(57)【要約】【課題】Ｅ２Ｆ遺伝子ファミリーに属する２つの新規転写因子を開示する。【解決手段】これらは、ヒトおよびマウスＥ２Ｆ−５である。それらは、ＤＰ−１およびｐ１３０と相互作用し得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  配列番号２または配列番号４で表される配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２または配列番号４で表される配列において、１個のアミノ酸が付加、欠失または置換された（ａ）に記載のタンパク質の突然変異体、
（ｃ）（ａ）のタンパク質に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、哺乳類転写因子として機能し得るタンパク質、または
（ｄ）ＤＰタンパク質、ｐ１０７またはｐ１３０と複合体を形成する能力を有する、少なくとも３０アミノ酸の（ａ）から（ｃ）のいずれか１つの断片、
を含んでなるポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチドの配列、
（ｂ）（ａ）に相補的な配列、
（ｃ）請求項１に記載のポリペプチドをコードする配列、または
（ｄ）少なくとも２５ヌクレオチド長の（ａ）から（ｃ）のいずれかの配列の断片、
を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドおよびその相補的配列を含んでなる二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項４】
検出可能な標識を有する、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするコーディング配列を含んでなる複製可能な組換えベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞または請求項６に記載の組換えベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項８】
請求項５に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞であって、コーディング配列が、該宿主細胞による該コーディング配列の発現を可能にする能力を有する制御配列に機能を発揮できるように結合していることを特徴とする前記宿主細胞。
【請求項９】
組換えベクターのコーディング配列の発現を可能にする条件下で請求項７または８に記載の宿主細胞を培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる、請求項１に記載のポリペプチドの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規転写因子およびその製造および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現を細胞周期の進行と同調させるためには、細胞周期中に生じる分子イベントが転写装置と統合される必要がある。
【０００３】
最近、Ｅ２Ｆ（またはＤＲＴＦ１）と称される転写因子が同定され、抗がん遺伝子またはがん抑制遺伝子である網膜芽細胞腫感受性遺伝子のタンパク質産物ｐＲｂに結合することが示された（例えば、非特許文献１参照）。細胞転写因子Ｅ２Ｆは、網膜芽細胞腫遺伝子産物（ｐＲｂ）、ｐ１０７、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼなどの重要な細胞周期調節タンパク質と結合し、さらに、その転写活性は、アデノウイルスＥｌａ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質などのある種のウイルスがんタンパク質によりモジュレーションされるため、Ｅ２Ｆは、細胞周期制御における鍵成分として機能していると広く考えられている。
【０００４】
転写因子Ｅ２Ｆ（またはＤＲＴＦ１）は、哺乳動物細胞で細胞周期が進行する間、細胞増殖の重要な調節体であることが知られている分子との一連の周期的相互作用を受けるため、細胞周期イベントと転写装置との統合において重要な役割を果たしていると考えられている。例えば、Ｇ１期からＳ期への進行を負に調節し腫瘍細胞中でしばしば修飾される網膜芽細胞腫がん抑制遺伝子産物（ｐＲｂ）は、Ｅ２Ｆに結合する。同様に、ｐＲｂ関連タンパク質ｐ１０７は、主として、Ｅ２ＦとのＳ期複合体中に生じる。ｐＲｂおよびｐ１０７は共に、Ｅ２Ｆの転写活性を抑制し、一方、Ｅ２Ｆ結合部位は、ｃ−ｍｙｃ、ｐ３４ｃｄｃ２などの増殖に関与する種々の遺伝子の制御領域中に生じるため、Ｅ２Ｆの転写活性は、細胞増殖の調節に基本的に重要であると考えられている。さらに、腫瘍細胞から単離された対立遺伝子によりコードされる突然変異Ｒｂタンパク質は、Ｅ２Ｆに結合しない。したがって、この突然変異Ｒｂタンパク質は、Ｅ２Ｆ部位依存性転写活性化を阻害する能力を有さない。