(57)【要約】【課題】  熱安定性が高く、不純物が少なく、リガンドと担体との結合が化学的に安定で、アフィニティ性の高いポリマー、及び該ポリマーを含むリガンド固定化用担体を提供すること。【解決手段】  少なくともスチレン系モノマーとｔ−ブチルメタクリレートとを含んで重合されてなるポリマーであって、前記スチレン系モノマーが３０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下であり、該ポリマーの少なくとも一部が、下記一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマー。【化１】2006119119.tif 000009  式中、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｑはスペーサー基を表す。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともスチレン系モノマーとｔ−ブチルメタクリレートとを含んで重合されてなるポリマーであって、
前記スチレン系モノマーが３０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下であり、該ポリマーの少なくとも一部が、下記一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマー。
【化１】
2006119119.tif 000008
（式中、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｑはスペーサー基を表す。）
【請求項２】
前記ポリマーが水不溶性であり、前記スペーサー基がポリオキシエチレン鎖を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記ポリマーが、架橋し、粒子の形状を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のポリマー。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のポリマーを含むリガンド固定化用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断薬、検査薬、液体クロマトグラフィに好適に使用可能なポリマーに関し、特にリガンド固定化用担体として好適に用いることができるポリマーに関する。当該リガンド固定化用担体は、アフィニティクロマトグラフィの原理を使い、抗体などの液体中の有用物質あるいは病因物質を分離または精製するのに好適である。
【背景技術】
【０００２】
分離または精製を目的とする物質（目的物質）に対し、親和性のある物質（リガンド）を不溶性担体に固定化しておき、該目的物質をこのリガンドに特異的に吸着させて回収し、精製を行う技術が、アフィニティクロマトグラフィとして知られている（例えば、非特許文献１参照。）。また、抗体の精製を目的に、リガンドとしてカッパ軽鎖結合蛋白をアガロースに結合させたアフィニティゲルを用いる方法（例えば、特許文献１参照。）や、両末端にエポキシ基を有する親水性スペーサーを介したエポキシ反応によりリガンド（抗体）を水不溶性セルロースに固定化した担体（例えば、特許文献２参照。）等が開示されている。
しかし、アガロースのごとき天然物由来の担体ゲルを用いた場合、ゲル自体が４０℃以上で溶解してしまい温度に対する安定性が悪いという欠点があった。セルロースの場合、エポキシ化セルロースを合成するためにエピクロルヒドリンのごとき毒性の強い試薬を使用しなければならず、また作製したエポキシ化セルロースはリガンドに存在する官能基との結合選択性が低いため、リガンドのアフィニティ機能を有する特定部位にも結合してしまい、その結果、得られた固定化担体はアフィニティ性能が低いという欠点があった。さらに、アガロースあるいはセルロースのごとき担体ゲルは天然物由来であることから純度が低いという欠点があった。
【０００３】
また、リガンドと担体がジスルフィド結合で連結したリガンド固定化担体が開示されている（例えば、非特許文献１及び特許文献３参照。）。しかしながら、ジスルフィド結合は化学的に不安定で他のチオール基を有する化合物（たとえば、システイン残基を有するペプチドやタンパク質）が存在すると容易に開裂してしまうという欠点があった。
