(57)【要約】【課題】    固定化が容易であると同時に自家発光することなく加工が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板を提供すること。【解決手段】  バイオチップの基板本体を金属で形成すると共に、該金属製基板本体上に活性基を有する炭素層を形成したものをバイオチップ用基板として用いる。【効果】  バイオチップ用基板は、基板本体が金属製であるので、加工が容易であるのみならず、割れや欠けを生じないので取り扱い性に優れ、高度な平坦性と表面精度を達成することができ、このため、蛍光の検出時に光学系の焦点を合わせ難いという問題が生じない。さらに、基板本体が金属製であるので、蛍光を自家発光することがない。さらに、炭素層がアミノ基等の活性基を有しているので、生体関連物質を容易に固定化することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属製の基板本体と、該基板上に積層された、活性基を有する炭素層とを具備するバイオチップ用基板。
【請求項２】
前記金属が、アルミニウム、チタン及びステンレススチール並びにこれらの少なくとも一種を含む合金から成る群より選ばれる金属である請求項１記載の基板。
【請求項３】
前記金属がアルミニウム又はその合金であり、前記基板と前記炭素層との間にめっき層又は該金属の酸化物層が設けられている請求項２記載の基板。
【請求項４】
前記活性基が、前記炭素に共有結合された、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、スルフヒドリル基若しくはエポキシ基又は前記炭素層に非共有結合的に結合されたポリリジンである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の基板。
【請求項５】
前記炭素層が、グラファイト、ダイヤモンド、ダイヤモンドライク炭素又はアモルファス炭素から成る請求項１ないし４のいずれか１項に記載の基板。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の基板上に、生体関連物質を固定化したバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、ペプチド、糖等の生体関連物質を固定化したバイオチップ及びそのための基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
平板状の基板表面にDNA、プロティンを固定化させたバイオチップには、フォトリソグラフィを用いて基板表面でオリゴヌクレオチドを合成するAffymetrix法と、予め準備したプローブDNA、プローブプロティンをスポットして基板表面に固定化するStanford法があり、いずれの場合もターゲットとの生化学反応後に蛍光を検出し、そのパターンから分子識別や診断を行うことは良く知られている。上記２法の内、Affymetrix法は基板表面で合成するため、安定的な固定化や長いオリゴヌクレオチドの合成が困難であり、コストも高いという欠点があった。また、Stanford法はプローブDNA、プローブプロティンなどの微少なスポットを基板表面に載せ、吸着や共有結合で被認識分子を固定化するために、基板表面に共有結合型のアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基あるいは非共有結合型のポリリジンを付与しておくが、提案されている基体が、ガラス、シリコン、セラミックス、グラッシー炭素、特殊炭素などの無機系材質の場合はいずれも脆性が大きいために加工時に割れたり、成形に時間とコストが掛かるという欠点があった。基体が有機物系の樹脂の場合は射出成形などで加工は用意である反面、平坦度が悪くて反りが大きいために検出時に焦点が合わないと共に自家発光によりS/N比を下げる欠点を有していた。更に保管中にその平面性が変化するという欠点もあった。
【０００３】
【特許文献１】特開2001-128683号公報
【特許文献２】特表2005-510440号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、Stanford法のプローブDNA、プローブプロティン、プローブ糖鎖などを基板表面にスポットする、あるいはマイクロビーズなどを固定化するにあたって、上記の欠点を解消すべく、固定化が容易であると同時に自家発光することなく加工が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、バイオチップの基板本体を金属で形成すると共に、該金属製基板本体上に活性基を有する炭素層を形成したものをバイオチップ用基板として用いることにより、生体関連物質を容易に固定化することができ、自家発光することなく、加工が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、金属製の基板本体と、該基板上に積層された、活性基を有する炭素層とを具備するバイオチップ用基板を提供する。