(57)【要約】【課題】  タンパク質を高発現できる乳酸菌、より具体的には、より広範な乳酸菌株においてタンパク質を高発現するために適切なプロモーターを有する乳酸菌を提供すること。【解決手段】  本発明のタンパク質高発現乳酸菌は、乳酸菌由来のプロモーター配列とＳ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子の５’−非翻訳領域配列とが結合された高発現用プロモーター、および該高発現用プロモーターの制御下に連結された目的のタンパク質をコードするＤＮＡを有する。好適には、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質は、Lactobacillus acidophilus由来である。また、目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、分泌シグナル配列または表層提示用配列と連結されていてもよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌由来のプロモーター配列とＳ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子の５’−非翻訳領域配列とが結合された高発現用プロモーター、および該高発現用プロモーターの制御下に連結された目的のタンパク質をコードするＤＮＡを有する、タンパク質高発現乳酸菌。
【請求項２】
前記Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質が、Lactobacillus acidophilus由来である、請求項１に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【請求項３】
前記Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子の５’−非翻訳領域配列が、配列表の配列番号１の３６６位〜５５６位のＤＮＡ配列を有する、請求項２に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【請求項４】
前記乳酸菌由来のプロモーター配列が、Lactobacillus caseiまたはLactobacillus fermentum由来である、請求項１から３のいずれかの項に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【請求項５】
Lactobacillus caseiの形質転換体である、請求項１から４のいずれかの項に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【請求項６】
前記目的のタンパク質が、異種生物由来である、請求項１から５のいずれかの項に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【請求項７】
前記目的のタンパク質が、α−アミラーゼである、請求項１から６のいずれかの項に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【請求項８】
前記目的のタンパク質をコードするＤＮＡが、分泌シグナル配列または表層提示用配列と連結されている、請求項１から７のいずれかの項に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【請求項９】
前記表層提示用配列が、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ配列である、請求項８に記載のタンパク質高発現乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質高発現乳酸菌に関する。より詳細には、より広範な乳酸菌株においてタンパク質を高発現するために適切なプロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、種々の有用なタンパク質を、酵母や細菌において分泌発現または表層提示させることによって、安価かつ大量に生産することが検討されている。例えば、細菌の表層への発現については、Bacillus sp.由来のポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素の遺伝子を含む発現プラスミドを用いて検討され、グラム陽性菌である乳酸菌やグラム陰性菌である大腸菌の表層に種々のタンパク質を提示できることが知られている（特許文献１）。
【０００３】
タンパク質をより大量に発現させるために、誘導物質によって遺伝子発現が誘導されるプロモーター、あるいは誘導を行わなくても発現効率のよい構成的プロモーターなどの、強力なプロモーターを組み込むことが試みられている。例えば、大腸菌においては、Bacillus sp. SK-1株由来のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に局在する構成的なプロモーターがある（特許文献２）。
【０００４】
乳酸菌においては、Lactobacillus acidophilus ATCC4356株由来のＳ−ｌａｙｅｒタンパク質の遺伝子の５’非翻訳領域が、ｍＲＮＡ分解の半減期を長くする機能を有することが報告されている（非特許文献１）。このプロモーター制御下にこの５’非翻訳領域が連結されたリポーター遺伝子を有するプラスミドをLactobacillus caseiを形質転換すると、細胞抽出物中のリポーター活性が他のプロモーターを有するプラスミドで形質転換したものよりも高くなり、効率的にリポーターが発現されたことが示されている。
【０００５】
