(57)【要約】【課題】  新規な細胞内への導入目的物質導入技術を提供する。【解決手段】  荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を、導電部を有する針状構造体に吸着させ、この針状構造体を細胞内に挿入し、導電部に電圧を印加することにより、導入目的物質を細胞内に放出する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を、導電部を有する針状構造体に吸着させ、
当該針状構造体を細胞内に挿入し、
当該導電部に電圧を印加することにより、導入目的物質を細胞内に放出する、
細胞内への導入目的物質導入方法。
【請求項２】
前記挿入対象物が、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなるものである、請求項１に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【請求項３】
前記導入目的物質と前記荷電部を有する物質とが疎水性部分を有し、
当該二つの疎水性部分を介して当該荷電部を有する物質に当該導入目的物質を引きつけて挿入対象物となす、
請求項２に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【請求項４】
挿入対象物を含んだ液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、イオン濃度、塩濃度、温度、溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上における吸着面積、
前記細胞を含む液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、イオン濃度、塩濃度、温度、溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上の挿入対象物放出面積、ならびに
前記導電部に印加する電圧、電圧印加時間、前記導電部の前記細胞内における保持時間、前記導電部の表面電位、材質および構造
からなる群から選ばれた少なくとも一つのパラメータにより、前記吸着量または放出量または吸着量と放出量とを制御する、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【請求項５】
前記針状構造体を所望の長さだけ細胞内に挿入することによって前記針状構造体上の挿入対象物放出面積を制御する、請求項４に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【請求項６】
荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を吸着し得る導電部を有する針状構造体と、
当該針状構造体を細胞内に挿入するための針状構造体駆動部と、
細胞を含む液体を入れた容器と、
当該導電部に電圧を印加し、導入目的物質を細胞内に放出するための電圧印加部と
を含む、細胞内への導入目的物質導入装置。
【請求項７】
前記挿入対象物が、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなるものである、請求項６に記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内へ導入目的物質を導入する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内に物質を導入するための技術は幾つか存在するが、その中で、細胞一個ずつのレベルでの導入技術としては、現状ではマイクロインジェクション法および、細胞懸濁液に数千Ｖ／ｃｍの高電圧を数十マイクロ秒のパルスで与えた時に細胞膜に短時間生じる小孔を通して、ＤＮＡ等の注入したい試料を細胞に導入するエレクトロポレーション法が知られている（たとえば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】「メソッズ イン エンザイモロジィー（"Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ"）」，第６５巻，１９８０年，ｐ．８１６−８２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
エレクトロポレーション法では、細孔の径や寿命を制御するのが難しいため、定量的に試料を細胞内に注入するのは困難であった。
【０００４】
一方、現状のマイクロインジェクション法では、中空のガラスキャピラリーを用いて空気圧で導入目的物質を細胞中に導入するため、以下のような欠点が残っている。
【０００５】
（１）導入時に細胞内の圧力が上昇し細胞に損傷を与え易い。
【０００６】
（２）細胞に対してガラスキャピラリーのサイズが十分小さくないので、細胞内へのキャピラリー先端の挿入時に細胞へ与える損傷が大きい。
【０００７】
（３）細胞膜片などがキャピラリーに詰まってインジェクション不良がおこり易い。現状以上にガラスキャピラリーのサイズを小さくすると、ますますインジェクション不良の率が高くなる恐れが大きくなるものと思われる。
【０００８】
（４）導入目的物質を、同一細胞内へ、短時間に繰り返しインジェクションすることができない。特に新しい研究領域では、研究のスピード向上のため、導入目的物質を短時間に繰り返しインジェクションする技術へのニーズが大きい。
【０００９】
