(57)【要約】    【課題】  本発明の課題は、従来のセロビオース製造法に比べて製造工程を簡略化することができ、さらに純度の高いセロビオースを安価に得ることができるセロビオースの製造方法、および生産物であるセロビオースを過分解してしまうβ−グルコシダーゼをセルラーゼから分離除去する方法を提供することである。    【解決手段】  セルロース性原料３を管式あるいは塔式反応器１に充填し、セロビオハイドロラーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、セルロース性原料とセルラーゼ溶液を接触させて反応し、流出する溶液からセロビオースを含む画分を得ることを特徴とするセロビオースの製造方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、セルロース性原料とセルラーゼ溶液を接触させて反応し、流出する溶液からセロビオースを含む画分を得ることを特徴とするセロビオースの製造方法。
【請求項２】
前記セルラーゼ溶液を通液させる前、あるいは反応の全期間において、反応器内に充填されたセルロース性原料の隙間のみを液相で置換し、余剰な液相を排除することを特徴とする請求項１に記載のセロビオースの製造方法。
【請求項３】
セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含みかつ不純物としてβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、β−グルコシダーゼを含む画分を選択的に分離除去することを特徴とする、セルラーゼからのβ−グルコシダーゼの分離除去方法。
【請求項４】
前記方式によりβ−グルコシダーゼを除去した反応液をくりかえし管式あるいは塔式反応器に通液することを特徴とする請求項１に記載のセロビオースの製造方法。
【請求項５】
β−グルコシダーゼが除去されたセロビオハイドラーゼを含むセルラーゼ溶液とセロビオースの混合液を、セルロース性原料が充填された管式あるいは塔式反応器に通液し、酵素成分のみを反応器に吸着させ、セロビオースのみを溶出させることを特徴とするセルラーゼの回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甘味料、医薬品、健康食品、食物繊維、試薬などに用いられるセロビオースの製造方法、および、セロビオース製造に重要なセロビオハイドロラーゼを含むセルラーゼからβ−グルコシダーゼを分離除去する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
セロビオースは、甘味料、医薬品、健康食品、食物繊維、試薬などに用いられる有用な糖類である。
【０００３】
これまで、セロビオースの製造はセルロース性原料の酸加水分解反応かセルラーゼによる酵素加水分解反応により行われている。酸加水分解反応では、セロビオース収率が低く、大量の副産物の中からセロビオースを精製する必要があった。また酸加水分解法は、高圧、耐酸設備を要するなど工業的に簡便なセロビオースの製造方法ではなかった。
【０００４】
これに対して、酵素加水分解反応では、反応条件が温和で、高圧、耐酸設備などは必要ない。しかし、セルラーゼは、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼなどを含む複合酵素系であるために、主としてグルコースが生成され、セロビオースの割合が低くなるという欠点があった。
【０００５】
そこで、セロビオースの製造に関していくつかの技術が提案されている。特許文献１ではセルロース系原料を使わない製造法が提案されている。特許文献２では、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼをキトサンを使って除去し、β−グルコシダーゼが除去された酵素を使ってセロビオースを得る方法が提案されている。この方法は、β−グルコシダーゼの分離除去工程が複雑であり、簡便な方法とは言えない。特許文献３は、リグニンを含むセルロース系原料を脱リグニン処理せずにリグニン分解菌を共存させることで利用できるようにした技術であり、セルラーゼの反応器としては通常のタンク式反応器および限外ろ過装置が使われている。これらの装置では反応生成物中のセロビオース含有率が低く、セロビオースの精製が必要となっていた。特許文献４は、セロビオースの含有率を高めるために（１）原料に非結晶性セルロースを多く含むものを選択する、（２）リグニンの存在下で酵素反応を行う、という方法が提案されている。