一般に、乳酸菌においては、菌株の種類と使用可能な強力なプロモーターの種類とは一対一に対応していることが多い。すなわち、プロモーターは菌株特異的であると考えられている（非特許文献２）。そのため、上記のように異なる種に由来するプロモーターが、どのような菌株においても必ずしも効率的に作動するわけではない。
【特許文献１】国際公開第０３／０１４３６０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／８３７８７号パンフレット
【非特許文献１】Boot, H.J.ら、J. Bacteriol.，1993年，175巻，19号，pp.6089-6096
【非特許文献２】McCracken, A.ら、J. Bacteriol., 1999年, 181巻, 20号, pp.6569-6572
【非特許文献３】E. Satohら、Appl. Environ. Microbiol.，1997年，63巻，pp.4593-4596
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質を高発現できる乳酸菌、より具体的には、より広範な乳酸菌株においてタンパク質を高発現するために適切なプロモーターを有する乳酸菌を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質のプロモーターだけでなく、さらに他の乳酸菌由来プロモーターと５’非翻訳領域とを組み合わせたプロモーターを構築することにより、より広範な乳酸菌株においてタンパク質を効率よく発現できることを見出したことに基づく。
【０００８】
本発明は、乳酸菌由来のプロモーター配列とＳ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子の５’−非翻訳領域配列とが結合された高発現用プロモーター、および該高発現用プロモーターの制御下に連結された目的のタンパク質をコードするＤＮＡを有する、タンパク質高発現乳酸菌を提供する。
【０００９】
好適な実施態様では、上記Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質は、Lactobacillus acidophilus由来である。
【００１０】
より好適な実施態様では、上記Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子の５’−非翻訳領域配列は、配列表の配列番号１の３６６位〜５５６位のＤＮＡ配列を有する。
【００１１】
１つの実施態様では、上記乳酸菌由来のプロモーター配列は、Lactobacillus caseiまたはLactobacillus fermentum由来である。
【００１２】
ある実施態様では、本発明のタンパク質高発現乳酸菌はLactobacillus caseiの形質転換体である。
【００１３】
１つの実施態様では、上記目的のタンパク質は、異種生物由来である。
【００１４】
さらなる実施態様では、上記目的のタンパク質は、α−アミラーゼである。
【００１５】
ある実施態様では、上記目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、分泌シグナル配列または表層提示用配列と連結されている。
【００１６】
好適な実施態様では、上記表層提示用配列は、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ配列である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の乳酸菌は、上記のような配列の組み合わせを有していれば、その菌株は特定されない。したがって、種々の異種タンパク質を効率よく発現させるために、広範な菌株について応用可能である。したがって、本発明の乳酸菌は、乳酸菌の種類および提示されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のタンパク質高発現乳酸菌は、乳酸菌由来のプロモーター配列とＳ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子の５’−非翻訳領域配列とが結合された高発現用プロモーター、および該高発現用プロモーターの制御下に連結された目的のタンパク質をコードするＤＮＡを有する。
【００１９】
本発明において「乳酸菌」とは、炭水化物を加水分解して乳酸を生成することによってエネルギーを獲得する細菌をいう。例えば、グラム陽性桿菌としては、Lactobacillus属が挙げられ、そしてグラム陽性球菌としては、Streptococcus属、Pediococcus属、Lactococcus属、およびLeuconostoc属が挙げられる。
【００２０】
本発明のタンパク質高発現乳酸菌の宿主として用いられる乳酸菌の種類は特に限定されず、上記のどのような種類の乳酸菌であってもよい。発酵や遺伝子工学の分野で通常使用されている市販の株がより好ましい。例えば、Lactococcus lactis IL1403、Lactobacillus plantarum WCFS1、Lactobacillus acidophilus NCFMなどが挙げられる。本発明においては、特にLactobacillus属の菌株が好ましい。
【００２１】
本発明において「高発現」とは、目的のタンパク質を効率よく発現すること、すなわち、タンパク質が大量に発現されることをいう。当該技術分野で通常用いられているプロモーターを有する乳酸菌（天然の乳酸菌を含む）の場合と比較して、単位時間当たりに少なくとも２倍、好ましくは５倍以上の量のタンパク質が発現されることをいう。
【００２２】
