(57)【要約】【課題】  患者から採取した間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させる。【解決手段】  ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌ、塩基性繊維芽細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加した培地、およびその培地内において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法を提供する。【選択図】      図３
2006136281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌ、塩基性繊維芽細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加した培地。
【請求項２】
ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌ、塩基性繊維芽細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加した培地内において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、培地および間葉系幹細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪等に分化可能な多分化能を有しているため、細胞治療や再生医療の細胞ソースとして注目を集めている。しかしながら、骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞はごく微量であるため、臨床治療に用いる場合には、骨髄液内から集めた間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることが重要である。
【０００３】
従来、間葉系幹細胞を効率よく増殖させる方法として、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている方法が知られている。
特許文献１には、任意の培地内に、ｂＦＧＦ（basic Fibloblast Growth Factor；塩基性繊維芽細胞増殖因子）を０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加して培養する間葉系幹細胞の培養方法が開示されている。
また、特許文献２には、任意の培地内に、ｂＦＧＦ（basic Fibloblast Growth Factor；塩基性繊維芽細胞増殖因子）を０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、かつ、Ｌアスコルビン酸を７５〜１５００μｍ／ｍｌの濃度で添加して培養する細胞の培養方法が開示されている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０２／２２７８８Ａ１号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０１／４８１４７Ａ１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１には、ビタミンＣとの関係でｂＦＧＦによる間葉系幹細胞の増殖促進効果について開示されておらず、また、特許文献２には、高濃度のｂＦＧＦによる間葉系幹細胞の増殖促進効果について何ら開示していない。
これに対して、本発明者は、試験、研究の結果、間葉系幹細胞をさらに短期間で大量に増殖させる培地および培養方法を見いだした。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、患者から採取した間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることができ、大量の間葉系幹細胞を必要とする臨床治療に貢献し得る培地および間葉系幹細胞の培養方法提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌ、塩基性繊維芽細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加した培地を提供する。
また、本発明は、ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌ、塩基性繊維芽細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ添加した培地内において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
【０００６】
これらの発明によれば、高濃度の塩基性繊維芽細胞増殖因子とビタミンＣの相乗効果によって、ビタミンＣを含まない場合および低濃度の塩基性繊維芽細胞増殖因子による場合と比較して大幅に増殖促進効果を向上することができる。
なお、ビタミンＣの濃度は、２５μｇ／ｍｌ以上７５μｇ／ｍｌ未満、１５００μｇ／ｍｌより大きく４０００μｇ／ｍｌ以下でもよい。
また、ｂＦＧＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌより大きく１００ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることがより好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、間葉系幹細胞を効率的に増殖して、患者から採取した骨髄液等に含まれる微量の間葉系幹細胞から、短期に、かつ大量に間葉系幹細胞を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の一実施形態に係る培地および間葉系幹細胞の培養方法について説明する。
本実施形態に係る培地は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum ）、２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌのビタミンＣ、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度の塩基性繊維芽細胞増殖因子（basic Fibloblast
