(57)【要約】【課題】  検体中の核酸を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において、短時間で効率よくコンタミネーションが発生しないように処理でき、かつ、小型化が可能な核酸分離精製方法を提供すること。【解決手段】  固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて固相に核酸を吸着及び脱着させる工程を含む、核酸の分離精製方法において、固相に核酸を吸着させる溶液がタンパク質分解酵素及びタンパク質分解酵素安定化剤を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）核酸を含む試料溶液を固相に通過させて、該固相内に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該固相に通過させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、及び
（３）回収液を該固相に通過させて、該固相内から核酸を脱着させる工程
を含有する核酸分離精製方法において、固相に核酸を吸着させる溶液がタンパク質分解酵素及びタンパク質分解酵素安定化剤を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。
【請求項２】
タンパク質分解酵素安定化剤とタンパク質分解酵素とをあらかじめ混合したものを核酸を含む試料溶液に添加する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３】
タンパク質分解酵素安定化剤が、糖類、糖アルコール、ポリエチレングリコール、金属イオンの少なくとも何れか１つであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項４】
タンパク質分解酵素が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、酸性プロテアーゼの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項５】
タンパク質分解酵素が、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素溶液で供されることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項６】
固相に核酸を吸着させる溶液が、タンパク質分解酵素とさらに、消泡剤、カオトロピック塩、核酸安定化剤、緩衝剤、水溶性有機溶媒および界面活性剤の中から選ばれる化合物を少なくとも一種を含む前処理液を、細胞又はウイルスを含む検体に添加、混合して得られる溶液であることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項７】
タンパク質分解酵素が、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに１つの試薬として同時に添加されることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項８】
消泡剤が、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を含むことを特徴とする請求項６または７に記載の核酸の分離製精方法。
【請求項９】
前処理液に、核酸安定化剤を０.１〜２０質量％の濃度で含有することを特徴とする請求項６〜８何れかに記載の核酸の分離製精方法。
【請求項１０】
核酸安定化剤が、還元剤であることを特徴とする請求項９に記載の核酸分離精製方法。
【請求項１１】
還元剤がメルカプト化合物であることを特徴とする請求項１０に記載の核酸分離精製方法。
【請求項１２】
核酸安定化剤が、キレ−ト剤であることを特徴とする請求項９に記載の核酸分離精製方法。
【請求項１３】
カオトロピック塩がグアニジウム塩である請求項６〜１２の何れかに記載の核酸分離精製方法。
【請求項１４】
水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールのいずれかを含むことを特徴とする請求項６〜１３の何れかに記載の核酸分離精製方法。
【請求項１５】
固相がシリカ又はその誘導体、珪藻土、又はアルミナから成る固相であることを特徴とする請求項１〜１４の何れかに記載の核酸分離精製方法。
【請求項１６】
固相が有機高分子から成る固相であることを特徴とする請求項１〜１４の何れかに記載の核酸分離精製方法。
【請求項１７】
有機高分子から成る固相が、多糖構造を有する有機高分子から成る固相であることを特徴とする請求項１６に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項１８】
多糖構造を有する有機高分子から成る固相がアセチルセルロ−スから成る固相であることを特徴とする請求項１７に記載の核酸分離精製方法。
【請求項１９】
アセチルセルロ−スから成る固相が、アセチルセルロ−スまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子からなる固相であることを特徴とする請求項１８に記載の核酸分離精製方法。
【請求項２０】
アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が５％以上であることを特徴とする請求項１９に記載の核酸の分離精製方法
【請求項２１】
多糖構造を有する有機高分子から成る固相が再生セルロ−スから成る固相であることを特徴とする請求項１７に記載の核酸分離精製方法。
【請求項２２】
固相が多孔膜であることを特徴とする請求項１５〜２１の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２３】
多孔膜が表裏非対称性の多孔性膜であることを特徴とする請求項２２に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２４】
多孔膜が平均孔径０．１〜１０．０μｍの多孔膜であることを特徴とする請求項２２または２３に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２５】
多孔膜が厚さ1０〜５００μｍの多孔膜であることを特徴とする請求項２２〜２４の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２６】
固相が非孔性であることを特徴とする請求項１５〜２１の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２７】
固相がビーズにコーティングされていることを特徴とする請求項１５〜２６の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２８】
ビーズが磁性ビーズであることを特徴とする請求項２７に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項２９】
少なくとも２個の開口を有する容器内に固相を収容した核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことを特徴とする請求項１〜２８の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３０】
(ａ) 固相、(ｂ) 前記固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことを特徴とする請求項１〜２９の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３１】
圧力差発生装置が加圧の装置であることを特徴とする請求項３０に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３２】
圧力差発生装置が減圧の装置であることを特徴とする請求項３０に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３３】
上記圧力差発生装置が、容器の一の開口に着脱可能に結合されていることを特徴とする請求項３０〜３２の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３４】
下記工程(ａ)〜(ｆ) を含むことを特徴とする請求項３０または３１に記載の核酸の分離精製方法。
(ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸分離精製ユニットの一の開口に前記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(ｂ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、核酸を固相に吸着させる工程、
(ｃ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(ｄ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した洗浄液を前記他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、固相を洗浄する工程、
(ｅ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を注入する工程、
(ｆ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を前記他の開口より排出させることによって、固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。
【請求項３５】
（ｅ）の工程の前に、固相にＤＮＡ分解酵素溶液を接触させた後、洗浄液を用いて固相を洗浄する工程を行うことを含むことを特徴とする請求項３４に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３６】
洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００質量％含む溶液であることを特徴とする請求項１〜３５に記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３７】