乳酸菌由来の「プロモーター配列」とは、通常、乳酸菌の遺伝子の転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあって、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類似の領域の配列をいい、この配列以外に、発現調節のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な配列を含んでいてもよい。このようなプロモーター配列としては、乳酸菌の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター配列（例えば、Lactobacillus casei ATCC393由来の場合は、配列番号２に記載の配列）、ＣｌｐＣ  ＡＴＰａｓｅシャペロンのプロモーター配列（例えば、Lactobacillus fermentum BR11由来の場合は、配列番号３に記載の配列）などが挙げられる。
【００２３】
Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質（表層タンパク質）とは、規則的な結晶構造によって多くの細菌の細胞壁を覆っているＳ−ｌａｙｅｒを構成するタンパク質である。本発明において、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質の遺伝子の５’−非翻訳領域配列（untranslated leader sequence：以下、ＵＴＬＳという）とは、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子のプロモーター下流に存在する領域をいう（ＰｓｌｐＡ：配列番号１；非特許文献１）。本発明においては、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子のプロモーター領域は、好ましくはLactobacillus acidophilus由来であり、より好ましくはLactobacillus acidophilus ATCC4356株由来である。特に、Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子のプロモーター領域のうち下流側（３’側）のＵＴＬＳを含むことが好ましい。例えば、Lactobacillus acidophilus ATCC4356株由来Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子のＵＴＬＳ（配列番号１の３６６位〜５５６位のＤＮＡ配列）が好適である。
【００２４】
本発明において、上記乳酸菌由来のプロモーター配列およびＳ−ｌａｙｅｒタンパク質の遺伝子のＵＴＬＳは、それぞれの天然のＤＮＡ配列；該天然のＤＮＡ配列に少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有するＤＮＡ配列；該天然のＤＮＡ配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列；該天然のＤＮＡ配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列などであり得る。乳酸菌由来のプロモーター配列の場合は、宿主の乳酸菌において構成的プロモーター活性を呈する限り、上記ＤＮＡの断片であってもよい。
【００２５】
ここで、「ストリンジェント条件」とは、例えば、以下の条件をいう。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）、0.5％ SDS、５×Denhard't（0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400）、および100μg/mLサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、50℃にて一晩保温する条件が挙げられる。
【００２６】
「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド間の残基の配列類似性をいい、比較対象のＤＮＡの塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの塩基配列を比較することにより決定され得る。配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の核酸塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いで、この適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出され得る。最適なアラインメントおよびホモロジーを得るためのアルゴリズムは、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。核酸間の配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウエア（例えば、BLASTN、FASTAなど）を用いて測定される。
【００２７】
本発明において、「高発現用プロモーター」とは、上記乳酸菌由来のプロモーター配列と上記Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子のＵＴＬＳとをこの順で結合して構築したプロモーターをいう。このように２種類の構成的プロモーターを組み合わせることにより、この制御下に連結された目的のタンパク質がより効率的に発現されるようになる。
【００２８】
本発明の乳酸菌で発現され得る目的のタンパク質は、特に限定されず、本来乳酸菌が有するタンパク質であっても、あるいは乳酸菌に存在しないタンパク質であってもよい。例えば、タンパク質を分泌発現させてもよく、あるいは分泌性タンパク質、外来タンパク質（抗体、リガンドなど）などを表層に提示するように発現させてもよい。分泌性タンパク質としては、アミラーゼ類（α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼなど）、セルラーゼ類（エンドグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなど）、リパーゼなどが挙げられる。
