(57)【要約】      （修正有）【課題】  癌の遠隔転移の予後的な見極めのための極めて精度の高い検査方法及び検査キットを提供する。【解決手段】  癌の遠隔転移の予後的な見極めのための検査方法であって、患者から採取した試料中のＥＣＡ３９の発現を確認する工程、さらに、患者から採取した試料中のＣＸＣＲ４、ＨＤＪ−２、ＴＮＩＫ、ＴＲＡＸ、Ｃ−ＮＡＰ１、モエシン、ＡＭＰＫ  ｂ、ＭＣＰ−１、β−チューブリン、カスパーゼ−９／ＩＣＥ−ＬＡＰ６／Ａｐａｆ−３、シナプトタグミン、ＥＲＫ２からなる群より選択される１以上の発現を確認する手段を含む、検査方法を提供する。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の遠隔転移の予後的な見極めのための検査方法であって、患者から採取した試料中のＥＣＡ３９の発現を確認する工程を含む、検査方法。
【請求項２】
さらに、患者から採取した試料中のＣＸＣＲ４、ＨＤＪ−２、ＴＮＩＫ、ＴＲＡＸ、Ｃ−ＮＡＰ１、モエシン、ＡＭＰＫ  ｂ、ＭＣＰ−１、β−チューブリン、カスパーゼ−９／ＩＣＥ−ＬＡＰ６／Ａｐａｆ−３、シナプトタグミン、ＥＲＫ２からなる群より選択される１以上の発現を確認する工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
癌が、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、咽喉頭癌、肺癌又は乳癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
癌の遠隔転移の予後的な見極めのための検査キットであって、患者から採取した試料中のＥＣＡ３９の発現を確認する手段を含む、検査キット。
【請求項５】
さらに、患者から採取した試料中のＣＸＣＲ４、ＨＤＪ−２、ＴＮＩＫ、ＴＲＡＸ、Ｃ−ＮＡＰ１、モエシン、ＡＭＰＫ  ｂ、ＭＣＰ−１、β−チューブリン、カスパーゼ−９／ＩＣＥ−ＬＡＰ６／Ａｐａｆ−３、シナプトタグミン、ＥＲＫ２からなる群より選択される１以上の発現を確認する手段を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
癌が、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、咽喉頭癌、肺癌又は乳癌である、請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の遠隔転移の予後的な見極めのための検査方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遠隔転移は、進行大腸癌の治療における重要な問題の一つである。
多糖類−Ｋ（ＰＳＫ）すなわちクレスチンは、タンパク質結合多糖類であり、カワラタケ（coriolus versicolor）から調製される生物応答修飾剤（ＢＲＭ）であり、何世紀にもわたって漢方薬に用いられている。ＰＳＫ（三共）は、日本及びアジア諸国において外科療法又は放射線療法後のアジュバント療法において広く用いられている。日本の国民健康保険では、ＰＳＫは、胃癌、結腸直腸癌及び肺癌において適用される。
【０００３】
驚くべきことに、無作為臨床試験では、胃癌、結腸直腸癌、食道癌及び肺癌のアジュバント療法においてＰＳＫが患者の５年生存率を１０〜２０％まで有意に伸ばすことが明らかとなった。
【０００４】
ＰＳＫを投与していない結腸直腸癌患者と比べると、ＰＳＫを投与した患者は、より低い局所再発率（ＰＳＫ投与群では９．５％であるのに対しＰＳＫ非投与群では１１．９％）、全身性再発率（１６．３％対１９．８％）、リンパ節再発率（１．８％対５．３％）そして腹膜伝播率（１．８％対３．５％）を示し、また、より高い３年生存率（７７．２％対６７．７％）を示した。
【０００５】
ＰＳＫは、毒性がなく、そして耐用性にきわめて優れている。しかし、ＰＳＫの直接的抗腫瘍効果のメカニズムは、未だ解明されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌の遠隔転移の予後的な見極めのための検査方法及び検査キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、ＰＳＫの直接的抗腫瘍効果のメカニズムを解明し、ＰＳＫによる癌の遠隔転移抑制に関与する予後規定因子を同定することにより、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記に関する。
１  癌の遠隔転移の予後的な見極めのための検査方法であって、患者から採取した試料中のＥＣＡ３９の発現を確認する工程を含む、検査方法。
２  さらに、患者から採取した試料中のＣＸＣＲ４、ＨＤＪ−２、ＴＮＩＫ、ＴＲＡＸ、Ｃ−ＮＡＰ１、モエシン、ＡＭＰＫ  ｂ、ＭＣＰ−１、β−チューブリン、カスパーゼ−９／ＩＣＥ−ＬＡＰ６／Ａｐａｆ−３、シナプトタグミン、ＥＲＫ２からなる群より選択される１以上の発現を確認する工程を含む、上記２に記載の方法。
