(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列を明らかにし、当該ヒト由来ＰＧＩＳ及び該ＰＧＩＳをコードするＤＮＡを提供すること。【解決手段】ヒト由来プロスタサイクリンシンターゼ（PGIS）の特定アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを含むDNA、該DNAを含有するベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培地中で培養することによるヒト由来PGISの製造法。ヒト由来PGISのアミノ酸配列を有するポリペプチド、当該ヒト由来PGISに反応性を示す抗体。該DNA又は該DNAを含有するベクターを含有する医薬組成物。該DNA又は該DNAを含有するベクターを生体内に導入することを特徴とするPGI2産生の促進方法、又はPGI2産生低下に起因する疾患の処置方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１２で示されるヒト由来プロスタサイクリンシンターゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１１で示される塩基番号２８乃至１５２７の塩基配列を有する請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１２で示されるヒト由来プロスタサイクリンシンターゼのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１又は２のいずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６５３またはＦＥＲＭ ＢＰ−４６５４で識別される形質転換細胞。
【請求項７】
請求項５記載の宿主細胞を培地中で培養して得られる培養物からヒト由来プロスタサイクリンシンターゼを取得することを特徴とするヒト由来プロスタサイクリンシンターゼの製造方法。
【請求項８】
配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するヒト由来プロスタサイクリンシンターゼに反応性を有する抗体。
【請求項９】
請求項１又は２のいずれかに記載のＤＮＡを生体内に導入することを特徴とするプロスタグランジンＩ2の産生を促進する方法。
【請求項１０】
請求項４記載の組換えベクターを生体内に導入することを特徴とするプロスタグランジンＩ2の産生を促進する方法。
【請求項１１】
請求項１又は２のいずれかに記載のＤＮＡを生体内に導入することを特徴とするプロスタグランジンＩ2産生低下に起因する疾患の処置方法。
【請求項１２】
請求項４記載の組換えベクターを生体内に導入することを特徴とするプロスタグランジンＩ2産生低下に起因する疾患の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト由来のプロスタサイクリンシンターゼ（Prostacyclin synthase、以下、ＰＧＩＳという）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞および該宿主細胞を培養することによるヒト由来ＰＧＩＳの製造方法に関する。また本発明は、当該ＰＧＩＳまたはその断片に対して反応性を示す抗体に関する。更に本発明は、該ＤＮＡまたは該ＤＮＡを含有するベクターを含有する医薬組成物、プロスタグランジンＩ2の産生を促進する方法およびプロスタグランジンＩ2産生低下に起因する疾患の処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＧＩＳは、主として血管内皮細胞のミクロソーム画分に含まれ、プロスタグランジンＩ2（以下、ＰＧＩ2という）の合成、すなわちプロスタグランジンＨ2（以下、ＰＧＨ2という）からＰＧＩ2への変換を触媒する酵素である。
かかる酵素によって合成されるＰＧＩ2は、強力な血小板凝集抑制作用および血管平滑筋弛緩作用を有する物質である。一方、血小板には当該ＰＧＩ2とは相反する作用、すなわち強力な血小板凝集作用および血管平滑筋収縮作用を有するトロンボキサンＡ2（以下、ＴＸＡ2という）が存在しており、血管系において両物質が拮抗的に作用し生体内の恒常性の維持に関与している〔非特許文献１〕。
近年、成人病の一つとして挙げられている心筋梗塞血栓症や動脈硬化症等の循環器系の疾患は、かかるＰＧＩ2とＴＸＡ2の血管内における産生の不均衡、とりわけＰＧＩ2の産生低下に基づく血管系の機能不全によって生じるものと考えられている（同上文献）。
このようなＰＧＩ2産生低下が原因と考えられる疾病の治療法として、ＰＧＩ2を医薬品として体外から補うことが考えられる。しかし、ＰＧＩ2は化学的に極めて不安定な物質であるためＰＧＩ2自体を医第品として実用化することは困難である。かかる観点から、例えば現在、血液凝固阻止剤，血管拡張剤として安定なＰＧＩ2類縁体の開発が進められている。
しかしながら、本来ＰＧＩ2とＴＸＡ2との均衡のもとに成り立っている生体内の恒常性は、安定なＰＧＩ2類縁体の投与によって却って崩れる可能性が考えられる。すなわち、安定なＰＧＩ2類縁体を多量に投与することは、細胞のＰＧＩ2応答性を低下させ、緊急の場合にＰＧＩ2に反応できなくなるという危険性を含む（非特許文献２）。
従って、血栓症等の治療効果を期待すべくＰＧＩ2とＴＸＡ2との不均衡を是正して血管系の正常機能の回復を図るためには、化学的に安定な類縁体を用いる一方で、ＰＧＩＳの物理化学的性状及び生物学的性状を解明し、当該ＰＧＩＳあるいはＰＧＩＳをコードするＤＮＡを研究試薬として用いてＰＧＩＳとＰＧＩ2産生の関わりを明らかにすること、および該ＰＧＩＳあるいはそれをコードするＤＮＡを医薬品として開発し、ＰＧＩ2の産生を制御することが前述のようなＰＧＩ2とＴＸＡ2との不均衡に起因する各種疾患の治療に対して重要かつ有意義なことと考えられる。
従来、ＰＧＩＳに関しては、組織分布、即ち各種組織の血管内皮細胞、非血管平滑筋細胞、及び動脈平滑筋における存在が報告されている〔非特許文献３及び４〕。また、ブタ及びウシからＰＧＩＳの単離精製が試みられ〔ブタ：非特許文献５、ウシ：非特許文献６〕、ウシＰＧＩＳのＮ末端アミノ酸配列および下流の部分アミノ酸配列が報告されている〔非特許文献７、８等〕。
しかしながら、ヒトのＰＧＩＳについては、その単離、精製およびアミノ酸配列について、今だ解明されていない。
【非特許文献１】ブリティッシュ ジャーナル オブ フアーマコロジー（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），７６巻，３頁，１９８２年
【非特許文献２】プロスタグランジンズ、１９巻、２頁、１９８０年
【非特許文献３】Advances in Prostaglandin，Thromboxane，and Leukotriene Research，Vol.11，pp.87-92，（1983）
【非特許文献４】J．Biol．Chem.，Vol.258，No.9，pp.5922-5926，（1983）
【非特許文献５】Cytochrome P450，Biochemistry．Biophysics and Environmental Implications，pp.103-106（1982）
【非特許文献６】J．Biol．Chem.，Vol.258，No.9，pp.3285-3293（1983）
【非特許文献７】Advances in Prostaglandin，Thromboxane，and Leukotriene Research，Vol.17，pp.29-33（1987）
【非特許文献８】Biochemical and Biophysical Research Communications，Vol.197，No.3，pp.1041-1048（1993）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列を明らかにし、当該ヒト由来ＰＧＩＳ及び該ＰＧＩＳをコードするＤＮＡを提供することである。
該ＰＧＩＳ及びこれをコードするＤＮＡは、(1)ＰＧＩＳの分子あるいは遺伝子レベルでの物理化学的性状、及び生物学的性状の解析、(2)ＰＧＩＳの産生調節メカニズム、ＰＧＩＳに係るＰＧＩ2の産生調節メカニズムの解析、及び(3)ＰＧＩ2とＴＸＡ2との産生量不均衡に起因すると考えられる各種循環器系疾患の原因究明および該疾患に対する治療薬の開発のための分子あるいは遺伝子レベルでの解析のための試薬として有用である。また、ＰＧＩＳあるいはそのｍＲＮＡの体内組織発現レベルおよび分布を測定するための診断薬として有用である。さらには、それら自身、それらの断片、あるいはそれらの修飾体を疾患部位特異的に生体内に導入することにより、ＰＧＩ2の産生レベルを高めることによる、例えば血栓症，心筋梗塞，動脈硬化，狭心症等の各種循環器系疾患に対する治療薬としての利用が期待される。
さらに、本発明の目的は、ヒト由来ＰＧＩＳをコードするＤＮＡを含有する組換えベクター、および該ベクターで形質転換された宿主細胞からなるＰＧＩＳの発現系を提供することであり、さらに該発現系を用いてＰＧＩＳを遺伝子工学的に製造する方法を提供することである。
かかる方法により、ヒト由来ＰＧＩＳの簡便かつ効率的な量産が可能となる。
また、本発明はヒト由来ＰＧＩＳの精製、免疫組織化学、病因解析に有用なヒト由来ＰＧＩＳ抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上述の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト動脈血管内皮細胞からＰＧＩＳをコードするｃＤＮＡのクローン化に成功し、そのｃＤＮＡの塩基配列からヒト由来ＰＧＩＳの一次構造を決定して本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、実質的に配列番号１２で示されるヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むＤＮＡ、好ましくは実質的に配列番号１１に示される塩基番号２８乃至１５２７の塩基配列を有するＤＮＡを含むＤＮＡ、より好ましくは配列番号11に示される塩基番号２８乃至１５２７の塩基配列を有するＤＮＡに関する。
また本発明は、上記ＤＮＡを含有する組換えベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培地中で培養して得られる培養物からヒト由来ＰＧＩＳを取得することを特徴とするヒト由来ＰＧＩＳの製造方法に関する。
