(57)【要約】  【課題】従来、被験物質が有するヒトＴＰＯ様活性は、インビトロで行われてきており、インビボで評価する場合に満足のいく動物モデルが得られていなかった。そのため、本発明の課題はヒトＴＰＯ様活性のインビボ評価用の動物モデルを提供することである。  【解決手段】ヒトトロンボポエチン受容体を発現させたインターロイキン−３依存性細胞をマウス等に移植させることによって作製された動物モデルは、種々のサイトカインの影響を受けることなく生体内における被験物質のヒトＴＰＯ様活性の評価が可能である。また細胞にＧＦＰ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子等のマーカー遺伝子を導入することによって経時的に評価が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトトロンボポエチン受容体を発現させた、インターロイキン−３依存性細胞が移植された動物モデル。
【請求項２】
前記細胞がマーカー遺伝子を有するものである請求項１記載の動物モデル。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子が、ＧＦＰ遺伝子もしくはルシフェラーゼ遺伝子である請求項２記載の動物モデル。
【請求項４】
動物がマウスである請求項１〜３のいずれかに記載の動物モデル。
【請求項５】
動物が免疫不全動物である請求項１〜３のいずれかに記載の動物モデル。
【請求項６】
ヒトトロンボポエチン受容体を発現させたインターロイキン−３依存性細胞を、マウスに移植する動物モデルの作製方法。
【請求項７】
請求項３に記載の動物モデルに、被験物質を投与し、蛍光もしくは発光を指標として、被験物質のヒトトロンボポエチン様活性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトトロンボポエチン様低分子化合物をインビボで評価するために使用される動物モデルとして有用な、ヒトトロンボポエチン受容体を発現させたインターロイキン−３依存性細胞が移植された新規マウス及びその作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；以下、ＴＰＯともいう）は、１９９４年に発見された血小板産生調節因子であり、主に肝臓で産生される３３２残基からなる糖タンパク質である。トロンボポエチンは、骨髄において血小板前駆体細胞の生存、増殖、分化および成熟、即ち巨核球の分化および増殖を促進するサイトカインである。また、その受容体であるトロンボポエチン受容体についても、そのアミノ酸配列は既に同定されている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＨ００３６５５、Ｍ．Ｓｏｕｙｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６３：１１３７（１９９０））。ＴＰＯの有する生理活性より、ＴＰＯ自体、もしくはＴＰＯ受容体のアゴニストは、種々の血小板減少症の治療薬として、例えば癌患者に対する骨髄抑制及び脊髄切断療法に付随する血小板減少症を緩和する医薬としての応用が期待されている。
しかし、ＴＰＯそのものを医薬品として利用する場合には、赤血球増多因子であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）や顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）とは異なり、分子に内在する性質として抗原性という問題があることが知られている。また、蛋白質であるため代謝を受け易く、生体内での残存期間が短いという問題点がある。このため、ＴＰＯに代えて、これらと同様の活性を有するＴＰＯ様低分子化合物（以下、ＴＰＯミメティクスともいう）のスクリーニングが行われている。このとき、ＴＰＯ受容体のアミノ酸レベルにおいては、わずかな違いしかないにもかかわらず、ミメティクスとの反応性については、種特異性が見られることが報告されている（特許文献１）。例えば、サルＴＰＯ受容体とヒトＴＰＯ受容体については、膜貫通部位である４９９番目のロイシン残基とヒスチジン残基の違いしかないが、この置換により、ＴＰＯミメティクスとの反応性が異なることが報告されている。このため、ヒトＴＰＯミメティクスのスクリーニングにおいて使用する細胞として、通常、サイトカインに依存するＢＡＦ３細胞等にヒトＴＰＯ受容体を安定に発現させた細胞が利用されている（特許文献２）。
