(57)【要約】【課題】蛋白質に比べて核酸に対する結合力が選択的に高いｐＨ依存性のイオン交換物質、それが固定化されている固体基板、及び物質及び固体基板を利用して核酸を分離する方法を提供する。【解決手段】下記化学式ＭＯ、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３からなる群から選択される少なくとも一種の単量体由来の構成単位を含み、Ａを有する単量体及びＢを有する単量体由来の構成単位が少なくとも一種含まれ、重合度は２〜３０、０００であるｐＨ依存性のイオン交換物質であり：    【化１】2006326581.tif 000009  式中、Ａは、−Ｘ（ＣＨ２）ｎＹであり、この際、ｎが１〜１０の整数であり、Ｘが活性化エステルと反応できる官能基であり、Ｙが第１級、第２級、第３級アミノ基または窒素含有の芳香族複素環塩基であり、Ｂは、−Ｘ’（ＣＨ２）ｎＹ’であり、この際、ｎが１〜１０の整数であり、Ｘ’が活性化エステルと反応できる官能基であり、Ｙ’がｐＫａ値が４以下の酸発生基であり、Ｒ３は、炭素数が１〜１０のアルキレン基である。【選択図】図１
2006326581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式ＭＯ、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３からなる群から選択される少なくとも一種の単量体由来の構成単位を含み、Ａを有する単量体及びＢを有する単量体由来の構成単位が、少なくとも一種含まれ、重合度は２〜３０，０００であり、
【化１】
2006326581.tif 000008
ただし、
Ａは、−Ｘ（ＣＨ２）ｎＹであり、この際、ｎが１〜１０の整数であり、Ｘは、活性化エステルと反応できる官能基であり、Ｙは、第１級、第２級、第３級アミノ基または窒素含有の芳香族複素環塩基であり、
Ｂは、−Ｘ’（ＣＨ２）ｎＹ’であり、この際、ｎは、１〜１０の整数であり、Ｘ’は、活性化エステルと反応できる官能基であり、Ｙ’は、ｐＫａ値が４以下の酸発生基であり、
Ｒ３は、炭素数が１〜１０のアルキレン基、であるｐＨ依存性のイオン交換物質。
【請求項２】
Ａは、−Ｘ（ＣＨ２）ｎＹであり、この際、ｎは、１〜１０の整数であり、Ｘは、活性化エステルと反応する官能基であり、Ｙは、ピリジニル、ピロリルまたはイミダゾリル基であることを特徴とする、請求項１に記載のｐＨ依存性のイオン交換物質。
【請求項３】
Ｂは、−Ｘ’（ＣＨ２）ｎＹ’であり、この際、ｎは、１〜１０の整数であり、Ｘ’は、活性化エステルと反応する官能基であり、Ｙ’は、スルホニル、スルフェニル、スルフィニルまたはホスホリル基であることを特徴とする、請求項１または２に記載のｐＨ依存性のイオン交換物質。
【請求項４】
前記Ａまたは前記Ｂ中のＸまたはＸ’は、−ＮＨ−、−Ｏ−または−Ｓ−であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐＨ依存性のイオン交換物質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のｐＨ依存性のイオン交換物質が表面に固定化されていることを特徴とする、固体基板。
【請求項６】
前記固体基板は、マイクロ流体素子内のマイクロチャンネルの形態を有することを特徴とする、請求項５に記載の固体基板。
【請求項７】
前記イオン交換物質が固定化される固体基板は、シリカ、融合シリカ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スライドガラス及びシリコンウェーハからなる群から選択されることを特徴とする、請求項５または６に記載の固体基板。
【請求項８】
核酸を含む試料を請求項１〜４のいずれか１項に記載のｐＨ依存性のイオン交換物質と第１ｐＨで接触させる工程と、
核酸が結合された前記イオン交換物質を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨを有する溶液にさらしてイオン交換物質から核酸を放出させる工程と、
を含むことを特徴とする、ｐＨ依存性のイオン交換物質を利用して核酸を精製する方法。
【請求項９】
前記第１ｐＨは、２〜３．５であり、前記第２ｐＨは、７〜１０であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸を含む試料を請求項５〜７のいずれか１項に記載のｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化されている固体基板に第１ｐＨで接触させる工程と、
核酸が結合された前記イオン交換物質を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨを有する溶液にさらしてイオン交換物質から核酸を放出させる工程と、
を含むことを特徴とする、ｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化されている固体基板を利用した核酸の精製方法。
【請求項１１】
