(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子クローニングおよび発現のための多重欠損アデノウイルスベクター系と相補的細胞系を提供する。【解決手段】多重欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域およびＥ４領域、あるいは、Ｅ１領域：Ｅ２Ａ領域およびＥ４領域を欠損させ、欠損したＥ１領域に外来遺伝子を挿入することからなる。また、細胞系は、アデノウイルスのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域およびＥ４領域の必須の遺伝子機能における欠損を、トランスに相補する細胞ゲノムを有する２９３細胞系よりなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスのＥ１領域の１以上の必須の遺伝子機能における欠損およびアデノウイルスのＥ４領域の１以上の必須の遺伝子機能における欠損をトランスに相補する細胞ゲノムを有する２９３細胞。
【請求項２】
アデノウイルスのＥ１領域の１以上の必須の遺伝子機能における欠損ならびにアデノウイルスのＥ２ＡおよびＥ４領域の１以上の必須の遺伝子機能における欠損をトランスに相補する細胞ゲノムを有する２９３細胞。
【請求項３】
核ゲノムにアデノウイルスゲノムのＥ４領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６（誘導可能または抑制可能なプロモーターに機能的に連結している）が挿入されている（Ｅ４領域の他のＯＲＦは挿入されていない）２９３細胞系であって、アデノウイルスゲノムのＥ１領域およびＥ４領域に欠損があるアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターをトランスに相補する細胞系。
【請求項４】
該細胞株が２９３／ＯＲＦ−６である請求項３記載の細胞系。
【請求項５】
異種誘導プロモーターの制御下におかれたアデノウイルスゲノムのＥ４領域のＯＲＦ６を含むプラスミド。
【請求項６】
アデノウイルスベクターＡｄＧＶ．１２。
【請求項７】
アデノウイルスベクターＡｄＧＶ．１３。
【請求項８】
変異アデノウイルスゲノムを含む血清５型アデノウイルスベクターであって、変異アデノウイルスゲノムが、
（ａ）ヌクレオチド４５４−３３２５を含むアデノウイルスゲノムのＥ１領域を欠損させること、
（ｂ）ヌクレオチド３２８１１−３５６４０を含むアデノウイルスゲノムのＥ４領域を欠損させること、および
（ｃ）欠損したＥ１領域に外来遺伝子を挿入することにより構成される、前記ベクター。
【請求項９】
変異アデノウイルスゲノムを含む血清５型アデノウイルスベクターであって、変異アデノウイルスゲノムが、
（ａ）ヌクレオチド４５４−３３２５を含むアデノウイルスゲノムのＥ１領域を欠損させること、
（ｂ）アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域を欠損させること、
（ｃ）ヌクレオチド３２８１１−３５６４０を含むアデノウイルスゲノムのＥ４領域を欠損させること、および
（ｄ）欠損したＥ１領域に外来遺伝子を挿入することにより構成される、前記ベクター。
【請求項１０】
複製可能なアデノウイルスが存在しない組換えアデノウイルスベクターの保存株であって、該アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域およびＥ４領域からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの１以上の領域の１以上の必須の遺伝子機能に欠損があるものである保存株。
【請求項１１】
組換えアデノウイルスベクターおよび医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物であって、各組換えアデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２Ａ領域およびＥ４領域からなる群より選択されるアデノウイルスゲノムの１以上の領域の１以上の必須の遺伝子機能に欠損があるものである組成物（該医薬組成物は複製可能なアデノウイルスを含まない）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９４年６月１０日に出願された同時係属中の米国特許出願第０８／２５８，４１６号の一部継続出願である。本発明は、組換え多重欠損アデノウイルスベクターおよび当該ベクターの培養に有用な相補的細胞系に関する。さらに、本発明は、該ベクターの医療的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９５２〜１９５３年の冬から春にかけて、国立衛生研究所（ＮＩＨ）のロウとその共同研究者らは、ワシントン特別区に住む幼児から外科的に切除されたアデノイド（腺様増殖組織）を取得し、組織培養を行った（Roweら，Proc．Soc．Exp．Biol．Med.，84，570-573(1953)）。数週間後、該培養の多くが上皮細胞の破壊を特徴とする進行性の変性を示し始めた。この細胞変性効果は培養濾液によって、樹立されたヒト細胞系の組織培養物に連続的に伝達することができた。該細胞変性剤は「アデノイド変性」（Ａｄ）剤と呼ばれた。「アデノウイルス」の名前は、最終的に、これらの薬剤に一般的に使われる名称になった。アデノウイルスの多くの原型株−その中の幾つかは呼吸疾患を引き起こす−の発見がこれら最初の発見に続いた［Roweら，上述；Dingleら，Am．Rev．Respir．Dis.，97, 1-65(1968)；Horwitz，「アデノウイルス科とそれらの複製」(Adenoviridae and Their Replication),ウイルス学（Virology）（Fieldsら編，レイヴン出版社，ニューヨーク，第２版，1990年），1679-1721 頁に総説］。
【０００３】
ヒトから４０を越すアデノウイルスサブタイプが単離されており、さらに加えて５０を越すサブタイプが他の哺乳類又は鳥類から単離されている（Ishibashi ら，「動物のアデノウイルス」(Adenoviruses of animals)，アデノウイルス(The Adenoviruses)，Ginsberg 編，プレナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州，497-562 頁，（1984年）；Strauss，「ヒトにおけるアデノウイルス感染」（Adenovirus infections in humans），アデノウイルス(The Adenoviruses)，Ginsberg編，プレナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州，451-596 頁，（1984年））。これらのサブタイプは全てアデノウイルス科に属し、現在のところ２つの属、すなわちマストアデノウイルス属とアビアデノウイルス属とに分けられている。
【０００４】
全てのアデノウイルスは形態的および構造的に類似している。しかしながら、ヒトにおいては、アデノウイルスは互いに異なる免疫学的特性を有するがために、血清型に分けられている。２つのヒトアデノウイルス血清型、すなわち、Ａｄ２とＡｄ５は徹底的に研究されてきた。これらの研究によりアデノウイルス一般についての情報の大部分が提供された。
【０００５】
アデノウイルスはエンベロープを有さず、正二十面体で直径が６５〜８０ｎｍ、外部キャプシドと内部コアから成る。キャプシドは、２０の三角形の表面すなわち切子面と１２の頂点から成る（Horne ら，J．Mol．Biol.，1，84-86(1959)）。切子面はヘキソンで、頂点はペントンで構成されている。各頂点からファイバーが突出している。ヘキソン、ペントンおよびファイバーに加えて、８つの微量の構造ポリペプチドがあるが、それらの大多数の正確な位置は不明である。ある微量ポリペプチド成分、すなわち、ポリペプチドIXは、各切子面の９群中心（the group-of-nine center）といわれる場所において、ヘキソン−ヘキソンの接点を安定化させ得る位置で結合している（Furcinittiら，EMBO，8，3563-3570（1989））。微量ポリペプチドVIおよびVIIIは、隣接する切子面間のヘキソン−ヘキソンの接点を安定化させると信じられている。微量ポリペプチドIIIAは、頂点の領域に位置することが知られているが、キャプシドとコアとを繋いでいることがStewart ら（Cell，67，145-154(1991)）によって示唆されている。
【０００６】
ウイルスコアは、単離物によっては長さが１０３塩基対〜１６３塩基対と変化することが観察されている逆位末端反復配列（ＩＴＲｓ）を有する直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子を含有すると言われている（Garon ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，69，2391-2394（1972）；Wolfson ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，69，3054-3057（1972）；Arrandら，J．Mol．Biol.，128，577-594（1973）；Steenbergら，Nucleic Acids Res.，4， 4371-4389（1977）；およびTooze，ＤＮＡ腫瘍ウイルス（DNA Tumor Viruses ），第２版，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク：コールドスプリングハーバー研究所，943-1054頁，（1981年））。ＩＴＲはＤＮＡの複製起点を担持する（Garon ら，上述；Wolfson ら，上述；Arrandら，上述；Steenberg ら，上述）。
【０００７】
ウイルスＤＮＡは４つのポリペプチド、すなわち、V，VII，μおよび末端ポリペプチド（ＴＰ）と結合している。５５ｋｄのＴＰはｄＣＭＰを介してＤＮＡの５’末端に共有結合している（Rekoshら，Cell，11，283-295（1977）；Robinsonら，Virology，56，54-69(1973)）。他の３つのポリペプチドはＤＮＡに非共有結合的に結合してキャプシドの小さな容量に合うようにＤＮＡを折り畳んでいる。ＤＮＡはヌクレアーゼ消化パターンからわかるように細胞のヌクレオソームに類似した構造にパッケージングされているらしい（Cordenら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，73，401-404（1976）；Tateら，Nucleic Acids Res.，6，2769-2785（1979）；Mirza ら，Biochim．Biophys．Acta，696，76-86（1982））。
【０００８】
アデノウイルスゲノムの全体的な構造は血清型を通して保たれており、特定の機能は同様な位置に置かれている。Ａｄ２およびＡｄ５のゲノムは完全に配列決定されており、他の血清型由来のゲノムの選択された領域の配列も入手可能である。
アデノウイルスは、細胞膜上の特定の受容体にファイバーを付着させることにより細胞感染を始める［Londberg-Holm ら，J．Virol.，4，323-338（1969）；Morganら，J．Virol.，4，777-796（1969)；Pastanら，「アデノウイルスの細胞への侵入：古い問題に関するいくつかの新しい観察」(Adenovirus entry into cells: some new observations on an old problem)，ウイルス病原の概念（Concepts in Viral Pathogenesis），Notkins ら編，シュプリンガー−フェアラーク，ニューヨーク，ニューヨーク州，141-146 頁，（1987年）］。次いで、ペントンベースがアデノウイルスインテグリン受容体に結合する。それから、受容体と結合したウイルスは原形質膜から、エンドサイトーシス小胞又はレセプトソームを形成する、クラスリンで被覆された窪みに移動し、そこでＰｈが５．５に落ちる［Pastanら，ウイルス病原の概念（Concepts in Viral Pathogenesis）,Notkins and Oldstone編，シュプリンガー−フェアラーグ，ニューヨーク，141-146 頁，（1987年）］。Ｐｈの降下がウイルス表面の外形を変化させ、その結果レセプトソームが破裂してウイルスが細胞の細胞質中に放出されると信じられている。ウイルスＤＮＡは、核に輸送される間、細胞質中では部分的に被覆されていない、すなわち、部分的に結合タンパク質が外れている。
