(57)【要約】【課題】  有機塩素系化合物を嫌気的に分解することのできる微生物を継代培養し、活性を安定化して維持することのできる培養方法を提供すること。【解決手段】  本発明の培養方法は、微生物群を連続的に培養し、得られた培養液を植種源として回分培養を行なうことを特徴とする。本発明の微生物群の培養方法によれば、微生物が高度に限定されるため、有機塩素系化合物の分解活性を安定して維持することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物群を連続的に培養し、得られた培養液を植種源として回分培養を行なうことを特徴とする、微生物群の培養方法。
【請求項２】
上記微生物群が、有機塩素系化合物分解菌を含む、請求項１に記載の微生物群の培養方法。
【請求項３】
上記有機塩素系化合物が、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、トランス−１，２−ジクロロエチレン、１，１，−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエタン、塩化ビニルモノマー、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエタンからなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項２に記載の微生物群の培養方法。
【請求項４】
微生物群を固定床に付着させた状態で連続的に培養を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物群の培養方法。
【請求項５】
担体を充填したカラム内で、微生物群を連続的に培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物群の培養方法。
【請求項６】
上記担体の平均粒径が０．３〜１ｍｍである、請求項５に記載の微生物群の培養方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの培養方法によって得られた、微生物群を含む培養液。
【請求項８】
有機塩素系化合物により汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーギュメンテーションに用いられる、請求項７に記載の培養液。
【請求項９】
上記有機塩素系化合物が、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、トランス−１，２−ジクロロエチレン、１，１，−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエタン、塩化ビニルモノマー、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエタンからなる群から選択される１種以上の化合物である、請求項８に記載の培養液。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の培養液を、有機塩素系化合物によって汚染された地下水及び／又は土壌中に注入することを特徴とする、地下水及び／又は土壌の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物群の培養方法に関する。特には、有機塩素系化合物を嫌気的に分解することのできる微生物を継代培養し、活性を安定化して維持することのできる、微生物群の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において科学技術が発展し、それに伴い、種々の化学物質が利用されるようになってきており、土壌や地下水が各種の有害難分解物質によって汚染されることが問題となっている。特に、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン等の有機塩素系化合物による環境汚染は深刻な問題となっている。これらの有機塩素系化合物は、土壌中に残留したものが雨水等によって地下水中に溶解して、周辺に広がるものとされている。このような有機塩素系化合物は発ガン性を有していると考えられており、また環境中で非常に安定な化合物であるため、特に飲料水の水源として利用されている地下水の汚染は大きな社会問題である。
【０００３】
このような有機塩素化合物によって汚染された土壌や地下水を短期間で浄化する方法として、有機塩素系化合物等の汚染物質を分解する能力を有する微生物を用いた生物学的浄化方法が注目されている。
土壌や地下水を分解する能力を有する微生物としては、有機塩素系化合物を嫌気的分解する微生物が用いられるが、このような微生物は継代培養することが容易でなく、有機塩素系化合物の分解活性を安定して維持することは困難であった。
ヒト及び生態系への影響を考慮すると、土壌及び／又は地下水の原位置バイオオーギュメンテーションに用いる培養液に関しては、高度に限定（純化）された微生物で構成され、その構成が継続的に安定していることが好ましい。
【０００４】
有機塩素系化合物分解菌の培養方法に関する技術としては、例えば、特許文献１には、微生物を利用して汚染物質を分解除去したり有用物質を生産する装置に、連続的に微生物を供給する装置が開示されている。該公報に開示された装置によれば、目的活性のある菌液を連続的に供給することができる。
また、特許文献２には、培養液が連続的に一端から供給され、他端から排出されるチューブ状の培養槽で微生物を培養する、微生物の連続培養方法が開示されている。該特許文献２に開示された方法によれば、微生物の連続培養の効率を向上することができる。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１５７２５４号公報
