(57)【要約】【課題】酵母フィターゼの機能改変を実施し、胃内安定性の向上した改変フィターゼを創製することを課題とする。【解決手段】タンパク質の機能改変技術を利用し、改変フィターゼ遺伝子を創製する。該改変フィターゼ遺伝子を用いて改変フィターゼ生産株を構築する。該生産株を培養することにより、改変フィターゼを得る。得られた改変フィターゼを評価することにより、ブタの胃内での安定性の向上が期待できる改変フィターゼを創製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュワニオミセス属酵母フィターゼを改変することによって得られる、胃内での安定性が向上する改変フィターゼ。
【請求項２】
改変により至適ｐＨが酸性側にシフトしたことを特徴とする請求項１に記載の改変フィターゼ。
【請求項３】
改変によりペプシン耐性が向上したことを特徴とする請求項１に記載の改変フィターゼ。
【請求項４】
シュワニオミセス属酵母フィターゼのアミノ酸配列が配列番号２に示したアミノ酸配列である請求項１〜３の何れか一項に記載の改変フィターゼ。
【請求項５】
シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成する酸性アミノ酸のうちの少なくとも一つを他のアミノ酸に置換することにより創製される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
【請求項６】
酸性アミノ酸が配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４２９残基目のアスパラギン酸である請求項５に記載の改変フィターゼ。
【請求項７】
他のアミノ酸が、アスパラギンである請求項６に記載の改変フィターゼ。
【請求項８】
シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成するアミノ酸のうち少なくとも一つを塩基性アミノ酸に置換することにより創製される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
【請求項９】
塩基性アミノ酸がリジン又はアルギニンである、請求項８に記載の改変フィターゼ。
【請求項１０】
シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成するアミノ酸のうち少なくとも一つをヒスチジンに置換することにより創製される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
【請求項１１】
置換されるアミノ酸が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第２９２残基目のセリンである請求項８〜１０の何れか一項に記載の改変フィターゼ。
【請求項１２】
シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成するアミノ酸の少なくとも一つを他のアミノ酸を置換することでｐＨ３．５前後の静電ポテンシャルにおけるプラス電荷が弱められたことを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の改変フィターゼ。
【請求項１３】
置換されるアミノ酸が配列番号２に記載のアミノ酸配列の第８２残基目のセリンである請求項１２記載の改変フィターゼ。
【請求項１４】
第８２残基目に置換により導入される他のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である請求項１３に記載の改変フィターゼ。
【請求項１５】
置換されるアミノ酸が配列番号２に記載の第８５残基目のセリンである請求項１２に記載の改変フィターゼ。
【請求項１６】
第８５残基目に置換により導入される他のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸
である請求項１５に記載の改変フィターゼ。
【請求項１７】
置換されるアミノ酸が配列番号２に記載のアミノ酸配列の第３０１残基目のヒスチジンである請求項１２に記載の改変フィターゼ。
【請求項１８】
第３０１残基目に置換により導入される他のアミノ酸がタイロシンである請求項１７に記載の改変フィターゼ。
【請求項１９】
置換されるアミノ酸が配列番号２に記載の第３４２残基目のヒスチジンである請求項１２に記載の改変フィターゼ。
【請求項２０】
第３４２残基目に置換により導入される他のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である請求項１９に記載の改変フィターゼ。
【請求項２１】
配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第８２残基目、第８５残基目、第２９２残基目、第３０１残基目、第３４２残基目、および第４２９残基目から選択された少なくとも２つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより創製される請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
【請求項２２】
置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第８２残基目はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、第８５はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、第２９２残基は、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、３０１残基目はタイロシンであり、第３４２残基目はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、第４２９残基目はアスパラギンである請求項２１に記載の改変フィターゼ。
【請求項２３】
置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼの第３４２残基目はグルタミン酸であり、第４２９残基目はアスパラギンである請求項２１に記載の改変フィターゼ。
【請求項２４】
置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼの第２９２残基はリジンであり、３４２残基目はグルタミン酸であり、第４２９残基目はアスパラギンである請求項２１に記載の改変フィターゼ。  
【請求項２５】
置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第２９２残基はリジンであり、３０１残基目はタイロシンである請求項２１に記載の改変フィターゼ。
【請求項２６】
置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼの第２９２残基はリジンであり、３０１残基目はタイロシンであり、第３４２残基目はグルタミン酸である請求項２１に記載の改変フィターゼ。
【請求項２７】
置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼの第２９２残基はリジンであり、３０１残基目はタイロシンであり、第４２９残基目はアスパラギンである請求項２１に記載の改変フィターゼ。
【請求項２８】
請求項１〜２７の何れか一項に記載の改変フィターゼをコードする遺伝子。
【請求項２９】
部位特異的改変により配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼの機能改変を実施し、その結果胃内ｐＨでの安定性が向上した改変フィターゼを創製する方法。
【請求項３０】
部位特異的改変により配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼの機能改変を実施し、その結果至適ｐＨが酸性側にシフトした改変フィターゼを創製する方法。
【請求項３１】
部位特異的改変により配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼの機能改変を実施し、その結果ペプシン耐性が向上した改変フィターゼを創製する方法。
