(57)【要約】【課題】  高感度化を実現できるマイクロアレイ読取装置、さらには検出時間を短縮し得るマイクロアレイ読取装置を提供する。【解決手段】  プローブＤＮＡが固定化されたマイクロアレイ基板７０に対して、蛍光物質とターゲットＤＮＡとを含む試料を接触させた場合の、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの特異的な相互作用を検出するためのマイクロアレイ読取装置１００であって、レーザ光源１１と、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡが固定されている表面にエバネッセント場を発生させるように、レーザ光源１１によって照射される光をマイクロアレイ基板７０に対して入射させる対物レンズ１４と、エバネッセント場により励起された試料中に含まれる蛍光物質から出射される蛍光を検出するための光検出器１７と、を備えるマイクロアレイ読取装置によれば、高感度化を達成でき、かつ検出時間を短縮できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ物質が固定化されたマイクロアレイ基板に対して、少なくとも蛍光物質とターゲット物質とを含む試料を接触させた場合の、上記プローブ物質と上記ターゲット物質との特異的な相互作用を検出するためのマイクロアレイ読取装置であって、
光を照射するための光照射手段と、
上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている表面にエバネッセント場を発生させるように、上記光照射手段によって照射される光を上記マイクロアレイ基板に対して入射させる光入射手段と、
上記エバネッセント場により励起された試料中に含まれる蛍光物質から出射される蛍光を検出するための光検出手段と、を備え、
上記光検出手段は、対物レンズとして機能する光学レンズを有しており、該光学レンズが上記光入射手段として機能することを特徴とするマイクロアレイ読取装置。
【請求項２】
プローブ物質が固定化されたマイクロアレイ基板に対して、少なくとも蛍光物質とターゲット物質とを含む試料を接触させた場合の、上記プローブ物質と上記ターゲット物質との特異的な相互作用を検出するためのマイクロアレイ読取装置であって、
光を照射するための光照射手段と、
上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている表面にエバネッセント場を発生させるように、上記光照射手段によって照射される光を上記マイクロアレイ基板に対して入射させる光入射手段と、
上記エバネッセント場により励起された試料中に含まれる蛍光物質から出射される蛍光を検出するための光検出手段と、を備え、
上記光検出手段は、対物レンズとして機能する光学レンズを有しており、
上記光入射手段は、上記光照射手段からの光を、上記光学レンズを経由することなく、上記マイクロアレイ基板に対して入射させるものであることを特徴とするマイクロアレイ読取装置。
【請求項３】
上記光入射手段は、上記光照射手段によって照射される光を、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている面において全反射される角度以上の入射角で入射させるものであることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項４】
上記光入射手段は、上記マイクロアレイ基板と上記光学レンズとの間に配置されていることを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項５】
上記光入射手段は、上記光照射手段によって照射される光を反射させるための反射面を少なくとも１つ有するものであり、
上記反射面は、該反射面による反射光が、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている面において全反射される角度以上の入射角で入射されるように、設けられていることを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項６】
上記光入射手段の屈折率は、上記マイクロアレイ基板の屈折率と略同じであることを特徴とする請求項２に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項７】
上記光照射手段および光検出手段は、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている面の裏面側に配置されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項８】
上記マイクロアレイ基板と光入射手段との間には、オイル層が設けられていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項９】
さらに、上記マイクロアレイ基板上の上記ターゲット物質を含む試料の温度を調節するための温度調節手段を備えることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項１０】
上記プローブ物質とターゲット物質との特異的な相互作用を、実時間にて検出するものであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項１１】
さらに、上記マイクロアレイ基板と上記光入射手段との相対位置を変更させるための位置変更手段を備えることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項１２】
さらに、上記ターゲット物質がプローブ物質と相互作用していく過程を時系列観察することによって得られる検出データを用いて、上記プローブ物質と相互作用するターゲット物質の量を推定するための演算処理を行う演算処理手段を備えることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項１３】
上記プローブ物質およびターゲット物質は、１本鎖のＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項１４】
上記蛍光物質は、上記ターゲット物質と結合していることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【請求項１５】
上記蛍光物質は、上記プローブ物質とターゲット物質とが相互作用している状態の物質に対して、特異的に結合するものであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマイクロアレイ読取装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを高感度かつ高速にて検出可能なマイクロアレイ読取装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイは、１９９５年に報告されて以来、細胞や組織中で働くｍＲＮＡを網羅的に検出できる方法として、細胞生物学や基礎医学分野だけでなく、創薬や医療応用等の多く分野において用いられるようになってきている。ＤＮＡマイクロアレイは、細胞の核内でどのような遺伝子が転写されているか、また転写されたｍＲＮＡが細胞内にどのくらい存在するのか等の情報をそれぞれの遺伝子について一度に大量に調べることができるため、トランスクリプトーム解析の主な研究方法として定着してきている。
【０００３】
ｍＲＮＡを網羅的に検出することで、細胞中での遺伝子の役割を決定したり、発生の特定段階で働く遺伝子を検出したりすることができるだけでなく、生体各部位の細胞のトランスクリプトームやストレスに対する細胞応答、疾病と遺伝子との関係等についても調べることができる。このため、このマイクロアレイに関する技術は将来的にはさら多くの有益な情報をもたらすと考えられ、国内外で積極的に研究開発が行われている。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイの原理を簡単に説明する。一般的なＤＮＡマイクロアレイでは、各遺伝子のｍＲＮＡを検出するために各ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を持つＤＮＡ（プローブＤＮＡと呼ぶ）をあらかじめ基板上に固定しておき、細胞や組織試料から抽出したｍＲＮＡを逆転写して生成したｃＤＮＡ（ターゲットＤＮＡと呼ぶ）を基板上のプローブＤＮＡへハイブリダイゼーションさせることで各遺伝子のｍＲＮＡを検出している。
【０００５】
ハイブリダイゼーションでは、熱処理して一本鎖にしたプローブＤＮＡに対して、同じく一本鎖にしたターゲットＤＮＡが相補的な配列を持っていれば安定に再結合（ハイブリダイズ）して、配列が異なっていれば結合が不安定になることを利用して、それぞれの配列のＤＮＡが識別される。通常、プローブＤＮＡは直径１００〜２００μｍ程度の円形のスポットとして基板上に固定されており、異なった塩基配列のプローブＤＮＡを基板上にアレイ状に並べておいて、スポットの位置によってどの塩基配列のＤＮＡがあったかを検出する。ターゲットＤＮＡに蛍光色素を付けておけば、基板上の蛍光発光の強度からハイブリダイズしたターゲットＤＮＡの量を計測できる。
【０００６】
しかし、ＤＮＡマイクロアレイが実際の医療診断の現場や農業試験場での検査、食品検査等において用いられるようになるには、さらなる検査時間の短縮と検出の高感度化、検査結果の再現性向上が求められている。このため、近年、本発明者らの研究グループによって、全く新しい概念のＤＮＡマイクロアレイ検出方法が提唱されている。
【０００７】