【００２９】
このような目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、生物から単離する方法；適切なプローブまたはプライマーを用いて、生物のゲノムＤＮＡから選抜する方法；あるいは、既知の配列に基づいて化学合成する方法によって得られ得る。
【００３０】
目的のタンパク質を分泌させる場合は、分泌シグナル配列を連結する。具体的には、上記高発現用プロモーター、分泌シグナル配列、および目的のタンパク質をコードするＤＮＡをこの順で配置した組換えＤＮＡである。分泌シグナル配列は、特に限定されず、天然の分泌性タンパク質の分泌シグナル配列が好適に用いられる。例えば、α−アミラーゼの分泌シグナル配列、プロテイナーゼＰの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列などが好適に用いられる。
【００３１】
目的のタンパク質を表層提示させる場合は、表層提示用配列を連結する。具体的には、上記高発現用プロモーター、表層提示用配列、および目的のタンパク質をコードするＤＮＡをこの順で配置した組換えＤＮＡである。表層提示用配列としては、例えば、ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素であるｐｇｓＡをコードするＤＮＡ配列が挙げられる。ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素（ｐｇｓＢＣＡ）は、納豆の糸であるポリ−γ−グルタミン酸の合成に関与する細胞膜タンパク質であり、３９３アミノ酸のｐｇｓＢ、１４９アミノ酸のｐｇｓＣ、および３８０アミノ酸のｐｇｓＡからなる酵素複合体である。それぞれの機能は未だ解明されていないが、ｐｇｓＡは、Ｎ末端およびＣ末端に親水性アミノ酸配列を有しており、これは、細胞内膜の通過に際して、分泌シグナル、ターゲティングシグナル、および付着シグナルとして作用すると考えられている。本発明においては、このｐｇｓＡをコードするＤＮＡを利用することが好ましい。本発明においては、上記ｐｇｓＡは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来であることが好ましい。より好ましくは、ｐｇｓＡをコードするＤＮＡは、配列番号４に記載のＤＮＡ配列；配列番号４に記載のＤＮＡ配列において、少なくとも１塩基の置換、欠失、または付加を有するＤＮＡ配列；配列番号４に記載のＤＮＡ配列に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列；または、配列番号４に記載のＤＮＡ配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列である。ここで、ストリンジェント条件および配列同一性とは、上記のとおりである。発現されるｐｇｓＡと目的のタンパク質とは、直接連結されてもよく、あるいは数アミノ酸〜数十アミノ酸でなるスペーサーを介して連結されてもよい。
【００３２】
これらの各種ＤＮＡおよび組換えＤＮＡの合成、結合、および発現ベクターへの挿入は、当業者が通常用い得る技法で行われ得る。
【００３３】
上記の組換えＤＮＡが挿入される発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクターなどが挙げられる。プラスミドベクターとしては、pHCE1LB、pHY300PLK、pWVO1、pAMβ1、pSECE1などが挙げられる。また、ファージベクターとしては、φFSVなどが挙げられる。
【００３４】
このような発現ベクターは、乳酸菌の複製起点を有しており、さらに、例えば、乳酸菌の選択マーカーを有することが好ましい。選択マーカーとしては、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。また、タンパク質をコードするＤＮＡを効率よく発現させるために、この発現を調節するオペレーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列をさらに含むことが望ましい。
【００３５】
本発明の乳酸菌は、上記組換えＤＮＡまたは発現ベクターを導入することにより得られる。ＤＮＡの導入とは、宿主乳酸菌の中にＤＮＡを発現可能に導入することを意味する。ＤＮＡの導入の方法には、コンピテンス法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法などの方法があり、現在では、エレクトロポレーション法を用いることが一般的である。
【００３６】
組換えＤＮＡが導入された乳酸菌は、適切な培地中で培養して選択マーカーで選択され、例えば、発現されたタンパク質の活性を測定することにより選択される。
【００３７】
このように、乳酸菌由来のプロモーター配列とＳ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子のＵＴＬＳとが結合された高発現用プロモーターを構築し、目的のタンパク質をコードする遺伝子とともに乳酸菌に導入することによって、乳酸菌で目的のタンパク質を大量に発現させることが可能である。特に、野生種の乳酸菌やグラム陽性菌に好適に適用できる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１：α−アミラーゼを分泌する乳酸菌の作成）
（１）乳酸菌プロモーターを欠如したα−アミラーゼ分泌発現ベクターの構築