【請求項３２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼにおける酸性アミノ酸を減らすことを特徴とする請求項２９〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼにおける塩基性アミノ酸を増やすことを特徴とする請求項２９〜３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼにおけるｐＨ３．５前後の静電ポテンシャルにおけるプラス荷電を弱めることにより改変フィターゼを創製する請求項２９〜３３の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母フィターゼの至適ｐＨが酸性側にシフトした改変フィターゼと該改変フィターゼをコードする遺伝子に関する。更に、本発明はペプシン耐性が向上した改変フィターゼと該改変フィターゼをコードする遺伝子に関する。本発明は、ブタの胃内での安定性の向上が期待できる改変フィターゼと該改変フィターゼをコードする遺伝子に関する。また、改変フィターゼの創製方法に関する。この改変フィターゼを含む動物用飼料組成物は、動物飼料としての性能の向上が期待される。
【背景技術】
【０００２】
ブタやニワトリなど家畜の飼料に用いられる穀物や種子中のリンの多くは、フィチン酸（イノシトールヘキサリン酸、フィチン態リン）として存在している。これらの家畜はフィチン態リンを利用できないため、排泄物中のリン含量が増加し、河川や湖沼等での汚染の一因となっている。
【０００３】
フィターゼは、フィチン酸を加水分解するフォスファターゼであり、植物、動物および微生物に存在する。
【０００４】
このような点から、フィチン態リンをブタ等の家畜が利用可能なリン（有効リン）に加水分解するフィターゼに注目が集まり、アスペルギルス属かび由来フィターゼ（以下、かびフィターゼ）が飼料添加物として製造・販売されている。
【０００５】
しかしながら、飼料添加物としては比較的高価な点が普及の妨げとなっている（非特許文献１）。さらに、既に上市されているかびフィターゼも以下の（１）、（２）に示す問題点が知られている。
（１）フィターゼは主に胃で作用し（非特許文献２）、ブタ胃内容物のｐＨは３．０〜４．５前後であるが（非特許文献３、４、５、６）、かびフィターゼの至適ｐＨは５．５であり、その活性はｐＨ３．５で著しく低下すること（非特許文献７）。
（２）フィターゼを含む飼料添加物は、通常ペレット化した型で使用されている。ペレット形成過程においては６０〜８０℃の高温処理が行なわれるが、かびフィターゼはこのペレット形成中の温度では大部分の活性が失われてしまう（非特許文献７）。
【０００６】
以上のような欠点を補うために飼料に添加するかびフィターゼの量を増加する必要が生じ、これが飼料のコストアップに繋がる。このような観点から、既に市販されているかびフィターゼにおいても、高機能化に伴う施用量の低減化、その結果のコストダウンを目指した機能改変が現在進行中であり、実際、低い領域での活性を改善させる試み（非特許文献８）や耐熱性を上げる試み（非特許文献９）が報告されている。しかし、実用化に至ったという報告はない。
【０００７】
かびフィターゼ以外に、様々な生物由来のフィターゼが知られており、大腸菌由来フィターゼ（以下、大腸菌フィターゼ）においても、かびフィターゼと同様に至適ｐＨの改善や、耐熱性改善の試みが報告されている（特許文献1）。
【０００８】
一方、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）酵母由来フィターゼ（以下、酵母フィターゼ）は、かびフィターゼや大腸菌フィターゼと異なり、耐熱性に優れている。さらに、酵母フィターゼの至適ｐＨがブタの胃内ｐＨ領域付近にあり、ブタに対してはかびフィターゼより、酵母フィターゼの方が潜在的に高い効果を示すことが期待されていた。そこで、実際、ブタの飼料に酵母フィターゼあるいはかびフィターゼを添加し、飼料中からのリン吸収に及ぼす効果が検討された。結果的には、酵母フィターゼはリン吸収を促進したものの、その作用はかびフィターゼに比し弱いことが判明している（非特許文献１０）。この原因として、酵母フィターゼは胃内安定性が劣ることが明らかとなっている（非特許文献１１）。
【０００９】
以上のように、かびフィターゼ、大腸菌フィターゼ、酵母フィターゼともに、効果並びに経済性に優れた次世代の高機能フィターゼの開発が求められているのが現状である。
【特許文献１】特表２００３−５３１５７４公報
【特許文献２】特開平１１−２０６３６８号公報
【非特許文献１】滝澤  昇、BIO  INDUSTRY、16（１）、72-77 (1999)
【非特許文献２】AW Jongbloed et. al., J. Anim. Sci., 70, 1159-1168 (1992)
【非特許文献３】FR Dintzis  et. al., J. Anim.Sci., 73, 1138〜1146 (1995)
【非特許文献４】Z Yi et. al., Animal. Feed. Sci. Technol., 61, 361-368 (1996)
【非特許文献５】DC Regina et. al., J. Anim. Sci., 77, 2721-2729 (1999)
【非特許文献６】FO Omogbenigun et.al., J. Anim. Sci., 81, 1806-1813 (2003)
【非特許文献７】XG Lei et.al., Biotechnology Letters,  25, 1787-1794 (2003)
【非特許文献８】EJ Mullaney et. al., Biochemical and Biophysical Research     Communication ., 297, 1016-1020 (2002)
【非特許文献９】M Lehmann et. al., Protein Engineering, 13(1), 49-57 (2000)
【非特許文献１０】A Tamura et. al., Animal Science Journal, 70(6), 479-483 (1999)
【非特許文献１１】T Matsui et. al., J. Anim. Sci., 78, 94-99 (2000)
【非特許文献１２】B Honig et. al., J. Phys. Chem., 97, 1101-1109 (1993)
【非特許文献１３】Y. Sakai et.al., J. Bacteriology, 173(23), 7458〜7463,(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
かびフィターゼ、大腸菌フィターゼ、および酵母フィターゼが知られているが、既に上市されているかびフィターゼにおいても、その効果は不十分で、効果並びに経済性に優れた高機能フィターゼが求められている。
【００１１】
タンパク質の機能改変技術を利用することにより、飼料添加酵素としての諸特性が改善された改変フィターゼを創製することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討の結果、従来知られているフィターゼを幾つかの指標に従いアミノ酸配列を改変することにより所望の効果を奏することを見出し、当該知見に基き本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］シュワニオミセス属酵母フィターゼを改変することによって得られる、胃内での安定性が向上する改変フィターゼ。
［２］改変により至適ｐＨが酸性側にシフトしたことを特徴とする［１］に記載の改変フィターゼ。
［３］改変によりペプシン耐性が向上したことを特徴とする［１］に記載の改変フィターゼ。
［４］シュワニオミセス属酵母フィターゼのアミノ酸配列が配列番号２に示したアミノ酸配列である請求項［１］〜［３］の何れか一項に記載の改変フィターゼ。
［５］シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成する酸性アミノ酸のうちの少なくとも一つを他のアミノ酸に置換することにより創製される、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
［６］酸性アミノ酸が配列番号２に記載のアミノ酸配列の第４２９残基目のアスパラギン酸である［５］に記載の改変フィターゼ。
