(57)【要約】      （修正有）【課題】口腔衛生商品用の酵素として有用なムタナーゼをコードする遺伝子の取得並びにその遺伝子を用いた単一且つ大量のムタナーゼを生産する方法の確立。【解決手段】以下の酵素学的性質を有するムタナーゼ。１．作用：α−１，３−グルカンを加水分解する。２．基質特異性：ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する。３．最適反応ｐＨ：ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す。４．ｐＨ安定性：ムタンを基質として３０℃で３０分間処理した場合、ｐＨ５〜１０の範囲で安定である。５．最適反応温度：ムタンを基質としてｐＨ６．５で反応させた場合、４５〜５０℃において高い活性を示す。６．耐熱性：ムタンを基質としてｐＨ６．５で１５分間熱処理した場合、５０℃まで安定である。７．分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約１２０ｋＤａである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するムタナーゼ。
１．作用：
α−１，３−グルカンを加水分解する。
２．基質特異性：
ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す。
４．ｐＨ安定性：
ムタンを基質として３０℃で３０分間処理した場合、ｐＨ５〜１０の範囲で安定である。
５．最適反応温度：
ムタンを基質としてｐＨ６．５で反応させた場合、４５〜５０℃において高い活性を示す。
６．耐熱性：
ムタンを基質としてｐＨ６．５で１５分間熱処理した場合、５０℃まで安定である。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約１２０ｋＤａである。
８．等電点：
等電点電気泳動法により測定した等電点が６．０〜７．０である。
【請求項２】
以下の酵素学的性質を有するムタナーゼ。
１．作用：
α−１，３−グルカンを加水分解する。
２．基質特異性：
ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す。
４．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
５．アミノ末端のアミノ酸配列：
アミノ末端側の１９アミノ酸残基の配列が、
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙである。
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
請求項３記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項６】
以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなる配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
請求項６記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項９】
請求項４、５、７又は８記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
宿主が微生物である請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換体を培養し、ムタナーゼを採取することを特徴とするムタナーゼの製造方法。
【請求項１３】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２１として寄託された微生物（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス属細菌由来のムタナーゼ、及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯科領域の二大疾患である歯周病とウ蝕は、生活習慣と深い関わりをもつことが知られている。従って、これらの疾患を効果的に予防できる口腔衛生関連の商品を開発することはきわめて重要なことである。
ウ蝕は、ストレプトコッカス  ミュータンス等の細菌が歯垢中の糖類から乳酸や酢酸等の酸を生成することが原因とされる。口腔中のストレプトコッカス  ミュータンスは、食餌中のショ糖を基質として高分子のグルカンを合成し、それが歯垢形成の開始に関与するといわれている。合成されるグルカンには水溶性のα−１，６結合を主体とするデキストランと不溶性のα−１，３結合を主体とするムタンがあり、歯垢形成の開始には粘着性で不溶性のムタンの関与が大きいとされている（非特許文献１、２）。即ち、ムタンを分解することで歯垢形成を阻止できると共にウ蝕の誘発を抑えることができると考えられる。
【０００３】
従ってムタンを分解するムタナーゼの開発は、非常に重要であり、ムタナーゼあるいはムタナーゼ生産菌について報告がなされている（特許文献３−６）。またムタナーゼだけではなく、デキストランを分解するデキストラナーゼとの併用がより歯垢の分解に効果があることも報告されている（非特許文献７）。
【非特許文献１】浜田茂幸  虫歯はどうしてできるか  岩波新書  １９８２年
【非特許文献２】Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１，３８１１−３８１７，１９９３
【非特許文献３】嶋田ら、口腔衛生学会誌、３３、８９−９８，１９８３
【特許文献１】特開昭４７−９７４３号公報
【特許文献２】特開昭６３−３０１７８８号公報
【特許文献３】特開平９−３７７７３号公報
