(57)【要約】  【課題】  優れた抗ウイルス剤、特に抗コロナウイルス剤として使用可能な新規化合物を提供する。  【解決手段】式（Ｉ）：【化１】2006169176.tif 000014（式中、Ｒ1は水素または低級アルキルであり、Ｒ2は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ3はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ4はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、ｍは０〜２の整数であり、ｎは０〜４である）で示される化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2006169176.tif 000011
（式中、Ｒ1は水素または低級アルキルであり、Ｒ2は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ3はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ4はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、ｍは０〜２の整数であり、ｎは０〜４である）で示される化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項２】
式：
【化２】
2006169176.tif 000012
で示される基が、式：
【化３】
2006169176.tif 000013
（式中、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンである）である、請求項１記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項３】
Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して低級アルコキシまたはヒドロキシである、請求項２記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス活性、詳しくは抗コロナウイルス活性を有し、動物薬または医薬として有用な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性疾患に対する有効な治療薬の開発は、医学及び薬学の分野において最も重要な課題の１つである。
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、１本鎖のＲＮＡウイルスであり、血清学的に大きく３群に分けられている。コロナウイルスは哺乳動物や鳥類にさまざまな呼吸器系、消化官系、肝臓、神経系などで重篤な症状を発症させる疾病を引き起こすが、ヒトでは呼吸器や腸等で炎症を起こし、比較的軽度〜中等度の感冒の症状を引き起こすウイルスとして知られている。家畜・家禽に対してはワクチン使用が一般化しており、その有効性も確認されているケースが多い。これらのことからコロナウイルスに対する薬剤はこれまで開発されることはなかった。
【０００３】
しかし、最近、世界的に新型肺炎であるＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）が流行し、その原因病原体が、ＷＨＯにより新型のコロナウイルスであると決定され、ＳＡＲＳコロナウイルスと名付けられた（２００３年４月）。そのため、コロナウイルス、特にＳＡＲＳコロナウイルスに有効な薬剤の開発は世界的に緊急の課題であるが、今の所、有効な治療薬は上市されておらず、報告例も少数である。例えば、ライノウイルスのプロテアーゼ阻害剤をコロナウイルスのプロテアーゼ阻害剤として使用することができることが報告されている（特許文献１参照）。また、東京医科歯科大等の実験により、抗ＨＩＶ薬であるネルフィナビルがＳＡＲＳウイルスの増殖を抑制することが報告されている（非特許文献１参照）。その他、Ｃ型肝炎治療薬であるグリチルリチンやインターフェロンにも同様の作用が報告されている（非特許文献２及び３参照）。
【特許文献１】国際公開第２００４／０９３８６０号パンフレット
【非特許文献１】N, Yamamotoら、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Biochem Biophys Res Commun.）、３１８巻、７１９−７２５頁（２００４）
【非特許文献２】Doerr, HWら、ザ  ランセット（The LANCET）、３６１巻、２０４５−２０４６頁（２００３）
【非特許文献３】Doerr, HWら、ザ  ランセット（The LANCET）、３６２巻、２９３−２９４頁（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、抗ウイルス活性、詳しくは抗コロナウイルス活性を有し、動物薬または医薬として有用な新規化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に対して優れた抗ウイルス活性を有する化合物の合成に成功した。本発明の化合物は、ライノウイルスやＨＩＶ等、いくつかの他属のウイルスに対する活性について検索した結果、他属のウイルスに対しては抗ウイルス活性を示さず、特異性が高いことが確認された。これまで、抗コロナウイルス薬に関する報告は少なく、既存の薬剤の応用が多い。そのため、抗コロナウイルス活性を特異的に持つ新規化合物はコロナウイルスに関連する疾患の予防薬・治療薬に非常に有用である。
【０００６】
また、近年問題となっているＳＡＲＳウイルスの増殖を阻害することが報告されている抗ＨＩＶ薬であるネルフィナビルのＴＧＥＶに対する活性と本発明の化合物の活性は同程度であった。主要プロテアーゼの作用部位がＴＧＥＶとＳＡＲＳコロナウイルスとの間で保存されていることが報告されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ.３００，１７６３−１７６７（２００３）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ.４３，４９０６−４９１２（２００３））、本発明の化合物も、ネルフィナビルと同様、ＳＡＲＳコロナウイルスにも有効性を示すと考えられる。
【０００７】
