(57)【要約】 【課題】  アガリクス（Ａｇａｒｉｃｓｕ ｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分の抗腫瘍活性を増強させた抗腫瘍活性剤を提供することを目的とする。【解決手段】（１）アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分を、ビタミンＣと併用する抗腫瘍活性剤。（２）アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の培養液である前記（１）の抗腫瘍活性剤。（３）アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の熱水抽出物である前記（２）の抗腫瘍活性剤。（４）アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉＭｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分とビタミンＣを添加した健康食品。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分を、ビタミンＣと併用することを特徴とする抗腫瘍活性剤。
【請求項２】
アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の培養液である請求項１に記載する抗腫瘍活性剤。
【請求項３】
アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の熱水抽出物である請求項１に記載する抗腫瘍活性剤。
【請求項４】
アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分を、ビタミンＣと併用することを特徴とする抗腫瘍活性作用の増強方法。
【請求項５】
アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の培養液である請求項４に記載する抗腫瘍活性作用の増強方法。
【請求項６】
アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の熱水抽出物である請求項４に記載する抗腫瘍活性作用の増強方法及び抗腫瘍活性作用の増強方法。
【請求項７】
アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分とビタミンＣを添加したことを特徴とする健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アガリクスブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）由来の抗腫瘍活性剤、及びこれを用いた健康食品、及び抗腫瘍活性作用の増強方法に関し、更に詳しくは、アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分とビタミンＣとを併用することによって、その抗腫瘍活性を増強させた抗腫瘍活性剤、及びこれを用いた健康食品、及び抗腫瘍活性作用の増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アガリクスブラゼイは、ブラジルおよび北米に自生する食用きのこである。形状は同属のマッシュルームに似ているが、柄が太くて長い。さらに香りが強く、甘味があり、歯ざわりが良く、和洋中華に適するといわれている。ここ数年、このアガリクスブラゼイ子実体の成分中に強い抗腫瘍活性があることが数々の研究から明らかになっている。そこで、この薬効に注目してアガリクスブラゼイを人工栽培するための培養特性の研究が盛んに行われるようになった。ただ、アガリクスブラゼイは同属のマッシュルームと同様にコンポストを用いて栽培されているため、その工程には菌の培養とは別に培地となるコンポストの作製が必要となる。また、子実体は培地組成や外部環境により大きく影響を受けやすい。したがって、アガリクスブラゼイの栽培は木材腐朽菌と比べ、かなり複雑かつ長期間を要し、一般の食用きのこに比べ、かなり高価なきのことなっている。
【０００３】
そのため、アガリクスブラゼイはコンポストによる子実体の栽培に代えて液体培地内で菌糸体を培養し、この菌糸体（の細胞壁）を、酵素又は物理的な種々の手段により、分解・破砕して利用する方法が汎用されるようになった。又、この際発生する、多量の菌糸体の分離後（済）の培養液についても、強い抗腫瘍活性があることが明らかとなり、利用されるようになった（特許文献１〜９参照）。
しかしながら、未だヒトに対する効果が確定しているものは少ない。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−３２７２３
【特許文献２】特開２００１−８９３８８