前記第１ｐＨは、２〜３．５であり、前記第２ｐＨは、７〜１０であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体基板は、マイクロ流体素子内のマイクロチャンネルの形態を有することを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イオン交換物質が固定化される固体基板は、シリカ、融合シリカ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スライドガラス及びシリコンウェーハからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸に対する結合力が特異的に高いｐＨ依存性のイオン交換物質、前記物質が固定化されている固体基板及びそれを利用して核酸を分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ｐＨ依存性のイオン交換物質（マトリックス）を利用した核酸の分離方法が知られていた。例えば、特許文献１には、イオン化可能な基を有している物質を利用する、核酸の分離方法が開示され、前記イオン化可能な基は、第１ｐＨにおいて正電荷を有して核酸と結合でき、前記第１ｐＨよりも高い第２ｐＨにおいて前記核酸を放出させる。イオン化可能な基を有している物質の例としては、Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミドジアセト酸（ＡＤＡ）、Ｎ−トリヒドロキシメチル−メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）及びトリヒドロキシメチルアミノエタン（Ｔｒｉｓ）などが含まれる。また、特許文献２には、シリカ磁性粒子および複数個の第１イオン交換リガンドを含むｐＨ依存性のイオン交換物質（マトリックス）を利用して核酸を分離する方法が開示され、前記複数個の第１イオン交換リガンドは、前記芳香族炭化水素環に共有的に付着されているスペーサ、及び第１末端で前記シリカ磁性粒子に付着されており第２末端で前記スペーサに付着されているリンカーアルキル鎖を含むリンカーを有する。
【０００３】
しかし、前記従来の技術においては、イオン化可能な基を有している物質と核酸との結合速度が速く、かつ、ｐＨを上昇させた場合に核酸を放出する効率の高い物質が、依然として要求されていた。また、従来の技術では、ＤＮＡだけでなく蛋白質までもが結合してしまい、核酸に対する選択性が低いという問題点を有していた。これにより、本願の発明者は、高い選択性で核酸を結合でき、ｐＨを上昇させた場合に核酸を放出する効率が顕著に高い物質を探索する中で、ｐＫａ値が４以下である酸の官能基と塩基を含むｐＨ依存性のイオン交換物質を知得し、本発明を完成するに至った。
【特許文献１】米国特許公開第２００１／００１８５１３号
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１９９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明に係る目的は、第１ｐＨにおいて、蛋白質に対する結合力に比べて核酸に対する結合力が相対的に強く、選択的に核酸と結合でき、ｐＨを上昇させたときに核酸の放出効率の高い、ｐＨ依存性のイオン交換物質を提供することである。
本発明に係る他の目的は、前記物質が固定化されている固体基板を提供することである。
本発明に係るさらに他の目的は、前記本発明に係る物質またはそれが固定化された基板を利用して核酸を分離する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明による一態様おいて、下記化学式ＭＯ、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３からなる群から選択される一種以上の単量体由来の構成単位を含み、Ａを有する単量体及びＢを有する単量体由来の構成単位が、少なくとも一種含まれ、重合度は、２〜３０，０００であるｐＨ依存性のイオン交換物質を提供する：
【０００６】
【化１】
2006326581.tif 000003
【０００７】
ただし、
Ａは、−Ｘ（ＣＨ２）ｎＹであり、この際、ｎは、１〜１０の整数であり、Ｘは、活性化エステルと反応しうる官能基であり、Ｙは、第１級、第２級、第３級アミノ基または窒素含有の芳香族複素環塩基であり、
Ｂは、−Ｘ’（ＣＨ２）ｎＹ’であり、この際、ｎは、１〜１０の整数であり、Ｘ’は、活性化エステルと反応できる官能基であり、Ｙ’は、ｐＫａ値が４以下の酸発生基であり、
Ｒ３は、炭素数が１〜１０のアルキレン基である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質及びそれが固定化されている固体基板によれば、蛋白質に対する結合力は弱いが、核酸に対しては高い結合力を維持していて、選択的な核酸の分離に有用である。
【０００９】
本発明に係る核酸分離方法によれば、核酸に対する高い選択性及び高い回収率で核酸を分離できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明による一態様によると、下記化学式ＭＯ、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３からなる群から選択される少なくとも一種の単量体が結合されており、Ａを有する単量体及びＢを有する単量体が少なくとも一種含まれ、重合度は２〜３０，０００であるｐＨ依存性のイオン交換物質を提供する：
【００１１】
【化２】
2006326581.tif 000004
【００１２】
ただし、Ａは、−Ｘ（ＣＨ２）ｎＹであり、この際、ｎが１〜１０の整数であり、Ｘは、活性化エステルと反応しうる官能基であり、Ｙは、第１級、第２級、第３級アミノ基または窒素含有の芳香族複素環塩基であり、Ｂは、−Ｘ’（ＣＨ２）ｎＹ’であり、この際、ｎが１〜１０の整数であり、Ｘ’は、活性化エステルと反応できる官能基であり、Ｙ’は、ｐＫａ値が４以下の酸発生基であり、Ｒ３は、炭素数が１〜１０のアルキレン基である。
【００１３】