【０００９】
ウイルスが核孔に達すると、ウイルスＤＮＡは、残りのタンパク質のほとんどを細胞質に残して核に入る（Philipson ら，J．Virol.，2，1064-1075(1968)）。しかしながら、ウイルスＤＮＡは完全にタンパク質を持たないわけではなく、少なくともウイルスＤＮＡの一部は少なくとも４つのウイルスポリペプチド、すなわち、V，VII，TPおよびμと結合しており、ウイルスＤＮＡ−細胞ヒストン複合体に転化される（Tateら，Nucleic Acids Res.，6，2769-2785（1979））。細胞感染からウイルス粒子産生へのサイクルは１〜２日続き、結果として細胞あたり１万に達する感染性粒子が産生される（Green ら，Virology，13，169-176(1961)）。アデノウイルスの感染過程はウイルスＤＮＡの複製によって分けられる、初期（Ｅ）および後期（Ｌ）の相に区分される。もっとも、初期相の間に起こる事のいくつかは後期相の間にも起こり、その逆もある。ウイルス遺伝子の一時的な発現を十分に記述するためにさらに下位区分がなされている。
【００１０】
初期相の間に、細胞内に存在する全ＲＮＡのうちの小さな割合を占めているウイルスｍＲＮＡが、細胞核に存在するアデノウイルスＤＮＡの両方の鎖から合成される。少なくとも、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４およびＭＬＰ−Ｌ１と命名された５つの領域が転写される［Lewis ら，Cell，7，141-151（1976）；Sharp ら，Virology，75，442-456（1976）；Sharp，「アデノウイルスの転写」（Adenovirus transcription），アデノウイルス（The Adenoviruses），Ginsberg編，プレナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州，173-204 頁，1984年）］。それぞれの領域は少なくとも１つの明瞭なプロモーターを有し、プロセスされて複数のＭＲＮＡ種を生じる。
【００１１】
初期（Ｅ）領域の産物は、（１）他のウイルス成分の発現に制御的な役割を果たし、（２）細胞のＤＮＡ複製およびタンパク質合成の一般的な停止に関与し、および（３）ウイルスＤＮＡの複製に必要である。初期ｍＲＮＡの転写を調節する複雑な一連の出来事は、Ｅ１Ａ、Ｌ１および１３．５ｋｄ遺伝子を含むある特定の、すぐの初期領域の発現で始まる［Sharp(1984)，上述，に総説されている；Horwitz(1990)，上述］。遅延初期領域であるＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３およびＥ４の発現はＥ１Ａ遺伝子産物に依存する。３つのプロモーター、７２マップ単位（ｍｕ）にあるＥ２プロモーター、タンパク質ＩＸプロモーターおよびＩＶａプロモーターは、ＤＮＡ複製の開始によりエンハンスされるがそれに依存しない（Wilsonら、Virology，94，175-184(1979)）。それらの発現はウイルスの遺伝子発現の移行期を特徴づける。初期遺伝子発現のカスケードの結果、ウイルスＤＮＡの複製が開始される。
【００１２】
アデノウイルスＤＮＡの複製は、ゲノムのどちらかの末端にある複製起点から、５’から３’方向への連続的合成によって親の一本鎖を置換する［Kelly ら，「ウイルスのＤＮＡ複製の開始」（Initiation of Viral DNA replication），ウイルス研究の進歩（Advances in Virus Research），Maramorosch ら編，アカデミック出版社，サンディエゴ，カリフォルニア州，34，1-42 1988年）；Horwitz(1990)，上述；Van derVliet，「生体外におけるアデノウイルスＤＮＡの複製」（Adenovirus DNA replication in vitro），真核細胞の核（The Eukaryotic Nucleus），Strauss ら編，テルフォード出版，カルドウェル，ニュージャージー州，1，1-29，（1990年），に総説されている］。Ｅ２由来のコードされている３つのウイルスタンパク質：（１）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）、（２）アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ（Ａｄ ｐｏｌ）、および（３）プレ末端タンパク質（ｐＴＰ）はアデノウイルスＤＮＡ合成に必須である。これら必須のタンパク質に加えて生体外の実験によって多くの宿主細胞因子がＤＮＡの合成に必要であることが確認されている。
【００１３】
ＤＮＡ合成はｄＣＭＰ分子のｐＴＰのセリン残基への共有結合的接着によって開始する。それからｐＴＰ−ＤＣＭＰ複合体はＡｄ ｐｏｌが伸長するためのプライマーとして機能する。置換された親の一本鎖は逆位末端反復配列の塩基の対合によってフライパンの柄のような構造を形成することができる。この末端の２重の構造は親ゲノムの末端と同一であり、相補鎖合成の開始の起点として機能できる。
【００１４】
ウイルスＤＮＡの複製の開始が後期相に入るのに必須のように思われる。ウイルス感染の後期相はウイルス構造ポリペプチドおよびキャプシドの構築に関わる非構造タンパク質の大量産生によって特徴付けられる。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）が十分に活性となり、１６．５ｍｕで始まりゲノムの末端付近で終結する転写産物を産生する。この長い転写産物の転写後のプロセッシングは後期ｍＲＮＡの５つの系統をもたらし、それぞれＬ１からＬ５と命名される（Shawら，Cell，22，905-916(1980)）。初期相から後期相への変遷を制御し、又結果としてそのような転写産物の利用における劇的な変遷を生じる機構は明らかでない。
【００１５】
一次感染ウイルスの後期の転写が活性である時は、後期転写は重感染ウイルスからは起こらないので、ＤＮＡ複製の条件はＤＮＡ鋳型がシス特性であるかもしれない（Thomasら，Cell，22，523-533(1980)）。
ウイルス粒子の構築は、個々のポリペプチド鎖から主要な構造単位を組み立てる最初のステップから複雑なプロセスである［Philipson，「アデノウイルスの構築」（Adenovirus Assembly），アデノウイルス（The Adenoviruses），Ginsberg編，プレナム出版，ニューヨーク，ニューヨーク州，309-337 頁，（1984年），に総説されている; Horwitz(1990)，上述］。ヘキソン、ペントンベースおよびファイバーは細胞質内での合成後、三量体のホモポリマー形態を構築する。１００ｋｄタンパク質はヘキソンの３量体化の為の骨格タンパク質として機能するようであり、得られたヘキソン三量体はヘキソンカプソマーと呼ばれる。
ヘキソンカプソマーは自己構築して空のキャプシドの殼を形成することができ、ペントンベースとファイバーの三量体は、構成成分が核内に存在するときは、結合してペントンを形成することができる。正二十面体の切子面は３つのヘキソンカプソマーで構成され、そのことはキャプシドが分離することでわかるが、９群中心ヘキソン形成の途中のステップは観察されていない。幾つかの構築中間体が温度感受性変異株を用いた実験により示されている。キャプシド構築の進行は５０ｋｄおよび３０ｋｄの骨格タンパク質に依存していると考えられる。裸のＤＮＡはおそらく、頂点の一つの開口部を通って完成状態に近いキャプシドに入り込む。該プロセスの最後の段階は、前駆ポリペプチドpVI、pVII、pVIIIおよびpTPのタンパク分解的なトリミングを含んでおり、それはキャプシド構造を安定化させ、該ＤＮＡをヌクレアーゼ処理に非感受性とし、成熟したウイルス粒子を産生する。
【００１６】
ある種の組換えアデノウイルスベクターが遺伝子治療に用いられている。１つあるいはそれ以上の組換え遺伝子を運搬するための組換えアデノウイルスベクターの使用は、治療を必要とする器官、組織あるいは細胞への１またはそれ以上の遺伝子の目的とする送達を可能にし、それにより体細胞の遺伝子治療のほとんどの場合に遭遇する送達に関する問題が克服される。さらに、組換えアデノウイルスベクターはアデノウイルスタンパク質の発現に宿主細胞の増殖を必要としない［Horwitz ら，ウイルス学（Virology），レイヴン出版，ニューヨーク，2，1679-1721，（1990年）；Berkner，BioTechniques，6，616(1988)］。さらにもし治療が必要な疾病器官が肺であれば、遺伝子情報の運びやとしてのアデノウイルスの使用は、アデノウイルスが通常気道上皮栄養性であるという点でさらに有利である［Straus，アデノウイルス（Adenoviruses），プレナム出版，ニューヨーク，451-496 頁，（1984年）］。
【００１７】
ヒトの遺伝子治療に使用可能なベクターとしてのアデノウイルスの他の長所は以下の通りである：（ｉ）組換えが稀であり；（ii）ヒトがアデノウイルスに感染することが頻繁にあるにもかかわらず、アデノウイルス感染からヒトへの悪影響に関連するものが今のところなく；（iii）現在、アデノウイルスゲノム（直鎖状で二本鎖ＤＮＡ）は、長さにして７．０〜７．５ｋｂまでの範囲の外来遺伝子を収容するように操作でき；（iv）アデノウイルスベクターはそれ自身のＤＮＡを細胞の染色体には挿入せず、そのためその効果は一時的で細胞の正常な機能を妨害することはありそうにもなく；（ｖ）アデノウイルスは脳や肺の細胞の様な、分裂せず、つまり最終分化を遂げた細胞に感染することができ；（vi）生アデノウイルス−必須な特徴として複製する能力を有している−がヒトワクチンとして安全に利用されている（Horwitz ら，上述；Berkner ら，J．Virol.，61，1213-1220（1987）；Straus，上述；Chanockら，JAMA，195，151（1966）；Haj-Ahmad ら，J．Virol.，57，267（1986）；およびBallayら，EMBO，4，3861(1985)）。
【００１８】
発現ベクターとして使うために、外来遺伝子をアデノウイルスゲノムの２つの主要な領域、すなわちＥ１およびＥ３領域に挿入して、単欠損アデノウイルスおよびそれ由来のベクターを得ている。Ｅ１領域への挿入は、相補細胞内での増殖あるいは完全なヘルパーウイルスの存在を必要とする欠損のある子孫を生み出す。それらは、損傷を受けたあるいは消失したＥ１領域の機能を代替する（Berkner ら，上述；Davidsonら，J．Virol.，61，1226-1239（1987）；およびMansourら，Mol．Cell Biol.，6，2684-2694(1986)）。ゲノムのこの領域は外来遺伝子の発現に最も頻繁に利用されている。
【００１９】
Ｅ１領域に挿入された遺伝子は種々のプロモーターの制御下におかれ、多くは発現カセットによっては大量に外来遺伝子産物を産生する。しかしながらこれらのアデノウイルスベクターは非相補的細胞系中では増殖しない。現在のところ、単欠損アデノウイルスに欠けている必須機能を相補する細胞系は２、３存在するのみである。それらの細胞系の例としては、ＨＥＫ−２９３（Grahamら，Cold Spring Harbor Sym．Quant．Biol.，39，637-650（1975））やＷ１６２（Weinbergら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80，5383-5386(1983)）およびgＭＤＢＰ（Klessig ら,Mol．Cell Biol.，4，1354-1362（1984）；Broughら，Virology，190，624-634（1992））が含められる。
