(57)【要約】【課題】  環境中におけるバイオフィルムを排除するためのバイオフィルム抑制・除去剤を提供する。【解決手段】  下記式（Ａ）：【化１】2006347941.tif 000008〔式中、Ｒは置換されてもよい炭素数６〜１８のアルキル基を示し、Ｇは炭素数５〜６の還元糖由来の残基を示し、ｍは０〜２００の数を示し、ｎは１〜３０の数を示す。〕で表される化合物を含有するバイオフィルム抑制・除去剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ａ）：
【化１】
2006347941.tif 000007
〔式中、Ｒは置換されてもよい炭素数６〜１８のアルキル基を示し、Ｇは炭素数５〜６の還元糖由来の残基を示し、ｍは０〜２００の数を示し、ｎは１〜３０の数を示す。〕
で表される化合物を含有するバイオフィルム抑制・除去剤。
【請求項２】
Ｇがガラクトース残基又はグルコース残基である請求項１記載のバイオフィルム抑制・除去剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルムを環境から排除するバイオフィルム抑制・除去剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、細菌やカビ等の微生物が固体や液体の表面に付着し、分泌物等と共に形成される微生物の群落であり、微生物が環境中に生息する場合は、バイオフィルムの状態にあることが非常に多い。バイオフィルムは、生活環境や産業上で、深刻な問題を引き起こす場合がある。例えば、住環境では、台所、浴室、トイレ等の排水口のぬめりやつまりの原因や悪臭の原因となり不快感を与える。温泉施設等の循環式の浴槽内で形成されたバイオフィルム中の細菌により感染症が発症する場合もある。一方、産業上では、下水道管や船底に形成されることにより腐食を引き起こす事が知られている。工場の製造ライン上のバイオフィルムが微生物汚染の原因となることもある。医療関連では、透析等のチューブや内視鏡、コンタクトレンズ等の医療器具に形成されたバイオフィルムが感染源となったり、また、皮膚等の人体組織でのバイオフィルム形成により疾病を引き起こしたりする。食品関連では、野菜等の生鮮食料品や加工食品原料及び調理器具に形成されたバイオフィルムが腐敗や食中毒の原因となる。
【０００３】
さらに微生物がバイオフィルムを形成することにより、洗浄除去や薬剤、熱等のストレスに対して浮遊の状態にある場合に比べ非常に強固になることが知られており、通常の洗浄や殺菌方法ではその効果が十分発揮できないことが多く、徹底的な微生物の排除を困難にするため、深刻な問題となっている。
【０００４】
バイオフィルムを除去または殺菌する方法としては、一般的な洗浄剤や殺菌剤を用いることのほか、モノグリセリド多価カルボン酸エステル等の界面活性剤やデキストラナーゼ、ぺプチターゼ、グルカナーゼ等の酵素を組み合わせて用いるにことやアルカリ電解水により化学的に除去すること等が提案されている（特許文献１〜４参照）。また、バイオフィルムの付着部分を液体と接触させながら、それにパルスレーザを照射することやバブリング等で物理的にバイオフィルムを除去する方法（特許文献５〜７参照）も提案されている。
【０００５】
しかしながら、一旦、バイオフィルムが形成されると、菌から産出される多糖類等の粘性物質は単に洗浄液を流したり、擦ったりすることでだけで充分に除去することは容易ではない。従って、バイオフィルムを環境から排除するためには、バイオフィルムの形成を抑制することが効果的である。これらの方法としてはファルネソールやキシリトールを用いてバイオフィルムの形成を抑制する方法（特許文献８参照）やラクトン誘導体及び／またはフラン誘導体を有効成分とするバイオフィルムの形成を抑制する方法（特許文献９参照）等が提案されているが、効果が十分ではなく、対象の菌種が限られている等の問題があった。その為、より効果が高く多くの菌種のバイオフィルム形成抑制能を持つ剤が求められている。