【特許文献３】特開２００２−２２９
【特許文献４】特開２００３−４０７９４
【特許文献５】特開２００５−１０２５２５
【特許文献６】特開２００５−１０５２４７
【特許文献７】特開２００５−３５９８７
【特許文献８】特開２００４−３３１５６７
【特許文献９】特開２００２―１４５７９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者等は、従来よりアガリクスの子実体及び菌糸体の抗腫瘍活性・抗癌作用を増加させる方法について、鋭意研究してきたところ、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分（特にアガリクス菌糸体の培養液及びアガリクス菌糸体の熱水抽出物等）とビタミンＣとを併用すると、抗腫瘍活性が著しく増加することを知り本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明は下記の請求項１〜請求項７により構成されている。
請求項１：  アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分を、ビタミンＣと併用することを特徴とする抗腫瘍活性剤。
請求項２：  アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の培養液である請求項１に記載する抗腫瘍活性剤。
請求項３：  アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の熱水抽出物である請求項１に記載する抗腫瘍活性剤。
請求項４：  アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分を、ビタミンＣと併用することを特徴とする抗腫瘍活性作用の増強方法。
請求項５：  アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の培養液である請求項４に記載する抗腫瘍活性作用の増強方法。
請求項６：  アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分が、アガリクス菌糸体の熱水抽出物である請求項４に記載する抗腫瘍活性作用の増強方法及び抗腫瘍活性作用の増強方法。
請求項７：  アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ）菌糸体の液体培養物由来成分とビタミンＣを添加したことを特徴とする健康食品。
【０００７】
本願発明を以上のように構成する理由は、アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分（特にアガリクス菌糸体の培養液及びアガリクス菌糸体の熱水抽出物）とビタミンＣを併用すれば、アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分の抗腫瘍活性が著しく増加することによる。
本願発明において、アガリクス菌糸体の液体培養物由来成分とは、液体培地にアガリクスの菌糸体を接種し、通気培養して得られる培養物（菌糸体及び培養液）から誘導される成分をいう。
【発明の効果】
【０００８】
本願発明に係る抗腫瘍活性剤、及びこれを用いた健康食品、及び抗腫瘍活性作用の増強方法によれば、従来知られているアガリクス菌糸体の液体培養物由来成分とビタミンＣを併用することにより、その抗腫瘍活性を著しく増加させることができるという効果を有する。
以下、本発明について詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
＊抗腫瘍活性被検材料（サンプル）の調整
イ）アガリクスブラゼイの供試菌株は株式会社アイ・ ビー・アイ、応用きのこ研究所の保有菌株ＡＢ７００２を用いた。
大型タンク（１０００Ｌ）を用いて、炭素源としてスクロースを３％、天然物由来窒素源イーストエキス及びポリペプトンを各０．３％、ＫＨ２ＰＯ４及びＮａ2ＨＰＯ4を各０．０５％含み、初発培地ｐＨ６．０の培養液に、アガリクス菌糸体を接種し、強制的に０．２２μｍフィルターを通した無菌空気を培地内に通気し、２８℃で４４日間培養した。この培養液を遠心分離して得られた菌糸体と培養液を用いて試験用サンプルの調製を行った。
ロ）アガリクス菌糸体培養液（以下「ＡＢ−ＣＦ」ともいう）
タンクより取り出した培養液を２０−２５μｍ孔径の濾紙を用いて減圧濾過し、培養液サンプルを得た。
ハ）アガリクス菌糸体の熱水抽出物（以下「ＡＢ−ＨＷＥ」ともいう）
前記、アガリクス菌糸体を１０５℃，２４時間乾燥させて含水量を求め、乾燥重量に対し、２０倍量の含水量となるように蒸留水を加えて３分間ホモジナイズした。ホモジナイズした菌糸体を１０５℃６０分間、高圧滅菌釜を用いて強制的に熱水抽出を行った。遠心分離（遠心加速度２０，８００×ｇ）によって抽出物と抽出残査を分離し、抽出物を２０−２５μｍ孔径の濾紙を用いて減圧濾過し、熱水抽出サンプルを得た。
