(57)【要約】  【課題】  グリコサミノグリカン合成の制御メカニズムの解明に有用な手段の提供。  【解決手段】  糖ヌクレオチド輸送体タンパク質ＵＧＴｒｅｌ7遺伝子が破壊された変異体非ヒト哺乳動物、特にＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してホモ接合体である、変異体非ヒト哺乳動物（ＵＧＴｒｅｌ７ノックアウト動物）、その子孫、並びに当該遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物細胞。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する、変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してヘテロ接合体である、請求項１記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してホモ接合体である、請求項１記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
軟骨形成不全症モデルである、請求項３記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
小胞体でのコンドロイチン硫酸合成が抑制されていることを特徴とする、請求項３又は４記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
鎖長が短縮されたアグリカンを有する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊が、該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損によるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損が、第１〜第３エクソンを含む領域の欠損である、請求項７記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
非ヒト哺乳動物がげっ歯類に属する動物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
げっ歯類に属する動物がマウスである、請求項９記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異体非ヒト哺乳動物から単離された非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１２】
破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する、非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１３】
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してヘテロ接合体である、請求項１２記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１４】
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してホモ接合体である、請求項１２記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１５】
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊が、該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損によるものである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１６】
該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損が、第１〜第３エクソンを含む領域の欠損である、請求項１５記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１７】
非ヒト哺乳動物がげっ歯類に属する動物である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１８】
げっ歯類に属する動物がマウスである、請求項１７記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異体非ヒト哺乳動物の作製方法であって、
（ａ）ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、及び／又は他の配列の挿入を目的としたターゲッティングベクターを作製する工程、
（ｂ）上記ベクターをＥＳ細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたＥＳ細胞を得る工程、
（ｃ）上記組換えＥＳ細胞を、妊娠した雌から得た胚に導入してキメラ胚を作製する工程、及び
（ｄ）該キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し発生させてキメラ動物を得る工程、
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異体非ヒト哺乳動物を野生型動物と交配して得られるＦ１ヘテロ接合体。
【請求項２１】
請求項２０記載のＦ１ヘテロ接合体同士を交配して得られるＦ２動物。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異体非ヒト哺乳動物、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物細胞、請求項２０記載のＦ１ヘテロ接合体、又は請求項２１記載のＦ２動物を用いることを特徴とする医薬品のスクリーニング方法。
【請求項２３】
医薬品が、小人症又は関節疾患の予防、治療及び／又は診断用である、請求項２２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖ヌクレオチド輸送体の１種であるＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の機能が欠損した哺乳動物、及びその作製方法に関する。さらに本発明は、糖ヌクレオチド輸送体が関与しているグリコサミノグリカン合成等の異常により発症し得る種々の疾患の治療法や治療薬開発の為の該哺乳動物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、典型的には、アミノ糖とウロン酸が結合した二糖構造の繰り返しと硫酸残基から構成されている。グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、へパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等が知られている。
【０００３】
ヒアルロン酸は、ウロン酸のグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）にアミノ糖（ヘキソアミン）のN−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）が結合した、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃの基本構造（繰り返し単位）から構成されている。ケラタン硫酸は、ガラクトース（Ｇａｌ）に、ＧｌｃＮａｃが結合した、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの基本構造（繰り返し単位）から構成されている。へパラン硫酸及びヘパリンは、ＧｌｃＵＡ又はイズロン酸（ＩｄｏＡ）に、ＧｌｃＮａｃが結合した、ＧｌｃＵＡ−ＧｌｃＮＡｃや、ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃの基本構造から構成されている。コンドロイチン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸は、ＧｌｃＵＡに、アミノ糖のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が結合した、ＧｌｃＵＡ−ＧａｌＮＡｃの基本構造から構成されている。デルマタン硫酸は、ＩｄｏＡに、ＧａｌＮＡｃが結合した、ＩｄｏＡ−ＧａｌＮＡｃの基本構造から構成されている。
コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸中の二糖構造は、まず小胞体（ＥＲ）ルーメン中で、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ、ＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ及びＵＤＰ−Ｎ−ＧｌｃＮａｃ等のヌクレオチド糖から重合化される（非特許文献１参照）。これらのヌクレオチド糖は本質的には細胞質で合成され、ＥＲ膜上に存在する特定の糖ヌクレオチド輸送体によってＥＲルーメンに運ばれる。ＵＧＴｒｅｌ７はこの輸送体活性を有する（非特許文献２参照）。遺伝子データバンク上では哺乳類の糖ヌクレオチド輸送体は１７分子種が知られているが分子レベルで同定されているのはそのうち５つにすぎない。脊椎動物モデルにおける最近の研究では、種々の器官の分化に必須な糖鎖を合成するためにはＵＧＴｒｅｌ７のホモログが必要であるということを示している（非特許文献３〜５参照）。
【０００４】
コンドロイチン硫酸は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中、及び細胞表面上に存在するプロテオグリカンとしての哺乳動物の組織に普遍的に見られる。このグリコサミノグリカンはＥＣＭの保水性の維持や多様な細胞応答の制御等、多彩且つ必要不可欠な役割をインビボで担っている。小人症や関節症の事例研究でコンドロイチン硫酸の異常がそれらの病理に関与していることが強く示唆されており、コンドロイチン硫酸をはじめとした、グリコサミノグリカン合成の制御メカニズムを明らかにすることが切望されている。
【非特許文献１】Varki, A., Cummings, R., Esko, J., Freeze, H., Hart, G., Marth, J., et al. (eds) Essentials of Glycobiology (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999)
【非特許文献２】Muraoka M, Kawakita M, Ishida N. Molecular characterization of human UDP-glucuronic acid/UDP-N-acetylgalactosamine transporter, a novel nucleotide sugar transporter with dual substrate specificity. FEBS Lett. 2001 Apr 20;495(1-2):87-93.
【非特許文献３】Selva EM, Hong K, Baeg GH, Beverley SM, Turco SJ, Perrimon N, Hacker U. Dual role of the fringe connection gene in both heparan sulphate and fringe-dependent signalling events. Nat Cell Biol. 2001 Sep;3(9):809-15.
【非特許文献４】Goto S, Taniguchi M, Muraoka M, Toyoda H, Sado Y, Kawakita M, Hayashi S. UDP-sugar transporter implicated in glycosylation and processing of Notch. Nat Cell Biol. 2001 Sep;3(9):816-22.