また、本発明は、上記本発明のバイオチップ用基板生体関連物質を固定化したバイオチップを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、生体関連物質を容易に固定化することができ、自家発光することなく、加工が容易で平坦性と表面精度が良好なバイオチップ用基板が初めて提供された。本発明のバイオチップ用基板は、基板本体が金属製であるので、加工が容易であるのみならず、割れや欠けを生じないので取り扱い性に優れ、高度な平坦性と表面精度を達成することができ、このため、蛍光の検出時に光学系の焦点を合わせ難いという問題が生じない。さらに、基板本体が金属製であるので、蛍光を自家発光することがない。さらに、炭素層がアミノ基等の活性基を有しているので、生体関連物質を容易に固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
上記の通り、本発明のバイオチップ用基板は、その基板本体が金属製である。金属としては、アルミニウム、チタン及びステンレススチール並びにこれらの少なくとも一種を含む合金から成る群より選ばれる金属が、加工が容易で、かつ、剛性があるために平坦性に優れ、表面硬度が高いために研磨後の平滑性に優れるなどの理由で好ましい。
【０００９】
基板本体が曲がっていたり表面に凹凸があると、乱反射が多くなったり、検出時の焦点が合わなかったりして、検出時のＳ／Ｎ比が下がるので、基板本体は平坦でかつその表面が平滑であることが好ましい。このため、打ち抜きなどの寸法加工後に加圧焼鈍を行い歪みを取り去ると共に平坦性を向上させ、次いで表面の研削加工を施して平滑化した後、更に表面を研磨して表面精度を上げて基板本体を製造することが好ましい。これらの平坦／平滑化加工は、金属加工の常法により行うことができる。なお、金属がアルミニウム又はアルミニウム合金である場合には、柔らかくて表面精度を確保し難いので、無電解NiPめっきや陽極酸化などの硬質化処理を表面に施すことが好ましい。基板本体の表面の表面粗さRaは1nm未満であることが好ましい。Raの下限は特にないが、通常、0.2nm程度が加工精度の限界に近い。また、基板本体の表面の平坦度は、５μｍ未満であることが好ましい。基板本体の厚さは何ら限定されないが、通常、0.5mm〜2mm程度である。また、アルミニウム又はアルミニウム合金から成る基板本体上にNiP等のめっき層を形成したり、その表面を陽極酸化して酸化物層を形成する場合、これらのめっき層や酸化物層の厚さも何ら限定されないが、通常、５μm〜３０μm程度である。
【００１０】
上記基板本体の表面上に、活性基を有する炭素層が積層される。なお、上記のように、めっき層や酸化物層が形成される場合にはその上に炭素層が形成される。すなわち、炭素層は、基板本体の表面上に直接又は他の層を介して間接的に積層される。炭素層は、グラファイト、ダイヤモンド、ダイヤモンドライク炭素、アモルファス炭素等の、炭素から成る層であり、これらはスパッタ法、蒸着法、ＣＶＤ(chemical vapor deposition)法等により形成することができる。すなわち、グラファイト層は、例えば、グラファイト粒子を蒸着源とする真空蒸着法により、形成することができる。ダイヤモンド層は、例えば、熱フィラメントCVD装置を用いて低圧気相合成法により、形成することができる。ダイヤモンドライク炭素は、例えば、イオンビームスパッタ法あるいは高周波プラズマCVD法により、形成することができる。アモルファス炭素は、例えば、高周波スパッタ法により、形成することができる。これらは、市販の装置を用いて容易に行うことができる。
【００１１】
炭素層は生体関連物質を固定化するための活性基を有する。活性基は、上記のように炭素層を形成した後、炭素層に活性基を結合させることにより付与することができる。活性基としては、特に限定されないが、炭素に共有結合されたアミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、スルフヒドリル基及びエポキシ基を例示することができる。これらの中でもアミノ基は、汎用性が高く、生体関連物質との結合も容易であるので特に好ましい。これらの共有結合により炭素に結合されるこれらの官能基は、プラズマあるいは紫外線照射によって炭素のＣ−Ｃ結合、Ｃ＝Ｃ結合、Ｃ−Ｏ結合を切り、ラジカル化したＣと、該官能基又は該官能基を有する化合物とを結合させることにより炭素に共有結合させることができる。例えば、アミノ基は、下記実施例に詳述するように、炭素層に大気雰囲気下で紫外線を照射することにより、大気中の酸素をオゾンに変えてこのオゾンを炭素と作用させ、次いで、排気後、塩素ガスを作用させて炭素を塩素化し、さらに、排気後、アンモニアガスを作用させて炭素をアミノ化することにより炭素に共有結合させることができる。