(57)【要約】【課題】多数の蛍光体を導入しても、認識物が変性することなく、蛍光体も消光せずに蛍光強度が増幅される蛍光標識体と、該標識体で標識化された蛍光標識認識物、および該認識物を用いた免疫測定法等を提供する。【解決手段】アニオン性基を有する親水性重合体から、共有結合を介して分鎖上に伸びた複数のポリエーテル誘導体の一部に、蛍光体が共有結合により結合された構造の蛍光標識体および、該標識体中の親水性重合体に、直接あるいは分鎖上に伸びたポリエーテル誘導体と共有結合された蛍光標識認識物を用いて、免疫測定等の各種測定を行なう。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオン性基を有する親水性重合体、ポリエーテル誘導体および蛍光体からなる蛍光標識体であって、
前記蛍光体が、ポリエーテル誘導体を介して親水性重合体に結合されていることを特徴とする蛍光標識体。
【請求項２】
前記親水性重合体が、アクリル酸誘導体が重合されたものであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識体。
【請求項３】
前記親水性重合体が、アクリル酸、メタクリル酸、２−アミノエチルメタクリレート、３−スルホプロピルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−エチルメタクリル酸グルコシドおよびＮ−アクリロキシサクシニミドからなる群より任意に選ばれる一種類以上のものが重合されたものであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識体。
【請求項４】
前記親水性重合体が、分子量５〜５００ｋＤａのものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光標識体。
【請求項５】
前記親水性重合体に含まれるアニオン性基が、スルホン酸基、リン酸基、またはそれらの塩のいずれかであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光標識体。
【請求項６】
前記ポリエーテル誘導体が、ポリエチレングリコール誘導体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光標識体。
【請求項７】
前記ポリエーテル誘導体が、分子量０．１〜５０ｋＤのものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光標識体。
【請求項８】
前記蛍光体の数が１〜９０個であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光標識体。
【請求項９】
前記蛍光体が、インダセン誘導体、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、インドカルボシアニン誘導体およびフラザン誘導体のいずれかであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光標識体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光標識体によって標識化された蛍光標識認識物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の蛍光標識認識物を含む免疫測定試薬。
【請求項１２】
請求項１０に記載の蛍光標識認識物を用いる免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数の蛍光体がポリエーテル誘導体を介して親水性重合体に結合された構造からなる、高感度の蛍光標識体および該標識体で標識化された蛍光標識認識物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原・抗体の濃度の測定法としては、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光体等で抗原・抗体を標識化し、これらの標識が発するシグナルの強度を測定する方法が用いられてきた。しかし、ラジオアイソトープを用いる方法は、特殊な施設や機器が必要であるため、近年ほとんど用いられなくなってきている。また、酵素で標識化する方法は、発光基質を用いた方法が普及しているが、感度が高い反面、基質が高価であり、さらに、酵素と基質を反応させる時間が必要であるため、短時間での測定ができない。
【０００３】
