(57)【要約】【課題】  本発明は、エンドソーム内で膜融合を促進させるペプチド誘導体を提供するものである。【解決手段】  融合ペプチドとコイルドコイルドメインと膜貫通ドメインからなるペプチド誘導体であって、融合ペプチドはトリプトファン残基であり、コイルドコイルドメインは中性（ｐH７．５、実線）でランダム構造、酸性（ｐH４．５、点線）でコイルドコイル構造をとり、膜貫通ドメインはステアリン酸を有するペプチド誘導体を用いることにより、上記課題の解決を図る。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ペプチドとコイルドコイルドメインと膜貫通ドメインからなるペプチド誘導体であって、
前記融合ペプチドは、疎水性ペプチドであり、
前記コイルドコイルドメインは、中性でランダム構造となり、酸性でコイルドコイル構造となり、
膜貫通ドメインは、Ｃ15〜Ｃ20の飽和若しくは不飽和脂肪酸、またはコレステロール誘導体である
ことを特徴とするペプチド誘導体。
【請求項２】
前記膜貫通ドメインは、ステアリン酸であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項３】
前記疎水性ペプチドは、ロイシン、フェニルアラニン、または疎水性の膜融合ペプチドで修飾されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項４】
細胞と、予め遺伝子が内包されているリポソームとを共存させた後に、請求項１に記載のペプチド誘導体を加えることを特徴とする細胞への遺伝子導入方法。
【請求項５】
細胞融合の対象となる２つの細胞を混合させ、請求項１に記載のペプチド誘導体を混合させることを特徴とする細胞融合法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性条件で膜融合を促進するペプチド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中に薬物が投与された場合、その薬物は細胞に到達すると、細胞膜に付着して、エンドサイトーシスや膜内への自然浸透で細胞質に入る。より効果的に薬物を細胞に導入するには細胞膜と相互作用する物質を薬物に修飾させるか、またはその物質で修飾されたカプセルの中に薬物に入れる方法がとられる。
【０００３】
この際、細胞膜と相互作用する物質としては、コレステロールなどの疎水性物質やポリリジンなどの塩基性の物質が用いられる。細胞内に送られた薬物はエンドソームに送られ自然浸透で細胞質に移行する。
【０００４】
さて、本願の発明者らは、疎水性部のアミノ酸を選択することで幾つかの新しいコイルドコイルペプチドを報告している（例えば、非特許文献１）。非特許文献１では、酸性条件下では三本鎖コイルドコイル構造、中性条件下ではランダム構造というｐＨ依存的構造変化を有するペプチドが報告されている。
【非特許文献１】Ｋａｚｕｏ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔｏｍｏｋｏ  Ｙａｍａｄａ，Ｔｏｓｈｉｋｉ  Ｔａｎａｋａ  “Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｕｒｉｅｄ  Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａ−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｃｏｉｌｅｄ  Ｃｏｉｌ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，１７５１−１７５６（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述の通り、細胞内に薬物を導入する際には、細胞の外膜との相互作用にのみ注目されてきた。外膜と相互作用する化合物を用いることで薬物の細胞への取り込みに向上が見られるが、効果を出させるためには多量に薬物を使用する必要がある。
【０００６】
一方、エンドソームから細胞質への取り込みについては注目がされてこなかった。そこで、本発明ではエンドソームから細胞質への輸送も、薬物を効率良く細胞質に移行させるのに大事であると考えた。インフルエンザウイルスは細胞に感染すると効率良く自身のＲＮＡを細胞内に注入する。これに関与しているのがヘマグルチニンと呼ばれるタンパク質である。ヘマグルチニンのアミノ末端部には融合ペプチドと呼ばれる疎水的部分がある。
【０００７】