【非特許文献５】Berninsone P, Hwang HY, Zemtseva I, Horvitz HR, Hirschberg CB. SQV-7, a protein involved in Caenorhabditis elegans epithelial invagination and early embryogenesis, transports UDP-glucuronic acid, UDP-N- acetylgalactosamine, and UDP-galactose. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 27;98(7):3738-43.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、軟骨等の器官形成におけるグリコサミノグリカン合成の制御メカニズムの解明に有用な手段の提供を目的とする。具体的には、糖ヌクレオチド輸送体タンパク質の１種であるＵＧＴｒｅｌ７遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物、その子孫、並びに当該遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物細胞の提供を目的とする。さらに本発明はそれらを用いた医薬品のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、小胞体上の糖ヌクレオチド輸送体タンパク質の１種であるＵＧＴｒｅｌ７を欠損したマウスが実際に軟骨マトリックスを欠いた深刻な軟骨形成不全症、小人症様の症状を呈することを確認し、ＵＧＴｒｅｌ７が軟骨におけるグリコサミノグリカン合成に必須であることを見出した。かかる知見により、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子が破壊されたマウス等の非ヒト哺乳動物が、器官形成におけるグリコサミノグリカン合成の制御メカニズムを解明するのに有用な手段となり得ることが示された。すなわち本発明は以下の通りである。
【０００７】
〔１〕破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する、変異体非ヒト哺乳動物。
〔２〕ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してヘテロ接合体である、上記〔１〕記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔３〕ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してホモ接合体である、上記〔１〕記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔４〕軟骨形成不全症モデルである、上記〔３〕記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔５〕小胞体でのコンドロイチン硫酸合成が抑制されていることを特徴とする、上記〔３〕又は〔４〕記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔６〕鎖長が短縮されたアグリカンを有する、上記〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔７〕ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊が、該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損によるものである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔８〕該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損が、第１〜第３エクソンを含む領域の欠損である、上記〔７〕記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔９〕非ヒト哺乳動物がげっ歯類に属する動物である、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の変異体非ヒト哺乳動物。
〔１０〕げっ歯類に属する動物がマウスである、上記〔９〕記載の変異体非ヒト哺乳動物。
【０００８】
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の変異体非ヒト哺乳動物から単離された非ヒト哺乳動物細胞。
〔１２〕破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する、非ヒト哺乳動物細胞。
〔１３〕ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してヘテロ接合体である、上記〔１２〕記載の非ヒト哺乳動物細胞。
〔１４〕ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊に関してホモ接合体である、上記〔１２〕記載の非ヒト哺乳動物細胞。
〔１５〕ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊が、該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損によるものである、上記〔１１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物細胞。
〔１６〕該遺伝子又は発現制御領域の少なくとも一部の欠損が、第１〜第３エクソンを含む領域の欠損である、上記〔１５〕記載の非ヒト哺乳動物細胞。
〔１７〕非ヒト哺乳動物がげっ歯類に属する動物である、上記〔１１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物細胞。
〔１８〕げっ歯類に属する動物がマウスである、上記〔１７〕記載の非ヒト哺乳動物細胞。
〔１９〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の変異体非ヒト哺乳動物の作製方法であって、
（ａ）ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、及び／又は他の配列の挿入を目的としたターゲッティングベクターを作製する工程、
（ｂ）上記ベクターをＥＳ細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたＥＳ細胞を得る工程、
（ｃ）上記組換えＥＳ細胞を、妊娠した雌から得た胚に導入してキメラ胚を作製する工程、及び
（ｄ）該キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し発生させてキメラ動物を得る工程、
を含む方法。
〔２０〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の変異体非ヒト哺乳動物を野生型動物と交配して得られるＦ１ヘテロ接合体。
【０００９】
〔２１〕上記〔２０〕記載のＦ１ヘテロ接合体同士を交配して得られるＦ２動物。
〔２２〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の変異体非ヒト哺乳動物、上記〔１１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物細胞、上記〔２０〕記載のＦ１ヘテロ接合体、又は上記〔２１〕記載のＦ２動物を用いることを特徴とする医薬品のスクリーニング方法。
〔２３〕医薬品が、小人症又は関節疾患の予防、治療及び／又は診断用である、上記〔２２〕記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の、破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物、その子孫、破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する非ヒト哺乳動物細胞は、器官形成におけるグリコサミノグリカン合成の制御メカニズムを解明するのに有用な手段となり得る。さらにこれらの手段を用いることによって、器官形成におけるグリコサミノグリカン合成の制御異常に伴う種々の疾患の、予防、治療並びに診断の分野で有用な医薬品をスクリーニングすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物（以下、単に変異体動物とも称する）、非ヒト哺乳動物細胞を提供する。本明細書において「変異体」とは、遺伝子変化を指し、核酸又はコードされるポリペプチドの変異体形態とは、その核酸がもととなる核酸（即ち、その核酸の野生型形態）と比較して遺伝子改変を含むことを意味する。同様に、動物に関して使用される場合には、「変異体」とは、遺伝子改変された動物を指す。その遺伝子改変は、「トランスジェニック」動物を生じる、遺伝子の挿入であり得る。本明細書で使用される場合、トランスジェニック動物に関して使用される場合、「トランスジーン（導入遺伝子）」とは、正常な遺伝子としての機能、複製及び伝達を保証する様式で動物の生殖系列中に挿入される遺伝子を指す。その遺伝子改変はまた、「ノックアウト」動物を生じる、遺伝子の欠失又は破壊であってもよい。「ノックアウト」動物とは、細胞における内因性ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現が部分的に抑制又は完全に抑制されている動物を指す。又、特定の環境下での抑制も含まれる。同様に、本発明において「破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子」としては、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域の全部又は一部が欠損した遺伝子が例示され、その遺伝子発現の完全な抑制又は部分的な抑制を生じる。又、２つのアレルの一方が破壊されている場合（ヘテロ接合体）も両方が破壊されている場合（ホモ接合体）も含まれる。後述するが、本発明の、破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物は、ホモ接合体の場合、肺形成不全症を伴う呼吸不全を呈し致死性である。