また、インビボで行った評価系としては、このようなＴＰＯミメティクスを実際に正常動物に投与して、投与後の血小板の増加を調べる方法が行われている（非特許文献１）。しかし、これらの評価系では、宿主が有するＴＰＯ受容体を介したシグナル伝達系を評価していること、及び、ＴＰＯミメティクスとＴＰＯ受容体の反応性に関しては、種特異性が大きくなることを考慮すると、現在のＴＰＯミメティクスの評価系が、満足できるものであるとは言えない。また、ヒトＴＰＯ受容体と相同性が高い受容体を有することが知られるチンパンジーを用いた評価系の報告（非特許文献２）もあるが、その使用に制約（例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ等）があり、一般的に動物モデルには適さないとされる。
【特許文献１】国際公開第０２／０５７３００号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／００７４２３号パンフレット
【非特許文献１】米国血液学会抄録 ２００４年、演題番号２０６３
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ  １９９８年、第９１巻、ｐ４４２７−４４３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このように、被験物質が有するヒトＴＰＯ様活性をインビボで評価する場合、満足のいく動物モデルが得られていないのが現状である。従って、本発明の課題は、ヒトＴＰＯ様活性のインビボ評価用の動物モデルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、種々のサイトカインの影響を受けるために、ヒトＴＰＯ受容体を発現させたインターロイキン−３依存性細胞株は、主にインビトロでの増殖能や分子生物学的手法を指標にしてのＴＰＯ及びヒトＴＰＯ様活性物の評価に利用されてきたが、インビボで免疫不全マウスに移植しても、サイトカインの影響を最小限にとどめ生体内における被験物質のヒトＴＰＯ様活性の評価が可能となることを実証して、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
[１]ヒトトロンボポエチン受容体を発現させた、インターロイキン−３依存性細胞が移植された動物モデル。
[２]前記細胞がマーカー遺伝子を有するものである上記[１]記載の動物モデル。
[３]前記マーカー遺伝子が、ＧＦＰ遺伝子もしくはルシフェラーゼ遺伝子である上記[２]記載の動物モデル。
[４]動物がマウスである上記[１]〜[３]のいずれかに記載の動物モデル。
[５] 動物が免疫不全動物である上記[１]〜[３]のいずれかに記載の動物モデル。
[６]ヒトトロンボポエチン受容体を発現させたインターロイキン−３依存性細胞を、マウスに移植する動物モデルの作製方法。
[７]上記[３]に記載の動物モデルに、被験物質を投与し、蛍光もしくは発光を指標として、被験物質のヒトトロンボポエチン様活性を評価する方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、ヒトＴＰＯ様活性のインビボ評価用マウスの作製が可能となる。このマウスは、血小板減少症などの治療薬としての利用が期待される薬剤の探索、評価において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本明細書において「ＴＰＯ様活性」とは、ＴＰＯ受容体に結合することにより細胞内にシグナルが伝達されて該細胞に生じる生物学的作用をいい、具体的には、巨核球の増殖、分化または成長の刺激、血小板の産生等の作用をいう。
【０００７】
本明細書において「ＴＰＯ様低分子化合物」とは、細胞表面上に発現した受容体に特異的に結合するという特性、受容体を活性化しうる特性または細胞内においてシグナルを代用する特性の何れか一つまたは複数を有し、生体に対しあたかもＴＰＯのように作用する低分子化合物をいう。一般に、ＴＰＯミメティクスともいう。
【０００８】
細胞の調製方法
本発明のマウスの作製に利用する細胞株は、培養培地中にＴＰＯまたはＴＰＯ様低分子化合物が存在する場合にのみ、生育、増殖の可能な細胞株をいう。このような細胞株は、インターロイキン−３（以下、「ＩＬ−３」という）依存性細胞株に、ヒトＴＰＯ受容体遺伝子を導入することにより調製される。
【０００９】