さらに本発明は、実質的に配列番号１２で示されるヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列を有するポリペプチド、また当該ヒト由来ＰＧＩＳに反応性を示す抗体に関する。
さらに本発明は、上記ＤＮＡまたは上記ＤＮＡを含有する組換えベクターを含有する医薬組成物に関する。当該医薬組成物は、ＰＧＩ2産生を促進するための医薬あるいはＰＧＩ2産生低下に起因する疾患を処置するための医薬として用いられる。
さらに本発明は、上記ＤＮＡまたは上記ＤＮＡを含有する組換えベクターを生体内に導入することを特徴とするＰＧＩ2の産生を促進する方法に関する。また本発明は、上記ＤＮＡまたは上記ＤＮＡを含有する組換えベクターを生体内に導入することを特徴とするＰＧＩ2産生低下に起因する疾患の処置方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、ヒト由来のＰＧＩＳのアミノ酸配列、該配列を有する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を初めて明らかにするものである。かかるアミノ酸配列および塩基配列の解明に基づいて、本発明は遺伝子工学的手法によるＰＧＩＳの製造法およびこれに関連する発現系を提供する。
本発明のＰＧＩＳ及びこれをコードするＤＮＡは、
(1)ＰＧＩＳの分子あるい遺伝子レベルでの物理化学的性状、及び生物学的性状の解析、
(2)ＰＧＩＳの産生調節メカニズム、ＰＧＩＳに係るＰＧＩ2の産生調節メカニズムの解析、及び
(3)ＰＧＩ2とＴＸＡ2との産生量不均衡に起因すると考えられる各種循環器系疾患の原因究明および該疾患に対する治療薬の開発のための分子あるいは遺伝子レベルでの解析、
のための試薬として有用である。
また、ＰＧＩＳあるいはそのｍＲＮＡに体内組織発現レベルおよび分布を測定するための診断薬として有用である。
さらには、ＰＧＩＳまたはＰＧＩＳをコードするＤＮＡ、それらの断片、あるいはそれらの修飾体を疾患部位特異的に生体内に導入することにより、ＰＧＩ2の産生レベルを高めることによる、例えば血栓症，心筋梗塞，動脈硬化，狭心症等の各種循環器系疾患に対する治療薬として利用することができる。
さらに、本発明のヒト由来ＰＧＩＳをコードするＤＮＡを含有する組換えベクター、および該ベクターで形質転換された宿主細胞からなるＰＧＩＳの発現系は、ヒト由来ＰＧＩＳの簡便かつ効率的な量産を可能とする遺伝子工学的製造に有用である。
また、本発明のヒト由来ＰＧＩＳ抗体は、ヒト由来ＰＧＩＳの精製、免疫組織化学的、病因解析〔各種組織（子宮，心臓，骨格筋，肺，前立腺等）の特異染色〕に有用である。
本発明の実施例において用いるプラスミド，制限酵素等の酵素，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び他の物質は市販のものであり、常法に従って使用することできる。ｃＤＮＡのクローニング，塩基配列の決定，宿主細胞のトランスフェクション，形質移入体の培養，得られる培養物からのＰＧＩＳの採取，精製等および抗体の取得に用いられた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。
また、本発明で用いるｐＨＰＧＩＳ３６（ＰＢＪＴ−ＢＡ−４、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６５３）およびｐＨＰＧＩＳ１３５（ＰＢＪＴ−ＢＡ ５、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４６５４）は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドは、ＰＧＨ2をＰＧＩ2に変換する触媒活性を有し、実質的に後記配列表の配列番号１２に示されるヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
ここで「実質的に」とは、本発明のポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに限定されず、当該アミノ酸配列を有するヒト由来ＰＧＩＳと同様な免疫学的かつ生物学的活性（ヒトＰＧＩＳ活性）を有する限り、配列番号１２で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸の幾つかについて欠失，置換もしくは付加等あってもよいという趣旨である。
アミノ酸の欠失，置換もしくは付加部位は特に制限されないが、少なくとも配列番号１２に示されるアミノ酸配列中の４４１位のＣｙｓ残基周辺領域は保存されている必要がある。というのも、本発明のヒト由来ＰＧＩＳは、そのアミノ酸配列において既知のチトクロームＰ４５０とホモロジーを有し、かつＣ末端側のアミノ酸配列中にチトクロームＰ４５０の生物活性発現に重要なヘム結合部位（第５配位子）に相当するＣｙｓ残基を有することから、チトクロームＰ４５０ファミリーに属する新規タンパクであると推定されるからである（生物物理，Vol.32，No.1，pp.10-15，1992年参照）。
本発明のポリペプチドは、好ましくは配列番号１２に示されるヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明のポリペプチドが有するＰＧＩＳ活性とは、ＰＧＨ2をＰＧＩ2に変換する触媒活性をいう。当該ＰＧＩＳ活性は、例えばSalmon．J．A.およびFlower, R．J．らの方法〔Methods Enzymol．86, pp.p91-99（1982）〕に従って、14Ｃラベル化ＰＧＨ2のＰＧＩ2への変換を、代謝産物である6-ケト-ＰＧＦ1αを薄層クロマトグラフィーにて分離したのち、該６−ケト−ＰＧＦ1αの放射活性を検出することによって測定される。
【０００８】
また、本発明は、実質的に配列番号１２で示されるヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むＤＮＡに関する。
当該ＤＮＡは、上述のヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含むものであればいかなるものでもよく、具体的には、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれと同等の免疫学的および生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。より具体的には、配列番号11で示される塩基配列中、塩基番号２８乃至１５２７で示される塩基配列を含有するＤＮＡを挙げることができる。
一般に、遺伝子組換え技術分野では、遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から産生される蛋白質のアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡは、配列表配列番号１１の塩基番号２８乃至１５２７で示される塩基配列を遺伝暗号に基づく置換によって変化された塩基配列を有するＤＮＡをも包含する。
また、本発明のＤＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
【０００９】
本発明のＤＮＡは、常法に従ってヒト由来ＰＧＩＳのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
（1）例えば、ヒト由来ＰＧＩＳのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、ヒト動脈血管細胞などのヒト由来ＰＧＩＳを産生（分泌）する細胞を培養し、その培養液から該ＰＧＩＳをコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法〔Chirgwin．J．M．et al.，Biochem.，18，5294（1979）〕、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばOkayama，H.らの方法｛Okayama，H．et al.，Mol．Cell．Biol.，2，161（1982）及び同誌3，280（1983）｝やGubler，U.とHoffman，B．J.の方法｛Gubler．H．and Hoffman，B．J.，Gene，25，263（1983）｝が例示される。〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクターもしくはファージベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてｐＵＣ１１９，λｇｔ１０，λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内でＰＧＩＳ遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えばManiatis，T．ら，モレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory，p.239（1982）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunh，T．V.らの方法〔Hyunh, T．V.，DNA Cloning, a practical approach，1，49（1985）｝などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１，ＤＨ５またはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。
プラスミドを宿主に導入する方法としては、Maniatis．T.らのモレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory，p.239（1982）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製，アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
上記の方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから、本発明のＰＧＩＳをコードするｃＤＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を組み合わせることによって行うことができる。
