(57)【要約】【課題】哺乳動物における生体由来材料のうち血液、尿、脳脊髄液、或いは末梢組織などのように比較的容易に採取可能な材料を用いることができ、クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症、スクレイピー、鹿慢性消耗性疾患、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）症候群、致死性家族性不眠症等のプリオン病を含む退行性神経変性疾患の発症早期における段階から検出可能な体外診断キット及び体外診断方法を提供する。【解決手段】抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を備えた哺乳動物におけるプリオン病の体外診断キット。
【請求項２】
前記生体由来成分が血液中に含まれる成分であることを特徴とする請求項１に記載の体外診断キット。
【請求項３】
前記プリオン病の１次スクリーニングに用いられるものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の体外診断キット。
【請求項４】
前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、鹿慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）症候群、致死性家族性不眠症から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の体外診断キット。
【請求項５】
前記哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれたものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の体外診断キット。
【請求項６】
前記プリオン病が、反芻類哺乳動物におけるプリオン病であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の体外診断キット。
【請求項７】
前記検出材が生体由来成分の染色標識剤、又は発色標識剤、又は化学発光標識剤、又は生物発光標識剤、又は蛍光標識剤を含んで成ることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の体外診断キット。
【請求項８】
前記検出材が、前記抗Ｆａｓ抗体に結合可能なアミノ酸配列を有する蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の体外診断キット。
【請求項９】
前記検出材が、クローニングした哺乳動物Ｆａｓ遺伝子から得られた哺乳動物Ｆａｓ蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の体外診断キット。
【請求項１０】
抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を用いる哺乳動物におけるプリオン病の体外診断方法。
【請求項１１】
前記生体由来成分が血液中に含まれる成分であることを特徴とする請求項１０に記載の体外診断方法。
【請求項１２】
前記プリオン病の１次スクリーニングに用いることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の体外診断方法。
【請求項１３】
前記プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、鹿慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）症候群、致死性家族性不眠症から１以上選ばれたものであることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれかに記載の体外診断方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれたものであることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれかに記載の体外診断方法。
【請求項１５】
前記プリオン病が、反芻類哺乳動物におけるプリオン病であることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の体外診断方法。
【請求項１６】
前記検出材が生体由来成分の染色標識剤、又は発色標識剤、又は化学発光標識剤、又は生物発光標識剤、又は蛍光標識剤を含んで成ることを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれかに記載の体外診断方法。
【請求項１７】
前記検出材が、前記抗Ｆａｓ抗体に結合可能なアミノ酸配列を有する蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項１０乃至１６のいずれかに記載の体外診断方法。
【請求項１８】
前記検出材が、クローニングした哺乳動物Ｆａｓ遺伝子から得られた哺乳動物Ｆａｓ蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成ることを特徴とする請求項１０乃至１７のいずれかに記載の体外診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるプリオン病の体外診断キット及び体外診断方法に係り、特に、哺乳動物の生体材料のうち血液、尿、脳脊髄液、或いは末梢組織などのように比較的容易に採取可能な材料を用いることができ、プリオン病の発症早期における段階から検出可能な体外診断キット及び体外診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物のプリオン病には、ヒトにおける代表的疾患としてクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の外、遺伝性プリオン病であるゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＧＳＳ）や、致死性家族性不眠症、クールー（Ｋｕｒｕ）などがある。ＣＪＤは、病因が不明の散発性ＣＪＤ、遺伝性の家族性ＣＪＤ、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）からの経口感染による変異型ＣＪＤ〔例えば、非特許文献１参照〕、ヒト下垂体の抽出製剤やヒト由来硬膜、角膜等を介する感染による医原性ＣＪＤなどに区分されるが、異常型プリオン蛋白（ＰｒＰＳｃ）が中枢神経系に蓄積する点では共通している。一方、変異型ＣＪＤでは、扁桃などのリンパ組織にもＰｒＰＳｃが認められている〔例えば、非特許文献２参照〕。ＢＳＥは、ヒツジやヤギのスクレイピー臓器などにより汚染した配合飼料からの感染によるものとされており、スクレイピーと同様に中枢神経系などに変性を認めＰｒＰＳｃが沈着するが、リンパ組織にＰｒＰＳｃの沈着が認められない点でスクレイピーとは異なっている〔例えば、非特許文献３参照〕。
【０００３】
このような、哺乳動物におけるプリオン病の診断方法として、ヒトのプリオン病では、変異型ＣＪＤの場合、扁桃などのリンパ組織生検材料について免疫組織化学的な検査が提案されている〔例えば、非特許文献２参照〕。散発性ＣＪＤでは、脳脊髄液に、１４−３−３蛋白質が特異的に増加すること〔例えば、非特許文献４参照〕、また、神経細胞特異的エノラーゼ（Ｎｅｕｒｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｎｏｌａｓｅ）などが補助的診断マーカーとして知られている。
【０００４】
ＢＳＥについては、これまで組織病理学的、臨床学的、疫学的方法を用いて検出が行われており、脳幹（延髄）組織を採取し、正常プリオン蛋白（ＰｒＰＣ）ではプロティナーゼＫ（ＰＫ）により完全に分解されるが、ＰｒＰＳｃの凝集体ではＰＫで分解した後に残る「ＰｒＰ２７−３０」と呼ばれるフラグメントをプリオン蛋白質（ＰｒＰＣ、ＰｒＰＳｃ）特異抗体と反応させることにより異常プリオンを検出する検査キットが市販されている〔例えば、非特許文献５参照〕。また、例えば、組織の病理学的変化について、検体の赤外線スペクトルを参考データベースと比較し、分類することを特徴とする診断方法〔例えば、特許文献１参照〕、一価抗体との反応を利用する異常プリオン蛋白定量方法〔例えば、特許文献２参照〕、ＢＳＥの発症前又は発症後の血液から濃縮した標的血球細胞における、プリオン蛋白質、インターフェロン、ラミニン受容体又はラミニン前駆体などのマーカー蛋白質の発現を免疫試験などにより決定し、対照と比較する方法〔例えば、特許文献３参照〕などが提案されている。
【０００５】
