(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも１つの有益な核酸配列を含み、この核酸配列の複製を可能にする領域が複製起点を含んでおり、この複製起点が機能するためには宿主細胞に外来の少なくとも１つの特異的タンパク質の存在が必要である、遺伝子治療に有用な環状ＤＮＡ分子の提供。該ＤＮＡ分子を取込んだ細胞及び遺伝子治療におけるその使用を目的とする。【解決手段】少なくとも１つの有益な核酸配列を含み、この核酸配列の複製を可能にする領域が複製起点を含んでおり、この複製起点が機能するためには宿主細胞に外来の少なくとも１つの特異的タンパク質の存在が必要である、遺伝子治療に有用な環状ＤＮＡ分子及び該ＤＮＡ分子の製造方法。【選択図】図５
2006136328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生するためのＤＮＡ分子の使用であって、前記ＤＮＡ分子が、遺伝子治療に有用な環状ＤＮＡ分子であって、標的真核細胞内でそれが転写及び翻訳されて治療用、ワクチン用、農学的または獣医学的に有益な物質を産生する少なくとも１つの治療的に有益な核酸配列及びその発現調節シグナルを含み、
（ａ）前記ＤＮＡ分子が条件複製起点であって、プラスミドまたはバクテリオファージに由来し、前記複製起点が原核細胞中で機能するためには前記プラスミドまたはバクテリオファージに特異的であり、かつ前記原核宿主細胞にとって外来の複製開始タンパク質が必要である条件複製起点を含有し、
（ｂ）前記環状ＤＮＡ分子が、前記複製開始タンパク質をコードする配列を含有せず、
（ｃ）前記ＤＮＡ分子が、選択マーカー遺伝子を含有し、且つ抗生物質耐性遺伝子を含有せず、
（ｄ）前記ＤＮＡ分子が、前記複製開始タンパク質を補充された細胞内のみで複製する
ことを特徴とする環状ＤＮＡ分子であるＤＮＡ分子の使用。
【請求項２】
条件複製起点が、複数のアイテロンによって表される複製起点を有しており且つその複製起点の機能を調節する少なくとも１つの複製開始タンパク質をコードしているプラスミドまたはバクテリオファージに由来することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項３】
条件複製起点が、ＲＫ２、Ｒ６Ｋ、Ｒ１、ｐＳＣ１０１、Ｒｔｓ１、Ｆ、ＲＳＦ１０１０、Ｐ１、Ｐ４、ラムダ、ファイ８２及びファイ８０から選択されるプラスミドまたはバクテリオファージに由来することを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項４】
前記複製起点が、細菌プラスミドＲ６Ｋに由来することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項５】
前記複製起点が、プラスミドＲ６Ｋのγ複製起点の全部またはそのコア部分を含むプラスミドＲ６Ｋのγ複製起点の一部から成ることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項６】
前記複製起点の全部または一部が、配列番号１の配列によって表されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項７】
前記ＤＮＡ分子を取込んだ宿主細胞を選択し得る領域が、抗生物質耐性遺伝子とは異なっていることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項８】
前記ＤＮＡ分子を取込んだ宿主細胞を選択し得る領域の全部または一部が、特異的コドンのサプレッサー転移ＲＮＡの発現カセットによって表されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項９】
前記発現カセットが、アンバーコドン（ＴＡＧ）のサプレッサーｔＲＮＡの発現カセットであることを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項１０】
更に、部位特異的リコンビナーゼの標的領域を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項１１】
部位特異的リコンビナーゼの前記標的領域が、トランスポゾンＴｎ３、Ｔｎ２１またはＴｎ５２２のリゾルベース、ミューバクテリオファージのインベルターゼ、ＲＰ４のｐａｒフラグメントによってコードされているリゾルベースから選択されるプラスミドのリゾルベース、ラムダ、ファイ８０、Ｐ２２、ＨＰ１のインテグラーゼから選択されるラムダバクテリオファージのインテグラーゼのファミリーのリコンビナーゼ、Ｐ１のＣｒｅインテグラーゼ、プラスミドｐＳＡＭ２のインテグラーゼ、プラスミド２μのＦＬＰリコンビナーゼ、大腸菌のリコンビナーゼＸｅｒＣ及びＸｅｒＤから選択され得ることを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項１２】
部位特異的リコンビナーゼの前記標的領域が、ＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメントまたは前記ｃｅｒフラグメントと同じ特性を有する、より小さいＨｐａＩＩ−ＴａｑＩフラグメントの全部または一部を含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項１３】
以下に示すプラスミドｐＸＬ２７７４：
【化１】
2006136328.tif 000023
であるか、または、プラスミドｐＸＬ２７７４から誘導されるルシフェラーゼ遺伝子をコードする核酸配列以外の１つまたは複数の有益な核酸配列を含んでいる任意の他の構築物であることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項１４】
有益な核酸配列が、薬品製造、農業生産または生体触媒作用に使用できる有益なタンパク質をコードしていることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。
【請求項１５】
−組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列と前記核酸配列の複製を可能にする領域とを含み、前記領域が複製起点を含み、前記複製起点が宿主細胞中で機能するためには前記宿主細胞にとって外来の少なくとも１つの特異的複製開始タンパク質の存在が必要である請求項１に記載の環状ＤＮＡ分子と、
−前記宿主細胞にとって外来の特異的複製起点の機能を調節する、ｉｎ  ｓｉｔｕ発現するかまたはしない複製開始タンパク質、とを少なくとも含む宿主細胞を培養し、次いで、産生された組換えタンパク質を回収することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
複製開始タンパク質をコードする遺伝子が追加レプリコン上に存在するかまたは前記細胞のゲノムに組込まれていることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が大腸菌の菌株から選択されることを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療または組換えタンパク質の産生に有用な条件複製型の新規なＤＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法は、病気に冒された細胞または器官に遺伝情報を導入することによって欠損または異常を矯正する治療方法である。遺伝情報を、器官から抽出した細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入し、生物体内に再導入してもよく、または、遺伝情報を標的となる組織に直接ｉｎ  ｖｉｖｏ導入してもよい。ＤＮＡは負電荷をもつ高分子量の分子であるため、リン脂質の細胞膜をＤＮＡが自然に透過することは難しい。従って、遺伝子導入を可能にするために種々のベクター、即ち、一方ではウイルスベクター、他方では天然または合成の化学的及び／または生化学的ベクターが利用されている。
【０００３】
ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス）は、特に膜透過のためには極めて有効であるが、病原性、組換え、複製、免疫原性のようないくつかの危険性をはらんでいる。
【０００４】
化学的及び／または生化学的ベクターではこのような危険性は存在しない（参考文献としては、Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｃｏｔｔｅｎ  ＆  Ｗａｇｎｅｒ，１９９３）。例えば、カチオン（リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、など）はＤＮＡと共に沈殿物を形成する作用を有しておりこの沈殿物は細胞の食作用によって“吸収”され得る。また、リポソームはその内部にＤＮＡを取込んで細胞質膜と融合する。合成の遺伝子導入用ベクターは一般には、ＤＮＡと複合体を形成しＤＮＡと共に表面に正電荷をもつ粒子を形成する脂質またはカチオン性ポリマーから成る。この種のベクターの代表例としては特に、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））またはＮ−〔１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）がある。
【０００５】
また、化学的及び／または生化学的ベクターまたはヌードＤＮＡを使用できれば、薬理学的純度のＤＮＡを大量に産生させることが可能になると考えられる。実際、遺伝子治療の技術においては、医薬がＤＮＡ自体から構成されている。従って、ヒトの治療に使用するために好適な特性を有するＤＮＡを十分な量で製造できることは必須要件である。
【０００６】
非ウイルス性ベクターの作製理論においては、細菌起原のプラスミドが使用される。遺伝子治療で一般的に使用されるプラスミドは、（ｉ）複製起点と、（ｉｉ）抗生物質（カナマイン、アンピシリン、など）耐性遺伝子のようなマーカー遺伝子と、（ｉｉｉ）発現に必要な配列（（１つまたは複数の）エンハンサー、（１つまたは複数の）プロモーター、ポリアデニル化配列など）をもつ１つまたは複数のトランスジーンとを保有している。
【０００７】
しかしながら、現在利用できる技術ではまだ十分に期待に応えることができない。
【０００８】
一方では、生体内伝播の危険性が残っている。例えば、生物体内に存在する細菌がこのプラスミドを受容する可能性は低頻度ではあるが存在する。ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子療法による治療の場合、ＤＮＡが患者の体内に伝播し、患者に感染している細菌または片利共生叢の細菌に接触し易いので、上記のような危険が発生する機会がそれだけ多くなる。プラスミド受容性細菌が大腸菌のような腸内細菌の場合、このプラスミドは複製される。このようなイベントが生じると治療用遺伝子が伝播される。遺伝子療法の治療に使用された治療用遺伝子が、例えばリンフォカイン、成長因子もしくは抗癌遺伝子をコードしている遺伝子であるか、または、宿主にその機能の欠損があり従って遺伝的障害を矯正し得るタンパク質をコードしている遺伝子であるような場合、これらの遺伝子のうちのいくつかの遺伝子については、その伝播が予測できない危険な結果を生じることがあるかもしれない（例えば、病原菌がヒト成長因子の遺伝子を獲得する場合が考えられる）。
【０００９】
他方では、非ウイルス性の遺伝子治療に一般的に使用されているプラスミドは、抗生物質（アンピシリン、カナマインなど）耐性マーカーも有している。従って、このようなプラスミドを獲得した細菌は選択上の明らかな利点を有している。何故なら、プラスミドの耐性遺伝子を選択する抗生物質と同じファミリーの抗生物質を使用した抗生剤療法による治療において常に問題のプラスミドが選択されるからである。この点で、アンピシリンは、全世界で最も頻用されている抗生物質のファミリーであるβ−ラクタムの一員である。従って、抗生物質耐性遺伝子でない選択マーカーを細菌中で使用することは特に有利であろう。これによって、このようなマーカーを保有しているプラスミドを受容した細菌の選択を回避できる。
【発明の開示】
【００１０】
従って、治療用遺伝子の伝播及び耐性遺伝子の伝播を最大限に抑制することが重要である。
【００１１】
より詳細には本発明の目的は、遺伝子治療または組換えタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生に使用でき、上記のような非ウイルス性ベクターのいくつかの機能を補完できる細胞中でのみ複製される新規なＤＮＡ分子を提供することである。
【００１２】
本発明はまた、これらのＤＮＡ分子を作製するための特に有効な方法に関する。
【００１３】
請求の範囲に記載されたＤＮＡ分子の利点は、プラスミドの伝播に関連した危険性、例えば、（１）治療用遺伝子のコントロールされない超発現につながる複製及び伝播、（２）耐性遺伝子の伝播及び発現、などが排除されることである。本発明のＤＮＡ分子に含まれている遺伝情報は詳細には、（１つまたは複数の）治療用遺伝子及びその発現調節シグナルと、このプラスミドの細胞宿主スペクトルを極めて厳密に限定する機能性条件複製起点と、好ましくは抗生物質耐性を与える遺伝子とは異なった小さい選択マーカーとを含み、必要な場合には更に、プラスミドのマルチマーを分解し得るＤＮＡフラグメントを含む。これらの分子（従ってこれらの分子が含んでいる遺伝情報）が微生物に導入され安定に維持されるという確率は極めて低い。
【００１４】