【００１２】
動物の種類は、ヒトを除く哺乳動物であれば特に限定されず、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、モルモット、ヒツジ、ウシ等が例示され、好ましくは、マウス、ハムスター、ラット等のげっ歯類であり、特に好ましくはマウスである。
【００１３】
本発明の変異体動物は、器官形成におけるグリコサミノグリカン合成の制御メカニズムを解明するのに有用な手段となり得る。さらにこれらの手段を用いることによって、器官形成におけるグリコサミノグリカン合成の制御異常に伴う種々の疾患の、予防、治療並びに診断の分野で有用な医薬品をスクリーニングすることが可能となる。
【００１４】
「器官」としては、骨、軟骨、肺、脳（特に海馬領域）等が挙げられる。好ましくは骨、軟骨である。
「グリコサミノグリカン」としては、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸等が例示されるが、好ましくはコンドロイチン硫酸又はヘパラン硫酸、より好ましくはコンドロイチン硫酸である。
【００１５】
又、本発明の変異体動物から調製された細胞を用いて、同様のスクリーニングを行うこともできる。
【００１６】
スクリーニングは、例えば、本発明の変異体動物又は変異体動物の胚等から調製される細胞を用いて、グリコサミノグリカン合成に対する影響を調べる。その結果、所望の効果を示す化合物を選択する。細胞は、初代培養細胞を用いることもできれば、株化した細胞を作製して用いることもできる。スクリーニングされた化合物は医薬品の候補となる。
【００１７】
さらに、本発明は、破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有し、且つ、個体への分化が可能な非ヒト哺乳動物細胞を提供する。ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の破壊の手段やその意味、並びに対象とする動物の種類は、上記の本発明の変異体動物の場合と同様である。
【００１８】
本発明の非ヒト哺乳動物細胞を作製する方法は特に限定されないが、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域の少なくとも一部の欠損によりＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の発現が抑制された細胞は、ノックアウト用のベクター（ターゲティングベクター）を構築し、該ベクターを適当な細胞内に導入することにより作製することができる。
ターゲティングベクターは、標的動物の内在性ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を失活させる為に設計された核酸配列を含む。このような核酸配列は、例えばＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域の少なくとも一部を欠失させた核酸配列でもよく、また、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域に他の遺伝子が挿入された核酸配列であってもよい。
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の欠失させる領域の一例としては、翻訳開始点（メチオニン）が挙げられる。また、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の欠失させる領域の別の一例としては、翻訳開始点（メチオニン）及び膜貫通領域の欠失、具体的には、ＵＧＴｒｅｌ７タンパク質のＮ末端の１０８アミノ酸をコードする、第１〜第３エクソンを含む領域が挙げられる。
【００１９】
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域に挿入される他の遺伝子としては、選択マーカーとしても機能する遺伝子が好ましい。「選択マーカー」とは、該マーカーが導入される細胞、選択表現型を提供する遺伝エレメントを意味する。一般に、選択マーカー遺伝子は、細胞増殖を阻害するか、又は細胞を殺傷する因子に対する耐性をその遺伝子産物が提供する遺伝子である。種々の選択マーカー遺伝子が、本発明において使用可能なターゲティングベクターにおいて使用され得る。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ遺伝子；Ｇ４１８耐性により選択）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ遺伝子；ハイグロマイシン耐性により選択）やチミジンキナーゼ遺伝子（ガンシクロビル耐性により選択）等の薬剤耐性遺伝子、ジフテリア毒素（ＤＴ）Ａ遺伝子等の毒素遺伝子、又はこれらの組み合わせを用いることができる。これら遺伝子のＵＧＴｒｅｌ７遺伝子における挿入場所は、標的における内在性ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の発現を抑制し得る位置であれば特に限定されない。
【００２０】
クローニングしたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子へのこれらの遺伝子の挿入は、試験管内において、通常のＤＮＡ組換え技法を用いて行うことができる（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）。
かくして得られたＤＮＡ構築物（破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子）は、増殖又は適切な細胞へのトランスフェクションの為のベクター中に取り込まれ得る。例えば、特定の細胞（哺乳動物細胞又は細菌細胞等）におけるベクターの生産の為に、所望の特性に基づいてベクターを選択し得る。具体的には、当該ＤＮＡ構築物を適切な細胞又は組織におけるＤＮＡ構築物中の遺伝エレメントの発現を可能にするように適切な発現エレメント（例えばプロモーター及び／又はエンハンサー）に作動可能に連結することによってターゲティングベクターを構築することができる。
【００２１】
このようにして構築されたターゲティングベクターを個体へ分化させることが可能な非ヒト哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞）に導入し、該細胞中の内在性ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子との相同組換えを行う。本発明において用いられる非ヒト哺乳動物細胞としては、その由来する生物に特に制限はないが、好ましくはげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター等）である。
ターゲティングベクターの細胞への導入は、当業者によく知られた方法、例えばエレクトロポレーション法を利用して行うことができる。この結果、一部の細胞内においては細胞中のＵＧＴｒｅｌ７遺伝子とターゲティングベクターの対応する領域との間で組換えが生じ、ターゲティングベクター中に構築されていた変異体遺伝子と野生型遺伝子が置き換わることになる。かくしてマーカー遺伝子が挿入されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を持つ細胞が得られる。
【００２２】
ターゲティングベクターにおいてマーカー遺伝子を利用している場合には、所望の相同組換えが行われた細胞は、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子が失活し、同時にマーカー遺伝子を得ることとなるので、このマーカー遺伝子を指標とすることにより選抜を行うことができる。例えばマーカー遺伝子として、薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、ベクター導入後の細胞を、致死濃度の薬剤の存在下で培養することにより、所望の相同組換えが行われた細胞を選抜することができる。
【００２３】
このようにして得られた、本発明の破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有し、且つ、個体への分化が可能な非ヒト哺乳動物細胞は、上述の、本発明の破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物を作製する為に利用することができる。また、本発明の変異体非ヒト哺乳動物から調製される細胞と同様に医薬品のスクリーニングに用いることもできる。
【００２４】
本発明の変異体非ヒト哺乳動物の作製方法は、例えば以下の工程を含む。
（ａ）ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子又はその発現制御領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、及び／又は他の配列の挿入を目的としたターゲティングベクターを作製する工程、