例えば、非特許文献１には、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡにハイブリダイズしていく過程を時系列観察して、ハイブリダイズ量の時間変化からそれぞれの塩基配列のＤＮＡがどのくらいあったかを推定することにより、ＤＮＡマイクロアレイの読み取りを行うという概念が開示されている。
【０００８】
また、近年、ＤＮＡマイクロアレイ基板の近傍にエバネッセント場を発生させ、このエバネッセント場による照明で蛍光分子を励起して蛍光観察することでプローブＤＮＡにハイブリダイズしたＤＮＡ量をリアルタイムで計測する技術が開発されている（例えば、非特許文献２参照）。図９に示すように、エバネッセント場５０１とは、ガラス基板５００側から光を全反射角度以上の入射角で入射したときに生じる光の場のことで、ガラス基板５００の表面近傍に１００〜２００ｎｍ程度の厚さで存在させることができる。エバネッセント場５０１による照明では、入射する光のエネルギーは全反射してガラス基板５００側に戻っていくが、エバネッセント場５０１中に蛍光分子５０２が存在すると励起して蛍光発光させることができる。エバネッセント場５０１による照明で蛍光分子５０２を励起すると、ガラス基板５００表面近傍に存在する蛍光分子５０２のみを蛍光励起することができるので、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション過程で用いれば、プローブＤＮＡにハイブリダイズした分子のみを選択的に蛍光励起して検出することができる。
【０００９】
また、エバネッセント場による照明で蛍光励起を行った場合、ターゲットＤＮＡを流すために用いる溶液中に蛍光分子が存在しても殆ど励起光があたらず蛍光励起されないので、計測時のバックグラウンドが小さいというメリットがある。
【非特許文献１】春名かおり、杉浦忠男、佐藤哲大、田畑慶人、湊小太郎  共著、「ＤＮＡマイクロアレイにおけるハイブリダイゼーション過程のリアルタイム検出.」、生体医工学 41 (Suppl)：148,2003
【非特許文献２】Carolin Peter er al., “Optical DNA-sensor chip for real-time detection of hybridization events” Fresenius J Anal Chem (2001) 371: 120-127
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、従来のＤＮＡマイクロアレイ技術に対して、さらなる検査時間の短縮と検出の高感度化、検査結果の再現性向上が求められている。特に、ＤＮＡマイクロアレイではハイブリダイゼーション過程を経て特定の配列を持つＤＮＡを検出することになるが、このハイブリダイゼーションには約８時間〜１６時間もの時間がかかり、検出にかかる作業開始から検出終了まで含めるとかなりの時間を必要としていた。これは医療分野での応用や、ハイスループットな解析を目的とする場合では、絶望的なまでの時間が掛かることを意味している。
【００１１】
そして、上記の問題を解決する一つの手段として、本発明者らの研究グループは、実時間観察型のＤＮＡマイクロアレイ検出技術の概念を上記非特許文献１に開示している。
【００１２】
しかしながら、かかる非特許文献１には、実時間観測型ＤＮＡマイクロアレイの検出方法についての抽象的な概念は開示されているが、この非特許文献１が発行された段階では、その具体的な構成にまで具現化されていなかった。つまり、非特許文献１には、実時間観測型ＤＮＡマイクロアレイの検出方法について、実現可能な程度に開示されていない。
【００１３】
また、非特許文献２には、エバネッセント場を用いた実時間型のＤＮＡマイクロアレイ読取装置が開示されているが、この装置も現実の使用に堪え得るものではないと考えられる。すなわち、非特許文献２に開示のＤＮＡマイクロアレイ読取装置は、プリズムの表面にプローブＤＮＡをスポットしており、一般的なＤＮＡマイクロアレイ基板に対して汎用性に欠けるという問題点がある。また、本装置では、シャッターを動かすことにより光検出器（light detector）においてスポットにおける蛍光強度を検出しているが、この系ではイメージングを行うことができず、高精度のＤＮＡマイクロアレイの検出を行うことができない。さらに、本装置には、走査機構については全く考慮されていないため、スキャニングしながら検出することができず、より多くのスポットを有するマイクロアレイに対応することができないという問題点がある。
【００１４】
したがって、現実の使用に堪え得るように、高感度化を実現できるマイクロアレイ読取装置、さらには検出時間を短縮し得るマイクロアレイ読取装置の開発が強く望まれていた。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高感度化を実現できるマイクロアレイ読取装置、さらには検出時間を短縮し得るマイクロアレイ読取装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、マイクロアレイの検出にかかる時間を短縮するために、まず、蛍光を励起する手段と蛍光を検出する手段とをマイクロアレイ基板に対して同じ側に配置することにより、より高精度化を実現することができることを見出した。また、ハイブリダイゼーション過程に着目し、ハイブリダイゼーション過程を実時間で観察することでハイブリダイゼーションが完全に終了するまで待たなくとも検査結果が得られるようになり、検出時間を短縮化できることを見出した。さらに、蛍光励起用のレーザ光を対物レンズの外側から照射することにより、視野角を拡大させることができ、一度に多量のスポットの検出を実現し、検出時間を短縮化できることを見出した。本発明者は、これらの新規な知見に基づき、本願発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明（１）〜（１４）を包含する。
【００１７】
（１）プローブ物質が固定化されたマイクロアレイ基板に対して、少なくとも蛍光物質とターゲット物質とを含む試料を接触させた場合の、上記プローブ物質と上記ターゲット物質との特異的な相互作用を検出するためのマイクロアレイ読取装置であって、光を照射するための光照射手段と、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている表面にエバネッセント場を発生させるように、上記光照射手段によって照射される光を上記マイクロアレイ基板に対して入射させる光入射手段と、上記エバネッセント場により励起された試料中に含まれる蛍光物質から出射される蛍光を検出するための光検出手段と、を備え、上記光検出手段は、対物レンズとして機能する光学レンズを有しており、該光学レンズが上記光入射手段として機能するマイクロアレイ読取装置。
【００１８】
（２）プローブ物質が固定化されたマイクロアレイ基板に対して、少なくとも蛍光物質とターゲット物質とを含む試料を接触させた場合の、上記プローブ物質と上記ターゲット物質との特異的な相互作用を検出するためのマイクロアレイ読取装置であって、光を照射するための光照射手段と、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている表面にエバネッセント場を発生させるように、上記光照射手段によって照射される光を上記マイクロアレイ基板に対して入射させる光入射手段と、上記エバネッセント場により励起された試料中に含まれる蛍光物質から出射される蛍光を検出するための光検出手段と、を備え、上記光検出手段は、対物レンズとして機能する光学レンズを有しており、上記光入射手段は、上記光照射手段からの光を、上記光学レンズを経由することなく、上記マイクロアレイ基板に対して入射させるものであるマイクロアレイ読取装置。
【００１９】
（３）上記光入射手段は、上記光照射手段によって照射される光を、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている面において全反射される角度以上の入射角で入射させるものである（１）または（２）に記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２０】
（４）上記光入射手段は、上記マイクロアレイ基板と上記光学レンズとの間に配置されている（２）に記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２１】
（５）上記光入射手段は、上記光照射手段によって照射される光を反射させるための反射面を少なくとも１つ有するものであり、上記反射面は、該反射面による反射光が、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている面において全反射される角度以上の入射角で入射されるように、設けられている（２）に記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２２】
（６）上記光入射手段の屈折率は、上記マイクロアレイ基板の屈折率と略同じである（２）に記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２３】
（７）上記光照射手段および光検出手段は、上記マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている面の裏面側に配置されている（１）〜（６）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２４】
（８）上記マイクロアレイ基板と光入射手段との間には、オイル層が設けられている（１）〜（７）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２５】