（５）微少量の制御ができない。たとえば、慢性骨髄性白血病でグリベックが効かないケースの研究には、グリベックが細胞内に導入されているのかどうかを確認することが重要であり、このためにはフェムトリットル（ｆＬ）オーダの薬剤を、その導入量を制御して細胞内に挿入できる技術が必要であるが、現状技術では困難である。
【００１０】
（６）上記（１）が主な原因となって、多数の導入目的物質の導入が困難である。上記（２）、（４）、（５）もこの困難さの副因となっている。数十種類位であれば、事前に導入目的物質の混合溶液を調製しておけば導入可能であろうが、これより多いレベル、たとえば数千、数万、それ以上の種類導入目的物質を、同時にあるいは多数回に分けて導入することは極めて困難である。
【００１１】
（７）定量導入ができない。せいぜいインジェクションする溶液の濃度が調整できる程度であり、導入量の制御は不可能である。
【００１２】
本発明は、上記問題を解決する新規な細胞内への導入目的物質導入技術を提供することを目的としている。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様によれば、荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を、導電部を有する針状構造体に吸着させ、この針状構造体を細胞内に挿入し、導電部に電圧を印加することにより、導入目的物質を細胞内に放出する、細胞内への導入目的物質導入方法が提供される。
【００１４】
本発明態様により、細胞に与える損傷が少なく、操作が容易で、多数の導入目的物質の導入、同一の細胞への導入目的物質の多数回導入、少量物質の導入、導入量の正確な制御のいずれかまたはその全部が可能な、細胞内への物質の導入を実現できる。
【００１５】
挿入対象物が、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなるものであること、導入目的物質と荷電部を有する物質とが疎水性部分を有し、二つの疎水性部分を介して荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけて挿入対象物となすこと、挿入対象物がヌクレオチド体を含むこと、針状構造体に吸着させる挿入対象物の吸着量または細胞内での放出量または両者を制御すること、挿入対象物を含んだ液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、イオン濃度、塩濃度、温度、溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上における吸着面積；細胞を含む液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、イオン濃度、塩濃度、温度、溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上の挿入対象物放出面積；ならびに導電部に印加する電圧、電圧印加時間、導電部の細胞内における保持時間、導電部の表面電位、材質および構造からなる群から選ばれた少なくとも一つのパラメータにより、吸着量または放出量または吸着量と放出量とを制御すること、針状構造体を所望の長さだけ細胞内に挿入することによって針状構造体上の挿入対象物放出面積を制御すること、針状構造体の先端が細胞に接触した位置を挿入開始点として、針状構造体を所望の長さだけ細胞内に挿入すること、目視、光の反射の変化または針状構造体に掛かる力によって挿入開始点を検知すること、細胞内に導入目的物質を放出した後の針状構造体を、酸による洗浄、アルカリによる洗浄、有機溶媒による洗浄、超音波洗浄、導電部に電圧を印加した状態での洗浄およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれた少なくとも一つの洗浄を実施することを含むことが好ましい。
【００１６】
本発明の他の一態様によれば、荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を吸着し得る導電部を有する針状構造体と、この針状構造体を細胞内に挿入するための針状構造体駆動部と、細胞を含む液体を入れた容器と、導電部に電圧を印加し、導入目的物質を細胞内に放出するための電圧印加部とを含む、細胞内への導入目的物質導入装置が提供される。
【００１７】
本発明態様により、細胞に与える損傷が少なく、多数の導入目的物質の導入、同一の細胞への導入目的物質の多数回導入、少量物質の導入、導入量の正確な制御のいずれかまたはその全部が可能な、細胞内への物質の導入を簡単な操作で実現できる。
【００１８】
挿入対象物が、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなるものであること、導入目的物質と荷電部を有する物質とが疎水性部分を有し、挿入対象物が、二つの疎水性部分を介して荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけて作製したものであること、挿入対象物がヌクレオチド体を含むこと、針状構造体に吸着させた挿入対象物の細胞内での放出量を制御する挿入対象物量制御部を有すること、挿入対象物量制御部が、細胞を含む液体中における、針状構造体上の挿入対象物放出面積、導電部に印加する電圧、電圧印加時間、導電部の細胞内における保持時間および導電部の表面電位からなる群から選ばれた少なくとも一つのパラメータにより、放出量を制御すること、針状構造体駆動部が、針状構造体を細胞内に挿入する長さを調整する機能を有すること、針状構造体駆動部が、針状構造体の先端が細胞に接触した位置を挿入開始点として、そこから細胞内に挿入する長さを調整する機能を有すること、針状構造体駆動部が、光の反射の変化または針状構造体に掛かる力によって挿入開始点を検知すること、導電部が、シリコン、シリサイド、金、白金、タングステン、モリブデンおよびそれらの合金ならびにそれらをメッキしたものからなる群から選ばれた材料からなること、が好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、新規な細胞内への導入目的物質導入技術が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明の実施の形態を図、実施例等を使用して説明する。