(57)【要約】【課題】骨の欠損部位および病変部位を修復するための複合材料を提供すること。【解決手段】本発明により、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料が提供される。この複合材料は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、およびＢ）生体に対して生体適合性を有する足場を含む。また、本発明により、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法が提供される。この方法は、Ａ）採取された肥大化能を有する軟骨細胞を提供する工程、およびＢ）該肥大化能を有する軟骨細胞を生体に対して生体適合性を有する足場上で培養する工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料であって、
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）該生体に対して生体適合性を有する足場
を含む、複合材料。
【請求項２】
前記骨形成は、骨の欠損部位を修復するためのものである、請求項１に記載の複合材料。
【請求項３】
前記複合材料は、固定のみでは修復できない大きさの骨の欠損部位の骨形成を改善するために用いられる、請求項２に記載の複合材料。
【請求項４】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体に対して生体適合性を有する足場の表面および該生体に対して生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域に含まれる、請求項１に記載の複合材料。
【請求項５】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンまたはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびコンドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを発現している、請求項１に記載の複合材料。
【請求項６】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的に肥大化することを特徴とする、請求項１に記載の複合材料。
【請求項７】
５×１０５個の前記細胞を含む培地を遠心することにより該細胞のペレットを作製し、該細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較し、有意な成長が確認されたときに、前記肥大化能を有すると判定される、請求項６に記載の複合材料。
【請求項８】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物由来である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項９】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、イヌ由来、ネコ由来、またはウマ由来である、請求項８に記載の複合材料。
【請求項１０】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体と同種異系の関係にある個体由来である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項１１】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体と異種の関係にある個体由来である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項１２】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部および骨増殖期の軟骨部からなる群より選択される部分から採取された細胞である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項１３】
前記長管骨の骨端線部が、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨からなる群より選択される部位である、請求項１２に記載の複合材料。
【請求項１４】
前記小骨の成長軟骨帯が、手骨、足骨および胸骨からなる群より選択される部位である、請求項１２に記載の複合材料。
【請求項１５】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、１×１０７細胞／ｍｌ〜１×１０４細胞／ｍｌの細胞密度に調整されている、請求項１に記載の複合材料。
【請求項１６】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される培地を含む培地中で培養された細胞である、請求項１に記載の複合材料。
【請求項１７】
前記培地は、細胞の増殖、分化、またはその両方を促進する物質を含む、請求項１６に記載の複合材料。
【請求項１８】
前記培地は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む培地である、請求項１６に記載の複合材料。
【請求項１９】
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、請求項１に記載の複合材料。
【請求項２０】
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、ゼラチン、コラーゲンまたはそれらの組み合わせから構成される、請求項１９に記載の複合材料。
【請求項２１】
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイトから構成される、請求項２０に記載の複合材料。
【請求項２２】
生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法であって、以下の工程：
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を提供する工程、および
Ｂ）該肥大化能を有する軟骨細胞を該生体に対して生体適合性を有する足場上で培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記Ａ）工程は、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンまたはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびコンドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの発現を指標として前記肥大化能を有する軟骨細胞を提供する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ａ）工程は、肥大化を指標として前記肥大化能を有する軟骨細胞を提供し、
５×１０５個の前記細胞を含む培地を遠心することにより該細胞のペレットを作製し、該細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較し、有意な成長が確認されたときに、前記肥大化能を有すると判定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物由来である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、イヌ由来、ネコ由来、またはウマ由来である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部および骨増殖期の軟骨部からなる群より選択される部分から採取された細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記長管骨の骨端線部が、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨からなる群より選択される部位である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記小骨の成長軟骨帯が、手骨、足骨および胸骨からなる群より選択される部位である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、１×１０７細胞／ｍｌ〜１×１０４細胞／ｍｌの細胞密度で提供される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｂ）工程について、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される培地を含む培地中で培養することを包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｂ）工程において、前記肥大化能を有する軟骨細胞は、細胞の増殖、分化またはその両方を促進する物質を含む培地中で培養される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｂ）工程において、前記肥大化能を有する軟骨細胞は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、ゼラチンまたはコラーゲンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体に対して生体適合性を有する足場の表面および該生体に対して生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域で、３７℃、５％〜１０％ＣＯ２存在下で培養された細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
前記培養する工程は、前記肥大化能を有する軟骨細胞が前記生体適合性を有する足場に定着するのに十分な期間にわたって実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３９】
生体内の骨形成を促進または誘発するためのインプラントまたは骨補填材料の製造における、複合材料の使用であって、該複合材料は、
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）該生体に対して生体適合性を有する足場、
を含む、使用。
【請求項４０】
骨の欠損部位を修復するための方法であって、該方法は、肥大化能を有する軟骨細胞と該生体に対して生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、該骨の欠損部位に移植する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
前記複合材料は、固定のみでは修復できない大きさの骨の欠損部位の骨形成を改善するために用いられる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
肥大化能を有する軟骨細胞を調製する方法であって、胸骨体下部の剣状突起移行部から細胞を採取する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発する材料に関する。より詳細には、肥大化能を有する軟骨細胞および足場を用いる複合材料ならびにその製造法およびその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨に関わる病気、あるいは骨の損傷または欠損の多くは、骨再生が好ましい治療法である。骨組織が骨折などの損傷を受けると、骨を作る細胞である骨芽細胞が増殖、分化し、骨が再生する。損傷の軽度な症例においては、患部を固定することによって骨芽細胞が機能し、治癒に至る。複雑骨折または関節内の損傷、さらに骨髄炎の併発などにより骨芽細胞が有効に機能し得ない環境では、損傷または欠損を修復するための標準的な方法として、自家骨移植が一般に考えられてきた。骨の欠損部位が大きくて自家骨では修復できない場合は、人工骨を使用するとしても、自家骨を一部混ぜる方法が採られている。しかし、ヒトの場合には自家骨の供給源は限られており、高額な費用および苦痛を伴うものである。さらに、自家骨を使用することにより、骨の採取部位（本来正常部位）には新たな骨欠損が生じる。また採取のためには余分な手術が必要であり、そして採取出来る量に限りがあるという欠点が存在する。
【０００３】
米国では死体から採取した同種骨が多く使用されている。しかし、日本では、死体を利用することは習慣として馴染みにくく、そのため利用されることは多くない。骨バンクも存在しているが、現在のところその供給量は多くはない。
【０００４】
例えば、米国では死体から採取した同種骨が多く使用されているが、感染症の伝播事故が頻回に起こり、問題になっている。
【０００５】
そこで、人工骨のインプラントおよび骨補填材料の使用などさまざまな外科的処置が利用されてきた。しかしながら、これら外科的処置の予後は必ずしも良好ではなく、複数回の手術を必要とすることも多い。
【０００６】
特許文献１（特開２００３−３８６３５号公報）には、骨軟骨の欠損部位を修復するための、β−リン酸三カルシウム多孔体に、可溶化したアテロコラーゲンに軟骨細胞または骨髄細胞を包埋してゲル化させた材料が記載されているが、肥大化能を有する軟骨細胞との組み合わせは意図されていない。この方法では、可溶化したアテロコラーゲンにこれらの細胞を包埋してゲル化しなければならない。
【０００７】
特許文献２（特開平１０−２４３９９６号公報）には、リン酸カルシウム系化合物と骨性細胞凝集体を主成分とする硬組織石灰化促進用生体材料が記載されている。この方法において使用される細胞には、肥大化能を有する軟骨細胞は意図されていない。さらに、この発明では、骨性細胞は凝集体を形成しており、足場上での培養を意図していない。
【０００８】
特許文献３（特開２００４−８６３４号公報）には、硬組織と軟組織の界面を効果的に再生し得る、リン酸カルシウムが傾斜化して含有される生分解性分子材料からなる足場が記載されている。この方法において使用されるリン酸カルシウムは、傾斜化されている必要がある。この文献に記載される足場では、肥大化能を有する軟骨細胞を使用することは意図されていない。
【０００９】
特許文献４（特表２００１−５２４９３７号公報）には、生物学的に活性な薬剤および／または細胞を含有する合成の結晶性不良のアパタイト系（ＰＣＡ）リン酸カルシウム物質が記載されている。この方法において使用されるリン酸カルシウムは、結晶性不良性でなければならない。特許文献４には、軟骨産生細胞を播種したＰＣＡ物質組成物を用いる、イン・ビボまたはイン・ビトロでの軟骨形成についての実施例が記載されているが（実施例２８〜３１）、軟骨形成の例であり、骨形成の例ではない。骨形成については異所性の骨形成の例が記載されているが（実施例２７）、骨髄細胞の使用が意図されている。特許文献４には、肥大化能を有する軟骨細胞は記載されていない。
【００１０】
このように従来の人工骨のインプラントおよび骨補填材料には、使用の容易性という点で課題がある。
【００１１】
さらに、従来の人工骨のインプラントおよび骨補填材料には、自家骨に比べて、骨形成能が悪く、骨が出来にくく、また靭性が低く衝撃で割れやすいという欠点があった。
【００１２】
上に記載した理由により、人工骨の使用割合は増えつつあるものの、未だ２〜３割で、残りの７〜８割は自家骨が使用されている。
【００１３】
人工骨のこれらの欠点を改良するために、細胞の再生力を利用した再生医療を使用する試みが行われ始めており、骨欠損に対する治療にも応用されている。この再生医療には骨髄由来の幹細胞が主に使用されている。
【００１４】
肥大化能を有する軟骨細胞を、ペレット状にして移植すると骨形成することが示された（非特許文献１：Ｏｋｉｈａｎａ  Ｈ．およびＳｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｙ．，Ｂｏｎｅ．１３，３８７−３９３（１９９２））。一般に細胞は、ペレット状にせずにそのまま生体に移植すると散逸し、骨を形成することはできず、骨の欠損部位の処置には不向きであった。また、ペレット状にしても実際の骨欠損処置に耐え得るサイズを達成するのは困難である。従来、再生医療に使用されている、骨髄細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞による骨修復は、未だ自家骨に比べて劣っており、満足するものではない（例えば、（特許文献５：特表２０００−５０８９１１号公報、特許文献６：特表平１０−５１２７５６号公報、特許文献７：特開２００３−１９９８１５号公報、特許文献８：特開２００３−５２３６５号公報、特許文献９：米国特許５４８６３５９号公報、特許文献１０：米国特許５２２６９１４号公報、特許文献１１：特表２０００−５０８９１１号公報、特許文献１２：特表２００２−５０６０８２号公報、非特許文献２：Ｏｈｇｕｓｈｉ，Ｈ．ら：Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．，６０：３３４−３３９（１９８９）、非特許文献３：Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．：Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，９：６４１−６５０（１９９１）、非特許文献４：Ｂｒｕｄｅｒ，Ｓ．ら：Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．，８０Ａ：９８５−９９６（１９９８）、非特許文献５：Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．ら：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｇ．，８：３１１−３２０（１９９８）、非特許文献６：Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３−１４７（１９９９）、非特許文献７：Ｂｉａｎｃｏ，Ｐ．＆  Ｒｏｂｅｙ，Ｐ．Ｇ．：Ｎａｔｕｒｅ，４１４：１１８−１２１（２００１）、非特許文献８：Ｑｕａｒｔｏ，Ｒ．ら：Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４４：３８５−３８６（２００１）、非特許文献９：Ｏｋｉｈａｎａ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｖｏｌ３０（１）（２００４）を参照のこと））。
【００１５】
非特許文献１０（Ｅｉｎｈｏｒｎ，Ｔ．Ａ．ら：Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．，６６Ａ：２７４−２７９（１９８４））には、ラットの骨の欠損部位に同種骨を移植すると、骨形成が生じることが記載されている。しかし、ヒトにおいて、骨の欠損部位の治療のために同種骨を移植することは制約も多く現実的ではない。従って、同種骨の移植に代わる代替方法が求められている。
【００１６】
非特許文献１１（Ｂｒｕｄｅｒ，Ｓ．Ｐ．ら：Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．，８０Ａ：９８５−９９６（１９８８））には、セラミックインプラントと間葉系幹細胞とをイヌ大腿骨欠損部に移植した実験が記載されている。この文献では、骨欠損部に、セラミックインプラントと間葉系幹細胞とを移植すると、骨癒合が生じることが報告されている。しかし、骨欠損部に間葉系幹細胞とセラミックインプラントとを移植した場合の成功率は自家骨移植ほど高くはなく、培養期間や費用などを勘案すると、実用的な手法とはいえない。
【００１７】
骨髄中の間葉系幹細胞は、骨に分化する系統の細胞であるので、足場と組み合せて骨の欠損部位に移植することが試みられている（非特許文献１１）。また、良好な骨形成には骨芽細胞またはその前駆細胞（例えば、間葉系幹細胞）が必須であると考えられきた。そこで、骨の欠損部位に、骨形成の足場と骨芽細胞を一緒に移植して骨形成させる試みが記載されている（特許文献４）が、実施したという記載はない。このことから、間葉系幹細胞と同様に実用に耐えないレベルであると予測される。
【００１８】
本発明者は、非特許文献１において、骨芽細胞または前駆細胞以外の細胞である成長軟骨細胞が骨形成を誘発し得ることを示した。しかし、足場と組み合わせて使用された例はない。したがって、肥大化能を有する軟骨細胞を足場とともに用いた時の骨形成レベルは予想されていない。元来、骨形成は骨芽細胞によって行われるものであるから、それ以外の細胞を使用することは現実的ではないと考えられている。
【特許文献１】特開２００３−３８６３５号公報
【特許文献２】特開平１０−２４３９９６号公報
【特許文献３】特開２００４−８６３４号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４９３７号公報
【特許文献５】特表２０００−５０８９１１号公報
【特許文献６】特表平１０−５１２７５６号公報
【特許文献７】特開２００３−１９９８１５号公報
【特許文献８】特開２００３−５２３６５号公報
【特許文献９】米国特許５４８６３５９号公報
【特許文献１０】米国特許５２２６９１４号公報
【特許文献１１】特表２０００−５０８９１１号公報
【特許文献１２】特表２００２−５０６０８２号公報
【非特許文献１】Ｏｋｉｈａｎａ，Ｈ．およびＳｈｉｍｏｍｕｒａ  Ｙ．，Ｂｏｎｅ．１３，３８７−３９３（１９９２）
【非特許文献２】Ｏｈｇｕｓｈｉ，Ｈ．ら：Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．，６０：３３４−３３９（１９８９）
【非特許文献３】Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．：Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，９：６４１−６５０（１９９１）
【非特許文献４】Ｂｒｕｄｅｒ，Ｓ．ら：Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．，８０Ａ：９８５−９９６（１９９８）
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．ら：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｅｎｇ．，８：３１１−３２０（１９９８）
