目した。すなわち、一般に、細胞機能を保つような細胞培養系の構築においては、その培養足場が極めて重要であることが知られている。
【００１４】
かかる考え方に立脚して本発明者らは、ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、かつ、サイトカインの添加のもとに培養することにより、効率良く抗原提示細胞（ＡＰＣ）の一種であるヒト樹状細胞（ＤＣ）またはマクロファージを分化・培養させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって本発明は、基本的態様として；
（１）  ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、サイトカインの添加のもとに培養することを特徴とする効率良くヒト樹状細胞またはマクロファージに分化・培養する方法；
（２）  添加するサイトカインがＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＧＳＦである上記（１）に記載の分化・培養方法；
である。
【００１６】
より具体的には、本発明は、一つの態様として、
（３）  ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、ＩＬ−４及び／又はＧＭ−ＣＳＦの添加のもとに培養することを特徴とする効率良くヒト樹状細胞に分化・培養する方法である。
【００１７】
また別の一つの具体的態様として、本発明は、
（４）  ヒト末梢血由来単球を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、Ｍ−ＣＳＦの添加のもとに培養することを特徴とする効率良くマクロファージに分化・培養する方法である。
【００１８】
さらに具体的には、
（５）  生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場が、多孔性ポリマーからなるシート状物であることを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の分化・培養方法；
（６）  多孔性ポリマーにおける孔径が２〜２０μｍであることを特徴とする上記（５）に記載の分化・培養方法；
である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明が提供する方法により、これまで効率的に大量に分化・培養ができなかったヒト樹状細胞（ＤＣ）を、安定して大量に分化・培養することが可能となった。またあわせてマクロファージについても大量に分化・培養することが可能となった。
したがって、ＤＣを本発明方法により大量に培養することができることから、ＤＣを用いた免疫療法を効率的に行い得るものであり、ＨＩＶ−１感染患者、ＡＩＤＳ患者、癌患者の治療に対して多大な光明を与えるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
従来のＤＣの分化・培養を行う場合に必要となるヒト末梢血単核球からの単球の単離・精製に際しては、プラスチック付着法あるいは磁石抗体ネガティブ分離法があった。しかしながら、プラスチック付着法では、非効率的であり、また操作する人の個人差があり、低精度で効率的に単球の単離・精製することは困難であった。また、磁石抗体ネガティブ分離法は、ある程度の精度が得られるが、コストが高い等の問題があった。
【００２１】
本発明の方法は、これらに比して低コストで、操作も簡単なものであって、効率的に精度良く単球を単離・精製することができる点で特に優れた方法である。かかる方法は、基本的には、ヒト末梢血単核球細胞（以下、単にＰＢＭＣと記す場合もある）を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、効率よくヒトＰＢＭＣ由来の単球だけを単離させることができる。
【００２２】
そのような培養足場として、多孔性ポリマーからなるシート状物を使用するのがよいことが判明した。すなわち、多孔性ポリマーの孔内にヒトＰＢＭＣ由来の単球がはまり込み、単球だけを単離させることが可能となる。なお、この単離はヒトＰＢＭＣ由来の単球がある程度得られる程度でよく、完全に単球のみが単離されている必要はない。
単球をより多く含む状態のものを用いて培養することによりＤＣへの分化・培養を行うことができる。
【００２３】
この培養足場に利用する多孔性ポリマーの材質としては、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリ無水物等のポリマーが挙げられ、そのなかでも、ポリカーボネートのシートを好適に使用することができる。
このようなシートとしては、例えば、各種の孔径を有する市販のポリカーボネート製シート［例えば、Whatman社製：サイクロポア／Cyclopore（登録商標）やヌクレポア／Nuclepore（登録商標）］などがあり、これらを好適に使用することができる。
【００２４】
多孔性ポリマーにおける孔の孔径は、ヒトＰＢＭＣ由来の単球が吸着し、培養されるために、２μｍ〜２０μｍ程度であることが必要である。この孔径が２μｍ未満であると、培養足場として使用したとしても、単球を効率的に吸着・培養させることができず、また、２０μｍを超える場合には、培養足場としての機能が低下する。
【００２５】
かくして培養足場に捕獲・吸着した単球を分化・培養するのであるが、培養に用いる培地としては、単球を分化・培養し得る培地であればどのようなものでも使用することができるが、ＲＰＭＩ−１６４０液体培地シリーズが好ましく使用される。
【００２６】