最後に、環状構造を有しており小さいサイズであり且つ超コイル形態を有しているという理由でミニプラスミドとも呼ばれる本発明のベクターは更に下記の利点を有している。即ち、本発明のＤＮＡ分子は従来から使用されているＣｏｌＥ１に由来のプラスミドに比べてサイズが小さいので、ｉｎ  ｖｉｖｏでより優れた生体内受容性を有していると推測できる。本発明のＤＮＡ分子は特に、改善された細胞内侵入及び細胞内分布の能力を有している。例えば、組織内の拡散係数は分子量に反比例することが認識されている（Ｊａｉｎ，１９８７）。細胞レベルでも同様に、高分子量の分子は細胞質膜に対する透過性が低い。更に、分子が発現するためにはプラスミドがコアに侵入することが不可欠であるが、コアに拡散できる分子のサイズは核孔によって制限されるので、高分子量の分子はやはり不都合である（Ｌａｎｄｆｏｒｄら，１９８６）。本発明によれば、
ＤＮＡ分子の非治療用部分（特に複製起点及び選択遺伝子）のサイズを短縮することによって、ＤＮＡ分子のサイズを更に短縮し得る。ベクターの複製起点及び耐性マーカーに相当する部分を例えば３ｋｂとすると、細菌中でこのプラスミドの複製及び選択を可能にする部分（１．１ｋｂ）は、１／３に短縮されている。本発明分子では、このような（ｉ）分子量の低減、及び、（ｉｉ）負電荷の低減によって、組織内、細胞内及び核内の拡散及び生体受容性に関する能力が改善されている。
【００１５】
より詳細には本発明は、少なくとも１つの有益な核酸配列を含み、その複製を可能にする領域が複製起点を含み、この複製起点が宿主細胞中で機能するためには宿主細胞に外来の少なくとも１つの特異的タンパク質の存在が必要であることを特徴とする、遺伝子治療に有用な環状形態のＤＮＡ分子に関する。
【００１６】
このＤＮＡ分子は一本鎖または二重鎖のいずれの形態を有していてもよく、好ましくは超コイル形態を有している。
【００１７】
本発明で使用された宿主細胞なる用語は、種々の起原の細胞を包含する。宿主細胞は真核細胞でもよくまたは原核細胞でもよい。本発明の有利な実施態様においては宿主細胞が原核細胞である。
【００１８】
従来から、細菌プラスミドの複製には、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの種類のような、細胞性宿主によってコードされた少なくとも１つのタンパク質の存在が必要である。この種の複製が行われる場合、前述した理由から、治療される生物体内における伝播という潜在的な危険から完全に逃れることはできない。本発明のＤＮＡ分子の複製起点は、機能するためには宿主細胞に外来の特異的なタンパク質の存在を要するという有利な特徴を有している。この特徴によって得られる利点は、請求の範囲に記載されたプラスミドの宿主スペクトルがこのイニシエータータンパク質を発現する特異的菌株に限定されることである。従って、本発明によって作製されたＤＮＡ分子は、いわゆる条件複製起点を有するという利点をもつ。
【００１９】
本発明で使用される条件複製起点は、以下の特徴を共通に有しているプラスミドまたはバクテリオファージに由来し得る。即ち、これらのプラスミドまたはバクテリオファージは、複製起点内に反復配列、即ちアイテロン（ｉｔｅｒｏｎ）を含んでおり、また、これらのプラスミドまたはバクテリオファージに特異的な少なくとも１つの複製開始タンパク質（Ｒｅｐ）をコードしている。プラスミド及びバクテリオファージの条件複製系の例を以下に示す。
【００２０】
【表１】
2006136328.tif 000003
【００２１】
本発明の好ましい実施態様によれば、請求の範囲に記載されたＤＮＡ分子中で使用される複製起点はＲ６Ｋと呼ばれる天然の大腸菌プラスミドに由来する。
【００２２】
Ｒ６Ｋの複製機能は、３つの複製起点α、β及びγ（γ及びβが複製の９０％を確保する）と、複製開始タンパク質π及びプロテインＢｉｓをコードするオペロンとを含む５．５ｋｂｐのＤＮＡフラグメントに集中している（図１参照）。このプラスミドを特有のコピー数（ゲノムあたり１５コピー）に維持するために必要な最小の遺伝情報は２つのエレメント、即ち、４００ｂｐのｏｒｉ（複製起点）γとイニシエータータンパク質πを産生するｐｉｒ遺伝子とに含まれている。
【００２３】
ｏｒｉγは、２つの機能性部分、即ち、コア領域とアクチベーターエレメントとに分割される（図１）。複製に必須のコア領域は、配列１で示されるπタンパク質が結合しているアイテロン（７個の２２ｂｐ直接反復配列）と、宿主のタンパク質標的であるフランキングセグメント（ＩＨＦ、ＤｎａＡ）とを含む。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、請求の範囲に記載されたベクターの複製起点の全部または一部はプラスミドＲ６ｋのこの複製起点γから構成されており、より好ましくはその全部または一部が配列１またはその誘導体の１つから構成されている。
【００２５】
本文中で使用された誘導体なる用語は、考察される配列に１つまたは複数の遺伝的及び／または化学的な修飾を加えることによって得られた配列であって、原配列に対して遺伝暗号の縮重性に基づく違いを有している任意の配列を意味し、また、このような配列もしくはこのような配列のフラグメントとハイブリダイズする配列であって、その産物が複製開始タンパク質πと同様の活性を有している任意の配列を意味している。遺伝的及び／または化学的修飾なる用語は、１つまたは複数の残基の突然変異、置換、欠失、付加および／または修飾を意味する。誘導体なる用語はまた、他の細胞性ソース、特にヒト起原もしくは他の生物の細胞から得られた原配列に相同の配列であって原配列と同じタイプの活性を有している配列を包含する。このような相同配列は、ハイブリダイゼーション実験によって得られる。ハイブリダイゼーションは、核酸バンクを出発物質とし、天然型配列またはそのフラグメントをプローブとして用い、好適な緊縮性条件（Ｍａｎｉａｔｉｓら，分子生物学の汎用技術（ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｇｅｎｅｒａｌｅｓ  ｄｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ）参照）、好ましくは高緊縮性条件下で行うことができる。
【００２６】
サイズが極めて小さいという利点を有する上記の複製起点は、ｐｉｒ遺伝子（配列２）の産物であるプロテインＰｉが特異的イニシエータータンパク質として存在するときにのみ機能し得る。このタンパク質はトランス作用できるので、ｐｉｒ遺伝子のｏｒｉガンマを物理的に分離し得る。従って、分離されたｏｒｉガンマは、これらのプラスミドの特異的宿主として選択された細胞のゲノムに導入され得る。πの内部の突然変異はその阻害機能を改変し（Ｉｎｕｚｕｋａ  ＆  Ｗａｄａ，１９８５）、Ｒ６Ｋの誘導体のコピー数を初期コピー数の１０倍以上に増加させ得る。これらの置換は４０個のアミノ酸から成るドメインに完全に内包されており、従って、πのこのドメインがプラスミドコピー数のコントロールを担当していると考えられる（図２）。
【００２７】
本発明の有利な実施態様によれば、宿主細胞中で発現されたπタンパク質は、配列２で表される遺伝子または前記に定義のようなその誘導体の１つ、より特定的にはｐｉｒ遺伝子に対して１つの突然変異を含む遺伝子ｐｉｒ１１６の発現によって産生される。この突然変異はロイシンによるプロリンの置換に対応する。この場合、Ｒ６Ｋの誘導体のコピーの数はゲノムあたり約２５０コピーである。
【００２８】
請求の範囲に記載されたＤＮＡ分子は、前記に定義のような条件複製起点を有することに加えて、選択された宿主中での
ＤＮＡ分子の選択を確保し得る１つ（または複数の）遺伝子を含む領域を有している。
【００２９】
この領域は、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、リビドマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える従来の遺伝子型マーカーであってもよい。
【００３０】
しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれば、この領域が抗生物質耐性遺伝子から構成されない。即ちこの領域は、定義された培養条件で対象宿主の生存に必須な物質を産生する遺伝子から構成される。その例としては、
−天然起原または合成起原のサプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子、より好ましくはアンバーコドン（ＴＡＧ）のｔＲＮＡ、
−いくつかの培養条件で細胞の代謝作用に必要な物質を産生する遺伝子、代謝産物（アミノ酸、ビタミンなど）の生合成に関与する遺伝子、培養培地中に存在する物質（特に窒素源または炭素源）を同化させ得る異化作用遺伝子、がある。
【００３１】
本発明の有利な実施態様によれば、この領域は、特異的コドンのサプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子の発現カセットを含む。サプレッサーｔＲＮＡは特に、フェニルアラニン、システイン、プロリン、アラニン及びヒスチジンのような塩基をコードするｔＲＮＡから選択される。より好ましいサプレッサーｔＲＮＡはアンバーコドン（ＴＡＧ）のサプレッサーｔＲＮＡである。
【００３２】
この特定の場合に、細胞性宿主内で本発明の目的であるＤＮＡ分子を選択するために使用される系は、２つのエレメント、即ち、（１）ＤＮＡ分子上で選択マーカーを構成するアンバーコドン（ＴＡＧ）のサプレッサー転移ＲＮＡをコードする遺伝子、即ち遺伝子（ｓｕｐ）と、（２）保有する複数の遺伝子のうちでいくつかの培養条件で必須である１つの遺伝子がアンバーコドンＴＡＧを含んでいるような特異的宿主とを含む。この細胞は、ＴＡＧコドンを含む遺伝子の産物を必須とする培養条件で、ｓｕｐの発現を許容するプラスミドが細胞中に存在するときにのみ増殖し得る。従って培養条件は、ＤＮＡ分子の選択圧を構成する。使用されるｓｕｐ遺伝子は、天然起原でもよく（Ｇｌａｓｓら，１９８２）、または、合成構築物から得られてもよい（Ｎｏｒｍａｎｌｙら，１９８６；Ｋｌｅｉｎａら，１９９０）。
【００３３】
このような系は、アンバー突然変異を含む遺伝子次第で種々の選択培地を決定し得るという点で極めて融通性が大きい。例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ菌中では、アンバーコドンはプリンの生合成遺伝子内に局在している。このため、細菌が牛乳中で増殖するときに、サプレッサーｔＲＮＡをコードする遺伝子のキャリアープラスミドを選択し得る。このようなマーカーは、極めて小さいサイズであり、また、ファージまたはトランスポゾンに由来する“外来”配列を含まないという利点を有している。
【００３４】
本発明の特定実施態様によれば、ＤＮＡ分子は更に、プラスミドのマルチマーを分解し得る部位特異的リコンビナーゼの標的となるＤＮＡフラグメントを含む。
【００３５】
従って、環状ＤＮＡ分子に導入されその複製起点が例えば
ｏｒｉガンマであるこのようなフラグメントは、このようなプラスミドのマルチマーを分解し得る。このようなマルチマーは特に、ｐｉｒ−１１６のような、Ｒ６Ｋ誘導体のコピー数を増加させ得るｐｉｒの変異型対立遺伝子を保有する菌株中でＤＮＡ分子が調製されるときに観察される。
【００３６】
この組換えは、配列間の部位特異的組換えを惹起する種々の系を用いて行うとよい。より好ましくは、本発明の部位特異的組換えは、一般にリコンビナーゼと呼ばれる特異的タンパク質の存在下で互いに組換えられる特異的分子間組換え配列によって得られる。本発明では特にリコンビナーゼＸｅｒＣ及びＸｅｒＤが使用される。このような理由で、本発明のＤＮＡ分子は一般に、この部位特異的組換えを可能にする配列を更に含んでいる。本発明の遺伝子構築物中に存在する特異的組換え系（リコンビナーゼ及び特異的認識部位）は種々の起原から得られた系でよい。特に、使用される特異的配列及びリコンビナーゼは構造的に異なるクラスに所属してもよく、特にトランスポゾンＴｎ３のリゾルベースのファミリーまたはラムダバクテリオファージのインテグラーゼのファミリーに所属してもよい。トランスポゾンＴｎ３のファミリーに所属するリコンビナーゼとしては、特に、トランスポゾンＴｎ３のリゾルベースまたはトランスポゾンＴｎ２１及びＴｎ５２２のリゾルベース（Ｓｔａｒｋら，１９９２）、ミューバクテリオファージのインベルターゼＧｉｎ、または、ＲＰ４のｐａｒフラグメントのリゾルベースのようなプラスミドのリゾルベース（Ａｂｅｒｔら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２（１９９４）１３１）がある。λバクテリオファージのインテグラーゼのファミリーに所属するリコンビナーゼとしては特に、ラムダファージのインテグラーゼ（Ｌａｎｄｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７（１９７７）１１４７）、ファージＰ２２及びφ８０のインテグラーゼ（Ｌｅｏｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）４４６８）、インフルエンザ菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨＰ１（Ｈａｕｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）６８５９）、Ｐ１ファージのインテグラーゼＣｒｅ、プラスミドｐＳＡＭ２のインテグラーゼ（欧州特許３５０３４１）、または、プラスミド２μのリコンビナーゼＦＬＰ、大腸菌のリコンビナーゼＸｅｒＣ及びＸｅｒＤがある。
【００３７】