（ｂ）上記ベクターをＥＳ細胞に導入し、該ベクターで相同組換えされたＥＳ細胞を得る工程、
（ｃ）上記組換えＥＳ細胞を、妊娠した雌から得た胚に導入してキメラ胚を作製する工程、
（ｄ）該キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し発生させてキメラ動物を得る工程。
工程（ａ）で作製されるターゲティングベクターは、上記本発明の非ヒト哺乳動物細胞を作製する方法と同様にして作製することができる。
本発明において胚に注入する細胞として、ＥＳ細胞を用いた場合には、これを胚盤胞に注入することによりキメラ胚を作製することができる。注入に用いる胚盤胞は妊娠した雌の子宮を灌流することによって得ることができる。続いてキメラ胚を偽妊娠させた哺乳動物の子宮に移植することによりキメラ動物を得ることができる。胚に注入した細胞（ＥＳ細胞）が発生分化中の胚に取り込まれたか否かを個体作製後に検定できるようにするために、作製された個体の外部的特徴（例えば、毛色）が、注入した細胞に由来する部分と胚盤胞に由来する部分とで異なるように、胚盤胞を選択することが好ましい。
こうして得られたキメラ動物を適当な系統の同種動物と交配させることにより産仔を得る。キメラ動物の生殖細胞が注入した細胞に由来すれば、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子が破壊された、即ちＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の発現が抑制された産仔（Ｆ１）を得ることができる。Ｆ１同士を交配することによって得られるＦ２動物は、ヘテロ接合体であってもホモ接合体であってもよい。ヘテロ接合体の表現型はＵＧＴｒｅｌ７遺伝子が破壊されていない野生型と変わらないが、ホモ接合体は、極度の成長遅延、ドーム型の頭骨、短い鼻と下顎、突き出た舌、短い四肢と尾、不釣合いに膨張した腹部等の軟骨形成不全の表現型を示し、致死性であった。
【００２５】
本発明においてＥＳ細胞を用いず、他の体細胞を用いる場合は、体細胞クローン動物の作製技術に従って変異体動物の作製を行うことができる。具体的には、例えば、
１）線維芽細胞等のＥＳ細胞以外の細胞を用いて、ＥＳ細胞の場合と同様な方法によって相同組換え法により遺伝子に変異が導入された細胞を樹立する。
２）この細胞より、体細胞クローン動物作製の技術を応用し、変異遺伝子を持つ動物を作製する。
３）こうして生まれた変異遺伝子を持つ動物は、ＥＳ細胞を用いた場合のＦ１動物に相当し、それ以降はＥＳ細胞を用いた場合と同様に使用することができる。
【００２６】
本発明の変異体非ヒト哺乳動物若しくはそれらの子孫、又は非ヒト哺乳動物細胞を用いることにより、器官形成におけるグリコサミノグリカン合成の制御異常に伴う種々の疾患の、予防、治療並びに診断の分野で有用な医薬品をスクリーニングすることができる。このような医薬品としては、例えば、破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物において発現が変化している標的遺伝子のより通常の発現レベルへの回復が可能な化合物であって、骨・軟骨形成の改善に有用である。破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物において発現が変化している標的遺伝子としては、発現が減少あるいは消失している遺伝子としてＵＧＴｒｅｌ７遺伝子等が、発現が増加する遺伝子としてコラーゲン１０遺伝子、ＦＧＦＲ３遺伝子等が例示される。また、発現が増加する遺伝子として細胞外マトリックスプロテオグリカンであるパールカンの遺伝子も挙げられるが、パールカンタンパク質の蓄積は減少する（パールカンは細胞外マトリックスタンパク質であり、ＵＧＴｒｅｌ７ノックアウトマウスでは細胞外への分泌が阻害される為であると考えられる）。パールカンは骨の正常な分化及び神経筋接合部位の形成に必須である。
コラーゲン１０はコラーゲン繊維の一種である。ＦＧＦＲ３はＦＧＦ受容体の一つで骨の生育を抑制する機能を有する。
【００２７】
破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物において発現が変化している標的遺伝子のより通常の発現レベルへの回復が可能な化合物を同定する為の方法は、例えば以下の工程を含む。
（ａ）破壊されたＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を有する変異体非ヒト哺乳動物において発現が変化している標的遺伝子と、試験化合物とを接触させる工程；
（ｂ）上記標的遺伝子の発現を測定する工程、及び
（ｃ）上記標的遺伝子の発現を野生型のレベルと一致する発現レベルに調節する化合物を選択する工程。
【００２８】
「より通常の発現レベル」とは、野生型動物における標的遺伝子の発現レベルと類似した、標的遺伝子の発現レベルである。通常の発現レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、本質的には約１００％までに回復させる化合物を選択することが好ましい。
【００２９】
発現が変化している標的遺伝子は、例えば、変異体動物に、この変異体動物から単離された器官、組織又は細胞に、あるいは細胞調製物に含有され得るが、いずれも標的遺伝子の発現が調節され得る条件下で用いられる。
【００３０】
「試験化合物」は、標的遺伝子の発現レベルをより正常なレベルに回復し得ることが推測される任意の物質、分子、化合物、分子若しくは化合物の混合物、又は任意の他の組成物であり得る。試験化合物は、公知の化合物であっても今後開発される新規な化合物であってもよい。公知のものであれば商業的に入手可能であるか、各報告文献に従って採取、製造、精製等の工程を経て得ることができる。これらは、天然由来であっても、また遺伝子工学的に調製されるものであってもよく、また半合成等によっても得ることができる。
【００３１】
試験化合物は、高分子、例えば生物学的ポリマーであり、有機分子、金属含有化合物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体等が例示される。
【００３２】
標的遺伝子の発現を測定する方法は、当分野で通常実施されている方法を用いて行うことができる。遺伝子レベルでの発現を測定する方法に加え、遺伝子発現レベルに対応するタンパク質発現レベルでの測定も好適に実施され得る。具体的には、遺伝子レベルでの発現は、ｃＤＮＡ配列決定、クローンハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、ｃＤＮＡフラグメントフィンガープリント法、遺伝子発現の連続的分析（ＳＡＧＥ）、及びＤＮＡマイクロアレイ等によって測定することができる。タンパク質レベルでの発現は免疫化学法（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ＲＩＡ）、ゲル電気泳動法、タンパク質又はペプチドのクロマトグラフィーに基づく方法等が挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。本出願全体を通して引用されたすべての刊行物は参照として本明細書に組み入れられる。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００３４】
実施例１：ＵＧＴｒｅｌ７変異マウスの作製
（１）ターゲティングベクターの構築
ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子の翻訳開始部位の５’側の上流１９６９〜９１１ｂｐ迄の１ｋｂ断片と、Ｒ１  ＥＳ細胞のゲノムライブラリー（かずさＤＮＡ研究所）から４〜６番目のエクソンをコードするＢｇｌＩＩ消化による５．４ｋｂ断片とを得た。ＰＢＣ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングされたＰＧＫ−ＮＥＯカセットの両隣に各断片を挿入し、ついでＨＳＶ−ＴＫカセットをネガティブセレクションマーカー（McBurney MW, Sutherland LC, Adra CN, Leclair B, Rudnicki MA, Jardine K. The mouse Pgk-1 gene promoter contains an upstream activator sequence. Nucleic Acids Res. 1991 Oct 25;19(20):5755-61.; Mansour SL, Thomas KR, Capecchi MR. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 1988 Nov 24;336(6197):348-52.）として結合し、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子を破壊乃至機能抑制する為のターゲティングベクターを得た（図１Ａ参照）。
（２）ターゲティング変異の同定