Ｅ２Ｆのもう１つの重要な特徴は、アデノウイルスＥｌａ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヒトパピローマウイルスＥ７などのある種のウイルスがんタンパク質が、不活性転写因子からｐＲｂおよびｐ１０７を隔離することにより、その活性をモジュレーションすることである。この効果の発現に要求されるのは、組織培養細胞がトランスフォーメーションされ、成長制御に打ち勝つのに必要な、これらのウイルスタンパク質中の領域である。したがって、これらのがんタンパク質がＥ２Ｆを調節する能力は、該がんタンパク質が細胞成長制御の正常なメカニズムを圧倒するための手段であるかもしれないし、逆に、ｐＲｂによる転写抑制がｐＲｂ媒介性の負の成長制御の基礎であるかもしれない。
【０００５】
ｐＲｂおよびｐ１０７の転写−調節特性を他の細胞周期イベントと統合するための可能性のあるメカニズムは、Ｅ２Ｆ複合体中のサイクリンＡおよびｃｄｃ２関連サイクリン依存性キナーゼｐ３３ｃｄｋ２の同定から示唆された。サイクリンＡはＳ期を経る進行（おそらく、サイクリン依存性キナーゼｐ３３ｃｄｋ２をＥ２ＦへリクルートするサイクリンＡの能力により媒介されると考えられる機能）に必要である。これらのデータを総合すると、転写因子Ｅ２Ｆの主要な役割は、細胞周期イベントをｐＲｂ、ｐ１０７、サイクリン、ｃｄｋなどの分子を介して転写装置へ中継することであると示唆され、したがってこのことは、遺伝子発現が細胞周期の進行と同調し統合されることを保証するものである。
【０００６】
さらに最近になって、Ｅ２Ｆの性質を有する転写因子がクローニングされ配列決定された（非特許文献２及び３を参照）。
【非特許文献１】WagnerおよびGreen, Nature 352, 189-190, 1991
【非特許文献２】Helinら, Cell 70 (1992), 337-350
【非特許文献３】Kaelinら, Cell 70 (1992), 351-364
【発明の開示】
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは、Ｅ２Ｆ遺伝子ファミリーの新規メンバーと考えられる、さらに２つの新規タンパク質を見いだし、これをＥ２Ｆ−５と命名した。ヒトＥ２Ｆ−５のｃＤＮＡ配列を、このタンパク質のアミノ酸配列と共に図１Ａに示す。マウスＥ２Ｆ−５についての対応する配列を図９Ａに示す。これらの新規タンパク質は、Ｅ２Ｆ−５と称され、本明細書ではこの名称を使用することにする。
【０００８】
Ｅ２Ｆ−５は、関連転写因子成分のファミリーの１つであることが見いだされた。このファミリーのメンバーは、ＤＰタンパク質と相互作用して一連の転写因子を形成すると考えられている。ＤＰタンパク質（またはポリペプチド）には、ＤＰ−１、ＤＰ−２およびＤＰ−３が含まれるが、通常は、これらの最初に挙げたものが残りのものに優先すると考えられる。
【０００９】
本発明は、その第１の態様において、図１Ａまたは９Ａに示すタンパク質、その同族体、並びに該配列および該同族体の断片であって、哺乳動物転写因子として機能しうるものを提供する。特に、本発明は、
（ａ）Ｅ２Ｆ−５、
（ｂ）図１Ａまたは９Ａのタンパク質、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の突然変異体、対立遺伝子変異体または種同族体、
（ｄ）（ａ）または（ｂ）に少なくとも７０％相同なタンパク質、
（ｅ）ＤＰタンパク質、ｐＲｂ、ｐ１０７および／またはｐ１３０と複合体を形成する能力を有する（ａ）から（ｄ）のいずれか１つの断片、または
（ｆ）少なくとも１５のアミノ酸長の（ａ）から（ｅ）のいずれかの断片、
を含んでなるポリペプチド（好ましくは実質的に単離された形態のもの）を提供する。
【００１０】
以下、この定義に包含されるすべてのポリペプチドを、本発明のポリペプチドと称する。
【００１１】
タンパク質ｐＲｂ、ｐ１０７、ＤＰタンパク質およびｐ１３０は本発明のタンパク質と複合体を形成しうるので、本明細書では、これらを、複合体形成タンパク質（complexingproteins）または「複合体形成体（complexors）」と称する。Ｅ２Ｆ−５は、ある条件の下では、ｐＲｂと弱くしか結合できないかもしれない。
【００１２】
本発明のポリペプチドが、その天然環境（例、体内）で結合しうる他のポリペプチドを含まない形態である場合、本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態である。本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドの意図する目的を妨げない担体または希釈剤と混合してもよく、その場合であっても、実質的に単離されているとみなされると理解される。
【００１３】
また、本発明のポリペプチドは、実質的に精製されている形態であり、この場合一般には、調製物中に含まれるポリペプチドの９０％以上、例えば９５％、９８％または９９％が本発明のポリペプチドである。
【００１４】