［７］他のアミノ酸が、アスパラギンである［６］に記載の改変フィターゼ。
［８］シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成するアミノ酸のうち少なくとも一つを塩基性アミノ酸に置換することにより創製される、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
［９］塩基性アミノ酸がリジン又はアルギニンである、［８］に記載の改変フィターゼ。［１０］シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成するアミノ酸のうち少なくとも一つをヒスチジンに置換することにより創製される、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
［１１］置換されるアミノ酸が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第２９２残基目のセ
リンである［８］〜［１０］の何れか一項に記載の改変フィターゼ。
［１２］シュワニオミセス属酵母フィターゼを構成するアミノ酸の少なくとも一つを他のアミノ酸を置換することでｐＨ３．５前後の静電ポテンシャルにおけるプラス電荷が弱められたことを特徴とする、［１］〜［４］の何れか一項に記載の改変フィターゼ。
［１３］置換されるアミノ酸が配列番号２に記載のアミノ酸配列の第８２残基目のセリンである［１２］記載の改変フィターゼ。
［１４］第８２残基目に置換により導入される他のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である［１３］に記載の改変フィターゼ。
［１５］置換されるアミノ酸が配列番号２に記載の第８５残基目のセリンである［１２］に記載の改変フィターゼ。
［１６］第８５残基目に置換により導入される他のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸である［１５］に記載の改変フィターゼ。
［１７］置換されるアミノ酸が配列番号２に記載の第３０１残基目のヒスチジンである［１２］に記載の改変フィターゼ。
［１８］第３０１残基目に置換により導入される他のアミノ酸がタイロシンである［１７］に記載の改変フィターゼ。
［１９］置換されるアミノ酸が配列番号２に記載の第３４２残基目のヒスチジンである［１２］に記載の改変フィターゼ。
［２０］第３４２残基目に置換により導入される他のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパアギン酸である［１９］に記載の改変フィターゼ。
［２１］配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第８２残基目、第８５残基目、第２９２残基目、第３０１残基目、第３４２残基目、および第４２９残基目から選択された少なくとも２つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより創製される［１］〜［４］のいずれか一項に記載の改変フィターゼ。
［２２］置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第８２残基目はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、第８５はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、第２９２残基は、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、第３０１残基目はタイロシンであり、第３４２残基目はグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、第４２９残基目はアスパラギンである［２１］に記載の改変フィターゼ。
［２３］置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第３４２残基目はグルタミン酸であり、第４２９残基目はアスパラギンである［２１］に記載の改変フィターゼ。
[２４]   置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第２９２残基目はリジンであり、第３４２残基目はグルタミン酸であり、第４２９残基目はアスパラギンである［２１］に記載の改変フィターゼ。
[２５]   置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第２９２残基目はリジンであり、第３０１残基目はタイロシンである［２１］に記載の改変フィターゼ。
[２６]   置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第２９２残基目はリジンであり、第３０１残基目はタイロシンであり、第３４２残基目はグルタミン酸である［２１］に記載の改変フィターゼ。
[２７]   置換により導入されるアミノ酸残基が、配列番号２に記載のフィターゼのアミノ酸配列の第２９２残基目はリジンであり、第３０１残基目はタイロシンであり、第４２９残基目はアスパラギンである［２１］に記載の改変フィターゼ。
［２８］［１］〜［２７］の何れか一項に記載の改変フィターゼをコードする遺伝子。
［２９］部位特異的改変により配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼの機能改変を実施し、その結果胃内ｐＨでの安定性が向上した改変フィターゼを創製する方法。
［３０］部位特異的改変により配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼの機
能改変を実施し、その結果至適ｐＨが酸性側にシフトした改変フィターゼを創製する方法。
［３１］部位特異的改変により配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼの機能改変を実施し、その結果ペプシン耐性が向上した改変フィターゼを創製する方法。
［３２］配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼにおける酸性アミノ酸を減らすことを特徴とする［２９］〜［３１］の何れか一項に記載の方法。
［３３］配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼにおける塩基性アミノ酸を増やすことを特徴とする［２９］〜［３１］の何れか一項に記載の方法。
［３４］配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼにおけるｐＨ３．５前後の静電ポテンシャルにおけるプラス荷電を弱めることにより改変フィターゼを創製する［２９］〜［３３］の何れか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明で創製したものは、酵母フィターゼの至適ｐＨがｐＨ４．５より酸性側にシフトした改変フィターゼの遺伝子と改変フィターゼである。本発明で創製したものは、ペプシン耐性が向上した改変フィターゼの遺伝子と改変フィターゼである。本発明で創製したものは、ブタの胃内での安定性の向上が期待できる改変フィターゼの遺伝子と改変フィターゼである。本発明の改変フィターゼを用いることにより、高機能化に伴う施用量の低減化が達成でき、飼料に占めるフィターゼ費用のコストダウンが可能となる。
【００１５】
本発明の方法は、フィターゼを始めとする胃内で作用する他の飼料添加酵素の高機能化に広く応用することができる。
【００１６】
本発明の改変フィターゼ遺伝子を用いて、当該技術分野において周知の技術を用いることにより改変フィターゼ生産株を構築することができる。
【００１７】
構築した改変フィターゼ生産株を培養することにより、改変フィターゼを培養液中に分泌生産させることができる。
【００１８】
培養液中の改変フィターゼの回収は、得られた培養液を遠心分離等により菌体を除去した後、通常用いられる蛋白質の回収法に準じて回収すればよい。また、本発明の改変フィターゼが家畜の飼料添加酵素として有効であることを考慮すれば、培養液から回収された粗精製改変フィターゼを最終生産物とすることができるし、さらに、家畜の生育に問題がない範囲で培地成分を含む当該フィターゼを最終生産物とすることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