上述のような哺乳動物プリオン病、すなわちスクレイピー、ＢＳＥ、ＣＪＤ、ＣＷＤ、ＭＴＥなどは、神経変性疾患における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥｓ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ）とも呼ばれる。８７Ｖスクレイピーの脳内接種によって感染させたスクレイピーマウスの実験において、異常プリオン蛋白の蓄積に先立ち、アポトーシスに関与しＣＤ９５又はＡＰＯ−１とも呼ばれるＦａｓや、カスパーゼ３（Ｃａｓｐａｓｅ３）の早期誘導が認められたことが報告されている〔例えば、非特許文献６参照〕。また、散発性ＣＪＤ及びオリーブ・橋・小脳萎縮症の患者小脳について免疫組織化学的方法により、Ｆａｓ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＥＲＫ、ＭＥＫ、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、プロカスパーゼ−２、カスパーゼ−３の発現を調べた結果、これら蛋白質の過剰発現が、神経変性における細胞死の経路でアポトーシスとは別の機能を持つ可能性が示唆されている〔例えば、非特許文献７参照〕外、ＴＳＥ以外の退行性（進行性）神経変性疾患についてもアポトーシスに関連する多くの研究がなされている。
【０００６】
なお、主要なアポトーシス誘導因子となるＦａｓは、ヒト線維芽細胞（ＦＳ−７）でマウスを免疫して得られたモノクローナル抗体が細胞を殺すことから、このマウスモノクローナル抗体に対する抗原として発見され〔例えば、非特許文献８参照〕、そのｃＤＮＡクローニングからアミノ酸配列が確認されており、細胞膜貫通部分を有し細胞表層に存在するＴＮＦレセプターファミリーに属する細胞膜貫通部分を含むＩ型膜蛋白質であることが明らかとなっている〔例えば、非特許文献９、非特許文献１０、特許文献４参照〕。また、マウスＦａｓ遺伝子や、ウシＦａｓ遺伝子もクローニングされている〔例えば、非特許文献１１、非特許文献１２参照〕。
【０００７】
【特許文献１】特表２００３−５００６４８号公報
【特許文献２】特開２００３−１２１４４８号公報
【特許文献３】特表２００２−５４３３８９号公報
【特許文献４】米国特許第５８７４５４６号明細書
【非特許文献１】Ｗｉｌｌ，Ｒ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ  Ｖｏｌ．３４７、ｐｐ９２１−９２５（１９９６）
【非特許文献２】Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ；Ｌａｎｃｅｔ  Ｖｏｌ．３４９、ｐｐ９９−１００（１９９７）
【非特許文献３】Ｏ′Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．３８、ｐｐ３２５４−３２５９（２０００）
【非特許文献４】Ｈｓｉｃｈ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ；Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．  Ｖｏｌ．３３５、ｐｐ９２４−９３０（１９９６）
【非特許文献５】能田健、永井英貴、平沢緑著、獣医畜産新報、５６巻、９号、７１９〜７２５頁、２００３年
【非特許文献６】Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．１６、ｐｐ３５６７−３５７２（２００１）
【非特許文献７】Ｐｕｉｇ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ；Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．  Ｖｏｌ．１０２、ｐｐ２０７−２１５（２００１）
【非特許文献８】Ｙｏｎｅｈａｒａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  Ｖｏｌ．１６９、ｐｐ１７４７−１７５６（１９８９）
【非特許文献９】Ｉｔｏ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ；Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．６６、ｐｐ２３３−２４３（１９９１）
【非特許文献１０】Ｎａｇａｔａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ；Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．８８、ｐｐ３５５−３６５（１９９７）
【非特許文献１１】Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｖｏｌ．１４８、ｐｐ１２７４−１２７９（１９９２）
【非特許文献１２】Ｙｏｏ，  Ｊ．ｅｔ  ａｌ；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．１５（３）、ｐｐ２２７−２３４（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
変異型ＣＪＤでは、非特許文献２に示されているように扁桃などのリンパ組織を採取し、ＰｒＰＳｃを検出することで生前診断も可能ではあるが、侵襲性が高く実用的とはいえず、また、散発性ＣＪＤでは、非特許文献４の１４−３−３蛋白質をマーカーとする診断法は感度は高いものの、他のヒトプリオン病の場合と同様、脳のＭＲＩ検査などと共に補助的な脳脊髄液検査の一つとして適用されるに留まり、最終的には脳生検あるいは剖検時脳病理検査による確定診断が行われている。スクレイピーにおいても変異型ＣＪＤの診断の場合と同様、非特許文献３に示されるようにリンパ組織に分布するＰｒＰＳｃを検出し生前診断を行うこともできるが、実用的ではないという問題があった。ＢＳＥについては、非特許文献５、特許文献１、特許文献２などを含む殆どの検査法は、ＰｒＰＳｃが中枢神経系に沈着し、血液や末梢リンパ組織には実質的に分布しないことから、生前診断としての実施は困難であった。また、特許文献３などのように血液を材料として発症前後における診断を行う方法もあるが、標的血球細胞の濃縮などの工程が必要となり操作が繁雑であること、その他、尿中のＰｒＰＳｃを検出する方法等においても充分な感度が得にくいことなどから、大規模な簡易スクリーニングに適用できるプリオン病、特にＢＳＥの診断方法、診断キットが望まれている。
【０００９】
本発明は、上記のような状況に鑑みてなされたものであり、哺乳動物の生体材料のうち血液、尿、脳脊髄液、或いは末梢組織などのように比較的容易に採取可能な材料を用いることができ、プリオン病の発症早期における段階から検出可能な体外診断キット及び体外診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明による哺乳動物におけるプリオン病の体外診断キットは、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を備えたことを特徴とする。このような体外診断キットにおいて、生体由来成分が血液中に含まれる成分であることが好ましく、また、プリオン病の１次スクリーニングに用いられるものであることが良く、さらに、哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれたものであっても良く、さらにまた、プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、鹿慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）症候群、致死性家族性不眠症から１以上選ばれたものであることが好適である。そして、プリオン病が、反芻類哺乳動物におけるプリオン病であることが好ましく、また、検出材が生体由来成分の染色標識剤、又は発色標識剤、又は化学発光標識剤、又は生物発光標識剤、又は蛍光標識剤を含んで成ることができ、さらに、検出材が、前記抗Ｆａｓ抗体に結合可能なアミノ酸配列を有する蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成ることが好ましく、さらにまた、検出材が、クローニングした哺乳動物Ｆａｓ遺伝子から得られた哺乳動物Ｆａｓ蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成ることができる。
【００１１】
