(57)【要約】  【課題】作業が簡単であり、且つ、正確で検出感度が高い、有用なタンパク質のキャッチ能力判別方法を提供する。  【解決手段】筋肉等を構成するタンパク質であるアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンの関与を受けて所定の張力を保って結合するキャッチ状態を取り得る能力であるキャッチ能力を判別するための筋肉等のキャッチ能力判別方法であって、前記筋肉等の懸濁液を所定の高塩濃度緩衝液で得た抽出物である前記ミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントと、前記筋肉等の懸濁液から得られた可溶性タンパク質画分とを使用して、キャッチ能力を判別するようにしている筋肉等のタンパク質のキャッチ能力判別方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉等を構成するタンパク質であるアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンの関与を受けて所定の張力を保って結合するキャッチ状態を取り得る能力であるキャッチ能力を判別するためのタンパク質のキャッチ能力判別方法であって、
前記筋肉等の懸濁液を所定の高塩濃度緩衝液で得た抽出物である前記ミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントを使用して、
キャッチ能力を判別するようにしているタンパク質のキャッチ能力判別方法。
【請求項２】
筋肉等を構成するタンパク質であるアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンの関与を受けて所定の張力を保って結合するキャッチ状態を取り得る能力であるキャッチ能力を判別するためのタンパク質のキャッチ能力判別方法であって、
前記筋肉等の懸濁液を所定の高塩濃度緩衝液で得た抽出物である前記ミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントと、
前記筋肉等の懸濁液から得られた可溶性タンパク質画分とを使用して、キャッチ能力を判別するようにしているタンパク質のキャッチ能力判別方法。
【請求項３】
前記抽出物は、前記可溶性タンパク質画分の抽出を行った後の懸濁液から得られたものである請求項２記載のタンパク質のキャッチ能力判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉等を構成するタンパク質のキャッチ能力を判別するためのタンパク質のキャッチ能力判別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、貝類の筋肉においては、その筋肉を構成するタンパク質であるアクチンがミオシンによって運動し筋肉の収縮を起こすアクティブ状態、及び、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが結合せず筋肉が弛緩した状態となるリラックス状態以外に、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが低エネルギー消費で高い張力を保って結合する「キャッチ」と呼ばれる状態を形成することが知られていた（Ｒｕｅｇｇ、１９７１；Ｗａｔａｂｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｓｈｏｒｎｅ，１９９０）。
【０００３】
本発明者らは、筋肉から取り出したタンパク質フィラメント、または筋肉から精製したタンパク質を使って、上記キャッチ状態及びリラックス状態を試験管内で再構成することに成功している（非特許文献１、２参照）。そして、このキャッチ、リラックスのメカニズムを利用することにより、ナノマシン等で用いることのでき得る全く新たなデバイスの開発も期待されている。
【０００４】
従って、ある筋肉又は筋肉以外の組織がキャッチ状態を作り出す能力があるのかどうか、または、キャッチ状態への成り易さはどの程度のものなのかを調べることには極めて重要な意味がある。
【０００５】
従来は、このために、筋肉からキャッチ状態に関わるアクチン、ミオシン、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンを精製し、それら精製したタンパク質を使用してキャッチ状態を検出する方法、または、筋肉中から得られるアクチンを含む天然の細いフィラメントと、ミオシン及びツイッチンを含む天然の太いフィラメントとを使用してキャッチ状態を検出する方法によって調べていた。
【非特許文献１】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００１年６月５日号  ｖｏｌ．９８；ｐｐ６６３５−６６４０
【非特許文献２】遺伝２００１年９月号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、タンパク質を精製する方法によれば、煩雑な作業を必要とする上、精製するのに長時間を要してしまうという問題点があった。
【０００７】