しかし、ｐＨ７の血液中などの中性条件では融合ペプチドはタンパク質の構造内に覆われており、そのヘマグルチンは外部に露出していない。一方、ウイルスがエンドサイトーシスで細胞に入り、ｐＨ５のエンドソームに送られるとヘマグルチニンに構造変化が起こり、融合ペプチドが外に現れ、ウイルスと標的膜との融合が容易に起こり得る。これに似た例としてＡＩＤＳウイルスの膜融合の際にも起こっている。
【０００８】
この系を応用し、エンドソームに入ったときに膜融合を促進させることで薬物の細胞質内への投与を促進させるのに有用となる。外膜と相互作用する化合物と共に用いることで、薬物の細胞への移行を効果的に行なうことが期待できる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題は、特許請求の範囲の請求項１に記載の発明によれば、融合ペプチドとコイルドコイルドメインと膜貫通ドメインからなるペプチド誘導体であって、前記融合ペプチドは、疎水性ペプチドであり、前記コイルドコイルドメインは、中性でランダム構造となり、酸性でコイルドコイル構造となり、膜貫通ドメインは、Ｃ15〜Ｃ20の飽和若しくは不飽和脂肪酸、またはコレステロール誘導体であることを特徴とするペプチド誘導体を提供することによって達成できる。
【００１０】
このように構成することによって、酸性条件で膜融合を促進することができる。
上記課題は、特許請求の範囲の請求項２に記載の発明によれば、前記膜貫通ドメインは、ステアリン酸であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体を提供することによって達成できる。
【００１１】
このように構成することによって、膜貫通ドメインはより膜内に安定に存在することができる。
上記課題は、特許請求の範囲の請求項３に記載の発明によれば、前記疎水性ペプチドは、ロイシン、フェニルアラニン、または疎水性の膜融合ペプチドで修飾されていることを特徴とする請求項１に記載のペプチド誘導体を提供することによって達成できる。
【００１２】
このように構成することによって、ロイシン、フェニルアラニンの疎水性の高い残基や疎水性の膜融合ペプチドをトリプトファンの先に修飾させて膜融合の効率を高めることができる。
【００１３】
上記課題は、特許請求の範囲の請求項４に記載の発明によれば、細胞と、予め遺伝子または薬剤が内包されているリポソームとを共存させた後に、請求項１に記載のペプチド誘導体を加えることを特徴とする細胞への遺伝子導入方法を提供することによって達成できる。
【００１４】
このように構成することによって、血中等中性条件では膜とは作用せず、エンドソーム内で膜融合を引き起こし、薬物または遺伝子を効果的に細胞内に導入することができる。
上記課題は、特許請求の範囲の請求項５に記載の発明によれば、細胞融合の対象となる２つの細胞を混合させ、請求項１に記載のペプチド誘導体を混合させることを特徴とする細胞融合法を提供することによって達成できる。
【００１５】
このように構成することによって、ハイブリドーマ作成の際の細胞融合促進剤として用いることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、エンドソーム内で膜融合を促進させる新規ペプチド誘導体を提供するものである。かかるペプチドは血中等中性条件では膜とは作用せず、エンドソーム内で膜融合を引き起こし、薬物を効果的に細胞内に導入することができる。したがって、薬物の拡散を防ぎ、効果的に細胞内薬物の注入に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
インフルエンザウイルスの膜融合にかかわるヘマグルチニンタンパク質は、三量体を形成する巨大分子である。そのため全体を用いることは困難である。本発明は、インフルエンザウイルスの膜融合と類似の構造変化を起こす低分子化合物を提供するものである。
【００１８】
インフルエンザウイルスの膜融合にかかわる細胞外部分としてα−ヘリカルコイルドコイル構造と融合ペプチドが存在している。Ｘ線結晶構造解析の結果、α−ヘリカルコイルドコイル構造は中性では折れ曲がった構造で融合ペプチドをタンパク質の中に覆い、酸性条件下で伸びたコイルドコイル構造となり融合ペプチドを外に出す。外に出た融合ペプチドは容易に標的細胞に結合し膜融合を促進させる。従って、膜融合に関係するドメインは膜貫通ドメイン、コイルドコイルドメイン、融合ペプチドと考えられる。
【００１９】
膜貫通ドメインとして膜内に安定に存在できる脂溶性物質であるステアリン酸を使った。膜と相互作用するものであればステアリン酸以外の化合物を使うことも可能である。例えば、Ｃ15〜Ｃ20の飽和または不飽和脂肪酸を用いてもよい。
【００２０】
コイルドコイルドメインは、中性でランダム構造、酸性でコイルドコイル構造となるペプチドとした。
