(57)【要約】【課題】安全かつ取扱い性の良いシアンヒドリン類濃縮液又はα-ヒドロキシカルボン酸類結晶を得る。【解決手段】シアンヒドリン類、酵素並びに水及び/又は有機溶剤を含む酵素反応溶液から酵素を分離することなく、水及び/又は有機溶剤を留去して濃縮するシアンヒドリン類濃縮液の製造方法、及び前記方法で得られたシアンヒドリン類濃縮液を加水分解し、α-ヒドロキシカルボン酸類結晶を回収するα-ヒドロキシカルボン酸類結晶の製造方法である、並びに、結晶の回収前に活性炭と接触処理することを含む前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアンヒドリン類、酵素並びに水及び/又は有機溶剤を含む酵素反応溶液から酵素を分離することなく、水及び/又は有機溶剤を留去して濃縮するシアンヒドリン類濃縮液の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法で得られたシアンヒドリン類濃縮液を加水分解し、α-ヒドロキシカルボン酸類結晶を回収するα-ヒドロキシカルボン酸類結晶の製造方法。
【請求項３】
結晶の回収前に活性炭と接触処理することを含む請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬中間体等として有用なシアンヒドリン類又はα-ヒドロキシカルボン酸類を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α-ヒドロキシカルボン酸類の製造方法としては、アルデヒド化合物とシアニドとの付加反応によってシアンヒドリン類を得、次いで、得られたシアンヒドリン類を酸加水分解する製造方法が知られている（特許文献１）。光学活性シアンヒドリン類をＨＣＮとカルボニル化合物とから直接合成する手段の一つとして、ヒドロキシニトリルリアーゼと呼ばれる酵素(EC-No.4.1.2.-)を使う方法が知られている。
通常、当該酵素を使う光学活性シアンヒドリン類の合成は、酵素、基質であるＨＣＮ及びカルボニル化合物を含む水系、水―有機溶媒二相系、有機溶媒―微水系、有機溶媒系で実施される。酵素反応に用いる有機溶媒としては、水に難溶又は不溶な有機溶媒が好ましく使用される。また、光学活性α-ヒドロキシカルボン酸類は、上記光学活性シアンヒドリン類を加水分解することにより製造されている(非特許文献１〜２、特許文献２〜４)。上記の光学活性α-ヒドロキシカルボン酸の製造方法は、光学活性シアンヒドリン類を固液分離操作し、溶剤抽出あるいは相分離により、光学活性シアンヒドリン類と酵素を分離した後、加水分解している。上述の方法では残存するＨＣＮの存在下で酵素を分離する必要があり、危険性が高いという問題があった。また、化学純度、及び光学純度の高い光学活性シアンヒドリン類は室温付近で固結する場合があり、固結したシアンヒドリン類は取り扱いが困難であるという問題があった。
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−５９８９５号公報
【特許文献２】特開昭６３−２１９３８８号公報
【特許文献３】特開２００１−３４８３５６号公報
【特許文献４】特開２００２−１４２７９２号公報
【非特許文献１】Thomas Ziegler 等,Synthesis, 1990, 575-578（1990）
【非特許文献２】Franz Effenberger 等,Tetrahedron Letters, 32, 2605-2608 (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、安全かつ取扱い性の良いシアンヒドリン類濃縮液又はα-ヒドロキシカルボン酸類結晶を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、シアンヒドリン類、酵素並びに水及び/又は有機溶剤を含む酵素反応溶液から酵素を分離することなく、水及び/又は有機溶剤を留去して濃縮するシアンヒドリン類濃縮液の製造方法である。また、本発明は、前記方法で得られたシアンヒドリン類濃縮液を加水分解し、α-ヒドロキシカルボン酸類結晶を回収するα-ヒドロキシカルボン酸類結晶の製造方法である、並びに、結晶の回収前に活性炭と接触処理することを含む前記方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、安全かつ取扱い性の良いシアンヒドリン類濃縮液及びα-ヒドロキシカルボン酸類結晶を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明の濃縮の対象となるシアンヒドリン類、酵素並びに水及び/又は有機溶剤を含む酵素反応溶液は、以下の方法で得ることができる。シアンヒドリン類は、シアニドドナーの存在下、カルボニル化合物から合成する。この合成反応には、酵素であるヒドロキシニトリルリアーゼを使用する。
【０００８】
酵素反応の基質となるカルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、次式（Ｉ）で示される化合物が挙げられる。
【０００９】
【化１】
2006347886.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子又は炭素数２２以下の１価の炭化水素基を示す。）炭化水素基中、−ＣＨ２−並びに−ＣＨ３のＣＨ２はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されていてもよく、＝ＣＨ２は＝Ｏ又は＝Ｓで置換されていて良い。また、−ＣＨ２−のＣ−Ｈ、−ＣＨ３のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ並びに＝ＣＨ２のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置換されていても良い。さらには、Ｒ１及びＲ２は、共同して２価の基を示してもよい。
【００１１】
上記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状又は分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のない又は側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基並びに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。
【００１２】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、並びに、フェニルフェニル基又は側鎖のあるフェニルフェニル基等を併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状又は分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００１３】
