(57)【要約】     【課題】インビトロで、簡便且つ確実に血管強化剤等をスクリーニングする方法を提供する。    【解決手段】血管内皮細胞を播種したコラーゲンゲルを、被検試料と共に一定時間培養し、当該コラーゲンゲルのゲル面積を測定することにより被検試料のゲル収縮抑制効果を判定することを特徴とする血管内皮細胞収縮抑制剤又は血管強化剤のスクリーニング方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞を播種したコラーゲンゲルを、被検試料と共に一定時間培養し、当該コラーゲンゲルのゲル面積を測定することにより被検試料のゲル収縮抑制効果を判定することを特徴とする血管内皮細胞収縮抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
血管内皮細胞を播種したコラーゲンゲルを、被検試料と共に一定時間培養し、当該コラーゲンゲルのゲル面積を測定することにより被検試料のゲル収縮抑制効果を判定することを特徴とする血管強化剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
一定時間培養後、血管内皮細胞収縮物質を添加するものである請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
血管内皮細胞収縮物質がトロンビンである請求項３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンゲルを用いた血管強化剤等のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スパイダーベイン（くも状血管）、静脈瘤、酒さ、毛細血管過拡張症、紫斑病、鼻出血、眼底出血、慢性静脈不全症等の抹消血管疾患は、血管組織の機械的強度の低下、血管透過性の亢進等、血管が脆弱化することにより発症することが知られている。従って、斯かる疾患の予防・治療には、血管組織の機械的強度や毛細血管の抵抗性を高める血管強化薬が有効であると考えられ、例えばヘスペリジン、ルチンといったＦｌａｖｏｎｉｄ類が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
血管組織の強度は、紫斑計を用いて皮膚を一定の圧力で吸引し、できた紫斑を計数する、出血斑形成試験等により測定されている。しかしながら、斯かる測定法は、ヒトあるいは動物で試験されるものであり、多くの化合物の候補中から迅速に有効な薬剤を選定するには充分な方法とはいえない。
すなわち、血管強化剤を簡易に選定するための有効な方法は、未だ見出されていないのが現状である。
【０００４】
一方、線維芽細胞をコラーゲンゲル中に埋包培養すると、コラーゲンゲルが収縮することや（例えば、非特許文献２参照）、線維芽細胞埋包コラーゲンゲルを用いることにより、皮膚のたるみを測定できることが報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、血管内皮細胞をコラーゲンゲルに播種した報告はこれまでになく、当該ゲルが血管内皮細胞の収縮力に応じて収縮することは全く知られていない。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−９５７１３号公報
【非特許文献１】V. Ibegbuna et al. Angiology, 48, 45-49 (1997)
【非特許文献２】Review: E. Bell et al. J. Invest. Dermatol.,81,2s(1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、インビトロで、簡便且つ確実に血管強化剤等をスクリーニングする方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、血管内皮細胞を用いたスクリーニング系について検討したところ、血管内皮細胞をコラーゲンゲル上に播種した場合に、当該細胞の収縮力に応じてコラーゲンゲルが収縮することを見出し、当該コラーゲンゲルを被検試料と共に培養し、被検試薬のゲル収縮抑制効果を判定すれば、血管内皮細胞収縮抑制剤、更には血管強化剤を評価できることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、血管内皮細胞を播種したコラーゲンゲルを、被検試料と共に一定時間培養し、当該コラーゲンゲルのゲル面積を測定することにより被検試料のゲル収縮抑制効果を判定することを特徴とする血管内皮細胞収縮抑制剤又は血管強化剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、血管の脆弱化に起因する末梢血管疾患の予防、改善又は治療を目的とした医薬又は化粧料として有用な血管内皮細胞収縮抑制剤又は血管強化剤を、インビトロで、簡便且つ確実に評価、選定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において用いられる血管内皮細胞としては、コラーゲンゲルを収縮させる作用のある細胞であれば使用することができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウシ、サル、ニワトリ、ウマ等の哺乳動物の血管内皮細胞を用いることができ、中でもヒト、ウサギ又はウシの細胞を用いるのが好ましい。また血管の種類は限定されず、臍帯静脈由来血管内皮細胞、大動脈由来血管内皮細胞、大静脈由来血管内皮細胞、皮膚微小血管内皮等を用いることができる。特に、比較的多量の細胞を安定に入手できる点から、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞を用いるのが好ましい。