より好ましくは、本発明の目的であるＤＮＡ分子は、大腸菌の天然プラスミドＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメントを含んでいる。使用されるｃｅｒフラグメントはＣｏｌＥ１の３８２ｂｐのＨｐａＩＩフラグメントであり、このフラグメントがシス作用によってプラスミドのマルチマーを分解し得ることは証明されていた（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９８４；Ｌｅｕｎｇら，１９８５）。また、同じ特性を有しているより小さいサイズ（２８０ｂｐ）のＨｐａＩＩ−ＴａｑＩフラグメント、または、フラグメントＨｐａＩＩの内部に含まれている更に小さいフラグメント（約２２０ｂｐ）を使用することも可能である（Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＆  Ｓｈｅｒｒａｔｔ，１９８８）。この分解は、大腸菌のゲノムによってコードされている４つのタンパク質：ＡｒｇＲ、ＰｅｐＡ、ＸｅｒＣ及びＸｅｒＤが関与する特異的分子間組換えを介して行われる（Ｓｔｉｒｌｉｎｇら，１９８８，１９８９；Ｃｏｌｌｏｍｓら，１９９３；Ｂｌａｋｅｌｙら，１９９３）。
【００３８】
このため、ＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメントまたは前記に定義のようなその誘導体の１つの全部または一部を使用するのが特に有利である。
【００３９】
変形実施態様によれば、本発明のＤＮＡ分子は更に、リガンドと特異的に相互作用し得る配列を含み得る。より好ましくはこの配列は、ハイブリダイゼーションによって特異的オリゴヌクレオチドと共に三重らせんを形成し得る配列である。従ってこの配列は、支持体に固定化された相補的オリゴヌクレオチドとの選択的ハイブリダイゼーションによって本発明の分子を精製し得る（国際特許出願ＷＯ９６／１８７４４参照）。この配列は有益な遺伝子及び複製起点の機能に影響を与えないという条件で本発明のＤＮＡ分子の任意の部位に配置され得る。
【００４０】
本発明のＤＮＡ分子の代表例として特に、プラスミドｐＸＬ２７７４及びその誘導体を挙げることができる。この場合の誘導体という用語は、ｐＸＬ２７７４に由来しルシフェラーゼ遺伝子以外の１つまたは複数の有益な遺伝子を含む任意の構築物を意味する。本発明のＤＮＡ分子としてはまた、治療用遺伝子の発現カセットとリガンドに特異的に相互作用し得る配列とを含むプラスミドｐＸＬ３０２９及び３０３０を挙げることができる。
【００４１】
本発明はまた、これらの治療用ＤＮＡ分子を産生させるために特に有効な特異的細胞性宿主の構築方法に関する。
【００４２】
本発明の別の目的は、環状ＤＮＡ分子の製造方法であって、前記に定義のような少なくとも１つのＤＮＡ分子と、ｉｎ  ｓｉｔｕ発現されるか否かによって宿主細胞に外来の特異的ＤＮＡ分子の複製起点の機能を左右する１つのタンパク質とを含む宿主細胞を、このＤＮＡ分子によって形質転換された宿主細胞を選択し得る条件で培養することを特徴とする方法を提供することである。
【００４３】
より好ましくは、ＤＮＡ分子の複製起点の機能を左右するタンパク質は、対応する遺伝子からｉｎ  ｓｉｔｕ発現される。複製開始タンパク質をコードする遺伝子は、使用される条件複製起点の誘導体に和合性の追加レプリコンによって担持されてもよく、または、トランスポゾン、バクテリオファージまたは他の任意のベクターを用いた組換えによって宿主細胞に導入されてもよい。特に、タンパク質を発現する遺伝子が追加レプリコンに配置されている場合には、この追加レプリコンは更に、細胞内機能性の転写プロモーター領域と、３′に位置する転写終了シグナル特定領域とを含む。プロモーター領域は、細胞内で機能し得るときに考察中の遺伝子を発現させる天然のプロモーター領域でもよい。プロモーター領域はまた、異なる起原の領域でもよい（他のタンパク質の発現を担当する領域でもよくまたは合成の領域であってもよい）。特に、原核細胞遺伝子またはバクテリオファージ遺伝子のプロモーター配列でもよい。例えば、プロモーター領域は、細胞のゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。
【００４４】
複製開始タンパク質をコードする遺伝子としては、野生型遺伝子を使用してもよく、または、ＤＮＡ分子中に使用された複製起点の機能を左右するイニシエータータンパク質の特異的プラスミド（または誘導体）が増加コピー数で得られる変異型対立遺伝子を使用してもよい。
【００４５】
このような突然変異体としては特に、Ｒ６Ｋ（ｉｎｕｚｕｋａ  ＆  Ｗａｄａ，１９８５；Ｇｒｅｅｎｅｒら，１９９０），Ｒｔｓ１（Ｔｅｒａｗａｋｉ  ＆  Ｉｔｏｈ，１９８５；Ｔｅｒａｗａｋｉら，１９９０；Ｚｅｎｇら，１９９０）；Ｆ（Ｓｅｅｌｋｅら，１９８２；Ｈｅｌｓｂｅｒｇら，１９８５；Ｋａｗａｓａｋｉら，１９９１），ＲＫ２（Ｄｕｒｌａｎｄら，１９９０；Ｈａｕｇａｎら，１９９２，１９９５），ｐＳＣ１０１（Ｘｉａら，１９９１；Ｇｏｅｂｅｌら，１９９１；Ｆａｎｇら，１９９３）などのプラスミドに関するものが記載されている。
【００４６】
特に、使用されるＤＮＡ分子がプラスミドＲ６ｋに由来の複製起点を有している場合、イニシエータータンパク質はこの同じプラスミドのπタンパク質であるかまたはπタンパク質の誘導体である。初期コピー数を顕著に増加させ得るこのタンパク質の突然変異形態を発現させるのが特に有利である。このために、宿主細胞の処に組込まれる遺伝子は好ましくは、配列２で表される配列の全部もしくは一部またはその誘導体の１つの全部もしくは一部によって表され、より好ましくは遺伝子ｐｉｒ１１６によって表される。関連する突然変異は、ロイシンによるプロリンの置換に対応する。本発明の特定実施態様によれば、この遺伝子ｐｉｒ１１６は宿主細胞のゲノムに直接に取込まれる。
【００４７】
選択された培養条件に必須である特異的細胞性宿主の遺伝子の１つが、選択されたサプレッサーｔＲＮＡによって認識され得る特異的コドンをＤＮＡ分子の処に含むのが有利である。本発明の好ましい実施態様によれば、この特異的コドンはアンバーコドンＴＡＧである。この特定の場合には細胞は、ＴＡＧコドンを含む遺伝子の産物が必須であるという培養条件下でｓｕｐを発現させ得るプラスミドが宿主細胞中に存在するときにのみ増殖し得る。従って、培養条件がＤＮＡ分子の選択圧を構成する。
【００４８】
好ましくは、アンバーコドンを含む遺伝子は、アルギニンというアミノ酸の生合成に関与する遺伝子である。この遺伝子ａｒｇＥは、Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードしており（Ｍｅｉｎｎｅｌら，１９９２）、この場合には点突然変異Ｇｌｎ−５３（ＣＡＧ）→ＴＡＧに対応するＴＡＧコドンを含む。この場合に、ｓｕｐ遺伝子を担持するプラスミドの選択圧は最少培地Ｍ９（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）中での培養によって確保される。しかしながらまたアンバーコドンを含む遺伝子が、例えば、ビタミンの生合成遺伝子、核酸の１つの塩基、特別な炭素源もしくは窒素源を使用し得る遺伝子、または、選択された培養条件下で細胞が生存するためにその機能が必須である他の任意の遺伝子であってもよい。
【００４９】
宿主細胞は好ましくは大腸菌の菌株から選択され、より好ましくは大腸菌ＸＡＣ−１株で表される。
【００５０】
本発明の特定実施態様によれば、請求の範囲に記載の方法で使用される宿主細胞は、遺伝子ｐｉｒ１１６をそのゲノムに含んでおりプラスミドｐＸＬ２７７４またはその誘導体の１つによって形質転換された大腸菌ＸＡＣ−１株の細胞である。
【００５１】
本発明の有利な変形例によれば、請求の範囲に記載の方法で使用される宿主細胞は、ｅｎｄＡ１遺伝子または相同遺伝子が失活している原核細胞である。ｅｎｄＡ遺伝子は大腸菌のエンドヌクレアーゼＩをコードしている。このペリプラズム酵素は二重鎖ＤＮＡの非特異的切断活性を有している（Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．，Ｇ．Ｇ．Ｒｏｕｓｓｏｓ  ＆  Ｅ．Ａ．Ｐｒａｔｔ（１９６２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３７：８１９−８２８；Ｗｒｉｇｈｔ  Ｍ．（１９７１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０７：８７−９４）。大腸菌の種々の菌株（野生型またはｅｎｄＡ）に対して行った研究は、これらの細菌の菌株の抽出物中でインキュベートされたプラスミドＤＮＡの分解はｅｎｄＡ＋菌株中には存在していたが、ｅｎｄＡ突然変異体には存在していなかったことが証明された（Ｗｎｅｎｄｔ  Ｓ．（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２７０−２７２）。ｅｎｄＡ＋菌株またはｅｎｄＡ突然変異体から単離されたプラスミドＤＮＡの品質についてはＰｒｏｍｅｇａ社が彼らの精製システムを用いて研究した（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｅｎｄｅｚ，Ｄ．Ｓｔｏｒｔｓ，Ｅ．Ｐｏｒｔｍａｎ，Ｂ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎ  ＆  Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，１９９５，ウィザードプラスミド精製システムで単離したＤＮＡの品質に対してｅｎｄＡ１遺伝子型を保有する細菌株が与える効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｄＡ１  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｗｉｚａｒｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ），Ｐｒｏｍｅｇａ  ｎｏｔｅｓ  ５３）。彼らはその研究から以下のような結論を導いた。即ち、ｅｎｄＡ突然変異体から調製されたＤＮＡの品質は試験したｅｎｄＡ＋菌株中で調製されたＤＮＡの品質よりも総体的に優れている。
【００５２】
従ってプラスミドＤＮＡ調製物の品質はこのエンドヌクレアーゼの混入によって影響を受ける（多少とも長期のＤＮＡの分解）。
【００５３】
ｅｎｄＡ遺伝子の欠失または突然変異は、このエンドヌクレアーゼの活性を喪失した突然変異体が全体としては野生型細菌のような挙動を示すという程度であれば問題なく計画できる（Ｄｕｒｗａｌｄ，Ｈ．＆  Ｈ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：３３１−３４６）。
【００５４】
ｅｎｄＡ１遺伝子は突然変異、完全欠失または部分的欠失、破壊、などによって失活し得る。特にプラスミドｐＣＯＲを作製するために選択された大腸菌の菌株のｅｎｄＡ遺伝子の失活は、Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ  ＆  Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌによって記載されているように（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ｐ．Ｐ．＆  Ｗ．Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ，１９９５，抗生物質耐性決定基のＦｌｐ触媒切除を任意に伴う大腸菌：ＴｃＲ及びＫｍＲカセット中の遺伝子破壊（Ｇｅｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ＴｃＲ  ａｎｄ  ＫｍＲ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｐ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）Ｇｅｎｅ１５８：９−１４）、バクテリオファージＰ１によって欠失ΔｅｎｄＡ：：ＴｃＲを導入することによって行われるか、または、例えば相同的組換えを用い、有益な細菌のゲノム中に存在する野生型対立遺伝子をｅｎｄＡが突然変異または欠失した対立遺伝子に交換することによって行われる。本発明によれば、この種の菌株の使用によって産生ＤＮＡの品質を向上させるという利点が得られる。
【００５５】
本発明はまた、上記に定義のようなＤＮＡ分子を含む任意の組換え細胞に関する。本発明の組換え細胞は真核細胞、原核細胞のタイプの種々の起原の細胞である。
【００５６】
これらの細胞は、プラスミドを所与の細胞に導入し得る当業者に公知の任意の技術によって得られる。これらの技術としては特に、形質転換、電気穿孔、コンジュゲーション、プロトプラスト融合または当業者に公知の他の任意の技術がある。
【００５７】
本発明のＤＮＡ分子は、ワクチン接種または細胞の遺伝子治療のような任意の用途で、遺伝子を生物、組織または所与の細胞の内部に導入するために、または、組換えタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造するために使用され得る。
【００５８】
本発明のＤＮＡ分子は特に、該ＤＮＡ分子を患者に移植する目的で、ｉｎ  ｖｉｖｏの直接投与によって使用されてもよく、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ即ちｅｘ  ｖｉｖｏの細胞修飾によって使用されてもよい。
【００５９】