まず、機能改変の対象とするフィターゼとしては、かびフィターゼと酵素学的な特長を異にする酵母フィターゼを選択した。酵母フィターゼは、ブタの胃内ｐＨ領域内に至適ｐＨを有し、耐熱性もかびフィターゼに比し優れている。しかしながら、胃内安定性が劣るという欠点も知られている。  
【００２０】
なお、配列表の配列番号：１に酵母フィターゼ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を示した。配列表の配列番号：２に酵母フィターゼのアミノ酸配列を示した。また、配列表の配列番号：２に記載のフィターゼのアミノ酸配列と７０％、好ましくは９０％の相同性を有するアミノ酸配列も、フィターゼ活性を有するかぎり酵母フィターゼに含まれる。
【００２１】
本特許は、酵母フィターゼの胃内安定性の改善に関する。
【００２２】
まず、酵母フィターゼの胃内での安定性に及ぼす諸要因について解析を試みた。
フィターゼが作用発現する場所は胃である。一般に、フィターゼ添加飼料摂取後の胃内の状態は、飼料とペプシン（消化酵素）およびフィターゼが混在した状態である。胃内pHは３．０~４．５である。
【００２３】
胃内でのフィターゼの安定性に及ぼす要因を検討する場合、飼料存在下、胃内ｐH領域内で、消化酵素であるペプシンを作用させるのが一般的である。飼料の主成分である大豆やトウモロコシ等には、フィターゼの基質となるフィチン酸が存在し、フィターゼとコンプレックスを形成することによって、フィターゼの構造を安定化させることが知られている。
【００２４】
そこで、フィターゼの基本的な性質を検討するため、我々はあえて基質となるフィチン酸を加えない評価系におけるフィターゼの安定性を評価した。その結果、驚くべきことに
、ペプシンが存在しなくても、フィターゼ溶解液を胃内ｐＨ領域であるｐＨ３．０、
ｐＨ３．５に調整しただけで、フィターゼ活性が瞬時に著しく低下することを見出した（実施例１）。
【００２５】
次に、フィターゼのペプシンに対する耐性について検討した。ブタの胃内のｐＨ領域は先に述べた様に、ｐＨ３．０〜ｐＨ４．５であることが知られているが、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５においては、フィターゼは瞬時に失活してしまうため、フィターゼが安定に存在するｐＨ４．０でのペプシンに対する耐性を調べた。ｐＨ４．０においては、十分なペプシン処理を行っても酵母フィターゼ活性の大きな低下は認められなかった（実施例１）。
【００２６】
これらのことから、酵母フィターゼの至適ｐＨを酸性側にシフトさせることができれば、ペプシンに対する耐性を向上させることが可能で、結果として、酵母フィターゼの欠点と考えられている胃内安定性が向上した改変フィターゼの創製が可能と考えられた。
【００２７】
酵母フィターゼの機能改変は、部位特異的変異導入法を用いて以下のように実施した（実施例２）。
【００２８】
一般に、蛋白質は中性付近で分子表面のプラスの電荷とマイナスの電荷がバランスよく分布しており、それらの静電引力のためコンパクトな分子の形が安定に保たれている。極端なｐＨ、例えばｐＨ３．５以下になると、酸性アミノ酸がプロトン化してマイナスの電荷が減少するので、静電相互作用による安定化がなくなるとともに、プラスの電荷同士の反発が優勢になって分子の構造が緩み変性する場合が想定される。
【００２９】
そこで、第１番目の方策としては、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５での不安定性を除去するために、酵母フィターゼを構成する酸性アミノ酸のうち少なくとも１つを他のアミノ酸に置換することによって、酸性アミノ酸の数を減少させることにした。
【００３０】
第２番目の方策としては、酵母フィターゼを構成するアミノ酸のうち少なくとも一つを塩基性アミノ酸に置換することによって、酵母フィターゼに存在する酸性アミノ酸の影響を減らすことを試みた。
【００３１】
次に、実際に、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５での予測静電ポテンシャルを計算した。その結果、フィターゼの反応部位・基質認識部位周辺が極端にプラス電荷に偏っていることが判明した（図１）。そこで、第３番目の方策として、この領域のプラス電荷を和らげるために、この領域にｐＨ３．０、ｐＨ３．５においてマイナス状態で存在する酸性アミノ酸に置換することにした。
【００３２】
第１番目の方策でいう酸性アミノ酸を減らすような改変とは、酵母フィターゼを構成する酸性アミノ酸であるアスパラギン酸やグルタミン酸を他のアミノ酸に置換することによって達成できる。
【００３３】
第２番目の方策でいう塩基性アミノ酸を増やすような改変とは、酵母フィターゼを構成するアミノ酸で塩基性アミノ酸でないアミノ酸を、塩基性アミノ酸であるリジンやアルギニンに置換することによって達成できる。
【００３４】
第３番目の方策でいうｐＨ３．５での予測静電ポテンシャルにおいて、プラス電荷を弱めるような改変とは、酵母フィターゼを構成するアミノ酸でｐＨ３．５において中性状態で存在するアミノ酸を、ｐＨ３．５においてマイナス状態で存在するアミノ酸に置換することによって達成できる。あるいは、酵母フィターゼを構成するアミノ酸でｐＨ３．５においてプラス状態で存在するアミノ酸を、ｐＨ３．５において中性、あるいはマイナス状態で存在するアミノ酸に置換することによって達成できる。なお、ｐＨ３．５前後の予測静電ポテンシャルは、Delphi等（非特許文献１２）のソフトによりPoisson−Boltzmann式を数値的に解いたときの、ｐＨ３．５前後の予測静電ポテンシャルを計算して求めた。
【００３５】
改変フィターゼ遺伝子の構築は、部位特異的改変によって、例えば、QuickChangeR  Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて作製することができる。すなわち、同じ場所に変異の入った相補的な合成プライマーを１組作成し、これらプライマーを鋳型ＤＮＡとアニールさせた後、ＰＣＲ反応を行った。鋳型ＤＮＡとしては、酵母フィターゼ遺伝子を有するプラスミドｐＰＨＹ３６を用いることができる（特許文献２）。
【００３６】
構築した改変フィターゼ遺伝子を用いることにより、当該技術分野において周知の技術を用いることにより改変フィターゼ発現プラスミドを構築することができる。該発現プラ
スミドの構築法の好ましい一例としては、以下に示す方法が挙げられる。すなわち、改変フィターゼ遺伝子を用いて、キャンディダ  ボイディニィ（Candida  boidinii）のアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＤ１）のプロモーターの下流に改変フィターゼ遺伝子を結合させることにより、改変フィターゼ発現プラスミドを構築することができる。さらに、発現効率を向上させる為に、フィターゼ遺伝子の下流にはターミネーターを付加しておくことが望ましい。そのようなターミネーターとしては、キャンディダ  ボイディニィのＡＯＤ１遺伝子のターミネーターが挙げられる（実施例２）。
【００３７】
このプラスミドでキャンディダ  ボイディニィを公知の形質転換法を用いて、形質転換することにより、改変フィターゼ生産株を構築することができる（実施例３）。形質転換した生産株を判別するために、組換えプラスミド中に適当な選択マーカーを連結しておくことが望ましい。選択マーカーとしては、核酸の生合成に関する遺伝子や、アミノ酸の合成に関する遺伝子等生育に関係する遺伝子や、薬剤耐性に関する遺伝子等が挙げられる。また、本発明の組換えプラスミドは形質転換した宿主細胞に保持されるため、細胞内で自立複製可能を可能とする配列を含むか、相同組換えにより染色体内に組込むために宿主細胞の染色体の配列と相同性の高い配列を含むことが望ましい。
【００３８】
構築した改変フィターゼ生産株を培養し、該改変フィターゼを該組換えキャンディダ  ボイディニィの菌体外へ分泌生産させることができる。その培養上清から改変体を得て、諸性質について評価した（実施例４）。
【００３９】
