(57)【要約】【課題】  ビスフェノールＡを効率的に分解できる微生物、及びそのような微生物を使用して廃水、廃棄物等に含まれるビスフェノールＡを効率的に分解処理できる分解処理方法等を提供する。【手段】  本発明は、ビスフェノールＡを分解する能力を有し、Nocardioides属に属するビスフェノールＡ分解細菌を提供する。その代表株は、Nocardioides sp. JBB-41株（FERM AP-20004）である。本発明によるビスフェノールＡの分解処理方法は、上記ビスフェノールＡ分解細菌を、ビスフェノールＡを除去すべき試料に接触させる工程を含む方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビスフェノールＡを分解する能力を有し、Nocardioides属に属するビスフェノールＡ分解細菌。
【請求項２】
Nocardioides sp. JBB-41株（FERM AP-20004）である、請求項１に記載のビスフェノールＡ分解細菌。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のビスフェノールＡ分解細菌を、ビスフェノールＡを除去すべき試料に接触させる工程を含む、ビスフェノールＡの分解処理方法
【請求項４】
請求項１又は２に記載のビスフェノールＡ分解細菌又はその培養物をあらかじめ担体に担持させ、該担体を、ビスフェノールＡを除去すべき廃水または廃棄物の処理槽に投入する工程を含む、請求項３に記載の分解処理方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のビスフェノールＡ分解細菌又はその培養物をあらかじめ担持させた担体をカラムに充填し、該カラムにビスフェノールＡを除去すべき廃水を通水する工程を含む、請求項３に記載の分解処理方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のビスフェノールＡ分解細菌又はその培養物を含有するビスフェノールＡ分解剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビスフェノールＡ分解細菌およびその用途に関し、より詳しくは、ビスフェノールＡを効果的に分解する新規微生物とそれを利用した環境浄化方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビスフェノールＡはエポキシ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂などの原料として広く利用されている。一方、ビスフェノールＡは近年内分泌かく乱作用を有すると指摘され、社会問題化している。このようにビスフェノールＡによる河川や湖沼など水環境における生態系への悪影響が懸念されることから、廃水などに含まれるビスフェノールＡを低濃度まで除去する技術が必要である。このような技術としては、オゾン処理法、促進酸化法、活性炭吸着法、逆浸透膜分離法のような処理技術が効果的であることがすでに確認されている。
【０００３】
しかし、これらの技術は一部の下水処理場において、処理水の再利用を目的とした高度処理法として適用されているものであり、希薄なビスフェノールＡを含む多大な下水処理水の全量をこのような高度処理法によって処理するには効率的に不利であり、多大のエネルギー、コストを要するなど問題があった。
【０００４】
一方、生物学的な処理は低コストであるという利点がある。公知のビスフェノールＡ分解微生物としては、非特許文献１記載の未同定のMV1株、非特許文献２記載のPseudomonas paucimobilis FJ-4 株(後にSphingomonas paucimobilis と変更)、特許文献１及び２記載のSphingomonas属細菌、特許文献３記載の糸状菌などが僅かながら知られている。
【０００５】
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology, 58: 1823-1831, 1992
【非特許文献２】Japanese Journal of Water Treatment Biology， 31 203-212， 1995
【特許文献１】特開2002-142757号公報