なお、これらの図、実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。図中、同一の符号は同一の要素を表す。
【００２１】
本発明に係る細胞内への導入目的物質導入方法においては、細胞内に導入したい物質を含む物体であって荷電部を有する物体を、導電部を有する針状構造体に吸着させ、この針状構造体を細胞内に挿入し、導電部に電圧を印加することにより、細胞内に導入したい物質を電気的に細胞内に放出する。なお、本発明では「細胞内に導入したい物質」を導入目的物質と呼称し、「細胞内に導入したい物質を含む物体であって荷電部を有する物体」を挿入対象物と呼称する。
【００２２】
導入目的物質が荷電部を有する場合には、導入目的物質その物を挿入対象物とすればよい。導入目的物質が荷電部を有しない場合には、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけて、挿入対象物を作製することができる。
【００２３】
荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつける方法は、吸着、付着、化学的結合、物理的結合、化学的親和性の利用等どのような方法から選択することもできる。荷電部を有する物質に導入目的物質が引きつけられたかどうかは、針状構造体上に吸着させた挿入対象物中に存在する導入目的物質量を分析することにより知ることができる。また、導入目的物質が蛍光発光機能を有している場合には、その発光／消光挙動で、荷電部を有する物質に引きつけられたかどうかを目視確認することができる。さらに、挿入対象物を細胞内に挿入することにより、導入目的物質を細胞内に導入できれば、本発明に係る「引きつけ」が成立していたものと考えることもできる。
【００２４】
細胞内への導入目的物質の放出が妨げられない程度の引きつけ力である必要があることから、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつける方法としては化学的親和性を利用する方法が好ましい。具体的には、導入目的物質が疎水性部分を有する場合に、疎水性部分と荷電部とを有する他の物質と共存させれば、この二つの疎水性部分の相互の親和性により、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけ、挿入対象物となすことができる。これら二つの疎水性部分の構成は、互いに独立に、かつ任意に選択することができる。疎水性部分としては、アルキル基、ヌクレオチド体やヌクレオシド疎水部等を挙げることができる。疎水性を有しているかどうかは、上記引きつけが生じるかどうかで確認することができる。
【００２５】
ついで、このようにして準備した挿入対象物を、導電部を有する針状構造体に吸着させる。この吸着方法は、針状物に物質を付着させるための公知の任意の方法から選択することができる。吸着したかどうかは、導電部上の挿入対象物量を分析することによって判断することができる。また、針状構造体を細胞内に挿入することにより、細胞内に導入できれば、本発明に係る吸着が成立していたものと考えることもできる。
【００２６】
たとえば、挿入対象物を含む液体に導電部を有する針状構造体を浸漬する方法を採用することができる。この際、針状構造体の導電部に電圧を印加して、電気的引力を利用して、挿入対象物の荷電部を針状構造体の導電部が引きつけるようにする方法を採用することもできる。
【００２７】
図１は、荷電部を有する導入目的物質である挿入対象物１を、導電部２を有する針状構造体３に吸着させた様子を示す模式図である。また、図２は、荷電部を有する物質４に導入目的物質５を引きつけてなる挿入対象物１を、導電部２を有する針状構造体３に吸着させた様子を示す模式図である。
【００２８】
ついで、針状構造体を細胞内に挿入し、導電部に電圧を印加することにより、導電部と荷電部との電気的反発を利用して、導入目的物質を細胞内に放出する。あるいは、挿入対象物を細胞内に放出することに伴い、導入目的物質を細胞内に放出する。図３は、荷電部を有する導入目的物質である挿入対象物１を細胞６内に放出する様子を示す模式図である。
【００２９】
また、図４は、荷電部を有する物質４に導入目的物質５を引きつけてなる挿入対象物１を細胞６内に放出する様子を示す模式図である。荷電部を有する物質４に導入目的物質５を引きつけてなる挿入対象物１は、そのままでは、細胞内に入った後も、導入目的物質５が荷電部を有する物質４に引きつけられている。従って、図４の場合には、荷電部を有する物質が、細胞内に入った後、導入目的物質の作用を妨げないように選択することが重要である。ただし、荷電部を有する物質としてＤＮＡ等を使用した場合には、やがて細胞内に分解吸収され無害化される場合も多い。