固相に吸着した核酸を脱着せしめうる液が、塩濃度が０．５ｍｏｌ/Ｌ以下の溶液であることを特徴とする請求項１〜３６の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７の何れかに記載された方法を行うための試薬キット。
【請求項３９】
請求項１〜３８の何れかに記載された方法を行うための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を分離精製する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸を分離精製するために、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法に関する。さらに詳しくは、得られた核酸を含む試料を用いて、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む試料から核酸を分離精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、様々な分野で種々の形態で使用されている。例えば、組換え核酸技術の領域においては、核酸をプローブ、ゲノム核酸、およびプラスミド核酸の形状で用いることを要求する。
【０００３】
診断分野においても、核酸は種々の方法で用いられている。例えば、核酸プローブは、ヒトの病原体の検出および診断に日常的に用いられている。同様に核酸は遺伝障害の検出に用いられている。核酸はまた食品汚染物質の検出にも用いられている。さらに、核酸は遺伝地図の作製からクローニングおよび組換え発現におよぶ種々の理由により、興味ある核酸の位置確認、同定および単離において日常的に用いられている。
【０００４】
多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、そして単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。血清、尿およびバクテリアのカルチャーから得られた試料の核酸の精製においては、コンタミネーションおよび疑陽性の結果が生じるという危険性も加わる。
【０００５】
また、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１２８６９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、検体中の核酸を核酸吸着性の多孔性膜に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法を提供することである。本発明の別の目的は、分離性能に優れ、洗浄効率が良く、簡便で、迅速で、自動化および小型化適性に優れ、実質的に同一の分離性能を有するものを大量に生産可能である多孔性膜を使用した核酸の分離精製方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、短時間で効率よくコンタミネーションが発生しないように処理でき、かつ、小型化が可能な、核酸分離精製装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸を多孔性膜に吸着及び脱着させる過程を含む核酸の分離精製方法において、該多孔性膜としてイオン結合が関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜を用いることによって、核酸を含む検体から核酸を収率よく、高純度で分離精製することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、核酸を含む試料溶液がタンパク質分解酵素を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法が提供される。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の構成により前記目的を達成したものである。
＜１＞（１）核酸を含む試料溶液を固相に通過させて、該固相内に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該固相に通過させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、及び
（３）回収液を該固相に通過させて、該固相内から核酸を脱着させる工程
を含有する核酸分離精製方法において、固相に核酸を吸着させる溶液がタンパク質分解酵素及びタンパク質分解酵素安定化剤を含むことを特徴とする核酸の分離精製方法。
＜２＞タンパク質分解酵素安定化剤とタンパク質分解酵素とをあらかじめ混合したものを核酸を含む試料溶液に添加する工程を含むことを特徴とする上記＜１＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜３＞  タンパク質分解酵素安定化剤が、糖類、糖アルコール、ポリエチレングリコール、金属イオンの少なくとも何れか１つであることを特徴とする記載事項＜１＞または＜２＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜４＞  タンパク質分解酵素が、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、酸性プロテアーゼの少なくとも１つであることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜３＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜５＞  タンパク質分解酵素が、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素溶液で供されることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜６＞  固相に核酸を吸着させる溶液が、タンパク質分解酵素とさらに、消泡剤、カオトロピック塩、核酸安定化剤、緩衝剤、水溶性有機溶媒および界面活性剤の中から選ばれる化合物を少なくとも一種を含む前処理液を、細胞又はウイルスを含む検体に添加、混合して得られる溶液であることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜５＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜７＞  タンパク質分解酵素が、予めカオトロピック塩、界面活性剤等のその他の試薬とともに１つの試薬として同時に添加されることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜６＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜８＞  消泡剤が、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を含むことを特徴とする記載事項＜６＞または＜７＞に記載の核酸の分離製精方法。
＜９＞  前処理液に、核酸安定化剤を０.１〜２０質量％の濃度で含有することを特徴とする記載事項＜６＞〜＜８＞何れかに記載の核酸の分離製精方法。
＜１０＞核酸安定化剤が、還元剤であることを特徴とする記載事項＜９＞に記載の核酸分離精製方法。
＜１１＞還元剤がメルカプト化合物であることを特徴とする記載事項＜１０＞に記載の核酸分離精製方法。
＜１２＞核酸安定化剤が、キレ−ト剤であることを特徴とする記載事項＜９＞に記載の核酸分離精製方法。
＜１３＞カオトロピック塩がグアニジウム塩である記載事項＜６＞〜＜１２＞の何れかに記載の核酸分離精製方法。
＜１４＞水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールのいずれかを含むことを特徴とする記載事項＜６＞〜＜１３＞の何れかに記載の核酸分離精製方法。
＜１５＞固相がシリカ又はその誘導体、珪藻土、又はアルミナから成る固相であることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜１４＞の何れかに記載の核酸分離精製方法。
＜１６＞  固相が有機高分子から成る固相であることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜１４＞の何れかに記載の核酸分離精製方法。
＜１７＞有機高分子から成る固相が、多糖構造を有する有機高分子から成る固相であることを特徴とする記載事項＜１６＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜１８＞多糖構造を有する有機高分子から成る固相がアセチルセルロ−スから成る固相であることを特徴とする記載事項＜１７＞に記載の核酸分離精製方法。
＜１９＞アセチルセルロ−スから成る固相が、アセチルセルロ−スまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子からなる固相であることを特徴とする記載事項＜１８＞に記載の核酸分離精製方法。
＜２０＞アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が５％以上であることを特徴とする記載事項＜１９＞に記載の核酸の分離精製方法
＜２１＞多糖構造を有する有機高分子から成る固相が再生セルロ−スから成る固相であることを特徴とする記載事項＜１７＞に記載の核酸分離精製方法。