【００２０】
外来遺伝子の挿入に有効であるとして上述したもう１つの領域、Ｅ３領域は組織培養中でのウイルスの増殖には非必須なので、この領域を外来遺伝子発現カセットで置換すると非相補的細胞系においても生産的に増殖できるウイルスが得られる。例えば、Ｅ３領域内へのＢ型肝炎表面抗原の挿入および発現、それに続くハムスターへの接種および抗体の形成が報告されている（Morinら，Proc．Natl.Acad．Sci．USA，84，4626-4630(1987)）。
【００２１】
単欠損アデノウイルスベクターの問題点は、外来遺伝子の挿入や発現に利用できるアデノウイルス内のスペース量を制限してしまうことである。現在存在している単欠損アデノウイルスベクターと相補的細胞系とに含まれているウイルス配列に類似性あるいは重複がある為に、組換え現象（上述の様に通常は極めて稀である）が起こり得、そしてベクター保存株中において、そのように繁殖した複製可能なウイルスを生み出すことがありうる。この現象が実際問題として、ベクターの保存株を遺伝子治療の目的で利用できないようにしている。
したがって、本発明の目的は外来ＤＮＡの、より大きな断片の挿入および発現に適応可能な多重欠損アデノウイルスベクターを提供することである。本発明の別の目的は該本発明の多重欠損アデノウイルスベクターを相補する細胞系を提供することである。さらに本発明の目的は又、多重欠損アデノウイルスベクターの組換え体およびそのような組換え体を用いる治療方法、特に遺伝子治療、予防接種などに関する治療方法を提供することである。本発明のこれらの、又他の目的および利点、又発明の他の特色は、以下の詳細な説明から明確になるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補的細胞系を提供する。該多重欠損アデノウイルスベクターは、現在入手可能な単欠損アデノウイルスベクターで可能とされる以上の、より大きな外来ＤＮＡの断片の挿入および発現に適応可能である。該多重欠損アデノウイルスベクターは又、複製に欠陥を有し、相補的細胞系中で繁殖あるいは増殖させた時の組換えに耐性であり、その特性が遺伝子治療および他の治療目的に特に望ましい。従って、本発明はさらに、組換え多重欠損アデノウイルスベクターおよびそのような組換え体の利用を含む治療方法、例えば遺伝子治療、予防接種などに関する治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は特に、遺伝子クローニングおよび発現のための多重欠損アデノウイルスベクターを提供する。本発明の多重欠損アデノウイルスベクターは、現在、入手可能な単欠損アデノウイルスベクターとは、アデノウイルスゲノムの少なくとも２つの領域に欠損があるという点で、又外来ＤＮＡのより大きな断片を受入れ、発現できるという点で異なっている。ここで用いられる「外来ＤＮＡ」という用語は、アデノウイルスゲノムにとって外来の、本発明のベクターに挿入されたいかなるＤＮＡ配列をも意味する。そのような外来ＤＮＡは遺伝子、遺伝子の部分あるいはその他のいかなるＤＮＡ配列を構成しても良く、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および／又はポリペプチドをコードする配列が含むがそれらに限定されない。
【００２４】
アデノウイルスゲノムの領域は１つあるいはそれ以上の遺伝子からなる。Horwitz（1990）、上述。そのような遺伝子は接着、浸透、脱外皮、複製、コアタンパク質、ヘキソン、ファイバー、ヘキソン関連タンパク質などのアデノウイルスの種々の構成成分や活性を仲介、促進、引き起こし、あるいはそのものである遺伝子産物をコードしている。例えば、前述の構成成分や活性のいくつかに、あるいは全てに関与するかもしれない欠損領域による一つの影響はアデノウイルスの繁殖が不能であることである。ここでは前述の構成成分や活性を遺伝子の機能と呼ぶこととする。
【００２５】
ここで用いられる、遺伝子あるいは遺伝子機能における欠損、すなわち、欠損した遺伝子、遺伝子領域もしくは領域とは、ウイルスゲノムの遺伝的な材料の欠失として定義され、ＤＮＡ配列が全体にもしくは部分的に欠失した遺伝子の機能を減ずるもしくは抹消するように、又ウイルスゲノムにとって外来のＤＮＡを挿入するためにウイルスゲノム内に余地もしくは容量を与える。そのような欠損は、非相補的な細胞宿主の組織培養中におけるアデノウイルスベクターの繁殖に必須な遺伝子内にあっても、又、必須でない遺伝子内にあっても良いが、該発明のウイルスベクターの欠損した遺伝子の、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つが繁殖に必須な遺伝子の欠損である。
いかなるサブタイプ、サブタイプの混合物又はキメラアデノウイルスを多重欠損アデノウイルスベクターの作製のためのＤＮＡの原料として用いてもよい。しかしながら、Ａｄ５ゲノムは完全に配列が決定されているので、本発明ではＡｄ５血清型について記載する。
【００２６】
本発明のアデノウイルスベクターはアデノウイルスゲノムの初期領域１（Ｅ１）、初期領域２Ａ（Ｅ２Ａ）および／又は初期領域２Ｂ（Ｅ２Ｂ）を含む初期領域２（Ｅ２）、初期領域３（Ｅ３）および初期領域４（Ｅ４）を含む初期領域の１つあるいはそれ以上によって与えられる機能を少なくとも欠損しているのが好ましい。Ｅ１領域における欠損は領域Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢあるいはＥ１ＡとＥ１Ｂの両方に存在する。本発明のアデノウイルスベクターは領域Ｅ２（すなわちＥ２Ａ、Ｅ２ＢあるいはＥ２ＡとＥ２Ｂの両方）、および／又はＥ３、および／又はＥ４における欠損と共に領域Ｅ１によって与えられる機能を少なくとも欠損しているのがさらに好ましい。
【００２７】
欠失した領域のいかなる１つもアデノウイルスにとって外来である外来遺伝子産物を生み出すためにプロモーター可変性発現カセットで置換してもよい。例えば、外来遺伝子のＥ２Ａ領域への挿入は、特異な制限部位の導入によって容易になされ、外来遺伝子産物はＥ２Ａプロモーターから発現され得る。
しかしながら本発明はゲノムの初期領域においてのみ遺伝子機能を欠損したアデノウイルスベクターに限定されない。ゲノムの後期領域に欠損のあるアデノウイルスベクター、ゲノムの初期および後期領域に欠損のあるアデノウイルスベクター、本質的に全てのゲノムが除かれているベクターも又包含される。この場合少なくともウイルスの逆位末端反復配列およびいくらかのプロモーターあるいはウイルスの逆位末端反復配列およびパッケージングシグナルのいずれかが完全に残されていることが好ましい。当業者であれば排除されるアデノウイルスゲノムの領域が大きいほど、より大きな外来性のＤＮＡの断片がゲノムに挿入できるということが認識できるであろう。例えば、３６ｋｂのアデノウイルスゲノムであれば、ウイルスの逆位末端反復配列といくらかのプロモーターを完全な形で残すと、アデノウイルスの許容量はおよそ３５ｋｂである。あるいは、ＩＴＲとパッケージングシグナルのみを有する多重欠損アデノウイルスベクターを作製することもできる。これにより、このベクターから３７−３８ｋｂの外来ＤＮＡの発現が効果的に予測されよう。
【００２８】
一般的に、ウイルスベクターは細胞内でのアデノウイルスＤＮＡ断片間での高レベルの組換えを期待して構築される。断片間で類似（あるいは重複）している領域を有しゲノムの完全長を構成しているアデノウイルスベクターの２つ又は３つの断片を細胞にトランスフェクションする。宿主細胞の組換え機構は前述の断片を組変えることによって完全長のウイルスベクターゲノムを構成する。種々の単一領域における改変を含む、ウイルスを構築するための他の好適な手法が以前に報告されており（Berkner ら，Nucleic Acids Res.，12，925-941（1984）；Berkner ら，Nucleic Acids Res.，11，6003-6020（1983）；Broughら，Virol.,190，624-634(1992)）、これらは多重欠損ウイルスの構築のために用いることができる。さらに他の好適な手法は、例えば生体外での組換えや連結も含む。
【００２９】
ウイルスベクター構築の最初の段階は標準的な分子生物学的な技術を用いて、プラスミドカセット内でアデノウイルスゲノムの特定の領域の欠失あるいは改変を構築することである。示量解析の後、この変化させたＤＮＡ（欠失あるいは改変を含む）はそれからアデノウイルスゲノムの１／２までを含むより大きなプラスミドに移される。次の段階は該プラスミドＤＮＡ（欠失あるいは改変を含む）およびアデノウイルスゲノムの大きな断片を受容細胞にトランスフェクトすることである。これら２つのＤＮＡ断片は合わせると、アデノウイルスゲノムと類似領域の全てを包含する。この類似領域内で組換え現象が起こり、欠失又は改変を含んでいる組換えウイルスゲノムが造られる。多重欠損ベクターの場合、受容細胞は組換え機能だけではなく、トランスフェクトされたウイルスゲノムには含まれていない失われたウイルス機能の全てを提供、すなわち組換えウイルスゲノムの全ての欠損を相補する。多重欠損ベクターは、例えばＩＴＲおよび／又はパッケージングシグナルの改造によってもさらに改変され、そのような多重欠損ベクターのみ、相補的細胞系において機能し、又増殖する。
【００３０】
加えて、本発明は、本発明の多重欠損アデノウイルスベクターの繁殖あるいは増殖のための相補的細胞系をも提供する。本発明の好ましい細胞系はアデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４領域を含む遺伝子機能の内の少なくとも１つの遺伝子機能を相補することで特徴付けられる。他の細胞系としては後期領域を含む遺伝子機能由来の少なくとも１つの遺伝子機能において欠損があるアデノウイルスベクターを相補するもの、初期および後期の遺伝子機能の組合わせを相補するもの、および全てのアデノウイルス機能を相補するものが含まれる。
【００３１】
当業者であれば選択する細胞系は、関心のある組換え多重欠損アデノウイルスベクターから欠失し、それらの機能を特異的に相補するものであり、標準的な分子生物学的技術を用いて製せられるものであることがわかるであろう。該細胞系はさらに相補的遺伝子を重複しないように含んでおり、それがベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組変えする可能性を最小限に、実質的に排除するということによってさらに特徴付けられる。従って、複製可能なアデノウイルスはベクター保存株からは排除され、従って特定の治療目的、特に遺伝子治療の目的に好適である。これは又非相補的細胞におけるアデノウイルスの複製をも排除する。
【００３２】
相補的細胞系は、組換えアデノウイルスベクターの高力価保存株を製する為には、２以上の欠損アデノウイルス遺伝子機能の産物を、それらの産物にとって適切なレベルで発現することが可能なものでなければならない。例えば、Ｅ２Ａ産物であるＤＢＰは、アデノウイルスＤＮＡの複製のためには、化学量論的なレベル、すなわちかなり高レベルで発現する必要があるが、Ｅ２Ｂ産物であるＡｄｐｏｌはアデノウイルスＤＮＡの複製のためには、触媒レベル、すなわち比較的低レベルでのみ発現する必要がある。組換えアデノウイルスベクターの高力価保存株を確実にするためには、産物のレベルを適切にしなければならないだけでなく、産物の時間的な発現を細胞の通常のウイルス感染において見られるものと矛盾がないようにしなければならない。例えば、ウイルスのＤＮＡ複製に必要な構成成分はウイルス粒子の構築に必要な構成成分よりも前に発現されなければならない。ウイルス産物の高レベルの発現にしばしば伴う細胞毒性を回避するために、又産物の時間的発現を調節するために、誘導プロモーター系が使用される。例えば、ヒツジのメタロチオネイン誘導プロモーター系が、完全なＥ４領域、Ｅ４領域の転写解読枠６、およびＥ２Ａ領域を発現するのに使用できる。他の好適な誘導プロモーター系の例には細菌のｌａｃオペロン、テトラサイクリンオペロン、Ｔ７ポリメラーゼ系、および真核生物と原核生物の転写因子、抑制因子やその他の構成成分を組み合わせたものやキメラ構築物があるが、これらのものに限定されない。発現されるべきウイルス産物に高い毒性があるときは、２つに分かれた誘導系を用いることが好ましく、ここでインデューサーはウイルスベクター内に保持され、誘導産物は相補的細胞系の染色質内に保持される。テトラサイクリン発現系やｌａｃ発現系の様な、抑制性／誘導性発現系も又使用してよい。