【００３０】
導電部への電圧の印加は、導電部と細胞を含む液体との間に印加する。導電部の電位は、挿入対象物を放出しやすいように選択する。たとえば荷電部が負の電荷を有する場合には、導電部と荷電部との電気的反発を利用できるように、導電部も負の電位にする。図３，４は共に、導電部に負の電位を付与している例である。導電部への電位の正確な付与には三電極法を採用することが好ましい。電圧の大きさと印加時間は、適宜選択することができる。ＤＮＡの場合には、細胞を含む液体に対して、導電部に−０．００１〜−１．５Ｖ程度の電位を０．１〜１０，０００秒程度掛ける条件を例示することができる。
【００３１】
本方法によれば、従来のインジェクション法のように、空気圧を利用することなく、導入目的物質を細胞内に導入できるので細胞に与える損傷が少ない。細胞内に挿入される構造体部分を従来のキャピラリーより細くできることも、細胞に与える損傷を小さくする上で有利である。キャピラリーを使用しないので、詰まりの問題が解消する。主要操作が細胞への針状構造体の挿入と電圧印加であり、容易であるため、導入目的物質を短時間に細胞内に導入でき、従って、細胞に与える損傷が少ないことも相俟って、多数の導入目的物質の導入が可能となる。同一の細胞に多数回導入することも可能である。
【００３２】
本発明の対象となる細胞は、動物の細胞でも、植物の細胞でもよい。何らかの事前処理を施した細胞でもよい。細胞は個々に独立したものであっても、組織の一部となっている状態のものでもよい。
【００３３】
導入目的物質については、本発明の趣旨に反しない限り特に制限はない。化学物質、ヌクレオチド体、タンパク質、生理活性物質、生体組織や細胞から取り出した物質を例示することができる。なお本発明においてヌクレオチド体とは、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（すなわち核酸）のいずれかを意味する。ヌクレオチド体の塩基部分またはリン酸基部分のように、導入目的物質が荷電部を有している場合には、導入目的物質そのものを挿入対象物として扱うことができる。
【００３４】
上記荷電部を有する物質については、導入目的物質を引きつけることができる物質であればどのような物質から選択してもよい。イオン化している物質、イオン化し得る物質の他、分子が分極している物質および分子が分極し得る物質の中から選択することができる。本発明に係る「荷電部を有する物質」として適切かどうかは、導入目的物質を引きつけることができ、かつ、針状構造体の導電部への電圧の印加により、挿入対象物が細胞内に放出されるかどうかで判断することができる。一般的にはイオン化している物質が有利である。挿入対象物が細胞内に放出されたかどうかは、細胞への挿入対象物の挿入の前後における、針状構造体の導電部上に吸着した挿入対象物の量を分析することにより知ることができる。導入目的物質が蛍光発光機能を有している場合には、その発光／消光挙動で目視確認することもできる。
【００３５】
その中でも、上記荷電部を有する物質が疎水性部分を有する場合には、上記したように容易に導入目的物質を引きつけることができるので好ましい。たとえば、グリベックのような疎水性薬剤（導入目的物質）を、荷電部である塩基またはリン酸基と疎水性部分である糖部分とを有するヌクレオチド体（荷電部を有する物質）に引きつけて挿入対象物とするのである。ヌクレオチド体は、このように、荷電部である塩基またはリン酸基と疎水性部分である糖部分とを有するので、挿入対象物としてまたは挿入対象物の一部として使用するのに好ましい物質である。その中で、分子量の小さいものが、細胞中で放出されやすく、また細胞中に導入された後分解されやすいので有利である。
【００３６】
本発明に係る針状構造体は、細胞に挿入しやすいように、とがった先端部を有する。その形状については特に制限はない。図５に二つの例を示す。そのサイズについては、細胞に挿入できる限りは特に制限はないが、従来のインジェクション法で使用される注入針が針の内部を経由して導入目的物質を導入するのとは異なり、導電部の表面に吸着した導入目的物質を細胞内に導入するので、その断面積（図５のＸ−Ｘ断面の断面積）は、従来のインジェクション法で使用される注入針より小さくても構わない。一般的には、細胞を損傷させる度合いが減少するので、その断面積は小さい方が好ましい。たとえば、サイズが１０μｍ程度の細胞の特定領域に位置精度良く導入目的物質を導入するためには、挿入部分の断面の最大直径を１．０μｍ程度以下にすることを例示することができる。
【００３７】
針状構造体は、そのすべてが導電部から成り立っていてもよいが、その一部のみが導電部であってもよい。導電部の先端がとがった状態となっていてもよく、先端部が非導電部になっており、その後ろに導電部が存在する構造でもよい。後者の場合は構造が複雑になるが、材料の選択範囲が広くなるので、先端を鋭利にし、多数回使用しても鈍磨しにくいようにすることが容易になる。なお、針状構造体が導電部ではない部分を有する場合には、その部分についても挿入対象物が付着し、細胞内へ挿入されたときにその挿入対象物を放出することもあり得るので、その影響を考慮すべきである。この意味からは、針状構造体の内少なくとも細胞内に挿入される部分が導電部からなっていることが好ましい。
【００３８】
本発明に係る導電部の形状はどのようなものでもよい。断面としては、通常は円形が採用されるがそれ以外のものであってもよい。表面は平坦でもよいが、表面積を増加させるように溝が付けてあったり凸凹があるものでもよいと考えられる。