例えば、別個にヒトＰＧＩＳのアミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーシヨン法〔Crunstein，M．and Hogness，D.S.：Proc．Natl．Acid．Sci．USA 72，3961（1975）〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔Molecular Cloning，A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory，p.239（1982）〕により、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方法、ＰＣＲプライマーを作製しＰＧＩＳの特定領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λｇｔ１１ファージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、後述の本発明のＰＧＩＳ抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Maxam，A.M．and Gilbert，W., Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，74，560（1977）〕あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法〔Sanger，F.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74，5463-5467（1977）〕によって決定することができる。ＰＧＩＳ遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【００１０】
（2）また、ヒト動脈血管細胞のゲノムＤＮＡからＰＧＩＳをコードするＤＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
ヒト動脈血管細胞を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クローンからＰＧＩＳの遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
（3）また、化学的合成による本発明のＤＮＡの製造は、配列表配列番号１１に示される塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができる。
【００１１】
さらに本発明は、上述のＰＧＩＳをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される。
当該組換えベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリオファージＤＮＡ）に本発明のヒト由来ＰＧＩＳをコードするＤＮＡを常法により連結することによって調製することができる。用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322，pBR325，pUC12，pUC13など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH19，pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB110，pTP5，pC194などが例示される。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルス、アデノウイルスなどの動物や昆虫のウイルス〔pVL1392，pBK283，Autographa californica多核体ウイルス（AcNPV），Bombyx mori多核体ウイルス（BmNPV）〕が例示される。
ＰＧＩＳ遺伝子を発現させＰＧＩＳを生産させる目的においては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中でＰＧＩＳ遺伝子を発現し、これら蛋白質を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。好ましくは、昆虫細胞に感染し、該細胞中でＰＧＩＳを産生する昆虫ウイルス由来の発現ベクター、または動物細胞に感染し、該細胞中でＰＧＩＳを産生する動物ウイルス由来の発現ベクターである。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域，開始コドン，本発明のＰＧＩＳをコードするＤＮＡ，終止コドン，ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター，開始コドン，本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ，終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ，エンハンサー配列，本発明のポリペプチドの５’側および３’側の非翻訳領域，スプライシング接合部，ポリアデニレーション部位，選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。
細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーターおよびShine-Dalgarno（SD）配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主が大腸菌の場合、好適にはＴｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明のＰＧＩＳを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ０５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター，ＳＰ０２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルスのプロモーター，ヒートショックプロモーター、核多角体ウイルスの有するポリヘドリンプロモーター、サイトメガロウイルスのプロモーター、アデノウイルスのプロモーター、β−アクチンプロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示される。
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡをいい、天然のプラスミド，人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E．coliではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198，プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145，プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224，プラスミドpSV2neo ATCC 37149等があげられる。
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン，アンピシリン，またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター，開始コドン，本発明のＰＧＩＳをコードするＤＮＡ，終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
【００１２】
本発明の形質転換体は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
宿主細胞としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリキア属菌、バチルス属菌），酵母（例えば、サッカロマイセス属など），動物細胞および昆虫細胞など〕が挙げられる。具体的には、エシェリキア属菌ではエシェリキア・コリ（Escherichia coli）K12DH1，M103，JA221，HB101，C600，XL-1 Blue，JM109などが例示される。バチルス属菌ではバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）207-21などが挙げられる。酵母としてはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5Dなどが挙げられる。動物細胞としてはサル細胞COS-7，Vero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞，ヒトＦＬ細胞，ヒト２９３細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはBmN4，Sf9などが挙げられる。好ましくは、昆虫細胞または動物細胞である。
一般にＤＮＡ配列のクローニングおよびベクターの組立てのための宿主細胞としては原核細胞が好ましい。組立てられた発現ベクターは次に適当な宿主細胞に形質転換されるが、この際の宿主細胞としては原核細胞のみならず真核細胞をも使用することができる。好ましくは、昆虫細胞（BmN4，Sfなど）または動物細胞である。
発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転換（本発明では、形質移入を含む概念で用いる。）〕は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（大腸菌，Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法〔Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，69，2110（1972）〕、プロトプラスト法〔Mol．Gen．Genet.，168，111（1979）〕やコンピテント法〔J．Mol．Biol.，56，209（1971）〕によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法〔Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，75，1927（1978）〕やリチウム法〔J．Bacteriol.，153，163（1983）〕によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法〔Virology，52，456（1973）〕、リポフェクチン法、ＨＶＪ−リポソーム法〔Hypertension．21，894-899（1993）〕によって、昆虫細胞の場合は、例えばSummersらの方法〔Mol．Ce1l．Biol．3，2156-2165（1983）〕によってそれぞれ形質転換することができる。
