(57)【要約】【課題】光機能性を有する変異タンパク質を提供する。【解決手段】ヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰのアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸を光反応性アミノ酸に置換し、光を照射することによって機能を制御することができる変異タンパク質を作製する。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換され、かつ光を照射することによって機能の発現が制御される変異タンパク質であって、
ヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰの変異体であることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２】
配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ光を照射することによって機能の発現が制御されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項３】
配列番号８に示されるアミノ酸配列中の１９７番目又は２８８番目のアミノ酸であるフェニルアラニンが光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項４】
前記光反応性アミノ酸は、次に示す式（２）
【化１】
2006169258.tif 000005
で表される非天然アミノ酸であることを特徴とする請求項３に記載の変異タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光を照射することによって機能の発現が制御されるという光機能性を有する変異タンパク質に関するものであり、その中でも特に、光機能性のＤＮＡ結合タンパク質に関するものである。さらに、本発明はガン（癌）の治療薬剤等に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
自身の塩基配列に遺伝情報を記憶しているＤＮＡや、自身のアミノ酸同士の相互作用によって立体構造を形成して機能を発現しているタンパク質などの生体分子の機能を模倣した人工生体分子の研究は、物理、化学、生物、医学、薬学、情報科学などの広い分野で活発に行われている。生体分子の機能や動作原理を基本にした人工生体分子の機能化の最も有効で現実的な方法として、光を利用して人工生体分子の機能発現を制御する方法が検討されている。
【０００３】
ところで、光の照射によって活性化されたり、失活されたりする生理活性物質は、ケージド化合物と呼ばれている。上記ケージド化合物は、生理活性物質内の活性に必須な部分を、光分解性の保護基によって保護することにより、通常の状態では活性を失っている化合物である。そして、上記ケージド化合物は、適当な波長および強さの光が照射されることによって、保護基が脱離し、本来の活性を取り戻すという性質を有している。ケージド化合物の一例として、アデノシン３リン酸、γ−１（２−ニトロフェニル）エチルエステルなどを挙げることができる。これらは試薬として実用化されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、光照射によって生体反応の制御を可能にするという光機能性を有するタンパク質については、実用化されるには至っていないのが現状である。上記のような光機能性タンパク質が実用化されれば、酵素活性、タンパク質の相互作用、リン酸化等の光照射による制御を可能にし、生体研究やバイオ産業の発展に寄与するものと思われる。さらに、上記光機能性タンパク質は、医薬分野にも応用できる可能性を有することから、非常に有用性が高い。
【０００５】
また、生体機能の多くはタンパク質の働きに支配されている。このタンパク質としては、生体の活動に必要な酵素や器官を構成するものから、情報伝達や遺伝子発現にかかわるものまで存在し、生体内で精密に制御されている。これら生体の恒常性を維持するために働くタンパク質に異常をきたすと、多くの疾患を起こすことが知られている。その端的な一例はガンである。従来のガン治療は化学療法や放射線療法である。しかしながら、化学療法や放射線治療によるガン治療では、ガン細胞のみならず、正常な細胞にも薬物や放射線の影響を及ぼし、様々な副作用を引き起こす。ガン細胞選択的に治療が可能であれば、現在の不可避な副作用は著しく軽減され、治癒効率が極めて改善されることが期待される。即ち、生体中ではタンパク質によって最終的に機能が発現されるため、その機能を人為的に制御できれば、細胞のもつ生体機能の制御が可能になり、ガン細胞の除去などに大きく貢献することが期待される。
【０００６】
本発明は上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質であるｈＴＢＰに光反応性アミノ酸を導入し、光照射によって機能の発現を制御することが可能な変異タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は、光を外部刺激とした生体内反応の発現および制御を可能とする光機能性デバイスの構築を目指し、４塩基コドン法を用いて光応答性分子として光反応性アミノ酸を組み込んだ光機能性の変異タンパク質の創製を試みた。その結果、光を照射することによって、天然型タンパク質に本来備えられている機能の発現を制御することが可能な光機能性を有する変異タンパク質を作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明に係る変異タンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換され、かつ光を照射することによって機能の発現が制御される変異タンパク質であって、ヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰの変異体であることを特徴とする。
【０００９】
多くのタンパク質の機能は構造によって制御されているため、その機能発現はタンパク質の構造に変化を加えることによって調節することができる。本発明においては、タンパク質の構造を変化させるために光反応性アミノ酸を使用する。上記光反応性アミノ酸とは、光が照射されることによって構造を変化させるアミノ酸である。上記光反応性アミノ酸としては、例えば、ケージド化合物のように光照射によって保護基が脱離する光分解性を有するもの、あるいは、照射する光の波長によってシス−トランス異性化反応を起こす光異性化性を有するものなどが挙げられる。
【００１０】
即ち本発明においては、タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸を、後述する４塩基コドン法を用いて上述のような光反応性アミノ酸に置換し、細胞内で発現できる系を構築することによって、目的とする変異タンパク質を得ることができるのである。このようにして得られた上記変異タンパク質は、通常の状態では構造が変化しているため、本来の機能を失っているが、適当な光を照射することによって天然型の構造に戻るなどして構造を変化させ、本来の機能を取り戻すことができる。それゆえ、本発明に係る変異タンパク質は、光が照射されることによって機能の発現を制御することができるという光機能性を有している。
【００１１】
光機能性を有する上記変異タンパク質を細胞内に導入すれば、例えば、レーザー光などを細胞へ向けて照射することで、細胞の持つ情報伝達経路及び遺伝子発現経路へ直接外部から制御することが可能になる。従って、上記変異タンパク質は、生体研究やバイオ産業への高い利用価値を有している。
【００１２】
本発明に係る変異タンパク質として、具体的には、配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ光を照射することによって機能の発現が制御される変異タンパク質を挙げることができる。
