(57)【要約】【課題】  生体分子等の相互作用を、簡単な構成で測定する。【解決手段】  貴金属微粒子に生体を固定し、この貴金属微粒子に光源８から光ファイバ５を介して光を照射する。この照射光の貴金属微粒子からの反射光を光検出手段１１ａ〜１１ｃに光ファイバ６を介して導く。光検出手段は、入力光における極大吸収波長を含む第２の帯域と、この第２の帯域よりも長波長側に位置する第１の波長帯域と、この第２の波長帯域よりも短波長側に位置する第３の波長帯域の光の強度をそれぞれ別個に測定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に物質が吸着すると表面の光学的特性が変化するオプティカルバイオセンサと、このオプティカルバイオセンサの表面の光学特性を測定する光学測定装置とを有することを特徴とする生体分子相互作用測定装置。
【請求項２】
前記光学測定装置は、予め定めた波長帯域の強度を測定可能であることを特徴とする請求項１に記載の生体分子相互作用測定方法。
【請求項３】
前記光学測定装置は、前記オプティカルバイオセンサからの出力光の中の極大吸収波長を含む第２の帯域と、この極大吸収波長よりも長波長側に位置する第１の帯域と、極大吸収波長よりも短波長側に位置する第３の帯域の強度を測定可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子相互作用測定装置。
【請求項４】
前記オプティカルバイオセンサに光を照射するための光源を設け、前記光学装置に特定の波長帯域光のみを通過させるフィルタを設けたことを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子相互作用測定装置。
【請求項５】
前記光源は、特定の波長帯域の発光特性を有することを特徴とする請求項４に記載の生体分子相互作用測定装置。
【請求項６】
前記光源は複数個設けられており、各光源はそれぞれ異なる波長帯域で発光する特性を有しており、これら複数の光源の発光時間と前記光学測定装置の測定時間とを同期させる制御装置とを設けたことを特徴とする請求項４に記載の生体分子相互作用測定装置。
【請求項７】
貴金属微粒子に生体を固定し、この貴金属微粒子に光源から光を照射し、この照射光の貴金属微粒子からの反射光を複数の光検出手段に導く生体分子相互作用測定方法において、前記光検出手段に入力される光における極大吸収波長を含む第２の帯域と、この第２の帯域よりも長波長側に位置する第１の波長帯域と、この第２の波長帯域よりも短波長側に位置する第３の波長帯域の光の強度を別個の光検出手段が測定することを特徴とする生体分子相互作用測定方法。
【請求項８】
前記光源から照射される光が白色光であり、前記第１の帯域が赤色域であり、前記第２の帯域が緑色域であり、前記第３の帯域が青色域であることを特徴とする請求項７に記載の生体分子相互作用測定方法。
【請求項９】
前記光源からの照射光を光ファイバでセンサウェル中のランニングバッファに浸漬した貴金属微粒子に導き、貴金属微粒子からの反射光を照射光に用いたものとは異なる光ファイバでフォトダイオードおよびフィルタを備えた光検出手段に導くことを特徴とする請求項７に記載の生体分子作用測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の相互作用を測定する測定装置及び測定方法に係り、特に医療診断や食品検査等に好適な生体分子の分子相互作用を測定する測定装置および測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の相互作用を測定する原理が、非特許文献１に記載されている。この文献では、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いて免疫センサやガスセンサを作成するために、金属薄膜と誘電体の界面で、この界面を伝播する自由電子の疎密波を共鳴させている。
【０００３】
生体分子の相互作用を測定する他の例が、特許文献１に記載されている。この公報に記載の生体分子検出方法では、液体中における生体分子結合を簡便に測定するために、貴金属微粒子が固相された基板に特定角度から光を照射し、正反射光の吸収極大波長を求めている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３６５２１０号公報
【０００５】
【非特許文献１】永田和宏・半田宏著「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、頁１３〜２６、シュプリンガー・フェアラーク東京