しかしながら、セロビオースを随時採取する具体的な方法は、タンク式反応器で酵素反応を行い、生成されたセロビオースを限外ろ過装置を使用して回収するというものである。したがって、装置として限外ろ過装置が必須の技術である。特許文献５は、特定の保水度かつ濾水度をもつ晒スラッシュパルプおよびサルファイトパルプを原料とすることでセロビオースの収率を高めているが、酵素反応器について言及した物ではなく、原料特性に基づいた技術である。特許文献６は、天然リグノセルロースを含む原料を蒸解後未乾燥の原料を使うことで分解効率を高め、さらに分画分子量１万の限外ろ過膜を使って糖液を回収することを特徴としている。これもセロビオース含有率を高くするためには、装置として限外ろ過装置が必須の技術である。特許文献７ではセルラーゼ中のβ−グルコシダーゼをセルロースエステルあるいはセルロースエーテルエステルを使って選択的に除去し、酵素反応を行わせることが提案されているが、酵素精製時の分離工程が必須であり、反応前後で可溶化と不溶化を行うこととなり工程が複雑である。特許文献８ではβ−グルコシダーゼが他のセルラーゼ成分に比較してセルロースへの吸着力が弱いという知見を利用し、不溶性セルロースにβ−グルコシダーゼ以外のセルラーゼ成分を吸着させ、分離ろ過によってβ−グルコシダーゼを選択的に除去した後、固形画分をタンク中で水性媒体を使って懸濁して酵素反応を行わせている。β−グルコシダーゼの除去工程と分解反応の工程が分離していた。さらに、固形画分の分離ろ過に大量の洗浄液が必要であった。
【特許文献１】特開２００１−１１２４９６号公報
【特許文献２】特開平５−２２７９５８号公報
【特許文献３】特開平８−８９２７４号公報
【特許文献４】特開平５−３１７０７３号公報
【特許文献５】特開平９−１０７９８７号公報
【特許文献６】特開平７−１８４６７８号公報
【特許文献７】特開平５−２２７９５７号公報
【特許文献８】特許第１９４８１８４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、従来のセロビオース製造法に比べて製造工程を簡略化することができ、さらに純度の高いセロビオースを安価に得ることができるセロビオースの製造方法、および生産物であるセロビオースを分解してしまうβ−グルコシダーゼをセロビオースの製造と同時にセルラーゼから分離するβ−グルコシダーゼの分離除去方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題の解決を目指して、セルロース性物質へのセルラーゼの作用機構を研究した結果、固液分離可能な反応器にセルロース性原料を充填し、移動相である酵素液を通液させながらセルラーゼを作用させると、効率的にセルロース性原料の分解が進行するとともに、生産物中のセロビオース濃度をタンク式反応器での場合と比較し格段に向上させられることを見出し、さらに、この反応を通じて、生産物であるセロビオースを分解してしまうβ−グルコシダーゼをセルラーゼから分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は下記を要点とするものである。
【０００９】
（１）  セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、セルロース性原料とセルラーゼ溶液を接触させて反応し、流出する溶液からセロビオースを含む画分を得ることを特徴とするセロビオースの製造方法。
【００１０】
（２）  前記セルラーゼ溶液を通液させる前、あるいは反応の全期間において、反応器内に充填されたセルロース性原料の隙間のみを液相で置換し、余剰な液相を排除することを特徴とする（１）に記載のセロビオースの製造方法。
【００１１】
（３）  セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含みかつ不純物としてβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、β−グルコシダーゼを含む画分を選択的に分離除去することを特徴とする、セルラーゼからのβ−グルコシダーゼの分離除去方法。
【００１２】
（４）  前記方式によりβ−グルコシダーゼを除去した反応液をくりかえし管式あるいは塔式反応器に通液することを特徴とする（１）に記載のセロビオースの製造方法。
【００１３】
（５）  β−グルコシダーゼが除去されたセロビオハイドラーゼを含むセルラーゼ溶液とセロビオースの混合液を、セルロース性原料が充填された管式あるいは塔式反応器に通液し、酵素成分のみを反応器に吸着させ、セロビオースのみを溶出させることを特徴とするセルラーゼの回収方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のセロビオースの製造方法により、簡略な製造工程により純度の高いセロビオースを安価に得ることができる。
