(57)【要約】【課題】ミトコンドリアにおけるアポトーシスシグナル伝達経路とは異なる経路に基づきアポトーシスに作用（例えば、抑制、促進）させうる手段を提供すること。【解決手段】小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価方法、該物質の評価系並びに前記小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに関連して引き起こされる疾患又はその進行を阻害しうる医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞とを接触させ、それにより、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下での該細胞内におけるカスパーゼ−４を介した動態を調べるステップを含む、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価方法。
【請求項２】
該プロカスパーゼ−４を発現する細胞が、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＹ−５Ｙ細胞及びプロカスパーゼ−４をコードする核酸を導入したトランスフェクト細胞からなる群より選ばれた細胞である、請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
該プロカスパーゼ−４を発現する細胞が、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プロカスパーゼ−４をコードする核酸を導入して得られたトランスフェクト細胞である、請求項１又は２記載の評価方法。
【請求項４】
（１）被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞とを接触させるステップ、
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下に培養するステップ、及び
（３）前記ステップ（２）を行なった後の細胞について、アポトーシスに特異的な変化を調べるステップ、
を含む、請求項１〜３いずれか１項に記載の評価方法。
【請求項５】
（Ａ）プロカスパーゼ−４を発現する細胞を、被検物質と、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βとの存在下に培養するステップ、及び
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）を行なった後の細胞について、アポトーシスに特異的な変化を調べるステップ、
を含む、請求項１〜４いずれか１項に記載の評価方法。
【請求項６】
カスパーゼ−４の基質の存在下に、被検物質の存在により引き起こされる動態の変化の有無を調べる、請求項１〜５いずれか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
該被検物質が、
ａ）プロカスパーゼ−４と結合する物質をスクリーニングするステップ、
ｂ）前記ステップａ）で得られた物質について、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下に、プロカスパーゼ−４に接触させ、切断産物を生じる物質をスクリーニングするステップ、及び
ｃ）前記ステップｂ）で得られた物質のカスパーゼ−４による切断部位に基づき、該物質の切断部位周辺を含む誘導体として被検物質を作製するステップ、
を行なうことにより得られた物質である、請求項１〜６いずれか１項に記載の評価方法。
【請求項８】
該被検物質が、カスパーゼ−４の基質の誘導体、該基質のミミック及び該カスパーゼ−４に結合しうる物質からなる群より選ばれた物質である、請求項１〜７いずれか１項に記載の評価方法。
【請求項９】
該動態が、核凝縮、染色体の断片化、細胞凝縮、ＭＴＳの放出、プロカスパーゼ−４の切断、乳酸脱水素酵素の放出及びカスパーゼ−４の基質から生じる産物の生成からなる群より選ばれた少なくとも１種の事象である、請求項１〜８いずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１０】
プロカスパーゼ−４を発現する細胞と、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βと、被検物質と該細胞との接触に適した試薬とを含有してなる、請求項１〜９いずれか１項に記載の評価方法を行なうための、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価用キット。
【請求項１１】
請求項１〜９いずれか１項に記載の評価方法により評価された物質であって、かつ小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質を有効成分として含有してなる、医薬組成物。
【請求項１２】
該物質が、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４に特異的なｓｉＲＮＡ又はカスパーゼ−４をコードする核酸に対するアンチセンス核酸である、請求項１１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価方法、該物質の評価系並びに前記小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに関連して引き起こされる疾患又はその進行を阻害しうる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体におけるアポトーシスによる細胞死は、発生過程、正常細胞の交替等の生理的事象、ウイルス感染等の病理的事象に見られることが知られている。かかるアポトーシスによる細胞死は、例えば、紫外線、放射線、過剰な又は長期の小胞体ストレス等によっても、引き起こされることが示されている。
【０００３】
前記アポトーシスにおいては、例えば、アンフォールディングタンパク質応答が、細胞死に密接に関連するＣＨＯＰの転写を増加させること{非特許文献１}、活性化ＩＲＥ１αへのＴＮＦレセプター関連因子２（ＴＲＡＦ２）の補充が、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を誘導すること{非特許文献２}、あるいはカルパインが、下流カスパーゼ−カスケードを活性化すること{非特許文献３}が報告されている。
【０００４】
また、アポトーシスによる細胞死プロセスにおいては、特定のアスパラギン酸残基で基質を切断するシステインプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼの活性化が、主要な機構の１つであると考えられている{非特許文献４及び非特許文献５を参照のこと}。
【０００５】
既知カスパーゼのうち、マウスカスパーゼ−１２は、小胞体ストレス誘導性アポトーシスに特異的なシグナル伝達経路に関与すると考えられている{非特許文献６}。
【０００６】
一方、前記マウスカスパーゼ−１２に対応するヒトカスパーゼ−１２に関して、ヒト第１１染色体ｑ２２．３上のカスパーゼ−１／ＩＣＥ（インターロイキン−１β変換酵素）遺伝子クラスター内の遺伝子座に、該マウスカスパーゼ−１２をコードする核酸と高度に相同な配列が存在することが同定されている。しかしながら、前記配列は、フレームシフト及び未成熟ストップコドンにより中断されており、カスパーゼ活性に重要な部位におけるアミノ酸置換も有しているため、機能を発揮していないことが示唆されている{非特許文献７}。
【０００７】
また、ヒトにおけるカスパーゼ−１２は、白人人種及びアジア人人種では、不完全なポリペプチドがみられるにすぎず、黒人人種において、全長カスパーゼ−１２の多型が発現し、小胞体ストレス媒介アポトーシスに関与しないことが示唆されている{非特許文献８}。
【非特許文献１】ブリューワー（Ｂｒｅｗｅｒ  Ｊ．Ｗ．）ら、「哺乳動物アンフォールディングタンパク質応答とは異なる経路が、非ストレス細胞における小胞体シャペロンの発現を制御する」，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１６：７２０７−７２１６（１９９７）
【非特許文献２】ウラノ（Ｕｒａｎｏ，Ｆ）ら、「ＥＲにおけるストレスとトランスメンブランプロテインキナーゼＩＲＥ１によるＪＮＫプロテインキナーゼの活性化との共役」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，６６４−６６６（２０００）
【非特許文献３】ナカガワ（Ｎａｋａｇａｗａ）ら，「２つのシステインプロテアーゼファミリー間のクロス−トーク。アポトーシスにおけるカルパインによるカスパーゼ−１２の活性化」，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５０：８８７−８９４（２０００）
【非特許文献４】サルブセン（Ｓａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．Ｓ．）ら，「カスパーゼ：タンパク質分解による細胞内シグナル伝達」，Ｃｅｌｌ，９１：４４３−４４６（１９９７）
【非特許文献５】ゾーンベリー（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．）ら，「カスパーゼ：内なる敵」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１３１２−１３１６（１９９８）を参照のこと
【非特許文献６】ナカガワ（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｔ．）ら，「カスパーゼ−１２は、小胞体ストレス特異的アポトーシス及びアミロイド−βによる細胞傷害性を媒介する」，Ｎａｔｕｒｅ，４０３：９８−１０３（２０００）を参照のこと
【非特許文献７】フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｈ．）ら、「ヒトカスパーゼ−１２は、有害な変異を獲得している」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２９３：７２２−７２６（２００２）を参照のこと
【非特許文献８】マヤ（Ｍａｙａ  Ｓａｌｅｈ）ら、「ヒトカスパーゼ−１２多型によるエンドトキシン応答性のディファレンシャルモデュレーション」，Ｎａｔｕｒｅ，４２９，７５−７９（２００４）を参照のこと
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の１つの側面は、ミトコンドリアにおけるアポトーシスシグナル伝達経路とは異なる経路に基づくアポトーシスに作用（例えば、抑制又は促進）する物質、特に、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに特異的に作用する物質のスクリーニング及び／又はバリデーションを行なうこと、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに関連して引き起こされる疾患又はその進行を阻害しうる物質のスクリーニング及び／又はバリデーションを行なうこと、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患の治療又は予防手段を開発すること等の少なくとも１つを可能にする、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価方法を提供することにある。また、本発明の他の側面は、迅速に、簡便に、再現性よく、あるいは精度よく前記評価方法を行なうこと、生体における状態により反映させて前記評価方法を行なうこと等の少なくとも１つを可能にする、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価系、例えば、評価用キットを提供することにある。本発明のさらに別の側面は、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患又はその進行を阻害することを可能にする、医薬組成物を提供することにある。なお、さらなる課題は、本明細書により明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞とを接触させ、それにより、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下での該細胞内におけるカスパーゼ−４を介した動態を調べるステップを含む、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価方法、
〔２〕  該プロカスパーゼ−４を発現する細胞が、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＳＹ−５Ｙ細胞及びプロカスパーゼ−４をコードする核酸を導入したトランスフェクト細胞からなる群より選ばれた細胞である、前記〔１〕記載の評価方法、
〔３〕  該プロカスパーゼ−４を発現する細胞が、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プロカスパーゼ−４をコードする核酸を導入して得られたトランスフェクト細胞である、前記〔１〕又は〔２〕記載の評価方法、
〔４〕  （１）被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞とを接触させるステップ、
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下に培養するステップ、及び
（３）前記ステップ（２）を行なった後の細胞について、アポトーシスに特異的な変化を調べるステップ、
を含む、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の評価方法、
〔５〕  （Ａ）プロカスパーゼ−４を発現する細胞を、被検物質と、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βとの存在下に培養するステップ、及び
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）を行なった後の細胞について、アポトーシスに特異的な変化を調べるステップ、
を含む、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の評価方法、
〔６〕  カスパーゼ−４の基質の存在下に、被検物質の存在により引き起こされる動態の変化の有無を調べる、前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の評価方法、
〔７〕  該被検物質が、
ａ）プロカスパーゼ−４と結合する物質をスクリーニングするステップ、
ｂ）前記ステップａ）で得られた物質について、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下に、プロカスパーゼ−４に接触させ、切断産物を生じる物質をスクリーニングするステップ、及び
ｃ）前記ステップｂ）で得られた物質のカスパーゼ−４による切断部位に基づき、該物質の切断部位周辺を含む誘導体として被検物質を作製するステップ、
を行なうことにより得られた物質である、前記〔１〕〜〔６〕いずれか１項に記載の評価方法、
〔８〕  該被検物質が、カスパーゼ−４の基質の誘導体、該基質のミミック及び該カスパーゼ−４に結合しうる物質からなる群より選ばれた物質である、前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の評価方法、
〔９〕  該動態が、核凝縮、染色体の断片化、細胞凝縮、ＭＴＳの放出、プロカスパーゼ−４の切断、乳酸脱水素酵素の放出及びカスパーゼ−４の基質から生じる産物の生成からなる群より選ばれた少なくとも１種の事象である、前記〔１〕〜〔８〕いずれか１項に記載の評価方法、
〔１０〕  プロカスパーゼ−４を発現する細胞と、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βと、被検物質と該細胞との接触に適した試薬とを含有してなる、前記〔１〕〜〔９〕いずれか１項に記載の評価方法を行なうための、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価用キット、
