(57)【要約】【課題】生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られるcDNA量として３００コピー未満と、極微量な場合であっても、PCR法等により増幅可能な程度にまでcDNA量を増幅できる方法を提供すること。【解決手段】生物試料に含まれるmRNAから目的遺伝子を逆転写する方法。前記生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られるDNA量として３００コピー未満であり、生物試料を逆転写反応に供し、さらに以下の（１）および（２）を１回以上繰り返す。（１）得られた反応生成物を、反応生成物に含まれるmRNAが直鎖状になるように変性処理する、（２）直鎖状にしたmRNAを含む反応生成物を逆転写反応に供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料に含まれるmRNAから目的遺伝子を逆転写する方法であって、
生物試料を逆転写反応に供し、
さらに以下の（１）および（２）を１回以上繰り返す、上記方法。
（１）得られた反応生成物を、反応生成物に含まれるmRNAが直鎖状になるように変性処理する、
（２）直鎖状にしたmRNAを含む反応生成物を逆転写反応に供する。
【請求項２】
前記生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られ、かつ逆転写反応の後に行われる増幅反応に鋳型として用いられるcDNAの量として３００コピー未満である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
逆転写反応生成物の全量を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の全量に含まれるcDNA量が３００コピー未満である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
逆転写反応生成物の一部を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の前記一部に含まれるcDNA量が３００コピー未満である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られ、かつ逆転写反応の後に行われる増幅反応に鋳型として用いられるcDNAの量として５０コピー未満である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
逆転写反応生成物の全量を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の全量に含まれるcDNA量が５０コピー未満である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
逆転写反応生成物の一部を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の前記一部に含まれるcDNA量が５０コピー未満である請求項５に記載の方法。
【請求項８】
生物試料が１つの細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生物試料がリンパ球であり、目的遺伝子が特定の抗体遺伝子またはT細胞受容体遺伝子である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
生物試料が１つの受精卵、癌細胞、胚性幹細胞(ES細胞)、または神経細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（１）における反応生成物の変性処理を、反応生成物を９０〜９６℃の温度に１〜６０秒暴露することで行う、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
逆転写酵素が非耐熱性であり、（１）において直鎖状になるように変性処理したmRNAを含む反応生成物に、逆転写酵素を添加した後に（２）の逆転写反応を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（１）および（２）を２〜１０回繰り返す請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
逆転写酵素が耐熱性であり、（１）において直鎖状になるように変性処理したmRNAを含む反応生成物に、逆転写酵素を再度添加することなしに（２）の逆転写反応を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（１）および（２）を２〜３０回繰り返す請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法において、（１）および（２）を所定回数繰り返して得られた逆転写反応生成物に含まれる、一部または全部のcDNAを鋳型として増幅反応を行って目的遺伝子を増幅させる、目的遺伝子の調製方法。
【請求項１７】