【００１５】
また、本発明のβ−グルコシダーゼの分離除去方法により、セロビオースの製造と同時に、β−グルコシダーゼを効率的に分離除去できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において用いるセルロース性原料としては古紙、パルプ、リグニンを分解した木質系材料など、セルラーゼが作用できる形のセルロースを含むものであればその種類は問わない。但し、酵素反応を効率的に行うためには粉末またはスラリー状になるほど細かくした方が好ましい。
【００１７】
本発明において使用するセルラーゼはセロビオハイドロラーゼを含む酵素であれば特に限定されないが、例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、フミコラ属、アクレモニウム属、バチルス属、セルロモナス属、クロストリジウム属、ストレプトマイセス属などから得られるセルラーゼを例示することができる。また、本発明においては至適ｐＨが近いセルラーゼを混合して用いることができる。また、セルラーゼとして未精製の上記菌の培養物などもセルラーゼの活性を持つものであれば使用することができる。なお、セルラーゼには、生産物であるセロビオースを分解してしまうβ−グルコシダーゼが不純物として含まれているが、請求項３に記載された本発明方法により効率的にβ−グルコシダーゼを分離除去することができる。
【００１８】
本発明において用いる反応器は、一般に管式あるいは塔式反応器（以下、「反応器」と略称する場合がある）と呼ばれるものである。本発明の反応器は、固体原料であるセルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含むセルラーゼ溶液（以下、「酵素液」と略称する場合がある）を一方から通液しセルロース性原料の固体原料が漏れない構造を有するものである。すなわち、セルロース性原料が漏出しないように、セルロース性原料が通過しない孔径のフィルターを反応器に設ければよい。
【００１９】
酵素液を、セルロース性原料が充填された反応器に一方向に通液させるには、下降流でも上昇流でもよい。下降流で酵素液を通液させる場合は、反応器の上下端の両方にフィルターを設けてもよく、反応器の下端のみにフィルターを設けてもよい。酵素液を上昇流で通液させる場合は、反応器の上端と下端にフィルターを設けることにより、セルロース性原料が漏出することを防ぐことができる。なお、下から上に向けて上昇流で酵素液を通液した方がセルロース性原料の隙間に空気層が発生しにくいという利点がある。
【００２０】
セルロース性原料が通過しない孔径のフィルターとしては、孔径０．１〜３０００マイクロメーターのフィルターを挙げることができ、その材質はセルラーゼに耐性のあるものであれば特に限定されない。反応器の断面積と長さの関係は反応の速度に関係するため必要に応じて変更することができるが、好ましくは反応器の長さは断面の直径の５倍以上とした方がよい。
【００２１】
なお管式あるいは塔式の反応器は、縦型でも横型でもかまわない。
【００２２】
本発明において、セルロース性原料を充填する際の水性媒体の量を調整することが重要である。すなわち、反応器内に充填されたセルロース性原料の隙間を液相で置換する必要がある。具体的には、セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填したとき、セルロース性原料の固形分の隙間を十分に埋める程度の水性媒体を加えることであり、余分な水性媒体が存在したり、セルロース性原料固形分の隙間に空間が生じたりしないようにする必要がある。従って、例えば先にセルロース性原料をスラリー状にしたり、過剰の水性媒体が存在する状態で混合し、管式あるいは塔式反応器に充填し、余剰の水性媒体を流出させる方法を挙げることができる。
【００２３】
また、反応に伴ってセルロース性原料が減少した場合にも、余分な水性媒体を除去する方が良い。
【００２４】
セルロース性原料を充填した反応器に、酵素液を一方向から通液することにより、セルロース性原料とセロビオハイドロラーゼを含むセルラーゼが反応し、反応器からセロビオースを含む画分が流出してくる。流出してくる反応液において、セロビオース濃度の高い画分を採取することにより、セロビオースを効率的に製造することができる。得られたセロビオース画分は、公知の方法により精製することによりセロビオースの純度を高めることができる。
【００２５】
本発明の一実施形態を表すフロー図を図１、図２に示す。