＜２２＞固相が多孔膜であることを特徴とする記載事項＜１５＞〜＜２１＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜２３＞多孔膜が表裏非対称性の多孔性膜であることを特徴とする記載事項＜２２＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜２４＞多孔膜が平均孔径０．１〜１０．０μｍの多孔膜であることを特徴とする記載事項＜２２＞または＜２３＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜２５＞多孔膜が厚さ1０〜５００μｍの多孔膜であることを特徴とする記載事項＜２２＞〜＜２４＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜２６＞固相が非孔性であることを特徴とする記載事項＜１５＞〜＜２１＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜２７＞固相がビーズにコーティングされていることを特徴とする記載事項＜１５＞〜＜２６＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜２８＞ビーズが磁性ビーズであることを特徴とする記載事項＜２７＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜２９＞少なくとも２個の開口を有する容器内に固相を収容した核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことを特徴とする記載事項＜１＞〜＜２８＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜３０＞(ａ) 固相、(ｂ) 前記固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことを特徴とする記載事項＜１＞〜＜２９＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜３１＞圧力差発生装置が加圧の装置であることを特徴とする記載事項＜３０＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜３２＞圧力差発生装置が減圧の装置であることを特徴とする記載事項＜３０＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜３３＞上記圧力差発生装置が、容器の一の開口に着脱可能に結合されていることを特徴とする記載事項＜３０＞〜＜３２＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜３４＞下記工程(ａ)〜(ｆ) を含むことを特徴とする請求項３０または３１に記載の核酸の分離精製方法。
(ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸分離精製ユニットの一の開口に前記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(ｂ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、核酸を固相に吸着させる工程、
(ｃ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(ｄ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した洗浄液を前記他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、固相を洗浄する工程、
(ｅ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を注入する工程、
(ｆ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を前記他の開口より排出させることによって、固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。
＜３５＞（ｅ）の工程の前に、固相にＤＮＡ分解酵素溶液を接触させた後、洗浄液を用いて固相を洗浄する工程を行うことを含むことを特徴とする記載事項＜３４＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜３６＞洗浄液が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ−プロパノールを２０〜１００質量％含む溶液であることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜３５＞に記載の核酸の分離精製方法。
＜３７＞固相に吸着した核酸を脱着せしめうる液が、塩濃度が０．５ｍｏｌ/Ｌ以下の溶液であることを特徴とする記載事項＜１＞〜＜３６＞の何れかに記載の核酸の分離精製方法。
＜３８＞記載事項＜１＞〜＜３７＞の何れかに記載された方法を行うための試薬キット。
＜３９＞記載事項＜１＞〜＜３８＞の何れかに記載された方法を行うための装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の核酸の分離精製方法により、分離性能良く、簡便で、迅速に、自動化可能に、核酸を含む検体から核酸を分離精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明による核酸の分離精製方法について具体的に説明する。本発明では、核酸を含む試料溶液を固相に接触させることにより試料溶液中の核酸を固相に吸着させ、次いで、固相に吸着させた核酸を、以下に説明する好適な溶液を用いて固相から脱着させる。好ましくは、核酸を含む試料溶液は、細胞又はウイルスを含む検体をタンパク質分解酵素とさらに、核酸安定化剤、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤および消泡剤の中から選ばれる化合物を少なくとも一種を含む前処理液を核酸可溶化試薬として用いて処理することにより得られた溶液に、更に水溶性有機溶媒を添加した溶液である。
【００１４】
本発明において使用できる核酸を含む試料溶液に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは細胞、細菌、植物（又はその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。
【００１５】
最初にこれらの検体を、細胞膜を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散する。
【００１６】
本発明において「核酸」は一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。
【００１７】
試料とは、核酸を含む任意の試料を意味する。試料中の核酸の種類は１種類でも２種類以上の複数でもよい。個々の核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意の長さの核酸を使用することができる。取り扱い上の観点からは、核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。
【００１８】
細胞膜の溶解および核酸の可溶化のためには、例えば、対象となる試料が全血の場合、Ａ．赤血球の除去、Ｂ．各種タンパク質の除去、及びＣ．白血球の溶解及び核膜の溶解が必要となる。Ａ．赤血球の除去およびＢ．各種タンパク質の除去は、固相への非特異吸着および多孔膜の目詰まりを防ぐために、Ｃ．白血球の溶解及び核膜の溶解は、抽出の対象である核酸を可溶化させるためにそれぞれ必要となる。例えば、塩酸グアニジン、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテアーゼＫ（ＳＩＧＭＡ製）を添加した状態で６０℃、１０分インキュベートすることによって前記のＡ、Ｂ及びＣを同時に達成することができる。
【００１９】
前処理液は、核酸の回収量及び回収効率の向上、必要な核酸を含む検体の微量化及び迅速化の観点から、タンパク質分解酵素を含む。
タンパク質分解酵素としては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼの少なくとも１つのタンパク質分解酵素を用いることができる。
セリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばプロテアーゼＫなどを好ましく用いることができる。システインプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばパパイン、カテプシン類などを好ましく用いることができる。金属プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えばカルボキシペプチターゼ等を好ましく用いることができる。
タンパク質分解酵素の前記前処理液における濃度は、添加時の全容積１ｍＬあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵで用いることができる。
また、タンパク質分解酵素は、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素を好ましく用いることができる。
【００２０】
タンパク質分解酵素安定化剤はあらかじめタンパク質分解酵素に加えられ混合した状態で使用しても良いし、タンパク質分解酵素を使用する前後に試料溶液にに別途添加してもよい。
タンパク質分解酵素安定化剤としては、糖類、糖アルコール、ポリエチレングリコール、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、糖類では、グルコース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロースが好ましい。糖アルコールでは、ソルビトール、マンニトール、ミオイノシトールが好ましい。ポリエチレングリコールでは、平均分子量が、２００〜１０，０００の範囲にあることが好ましく用いることが出来る。金属イオンでは、マグネシウム、カルシウムなどの２価金属イオンが挙げられ、マグネシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムなどの形で添加することができる。
タンパク質分解酵素は安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。
タンパク質分解酵素の安定化剤の前記前処理液における濃度は、好ましくは１〜１０００ｍｍｏｌ/Ｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｍｏｌ/Ｌで含有することが好ましい。
【００２１】
タンパク質分解酵素は、予め消泡剤、カオトロピック塩、界面活性剤等、緩衝剤のその他の試薬とともに混合されて前処理液（以下、前処理液Ａという。）として核酸の回収に供されても良い。