【特許文献２】特開２０００−２８７６７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１及び２には、その培養液を原位置バイオオーギュメンテーションに用いることができることについての記載はなく、また、菌相の単純化についても全く触れられておらず、該特許文献１及び２に記載の装置又は方法は、有機塩素系化合物の分解活性を安定化して維持し、かつ微生物の構成を高度に限定させることのできるものではなかった。
従って、本発明の目的は、有機塩素系化合物を嫌気的に分解することのできる微生物の活性を安定化して維持し、かつ微生物の構成を高度に限定させることのできる培養方法を提供することにある。
また、本発明の目的は、上記培養方法によって得られた培養液を用いる、地下水及び／又は土壌の浄化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、微生物群を培養する際に、連続的な培養と回分培養とを組み合わせることにより、上記目的を達成し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、微生物群を連続的に培養し、得られた培養液を植種源として回分培養を行なうことを特徴とする、微生物群の培養方法を提供するものである。
また、本発明は、上記培養方法によって得られた、微生物群を含む培養液を提供する。該培養液は、有機塩素系化合物により汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーギュメンテーションに用いられる。
また、本発明は、上記培養液を、有機塩素系化合物によって汚染された地下水及び／又は土壌中に注入することを特徴とする、地下水及び／又は土壌の浄化方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物群の培養方法によれば、微生物の構成を高度に限定させることができる。また、本発明の培養方法を、有機塩素系化合物分解菌を含む微生物群に適用することにより、有機塩素系化合物の分解活性を安定して維持することができる。
また、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、本発明の微生物群の培養方法によって得られた培養液を用いており、有機塩素系化合物の分解活性が安定されるため、地下水及び／又は土壌中の有機塩素系化合物の分解効率が向上したものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、先ず本発明の微生物群の培養方法について説明する。
本発明の微生物群の培養方法は、微生物群を連続的に培養し、得られた培養液を植種源として回分培養を行うことを特徴とする。
本発明の微生物群の培養方法においては、先ず微生物群を連続的に培養する。本明細書において、「連続的に培養」とは、連続的に培地を供給し、培養物を連続的に取り出す方法を意味するものとする。
【００１０】
連続的に培養する方法としては、微生物群を固定床に付着させた状態で連続的に培養を行う方法が挙げられ、具体的には、担体を充填したカラム内で微生物群を連続的に培養する方法、担体を培養容器に入れて連続撹拌しながら微生物群を培養する方法等が挙げられる。
【００１１】
有機塩素系化合物を嫌気的に分解する微生物は、固定床に付着させた状態で培養することが、分解能を発揮させる上で好ましい。微生物群を固定床に付着させることによって、固定床に生物膜を形成した状態で微生物群を連続培養することにより、有機塩素系化合物を分解する活性を安定して維持することが可能となる。用いられる固定床としては、以下に説明する担体が好ましく用いられる。
【００１２】
微生物群を連続的に培養する方法について図面を参照しつつ説明する。図１は、微生物群を連続的に培養し、次いで回分培養する方法を実施するための培養装置の構成を示す図である。
図１に示す培養装置は、微生物群を連続的に培養する、カラム１０と、微生物群を回分培養する回分培養容器２０とから主に構成される。
微生物群は、ポンプ１４によって加圧され、微生物群及び培地供給管１２を通ってカラム１０に供給される。ここで用いられる微生物群としては、有機塩素系化合物分解菌を含むものが挙げられる。有機塩素系化合物としては、例えば、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、トランス−１，２−ジクロロエチレン、１，１，−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエタン、塩化ビニルモノマー、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエタンからなる群から選択される１種以上の化合物が挙げられ、本発明の微生物群の培養方法において用いられる微生物は、上記化合物を分解する微生物である。
【００１３】
上記微生物群としては、有機塩素系化合物を分解する能力を有するものとして、従来より公知の微生物を特に制限なく用いることができ、有機塩素系化合物を分解する能力を有する微生物であれば、どのような微生物であっても用いることができる。また、有機塩素系化合物で汚染された土壌又は地下水を植種源として用いることもできる。また、有機塩素系化合物で汚染された土壌又は地下水を植種源として用いる場合には、その土壌又は地下水に含まれている、有機塩素系化合物の分解能を有する微生物のみが増殖してくるので、有機塩素系化合物を分解する能力を有する微生物のスクリーニングにも利用することができる。