３  癌が、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、咽喉頭癌、肺癌又は乳癌である、上記２に記載の方法。
４  癌の遠隔転移の予後的な見極めのための検査キットであって、患者から採取した試料中のＥＣＡ３９の発現を確認する手段を含む、検査キット。
５  さらに、患者から採取した試料中のＣＸＣＲ４、ＨＤＪ−２、ＴＮＩＫ、ＴＲＡＸ、Ｃ−ＮＡＰ１、モエシン、ＡＭＰＫ  ｂ、ＭＣＰ−１、β−チューブリン、カスパーゼ−９／ＩＣＥ−ＬＡＰ６／Ａｐａｆ−３、シナプトタグミン、ＥＲＫ２からなる群より選択される１以上の発現を確認する手段を含む、上記４に記載の方法。
６  癌が、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、咽喉頭癌、肺癌又は乳癌である、上記５に記載のキット
【発明の効果】
【０００９】
癌の遠隔転移の有無を予測することができ、転移抑制のための個別化した治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で遠隔転移とは、癌細胞が最初にできた癌の病巣から遠く離れた臓器に転移することをいう。例えば、結腸直腸癌の場合では、肝臓、肺、骨、脳への転移をいう。この場合、遠隔転移陽性症例とは、病理学又は画像診断にて癌を確定されたものとする。
【００１１】
本発明で予後的な見極めのための検査とは、病気が、術後どのような経過をたどるのかを予測し、見通しを立て、患者に個別化した適切な治療方法を選択するための判断材料を提供することをいう。
【００１２】
本発明の検査方法のための試料の採取源は、癌の遠隔転移の可能性のある細胞、臓器、器官であれば特に限定されないが、好ましくは、腫瘍組織、血液である。
【００１３】
ＥＣＡ３９遺伝子は、癌遺伝子ｃ−Ｍｙｃの下流で直接的な標的となる遺伝子である。
【００１４】
ＥＣＡ３９の発現を確認するとは、ＥＣＡ３９遺伝子から転写されたｍ−ＲＮＡ及び／又は翻訳されたタンパク質を検出することをいう。検出方法は、従来公知の方法であれば制限されることなく用いることができ、例えば、ｍ−ＲＮＡの検出であれば、ＲＴ−ＰＣＲ法を、また、タンパク質の検出であれば、酵素免疫測定法や免疫組織化学的染色法を用いることができる。
【００１５】
試料の採取方法は、従来検査に用いられている方法であれば特に限定されず、本発明の方法に用いることができる。
【実施例１】
【００１６】
患者及び方法
ＰＳＫの抗腫瘍作用は、腫瘍の成長因子や酵素活性に対する、宿主が介在した間接的な免疫賦活作用が関与すると考えられている。この度、転移抑制を誘導する、腫瘍細胞に対する直接作用に着目しこれを明らかにするために、ｃ−Ｍｙｃ増幅、及びｐ５３変異及びｒａｓ変異を示す、ヒト結腸直腸腺癌細胞株であるＳＷ４８０及び野生型ｐ５３遺伝子を有するＨＣＴ１１６における候補タンパク質をスクリーニングした。次に、得られた候補タンパク質の臨床効果を明らかにするために、手術標本における発現の有無を検討した。
【００１７】
患者及び方法
細胞培養
結腸直腸癌細胞株：野生型ｐ５３を有するＨＣＴ１１６及び変異型ｐ５３を有するＳＷ４８０
ＰＳＫ処理（呉羽化学）：５００μg/ml、９６時間
【００１８】
フローサイトメトリー
ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン）、ＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔ及びＭｏｄ  Ｆｉｔ  ＬＴ１．０ソフトウェアー（Verity Software House）
【００１９】
タンパク質発現プロファイルの同定
タンパク質抽出、マイクロアレイハイブリダイゼーション、スキャンニング、グリッド援用スポット同定及び解析は製造者（Clontech laboratories,Inc.）のプロトコールに拠った。サンプル及びコントロールでラベルしたプローブを互いに混合し、Ab Microarray（Lot 3080600）中の５００種のヒトタンパク質を含むタンパク質マイクロアレイスライドにハイブリダイズさせた。
【００２０】
兵庫医科大学において外科的に切除されたデュークスＣ型結腸直腸癌を有する患者３５人から同意書を得たうえで、研究に加えた。患者は、女性が１２名であり、男性が２３名であり、平均年齢は、６２．９才（４１〜８３才）であり、全員を対象に調査した。病理組織学的所見では、６名が高分化と、２７名が中分化と、そして２名が低分化腺癌又は粘液性癌と分類された。
【００２１】
２２名が遠隔転移陰性症例、１３名が遠隔転移陽性症例で、このうち３名がリンパ節転移を、２名が肝転移を、７名が肺転移を、そして２名が局所転移を示した。これらの手術標本をＥＣＡ３９について免疫組織化学的染色をおこなった。