【００１３】
本発明のヒト由来ＰＧＩＳは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換体（本発明では形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばアンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよび培養時間は、ＰＧＩＳの最高力価が得られるように適宜選択される。
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。
宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＭ９培地〔Miller．J.，Exp．Mol．Genet，p.431，Cold Spring Harbor Laboratory，New York（1972）〕が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気，攪拌をしながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気，攪拌をしながら、通常30〜40℃、約１６〜９６時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkholder最小培地〔Bostian．K．L．et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77，4505（1980）〕が挙げられ、pHは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science，122，501（1952）〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology，8，396（1959）〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔J．Am．Med．Assoc.，199，519（1967）〕，１９９培地〔proc．Soc．Exp．Biol．Med.，73，1（1950）〕等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's培地〔Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82，8404（1985）〕等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００１４】
本発明のヒト由来ＰＧＩＳは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得できる。
すなわち、本発明のヒト由来ＰＧＩＳが、培養物のうち培養液中に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って該ＰＧＩＳを精製、単離する。
単離，精製方法としては、例えば塩析，溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析，限外濾過，ゲル濾過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
一方、本発明のヒト由来ＰＧＩＳが培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法でＰＧＩＳを含有する膜画分を得る。該膜画分をトリトン等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いて処理することにより、本発明のＰＧＩＳを単離，精製することができる。
【００１５】
また、本発明は、上述のヒト由来ＰＧＩＳに反応性を有する抗体に関する。本発明の抗体は、上記性質を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を共に包含する。本発明の抗体は、常法に従って取得することができる。
例えば、本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されたハイブリドーマから製造することができる。即ち、抗体産生細胞と骨髄細胞との間で、融合ハイブリドーマを形成させ、当該ハイブリドーマをクローン化し、ヒト由来ＰＧＩＳのアミノ酸配列の一部または全部を有するポリペプチドを抗原としてそれに対して特異的親和性を示す抗体を生産するクローンを選択することによって製造される。その操作は、免疫抗原として本発明のヒト由来ＰＧＩＳを使用する以外は、従来既知の手段を用いることができる。
免疫原は、例えば完全フロインドアジュバンドと混和後、動物の免疫用として使用される。動物としては、例えばマウス，ラット，ウサギ等が例示される。免疫は動物の皮下、筋肉内、腹腔内に約５〜２００μｇ／回を注射することにより行われる。初回免疫から約１〜２週間毎に１〜４度免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節細胞等が挙げられる。
骨髄細胞としては、例えばマウス、ラット、ヒト由来のものが使用される。例えばマウスミエローマＰ３・Ｘ６３・Ａｇ８，Ｐ３・Ｘ６３・Ａｇ８−Ｕ１，Ｐ３・ＮＳ１−Ａｇ４，ＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｘ６３−Ａｇ８・６５３等が例示される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物由来であることが好ましい。
細胞融合は、例えばネイチャー、第２６６巻、５５０頁（１９７７）に記載の方法またはこれに準じる方法によって行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（平均分子量１，０００〜４，０００）を用いて３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させることによって行われる。
細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリーニングに付される。すなわち、当該細胞を例えばマイクロプレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を、例えば酵素抗体法等によって測定し、適切な抗体を産生しているウェルを得る。このようなウェルから更に例えば限界希釈法によってクローニングを行ってクローンを得る。本発明のモノクローナル抗体は、当該ハイブリドーマ細胞クローンを通常の培養方法、高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法等の培養上清よりプロテインＡ結合担体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製することにより得られる。
また培養したハイブリドーマ細胞を、予めプレステン処理した同系マウス腹腔に注射することにより腹水を得、これを硫安塩析した後ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーによりＩｇＧ画分として精製し調製することができる。
【００１６】
本発明のヒト由来ＰＧＩＳをコードするＤＮＡは遺伝子治療に利用することができる。
本発明のヒト由来ＰＧＩＳをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含有する組換えベクターを生体内に導入することにより、生体内においてＰＧＩＳが産生され、ＰＧＩ2産生を促進することができる。さらにＰＧＩ2産生を促進することにより、ＰＧＩ2産生低下に起因する疾患の処置（治療または症状の改善）が可能となる。ＰＧＩ2産生低下に起因する疾患としては、例えば血栓症、心筋梗塞、動脈硬化、狭心症などの循環器系疾患が挙げられる。組換えベクターは該組換えベクターで形質転換された細胞の形態で生体内に導入してもよい。
このような本発明の遺伝子（ＤＮＡおよび組換えベクターを含む）を利用する遺伝子治療は、導入された本発明の遺伝子がその機能を奏するような適宜の設定とすることができ、本発明遺伝子の所望の発現を意図する限りにおいて常法に従うことができる。これは例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクター等を利用するウイルス学的手段、パーティクルガン法やネーキッドＤＮＡ（naked DNA）による遺伝子導入等の物理的手段、およびリピド法等の化学的手段等によることができる〔Molecular Medicine，Vol.30，No.12，p.1526（1993）；実験医学，Vol.12，No.3，p.15，28および40（1994）；Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92，1137（1995）等〕。特に、嚢胞性繊維症の遺伝子治療に使用され、分化した細胞や組織への効率的な遺伝子導入、発現を行い得ることが知られているアデノウイルスベクターおよびin vivoで任意の遺伝子を組織の細胞に導入することができる膜融合リポソームによる方法は、本発明の遺伝子治療に好適である。
本発明のＤＮＡまたは組換えベクターの投与量は、患者の性別、年齢、体重、疾患の種類や病態、投与経路により適宜変わりうる。例えば、ＤＮＡとして投与する場合、通常１００μｇ〜１０ｍｇを投与する。
本発明のＤＮＡまたは組換えベクターは、静脈注射、経粘膜投与、経口投与（腸溶剤を用いる）、局所投与などの投与経路で投与される。好ましくはカテーテルなどを用いてできる限り局所的に投与する。