まず、乳酸菌複製遺伝子（ｒｅｐ）およびエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＡ）を含むプラスミドｐＳＥＣＥ１（明治乳業より入手）を鋳型とし、配列番号５および６の各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素BglIIおよびSacIで消化して、ｒｅｐおよびｅｒｍＡ遺伝子を含むBglII-SacI断片を得た。
【００４０】
次いで、Streptococcus bovis 148株由来のα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＡ：配列番号７；非特許文献３）が挿入されたプラスミドｐＨＬＳαＡ（神戸大学より入手）を鋳型とし、配列番号８および９の各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素BglIIおよびSacIで消化して、ａｍｙＡ遺伝子を含むBglII-SacI断片を得た。
【００４１】
上記のようにして得られたｒｅｐおよびｅｒｍＡ遺伝子を含むBglII-SacI断片とａｍｙＡ遺伝子を含むBglII-SacI断片とを、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）を用いて結合することにより、乳酸菌で複製しかつプロモーターを導入することによってα−アミラーゼを分泌発現できるプロモーターを欠如したベクターを得、これをプラスミドｐＩαＡ２２と命名した。このプラスミドｐＩαＡ２２に種々のプロモーターを挿入することによって、各種プロモーターについて検討することができる。図１に、プロモーターを変更することが可能な乳酸菌アミラーゼ分泌発現ベクターの構築の模式図を示す。
【００４２】
（２）乳酸菌プロモーターＰ−ｌｄｈＵＴＬＳの作成
乳酸菌（Lactobacillus casei ATCC393）由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｐ−ｌｄｈ：配列番号２）を、配列番号１０および１１の各オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって合成、増幅した。得られた断片を制限酵素BglIIおよびSphIで消化し、Ｐ−ｌｄｈプロモーター配列を含むBglII-SphI断片を得た。
【００４３】
次いで、Lactobacillus acidophilus JCM1132株（ATCC4356と同じ株）由来Ｓ−ｌａｙｅｒタンパク質遺伝子のプロモーター部分（ＰｓｌｐＡ：配列番号１）が挿入されたプラスミドｐＵＣ１９−ＰｓｌｐＡ（神戸大学より入手）を鋳型とし、配列番号１３および１４の各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片は、５’−非翻訳領域の一部（untranslated leader sequence：以下、ＵＴＬＳ：配列番号１の３６６位〜５５６位のＤＮＡ配列）を含む。得られたＤＮＡ断片を制限酵素SphIおよびEcoRVで消化し、ＵＴＬＳを含むSphI-EcoRV断片を得た。
【００４４】
上記のようにして得られたＰ−ｌｄｈプロモーターを含むBglII-SphI断片とＵＴＬＳを含むSphI-EcoRV断片とを、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）を用いて結合することにより、Ｐ−ｌｄｈ−ＵＴＬＳをこの順で有するプロモーター配列断片（Ｐ−ｌｄｈＵＴＬＳプロモーター）を得た。
【００４５】
上記（１）で得たプラスミドｐＩαＡ２２を制限酵素BglIIおよびPvuIIで切断し、この切断部位に上記Ｐ−ｌｄｈＵＴＬＳプロモーターを挿入して、目的のアミラーゼ分泌用ベクターｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈＵＴＬＳを得た。このベクターを、制限酵素BglIIおよびEcoRVで消化し、ABI PRISM(登録商標)310 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、得られた断片の塩基配列を決定して、Ｐ−ｌｄｈＵＴＬＳプロモーター配列の導入を確認した。
【００４６】
（３）乳酸菌プロモーターＰ−ｃｌｐＣＵＴＬＳの作成
乳酸菌（Lactobacillus fermentum BR11）由来のＣｌｐＣ  ＡＴＰａｓｅシャペロンのプロモーター（Ｐ−ｃｌｐＣ：配列番号３）を配列番号１５および１６の各オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって合成、増幅した。得られた断片を制限酵素BglIIおよびSphIで消化し、Ｐ−ｃｌｐＣプロモーターを含むBglII-SphI断片を得た。
【００４７】
得られたＰ−ｃｌｐＣプロモーターを含むBglII-SphI断片と上記（２）で得られたＵＴＬＳを含むSphI-EcoRV断片とを、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）を用いて結合することにより、Ｐ−ｃｌｐＣ−ＵＴＬＳをこの順で有するプロモーター配列断片（Ｐ−ｃｌｐＣＵＴＬＳプロモーター）を得た。
【００４８】
上記（１）で得たプラスミドｐＩαＡ２２を制限酵素BglIIおよびPvuIIで切断し、この切断部位に上記Ｐ−ｃｌｐＣＵＴＬＳプロモーターを挿入して、目的のアミラーゼ分泌用ベクターｐＩαＡ２２−ＰｃｌｐＣＵＴＬＳを得た。このベクターを、制限酵素BglIIおよびEcoRVで消化し、ABI PRISM(登録商標)310 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、得られた断片の塩基配列を決定し、Ｐ−ｃｌｐＣＵＴＬＳプロモーター配列の導入を確認した。