【特許文献４】特開平１０−２０１４８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、口腔衛生商品用の酵素として有用なムタナーゼを見出し、それらをコードする遺伝子の取得並びにその遺伝子を用いた単一且つ大量のムタナーゼを生産する方法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、自然界から歯垢分解に関わるグルカナーゼ、特にα−１，３グルカンであるムタンを分解する酵素（ムタナーゼ）の生産菌をスクリーニングし、特定の性質を有するムタナーゼを見出した。更に当該ムタナーゼをコードする遺伝子をクローン化し、これを用いることにより当該ムタナーゼを遺伝子工学的に製造できること、また当該ムタナーゼのアミノ酸配列のうち連続した一部のアミノ酸配列からなるタンパク質がムタナーゼ活性を有することを見出した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の酵素学的性質を有するムタナーゼを提供するものである。
１．作用：
α−１，３−グルカンを加水分解する。
２．基質特異性：
ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す。
４．ｐＨ安定性：
ムタンを基質として３０℃で３０分間処理した場合、ｐＨ５〜１０の範囲で安定である。
５．最適反応温度：
ムタンを基質としてｐＨ６．５で反応させた場合、４５〜５０℃において高い活性を示す。
６．耐熱性：
ムタンを基質としてｐＨ６．５で１５分間熱処理した場合、５０℃まで安定である。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約１２０ｋＤａである。
８．等電点：
等電点電気泳動法により測定した等電点が６．０〜７．０である。
【０００７】
また本発明は、以下の酵素学的性質を有するムタナーゼを提供するものである。
１．作用：
α−１，３−グルカンを加水分解する。
２．基質特異性：
ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す。
４．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
５．アミノ末端のアミノ酸配列：
アミノ末端側の１９アミノ酸残基の配列が、
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙである。
【０００８】
また本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのタンパク質及びこれをコードする遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
また本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１０】
また本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのタンパク質及びこれをコードする遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなる配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
【００１１】
また本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）いずれかのポリヌクレオチドからなる遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号２に示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１２】
また本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、該形質転換体を培養し、ムタナーゼを採取することを特徴とするムタナーゼの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の遺伝子を用いれば、歯垢形成の阻止、ウ蝕予防のための口腔衛生商品への配合用酵素として有用なムタナーゼ及び小型化ムタナーゼを単一且つ大量に生産することができる。また、このムタナーゼ及び小型化ムタナーゼはガム、キャンディー等の食品へ配合することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のムタナーゼは、新規酵素であり、以下の酵素学的性質を有するものである。
（１）作用
ムタンに作用しこれを加水分解する。すなわち、ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分解する。
（２）基質特異性
ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する。即ち、本発明のムタナーゼ溶液（０．００４単位／ｍＬ）に対し、標準反応条件下（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．５ｍＭ  塩化コバルト、０．２％ムタンからなる反応液にムタナーゼ溶液を添加し、４０℃、６０分間反応させる）、様々な多糖類（０．２％ムタン、ニゲラン、デキストラン、プルラン、スターチ、β‐グルカン、キトサン）を添加し反応を行うと、ムタン及びニゲランをよく分解し、ムタンを特によく分解する。
（３）至適作用ｐＨ
酢酸（ｐＨ４−６）、クエン酸（ｐＨ４．３−６．４）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６−７．８）、リン酸（ｐＨ６．４−８）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ７．３−１０）、炭酸（ｐＨ９．６−１１．２）の各緩衝液で各ｐＨに調整した０．２％ムタン溶液に本発明のムタナーゼを０．００４単位／ｍＬとなるように加え、４０℃で６０分間反応させ、活性を測定し、至適ｐＨでの活性を１００％とするときの各ｐＨでの相対活性を求めた場合、ｐＨ６付近において作用が至適であり、特にｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す（図１）。
（４）作用ｐＨ