【００１３】
配列番号８に示すアミノ酸配列は、ヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰのアミノ酸配列である。従って、上記変異タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰの変異タンパク質である。
【００１４】
さらに具体的には、本発明の変異タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列中の１９７番目又は２８８番目のアミノ酸であるフェニルアラニンが光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質である。
【００１５】
上記変異タンパク質は、光反応性アミノ酸を用いているため、通常は不活性な状態である。そのため、活性を失った安全な状態で生体内へ導入することが可能である。上記変異タンパク質を生体内に導入し、例えば、レーザー光による局所的な光照射を行えば、細胞選択的に上記変異タンパク質の機能を発現させることができる。
【発明の効果】
【００１６】
以上のように、本発明に係る変異タンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換され、かつ光を照射することによって機能の発現が制御される変異タンパク質であって、ヒト由来のＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰの変異体であることを特徴とする変異タンパク質である。
【００１７】
上記変異タンパク質は、光の照射によって生体反応の制御をすることができるという光機能性タンパク質である。従って、上記変異タンパク質は、生体研究やバイオ産業、ひいては医薬分野にも種々に利用することができるため、バイオ産業および医薬分野の発展に多大に貢献することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施の形態であるＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰの変異体、および、その参考例である制限酵素ＢａｍＨＩの変異体について、図１ないし図５および図１３ないし図１６を用いて以下に説明する。なお、本発明は特にこの記載に限定されるものではない。
【００１９】
制限酵素ＢａｍＨＩは、２量化によって活性を持つエンドヌクレアーゼの一つである。上記ＢａｍＨＩは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、配列番号１に示す塩基配列を有するｃＤＮＡは、上記ＢａｍＨＩをコードする遺伝子の一つである。
【００２０】
図２（ａ）には、２量化したＢａｍＨＩの模式図を示す。図２（ａ）に示すように、ＢａｍＨＩは各サブユニットＢａｍＨＩ−１とＢａｍＨＩ−２とが、図中矢印Ａで示す位置（この位置を２量化インターフェースと称する。）において相互作用することによって、複合体を形成している。即ち、図２（ｂ）に示すように、ＢａｍＨＩ−１のαへリックス（α４）内の１３２番目のアミノ酸であるリジン（Ｋ１３２）及び１３３番目のアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ１３３）と、ＢａｍＨＩ−２のαへリックス（α６’）内の１６７番目及び１７０番目のアミノ酸である２つのグルタミン酸とを介して、側鎖が水素結合及び静電的な相互作用をすることによって２量体を形成している。このように２つのＢａｍＨＩが２量化し複合体を形成することによって、図２（ａ）に示すように、ＢａｍＨＩの基質となるＤＮＡ３は、ＢａｍＨＩ−１とＢａｍＨＩ−２との中間の位置において切断される。
【００２１】
従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１３２番目のアミノ酸であるリジン、１３３番目のアミノ酸であるヒスチジン、１６７、１７０番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、上記ＢａｍＨＩが２量体を形成し、機能を発現して活性化するために必須の領域であると言える。
【００２２】
本実施の形態に係る変異タンパク質は、上記ＢａｍＨＩにおいて、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ光を照射することによって活性化されるものである。
【００２３】
上記変異タンパク質においては、配列番号２に示すアミノ酸配列において、機能の発現に必須である１３２番目のリジン、１３３番目のヒスチジン、１６７及び１７０番目のグルタミン酸のうち、何れか１つのアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換されることが好ましい。
【００２４】
また、上記変異タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、その配列中の１３２番目のリジンが光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなることがさらに好ましい。これによれば、後述の実施例にも示すように、光を照射することによって機能の発現を確実に制御することができる。
【００２５】
上記光反応性アミノ酸としては、例えば、図３（ａ）に示す非天然アミノ酸Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジン、図３（ｂ）に示す非天然アミノ酸γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸などが挙げられる。なお、上記Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンは、リジンのε−アミノ基に、保護基として６−ニトロベラチロキシカルボニル（ＮＶＯＣ）基を導入することによって得られる。上記γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸のε−カルボキシル基に、保護基として６−ニトロベラチル基を導入することによって得られる。
【００２６】
上記Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンでは、波長（λ）３６５ｎｍの光を照射することによって、図４（ａ）に示すようなＮＶＯＣ基の光脱離反応が起こり、ε−アミノ基が露出する。即ち、上記Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンは、波長３６５ｎｍの光を照射することによってリジンとなる。
【００２７】
また、上記γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸では、波長３６５ｎｍの光を照射することによって、図４（ｂ）に示すような６−ニトロベラチル基の光脱離反応が起こり、ε−カルボキシル基が露出する。即ち、上記γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸は、波長３６５ｎｍの光を照射することによってグルタミン酸となる。従って、上記２つの光反応性アミノ酸は、光照射によって保護基が脱離するケージド化合物の一種である。
【００２８】
上記Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンは、上述のように、波長３６５ｎｍの光照射によってリジンとなる。従って、上記変異タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列中の１３２番目のリジンが、光反応性アミノ酸として、次に示す式（１）
【００２９】
【化１】