固定化担体として、チオール基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基のような官能基が導入されたポリスチレン、ポリメタクリル酸およびその誘導体、あるいはこれらの共重合体、更にはポリビニルアルコール、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの合成高分子化合物が開示されている（例えば、特許文献４及び特許文献５参照。）。しかしながら、上述の一般的な合成高分子では、たとえばポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸のごとき脂肪族系のポリマーからなるリガンド固定化担体の場合、抗体分離性が著しく低下し、ポリスチレン、ヒドロキメチルポリスチレンのごとき芳香族系のポリマーは、目的物質以外の抗体も結合させるという非特異的な結合が起こり、選択性が低いという欠点があることがわかった。
【特許文献１】特開平７−１４６２８０号公報
【特許文献２】特開平６−３４６３３号公報
【特許文献３】特開平２００４−４５１２０号公報
【特許文献４】特開平６−３４６３３号公報
【特許文献５】特開２００４−４５１２０号公報
【非特許文献１】「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２年発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、担体の熱安定性が高く、不純物が少なく、リガンドと担体との結合が化学的に安定で、アフィニティ性の高いポリマー、及び該ポリマーを含むリガンド固定化用担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
少なくともスチレン系モノマーとｔ−ブチルメタクリレートとを含んで重合されてなるポリマーであって、前記スチレン系モノマーが３０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下であり、該ポリマーの少なくとも一部が、下記一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマーによって、上記課題の解決に至った。
【化１】
2006119119.tif 000002
一般式（１）中、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し、Ｑはスペーサー基を表す。
【０００６】
さらに、一般式（１）中、Ｑで表されるスペーサー基がポリオキシエチレン鎖を含み、かつポリマーが水不溶性である場合や、前記ポリマーが架橋し、粒子の形状を有する場合が好適である。
これらのポリマーは、リガンド固定化用担体として好適に利用できる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に因れば、担体の熱安定性が高く、不純物が少なく、リガンドと担体との結合が化学的に安定で、アフィニティ性の高いポリマー、及び該ポリマーを含むリガンド固定化用担体を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のポリマーは、少なくともスチレン系モノマーとｔ−ブチルメタクリレートとを含んで重合されてなるポリマーであって、前記スチレン系モノマーが３０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下であり、該ポリマーの少なくとも一部が、一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマーである。
【０００９】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明のポリマーは、少なくともスチレン系モノマーとｔ−ブチルメタクリレートとを含んで重合されてなるポリマーであって、前記スチレン系モノマーが３０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下であり、該ポリマーの少なくとも一部が、下記一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基で置換されてなることを特徴とするポリマーであり、好ましくはスチレン系モノマーが４０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下の場合である。
【００１０】
スチレン系モノマーとｔ−ブチルメタクリレート以外の成分として、上記条件を満足する範囲内で他の重合体成分を含有させることができる。他の成分としては（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、架橋する場合にはジビニルベンゼン、ジメタクリル酸エチレングリコールが好ましい。
該成分スチレン系モノマーが９０ｍｏｌ％より大きいとリガンドの選択性が低下し、目的物質以外の物理吸着が大きくなる。また、該成分スチレン系モノマーが３０ｍｏｌ％より小さいと、リガンドのアフィニティ性が低下し、目的物質の吸着が著しく低下する。  
