(57)【要約】    【課題】  副作用の少ない天然物由来の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤を提供する。    【解決手段】  リンゴおよび／またはホップ由来のポリフェノール画分を含有することを特徴とする誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴおよび／またはホップ苞由来のポリフェノール画分を含有することを特徴とする誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤を含有する飲食品。
【請求項３】
請求項１に記載の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤を含有する食品添加物。
【請求項４】
請求項１に記載の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導型一酸化窒素合成酵素の誘導を阻害する誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（以下、「ＮＯ」と略称することがある）は生体内の様々な細胞において、一酸化窒素合成酵素（以下、「ＮＯＳ」と略称することがある）によって産生され、血管弛緩、血小板凝集抑制作用、神経伝達物質、抗腫瘍、殺菌作用等の重要な役割を担っている。
【０００３】
ＮＯＳは現在３種のアイソザイムが知られている。すなわち、血管内皮型ＮＯＳ（以下、「ｅＮＯＳ」と略称することがある）、神経型ＮＯＳ（以下、「ｎＮＯＳ」と略称することがある）および誘導型ＮＯＳ（以下、「ｉＮＯＳ」と略称することがある）の３種類のアイソザイムである。
【０００４】
好中球、マクロファージまたは平滑筋において、エンドトキシンや各種サイトカイン刺激によって誘導されるｉＮＯＳは、過剰なＮＯを産生することによって、内皮細胞障害、心筋収縮力低下、自己免疫疾患などの弊害を引き起こす。従って、過剰なＮＯの産生を抑制するためにはｉＮＯＳの活性を阻害する必要があるが、従来の阻害剤は、恒常的な循環動態調節の阻害、血圧上昇等の副作用があり、このような副作用の少ない天然物由来のｉＮＯＳ阻害剤の開発が求められていた。
【０００５】
天然物由来でＮＯ産生阻害を有するものとしては、緑茶抽出物（特許文献１）、オリーブ種植物抽出物（特許文献２）、プロポリス（特許文献３）、インドネシア産植物（特許文献４）、ブドウ種植物（特許文献５）、ニシキギ科植物（特許文献６）、カンラン科灌木由来（特許文献７）等が知られおり、またカカオのポリフェノールについてエンドトキシン活性中和剤としてのＮＯ産生阻害（特許文献８）が報告されている。
【０００６】
一方、リンゴ由来ポリフェノールには酸化防止や抗変異原性、アレルギー抑制、抗う蝕、消臭などの効果（特許文献９）があり、ホップ由来ポリフェノールには抗う蝕などの効果があることが知られている。しかし、リンゴまたはホップ由来ポリフェノールでのＮＯ産生阻害は報告されていない。
【０００７】
さらに、上記天然物由来のＮＯ産生阻害剤はエンドトキシン刺激時のＮＯ産生量の減少を報告しているが、ｉＮＯＳ遺伝子自体の発現を抑制した報告はない。ｉＮＯＳ遺伝子の発現抑制は、一旦産生された過剰なＮＯを消去するのではなく、未然に過剰なＮＯの発生を防ぐことを意味するため、生体にとってより効率的なＮＯ産生阻害効果が期待できる。また、エンドトキシン刺激時以外にｅＮＯＳやｎＮＯＳによって、産生され、血管拡張等の重要な機能を担うＮＯについては影響を及ぼさず、副作用等の問題もないものと考えられる。
【特許文献１】特表２００２−５２１４５１号公報
【特許文献２】特表２００３−５３１８６０号公報
【特許文献３】特開２００３−３３５６８９号公報
【特許文献４】特開２０００−３４２３３号公報
【特許文献５】特表２００３−５３２６４４号公報
【特許文献６】特開２００３−６３９７４号公報
【特許文献７】特開２００２−２３４８３４号公報
【特許文献８】特開平１１−２９４９２号公報
【特許文献９】特開平７−２８５８７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来技術に鑑み、本発明者らが副作用の少ない天然物由来の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤について鋭意研究を重ねた結果、リンゴおよび／またはホップ由来ポリフェノール画分が誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤として優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の内容を要旨とするものである。