一方、蛍光体で標識化する法は、特殊な施設や機器あるいは高価な基質などを必要としないが、感度が低い。そこで、感度を上げるためには多数の蛍光体を抗体等に導入する必要がある。しかし、多数の蛍光体を抗体等に直接結合させると、消光現象が起こって蛍光強度が下がるうえ、蛍光体を導入された抗体等は、疎水性が増して変性してしまう。これに対して、抗体等に親水性重合体のリンカーを導入し、このリンカーに多数の蛍光体を導入することにより、１つの抗体等に多数の蛍光体を導入する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開昭５８−７９１６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記方法では、抗体等の変性および蛍光強度の低下を回避できるが、実用性を高めるためには、より蛍光強度の高い蛍光標識体が望まれる。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、多数の蛍光体を導入しても、認識物が変性することなく、蛍光体も消光せずに蛍光強度が増幅される蛍光標識体および該標識体で標識化された蛍光標識認識物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多数の蛍光体がポリエーテル誘導体を介してアニオン性基を有する親水性重合体に結合された構造の蛍光標識体は、認識物を変性させることなく、蛍光強度を増幅させることを見出すに至った。
【０００６】
すなわち、かかる課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、アニオン性基を有する親水性重合体、ポリエーテル誘導体および蛍光体からなる蛍光標識体であって、前記蛍光体が、ポリエーテル誘導体を介して親水性重合体に結合されていることを特徴とする蛍光標識体である。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、前記親水性重合体が、アクリル酸誘導体が重合されたものであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識体である。
【０００８】
請求項３に記載の発明は、前記親水性重合体が、アクリル酸、メタクリル酸、２−アミノエチルメタクリレート、３−スルホプロピルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−エチルメタクリル酸グルコシドおよびＮ−アクリロキシサクシニミドからなる群より任意に選ばれる一種類以上のものが重合されたものであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光標識体である。
【０００９】
請求項４に記載の発明は、前記親水性重合体が、分子量５〜５００ｋＤａのものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光標識体である。
【００１０】
請求項５に記載の発明は、前記親水性重合体に含まれるアニオン性基が、スルホン酸基、リン酸基、またはそれらの塩のいずれかであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光標識体である。
【００１１】
請求項６に記載の発明は、前記ポリエーテル誘導体が、ポリエチレングリコール誘導体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光標識体である。
【００１２】
請求項７に記載の発明は、前記ポリエーテル誘導体が、分子量０．１〜５０ｋＤのものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光標識体である。
【００１３】
請求項８に記載の発明は、前記蛍光体の数が１〜９０個であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光標識体である。
【００１４】
請求項９に記載の発明は、前記蛍光体が、インダセン誘導体、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、インドカルボシアニン誘導体およびフラザン誘導体のいずれかであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光標識体である。
【００１５】
請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光標識体によって標識化された蛍光標識認識物である。
【００１６】
請求項１１に記載の発明は、請求項１０に記載の蛍光標識認識物を含む免疫測定試薬である。
【００１７】
請求項１２に記載の発明は、請求項１０に記載の蛍光標識認識物を用いる免疫測定方法である。
【発明の効果】
【００１８】
請求項１の発明によれば、蛍光体の数から想定される通常の総蛍光量和よりも強い蛍光を検出でき、蛍光標識体を高感度化できる。具体的には、本発明の蛍光標識体の蛍光強度は、蛍光体の数から想定される通常の総蛍光量和よりも、少なくとも１０倍以上に増幅される。
また、該蛍光標識体の水溶性が著しく向上し、蛍光標識認識物を変性させることがない。
【００１９】
請求項２〜９の発明によれば、より水溶性および／または検出感度に優れた蛍光標識体および蛍光標識認識物を得られる。