本発明のイオン交換物質は、上述したように、Ａ及びＢを有する上記化学式Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３の少なくとも１種の単量体由来の構成単位を含むものであればよい。このため、本発明のイオン交換物質は、上記化学式Ｍ１およびＭ２の単量体のホモポリマーであっても、あるいは、上記化学式Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３の単量体のいずれか２種以上の単量体からなる共重合体であってもよい。後者の場合には、上記化学式Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３の単量体の結合形式は、特に制限されず、ランダム、ブロックのいずれの形態で付加してもよい。また、本発明において、上記化学式Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３の単量体由来の各繰り返し単位におけるＡ（即ち、Ｘ、Ｙ及びｎ）、Ｂ（即ち、Ｘ’、Ｙ’及びｎ）並びに、Ｒ３は、同一であってもあるいは異なるものであってもよい。また、本発明のイオン交換物質は、上記化学式Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３の単量体に加えて、他の単量体由来の構成単位を有するものであってもよい。
【００１４】
さらに、上記化学式Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３におけるＲ３は、炭素数１〜１０のアルキレン基であり、具体的には、メチレン基（−ＣＨ２−）、エチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２−）、トリメチレン基（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン基（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−）等の、直鎖あるいは分岐鎖のアルキレン基が挙げられる。
【００１５】
本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質を構成する構成単位の一例には、Ａは、−Ｘ（ＣＨ２）ｎＹがあり、この際、ｎは、１〜１０の整数であり、Ｘは、活性化エステルと反応しうる官能基であり、Ｙは、ピリジニル、ピロリルまたはイミダゾリル基である。
本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質を構成する構成単位の他の例には、Ｂは、−Ｘ’（ＣＨ２）ｎＹ’であり、この際、ｎが１〜１０の整数であり、Ｘ’は、活性化エステルと反応しうる官能基であり、Ｙ’は、スルホニル、スルフェニル、スルフィニルまたはホスホリル基である。
【００１６】
本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質において、前記ＡまたはＢ中のＸまたはＸ’は、−ＮＨ−、−Ｏ−または−Ｓ−であってもよい。
本発明に係る実施形態におけるｐＨ依存性のイオン交換物質を構成する構成単位は、当該分野において既知の合成方法により合成されうる。例えば、ポリ無水物（例えば、ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）（分子量１００,０００〜５００，０００））のうち無水物部分（モイエティ）を加水分解してカルボキシル基を露出させ、前記カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１、［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）のような物質と反応させて活性化エステルを形成させる。次いで、前記Ａ（例えば、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）またはＢ（例えば、タウリン）部分（モイエティ）を、活性化エステルと反応させることによって、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質を製造できる。前記ポリ無水物、Ａ（例えば、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）またはＢ（例えば、タウリン）モイエティは、当業者が容易に合成できるか、または商業的に購入できる。このとき、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質の純電荷は、ＡまたはＢ部分（モイエティ）を反応中、適切な割合で使用することによって調節できる。
【００１７】
また、本発明は、前記の本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が表面に固定化されている固体基板を提供する。
【００１８】
本発明に係るもう一つの実施形態において、前記ｐＨ依存性のイオン交換物質が表面に固定化されている固体基板は、任意の形態を有しうる。例えば、前記固体基板は、平板、球形、またはマイクロチャンネルの形態を有しうるが、これらに限定されるものではない。本発明に係る前記固体基板の望ましい一形態において、マイクロ流体素子内のマイクロチャンネルの形態を有してもよい。
本発明に係る前記ｐＨ依存性のイオン交換物質が表面に固定化されている固体基板は、シリカ、融合シリカ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ガラス、特に、スライドガラス及びシリコンウェーハからなる群から選択されうるが、これらの材質の基板に限定されるものではない。
