(57)【要約】【課題】  リガンドと試料との結合の有無を高い精度で測定する。【解決手段】  センサユニット１２は、プリズム１４と、流路部材１８とからなる。プリズム１４の上面には、リガンドが固定されるリンカー膜２３が形成される。リンカー膜２２は長細形状をしており、流路部材１８には、このリンカー膜２３へ試料溶液を送液する流路１６が形成される。この流路１６には、注入口１６ａから試料溶液が注入される。注入された試料溶液は、リンカー膜２３と対向する対向部分１６ｃを通過して、排出口１６ｂから排出される。リンカー膜２３と試料との結合反応は、ＳＰＲを利用して測定する。測定ポイントとなる金属膜３１は、流路１６の全長の半分よりも上流側に設定される。このため、結合量が多い上流側で測定が行われるので、高い出力の検出信号が得られる。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され、前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有し、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光を入射させときに、前記結合反応に応じて、その反射光が全反射減衰を生じる減衰角が変化する全反射減衰を利用するセンサユニットにおいて、
前記結合反応の測定ポイントが、前記流路の全長の半分よりも上流側に設けられていることを特徴とする全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項２】
前記薄膜を、前記リガンド固定膜のうち、前記測定ポイントに対応する部分にのみ形成することにより、前記測定ポイントを設定することを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項３】
前記誘電体に照射される照射光の光路内に配置され、前記照射光のうち、前記誘電体を通じて前記測定ポイントに向かう光を透過して、他の部分へ向かう光を遮断する照射光規制部材を設けたことを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項４】
前記流路は、前記リガンド固定膜と対向する対向部分が屈曲していることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項５】
前記流路は、うずまき状又はつづらおり状に屈曲していることを特徴とする請求項４記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項６】
前記リガンド固定膜は、前記流路のほぼ全域に渡って形成されていることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の全反射減衰を利用するセンサユニット。
【請求項７】
透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有するセンサユニットを用い、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、その反射光を受光して前記反射光が全反射減衰を生じる減衰角の変化を検出することにより、前記結合反応を測定する全反射減衰を利用する測定方法において、
前記流路の全長の半分よりも上流側に前記結合反応を検知する測定ポイントを設定して、前記結合反応を測定することを特徴とする全反射減衰を利用する測定方法。
【請求項８】
前記測定ポイントにのみ前記薄膜を形成して前記結合反応を測定することを特徴とする請求項７記載の全反射減衰を利用する測定方法。
【請求項９】
前記測定ポイントにのみ前記光を入射させて前記結合反応を測定することを特徴とする請求項７記載の全反射減衰を利用する測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドと試料との結合反応を測定する全反射減衰を利用するセンサユニット及び全反射減衰を利用する測定方法。
【背景技術】
【０００２】
例えば、細胞から発現する物質のうち、ペプチドやタンパク質と結合する未知の物質を同定，解析するために、質量分析計（マススペクトロメーター）を用いて、質量分析が行われている。質量分析計は、試料となる物質をイオン化し、その質量／電荷比に基づいて分離し、最後にそのイオンを検出し、検出したイオンの分子量を記録する。
【０００３】
この質量分析の対象となる未知の物質を回収する方法として、細胞から発現した物質を試料として含む試料溶液を、ペプチドやタンパク質をリガンドとして固定したリガンド固定膜に送液して接触させ、この後、溶出液をリガンド固定膜に送液して、リガンド固定膜に結合した物質（以下、結合物質という）をリガンドから解離させて、解離した結合物質を回収する回収方法が知られている。