【００１４】
図１に示すカラム内には担体が充填されており、該担体に生物膜が形成された状態で微生物群を連続培養することにより、有機塩素系化合物を分解する活性を安定して維持することが可能となる。用いられる担体としては、例えば、天然素材、無機素材、高分子素材等が用いられ、ゲル状物質であってもよい。具体的には、ゼオライト、砂（川砂）、焼成汚泥、鉄粉等があげられる。また、培地成分中に硫化鉄（ＦｅＳ）を含有する場合には、硫化鉄自体が担体の役割を果たすことになるため、他の担体を用いなくても、本発明の効果を得ることができる。
担体の形状は、球状、ペレット状、中間筒状、糸状等、任意の形状でよい。大きさは、球状の場合、平均粒径が好ましくは０．１〜１０ｍｍであり、更に好ましくは０．３〜１ｍｍである。なお、担体としては、有機塩素系化合物によって汚染された現場を模擬して、粒径が０．１〜１．０ｍｍ程度の川砂を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明の微生物群を連続的に培養するための培地としては、微生物を培養するために通常に用いられる培地を特に制限なく用いることができる。本発明の微生物群の培養方法において用いられる培地には、有機塩素系化合物を含有させて用いる。培地に含有させる有機塩素系化合物としては、上述したものが挙げられ、有機塩素系化合物は、単独で用いてもよく、２種以上を用いてもよい。有機塩素系化合物の培地中の濃度は０．１〜１００ｍｇ／Ｌ程度が好ましく、１〜２０ｍｇ／Ｌ程度が更に好ましい。有機塩素系化合物の培地中の濃度が上記範囲より高いと、微生物の増殖が遅くなる場合があり、一方、濃度が上記範囲より低い場合は、有機塩素系化合物の分解能力を有していない微生物が増殖する場合がある。
【００１６】
連続培養は、ポンプ１４を加圧して微生物及び培地供給管１２から培地を供給しながら、ポンプ１８を加圧して培養液排出管１６から培養液を排出して行なう。培地の供給及び培養液の排出の速度は、カラムの容量によっても異なるが、カラムの容量が１Ｌ程度である場合、好ましくは１０〜１００ｍＬ／ｈｒ程度である。なお、有機塩素系化合物分解菌は還元力（電子供与体）及び炭素源として機能する栄養素の存在下で、嫌気微生物によって還元的に分解され、例えば、テトラクロロエチレンはトリクロロエチレン、ジクロロエチレン及び塩化ビニルを経てエチレンに分解される。従って、嫌気的な条件下で培養を行うことが好ましい。また、図１においては、微生物及び培地供給管１２が設けられているが、微生物供給管と培地供給管とを別々に設けてもよい。
図１に示す装置においては、カラム１０を１個有して成るが、本発明の微生物群の培養方法においては、カラム１０を複数個連結させた装置を用いてもよい。このようにカラム１０を連結させることによって、有機塩素系化合物分解菌の活性の安定化が更に向上する。
【００１７】
次いで、上述のようにして微生物群を連続的に培養し、得られた培養液を植種源として回分培養を行う。上述したように、担体を用いて、該担体に生物膜を形成して微生物群を培養した場合、菌相が複雑になるのが一般的である。例えば、図１に示すカラム１０を有する培養装置で微生物群を培養した場合、カラムの入り口付近と出口付近とで基質濃度が変化し、それぞれの基質濃度に適応した微生物が増殖する。また、図１に示すような培養装置においても、担体を用いた場合には生物膜が形成されており、菌相が複雑化すると考えられる。そのため、担体を用いた連続培養法は、有機塩素系化合物分解菌の活性を安定化して維持することができるが、高度に限定された微生物で構成された菌相を維持することは困難である。一方、回分培養法においては、与えられた基質に対して最も増殖の速い微生物のみが選択される。そのため、培地中の基質濃度を同一の条件になるようにしておけば、常に限られらた微生物のみが増殖することになる。このため、菌相が単純化される。従って、上述したように連続的培養によって活性を維持した状態の培養液を植種源として回分操作を行うことによって、菌相を単純化することが可能である。
【００１８】
図１におけるカラム１０内で連続的に培養された培養液中には、有機塩素系化合物分解活性を安定して有する微生物群が含まれている。カラム１０内で連続的に培養された培養液は、ポンプ１８が加圧され、微生物培地排出・供給管１６を通って、回分培養容器２０へ送られる。
回分培養容器２０は、密閉して微生物群を培養することのできる容器であれば、どのような材質のものであっても使用可能であるが、培地中に有機塩素系化合物を添加することを考慮すると、ガラス製又はステンレス製の容器を用いることが好ましく、容器の蓋としてはテフロン（登録商標）製のものが好ましい。
【００１９】
図１におけるカラム１０内で連続的に培養された培養液中には、有機塩素系化合物分解活性を有する微生物群が含まれており、この培養液を回分培養容器２０に注入して回分培養を行うことにより、菌相が単純化され、有機塩素系化合物分解活性を有する微生物のみが増殖することとなり、この方法により得られた培養液には、有機塩素系化合物を分解する能力を有する微生物が含まれる。
【００２０】
次に、本発明の第二の実施の形態にかかる微生物群の培養方法について図２を参照しつつ説明する。
図２は、本発明の第二の実施の形態にかかる微生物群の培養方法を実施するための培養装置の構成を示す図である。
図２に示す培養装置は、基本的な構成は図１に示す培養装置とほぼ同様である。図２に示す構成部品のうち、図１と同じものは同じ符号を付し、その説明を省略する。
【００２１】