【非特許文献６】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１４３−１４７（１９９９）
【非特許文献７】Ｂｉａｎｃｏ，Ｐ．＆  Ｒｏｂｅｙ，Ｐ．Ｇ．：Ｎａｔｕｒｅ，４１４：１１８−１２１（２００１）
【非特許文献８】Ｑｕａｒｔｏ，Ｒ．ら：Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４４：３８５−３８６（２００１）
【非特許文献９】Ｏｋｉｈａｎａ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｖｏｌ３０（１）(２００４)
【非特許文献１０】Ｅｉｎｈｏｒｎ，Ｔ．Ａ．ら：Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．，６６Ａ：２７４−２７９（１９８４）．
【非特許文献１１】Ｂｒｕｄｅｒ，Ｓ．Ｐ．ら：Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．，８０Ａ：９８５−９９６（１９８８）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、生体骨の大規模な欠損、骨腫瘍および複雑骨折などの処置において使用することができる、自家骨に匹敵するか、あるいは少なくとも同種骨に匹敵する複合材料ならびにその製造法およびその利用法を提供することを課題とする。
【００２０】
本発明は、骨再生の速度、再生された骨の強度などの点からみて、従来の人工骨インプラントおよび骨補填材料よりも有用な複合材料を提供することを課題とする。
【００２１】
本発明は、固定のみでは修復できない大きさの骨の欠損部位の骨形成を改善するために用いられる複合材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題は、一部、本発明において肥大化能を有する軟骨細胞および該生体に対して生体適合性を有する足場を使用することによって足場と細胞との組み合わせとしては、予想外に骨化が進展するという性質をもつ複合材料を見出したことによって解決された。特に、肥大化能を有する軟骨細胞と足場との組み合わせが、骨形成に必須と考えられていた骨芽細胞と足場との組み合わせよりも予想外に優れた骨形成率を示し、実用的とは従来考えられていなかった足場と細胞との組み合わせが骨欠損に実用上耐え得るレベルで使用可能ということを本発明者は見出した。本発明が達成した骨形成率は、骨形成は骨芽細胞によって行われるものであるから、それ以外の細胞を使用することは現実的ではないと考えられていることを考慮しても、顕著に優れているといえる。
【００２３】
本発明はまた、自家骨に匹敵するか、あるいは少なくとも同種骨に匹敵する複合材料の製造法およびその利用法を提供する。
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料であって、
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）該生体に対して生体適合性を有する足場
を含む、複合材料。
（項目２）
前記骨形成は、骨の欠損部位を修復するためのものである、項目１に記載の複合材料。
（項目３）
前記複合材料は、固定のみでは修復できない大きさの骨の欠損部位の骨形成を改善するために用いられる、項目２に記載の複合材料。
（項目４）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体に対して生体適合性を有する足場の表面および該生体に対して生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域に含まれる、項目１に記載の複合材料。
（項目５）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンまたはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびコンドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを発現している、項目１に記載の複合材料。
（項目６）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的に肥大化することを特徴とする、項目１に記載の複合材料。
（項目７）
５×１０５個の前記細胞を含む培地を遠心することにより該細胞のペレットを作製し、該細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較し、有意な成長が確認されたときに、前記肥大化能を有すると判定される、項目６に記載の複合材料。
（項目８）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物由来である、項目１に記載の複合材料。
（項目９）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、イヌ由来、ネコ由来、またはウマ由来である、項目８に記載の複合材料。
（項目１０）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体と同種異系の関係にある個体由来である、項目１に記載の複合材料。
（項目１１）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体と異種の関係にある個体由来である、項目１に記載の複合材料。
（項目１２）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部および骨増殖期の軟骨部からなる群より選択される部分から採取された細胞である、項目１に記載の複合材料。
（項目１３）
前記長管骨の骨端線部が、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨からなる群より選択される部位である、項目１２に記載の複合材料。
（項目１４）
前記小骨の成長軟骨帯が、手骨、足骨および胸骨からなる群より選択される部位である、項目１２に記載の複合材料。
（項目１５）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、１×１０７細胞／ｍｌ〜１×１０４細胞／ｍｌの細胞密度に調整されている、項目１に記載の複合材料。
（項目１６）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される培地を含む培地中で培養された細胞である、項目１に記載の複合材料。
（項目１７）
前記培地は、細胞の増殖、分化、またはその両方を促進する物質を含む、項目１６に記載の複合材料。
（項目１８）
前記培地は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む培地である、項目１６に記載の複合材料。
（項目１９）
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、項目１に記載の複合材料。
（項目２０）
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、ゼラチン、コラーゲンまたはそれらの組み合わせから構成される、項目１９に記載の複合材料。
（項目２１）
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイトから構成される、項目２０に記載の複合材料。
（項目２２）
生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法であって、以下の工程：
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を提供する工程、および
Ｂ）該肥大化能を有する軟骨細胞を該生体に対して生体適合性を有する足場上で培養する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）
前記Ａ）工程は、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンまたはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびコンドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの発現を指標として前記肥大化能を有する軟骨細胞を提供する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記Ａ）工程は、肥大化を指標として前記肥大化能を有する軟骨細胞を提供し、
５×１０５個の前記細胞を含む培地を遠心することにより該細胞のペレットを作製し、該細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較し、有意な成長が確認されたときに、前記肥大化能を有すると判定される、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物由来である、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、イヌ由来、ネコ由来、またはウマ由来である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部および骨増殖期の軟骨部からなる群より選択される部分から採取された細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記長管骨の骨端線部が、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨からなる群より選択される部位である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記小骨の成長軟骨帯が、手骨、足骨および胸骨からなる群より選択される部位である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、１×１０７細胞／ｍｌ〜１×１０４細胞／ｍｌの細胞密度で提供される、項目２２に記載の方法。
（項目３１）
前記Ｂ）工程について、前記肥大化能を有する軟骨細胞を、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される培地を含む培地中で培養することを包含する、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｂ）工程において、前記肥大化能を有する軟骨細胞は、細胞の増殖、分化またはその両方を促進する物質を含む培地中で培養される、項目２２に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｂ）工程において、前記肥大化能を有する軟骨細胞は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む培地中で培養される、項目２２に記載の方法。
（項目３４）
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３５）
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、ゼラチンまたはコラーゲンである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記生体に対して生体適合性を有する足場は、ヒドロキシアパタイトである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記肥大化能を有する軟骨細胞は、前記生体に対して生体適合性を有する足場の表面および該生体に対して生体適合性を有する足場の内部孔内からなる群より選択される領域で、３７℃、５％〜１０％ＣＯ２存在下で培養された細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目３８）
前記培養する工程は、前記肥大化能を有する軟骨細胞が前記生体適合性を有する足場に定着するのに十分な期間にわたって実施される、項目２２に記載の方法。
（項目３９）
生体内の骨形成を促進または誘発するためのインプラントまたは骨補填材料の製造における、複合材料の使用であって、該複合材料は、
Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、および
Ｂ）該生体に対して生体適合性を有する足場、
を含む、使用。
（項目４０）
骨の欠損部位を修復するための方法であって、該方法は、肥大化能を有する軟骨細胞と該生体に対して生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、該骨の欠損部位に移植する工程を包含する、方法。
（項目４１）
前記複合材料は、固定のみでは修復できない大きさの骨の欠損部位の骨形成を改善するために用いられる、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
肥大化能を有する軟骨細胞を調製する方法であって、胸骨体下部の剣状突起移行部から細胞を採取する工程を包含する、方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によって、生体骨の大規模な欠損、骨腫瘍および複雑骨折などの処置において使用することができる、自家骨に匹敵する複合材料ならびにその製造法およびその利用法が提供される。このような複合材料は、従来の複合材料では修復困難な大きさの骨欠損を修復し、予想外の効率で骨形成が起こり、骨の再生を導くことができることから、従来人工物での移植処置の成績が不良であった部位の処置が可能になった。本発明の複合材料は、生体適合性の足場を使用しており、実際に移植治療において機能する。このような複合材料は、従来技術では提供されるものではなく、初めて提供されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２７】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２８】
本明細書において「複合材料」とは、細胞と足場を含む材料をいう。
【００２９】
骨形成の「促進」とは、すでに骨形成が起こっている場合に、目的とする変化を加えると、その骨形成の速度が増加することをいう。骨形成の「誘発」とは、骨形成が起こっていない場合に、目的とする変化を加えると骨形成が生じることをいう。
【００３０】
本明細書における「骨欠損」には、骨腫瘍、骨粗しょう症、リウマチ性関節炎、変形性関節症、骨髄炎および骨壊死などの病変；骨固定術、椎管拡張術および骨切術などの矯正手術；複雑骨折などの外傷および腸骨採取などによって生じる骨の欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
骨の欠損部位の「修復」とは、その欠損部位が健常状態になるか、またはそれに近づくことをいう。
【００３２】
本明細書において「固定のみでは修復できない大きさ」とは、インプラントおよび骨補填材料の使用が不可欠である大きさをいう。
【００３３】
（細胞）
本明細書において「成長軟骨細胞（ｇｒｏｗｔｈ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｅｌｌ）」とは、発生期または成長期および骨折修復期または骨増殖期に、骨を形成する組織（すなわち成長軟骨）にある細胞をいう。成長期に骨を形成する組織を成長軟骨と呼ぶのが一般的であるが、本明細書では、発生期、成長期、骨増殖期または骨折修復期に骨を形成する組織を意味する。成長軟骨細胞はまた、肥大（化）軟骨細胞、石灰化軟骨細胞、または骨端（線）軟骨細胞ともいわれる。成長軟骨細胞がヒトに対して用いられる場合、この成長軟骨細胞はヒト由来であることが好ましいが、周知技術により拒絶反応等の問題が克服できることから、ヒト以外に由来する細胞でも用いることができる。
【００３４】
本発明における成長軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、イヌ由来、ネコ由来、またはウマ由来である。
【００３５】
本発明における成長軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨などの長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、手骨、足骨および胸骨などの成長軟骨帯、軟骨膜、胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部、ならびに骨増殖期の軟骨部から採取され得る。これらの成長軟骨細胞は、例えば、本明細書の実施例に記載される方法によって調製され得る。
【００３６】
本明細書において「肥大化能を有する軟骨細胞」とは、将来的に肥大化する能力のある細胞をいう。肥大化能を有する軟骨細胞は、生体から直接採取した「成長軟骨細胞」に加えて、本明細書において以下に定義される「肥大化能」の判定法により肥大化能を有する任意の細胞を含む。
【００３７】
本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、イヌ由来、ネコ由来、またはウマ由来である。肥大化能を有する軟骨細胞がヒトに対して用いられる場合、この肥大化能を有する軟骨細胞はヒト由来であることが好ましいが、周知技術により拒絶反応等の問題が克服できることから、ヒト以外に由来する細胞でも用いることができる。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、例えば、肋骨の骨軟骨移行部、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨などの長管骨の骨端線部、脊椎骨の骨端線部、手骨、足骨および胸骨などの成長軟骨帯、軟骨膜、ならびに胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部、ならびに骨増殖時の軟骨部から採取され得る。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、未分化細胞を分化誘導させて得ることも可能である。
【００３８】
肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的には肥大化することを特徴とする。
【００３９】
本明細書において「肥大化」とは、検鏡下で形態学的に判断され得る。細胞の肥大化は、細胞が柱状配列をしている場合には増殖層に続いて観察され、柱状配列していない場合には、周囲細胞と比較してより大きい状態をいう。
【００４０】
肥大化能は、５×１０５個の前記細胞を含む培地を遠心することにより該細胞のペレットを作製し、該細胞ペレットを一定期間培養し、顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較し、有意な成長が確認されたときに、肥大化能を有すると判定される。
【００４１】
本明細書において、「静止軟骨細胞」とは、肋軟骨の肋骨移行部（成長軟骨部）から離れた部分に位置する軟骨をいい、生涯に亘って軟骨として存在する組織である。静止軟骨部にある細胞を静止軟骨細胞という。本明細書において、「関節軟骨細胞」とは、関節面に存在する軟骨組織（関節軟骨）にある細胞をいう。
【００４２】
本明細書において、軟骨細胞は、マーカーとして、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンまたはコンドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つを発現していることを確認することにより判定される。軟骨細胞のうち、肥大化能を有する細胞は、さらにＸ型コラーゲン、アルカリホスファターゼおよびオステオネクチンからなる群より選択される少なくとも１つを発現していることを確認することによって判定される。Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼまたはオステオネクチンのいずれも発現していない軟骨細胞は、肥大化能を有していないと判定される。従って、本明細書における肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的に肥大化することを確認する代わりに、軟骨細胞マーカー群より選択される少なくとも１つおよび肥大化能を有する軟骨細胞マーカー群より選択される少なくとも１つを発現していることを確認することによっても判定され得る。マーカーは、特異的な染色法、免疫組織化学的な手法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法またはＰＣＲ法などの培養細胞から抽出したタンパク質またはＲＮＡを解析する手法で、局在または発現が同定される。
【００４３】
本明細書において「軟骨細胞マーカー」とは、軟骨細胞において、その局在または発現が軟骨細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンまたはコンドロモジュリンの局在または発現）によって軟骨細胞であることが同定できるものをいう。本明細書において「肥大化能を有する軟骨細胞マーカー」とは、肥大化能を有する軟骨細胞において、その局在または発現が軟骨細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼまたはオステオネクチンの局在または発現）によって肥大化能を有する軟骨細胞であることが同定できるものをいう。
【００４４】
本明細書において、「軟骨型プロテオグリカン」とは、コアタンパク質にコンドロイチン４硫酸、コンドロイチン６硫酸、ケラタン硫酸、Ｏ−結合オリゴ糖、Ｎ−結合オリゴ糖などのグルコサミノグリカンが多数結合した高分子をいう。この軟骨型プロテオグリカンは、さらにリンクタンパクを介してヒアルロン酸と結合して軟骨型プロテオグリカン集合体を形成する。軟骨組織においてグルコサミノグリカンは豊富で、乾燥重量の２０〜４０％を占める。軟骨型プロテオグリカンは、アグリカンとも称される。
【００４５】
本明細書において、「骨型プロテオグリカン」とは、軟骨型プロテオグリカンより分子量が小さく、コアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、Ｏ−結合オリゴ糖、Ｎ−結合オリゴ糖などのグルコサミノグリカンが結合した高分子をいう。骨組織におけるグルコサミノグリカンは、脱灰骨の乾燥重量の１％以下である。骨型プロテオグリカンとしては、例えば、デコリン、バイグリカンが挙げられ得る。
【００４６】