【０００４】
下記特許文献１では、こうした結合物質の回収を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance）センサチップと、このＳＰＲセンサチップを使用してＳＰＲ検出を行うＳＰＲ測定装置を使用して行う方法が開示されている。ＳＰＲとは、金属中の自由電子が集団的に振動することによって生じ、その金属の表面に沿って進む自由電子の粗密波である。ＳＰＲセンサチップは、透明な誘電体と、この誘電体上に形成され、一方の面が試料の反応を検知するセンサ面となる金属膜を持っている。前記誘電体を通じて前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように（臨界角以上の入射角で）光を入射すると、その光入射面において全反射が起こるが、入射光のうちわずかな光は反射せずに金属膜内を通過して、センサ面に染み出す。この染み出した光波はエバネッセント波と呼ばれ、このエバネッセント波と表面プラズモンの振動数が一致して共鳴すると（ＳＰＲが発生すると）、反射光の強度が大きく減衰する。ＳＰＲ測定装置は、前記光入射面で反射する反射光の減衰を捉えることにより、その裏側のセンサ面で発生するＳＰＲを検出する。
【０００５】
ＳＰＲを発生させるための光の入射角（共鳴角）は、エバネッセント波および表面プラズモンが伝播する媒質の屈折率に依存する。言い換えると、媒質の屈折率が変化すれば、ＳＰＲを発生させる共鳴角が変化する。センサ面と接する物質は、エバネッセント波および表面プラズモンを伝播させる媒質となるので、例えば、センサ面において、２種類の分子間の結合や解離などの反応が生じると、それが媒質の屈折率の変化として顕れて、共鳴角が変化する。ＳＰＲ測定装置は、この共鳴角の変化を捉えることにより分子間の相互作用を測定する。
【０００６】
このＳＰＲ測定装置を使用して、リガンドと試料とを接触させれば、ＳＰＲ信号の測定により、試料とリガンドとの結合の有無を調べられるので、質量分析の前に、回収液に結合物質が含まれているかいないかを識別して、質量分析の対象を絞り込むことができるので、質量分析作業を効率化できる。
【０００７】
下記特許文献１記載のＳＰＲ測定装置には、ＳＰＲセンサチップが着脱自在にセットされる。このＳＰＲセンサチップのセンサ面には、リガンドを固定するリガンド固定膜が形成される。ＳＰＲ測定装置には、前記センサ面へ液体を送液する流路が形成された流路部材が設けられており、ＳＰＲセンサチップは、前記流路とセンサ面とが対向するように装着される。
【０００８】
リガンド固定膜への結合物質の結合の有無は、試料溶液を流路へ注入して、試料溶液とリガンド固定膜とを接触するときのＳＰＲ信号を測定することにより調べられる。
【０００９】
【特許文献１】特表平９−５００２０８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
所定量の試料溶液を用いて結合物質の結合量を多くするには、試料溶液をリガンド固定膜と接触させる流路長は長い方がよいため、流路の形状は細長になる。こうした細長の流路では、流路の注入口から排出口までの全長のうち、どの位置をＳＰＲ信号の測定ポイントとするかによってＳＰＲ信号の出力レベルが変化する。出力レベルが小さいと測定精度が低下するため、高い出力レベルのＳＰＲ信号を取得することが求められていた。
【００１１】
本発明の目的は、高い出力レベルの測定信号を取得して、結合物質とリガンドとの結合反応の測定精度を向上することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の全反射減衰を利用するセンサユニットは、透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され、前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有し、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光を入射させときに、前記結合反応に応じて、その反射光が全反射減衰を生じる減衰角が変化する全反射減衰を利用するセンサユニットにおいて、前記結合反応の測定ポイントが、前記流路の全長の半分よりも上流側に設けられていることを特徴とする。
【００１３】
前記測定ポイントは、例えば、前記薄膜を、前記リガンド固定膜のうち、前記測定ポイントに対応する部分にのみ形成することにより、上流側に設定される。
【００１４】
前記誘電体に照射される照射光の光路内に配置され、前記照射光のうち、前記誘電体を通じて前記測定ポイントに向かう光を透過して、他の部分へ向かう光を遮断する照射光規制部材を設けてもよい。
