(57)【要約】【課題】  ピークのテーリングが最小限に抑えられ、十分な分離が達成され、高感度かつ迅速分析が可能な三環系抗うつ剤の分析方法を提供する。【解決手段】  三環系抗うつ剤を高速液体クロマトグラフィーにより分析するに際して、分析すべき三環系抗うつ剤を含む試料Ｓを前処理移動相により陽イオン交換型の前処理カラム１７に導入し、試料中の三環系抗うつ剤を前処理カラム１７に保持する前処理工程と、前処理カラム１７に保持された三環系抗うつ剤を分析移動相によって前処理カラム１７から溶出させ、この前処理された溶出液を分析カラム１９に導き、分析カラム１９によって三環系抗うつ剤を分離する分離工程と、分離された三環系抗うつ剤を検出器２０によって検出する検出工程とを備えた三環系抗うつ剤の分析方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
三環系抗うつ剤を高速液体クロマトグラフィーにより分析するに際して、
分析すべき三環系抗うつ剤を含む試料を前処理移動相により陽イオン交換型の前処理カラムに導入し、試料中の三環系抗うつ剤を前処理カラムに保持する前処理工程と、
前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を分析移動相によって前処理カラムから溶出させ、この前処理された溶出液を分析カラムに導き、分析カラムによって三環系抗うつ剤を分離する分離工程と、
分離された三環系抗うつ剤を検出器によって検出する検出工程とを備えた三環系抗うつ剤の分析方法。
【請求項２】
前処理移動相として、酸性移動相を用いる、請求項１に記載の三環系抗うつ剤の分析方法。
【請求項３】
分析移動相として、前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を溶出させ得る高い陽イオン濃度を有する緩衝液を用いる、請求項１又は２に記載の三環系抗うつ剤の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三環系抗うつ剤を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
三環系抗うつ剤は、高極性の塩基性化合物であり、うつ病の治療薬や抗不安作用薬として用いられる。
【０００３】
三環系抗うつ剤を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析するに際して、前処理カラムと分析カラムとを組み合わせて用いる方法が知られている。まず、三環系抗うつ剤を含む試料（例えば、血漿などの生体由来試料）を前処理カラムに導入し、試料中の三環系抗うつ剤を前処理カラムに保持し、一方、試料中のタンパク質やその他の大きな生体分子を前処理移動相と共に前処理カラムを通過させて取り除く。その後、前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を分析移動相によって前処理カラムから溶出させ、この前処理された溶出液を分析カラムに導き、分析カラムによって三環系抗うつ剤を分離し、検出器で三環系抗うつ剤を検出する。
【０００４】
例えば、Therapeutic Drug Monitoring, 24, 537-544 (2002) には、前処理カラムとしてポリマー型カラムである Oasis extraction カラムを用いたヒト血漿中の三環系抗うつ剤の同時分析が開示されている。また、Chromatographia, 51, 353-356 (2000) には、前処理カラムとして逆相型カラムである Capcell Pak MF Ph-1を用いたヒト血漿中の三環系抗うつ剤クロミピラミンの分析が開示されている。しかしながら、三環系抗うつ剤は高極性の塩基性化合物であるため、三環系抗うつ剤を疎水性相互作用によってポリマー型カラムあるいは逆相型カラムに保持させようとしても、保持は不十分である。そのため、その後の分析カラムによる分離が不十分となり、ピークのテーリングが生じる。結果として、高感度分析が困難であり、分析に要する時間が長くなるという問題があった。
【０００５】
【非特許文献１】M.Kollroser and C.Schober, Therapeutic Drug Monitoring, 24, 537-544 (2002)
【非特許文献２】H.M.Lee, C.K.Jeong, S.J.Choi, B.M.Yoon, D.H.Na, K.C.Lee, and H.S.Lee, Chromatographia, 51, 353-356 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し、ピークのテーリングが最小限に抑えられ、十分な分離が達成され、高感度かつ迅速分析が可能な三環系抗うつ剤の分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、高極性の塩基性化合物である三環系抗うつ剤を十分に保持し、その後溶出させるために、前処理カラムとして陽イオン交換型カラムを用いるとよいことを見いだした。
【０００８】
本発明は、三環系抗うつ剤を高速液体クロマトグラフィーにより分析するに際して、
分析すべき三環系抗うつ剤を含む試料を前処理移動相により陽イオン交換型の前処理カラムに導入し、試料中の三環系抗うつ剤を前処理カラムに保持する前処理工程と、
前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を分析移動相によって前処理カラムから溶出させ、この前処理された溶出液を分析カラムに導き、分析カラムによって三環系抗うつ剤を分離する分離工程と、
