(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト脊髄性筋萎縮症をはじめとする各種アポトーシス性疾患の発症メカニズムの解明、発症の危険性の診断、発症の予防もしくは病態の改善、治療のための医療技術及び薬剤の開発等に有用の遺伝子材料において、新規なアポトーシス抑制蛋白質と、この蛋白質をコードするｃＤＮＡを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるヒト・アポトーシス抑制蛋白質と、このヒト・アポトーシス抑制蛋白質をコードするヒト遺伝子のｃＤＮＡであって、特定の塩基配列からなるｃＤＮＡ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるヒト・アポトーシス抑制蛋白質。
【請求項２】
請求項１のヒト・アポトーシス抑制蛋白質をコードするヒト遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号４の塩基配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１のヒト・アポトーシス抑制蛋白質に対する抗体。
【請求項４】
請求項２のｃＤＮＡを保有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項２のｃＤＮＡには存在し、配列番号３の塩基配列からなるｃＤＮＡには存在しない一部配列からなるＤＮＡプローブ。
【請求項６】
請求項２のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するプライマーセットであって、一方のプライマーが、請求項２のｃＤＮＡには存在し、配列番号３の塩基配列からなるｃＤＮＡには存在しない一部配列にアニールするプライマーであるＰＣＲプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ヒト・アポトーシス抑制蛋白質とこの蛋白質をコードする遺伝子およびそのｃＤＮＡに関すものである。さらに詳しくは、この発明は、ヒト脊髄性筋萎縮症をはじめとする各種アポトーシス性疾患の発症メカニズムの解明、発症の危険性の診断、発症の予防もしくは病態の改善、治療のための医療技術および薬剤の開発等に有用な遺伝子材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、プログラムされた細胞死の一種であり、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮および核凝縮、核の断片化、膜被包性球状小体化、隣接するマクロファージもしくは上皮細胞などによる球状小体の貪食、またはエンドヌクレアーゼ活性によりＤＮＡのヌクレオソーム単位が180〜200塩基長のＤＮＡに断片化するといった現象が観察され、このような現象が認められるアポプティック体細胞の最終断片が隣接する細胞により貪食される機構として論じられている（例えば、Immunology Today 7:115-119, 1986；Science 245:301-305, 1989 ）。
【０００３】
このアポトーシスを制御する遺伝子としてしては、例えば、1985年に胞性Ｂ細胞腫から発見されたガン遺伝子のひとつであるbcl-2 遺伝子が知られている。このbcl-2 遺伝子は、免疫系や神経性の細胞で高頻度に発現しており、この遺伝子の発現産物はこれら細胞のアポトーシスを抑制することによって、ヒトの免疫機能や神経系機能の恒常性を維持していると考えられている。また、このbcl-2 遺伝子は、胎児では特に広範囲には発現していることから、個体発生の際の形態形成にも重要な役割を果たしていると考えられてもいる。
【０００４】
一方、この発明の発明者等は、家族性の遺伝病である脊髄性筋萎縮症候群（Spinal Mascular Atropy：ＳＭＡ）の原因遺伝子として、ヒト染色体５ｑ１３．１領域より神経細胞アポトーシス抑制蛋白質（Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein : ＮＡＩＰ）遺伝子を単離している（Roy et al., Cell 80: 167-178, 1995）。すなわち、このＮＡＩＰ遺伝子の変異またはコピー数の減少が脊髄ニューロンのアポトーシスを生じさせ、これがＳＭＡ発症の原因となると想定されている。また、このＮＡＩＰ遺伝子を種々の培養細胞に導入し、アポトーシスを誘起させる刺激を細胞に与えたところ、その細胞死が抑制されることが明らかにされ（Liston et al., Nature 379:349-353, 1996 ）、ＮＡＩＰが神経細胞だけではなく、体細胞全体のアポトーシス抑制因子であることが明らかにされた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この発明の発明者等は、上記のＮＡＩＰ遺伝子についてさらに解析を続けた結果、その完全ｃＤＮＡをクローニングすることに成功し、このｃＤＮＡにコードされている蛋白質を明らかにした。
【０００６】
この発明は、この発明者等によって見出されたＮＡＩＰ遺伝子の完全ｃＤＮＡとともに、このｃＤＮＡに関連する遺伝子材料、その発現産物等を産業上利用可能な形態として提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、配列番号２のアミノ酸配列からなるヒト・アポトーシス抑制蛋白質を提供する。
【０００８】
さらにこの発明は、上記のヒト・アポトーシス抑制蛋白質をコードするヒト遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号４の塩基配列からなるｃＤＮＡを提供する。
【０００９】
さらにまた、この発明は、上記のヒト・アポトーシス抑制蛋白質に対する抗体；上記のｃＤＮＡを保有する組換えベクター；上記のｃＤＮＡの一部配列からなるＤＮＡプローブおよびＰＣＲプライマーをそれぞれ提供する。
【００１０】
以下、発明の実施の形態を示し、この発明について詳しく説明する。
【発明の効果】
【００１１】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、新規なアポトーシス抑制蛋白質と、この蛋白質をコードする遺伝子およびそのｃＤＮＡが提供される。これによって、ヒト脊髄性筋萎縮症をはじめとする各種アポトーシス性疾患の発症メカニズムの解明、発症の危険性の診断、発症の予防もしくは病態の改善、治療のための医療技術および薬剤の開発等が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明のヒト・アポトーシス抑制蛋白質は、配列番号１または２のアミノ酸配列を含むヒト蛋白質であって、この蛋白質には、配列番号１または２のアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。さらに、この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質（例えば、蛍光蛋白質など）との融合蛋白質も含まれる。
【００１３】
この発明の蛋白質は、公知の方法によってヒトの臓器、細胞株などから単離することができる。また、ペプチドとして使用する場合には、この発明によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によって調製することもできる。あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮＡ断片を用いて組換えＤＮＡ技術によりインビトロで生産することにより取得することもできる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターによる形質転換体細胞（大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等）からこの発明の蛋白質を大量に発現させることができる。具体的には、例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡを挿入結合して発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。得られた融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって、ｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。