本発明は、
（１）式（Ｉ）：
【化１】
2006169176.tif 000002
（式中、Ｒ1は水素または低級アルキルであり、Ｒ2は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ3はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ4はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、ｍは０〜２の整数であり、ｎは０〜４である）で示される化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、
（２）式：
【化２】
2006169176.tif 000003
で示される基が、式：
【化３】
2006169176.tif 000004
（式中、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンである）である、（１）記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、
（３）Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して低級アルコキシまたはヒドロキシである、（２）記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物、
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を有効成分とする医薬組成物、
（５）（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物、その製薬上許容される塩、またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする抗ウイルス剤、に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の化合物は、強い抗コロナウイルス活性を示し、該誘導体から優れた抗ＣｏＶ剤が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書中において、「低級アルキル」とは、炭素数１〜８個の直鎖状又は分岐状のアルキル基を意味し、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル、tert−ぺンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。
【００１０】
「低級アルコキシ」とは、炭素数１〜６個の直鎖状又は分岐状のアルコキシ基を意味し、具体的にはメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシが挙げられる。
【００１１】
「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【００１２】
以下に本発明化合物の製造法について、記載する。
【化４】
2006169176.tif 000005
（式中、Ｒ1は水素または低級アルキルであり、Ｒ2は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ3はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、Ｒ4はそれぞれ独立して低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたはハロゲンであり、ｍは０〜２の整数であり、ｎは０〜４である。）
【００１３】
第一工程
式（Ｘ１）で示される化合物と、式（Ｘ２）で示される化合物を反応させ、式（Ｘ３）で示される化合物を得る工程である。
式（Ｘ１）で示される化合物は、市販のものを用いるか、それらを当業者によく知られる方法で構造修飾することにより、容易に製造することができる。
溶媒としては、酢酸を用いることができる。
反応は、５０〜２００℃で行うことができる。たとえば、１００〜１２０℃で行うことができる。
【００１４】
第二工程
式（Ｘ３）で示される化合物をエノラートにし、式（Ｘ４）で示される化合物を反応させ、ついで脱水することにより、式（Ｉ）で示される化合物を製造する工程である。
式（Ｘ４）で示される化合物は、市販のものを用いるか、それらを当業者によく知られる方法で構造修飾することにより、容易に製造することができる。
式（Ｘ３）で示される化合物をエノラートにするには、式（Ｘ３）で示される化合物にトリ-n-ブチルボレートを反応させればよい。本工程は、０〜１００℃、たとえば、室温で行うことができる。溶媒は、無水のものが好ましく、たとえば、無水酢酸エチルエステルなどを用いることができる。また、無水ボロン酸の存在下で行うのが好ましい。
脱水工程は、塩基の存在下で行うことができる。塩基としては、n-ブチルアミンを用いることができる。塩基の量は、触媒量でもよいし、当量用いることもできる。脱水工程は、５０〜２００℃、たとえば、７０〜９０℃で行うことができる。また、TsOHなどの適当な酸触媒下または、水酸基をメシル基などの適当な脱離基で保護した後、塩基処理する事によっても行うことが出来る。
【００１５】
本発明化合物の塩としては製薬上許容される塩が使用可能である。「製薬上許容される塩」は、以下の塩基性付加塩や酸付加塩を含有する。塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩；ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；例えばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩；リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等を挙げることができる。
【００１６】
本発明化合物はその溶媒和物を包含し、化合物（Ｉ）に対し、任意の数の溶媒分子と配位していてもよい。好ましくは水和物である。
【００１７】
本発明は、一般式（Ｉ）で示される化合物の全ての立体異性体（ジアステレオマー、エピマー、エナンチオマー等）を包含する。本発明化合物は抗ウイルス作用を有するのでそれ自身が医薬として有用であり、また他の本発明化合物の合成中間体としても有用である。