【００１９】
本発明に係る前記固体基板は、本発明に係る前記ｐＨ依存性のイオン交換物質鎖の末端部分をアルデヒド及びエステル基のような活性基で活性化させ、活性化された前記イオン交換物質を、アミノ基のような活性基でコーティングされている固体基板とカップリングさせることによって製造されうる。前記イオン交換物質及び固体基板の活性化は、当該分野において既知である任意の方法により行われうる。例えば、前記イオン交換物質は、末端基を酸化または酸無水物のようなエステル化合物とカップリングさせて活性基を導入することによって活性化されうる。また、前記固体基板は、固体基板の表面上にアミノ基のような活性物質を、例えば、スピンコーティングのような方法によってコーティングすることによって活性化させうる。前記イオン交換物質を固体基板に固定化する方法の他の例は、前記ポリ無水物（例えば、ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）（分子量１００，０００〜５００，０００））を基板上のアミノ基とカルボキシ無水物基との間の直接的反応によって活性化された基板上にコーティングし、基板上にコーティングされている残りの前記ポリ無水物のうち無水物部分（モイエティ）を加水分解してカルボキシル基を露出させる。次いで、前記カルボキシル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−３［（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）のような物質と反応させて活性化エステルを形成させる。次に、前記活性化エステルと前記Ａ（例えば、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）またはＢ（例えば、タウリン）部分（モイエティ）を反応させることによって、その表面上で固定化されたｐＨ依存性のイオン交換物質を有する基板を製造する。前記ポリ無水物、Ａ（例えば、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール）またはＢ（例えば、タウリン）モイエティは、当業者が容易に合成できるか、または商業的に購入できる。
【００２０】
また、本発明に係るさらにもう一つの実施形態において、核酸を含む試料を本発明によるｐＨ依存性のイオン交換物質またはそれらが固定化されている固体基板に第１ｐＨで接触させる工程と、前記核酸が結合された前記イオン交換物質を前記第１ｐＨより高い第２ｐＨを有する溶液にさらして、核酸を放出させる工程と、を含む、ｐＨ依存性のイオン交換物質または前記イオン交換物質が固定化されている固体基板を利用して核酸を分離（精製）する方法を提供する。
【００２１】
本発明に係る方法は、核酸を含む試料を、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質または前記イオン交換物質が固定化されている固体基板と第１ｐＨにおいて接触させる工程を含む。前記試料は、核酸を含む生物学的または非生物学的試料であり、例えば血液、細胞及びＰＣＲ産物がある。ｐＨ依存性のイオン交換物質および前記イオン交換物質が表面上で固定化されている固体基板は、前記の通りである。前記第１ｐＨは、前記ｐＨ依存性のイオン交換物質のうち、Ａの塩基部分が正電荷を有し、Ｂの酸発生基部分が電荷を有さない、または、負電荷を有するｐＨであってよい。Ｂが負電荷を有すれば、Ａの量はＢの量よりはるかに多くて表面上には純正電荷を有する。前記第１ｐＨは、４以下、望ましくは、２〜３．５、より望ましくは、２〜２．５である。
【００２２】
本発明に係る方法は、核酸が結合された前記イオン交換物質を、前記第１ｐＨより高い第２ｐＨを有する溶液にさらして、イオン交換物質から核酸を放出させる工程を含む。前記第２ｐＨは、前記ｐＨ依存性のイオン交換物質のうち、Ａの塩基部分が電荷を有さず、Ｂの酸発生基部分が負電荷を有するｐＨであってよい。望ましくは、前記第２ｐＨは、７〜１０である。前記核酸−ｐＨ依存性のイオン交換物質複合体の溶出に使われる溶液は、水及び適切なバッファなどが使われうる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を、実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、それらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明に係る範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板を利用した核酸の回収
本実施例では、下記化学式ＭＯ、Ｍ１、Ｍ２及びＭ３からなる群から選択される少なくとも一種の単量体が結合されており、Ａを有する単量体及びＢを有する単量体が、少なくとも一種含まれており、重合度２〜３０，０００であるｐＨ依存性のイオン交換物質を基板上で合成し、前記基板を利用して核酸を精製（分離）した：
ただし、
Ａは、１−（３−アミノプロピル）イミダゾールであり、
Ｂは、タウリンであり、
Ｒ３は、−ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００２４】
【化３】
2006326581.tif 000005
【００２５】
（１）前記ｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板の製造