一方、天然のフィラメントを使用する方法によれば、天然の太いフィラメント画分が、アクチンを含みまたキャッチ状態に関与しないパラミオシンをミオシンより多く含んでいることなどから、太いフィラメントのほぼ半分がアクチンフィラメントとは結合しないことがわかっており、すなわち、精製したタンパク質を使用した場合よりもかなり感度が低くなってしまう。さらに、天然の太いフィラメントは不均質であるため、アクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとの結合及び解離に関する正確なデータを取得しにくいという問題点があった。
【０００８】
しかして、これらの問題点を一気に解決するために、作業が簡単であり、且つ、正確で検出感度が高い、有用なタンパク質のキャッチ能力判別方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、筋肉等を構成するタンパク質であるアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンの関与を受けて所定の張力を保って結合するキャッチ状態を取り得る能力であるキャッチ能力を判別する方法であって、筋肉等の懸濁液を所定の高塩濃度緩衝液で得た抽出物である前記ミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントを使用して、タンパク質のキャッチ能力を判別するようにしているキャッチ能力判別方法である。ここで、「ミオシン又はミオシンを含むフィラメント」とは、フィラメントを形成しているミオシンや形成していないミオシン、ミオシンがツイッチンやその他のタンパク質を含んでフィラメントを形成している状態となっているもののことを指す。
【００１０】
また、本発明の別の態様としては、筋肉等を構成するタンパク質であるアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンの関与を受けて所定の張力を保って結合するキャッチ状態を取り得る能力であるキャッチ能力を判別する方法であって、筋肉の懸濁液を所定の高塩濃度緩衝液で得た抽出物である前記ミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントを使用するとともに、筋肉の懸濁液から得られるキャッチ状態を形成する酵素や当該酵素の活性化させる所定物質を含む可溶性タンパク質画分を使用して、前記筋肉のキャッチ能力を判別するようにしているタンパク質のキャッチ能力判別方法が挙げられる。
【００１１】
そして、この場合に、上述した高塩濃度抽出物を、この可溶性タンパク質画分の抽出を行った後の懸濁液から得るようにすれば、キャッチ状態を再構成するのに必要な太いフィラメントと可溶性タンパク質画分とを同時に効率的に得られるため、無駄がなく効率的にキャッチ能力を判別する実験が行うことができるようになる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来のようにキャッチ能力を保有しているかどうか、又はどの程度のキャッチ能力を保有しているのか、を判別しようとする筋肉等からミオシンやツイッチンを精製するという煩雑な作業と比較して、極めて簡単な分画操作によって得られる合成の太いフィラメントを使ってキャッチ能力を判別することができるようになる。
【００１３】
しかも、この合成の太いフィラメント画分は、アクチンをほとんど含んでおらず、また天然の太いフィラメントよりもキャッチ状態を作り出すのに関与しないパラミオシンの含有率が低いので、検出感度がよく正確なデータが得られる。
【００１４】
すなわち、簡単で且つ高感度で正確なデータが得られる筋肉等のキャッチ能力判別方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。
【００１６】
このキャッチ能力判別方法は、筋肉等を構成するタンパク質であるアクチンとミオシン又はミオシンを含むフィラメントとが、このミオシンとともに太いフィラメントを構成するツイッチンの関与を受けて所定の張力を保って結合するキャッチ状態を取り得る能力であるキャッチ能力を判別する方法であって、筋肉等の懸濁液を所定の高塩濃度緩衝液で得た抽出物である前記ミオシン及びツイッチンを含む合成の太いフィラメントと、前記筋肉等の懸濁液から得られた可溶性タンパク質画分とを使用して、タンパク質のキャッチ能力を判別するようにしているキャッチ能力判別方法である。
【００１７】
また、本実施形態におけるキャッチ能力判別方法は、キャッチ能力を有していることが明らかなムラサキイガイの足糸牽引筋や後閉殻筋（平滑筋）に対して適用している。
【００１８】
アクチンは、ウサギの骨格筋から精製したアクチンフィラメントを使用した。そして、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｐ−１９５１）でラベルし、２μｇ／ｍｌの濃度とした。なお、アクチンに関しては、キャッチ能力を有しているかどうかを判別しようとする筋肉等から抽出したものでなくとも構わない。
【００１９】
合成の太いフィラメントは、上記ムラサキイガイの足糸牽引筋や後閉殻筋を、所定の緩衝液中でホモジネートさせ、後述する可溶性タンパク質画分を抽出した後の懸濁液を、高塩濃度緩衝液で抽出し、低塩濃度緩衝液に透析して得たものを使用している。
【００２０】