【００１０】
前記操作において、乾燥重量として４．０ｇの菌糸体より、熱水抽出サンプルが１．４５ｇ得られた。
前記ロ）、ハ）のサンプルは０．２μｍフィルターを通し、濾過滅菌の後、滅菌蒸留水を用いて固形分で細胞添加時の終濃度が１．５ｍｇ／ｍｌになるように調整し、添加被検材料として使用した。
【００１１】
＜試験例１＞
＊各サンプルの全糖・全蛋白質
イ）全糖の測定
１．５ｍｇ／ｍｌサンプル中の糖含有量はフェノール硫酸法を用いて測定した。
サンプルを任意に希釈し、５０μｌに対し，２００μｌの５％フェノール、濃硫酸を１ｍｌ加え発色させた。放冷後４８５ｎｍでの吸光度を測定した。なお、グルコースを用いて検量線を作成した。
ロ）全蛋白質の測定
１．５ｍｇ／ｍｌサンプル中の蛋白含有量はＬｏｗｒｙ改良法を用いて測定した。任意に希釈したサンプル液を１００μｌに対し、Ｌｏｗｒｙ試薬１ｍｌ加え、室温で１０分間放置した。ここにＦｏｌｉｎ試薬１００μｌ添加し、正確に３０分後、７５０ｎｍでの吸光度を測定した。なお、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ）を用いて検量線を作成した。
糖、蛋白質の測定結果は、下記の通りであった。
アガリクス菌糸体培養液      ：  全糖      ０．１２６％
：  蛋白質    ０．００９％
アガリクス菌糸体の熱水抽出物：  全糖      ０．０７０％
：  蛋白質    ０．０２８％
【００１２】
＜試験例２＞
＊ヒト骨髄性白血病由来細胞（ＨＬ−６０細胞）に対する増殖抑制活性
各抽出で得られたサンプル単体と各サンプルにビタミンＣ（以下「ＶＣ」ともいう）を加えたものを使用して、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を試験した。ＨＬ−６０細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。対数増殖期にあるＨＬ−６０細胞を２４ウェル平底プレートに５−６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１．５ｍｇ／ｍｌに調整した各サンプルを添加し、これらを３７℃、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ2条件下で２４時間培養し、０．５％トリパンブルーを用いて細胞数を数え、細胞増殖抑制率を求めた。なお、対照として、溶媒のみ（滅菌蒸留水：Ｄ．Ｗ．）、ビタミンＣのみを添加したものについても同様な条件下で試験を行った。結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
表１で表すように各サンプル単体では細胞の増殖抑制を示さないが、ＡＢ−ＣＦ、ＡＢ−ＨＷＥにビタミンＣを添加したものにおいて、顕著に細胞の増殖を抑制していた。
【００１５】
次に、前記アガリクス菌糸体培養液、及びアガリクス菌糸体熱水抽出物に対し、ＶＣの濃度を変えて細胞生存率を調べた。その結果を図１及び図２に示す。
【００１６】
又、ビタミンＣ添加における細胞生存率の濃度依存性を確認した。ＨＬ−６０細胞は１０％牛胎児血清含有のＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。２４ウェル平底プレートに、５−６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製したＨＬ−６０細胞に０．０１ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌに調整したビタミンＣを添加し、これらを３７℃、９５％ air−５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。０．５％トリパンブルー用いて細胞数を数え、細胞生存率を求めた。なお、対照として、溶媒のみ（滅菌蒸留水；Ｄ．Ｗ．）を添加したものについても同様な条件下で試験を行った。
結果を図３に示す。
ビタミンＣ、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲内でのビタミンＣの添加は細胞の増殖に影響を与えなかった。
以上の結果によれば、ＶＣの併用が、著しくアガリクス菌糸体の液体培養物由来成分の細胞増殖抑制率を増加させることがわかる。
【００１７】
＜試験例３＞
＊ヒト骨髄性白血病由来細胞（ＨＬ−６０細胞）に対するアポトーシス誘導作用