まず、各改変体のｐＨ３．５とｐＨ４．５での活性を測定した。次に、ｐＨ４．５に対するｐＨ３．５における活性値（ｐＨ３．５における活性値／ｐＨ４．５における活性値）を計算し、この値を“酸性シフト値”とした。酵母フィターゼの至適ｐＨは４．５であるので、この値が大きいほど、至適ｐＨが酸性側へシフトしていると考えられ、ブタの胃内ｐＨ領域（ｐＨ３．０〜ｐＨ４．５）での活性の向上が期待できる。
【００４０】
上記１番目の方策では、酵母フィターゼを構成する４６１アミノ酸のうち、酸性アミノ酸数は５５箇所も存在する。このように多くの酸性アミノ酸の中から、鋭意検討した結果、特に、４２９残基目のアスパラギン酸を置換することで、“酸性シフト値”が大きくなった改変体４２９を創製することができた（表５）。置換するアミノ酸としては、酸性アミノ酸以外ならなんでもよく、好ましくはアスパラギンをあげることが出来る。
【００４１】
上記２番目の方策では、酵母フィターゼを構成する４６１アミノ酸残基の中から、鋭意検討した結果、特に、２９２残基目のセリンを置換することで、“酸性シフト値”が大きくなった、改変体２９２を創製することができた（表５）。置換するアミノ酸としては、塩基性アミノ酸が好ましく、特に好ましいアミノ酸としては、リジン、アスパラギン、グルタミンをあげることが出来る。
【００４２】
上記３番目の方策では、すなわち、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５においてマイナス状態で存在する酸性アミノ酸に置換する方策では、鋭意検討した結果、８２残基目のセリン、８５残基目のリジン、３０１残基目のヒスチジン、あるいは、３４２残基目のヒスチジンを置換することで、“酸性シフト値”が大きくなった、改変体８２、改変体８５、改変体３０１、改変体３４２を創製することができた（表５）。置換されるアミノ酸がｐＨ３．０、ｐＨ３．５でプラスに荷電している塩基性アミノ酸の場合は、置換するアミノ酸としては塩基性アミノ酸以外ならなんでも良く、アスパラギン酸やグルタミン酸、グリシン、タイロシン、あるいは、システイン等をあげることができる。置換されるアミノ酸がｐＨ３．０、ｐＨ３．５で中性状態である中性アミノ酸の場合は、置換するアミノ酸としては酸性アミノ酸が好ましく、アスパラギン酸やグルタミン酸をあげることができる。
【００４３】
以上の改変体（改変体８２、改変体８５、改変体２９２、改変体３０１、改変体３４２、改変体４２９）は、酵母フィターゼに比べ、至適ｐＨがｐＨ４．５からより酸性側にシフトしていると考えられ、豚の胃内での活性の向上が期待できる結果となった。
【００４４】
酵母フィターゼは胃内安定性が劣ることが判明しているので、胃内を想定した環境下、すなわち、飼料とペプシン存在下における各改変体（改変体８２、改変体８５、改変体２９２、改変体３０１、改変体３４２、改変体４２９）のペプシン耐性を評価した。
【００４５】
これらの改変フィターゼはすべて酵母フィターゼに比し、ペプシン耐性が向上している
ことが確認でき（表７）、本発明で創製した改変フィターゼは、酵母フィターゼに比し、優れていることを見出した。
【００４６】
次に、本発明で見出した改変体（改変体８２、改変体８５、改変体２９２、改変体３０１、改変体３４２、改変体４２９）における置換部位の組合せの効果を検討するために、該置換部位を少なくとも２箇所以上含む改変体を数種構築し、前述の酸性シフト値およびペプシン耐性を評価した。一例として、改変体３６Ｇ０９、改変体４３Ｃ０３、改変体１３５Ｅ０５、改変体１３６Ｄ０６、改変体１４６Ｈ０６を構築した（実施例５）。なお、改変体３６G０９は改変体３４２と改変体４２９の組合せであり、改変体４３Ｃ０３は改変体２９２と改変体３４２および改変体４２９の組合せであり、改変体１３５Ｅ０５は改変体２９２と改変体３０１および改変体４２９の組合せである。改変体１３６Ｄ０６は改変体２９２と改変体３０１と改変体３４２の組合せであり、１４６Ｈ０６は改変体２９２と改変体３０１の組合せである。
【００４７】
その結果、新しく構築した置換部位を少なくとも２箇所以上含む改変体（改変体３６Ｇ０９、改変体４３Ｃ０３、改変体１３５Ｅ０５、改変体１３６Ｄ０６、改変体１４６Ｈ０６）は、単一の置換部位からなる改変体（改変体８２、改変体８５、改変体２９２、改変体３０１、改変体３４２、改変体４２９）と同様に、酵母フィターゼに比べ、至適ｐＨがｐＨ４．５からより酸性側にシフトしていると考えられ、豚の胃内での活性の向上が期待できる結果となり（表６）、本発明で見出した改変体における置換部位の組合せが可能であることを見出した。
【００４８】
また、新しく構築した置換部位を少なくとも２箇所以上含む改変体（改変体３６Ｇ０９、改変体４３Ｃ０３、改変体１３５Ｅ０５、改変体１３６Ｄ０６、改変体１４６Ｈ０６）はすべて、単一の改変部位からなる改変体（改変体８２、改変体８５、改変体２９２、改変体３０１、改変体３４２、改変体４２９）と同様に、酵母フィターゼに比し、ペプシン耐性の向上していることを確認でき（表８）、本発明で見出した改変体を構成する置換部位の組合せが可能であることを見出した。なお、改変体１３５Ｅ０５と改変体１３６Ｄ０６および１４６H０６は、酵母フィターゼに比べペプシン耐性値が大きく（表８）、ブタの胃内での安定性の向上が特に期待されるものであった。
【００４９】
なお、本発明で見出した改変体（改変体８２、改変体８５、改変体２９２、改変体３０１、改変体３４２、改変体４２９）における置換部位の組合せとしては、一例として実施例５で構築した改変体（改変体３６Ｇ０９、改変体４３Ｃ０３、改変体１４６Ｈ０６、改変体１３５Ｅ０５、改変体１３６Ｄ０６）以外の他の組合せとして、以下の組合せを挙げることができる。すなわち、第８２残基目と第８５残基目、第８２残基目と第２９２残基目、第８２残基目と第３０１残基目、第８２残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第４２９残基目、第８５残基目と第２９２残基目、第８５残基目と第３０１残基目、第８５残基目と第３４２残基目、第８５残基目と第４２９残基目、第２９２残基目と第４２９残基目、第３０１残基目と第３４２残基目、第３０１残基目と第４２９残基目、第３４２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目、第８２残基目と第８５残基目と第３０１残基目、第８２残基目と第８５残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第８５残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第２９２残基目と第３０１残基目、第８２残基目と第２９２残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第２９２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第３０１残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目、第８５残基目と第２９２残基目と第３４２残基目、第８５残基目と第２９２残基目と第４２９残基目、第８５残基目と第３０１残基目と第３４２残基目、第８５残基目と第３０１残基目と第４２９残基目、第８５残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第８５残基目と第３０１残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第８５残基目と第３０１残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第８５残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目、第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第４２９残基目、第８５残基目と第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目、第８２残基目と第８５残基目と第２９２残基目と第３０１残基目と第３４２残基目と第４２９残基目等が挙げることができる。
【００５０】
改変フィターゼの生産は、構築した改変フィターゼ生産株を公知の方法（特許文献２）に示したように、リン酸またはリン酸化合物を含有する液体培地中で、メタノールを添加しながら培養し、該改変フィターゼを培地中に分泌生産させることができる。