酢酸（ｐＨ４−６）、クエン酸（ｐＨ４．３−６．４）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６−７．８）、リン酸（ｐＨ６．４−８）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ７．３−１０）、炭酸（ｐＨ９．６−１１．２）の各緩衝液で各ｐＨに調整した０．２％ムタン溶液に本発明のムタナーゼを０．００４単位／ｍＬとなるように加え、４０℃で６０分間反応させ、活性を測定し、至適ｐＨでの活性を１００％とするときの各ｐＨでの相対活性を求めた場合、ｐＨ５．５〜７．０で９０％以上の活性を示し、ｐＨ５．０〜８．０で８０％以上の活性を示す（図１）。
（５）ｐＨ安定性
本発明のムタナーゼを２５ｍＭの酢酸（ｐＨ４−６）、クエン酸（ｐＨ４．３−６．４）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６−７．８）、リン酸（ｐＨ６．４−８）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ７．３−１０）、炭酸（ｐＨ９．６−１１．２）、リン酸（ｐＨ１１−１２．５）の各緩衝液中に０．０１単位／ｍＬとなるように添加し、３０℃、３０分間恒温した後の残存活性を測定すると、ｐＨ５〜１０の範囲で８０％以上の残存活性を示し、安定である（図４）。
（６）最適反応温度
ムタンを０．２％含有するｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液に、本発明のムタナーゼを０．００３単位／ｍＬとなるように加え、６０分間各温度で反応させ、４５℃での活性を１００％として各温度での相対活性を求めた場合、４５℃〜５０℃で最も反応速度が高い（図２）。
（７）耐熱性
２５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に０．００４単位／ｍＬの本発明のムタナーゼを加え、３０℃〜７０℃で１５分間放置する。その後、急冷し、標準反応条件を用いて残存活性を測定したところ、５０℃において９０％以上の残存活性を示し安定である（図３）。
（８）分子量
１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により精製した本酵素の分子量は、約１２０ｋＤａである（但し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では測定条件により１０ｋＤａ程度上下することがある）。
（９）等電点
等電点電気泳動法に測定した等電点は、６．０〜７．０である。また、ＰＡＧプレート（ファルマシア）を用いて測定した等電点は、６．５付近である。
【００１６】
また、本発明のムタナーゼは以下の酵素学的性質を有するムタナーゼも包含する。
（１）作用
α−１，３−グルカンを加水分解する。
（２）基質特異性
ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する。
（３）最適反応ｐＨ
ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す。
（４）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである（但し、５ｋＤａ程度上下することがある）。
（５）アミノ末端のアミノ酸配列
アミノ末端側の１９アミノ酸残基の配列が、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙである。このアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から６６８番目のアミノ酸までのアミノ酸配列に相当するものである。
【００１７】
また、本発明のムタナーゼには（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含される。
【００１８】
ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列とそれぞれ等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてムタナーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１９】
本発明の配列番号１に示すムタナーゼのアミノ酸配列と公知のムタナーゼのアミノ酸配列との同一性を比較した結果、バチルス  エスピー  ＲＭ１株の生産するムタナーゼ（特開平１０−２０１４８３号報）と７５．６％の同一性を示した。その他の公知のムタナーゼとの同一性は極めて低く、本発明のムタナーゼは新規な酵素であることが示唆された。
【００２０】
従って、配列番号１に示すアミノ酸配列と相当する配列を適切にアライメントした時、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有し、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質は上記ムタナーゼと等価であり本発明に含まれる。
【００２１】
ここで、ムタナーゼ活性を有するとは、ムタンに作用し、そのα−１，３−グルコシド結合を分解する活性を意味するが、その活性の程度は、その機能を発揮する限り配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度のもののみならず、これより高いもの、或いは低いものであってもよい。
【００２２】
また、上記ムタナーゼと等価なタンパク質は、ムタナーゼ活性を有していれば、さらに付加的な性質を有していても良い。斯かる性質としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、低温及び／又は高温においてのみ異なる機能を有する性質、最適pＨが異なるという性質などが挙げられる。
【００２３】
また、配列番号１に示すアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなるタンパク質は、上記ムタナーゼと同様の酵素学的性質を有する。すなわち、（１）α−１，３−グルカンを加水分解する、（２）ムタン及びニゲランを分解し、特にムタンをよく分解する、（３）ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す、（４）ムタンを基質として３０℃で３０分間処理した場合、ｐＨ５〜１０の範囲で安定である、（５）ムタンを基質としてｐＨ６．５で反応させた場合、４５〜５０℃において高い活性を示す、（６）ムタンを基質としてｐＨ６．５で１５分間熱処理した場合、５０℃まで安定である、（７）等電点電気泳動法により測定した等電点が６．０〜７．０である、という性質を有する。以下、この分子量の小さいムタナーゼ様タンパク質を「小型化ムタナーゼ」と称する。