より具体的には、ムラサキイガイの上記筋肉を懸濁した緩衝液は、本実施形態では、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（以下、ＤＴＴと言う）、２０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ−ＮａＯＨを含み、ｐＨ７．０に調整したものを使用した。
【００２１】
そして、前記懸濁液を遠心分離し（例えば３０万Ｇで３０分）、その上清を除いた沈殿を、高塩濃度緩衝液で抽出した。この高塩濃度緩衝液としては、本実施形態においては、０．４Ｍ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＡＴＰ、４ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴを含んで、ｐＨ７．０に調整した１０ｍＭリン酸緩衝液を使用した。そして、沈殿させた溶液を遠心分離して（例えば３０万Ｇで３０分）、得られた上清に当該上清の5倍量の冷水を加えて、さらに遠心分離を行った。その際の沈殿物を前記リン酸緩衝液に溶解し、その溶液を前記ホモジネートに使用した緩衝液と同様の緩衝液に対して、攪拌しない状態で透析した。
【００２２】
キャッチ状態を再構成するための酵素を含む可溶性タンパク質画分は、前記懸濁液を遠心分離し（例えば、３０万Ｇで３０分）、その上清を使用した。
【００２３】
しかして、上記のアクチン、合成の太いフィラメント、可溶性タンパク質画分を使って、筋肉等のキャッチ能力を判別するための手順を以下に説明する。
【００２４】
本実施形態では、キャッチ状態のみならず、アクチンとミオシンフィラメントとが結合しない状態であるリラックス状態への再構築の様子をも観察している。なお、これらリラックス状態とキャッチ状態とは可逆的に変化する。これらの仕組みに関しては、本発明者らによって、図１に示すように、筋肉に含まれているタンパク質脱リン酸化酵素であるセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂ（図中、ＰＰ２Ｂとしている）によって、ツイッチンが脱リン酸化されてリラックス状態からキャッチ状態へ変換することが明らかにされている。また、筋肉に含まれているタンパク質リン酸化酵素であるプロテインキナーゼＡ（図中、ＰＫＡとしている）によってツイッチンがリン酸化されてキャッチ状態からリラックス状態へ変換することもすでに明らかになっている。
【００２５】
合成の太いフィラメントとアクチンフィラメントとの結合状態は、図２〜５にその観察画像を示しているように、暗視野顕微鏡と蛍光顕微鏡とによって観察した。
【００２６】
なお、図において、暗視野顕微鏡で観察されるのが合成の太いフィラメントであり、図２では上図、図３〜５においては左図に示したように、長いフィラメントの束として観察されている。また、蛍光顕微鏡で観察されるのが、後述するように蛍光標識したアクチンフィラメントであり、図２では下図、図３〜５においては右図に示している。
【００２７】
まず、合成の太いフィラメント（２〜３ｍｇ／ｍｌ）と、可溶性タンパク質画分（約０．１ｍｇ／ｍｌ）とを、１０−５Ｍのカルシウムイオンの存在下で混合した。この処理をキャッチ処理という。このキャッチ処理を行った合成の太いフィラメントとアクチンとをＭｇＡＴＰ及び低濃度のカルシウムイオン（１０−７Ｍ以下）の存在下で混合すると、図３に示したように、合成の太いフィラメントに対するアクチンフィラメントの結合が観察されるキャッチ状態を形成し、すなわち筋肉がキャッチ能力を保有していることがわかる。
【００２８】
また、１０−５Ｍ  ｃＡＭＰ、及び１〜４ｍＭ  ＡＴＰの存在下で、合成の太いフィラメントと、可溶性タンパク質画分とを混合した。この処理をリラックス処理と言う。このリラックス処理を行った合成の太いフィラメントとアクチンフィラメントとを、ＭｇＡＴＰ及び低濃度のカルシウムイオン（１０−７Ｍ以下）の存在下で混合したが、図４に示したように、合成の太いフィラメントに対するアクチンフィラメントの結合は観察されなくなり、リラックス状態を形成した。
【００２９】
そして、再び可溶性タンパク質画分でキャッチ処理をしてアクチンフィラメントと混合すれば、図５に示したように、キャッチ状態へ戻った。
【００３０】
このように合成の太いフィラメントを使用してキャッチ能力を判別した場合に得られた観察画像を、図６〜８に示している精製したミオシンフィラメント及びツイッチンを使用した場合と比較する。太いフィラメントに結合したアクチンフィラメントが観察される蛍光画像を見ると、精製したフィラメントを使用した場合と、合成の太いフィラメントを使用した場合とはほぼ同程度のアクチンの結合の状態が観察される。すなわち、検出感度はほぼ変わらないことがわかる。
【００３１】
一方、天然のフィラメントと比較すると、図９に示しているように、ミオシン及びツイッチンを含む天然の太いフィラメントの暗視野顕微鏡による観察画像（上図）と、アクチンを含む天然の細いフィラメントの蛍光顕微鏡の観察画像（下図）は、明瞭でない。すわなち、天然のフィラメントを利用するとあまりはっきりしたデータが得られないことがわかる。
【００３２】
さらに、合成の太いフィラメントをＳＤＳ‐ＰＡＧＥと、［γ−32Ｐ］ＡＴＰを使用したオートラジオグラフィーとで調べたところ、図１０に示したような結果を得た。図中、３、４、５と記しているものは、図３に対応するキャッチ処理をした合成の太いフィラメント、図４に対応するリラックス処理をした合成の太いフィラメント、図５に対応した合成の太いフィラメントを示している。