具体的には、ＩＬ−３依存性細胞株を適当な緩衝液に懸濁させた後、ＴＰＯ受容体遺伝子を公知の手段により導入することにより調製される。例えば、ＩＬ−３依存性細胞株であるＢＡＦ／Ｂ０３に、ヒトＴＰＯ受容体遺伝子を導入する方法については、コリンスらが報告しているので、これを参考として実施することができる（Ｊ．Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３７，２９３−２９８，１９８８）。なお、ＴＰＯ受容体遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＨ００３６５５、Ｍ．Ｓｏｕｙｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６３：１１３７（１９９０）に開示されている。
【００１０】
「ＩＬ−３依存性細胞」とは、サイトカインの一種であるＩＬ−３によって増殖することのできる細胞を指し、例えば、ＢＡＦ／Ｂ０３やＢＡＦ３（Ｇａｌａ  Ｓ，ｅｔ ａｌ．”Ｂｌｏｏｄ”，９７，２２７−２３４，２００１）、Ｂａ／Ｆ３（Ｄｉｎｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｂｌｏｏｄ”，１０３，４１９８−４２００，２００４）等を挙げることができる。
【００１１】
このとき好ましい実施形態は、薬剤耐性遺伝子をヒトＴＰＯ受容体遺伝子と同時に導入した細胞株である。薬剤耐性遺伝子は、ＴＰＯ受容体遺伝子、もしくは後述するマーカー遺伝子を導入した細胞の選択を容易にできるからである。例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が当業者に公知である。
【００１２】
なお、これらの薬剤耐性遺伝子を組み込んだプラスミドが既に市販品として提供されているので、これらプラスミドに上記のＴＰＯ受容体遺伝子を組み込み、ＴＰＯ受容体遺伝子および薬剤耐性遺伝子を組み込んだＤＮＡとして利用することもできる。このようなプラスミドの例としては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（インビトロジェン社製）、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（クローンテック社製）等を例示することができる。
【００１３】
ここでＴＰＯ受容体遺伝子が導入されたＩＬ−３依存性細胞株（以下、「形質転換細胞株」という）を、ＴＰＯ受容体遺伝子が導入されていない細胞から分離するためには、薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質の存在下で培養すればよい。このとき使用される培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地やＤＭＥＭ培地（シグマ社製）等の通常の培地でよいが、培養時にはＴＰＯの他に薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質の存在が必要となる。
【００１４】
この培養において、形質転換細胞株はＴＰＯ受容体遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子が導入されているため、ＴＰＯと抗生物質の存在下で生存することができるが、ＴＰＯ受容体遺伝子が導入されていない細胞株は生存することができない。よって、ＴＰＯ受容体遺伝子を安定に発現する細胞を、安定に発現することができない細胞から分離することが可能となる。このような選択操作を行わなければ、培地中の成分、例えばウシ胎児血清（ＦＣＳ）により、ＴＰＯ受容体遺伝子が導入されなかった細胞株でも増殖する可能性が残ってしまい、この細胞株をスクリーニング等に用いた場合に正確な結果が得られない可能性がある。
【００１５】
さらに、好ましい実施形態は、上記細胞にさらにマーカー遺伝子を導入した細胞株である。このとき、マーカー遺伝子は、細胞数の測定を容易にできるからである。マーカー遺伝子とは、通常レポーターアッセイ等に使用されているものを挙げることができるが、ルシフェラーゼ遺伝子やＧＦＰ遺伝子など色の変化を、表現形式でとするものが望ましい。ルシフェラーゼ遺伝子には例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどをコードする遺伝子を、ＧＦＰ遺伝子としては、例えばＥＧＦＰ（ｅｎｈａｃｅｄ  ＧＦＰ）やＥＹＦＰ、ＥＣＦＰなど（いずれもクローンテック社製）を挙げることができる。市販されているこれらの遺伝子は、既に各種細胞への導入に適したＤＮＡ形態に調整されており、各製品のマニュアルに従って容易に細胞に導入することができる。特に、ＧＦＰ遺伝子を利用すれば、コファクターや基質を必要とせず、生きた細胞で生じる現象をそのまま蛍光強度として観察、測定できる利点がある。また、安定にマーカー遺伝子を発現する細胞株を選択するのが容易になる。
【００１６】