この観点から、本発明の別の目的は、上記に定義の少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む任意の医薬組成物に関する。医薬組成物中でこの分子は化学的及び／または生化学的なトランスフェクションベクターに結合されていてもよく結合されていなくてもよい。このようなベクターとしては特に、カチオン（リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなど）、リポソームがある。結合される合成ベクターは、脂質でもよくまたはカチオン性ポリマーでもよい。このようなベクターの例としては特に、ＤＯＧＳ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））またはＤＯＴＭＡ（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））がある。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、外用、経口、非経口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮などの経路で投与される製剤の形態に調製され得る。好ましくは、請求の範囲に記載のプラスミドを注射可能形態で使用するかまたは塗布によって使用する。注射可能な製剤、特に治療すべき部位の処に直接注射可能な製剤を得るために、医薬的に許容される任意のビヒクルをプラスミドと混合するとよい。特に、等張性無菌液、または、乾燥組成物特に凍結乾燥組成物の形態の製剤が好ましく、乾燥組成物は、無菌水または生理的血清を適宜添加することによって注射可能な溶質を復元し得る。特に、ブドウ糖または塩化ナトリウムに希釈したトリスバッファまたはＰＢＳバッファを使用し得る。患者の患部への直接注入は、疾病組織の処に治療効果を集中させることができるので特に有利である。使用される薬用量は、種々のパラメーター、特に遺伝子、ベクター、使用される投与形態、対象となる疾病または必要な治療期間、などに応じて選択される。
【００６１】
本発明のＤＮＡ分子は、１つまたは複数の有益な遺伝子、即ち、標的細胞中で転写及び任意に翻訳されることによって治療用、ワクチン用、農学的または獣医学的に有益な物質を産生する１つまたは複数の核酸（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成または半合成ＤＮＡなど）を包含し得る。
【００６２】
治療的に有益な遺伝子としては特に、酵素；血液誘導体；ホルモン；インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦなどのリンホカイン（フランス特許第９２０３１２０号）；成長因子；神経伝達物質、その前駆体もしくはその合成用酵素；ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３などの栄養因子；ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなどのアポリポタンパク質（フランス特許第９３０５１２５号）；ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（フランス特許第９１１１９４７号）；ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖなどの腫瘍抑制遺伝子（フランス特許第９３０４７４５号）；ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子などの凝固関与因子をコードする遺伝子；チミジンキナーゼ、シトシンデスアミナーゼなどの自殺遺伝子；天然もしくは人工の免疫グロブリンの全部もしくは一部（Ｆａｂ、ＳｖＦｖなど）；リガンドＲＮＡ（国際特許ＷＯ９１／１９８１３）などを例示し得る。治療用遺伝子はまた、標的細胞中で発現することによって遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写をコントロールできる遺伝子またはアンチセンス配列であってもよい。このような配列は例えば、欧州特許第１４０３０８号に記載の技術に従って標的細胞中に細胞性ｍＲＮＡの相補的ＲＮＡとして転写され、細胞性ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻害する。
【００６３】
有益な遺伝子はまた、ワクチン用遺伝子、即ち、ワクチンを製造するためにヒトまたは動物の体内で免疫応答を誘発し得る抗原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。このような遺伝子としては特に、エプスタイン・バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂウイルス（欧州特許第１８５５７３号）、偽狂犬病ウイルスの特異的抗原性ペプチド、または、腫瘍特異的遺伝子（欧州特許第２５９２１２号）がある。
【００６４】
一般的に、本発明のＤＮＡ分子中の治療用、ワクチン用、農学的または獣医学的に有益な遺伝子は更に、標的細胞または標的生物中の機能性転写のプロモーター領域と、転写終了シグナルを特定する３′に位置する領域と、ポリアデニル化部位とを含んでいる。このプロモーター領域は、考察される遺伝子が発現するために当該細胞中または生物体内で機能することが必要な天然のプロモーター領域であってもよい。プロモーター領域はまた、異なる起原の領域（他のタンパク質を発現させるために必要な領域または合成領域）であってもよい。プロモーター領域は特に、真核細胞遺伝子またはウイルス遺伝子のプロモーター配列でもよい。例えばプロモーター配列が標的細胞のゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。真核細胞プロモーターのうちでは、遺伝子の転写を特異的または非特異的に、誘導的または非誘導的に、高度にまたは低度に刺激または抑制する任意のプロモーターまたは誘導配列を使用し得る。特に、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ＰＧＫ、α−アクチン、チューブリンなどの遺伝子のプロモーター）、中間フィラメントのプロモーター（ＧＦＡＰ、デスミン（ｄｅｓｍｉｎｅ）、ビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎｅ）、ニューロフィラメント、ケラチンなどのプロモーター）、治療用遺伝子のプロモーター（例えば、ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、ＶＩＩＩ因子、ＡｐｏＡＩなどの遺伝子のプロモーター）、組織特異的プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、腸内の脂肪酸結合タンパク質、平滑筋のα−アクチンなどの遺伝子のプロモーター）、あるいは、刺激に反応するプロモーター（ステロイドホルモンのレセプター、レチノイン酸のレセプターなど）を例示し得る。また、例えばアデノウイルスの遺伝子Ｅ１Ａ及びＭＬＰのプロモーター、ＣＭＶの初期プロモーターまたはＲＳＶのＬＴＲのプロモーターなどのようなウイルスのゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。更に、これらのプロモーター領域は、活性化配列もしくは調節配列の付加によって、または、組織特異的発現もしくは多数発現を可能にする配列の付加によって修飾されてもよい。
【００６５】
更に、有益な遺伝子はまた、合成された産物を標的細胞の分泌経路に導くシグナル配列を含み得る。このシグナル配列は、合成された産物の天然シグナルでもよいが、他の任意の機能性シグナル配列でもよくまたは人工のシグナル配列でもよい。
【００６６】
有益な遺伝子次第で、本発明のＤＮＡ分子は、遺伝性疾患（ジストロフィー、嚢胞性線維症など）、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳなど）、癌、凝固異常または脂肪タンパク質異常血症に関連する疾病、ウイルス感染に関連する疾病（肝炎、エイズなど）を含む多くの疾病の治療または予防に使用でき、あるいは農学及び獣医学の分野で使用できる。
【００６７】
更に、本発明はまた、組換えタンパク質を製造するための条件複製型ＤＮＡ分子の使用に関する。細菌は、種々の起原の真核細胞または原核細胞のタンパク質を製造するために使用され得る。細菌のうちでも大腸菌は、操作が容易であること、入手できる発現系の数が多いこと、大量のタンパク質が得られること、などの理由から、異種遺伝子を発現させるための最も優れた生物である。勿論、本発明の系は、その向性が前述のように複製起点の種類によって決定されるので他の生物中でも使用できる。この使用に好適な有益な核酸配列は、選択された宿主、特に原核細胞宿主に適した発現シグナルのコントロール下のコーディング領域を含んでいる。例えば、プロモーターＰｌａｃ、Ｐｔｒｐ、ＰＴ７、Ｐｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ、シャイン・ダルガーノ配列、などである（この全体が発現カセットを構成する）。有益な核酸配列は、薬学、農業生産、化学または農芸化学の分野で有益であるタンパク質をコードするいかなる配列でもよい。例えば、構造遺伝子、相補的ＤＮＡ配列、合成配列または半合成配列、などがある。
【００６８】
発現カセットは、本発明の目的である条件複製型ベクターに導入でき、従って大腸菌中で有益なタンパク質を発現させ得る条件複製型ベクターを構成する。このベクターは、細菌中で選択するための抗生物質が不要である（コストを削減できる、最終産物中で抗生物質または潜在的に有毒な誘導産物の存在を試験する必要がない）こと、その特性（条件複製起点を有するいう特性）の当然の結果としてプラスミドが伝播する確率は実質的に零であること、完全に規定された培地中で発酵させることが可能であること、などの複数の利点を有している。提示された実施例は、組換えタンパク質を産生させるためにこれらの条件複製型ベクターが有している有利な特性を証明する。
【００６９】
本発明を実施例に基づいてより十分に以下に説明する。これらの実施例が非限定的代表例であることを理解されたい。
【００７０】
（１）培養培地
完全培地ＬＢ、２ＸＴＹ及びＳＯＣ、最少培地Ｍ９（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら，１９８９）を使用した。１５ｇのＧｉｆｃｏ寒天の添加によってゲル化した培地を得た。更に、必要な場合には、抗生物質アンピシリンまたはカナマイシンを夫々１００ｍｇ／リットル及び５０ｍｇ／リットルの濃度で培地に補充した。発色性基質Ｘ−Ｇａｌ及びＸ−Ｇｌｕｃを濃度４０ｍｇ／リットルで使用した。
【００７１】
（２）大腸菌株、プラスミド及びバクテリオファージ
使用した大腸菌株、プラスミド及びバクテリオファージは夫々以下の実施例に特定する。
【００７２】
（Ｂ）方法
（１）ＤＮＡの操作
細菌ＤＮＡ（プラスミド、ゲノム）及びファージＤＮＡ
（Ｍ１３の複製形態）の単離、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ＤＮＡフラグメントの結合、アガロースゲル電気泳動（ＴＢＥバッファ中）及びその他の標準技術は、提供業者による酵素使用に関する指示通りに行うか、または、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）に記載のプロトコルに従って行った。
【００７３】
電気泳動で使用されるＤＮＡのサイズマーカーは、直鎖状フラグメントに対しては１ｋｂｐの標準（ＢＲＬ）、非消化プラスミドに対しては超コイルＤＮＡマーカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
【００７４】
配列決定は、Ｓａｎｇｅｒの技術（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７）を、蛍光性ジデオキシヌクレオチドとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとを用いる全自動方法（ＰＲＩＳＭ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＤｙｅＤｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に応用して行った。
【００７５】
使用したオリゴデオキシヌクレオチド（以下に配列番号で示す）は、シンセサイザー“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ”を使用し、β−シアノエチル保護基（Ｓｉｎｈａら，１９８４）を用いるホスホラミジット法によって合成した。合成後、アンモニア水で処理して保護基を除去した。２回のブタノール沈殿によってオリゴヌクレオチドを精製し濃縮することが可能である（Ｓａｗａｄｏｇｏら，１９９１）。
【００７６】
ＰＣＲ増幅に使用されたオリゴヌクレオチド配列
配列３：５′−ＧＡＣＣＡＧＴＡＴＴＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＴＧＡＧ−３′
配列４：５′−ＧＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＴＣＣＣ−３′
配列５：５′−ＣＴＣＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧ−３′
