(57)【要約】【課題】  天然物由来で安全かつ優れた効果を奏するチトクロームＰ４５０阻害剤を提供する。【解決手段】  大豆サポニン抽出画分及び／または甘草抽出物を有効成分とするＣＹＰ２Ａ６阻害剤。ＣＹＰ２Ａ６阻害剤を含む喫煙回数低減剤あるいは発癌抑制剤は、いずれも安全性が高く、かつ日常的に簡便に服用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆サポニン抽出画分及び／または甘草抽出物を有効成分とするＣＹＰ２Ａ６阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＹＰ２Ａ６阻害剤を含む喫煙回数低減剤。
【請求項３】
請求項１に記載のＣＹＰ２Ａ６阻害剤を含む発癌抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発癌物質の生成に関与する、チトクロームＰ４５０の一種であるＣＹＰ２Ａ６に対する、天然物由来の阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
喫煙が、肺癌、心臓疾患あるいは肺疾患などを代表とする種々の疾患の誘引となり得ると指摘されて久しいが、喫煙者、特にニコチン依存症患者の喫煙を止めさせることは、一般に難しい試みであると理解されている。これは、ニコチンが中毒性アルカロイドであり、喫煙を中止すると、ニコチンが体内で代謝されて消失するに伴って、集中力の欠如、不安、不快性欲求不満、不眠などの様々な症状を呈する、いわゆる離脱症状をもたらすためであり、喫煙者は、これらの解消の為に、再びニコチン摂取を目的として喫煙を繰り返すこととなる。
【０００３】
ニコチンは、体内において、チトクロームＰ４５０と呼ばれる酵素により代謝されることが知られている。Ｐ４５０には、ＣＹＰ２Ａと称されるアイソフォーム群が存在し、例えば、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１２、ＣＹＰ２Ａ１３及びＣＹＰ２Ａ１６などが挙げられる。中でも、ＣＹＰ２Ａ６は、ヒト肝臓の薬物、特にニコチンの主要代謝酵素である。また、ＣＹＰ２Ａ６は、タバコ、特に紫煙中に含まれる発癌性物質を活性化する機能を有していることも知られている。
【０００４】
このＣＹＰ２Ａ６の機能に着目し、ＣＹＰ２Ａ６の発現あるいは酵素活性を抑制することで、体内でニコチンを代謝させず長く留まらせ、喫煙者の喫煙回数を減らす（喫煙回数低減）試み、あるいは発癌性物質の活性化を妨げて発癌リスクを低減させる試みが報告されている（例えば特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、ここで提唱されているＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、抗白癬菌剤であるメトキサレン、トラニルシプロミン、プソラレン、ピロカルピン、クマリン、クロモン、エスクレチン、フェネルジン、パロキセチン、セレギリンおよびパルギリンなどであり、いずれも医師の処方箋による投与指導が必要で、日常的かつ簡便に行い得るものではない。
【０００６】
また、同文献は、天然産生物又は天然産生物の抽出物を利用したＣＹＰ２Ａ６阻害剤として、ハイペリカム（Hypericum）、チコリー（Cichorium intybus）若しくはボウガインブルラ・スペクタビリス（Bougainvllra spectabillis）などの抽出物、特にエスクレチン、エスクリンまたはエスクリン一水和物などを開示しているが、その阻害効果は満足できるものではなく、その入手も容易ではない。
【特許文献１】特開２００１−５２４５１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便に経口摂取することのできる飲食品レベルで、ＣＹＰ２Ａ６阻害作用を示す素材を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、植物由来の天然成分中にＣＹＰ２Ａ６阻害活性を求めて広く探索した結果、大豆サポニン抽出画分ならびに甘草抽出物にＣＹＰ２Ａ６阻害活性を確認し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち本発明は、大豆サポニン抽出画分及び／または甘草抽出物を有効成分とするＣＹＰ２Ａ６阻害剤に関する。また本発明は、前記のＣＹＰ２Ａ６阻害剤を含む喫煙回数低減剤もしくは発癌抑制剤に関する。