本明細書において「骨芽細胞」とは、骨基質上に存在し、骨基質形成およびその石灰化を行う細胞である。骨芽細胞は、２０〜３０μｍで、立方体または円柱状の細胞である。本明細書において使用される場合、骨芽細胞は、骨芽細胞の前駆体細胞である「前骨芽細胞」を含み得る。
【００４７】
骨芽細胞は、マーカーとして、Ｉ型コラーゲン、骨型プロテオグリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、基質Ｇｌａタンパク質、オステオグリシン、オステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、オステオネクチンまたはプレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）からなる群より選択される少なくとも１つを発現することによって判定される。加えて、骨芽細胞は、軟骨細胞マーカーであるＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）またはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンまたはコンドロモジュリンを発現していないことを確認することによって確定され得る。マーカーは、特異的な染色法、免疫組織化学的な手法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法またはＰＣＲ法などの培養細胞から抽出したタンパク質またはＲＮＡを解析する手法で、局在または発現が同定される。
【００４８】
本明細書において「骨芽細胞マーカー」とは、骨芽細胞において、その局在または発現が骨芽細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、Ｉ型コラーゲン、骨型プロテオグリカン（例えば、デコリン、バイグリカン）、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、基質Ｇｌａタンパク質、オステオグリシン、オステオポンチン、骨シアル酸タンパク質、オステオネクチンまたはプレイオトロフィンの局在または発現）によって骨芽細胞であることを確認することができるものをいう。オステオグリシンは、骨誘導因子（ＯＩＦ）ともいわれる。オステオポンチンは、ＢＳＰ−Ｉ、２ａｒともいわれる。骨シアル酸タンパク質は、ＢＳＰ−ＩＩともいわれる。プレイオトロフィンは、ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＳＦ−１）、骨芽細胞特異的因子−１ともいわれる。オステオネクチンは、ＳＰＡＲＣ、ＢＭ−４０ともいわれる。
【００４９】
骨芽細胞であると認定するためには、骨芽細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性であることを示すか：骨芽細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別し、軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ骨芽細胞と軟骨細胞とを陽性と識別し、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；骨芽細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、骨芽細胞を陰性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または骨芽細胞と軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、骨芽細胞を陰性と識別し軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。
【００５０】
肥大化能を有する軟骨細胞であると認定するためには、肥大化能を有する軟骨細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性あることを示すか；肥大化能を有する軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別し軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞と軟骨細胞とを陽性と識別し骨芽細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；肥大化能を有する軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別し骨芽細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または肥大化能を有する軟骨細胞と軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別し軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。
【００５１】
（肥大化能を有しない）軟骨細胞であると認定するためには、軟骨細胞のみを陽性と識別するマーカーで陽性あることを示すか；軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別し骨芽細胞を陰性と識別するマーカーで陽性であることを示すか；軟骨細胞と骨芽細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞を陰性と識別し骨芽細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることを示すか；または軟骨細胞と肥大化能を有する軟骨細胞とを陽性と識別するマーカーで陽性であり、かつ、軟骨細胞を陰性と識別し肥大化能を有する軟骨細胞を陽性と識別するマーカーで陰性であることなどを示せばよい。
【００５２】
本明細書において、軟骨細胞、肥大化能を有する軟骨細胞、および骨芽細胞を認定するためには、例えば、以下の表に列挙される細胞マーカーの組み合わせが用いられ得る。
【００５３】
【表１】
2006289062.tif 000002
【００５４】
本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉系の組織に見出される幹細胞をいう。間葉系の組織としては、骨髄、脂肪、血管内皮、平滑筋、心筋、骨格筋、軟骨、骨、じん帯が挙げられるが、これらに限定されない。間葉系幹細胞は、代表的には、骨髄、脂肪組織、滑膜組織、筋組織、末梢血、胎盤組織、月経血または臍帯血に由来する幹細胞であり得る。
【００５５】
（足場）
本明細書において「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」とは、細胞を支持するための材料を意味する。足場は、一定の強度、生体適合性を有する。本明細書中で使用される場合、足場は、生物学的物質または天然から供給される物質、天然に存在する物質または合成で供給される物質から製造される。特に言及する場合、足場は、有機体（例えば、組織、細胞）以外の物質（非細胞物質）から形成される。本明細書で使用される場合、足場は、有機体（例えば、組織、細胞）以外の物質から形成された構成物（生物由来の材料（例えば、コラーゲン、ヒドロキシアパタイトも含む）である。本明細書で使用する場合、「有機体」とは、生活機能をもつように組織された物質系をいう。すなわち、有機体は、生物を他の物質系と区別していう。細胞、組織などは有機体の概念に含まれるが、有機体から取り出した生物由来の材料は、有機体には含まれない。細胞が定着する足場の部分としては、足場の表面のほか、内部に孔が存在し、その孔が細胞を収容し得る場合、その内部孔を挙げることができる。例えば、ヒドロキシアパタイトで作製した足場には、通常、細胞を充分に収容し得る孔が多数存在する。
【００５６】
足場の材料としては、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される材料が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、足場の材料は、リン酸カルシウム、ゼラチンまたはコラーゲンである。より好ましくは、足場の材料は、ヒドロキシアパタイトである。
【００５７】
これらの足場は、顆粒形態、ブロック形態、スポンジ形態などの任意の形態で提供され得る。これらの足場は、孔があってもなくてもよい。このような足場は、市販されているものを使用してもよく、例えば、ペンタックス株式会社、オリンパス株式会社、京セラ株式会社、三菱ウェルファーマ株式会社、大日本住友製薬株式会社、小林製薬株式会社、ジンマー株式会社などから市販されている。一般的な足場の調製および特徴付けは当該分野において公知であり、そして慣用的な実験および当該分野の技術常識しか必要としない。例えば、米国特許第４，９７５，５２６号；同第５，０１１，６９１号；同第５，１７１，５７４号；同第５，２６６，６８３号；同第５，３５４，５５７号および同第５，４６８，８４５号を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。他の足場はまた、例えば、以下の文献において記載されている：ＬｅＧｅｒｏｓおよびＤａｃｕｌｓｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｒａｍｉｃｓ，ＩＩ  １７−２８頁（１９９０，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）のような生体適合物質論文；および、Ｙａｎｇ  Ｃａｏ，Ｊｉｅ  Ｗｅｎｇ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７，（１９９６）４１９−４２４頁のような他の公開された記載；ＬｅＧｅｒｏｓ，Ａｄｖ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．２，１６４（１９８８）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，１４巻、３５１−３６９頁；ならびにＰｉａｔｔｅｌｌｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９６、１７巻、１７６７−１７７０頁を参照のこと（これらの開示は本明細書中に参考として援用される）。
【００５８】
本明細書において「リン酸カルシウム」とは、カルシウムリン酸塩の総称である。例えば、ＣａＨＰＯ４、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏなどの化学式で示される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書において「ヒドロキシアパタイト」とは、一般組成をＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２とする化合物であり、コラーゲンとともに哺乳類動物の硬組織（骨および歯）の主要構成成分である。ヒドロキシアパタイトは、上記の一連のリン酸カルシウムを含むが、生体硬組織中のアパタイトのＰＯ４およびＯＨ成分は体液中のＣＯ３成分と置換していることが多い。また、ヒドロキシアパタイトは、厚生労働省および米国連邦食品医薬品局（ＦＤＡ（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｕｔｒａｔｉｏｎ）により安全性が承認されている物質である。ヒドロキシアパタイトは、市販のものは生体非吸収性材料であるものが多く、生体内にほとんど吸収されず残存するが、吸収性のものもある。
【００６０】
生体に対して生体適合性を有する足場としては、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される材料を含む足場が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書において「コラーゲン」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、動物の細胞外マトリクスの主成分である。コラーゲンは、例えば、新田ゼラチン、日本皮革、和光純薬、半井、フナコシ、シグマアルドリッチおよびメルクなどから入手可能であり、その他の供給源からのコラーゲンもまた、本発明において利用可能である。
【００６２】
本明細書において「ゼラチン」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、コラーゲン（動物の皮、腱、骨から採取）を変性、（例えば、熱変性）させて得られる。コラーゲンのペプチド連鎖間の塩類結合または水素結合が開裂した結果、非可逆的に水溶性タンパク質に変化したものと考えられる。ゼラチンは、例えば、新田ゼラチン、日本皮革、和光純薬、半井、フナコシ、シグマアルドリッチおよびメルクなどから入手可能であり、その他の供給源からのゼラチンもまた、本発明において利用可能である。
【００６３】
本明細書において「生体適合性」とは、毒性、免疫反応、損傷などを生じることなく生体組織または臓器と適合する性質をいう。本発明において使用され得る生体適合性材料としては、例えば、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロンなど、およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６４】
本明細書において「細胞生理活性物質」または「生理活性物質」（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞または組織に作用する物質をいう。そのような作用としては、例えば、その細胞または組織の制御、変化などが挙げられるがそれらに限定されない。生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものであるが改変された作用を持つものであってもよい。本明細書では、生理活性物質は、ペプチドを含むタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得る。
【００６５】
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用、細胞機能の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点において、サイトカインは、通常、ペプチドを含むタンパク質形態であることが多い。
【００６６】
本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖および分化誘導を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。
【００６７】
骨形成関連のサイトカインには、代表的には、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの因子、ならびにアスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸などの化合物が挙げられる。
【００６８】
サイトカインおよび増殖因子などの生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能（例えば、細胞接着活性または細胞−基質間の接着活性など）で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性（例えば、幹細胞を増殖させる活性または骨芽細胞を形成させる活性）を有してさえいれば、本発明の実施において使用することができる。
【００６９】
本明細書において「同系に由来する」とは、自己（自家）、純系または近交系に由来することをいう。
【００７０】
本明細書において「生体と同種異系の関係にある個体由来」とは、同種であっても遺伝的には異なる他の個体を起源とすることをいう。
【００７１】
本明細書において「生体と異種の関係にある個体由来」とは、異種個体を起源とすることをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ラット由来の細胞は「生体と異種の関係にある個体由来」である。
【００７２】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、またはウマ、好ましくは、ヒトであり得る。
【００７３】
本明細書において「インプラント」または「骨補填材料」とは、当該分野において用いられる意味で用いられ、本明細書で使用する場合、実質的に同じ意味で用いられるが、特に言及する場合、インプラントとは埋める材料全般を意味し、骨補填材料とは骨の欠損部位を補う材料全般をいう。
【００７４】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００７５】
（複合材料）
１つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を提供する。従来、骨の欠損部位の骨形成を促進または誘発するために使用される人工骨のインプラントおよび骨補填材料は、骨再生の速度、再生された骨の強度などの点からみて十分なものは提供されてこなかった。本発明は、従来技術では再生効率の不良な骨欠損を修復し、骨の再生を導くことができる複合材料を提供することにより、従来、人工物での移植処置が困難であった部位の処置が可能になるという効果を有する。本発明の複合材料は、固定のみでは修復できない大きさの骨の欠損部位の骨形成を改善するためにも用いられ得る。このような複合材料は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、およびＢ）該生体に対して生体適合性を有する足場を含む。
【００７６】
１つの好ましい実施形態において、本発明の軟骨細胞は、マーカーとして、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンまたはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびコンドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つを発現している。従って、本明細書における肥大化能を有する軟骨細胞は、形態学的に肥大化することを特徴とし、かつこれらのマーカー群より選択される少なくとも１つを発現する細胞である。好ましい実施形態において、本発明の肥大化能を有する軟骨細胞は、上述の軟骨細胞マーカーの発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定され得る。
【００７７】
別の実施形態において、本発明の肥大化能を有する軟骨細胞は、哺乳類動物、好ましくは、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ウサギ由来、イヌ由来、ネコ由来、またはウマ由来である。本発明における肥大化能を有する軟骨細胞は、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部（例えば、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨）、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯（例えば、手骨、足骨または胸骨）、軟骨膜または胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部ならびに骨増殖時の軟骨部のような部位から分離または誘導され得る。肥大化能を有する軟骨細胞は、分化誘導によっても得られ得る。
【００７８】
本発明の肥大化能を有する軟骨細胞は、通常、１×１０７細胞／ｍｌ〜１×１０４細胞／ｍｌの細胞密度に調整されているが、１×１０４細胞／ｍｌ未満または１×１０７細胞／ｍｌより多くてもよい。１×１０４細胞／ｍｌ未満のときは、培養器で肥大化能を有する軟骨細胞を増殖させ得るからである。本発明の肥大化能を有する軟骨細胞が、１×１０７細胞／ｍｌより多い場合には、そのまま使用することが可能であるが、必要に応じて、より広い足場へ播種するか、または培地を用いて適切な濃度に希釈され得る。本発明の１つの実施形態において、肥大化能を有する軟骨細胞の細胞密度は、例えば、０．５〜１×１０６／ｃｍ３（ｍｌ）、１×１０５／ｃｍ３（ｍｌ）であり得る。本発明の別の実施形態において、肥大化能を有する軟骨細胞は、４×１０４／ｃｍ３（ｍｌ）であり得る。
【００７９】