【００３３】
図１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から明らかなように、アクチン（図中、Ａｃと記している）は、ごくわずかしか含まれていない。また、キャッチ状態に関与しないパラミオシン（図中ＰＭと記している）の含有量は、ミオシン重鎖（図中ＭＨＣと記している）とほぼ同量か若干少ない。これらは、天然の太いフィラメント画分が、アクチンを多量に含有しているとともに、パラミオシンをミオシンより多く含有している点と大きく異なっている。
【００３４】
上記のように説明した本実施形態の筋肉のキャッチ能力判別方法によれば、従来のミオシン及びツイッチンを精製して使用する場合と比較して、非常に簡単な手順で抽出できる合成の太いフィラメントによって、精製したミオシン及びツイッチンを使用した場合とほぼ同程度の検出感度でキャッチ能力の判別を行うことができる。
【００３５】
また、本実施形態による合成の太いフィラメントは、天然のフィラメント画分と比較すると、キャッチ状態の観察の阻害となるアクチンをほとんど含んでおらず、またキャッチ状態の形成に関与しないパラミオシンの含有量も少ないので、検出感度が高く正確なデータが得られる。
【００３６】
なお、本発明は、本実施形態に限られない。
【００３７】
上記実施形態においては、キャッチ状態を形成するための酵素を含むものとして同じ筋肉から抽出された可溶性タンパク質画分を使ってキャッチ能力を判別しているが、例えばこの可溶性タンパク質画分の分画が困難であったり、当該可溶性タンパク質が不安定なものであるような場合は、キャッチ状態を形成する酵素として本発明者が明らかにしたセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂ（以下、ＰＰ２Ｂという）のひとつであるカルシニューリン（例えば牛由来のもの）の精製品及びこれを活性化するカルモジュリンを使用してもよい。
【００３８】
ここで、上記アクチンフィラメントと合成の太いフィラメントと、牛由来カルシニューリンと、上記リラックス状態を形成する酵素として特定されているプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡという）の一種である牛由来のＰＫＡとを使って、キャッチ状態及びリラックス状態の再構成を行った実験について説明しておく。
【００３９】
図３に示したキャッチ状態にある合成の太いフィラメントに、ボバインＰＫＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−５５１１）  ２μｇ／ｍｌを、１０−５Ｍ  ｃＡＭＰ、１−４ｍＭ  ＡＴＰの存在下で加え、リラックス状態を形成した。
【００４０】
一方、このリラックス状態にある合成の太いフィラメントに、ボバインカルシニューリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−１９０７）０．２μＭ及びカルモジュリン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−２２７７）２μＭを、１０−５Ｍのカルシウムイオンの存在下において混合した。室温（２４℃）で１０分間放置した後、過剰のＥＧＴＡを加えて、カルシウムイオン濃度を１０−７Ｍ以下まで下げた。このようにすると、再びアクチンフィラメントが合成の太いフィラメントに結合した。すなわち、上記実施形態における合成の太いフィラメントは、可溶性タンパク質画分のみならず、精製した酵素を使用しても、筋肉のキャッチ能力を判別するためのアッセイシステムとして充分に成立することがわかった。
【００４１】
その他、各部の具体的構成についても上記実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の根拠となる概略説明図。
【図２】図１の説明となるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図３】本発明の一実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図４】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図５】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図６】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図７】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図８】同実施形態により得られるタンパク質の状態を示す画像を示す図。
【図９】天然のフィラメントを使用した場合の状態を示す画像を示す図。
【図１０】同実施形態による合成の太いフィラメントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーの結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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