(57)【要約】【課題】  早期に大量の幹細胞を得ることを可能とするとともに、培養された細胞の移植後における免疫的な障害の発生を防止する。【解決手段】  患者から採取した幹細胞を含む細胞を、胎盤もしくは臍帯から得られる胎盤等由来細胞と混合して培養する細胞培養方法を提供する。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した幹細胞を含む細胞を、胎盤もしくは臍帯から得られる胎盤等由来細胞と混合して培養する細胞培養方法。
【請求項２】
前記胎盤等由来細胞が、臍帯血から赤血球を除去したものである請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
放射線を用いて増殖能を失わせる処理を胎盤等由来細胞に施した後に、幹細胞を含む細胞と混合する請求項１または請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
胎盤等由来細胞を培養容器に播いた後に、培養容器上に播かれた胎盤等由来細胞上に、幹細胞を含む細胞を播いて培養する細胞培養方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞培養方法により、幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを混合して所定の培地内において一次培養した後に、生体組織補填材と混合して二次培養する生体組織補填体の製造方法。
【請求項６】
胎盤等由来細胞および幹細胞を含む細胞を別々に所定の培地内において一次培養した後に、請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞培養方法により、一次培養された胎盤等由来細胞と幹細胞を含む細胞とを混合し、さらに生体組織補填材を混合して二次培養する生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞培養方法および生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを吸収し、骨芽細胞が新しい骨を形成するいわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。この場合において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるには、例えば、デキサメタゾンのような分化誘導因子が有効であることが知られている。したがって、このような分化誘導因子とともに培養されることにより、骨芽細胞が骨補填材を足場にして増殖した状態の培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
また、間葉系幹細胞の増殖を促進するために、幹細胞を含む細胞とヒト繊維芽細胞とを混合して培養することが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。この方法によれば、ヒト繊維芽細胞の分泌するサイトカインとマトリクス等の因子の相互作用により、幹細胞の増殖を促進することができるという利点がある。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【特許文献１】特開２００４−７３１９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ヒト繊維芽細胞は、入手が容易ではないとともに、他家細胞を用いた場合に、移植後に生ずる感染症や、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ：graft versus host
disease）等の免疫的な拒絶反応による障害が発生する可能性がある。
【０００６】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、早期に大量の幹細胞を得ることを可能とするとともに、培養された細胞の移植後における免疫的な障害の発生を防止することができる細胞培養方法および生体組織補填体の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、患者から採取した幹細胞を含む細胞を、胎盤等由来細胞と混合して培養する細胞培養方法を提供する。
ここで、胎盤等由来細胞とは、母体と胎児とを結ぶ臍帯や胎盤、あるいはこれらに含まれる臍帯血等の血液に含まれる細胞である。胎盤等由来細胞は、様々なサイトカイン（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＦＣ）等を分泌するので、幹細胞とこれらの因子とを相互作用させることにより、幹細胞の増殖を促進することが可能となる。そこで、幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを混合して培養することにより、胎盤等由来細胞をフィーダ細胞として利用し、患者から採取した幹細胞を含む細胞の増殖能力を高めることができる。
【０００８】
また、臍帯血には、骨髄よりも多量の造血幹細胞が含まれていることが知られている。さらに、臍帯血中の細胞は胎児（もしくは新生児）所以に免疫機能が未熟である。したがって、この免疫機能の未熟さも手伝って、幹細胞を含む細胞と共培養された胎盤等由来細胞自体を移植物に含めても、免疫拒絶反応の可能性が低いという利点がある。
【０００９】
上記発明においては、前記胎盤等由来細胞が、臍帯血から赤血球を除去したものであることが好ましい。