配列６：５′−ＧＣＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧ−３′
【００７７】
ＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉら，１９８５）は、総量１００μｌ中で以下の条件で実施した。反応混合物は、試験すべき菌株の１５０ｎｇのゲノムＤＮＡと、各１μｇの２つのオリゴヌクレオチドプライマー（２４ｍｅｒ）と、“５００ｍＭのＫＣｌと０．１％のゼラチンと２０ｍＭのＭｇＣｌ２と１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５”とから成る組成の１０μｌの１０ＸＰＣＲバッファと、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）とを含む。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＣｅｔｕｓのＤＮＡサーマルサイクラー装置におけるＰＣＲ条件は、９１℃で２分間維持し、変性（９１℃で１分）、ハイブリダイゼーション（４２℃で２分）及び伸長（７２℃で３分）から成るサイクルを連続３０サイクルを実施し、最後に７２℃で５分維持するという条件である。このようにして得られた産物を制限酵素で消化するかまたは非消化でアガロースゲル電気泳動によって分析する。
【００７８】
ＤＮＡトポイソメラーゼによる多様なプラスミド種の分析は以下のプロトコルで行った。実験室で精製した酵素を３７℃で１時間インキュベートする。反応混合物（総量：４０μｌ）の組成は、１５０ｎｇのプラスミドと、３００ｎｇのＤＮＡトポイソメラーゼＩもしくは１５０ｎｇの大腸菌ＤＮＡジャイレースまたは１６０ｎｇのＳ．ａｕｒｅｕｓのＤＮＡトポイソメラーゼＩＶと、各酵素に特異的な２０μｌのバッファとから成る。これらのバッファの組成を以下に示す。
【００７９】
ＤＮＡトポイソメラーゼＩに対しては：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．７、４０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＳＡＢ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ；
ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶに対しては：６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．７、６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＳＡＢ、１．５ｍＭのＡＴＰ、３５０ｍＭのグルタミン酸カリウム；
ＤＮＡジャイレースに対しては：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．７、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＳＡＢ、２０ｍＭのＫＣｌ。
【００８０】
（２）大腸菌の形質転換
大腸菌の形質転換はＣｈｕｎｇ  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）
によって記載されたＴＳＢ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、形質転換及び蓄積バッファ）の方法に従って常法で行った。ＴＧ１のような菌株（Ｇｉｂｓｏｎら，１９８４）の場合、得られる形質転換効率は１μｇのｐＵＣ４Ｋあたり約１０５−１０６の形質転換体が得られる割合である（Ｖｉｅｉｒａ  ＆  Ｍｅｓｓｉｎｇ；１９８２）。もっと高い形質転換効率が必要な場合には、エレクトロポレーターを製造業者（Ｂｉｏｒａｄ）の推薦するプロトコルに従って用いた電気穿孔によって細菌を形質転換した。この方法によれば、１μｇのｐＵＣ４Ｋあたり１０８−１０１０の形質転換体が得られる効率を達成し得る。
【００８１】
（３）カチオン性リポフェクタントによって媒介される細胞性トランスフェクション
使用される細胞は、前日に２４ウェルのプレートにウェルあたり５０，０００細胞の密度で播種されたマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３である。使用される培養培地は、４．５ｇ／リットルのブドウ糖を含み１０％のウシ胎仔血清と１％の２００ｍＭのグルタミン溶液と抗生物質（ストレプトマイシン５×１０３単位／ｍｌ、ペニシリン５×１０３μｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）とを加えたＤＭＥＭ培地である。プラスミドＤＮＡ（２５μｌの０．９％ＮａＣｌ中に１μｇ）を同量のリポフェクタントの懸濁液に混合する。“リポフェクタントの電荷／ＤＮＡの電荷”の比が０、３、６及び９の４つの値である場合を試験する。これらの比は、１μｇのプラスミドＤＮＡが３．１ナノモルの負電荷を有し、リポフェクタントが分子あたり３つの正電荷を含むと考えて計算する。ＤＮＡ／脂質複合体を形成し得る１０分間の接触後に、５０μｌのＤＮＡ−リポフェクタント混合物を無血清培養培地（５００μｌ）中の細胞に導入する。細胞を同じ培地で予め２回洗浄しておいた。これによって血清によるトランスフェクション阻害が防止される。インキュベーション（ＣＯ２含有インキュベータ内で３７℃で２時間）後に、１０％のウシ胎仔血清を培地に加える。次いで、細胞を再度２４時間インキュベートする。
【００８２】
（４）真核細胞のルシフェラーゼ活性の測定
ルシフェラーゼ活性の測定はトランスフェクションの２４時間後に行う。ルシフェラーゼは、ＡＴＰとＭｇ２＋とＯ２との存在下でルシフェリンの酸化を触媒し、これに伴って光子を発生させる。光度計（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｅ）によって測定された全発光量はサンプルのルシフェラーゼ活性に比例する。
【００８３】
Ｐｒｏｍｅｇａによって提供された反応体（ルシフェラーゼアッセイシステム）をＰｒｏｍｅｇａが勧めるプロトコルに従って使用する。細胞溶解後に各抽出物の不溶性画分を遠心分離によって除去する。細胞溶解バッファに希釈するかまたは非希釈の５μｌの上清をアッセイに用いる。
【００８４】
（３）細胞抽出物のタンパク質濃度の測定
この測定は、二シンコニン酸（Ｗｉｅｃｈｅｌｍａｎら，１９８８）を用いるＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って行う。溶菌バッファ中でＳＡＢ標準を作成する（ＩＩＩ−Ｂ−４参照）。アッセイサンプル及び標準サンプルを、同量の０．１Ｍのヨードアセトアミドを含む０．１Ｍのトリスバッファ，ｐＨ８．２によって３７℃で１時間予備処理する。この処理によれば、アッセイのときに溶菌バッファ中に存在する還元剤（ＤＴＴ）の干渉を防止し得る。５６２ｎｍでアッセイの読取りを行う。
【実施例１】
【００８５】
相同的組換えによる宿主菌株ＸＡＣ−１ｐｉｒ及びｐｉｒ−１１６の構築
使用される菌株は大腸菌ＸＡＣ−１株である（Ｎｏｒｍａｎｌｙら；１９８０）。この菌株の利点は、この菌株のａｒｇＥ遺伝子のグルタミン−５３（ＣＡＧ）がアンバーコドン（ＴＡＧ）に突然変異していることである（Ｍｅｉｎｎｅｌら，１９９２）。ａｒｇＥ遺伝子は分岐オペロンａｒｇＥＣＢＨに所属しており、アルギニンの生合成酵素、Ｎ−アセチルオルニチナーゼをコードしている。従って、ＸＡＣ−１はアルギニンを合成せず、その結果として最少培地中で増殖できない。菌株がサプレッサーｔＲＮＡの発現を許容するプラスミドを含んでいるならば、この栄養要求性は除去されるであろう。従って、最少培地中で培養することによってこのようなプラスミドを保有する細菌を選択することが可能である。Ｒ６Ｋに由来のプラスミドを細菌中で複製可能にするためには、相同的組換えによってｐｉｒ遺伝子をＸＡＣ−１のゲノムに導入することが必要であった。
【００８６】
ｐｉｒ遺伝子（野生型または突然変異型）は、野生型ｕｉｄＡ遺伝子をｐｉｒ（またはｐｉｒ−１１６）遺伝子を割込ませているコピーで置換することによって遺伝子座ｕｉｄＡに導入される。ｕｉｄＡ遺伝子はβ−グルクロニドの加水分解酵素であるβ−グルクロニダーゼをコードしている。この遺伝子は、β−グルクロニドが使用されていない従来の合成培地中では増殖に必須ではないので失活させても問題はない。更に、β−グルクロニダーゼ活性は、加水分解によって青色顔料を放出する発色性基質Ｘ−Ｇｌｕｃによって追跡できる。
【００８７】
（１）カセット“ＫｍＲ−ｕｉｄＡ：：ｐｉｒ（またｐｉｒ−１１６）を保有している自殺ベクターの構築
細菌宿主を単独で使用し、有益な菌株のゲノムの修飾を最小にする戦略を使用した。ファージＭ１３ｍｐ１０（Ｍｅｓｓｉｎｇ  ＆  Ｖｉｅｉｒａ；１９８２）を自殺ベクター（Ｂｌｕｍら，１９８９）として使用した。複製に必須の遺伝子ＩＩ中のアンバー突然変異は、このＭ１３の宿主スペクトルを、アンバーのサプレッサーｔＲＮＡを産生するＴＧ１（ｓｕｐＥ）のような菌株に限定する。従って、Ｍ１３はＸＡＣ−１のような大腸菌のｓｕｐ＋株中で複製できない。
【００８８】
Ｔｎ５のカナマイシン耐性遺伝子と ｕｉｄＡ：：ｐｉｒまたはｐｉｒ−１１６とを含む３．８ｋｂｐのＢａｍＨＩカセットを夫々、Ｍ１３ｗｍ３４及び３３から精製した（Ｍｅｔｃａｌｆら；１９９４）。これらのカセットをＢａｍＨＩによって直鎖化したＭ１３ｍｐ１０にクローニングした。結合混合物を電気穿孔によってＴＧ１に導入した後で、ゲル化したＬＢ＋Ｋｍ培地に平板培養することによって組換えクローンを選択した。得られたクローンの一致性は制限プロフィルの分析及び突然変異ｐｉｒ−１１６に対応する領域の配列決定によって証明された。
【００８９】
（２）相同的組換えによる大腸菌ＸＡＣ−１株のゲノム内への遺伝子ｐｉｒまたはｐｉｒ−１１６の導入
採用した戦略及び関与する種々のイベントを図３に示す。
【００９０】
（ａ）第一の組換えイベント
１０、１００または２０００ｎｇの各ＲＦ（ｍｐ１０− ｕｉｄＡ：：ｐｉｒまたはｐｉｒ−１１６）を用いた電気穿孔によってＸＡＣ−１株を形質転換した。各発現混合物の１／３を、カナマイシンを収容したＬＢ容器に平板培養し、３７℃で一夜インキュベートした。ファージｍｐ１０− ｕｉｄＡ：：ｐｉｒまたはｐｉｒ−１１６はＸＡＣ−１（ｓｕｐ＋）株中で複製できない。従ってマーカーＫｍＲはｕｉｄＡ遺伝子の野生型コピーを用いた相同的組換えを介して細菌のゲノムに組込まれない限り維持されることができない。ＸＡＣ−１の電気穿孔の結果を表１に示す。得られた形質転換効率は、１μｇのｐＵＣ４Ｋあたり４×１０９の形質転換体が得られるという割合であった。
【００９１】
【表２】
2006136328.tif 000004
【００９２】
試験条件で、組込み体の数はＤＮＡの量に伴って非線形的に増加する。形質転換効率及びＲＦのサイズ（１１．７ｋｂｐ）がわかれば、組換え率をほぼ予測できる。１００ｎｇの場合では、約１０−６の組換え頻度が得られる。
【００９３】
（ｂ）第二の組換えイベント
次に第二の組換えイベントを菌株のデオキシコール酸塩耐性（ＤｏｃＲ）によって選択する。
【００９４】
このためには、各構築物の５つの組込み体を、０．２％のデオキシコール酸ナトリウムを加えた２ＸＴＹ培地で培養した。異なる２つの集団が出現する。３７℃に約８時間維持した後でいくつかのクローンは十分に観察できる混濁を生じる（構築物ｐｉｒの２つのクローン及び構築物ｐｉｒ−１１６の３つのクローン）。他のクローンは３７℃に一夜維持した後に初めて高密度の培養物を生じた。これらのクローンはほぼ全部が予想通りにＫｍＳであった。試験したエレクトロポーラントの各々について、５０のＫｍＳ後代をＸ−Ｇｌｕｃを加えたＬＢでスクリーニングした。３７℃で４８時間維持した後、クローンＵｉｄＡ＋は淡青色であったが、対立遺伝子置換が生じたクローン（図３のケース１）は、この培地で白色を維持していた（ＵｉｄＡ−）。二重組換えによって得られた組換え体の表現型の分析を表２に要約する。
【００９５】
二重組換えによって得られた組換え体の１８〜３０％が対立遺伝子置換を生じていた。
【００９６】
【表３】
2006136328.tif 000005
【００９７】
（３）組換えによって得られた菌株のＰｉｒ＋特性のコントロール
二重組換えによって得られた菌株のＰｉｒ＋特性を確認するために、各構築物の３つのクローンをｐＢＷ３０（Ｍｅｔｃａｌｆら，１９９４）によって形質転換させた。試験した全部の菌株で形質転換体が得られたが、このことは、ＸＡＣ−１のゲノムに組込まれた遺伝子ｐｉｒ及びｐｉｒ−１１６が機能したことを示した。同じ条件で、親菌株ＸＡＣ−１を試験したときには形質転換体は全く得られなかった。２つのＸＡＣ−１ｐｉｒクローン（Ｂ及びＣ）と２つのＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６クローン（Ｅ及びＤ）について試験を継続した。
【００９８】
（４）組換えによって得られた菌株のＰＣＲ増幅によるコントロール
対立遺伝子置換を確認するために、遺伝子座ｕｉｄＡの両側のゲノム領域をＰＣＲ増幅によってコントロールした。各オリゴヌクレオチド対は、ｐｉｒの内部領域に対応する１つのオリゴヌクレオチドと染色体ｕｉｄＡの近傍にあるが組換えに使用されたフラグメントには含まれていない領域に対応する第二のオリゴヌクレオチドとから構成されていた。この後者のオリゴヌクレオチドの配列はＧｅｎｂａｎｋの配列ＥＣＯＵＩＤＡＡ（アクセス番号：Ｍ１４６４１）によって決定された。このようにして細菌のゲノム中のｐｉｒ遺伝子の正確な位置を確認できた。予測したサイズに一致するサイズをもつ増幅フラグメントの特性をＭｌｕＩ消化によって確認した。