【００３９】
本発明に係る導電部は、導電性の材料の中から選択することができる。この導電性の材料としては、シリコン、シリサイド、金、白金、タングステン、モリブデン等の金属、合金、金属酸化物、炭素、導電性プラスチックおよびこれらの材料が非導電性材料の上にメッキや蒸着などにより付着またはコーティングされたものを挙げることができる。図６−Ａは、針状構造体の全体が導電性材料からなる場合、図６−Ｂは、先端を含め、針状構造体の一部が導電性材料からなる場合、図６−Ｃは、針状構造体の一部が導電性材料からなる場合で、その先端は非導電性の材料からなる場合を模式的に例示したものである。図６−Ａ〜Ｃ中、斜線部分が導電性材料からなる部分である。導電部以外の針状構造体に使用できる材料については特に制限はない。
【００４０】
本発明に係る細胞内への導入目的物質導入方法では、針状構造体に吸着させる挿入対象物の吸着量または細胞内での放出量または両者を制御することにより、細胞内への導入目的物質の導入量を容易に制御できる。従って、微少量の導入や定量導入が可能となる。
【００４１】
具体的には、針状構造体に挿入対象物を吸着させるための挿入対象物を含んだ液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、使用するイオンの濃度、使用する塩の濃度、温度、使用する溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上における吸着面積からなる群から選ばれたパラメータを制御する方法を挙げることができる。
【００４２】
また、針状構造体に吸着した挿入対象物を放出する対象である細胞を含む液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、使用するイオンの濃度、使用する塩の濃度、温度、使用する溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上の挿入対象物放出面積からなる群から選ばれたパラメータを制御する方法を挙げることもできる。
【００４３】
上記において、針状構造体上における吸着面積とは、挿入対象物を吸着させるべき部分の面積すなわち、吸着に使用される導電部の面積を意味する。また、針状構造体上の挿入対象物放出面積とは、細胞内に挿入されて挿入対象物を放出するのに使用される導電部の面積を意味する。
【００４４】
使用するイオンとしてはＮａ+，Ｃｌ-を、使用する塩の濃度としては１０〜５０ｍＭを、使用する溶媒としてはＨＥＰＥＳバッファを挙げることができる。また、導入目的物質の状態を変化させる物質としてはたとえば界面活性剤のようにタンパク質の構造や会合状態を変化させることができる物質を挙げることができる。
【００４５】
さらに、導電部に印加する電圧、電圧印加時間、導電部の細胞内における保持時間、導電部の表面電位、材質および構造からなる群から選ばれたパラメータを制御する方法を挙げることもできる。
【００４６】
これらのパラメータの少なくとも一つを制御することにより、細胞内への導入目的物質の導入量を制御することができる。
【００４７】
とりわけ、針状構造体上の挿入対象物の放出面積の制御は、最終的に挿入対象物を放出する際における放出量を制御することになるので有用性が高い。より具体的には、針状構造体を所望の長さだけ細胞内に挿入することによって針状構造体上の挿入対象物放出面積を制御することができる。この場合、針状構造体の先端が細胞に接触した位置を挿入開始点とすれば、その後挿入したい針状構造体の長さを容易に決めることができる。針状構造体の先端が細胞に接触した位置は、顕微鏡下での目視によって決めてもよいが、光の反射の変化が観察される場合が多いので、この変化を捕らえる方がより客観的な検知になる。さらに針状構造体に掛かる力によって挿入開始点を検知してもよい。光の反射の変化や針状構造体に掛かる力の検知は機械的に行うことも容易である。なお、検知手段によっては、細胞の変形に応じて、細胞に接触した位置が若干の幅を有する場合もあり得るが、そのようなときには、本発明の趣旨に反しない限り、その幅の中から特定の位置を適宜決めることができる。
【００４８】
このようにして、細胞内への導入目的物質の導入量を制御することにより、微少量の導入目的物質の導入が可能となる。また、導入目的物質の導入量を正確に制御することができる。
【００４９】
細胞内への導入目的物質の導入は、荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を吸着し得る導電部を有する針状構造体と、この針状構造体を細胞内に挿入するための針状構造体駆動部と、細胞を含む液体を入れた容器と、導電部に電圧を印加し、導入目的物質を細胞内に放出するための電圧印加部とを含む、細胞内への導入目的物質導入装置を使用して実行することができる。
【００５０】
本装置を使用すれば、細胞に与える損傷が少なく、多数の導入目的物質の導入、同一の細胞への導入目的物質の多数回導入、少量物質の導入、導入量の正確な制御のいずれかまたはその全部が可能な細胞内への物質の導入を、簡単な操作で実現できるようになる。
【００５１】
本装置の構成とその使用法を、図７，８を用いて例示的に説明する。図７は本装置の構成を示す図であり、図８は本装置を使用して細胞内へ導入目的物質を導入する作業の例のフロー図である。
【００５２】