【００２０】
請求項１０〜１２の発明によれば、蛍光免疫測定等を高感度かつ短時間で実施できる。具体的には、本発明の蛍光標識法では、従来の酵素標識法に対しほぼ同等の感度（２Ｓ／Ｎ）を有し、最短で１／５程度の時間で測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳しく説明する。
図１は、本発明の蛍光標識体の構造を模式的に示すものである。符号１は親水性重合体であり、その構造中には、アニオン性基５が導入されている。また、符号２は、親水性重合体１に導入されたアニオン性基以外の親水性置換基である。また、符号３はポリエーテル誘導体であり、一つの親水性重合体１に複数が共有結合を介して分鎖状に結合しており、その一部のポリエーテル誘導体３の末端には、蛍光体４が共有結合を介して結合されている。認識物は、親水性重合体中の官能基に、共有結合を介して、直接結合されている。（図示略）
【００２２】
（親水性重合体）
本発明の蛍光標識体を構成する親水性重合体は、その構造中にアニオン性基などの親水性置換基を有するものであり、好ましくはアクリル酸誘導体またはビニル誘導体等のモノマーを重合したものが用いられる。アクリル酸誘導体としては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、２−アミノエチルメタクリレート、３−スルホプロピルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−エチルメタクリル酸グルコシド、Ｎ−アクリロキシサクシニミド等が挙げられ、ビニル誘導体としては、例えば、ビニルスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ビニルジメチルアミン、Ｎ−ビニルジエチルアミン、ビニルホスホン酸ジメチル、ビニルホスホン酸ジエチル等が挙げられるが、用いることのできるモノマーは、これらの化合物に限定されない。中でも、アミノ基を有するアクリル酸誘導体またはビニル誘導体と、スルホン酸基またはリン酸基を有するアクリル酸誘導体またはビニル誘導体とからなる親水性重合体が好ましい。またモノマーは、単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。
【００２３】
親水性置換基としては、アニオン性基の他、水酸基、チオール基、アミノ基、四級アンモニウム基等を挙げることができる。
また、前記親水性重合体は、分子量が好ましくは５〜５００ｋＤａ、より好ましくは５〜１００ｋＤａのものが用いられる。
【００２４】
アニオン性基を有する親水性重合体の調製方法としては、アニオン性基を有するモノマーを重合する方法と、アニオン性基を持たないモノマーを重合して得られる重合体に、アニオン性基を導入する方法のいずれも適用できる。
ここで、アニオン性基としては、好ましくは、スルホン酸基、リン酸基、またはそれらの塩を用いるが、これら以外にも、例えば、ホスフィン酸基（−ｐｈｏｓｐｈｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、スルフィン酸基（−ｓｕｌｆｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、スルフェン酸基（−ｓｕｌｆｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、カルボン酸基、またはそれらの塩等を用いることができる。
【００２５】
（ポリエーテル誘導体）
本発明の蛍光標識体を構成するポリエーテル誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体等を挙げることができる。
これらのポリエーテル誘導体は、例えば、ポリ（エチレングリコール）ビスアミノプロピル、ポリ（プロピレングリコール）ビスアミノプロピルのように、両端にアミノ基等の官能基を有する誘導体を、一端の官能基は親水性重合体と、他方の官能基は蛍光体と反応させることにより、導入されている。
ポリエーテル誘導体は、分子量が好ましくは０．１〜５０ｋＤａ、より好ましくは１０〜３０ｋＤａのものが用いられる。
【００２６】
（蛍光体）
本発明の蛍光標識体を構成する蛍光体としては、例えば、インダセン誘導体、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、インドカルボシアニン誘導体およびフラザン誘導体等を挙げることができる。
また、キサンテン色素体、シアニン色素体、クマリン色素体、ポルフィリン色素体、または複合色素体等の蛍光色素を用いることも出来るが、本発明で蛍光体として用いることのできるものは、これらに限定されるものではない。天然に存在する物質（天然由来物質）は、約２００ｎｍ〜５００ｎｍの比較的短い波長で励起され発光する。従って、蛍光測定時に天然由来物質からの蛍光と誤認しないために、約５００ｎｍを越える波長、好ましくは約５００ｎｍ〜９００ｎｍのスペクトル範囲の光によって励起される前記蛍光体が用いられる。