【実施例２】
【００９９】
選択マーカーｓｕｐ  Ｐｈｅを保有するＲ６Ｋに由来のプラスミドベクターの構築
Ｒ６Ｋのｏｒｉγとカナマイシン耐性遺伝子とを含むベクターを構築した（ｐＸＬ２６６６）。菌株ＢＷ１９６１０（ｐｉｒ−１１６）５（Ｍｅｔｃａｌｆら；１９９３）中でｐＸＬ２６６６のマルチマーが観察されたので、この現象に対するＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメントの効果を試験した。次に、フェニルアラニンサプレッサー（ｓｕｐ  Ｐｈｅ）ｔＲＮＡの発現カセットをベクターｏｒｉγ−ＫｍＲ−ｃｅｒ（ｐＸＬ２７３０）に導入した。このベクターｐＸＬ２７６０は遺伝子治療に使用可能なベクターを構築するための基材として使用できる。
【０１００】
（１）Ｒ６Ｋのｏｒｉγとカナマイシン耐性遺伝子とを含むベクターの構築及び分析
（ａ）構築物
構築された第一のプラスミドｐＸＬ２６６６中のカナマイシン耐性遺伝子はｐＵＣ４Ｋ（Ｖｉｅｉｒａ  ＆  Ｍｅｓｓｉｎｇ；１９８２）に由来し、４１７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに含まれている複製起点は自殺ベクターｐＵＴ−Ｔ７ｐｏｌ（Ｈｅｒｒｅｒｏら；１９９０）に由来する（図４）。菌株ＢＷ１９０９４及び１９６１０（Ｍｅｔｃａｌｆら；１９９４）中へのｐＸＬ２６６６の導入は、プラスミドの量が菌株ｐｉｒ中の同じプラスミドに比較して菌株ｐｉｒ−１１６中で著しく増加していることを示した。しかしながら、非消化プラスミドを電気泳動によって分析すると、この増加に伴っていくつかのマルチマー形態が出現することが証明された。この現象がプラスミドの多数コピー間の分子間組換えに関係している可能性が大きい。また、シス作用によってプラスミドのダイマーを分解できることが証明されていた大腸菌ＣｏｌＥ１の天然プラスミ
ドのｃｅｒフラグメント（Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＆  Ｓｈｅｒｒａｔ，１９８４）を、ｐＸＬ２６６６にクローニングすることによってｐＸＬ２７３０を構築した。使用したフラグメントは、ＣｏｌＥ１の３８２ｂｐのＨｐａＩＩフラグメントに対応する（Ｌｅｕｎｇら，１９８５）。このフラグメントは、特異的分子間組換え部位を含む。このフラグメントが機能するためにはリコンビナーゼＸｅｒＣ及びＸｅｒＤと副次的因子ＡｒｇＲ及びＲｅｐＡとをもつ宿主のタンパク質だけが必要である（Ｓｔｉｒｌｉｎｇら，１９８８；Ｃｏｌｌｏｍｓら，１９９０）。観察された結果が確かにｃｅｒフラグメントによって得られたことを確認するために、ｃｅｒフラグメントから１６５ｂｐが欠失した対照プラスミドｐＸＬ２７５４を構築した。この欠失によって、マルチマーの分解に対するｃｅｒの作用が消滅することが証明された（Ｌｅｕｎｇら，１９８５）。これらのプラスミドを構築するための種々のクローニング段階を図４に示す。
【０１０１】
（ｂ）プラスミド種の定量的及び定性的分析・アガロースゲル電気泳動による分析
構築した種々のプラスミドの電気泳動分析は、プラスミド種が使用した菌株次第で種々に異なることを証明した。非消化プラスミドのサイズを超コイルＤＮＡマーカーとの比較によって測定した。菌株ｐｉｒ（ＢＷ１９０９４）中で、プラスミドｐＸＬ２６６６、２７５４及び２７３０は実質的に完全にモノマー形態である。各主要バンドの上方のバンドは、ＤＮＡジャイレースとｐＸＬ２７３０との作用後に観察されたプロフィルによって確認されるように、多少緩和された超コイル構造の種々のトポイソマーに対応する。
【０１０２】
菌株ｐｉｒ−１１６（ＢＷ１９６１０）中では種々のプロフィルが観察される。プラスミドｐＸＬ２６６６及び２７５４の場合、モノマーからマルチマー（２、３または４量体）までの多様な種が観察され、最も多い形態はダイマーである。ＥｃｏＲＩによる消化後には、直鎖状のプラスミドＤＮＡだけが観察される。これらのプラスミド種は、プラスミドのマルチマーに対応するかまたは種々のトポイソマーに対応する。しかしながら、超コイルＤＮＡマーカーに基づいて測定した形態のサイズはモノマープラスミドのサイズの整数積なので、マルチマーである可能性が極めて大きい。２つの菌株ＢＷ１９０９４及びＢＷ１９６１０は厳密にアイソジェニックではないが（ＢＷ１９６１０はｒｅｃＡである）、マルチマーの形成が突然変異ｐｉｒ−１１６に起因する可能性は極めて大きい。ｐＸＬ２７３０の場合には異なるプロフィルが得られる。マルチマー形態も依然として観察できるが、主要な形態はモノマー形態である。従って、ｃｅｒフラグメントは発明者らが構築したプラスミドのマルチマーを容易に分解でき、この分解はＢＷ１９６１０中ではｒｅｃＡと無関係に生じる。
・ＤＮＡトポイソメラーゼによる処理後の分析
対立遺伝子ｐｉｒ−１１６を保有している菌株中で観察された形態が特定のトポイソマーであるという仮説を否定するために、各プラスミド調製物にＤＮＡトポイソメラーゼを作用させた。種々の酵素は実験条件で以下の活性、即ち、大腸菌のＤＮＡトポイソメラーゼＩはＤＮＡの緩和活性、大腸菌のＤＮＡジャイレースは緩和ＤＮＡの負の超コイル形成活性、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＤＮＡトポイソメラーゼＩＶは、絡み合ったＤＮＡの解離及び超コイルＤＮＡの緩和活性を有していた。
【０１０３】
ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶの作用は、高分子量のプラスミド形態がプラスミドの複数の分子の絡み合いの結果として生じるのではないことを証明した。この場合にはプラスミドの複数の分子がモノマー種に変換されたと考えられる。絡み合ったＤＮＡ分子から成るキネトプラストＤＮＡ調製物に対する酵素の機能は確かにコントロールされていた（図示せず）。非処理対照中よりも泳動し難い種が得られるので緩和活性も観察できる。ＤＮＡジャイレースの作用によって、多少緩和されたトポイソマーが細菌から抽出された最多の超コイルをもつ種に変換された（主としてモノマーまたはダイマー）。ＤＮＡジャイレースの作用によって更に、調製されたＤＮＡが主として超コイル形態であることが確認された。このようにして処理されたサンプルは、各構造物の大部分の種に関しては前述の結果の裏付けと成り得る。ＤＮＡトポイソメラーゼＩは確かにＤＮＡを緩和したが、この緩和は部分的でしかなかった。その原因は、この酵素に優先的に結合し得る一本鎖領域が試験したプラスミドにほとんど含まれていないからであると考えられる（Ｒｏｃａ，１９９５）。
【０１０４】
（２）ｐＸＬ２７３０に対する選択マーカーｓｕｐ  Ｐｈｅの導入
合成サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子（Ｐｈｅ）の発現カセットを使用した（Ｋｌｅｉｎａら，１９９０）。この遺伝子は、ＴＡＧコドンに応答してフェニルアラニンを形成することによってポリペプチド鎖に導入される。更に、この遺伝子は、アルギニン欠損培地中で有効に増殖するために十分に活性のタンパク質ＡｒｇＥをＸＡＣ−１中で産生し得る。プラスミドｐＣＴ−２−Ｆ（Ｎｏｒｍａｎｌｙら；１９８６）上で、ｓｕｐ  Ｐｈｅは大腸菌のｌｐｐ遺伝子のプロモーターＰｌｐｐの配列に由来の合成プロモーターから構成的に発現される。転写終了は、この遺伝子の下流で、大腸菌のオペロンｒｒｎＣの合成ターミネーターＴｒｒｎＣ（Ｎｏｒｍａｎｌｙら，１９８６）によって確保される。種々のクローニング段階を図５に示す。
【０１０５】
ＸＡＣ−１中で種々のサブクローニングを行った。サプレッサーｔＲＮＡの発現カセットの機能は、遺伝子ｌａｃＺｕ１１８ａｍのアンバーコドンが削除されているときにだけ存在するこの菌株のβ−ガラクトシダーゼ活性によってコントロールされている。最終段階はｐＸＬ２７３０上のｓｕｐ  Ｐｈｅの発現カセットの導入から成る。この実験でき、ｃｅｒフラグメントによって得られた結果（Ｂ−１−ｂ）に基づいて、ｐＸＬ２６６６でなくこのプラスミドを選択した。以後のクローニングが容易になるように、特に最終クローニングの際の追加のスクリーニング（ＫｍＲの喪失）が容易になるように、カナマイシン耐性遺伝子を保存した。
【実施例３】
【０１０６】
マウス線維芽細胞のトランスフェクションによる遺伝子治療用プラスミドベクターの有効性の評価
（１）リポーターベクターｐＸＬ２７７４の構築
遺伝子治療におけるプラスミドＤＮＡ産生系の有効性を試験するために、真核細胞中で使用可能なリポーター遺伝子をｐＸＬ２７６０に導入した。生物発光の測定試験は極めて高感度で、広い範囲で線形であり、真核細胞の内在活性に起因するバックグラウンドノイズが極めて弱いので、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子を使用した。ｌｕｃ遺伝子は高い割合で発現し得るヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子の増幅プロモーター配列（ＣＭＶプロモーター）のコントロール下にある。ｌｕｃの３′には、ポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ）＋）を含むＳＶ４０ウイルスに由来の非翻訳領域が存在する。使用できる制限部位の数を増加させる中間クローニング後に、“プロモーターＣＭＶ−ｌｕｃ−ポリ（Ａ）＋”のカセットを、最小ベクターｏｒｉγ−ｃｅｒ−ｓｕｐ  Ｐｈｅ（ｐＸＬ２７６０）にマーカーＫｍＲに置換して導入する。得られたプラスミドをｐＸＬ２７７４と命名した。種々のクローニング段階を図６にまとめる。結合混合物を電気穿孔によってＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６に導入し形質転換させた。富化培地（ＳＯＣ培地）中でインキュベーションを行うことによって細菌に選択マーカーを発現させる。従って、平板培養の前にＭ９培地で細胞を２回洗浄する必要があった。これによって、最少培地中の培養のバックグラウンドノイズの原因となる残留培地を除去し得る。
【０１０７】
電気穿孔した細胞を平板培養するために選択した培地は、サプレッサーｔＲＮＡを発現する細菌を選択でき従って本発明のプラスミドの存在を選択できる最少培地Ｍ９である。Ｘ−Ｇａｌの添加後の青い呈色反応はサプレッサーｔＲＮＡの発現を表す。３７℃で約２０時間維持後に容器を分析する。ＤＮＡ非含有の対照にはコロニーが存在しないので、高密度の播種を行った場合にも正しい選択が行われたと確信できる。制限によって試験した全部のクローン（８）が予想プロフィルに対応するプラスミドを確かに保有している。このようにして構築したプラスミドｐＸＬ２７７４を、１リットルの液体培地Ｍ９中で（３７℃で約１８時間）培養したクローンから、特にイオン交換を用いる技術によって（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＭｅｇａＰｒｅｐｓキット）調製した。ＤＮＡの回収量は２ｍｇであった。
【０１０８】
（２）哺乳動物細胞にトランスフェクトされたリポーターベクターｐＸＬ２７７４の分析
真核細胞にトランスフェクトしルシフェラーゼを発現させるｐＸＬ２７７４の能力を、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３へのトランスフェクションによって評価する。標準ベクターとしては、ｐＸＬ２７７４と同じルシフェラーゼ発現カセットを異なるレプリコンに保有しているプラスミドｐＸＬ２６２２を選択した（このプラスミドはＳＶ４０プロモーターがＣＭＶプロモーターによって置換されたＰｒｏｍｅｇａのプラスミドｐＧＬ２である）。このプラスミドはアンピシリン耐性遺伝子を保有している６．２ｋｂｐのＣｏｌＥ１の誘導体である。このプラスミドを対照として使用する。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ、相対的発光量、で表す）を表３に示す。
【０１０９】
“リポフェクタント添加量／ＤＮＡ添加量”の比を６にしたときに最良の結果が得られた。これらの条件ではｐＸＬ２６２２と２７７４とは等価であると考えられる。
【０１１０】
【表４】
2006136328.tif 000006
【実施例４】
【０１１１】
大腸菌におけるプラスミドｐＣＯＲの自殺ベクター特性の証明
ｐＣＯＲ型のＲ６Ｋに由来のプラスミドが複製できないという特性を、プラスミドｐＵＣ４Ｋ（ｏｒｉ  ＣｏｌＥＩ−ＫｍＲ，（Ｖｉｅｉｒａ  ＆  Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８２））及びｐＸＬ２７３０（Ｒ６Ｋ−ＫｍＲのｏｒｉγ、実施例２参照）を大腸菌ＪＭ１０９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら，１９８５）に導入する電気穿孔実験で確認した。使用したエレクトロポレーターはＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｂｉｏｒａｄであり、エレクトロコンピテント細胞ＪＭ１０９は製造業者のプロトコルに従って調製し使用する（細菌のエレクトロトランスホーメーション及びパルスコントローラーの使用説明書（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍａｎｕａｌ），ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  １６５−２０９８）。
【０１１２】