得られたターゲティングベクターを以前の報告（Nagy A, Rossant J, Nagy R, Abramow-Newerly W, Roder JC. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Sep 15;90(18):8424-8.）に基づいてＲ１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーション法によって導入した。相同組換えされたＥＳ細胞をガンシクロビルとＧ４１８により選別し、ターゲティングされた部位をＰＣＲ及びゲノムサザンハイブリダイゼーション法によって確認した（Joyner AL., 1992. Gene Targeting. Oxford University Press, Oxford.）。まずＰＣＲによってハイブリダイゼーションプローブを作製した。図１Ａ中のプローブａ及びｂはそれぞれ、翻訳開始部位をコードする部位に対して−２２４９〜−２６８６ｂｐの５’上流領域と６６２２〜６９３２ｂｐの３’下流領域に位置する。サザンハイブリダイゼーションの結果を図１Ｂに示した。遺伝子型はまた、図１Ｃに示すようにＰＣＲによっても確認した。プライマーｃ及びｄは野生型の染色体を、プライマーｃ及びｅはターゲティングされた染色体を検出するためのプライマーセットである。
プライマーｃ：ＴＧＡＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧ（配列番号１）
プライマーｄ：ＡＴＡＡＧＣＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＧ（配列番号２）
プライマーｅ：ＣＴＡＧＧＡＧＡＣＴＣＴＣＧＴＧＡＴＡＴＣ（配列番号３）
ＵＧＴｒｅｌ７ｍＲＮＡを検出するためにＲＴ−ＰＣＲを行った（図１Ｄ参照）。交配後１８．５日目の胎仔の肺から全ｍＲＮＡを抽出し、それを用いて逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は次のプライマーセットを用いて行った。
ＴＣＧＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＡＣＣＴＣＧＡ（配列番号４）
ＧＡＧＴＴＡＴＡＴＴＧＡＧＴＡＣＡＧＡＧ（配列番号５）
（３）ターゲティングされたＥＳ細胞クローンをＢＤＦ１マウス（日本クレア）から得た８細胞と凝集させることによってキメラマウスにまで発生させた。それらの子孫を公知手法（Joyner AL., 1992. Gene Targeting. Oxford University Press, Oxford.）を用いて繁殖することによってホモ接合体マウス（ＵＧＴｒｅｌ７−／−マウス）を得た。
ＵＧＴｒｅｌ７−／−マウスは出生と同時に死んだが、これは肺形成不全症を伴う呼吸不全によるためであった。それらは、小人症の身長、ドーム型の頭骨、短い鼻と下顎、突き出た舌、短い四肢と尾、及び不釣合いに膨張した腹部によって特徴付けられる深刻な軟骨形成不全の表現型を示した（図２ａ，ｂ）。ホモ接合体の成長遅延は交配後１５．５日目で既に四肢に認められた（図２ｃ）。対照的に交配後１２．５日目では明らかな異常は認められなかった（図２ｄ）。
【００３５】
実施例２：ホモ接合体マウスの形態学的観察
実施例１で確認されたホモ接合体における異常を正確に調べる為に、交配後１８．５日目の胎仔をアルシアン青とアリザリン赤でそれぞれ軟骨及び骨を染色した骨格標本を作製した（図２ｅ〜ｍ）。ホモ接合体のほとんど全ての骨が極度の成長遅延を示した（図２ｅ）。四肢、頭骨、下顎、肋骨、胸骨及び椎体は明らかに損なわれており（図２ｆ〜ｌ）、恥骨結合は成熟していなかった（図２ｍ）。ホモ接合体マウスの頭骨の縦方向への伸長は、いくらか遅延しており、その結果として球形の奇形を生じていた（図２ｈ，ｉ）。ホモ接合体マウスの椎体の骨形成は遅延し、その高さは野生型マウスの２／３であった（図２ｌ）。肋骨の周囲の長さと胸腔の面積が減少し変形していた（図２ｋ）。
【００３６】
実施例３：ホモ接合体マウスの骨及び軟骨中のグリコサミノグリカンの解析
ＵＧＴｒｅｌ７はＥＲ膜に存在し、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ／ＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ／ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃのＥＲルーメンへの取り込みを触媒する。この取り込みは、これらの基質を必要とする、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンの合成の綿密な第１段階である。これらのグリコサミノグリカンの、変異体マウスの骨及び軟骨中の量が影響を受けているかどうかを二糖組成解析(Toyoda, H., Kinoshita-Toyoda, A., and Selleck, S. B. Structural Analysis of Glycosaminoglycans in Drosophilaand Caenorhabditis elegans and Demonstration That tout-velu, a Drosophila Gene Related to EXT Tumor Suppressors, Affects Heparan Sulfate in Vivo. J. Biol. Chem. 275, 2269-2275. (2000))によって調べた。二糖組成解析の為に調製した凍結上腕骨及び凍結大腿骨からグリコサミノグリカンを抽出した。コンドロイチナーゼとヘパリチナーゼの混合物で部分精製したグリコサミノグリカンを徹底的に酵素消化した後、不飽和二糖を定法に従い蛍光ポストカラムＨＰＬＣによって標準と対比して同定し測定した。グリコサミノグリカン量はＨＰＬＣで得られたクロマトグラムによって推定した。交配後１８．５日目の変異体マウス胚の上腕骨と大腿骨中のコンドロイチン硫酸の量が野生型マウスに比べておよそ１／５に減少していた。対照的にヘパラン硫酸の含量に顕著な変化は認められなかった（表１参照）。
【００３７】
【表１】
2006262855.tif 000002
【００３８】
コンドロイチン硫酸が減少した理由を調べる為にプロテオグリカン上のグリコサミノグリカン合成を、[３５Ｓ]硫酸塩で標識した軟骨の組織片培養によって解析した。本実施例においてプロテオグリカンは、アグリカンを意味する。グリコサミノグリカンの標識とそれに続く解析は、セファクリルＳ５００ＨＲクロマトグラフィーを用いることを除いては以前報告されたようにして行った（Ogihara Y, Suda N, Hammond VE, Senior PV, Beck F, Yanagishita M. Biosynthesis of proteoglycan in bone and cartilage of parathyroid hormone-related protein knockout mice. J Bone Miner Metab. 2001;19(1):4-12.）。交配後１８．５日目の３胎仔由来の肋骨軟骨をＤＭＥＭ中、３００μＣｉ[３５Ｓ]硫酸塩とともに６時間培養しグリコサミノグリカンの硫酸残基を標識した。これらの培養物から４Ｍ塩酸グアニジンでプロテオグリカンを抽出し、Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィーで、酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、０．５％（ｗ/ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び８Ｍウレアを含有する緩衝液中０．２〜１．５ＭのＮａＣｌの直線勾配によって精製した。ＵＧＴｒｅｌ７−／−マウス（ホモ接合体マウス）及びＵＧＴｒｅｌ７＋／−マウス（ヘテロ接合体マウス）それぞれの組織片からのプール画分の放射活性はそれぞれ９×１０５及び２．１×１０５ＣＰＭであった。およそ１×１０４ＣＰＭに相当するプール画分のアリコートをさらなる解析に用いた。ホモ接合体マウス及びヘテロ接合体マウス由来のプロテオグリカンに総分子量の違いがあるかを調べる為にセファクリルＳ５００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。０．５Ｎ  ＮａＯＨ中β遊離によってプロテオグリカンからグリコサミノグリカンを放出させ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ゲル濾過クロマトグラフィーで解析した。プロテオグリカン上のコンドロイチン硫酸鎖を０．１ユニットのコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業）によって消化しＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  クロマトグラフィーで解析した。
グアニジン塩酸塩を用いた抽出工程及びイオン交換クロマトグラフィー工程を用いてプロテオグリカン画分を得た（図３ａ）。ヘテロ接合体マウスでは１５〜２３番のフラクションに、ホモ接合体マウスでは１５〜２１のフラクションに放射活性のピークがあった。これらのフラクションをプロテオグリカン画分としてプールした。ヘテロ接合体マウスについて、プールした画分の放射活性及び組織片１ｇあたりの放射活性はそれぞれ１．４×１０６及び１．８×１０７ＣＰＭであった。一方で、ホモ接合体マウスについて、プールした画分の放射活性及び組織片１ｇあたりの放射活性はそれぞれ２．７×１０５及び５．６×１０６ＣＰＭであった。凡そ１００００ＣＰＭに相当するアリコートを以下の解析に用いた。プールした画分の放射活性及び組織片重量当たりの放射活性について、ホモ接合体マウスはヘテロ接合体マウスに比べてそれぞれ１／５及び１／３と減少していた。続いて、ホモ接合体マウス並びにヘテロ接合体マウスの組織片由来のプロテオグリカンに分子量の違いがあるかゲルろ過クロマトグラフィーを用いて調べた。先に得られたサンプルを直接セファクリルＳ−５００ＨＲゲル濾過クロマトグラフィーで分離した。ホモ接合体マウス及びヘテロ接合体マウスについてのピーク位置（矢印によって示される）は、ホモ接合体マウスのピーク位置がヘテロ接合体マウスに比べて５フラクション移動していた。各ピーク位置は、それぞれデキストランの３．１×１０５ｋＤ又は１．２×１０６ｋＤに対応している。（図３ｂ）。
