(57)【要約】【課題】β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの生産能を有する微生物を用いるβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法を提供すること。【解決手段】ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する糸状菌、特にペニシリウム・エスピー  ＡＢ５５７７株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＢ５５７７）がβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンを効率よく生産する。ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する糸状菌またはその変異体を栄養培地で培養し、培養物からβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンおよび／またはその塩類を採取することによる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−Ｌ−ホモフコノジリマイシン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物からβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンおよび／またはその塩類を採取することを特徴とする、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法。
【請求項２】
β−Ｌ−ホモフコノジリマイシン生産能を有する微生物が、糸状菌であることを特徴とする、請求項１に記載のβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法。
【請求項３】
β−Ｌ−ホモフコノジリマイシン生産能を有する糸状菌が、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する糸状菌またはその変異株であることを特徴とする、請求項２に記載のβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法。
【請求項４】
β−Ｌ−ホモフコノジリマイシン生産能を有する糸状菌が、ペニシリウム・エスピー  ＡＢ５５７７株（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＢ５５７７）またはその変異株であることを特徴とする、請求項２または３のいずれかに記載のβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの生産能を有する微生物を用いるβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グリコシダーゼは、複合糖質の生合成や分解における代謝酵素として多くの生物学的機能に関与している。そのグリコシダーゼの一種であるフコシダーゼは、癌細胞の転移やウイルスの感染などに関与していると考えられている。そのため、フコシダーゼ阻害剤は癌やウイルスによる疾病の治療薬として利用できる可能性を有している。
【０００３】
β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンは、フコシダーゼ阻害活性を有する擬似糖であり、フコシダーゼ阻害剤として化学合成方法により物質合成されている。（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）  また、化学合成方法以外では、植物であるマメ科のＡｎｇｙｌｏｃａｌｙｘ ｐｙｎａｅｒｔｉｉ（例えば、非特許文献２、３参照）やユリ科のＳｃｉｌｌａ ｓｉｂｉｒｉｃａ（例えば、非特許文献４参照）からの抽出によって得られる。
【特許文献１】米国特許第５１００７９７明細書
【非特許文献１】「テトラヘドロン  レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、（英国）、１９８９年、３０巻、ｐ．４４３９‐４４４２
【非特許文献２】「ユーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（英国）、２００１年、２６８巻、ｐ．３５‐４１
【非特許文献３】「ジャーナル  オブ  ナチュラル  プロダクツ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」、（米国）、２００２年、６５巻、ｐ．１９８‐２０２
【非特許文献４】「ジャーナル  オブ  ナチュラル  プロダクツ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」、（米国）、２００２年、６５巻、ｐ．１８７５‐１８８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上のような化学合成方法または植物材料を用いてβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンを生産する方法は、それ自体がその目的を達成するものであるが、工業的利用の観点からは必ずしも満足し得るものではない。
【０００５】
すなわち化学合成方法では工業的規模で製造する方法としては操作の煩雑さ、あるいはコスト面で問題がある。一方、植物から調製する方法では、植物を栽培して収穫するまでに時間がかかり、また、植物の栽培は天候に左右され、材料の入手に安定性を欠くという問題がある。
【０００６】
このためβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンを安定的に効率よく生産できる微生物を開発創製する必要性は依然として存在する。本発明の目的は、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの生産能を有する微生物を用いるβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者らにより種々の分離源から分離された各種の糸状菌のうち、ペニシリウム・エスピー  ＡＢ５５７７  （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＢ５５７７）  株（ＦＥＲＭ  Ｐ―１９５１５）がβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンを生産することを初めて見出した。この糸状菌の培養液から、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンを効率よく生産することに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物を培地中に培養し、培養物からβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンおよび／またはその塩類を採取することを特徴とする、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法である。ここで、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの塩類とは、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸などのような無機酸類あるいは、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸などの有機カルボン酸類との塩類である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物によるβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの製造方法は、安定したβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの生産・供給を実現するものであり、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンを効率よく安価に製造していくことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法で用いられるβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの生産菌としては、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンまたはその塩を産生する能力を有するものであれば、いかなる微生物でもよい。その具体的な例としては、本発明者らが神奈川県南足柄市より採取した土壌から分離したＡＢ５５７７菌株がある。この菌株はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する菌株であり、α−ホモノジリマイシン生産菌として独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ―１９５１５の受託番号で寄託されており、本発明の方法に最も有効に用いられるα−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性物質であるβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシン生産菌の一例である。
【００１１】
一般的には菌類の菌学上の性状は極めて変化しやすく、一定したものではない。菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンあるいはエチルメタンスルホネートなど）または遺伝子組換えを用いる人為的変異手段により変異することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、ペニシリウム属に属し、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンを生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
【００１２】