最初に、図８のステップＳ１に従って、荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を、たとえば水中に分散または溶解させた液体を作製する。つぎに、図８のステップＳ２に従って、針状構造体を細胞内に挿入する距離、印加電圧の大きさ、印加時間等の必要なデータを、図７の制御用コンピュータ７１にインプットする。つぎに、図８のステップＳ３に従って、導電部を有する針状構造体をその液体に浸漬し、必要であれば針状構造体と液体との間に電圧を印加し、針状構造体に挿入対象物を吸着させる。つぎに、図８のステップＳ４に従って、図７の針状構造体３を、針状構造体駆動部７３の先端の針状構造体取り付け部７４に取り付け、図８のステップＳ５に従って、顕微鏡７５とその画像を表示するディスプレー７６とを使用し、容器７８中にある細胞が分散された液体７２中の、ターゲットとする細胞の三次元的位置を、たとえばライトペンで指定する。すると、図８のステップＳ６に従って、コンピュータ７１による制御により、針状構造体駆動部７３が針状構造体３を細胞内に挿入する。その後、図８のステップＳ７に従って、コンピュータ７１による制御により、電圧印加部７７が、針状構造体３の導電部と液体７２の間に所定の電圧を所定時間印加し、図８のステップＳ８に従って、コンピュータ７１による制御により、針状構造体駆動部７３が針状構造体３を細胞外に抜き出し、操作が完了する。なお、電圧の印加において三電極法を使用すれば、導電部の電位をより正確に制御できるので好ましい。針状構造体３の数は２以上あってもよい。その場合には、それぞれの針状構造体が相異なる導入目的物質を有していてもよい。複数の針状構造体を同時に一つの細胞に挿入できる構造とすることも可能である。
【００５３】
なお、上記の細胞内への導入目的物質導入方法の説明において使用した用語の意味は、特に断らない限り、細胞内への導入目的物質導入装置の説明においても、同様の意味を有する。また、上記の細胞内への導入目的物質導入方法の説明における挿入対象物、導入目的物質および荷電部を有する物質に関する好ましい形態は、細胞内への導入目的物質導入装置の説明においても、同様に好ましい。
【００５４】
本発明に係る細胞内への導入目的物質導入装置では、針状構造体に吸着させる挿入対象物の細胞内での放出量を制御する挿入対象物量制御部を有することが好ましい。この挿入対象物量制御部は、具体的には、細胞を含む液体中における針状構造体上の挿入対象物放出面積および、導電部に印加する電圧、電圧印加時間、導電部の細胞内における保持時間、導電部の表面電位の少なくとも一つのパラメータを制御できるものであることが好ましい。上記の例ではコンピュータ７１がその役割を担っている。
【００５５】
細胞が分散された液体の入った容器の材質および形状は任意に選択することができる。針状構造体に吸着させるための挿入対象物を含む液体を流す流路と、対象である細胞を含む液体を流すための流路とを有し、流路上の蓋に針状構造体を差し込める孔を有する板状体とすると、挿入対象物の種類を素早く変更でき、細胞への針状構造体の挿入も容易になり、細胞の供給も迅速になるので好ましい場合が多い。この板状体は、たとえば縦横が数ｍｍ角の大きさにすることができる。
【００５６】
針状構造体駆動部については、細胞内に導入する導入目的物質の量に精度が必要ではない場合には、細胞内に針状構造体を単に所定の長さだけ挿入できる機能を有していればよいが、導入目的物質の量を制御したい場合には、上記の例で示したように針状構造体駆動部が、針状構造体を細胞内に挿入する長さを調整する機能を有することが好ましい。
【００５７】
また、針状構造体駆動部が、針状構造体の先端が細胞に接触した位置を挿入開始点として検知できる機能を有することが好ましい。光の反射の変化または針状構造体に掛かる力によって挿入開始点を検知する機能は、公知の技術により容易に実現できるので特に好ましい。
【００５８】
本発明に係る細胞への導入目的物質導入方法および装置は、狭義には生体物質の機能解明に利用できると考えられる。また、電圧印加により瞬時に電極近傍にのみ導入目的物質を放出できるという利点もある。従って、医療分野への応用が考えられる。今後、ヒトゲノム計画により得られる生体物質の機能が解明されるにつれ、応用範囲が広がるものと期待できる。
【００５９】
より具体的には、本発明に係る細胞への導入目的物質導入方法および装置により、次の諸効果のいずれかを実現することができる。
【００６０】
（１）中空針による空気圧を利用しないので、微細プロセスで可能なレベルまで微細な針状構造体を作製でき、細胞への損傷を軽減できる。
【００６１】
（２）導入目的物質のみを微少量導入できるため、応用分野が広く、多数の導入目的物質の導入または同一細胞への連続的な導入が可能である。
【００６２】
（３）三電極方式により電圧を正確に制御できるため、電圧によって導入量を制御でき、電圧と電圧印加時間の制御によって定量的な導入が可能にある。また細胞内には導入目的物質を吸着させた針状構造体の導電部のみを挿入すればよいため、細胞への損傷を軽減することができる。
【００６３】
なお、本発明に係る針状構造体は、細胞内に導入目的物質を放出した後の洗浄が容易であり、物理的に破損しない限り繰り返し使用することができる。そのため、同一または異なる導入目的物質を連続的に細胞内に導入することができるようになる。この場合の洗浄としては、酸による洗浄、アルカリによる洗浄、有機溶媒による洗浄、超音波洗浄、導電部に電圧を印加した状態での洗浄およびこれらの組み合わせを採用することができる。導電部に電圧を印加した状態での洗浄およびこれと他の洗浄方法との組み合わせが、本発明に係る針状構造体の構造を利用できるので好ましい。この場合の電圧印加は、水溶液中、通常１〜２Ｖで数秒間行えば十分であることが多い。