本発明方法による培養に際しては、培地に各種サイトカインを添加することにより目的とするＤＣあるいはマクロファージへ分化・培養することが可能となる。そのなかでも、培養足場上に捕獲・吸着した単球をサイトカインの添加なしで培養するとマクロファージへ分化することが判明した。また、サイトカインとしてＭ−ＣＧＦを添加し培養すれば、単球はマクロファージへと分化・培養される。マクロファージは例えば、ＨＩＶ−１感染実験あるいは抗ＨＩＶ−１薬剤評価等に使用することが可能であることから、これらの実験に使用するマクロファージを大量に得たい場合には、サイトカインとしてＭ−ＧＣＦを添加、あるいは添加なしに培養足場上に捕獲・吸着された単球を培養すればよい。
【００２７】
一方、ＤＣを得たい場合には、培地にサイトカインを添加し培養足場上に捕獲・吸着した単球を培養することで目的とするＤＣへと大量に分化・培養することができる。添加するサイトカインとしては、各種のサイトカインを挙げることができるが、これまでの増殖因子としてＩ型インターフェロンや腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の添加では、ＤＣへの分化促進作用による増殖阻害がある。本発明者らの検討によれば、ＤＣへの分化促進作用としてのサイトカインとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４が好ましく使用される。特にＩＬ−４を使用することにより、ＧＭ−ＣＳＦの添加なしにＤＣへ分化することが判明した。
【００２８】
かくして単球より効率良く分化・培養されたＤＣは、ＤＣを利用した免疫療法に利用することができ、例えば、ワクチン開発、感染症免疫、癌免疫等に使用することが可能となる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明を、実施例に代わる試験例を記載することにより、更に詳細に説明する。
【００３０】
試験例１：培養足場の検討
生体培養材料としての培養足場における多孔性ポリマーの孔径の違いによるヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）からの単球の単離・精製に与える影響を検討した。
各種の孔径を有する多孔性ポリマーのシートを細胞培養プレートまたは培養用ペトリ皿の底に敷いて、シート上にヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）が乗るような状態とし、ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて培養し、単球の捕獲・吸着を検討した。
その結果を、下記表１にまとめた。
【００３１】
【表１】
2006262782.tif 000002
【００３２】
＊１：培養足場プレート上の顕微鏡写真の結果、プレート上に単球の吸着がほんの僅かか、あるいはほとんど認めない。
＊２：培養足場プレート上の顕微鏡写真の結果、プレート上に多数の単球の捕獲・吸着を認める。
【００３３】
試験例２：培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球について、サイトカイン添加なし培養した場合におけるマクロファージへの分化・培養
試験例１で得られた培養足場プレート（孔径８μｍまたは１２μｍのCyclopore/Nucleporeを使用）上に捕獲・吸着した単球を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用し、サイトカインの添加なしに培養し、その単球の分化を検討した。その結果、培養後７日目において、培養足場上に捕獲・吸着した単球は、マクロファージに分化・培養されていることが判明した。
したがって、サイトカインの添加なしに培養した場合には、単球はマクロファージに分化・培養することが判明した。
【００３４】
試験例３：培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球について、サイトカインを添加して培養した場合におけるＤＣへの分化・培養
試験例１で得られた培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用し、培地に各種サイトカインを添加して培養し、その単球の分化を検討した。
すなわち、培養足場として孔径８または１２μｍの多孔性ポリマー（サイクロポア／Cycloporeあるいはヌクレポア／Nuclepore）を使用し、単球を捕獲・吸着し、サイトカインの添加による培養を行い、単球の分化を顕微鏡下に観察した。
その培養後７日目の結果を表２にまとめた。
【００３５】
【表２】
2006262782.tif 000003
【００３６】
すなわち、単球は、サイトカインの添加なしで培養した場合には、マクロファージに分化・培養されているのに対し、サイトカインとしてＩＬ−４単独、あるいはＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの両者を添加して培養した場合には、ＤＣに分化・培養されている。
したがって、サイトカインとしてＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの両者を添加しなくても、ＩＬ−４の添加のみでＤＣへの分化・培養が行われることが判明した。
【００３７】
試験例４：単球のＤＣへの分化・培養がＨＩＶ−１により阻害されるか否かの検討
試験例１で得られた培養足場プレート上に捕獲・吸着された単球のＤＣへの分化・培養が、ＨＩＶ−１により阻害されるか否かの検討した。
すなわち、試験例１で得られた培養足場として孔径１２μｍを有するCyclopore/Nucleporeプレート上に捕獲・吸着した単球を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して培養する場合に、培地にサイトカインとしてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加し、さらにＤＣへ分化させる段階で不活性化されたＨＩＶ−１  ＩＩＩＢを加え１３日間養し、ＤＣへの分化がＨＩＶ−１により阻害されるか否かを検討した。
【００３８】