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【００３０】
で表される非天然アミノ酸Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンに置換されたものであることが好ましい。
【００３１】
上記変異タンパク質は、波長３６５ｎｍの光を照射することによって、ＮＶＯＣ基が脱離し、天然型ＢａｍＨＩとなることができる。即ち、上記変異タンパク質は、図１（ａ）に示すように、通常の状態では１３２番目のリジン（Ｋ１３２）がＮＶＯＣ基に保護されて変異型ＢａｍＨＩとなっているため、２量化が阻害され、不活性（ｉｎａｃｔｉｖｅ）である。しかし、波長（λ）３６５ｎｍの光を照射することによって、図１（ｂ）に示すように、上記変異タンパク質からＮＶＯＣ基が脱離するため、２量体が形成され、天然型ＢａｍＨＩと同じ構造になって活性化（ａｃｔｉｖｅ）される。
【００３２】
なお、図５には、上記変異タンパク質の２量化インターフェースの部分を模式的に示す。図５（ａ）においては、２つのＢａｍＨＩ変異タンパク質において、１３２番目の酸Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンおよび１３３番目のヒスチジンと、１６７番目および１７０番目の２つのグルタミン酸とが、それぞれのＮＶＯＣ基に邪魔されて２量化を阻害されている様子を示す。一方、図５（ｂ）には、波長３６５ｎｍの光が照射されることによって、ＮＶＯＣ基が脱離した上記変異タンパク質の２量化インターフェースの部分を示す。図５（ｂ）に示すように、上記２つのＢａｍＨＩ変異タンパク質は、ＮＶＯＣ基が脱離することによって、天然型と同様に２量化インターフェースを形成することができる。
【００３３】
本実施の形態において上記変異タンパク質の作製は、従来文献：T.Hohsaka, Y. Ashizuka, H. Taira, H. Murakami and M. Sisido, Biochemistry 2001, 40, 11060-1106に記載されている４塩基コドン法によって実施される。
【００３４】
上記４塩基コドン法においては、４塩基アンチコドンを有するｔＲＮＡに上記光反応性アミノ酸を結合させ、アミノアシルｔＲＮＡを作製する。また、変異させるタンパク質のアミノ酸配列においては、置換を行うアミノ酸をコードするコドンを、上記４塩基アンチコドンに対応する４塩基コドンと置き換えて、変異遺伝子のｍＲＮＡを作製する。なお、上記変異遺伝子の作製は、従来公知の方法によって実施すればよい。このようにして得られた変異遺伝子のｍＲＮＡについて、上記４塩基アンチコドンを有するアミノアシルｔＲＮＡを添加して翻訳することによって、目的とする位置に上記光反応性アミノ酸が導入された変異タンパク質を得ることができる。上記４塩基コドン法による変異タンパク質の作製方法については、後述の実施例にて詳述する。
【００３５】
ＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰから得られる変異タンパク質の実施の形態について、さらに説明する。
【００３６】
ヒトなどの真核生物のクラスＩＩ転写（ｍＲＮＡの合成）は、プロモーターに基本転写因子が結合し、制御することでＲＮＡポリメラーゼＩＩに正確な位置からＲＮＡ合成を開始させる。上記ｈＴＢＰは、この基本転写因子の一つであるＴＦＩＩＤを構成し、ＤＮＡのＴＡＴＡボックス位置に結合するＤＮＡ結合タンパク質である。
【００３７】
図１３は、ヒトのクラスＩＩ転写における基本転写因子ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＣ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨと、ＤＮＡとの複合体に、ＲＮＡポリメラーゼが作用し、転写を行う様子を模式的に示す図である。基本転写因子ＴＦＩＩＤは、上記ＤＮＡ結合タンパクｈＴＢＰ（図中ではＴＢＰ）とＴＢＰ結合因子（図中ではＴＡＦｓ）とから構成され、上記ｈＴＢＰがＤＮＡのプロモーター領域（Ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）内のＴＡＴＡボックスと結合する。上記ＴＦＩＩＤが、基本転写因子の中で唯一ＤＮＡに配列特異的に結合し、この結合によって、ＤＮＡと基本転写因子との複合体は形成され、転写反応が行われる。
【００３８】
このように、上記ｈＴＢＰは、転写因子の機能を果たすために必須のタンパク質であり、その機能の発現を制御することで、遺伝子の発現の制御までをも行うことが可能である。従って、上記ｈＴＢＰから本発明に係る変異タンパク質を作製すれば、光照射でその機能の発現を制御することによって、遺伝子の発現の制御を行うことができると思われ、有用性が高い。
【００３９】
上記ｈＴＢＰは、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり、配列番号７に示す塩基配列を有するｃＤＮＡは、上記ｈＴＢＰをコードする遺伝子の一つである。従って、上記変異タンパク質は、配列番号８に示されるアミノ酸配列中の任意のアミノ酸が、光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ光を照射することによって機能の発現が制御されるものであってもよい。
【００４０】
また、上記ｈＴＢＰは、配列番号８に示すアミノ酸配列中の１９７番目および２８８番目のアミノ酸であるフェニルアラニンが、上記ＴＡＴＡボックスにインターカレートすることで、図１４の模式図に示すように、結合するＤＮＡをマイナーグルーブ側に９０度折り曲げる性質を有している。このように、ＤＮＡを折り曲げることで、転写が活性化されるのである。即ち、上記配列中の１９７番目および２８８番目のフェニルアラニンは、上記ｈＴＢＰにおいて、その機能を発現する上で必須のアミノ酸であると言える。
【００４１】
従って、上記変異タンパク質は、配列番号８に示すアミノ酸配列において、その配列中の１９７番目又は２８８番目のアミノ酸であるフェニルアラニンが光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００４２】
上記ｈＴＢＰの変異タンパク質に導入される光反応性アミノ酸としては、例えば、次に示す式（２）
【００４３】
【化２】
2006169258.tif 000004
【００４４】
で表される非天然アミノ酸を挙げることができる。なお、上記非天然アミノ酸は、図１５（ａ）に示すフェニルアゾフェニルアラニンである。上記フェニルアゾフェニルアラニンは、波長３６５ｎｍの光を照射することによって、ジアゾベンゼン基が図１５（ａ）に示すトランス体から、図１５（ｂ）に示すシス体へ異性化される。さらに、図１５（ｂ）に示すシス体へ波長４５０ｎｍの光を照射すると、図１５（ａ）に示すトランス体へ異性化される。即ち、上記フェニルアゾフェニルアラニンは光異性化性を有するアミノ酸である。
【００４５】
上記フェニルアゾフェニルアラニンを、４塩基コドン法を用いて、上記ｈＴＢＰのアミノ酸配列中の１９７番目のフェニルアラニンと置換することによって得られた変異タンパク質の模式図を図１６に示す。図１６（ａ）は、上記変異タンパク質（図中ＴＢＰ）の１９７番目のアミノ酸であるフェニルアゾフェニルアラニンがトランス体の場合を示す。この時、ＤＮＡは、図にも示されるように、天然型と同様に上記１９７番目のアミノ酸がＤＮＡのＴＡＴＡボックスにインターカレートし、ＤＮＡは折り曲げられる。従って、ＤＮＡの転写は活性化される。一方、図１６（ｂ）に示す変異タンパク質（図中ＴＢＰ）は、１９７番目のアミノ酸であるフェニルアゾフェニルアラニンがシス体の場合のものである。この時、フェニルアゾフェニルアラニンはＤＮＡにインターカレートせず、ＤＮＡの転写は行われないと予想される。
【００４６】