図２に示す培養装置においては、混合培養槽３０を用いて、微生物群の連続培養を行っている。微生物群は、ポンプ１４によって加圧され、微生物群及び培地供給管１２を通って混合培養槽２０に微生物群が供給される。
混合培養槽３０中には、微生物群を培養するための培地が含まれており、また、担体が該培地中に懸濁されている。図１に示した方法と同様に、担体に生物膜が形成された状態で微生物群を連続培養するため、担体は培地中に浮遊状態にあることが好ましい。担体を浮遊状態にするためには、混合培養槽３０中の培地を撹拌しながら培養を行うことにより実施することが好ましい。培地の撹拌速度は、担体の大きさや比重によって異なってくるので、適宜選択することができる。用いられる担体としては、上述したものと同様なものが用いられる。
【００２２】
なお、図２に示す装置は、混合培養槽３０を１個有するが、本発明の微生物群の培養方法においては、混合培養槽３０を複数個連結させて用いてもよい。この場合、最初の混合培養槽３０で微生物群の培養を行って得られた培養液を、それに続く混合培養槽３０へと注入し、この操作を繰り返して用いる。このように、混合培養槽３０を複数個連結させることによって、有機塩素系化合物の分解菌の活性の安定化が更に向上する。
【００２３】
図２に示す培養装置を用いて連続培養を行う際には、ポンプ１４を加圧して微生物及び培地供給管１２から培地を供給しながら、ポンプ１８を加圧して培養液排出管１６から培養液を排出して行なう。培地の供給及び培養液の排出の速度は、混合培養槽３０の容量によっても異なるが、混合培養槽３０の容量が１０Ｌ程度である場合、好ましくは０．１〜１Ｌ／ｄａｙ程度である。
【００２４】
上述のようにして微生物群を連続的に培養し、得られた培養液を植種源として回分培養を行う。回分培養については、図１について説明したのと同様である。
図２における混合培養槽３０内で連続的に培養された培養液中には、有機塩素系化合物分解活性を有する微生物群が含まれており、この培養液を回分培養容器２０に注入して回分培養を行うことにより、菌相が単純化され、有機塩素系化合物分解活性を有する微生物のみが増殖することとなり、この方法により得られた培養液には、有機塩素系化合物を分解する能力を有する微生物が含まれる。
【００２５】
次に、本発明の微生物群を含む培養液について説明する。
本発明の微生物群の培養方法によって得られた培養液は、微生物群を含んでおり、特に有機塩素系化合物分解菌を含んでいる培養液は、有機塩素系化合物により汚染された土壌及び又は地下水のバイオオーギュメンテーションに用いることができる。
バイオオーギュメンテーションとは、有害物質（例えば、有機塩素系化合物）の分解活性を有する微生物を大量培養し、この微生物を、有害物質に汚染された地下水及び／又は土壌に注入して、有害物質の分解を行わせる方法のことである。本発明の培養液は、原位置バイオオーギュメンテーションに用いることができるのみならず、汚染現場から揚水された地下水、掘削された土壌を浄化するためにも用いることができる。
地下水又は土壌に注入される培養液の量、注入速度等については、汚染された地下水及び／又は土壌の汚染状況によって異なり、適宜選択することが可能である。
【００２６】
次に、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法について説明する。
本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、上記培養液を、有機塩素系化合物によって汚染された地下水及び／又は土壌中に注入することを特徴とする。
具体的には、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、地下水及び／又は土壌のバイオオーギュメンテーションによって行なうことができる。バイオオーギュメンテーションについては上述した通りであり、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、上記培養液を、有機塩素系化合物によって汚染された地下水及び又は土壌中に注入することを特徴とし、すなわち原位置バイオオーギュメンテーションで行なうことができる。しかし、本発明の地下水及び／又は土壌の浄化方法は、原位置バイオオーギュメンテーションのみならず、汚染現場から揚水された地下水、掘削された土壌を浄化するためにも用いることができる。なお、地下水及び／又は土壌に注入する培養液の量、注入速度等については、汚染された地下水の汚染状況によって異なり、適宜選択することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
図３に示す培養装置を作成した。
図３は、本実施例で微生物群を培養するために用いた連続培養装置の培養装置の構成を示す図である。図３に示す連続培養装置は、微生物群を培養するためのカラム５０、カラム５２及びカラム５４が連結されてなる。図３に示す連続培養装置においては、ポンプ５１を加圧し、微生物群及び培地供給管５６からカラム５４に無機培地を供給する。また、ポンプ５３を加圧し、培地の成分としてのシス−１，２−ジクロロエチレンをカラム５０に供給し、ポンプ５５を加圧し、培地成分としての栄養剤をカラム５０に供給する。なお、本実施例においては、無機培地、シス−１，２−ジクロロエチレン及び栄養剤の供給速度は、それぞれ、２３ｍｌ／時間、０．２５ｍｌ／時間及び２．５ｍｌ／時間となるように、ポンプ５１、５３及び５５の圧力が調整されている。
【００２８】