ＩＬ−３依存性細胞株にＴＰＯ受容体遺伝子、薬剤耐性遺伝子、及びマーカー遺伝子を導入する方法としては、これらの遺伝子を含有してなるＤＮＡ（例えば、プラスミドやベクターなど）を、実施例に示すようにウイルスベクターを用いて導入する方法の他、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法など当業者に公知の方法を挙げることができる。例えば、市販のリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いる場合には、添付のマニュアルに従って操作を行ない、導入するプラスミドＤＮＡの量、リポフェクチンの量、細胞の種類、細胞数などは、予備検討を行ない最適条件を求めておくとよい。
【００１７】
前記形質転換細胞株の培養条件は、５％ＣＯ2及び飽和湿度条件下に３７℃が望ましい。また所望によりＩＬ−３や還元剤を培地中に添加してもよい。ＩＬ−３は、培養細胞の増殖を維持する作用を奏するものである。還元剤は、形質転換細胞の活性を上げ、その増殖を促進するという作用を奏するものである。ＩＬ−３としては、マウスリコンビナントＩＬ−３等のＩＬ−３の他、これを含有することが知られている培養物（例えばＷＥＨＩ−３細胞の培養上清など）を利用してもよい。還元剤としては、特に制約されるものではないが、作用の面から２−メルカプトエタノール、α−チオグリセロール等の還元剤を用いることが好ましい。
【００１８】
前記形質転換細胞株は、細胞表面にヒトＴＰＯ受容体を発現させた細胞株であるため、受容体からのシグナルが、細胞内に伝達されなければ増殖することができない。つまり、ヒトＴＰＯあるいはＴＰＯ様活性を有する化合物等が、細胞表面に発現したＴＰＯ受容体に結合しなければ、生存することができないものである。これらの細胞株は、ＴＰＯ様活性を有する物質の存在を、細胞株の生死で表現できることから、この分野の当業者にＴＰＯ様低分子化合物のスクリーニングに用いられている（例えば、ＷＯ０１／００７４２３号）。
【００１９】
なお、前記形質転換細胞株は、ヒトＴＰＯだけでなくマウスＴＰＯ及びマウスＩＬ−３によっても増殖することが知られている。これは、マウスＴＰＯがヒトＴＰＯ受容体とも反応すること、および、ＩＬ−３依存性細胞は、細胞膜上に生来のマウスＩＬ−３受容体を有していることに由来する。後述の実施例２にも示すように、ヒトＴＰＯ受容体挿入形質転換細胞を使った実験では、マウスＴＰＯやマウスＩＬ−３についても、ヒトＴＰＯと同様の挙動を示すことは公知の事実である（例えば、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３３，ｐ８５−９３，２００５）。
【００２０】
移植方法
本発明の動物モデルを作製するには、上記の形質転換細胞株をさらに動物に移植して生着させればよい。移植は該細胞を生理食塩水等中に適当な密度で分散させ、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射等により行えばよく、細胞株に応じて適宜移植方法を選択することができる。移植細胞数も、細胞株の種類に応じて適宜選択できるが、例えば、マウスであれば１匹当たり１０6〜１０7細胞を移植すればよい。このような外来細胞を動物に移植させる手法は当業者にとって公知である（例えば、特開２０００−３１２５４４など）。
【００２１】
本発明の動物モデルを作製するにあたり、用いる動物としてマウス、ラット、ハムスター等が挙げられるが、免疫機構の一部を欠損させることにより免疫不全の状態にしていることが望ましい。特に、免疫機構の一部を欠損させた近交系マウスである免疫不全マウスを用いることが望ましい。このようなマウスとして、具体的には、Ｔ細胞を欠損するヌードマウス、Ｂ細胞及びＴ細胞を欠損するＳＣＩＤマウス、ＳＣＩＤマウスに、さらにＮＫ細胞および/またはマクロファージ等の免疫細胞の活性を欠損させたＮＯＤ/ＳＣＩＤマウス、及び、ＮＯＤ/ＳＣＩＤマウスとインターロイキン−２受容体γ鎖ノックアウトマウスを掛け合わせて重度の免疫不全としたＮＯＧマウス等を挙げることができる。マウスの性別・齢などは特に制限がないが、例えば８〜１２週齢のものを用いることができる。なお、マウスは、ＳＰＦ動物（特に指定された微生物や寄生虫の居ない動物）が使用される。
【００２２】
測定の方法
本発明の動物モデルを用いて被験物質のＴＰＯ様活性を評価するためには、投与後に細胞数を測定し、その増減を調べる必要がある。簡便な手法として、移植部位の形成した細胞塊をノギス使って、長径と短径を測定し、体積を算出することによりその増減を調べることができる。また測定時に細胞塊を動物より取り出し、重量を測ったり、ＰＢＳやハンクス液等に分散させ血球計算板法や自動細胞計数機法により測定することもできる。