また、タンパク質分解酵素は、消泡剤、カオトロピック塩、界面活性剤等、緩衝剤のその他の試薬を含む前処理液（以下、前処理液Ｂという。）とは個別の２つ以上の試薬として供されても良い。後者の場合、タンパク質分解酵素を含む試薬を先に検体と混合した後に、前処理液Ｂと混合される。また、前処理液Ｂを先に検体と混合した後に、タンパク分解酵素を混合してもよい。
また、タンパク質分解酵素を検体または、検体と前処理液Ｂとの混合液に、タンパク質分解酵素保存容器から直接目薬状に滴下させることもできる。この場合、操作を簡便にすることができる。
【００２２】
前処理液は、乾燥された状態、すなわち前処理剤として供給されることも好ましい。また、凍結乾燥のように乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いることができる。前記の、前処理剤、および／または乾燥された状態のタンパク質分解酵素を予め含む容器を用いて、核酸を含む試料溶液を得ることもできる。
前記の方法で核酸を含む試料溶液を得る場合、前処理剤および乾燥された状態のタンパク質分解酵素の保存安定性が良く、核酸収量を変えずに操作を簡便にすることができる。
【００２３】
本発明で用いる消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルへキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。
【００２４】
核酸安定化剤としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。検体によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、検体中の核酸を安定に存在させることができ、好ましい。
【００２５】
ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。特に、β−メルカプトエタノールが好ましい。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、前処理液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で、用いることができる。メルカプト化合物は、前処理液における濃度は０．１〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５質量％で、用いることができる。
【００２６】
また、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤として、キレート剤を用いることができる。キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＥＧＴＡ等を挙げることができる。キレート剤は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
カオトロピック塩としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンが挙げられ、中でも塩酸グアニジンが好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。前記前処理液中のカオトロピック塩濃度は、０．５ｍｏｌ/Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．５〜４ｍｏｌ/Ｌ、さらに好ましくは、１〜３ｍｏｌ/Ｌである。
カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として尿素を用いることもできる。
【００２８】
界面活性剤としては、例えば、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはノニオン界面活性剤およびカチオン界面活性剤を好ましく用いることができる。
ノニオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤のなかでも、ＰＯＥデシルエ−テル、ＰＯＥラウリルエ−テル、ＰＯＥトリデシルエ−テル、ＰＯＥアルキレンデシルエ−テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコ−ルがさらに好ましい。
【００２９】
カチオン界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドが挙げられる。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の前記前処理液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましい。
【００３０】
緩衝剤としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤(buffer)を挙げることができる。好ましくは、生化学用のｐＨ緩衝剤が挙げられる。このような緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩から成る緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ/ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ/ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ/ＥＤＴＡ）、グッド緩衝剤が挙げられる。グッド緩衝剤としては、ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonicacid)、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(Bis(2-hydoroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane)、ＨＥＰＥＳ(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicasid)、ＰＩＰＥＳ(Piperaxine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid))、ＡＣＥＳ(N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonicacid)、ＣＡＰＳ(N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonicacid)、ＴＥＳ(N-Tris(hydroxyl-methyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid) が挙げられる。
これらの緩衝剤は、前期前処理液中の濃度は１〜３００ｍｍｏｌ/Ｌであることが好ましい。
【００３１】
消泡剤、核酸安定化剤、カオトロピック塩、界面活性剤、緩衝剤等を溶解し、混合して試料溶液を得るために水溶性有機溶媒を添加しても良い。水溶性有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等上げられる。これらの中でも、試料溶液に含まれる前記化合物の溶解性を上げることができることから、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でもメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体などが挙げられ、エタノールがさらに好ましい。これらの水溶性有機溶媒は、単独でも複数組み合わせて用いてもよい。これら水溶性有機溶媒の試料溶液における濃度は１〜２０質量％であることが好ましい。
【００３２】
次いで核酸が分散した水溶液中に、水溶性有機溶媒を添加して、固相と接触させる。この操作により、試料溶液中の核酸が固相に吸着される。本明細書中前記した操作で可溶化された核酸を、固相に吸着させるためには、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することが必要である。
【００３３】
即ち、核酸の周りに存在する水分子の水和構造を破壊することにより、核酸は不安定な状態で可溶化することになる。この状態の核酸を、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相と接触させると、核酸表面上の極性基と固相表面の極性基間で相互作用し、核酸は固相表面上に吸着するものと考えられる。本発明の方法では、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた核酸混合液中に塩が存在することによって、核酸を不安定な状態にさせることができる。
【００３４】
この水溶性有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等上げられる。これらの中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でもメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体などが挙げられ、エタノールがさらに好ましい。
【００３５】
また、これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。さらに好ましくは２０質量％〜６０質量％である。エタノールの添加濃度は、擬集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。
【００３６】
得られた核酸混合液中に存在する塩としては、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム等が好ましい。特にグアニジウム塩は、細胞膜の溶解および核酸の可溶化の効果を併有するので特に好ましい。
【００３７】
前記試料溶液は、好ましくはｐＨ３〜１０、より好ましくはｐＨ４〜９、さらに好ましくはｐＨ５〜８のものが用いられる。
【００３８】
また、得られた核酸を含む試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ2以下、粘度は１〜１００００ｍＰａ、比重は  ０．８〜１．２の範囲であることが好ましい。この範囲の溶液にすることで、次の工程において、核酸を含む試料溶液を前記固相に通過させて、核酸を吸着させた後に残った溶液を除去しやすくする。