〔１１〕  前記〔１〕〜〔９〕いずれか１項に記載の評価方法により評価された物質であって、かつ小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質を有効成分として含有してなる、医薬組成物、並びに
〔１２〕  該物質が、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４に特異的なｓｉＲＮＡ又はカスパーゼ−４をコードする核酸に対するアンチセンス核酸である、前記〔１１〕記載の医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の評価方法によれば、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに特異的に作用する物質のスクリーニング及び／又はバリデーションを行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の評価方法によれば、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに関連して引き起こされる疾患又はその進行を阻害しうる物質のスクリーニング及び／又はバリデーションを行なうことができ、該疾患の治療又は予防手段を開発することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の評価用キットによれば、迅速に、簡便に、再現性よく、かつ精度よく、生体における状態により反映させて前記評価方法を行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の医薬組成物によれば、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患又はその進行を阻害することが可能になるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、プロカスパーゼ−４が切断されて、カスパーゼ−４が生じるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。さらに、本発明は、前記カスパーゼ−４をコードする配列が、マウスにおける小胞体ストレス誘導性アポトーシスに特異的に作用するマウスカスパーゼ−１２に対応すると考えられていた第１１染色体ｑ２２．３上のカスパーゼ−１／ＩＣＥ（インターロイキン−１β変換酵素）遺伝子クラスター内の遺伝子座に局在する配列ではないにもかかわらず、予想外にも、カスパーゼ−４が、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに特異的に作用するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１２】
本発明の１つの側面は、被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞とを接触させ、小胞体ストレスを引き起こす物質（小胞体ストレスインデューサーともいう）又はアミロイド−βの存在下における該細胞におけるカスパーゼ−４を介した動態を調べる、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価方法に関する。
【００１３】
本発明の評価方法では、細胞におけるカスパーゼ−４を介した動態が調べられているため、本発明の評価方法によれば、簡便な手順により、迅速に、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに特異的に作用する物質をスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の評価方法は、薬理評価等におけるバリデーションにも用いることができる。
【００１４】
また、本発明の評価方法では、細胞におけるカスパーゼ−４を介した動態が調べられているため、本発明の評価方法によれば、特に、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに関連して引き起こされる疾患又はその進行を特異的に阻害しうる物質のスクリーニング及び／又はバリデーションを行なうことができる。
【００１５】
さらに、本発明の評価方法では、細胞におけるカスパーゼ−４を介した動態が調べられているため、本発明の評価方法によれば、生体における状態をより反映させてカスパーゼ−４により引き起こされる事象を評価することができる。
【００１６】
したがって、本発明の評価方法によれば、前記疾患の治療又は予防手段を開発することができる。
【００１７】
本発明に用いられるカスパーゼ−４は、哺乳動物由来カスパーゼ−４であり、ヒトにおける疾患の治療に用いる場合、好ましくは、ヒトカスパーゼ−４であることが望ましい。ヒトプロカスパーゼ−４をコードする核酸としては、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列を含有する核酸が挙げられる。また、ヒトプロカスパーゼ−４としては、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが挙げられる。ヒトカスパーゼ−４をコードする核酸としては、（Ｉ）配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される配列からなる塩基配列を含有する核酸等が挙げられる。ヒトカスパーゼ−４としては、（ｉ）配列番号：２のアミノ酸番号：９４〜３７７に示される配列からなるアミノ酸配列を含有するポリペプチド等が挙げられる。
【００１８】
なお、生体では、個体の種類、局在組織等により、前記配列番号に示される塩基配列又はアミノ酸配列中に変異が天然に生じているにもかかわらず、当該変異を有する塩基配列からなる核酸（その翻訳産物）、又は当該変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、機能的活性を示す場合がある。したがって、本発明に用いられるプロカスパーゼ−４をコードする核酸、プロカスパーゼ−４、カスパーゼ−４をコードする核酸及びカスパーゼ−４には、機能活性を有するものであれば、前記（Ａ）、（ａ）、（Ｉ）及び（ｉ）それぞれのバリアントも含まれる。
【００１９】
なお、本明細書において、前記「機能活性」の用語は、プロカスパーゼ−４に関して用いられる場合、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、システインプロテアーゼ活性を有する切断産物を生じる機能活性を意味し、カスパーゼ−４に関して用いられる場合、システインプロテアーゼ活性を意味する。また、本明細書において、前記核酸に関する「機能活性」は、該核酸によりコードされるポリペプチド（すなわち、翻訳産物）を介して発現する活性をも包含する。
【００２０】
前記機能活性は、プロカスパーゼ−４のバリアントの場合、
−  試験対象のバリアントをコードする核酸を細胞に導入して、該バリアントを細胞内で発現させ、
−  小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βの存在下に、当該細胞を維持する
ことにより評価される。ここで、プロカスパーゼ−４のバリアントが切断され、システインプロテアーゼ活性を示す切断産物を生じることが、前記バリアントが、前記機能活性を有することの指標となる。
【００２１】
前記機能活性は、カスパーゼ−４のバリアントの場合、試験対象のバリアントをコードする核酸を細胞に導入して、該バリアントを細胞内で発現させることにより評価される。ここで、前記バリアントが、システインプロテアーゼ活性を示すことが、前記バリアントが、前記機能活性を有することの指標となる。前記システインプロテアーゼ活性は、例えば、カスパーゼ−４が特異的に認識するテトラペプチドＷＨＥＤ（Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ；配列番号：９）に蛍光色素７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）が共有結合したＡｃ−ＷＥＨＤ−ＡＭＣを基質として用いて測定される。具体的には、前記システインプロテアーゼ活性は、カスパーゼ−４のシステインプロテアーゼ活性により前記基質が切断され、遊離したＡＭＣを定量することにより測定され得る。なお、かかるシステインプロテアーゼ活性の測定には、例えば、組成：０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０重量％  ポリエチレングリコール、０．１体積％  ３−（（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、ｐＨ７．０の反応液等が用いられうる。なお、本明細書において、前記システインプロテアーゼ活性の１Ｕは、室温（２５℃）で飽和濃度の基質を使用した場合に１ｐｍｏｌ  ＡＭＣ／分を産生するために必要な酵素量として定義される。
【００２２】
プロカスパーゼ−４をコードする核酸のバリアントとしては、
（Ｂ）配列番号：１に示される配列において、少なくとも１ヌクレオチド残基の変異（置換、欠失、付加又は挿入）を有する塩基配列を含有し、該塩基配列によりコードされるポリペプチドが、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、システインプロテアーゼ活性を有する切断産物を生じうるポリペプチドである核酸、
（Ｃ）配列番号：１に示される配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の塩基配列を含有し、該塩基配列によりコードされるポリペプチドが、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、システインプロテアーゼ活性を有する切断産物を生じうるポリペプチドである核酸、
（Ｄ）配列番号：１に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列であり、該塩基配列によりコードされるポリペプチドが、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、システインプロテアーゼ活性を有する切断産物を生じうるポリペプチドである核酸、
（Ｅ）前記（Ａ）の核酸とは、縮重を介して異なる核酸、
等が挙げられる。
【００２３】
プロカスパーゼ−４のバリアントとしては、
（ｂ）配列番号：２に示される配列において、少なくとも１アミノ酸残基の変異（置換、欠失、付加又は挿入）を有するアミノ酸配列を含有し、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、システインプロテアーゼ活性を有する切断産物を生じうるものであるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：１に示される配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸によりコードされ、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、システインプロテアーゼ活性を有する切断産物を生じうるものであるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、小胞体ストレス及び／又はアミロイド−βにより、システインプロテアーゼ活性を有する切断産物を生じうるものであるポリペプチド、
等が挙げられる。
【００２４】
カスパーゼ−４をコードする核酸のバリアントとしては、
（II）配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される配列において、少なくとも１ヌクレオチド残基の変異（置換、欠失、付加又は挿入）を有する塩基配列を含有し、該塩基配列によりコードされるポリペプチドが、システインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドである核酸、
（III）配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の塩基配列を含有し、該塩基配列によりコードされるポリペプチドが、システインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドである核酸、
（IV）配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列であり、該塩基配列によりコードされるポリペプチドが、システインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドである核酸、
（V）前記（Ｉ）の核酸とは、縮重を介して異なる核酸、
等が挙げられる。なお、前記カスパーゼ−４のバリアント（II）〜（V）には、前記プロカスパーゼ−４（Ａ）及びそのバリアント（Ｂ）〜（Ｄ）は包含されないものとする。
【００２５】
カスパーゼ−４のバリアントとしては、
（ii）配列番号：２のアミノ酸番号：９４〜３７７に示される配列において、少なくとも１アミノ酸残基の変異（置換、欠失、付加又は挿入）を有するアミノ酸配列を含有し、システインプロテアーゼ活性を有するポリペプチド
（iii）配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸によりコードされ、システインプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
（iv）配列番号：２のアミノ酸番号：９４〜３７７に対応する配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸によりコードされ、システインプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｖ）配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、システインプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、
等が挙げられる。なお、前記カスパーゼ−４のバリアント（ii）〜（ｖ）には、前記プロカスパーゼ−４（ａ）及びそのバリアント（ｂ）〜（ｄ）は包含されないものとする。
【００２６】
本明細書において、「少なくとも１ヌクレオチド残基」は、コードされるポリペプチドが機能活性を有する範囲（すなわち、該ポリペプチドが機能活性を示す範囲）のヌクレオチド残基数であればよい。具体的には、「少なくとも１ヌクレオチド残基」とは、例えば、１個又は複数個、好ましくは、１個又は数個のヌクレオチド残基をいう。また、本明細書において、「少なくとも１アミノ酸残基」とは、ポリペプチドが機能活性を有する範囲のアミノ酸残基数であればよい。具体的には、「少なくとも１アミノ酸残基」とは、例えば、１個又は複数個、好ましくは、１個又は数個のアミノ酸残基をいう。
【００２７】
前記（Ｂ）若しくは（II）の核酸又は前記（ｂ）若しくは（ii）のポリペプチドは、
−  慣用の部位特異的変異導入方法により、配列番号：１に示される塩基配列又は該配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される塩基配列からなる核酸に変異を導入すること、前記塩基配列を参照して、変異を有する核酸を合成すること等により、候補となる核酸を得、
−  得られた核酸を、適切なベクターに組込み、適切な細胞で該核酸によりコードされるポリペプチドを発現させ、
−  前記のように、機能活性を評価して、当該機能活性を有する核酸（すなわち、その発現産物）又はポリペプチドを選別すること
により得られうる。
【００２８】
前記ベクターとしては、用いられる細胞の種類等に応じて適宜選択されうるが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。かかるベクターは、用いる細胞により適宜選択されうる。また、前記ベクターは、細胞内直接発現型ベクター、分泌発現型ベクター及び融合タンパク質発現型ベクターのいずれであってもよい。具体的には、前記ベクターとしては、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ４、ｐｃＤＮＡ６、ｐＳＦＶ、ｐＣＡＧＳＳ等が挙げられる。かかるベクターは、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等の因子を適宜有していてもよい。また、前記ベクターは、融合タンパク質として発現させるための、タグ配列等も適宜含有していてもよい。また、前記ベクターのかわりに、リポソーム、ＤＥＡＥ−デキストラン等の担体に導入対象となる核酸を保持させて得られた構築物を用いてもよい。