本発明において用いられる肥大化能を有する軟骨細胞は、どのような培地で培養されてもよく、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）またはそれらの組み合わせのような培地中で培養された細胞であるが、これらに限定されない。肥大化能を有する軟骨細胞は、細胞の増殖、分化またはその両方を促進する物質を含んでいる培地で培養された細胞であってもよい。好ましくは、例えば、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分のような物質を含む培地で培養された細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書において使用されるＨａｍＦ１２培地は、例えば、ＣａＣｌ２（無水物）３３．２０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．００２５ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．８３ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ２２３．６０ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２（無水物）５７．２２ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ７５９９．００ｍｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３  １１７６．００ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４（無水物）１４２．００ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．８６ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース  １８０２．００ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン・Ｎａ  ４．７７ｍｇ／Ｌ、リノール酸  ０．０８ｍｇ／Ｌ、リポ酸  ０．２１ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド  １．２０ｍｇ／Ｌ、プトレッシン  ２ＨＣｌ  ０．１６１ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム１１０．００ｍｇ／Ｌ、チミジン  ０．７０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニン  ８．９ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ  ２１１．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ  １５．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸１３．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン  ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  ３５．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸  １４．７０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン  ２１７．００ｍｇ／Ｌ、グリシン  ７．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン  ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  ２１．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン  ４．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン  １３．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン・ＨＣｌ  ３６．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン  ４．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン  ５．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン  ３４．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン  １０．５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン  １２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン  ２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  ７．８０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン  １１．７０ｍｇ／Ｌ、ビオチン  ０．００７ｍｇ／Ｌ、Ｄ−Ｃａ  パントテナート  ０．５０ｍｇ／Ｌ、塩化コリン  １４．００ｍｇ／Ｌ、葉酸  １．３０ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール  １８．００ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド  ０．０４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン  ＨＣｌ  ０．０６ｍｇ／Ｌ、リボフラビン  ０．０４ｍｇ／Ｌ、チアミン  ＨＣｌ  ０．３０ｍｇ／ＬおよびビタミンＢ１２  １．４０ｍｇ／Ｌ）から構成される。
【００８１】
本明細書において使用されるＭＥＭ培地は、例えば、ＣａＣｌ２（無水物）２００．００ｍｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ４００．００ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４（無水物）９８．００ｍｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ６８００．００ｍｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３  ２２００．００ｍｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  １４０．００ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース  １０００．００ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド  １０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ  １２６．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ  ３１．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン  ２９２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスタミン  ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  ４２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン  ５２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン５２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン  ＨＣｌ  ７３．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン  １５．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン  ３２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン  ４８．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン  １０．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  ５２．００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン  ４６．００ｍｇ／Ｌ、Ｄ−Ｃａパントテナート  １．００ｍｇ／Ｌ、塩化コリン  １．００ｍｇ／Ｌ、葉酸  １．００ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール  ２．００ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド  １．００ｍｇ／Ｌ、ピリドキサル  ＨＣｌ  １．００ｍｇ／Ｌ、リボフラビン  ０．１０ｍｇ／Ｌ、チアミンＨＣｌ  １．００ｍｇ／Ｌから構成される。
【００８２】
本発明において用いられる生体に対して生体適合性を有する足場は、生体適合性を有する限りどのような足場であってもよく、例えば、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルミナ、ジルコニア、アパタイト−ウォラストナイト析出ガラス、ゼラチン、コラーゲン、キチン、フィブリン、ヒアルロン酸、絹、セルロース、デキストラン、ポリ乳酸、ポリロイシン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリシアノアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチレン酢酸ビニル共重合体、ナイロン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される物質を含む。好ましくは、生体に対して生体適合性を有する足場は、リン酸カルシウム、ゼラチンまたはコラーゲンであり、より好ましくは、種々の形態のヒドロキシアパタイト（例えば、結晶質性ヒドロキシアパタイトまたは傾斜化していないヒドロキシアパタイト）である。足場の生体適合性は、骨内埋植試験、復帰突然変異試験、染色体異常試験、細胞毒性試験、筋肉内埋植試験、皮膚感作試験、皮膚及び皮内刺激性試験、発熱毒性試験、溶血性試験、抗原性試験、急性毒性試験および反復投与試験からなる群より選択される少なくとも１つの試験によって測定され得る。好ましくは、上記の全ての試験によって測定され得る。
【００８３】
骨形成の皮下試験は、本来骨の無い部分に骨を形成（異所性骨形成とも呼ばれる）させ、骨形成能を評価する試験である。この試験は容易に実施できるので、当該分野で広く使用されている。骨を治療するときの試験方法には、骨欠損試験が用いられ得る。骨形成は、既に近傍に存在する骨芽細胞および誘導・遊走した骨芽細胞によって骨が形成されるので、通常、皮下試験よりも骨形成率は良いと考えられている。皮下試験の結果は、実際の骨欠損における骨形成の結果によく一致することが知られている（例えば、Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｒ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０：８９３−８９９（１９６５）、Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら：Ｓｃｉｅｎｅｃｅ，２４２：１５２８−１５３２（１９８８）、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｅ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，２３０：２５７−２６５（１９８８）、Ｅｋｅｌｕｎｄ，Ａ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，２６３：１０２−１１２（１９９１）、およびＲｉｌｅｙ，Ｅ．Ｈ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，３２４：３９−４６（１９９６）を参照のこと）。従って、皮下試験の結果で骨形成が得られる場合、当業者は、骨欠損試験において当然に骨形成が得られることを理解する。
【００８４】
（製造方法）
１つの局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料を製造するための方法を提供する。この方法は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞を提供する工程、およびＢ）該肥大化能を有する軟骨細胞を該生体に対して生体適合性を有する足場上で培養する工程を包含する。肥大化能を有する軟骨細胞は、生体に対して生体適合性を有する足場の表面または内部孔内で、好ましくは、３７℃、５〜１０％ＣＯ２存在下で培養され得る。
【００８５】
好ましい実施形態において、Ａ）工程は、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンまたはその成分、ヒアルロン酸、ＩＸ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲンおよびコンドロモジュリンからなる群より選択される少なくとも１つの発現（指標となる発現は、これらのマーカーに限定されない）を指標として前記肥大化能を有する軟骨細胞を提供し得る。
【００８６】
他の好ましい実施形態において、Ａ）工程は、肥大化を指標として前記肥大化能を有する軟骨細胞を提供し得る。肥大化は、例えば、５×１０５個の該細胞を含むＨａｍＦ１２増殖培地を遠心することにより、細胞のペレットを作製し、この細胞ペレットをそのまま培養することによって、顕微鏡下に確認され得る。
【００８７】
本明細書において使用される場合、「ＨａｍＦ１２増殖培地」とは、１０％のウシ胎児血清を補充し、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンと、０．１ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシンと、０．２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢとを含むＨａｍＦ１２培地をいう。
【００８８】
本明細書において使用される場合、「ＭＥＭ増殖培地」とは、１５％のウシ胎児血清を補充し、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンと、０．１ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシンと、０．２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢとを含むＭＥＭ培地をいう。
【００８９】
本発明において、肥大化能を有する軟骨細胞の培養は上述のようにして分離または誘導された細胞を用いて行われる。本発明の肥大化能を有する軟骨細胞は、生体に対して生体適合性を有する足場の表面で培養されてもよく、足場に内部孔が存在する場合には、内部孔内で培養されてもよい。肥大化能を有する軟骨細胞の細胞密度は、例えば、１×１０７細胞／ｍｌ〜１×１０４細胞／ｍｌの細胞密度に調整されるが、１×１０４細胞／ｍｌ未満または１×１０７細胞／ｍｌより多くてもよい。１×１０４細胞／ｍｌ未満のときは、培養器で肥大化能を有する軟骨細胞を増殖させ得るからである。本発明の肥大化能を有する軟骨細胞が、１×１０７細胞／ｍｌより多い場合には、そのまま使用することが可能であるが、必要に応じて、より広い足場へ播種するか、または培地を用いて適切な濃度に希釈され得る。本発明の１つの実施形態において、肥大化能を有する軟骨細胞の細胞密度は、例えば、０．５〜１×１０６／ｃｍ３（ｍｌ）、１×１０５／ｃｍ３（ｍｌ）であり得る。本発明の別の実施形態において、肥大化能を有する軟骨細胞は、４×１０４／ｃｍ３（ｍｌ）であり得る。
【００９０】
本発明において使用される培地は、肥大化能を有する軟骨細胞が増殖する限りどのような培地であってもよいが、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（ＨａｍＦ１２）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、最小必須培地α（αＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、フィットン−ジャクソン改変培地（ＢＧＪｂ）またはそれらの組み合わせのような培地が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９１】
他の実施形態において、本方法において肥大化能を有する軟骨細胞の培養に用いられる培地は、細胞の増殖、分化、またはその両方を促進する物質を含んでいてもよい。例えば、このような物質としては、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分のような物質を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９２】
他の好ましい実施形態において、肥大化能を有する軟骨細胞は、どのような部位から採取された細胞であってもよく、例えば、このような部位としては、肋骨の骨軟骨移行部、長管骨の骨端線部（例えば、大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨および橈骨）、脊椎骨の骨端線部、小骨の成長軟骨帯（例えば、手骨、足骨または胸骨）、軟骨膜または胎児の軟骨から形成された骨原基部、骨折治癒時の仮骨部、ならびに骨増殖期の軟骨部のような部位から採取され得る。
【００９３】
本方法において用いられる生体に対して生体適合性を有する足場は、上述の通り、生体適合性を有する限りどのような足場であってもよい。
【００９４】
本発明において使用される場合、細胞が足場に「定着する」とは、細胞を足場に播種した場合に、足場と細胞との一体性が保持されている状態をいう。細胞が足場に定着したことは、細胞をある環境（培地など）の足場に播種し、細胞が播種された足場を別の環境（例えば、別の培地）に移動させた場合に、播種された細胞と足場との一体性が保持されることを確認することによって確認され得る。別の環境とは、例えば、培養していた培地と同じ培地の入った容器であってもよい。移植適合性を調べる場合は、別の環境は、移植される環境を採用することが好ましいが、これに限定されない。
【００９５】
本方法において、肥大化能を有する軟骨細胞を生体に対して生体適合性を有する足場上で培養する期間は、この肥大化能を有する軟骨細胞が足場に定着するのに十分な期間であり得る。この期間は、好ましくは、３時間〜３ヶ月であるが、これに限定されない。より好ましくは、３時間〜３週間、さらにより好ましくは、肥大化能を有する軟骨細胞の培養時間は、半日〜１週間である。肥大化能を有する軟骨細胞の培養時間は、３時間未満であってもよい。なぜなら、肥大化能を有する軟骨細胞は少なくとも１時間で生体適合性を有する足場に付着し得るからである。肥大化能を有する軟骨細胞の培養期間はまた、３ヶ月を超えてもよい。なぜなら肥大化能を有する軟骨細胞が増殖しすぎた場合は、より広い足場へ播種するか、または肥大化能を有する軟骨細胞の細胞密度を再度調整し得るであるからである。
【００９６】
他の好ましい実施形態において、肥大化能を有する軟骨細胞は、Ｂ）工程において、細胞の増殖、分化、またはその両方を促進する物質を含む培地中で培養され得る。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、肥大化能を有する軟骨細胞は、Ｂ）工程おいて、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、アスコルビン酸、デキサメサゾン、グリセロリン酸、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む培地中で培養され得る。
【００９８】
（キット）
別の局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するための複合材料キットを提供する。このキットは、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞と該生体に対して生体適合性を有する足場とを含む複合材料、およびＢ）送達手段を備える。本発明のキットにおいて使用される複合材料は、上述の（複合材料）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００９９】
（複合材料の使用）
他の局面において、本発明は、生体内の骨形成を促進または誘発するためのインプラントおよび骨補填材料の製造における、複合材料の使用を提供する。ここで複合材料は、Ａ）肥大化能を有する軟骨細胞、およびＢ）該生体に対して生体適合性を有する足場を含む。本発明の複合材料の使用に用いられる肥大化能を有する軟骨細胞および生体に対して生体適合性を有する足場は、上述の（複合材料）に記載される任意の形態が使用され得る。
【０１００】
（処置方法）
別の局面において、本発明は、骨の欠損部位を修復するための方法を提供する。この方法は、肥大化能を有する軟骨細胞と該生体に対して生体適合性を有する足場とを含む複合材料を、該骨の欠損部位に移植する工程を包含する。骨の欠損部位は、固定のみでは修復できない大きさを有する大きさの欠損部位であってもよい。この方法において用いられる移植方法としては、手術時に目視下に骨の欠損部位に埋入する方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の処置方法において用いられる複合材料は、上述の（複合材料）に記載される任意の形態が使用され得る。例えば、本願発明の複合材料は、人工関節のような移植物、プレート、ケージ、釘、ピンなどの医療用デバイスとともに生体内に移植され得る。
【０１０１】
（肥大化能を有する軟骨細胞を調製する方法）
別の局面において、本発明は、肥大化能を有する軟骨細胞を調製する方法を提供する。この方法は、胸骨体下部の剣状突起移行部から細胞を採取する工程を包含する。本発明において「胸骨体下部の剣状突起移行部」とは、胸骨体下部（骨部）から剣状突起（軟骨部、剣状軟骨ともいう）に移行する境界部分をいう（図１Ａ）。従来、胸骨には成長軟骨細胞が存在すると考えられていたが、その採取は行われていなかった。本発明者は、「胸骨体下部の剣状突起移行部」に成長軟骨細胞（肥大化した軟骨細胞）が存在していることを確認し（図１Ｂ）、容易に採取できることを見出した。従って、本発明は成長軟骨細胞を調製する新しい方法を提供する。本発明者は、「胸骨体下部の剣状突起移行部」は、従来の成長軟骨細胞の供給源である肋骨・肋軟骨部と同等量もしくはそれ以上量の成長軟骨細胞が存在すること、および容易に採取できることを見出した。
【０１０２】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１０３】
（実施例１：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