【０００６】
ラウリルグルコシド、オクチルガラクトシド等のアルキルグリコシド類は、低刺激性の非イオン性界面活性剤として広く知られている。しかし、微生物のバイオフィルムを環境から排除する効果があることについては全く知られていない。
【特許文献１】特開平１０−２３４２９４号公報
【特許文献２】特開平１０−２３４５９５号公報
【特許文献３】特開平３−１９３号公報
【特許文献４】特開２００３−２５０４３６号公報
【特許文献５】特開２００４−２７５９７９号公報
【特許文献６】特開２００４−６５６１２号公報
【特許文献７】特開２００２−２８４６０４号公報
【特許文献８】特開２００４−３２４０４５号公報
【特許文献９】特開２００４−１５５６８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、環境中におけるバイオフィルムを排除するためのバイオフィルム抑制・除去剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、安全性が高く居住空間等に広く使用可能な化合物について検討したところ、下記式（Ａ）で表されるアルキルグリコシド類が優れたバイオフィルムの形成抑制作用及びバイオフィルム除去作用を有することを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、下記式（Ａ）：
【００１０】
【化１】
2006347941.tif 000002
【００１１】
〔式中、Ｒは置換されてもよい炭素数６〜１８のアルキル基を示し、Ｇは炭素数５〜６の還元糖由来の残基を示し、ｍは０〜２００の数を示し、ｎは１〜３０の数を示す。〕
で表される化合物を含有するバイオフィルム抑制・除去剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、住居内及び産業上の様々な環境において形成されるバイオフィルムの付着を簡便にかつ効率的に抑制、除去できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明に用いられる式（Ａ）で表される化合物は、炭素数６〜１８のアルキル基に直接又は１つ以上のオキシエチレン基を介して、１つ以上の炭素数５〜６の還元糖由来の残基がα−配置もしくはβ−配置でグリコシド結合した化合物である。
「炭素数６〜１８のアルキル基」としては、直鎖又は分岐鎖のいずれでもよく、例えばｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソステアリル基（イソオクタデシル基）、２−エチルヘキシル基等が挙げられる。このうち、配合上及び効力の面から、炭素数８〜１６のアルキル基が好ましく、炭素数８〜１４がより好ましい。
【００１４】
アルキル基の水素原子は、置換基で置換されてもよい。この置換基としては、炭素数１〜６のアルコキシ基、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等）、ニトロ基、炭素数１〜６のハロアルキル基、炭素数１〜６のハロアルコキシ基が挙げられる。
【００１５】
「炭素数５〜６の還元糖」としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、マンノース、アラビノース等が挙げられ、これらの組み合わせであってもよい。このうちバイオフィルム形成抑制効果の点から、グルコース、ガラクトースが好ましい。また、これらの還元糖は、ピラノース型、フラノース型又はそれらの混合物のいずれも含まれる。
【００１６】
「還元糖由来の残基」とは、還元糖又はその縮合体におけるすべての非グリコシド性水酸基の水素原子及びグリコシド性水酸基の水素原子を除いたあとに残る糖残基を意味する。
【００１７】