また、アンモニアプラズマ照射で直接導入する事もできる。またアルゴンプラズマ照射基板表面にラジカルを形成させ、空気酸化でパーオキサイドとし、アリルアミン等との反応によってもアミノ基を表面で生成できる。アルデヒド基は、例えば、炭素表面を酸塩化物にして還元することで得られる。カルボキシル基は、例えば、アミノ基をジアゾニウムイオンとし、ニトリルに変換した後、これを加水分解することで得られる。また、アルキル基を過マンガン酸カリ等で酸化させても得られる。スルフィヒドリル基は、例えば、炭素表面を光などでハロゲン化し、生成するハロゲン化アルキルにチオ−ルを反応させて得ることができる。エポキシ基は、例えば、炭素・炭素二重結合を過酸で処理してつくることができる。これらはいずれも当業者にとって周知の有機合成化学の反応に基づき行うことができる。また、活性基は、必ずしも共有結合により炭素に結合させる必要はなく、活性基を有する化合物を炭素層に非共有結合的に物理吸着させてもよい。例えば、側鎖にアミノ基を有するアミノ酸であるリジンを重縮合したポリリジンを炭素層に物理吸着させることにより炭素層にアミノ基を付与することができる。炭素層に付与する活性基の密度は、特に限定されないが、炭素層1cm2当り通常  50 pmol〜200 pmol程度、好ましくは、100 pmol〜200 pmol程度である。
【００１２】
上記した本発明のバイオチップ用基板に生体関連物質を固定化することによりバイオチップを得ることができる。ここで、生体関連物質としては、DNA、RNA等の核酸、各種タンパク質、抗体、酵素並びに合成及び天然ペプチド等のペプチド、多糖類、少糖類等の糖類、各種脂質、並びにこれらの複合体（糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質等）を例示することができる。また、細胞自体を固定化することも可能であり、細胞自体も本願発明で言う「生体関連物質」に包含される。さらに、補酵素、抗原エピトープ、ハプテンのような低分子化合物も、酵素や抗体のような生体高分子と特異的に相互作用するので本願発明で言う「生体関連物質」に包含される。これらの生体関連物質は、そのまま上記炭素層に結合することもできるし、生体関連物質をプラスチックビーズ等の他の担体上に担持した状態で上記炭素層に結合することもできる。
【００１３】
炭素層上への生体関連物質の固定化は、上記した活性基を介して周知の方法により行なうことができる。例えば、活性基がアミノ基である場合、下記実施例に詳述するように、アミノ基をブロモ酢酸とカルボジイミドにより相当する無水物とし、アミノ基と反応させて表面をブロモアセチル化し、ついでペプチド等の生体関連物質中のスルフィドリル基と反応させることにより、固定化することができる。あるいは、グルタルアルデヒドを介して生体関連分子中のアミノ基と反応させて固定化できる。活性基がアルデヒド基の場合には、固定化したい生体分子のアミノ基と共有結合で固定化できる。活性基がカルボキシル基の場合には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとエステルを形成し生体関連物質のアミノ基と結合できる。活性基がスルフヒドリル基の場合には、生体関連分子のアミノ基を選択的にブロモアセチル化することにより固定化できる。あるいは同じスルフィドリル基とジスルフィドを介して固定化できる。さらに、スルフィドリル基は固定化する位置のアミノ基を選択的にマレイミド化（たとえばＮ−６マレイミドカプロン酸とアミノ基とを縮合させる）して反応させることで固定化できる。活性基がエポキシ基の場合には、同様にマレイミドのついた生体関連物質と反応することにより固定化することができる。
【００１４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１５】
バイオチップ用基板の製造
板厚1.2mmの高純度Al-Mg合金板（Mg含有量４重量％）を26x76mm角にプレスで打ち抜いた後に、340℃の雰囲気下で複数枚を積み重ねて加圧焼鈍を行い、歪みを取り去ると共に平坦度を5μm以下にした。その後、端面とチャンファの加工（具体的には、角度４５°、a寸法0.2mm）を行い、25x75mmの平板を作製した。次いで、スポンジ砥石を貼ったスピードファム社製の両面研削機１６Ｂを用いて研削加工を行い、板厚0.98mm、平行度1μm以下とした。続いて、この平板に順に脱脂、エッチング、酸活性処理、ジンケート処理を施した。具体的には、上村製アルカリ脱脂液AD-68F（50℃）に5分間、硫酸・リン酸系エッチング液AD-101F（80℃）に2分間、硝酸活性液（20℃）に1分間、ジンケート液AD-301F3X（20℃）に30秒間、順次、浸セキ処理を行って前処理を施した。さらにその後に、メルテック社製無電解NiP液NI-422（90℃）に2時間、浸セキして両面に各12μm厚のめっき膜を形成した。更に、これをスピードファム社製の両面研磨機１６Bにコロイダルシリカ砥粒を用いて両面を各２μm研磨し、超平滑基板とした。基板は板厚1.00mm、表面粗さRaが0.35nmであった。なお、平坦度、平行度及びRaは、それぞれ、溝尻製平坦時計FT-50LD、ランクテーラーホブソン製真円度測定機タリロンド、ランクテーラーホブソン製触針式粗さ計タリステップを用いて測定した。