上記炭化水素基中、−ＣＨ２−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換されると、それぞれケトン、スルホン、エーテル又はチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ３の−ＣＨ２−がカルボニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置換すると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基又はメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ２が＝Ｏ又は＝Ｓに置換すると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ２−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ３のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ２が導入され、＝ＣＨ２のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ３、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、≡ＣＨ又は＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置換されると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置換は、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ２並びにＣ−Ｈにおける置換は、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置換を行った後、なお当該炭素上にＣＨ２又はＣ−Ｈが残存する際には、更に置換がなされてもよい。更には、前記の置換により、−ＣＨ２−ＣＨ３の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換等もなされる。
ハロゲン原子の例としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
【００１４】
従って、上記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基並びに環式炭化水素基等環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基であるアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基であるアルケニル基、アルキニル基、アルカジエニル基等、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基等、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基等が挙げられる。
【００１５】
更に詳しくいえば、アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基等が挙げられる。シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基等、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基等が挙げられる。アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）等が挙げられる。シクロアルケニル基又はシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基等が挙げられる。アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基等が挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基等が挙げられる。
【００１６】
上記記炭化水素基中のＣＨ２がカルボニル基、スルホニル基、Ｏ又はＳで、又はＣ−ＨがＮ又はＣ−ハロゲンで置換された基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）等の構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置換されるものを意味し、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。上記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；エステル構造のアセトキシ基、プロピオキシ基;スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、ク��ロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基等が挙げられる。  Ｒ１及びＲ２で表される非対称の２価の基としては、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデン等が挙げられる。
【００１７】
上記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール、２-ピリジンカルボキシアルデヒド、３-ピリジンカルボキシアルデヒド、4-ピリジンカルボキシアルデヒド等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド、4−ヒドロキシ−３,３−ジメチルブチルアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、２-ピリジンカルボキシアルデヒド、３−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ピリジンカルボキシアルデヒド、４−ヒドロキシ−３，３−ジメチルブチルアルデヒドの使用が好ましく、ベンズアルデヒドが特に好ましい。
【００１８】
酵素反応に用いるシアニドドナーとは、反応系へ添加することによって、シアン化物イオン（ＣＮ−）を生じる物質である。例えば、ＨＣＮ、シアン化ナトリウム又はシアン化カリウム等のシアン化水素の塩又はアセトンシアンヒドリン等のシアンヒドリン類が挙げられる。特に、無機塩や副生物が生じないＨＣＮを用いるのが好ましい。
シアンヒドリン類において、一方の鏡像異性体(例えばＲ体)が他方の鏡像異性体(例えば、Ｓ体)より多く含まれているシアンヒドリン類、又はいずれか一方の鏡像異性体のみからなるシアンヒドリン類のことを光学活性シアンヒドリン類という。なお、光学活性シアンヒドリン類がいずれか一方の鏡像異性体のみからなる場合、光学純度１００％という。
【００１９】
ヒドロキシニトリルリアーゼは、シアニドドナーの存在下、カルボニル化合物からシアンヒドリン類を合成する活性を有する。