【００５１】
改変フィターゼの回収は、得られた培養液から遠心分離等により菌体を除去した後、通常用いられる蛋白質の回収法に準じて回収すればよい。回収された改変フィターゼは更に精製してもよい。また、本発明により生産される改変フィターゼが家畜飼料として用いることを考慮すれば、培養液から回収された粗精製な改変フィターゼを最終生産物とすることもできるし、さらに、家畜の生育に問題がない範囲で培地成分を含むフィターゼも最終生産物とすることができる。
【００５２】
以下、具体例によって、酵母フィターゼの胃内安定性に及ぼす要因の解析、改変フィターゼ遺伝子の構築、改変フィターゼ生産株の構築、および、改変フィターゼの評価について説明するが、本発明はこの実施例によって何ら制限されるものでない。
【実施例１】
【００５３】
（酵母フィターゼの胃内安定性に及ぼす要因の解析）
酵母フィターゼは、ブタ等の単胃動物での胃内の安定性が劣ることが報告されている。そこで、胃内での安定性に及ぼす諸要因についての解析を試みた。
フィターゼ添加酵素摂食後のブタ胃内の状態は、基質としての飼料、消化酵素（ペプシン）と添加したフィターゼが混在した状態である。また、ブタの胃内のpH領域は3.0〜4.5であるとの報告がある。
【００５４】
そこでまず、胃内pH領域でのフィターゼの安定性を評価した。
【００５５】
酵母フィターゼを分泌生産する形質転換株の培養上清を用いて、以下のような方法でpH処理を実施し、それぞれのpHでの活性を測定した。
【００５６】
酵母培養上清を水で２倍に希釈後、その液を0.4Mの各ｐH溶液（pH3.0、pH3.5、pH4.0）で５倍に希釈した。なお、各pH溶液は、0.4ＭCH3COONaにaceteteを加えて各pHに調整したものを使用した。培養上清の希釈液は50μｌずつ５本のエッペンドルフチューブに分注し、それぞれ37℃で0、10、30、60、120分間保存し、反応終了時に9倍量の水(450μｌ)を加え、最終的に10倍量になるようにして反応を止めた。さらにこの液を10倍に希釈し酵素溶液とした。
【００５７】
この溶液を用いて以下の方法でフィターゼ活性を測定した。
【００５８】
10mM  フィチン酸ナトリウム／0.4M  CH3COONa-acetete  buffer  （pH4.5）を10μｌ、H2Oを85μｌ、酵素溶液を5μｌを混合した後、37℃で15分間反応した。この反応液を4μｌとって、200μｌの5mM  H2SO4に加え反応を停止し、この液160μｌに発色液40μｌを加え、655nmでの吸光度を測定した。検量線との比較から活性を算出した。発色液は、使用直前にA液、B液、C液を1000：250：20の割合で混合したものを用いた。
【００５９】
なお、A液としてはマラカイトグリーン0.147g/20%(V/V)H2SO4100ml）を、B液としては7.5%モリブデン酸ナトリウムを、C液としては11％Tween20を使用した。
【００６０】
各pHでのフィターゼ活性の経時変化を図３に示した。酵母フィターゼは、pH3.0で処理
すると瞬時に失活した。pH3.5では、10分間の処理で完全に失活した。pH4.0では安定であった。なお、各pHで低下した活性は、反応液を至適pHであるpH4.5に戻しても回復しなかった。また、各pH処理後のフィターゼの分子サイズをSDS-PAGEで検討した結果、分子サイズに変化はなかったことから、各pHでの失活は分解によるものではなく、構造的な変化であることが推察された。
【００６１】
次に、ペプシンに対する安定性を評価した。先に述べた如く、ブタの胃内ｐＨ領域であるpH3.0、3.5ではフィターゼは非常に不安定であったので、pH4.0でペプシン処理を行った。上記と同じ培養上清を用いて、以下のような方法でペプシン処理を実施し、フィターゼ活性を測定した。すなわち、酵母フィターゼは酵素液１に対し、４倍量の0.4M  CH3COONa-acetete buffer（pH4.0）で５倍に希釈し、pHを調整した。このpH調整酵素液を100μｌずつエッペンドルフチューブ５本に分注した。次に、ペプシン溶液100μｌを加え、37℃でインキュベーションを開始した。0、10、30、60、120分後にそれぞれのチューブから50μｌの反応液を、別に用意した450μｌの水の中に分取し、反応を止めた。なお、ペプシン溶液は、3660  units／ｍg（SIGMA社製）2mgを10mM  HCl溶液  1mlに溶解したものを用いた。コントロールとしては、ペプシン溶液の代わりに10mMのHCl溶液を用いた。反応を停止した溶液は、さらに水で10倍に希釈して活性を測定した。活性測定は、実施例１に示した方法を用いた。
【００６２】
図４に示すように、酵母フィターゼは、pH4.0でペプシン処理の影響は認められなかった。
【００６３】
以上のように、胃内安定性を決定する要因としてpH安定性、ペプシンの影響について検討した。その結果、酵母フィターゼはその溶解液のpHを3.0あるいは3.5に調整しただけで、活性が著しく低下することを認めた。
【実施例２】
【００６４】
（改変フィターゼ遺伝子の構築と改変フィターゼ発現プラスミドの作成）
酵母フィターゼ遺伝子の改変は、QuickChangeR  Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて行った。すなわち、同じ場所に変異の入った相補的な合成プライマーを１組作成し、これらのプライマーを鋳型DNAとアニールさせた後、PCR反応を行った。鋳型DNAとしては、酵母フィターゼ遺伝子を有するプラスミドpPHY36（特許文献３）を用いた。pPHY36の構造は、2895bpからなるpBlueScript SK−(STRATAGENE社製)のEcoRI、XhoI部位に酵母フィターゼ遺伝子をコードする約1800bpのDNA断片が含まれているものである。
【００６５】
変異の入った相補的な合成プライマーとしては、PM54（配列番号３）とPM54R（配列番号４）、PM34（配列番号５）とPM34R（配列番号６）、PM76（配列番号７）とPM76R（配列番号８）、PM134（配列番号９）とPM134R（配列番号１０）、PM63（配列番号１１）とPM63R（配列番号１２）、およびPM22（配列番号１３）とPM22R（配列番号１４）を用いた。なお、合成プライマー、プライマー配列、および改変部位の関係を表１に示した。
【００６６】
【表１】
2006136314.tif 000002
【００６７】
PCR反応条件等は使用説明書に従った。すなわち、x10のReaction  Buffer  5μｌ、
10ng／μｌのpPHY36DNA  1μｌ、10ng／μｌの合成プライマーそれぞれ12.5μｌ、
dＮTP mix  1μｌ、DW  １7μｌ、PfuTurburbo  DNA  polymerase(2.5U/μｌ)  
１μｌを加え、反応溶液を調製した。反応は、T-GRADIENT Thermocycler
( BIOMETRA社製)を用いて、95℃を１サイクル（30秒）、〔95℃（30秒）、55℃（１分）
、および68℃（4.6分）〕を16サイクル実施した。
【００６８】
PCR後の反応液５μｌを用いてCompetent high DH5（TOYOBO社製）を形質転換した。得られた形質転換株からプラスミドを調製し、改変フィターゼプラスミドとした。該プラスミドに含まれる改変フィターゼ遺伝子の塩基配列は、ABI  PRISM  310  Genetic  Analyzer用いて決定した。
【００６９】
各改変フィターゼプラスミドに含まれるフィターゼ遺伝子の部分で、酵母フィターゼの塩基配列と異なる部分の塩基配列を表２にイタリックで、該プラスミド（p82-1、p82-2、p82-3、p85-1、p292-1、p301-1、p342-1、p429-1）に含まれる改変フィターゼをそれぞれ改変体82、改変体85、改変体292、改変体301、改変体342、改変体429とし、酵母フィターゼと異なる部分のアミノ酸配列をイタリックで表３に示した。
【００７０】
【表２】
2006136314.tif 000003
【００７１】
【表３】
2006136314.tif 000004
【００７２】
次に、改変フィターゼ発現プラスミドの構築は次のように行った。
【００７３】