【００１０】
本発明の大豆サポニン抽出画分は、大豆（Glycine hispida MAX）の種子、特に胚芽から、従来公知の溶媒抽出法などによってトリテルペノイド配糖体の一群である大豆サポニンを含む画分として調製されるものである。一般に、大豆原料に対してサポニン成分は０．５〜０．７重量％、脱脂大豆に対しては０．７〜１．０重量％含まれていると報告されている。
【００１１】
いわゆる大豆サポニンは、一般的には、黄白色〜褐色で、わずかに苦みを有する無臭の粉末であり、加水分解により、グルクロン酸、ガラクトース、グルコース、アラビノース、ラムノース、キシロースなどの可溶性画分と、構成主成分であるゲニン体、例えばソーヤサポゲノールＡ、ソーヤサポゲノールＢ、ソーヤサポゲノールＣ、ソーヤサポゲノールＤ、ソーヤサポゲノールＥが得られる。
【００１２】
大豆サポニンの生理作用としては、過酸化脂質の生成抑制作用（特公昭60−16925号公報）、血栓症候群の予防作用（特開昭61−249364号公報）、イソフラボンとの併用による制癌作用（Konoshima.Tら、Experimental Medicine and Biology、1996年）、エイズウイルスに起因する細胞変性ならびにウイルス抗原発現の抑制効果（Okubo.Kら、AIDS、1989年）などが報告されている。しかし、大豆サポニンを含む画分がＣＹＰ２Ａ６活性を阻害し、ＣＹＰ２Ａ６活性に起因するニコチン代謝や発癌性物質の活性化を抑制する効果を有していることは、報告がない。
【００１３】
また、甘草抽出物は、甘草（Glycyrrhizae Radix）から、こちらも従来公知の溶媒抽出法などによって調製される抽出物をいう。古来、甘草あるいはその抽出物は生薬成分として利用され、エキス自体またはその中に含まれる種々の物質について、数多くの生理活性が報告されている。特に、抽出成分の一つであるグリチルリチンについては、鎮静・鎮痙作用、鎮咳作用、抗消化性潰瘍作用、利胆作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用、ステロイドホルモン様作用、血小板凝集抑制作用など、多岐にわたる生理活性が知られている。しかしながら、甘草抽出物のＣＹＰ２Ａ６阻害活性については、これまでのところ報告がない。
【００１４】
本発明者らが見出したのは、大豆サポニン抽出画分ならびに甘草抽出物の、遺伝子工学的に調製したＣＹＰ２Ａ６に対する強力な阻害作用である。特に、その阻害は持続的であることが認められる（図１）。これは、同画分ならびに抽出物中の成分がＣＹＰ２Ａ６によって代謝されて生じる代謝物とＣＹＰ２Ａ６とが結合することにより活性が阻害されるという、いわゆるmechanism−based阻害によってＣＹＰ２Ａ６活性が阻害される結果である。その為、本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、他の、例えば単なる拮抗的なＣＹＰ２Ａ６阻害剤とは異なり、阻害効果が長時間に亘って持続されるという利点を有する。
【００１５】
また、大豆サポニン抽出画分ならびに甘草抽出物は、いずれも古くから食用あるいは薬用として利用されてきた成分であり、またその入手も極めて容易であることから、これらを飲食品として日常的に摂取することも容易であり、かつ大量に摂取しても副作用を心配する必要もない。従って、本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、メトキサレンなどの抗白癬菌剤などとは異なり、極めて安全かつ簡便に利用することができる点でも有利である。
【００１６】
本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害作用剤は、上記の強いＣＹＰ２Ａ６阻害作用ならびにその持続性から、ニコチン代謝をより強くかつ長期に抑制し、その結果、ニコチンの脱離症状の発現を抑制あるいは緩和することで、喫煙者の喫煙欲求を減じ、喫煙回数を低減させる効果も期待することができる。本発明に言う喫煙回数低減剤とは、大豆サポニン抽出画分あるいは甘草抽出物を有効成分とした、喫煙者のニコチン脱離症状からの回避のための喫煙要求を抑制して喫煙回数を減らす為の製剤あるいは飲食品の形態をいう。
【００１７】
