(57)【要約】      （修正有）【課題】反応の場となる多孔性担体自体が着色されていなくとも発光反応のバックグラウンドノイズを低減させ、測定対象物質の検出力を向上させる。【解決手段】試料中の測定対象物質を、低分子化合物が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質、および発光性物質または発光反応を誘導する物質が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質と複合体を形成させ、該複合体を第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質があらかじめ固定化されている無着色の多孔性担体３上に捕捉し、第二の物質に標識された発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出する方法において、該担体の直下に位置する層４の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色している反応容器１を用いることを特徴とする、測定対象物質を検出する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の測定対象物質の複合体を多孔性担体上に捕捉し、該複合体中に含まれる発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出する方法において、該担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色している反応容器を用いることを特徴とする、測定対象物質を検出する方法。
【請求項２】
試料中の測定対象物質を、低分子化合物が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質、および発光性物質または発光反応を誘導する物質が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質と液相中で複合体を形成させ、該複合体を第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質があらかじめ固定化されている無着色の多孔性担体上に捕捉し、第二の物質に標識された発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出する方法において、該担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色している反応容器を用いることを特徴とする、測定対象物質を検出する方法。
【請求項３】
試料中の測定対象物質を、低分子化合物が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質と液相中で複合体を形成させ、該複合体を第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質があらかじめ固定化されている無着色の多孔性担体上に捕捉し、多項性担体上の該複合体に、発光性物質または発光反応を誘導する物質が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質を結合させ、第二の物質に標識された発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出する方法において、該担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色している反応容器を用いることを特徴とする、測定対象物質を検出する方法。
【請求項４】
多孔性担体がガラス繊維フィルターである、請求項１から３に記載の方法。
【請求項５】
ガラス繊維フィルターの重量が１立方メートル当たり１００〜２００ｇかつ厚さが０．３〜１．０ｍｍである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試料中の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以下の測定対象物質を検出する、請求項１から５に記載の方法。
【請求項７】
低分子化合物がビオチンである、請求項２から３に記載の方法。
【請求項８】
低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質が抗ビオチン抗体、アビジンまたはストレプトアビジンのうちの少なくともひとつである、請求項２から３に記載の方法。
【請求項９】
発光反応を誘導する物質が酵素である、請求項２から３に記載の方法。
【請求項１０】
酵素がペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼのうちの少なくともひとつである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の測定対象物質の複合体を多孔性担体上に捕捉し、該複合体中に含まれる発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出するための反応容器であって、開口部を有する液体不透過性容器に収納された多孔性担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色していることを特徴とする反応容器。
【請求項１２】
試料中の測定対象物質を、低分子化合物が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質、および発光性物質または発光反応を誘導する物質が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質と液相中で複合体を形成させ、該複合体を第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質があらかじめ固定化されている無着色の多孔性担体上に捕捉し、第二の物質に標識された発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出するための反応容器であって、開口部を有する液体不透過性容器に収納された多孔性担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色していることを特徴とする反応容器。
【請求項１３】