融合ペプチドとして膜と相互作用すると考えられているトリプトファン残基を用いた。さらに、トリプトファンよりも疎水性の高い残基、例えばロイシン、フェニルアラニンなどや疎水性の膜融合ペプチドをこのトリプトファン残基の先に修飾させて膜融合の効率を高めることができる。また、既存の融合ペプチドを用いることもできる。
【００２１】
このように３つのドメインを繋ぎあわせたペプチドを考えた。この構造を合成するため、樹脂にリジンを結合させ、リジン残基の側鎖アミノ基に脂溶性のステアリン酸を結合させた。その後、ペプチドの伸長は通常のペプチドの固相合成法で行なった。この方法によりカルボキシ末端側に脂溶性のステアリン酸が結合したペプチドを収率、純度よく合成できる。
【実施例１】
【００２２】
＜長鎖アルキル基修飾ペプチドの合成＞
以下に示すペプチド誘導体（１）を合成した。Ｒはステアリン酸を用いた例を示す。
【００２３】
【化１】
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リンクアミド樹脂（ＮＯＶＡ  ＢＩＯ  ＣＨＥＭ社製）（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ）をN−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中２０％ピぺリジンに加え、１０分間震盪させて、樹脂上に存在するアミノ基保護基であるＦｍｏｃ基の脱離を行った。
【００２４】
次に、固相合成における第１アミノ酸となるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）（ＮＯＶＡ  ＢＩＯ  ＣＨＥＭ社製）を、ＨＢＴＵ・ＨＯＢＴ（０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液）（ＮＯＶＡ  ＢＩＯ  ＣＨＥＭ社製）を縮合剤に用いて、上記で処理したリンクアミド樹脂と３０分間縮合反応させた。
【００２５】
その後、リジン側鎖アミノ基の保護基であるＭｔｔ基を除去するため、この反応物に塩化メチレン中２％トリフルオロ酢酸を加えて３０分間震盪させた。この操作を２回行った。
【００２６】
次に、ステアリン酸をリジンの側鎖アミノ基にＨＢＴＵ・ＨＯＢＴ（０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液）を用いて上記と同様な方法により縮合した。
引き続き、主鎖アミノ基の保護基であるＦｍｏｃ基をピペリジンで処理して脱保護し、その後は通常のＦｍｏｃ固相合成法に従って目的のペプチド誘導体（１）を合成した。
【００２７】
ペプチド誘導体の樹脂からの切り出しは、固相合成を行った樹脂（１００ｍｇ）をトリフルオロ酢酸−水（９５：５）（２ｍｌ）中で１．５時間震盪反応させることによって行った。
【００２８】
反応液を冷ジエチルエーテルに加えてペプチド誘導体（１）を沈殿化させ、得られた沈澱をさらにジエチルエーテルで３回洗浄後、２０%酢酸水に一旦溶かして高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による精製を行った。なお、ＨＰＬＣカラムにはＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ｃｏｌｕｍｎ（１０ｍｍ  ｉ．ｄ．×  ２５０ｍｍ，５μｍ）を用い、溶離液としては０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル、水の混合溶媒を用いた。アセトニトリルの割合が３０分で５０％−６０％となる濃度勾配条件で用い、流速は４ｍｌ／分とした。
【００２９】
この化合物の同定はマススペクトルで行った。マススペクトルはアプライドバイオシステムズ社ＭＡＬＤＩ−トフマスを用いた。
マススペクトル  実測値：４１２４．７６    理論値：４１２１．８７
【実施例２】
【００３０】
＜ペプチド誘導体（１）のＣＤスペクトル＞
ＮａＣｌ（１００ｍＭ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７又はｐＨ４．５）にペプチド誘導体（１）を２０μＭの濃度で溶かして、ＣＤスペクトルを調べた（図１）。このペプチド誘導体（１）のｐＨ７でのＣＤスペクトル（図１の実線）は２００ｎｍ以下に負のピークを示すことからランダム構造であったのに対し、ｐＨ４．５でのＣＤスペクトル（図１の点線）は２０２ｎｍと２０８ｎｍに負のピークを示すことからα-へリックスの構造を取っていることが分かった。
【００３１】