【００３９】
固相の種類は特に限定されず、例えば、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相や、あるいは二酸化珪素、シリカポリマー又は珪酸マグネシウムから成る固相、あるいはシリカ又はその誘導体、珪藻土、又はアルミナから成る固相などを使用することができる。好ましくは、多糖構造を有する有機高分子から成る固相を使用することができる。さらに好ましくは、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する固相である。これは、固相側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と固相が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。これは、親水基を有する固相であり、環境の極性を変化させることで、酢酸と固相の親水基同士が引きあるようになると推定される。
【００４０】
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。
【００４１】
ここで、親水基を有する固相とは、固相を形成する材料自体が親水性基を有すること、または固相を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入することを意味する。固相を形成する材料を処理またはコーティングする場合、固相を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、固相を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である固相、親水基を持たない有機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない有機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相、固相を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である固相、親水基を持たない無機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない無機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相などを使用することができるが、加工の容易性から、固相を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。
【００４２】
親水基を有する材料の固相としては、水酸基を有する有機材料の固相を挙げることができる。水酸基を有する有機材料の固相としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、多糖構造を有する有機材料などを挙げることができる。
【００４３】
多糖構造を有する有機材料としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を好ましく用いることができるが、多糖構造およびその誘導体であれば前記に挙げた材料に限定されることはない。また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体についても好ましく用いることができる。また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００４４】
前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体のエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造の、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００４５】
前記いずれかの多糖構造のカルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００４６】
前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステルのエステル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００４７】
前記いずれかの多糖構造のアルケニルカルボニルエステルのエステル基がアクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００４８】
前記いずれかの多糖構造の芳香族カルボニルエステルのエステル基がベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００４９】
前記いずれかの多糖構造の硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
また、前記、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５０】
前記いずれかの多糖構造の硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５１】
前記いずれかの多糖構造のスルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５２】
前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５３】
前記いずれかの多糖構造のホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５４】
前記いずれかの多糖構造のピロリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。
【００５５】
前記いずれかの多糖構造のエーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。
【００５６】
前記いずれかの多糖構造の水酸基が、任意の置換度でハロゲン化したものについても好ましく用いることができる。
【００５７】
多糖構造を有する有機高分子から成る固相として好ましくは、アセチルセルロ−スが挙げられ、更にアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物から成る有機高分子の固相を使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物を好ましく使用する事ができる。特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。
【００５８】
特に好ましい、アセチルセルロ−スから成る固相としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。鹸化処理により得られる固相の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。また、水酸基を有する固相の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの固相を鹸化処理することが好ましい。固相は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
【００５９】
ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分は、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。本発明において固相として、再生セルロースの固相を用いることが特に好ましい。
又、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
【００６０】
親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を固相に結合することができる。
有機材料の固相にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、固相を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
【００６１】
まず、固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に固相と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と固相の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。固相と反応する官能基としては、固相の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。
【００６２】
固相を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、固相と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって固相と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーである。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
【００６３】
親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
【００６４】
また、親水基を持たない有機材料の固相に、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。
【００６５】
親水基を有する無機材料である固相としては、シリカ化合物を含有する固相を挙げることができる。シリカ化合物を含有する固相としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
【００６６】
親水基を持たない無機材料の固相に親水基を導入する方法としては、固相と親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、固相を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