試料中の測定対象物質を、低分子化合物が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質と液相中で複合体を形成させ、該複合体を第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質があらかじめ固定化されている無着色の多孔性担体上に捕捉し、多項性担体上の該複合体に、発光性物質または発光反応を誘導する物質が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質を結合させ、第二の物質に標識された発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出するための反応容器であって、開口部を有する液体不透過性容器に収納された多孔性担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色していることを特徴とする反応容器。
【請求項１４】
多孔性担体がガラス繊維フィルターである、請求項１１から１３に記載の反応容器。
【請求項１５】
ガラス繊維フィルターの重量が１立方メートル当たり１００〜２００ｇかつ厚さが０．３〜１．０ｍｍである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料中の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ以下の測定対象物質を検出する、請求項１１から１５に記載の反応容器。
【請求項１７】
低分子化合物がビオチンである、請求項１２から１３に記載の反応容器。
【請求項１８】
低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質が抗ビオチン抗体、アビジンまたはストレプトアビジンのうちの少なくともひとつである、請求項１２から１３に記載の反応容器。
【請求項１９】
発光反応を誘導する物質が酵素である、請求項１２から１３に記載の反応容器。
【請求項２０】
酵素がペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼのうちの少なくともひとつである、請求項１９に記載の反応容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の核酸、抗原、抗体あるいはホルモン等の測定対象物質を多孔性担体上の発光反応を利用して検出する方法およびその反応容器に関し、特に発光性標識からの光を直接的に測定する、簡便で高感度な検出法およびその反応容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、多孔性担体上で各種反応を行わせ、試料中の測定対象物質を検出する手法が用いられている。この測定法は、反応容器に収納された多孔性担体上に試料や試薬を順次滴下するだけで測定することができるため測定操作が簡便である、担体の比表面積が大きいため反応速度が速くなり測定時間が短くなる、廃液が容器内に保持され外部に漏れ出にくい、などの利点がある。
【０００３】
一方、測定対象物質を測定するための検出系には放射性同位元素や色素、着色微粒子等を用いることが一般的であるが、近年、微量な測定対象物質を検出するために、より高感度な検出系である蛍光法あるいは発光法が利用されることが増えてきている。また、蛍光法あるいは発光法を利用して試料中の測定対象物質を測定する際には、蛍光あるいは発光のバックグラウンドノイズの低減を目的として黒色マイクロプレートを使用することはよく知られており、黒色マイクロプレートも各社から発売されている。
【０００４】
特許文献１には繊維マトリックスを使用した発光免疫測定法において、発光のバックグラウンドを低減させるために「吸収パッドから発せられる化学発光を低減させるために吸水パッドに結合された要素」を用いることが開示されており、微粒子捕獲分離技法およびイオン捕獲分離技法を使用して反応生成物を繊維マトリックス上に捕捉することには触れられているが、繊維マトリックス上にあらかじめ結合性の生理活性物質が固定化され、固定化された生理活性物質を介して反応生成物を繊維マトリックス上に捕捉する事例については言及していない。
【０００５】
特許文献２には「平均直径が０．５ 〜２．０μｍかつ平均繊維長が０．５〜２ｍｍであるガラス繊維で構成されたフィルター」を用いた測定方法が開示されており、その中に発光法を適用した実施例が記載されているが、該文献の方法では「被測定物質と特異的に反応する第一の物質」が「ガラス繊維で構成されたフィルター」に直接固定化されていることから、反応が全て固相上で行われるため、特に１０ｎｇ／ｍＬ以下の低濃度の物質を検出する必要のある場合には充分な感度が得にくく、また測定項目毎に異なる反応容器を準備しなくてはならない。
【特許文献１】第２８８０８０１号特許
【特許文献２】第３１３４２３１号特許
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多孔性担体の例としてニトロセルロース、ナイロン類、酢酸セルロース類、ポリビニリデンフルオライド類、４−フッ化エチレン類等からなるメンブレンフィルターまたはセルロース繊維、ガラス繊維等からなるいわゆる濾紙類などが挙げられるが、それらの市販品はいずれも白色のものが多く、着色されている多孔性担体を得ることは困難であった。また、それら多孔性担体を直接着色する場合、該担体の物理的・化学的特性が変化するためその担体用に培われた固定化等の製造ノウハウが適用できなくなる、あるいは着色に用いる染料、顔料や残留溶媒などが多孔性担体上で行われる発光反応等の各種反応系、あるいは多孔性担体に固定化される生理活性物質の保存安定性に悪影響を及ぼす、などという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、試料中の測定対象物質の複合体を多孔性担体上に捕捉し、該複合体中に含まれる発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出する方法において、該担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色している反応容器を用いることを特徴とする、測定対象物質を検出する方法、およびその反応容器に関する。
【０００８】
また本発明は試料中の測定対象物質を、低分子化合物が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質、および発光性物質または発光反応を誘導する物質が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質と液相中で複合体を形成させ、該複合体を第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質があらかじめ固定化されている無着色の多孔性担体上に捕捉し、第二の物質に標識された発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出する方法において、該担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色している反応容器を用いることを特徴とする、測定対象物質を検出する方法、およびその反応容器に関する。
