(57)【要約】【課題】簡易な操作でα-アミラーゼの酵素活性を顕著に高める活性化方法を提供する。【解決手段】α-アミラーゼ又はこれを含む粒子と酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させる。接触後は、α-アミラーゼと酸化剤とを分離することにより、酵素活性が向上したαアミラーゼを容易に入手できる。また、接触後、α-アミラーゼと酸化剤を混合物の形態で洗剤ベースに配合することにより、酵素効果が向上した洗浄剤組成物を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子と、B)酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させる工程を含む、α-アミラーゼの活性化方法。
【請求項２】
A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子と、B)酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させる工程と、接触後のA）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子を回収する工程を有するα-アミラーゼの活性化方法。
【請求項３】
A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子と、B)酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させる工程と、接触後のA）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子を回収する工程を有する、活性化されたα-アミラーゼの製造方法。
【請求項４】
成分A)と成分B)とを30秒以上接触させる請求項１〜３の何れか１項記載の方法。
【請求項５】
酸化剤が、過炭酸塩、過ホウ酸塩、過硫酸塩、過塩素酸塩、及び過マンガン酸塩からなる群から選ばれる請求項１〜４の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
有効酸素１ｇに相当する酸化剤に対して、１〜５億IU（国際単位）のα-アミラーゼを接触させる請求項１〜５の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項記載の方法に従って得られるα-アミラーゼ。
【請求項８】
請求項７記載のα-アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。
【請求項９】
A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子とB)酸化剤又はこれを含む粒子とを混合させた混合処理物と、洗剤ベースとを混合させる、α-アミラーゼを含有する洗浄剤組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α-アミラーゼの活性化方法及び該方法により活性化されたα-アミラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
α-アミラーゼ（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase[EC3.2.1.1]）はデンプン、グリコーゲンなどのα-1,4グルコシド結合をランダムに切断するエンド型の酵素である。工業的には、デンプン加工、食品加工、繊維加工、醸造、医薬、臨床検査、洗剤などに広く利用されており、その起源も微生物、植物、動物と多岐にわたる。
【０００３】
この工業的に極めて重要な酵素に関しては、従来からその活性や価格において必ずしも、満足できるものではなく、これを解決するための手段として、遺伝子組換えや蛋白工学技術による酵素の高生産化や酵素触媒能の強化、また酵素反応系において酵素の反応速度を向上させる方法、すなわち酵素反応の活性化方法について検討されてきた。
【０００４】
酵素の活性化方法としては、酵素反応系に特定のポリマーを添加することによって得られるもの（特許文献１）、特定のアミラーゼに対して塩素イオンを加えることで得られるもの（非特許文献１）、ｎ-ヘキサンにTween20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を添加して得られる逆相ミセル系を利用して酵素活性を高めるもの（非特許文献２）、酵素反応系に特定のアルキル鎖長を有するアルキル硫酸塩及び／又はアルキルスルホン酸塩を添加して酵素活性を高めること（特許文献２）などが報告されている。また、予め酵素を電解生成水に溶解させることにより、酵素反応の前段階で酵素を活性化させる方法（特許文献３）、酵素を発熱性無機塩に溶解することにより酵素を活性化する方法（特許文献４）が報告されている。