Growth Factor：以下、ｂＦＧＦという。）および抗生物質を混合したものである。また、血清はＦＢＳに限られず、ヒト血清や人工血清でもよい。
【０００９】
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、培地として上記培地を使用して所定の培養条件（例えば、温度３７℃、５％ＣＯ２）で間葉系幹細胞の培養を行う方法である。
本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および細胞増殖因子の使用方法によれば、高濃度のｂＦＧＦおよびビタミンＣの作用により、これらを含まない場合と比較して間葉系幹細胞を大幅に増殖させることができるという効果がある。
【実施例】
【００１０】
［第１の実施例］
上記実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法の第１の実施例を以下に説明する。
まず、培地に添加するビタミンＣの効果について説明する。
対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁し、次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、６ウェルプレートに播き、種々の濃度のビタミンＣを含んだ培地２ｍｌを加えた。
【００１１】
このように調製された培地内に配された間葉系幹細胞をＣＯ２インキュベータ内に投入し、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１週間培養した。培養期間中、２日ごとに培地の交換を行った。培養２日目、４日目および７日目において細胞をトリプシンで回収して血球計算盤で細胞数を計測した。その結果を図１に示す。コントロールとして、ビタミンＣを含まない培地で同様の培養を行った結果を示す。
【００１２】
この実施例によれば、培地に５０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌのビタミンＣを添加したいずれの場合においても、添加しないコントロールの場合と比較して、間葉系幹細胞の増殖促進効果が認められた。特に、培養４日目においては、約２．１倍も多く間葉系幹細胞を増殖させることができた。また、これらの場合において、ビタミンＣの濃度の相違による増殖促進効果に差異は見られなかった。したがって、ビタミンＣについては濃度範囲の制限はないが、現実的には２５μｍ〜４０００μｇ／ｍｌの範囲であることが好ましい。
【００１３】
次に、培地に添加するｂＦＧＦの効果について説明する。
対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁し、次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、６ウェルプレートに播き、種々の濃度のｂＦＧＦを含んだ培地２ｍｌを加えた。
【００１４】
このように調製された培地内に配された間葉系幹細胞をＣＯ２インキュベータ内に投入し、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１週間培養した。培養期間中、２日ごとに培地の交換を行った。培養２日目、４日目および７日目において細胞をトリプシンで回収して血球計算盤で細胞数を計測した。その結果を図２に示す。コントロールとして、ｂＦＧＦを含まない培地で同様の培養を行った結果を示す。
【００１５】
この実施例によれば、培養４日目において、ｂＦＧＦを添加しないコントロールの場合と比較して、ｂＦＧＦを１ｎｇ／ｍｌ添加した場合は約１．９倍、ｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ以上添加した場合は約２．９倍も多く間葉系幹細胞を増殖させることができた。一方、培養７日目になると、ｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ添加した場合よりも、５０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ添加した場合の方が高い増殖促進効果が得られた。これは、ｂＦＧＦの濃度が高くなるにつれて細胞が小さくなり、低濃度ｂＦＧＦの場合と比べると細胞がまだコンフルエントになっておらず、細胞増殖スペースが空いていたためである。
したがって、間葉系幹細胞の増殖効果を促進するためには、ｂＦＧＦについては、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの高濃度であることが好ましく、５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
【００１６】
次に、ｂＦＧＦおよびビタミンＣの両方を培地に添加した場合について説明する。
対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁し、次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、６ウェルプレートに播き、１０，５０，１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを含んだ培地２ｍｌをそれぞれ加えた。
【００１７】
このように調製された培地内に配された間葉系幹細胞をＣＯ２インキュベータ内に投入し、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１０日間培養した。培養期間中、週に２回培地の交換を行った。培養３日目、６日目および１０日目において細胞をトリプシンで回収して血球計算盤で細胞数を計測した。その結果を図３に示す。コントロールとしてｂＦＧＦおよびビタミンＣを含まない培地（ＯＢＧＭ）、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含みビタミンＣを含まない培地（ｂＦＧＦ）および５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを含みｂＦＧＦを含まない培地（ＶＣ）で同様の培養を行った結果を示す。図中符号ＶＣはビタミンＣを意味する。
【００１８】
