(57)【要約】【課題】迅速、簡便かつ高精度なモノアミンの測定方法、特にチラミンとヒスタミンの分別定量を可能とする。【解決手段】緩衝液の流れを形成する機構２と、該緩衝液流に試料を注入する機構３と、該試料注入機構の下流に、第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体５、さらに下流に電気化学的活性物質濃度を検知できる電極６を配置し、さらにその下流側に第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体に比べて比活性が大きい同一種の第２のモノアミンオキシダーゼ固定化体７と電気化学的活性物質濃度を検知できる電極８を配置する。一定量の固定化体に含まれる酵素の固定化量を変化させる、すなわち比活性を変えるだけで２種類のモノアミンに対して異なった検量線が得られ測定可能となる。【選択図】図１
2006038612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1)緩衝液の流れを形成し、(2)該緩衝液流に試料を注入し、(3)注入点の下流側において、第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体を緩衝液に接触させ、(4)前記固定化体に接触後の緩衝液中の電気化学的活性物質濃度を測定し、(5)前記緩衝液中の電気化学的活性物質濃度を測定後の緩衝液に、第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体に比べて比活性が大きい同一種の第２のモノアミンオキシダーゼ固定化体を接触させ、(6)前記第２のモノアミンオキシダーゼ固定化体に接触後の緩衝液中の電気化学的活性物質濃度を更に測定する、モノアミンの濃度測定方法。
【請求項２】
前記第１および第２のモノアミンオキシダーゼがチラミンオキシダーゼである請求項1記載のモノアミンの濃度測定方法。
【請求項３】
測定対象のモノアミンがチラミンおよびヒスタミンである請求項１または２記載のモノアミンの濃度測定方法。
【請求項４】
緩衝液の流れを形成する機構と、該緩衝液流に試料を注入する機構と、該注入機構の下流側に配置した第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体と、この固定化体の下流側に配置した電気化学的活性物質濃度を検知する第１の電極と、さらに下流側に配置した第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体に比べて比活性が大きい第２のモノアミンオキシダーゼ固定化体と、この固定化体の下流側に配置した電気化学的活性物質濃度を検知する第２の電極と、を備えるモノアミンの濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はモノアミンの濃度測定に関する。モノアミンは食品、特に海産物等の微生物汚染検査、品質管理面で注目されており、そのような中で、特に迅速、簡便かつ高精度で分析可能な酵素固定化体を利用したモノアミンの濃度測定に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノアミンは、食品中のタンパク質、ペプチドおよび遊離アミノ酸が微生物的、もしくは酵素による変換反応を受けて生成する。中でもヒスタミンは魚、貝などの海産物が大腸菌などに汚染され、含まれるヒスチジンがその微生物の有するヒスチジン脱炭酸酵素により分解されて生成する。ヒスタミンは個人差はあるもののアレルギー反応を引き起こす可能性があり、食品安全性の面から測定する必要性が高い。同様にチラミンはチロシンからチロシン脱炭酸酵素の作用で生成し、ヒスタミンに比べて毒性は低いが、血管拡張作用などを有するため高濃度の摂取は望ましくないとされている。
【０００３】
このようにモノアミン類の中でも、ヒスタミンやチラミンの測定の要求は高いため、酵素法、免疫法など各種の測定方法が提案されている。酵素法は免疫法に比べて操作が簡単で、迅速である点が優れているが、モノアミンに作用する酵素の特異性は低いものが多く、両者を正確に分別定量することは従来困難であった。
特許文献１には、食品中等のヒスタミンを測定する場合等に使用するのに好適な固定化ヒスタミンオキシダーゼ及びこれを用いたヒスタミン測定装置が開示されている。本文献ではアルスロバクター・クリスタロポイーテス由来の酵素を精製し、アルスロバクター・グロビホルミス由来の酵素との比較がなされている。その結果、どちらの酵素もヒスタミン１００％に対して４０％程度チラミンに活性を有することが記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開2002-264号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前出の特許文献１では固定化したヒスタミンオキシダーゼによる魚肉抽出液の分析を実施した例も開示されているが、その中で基質特異性は遊離の酵素と固定化酵素で変化しない旨の記載がある。一方、本発明者等の試行によるところでは、実際には魚肉が微生物汚染を受けるとヒスタミンと同時にチラミンの生成が認められた。すなわち、この先行技術ではヒスタミンの応答にチラミンの応答が上乗せされる場合があり正確なモノアミン類の測定は不可能である。