【００１８】
本発明は、ウイルス、特に、コロナウイルス（ＣｏＶ）に起因すると考えられる種々の感染症（例：コロナウイルス感染症等）の予防又は治療剤として使用できる。抗ＣｏＶ剤は、単独使用でも十分効果があるが、他の抗ＣｏＶ剤（ネルフィナビル、グリチルリチン等）等と併用してもよい。コロナウイルス（ＣｏＶ）としては、例えば、ＴＧＥＶ、ＳＡＲＳコロナウイルスなどが例示される。
【００１９】
本発明化合物は、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与による場合、本発明化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合、本発明化合物は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトやラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリ等の哺乳動物に対して投与することができる。
【００２０】
本発明化合物の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態及び疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり約０．０５ｍｇ〜５ｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇを１〜５回に分割して投与すればよい。また、非経口投与の場合、成人１日あたり約０．０１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇ〜５００ｍｇを１〜５回に分割して投与する。
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
【化５】
2006169176.tif 000006
化合物Ｉ-1 
1-（5-クロロ-1-メチル-1H-インドール-3-イル）-5-（3-ヒドロキシ-4-メトキシ-フェニル）-ペント-4-エン-1,3-ジオン
工程１
無水ジメチルホルムアミド（30 mL）に水素化ナトリウム（1.53g, 38.3 mmol）を加え、氷冷下、撹拌しながら5-クロロインドール（5.1g, 33 mmol）を加えた。室温で３０分間撹拌後、再び氷冷し、ヨウ化メチル（5.6g, 39.6 mmol）を滴下した。さらに室温で３０分間撹拌後、反応液を氷水に投入し、ジエチルエーテルで抽出した。抽出液を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた油状物を、シリカゲルクロマトグラフィーに付し、精製した。ヘキサン- 酢酸エチル（３：１,  v/v）で溶出して得られた目的物の画分を減圧下、濃縮することにより、化合物２（5.6g, 33.8mmol）を収率 ８８．３％で得た。
【００２３】
工程２
第１工程で得られた化合物２（2.48g, 15 mmol）、ジケテン（1.8 mL, 15 mmol）及び酢酸（10mL）の混合物を１２０℃で１００分間撹拌後、冷却し、減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルで抽出、水洗後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、精製した。ヘキサン−酢酸エチル（１：１,  v/v）で溶出される目的物画分を、減圧下濃縮することより、化合物３（1.9g, 7.7 mmol）を収率 ５１．３％で得た。
【００２４】
工程３
室温下、3-ヒドロキシ-4-アニスアルデヒド（610 mg, 4 mmol）とトリ-n-ブチルボレート（1.8g, 8 mmol）を無水酢酸エチル（10 mL）に溶解、撹拌した。次いで工程２で得られた化合物３（1.0 g, 4.0 mmol）の無水酢酸エチル溶液（5 mL）に無水ボロン酸（195 mg, 2.8 mmol）を加えて調整した懸濁液を上記反応液に加え、５分間撹拌した。さらに反応液にn-ブチルアミン（5 μL）を４回（計20 μL）加え、９０分間室温で反応後、反応液を８０℃に加熱しながら、常圧で濃縮した。黄色の懸濁液は徐々に橙色の油状物に変化し、さらに赤色の油状物に変化した。この状態で６０分間加熱撹拌後、反応液を６０℃まで冷却し、0.4N HCl（10 mL）と酢酸エチル（30 mL）を加え２０分間撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、順次、水、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去することにより粗結晶を得た。本品をメタノールから再結晶することにより表題化合物Ｉ-1（900 mg, 2.3 mmol）を淡黄色結晶として、収率５８．６%で得た。
融点 : 188 -190 ℃,  再結晶溶媒 : メタノール
NMR（d6-DMSO） δ: 3.83 （3H, s）, 3.91 （3H, s）, 6.45 （1H, s）, 6.60 （1H, d, J=15.6 Hz）, 6.94-7.16（3H, m）, 7.30-7.48 （2H, m）, 7.60-7.68 （1H, m）, 8.22-8.50 （1H, m）, 8.48 （1H, s）, 9.24 （1H, brs）.
【００２５】
【化６】
2006169176.tif 000007
化合物I-2 
5-（3-ヒドロキシ-4-メトキシ-フェニル）-1-（1H-インドール-3-イル）-ペント-4-エン-1,3-ジオン
実施例1の合成法に準じて化合物I-2を合成した．
融点 : 175 -177 ℃,  再結晶溶媒 : メタノール
元素分析 : C20H17NO4 ・0.35H2Oとして
計算値 （%） : C, 70.31; H, 5.22; N, 4.10．
分析値 （%） : C, 70.14; H, 5.37; N, 4.04.
NMR （d6-DMSO） δ: 3.82 （3H, s）, 6.53 （1H, s）, 6.58 （1H, d, J=15.6 Hz）, 6.94-7.30（5H, m）, 7.39 （1H, d, J=15.6 Hz）, 7.48-7.58 （1H, m）, 8.20-8.32 （1H, m）, 8.41 （1H, s）, 9.22 （1H, brs）, 12.10 （1H, brs）.