【００３３】
トランスフェクトされた細胞の小さな部分に入り込むＤＮＡは、より小さな分画内でさえも安定に維持されるようになる。１つあるいはそれ以上のトランスフェクトされた遺伝子を発現している細胞系の単離は、例えば抗生物質、薬物あるいはその他の化合物に対する耐性を与える第２の遺伝子（マーカー遺伝子）を同じ細胞に導入することによって達成される。この選別は、抗生物質、薬物あるいはその他の化合物の存在下では、移入された遺伝子を有さない細胞は死に、一方で移入された遺伝子を含む細胞は生き残るという事実に基づいている。そして生き残った細胞はクローン単離され個々の細胞系として拡大される。これらの細胞系ではマーカー遺伝子と関心ある１またはそれ以上の遺伝子の両方を発現するものが含まれる。細胞の繁殖は親の細胞系およびその選別の方法に依存している。
【００３４】
細胞のトランスフェクションも又細胞のタイプに依存している。トランスフェクションに使用される最も一般的な技術は、リン酸カルシウム沈澱、リポソーム、ＤＥＡＥデキストランにより仲介されるＤＮＡ伝達である。
【００３５】
ここで具体的に説明されるＤＮＡ配列およびプラスミドの多くの改変や変異が可能である。例えば、遺伝暗号の縮重により、コードされたポリペプチドコーディング配列の変更なしに、ポリペプチドのコーディング全領域にわたる、又、翻訳停止シグナル中での、ヌクレオチドの置換が見込まれる。そのような置換可能な配列は、特定の遺伝子の既知のアミノ酸あるいはＤＮＡ配列から演繹することができ、常套の合成あるいは部位特異的変異導入法によって構築され得る。合成ＤＮＡ法はItakura らの方法，Science，198，1056（1977）およびCreaらの方法，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75，5765 （1987）に実質的に一致して行われ得る。部位特異的変異導入法はManiatisら，モレキュラークローニング：ア ラボラトリー マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（第２版 1989 年）に記載されている。従って、本発明はここで特に例示されたＤＮＡ配列およびプラスミドに決して限定されない。例示されたベクターは嚢胞性線維症の遺伝子治療の為のものであるので、嚢胞性線維症膜貫通型制御因子（cystic fibrosis transmembrane regulator:ＣＦＴＲ）遺伝子を有し、発現するが、しかしながら記載されたベクターは他の疾病−気腫、喘息、成人呼吸促進症候群および慢性気管支炎のような慢性の肺疾患、癌や冠状動脈性心臓病や遺伝子治療や予防接種などによって好適に治療あるいは予防されるその他の疾患が含められるがそれらに限定されない−を治療するために容易に改造される。従って、いかなる遺伝子あるいはＤＮＡ配列も多重欠損アデノウイルスベクターに挿入され得る。遺伝子あるいはＤＮＡ配列の選択は、例えば遺伝子治療、予防接種などの状況において治療および／又は予防効果をなし遂げるものである。
【００３６】
当業者であれば本発明の多重欠損アデノウイルスベクターを治療や予防、すなわち遺伝子治療、予防接種など（例えばRosenfeld ら，Science，252，431-434(1991),Jaffe ら，Clin．Res.，39(2)，302A(1991)，Rosenfeld ら、Clin．Res.，39(2)，311A (1991)， Berkner，BioTechniques，6，616-629（1988）参照）の目的で動物に投与する好適な方法があることが理解できよう。又ベクターの投与には複数の経路を用いることができるが、特別な経路が別の経路に比べてより迅速、且つより効果的な反応を可能にするということがわかるだろう。医薬上許容しうる賦形剤も又当業者に良く知られているものであり容易に入手できるものである。賦形剤の選択は組成物を投与するのに用いられる個々の方法によって幾分決定される。従って、本発明の医薬組成物の好適な製剤は広く多様である。
【００３７】
以下の製剤および方法は単なる例示であって何らこれに限定されるものではない。しかしながら経口、注射およびエアロゾル製剤が好ましい。
経口投与に好適な製剤は（ａ）水、生理食塩水あるいはオレンジジュースのような希釈液に有効量の化合物を溶解させた液状溶液剤；（ｂ）各々、特定量の活性成分を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤あるいは錠剤；（ｃ）適当な液体での懸濁液剤および（ｄ）好適な乳剤からなる。錠剤にはラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化シリコン、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびその他の賦形剤、着色剤、希釈液、緩衝剤、給湿剤、防腐剤、芳香剤および医薬上適合し得る賦形剤を１つあるいはそれ以上含めることができる。ロゼンジ剤は、活性成分を通常シュクロースやアカシアあるいはトラガカントといった香味料に含めることができ、又、ゼラチンやグリセリン、あるいはシュクロースやアカシアのような不活性な基剤に活性成分を含めている香錠剤や、乳剤、ゲル剤などは活性成分に加え、この分野で公知の賦形剤が含められる。
【００３８】
本発明のベクターは、単独であるいは他の好適な成分と組み合わせて、吸入によって投与されエアロゾル製剤に製せられる。これらのエアロゾル製剤はジクロロジフロロメタン、プロパン、窒素などのような圧縮された許容しうる抛射薬内に入れることができる。それらは又ネブライザーやアトマイザーのような非圧縮性製剤用医薬品として製剤化してもよい。
【００３９】
非経口的な投与に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤および予定された被投与者の血液と製剤を等張にするための溶質が含まれていても良く、又水性および非水性の無菌の懸濁液剤があり、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤および防腐剤が含まれていてもよい。製剤はアンプルやバイアルのように単位投与量あるいは多投与量で容器に封入され、フリーズドライ（凍結乾燥）され、注射するためには使用直前に例えば水のような注射用の無菌の液体の希釈液を添加するだけでよい状態で保存され得る。即席の注射液剤や懸濁液剤は前述の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製される。
【００４０】
さらに、本発明において用いられるベクターは乳化基剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合することにより座剤に製することができる。
膣内投与に好適な製剤にはペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、パスタ、泡あるいはスプレー形態が挙げられ、それらには活性成分に加え、当分野で適当であることが知られている担体が含められる。
本発明において、動物、とくにヒトに投与される量は重要な遺伝子又は他の配列、用いた組成、投与の方法および治療される特定の部位および生物によって変化する。投与量は好ましい応答、例えば、治療あるいは予防応答を好ましい時間枠内でもたらすに十分であるべきである。
【００４１】
本発明の多重欠損アデノウイルスベクターおよび相補的細胞系は又、生体外でも利用可能性がある。例えば、アデノウイルスの遺伝子機能および構築、あるいは好適な標的細胞における外来ＤＮＡの発現を研究するのに用いることができる。当業者であれば、本発明のアデノウイルスベクターでトランスフェクトされ得る、および／又はアデノウイルス粒子に感染させて、結果として挿入されたアデノウイルスＤＮＡ補充成分の発現を生じる細胞を選択することによって、好適な標的細胞を同定することができる。好ましくは、好適な標的細胞はアデノウイルスの細胞への接着および侵入のための受容体を有するものが選択される。そのような細胞は全ての哺乳類からはじめに単離されたものをも含むが、それらに限定されるものではない。一旦好適な標的細胞を選抜すれば、該標的細胞を、本発明の外来のＤＮＡを有する組換え多重欠損アデノウイルスベクターあるいはアデノウイルス粒子に接触させて、それぞれトランスフェクションあるいは感染させる。発現、毒性および標的細胞での外来ＤＮＡの挿入および活性に関連する他のパラメーターは当分野で良く知られている通常の方法を用いて測定する。その際研究者らは、種々の生物から外殖され組織培養で研究されている種々の細胞種における該発明のベクターによって導入された外来ＤＮＡの種々の配列の発現の効能や効果と同様に、アデノウイルス感染に関する現象論について学び、解明することができる。
【００４２】
さらに遺伝子治療において好適に治療される疾患を有する患者からの外殖あるいは除去された細胞が、本発明において有用に生体外で操作される。例えば、生体外で培養されたそのような個体由来の細胞を本発明のアデノウイルスベクターと、トランスフェクションするのに好適な条件下で接触させるが、その条件は当業者であれば容易に決定できるものであり、該ベクターは、好適な外来ＤＮＡを含む。そのような接触は好適には培養細胞へのベクターのトランスフェクションをもたらし、トランスフェクトされた細胞は好適なマーカーおよび選択的な培養条件によって選択される。その際、標準的な方法を用いて細胞の生存性を調べ、すなわち毒性を測定し、関心のベクターの１またはそれ以上の外来遺伝子の遺伝子産物の存在を調べる、すなわち発現を測定し、個々の細胞について、関心ある外来遺伝子を有するベクターとの適合性、その発現およびその毒性について調べる。それによってそのようにして調べたベクター／外来ＤＮＡ系を用いて、個体の治療の妥当性や効能についての情報が得られる。そのような外殖およびトランスフェクトされた細胞、用いた遺伝子治療法の可能な効能／毒性を調べるのに役立つのに加えて、又その個体内の生体内の位置に戻すことが出来る。そのような個体に戻される細胞は、それについての生体外トランスフェクションあるいは個体体内の他の組織や細胞と隔てるマトリックスによって包まれあるいは埋め込まれている場合を除いては、改変せず、装飾せずに戻されるかもしれない。そのような基質としてはコラーゲンやセルロースなどの生体適合性物質であってもよい。
【００４３】