本発明は前記の問題点を解決することを主な目的として、迅速、簡便かつ高精度なモノアミンの測定方法、特にチラミンとヒスタミンの分析方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、(1)緩衝液の流れを形成し、(2)該緩衝液流に試料を注入し、(3)注入点の下流側において、第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体を緩衝液に接触させ、(4)前記固定化体に接触後の緩衝液中の電気化学的活性物質濃度を測定し、(5)前記緩衝液中の電気化学的活性物質濃度を測定後の緩衝液に、第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体に比べて比活性が大きい同一種の第２のモノアミンオキシダーゼ固定化体を接触させ、(6)前記第２のモノアミンオキシダーゼ固定化体に接触後の緩衝液中の電気化学的活性物質濃度を更に測定する、モノアミンの濃度測定方法である。
更に前記第１および第２のモノアミンオキシダーゼがチラミンオキシダーゼであることが好ましい。
また更に測定対象のモノアミンがチラミンおよびヒスタミンであることが好ましい。
本発明は、緩衝液の流れを形成する機構と、該緩衝液流に試料を注入する機構と、該注入機構の下流側に配置した第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体と、この固定化体の下流側に配置した電気化学的活性物質濃度を検知する第１の電極と、さらに下流側に配置した第１のモノアミンオキシダーゼ固定化体に比べて比活性が大きい第２のモノアミンオキシダーゼ固定化体と、この固定化体の下流側に配置した電気化学的活性物質濃度を検知する第２の電極と、を備えるモノアミンの濃度測定装置である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のモノアミンの濃度測定装置は、同一種のモノアミンオキシダーゼを用いて固定化量の異なる固定化体を複数用いて測定するため、単数の固定化酵素体では同時に反応するために分別定量が不可能であった例えばチラミンおよびヒスタミンの分別定量が可能にという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書で言うモノアミンオキシダーゼとは、担子菌、細菌、カビなどから分離され、モノアミンと溶存酸素を反応させ、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である。
これを反応式で示せば、
Ｒ−ＣＨ２−ＮＨ４＋ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２ → Ｒ−ＣＨＯ ＋ Ｈ２Ｏ２
となる。
従って本酵素を用いた測定方法としては、酸素電極等を用いて反応により減少する溶存酸素を検知するか、あるいは過酸化水素電極等を用いて反応により増加する過酸化水素を検知する方法が適用可能である。
【０００９】
一般にモノアミン類を酸化する酵素は最も分解率の高いモノアミンの名称を冠して呼ばれ、たとえば「酵素ハンドブック」（丸尾文治、田宮信雄 監修、朝倉書店、１９８２年）には、エタノールアミンオキシダーゼ、メチルアミンオキシダーゼなどが収載されている。しかしどの酵素も他のモノアミンに応答するため、確定的な分析には用いにくいものである。
【００１０】
これらのモノアミン類のオキシダーゼ固定化体を検討する過程で、同一種のモノアミンオキシダーゼであっても一定量の固定化体に固定する酵素量によって各種のモノアミンに対する応答比率が異なることに気づいた。
つまり各酵素は本質的に各種モノアミンを酸化する能力を要する。しかし一定量の固定化体に大量の酵素を固定化すると、主な反応系は飽和し、モノアミン濃度を増やしてもそれ以上感度が上昇しない。つまり試料が非常に長い時間固定化体に接触する場合を考えると、定量的に過酸化水素が生成してしまうとそれ以上の反応は進行しない。一方で比較的反応率の低いモノアミンの酸化は酵素量が増えるにつれて、濃度に対する応答値が直線的に増加する。
【００１１】
