(57)【要約】      （修正有）【課題】設計の自由度が高く、生産性に優れた微粒子充填型マイクロチップを提供する。【解決手段】一対の平板を貼り合わせて成るマイクロチップにおいて、目的成分吸着用の微粒子１５を充填するための凹状の粒子充填室１６と、該粒子充填室１６への液体の導入及び排出を行うための２つの溝状の送液用流路１３とが離間して形成された基板１１と、 前記粒子充填室１６及び送液用流路１３の境界部に略対応する位置に形成された凹状の接続流路１８を備えた表面板１２とを前記送液用流路１３、粒子充填室１６、及び接続流路１８が内側にくるように接合することにより、該送液用流路１３と粒子充填室１６とが該接続流路１８によって接続されるようにする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平板状の基板と表面板とを貼り合わせて成り、内部に液体を流すための流路と目的成分吸着用の微粒子を充填する空間を備え、該流路が開口部によって外部と連通された微粒子充填型マイクロチップであって、
a) 前記基板上に設けられた凹状の粒子充填室と、
b) 前記基板上に、少なくとも１つが前記粒子充填室と離間するように設けられた２つの溝状の送液流路と、
c) 前記粒子充填室と離間するように設けられた送液流路と粒子充填室との境界部に略対応する前記表面板上の位置に設けられた、前記粒子の粒径よりも深さ又は幅の小さい凹状の接続流路と、
を備え、該基板と表面板とを前記送液用流路、粒子充填室、及び接続流路が内側にくるように接合することにより、前記離間して設けられた送液用流路と粒子充填室とが接続流路によって接続されることを特徴とする微粒子充填型マイクロチップ。
【請求項２】
一つの送液流路と粒子充填室との境界部に、上記接続流路を複数設けたことを特徴とする請求項１に記載の微粒子充填型マイクロチップ。
【請求項３】
更に、上記粒子充填室に上記微粒子を導入するための充填流路を備えたことを特徴とする請求項１又は２に記載の微粒子充填型マイクロチップ。
【請求項４】
更に、上記送液用流路の一端と連通する分離用キャピラリー流路を備えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微粒子充填型マイクロチップ。
【請求項５】
上記粒子充填室を複数備えたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微粒子充填型マイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量分離/分析、特にタンパク質や核酸等の生体高分子等の脱塩やアフィニティー分離といった前処理に使用されるマイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、核酸等の生体高分子を含む溶液の脱塩を行う際には、該溶液を逆相系の粒子やカラム等の基材表面と接触させて疎水性相互作用により該生体高分子を基材表面にいったん吸着させ、その後、洗浄及び有機溶媒での脱離を行うことにより目的分子を回収する方法が一般的に用いられる。特に、前記粒子をマイクロピペット用チップの先端に充填したジップチップ（登録商標）はこの用途に広く用いられている。しかし、このような方法ではマイクロピペット容量でのサンプル操作が必要となり、サンプルの微量化や前後処理との連続性確保が困難になるという問題がある。
【０００３】
そこで、平板状基材の内部に微細な流路を形成したいわゆるマイクロチップの内部に上記のような粒子を充填することによって、脱塩操作や酵素反応などを実施するものが考案されている（非特許文献１及び２）。このようなマイクロチップの概略構成を示す模式図を図１０に示す。該マイクロチップは、表面に溝１０３を形成した基板１０１と、該溝１０３の端と対応する位置に貫通孔１０４を備えた表面板１０２との2枚の平板から成り、これらを該溝１０３が内側になるように貼り合わせることによって、該溝１０３に対応した送液用流路１０３が形成された構成となっている。送液用流路１０３の途中には吸着用の微粒子１０５を充填するための粒子充填室１０６が設けられており、該送液用流路１０３と粒子充填室１０６の間には該微粒子１０５が粒子充填室１０６から送液用流路１０３中に流出するのを防ぐために堤防状の堰き止め構造１０７が設けられている。
該堰き止め構造１０７は、離間して設けられた送液用流路１０３と粒子充填室１０６の間に接続流路１０８を設けることによって形成される。該接続流路１０８は、液体は通過することができるが、粒子充填室１０６に充填された微粒子は通過することができない深さに設計されている。
【０００４】