改変フィターゼプラスミド（p82-1、p85-1、p342-1、p292-1、p301-1、ｐ429-1）とフィターゼ発現プラスミドpNNPH60Iを用いた。なお、pNNPH60Iは、酵母フィターゼ発現プラスミドpNNPH60（特許文献２）のフィターゼ遺伝子の前後にある２つのNotI切断部位のうち一つにXhoI部位を有するリンカーを用いてライゲーションして、XhoI部位を作成したものである。
【００７４】
酵母フィターゼ発現プラスミドp82-1EXの構築は図１に示したように行った。
【００７５】
まず、改変フィターゼプラスミドp82-1を制限酵素NotIと制限酵素XhoIで切断後、改変フィターゼを含むDNAを回収した。回収したこのDNA断片は、酵母フィターゼ発現プラスミドpNNPH60IのNotIとXhoIの間に含まれる酵母フィターゼ遺伝子を切り出した残りのベクター部分とT4ライゲーションキットを用いて結合し、改変フィターゼ発現プラスミドを構築した。同様にして、p85-1EX、p292-1EX、p342-1EX、p429-1EXを、改変フィターゼプラスミドp85-1、p292-1、p342-1、p429-1からそれぞれ構築した。
【００７６】
改変フィターゼプラスミドと改変フィターゼ発現プラスミドの関係を表４に示した。
【００７７】
【表４】
2006136314.tif 000005
【実施例３】
【００７８】
（改変フィターゼ生産株の作出および選択）
キャンディダ  ボイディニィ  S2  AOU-1株より、ウラシル要求株TK62株を取得した。なお、キャンディダ  ボイディニィ S2  AOU-1株は、MCI-040820と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM  P-20199として、2004年9月２日付けにて、寄託されている。このウラシル要求株を用いて形質転換を実施した。ウラシル要求株の取得法およびこのウラシル要求株がURA３遺伝子の変異株であることは、阪井らによって明らかにされている（非特許文献13）。形質転換は以下のように実施した。TK62株を約24時間振とう培養し、前培養液とした。得られた前培養液100μｌを用いて100mlのYPD培地でOD610が1.0付近になるまで、約12時間培養した。この培養液を集菌し、25mlのリチウム溶液（10mM  Tris-HCl（pH8.0）、1mM  EDTA、3mM  酢酸リチウム）に懸濁した。
【００７９】
これを遠心分離により集菌し、再度5mlのリチウム溶液に懸濁した後、振とうしながら30℃で１時間インキュベートし、コンピテントセルとした。1．5mlチューブに熱変性させた10μｇ／μｌ  Calf  thymus  DNAを10μｌ、EcoRVで切断した  20μｇ／μｌ  改変フィターゼ発現ベクター  を  5μｌ、およびコンピテントセル100μｌを加え、穏やかに混合した後、30℃、30分間静置した。静置後、700μｌの45%PEG溶液（45%（ｗ/v）ポリエチレングリコール＃4000（PEG）、10mM  Tris-HCl（pH8.0）、1mM  EDTA、3mM  酢酸リチウム）を加え、穏やかに混合した後、30℃１時間静置した。その後、42℃、5分間のヒートショックをかけた後、30℃で5分間静置した。遠心分離で集菌した後、１ｍｌの滅菌水に懸濁して200μｌずつYNBプレート（0.67%  Yeast Nitrogen base w/o Amino acid (Difco社製)、2%  グルコース、2%  寒天）に塗布して28℃、3日間培養した。この操作により形質転換された菌体のみがコロニーを形成した。改変フィターゼ発現プラスミド（p82-1EX、p85-1EX、p292-1EX、ｐ301-1EX、p342-1EX、p429-1EXを用いてTK62株を形質転換することによって得られた形質転換株をそれぞれ形質転換株82、形質転換株85、形質転換株292、形質転換株301、形質転換株342、形質転換株429とした。
【実施例４】
【００８０】
（各種改変体の評価）
実施例3で構築した形質転換株（形質転換株82、形質転換株85、形質転換株292、形質転換株301、形質転換株342、形質転換株429）を20ｍｌのYPGM培地（1％酵母エキス、2％  ポリペプトン、3％グリセロール、1.5％メタノール）を用いて28℃で5日間培養した。
【００８１】
次に、上記と同じ培養上清から改変フィターゼ（改変体82、改変体85、改変体292、形質転換株301、改変体342、改変体429）を含む酵素液を調製し、pH3.5とpH4.5におけるフィターゼ活性を実施例１に示した方法を用いてそれぞれ測定した。
【００８２】
pH4.5に対するpH3.5における活性値（pH3.5における活性値／pH4.5における活性値）を計算した。この値を“酸性シフト値”とした。酵母フィターゼの至適pHは4.5であるので、この値が大きいほど、至適pHが、酸性側へシフトしたと考えられる。酵母フィターゼの酸性シフト値は60.3であった。これに対し、各改変体の酸性シフト値はそれぞれ、88.3、73.9、79.4、61.5、68.2、66.3であった。酵母フィターゼの酸性シフト値を100としたときの各改変体の相対値を表５に示す。
【００８３】
【表５】
2006136314.tif 000006
【実施例５】
【００８４】
（各種改変体の組合せの効果）
次に、本発明で見出した酸性シフト値が高くなった改変体（改変体82、改変体85、改変体292、改変体301、改変体342、改変体429）の置換部位の組合せ効果を検討するために、該置換部位を少なくとも２つ以上含む改変体を数種構築した（改変体36G09、改変体43C03、改変体135E05、改変体136D06、改変体146H06）。なお、改変体36G09は改変体342と改変体429の組合せであり、改変体43C03は改変体292と改変体342および改変体429の組合せであり、改変体135E05は改変体292と改変体301および改変体429の組合せであり、改変体136D06は改変体292と改変体301と改変体342の組合せであり、146H06は改変体292と改変体301の組合せである。
【００８５】
これらの改変体（改変体36G09、改変体43C03、改変体135E05、改変体136D06、改変体146H06）を生産する形質転換株（形質転換株36G09、形質転換株43C03、形質転換株135E05、形質転換株136D06、形質転換株146H06）は以下のようにして得た。
【００８６】
まず、形質転換株36G09は、実施例２に示したのと同様の方法を用いて、改変フィターゼプラスミド（p342-1）DNAを鋳型として、合成プライマーとしてPM22とPM22Rを用いて改変フィターゼプラスミド（ｐ36G09-1）を構築した。次に、改変フィターゼプラスミド（p36G09-1）とフィターゼ発現プラスミドｐNNPH60Iを用いて、改変フィターゼ発現プラスミド（p36G09-1EX）を構築した。得られた改変フィターゼ発現プラスミド（p36G09-1EX）を用いて、実施例３に示した同様の方法を用いて、TK62株を形質転換することによって形質転換株36G09を得た。
【００８７】
形質転換株43C03も前述と同様の方法を用いて、改変フィターゼプラスミド（p36G09-1）DNAを鋳型として、合成プライマーとしてPM76とPM76Rを用いて改変フィターゼプラスミド（ｐ43C03-1）を構築した。次に、改変フィターゼプラスミド（p43C03-1）とフィターゼ発現プラスミドｐNNPH60Iを用いて、改変フィターゼ発現プラスミド（p43C03-1EX）を構築した。得られた改変フィターゼ発現プラスミド（p43C03-1EX）を用いて、実施例３に示した同様の方法を用いて、TK62株を形質転換することによって形質転換株43C03を得た。
【００８８】
形質転換株146H06も前述と同様の方法を用いて、改変フィターゼプラスミド（p292-1）DNAを鋳型として、合成プライマーとしてPM134とPM134Rを用いて改変フィターゼプラスミド（ｐ146H06-1）を構築した。次に、改変フィターゼプラスミド（p146H06-1）とフィターゼ発現プラスミドｐNNPH60Iを用いて、改変フィターゼ発現プラスミド（p146H06-1EX）を構築した。得られた改変フィターゼ発現プラスミド（p146H06-1EX）を用いて、実施例３に示した同様の方法を用いて、TK62株を形質転換することによって形質転換株146H06を得た。