【特許文献２】特開2002-262号公報
【特許文献３】特開2001-86980号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、糸状菌による分解はラッカーゼなどの非特異的な酸化酵素によるものであり、ビスフェノールＡを完全に分解するものではない。またSphingomonas属細菌には、ビスフェノールＡを完全に分解することができない場合があること、ビスフェノールＡの毒性の影響を受けやすいことなどの問題があった。
【０００７】
特に生物学的な分解処理には、処理の不安定性やビスフェノールＡを高濃度に含む廃水への対応に課題があった。従来、高濃度のビスフェノールＡを環境への悪影響がない低濃度まで効率よく分解処理できる微生物についての報告例はない。
【０００８】
そこで、本発明は、比較的高濃度のビスフェノールＡを効率的に分解できる微生物、及びそのような微生物を使用して廃水、廃棄物等に含まれるビスフェノールＡを効率的に分解処理できる分解処理方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記解題を解決するために種々の検討を重ねた結果、ビスフェノールＡを効率的に分解除去する新規の細菌を下水処理場の活性汚泥から単離することに成功した。この発見に伴い、さらに当該細菌を単独あるいは活性汚泥中に共存させることにより、ビスフェノールＡを極低濃度まで効率的に低減する技術を開発した。
【００１０】
本発明は、ビスフェノールＡを分解する能力を有し、Nocardioides属に属するビスフェノールＡ分解細菌を提供する。その代表株は、Nocardioides sp. JBB-41株（FERM AP-20004）である。
本発明によるビスフェノールＡの分解処理方法は、上記のビスフェノールＡ分解細菌を、ビスフェノールＡを除去すべき試料に接触させる工程を含む。
【００１１】
本発明の分解処理方法の一態様では、上記のビスフェノールＡ分解細菌又はその培養物をあらかじめ担体に担持させ、該担体を、ビスフェノールＡを除去すべき廃水または廃棄物の処理槽に投入する工程を含み、或いは上記のビスフェノールＡ分解細菌又はその培養物をあらかじめ担持させた担体をカラムに充填し、該カラムにビスフェノールＡを除去すべき廃水を通水する工程を含む。
また本発明は、上記ビスフェノールＡ分解細菌又はその培養物を含有するビスフェノールＡ分解剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ビスフェノールＡを効率よく分解できる微生物、特に高濃度のビスフェノールＡを分解する能力を有するNocardioides属のビスフェノールＡ分解細菌が提供され、またこの細菌を使用して廃水、廃棄物等のビスフェノールＡを効率よく分解処理できる浄化処理方法等が提供される。
【発明の実施の形態】
【００１３】
（１）本発明のビスフェノールＡ分解細菌
本発明のビスフェノールＡ分解細菌は、次のようにして単離される。先ず、活性汚泥、土壌などの分離源をビスフェノールＡを主な炭素源として含有する培地で培養する。そして培養後のビスフェノールＡ濃度を測定し、分解活性が認められた培養体は同じ培養液に数回植え継ぐことにより、分解微生物を集積化する。そしてこの集積培養体を栄養寒天培地などに混釈し培養することによりコロニーを形成させる。形成したコロニーを釣り上げ、液体培地により培養し、培養後の各菌体をビスフェノールＡを含む反応液に加える。反応後のビスフェノールＡ濃度を測定することによりビスフェノールＡ分解細菌を選択する。すなわち、ビスフェノールＡ濃度の所望の低下が見られる反応液からビスフェノールＡ分解細菌を分離する。
【００１４】
こうして選択した細菌の中から、ビスフェノールＡをより効率的に分解処理できる細菌をさらに選択する。この選択は、上で分離された菌体を含む反応液にビスフェノールＡを最終濃度10000〜0.1μg/lになるように添加し、反応後のビスフェノールＡ濃度を測定することにより行う。ビスフェノールＡの測定方法としては、ELISAキットを用いる方法、GC/MSを用いる方法など公知の方法でよい。
【００１５】