【０００５】
また、酵素を含有する洗浄剤組成物の製造方法としては、各種造粒操作により得られた洗剤ベースに対して、酵素や漂白剤などを別個にアフターブレンドすることが多数の文献に報告されている。
【特許文献１】特表平5-507615号
【特許文献２】特開平8-256768号
【特許文献３】特開2000-245453号
【特許文献４】特開2000-37186号
【非特許文献１】Clin. Biochem., 16, 224-228 (1983)
【非特許文献２】Biotechnol. Bioeng., 29, 901-902 (1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これらの活性化方法は酵素の反応速度をある程度高めることはできるものの、未だその活性化力が十分とは言えなかった。また、これらの方法は溶液状態で酵素の活性化処理を行うために大掛かりな設備が必要になること、さらに酵素反応活性化剤を分離することが困難であるために、これが最終製品に混入してその製品価値を下げるなどの問題があり、汎用技術として広く使用する上で問題があった。
【０００７】
本発明の課題は、簡易な操作でα-アミラーゼの酵素活性を顕著に高める活性化方法を提供することである。又は、該活性化方法に従って得られるα-アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者らは、α-アミラーゼの活性化方法について鋭意検討を続けてきた結果、酵素反応の前処理方法としてα-アミラーゼと酸化剤をそれぞれ固体状態で接触させることによって酵素活性が著しく活性化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は、A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子と、B)酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させる工程を含む、α-アミラーゼの活性化方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子と、B)酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させる工程と、接触後のA）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子を回収する工程を有するα-アミラーゼの活性化方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子と、B)酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させる工程と、接触後のA）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子を回収する工程を有する、活性化されたα-アミラーゼの製造方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、上記本発明の方法に従って得られるα-アミラーゼ、該α-アミラーゼを含有する洗浄剤組成物に関する。
【００１３】
更に、本発明は、A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子とB)酸化剤又はこれを含む粒子とを混合させた混合処理物と、洗剤ベースとを混合させる、α-アミラーゼを含有する洗浄剤組成物の製造方法に関する。
【００１４】
以下において、α-アミラーゼという場合には、α-アミラーゼを含む粒子を包含する場合もあり、また酸化剤という場合には、酸化剤を含む粒子を包含する場合もある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、活性化されたα-アミラーゼを簡便な方法で取得できる。接触に用いた酸化剤は容易にα-アミラーゼと分離することができ、不純物の少ない活性化されたα-アミラーゼを各種産業プロセスや洗剤等の成分として広く使用することができる。本発明により活性化されたα-アミラーゼは、酵素使用量の低減、あるいは反応時間の短縮に功を奏する。また、本発明において活性化に用いた酸化剤は繰り返して使用できる。従って、本発明は、α-アミラーゼを用いた酵素反応やその応用技術において、経済的な面でも有利な効果をもたらす。