【００２６】
図１に示したように、本発明の反応器１は管式あるいは塔式の反応器であり、反応器１内に充填したセルロース性原料３が反応器から漏れないように、管式あるいは塔式反応器の端部にセルロース性原料が通過しない孔径のフィルター２を設けている。
【００２７】
セルロース性原料３が充填された管式あるいは塔式反応器１にセロビオハイドロラーゼを含むセルラーゼの酵素液を一方向に通液させることにより、セルロース原料と酵素液を接触させ反応させる。反応液は管式あるいは塔式反応器１から流出してくる。
【００２８】
本発明を実施するために、水性媒体をセルロース性原料３の隙間に充填させるための流路を設け、バルブ５の切り替えにより、水性媒体を通液させてもよい。また、塔式あるいは管式反応器１に、酵素液や水性媒体を供給するためのポンプ４を設けてもよい。
【００２９】
また、その他の実施形態として、図２に示したように、反応器１は直列につなぐことが可能であり、反応器１の実質上の長さを増加することができる。さらに、反応器１の途中に排出口を設け、最初に流出してくるβ−グルコシダーゼ画分の排出を早めて除去してもよい。
【００３０】
反応器はヒーター等の温度保持機構を有するものが好ましいが、通液する液相の温度を熱交換機などを使って保持してもよい。
【００３１】
本発明において液相として使用する媒体として水性媒体が挙げられるが、具体的には、水、塩溶液などを使用することができる。しかしながら、水性媒体としては、使用するセルラーゼの至適ｐＨ（ｐＨ３〜９）を保持できる緩衝液が好ましい。
【００３２】
反応器の内部は酵素の活性が十分得られる温度、例えば１０〜７０℃に調整する。
【００３３】
そのような状態で充填されて固定されたセルロース性原料に対し、移動相である水性媒体を一方から通液する。通液方向は、反応容器を縦型で用いる場合は、下降流でも上昇流でもよいが、この時も水性媒体の量がセルロース性原料固形分の量に対して、上記記載の状態が保持されるように通液量と廃液量を調整する必要がある。この時の通液速度は、管式あるいは塔式反応器に対する線流速として、０．１〜３５ｃｍ／ｈとし、好ましくは０．５〜２０ｃｍ／ｈとする。この通液は、酵素添加開始直後から開始する。
【００３４】
酵素は先に溶液状にした後、上記流速で移動相と一緒に通液しながら添加する。酵素液量は、原料充填体積の１０％未満、好ましくは5％未満が望ましい。
【００３５】
酵素は、反応器に充填されたセルロース性原料と接触し移動しながら、セルロース性原料成分と吸着と脱離を繰り返し、セルロース性原料成分を分解していくが、酵素中のβ−グルコシダーゼは、原料との吸着性が弱いために、先に溶出してくる。その間もセルラーゼはセルロース性原料を分解し、セロビオースを生成している。セロビオースは原料に吸着しないため、β−グルコシダーゼの溶出後に順次溶出されてくる。従って、β−グルコシダーゼ溶出画分とセロビオース画分とは分けて回収する。
【００３６】
反応器中のセルラーゼは分解反応を続けながら、溶出されてくる。これは、さらに新しい反応器へ通液し、連続的に分解を行うことができる。また、同一の反応器へ戻すこともできる。一度、β−グルコシダーゼを除去してあるのでグルコースの生成は抑制される。
【００３７】
この発明の重要な点は、常に酵素液を流動させておくことにある。流動させることで、セロビオースによるセルラーゼの反応阻害を防止することができ、酵素の反応効率を高めることが可能であり、酵素の使用量を従来のタンク式反応に比べて、大幅に減らすことができる。
【００３８】
最初に流出する溶液からβ−グルコシダーゼを含む画分を分離除去することにより、得られたセロビオース画分には、β−グルコシダーゼが除去されたセルラーゼが混入してくる。従って、これを再利用するためには、限外ろ過等により精製したセルラーゼを濃縮し回収することができるが、セルロース性原料が充填された反応器に、得られたセロビオース画分を通液し、セルラーゼだけを吸着させる方が好ましい。また、β−グルコシダーゼを分離除去した後に得られるセロビオース画分をセルロース性原料が充填された反応器に再度通液し、これを繰り返すことにより、セロビオースに富んだ画分を得ることができる。
【００３９】
実施例
以下、実施例に従って本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