突然変異ポリペプチドは、アミノ酸残基の付加、欠失または置換である１以上の突然変異を有する。好ましくは、該突然変異は、該ポリペプチドの構造および／または機能および／または性質に、全くあるいは実質的に影響を及ぼさない。したがって、突然変異体は、適切には、ＤＰタンパク質、ｐＲｂ、ｐ１０７および／またはｐ１３０と複合体を形成しうる能力を有する。突然変異体は、天然に生じるもの（すなわち、天然源から精製または単離されている形態）であっても、合成的に得られるもの（例えば、コード化ＤＮＡ上の部位特異的突然変異誘発を行うことによるもの）であってもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、天然に生じるものであっても、組換え体（すなわち、遺伝子工学技術を用いて調製されたもの）であってもよいことは明らかである。
【００１５】
対立遺伝子変異体は、ヒトまたは動物（例、マウス）において天然に生じ、図１Ａまたは９Ａのタンパク質と実質的に同様に遺伝子発現を調節するように機能する変異体である。
【００１６】
同様に、上記タンパク質の種同族体は、別の種で天然に生じ、その種において図１Ａまたは９Ａのタンパク質と同等の機能を発揮する同等のタンパク質である。いずれか１つの種内に、同族体がいくつかの対立遺伝子変異体として存在していてもよく、これらはすべて上記タンパク質の同族体と考えられる。対立遺伝子変異体および種同族体は、図１Ａまたは９Ａのタンパク質の製造に関して本明細書に記載されている方法に従い、対立遺伝子変異体を保持する適当な細胞源（例えば、ヒトまたはげっ歯類からのもの）または別の種上でそのような方法を行うことにより得ることができる。上記タンパク質は進化的に保存されている場合があるため、対立遺伝子または種変異体をコードするクローンを得るために、本発明のポリヌクレオチドを使用して、ヒト、げっ歯類または他の細胞から作製されたライブラリーをプローブすることも可能である。上記クローンを通常の技術により操作して、本発明のポリペプチドを同定し、ついでそれ自体が公知の組換えまたは合成技術により該ポリペプチドを製造することができる。好ましい種同族体には、哺乳動物または両生類種同族体が含まれる。
【００１７】
図１Ａまたは９Ａのタンパク質に少なくとも７０％相同なタンパク質、および図１Ａまたは９Ａのタンパク質に少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同なタンパク質が本発明に包含される。これは、一般に、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０または１００以上連続するアミノ酸の領域にわたる。タンパク質の相同性を測定する方法は当該技術分野で公知であるので、上述のように当業者に理解されるであろう。相同性は、通常、アミノ酸の同一性に基づいて計算される（「硬相同性（hard homology）」と称されることもある）。
【００１８】
一般に、上記複合体形成体と複合体を形成する能力を有する、図１Ａまたは９Ａのポリペプチドまたはその対立遺伝子変異体またはその種同族体の断片は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、例えば少なくとも２０、２５、３０、４０、５０または６０のアミノ酸長である。
【００１９】
断片がタンパク質の複合体と複合体を形成するか否かの判定は、複合体形成タンパク質および該断片を、それらが正常にトランス活性化転写因子を形成する条件下で用意し、そして複合体が形成されたか否かを判定することにより行うことができる。この判定は、例えば、上記複合体がＥ２Ｆ結合部位にin vitroで結合する能力を測定することにより、あるいは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法により推定複合体の分子量を測定することにより行ってもよい。
【００２０】
好ましい断片には、ＤＰ−１または他の複合体形成体とトランス活性化複合体を形成する能力を有する断片が含まれる。本明細書中の実施例では、上記タンパク質の機能を分析するためのいくつかの方法を記載する。ポリペプチドがＤＰ−１タンパク質とトランス活性化複合体を形成する能力を有するか否かを評価するために、上記実施例を適合させてもよい。例えば、ＤＰ−１／Ｅ２Ｆ−５複合体により活性化されるように適合されたレポーター遺伝子構築物の存在下、上記ポリペプチドを上記複合体形成体へ加えることができる（例えば、Medical Research CouncilのWO-A-94/10307の図１０を参照されたし）。そのような実験により、上記ポリペプチド断片が必要な活性を有するか否かを判定することができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、表示的または検出可能な標識で標識してもよい。上記（表示的）標識は、上記ポリペプチドの検出を可能にする、どのような適当な標識であってもよい。適当な標識としては、放射性同位元素（例えば125Ｉ）、酵素、抗体、リンカー（例えばビオチン）などが挙げられる。サンプル中のＥ２Ｆ−５タンパク質の量を測定するために、イムノアッセイなどの診断方法において本発明の標識ポリペプチドを使用してもよい。