【実施例２】
【００２６】
抗TGEVアッセイ（MTT法）
（１）  日生研豚TGE生ワクチン（母豚用）を使用説明書に従い、添付溶解用液を用いて調製し、使用まで−８０℃で保存した。被検化合物をMedium １９９にウシ胎児血清（FCS）５％（v/v）およびカナマイシン６０μg/mlで加えた培養液にて所定の濃度になるように希釈し、９６穴マイクロプレートに５０μlずつ分注する。次に LLC-PK１細胞浮遊液を１００μl（2×104 細胞）ずつを分注し、３７℃、1時間培養後、更に上記ＴＧＥ生ワクチンをＦＣＳ無添加培養液（Medium 199）培地で希釈したものを５０μlずつ加えた。
（２）  炭酸ガス培養器内３７℃で２日間培養した後、全てのウェルに MTT（3−（4,5−ジメチルチアゾール−2−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）５mg/mlのＰＢＳ溶液を３０μlずつ加え、４−５時間培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を １５０μlずつ取り除き、代わりに１５０μlの溶解液（10%トリトンX-100及び0.4%（V/V）HCl添加イソプロパノール）を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を５０％抑制する化合物濃度をEC50とした。
（３）  上記（１）において、TGEV含有上清（ウイルス液）の代わりに各ウェルに培養培地５０μlずつ加え、（２）と同様に処理し化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が５０％である化合物濃度をCC50とした。
抗TGEVアッセイの結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
2006169176.tif 000008
【００２８】
上記結果は、本発明化合物がTGEVに対して、in vitro において良好な抗ウイルス活性を有することを示す。
上記に示した化合物の誘導体も、上記同等あるいはそれ以上のTGEV阻害活性を示した。
【実施例３】
【００２９】
抗ライノウイルスアッセイ（MTT法）
（１）  被検化合物をDMEM培地にウシ胎児血清（FCS）10%（v/v）およびカナマイシン６０μg/mlで加えた培養液にて所定の濃度になるように希釈し、９６穴マイクロプレートに５０μlずつ分注する。次に HeLa Ohio細胞浮遊液を１００μl（2×104 細胞）ずつを分注し、３７℃、１時間培養後、ライノウイルスHRV１４を４０mM HEPES、６０mM MgCl2を含むDMEM培地で希釈したものを５０μlずつ加えた。
（２）  炭酸ガス培養器内３３℃で２日間培養した後、全てのウェルに MTT（3−（4,5−ジメチルチアゾール−2−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）５mg/mlのPBS溶液を３０μlずつ加え、２時間３０分培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を１５０μlずつ取り除き、代わりに１５０μlの溶解液 （10%トリトンX-100及び 0.4%（V/V） HCl添加イソプロパノール）を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を５０％抑制する化合物濃度をEC50とした。
（３）  上記（１）において、ライノウイルス含有上清（ウイルス液）の代わりに各ウェルにウイルスの希釈に用いた培養培地５０μlずつ加え、（２）と同様に処理し、化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が５０％である化合物濃度をCC50とした。
抗ライノウイルスアッセイの結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
2006169176.tif 000009
【００３１】
上記結果は、本発明化合物がライノウイルスに対して、in vitroにおいて抗ウイルス活性保有しないことを示す。
上記に示した化合物の誘導体も、上記化合物以上のライノウイルス阻害活性を示さなかった。
【実施例４】
【００３２】
抗HIVアッセイ（MTT法）
（１）  HIV持続感染ヒトＴ細胞株 Molt-４を１０％牛胎児血清添加 RPMI−1640培地で培養し、上清を濾過してウイルスの力価を測定し、−８０℃で保存した。他方、被検化合物を上記の培養培地で所定の濃度になるように希釈し、９６穴マイクロプレートに５０μlずつ分注する。次に MT-４細胞浮遊液を１００μl（2.5×104細胞）ずつを分注し、更に上記 HIV含有上清を上記の培養培地で希釈したものを５０μl（4-10 TCID50/50μl）ずつ加えた。（1TCID50=５０％に細胞を死滅させるウイルスの濃度）
（２）  炭酸ガス培養器内で３７℃で４日間培養した後、全てのウェルにMTT（3−（4,5−ジメチルチアゾール−2−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）５mg/ml, PBSを３０μlずつ加え、更に１時間培養した。このとき、生存する細胞はMTTを還元してフォルマザンを析出させる。全てのウェルから培養上清を１５０μlずつ取り除き、代わりに１５０μlの溶解液（10%トリトンX-100及び 0.4%（V/V） HCl添加イソプロパノール）を加え、プレートミキサーで振とうしてフォルマザンを溶出した。フォルマザンをOD560nmで測定し、結果を被対照と比較した。ウイルスによる細胞傷害を５０％抑制する化合物濃度をEC50とした。
（３）  上記（１）において、HIV含有上清（ウイルス液）の代わりに各ウェルに培養培地 ５０μlずつ加え、（２）と同様に処理し、化合物の細胞毒性を調べた。化合物による細胞毒性が５０％である化合物濃度をCC50とした。
抗HIVアッセイの結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
2006169176.tif 000010
【００３４】
上記結果は、本発明化合物がヒト免疫不全ウイルスに対して、in vitro において抗ウイルス活性保有しないことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の化合物は、抗ウイルス活性、詳しくは抗コロナウイルス活性を有し、医薬として有用な化合物にである。本発明の化合物を含有する抗ＣｏＶ剤はコロナウイルスに関連する疾患の予防薬・治療薬に非常に有用である。