【００２７】
（蛍光標識体）
本発明の蛍光標識体は、一つの親水性重合体に、複数のポリエーテル誘導体が共有結合により分鎖状に結合しており、その一部のポリエーテル誘導体の末端には、蛍光体が共有結合を介して結合した構造からなる。蛍光体が直接親水性重合体に結合していないため、各蛍光体同士は凝集しにくく、かつ、蛍光標識体は十分な親水性を維持できるため、認識物と結合しても変性しない。
【００２８】
蛍光強度の増幅効果は、親水性重合体１個に対して導入された蛍光体の数が１個である蛍光標識体でも観察される。各測定系において高感度測定を行うためには、親水性重合体１個に対して、蛍光体を好ましくは１〜９０個、より好ましくは３〜６０個導入する。９０個以上の蛍光体を導入することも可能だが、蛍光強度の増幅効果は徐々に低下する。
【００２９】
（蛍光標識認識物）
前記蛍光標識体は、各種認識物を蛍光標識できる。ここで、認識物としては、蛋白質、ペプチド、抗体、抗原、ハプテン、受容体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、天然または合成薬剤、合成オリゴマー、合成ポリマー、ホルモン、リンフォカイン、サイトカイン、トキシン、リガンド、炭水化物、糖、オリゴ糖、多糖等を挙げることができる。
【００３０】
蛍光標識体と前記認識物との結合は、親水性重合体に存在するカルボキシル基、アミノ基等の官能基と、認識物に存在する官能基とを反応させて形成する。例えば、一方の官能基がカルボン酸の場合には、カップリング試薬を用いて反応させる方法のほか、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、カルボン酸ヒドラジド、カルボン酸アジド、活性化エステル等に活性化した後、他方のアミノ基と反応させることができる。また、一方の官能基がアミノ基の場合には、イミノチオランによってチオール化した後、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を用いて他方のアミノ基と結合させる方法がある。
蛍光標識認識物の調製にあたっては、前記蛍光標識体１個あたり、１〜４個の認識物を導入することが好ましい。
【００３１】
（蛍光標識認識物を含む免疫測定試薬及び該試薬を用いた免疫測定方法）
本発明の蛍光標識認識物は、従来の免疫測定法に用いられる、抗体等を結合させた各種免疫測定用の固相試薬とともに、免疫測定に用いることができる。これらの試薬は、周知の１ステップ法、ディレイ１ステップ法、２ステップ法等のサンドイッチ法、競合法等に用いられ、免疫反応により、固相上の抗体等との間に免疫複合体を形成した蛍光標識認識物の蛍光強度を測定することで、免疫測定を実施できる。測定できる物質は、前記蛍光標識認識物と反応あるいは相互作用する物質であり、例えば、生体由来の各種抗原、抗体等を挙げることができる。これら抗原、抗体等を含む検体としては、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液、便抽出液等を挙げることができる。
【００３２】
以下、本発明を実施例等に基づき、さらに詳しく説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［製造例１］
（３−スルホプロピルメタクリレートと２−アミノエチルメタクリレート塩酸とからなる親水性重合体の調製）
３−スルホプロピルメタクリレート１．９７ｇ、２−アミノエチルメタクリレート塩酸０．３３ｇを１００ｍｌのナスフラスコに入れ、これに無水ジメチルホルムアミド２５ｍｌを加えて溶解した。次に、反応開始剤としてＡＩＢＮ１６３ｍｇを加えて脱気し、アルゴンガスに置換した。６５℃に加温したオイルバスにナスフラスコを浸し、３時間反応させた。反応終了後、ナスフラスコに乾燥アセトン１５０ｍｌを加え、生じた沈殿物をガラスフィルターで濾取した。得られた沈殿物を３０〜４０℃に加温しながら真空乾燥させ、３−スルホプロピルメタクリレートと２−アミノエチルメタクリレート塩酸とからなる親水性重合体を２．１ｇ得た。
【００３４】
［実施例１］
（親水性重合体の調製）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸０．５８ｇ、Ｎ−アクリロキシサクシニミド１．１３ｇを２００ｍｌのナスフラスコに入れ、これに無水ジメチルホルムアミド５０ｍｌを加えて溶解した。次に、反応開始剤としてＡＩＢＮ１６３ｍｇを加えて脱気し、アルゴンガスに置換した。６５℃に加温したオイルバスにナスフラスコを浸し、３時間反応させた。反応終了後、ナスフラスコに乾燥酢酸エチル１５０ｍｌを加え、生じた沈殿物をガラスフィルターで濾取した。得られた沈殿物を３０〜４０℃に加温しながら真空乾燥させ、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸とＮ−アクリロキシサクシニミドとからなる親水性重合体を１．３ｇ得た。