上記のようにして分離された微生物には、ビスフェノールＡを分解する能力を有する細菌であって、異なる属・種に属する複数の細菌が含まれる。特にビスフェノールＡを効率的に分解除去する微生物として、Nocardioides属に属する細菌が分離された。その代表的な株は、Nocardioides sp. JBB-41株と命名され、平成16年4月8日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにFERM AP-20004として寄託されている。従来においてビスフェノールＡを分解するNocardioides属の細菌は知られていなかったことから、本発明は、Nocardioides属に属し、ビスフェノールＡ分解能力を有する新種の細菌を提供するものである。
【００１６】
特に、Nocardioides sp. JBB-41株に代表される本発明の細菌は、10mg/l程度の高濃度のビスフェノールＡを１週間で10分の1の濃度まで分解することができ、さらに10μg/l程度の低濃度のビスフェノールＡを0.01μg/l程度又はそれ未満までの極低濃度まで分解することもできる。すなわち、本発明の細菌は、ゴミ埋立地浸出水に含まれるような比較的高濃度のビスフェノールＡを、その毒性に影響されることなく、環境への影響が無い低濃度まで分解できるという有用な分解能力を有する。
【００１７】
また、Nocardioides sp. JBB-41株の他には、Sphingomonas属に属する細菌(代表的にはJBN-2株)やRhodanobacter属に属する細菌(代表的にはJBN-33株)も分離された。
各代表株の微生物学的性状は表１の通りである。
【００１８】
【表１】
2006034171.tif 000002
【００１９】
本発明のビスフェノールＡ分解細菌を培養するには、当該細菌が増殖可能な任意の培地を使用できる。本発明の細菌は、ビスフェノールＡを含む各種廃水やビスフェノールＡを炭素源とした培地で培養することもできるが、微生物の培養に一般的に用いられる栄養培地、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどでも容易に培養できる。
【００２０】
また一般に、難分解性有機物を分解する微生物には増殖速度の遅いものが多く、産業上の利用に制限を与える場合があったが、本発明のビスフェノールＡ分解細菌の多くは、一般的に使用される栄養培地において最大比増殖速度（μmax）0.１（h-1）以上を示すことから（例えばJBB-41株）、当該細菌の菌体を工業的に生産することが容易であり、産業利用上の制限がない。
【００２１】
また本発明のビスフェノールＡ分解細菌は、必ずしもビスフェノールＡを単一の炭素源として資化増殖するだけではない。ビスフェノールＡを除去すべき試料（例えば各種廃水）はmg/lレベル以上の有機物を含む場合が多いが、本発明の細菌には、そのような他の栄養源が含まれる溶液中においても低濃度のビスフェノールＡを効率的に分解処理できる細菌も含まれる（例えばJBB-41株）。
【００２２】
（２）本発明のビスフェノールＡ分解細菌を用いた処理方法
さらに本発明によれば、上記のビスフェノールＡ分解細菌をビスフェノールＡに作用させることを特徴とする分解処理方法が提供される。すなわち、本法は、微生物を用いた環境浄化処理プロセスにおいて、本発明のビスフェノールＡ分解細菌、その培養物、または同細菌をあらかじめ担持した固定化担体などを、ビスフェノールＡを除去すべき試料と好気的または嫌気的な条件下で接触させる工程を含む。
【００２３】
その接触方法としては、本発明のビスフェノールＡ分解細菌の菌体を試料中に直接添加する方法、固定化担体を用いる方法、好気性ろ床法や回転円板法のろ材に付着させて試料と接触させる方法などが採用できるが、これらに限定されない。例えば、廃水との接触方法としては、本発明の細菌を生物処理槽に添加する方法、廃水に添加する方法、同細菌をあらかじめ担持した担体を生物処理槽内に投入し、スクリーンなどにより槽内に安定的に維持する方法、あるいは本発明の細菌をあらかじめ担持した担体を投入したカラムに廃水を通水する方法などを適用できる。
【００２４】
使用されるビスフェノールＡ分解細菌の形態も様々である。例えば、本発明の細菌は一般的な栄養培地によって培養できるので、その培養物のまま、あるいは冷蔵もしくは凍結保存して、あるいは乾燥菌体として利用できる。また培養液から遠心分離などにより菌体を回収濃縮して保存、使用できる。