【００２２】
本発明のポリペプチドまたは標識ポリペプチドを固相、例えばイムノアッセイディッシュの壁に固定してもよい。
【００２３】
本発明の第２の態様は、
（ａ）図１Ａまたは９Ａに示すヌクレオチドの配列、
（ｂ）（ａ）に相補的な配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかの中の配列と選択的にハイブリッド形成する能力を有する配列、
（ｄ）第１の態様で定義されたポリペプチドをコードする配列、または、
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の中の配列のいずれかの断片、
を含んでなるポリヌクレオチドに関する。
【００２４】
したがって、本発明は、図１Ａまたは９Ａの配列または相補的配列と選択的にハイブリッド形成する能力を有するヌクレオチドの連続した配列を含んでなる、好ましくは実質的に単離または精製された形態のポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、図１Ａまたは９ＡのＤＮＡ配列および図１Ａまたは９ＡのＤＮＡ配列と選択的にハイブリッド形成する能力を有するその断片を含む。本発明は、そのさらに別に実施態様において、図１Ａまたは９Ａのタンパク質をコードするＤＮＡまたはその断片を提供する。
【００２５】
また、上記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含んでなるものであってもよい。また、それは、その中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる型の修飾が当該技術分野で公知である。これらには、メチルホスホナートおよびホスホロチオナートバックボーン、該分子の３'および／または５'末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が含まれる。本発明の目的のためには、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で利用可能ないかなる方法により修飾してもよいと理解されるべきである。治療方法で使用される本発明のオリゴヌクレオチドのin vivo活性または寿命を増加させるために、そのような修飾を行ってもよい。
【００２６】
図１Ａまたは９ＡのＤＮＡと選択的にハイブリッド形成する能力を有するポリヌクレオチドは、一般に、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０または１００以上の連続ヌクレオチドの領域内において、図１Ａまたは９ＡのＤＮＡに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、最適には少なくとも９５％相同である。これらのポリヌクレオチドは、本発明に包含される。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドが、その天然環境（例えば体内）で結合しうる他のポリヌクレオチドを含まない形態である場合、本発明のポリヌクレオチドは、実質的に単離された形態である。上記ポリヌクレオチドは、意図する目的を妨げない担体または希釈剤と混合してもよく、その場合であっても、該ポリヌクレオチドは実質的に単離されているとみなされると理解される。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、プライマー（例えばＰＣＲプライマー）、プローブ（例えば放射活性または非放射活性標識を用いる通常の手段により表示的または検出可能な標識で標識されているプローブ）を製造するのに使用してもよいし、該ポリヌクレオチドをベクター中にクローニングしてもよい。そのようなプライマー、プローブおよび図１Ａまたは９ＡのＤＮＡの他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０または４０のヌクレオチド長であり、それらも本発明に包含される。
【００２９】
本発明のＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換え的、合成的または当業者が利用可能ないかなる手段により製造してもよい。また、本明細書に開示する技術を参照して、それをクローニングしてもよい。