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記非特許文献１に記載のＳＰＲ法を用いた測定方法では、金属薄膜を形成したプリズムを用いて共鳴入射角度を測定している。しかしながら、共鳴入射角度を高精度に測定するためには、照射光の光源や金属薄膜、光検出器の位置関係を精度良く保持および駆動しなければならない。またＳＰＲ法は、温度に敏感であり、測定試料や装置全体の温度を高精度に制御するか温度補正する必要がある。また、上記特許文献１に記載の生体分子検出方法では、かなりの程度簡便さが進められているものの、分光光度計等の高価な装置を必要とし、さらなる低廉化が求められている。
【０００７】
本発明は上記従来技術の不具合に鑑みなされたものであり、その目的は、生体分子の相互作用を、小型で簡易な構成の装置で測定することにある。本発明の他の目的は、低コストで生体分子の相互作用を測定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成する本発明の特徴は、表面に物質が吸着すると表面の光学的特性が変化するオプティカルバイオセンサと、このオプティカルバイオセンサの表面の光学特性を測定する光学測定装置とを有することにある。
【０００９】
そしてこの特徴において、光学測定装置は、予め定めた波長帯域の強度を測定可能であるのが好ましく、光学測定装置は、前記オプティカルバイオセンサからの出力光の中の極大吸収波長を含む第２の帯域と、この極大吸収波長よりも長波長側に位置する第１の帯域と、極大吸収波長よりも短波長側に位置する第３の帯域の強度を測定可能であることがさらに好ましい。
【００１０】
また、オプティカルバイオセンサに光を照射するための光源を設け、前記光学装置に特定の波長帯域光のみを通過させるフィルタを設けてもよく、光源は、特定の波長帯域の発光特性を有するものであってもよい。さらに、光源は複数個設けられており、各光源はそれぞれ異なる波長帯域で発光する特性を有しており、これら複数の光源の発光時間と前記光学測定装置の測定時間とを同期させる制御装置とを設けるようにしてもよい。
【００１１】
上記目的を達成する本発明の他の特徴は、貴金属微粒子に生体を固定し、この貴金属微粒子に光源から光を照射し、この照射光の貴金属微粒子からの反射光を光検出手段に導く生体分子相互作用測定方法において、前記光検出手段に入力される光における極大吸収波長を含む第２の帯域と、この第２の帯域よりも長波長側に位置する第１の波長帯域と、この第２の波長帯域よりも短波長側に位置する第３の波長帯域の光の強度を測定するものである。
【００１２】
そしてこの特徴において、光源から照射される光が白色光であり、前記第１の帯域が赤色域であり、前記第２の帯域が緑色域であり、前記第３の帯域が青色域であるのがよく、光源からの照射光を光ファイバでセンサウェル中のランニングバッファに浸漬した貴金属微粒子に導き、貴金属微粒子からの反射光を照射光に用いたものとは異なる光ファイバでフォトダイオードおよびフィルタを備えた光検出手段に導くようにしてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、金属微粒子を用いて吸収波長の反射光強度の変化を測定し、その計測波長中の特定波長に着目してその変化を測定したので、簡単な装置で分光光度計を用いたときと同様の計測が可能になる。また、測定装置を小型化し、コストを低減出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明に係る生体分子の相互作用を測定する装置の実施例を、図面を用いて説明する。図１に、生体分子結合量の測定装置１００の一実施例を、模式図で示す。測定用試料３を収容する容器であるセンサウェル１は、生化学分析に用いるサンプルプレートと同様の容器である。このセンサウェル１の底面には、特許文献１である特開２０００−５５９２０号公報に記載のものと同様の貴金属微粒子センサ２が形成されている。この貴金属微粒子センサ２の表面には、測定目的に応じて、化学修飾されるか、抗原等のアナライト物質が固定されている。本実施例では測定試料３として、リン酸緩衝液などのランニングバッファ３を用いている。
【００１５】
センサウェル１には測定プローブ４が挿入されており、測定プローブ４の先端はランニングバッファ３の中まで挿入されている。測定プローブ４の内部には、照射用光ファイバ５と測定用光ファイバ６が保持されている。これら照射用光ファイバ５と測定用光ファイバ６とは、貴金属微粒子センサ２に対向して配置されている。