分離された三環系抗うつ剤を検出器によって検出する検出工程とを備えた三環系抗うつ剤の分析方法である。
【０００９】
本発明において、前処理移動相として、酸性移動相を用いるとよい。
分析移動相として、前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を溶出させ得る高い陽イオン濃度を有する緩衝液を用いるとよい。また、ｐＨをコントロールすること、あるいは有機溶媒濃度を高めることも、三環系抗うつ剤の溶出に効果がある。
【００１０】
前処理移動相により三環系抗うつ剤を前処理カラムに保持させ、その後、前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を分析移動相によって前処理カラムから溶出させて分析カラムに導くためには、公知の流路切替えバルブを用いるとよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、前処理カラムとして陽イオン交換型カラムを用いるので、静電相互作用によってこの前処理カラムに高極性の塩基性化合物である三環系抗うつ剤を十分に保持することができる。そして、その後、前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を分析移動相によって前処理カラムから溶出させ分析カラムに導くので、分析カラムによって三環系抗うつ剤を十分に分離することができる。その結果、ピークのテーリングが最小限に抑えられ、高感度かつ迅速分析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１を参照して、本発明を実施するための形態について説明する。図１は、本発明の分析方法を実施するための高速液体クロマトグラフィー分析装置の一例の概略を示す図である。
【００１３】
図１において、分析装置は、六方切替えバルブ(16)を介して流路が構成されているものである。分析装置は、前処理移動相を収容する容器(C11) と送液ポンプ(P11) とからなる前処理移動相送液ユニット(11)と、送液ユニット(11)から延びる流路に設けられた試料導入器(15)と、試料導入器(15)から延びる流路をポートａに受入れる六方切替えバルブ(16)と、切替えバルブ(16)のポートｂから延びポートｅに受け入れられる流路の途中に設けられた前処理カラム(17)と、切替えバルブ(16)のポートｆから延び排出口(18)を有する流路とを有し、一方、分析移動相Ａを収容する容器(C12) と送液ポンプ(P12) とからなる分析移動相Ａ送液ユニット(12)と、分析移動相Ｂを収容する容器(C13) と送液ポンプ(P13) とからなる分析移動相Ｂ送液ユニット(13)と、両送液ユニット(12)及び(13)からの流路を合流させ分析移動相とする混合器(14)と、混合器(14)から延び切替えバルブ(16)のポートｃに受け入れられる流路と、切替えバルブ(16)のポートｄから延びる流路に設けられた分析カラム(19)と、分析カラム(19)から延びる流路を受け入れる検出器(20)とを備えている。
【００１４】
前処理カラム(17)は、陽イオン交換型カラムである。陽イオン交換型カラムは、分析対象である三環系抗うつ剤を捕捉・保持することができるものであればよく、公知のものから選択するとよい。例えば、液体クロマトグラフィー用カラム Shim-pack MAYI-SCX (G) （内径４．６ｍｍ×長さ１０ｍｍ、島津製作所製）が挙げられる。
【００１５】
前処理移動相としては、三環系抗うつ剤の陽イオン交換型カラムへの保持を促進するために酸性移動相が用いられ、一例としては、０．１％酢酸水（容量基準）が挙げられる。ただし、前処理移動相は、三環系抗うつ剤を陽イオン交換型カラムに保持し得るものであればよく、その種類や濃度などに制約はない。
【００１６】
分析カラム(19)は、分析すべき三環系抗うつ剤を分離することができるものであればよく、公知のものから選択するとよい。例えば、液体クロマトグラフィー用カラム Gemini C18 （内径２．０ｍｍ×長さ５０ｍｍ、フェノメネクス製）が挙げられる。
【００１７】
分析移動相としては、前処理カラム(17)に捕捉・保持された三環系抗うつ剤を脱離・溶出させ、分析カラム(19)において三環系抗うつ剤を分離させるものであればよく、このためには、高い陽イオン濃度を有する緩衝液を用いるとよい。一例としては、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）が挙げられる。ただし、上記の機能を有していればよく、その種類や濃度などに制約はない。例えば、ｐＨをコントロールすることや、有機溶媒濃度を高めることによって、三環系抗うつ剤を溶出させてもよい。また、グラジエント分析を行うために、２種（又はそれ以上）の分析移動相Ａ，Ｂを用いることが好ましい。
【００１８】
検出器(20)として、この例では質量分析計が備えられている。検出器(20)としては、質量分析計の他に、吸光度検出器などが用いられる。三環系抗うつ剤を検出できるものであればよい。
【００１９】
まず、六方切替えバルブ(16)において図１の実線で示された通りの流路とする。
前処理移動相送液ユニット(11)から前処理移動相を送液し、陽イオン交換型前処理カラム(17)を平衡化する。分析すべき三環系抗うつ剤を含む試料Ｓ（例えば、血漿などの生体由来試料）をマイクロシリンジなどを用いて試料導入器(15)から導入し、試料中の三環系抗うつ剤を前処理カラム(17)に捕捉・保持し、一方、試料中のタンパク質やその他の大きな生体分子を前処理移動相と共に前処理カラム(17)を通過させ、流路の排出口(18)から廃棄液Ｗとして取り除く。