【００２９】
前記細胞としては、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＹ−５Ｙ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等が挙げられる。
【００３０】
なお、細胞への核酸の導入は、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガンによる導入法等の慣用の遺伝子導入手段により行なわれうる。
【００３１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１））等の記載の条件が挙げられる。機能活性を有する核酸又はポリペプチドである蓋然性を高める観点から、前記「ストリンジェントな条件」は、好ましくは、中ストリンジェンシーの条件、より好ましくは、高ストリンジェンシーの条件であることが望ましい。前記ストリンジェントな条件としては、より具体的には、例えば、２０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．１％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡとを含む溶液中、６５℃で一晩インキュベーションし、２×ＳＳＣと０．１％  ＳＤＳとを含む溶液を用い、室温で１５分間洗浄するという条件が挙げられる。
【００３２】
また、かかるストリンジェントな条件下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、３×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の２５℃下、よりストリンジェントには、２２℃下、さらにストリンジェントには、２０℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、６５℃以上、よりストリンジェントには、６７℃以上、さらにストリンジェントには、７０℃以上等の条件下でのインキュベーションが行なわれる。また、同様の観点から、よりストリンジェントな洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、１×ＳＳＣ、さらにストリンジェントには、０．５×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、用いられる核酸のＴｍ値の４０℃下、よりストリンジェントには、３０℃下、さらにストリンジェントには、２５℃下、具体的には、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、３０℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、４５℃以上等の条件下での洗浄等が行なわれる。かかるハイブリダイゼーションにより、例えば、配列番号：１に示される塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９７％以上の配列同一性を有する核酸を得ることが可能になる。なお、Ｔｍは、前記モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版等の記載に従って、算出されうる。
【００３３】
前記（Ｃ）若しくは（III）の核酸又は前記（ｃ）若しくは（iii）のポリペプチドは、
−  前記ストリンジェントな条件下に、配列番号：１に示される塩基配列又は該配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される塩基配列からなる核酸と試験対象の核酸とのハイブリダイゼーションを行ない、
−  得られた核酸を、適切なベクターに組込み、適切な細胞で発現させ、
−  前記のように、機能活性を評価して、当該機能活性を有する核酸又はポリペプチドを選別すること
により得られうる。また、前記（iv）のポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸番号：９４〜３７７に対応する配列からなる核酸を用い、前記（Ｃ）若しくは（III）の核酸又は前記（ｃ）若しくは（iii）のポリペプチドと同様の手法により得られうる。
【００３４】
ここで、ベクター、細胞、細胞への核酸の導入方法は、前記と同様である。また、前記ハイブリダイゼーションは、前記モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版等に記載の方法により行なわれうる。
【００３５】
なお、本明細書において、前記「配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸」は、好ましくは、前記配列番号：１の塩基番号：３１８〜１１７３に示される配列からなる核酸と実質的に同等の鎖長の配列からなる核酸であることが望ましい。また、前記「配列番号：２のアミノ酸番号：９４〜３７７に対応する配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸」は、好ましくは、前記配列番号：２のアミノ酸番号：９４〜３７７に対応する配列からなる核酸と実質的に同等の鎖長の配列からなる核酸であることが望ましい。ここで、「実質的に同等の長さ」とは、特定の配列との鎖長の差が、０〜４００ヌクレオチド長、好ましくは、０〜２００ヌクレオチド長、より好ましくは、０〜１００ヌクレオチド長であることをいう。
【００３６】
本明細書において、配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、塩基配列について、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ５、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ２、Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  −３、ｒｅｗａｒｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  １１、ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １のパラメーター値、アミノ酸配列について、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ５、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ２、Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  −３、ｒｅｗａｒｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  １１、ｇａｐ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １０、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １のパラメーター値で、参照配列に対して、適切にアライメントされ、例えば、両方の配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけること算出された値をいう。なお、前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）のホームページを介して利用可能である。
【００３７】
本発明の評価方法を適用しうる被検物質としては、例えば、カスパーゼ−４の基質の誘導体、該基質のミミック、該カスパーゼ−４に結合しうる物質等が挙げられる。前記被検物質としては、具体的には、化合物、ペプチド、ペプチドミミック、各種タンパク質、核酸、核酸アナログ、抗体、抗体断片等が挙げられる。
【００３８】
前記化合物は、コンビナトリアルケミストリーにより得られたコンビナトリアルライブラリーの化合物であってもよい。
【００３９】
前記核酸及び核酸アナログには、センス核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等が含まれる。なお、特に、ＤＮＡについて、安定性を向上させる観点から、ペプチド骨格を有するＰＮＡとしてもよい。
【００４０】
前記核酸及び核酸アナログは、既知配列のデータベースを参照し、既知配列に対する配列同一性が低い配列、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づき、前記と同様のパラメーター値で、参照配列に対して、適切にアライメントされて、算出された配列同一性が、好ましくは、１５％以下、より好ましくは、１０％以下、さらに好ましくは、５％以下、よりさらに好ましくは、０％である配列に基づきデザインされうる。
【００４１】
前記核酸及び核酸アナログの鎖長は、該核酸又は核酸アナログの種類等に応じて適宜設定されうる。
【００４２】
センス核酸又はアンチセンス核酸の鎖長は、特に限定されるものではなく、適宜設定されうる。
【００４３】
前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＲＮＡｉに無関係な結合因子影響を減少させる観点から、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、開始コドン周辺領域等を含まない配列であることが望ましい。前記ｓｉＲＮＡの配列は、例えば、慣用のｓｉＲＮＡデザインツール（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製のｓｉＲＮＡデザインツール等）によりデザインされうる。
【００４４】
前記ｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、例えば、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４をコードする核酸における機能を阻害する標的となる配列の開始コドンから、好ましくは、５０〜１００ヌクレオチド以上下流、より好ましくは、少なくとも７５ヌクレオチド下流の領域に対応する配列であることが望ましい。また、前記ｓｉＲＮＡは、前記領域において、好ましくは、２つの連続したアデニル酸残基と任意の１９ヌクレオチド残基とからなる配列又は２つの連続したアデニル酸残基と任意の２１ヌクレオチド残基の配列、さらに好ましくは、２つのアデニル酸残基と１つのグアニル酸残基と任意の１８ヌクレオチド残基とからなる配列又は２つのアデニル酸残基と１つのシチジル酸残基と任意の１８ヌクレオチド残基とからなる配列であることが望ましい。さらに、前記ｓｉＲＮＡのＧＣ含量は、好ましくは、３０％〜７０％、より好ましくは、４０％前後〜５０％前後、さらに好ましくは、５０％前後であることが望ましい。かかるｓｉＲＮＡは、既知配列のデータベース中の配列に対する配列同一性が低く、標的となる配列に対して特異的である配列であることが望ましい。
【００４５】
また、前記リボザイムは、例えば、ｔＲＮＡ連結型リボザイムの場合、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４をコードする核酸の機能を阻害する標的となる配列中におけるリボザイムにより切断可能な配列とその隣接の両側の６〜９ヌクレオチドとを有する認識配列に相補的なリボザイムであることが望ましい。また、前記リボザイムは、例えば、ｔＲＮＡの構造を正しく形成し、構造が安定であり、標的となるｍＲＮＡにおいて、ステム構造を形成しない核酸であることが望ましい。
【００４６】
なお、前記被検物質は、
ａ）プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と結合する物質をスクリーニングするステップ、
ｂ）前記ステップａ）で得られた物質を、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下に、カスパーゼ−４に接触させ、産物を得るステップ、及び
ｃ）前記ステップｂ）で得られた産物のカスパーゼ−４による切断部位に基づき、該産物の切断部位周辺を含む誘導体として被検物質を作製するステップ、
を行なうことにより得られた物質であってもよい。
【００４７】
前記ステップａ）において、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と結合する物質のスクリーニングは、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、共免疫沈降法、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法、共鳴プラズモン相互作用解析等により行なわれうる。
【００４８】
前記ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法は、例えば、
１）  プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４をコードする核酸を、ｐｒｅｙベクターに組込み、ｐｒｅｙプラスミドを得るステップ、
２）  得られたｐｒｅｙプラスミドを酵母（EGY48(p8op lacZ)）に導入して、ｐｒｅｙプラスミド保持クローンを得るステップ、
３）  被検物質（ポリペプチド）をコードする核酸を、ｂａｉｔベクターに組込み、ｂａｉｔプラスミドを得るステップ、
４）  ステップ３）で得られたｂａｉｔプラスミドを、前記ステップ２）で得られたｐｒｅｙプラスミド保持クローンに導入し、クローンを得るステップ、及び
５）  前記ステップ４）で得られたクローンを、ロイシン欠失プレート上で３日間培養し、酵母細胞内における該被検物質（ポリペプチド）とプロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４との結合能をロイシン欠失プレート上でのコロニー形成能により評価するステップ、
により行なわれる。かかる方法では、ロイシン欠失プレート上でコロニーが形成されることを、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と被検物質（ポリペプチド）とが結合することの指標として用いて評価される。
【００４９】
前記共免疫沈降法は、例えば、
１）  シグナル配列の下流にＦＬＡＧ配列を有する被検物質（ポリペプチド）を発現する被検物質（ポリペプチド）−ＦＬＡＧ発現プラスミドを得るステップ、
２）  Ｎ末端側にＨＡ配列を有するプロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４を発現しうるＨＡ−（プロ）カスパーゼ−４発現プラスミドを得るステップ、
３）  細胞に、前記ステップ１）で得られた被検物質（ポリペプチド）−ＦＬＡＧ発現プラスミドと前記ステップ２）で得られたＨＡ−（プロ）カスパーゼ−４発現プラスミドとを、一過的にコトランスフェクトして、コトランスフェクタントを得るステップ、
４）  前記ステップ３）で得られたコトランスファクタントを培養して、培養細胞を得るステップ、
５）  前記ステップ４）で得られた培養細胞から、細胞抽出物を得るステップ、
６）  前記ステップ５）で得られた細胞抽出物に抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＨＡ抗体を加えて共免疫沈降を行なうステップ、及び
７）  共免疫沈降を、ウエスタンブロット解析により検出するステップ
により行なわれる。かかる方法では、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＨＡ抗体のいずれの場合においても、被検物質（ポリペプチド）−プロカスパーゼ−４又は被検物質（ポリペプチド）−カスパーゼ−４の複合体の沈降がみられることを、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と被検物質（ポリペプチド）とが結合することの指標として用いて評価される。
【００５０】
前記ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法は、例えば、
１）  ＧＳＴとプロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４とからなる融合タンパク質（ＧＳＴ−（プロ）カスパーゼ−４）と、被検物質（ポリペプチド）とを接触させるステップ、