また、上記目的を達成するため、本発明による哺乳動物におけるプリオン病の体外診断方法は、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を用いることを特徴とする。この哺乳動物におけるプリオン病の体外診断方法において、生体由来成分が血液中に含まれる成分であることが良く、また、プリオン病の１次スクリーニングに用いることが好適であり、さらに、哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、オオジカ、ミンク、ブタ、サル、マウス、ラット、ハムスター、ネコから選ばれたものであることが良く、さらにまた、プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、スクレイピー、鹿慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー（Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ）症候群、致死性家族性不眠症から１以上選ばれたものであることが好ましい。そして、プリオン病が、反芻類哺乳動物におけるプリオン病であることが良く、また、検出材が生体由来成分の染色標識剤、又は発色標識剤、又は化学発光標識剤、又は生物発光標識剤、又は蛍光標識剤を含んで成ることができ、さらに、検出材が、前記抗Ｆａｓ抗体に結合可能なアミノ酸配列を有する蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成ることが好ましく、さらにまた、検出材が、クローニングした哺乳動物Ｆａｓ遺伝子から得られた哺乳動物Ｆａｓ蛋白質又はその部分ペプチドを含んで成っても良い。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の哺乳動物におけるプリオン病の体外診断キット及び体外診断方法によれば、プリオン病の発症早期に哺乳動物の生体中、特に血液、尿、脳脊髄液や末梢組織などに現れる抗Ｆａｓ抗体を検出可能な検出材を備え、また、このような検出材を用いるため、プリオン病発症早期における生前診断が可能である。また、容易に診断対象の生体由来材料が採取でき、血清、血漿、尿、脳脊髄液などを検体として簡便に抗Ｆａｓ抗体の検出が可能であることから、プリオン病の大規模スクリーニングにも適用できる。
【００１３】
また、本発明は、哺乳動物プリオン病の発症に伴い抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分が血液中などに出現、増加することを、ＰｒＰＳｃを脳内接種したマウスを用いた実験によって確認したことに起因するもので、その作用機序は不明ではあるが、プリオン病はアポトーシスが関与する神経変性疾患であることから、本発明の体外診断キット及び体外診断方法は、退行性神経変性疾患のスクリーニングにも用いることができる。さらに、各プリオン病を含む神経変性疾患に特異的な診断マーカーと組み合わせることにより、各神経変性疾患毎の生前診断を行うこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の哺乳動物におけるプリオン病の体外診断キット及び体外診断方法を実施するための最良の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１５】
〔第１の実施形態〕
第１の実施形態による哺乳動物プリオン病の体外診断キット及び体外診断方法は、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を備え、また、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を用いるものである。生体由来成分は、血液、尿、脳脊髄液や末梢組織など哺乳動物診断対象個体からの生体由来材料検体に含まれる成分であり容易に採取可能である。血液は血清又は血漿検体とすることができる。本実施形態では、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分について、公知の分離材、分離装置などを用いた分離方法により抗Ｆａｓ抗体と他の生体由来成分が分離した状態とすることができ、この場合における検出材としては、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分を検出可能であれば、染色標識剤、発色標識剤（酵素標識剤と基質剤を組み合わせたものを含む）、化学発光標識剤、生物発光標識剤、蛍光標識剤など如何なる検出材も使用できる。また、これらの標識剤の２種以上を組み合わせた検出材としても良い。
【００１６】
さらに、検出材に加えて分離材及び／又は分離装置を組み合わせた体外診断キットとすることもできる。ここで、分離材及び／又は分離装置による抗Ｆａｓ抗体と他の生体由来成分の分離方法としては、如何なる公知の分離方法も使用可能である。例えば、寒天、アガロース、デンプン、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム添加ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などのスラブゲル電気泳動、ディスク電気泳動、キャピラリー電気泳動、等速電気泳動、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、濾紙電気泳動やセルロースアセテート膜電気泳動、ゲルビーズ電気泳動、免疫電気泳動、また、これらゲル担体（分離剤）についてゲル密度勾配やｐＨ勾配等を持たせたグラジエントゲルなどによる電気泳動法、さらに、これらのうち２種以上の電気泳動法の組み合わせや、２次元電気泳動法など公知の各種電気泳動法を適用することができる。このような電気泳動による分離法、分離材、分離装置を用いる際の各種詳細条件は、〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｖｏｌ．２２７、ｐ６８０（１９７０）〕、〔Ｄａｖｉｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．１２１、ｐ４０４（１９６４）〕、〔奥山典生ら  ；蛋白質  核酸  酵素別冊「等電点電気泳動と等速電気泳動」  共立出版（１９７８）〕、〔Ｋｏｈｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ；Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．  Ｖｏｌ．２、ｐ２９７（１９５７）〕、〔Ｓｈａｐｉｒｏ，Ａ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、  Ｖｏｌ．２８、ｐ８１５（１９６７）〕、〔Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２４４、ｐ４４０６（１９６９）〕、〔真鍋ら；「免疫実験操作法」日本免疫学会出版  Ｖｏｌ．１２、ｐ３８０７（１９８３）〕、〔Ｏ′Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２５０、ｐ４００７（１９７５）〕、〔Ｍａｎａｂｅ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．８５、ｐ６４９（１９７９）〕、〔日本生化学会編、「基礎生化学実験法；第３巻、タンパク質Ｉ」、東京化学同人（２００１）〕などに準じて実施することができる。
【００１７】
電気泳動法の外、超遠心分離法、異方性濾過膜やホロファイバーを用いる限外濾過法、高性能液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）を含む各種クロマトグラフ法〔イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過とも呼ばれるサイズ排除（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ：ＳＥ）クロマトグラフィー、疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ：ＨＩＣ）クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング（等電点クロマトグラフィー）、アフィニティクロマトグラフィー、逆相（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｐｈａｓｅ：ＲＰ）クロマトグラフィー等〕も使用することが可能である。このようなクロマトグラフなどの分離法、分離材、分離装置を用いる際の各種詳細条件は、〔日本生化学会編、「生化学実験講座１；タンパク質の化学」、東京化学同人（１９７６）〕、〔日本生化学会編、「生化学実験講座５；酵素研究法」、東京化学同人（１９７５）〕、〔日本生化学会編、「続生化学実験講座２；タンパク質の化学」、東京化学同人（１９８７）〕、〔日本生化学会編、「新生化学実験講座１；タンパク質Ｉ」、東京化学同人（１９９０）〕、〔日本生化学会編、「基礎生化学実験法；第３巻、タンパク質Ｉ」、東京化学同人（２００１）〕などに準じて実施することができる。
【００１８】
このような分離法のうち、例えば、分子量と等電点、分子量と特定物質への親和性又は吸着性又は疎水性、等電点と特定物質への親和性又は吸着性など２種類の異なる分離原理に基く分離方法の組み合わせ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＳＥ−ＨＰＬＣと等電点電気泳動又はクロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＳＥ−ＨＰＬＣとアフィニティクロマトグラフィー又は吸着クロマトグラフィー又はＨＩ又はＲＴ−ＨＰＬＣ、ｐＨグラジエント（ＩＥＦ）・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ２次元電気泳動法など）が好ましく、分離後の検出操作性、感度、陰性対照との比較が肉眼で可能な点などでは、ｐＨグラジエント（ＩＥＦ）・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ２次元電気泳動法がより好ましく、本実施形態ではこのような２次元電気泳動法を採用した。泳動後の検出は、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜などの転写膜へ転写した後であっても良く、転写せずゲル上で直接検出しても良い。