【００４９】
（４）α−アミラーゼを分泌する乳酸菌の作成
上記（２）で得られたベクターｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈＵＴＬＳおよび上記（３）で得られたベクターｐＩαＡ２２−ＰｃｌｐＣＵＴＬＳを、それぞれ乳酸菌Lactobacillus casei BLSJ03135（Bioleaders Japan Corporation）、Lactobacillus plantarum NCIMB8826、およびLactococcus lactis IL1403コンピテントセルにエレクトロポレーション法によって導入し、乳酸菌形質転換体を得た。得られた形質転換体を、25μg/mlのエリスロマイシンおよび0.25w/v％レマゾールブリリアントブルーデンプン（ナカライテスク社）を含む乳酸桿菌寒天培地（ＭＲＳ：Difco製）あるいは５μg/mlのエリスロマイシン、0.25w/v％レマゾールブリリアントブルーデンプンおよび0.5％グルコースを含む乳酸菌寒天培地（Ｍ１７：Difco製）上に塗布し、インキュベーター中で３７℃にて２４時間〜１２０時間培養した。コロニーの周囲のレマゾールブリリアントブルーデンプンが分解されてハロを生じた株を形質転換体として選択した。
【００５０】
（４−１）α−アミラーゼ活性測定による確認
次いで、選択した形質転換体を、炭酸カルシウムおよび可溶性デンプンを含むＭＲＳ液体培地あるいはＭ１７液体培地に接種し、インキュベーター中で３０℃あるいは３７℃にて培養し、４８時間まで経時的にサンプリングした。培養培地を遠心分離により培地と菌体とに分離して、培養上清のα−アミラーゼ活性を測定した。コントロールとして、ＵＴＬＳを含まないＰ−ｌｄｈプロモーターのｐＩαＡ２２−Ｐｌｄｈプラスミド、ＵＴＬＳを一部欠損させてその機能を低下させたプロモーターＰ−ｌｄｈΔＵＴＬＳプロモーターのｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈΔＵＴＬＳプラスミドを、ならびに比較対照として、大腸菌構成的高発現プロモーター（ＨＣＥプロモーター）のｐＳＨＳαＡプラスミドを使用した。α−アミラーゼ活性は、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン株式会社製）を用いて、プロトコルに従って測定した。結果を図２に示す。なお、図２において、α−アミラーゼ活性の１Ｕは、１分間にＮ３−Ｇ５−β−ＣＮＰ（合成基質：２−クロロ−４−ニトロフェニル−６５−アジド−６５−デオキシ−β−マルトペンタオシド）から１μmolのＣＮＰ（２−クロロ−４−ニトロフェノール）を遊離する力価を表す。
【００５１】
図２に示すように、形質転換したL. caseiは、α−アミラーゼ活性を有していた。Ｐ−ｌｄｈＵＴＬＳプロモーター支配下のプラスミドｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈＵＴＬＳで、最も高い活性を示した。
【００５２】
（４−２）リアルタイム定量ＰＣＲによるアミラーゼ発現の相対定量
上記（２）で得られたベクターｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈＵＴＬＳならびに上記（４−１）のｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈプラスミドおよびｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈΔＵＴＬＳプラスミドを用いて形質転換した乳酸菌Lactobacillus casei BLSJ03135（Bioleaders Japan Corporation）について、リアルタイム定量ＰＣＲによるアミラーゼ遺伝子発現の相対定量を行った。得られた形質転換体を２４時間培養し、TRIzol Max Bacterial RNA Isolation Kit（Invitrogen）を用いて、プロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡ抽出溶液へのＤＮＡの混入を防ぐために、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（タカラ）を全ＲＮＡ抽出溶液に添加し、３７℃で３０分間インキュベートして混入ＤＮＡを破壊した。次に、得られた全ＲＮＡ抽出溶液を鋳型として逆転写によるｃＤＮＡ合成を行った。リアルタイム定量ＰＣＲの逆転写反応およびＲＴ−ＰＣＲは、SuperScript III Platinum Two-Step qRT-PCR Kit（Invitrogen）を用い、プロトコルに従って実験を行った。また、ＲＴ−ＰＣＲ装置はABI PRISM(登録商標) 7000 Sequence Detection system（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲにおいてアミラーゼの検出に必要なプライマーとしては配列番号１６および１７を、アミラーゼのプローブとしては、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列の５’−末端にＦＡＭ標識および３’−末端にＴＡＭＲＡ標識したものを用いた。また、内部標準としては、L. casei BLSJ03135の16S rRNA遺伝子を一部増幅するプライマー（配列番号１９および２０）を用い、そのプローブとしては、配列番号２１に記載のヌクレオチド配列の５’−末端にＶＩＣ標識および３’−末端にはＴＡＭＲＡ標識したものを用いた。結果を、以下の表１に示す。
【００５３】
【表１】
2006262724.tif 000002
【００５４】