【００１５】
前記流路は、前記リガンド固定膜と対向する対向部分が、例えば、うずまき状又はつづらおり状に屈曲されていることが好ましい。
【００１６】
前記リガンド固定膜は、前記流路のほぼ全域に渡って形成されていることが好ましい。
【００１７】
本発明の全反射減衰を利用する測定方法は、透明な誘電体と、この誘電体の上面に形成されリガンドが固定されたリガンド固定膜と、このリガンド固定膜と対向して配置され、前記リガンドと結合する結合物質を含む試料溶液を前記リガンド固定膜と接触させながら送液する細長い流路が形成された流路部材と、前記リガンド固定膜と前記誘電体の間に形成され前記リガンド固定膜と接する一方の面が前記リガンドと前記結合物質との結合反応を検知するセンサ面となる薄膜とを有するセンサユニットを用い、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、その反射光を受光して前記反射光が全反射減衰を生じる減衰角の変化を検出することにより、前記結合反応を測定する全反射減衰を利用する測定方法において、前記流路の全長の半分よりも上流側に前記結合反応を検知する測定ポイントを設定して、前記結合反応を測定することを特徴とする。
【００１８】
前記測定ポイントにのみ前記薄膜を形成して前記結合反応を測定したり、前記測定ポイントにのみ前記光を入射させて前記結合反応を測定することが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、誘電体上に形成されたリガンド固定膜に対応して流路が形成された流路部材を備えたセンサユニットを用い、前記誘電体を通じて前記薄膜の裏面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、その反射光を受光して前記反射光が全反射減衰を生じる減衰角の変化を検出することにより、前記リガンドと試料との結合反応を測定する際に、前記流路の全長の半分よりも上流側に前記結合反応を検知する測定ポイントを設定して、前記結合反応を測定するようにしたから、高い出力レベルの測定信号を取得して、測定精度を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図１に示すセンサユニット１２は、透明な誘電体であるプリズム１４と、液体を送液する流路１６が形成された流路部材１８と、この流路部材１８を、プリズム１４の上面に圧接させ、流路部材１８とプリズム１４とを一体的に保持する保持部材１９と、この保持部材１９の上面に、両面テープ２１によって取り付けられる蓋部材２２とからなる。
【００２１】
プリズム１４の上面には、リガンドを固定するリガンド固定膜となるリンカー膜２３が形成されている。このリンカー膜２３には、流路１６を通じて、リガンドと結合する結合物質を含む試料を溶媒に溶かした試料溶液が送液される。試料溶液がリンカー膜２３と接触すると、結合物質がリガンドと結合してリンカー膜２３に固定される。
【００２２】
センサユニット１２は、ＳＰＲを利用して、この結合物質のリンカー膜２３への結合反応を測定するＳＰＲセンサである。図２に示すように、センサユニット１２は、ＳＰＲ測定機に着脱自在にセットされる。ＳＰＲ測定機には、前記結合反応を測定する測定部と、前記流路１６への前記試料溶液の注入と排出とを行う一対のピペット２８ａ，２８ｂを備えた分注ヘッド２８とが設けられている。測定部は、センサユニット１２に対して光を照射する照明部２６と、センサユニット１２で反射した反射光を受光して測定信号を出力する検出器２７とからなる。
【００２３】
保持部材１９の上部には、流路１６の注入口１６ａ及び排出口１６ｂに対応する位置に、ピペット２８ａ，２８ｂの先端を、注入口１６ａ及び排出口１６ｂに誘い込む受け入れ口１９ｂが形成されている。保持部材１９が流路部材１８を挟み込んでプリズム１４と係合すると、受け入れ口１９ｂと、注入口１６ａ及び排出口１６ｂとが連結される。
【００２４】
また、これら各受け入れ口１９ｂの両脇には、円筒形のボス１９ｃが設けられている。これらのボス１９ｃは、蓋部材２２に形成された穴２２ａと嵌合して、蓋部材２２を位置決めするためのものである。
【００２５】
蓋部材２２は、流路１６に通じる受け入れ口１９ｂを覆うことで、流路１６内の液体の蒸発を防止する。蓋部材２２は、弾性部材、例えば、ゴムやプラスチックで形成されており、各受け入れ口１９ｂに対応する位置に、十字形のスリット２２ｂが形成されている。ピペット２８ａ，２８ｂは、スリット２２ｂを押し広げながら挿入される。スリット２２ｂは、ピペット２８ａ，２８ｂが引き抜かれると、弾性力によって初期状態に復帰して、受け入れ口１９ｂを塞ぐ。