赤血球は幹細胞の接着を阻害する要因となるため、臍帯血から除去しておくことにより、共培養される幹細胞の接着を早め、早期に増殖を開始させることができる。さらには、赤血球が残存することにより生じるＧＶＨＤの発生リスクを低減する効果もある。
【００１０】
また、上記発明においては、放射線を用いて増殖能を失わせる処理を胎盤等由来細胞に施した後に、幹細胞を含む細胞と混合することとしてもよい。
胎盤等由来細胞は、増殖能力が高く、共培養される幹細胞よりも早期に増殖する可能性がある。そこで、放射線を用いて増殖能を失わせる処理を胎盤等由来細胞に施すことにより、胎盤等由来細胞の分泌するサイトカインやマトリクスのみを利用して目的細胞である幹細胞の増殖のみを促進することが可能となる。また、免疫拒絶反応のリスクをより低減することも可能となる。
【００１１】
また、本発明は、胎盤等由来細胞を培養容器に播いた後に、培養容器上に播かれた胎盤等由来細胞上に、幹細胞を含む細胞を播いて培養する細胞培養方法を提供する。
この発明によれば、最初に培養容器内に播かれた胎盤等由来細胞の作用により、幹細胞の培養容器底面への接着効率を向上することが可能となる。その結果、培養の開始時に即座に増殖可能な幹細胞の数を増やし、培養効率を向上することができる。
【００１２】
また、本発明は、上記細胞培養方法により、幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを混合して所定の培地内において一次培養した後に、生体組織補填材と混合して二次培養する生体組織補填体の製造方法を提供する。
この製造方法によれば、一次培養において幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを共培養することにより、幹細胞を含む細胞を十分に増殖させておき、二次培養において生体組織補填材と混合することにより、生体組織補填材を足場として幹細胞を成長させた生体組織補填体を早期に製造することができる。
【００１３】
また、本発明は、胎盤等由来細胞および幹細胞を含む細胞を別々に所定の培地内において一次培養した後に、上記細胞培養方法により、一次培養された胎盤等由来細胞と幹細胞を含む細胞とを混合し、さらに生体組織補填材を混合して二次培養する生体組織補填体の製造方法を提供する。
この製造方法によれば、幹細胞自体をある程度増殖させた後に胎盤等由来細胞と混合することによって、生体組織補填材上における幹細胞の増殖能力を高めて、早期に生体組織補填体を製造することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る細胞培養方法によれば、早期に大量の幹細胞を得ることができる。また、上記生体組織補填体の製造方法によれば、移植後における免疫拒絶等の免疫的な障害の発生を防止可能な生体組織補填体を製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る細胞培養方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養方法は、幹細胞を含む細胞と、胎盤等由来細胞とを混合して培養する培養方法である。具体的には、本実施形態に係る細胞培養方法は、培養容器内に、幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを投入して、所定の培養条件により培養するものである。幹細胞を含む細胞としては、例えば、骨髄細胞を用いる。胎盤等由来細胞としては、例えば、臍帯血に含まれる細胞（以下、臍帯血内細胞という。）を用いる。
【００１６】
所定の培養条件は、培地として、所定の培地、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential
Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）および抗生物質を適当な比率で混合することにより構成された培地内を用いること、および、例えば、３７±０．５℃およびＣＯ２濃度５％に設定したインキュベータ内で約１０日間にわたって培養することである。培養途中においては、培地内の養分を補充し、細胞からの老廃物を除去するために、定期的に培地を交換する。
【００１７】
この培養方法によれば、所定の培地内において骨髄細胞と臍帯血内細胞とが共培養される。骨髄細胞に含まれる間葉系幹細胞は、培地から栄養分を受け取り、培養容器の底面に接着して成長する。このとき、共培養されている臍帯血内細胞からは、様々なサイトカイン（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＦＣ）などの成長因子が分泌され続けるので、これらの成長因子の相互作用により、共培養されている間葉系幹細胞が効率的に増殖させられることになる。
【００１８】
すなわち、本実施形態に係る細胞培養方法によれば、共培養される臍帯血内細胞をフィーダ細胞として利用することにより、間葉系幹細胞が効率的に増殖させられ、移植に必要な細胞数の間葉系幹細胞を培養開始後、早期に得ることができる。したがって、培養期間を短縮して患者にかかる負担を軽減することができるという効果がある。
【００１９】
また、臍帯血内細胞は、その免疫機能が未熟であるという特徴がある。したがって、この臍帯血内細胞と間葉系幹細胞とを共培養して、間葉系幹細胞を増殖させた場合に、患者の生体組織欠損部に補填される間葉系幹細胞に臍帯血内細胞が混入することになるが、臍帯血内細胞による免疫拒絶反応の発生の可能性は極めて低く、感染症やＧＶＨＤ等の発生を抑制することができるという利点がある。言い換えると、共培養後に間葉系幹細胞から臍帯血内細胞を分離する必要がなく、簡易であるという利点がある。また、免疫拒絶の可能性が低いので、自家細胞のみならず他家細胞を採用することが可能となり、入手容易性を向上することができるという利点もある。