４週齢〜８週齢の雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺した。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋骨・肋軟骨部を採取した。この肋骨・肋軟骨部の境界部分より半透明の成長軟骨部を採取した。この成長軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中で、３７℃で１時間攪拌した。Ｄ−ＰＢＳの組成は、ＫＣｌ  ０．２０ｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４  ０．２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ８．００ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．１６ｇ／Ｌである。次いで、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）を含むＨａｍＦ１２増殖培地（１０％のウシ胎児血清を補充し、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンと、０．１ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシンと、０．２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢとを含むＨａｍＦ１２培地とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。翌日、得られた細胞懸濁液を濾過し、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
【０１０４】
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
【０１０５】
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例１によって得られた細胞は、分離の際に使用した酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ）によって障害を受けているので、培養によって障害を回復させ、肥大化能を有する軟骨細胞を、軟骨細胞マーカーの発現、および顕微鏡下で形態学的な肥大化を確認することによって同定する。
【０１０６】
（肥大化能を有する軟骨細胞特異的マーカーの発現）
上記の操作により得られた細胞の溶解物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理する。ＳＤＳ処理した溶液をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動する。その後、転写用膜にブロッティング（ウェスタンブロティング）し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはイソチオシアン酸フルオレッセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
【０１０７】
上記の操作により得られた細胞培養物を、１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、軟骨細胞マーカーに対する一次抗体を反応させて、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコシダーゼなどの酵素またはＦＩＴＣ、ＰＥ、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ローダミンなどの蛍光を標識した二次抗体で検出する。
【０１０８】
（軟骨細胞の肥大化能に関する組織学的検索）
５×１０５個の細胞を含む、ＨａｍＦ１２増殖培地を遠心することにより細胞のペレットを作製した。この細胞ペレットを一定期間培養し、１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、パラフィン包埋した。薄切標本を作製し、ヘマトキシリン‐エオシン染色（ＨＥ染色）した。顕微鏡下に確認した培養前の細胞の大きさと培養後の細胞の大きさを比較した。有意な成長が確認されたときに、細胞を肥大化能を有すると判定した（図１Ｃ）。
【０１０９】
（マーカー遺伝子による分析）
本実施例で得られた肥大化能を有する軟骨細胞について、肥大化能を有する軟骨細胞のマーカーであるＸ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、ＩＩ型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンのｍＲＮＡ量について分析する。各ｍＲＮＡは、下記のようにリアルタイムＰＣＲにより検出する。
【０１１０】
（リアルタイムＰＣＲ）
試料として、本実施例により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、ＨａｍＦ１２増殖培地中のヒドロキシアパタイトに１×１０６細胞／ｍｌで播種し、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養する。対象として軟骨細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を用いる。これらの試料から全ＲＮＡを抽出する。
【０１１１】
これらの試料を粉砕用セルに入れて液体窒素をかけ、粉砕機で粉砕し、２．０ｍｌのチューブに入れる。このチューブに、ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬）を１ｍｌ入れ、Ｖｏｒｔｅｘで撹拌し、ポリトロンで均一になるまで破砕する。チューブを、室温、１０分放置した後、クロロホルム０．２ｍｌを加えて、激しくＶｏｒｔｅｘする。さらに、４℃、５分放置した後、１２，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心する。チューブから水相を採取し、イソプロパノール０．６  ｍｌを加えてＶｏｒｔｅｘする。室温、１０分放置した後、−３０℃に１晩静置する。翌日、１２，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心した後、上清を除き、乾燥させ、７５％エタノール１ｍｌで洗浄して全ＲＮＡを得る。
【０１１２】
全ＲＮＡからＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてｃＤＮＡを合成する。Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、II型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンのそれぞれについて発現定量試薬をアプライドバイオシステムズ社に発注したものを用いる。次いで、上記ｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、II型コラーゲン、軟骨型プロテオグリカンの発現を、Ｔａｑｍａｎアッセイ法（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社））を用いて確認する。
【０１１３】
リアルタイムＰＣＲ反応液（２５μＬの２×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、２．５μＬの２０×Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ、２１．５μＬのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ、１μＬのテンプレートｃＤＮＡ）を調製し、９６ウェル反応プレートに分注する。次いで、ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を使用して、５０℃で２分、および９５℃で１０分の後、９５℃で１５秒、および６０℃、１分を４０サイクルでＰＣＲを行う。次いで、リアルタイムＰＣＲ機器（ＡＢＩ社、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）にて測定を行う。ＰＣＲ反応後、しきい値の設定および到達サイクルの算出を、機器（ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ）内蔵の解析ソフトにより実施する。
【０１１４】
（結果）
肥大化能を有する軟骨細胞において、軟骨細胞マーカーであるＩＩ型コラーゲンおよび軟骨型プロテオグリカンが発現しており、肥大化軟骨マーカーであるＸ型コラーゲンおよびアルカリホスファターゼの発現は、対照とした軟骨細胞でのこれらの発現よりも有意に高いことが確認される。
【０１１５】
（肥大化能を有する軟骨細胞の存在の確認）
肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを確認するために、以下の実験を行った。肥大化能を有する軟骨細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、気孔率８５％円盤状ヒドロキシアパタイト（直径５ｍｍ）７個／２４ウェルプレート上に播種し（円盤状ヒドロキシアパタイト１個あたり、１．４３×１０５細胞）、ＨａｍＦ１２増殖培地中で３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で、３時間、１日間、３日間、または１週間培養した。次いで、この試料（細胞を播種したヒドロキシアパタイト）を、アルカリホスファターゼ染色した後、１０％中性ホルマリン緩衝液で固定し、トルイジン青染色した。アルカリホスファターゼ染色は、試料を、６０％アセトン／クエン酸バッファー中に３０秒浸漬して固定し、水洗後、アルカリホスファターゼ染色液（２ｍｌの０．２５％ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸アルカリ溶液（シグマアルドリッチ社）＋４８ｍｌの０．０２５％ファーストバイオレットＢ塩溶液（シグマアルドリッチ社））とともに、室温、遮光下で３０分間インキュベートすることにより行った。トルイジン青染色は、トルイジン青染色液（０．０５％トルイジン青溶液、ｐＨ７．０、和光純薬工業）とともに室温、３〜１０分間インキュベートすることにより行った。アルカリホスファターゼ染色では、すべての培養期間において、試料は、赤く斑点状に染まった（図２Ａ〜Ｄを参照のこと）。トルイジン青では、すべての培養期間において、同一部分が青く斑点状に染まり、細胞が存在することが分かる（図２Ｅ〜Ｈを参照のこと）。従って、ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞がアルカリホスファターゼ活性を有することが分かった。
【０１１６】
（結果）
本実施例によって得られた細胞は、軟骨細胞マーカーを発現しており、形態学的には肥大化していることを確認した。このことにより、本実施例１によって得られた細胞は、肥大化能を有する軟骨細胞であることが確認された。この細胞を以下の実験に用いた。
【０１１７】
（肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本実施例により得られた肥大化能を有する軟骨細胞に、ＨａｍＦ１２増殖培地を加えて１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。この細胞液を、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイトのそれぞれに均一に播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した。
【０１１８】
これらの培養物を、ラットの皮下に移植した。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認した。ゼラチン（図３Ａ）、コラーゲン（図３Ｂ）およびヒドロキシアパタイト（図３Ｃ）の全ての生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察された。
【０１１９】
（比較例１Ａ：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞のペレットを皮下に移植した場合の効果）
（肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞ペレットの調製）
実施例１と同様の方法により、肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を採取した。これらの細胞（５×１０５個）に、ＨａｍＦ１２増殖培地を加えて５×１０５個／０．５ｍｌに希釈した。この細胞液を、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）して肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを調製した。
【０１２０】
この肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを、ラットの皮下に移植した。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認した。肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを移植した場合には、わずかに骨形成が観察されるが、その骨形成の範囲は、肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を移植した場合（実施例１を参照のこと）よりも、はるかに小さかった。
【０１２１】
（比較例１Ｂ：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞単独を皮下に移植した場合の効果）
実施例１と同様の方法により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を単独でラットの皮下に移植した。肥大化能を有する軟骨細胞を単独で移植した場合、骨形成は生じなかった。
【０１２２】
（比較例１Ｃ：ヒドロキシアパタイト単独を皮下に移植した場合の効果）
実施例１と同じ方法により、足場であるヒドロキシアパタイトを単独でラットの皮下に移植した。ヒドロキシアパタイトを単独で移植した場合、骨形成は生じなかった（図４）を参照のこと。
【０１２３】
（実施例１および比較例１Ａ〜１Ｃのまとめ）
肥大化能を有する軟骨細胞と生体適合性足場とを含む複合材料をラット皮下に移植した場合の骨形成は、ペレット状にした肥大化能を有する軟骨細胞単独を移植した場合よりも大きかった。一方、肥大化能を有する軟骨細胞またはヒドロキシアパタイトを単独で移植した場合、骨形成は生じなかった。この結果から、本発明の複合材料を使用した場合、従来の複合材料では治療できなかったほどの大きさの骨欠損を治療可能であると考えられる。
【０１２４】
（実施例２：胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（胸骨からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
４週齢〜８週齢の雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺した。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、胸骨から胸骨体下部の剣状突起移行部および他の部位を無菌的に採取した。この剣状突起移行部より半透明の成長軟骨部を採取した。これらの組織を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収し、その後０．２％コラゲナーゼ／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ／ＨａｍＦ１２増殖培地とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの１晩処理を省く場合もある。翌日、この細胞懸濁液を濾過し、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収した。細胞を、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
【０１２５】
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
【０１２６】
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例１と同様の方法を使用して、採取した細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であることを確認した（図５Ａ）。胸骨の成長軟骨部以外の部位から採取した細胞は、肥大化能を有さなかった（図５Ｂ）。
【０１２７】
（胸骨から採取した肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本実施例により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を用いて、実施例１に記載の方法により、複合材料を調製し、ラットの皮下に移植する。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０１２８】
（比較例２Ａ：胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞のペレットを皮下に移植した場合の効果）
（胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞ペレットの調製）
実施例２と同様の方法により、胸骨から肥大化能を有する軟骨細胞を採取する。これらの細胞（５×１０５個）に、ＨａｍＦ１２増殖培地を加えて５×１０５個／０．５ｍｌに希釈する。この細胞液を、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）して肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを調製する。
【０１２９】
この肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを、ラットの皮下に移植する。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを移植した場合には、わずかに骨形成が観察されるが、その骨形成の範囲は、胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を移植した場合（実施例２を参照のこと）よりも、はるかに小さい。
【０１３０】
（比較例２Ｂ：胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞単独を皮下に移植した場合の効果）
実施例２と同様の方法により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、単独でラットの皮下に移植する。肥大化能を有する軟骨細胞を単独で移植した場合、骨形成は生じない。
【０１３１】
（実施例２ならびに比較例２Ａ、２Ｂおよび１Ｃのまとめ）
肥大化能を有する軟骨細胞と生体適合性足場とを含む複合材料をラット皮下に移植した場合の骨形成は、ペレット状にした肥大化能を有する軟骨細胞単独を移植した場合よりも大きい。一方、肥大化能を有する軟骨細胞またはヒドロキシアパタイトを単独で移植した場合、骨形成は生じない（比較例１Ｃを参照のこと）。この結果から、本発明の複合材料を使用した場合、従来の複合材料では治療できなかったほどの大きさの骨欠損を治療可能であると考えられる。
【０１３２】
（比較例３Ａ：耳介軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（耳介軟骨部からの肥大化能を有さない軟骨細胞の調製）
４週齢〜８週齢の雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺する。ラットをヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒する。耳介軟骨周囲を切開し、無菌的に皮膚を除去して耳介軟骨部を採取する。この耳介軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ中で、３７℃で１時間攪拌する。次いで、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収し、その後０．２％コラゲナーゼ／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌する。遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ／ＨａｍＦ１２増殖培地とともに、３７℃にて、１晩攪拌する。０．２％ディスパーゼでの１晩処理を省く場合もある。翌日、この細胞懸濁液を濾過し、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収する。細胞を、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントする。
【０１３３】
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とする。
【０１３４】
（耳介軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）
耳介軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを、実施例１と同様の手順を用いて確認する。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらない。トルイジン青染色では、その試料は青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認される。ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞にはアルカリホスファターゼ活性がないことが確認される。このことにより、本比較例で使用する細胞液には、肥大化能を有さない軟骨細胞が存在することが確認される。
【０１３５】
実施例１と同様の方法を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であることを確認する。
【０１３６】
（耳介軟骨部から採取した肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた肥大化能を有さない軟骨細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、ラットの皮下に移植する。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じない。