【００３０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびその相補体を含んでなる二本鎖ポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明の第３の態様は、本発明のポリヌクレオチド、特にＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドの複製および発現に適したベクター（例えば発現ベクター）に関する。上記ベクターは、例えば、複製起点、所望によりポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび所望により該プロモーターの調節体が設けられている、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよい。上記ベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または哺乳動物ベクターの場合にはネオマイシン耐性遺伝子を含有していてもよい。上記ベクターは、例えばＲＮＡの製造などにin vitroで使用してもよいし、宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換させるために使用してもよい。また、上記ベクターは、例えば遺伝子治療方法などにin vivoで使用できるように適合させてもよい。
【００３２】
この第３の態様のベクターは、好ましくは、複製可能な組換えベクターである。したがって、上記ベクターを使用して上記ＤＮＡを複製してもよい。好ましくは、上記ベクター中のＤＮＡは、宿主細胞による上記コーディング配列の発現を付与する能力を有する制御配列に機能を発揮できるように結合している。「機能を発揮できるように結合している」という語は、記載成分が、それらが意図されるように機能できる関係で並んでいることを意味する。コーディング配列に「機能を発揮できるように結合している」制御配列は、該制御配列に適合した条件下で該コーディング配列の発現が達成されるように連結されている。本発明のポリペプチドの発現を付与するために、そのようなベクターを、適当な宿主細胞中へ形質転換またはトランスフェクションしてもよい。
【００３３】
したがって、本発明のさらに別の態様は、上記第３の態様のベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞に関する。これは、図１Ａまたは９Ａの配列またはそのオープンリーディングフレームを含む本発明のポリヌクレオチドの複製および発現を可能にする。上記細胞としては、上記ベクターに適合するものが選択され、例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物であってもよい。
【００３４】
また、アンチセンスＲＮＡを製造するために、本発明のポリヌクレオチドを上記ベクター中にアンチセンス配向で挿入してもよい。また、アンチセンスＲＮＡまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドを、合成的手段により製造してもよい。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドを、細胞中のＥ２Ｆ−５タンパク質のレベルを制御するための方法に使用してもよい。そのような方法は、Ｅ２Ｆ−５ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳レベルを阻害または減少させるのに有効な量の上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記細胞中に導入することを含んでいてもよい。上記細胞は、腫瘍細胞などの非制御的に増殖する細胞であってもよい。
【００３５】
したがって、本発明は、第５の態様において、上記第３の態様の（発現）ベクターを用いて、本発明のポリペプチドをコードするコーディング配列の発現（該ベクターによる）を付与する条件下で形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞を培養し、そして、発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明のポリペプチドの製造法を提供する。
【００３６】
また、本発明は、第６の態様において、本発明のポリペプチドに特異的な抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体）を提供する。本発明の抗体は、該抗体の結合活性を保持するその断片および突然変異体を含む。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造法を提供する。モノクローナル抗体は、上記タンパク質またはそのペプチド断片を免疫原として用いる通常のハイブリドーマ技術により製造してもよい。また、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを宿主動物（例、ラット、ウサギ）に接種し、そして免疫血清を回収することを含んでなる通常の手段により製造してもよい。
【００３７】
モノクローナル抗体の抗原結合活性を保持することができる該モノクローナル抗体の断片（例えば、Ｆｖ、Ｆ(ａｂ')およびＦ(ａｂ2)'断片）が、本発明のこの態様に含まれる。さらに、本発明のモノクローナル抗体を分析し（例えば、かかる抗体を発現する遺伝子のＤＮＡ配列分析による）、例えばEP-A-0239400（Winter）に開示されている方法に従い、本発明の抗体の相補性決定領域を有するヒト化抗体を作製してもよい。