【００２３】
このとき好ましい実施形態としては、マーカー遺伝子を安定に発現できる細胞株を移植したマウスを用いて、被験物質投与後に、マーカー遺伝子の発現（例えば、蛍光強度）を測定することによって細胞数の増減を測定する方法である。例えば、マーカー遺伝子を安定に発現できる細胞株を皮下に移植したマウスを、イメージング装置（例えば、ＩＶＩＳTMＩｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｘｅｎｏｇｅｎ社）により測定する方法が挙げることができる。この方法では、動物を屠殺することなく、インビボの状態で細胞数の増減をリアルタイムでモニタリングをすることができる。
【００２４】
動物モデルの利用形態
本発明の動物モデルは、ＴＰＯ様物質のスクリーニングに使用することができる。例えば、適当な濃度の被検物質を当該モデルに投与し、その増殖の程度を調べることにより、被験物質のＴＰＯ様活性を検出することができる。すなわち、本発明の動物モデルでは、経口、皮下等の適当な方法で投与した被験物質が、移植された細胞へ移行したあと、そのＴＰＯ様活性に依存して細胞が生育・増殖するので、当該細胞株が増殖した場合は、被験物質がＴＰＯ様活性を有すると判断することができる。後述の実施例３に記載の実験では、ヒトＴＰＯ受容体を発現させたＢＡＦ／Ｂ０３細胞を、皮下組織内に移植したヌードマウスに、３−(２、６−ジクロロ−４−｛４−[２−フルオロ−３−（１−メトキシデシル）フェニル]チアゾール−２−イルカルボニル｝フェニル)−２−メチルアクリル酸ジナトリウム塩を公比４で最高用量１ｍｇ／ｋｇから０．０１５６ ｍｇ／ｋｇまでの４用量を１４日間連続で皮下投与したところ、細胞塊の体積が用量依存的に増大し、被験物質の有するＴＰＯ様活性の評価に有効でであることが確認されている。
【００２５】
また、本発明の動物モデルを使用して見出した被験物質は、ＴＰＯと比較して顕著な低分子化が達成されているため、組織、腫瘍への移行性に優れており、さらに高い吸収性を有する。このため、本発明の動物モデルを用いることにより、ＴＰＯのシグナルを細胞内に効率よく伝達する化合物を探索することができる。故に、これを含有する医薬製剤は、血小板減少が関与する血液疾患、癌や白血病等の化学治療後の血小板減少症などの治療薬としての利用が期待される。
【００２６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
Ｂａｆ／ｈ−Ｇ１細胞の作製方法
まず、コリンスらのＪ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３７：２９３−２９８（１９８８）に記載されている方法に準じて、ＢＡＦ／Ｂ０３細胞にヒトトロンボポエチン受容体遺伝子を導入して、受容体を安定に発現する細胞（以下、Ｂａｆ／ｈ細胞という。）を取得した。次に、レトロウィルスベクターｐＱＣＸＩＰ（ＢＤクロンテック社）を用いて、ＣＭＶプロモーター下流のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩサイトに、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（ＢＤクロンテック社）より制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで切り出したＥＧＦＰ遺伝子を組み込み、ベクターｐＱＣＸＩＰ−ＥＧＦＰを構築した。当該ベクターをパッケージング細胞である２９３ＧＰ２に、パッケージ用プラスミドｐＶＳＶ−Ｇベクターと共に導入して、１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地に懸濁した。細胞懸濁液を、ＣＯ2インキュベーター（ＣＯ2５％、３７℃）で培養して、レトロウィルスを産生させた。培養上清（ウィルス液）４０ｍｌを、超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製Ｌ８−６０、ＳＷ−２８ローター使用）にて１９４００ｒｐｍ×２時間遠心した後、生成した沈殿を１００μｌのＰＢＳに懸濁してウィルス濃縮液を作製した。上記のＢａｆ／ｈ細胞を増やした後、２４ウェルプレートに１０4個／ｍｌの濃度に捲種し、マウスＩＬ−３(５ｎｇ／ｍｌ)を含む１０％牛血清ＲＰＭＩ１６４０培地中にウィルス濃縮液５０μｌを添加して、培養を続けた（ＣＯ2５％、３７℃）。２４時間後にウィルスを除去してからさらに培養を続けた。増殖を確認した後、マウスＩＬ−３(５ｎｇ／ｍｌ)を含む０.１ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を分注した９６ウェルプレートに、この細胞を０．５個／ウェルとなるように捲種してクローニングし、蛍光顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＳ１００、Ｎｉｋｏｎ社製）下でＧＦＰの惹起を目視により採取した１１株の中から最も強く光った細胞株を「Ｂａｆ／ｈ−Ｇ１」として樹立した。