各サンプルについてアポトーシス誘導作用を確認するため、細胞の形態変化をギムザ染色を用いて観察した。ＨＬ−６０細胞は１０％ウシ胎児血清含有のＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。２４ウェル平底プレートに５−６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＨＬ−６０細胞に１．５ｍｇ／ｍｌに調整した各サンプルを添加し、これらを３７℃、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ2条件下で３時間培養した。それぞれの試験区の細胞懸濁液をスピッツ管に入れ、カルノア固定液（メタノール：酢酸＝３：１で混合したもの）を１ｍｌ重層した。室温で１０分間放置した後、静かに左右に振って、上層と下層を混合し、更に室温で、１０分間放置した。４３０×ｇで５分間遠心分離し、上澄みを除去した後、沈殿を崩してカルノア固定液２ｍｌを加え、密栓後、−２０℃で一晩放置した。４３０×ｇで５分間遠心分離し、上澄みを除去した後、氷冷した新しいてカルノア固定液、０．２ｍｌで懸濁した。スライドグラスに懸濁液を滴下し、自然乾燥の後、染色ビンにギムザ染色液を入れ、細胞を２０分間染色した。スライドグラスを蒸留水で洗浄し、６００倍で顕微鏡下で細胞の形態変化を確認した。結果を図４に表す。
【００１８】
図４に示すように、対照区、ビタミンＣのみの添加ではアポトーシスの形態変化が見られず、又アガリクス菌糸体培養液（ＡＢ−ＣＦ）及びアガリクス菌糸体熱水抽出物（ＡＢ−ＨＷＥ）単体の添加においても形態変化は見られなかった。一方、（ＡＢ−ＣＦ）及び（ＡＢ−ＨＷＥ）にビタミンＣを加えたものには、アポトーシスの形態的特徴であるアポトーシス小体を多く観察することができた。
【００１９】
試験例４
ＤＮＡ断片化の確認
細胞にアポトーシスが誘導されると、ＤＮＡの断片化が生ずる。各サンプルを添加した細胞からＤＮＡを抽出し、電気泳動を行いＤＮＡの断片化を観察した。ＨＬ−６０細胞は１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。５−６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したＨＬ−６０細胞に１．５ｍｇ／ｍｌに調整した各サンプルを添加し、これらを３７℃、９５％Ａｉｒ−５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。細胞を１．５ｍｌの滅菌済みマイクロチューブに移し、２４００×ｇ、５分間、遠心分離して上澄みを除き、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。細胞ペレットにｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を懸濁させた。ここにＲＮＡａｓｅＡを加えて、３７℃で１時間反応させてからＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加え、更に１時間反応させた。エタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた後、ＴＥｂｕｆｆｅｒでＤＮＡを融解させた。これをローディングバッファーと混合し、１．５％アガロースゲルを用いて１００ボルトで電気泳動を行った。エチジウムブロマイドで染色し、トランスイルミネーター上でＤＮＡの断片化を確認した。    なお、対照として、蒸留水のみの添加、ビタミンＣのみの添加を行った細胞についても同様に確認を行った。結果を図５に示す。
【００２０】
図５において、「Ｍ」はＤＮＡサイズマーカー、「Ｃ」は対照（Ｄ．Ｗ．）、１はＶＣ、２はＡＢ−ＣＦ、３はＡＢ−ＨＷＥ、４はＡＢ−ＣＦ＋ＶＣ、５はＡＢ−ＨＷＥ＋ＶＣの３時間後のＤＮＡ断片化を示す。ＶＣの単品での添加では、ＤＮＡの断片化が確認できなかったのに対し、ＡＢ−ＣＦ＋ＶＣ、ＡＢ−ＨＷＥ＋ＶＣにおいてのみ、ＤＮＡ断片化が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＣＦ＋ＶＣ（アガリクス菌糸体培養液に対しＶＣの濃度を変えて添加したとき）の細胞生存率を示す図である。
【図２】ＨＷＥ＋ＶＣ（アガリクス菌糸体熱水抽出物に対しＶＣの濃度を変えて添加したとき）の細胞生存率を示す図である。
【図３】ビタミンＣ添加における細胞生存率の濃度依存性を示す図である。
【図４】アポトーシスの形態変化を示す図である。
【図５】ＤＮＡの断片化を示す図である。
【符号の説明】
【００２２】
Ｍ  ＤＮＡサイズマーカー
Ｃ  対照（Ｄ．Ｗ．）
１  ＶＣ
２  ＡＢ−ＣＦ（アガリクス菌糸体培養液）
３  ＡＢ−ＨＷＥ（アガリクス菌糸体熱水抽出物）
４  ＡＢ−ＣＦ＋ＶＣ
５  ＡＢ−ＨＷＥ＋ＶＣ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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