【００２４】
すなわち、小型化ムタナーゼには、以下（ａ）〜（ｃ）のものが包含される。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなる配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質
【００２５】
本発明の遺伝子は、配列番号１に示すアミノ配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであるが、（ａ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）当該遺伝子とストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子が好ましい。すなわち、本発明の遺伝子には、配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡにおいて、変異剤処理、ランダム変異、特定部位突然変異、欠損あるいは挿入等によって部分的に塩基配列が変化したものであっても、これらのＤＮＡ変異体が配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレトチドからなる遺伝子を包含するものである。
【００２６】
ここで「ストリンジエントな条件」とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  −ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。即ち、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００２７】
また、上記（ｂ）又は（ｃ）で示される遺伝子は、例えば、（ａ）で示される遺伝子に比べて、ｍＲＮＡの発現量が多い、そのｍＲＮＡの安定性が高い、翻訳されるタンパク質の安定性が優れている、等の付加的な性質を有していてもよい。
【００２８】
また、本発明は小型化ムタナーゼに関する遺伝子を提供するが、斯かる遺伝子としては、配列番号１に示すアミノ酸配列の６５０番目のアミノ酸から１２１７番目のアミノ酸からなるタンパク質（小型化ムタナーゼ）又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよく、好ましくは（ａ）配列番号２に示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号２で示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２で示される塩基配列の１９４８番目の塩基から３６５１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つムタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる遺伝子が挙げられる。
【００２９】
なお、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。具体的にはＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウエァ開発）のサーチホモロジーやマキシマムマッチングプログラムを用いて同一性を求めることができる。
【００３０】
本発明のムタナーゼは、例えば、バチルス属に属する微生物、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株や本菌と同等の菌学的性質並びに生理学的性質を有する菌を公知の方法により培養することで生産、取得することができる。バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株の菌学的性質並びに生理学的性質を以下に示す。
【００３１】
（ａ）細胞の形、大きさ：桿菌（０．５３〜０．７３ｘ２〜２．７μｍ）
（ｂ）細胞の多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子：有り、中央、膨潤有り（０．６７〜１．０ｘ１．３〜２．０μｍ）
（ｅ）グラム染色：陽性
Ｂ．生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元：陰性
（ｂ）カタラーゼ：陽性
（ｃ）ＶＰテスト：陽性
（ｄ）インドールの生成：陰性
（ｅ）澱粉の加水分解：陽性
（ｆ）ジヒドロキシアセトンの生成：陽性
（ｇ）オキシダーゼ：陽性
（ｈ）グルコースからの酸産生：陽性
（ｉ）アラビノースからの酸産生：陰性
（ｊ）キシロースからの酸産生：陽性
（ｋ）マンニットからの酸産生：陰性
（ｌ）グルコースからのガス産生：陰性
（ｍ）レシチナーゼ：陰性
（ｎ）クエン酸の利用：陽性
（ｏ）プロピオン酸の利用：陰性
（ｐ）チロシンの分解：陰性
（ｑ）フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性
（ｒ）カゼインの分解：陽性
（ｓ）ゼラチンの分解：陽性
（ｔ）嫌気性下での生育：生育する
（ｕ）食塩耐性：２％以下
（ｖ）生育温度：１５℃〜３５℃
（ｗ）ＹＭ寒天培地：弱い生育
（ｘ）ニュートリエント寒天培地：生育する
【００３２】
上記のＫＳＭ−Ｍ８６株の菌学的性質並びに生理学的性質についてBergey's Mannual of Systematic Bacteriology (Williams & Wilkins社、1984年)の記載に準じ検討した結果、バチルス属細菌に属することは明白であったが、種については既知のバチルス属細菌とは完全に一致するものではなかった。そこで新規な微生物として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７２１）として寄託した。