固相と親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用し、固相を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。
【００６７】
親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する方法において、記載した親水性基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
【００６８】
親水基を持たない無機材料の固相に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物などを挙げることができる。
【００６９】
また、親水基を持たない無機材料の固相に、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロ−スまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。
【００７０】
親水基を持たない無機材料の固相としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した固相を挙げることができる。
【００７１】
前記の固相は、フィルター、膜状の形態で使用することが、溶液が内部を通過可能であり、好ましい。この場合、厚さが１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。
【００７２】
前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、平均孔径が０．１μｍ〜１０μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、平均孔径が１μｍ〜５μｍである。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。この溶液が内部を通過可能な固相の平均孔径は、バブルポイント法(ASTM316-86、JIS3832準拠)を用いて決定することができる。
【００７３】
前記の溶液が内部を通過可能な固相は、表裏非対称性の多孔性膜であることが好ましい。ここで、表裏非対称性とは、多孔膜の一方の面から他方の面へと膜の物理的性質または化学的性質が変化している性質を示す。膜の物理的性質の例としては、平均孔径が挙げられる。また膜の化学的性質としては鹸化度が挙げられる。平均孔径が表裏非対称性の多孔膜を本発明で使用する場合は、液の通過する方向に平均孔径が、大→小に変化するようにするのが好ましい。ここで、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔性膜を用いる事が好ましい。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。
【００７４】
前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、空隙率が５０〜９５％であることが好ましい。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ2である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ2である。
【００７５】
前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。
【００７６】
前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ2の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ2あたり１分間で５〜１０００ｍＬである。
【００７７】
前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔性膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である。
【００７８】
核酸を含む試料溶液を前記固相に通過させる場合の流速は、液の固相への適切な接触時間を得るために、固相の面積ｃｍ2あたり、２〜１５００μＬ/secである事が好ましい。液の固相への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、前記流速は、固相の面積ｃｍ2あたり、５〜７００μＬ/secである事が好ましい。
【００７９】
また、使用する溶液が固相の内部を通過可能な場合は、１種類であってもよいが、複数を使用することもできる。複数の固相は、同一の素材であっても、異なるものであって良い。
【００８０】
核酸を固相に吸着させた後。固相を洗浄することにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む検体の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。
【００８１】
洗浄液は、水溶性有機溶媒及び/または水溶性塩を含んでいる溶液であることが好ましい。又、必要に応じて緩衝剤、界面活性剤を含むでも良い。洗浄液は、固相に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、固相から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸がアルコール等の水溶性有機溶媒に難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用が向上する。
【００８２】
洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール、アセトンなどを用いることができ、アルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。この中でも、エタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜８０質量％であることがより好ましい。
【００８３】
一方、洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物がより好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上含まれていることが好ましい。
【００８４】
緩衝剤及び界面活性剤としては、既述の緩衝剤及び界面活性剤が挙げられる。これらの内では、エタノール、Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液が好ましい。Ｔｒｉｓ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００の好ましい濃度は、それぞれ１０〜１００ｍｍｏｌ/Ｌ、及び０．１〜１０質量％である。
【００８５】
洗浄液は、カオトロッピック物質を含んでいないことが好ましい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが理想的である。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここでカオトロピック物質とは、前記した尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。
【００８６】
従来、核酸分離精製工程における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。
【００８７】
したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ2未満が好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。
【００８８】
しかし、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ2以上の場合は、カートリッジの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量が抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。
【００８９】
洗浄工程における洗浄液の液量は、２μＬ/ｍｍ2以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、２００μＬ/ｍｍ2以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ好ましい。
【００９０】
洗浄工程において、洗浄液を固相に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ2）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになる。しかし、前記の範囲とすることで、洗浄効率を落とすことなく、核酸の分離精製操作を迅速化でき、好ましい。
【００９１】
洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また、洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。
【００９２】
次に、固相に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液に、前記洗浄後の固相を接触させる。この溶液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供する。
【００９３】
検体から調整した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する検体量による。一般的によく使われる回収液量は数１０〜数１００μＬであるが、検体量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１〜数１０ｍＬの範囲で変える事ができる。
【００９４】
回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファー等が使用でき、ｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。こうすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。