モノアミンオキシダーゼの一例として前出「酵素ハンドブック」に収載されているチラミンオキシダーゼ（EC1.4.3.4）を考える。この酵素は安定性に優れている。主にチラミンを酸化するが、高濃度で固定化するとヒスタミンに対しても直線的に応答する。例えば酵素の固定化量を１とするものとその10倍に変化させたものの二つの固定化体を用意し、それぞれ試料を接触させると、低固定化量の固定化体はチラミンのみを酸化し、高固定化量の固定化体はチラミンとヒスタミンをほぼ同じ程度酸化することが分かった。
従って２つの固定化体で生成する過酸化水素量を比較すると、チラミンとヒスタミンを分別定量することが可能である。
【００１２】
一般的に、酵素の量を表す場合、酵素タンパク質量もしくは不純物等を含む全重量と酵素反応の活性の比を取ることにより、単位量あたりの酵素量、つまり比活性で定義される。例えば固定化された酵素の活性を固定化担体の単位重量で除した値も比活性となる。換言すれば、比活性に固定化担体量をかけると酵素の全活性が得られる。
一定量の固定化体に含まれる酵素の固定化量を変化させる、すなわち比活性を変えるだけで２種類のモノアミンに対して異なった検量線が得られるわけである。
本発明においては、２つの固定化体の比活性の比率が重要である。比活性が同じ固定化体を用いた場合は、２つの固定化体の示す複数のモノアミンに対する変換速度は等しく、検量線の勾配の比率は同じとなる。したがって２つの電極から得られる結果の差演算を行っても複数のモノアミンを測定することはできない。一方で比活性の低い固定化担体と、高い固定化担体を利用すると、高比活性の固定化担体内を試料が通過する際に、第１のモノアミンに対する変換速度が飽和して、第２のモノアミンに対する相対感度が上昇する。これにより差演算が可能になる。
【００１３】
さらにこの２つの固定化体は同種の酵素を固定化したものであるから、反応等の最適化、安定化についてはその酵素の最適な反応条件を探索するだけで良い。これに対して、従来使用されているような異種の酵素を固定化したものを組み合わせて測定を行う場合は、その異種の酵素に対して最大公約数的な反応条件の模索が必要になるので非常に煩雑になる。
【００１４】
酵素の固定化量必要量は、基本的に試料の接触時間と関係している。一般的に酵素の量は特定温度、特定pHにおいて１分間に基質を１マイクロモル変換する酵素の活性で表示する。これがユニット数と呼ばれるものである。たとえばフロー型分析装置で、固定化担体の中を10秒間で基質が通り抜けるとすると、６ユニットの酵素が固定化されていると１マイクロモルの基質が変換される。実際には測定濃度範囲を広げるために、より多くの酵素を固定化して用いる場合が多い。
本発明における、酵素の固定化量の比率としては、前記の計算から割り出された低固定化量の固定化カラムに対して、高固定化量の固定化カラムでは２から50倍程度にすることが望ましい。より望ましくは２ないし20倍程度にすると好適である。
2倍未満の差では検量線の変化が少なく、差演算処理を行った際の誤差が大きくなってしまう。一方固定化量が多すぎると当然のことであるが、タンパク質の絶対量が多くなり、固定化担体表面が埋め尽くされることにより基質および生成物の拡散が阻害されて、分析時間が長くなる、測定精度が低下するなどの問題を起こす恐れがある。
【００１５】
以下に実際にチラミンとヒスタミンを例に低固定化量の固定化体と高固定化量の固定化体を使用して分別定量を行う場合を説明する。
図１はフロー型の２チャンネル測定装置である。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液し、オートサンプラー（３）より試料を注入する。送液された試料は、恒温槽（４）中に設置された低固定化量の第１のチラミンオキシダーゼ固定化カラム（５）第１の過酸化水素電極（６）、比活性を上げた高固定化量の第２のチラミンオキシダーゼ固定化カラム（７）第２の過酸化水素電極（８）を通過し、チラミンおよびヒスタミンから過酸化水素が生成し電流値の変化をとらえる。
電流値の変化は、検出器（９）により検出される。さらに信号をパーソナルコンピューター（１０）に送ることもできる。検出器（９）は電流値の測定演算の他、ポンプ（２）やオートサンプラー（３）の制御等を行う演算制御部を搭載している。
【００１６】
上記の低固定化量の固定化体と過酸化水素電極を組み合わせた検出系すなわち第１の過酸化水素電極（６）で得られたチラミンの検量線を
ｙ＝ａ１１×ｘ＋ｂ１１
ヒスタミンの検量線を
ｙ＝ａ１２×ｘ＋ｂ１２
とし、
【００１７】
高固定化量の固定化体と過酸化水素電極を組み合わせた検出系すなわち第２の過酸化水素電極（８）で得られたチラミンの検量線を
ｙ＝ａ２１×ｘ＋ｂ２１
ヒスタミンの検量線を
ｙ＝ａ２２×ｘ＋ｂ２２
とすると、
【００１８】
ｘ１の濃度のチラミンとｘ２の濃度のヒスタミンによる応答値は
低固定化量の固定化体と過酸化水素電極を組み合わせた検出系では、