【００２６】
流路部材１８は、断面が四角形の長尺の各柱状をしており、弾性部材で形成されている。流路１６は、リンカー膜２３と対向して配置され試料溶液をリンカー膜２３に接触させながら送液する直線状の対向部分１６ｃと、この対向部分１６ｃの両端から流路部材１８の上面１８ａに向けて流路部材１８を縦方向に貫通する貫通部分１６ｄとからなる。
【００２７】
一方の貫通部分１６ｄの上端が、注入口１６ａとなり、他方の貫通部分１６ｄの上端が、排出口１６ｂとなる。流路１６の管径は、例えば、約１ｍｍ程度であり、注入口１６ａと排出口１６ｂの間隔は、例えば、約１０ｍｍ程度である。対向部分１６ｃは、流路部材１８の底面１８ｂに形成された溝であり、流路部材１８の底面に圧接されるプリズム１４の上面によってその開放部位が覆われて封止される。
【００２８】
プリズム１４は、例えば、断面が台形の棒状をしている。プリズム１４の素材としては、例えば、ホウケイクラウン（ＢＫ７）やバリウムクラウン（Ｂａｋ４）などに代表される光学ガラスや、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネイト（ＰＣ）、非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）などに代表される光学プラスチックなどが用いられる。
【００２９】
プリズム１４と流路部材１８とは、保持部材１９によって一体的に保持される。プリズム１４の長手方向の両側面１４ｃには、保持部材１９の係合部１９ａと係合する係合爪１４ａが設けられている。これらの係合により、流路部材１８が、保持部材１９とプリズム１４とによって挟み込まれる。また、プリズム１４の短辺方向の両端部には、突部１４ｂが設けられている。この突部１４ｂは、センサユニット１２をホルダ（図示せず）に収納する際に、その内壁と係合してその収納位置を位置決めする位置決め部材である。
【００３０】
プリズム１４の上面には、リンカー膜２３が短冊状に形成されている。このリンカー膜２３は、対向部分１６ｃを流れる試料溶液と接触する接触面積が多くなるように、対向部分１６ｃのほぼ全域に渡って設けられる。
【００３１】
図３（Ａ）に示すように、試料溶液は、注入口１６ａから注入されて、対向部分１６ｃを通過して、排出口１６ｂから排出される。この送液中に試料溶液内の結合物質が拡散してリガンドと結合する。そのため、図３（Ｃ）に示すように、リンカー膜２３への試料の結合量は、対向部分１６ｃの上流側（注入口１６ａ側）ほど多く、下流側（排出口１６ｂ）に向けて少ない。結合量が多い方が測定信号のレベルも高いので、図３（Ｂ）に示すように、リガンドと結合物質との結合反応を測定する測定ポイントは、対向部分１６ｃの全長の半分よりも上流側に設けられている。
【００３２】
測定ポイントには、表面が前記結合反応を検知するセンサ面３１ａとなる金属膜３１が設けられる。金属膜３１は、略矩形状をしており、その長さは、リンカー膜２３の長さに比べて短い。金属膜３１は、プリズム１４の上面に、例えば、蒸着によって形成される。金属膜３１としては、例えば、金が使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。この膜厚は、金属膜の素材、照射される光の発光波長などに応じて適宜選択される。リンカー膜２３は、その一部がセンサ面３１ａを横切るように金属膜３１に重ねられる。これにより、金属膜３１がプリズム１４とリンカー膜２３との間に挟み込まれる。
【００３３】
プリズム１４の各側面１４ｃは、一方が光照射面となり、他方が光出射面となる。照明部２６は、一方の側面１４ｃに光を照射して、センサ面３１ａの裏面３１ｂに向けて全反射条件を満足するように光を入射させる。検出器２７は、裏面３１ｂで反射して他方の側面１４ｃから出射した光を受光する。
【００３４】
裏面３１ｂに、全反射条件を満たすように光を入射すると、センサ面３１ａにはＳＰＲが発生する。ＳＰＲが発生すると、裏面３１ｂで反射する反射光は、減衰する。この減衰が生じる共鳴角は、センサ面３１ａ上の前記結合反応に応じて変化する。共鳴角の変化は、検出器３３の受光面内の減衰位置の変化として現れる。検出器３３は、前記減衰位置の変化を表す測定信号を出力する。この測定信号に応じて前記結合反応の有無が測定される。
【００３５】
また、図示しないが、このセンサユニット１２には、個々のユニットを識別できるように各ユニット毎の識別ＩＤなどの情報を含むバーコードが記録されている。各センサユニット１２に識別ＩＤを記録しておけば、例えば、各センサユニット１２毎の測定結果と、注入した試料溶液の種類などを対応付けてデータを管理することが可能になる。なお、バーコードを設ける代わりに、例えば、ＲＦＩＤタグなどのＩＣタグを設けてもよい。
