(57)【要約】【課題】    少なくとも肝細胞癌を高頻度に検出することができる、遺伝子検査による癌の検出方法を提供すること。【解決手段】  癌の検出方法は、被検者から分離された被検試料中のRFC3遺伝子のエクソン３中の10ntから19ntの位置にある１０個の連続するAから成るA10領域中のAが１個欠失しているか否か又はAが１個挿入されているか否かに基づき癌の有無を予測することを含む。上記方法は、肝細胞癌、乳癌、肺癌、胃腸管癌、生殖器癌および骨・軟部組織癌等の種々の癌の検出に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から分離された被検試料中のRFC3遺伝子のエクソン３中の10ntから19ntの位置にある１０個の連続するAから成るA10領域中のAが１個欠失しているか否か又はAが１個挿入されているか否かに基づき癌の有無を予測することを含む、癌の検出方法。
【請求項２】
前記A10領域中のAが１個欠失しているか否かを調べる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記癌が、肝細胞癌、乳癌、肺癌、胃腸管癌、生殖器癌および骨・軟部組織癌から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記癌が、肝細胞癌、乳癌又は胃腸管癌である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記癌が、肝細胞癌である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記肝細胞癌が早期肝細胞癌である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記A10領域中にAが１個挿入されているかを否かを調べることを含み、前記癌が、肝細胞癌、乳癌、肺癌、胃腸管癌、生殖器癌および骨・軟部組織癌から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記A10領域を少なくとも含む領域の塩基配列を直接決定することを含む請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
RFC3遺伝子又はそのcDNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、前記A10領域を少なくとも含む領域を核酸増幅法により増幅するために利用可能な、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌及び乳癌等の種々の癌の検出方法及びそれに用いられるプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、肝細胞癌の検査は、肝臓の生検検体を病理組織学的に検査することにより行われている。しかしながら、肝癌の針生検は、生検による腫瘍の移植、播種の問題があるため、採取する生検検体の量を可能な限り少なくすることが要請されている。しかし、検体の量が少ないと、病理組織学的な検査は困難になる。このため、一般に少量の検体で診断を行なうことが可能な遺伝子検査により肝細胞癌を検出することが望まれる。これまでに、ヒト肝がんや実験発がんモデルなどを用いて、肝細胞癌の遺伝子マーカーが探索されてきたが（非特許文献１及び２）、高頻度で肝細胞癌の検出が可能な遺伝子マーカーは見出されていない。
【０００３】
【非特許文献１】Miyasaka, et al., Mol. Carcinogenesis, 13, 37-43 (1995)
【非特許文献２】神田浩明ら, 日本臨床 59 (suppl. 6), 35-39 (2001)
【非特許文献３】Ellison,V. et al., J. Biol. Chem. 273 (10), 5979-5987 (1998)
【非特許文献４】Cai,J., et al., J. Biol. Chem. 272 (30), 18974-18981 (1997)
【非特許文献５】Uhlmann,F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (13), 6521-6526 (1996)