勿論それとは別に、あるいはそれに加えて、生体外の試験で一旦陽性の反応を観察したら、上に詳細に記載した投与方法によって生体内のそのままの位置でトランスフェクションを実行することができる。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例にさらに本発明を説明するが、勿論、どのような場合にもその範囲を限定するものと解釈すべきではない。本実施例で言及される酵素類は特に指定し示さない限りベセスダリサーチラボラトリーズ（ＢＲＬ），ガイザースバーグ(Gaithersburg)，メリーランド州２０８７７，ニューイングランドバイオラブス社（ＮＭＢ），ベバリー，マサチューセッツ州０１９１５あるいはベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ（ＢＭＢ），７９４１ キャッスルウェイドライブ，インディアナポリス，インディアナ州 ４６２５０ より入手可能であり、製造元の推奨に実質的に従って用いる。ここで用いる技術の多くは当業者に良く知られたものである。分子生物学的な技術は、Maniatisら，モレキュラークローニング：ア ラボラトリー マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク（第２版，1989年）およびカレント プロトコール イン モレキュラー バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology)，（Ausubelら編，1987年）のような好適な実験マニュアルに詳細に記載されている。当業者であれば以下に示した種々に代えて別の方法をそれに代わる別の方法に置換えができることを認識するであろう。実施例および図は、嚢胞性線維症膜貫通型制御因子遺伝子（ＣＦＴＲ）を有するＡｄGV．１０、ＡｄGV．１１、ＡｄGV．１２およびＡｄGV．１３、すなわちＡｄGVＣＦＴＲ．１０、ＡｄGVＣＦＴＲ．１１、ＡｄGVＣＦＴＲ．１２およびＡｄGVＣＦＴＲ．１３に関するものであるが、これらのベクターはＣＦＴＲ遺伝子の発現に限定されるものではなく、他の遺伝子およびＤＮＡ配列の発現にも利用できる。従って、例えば本発明は外来遺伝子、その断片である好適なＤＮＡ配列あるいはその他のＤＮＡ配列からなるようなベクターをも包含する。そのような好適なＤＮＡ配列は遺伝子治療によって好適に治療される疾患を治療するための遺伝子治療において効果を有するであろう。あるいは好適なＤＮＡ配列は又、ＤＮＡ配列が哺乳類中で発現され、結果として例えばポリペプチド−該ポリペプチドに対する免疫反応を引き起こすことができる−を生じ、予防接種に用いるような時など予防効果も有するであろう。さらに哺乳類で発現しうる好適なＤＮＡ配列のさらに別の使途は、アンチセンス分子、特にＭＲＮＡおよび合成オリゴヌクレオチドからなる群より選択されるアンチセンス分子のような、何か他の好適な治療および／又は予防剤を提供することである。
【００４５】
実施例１
この実施例においてＥ１およびＥ３領域に欠損のあるＡｄGV．１０を含む１つの実施態様、すなわちＡｄGVＣＦＴＲ．１０の作製について述べる。
ＡｄGVＣＦＴＲ．１０はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターからＣＦＴＲ遺伝子を発現する。このベクターの２つの作製例を構築し、図１−ＡｄGVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄGVＣＦＴＲ．１０Ｒの一連の概略図である−に示されるようにベクターゲノムのＥ１領域にＣＦＴＲ発現カセットが置かれる方向によってＡｄGVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄGVＣＦＴＲ．１０Ｒと命名した。
ＣＦＴＲ発現カセットは以下のようにして構築した。ｐＲＫ５（ジェネンテック社，サウスサンフランシスコ，カリフォルニア州）をKpn Ｉ（ニューイングランドバイオラブズ（ＮＥＢ），ベバリー，マンハッタン州）で消化し、マングビーンヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で平滑末端化し、Xho Ｉリンカー（ＮＥＢ）をKpn Ｉサイトの位置で連結させた。得られたベクターをｐＲＫ５−Xho Ｉと命名した。そしてｐＲＫ５−Xho ＩをSma Ｉ（ＮＥＢ）とHin dIII（ＮＥＢ）で消化し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。ＣＦＴＲ遺伝子を含むプラスミド、ｐＢＱ４．７（Lap-Chee Tsui 博士，Hospital for Sick Children，トロント，カナダ）を有するプラスミドはAva Ｉ（ＮＥＢ）およびSac Ｉ（ＮＥＢ）で消化し、マングビーンヌクレアーゼで平滑末端化した。これら２つの断片を単離し相互に連結させてＣＦＴＲ発現カセットであるｐＲＫ５−ＣＦＴＲ１を作製した。
ｐＲＫ５−ＣＦＴＲ１をSpe Ｉ（ＮＥＢ）およびXho Ｉで消化し、クレノウ（ＮＥＢ）で平滑末端化した。１−４５４／３３２５−５７８８由来のＡｄ５配列を含むｐＡｄ６０．４５４（L.E．Babiss 博士，ロックフェラー大学，ニューヨーク，ニューヨーク州）をBglII（ＮＥＢ）で消化し、クレノウで平滑末端化した。これら２つの断片は低融点アガロース技術（Maniatisら，モレキュラークローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Motecular Cloning: alaboratory manual），コールドスプリングハーバー研究所，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州（第２版 1989年））によってベクター配列から精製し、相互に連結させてｐＧＶＣＦＴＲ．１０ＬおよびｐＧＶＣＦＴＲ．１０Ｒの左アームプラスミドを作製した。
ｐＧＶＣＦＴＲ．１０ＬあるいはｐＧＶＣＦＴＲ．１０Ｒ由来の左アームプラスミドをNhe Ｉ（ＮＥＢ）で消化した。ウイルスの右アームはＡｄ５ｄ１３２４（Thomas E．Shenk 博士，プリンストン大学，プリンストン，ニュージャージー州）をCla Ｉ（ＮＥＢ）で消化することによって作製した。２つの断片−小さい９１８塩基対断片および大きい、およそ３２，８００塩基対断片−をショ糖密度勾配遠心（マニアティスら，上述）によって分離した。大きい方の断片を左アームプラスミド断片と混合し、常套のリン酸カルシウム法（Grahamら，Virology,52，456(1973)）によって２９３細胞にトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを２９３細胞上でプラーク精製し、常套のウイルス技術（例えばBerknerら，(1983)および(1984)，上述）を用いてウイルスの保存株を樹立した。
【００４６】
実施例２
この実施例においてＥ１、Ｅ３およびＥ４領域に欠損のあるＡｄGVＣＦＴＲ．１１の作製について述べる。
ＡｄGVＣＦＴＲ．１１はＡｄGVＣＦＴＲ．１０の１−２７０８２、即ち左アームとBam HI（ＮＥＢ）およびSal Ｉ（ＮＥＢ）で線状化されたＡｄ５の２１５６２−３５９３５、即ち右アームを含むプラスミド（ｐＧＶ１１Ａ，ｐＧＶ１１Ｂ，ｐＧＶ１１ＣあるいはｐＧＶ１１Ｄ；後で詳細に述べる）との間での単一の生体内組換えによって構築され、それに後述の種々のＥ３およびＥ４の改変体を導入した。
完全なＡｄGVＣＦＴＲ．１０をSpe Ｉ（ＮＥＢ）およびSrf Ｉ（ストラタジーン社，ラ ジョラ，カリフォルニア州）で消化して１−２７０８２塩基対の断片を得た後、ＡｄGVＣＦＴＲ．１０由来の左アームを全溶液の１／４が４０％である凹型１０−４０％ショ糖密度勾配で単離した。
右アームを改変ｐＧＥＭベクター（ｐＧＢＳ）のBam HI-Sal Ｉ消化によって得られた。ｐＧＢＳは以下のようにして作製した。ｐＧｅｍＩ（プロメガ社，マディソン，ウイスコンシン州）をEco RIで消化しクレノウで平滑末端化し、そしてSal Ｉリンカーを該ベクターに連結させた。そして、得られたＤＮＡをSal Ｉで消化し再び連結させ、それによってEco RIサイトをSal Ｉサイトで置換し２つのSal Ｉサイト間の配列を欠如させ、Hin dIIIで消化されクレノウで平滑末端化したｐＧＥＭＨ／Ｐ／Ｓを作製し、Bam HIリンカーを該ベクターに連結させてｐＧＥＭＳ／Ｂを作製した。ｐＧＥＭＳ／ＢをBam HIおよびSal Ｉで消化し、ｐ５０−１００（Paul Freimuth 博士，コロンビア大学，ニューヨーク州）と呼ばれるｐＢＲプラスミド由来の約１４ｋｂのBam HI-Sal Ｉ断片（Ａｄ５由来の２１５６２−３５９３５）と連結させ、ｐＧＢＳを作製した。
抗免疫性および抗炎症性の特性を有する２つのＡｄ Ｅ３遺伝子産物をアデノウイルスベクターに導入するために３つの異なった様式の右アームプラスミドを構築した。ｐＧＶ１１（０）（実施例７）と命名されたｐＧＢＳ△Ｅ３ＯＲＦ６での大きなＥ３欠失を、５’末端にＡｄ２ Ｅ３ １９ｋＤａの抗免疫性遺伝子産物を、および３’末端にＡｄ５ Ｅ３ １４．７ＫＤａの抗炎症性遺伝子産物を有する２シストロン性のｍＲＮＡの発現を駆動するラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ロングターミナルリピート）（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーターを有する発現カセットの３つの異った様式のものに必須的に置換した。Bst BI（ＮＥＢ）断片の欠失によって１９ｋＤａのｃＤＮＡ断片を欠失させることによりさらに１つのウイルスを構築した。ＡｄGVＣＦＴＲ．１１（Ｄ）と命名されたこのウイルスはＥ３ １４．７ｋＤａの抗炎症性遺伝子産物のみを有する単シストロン性のｍＲＮＡの発現を駆動するＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターを有する。
まず、Eco RI（２７３３１）−Nde Ｉ（３１０８９）断片をＰＵＣ１９ポリリンカーの同一サイトにクローニングすることによりｐＧＢＳ△Ｅ３（実施例５）由来のSpe Ｉ（２７０８２）−Nde Ｉ（３１０８９）断片をｐＵＣ１９にサブクローニングした。ｐＧＢＳから生成されたHin dIII（２６３２８）− Eco RI（２７３３１）断片をこのクローンの Eco RI サイトにクローニングして、ｐＨＮ△Ｅ３を作製した。適切なプライマーを用いて、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ａｄ２ Ｅ３ １９ｋＤａの遺伝子産物およびＡｄ５ Ｅ３ １４．７ｋＤａの遺伝子産物を有する、フランキングXba Ｉサイトを持つＰＣＲ断片を作製した。増幅した断片をXba Ｉで消化しｐＵＣ１９にサブクローニングしてｐＸＡを作製した。XbaＩ断片の解析後、該断片をｐＨＮ△Ｅ３に連結させｐＨＮＲＡを作製した。
適当なプライマーを用いて、それらを含むｍＲＮＡの翻訳を増強させることが知られている（Jobling ら，Nature，325，622-625(1987)；Jangら，Genes and Development，4，1560-1572(1990)）内部リボーゾーム導入サイト（ＩＲＥＳ）をコードしているフランキングBst BIサイトを持つ２つのＰＣＲ断片を作製した。１つの断片（様式Ｂ）にはアルファルファモザイクウイルスの外皮タンパク質ｍＲＮＡの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４ リーダー）（Joblingら，上述）由来の３４塩基対のＩＲＥＳが含まれる。もう１つの断片（様式Ｃ）には脳心筋炎ウイルス（エンセファロマイオカルディティスウイルス）（ＥＭＣＶ）ｍＲＮＡ（Jangら，上述）の５’非翻訳領域由来の５７０塩基対のＩＲＥＳが含まれる。様式ＢあるいはＣ由来の各々のBst BI断片をｐＸＡにおいてBst BI断片の代わりにクローニングした。得られたプラスミド−それぞれｐＸＢ、ｐＸＣと命名される−をXba Ｉ断片の配列解析の後、それぞれｐＨＮ△Ｅ３に移し、ｐＨＮＲＢおよびｐＨＮＲＣを作製した。
ｐＧＢＳ△Ｅ３ＯＲＦ６由来のSpe Ｉ（２７０８２）−Nde Ｉ（３１０８９）断片を、ｐＨＮＲＡ、ｐＨＮＲＢ、ｐＨＮＲＣおよびｐＨＮＲＤ由来のSpe Ｉ−Nde Ｉ断片で置換し、それぞれｐＧＶ１１Ａ、ｐＧＶ１１Ｂ、ｐＧＶ１１ＣおよびｐＧＶ１１Ｄを作製した。
ｐＧＢＶプラスミドＤＮＡをBam HIおよびSal Ｉで線状化し、精製した左アームＤＮＡ断片と２０μｇ全ＤＮＡまでで種々に濃度を変えて混合し、必要に応じてサケ精子あるいはウシ胸腺ＤＮＡ（ライフテクノロジー社，ガイザースバーグ(Gaithersburg)，マサチューセッツ州）でＤＮＡ量を約２０μｇになるように用いた。混合した断片を常法のリン酸カルシウム技術（Grahamら，上述）を用いて２９３細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクトして５日後、細胞単層を３回の凍結融解により回収した。得られたハイブリッドウイルスは２９３細胞上で力価検定し、単離されたプラークを選び取った。最初のプラーク保存株中に単一の組換えウイルスが存在するのを確実にするためにプラーク単離の工程を２回以上繰り返した。単離プラーク保存株をBurlseson ら、ヴィロロジー：ラボラトリー マニュアル（Virology: a Laboratory Manual ）、アカデミック出版社、（1992年）に記載されている常套のウイルス技術に従って大容量のウイルス保存株に増幅した。