【００２０】
一方、分析移動相Ａ送液ユニット(12)及び分析移動相Ｂ送液ユニット(13)から分析移動相Ａ及びＢを送液し、混合器(14)においてこれらを混合し、所定容量混合比Ａ／Ｂとされた分析移動相で分析カラム(19)を平衡化する。
【００２１】
次に、一定時間経過後に、切替えバルブ(16)において図１の破線で示された通りの流路として、分析移動相Ａ送液ユニット(12)、分析移動相Ｂ送液ユニット(13)及び混合器(14)を用いて、所定容量混合比Ａ／Ｂとされた分析移動相を前処理カラム(17)に導入し、カラム(17)中に保持された三環系抗うつ剤を脱離させ溶出させ、続いて、カラム(17)からの溶出液を分析カラム(19)に導く。分析カラム(19)によって三環系抗うつ剤を分離し、分離された三環系抗うつ剤を検出器(20)によって検出する。
【００２２】
前処理カラム(17)として陽イオン交換型カラムを用いるので、静電相互作用によって三環系抗うつ剤を十分に捕捉・保持することができる。そして、その後、前処理カラムに保持された三環系抗うつ剤を分析移動相によって前処理カラムから脱離・溶出させ分析カラムに導くので、分析カラムによって三環系抗うつ剤を十分に分離することができる。その結果、試料中に含まれている三環系抗うつ剤の各ピークのテーリングが最小限に抑えられ、高感度かつ迅速分析が可能となる。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例］
図１に示された高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置を用いて、次のようにして、６種の三環系抗うつ剤ドキセピン、デシプラミン、イミプラミン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、及びクロミプラミンが添加されたラット血漿試料の分析を行った。
【００２５】
（１）  試料液の調製
上記各三環系抗うつ剤を水に溶解し、濃度１０００μｇ／ｍＬの水溶液をそれぞれ調製した。次に、調製した６種の水溶液を、６種の各三環系抗うつ剤が１０ｎｇ／ｍＬとなるようにラット血漿試料に添加した。これを試料液とした。
【００２６】
（２）  前処理条件（前処理工程）
前処理カラム(17)： Shim-pack MAYI-SCX (G) （内径４．６ｍｍ×長さ１０ｍｍ、島津製作所製）
前処理移動相：０．１％酢酸水
前処理流速：３ｍＬ／ｍｉｎ
前処理時間：１ｍｉｎ
試料液注入量：２０μＬ
【００２７】
前処理時間経過後に、切替えバルブ(16)によって流路を変更し、前処理カラム(17)からの溶出液を分析カラム(19)に導入した。
【００２８】
（３）  分析条件（分離工程）
分析カラム(19)： Gemini C18 （内径２．０ｍｍ×長さ５０ｍｍ、フェノメネクス製）
分析移動相：Ａ液：１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）
Ｂ液：アセトニトリル
グラジエントプログラム：
Ｂ２０％（０−１ｍｉｎ）−Ｂ９０％（４ｍｉｎ）−Ｂ２０％（４．０１−７ｍｉｎ）
分析流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
【００２９】
（４）  検出条件（検出工程）
検出器：質量分析装置（ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ、島津製作所製）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法（ポジティブイオン検出）
ＳＩＭモニターイオン：ｍ／ｚ２８０（ドキセピン）、ｍ／ｚ２６７（デシプラミン）、ｍ／ｚ２８１（イミプラミン）、ｍ／ｚ２６４（ノルトリプチリン）、ｍ／ｚ２７８（アミトリプチリン）、ｍ／ｚ３１５（クロミプラミン）
【００３０】
（５）分析結果
分析結果を図２に示す。図２は、６種の三環系抗うつ剤を含むラット血漿試料液について得られたＳＩＭクロマトグラムである。横軸：保持時間（ｍｉｎ）ｖｓ縦軸：強度。各三環系抗うつ剤についてのベースラインは、適宜ずらされて表示されている。
ピーク１：ドキセピン
ピーク２：デシプラミン
ピーク３：イミプラミン
ピーク４：ノルトリプチリン
ピーク５：アミトリプチリン
ピーク６：クロミプラミン
【００３１】
図２から、本方法によれば、分析カラムによって三環系抗うつ剤は十分に分離され、各ピークがテーリングすることなくシャープであることが分かる。いずれのピークについても、ピークの始端から終端まで僅か０．１分程度であった。このように、本方法によれば、三環系抗うつ剤の高感度かつ迅速分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の分析方法を実施するための高速液体クロマトグラフィー分析装置の一例の概略を示す図である。
【図２】実施例において、６種の三環系抗うつ剤を含むラット血漿試料液について得られたＳＩＭクロマトグラムである。
【符号の説明】
【００３３】
(16)：六方切替えバルブ
(11)：前処理移動相送液ユニット
(15)：試料導入器
(17)：前処理カラム
(18)：排出口
(12)：分析移動相Ａ送液ユニット
(13)：分析移動相Ｂ送液ユニット
(14)：混合器
(19)：分析カラム
(20)：検出器
【図１】
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【図２】
2006329708.tif 000004