カラム５０、５２及び５４は、約２４０ｍｌ容量のアクリルカラムであり、カラムの下部５ｍｍ程度には、粒径２ｍｍのガラスビーズが充填されており、ガラスビーズの上部に、平均粒径が０．３５ｍｍの川砂が充填されている（間隙率：０．４）。微生物供給管５６、カラムとカラムを連結する配管等は、テフロン（登録商標）製のものを用いており、ポンプ５１、５３及び５５はマイクロチューブポンプを用いており、ポンプの部分にはフルランチューブが用いられている。
【００２９】
また、カラム５０の入り口（ポンプ５３とポンプ５５との間）にはサンプリング用バイアル瓶６０が設置されており、カラム５０とカラム５２との間にはサンプリング用バイアル瓶６１が、カラム５２とカラム５４との間にはサンプリング用バイアル瓶６２が、カラム５２の出口部分にはサンプリング用バイアル瓶６３が設置されている。
【００３０】
本実施例１で用いた無機培地の組成は以下の通りである。
ＮＨ４Ｃｌ              ３８ｍｇ／Ｌ
ＮａＨ２ＰＯ４           ８０ｍｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４             ５０ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ      ６ｍｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ    １７ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ      ２ｍｇ／Ｌ
微量金属              ０．１ｍＬ／Ｌ
レザズリン            ０．５ｍｇ／Ｌ
【００３１】
上記において、微量金属は、下記組成を有する。
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ      １，０００ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ      １，９００ｍｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２                    ７００ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ            ４０ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３                      ６０ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ          ２５０ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２Ｍｏ４・２Ｈ２Ｏ        ４４０ｍｇ／Ｌ
ＨＣｌ                          １ｍＬ／Ｌ
【００３２】
また、栄養剤の組成は以下の通りである。
クエン酸三ナトリウム      ５００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ          ２５０ｍｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３              １００ｍｇ／Ｌ
【００３３】
図３に示す培養装置のポンプ５１を加圧して無機培地を２３ｍｌ／時間の速度で、ポンプ５３にを加圧してシス−１，２−ジクロロエチレン飽和水溶液を０．２５ｍｌ／時間の速度で、ポンプ５５を加圧して栄養剤を２．５ｍｌ／時間の速度でカラム５０に注入しながら培養を行った。なお、還元雰囲気を保つため、無機培地は常に窒素パージを行い、栄養剤及びシス−１，２−ジクロロエチレン飽和水溶液の入った瓶については、窒素ガスを充填したサンプリングパック（１００ｍＬ）を取り付けた。シス−１，２−ジクロロエチレン飽和水溶液については、培養を開始して最初の１週間はクエン酸を与えずにシス−１，２−ジクロロエチレンのみを通水して培養を行い、１週間経過した後はクエン酸及び酵母エキスを、１０ｍｇ／Ｌの濃度になるように、シス−１，２−ジクロロエチレン飽和水溶液に添加した水溶液を供給した。次いで、シス−１，２−ジクロロエチレン分解菌の種菌として、シス−１，２−ジクロロエチレンで汚染された４カ所の場所（現場Ａ、現場Ｂ、現場Ｃ及び現場Ｄ）の地下水１０ｍｌをサンプリング用バイアル瓶６０から植種した。
【００３４】
２０℃の温度で１２０日間培養を行った。サンプリング用バイアル瓶６０及びサンプリング用バイアル瓶６３から培養期間中に８回サンプリングを行った。サンプリング用バイアル瓶６０から得られたサンプルについてシス−１，２−ジクロロエチレンの定量を行い、またサンプリング用バイアル瓶６３から得られたサンプルについてシス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの定量を行った。なお、シス−１，２−ジクロロエチレンは嫌気的に部生物によって分解され、塩化ビニルに変換され、次いでエチレンに分解されることは既に知られている。
【００３５】
上記定量は、それぞれのバイアル瓶から得られたサンプル１ｍＬを、別の３ｍＬの純水及び１．２ｇの塩化ナトリウムを入れた、２２ｍＬのバイアル瓶に注入し、３０℃の温度に３時間静置した後、気相より２００μＬの試料をサンプリングし、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルについてガスクロマトグラフィー（ＧＣ１７Ａ）を用いて、エチレンについてはガスクロマトグラフィー（ＧＣ９Ａ）により行った。
【００３６】