【００３３】
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６から本発明のムタナーゼを生産するには、０．００５％〜１０％（ｗ／ｖ）のムタンを添加した培地に植菌し、適当な温度で好気的な条件下で培養すればよい。培養液からのムタナーゼの精製は、常法に従って行うことができる。即ち、培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、上清を硫安添加により酵素を沈殿させたり、あるいは限外ろ過膜などを用いて濃縮することができる。さらに噴霧乾燥、凍結乾燥、結晶化などにより様々な形態として調製することができる。
【００３４】
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６から得られた本発明のムタナーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によって測定した分子量が約４０ｋＤａ（但し、５ｋＤａ程度上下することがある）であり、ムタンを基質として４０℃で反応させた場合、ｐＨ６〜６．５の範囲で高い活性を示す。また、アミノ末端側の１９アミノ酸残基の配列が、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙである。
【００３５】
本発明のムタナーゼは上記のように自然界から得ることが可能ではあるが、その遺伝子を上記微生物の染色体ＤＮＡからクローニングし、当該ムタナーゼを大量に生産、取得することもできる。
ムタナーゼ遺伝子のクローニング方法としては、例えば当該遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させる、あるいは当該遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる等の方法で本発明のムタナーゼをコードするＤＮＡを安定に増幅し、さらに当該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、ムタナーゼを生産させる方法が採用できる。
【００３６】
また、本発明のムタナーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、当該酵素を安定に発現させることができ、当該遺伝子を安定に保持できるベクターにムタナーゼ遺伝子を組込めばよい。係る発現用ベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＹＬ（タカラバイオ）等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ＰＹＬ等が挙げられる。
【００３７】
なお、本発明の小型化ムタナーゼを得る場合には、上記微生物の染色体と上記微生物の染色体ＤＮＡからクローニングしたムタナーゼ遺伝子配列を元にデザインした適当なプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、小型化ムタナーゼ遺伝子を取得し、例えば当該遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させる、あるいは当該遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる等の方法で本発明の小型化ムタナーゼをコードするＤＮＡを安定に増幅し、さらに当該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、小型化ムタナーゼを生産させる方法が採用できる。
【００３８】
得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するには、塩化カルシウム法、プロトプラスト法、コンピテントセル法やエレクトロポレーション法等を用いることができる。宿主菌としては、例えば枯草菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌等が挙げられ、好ましくは枯草菌で、より好ましくはプロテアーゼ遺伝子が欠損若しくは欠失した枯草菌である。
【００３９】
形質転換体は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適度な条件下で培養すればよい。培養液から、一般的な方法により酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００４０】
さらに本発明のムタナーゼ及び小型化ムタナーゼは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して生産性の向上、比活性の向上等を目論み、変異酵素を調製することもできる。例えば、ムタナーゼ又は小型化ムタナーゼをコードする遺伝子に対し、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えば宝酒造社のＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎｔ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）を用いることもできる。
以上のように調製された本発明のムタナーゼ及び小型化ムタナーゼは、各種口腔衛生商品、特に歯磨き剤、あるいはガム、キャンディーのような形態の商品への配合用酵素として有用である。
【実施例】
【００４１】
実施例１  ムタナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌サンプル０．５ｇを生理食塩水（５ｍＬ）に懸濁し、８０℃で２０分間処理を行った。その後、表１記載の組成からなる液体培地（４ｍＬ）に０．１ｍＬの熱処理上清液を添加し、３０℃で７日間振盪培養を行った。菌が生育した培養液は、新たな同組成の培地へ０．１ｍＬ接種し、さらに７日間振盪培養を行った。この操作をさらに１回繰り返した後、菌液をトリプティケースソイ寒天培地へ塗抹し、３０℃で３日間、静置培養を行った。生育した菌を選抜し、純化した後に液体培地へ接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行い、上清液中のムタナーゼ活性を測定した。ムタナーゼ生産量の高い菌株の中からバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株を選抜した。