【００１６】
更に本発明によれば、α-アミラーゼは酸化剤と分離することなく、混合状態で洗剤等の組成物に配合することができる。この操作は組成物が酸化剤を有効成分として含有する場合に特に有効である。すなわち、通常行なわれるα-アミラーゼと酸化剤をそれぞれ個別に添加する方法に比べ、より高い酵素効果を組成物に付与することができるとともに、α-アミラーゼと酸化剤の投入が一度で完結するという製法上のメリットももたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の対象とするα-アミラーゼとしては、バチルス  ズブチリス  マーバーグ（Bacillus subtilis Marburg）、バチルス  ズブチリス  ナットウ（Bacillus subtilis natto）、バチルス  アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス  リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス  セレウス（Bacillus cereus）、バチルス  マセランス（Bacillus macerans）、シュードモナス  シュツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、クレブシェラ  アエリゲネス(Klebusiella aerogenes)などの細菌、ストレプトマイセス  グリセウス（Streptomyces griseus）等の放線菌、アスペルギウス  オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）などのカビ類、イネ科及びマメ科植物の種子、ヒト及びブタなどの動物の消化腺など多くの生物から得られているものを使用することができる。
【００１８】
本発明に用いるα-アミラーゼは、前記微生物又は、それらの変異株、あるいはこれらの酵素若しくはその変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換えベクターで形質転換された宿主細胞等を、同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養し、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて得ることができる。このようにして得られる酵素液はそのまま用いることもできるが、さらに公知の方法により精製、結晶化、粉末化又は造粒化（例えば特公昭58-26315号、特表平7-500013号、特開昭62-255990号、特開平9-48996号）したものを用いることができる。
【００１９】
本発明に用いるα-アミラーゼの形態としては、(1)酵素蛋白質の乾燥物、(2)酵素蛋白質を含む固体、及び(3)酵素蛋白質を含む液体が挙げられるが、α-アミラーゼと、酸化剤又はこれを含む粒子とを接触させ、その後に各々を簡便に分離するという理由により、(1)及び(2)を用いることが好ましい。これらを用いる場合、その平均粒子径は20〜4000μm、更に250〜1000μｍが好ましい。なお、平均粒子径は、ＪＩＳ  Ｋ  ８８０１の標準篩（目開き２０００〜３７μｍ）と受け皿を用い、ロータップマシーン（ＨＥＩＫＯ  ＳＥＩＳＡＫＵＳＨＯ製、タッピング：１５６回／分、ローリング：２９０回／分）に取り付け、１００ｇの試料を１０分間振動して篩い分けを行った後、篩目のサイズによる重量分率からメディアン径を算出する。また、ＪＩＳ  Ｋ  ８８０１の標準篩を用いて算出したメディアン径が５０μｍ以下になった場合は、走査型電子顕微鏡による定方向接線径（Ｆｅｒｅｌ径）の平均値による算出方法を使用することができる。またこれらのα-アミラーゼ濃度は酵素蛋白重量％で0.1〜20％が好ましい。なお、酵素蛋白の定量はLowryらによる方法（Lowry, O.H.et.al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)）に準じ、牛血清アルブミン（Bovine Serum Albumin、SIGMA社製、製品番号A-7030）に換算して表わした。
【００２０】
本発明に用いる酸化剤は固体であれば特に限定されず、粉体、顆粒、及び造粒物の粒子のどの形態でも用いることができる。酸化剤は、過炭酸塩、過ホウ酸塩、過硫酸塩、過マンガン酸塩、及び過塩素酸塩からなる群から選ばれる1種以上が挙げられる。
【００２１】