図２は種々のＡｄGVＣＦＴＲ．１１ウイルスベクターの一連の概略図である。図は比較の為ＡｄGVＣＦＴＲ．１０Ｌの図と一列に並べた。
【００４７】
実施例３ 
この実施例においてＥ１、Ｅ３およびＥ４領域に欠損のあるＡｄGVＣＦＴＲ．１２の作製について述べる。
ＡｄGV．１２はＥ４領域の完全な排除により特徴付けられる。この大きな欠失によりおよそ１０ｋｂまでの外来のＤＮＡを挿入することができる。さらに重要なことに、ゲノムの他の領域はＡｄGVＣＦＴＲ．１２ベクターを用いた外来ＤＮＡ発現カセットの導入に利用しやすい。いまやこの欠失が他の産物のためのより大きな発現カセットの取り込みを可能にするのである。例えば、膜貫通型のドメインを有さず、それゆえ膜に結合していないＴＮＦあるいはＩＬ−６などの可溶性の受容体、および例えばｃｄｃ２、ｃｄｋキナーゼ、サイクリンＥあるいはサイクリンＤといったサイクリン類のような細胞周期制御産物に対するもののようなアンチセンス分子、および炎症や免疫応答を排除するための転写因子、すなわちＥ２Ｆあるいはｃ−ｍｙｃなどである。
ｐＧＶ１１（０）を改造し全Ｅ４領域が欠失している右アームプラスミドを作製する。得られたプラスミドは全Ｅ３およびＥ４領域を欠失し、ｐＧＶ１２（０）と命名される。これは３２８１１のAfl IIIサイトおよび３５６４０のBsq ＩサイトでPac Ｉ制限部位を導入することによりなされる。これら２つのサイト間でのPac Ｉ断片の欠失がＥ４プロモーターおよびＥ４ポリＡサイト内にあるＥ４ ＴＡＴＡ要素を含む全てのＥ４配列を効果的に排除する。
ウイルスの構築は２９３／Ｅ４細胞系あるいは２９３／ＯＲＦ６細胞系を使用する以外は先に述べたようにして行う。ＡｄGVＣＦＴＲ．１０Ｌ由来の左アーム右アームｐＧＶ１２（０）プラスミド、および全ての他の一般的な技術は、実施例２で述べたものである。Ｅ４はウイルスの増殖に必要な必須遺伝子産物を有しているので、得られたＥ４欠失変異ウイルスは外因的に発現されたＥ４の非存在下では増殖できない。従って、全てのウイルス構築の操作は新しい２９３／Ｅ４細胞系あるいは２９３／ＯＲＦ６細胞系で行われる（各々実施例８および実施例９に述べられている）。得られたウイルスがＡｄGVＣＦＴＲ．１２であり比較としてＡｄGVＣＦＴＲ．１０Ｌのみ用いて図３に図式的に示してある。
【００４８】
実施例４ 
この実施例においてＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ３およびＥ４領域に欠損のあるＡｄGVＣＦＴＲ．１３の作製について述べる。
ＡｄGV．１３はＥ１およびＥ４領域の完全な排除（ＡＤGV．１２の如く）だけでなくＥ２Ａの完全な排除によっても特徴付けられる。Ｅ２Ａの完全なコード領域は、転写解読枠（Vos ら，Virology，172，634-642（1989）；Broughら，Virology，190，624-634（1992））の両末端でのCla Ｉ制限部位の挿入を有するＨ５ｉｎ８００およびＨ５ｉｎ８０４という２つのＥ２Ａ変異ウイルス由来のＤＮＡを相互に融合させることによって欠失させる。Ｈ５ｉｎ８００のCla Ｉサイトは遺伝子のコドン２および３の間にあり、Ｈ５ｉｎ８０４のClaＩサイトはＥ２Ａ遺伝子の停止コドン内にある。結果として生ずるウイルスはＥ２Ａ読み枠と類似点を持たない２３アミノ酸からなる転写解読枠を含む。さらに重要なことに、このカセットはウイルスゲノムの他の領域に特徴的な遺伝子を導入することができる。これは関心ある遺伝子を小ＯＲＦが存在する適切な読み枠に挿入することにより、あるいは関心ある遺伝子に加えてそれ自身のプロモーター配列、ポリアデニレーションシグナルおよび停止コドンを有する他の発現カセットを導入することによって成し得る。
アデノウイルスＤＮＡをＨ５ｉｎ８００およびＨ５ｉｎ８０４から調製した。制限酵素Hin dIII（ＮＥＢ）で消化した後、両Ｈ５ｉｎ８００およびＨ５ｉｎ８０４由来のHindIIIA断片をｐＫＳ+（ストラタジーン社）にクローニングする。
得られたプラスミドをｐＫＳ+ Ｈ５ｉｎ８００Hin dIIIAおよびｐＫＳ+ Ｈ５ｉｎ８０４Hin dIIIAとそれぞれ命名した。そしてｐＫＳ+ Ｈ５ｉｎ８００Hin dIIIA由来のCla Ｉ（ＮＥＢ）断片を単離し、ｐＫＳ+ Ｈ５ｉｎ８０４Hin dIIIA由来の同一のCla Ｉ断片の代わりにクローニングする。このキメラプラスミド、ｐHin dIIIA△Ｅ２Ａは上に述べたように全てのＥ２Ａ読み枠を効果的に排除している。この点で、Ｅ２Ａの欠失をBamH Ｉ（ＮＥＢ）および Spe Ｉ（ＮＥＢ）制限部位に移し、ｐＧＶ１２（０）中の野性型の配列を置換してｐＧＶ１３（０）を構築した。
ＡｄGVＣＦＴＲ．１３ウイルス（図４参照）をＡｄGVＣＦＴＲ．１０左アームＤＮＡおよびｐＧＶ１３（０）右アームプラスミドＤＮＡを用いることによって既に述べた様にして構築する。しかしながら、このウイルス構築物の宿主細胞系は３重の相補的細胞系２９３／Ｅ４／Ｅ２Ａである。図４はＡｄGVＣＦＴＲ．１３ウイルスベクターの概略図である。図は比較の為にＡｄGVＣＦＴＲ．１０Ｌの図と一列に並べてある。
【００４９】
実施例５ 
この実施例においてｐＧＢＳΔＥ３の作製について述べる。
このプラスミドは、Ｅ３プロモーターおよび現存するＥ３遺伝子を含めた、ｐＧＢＳ内のＥ３領域の大部分を除去するため、他の構築物のために場所を空けるため、そしてＥ３発現カセットの導入を容易にするために製せられる。このプラスミドは２８３３１から３０４６９までの欠失を含んでいる。
ＰＣＲ断片はＡｄ５ｓ（２７３２４）およびＡ５ａ（２８３３０）Ｘをプライマーとして、そしてｐＧＢＳを鋳型として用いて製せられる。得られた断片をEco RI（２７３３１）およびXba Ｉ（２８３３０）で消化し、ゲル精製した。そしてこの断片をEco RIサイト（２７３３１）およびXba Ｉ（３０４７０）サイトでｐＧＢＳに導入した。
【００５０】
実施例６
この実施例においてｐＧＢＳΔＥ３ΔＥ４の作製について述べる。
さらなる外来性の配列をアデノウイルスゲノム内に移すのを容易にするためにＡｄ５ Ｅ４領域の大きな欠失をｐＧＢＳΔＥ３に導入した。３２８３０−３５５６６Ｅ４コーディング配列を欠失させた。
ｐＧＢＳをMun Ｉで消化したＤＮＡ断片をクレノウで処理して該断片を平滑末端化し、これにPac Ｉリンカーを連結させることによって３２８３０の位置でMun Ｉサイトの代わりにPac Ｉサイトを製した。その改変したＤＮＡをNde Ｉで消化し、得られた１７３６塩基対断片（Nde Ｉ３１０８９−Pac Ｉ３２８３０）をゲル精製した。ＰＣＲ断片を、Ａ５（３５５６４）Ｐ（ＩＤＴ、コーラルビレー、アイオワ州）およびＴ７プライマー（ＩＤＴ、コーラルビレー、アイオワ州）、並びに鋳型としてｐＧＢＳを用いて調製した。得られた断片をPac ＩおよびSal Ｉで消化しPac Ｉ３５５６６−Sal Ｉ３５９３５を作製した。ｐＵＣ１９のポリリンカー領域内のSmaＩサイトをPac Ｉリンカーに連結させることによってPac Ｉサイトに改変した。Pac Ｉ３５５６６−Sal Ｉ３５９３５断片を改変させたｐＵＣ１９ベクターにポリリンカー領域内のPac ＩおよびSal Ｉサイトの位置でそれぞれ移した。改変したNde Ｉ３１０８９−Pac Ｉ３２８３０断片を、Pac Ｉ３５５６６-Sal Ｉ３５９３５断片が既に挿入されているｐＵＣ１９に、Nde ＩおよびPac Ｉサイトの位置でそれぞれ移した。ｐＵＣ１９プラスミド由来のNde Ｉ３１０８９−Sal Ｉ３５９３５断片をゲル精製によって精製し、ｐＧＢＳΔＥ３内の各Nde ＩおよびSal Ｉサイトに置き換えてクローニングしてｐＧＢＳΔＥ３ΔＥ４を得た。
【００５１】
実施例７ 
この実施例においてｐＧＢＳΔＥ３ＯＲＦ６の作製について述べる。
Ａｄ５の８９４塩基対のＥ４ ＯＲＦ−６遺伝子をｐＧＢＳΔＥ３ΔＥ４中のＥ４プロモーターの３’に置いた。ＯＲＦ−６は非Ｅ４相補的細胞系においてはウイルスの増殖に唯一絶対的に必要なＥ４産物である。それゆえに、ＡｄGVＣＦＴＲ．１１ウイルスを２９３細胞で繁殖させ得る為に、この産物をそれ独自のプロモーター制御下で右アームプラスミド（実施例２）に再導入した。
ＰＣＲ断片をＡ５ｓ（３３１９０）Ｐ（３２塩基対；5'CACTTAATTAAACGCCTACATGGGGGTAGAGT3'）（配列表配列番号１）およびＡ５ａ（３４０８４）Ｐ（３４塩基対；5'CACTTAATTAAGGAAATATGACTACGTCCGGCGT）（配列表配列番号２）をプライマー（ＩＤＴ、コーラルビレー、アイオワ州）として、ｐＧＢＳを鋳型として用いて製した。この断片をPac Ｉで消化しゲル精製した。その産物をｐＧＢＳΔＥ３ΔＥ４中の１つのPac Ｉサイトに導入し、１９ｋＤａおよび１４．７ｋＤａＡｄ Ｅ３産物の発現のためにＥ３が改変されているプラスミドｐＧＶ１１（０）を製した。
【００５２】
実施例８
この実施例において２９３／Ｅ４細胞系の作製について述べる。
ｐＳＭＴ／Ｅ４は以下の様にして作製した。２７５２塩基対のMun Ｉ（Ａｄ２のサイト３２８２５）−Sph Ｉ（ポリリンカー）断片を、Ａｄ２由来の領域３２２６４−３５５７７がサブクローニングされたｐＵＣ１９プラスミドであるｐＥ４（８９−９９）から単離、クレノウで平滑末端化し、ホスファターゼ（ＮＥＢ）で処理した。発現カセットプラスミドｐＳＭＴ／Ｅ４を作製するために、２７５２塩基対のMun Ｉ−Sph Ｉ断片を、Bam HIで線状化しクレノウで平滑末端化しホスファターゼで処理したｐＭＴ０１０／Ａ+（McNeall ら，Gene，76，81-89(1989)）に連結させた。
細胞系２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；アメリカンタイプカルチャーコレクション，ロックヴィル，メリーランド州）は１０％ウシ胎児血清ダルベッコの改変イーグル培地（ライフテクノロージ社，ガイザースバーグ(Gaithersburg)，メリーランド州）で培養した。ついで２９３細胞をEco RIで線状化したｐＳＭＴ／Ｅ４にリン酸カルシウム法（Sambrookら，モレキュラークローニング：ア ラボラトリー マニュアル( Molecular Cloning: a laboratory manual ),コールドスプリングハーバー研究所出版（1989年））によりトランスフェクトした。トランスフェクション後、約２４−４８時間で１００μＭメトトレキサートおよびアメソプテリン（シグマ化学社，セントルイス，ミズーリ州）を含有する培地（上記）を添加した。培地中のメトトレキサートの存在はｐＳＭＴ／Ｅ４プラスミドにおける選択マーカーであるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子の発現を選択する。
正常の細胞のＤＨＦＲ遺伝子は与えるメトトレキサートの濃度によって阻害され（細胞種特異的）、細胞死を引き起こす。ｐＳＭＴ／Ｅ４を有するトランスフェクトされた細胞におけるさらなるＤＨＦＲ遺伝子の発現はメトトレキサートに対する耐性を与える。従って、新しい遺伝子を有するトランスフェクトされた細胞のみがこれらの条件下で生育する細胞である（Sambrookら参照，上述，に総説されている）。
選択マーカーを保持している最初の１つの細胞から細胞の小コロニーが形成されると、それらをクローンごとに単離し回収した（サムブルークら参照，上述，で概観されている）。これらのクローンは細胞系を生成するまで拡大した。これらの細胞系はその産物−−この場合Ｅ４−−の発現でスクリーニングされる、また欠損のあるウイルス−−この場合Ｅ１およびＥ４の両方を欠損したウイルス−−を相補する機能性でスクリーニングされる。