【００１６】
照射用光ファイバ５の一端は、ランニングバッファ３に漬けられており、照射用光ファイバ５の他端部は測定プローブ４外に延在してＬＥＤホルダ７に接続されている。ＬＥＤホルダ７内には、発光回路８が駆動する白色ＬＥＤ９が搭載されている。発光回路８により駆動される白色光は、測定プローブ４を介して貴金属微粒子センサ２の表面に照射される。
【００１７】
測定用光ファイバ６も一端部が測定プローブ４から延在しており、その端部は光センサホルダ１０に接続されている。光センサホルダ１０の内部には、異なる波長フィルタを備えた複数個のフォトダイオード１１ａ〜１１ｃが保持されている。白色ＬＥＤ９で発光し、貴金属微粒子センサ２の表面で反射した光は、測定用光ファイバ６を介してこれらのフォトダイオード１１ａ〜１１に導かれる。フォトダイオード１１ａ〜１１ｃは、それぞれが備えるフィルタでフィルタリングされた波長帯域の光を受光し、受光強度に応じた電流を発生する。発生した電流は、アンプ回路１２で電圧に変換されるとともに増幅される。そして、インターフェース回路１３を経由して、データ処理装置１４に入力される。
【００１８】
このように構成した本実施例の生体分子相互作用測定装置の動作を、以下に説明する。図２に、ＬＥＤホルダ７内に保持する白色ＬＥＤ９の波長特性を、図３に金属微粒子センサ２からの反射光の吸光度スペクトル特性を示す。白色ＬＥＤ９は、いわゆる青色ＬＥＤに黄色蛍光体を加えることにより構成できる。本実施例で用いる白色ＬＥＤ９は、波長帯域が約４００〜８００ｎｍで発光する。この光を、粒子径約１１０ｎｍの貴金属微粒子センサ２に照射すると、図３に示すように、波長５５０ｎｍ付近に吸収ピークを有する反射光の吸光度スペクトルが得られる。
【００１９】
そこで、光センサフォルダ１０に収容するフォトダイオード１１ａ〜１１ｃに適用する波長フィルタを、図３に示す吸光度スペクトルに基づいて選定する。すなわち、図２に示した白色ＬＥＤ９のピーク波長に対応して、そのピーク波長よりも長波長域の第１のフィルタと、ピーク波長を含む波長域の第２のフィルタと、ピーク波長よりも短波長側の第３のフィルタを選定する。具体的には、図４に示す分光感度特性４０１〜４０３を有するフィルタであり、第１のフィルタは６２０ｎｍ付近に、第２のフィルタは５５０ｎｍ付近に、第３のフィルタは４６０ｎｍ付近に設定する。これらの波長帯域は、光の３原色である赤、緑および青の波長とほぼ同じであるので、一般に用いられるＲＧＢカラーフィルタを、利用する。
【００２０】
データ処理装置１４は、フォトダイオード１１ａ〜１１ｃが受光した反射光の強度から、（式１）により、各波長帯域での吸光度Ａ（λ）を算出する。  
Ａ（λ）＝−ｌｏｇ［Ｌ（λ）／｛（Ｒ（λ）−ｄ（λ））｝  ……（式１）
ここで、λは波長帯域であり、第１〜第３のフィルタの波長帯域であるλ１、λ２、λ３である。Ｒ（λ）は、反射量が既知の標準反射板を用いて予め測定した測定強度、ｄ（λ）は、予め測定した光量無しでの測定強度、Ｌ（λ）はフォトダイオード１１ａ〜１１ｃを用いて測定した測定強度である。
【００２１】
（式１）から算出した吸光度Ａ（λ）の変化量をΔＡ（λ）として、この変化量ΔＡ（λ）の時間変化を、図５のグラフに示す。初期状態では、センサウェル１内にランニングバッファ３が十分な量だけ保持されている。この初期状態では、第３のフィルタを装着したフォトダイオード１１ｃの吸光度変量５０１と、第１のフィルタを装着したフォトダイオード１１ａの吸光度変化量５０２は、ほとんど変動しない。
【００２２】
所定時間経過した時間５０３において、図示しない抗原をランニングバッファ３中に投入する。貴金属微粒子センサ２の表面に抗原が吸着し始める。それに伴い、貴金属微粒子センサ２の吸収ピーク波長が長波長側に移動する。このとき、短波長側のフォトダイオード１１ｃの吸光度変化量５０２が減少し、長波長側のフォトダイオード１１ａの吸光度変化量５０１が増加する。この増減量は抗原物質の吸着量に依存する。
【００２３】
抗原を含む溶液をランニングバッファ３で置換した後、時間５０４において抗原物質と結合する抗体物質をランニングバッファ３中に添加する。貴金属微粒子センサ２表面上に吸着した抗原物質に、抗体物質が結合する。このとき、抗原物質と抗体物質との結合量に応じて、短波長側のフォトダイオード１１ｃの吸光度変化量５０２が減少し、長波長側のフォトダイオード１１ａの吸光度変化量５０１が増加する。
【００２４】