２）  グルタチオンビーズで融合タンパク質を、回収するステップ、及び
３）  抗被検物質（ポリペプチド）抗体を用いたウエスタンブロット解析を行ない、ＧＳＴ−（プロ）カスパーゼ−４と、被検物質（ポリペプチド）との複合体を検出するステップ、
により行なわれる。かかる方法では、ＧＳＴ−（プロ）カスパーゼ−４と被検物質（ポリペプチド）との複合体の存在を、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と被検物質（ポリペプチド）とが結合することの指標として用いて評価される。
【００５１】
前記共鳴プラズモン相互作用解析は、
１）  被検物質又はプロカスパーゼ−４（若しくはカスパーゼ−４）を固定化したチップに、対応して、プロカスパーゼ−４（若しくはカスパーゼ−４）又は被検物質を一定の流速で、送液するステップ、及び
２）  適切な検出手段（例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度など）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳなど））により相互作用を検出するステップ、
により行なわれる。かかる方法では、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と被検物質とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示されることを、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と被検物質とが結合することの指標として用いて評価される。なお、前記共鳴プラズモン相互作用解析は、種々の物質に適用できる点で有利である。
【００５２】
前記プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４は、例えば、カマダ（Ｋａｍａｄａ  Ｓ．）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１５、２８５−２９０（１９９７）、ハナ  ブルチョバ（Ｈａｎａ  Ｂｒｕｃｈｏｖａ）ら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ、４３、１２８９−１２９５（２００２）等に記載の方法で得られうる。
【００５３】
なお、本発明の評価方法では、前記ステップａ）で得られた物質について、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と該物質との結合領域の形状並びに該結合領域及びその近傍に存在するアミノ酸残基の立体座標を側鎖レベルで同定し、同定された結合領域の形状と該結合領域及びその近傍に存在するアミノ酸残基の立体座標とに適合する化合物をデザインしてもよい。
【００５４】
立体座標の側鎖レベルでの同定は、例えば、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４と前記ステップａ）で得られた物質との複合体について、３次元ＮＭＲにより、立体構造を解析すること；該複合体を結晶化させて、得られた結晶について、Ｘ線結晶構造解析法により、立体構造を解析し、重原子置換法、同型置換法、重波長異常分散法、分子置換法等により解析すること等により行なわれうる。また、化合物のデザインは、慣用のコンピュー支援ドラッグデザインにより行なわれうる。
【００５５】
なお、本明細書において、前記「結合領域の近傍に存在するアミノ酸残基」とは、一次構造上の連続したアミノ酸配列における位置関係に限定されるものではなく、アミノ酸残基に対して、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合等に関与する領域範囲内にある残基をいい、結合領域の立体構造において、結合領域に空間的に隣接する残基を意味する。
【００５６】
ついで、前記ステップｂ）において、前記ステップａ）で得られた物質について、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下に、カスパーゼ−４に接触させ、産物を得る。
【００５７】
前記ステップｂ）において、切断産物は、電気泳動、ＨＰＬＣ、ＭＥＬＤ−ＭＡＳＳ、免疫染色（ウエスタンブロッティング）等により検出され得、所望により分取されうる。
【００５８】
その後、前記ステップｃ）において、前記ステップｂ）で得られた産物のカスパーゼ−４による切断部位に基づき、該産物の切断部位周辺を含む誘導体として被検物質を作製する。
【００５９】
前記ステップｃ）において、前記ステップｂ）で得られた産物におけるカスパーゼ−４の切断部位は、産物が、ペプチドである場合、例えば、慣用のエドマン分解法、アミノ末端ペプチダーゼ等による分解と質量分析との組み合わせ等のアミノ酸配列解析法により解析されうる。
【００６０】
前記ステップｂ）で得られた産物の切断部位周辺を含む誘導体は、慣用の合成方法等、例えば、コンビナトリアルケミストリー等により網羅的に作製されうる。
【００６１】
プロカスパーゼ−４を発現する細胞としては、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＹ−５Ｙ細胞、プロカスパーゼ−４をコードする核酸を導入したトランスフェクト細胞等が挙げられる。前記トランスフェクト細胞における宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等が挙げられる。なお、前記ＨＥＫ２９３細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、内因性のカスパーゼ−４を発現しない細胞である。したがって、該ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プロカスパーゼ−４をコードする核酸を導入して得られたトランスフェクト細胞は、カスパーゼ−４を介した動態をより特異的に検出できる点で有利である。
【００６２】
本発明においては、前記プロカスパーゼ−４をコードする核酸を導入したトランスフェクト細胞としては、
Ａ）内因性カスパーゼ−４を実質的に欠損した細胞又は変異により内因性カスパーゼ−４が実質的に機能しない細胞に、プロカスパーゼ−４をコードする核酸を外的に導入することにより得られた細胞、
Ｂ）内因性カスパーゼ−４を保持した細胞に、プロカスパーゼ−４をコードする核酸をさらに外的に導入した細胞、
Ｃ）相同組換え等により内因性カスパーゼ−４をコードする核酸を改変若しくは変異させた細胞であって、プロカスパーゼ−４の機能活性を有する細胞
等が挙げられる。前記Ａ）〜Ｃ）の細胞においては、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４をコードする核酸は、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４を適切な融合パートナー、例えば、ＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、フラッグタグ、ポリヒスチチジンタグ等との融合タンパク質として発現させうるような改変が加えられた核酸であってもよい。
【００６３】
前記プロカスパーゼ−４をコードする核酸を細胞に導入する場合、該核酸を適切なベクターに作動可能に連結させて得られた発現ベクターを細胞に導入すればよい。ここで、ベクター、細胞への核酸の導入法は、前記と同様であればよい。
【００６４】
小胞体ストレスを引き起こす物質としては、ツニカマイシン、タプシガーギン、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、２−デオキシグルコース等が挙げられる。前記物質を用いて、小胞体ストレスを引き起こさせる場合、例えば、該物質を、最終濃度０．１μＭ以上、好ましくは、１μＭ以上、１００μＭ以下、好ましくは、１０μＭ以下となるように用いればよい。また、本発明においては、小胞体ストレスは、前記物質を用いる代わりに、グルコース飢餓、低酸素曝露（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ、ジチオスレイトール等）、低血清等の条件により引き起こされたものであってもよい。
【００６５】
アミロイド−βを用いる場合、全長のアミロイド−βを用いてもよく、該アミロイド−βの部分ペプチド、例えば、Ａβ25-35等を用いてもよい。前記アミロイド−βは、最終濃度０．１μＭ以上、好ましくは、１μＭ以上、１００μＭ以下、好ましくは、１０μＭ以下となるように用いればよい。なお、本発明においては、前記アミロイド−βと同等の機能を有するペプチド、例えば、６−ヒドロキシドーパミン等の神経毒を用いてもよい。
【００６６】
本明細書において、「被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞との接触」とは、被検物質存在下で細胞を培養又は維持すること、被検物質を細胞内に直接的又は間接的に導入すること等を含む概念を意味する。
【００６７】
被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞との接触は、具体的には、該被検物質が、化合物、ペプチド、ペプチドミミックである場合、例えば、プロカスパーゼ−４を発現する細胞を、被検物質を含有した適切な培地又は緩衝液中で培養又は維持すること等により行なわれうる。被検物質が、ペプチド等の高分子化合物の場合には、マイクロインジェクション法等により、プロカスパーゼ−４を発現する細胞に被検物質を導入することによっても行なわれうる。
【００６８】
前記培地としては、前記細胞を培養又は維持するに適した培地であればよく、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、Ｆ１２等が挙げられる。前記培地は、単独で、又は適切に混合して用いられうる。また、前記培地は、必要に応じて、各種成長因子、血清、抗生物質等を含有していてもよい。被検物質存在下に細胞を培養するための培養気相は、細胞に応じて適宜設定されうる。前記培養気相としては、例えば、３４〜３７℃、０〜５体積％  ＣＯ2等が挙げられる。具体的には、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の場合、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ中、３７℃、５体積％  ＣＯ2で培養すること、ＨｅＬａ細胞の場合、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したＤＭＥＭ中、３７℃、５体積％  ＣＯ2で培養すること、０体積％  Ｏ2、５体積％  ＣＯ2、９５体積％  Ｎ2で低酸素培養すること等が挙げられる。
【００６９】
前記緩衝液としては、ハンクス平衡塩溶液、クレブスリンゲル溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。前記緩衝液は、細胞の生理的生存条件を維持する観点から、ｐＨ７．０以上、好ましくは、ｐＨ７．２以上、より好ましくは、ｐＨ７．４以上であることが望ましく、ｐＨ８．５以下、好ましくは、ｐＨ７．８以下、より好ましくは、ｐＨ７．６以下であることが望ましい。
【００７０】
培養又は維持時間は、アポトーシスを引き起こす条件（例えば、小胞体ストレス、アミロイド−β）、細胞の種類等に応じて適宜設定されうる。具体的には、ツニカマイシンの場合、例えば、６〜７２時間、好ましくは、２４〜４８時間、タプシガーギンの場合、例えば、１〜７２時間、好ましくは、２４〜４８時間であればよい。また、アミロイド−βの場合、例えば、８〜７２時間、好ましくは、８〜２４時間であればよい。
【００７１】
また、被検物質が、ペプチド又はタンパク質の場合、該ペプチド又はタンパク質をコードする核酸を、適切なベクターに作動可能に連結させ、得られた発現ベクターを細胞に導入すればよい。ここで、ベクター、細胞への核酸の導入法等は、前記と同様であればよい。被検物質が、核酸又は核酸アナログの場合、該核酸又は核酸アナログを直接細胞に導入してもよい。前記核酸又は核酸アナログは、適切なベクターに作動可能に連結させ、得られた発現ベクターを介して細胞に導入してもよい。
【００７２】
細胞への被検物質（核酸等）の導入は、前記と同様の遺伝子導入手段により行われうる。なお、被検物質が核酸である場合、該核酸を適切なベクターに連結させて、細胞に導入してもよく、該核酸をそのまま細胞に導入してもよい。用いられるベクターは、前記と同様のベクターであればよい。
【００７３】
また、前記ｓｉＲＮＡを細胞に導入する場合、用いられうるベクターとしては、特に限定されないが、例えば、商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．１．０−Ｕ６（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製）等が挙げられる。
【００７４】
また、本発明の評価方法において、被検物質が、ｓｉＲＮＡである場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｉＲＮＡを合成し、慣用の手法により、細胞に該ｓｉＲＮＡを導入することができる。
【００７５】
なお、本発明の評価方法において、被検物質が、ｓｉＲＮＡである場合、ｓｉＲＮＡの効果は、用いられたｓｉＲＮＡと同じ塩基組成を有するｓｉＲＮＡを陰性対照として用いることにより評価されうる。
【００７６】
リボザイムを、細胞に導入する場合、用いられるベクターとしては、例えば、商品名：ｐｉＧＥＮＥｔＲＮＡ（タカラバイオ社製）等が挙げられる。
【００７７】
前記カスパーゼ−４を介した動態としては、プロカスパーゼ−４の切断によるカスパーゼ−４の生成、クロマチン凝縮、染色体の断片化、細胞縮小、ＭＴＳの放出、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出、カスパーゼ−４の基質から生じる産物の生成等が挙げられる。
【００７８】
前記プロカスパーゼ−４の切断によるカスパーゼ−４の生成は、例えば、細胞から細胞抽出物を調製し、プロカスパーゼ−４に反応し、かつカスパーゼ−４に反応しない抗体と、カスパーゼ−４に反応し、かつプロカスパーゼに反応する抗体とを用い、該細胞抽出物について、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、その他の免疫学的検出方法等を行なうことにより検出されうる。前記クロマチン凝縮は、ＤＮＡに特異的に結合する蛍光色素で染色後、蛍光顕微鏡等で観察することにより検出できる。染色体の断片化は、細胞から染色体含有試料を抽出し、慣用の電気泳動法により泳動することにより、ラダーとして検出されうる。細胞縮小は、細胞のサイズ分布の測定装置、フローサイトメトリー等で測定されうる。ＭＴＳの放出は、慣用の測定キット等により測定できる。具体的には、例えば、ＭＴＳ溶液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）を用い、細胞から放出されたＭＴＳ量を、分光光度計を用いて、４９０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＭＴＳの放出を評価することができる。また、ＴＵＮＥＬ法により細胞の動態を検出することもできる。
【００７９】
本発明の評価方法は、具体的には、例えば、
（１）被検物質と、プロカスパーゼ−４を発現する細胞とを接触させるステップ、
（２）前記ステップ（１）で得られた細胞を、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βの存在下に培養するステップ、及び
（３）前記ステップ（２）を行なった後の細胞について、アポトーシスに特異的な変化を調べるステップ、
を含むプロセス（プロセス１という）、
（Ａ）プロカスパーゼ−４を発現する細胞を、被検物質と、小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βとの存在下に培養するステップ、及び
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）を行なった後の細胞について、アポトーシスに特異的な変化を調べるステップ、