（９）さらに、上記マイクロアレイ基板上の上記ターゲット物質を含む試料の温度を調節するための温度調節手段を備える（１）〜（８）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２６】
（１０）上記プローブ物質とターゲット物質との特異的な相互作用を、実時間にて検出するものである（１）〜（９）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２７】
（１１）さらに、上記マイクロアレイ基板と上記光入射手段との相対位置を変更させるための位置変更手段を備える（１）〜（１０）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２８】
（１２）さらに、上記ターゲット物質がプローブ物質と相互作用していく過程を時系列観察することによって得られる検出データを用いて、上記プローブ物質と相互作用するターゲット物質の量を推定するための演算処理を行う演算処理手段を備える（１）〜（１１）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００２９】
（１３）上記プローブ物質およびターゲット物質は、１本鎖のＤＮＡである（１）〜（１２）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００３０】
（１４）上記蛍光物質は、上記ターゲット物質と結合している（１）〜（１３）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００３１】
（１５）上記蛍光物質は、上記プローブ物質とターゲット物質とが相互作用している状態の物質に対して、特異的に結合するものである（１）〜（１４）のいずれかに記載のマイクロアレイ読取装置。
【００３２】
なお、上記演算処理手段は、コンピュータによって実現してもよく、この場合には、コンピュータを上記各手段として動作させることにより上記演算処理手段をコンピュータにて実現させる演算処理手段の制御・演算プログラム、およびそれを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体も、本発明の範疇に入る。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係るマイクロアレイ読取装置によれば、マイクロアレイ基板上のプローブ物質と試料中に含まれるターゲット物質との結合を、より高精度に効率よく検出することができるという効果を奏する。さらに、本マイクロアレイ読取装置によれば、プリズム上にＤＮＡをスポットしていない。このため、市販されている多くのマイクロアレイ基板に対して用いることができる。
【００３４】
また、光入射手段（例えば、高屈折率ブロック）によって、マイクロアレイ基板に対して対物レンズを経由せずに光を入射させるという構成により、視野角を大きくすることができるため、一度により多くのスポットを読み取ることができ、検出の時間を短縮させることができる。
【００３５】
加えて、温度調節手段を備えることにより、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを実時間にて検出することができるため、検出時間を短縮することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
〔実施の形態１〕
本発明の一実施形態について図１〜図４に基づいて説明すると以下の通りである。
【００３７】
＜マイクロアレイ基板および検査対象＞
まず、本発明に係るマイクロアレイ読取装置は、プローブ物質が固定化されたマイクロアレイ基板に対して、少なくとも蛍光物質とターゲット物質とを含む試料を接触させた場合の、上記プローブ物質と上記ターゲット物質との特異的な相互作用を検出するためのものである。
【００３８】
このため、まず、読み取り対象となるマイクロアレイ基板およびマイクロアレイ基板を用いて検出する検出対象（試料）について説明する。なお、本明細書でいう文言「読み取り（読取）」とは、検出、測定、計測等と同義に用いられるものである。
【００３９】
本発明に用いられるマイクロアレイ基板は、ターゲット物質を含む試料と接触した際に、試料中に含まれる該ターゲット物質と特異的な相互作用（例えば、結合、ハイブリダイゼーション等）し、該ターゲット物質を検出するためのプローブ物質が固定されているものであればよく、例えば、プローブ物質の種類、数、量、スポットの大きさ等といった具体的な構成は特に限定されるものではない。しかし、一度に多量の試料を同時に計測するというマイクロアレイの特徴を最大限に生かすためにも、プローブ物質は複数種類であることが好ましい。
【００４０】
また、後述するように、マイクロアレイ基板上で発生した蛍光を、マイクロアレイ基板越しに蛍光を検出することになるため、マイクロアレイ基板は少なくとも光を透過させる材質から構成されている。例えば、マイクロアレイ基板としては、ガラス基板やポリカーボネート、ＰＭＭＡ等の樹脂からなるもの等の光透過率が高い材質から構成される基板を好適に用いることができるが、熱による屈折率の変化率を考慮すると、ガラス基板が最も好適である。なお、本発明に係るマイクロアレイ読取装置によれば、上述の条件を具備する従来公知のマイクロアレイ基板を読み取り対象とすることができ、適用範囲が広範であるという利点がある。
【００４１】
また、マイクロアレイ基板に固定されるプローブ物質としては、具体的には、例えば、核酸（ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを含む）、ポリペプチド（タンパク質、オリゴペプチド、抗体を含む）、生体内低分子物質（ホルモン等）、環境ホルモン等の低分子物質を挙げることができる。また、ターゲット物質は、上記プローブ物質と相互作用するものであればよく、特に限定されるものではないが、プローブ物質と相互作用する関係上、核酸（ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを含む）、ポリペプチド（タンパク質、オリゴペプチドを含む）、生体内低分子物質（ホルモン等）、環境ホルモン等の低分子物質等が好適である。なかでも、プローブ物質およびターゲット物質としては、特に、１本鎖のＤＮＡが好適である。
【００４２】
また、後述するように、本発明に係るマイクロアレイ読取装置は、エバネッセント場を発生させ、該エバネッセント場により試料中に含まれる蛍光物質を励起させてプローブ物質とターゲット物質との相互作用を検出するものである。このため、マイクロアレイ基板７０上を流通させる試料溶液には、蛍光物質が含まれていることが必要である。かかる蛍光物質は、ターゲット物質と結合させておくことが好ましいが、この手法に限られるものではなく、例えば、プローブ物質単独またはターゲット物質単独で存在している場合にはそれらの物質と結合しないが、プローブ物質とターゲット物質とが相互作用（例えば、結合、ハイブリダイズ等）している場合に、これらプローブ物質とターゲット物質とが相互作用している状態の物質に対して、特異的に結合する蛍光物質であってもよい。
【００４３】
例えば、プローブ物質およびターゲット物質として１本鎖のＤＮＡを用いる場合であれば、蛍光性官能基（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５等）をターゲットＤＮＡの５’末端に結合させておくこと、またはターゲットＤＮＡに取り込ませること等が可能であり、また、ターゲットＤＮＡには蛍光物質を付加せずに、２本鎖を形成したＤＮＡに特異的に付着して蛍光発光するインカレーター分子（例えば、ＰＯＰＯ−３（Molecular Probes, Inc））を用いることができる。
【００４４】
また、検査対象となる試料溶液は、少なくとも上述のターゲット物質と蛍光物質とが含まれるものであればよく、その具体的な組成や濃度、ｐＨ等の諸条件については特に限定されるものではない。例えば、溶液のベースも水溶液であることが好ましいが、これに限定されず、有機溶媒等が含まれる溶液であってもよい。例えば、ＤＮＡやタンパク質等の生体高分子を検出対象とする場合は、その物質に合わせた緩衝液（バッファー）を好適に用いることができる。
【００４５】
さらに、検査対象となる試料溶液は、マイクロアレイ基板上のプローブ物質と接触するようになっていればよく、その際の具体的な構成や条件等は特に限定されるものではない。より好ましくは、検査対象となる試料溶液をマイクロアレイ基板上に流通または流動させることが好適である。
【００４６】
上述したように、本発明に係るマイクロアレイ読取装置の読み取る対象となるマイクロアレイ基板において、プローブ物質およびターゲット物質としては、１本鎖のＤＮＡを用いることが好適である。このため、以下、プローブ物質およびターゲット物質として１本鎖のＤＮＡを用いる場合、つまり、いわゆるＤＮＡマイクロアレイの検出結果を読み取る場合を例に挙げて説明する。
【００４７】
＜マイクロアレイ読取装置の構成＞
本実施の形態では、倒立型顕微鏡をベースとして構成したマイクロアレイ読取装置であって、光入射手段として対物レンズを用いる場合のマイクロアレイ読取装置１００について説明する。つまり、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置１００は、倒立型顕微鏡をベースとした観察装置となっているため、エバネッセント場による照明は顕微鏡光学系が有する対物レンズを通して行い、顕微鏡光学系を通して蛍光検出できるように構成されている。ベースとして利用できる倒立型顕微鏡としては、例えば、ニコン製、ＴＥ−２０００を挙げることができる。なお、本発明に係るマイクロアレイ読取装置は、倒立型顕微鏡をベースとして構成したものに限られるものではなく、本発明の構成を有し、本発明の効果を奏することができるものであれば、本発明の技術的範囲に含まれることはいうまでもない。