ｍは、０〜２００の数を示すが、バイオフィルム形成抑制作用の面から０〜１２が好ましく、０〜３がより好ましい。還元糖の縮合度を示すｎは１〜３０の数であるが、１〜６が好ましく、１〜３がより好ましい。ｎが１より大きい場合、即ちＧが２糖以上の糖鎖で構成される場合、糖鎖の結合様式は、１−２、１−３、１−４、１−６結合、及びこれらが混合された結合様式であってもよい。
【００１８】
式（Ａ）で表される化合物のうち、特に好ましいものとして、例えば、β−オクチルグルコシド、α−オクチルガラクトシド、β−オクチルガラクトシド、ラルリルガラクトシド、トリオキシエチレンラウリルガラクトシド、ラウリルグルコシド、Ｃ８〜Ｃ１６グルコシド混合物、Ｃ８〜Ｃ１６ガラクトシド混合物等が挙げられる。
【００１９】
式（Ａ）で表される化合物は、堀らの方法（薬学雑誌，Vol. 79, No.1, p80-83）や後述する製造例により製造することができる。また、マイドール（Ｃ８〜Ｃ１６グルコシド混合物、花王株式会社製）等の市販品を用いることもできる。
【００２０】
斯かる化合物（Ａ）は、後記実施例に示すように、緑膿菌、セパシア菌、大腸菌、セラチア菌を初めとするグラム陰性菌や黄色ブドウ球菌等のグラム陽性菌、酵母等の真菌等様々な環境に存在する微生物によるバイオフィルムの形成抑制作用及び除去作用を有する。従って、化合物（Ａ）は、様々な環境中のバイオフィルム抑制・除去剤として幅広く有用である。ここで、本発明におけるバイオフィルムの抑制・除去とは、微生物（細菌及び真菌）が分泌物や沈着物と共に形成する群落（バイオフィルム）の形成を阻止若しくは抑制すること及び／又は形成されたバイオフィルムを除去することをいい、形成に関わる微生物の種類やその種類数は特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明のバイオフィルム抑制・除去剤は、必要に応じて乳化剤、固着剤、分散剤、湿潤剤、安定剤、噴射剤等を適宜添加することにより、油剤、乳剤、水和剤、噴霧剤、エアゾール剤、燻煙剤、塗布剤、洗浄剤、粉剤及び粒剤の形態として製剤化することができ、化粧品、皮膚外用剤等の医薬品、医薬部外品として使用できる。斯かる化粧品や医薬部外品、洗浄剤等は、本発明の化合物（Ａ）を含有し、バイオフィルム形成抑制及び／又は除去作用を有し、そのために用いるものである旨の表示を付していることができる。
【００２２】
ここで、洗浄剤としては、住居用洗浄剤、台所用洗剤、工業用の洗浄剤、医療用の洗浄剤が挙げられ；化粧料としては、メーキャップ化粧料や基礎化粧料、毛髪用化粧料等が挙げられ、医薬品としては、例えば傷薬等が挙げられ；医薬部外品（薬事法第２条２項）としては、例えば浴用剤、薬用化粧品、コンタクトレンズ用消毒剤、外皮消毒剤、きず消毒保護剤、ひび・あかぎれ用剤等が挙げられる。
これらをバイオフィルムが形成される種々の環境、例えば床面、畳、浴槽、壁、便器等の住環境中や船底、工場等の配管、皮膚、傷口等の人体、コンタクトレンズ、内視鏡等の医療機器等に散布、噴霧、塗布又は蒸散することにより、その効果を発揮させることができる。
【００２３】
上記の製剤には、本発明の化合物（Ａ）に加えて、抗菌抗カビ剤、防腐防黴剤、抗生物質、浸透促進剤、界面活性剤、消臭剤及び芳香剤等を配合するとより効果的である。
抗菌抗カビ剤としては、例えばチアベンダゾール、トリクロサン、クロルヘキシジン、ジンクピリチオン、クロルキシレノール等や、キトサン、カテキン、チモール、ヒノキチオール、孟宗竹エキス、カラシ精油、ワサビ精油等の天然由来の抗菌成分等が挙げられる。
【００２４】
防腐防黴剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル（パラベン）類、２-フェノキシエタノール、安息香酸及びその塩類、サルチル酸及びその塩類、ソルビン酸及びその塩類、デヒドロ酢酸及びその塩類、ｐ‐トルエンスルホン酸及びその塩、エタノールやイソプロパノール等のアルコール類、塩化ベンザルコニウム等の第四級アンモニウム塩等及び防腐力を有する原料である多価アルコール類、中鎖脂肪酸やそのエステル類、グルセリン誘導体類、及びＥＤＴＡ等のキレート剤等が挙げられる。