【非特許文献６】Okumura,K. et al., Genomics,1(1)274-278, 1995.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、少なくとも肝細胞癌を高頻度に検出することができる、遺伝子検査による癌の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、各種癌患者から採取した検体では、RFC3遺伝子のエクソン３中の10ntから19ntの位置にある１０個の連続するAから成るA10領域中のAが１個欠失しているか又はAが１個挿入されている変異が高頻度で起きていることを見出し、この変異をマーカーとして各種癌の検出が可能であることに想到し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、被検者から分離された被検試料中のRFC3遺伝子のエクソン３中の10ntから19ntの位置にある１０個の連続するAから成るA10領域中のAが１個欠失しているか否か又はAが１個挿入されているか否かに基づき癌の有無を予測することを含む、癌の検出方法を提供する。また、本発明は、RFC3遺伝子又はそのcDNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、前記A10領域を少なくとも含む領域を核酸増幅法により増幅するために利用可能な、前記本発明の方法に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、少なくとも肝細胞癌を高い確率で検出することができる、遺伝子検査による癌の検出方法が初めて提供された。本発明の方法は、肝細胞癌の他にも下記に記載される種々の癌の検出に有効である。本発明の方法によれば、遺伝子検査により肝細胞癌等の癌を高確率で検出可能であるので、病理組織学的検査に比べて少量の生検検体を用いて癌の検査を行うことができ、安全、簡便に癌の診断を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の癌の検出方法では、RFC3遺伝子のエクソン３中にあるA10領域中のAが１個欠失しているか否か又はAが１個挿入されているかを直接的又は間接的に調べる。RFC3遺伝子は、染色体13q14上に位置する公知の遺伝子であり、DNAの複製の際に働くタンパク質としてクローニングされた（非特許文献３〜６）。RFC3遺伝子の塩基配列も公知であり、ゲノミック遺伝子配列又はcDNA配列は、例えばGenBank Accession No. NM_002915及びNT_024524等に記載されている。GenBank Accession No. NM_002915記載のcDNA配列を配列表の様式に変えた配列を配列表の配列番号１に示す。配列番号２は、配列番号１中の推定アミノ酸配列のみを取り出して示す。配列番号１中、エクソン３は308番目の塩基（「308 nt」のように表示、他も同様）から375ntまでの領域である。配列番号１の317nt〜326ntにA（アデニン）が１０個連続している領域がある。この領域を本明細書及び請求の範囲において「A10領域」と呼ぶ。A10領域は、エクソン３の5'末端のAを1ntとすると10ntから19ntの位置にある。なお、GenBankに複数登録されているRFC3遺伝子の塩基配列は、互いにほぼ一致しているが、数個のSNPも存在する。配列番号１に示す塩基配列と比較して数個のSNPを含むこのような配列を有するものもRFC3遺伝子であることは言うまでもない。
【０００９】
下記実施例において具体的に示されるように、本願発明者らは、肝細胞癌、乳癌、胃腸管癌等の癌患者では、上記A10領域中のAが、高頻度で１個欠失していることを見出した（以下、この変異を「A9変異」と言う）。また、上記癌では、A9変異のみならず、A10領域に１塩基のアデニンが挿入される変異（以下、「A11変異」）も検出された。従って、A10領域において、A9変異又はA11変異が起きているか否かを調べることにより癌を高い確率で検出することができる。
【００１０】
下記実施例に具体的に示される通り、A9変異を検出する本発明の方法は、肝細胞癌、乳癌、肺癌、胃腸管癌（大腸癌、食道癌、十二指腸癌、胃癌等）、生殖器癌（前立腺癌、女性性器癌、男性性器癌、子宮内膜癌、卵巣癌等）、頭頸部癌（舌癌等）、内分泌癌（甲状腺癌等）および骨軟部組織癌から成る群より選ばれる少なくとも１種の癌の検出に有効であり、このような広範囲な癌の検出に有効なことから他の癌の検出にも有効であると考えられる。この方法は、肝細胞癌、乳癌、胃腸管癌（特に大腸癌、食道癌、十二指腸乳頭部癌）の検出に特に有効であり、とりわけ肝細胞癌の検出に有効である。特に、早期肝細胞癌では、9例中８例(89%)でA9変異が起きており、A9変異を検出する本発明の方法は、病理組織学的検査で前がん病変との鑑別が難しい早期肝細胞癌の検出にも有効である。また、A11変異を検出する本発明の方法は同様に、下記実施例に具体的に示されているように、上記癌から成る群より選ばれる少なくとも１種の癌の検出に有効である。
【００１１】