ｙ１＝ａ１１×ｘ１＋ｂ１１＋ａ１２×ｘ２＋ｂ１２
高固定化量の固定化体と過酸化水素電極を組み合わせた検出系では、
ｙ２＝ａ２１×ｘ１＋ｂ２１＋ａ２２×ｘ２＋ｂ２２
となる。
【００１９】
これらの値を元にチラミン、ヒスタミンの濃度をそれぞれ求めると、すなわち
チラミンの濃度ｘ１は
ｘ１＝（ａ１２×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２２×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１２×ａ２１−ａ１１×ａ２２）
ヒスタミンの濃度ｘ２は
ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１１×ａ２２−ａ１２×ａ２１）
となる。
【００２０】
もちろん低固定化量の固定化体でのヒスタミンの応答がある場合でもこのように、チラミン、ヒスタミンの濃度が算出でき分別定量が可能であるが、高精度での測定を考えると低固定化量の固定化体と高固定化量の固定化体でのヒスタミンに対する応答値の差が大きいほど望ましく、さらに先に述べたように低固定化量の固定化体でのヒスタミンの応答がない場合、上式の ａ１２、ｂ１２ は ０ となり、
チラミンの濃度ｘ１は
ｘ１＝(ａ２２×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１１×ａ２２）
ヒスタミンの濃度ｘ２は
ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１））／（ａ１１×ａ２２）
となる。
【００２１】
モノアミンオキシダーゼの固定化方法としては、物理吸着法、イオン結合法、包括法、共有結合法などタンパク質の固定化方法として公知の方法を利用できるが、中でも共有結合法が長期安定性に優れ望ましい。タンパク質を共有結合させる方法としては、ホルムアルデヒド、グリオキザール、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を有する化合物を用いるか、多官能基性アシル化剤を利用する方法、スルフヒドリル基を架橋させる方法など各種の方法を利用できる。酵素固定化体の形状としては、膜状に固定化し白金、金、カーボンなどからなる電極上にのせることもできるし、不溶性担体に固定化し担体をカラムリアクターに充填して用いることもできる。
【００２２】
さらに固定化の際に他種の酵素あるいはゼラチンや血清アルブミンなどのタンパク質、ポリアリルアミンやポリリジンなどの合成高分子を共存させ、酵素固定化体の特性、すなわち膜強度、基質透過特性などを変更することもできる。酵素を不溶性担体に固定化する場合の担体としては、ケイソウ土、活性炭、アルミナ、酸化チタン、架橋処理デンプン粒子、セルロール系高分子、キチンおよびキトサン誘導体などの公知の担体を利用できる。
【００２３】
モノアミンオキシダーゼとしてはエタノールアミンオキシダーゼ、メチルアミンオキシダーゼなどが挙げられる。なかでもチラミンオキシダーゼ（EC1.4.3.4）はそのような固定化する酵素量によって各種のモノアミンに対する応答比率の異なり方が著しく違い、高い測定精度を得やすい種類の酵素であることがわかった。
固定化された酵素に試料を一定時間接触させて反応を進行させるには、試料液を一定時間撹拌しながら反応を起こさせるバッチ方式でも可能であるが、より高精度の測定を実施するためにフロー方式の測定を用いることが望ましい。
【００２４】
以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例）
（１）低固定化量の第１のチラミンオキシダーゼ固定化カラムの製造
耐火レンガ（８０〜１００メッシュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にチラミンオキシダーゼを２．５ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液３５０μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填し第１のチラミンオキシダーゼ固定化カラムとする。
【００２５】
（２）比活性を上げた高固定化量の第２のチラミンオキシダーゼ固定化カラムの製造
（１）の第１のチラミンオキシダーゼ固定化カラムの製造方法と同様に耐火レンガをホルミル化する。そしてこの耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にチラミンオキシダーゼを２５ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液３５０μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填し比活性を上げた第２のチラミンオキシダーゼ固定化カラムとする。