【００３８】
さらに本発明は、本発明の抗体またはその断片と担体または希釈剤とを含んでなる組成物を提供する。そのような組成物には医薬組成物が含まれ、この場合、上記担体または希釈剤は薬学的に許容されるものである。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、担体または希釈剤と共に組成物中に存在していてもよい。これらの組成物には医薬組成物が含まれ、この場合、上記担体または希釈剤は薬学的に許容されるものである。
【００４０】
薬学的に許容される担体または希釈剤には、経口、直腸、鼻内、局所（頬、舌下など）、膣または非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、脊髄内、硬膜外）投与に適した製剤中で用いられるものが含まれる。上記製剤は単位投与形で提供されるのが好都合であり、薬学分野でよく知られている方法のいずれにより製造してもよい。そのような方法は、有効成分を、１以上の補助成分を構成する担体と混合する工程を含む。一般に、上記製剤は、有効成分と液体担体若しくは微小固体担体またはその両方とを均一かつ十分に混合し、ついで生成物を必要に応じて成型することにより製造する。
【００４１】
例えば、非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および目的の受容者の血液と該製剤とを等張にする溶質を含有していてもよい水性または非水性の無菌注射溶液；並びに懸濁化剤、濃稠化剤、および該ポリペプチドを血液成分または１以上の器官へ標的化するように設計されているリポソームまたは他の微小粒子系を含んでいてもよい水性または非水性の無菌懸濁液が含まれる。
【００４２】
本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドに対する抗体またはその断片および前記組成物は、ヒトなどの哺乳動物における増殖性疾患などの状態の治療、調節または診断に使用しうる。そのような状態には、ＤＰまたはＥ２Ｆタンパク質または関連ファミリーメンバーなどの１以上の転写因子の異常な（例えば、異常に高いまたは低いレベルの）および／または異常な（例えば、遺伝子配列の突然変異によるもの）発現が含まれる。また、この状態には、図１Ａまたは９Ａのタンパク質により調節される遺伝子産物を与える遺伝子の異常発現により引き起こされる状態が含まれる。上記ペプチド、抗体、その断片、組成物などを用いる状態の治療または調節には、通常、そのような治療を必要とする受容者に、ポリペプチド、抗体、その断片または組成物の有効量を適宜投与することが含まれる。
【００４３】
また本発明は、Ｅ２Ｆ−５−ＤＰタンパク質複合体の形成の妨害を介して転写因子の活性化を阻害するためにこの領域に標的化されている抗体およびその断片を提供する。
【００４４】
さらに本発明は、サンプル中の本発明のポリペプチドの存在または不存在を検出するためのイムノアッセイを行う方法であって、
（ａ）本発明の抗体を用意し、
（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を許容する条件下、該サンプルを該抗体と共にインキュベーションし、そして
（ｃ）該抗体−抗原複合体が存在すれば、これを検出する、
ことを含んでなる前記方法を提供する。
【００４５】
もう１つの態様において本発明は、増殖性またはウイルス性の疾患の治療のための推定化学療法剤を同定するための新規アッセイであって、ＤＰタンパク質またはその誘導体、本発明のポリペプチドおよび推定化学療法剤を接触させ、そして、該剤がＤＰ／Ｅ２Ｆ−５タンパク質複合体の形成を阻害する程度を測定することを含んでなる前記新規アッセイを提供する。このアッセイでは、それぞれのタンパク質が十分に用意され、上記剤の不存在下のアッセイ条件下でＤＰ−１および／またはＥ２Ｆ−５タンパク質がヘテロ二量体を形成する限り、完全なＤＰ−１および／またはＥ２Ｆ−５タンパク質を使用する必要はないかもしれない。
【００４６】
ＤＰ−１（およびＥ２Ｆ１、２および３）のクローニングおよび配列決定は、当該技術分野で公知であり、ＤＰ−１に対する抗体の組換え発現および製造は、WO-A-94/10307に記載されている。
【００４７】
したがって、本発明は、増殖性疾患の治療のための推定化学療法剤を同定するためのスクリーニング方法であって、
（Ａ）（ｉ）  ＤＰポリペプチド、
（ii）  上記第１の態様のポリペプチド、および
（iii） 推定化学療法剤、
を、成分（ｉ）と（ii）とが（iii）の不存在下で複合体を形成する条件下で接触させ、そして
（Ｂ）成分（iii）が上記複合体を阻害しうる程度を測定する、
ことを含んでなる前記スクリーニング方法を提供する。
【００４８】
このアッセイでは、アッセイの結果を測定できるように、その３つの成分のいずれか１つ以上を、例えば放射活性または比色標識により標識してもよい。推定化学療法剤には、本発明のペプチドが含まれる。