【０１３７】
（比較例３Ｂ：関節軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（関節軟骨からの肥大化能を有さない軟骨細胞の調製）
４週齢〜８週齢の雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺した。ラットの膝関節周囲をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。膝関節部を切開し、無菌的に関節軟骨を採取した。この関節軟骨を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収し、その後０．２％コラゲナーゼ／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ／ＨａｍＦ１２増殖培地とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの１晩処理を省く場合もある。翌日、この細胞懸濁液を濾過し、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収した。細胞を、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
【０１３８】
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
【０１３９】
（関節軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の確認）
関節軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを、実施例１と同様の手順を用いて確認した。肥大化能を有さない軟骨細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、気孔率８５％円盤状ヒドロキシアパタイト（直径５ｍｍ）７個／２４ウェルプレート上に播種し（円盤状ヒドロキシアパタイト１個あたり、１．４３×１０５細胞）、ＨａｍＦ１２増殖培地中で３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらなかった。トルイジン青染色では、その試料は青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された（図６Ａを参照のこと）。ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞にはアルカリホスファターゼ活性がないことが確認された（図６Ｂを参照のこと）。このことにより、本比較例で使用する細胞液には、肥大化能を有さない軟骨細胞が存在することが確認された。
【０１４０】
実施例１と同様の方法を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であることを確認する。
【０１４１】
（関節軟骨部から採取した肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた肥大化能を有さない軟骨細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、ラットの皮下に移植する。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じない。
【０１４２】
（比較例３Ｃ：肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（肋軟骨からの肥大化能を有さない静止軟骨細胞の調製）
４週齢〜８週齢の雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）をクロロホルムを使用して屠殺した。ラットの胸部をバリカンで剃毛し、ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒した。胸部を切開し、無菌的に肋軟骨部を採取した。この肋軟骨部分より不透明の静止軟骨部を採取した。この静止軟骨部を細切し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ／Ｄ−ＰＢＳ中で、３７℃で１時間攪拌した。次いで、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）で３分間）により洗浄および回収し、その後０．２％コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ：インビトロジェン社製）／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、２．５時間攪拌した。遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）で３分間）により洗浄および回収した後、攪拌用フラスコ中で０．２％ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ：インビトロジェン社製）／ＨａｍＦ１２増殖培地とともに、３７℃にて、１晩攪拌した。０．２％ディスパーゼでの１晩処理を除く場合もある。翌日、得られた細胞を濾過し、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）で３分間）により洗浄および回収した。細胞をトリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントした。
【０１４３】
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とした。
【０１４４】
（肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞の確認）
肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞を希釈した細胞液に、肥大化能を有する軟骨細胞が存在するか否かを、実施例１と同様の手順を用いて確認した。静止軟骨細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、気孔率８５％円盤状ヒドロキシアパタイト（直径５ｍｍ）７個／２４ウェルプレート上に播種し（円盤状ヒドロキシアパタイト１個あたり、１．４３×１０５細胞）、ＨａｍＦ１２増殖培地中で３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で、３時間、１日間、３日間、または１週間培養した。アルカリホスファターゼ染色では、いずれの試料も染まらなかった。トルイジン青染色では、それらの試料は青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された（図７Ａ〜７Ｄを参照のこと）。ヒドロキシアパタイト上に存在する細胞にはアルカリホスファターゼ活性がないことが確認された（図７Ｅ〜７Ｈを参照のこと）。このことにより、本比較例で使用する細胞液には、肥大化能を有さない軟骨細胞が存在することが確認された。
【０１４５】
実施例１と同様の方法を使用して軟骨細胞マーカーの局在または発現を検出し、形態学的にも検索して、得られた細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であることを確認した（図８）。
【０１４６】
（肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた肥大化能を有さない静止軟骨細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、ラットの皮下に移植する。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じない。
【０１４７】
（比較例４：骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（骨芽細胞の調製）
雄性ラット（Ｗｉｓｔａｒ系）新生仔をクロロホルムを使用して屠殺する。ヒビテン液（１０倍希釈）に全身を浸し消毒する。頭蓋を切開し、頭蓋骨を採取する。この頭蓋骨を細切し、０．２％コラゲナーゼ／Ｄ−ＰＢＳとともに３７℃で、１．５時間攪拌する。この細胞懸濁液を濾過し、遠心分離（１０００ｒｐｍ（１７０×ｇ）×５分間）により洗浄および回収して細胞を単離する。細胞を、トリパンブルーにより染色し、顕微鏡を用いて細胞数をカウントする。
【０１４８】
評価は、呈色しなかった細胞を生細胞とし、青色に呈色した細胞を死細胞とする。
【０１４９】
（骨芽細胞の確認）
マーカーとして骨芽細胞に対するマーカーを使用すること、および培地としてＭＥＭ増殖培地を使用すること以外、実施例１と同様の方法を使用して、骨芽細胞であることを確認する。
【０１５０】
（骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた骨芽細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、ラットの皮下に移植する。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。骨芽細胞と、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場とを用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。その骨形成を、肋骨・肋軟骨部および胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を移植した場合（実施例１および２を参照のこと）と比較することにより、肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料が、骨芽細胞の場合より優れた骨形成能力を有することが示される。
【０１５１】
（比較例５：間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（間葉系幹細胞の調製）
検体として４〜８週齢ラットを用いる。ラットを屠殺し、大腿骨を無菌的に採取し、両断を切断して、ＭＥＭ増殖培地で骨髄内を洗浄および回収する。洗い出された骨髄細胞を７５ｃｍ２の培養フラスコ（Ｔ−７５）に播種する。５％  ＣＯ２、３７℃で１週間〜１０日間培養した後、培養器に接着した細胞を骨髄由来の間葉系幹細胞として以下の実験に用いる。
【０１５２】
（間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた間葉系幹細胞とＭＥＭ増殖培地を用いること以外、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製する。さらに、この複合材料をＭＥＭ分化培地（基礎培地を含み、かつグルココルチコイド、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸からなる群より選択される従来型骨芽細胞分化誘導成分の少なくとも１つを含んでいる培地）中で５％  ＣＯ２、３７℃で２週間培養し、生体適合性を有する足場に存在する間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導させる。分化誘導された骨芽細胞とヒドロキシアパタイトを用いる複合材料を、ラットの皮下に移植する。この２週間の間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導操作を省き、生体適合性を有する足場に間葉系幹細胞が存在する複合材料も移植に用いる。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。間葉系幹細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は観察されない。間葉系幹細胞から誘導された骨芽細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。その骨形成を、肥大化能を有する軟骨細胞（肋骨・肋軟骨部由来および胸骨由来）および生体適合性足場を用いる複合材料の各々を移植した場合（実施例１および２を参照のこと）と比較することにより、肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料が、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞から分化誘導させた骨芽細胞の場合より優れた骨形成能力を有することが示される。
【０１５３】
（比較例３〜５のまとめ）
肥大化能を有さない軟骨細胞（耳介軟骨部由来、関節軟骨部由来および肋軟骨部由来）と生体適合性足場を含む複合材料、ならびに間葉系幹細胞と生体適合性足場を含む複合材料の各々をラット皮下に移植した場合、骨形成が生じないことが確認される。一方、骨芽細胞または間葉系幹細胞から分化誘導させた骨芽細胞と、生体適合性足場とを含む複合材料をラット皮下に移植した場合、骨形成はわずかに観察される。その骨形成を、肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を移植した場合と比較することにより、肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料が、骨芽細胞または間葉系幹細胞から分化誘導させた骨芽細胞の場合より優れた骨形成能力を有することが示される。
【０１５４】
（実施例３：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
（肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製および確認）
実施例１と同じ方法を用いて肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を調製した。
【０１５５】
（骨の欠損部位の作製）
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラットを麻酔し、無菌的に大腿骨または脛骨の皮膚を切開し、軟部組織を一方にそらせて、大腿骨または脛骨の骨欠損作製部位を露出させた。あるいは、頭蓋骨の皮膚を切開し、頭蓋骨の骨欠損作製部位を露出させた。歯科用穿孔器にトレフィンバールまたはディスクを装着し、穿孔骨欠損または離断骨欠損を作製した。この作製した骨の欠損部位に上記で調製した複合材料を移植した。移植の４、１２週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認した。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察された。
【０１５６】
（比較例６Ａ：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞のペレットを骨の欠損部位に移植した場合の効果）
（肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞ペレットの調製）
比較例１Ａと同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを調製し、ラットの骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後に移植部位の状態を確認する。肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを骨の欠損部位に移植した場合には、わずかに骨形成が観察されるが、その骨形成の範囲は、肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合（実施例３を参照のこと）よりも、はるかに小さい。
【０１５７】
（比較例６Ｂ：肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞単独を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
実施例１と同様の方法により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を単独でラットの骨の欠損部位に移植する。肥大化能を有する軟骨細胞を単独で骨の欠損部位に移植した場合、骨形成は生じない。
【０１５８】
（比較例６Ｃ：ヒドロキシアパタイト単独を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
実施例３と同様の方法と同じ方法を用いて、足場であるヒドロキシアパタイトを単独でラットの骨の欠損部位に移植した。ヒドロキシアパタイトを単独で移植した場合、骨形成は移植片周辺部にわずかに生じた。
【０１５９】
（実施例４：胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
実施例２と同様の方法により得られた胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、ラットの骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０１６０】
（比較例７Ａ：胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞のペレットを骨の欠損部位に移植した場合の効果）
比較例２Ａと同様の方法により、肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを調製し、ラットの骨の欠損部位に移植する。移植４、１２週間後に移植部位の状態を確認する。胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞ペレットを骨の欠損部位に移植した場合には、わずかに骨形成が観察されるが、その骨形成の範囲は、胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合（実施例４を参照のこと）よりも、はるかに小さい。
【０１６１】
（比較例７Ｂ：胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞単独を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
実施例２により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を、単独でラットの骨の欠損部位に移植する。肥大化能を有する軟骨細胞を単独で移植した場合、骨形成は生じない。
【０１６２】
（比較例８Ａ：耳介軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
比較例３Ａにより得られた耳介軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、ラットの骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチンおよびコラーゲン各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じなく、ヒドロキシアパタイトの生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は移植片周辺部にわずかに生じるのみである。
【０１６３】
（比較例８Ｂ：関節軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
比較例３Ｂにより得られた関節軟骨由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、ラットの骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチンおよびコラーゲン各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じなく、ヒドロキシアパタイトの生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は移植片周辺部にわずかに生じるのみである。
【０１６４】
（比較例８Ｃ：肋軟骨由来の静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
比較例３Ｃにより得られた肋軟骨由来の静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、ラットの骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチンおよびコラーゲン各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じなく、ヒドロキシアパタイトの生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は移植片周辺部にわずかに生じた。
【０１６５】
（比較例９：骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
比較例４により得られた骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、ラットの骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。その骨形成を、肋骨・肋軟骨部および胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を移植した場合（実施例３および４を参照のこと）と比較することにより、肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料が、骨芽細胞の場合より優れた骨形成能力を有することが示される。
【０１６６】
（比較例１０：間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の骨形成率および骨形成量の比較）