ところで、図５の期間５０５では、生体分子の結合に無関係な変動が生じている。これは、溶液の混合または置換、光源の変動、その他の要因による変動である。この期間５０５では、吸光ピーク波長がほとんど変動していない。また、全体の吸光度が変動している。短波長側のフォトダイオード１１ｃの吸光度変化量５０２と、長波長側のフォトダイオード１１ａの吸光度変化量５０１は、ともに減少またはともに増加する。
【００２５】
このようなノイズ成分を除去するため、短波長側のフォトダイオード１１ｃの吸光度変化量５０２と、長波長側のフォトダイオード１１ａの吸光度変化量５０１との差を求める。その際、ピーク波長変化量に対する短波長側および長波長側のダイオード１１ｃ、１１ａの吸光度変化量５０２、５０１は、ピーク波長の吸光度の大きさにより変化するから、ピーク波長であるフォトダイオード１１ｂの吸光度を用いて、これを規準化する。この結果、結合シグナルＵは、例えば（式２）のように求められる。
【００２６】
Ｕ＝ΔＡ（λ３）／（Ａ（λ２）−Ａ（λ３））
−ΔＡ（λ１）／（Ａ（λ２）−Ａ（λ１））    ……（式２）
算出した結合シグナルＵを、図５中にデータ５０６で示す。期間５０５で生じていたノイズが打ち消され、良好なシグナルが得られる。
【００２７】
本実施例によれば、貴金属微粒子センサ２表面での生体分子の結合量を、波長の異なるフィルタを有する複数の検出器を用いて測定するので、ピーク吸光度の大きさや外乱による変動の影響を排除することが可能になる。なお、貴金属微粒子センサ２の品質が均一で、ピーク吸光度をほぼ一定とすることができれば、ピーク吸光度の大きさの影響を無視でき、結合シグナルＵは、（式３）から求められる。
【００２８】
Ｕ＝ΔＡ（λ３）−ＫΔＡ（λ１）    ……（式３）
ここで、Ｋはピーク吸光度の変動量ΔＡ（λｉ）を規準化する為の定数である。
【００２９】
ピーク吸光度がほぼ一定であるから、フォトダイオード１１ｂは不要である。したがって、生体分子相互作用測定装置をさらに簡略化および小型化できる。また、溶液の注入方法を適切に選定すれば、結合シグナル以外のノイズも抑制可能である。その場合、２個の波長帯域の差を求めて補正する必要が無くなり、短波長側または長波長側のフォトダイオード１１ａ、１１ｃのいずれか一方を用いて、結合シグナルＵを求めることができる。
【００３０】
なお、本実施例では特許文献１に記載の方法で作成した貴金属微粒子を用いて生体分子相互作用を測定するためのセンサとしているが、センサはこれに限るものではない。たとえば、金コロイドや基板上にパターニングされた微小スリット加工された金属膜などで形成されたバイオセンサは、可視光波長よりも微小な凹凸形状を持つ金属体を利用しており、貴金属微粒子同様の光学的性質を有している。したがって、これらのバイオセンサも生体分子相互作用の検出用センサに用いることができる。
【００３１】
本発明に係る生体分子相互作用測定装置の他の実施例の模式図を、図６に示す。本実施例の生体分子相互作用測定装置１０１は、上記実施例とは以下の点で相違する。ＬＥＤホルダ７内に、発光波長特性の異なる３個のＬＥＤを収容している。すなわち、図７に示す発光波長特性７０１を有する青色ＬＥＤ６０１ａ、発光波長特性７０２を有する緑色ＬＥＤ６０１ｂ、発光波長特性７０３を有する赤色ＬＥＤ６０１ｃが、ＬＥＤホルダ７内に保持されている。
【００３２】
これらのＬＥＤ６０１ａ〜６０１ｃの波長特性は、上記実施例に示したフォトダイオード１１ａ〜１１ｃの波長フィルタの特性にほぼ一致する。青色ＬＥＤ６０１ａおよび緑色ＬＥＤ６０１ｂ、赤色ＬＥＤ６０１ｃは、発光回路６０２および同期回路６０３によって個別に制御される。そしてこれら３個のＬＥＤ６０１ａ〜６０１ｃは、一定間隔で順番に発光する。
【００３３】
光センサホルダ１０内には、青色ＬＥＤ６０１ａおよび緑色ＬＥＤ６０１ｂ、赤色ＬＥＤ６０１ｃの発光波長帯域をカバーする広帯域なフォトダイオード６０４が搭載されている。フォトダイオード６０４の受光シグナルは、アンプ回路１２で増幅されて同期インターフェース回路６０５に入力される。同期インターフェース回路６０５では、同期回路６０３から送信された同期信号に基づいて、フォトダイオード６０４が検出した測定データを、３つの波長帯域に振り分けてデータ処理装置１４に送信する。３個のＬＥＤ６０１ａ〜６０１ｃの発光間隔を十分に短くすれば、図１に示した実施例とほぼ同じ３個の波長帯域の受光強度データが得られる。
【００３４】
フォトダイオード６０４の感度は、受光面積に依存する。本実施例では、フォトダイオード６０４が有する受光面積を、どの波長帯域の測定においてもフルに活用できるので、感度が向上する。本実施例においても、データ処理装置１４が処理するデータ処理方法は同じであるが、測定対象および測定内容に応じて、適宜ＬＥＤの個数を増減できる。ＬＥＤを減らした場合には、装置構成が簡略化する。