【００２６】
（３）過酸化水素電極の製造
直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テトラフルオロエチレンで被覆し、その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極とする。
また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
【００２７】
（４）測定装置
図１はフロー型の２チャンネル測定装置である。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液し、オートサンプラー（３）より試料５μｌを注入する。送液された試料は、恒温槽（４）中に設置された低固定化量の第１のチラミンオキシダーゼ固定化カラム（５）第１の過酸化水素電極（６）、比活性を上げた高固定化量の第２のチラミンオキシダーゼ固定化カラム（７）第２の過酸化水素電極（８）を通過し、チラミンおよびヒスタミンから過酸化水素が生成し電流値の変化をとらえる。
電流値の変化は、検出器（９）により検出される。さらに信号をパーソナルコンピューター（１０）に送ることもできる。検出器（９）の演算処理部では電流値の測定演算の他、ポンプ（２）やオートサンプラー（３）の制御等も行っている。
この装置に流す緩衝液の組成は、１００ｍＭのリン酸、５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのアジ化ナトリウム、を含みｐＨが７．０である。緩衝液の流速は１．０ｍｌ／分、恒温槽の温度は３０℃であった。
【００２８】
（５）チラミン・ヒスタミンの測定
（４）の測定装置を利用して、０、１、２、５ｍＭのチラミンおよびヒスタミンの溶液の各５μｌずつを注入し、検出値を得た。
上流側の第１の過酸化水素電極６の測定結果は表１のようになり、図２で示す次式の検量線が得られた。ただしＹは検出値（ｎＡ）Ｘは試料中の濃度（ｍＭ）である。またｒは相関係数である。
チラミン検量線    Ｙ＝  ２０．１１Ｘ＋２．１２  ｒ＝０．９９９０
ヒスタミン検量線  Ｙ＝０．００Ｘ＋０．００
【００２９】
【表１】
2006038612.tif 000003
【００３０】
直線性は良好であり、かつチラミンからアルデヒドへの変換が８０％以上の効率で行われていることがわかった。
また、下流側の比活性をあげたチラミンオキシダーゼ固定化カラムの下流の第２の過酸化水素電極８での測定結果は表２のようになり図３で示す次式の検量線が得られた。ただしＹは検出値（ｎＡ）Ｘは試料中の濃度（ｍＭ）である。またｒは相関係数である。
チラミン検量線    Ｙ＝  ２６．７４Ｘ＋１．１６  ｒ＝０．９９９８
ヒスタミン検量線  Ｙ＝１２．５８Ｘ＋０．３１  ｒ＝０．９９９９
【００３１】
【表２】
2006038612.tif 000004
【００３２】
この測定装置を用いてチラミン１．５ｍＭとヒスタミン１．５ｍＭの混合溶液を測定したところ、上流側の第１の過酸化水素電極６の測定値は３２．３０ｎＡの値を、下流側の第２の過酸化水素電極８の測定値は６０．４９ｎＡの値を得た。これからチラミンの濃度ｘ１は前出の式 ｘ１＝ａ２２×（ｙ１−ｂ１１−ｂ１２））／（ａ１１×ａ２２） より
ｘ１＝ １．５０１ｍＭが得られ、またヒスタミンの濃度ｘ２は式 ｘ２＝（ａ１１×（ｙ２−ｂ２１−ｂ２２）−ａ２１×（ｙ１−ｂ１１））／（ａ１１×ａ２２） よりｘ２＝ １．５０２ｍＭ と求めることができた。
以上の結果よりわかるようにチラミン、ヒスタミンの２成分について極めて精度良く濃度測定ができることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
食品の微生物汚染等、食品安全分野での指標となるモノアミン類の測定用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のモノアミンの濃度測定装置を示した説明図。
【図２】第１の過酸化水素電極で得られたチラミン、ヒスタミンの検量線のグラフ。
【図３】第２の過酸化水素電極で得られたチラミン、ヒスタミンの検量線のグラフ。
【符号の説明】
【００３５】
１    緩衝液槽
２    ポンプ
３    オートサンプラー
４    恒温槽
５    第１のチラミンオキシダーゼ固定化カラム
６    第１の過酸化水素電極
７    第２のチラミンオキシダーゼ固定化カラム
８    第２の過酸化水素電極
９    検出器
１０  パーソナルコンピューター
【図１】
2006038612.tif 000005
【図２】
2006038612.tif 000006
【図３】
2006038612.tif 000007