Ｒ体のシアンヒドリン類を合成するヒドロキシニトリルリアーゼ((Ｒ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ)としては、アーモンド(Prunus amygdalus)等のバラ科植物由来の(Ｒ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC-No.4.1.2.10)及びアマ科植物由来の(Ｒ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC-No.4.1.2.10)等を例示できる。Ｓ体のシアンヒドリン類を合成するヒドロキシニトリルリアーゼ((Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ)としては、モロコシ(Sorghum bicolor) (EC-No.4.1.2.11)等のイネ科植物由来の(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ(Manihot esculenta) (EC-No.4.1.2.37)、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis) (EC-No.4.1.2.39)等のトウダイグサ科植物由来の(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ、キシメニア(Ximenia americana) (EC-No.4.1.2.10)等のボロボロノキ科植物由来の(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ等を例示できる。好ましくは、アーモンド(Prunus amygdalus)由来の(Ｒ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ、キャッサバ(Manihot esculenta)由来の(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼが使用されるが、キャッサバ(Manihot esculenta)由来の(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼが特に好ましい。なお、キャッサバ（Manihot esculenta）由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列は公知であり、文献等に公開されている（Jane Hughes et al, Arch.Biochem.Biophys.331(1994)496-502及びGenBank accession number Z29091）。該遺伝子の塩基配列は配列番号２で表される。また、該遺伝子がコードするアミノ酸配列は配列番号1で表される。
【００２０】
上述のヒドロキシニトリルリアーゼは、生物組織からの抽出によって調製することができるが、ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を組み込んで作製した遺伝子組換え生物によっても生産することもできる。また、天然型のヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を改変し、酵素機能を改変したヒドロキシニトリルリアーゼについても、上記の活性を有するものであれば本発明に用いることができる。抽出は常法によって実施すればよく、調製物にはヒドロキシニトリルリアーゼ以外の成分が含まれていても反応に悪影響を与えなければ特に精製する必要はない。ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子を組み込んで作成した遺伝子組換え大腸菌(Escherichia coli)を培養して得られるヒドロキシニトリルリアーゼが、調製が容易なことから好ましく使用される。
【００２１】
更に、ヒドロキシニトリルリアーゼは、粉末状酵素、緩衝液等に溶解させた酵素水溶液、適当な担体に固定化してなる固定化酵素等の状態のものを使用することができる。緩衝液等に溶解させた酵素水溶液が、調製が容易なことから好ましく使用される。なお、酵素水溶液については夾雑物を含む懸濁液でも良い。例えば、遺伝子組換え大腸菌を破砕して得られる懸濁液等が挙げられる。
【００２２】
カルボニル化合物とシアニドドナーから酵素反応でシアンヒドリン類を合成する反応は、シアンヒドリン類の生産性を高めるために、水と実質的に混和しない有機溶媒の存在下で行うことが好ましい。ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、２５℃において水と質量比１:１に混合した場合に二層に分離する有機溶媒を意味する。有機溶媒は、水と実質的に混和せず、基質及び生成物を充分に溶解するもの及び酵素反応に悪影響を与えないものであれば良い。このような有機溶媒は、原料のアルデヒド又はケトンの物性、生成物であるシアンヒドリン類の物性に応じて適宜選択される。
【００２３】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていても良い炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム等；ハロゲン化されていても良いアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコール等；ハロゲン化されていても良いエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタン等；ハロゲン化されていても良いエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状又は環状の飽和又は不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられる。特に、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテルを用いるのが好ましい。上記溶媒を単独あるいは２種以上を混合して用いることができる。
【００２４】
上記有機溶媒は、水又は水性緩衝液で飽和されているのが好ましい。ここで水性緩衝液としては、酵素活性の最適ｐＨの付近、例えば、ｐＨ４〜７において緩衝能を発揮する緩衝液が好ましい。例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、o-フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液等が挙げられる。
【００２５】
上記有機溶媒は予めシアニドドナーを含んでいても良い。含まれるシアニドドナーの濃度は、２０質量％以下とすることが好ましく、１０質量％以下とすることが特に好ましい。有機溶媒中のシアニドドナーの濃度は、シアニドドナーを含まない有機溶媒でシアニドドナーを希釈するか又は、シアニドドナーを有機溶媒に添加して濃度を調整する。
【００２６】