【００１９】
また、本実施形態における検出材としては、その検出感度はｎｇ〜μｇ程度のレベルであり他の標識剤に比較すると低いが、広く一般に使用され簡便に染色可能である点で染色標識材を使用する。また、染色標識剤としては、ペプチド、糖蛋白を含む蛋白質などの生体由来成分を染色できるものであれば如何なる染色標識剤も使用可能であり、例えば、公知の各種クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ：ＣＢＢ−Ｇ２５０、ＣＢＢ−Ｒ１５０、ＣＢＢ−Ｒ２５０、ＣＢＢ−Ｒ３５０等）、アンモニア性硝酸銀等の水溶性銀化合物や銀コロイド、金コロイド、エチジウムブロマイド（ＥＴＢｒ）、アシッドブルー、アミドブラックＢ、エリオクロムブラックＴなどが好適に使用でき、それぞれ適宜適切な公知の緩衝液や有機溶媒混合水溶液などに溶解して用いれば良い。なお、このような染色標識剤による染色条件等については、例えば〔Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．９６、ｐ２３６（１９７９）〕、〔Ｏａｋｌｅｙ，Ｂ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．１０５、ｐ３６１（１９８０）〕、〔Ｍｏｅｒｅｍａｎｓ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、  Ｖｏｌ．７４、ｐ３５３（１９８４）〕などに準じて実施することができる。
【００２０】
このような染色標識剤以外の検出材を用いる場合、発色標識剤としては、発色基質剤又は酵素（標識）剤が、ペプチド、糖蛋白を含む蛋白質などの生体由来成分に結合、又は物理的に付着又は吸着し、このような状態で発色させることにより検出可能とするものであれば如何なる発色標識剤であっても良い。また、酵素（標識）剤、発色基質剤、発色補助剤、発色増強剤、ｐＨ緩衝剤などを組み合わせたものを含むことができる。発色基質剤としては、酵素剤や発色補助剤により発色するものであれば如何なる発色基質剤も使用可能であり、例えば、ｏ−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、ｐ−ニトロフェノールリン酸、フェノールリン酸、フェノール、４−アミノアンチピリン、ｏ−ジアニシジン、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクシド、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。酵素（標識）剤としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼなどを挙げることができる。それぞれ適切な発色基質剤と酵素剤を組み合わせれば良く、例えば、ペルオキシダーゼとｏ−フェニレンジアミン、ペルオキシダーゼと５−アミノサリチル酸、ペルオキシダーゼとＴＭＢ、アルカリフォスファターゼとｐ−ニトロフェノールリン酸、アルカリフォスファターゼとフェノールリン酸、アルカリフォスファターゼとフェノール及び４−アミノアンチピリン、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクシド、などを挙げることができ、これらに過酸化水素などの酸化剤や各反応の至適ｐＨとするｐＨ緩衝剤を加えても良い。さらに、ビオチンとアビジンを組み合わせた発色標識剤も使用できる。このような発色標識剤を用いる際の各詳細な条件は、〔日本生化学会編、「生化学実験講座５；酵素研究法」、東京化学同人（１９７５）〕、〔石川英治ら、「酵素免疫測定法」医学書院（１９８７）〕、〔日本生化学会編、「新生化学実験講座１；タンパク質Ｖ」、東京化学同人（１９９１）〕、〔日本生化学会編、「新生化学実験講座１２；分子免疫学ＩＩＩ」、東京化学同人（１９９２）〕などに準じて実施することができる。
【００２１】
化学発光標識剤としては、化学発光化剤又は酵素（標識）剤がペプチド、糖蛋白を含む蛋白質などの生体由来成分に結合、又は物理的に付着又は吸着し、このような状態で酸化反応などにより化学発光化剤自体が励起され化学発光することにより検出可能とするものであれば如何なる化学発光標識剤であっても良い。また、化学発光化剤に加えて酵素（標識）剤と基質剤、化学発光増強剤、ｐＨ緩衝剤などを組み合わせたものを含むことができる。化学発光化剤としては、例えば、２，４，５トリフェニルイミダゾール、３−メチルインドール、テトラキスエチレン等の他、ベンゾペリレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドやイソルミノールのＮ−アルキル誘導体のようなルミノール誘導体、アクリジニウム塩やルシゲニンのようなアクリジン系化合物、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンのようなアダマンチル−１，２−ジオキセタン誘導体などを用いることができる。このような、化学発光化剤と組み合わせることのできる酵素（標識）剤、基質剤、化学発光増強剤としては、例えば、（ミクロ）ペルオキシダーゼやＮ−アセチルグルコサミダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼのような酵素剤、過酸化水素、過マンガン酸塩、次亜塩素酸のような酸化剤や、鉄、コバルト、銅、マンガンのような金属の化学発光増強剤などを挙げることができ、適宜選定すれば良い。
【００２２】
生物発光標識剤としては、生物発光基質剤又は酵素（標識）剤がペプチド、糖蛋白を含む蛋白質などの生体由来成分に結合、又は物理的に付着又は吸着し、このような状態で生物発光させることにより検出可能とするものであれば如何なる生物発光標識剤であっても良い。また、生物発光基質又は酵素（標識）剤の外に、他の酵素剤、反応補助剤、ｐＨ緩衝剤などを組み合わせたものを含むことができる。生物発光基質剤としては、例えば、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェリン、ウミホタル（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェリン、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェリン、発光ミミズ（Ｄｉｐｌｏｃａｒｄｉａ）ルシフェリン、ラチア（Ｌａｔｉａ  ｎｅｒｉｔｏｉｄｅｓ）ルシフェリン、ホタルイカ（Ｗａｔａｓｅｎｉａｅ）ルシフェリンやバクテリアルシフェリン（還元型フラビンモノヌクレオチド）のような発光生物由来のルシフェリンの外、オワンクラゲ由来のエクオリンなどを用いることができる。
【００２３】
なお、酵素（標識）剤、反応補助剤としては、それぞれ対応する生物由来のルシフェラーゼ、ＡＭＰ（アデノシン−１−リン酸）、ＡＴＰ（アデノシン−３リン酸）、マグネシウム塩やカルシウム塩のような金属塩、脂肪族アルデヒドなどを挙げることができ、適宜適切な組み合わせとなるように選定すれば良い。上述の化学発光標識剤や生物発光標識剤を用いる際の各詳細な条件は、〔ＶａｎＤｙｋｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ；「Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅ  Ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ」  Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｆｌｏｒｉｄａ（１９８５）〕、〔今井一洋編、「生物発光と化学発光」広川書店（１９８９）〕、〔後藤俊夫著、「生物発光」共立出版（１９７５）〕、〔稲場文男ら、「最新ルミネッセンスの測定と応用」ＮＴＳ出版（１９９０）〕、〔Ｈａｓｔｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ；Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．３１、ｐ５４９（１９７７）〕、〔Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．２２７、ｐ６８０（１９７０）〕、〔Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｖｏｌ．５７、ｐ４２４（１９７８）〕、〔Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ；Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．１５９、ｐ３６３（１９８６）〕、〔Ｖｏｙｔａ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ；Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．３４、ｐ６８０（１９８８）〕、〔Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．  Ｖｏｌ．４、ｐ９９（１９８９）〕などに準じて実施することができる。