【００３５】
（親水性重合体へのポリエチレングリコール誘導体の導入）
ポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパン（アルドリッチ社製）約４．８ｇ（親水性重合体の約２００倍量）の５０ｍｌ水溶液を調製し、塩酸を用いてｐＨ７〜８に合わせた。この溶液に、上記の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸とＮ−アクリロキシサクシニミドとからなる親水性重合体５００ｍｇ（平均分子量３０，０００）のジメチルスルホキシド溶液を、撹拌しながら少量ずつ加えた。室温で３時間反応後、スーパーデックス−２００（ファルマシア社製；３５×６００ｍｍ、５０ｍＭ  ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ１０緩衝液で平衡化）でゲル濾過し、未反応のポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパンを取り除いた。目的物を含むフラクションを集め、透析膜を用いて一昼夜透析後、凍結乾燥し、ポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパンが導入された２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸とＮ−アクリロキシサクシニミドとからなる親水性重合体を約７２０ｍｇ得た。
【００３６】
（蛍光標識体の調製）
次いで、上記のポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパンが導入された親水性重合体５ｍｇを秤量し、５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌに溶解した。次に、この溶液を攪拌しながら、蛍光体４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸スクシミニジルエステル（モレキュラープローブス社製、以下、ＢＯＤＩＰＹ−５６０と略記）２．７ｍｇ／２００μｌ乾燥ジメチルスルホキシド溶液を３０分かけて少量ずつ添加し、添加終了後約２時間攪拌した。攪拌終了後、純水で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）を用いて、未反応のＢＯＤＩＰＹ−５６０とジメチルスルホキシドを取り除いた。目的物を含むフラクションを集め、分画分子量１万の限外ろ過器（ミリポア社製；セントリプレップ−１０）で１ｍｌ程度まで濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、目的物であるＢＯＤＩＰＹ−５６０で標識化された蛍光標識体を３．７ｍｇ得た。
【００３７】
［実施例２］
（親水性重合体の調製）
３−スルホプロピルメタクリレート１．２３ｇ、Ｎ−アクリロキシサクシニミド０．９８ｇを２００ｍｌのナスフラスコに入れ、これに無水ジメチルホルムアミド２５ｍｌを加えて溶解した。次に、反応開始剤としてＡＩＢＮ１６３ｍｇを加えて脱気し、アルゴンガスに置換した。６５℃に加温したオイルバスにナスフラスコを浸し、１時間反応させた。反応終了後、ナスフラスコに乾燥酢酸エチル１５０ｍｌを加え、生じた沈殿物をガラスフィルターで濾取した。得られた沈殿物を３０〜４０℃に加温しながら真空乾燥させ、３−スルホプロピルメタクリレートとＮ−アクリロキシサクシニミドとからなる親水性重合体を１．６ｇ得た。
【００３８】
（親水性重合体へのポリエチレングリコール誘導体の導入）
ポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパン（アルドリッチ社製）約１．４ｇ（親水性重合体の約２００倍量）の５０ｍｌ水溶液を調製し、塩酸を用いてｐＨ７〜８に合わせた。この溶液に、上記の３−スルホプロピルメタクリレートとＮ−アクリロキシサクシニミドとからなる親水性重合体１００ｍｇ（平均分子量４５，０００）のジメチルスルホキシド溶液を、撹拌しながら少量ずつ加えた。室温で３時間反応後、スーパーデックス−２００（ファルマシア社製；３５×６００ｍｍ、５０ｍＭ  ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ１０緩衝液で平衡化）でゲル濾過し、未反応のポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパンを取り除いた。目的物を含むフラクションを集め、透析膜を用いて一昼夜透析後、凍結乾燥し、ポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパンが導入された３−スルホプロピルメタクリレートとＮ−アクリロキシサクシニミドとからなる親水性重合体を約１５０ｍｇ得た。
【００３９】
（蛍光標識体の調製）