比較例５により得られた間葉系幹細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料、または間葉系幹細胞から分化誘導させた骨芽細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料を、各々ラットの骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、間葉系幹細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料を移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。間葉系幹細胞から分化誘導させた骨芽細胞と生体適合性足場とを移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。その骨形成を、肋骨・肋軟骨部および胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を移植した場合（実施例３および４を参照のこと）と比較することにより、肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料が、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞から分化誘導させた骨芽細胞の場合より優れた骨形成能力を有することが示される。
【０１６７】
（実施例３〜４および比較例６Ａ〜１０のまとめ）
肥大化能を有する軟骨細胞と生体適合性足場とを含む複合材料をラット骨の欠損部位に移植した場合の骨形成は、ペレット状にした肥大化能を有する軟骨細胞単独を移植した場合よりも大きい。一方、肥大化能を有する軟骨細胞を単独で移植した場合、骨形成は生じない。ヒドロキシアパタイトを単独で移植した場合、骨形成は移植片周辺部にわずかに生じるのみである。これらの結果は、皮下試験の結果（実施例１〜２および比較例１Ａ〜２Ｂ）における複合材料と単独材料とを対比したときの傾向とほぼ同様である。さらに、耳介軟骨部、関節軟骨部または静止軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞と、生体適合性足場とを用いる複合材料を骨の欠損部位に移植する場合、ならびに骨芽細胞、間葉系幹細胞から分化誘導させた骨芽細胞または間葉系幹細胞と生体適合性足場とを用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、いずれの場合にも骨の欠損部位に骨形成がわずかに観察されることが確認される。
【０１６８】
（実施例５：肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の骨形成率および骨形成量）
（骨の欠損部位の作製ならびに骨形成率および骨形成量の測定）
骨形成の観察された実施例１の複合材料を骨の欠損部位に移植した場合について、骨形成率および骨形成量を、マイクロＣＴ（株式会社東陽テクニカ、スカイスキャン１１７２）を用いて測定した。生体適合性足場としてヒドロキシアパタイトを用いた。実施例１と同様の方法により得られた肥大化能を有する軟骨細胞とヒドロキシアパタイトの複合材料（直径４ｍｍ×厚さ１ｍｍの円盤状）を、骨の欠損部位（直径４ｍｍ円孔の打抜き）に移植した。骨の欠損部位は、実施例３と同様の方法により作製した。移植の４、１２週間後に移植部位を摘出し、μＣＴデータを測定した（６５ｋＶ−１５４μＡ、８０ｋＶ−１２５μＡ、または１００ｋＶ−１００μＡ、ＡｌまたはＴｉフィルター、回転角度０．４度）。
【０１６９】
（骨形成率および骨形成量）
表２に示すように、肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４週間後に５．７８ｍｍ３の骨が新生された。新しく形成された骨の全体に占める割合は４５．９０％であった。
【０１７０】
（比較例１１：肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の骨形成率および骨形成量）
（骨の欠損部位の作製ならびに骨形成率および骨形成量の測定）
生体適合性足場としてヒドロキシアパタイトを用いた。比較例３Ｃと同様の方法により得られた肥大化能を有さない軟骨細胞とヒドロキシアパタイトの複合材料（直径４ｍｍ×厚さ１ｍｍの円盤状）を、骨の欠損部位（直径４ｍｍ円孔の打抜き）に移植した。骨の欠損部位は、実施例３と同様の方法により作製した。
【０１７１】
（骨形成率および骨形成量）
表２に示すように、肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４週間後に２．７４ｍｍ３の骨が新生された。新しく形成された骨の全体に占める割合は２４．１６％であった。骨形成率および骨形成量は、実施例５に記載される肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料と比べて低かった。
【０１７２】
（比較例１２：生体適合性足場単独を骨の欠損部位に移植した場合の骨形成率および骨形成量）
（骨の欠損部位の作製ならびに骨形成率および骨形成量の測定）
生体適合性材料としてヒドロキシアパタイトを用いた。ヒドロキシアパタイト（直径４ｍｍ×厚さ１ｍｍの円盤状）を、骨の欠損部位（直径４ｍｍ円孔の打抜き）に移植した。この骨の欠損部位は、実施例３と同様の方法により作製した。移植の４週間後に移植部位を摘出し、μＣＴデータを測定した（６５ｋＶ−１５４μＡ、８０ｋＶ−１２５μＡ、または１００ｋＶ−１００μＡ、ＡｌまたはＴｉフィルター、回転角度０．４度）。
【０１７３】
（骨形成率および骨形成量）
表２に示すように、ヒドロキシアパタイト単独を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４週間後に２．７２ｍｍ３の骨が新生された。新しく形成された骨の全体に占める割合は２９．４８％であった。骨形成率および骨形成量は、実施例５に記載される肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料と比べて低かった。
【０１７４】
（実施例５ならびに比較例１１および１２のまとめ）
骨の欠損部位に、肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を移植した場合、肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を移植したものと比べて、骨形成率は高く、骨形成量は多かった（図９、図１０および表２を参照のこと。）。骨の欠損部位に、肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を移植した場合、ヒドロキシアパタイト単独を移植したものと比べて、骨形成率は高く、骨形成量は多かった（図９、図１０および表２を参照のこと。）。骨の欠損部位に、肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を移植した場合と、ヒドロキシアパタイト単独を移植した場合とは、骨形成率および骨形成量に差異はなかった（図９、図１０および表２を参照のこと。）。
【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
Ｅｍｐｔｙ：ヒドロキシアパタイト単独を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成量（体積）と骨形成率（比率）。
ＧＣ：肥大化能を有する軟骨細胞（肋骨・肋軟骨部から採取した成長軟骨細胞）およびヒドロキシアパタイトと用いる複合材料を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成量（体積）と骨形成率（比率）。
ＲＣ：肥大化能を有さない軟骨細胞（肋軟骨部から採取した静止軟骨細胞）およびヒドロキシアパタイトと用いる複合材料を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成量（体積）と骨形成率（比率）。
【０１７７】
（比較例１３：骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の骨形成率および骨形成量）
（骨の欠損部位の作製ならびに骨形成率および骨形成量の測定）
生体適合性足場としてヒドロキシアパタイトを用いる。比較例４と同様の方法により得られた骨芽細胞とヒドロキシアパタイトの複合材料（直径４ｍｍ×厚さ１ｍｍの円盤状）を、骨の欠損部位（直径４ｍｍ円孔の打抜き）に移植する。骨の欠損部位は、実施例３と同様の方法により作製する。移植の４、１２週間後に移植部位を摘出し、μＣＴデータを測定する（６５ｋＶ−１５４μＡ、８０ｋＶ−１２５μＡ、または１００ｋＶ−１００μＡ、ＡｌまたはＴｉフィルター、回転角度０．４度）。
【０１７８】
（骨形成率および骨形成量）
骨芽細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨はわずかに新生される。新しく形成された骨の全体に占める割合は少ないことが確認される。骨形成率および骨形成量は、実施例５に記載される肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料と比べて低いことが確認される。
【０１７９】
（比較例１４：間葉系幹細胞もしくは間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の骨形成率および骨形成量）
（骨の欠損部位の作製ならびに骨形成率および骨形成量の測定）
生体適合性足場としてヒドロキシアパタイトを用いる。比較例５と同様の方法により得られた間葉系幹細胞もしくは間葉系幹細胞由来の骨芽細胞とヒドロキシアパタイトの複合材料（直径４ｍｍ×厚さ１ｍｍの円盤状）を、骨の欠損部位（直径４ｍｍ円孔の打抜き）に移植する。骨の欠損部位は、実施例３と同様の方法により作製する。移植の４、１２週間後に移植部位を摘出し、μＣＴデータを測定する（６５ｋＶ−１５４μＡ、８０ｋＶ−１２５μＡ、または１００ｋＶ−１００μＡ、ＡｌまたはＴｉフィルター、回転角度０．４度）。
【０１８０】
（骨形成率および骨形成量）
間葉系幹細胞もしくは間葉系幹細胞由来の骨芽細胞とヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨はわずかに新生される。新しく形成された骨の全体に占める割合は少ないことが確認される。骨形成率および骨形成量は、実施例５に記載される肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料と比べて低いことが確認される。
【０１８１】
（実施例６：肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料に対して、培養培地が与える影響）
（肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製および確認）
実施例１と同じ方法を用いて肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を調製した。
【０１８２】
（肋骨・肋軟骨部から採取した肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
実施例１により得られた肥大化能を有する軟骨細胞に、ＭＥＭ増殖培地を加えて１×１０６細胞／ｍｌに希釈した。この細胞懸濁液を、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイトのそれぞれに均一に播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した。
【０１８３】
これらの培養物を、ラットの皮下に移植する。移植の４週間後、ラットを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０１８４】
（実施例７：ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
多肢症、腫瘍、提供軟骨組織などのヒト組織由来の肥大化能を有する軟骨細胞を、ヒト組織資源活用機関（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの日本の機関、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＩＡＭ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの海外の機関、大日本住友製薬株式会社、三光純薬株式会社、東洋紡績株式会社、Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｏｓｉｒｉｓ社などの細胞提供業者）より入手する。入手した細胞をＨａｍＦ１２増殖培地に播種する。
【０１８５】
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例１と同様の方法を使用して、調製した細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であることを確認する。
【０１８６】
（ヒト由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本実施例により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を用いて、実施例１に記載の方法により、複合材料を調製し、免疫不全動物（ヌードマウスおよびヌードラットなど）の皮下に移植する。移植の４週間後、該動物を屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０１８７】
（肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本実施例より得られた肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０１８８】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生が確認される。
【０１８９】
（比較例１５Ａ：ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞の調製および確認）
多肢症、腫瘍、提供軟骨組織などのヒト組織由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を、ヒト組織資源活用機関（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの日本の機関、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＩＡＭ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの海外の機関、大日本住友製薬株式会社、三光純薬株式会社、東洋紡績株式会社、Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｏｓｉｒｉｓ社などの細胞提供業者）より入手する。入手した細胞をＨａｍＦ１２増殖培地に播種する。実施例１と同様の方法を使用して、調製した細胞が肥大化能を有さない軟骨細胞であることを確認する。
【０１９０】
（ヒト由来の肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた肥大化能を有さない軟骨細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、免疫不全動物（ヌードマウスおよびヌードラットなど）の皮下に移植する。移植の４週間後、該動物を屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じない。
【０１９１】
（肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチンおよびコラーゲン各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じなく、ヒドロキシアパタイトの生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は移植片周辺部にわずかに生じる。
【０１９２】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０１９３】
（比較例１５Ｂ：ヒト由来の骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（ヒト由来の骨芽細胞の調製および確認）
ヒト組織資源活用機関（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの日本の機関、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＩＡＭ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの海外の機関、大日本住友製薬株式会社、三光純薬株式会社、東洋紡績株式会社、Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｏｓｉｒｉｓ社などの細胞提供業者）よりヒト骨芽細胞を入手する。入手した細胞をＭＥＭ増殖培地に播種する。比較例４と同様の方法を使用して、調製した細胞が骨芽細胞であることを確認する。
【０１９４】
（ヒト由来の骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた骨芽細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、免疫不全動物（ヌードマウスおよびヌードラットなど）の皮下に移植する。移植の４週間後、該動物を屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成はわずかに生じる。
【０１９５】
（骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成はわずかに生じる。
【０１９６】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。骨芽細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０１９７】
（比較例１５Ｃ：ヒト由来の間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（ヒト由来の間葉系幹細胞の調製および確認）
ヒト組織資源活用機関（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク、東北大学加齢医学研究所などの日本の機関、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＩＡＭ）、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）などの海外の機関、大日本住友製薬株式会社、三光純薬株式会社、東洋紡績株式会社、Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｏｓｉｒｉｓ社などの細胞提供業者）よりヒト由来の間葉系幹細胞を入手する。入手した細胞をＨａｍＦ１２増殖培地に播種する。
【０１９８】
（ヒト由来の間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた間葉系幹細胞とＭＥＭ増殖培地を用いること以外、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製する。さらに、この複合材料をＭＥＭ分化培地中で５％  ＣＯ２、３７℃で２週間培養し、生体適合性を有する足場に存在する間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導させる。分化誘導された骨芽細胞とヒドロキシアパタイトの複合材料を、免疫不全動物（ヌードマウスおよびヌードラットなど）の皮下に移植する。この２週間の間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導操作を省き、生体適合性を有する足場に間葉系幹細胞が存在する複合材料も移植に用いる。移植の４週間後、該動物を屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。間葉系幹細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は観察されない。間葉系幹細胞から誘導された骨芽細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。
【０１９９】
（ヒト由来の間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料においてわずかに骨形成が観察される。
【０２００】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞とヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０２０１】
（実施例８：マウス肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製および確認）
検体としてマウスを用いる。実施例１と同様の方法により、マウスの肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を調製し、この調製した細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であることを確認する。
【０２０２】
（マウス肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本実施例により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を用いて、実施例１に記載の方法により、複合材料を調製し、マウスの皮下に移植する。移植の４週間後、マウスを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０２０３】
（肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本実施例より得られた肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０２０４】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生が確認される。
【０２０５】