【００９５】
回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００であり、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０である。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により検体よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。
【００９６】
回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。
【００９７】
また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。
【００９８】
また、上記の核酸分精製の工程では、１ｋｂｐから２００ｋｂｐ、特に２０ｋｂｐから１４０ｋｂｐと広範囲に及ぶ分子量の核酸を回収することができる。すなわち、従来行なわれているガラスフィルターを用いたスピンカラム法に比べて、長鎖の核酸を回収できる。
【００９９】
また、上記の核酸分精製の工程では、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ)が、ＤＮＡの場合は１．６〜２．０、ＲＮＡの場合は１．８〜２．２となる純度を持つ核酸を回収することができ、不純物混入量の少ない高純度の核酸を定常的に得ることができる。さらには、紫外可視分光光度計での測定値(２６０ｎｍ／２８０ｎｍ)がＤＮＡの場合は１．８付近、ＲＮＡの場合は２．０付近となる純度を持つ核酸を回収することができる。
【０１００】
本発明で使用する核酸分離精製ユニットは、(ａ) 固相、(ｂ) 前記固相を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置、を含むものであることが好ましい。以下、この核酸分離精製ユニットについて説明する。
【０１０１】
容器の材料に特別な限定はなく、固相が収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよいが、製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明の樹脂を用いるのが好ましい。
【０１０２】
容器は、固相の収容部を持ち、収容部に固相を収容でき、固相が試料液等の吸引及び排出時に収容部の外へは出ることがなく、開口に圧力差発生装置、例えば注射器を接合できればよい。このためには、容器が当初は二つの部分に分かれており、固相を収容した後で一体化できることが好ましい。また、固相が収容部から外へでることをさける為には、固相の上下に核酸を汚染しない材料で作成されたメッシュを置くことができる。
【０１０３】
前記容器に収容される固相の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円、膜の場合には筒状、巻物状、あるいは表面に水酸基を有する有機高分子をコーティングしたビーズ等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、円、正方形、円筒状、巻物状等の対称性の高い形状及びビーズが好ましい。
【０１０４】
容器は、通常、固相を収容する本体と、蓋体に分けた態様で作製され、いずれにも少なくとも１個の開口が設けられている。開口は核酸を含有する試料溶液、洗浄液(核酸洗浄バッファー)及び固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口として使用され、又、容器内を減圧又は加圧状態にせしめうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特に限定はないが、製造が容易で、試料溶液等が固相の全面に拡散し易くするには、断面を円形にすることが好ましい。断面を四角形にすることも、固相の裁断屑を発生させないために好ましい。
【０１０５】
前記蓋は、圧力差発生装置によって容器内部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されている必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙げられる。
【０１０６】
容器の内容積は処理すべき試料溶液の量のみによって決められるが、通常、収容される固相の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍの固相を１枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。
【０１０７】
固相の端面は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。
【０１０８】
試料溶液等の入り口に使用される開口に対向する固相の下は、容器の内壁に密着させずに空間を設け、試料溶液等が固相の全面にできるだけ均等に拡散する構造にする。
【０１０９】
圧力差発生装置に結合される開口に対向する固相の上には、ほぼ中央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材は、固相を押さえると共に、試料溶液等を効率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量や固相を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が適宜定めることができる。この部材と当該開口の間には、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けることが好ましい。この空間の大きさも当業者が適宜選択することができる。なお、核酸を効率良く集めるためには、固相の全体が浸る以上の量の核酸を含む試料溶液を吸引することが好ましい。
【０１１０】
また、吸引している開口の真下の部分にのみ試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等が固相内を比較的均一に通過できるようにするため、固相とこの部材の間にも空間を設けることが好ましい。このためには、当該部材から固相に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができるが、空間を保持しながら固相の開口面積をできる限り大きく保つことが好ましい。
【０１１１】
なお、容器に３以上の開口を設けた場合には、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能にすべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があることはいうまでもない。
【０１１２】
圧力差発生装置は、まず固相を収容した容器内を減圧にして核酸を含む試料溶液を吸引する。圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような吸引及び加圧が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。
【０１１３】
次に、前記した核酸分離精製ユニットを使用した、核酸の精製方法について説明する。
【０１１４】
本発明の核酸の分離精製方法では、好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に前記固相を収容した核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【０１１５】
さらに好ましくは、(ａ) 前記固相、(ｂ) 該固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ) 該容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核  酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。
【０１１６】
この場合、本発明の核酸分離精製方法の第一実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸分離精製ユニットの一の開口を該試料溶液中に挿入する工程、
(ｂ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして核酸を含む試料溶液を吸引し、固相に接触させる工程、
(ｃ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された核酸を含む試料溶液を容器外に排出する工程、
(ｄ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を洗浄液(核酸洗浄バッファー)に挿入する工程、
(ｅ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして洗浄液を吸引し、固相に接触させる工程、
(ｆ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された洗浄液を容器外に排出する工程、
(ｇ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を、固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液中に挿入する工程、
(ｈ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして、固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を吸引し、固相に接触させる工程、及び
(ｉ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を容器外に排出する工程。
（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）の際に、固相のほぼ全体と接触する量の溶液を吸引することが好ましいが、圧力差発生装置内に吸引すると装置を汚染するので、適量に調整する。適量の溶液を吸引後、圧力差発生装置を用いてユニットの容器内を加圧して、吸引した液を排出する。この操作までに間隔を開ける必要はなく、吸引後直ちに排出してもよい。