【００４２】
【表１】
2006136248.tif 000002
【００４３】
実施例２  ムタナーゼの生産並びに精製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株を１．５％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１．０％魚肉エキス（和光）、０．１％リン酸２カリウム、０．０１％硫酸マグネシウム７水塩、０．００１％硫酸マンガン、０．１％ムタンからなる７０ｍＬの液体培地に接種し、３０℃、３日間振盪培養を行った。培養液（０．０８４Ｕ／ｍＬ）を遠心分離（８，０００ｘｇ、１０分間、４℃）し、得られた上清液２Ｌに対し、硫安を８０％飽和になるように徐々に加え遠心分離（８，０００ｘｇ、１５分間、４℃）し、沈殿を集め、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し１昼夜透析を行った。透析内液を予め５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＳｕｐｅｒＱ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた。ムタナーゼ活性は非吸着画分に得られ、次いで予め０．７５Ｍ硫安を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいたＢｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた後、０．７５Ｍ〜０Ｍ硫安の直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。ムタナーゼ活性画分を集め、限外ろ過にて濃縮脱塩を行い、予め１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた。０．１Ｍまでの塩化カリウムを用いた直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させ、活性画分を集め、予め１０ｍＭリン酸緩衝液にて平衡化しておいたヒドロキシアパタイトカラムへ吸着させた。同緩衝液で溶出された画分に活性が認められ、集めて濃縮した。濃縮液のＳＤＳ電気泳動を行ったところ、分子量４０ｋＤａ付近に均一のタンパク質バンドが確認された。このバンドのアミノ末端のアミノ酸配列を解析した結果、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙの１９アミノ酸配列が決定された。
【００４４】
実施例３  ムタナーゼ遺伝子のクローニング
実施例２で得られた１９アミノ酸配列を基にプライマー１（配列番号３）、プライマー２（配列番号４）をデザインした。
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株を１．０％(w/v) バクトトリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１．０％ＮａＣｌ、から成る１０ｍＬの液体培地に接種し、３０℃、１日間振盪培養した後、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（タカラバイオ）を用いて菌体から染色体を抽出した。ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ）に従い、得られた染色体５μｇをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理した後、カセット（キット添付）と連結させ、プライマー１とプライマーＣ１（キット添付）を用いたＰＣＲを行った。得られた増幅断片を鋳型とし、さらにプライマー２とプライマーＣ２（キット添付）を用いたＰＣＲを行い、約０．８ｋｂのＰＣＲ増幅断片を取得した。増幅したＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ）と連結し、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換した。白色形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、プライマー２とプライマーＣ２を用いてシーケンスを行い、ムタナーゼ遺伝子の部分配列を解析した。得られた塩基配列を基にプライマーを構築し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットによりムタナーゼをコードする遺伝子を含む４７６３ｂｐの塩基配列を決定した。
本発明のムタナ−ゼの発現には枯草菌のｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター領域を利用した。公知の枯草菌の遺伝子配列及び決定したムタナーゼ遺伝子配列を基にプライマー３（配列番号５）、プライマー４（配列番号６）、プライマー５（配列番号７）をデザインした。枯草菌１６８株（BGSC 1A1）の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー３及びプライマー４を用いてＰＣＲを行い、ｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター領域、約０．２ｋｂの増幅断片を取得した。ＰＣＲはLA Taq（タカラバイオ）を用い、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で２分間保温した。次にバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、取得した約０．