本発明のヒト由来ＰＧＩＳをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含有する組換えベクターは、慣用の医薬的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定化剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他の添加剤、具体的には、水、塩溶液、リン酸緩衝液、植物油、エタノール、ポリエチレングリコール、グリセリン、ゼラチン、ラクトース、グルコース、マンニトール、デンプン、ショ糖、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、タルク、ラノリン、ワセリン等と混合して、注射剤、錠剤、散剤、カプセル剤、腸溶剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、噴霧剤、吸入剤、点鼻剤等の形態で使用することができる。
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含有する組換えベクターを含有する医薬組成物は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ等の哺乳類に対して投与することができる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を具体的に説明するため実施例および参考例を示すが、本発明はこれら実施例等によって何ら制限されるものではない。
【００１８】
実施例１  ｃＤＮＡ塩基配列の決定
（１）λｈＰＧＩＳ１４１の作製
ヒトゲノムライブラリー（Genomic Lung fibroblast cell line，W I 38、クローンテック社製）を２×１０5PFU程まき、本発明者が先に作製したウシｃＤＮＡ（Tanabe．T.，Hara，S.，Miyata, A.，Brugger, R.，and Ullrich, V.（1993）in Abstract book of 3rd international conference on eicosanoid and other bioactive lipids in cancer，inflammation and radiation Injury，pp．137参照）をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。
その結果、４つのポジティブシグナルを得て、そのうちの１つを単一プラークにまで単離した。これを液体培養することにより大量のファージＤＮＡを調製して、精製後種々の制限酵素消化によるマッピングを行った。サザンハイブリダイゼーションにより、エクソンを含むフラグメントを同定して、ＤＮＡシークエンスによる構造解析を行い、最終的に単離されたクローン（λｈＰＧＩＳ１４１）がヒトＰＧＩＳをコードするものであることを確認した。
このようにして得られたλｈＰＧＩＳ１４１について、制限酵素サイトマッピングや塩基配列決定など構造解析した結果、λｈＰＧＩＳ１４１はウシＰＧＩＳのｃＤＮＡの塩基配列の６７３〜８５５に相当する領域を含んでいることが確認された（配列番号８）。
この得られたλｈＰＧＩＳ１４１のｃＤＮＡフラグメントの塩基配列をもとに、配列表配列番号１〜４に示す配列を有するプライマー〔配列番号１：Ｐ１プライマー（674-689）、配列番号２：Ｐ２プライマー（699-718）、配列番号３：Ｐ３プライマー（696-713）、配列番号４：Ｐ４プライマー（805-822）〕を合成した。
（２）ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅
該プライマーを用いて、ヒト動脈血管内皮細胞（以下、ＨＡＥＣという。クラボー社製）１μｇのpoly(A)+ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を鋳型として、３’下流領域および５’上流領域のｃＤＮＡをそれぞれＰＣＲ法により増幅した（Biochem．Biophys．Res．Commun．178，1479-1484（1991））。
３’下流領域に相当するｃＤＮＡを増幅するために、まずｄＴ17アダプター（5'-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3'、配列番号５）でプライムし、伸長作成したファーストｃＤＮＡ鎖をＰ１プライマー（674-689）およびアダプタープライマー（配列番号６）で、ついでＰ２プライマー（699-718）及びアダプタープライマー（配列番号６）を用いて増幅した。一方、５’上流領域のｃＤＮＡは5'ＲＡＣＥシステム（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を用いて増幅した。プロトコールに従って、ホモメリックｄＣテイルをファーストｃＤＮＡ鎖につけて、更にセカンドｃＤＮＡ鎖をアダプタープライマー（5'-(CUA)4GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'）（配列番号７）を用いて作成した。第１段階の増幅はＰ４プライマーとアダプタープライマー（配列番号７）とを用いて行った。次いで第２段階の増幅をＰ３プライマーとアダプタープライマー（配列番号７）とを用いて行った。なお、ＰＣＲ法は下記のサイクロプロファイルに従って３５サイクル行った。
変性                ９４℃，１分
アニーリング        ５４℃，１分
伸長                ７２℃，３分
各ＰＣＲ生成物（３’下流領域増幅産物、５’下流領域増幅産物）から一部を取り出して、それぞれを１％アガロースゲルを用いた電気泳動で精製を行った。ウシＰＧＩＳのｃＤＮＡ（ｐＢＰＧＩＳＩ）をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションにより、該プローブにクロスハイブリダイズしたバンドからＤＮＡを抽出して、得られたＤＮＡをpBluescriptII SK（-）にクローン化した。
すなわち、以下の手順に従ってクローン化、スクリーニングを行った。
（1）電気泳動後、ゲルからシグナルの見られたバンドを切り出す。
（2）アガラーゼ消化を４０℃で１時間行う（アガラーゼ１unit/100μｌゲル）。
（3）ＤＮＡをフェノールで抽出した後、エタノール沈澱する。
（4）該ＤＮＡエタノール沈澱を滅菌水に溶解後、３７℃で１時間のポリヌクレオチドカイネース処理する。
（5）クレノウフラグメントにより、末端の修復を行う（１６℃、１時間）。
（6）Takara ligation kitによるライゲーションを行う。
（7）常法に従い、トランスフォーメーションを行う。
（8）プレートにまく。
（9）常法に従ってレプリカを作成する。
（10）レプリカのニトロセルロースフィルターをウシＰＧＩＳのｃＤＮＡをプローブとして用いて、常法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行う。
尚、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ〔１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含有する〕，５×Denhardt'ｓ 溶液，２５０μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ，０．１％ＳＤＳおよびランダムプライミング法によりラベル化したｃＤＮＡのフラグメント（１０6 cpm/ml）の中で６０℃で行った。得られたフィルターに対して３×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で室温下、５分間の洗浄を２回、それから０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で５０℃、１５分間の洗浄を２回行った。該フィルターを風乾し、−８０℃で１２〜１６時間、増感スクリーンを用いてフジＸ線フィルムを当てた。
得られたインサートＤＮＡをpBluescriptII SK（-）にサブクローニングした。
これにより、ヒト由来ＰＧＩＳの３’下流領域のＤＮＡを含有するクローンｐＨＰＧＩＳ１３５および５’上流領域のＤＮＡを含有するクローンｐＨＰＧＩＳ３６を取得した。次に、サンガー法〔Sanger，F.，Nickle.，S.，and Coulson．A.R．（1977）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74，5463-5467〕に従って、Taq dyeプライマーサイクル配列キット（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてモデル３７３Ａ ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製）によって、各クローンの挿入ＤＮＡの塩基配列を決定した。これにより、ｐＨＰＧＩＳ３６クローンはインサートＤＮＡ配列として、５’側にアダプター配列を配したヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡの７４０ｂｐの塩基配列を有している（配列番号９）ことがわかり、これによりＡＴＧを翻訳開始配列（Ｍｅｔ）とする２３７アミノ酸残基からなるＰＧＩＳのアミノ酸の部分配列が解明された。
また、ｐＨＰＧＩＳ１３５クローンはインサートＤＮＡ配列として、３’側にアダプター配列を配したヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡの１２７７ｂｐの塩基配列を有している（配列番号１０）ことがわかり、これにより２２６番目のアスパラギン酸から始まるカルボキシル基側領域のＰＧＩＳの部分アミノ酸配列が解明された。後記配列表の配列番号９にｐＨＰＧＩＳ３６クローンに含有されるヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡの塩基配列およびこれからコードされるアミノ酸配列を、配列番号10にｐＨＰＧＩＳ１３５クローンに含有されるヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡの塩基配列およびこれからコードされるアミノ酸配列を記載する。なお、図１にヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡの制限酵素マップおよびλｈＰＧＩＳ１４１，ｐＨＰＧＩＳ３６およびｐＨＰＧＩＳ１３５に含まれるＤＮＡが当該ヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡのどの領域に相当するかを示す。また、図２にｐＨＰＧＩＳ３６の制限酵素マップを、図３にｐＨＰＧＩＳ１３５の制限酵素マップを示す。