また、ＣＹＰ２Ａ６酵素活性を阻害することにより、例えばニコチンの酸化生成物である発癌性物質のニトロソアミンの代謝的活性化を抑制し、発癌のリスクを大きく低減することも可能である。本発明に言う発癌抑制剤とは、大豆サポニン抽出画分あるいは甘草抽出物を有効成分とした、喫煙者の体内におけるＣＹＰ２Ａ６活性による発癌性物質の発生あるいは活性化を抑制し、発癌リスクを抑制する為の製剤あるいは飲食品の形態をいう。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、阻害活性ならびに阻害効果の持続性が高く、かつ副作用がなく、極めて安全に服用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の大豆サポニン抽出画分は、広く食用に供されている大豆の種子や胚芽部分を砕いたもの、好ましくは粉末化したものを、適当な抽出溶媒を加えて攪拌し、遠心分離あるいは濾過等によって回収される抽出液またはその乾燥物として得ることができる。また、抽出に先立って、ヘキサンなどの脂溶性有機溶媒を用いて脱脂することもできる。
【００２０】
また、甘草抽出物も、いわゆる甘草（Glycyrrhizae Radix）の根を砕いたもの、好ましくは粉末化したものを、適当な抽出溶媒を加えて攪拌し、遠心分離あるいは濾過等によって回収される抽出液またはその乾燥物として得ることができる。
【００２１】
抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタン、ヘキサンなどの低級アルコール、アセトン、エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、イソブチルメチルケトンなどの低級アルキルケトン、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ブチルメチルエーテル、ブチルエチルエーテルなどの低級アルキルエーテル、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール、グリセロール、ジグリセロールなどの多価アルコール、およびこれらの２種以上の混合溶媒を用いて抽出することができる。好ましくは水、エタノール等の低級アルコールあるいはそれらの混合液である。
【００２２】
また、シクロヘキサン、トルエン、キシレン等の炭化水素、ならびにジクロルメタン、ジクロルエタン等のハロゲン化炭化水素を抽出溶媒として用いることも可能である。
【００２３】
この様な抽出溶媒による抽出液は、さらに蒸発濃縮してもよい。また、濃縮画分を再び低級脂肪族アルコールに溶解後、蒸発乾固するか、あるいはエーテル中に攪拌して生成した析出物を濾取して、大豆サポニン抽出画分（固体）または甘草抽出物（固体）を得てもよい。
【００２４】
大豆サポニン抽出画分を調製する別の方法としては、水、低級脂肪族アルコールあるいはそれらの混合液による抽出画分を濃縮後、アンバーライトＸＡＤ−７やダイアイオンＨＰ−２０などの樹脂吸着剤と接触させて大豆サポニン成分を吸着させた後、低級アルコール又は３０％以上の低級アルコール／水混合溶液で吸着剤から溶離処理し、大豆サポニン成分を得てもよい。
【００２５】
大豆サポニン抽出画分ならびに甘草抽出物は、上記の様にして得られた画分あるいは抽出物をそのまま使用してもよく、あるいは適当な医薬賦形剤もしくは他の生理活性成分、食品原料または食品添加物などを用いて、医薬、あるいは飲食品の形態として利用することができる。
【００２６】
例えば、医薬あるいは飲食品の形態としては、水溶液、油液、その他の溶液、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形等の形態をとり得る。これらは、それ自体既知の方法で各形態に調製すればよく、格別の制限はない。
【００２７】
また、上記各形態の医薬あるいは飲食品を調製する際には、常用されている賦形剤、香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子、増粘剤、粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、薬効成分、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等を適宜配合することができる。
【００２８】
以下、実施例を挙げてさらに本発明を説明する。
【実施例１】
【００２９】
大豆サポニン抽出画分の調製