を含むプロセス（プロセス２という）等により行なわれうる。前記プロセス１においては、ステップ（２）の前後における細胞について、アポトーシスに特異的な変化として、細胞におけるカスパーゼ−４を介した動態が評価され、前記プロセス２においては、ステップ（Ａ）の後、アポトーシスに特異的な変化として、経時的に、細胞におけるカスパーゼ−４を介した動態が評価される。
【００８０】
前記アポトーシスに特異的な変化としては、クロマチン凝縮、染色体の断片化、細胞縮小、ＭＴＳの放出、ＬＤＨの放出等が挙げられる。
【００８１】
また、本発明の評価方法においては、さらに、カスパーゼ−４の基質の存在下に、被検物質の存在により引き起こされる動態の変化の有無を調べてもよい。
【００８２】
本発明の評価方法によれば、Ｉ）プロカスパーゼ−４の発現を阻害する物質、プロカスパーゼ−４と基質との結合を阻害する物質、プロカスパーゼ−４の切断を阻害し、それにより、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスを阻害する物質、II）プロカスパーゼ−４に作用して、カスパーゼ−４の生成を促進し、それにより、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスを引き起こす物質等が評価されうる。
【００８３】
前記Ｉ）の物質は、本発明の評価方法により、例えば、当該物質の非存在下では、プロカスパーゼ−４が切断され、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスを引き起こすが、当該物質の存在下では、プロカスパーゼ−４の切断が、実質的に阻害又は減少し、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスを実質的に引き起こさないか、あるいは減少させることを指標として評価されうる。
【００８４】
また、前記II）の物質は、本発明の評価方法により、例えば、当該物質の非存在下の場合に比べ、当該物質の存在下において、プロカスパーゼ−４の切断が増加し、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスの発生が増加することを指標として評価されうる。前記II）の物質は、例えば、癌（慢性骨髄性白血病等）の治療にも有用である。
【００８５】
なお、本発明の評価方法においては、プロカスパーゼ−４の切断、カスパーゼ−４を介したアポトーシス、被検物質の作用等が、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに特異的であるかどうかは、小胞体ストレスを引き起こす物質、アミロイド−β若しくはそれと同等の神経毒以外の物質、例えば、エトポシド、スタウロスポリン等による動態又は小胞体ストレスを引き起こさない条件、例えば、ＵＶ照射等による動態を対照として評価すればよい。
【００８６】
また、本発明の評価方法には、アポトーシスのシグナル伝達におけるカスパーゼ−４の作用の細胞内での阻害又は促進を指標として評価する態様も含まれる。この場合、カスパーゼ−４の作用としては、システインプロテアーゼ活性等が挙げられる。
【００８７】
本発明の他の側面は、１）プロカスパーゼ−４を発現する細胞と、
２）小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βと、
３）被検物質と該細胞との接触に適した試薬と
を含有した、本発明の評価方法を行なうための、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の評価用キットである。
【００８８】
本発明の評価用キットは、前記１）〜３）を含有しているため、本発明の評価用キットによれば、迅速に、簡便に、再現性よく、かつ精度よく、本発明の評価方法により、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質を評価することができる。また、本発明の評価用キットは、前記１）〜３）を含有しているため、本発明の評価用キットによれば、生体における状態をより反映させて、本発明の評価方法を行なうことができる。
【００８９】
本発明の評価用キットにおいて、前記１）プロカスパーゼ−４を発現する細胞は、該細胞を維持するに適した培地中に保存された状態であってもよい。前記培地としては、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、αＭＥＭ、Ｆ１２等が挙げられる。
【００９０】
本発明の評価用キットにおいて、前記２）の小胞体ストレスを引き起こす物質又はアミロイド−βは、粉末状、液状等のいずれの形態であってもよく、該物質又はアミロイド−βを保存するに適した溶液、例えば、緩衝液等中に保存された状態であってもよい。前記緩衝液としては、リン酸緩衝化食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。かかる緩衝液は、細胞の生理的生存条件を維持する観点及び前記物質又はアミロイド−βの生物学的活性を維持する観点から、ｐＨ７．０以上、好ましくは、ｐＨ７．２以上、より好ましくは、ｐＨ７．４以上であることが望ましく、ｐＨ８．５以下、好ましくは、ｐＨ７．８以下、より好ましくは、ｐＨ７．６以下であることが望ましい。
【００９１】
前記３）の被検物質と該細胞との接触に適した試薬としては、前記培地、前記緩衝液等が挙げられる。
【００９２】
なお、本発明の評価用キットは、本発明の評価方法を行なうのに適した希釈律の細胞量又は本発明の評価方法を行なうのに適した希釈律の小胞体ストレスを引き起こす物質若しくはアミロイド−βの量となるように予め分注された試薬群としても提供されうる。
【００９３】
本発明の評価用キットは、培養に適した容器、細胞抽出物の調製用試薬等をさらに含有してもよい。
【００９４】
本発明の別の側面は、本発明の評価方法により評価された物質であって、かつ小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質を有効成分として含有した、医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質を有効成分として含有しているため、本発明の医薬組成物によれば、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患又はその進行を阻害することが可能になる。したがって、アポトーシスのシグナル伝達において、カスパーゼ−４による作用が、疾患の発症又は進行に役割を果たす場合、本発明の医薬組成物は、特に有用である。
【００９５】
前記「小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患」としては、てんかん；神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型痴呆、大脳皮質基低核変性病、ハンチントン病等；虚血性疾患、例えば、脳虚血、心筋梗塞、脳卒中等；Ｉ型糖尿病等が挙げられる。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、具体的には、本発明の評価方法により得られた前記Ｉ）、II）等の物質を有効成分として含有する。
【００９７】
本発明の医薬組成物の有効成分が、前記Ｉ）の物質である場合、かかる医薬組成物は、例えば、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳虚血、前頭側頭型痴呆、大脳皮質基低核変性症、ハンチントン病等に適用されうる。
【００９８】
前記I)の物質としては、上記被検物質から、本発明の評価方法を用いて得られる物質であり、例えば、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４に特異的なｓｉＲＮＡ、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、プロカスパーゼ−４又はカスパーゼ−４をコードする核酸に対するリボザイム等が挙げられる。
【００９９】
前記ｓｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、具体的には、配列番号：３に示される配列からなる核酸と配列番号：４に示される配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸、配列番号：５に示される配列からなる核酸と配列番号：６に示される配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸等が挙げられる。
【０１００】
また、本発明の医薬組成物の有効成分が、前記II）の物質である場合、本発明の医薬組成物は、例えば、ウイルス感染、癌等に適用されうる。この場合、本発明の医薬組成物は、好ましくは、前記II）の物質を、適用部位、例えば、ウイルス感染部位、癌組織等へ送達するに適した成分をさらに含有していることが望ましい。前記II）の物質を適用部位へ送達するに適した成分としては、例えば、適用部位に特異的に発現する因子に対するリガンド、レセプター、抗体等が挙げられる。
【０１０１】
本発明の医薬組成物の有効成分は、個体、器官、局所部位、組織等に導入するに適した薬学的に許容されうる担体に保持させてもよい。
【０１０２】
本発明の医薬組成物は、適用対象となる疾患又は適用対象となる個体、器官、局所部位若しくは組織に応じて、他の助剤をさらに含有していてもよい。具体的には、有効成分が、核酸、核酸アナログ、ペプチド又はペプチドミミックである場合、有効成分の効果を発現させる対象となる部位に到達するまでの間に、該核酸、核酸アナログ、ペプチド又はペプチドミミックの分解を抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を含有してもよい。
【０１０３】
本発明の医薬組成物中の有効成分の含有量は、治療上有効量であればよく、有効成分となる物質の種類、適用対象となる個体、該個体の体重、該個体の年齢等により適宜設定されうる。具体的には、有効成分が、核酸である場合、前記有効成分の含有量は、活性、溶解性、吸収性、生物学的半減期等の観点から、１日あたり、約０．００１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは、約０．００５ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ以上であり、約２．０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは、約１．０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇ以下であることが望ましい。また、有効成分が、ペプチド又はペプチドミミックである場合、前記有効成分の含有量は、活性、溶解性、吸収性、生物学的半減期等の観点から、１日あたり、約０．００１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは、約０．００５ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ以上であり、約２．０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは、約１．０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇ以下であることが望ましい。さらに、有効成分が、前記核酸とペプチドとを除く化合物である場合、前記有効成分の含有量は、活性、溶解性、吸収性、生物学的半減期等の観点から、１日あたり、約０．００１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは、約０．００５ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ以上であり、約２．０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは、約１．０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは、約０．５ｍｇ／ｋｇ以下であることが望ましい。
【０１０４】
本発明の医薬組成物の投与形態及び投与量は、有効成分の種類、適用対象となる疾患、適用対象となる個体、器官、局所部位、組織、適用対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、局所投与；皮下注射；筋肉内注射；静脈内注射；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等による経口投与等が挙げられる。
【０１０５】
また、本発明の医薬組成物の有効成分が、核酸成分である場合、該医薬組成物を、有効成分の核酸を保持したウイルスベクター又はリポソームとして、直接体内に導入してもよく、適用対象の個体等のある種の細胞に、体外で導入し、得られた細胞を体内に戻すことにより該医薬組成物を体内に導入してもよい。具体的には、例えば、アルツハイマー病等の場合、本発明の医薬組成物を脳内の特定の部位に局所注入すること、アストロサイト等の細胞に本発明の医薬組成物を導入し、得られた細胞を脳内に移植すること等により投与されうる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物の効果の評価は、例えば、本発明の医薬組成物の投与及び非投与の前記疾患に対するモデル動物（例えば、β−アミロイド脳室内投与モデル、中大脳動脈閉塞モデル、６−ヒドロキシドーパミンパーキンソンモデル）、ヒトカスパーゼ−４をコードする核酸を導入したノックイン動物等において、非投与動物に比べ、投与動物において、疾患の症状の軽減又は治癒、病理学的特徴の減少又は消滅等が見られた場合を指標とすること等により行なわれうる。
【０１０７】
本発明のさらに別の側面は、本発明の評価方法により評価された物質であって、かつ小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質を、前記小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患に罹患した個体に投与する、該疾患の治療又は予防方法に関する。本発明の治療又は予防方法においては、前記「本発明の評価方法により評価された物質であって、かつ小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質」が用いられているため、かかる治療又は予防方法によれば、小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患に対し、特にカスパーゼ−４の作用に基づく治療又は予防が可能になる。
【０１０８】
前記「本発明の評価方法により評価された物質であって、かつ小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質」の投与量は、治療上有効量であればよく、前記医薬組成物の場合と同様に適宜設定されうる。また、前記物質の投与形態も、前記医薬組成物の場合と同様である。
【０１０９】
本発明の治療又は予防方法の治療又は予防効果は、適用対象の個体における疾患に特徴的な事象の減少、学習能力低下等を指標として評価されうる。例えば、アルツハイマー病の場合、本発明の治療又は予防方法を適用することにより、個体における変性神経細胞の発生の減少等、学習障害の遅延、痴呆進行度の減少（停滞）等が見られた場合、前記治療又は予防効果が見られたことの指標となる。また、脳虚血の場合、虚血部位の縮小、麻痺の改善等が見られた場合、効果が見られたことの指標となる。
【０１１０】
さらに、本発明の別の側面は、前記小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患に罹患した個体に投与して、該疾患を治療又は予防するための医薬の製造のための、本発明の評価方法により評価された物質であって、かつ小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに作用しうる物質の使用に関する。
【０１１１】
また、本発明の他の側面は、プロカスパーゼ−４の切断により生じるカスパーゼ−４の増加若しくは減少又はカスパーゼ−４の生体内基質から生じる反応産物の増加若しくは減少に基づく、前記小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患の診断方法に関する。なお、かかる診断方法は、前記小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患に罹患した個体に由来する試料の検出方法にも応用されうる。