【００１４】
一方、この発明の蛋白質を動物細胞で分泌発現させる場合には、ｃＤＮＡ断片を、動物細胞用プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する動物細胞用発現ベクターに組換え、動物細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で発現させることができる。
【００１５】
この発明の遺伝子は、上記蛋白質をコードするヒトおよび他の哺乳動物の遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
【００１６】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号３または４の塩基配列を含むことを特徴とするものである。そして、配列番号３および４の塩基配列を有するｃＤＮＡは、各々、配列番号１および２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードしている。
【００１７】
なお、この発明の蛋白質は、いかなるヒト組織でも発現しているので、配列番号３あるいは配列番号４のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号３あるいは配列番号４において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明に含まれるものである。同様に、これらの変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１または２のアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の範疇に含まれるものである。
【００１８】
また、この発明のｃＤＮＡの部分配列は、配列番号３あるいは４の塩基配列中の10bp以上の連続配列であり、この連続配列からなるＤＮＡ断片（センス鎖およびアンチセンス鎖）もこの発明の範囲に含まれる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
【００１９】
さらに、この発明の抗体は、上記の蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００２０】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は、以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
実施例１：ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
配列番号５および６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＮＡＩＰ遺伝子のエクソン１６をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は、15秒間；94℃、30秒間；56℃、１分間；72℃とした。
【００２２】
次いで、このＰＣＲ産物を用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene  ＮＡ937227）をスクリーニングした。その結果、ＮＡＩＰ遺伝子にオーバーラップする８個のクローンが同定された。
【００２３】
配列解析の結果、８個のｃＤＮＡクローンは、３’側に同一のコード領域を有する７個のクローンと、これよりも短いＤＮＡ断片からなる１クローンとに分離された。さらに、ＤＮＡ断片の長さから、これらのｃＤＮＡクローンをコードする遺伝子は、既に報告されているＮＡＩＰ遺伝子よりも長いＤＮＡ分子であることが判明した。
【００２４】
以下、便宜的に、従来公知のＮＡＩＰ遺伝子を「ＮＡＩＰS」と記載し、今回スクリーニングされた長いｃＤＮＡをコードする遺伝子を「ＮＡＩＰL」、これより短い遺伝子を「ＮＡＩＰM」と記載する。
実施例２：ｃＤＮＡの配列決定
実施例１で同定したｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。１次プライマーとして配列番号７および８のオリゴヌクレオチドを用い、これらによって決定された配列を用いて更なるプライマーを順次に作成して、ウォーキング法によりｃＤＮＡの全配列を決定した。
【００２５】
その結果、ＮＡＩＰMおよびＮＡＩＰL は、これまでに知られていたＮＡＩＰS のエクソン１４とエクソン１５（図１上段）の間に、新たなエクソン(153bp)を有することが判明した（図１中断および下段）。また、ＮＡＩＰL は、ＮＡＩＰS およびＮＡＩＰM の3'側に、さらに１つのエクソンを有することも確認された。
【００２６】
すなわち、ＮＡＩＰSがエクソン１〜１６までを有するのに対し、この発明のＮＡＩＰMはエクソン１から１７までを、ＮＡＩＰLはエクソン１〜１８までを有していた。さらに詳しくは、ＮＡＩＰMは、新規なエクソン１５に加え、エクソン１７（ＮＡＩＰSのエクソン１６に相当）の３’側に39 bp を余分に含んでおり、そのｃＤＮＡは配列番号４に示した塩基配列を有し、このｃＤＮＡは配列番号２のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードしていた。一方、ＮＡＩＰLはエクソン１５に加え、363 bpからなるエクソン１８を含んでおり、そのｃＤＮＡは配列番号３に示した塩基配列を有し、このｃＤＮＡは配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードしていた。
【００２７】
以上の結果から、この発明のアポトーシス抑制遺伝子ＮＡＩＰMおよびＮＡＩＰLは、従来知られていた遺伝子ＮＡＩＰSとは明らかに異なる新規な遺伝子であり、これらがコードするアポトーシス抑制蛋白質も新規な蛋白質であることが確認された。
実施例３：大腸菌による蛋白質の発現
実施例１で単離したＮＡＩＰLを含むクローンを鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物を大腸菌用発現ベクターに挿入、インサートの塩基配列を確認した後、宿主大腸菌を形質転換した。この形質転換体をＬＢ培地中で37℃で５時間培養し、IPTGを最終濃度が0.4 mMになるように加え、さらに37℃で2.5時間培養した。菌体を遠心により分離し、溶解溶液に溶かし、一度−８０℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行った。この破砕溶液を遠心し、その上清より、定法に従って蛋白質を分離・精製し、この発明のアポトーシス抑制蛋白質（配列番号１）を得た。
（４）抗体作製
実施例３で得た蛋白質を抗原として家兔に常法により免疫を行い抗血清を得た。抗血清はまず、40％飽和硫安沈殿画分をGSTアフィニティーカラムによりGST抗体を除いた。素通り画分をさらにGST-HP10345の抗原カラムにより精製した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】従来公知のアポトーシス抑制遺伝子ＮＡＩＰS と、この発明の遺伝子ＮＡＩＰMおよびＮＡＩＰLのそれぞれの３’側構造を示した模式図である。
【図１】
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【配列表】
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