２ｋｂのＤＮＡ断片とプライマー５を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で３分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で２分間保温した。増幅した約３．９ｋｂＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅI及びＢｇｌIIで処理し、同様にＳｐｅI及びＢｇｌIIで処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）と連結反応を行い、反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ）を形質転換した。テトラサイクリン耐性株からムタナーゼ遺伝子を導入したプラスミドを選択した。形質転換体からムタナーゼ遺伝子を含むプラスミドを抽出し、アルカリプロテアーゼを欠損させた枯草菌ＩＳＷ１２１４株（ヤクルト本社）を形質転換した。
【００４５】
実施例４  小型化ムタナーゼ（Δ）の作製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株のムタナーゼ遺伝子配列を基にデザインしたプライマー６（配列番号８）とプライマー５（配列番号７）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＬＡ  Ｔａｑを用い、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で２分間保温した。増幅した約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製後、制限酵素ＳａｌI及びＢｇｌIIにて処理し、同様にＳａｌI及びＢｇｌIIにて処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）と連結反応を行った。反応溶液を用いて、大腸菌ＨＢ１０１株のコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換し、テトラサイクリン耐性菌から小型化ムタナーゼ遺伝子領域が導入されたプラスミドを選択した。
実施例３と同様に小型化ムタナ−ゼの発現には枯草菌のｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター領域を利用した。即ち公開されている枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡの塩基配列を基に、プライマー７（配列番号９）、プライマー８（配列番号１０）を設計した。さらにＳＤ配列並びにシグナル配列はバチルス  エスピー  ＫＳＭ−６４株のアルカリセルラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ８４９６３）の配列を利用し、プライマー９（配列番号１１）、プライマー１０（配列番号１２）を設計した。また、小型化ムタナーゼ遺伝子配列を基にシグナル配列との結合を考慮し、プライマー１１（配列番号１３）及びプライマー１２（配列番号１４）を設計した。
枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー７とプライマー８を用いてプロモーター領域のＰＣＲを、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−６４株の染色体ＤＮＡを鋳型にプライマー９とプライマー１０を用いてＳＤ配列及びシグナル領域のＰＣＲを、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｍ８６株の染色体ＤＮＡを鋳型にプライマー１１とプライマー１２を用いて小型化ムタナーゼ領域のＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとして３０サイクル行い、更に７２℃で２分間保温した。増幅したＤＮＡ断片を用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行い、更に引き続きプライマー７とプライマー１２を添加したＰＣＲを行い、３断片を結合させた約０．５ｋｂの増幅断片を取得した。取得したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨI及びＨａｅII処理し、同様にＢａｍＨI及びＨａｅII処理したムタナーゼ遺伝子下流領域が導入されたプラスミドと結合反応を行った。反応溶液を用いて大腸菌ＨＢ１０１コンピテントセルを形質転換し、テトラサイクリン耐性株から小型化ムタナーゼ遺伝子を導入したプラスミドを選択した。形質転換体から小型化ムタナーゼ遺伝子を含むプラスミドを抽出し、アルカリプロテアーゼを欠損させた枯草菌ＩＳＷ１２１４株（ヤクルト本社）を形質転換した。
【００４６】
実施例５  組換えムタナーゼ及び小型化ムタナーゼ（Δ）の生産と精製
実施例３及び実施例４で得られた形質転換体を８％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、１％魚肉エキス、０．５％酵母エキス、０．２％リン酸カリウム、０．０４％硫酸マグネシウムからなる培地（５０ｍＬ）に接種し３０℃、３日間振盪培養を行った。
培養液（０．２８Ｕ／ｍＬ、Δは０．０６８Ｕ／ｍＬ）を遠心分離（８，０００×ｇ、１０分間、４℃）し、得られた上清液６００ｍＬに対し、硫安を８０％飽和になるように徐々に加え遠心分離（８，０００×ｇ、１分間、４℃）し、沈殿を集め、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し１昼夜透析を行った。透析内液を予め５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＳｕｐｅｒＱ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた。ムタナーゼ活性は非吸着画分に得られ、次いで予め１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６）で平衡化しておいたＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた後、０〜０．