【００２４】
蛍光標識剤としては、蛍光基質剤又は酵素（標識）剤がペプチド、糖蛋白を含む蛋白質などの生体由来成分に結合、又は物理的に付着又は吸着し、このような状態で蛍光を発せさせることにより検出可能とするものであれば如何なる蛍光標識剤であっても良い。また、蛍光基質剤又は酵素（標識）剤の外に、他の酵素剤、反応補助剤、ｐＨ緩衝剤などを組み合わせたものを含むことができる。蛍光基質剤としては、例えば、フルオレセイン、アクリジン、キノリン、クマリン、レゾルフィンなどの芳香族複素環化合物や、ナフタレン、アントラセン、ペリレン、ピレンなどの多環芳香族化合物の外、アントラニル酸、ニトロベンゾフラン、スチルベンなどの発蛍光団となる化合物、また、これら発蛍光団化合物の各種誘導体化化合物を挙げることができ、いずれの蛍光基質剤も適用可能である。発色基質剤と酵素（標識）剤との組み合わせとしては、例えば、アルカリフォスファターゼと４−メチルウンベリフェリルリン酸、β−Ｄガラクトシダーゼと４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄガラクトシド、ペルオキシダーゼとｐ−ヒドロキシフェニル酢酸又はｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸又はフルオレセインイソチオシアネート又はチラミンなども適用できる。さらに、必要に応じて反応補助剤としての過酸化水素のような酸化剤や補酵素を含む酵素剤、また、各反応の至適ｐＨに調整するｐＨ緩衝剤を加えても良い。このような蛍光標識剤を検出材に用いる際の各詳細な条件は、〔日本生化学会編、「生化学実験講座５；酵素研究法」、東京化学同人（１９７５）〕、〔石川英治ら、「酵素免疫測定法」医学書院（１９８７）〕、〔日本生化学会編、「新生化学実験講座１；タンパク質Ｖ」、東京化学同人（１９９１）〕、〔Ｆｒｅｉ，Ｒ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ；「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」  Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１，８２）〕などに準じて実施することができる。
【００２５】
検出材の検出対象となる生体成分に含まれる抗Ｆａｓ抗体は、細胞膜貫通部分を含むＩ型膜蛋白質Ｆａｓ、分泌型Ｆａｓ、細胞膜外部分Ｆａｓ、細胞膜内部分Ｆａｓ、及びこれらの部分フラグメントＦａｓ（ペプチド）などの外、Ｆａｓリガンド結合体Ｆａｓ等、いずれに対する抗体であっても良く、本実施形態において検出材は、いずれかの抗Ｆａｓ抗体に特異的な検出材、また、いずれの抗Ｆａｓ抗体であっても広範に検出できるユニバーサルな検出材とすることができる。上記いずれかの抗Ｆａｓ抗体に特異的な検出材としては、それぞれ抗Ｆａｓ抗体に対応する上記各Ｆａｓ蛋白質を好適に使用することができ、また、これら各蛋白質を上述の各標識剤で標識しても良い。なお、これら各Ｆａｓ蛋白質は、由来する動物種によってそれぞれ分子量などが異なり、例えば、細胞膜貫通部分を含むＩ型膜蛋白質Ｆａｓのアミノ酸配列における相同性は、ヒトとマウスでは５０％、ヒトとウシでは５７％であることが知られており（特許文献４、並びに非特許文献８乃至１２参照）、以下に、ヒトＦａｓ（配列１）及びウシＦａｓ（配列２）についてのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列１（ヒトＦａｓ）：ＭＬＧＩＷＴＬＬＰＬＶＬＴＳＶＡＲＬＳＳＫＳＶＮＡＱＶＴＤＩＮＳＫＧＬＥＬＲＫＴＶＴＴＶＥＴＱＮＬＥＧＬＨＨＤＧＱＦＣＨＫＰＣＰＰＧＥＲＫＡＲＤＣＴＶＮＧＤＥＰＤＣＶＰＣＱＥＧＫＥＹＴＤＫＡＨＦＳＳＫＣＲＲＣＲＬＣＤＥＧＨＧＬＥＶＥＩＮＣＴＲＴＱＮＴＫＣＲＣＫＰＮＦＦＣＮＳＴＶＣＥＨＣＤＰＣＴＫＣＥＨＧＩＩＫＥＣＴＬＴＳＮＴＫＣＫＥＥＧＳＲＳＮＬＧＷＬＣＬＬＬＬＰＩＰＬＩＶＷＶＫＲＫＥＶＱＫＴＣＲＫＨＲＫＥＮＱＧＳＨＥＳＰＴＬＮＰＥＴＶＡＩＮＬＳＤＶＤＬＳＫＹＩＴＴＩＡＧＶＭＴＬＳＱＶＫＧＦＶＲＫＮＧＶＮＥＡＫＩＤＥＩＫＮＤＮＶＱＤＴＡＥＱＫＶＱＬＬＲＮＷＨＱＬＨＧＫＫＥＡＹＤＴＬＩＫＤＬＫＫＡＮＬＣＴＬＡＥＫＩＱＴＩＩＬＫＤＩＴＳＤＳＥＮＳＮＦＲＮＥＩＱＳＬＶ（特許文献４、非特許文献８参照；３３５アミノ酸）
【００２７】
配列２（ウシＦａｓ）：ＭＳＧＩＷＶＨＬＳＬＩＦＩＳＶＳＧＰＬＳＫＧＥＮＡＨＭＡＧＩＮＳＥＧＬＫＬＮＩＴＥＡＮＳＣＱＥＧＬＹＲＥＨＱＦＣＣＱＰＣＰＰＧＫＲＫＮＧＤＣＫＲＤＧＤＴＰＥＣＶＬＣＳＥＧＮＥＹＴＤＫＳＨＨＳＤＫＣＩＲＣＳＩＣＤＥＥＨＧＬＥＶＥＱＮＣＴＲＴＲＮＴＫＣＲＣＫＳＮＦＦＣＮＳＳＰＣＥＨＣＮＰＣＴＴＣＥＨＧＩＩＥＫＣＴＰＴＳＮＴＫＣＫＧＳＲＳＨＡＮＳＬＷＡＬＬＩＬＬＩＰＩＶＬＩＩＹＫＶＶＫＳＲＥＲＮＫＫＮＤＹＣＮＳＡＡＳＮＤＥＧＲＱＬＮＬＴＤＶＤＬＧＫＹＩＰＳＩＡＥＱＭＲＩＴＥＶＫＥＦＶＲＫＮＧＭＥＥＡＫＩＤＤＩＭＨＤＮＶＨＥＴＡＥＱＫＶＱＬＬＲＮＷＹＱＳＨＧＫＫＮＡＹＣＴＬＴＫＳＬＰＫＡＬＡＥＫＩＣＤＩＶＭＫＤＩＴＮＥＲＥＮＡＮＬＱＮＥＮＥＮＬＶ（非特許文献１２参照；３２３アミノ酸）
【００２８】
また、分泌型ヒトＦａｓ、細胞膜外部分ヒトＦａｓ（可溶性Ｆａｓ）、及び細胞膜内部分ヒトＦａｓについてのアミノ酸配列は、それぞれ、配列１における第第１番〜第１６番のアミノ酸配列に相当するシグナル配列領域と第１７４番〜第１９０番のアミノ酸配列に相当する膜貫通領域を除く配列３、配列１における第１７番〜第１７３番のアミノ酸配列に相当する配列４、及び配列１における第１９１番〜第３３５番のアミノ酸配列に相当する配列５であることが報告されている〔小林清一ら  ；日本臨床  Ｖｏｌ．５４  （７）、ｐｐ１７４１−１７４６（１９９６）〕。
【００２９】
配列３（分泌型ヒトＦａｓ）：ＲＬＳＳＫＳＶＮＡＱＶＴＤＩＮＳＫＧＬＥＬＲＫＴＶＴＴＶＥＴＱＮＬＥＧＬＨＨＤＧＱＦＣＨＫＰＣＰＰＧＥＲＫＡＲＤＣＴＶＮＧＤＥＰＤＣＶＰＣＱＥＧＫＥＹＴＤＫＡＨＦＳＳＫＣＲＲＣＲＬＣＤＥＧＨＧＬＥＶＥＩＮＣＴＲＴＱＮＴＫＣＲＣＫＰＮＦＦＣＮＳＴＶＣＥＨＣＤＰＣＴＫＣＥＨＧＩＩＫＥＣＴＬＴＳＮＴＫＣＫＥＥＧＳＲＳＮＫＲＫＥＶＱＫＴＣＲＫＨＲＫＥＮＱＧＳＨＥＳＰＴＬＮＰＥＴＶＡＩＮＬＳＤＶＤＬＳＫＹＩＴＴＩＡＧＶＭＴＬＳＱＶＫＧＦＶＲＫＮＧＶＮＥＡＫＩＤＥＩＫＮＤＮＶＱＤＴＡＥＱＫＶＱＬＬＲＮＷＨＱＬＨＧＫＫＥＡＹＤＴＬＩＫＤＬＫＫＡＮＬＣＴＬＡＥＫＩＱＴＩＩＬＫＤＩＴＳＤＳＥＮＳＮＦＲＮＥＩＱＳＬＶ
【００３０】
配列４（細胞膜外部分ヒトＦａｓ）：ＲＬＳＳＫＳＶＮＡＱＶＴＤＩＮＳＫＧＬＥＬＲＫＴＶＴＴＶＥＴＱＮＬＥＧＬＨＨＤＧＱＦＣＨＫＰＣＰＰＧＥＲＫＡＲＤＣＴＶＮＧＤＥＰＤＣＶＰＣＱＥＧＫＥＹＴＤＫＡＨＦＳＳＫＣＲＲＣＲＬＣＤＥＧＨＧＬＥＶＥＩＮＣＴＲＴＱＮＴＫＣＲＣＫＰＮＦＦＣＮＳＴＶＣＥＨＣＤＰＣＴＫＣＥＨＧＩＩＫＥＣＴＬＴＳＮＴＫＣＫＥＥＧＳＲＳＮ
【００３１】
配列５（細胞膜内部分ヒトＦａｓ）：ＫＲＫＥＶＱＫＴＣＲＫＨＲＫＥＮＱＧＳＨＥＳＰＴＬＮＰＥＴＶＡＩＮＬＳＤＶＤＬＳＫＹＩＴＴＩＡＧＶＭＴＬＳＱＶＫＧＦＶＲＫＮＧＶＮＥＡＫＩＤＥＩＫＮＤＮＶＱＤＴＡＥＱＫＶＱＬＬＲＮＷＨＱＬＨＧＫＫＥＡＹＤＴＬＩＫＤＬＫＫＡＮＬＣＴＬＡＥＫＩＱＴＩＩＬＫＤＩＴＳＤＳＥＮＳＮＦＲＮＥＩＱＳＬＶ
【００３２】
〔第２の実施形態〕
第２の実施形態による哺乳動物プリオン病の体外診断キット及び体外診断方法は、第１の実施形態と同様に抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を備え、また、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分の検出材を用いるものである。主として、酵素免疫測定法に適用する検出材を用いる点で第１の実施形態と異なる。生体由来成分は、血液、尿や末梢組織など哺乳動物診断対象個体からの生体由来材料検体に含まれる成分であり容易に採取可能であり、血液は血清又は血漿検体とすることができる。本第２の実施形態において、抗Ｆａｓ抗体を含む生体由来成分について、第１の実施形態の場合と同様の分離材、分離装置などを用いた分離方法により抗Ｆａｓ抗体と他の生体由来成分が分離した状態とすることもできるが、予め分離する必要はなく、酵素免疫測定法によって直接抗Ｆａｓ抗体を特異的に検出可能である。
【００３３】
酵素免疫測定法（ＥＩＡ：ＥＬＩＳＡ含む）は、競合法と非競合法に大別され、それぞれ、抗原・抗体反応結合体（Ｂ：Ｂｏｕｎｄ  Ｆｏｒｍ）と非結合未反応体（Ｆ：Ｆｒｅｅ  Ｆｏｒｍ）とをＢＦ分離するヘテロジニアス法（不均一法：分離法）と、ＢＦ分離しないホモジニアス法（均一法：非分離法）に区分される。ヘテロジニアス法においては、抗原・抗体反応を液相で行う液相法、固相と液相間にて行う固相法がある。血清又は血漿を生体由来材料検体とし、抗Ｆａｓ抗体を直接測定する場合においては、ホモジニアス法を用いることは実質的に困難であり、第１の実施形態の場合と同様の分離材、分離装置などを用いた分離方法により、予め抗Ｆａｓ抗体と他の生体由来成分（特に非特異的免疫グロブリン）を分離した抗Ｆａｓ抗体を含む画分を検体として用いることが望ましい。なお、競合法及び非競合法のいずれも適用可能であり限定されないが、検出感度が優れる点では、競合法より非競合法を適用することが好ましく、同様に、液相法より固相法を適用することが好ましい。本第２の実施形態においては、ヘテロジニアス−固相法を採用することとした。固相としては、チューブ、マイクロプレート、ビーズ、ストリップ、マイクロチップなど如何なる形態のものであっても良く、また、その材質についても、ポリスチレン、ガラス、ラテックス、セルロース、セファロース、濾紙など酵素免疫測定用の抗原又は抗体が物理吸着、共有結合などによって不溶化され担持可能であれば、如何なる材質の固相も適用でき、磁性体粒子であっても良い。