これはホモ接合体マウスのプロテオグリカンの平均分子量が野生型と同じ表現型を有するヘテロ接合体マウスに比べて１／４に減少していることを意味している。
プロテオグリカン画分をコンドロイチナーゼＡＢＣによって消化すると、殆ど全ての放射活性がＶＴへとシフトしていた（図３ｃ）。これはプロテオグリカン上のグリコサミノグリカンが主としてコンドロイチン硫酸であることを示している。さらに、プロテオグリカンをコアとするタンパク質からβ脱離によってグリコサミノグリカンを遊離しその長さを測定した。β遊離は０．５ＮのＮａＯＨ条件下で行った。ホモ接合体マウスのクロマトグラム上のシグナルの挙動はヘテロ接合体マウスのそれとは明らかに異なっており、主要な放射活性ピークはブロードで、低分子量側にシフトしていた（図３ｄ）。ホモ接合体マウス及びヘテロ接合体マウスについてのピーク位置（矢印によって示される）は、それぞれオリゴ多糖の１．３×１０４ｋＤ又は２．７×１０４ｋＤに対応していた。このピーク位置のシフトはグリコサミノグリカンの長さが１／２に短くなったことを示している。
以上の観察により、ＵＧＴｒｅｌ７変異体マウスの骨並びに軟骨のコンドロイチン硫酸の減少は、軟骨細胞でのプロテオグリカン合成におけるコンドロイチン硫酸合成の欠陥により引き起こされるものであると考えられた。
【００３９】
実施例４：軟骨細胞の分化に及ぼすＵＧＴｒｅｌ７分子の影響
軟骨細胞の分化に対してＵＧＴｒｅｌ７分子が影響を及ぼすのか調べることによってＵＧＴｒｅｌ７（−／−）マウス（変異体マウス）における骨成長の抑制の細胞基準を定義づけるために骨端成長板の構造と機能を調べた。成長板は、様々な分化段階（即ち、休止期領域、増殖期領域、前肥大領域及び肥大領域）を示す軟骨細胞の層領域を形成する（Kronenberg HM. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 2003 May 15;423(6937):332-6.）。野生型マウスにおいてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより成長板の増殖期領域におけるＵＧＴｒｅｌ７ｍＲＮＡの選択的な発現が認められた（図４ｊ）。一方、変異体マウスではＵＧＴｒｅｌ７ｍＲＮＡの発現が認められなかった（図４ｉ）。ヘマトキシリンエオシン及びトルイジンブルーを用いて交配後１８．５日目の胎仔の骨と軟骨を公知手法（Kessel M, Gruss P. Murine developmental control genes. Science. 1990 Jul 27;249(4967):374-9.）により染色した。変異体マウスにおいて顕著なＥＣＭ空間の減少及び典型的な軟骨細胞の円柱状の並びの消失を伴う成長板のサイズの減少が確認された（図４ａ，ｂ，ｅ〜ｈ）。増殖期領域に相当する部分にある変異体マウスの細胞は野性型マウスの細胞に比べてより大きく球形であった（図４ｅ〜ｈ）。変異体マウスの成長板の構造がまだ軟骨細胞を分化させるだけの能力を有しているのかどうかを調べた。ＢｒｄＵを取り込んだ細胞を染色することによって増殖期領域を染色したところ、変異体マウスではその領域が極めて限定されていた（図４ｃ，ｄ）。さらに成長板における層構造を識別可能にする遺伝子発現を確認する為、骨・軟骨の形成や分化に関与していることが報告されている、Ｒｕｎｘ２、Ｉｈｈ、コラーゲン１０、コラーゲン２遺伝子に対するプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
野生型マウスの軟骨では、Ｒｕｎｘ２、Ｉｈｈ及びコラーゲン１０が前肥大領域及び肥大領域でそれぞれ発現していた（図４ｌ，ｎ，ｐ）。一方、コラーゲン２は休止期領域及び増殖期領域に優先的に発現していた（図４ｒ）。各遺伝子の発現ドメインは変異体マウスの成長板で変化はなかった（図４ｋ，ｍ，ｏ，ｑ）。これらの知見は、連続した軟骨の分化が変異マウスの成長板においてもいくらかは保存されていることを示唆していた。さらにＦＧＦＲ１（図６ｃ，ｄ）、ＦＧＦＲ２（図６ｅ，ｆ）及びＦＧＦＲ３（図６ｉ，ｊ）等のＦＧＦＲ受容体遺伝子の発現が変異体マウスの骨形成に影響を与えるのか、同様に各遺伝子のプローブを用いて調べた（図６）。結果、変異体マウスの軟骨におけるＦＧＦＲ３発現は、著しく上昇し休止期領域に広がっていることが確認された（野生型マウスでは発現していなかった）（図６ｉ，ｊ）。この現象は、変異体マウス胎仔で観察された軟骨形成不全症がこのＦＧＦＲ３遺伝子の過剰発現によって引き起こされている可能性を示唆している。
続いてホモ接合体マウス（変異体マウス）の成長板におけるＥＣＭ成分について調べた。まず、交配後１７．５日目の胎仔の長骨のパラフィン包埋切片（厚さ５μｍ）標本を作製し、組織学的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び免疫組織化学を用いて解析を行った。典型的な軟骨性ＥＣＭは、主として、アグリカン、ヒアルロン酸、それらを繋ぐリンクプロテインの凝集物から構成されている。１つのアグリカン分子が１００以上のコンドロイチン硫酸鎖をそのコアタンパク質上に保有していることが知られている。解析した各分化段階の骨端におけるコンドロイチン硫酸は殆どがアグリカンのコアタンパク質上で合成されていて、バーシカンやパールカン等の他のコアタンパク質上では僅かである（Shibata S, Fukada K, Imai H, Abe T, Yamashita Y. In situ hybridization and immunohistochemistry of versican, aggrecan and link protein, and histochemistry of hyaluronan in the developing mouse limb bud cartilage. J Anat. 2003 Oct;203(4):425-32.）。成長板中のグリコサミノグリカンの分布を解析した。変異体マウスの骨端において、コンドロイチン硫酸の含量が顕著に減少していた（図５ａ，ｂ）が、抗グリコサミノグリカン抗体を用いた免疫染色によって観察したところ、ヘパラン硫酸含量には変化がなかった。表１に長骨の二糖組成分析の結果を示す。
さらに、ホモ接合体マウスの骨におけるコンドロイチン硫酸含量の減少がこれらのプロテオグリカンのコアタンパク質合成の減少によって引き起こされているのか否か検討した。抗コアタンパク質抗体を用いた免疫染色により、変異体マウスの成長板におけるアグリカンのコアタンパク質量がいくらか減少していることが示された（図５ｃ，ｄ）。パールカンについては変異体マウスに顕著な減少が認められた（図５ｅ，ｆ）。コアタンパク質のｍＲＮＡ合成を検出する為にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。野生型マウス標本及び変異体マウス標本の間でアグリカンｍＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルに顕著な差は認められなかった（図５ｉ，ｊ）。しかしながらパールカンｍＲＮＡについては、変異体マウスの方がややシグナルが増加しており、陽性領域が骨端の端の部分に迄広がっていた（図５ｋ，ｌ）。これらの現象は、そのグリコサミノグリカンの成熟が損なわれることによって引き起こされるパールカン分泌の欠陥が変異マウスのＥＣＭにおけるパールカン量の減少を招いているに違いないということを示唆している。超微形態的な解析を行うために交配後１８．５日目胎仔の上腕骨成長板から得た標本を、５％グルタルアルデヒド−４％パラホルムアルデヒド溶液に１日間浸し、ついで１％の四酸化オスミウムに３時間浸して固定した。さらにこの標本をＥｐｏｎ８１２（ＴＡＡＢ，Ｂｅｒｋｓ，ＵＫ）に包埋しそれらの超薄切片をＨＩＴＡＣＨＩ  Ｈ−８００透過型電子顕微鏡で観察した。変異体マウスにおいて繊維状コラーゲンの蓄積が増殖期領域で観察された（図５ｏ，ｐ）。
尚、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは以前に報告されたように、放射標識されたアンチｍＲＮＡを用いて行った（Kessel M, Gruss P. Homeotic transformations of murine vertebrae and concomitant alteration of Hox codes induced by retinoic acid. Cell. 1991 Oct 4;67(1):89-104.）。
ＵＧＴｒｅｌ７、アグリカン、パールカン、コラーゲン２、コラーゲン１０のアンチｍＲＮＡプローブはそれぞれ鋳型から合成した。鋳型としたプラスミドは以下の通り。
ＵＧＴｒｅｌ７及びパールカン；文献（Ohara O, Nagase T, Mitsui G, Kohga H, Kikuno R, Hiraoka S, Takahashi Y, Kitajima S, Saga Y, Koseki H. Characterization of size-fractionated cDNA libraries generated by the in vitro recombination-assisted method. DNA Res. 2002 Apr 30;9(2):47-57.）で構築されたライブラリーから得た鋳型プラスミド。
コラーゲン２；文献（Metsaranta M, Toman D, De Crombrugghe B, Vuorio E. Specific hybridization probes for mouse type I, II, III and IX collagen mRNAs.