【００２２】
統計学的解析
手術標本のデータをスチューデントｔ検定によって比較した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とした。
ＰＳＫ処理（５００及び１０００μg/ml、９６時間）によってＨＣＴ１１６細胞の増殖をそれぞれ５８．９％及び５１．６％まで抑制し、ＳＷ４８０細胞の増殖をそれぞれ６９．５％及び６０．８％まで抑制した。
【００２３】
ＰＳＫ処理（５００μg/ml、９６時間）前後の細胞周期分布パターンについては、ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０のいずれも大きな変化は認められなかった。ＰＳＫ処理によってアポトーシス細胞の比率が、ＨＣＴ１１６細胞において３．６％から９．８％に増加し、そしてＳＷ４８０細胞において２．８％から９．８％に増加した。
【００２４】
ＰＳＫ処理（５００μg/ml、９６時間）によるタンパク質発現の変化をＳＷ４８０細胞株において解析した（Abマイクロアレイ＃３０８０６００）。１．３倍以上の発現変化を統計学的有意差を示す基準とすると、５００種類のタンパク質から１４種類のタンパク質が、ＰＳＫによる抗腫瘍効果の責任タンパク質の候補としてスクリーニングされた。これらのタンパク質のうち、増加を示した８種及び低下を示した６種のタンパク質を同定し、代表例を下記に示した。
【００２５】
ＰＳＫによって増加したタンパク質
タンパク質名        正規化平均ＩＮＲ
ＨＤＪ−２                  １．４７
ＴＮＩＫ                    １．４６
ＴＲＡＸ                    １．４６
Ｃ−ＮＡＰ１                １．３５
Ｍｏｅｓｉｎ                １．３２
【００２６】
ＰＳＫによって抑制されたタンパク質
タンパク質名        正規化平均ＩＮＲ
ＥＣＡ３９                  ０．６５
Caspase-9/ICE-LAP6/Apaf-3   ０．６７
Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  ０．７１
ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ２）      ０．７４
ＰＭＣＡ２                  ０．７５
【００２７】
ＰＳＫによって増加したタンパク質のうちＨＤＪ−２、ＴＮＩＫ及びＴＲＡＸの順で大きな変化を示した。また、ＰＳＫによって抑制されたタンパク質のうちＥＣＡ３９、Ｃａｓａｐａｓｅ−９／ＩＣＥ−ＬＡＰ６／Ａｐａｆ−３及びＳｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎの順で大きな変化を示した。
【００２８】
また、転移陽性直腸癌患者から得られた手術標本は、ＥＣＡ３９免疫組織化学的染色で約９０％の確率で陽性を示した。転移陰性直腸癌患者から得られた手術標本は、ＥＣＡ３９免疫組織化学的染色で約９０％の確率で陰性を示した。この際、陰性は、全視野で陽性細胞を全く認めないもの、また、陽性は、それ以外のものとした。
【００２９】
ＰＳＫによって顕著に抑制された癌遺伝子であるｃ−ｍｙｃの標的であるＥＣＡ３９の発現と遠隔転移の有無との関連を外科手術標本を用いて検討した。その結果、癌の遠隔転移の予後因子としてのＥＣＡ３９の診断的価値は、感度が８６．７％であり、特異性が９０％であり、陽性予測力（ＰＰＶ）が８６．７％であり、陰性予測力（ＮＰＶ）が９０％であった。
【００３０】
現在までに報告されている統計学的に有意で信頼の高い、癌の遠隔転移の予後因子としては、ｐ５３やＶＥＧＦなどがある。しかし、これらの特異度は高くても７０％程度にすぎない。また、これらのマーカーでは、予後判定に用いるには偽陽性が多いため、予めカットオフ値を解析する手間が必要である。（Galizia G et al. Determination of molecular marker expression can predict clinical outcome in colon carcinomas. Clin Cancer Res 10: 3490-9, 2004））。したがって、予後判定における信頼性は臨床上低いものである。
【００３１】
癌の遠隔転移の予後因子としてのＥＣＡ３９は、その感度、特異性、陽性予測力、陰性予測力のいずれもが約９０％を示すことから、ＥＣＡ３９は、癌の遠隔転移の診断能が極めて高く、予後判定に有用である。また、このような効果は、従来技術から予測不可能な格別なものである。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
癌の遠隔転移の有無を極めて高精度に予測することができ、転移抑制のための個別化した治療が可能となる。