【００１６】
次に、徳田製作所社製高周波スパッタ装置CFS-8EPを用いて、片面にアモルファスカーボンを40nm厚つけた。具体的には、Ar雰囲気1.0Pa、投入進行波電力(Pf)1kW、反射波電力(Pr)20Wの条件で5分間スパッタした。次にこのアモルファスカーボン層に活性基を付与した。活性基の付与は次の方法で行った。まず、合成石英の窓を持つステンレス製容器内に基板をセットした後に大気雰囲気下で波長185nmを30%強度、波長254nmを100%強度の比率を持つ紫外線（ランプ出力110W）を３cm離れた位置で照射して基板表面のオゾン処理を行った。次に、排気の後に塩素を導入し13Pa塩素雰囲気下で塩素処理（25℃、5分間）を行い、更に排気の後にアンモニアを導入し13Paアンモニア雰囲気下でアミノ化処理（25℃、5分間）を行った。この基板のアミノ基量は4.1 nmol/両面であった。なお、アミノ基量は、基板表面を塩酸で処理した後に残存する塩酸を水酸化ナトリウム水溶液で逆滴定する方法（特願２００５−０６９５５４）により測定した。
【実施例２】
【００１７】
バイオチップの製造及びそれを用いた測定
バイオチップに固定化するペプチドとして、次の配列を有する蛍光標識ペプチドを化学合成した。Ac-Cys-Gly-Lys(FAM)-Gly-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys(TAMRA)-Gly-NH2
ここで、FAM及びTAMRAは、いずれも蛍光色素である。FAMを光励起すると、FAMとTAMRA間の距離に応じて、FAMの励起エネルギーがTAMRAに移動し、TAMRAの蛍光が発する（蛍光共鳴エネルギー移動、FRET、蛍光という)。タンパク質が結合するとペプチドのへリックス構造が固定され、FRET蛍光が増大する。FRETは励起状態にある供与体分子（この場合FAM）から基底状態にある受容体分子（この場合TAMRA）へのエネルギー移動により受容体からの蛍光が観測される現象である。このペプチドは、タンパク質であるカルモジュリン(CaM)と特異的に結合することが知られているが、結合するとFAMとTAMRAの距離が小さくなる。CaMの量が多いほど測定されるＴＡＭＲＡからの蛍光強度が大きくなり結合の定量が可能である。
【００１８】
上記標識ペプチドを60%ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、２μMの濃度とした。一方、実施例１で作製した基板上のアミノ基をブロモアセチル化した。これは具体的には次のようにして行なった。ブロモ酢酸 (BrAcOH、東京化成  Mw=138.95, 2.00 mmol, 278 mg) 、ジイソプロピルカルボジイミド  （DIC） (Ardrich  Mw=126.20, 1.00 mmol, 126 mg)をNメチルピロリドン（NMP）(3.33 ml)に溶解し室温で60分間ゆっくりしんとうし、ブロモ酢酸無水物を形成させた。えられた混合物を超純水（Milli Q水（商品名））で約10 mMに希釈して約100mlの溶液とし、当該アミノ化基板に加え、室温で２時間浸し、時々軽くしんとうし、ブロモ化した。得られた基板を超純水（Milli Q水（商品名））で洗浄し、窒素で乾燥させた。次に、上記標識ペプチド溶液を基板上にスポットして該標識ペプチドを、上記ブロモアセチル化したアミノ基と反応させて結合させ、基板上に固定化した。スポットはTeleChem International 社（米国カリフォルニア）製のSpotBot装置を用い、同じくTeleChem International 社のマイクロスポッティングピンを使用して実施した。
【００１９】
このようにして作製した標識ペプチド固定化基板に、異なる量のCaMを含む溶液（CaMを１００μMの塩化カルシウム溶液に溶解した）を塗布し、洗浄後、蛍光をスキャナー（日立ソフトウエアエンジニアリング社製  CRBIO IIe）を用いて測定した。
【００２０】
結果を図１に示す。図１に示されるように、測定された蛍光強度は、基板に添加したCaMの量に依存して増大しており、本発明のバイオチップにより、チップに固定化された生体関連物質と特異的に反応する物質を定量できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施例において作製したバイオチップを用いて被検試料中のカルモジュリンを測定した際の、カルモジュリン量と測定された蛍光強度との関係を示す図である。
【図１】
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