増幅反応がＰＣＲである請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料に含まれるmRNAから目的遺伝子を逆転写する方法および目的遺伝子を増幅する方法に関する。特に、本発明は、生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られ、増幅反応に鋳型として用いられるcDNA量として３００コピー未満と、極微量な場合であっても、あるいは、生物試料が１つの細胞であって、そこに含まれる目的遺伝子についてのmRNAの数が１０未満の場合であっても、ＰＣＲ法等の増幅反応によって増幅可能な程度にまで逆転写生成物であるcDNA量を増大できる方法に関する。さらに、本発明は、この逆転写生成物を用いた目的遺伝子の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、目的とする遺伝子を増幅する方法としてRT-PCR法が用いられている。RT-PCR法では、細胞よりmRNAを抽出、精製を行い、逆転写反応の後に、得られたcDNAを鋳型としてPCRによる増幅が行われる。一方、本発明者らは、1個の細胞、具体的には1個のＢ細胞から、抗体遺伝子を増幅し、抗体を得る方法を構築している。しかしながら1個の細胞から目的とする遺伝子を増幅する場合には、1個の細胞に存在するmRNAの量が極めて微量であることから、mRNAの抽出、精製を行うことが極めて困難である。そのため、細胞よりmRNAを抽出、精製することなしに、逆転写反応液中に1個の細胞を入れて直接、逆転写反応を行い、PCR法の鋳型を作製していた。しかし、１回の逆転写反応で得られるcDNA量は極微量であり、その後のPCRによって、目的とする抗体遺伝子のDNA断片を増幅させにくいか、または、増幅できないことがあった。
【０００３】
PCRにおいては、鋳型となるDNA量が、一定量以下になると、所望のDNA断片が増幅できないか、あるいは、増幅できても、複製の精度（正確性）が低下することが知られている。1個のＢ細胞から逆転写反応で得られる目的遺伝子である抗体のcDNA量は、多くの場合数コピー以下であり、通常のPCRによっては、良好な正確性および再現性の下に、目的とする抗体遺伝子を増幅することは、事実上、困難であった。
【０００４】
本発明者らによる検討によれば、PCRに用いる鋳型DNAのコピー数が、３００コピー未満の場合、目的とする遺伝子のDNA断片を、良好な正確性および再現性を満足しつつ、PCRによって増幅することは困難な場合があった。そして、鋳型DNAのコピー数が少なければ少ない程、この傾向は強くなり、５０コピー未満になると正確性および再現性は大きく低下し、１０コピー未満になると、事実上、目的とする遺伝子のDNA断片を増幅できない場合もあった。
【０００５】
これに対して、mRNAを増幅する方法として、EberwineらがT7-プロモーターを含むプライマーを用いてcDNAを合成し、T7 RNA ポリメラーゼを用いてRNAを合成する方法を確立している(非特許文献１)。
【非特許文献１】J. Eberwine, H Yeh, K Miyashiro, Y Cao, S Nair, R Finnell, M Zettel and P Coleman, Analysis of gene expression in single live neurons, Proc Natl Acad Sci USA, 89: 3010-3014, 1992.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この方法では、cDNAを合成する段階でT7 RNA ポリメラーゼが結合するプロモータの配列を含むoligo-dTプライマーを用いて一本鎖のcDNAを合成し、E. coli RNase H、E. coli DNA ポリメラーゼ Iを用いて二本鎖cDNAを合成する。その後にT7 RNAポリメラーゼを用いてRNAを増幅させるものである。増幅させたRNAを鋳型としてcDNAを合成することにより大量のcDNAを合成することが可能である。しかし、この方法では二本鎖のcDNAを合成する必要があることから反応のステップが多段階に渡り、複数あるどこかのステップが１つでもうまくいかない場合、その結果として大量のcDNAを合成する事ができない難しい方法であった。
【０００７】
また、この方法を１個の細胞を用いて行う際には、そこから得られるmRNA量が非常に僅かであるため、その反応系自体を構築し確実に行わせることが難しいという問題もあった。さらにこの方法は、二本鎖cDNAを合成する過程で、5'端が削れてしまうために完全長のcDNAを得ることが不可能であるという問題もあった。
【０００８】
もしも、１個の細胞から得られたmRNA量を確実に増やすことができればPCR法等の鋳型であるcDNAの合成量を増やすことにつながり、PCR法等による増幅が安定化すると期待される。またmRNA量を増やさなくてもcDNAの合成量を増やすことができれば、同様にPCR法等による増幅が安定化する、即ち、正確性と再現性が向上すると期待される。
【０００９】
そこで本発明の目的は、生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られるcDNA量として３００コピー未満と、極微量な場合であっても、PCR法等により増幅可能な程度にまで逆転写生成物であるcDNA量を増大できる方法を提供することにある。