（１）  リンゴおよび／またはホップ由来のポリフェノール画分を含有することを特徴とする誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤。
（２）  （１）に記載の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤を含有する飲食品。
（３）  （１）に記載の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤を含有する食品添加物。
（４）  （１）に記載の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤を含有する医薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤は、ｉＮＯＳ遺伝子自体の発現を抑制するため未然に過剰なＮＯの発生を防ぐことができ、生体にとってより効率的なＮＯ産生阻害効果が期待できる。
【００１１】
また本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤は、天然物由来であるため、副作用を大幅に低減することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明における誘導型一酸化窒素合成酵素とは、マクロファージや好中球、肝実質細胞、血管平滑筋細胞、繊維芽細胞、膵島β細胞、腎メサンギウム細胞、消化管上皮、グリア細胞等あらゆる細胞に存在している酵素で、L-アルギニンをL-シトルリンに転換する際に一酸化窒素を産生する。血管内皮型ＮＯＳや神経型ＮＯＳが恒常的に一酸化窒素を産生するのに対し、誘導型ＮＯＳはエンドトキシンや各種サイトカイン等の刺激によって活性化され、生体防御のために一酸化窒素を産生するが、血管内皮型ＮＯＳや神経型ＮＯＳと比較すると誘導型ＮＯＳの作用は長時間持続するため、産生する一酸化窒素量が過剰になり、生体に様々な弊害を引き起こす原因となる。そのため、過剰な一酸化窒素合成を未然に防ぐ阻害剤の開発が求められている。
【００１３】
本発明で使用するリンゴポリフェノールを含有するリンゴ抽出物は、バラ科リンゴ属植物の果実、例えば、フジ、陸奥、津軽、スターキング・デリシャス等の栽培品種及び原種リンゴ等より抽出して得られる。
【００１４】
果実としては成熟果実、未熟果実ともに用いることができるが、より多くのポリフェノール化合物を含有すること、及び広範な生理作用を有する各種活性成分を多量に含むことから、未熟果実が特に好ましい。リンゴ抽出物の抽出方法としては、洗浄した原料をpH３．２〜４．６、好ましくはpH３．５〜４．３で破砕し、得られた果汁にペクチナーゼを５〜７５℃、好ましくは３０〜６０℃で１０〜１００ｐｐｍ、好ましくは２０〜３０ｐｐｍで清澄化を行い、遠心分離後、５〜７５℃、好ましくは１５〜２５℃で珪藻土（商品名「シリカ３００S」、中央シリカ社製）濾過によりさらに清澄化を行い、清澄果汁を得る。或いはヘキサン、クロロホルム等の有機溶媒による分配及び濾過を行い、清澄抽出液を得る。清澄果汁を０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃、pH１．５〜４．２、好ましくはpH３．０〜４．０で吸着カラム（商品名「セパビーズＳＰ−８５０」、三菱化学社製）に通液し、ポリフェノール類を吸着させる。続いて純水を通液し、カラム中の非吸着物質（糖類、有機酸類等）を除去した後、１０〜９０％、好ましくは３０〜８０％のエタノールで溶出する。得られた画分からエタノールを２５〜１００℃、好ましくは３５〜９０℃で減圧濃縮し、濃縮液をそのまま或いはデキストリン等の粉末助剤を添加し、噴霧乾燥又は凍結乾燥を行い、抽出粉末品を得る。
【００１５】
本発明で使用するホップ苞ポリフェノールを含有するホップ苞抽出物は、ホップ毬果よりルプリン部分を除いて得られるものであり、一般に、ホップ毬果を粉砕後、篩い分けによってルプリン部分を除くことによってホップ苞を得る。しかし、最近のビール醸造において、ホップ苞を篩い分けして除去する手間を省くために、ビール醸造に有用でないホップ苞を取り除かずにホップ毬果をそのままペレット状に成形し、ホップペレットとして、ビール醸造に利用する傾向にある。したがって、本発明の原料としては、ホップ苞を含むものであれば特に限定せず、ホップ苞を含むホップ毬果やホップペレットを原料としてもなんら問題ない。
【００１６】