即ち、上記変異タンパク質は、波長３６５ｎｍ、４５０ｎｍの光をそれぞれ照射することによって、図１６（ａ）から図１６（ｂ）へ、あるいは、図１６（ｂ）から図１６（ａ）へ構造変化すると考えられる。従って、上記変異タンパク質は、光照射によって、機能の発現を制御することができる。
【００４７】
なお、本発明に用いられるタンパク質の具体的な例としては、以上のような制限酵素ＢａｍＨＩおよびＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰを挙げることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。上記以外のものとしては、例えば、２つ以上のサブユニットからなるホモまたはヘテロの多量体を形成するタンパク質を用いることができる。上記多量体を形成するタンパク質は、生体中で各サブユニットである個々のタンパク質が単量体として存在する場合、その機能は不活性であるか、あるいは著しく活性の低下した状態であることが多い。従って、上記多量体を形成するタンパク質から、本発明の変異タンパク質を作製すれば、適当な波長及び強さの光を照射することによって、機能の発現を制御することができるため、生体研究などに有用である。
【００４８】
また、その他のタンパク質としては、遺伝子発現制御に関わる転写因子、細胞内情報伝達に関わるタンパク質、あるいは、アポトーシスを誘導するカスパーゼなどを用いることが好ましい。
【００４９】
上記転写因子の具体例として、上述の塩基配列中のＴＡＴＡボックスに結合するＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰ、あるいはＳＴＡＴ（signal transducer and activator transcription）、ＮＦ−κＢ（nuclear factor-κＢ）などを挙げることができる。上記細胞内情報伝達に関わるタンパク質として具体的には、細胞増殖のシグナルを伝達するＲａｓタンパク質、ＳＴＡＴなどを挙げることができる。Ｒａｓタンパク質は、ＧＴＰ（グアノシン３リン酸）を結合した状態で活性化され、次にキナーゼであるＲａｆタンパク質と結合し、シグナルを伝達する。Ｒａｓタンパク質から上記変異タンパク質を作製すれば、Ｒａｓタンパク質とＧＴＰとの結合及び、Ｒａｓ−ＧＴＰとＲａｆタンパク質との結合を光照射によって制御することができる。
【００５０】
また、インターフェロンをシグナルとして情報伝達と転写の活性化の両方を行うＳＴＡＴは、リン酸化で活性化される。上記ＳＴＡＴから上記変異タンパク質を作製し、光照射によってリン酸化されるようにすれば、情報伝達の制御を行うことができる。
【００５１】
なお、本実施の形態においては、４塩基コドン法によって光反応性アミノ酸への置換を行っているが、本発明はこれに限定されることなく、他の置換方法を用いることもできる。上記置換方法として、例えば、アンバーサプレッション法、非天然塩基コドン法などを挙げることができる。
【００５２】
変異させるタンパク質のアミノ酸配列中で、光反応性アミノ酸に置換するアミノ酸としては、そのタンパク質の立体構造、ひいてはその機能を維持する上で必須のアミノ酸を選択することが好ましい。これによれば、得られた変異タンパク質は、光照射をしない通常の状態では、著しく活性を失うことが可能であり、容易に機能の発現の制御を行うことができると考えられる。
【００５３】
上記光反応性アミノ酸としては、側鎖（α−アミノ基、α−カルボキシル基以外の側鎖）に光反応性基を有するものであれば、特に限定されるものではないが、天然のアミノ酸の側鎖が光照射によって脱離する保護基で修飾されたものを用いることが好ましい。これによれば、光照射によって上記保護基が脱離し、天然のアミノ酸に戻ることができるため、上記変異タンパク質において活性を取り戻すことが可能である。上記保護基として、具体的には、ＮＶＯＣ基、６−ニトロベラチル基、ニトロベンジル基などを挙げることができ、天然のアミノ酸の側鎖に応じて適宜選択すればよい。
【００５４】
また、上記光反応性アミノ酸として、側鎖に光異性化可能な構造を有するものを使用することもできる。この光反応性アミノ酸として、具体的には、フェニルアゾフェニルアラニンを挙げることができる。
【００５５】
本発明に係る変異タンパク質は光反応性のアミノ酸を用いているので、安全な不活性の状態で細胞内に導入でき、レーザーによる局所的な光照射で細胞選択的にタンパクの発現を行うことが可能である。従って、アポトーシスを強力に誘導できるタンパク、例えばカスパーゼなどに光反応性アミノ酸を導入し変異タンパク質を作製した後、不活性な状態で細胞に導入し、導入後にガン化した細胞のみに選択的に光照射を行うことで、ガン細胞を死滅させることが可能になる。それゆえ、本発明に係る変異タンパクは、局部的な光照射を用いることによって、ガン細胞除去に応用することができる。
【００５６】
さらに、昨今の光学機器の精密化、特に短パルス高ピークパワーのレーザーの開発によって、細胞透過性の良い長波長の光照射でも２光子反応を起こすことが可能になり、細胞内小器官程度の大きさのターゲットに対して空間的及び時間的に光反応制御を行うことが可能になってきている。そのため、上記変異タンパク質を生体内に導入した後、上記短パルス高ピークパワーのレーザーを用いて、ガン細胞のみに選択的にレーザー光を照射すれば、より確実にガン細胞のみを死滅させることができる。
【００５７】
従って、本発明に係るガンの治療薬剤は、上記変異タンパク質を含んでなり、かつ、生体内に導入した後に、ガン細胞特異的に上述のレーザー光などの光を照射するという方法で利用することが好ましい。これによれば、上記変異タンパク質を含むガンの治療薬剤は、ガン細胞内だけで機能を発現し、ガン細胞を死滅させることができる。なお、上記治療薬剤に含まれる変異タンパク質は、機能を発現した場合に、ガン細胞を死滅させるように作用することが好ましい。上記変異タンパク質としては、例えば、細胞内の遺伝子を切断して発現を抑制するＢａｍＨＩなどの制限酵素の変異体、あるいは、アポトーシスを誘導するカスパーゼなどの変異体であることが好ましい。
【００５８】
なお、本発明は、以下の発明を含有するものであってもよい。
（１）タンパク質のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換され、かつ光を照射することによって機能の発現が制御されることを特徴とする変異タンパク質。
（２）前記変異タンパク質は、２量体を形成する制限酵素ＢａｍＨＩの変異体であることを特徴とする上記（１）欄に記載の変異タンパク質。
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、かつ光を照射することによって活性化されることを特徴とする変異タンパク質。
（４）前記変異タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、その配列中の１３２番目のアミノ酸であるリジンが前記光反応性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（２）欄または（３）欄に記載の変異タンパク質。
（５）  前記光反応性アミノ酸は、上記式（１）欄で表される非天然アミノ酸であることを特徴とする上記（４）欄に記載の変異タンパク質。
【実施例】
【００５９】
〔参考例〕
本発明の参考例を、図６ないし図１２を用いて説明する。本参考例においては、４塩基コドン法を用いて制限酵素ＢａｍＨＩより変異タンパク質を作製した。以下にその方法を示す。
【００６０】
１．４塩基アンチコドンを導入したｔＲＮＡの合成
４塩基アンチコドンを導入したｔＲＮＡは、酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のフェニルアラニンのｔＲＮＡの塩基配列に基づいて作製された。
【００６１】