斯かる細胞は、組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品を購入して用いてもよい。
【００１２】
本発明において用いられるコラーゲンとしては、動物由来のコラーゲンであればいずれでもよいが、動物としては哺乳類が好ましく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシ等由来のコラーゲンがより好ましい。これらのコラーゲンは組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品（例えば新田ゼラチン社製、type I-A）を購入して用いてもよい。
【００１３】
コラーゲンゲルは、公知の方法に準じて作製できる。コラーゲンゲル作製時のコラーゲンの濃度は、例えば0.1〜10mg／mLが好ましく、1.0〜5.0mg／mLがより好ましい。作製されるコラーゲンの形状はいずれの形状でもよいが、円形の培養プレートで作製した円柱型が好ましい。
作製されたコラーゲンゲル上へ血管内皮細胞が播種されるが、当該細胞の密度は0.25×104〜20.0×104cells／cm2が好ましく、1.0×104〜 10.0×104cells／mlがより好ましい。
【００１４】
上記のコラーゲンゲルに添加する被検試料としては、例えば、化合物、化学物質、動植物抽出物等が広く適用される。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法は、上記のように作製されたコラーゲンゲルをスクリーニングする対象物である被検試料と共に一定時間培養し、当該コラーゲンゲルのゲル面積を測定し、当該被検薬のゲル収縮抑制効果を判定するものである。
【００１６】
一定時間とは、添加した被検試料がコラーゲンゲル上の血管内皮細胞に作用し、ゲル収縮抑制効果を発揮するのに十分な時間をいい、1分〜48時間程度、好ましくは30分〜2時間程度が一般的である。
【００１７】
培養は、コラーゲンゲルに被検試料が添加された後、細胞活動が維持できるような条件であればよく、用いる培地としては、例えばＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９等が挙げられる。例えば、好適な培養法として、被検試料を加えた後、培養ウェルを無血清培地に置き換えると共に、ゲルをウェルから剥がして、浮遊培養する方法が挙げられる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法においては、上記培養終了後、血管内皮細胞収縮物質を添加し、内皮細胞の収縮を増強せしめるのが、評価の迅速化、高い再現性を求める点から好ましい。斯かる血管収縮物質としては、トロンビン、ブラジキニン、ヒスタミン等が挙げられ、特にトロンビンが好ましい。また、血管内皮細胞収縮物質の添加量は、トロンビンの場合、培養容器中の終濃度で0.2〜10.0Units／mlであるのが好ましい。
【００１９】
被検試薬のゲル収縮抑制効果は、当該コラーゲンゲルのゲル面積を測定することにより行われる。具体的には、培養容器上部より写真撮影し、コラーゲンゲルの上端円部の直径を水平方向および垂直方向について計測し、平均化したものを平均直径とみなし、その値からゲル上端円部の面積を求める。
【００２０】
このように、被検試薬のゲル収縮抑制効果を判定することにより血管内皮細胞収縮抑制効果が判定できる。こうした血管内皮収縮抑制の作用は、炎症や創傷、熱傷のような組織が障害を受けた際に分泌されるブラジキニンやトロンビンといった細胞収縮物質の刺激や、血管が収縮損傷を受けたり血管からの物質漏出を起こすことに対して抵抗性を示すことを意味する。従って、血管強化作用の判定が可能である。
かように、コラーゲンゲルのゲル面積を測定する方法によれば、血管内皮細胞収縮抑制剤及び血管強化剤を適切且つ簡易にスクリーングすることができる。
【実施例】
【００２１】
実施例１  コラーゲンゲル収縮抑制作用の評価方法
血管内皮細胞用三次元培養キット（岩城硝子）のコラーゲンゲル溶液を処方通りに混和調製し、２４穴マイクロプレート（１８９ｍｍ2／ウェル）に５００μｌ／ウェルづつ分注したのち３７℃にて３０分以上インキュベートして固化させた。そのゲル上にヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を０．７×１０5ケ／ウェルの密度で播種し、細胞を定着させた。播種時には、血管内皮細胞用基礎培地ＥＢＭ−２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）にウシ血清（関東化学）を１０％添加した培地を用いた。播種して２４時間後、それぞれの培養ウェルを、表１に示すヘスペリジンを加えた無血清培地（ＥＢＭ−２）に置き換えるとともにゲルをウェルから剥がして浮遊培養した。コントロールには、ヘスペリジンを加えないＥＢＭ−２を用いた。１７時間培養後、すべてのウェルをトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を０．５Ｕ／ｍｌ含むＥＢＭ−２に置換し、３０分後に、収縮したゲルの上部径を計測することでゲル面積を算出した。効果判定には、植物抽出物の収縮抑制率を求めた。即ち、植物抽出物添加試料とコントロールとのゲル面積の差をコントロールのゲル面積の収縮量に対する割合で示した（下記式１）。結果を表１に示す。
血管強化剤として知られるヘスペリジンの注加濃度に依存してコラーゲンゲルの収縮が抑制されており、本発明の方法が血管強化剤のスクリーニング方法となり得ることが分かる。
【００２２】
【数１】
2006034157.tif 000002
【００２３】
【表１】
2006034157.tif 000003