本発明の方法に供される被検試料は、被検者から分離されたものであり、通常、癌の有無を検査すべき臓器又は組織から採取された生検検体であるが、必ずしもこれに限定されるものではない。なお、本発明の方法は、後述のように遺伝子増幅法等を用いて極めて高感度に行うことができるので、病理組織学的検査を行う場合に比べると、はるかに少量の検体を用いて行なうことができるので、より安全であり被検者の負担も少ない。
【００１２】
本発明の方法では、上記したA9変異又はA11変異の有無を直接的又は間接的に調べる。これは種々の方法で可能である。例えば、被検試料から抽出したゲノミックDNAを鋳型として用い、A10領域を含む領域をPCR等の核酸増幅法により増幅し、その増幅断片の塩基配列を決定することにより行うことができる。RFC3遺伝子は、その塩基配列が公知であり、また、PCR等の核酸増幅法は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、A10領域を含む領域の核酸増幅法による増幅は容易に行うことができる。PCRに用いる一対のプライマーは、増幅領域の端部領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、そのサイズは特に限定されないが、通常、１２塩基〜５０塩基、好ましくは１５塩基〜３５塩基程度である。プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは、それがハイブリダイズする鋳型の鎖と相補的な塩基配列を有することが好ましいが、１塩基又２塩基程度のミスマッチがあっても、鋳型の鎖とハイブリダイズし、PCRによる増幅が可能なものであれば用いることができる。なお、本明細書において、核酸増幅法におけるプライマーに関し、「ハイブリダイズする」とは、核酸増幅法を行なう条件下において、核酸増幅法により増幅が可能なようにハイブリダイズすることを意味する。プライマーは、エクソン領域中に設定してもよいし、イントロン中に設定してもよいし、これらにまたがる部分に設定してもよい。また、ゲノミックDNAに代えて、cDNAを鋳型として用いることも可能である。cDNAは、常法により被検試料からmRNAを回収し、それを鋳型として常法により逆転写により調製することができる。調製したcDNAをさらにPCR等の核酸で増幅してもよい(RT-PCR)。
【００１３】
あるいは、A9変異及びA11変異は、いずれもフレームシフトを起こすので、RFC3遺伝子によりコードされるポリペプチドは、これらの変異よりも下流（Ｃ末端側）の配列が正常なA10領域を有する遺伝子によりコードされるポリペプチドとは全く異なっている。従って、これらの変異したアミノ酸配列の領域をエピトープとする抗体、好ましくはモノクローナル抗体を作出し、それを用いて被検試料を免疫測定することにより、間接的にA9変異又はA11変異を検出することも可能である。特に、A9変異では、A9変異から２４コドン下流の位置にストップコドンが入るので、それよりも下流のアミノ酸配列は欠失する。従って、A9変異で欠失するアミノ酸配列の領域をエピトープとする抗体を用いて免疫測定を行うことにより正常型のみを検出することが可能になる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１５】
１．  材料及び方法
(1)  組織試料
内部の倫理委員会により承認された、政府のヒトゲノム／遺伝子解析研究のための倫理ガイドラインに従った、組織収集のためのプロトコール／倫理承認手続に従い、癌研究会付属病院及び東京大学付属病院から腫瘍及び正常組織試料を得た。凍結試料65例及び顕微鏡下で選択採取したホルマリン固定パラフィン包埋試料91例から、肝細胞癌(HCC)、乳癌、胃癌、結腸癌、食道癌、十二指腸乳頭部癌、肺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、舌癌、甲状腺癌、並びに骨および軟部組織腫瘍のゲノミックDNAを、SDS-プロテイナーゼK法又はGoeltzらの方法(Goeltz et al Biochem. Biophys. Res.Commun. 130; 118-126, 1985)により抽出した。
【００１６】
(2)  突然変異スクリーニング