従って、このペプチド誘導体（１）はｐＨの変化により構造変化を起こすことが確認された。ＣＤスペクトルは、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−８２０  ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒを用いて測定した。
【実施例３】
【００３２】
＜リポソームの作成＞
ＥｇｇＰＣ（卵黄由来ホスファチジルエタノールアミン、平均分子量７００）（１４ｍｇ）をクロロホルム（１ｍｌ）に溶解し、これを５０mlナス型フラスコに入れて減圧留去することにより薄膜状にする。ここへ脂質濃度が５ｍＭになるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２．８ｍｌ加え、凍結させた後に融解させた。この凍結融解の操作を３回行った。
【００３３】
この溶液をさらに１０分間超音波処理することにより単層膜のリポソームを調製し、これを１０ｍＭリン酸衝液（ｐＨ７．５）を溶離液として用いてセファデックスＧ−５０ｆｉｎｅ（１ｃｍ×３０ｃｍ）にかけ、最初の画分をリポソーム画分として集めた。
【実施例４】
【００３４】
＜ペプチド誘導体（１）の脂質融合の実験（濁度の測定）＞
実施例３で作成したリポソーム溶液（脂質濃度が約１ｍＭ）２mlを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し１２ｍｌとした。その半量（６ｍｌ）にペプチド誘導体（１）を約２０μＭになるように加え、ペプチド誘導体（１）が脂質膜中に導入されたリポソームの調製を行った。
【００３５】
この操作により全てのペプチド誘導体（１）が脂質に取り込まれたことを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０  ｆｉｎｅにより確認した。その後、溶液を酸性にする場合は、０．１Ｎ塩酸を直接溶液に加えることにより行い、実際にｐＨを４．５に調整した。
【００３６】
次に、サンプルを室温で静置し、４，８，１６，２４時間後の５００ｎｍにおける吸光度の測定に基づいて、溶液の濁度評価を行った（図２）。膜融合が起こった場合には、リポソーム粒径の上昇に伴う有意な濁度上昇が期待できる。
【００３７】
図２に基づく評価の結果、ペプチド誘導体（１）を含まないリポソームにおいては、ｐＨ７でも４．５においても濁度はほとんど増加せず、膜融合は観測されなかった。一方で、ペプチド誘導体（１）を添加したリポソームの場合には、ｐＨ７．５では濁度の増加は観測されなかった（膜融合の促進はなかった）が、ｐＨ４．５では１６時間後から顕著な増加が見られた。このことから今回設計を行ったペプチド誘導体（１）はｐＨ７では膜融合の能力はないが、ｐＨ４．５の酸性条件で膜融合を促進することが分かった。
【実施例５】
【００３８】
＜ペプチド誘導体（１）の脂質融合の実験（蛍光のエネルギー移動の測定）＞
ＥｇｇＰＣ（１４ｍｇ）を用いてリポソームを作る際に、蛍光プローブとして、ローダミン（Ｒｈ）をＥｇｇＰＣの親水部アミノ基に修飾したものと、ニトロベンゾキサジオール（ＮＢＤ）をＥｇｇＰＣの親水部アミノ基に修飾したものとを、それぞれ６１μｇ、７７μｇ添加し、上記と同様のリポソーム合成法により、蛍光プローブが膜表面に導入されたリポソームを作成した。
【００３９】
ＲｈとＮＢＤは、相互間の距離がある一定の距離以下に近付くことにより蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が観測できることが知られており、例えばＲｈの励起波長である４６０ｎｍの光を照射した際には、Ｒｈ由来の蛍光スペクトルと共に、ＮＢＤ由来の蛍光スペクトルも観測される。
【００４０】
この各々の蛍光スペクトルの割合が、互いの距離に大きく依存することから、それぞれの蛍光スペクトル強度の比から、互いの平均距離が推定できる。そこで、もしこの蛍光プローブを導入したリポソームと、ペプチド誘導体（１）の導入されたリポソームが膜融合を起こした場合には、１つのリポソームを構成する脂質分子数の上昇から蛍光プローブ同士の平均距離が上昇（すなわちリポソーム膜内での蛍光プローブの濃度の減少）することから、Ｒｈ由来、ＮＢＤ由来の蛍光スペクトルの比が変化する（Ｒｈ由来の蛍光スペクトルの割合の上昇）ことを期待した。
【００４１】
そこで、前記の方法により調製された、ペプチド誘導体（１）の導入されたリポソームを、蛍光プローブの導入されたリポソームと混合し、溶液のｐＨを変化させることによる蛍光強度比の評価を、ＦＲＥＴを利用して行った。ＦＲＥＴを利用して、４，１６，２４時間後に４６０ｎｍで励起したときの、溶液の蛍光スペクトルを測定した（図３Ａ〜図３Ｄ）。
【００４２】