先ず、酵母由来のｔＲＮＡの塩基配列中に、４塩基アンチコドン「ＣＣＣＧ」を導入した塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡが、ＤＮＡ合成機によって合成された。合成された上記２本鎖ＤＮＡの塩基配列を、図６に模式的に示す。なお、図中において、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃは、それぞれアデニン、チミン、グアニン、シトシンを示し、上段に示す２本鎖ＤＮＡと下段に示す２本鎖ＤＮＡとは、それぞれａとａ’と、またはｂとｂ’とでつながっている。図６に示す上記２本鎖のセンス鎖は、５’末端から順に、ＥｃｏＲＩ制限酵素配列、Ｔ７プロモーター配列、ｔＲＮＡの配列、ＦｏｋＩ制限酵素配列、ＢａｍＨＩ制限酵素配列となっている。
【００６２】
上記ｔＲＮＡの塩基配列は、図６中の矢印Ｂに示すグアニンから、矢印Ｃに示すアデニンまでである。また、上記ｔＲＮＡ配列中の太字で示した部分「ＣＣＣＧ」が上記４塩基アンチコドンである。なお、上記ｔＲＮＡ配列は、配列番号４に示す塩基配列に相当する。配列番号４に示す塩基配列は、酵母由来のフェニルアラニンのｔＲＮＡの塩基配列中に、４塩基アンチコドン「ＣＣＣＧ」が挿入された塩基配列でもある。なお、配列番号４に示す塩基配列において、上記４塩基アンチコドンは、３４番目から３７番目の配列に相当する。
【００６３】
続いて、合成された上記２本鎖ＤＮＡをｐＵＧ１９プラスミドのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイトへ挿入した。上記２本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドは、大腸菌ＤＨ５α株に導入され形質転換された後、アンピシリンで選択し精製した。上記プラスミドの配列はＤＮＡシークエンシングによって確認された。その後、上記プラスミドは制限酵素ＦｏｋＩで切断され、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写された。この転写反応によって得られた４塩基アンチコドンが導入されたｔＲＮＡは、ポリアクリルゲル電気泳動によって精製された。
【００６４】
２．非天然アミノ酸の合成
本参考例においては、光反応性アミノ酸として、図３に示す２つの非天然アミノ酸Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジン、γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸を合成した。
【００６５】
Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンは、図７（ａ）から（ｃ）に示す手順に従って合成された。この方法よって、Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンは、図７（ｃ）に示すようなα−アミノ基とα−カルボキシル基とが、それぞれｔ−ブトキシ基とシアノメチル基とで保護された形で得られた。なお、図７（ａ）から（ｂ）の合成には、６−ニトロベラチルクロロフォルメートおよびＮａＨＣＯ３が使用され、図７（ｂ）から（ｃ）の合成にはＣＮＣＨ２Ｃｌが使用された。
【００６６】
また、γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸は、図７（ｄ）から（ｈ）に示す手順に従って合成された。この方法によって、γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸は、図７（ｈ）に示すようなα−アミノ基とα−カルボキシル基とが、それぞれｔ−ブトキシ基とシアノメチル基とで保護された形で得られた。なお、図７（ｄ）から（ｅ）の合成には６−ニトロベラチルアルコールが使用され、図７（ｅ）から（ｆ）の合成にはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が使用され、図７（ｆ）から（ｇ）の合成にはＢｏｃ２Ｏが使用され、図７（ｇ）から（ｈ）の合成にはＣＮＣＨ２Ｃｌが使用された。
【００６７】
上記の合成方法によって得られた上記２つの非天然アミノ酸は、１Ｈ−ＮＭＲ及び質量分析ＥＳＩ−ＭＳで同定された。
【００６８】
３．非天然アミノ酸の核酸２量体ｐｄＣｐＡへのアミノアシル化
図７（ｃ）および（ｈ）に示す非天然アミノ酸は、核酸２量体ｐｄＣｐＡへアミノアシル化され、図８（ａ）または（ｂ）に示す化学式において、非天然アミノ酸由来のα−アミノ基がＢｏｃ基で保護された物質、ｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ、ｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯ−Ｇｌｕがそれぞれ得られた。
【００６９】
上記ｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓは、１ＨＮａＯＨによってｐｄＣｐＡとＢｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓとに加水分解された。その結果を図９（ａ）、（ｂ）に示す。図９に示すＨＰＬＣ分析のチャートにおいて、横軸は保持時間（分）を示し、反応前後の試料中に含まれる物質を分析した結果を示すものである。なお、図９（ａ）が反応前、図９（ｂ）が反応後である。図９（ａ）に示すピーク（保持時間約１４．５分）は、ｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓを示し、図９（ｂ）に示す左側のより大きなピーク（保持時間約７分）は、分解によって生成したｐｄＣｐＡを、右側のより小さなピーク（保持時間約１７分）は、分解によって生成したＢｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓを示す。この結果より、ｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓは、ｐｄＣｐＡとＢｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓとがエステル結合で結合していることがわかる。
【００７０】
また、ｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓに波長３６５ｎｍの光を照射した場合の、試料中に含まれる物質をＨＰＬＣ分析で経時的に分析した結果を、時間の経過順に図９（ｃ）から（ｅ）に示す。図９（ｃ）に示されるピーク（保持時間約１４．５分）は、原料のｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓを示す。図９（ｄ）に示される右側のピーク（保持時間約１４．５分）は、原料のｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓを、左側のピークは、分解によって生成したｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓを示す。図９（ｅ）に示される大きなピークは、分解して得られたｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓを示す。この結果より、光照射によって、容易にＮＶＯＣ基が脱離することがわかる。なお、０℃におけるｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓの半減期は２分であった。
【００７１】
４．アミノアシルｔＲＮＡの合成
得られたｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ及びｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯ−Ｇｌｕは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって処理され、Ｂｏｃ基が脱保護され、図８（ａ）および（ｂ）に示すＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｐｄＣｐＡ、ＮＶＯ−Ｇｌｕ−ｐｄＣｐＡが得られた。その後、ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｐｄＣｐＡおよびＮＶＯ−Ｇｌｕ−ｐｄＣｐＡは、３’末端のＣＡを欠いた４塩基アンチコドンが導入された上記ｔＲＮＡとＴ４リガーゼによって結合された。これによって、図１０（ａ）及び（ｂ）に示すアミノアシルｔＲＮＡ（即ち、ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｔＲＮＡｃｃｃｇ及びＮＶＯ−Ｇｌｕ−ｔＲＮＡｃｃｃｇ）が得られた。
【００７２】
５．ＢａｍＨＩ発現用プラスミドとＢａｍＨＩのｍＲＮＡの合成
制限酵素ＢａｍＨＩをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、プロテインデータバンク（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＢＡＭ）より得た。なお、この塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列に相当する。この塩基配列をＤＮＡ合成機によって分割して合成し、オリゴマーのリン酸化及びライゲーションによって全長のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡは、ｐＵＣベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイトに組み込まれた。塩基配列はシークエンシングによって確認された。得られた全長のｃＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅し、タンパク発現用のｐＥＴ２６ｂベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩサイトに導入され、ＢａｍＨＩ発現用プラスミドが得られた。
【００７３】
また、上記ＢａｍＨＩ発現用プラスミドの上記ｃＤＮＡの塩基配列において、ＢａｍＨＩタンパク質のアミノ酸配列の１３２番目のリジンをコードするコドン「ＡＡＡ」（配列番号１に示す塩基配列において３９４から３９６番目）が、上記４塩基アンチコドンに対応する４塩基コドン「ＣＧＧＧ」に置換された塩基配列を有するプラスミドが作製された。この塩基配列は、配列番号３に示す塩基配列に相当する。
【００７４】
同様にして、１６７番目のグルタミン酸をコードするコドン「ＧＡＡ」（配列番号１に示す塩基配列において４９９から５０１番目）、１７０番目のグルタミン酸をコードするコドン「ＧＡＡ」（配列番号１に示す塩基配列において５０８から５１０番目）について、それぞれ上記４塩基コドン「ＣＧＧＧ」に置換された塩基配列を有するプラスミドが作製された。なお、この塩基配列は、配列番号５あるいは配列番号６に示す塩基配列に相当する。
【００７５】
これらのプラスミド（Ｔ７プロモーターを有する）より、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる細胞外転写反応でｍＲＮＡを合成した。なお、ここで得られるｍＲＮＡは、天然型ＢａｍＨＩをコードする天然型ｍＲＮＡ及び、各部位に４塩基コドンが導入された変異型ｍＲＮＡ（３種）である。
【００７６】
６．天然型ＢａｍＨＩ及び変異型ＢａｍＨＩの細胞外翻訳反応
上述の４種のプラスミドを使用して、天然型ＢａｍＨＩ及び光反応性アミノ酸ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ又はＮＶＯＣ−Ｇｌｕを導入した変異型ＢａｍＨＩの合成を行った。上記変異型ＢａｍＨＩの翻訳反応においては、４塩基アンチコドンが導入されたアミノアシルｔＲＮＡを添加して翻訳反応を進めることによって、上記変異型ｍＲＮＡの４塩基コドンに相当する位置において、上記アミノアシルｔＲＮＡに含まれるＮＶＯＣ−Ｌｙｓ又はＮＶＯＣ−Ｇｌｕという光反応性アミノ酸に置換することができると考えられる。
【００７７】
上記翻訳反応は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、温度３７℃で、２時間行われた。これによって、ＢａｍＨＩタンパク質を得た。
【００７８】
図１１には、変異型ｍＲＮＡのうち、１３２番目のリジンに相当するコドンが上記４塩基コドンに置換されたものについて行われた翻訳反応の結果を示す。なお、比較のために天然型ＢａｍＨＩについて翻訳反応を行った結果も併せて示す。図１１は、上記翻訳反応よって得られた生成物について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果を示す模式図である。図１１において、レーン１は、天然型ｍＲＮＡから得られた反応後の生成物である。レーン２は、ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｔＲＮＡを添加しない場合の、上記変異型ｍＲＮＡから得られた反応後の生成物である。レーン３は、ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｔＲＮＡを添加した場合の、上記変異型ｍＲＮＡから得られた反応後の生成物である。レーンＭは、分子量マーカーである。
【００７９】
図１１において、点線で囲んだ部分に示されるように、レーン１および３においては、分子量３０ｋＤａ付近に全長のＢａｍＨＩタンパク質のバンドが確認されたが、レーン２においては全長のＢａｍＨＩタンパク質のバンドは検出されなかった。この結果より、ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｔＲＮＡが存在したときのみ、変異型ｍＲＮＡより全長のＢａｍＨＩタンパク質が得られることが確認された。
【００８０】
即ち、上記変異型ｍＲＮＡは、ＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｔＲＮＡの存在下での翻訳反応によって、天然型ＢａｍＨＩのアミノ酸配列において１３２番目のリジンが光反応性アミノ酸であるＮＶＯＣ−Ｌｙｓに置換された変異タンパク質に翻訳される。この１３２番目のリジンがＮＶＯＣ−Ｌｙｓに置換された変異タンパク質を、変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）と称する。
【００８１】
７．変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）のＤＮＡの加水分解反応の光照射による制御
得られた天然型ＢａｍＨＩ及び変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）の、塩基配列特異的なＤＮＡの加水分解反応の活性を、λＤＮＡを基質として調べた。
【００８２】
その結果を図１２に示す。なお、図１２は、加水分解反応後の試料について電気泳動を行って得られたゲルのパターンを示す模式図である。図１２において、レーン１は、変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）を光照射せずにλＤＮＡと反応させたものである。レーン２は、変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）を光照射後にλＤＮＡと反応させたものである。レーンＭは、ＤＮＡマーカーである。
【００８３】