結果を図４に示す。図４は、各種揮発性成分の定量試験の結果を示すグラフであり、横軸は培養日数を表し、縦軸は各種揮発性成分の定量値を表す。なお、図４に示す結果は、現場Ａから得られた地下水を種菌として用いた場合の結果である。現場Ｂ及びＣについてもほぼ同様の結果であった。図４において、出口ｃＤＣＥは、サンプリング用バイアル瓶６３から得られたサンプル中のシス−１，２−ジクロロエチレンの定量結果であり、出口ＶＣは、サンプリング用バイアル瓶６３から得られたサンプル中の塩化ビニルの定量、出口ＥＴＨは、サンプリング用バイアル瓶６３から得られたサンプル中のエチレンの定量、入口ｃＤＣＥは、サンプリング用バイアル瓶６０から得られたサンプル中のシス−１，２−ジクロロエチレンの定量結果である。図４において、横軸は培養が始まってからの日数であり、縦軸は揮発成分の濃度を表す。
【００３７】
図４に示すように、サンプリング用バイアル瓶６０から得られたサンプル中のシス−１，２−ジクロロエチレンは、培養している間、ほぼ同じ濃度であった。サンプリング用バイアル６３から得られたサンプル中のシス−１，２−ジクロロエチレン濃度は、培養開始２５日頃から減少し始め、培養開始から６０日以降には、ほとんど検出されなかった。サンプリング用バイアル６３から得られたサンプル中の塩化ビニル濃度は、培養開始３５日頃に一端上昇したが、それ以外は、ほとんど塩化ビニルは検出されなかった。また、サンプリング用バイアル６３から得られたサンプル中のエチレン濃度は、培養開始３０日目頃まではほとんど検出できなかったが、その後、エチレン濃度は上昇し、培養開始６０日頃には上昇していた。本実施例においては、培養開始時にはほとんど検出されなかったエチレンが、培養開始６０日経過すると、エチレン濃度が上昇しており、このことは、培養された微生物群が、シス−１，２−ジクロロエチレンをエチレンにまで分解する能力を有していることがわかる。また、混合培養によって連続培養を行った場合、有機塩素系化合物の活性を安定して維持することができることが明らかである。なお、現場Ｄから得られた地下水を種菌として用いた場合は、シス−１，２−ジクロロエチレンは塩化ビニルにまで分解されたが、エチレンまでは分解されなかった。
【００３８】
実施例２
図５に示す培養装置を作成した。
図５は、微生物群を培養するために用いた回分培養を行うための培養容器の構成を示す図である。図４に示す回分培養容器は、微生物群を培養するための容器２０、植種口及びサンプリング口２４を有してなる。図４に示す回分培養容器に、下記組成からなる培地にシス−１，２−ジクロロエチレンを含有させた培地を作成し、この培地９０ｍｌを容器５０に注入した。
【００３９】
クエン酸三ナトリウム      ５００ｍｇ／Ｌ
酵母エキス                １００ｍｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３              ２，５２０ｍｇ／Ｌ
Ｔｒｉｓ                  ２，２９０ｍｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                  ５００ｍｇ／Ｌ
ＫＣｌ                    ３００ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４Ｃｌ                ３００ｍｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４              ２００ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ      １５ｍｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ      ５００ｍｇ／Ｌ
微量金属                  １ｍＬ／Ｌ
レザズリン                １ｍｇ／Ｌ
ＨＣｌ                    １ｍＬ／Ｌ
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ      ４８０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ    ２００ｍｇ／Ｌ
なお、上記において、微量金属は実施例１で用いたものと同一のものである。
【００４０】
次いで、上記容器２０に、シス−１，２−ジクロロエチレンで汚染された４カ所の場所（現場Ａ、現場Ｂ、現場Ｃ及び現場Ｄ）の地下水１０ｍｌを植種口及びサンプリング口２４から植種し、嫌気条件下で３０℃の温度で６０日間培養を行った。培養終了後、培養液を植種口及びサンプリング口２４からサンプリングし、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの定量を実施例１と同様の方法で行った。現場Ａの地下水を植種したものは、培地中にエチレンが検出され、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルは検出されなかった。すなわち、シス−１，２−ジクロロエチレンがエチレンにまで分解された。現場Ｃの地下水を植種したものは、培地中に塩化ビニルが蓄積しており、このことは、現場Ｃの地下水を植種したものは、シス−１，２−ジクロロエチレンを塩化ビニルにまで分解したがエチレンまで分解しなかったことを意味する。また、現場Ｂ及びＤの地下水を植種したものは,培地中にシス−１，２−ジクロロエチレンが検出され、塩化ビニル及びエチレンは検出されなかった。すなわち、シス−１，２−ジクロロエチレンの分解が起こらなかったことを意味する。