【０１１２】
本発明の診断方法は、例えば、
１．  プロカスパーゼ−４に反応しないが、カスパーゼ−４には反応する抗体若しくはその抗体断片及び／又はプロカスパーゼ−４に反応するが、カスパーゼ−４には反応しない抗体若しくはその抗体断片を用いて、プロカスパーゼ−４の切断により生じるカスパーゼ−４について、疾患が発生しうる組織又は器官に由来する試料における増加若しくは減少を検出すること、
２．  カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物に反応する抗体を用いて、カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物について、疾患が発生しうる組織又は器官に由来する試料における増加若しくは減少を検出すること、
３．  カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物をコードする核酸に特異的に結合する核酸を用いて、疾患が発生しうる組織又は器官に由来する試料から抽出された核酸含有試料について、カスパーゼ−４の生体内基質から生じる反応産物をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ等の増加又は減少を検出すること、
等により行われうる。ここで、正常個体の場合に比べ、診断対象の個体の場合において、プロカスパーゼ−４の切断により生じるカスパーゼ−４、該カスパーゼ−４をコードする核酸、カスパーゼ−４の生体内基質から生じる反応産物、該反応産物をコードする核酸等の量が有意に変化したことが、該試験対象の個体が、胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患に罹患している可能性があることの指標となる。
【０１１３】
前記試料としては、個体、具体的には、例えば、痴呆患者、パーキンソン病患者等由来の滲出液、血液、組織生検、脳脊髄液等が挙げられる。
【０１１４】
前記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。さらに、本発明においては、前記抗体は、公知技術によって修飾された抗体や抗体の誘導体、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体等であってもよい。また、前記抗体断片としては、前記抗体を、ペプチダーゼ、例えば、パパイン、ペプシン等で消化することにより得られる産物であればよい。前記抗体断片としては、例えば、モノクローナル抗体を、パパインで消化することにより得られるＦａｂフラグメント、モノクローナル抗体を、ペプシンで消化することにより得られるＦ（ａｂ’）2フラグメント等が挙げられる。前記抗体は、例えば、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法により、容易に作製され得る。なお、抗体作製時における動物の免疫には、プロカスパーゼ−４、カスパーゼ−４、プロカスパーゼ−４に存在するが、カスパーゼ−４には存在しない領域からなるペプチド、カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物等を用いればよい。また、前記抗体は、遺伝子工学的に作製することもできる。さらに、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等によって処理することにより、抗体の断片が得られる。本発明に用いられる抗体又はその断片は、酵素、蛍光物質、放射性物質等により標識されていてもよい。
【０１１５】
前記プロカスパーゼ−４に反応しないが、カスパーゼ−４には反応する抗体、又はその抗体断片と、プロカスパーゼ−４に反応するが、カスパーゼ−４には反応しない抗体、又はその抗体断片とは、例えば、プロカスパーゼ−４、カスパーゼ−４、プロカスパーゼ−４に存在するが、カスパーゼ−４には存在しない領域からなるペプチド等を用いて、ＥＬＩＳＡ、オクタロニー法等を行ない、プロカスパーゼ−４とカスパーゼ−４とに対する交差反応性を調べることにより評価される。
【０１１６】
また、カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物に反応する抗体は、該反応産物等を用いて、ＥＬＩＳＡ、オクタロニー法等を行ない、該反応産物に対する反応性を調べることにより、評価される。
【０１１７】
本発明の診断方法において、抗体又は抗体断片を用いる場合、例えば、ウエスタンブロッティング法、抗体カラム法、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法等の方法により、カスパーゼ−４又は前記反応産物の量を検出すればよい。
【０１１８】
前記核酸は、例えば、カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物をコードする核酸の塩基配列等において、既知配列に対する配列同一性が低い配列、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づき、前記と同様のパラメーター値で、参照配列に対して適切にアライメントされて、算出された配列同一性が、好ましくは、１５％以下、より好ましくは、１０％以下、さらに好ましくは、５％以下、よりさらに好ましくは、０％である配列に基づきデザインされうる。なお、本発明の診断方法に用いられる核酸は、反応産物をコードする核酸又はその一部を特異的に増幅するプライマー対（すなわち、カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物をコードする核酸の塩基配列において、既知配列に対する配列同一性が低い配列を特異的に増幅しうるプライマー対）等であってもよい。
【０１１９】
ここで、前記プライマーの鎖長は、特に限定されないが、例えば、好ましくは、連続した少なくとも１０ヌクレオチド長、さらに好ましくは、連続した１０〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは、連続した１５〜２５ヌクレオチド長であることが望ましい。
【０１２０】
本発明の診断方法において、核酸を用いる場合、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析、ＤＮＡアレイによるハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等により、定量的に、カスパーゼ−４をコードする核酸又は前記反応産物をコードする核酸を検出すればよい。
【０１２１】
また、本発明によれば、前記プロカスパーゼ−４に反応しないが、カスパーゼ−４には反応する抗体若しくはその抗体断片、前記プロカスパーゼ−４に反応するが、カスパーゼ−４には反応しない抗体若しくはその抗体断片、前記カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物に反応する抗体、プロカスパーゼ−４をコードする核酸に特異的に結合し、かつカスパーゼ−４をコードする核酸に結合しない核酸、プロカスパーゼ−４とカスパーゼ−４との間で相違する領域を特異的に増幅するプライマー対、カスパーゼ−４の作用により生体内基質から生じる反応産物をコードする核酸に特異的に結合する核酸及び反応産物をコードする核酸又はその一部を特異的に増幅するプライマー対からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有した、前記小胞体ストレス誘導性及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスにより引き起こされる疾患の診断用キットも提供されうる。
【０１２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２３】
各種ヒトＤＮＡライブラリーについて、小胞体ストレス誘導性アポトーシスを引き起こす因子をスクリーニングしたところ、ヒト大腸ｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）において、候補となる因子をコードする核酸が見出された。また、前記核酸は、マウスカスパーゼ−１２遺伝子の部分配列に相同的な配列を有していることがわかった。
【０１２４】
その後、得られた核酸について、配列を解析した。その結果、前記核酸は、ヒトカスパーゼ−４をコードする核酸として同定された。すなわち、前記カスパーゼ−４の発現量がカスパーゼ−５の発現量よりも低い大腸のｃＤＮＡライブラリーから見出されたにもかかわらず、意外にも、マウスカスパーゼ−１２と同様な作用を示す因子の存在が見出された。
【０１２５】
ついで、前記ヒトカスパーゼ−４の細胞における局在を調べた。
【０１２６】
ミトコンドリアを染色しうる商品名：Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（モレキュラープローブ社製）の存在下又は非存在下、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ2で２０分間培養した。また、同様に、ヒト癌ＨｅＬａ細胞を、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したＤＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中、３７℃、５体積％  ＣＯ2で２０分間培養した。
【０１２７】
培養後のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨｅＬａ細胞を、それぞれ、４重量％  パラホルムアルデヒドを含有した０．１Ｍ  リン酸緩衝液中、４℃で２時間維持して、固定した。
【０１２８】
ついで、固定後の細胞を、抗ヒトカスパーゼ−４モノクローナル抗体（商品名：４Ｂ９，ＭＢＬ医学生物研究所製）とともに、小胞体マーカーであるＧＲＰ７８とＧＲＰ９４との両方を検出することができる抗ヒトＫＤＥＬモノクローナル抗体（１０Ｃ３，ストレスゲン（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）社製）の存在下又は非存在下にインキュベーションした。前記細胞のそれぞれを、ＦＩＴＣ結合抗ヤギＩｇＧ抗体（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）社製）又はＡｌｅｘａ５８８結合抗マウスＩｇＧ抗体（モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製）とともにインキュベーションした。その後、染色された細胞を、共焦点顕微鏡（商品名：ＬＳＭ５１０、カールツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）社製）で、内因性カスパーゼ−４の細胞局在を観察した。結果を図１のパネルａ〜パネルｌに示す。
【０１２９】
また、生細胞におけるカスパーゼ−４の局在を決定するために、ＨｅＬａ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＦＰ−タグプラスミド（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）にサブクローン化されたカスパーゼ４をコードする核酸をトランスフェクションした。２４時間後、トランスフェクト細胞を、商品名：ＥＲ−ｔｒａｃｋｅｒとともに３０分間インキュベーションし、その後、蛍光顕微鏡下に観察した。結果を図１のパネルｍ〜パネルｏに示す。
【０１３０】
その結果、図１のパネルａ〜パネルｃに示されるように、カスパーゼ−４に対する免疫反応が、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４等の小胞体マーカーに対する免疫反応と厳密に共局在することがわかる。しかしながら、前記結果は、図１のパネルｄ〜パネルｆに示されるように、商品名：Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒによる染色の結果とは一致しないことがわかる。また、図１のパネルｇ〜パネルｌに示されるように、ＨｅＬａ細胞を用いた場合にも、同様の結果が得られた。
【０１３１】
一方、ＧＦＰと融合させたカスパーゼ−４は、ＨｅＬａ細胞で過剰発現させて、生細胞における細胞局在を見た場合、図１のパネルｍ〜パネルｏに示されるように、多くのカスパーゼ−４／ＧＦＰ融合タンパク質由来の蛍光シグナルが、商品名：ＥＲ−ｔｒａｃｋｅｒ由来のものと重複することがわかる。これらの結果により、カスパーゼ−４は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨｅＬａ細胞の両方において、ミトコンドリアよりも小胞体に優先的に局在することがわかる。
【実施例２】
【０１３２】
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、ツニカマイシン（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製）、タプシガーギン（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製）、エトポシド（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製）、スタウロスポリン（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製）、ＵＶ等の各種アポトーシスインデューサーで処理し、カスパーゼ−４の変化を評価した。具体的には、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ２の条件下、小胞体ストレスインデューサーであるツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）又はタプシガーギン（０．５μＭ）への曝露、非小胞体ストレスインデューサーであるエトポシド（１００μＭ）若しくはスタウロスポリン（０．１μＭ）への曝露及び１５０Ｊ／ｍ２  ＵＶ照射のいずれかにより、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を処理した。なお、ツニカマイシン、タプシガーギン及びエトポシドへの曝露は、１６又は２４時間、スタウロスポリンへの曝露は、８時間、ＵＶ照射は、８時間とした。
【０１３３】
その後、得られた細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、回収した。得られた細胞を、０．５重量％  ＮＰ−４０（商品名：Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）を含有したＴＮＥ緩衝液（組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド）を用いて、溶解させ、細胞抽出物を得た。等量の細胞抽出物（１５μｇタンパク質相当量）を、１２重量％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲル上のタンパク質を、ＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）に転写した。前記膜を、５重量％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により、ブロックした。得られた膜を、一次抗体（抗カスパーゼ−４抗体、抗カスパーゼ−３抗体、抗カスパーゼ−７抗体又は抗β−アクチン抗体）とともにインキュベーションし、ついで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともにインキュベーションした。その後、商品名：ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）により、カスパーゼ−４、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７又はβ−アクチンを検出した。
【０１３４】