このように一枚の基材上に深さの異なる送液用流路/粒子充填室、及び接続流路を形成するためには、例えば、基板の表面に上記送液用流路と粒子充填室を形成した後に接続流路を形成する、又は接続流路を形成した後に送液用流路と粒子充填室を形成するといったように、深さ方向の微細加工を少なくとも2回行う必要がある。
【０００５】
【非特許文献１】「エレクトロフォレーシス（Electrophoresis）」、（ドイツ）、2002年、第23巻、pp.3537-3544
【非特許文献２】「モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & Cellular Proteomics）」、（米国）、2002年、第1.2巻、pp.157-168
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、一般的なフォトリソグラフィー/エッチングを繰り返す微細加工プロセスにおいては、数μm以上の段差を形成した後はスピンコート等によるフォトレジストの均一塗布が困難になるため、エッチング形成される送液用流路や接続流路の深さが制限され、結果的に各流路の深さが堰き止め構造形成上の大きな制約条件となる。これに加えて、一枚の基材に複数回の加工を施すためには各微細加工工程における面方向の高精度な位置合わせが必要となるため生産性が悪いという問題があった。
すなわち、本発明が解決しようとする課題は、設計の自由度が高く、生産性に優れた微粒子充填型マイクロチップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本願発明者は上記送液用流路/粒子充填室と接続流路とを別の基材に形成した上で両基材を接合することにより簡便に堰き止め構造を形成できることに想到し、本願発明に至った。
すなわち、上記課題を解決するために成された本発明に係る微粒子充填型マイクロチップは、平板状の基板と表面板とを貼り合わせて成り、内部に液体を流すための流路と目的成分吸着用の微粒子を充填する空間を備え、該流路が開口部によって外部と連通された微粒子充填型マイクロチップであって、
a) 前記基板上に設けられた凹状の粒子充填室と、
b) 前記基板上に、少なくとも１つが前記粒子充填室と離間するように設けられた２つの溝状の送液流路と、
c) 前記粒子充填室と離間するように設けられた送液流路と粒子充填室との境界部に略対応する前記表面板上の位置に設けられた、前記粒子の粒径よりも深さ又は幅の小さい凹状の接続流路と、
を備え、該基板と表面板とを前記送液用流路、粒子充填室、及び接続流路が内側にくるように接合することにより、前記離間して設けられた送液用流路と粒子充填室とが接続流路によって接続されることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微粒子充填型マイクロチップは、送液用流路/粒子充填室と接続用流路とを別々の基材表面に形成したことによって、上述のような一枚の基材上にこれらを形成することによる設計上の制約を解消することができると共に、面方向の位置合わせ精度も従来のものほど厳密でなくてもよくなるため、簡便に上記堰き止め構造を形成することができ、生産性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に係る微粒子充填型マイクロチップを構成する基材の材質は特に限定するものではないが、微細加工を精度よく行うためには表面平滑性が高く、且つ機械的耐久性に優れ、その上微細加工が容易であることが望ましい。具体的にはシリコン、石英、ほうケイ酸ガラス、亜鉛ほうケイ酸ガラス等の各種ガラス、アルミナや酸化マグネシウム等の各種セラミックス、金属、樹脂などが挙げられる。また、このような材質の選択に際しては、目的とする分離/分析等に用いる溶液に対する耐薬品性を考慮するほか、加圧による送液を実施する場合には機械的な耐久性を、流路内の光学的検出が必要となる場合には材料の透過率などの光学的特性を、電気泳動による分離と組み合わせる際には材料の絶縁性などの電気的特性なども勘案して適宜選択する。
【００１０】
本発明に係る微粒子充填型マイクロチップの製造に際しては、一般的な微細加工プロセスを適用することができる。具体的には、フォトリソグラフィー/エッチングを用いる方法、スクリーン印刷等を用いる方法、金型を用いる方法、機械加工を用いる方法などから、基材の材質や所望する形状に応じて適切な加工方法を選択する。また、基材同士の接合方法としては、例えば、熱融着、超音波接合、接着剤等による接着、陽極接合、フッ酸接合等を挙げることができ、これらの中から基材の材質等に応じて適宜選択する。
【００１１】