図３Ａは、溶液のｐＨをｐＨ７．５とし、ペプチド誘導体（１）を用いていない場合の溶液の蛍光スペクトルを示す。図３Ｂは、溶液のｐＨをｐＨ４．５とし、ペプチド誘導体（１）を用いていない場合の溶液の蛍光スペクトルを示す。図３Ｃは、溶液のｐＨをｐＨ７．５とし、ペプチド誘導体（１）を用いた場合の溶液の蛍光スペクトルを示す。図３Ｄは、ｐＨ４．５とし、ペプチド誘導体（１）を用いた場合の溶液の蛍光スペクトルを示す。それでは、各グラフについてさらに詳述する。
【００４３】
図３Ａ，図３Ｃでは、ｐＨ７．５における評価を行ったが、ペプチド誘導体（１）の有無にかかわらず蛍光スペクトルに顕著な変化は見られなかった。このことから中性条件では膜融合は起こらないことが分かった。
【００４４】
なお、膜融合を誘発することが知られているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた場合には、ＰＥＧ添加によりＮＢＤ由来の５９０ｎｍの蛍光強度が下がり、Ｒｈ由来の５３０ｎｍの蛍光強度が増加することから膜融合が促進される。
【００４５】
一方で、図３Ｂにおいては、ペプチド誘導体（１）を含まないリポソームの溶液ｐＨを４．５に調整した場合の結果である。２４時間後には５９０ｎｍの蛍光強度が下がったが、一方で５３０ｎｍには変化が見られなかった。この結果、酸性条件下では、ＥｇｇＰＣを用いたリポソームにおいては、ペプチド誘導体（１）が無くとも若干膜融合する性質があると考えられる。
【００４６】
図３Ｄにおいては、今回設計したペプチド誘導体（１）を含むリポソームのｐＨ４．５における結果である。ＰＥＧを添加した場合と同様に、５９０ｎｍの蛍光強度が下がり、一方で５３０ｎｍの蛍光強度の増加が見られた。この結果は、今回のペプチド誘導体（１）が酸性条件において有為に膜融合を促進する性質があることを示している。
【００４７】
図４は、５３０ｎｍと５９０ｎｍの蛍光強度の比を時間に対してプロットしたものである。同図において、「○」は、ｐＨ７．５で、ペプチド誘導体（１）がない場合の蛍光強度の比を示す。「△」は、ｐＨ４．５で、ペプチド誘導体（１）がない場合の蛍光強度の比を示す。「□」は、ｐＨ７．５で、ペプチド誘導体（１）がある場合の蛍光強度の比を示す。ｐＨ４．５で、ペプチド誘導体（１）がある場合の蛍光強度の比を示す。
【００４８】
このとき、ペプチド誘導体（１）を導入したリポソームにおいてのみ、ｐＨ４．５の条件で顕著な増加が観測された（図４の「×」参照）。
このように、今回設計したペプチド誘導体（１）は、ｐＨ７では膜融合の能力はないが、ｐＨ４．５の酸性条件で膜融合を促進することが、蛍光エネルギー移動の測定からも確認された。
【００４９】
以上より、本発明にかかるペプチド誘導体を用いることで、細胞への遺伝子導入の際に予め遺伝子を内包させたリポソームと細胞とを共存させ、その系にペプチド誘導体（１）を加えることで、遺伝子の細胞への導入が期待できる。
【００５０】
また、一般にモノクロナール抗体の作成には、目的抗原に対する抗体の提示されたＢ細胞とミエローマ細胞を融合させたハイブリドーマを作製し、この細胞に産出させる手法をとる。ここで、融合細胞の作成が必要となってくるが、この方法には、電気融合法、ＰＥＧ法、センダイウイルス法が知られている。このうち、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法は安価で簡便な操作で行うことができ、実際にキットとしても販売されている。本発明にかかる膜融合ペプチド誘導体は、濁度変化、ＦＲＥＴの測定等によりＰＥＧと同様な膜融合挙動を示すことが明らかであり、このことから、同様な応用が可能であることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ペプチド誘導体のＣＤスペクトルの模写図である。
【図２】ＥｇｇＰＣの濁度の測定を示す図である。
【図３Ａ】ＥｇｇＰＣ膜に入れたＲｈとＮＢＤの蛍光図（pH7.5  ペプチド誘導体なし）である。
【図３Ｂ】ＥｇｇＰＣ膜に入れたＲｈとＮＢＤの蛍光図（pH4.5  ペプチド誘導体なし）である。
【図３Ｃ】ＥｇｇＰＣ膜に入れたＲｈとＮＢＤの蛍光図（pH7.5  ペプチド誘導体あり）である。
【図３Ｄ】ＥｇｇＰＣ膜に入れたＲｈとＮＢＤの蛍光図（pH4.5  ペプチド誘導体あり）である。
【図４】５３０ｎｍと５９０ｎｍの蛍光強度の比を時間に対してプロットした図である。
【図１】
2006034211.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2006034211.tif 000009
【図４】
2006034211.tif 000010
【配列表】
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