表１に示すように、ｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈＵＴＬＳプラスミド形質転換L. caseiは、ｐＩαＡ２２−Ｐｌｄプラスミド形質転換を基準した場合、約１２．３倍の相対アミラーゼ発現量を示した。この結果から、Ｐ−ｌｄｈＵＴＬＳプロモーター支配下では、アミラーゼのｍＲＮＡが菌体内により安定に保持されており、したがってｐＩαＡ２２−ＰｌｄｈＵＴＬＳプラスミド形質転換体は最も高いアミラーゼ活性に達したことがわかった。
【００５５】
（実施例２：α−アミラーゼを表層提示する乳酸菌の作成）
（１）乳酸菌α−アミラーゼ表層提示ベクターの構築
ｐＳＥＣＥ１（明治乳業より入手）を制限酵素BglIIおよびPvuIIで切断し、上記実施例１の（２）で得たＰ−ｌｄｈＵＴＬＳプロモーターを有するＤＮＡを導入して、ｐＬ３Ｕプラスミドを構築した。
【００５６】
ポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素の１つであるｐｇｓＡの遺伝子（配列番号４）を含むプラスミドｐＨＣＥ１ＬＢ−ｐｇｓＢＣＡ−ＨＢ１６８（Bioleaders Corporationより入手）を鋳型とし、配列番号２２および２３のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。次いで、ｐＬ３ＵをEcoRVおよびBamHIで切断し、同様に切断したｐｇｓＡ遺伝子を含むＰＣＲフラグメントを挿入し、ｐＬ３ＵＡ細胞表層提示プラスミドとした。
【００５７】
一方、プラスミドｐＱＥ３１（キアゲン社）にStreptococcus bovis 148由来のα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＡ：配列番号７；非特許文献３）が挿入されたプラスミドｐＱＥ３１：：ａｍｙＡから（神戸大学より入手、H. Shigechiら、Appl. Environ. Microbiol. 2004年, 70巻, 8号, pp.5037-5040）、成熟α−アミラーゼ遺伝子を、配列番号２４および２５のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。成熟α−アミラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をBamHIおよびHindIIIで切断し、同様に切断したｐＬ３ＵＡ細胞表層提示プラスミドにライゲートして、ｐＬ３ＵＡαＡＦベクター（図３）を得た。３’末端のHindIII部位の導入により、ａｍｙＡのＣ末端にＦＬＡＧタグの８アミノ酸（配列番号２６）が挿入された。
【００５８】
（２）α−アミラーゼを表層提示する乳酸菌の作成
上記（１）で得たＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ−ＦＬＡＧ融合タンパク質の細胞表層発現用のプラスミドｐＬ３ＵＡαＡＦを、乳酸菌Lactobacillus casei BLSJ03135（Bioleaders Japan Corporation）コンピテントセルにエレクトロポレーション法によって導入して、乳酸菌を形質転換した。
【００５９】
（２−１）ウエスタンブロッティングによる確認
形質転換したL. caseiの５mLの培養物から1,500×ｇで４℃にて５分間の遠心分離によって、細胞を採取し、３回洗浄し、そしてリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）（50mMリン酸、150mM塩化ナトリウム；pH7.4）に再懸濁した。細胞を、超音波処理によって破砕し、そして未破砕細胞を、1,500×ｇで４℃にて５分間の遠心分離を繰り返して除去した。次いで、上清を、21,000×ｇで４℃にて３０分間遠心分離した。L. caseiの膜および細胞壁からのタンパク質画分を、一次抗体としてマウス抗ＦＬＡＧ抗体（Promega Co.，Madison，Wis.）を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。結果を図４に示す。図４において、レーン１はｐＬ３ＵＡを有する形質転換体の膜および細胞壁画分であり、レーン２はｐＬ３ＵＡαＡＦを有する形質転換体の膜および細胞壁の画分であり、そしてＭは分子量マーカーである。図４から明らかなように、ｐＬ３ＵＡαＡＦを有するL. casei BLSJ 03135の膜および細胞壁の画分で、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ−ＦＬＡＧ融合タンパク質（約１２１ｋＤａ）の存在が確認できた。
【００６０】
（２−２）免疫蛍光顕微鏡検査による確認
ＡｍｙＡが細胞表層に提示されたことを確認するために、細胞の免疫蛍光標識を、一次抗体としてマウス抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行った。二次抗体は、１:３００の希釈割合のAlexa Flour 488と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｇ）（Molecular Probes, Inc.，Eugene，Oreg.）を用いた。細胞をＰＢＳで洗浄後、これらを顕微鏡で観察した。図５に免疫蛍光顕微鏡写真を示す。カラム１はNomarski微分干渉顕微鏡写真、およびカラム２は免疫蛍光顕微鏡写真である。ｐＬ３ＵＡαＡＦでの形質転換体では、Alexa Flour 488と結合したヤギ抗マウスＩｇＧによって免疫染色したＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ−ＦＬＡＧ融合タンパク質の緑色蛍光が観察された。逆に、コントロールプラスミドｐＬ３ＵＡを有する細胞は免疫染色されなかった。これらの事実は、ＡｍｙＡが、ｐＬ３ＵＡαＡＦを有するL. casei BLSJ 03135細胞表層に提示されたことを示す。