（比較例１６Ａ：マウス肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（マウス肋軟骨からの静止軟骨細胞の調製および確認）
検体としてマウスを用いる。比較例３Ｃと同様の方法により静止軟骨細胞を調製し、この調製した細胞が肥大化能を有さない静止軟骨細胞であることを確認する。
【０２０６】
（マウス肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた肥大化能を有さない静止軟骨細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、マウスの皮下に移植する。移植の４週間後、マウスを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じない。
【０２０７】
（肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた肥大化能を有さない軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチンおよびコラーゲン各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じなく、ヒドロキシアパタイトの生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は移植片周辺部にわずかに生じる。
【０２０８】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０２０９】
（比較例１６Ｂ：マウス由来の骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（マウス由来の骨芽細胞の調製および確認）
検体としてマウスを用いる。比較例４と同様の方法を使用して、マウスから骨芽細胞を調製し、この調製した細胞が骨芽細胞であることを確認する。
【０２１０】
（マウス由来の骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた骨芽細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、マウスの皮下に移植する。移植の４週間後、マウスを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成はわずかに生じる。
【０２１１】
（マウス由来の骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料においてわずかに骨形成が観察される。
【０２１２】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。骨芽細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０２１３】
（比較例１６Ｃ：マウス由来の間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（マウス由来の間葉系幹細胞の調製および確認）
検体としてマウスを用いる。比較例５と同様の方法を使用して間葉系幹細胞を調製し、この調製した細胞が間葉系幹細胞であることを確認する。
【０２１４】
（マウス由来の間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた間葉系幹細胞とＭＥＭ増殖培地を用いること以外、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製する。さらに、この複合材料をＭＥＭ分化培地中で５％  ＣＯ２、３７℃で２週間培養し、生体適合性を有する足場に存在する間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導させる。分化誘導された骨芽細胞とヒドロキシアパタイトの複合材料を、マウスの皮下に移植する。この２週間の間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導操作を省き、生体適合性を有する足場に間葉系幹細胞が存在する複合材料も移植に用いる。移植の４週間後、マウスを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。間葉系幹細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は観察されない。間葉系幹細胞から誘導された骨芽細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。
【０２１５】
（間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料においてわずかに骨形成が観察される。
【０２１６】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞とヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０２１７】
（実施例９：ウサギ肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（肋骨・肋軟骨部からの肥大化能を有する軟骨細胞の調製）
検体としてウサギを用いる。実施例１と同様の方法により、ウサギの肋骨・肋軟骨部から肥大化能を有する軟骨細胞を調製する。
【０２１８】
（肥大化能を有する軟骨細胞の確認）
実施例１と同様の方法を使用して、調製した細胞が肥大化能を有する軟骨細胞であることを確認する。
【０２１９】
（ウサギ肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本実施例により得られた肥大化能を有する軟骨細胞を用いて、実施例１に記載の方法により、複合材料を調製し、ウサギの皮下に移植する。移植の４週間後、ウサギを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０２２０】
（肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本実施例より得られた肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成が観察される。
【０２２１】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生が確認される。
【０２２２】
（比較例１７Ａ：ウサギ肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（ウサギ肋軟骨からの肥大化能を有さない静止軟骨細胞の調製および確認）
検体としてウサギを用いる。比較例３Ｃと同様の方法により静止軟骨細胞を調製し、この調製した細胞が肥大化能を有さない静止軟骨細胞であることを確認する。
【０２２３】
（ウサギ肋軟骨由来の肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた肥大化能を有さない静止軟骨細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、ウサギの皮下に移植する。移植の４週間後、ウサギを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じない。
【０２２４】
（肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた肥大化能を有さない静止軟骨細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチンおよびコラーゲン各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は生じなく、ヒドロキシアパタイトの生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は移植片周辺部にわずかに生じる。
【０２２５】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０２２６】
（比較例１７Ｂ：ウサギ由来の骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（ウサギ由来の骨芽細胞の調製および確認）
検体としてウサギを用いる。比較例４と同様の方法を使用して、ウサギから骨芽細胞を調製し、この調製した細胞が骨芽細胞であることを確認する。
【０２２７】
（ウサギ由来の骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた骨芽細胞を用いて、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製し、ウサギの皮下に移植する。移植の４週間後、ウサギを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成はわずかに生じる。
【０２２８】
（骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた骨芽細胞および生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料においてわずかに骨形成が観察される。
【０２２９】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。骨芽細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０２３０】
（比較例１７Ｃ：ウサギ由来の間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合の効果）
（ウサギ由来の間葉系幹細胞の調製および確認）
検体としてウサギを用いる。比較例５と同様の方法を使用して間葉系幹細胞を調製し、この調製した細胞が間葉系幹細胞であることを確認する。
【０２３１】
（ウサギ由来の間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料の作製）
本比較例により得られた間葉系幹細胞とＭＥＭ増殖培地を用いること以外、実施例１と同様の方法を使用することにより、複合材料を調製する。さらに、この複合材料をＭＥＭ分化培地中で５％  ＣＯ２、３７℃で２週間培養し、生体適合性を有する足場に存在する間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化誘導させる。分化誘導された骨芽細胞とヒドロキシアパタイトの複合材料を、ウサギの皮下に移植する。この２週間の間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導操作を省き、生体適合性を有する足場に間葉系幹細胞が存在する複合材料も移植に用いる。移植の４週間後、ウサギを屠殺して移植部位を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋する。薄切標本を作製し、ＨＥ染色して移植部位の状態を確認する。間葉系幹細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成は観察されない。間葉系幹細胞から誘導された骨芽細胞と生体適合性を有する足場を用いる複合材料を皮下に移植した場合、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料において骨形成がわずかに観察される。
【０２３２】
（間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を骨の欠損部位に移植した場合の効果）
骨の欠損部位を、実施例３と同様の方法により作製する。本比較例より得られた間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞と生体適合性足場を用いる複合材料を、骨の欠損部位に移植する。移植の４、１２週間後、ゼラチン、コラーゲンおよびヒドロキシアパタイト各々の生体適合性を有する足場を用いる複合材料においてわずかに骨形成が観察される。
【０２３３】
（骨の欠損部位における骨形成率および骨形成量の測定）
移植部位における骨形成率および骨形成量を、実施例５と同じ方法によって測定する。間葉系幹細胞または間葉系幹細胞由来の骨芽細胞とヒドロキシアパタイトを用いた複合材料を骨の欠損部位に移植した場合、移植の４、１２週間後に骨の新生がわずかに確認される。
【０２３４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２３５】
本発明は、肥大化能を有する軟骨細胞および生体に対して生体適合性を有する足場を使用することによって足場と細胞との組み合わせとしては、予想外に骨形成が進展するという性質をもつ複合材料を提供することにより、実用的とは従来考えられていなかった足場と肥大化能を有する軟骨細胞との組み合わせが骨欠損に実用上耐え得るレベルで使用可能となり、従来人工物での移植処置の成績が不良であった部位の処置が可能になるという有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１Ａ】図１Ａは、胸骨体下部の剣状突起移行部を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞が肥大化した軟骨細胞が存在する成長軟骨層（中央部）、骨から構成される胸骨体部（右側）、肥大化していない軟骨細胞が存在する層（左側）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、肥大化能を有する軟骨細胞（肋骨・肋軟骨由来の成長軟骨細胞）５×１０５個を含むペレットを１週間培養した後の顕微鏡写真である。染色はＨＥ染色である。図８と比較すると、細胞が肥大化していることが観察できる。左下のバーは３０μｍ。
【図２Ａ】図２Ａは、肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で３時間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は赤く染まった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１日間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は赤く染まった。
【図２Ｃ】図２Ｃは、肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で３日間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は赤く染まった。
【図２Ｄ】図２Ｄは、肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は赤く染まった。
【図２Ｅ】図２Ｅは、図２Ａのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では同一部分が青く染まり、細胞が存在することが確認された。下段は、トルイジン青染色したヒドロキシアパタイトの断面図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、図２Ｂのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では同一部分が青く染まり、細胞が存在することが確認された。
【図２Ｇ】図２Ｇは、図２Ｃのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では同一部分が青く染まり、細胞が存在することが確認された。
【図２Ｈ】図２Ｈは、図２Ｄのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では同一部分が青く染まり、細胞が存在することが確認された。
【図３Ａ】図３Ａは、肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性を有する足場としてゼラチンを用いた場合の複合材料を移植したラット皮下移植部位の４週間後のＨＥ染色である。左下のバーは１００μｍ。
【図３Ｂ】図３Ｂは、肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性を有する足場としてコラーゲンを用いた場合の複合材料を移植したラット皮下移植部位の４週間後のＨＥ染色である。左下のバーは１００μｍ。
【図３Ｃ】図３Ｃは、肋骨・肋軟骨部由来の肥大化能を有する軟骨細胞および生体適合性を有する足場としてヒドロキシアパタイトを用いた場合の複合材料を移植したラット皮下移植部位の４週間後のＨＥ染色である。左下のバーは２００μｍ。
【図４】図４は、ヒドロキシアパタイト単独を移植したラット皮下移植部位の４週間後のＨＥ染色である。
【図５Ａ】図５Ａは、胸骨由来の肥大化能を有する軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は赤く染まった。
【図５Ｂ】図５Ｂは、胸骨の成長軟骨部以外の部位から採取した軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらなかった。
【図６Ａ】図６Ａは、関節軟骨部由来の肥大化能を有さない軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらなかった。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、試料は青く斑点状に染まり、細胞が存在することが確認された。
【図７Ａ】図７Ａは、肥大化能を有さない静止軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で３時間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらなかった。
【図７Ｂ】図７Ｂは、肥大化能を有さない静止軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１日間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらなかった。
【図７Ｃ】図７Ｃは、肥大化能を有さない静止軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で３日間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらなかった。
【図７Ｄ】図７Ｄは、肥大化能を有さない静止軟骨細胞を希釈した細胞液をヒドロキシアパタイトに播種し、アルカリホスファターゼ染色した結果を示す。１×１０６細胞／ｍｌでヒドロキシアパタイトに播種し、３７℃にて、５％  ＣＯ２インキュベーター中で１週間培養した後、アルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼ染色では、試料は染まらなかった。
【図７Ｅ】図７Ｅは、図７Ａのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、試料は青く染まり、細胞が存在することが確認された。
【図７Ｆ】図７Ｆは、図７Ｂのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、試料は青く染まり、細胞が存在することが確認された。
【図７Ｇ】図７Ｇは、図７Ｃのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、試料は青く染まり、細胞が存在することが確認された。
【図７Ｈ】図７Ｈは、図７Ｄのアルカリホスファターゼ染色した試料を、トルイジン青染色をした結果を示す。トルイジン青染色では、試料は青く染まり、細胞が存在することが確認された。
【図８】図８は、肥大化能を有さない軟骨細胞（肋軟骨由来の静止軟骨細胞）５×１０５個を含むペレットを１週間培養し、ＨＥ染色した顕微鏡写真である。図１と比較すると、細胞が肥大化していないことが観察された。左下のバーは３０μｍ。
【図９】図９は、骨の欠損部位に、肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料、肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料、またはヒドロキシアパタイト単独を移植した場合の骨形成率を示す。Ｅｍｐｔｙ：ヒドロキシアパタイト単独を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成率（比率）。ＧＣ：肥大化能を有する軟骨細胞（肋骨・肋軟骨部から採取した成長軟骨細胞）およびヒドロキシアパタイトと用いる複合材料を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成率（比率）。ＲＣ：肥大化能を有さない軟骨細胞（肋軟骨部から採取した静止軟骨細胞）およびヒドロキシアパタイトと用いる複合材料を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、骨形成率（比率）。
【図１０】図１０は、骨の欠損部位に、肥大化能を有する軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料、肥大化能を有さない軟骨細胞およびヒドロキシアパタイトを用いた複合材料、またはヒドロキシアパタイト単独を移植した場合の骨形成量を示す。Ｅｍｐｔｙ：ヒドロキシアパタイト単独を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成量（体積）。ＧＣ：肥大化能を有する軟骨細胞（肋骨・肋軟骨部から採取した成長軟骨細胞）およびヒドロキシアパタイトと用いる複合材料を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成量（体積）。ＲＣ：肥大化能を有さない軟骨細胞（肋軟骨部から採取した静止軟骨細胞）およびヒドロキシアパタイトと用いる複合材料を、ラット頭蓋骨の欠損部位に移植した場合の、４週後の骨形成量（体積）。
【図１Ａ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１Ｂ】
2006289062.tif 000007
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図８】
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