【００４１】
実施例３
実施例１に示す培養装置を用いて１００日間培養を行った。培養１００日目に、図３に示す培養装置のサンプリング用バイアル瓶６３からサンプリングし、この培養液を用いて回分培養を行った。回分培養は、実施例２で示す培養容器と同じ形状であり、容量が１０Ｌの容器を用いて行い、上記培養液を、回分培養容器の培地に対して２質量％となるように植菌して行った。３０℃の温度で３５日間培養を行った後、植種口及びサンプリング口２４から培養液をサンプリングし、シス−１，２−ジクロロエチレン、塩化ビニル及びエチレンの定量を実施例１と同様の方法で行った。定量の結果を図６に示す。図６は、各種揮発性成分の定量試験の結果を示すグラフであり、横軸は培養日数を表し、縦軸は各種揮発性成分の定量値を表す。図６に示すように、シス−１，２−ジクロロエチレンは、培養が進むにつれ、徐々に減少するのが認められた。また、塩化ビニルは、培養開始から初期は増加したが、徐々に減少した。エチレンは、培養開始直後は検出されなかったが、徐々に増加した。培養を開始して３３日経過後には、シス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニルはほとんど検出されず、ほとんどがエチレンであった。この結果は、回分培養においてもシス−１，２−ジクロロエチレンが完全にエチレンにまで分解されたことを示す。
【００４２】
実施例４
実施例１で培養を行った培養液に含まれる微生物、及び実施例３で回分培養を行った培養液に含まれる微生物の菌相解析を行った。菌相解析の手順について以下に説明する。
培養液１０〜２０ｍLを、孔径０．２μｍのフィルターで濾過して微生物をフィルター上に収穫した。次いで、フィルターを２ｍＬ容のエッペンドルフチューブに入れ、凍結融解、SDS処理を行い、次いでBead Beater処理を行った。抽出したＤＮＡを５０μＬのＴＥバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解した。
【００４３】
上述のようにして得られたＤＮＡ溶液１μＬをテンプレートとして１６ＳＤＮＡをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅の反応液の全容量は１００μＬとし、2.5ＵのEx Taq DNA ポリメラーゼ (宝酒造（株）製)、200μMのdNTPを用いた。また、プライマーとしてはBact0009f（GAGTTTGATCCTGGCTCAG 、配列番号：１）の５’末端を４，７，２’，４’，５’，７’−hexachloro−６−carboxyfluorescein（HEX）で標識したもの、及びBact1492r(ACGGYTACCTTGTTACGACTT、配列番号：２)の５’末端を６−carboxyfluorescein（６−FAM）で標識したものを用いた。なお、上記プライマーはPerkin-Elmer社に依頼して合成した。その他の反応液組成は添付のマニュアルに従った。PCR反応は、熱変性；９４℃、２ 分に続き、第１段階; 94℃, 20 秒、第２段階; 55℃30 秒、第３段階; 72℃, 2 分を30サイクル繰り返し、Post extension; 72℃, 7 分を行った。本反応には、Perkin-Elmer製 GeneAmp PCR System 2400を利用した。得られたPCR増幅産物（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）を、ファルマシア製のS-300HRスピンカラムを用いて精製し、適量を制限酵素（ＢｓｔＵＩ,ＨｈａＩ,ＲｓａＩ）を用いて切断した。切断された16S rDNAを、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystem社製）によりGene Scanモードで解析し、T-RFLP（0〜550 塩基の範囲）のエレクトロフェログラムを得た。T-RFLPのエレクトロフェログラムは16S rDNA の５’末端のHEXによる解析結果のみを利用した。また、内部標準にはGeneScan500 ROX （ROX: 6-carboxy-X-rodamine, Applied Biosystem社製）を用いた。
【００４４】
実施例１で培養した場合の培養液、及び実施例３で培養した場合の培養液について、ＢｓｔＵＩで制限酵素処理した際のT-RFLPによる解析結果を図７に示す。図７（Ａ）は実施例１で得られた培養液の結果であり、図７（Ｂ）は実施例３で得られた培養液の結果である。図７（Ａ）から明らかなように、実施例１で得られた培養液からは、複数のピークが検出された。実施例３で得られた培養液、すなわち、更に回分培養を行った培養液からは、ピークは大きなピーク１個と小さなピーク１個となった。実施例３で得られた培養液の結果に示されるピークのエリア値は19254及び1657となっており、培養液中にはほぼ1種類の細菌(属レベル)が優占して存在していることがわかった。
【００４５】
実施例５
次に、この優占種が安全な菌であるかどうかを調べるため、優占種の同定を行った。手順は以下に示すとおりである。