シアニドドナー及び／又はカルボニル化合物の添加方法は、例えば、反応系に、シアニドドナー及び／又はカルボニル化合物を含む溶液を複数回に分けて添加する方法や、反応系に、シアニドドナー及び／又はカルボニル化合物を含む溶液を連続的に滴下する方法が挙げられる。
【００２７】
酵素反応に使用するヒドロキシニトリルリアーゼは、シアンヒドリン類合成反応が進行する量を使用すれば良い。例えば、最終的な使用量のカルボニル化合物1ミリモルあたり、１〜１０００単位使用する。ここで、１単位（Ｕ; ｕｎｉｔ）とは、ＤＬ-マンデロトリルを基質として1分間にベンズアルデヒド１μｍｏｌを生成する活性と定義し、その活性は特表平１１-５０８７７５ 号公報に記載の方法により測定される。
ヒドロキシニトリルリアーゼを多量に使用すると、水及び/又は有機溶剤を留去した後のシアンヒドリン類濃縮液が鉱酸による加水分解工程に供される場合にα-ヒドロキシカルボン酸が着色する傾向にある。そのため、ヒドロキシニトリルリアーゼの使用量はカルボニル化合物の最終的な使用量の1ミリモルあたり、１〜２０単位とすることが好ましく、１〜１０単位とすることが特に好ましい。
【００２８】
シアンヒドリン類合成の酵素反応温度は、ヒドロキシニトリルリアーゼの活性を保持する温度、例えば−１０〜４０℃の範囲とすることが好ましい。この範囲内とすることにより反応系冷却のためのエネルギー消費量の削減及びカルボニル化合物への非酵素的反応によるシアニドドナーの付加を防止できる。反応温度は０〜３０℃とすることがより好ましく、４〜２０℃とすることが特に好ましい。
【００２９】
また、シアニドドナーの使用量はカルボニル化合物の最終的な使用量に対して、１〜４倍モル使用することが好ましい。この範囲内とすることにより反応後に大量のシアニドドナーが反応系内に残留せず、安全である。シアニドドナーの使用量は、１〜１.５倍モルとすることがより好ましい。反応時間は、反応系内のシアンヒドリン類の濃度が３０質量％以上に達するまでの時間以上であれば良い。反応系内にシアニドドナー及び／又はカルボニル化合物を含む溶液を添加し始めてから添加を終了するまでの時間は、２時間以上とすることが好ましい。この時間以上であると反応熱による急激な温度上昇を防ぐことができる。反応系内は、撹拌等により酵素が反応系内に分散することが好ましい。
【００３０】
本発明においては、上記のようにして得られたシアンヒドリン類、酵素並びに水及び/又は有機溶剤を含む酵素反応溶液を、酵素を分離することなく、水及び/又は有機溶剤を留去して濃縮する。シアニドドナー存在下では、酵素反応溶液から酵素を分離する工程の危険性が高いので、酵素反応溶液と酵素との分離工程を無くすことで、煩雑な工程が大幅に軽減され安全性が高まる。さらには、シアンヒドリン類と酵素とが共存することでシアンヒドリン類の固結を防ぐことができる。
【００３１】
本発明において、濃縮操作はシアンヒドリン類が高温下で不安定であるため、減圧低温下で濃縮をすることが好ましい。
減圧度及び温度は用いる有機溶剤の種類に応じて適宜決定する。例えば、t-ブチルメチルエーテルやジイソプロピルエーテル等の、沸点が約３０〜１００℃の有機溶剤が用いられる場合は、温度は、０〜１００℃とすることが好ましく、２０〜７０℃とすることがより好ましく、２０〜６０℃とすることが特に好ましい。減圧度は、１〜６００Ｔｏｒｒとすることが好ましく、５〜４００Ｔｏｒｒが特に好ましい。また、留出した水及び/又は有機溶剤は、水及び/又は有機溶剤を捕集するのに十分な温度、例えば、１０℃以下に冷却された冷却管を使い効率よく捕集することができる。
【００３２】
シアンヒドリン類を含む酵素反応溶液から水及び/又は有機溶剤を留去して濃縮した濃縮液中のシアンヒドリン類の濃度は８０質量％以上であることが好ましく、９０質量％以上であることが特に好ましい。
【００３３】
上述の濃縮操作に用いられるシアンヒドリン類、水及び/又は有機溶剤を含む酵素反応溶液にシアンヒドリン類の安定化剤を添加しても良い。安定化剤は、シアンヒドリン類濃縮液を酸性に維持するものであれば良い。例えば、p-トルエンスルホン酸、酢酸等の有機酸、硫酸等の無機酸等が挙げられ、これらをシアンヒドリン類に対して１/２００〜１/１０モル添加することが好ましい。
【００３４】
上述の方法で濃縮された濃縮液は、加水分解される。濃縮液の加水分解の手段は、例えば、鉱酸を用いた加水分解等が挙げられる。鉱酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、リン酸、過塩素酸等が挙げられる。好ましくは、塩酸を用いる。鉱酸は、加水分解する濃縮液の含有するシアンヒドリン類に対して０．５〜２０当量使用することが好ましく、０．９〜１０当量使用することがより好ましく、１〜５当量使用することが特に好ましい。
【００３５】
加水分解は、必要に応じて反応溶媒を使用する。反応溶媒としては、水を使用することが好ましいが、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等の極性溶媒、トルエン、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素系溶媒又は、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒等を用いることもできる。これら溶媒は、単一又は混合して用いることができる。
【００３６】
濃縮液、鉱酸又は溶媒の添加方法は、濃縮液を鉱酸中に添加した後、次いで該反応液に溶媒を添加する方法が反応効率が向上する点から好ましい。
加水分解するシアンヒドリン類の濃度は、１〜７０質量％とすることが好ましい。この範囲内とすることにより加水分解速度が速くなる。濃度は、５〜６０質量％とすることがより好ましく、１０〜５０質量％とすることが特に好ましい。
【００３７】
加水分解温度は、−５℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましい。この範囲内とすることにより反応速度が速く、不純物を低減できる。温度は、１０〜９０℃とすることが特に好ましい。
また、加水分解においては、濃縮液を鉱酸中に添加する時の反応温度と、該反応液に溶媒を添加する時の反応温度は異なっていても良い。例えば、濃縮液を鉱酸中に添加する時の反応温度は−５℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、１０〜４０℃とすることが特に好ましい。該反応液に溶媒を添加する時の反応温度は１０℃〜溶媒の沸点温度とすることが好ましく、３０〜９０℃とすることが特に好ましい。
【００３８】
このような加水分解反応によりシアニドドナーが残存しなくなるため、α-ヒドロキシカルボン酸類の結晶回収工程は、安全に実施することができる。
加水分解により、シアンヒドリン類及び中間体であるα-ヒドロキシアミドが実質的に消失した後、加水分解反応溶液(結晶が析出し、不均一な状態、いわゆるスラリーになっている場合もある。)からα-ヒドロキシカルボン酸類結晶を回収する。
ここで、「実質的に消失」とは、高速液体クロマトグラフィーでの分析結果が、シアンヒドリン類及び中間体であるα-ヒドロキシアミドがα-ヒドロキシカルボン酸類に対して面積比で１０％以下であることをいう。