【００１０】
さらに本発明の目的は、1個のＢ細胞から目的とする抗体遺伝子を、高い正確性と再現性の下で増幅し得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決する本発明は、以下のとおりである。
[請求項１］生物試料に含まれるmRNAから目的遺伝子を逆転写する方法であって、
生物試料を逆転写反応に供し、
さらに以下の（１）および（２）を１回以上繰り返す、上記方法。
（１）得られた反応生成物を、反応生成物に含まれるmRNAが直鎖状になるように変性処理する、
（２）直鎖状にしたmRNAを含む反応生成物を逆転写反応に供する。
[請求項２]前記生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られ、かつ逆転写反応の後に行われる増幅反応に鋳型として用いられるcDNAの量として３００コピー未満である請求項１に記載の方法。
[請求項３]逆転写反応生成物の全量を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の全量に含まれるcDNA量が３００コピー未満である請求項２に記載の方法。
[請求項４]逆転写反応生成物の一部を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の前記一部に含まれるcDNA量が３００コピー未満である請求項２に記載の方法。
[請求項５]前記生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られ、かつ逆転写反応の後に行われる増幅反応に鋳型として用いられるcDNAの量として５０コピー未満である請求項１に記載の方法。
[請求項６]逆転写反応生成物の全量を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の全量に含まれるcDNA量が５０コピー未満である請求項５に記載の方法。
[請求項７]逆転写反応生成物の一部を増幅反応の鋳型に用いる場合であって、逆転写反応生成物の前記一部に含まれるcDNA量が５０コピー未満である請求項５に記載の方法。
[請求項８]生物試料が１つの細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
[請求項９]生物試料がリンパ球であり、目的遺伝子が特定の抗体遺伝子またはT細胞受容体遺伝子である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１０]生物試料が１つの受精卵、癌細胞、胚性幹細胞(ES細胞)、 または神経細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１１]（１）における反応生成物の変性処理を、反応生成物を９０〜９６℃の温度に１〜６０秒暴露することで行う、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１２]逆転写酵素が非耐熱性であり、（１）において直鎖状になるように変性処理したmRNAを含む反応生成物に、逆転写酵素を添加した後に（２）の逆転写反応を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１３]（１）および（２）を２〜１０回繰り返す請求項１２に記載の方法。
[請求項１４]逆転写酵素が耐熱性であり、（１）において直鎖状になるように変性処理したmRNAを含む反応生成物に、逆転写酵素を再度添加することなしに（２）の逆転写反応を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
[請求項１５]（１）および（２）を２〜３０回繰り返す請求項１４に記載の方法。
[請求項１６]請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法において、（１）および（２）を所定回数繰り返して得られた逆転写反応生成物に含まれる、一部または全部のcDNAを鋳型として増幅反応を行って目的遺伝子を増幅させる、目的遺伝子の調製方法。
[請求項１７]増幅反応がＰＣＲである請求項１６に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
微量のmRNAからスタートする場合、従来の方法では、二本鎖のcDNAを合成する必要があったが、本発明による方法では、一本鎖のcDNAを逆転写合成し、二本鎖のcDNAを合成する必要がない。そのため、従来の方法に比べて、反応ステップが簡単になっているという利点がある。さらに従来の方法では、完全長cDNAを得ることができなかったが、本発明の方法によれば、完全長cDNAを得ることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、生物試料に含まれるmRNAから目的遺伝子を逆転写する方法である。