また、前記と同様に、各種アポトーシスインデューサーにより処理したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞について、位相差顕微鏡下に、細胞の形態学的変化を評価した。同様に処理したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞について、１０μＭ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で細胞を染色した。ついで、染色後の細胞について、蛍光顕微鏡下に、核形態変化を評価した。細胞が、形態学的変化を示し、核が形態学的変化を示すことを指標として、細胞死を検出した。少なくとも５００細胞をカウントし、３回の独立した実験から、平均値±ＳＥＭとして、データを表わし、Ｐ値を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定で算出した。
【０１３５】
さらに、前記と同様に処理した細胞を、ＭＴＳ溶液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）とともに、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、分光光度計を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定することにより、生存細胞から放出されたＭＴＳ量を定量した。結果を、上記したように、対照における死細胞に対する処理後の死細胞の割合（％）として表わした。結果を図２のパネルＡに示す。
【０１３６】
その結果、図２のパネルＡに示されるように、小胞体ストレスインデューサーであるツニカマイシン又はタプシガーギンにより、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を処理した場合、プロカスパーゼ−４の切断が誘導されることがわかる。
【０１３７】
一方、図２のパネルＡに示されるように、エトポシド、スタウロスポリン、ＵＶ等の非小胞体ストレスインデューサーによる細胞死の程度は、ツニカマイシン及びタプシガーギンそれぞれによる細胞死の程度と類似するが、細胞を前記非小胞体ストレスインデューサーに曝露した場合、プロカスパーゼ−４は、切断されないことがわかる。
【０１３８】
また、図２のパネルＡに示されるように、アポトーシス刺激にもかかわらず、前記プロカスパーゼ−４の場合と同条件下、カスパーゼ−７の切断が観察された。
【０１３９】
これらの結果により、カスパーゼ−４が、小胞体ストレスを誘導するアポトーシス刺激により特異的に活性化されるが、小胞体ストレスを引き起こさない他の刺激により特異的に活性化されないことが示唆される。
【０１４０】
ついで、アミロイド−β（Ａβ）（シグマアルドリッチ社製）若しくはその部分ペプチド又はそれらの誘導体ペプチドによる処理後のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるカスパーゼ−４の切断を調べた。
【０１４１】
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ2の条件下、２５μＭ  Ａβ25-35、５μＭ  Ａβ１-40、２５μＭ  Ａβ35-25又は５μＭ  Ａβ40-1とともにインキュベーションした。その後、前記と同様に、細胞抽出物中のカスパーゼ−４、カスパーゼ−７またはβ−アクチンを検出した。結果を図２のパネルＢ及び図２のパネルＣに示す。
【０１４２】
その結果、図２のパネルＢに示されるように、２５μＭ  アミロイド−β（Ａβ）25-35又は５μＭ  Ａβ1-40とともに細胞をインキュベーションした場合、カスパーゼ−４の切断が観察された。対照的に、図２のパネルＣに示されるように、アミノ酸配列の方向が逆のペプチド（それぞれ、Ａβ35-25又はＡβ40-1）とともに細胞をインキュベーションした場合、カスパーゼ−４の切断が観察されなかった。これらの結果により、カスパーゼ−４が、小胞体ストレス誘導性アポトーシスに似た神経毒のＡβ処理により活性化されることが示される。
【実施例３】
【０１４３】
慣用の方法で、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＢｃｌ−２（イワハシ（Ｉｗａｈａｓｈｉ，Ｈ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，４１３−４１７（１９９７））でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を安定的にトランスフェクトした。ついで、得られた細胞を、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ２で培養して、Ｂｃｌ−２を過剰発現させた。同様に、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＢｃｌ−２でＨｅＬａ細胞を安定的にトランスフェクトした。ついで、得られた細胞を、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したＤＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ2で４８時間培養して、Ｂｃｌ−２を過剰発現させた。なお、対照として、商品名：ｐＣＡＧＧＳ（ニワ（Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｎｉｗａ）ら、Ｇｅｎｅ、１０８、１９３−２００（１９９１））で、前記と同様に、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨｅＬａ細胞を安定的にトランスフェクトした。
【０１４４】
得られた各トランスフェクタントを、ツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）存在下又は非存在下に、１６時間インキュベーションした。その後、得られた細胞から、前記実施例２と同様に、細胞抽出物を調製し、該細胞抽出物を、１２重量％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲル上のタンパク質を、ＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）に転写した。前記膜を、５重量％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により、ブロックした。得られた膜を、一次抗体（抗カスパーゼ−４抗体、又は抗Ｂｃｌ−２抗体（カタログ番号１００、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製））とともにインキュベーションし、ついで、ＨＲＰ結合二次抗体とともにインキュベーションした。その後、商品名：ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム−ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）により、カスパーゼ−４又はＢｃｌ−２を検出した。結果を図３のパネルＡに示す。
【０１４５】
また、前記トランスフェクタントのそれぞれを、ツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で３０時間処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。結果を図３のパネルＢに示す。
【０１４６】
その結果、アポトーシスによる核形態変化は、図３のパネルＢに示されるように、ベクターを導入した細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨｅＬａ細胞）を、ツニカマイシンにより３０時間処理することにより誘導されるが、かかる変化は、Ｂｃｌ−２の過剰発現により完全に抑制されることが分かる。したがって、下流のアポトーシスシグナル伝達経路は、これらの抗アポトーシスタンパク質の過剰発現により細胞において、働いていないことが示される。
【０１４７】
しかしながら、ツニカマイシン処理後１６時間におけるカスパーゼ−４の切断は、図３のパネルＡに示されるように、Ｂｃｌ−２の過剰発現によりわずかに影響を受けるに過ぎなかった。これらの結果により、カスパーゼ−４の大部分が、小胞体ストレス誘導細胞死の間におけるエフェクターカスパーゼの活性化の前に活性化されることが示唆される。
【０１４８】
なお、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＢｃｌ−XL（タガミ（Ｔａｇａｍｉ，Ｓ．）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，５７３６−５７４６（２０００））を用いて、前記ｐＣＡＧＧＳ−ｈＢｃｌ−２の場合と同様に、Ｂｃｌ−XL過剰発現によるカスパーゼ−４の切断及び核形態変化への影響を調べた。その結果も、前記Ｂｃｌ−２の場合と同様であった。
【０１４９】
したがって、カスパーゼ−４の切断が、他のカスパーゼにより活性化された下流のミトコンドリア経路によるものではないことが示唆される。
【実施例４】
【０１５０】
カスパーゼ−４に対するｓｉＲＮＡ、又は対照としてＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを用い、カスパーゼ−４が、小胞体ストレス誘導細胞死に必要であるかどうかを調べた。アニールさせた二本鎖ｓｉＲＮＡ（ダルマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）社製）を、カスパーゼ−４遺伝子又はＧＦＰ遺伝子の発現を減少させるために用いた。前記アニールさせた二本鎖ｓｉＲＮＡは、カスパーゼ−４について、
5'-AAGUGGCCUCUUCACAGUCAUdTdT-3'（配列番号：３（センス））と、
5'-AAAUGACUGUGAAGAGGCCACdTdT-3'（配列番号：４（アンチセンス））とからなるｓｉＲＮＡ−ａ、及び
5'-AAGAUUUCCUCACUGGUGUUUdTdT-3'（配列番号：５（センス））
5'-AAAAACACCAGTGAGGAAATCdTdT-3'（配列番号：６（アンチセンス））とからなるｓｉＲＮＡ−ｂであり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）について、
5'-PGGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3'（配列番号：７（センス））と、
5'-PUGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3’（配列番号：８（アンチセンス））とからなるｓｉＲＮＡである。
【０１５１】
なお、前記配列番号：３〜８に示される配列は、ＢＬＡＳＴサーチ（ＮＣＢＩ、２００４年５月１９日付更新データ）により、カスパーゼ−４遺伝子又はＧＦＰ遺伝子以外の遺伝子に顕著に相同的でない配列である。
【０１５２】
商品名：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）を用いて、製造者のプロトコールにしたがい、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）が入った２４ウェルプラスチックプレート（ヌンク社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ２、５０％のコンフルエンスのＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、前記ｓｉＲＮＡ  １．０μｇを導入した。培地を換えることなく、トランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、３７℃で６０時間培養した。
【０１５３】
培養後のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、４重量％  パラホルムアルデヒドを含有した０．１Ｍ  リン酸緩衝液中、４℃で２時間維持して、固定した。ついで、固定後の細胞を、前記抗ヒトカスパーゼ−４  モノクローナル抗体、又は対照として、前記抗β−アクチン抗体とともにインキュベーションし、前記細胞を、Ａｌｅｘａ５８８結合抗マウスＩｇＧ抗体（モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製）とともにインキュベーションした。その後、染色された細胞中における内因性カスパーゼ−４を、共焦点顕微鏡（商品名：ＬＳＭ５１０、カールツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）社製）で観察して、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）の効率を評価した。結果を、図４のパネルＡに示す。
【０１５４】
その結果、図４のパネルＡに示されるように、トランスフェクト細胞においては、カスパーゼ−４に対するｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後６０時間のインキュベーションにより、カスパーゼ−４の量が、実質的に減少するが、非トランスフェクト細胞と比べて、カスパーゼ−４の免疫反応性が、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションにより影響を受けないことがわかる。
【０１５５】
また、前記培養後のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ２の条件下、０．５μＭ  タプシガーギンの存在下又は非存在下に４０時間インキュベーションした。インキュベーション後に得られたタプシガーギン処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞から、実施例２と同様に、細胞抽出物を得、該細胞抽出物（１０μｇタンパク質相当量）を、１２重量％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲル上のタンパク質を、ＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）に転写した。前記膜を、５重量％  ＢＳＡにより、ブロックした。得られた膜を、一次抗体（抗カスパーゼ−４抗体、又は抗β−アクチン抗体（カタログ番号１００、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製））とともにインキュベーションし、ついで、ＨＲＰ結合二次抗体とともにインキュベーションした。その後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム−ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）により、カスパーゼ−４又はβ−アクチンを検出した。結果を図４のパネルＢに示す。
【０１５６】
その結果、図４のパネルＢに示されるように、カスパーゼ−４の量が、カスパーゼ−４に対するｓｉＲＮＡにより減少することがわかる。また、図４のパネルＢに示されるように、タプシガーギンによる２４時間の処理は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞よりも、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞において、カスパーゼ−４の切断が、より低レベルであることがわかる。
【０１５７】
さらに、前記タプシガーギン処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の形態学的変化を観察することにより、ｓｉＲＮＡでカスパーゼ−４レベルを減少させた場合の細胞における小胞体ストレス誘導性アポトーシスを調べた。その結果を、図４のパネルＣに示す。
【０１５８】
形態学的変化に基づき、細胞死を評価した結果、図４のパネルＣのｃに示されるように、非トランスフェクト細胞の約６０％が、タプシガーギンによる４０時間の処理により死に至ることがわかる。なお、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞における細胞死は、対照(ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞）における細胞死の場合とは、有意に異なる（ｐ＜０．０１）。
【０１５９】