α-ヒドロキシカルボン酸類溶液は、回収する結晶への着色を防止するためにα-ヒドロキシカルボン酸類結晶の回収前に、活性炭と接触処理することが好ましい。
接触処理とは、例えば、回分式で接触処理する場合は、α-ヒドロキシカルボン酸類溶液に活性炭を加え、攪拌して脱色すれば良い。連続式で接触処理する場合は、活性炭を充填したカラム内にα-ヒドロキシカルボン酸溶液を通すことにより脱色すれば良い。
α-ヒドロキシカルボン酸類溶液は、有機溶媒を用いて抽出し、必要に応じて水洗する。その後、溶媒を蒸発・乾固するか、あるいは、反応溶液を濃縮及び／又は冷却晶析することによりα-ヒドロキシカルボン酸類結晶を析出し、結晶を回収する。
得られたα-ヒドロキシカルボン酸類結晶が着色している場合は、α-ヒドロキシカルボン酸類結晶を溶剤に再溶解した後、活性炭と接触処理して結晶を脱色すれば良い。
回分式で接触処理した場合は、接触処理後、活性炭を濾別し、溶媒を蒸発・乾固する。または、活性炭を濾別した後、α-ヒドロキシカルボン酸類溶液を濃縮及び／又は冷却晶析した後、結晶を濾別する。
連続式で接触処理した場合は、活性炭を濾別する必要がないので、接触処理後のα-ヒドロキシカルボン酸類溶液から溶媒を蒸発・乾固するか、あるいは接触処理後のα-ヒドロキシカルボン酸類溶液を濃縮及び／又は冷却晶析した後、結晶を濾別して結晶を回収する。
【００３９】
接触処理に使用する活性炭の量、処理温度及び処理時間は着色の度合いによって適宜決定することができる。接触処理後の着色の度合いは、比色管によりＡＰＨＡ標準色と比較することで数値化(ハーゼン色数)することができ、本発明においては、２００番以下とすることが好ましい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。
[調製例１]
ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体の調製
(１)  ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
Ｊａｎｅ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ, Ａｒｃｈ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.３３１<１９９４>４９６-５０２及びＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｚ２９０９１記載の塩基配列を元に、配列番号２によって表されるキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来のヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子をＰＣＲ法により合成した。具体的には、２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０(配列番号３〜２２)を設計及び合成した。オリゴヌクレオチドに相補的に設定された２０種のオリゴヌクレオチドは、それぞれ約２０塩基ずつ重なるように設計した。図１に２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）の位置関係を模式的に表した。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを蒸留水で再懸濁し、１００ ｐｍｏｌ/μｌとした。２０種のオリゴヌクレオチド溶液のそれぞれから１μｌずつ集めてミックスオリゴを作製した。この混合液をＰＣＲ-ｍｉｘ（Ｐｗｏ １０×緩衝液、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ）(Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製)に加えた。表1にＰＣＲ反応液の組成を示した。
【００４１】
【表１】
2006347886.tif 000003
【００４２】
ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒のセットを５５サイクル行い、オリゴヌクレオチドを伸長させて、遺伝子をＰＣＲ合成した。この操作を１ｓｔ ＰＣＲとした。次に、上述の方法で作製した合成遺伝子をＰＣＲによって以下のようにして増幅した。この操作を２ｎｄ ＰＣＲとした。表１に示したＡ、Ｂ、Ｃの反応産物１．３μｌに、5μｌのPwo １０×緩衝液、5μｌのdNTP ｍｉｘ、0.5μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、36.2μｌの蒸留水及び１μｌの外側プライマ−を添加した。外側プライマ−として、F01（配列番号３）及びR01（配列番号１３）のプライマ−を用いた。２ｎｄ ＰＣＲは、94℃で30秒、50℃で３０秒、７２℃で60秒のセットを２３サイクル行い、遺伝子を増幅した。得られた増幅産物を1.5％アガロ−スゲル電気泳動に供し、約１ｋｂの増幅産物を確認した。
【００４３】
(２)ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のクローニング
上記（１）で得られた２ｎｄ ＰＣＲの増幅産物のバンド（約１ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製した。精製したＤＮＡ（５μl）を制限酵素ＢａｍＨＩ  (１μl)（オリゴヌクレオチドＦ０１中に消化認識部位が含まれる）及びＫｐｎＩ(１μｌ)（オリゴヌクレオチドＲ０１中に消化認識部位が含まれる）で３７℃、１時間消化し、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ (１９８９)）］により精製した。精製したＤＮＡ（５μｌ）、ＢａｍＨＩ並びにＫｐｎＩで予め消化しておいたベクタ−ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）（１μｌ）、蒸留水（４μｌ）及びｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））（１０μｌ）を混合してライゲ−ション混合物を作った。得られた混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることで、精製したDNAとベクタ−を結合しライゲーション産物を作製した。
【００４４】
（３）大腸菌 JM109株のコンピテントセルの作製