【００３６】
以下、上記構成による作用について説明する。測定部による信号測定を開始した後、リガンド固定済みのセンサユニット１２に対して、分注ヘッド２８によって、試料溶液が注入される。注入口１６ａから注入された試料溶液は、対向部分１６ｃに進入し、対向部分１６ｃを注入口１６ａから排出口１６ｂに向けて流れてその間にリンカー膜２３と接触する。これにより、試料に含まれる結合物質とリンカー膜２３とが結合する。この間、センサ面３１ａの反応状況に応じた測定信号が取得される。測定ポイントは、対向部分１６ｃの上流側にあるため、信号レベルの高い測定信号が得られるので、高い精度で測定することができる。
【００３７】
この測定結果に基づいて、結合反応を検知した場合には、試料に結合物質が含まれていたことが検知されるので、分注ヘッド２８で解離用バッファを流路１６に注入して、結合物質をリンカー膜２３から解離させて回収する。回収された結合物質は、質量分析機に送られて分析がなされる。
【００３８】
上記実施形態では、短冊状のリンカー膜に対応して直線状の流路を持つセンサユニットを例に説明しているが、流路は直線状でなくてもよく、図４（Ａ），（Ｂ）に示すように、屈曲した流路を用いてもよい。図４（Ａ），（Ｂ）は、各流路４１，４６の上面図である。図４（Ａ）に示す流路４１は、注入口４１ａと排出口４１ｂの間が渦巻き状に屈曲しており、この流路４１の屈曲に合わせてリンカー膜が形成されている。そして、金属膜が設けられる測定ポイント４２は、流路４１の注入口４１ａに近い上流側に設定される。図４（Ｂ）に示す流路４６は、注入口４６ａと排出口４６ｂの間がつづら折り状に屈曲されており、測定ポイント４７が流路４６の上流側に設定される。
【００３９】
このように、流路を屈曲させることで、センサユニットの全長を抑えながら、流路長を長くすることができる。流路長を長くすると、リンカー膜の面積が広がるので、結合物質の結合量及び回収量を稼ぐことができる。なお、流路の屈曲形状として、渦巻き状及びつづら折り状を例に説明したが、屈曲形状はこれ以外にも各種の形状が考えられ、どのような形状でもよい。
【００４０】
また、上記実施形態では、リンカー膜の一部に金属膜を設けて、これを測定ポイントとする例で説明したが、このように金属膜の位置で測定ポイントを設定しなくてもよい。例えば、図５に示すセンサユニット５１は、保持部材５２の側板５３が、プリズム１４の側面１４ｃ全体を覆う大きさで形成されており、その側板５３には、光透過窓５３ａが形成されている。側板５３は、照明部がプリズム１４に照射する照射光の光路内に配置されているので、照射光は、光透過窓５３ａを通してのみプリズム１４に入射し、他の部分では遮断される。このように側板５３によって照射光を規制すれば、図５（Ｂ）に示すように、金属膜５４をリンカー膜２３の全面に設けても、光の入射位置が制限される。光透過窓５３ａを流路１６の全長の半分よりも上流側に配置すれば、測定ポイントを上流側に設定することができる。
【００４１】
また、本実施形態では、センサ面上にＳＰＲを発生させて、そのときの反射光の減衰を検出するＳＰＲセンサを利用して、リガンドと試料との結合反応を測定する例で説明しているが、ＳＰＲセンサに限らず、全反射減衰を利用する他のセンサを用いてもよい。全反射減衰を利用するセンサとしては、ＳＰＲセンサの他に、例えば、漏洩モードセンサが知られている。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を透過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において、導波モードが励起されると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。導波モードが励起される入射角は、ＳＰＲの共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】センサユニットの分解斜視図である。
【図２】リガンドと試料との結合反応を測定する測定方法の説明図である。
【図３】測定ポイントの位置の説明図である。
【図４】屈曲した流路の説明図である。
【図５】光の入射位置を制限して測定ポイントを設定する例の説明図である。
【符号の説明】
【００４３】
１２  センサユニット
１４  プリズム
１６  流路
１６ａ  注入口
１６ｂ  排出口
１６ｃ  対向部分
１８  流路部材
２３  リンカー膜
２８  分注ヘッド
３１  金属膜
３１ａ  センサ面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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