また、図４のパネルＣに示されるように、細胞死の程度は、ＧＦＰに対するｓｉＲＮＡによるトランスフェクションにより影響を受けないが、細胞の約３０％のみが、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされ、タプシガーギンによる同じ刺激に曝露された後、死に至ることがわかる。
【０１６０】
図４のパネルＢに示される切断されたカスパーゼ−４の量は、図４のパネルＣに示される細胞死の程度とよく相関関係を示した。したがって、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、細胞死が不完全に阻害されたことは、おそらく、カスパーゼ−４の残存活性によるものであると考えられる。これらの結果は、カスパーゼ−４の発現を減少した細胞は、小胞体ストレス誘導細胞死に対して、より耐性になることを示す。
【０１６１】
さらに、前記タプシガーギン処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及び当該ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と同様の条件でタプシガーギン処理したＨｅＬａ細胞について、前記実施例２と同様に、細胞から放出されたＭＴＳ量を定量した。その結果を図４のパネルＤ（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）及び図４のパネルＥ（ＨｅＬａ細胞）に示す。
【０１６２】
その結果、図４のパネルＤ及び図４のパネルＥに示されるように、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に比べ、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞では、小胞体ストレス誘導細胞死に対する抵抗性が、より増加した。一方、非小胞体ストレスインデューサーであるエトポシドでの処理により誘導された細胞死の効率は、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより影響を受けなかった。なお、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞における細胞死は、対照(ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞）における細胞死の場合とは、有意に異なる（ｐ＜０．０５）。したがって、カスパーゼ−４は、小胞体ストレス誘導細胞死に特異的に関連することが示唆される。
【０１６３】
また、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ又はカスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞について、実施例２と同様に、以下のように、Ａβ誘導細胞死を調べた。ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ又はカスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡでＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞をトランスフェクトした。その後、得られた細胞を、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ2の条件下、６０時間インキュベーションした。得られた細胞を、１０重量％  ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中、３７℃、５体積％  ＣＯ２の条件下、２５μＭ  Ａβ25-35ペプチドとともに４０時間インキュベーションした。その後、生存率を評価した。その結果を図４のパネルＦに示す。
【０１６４】
図４のパネルＦに示されるように、Ａβ25-35により処理した場合、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトした細胞に比べ、細胞死の顕著な減少を示した。なお、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞における細胞死は、対照(ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞）における細胞死の場合とは、有意に異なる（**ｐ＜０．０１）。これらの結果から、カスパーゼ−４が、Ａβ誘導細胞死及び小胞体ストレス誘導細胞死に本質的に関与することが示される。
【実施例５】
【０１６５】
アルツハイマー病患者の海馬ＣＡ１−２領域の錐体細胞層の組織を、以下のように、抗体により免疫染色し、錐体細胞層におけるカスパーゼ４の発現を確認した。なお、対照として、他の神経変性疾患患者の組織を用いた。
【０１６６】
パラフィン包埋した脳切片１０μｌから、５００ｍｌ  キシレンと１体積％  Ｈ2Ｏ2とを含有したメタノールでパラフィンを除いた。得られた切片を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。洗浄後の切片をスライドグラスに乗せ、ブロッキング液（組成：リン酸緩衝化生理食塩水  ５０ｍｌ、３重量％  ウシ血清アルブミン（１．５ｍｌ）、３重量％  ヤギ血清（１．５ｍｌ））を該切片にかけ、室温で１時間放置した。
【０１６７】
その後、前記ブロッキング液で２００〜５００倍に希釈した抗ヒトカスパーゼ４抗体（商品名：４Ｂ９、ＭＢＬ医学生物研究所製）  ３２μｌを前記スライドグラス上の切片に添加し、該切片を４℃で２日間インキュベーションした。
【０１６８】
ついで、前記スライドグラス上の切片を、リン酸緩衝化生理食塩水により室温で洗浄した。洗浄後の切片に、ブロッキング液  ２０ｍｌと、ビオチン標識２次抗体（商品名：ベクタステインＡＢＣキット、フナコシ社製)とを添加した。その後、得られた混合物を、室温で一晩インキュベーションした。インキュベーション後の切片を、リン酸緩衝化生理食塩水で、５分間洗浄した。
【０１６９】
ブロッキング液  ２０ｍｌと、精製アビジン溶液と、ビオチン化アルカリホスファターゼ溶液とを混合して、３０分以上反応させた。ついで、得られた混合物を前記切片にかけた。その後、前記切片を、室温で３０〜６０分間放置した。
【０１７０】
その後、前記切片を、リン酸緩衝化生理食塩水で５分間、３回以上洗浄し、最後に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で洗浄した。前記切片に発色液（１００ｍｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液  ５０ｍｌ、ＤＡＢタブレット１個、Ｈ2Ｏ2  ３３μｌ）を添加した。その後、スライドグラス上の切片を、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で洗浄し、顕微鏡観察を行なった。
【０１７１】
その結果、図５に示されるように、アルツハイマー患者の脳切片において、顕著にカスパーゼ−４が発現していることがわかる。したがって、アポトーシスは、アルツハイマー病の発症原因であることから、生体内においてアポトーシスが誘導される際にカスパーゼ−４が発現していることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
本発明により、神経変性疾患、虚血性疾患等の小胞体ストレス誘導性アポトーシス及び／又はアミロイド−β誘導性アポトーシスに関連して引き起こされる疾患の治療又は予防が可能になる。また、本発明により、前記疾患の治療又は予防手段、前記疾患に有効な薬剤等のスクリーニングや薬理評価が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるカスパーゼ−４の局在を示す。パネルａ〜パネルｆは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を示し、パネルｇ〜パネルｌは、ＨｅＬａ細胞を示す。また、パネルａ及びパネルｇは、抗カスパーゼ−４抗体による染色を示し、パネルｂ及びパネルｈは、抗ＫＤＥＬ抗体による染色を示し、パネルｃ及びパネルｉは、抗カスパーゼ−４抗体による染色の結果と抗ＫＤＥＬ抗体による染色の結果とを重ねて表示した結果を示す。さらに、パネルｄ及びパネルｊは、抗カスパーゼ−４抗体による染色を示し、パネルｅ及びパネルｋは、商品名：Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒによる染色を示し、パネルｆ及びｌは、抗カスパーゼ−４抗体による染色の結果と商品名：Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒによる染色の結果とを重ねて表示した結果を示す。パネルｍ〜パネルｏは、カスパーゼ−４−ＧＦＰ融合遺伝子をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を示す。パネルｍは、抗カスパーゼ−４抗体による染色を示し、パネルｎは、商品名：ＥＲ−ｔｒａｃｋｅｒによる染色を示し、パネルｏは、抗カスパーゼ−４抗体による染色の結果と商品名：ＥＲ−ｔｒａｃｋｅｒによる染色の結果とを重ねて表示した結果を示す。図中、スケールバーは、５μｍを示す。
【０１７４】
【図２】図２は、小胞体ストレス及びＡβ処理によるカスパーゼ−４の特異的切断を示す。図２のパネルＡは、１μｇ／ｍｌ  ツニカマイシン（ＴＭ）、０．５μＭ  タプシガーギン（ＴＧ）、１００μＭ  エトポシド（Ｅｔｏｐ）若しくは０．１μＭ  スタウロスポリン（ＳＴＳ）で示された期間、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を処理し、その後、示された期間インキュベーションした結果、又は１５０Ｊ／ｍ2ＵＶを照射し、その後、示された期間インキュベーションした結果を示す。前記図２のパネルＡは、各種抗体を用いてウエスタンブロッティングにより解析した結果である。前記図２のパネルＡの上部パネルは、抗カスパーゼ−４抗体、中央パネルは、抗カスパーゼ−３抗体及び抗カスパーゼ−７抗体を示し、下部パネルは、抗β−アクチン抗体を示す。図２のパネルＡ中のゲルの上部は、示された時間のインキュベーション後、ＭＴＳアッセイにより評価した細胞死の程度を示す。図２のパネルＢは、２５μＭ  Ａβ25-35又は５μＭ  Ａβ1−４0ペプチドで、示された時間、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を処理した結果を示す。前記図２のパネルＢは、各種抗体を用いてウエスタンブロッティングにより解析した結果である。前記図２のパネルＢの上部パネルは、抗カスパーゼ−４抗体を示し、下部パネルは、抗β−アクチン抗体を示す。図２のパネルＣは、アミノ酸配列の方向が逆であるペプチド｛Ａβ35-25（２５μＭ）及びＡβ40-1（５μＭ）｝で、示された期間、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を処理し、カスパーゼ−４の切断を試験した結果を示す。
【０１７５】
【図３】図３は、カスパーゼ−４の小胞体ストレス誘導切断におけるＢｃｌ−２過剰発現の影響を調べた結果を示す。図３のパネルＡのａは、ベクター又はＢｃｌ−２発現系を安定的にトランスフェクトしたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、図３のパネルＡのｂは、ベクター又はＢｃｌ−２発現系を安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を示す。また、図３のパネルＡのａ及び図３のパネルＡのｂにおいて、「＋」は、１μｇ／ｍｌ  ツニカマイシン存在下での結果、「−」は、ツニカマイシン非存在下での結果を示す。また、前記図３のパネルＡのａ及び図３のパネルＡのｂは、各種抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。前記図３のパネルＡのａ及び図３のパネルＡのｂにおいて、上部パネルは、抗カスパーゼ−４抗体、下部パネルは、抗Ｂｃｌ−２抗体を示す。図３のパネルＢは、示された細胞を、ツニカマイシン（１μｇ／ｍｌ）で３０時間処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す。スケールバーは、２５μｍを示す。
【０１７６】
【図４】図４は、ｓｉＲＮＡによるカスパーゼ−４発現減少後の小胞体ストレス誘導細胞死又はＡβ誘導細胞死における減少を示す。図４のパネルＡは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＧＦＰ（対照）に対するカスパーゼ（図中、「ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ−ａ」）又はカスパーゼ−４に対するｓｉＲＮＡ（図中、「カスパーゼ  ｓｉＲＮＡ」）（各１μｇ  ｓｉＲＮＡ／２４ウェルプレート）を導入し、カスパーゼ−４が減少した結果を示す。スケールバーは、５μｍを示す。図４のパネルＢは、前記ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞において、小胞体ストレスを誘導した場合のカスパーゼ−４を示す。図４のパネルＢにおいて、「＋」は、０．５μＭ  タプシガーギンの存在下での結果、「−」は、タプシガーギン非存在下での結果を示す。また、図４のパネルＢは、各種抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。図４のパネルＢにおいて、上部パネルは、抗カスパーゼ−４抗体を示し、下部パネルは、抗β−アクチン抗体を示す。図４のパネルＣのａは、０．５μＭ  タプシガーギンで４０時間の処理後のＧＦＰ  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞の代表的な位相差顕微鏡写真を示し、図４のパネルＣのｂは、カスパーゼ−４  ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞の代表的な位相差顕微鏡写真を示す。図４のパネルＣのｃは、３回の実験の平均±ＳＥＭとして表された細胞死の程度を示す。スケールバーは、５０μｍである。図４のパネルＤ及び図４のパネルＥは、各ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞を、０．５μＭ  タプシガーギン又は１００μＭ  エトポシドで処理した場合の細胞生存率を示す。図４のパネルＤは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を示し、図４のパネルＥは、ＨｅＬａ細胞を示す。結果を、３回の実験の平均±ＳＥＭとして表す。図４のパネルＦは、各ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において、Ａβにより細胞死を誘導した場合の生存率を示す図である。各値は、３回の実験の平均±ＳＥＭとして表わされたものである。
【０１７７】
【図５】図５は、脳におけるカスパーゼ−４の発現を調べた結果を示す図である。図中、「ＡＤ」は、アルツハイマー病患者の脳組織の結果を示し、「ＤＣ」は、他の神経変性疾患患者の脳組織の結果を示す。スケールバーは、９．５２μｍである。
【配列表フリーテキスト】
【０１７８】
配列番号：３は、Ｃａｓｐａｓｅ−４遺伝子に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列である。
【０１７９】
配列番号：４は、Ｃａｓｐａｓｅ−４遺伝子に対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列である。
【０１８０】
配列番号：５は、ＧＦＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の配列である。
【０１８１】
配列番号：６は、ＧＦＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の配列である。
【０１８２】
配列番号：７は、カスパーゼ−４が特異的に認識するテトラペプチドＷＨＥＤ（Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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