大腸菌 JM109株をＬＢ培地(１％ バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、０．５％ ＮａＣｌ) １ｍｌに接種し３７℃、５時間好気的に前培養した。この前培養液 ０．４ｍｌを ＳＯＢ培地 ４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ 、２．５ｍＭ ＫＣｌ 、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ） に加え、１８℃で２０時間培養した。次いで、培養物を遠心分離により集菌（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）した後、冷ＴＦ溶液(２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ-ＫＯＨ（ｐＨ ６．０） 、２００ｍＭ ＫＣｌ 、１０ｍＭ ＣａＣｌ２ 、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２ ) を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間静置した。その後、再度遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）し、上澄を除いた。沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液 ３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間静置した。その後、２００μｌずつ分注してコンピテントセルを作製した。
【００４５】
（４）ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のクロ−ニング
工程（３）で得られたコンピテントセル ２００μｌ を工程(２)で作製した該ライゲーション産物１０μlに加え、０℃で３０分静置した。次いで、４２℃で３０秒間ヒ−トショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、これにＳＯＣ 培地（２０ｍＭ グルコ−ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ−ストエキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ 、２．５ｍＭ ＫＣｌ 、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、１ｍＭ ＭｇＣｌ２ ）１ｍｌ を添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。この培養液を ２００μｌ ＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン １００ｍｇ/Ｌ 、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）にまき、３７℃で培養した。寒天培地上に生育した複数個の形質転換体コロニーを各々 １．５ｍｌのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン １００ｍｇ/Ｌを含有するＬＢ培地）で一晩３７℃で培養した。この培養液を各々集菌後、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて組換えベクターを回収した。得られた組換えベクターの塩基配列をＣＥＱ ＤＴＣＳ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ及び蛍光シ−ケンサＣＥＱ ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて解析した。プライマ−は、オリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０を用いた。
解析した結果、取得した組換えベクターが、配列番号２で表されるキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の塩基配列と同一の配列を有することがわかった。それ組換えベクターをｐＵＭＥと命名した。
【００４６】
(５)発現ベクター組み込み用ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製
実験のコントロール及び後述する高発現型ヒドロキシニトリルリア−ゼ作製の際の鋳型として使用するため、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ） 由来ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミドを、以下の方法で作製した。まず、ヒドロキシニトリルリア−ゼをコ−ドするＤＮＡ断片を発現ベクタ−に容易に導入可能な制限酵素認識部位を両端に有する形となるようＰＣＲ法で作製した。ＰＣＲ用の反応混合物は、５μｌのＰｗｏ １０×バッファ−、５μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、０．５μｌのＰｗｏ ＤＮＡポリメラ−ゼ、３６．２μｌの蒸留水、１μｌのセンスプライマー（配列番号２３、２９ヌクレオチドからなり、その配列中にＮｃｏＩ認識部位及びヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン以降を有する）、アンチセンスプライマ−（配列番号２４、３３ヌクレオチドからなり、その配列中にＳｓｅ８３８７Ｉ認識部位及びヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の終止コドンを含む）、並びに鋳型としてプラスミドｐＵＭＥを１μｌ添加したものを用いた。ＰＣＲは、９５℃で２分の変性を行った後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル行った。  
【００４７】
センスプライマ−：
CCACCATGGTAACTGCACATTTTGTTCTG（配列番号２３；下線部は制限酵素ＮｃｏＩ認識部位を示す）
アンチセンスプライマ−：
GGCCTGCAGGTTAACTTAATAGGAGCTAAAAGC（配列番号２４；下線部は制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ認識部位を示す）
【００４８】
ＰＣＲ法により得られた増幅ＰＣＲ産物は、Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化後、ＮｃｏＩによって部分消化した。次いで、アガロ−スゲル電気泳動で分離し、ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子全長を含むバンド（約０．８ｋｂ）のゲルを切り出した。このゲル中の増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。
【００４９】
(６) ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現用ベクターの調製