セルロース粉末であるアビセル（商品名、旭化成（株）製）５ｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に懸濁させた後、管径１６ｍｍ、長さ１０ｃｍのクロマトグラフィー用ガラスカラムに充填し、アダプターを使って余分な水性媒体を除去した。カラムの出口と入り口は孔径１０マイクロメーターのメッシュフィルターを使用し、アビセルが流出しないようにした。温度を５０℃に調製し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を線速５ｃｍ／ｈで通液した。酵素は、トリコデルマ属起源の市販セルラーゼ製剤、メイセラーゼ（明治製菓）０．０２ｇを１ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解させ、インジェクションバルブから添加し、その後も線速５ｃｍ／ｈで５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を通液した。反応開始から５時間は、β−グルコシダーゼ溶出画分として別にし、その後のセロビオース画分は繰り返しもどし通液を行い、１００時間反応させた。
【００４１】
溶出された液の糖組成は高速液体クロマトグラフィーを用い、ピーク面積から求めた。使用したカラムは、昭和電工製ＫＳ−８０２、溶離液は水、検出は示差屈折で行った。
【００４２】
対照としてビーカーに５ｇのアビセルを１００ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に懸濁させ、メイセラーゼ０．０２ｇを加えて、５０℃、１００時間反応させた。
【００４３】
その結果を下表に示す。
【００４４】
【表１】
2006034206.tif 000003
【００４５】
このように、タンク式反応器では、ほとんどセロビオースが得られないのに対して、本発明の管式反応器を使用することによりセロビオース含量が高くなり、かつ収率も向上した。
【実施例２】
【００４６】
シラカバ材を１８５℃、１５分間蒸煮し、セルラーゼによる分解が可能になった材料を粒径１ｍｍの粉末にした。この原料７００ｇを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に懸濁させた後、管径５０ｍｍ、長さ１００ｃｍのクロマトグラフィー用ガラスカラムに充填し、アダプターを使って余分な水性媒体を除去した。カラムの出口と入り口は孔径５０マイクロメーターのメッシュフィルターを使用し、木粉が流出しないようにし、これを２本用意した。温度を５０℃に調製し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を線速１５ｃｍ／ｈで通液した。酵素は、トリコデルマ属起源の市販セルラーゼ製剤、メイセラーゼ（商品名、明治製菓（株）製）１ｇを１５ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解させ、インジェクションバルブから１本目のカラム入り口から添加し、その後１０時間は、線速１５ｃｍ／ｈで５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を通液した。反応開始から１０時間は、β−グルコシダーゼ溶出画分として１本目のカラムの出口から溶出させた。その後２本のカラムを直列につなぎ、溶出液の流速を線速２ｃｍ／ｈにし、１００時間反応させた。溶出されたセロビオース画分はそのまま回収した。
【００４７】
溶出された液の糖組成は前記方法で分析した。その結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
このように、本発明方法によりセロビオースの含有率の高い液を回収することができた。また、最初に溶出するβ−グルコシダーゼ溶出画分を除去することにより、セルラーゼを効率的に精製することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のセロビオースの製造方法により、簡略な製造工程により純度の高いセロビオースを安価に得ることができるので、本発明は有用である。
【００５１】
また、本発明のβ−グルコシダーゼの分離除去方法により、β−グルコシダーゼの含有量が低いセルラーゼを得ることができるので、本発明は有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明の一実施形態を示すフロー図。
【図２】本発明の一実施形態を示すフロー図。
【符号の説明】
【００５３】
１  反応器
２  フィルター
３  セルロース性原料
４  ポンプ
５  バルブ
６  セルラーゼのもどし配管
【図１】
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【図２】
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