【実施例２】
【００２８】
（１）  Ｂａｆ／ｈ−Ｇ１細胞のヒトＴＰＯ及びヒトＴＰＯミメティクスへの反応性
実施例１において作製したＢａｆ／ｈ−Ｇ１細胞の、ヒトＴＰＯ及びヒトＴＰＯミメティクスに対する反応性について増殖誘導能を指標として検証した。まず、９６ウェルマイクロタイタ−プレ−トの各ウェルに、１０％牛血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁した５０００個の細胞を０．１ｍｌのスケールで分注した。次に、終濃度が０〜１００μＭとなるように調製した各被験物質溶液を、各ウェルに０．１ｍｌずつ添加後、５％ＣＯ2存在下、３７℃で３日間培養した。培養終了後、各ウェルに、ＰＢＳで６ｍｇ／ｍｌ に調製したＭＴＴ[３−(４、５-ジメチルチアゾ−ル-２イル)−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド]（シグマ社製）溶液２０μｌを添加し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で約４時間培養した。終了後、２０％ドデシルナトリウムスルホン酸（ＳＤＳ）の０．０２Ｎ−塩酸溶液を４０μｌ加えて、３７℃で約２４時間放置した後、イムノリ−ダ−（ＩｎｔｅｒＭｅｄ）によって５７０ｎｍの波長で、吸光強度（ＯＤ）を測定した。各被験物質濃度における吸光強度を測定し、その相関から各被験物質のＥＣ５０値（最大増殖能の５０％を示す最小濃度）を算出した（参照：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５〜６３，１９８３年）。結果を表１に示す。なお、ヒトＴＰＯミメティクスとして用いた化合物は以下の通りである。
化合物Ａ：（３−(２、６−ジクロロ−４−｛４−[２−フルオロ−３−（１−メトキシデシル）フェニル]チアゾール−２−イルカルボニル｝フェニル)−２−メチルアクリル酸ジナトリウム塩）
化合物Ｂ：（３−(２、６−ジクロロ４−｛４−[２−フルオロ３−（１−メトキシ３−プロポキシプロピル）フェニル]チアゾール２−イルカルボニル｝フェニル)−２-メチルアクリル酸）、
化合物Ｃ：（３−(４−｛４−[３−（４−ブトキシ−1−メトキシブチル）−２−フルオロフェニル]チアゾ−ル２−イルカルボニル｝−２、６−ジフルオロフェニル)−２−メチルアクリル酸）、
化合物Ｄ：（３−(２、６−ジクロロ４−｛４−[３−（４−エトキシ1−メトキシブチル）−２−フルオロフェニル]チアゾ−ル２−イルカルボニル｝フェニル)−２−メチルアクリル酸）、
化合物Ｅ：（３−(２、６−ジクロロ４−｛４−[３−（３−エトキシ1−メトキシプロピル）−２−フルオロフェニル]チアゾ−ル２−イルカルボニル｝フェニル)−２−メチルアクリル酸）及び、
化合物Ｆ：（３−(２、６−ジフルオロ４−｛４−[３−(３−イソブトキシプロピル)−２−メトキシフェニル]チアゾール２−イルカルボニル｝フェニル)−２−メチルアクリル酸）
【表１】
2006262820.tif 000002
【００２９】
表に示すように、Ｂａｆ／ｈ−Ｇ１細胞は、ヒトＴＰＯ及びヒトＴＰＯミメティクスに反応して増殖することがわかる。
（２）Ｂａｆ／ｈ−Ｇ１細胞のＩＬ−３及びＴＰＯに対する反応性
当該細胞の親株であるＢａＦ／Ｂ０３細胞は、マウスＩＬ−３の量に依存的に増殖することが知られている（例えば、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３３，ｐ８５−９３，２００５）。そこで、当該細胞についても、ヒトＩＬ−３、マウスＩＬ−３及びマウスＴＰＯとの反応性を検討した。測定は、上記方法に準じて行った。結果を、図１に示す。縦軸は、細胞が最大増殖を示すときの吸光度測定値を１００として求めた各被験物質濃度における吸光度の相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）として示したものである。図１に示すように、Ｂａｆ／ｈ−Ｇ１細胞は、ヒトＩＬ−３とは反応しないが、マウスＩＬ−３については、用量依存的に反応している。一方、ヒトＴＰＯだけでなく、マウスＴＰＯについても用量依存性が見られた。