【００８９】
形質転換株135E05も前述と同様の方法を用いて、改変フィターゼプラスミド（p146H06-1）DNAを鋳型として、合成プライマーとしてPM22とPM22Rを用いて改変フィターゼプラスミド（ｐ135E05-1）を構築した。次に、改変フィターゼプラスミド（p135E05-1）とフィターゼ発現プラスミドｐNNPH60Iを用いて、改変フィターゼ発現プラスミド（p135E05-1EX）を構築した。得られた改変フィターゼ発現プラスミド（p135E05-1EX）を用いて、実施例３に示した同様の方法を用いて、TK62株を形質転換することによって形質転換株135E05を得た。
【００９０】
形質転換株136D06も同様に、実施例２に示したのと同様の方法を用いて、改変フィターゼプラスミド（p146H06-1）DNAを鋳型として、合成プライマーとしてPM63とPM63Rを用いて改変フィターゼプラスミド（ｐ136D06-1）を構築した。次に、改変フィターゼプラスミ
ド（p136D06-1）とフィターゼ発現プラスミドｐNNPH60Iを用いて、改変フィターゼ発現プラスミド（p136D06-1EX）を構築した。得られた改変フィターゼ発現プラスミド（p136D06-1EX）を用いて、実施例３に示した同様の方法を用いて、TK62株を形質転換することによって形質転換株136D06を得た。
【００９１】
得られた形質転換株（形質転換株36G09、形質転換株43C03、形質転換株146H06、形質転換株135E05、形質転換株136D06）を実施例４に示した同様の方法で培養し、培養上清から改変フィターゼ（改変体36G09、改変体43C03、改変体146H06、改変体135E05、改変体136D06）を含む酵素液を調製し、pH3.5とpH4.5におけるフィターゼ活性を前述の方法を用いて測定し、酸性シフト値を計算した。酵母フィターゼの酸性シフト値を100としたときの各改変体の相対値を表６に示した
【００９２】
【表６】
2006136314.tif 000007
【００９３】
その結果、新しく構築した置換部位を少なくとも２箇所以上含む改変体（改変体36G09、改変体43C03、改変体146H06、改変体135E05、改変体136D06）も、単一の改変部位からなる改変体（改変体82、改変体85、改変体292、改変体301、改変体342、改変体429）と同様に、酵母フィターゼに比べ、至適pHがpH4.5からより酸性側にシフトしていると考えられ、豚の胃内での活性の向上が期待できる結果となり、本発明で見出した改変体の組合せが可能であることか判明した。
【００９４】
［試験例１］
次に、酵母フィターゼは胃内安定性が劣ることが判明しているので、胃内を想定した環境下で、すなわち飼料と消化酵素（ペプシン）存在下での各改変体（改変体82、改変体85、改変体292、改変体301、改変体342、改変体429）のペプシン耐性を評価した。
【００９５】
まず、豚の餌を模した飼料標品を作成した。飼料標品の成分の混合比は、とうもろこし
75%、大豆粕  24%、米ぬか1%のものを用いた。飼料標品の調製は以下のように行った。とうもろこしは細かく砕き、乳鉢で細かくした大豆粕と混ぜ、さらに米ぬかも加えてよく混合した。このようにして作製した飼料標品１ｇを水に懸濁し、5mlの溶液を調製した。この溶液を4℃で１〜２日保存、その後5000回転で１分間遠心し、回収した上清をエサ懸濁液とした。
【００９６】
ペプシン耐性試験は以下の方法で実施した。上記作製のエサ懸濁液  10μｌ、0.4M  CH3COONa-acetate  buffer  pH3.0  10μｌ、ペプシン溶液（7320U/ml  10mM  HCl）0、10、あるいは20μｌ、水50μｌを含む溶液の中に酵母フィターゼ酵素溶液  10μｌを最終的に加え100μｌの反応液とした。ペプシン溶液の代わりに10mM  HCl溶液20μｌを加えたものをコントロールとした。37℃で反応を行い、0、30、60、90、120分後に反応液をそれぞれ4μｌずつ、200μｌの5mM  H2SO4溶液に加え反応を止めた。この液  160μｌに発色液を40μｌ  加え、655ｎｍでの吸光度を測定した。解析は次のような方法で実施した。横軸に反応時間、縦軸に活性（吸光度）をプロットし、各反応液における吸収度の上昇の勾配、それらのコントロールに対する比をそれぞれ計算し、その比の値をペプシン耐性値とした。値が大きいほど耐性が高いと評価される。
【００９７】
ペプシン10μｌと20μｌの結果を酵母フィターゼの値を100としたときの相対値で表７に示す。
【００９８】
【表７】
2006136314.tif 000008
【００９９】
これらの結果から、いずれの改変フィターゼも酵母フィターゼに比べ、ペプシン耐性が向上していることが確認できた。
【０１００】
［試験例２］
次に、上記改変体の組合せ効果を検討するために、胃内を想定した環境下で、すなわち、飼料と消化酵素（ペプシン）存在下での本発明で見出した改変体に含まれる置換部位を少なくとも２箇所以上含む改変体（36G09、43C03、改変体146H06、135E05、136D06）のペプシン耐性を評価した。その結果を表８に示す。
【０１０１】
【表８】
2006136314.tif 000009
【０１０２】
その結果、新たに構築した置換部位を少なくとも２箇所以上含む改変体（36G09、43C03、135E05、136D06、146H06）はすべて、単一の置換部位からなる改変体(改変体82、改変体85、改変体292、改変体301、改変体342、改変体429)と同様に、酵母フィターゼに比し、ペプシン耐性の向上していることが確認でき（表８）、本発明で見出した改変体を構成する置換部位の組合せが可能であることが判明した。特に、改変体135E05と改変体136D06および改変体146H06は、酵母フィターゼに比べペプシン耐性値が大きく（表８）、ブタの胃内での安定性の向上が期待されるものであった。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明の改変フィターゼを家畜飼料に配合して使用することで、高機能化に伴う施用量の低減化ができ、結果として飼料に占めるフィターゼ費用のコストダウンが可能となる。つまり、これは効果および経済性に優れた高機能飼料添加酵素を提供することとなる。
【０１０４】
本発明は、さらに、豚の胃内での安定性を向上が期待できる改変フィターゼを創製する方法を提供するものであり、フィターゼを始めとする胃内で作用する他の飼料添加酵素の高機能化に広く応用することが可能であり、飼料添加酵素を高機能化させる基本的な方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】酵母フィターゼのpH3.5前後での予測静電ポテンシャル。酵母フィターゼの立体モデルにpH3.5前後での予測静電ポテンシャルを示したもの。フィターゼの原子を黒で、プラス電荷の領域を灰色で示した。
【図２】改変フィターゼ発現プラスミド（p82-1EX）の構築法。構築法の詳細は実施例２に記載した。pPHY36は酵母フィターゼ遺伝子を有するプラスミド、pNNPH60Iは酵母フィターゼ遺伝子発現プラスミド、p82-1は改変フィターゼ遺伝子を有するプラスミド、p82-1EXは改変フィターゼ遺伝子発現プラスミド、AOD  Pはアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、AOD  Tはアルコールオキシダーゼ遺伝子のターミネーターをそれぞれ示す。
【図３】酵母フィターゼのpH安定性を示すグラフである。図中、横軸はpH処理時間を、縦軸はフィターゼ活性を示す。白丸印はpH3.0での、米印はpH3.5での、黒三角印はpH4.0での処理した場合の活性の経時変化を示す。活性の測定は、実施例１に示した方法を用いて測定した。
【図４】酵母フィターゼのペプシン耐性を示すグラフである。図中、横軸はペプシン処理時間を、縦軸はフィターゼ活性の相対値を示す。白三角印はpH4.0でペプシンを作用させた場合の活性の経時変化を、黒三角印はpH4.0でペプシンなしで作用させた場合のフィターゼ活性の経時変化をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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