具体的には、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム過酸化水素付加物、尿素過酸化水素付加物、トリポリリン酸ナトリウム過酸化水素付加物、ピロリン酸ナトリウム過酸化水素付加物、4Na2SO4・2H2O2・NaCl複塩、過酸化ナトリウム、過酸化カルシウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、及びこれらの混合物など硫酸イオンラジカルを生成するもの、過マンガン酸カリウム、過塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００２２】
これらの中でも特に使用する際の安全性や取り扱い易さを考慮すると、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウムが好ましい。これらは１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。過炭酸塩は、和光純薬（株）、三菱ガス化学（株）、日本パーオキサイド（株）、旭電化工業（株）から、また過ホウ酸塩は和光純薬（株）、三菱ガス化学（株）、Degussa-Huels Co.、Shaoxing Sino-USA(Meihua) Home Solution Co., Ltd.から、過塩素酸塩は和光純薬（株）、三菱ガス化学（株）等から市販されているものを使用することができる。酸化剤は、平均粒子径40〜4000μm、更に100〜1500μｍの粒子であることが好ましい。
【００２３】
特に、酸化剤は、有効酸素１ｇに相当する酸化剤に対して、１IU〜５億IU（国際単位）、さらに100IU〜5000万IUのα-アミラーゼと接触させることが好ましい。
【００２４】
ここで、α-アミラーゼの活性は、後述の実施例で示したファデバス（phadebas）法により測定される。
【００２５】
また、酸化剤の有効酸素量は下記のヨードメトリー法で測定を行うことにより求められる。
（有効酸素量の測定方法）
酸化剤を０．５重量％硫酸水溶液に溶解し、この１０ｍｌをスクリュー管（マルエム（株）製、No.8）にサンプリングし、２０重量％硫酸水溶液１０ｍｌを添加した後、１０重量％ヨウ化カリウム１０ｍｌを加え、密閉した後に、遮光状態で４０℃に一定時間静置した。これを室温まで放冷した後、チオ硫酸ナトリウム標準液を用いて滴定する。次式により定義されるサンプル１ｇ当たりの有効酸素量を測定する。なお、チオ硫酸ナトリウム標準液で滴定するまでの４０℃下での静置時間は、有効酸素量の変動が±１０％以内の範囲内に収まるまでの時間とする。
【００２６】
【数１】
2006187276.tif 000002
【００２７】
また、α-アミラーゼと酸化剤の接触時間は、10秒以上、更に5分〜２カ月が好ましい。
【００２８】
また、α-アミラーゼと酸化剤を接触させる際の温度は、５℃〜8０℃、更に２０℃〜５０℃が好ましい。この温度は、両成分の周囲温度である。
【００２９】
また、α-アミラーゼと酸化剤の接触絶対湿度は、0.5g/m3〜1000g/m3、更に1.5g/m3〜200g/m3が好ましい。この湿度は、両成分の周囲湿度である。
【００３０】
本発明では、α-アミラーゼ又はこれを含有する粒子と、酸化剤又はこれを含有する粒子とを接触させた後、それぞれを分離するために公知の方法を用いる事ができる。例えば外観の違いにより分離する拾い分けや、粒子径や真比重の違いにより分離する方法等が挙げられる。後者の場合は、篩分けや風力分級があり、篩分けには振動篩が挙げられ、また風力分級としては動式、慣性式、遠心式などが挙げられる。操作上の簡便性からは、振動篩による分離法が好適である。具体的には、ダルトン（株）の振動ふるい（型式５０２）や、徳寿工作所（株）製のジャイロシフター（型式ＧＳ−１３２−２５・ＡＭ型）などの装置が挙げられる。特に、α-アミラーゼ又はこれを含有する粒子と酸化剤又はこれを含有する粒子の粒子径分布は、篩い分け等によりα-アミラーゼを十分に分離、回収できる程度に異なっていることが好ましく、通常は双方の平均粒子径が十分に異なればこれを達成できる。一方の粒子（粒子群）の最小粒子径と他方の粒子（粒子群）の最大粒子径が異なること、例えば１μｍ以上異なることが好ましい。
【００３１】
なお、α-アミラーゼ又はこれを含有する粒子と、酸化剤又はこれを含有する粒子とを混合することで接触は達成されるが、造粒物等、粒子を用いる場合、前記した粒子径のものであれば、粒子中でのα-アミラーゼや酸化剤の分布状況（濃度分布）によらず、両者を直接接触させた場合と同等の効果が奏される。
【００３２】