【００３４】
本第２の実施形態における酵素免疫測定用の抗原、すなわち、検出材の検出対象となる生体成分に含まれる抗Ｆａｓ抗体に結合可能な抗原としては、診断対象がヒトの場合では、第１の実施形態において説明した、細胞膜貫通部分を含むＩ型膜蛋白質ヒトＦａｓ（アミノ酸配列１）、分泌型ヒトＦａｓ（アミノ酸配列３）、細胞膜内部分ヒトＦａｓ（アミノ酸配列４）、細胞膜外部分ヒトＦａｓ（アミノ酸配列５）、及びこれらの部分フラグメントＦａｓ（ペプチド）などの外、ヒトＦａｓリガンド結合体ヒトＦａｓ等を用いることができる。なお、これらのヒトＦａｓ及びＦａｓ関連タンパク質は、特許文献１、非特許文献８、〔国際特許公開ＷＯ９５−１３２９３のパンフレット〕、〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）〕などに準じて調製することができる。なお、抗ヒトＦａｓ抗体のアミノ酸配列についても明らかになっており〔特開平１１−１７１９００号公報〕、抗Ｆａｓ抗体のＦａｂ部における可変領域に結合可能なアミノ酸配列を有する蛋白質又はその部分ペプチドとして上記の部分フラグメントＦａｓ（ペプチド）を設計することもでき、ペプチドについては、公知の合成法、合成装置を用いて調製しても良い。また、Ｆａｓ抗体Ｆｃ部の診断対象哺乳動物についての固定特異配列と結合可能なアミノ酸配列を有する蛋白質又はその部分ペプチドを含む抗原との組み合わせも可能である。
【００３５】
また、診断対象の哺乳動物がウシの場合についても、第１の実施形態において説明したような細胞膜貫通部分を含むウシＦａｓ蛋白質（アミノ酸配列２）を、酵素免疫測定用の抗原として適用することが可能であり、例えば、非特許文献１２、〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）〕などに準じて調製することができる。また、本第２の実施形態においては、マウスＦａｓのクローニング、ウシＦａｓのクローニングとして後述する方法によって得られるマウスＦａｓ蛋白質、ウシＦａｓ蛋白質を酵素免疫測定用の抗原として使用することができる。ヒト、ウシ、マウス以外の哺乳動物を診断対象とする場合においても、同様にして各哺乳動物Ｆａｓ蛋白質を調製し、酵素免疫測定用の抗原として使用することができる。また、各哺乳動物における分泌型Ｆａｓ、細胞膜内部分Ｆａｓ、細胞膜外部分Ｆａｓ、及びこれらの部分フラグメントＦａｓ（ペプチド）などについても、上述したそれぞれヒトの分泌型Ｆａｓ、細胞膜内部分Ｆａｓ、細胞膜外部分Ｆａｓ、及びこれらの部分フラグメントＦａｓ（ペプチド）の場合と同様にして調製し、酵素免疫測定用の抗原として適用可能である。
【００３６】
本第２の実施形態における、検出材の一部として含むことができる酵素免疫測定用の抗体としては、上述した各診断対象哺乳動物の抗原（細胞膜貫通部分を含むＦａｓ、分泌型Ｆａｓ、細胞膜内部分Ｆａｓ、細胞膜外部分Ｆａｓ、及びこれらの部分フラグメントＦａｓ、Ｆａｓリガンド結合体Ｆａｓ等）を用い、ウサギ、ヤギなどの免疫用動物に感作、免疫して得られる抗血清から精製したポリクローナル抗体、又は、免疫動物の脾臓など抗体産生細胞とミエローマを細胞融合し、ＨＡＴ培養液などで選択培養して得られるハイブリドーマからクローニングされた所望の抗体を産生するハイブリドーマクローンを用いて調製したモノクローナル抗体や、Ｆａｓモノクローナル抗体遺伝子を大腸菌、酵母などに導入し産生されたモノクローナル抗体など、如何なる公知の抗体作製法により作製された各種抗体であっても適用できる。このような抗体の作製条件は、例えば、〔非特許文献８〜１２〕、〔特開平１１−１７１９００号公報〕、〔Ｈａｒｌｏｗ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕、〔日本生化学会編、「新生化学実験講座１；タンパク質ＩＶ」、東京化学同人（１９９２）〕、〔黒木登志夫ら、「実験医学別冊  細胞工学ハンドブック」、羊土社（１９９２）〕などに準じて作製することができる。
【００３７】
本第２の実施形態では、検出材の一部として含むことができる酵素（標識）剤、発色基質剤等としては、第１の実施形態の発色標識剤に示した酵素（標識）剤、発色基質剤の外、発色補助剤、ｐＨ緩衝剤なども用いることができる。酵素（標識）剤又は発色基質剤については、上述した酵素免疫測定用の抗原又は抗体に標識することができ、その標識方法としては、例えば、過ヨウ素酸法、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法など公知の如何なる標識方法によっても標識することが可能である。このような、標識方法の詳細条件については、〔石川英治ら、「酵素免疫測定法」医学書院（１９８７）〕、〔Ａｖｒａｍｅａｓ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｅｌｓｅｖｉｒ  Ｖｏｌ．１８、（１９８３）〕、〔Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１９８４）〕などに準じて行うことができる。
【００３８】
本第２の実施形態の体外診断キットにおいては、上述の検出材以外に別途、抗Ｆａｓ抗体標準品として、上述した酵素免疫測定用の抗体から適宜選定した抗Ｆａｓ抗体を備えることができ、これにより検量線を作成することにより生体由来材料検体中の抗Ｆａｓ抗体を定量又は半定量することが可能となる。このような抗Ｆａｓ抗体標準品は、診断対象哺乳動物のＦａｓ抗体とすることが望ましい。以上、本第２の実施形態における体外診断キット及び体外診断方法として、酵素免疫測定法による例について説明したが、上述のような酵素（標識）剤、発色基質剤に加えて、又は替えて、第１の実施形態における化学発光標識剤、生物発光標識剤、蛍光標識剤を用いることにより、それぞれ、化学発光（酵素）免疫測定法、生物発光（酵素）免疫測定法、蛍光（酵素）免疫測定法による体外診断キット及び体外診断方法とすることができる。また、酵素（標識）剤、発色基質剤に替えて、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなどの放射性同位元素標識剤を用いることにより、ラジオイムノアッセイ法による体外診断キット及び体外診断方法とすることも可能である。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の哺乳動物におけるプリオン病の体外診断キット及び体外診断方法について、試験例、実施例を示して具体的に説明するが、これによって本発明を限定するものではない。
【００４０】
〔試験例１〕：（プリオン病発症哺乳動物の生体由来材料の採取）
［Ｔ１−Ａ］：（ＰｒＰＳｃ感染マウス作出）
マウス型プリオン蛋白を欠きハムスター型プリオン蛋白を発現するＴｇ７マウス（［Ｐｒｉｏｌａ，  Ｓ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２８７，  ｐ１５０３（２０００）］等に作出方法が記載されている：雄ｎ＝３０、雌ｎ＝３０）を用い、ハムスタースクレイピー（ＰｒＰＳｃ）２６３Ｋを各マウスの脳内に注入することにより、ＰｒＰＳｃ感染マウスを作出した。予備飼育及びＰｒＰＳｃ注入後の飼育条件は、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）環境下とし、生後８週齢にて注射感染させた。また、ＰｒＰＳｃの注入条件は、２６３Ｋ罹患末期Ｔｇ７マウス脳より生理食塩水を用いて調製した１％脳乳剤、２０μｌ、注射部位右頭頂部脳内とした。また、対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＰｒＰＳｃに替えて、正常なＴｇ７マウスの１％脳乳剤を生理食塩水で作成し、この２０μＬをＰｒＰＳｃ感染マウスの場合と同様にＴｇ７マウス脳内に注射した。
【００４１】
［Ｔ１−Ｂ］：（血液採取）
各ＰｒＰＳｃ感染マウス、対照マウスにつき、注射後３５日目、５５日目（感染マウスでは死亡直前）において、それぞれ深麻酔下のもとに心臓から約２００μＬ採血し、遠心分離により血球を除去し、生体由来材料として各血漿検体を得た。
［Ｔ１−Ｃ］：（脳病理解析）
各ＰｒＰＳｃ感染マウスは、注射後１週間毎に安楽死させ、直ちに解剖して脳組織の病理検査を行った。その結果、注射後（感染後）３５日目頃より脳内に異常プリオン蛋白の沈着が観察されることを確認した。
【００４２】
〔実施例１〕：（ポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動）