【００２５】
本発明のバイオフィルム抑制・除去剤における化合物（Ａ）の配合量は、０．０１〜１０質量％、特に０．０３〜５質量％が好ましい。
【実施例】
【００２６】
製造例１  α，β−ラウリルガラクトシドの製造
Ｄ−ガラクトースとラウリルアルコールを触媒量のパラトルエンスルホン酸１水和物存在下、加熱、減圧条件で脱水しながら反応させた。得られた混合物をシリカゲルカラムにより精製し、ガラクトース縮合度１〜３のラウリルガラクトシドを得た。ゲル浸透クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、1Ｈ−ＮＭＲによる分析の結果、得られたラウリルガラクトシドの平均糖縮合度は１．４８であり、成分中のラウリルモノガラクトシドの組成はピラノシド／フラノシド＝８３／１７、そのうちピラノシドのα／β比は７５／２５であった。
【００２７】
製造例２  β−トリオキシエチレンラウリルガラクトシドの製造
ペンタアセチル−Ｄ−ガラクトースとトリオキシエチレンモノラウリルエーテルを三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体存在下、ジクロロメタン中、室温で反応させた。溶媒を減圧下で留去した後、シリカゲルカラムで精製することによりβ−トリオキシエチレンラウリル−２，３，４，６−テトラアセチルガラクトシドを得た。これをナトリウムメトキシドにより脱アセチル化して、β−トリオキシエチレンラウリルガラクトシドを得た。
【００２８】
1H-NMR(400MHz, CDCl3) 0.88(t, 3H), 1.2-1.35(m, 18H), 1.57(m, 2H), 3.35-3.8(overlapped, 13H), 3.84(t,2H),3.97-4.07(overlapped, 3H), 4.17(d, 1H), 4.29(d, J=7.6Hz, 1H) ,4.41(d, 1H)。
【００２９】
製造例３  α−及びβ−オクチルガラクトシドの製造
製造例２と同様にオクチルアルコールを原料として製造したα，β−オクチルガラクトシドをカラムにより精製し、α−オクチルガラクトシド及びβ−オクチルガラクトシドを得た。
【００３０】
α体：0.78(t, 3H), 1.1-1.3(m, 10H), 1.47(m, 2H), 3.45-3.70(overlapped, 7H), 4.63(d, J=2.8Hz, 1H)、β体：0.86(t, 3H), 1.2-1.35(m, 10H), 1.51(m, 2H), 3.25-3.75(overlapped, 7H), 4.09(d, J=7.6Hz, 1H)。
【００３１】
製造例４  Ｃ８〜Ｃ１６ガラクトシド混合物の製造
製造例１と同様の方法でＤ−ガラクトースとC8〜C16の混合アルコール(C8:C10:C12:C14 = <1:60:30:10:<1)を反応させた。得られた混合物から未反応アルコールを減圧下で留去することにより、C8〜C16ガラクトシド混合物を得た。分析の結果、平均糖縮合度は1.3であった。
【００３２】
上記製造例１〜４で製造された、α，β−ラウリルガラクトシド、β−トリオキシエチレンラウリルガラクトシド、α−オクチルガラクトシド及びβ−オクチルガラクトシド、Ｃ８〜Ｃ１６ガラクトシド混合物並びにβ-ｎ-オクチルグルコシド（同仁化学研究所製）、Ｃ８〜Ｃ１６グルコシド混合物（「マイドール12」花王株式会社製））を、実施例の試験物質として用いた。
【００３３】
実施例１  緑膿菌のバイオフィルム形成に対する抑制効果
（１）供試菌株
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa  ＮＢＲＣ １３７２５）
（２）実験方法
供試菌株を２４穴マイクロプレートを用いＬＢ培地（和光純薬工業）（600μL/ｗｅｌｌ）で振盪培養（３０℃、700ｒｐｍ、一昼夜）した後１００倍希釈したものを供試菌液とした。