以上のクローニングにより得られたヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡは、翻訳開始コドン周辺にKozakら〔Nucleic Acids Res．12，857-872（1984）〕によって示された真核生物の開始コドンのコンセンサス配列を有しており、終止コドンに相当するＴＧＡコドンが５００コドン後に存在していた。これらのことから、クローニングされたヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡは、配列番号１２に示すように５００アミノ酸残基をコードする１５００ｂｐの有する１９７７ｂｐであることが判り、これによりコードされるタンパクの分子量は約５７，０００であろうと推測された。
また、当該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を、本発明者らによって別にクローニングされたウシ由来のＰＧＩＳのアミノ酸配列と比較したところ、約８８％のホモロジーを有していることがわかった。本発明者らによるウシＰＧＩＳの研究から、ウシＰＧＩＳは、チトクロムＰ４５０ ７ファミリー（ＣＹＰ７）に属するコレステロール７α−ヒドロキシラーゼと３１％のホモロジーを有しており、特にチトクロムＰ４５０のヘム結合部位（第５配位子）である４４１位のＣｙｓ残基周辺領域が保存されていることが判っているが、本発明のヒトＰＧＩＳも同様にその領域に相当するアミノ酸配列が保存されており、かかる領域がＰＧＩＳの活性に重要な役割を担うものと考えられる。
また、ウシＰＧＩＳは、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼとは３１％のホモロジーがあるものの、チトクロムＰ４５０ファミリーに属するヒトトロンボキサンシンターゼとは１６％のホモロジーしか、また既知のチトクロムＰ４５０タンパクのいずれとも４０％以上のホモロジーは有しないことから、チトクロムＰ４５０スーパーファミリーの中の新しいファミリーであることが予想されるが、ヒトＰＧＩＳも同様にこの新しいファミリーに属するものと考えられる。
このような構造活性相関の探索は医薬品の研究開発に不可欠なものであるが、かかる探索は、ヒトＰＧＩＳの一次構造が明らかになることにより初めて成しえるものである。従って、ヒトＰＧＩＳの一次構造を初めて開示する本発明は、研究の分野のみならず産業上においても極めて重要な意義を有する。
【００１９】
実施例２  ヒトＰＧＩＳの発現
（１）ヒトＰＧＩＳの発現ベクターの構築
得られたｐＨＰＧＩＳ３６クローンおよびｐＨＰＧＩＳ１３５クローンそれぞれより、ｃＤＮＡインサート領域を適切な制限酵素を用いて切り出し精製する。得られる両フラグメントを熱変性（９５℃、１０分間）した後、アニーリングさせる。次にＤＮＡポリメラーゼにより、オーバーラップ領域を合成開始領域として、当該領域から５’方向および３’方向の両方向に複製を行う。得られた全長ｃＤＮＡを鋳型として開始コドン，終止コドンそれぞれの領域よりプライマーを合成してＰＣＲを行う。その際、プライマーの３’には適当な制限酵素サイトをアンカー部位として構築する。
得られたＰＣＲ産物を精製後、それらの塩基配列を確認するとともに、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ（ＢｇｌII）にて消化を行い、ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ（ＢｇｌII）フラグメントを得る。当該ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ（ＢｇｌII）フラグメントをあらかじめＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ処理したｐＶＬ１３９３発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位に導入する。作成された組換えプラスミド（ＰＧＩＳ７）を制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列分析によってキャラクタライズする。
（２）バキュロウイルス発現システム
Ｓｆ９細胞（インビトロゲン社製）を１０％ウシ胎児血清，０．３３％イーストレイト及び０．３３％ラクトアルブミンハイドロライセートを含有するグレースインセクト培地を用いて２７℃で単層培養する。組換えウイルスを産生させるため、Ｓｆ９細胞（１．５×１０6細胞）組換えプラスミド（ＰＧＩＳ７、５０μｇ）と野生型バキュロウイルスＤＮＡ（ＡｃＮＰＶ；１μｇ）とを混合してリン酸カルシウム沈澱法によりトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスは、プラークアッセイとプローブとして32Ｐ−ラベルしたＰＧＩＳのｃＤＮＡフラグメントを使用するスロットハイブリダイゼーションとを組み合わせることによって単離し、さらに増幅させる。
該Ｓｆ９細胞を野生型バキュロウイルスまたは組換えバキュロウイルスにインフェクションする。インフェクションして３日後、細胞を集め（２×108細胞）、１０μＭヘミンを含有する血清含有培地中、または含有しない血清含有培地中で５時間インキュベーションする。
得られた細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、−８０℃に保存する。細胞のミクロソーム画分をHaurandとUllrichらの方法に従って調製する〔J．Biol．Chem．260．15059-15067 (1985)〕。得られた細胞（２×１０8細胞）を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭグルコース，0.1ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），１．１５％ＫＣｌ，２μｇ／ｍｌロイペプチン，２μｇ／ｍｌペプスタチン，１０μｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤および４４μｇ／ｍｌフェニルメチルスルフォニルフルオライドからなる溶液２０ｍｌでホモジナイズし、Branson sonifierモデル４５０を用いて３０秒間、４回の超音波処理をする。
得られたホモジネートを７，０００×ｇで１５分間遠心して得られた上清をさらに１０５，０００×ｇの超遠心に６０分間かける。得られる沈澱を２０％グリセロール，１ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）３ｍｌにソニケートすることにより懸濁した。蛋白質の濃度はウシ血清アルブミンをスタンダードとして用いてＬｏｗｒｙ法によって測定し、イムノブロット分析およびＰＧＩＳアッセイ用の溶液を５ｍｇ／ｍｌに調製する。
（３）ウエスタン イムノブロット分析
インフェクションされたSf９細胞とヒト血小板のミクロソーム画分をLaemmliの方法〔Nature227，680-685（1979）〕に従って１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。泳動されたタンパクをTowbinらの方法〔Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76，4350-4354（1979）〕に従ってポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（イモビロン，ミリポア）上に電気泳動的に移す。１０％ウマ血清含有トリス塩酸緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４）を室温下で３０分間前処理し、３％スキムミルクを含むＴＢＳ中で、ブロットメンブレンをウシＰＧＩＳに対するポリクローナル抗体と一緒にインキュベーションする。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで洗浄した後、メンブレンをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ベクター・ラボラトリーズ社製）をコンジュゲートした抗マウスＩｇＧウマ抗体と３％スキムミルクを含有するＴＢＳで３７℃で３０分間インキュベーションする。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで、さらにＴＢＳで十分洗浄した後、免疫反応陽性のバンドをイムノステイニングＨＲＰキット（コニカ製）で検出する。
【００２０】
実施例３  ヒトＰＧＩＳの動物培養細胞での発現
（１）完全長ヒトＰＧＩＳｃＤＮＡの取得
得られたｐＨＰＧＩＳ３６クローンを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｓｐＩで切り出して精製し、ＳａｌＩ−ＮｓｐＩフラグメントを得た。また、ｐＨＰＧＩＳ135クローンを制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切り出して精製し、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを得た。さらに、λｈＰＧＩＳ１４１の塩基配列をもとに、配列表配列番号13および14に示す配列を有するプライマー〔配列番号１３：Ｐ５プライマー（676-699）、配列番号１４：Ｐ６プライマー（832-855）〕を合成した。これらのプライマーを用いλｈＰＧＩＳ１４１を鋳型としてＰＣＲ法によりヒトＰＧＩＳの中流領域のｃＤＮＡを増幅し、制限酵素ＮｓｐＩおよびＰｓｔＩで切り出し、精製および塩基配列の確認を行った後、これをＮｓｐＩ−ＰｓｔＩフラグメントとした。これらのＳａｌＩ−ＮｓｐＩフラグメント、ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントおよびＮｓｐＩ−ＰｓｔＩフラグメントを結合させ、あらかじめＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ処理したpBluescriptII SK+（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入し、完全長ヒトＰＧＩＳｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＨＰＧＩＳ１）を作製した。図４にｐＨＰＧＩＳｌの制限酵素マップを示す。