試験例１（Ｔ１−Ｂ）で得られた生体由来材料としての各血漿検体につき、それぞれ蒸留水で１０倍希釈して液体窒素で凍結し、−３０℃の冷凍庫にて保存した各血漿希釈凍結液を、用時、再融解し、各試料血漿希釈液又は対照血漿希釈液として用いた。本実施例では、第１の実施形態における２次元電気泳動法：第１次元目にｐＨグラジエント（勾配）ポリアクリルアミドゲルを用いたＩＥＦ、第２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、各血漿検体中の生体由来成分を分離し、染色標識剤としてＣＢＢ−Ｒ２５０を含む検出材を用いて検出した。詳細な実施条件は以下に示すとおりとした。
【００４３】
［Ｅ１−Ａ］：（第１次元目ＩＥＦ用ゲルの調製）
第１次元目ＩＥＦ用ゲルとして、用時、膨潤化液にて膨潤させる乾燥タイプ、ストリップ状（細長板状）の固定化ｐＨグラジエント（ＩＰＧ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐＨ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）ゲル、ここでは、ｐＨ３〜１０のｐＨ勾配レンジ、長さ１１ｃｍのＩＰＧストリップ（ＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅＴＭ  Ｄｒｙ  Ｓｔｒｉｐｓ  ｐＨ３−１０，１１ｃｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。総液量２００μＬになるように、各試料血漿希釈液又は対照血漿希釈液２０μＬに、それぞれ膨潤用溶液［  １．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８；関東化学社製）、８Ｍ  尿素（Ｕｒｅａ；関東化学社製）、２％ＣＨＡＰＳ（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；和光純薬社製）、ＢＰＢ（微量、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ；関東化学社製）、ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、半井薬品社製）７ｍｇ／２．５ｍｌ、０．５％ＩＰＧバッファー（ＩＰＧ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ３−１０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）］１８０μｌを混合し、室温で３０分間反応させた後、各膨潤化液とした。各膨潤用トレーにそれぞれ膨潤化液を添加し、第１次元目ＩＥＦ用ゲル（ＩＰＧストリップ）面を液面に着くように置いた。ゲルの乾燥を防ぐためシリコンオイル（ＫＦ９６Ｌ−１．５ＣＳ；信越化学工業株式会社製）で覆い、約１８時間膨潤した。
【００４４】
［Ｅ１−Ｂ］：（第１次元目電気泳動）
恒温循環装置（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を予め２０℃に設定しておき、泳動中のゲル表面へのＵｒｅａの結晶生成を未然に防ぐため、［Ｅ１−Ａ］において膨潤させた各ＩＰＧストリップ表面に再蒸留水をかけて洗った後、恒温循環装置にＩＰＧストリップをセットし、３００Ｖで１分間、１０００Ｖで１時間３０分間、さらに３０００Ｖで２時間３５分間通電し電気泳動を行った。この第１次元目電気泳動済のＩＰＧストリップは、引続き第２次元目電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実施しない場合には、−３０℃にて保存した。
【００４５】
［Ｅ１−Ｃ］：（第２次元目電気泳動）
予め恒温循環装置（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を１５℃に設定し、第２次元目電気泳動に必要な試薬をゲルに導入するために、ゲルの平衡化を行った。ＳＤＳ平衡化用バッファー［５０ｍＭ  １．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．８；関東化学社製）、３０％グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ；キシダ化学社製）、２％ＳＤＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、６Ｍ  尿素（Ｕｒｅａ；関東化学社製）、ＢＰＢ（微量、Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ；関東化学社製）］１０ｍＬにつき、１００ｍｇのＤＴＴを加えた第１平衡化溶液に、［Ｅ１−Ｂ］により得た第１次元目電気泳動済のＩＰＧストリップを入れ、３０分間振盪した。さらに、ＳＤＳ平衡化用バッファー１０ｍｌにつき、ヨードアセトアミド２５０ｍｇを加えた第２平衡化溶液にＩＰＧストリップを移し、３０分間振盪した。その後、ＩＰＧストリップを湿らせたろ紙の上に置き、余分な平衡化溶液を除いた。予め、恒温循環装置（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩＩ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を１５℃に設定し、第２次元目（グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用ゲル（Ｅｘｃｅｌ  ＧｅｌＴＭ  ＳＤＳ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ８−１８；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を恒温循環装置にセットし、この第２次元目用ゲル表面に、平衡化したＩＰＧストリップのゲル面が直接接触するようにのせ、２０ｍＡで３０〜３５分間電気泳動した後、ＩＰＧストリップを取り除き、５０ｍＡで１時間通電し、電気泳動した。これをＣＢＢ−Ｒ２５０（ナカライテスク株式会社製）染色液（０．１％ＣＢＢ−Ｒ２５０、５０％メタノール、１０％酢酸）を用いて染色した後、脱色液（１０％メタノール、７％酢酸）で脱色した。また、検出した各スポットの分子量は、フォスフォリラーゼｂ（９７ｋＤａ）、アルブミン（６６ｋＤａ）、卵白アルブミン（４５ｋＤａ）、カルボニックアンハイドラーゼ（３０ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、α−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）を含む分子量マーカー（Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して測定した。
【００４６】
［Ｅ１−Ｄ］：（特異蛋白質の分取・トリプシン消化）
試験例１におけるＰｒＰＳｃ感染マウス（脳内注射後４０日目）、対照マウス（脳内注射後４０日目）から得られた各血漿検体について、［Ｅ１−Ａ］〜［Ｅ１−Ｃ］によりポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動を行った場合のエレクトロフォレトグラムを図１に示した。また、図１において、ＰｒＰＳｃ感染マウスに特異的なスポットのうち、矢印を付した３個のスポット（ｐＩ中性側からＳｐｏｔ１〜Ｓｐｏｔ３：分子量約３０ｋＤａ、ｐＩ約５〜６）付近を部分拡大し、図２に示した。なお、図示を省略するが、Ｓｐｏｔ１〜Ｓｐｏｔ３の各特異スポットの量（染色濃度、大きさ）は、脳内注射後３５日目のＰｒＰＳｃ感染マウスにおける血漿検体に比してそれぞれ微増することが確認された。この３個の特異スポット部分のゲルをカッター（剃刀）で個別に切り出し分取した。切り出した各特異スポットゲルをそれぞれさらに細断粉砕した後、各特異スポットゲル毎に２００μＬの５０％アセトニトリル水溶液で１５分間、続いて同量のアセトニトリル（１００％）で１５分間洗い、一旦完全に乾燥させた。次に、乾燥させた各特異スポットゲル毎に、２．５ｎｇ／μＬのトリプシン（シークエンスグレード修飾トリプシン；プロメガ社製）と５ｍＭ塩化カルシウムを含んだ５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液に２０分間浸して、膨潤させ、ゲルに浸潤しないで余った液を取り除き、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を加え、３７℃、１５時間反応させ、ゲル内トリプシン消化を行った。各上清液を質量分析：（ｎａｎｏ）ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−ＭＳ／ＭＳに供した。
【００４７】
［Ｅ１−Ｅ］：（特異蛋白質のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ試験、解析）