【００６１】
（２−３）フローサイトメトリー分析による確認
FACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，Calif.）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。細胞試料を、約１０６細胞/mLに希釈し、そして150〜300細胞／秒に対応する低流速で送達した。530nm（515〜545nm）のバンドパスフィルターを用いて、緑色蛍光（ＦＬ１）を回収した。図６から、ＡｍｙＡが、特異抗体での免疫蛍光標識によって、L. caseiの表層の環境に曝露されることが示された。
【００６２】
（２−４）α−アミラーゼ活性測定による確認
次いで、L. casei細胞表層におけるα−アミラーゼ活性を、基質としてＮ３−Ｇ５−β−ＣＮＰを用いてα−アミラーゼ測定キット（キッコーマン株式会社製）で測定した。まず、培養培地から回収したL. caseiを洗浄し、そしてボルテックスを用いて激しく攪拌しながらＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液容量当たりの湿細胞重量および細胞懸濁液のα−アミラーゼ活性を測定した。結果を、図７に示す。ＡｍｙＡを提示するL. caseiは、２４時間で１３．０Ｕ／ｇ（湿細胞重量）の高レベルのα−アミラーゼ活性を示した（●）。一方、コントロールプラスミドｐＬ３ＵＡを有するL. caseiでは活性は検出されなかった（■）。
【００６３】
（３）α−アミラーゼ表層提示乳酸菌を用いる乳酸発酵
α−アミラーゼ表層提示L. caseiを用いて、可溶化デンプンからの乳酸の産生のための、直接的同時糖化および発酵を行った。乳酸発酵培地は、炭素源として５０ｇ／Ｌの可溶化デンプンを含んでいた。α−アミラーゼ活性および生存細胞カウントを保持するために、発酵培地のｐＨを、5.0N NaOHの自動添加によって６．０に制御した。乳酸濃度を、有機酸分析システム（株式会社島津製作所製）：溶媒送達系、LC-10ADvp；カラム、Shim-pack SPR-H；検出器、CDD-10A；移動相、５mM p-トルエンスルホン酸；反応混合物、５mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris；カラム温度、４０℃を用いて測定した。また、フェノール−硫酸反応に基づく比色方法（Dubois, M.ら、Anal. Chem.，1956年，28巻，pp.350-356）を用いて、デンプンおよびデンプン加水分解産物に対応する全糖類の量を測定した。また、グルコースの濃度を、Glucose CII-Test Wakoキット（和光純薬株式会社製）を用いて測定した。結果を図８に示す。
【００６４】
α−アミラーゼ表層提示L. caseiにおいて、発酵の２４時間後に、約２１．８ｇ／Ｌの最も高い乳酸濃度を示した（○）。全糖類濃度（●）が減少するにつれて乳酸濃度が上昇するので、乳酸の産生は、ｐＬ３ＵＡαＡＦを有するL. caseiによる可溶化デンプンの同時糖化および発酵によって生じることがわかる。乳酸生産能は、１．５０ｇ／Ｌ／時間であった。産生した乳酸の収量は、２４時間で消費した炭水化物のｇ当たり０．６０ｇであった。なお、グルコースは、乳酸発酵中には検出されなかった（データは示さず）。また、α−アミラーゼを発現しないｐＬ３ＵＡを有するL. caseiでは、可溶化デンプンを利用できないため（■）、乳酸はほとんど産生されなかった（□）。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、菌株に関係なく、種々のタンパク質を活性な状態で効率よく発現し得る乳酸菌が提供される。発現させるタンパク質は、分泌されてもまたは表層提示されてもよい。このような乳酸菌は、大量に培養することが可能であり、乳酸菌の種類および発現されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。例えば、発現されるタンパク質がα−アミラーゼである場合は、可溶化デンプンを炭素源として直接的に利用して乳酸発酵を行うことができ、非常に有効に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】乳酸菌アミラーゼ分泌発現ベクターの構成を示す模式図である。
【図２】α−アミラーゼを分泌発現するように形質転換した乳酸菌のα−アミラーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図３】乳酸菌アミラーゼ表層提示ベクターの構成を示す模式図である。
【図４】α−アミラーゼを表層提示するように形質転換した乳酸菌の膜および細胞壁画分におけるα−アミラーゼについてのウエスタンブロッティングの写真である。
【図５】ｐＬ３ＵＡαＡＦまたはｐＬ３ＵＡでの形質転換体の免疫蛍光顕微鏡写真である。
【図６】ｐＬ３ＵＡαＡＦまたはｐＬ３ＵＡでの形質転換体のフローサイトメトリー分析結果のグラフである。
【図７】α−アミラーゼを表層提示するように形質転換した乳酸菌のα−アミラーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図８】ｐＬ３ＵＡαＡＦ（丸）またはｐＬ３ＵＡ（四角）を有する乳酸菌を用いる乳酸発酵における、乳酸濃度（白）および糖類濃度（黒）の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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