【００２５】
また本発明のビスフェノールＡ分解細菌は、当該細菌又はその培養物を含有するビスフェノールＡ分解剤の態様で提供されてもよい。ビスフェノールＡ分解剤としては、適切な用量の当該細菌の培養液や乾燥粉末を含むものが挙げられる。例えば、乾燥粉末のものは、当該技術分野においてよく知られた凍結乾燥装置等を用いた乾燥処理によって製造できる。また本細菌をポリエチレングリコールやポリビニルアルコールなどのポリマーと混合固化して粒状又はキューブ状に成形して得られる包括固定化物としてもよいし、あらかじめ成形して固化形成したポリマー担体、活性炭、セラミック担体、又はウレタンスポンジなどに前記培養菌体を接触させ、付着させてもよい。
【００２６】
本発明の分解処理方法におけるビスフェノールＡ分解細菌の使用量は、処理される試料の種類、所望される処理時間などにより適宜設定すればよい。例えば、本細菌と廃水とを接触させる場合、細菌の最終濃度は105個／ｌ以上、特に107個／ｌ以上が好ましい。乾燥重量であれば0.001ｍｇ／ｌ以上、特に0.1ｍｇ／ｌ以上が好ましい。
【００２７】
本発明のビスフェノールＡ分解細菌を担持する担体としては、プラスチック、セラミックス、活性炭、ポリアクリルアミドゲル、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、アルギン酸、アガロース、デキストリンゲルなどが挙げられる。これらを本発明の細菌の付着もしくは包括固定化に使用してもよいし、好気性ろ床や回転円板法などの固定床として使用してもよい。また本発明の遊離細菌をメンブレンバイオリアクター内に保持して、廃水を通水することも可能である。
【００２８】
本発明によりビスフェノールＡを除去すべき試料としては、ビスフェノールＡに汚染され得る種々の環境試料が挙げられる。例えば、本発明の分解処理方法は、生汚泥、余剰汚泥、返送汚泥、濃縮汚泥、嫌気性消化汚泥など各汚泥の浄化処理プロセスに適用でき、また脱水ろ液、返送水などの汚泥分離水へ適用することもできる。これら汚泥中には比較的高濃度のビスフェノールＡが含まれることから、本発明の細菌を汚泥廃棄物や汚泥処理工程の種々の汚泥あるいは廃水に好気的または嫌気的に接触させることにより、それら試料中のビスフェノールＡを効率的に低減できる。
【００２９】
この場合、汚泥処理工程を有する廃水処理場において、本発明の処理方法をその汚泥処理工程に適用することにより、汚泥処理工程から廃水処理工程に返送される廃水中のビスフェノールＡ濃度を著しく低減できる。こうして廃水処理系に対するビスフェノールＡ負荷を低減できることから、結果的に処理水中のビスフェノールＡを低減することが可能となる。また廃棄物として排出される汚泥中のビスフェノールＡ濃度も低減でき、農地還元する場合にも環境負荷を低減することができる。本発明の分解処理方法によれば、廃水中のビスフェノールＡを容易に100ng/l以下まで除去できる。
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。
【実施例１】
【００３０】
［ビスフェノールＡ分解細菌の単離］
本発明の細菌の単離は以下のように行った。
集積培養体の作製
栃木県内の下水処理場より活性汚泥を採取し、冷蔵して輸送後直ちに集積培養の種汚泥として実験に供した。集積培養のための培地は、YNB（Yeast Nitrogen Base without amino acid）培地（Difco）とYNB培地に50mg/lの酵母エキスを加えたYNBYE培地の２種類の培地を基礎培地とし、ここに最終濃度100mg/lのビスフェノールＡを炭素源として加えて使用した。滅菌した試験管に酢酸エチルに溶解したビスフェノールＡを注入し、酢酸エチルを揮発除去した後にろ過滅菌した基礎培地と種汚泥（最終濃度100mg/l）を添加しシリコ栓をして28℃で振とう培養を行った。培養後のビスフェノールＡ濃度を測定し、減少が認められたものを分解とみなした。分解作用が確認された集積培養体は、新しい同じ組成の培地に1％を植え継ぎ、この操作を繰り返して安定した集積培養体を作製した。ビスフェノールＡの濃度は、集積培養試験管に3ml×2の酢酸エチルで抽出し、GC/MSで測定した。
【００３１】
ビスフェノールＡ分解細菌の単離