【００２０】
なお、本実施形態においては、幹細胞を含む細胞として、骨髄細胞を用いたが、これに代えて、骨髄細胞を遠心分離することにより、赤血球を除去したものを用いることにしてもよい。また、胎盤等由来細胞として臍帯血を用いたが、これに代えて、臍帯血を遠心分離することにより、臍帯血から赤血球を除去したものを胎盤等由来細胞として採用してもよい。
【００２１】
このようにすることで、培養目的細胞である間葉系幹細胞、および、これと共培養される胎盤等由来細胞から赤血球が除去されていることになるので、間葉系幹細胞が培養容器に接着し易く、より効果的に間葉系幹細胞を増殖させることができる。
また、胎盤等由来細胞として臍帯血に含まれる細胞を採用したが、これに代えて、胎盤や臍帯自体に含まれる細胞を採用してもよい。
【００２２】
また、胎盤等由来細胞は、上述したように免疫機能が未熟であり、移植されても免疫拒絶等の障害を発生する可能性が低いが、その一方で、それ自体の増殖能力が高いために、間葉系幹細胞と共培養された場合に、間葉系幹細胞から分泌される成長因子によって本来培養すべき間葉系幹細胞ではなく、胎盤等由来細胞が早期に増殖してしまうことが考えられる。そこで、胎盤等由来細胞の増殖能を抑制するために、例えば、１５〜５０Ｇｙ程度のγ線を照射した後に、間葉系幹細胞と混合して共培養することが好ましい。
【００２３】
また、培養容器内に幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを同時に投入して混合する方法に代えて、まず、胎盤等由来細胞を培養容器内に播いた後に、その胎盤等由来細胞の上から幹細胞を含む細胞を播くことにすれば効果的である。すなわち、胎盤等由来細胞は培養容器底面への幹細胞の接着を促進する作用を有する。幹細胞は、培養容器の底面に接着して所定のコロニーを形成しながら増殖するため、培養される際には早期に培養容器の底面に接着させておく必要がある。
【００２４】
現在、１ｍｌの骨髄液中に２８００個の幹細胞が存在すると考えられているが、骨髄液をそのまま培地内に投入するだけでは、培養容器の底面に接着する細胞数は非常に少なかった。そこで、このように最初に胎盤等由来細胞を培養容器内に播いておくことにより、培養の開始時から早期に培養器の底面に接着する幹細胞の細胞数を大幅に増加させることができ、結果として、必要細胞数まで増殖させるための培養期間を大幅に短縮することができるという効果がある。
【００２５】
また、本発明によれば、上記細胞培養方法により培養された幹細胞を用いて生体組織補填体を製造する生体組織補填体の製造方法が提供される。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを混合して所定の培地内において一次培養した後に、生体組織補填材と混合して二次培養するものである。生体組織補填材としては、例えば、βリン酸三カルシウム多孔体、βリン酸三カルシウムとポリ乳酸との混合体等が挙げられる。
【００２６】
一次培養工程において、幹細胞と胎盤等由来細胞とを共培養することにより、早期に必要細胞数の幹細胞を得ることができ、その結果、製造工程全体に要する期間を大幅に短縮することができる。また、胎盤等由来細胞の分泌するサイトカインやマトリクス等の成長因子の作用により、幹細胞が活性化させられているので、生体組織補填材と混合して行われる二次培養工程においても、その増殖速度を向上して、早期に生体組織補填体を製造することができるという利点がある。
【００２７】
また、特に、胎盤等由来細胞には上述したように免疫機能が未熟であるという特徴があるため、一次培養工程において共培養された幹細胞から胎盤等由来細胞を分離しなくても、免疫拒絶等の障害を発生する可能性の低い生体組織補填体を製造することができる。
【００２８】
また、上記実施形態においては、一次培養工程において幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを共培養することとしたが、これに代えて、または、これとともに、二次培養工程において幹細胞を含む細胞と胎盤等由来細胞とを共培養することにしてもよい。胎盤等由来細胞を混入する前に、一次培養工程において幹細胞を含む細胞をある程度増殖させておくことにより、混入後の幹細胞の増殖を安定的に確保することができる。
【００２９】
なお、培地４に加える成分として、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や他の栄養剤を混合することにしてもよい。
【００３０】
この場合に、培養すべき間葉系幹細胞の活性度に応じて、これらの成長因子やホルモン剤もしくは栄養剤の配合割合を決定することにしてもよい。また、抗生剤として、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００３１】
また、生体組織補填材として、βリン酸三カルシウム多孔体やβリン酸三カルシウムとポリ乳酸との混合体物を使用したが、これに代えて、他の多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸あるいはこれらの組合せを採用してもよい。βリン酸三カルシウム、コラーゲン、ポリ乳酸等は生分解性を有し、生体に吸収されるので除去の必要がなく、またアパタイト等はその強度が高いという特徴を有する。当業者であれば、移植する部位等に応じて、適切な種類の生体組織補填材を選択することができる。