次いで、上記のポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパンが導入された親水性重合体５ｍｇを秤量し、１ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解した。次に、この溶液を攪拌しながら、蛍光体Ｎ−エチル−Ｎ−｛５−（Ｎ″−サクシニミジロキシカルボニル）ペンチル｝インドカルボシアニン塩酸塩（同仁化学社製、以下、ＩＣ３と略記）０．３２ｍｇ／２００μｌ乾燥ジメチルスルホキシド溶液を３０分かけて少量ずつ添加し、添加終了後約２時間攪拌した。攪拌終了後、純水で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）を用いて、未反応のＩＣ３とジメチルスルホキシドを取り除いた。目的物を含むフラクションを集め、分画分子量1万の限外ろ過器（ミリポア社製；セントリプレップ−１０）で１ｍｌ程度まで濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、目的物であるＩＣ３で標識化された蛍光標識体を３．８ｍｇ得た。
【００４０】
［実施例３］
（蛍光標識体の調製）
実施例２で用いた、上記のポリエチレングリコール−ビス−３−アミノプロパンが導入された３−スルホプロピルメタクリレートとＮ−アクリロキシサクシニミドとからなる親水性重合体５ｍｇを秤量し、５０ｍＭリン酸緩衝液１ｍｌに溶解した。次に、この溶液を攪拌しながら、ＢＯＤＩＰＹ−５６０（モレキュラープローブス社）２．７ｍｇ／２００μｌ乾燥ジメチルスルホキシド溶液を、３０分かけて少量ずつ添加し、添加終了後約２時間攪拌した。攪拌終了後、純水で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）を用いて、未反応のＢＯＤＩＰＹ−５６０とジメチルスルホキシドを取り除いた。目的物を含むフラクションを集め、分画分子量1万の限外ろ過器（ミリポア社製；セントリプレップ−１０）で１ｍｌ程度まで濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、目的物であるＢＯＤＩＰＹ−５６０で標識化された蛍光標識体を４．５ｍｇ得た。
【００４１】
［実施例４］
（蛍光標識認識物の調製）
αフェトプロテイン抗体２ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７  リン酸緩衝液溶液）をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ８．５に置換した。緩衝液を置換後、イミノチオラン１１７μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）加え、３７℃で１時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、限外ろ過器（ザルトリウス社製；分子量３０，０００カット）で２ｍｌ以下まで濃縮した。濃縮後、ＰＤ−１０カラム（ｐＨ６．３、５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化）で緩衝液を置換し、イミノチオラン化αフェトプロテイン抗体を得た。
次に、実施例１で調製した蛍光標識体０．９ｍｇ（０．０６μｍｏｌ）秤量し、ｐＨ７のリン酸緩衝液に溶解した。この中に、ＧＭＢＳ（同仁化学社製）６．２ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド溶液１８５μｌを加えた。暗所で１時間反応後、ＰＤ−１０カラム（ｐＨ６．３、５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化）で未反応のＧＭＢＳとジメチルホルムアミドを取り除き、ＧＭＢ化蛍光標識体分画を得た。
上記イミノチオラン化αフェトプロテイン抗体とＧＭＢ化蛍光標識体を混和し、暗所で一昼夜反応させた。反応終了後、スーパーデックス２００（ファルマシア社製）を用いて、ＢＯＤＩＰＹ−５６０で蛍光標識化された抗体、すなわち蛍光標識認識物を得た。
【００４２】
（蛍光標識体の蛍光強度の測定）
［試験例１］
（ＢＯＤＩＰＹ−５６０で標識化された蛍光標識体の蛍光強度の測定）
実施例１で調製した蛍光標識体１ｍｇを秤量し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解し、１ｍｇ／ｍｌ溶液とした。この溶液をさらに１／１００希釈し、１０μｇ／ｍｌとした。この溶液を上記緩衝液で３ｎ希釈し、１／２１８７の濃度のものまでサンプルを調製した。これら希釈サンプルの蛍光強度を、蛍光光度計で励起波長５６３ｎｍ、蛍光波長５７３ｎｍで測定した。結果を図２に示す。図２のグラフの縦軸は蛍光強度（５６３／５７３ｎｍと略記）を示し、横軸はＢＯＤＩＰＹ−５６０の濃度を示す。
【００４３】
［試験例２］
（ＩＣ３で標識化された蛍光標識体の蛍光強度の測定）