本発明において、生物試料は、特に制限されない。しかし、本発明の方法は、特に、生物試料に含まれる目的遺伝子の量が、１回の逆転写反応で得られ、かつ逆転写反応の後に行われる増幅反応に鋳型として用いられるcDNAの量として３００コピー未満である場合に有用であり、５０コピー未満である場合にさらに有用であり、１０コピー未満である場合、特に有用である。増幅反応に鋳型として用いられるcDNAは、逆転写反応生成物の全量である場合と、逆転写反応生成物の一部である場合とがある。逆転写反応生成物の全量を、増幅反応の鋳型として用いる場合には、逆転写反応生成物の全量に含まれるcDNA量が３００コピー未満である場合に、本発明の方法は有用である。一方、逆転写反応生成物の一部を、増幅反応の鋳型として用いる場合には、逆転写反応生成物の一部（鋳型として用いられる部分）に含まれるcDNA量が３００コピー未満である場合に、本発明の方法は有用である。
【００１４】
増幅反応の鋳型として用いられるDNA量が３００コピー未満になると、このDNAを鋳型としてPCRを行う場合、正確性と再現性良く、目的とするDNA断片を増幅することが困難になり、コピー数が少なくなればなる程、目的とするDNA断片が増幅しにくくなる。それに対して、本発明の方法は、１回の逆転写反応で得られ、かつ逆転写反応の後に行われる増幅反応の鋳型として用いられるcDNA量が３００コピー未満であっても、さらには５０コピー未満であっても、特に、１０コピー未満であっても、その後のPCR法等により増幅可能な程度にまで逆転写生成物である目的cDNA量を増大できる。従って、生物試料に含まれる遺伝子量が極微量である、例えば、生物試料が１つの細胞である場合や、生物試料が１つのリンパ球、受精卵、癌細胞、胚性幹細胞(ES細胞) または神経細胞である場合に、本発明は好適である。
【００１５】
生物試料とそこに含まれる目的遺伝子の例としては、例えば、生物試料がリンパ球の場合、目的遺伝子の例としては、抗体遺伝子及びＴ細胞受容体遺伝子を挙げることができる。生物試料が癌細胞の場合、目的遺伝子の例としては、癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子を挙げることができる。生物試料が受精卵の場合、目的遺伝子の例としては、分化、発生に関わる遺伝子を挙げることができる。生物試料が神経細胞の場合、目的遺伝子の例としては、分化、受容体、回路、シナプスに関わる遺伝子を挙げることができる。生物試料が胚性幹細胞(ES細胞)の場合、目的遺伝子の例としては、胚性幹細胞に含まれる全ての遺伝子を挙げることができる。
【００１６】
本発明の方法においては、まず、生物試料を逆転写反応に供する(図1参照)。この逆転写反応は常法によって行うことができる。具体的には、逆転写酵素として例えば、SuperScriptIII(SuperScriptIII RNaseH- 逆転写酵素、Invitrogen)を用いることができる。逆転写酵素として、SuperScriptIIIを用いるときの反応条件の典型例を以下に示す。以下の例は、細胞から抽出したRNAを逆転写反応に使用する例である。本発明では、細胞から抽出したRNAではなく、細胞自体そのまま逆転写反応に使用することもでき、この場合の例は、後述する実施例に示す。
【００１７】
total RNA                       0.5μl
oligo-dT (50pmol/μl)           0.5μl
5x 1st strand Buffer              3μl
2.5mM dNTP                      1.5μl
2.5% NP40                       1.5μl
1mg/ml BSA                      1.5μl
0.1M DTT                        1.5μl
RNaseOUT (40Unit/μl)         0.225μl
SuperScriptIII (200Unit/μl)  0.225μl
DEPC-H2O                       4.55μl          
total                            15μl
【００１８】
GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)を用い55℃で1hr保温することで逆転写反応を行うことができる。
【００１９】
細胞をそのまま用いる場合は、total RNAを細胞に代える。上記「total RNA 0.5μl 」に含まれるRNAのコピー数は、RNAの抽出に用いた細胞の量や1個の細胞に含まれる目的遺伝子のRNAのコピー数によって変化する。例えば、上記「total RNA」に含まれるRNA量が約2.5x103cell相当量であり、かつ目的遺伝子がアクチンである場合、1個の細胞に含まれるアクチンRNA量は、通常は10個未満であることから、１回の逆転写反応で得られるアクチンDNA量は、2.5x104コピー未満である。そして、2.5x104コピーのDNAを含む逆転写反応生成物の50分の1を増幅用の鋳型に用いると、RNAのコピー数は、５００コピーの量になる。さらに、本発明者らのリアルタイムPCRによる計測によれば、1個の細胞に含まれるアクチンRNA量は4〜7個であったので、１回の逆転写反応で得られるアクチンDNA量は、実際には1〜1.75x104コピーであり、この1〜1.75x104コピーのDNAを含む逆転写反応生成物の50分の1を増幅用の鋳型に用いると、RNAのコピー数は、200〜350コピーの範囲の量になる。