エレクトロトランスホームした細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／リットル）を加えたＬＢ培地に平板培養し、３７℃で一夜インキュベートした。得られた結果を以下に示す。
【０１１３】
【表５】
2006136328.tif 000007
【０１１４】
これらの結果は、ｐｉｒ遺伝子を発現しない菌株中のＣｏｌＥＩの誘導体（ｐＵＣ４Ｋ）の形質転換効率がＲ６Ｋの誘導体（ｐＸＬ２７３０）に比べて最小でも５ｌｏｇの差があることを示す。ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６のようなｐｉｒ＋菌株中では、Ｒ６Ｋに由来のプラスミドのエレクトロトランスホーメーション効率はプラスミド１μｇ当り１０８の形質転換体という従来の値に等しいかまたは従来の値を上回る。
【実施例５】
【０１１５】
大腸菌ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ２７７４）株の高密度培養によるプラスミドＤＮＡの産生：発酵方法
５．１．菌株：大腸菌ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６株（実施例１）中で最小プラスミドｐＸＬ２７７４を産生させる。このプラスミドは、ｏｒｉＲ６Ｋ−ｃｅｒ−ｔＲＮＡａｍｓｕｐＰｈｅとＣＭＶプロモーターのコントロール下のｌｕｃリポーター遺伝子の発現カセット（実施例３）とをそのエレメントとして含んでいる。高い生産効率でこの種のプラスミドを産生する方法は開発されていた。
【０１１６】
５．２．培地及び培養条件：
（ａ）増殖培地：
・植込み培養物に対して使用した指定培地の組成（ｇ／リットル）：Ｎａ２ＨＰＯ４  ６、ＫＨ２ＰＯ４  ３、ＮａＣｌ  ０．５、ＮＨ４Ｃｌ  １、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４  ３、ブドウ糖５、ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ０．２４、ＣａＣｌ２，２Ｈ２Ｏ  ０．０１５、チアミンＨＣｌ  ０．０１０。
・バッチ仕込み培養物に対して使用した複合培地の組成（ｇ／リットル）：ＫＨ２ＰＯ４  ８、Ｋ２ＨＰＯ４  ６．３、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．７、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．７４、ＮＨ４Ｃｌ  ０．１２、酵母エキス３、ブドウ糖２、ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ  ２．４ｇ／リットル、ＣａＣｌ２，２Ｈ２Ｏ  ０．０１５、チアミン０．０１０、塩溶液（Ｆｅ，Ｍｎ，Ｃｏ，Ｚｎ，Ｍｏ，Ｃｕ，Ｂ，Ａｌ）。
・バッチ仕込み培養物に対する指定培地の組成：複合培地の組成の酵母エキスを２．５ｇ／リットルのＮＨ４Ｃｌで置換した培地。
【０１１７】
（ｂ）バッチ仕込み培養の条件：
プラスミドＤＮＡの増殖及び産生の最適条件を決定するために、１リットルの培地を収容した２リットルの発酵槽（Ｓｅｔｒｉｃ  Ｆｒａｎｃｅ）中で試験を行った。定常増殖期の開始に到達した８０ｍｌの植込み培養物を発酵槽に播種した。
【０１１８】
発酵中には、１０％（ｗ／ｖ）のアンモニア水によってｐＨを自動的に６．９から７．０の範囲にコントロールし調整した。温度を３７℃に維持した。０．２バールの圧力下で７５リットル／時（１．１ｖｖｍ）の一定の通気速度を維持し、撹拌速度に対するフィードバック及び必要な場合には純粋酸素の添加によって溶存酸素を空気中の飽和状態の４０％にコントロールした。
【０１１９】
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ９０００に接続されたインタフェースＨＰ３８５２を介して全部のパラメーター（ｐＨ、温度、撹拌、ＯＤ、流出ガス中のＯ２及びＣＯ２）をオンラインで収集し計算した。
【０１２０】
補充培地の基底組成は、炭素源５０％、硫酸マグネシウム
０．７％、チアミン０．０２％から構成され、複合培地の場合には、この補充培地に酵母エキスを好ましくは５〜１０％の濃度で添加した。
【０１２１】
培養条件を８００リットルの発酵槽に適応させるために、継続培養によって２つの植込み培養物の生産工程を実験室規模で実施した。即ち、植込み培養物Ｉはエルレンマイヤーフラスコで撹拌し、植込み培養物ＩＩは２リットルの発酵槽で培養し（バッチ培養）、次いで７リットルの発酵槽にバッチ仕込みして生産培養した。
５．３．結果
複合培地中、指定培地中及び種々の増殖率で種々の培養条件を試験した。どの場合にも、細菌株の初期バッチ培養と炭素源の消費の後、プレプログラムした添加計画に接続した蠕動ポンプによって発酵槽に補充培地を添加した。この添加計画は、培地の補充率を溶存酸素率または定常増殖率に従属させた先行実験に基づいて作成した。
【０１２２】
更に、培地の過酸素化を生じることなく２リットルの発酵条件を８００リットルの発酵槽に容易に応用できるように、培養終了時の最大酸素要求量を２．５〜３ｍＭ／分の一定値に維持した。このために、必要な場合には補充培地の供給速度を操作することによって微生物の増殖率を低下させた。
【０１２３】
表４に示すように、実験室規模でも８００リットルの発酵槽の規模でも複合培地中及び指定培地中の双方で極めて優れた結果が得られた。更に、プラスミドＤＮＡの増殖及び生産の速度も全く同等である（図６及び図７の比較）。
【０１２４】
【表６】
2006136328.tif 000008
【０１２５】
結果を総合すると以下の事実が判明する。
【０１２６】
−２リットルの発酵槽から８００リットルの発酵槽への規模の変更は全く問題なく行われる。
【０１２７】
−酸素消費量は発生するバイオマスに密接な相関関係を示す（発生バイオマス１ｇあたり１．０８ｇのＯ２消費量）。
【０１２８】
−プラスミドは少なくとも５０世代は選択圧を生じることなく安定である。
【０１２９】
−複合培地中では１リットルあたり乾燥細胞４０ｇを上回る高濃度のバイオマスが得られる。
【０１３０】
−プラスミドＤＮＡの産生量は、培地１リットルあたり１００
ｍｇの超コイルＤＮＡという量に達する。
【０１３１】
−ＤＮＡの産生量とバイオマスとの間に十分な相関関係が存在する。発酵持続時間に関わりなく、１単位のＯＤあたり１
ｍｇのプラスミドＤＮＡまたは１ｇのバイオマスあたり２．７ｍｇのプラスミドＤＮＡという産生量を計算できる。
【０１３２】
−指定培地を使用した場合にも、生産効率を全く低下させることなく高いレベルのバイオマス（１リットルあたり乾燥細胞３０ｇ）及びプラスミドＤＮＡ産生量（１リットルあたり１００ｍｇ）を達成し得る。
【実施例６】
【０１３３】
動物細胞中へのｐＸＬ２７７４のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ導入
６．１．動物細胞中へのｐＸＬ２７７４のｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入
種々の細胞系にトランスフェクトする最小プラスミドｐＸＬ２７７４の能力をヒト起原の細胞とマウス起原の細胞との双方についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。プラスミドｐＸＬ２７７４を対照として使用した。プラスミドｐＸＬ２７７４は、ｐＸＬ２７７４と同じ真核細胞発現カセット（ＣＭＶプロモーター−ルシフェラーゼ−ポリＡ）を含むが、この発現カセットは、大腸菌中でカナマイシン耐性を与える遺伝子を含む６．４ｋｐのＣｏｌＥ１の誘導体である。
【０１３４】
以下の細胞を試験した：
【０１３５】
【表７】
2006136328.tif 000009
【０１３６】
以下のトランスフェクション条件を用いた：
Ｊ−１：１０％ウシ胎仔血清（ＳＶＦ）を補充したＤＭＥＭ培地（ダルベッコの改質イーグル培地）中の２ｃｍ２のウェル（２４ウェルのプレート）あたり１００，０００細胞の密度で細胞を播種した。Ｊ−３：１０％のＳＶＦ添加または非添加の２５０μｌの培養培地中に０．５μｇのＤＮＡと１５０ｍＭのＮａＣｌと５％のブドウ糖とＤＮＡ１μｇ当たり３ナノモルのリポフェクタントＲＰＲ１２０５３５とを含む１０μｌのトランスフェクション溶液によって細胞のトランスフェクションを行った。２時間のインキュベーション後、培地を、１０％のＳＶＦを加えた５００μｌのＤＭＥＭ培地に交換した。
Ｊ−４：培養培地を交換する。
Ｊ−５：細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１００μｌのＰｒｏｍｅｇａ
溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ細胞溶解バッファＥ１５３Ａ）で溶解する。Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用い１０μｌの溶解液に対して１０秒の積分時間でルシフェラーゼ活性の定量アッセイを行う。使用した反応体はＰｒｏｍｅｇａの反応体である（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ基質）。結果を以下の表にまとめる。以下の表では結果を、１０μｌの溶解液当たりのＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔｓ  Ｕｎｉｔ、相対的発光量）として表す（４つのウェルの測定値の平均）。変動係数（ＣＶ）も示す。
【０１３７】
血清の非存在下のトランスフェクションの結果を以下に示す。
【０１３８】
【表８】
2006136328.tif 000010
【０１３９】
【表９】
2006136328.tif 000011
【０１４０】
血清（１０％）の存在下のトランスフェクションの結果を以下に示す。
【０１４１】
【表１０】
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【０１４２】
【表１１】
2006136328.tif 000013
【０１４３】
これらの結果から、ｐＸＬ２７７４が、マウス起原及びヒト起原の種々の細胞のタイプにｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効にトランスフェクトする能力を有することが判明する。リポーター遺伝子ｌｕｃの発現は、そのトランスフェクション効率が、同じルシフェラーゼの発現カセットを保有しているＣｏｌＥ１に由来の“古典的”プラスミドの効率に少なくとも等しい優れた値であることを示す。
【０１４４】
６．２．動物（マウス）体内へのｐＸＬ２７７４のｉｎ  
ｖｉｖｏ導入
（ａ）モデル１：マウスの前脛骨筋中のヌードＤＮＡ
“５％ブドウ糖、１５０ｍＭのＮａＣｌ”中に溶解したヌードプラスミドＤＮＡをＯＦ１マウスの前脛骨筋に注射する。注射の７日後に筋肉を採取し、粉砕し、７５０μｌの溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａの細胞溶解バッファＥ１５３Ａ）中でホモジェナイズし、次いで２０，０００×ｇで１０分間遠心する。
【０１４５】
５０μｌの反応体（Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイ基質）を添加した後、１０μｌの上清に対してルシフェラーゼ活性の定量アッセイを行う。Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用い、１０秒間の積分時間で読取りを行う。
【０１４６】
結果を以下の表に示す。
【０１４７】
【表１２】
2006136328.tif 000014
【０１４８】
これらの結果は、ｐＸＬ２７７４のような条件複製型プラス
ミドがマウス筋肉細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで十分にトランスフェクトできること、しかも、ルシフェラーゼの遺伝子と同じ発現カセットを保有しているＣｏｌＥ１に由来の“古典的”プラスミドの効率と同等以上の効率でトランスフェクトできることを示す。
（ｂ）モデル２：腫瘍性３Ｔ３ＨＥＲ２モデル
以下のモデルを使用する：
−Ｓｗｉｓｓ種の成熟雌ヌードマウスを使用する。
【０１４９】
−脇腹に１０７個の３Ｔ３ＨＥＲ２細胞を皮下注射して実験的腫瘍を誘発する。
【０１５０】
−細胞注入の７日後にトランスフェクション混合物を注入する。
【０１５１】
注入溶液：先ず、ＤＮＡをバッファに溶解させる。全部の成分を添加した後の混合物は、ＤＮＡに加えて、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）と５％のＤ−ブドウ糖とを水または５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ中に含んでいる。
【０１５２】
−注入の２日後に、腫瘍組織を採取し、計量し、粉砕し、７５０μｌの溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａの細胞溶解バッファＥ１５３Ａ）中でホモジェナイズする。遠心（２０，０００ｇで１０分間）後、１０μｌの上清を採取してルシフェラーゼ活性を測定し得る。５０μｌの反応体（Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイ基質）との混合後に得られた全発光量をＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０１光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて１０秒間の積分時間で測定することによってルシフェラーゼ活性を定量する。