【００１１】
下記一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基は、ｔ−ブチルメタクリレートのカルボン酸基の部分で置換され得る。置換の割合は、存在するカルボン酸基の全体に対して、１％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上９０％以下であることがより好ましい。
【００１２】
一般式（１）で表されるマレイミジル基を含む官能基について説明を行う。
【化２】
2006119119.tif 000003
【００１３】
ここで、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−を表す。Ｑはスペーサー基を表し、好ましくは、ポリオキシエチレン鎖、アルキレン鎖、アミノ鎖、ポリオキシプロピレン基を含有する２価の連結基であり、より好ましくは下記（１）又は（２）で表される二価の連結基である。
【００１４】
【化３】
2006119119.tif 000004
【００１５】
スペーサー基が上記（１）の場合、ａは、１以上の整数を表す。ポリオキシエチレン鎖の長さは特に限定されないが、分子量で６０から１００００までが好ましい。より好ましくは１００から１０００である（ここで述べるポリオキシエチレン鎖には単一のエチレンオキサイドをも含む）。ｂは、０又は１以上の整数を表し、好ましくは０又は１〜６の整数であり、より好ましくは０〜２であり、特に好ましくは０又は１である。
【００１６】
スペーサー基が上記（１）の場合、ポリオキシエチレンの末端水酸基と、水酸基含有マレイミジルとをエーテル化反応で結合させることで得られる。マレイミジル基と水酸基の間にアルキレン基を介す場合（ｂが１以上の場合）は、ヒドロキシアルキルマレイミジル等の化合物を用いることで得られる。
スペーサー基が上記（１）で、Ｘが−Ｏ−の場合は、ポリオキシエチレンの末端水酸基と、水酸基含有マレイミジルとをエーテル化反応で結合させたときの、ポリオキシエチレンの片端水酸残基である。
スペーサー基が上記（１）で、Ｘが−ＮＨ−の場合は、（ｉ）ポリオキシエチレンの末端水酸基と、水酸基含有マレイミジルとをエーテル化反応で結合し、ポリオキシエチレンの他方の末端水酸残基をアミノ基に変換する、（ｉｉ）上記（１）のスペーサーの両末端がアミンである化合物に無水マレイン酸を反応させた後、脱水し閉環する、（ｉｉｉ）ポリオキシエチレンの片末端水酸基をアミノ基に変換した後、ポリオキシエチレンの他方の末端水酸基と水酸基含有マレイミジルをエーテル化反応させる、（ｉｖ）ポリオキシエチレンの末端水酸基をアミノ基に変換した後、一分子中にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基とマレイミジル基を持つような二官能性試薬を反応させてマレイミジル基を導入する、等の方法により目的物質を得ることができる。
【００１７】
スペーサー基が上記（２）の場合、ｃは、１以上の整数を表し、好ましくは１〜１２の整数であり、より好ましくは１〜６である。
スペーサー基が上記（２）の場合で、Ｘが−Ｏ−の場合は、マレイミジル基と水酸基の間にアルキレン基を介す化合物、例えば、ヒドロキシメチルマレイミジル等の化合物を用いることで目的物質を得ることができる。
スペーサー基が上記（２）で、Ｘが−ＮＨ−の場合は、スペーサー基が（１）の場合と同様の方法により目的物質を得ることができる。
【００１８】
Ｑで表されるスペーサー基として好ましくは、上記（１）で表されるポリオキシエチレン鎖を有するスペーサー基である。特に、リガンド固定化用担体として、粒子の形状を有する場合が好適である。ポリオキシエチレン鎖を導入することで水中、バッファ液中での分散性が高まり、操作性が容易になる。また、Ｑで表されるスペーサー基が上記（１）で表されるポリオキシエチレン鎖を有する結合基の場合、Ｘは−Ｏ−であることが好ましい。
【００１９】
マレイミジル基をＱ及びＸを介して共重合体に導入する方法は、いかなる方法であってもよく、その目的によって適宜選択することができる。
例えば、Ｘが−Ｏ−の場合、（メタ）アクリル酸ｔ−ブチル共重合体のごとき基材を酸又はアルカリで加水分解し、エステル部を一旦カルボキシル基に変換したカルボン酸含有共重合体と、Ｘの末端が水酸基である化合物とを、エステル反応させて導入しても良いし、あるいは、エステル交換触媒を用いて上記基材と直接エステル交換反応させることにより導入しても良い。または、あらかじめＸ及びＱが結合した対応するモノマーを共重合することによって得ることもできる。Ｑが上記（１）に示すようなポリオキシエチレン鎖を有する場合には、カルボン酸に加水分解してからエステル反応させる方法が好ましい。