実施例２で調製した蛍光標識体１ｍｇを秤量し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解し、１ｍｇ／ｍｌ溶液とした。この溶液をさらに１／１００希釈し、１０μｇ／ｍｌとした。この溶液を上記緩衝液で３ｎ希釈し、１／２１８７の濃度のものまでサンプルを調製した。これら希釈サンプルの蛍光強度を、蛍光光度計で励起波長５５２ｎｍ、蛍光波長５６６ｎｍで測定した。結果を図３に示す。図３のグラフの縦軸は蛍光強度（５５２／５６６ｎｍと略記）を示し、横軸はＩＣ３の濃度を示す。
【００４４】
［参考例１］
（ＢＯＤＩＰＹ−５６０単独での蛍光強度の測定）
ＢＯＤＩＰＹ−５６０を少量のジメチルスルホキシドで溶解し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した。さらに、この緩衝液で４ｎ希釈を行い、終濃度として２２５ｎＭ〜０．３ｎＭの濃度のサンプルを調製した。調製したＢＯＤＩＰＹ−５６０溶液を、励起波長５６３ｎｍ、蛍光波長５７３ｎｍで蛍光強度を測定した。結果を図４に示す。図４のグラフの縦軸は蛍光強度（５６３／５７３ｎｍと略記）を示し、横軸はＢＯＤＩＰＹ−５６０の濃度を示す。
【００４５】
［参考例２］
（ＩＣ３単独での蛍光強度の測定）
ＩＣ３のジメチルホルムアミド溶液を調製し、更に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３ｎ希釈を行い、終濃度として２７７ｎＭ〜０．１２６ｎＭの濃度のサンプルを調製した。調製したＩＣ３溶液を、励起波長５５２ｎｍ、蛍光波長５６６ｎｍで蛍光強度を測定した。結果を図５に示す。図５のグラフの縦軸は蛍光強度（５５２／５６６ｎｍと略記）を示し、横軸はＩＣ３の濃度を示す。
【００４６】
図２および４のグラフを比較すると、例えば、ＢＯＤＩＰＹ−５６０単独で６ｎＭの濃度で得られる蛍光強度は、蛍光標識体中のＢＯＤＩＰＹ−５６０では、０．１ｎＭの濃度で得られることから、本発明の蛍光標識体中のＢＯＤＩＰＹ−５６０は、蛍光強度が６０倍程度増幅されていることが確認された。
【００４７】
図３および５のグラフを比較すると、例えば、ＩＣ３単独で１０ｎＭの濃度で得られる蛍光強度は、蛍光標識体中のＩＣ３では、０．８ｎＭの濃度で得られることから、本発明の蛍光標識体中のＩＣ３は、蛍光強度が１３倍程度増幅されていることが確認された。
【００４８】
［実施例５］
（蛍光標識認識物を用いた免疫測定）
実施例４で調製した、蛍光標識認識物を用いて、ＥＬＩＳＡによる免疫測定を行った。
前記蛍光標識認識物と認識部位を異にするαフェトプロテイン抗体を固定化した96穴ＥＬＩＳＡプレート３枚に、αフェトプロテイン抗原（０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を１濃度につき２穴それぞれに５０μｌ加えた。次に、実施例４で調製した蛍光標識認識物をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）で１／１０倍希釈し、５０μｌづつ添加した。添加後、３７℃の恒温槽で振盪させながら１５分、１０分および５分ずつ反応させた。反応終了後、０．０１％トライトンＸ−１００を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）で４回洗浄した。洗浄後、エタノール１００μｌを加え、蛍光プレートリーダー（ＡＲＶＯ−ｓｘ、ワラック社製）で蛍光強度を測定した。結果を図６に示す。図６のグラフの縦軸は蛍光強度（ＡＲＶＯ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示し、横軸はαフェトプロテイン抗原（ＡＦＰと略記）の濃度を示す。
【００４９】
［比較例１］
（アルカリ性フォスファターゼ標識抗体の調製とＥＬＩＳＡによるαフェトプロテインの測定）
市販のアルカリ性フォスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）２７８μｌ（１８ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）を用いて緩衝液を置換した。得られたアルカリ性フォスファターゼをビバスピン（ザルトリウス社製、分子量３０，０００カット）で１ｍｌまで濃縮し、この中にジメチルホルムアミドに溶解したＧＭＢＳ（同仁化学社）５ｍｇ／ｍｌを２０μｌ加えた。室温で１時間反応後、前記と同じＰＤ−１０カラムを用いて未反応のＧＭＢＳとジメチルホルムアミドを取り除き、ＧＭＢ化アルカリ性フォスファターゼを得た。