【００４８】
図１は、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置の構成を模式的に示す図である。同図に示すように、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置１００は、レーザ光源１１、第１のレンズ１２、反射面１３、対物レンズ１４、励起光カットフィルタ１５、結像レンズ１６、光検出器１７、温度調節部１８、演算処理部１９、位置変更部２１を備えている。また、マイクロアレイ読取装置１００は、マイクロアレイ基板７０をその読み取りの対象とする。
【００４９】
レーザ光源１１は、光を照射するための光照射手段として機能するものである。かかるレーザ光源１１は、後述するように、マイクロアレイ基板７０上にてエバネッセント場を発生させるための光を照射することができるものであればよく、その他の具体的な構成や条件等（例えば、照射する光の波長、強度、種類等）は特に限定されるものではない。例えば、蛍光励起用レーザとして、２ωＮｄ：ＹＡＧレーザ（波長５３２ｎｍ）のレーザ光を照射するレーザ光源、ＬＥＤ、水銀ランプ等を好適に用いることができる。
【００５０】
第１のレンズ１２は、レーザ光源１１から照射されたレーザ光を集光し、反射面１３に対して導くための光学レンズであればよく、その他の具体的な構成（例えば、材質、大きさ、厚み等）は特に限定されるものではない。反射面１３は、第１のレンズ１２からのレーザ光を対物レンズ１４に対して反射させるものであればよく、従来公知の光学系機器に使用される反射手段を用いることができる。本実施の形態では、反射面１３は、第１のレンズ１２を経由して到達するレーザ光源１１からのレーザ光を、顕微鏡光学系（例えば、対物レンズ１４）の光軸と平行な光であって、該光軸から一定の距離オフセットされた光として、対物レンズ１４に対して反射させるものである。
【００５１】
対物レンズ１４は、マイクロアレイ基板７０上において発生した蛍光を集めるための対物レンズとして機能する光学レンズである。さらに、本実施の形態において、対物レンズ１４は、マイクロアレイ基板７０におけるプローブ物質が固定されている表面においてエバネッセント場を発生させるように、レーザ光源１１によって照射されるレーザ光をマイクロアレイ基板７０に対して入射させる光入射手段としても機能する。かかる対物レンズ１４も、上述の機能を実行できるものであればよく、その他の具体的な構成等は特に限定されるものではない。例えば、後述する実施例に示すように、対物レンズ１４として、ニコン製、ＴＩＲＦ用対物、開口数ＮＡ＝１．４５の光学レンズを用いることができる。
【００５２】
また、対物レンズ１４とマイクロアレイ基板７０と間には、オイル層２０が設けられている。オイル層２０は、対物レンズ１４の屈折率とマイクロアレイ基板７０の屈折率とを整合させ、境界面上での反射を低減させるためのものである。オイル層２０がない場合、対物レンズ１４の上面にて光が全反射してしまい、マイクロアレイ基板７０の表面においてエバネッセント場を発生させることができない。また、これは、マイクロアレイ基板７０の板厚が異なる場合であっても、対物レンズ１４からマイクロアレイ基板７０に入射される光の入射位置を一定に調節し、マイクロアレイ基板７０上に焦点を合わせる働きをするためのものである。
【００５３】
励起光カットフィルタ１５は、短波長の光（励起光）をカット（除去）し、マイクロアレイ基板７０上で発生した蛍光のみを透過させるための光学フィルタであればよく、従来公知のいわゆるＳＣフィルタと称されるものを好適に使用することができる。このフィルタを用いることにより、蛍光をより高精度に検出することができる。
【００５４】
結像レンズ１６は、励起光カットフィルタ１５を透過した光を、光検出器１７において結像させるための光学レンズであり、従来公知の光学機器に用いられる結像レンズを好適に用いることができ、その具体的な構成（例えば、材質、大きさ、厚み等）は特に限定されるものではない。なお、これら対物レンズ１４、励起光カットフィルタ１５、結像レンズ１６は、ベースとした倒立顕微鏡において顕微鏡光学系（光学系機構）を構成している。
【００５５】
光検出器１７は、結像レンズ１６によって結像された光を検出するための光検出装置として機能するものであればよく、従来公知の光学機器に使用され得る光検出器を好適に利用することができる。例えば、後述する実施例に示すように、冷却ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス、ＯＲＣＡ−ＥＲ）を用いることができるが、これに限定されるものではない。なお、ＣＣＤカメラを用いる場合は、ＣＣＤカメラ１７の動作を制御するＣＣＤ制御部や、ＣＣＤカメラによって検出された画像データを表示したり、加工したりするための演算装置（ＰＣ等）を備えていてもよい。なお、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置１００では、上述の顕微鏡光学系（光学系機構）として機能する対物レンズ１４、励起光カットフィルタ１５、結像レンズ１６と、光検出装置として機能する光検出器１７とを合わせて、光検出手段と称する。
【００５６】
温度調節部１８は、後述するマイクロアレイ基板７０上に存在する（より好ましくはマイクロアレイ基板７０上を流通または流動して存在する）試料溶液の温度を調節するためのものであればよく、従来公知の温度調節手段を好適に用いることができる。例えば、セラミックヒータ（５０×５０ｍｍ）、熱電対温度センサー（ＴＣ）、ヒータ制御部から構成される温度調節手段を用いて、ヒータとＴＣとを、ヒータ制御部によりＰＩＤ制御することによって、マイクロアレイ基板７０上の試料の温度を最適に調節することができる。例えば、マイクロアレイ基板７０がＤＮＡマイクロアレイである場合、この温度調節部１８は、後述するように、マイクロアレイ基板７０上を流通する試料溶液の温度を、バイブリダイゼーションが行われるのに好適な温度（例えば、６５℃）に保つことができる。このため、ＤＮＡマイクロアレイを検出する際には、マイクロアレイ読取装置１００において、実時間でハイブリダイゼーション過程を評価するために必要な構成といえる。ただし、タンパク質を検出するためのマイクロアレイ（例えば、プロテインチップ等）の場合は、常温にて実時間で結合を検出できる場合もあるため、かならずしも温度調節部１８が必要になるわけではない。
【００５７】
演算処理部１９は、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡにハイブリダイズしていく過程を時系列観察することによって得られる検出データを用いて、ハイブリダイズ量の時間変化からターゲットＤＮＡ（ターゲットＤＮＡが複数種類の場合は、それぞれの塩基配列のＤＮＡ）がどのくらいあったかを推定するための演算処理を行うものである。なお、演算処理部１９が行う演算処理についての詳細は後述する。
【００５８】
位置変更部２１は、マイクロアレイ基板７０と対物レンズ１４との相対位置を変更させるための位置変更手段として機能するものである。かかる位置変更部２１としては、従来公知の顕微鏡等の光学機器に用いられている移動ステージ等を好適に用いることができる。位置変更部２１により、マイクロアレイ基板７０上に設けられているＤＮＡスポット（プローブＤＮＡが多数固定化されている領域）が複数個存在している場合でも、マイクロアレイ基板７０と対物レンズ１４との相対位置を変更することにより、異なるＤＮＡスポットにおけるハイブリダイゼーションを容易に検出することができる。また、位置変更部２１は、１軸方向の走査が可能な機構であってもよいが、より好適には、２次元的な走査が可能な２軸方向の走査が可能な機構であることが好ましい。
【００５９】
なお、本実施の形態では、マイクロアレイ基板７０を移動させて、対物レンズ１４との相対位置を変更しているが、この方式に限定されるものではなく、例えば、マイクロアレイ基板７０を固定しておき、対物レンズ１４や結像レンズ１５等の光学系機構および光検出器１７の位置を移動させる方式であってもかまわない。
【００６０】
＜ハイブリダイゼーション・セル＞
図１に示すように、読み取り対象となるマイクロアレイ基板７０は、マイクロアレイ読取装置１００に対して、ハイブリダイゼーション・セル５０としてセットされることになる。本実施の形態に係るハイブリダイゼーション・セル５０は、上述の温度調節部１８と組み合わせることによって、ハイブリダイゼーションを実時間観察するために温度調整機能を持つように構成されている。すなわち、リアルタイムにハイブリダイゼーションを検出するためには、(i) 温度調整が可能であること、(ii) セル内部にターゲットＤＮＡを含む試料溶液を流通させることができて、かつ、その流量が調整可能であること、が好ましい。このため、かかるハイブリダイゼーション・セルを用いることが好ましい。以下に、ハイブリダイゼーション・セル５０の具体的な構成について説明する。
【００６１】
図２（ａ）はハイブリダイゼーション・セルの構成の一例を上方から見た図であり、（ｂ）は（ａ）におけるａ−ａ’線に沿って切断した断面を示す図である。図２（ｂ）に示すように、本実施の形態に係るハイブリダイゼーション・セル５０は、マイクロアレイ基板７０、スライドガラス７１、スペーサ７２、固定器具７３を備えている。
【００６２】
ハイブリダイゼーション・セル５０は、図２（ｂ）中、上面がスライドガラス７１、下面がマイクロアレイ基板７０であり、マイクロアレイ基板７０はカバーガラスとしても機能する。また、プローブＤＮＡは、マイクロアレイ基板７０の表面であって、スライドガラス７１と向かい合う（対向する）面側に配置（固定化）してある。なお、プローブＤＮＡは、図２（ａ）に示すように、ＤＮＡスポットの形式で配置されている。