上述の活性化方法に従って得られたα-アミラーゼを含有する洗浄剤組成物は未処理のα-アミラーゼを含むものと比べて高い洗浄性能を有するものである。
【００３３】
更に、本発明では、A）α-アミラーゼ又はこれを含む粒子とB)酸化剤又はこれを含む粒子とを混合して接触させた後に、それぞれを分離することなく混合状態のままで洗剤ベースに配合することにより洗浄剤組成物を製造することができる。ここで、成分A）分と成分B）を混合処理する方法としては、洗浄剤組成物を製造する際に用いる混合機、例えば、水平円筒型やＶブレンダーなどの容器回転型とリボンミキサーなどの容器固定型の混合機を用いる方法などを用いる方法が挙げられる。また、洗剤ベースとしては、代表的な洗浄剤組成物の製法である噴霧乾燥法、ドライ中和法、乾式造粒法、攪拌造粒法、破砕造粒法、湿式造粒法によって得られる公知の洗剤ベースを用いることができる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例で用いたα-アミラーゼ活性の測定法〔ファデバス（phadebas）法〕を示す。
＜α-アミラーゼ活性測定法＞
（１）サンプルの吸光度の測定
5ｍLの緩衝液（Britton-Robinson Buffer、pH 8.5、50ｍM（阿南功一ら著. 基礎生化学実験法６. P277. 丸善株式会社））にネオ．アミラーゼテスト「第一」〔第一化学薬品（株）より入手、製品番号701501-005〕を1錠添加し、約10秒間攪拌した後、2ｍM塩化カルシウム水溶液で希釈した1ｍLの酵素溶液を添加して、50℃にて15分間反応させた。1ｍL の0.5N水酸化ナトリウム水溶液を添加、攪拌することで反応を停止させた後、遠心分離（400×g、5分間）にて不溶成分を沈殿させ、得られた遠心上澄の620nmにおける吸光度を測定した。
【００３５】
（２）ブランクの吸光度の測定
5ｍLの緩衝液（Britton-Robinson Buffer、pH 8.5、50ｍM（阿南功一ら著. 基礎生化学実験法６. P277. 丸善株式会社））にネオ．アミラーゼテスト「第一」を1錠添加し、約10秒間攪拌した。これに1mlの0.5N水酸化ナトリウム水溶液を添加、攪拌した後、1ｍLの酵素溶液を添加し、50℃にて15分間インキュベートした後遠心分離（400×g、5分間）を行った。得られた遠心上澄みの620nmにおける吸光度を測定した。
【００３６】
（３）酵素活性の算出
ネオ．アミラーゼテスト「第一」同封の国際単位の検量線を基準とし、これに（１）と（２）の吸光度の差をあてはめることでアミラーゼの活性を算出した。
【００３７】
実施例１
（１）α-アミラーゼと酸化剤
ノボザイムズ社より市販されているデュラミル60T（α-アミラーゼ）を篩い分けし、JIS規格500μmの篩残留分から大粒径のデュラミル60T〔(a1)、平均粒子径（メディアン径）：709μｍ〕を得た。また、三菱ガス化学（株）から入手することができる過炭酸系の酸化剤 SPC-Dを乳鉢により粉砕し、JIS規格500μmの篩通過分から小粒径の酸化剤粉末〔(b1)、平均粒子径（メディアン径）：281μｍ〕を得た。なお、この酸化剤 SPC-D(b1)の1gを有効酸素量に換算すると0.12gであり、デュラミル60Tは、接触前の酵素活性が12000ＩＵ／gであった。なお、メディアン径とは、ふるい上分布曲線の50％に対する粒径のことである。
【００３８】
（２）混合比率
上記（１）で調製したデュラミル60T(a1) 3.0gと酸化剤粉末(b1)とを、重量比（酵素／酸化剤）100／1、10／1、1／10になるようにスクリュー管（マルエム（株）製、No.3）中で混合し、キャップを締めて25℃、8g/m3で30分間接触させた。これらの混合物をJIS規格500μmの篩により分離して、接触後のデュラミル60T(a1)を回収した。分離したデュラミル60Tの酵素活性を前述した方法により測定したところ、本発明品は、酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表１）。
【００３９】
【表１】
2006187276.tif 000003
【００４０】
（３）接触時間
上記（１）で調製したデュラミル60T(a1) 3.0gと酸化剤粉末(b1)0.3gを、重量比10／1（酵素／酸化剤）になるようにスクリュー管（マルエム（株）製、No.3）中で混合し、キャップを締めて25℃、8g/m3で、30秒、5分、30分、3日間、50日間接触させた（表２中、「口閉じ」と表記）。これらの混合物をJIS規格500μmの篩により分離した。分離したデュラミル60Tの酵素活性を前述した方法により測定したところ、本発明品は、酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表２）。