【０１１７】
本発明の核酸分離精製方法の第二実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ) 検体を用いて核酸を含む試料溶液を調製し、核酸分離精製ユニットの一の開口に前記の核酸を含む試料溶液を注入する工程、
(ｂ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、他の開口より排出することによって、固相に接触させる工程、
(ｃ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(ｄ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した洗浄液を前記他の開口より排出することによって、固相に接触させる工程、
(ｅ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を注入する工程、
(ｆ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を前記他の開口より排出させることによって、固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。
先ず、核酸を含む試料溶液中に、前記核酸分離精製ユニットの一の開口を挿入する。
【０１１８】
前記の工程において、試料溶液を容器に添加するには、限定はされないが、ピペットやスポイトなどの実験用器具を使用するのが好ましい。これらの器具が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
検体を混合する方法は、特に限定されない。例えば、混合する際、攪拌装置により３０〜３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５〜３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０〜５０回行うことによっても混合することができる。
以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に前記固相を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生装置を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程を自動で行う自動で行う自動装置の例を示すが、自動装置はこれに限定されるものではない。
【０１１９】
自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸を吸着する固相を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記固相に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し固相に吸着した核酸を脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離精製装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記試料液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。
【０１２０】
前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。
【０１２１】
また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。
【０１２２】
また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。
【０１２３】
前記のような自動装置によれば、核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備え、前記固相部材を備えた核酸分離精製カートリッジに核酸を含む試料液を注入加圧し核酸を該固相部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注して該固相膜部材に吸着した核酸を分離して回収する核酸分離精製工程を自動的に行って短時間で効率よく試料液の核酸を自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することとができる。
【０１２４】
また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。
【０１２５】
また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。
【０１２６】
また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。
【実施例】
【０１２７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１２８】
実施例１
（１）核酸精製カートリッジの作製
内径７ｍｍ、核酸吸着性多孔性膜を収容する部分を持つ核酸精製カートリッジをハイインパクトポリスチレンで作製した。
【０１２９】
（２）  核酸吸着性多孔性膜として、トリアセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理した多孔性膜（孔径２．５μｍ、直径７ｍｍ、厚さ１００μｍ、鹸化率９５％）を使用し、前記（１）で作製した核酸精製カートリッジの核酸吸着性多孔性膜収納部に収容した。
【０１３０】
（３）  材料及び試薬
前記（２）で作製した核酸精製カートリッジを使用した。前処理液（核酸精製用吸着バッファー溶液）及び洗浄液(核酸洗浄バッファー)は以下の通り調製した。
【０１３１】
前処理液（核酸精製用吸着バッファー溶液）                              
塩酸グアニジン（ライフテクノロジー製）                      ４．９５Ｍ
レオドールＴＷ−Ｓ１２０Ｖ（花王製非イオン性界面活性剤）    ３．０％  
エタノール                                                  ７．３％
セチルトリメチルアンモニウムブロミド                        ２％
ＡＫ−０２（信越化学製消泡剤）                              ０．６％
蒸留水                              １０００ｍＬ                      
【０１３２】
洗浄液（核酸洗浄バッファ）                          
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ                    ２０ｍＭ    
塩化ナトリウム                    ２００ｍＭ
蒸留水                                              
【０１３３】
（４）核酸精製操作
ヒト全血試料２００μＬに、前処理液（核酸精製用吸着バッファー溶液）２５０μＬとプロテアーゼ溶液（プロテアーゼ  ＮアマノＧ；天野エンザイム製中性プロテアーゼ）３０μＬ、安定化剤（グルコースまたはソルビトール）１０％(Ｗ／Ｖ)水溶液３０μＬを添加(対照は純水３０μＬ)して、５６℃で２分間インキュベートした。インキュベート後、エタノール２５０μＬを加え、攪拌した。攪拌後、前記（２）で作製した核酸吸着性多孔性膜を有する核酸精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて前記一の開口に圧力差発生装置（チュウビングポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させることで、核酸吸着性多孔性膜に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、前記核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に洗浄液を注入し、前記一の開口にチュウビングポンプを結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出した。続いて、前記核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に回収液を注入し、核酸分離精製カートリッジの前記一の開口にチュウビングポンプを結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。核酸分離精製操作（核酸を含む試料溶液を前記のカートリッジに注入してから回収するまで）に要した時間は２分であった。
【０１３４】
（５）核酸の回収量の定量
（４）の操作により精製されたＤＮＡの回収量を、波長２６０ｎｍの吸光度を測定することにより測定した。安定化剤水溶液のかわりに純水３０μＬを添加した時のＤＮＡ回収量を１００％とし、結果を下記表１に示した。また、安定化剤の例として、グルコース及びソルビトールを用いたときの結果を示した。表１の結果から、本発明によりＤＮＡの回収量を向上できることが分かる。
【０１３５】
【表１】
2006136285.tif 000002
【０１３６】
実施例２
（１）プロテアーゼ溶液への安定化剤の添加
モレキュラー・プローブ社のＥｎｚＣｈｅｃｋプロテアーゼアッセイキットを使用してプロテアーゼ活性を測定した。２００ｍｇ/ｍＬのプロテアーゼ溶液（プロテアーゼ  ＮアマノＧ；天野エンザイム製中性プロテアーゼ）に、グルコース、スクロース、トレハロース、ソルビトールの各安定化剤を１０％(Ｗ／Ｖ)になるように添加して、それらを４、２５、４５、６０℃の各温度で２０時間保存した後、活性を測定した。また、比較用に安定化剤を添加しないサンプルについても同様に測定を行った。
【０１３７】
（２）プロテアーゼ活性の測定
（１）の操作により測定されたプロテアーゼ活性を、４℃で保存した場合を１００として表２に示す。この結果から、本発明に用いる各種のタンパク質分解酵素安定化剤が安定化作用を持つことが分かる。
【表２】
2006136285.tif 000003