【００６３】
カバーガラスとして機能する側にプローブＤＮＡをスポッティングした理由は、後の処理において、エバネッセント場による照明によりプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する際、図２（ｂ）に示すように、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡを固定化した表面とは反対側から、マイクロアレイ読取装置１００によるレーザ光を入射するためである。つまり、図２（ｂ）に示すように、マイクロアレイ読取装置１００の対物レンズ１４は、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡを固定化した表面とは反対の表面側から近接し、レーザ光を入射することになる。なお、マイクロアレイ基板７０は、マイクロアレイ読取装置１００における対物レンズ１４に適合したカバーガラスを用いている。
【００６４】
マイクロアレイ基板７０とスライドガラス７１の間には所定の厚みのスペーサ７２が挿入されている。なお、マイクロアレイ基板７０とスライドガラス７１との間隔は、ターゲットＤＮＡを含む試料溶液を流通させることができる程度の間隔であればよく、その具体的な数値等は特に限定されるものではない。例えば、１００μｍの間隔をあければ、好適に試料溶液を流通させることができる。この場合、スペーサ７２の厚みは１００μｍになる。また、スペーサ７２の材質等も特に限定されるものではなく、公知のスペーサを好適に用いることができる。例えば、テフロン（登録商標）製のパッキンを用いることができる。
【００６５】
マイクロアレイ基板７０とスライドガラス７１の間には所定の厚みのスペーサ７２を挿入して、さらに、固定器具７３によって上下から押さえつけることでマイクロアレイ基板７０とスライドガラス７１の間を１００μｍの間隔を空けて保持させる。そして、この間隙に試料溶液を流す。この固定器具７３としては、従来公知の固定器具を用いることができ、その具体的な構成は限定されるものではない。例えば、ステンレス製フレームを用いることができる。
【００６６】
また、スライドガラス７１には、２つの穴７４・７４（例えば、直径１ｍｍ）が設けられている。図２（ａ）（ｂ）に示すように、この一方の穴７４を通して試料溶液をステンレスフレーム側から入れて、マイクロアレイ基板７０の表面に固定化されているプローブＤＮＡと接触させ、その後、もう一方の穴７４から出すことによって、試料溶液をプローブＤＮＡ上に流通させることができるように構成されている。試料溶液は、不図示の試料搬送装置によってマイクロアレイ基板７０とスライドガラス７１の間隙部分に流通させることができる。試料搬送装置としては、例えば、ペリスタリックポンプを挙げることができ、このペリスタックポンプによって圧力を印加することにより、ハイブリダイゼーション・セル５０中を流通させることができる。
【００６７】
さらに、固定器具７３は、例えば、スライドガラス７１側に温度調節部１８を設けることができるように構成されている。例えば、スライドガラス７１側にセラミックヒータを貼付し、マイクロアレイ基板７０側に熱電対温度センサー（ＴＣ）を設置して温度を計測しつつ、ヒータ制御部でセラミックヒータをＰＩＤ制御することにより、試料溶液の温度を一定に保つことができる。特に、ハイブリダイゼーション処理では、試料溶液の温度が、６５℃に保たれた状態でハイブリダイゼーションを行えるようにすることが好ましい。
【００６８】
また、ハイブリダイゼーション・セル中に流通させる試料溶液として用いられるバッファー等の具体的な組成や濃度、温度等の諸条件は特に限定されるものではなく、従来公知のＤＮＡマイクロアレイ実験に使用されるバッファーや条件等を好適に用いることができる。例えば、後述する実施例に示すように、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡなど）やＳＳＣバッファー（４×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、２０×Ｄｅｎｈａｒｔ）等を好適に用いることができる。
【００６９】
＜マイクロアレイ読取装置の動作説明＞
次いで、上述したマイクロアレイ基板７０を備えるハイブリダイゼーション・セル５０を用いて、ハイブリダイゼーション過程の時系列観察を行う場合を例に挙げて、マイクロアレイ読取装置１００の動作について説明する。
【００７０】
本実施の形態に係るハイブリダイゼーション実験では、まず、所定のｃＤＮＡがプローブＤＮＡとしてスポットされているマイクロアレイ基板７０上に対して、このｃＤＮＡに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ（蛍光性官能基が結合している）を含む試料溶液を接触させるべく、ハイブリダイゼーション・セル５０中に流通させる。次に、マイクロアレイ読取装置１００によって、マイクロアレイ基板７０上のプローブＤＮＡ（ＤＮＡスポット）にターゲットＤＮＡがハイブリダイズしているか否かを検出する。具体的には以下のように行う。
【００７１】
まず、図１に示すように、レーザ光源１１からレーザ光を照射する。照射されたレーザ光は、第１のレンズ１２によって集光され、続いて反射面１３によって反射される。反射面１３は、第１のレンズ１２を経由して到達するレーザ光源１１からのレーザ光を、顕微鏡光学系（例えば、対物レンズ１４）の光軸と平行な光であって、該光軸から一定の距離オフセットされた光として、対物レンズ１４に対して反射する。
【００７２】
反射面１３によって反射されたレーザ光は、対物レンズ１４の光軸からオフセットした方向より、対物レンズ１４に対して入射する。そして、対物レンズ１４に入射した光は、対物レンズ１４の働きにより、対物レンズ１４の出口において、平行光線でありながら、マイクロアレイ基板７０に対して大きな入射角を持って入射する光となり、ＤＮＡスポット（プローブＤＮＡが固定されている部分）の照明を行う。つまり、対物レンズ１４は、レーザ光を、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡが固定されている面において全反射される角度以上の入射角で入射させる光入射手段として機能するものといえる。
【００７３】
具体的には、ターゲットＤＮＡを含む試料溶液は、水溶液であり、マイクロアレイ基板７０はガラス基板として説明すると、水の屈折率は１．３３であり、屈折率１．５のガラスに比べて屈折率が低い。このため、図３に示すように、対物レンズ１４によって、マイクロアレイ基板７０へのレーザ光の入射角θを、水とガラスの境界面での全反射角θＣ（６２°）よりも大きくなるように調整して入射させることにより、レーザ光はマイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡ８０が固定化されている表面７０ａの下面側で全反射する。そしてこのとき、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａの上面側に薄くエバネッセント場６０が発生することになる。
【００７４】
図３に示すように、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａに発生したエバネッセント場６０は、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａから、波長程度の領域（約１００〜２００ｎｍ程度の領域）までしか存在していない。このため、１本鎖のプローブＤＮＡ８０と特異的にハイブリダイズしたターゲットＤＮＡ８１が有する蛍光性官能基８１ａのみを蛍光励起させ、遊離のターゲットＤＮＡ８２が有する蛍光性官能基８２ａを励起させることはない。このため、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション過程において、プローブＤＮＡ８０にハイブリダイズしたターゲットＤＮＡ８１のみを選択的に検出することができる。
【００７５】
すなわち、本実施の形態では、全反射条件でマイクロアレイ基板７０側におけるプローブＤＮＡを固定化した表面７０ａの裏面側から光を入射したときに生じるエバネッセント場６０を、ターゲットＤＮＡに付加してある蛍光物質を励起させるのに用いる。エバネッセント場６０は、マイクロアレイ基板７０から波長程度の厚さの領域に局在する光の場であるため、全反射条件でレーザ光を入射した場合、入射した光はマイクロアレイ基板７０の表面７０ａの下面側で全反射してマイクロアレイ基板７０内に戻っていくが、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａから波長程度の厚さの領域に蛍光物質が存在すると、蛍光物質で光吸収が起こり蛍光発光させることができる。また、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａから極近傍にしか光の場が存在しないので、マイクロアレイ基板７０に固定されたプローブＤＮＡとハイブリダイズしたターゲットＤＮＡが有する蛍光物質のみを蛍光励起して発光させることができる。
【００７６】
発生した蛍光は、対物レンズ１４で集めて、励起光カットフィルタ１５、結像レンズ１６といった顕微鏡光学系の機構を通して再び結像させ、光検出器１７によって検出する。特に、本実施の形態では、温度調節部１８を用いて、試料溶液の温度が６５℃にて一定に保ち温度安定化した状態でターゲットＤＮＡを含む試料溶液を流通させ、マイクロアレイ基板７０と接触させている。このため、蛍光像の時間変化を観察することにより、実時間でハイブリダイゼーション過程を評価できる。
【００７７】