【００２０】
また、total RNAとは、細胞から抽出されたRNAである。RNA源として、細胞から抽出されたRNAを用いる場合は、上記NP40の添加は不要である。それに対して、細胞そのまま使用する場合には、上記のようにNP40の添加が必要である。細胞1個をtotal RNAの代りに用いることもできる。
【００２１】
oligo-dT の使用量は、数回の逆転写反応を行うのに充分な量等を考慮して決定され、例えば、50pmol/μlの溶液を用意し、これを適当量(上記プロトコルでは0.5μl)、添加することができる。通常の逆転写反応を行う場合、SuperScriptIIIの添付説明書では50μMのoligo-dT20を1μl加える、即ち50pmol加える、と書かれている。しかし、この時のRNA量は、本発明におけるRNA量、例えば、2.5x103細胞のRNA量より遙かに多い量を想定している。そこで、本発明では、それよりも少ない、例えば、oligo-dT 25pmolであっても、数回の逆転写反応に充分すぎる量である。
【００２２】
5x 1st strand Buffer(Invitrogen)は、250mMTris-HCl(pH8.3)、375mM KCl、15mM MgCl2を含むバッファーである。5x 1st strand Buffer以外に、市販の逆転写酵素用のバッファーも適宜利用できる。
【００２３】
dNTP量は、逆転写酵素に添付されている説明書の記載等を考慮して、適宜決定できる。例えば、0.2〜0.5mMの範囲とすることができる。具体的には、2.5mM dNTPの溶液を用意し、これを適当量(上記プロトコルでは1.5μl)添加して、濃度調整することができる。
【００２４】
NP40は、界面活性剤であり、細胞を溶解させてRNAを抽出することを目的として添加する。NP40量は、細胞を溶解してRNAを抽出できる量であること等を考慮して、適宜決定できる。例えば、0.1〜1%の範囲とすることができる。具体的には、2.5% NP40の溶液を用意し、これを適当量(上記プロトコルでは1.5μl)、添加することができる。
【００２５】
BSAは、酵素の安定化を目的として添加する。BSA量は酵素が安定化できる量等を考慮して、適宜決定でき、一般には、0.1mg/ml程度で、酵素を安定化できる。従って、例えば、1mg/ml BSAの溶液を用意し、これを適当量(上記プロトコルでは1.5μl)、添加することができる。
【００２６】
DTT(ジチオスレイトール) は、逆転写酵素とRNase阻害剤の安定化を目的として添加する。DTT量は逆転写酵素に添付されている説明書の記載等を考慮して、適宜決定できる。ジチオスレイトールは抗酸化剤で、酵素やその他のスルフヒドリル基を含むタンパク質の安定化に用いられる。DTTが存在しないと、逆転写酵素やRNase阻害剤(RNaseOUTなど)の活性が著しく落ちる。本発明では、10mM前後を添加することが好ましい。例えば、0.1M DTT の溶液を用意し、これを適当量(上記プロトコルでは1.5μl)、添加することができる。
【００２７】
RNaseOUT(Invitrogen)は、RNaseの働きを抑え、RNAが分解するのを防ぐことを目的として添加する。RNaseOUT量は添付の説明書の記載等を考慮して、適宜決定できる。RNaseOUTを加えるのは、どの試薬にもRNaseが含まれている可能性が僅かでもあり、また、細胞の中にもRNaseが含まれているからである。細胞をNP40で溶解させた場合、結果的に反応溶液にRNaseが混入するため、それらRNaseの働きを抑えるために加える。例えば、RNaseOUT (40Unit/μl)の溶液を用意し、これを適当量(上記プロトコルでは0.225μl)、添加することができる。
【００２８】
SuperScriptIII量は、添付の説明書の記載等を考慮して、適宜決定できる。例えば、SuperScriptIII (200Unit/μl)の溶液を用意し、これを適当量(上記プロトコルでは0.225μl)、添加することができる。
【００２９】
最後に、DEPC (Dietyl Pyrocarbonate)-H2O [RNaseの分解処理を行ったH20]を適当量加える。DEPC-H2O の添加量は、反応液の全体量等を考慮して、適宜決定できる。
【００３０】
逆転写酵素としてSuperScriptIII以外に、例えば、以下に示すものを用いることもできる。尚、SuperScriptIII以外の逆転写酵素を用いる場合の反応条件は、上記SuperScriptIIIについての反応条件で説明したものと、ほぼ同様であり、各逆転写酵素についての説明書を併せて参照することが出来る。
【００３１】
【表１】
2006262751.tif 000003
【００３２】
SuperScriptIII、SuperScriptII、及びTth DNA Polymeraseの3種類の中での逆転写活性を比べると、SuperScriptIII > SuperScriptII >> Tth DNA Polymeraseのようである。
【００３３】