【０１５３】
得られた活性を、腫瘍性溶解上清全体について推定した
ＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔｓ  Ｕｎｉｔｓ、相対的発光量）で表す。
【０１５４】
【表１３】
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【０１５５】
これらの結果は、ｐＸＬ２７７４のような条件複製型プラスミドがマウス腫瘍細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで十分にトランスフェクトできること、しかも、ルシフェラーゼの遺伝子と同じ発現カセットを保有しているＣｏｌＥ１に由来の“古典的”プラスミドの効率に少なくとも同等の効率でトランスフェクトできることを示す。
【０１５６】
これらの種々の実験は、条件複製型プラスミド、より特定的にはｐＸＬ２７７４が、治療用遺伝子として使用するために不可欠な動物細胞に対するトランスフェクション特性を十分に有していることを証明した。より詳細には、
（１）ｐＸＬ２７７４がヒト起原またはマウス起原の種々の細胞のタイプにｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効にトランスフェクトする能力を有していること、
（２）ｐＸＬ２７７４がマウスの筋肉にｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトする能力を有していること、
（３）ｐＸＬ２７７４がマウスに移植された腫瘍細胞にｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトする能力を有していること、
が証明された。
【０１５７】
従って、エレクトロトランスホーメーション、発酵、及びトランスフェクションの実験は、条件複製型プラスミドが、
（ｉ）ｐｉｒ遺伝子（条件複製起点）を発現しない大腸菌の菌株中では検出可能な状態で複製されないこと、
（ｉｉ）抗生物質非含有の完全指定培地中で工業生産に好適な規模で産生され得ること、
（ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び特にｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物の細胞にトランスフェクトできること、を示したので、これらのプラスミドが遺伝子治療で使用可能なベクターとして有効であることが証明された。
【実施例７】
【０１５８】
組換えタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生
７．１．発現ベクターの構築
このような方法の実用化適性を証明するために、前述の基準（実施例２及び３）に従って発現ベクターを構築した。このベクターｐＸＬ３０５６は、
（１）条件複製起点（ｏｒｉガンマ）とＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメントと細菌中の選択を確保する遺伝子（ｓｕｐ）とを含む細菌性部分と、
（２）Ｓｔｕｄｉｅｒによって記載された系（Ｓｔｕｄｉｅｒら，１９９０）を基材とし、Ｔ７バクテリオファージの遺伝子１０のプロモーターとｌａｃＯオペレーターとａＦＧＦ１５４（酸性線維芽細胞増殖因子、１５４個のアミノ酸から成る形態）をコードする遺伝子と（Ｊａｙｅら，１９８６）、Ｔ７バクテリオファージのターミネーターＴＦとを含む発現カセットと、を含んでいる。この発現カセットは、国際特許出願ＷＯ
９６／０８５７２に記載されているプラスミドｐＸＬ２４３４上に存在する発現カセットと同じである。
【０１５９】
ｐＸＬ３０５６の構築を図８に示す。ａＦＧＦの発現カセットを含むｐＸＬ２４３４のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント（１．１ｋｂ）を条件複製型ベクターｐＸＬ２９７９（１．１ｋｂの精製フラグメント）のＢｇｌＩＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＸＬ３０５６を作製する。
【０１６０】
ｐＸＬ２９７９は３つのフラグメント、即ち、（ｉ）ｐＸＬ２７３０のＡｃｃＩ−ＸｂａＩフラグメント（ｏｒｉガンマ及びｃｅｒを与える０．８ｋｂ）と、（ｉｉ）ｐＸＬ２７５５のＮａｒＩ−ＳａｌＩフラグメント（ｓｕｐ  Ｐｈｅ遺伝子を与える０．１８ｋｂ）と、（ｉｉｉ）ｐＸＬ２６６０のＳａｌＩ−ＳｐｅＩフラグメント（カナマイシン耐性遺伝子を与える
１．５ｋｂ）との結合によって得られる。
【０１６１】
ｐＸＬ２６６０はｐＵＣ４Ｋ（Ｖｉｅｉｒａ  ＆  Ｍｅｓｓｉｎｇ，
１９８２）の１．２ｋｂのＰｓｔＩフラグメントを、ＰｓｔＩによって直鎖化したｐＭＴＬ２２（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９８８）にクローニングすることによって得られる。
【０１６２】
７．２．発現菌株の作製
プラスミドｐＸＬ３０５６を形質転換によって菌株ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６に導入する。得られた菌株を次にプラスミドＰＴ７ｐｏｌ２３（Ｍｅｒｔｅｎｓら，１９９５）によって３０℃で形質転換する。Ｔ７プロモーターのコントロール下で有益な遺伝子を発現させるために、細菌は、プラスミド上またはバクテリオファージ上でＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼを発現させ得るカセットをそのゲノムに含んでいなければならない。記載の実施例では、ｐＸＬ３０５６のようなＲ６Ｋの誘導体に和合性でＴ７バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼの温度によって誘導発現され得るプラスミドＰＴ７ｐｏｌ２３を使用した。しかしながら、プラスミドだけを保存し温度でなくＩＰＴＧによってＴ７のＲＮＡポリメラーゼの産生を誘発するために、菌株ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６をラムダＤＥ３（Ｓｔｕｄｉｅｒら，１９９０）によって溶原化してもよい。
【０１６３】
７．３．ａＦＧＦの発現
０．２％のカザミノ酸（ＤＩＦＣＯ）とカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とを加えたＭ９最少培地中で、６００ｎｍの光学密度が０．６〜１になるまで菌株ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ＰＴ７ｐｏｌ２３）を３０℃で培養する。次いで、培養物の半量を４２℃に加熱し（Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼの誘発）、残りの半量を３０℃に維持する（陰性対照）。
【０１６４】
Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼの非存在下のａＦＧＦの発現対照を構成する菌株ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ｐＵＣ４Ｋ）を用いて同じ実験を行う。
【０１６５】
得られた結果を図９に示す。これらの結果は、ａＦＧＦの産生量がＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＬ２４３４）（ＷＯ９６／０８５７２）で観察された量に比べて同等以上であることを示し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏ、特に大腸菌中で組換えタンパク質を発現させる条件複製型プラスミドの能力を十分に証明する。
【実施例８】
【０１６６】
野生型またはハイブリッド型のｐ５３タンパク質を発現するベクターｐＣＯＲの構築
この実施例は、ｐ５３タンパク質をコードする核酸を含む本発明の条件複製型ベクターの構築を記載する。これらのベクターは、特に腫瘍細胞のような欠陥細胞（突然変異、欠失）中のｐ５３型の活性を回復するために有用である。
【０１６７】
真核細胞発現カセットは以下のエレメントを含む：
（１）Ｉ型単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの遺伝子のリーダー配列（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．の論文（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：５９４９−５９６４に記載の配列を参照すると遺伝子の−６０位〜＋１位）の上流
の“即時型”ＣＭＶ初期プロモーター（−５２２位〜＋７２位）；
（２）野生型ｐ５３タンパク質をコードするかまたは特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１１１１に記載のようなｐ５３の変種をコードする核酸（変種Ｖ３２５Ｋ＝ＡＴＧにＫｏｚａｋ配列をもつＶ３２５）；
（３）ＳＶ４０のポリＡポリアデニル化配列。
【０１６８】
これらのエレメントをＡｓｃＩ−ＸｂａＩフラグメントの形態でベクターｐＣＯＲ  ｐＸＬ２９８８のＢｓｓＨＩＩ部位とＳｐｅＩ部位との間に配置した。ｐＸＬ２９８８は、ガンマ複製起点に隣接の１７個のトリヌクレオチドＧＡＡから成りＤＮＡの三重らせんを形成し得る配列を追加エレメントとして有していることを除けば、ｐＸＬ２９７９（実施例７．１．）に等しい。
【０１６９】
得られたプラスミドをｐＸＬ３０２９及び３０３０と命名する（図１０）。
【０１７０】
ｐ５３−ＳＡＯＳ２細胞を培養し、培養した細胞中でｐ５３またはｐ５３ｓｕｐｅｒＷＴの転写アクチベーター活性を測定することによって、これらの構築物の機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認した。
【０１７１】
【表１４】
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2006136328.tif 000017
2006136328.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】複製に関与するＲ６Ｋの領域の機能的編成を示す。
【図２】プラスミドＲ６ｋのπタンパク質の機能性ドメインの編成を示す。
【図３】ｐｉｒ遺伝子を大腸菌ＸＡＣ１のゲノムに導入するプロトコルを示す。
【図４】ベクターｐＸＬ２６６６、２７３０及び２７５４の構築を示す概略図である。
【図５】ｐＸＬ２７７４の構築を示す。
【図６】２リットルの発酵槽における増殖及び産生を示すグラフである。
【図７】８００リットルの発酵槽における増殖及び産生を示すグラフである。
【図８】ｐＸＬ３０５６の構築を示す。
【図９】誘発後の大腸菌ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ＰＴ７ｐｏｌ２３）によって産生されたタンパク質ａＦＧＦの検出を表す。変性した全細胞抽出物を１２．５％−ＳＤＳのポリアクリルアミドゲルに載せる。Ｍ：分子量マーカー（Ｂｉｏｒａｄ，Ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ）。各バンドを、矢印及びその分子量をキロダルトンで表す数値によって同定する。１：非誘発ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ｐＵＣ４Ｋ）；２：４２℃で誘発されたＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ｐＵＣ４Ｋ）；３：非誘発ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ＰＴ７ｐｏｌ２３）クローン１；４：４２℃で誘発されたＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ＰＴ７ｐｏｌ２３）クローン１；５：非誘発ＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ＰＴ７ｐｏｌ２３）クローン２；６：４２℃で誘発されたＸＡＣ−１ｐｉｒ−１１６（ｐＸＬ３０５６＋ＰＴ７ｐｏｌ２３）クローン２；ｔ１：１μｇの精製ａＦＧＦ；ｔ４：４μｇの精製ａＦＧＦ。
【図１０】ベクターｐＸＬ３０２９及びｐＸＬ３０３０の構築を示す概略図である。
【０１７３】
【表１５】
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2006136328.tif 000020
2006136328.tif 000021
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【図１】
2006136328.tif 000024
【図２】
2006136328.tif 000025
【図３】
2006136328.tif 000026
【図４】
2006136328.tif 000027
【図５】
2006136328.tif 000028
【図６】
2006136328.tif 000029
【図７】
2006136328.tif 000030
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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