本発明に係る微粒子充填型マイクロチップに設けられる流路は、図１に示すように、一方の基材（基板１１）に形成された送液用流路１３と粒子充填室１６とが、もう一方の基材（表面板１２）に形成された接続流路１８によって接続された構成となるようにする。流路配置は任意であるが、例えば図３に示すように、粒子充填室１６への微粒子１５の充填及び/又は排出を行うための粒子充填流路１９を粒子充填室１６に接続した構成としたり、図４に示すように粒子充填室１６と送液用流路１３の間の堰き止め構造１７を一方のみに設けた構成とし、堰き止め構造１７が無い方の送液用流路１３を用いて粒子１５の充填及び/又は排出を行うような流路配置としてもよい。前者の場合は、微粒子充填後に粒子充填流路１９を適当な手段によって閉塞する。また、後者の場合は、サンプル溶液や緩衝液、溶離液等を該マイクロチップに導入する際には、堰き止め構造１７のある方が常に下流になるように送液を行う。
【００１２】
送液用流路の幅及び深さは、送液の安定性や微細加工の加工限界などの点から、一般的には、深さ1 μm以上200 μm以下、幅10 μm以上とすることが多いが、充填する粒子の径や送液圧力等を勘案して適宜選択するものとする。また、粒子充填室の幅は充填する粒子の径、送液圧力、及び利用する分離手法等に応じて適宜選択する。接続流路の深さは、使用する粒子の粒径よりも浅く、且つ送液時の圧力損失が実質上問題にならない程度に深いものとする。一般的に分離や抽出に用いられる粒子の径は3〜50 μm程度であることから、該流路の深さは1 μm以上20 μm以下とすることが好ましい。また、粒径5 μm以下の細かい粒子を使用する場合は、接続流路の流路幅を広くすることで堰き止め構造部の圧力損失を低減することが望ましい。また、接続流路の深さを小さくする代わりに、図５(a)に示すように一つの送液用流路１３/粒子充填室１６の境界部に幅の狭い接続流路１８を並列に複数設け、該接続流路１８の流路幅によって保持する粒子の粒径が規定されるようにしてもよい。また、図５(b)に示すように一つのマイクロチップ内に粒子充填室１６を複数設けることによって、連続処理や並行処理が可能な構成とすることもできる。
【００１３】
本発明に係る微粒子充填型マイクロチップにおいては、図１に示すように上記送液用流路１３及び／又は充填流路１９の端部に対応する上記表面板上の位置に貫通孔１４を設け、該貫通孔１４から液体の供給又は排出を行えるようにする。あるいは、図２に示すように、送液用流路１３及び／又は充填流路を基板１１の端縁まで達するものとし、該基板１１と表面板１２とを接合してマイクロチップを形成した際に、該マイクロチップの厚さ方向の側面に上記流路の出口又は入口にあたる開口部が形成されるようにしてもよい。
【００１４】
更に、本発明に係る微粒子充填型マイクロチップは、図６(a)に示すように、上記送液用流路１３、粒子充填室１６、及び接続流路１８から成る部分（以下適宜、前処理部２０と呼ぶ）と、電気泳動によるサンプル成分の分離を行うための分離用キャピラリー流路３０とを併設し、送液用流路１３の一端を分離用キャピラリー流路３０と連通させることによって、前処理と分離とをオンライン接続した構成とすることもできる。これにより、前処理したサンプルを直接分離用キャピラリー流路３０に導入して分析を行うことができ、分析装置の小型化やハンドリングによる試料ロスの抑制を実現することができると共に、更に高感度な検出が可能となる。更に、図６(b)に示すように、一つの分離用キャピラリー流路３０に対して複数の前処理部２０を設けることで、連続分析や他サンプル分析が可能な構成とすることもできる。なお、前処理部２０に併設する分離用キャピラリー流路３０の流路配置及び前処理部２０と分離用キャピラリー流路３０との位置関係は任意であり、図６に示すものに限定されるものではない。
【００１５】
本発明に係る微粒子充填型マイクロチップに吸着用の微粒子を充填する際には、上記接続流路の深さ又は幅のいずれか小さい方よりも大きな粒径を有する所望の粒子の懸濁液を所定の濃度に調製し、上流側を加圧、下流側を減圧、又は電圧を印加して電気浸透流を発生させる等の方法によって前記粒子充填流路又は送液用流路から該懸濁液を導入することで前記粒子充填室に該粒子を充填する。
【００１６】
上記微粒子の粒径・材質・細孔径・表面修飾及びその他の物性は所望する分離手法に応じて適宜選択する。具体的には、表面に疎水性官能基を有する粒子を使用することにより、疎水性相互作用を利用した試料中の特定成分の選択的回収が可能となり、表面に荷電性官能基を有する粒子を使用することにより、静電相互作用を利用した特定成分の選択的回収が可能となる。また、いわゆるアフィニティー分離用の成分を表面に有する粒子を使用すれば、アフィニティー分離による特定成分の選択的回収が可能となる。
【００１７】