下記反応式のように、前記ｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板を製造した。
【００２６】
【化４】
2006326581.tif 000006
【００２７】
まず、アミノ基でコーティングされたガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳガラス、コーニング社製）基板をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の２００ｍＭ（繰り返し単位基準）のポリ無水物（ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）（分子量１００，０００〜５００，０００））に室温で１時間浸漬した後、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥した。
【００２８】
得られた前記ポリ無水物が結合されたガラス基板をｐＨ９．０のホウ酸１０ｍＭの緩衝溶液に１時間浸漬して加水分解させた後、水とエタノールで洗浄して乾燥した。このガラス基板を、ＮＨＳを０．１５ｇ、ＥＤＣを０．１９ｇ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を１２０μｌ、１０ｍｌのＮＭＰに溶かした溶液に１時間浸漬した後、エタノールで洗浄し、乾燥して活性化エステル部分（モイエティ）を前記ｐＨ依存性のイオン交換物質に結合させた。得られたガラス基板にアセトニトリルを溶媒として使用して、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール及びタウリンを、モル比を基準としてそれぞれ６：４（実験例１：以下、“ＣＲＳ３−１”という）及び８：２（実験例２：以下、“ＣＲＳ３−２”という）を含む溶液に室温で１時間浸漬した後、エタノールで洗浄して乾燥した。
【００２９】
（２）対照群（コントロール）基板の製造
対照群（コントロール）基板として、下記化学式において、Ｒ１及びＲ２は、同じであるか、または異なっていてもよく、それぞれ独立的に−ＯＨ基及び−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２からなる群から選択され、この際、ｍは、２であり、ｌは、１〜３０，０００であるｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板（対照群１：以下、“ＣＲＳ１”ともいう）、ならびに、Ｒ１及びＲ２は同じであるか、または異なっていてもよく、それぞれ独立的に、−ＯＨ基及び１−（３−アミノプロピル）イミダゾリル基からなる群から選択され、この際、ｍは、２であり、ｌは１〜３０，０００であるｐＨ依存性の下記化学式のイオン交換物質が固定化された基板（対照群２：以下、“ＣＲＳ２”ともいう）を製造し、第１ｐＨでＤＮＡを結合させた後、第２ｐＨで前記ＤＮＡ−基板複合体から核酸を回収（分離）した。
【００３０】
【化５】
2006326581.tif 000007
【００３１】
対照群１及び２の基板は、以下のように製作された：まず、アミノ基でコーティングされたガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＧＡＰＳ  ｇｌａｓｓ、コーニング社製）基板をＮＭＰ中の２００ｍＭ（繰り返し単位基準）のポリ無水物（ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）（分子量１００，０００〜５００，００００））に室温で１時間浸漬した後、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥した。得られた前記ポリ無水物が固定化されているガラス基板を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を溶媒として使用して、モル比を基準としてエチレンジアミン：Ｈ２Ｏ＝４：６（対照群１）、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール：Ｈ２Ｏ＝４：６（対照群２）で作った溶液に室温で１時間浸漬した後、エタノールで洗浄して乾燥した。ここで、前記エチレンジアミン及び１−（３−アミノプロピル）イミダゾールの濃度は、それぞれ４００ｍＭであり、水は６００ｍＭであった。
【００３２】
前記のように得られたｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化されている基板（実験例及び対照群基板）上に、ｐＨ３で、５’末端がＣｙ３で標識された配列番号１のＤＮＡと反応させた。反応は、前記ＤＮＡの１μＭを含む０．１５Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ＝３．０）６０μｌを基板上に添加し、蓋を覆って室温で１分間放置することによって行われた。反応後、０．１５Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で洗浄した後、５３２ｎｍ（ＰＭＴ  ３５０）でエキソンスキャナ（ＧｅｎｅＰｉｘ社、米国）を使用して蛍光度を測定した。蛍光度の測定結果を図１に示した。図１は、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板上にＤＮＡをｐＨ３で結合させ、ｐＨ７．０で結合されたＤＮＡをｐＨ依存性のイオン交換物質から溶出した後、蛍光度を測定した結果を示す図面である。
【００３３】