上記の方法で作製した集積培養体を滅菌水で希釈してNB培地（Difco）または、PGY培地（2ｇ/lペプトン、0.5g/ｌグルコース、1.0ｇ/ｌ酵母エキス、pH7.0）に1.5％バクトアガー（Difco）を加えた寒天培地に混釈して、固化した寒天プレートを28℃で培養することでコロニーを形成させた。形成したコロニーを白金耳で釣り上げ、ビスフェノールＡ分解活性を以下の方法で測定した。
【００３２】
単離したコロニーをNB培地に接種して28℃で振とう培養し、培養後の各菌体を遠心分離（5000rpm、15分）によって集菌洗浄した。そして洗浄菌体をOD660nmが1.0になる濃度で10mg/lのビスフェノールＡを含むYNB培地に加え、滅菌済みシリコ栓付試験管に5ml注入して28℃で振とうして反応させた。そして反応0、7、21日後のビスフェノールＡ濃度を前述と同様の方法で測定し、ビスフェノールＡ濃度の低減が認められる微生物をビスフェノールＡ分解細菌として選択した。
【００３３】
寒天培地から単離した48株のうち、NB培地で増殖可能な33株について分解試験を行った。ビスフェノールＡ分解活性を示した株は33株中11株であり、分解特性は次の３パターンに大別された。
(1)1週間でほぼ完全に分解できるタイプ：JBB-41株
(2)1週間では分解できず、3週間で分解できるタイプ：JBN-2株、JBN-4株、JBN-11株、JBN-12株、JBB-15株、JBN-29株、JBN-30株、JBN-34株、JBN-35株
(3)１週間で60 %程度分解するが、その後は分解が進まないタイプ：JBN-33株
表２に各タイプを代表する単離株によるビスフェノールＡ濃度の変化を示す。
【００３４】
【表２】
2006034171.tif 000003
【実施例２】
【００３５】
［ビスフェノールＡ分解細菌の同定］
実施例１で単離された11株の分解微生物のうち、JBN-2株、JBN-29株、JBN-33株、JBB-41株について16S rRNA遺伝子の全長配列を決定した。JBB-41株の16S rRNA遺伝子の配列を配列番号１に示す。またそれら単離株について各16S rRNA遺伝子の全長配列に基づくBLASTサーチにより近縁種を検索した。表３に各単離株の近縁細菌と16S rRNAの相同性を示す。
【００３６】
【表３】
2006034171.tif 000004
【００３７】
このように最も高いビスフェノールＡ分解性を示す細菌JBB-41株はNocardioides simplexに近縁の細菌であった。Nocardioides 属に属するビスフェノールＡ分解微生物はこれまで知られていないことから、JBB-41株はNocardioides 属において公知のいずれの種にも含まれない、新種の微生物を代表する細菌であると結論付けられた。
表４及び表５に、JBB-41株の生化学的性質、各基質の発酵性の各結果を示す。
【００３８】
【表４】
2006034171.tif 000005
【００３９】
【表５】
2006034171.tif 000006
【００４０】
なお、本試験にはAPI Coryne (bioMerieux. France)を使用した。
【実施例３】
【００４１】
［ビスフェノールＡ分解細菌を用いた廃水処理］
下水処理場の流入下水、生物処理水、脱水ろ液、さらにゴミ埋め立て地の浸出水を試料として、実施例１で単離された分解細菌を用いたビスフェノールＡの処理を行った。実験はガラス製広口ビンに入れた2リットルの各廃水をマグネットスターラーで撹拌し、そこに5mg/lの濃度で各分解細菌を加えて、室温（25℃）で撹拌して反応させた。2時間反応後に採水し、ビスフェノールＡ濃度を測定した。なお、廃水中のビスフェノールＡの測定は、下水試験法（追補暫定版、下水道協会  2002年）に従って固相抽出後、脱水濃縮して、誘導体化（トリメチルシリル化）し、GC/MSによって行った。
【００４２】
表６に単離代表株で2時間処理した後の各種廃水におけるビスフェノールＡ濃度を示す。この結果によると、2時間反応後のビスフェノールＡ濃度はいずれの処理水においても著しく低減していた。他方、それら分解細菌を添加しないで同様に2時間反応させた系（対照）では、いずれの廃水にもビスフェノールＡの低減は認められなかった。
【００４３】
【表６】
2006034171.tif 000007
【配列表】
2006034171000001.app