本発明で使用される培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及び使用する微生物が要求する栄養物質を含有する培地であればいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、マルトース、グリセリン、デンプン、デキストリン、水飴、糖蜜、動・植物油などのβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシン生産菌が資化可能なものが使用可能である。窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、魚粉、コーンスティープリカー、酵母エキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどを使用できる。また、必要により微量金属塩、例えばコバルト、鉄、ニッケル、マンガンなどを添加できる。また、菌の発育を助け、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの生産を促進するような無機および有機物を適当に添加することができる。
【００１３】
本菌株の培養は好気条件下で、振とう培養、攪拌培養などで行う。通常培養温度は１５〜３７℃の範囲であるが、好ましくは２４〜３０℃で培養する。培養中のｐＨは３．０〜８．０の範囲で行なうのが好ましい。培養日数は３〜１４日間であるが、培養液中のβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの蓄積量が最高に達したときに培養を停止し、培養液から発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて単離を行うのがよい。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量などの培養条件は使用する菌株の種類および外部条件などに応じて、好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤などの消泡剤を便宜使用する。
【００１４】
培養液からのβ−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの採取は、遠心分離またはフィルターなどでろ過した後、陽イオン・陰イオン交換樹脂を用いた精製、脱色、クロマトグラフィー、および結晶化を順次行うことによりできる。
【００１５】
本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこの具体例に限定されるものではない。
【００１６】
なお、以下の例において、％は特にことわらない限り（重量／容量）％である。
【００１７】
α−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性は、既に報告された方法（ユーロピアン  ジャーナル  オブ  オーガニック  ケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２０００年、ｐ．２０８９−２０９３）に準じて測定される。具体的には以下の操作方法で測定した。
【００１８】
ｐ−ニトロフェニル  α−Ｌ−フコピラノシド（３４０μｇ）、α−Ｌ−フコシダーゼ  （ウシ腎臓由来シグマ社製、１．３ｎｇ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（３８μｇ）、および被検液５μＬの混合物を１７μＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０、４５μＬ）中で２７℃、６０分間反応させた後、５０ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ１０．１、９０μＬ）を加えて反応を停止させ、４００ｎｍの吸光度を測定した。その吸光度をＡｓとする。また、被験液を加えなかった時の吸光度をＡｗ、α−Ｌ−フコシダーゼを加えなかった時の吸光度をＡｂとして同時に測定した。それらの吸光度から次式によりα−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性を求めた。
【００１９】
【数１】
2006187223.tif 000002
【００２０】
１Ｈおよび１３Ｃ−ＮＭＲは、特に指示がない限り、重水（Ｄ２Ｏ）の溶液で、日本電子（株）社製核磁気共鳴装置（モデルＪＮＭ−ＬＡ３００）を使用して測定された。
【実施例１】
【００２１】
フラスコ培養：溶性デンプン  １．５％、  グルコース  ０．５％、麦芽エキス  ０．０５％、酵母エキス０．０２％、ポリペプトン０．１％、硝酸カリウム  ０．１％、  炭酸カルシウム ０．１％、ｐＨ  ６．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、ペニシリウム・エスピー  ＡＢ５５７７  （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＢ５５７７）株をスラントから一白金耳接種し、８日間、２７℃で回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００２２】
上記培養フラスコ１０本から集めた培養液１Ｌを遠心分離により菌体と上清に分けた。培養液上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）  Ｃ‐２０（Ｈ＋型）４００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに  １．２Ｌの脱イオン交換水を通過させて洗浄し、２．０％アンモニア水２．０Ｌで溶出した。α−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性成分を含む溶出液を減圧濃縮して１００ｍｌとし、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）  Ａ‐１１３（ＯＨ‐型）８０ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに  ２５０ｍＬの脱イオン交換水を通過させて洗浄した。上記操作により得た通過液および洗浄液を減圧下濃縮乾固し、これを少量の蒸留水に溶解し、弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）  ＩＲＣ−５０（ＮＨ４＋型）７０ｍｌを充填したカラムに供し、蒸留水で溶出して溶出液を分画した。α−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性画分を集めて、濃縮後に凍結乾燥し、α−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性物質  ２５ｍｇを得た。このようにして得られたα−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性物質のＮＭＲ分析を行なったところ、その１Ｈ−ＮＭＲケミカルシフト値および１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフト値が、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの文献値と一致した。
１ＨＮＭＲデータ：
δ（ｐｐｍ）：  ０．９６  （３Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ）、２．３４−２．３８  （１Ｈ，  ｍ）、２．７０  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．０，  ７．０  Ｈｚ）、３．４０−３．４２  （２Ｈ，  ｍ）、３．５６−３．６６  （３Ｈ，  ｍ）
１３ＣＮＭＲデータ：
δ（ｐｐｍ）：  ７７．７，  ７５．０，  ７０．５，  ６３．２，  ６３．０，  ５５．８，  １８．８
【実施例２】
【００２３】
溶性デンプン  １．０％、  グルコース  ５．０％、酵母エキス１．０％、硝酸カリウム  ０．２％、  炭酸カルシウム ０．１％、ｐＨ  ６．０の培地２．０Ｌを４Ｌ容ジャーファーメンターに入れ滅菌後、あらかじめ前培養したペニシリウム・エスピー  ＡＢ５５７７  （Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＢ５５７７）株を接種し、培養温度２７℃、撹拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量２Ｌ／ｍｉｎで７日間培養を行った。
【００２４】
その培養液２．０Ｌを遠心分離により菌体と上清に分けた。培養液上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）  Ｃ−２０（Ｈ＋型）６００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに  １．８Ｌの脱イオン交換水を通過させて洗浄し、２．０％アンモニア水３．０Ｌで溶出した。α−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性成分を含む溶出液を減圧濃縮して５００ｍｌとし、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）  Ａ‐１１３（ＯＨ‐型）７５ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに  ２５０ｍＬの脱イオン交換水を通過させて洗浄した。
【００２５】
上記により得た通過液および洗浄液を減圧下濃縮乾固し、これを少量の蒸留水に溶解し、弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）  ＩＲＣ−５０（ＮＨ４＋型）３００ｍｌを充填したカラムに供し、蒸留水で溶出して溶出液を分画した。α−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性画分を集めて、濃縮後に凍結乾燥し、α−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性物質  ９２ｍｇを得た。このようにして得られたα−Ｌ−フコシダーゼ阻害活性物質のＮＭＲ分析を行なったところ、その１Ｈ−ＮＭＲケミカルシフト値及び１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフト値が、β−Ｌ−ホモフコノジリマイシンの文献値と一致した。