ホップ苞抽出物の抽出方法としては、原料であるホップ苞またはホップ苞を含むホップ毬果やホップペレットなどを、４〜９５℃、好ましくは３０〜６０℃で０〜５０％、好ましくは１０〜４０％のエタノールと混和し、抽出する。原料と抽出溶媒の割合は、１：２０〜１００（重量比）、好ましくは１：３０〜９０（重量比）であり、攪拌下、２０〜６０分、好ましくは３０〜５０分で行う。５〜７５℃、好ましくは１５〜２５℃で珪藻土（商品名「シリカ３００S」、中央シリカ社製）濾過によりさらに清澄化を行う。抽出液を０〜４０℃、好ましくは１５〜２５℃で吸着カラム（商品名「セパビーズＳＰ−８５０」、三菱化学社製）に通液し、ポリフェノール類を吸着させる。続いて純水を通液し、カラム中の非吸着物質（糖類、有機酸類等）を除去した後、１０〜９０％、好ましくは３０〜８０％のエタノールで溶出する。次に、限外ろ過膜を用いる方法について述べる。上記の抽出工程で得られたホップ苞の抽出液を、分画分子量が１，０００以上、好ましくは１０，０００〜５０，０００の限外ろ過膜で処理する。その際必要があれば、抽出液を減圧濃縮し、エタノール濃度を下げておくこともできる。また処理は、抽出溶媒の有機溶媒濃度や抽出溶媒とホップまたはホップ苞の割合にもよるが、およそ上残り液の量が処理開始時の１／１０〜１／１００、好ましくは１／２０〜１／１００になるまで行う。その際の圧力は０．１〜１０ｋｇ／ｃｍ２、好ましくは１〜７ｋｇ／ｃｍ２である。このまま液体状態で利用することも可能であるが、下記記述のとおり、乾燥させることもできる。得られた画分からエタノールを２５〜１００℃、好ましくは３５〜９０℃で減圧濃縮し、濃縮液をそのまま或いはデキストリン等の粉末助剤を添加し、噴霧乾燥又は凍結乾燥を行い、抽出粉末品を得る。
【００１７】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤は、リンゴ由来ポリフェノール画分またはホップ苞由来ポリフェノール画分単独でもよく、両者を併用してもよい。
【００１８】
得られたポリフェノール画分は、一般に使用される担体、助剤、添加剤等と共に製剤化することができ、また食品素材と混合して飲食品とすることができる。医薬品としては公知の方法により、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口剤として用いることができる。飲食品としては、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、アルコール飲料、コーヒーや紅茶などの清涼飲料、アイスクリーム、飴、ガム、菓子、パン、麺類などに用いることができる。例えば経口剤として用いる場合は、投与対象の性別、年齢、体重、健康状況等により異なるが、乾燥ポリフェノール画分の重量として、１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で適宜調節して投与することができる。
【００１９】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤により、誘導型一酸化窒素合成酵素の活性が阻害されるのは、誘導型一酸化窒素合成酵素遺伝子の発現が抑制されることにより、本酵素の誘導が阻害されるためであると考えられる。
【実施例１】
【００２０】
（１）リンゴ及びホップ由来ポリフェノールのＪ７７４．１培養細胞ｉＮＯＳ遺伝子発現抑制評価
マウスマクロファージ由来細胞Ｊ７７４．１（ＪＣＲＢ００１８、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を１０％非働化牛血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を添加したＲＰＭＩ１６４０培地(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)中で、細胞濃度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製し、６穴平底プレートに３ｍＬずつ播き込んだ。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で３日間培養した後、ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ）１０μｇ／ｍＬ及びリンゴ由来ポリフェノール（Ａｐｐｌｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ、ＡＣＴ）、ホップ由来ポリフェノール（ＨＢＰ、ＨＢＰ−ＨＭＷ、ＨＢＰ−ＬＭＷ）、抗酸化活性を有する陽性対照物質（ＢＨＡ、Ｃａｆｆｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＣＡ）、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ（ＶＣ））をそれぞれ２００μｇ／ｍＬ添加した培地３ｍＬと交換してさらに３日間インキュベーターで培養した。培養終了後、培地を除去してＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）法によりｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。次いでＲＴ−ＰＣＲ法によりｉＮＯＳ遺伝子と内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を調査した。ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供試してエチジウムブロマイドによるＤＮＡ染色を行い、蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯ（日立ソフトウエアエンジニアリング）で各遺伝子の発現量を調査した。