【００６４】
なお、細胞が分散された液体の入った容器として、上記板状体を使用する場合には、洗浄用の流路を付設することにより、さらに作業を容易にできる。
【実施例】
【００６５】
次に本発明の実施例比較例を詳述する。
【００６６】
［実施例１］
針状構造体として先端をとがらせた、断面の直径が最大３００μｍのタングステン製ワイヤに金メッキしたものを使用した。従って、本発明に係る導電部は、針状構造体の任意の一部である。導入目的物質としてＤＮＡを使用した。従ってこの場合には導入目的物質そのものが挿入対象物である。細胞としてはＨＥＫ２９３を使用した。細胞は培養液を入れた培養用シャーレ中に分散した。
【００６７】
ＮａＣｌ５０ｍＭを含む緩衝液（ＨＥＰＥＳバッファ，ｐＨ７．４）にＤＮＡを分散し、針状構造体を、室温で１０秒間浸漬し、すぐに、細胞を分散した液中に浸漬し、細胞中に針状構造体を挿入し、針状構造体の電位が液に対して−０．７Ｖとなるように電圧を印加した。
【００６８】
細胞中に針状構造体を挿入している時間と細胞内に導入されたＤＮＡ量との関係を図９に示す。良好な直線関係が得られた。なお、細胞内に導入されたＤＮＡ量は、リアルタイムＰＣＲによって求めた。求められた導入量は最小で１００個であった。
【００６９】
［実施例２］
電圧バイアスを−０．７Ｖから、−１．０Ｖに変更した以外は実施例１と同様の条件において細胞内に導入されたＤＮＡ量を求めたところ、同一時間で、ほぼ１．５倍量の導入が認められた。
【００７０】
［実施例３］
針状構造体の細胞内への挿入長を半分の長さにした以外は実施例１と同様の条件において細胞内に導入されたＤＮＡ量を求めたところ、同一時間で、ほぼ１／４の量の導入が認められた。
【００７１】
なお、上記に開示した内容から、下記の付記に示した発明が導き出せる。
【００７２】
（付記１）
荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を、導電部を有する針状構造体に吸着させ、
当該針状構造体を細胞内に挿入し、
当該導電部に電圧を印加することにより、導入目的物質を細胞内に放出する、
細胞内への導入目的物質導入方法。
【００７３】
（付記２）
前記挿入対象物が、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなるものである、付記１に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００７４】
（付記３）
前記導入目的物質と前記荷電部を有する物質とが疎水性部分を有し、
当該二つの疎水性部分を介して当該荷電部を有する物質に当該導入目的物質を引きつけて挿入対象物となす、
付記２に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００７５】
（付記４）
前記挿入対象物がヌクレオチド体を含む、付記１〜３のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００７６】
（付記５）
前記針状構造体に吸着させる挿入対象物の吸着量または前記細胞内での放出量または両者を制御する、付記１〜４のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００７７】
（付記６）
挿入対象物を含んだ液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、イオン濃度、塩濃度、温度、溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上における吸着面積、
前記細胞を含む液体中における、挿入対象物の濃度、ｐＨ、イオン濃度、塩濃度、温度、溶媒の種類、導入目的物質の状態を変化させる物質の濃度および針状構造体上の挿入対象物放出面積、ならびに
前記導電部に印加する電圧、電圧印加時間、前記導電部の前記細胞内における保持時間、前記導電部の表面電位、材質および構造
からなる群から選ばれた少なくとも一つのパラメータにより、前記吸着量または放出量または吸着量と放出量とを制御する、付記１〜５のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００７８】
（付記７）
前記針状構造体を所望の長さだけ細胞内に挿入することによって前記針状構造体上の挿入対象物放出面積を制御する、付記６に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００７９】
（付記８）
前記針状構造体の先端が前記細胞に接触した位置を挿入開始点として、前記針状構造体を所望の長さだけ細胞内に挿入する、付記７に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００８０】
（付記９）
目視、光の反射の変化または前記針状構造体に掛かる力によって前記挿入開始点を検知する、付記８に記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００８１】
（付記１０）
細胞内に導入目的物質を放出した後の針状構造体を、酸による洗浄、アルカリによる洗浄、有機溶媒による洗浄、超音波洗浄、前記導電部に電圧を印加した状態での洗浄およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれた少なくとも一つの洗浄を実施することを含む、付記１〜９のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入方法。