この工程の結果、がＡｄGVＣＦＴＲ．１２のようなＥ１およびＥ４の機能の両方を欠損しているアデノウイルスベクターを相補することが可能な最初の２９３／Ｅ４細胞系が産生された。
【００５３】
実施例９
この実施例において２９３／ＯＲＦ−６細胞系の作製について述べる。
プライマーＡ５ｓ（３３１９０）ＰおよびＡ５ａ（３４０８４）Ｐをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［ＰＣＲプロトコール，ア ガイド トウ メソッド アンド アプリケーション（PCR Protocols，A guide to Methods and Applications），Innis ら編，アデミックプレス社、1990年］に用いてクローニングのためのＡｄ５ Ｅ４のＯＲＦ−６遺伝子を増幅し、又、末端にPac Ｉサイトをつくった。増幅した断片をクレノウで平滑末端化しｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ(+)（ストラタジーン社，ラ ジョラ，カリフォルニア州）にクローニングした。得られたプラスミド、ｐＣＲ／ＯＲＦ−６の配列を決定し、そのＯＲＦ−６挿入断片を、ＳＭＴプロモータを含んでいる平滑末端化されたEco RI− Hin dIII断片をｐＲＣｐｕｒｏの平滑末端化Mlu Ｉ−Hin dIIIサイトに連結させることによって作製したｐＳＭＴ／ｐｕｒｏ発現ベクターに移し、ｐＳＭＴ／ＯＲＦ−６を作製した。
トランスフェクトされた細胞がピューロマイシン耐性遺伝子［それを発現する細胞がピューロマイシンの存在下で生育し得る］の選択下に置かれているということを除けば、実施例８に記載したように２９３細胞系を培養しｐＳＭＴ／ＯＲＦ−６でトランスフェクトした。形質転換された細胞のコロニーをサブクローニングして、回収し、実施例８に記載したようにスクリーニングした。
この細胞系はＡｄGVＣＦＴＲ．１２ベクターシリーズのようなＥ１およびＥ４領域を欠損しているベクターを相補するのに好適である。
【００５４】
実施例１０
この実施例では２９３／Ｅ４／Ｅ２Ａ細胞系の作製について述べる。該２９３／Ｅ４／Ｅ２Ａ細胞系によりＥ１、Ｅ４およびＥ２Ａを欠損したウイルスベクターが増殖できる。
２９３／Ｅ４細胞に導入するためのＥ２Ａ発現カセット（図５参照）は以下のように製する。最初の段階はＥ２Ａの効率的な発現のためにＥ２ＡのＡＴＧのまわりの塩基を完全なコザックのコンセンサス（コザックら，J．Molec．Biol.，196，947-950(1987)）を形成するように改造することである。Ｅ２Ａ遺伝子の５’末端を改造するために２つのプライマーを設計した。１８塩基対のオリゴヌクレオチド（5'GCCGCCTCATCCGCTTTT3'）（配列表配列番号３）であるＡｄ５ｓ（２３８８４）をＥ２Ａ遺伝子のSma Ｉサイトの隣にある内部領域を始点とするように設計した。３２塩基対のオリゴヌクレオチド（5'CCGGAATTCCACCATGGCAGTCGGGAAGAGG3'）（配列表配列番号４）であるＤＢＰ（ＡＴＧ）Ｒ１を、クローニングを容易にするために、これを改造しているＥ２Ａ遺伝子のＡＴＧのまわりの翻訳コンセンサス配列を完全なコザック拡張コンセンサス配列を導入するように、および丁度５’のEco RIサイトを導入するように設計した。上記のプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物をEco RIおよびSma Ｉ（ＮＥＢ）で消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIＫＳ+（ストラタジーン社，ラ ジョラ，カリフォルニア州）の同一のポリリンカー部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＫＳ／ＥＳＤＢＰと命名した。
Sma Ｉ- Xba Ｉ断片をｐＨＲカウフマン（Morin ら，Mol．Cell Biol.，9，4372-4380(1989)）から単離し、Ｅ２Ａの読み枠を補うためにｐＫＳ／ＥＳＤＢＰの対応するSma ＩおよびXba Ｉサイトにクローニングした。得られたプラスミドはｐＫＳＤＢＰと命名した。発現カセット内に含まれるベクター由来のすべての相同配列を排除するために、ポリリンカー内のEco RIサイトが破壊されている（ジェンベク，ロックヴィル，メリーランド州）ＰＮＥＢ１９３（ＮＥＢ）の対応するKpnＩおよび Pme Iサイトに、ｐＫＳＤＢＰ由来のKpnＩ−Dra Ｉ断片を移した。得られたクローンｐＥ２Ａは実施例４のＥ２Ａを欠失したベクターに相同するどんな余分な配列も有さずＥ２Ａの読み枠の全てを含んでいる。
適切にｍＲＮＡが核でプロセッシングされるように、又、Ｅ２Ａの発現がさらにエンハンスされるように５’スプライスカセットをｐＥ２Ａに移した。このことを行うために、実施例１に記載したｐＲＫ５をSac II（ＮＥＢ）で消化し、マングビーンヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で平滑末端化し、そしてEco RI（ＮＥＢ）で消化した。得られた、スプライシングシグナルを含む、およそ２４０塩基対の重要な断片をｐＥ２ＡのClaＩ（クレノウにより平滑末端化された）−Eco RIサイトにクローニングし、ｐ５’Ｅ２Ａを製する。Ｅ２Ａ配列を有するｐ５’Ｅ２Ａ由来の平滑末端化された（クレノウ）Sal Ｉ− Hin dIII断片をｐＳＭＴ／ｐｕｒｏおよびｐＳＭＴ／ｎｅｏの平滑末端化された（クレノウ）Xba Ｉサイトに移す。
全てのＥ２Ａ遺伝子を含んだｐＫＳＥ２Ａ由来のXba Ｉ断片をｐＳＭＴ／ｐｕｒｏおよびｐＳＭＴ／ｎｅｏのXba Ｉサイトに移す。得られたＥ２Ａ発現プラスミド、ｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｐｕｒｏおよびｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｎｅｏをそれぞれ２９３／Ｅ４および２０３／ＯＲＦ−６細胞にトランスフェクトした。ｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｐｕｒｏでトランスフェクトされた細胞は標準培地＋ピューロマイシン中の生育で選択され、ｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｎｅｏでトランスフェクトされた細胞は標準培地＋ゲネチシン（Ｇ４１８；ライフテクノロジー社、ガイザースバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州）中の生育で選択される。単離したコロニーのクローンの拡大は実施例８に記載のとおりである。得られた細胞系はそのＥ１、Ｅ４およびＥ２Ａ欠損ウイルスベクターを相補する能力により選別される。
これらの細胞系は、ウイルスベクターのＡｄGVＣＦＴＲ．１３シリーズに記載されたものの様にウイルスのＥ１、Ｅ４およびＥ２Ａ領域を欠損しているウイルスベクターを相補するのに好適である。
【００５５】
実施例１１
この実施例では細胞系Ａ５４９（ＡＴＣＣ）を親株として用いた相補的細胞系の作製について述べる。
Ａｄ２ウイルスＤＮＡは前述の技術によって調製される。ゲノムＤＮＡはSsp ＩおよびXho Ｉで消化し、５４３８塩基対の断片を精製しｐＫＳ+（ストラタジーン）のEco RV/ Xho ＩサイトにクローニングしｐＫＳ３４１−５７７８を作製した。クローンの特徴を測定した後、Xho Ｉ（クレノウを用いて平滑末端化された）−Eco RI断片をｐＲＣ／ＣＭＶｎｅｏのNru Ｉ（平滑）− Eco RI サイトに移しｐＥ１ｎｅｏを製した。このクローンを用いてＡ５４９細胞を形質転換して相補的細胞系（２９３同様）を製する。該細胞では、２９３細胞の際に記載したのと同じ方法で、さらなる発現カセットが導入され、優れたプラーク形成能をもつ多相補的細胞系を製する。
【００５６】
実施例１２
この実施例では２９３／Ｅ２Ａ細胞系の作製の方法およびＥ２およびＥ４の両領域を欠損しているアデノウイルスベクターの構築のためのその利用について述べる。
実施例１０に記載および図５に描写されるように、Ｅ２Ａ発現カセットベクターが得られた。Ｅ２Ａ発現カセットベクターはトランスフェクトされた細胞のマーカーとしてネオマイシン耐性を与える遺伝子を含んでいる。
又、実施例１０に記載したように、２９３細胞はｐＳＭＴ／Ｅ２Ａ／ｎｅｏでトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は標準培地＋Ｇ４１８中での増殖で選別された。選別された細胞のクローン拡大は実施例８に記載されたようにして行われた。得られた細胞系は誘導時のそのＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ；Ｅ２Ａ遺伝子産物）を発現するそれらの能力およびＥ１およびＥ２Ａ欠損ウイルスベクターを相補するそれらの能力でスクリーニングした。
ＤＢＰ発現能力に対する、２９３／Ｅ２Ａ細胞系のネオマイシン陽性（ｎｅｏ+；すなわち、ネオマイシン耐性）の単離クローンの能力を調べるために、細胞をＧ４１８存在下で生育させて選別を続けた。独立した単離クローンからの樹立した単層を１００μＭのＺｎＣｌ2で２４時間誘導させ、ＤＢＰ遺伝子の発現を常法を用いてイムノブロッティングで検出した。調べた６２株の内、４２％のｎｅｏ+細胞系がＤＰＢ発現に陽性（ＤＰＢ+）であり、ＤＰＢ+細胞系の全ては誘導性のＤＢＰ発現を示した。以下の表１にはＤＢＰ発現によるスクリーニングからのデータを表す：
【００５７】
【表１】
2006136329.tif 000002
【００５８】
続いてブラウらの方法、上述、を用いたイムノブロッティングによって誘導されたＤＢＰの発現の程度でクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系をスクリーニングし、標識されたオートラジオグラフィー図で描写された結果を図６および７に示す。ＨｅＬａに基づくｇｍＤＢＰ２細胞のそれと同様程度にＤＢＰを蓄積した細胞をさらに解析した。図６に示す様に、誘導された細胞の溶解物によると、誘導されたＤＢＰの発現の程度は単離クローンによって大きく異なっている。例えば上述のように、細胞系１０４、１１２および２１６は誘導するとかなりの量のＤＢＰを産生する、その一方で細胞系１９および６１はｇｍＤＢＰ２細胞によって産生されるほども産生しない。
誘導して最初の２４時間にわたってＤＢＰを蓄積する能力を、又再び、ブラウらの方法、上述、を用いてクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系について解析した。
図７に示す様に、誘導後、０、２、１６および２４時間で回収した細胞の溶解物によると、いくつかの株にインキュベーション時間にわたる累進的なＤＢＰの蓄積がウイルスの増殖と矛盾無く見られた。
得られた２９３／Ｅ２Ａ細胞系による相補性を調べるために、常套の手法を用いてこれらの細胞系における増殖についてＥ２Ａ欠失ウイルスを調べた。当業者にはよく知られているように、ウイルス増殖は宿主細胞の単層におけるプラーク形成の単純な観察によって半定量的に測定でき、ここでもそれを行った。同じ株についてＥ２Ａ遺伝子の相対的な発現、すなわちＤＢＰの相対的な発現をブラウら，Virology，190，624-634（1992）、に従ってイムノブロットにより測定した。各々の細胞系の前述のパラメーター（最も低い＋／−〜最も高い＋＋＋＋＋）に関して、発現あるいは増殖の相対的な程度を表２に述べる： 
【００５９】
【表２】
2006136329.tif 000003
【００６０】
表２に反映されるように、この研究の結果は２つの２９３／Ｅ２Ａ細胞系（すなわち５４および１１２）はＥ２Ａ欠失ウイルスのプラーク形成および、従って増殖を補助することを示した。