【００２１】
（２）結果  
ポリフェノール及び陽性対照物質を添加した際の各遺伝子の発現量を図１に示す。ＬＰＳを添加しないコントロールではｉＮＯＳ遺伝子の発現が見られないのに対し、ＬＰＳを添加することによって発現の誘導が確認された。リンゴ及びホップ由来ポリフェノールを添加することにより、ＬＰＳ刺激で誘導されるｉＮＯＳ遺伝子の発現が抑制され、その発現抑制効果はＡＣＴとＨＢＰ−ＨＭＷで特に顕著であった。またその際、内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの発現への影響は見られず、当該添加濃度でのポリフェノールによる細胞毒性が無いことを確認した。陽性対照物質ＢＨＡでもｉＮＯＳ遺伝子の発現が低下していたが、ＧＡＰＤＨの発現も減少しており、ＢＨＡの細胞毒性により発現が低下したと考えられる。
【実施例２】
【００２２】
（１）Ｊ７７４．１培養上清中の一酸化窒素量の測定
マウスマクロファージ由来細胞Ｊ７７４．１（ＪＣＲＢ００１８、ヒューマンサイエンス研究資源バンク）を１０％非働化牛血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を添加したＲＰＭＩ１６４０培地(Ｉｎｖｔｉｔｒｏｇｅｎ)中で、細胞濃度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製し、２４穴平底プレートに１ｍＬずつ播き込んだ。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で３日間培養した後、検体１００μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬ及びＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ）１０μｇ／ｍＬを添加した培地１ｍＬと交換してさらに３日間インキュベーターで培養した。培養終了後、培養上清中に放出された一酸化窒素量をＮＯ２／ＮＯ３  ＡｓｓａｙＫｉｔ−ＣII（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）−Ｇｒｉｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ−（株式会社  同仁化学研究所）を用いて測定した。
【００２３】
（２）結果
ＬＰＳ１０μｇ／ｍＬ及びリンゴ由来ポリフェノール（Ａｐｐｌｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ、ＡＣＴ）、ホップ由来ポリフェノール（ＨＢＰ、ＨＢＰ−ＨＭＷ、ＨＢＰ−ＬＭＷ）、陽性対照物質（ＢＨＡ、Ｃａｆｆｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＣＡ）、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ（ＶＣ））をそれぞれ１００μｇ／ｍＬ或いは２００μｇ／ｍＬ添加培養した際の培養上清中の一酸化窒素量を図２に示す。ＬＰＳのみ添加した時と比較して、リンゴ及びホップ由来ポリフェノールを添加することにより濃度依存的に一酸化窒素量が減少した。その効果はＡＣＴ２００μｇ／ｍＬ添加時及びＨＢＰ−ＨＭＷ２００μｇ／ｍＬ添加時に特に顕著で、ＬＰＳ無添加時の対照と同程度まで低減し、ＬＰＳ刺激による一酸化窒素産生を阻害した。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明の誘導型一酸化窒素合成酵素阻害剤により、ＮＯの産生を抑制できるので、ＮＯの産生により引き起こされる内皮細胞障害、心筋収縮力低下および自己免疫疾患等を防止することができ、本発明は極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、リンゴ及びホップ由来のポリフェノール画分による誘導型一酸化窒素合成酵素遺伝子の発現阻害効果を示す図である。
【図２】図２は、リンゴ及びホップ由来のポリフェノール画分による一酸化窒素生成量の抑制効果を示す図である。
【図２】
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【図１】
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