すなわち、入射する光によってエバネッセント場を発生させてマイクロアレイを観測するとターゲットＤＮＡが基板上のプローブＤＮＡにハイブリダイズして固定化されるにしたがって基板表面から発光する蛍光強度が増加するので、蛍光強度を検出することでターゲットＤＮＡの増加をモニターすることができる。したがって、マイクロアレイ読取装置１００によれば、ハイブリダイゼーションにかかる時間を短縮することができるため、従来の装置に比べて、大幅に検出時間を短縮化できる。
【００７８】
また、図１に示すように、マイクロアレイ読取装置１００では、光照射手段として機能するレーザ光源１１や、光学系機構として機能する対物レンズ１４、励起光カットフィルタ１５、結像レンズ１６、および光検出装置として機能する光検出器１７は、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡが固定されている面７０ａの裏面側に配置されている。これは、光照射手段であるレーザ光源１１や光入射手段である対物レンズ１４は、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡが固定されている面７０ａにエバネッセント場を発生させるために、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａの裏面側からレーザ光を入射させる必要があるため、このように配置することが好ましいためである。
【００７９】
また、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａ近傍で蛍光発光が起きた場合、発光した蛍光のエネルギーの多くは、試料溶液中ではなく、高屈折率のマイクロアレイ基板７０側に放射される。このため、マイクロアレイ基板７０側に放射される光を効率よく検出するためには、蛍光を検出するための光学系機構や光検出器１７をマイクロアレイ基板７０の表面７０ａの裏面側に設けることが好ましいためである。
【００８０】
さらに、マイクロアレイ基板７０側に蛍光励起のための入射光学系と観察のための光学系を設ける構成にすることにより、スライドガラス７１におけるマイクロアレイ基板７０と対向する面と反対側の面をフリーな状態とすることができる。そして、このフリーとなったスライドガラス７１の面には、ハイブリダイゼーションやタンパク質チップ等に対して重要な温度コントロールを行うための温度調節部１８や金属ブロックなどの不透明な素材でできたものを設置することができる。
【００８１】
また、マイクロアレイ読取装置１００には、位置変更部２１が設けられている。このため、必要に応じて、位置変更部２１によりマイクロアレイ基板７０と対物レンズ１４等との相対位置を適宜変更させて、検出動作を行うことにより、スキャニングしながら検出することができ、より多くのスポットを有するマイクロアレイに対応することも可能である。
【００８２】
さらに、本実施の形態においてマイクロアレイ読取装置１００では、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡにハイブリダイズしてマイクロアレイ基板７０表面に固定されていく様子を実時間で観察する。このときのマイクロアレイ基板７０表面へ固定されたターゲットＤＮＡの分子数Ｘは、下記数式（１）に示すように増加していくと予測される。
【００８３】
Ｘ＝Ｃ（１−ｅｘｐ（−ｔ／α））      ・・・（１）
ここで、Ｃは、検体中に含まれるターゲットＤＮＡの分子数であり、マイクロアレイ基板７０の検出により求めたい値である。αは、ハイブリダイゼーション反応が起こるときの反応速度と脱離速度の比から決まる定数である。従来のＤＮＡマイクロアレイ読取装置による検出では、ハイブリダイゼーション後に全ての遺伝子に対して読み取りをすることから、αの影響を排除するためにｔの値を十分に長く取ってＤＮＡの分子数に関する係数Ｃを計測する必要があった。このため、αに対して十分長い時間を掛けてハイブリダイゼーションを行う必要があった。例えば、従来のＤＮＡマイクロアレイ読取装置では、ハイブリダイゼーション処理だけでも、約８〜１２時間以上を要しており、検出処理全体ではさらなる時間を要していた。
【００８４】
これに対して、実時間観察が可能な本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置１００では、ハイブリダイゼーションが進んでいく過程を観察・検出する。このため、演算処理部１９が、ハイブリダイゼーションの時系列変化について得られたデータを用いて、ハイブリダイズ量を上記数式（１）にフィッティングさせることにより、それぞれのスポットでのαの値とＣの値とを求めることができる。具体的には、演算処理部１９は、まず、画像処理により抽出した各スポット（ＤＮＡスポット）に対して蛍光強度を積分し、そのスポットに対するハイブリダイズ量Ｘｒとする。そして、このハイブリダイズ量Ｘｒと式（１）中の分子数Ｘとの２乗誤差（Ｘｒ−Ｘ）２が最小になるように、Ｃおよびαを決定する。Ｃとαを決定するには、例えば最急降下法を用いることができる。
【００８５】
このため、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置１００によれば、必ずしもハイブリダイゼーションが終了するまで待つ必要はなく、ハイブリダイゼーションが進行する途中で最終的な量を推定できるようになる。
【００８６】
また、この方法のメリットは、従来型のＤＮＡマイクロアレイ基板では、基板上に固定しておくターゲットＤＮＡの量がプローブＤＮＡの全量よりも多い場合、途中でプローブＤＮＡが不足してしまうという問題点があったが、実時間観察型であれば立ち上がり部分での立ち上がり速度より分子数を推定可能になるため、このような問題点を回避することができる。このため、ＤＮＡスポットが小さくハイブリダイゼーション途中でプローブＤＮＡが不足する場合でも、ターゲットＤＮＡの濃度を正確に計測でき、小さなスポットのＤＮＡマイクロアレイでも計測可能になる。
【００８７】
したがって、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置によれば、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡにハイブリダイズしていく過程を時系列観察して、ハイブリダイズ量の時間変化からそれぞれの塩基配列のＤＮＡがどのくらいあったかを推定することができる。このため、ハイブリダイゼーションに掛かる時間を短縮して検査時間を短縮することができる。さらに、エバネッセント場を発生させるための光学系機構と、蛍光を検出するための光学系機構とを同一の側に配置することにより、検出感度を向上させることもできる。
【００８８】
また、マイクロアレイ読取装置１００は、プリズム基板上にＤＮＡを直接スポットしておらず、光入射手段として機能する部材とマイクロアレイ基板とは別々の構成となっている。このため、マイクロアレイ基板７０を交換すれば、様々なタイプのマイクロアレイ基板に対して利用可能であり、汎用性に優れている。さらに、マイクロアレイ読取装置１００では、イメージングを行うことも可能であり、高精度のＤＮＡマイクロアレイの検出を行うことができる。
【００８９】
なお、上述の説明では、蛍光性官能基を結合させたターゲットＤＮＡを含む試料を用いているが、例えば、２本鎖ＤＮＡに対して特異的に結合する蛍光物質を含む試料を用いることもできる。この場合、図４に示すように、プローブＤＮＡ（１本鎖）８０が固定されているマイクロアレイ基板７０の表面７０ａ上に、ターゲットＤＮＡ（１本鎖）８２と蛍光物質８３とを含む試料溶液を流通させる。マイクロアレイ基板７０の表面７０ａ上に固定されたプローブＤＮＡ８０に検体のターゲットＤＮＡ８２がハイブリダイズすることで２本鎖ＤＮＡ８１が形成される。
【００９０】
ここで蛍光物質８３は、２本鎖ＤＮＡに特異的に結合するものであるため、マイクロアレイ基板７０の表面７０ａにおいてハイブリダイズによって生じた２本鎖ＤＮＡ８１に付着する。このとき、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡ８０が固定化されている表面７０ａの上面側に薄くエバネッセント場６０が発生しているため、２本鎖ＤＮＡ８１に付着している蛍光物質８４のみがエバネッセント場６０によって蛍光励起され発光する。一方、遊離の蛍光物質８３は、エバネッセント場６０によって励起されない。
【００９１】
このように、エバネッセント場６０を用いた照明によって、蛍光物質８４を励起することでマイクロアレイ基板７０の表面７０ａ近傍の蛍光物質８４のみを選択的に励起できる。そして、蛍光強度の時間変化をハイブリダイズ量の変化として計測し、理論曲線にフィッティングすることで最終的なハイブリダイズ量を予想することができる。
【００９２】
〔実施の形態２〕
本発明の他の一実施形態について図５および図６に基づいて説明すると以下の通りである。なお、本実施の形態において、上記実施形態１における構成要素と同一の機能を有する構成要素については、同一の符号を付し、その説明を省略する。本実施の形態では、前記実施の形態１との相違点について説明するものとする。
【００９３】
本実施の形態においても、プローブ物質およびターゲット物質として１本鎖のＤＮＡを用いる場合、つまり、いわゆるＤＮＡマイクロアレイを計測する場合を例に挙げて説明する。
【００９４】