（２）動物培養細胞用ヒトＰＧＩＳ発現ベクターの構築
得られたｐＨＰＧＩＳ１クローンより、ヒトＰＧＩＳｃＤＮＡインサート領域を制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切り出して精製しＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを得た。このＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをあらかじめＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ処理したｐＣＭＶ７発現ベクター（Dr．David W．Russel，University of Texas Southwestern Medical Centerより供与、Cell，75，187-197（1993）；J．Biol．Chem.，264，8222-8229（1989））のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入し、動物培養細胞用ヒトＰＧＩＳ発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＨＰＧＩＳ１）を作製した。図５にｐＣＭＶ−ＨＰＧＩＳｌの制限酵素マップを示す。
（３）動物培養細胞でのヒトＰＧＩＳの発現
ヒト胎児腎由来２９３細胞（大日本製薬社）を６０ｍｍシャーレに３×１０5細胞播種し、10％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて37℃で24時間単層培養した後、組換えプラスミド（ｐＣＭＶ−ＨＰＧＩＳ１，３μｇ）とｐＶＡ１（アデノウイルスＶＡ１遺伝子，３μｇ：Dr．David W．Russel，University of Texas Southwestern Medical Centerより供与、Mol．Cell．Biol.，7，549-551（1987））とを混合してリポフェクチン法（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）によりトランスフェクトした。トランスフェクトして４０時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し細胞を集め、１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５ｍＭグルコース、0.1ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１．１５％ＫＣｌ、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌペプスタチンおよび１０μｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤を含む１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、アストラソン モデルＸＬ２０２０を用いて１０秒間、１０回の超音波処理をした。
得られたホモジネートを１００，０００×ｇで６０分間遠心し、得られた沈澱を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２０％グリセロール、０．１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。得られた試料のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンをスタンダードとしてＢＣＡ（Bicinchoninic acid）タンパク質濃度測定キット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて測定した。また、得られた試料のＰＧＩＳ活性は、14Ｃラベル化ＰＧＨ2（5nmole）を基質として２４℃にて２分間反応させ、産生されたＰＧＩ2の代謝産物である６−ケト−ＰＧＦ1αを薄層クロマトグラフィーにて分離した後、この６−ケト−ＰＧＦ1αの放射活性を検出することによりＰＧＩＳ活性を測定した。なお図７に検出されたＰＧＩＳ活性、図８にポジテイブコントロール（ウシ血小板ミクロソーム）のＰＧＩＳ活性、図９にネガテイブコントロール（ｐＣＭＶ７のみ導入）の薄層クロマトグラフィーによる解析の結果を示す。
ヒトＰＧＩＳｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターを導入した細胞から調製した試料を用いて測定した結果、矢印（図７）で示したようにＰＧＩ2の代謝産物である６−ケト−ＰＧＦ1αのスポットが検出された。これは、ＰＧＩＳを含むウシ血小板ミクロソームをポジテイブコントロールとして用いた測定結果と同様の結果であった（図８）。一方、ヒトＰＧＩＳｃＤＮＡを組込まない発現ベクターを導入した細胞から調製した試料を用いた測定においては、６−ケト−ＰＧＦ1αのスポットは検出されなかった。またＰＧＨ2のスポットは、図７、図８より濃い結果が得られた（図９）。以上の結果は、発現ベクターに組込まれたＰＧＩＳｃＤＮＡがＰＧＩＳ活性を有する組換え型タンパク質（組換え型ＰＧＩＳ）として発現され、これがＰＧＨ2に作用することによりＰＧＩ2の代謝産物である６−ケト−ＰＧＦ1αを生成させたことを示している。
【００２１】
実施例４  ヒトＰＧＩＳの動物培養細胞での発現
図６に示す発現ベクターｐＵＣ−ＣＡＧＧＳ〔サイトメガロウイルスのエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターを有する〕（Gene 108，193-200（1991）の記載に従って調製した）のＸｈｏＩ部位にヒトＰＧＩＳｃＤＮＡを結合し、発現ベクターを構築した。このベクターおよびヒトＰＧＩＳｃＤＮＡを結合していない空のベクターの２種類のベクターを、それぞれラット動脈より調製した血管平滑筋細胞にＨＶＪ−リポソーム法（Hypertension 21，894-899（1993））を用いて導入し、３７℃，ＣＯ2インキュベーターにて血清を含まない培地〔５×１０-7Ｍインスリン、５０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．２ｍＭアスコルビン酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）〕中で２日間培養した。その後、培地を１％または５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地に交換し、16時間後、さらに3Ｈ−チミジンを加えた。チミジンを加えてから８時間後、チミジンの取り込みを常法（Cancer Immunol．Immunother．24，158-164（1987））に従い測定した。
結果を図10に示す。ｃｏｎｔｒｏｌ：空のベクターを導入した細胞、ＰＧＩＳ：ヒトＰＧＩＳｃＤＮＡを結合した発現ベクターを導入した細胞。
血清非存在下培養した血管平滑筋細胞に血清を添加すると増殖が促進され、チミジンの取込みが上昇する。ヒトＰＧＩＳｃＤＮＡを結合した発現ベクターを導入した血管平滑筋細胞では、空のベクターを導入した細胞に比べ、有意にチミジンの取込み、すなわち増殖が抑制された。この結果は、ＰＧＩＳｃＤＮＡの導入が、動脈硬化などで観察される血管内膜における平滑筋細胞の異常増殖を抑制する可能性を示唆する。
【００２２】
実施例５  抗ＰＧＩＳポリクローナル抗体の作製
０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したＰＧＩＳと等量のアジュバンドを乳化させた後、これをウサギに皮下注射する。その後、１０日おきに同様の皮下注射を２回行い、最後の皮下注射から１０日後に当該ウサギの血を採取する。該ウサギの血より調製したウサギ抗PGIS血清から抗ＰＧＩＳ／ＩｇＧをプロテインＡ セファロース ４Ｂ（バイオラッド社製）を用いることによって精製、取得する。
【００２３】
実施例６  抗ＰＧＩＳモノクローナル抗体の作製
（１）マウス
近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雄５週令を入手し、動物飼育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で標準ペレットを使用して飼育し、給水は任意に行う。
（２）免疫原
ヒト由来の精製ＰＧＩＳを使用した。ヒトＰＧＩＳはダルベッコＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、１００μｇずつ試験管に分注し、使用するまで−８０℃で凍結保存する。
（３）免疫方法
ヒトＰＧＩＳ１００μｇ／０．５ｍｌと同量のFreund's complete adjuvantを混合し、乳化状にした抗原２０μｇを５匹の５週令雄のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔および背中の皮下十数カ所に２週間毎に２か月間投与する。２か月間の免疫の後、抗体価を測定し、抗体価の高いマウスを選んでさらに１週間毎に５０μｇ、１００μｇ、２００μｇを腹腔内投与し追加投与を行う。
また、別の２匹のマウスに同様に２か月の免疫の後、１か月あけて１００μｇを腹腔内に投与し、さらに1週間後１００μｇを静注注射し追加免疫を行う。
（４）細胞融合
最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、ＥＭＥＭ培養液中で脾細胞の浮遊液を作成する。次いで脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄した後、細胞数を算定する。
細胞融合は、2-amino-6-oxy-8 azapurine（8-Azaguanine）耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫由来培養細胞株（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３：以下、Ｘ６３細胞と略す）を親細胞株として用いる。Ｘ６３細胞は、非働化した胎児ウシ血清（ＦＣＳ）５％を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（20μｇ／ｍｌ、8-Azaguanine含有）で継代培養し、対数増殖期のＸ６３細胞を用いＲＰＭＩ−１６４培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定する。