この実施例によれば、ｂＦＧＦを単独で添加した場合よりも、ビタミンＣとともに添加した場合の方が細胞増殖を促進することが明らかである。しかもその促進効果はｂＦＧＦ濃度に依存している。培養６日目においては、ビタミンＣとｂＦＧＦを同時に添加した場合には、ｂＦＧＦのみ添加した場合の１．８倍〜２．５倍、何も添加しない場合の４．０倍〜５．５倍も細胞が増殖したことが認められた。また、ビタミンＣの添加により、間葉系幹細胞からのコラーゲン産生が促進され、培養液中にコラーゲンが分泌されることにより容器内に蓄積するので、細胞の接着が促進されかつコラーゲン中に細胞が重層化して成長することによって３次元的な増殖が行われ、さらに増殖促進効果が高められることになる。また、ビタミンＣと同時に添加するｂＦＧＦの濃度は高ければ高いほど増殖促進効果が認められる。したがって、ｂＦＧＦは、１０ｎｇ／ｍｌより多く添加する方が好ましい。
【００１９】
［第２の実施例］
次に、本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法の第２の実施例を以下に説明する。この実施例は、上記第１の実施例が対数増殖中の間葉系幹細胞について、ｂＦＧＦとビタミンＣの両方を添加した場合の増殖促進効果を示したのに対し、患者の体内から採取した骨髄液に対してｂＦＧＦおよびビタミンＣを添加した培地を用いて、骨髄液内の間葉系幹細胞を初代培養したものである。
【００２０】
すなわち、骨髄液を１ｍｌ採取し、１０％の血清、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣおよび２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含んだ培地９ｍｌに加え、均一に混合して９０ｍｍのディッシュに播いた。そして、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。培養期間中、３〜４日ごとに培地の交換を行った。コントロールとして、ビタミンＣおよびｂＦＧＦを含まない培地を用いて同様の実験を行った。その結果を図４および図５に示す。図４は、培養１週間後のｂＦＧＦおよびビタミンＣを含む場合、図５は同時期のコントロールの場合である。
【００２１】
これらの図によれば、コントロールに比べて、ビタミンＣとｂＦＧＦを含む培地の方が、多くの細胞コロニーが形成されていることがわかる。また、このことから、ビタミンＣとｂＦＧＦの添加により、間葉系幹細胞の接着が促進されていることがわかる。
【００２２】
また、図６は、培養１１日後にトリプシンで回収した間葉系幹細胞の細胞数を血球計算盤によって計測した結果を示す。４種類の検体について測定した結果、細胞数の絶対値は検体ごとに差があったが、ｂＦＧＦとビタミンＣの両方を添加した場合は、コントロールの場合と比較して、いずれの検体においても約３〜５倍の細胞数が得られていることがわかる。
したがって、これらの結果から、患者から採取した骨髄液の初代培養においても効率的に間葉系幹細胞を増殖させることができることがわかった。
【００２３】
［第３の実施例］
次に、本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法の第３の実施例を以下に説明する。この実施例は、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣを含んだＤＭＥＭ培地１０ｍｌを間葉系幹細胞とともにディッシュ内に投入して、ＣＯ２インキュベータ内において、温度３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養するものである。３〜４日ごとに継代と血球計算盤による細胞数の計測とを行い、その結果を図７に示す。比較例として、特許文献２の結果を併せて示す。
【００２４】
図７によれば、比較例では、細胞の増殖速度が１６日目前後で停止しているのに対し、補実施例によれば２ヶ月経過後も増殖し続けていることがわかる。
本実施例によれば、間葉系幹細胞を長期にわたって培養し続けることができるので、細胞治療またはティシューエンジニアリングに非常に有効である。すなわち、本実施例によれば、例えば、骨、軟骨、神経等を形成する種々の細胞に分化できる多分化能を維持したまま長期培養できるので、細胞を増やしながら種々の臨床用途に供給することが可能となる。また、将来的に、間葉系幹細胞をセルバンク化して同種移植に応用する際に、本実施例によれば、１本のセルバンクから大量の細胞を増殖して多数の患者に供給することができるという利点がある。
【００２５】
なお、特許文献２においては、グルタミンやヘパリン等の種々の成分の添加量が規定されているが、これらについては特別に添加する必要はない。グルタミンは通常の培地には既に含有されているからであり、ヘパリンはｂＦＧＦとそのレセプタとの親和性を高める効果があるが、本実施形態のように高濃度ｂＦＧＦを採用することの効果と比較するとその効果は無視できるほど小さいからである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施形態に係る培地および間葉系幹細胞の培養方法とその効果を説明するためのビタミンＣの増殖促進効果を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施形態に係る培地および間葉系幹細胞の培養方法とその効果を説明するためのｂＦＧＦの増殖促進効果を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態に係る培地および間葉系幹細胞の培養方法とその効果を説明するための第１の実施例を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態に係る培地および間葉系幹細胞の培養方法を初代培養に利用した場合の効果を説明するための第２の実施例を示す図である。
【図５】図４の比較例として、ｂＦＧＦおよびビタミンＣを含まないコントロールを示す図である。
【図６】図４の実施例および図５の比較例における細胞数の比較結果を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態に係る培地および間葉系幹細胞の培養方法による長期間培養継続の効果を示すグラフである。
【図１】
2006136281.tif 000003
【図２】
2006136281.tif 000004
【図３】
2006136281.tif 000005
【図４】
2006136281.tif 000006
【図５】
2006136281.tif 000007
【図６】
2006136281.tif 000008
【図７】
2006136281.tif 000009