本実施の形態では、倒立型顕微鏡をベースとして構成したマイクロアレイ読取装置であって、対物レンズを経由させることなく、マイクロアレイ基板７０に対して光を入射する光入射手段を備えるマイクロアレイ読取装置２００について説明する。つまり、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置２００は、エバネッセント場による照明は顕微鏡対物レンズを通さずに行う点を除いて、実施形態１に示したマイクロアレイ読取装置１００とほぼ同様の構成となっており、蛍光検出は顕微鏡光学系を通して行うように構成されている。なお、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置２００において、ベースとして利用できる倒立型顕微鏡としては、例えば、実施形態１と同様に、ニコン製、ＴＥ−２０００を挙げることができる。
【００９５】
図５は、本実施の形態に係るマイクロアレイ読取装置２００の構成を模式的に示す図である。図６は、図５に示す構成の一部を上下反対にして模式的に示した斜視図である。これら図５および図６に示すように、マイクロアレイ読取装置２００は、レーザ光源１１、第１のレンズ１２、反射面１３、対物レンズ１４、励起光カットフィルタ１５、結像レンズ１６、光検出器１７、温度調節部１８、演算処理部１９、位置変更部２１、光入射部３０、光吸収部３２を備えている。また、マイクロアレイ読取装置２００は、マイクロアレイ基板７０をその読み取りの対象とする。
【００９６】
本実施の形態では、対物レンズ１４は、顕微鏡光学系における対物レンズの機能のみを有し、実施形態１のように光入射手段として機能するものではない。
【００９７】
光入射部３０は、レーザ光源１１から照射され反射面１３を経由してくる光を反射させるための反射面３１を有する。本実施の形態では、反射面３１は、レーザ光源１１から反射面１３を経由してくる光、つまり顕微鏡光学系（例えば、対物レンズ１４）の光軸と平行な光であって、該光軸から一定の距離オフセットされた光を、マイクロアレイ基板７０におけるプローブ物質が固定されている面において全反射される角度以上の入射角でマイクロアレイ基板７０に対して入射させる角度に設定されている。
【００９８】
すなわち、反射面３１を有する光入射部３０は、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡが固定されている表面にエバネッセント場を発生させるように、レーザ光源１１によって照射されるレーザ光をマイクロアレイ基板７０に対して入射させる光入射手段であって、レーザ光源１１からのレーザ光を、対物レンズ１４を経由させることなく（対物レンズ１４の外部を通過させて）、マイクロアレイ基板におけるプローブ物質が固定されている面において全反射される角度以上の入射角で、マイクロアレイ基板７０に対して入射させるように構成されている。
【００９９】
つまり、本実施形態では、対物レンズ１４を経由させずに、マイクロアレイ基板７０に対して光を入射して、エバネッセント場を発生させる点が、実施形態１と大きく異なる特徴点である。実施形態１に示したように、マイクロアレイ基板７０の表面上にエバネッセント場を発生させるための光の入射を、対物レンズ１４によって（対物レンズ１４を経由して）行う場合、視野角が小さくなり、一度に多くのＤＮＡスポットを検出することができないという問題点がある。
【０１００】
しかし、本実施の形態に示すように、マイクロアレイ基板７０の表面上にエバネッセント場を発生させるための光の入射を、対物レンズ１４の外部から、対物レンズ１４を経由させずに行う場合、より視野角が大きくなり、一度に多くのＤＮＡスポットを検出することができる。具体的には、実施形態１のように、対物レンズ１４を経由してマイクロアレイ基板７０に対して光を入射する場合、視野角は約１５０μｍ×１５０μｍ程度であるが、本実施の形態のように、対物レンズ１４を経由しないでマイクロアレイ基板７０に対して光を入射する場合、視野角は約１ｍｍ（１０００μｍ）×１ｍｍ（１０００μｍ）程度となり、大幅に視野角が広がる。
【０１０１】
また、光入射部３０は、マイクロアレイ基板７０と対物レンズ１４との間に配置されていることが好ましい。また、光入射部３０が対物レンズ１４と接していることがより好適である。これは、光入射部３０が対物レンズ１４と接していることにより、対物レンズ１４の開口数を大きくすることができるためである。これにより、微弱な蛍光を効率よく対物レンズ１４で取得することが可能になる。また、マイクロアレイ基板７０近傍に存在する蛍光物質からの発光はマイクロアレイ基板７０中を全反射角以上の大きな角度で進行する光として放射されるものが多く存在するが、このような蛍光も取得できるようになる。また、マイクロアレイ基板７０と光入射部３０との間にはオイル層２０が設けられている。かかるオイル層２０は、上述の実施形態１におけるオイル層２０と同様の機能を有するものであるため、ここでは、その説明を省略する。
【０１０２】
光入射部３０の屈折率は、マイクロアレイ基板７０の屈折率と略同じであることが好ましい。光入射部３０とマイクロアレイ基板７０との屈折率を合わせることにより、光の入射角度の調整・制御がより一層精度良く行うことができ、かつ境界面での反射を抑えることができるためである。このため、光入射部３０は、マイクロアレイ基板７０と同様に、光透過率の高い材質であるガラス基板や、ポリカーボネート、ＰＭＭＡといった樹脂から構成されていることが好ましいが、温度を変化させた場合の屈折率変化の少なさから、ガラス基板がより好適である。
【０１０３】
また、マイクロアレイ読取装置２００は、光吸収部３２を備えている。光吸収部３２は、マイクロアレイ基板７０の表面にて全反射した光を吸収するためのビームトラップとして機能するものである。かかる光吸収部３２としては、従来公知のビームトラップ装置を好適に用いることができる。例えば、シグマ光機製ビームディフューザーＢＤ−４０を用いることができる。
【０１０４】
次いで、上述したマイクロアレイ読取装置２００の動作について説明する。まず、図５、図６に示すように、レーザ光源１１からレーザ光を照射する。照射されたレーザ光は、第１のレンズ１２によって集光され、続いて反射面１３によって反射される。反射面１３は、第１のレンズ１２を経由して到達するレーザ光源１１からのレーザ光を、顕微鏡光学系（例えば、対物レンズ１４）の光軸と平行な光であって、該光軸から一定の距離オフセットされた光として、光入射部３０が有する反射面３１に対して反射する。
【０１０５】
反射面１３によって反射されたレーザ光は、対物レンズ１４の外部を通って（対物レンズ１４を通らずに）、光入射部３０に対して入射する。光入射部３０に入射した光は、反射面３１によって反射され、光入射部３０内部を通って、マイクロアレイ基板７０に対して入射する。ここで、光入射部３０に入射した光は、光入射部３０の働きにより、光入射部３０の出口においても、平行光線でありながら、マイクロアレイ基板７０に対して大きな入射角を持って入射する光となり、ＤＮＡスポットの照明を行う。
【０１０６】
つまり、光入射部３０は、レーザ光を、マイクロアレイ基板７０におけるプローブＤＮＡが固定されている面において全反射される角度以上の入射角で、マイクロアレイ基板７０に対して入射させる光入射手段として機能するものといえる。なお、光入射部３０の屈折率とマイクロアレイ基板７０の屈折率とは略同じであるため、マイクロアレイ基板７０に対する入射光の入射角度は、反射面３１によって反射された角度からほとんど変化しない。
【０１０７】
そして、このとき、マイクロアレイ基板７０の表面の上面側に薄くエバネッセント場が発生する。なお、エバネッセント場によって、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズしたか否かを検出する機構については、実施形態１と同様であるため、ここではその説明を省略する。
【０１０８】
発生した蛍光は、対物レンズ１４で集めて、励起光カットフィルタ１５、結像レンズ１６といった顕微鏡光学系の機構を通して再び結像させ、光検出器１７によって検出する。また、本実施の形態でも、温度調節部１８を用いて、試料溶液の温度が６５℃にて一定に保ち温度安定化した状態で、ターゲットＤＮＡを含む試料溶液を流通させ、マイクロアレイ基板７０と接触させている。このため、蛍光像の時間変化を観察することにより、実時間でハイブリダイゼーション過程を評価できる。
【０１０９】
したがって、マイクロアレイ読取装置２００によれば、ハイブリダイゼーション処理にかかる時間を短縮させることができるため、従来の装置に比べて、大幅に検出時間を短縮化できる。さらに、視野角が大きいため、一度に多くのＤＮＡスポットを観察でき、さらなる検出時間の短縮化および高精度な検出が可能となる。
【０１１０】
なお、本明細書では、もっぱらＤＮＡマイクロアレイ基板の読み取りを例に挙げて説明してきたが、本発明はこれに限られるものではない。すなわち、本発明は、ＤＮＡのみならずタンパク質や生体内小分子、環境ホルモン等の分子を検出する計測技術としても利用可能である。このため、当業者が、本願出願当時の技術水準に基づいて、ＤＮＡマイクロアレイの読み取り技術を、タンパク質またはその他の物質の検出技術に適用できる範囲についても、十分に本願発明の技術範囲に含まれることを念のため付言しておく。
【０１１１】
最後に、演算処理部１９は、ハードウェアロジックによって構成してもよいし、次のようにＣＰＵを用いてソフトウェアによって実現してもよい。
【０１１２】
すなわち、演算処理部１９は、各機能を実現する制御プログラムの命令を実行するＣＰＵ（central processing unit）、上記プログラムを格納したＲＯＭ（read only memory）、上記プログラムを展開するＲＡＭ（random access memory）、上記プログラムおよび各種データを格納するメモリ等の記憶装置（記録媒体）などを備えている。そして、本発明の目的は、上述した機能を実現するソフトウェアである演算処理部１９の制御プログラムのプログラムコード（実行形式プログラム、中間コードプログラム、ソースプログラム）をコンピュータで読み取り可能に記録した記録媒体を、上記演算処理部１９に供給し、そのコンピュータ（またはＣＰＵやＭＰＵ）が記録媒体に記録されているプログラムコードを読み出し実行することによっても、達成可能である。