さらに本発明においては、以下の（１）および（２）を１回以上繰り返す(図1参照)。（１）および（２）は、好ましくは２〜４回繰り返す。これにより、トータルで３〜５回の逆転写反応が行われることになり、mRNAから合成されるcDNA量は通常の１回しか逆転写反応が行われない場合に比べて格段に増大する。
（１）得られた反応生成物を、反応生成物に含まれるmRNAが直鎖状になるように変性処理する、
（２）直鎖状にしたmRNAを含む反応生成物を逆転写反応に供する。
【００３４】
（１）における反応生成物の変性処理は、mRNAとcDNAとの複合体を完全に解離するに十分な条件で行う。そのような条件は、例えば、温度が９０℃以上、具体的には、例えば、９０〜９６℃であり、時間は、１〜６０秒、より好ましくは５〜３０秒の範囲である。変性処理後、反応生成物は、氷冷等により急冷することが好ましい。氷冷等により、次の逆転写反応に適した温度付近に急速に制御する。
（２）においては、（１）で直鎖状にしたmRNAを含む反応生成物を逆転写反応に供する。この逆転写反応は、直鎖状にしたmRNAを含む反応生成物に、逆転写酵素を添加した後に行う。具体的には、逆転写酵素として、上記と同様に、例えば、SuperScriptIIIを用いることができ、逆転写酵素としてSuperScriptIIIを用いる場合、反応は上記と同様に行うことができる。また、逆転写酵素としてSuperScriptIII以外に前述した逆転写酵素を用いることもできる。
【００３５】
本発明の方法は、生物試料の逆転写反応に、耐熱性の逆転写酵素を用いて行うこともできる。熱安定性の逆転写酵素を用いることで、変性処理の後に、逆転写酵素を再度添加せずに、上記(1)および(2)を繰り返し行うことができる。その結果、cDNAの逆転写合成を自動化することができる。
【００３６】
本発明の方法により、逆転写合成されたcDNAは、次いで、これを鋳型として、さらにDNAの増幅を行うことができる。DNAの増幅としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop mediated isothermal amplification）法、ICAN（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）法、TMA（Transcription mediated amplification）法、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）法、LCR（Ligase chain reaction）法、あるいはNASBA（Nucleic acid sequence-based amplification）法などを挙げることができる。
【００３７】
本発明の方法においては、上記（１）および（２）の工程を、１回以上、好ましくは２〜４回繰り返す。これにより、トータルで２〜５回の逆転写反応が行われることになり、mRNAから合成されるcDNA量は通常の１回しか逆転写反応が行われない場合に比べて格段に増大する。その結果、１回の逆転写反応で得られたcDNAを鋳型とする場合に、正確性と再現性が良好でない場合であっても、２〜５回の逆転写反応で得られたcDNAを鋳型とすることで、その後のDNAの増幅方法における、正確性（増幅されるDNAの配列の正確性）と再現性（増幅されたり、されなかったりという再現性）が、格段に改善される。
【００３８】
より具体的には、DNAの増幅法がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である場合、PCRの変性と増幅の繰り返しを30回行う、典型的な操作条件の場合、増幅対象である目的遺伝子(鋳型)の量がcDNA量として３００コピー未満の場合、PCR法によって増幅できない場合があり、増幅できても安定性(再現性)が不良な場合がある。この傾向は、上記cDNA量のコピー数が減少する程顕著になり、５０コピー未満になると正確性および再現性は大きく低下し、１０コピー未満になると、事実上、目的とする遺伝子のDNA断片を増幅できない場合もあった。
【００３９】
それに対して、本発明の方法で、逆転写反応を繰り返し行うことで、cDNA量を増大させ、それにより、PCR法によるDNA断片の増幅の正確性および再現性を大幅に向上させることができる。さらに、目的とするDNA断片を増幅することが1回の逆転写反応で得られるcDNA量では不可能である場合でも、逆転写反応を繰り返し行うことで、目的とする遺伝子のDNA断片を増幅することが可能になる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
マウス脾細胞に含まれるアクチンを例に、本発明の方法を実施した。マウス脾細胞数を270個、90個または30個として以下の条件で逆転写反応を行った。
【００４１】
マウス脾細胞
oligo-dT (50pmol/μl)           0.5 μl
5x 1st strand Buffer              3 μl     (Invitrogen)
2.5mM dNTP                      1.5 μl
2.5% NP40                       1.5 μl
1mg/ml BSA                      1.5 μl
0.1M DTT                        1.5 μl