【００２０】
本発明のポリマーに含まれるマレイミジル基の量は特に限定されるものではないが、０．００１ｍｍｏｌ／ｇ以上含有することが好ましく、単位質量当たりの反応量をできるだけ多くするという観点から、０．０１ｍｍｏｌ／ｇ以上１．０ｍｍｏｌ／ｇ以下が更に好ましく、特に、０．０５ｍｍｏｌ／ｇ以上０．５ｍｍｏｌ／ｇ以下が好ましい。０．００１ｍｍｏｌ／ｇ以上とすることにより、アフィニティ担体としてＳＨ基含有物質を固定化することができ、０．０５ｍｍｏｌ／ｇ以上とすることにより固定化の能力が特に充足される。
なお、上記ポリマー中のマレイミジル基の量は、次の方法によって測定した値とする。
【００２１】
まず、ポリマー粒子を一定量ねじ口試験管にＷ（ｇ）秤量し、あらかじめ調製した２−メルカプトエチルアミン（東京化成社製）の反応液を、２−メルカプトエチルアミンが過剰量になるよう一定量加え、攪拌反応させる。
次に、ポリマー粒子を遠心分離したのち、上澄み溶液の２−メルカプトアミンと４，４’−ジチオジピリジンとを反応させ、３２４ｎｍの吸光度からモル吸光係数ε＝１９８００を用いて上澄み溶液中の２−メルカプトエチルアミン量Ｂ（ｍｏｌ）を求める。
ブランクとして、サンプルを含まない系の２−メルカプトアミン量Ｃ（ｍｏｌ）も同様に測定し、下記の式に従ってマレイミジル基量Ｍ（ｍｍｏｌ／ｇ）を求める。
Ｍ＝（Ｃ−Ｂ）／Ｗ×１０００
【００２２】
本発明においてスチレン系モノマーとは、ｔ−ブチルメタクリレートと共重合可能な芳香族モノマーを意味し、スチレン、メチルスチレン、アミノスチレン、アセトキシスチレン、ｔ−ブチルスチレン、クロロスチレン、ブロモスチレン、フルオロスチレン、クロロメチルスチレン、シアノメチルスチレン、メトキシスチレン、フェニルスチレンなどが挙げられる。この中でも特に重合性と価格面から、スチレンが好ましい。
【００２３】
本発明のポリマーの重合には公知の方法が利用でき、例えば、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法等が好適に用いられる。さらに、膜乳化法として知られる乳化方法を使って懸濁重合することもできる。必要に応じて、当業者には周知の重合開始触媒を用いることができる。具体的には、ジアシルパーオキサイド、ケトンパーオキサイドおよびアルキルハイドロパーオキサイドのような有機過酸化物；過酸化水素およびオゾンのような無機過酸化物；およびアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ；和光純薬社よりＶ−６０として入手可能）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）（和光純薬社よりＶ−５９として入手可能）および２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（和光純薬社よりＶ−６５として入手可能）のような油溶性アゾ系有機化合物；２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二酸塩（和光純薬社よりＶ−５０として入手可能）、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（和光純薬社よりＶＡ−０８６として入手可能）および２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二酸塩（和光純薬社よりＶＡ−０４４として入手可能）のような水溶性アゾ系有機化合物が挙げられる。重合開始剤を用いる場合は、それらは重合が良好に開始されるのに充分な量で用いられる。このような量は当業者に周知で
ある。一般には、０．１〜５．０質量％の量で用いることが好ましい。
【００２４】
得られたポリマーはメタノール等の溶媒に希釈分散させ、濾別し、更に水洗及び／又は溶剤洗浄の後、噴霧乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥等の通常の手段によって粉体として単離することができる。
上記で重合されたポリマーを熱融解したり、溶剤に溶解することにより所望の形に成型後、冷却したり、溶剤を除去することにより固化することができる。
また、本発明のポリマーは必要に応じて架橋されるが、重合時に架橋させても、重合した後に架橋させてもよい。架橋の方法は特に限定されるものではないが、架橋剤の添加、電磁波の照射、電子線の照射、粒子線の照射などがある。架橋剤の種類は特に限定されるものではないがジビニルベンゼン、ジメタクリル酸エチレングリコール、尿素樹脂、メラミン樹脂等がある。