次いで、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現用ベクターを以下のように調製した。ベクターｐＫＫ２３３-２（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ (ＣＢＳ)、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/）（５μｌ）をＨｉｎｄＩＩＩ（１μｌ）で消化後、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。次いで、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて末端の平滑処理を行った。この処理液を再度フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製した。精製した発現ベクタ−（５μｌ）をＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化処理を行った。この処理液を再度エタノ−ル沈殿により精製した。精製したベクタ−ＤＮＡ（５μｌ）、アニ−リング済みＳｓｅ８３８７Ｉリン酸化リンカ−ｐＳｓｅ８３８７Ｉ（タカラバイオ社製）（５μｌ）及びｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））（１０μｌ）を混合してライゲ−ション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることでリンカ−とベクタ−を結合した。工程（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行った。生育したコロニ−より組換えベクターを回収した。回収した組換えベクターに対してＳｓｅ８３８７Ｉ消化反応を行い、直鎖状に消化されることが確認されたものをｐＫＫ２３３-２（+Ｓｓｅ）とした。このｐＫＫ２３３-２（+Ｓｓｅ）を制限酵素ＮｃｏＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化後、フェノ−ル抽出・クロロホルム抽出・エタノ−ル沈殿により精製し、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現用ベクターを調製した。
【００５０】
（７）ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現プラスミド、及び該プラスミドを含むヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体の作製
工程(５)の方法で得られたヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子ＤＮＡ断片（５μｌ）と工程（６）の方法で作成したヒドロキシニトリルリア−ゼ発現用ベクターｐＫＫ２３３-２(+Ｓｓｅ) （５μｌ）を混合した。この混合液にｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製））（１０μｌ）を添加してライゲ−ション混合物を作った。この混合物を１２時間、１６℃でインキュベ−トすることでリンカ−とベクタ−を結合した。工程（４）と同様の操作により、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換を行い、生育コロニ−から組換えベクターを回収した。ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子ＤＮＡ断片が正しく発現ベクタ−に連結された組換えベクターを確認し、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現組換えベクターをｐＯＸＮ１０３と命名した。同時に、ヒドロキシニトリルリア−ゼ発現形質転換（導入）体ＪＭ１０９/ｐＯＸＮ１０３を得た。
【００５１】
[調製例２]
(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液の調製
形質転換（導入）体ＪＭ１０９/ｐＯＸＮ１０３を培地(２％  日本製薬社製ポリペプトンＮ、０．５％  オリエンタル酵母社製酵母エキス、０．１５％  リン酸水素２カリウム、０．１ｇ/Ｌ  アンピシリンナトリウム、１ｍＭ ＩＰＴＧ)を１００ｍｌ入れた三角フラスコ２０本に接種し、３７℃で一晩培養した。培養液の酵素活性は、特表平１１-５０８７７５ 号公報に記載の方法により測定したところ、４．７７ｕｎｉｔ/ｍＬであった。この培養液２Ｌを遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）して菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸及び７０ｍＭリン酸水素２ナトリウムを含むｐＨ６．０の緩衝液を加えて８０ｍＬの菌体懸濁液を得た。この菌体懸濁液をフレンチプレス（大岳製作所社製 フレンチ・プレス ５５０２ ５６１５Ｌ、１０００ｋｇ/ｃｍ２）で２回処理して菌体を破砕した。その後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間、４℃）により上清を回収し、１３０ｕｎｉｔ/ｍＬの酵素活性を持つ(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液６０ｍＬを得た。
【００５２】
以下の実施例において、マンデロニトリル、マンデルアミド、マンデル酸化学純度及び光学純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、下記の分析条件で決定した。
＜マンデロニトリル、マンデルアミド、マンデル酸化学純度＞
試料調製方法：試料２０ｍｇをキャリヤー２５ｍＬに溶解
装置：          カラムオーブン          日本分光社製    ８６５−ＣＯ
ＵＶ                    日本分光社製    ８７０−ＵＶ
ポンプ                  日本分光社製    ８８０−ＰＵ
インテグレーター        島津製作所社製  Ｃ−Ｒ３Ａ
カラム：        ＯＤＳ−２              ＧＬサイエンス社製
キャリヤー：    アセトニトリル：水＝３／７（リン酸にてｐＨ３．０に調整）
カラム温度：    ４０℃
流速：          １ｍＬ／ｍｉｎ
波長：          ２２０ｎｍ
＜マンデロニトリル、マンデルアミド、マンデル酸光学純度＞
試料調製方法：試料２０ｍｇをキャリヤー２５ｍＬに溶解
装置：          カラムオーブン          日本分光社製    ８６５−ＣＯ
ＵＶ                    日本分光社製    ８７０−ＵＶ
ポンプ                  日本分光社製    ８８０−ＰＵ
インテグレーター        島津製作所社製  Ｃ−Ｒ３Ａ
カラム：        ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＪ−Ｈ(４．６ｍｍ×２５０ｍｍ)ダイセル化学工業社製