RNaseOUT (40Unit/μl)         0.225 μl     (Invitrogen)
SuperScriptIII (200Unit/μl)  0.225 μl     (Invitrogen)
DEPC-H2O                                                
total                            15 μl
【００４２】
GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)を用いて反応を行った。
逆転写反応(1回目)
55℃で1hr       (逆転写反応1回はここで終わり)
94℃で20sec     1本鎖にする。
on ice          急冷
RNaseOUT        0.225 μl
SuperScriptIII  0.225 μlを加える。
【００４３】
逆転写反応(2回目)
55℃で1hr
94℃で20sec     1本鎖にする
on ice          急冷
RNaseOUT        0.225 μl
SuperScriptIII  0.225 μlを加える。
【００４４】
逆転写反応(3回目)
55℃で1hr
94℃で20sec     1本鎖にする。
on ice          急冷
RNaseOUT        0.225 μl
SuperScriptIII  0.225 μlを加える。
【００４５】
逆転写反応(4回目)
55℃で1hr
【００４６】
1〜16のテンプレートをそれぞれ1.5μlずつ用い、アクチンのプライマーでPCRによる増幅を行った。
【００４７】
テンプレート                    1.5 μl
10x ExTaq Buffer                1.5 μl (TaKaRa)
2.5mM dNTP                      1.2 μl
mBeta-actin F (10pmol/μl)     0.45 μl
(5'- TCCACACCCGCCACCAGTTC - 3' (配列番号1))
mBeta-actin R (10pmol/μl)     0.45 μl
(5'- ATCTGGGTCATCTTTTCACG - 3' (配列番号2))
ExTaq (5Unit/μl) 0.075μl      (TaKaRa)
dH20                           9.325 μl                
total                   15μl
【００４８】
PCRの反応は
94℃で3minの後、
94℃で15sec、60℃で15sec、72℃で1min30secを30cycle
72℃、2min
で行った。
【００４９】
電気泳動の結果を図２に示す。さらに、チューブ番号とマウス脾細胞の数および逆転写反応の回数の関係は次の通りである。また、リアルタイムPCRより目的遺伝子であるアクチンのコピー数を求めた。その結果、逆転写反応に用いた細胞数が270個の場合、上記1.5μlに含まれるアクチンのコピー数は、270未満と算出された。また複数回の逆転写反応を行った場合における目的遺伝子であるアクチンのコピー数は求めなかった。その代わりに４回目にサンプリングしたサンプルにおける目的遺伝子であるアクチンのコピー数は、逆転写反応１回のコピー数に逆転写の回数をかけた数値をコピー数として表２に示す。
【００５０】
【表２】
2006262751.tif 000004
【００５１】
図2に示すように、同じ細胞数でも逆転写反応を4回行った方が、増幅産物が多く認められた。即ち、チューブ番号1〜3と9〜11の泳動写真を対比すると、バンド強度は明らかに、9〜11で強くなり、1〜3では、3のバンドが見えないのに対して、9〜11では3つともバンドが明瞭であり、増幅の再現性および安定性が向上していることが分かる。即ち、PCRの鋳型量として300未満のコピー数では、PCR産物が安定して得られないのに対して、逆転写を2回以上(実施例では4回)繰り返すことで、PCR産物が安定して得られるようになることが分かる。
【００５２】
さらに、チューブ番号4〜6と12〜14の泳動写真を対比すると、4〜6では非常に薄いバンドしか観察されないが、12〜14では明らかにバンド強度は増していた。チューブ番号7,8と15,16の泳動写真を対比すると、7,8では増幅産物は認められないが、逆転写反応を4回行った15,16では増幅産物が認められるようになった。即ち、増幅産物自体が認められないような状態であっても、逆転写を2回以上(実施例では4回)繰り返すことで、PCR産物が認められるようになることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の方法は、診断、創薬に応用できると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の方法の説明図。
【図２】実施例1の結果(PCR産物を泳動した結果)を示す。
【図１】
2006262751.tif 000005
【図２】
2006262751.tif 000006
【配列表】
2006262751000001.app