選別された細胞系はまた当分野には慣例の細胞培養法を用いてウイルスのＥ１およびＥ２Ａ領域を欠損しているベクターを相補することも示された。そのような２重に欠損を有するベクターは実施例１および３に開示された方法を用いて製することができる。図８はＥ１およびＥ２Ａ領域を欠損しているアデノウイルスベクターであるＡｄGVＣＦＴＲ．１２Ｂの構造を示している。細胞継代後の、トランスフェクトされた細胞の３つの異なる溶解物におけるＡｄGVＣＦＴＲ．１２Ｂベクターの存在は常套のＰＣＲアッセイによって、ベクターに関連したＤＮＡ配列を検出することにより示された。ＣＦＴＲ配列（図９において“Ａ”と標記したカラム）の存在、Ｅ２Ａ配列の不在、すなわち欠失の根拠（“Ｂ”と標記したカラム）および野性型のＥ２Ａ配列（“Ｃ”と標記したカラム）の存在について３つの異なった溶解物を別々に調べた。その実験は常套の方法を用いて成された、図９に示された臭化エチジウムで染色された、ゲル分離されたＤＮＡ断片の逆コントラスト写真から解析され得る。
結果は、３つの溶解物全てがＡｄGVＣＦＴＲ．１２Ｂベクターの構造に一致したＣＦＴＲおよびＥ２Ａ欠失配列を含んでいることを示している。これらの溶解物には野性型のＥ２Ａ配列は検出されなかった。図９において“Ｍ”は産物のサイズを確かめるためのＤＮＡマーカーを表し、“＋”は与えられたプライマーセットに正の鋳型を用いた場合のサンプルの印であり、“−”は与えられたプライマーセットに負の鋳型を用いた場合のサンプルの印であり、そして上述のＡ、ＢおよびＣは試した３つのウイルス溶解物を表す。
それによって、Ｅ１およびＥ２領域に欠失を有するアデノウイルスベクターが作製され、２重の欠損ベクターを相補する能力を有する細胞系を確認した。
【００６１】
実施例１３
この実施例では外来ＤＮＡの発現へのＥ２Ａ欠失プラスミドの使用を説明する。
実施例４に述べたように、Ｅ２Ａ欠失プラスミドｐＧＶ１３（０）をｐＧＶ１２Ｂベクターシリーズの構築に用いた。ｐＧＶ１３（０）の改変には、特有のSce I制限サイトをCla Iサイトと置換し、Ｅ２Ａ遺伝子のＡＴＧのまわりの領域を能率的なコザックのコンセンサス配列に変更することが含められる。フランキングなSce I制限サイトを有するマーカー遺伝子（β−グルクロニダーゼ）をＥ２Ａ遺伝子に挿入し、そのマーカー遺伝子は最も豊富な初期遺伝子、すなわちＤＢＰの発現に用いられるシグナルの全てに応答して発現する。トランスフェクションおよび続いてβ−グルクロニダーゼ活性を評価することによって機能性について得られたプラスミド（ｐＧＢＳＥ２ＧＵＳ）を調べた；調べた全てのトランスフェクトした細胞系は、高いβ−グルクロニダーゼの発現レベルを示し、これはβ−グルクロニダーゼが基質Ｘ−ｇｌｕとの反応を触媒するときに青色を産生することによって検出される。
図１０で描写される様な他のウイルスベクター（ＡｄGVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳ）は、例えば遺伝子治療目的の為の外来ＤＮＡの配置への欠失したＥ２領域の利用を説明するために構築される。ＡｄGVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳベクターはＥ１領域にＣＭＶルシフェラーゼマーカーを含み、Ｅ２Ａ領域にβ−グルクロニダーゼを含む。前ベクター（ＡｄGVＬｕｃ．１０）は２９３／Ｅ２Ａ細胞をトランスフェクトするのに用いられ、得られたウイルスプラークのその後のＸ−ｇｌｕを用いたβ−グルクロニダーゼについての染色では実際、青色は示されなかった、すなわちβ−グルクロニダーゼ活性は検出されなかった。ＡｄGVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳベクターでトランスフェクトされた２９３／Ｅ２Ａ細胞から形成されたプラークは、Ｘ−ｇｌｕの添加によって、かなりの量の青色を産生した。
従って、アデノウイルスベクターのＥ２Ａ領域で置換された外来ＤＮＡは機能できる。
【００６２】
実施例１４
この実施例では２９３／ＯＲＦ６細胞系の作製方法およびＥ１およびＥ４領域の両方を欠損しているアデノウイルスベクターを構築するためのその利用について説明する。
図１１に描写されるＥ４−ＯＲＦ６発現カセットは上記の実施例９に開示された方法を用いて構築される。２９３細胞のトランスフェクションはｐＳＭＴ／ＯＲＦ６／ｐｕｒｏでなされ、トランスフェクトされた細胞は標準の培地＋ピューロマイシン中での生育によって選別された。クローンの拡大は実施例８に記載されたようにして行った。得られた細胞系は誘導の際のそれらのＥ４−ＯＲＦ６の発現能力およびＥ１およびＥ４を欠損したウイルスベクターを補う能力で選別した。
２９３／ＯＲＦ６細胞系のピューロマイシン陽性（ｐｕｒｏ+、すなわちピューロマイシン耐性）の単離クローンはそれらのＯＲＦ６の発現能力で選別した。
選別を維持するためにピューロマイシン存在下で細胞を生育させた。個々の単離クローンからの確立した単層を１００μＭのＺｎＣｌ2で２４時間かけて誘導した。ＯＲＦ６遺伝子の発現はノザンブロッティング、それによるＲＮＡ転写を確認することによって検出した。試した各々の細胞系の発現の相対的な程度（最も低い（＋）〜最も高い ＋＋＋＋＋）を表３に示す。
【００６３】
【表３】
2006136329.tif 000004
【００６４】
ＯＲＦ６遺伝子の発現を調べた結果はピューロマイシン耐性細胞系の５３％はＯＲＦ６転写陽性であり、ＯＲＦ６が陽性なような細胞系は全てＯＲＦ６発現を誘発しやすいことを示した。
またＰＣＲはアデノウイルスベクターのＥ４欠失領域での遺伝子の挿入を検出するために用いられ、その結果は図１２に描写される。ＡｄGVβgal．１２でトランスフェクトされた継代された細胞の溶解物を野性型Ｅ４に関連したある遺伝子配列、すなわち３０８７塩基対および３６７塩基対の断片を増幅するＰＣＲに付した。モック感染させた２９３／ＯＲＦ６細胞（レーン１）、ＡｄGVβgal．１０で感染させた細胞（レーン２）およびＡｄGVβgal．１２で感染させた細胞（レーン３）をゲル電気泳動および臭化エチジウム染色に付した。図１２に示される得られた染色されたゲルの逆コントラスト写真は、ＡｄGVβgal ．１０ベクターが３６７塩基対の配列を含むＥ４領域の部分を欠いていること、ＡｄGVβgal．１２ベクターが３０８７塩基対配列を含むＥ４領域の部分を欠いていることを示している。
２９３／ＯＲＦ６細胞系においてＥ４を欠失したベクターの増殖を観察した。細胞を１０感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、生育５日後でかなりの量のウイルスの増殖が相補性プラーク解析によって観察された。結果を細胞あたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）をｙ軸に、および調べた細胞系をｘ軸に示した棒グラフである図１３に描写する。陽性コントロール生育としては、Ｅ４の機能を補うことが知られている細胞系Ｗ１６２を用いた。陰性コントロールとしては、Ｅ１機能のみを補うことが知られている２９３細胞系を用いた。細胞系Ａ２、Ｂ８、２１６および４０６はＥ４欠失ウイルス（ｄ１３６６）の定量的に異なる相補性を示す２９３／ＯＲＦ６細胞系の独立した単離体である。
従って細胞系がＥ４機能を相補する−それによってＥ４欠失ウイルスの増殖を可能にし、機能を有する外来ＤＮＡを担持することが可能であることが示される−と確認された。これらの細胞系はウイルスのＥ１およびＥ４領域を２重に欠損した、上記のＡｄGVＣＦＴＲ．１２シリーズに記載された様な、あるいはＡｄGVβ- gal．１２ベクターの図説である図１４に示されたようなベクターを相補するに好適である。ＡｄGVβ- gal．１２ベクターはＥ１領域に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と欠失のあるＥ４領域を有している。
【００６５】
実施例１５
この実施例ではＥ１およびＥ４欠失を有するアデノウイルスベクターの利用を説明する。
Ｅ４欠失プラスミドであるｐＧＢＳ△Ｅ４はいくつかの特徴的な制限部位を含むように改変されている。これらのサイトは、この領域に好適な外来ＤＮＡをクローン化するために用いられ、発現のためには、アデノウイルスＥ４プロモーターが用いられる。上述のように、この領域でのβ−グルクロニダーゼのクローニングによって、完全に機能的であり、外来ＤＮＡを発現しているウイルスベクターが得られた。従って、Ｅ１領域に配置された好適な外来ＤＮＡおよびＥ４領域での他の好適な外来ＤＮＡ、これらはともに同一ウイルスベクター上にあり、それぞれの外来ＤＮＡをＥ１およびＥ４プロモーターあるいは必要とされる他のプロモーターの制御を利用して発現することができる。
Ｅ４領域の２番目の改変は種々の異種の制御要素由来の好適な外来ＤＮＡの発現を許す。プラスミド構築物は多数の交換が都合よくなされ得るようにして造られる。マルチプラスミドは都合よく交換され得る次のような特徴を有する：
１．相同組換えに使用されるアデノウイルス部分−ベクターのＥ１末端およびＥ４末端に外来ＤＮＡを配置するために結合している−；
２．プロモーター部分；
３．スプライスシグナル部分；
４．外来ＤＮＡ部分；
５．ポリアデニレーション部位；
６．アデノウイルスパッケージング配列；
７．アデノウイルスＩＴＲ；および
８．哺乳類の組織培養と同様に細菌においてもプラスミドを選択および生育するために必要な全てのプラスミドＤＮＡ配列。
【００６６】
ここで述べられた刊行物および特許を含めた全ての引例は、ここに言及したことで、引用により組み込まれるべく、個々に、詳細に示され、ここにその全てが明示されたと同程度に、明細書中に組み込まれるものである。
本発明は好適な具体例を強調して記載したものであるが、好適な具体例は変更させて良いことは当業者には明白である。ここで詳細に記載された以外の方法で該発明を実行してもよい。従って、本発明は添付の請求項の精神および範囲内に包含される全ての変更を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１はＡｄGVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄGVＣＦＴＲ．１０Ｒウイルスベクターの一連の概略図である。
【図２】図２はＡｄGVＣＦＴＲ．１１ウイルスベクターの一連の概略図である。
【図３】図３はＡｄGVＣＦＴＲ．１２ウイルスベクターの概略図である。
【図４】図４はＡｄGVＣＦＴＲ．１３ウイルスベクターの概略図である。
【図５】図５はＥ２Ａ発現ベクターの概略図である。
【図６】図６はあるクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系における誘導されたＢＰ発現の程度をスクリーニングする為に用いられたイムノブロット像である。
【図７】図７はあるクローン化２９３／Ｅ２Ａ細胞系による、誘導の最初の２４時間の間にわたるＤＢＰの蓄積を解析する為に用いられたイムノブロット像である。
【図８】図８はＡｄGVＣＦＴＲ．１０ＬおよびＡｄGVＣＦＴＲ．１２Ｂウイルスベクターの一連の概略図である。
【図９】図９は臭化エチジウムで染色したＤＮＡゲルの逆コントラスト写真であり、継代したトランスフェクション溶解物からのＡｄGVＣＦＴＲ．１２ＢウイルスベクターのＰＣＲ検出に関するデータを示す。
【図１０】図１０はＡｄGVＬｕｃ；Ｅ２ＧＵＳウイルスベクターの概略図である。
【図１１】図１１はＥ４−ＯＲＦ６発現ベクターの概略図である。
【図１２】図１２は臭化エチジウムで染色したＤＮＡゲルの逆コントラスト写真であり、継代したＡｄGVβｇａｌ．１２の溶解物におけるＥ４欠失領域のＰＣＲ検出に関するデータを示す。
【図１３】図１３はトランスフェクション後のある細胞系（ｘ軸）ごとのＰＦＵ／細胞（ｙ軸）の程度を示す棒グラフである。
【図１４】図１４はＡｄGVβｇａｌ．１２ウイルスベクターの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図６】
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【図９】
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【配列表】
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