【００２５】
本発明のポリマーは、リガンド固定化用担体として好適に用いることができる。
担体にリガンドを固定化する方法としては、担体に導入したマレイミジル基とリガンドのメルカプト基との反応が好適に用いられる。リガンドがペプチドである場合、ペプチド連鎖中のシステイン残基のメルカプト基を利用して担体に固定化することができ、リガンドが抗体である場合は、抗体をペプシンで消化し、抗体の可変部位のみに精製して、リガンドに生成するメルカプト基を用いて担体に固定化することができる。また、抗体をアミノエタンチオールなどのチオール化合物で還元断片化し、生成したメルカプト基を用いて担体に固定化することができる。マレイミジル基とメルカプト基との反応は速やかで、かつ得られた結合は化学的安定性が高い。担体へのリガンドの固定化は担体とリガンドとを純水中もしくはバッファ中で混合攪拌すれば良い。
【００２６】
ここで定義されるリガンドは、ターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成品、天然物の限定はされないが、抗体やレセプターなどを好ましく用いることができる。抗体を用いるのであれば、たとえば抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗黄色ブドウ球菌毒素抗体などを用いることができ、目的によってその他のものも含めて種々選定することができる。
【００２７】
また、レセプターを使用するのであれば、例えばＣＣＲ３，ＣＣＲ４等のサイトカインレセプターやＦｃγ，Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ，ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等，Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等を用いることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の担体は水不溶性であることが好ましい。本発明の担体の形態は特に限定しないが、液体処理カラムとして用いる場合には、粒子、繊維、中空繊維、糸束、ヤーン、ネット、編地、織物等が用いられるが、表面積が大きくかつ細胞を流した場合にも詰まることなく、流路抵抗の低いことを考慮すると、粒子、繊維、編地、織物、中空糸、多孔質膜が好ましく用いられる。特に操作性の点で粒子が好ましい。さらには、プレート上あるいはフィルム上にスポットとしてリガンド固定化担体が形成されていても良い。この場合、粒子状のリガンド固定化担体がプレート上あるいはフィルム上に固着されていても良いし、プレート上あるいはフィルム上にリガンド固定化部位が直接形成されていても良い。
【００２９】
粒子の場合、その粒径は種々の用途に応じて選択可能であるが、一般的に乾燥状態での個数平均粒径が０．１〜１０００μｍであり、中でも固液分離の容易性の観点から、１〜２００μｍであることが好ましく、特に、５〜１００μｍであることが好ましい。
ここで、個数平均粒径は、乾燥粒子を光学顕微鏡または電子顕微鏡にて写真撮影し、その中から無作為に選んだ１００個から２００個の粒子の粒子径を各々測定し、それらの合計値を個数で除した値である。
【００３０】
本発明において、ポリマーを粒子状とするためには公知の方法が利用でき、例えば、懸濁重合法、乳化重合法、分散重合法、シード重合法等が好適に用いられる。さらに、膜乳化法として知られる乳化方法を使って懸濁重合することもできる。
【００３１】
本発明におけるリガンド固定化用担体は、特殊な反応性官能基を有さないので添加剤や溶媒との反応、残存による粒子物性への悪影響が全くないか、きわめて少ないという利点がある。また本発明におけるリガンド固定化用担体は熱および溶剤に対する安定性が高いので、ソックスレー抽出などの精製処理を長時間行うことで不純物を低減化でき、純度を上げることができる。
【００３２】
さらに本発明におけるリガンド固定化用担体は着色を目的に、公知の染料、顔料、カーボンブラック、磁性粉などを添加することも可能である。マイクロカプセルにすることも可能で、多孔質粒子とすることも可能である。
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、部は質量部を示す。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］
（架橋ポリマー粒子の合成）
ジビニルベンゼン（純度５５質量％）を架橋剤として使用し、表１のごとくスチレン（和光純薬（株）製）およびメタクリル酸メチル（和光純薬（株）製）とメタクリル酸ｔ−ブチル（和光純薬（株）製）との共重合比を変化させた基材粒子を作製した。造粒方法は、懸濁重合法を用い、分級操作を施し、個数平均粒径５０μｍに調整した。個数平均粒径の測定は、上述の通りである。