バイオフィルムの調製と形成抑制効果の評価は次のように行った。
１）ＰＶＣ（ポリビニルアルコールクロライド）の96穴マイクロプレート（丸底）を用い、ＭＨＢ培地(ミューラヒントン液体培地、Difco)（100μL/ｗｅｌｌ）に各糖脂質を0.1％となるように添加した後、供試菌液を10μL接種し、３０℃で２４時間静置培養した。
２）培養液を取り除いた後、付着している菌体をバイオフィルムとし、0.1％クリスタルバイオレット液を200μL添加し、バイオフィルムを染色した。
３）クリスタルバイオレット液を除き、200μLの水道水で10回以上洗浄後、プレートに固着して残存していたバイオフィルムを定量した。
４）バイオフィルムの定量は染色したバイオフィルムを99.5％エタノール200μLに溶解後、吸光度（595nm）を測定することで行った。
５）なお、コントロールとして、試験物質を添加せずに同様の方法でバイオフィルムを形成させた。
結果を表１に示す。ここでバイオフィルム形成量は、コントロールを１００とした場合の比率で示した。
【００３４】
【表１】
2006347941.tif 000003
【００３５】
実施例２  種々の微生物によって形成されるバイオフィルムに対する抑制効果（１）
α、β-ラウリルガラクトシドを用い、供試菌株として表２に示す３種の菌株を用いて、実施例１と同様の方法でバイオフィルムの形成抑制効果を評価した。なお、α、β-ラウリルガラクトシドの濃度は0.05%及び0.2％とした。
結果を表２に示す。ここでバイオフィルム形成量は、コントロールを１００とした場合の比率で示した。
【００３６】
【表２】
2006347941.tif 000004
【００３７】
実施例３  種々の微生物によって形成されるバイオフィルムに対する抑制効果（２）
Ｃ８〜１６−グルコシド混合物を用い、供試菌株として表３に示す４種の菌株及び、環境分離菌２５株を用いて、実施例１と同様の方法でバイオフィルムの形成抑制効果を評価した。なお、菌株を混合する場合は培養後に混合したものを希釈した。また、Ｃ８〜１６−グルコシドの濃度は0.04％とした。
結果を表３に示す。ここでバイオフィルム形成量は、コントロールを１００とした場合の比率で示した。
【００３８】
【表３】
2006347941.tif 000005
【００３９】
実施例４  バイオフィルムの除去効果
（１）供試菌株
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa  ＮＢＲＣ １３７２５）
セラチア菌（Serratia marcescens ＮＢＲＣ  １２６４８）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus   ＮＢＲＣ  １３２７６）
（２）実験方法
供試菌株を２４穴マイクロプレートを用いＬＢ培地（和光純薬工業）（600μL/ｗｅｌｌ）で振盪培養（３０℃、700ｒｐｍ、一昼夜）した後１００倍希釈したものを供試菌液とした。
バイオフィルムの調製と除去効果の評価は次のように行った。
１）ＰＶＣ（ポリビニルアルコールクロライド）の96穴マイクロプレート（丸底）を用い、ＭＨＢ培地(ミューラヒントン液体培地、Difco)（100μL/ｗｅｌｌ）に供試菌液を10μL接種し、３０℃で２４時間静置培養した。
２）培養液を取り除きＰＢＳ（phosuphate-buffered saline(pH7.4)）で1回洗浄後プレート上に残ったバイオフィルムに200μLのＰＢＳを加え、さらにＣ８〜１6ガラクトシド混合物を0.1％になるように添加した後30℃で24時間放置した。
３）ＰＢＳを取り除いた後、残存しているバイオフィルムを実施例１の方法と同様に染色し、定量した。
なお、コントロールとして、Ｃ８〜１6ガラクトシド混合物を添加せずに同様の操作をした。
結果を表４に示す。ここでバイオフィルム量は、コントロールを１００とした場合の比率で示した。
【００４０】
【表４】
2006347941.tif 000006