大豆胚芽１２０ｇに５００ｍｌの８０容積％のエタノール水溶液を加え、８０℃で１時間加熱還流を行った。室温まで冷却後、ろ過して１番抽出液を得た。抽出残渣にさらに同エタノール水溶液５００ｍｌを加え、上記と同様に加熱還流を行って２番抽出液を得た。１番抽出液と２番抽出液とを合わせ、減圧下で約１００ｍｌにまで濃縮した。
【００３０】
濃縮液を１２０ｍｌの吸着樹脂（三菱化学社製ダイアイオンＨＰ−２０）のカラムに吸着させた後、同樹脂を３６０ｍｌの水、次いで３６０ｍｌの３０容積％エタノール水溶液で洗浄後、２４０ｍｌの８０容積％エタノール水溶液を加えて吸着画分を溶出させて回収し、回収した溶出液を減圧下で濃縮乾固した。乾固物を粉砕し、大豆サポニン抽出画分からなるＣＹＰ２Ａ６阻害剤３．３ｇを調製した。
【実施例２】
【００３１】
甘草抽出物の調製
粉砕した甘草の根５０ｇに２００ｍｌの９９容積％エタノール水溶液を加え、ときどき振り混ぜながら室温で３時間浸出後、濾過して１番抽出液を得た。抽出残渣にさらに２００ｍｌの同水溶液を加え、室温でときどき振り混ぜながら１時間浸出後、濾過して２番抽出液を得た。１番抽出液と２番抽出液とを合わせ、減圧下で濃縮乾固した。乾固物を粉砕し、甘草抽出物からなるＣＹＰ２Ａ６阻害剤２．２ｇを調製した。
【００３２】
＜ＣＹＰ２Ａ６阻害活性＞
Ｉｗａｔａらの方法（Biochemical Pharmacology、1998年、第５５巻、1315−1325頁） に従って調製した組換えＣＹＰ２Ａ６を含む大腸菌ライゼート(２ｐｍｏｌのＣＹＰ２Ａ６に相当）と、２０μｌの１Ｍカリウム−リン酸緩衝液ｐＨ７．４、２０μｌのＮＡＤＰＨ生成系（0.5mM NADP+、5mM G-6-P、10units/mL G-6-P DH、5mM塩化マグネシウム）、１０％（v/v）メタノールに溶解した実施例１または２のＣＹＰ２Ａ６阻害剤２０μｌ、及び水とを混合して全量１８０μｌの混合液を調製した。混合液中のＣＹＰ２Ａ６阻害剤の最終濃度は、１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとした。
【００３３】
この混合液に、１．０％(v/v)メタノールに溶解した１０μＭクマリン２０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応後、反応液に７０％(w/v)過塩素酸１０μｌを加えて反応を停止した。３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後、上清をWallac 1420 ARVOsx plate readerにて分析した。クマリンの代謝物である７−水酸化クマリンの検出には、励起波長３５５ｎｍおよび蛍光波長４６０ｎｍを用い、その生成量を蛍光強度より定量した。阻害率は、阻害剤非存在下における７−水酸化クマリンの生成量を１００％としたときの、阻害剤非存在下と存在下との差として算出した。
【００３４】
その結果、実施例１のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、１０μｇ／ｍｌの使用で約５５％、１００μｇ／ｍｌで約９５％のクマリン生成を阻害した。また実施例２のＣＹＰ２Ａ６阻害剤は、１０μｇ／ｍｌの使用で約７５％、１００μｇ／ｍｌで約９５％のクマリン生成を阻害した。
【００３５】
また、上記組成の混合液（ただし全量は２００μｌ）を氷上で調製した後、３７℃で０、２、４、６、８または１０分間振盪した。各時間振盪した混合液２０μｌを、２０μｌの１Ｍカリウム−リン酸緩衝液ｐＨ７．４、２０μｌのＮＡＤＰＨ生成系（0.5mM NADP+、5mM G-6-P、10units/mL G-6-P DH、5mM塩化マグネシウム）、１．０％(v/v)メタノールに溶解した１０μＭクマリン２０μｌ及び水を含む全量１８０μｌの反応液に加えて、３７℃で１０分間反応させた後、７０％(w/v)過塩素酸１０μｌを加えて反応を停止した。上記と同様にしてクマリンの生成量を確認した。
【００３６】
その結果、本発明の阻害剤は、ＣＹＰ２Ａ６に対してmechanism-basedで作用する阻害剤であることが明らかとなった（図１）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明のＣＹＰ２Ａ６阻害剤の阻害様式を調べた結果を表す。
【図１】
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