図１に示したように、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板（ＣＲＳ３−１及びＣＲＳ３−２）を使用する場合、従来のｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板（ＣＲＳ１及びＣＲＳ２）を使用する場合に比べて、ＤＮＡ結合能は若干低下したが、ＤＮＡ回収率は、ＣＲＳ１に比べては優秀であるが、ＣＲＳ２とは同等レベルであるということが分かった。
【００３４】
本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板（ＣＲＳ３−１及びＣＲＳ３−２）を使用する場合、結合されるＤＮＡ量が多少減少するが、１．５ａｍｏｌ／ｍｍ２の濃度は、約１、０００個の細胞からのＤＮＡ量の７５００倍であるため、通常的な生物学的実験、例えばＰＣＲ増幅などを進めるには十分な結合量であった。
【００３５】
実施例２：本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板を利用した蛋白質結合能の測定
実施例１で得られたｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化されている基板上に、標準蛋白質であるＡｌｅｘａ−５３２が標識されたＩｇＧ  １００ｎＭを含む０．１５Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ３．０）６０μｌを添加し、蓋を覆って室温で１分間放置した後、０．１５Ｍの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ３．０）６０μｌで洗浄し、蛍光度を測定した。ここで、Ａｌｅｘａ−５３２が標識されたＩｇＧは、ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社、米国）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５３２（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ社、米国）をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｂＬａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社、米国）によって反応させて製造した。
【００３６】
図２は、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板上に蛋白質をｐＨ３で結合させ、ｐＨ３．０で洗浄した後、蛍光度を測定した結果を示す図面である。
【００３７】
図２に示したように、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化されている基板（ＣＲＳ３−１及びＣＲＳ３−２）を利用する場合、従来のｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板（ＣＲＳ１及びＣＲＳ２）を利用する場合に比べて、蛋白質結合能の低下率が顕著であるということが分かった（ＣＲＳ１  ０％、ＣＲＳ２  ３０％、ＣＲＳ３−１  ８２％、ＣＲＳ３−２  ８２％）。これは、本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化されている基板の表面が、従来のｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化されている基板（ＣＲＳ１及びＣＲＳ２）に比べて、さらに親水性を有して選択的に蛋白質の疎水性結合を低下させるためであると考えられる。
【００３８】
本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質が固定化された基板を利用する場合、前記基板に対する核酸や蛋白質の結合能はいずれも低下するが、その程度は、蛋白質の結合能がはるかに顕著であるということが分かった（ＣＲＳ１と比較して、核酸の場合には２５％減少したが、蛋白質の場合には８２％減少した）。
【００３９】
本発明は、図面に示した一実施形態を参考にして説明されたが、これは、例示的なものに過ぎず、当業者であれば、これから多様な変形及び均等な他の実施形態が可能であるという点を理解しなければならない。したがって、本発明に係る真の技術的範囲は、特許請求の範囲の技術的思想により決まらねばならない。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、核酸の分離方法関連の技術分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質（ＣＲＳ３−１、ＣＲＳ３−２）または従来のｐＨ依存性のイオン交換物質（ＣＲＳ１、ＣＲＳ２）が固定化された基板上にＤＮＡをｐＨ３で結合させ、ｐＨ７．０で結合されたＤＮＡをｐＨ依存性のイオン交換物質から溶出した後、蛍光度を測定した結果を示す図面である。
【図２】本発明に係るｐＨ依存性のイオン交換物質（ＣＲＳ３−１、ＣＲＳ３−２）または従来のｐＨ依存性のイオン交換物質（ＣＲＳ１、ＣＲＳ２）が固定化された基板上に蛋白質をｐＨ３で結合させ、ｐＨ３．０で洗浄した後に蛍光度を測定した結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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