実施例４で用いたDNA溶液１μＬをテンプレートとして16S rDNAをPCR増幅した。実施例４で用いたPCR反応条件によりPCR 反応を行った。この際、プライマーはBact0009f（GAGTTTGATCCTGGCTCAG 、配列番号：１）及びBact1492r(ACGGYTACCTTGTTACGACTT、配列番号：２)を用いた。PCR増幅産物を１．０％アガロース電気泳動にかけ、目的である16S rDNA（約1.5 kb）断片を確認した。次いで、この断片を含むPCR増幅産物をプラスミドT-Vectorのマルチクローニングサイト（MCS）に挿入した。ライゲーション反応にはLigation high（東洋紡製）を使用し、16℃にて一晩反応させた。その後、大腸菌  ＪＭ１０９に形質転換させL broth寒天培地（Ampicillin 100 mg/mLを含有する）に塗布し、37℃で一晩培養した後、形質転換体を得た。16S rDNAクローンを含む大腸菌の少量をTEバッファーに懸濁し、95℃で2分間熱処理し、大腸菌を含むＴＥバッファー1μＬをテンプレートとしてPCR反応を行った。プライマーペアは、MCSの上流および下流の塩基配列からデザインしたKNA80f（TTCACCGTCATCACCGAAACG、配列番号：３）及びKNA80r （CATCCGCCAAAACAGCCAAGC、配列番号：４）を用いた。PCR組成、反応条件は、第２段階のアニーリング温度を６０℃とした以外は、基本的には実施例４と同じである。
【００４６】
PCRにより合成されたDNA断片は約1.5 kbであることを１．０％アガロース電気泳動により確認した。16S rDNAクローンは１サンプルにつき48個取得した。次にPCR反応液をＴＥバッファーで1/100に希釈し、この１μＬをテンプレートとして、Bact0003（ATTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCA・・・・・、配列番号：５）およびBact1492r（配列番号：２）のプライマーペアを利用し、再びPCR反応を行った。PCR反応の組成、条件は実施例４と同様である。PCR反応終了後、その溶液１μＬを３種類の制限酵素（BstUI, HhaI及びRsaI）によりそれぞれ切断し、４．０％アガロース電気泳動を行い、切断パターンを比較してT-RFLPにおける優占ピークと同様の切断パターンを示すクローンを決定した。このクローンに関して、プライマーとしてBact0003ST（ATTGAAGAGTTTGATCC、配列番号６）を用いて、代表クローンの前方500 塩基の塩基配列を決定した。DNAの伸長反応にはBigDye Terminator Kit（Applied Biosystem社製）を用い、配列決定にはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystem社製）を使用した。得られた塩基配列データをインターネット上でRibosomal Database Project（RDP）IIに送付し、近縁種を決定した。
【００４７】
同定の結果、実施例３で得られた培養液に含まれる優占種はLactosphaera pasteurii(旧Ruminococcus pasteurii)に近縁である微生物であることがわかった。この細菌は、日本細菌学会および国立感染症研究所の病原菌リストには掲載されておらず、ドイツDSMリストにおいても危険度は１であった（病原細菌研究会  江崎ら「病原体の取り扱い及び同定のための手引き」を参照）。
ヒトおよび生態系への影響を考慮すると、土壌及び／又は地下水の原位置バイオオーギュメンテーションに用いられる培養液に関しては、高度に限定された微生物で構成され、その構成が継続的に安定していることが望ましい。以上のように、土壌カラムで培養することにより長期に安定して分解菌の活性を維持することができ、またカラム内で形成された複雑な菌相は、回分培養に植え継ぐことにより高度に限定された安全な菌によって構成されるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】微生物群を連続的に培養し、次いで回分培養する方法を実施するための培養装置の構成を示す図である。
【図２】本発明の第二の実施の形態にかかる微生物群の培養方法を実施するための培養装置の構成を示す図である。
【図３】実施例で微生物群を培養するために用いた連続培養装置の培養装置の構成を示す図である。
【図４】各種揮発性成分の定量試験の結果を示すグラフである。
【図５】微生物群を培養するために用いた回分培養を行うための培養容器の構成を示す図である。
【図６】各種揮発性成分の定量試験の結果を示すグラフである。
【図７】ＢｓｔＵＩで制限酵素処理した際のT-RFLPによる解析結果である。
【符号の説明】
【００４９】
１０  カラム                          １２  微生物群及び培地供給管
１４  ポンプ                          １６  培養液排出管
１８  ポンプ                          ２０  回分培養容器
２０  容器                            ２４  植種口及びサンプリング口
３０  混合培養槽                      ５０  カラム
５２  カラム                          ５４  カラム
５１  ポンプ                          ５６  微生物群及び培地供給管
５３  ポンプ                          ５５  ポンプ
６０  サンプリング用バイアル瓶        ６１  サンプリング用バイアル瓶
６２  サンプリング用バイアル瓶        ６３  サンプリング用バイアル瓶
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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