【０００９】
更に本発明は、試料中の測定対象物質を、低分子化合物が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質と液相中で複合体を形成させ、該複合体を第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉することのできる生理活性物質があらかじめ固定化されている無着色の多孔性担体上に捕捉し、多項性担体上の該複合体に、発光性物質または発光反応を誘導する物質が標識された、該測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質を結合させ、第二の物質に標識された発光性物質または発光反応を誘導する物質から最終的に生じる発光の強度を測定することにより測定対象物質を検出する方法において、該担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面が白色以外の色に着色している反応容器を用いることを特徴とする、測定対象物質を検出する方法、およびその反応容器に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、反応の場となる多孔性担体自体を着色することなく発光反応のバックグラウンドノイズを低減させることができ、測定対象物質と該測定対象物質と特異的に結合できる物質との複合体をを液相中で形成させる手段を組み合わせることによって測定対象物質の検出力を向上させることができる。特に１０ｎｇ／ｍＬ以下の低濃度物質の定量に最適である。更には０．５ｐｇ／ｍＬ〜２０００ｐｇ／ｍＬの低濃度領域を正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明において用いられる多孔性担体は、液体が通過可能であり、あらかじめ生理活性物質を固定化することができ、かつ多孔性担体上で発光反応を起こし得るものであれば特に限定されない。材料としては例えばニトロセルロース、ナイロン類、酢酸セルロース類、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）類、４−フッ化エチレン類等からなるメンブレンフィルターまたはセルロース繊維、ガラス繊維等から製するいわゆる濾紙類が使用し得る。その中でもガラス繊維フィルターが好ましく、重量が比較的大きくかつ比較的厚い、具体的には重量が１立方メートル当たり１００〜２００ｇかつ厚さが０．３〜１．０ｍｍのガラス繊維フィルターを用いることがより好ましい。
【００１２】
本発明において用いられる反応容器は、多孔性担体に測定対象物質と複合体を形成する物質を介して捕捉することができる結合性の生理活性物質があらかじめ固定化された状態で提供される。固定化される結合性の生理活性物質の例としては、測定対象物質と特異的に結合する第一の物質に標識された低分子化合物を捕捉できるものであれば特に限定はされないが、抗ビオチン抗体、抗ジニトロフェノール抗体または抗ジゴキシゲニン抗体のような、低分子化合物に対する抗体または抗体フラグメントや、ビオチンと結合するアビジン、ストレプトアビジン等が例として挙げられる。
【００１３】
多孔性担体に生理活性物質を固定化するには一般的に知られているような、例えば物理的に吸着させる方法または化学的に結合させる方法を用いればよい。その際、該生理活性物質を多孔性担体に直接固定化してもよいし、該生理活性物質に特異的に結合する抗体や受容体などの物質を多孔性担体に固定化し、該物質を介して該生理活性物質を固定化してもよい。また、固定化した多孔性担体を切り出して反応容器に装着してもよいし、未固相の多孔性担体を反応容器に装着した後に固定化を実施してもよい。また保存時や輸送時の安定性等を考慮すると、反応容器は生理活性物質を固定化した後に乾燥した状態で提供されることが望ましく、乾燥の方法としては自然乾燥、風乾、真空乾燥、減圧乾燥、凍結真空乾燥、赤外線や遠赤外線による乾燥、またマイクロウェーブなどの高周波を利用した乾燥等が挙げられる。
【００１４】
本発明の多孔性担体の直下に位置する層とは多孔性担体の底面に直接接し、多孔性担体と共に液体不透過性容器に収納されている層のことを言い、少なくとも多孔性担体と接する面が白色以外の色に着色していること以外、特に限定はされないが、図２に示すように、滴下した試料や試薬を保持するための吸水層を着色したものが好ましい。また、図４に示すように、多孔性担体の直下に、着色した液体透過層を備えていてもよい。ここで言う液体透過層とは、開口部より多孔性担体上に滴下した試料や試薬の、吸水層への移行を妨げることなく存在する層のことを言う。また、これら層を形成する担体の材料は、例えばニトロセルロース、ナイロン類、酢酸セルロース類、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）類、４−フッ化エチレン類等からなる繊維やフィルターまたはセルロース繊維、ガラス繊維等から製するいわゆる濾紙類等が挙げられる。
【００１５】
本発明の多孔性担体の直下に位置する層の、少なくとも該担体と接する面の色は白色以外であって、蛍光あるいは発光のバックグラウンドノイズを低減させる色であれば、黒、赤、茶、青、黄等限定されるものではないが、黒色が特に好ましい。また、着色の方法については特に限定はされないが、多孔性担体の直下に位置する層を製する際、まず層を形成する材料を事前に染料を用いて染色するかまたは原料に顔料等を練り込むなどして着色したものを成形してもよいし、着色せずに層を製したのち、その完成品に着色してもよい。着色に用いるものは特に限定されないが染料や顔料、市販のインクや塗料などが挙げられる。また、着色することにより試薬や試料の液透過性が低下する、すなわち表面張力により水をはじいてしまうような場合は必要に応じて親水処理を実施してもよい。ここで言う親水処理とは、試薬や試料の液透過性を向上させる、あるいは表面張力を低下させるために施す処理のことであって、液透過性を向上させる方法であれば特に限定はされないが、各種界面活性剤を含む液や市販の洗浄液を添加または浸漬後乾燥させる方法などが挙げられる。また、着色された層からその色が測定中に多孔性担体表面に染み出て来ないものが好ましい。
【００１６】
本発明における反応容器の開口部は測定対象物質を含む試料や試薬を多孔性担体上に滴下するため、および多孔性担体上に生じる発光を検出するために設けられるものであり、反応容器の上面に設けられていることが望ましい。
【００１７】
本発明における液体不透過性容器は、液体が透過しないものであれば特に限定はされないが、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ＡＢＳ樹脂等のプラスチック類から製することが好ましく、更には光を通さない不透明なものであることが望ましい。
【００１８】