細胞融合は、ポリエチレングリコール−４０００をＲＰＭＩ−１６４０培養液で５０（ｗ／ｖ）％濃度となるように溶解して使用する。
脾細胞とＸ６３細胞の比が１０：１となるように混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を除去し、細胞ペレットをよく懸濁し、ポリエチレングリコールを用いて、KohlerとMilsteinの方法に準じて細胞融合を行う。その後、脾細胞が３．５×１０6個／ｍｌとなるように、ＨＡＴ選択培地（１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液に１×１０-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン及び１．６×１０-5Ｍチミジンを含有）に浮遊させる。次いで、細胞浮遊液の１００μｌずつを９６穴マイクロテストプレートの各穴に分注した後、炭酸ガスインキュベータ（３７℃、湿度９５％、８％炭酸ガス）で培養を行う。培養開始後、１日めと２日めにＨＡＴ培地を各穴に１滴ずつ、また培養開始後７日めと９日めにＨＡＴ培地を各穴に２滴ずつ添加してさらに培養を行う。
（５）スクリーニング
培養開始後、１０日めより細胞のクローンが出現し、抗体産生の有無を確認するため、ハイブリドーマの培養上清を用いて抗原抗体反応試験を行う。
すなわち、ハイブリドーマの培養上清とヒトＰＧＩＳ抗原液とを５０μｌずつＵボトムのマイクロタイタープレートに入れ、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体を結合させたセファロース４Ｂの２０％懸濁液を５０μｌ加えて室温で１時間攪拌した後、１０分間静置する。次に抗マウスイムノグロブリン抗体結合セファロース４Ｂがウェルに底に完全に沈むのを確認した後、この上清を２０μｌとり、この上清中に残存するヒトＰＧＩＳの濃度をＰＧＩＳ  ＥＬＩＳＡ系で測定する。このとき、ハイブリドーマの培養上清中にヒトＰＧＩＳに対する抗ヒトＰＧＩＳモノクローナル抗体が存在する場合には、ヒトＰＧＩＳと抗ヒトＰＧＩＳモノクローナル抗体とが反応し、さらに抗マウスイムノグロブリン抗体結合セファロース４Ｂとの抗原抗体複合体を介して沈降し、上清中に残存するヒトＰＧＩＳの濃度が減少し、抗ヒトＰＧＩＳモノクローナル抗体の存在が証明される。
【００２４】
参考例１  ＲＮＡブロット分析
幾種かのサイトカインの、ＨＡＥＣに由来するヒトＰＧＩＳｍＲＮＡの発現に対する影響をみるためにＲＮＡブロットハイブリダイゼーション分析を行った。
まず、幾種かのサイトカイン〔ＩＬ−１α（1ng/ml）、ＩＬ−１β（1ng/ml）、ＩＬ−６（2.5ng/ml）、ＴＮＦ−α（5ng/ml）、ＴＮＦ−β（1ng/ml）〕で２４時間のインキュベーション処理した各ＨＡＥＣ由来の全ＲＮＡ（30μｇ）をホルムアミドで変性して、１．５％ホルムアルデヒドを含む１％寒天ゲル上で電気泳動し、ナイロンメンブレンにトランスファーした。プローブ〔pHPGIS 135およびグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）〕をランダムプライミング法〔Feinberg，A.P.，and Vogelstein，B．（1983）Anal．Biochem．132，6-13〕を用いて、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰで標識した。
次に、Biochem．Biophys．Res．Commun．178，p1479-1484（1991）に記載の方法に従ってハイブリダイゼーションを行った。得られた膜は、最後に０．１％ＳＤＳを含有する６０℃の０．１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）で洗浄し、風乾後オートラジオグラフをとった。結果を図１１に示す。ＨＡＥＣ由来のヒトＰＧＩＳのｍＲＮＡの主なバンドは、約６ｋｂのところに認められ、その他３本のマイナーバンドが認められた（３．２、２．５および１．７ｋｂ）。実験の結果、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βもしくはＩＬ−６とともに２４時間インキュベーションしたときのヒトＰＧＩＳのｍＲＮＡの発現は、サイトカイン処理しなかったコントロールと比較して約２倍上昇していることが認められた。しかして、サイトカインによるＰＧＩ2産生量の増大は、サイトカインによるＰＧＩＳの発現，産生の増大によるものと考えられる。逆に、サイトカインによる処理は、ＰＧＩＳの発現を高めることによりＰＧＩＳの活性を増大させ、ひいてはＰＧＩ2産生を促進するのに極めて有効な方法である。
【００２５】
参考例２  ＰＧＩＳのｍＲＮＡの体内分布
ヒト体内におけるＰＧＩＳのｍＲＮＡの発現分布をみるために、ＲＮＡブロット分析を行った。具体的には、クローンテック社より、ヒト各組織ポリＡ ＲＮＡを電気泳動してブロッティングしてあるフィルターを購入し、ｈＰＧＩＳ１３５を上述の方法により32Ｐ標識化し、前述と同様の条件を用いてノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った。
結果を図１２および図１３に示す。この結果から、ＰＧＩＳのｍＲＮＡはヒト組織で広く、特に子宮，心臓，骨格筋，肺，前立腺に豊富に発現しており、また小腸，腎臓，肝臓及び脳にもわずかであるが有意なレベルで発現していることが確認された。これらの結果は、従来のＰＧＩＳの酵素活性および免疫反応による組織分布の報告と一致しており、ＰＧＩＳが血管系での作用に加えて様々な生理学的役割を担っていることが示唆される。また、図１１で示された６ｋｂの強い主なバンドと３本の弱いバンドは上記全ての組織において観察されたが、弱いバンドの相対的な濃さは組織間でさまざまであった。このような転写物の多様な存在様式は、ｍＲＮＡの別のスプライシングが生じている可能性もしくはプロスタグランジンエンドペルオキシダーゼにおいて見つかったような類似遺伝子（アイソザイム）の存在の可能性を示唆するものである。
【００２６】
【表１−１】
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【００２７】
【表１−２】
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【００２８】
【表１−３】
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【００２９】
【表１−４】
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【００３０】
【表１−５】
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【００３１】
【表１−６】
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【００３２】
【表１−７】
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【００３３】
【表１−８】
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【００３４】
【表１−９】
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【００３５】
【表１−１０】
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【００３６】
【表１−１１】
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【００３７】
【表１−１２】
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【００３８】
【表１−１３】
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【００３９】
【表１−１４】
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【００４０】
【表１−１５】
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【００４１】
【表１−１６】
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【００４２】
【表１−１７】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ヒトＰＧＩＳのｃＤＮＡの制限酵素マップ、およびλｈＰＧＩＳ141、ｐＨＰＧＩＳ１３５およびｐＨＰＧＩＳ３６に含有されるＰＧＩＳのＤＮＡの領域を示す図である。
【図２】プラスミドｐＨＰＧＩＳ３６の制限酵素マップを示す図である。
【図３】プラスミドｐＨＰＧＩＳ１３５の制限酵素マップを示す図である。
【図４】プラスミドｐＨＰＧＩＳ１の制限酵素マップを示す図である。
【図５】ヒトＰＧＩＳ発現ベクターｐＣＭＶ−ＨＰＧＩＳ１の制限酵素マップを示す図である。
【図６】発現ベクターｐＵＣ−ＣＡＧＧＳを示す図である。
【図７】ｐＣＭＶ−ＨＰＧＩＳ１を導入した細胞におけるＰＧＩＳ活性の薄層クロマトグラフィーによる解析の結果を示す写真である。
【図８】ポジテイブコントロール（ウシ血小板ミクロソーム）のＰＧＩＳ活性の薄層クロマトグラフィーによる解析の結果を示す写真である。
【図９】ネガテイブコントロール（ｐＣＭＶのみ導入）の薄層クロマトグラフィーによる解析の結果を示す写真である。
【図１０】ヒトＰＧＩＳ発現ベクター導入の血管平滑筋細胞増殖におよぼす効果を検討した結果を示すグラフである。
【図１１】サイトカインで処理したヒトＰＧＩＳのｍＲＮＡのＲＮＡブロット（電気泳動）分析の結果を示す写真である。
【図１２】ＰＧＩＳのｍＲＮＡのヒト体内（膵臓，腎臓，骨格筋，肝臓，肺，胎盤，脳，心臓）における発現分布を電気泳動的に示す写真である。
【図１３】ＰＧＩＳのｍＲＮＡのヒト体内（周辺白血球，大腸，小腸，卵巣，睾丸，前立腺，胸腺，脾臓）における発現分布を電気泳動的に示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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