【００４１】
（４）温度
上記（１）で調製したデュラミル60 T(a1) 3.0gと酸化剤粉末(b1)0.3gを、重量比10／1（酵素／酸化剤）になるようにスクリュー管（マルエム（株）製、No.3）中で混合し、キャップを締めて50℃、8g/m3で30分接触させた（表２中、「口閉じ」と表記）。これらの混合物をJIS規格500μmの篩により分離した。分離したデュラミル60Tの酵素活性を前述した方法により測定したところ、本発明品は、酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表２）。
【００４２】
（５）湿度
上記（１）で調製したデュラミル60T(a1)3.0gと酸化剤粉末(b1)0.3gを、重量比10／1（酵素／酸化剤）になるようにスクリュー管（マルエム（株）製、No.3）中で混合し、キャップを閉めずに20℃、11.2g/m3で60分間接触させた。これらの混合物をJIS規格500μmの篩により分離した。分離したデュラミル60Tの酵素活性を前述した方法により測定したところ、本発明品は、酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表２）。
【００４３】
【表２】
2006187276.tif 000004
【００４４】
（６）酸化剤の種類
過ホウ酸ナトリウム四水和物（和工純薬製、製品番号28-3630-5）又は過塩素酸ナトリウム一水和物（和工純薬製、製品番号193-08065）のそれぞれについて、JIS規格500μmの篩の通過分から小粒径の酸化剤粉末(b2)を得た。それぞれの酸化剤の1gを有効酸素量に換算すると、過ホウ酸ナトリウム四水和物の場合は0.12gであり、また過塩素酸ナトリウム一水和物の場合は0.03gであった。上記（１）で調製したデュラミル60T(a1) 3.0gと酸化剤粉末(b2)0.3gを、重量比10／1（酵素／酸化剤）になるようにスクリュー管（マルエム（株）製、No.3）中で混合し、キャップを締めて25℃、8g/m3で30分間接触させた。これらの混合物をJIS規格500μmの篩により分離した。分離したデュラミル60Tの酵素活性を前述した方法により測定したところ、本発明品は、酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表３）。
【００４５】
【表３】
2006187276.tif 000005
【００４６】
（７）酸化剤の粒径
デュラミル60TのJIS規格500μmの篩通過分〔(a2)、平均粒子径（メディアン径）：380μｍ〕3.0gと、粉砕処理を施していない SPC-DのJIS規格500μmの篩残留分〔(b3)、平均粒子径（メディアン径）：879μｍ、表４中「未粉砕」と表記〕0.3ｇを、重量比10／1（酵素／酸化剤）になるようにスクリュー管（マルエム（株）製、No.3）中で混合し、キャップを締めて25℃、8g/m3で30分間接触させた。これらの混合物をJIS規格500μmの篩により分離した。なお、同様の処理を、デュラミル60T (a1)とJIS規格500μmの篩通過分から得た小粒径の酸化剤粉末（表中、「粉砕」と表記）にて行った。分離したデュラミル60Tの酵素活性を前述した方法により測定したところ、本発明品は、酸化剤の粒径に関わらず、酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表４）。
【００４７】
【表４】
2006187276.tif 000006
【００４８】
（８）回収した酸化剤を使用したα-アミラーゼの活性化
実施例１の（２）で使用した接触後の酸化剤を回収し、酸化剤との接触履歴のないデュラミル 60T(a1)〔上記（１）で調製したもの〕を、上記（２）に基づいた方法で接触させたところ、本発明品は酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた。
【００４９】
（９）分離後の酵素
実施例１の（３）で酸化剤粉末(b1)と分離した酵素をスクリュー管（マルエム（株）製No.3）中でキャップを締めて、25℃、8g/m3で30日間保存した。デュラミル60Tの酵素活性を前述した方法により測定したところ、保存後も高い活性を保持していた。
【００５０】
実施例２