本発明において測定される測定対象物質は特に限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、抗原性を有するタンパクやペプチド、抗原やハプテンを認識する抗体、ホルモンや内分泌攪乱化学物質等の低分子化合物などが挙げられる。また測定対象物質と特異的に結合できる物質の例としては、測定対象の核酸と相補性を有する核酸、測定対象物質と特異的に結合する抗体、抗体フラグメントまたは受容体、測定対象物質である抗体に結合する抗原、糖鎖に結合するレクチン等が挙げられる。
【００１９】
測定対象物質と特異的に結合できる第一の物質に標識される低分子化合物の例として、ビオチン、ジニトロフェノール、ジゴキシゲニン等が挙げられる。また、測定対象物質と特異的に結合できる第二の物質に標識される発光性物質または発光反応を誘導する物質の例として、アクリジニウムエステルまたはその誘導体、アクリジニウムスルホンアミドまたはその誘導体、ルミノール、イソルミノールおよびそれらの誘導体またはアントラセン誘導体、あるいは酵素、発光性基質または蛍光物質などが挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。発光性基質としては１，２−ジオキセタン類（例えばＡＭＰＰＤなど）などが挙げられる。また蛍光物質としてはルシフェリンおよびその誘導体類、シュウ酸エステルおよびその誘導体類などが挙げられる。
【実施例】
【００２０】
１）着色吸水層の調製
円筒形の試液吸収フィルターの表面にホビー用スプレー・ブラック（日本ペイント社製）を吹き付けて着色し、風通しのよい場所に一晩放置して乾燥させたのち、０．１％ポリオキシエチレンモノラウレート溶液に浸漬し、凍結乾燥させた。
【００２１】
２）反応容器の調製
ガラス繊維濾紙（アドバンテック東洋社製）を円形にくりぬき、上記１）で製した着色吸水層上に載せ、図１に示すような、上部に開口部を有するポリエチレン製の液体不透過性容器内に収納した。
【００２２】
３）抗体固定担体の調製
上記２）で製した反応容器の開口部より、（Ａ）１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０を１００μＬ、（Ｂ）ウサギ抗ビオチンポリクローナル抗体１０μｇ／ｍＬ（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０）を１００μＬ、（Ｃ）５％グリセロール・１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を１００μＬ、直前に供給された液が吸引されるのを待って順次供給した後、凍結乾燥した。
【００２３】
４）ＣＥＡの測定
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）、およびその溶液にＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：癌胎児性抗原）を５ｎｇ／ｍＬとなるように添加したものを試料とし、ビオチン標識マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体液（１％ＢＳＡ・１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）とそれぞれ１：１の容量比で混合し、室温で５分間反応させた（一次反応液）。上記３）で製した反応容器の開口部より２５％ブロックエース（大日本製薬社製）を５０μＬ、上記一次反応液を５０μＬ、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体液（１％ＢＳＡ・１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を２０μＬ、０．０５％ポリオキシエチレンモノラウレート溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．０）を１６０μＬ、直前に供給された液が吸引されるのを待って順次滴下し、更にルミノール／エンハンサーおよび過酸化水素を含む発光基質を３０μＬ滴下した後、反応容器の開口部より発生する光の強度を、暗室に設置した光電子増倍管にて測定した。
【００２４】
［比較例］
実施例の工程１）を実施しない以外は実施例と同様に反応容器を製し、ＣＥＡを測定した。
【００２５】
実施例および比較例でＣＥＡ試料（０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ）を各５回測定し、発光強度（ＲＬＵ）の平均値（ｍｅａｎ）、標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣＶ）を算出した結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
2006119011.tif 000003
【００２７】
表１に示す通り、ＣＥＡ  ０ｎｇ／ｍＬの発光強度（即ちバックグラウンドノイズ）が比較例と比べ、実施例で著しく低下かつバラツキ（ＣＶ）も低減し、それによってバックグラウンドノイズに対するＣＥＡ  ５ｎｇ／ｍＬの発光強度（即ちＳｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ（Ｓ／Ｎ）比）が比較例では２１倍であったのに対し、実施例では３１倍と向上した。
【００２８】
このように、本発明の反応容器を用いることによって、あらかじめ生理活性物質が固定化されている無着色の多孔性担体上の発光反応におけるバックグラウンドノイズが低減し、それによって測定対象物質の検出力が向上した。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、反応の場となる多孔性担体自体が着色されていなくとも発光反応のバックグラウンドノイズを低減させることができ、その結果、検出力が向上し微量な測定対象物質も検出できることから、体外診断用医薬品などの各種分析用途に利用することができ、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の反応容器の一実施例における斜視図
【図２】図１に記載の反応容器の断面図
【図３】本発明の反応容器の一実施例における斜視図
【図４】図４に記載の反応容器の断面図
【符号の説明】
【００３１】
１：反応容器
２：開口部
３：多孔性担体
４：着色された吸水層
５：液体不透過性容器
６：着色された液体透過層
７：着色されていない吸水層
【図１】
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【図２】
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【図３】
2006119011.tif 000006
【図４】
2006119011.tif 000007