【００８２】
（付記１１）
荷電部を有し導入目的物質を含む挿入対象物を吸着し得る導電部を有する針状構造体と、
当該針状構造体を細胞内に挿入するための針状構造体駆動部と、
細胞を含む液体を入れた容器と、
当該導電部に電圧を印加し、導入目的物質を細胞内に放出するための電圧印加部と
を含む、細胞内への導入目的物質導入装置。
【００８３】
（付記１２）
前記挿入対象物が、荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなるものである、付記１１に記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００８４】
（付記1３）
前記導入目的物質と前記荷電部を有する物質とが疎水性部分を有し、
前記挿入対象物が、当該二つの疎水性部分を介して当該荷電部を有する物質に当該導入目的物質を引きつけて作製したものである、
付記１２に記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００８５】
（付記１４）
前記挿入対象物がヌクレオチド体を含む、付記１１〜１３のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００８６】
（付記１５）
前記針状構造体に吸着させる挿入対象物の前記細胞内での放出量を制御する挿入対象物量制御部を有する、付記１１〜１４のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００８７】
（付記１６）
挿入対象物量制御部が、前記細胞を含む液体中における、針状構造体上の挿入対象物放出面積、前記導電部に印加する電圧、電圧印加時間、前記導電部の前記細胞内における保持時間および前記導電部の表面電位からなる群から選ばれた少なくとも一つのパラメータにより、前記放出量を制御する、付記１１〜１５のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００８８】
（付記１７）
前記針状構造体駆動部が、前記針状構造体を細胞内に挿入する長さを調整する機能を有する、付記１６に記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００８９】
（付記１８）
前記針状構造体駆動部が、前記針状構造体の先端が前記細胞に接触した位置を挿入開始点として、そこから細胞内に挿入する長さを調整する機能を有する、付記１７に記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００９０】
（付記１９）
前記針状構造体駆動部が、光の反射の変化または前記針状構造体に掛かる力によって前記挿入開始点を検知する、付記１８に記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【００９１】
（付記２０）
前記導電部が、シリコン、シリサイド、金、白金、タングステン、モリブデンおよびそれらの合金ならびにそれらをメッキしたものからなる群から選ばれた材料からなる、付記１１〜１９のいずれかに記載の細胞内への導入目的物質導入装置。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】荷電部を有する導入目的物質である挿入対象物を、導電部を有する針状構造体に吸着させた様子を示す模式図である。
【図２】荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなる挿入対象物を、導電部を有する針状構造体に吸着させた様子を示す模式図である。
【図３】荷電部を有する導入目的物質である挿入対象物を細胞内に放出する様子を示す模式図である。
【図４】荷電部を有する物質に導入目的物質を引きつけてなる挿入対象物を細胞内に放出する様子を示す模式図である。
【図５】本発明に係る針状構造体の側面図である。
【図６−Ａ】本発明に係る針状構造体の他の側面図である。
【図６−Ｂ】本発明に係る針状構造体の他の側面図である。
【図６−Ｃ】本発明に係る針状構造体の他の側面図である。
【図７】本発明に係る装置の構成例を示す図である。
【図８】本発明に係る装置を使用して細胞内へ導入目的物質を導入する作業の例を示すフロー図である。
【符号の説明】
【００９３】
１    挿入対象物
２    導電部
３    針状構造体
４    荷電部を有する物質
５    導入目的物質
６    細胞
７１  制御用コンピュータ
７２  細胞が分散された液体
７３  針状構造体駆動部
７４  針状構造体取り付け部
７５  顕微鏡
７６  ディスプレー
７７  電圧印加部
７８  容器
【図１】
2006187261.tif 000002
【図２】
2006187261.tif 000003
【図３】
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【図４】
2006187261.tif 000005
【図５】
2006187261.tif 000006
【図６−Ａ】
2006187261.tif 000007
【図６−Ｂ】
2006187261.tif 000008
【図６−Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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