［Ｅ１−Ｄ］において得られた各上清液につき、マイクロピペットチップの先端部に逆相担体が担持されたインチップカラム（ＺｉｐＴｉｐＣ１８；ミリポア社製）に吸着させ、６０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶液で溶出して、各上清液の塩を除去した。Ｑフィルター−飛行時間型ＭＳ／ＭＳ質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｌｏｂａｌ；マイクロマス社製）を用いて、質量分析を行い、結果の解析はＮＣＢＩｎｒデータベース（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から、マスコットサーチプログラム（ＭＡＳＣＯＴ；マトリックスサイエンス社）を使って検索・解析した（ジーンワールド株式会社委託）。この解析結果から、各特異スポット；Ｓｐｏｔ１〜Ｓｐｏｔ３に相当する特異蛋白質は、図３に示す抗Ｆａｓ抗体のＦａｂ部分のアミノ酸配列に一致するペプチドフラグメントを有し、抗Ｆａｓ抗体を含むことが確認された。従って、第１の実施形態による体外診断キット及び体外診断方法では、例えば、所定量の抗Ｆａｓ抗体（各対象哺乳動物に対するＦａｓ抗体標準品等）について、各血漿検体の場合と同様に試験を実施し、この抗Ｆａｓ抗体や対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）の試験結果（分子量、ｐＩ、保持時間、測定量（濃度）など）との比較から、各血漿検体に含まれる抗Ｆａｓ抗体を定性的乃至定量的に検出することによって、質量分析を行うことなくプリオン病の生前診断が可能である。
【００４８】
〔実施例２〕：（ＥＬＩＳＡ）
本実施例は、第２の実施形態における酵素免疫測定法のうち、ヘテロジニアス−固相法（ＥＬＩＳＡ）による哺乳動物プリオン病の体外診断キット及び体外診断方法の例であり、固相にマイクロプレート（ＥＬＩＳＡ用９６ウェルマイクロプレート；Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ  ２５８０１、コーニング社製）、検出材として、酵素免疫測定用の抗原にヒトＦａｓ蛋白質（遺伝子組換可溶性ヒトＦａｓ蛋白質；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｆａｓ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、発色標識剤として、酵素標識剤にペルオキシダーゼ（西洋わさびペルオキシダーゼ：ＨＲＰ）を適用して標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体；ＰＩＥＲＣＥ社製）、及び発色（基質）剤として、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（３，３′，５，５′−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＥＬＩＳＡ；ＳＩＧＭＡ社製）を含む測定系構成とした。また、検量線作成用の抗Ｆａｓ抗体標準品として、マウス抗ヒトＦａｓ抗体（精製マウス抗ヒトＦａｓ蛋白質抗体；Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆａｓ（ＣＤ９５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、試験例１（Ｔ１−Ｂ）で得られた生体由来材料としての各血漿検体につき、正常マウス血漿をブランクとして抗Ｆａｓ抗体濃度（検出量）を測定した。詳細な実施条件は以下に示すとおりとした。
【００４９】
［Ｅ２−Ａ］：（固相化マイクロプレート調製）
酵素免疫測定用のヒトＦａｓ抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）にて１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、マイクロプレートの各ウェル（ｗｅｌｌ）に１００μＬずつ分注し、４℃で終夜インキュベートして固相化した。プレートのブロッキングはブロッキング液（ブロックエース；大日本製薬社製）を使用して室温で１時間３０分インキュベートすることにより行い、プレートの洗浄には、ＰＢＳにポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０；和光純薬社製）を０．０５％（Ｖ／Ｖ）添加したプレート洗浄液Ａを用いた。
【００５０】
［Ｅ２−Ｂ］：（検量線作成及び抗Ｆａｓ抗体濃度測定）
抗Ｆａｓ抗体標準品を正常マウス血漿希釈液（正常マウス血漿をＰＢＳで４００倍に希釈）で１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬに希釈し、それぞれ検量線作成用の抗Ｆａｓ抗体標準液とした。試験例１（Ｔ１−Ｂ）で得られた生体由来材料としての各ＰｒＰＳｃ感染マウス、対照マウスについての各血漿検体をＰＢＳで４００倍に希釈し、それぞれ、各ＰｒＰＳｃ感染マウス血漿希釈試料液、各対照マウス血漿希釈試料液とした。ブランクについても同様にＰＢＳで４００倍に希釈し、ブランク液とした。各抗Ｆａｓ抗体標準液、各ＰｒＰＳｃ感染マウス血漿希釈試料液、各対照マウス血漿希釈試料液、及びブランク液につき、［Ｅ２−Ａ］により調製した固相化マイクロプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し（３重測定：各標準液、各試料液及びブランク液毎に３ウェルずつ使用）、３７℃で１時間インキュベートした後、プレート洗浄液Ｂ（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ）にて洗浄した。続いて、酵素標識剤についてブロッキング液の１０倍希釈液で１００００倍に希釈した酵素標識剤希釈液を各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１時間インキュベートした後、プレート洗浄液Ａにて洗浄した。次に、発色剤を各ウェルに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、遮光して室温で３０分間インキュベートした後、各ウェルに０．５Ｍ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、攪拌してから４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５１】
試験例１における、脳内注射後３５日目（３５−１３）及び感染末期（Ｔ−１、Ｔ−５：死亡直前のマウス２匹）のＰｒＰＳｃ感染マウス、並びに対照マウス（Ｃ−２、Ｃ−７：脳内注射後５５日目マウス２匹）から得られた各血漿検体について、［Ｅ２−Ａ］、［Ｅ２−Ｂ］により抗Ｆａｓ抗体濃度を測定した場合の結果を表１に示した。また、検量線は図４に示したとおりである。本実施例の結果（表１）から、脳内注射後３５日目のＰｒＰＳｃ感染マウスの血漿検体中の抗Ｆａｓ抗体検出量は、対照マウス血漿検体中検出量の約５倍であり、感染末期マウス血漿検体では約２５倍となり、抗Ｆａｓ抗体が増加していることが確認された。したがって、第２の実施形態における体外診断キット及び体外診断方法により、哺乳動物プリオン病の生前診断が可能である。
【００５２】
【表１】
2006038536.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の体外診断キット及び体外診断方法は、哺乳動物プリオン病以外に、球脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、パーキンソン病、レヴィー（ｌｅｗｙ）小体型痴呆症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、ダウン症、家族性筋萎縮性側索硬化症、エフ・ティ・ディ・ピー−１７（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上皮性麻痺、皮質基底核変性症、ピック（Ｐｉｃｋ）病、家族性痴呆症などの退行性神経変性疾患のスクリーニングにも適用可能である。また、各プリオン病を含む神経変性疾患に特異的な診断マーカーと組み合わせることにより、各神経変性疾患毎の生前診断を行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】試験例１におけるＰｒＰＳｃ感染マウス及び対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）マウスから得られた各血漿検体について、実施例１による２次元電気泳動を行った場合のエレクトロフォレトグラムを示す図面代用写真である。
【図２】図１におけるＰｒＰＳｃ感染マウスに特異的なスポットのうち、矢印を付した３個のスポット（Ｓｐｏｔ１〜Ｓｐｏｔ３）付近を部分拡大した図面代用写真である。
【図３】図１及び図２における３個の特異スポットについての各トリプシン消化物に含まれ、抗Ｆａｓ抗体のアミノ酸配列に一致するペプチドフラグメントのアミノ酸配列を示す図である。
【図４】実施例２の酵素免疫測定系（ＥＬＩＳＡ）における抗Ｆａｓ抗体の検量線を示す図である。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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