Biochim Biophys Acta. 1991 Jun 13;1089(2):241-3.）に記載の鋳型プラスミド。
アグリカン；文献（Shibata S, Fukada K, Suzuki S, Ogawa T, Yamashita Y. Histochemical localisation of versican, aggrecan and hyaluronan in the developing condylar cartilage of the fetal rat mandible. J Anat. 2001 Feb;198(Pt 2):129-35.）に記載の鋳型プラスミド。
コラーゲン１０；文献（Apte SS, Seldin MF, Hayashi M, Olsen BR. Cloning of the human and mouse type X collagen genes and mapping of the mouse type X collagen gene to chromosome 10. Eur J Biochem. 1992 May 15;206(1):217-24.）に記載の鋳型プラスミド。
アグリカン、パールカン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸の免疫組織化学は以前に報告されたようにして行った（Shibata S, Fukada K, Imai H, Abe T, Yamashita Y. In situ hybridization and immunohistochemistry of versican, aggrecan and link protein, and histochemistry of hyaluronan in the developing mouse limb bud cartilage. J Anat. 2003 Oct;203(4):425-32.）。
アグリカン抗体はDevelopmental Studies Hybridoma Bank (Iowa City, IA, USA)より入手し、パールカン抗体、コンドロイチン硫酸抗体、ヘパラン硫酸抗体及びヒアルロン酸結合タンパクはそれぞれ生化学工業株式会社から入手した。
【００４０】
考察：本発明の変異体非ヒト哺乳動物（特にホモ接合体マウス）に特徴的な形態学的及び骨格的性質は、軟骨基質欠損症（ＣＭＤ）マウス（Watanabe H, Yamada Y. Chondrodysplasia of gene knockout mice for aggrecan and link protein. Glycoconj J. 2002 May-Jun;19(4-5):269-73.）の性質と非常によく似ている。軟骨細胞の典型的な円柱状の構造の消失、軟骨細胞の大きく球状の形態、きわめて狭いＥＣＭ空間、コラーゲン遺伝子のアップレギュレーション及び繊維状分子のＥＣＭへの侵入といった成長板の異常は両方の変異体マウスに通常に認められた。ＣＭＤ変異体マウスは、エクソン５にある７ｂｐの欠失がフレームシフトを引き起こすため正常なアグリカンコアタンパク質を合成することができない。アグリカンは軟骨で最も主要なプロテオグリカンであり、多量のコンドロイチン硫酸を保有している（Arikawa-Hirasawa E, Watanabe H, Takami H, Hassell JR, Yamada Y. Perlecan is essential for cartilage and cephalic development. Nat Genet. 1999 Nov;23(3):354-8.）。従って、両変異体マウスにおけるコンドロイチン硫酸の減少がこれらの異常を引き起こしていることが示唆された。パールカンの量は、ＵＧＴｒｅｌ７変異マウスの成長板においてかなり減少するがパールカン欠損マウス（Ｈｓｐｇ２−／−）において観察される表現型は、周産期死亡や短い四肢といった一般的な特徴を除いてはＵＧＴｒｅｌ７変異マウスのそれとは大きく異なっている（Nat Genet. 1999 Nov;23(3):354-8、上述）。Ｈｓｐｇ２−／−マウスの成長板におけるグリコサミノグリカンの沈着とアグリカンの減少は、ＵＧＴｒｅｌ７−／−マウスでも観察された。しかしながらＨｓｐｇ２−／−変異マウスの成長板は、Ｉｈｈ発現の消失及び異所性化骨を伴う層領域構造の変化といったＵＧＴｒｅｌ７−／−マウスとは異なる異常を示した。プロテオグリカンコアタンパク質欠損マウスの表現型は、コアタンパク質自身とそれに結合しているグリコサミノグリカン鎖の合わさった機能を反映するはずであり、グリコサミノグリカンｄｅ  ｎｏｖｏ合成を欠損する変異体の研究はグリコサミノグリカンに依存する正確な機能を知るのに必須である。本発明のＵＧＴｒｅｌ７ノックアウトマウスは、コンドロイチン硫酸ｄｅ  ｎｏｖｏ合成を欠損する最初の哺乳動物モデルである。
ヒトの骨の身長は骨端にある成長板での軟骨の分化によって形成される。思春期にはいると成長板が消失し骨の成長がとまる。これに伴い、軟骨プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸鎖の鎖長が短くなるので、成長板の活性維持にコンドロイチン硫酸鎖の鎖長を制御することが必要であろうと考えられてきたが、本発明のノックアウトマウス由来の軟骨細胞を用いて、成長板の活性を調節し得る物質のスクリーニング法の確立が期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
配列番号１：プライマーｃ
配列番号２：プライマーｄ
配列番号３：プライマーｅ
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Ａ：ターゲティング手法を示す模式図である。ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子のゲノム構成（野生型アレル）（上段）、ターゲティングベクター（中段）、ターゲティングされたアレル（下段）。各エクソンを矩形で示している。各エクソンの順序は個々の矩形の下に数字で示してある。ターゲティングベクターは、ＰＧＫ−ｎｅｏカセット（ＮＥＯ）で置換し、ネガティブセレクションマーカーとしてその隣にＨＳＶ−ｔｋを付加することによって、ＵＧＴｒｅｌ７遺伝子のエクソン１〜３迄を欠失したゲノム断片によって構築されている。ＮＥＯとＴＫの付近の矢印は、それらの転写方向を示している。制限酵素部位をそれぞれＡｐ（Ａｐａ１）、Ｂｇ（ＢｇｌＩＩ）で示した。Ｂ：リコンビナントＥＳクローンのゲノムサザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。ＥＳクローンのゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩ及びＡｐａ１で消化し、図１Ａに示すゲノム断片ａ又はｂをそれぞれ用いてサザンハイブリダイゼーションによって解析した。右のパネルはＢｇｌＩＩで消化しプローブａでハイブリダイゼーションを行った結果のイメージを示す。