ノボザイムズ社より市販されているターマミル60T又はステインザイム 12Tに実施例１の（１）、（３）、（５）と同様の処理を施し、α-アミラーゼ活性をそれぞれ測定したところ、本発明品は酸化剤と接触させていないそれぞれの酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表５）。なお、このターマミル60T〔(a3)、平均粒子径（メディアン径）：700μｍ〕とステインザイム 12T〔(a4)、平均粒子径（メディアン径）：652μｍ〕は、接触前の酵素活性がそれぞれ10000ＩＵ／gと180000ＩＵ／gであった。
【００５１】
【表５】
2006187276.tif 000007
【００５２】
実施例３
ジェネンコア社より市販されているプラスターOxAm（Purastar OxAm）に実施例１の（１）、（３）、（４）、（５）と同様の処理を施し、α-アミラーゼ活性を測定したところ、本発明品は酸化剤と接触させていない酵素（対照品）に対して高い酵素活性を有していた（表５）。なお、このプラスターOxAm（Purastar OxAm）〔(a5)、平均粒子径（メディアン径）：679μｍ〕は、接触前の酵素活性が37000ＩＵ／gであった。
【００５３】
【表６】
2006187276.tif 000008
【００５４】
実施例４
WO99/29830号公報の実施例３に記載の洗剤ベース99重量％に、実施例１で酸化剤と接触（重量比10／1（酵素／酸化剤））させたデュラミル60T(a1) 0.5重量％、及び香料0.5重量％を配合して洗剤組成物Aを得た。また、このデュラミル60T(a1)に代えて、酸化剤処理を施していないデュラミル60T(a1)を0.5重量％配合した洗剤組成物Bを得た。
【００５５】
30℃に調整した1Lの水道水に洗剤組成物A又は洗剤組成物Bを使用濃度（1質量％となる濃度）溶解し、ターゴトメーター（上島製作所（株）製）用ステンレスビーカーに移した。スターチ／色素汚染布（EMPA162）5枚（6cm四方）を洗剤溶液中に入れ、80rpmで10分間攪拌洗浄した。流水下で濯いだ後、アイロンプレスして反射率測定に供した。汚染布の原布、及び洗浄前後の人工汚染布の反射率を、460nmにて自記色差計（島津製作所（株））にて測定し洗浄率（％）を測定した。その結果、洗剤組成物Aは洗剤組成物Bに対して高い洗浄性能が確認された。
【００５６】
実施例５
（１）汚染皿の調製
直径25ｃｍの磁性皿を沸騰水道水で煮沸した後、軟質の炊き上がり米飯を30分間室温に放置し、3ｇを磁性皿に引き伸ばし塗布し、室温で約３時間乾燥させた後、使用直前まで５℃（半密閉状態）にて保存した。
【００５７】
（２）洗浄条件
上記の汚染皿を用いて、以下の条件で洗浄を行った。１回の洗浄には汚染皿を３枚供した。
・使用機種；松下電器（株）製全自動食器洗い機ＮＰ-810
・洗浄温度；水温から約55℃まで徐々に昇温する。
・洗浄用水；水道水
・洗浄剤濃度；0.2重量％
・洗浄時間；洗浄約20分→すすぎ約20分（標準コース）
・洗浄時の循環水量；3.5Ｌ
・使用洗剤組成物；表７のもの
【００５８】
【表７】
2006187276.tif 000009
【００５９】
１）ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン共重合体（旭電化工業社製、重量平均分子量2,000）
２）炭素数12〜14のsec-アルコールのエチレンオキサイド平均7モル、プロピレンオキサイド平均8.5モル付加物（ランダム付加物）
３）JIS  2号珪酸ナトリウム
４）アクリル酸-マレイン酸共重合体（アクリル酸／マレイン酸＝70／30モル比、重量平均分子量6000）。
５）実施例４で使用したデュラミル 60T(a1)〔実施例１において、重量比10／1（酵素／酸化剤）で処理したもの〕
６）酸化剤処理を施していないデュラミル 60T(a1)（対照品）
【００６０】
洗浄力評価方法洗浄後の皿にヨウ素溶液を塗布し、ヨウ素-澱粉反応による色を目視で判定した。その結果、活性化処理をしたα-アミラーゼを含有する洗剤組成物Cは、未処理のα-アミラーゼを含有する洗剤組成物Dに比べ極めて優れた洗浄性能を有していた。
【００６１】
実施例６
WO99/29830号公報の実施例３に記載の洗剤ベース99重量％に、実施例１の（２）混合比率の項で調製したデュラミル60T(a1)と酸化剤粉末(b1)の活性化処理混合物〔重量比10／1（酵素／酸化剤）、未分離〕0.5重量％、及び香料0.5重量％を配合して洗剤組成物Eを得た。また対照として、同じ洗剤ベース99重量％に、酸化剤処理を施していないデュラミル60T(a1) 0.455重量％、酸化剤粉末(b1) 0.045重量％、及び香料0.5重量％を配合した洗剤組成物Fを得た。
【００６２】
実施例４記載の洗浄方法で両洗剤組成物の洗浄力を比較した結果、洗剤組成物Eは洗剤組成物Fに対して高い洗浄性能が確認された。