その結果、培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球にサイトカインとしてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を添加して培養した場合、あるいはそれにさらに不活性化されたＨＩＶ−１  ＩＩＩＢを加え培養した場合にあっても、単球のＤＣへの分化が阻害されていないことが判明した。
【００３９】
以上の結果から判断すると、培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球は、培養による成熟化でその分化がＨＩＶ−１により阻害されていないこと、すなわちアポトーシスを回避していることが判明した。したがって、本発明で大量に培養されるＤＣは、極めて良好な免疫療法に使用し得るＤＣとなることが理解される。
【００４０】
試験例５：培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球の培養後における食菌作用
１２ｗｅｌｌプレート上に培養足場として１２μｍの孔径を有する多孔性ポリマー（Cyclopore）を敷き、そこにＰＢＭＣを接触させ、単球を吸着させた。その単球を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて種々の条件下で７日間培養を行い、培養後の食菌作用を検討した。
食菌作用の有無は、ＦＩＴＣラベルした大腸菌（E. coli）を使用したフローサイトメトリー法にしたがって行った。
また、オプソニンとしてウサギ抗Ｅ．ｃｏｌｉ−抗体を使用した。
単球の培養は種々のサイトカインの添加、あるいは添加なしに行い、サイトカインとしてはＧＭ−ＣＳＦを２００ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−４を２００ｎｇ／ｍＬならびにＭ−ＣＳＦを２０ｎｇ／ｍＬ添加することにより実施した。
その結果を下記表３にまとめた。
【００４１】
【表３】
2006262782.tif 000004
【００４２】
＊１：Mean Fluorescence Intensity
【００４３】
表に示した結果からも判明するように、培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球は、培養後（マクロファージあるいはＤＣへの分化・培養）において良好な食菌作用を示している。また、オプソニンによる促進が認められた。
【００４４】
試験例６：培養足場プレート上に捕獲・吸着した単球の培養後におけるマクロファージあるいはＤＣへの分化を、表面マーカーによる確認
１２ｗｅｌｌプレート上に培養足場として１２μｍの孔径を有する多孔性ポリマー（Cyclopore）を敷き、そこにＰＢＭＣを接触させ、単球を吸着させた。その単球を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて種々の条件下で７日間培養を行い、マクロファージあるいはＤＣへの分化・培養を、表面マーカーとしてＤＣ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３、ＣＤ１１ａを測定することで確認した。
単球の培養は種々のサイトカインの添加、あるいは添加なしに行い、サイトカインとしてはＧＭ−ＣＳＦを２００ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−４を２００ｎｇ／ｍＬならびにＭ−ＣＳＦを２０ｎｇ／ｍＬ添加することにより実施した。
その結果を下記表４にまとめた。
【００４５】
【表４】
2006262782.tif 000005
【００４６】
＊１：Mean Fluorescence Intensity
【００４７】
表中に示した結果からも判明するように、培養足場プレート上に捕獲・吸着された単球は、培養後マクロファージあるいはＤＣへの分化・培養していることが良く理解される。
【００４８】
試験例８：抗体をコートしたプレート上に捕獲・吸着した単球の培養後におけるマクロファージあるいはＤＣへの分化への収率
培養足場プレートに対する捕獲単球の分化後の収量を検討した。
すなわち、１２ｗｅｌｌプレート上に８μｍあるいは１２μｍの孔径を有する多孔性ポリマー（Cyclopore）を敷き、そこにＰＢＭＣを５×１０６cells量接触させた。対照として培養足場を用いないプレートについて同様実施した。
単球が吸着したプレートは一夜培養後洗浄し、それぞれ種々の条件下に７日間培養し、分化後におけるマクロファージおよびＤＣの量を求めた。
培養はＲＰＭＩ−１６４０培地のみの培養、サイトカインとしてＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４の両者、ＩＬ−４およびＭ−ＣＳＦを添加した培地での培養とした。
その結果を下記表５に示した。
【００４９】
【表５】
2006262782.tif 000006
【００５０】
表中に示した結果からも判明するように、培養足場プレート上に単球が良好に吸着し、その上、サイトカインとしてＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４の両者あるいはＩＬ−４を添加することによりＤＣに効率良く分化していることが判明する。また、ＭＧ−ＣＳＦの添加ではマクロファージに分化していることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上記載したように、本発明によりこれまで効率的に大量に分化・培養ができなかったヒト樹状細胞（ＤＣ）を安定して大量に分化・培養することが可能となった。またあわせてマクロファージについても大量に分化・培養することが可能となった。
したがって、ＤＣを本発明方法により大量に培養することができることから、ＤＣを用いた免疫療法を効率的に行いうるものであり、ＨＩＶ−１感染患者、ＡＩＤＳ患者、癌患の治療に対して多大な光明を与えるものである。