左のパネルはＡｐａ１で消化しプローブｂでハイブリダイゼーションを行った結果のイメージを示す。右パネルの４．１ｋｂと８．２ｋｂのバンドはそれぞれ野生型、あるいはターゲティングされたゲノムを示している。左パネルの７．６ｋｂ及び１０．８ｋｂのバンドも同様にそれぞれ野生型、あるいはターゲティングされたゲノムを意味している。Ｃ：ＵＧＴｒｅｌ７変異マウスのＰＣＲ解析の結果を示す図である。図１Ａに示す特定のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行って遺伝子型を決定した。野生型を検出するためにはプライマーｃとｄを、ターゲティングされたアレルを検出するためにはプライマーｃとｅをそれぞれ用いた。１．２ｋｂ及び１．５ｋｂのバンドはそれぞれ野生型及びターゲティングされたアレルを示す。図はそれぞれホモ接合体（−／−）、ヘテロ接合体（＋／＋）を示す。Ｄ：ＵＧＴｒｅｌ７の発現を検出するため行ったＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。ｃＤＮＡは、交配後１８日目の胎仔の肺ＲＮＡから逆転写によって合成した。このｃＤＮＡを鋳型として用いＰＣＲによってＵＧＴｒｅｌ７の発現を調べた。ホモ接合体マウスはＵＧＴｒｅｌ７ｍＲＮＡ由来の５４１ｂｐバンドを発現しなかった。
【図２】ホモ接合体の表現型を示す図である。各パネルの右及び左のイメージがそれぞれＵＧＴｒｅｌ７＋／＋（野生型）あるいは−／−（ホモ接合体）の遺伝子型の個体を示す。種々の発生段階での肉眼での形態学的観察を各パネルに示した。ａ−新生児；ｂ−交配後１７．５日目の胎仔；ｃ−交配後１５．５日目の胚；ｄ−交配後１２．５日目の胚。交配後１８．５日目の胚をアルシアン青及びアリザリン赤で染色した骨格標本を各パネルに示す（ｅ〜ｍ）。（ｅ）全骨格。ホモ接合体はほとんど全ての骨で深刻な形成不全が観察された。（ｆ）前肢、及び（ｇ）後肢。（ｈ）頭蓋底の下方図。（ｉ）頭骨の側方図。変異マウスは短い下顎とドーム型の頭骨を示した。（ｊ）胸郭。（ｋ）第３肋骨での胸郭の横断面。（ｌ）腰椎。（ｍ）恥骨。恥骨結合はホモ接合体にはなかった。
【図３】軟骨組織片でのグリコサミノグリカン合成を調べた結果を示す図である。縦軸及び水平軸はそれぞれ、各軟骨組織から抽出したフラクションの放射活性の平均、及びフラクションＮｏ．を示している。放射活性は、図３ａでは絶対値で示してあるが図３ｂ〜ｄでは総解析値に対する相対値（％）で示している。白丸及び黒丸はそれぞれＵＧＴｒｅｌ７＋／−マウス（ヘテロ接合体マウス）あるいはＵＧＴｒｅｌ７−／−マウス（ホモ接合体マウス）からのサンプルの平均値を示している。図３ａは、溶出プロファイルの結果を示している。図３ｂは、セファクリルＳ−５００ＨＲゲル濾過クロマトグラフィー上のグリコサミノグリカンの溶出プロファイルを示している。図３ｃは、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理後のＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲル濾過クロマトグラフィー上のクロマトグラムを示している。図３ｄは、グリコサミノグリカンのＳｕｐｅｒｏｓｅ６クロマトグラフィー解析の結果を示している。
【図４】ホモ接合体マウスの骨端軟骨における異常な細胞外マトリックス形成を示す図である。交配後１７．５日目での近位頸骨における成長端軟骨由来の（ａ〜ｈ）、あるいは上腕骨肘関節の軟骨由来の（ｉ〜ｒ）パラフィン切片を種々の処置により染色した。図ａ〜ｈは光学顕微鏡を用いて観察した図を示す。成長板における休止期領域、増殖期領域、及び肥大領域をそれぞれＲ、Ｐ及びＨで示した（矢印内の部分）。ホモ接合体の結果（ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉ，ｋ，ｍ，ｏ，ｑ）及び野生型の結果（ｂ，ｄ，ｆ，ｈ，ｊ，ｌ，ｎ，ｐ，ｒ）。図ａ及びｂはヘマトキシリンエオシンで染めた標本である。図ｃ及びｄはＢｒｄＵを取り込み抗ＢｒｄＵ抗体で可視化したものである。図ｅ及びｆはトルイジンで染めた標本である。図ｅ及びｆ中の囲った部分を拡大したものがそれぞれ図ｇ及びｈである。ホモ接合体マウスでは軟骨細胞の円柱状の列（ｈ）が球形への形状変化を伴って消失していた（ｇ）。図ｉ〜ｒは、ＵＧＴｒｅｌ７（ｉ，ｊ）、Ｒｕｎｘ２（ｋ，ｌ）、Ｉｈｈ（ｍ，ｎ）、コラーゲン１０（ｏ，ｐ）、コラーゲン２（ｑ，ｒ）それぞれのｍＲＮＡに対するプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果を示した図である。
【図５】ホモ接合体マウスの骨端軟骨における異常な細胞外マトリックス形成を示す図である。交配後１７．５日目での近位頸骨における成長端軟骨由来の（ａ〜ｈ，ｍ〜ｐ）、あるいは上腕骨肘関節の軟骨由来の（ｉ〜ｌ）パラフィン切片を種々の処置により染色した。成長板における休止期領域、増殖期領域、及び肥大領域をそれぞれＲ、Ｐ及びＨで示した（矢印内の部分）。ホモ接合体の結果（ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉ，ｋ，ｏ，ｐ）及び野生型の結果（ｂ，ｄ，ｆ，ｈ，ｊ，ｌ，ｍ，ｎ）。図ａ〜ｈは光学顕微鏡を用いて観察した図を示す。各標本を、コンドロイチナーゼ消化後コンドロイチン硫酸残基を残し、抗グリコサミノグリカン抗体を用いてコンドロイチン硫酸（ａ，ｂ）を、アグリカンコアタンパク質（ｃ，ｄ）、パールカンコアタンパク質（ｅ，ｆ）に対する特異抗体を用いてそれぞれを免疫染色した。図ｇ，ｈはヘマトキシリンエオシンで染色した像を示している。図ｉ〜ｌはアグリカン（ｉ，ｊ）又はパールカン（ｋ，ｌ）ｍＲＮＡに対する放射標識したプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果を示した図である。図ｍ〜ｐは成長板の電子顕微鏡写真である。倍率１万倍（ｍ，ｏ）、倍率３０万倍（ｎ，ｐ）。ホモ接合体マウスの軟骨（ｏ，ｐ）では、野生型軟骨（ｍ，ｎ）に比べて、プロテオグリカン凝集物の減少及び繊維状分子の顕著な侵入が認められた。
【図６】成長板活性の解析結果を示す図である。交配後１７．５日目の胎仔から得た上腕骨肘関節の軟骨由来のパラフィン切片を用いて種々の処置により染色した。図ａ，ｂ，ｇ，ｈはギムザで染色した像を示す。図ｃ〜ｆ，ｉ，ｊはそれぞれ、ＦＧＦＲ１（ｃ，ｄ）、ＦＧＦＲ２（ｅ，ｆ）、ＦＧＦＲ３（ｉ，ｊ）ｍＲＮＡに対する放射標識したプローブを用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果を示した図である。成長板における休止期領域、増殖期領域、及び肥大領域をそれぞれＲ、Ｐ及びＨで示した（矢印内の部分）。ホモ接合体の結果（ａ，ｃ，ｅ，ｇ，ｉ）及び野生型の結果（ｂ，ｄ，ｆ，ｈ，ｊ）。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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