本発明に係る微粒子充填型マイクロチップの内部に形成される粒子充填室や各流路の内面は、前記粒子と同種、あるいは実質的に同等の機能を有する表面修飾や、表面を不活性化する修飾を施すことが望ましい。このような表面修飾により、流路内面への非特異的な吸着／脱離による分離性能の劣化を抑制することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明に係る微粒子充填型マイクロチップの実施例について図を用いて説明する。本実施例の微粒子充填型マイクロチップは、合成石英基板（信越化学製 VIOSIL SX）から成る基板１１及び表面板１２から成り、基板１１には図３(a)に示すように送液用流路１３、粒子充填室１６、及び粒子充填流路１９が、表面板１２には上記送液用流路１３及び粒子充填流路１９の端部に対応する位置に設けられた貫通孔１４と、上記送液用流路１３と粒子充填室１６の境界に対応する位置に設けられた接続流路１８を備えている。上記各流路及び粒子充填室１６はフォトリソグラフィー/エッチングプロセスによって形成し、上記貫通孔１４は超音波加工によって形成した。送液用流路１３及び粒子充填室１６の深さは50 μmであり、接続流路１８の深さは充填する粒子の径に応じて変化させた（詳細は後述する）。基板１１及び表面板１２は常温接合であるフッ酸接合を利用して接合し、その後、外部送液手段との接続に用いる送液用ポート（Nanoport, Upchurch Scientific社製）を基材２表面の貫通孔１４の部分に接着した。完成した微粒子充填型マイクロチップの外観写真を図７に、顕微鏡による流路観察結果を図８に示す。
【００１９】
［試験例１］
以下、上記構成を有する本実施例の微粒子充填型マイクロチップへの粒子充填試験について説明する。ここでは、接続流路の深さが1 μmのマイクロチップに対し、粒径5 μmのC18粒子（DF-5-120A C18、旭硝子株式会社製）のアセトニトリル懸濁液（粒子濃度3 mg/mL）を加圧送液することにより、粒子充填室への粒子の充填を試みた。充填後のマイクロチップを顕微鏡によって観察した結果を図９(a)に示す。図９(a)から明らかなように、本実施例のマイクロチップでは流路内部に設けられた堰き止め構造により、粒子を完全に保持することができた。
【００２０】
［試験例２］
次に、異なる粒径の粒子を保持することを目的として、接続流路の深さが10 μmの微粒子充填型マイクロチップを作成し、該マイクロチップに対して直径13 μmのC18粒子（Kromasil-100Å、Eka Nobel AB社製）のアセトニトリル懸濁液（粒子濃度 8 mg/mL）を加圧送液することにより、粒子充填室への該粒子の充填を試みた。粒子充填後のマイクロチップを顕微鏡で観察した結果を図９(b)に示す。この結果、上記試験例１と同様に、充填された粒子は堰き止め構造によって完全に保持されていることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の微粒子充填型マイクロチップの構造を示す断面模式図。
【図２】本発明の微粒子充填型マイクロチップの別の例を示す断面模式図。
【図３】本発明の微粒子充填型マイクロチップの流路配置を示す平面図。(a)基板、(b)表面板。
【図４】本発明の微粒子充填型マイクロチップの流路配置の別の例を示す平面図。(a)基板、(b)表面板。
【図５】本発明の微粒子充填型マイクロチップに係る送液用流路、粒子充填室、及び接続流路の変形例を示す模式図。(a)接続流路を複数設けた例、(b)粒子充填室を複数設けた例。
【図６】本発明の微粒子充填型マイクロチップに分離用キャピラリー流路を併設した例を示す上面透視図。(a)分離用キャピラリー流路に対して前処理部を１箇所設けた例、(b)分離用キャピラリー流路に対して前処理部を２箇所設けた例。
【図７】本発明の一実施例である微粒子充填型マイクロチップに送液用ポートを取りつけた状態を示す写真。
【図８】同実施例の微粒子充填型マイクロチップの送液用流路と粒子充填室の境界部を示す顕微鏡写真。
【図９】同実施例の微粒子充填型マイクロチップを用いた粒子充填試験の結果を示す顕微鏡写真。(a)、接続流路の深さが1 μmで、微粒子の粒径が5 μmの場合、(b)接続流路の深さが10 μmで、微粒子の粒径が13 μmの場合。
【図１０】従来の微粒子充填型マイクロチップの構造を示す断面模式図。
【符号の説明】
【００２２】
１、１０１…基板
１２、１０２…表面板
１３、１０３…送液用流路
１４、１０４…貫通孔
１５、１０５…微粒子
１６、１０６…粒子充填室
１７、１０７…堰き止め構造
１８、１０８…接続流路
１９…粒子充填流路
２０…前処理部
３０…分離用キャピラリー流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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