得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して基材粒子を得た。
【００３５】
【表１】
2006119119.tif 000005
【００３６】
（ポリオキシエチレン鎖の導入）
上記で得られた基材粒子各１０部を塩酸（和光純薬（株）製）７５部に分散させ、ジオキサン（和光純薬（株）製）１５０部を加え、８０℃で６時間反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらにイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥してポリメタクリル酸含有担体粒子を得た。カルボン酸の定量から共重合体のメタクリル酸ｔ−ブチル成分の９８％がメタクリル酸に変換されていた。
このようにして得られたポリメタクリル酸含有担体粒子Ｐ１〜Ｐ７のいずれか１０部にポリエチレングリコール２００（和光純薬（株）製）１５０部、硫酸（和光純薬（株）製）１５部を混合して、１２０℃で５時間反応させた。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して担体粒子にポリオキシエチレン鎖を導入したポリオキシエチレン鎖導入基材粒子ＰＰ−１〜ＰＰ−７を得た。
【００３７】
（マレイミジル基の導入）
ポリオキシエチレン鎖導入基材粒子ＰＰ−１〜ＰＰ−７のいずれか１０部にヒドロキシメチルマレイミジル５部、トルエン３５０部を入れ６０〜７０℃に加熱撹拌し、触媒のｐ−トルエンスルホン酸一水和物０．５部を入れ、温度を上げて６時間還流下反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらに、エタノールで８時間ソックスレー抽出を行った。濾過した後、イオン交換水及び溶剤で再度洗浄後、単離乾燥して本発明のリガンド固定化用担体および比較の担体（試料１〜７）を得た。このようにして得られたマレイミジル基含有ポリマー粒子のマレイミジル基量は以下の方法で測定した。
【００３８】
（マレイミジル基含有担体粒子中のマレイミジル基定量法）
粒子を一定量ねじ口試験管にＷ（ｇ）秤量し、あらかじめ調製した２−メルカプトエチルアミン（東京化成社製）の反応液を、２−メルカプトエチルアミンが過剰量になるよう一定量加え、攪拌反応させた。
粒子を遠心分離したのち上澄み溶液の２−メルカプトアミンと４，４’−ジチオジピリジンと反応させ、３２４ｎｍの吸光度からモル吸光係数ε＝１９８００を用いて上澄み溶液中の２−メルカプトエチルアミン量Ｂ（ｍｏｌ）を求めた。ブランクとして、サンプルを含まない系の２−メルカプトアミン量Ｃ（ｍｏｌ）も同様に測定し、下記の式に従ってマレイミジル基量Ｍ（ｍｍｏｌ／ｇ）を求めた。
Ｍ＝（Ｃ−Ｂ）／Ｗ×１０００
【００３９】
求めたマレイミジル基量を表２に示した。この粒子１部を１０部の純水に入れ、３０秒間超音波処理して顕微鏡観察したところ、試料５以外は良好に分散していることを確認した。
【００４０】
【表２】
2006119119.tif 000006
【００４１】
（不純物の評価）
得られた担体を０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸／ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ７．２）中に３０℃で３時間浸漬した後、遠心分離し、上澄み液の２８０ｎｍの吸収度を分光光度計（日立製作所製Ｕ−３３１０）を用いて測定した。試料番号１から４の試料では、吸光度変化は０．００５から０．０１までの間で、ほとんど変化しなかった。比較としてアクチベーテッドチオールセファロース４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）を同様に測定したところ、吸光度で０．２増大した。天然物由来のアガロースベースのリガンド固定化用担体は不純物が多いものであった。
【００４２】
（アフィニティ特性を評価）
実施例１で作製した各担体に対し以下の方法でアフィニティ特性を評価した。
１）  マウスＩｇＧ（和光純薬工業（株）製，商品コード１３２−１３７２６）を一次抗体とし、この抗体を還元断片化し粒子に結合させる。ついで、抗マウスＩｇＧ，ウサギ，ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（和光純薬工業（株）製，商品コード０１７−１７６０１）を二次抗体として、アフィニティカップリングさせた後、二次抗体の分離操作を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥにて二次抗体の回収の有無を調べる。