キャリヤー：    Ｈｅｘａｎｅ／ＩＰＡ／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
カラム温度：    ３５℃
流速：          １．０ｍL／ｍｉｎ
波長：          ２２０ｎｍ      
＜着色度合い＞
比色管によりＡＰＨＡ標準色と比較することで数値化(ハーゼン色数、定量限界は５００番)した。
【００５３】
[実施例１]
（１）(Ｓ)-マンデロニトリルの合成
調製例２で得られた(Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ水溶液４４．６ｍＬ(５７９８単位)とt-ブチルメチルエーテル１２０．８ｍＬを混合した。ＨＣＮ  ５ｇ(０．１８５ｍｏｌ)をこれに添加し、６〜８℃で酵素水溶液が拡散するように攪拌した。次いで、攪拌しながら、ＨＣＮ  １．４５ｇ(０．０５３７ｍｏｌ)及びベンズアルデヒド  ５．５５ｇ(０．０５２３ｍｏｌ)を添加した。添加してから１０分後、１０分あたりＨＣＮ  １．５ｇ(０．０５５６ｍｏｌ)及びベンズアルデヒド  ４．５ｇ(０．０４２４ｍｏｌ)の比率でＨＣＮ及びベンズアルデヒドを３時間２０分かけて連続的に滴下した。滴下中、酵素水溶液が反応系内に拡散するように６〜８℃で攪拌した。滴下終了後、さらに１時間、６〜８℃で攪拌し(Ｓ)-マンデロニトリルの反応溶液を得た。その後、ＨＰＬＣ分析により この溶液を分析した。マンデロニトリルの濃度は、４５．０質量％、その光学純度は９８．０％ｅ.ｅ. のＳ体過剰であった。
【００５４】
（２）(Ｓ)-マンデロニトリルの濃縮
上記（１）で得られた反応溶液２６１ｇに、９８％硫酸を０．４ｇ添加した。次いで、エバポレーターを用いてバス温度５０℃で７０〜５０Ｔｏｒｒになるまで、水及び有機溶媒を留去して濃縮し、９０質量％の(Ｓ)-マンデロニトリル濃縮液  １３０．５ｇ(ベンズアルデヒドからの収率９８％)を得た。得られた(Ｓ)-マンデロニトリル濃縮液は、水及び有機溶剤に不溶な沈澱を含んでいた。
【００５５】
（３）(Ｓ)-マンデロニトリルの加水分解
上記（２）で得られた(Ｓ)-マンデロニトリル濃縮液１３０．５ｇを３５％塩酸１４６ｇ中に１７時間かけて滴下しながら３０〜３５℃で攪拌した。この反応溶液はスラリー状となり、攪拌後の反応溶液をＨＰＬＣ分析したところ、(Ｓ)-マンデロニトリルは検出されず、(Ｓ)-マンデルアミドと(Ｓ)-マンデル酸が混在していた。次いで、反応溶液中に、水３１９ｇを添加して７５℃で２時間攪拌した。この反応溶液は溶液状態の均一反応溶液となり、ＨＰＬＣ分析した。 (Ｓ)-マンデル酸の濃度は２１．３％((Ｓ)-マンデロニトリルからの収率９４．５％)で、その光学純度は９８．０％ｅ.ｅ.のＳ体過剰であり、得られた均一反応溶液はわずかに褐色に着色し、ハーゼン色数は２００〜２５０番であった。(Ｓ)-マンデロニトリル及び(Ｓ)-マンデルアミドは検出されなかった。
【００５６】
（４）加水分解反応溶液の活性炭による脱色
上記（３）で得られた均一反応溶液５９５ｇに、活性炭１２ｇ(クラレ社製Ｐ-６０Ｗ５; 含水率５０％)を加え、６０℃で２時間攪拌した。その後、活性炭を濾別した。この反応溶液のハーゼン色数は８０〜１００番であった。
【００５７】
（５）加水分解反応溶液からの(Ｓ)-マンデル酸結晶の回収
上記（４）で得られた反応溶液のうち５９０ｇを、冷却速度５℃／時間で６０℃から１５℃まで冷却し、結晶を析出させた。この結晶を濾別し、１０℃の水で結晶を洗浄した。その後、結晶を乾燥させて、白色のマンデル酸結晶１１４．５ｇを回収した。回収したマンデル酸結晶の純度は９７．０％(Ｒ体を含む)であり、その光学純度は９９．５％ ｅ.ｅ.のＳ体過剰であった。
【００５８】
[実施例２]
（１）(Ｒ)-２-クロロマンデロニトリルの合成
５０ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ５．０)２５ｍＬに溶解したアーモンド(Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ)由来の(Ｒ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ（シグマ社製ＭＯ６４６（登録商標））２４．３ｍｇ(１３２００単位) とt-ブチルメチルエーテル１４０ｍＬを混合した。ＨＣＮ  ３．０ｇ(０．１１１ｍｏｌ)をこれに添加し、２６〜２８℃で酵素水溶液が拡散するように攪拌した。次いで、攪拌しながら、ＨＣＮ  １．３ｇ(０．０４８ｍｏｌ)及び２-クロロベンズアルデヒド  ５．３ｇ(０．０３７７ｍｏｌ)を添加した。添加してから１０分後、１０分あたりＨＣＮ  １ｇ(０．０３７ｍｏｌ)及び２-クロロベンズアルデヒド  ４ｇ(０．０２８４ｍｏｌ)の比率でＨＣＮ及び２-クロロベンズアルデヒドを３時間２０分かけて連続的に滴下した。滴下中、酵素水溶液が反応系内に拡散するように２６〜２８℃で攪拌した。滴下終了後、さらに１時間、２６〜２８℃で攪拌し、(Ｒ)-２-クロロマンデロニトリルの反応溶液を得た。その後、ＨＰＬＣ分析により、この溶液を分析した。２-クロロマンデロニトリルの濃度は、４１．４質量％、その光学純度は９１．５％ｅ.ｅ. のＲ体過剰であった。
【００５９】
（２）(Ｒ)-２-クロロマンデロニトリルの濃縮
上記（１）で得られた反応溶液２３８ｇを実施例１（２）と同様の方法で、(Ｒ)-２-クロロマンデロニトリルの濃縮を行い、９０質量％の(Ｒ)-２-クロロマンデロニトリル濃縮液１０９．５ｇ(２-クロロベンズアルデヒドからの収率８７％)を得た。得られた(Ｒ)-２-クロロマンデロニトリル濃縮液は水及び有機溶剤に不溶な沈澱を含んでいた。
【００６０】
（３）(Ｒ)-２-クロロマンデロニトリルの加水分解
上記（２）で得られた２-クロロマンデロニトリル濃縮液１０９．５ｇを、３５％塩酸の添加量を９７ｇ及び水の添加量を２１３ｇに変えた以外は実施例１（３）と同様の方法で加水分解を行った。得られた加水分解反応溶液の (Ｒ)-２-クロロマンデル酸の濃度は、２６．８％((Ｒ)-２-クロロマンデロニトリルからの収率９３％)で、その光学純度は９１．５％ｅ.ｅ.のＲ体過剰であった。この反応溶液はわずかに褐色に着色し、ハーゼン色数は２５０〜３００番であった。
【００６１】
（４）加水分解反応溶液の活性炭による脱色
上記（３）で得られた反応溶液４１９．５ｇを、活性炭の添加量を８ｇに変えた以外は実施例１（４）と同様の方法で脱色を行った。その後、活性炭を濾別した。この反応溶液のハーゼン色数は１５０〜２００番であった。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＰＣＲによる野生型ヒドロキシニトリルリア−ゼ遺伝子の作製に用いた２０種のオリゴヌクレオチドＦ０１〜Ｆ１０及びＲ０１〜Ｒ１０（配列番号３〜２２）の位置関係を模式的に表した図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号３〜２４：Synthetic DNA
【図１】
2006347886.tif 000004
【配列表】
2006347886000001.app