【００３５】
本発明に係る生体分子相互作用測定装置のさらに他の実施例を、図８に模式図で示す。本実施例の生体分子相互作用測定装置１０２は、上記各実施例とは、貴金属微粒子からの反射光を測定する手段が相違している。上記各実施例では、フォトダイオードで反射光の強度等を検出していたが、本実施例ではカラーＣＣＤカメラ８０１を検出手段に用いている。カラーＣＣＤカメラ８０１では、光の３原色（ＲＧＢ）の各波長の強度を測定するＣＣＤ素子を、二次元アレイ状に配置している。個々のＣＣＤ素子が貴金属微粒子からの反射光を測定できるので、センサウェルの代わりに、センサアレイプレート８０２を使用する。
【００３６】
センサアレイプレート８０２では、平面上に貴金属微粒子センサスポット８０３が二次元配置されている。
【００３７】
センサアレイプレート８０２上には、貴金属微粒子センサスポット８０３が多点形成されている。すなわち、各センサスポット８０３がセンサウェルの働きをする。測定の事前準備として、ピペットやスポッティングマシン等を用いて、各貴金属微粒子センサスポット８０３に、それぞれ異なる種類の結合性を確認する化学物質や生体高分子を固定化する。その後、固定化された化学物質や生体高分子との結合性を調べる生体分子試料を、センサアレイプレート８０２の上面に塗布する。あるいは、図示しない試料溶液にセンサアレイプレート８０２を侵漬する。
【００３８】
センサアレイプレート８０２の状態を、カラーＣＣＤカメラ８０１を用いて測定する。センサアレイプレート８０２上の全貴金属微粒子センサスポット８０３のイメージを撮像し、インターフェースボード８０４を介して、データ処理装置８０５に送信する。データ処理装置８０５は、各貴金属微粒子センサスポット８０３のＲＧＢ値を画像処理する。これにより、図４や図７に示した各波長帯域における受光強度と同様の信号を、センサアレイプレート８０２上のすべての貴金属微粒子センサスポット８０３について得る。
【００３９】
本実施例によれば、アレイプレートやマイクロ流路中にマトリクス状に形成した貴金属微粒子センサを用いているので、効率よく同時多点計測することができる。なお本実施例では、カラーＣＣＤカメラがセンサアレイプレート上のすべての貴金属微粒子センサスポットを測定しているが、測定回数を増して、分割処理してもよいことはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明に係る生体分子相互作用測定装置の一実施例の模式図である。
【図２】図１に示した生体分子相互作用測定装置が有する白色ＬＥＤの波長特性を説明する図である。
【図３】図１に示した生体分子相互作用測定装置に用いる貴金属微粒子センサの吸収波長特性を説明する図である。
【図４】図１に示した生体分子相互作用測定装置が有するフォトセンサの感度特性を説明する図である。
【図５】図１に示した生体分子相互作用測定装置における測定例を示すグラフである。
【図６】本発明に係る生体分子相互作用測定装置の他の実施例の模式図である。
【図７】図１に示した生体分子相互作用測定装置が有する各色のＬＥＤの波長特性を説明する図である。
【図８】本発明に係る生体分子相互作用測定装置のさらに他の実施例の模式図である。
【符号の説明】
【００４１】
１…センサウェル、２…貴金属微粒子センサ(オプティカルバイオセンサ)、３…ランニングバッファ、４…測定プローブ、５…照射用光ファイバ、６…測定用光ファイバ、７…ＬＥＤホルダ、８…発光回路、９…白色ＬＥＤ、１０…光センサホルダ、１１ａ〜１１ｃ…フォトダイオード、１２…アンプ回路、１３…インターフェース回路、１４…データ処理装置、４０１〜５０２…フォトダイオードの分光感度特性、５０３、５０４…抗原添加時刻、５０５…ノイズ発生時刻、５０６…結合シグナル算出値Ｕ、６０１ａ…青色ＬＥＤ、６０１ｂ…緑色ＬＥＤ、６０１ｃ…赤色ＬＥＤ、６０２…発光回路、６０３…同期回路、６０４…フォトダイオード、６０５…同期インターフェース回路、７０１…青色ＬＥＤの発光波長特性、７０２…緑色ＬＥＤの発光波長特性、７０３…赤色ＬＥＤの発光波長特性、８０１…カラーＣＣＤカメラ、８０２…センサアレイプレート、８０３…貴金属微粒子センサスポット、８０４…インターフェースボード、８０５…データ処理装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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