【０１１３】
上記記録媒体としては、例えば、磁気テープやカセットテープ等のテープ系、フロッピー（登録商標）ディスク／ハードディスク等の磁気ディスクやＣＤ−ＲＯＭ／ＭＯ／ＭＤ／ＤＶＤ／ＣＤ−Ｒ等の光ディスクを含むディスク系、ＩＣカード（メモリカードを含む）／光カード等のカード系、あるいはマスクＲＯＭ／ＥＰＲＯＭ／ＥＥＰＲＯＭ／フラッシュＲＯＭ等の半導体メモリ系などを用いることができる。
【０１１４】
また、演算処理部１９を通信ネットワークと接続可能に構成し、上記プログラムコードを、通信ネットワークを介して供給してもよい。この通信ネットワークとしては、特に限定されず、例えば、インターネット、イントラネット、エキストラネット、ＬＡＮ、ＩＳＤＮ、ＶＡＮ、ＣＡＴＶ通信網、仮想専用網（virtual private network）、電話回線網、移動体通信網、衛星通信網等が利用可能である。また、通信ネットワークを構成する伝送媒体としては、特に限定されず、例えば、ＩＥＥＥ１３９４、ＵＳＢ、電力線搬送、ケーブルＴＶ回線、電話線、ＡＤＳＬ回線等の有線でも、ＩｒＤＡやリモコンのような赤外線、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、８０２．１１無線、ＨＤＲ、携帯電話網、衛星回線、地上波デジタル網等の無線でも利用可能である。なお、本発明は、上記プログラムコードが電子的な伝送で具現化された、搬送波に埋め込まれたコンピュータデータ信号の形態でも実現され得る。
【０１１５】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１６】
以下、本発明を具体化した実施例として、上述の実施形態１に示すマイクロアレイ読取装置１００を用いて、ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーション過程の時系列観察を行った結果を示す。本実施例では、一般的なＤＮＡマイクロアレイ実験で汎用される遺伝子ｒｅｌＡの検出に用いられるｃＤＮＡを用いてハイブリダイゼーション実験を行った。ｒｅｌＡは、細胞質から核へ移行し、標的遺伝子の発現誘導を行う転写因子ＮＦκＢの活性化と不活性化に重要な遺伝子（長さ２．２ｋｂｐ）で、免疫反応や発生分化に関与する細胞において幅広く発現していることが知られている。ハイブリダイゼーション実験では、このｃＤＮＡをプローブＤＮＡとしてカバーガラス基板にスポットしておき、そこに同じｃＤＮＡをターゲットＤＮＡとしてフローセル（ハイブリダイゼーション・セル）中を流して検出した。
【０１１７】
本実施例では、ハイブリダイゼーション・セルは倒立型顕微鏡（ニコン製、ＴＥ−２０００）の試料ステージに設置しておき、エバネッセント場による照明は対物レンズ（ニコン製、ＴＩＲＦ様態物、ＮＡ＝１．４５）側から行った。発生した蛍光は対物レンズで集めて顕微鏡光学系を通して再び結像し、冷却ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス、ＯＲＣＡ−ＥＲ）にて検出した。
【０１１８】
ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせて検出する実験を行った。作製したＤＮＡマイクロアレイを９８℃のウォーターバスにつけて熱変性させて一本鎖にした後、ＮａＢｒ水溶液に浸してブロッキング処理をして乾燥させて実験に使用した。ハイブリダイゼーション・セル中に流すターゲットＤＮＡは、無染色の状態でＴＥバッファーに分散させ、蛍光プローブを混合して濃度調整した後、９８℃で５分間熱変性させて一本鎖状態にして用いた。用いた蛍光プローブは、ＰＯＰＯ−３（Molecular Probes, Inc.）で、２本鎖ＤＮＡが選択的に検出できることを事前に評価してある。ハイブリダイゼーション・セルを６５℃に昇温して温度安定化した状態でターゲットＤＮＡを含む溶液を流して、蛍光像の時間変化を観察した。
【０１１９】
その結果を図７（ａ）〜（ｄ）に示す。（ａ）はｔ＝０、（ｂ）はｔ＝１（min）、（ｃ）はｔ＝５（min）、（ｄ）はｔ＝２０（min）の結果を示す図である。プローブＤＮＡをスポットした部分に明るい蛍光が観察され、その部分でハイブリダイゼーションが起こっていることがわかる。
【０１２０】
また、対象実験（コントロール）として、ＰＯＰＯ−３を混合して同様に調整したターゲットＤＮＡ溶液を熱変性させない状態（２本鎖状態）でハイブリダイゼーション・セルに流して実験を行った。２本鎖状態ではプローブＤＮＡにハイブリダイズしないので、プローブＤＮＡのスポットでは検出されないと考えられる。
【０１２１】
その観察結果を図７（ｅ）〜（ｈ）に示す。（ｅ）はｔ＝０、（ｆ）はｔ＝１（min）、（ｇ）はｔ＝５（min）、（ｈ）はｔ＝２０（min）の結果を示す図である。初期に少し明るくなっているが、その後ほぼ一定の明るさになっている。
【０１２２】
図７の結果から、それぞれのスポットの蛍光強度（スポット内の平均値）の変化をプロットした結果を図８に示す。なお、グラフ中、“Hybridization”で示すものが１本鎖ＤＮＡをハイブリダイズした場合の結果を示し、“Control”で示すものが対照実験の結果を示す。
【０１２３】
図８に示すように、ターゲットＤＮＡがフローセル内を流れるにつれて、スポット内の蛍光強度が増加していくが、あるところから強度が頭打ちになっている。これは上述の数式（１）で予測されるようにターゲットＤＮＡ量が減少するにつれて強度変化が頭打ちになることに対応している。
【０１２４】
また、グラフではステップ的に蛍光強度が増加する現象が見られるが、これはハイブリダイゼーション・セル中のＤＮＡ溶液が脈動したためとＤＮＡ溶液の濃度が時間的にバラついたためと考えている。初期の段階でバッファーを押しのけてＤＮＡ溶液が流れていくので、この段階でＤＮＡ溶液の濃度にバラつきが発生したこともステップが生じた原因と推測している。なお、本実施例における実験では、開始から５０分まで観測を続けたが、はじめの約１０分程度でハイブリダイゼーション過程が安定していることを確認した。
【０１２５】
本実施例にも示すように、実時間観察型のＤＮＡマイクロアレイ読取装置を用いることにより、ハイブリダイゼーション過程を観察できるようになり、従来型のＤＮＡマイクロアレイ読取装置に比べて、検出時間が大幅に短縮できることがわかった。本発明に係るマイクロアレイ読取装置では、ハイブリダイゼーション処理に掛かる時間を短縮できることが特徴である。現状では１５分程度のハイブリダイゼーション時間で計測が行えるようになる。さらに、ハイブリダイゼーション時のフローの安定化や、溶液濃度のバラツキの抑制、ハイブリダイゼーションの高効率化など技術的課題をクリアすることで、より完成度を高めることができると考える。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
以上のように、本発明によれば、検出時間を大幅に短縮することができ、さらに高精度化も達成できるため、基礎研究といった学術的な利用だけでなく、医療現場や農業試験場等で用いられるフィールドユース可能なマイクロアレイ読取装置を提供することができるため、医療業、食品産業、製薬産業、および環境といった広範な分野において産業上の利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】本発明に係る実施の一形態のマイクロアレイ読取装置の構成を模式的に示す図である。
【図２】（ａ）は本発明に係る実施の一形態のハイブリダイゼーション・セルの構成の一例を上方から見た図であり、（ｂ）は（ａ）におけるａ−ａ’線に沿って切断した断面を示す図である。
【図３】本発明に係る実施の一形態のマイクロアレイ基板に対して光を入射した場合の状態を模式的に説明する図である。
【図４】本発明に係る実施の他の一形態のマイクロアレイ基板に対して光を入射した場合の状態を模式的に説明する図である。
【図５】本発明に係る実施の他の一形態のマイクロアレイ読取装置の構成を模式的に示す図である。
【図６】図５に示すマイクロアレイ読取装置の構成の一部を上下反対にして模式的に示した斜視図である。
【図７】本発明に係る実施例におけるハイブリダイゼーション実験の結果を示す図であり、（ａ）〜（ｄ）は本実施例に係るマイクロアレイ読取装置を用いた場合の結果を示し、（ｅ）〜（ｈ）は対照実験の結果を示す図である。
【図８】図７の結果をグラフ化したものを示す図である。
【図９】ガラス基板に光を入射してエバネッセント場を発生させる現象を模式的に説明する図である。
【符号の説明】
【０１２８】
１１    レーザ光源（光照射手段）
１４    対物レンズ（光学レンズ、光入射手段）
１７    光検出器（光検出手段）
１８    温度調節部（温度調節手段）
１９    演算処理部（演算処理手段）
２０    オイル層
２１    位置変更部（位置変更手段）
３０    光入射部（光入射手段）
３１    反射面
７０    マイクロアレイ基板
１００、２００    マイクロアレイ読取装置
【図１】
2006038816.tif 000003
【図２】
2006038816.tif 000004
【図３】
2006038816.tif 000005
【図４】
2006038816.tif 000006
【図５】
2006038816.tif 000007
【図６】
2006038816.tif 000008
【図７】
2006038816.tif 000009
【図８】
2006038816.tif 000010
【図９】
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