図１２に示すように、光照射せずに変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）をλＤＮＡと反応させた場合は、レーン１に示すように、分解して得られるはずの７２３３ｂｐ、６５２７ｂｐ及び５６２６ｂｐの生成物は全く得られなかった。一方、変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）に対して光照射（波長３６５ｎｍ、０℃、２０分間）を行った後に、λＤＮＡと反応させた場合は、レーン２の点線で囲む部分に示すように、７２３３ｂｐの分解生成物が得られた。また、図１２では明瞭ではないが、レーン２では６２３７ｂｐ及び５６２６ｂｐの分解生成物のバンドも弱いながら観察された。
【００８４】
なお、天然型ＢａｍＨＩの結果については、図示されていないが、市販のＢａｍＨＩと同様の加水分解活性及び塩基配列特異的な切断パターンを示した。
【００８５】
この結果より、変異型ＢａｍＨＩ（Ｋ１３２Ｘ）においては、光照射によって活性が発現されることが確認された。即ち、本参考例においては、光照射によってＮＶＯＣ基が脱離し２量体を形成して、制限酵素としての機能を発現することのできる変異タンパク質ＢａｍＨＩを作製することに成功した。
【００８６】
〔実施例〕
本発明の実施例を、図１７ないし図２０を用いて説明する。本実施例においては、４塩基コドン法を用いて、ＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰより変異タンパク質を作製した。以下にその方法を示す。
【００８７】
１．非天然アミノ酸の合成
本実施例においては、光反応性アミノ酸として光異性化性を有する非天然アミノ酸フェニルアゾフェニルアラニン（Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ）（図１５（ａ）参照）を使用した。
【００８８】
Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅは、図１７（ａ）から（ｄ）に示す手順に従って合成された。この方法よって、Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅは、図１７（ｄ）に示すようなα−アミノ基とα−カルボキシル基とが、それぞれｔ−ブトキシ基とシアノメチル基とで保護された形で得られた。なお、図１７（ａ）から（ｂ）の合成には、Ｂｏｃ２Ｏが使用され、図１７（ｂ）から（ｃ）の合成には、ニトロソベンゼンが使用され、図１７（ｃ）から（ｄ）の合成には、ＣＮＣＨ２Ｃｌが使用された。
【００８９】
上記の合成方法によって得られた非天然アミノ酸Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅは、１Ｈ−ＮＭＲ及び質量分析ＥＳＩ−ＭＳで同定された。
【００９０】
図１８には、上記Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅを波長３６５ｎｍあるいは波長４５０ｎｍの光照射による光異性化反応における、トランス体の量の変化を波長３００ｎｍ付近の光の吸光度によって示す。なお、図１８のグラフにおいて、横軸は波長（ｎｍ）を、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を示す。また、図１８（ａ）は、波長３６５ｎｍの光を照射した場合、図１８（ｂ）は、波長４５０ｎｍの光を照射した場合を示す。図１８（ａ）においては、矢印Ｄに示すトランス体の特徴を示す波長３００ｎｍ付近の吸収ピークは、波長３６５ｎｍの光の照射時間の経過とともに矢印Ｅのように減少する一方、波長４４０ｎｍ付近のシス体の特徴を示す吸収ピークは、照射時間の経過とともに増加しており、トランス体からシス体への光異性化反応が進んでいることを示す。また、図１８（ｂ）においては、シス体の特徴を示す波長４４０ｎｍ付近の吸収ピークは、波長４５０ｎｍの光の照射時間の経過とともに減少する一方、矢印Ｆに示すトランス体の特徴を示す波長３００ｎｍ付近の吸収ピークは、照射時間の経過とともに矢印Ｇに示すように増加している。即ち、図１８（ｂ）においては、波長４５０ｎｍの光照射によって、シス体からトランス体への光異性化反応が進んでいることを示す。即ち、非天然アミノ酸Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅは、適当な波長の光照射によって、シス体からトランス体へ、または、トランス体からシス体へ構造を変化させることができる。
【００９１】
２．非天然アミノ酸の核酸２量体ｐｄＣｐＡへのアミノアシル化、及び、アミノアシル−ｔＲＮＡの合成
図１７（ｄ）に示す非天然アミノ酸は、参考例と同じ方法を用いて、核酸２量体ｐｄＣｐＡへアミノアシル化され、図１９（ａ）に示す化学式において、非天然アミノ酸由来のα−アミノ基がＢｏｃ基で保護された物質、Ｂｏｃ−Ｐｈ−Ａｚｏ−ｐｄＣｐＡを得た。上記Ｂｏｃ−Ｐｈ−Ａｚｏ−ｐｄＣｐＡの構造は、１Ｈ−ＮＭＲで同定された。
【００９２】
続いて、上記Ｂｏｃ−Ｐｈ−Ａｚｏ−ｐｄＣｐＡは、ＴＦＡでＢｏｃ基が脱保護され、図１９（ａ）に示すＰｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｐｄＣｐＡを得た。上記Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｐｄＣｐＡは、参考例と同様に、３’末端のＣＡを欠いた４塩基アンチコドンが導入された上記ｔＲＮＡとＴ４リガーゼによって結合された。これによって、図１９（ｂ）に示すアミノアシルｔＲＮＡ（即ち、Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡｃｃｃｇ）が得られた。
【００９３】
３．ｈＴＢＰ発現用プラスミドとｈＴＢＰのｍＲＮＡの合成
ヒト由来のｈＴＢＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、プロテインデータバンク（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＶＯＬ）より得た。なお、この塩基配列は、配列番号７に示す塩基配列に相当する。この塩基配列中の４７５番目から１０１７番目までをＰＣＲによって増幅した。なお、配列番号８に示すアミノ酸配列は上記ｈＴＢＰタンパク質のアミノ酸配列である。それゆえ、ＰＣＲによって増幅した配列番号７に示す塩基配列中の４７５番目から１０１７番目までの配列は、配列番号８に示すアミノ酸配列中の１５９番目のセリンから３３９番目のトレオニンをコードする遺伝子に相当する。得られたＰＣＲ産物は、ｐＥＴベクターのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩサイトに組み込まれ、プラスミドが作製された。
【００９４】
また、配列番号７に示す塩基配列において、ｈＴＢＰタンパク質のアミノ酸配列の１９７番目及び２８８番目のフェニルアラニン（それぞれＰｈｅ１９７、Ｐｈｅ２８８と称する）をコードするコドン「ＴＴＴ」（配列番号７に示す塩基配列において５８９から５９１番目、及び、８６２から８６４番目）が、上記４塩基アンチコドンに対応する４塩基コドン「ＣＧＧＧ」に置換された塩基配列を有するプラスミドが作製された。なお、この塩基配列は、それぞれ配列番号９又は配列番号１０に示す塩基配列に相当する。
【００９５】
得られたプラスミドの全ての配列は、シークエンシングによって確認された。これらのプラスミド（Ｔ７プロモーターを有する）より、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる細胞外転写反応でｍＲＮＡを合成した。なお、ここで得られるｍＲＮＡは、天然型ｈＴＢＰをコードする天然型ｍＲＮＡ及び、各部位に４塩基コドンが導入された変異型ｍＲＮＡ（２種）である。
【００９６】
４．天然型ｈＴＢＰ及び変異型ｈＴＢＰの細胞外翻訳反応