１０例のHCCの凍結試料中のRFC3遺伝子の９個の全エクソンをダイレクトシークエンス法でスクリーニングした。Beckman Coulter CEQ8000シーケンサーを用い、製造者のプロトコールに従い、各エクソンのPCR産物の塩基配列を決定した。エクソン３以外の全てのエクソンでは、突然変異は検出されなかった。次いで21例のHCCの凍結試料について、RFC3遺伝子のエクソン３をベクターにクローニングして調べた。PCRには次の塩基配列を有する２つのプライマーを用いた。5'-caaaagagtggggaaataggc-3'（エクソン３の上流側に隣接するイントロン（上記GenBank Accession No. NT_024524(2004年2月19日)に記載）内に設定）及び5'-gaaagcccaaaaccaatttc-3'(エクソン３の下流側に隣接するイントロン（上記GenBank Accession No. NT_024524(2004年2月19日)に記載）内に設定）。PCR増幅産物をpGEM-T easyベクター(Promega社製)に、製造者のプロトコールに従ってクローニングした。ユニバーサルT7プライマー及びBeckman Coulter CEQ8000シーケンサーを用い、１０を超える独立した形質転換コロニー中の塩基配列を決定した。同一の突然変異が２以上のクローンで検出された場合に、その試料が突然変異を有するものと判定した。検査は、PCR酵素を変えて(Promega社製Taqポリメラーゼ、東洋紡社製KODTaqポリメラーゼ及びAmersham-Pharmacia社製Amplitaq Gold)各３回行なった。HCCの前癌病変部及び「早期肝癌」病変部のホルマリン固定パラフィン包埋選択採取試料についても上記と同じプライマーを用いて同じ方法で行なった。HCC以外の癌について、上記と同じプライマーを用い、公知の方法(Wada et al, Hepatology 29,1718-1721(1999))によりSSCP解析を行なった。シフトバンドが検出された試料については、さらにHCCと同様にして検査した。
【００１７】
PCRの条件は下記の通りであった。
PCR条件(amplitaq gold, Amersham-Pharmacia社製): 95℃10分、(94℃30秒、60℃1分) x 45サイクル、60℃10分。蒸留水14.3μl、10xPCRバッファー2.5μl、dNTP 2.5μl、MgCl2 2.5μl、センスプライマー2.5μl、アンチセンスプライマー2.5μl、Taq 0.2μl、鋳型2.0μl(1.0μg) 
【００１８】
２．  結果
１０例の凍結HCC試料のRFC3遺伝子の９個の全てのエクソンをPCRで増幅し、直接塩基配列を決定した。エクソン３以外の他の全てのエクソンでは突然変異が検出されなかった。エクソン３の配列データは波形が乱れて、解析ができなかった。そこで、21例の凍結試料のRFC3のエクソン３をPCRで増幅し、PCR産物をpGEM-T easyベクター(Promega社製）にクローニングし、各クローンを独立して塩基配列決定した。10例(48%)において、１０個の連続するアデニン(「A10」、コドン78-82) のうちの１個のアデニンが欠失していた。HCCは多段階の過程を経て進行するので、HCCの「早期病変部」(early lesion)のホルマリン固定パラフィン包埋生検試料17例を調べた。全ての試料は顕微鏡下でマイクロ切断した。腺腫様過形成(adenomatous hyperplasia (AH))では、５例のうち１例(20%)のみがA10の１塩基欠失（以下、「A9変異」）を示したが、早期HCC(eHCC)では９例中８例(89%)がA9変異を有していた。組織学的によく分化した(Edmondson grade 1)のHCCでは３例のうち２例がA9変異を有し、1例にA10に１塩基のアデニンが挿入されるA11変異が検出された。これらのデータから、両変異がAHからeHCCへ進行する際に起きることが明らかになった。上記２つの試験をあわせると、63%(21/33)のHCCがA9あるいはA11変異を有していた。
【００１９】
ヒト13q14のLOHは他の癌でもしばしば検出されるので、22例の乳癌、16例の非小細胞肺癌、35例の大腸癌、14例の胃がん、3例の食道癌、1例の十二指腸乳頭部癌、15例の子宮内膜・卵巣癌、4例の前立腺癌、2例の舌癌、1例の甲状腺癌並びに5例の骨及び軟部組織肉腫を包含する他の種類の癌を調べた。最初のスクリーニングにおいて、PCR-SSCPを行なった。シフトバンドを示した例については、さらにHCCの場合と同様にして解析した。その結果、突然変異の検出率は、乳癌が82%(18/22)、非小細胞肺癌が38%(6/16)、大腸癌が91%(32/35)、胃癌が57%(8/14)、食道癌、十二指腸乳頭部癌がともに100%(3/3, 1/1)、子宮内膜癌・卵巣癌が20%(3/15)、前立腺癌が100%(4/4)、舌癌が50%(1/2)、甲状腺癌が100%(1/1)、骨・軟部組織肉腫が40%(2/5)であった。これらの変異にはA9, A11変異のみならず、少数のミッセンス変異も見つかった。また、6例の大腸癌と4例の乳癌ではA9とA11の変異がともに見出された。
【配列表】
2006034253000001.app