【実施例３】
【００３０】
本発明の動物モデルによるＴＰＯ様活性の評価
実施例１で作製したＢａｆ／ｈ細胞をヌードマウスに移植した動物モデルを用いて、インビボにおけるＴＰＯ様活性を調べた。具体的には、まず１０7個のＢａｆ／ｈ細胞を含むＲＰＭＩ１６４０溶液をヌードマウス右背部皮下に、マイジェクター（登録商標、インスリン用注射針付シリンジ）により０．１ｍｌ移入した。移植当日（ｄａｙ０）に化合物Ａを、５％ブドウ糖液（０．２５％アミノ酸、０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（和光純薬））に溶解させて、０．１ｍｇ／ｍｌ、 ０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．００６２５ｍｇ／ｍｌ、 ０．００１５６ｍｇ／ｍｌの各濃度に調製した後に、これらの溶液を移植反対側の皮下もしくは、臀部皮下にツベルクリン用２６Ｇシリンジ付１ｍｌ注射筒で１日１回、１４連日投与した。最終投与翌日（ｄａｙ１４）にＢａｆ／ｈ細胞塊の長径と短径をノギス（ミツトヨ製）で測定し，細胞塊の体積（長径×（短径）2×１／２）を計算した（単位はｍｍ3）。この測定結果を図２に示した。
（結果）対照群のビークル群が１４日目においても、Ｂａｆ／ｈ細胞塊が形成されなかったのに対して、化合物Ａを投与した群においては、投与日数及び投与量に応じて、Ｂａｆ／ｈ細胞塊の体積が増加していることがわかる。このことは、本発明の動物モデルが、被験物質のＴＰＯ様活性を評価できることを示唆している。
【実施例４】
【００３１】
本発明の動物モデルによるＴＰＯ様活性の評価
実施例１にて作製したＢａｆ／ｈ−Ｇ１細胞をヌードマウスに移植し、ＴＰＯ様活性をリアルタイムｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置により増殖活性を測定した。まず、５×１０6個のＢａｆ／ｈ細胞を含むＲＰＭＩ溶液をヌードマウス右背部皮下にマイジェクターR（インスリン用２７Ｇ注射針付シリンジ）で０．１ｍｌ移入した(ｄａｙ ０)。翌日(ｄａｙ １)から、リアルタイムｉｎ  ｖｉｖｏイメージング装置（Ｘｅｎｏｇｅｎ社、ＩＶＩＳTM２００）を用いて、各動物の体内から得られる蛍光強度（フォトン数）を測定した。本実験では、ビークル投与群と各被験物質投与群（４匹／群）を設定した。前群には、ビークル（０．５％メチルセルロース溶液）をマウスの体重２０gあたり０．２ｍｌを投与し、また後群には、被験物質を２０ｍｇ／ｋｇ投与した。被験物質としては、実施例２に示す化合物Ｂ〜Ｆを用いた。これらの化合物は、いずれも細胞を使ったインビトロ評価系においてＴＰＯ様活性が確認されている（実施例２参照）。各化合物を秤量後、乳鉢で粉砕し、ビークルに懸濁させて、０．２％（Ｖ／Ｖ）溶液に調整した。この溶液を１日１回、１４日間反復経口投与した。投与方法は、各化合物の０．２％溶液をマウス用経口ゾンデ針の付いた１ｍｌシリンジでマウス体重２０ｇあたり０．２ｍｌの用量で投与し、最終投与の翌日（ｄａｙ １５）に当該イメージング装置を用いてマウス体内より発する５１５〜５７５ｎｍの蛍光波長を測定した。
（結果）図３は、投与終了翌日にＴＰＯミメティクスによるＢａｆ／ｈ−Ｇ１細胞の増殖活性能を、フォトン数によって示したものである。化合物ＢからＦまで、いずれの化合物もビークル投与群よりもフォトン数が高く、これは化合物の経口投与によってマウス皮下に移植したＢａｆ／ｈ−Ｇ１細胞が増殖していることを示している。また、各々の化合物によってフォトン数が異なっており、生体内での増殖活性能に違いがあることを意味している。これらの増殖活性は、実施例２に示すインビトロでの増殖誘導能測定のみでは解らない体内動態の影響も考慮したＴＰＯミメティクスの評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】培養したＢＡＦ／Ｇ１細胞に、各種濃度のヒトＩＬ−３（ｒｈＩＬ−３）、マウスＩＬ−３（ｒｍＩＬ−３）、ヒトＴＰＯ（ｒｈＴＰＯ）、及びマウスＴＰＯ（ｒｍＴＰＯ）を添加した場合の細胞増殖を相対値（％）として示したものである。
【図２】本発明の動物モデルに、各種濃度のＴＰＯミメティクスである化合物Ａを投与したとき、ＢＡＦ／ｈ細胞が経時的に増殖することを示す図である。
【図３】本発明の動物モデルを用いて、ＴＰＯミメティクスのＴＰＯ様活性を評価した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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