上述の３種のプラスミドを使用して、天然型ｈＴＢＰと光反応性アミノ酸Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅを導入したｈＴＢＰの合成を行った。上記変異型ｈＴＢＰの翻訳反応においては、４塩基アンチコドンが導入されたアミノアシルｔＲＮＡを添加して翻訳反応を進めることによって、上記変異型ｍＲＮＡの４塩基コドンに相当する位置において、上記アミノアシルｔＲＮＡに含まれるＰｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅという光反応性アミノ酸に置換することができると考えられる。
【００９７】
上記翻訳反応は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、温度３０℃で、４時間行われた。これによって、ｈＴＢＰタンパク質を得た。
【００９８】
図２０には、上記翻訳反応によるｈＴＢＰの合成を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した結果を示す模式図である。図２０において、各レーンは以下の通りである。レーン1は、天然型ｍＲＮＡから生成した反応混合物である。レーン２は、Ｐｈｅ１９７に４塩基コドンを導入したＤＮＡから転写した変異型ｍＲＮＡより生成した反応混合物である。なお、レーン２は、Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡｃｃｃｇが添加されていない場合である。レーン３は、Ｐｈｅ１９７に４塩基コドンを導入したＤＮＡから転写した変異型ｍＲＮＡより生成した反応混合物である。なお、レーン３は、Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡｃｃｃｇが添加された場合である。レーン４は、Ｐｈｅ２８８に４塩基コドンを導入したＤＮＡから転写した変異型ｍＲＮＡより生成した反応混合物である。なお、レーン４は、Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡｃｃｃｇが添加されていない場合である。レーン５は、Ｐｈｅ２８８に４塩基コドンを導入したＤＮＡから転写した変異型ｍＲＮＡより生成した反応混合物である。なお、レーン５は、Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｔＲＮＡｃｃｃｇが添加された場合である。レーンＭは、分子量マーカーである。
【００９９】
図２０の模式図のレーン３及び、レーン５に示すように、変異型ｍＲＮＡにおいては、アミノアシルｔＲＮＡが存在したときのみ、全長ｈＴＢＰが生成した。即ち、本実施例では、アミノアシルｔＲＮＡの存在下において、上記変異型ｍＲＮＡから、ｈＴＢＰタンパク質のＰｈｅ１９７あるいはＰｈｅ２８８が、光反応性アミノ酸Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅに置換された変異タンパク質を作製することができたと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明に係る変異タンパク質の一例であり、２量体を形成するＢａｍＨＩ変異タンパク質を示す模式図である。（ａ）は光が照射されていない状態、（ｂ）は、光が照射された状態を示す。
【図２】（ａ）は、２量化した天然型ＢａｍＨＩの模式図を示す。（ｂ）は、ＢａｍＨＩの２量化インターフェースにおける各アミノ酸残基間の相互作用の様子を示す模式図である。
【図３】光反応性アミノ酸の一例の構造を示す化学式である。（ａ）は、酸Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンであり、（ｂ）は、γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸である。
【図４】（ａ）は、６−ニトロベラチロキシカルボニル基の光脱離反応の様子を示す化学反応式であり、（ｂ）は、６−ニトロベラチル基の光脱離反応の様子を示す化学反応式である。
【図５】本発明の参考形態であるＢａｍＨＩ変異タンパク質の２量化インターフェースの部分を示す模式図である。（ａ）は、光が照射されていない状態で、（ｂ）は、光が照射された状態である。
【図６】本発明の参考例において使用したｔＲＮＡを得るために作製した２本鎖ＤＮＡの塩基配列を示す模式図である。
【図７】本発明の参考例において行われた非天然アミノ酸の合成方法を示す化学式である。（ａ）から（ｃ）は、Ｎε−（６−ニトロベラチロキシカルボニル）リジンの合成方法であり、（ｄ）から（ｈ）は、γ−６−ニトロベラチルグルタミン酸の合成方法である。
【図８】（ａ）は、本発明の参考例において作製されたＮＶＯＣ−Ｌｙｓ−ｐｄＣｐＡを示す化学式であり、（ｂ）は、本実施例１において作製されたＮＶＯ−Ｇｌｕ−ｐｄＣｐＡを示す化学式である。
【図９】（ａ）および（ｂ）は、１ＮＮａＯＨによってｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓを加水分解した場合の試料について、ＨＰＬＣ分析を行った場合の結果を示すグラフである。また、（ｃ）から（ｅ）は、ｐｄＣｐＡ−Ｂｏｃ−ＮＶＯＣ−Ｌｙｓを波長３６５ｎｍの光照射によって分解させた場合の試料について、ＨＰＬＣ分析を行った場合の結果を示すグラフである。なお、（ａ）から（ｅ）において、横軸は保持時間（分）を、縦軸は各成分の濃度を示す。
【図１０】（ａ）は、光反応性アミノ酸ＮＶＯＣ−Ｌｙｓを導入したアミノアシルｔＲＮＡの構造を示す模式図である。（ｂ）は、光反応性アミノ酸ＮＶＯＣ−Ｇｌｕを導入したアミノアシルｔＲＮＡの構造を示す模式図である。
【図１１】本発明の参考例における翻訳反応よって得られた生成物について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って得られたゲルのパターンを示す模式図である。
【図１２】本発明の参考例において作製された変異タンパク質を用いて行った加水分解反応後の試料について、電気泳動を行った後に得られたゲルのパターンを示す模式図である。
【図１３】ヒトクラスＩＩ転写の様子を示す模式図である。
【図１４】ＤＮＡ結合タンパク質ｈＴＢＰの構造を示す模式図である。
【図１５】光反応性アミノ酸の一つフェニルアゾフェニルアラニンの構造を示す化学式である。（ａ）はトランス体であり、（ｂ）はシス体である。
【図１６】本実施の形態に係る変異タンパク質であるｈＴＢＰの変異体の構造を示す模式図である。（ａ）は、１９７番目のフェニルアゾフェニルアラニンがトランス体の場合であり、（ｂ）は、１９７番目のフェニルアゾフェニルアラニンがシス体の場合である。
【図１７】本発明の実施例において行われた非天然アミノ酸の合成方法を示す化学式である。
【図１８】Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅの光照射によるシス−トランス光異性化の様子を紫外線可視吸収スペクトル測定を行って測定した結果を示すグラフである。なお、（ａ）、（ｂ）において、横軸は波長（ｎｍ）を、縦軸は吸光度（ａｂｓ）を示す。
【図１９】（ａ）は、本発明の実施例において作製されたＰｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅ−ｐｄＣｐＡを示す化学式であり、（ｂ）は、反応性アミノ酸Ｐｈ−Ａｚｏ−Ｐｈｅを導入したアミノアシルｔＲＮＡの構造を示す模式図である。
【図２０】本発明の実施例において、翻訳反応によるｈＴＢＰの合成を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した結果を示すゲルのパターンの模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２０】
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【配列表】
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