２）  一次抗体を還元断片化処理しないでそのまま、粒子と混合する。二次抗体をアフィニティカップリングさせた後、二次抗体の分離操作を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥにて二次抗体の回収の有無を調べる。
【００４３】
１）の操作で二次抗体の分離が確認された場合の評価を○及び◎とし、特に分離が良好で明確に確認できる場合を◎とし、全く確認されない場合を×とした。
一方、２）の操作で二次抗体の分離が確認されないレベルに応じて○及び◎とし、特に分離が全く確認できないものを◎とし、明確に確認された場合を×とした。
結果を下記表３に示した。
【００４４】
［実施例２］
（アミノエトキシエタノール鎖の導入）
実施例１と同様にジビニルベンゼン（純度５５質量％）を架橋剤として使用し、スチレン（和光純薬（株）製）とメタクリル酸ｔ−ブチル（和光純薬（株）製）との共重合比が５０：５０の基材粒子を作製した。造粒方法は、懸濁重合法を用い、分級操作を施し、個数平均粒径５０μｍに調整した。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して基材粒子を得た。この粒子１０部を２−（２−アミノエトキシ）エタノール（和光純薬（株）製）５０部に分散させ、メシチレン（和光純薬（株）製）１５部を加え、窒素雰囲気下テトラ−ｎ−プロポキシチタンを０．２部滴下し、１４時間還流下反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらにイオン交換水及び溶剤で洗浄後、単離乾燥して水酸基導入基材粒子ＰＰ−８を得た。
【００４５】
（マレイミジル基の導入）
上記基材粒子ＰＰ−８の１０部にヒドロキシメチルマレイミジル５部、トルエン３５０部を入れ６０〜７０℃に加熱撹拌し、触媒のｐ−トルエンスルホン酸一水和物０．５部を入れ、温度を上げて６時間還流下反応させた。得られた粒子をメタノールに分散／洗浄しさらに、エタノールで８時間ソックスレー抽出を行った。濾過した後、イオン交換水及び溶剤で再度洗浄後、単離乾燥して本発明のリガンド固定化用担体（試料８）を得た。このようにして得られたマレイミジル基含有ポリマー粒子のマレイミジル基量を（試料１〜７）と同様の法で測定したところ、０．１ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００４６】
［実施例３］
（マレイミジル基の導入）
実施例１で作製した基材粒子Ｐ−２の１０部に、塩化チオニル（和光純薬（株）製）３００部を入れ分散させた後、７５〜８０℃に加熱撹拌し、５時間還流下反応させた。得られた粒子をトルエンに分散／洗浄し、単離乾燥した。この粒子１０部に乾燥トルエン９０部を加えて再分散した後、この中にピリジン（和光純薬（株）製）３部を入れ、ヒドロキシメチルマレイミジル５部を入れて室温で１２時間反応させた。得られた粒子をイオン交換水及び溶剤で繰り返し洗浄後、単離乾燥して本発明のリガンド固定化用担体（試料９）を得た。このようにして得られたマレイミジル基含有ポリマー粒子のマレイミジル基量を、試料１〜７と同様の方法で測定したところ、０．２ｍｍｏｌ／ｇであった。
【００４７】
実施例２と実施例３で得られた本発明の試料番号８と試料番号９を、実施例１と同様の測定方法によって、不純物とアフィニティ特性を評価した。
不純物の評価において、試料番号８と試料番号９の試料では、吸光度変化は０．００５から０．０１までの間で殆ど変化しなかった。
アフィニティ特性については、その結果を表３に示した。
【００４８】
【表３】
2006119119.tif 000007
【００４９】
表３に示すように、スチレン含有量が９０ｍｏｌ％を超えると物理吸着が増大し、選択性が低下し、スチレン含有量が３０ｍｏｌ％を下回るとアフィニティ特性自体が低下することがわかった。特に、スチレン含有量が４０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下の場合にアフィニティ特性が良好であった。
【００５０】
このように、アフィニティ特性の発現には基材粒子の親水性と疎水性のバランスが重要であることがわかった。スチレン含有量が３０ｍｏｌ％を下回ると親水性が強くなりすぎて抗体との親和性が低下し、９０ｍｏｌ％を超えると疎水性が強くなりすぎて物理吸着が増大し、かつ水分散性が低下するものと考えられる。特に、スチレン含有量を４０〜８０ｍｏｌ％に設定することにより親水性と疎水性のバランスがより好ましい状態になり良好なアフィニティ特性が得られる。