次に、αフェトプロテイン抗体２ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７リン酸緩衝液溶液）をＰＤ−１０カラム（ファルマシア社）で１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）に置換した。緩衝液を置換後、イミノチオラン１１７μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）加え、３７℃で１時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、限外ろ過器（ザルトリウス社製、分子量３０，０００カット）で２ｍｌ以下まで濃縮した。濃縮後、ＰＤ−１０カラム（ｐＨ６．３、５０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化）で緩衝液を置換し、イミノチオラン化αフェトプロテイン抗体を得た。
前記ＧＭＢ化アルカリ性フォスファターゼとイミノチオラン化αフェトプロテイン抗体を混和し、室温で２時間緩やかに撹拌し、反応させた。反応終了後スーパーデックス−２００で精製し、アルカリ性フォスファターゼで標識化されたαフェトプロテイン抗体を得た。
【００５０】
得られた前記標識抗体を用いて、αフェトプロテインの測定を行った。はじめに、標識抗体と認識部位を異にするαフェトプロテイン抗体を固定化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート３枚に、αフェトプロテイン抗原０〜５０ｎｇ／ｍｌを１濃度につき２穴それぞれに５０μｌ加えた。次に前記の標識抗体を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）で１／２０００倍希釈し、５０μｌそれぞれ添加した。添加後３７℃の恒温槽で振盪させながら１５分、１０分および５分ずつ反応させた。反応終了後、０．０１％トライトンＸ−１００を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）で４回洗浄した。洗浄後、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウムを含む０．１Ｍジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０、１ｍＭ塩化マグネシウム入り）基質液１００μｌを加え、３７℃の恒温槽で振盪させながら酵素反応を２０分間行った。反応終了後、１Ｍ水酸化ナトリウムを５０μｌ加え、酵素反応を停止した。十分に撹拌した後、プレートリーダー（ＭＴＰ−３２、コロナ社製）で波長４０５／６３０ｎｍにて吸光度の測定を行った。その結果を図７に示す。図７のグラフの縦軸は吸光度を示し、横軸はαフェトプロテイン抗原（ＡＦＰと略記）の濃度を示す。
【００５１】
図６および７のグラフを比較すると、標識認識物をＥＬＩＳＡプレートに固定化する時間が同じ場合は、本発明のＢＯＤＩＰＹ−５６０で標識化する方法は、アルカリ性フォスファターゼで標識化する方法と同等の検出感度を有することが確認された。ただし、アルカリ性フォスファターゼで標識化する方法では、酵素反応時間を延長することにより、感度はさらに上昇し、ＢＯＤＩＰＹ−５６０で標識化する方法では、蛍光検出における照射光のエネルギーを高くすれば、感度はさらに上昇する。
【００５２】
したがって、本発明の蛍光標識体を用いる方法は、従来の酵素反応を利用する方法と比較すると、同等の検出感度を持つうえ、高価な基質を必要とせず、酵素と基質を反応するステップを省略できるため、短時間での測定が可能であることが確認された。また、多数の蛍光体を抗体等に導入しても、蛍光標識体は変性を起こさないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、既存の蛍光体を利用して、蛍光強度の高い標識体を提供することができる。また、該蛍光標識体を用いることで、特殊な設備等を必要とせず、免疫測定等をより高感度で安価にかつ迅速に実施できるため、医療分野をはじめ他方面に有用な手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の蛍光標識体を示す模式図である。
【図２】蛍光標識体中のＢＯＤＩＰＹ−５６０の蛍光強度を示すグラフである。
【図３】蛍光標識体中のＩＣ３の蛍光強度を示すグラフである。
【図４】ＢＯＤＩＰＹ−５６０単独での蛍光強度を示すグラフである。
【図５】ＩＣ３単独での蛍光強度を示すグラフである。
【図６】ＢＯＤＩＰＹ−５６０で標識化された蛍光標識認識物を用いて行なった免疫測定の結果を示すグラフである。
【図７】アルカリ性フォスファターゼで標識化された標識認識物を用いて行なった免疫測定の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５５】
１・・・親水性重合体、  ２・・・親水性置換基、  ３・・・ポリエーテル誘導体、  ４・・・蛍光体、  ５・・・アニオン性基
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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