１Ｍ塩化カリウムの直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。ムタナーゼ活性画分を集め、１Ｍになるように硫安を添加した後、予め１Ｍ硫安を含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいたＰｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムへ添着させた。１Ｍから０Ｍまでの硫安を用いた直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させ、活性画分を集め、限外ろ過にて濃縮した。予め０．１Ｍ塩化カリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＢｉｏ−Ｇｅｌ−Ａ０．５ｍゲルろ過カラムへ濃縮液をのせた。溶出された画分の中で活性が認められたフラクションを集めて濃縮した。濃縮液のＳＤＳ電気泳動を行ったところ、分子量約１２０ｋＤａ付近に均一のタンパク質バンドが確認され、この濃縮液を用いて諸性質の検討を行った。なお、小型化ムタナーゼ（Δ）の場合は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムまでで完全に精製され、活性画分の濃縮液についてＳＤＳ電気泳動を行ったところ、分子量約５７ｋＤａ付近に均一のタンパク質バンドが確認され、この濃縮液を用いて諸性質の検討を行った。
【００４７】
実施例６  組換えムタナーゼの性質
１．最適反応ｐＨ
酢酸（ｐＨ４−６）、クエン酸（ｐＨ４．３−６．４）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６−７．８）、リン酸（ｐＨ６．４−８）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ７．３−１０）、炭酸（ｐＨ９．６−１１．２）の各緩衝液を用い、反応を行った。その結果、本酵素はｐＨ６付近のクエン酸緩衝液中で最も反応速度が高かった（図１）。
２．最適反応温度
標準反応条件において反応温度を３０℃〜８０℃とし、反応を行った。その結果、本酵素は、４５℃〜５０℃付近で最も反応速度が高かった（図２）。
３．耐熱性
酵素を２５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に添加し、３０℃〜７０℃で１５分間放置した。その後、急冷し、標準反応条件を用いて残存活性を測定した。その結果、本酵素は５０℃まで安定であった（図３）。
４．ｐＨ安定性
酵素を２５ｍＭの酢酸（ｐＨ４−６）、クエン酸（ｐＨ４．３−６．４）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６−７．８）、リン酸（ｐＨ６．４−８）、グリシン水酸化ナトリウム（ｐＨ７．３−１０）、炭酸（ｐＨ９．６−１１．２）、リン酸（ｐＨ１１−１２．５）の各緩衝液中に添加し、３０℃、３０分間恒温した後の残存活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ５−１０の範囲で安定であった（図４）。
５．基質特異性
標準反応条件下においてムタンの代わりに様々な多糖類（全て０．２％）を添加し、反応を行った。その結果、本酵素はムタンの他にニゲランを分解することができたが、他のα−１，３グルカン以外の多糖類を分解することはなかった。
６．分子量
１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により本酵素の分子量は約１２０ｋＤａであった（但し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では測定条件により１０ｋＤａ程度上下することがある）。
７．等電点
ＰＡＧプレート（ファルマシア）を用いて本酵素の等電点を測定した結果、６．５付近であった。
尚、アミノ酸６５０番目から１２１７番目までの小型化ムタナーゼ（Δ）の１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約５７ｋＤａ、ＰＡＧプレート（ファルマシア）を用いて測定した等電点はｐＨ６．５付近であった。最適反応温度（図５），最適反応ｐＨ（図６）、基質特異性などの性質は野生型ムタナーゼの性質とほぼ一致した。
【００４８】
参考例  ムタナーゼ活性測定法
上記、酵素学的性質における酵素活性は、以下に示す方法により行った。
５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．５ｍＭ  塩化コバルト、０．２％ムタンからなる反応液に適当に希釈した酵素液を添加し、４０℃、６０分間恒温した（全量１ｍＬ）。１ｍＬのＤＮＳ試薬［０．５％（ｗ／ｖ）ジニトロサリチル酸、０．４Ｎ  水酸化ナトリウム、３０％  酒石酸ナトリウム・カリウム］を添加した後、１００℃で５分間恒温し、生成された還元糖を定量した。ムタナーゼ１単位（ユニット）は、上記反応条件下で１分間に１μｍｏＬのグルコースに相当する還元糖を生成する量とした。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明のムタナーゼの最適反応ｐＨを示すグラフである。
【図２】本発明のムタナーゼの最適反応温度を示すグラフである。
【図３】本発明のムタナーゼの耐熱性を示すグラフである。
【図４】本発明のムタナーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。
【図５】本発明の小型化ムタナーゼの最適反応温度を示すグラフである。
【図６】本発明の小型化ムタナーゼの最適反応ｐＨを示すグラフである。
【図１】
2006136248.tif 000003
【図２】
2006136248.tif 000004
【図３】
2006136248.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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