【００４９】
ＤＰタンパク質の変異体、同族体および断片は、Ｅ２Ｆ−５タンパク質の変異体、同族体および断片と対応させて定義される。
【００５０】
（ｉ）と（ii）との複合体は、例えば、それがＥ２Ｆ ＤＮＡ結合部位にin vitroで結合する能力により測定してもよい。あるいは、上記アッセイは、レポーター遺伝子に結合したＥ２Ｆ結合部位を含んでなるプロモーターを上記複合体が活性化する能力を測定するin vivoアッセイであってもよい。このin vivoアッセイは、例えば、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物細胞におけるかかるアッセイを示す実施例を参照することにより行ってもよい。
【００５１】
上記アッセイで測定しうる候補治療剤には、上記第１の態様のポリペプチドだけでなく、特に、
（ａ）図１Ａまたは９Ａのタンパク質、
（ｂ）その対立遺伝子変異体または種同族体、または
（ｃ）（ａ）に少なくとも７０％相同なタンパク質、
の１０以上のアミノ酸の断片も含まれる。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリペプチドをコードする核酸を保持するベクターを、遺伝子治療方法に使用してもよい。そのような遺伝子治療は、細胞（例えば腫瘍細胞）の非制御増殖を治療するのに使用してもよい。遺伝子治療の方法は、治療が必要な患者中の細胞内で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを発現する能力を有するベクターの有効量を該細胞へ輸送して、Ｅ２Ｆ−５ｍＲＮＡからＥ２Ｆ−５タンパク質またはポリペプチド（Ｅ２Ｆ−５がＤＰタンパク質または関連ファミリーメンバーへ結合するのを妨害するもの）への翻訳を阻害または抑制することを含む。
【００５３】
上記ベクターは、好ましくは、ウイルスベクターである。このウイルスベクターは、腫瘍細胞を標的化するのに当該技術分野で利用可能ないかなる適当なベクターであってもよい。例えば、Huberら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88, 8039）は、ヘパトーム、乳、結腸または皮膚細胞の形質転換のための、両種性レトロウイルスの使用を報告している。また、Culverら（Science (1992)256; 1550-1552）は、Ramら（Cancer Research (1993)53; 83-88）と同様、ウイルス特異的酵素プロドラッグ療法（virus-directed enzyme prodrug therapy）でのレトロウイルスベクターの使用を記載している。Englehardtら（Nature Genetics (1993)4;27-34）は、細胞中への嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス産物（ＣＦＴＲ）の輸送における、アデノウイルスに基づくベクターの使用を記載している。
【００５４】
本発明は、いくつかのアッセイを意図する。一般には、これらは以下のように分類することができる。
【００５５】
１．Ｅ２Ｆ−５トランス活性化（trans-activation）の阻害剤（すなわち、転写の活性化の阻害）を見つけるためのアッセイの実施。したがって、この阻害剤は、ＤＮＡに対するＥ２Ｆ−５の結合（通常はＥ２Ｆ結合部位で生じる）を阻害するかもしれない。適当と考えられる阻害剤はタンパク質であり、これはｐ１０７と同様または同一の効果を有していてもよい。したがって、適当な阻害分子は、上記第１の態様のタンパク質で定義したのと同様に、ｐ１０７の断片、突然変異体、対立遺伝子変異体または種同族体を含んでなる。
【００５６】
２．（ヘテロ）二量体形成の阻害剤のアッセイ。そのような阻害剤は、Ｅ２Ｆ−５（または上記第１の態様のポリペプチド）と複合体形成体（例えば、ＤＰ−１などのＤＰタンパク質）との二量体形成を妨害するかもしれない。もちろん、この阻害剤は、上記第１の態様のタンパク質で定義したのと同様のＤＰタンパク質の断片、突然変異体、対立遺伝子変異体または種同族体であってもよい。
【００５７】
３．アッセイの第３のカテゴリーは、リン酸化の阻害剤を見つけることである。Ｅ２Ｆ−５（および上記第１の態様の他のタンパク質）はリン酸化により活性化されると考えられている。したがって、リン酸化の阻害剤は、Ｅ２Ｆ−５のトランス活性化特性を阻害すると考えられる（したがって、結局、この阻害剤は、上記の２つのアッセイのいずれかで見いだされた阻害剤と同じ効果を有するかもしれない）。リン酸化はｃｄｋにより引き起こされ、したがって、このリン酸化の阻害剤は、そのようなアッセイにより意図されるものである。
【００５８】
本発明は、いくつかの治療的用途を意図する。例えば、Ｅ２Ｆ−５に対してアンチセンスである配列の核酸を用いる遺伝子治療などである。さらに、ＤＰ−１タンパク質に結合し、それによって該ＤＰタンパク質と不活性複合体を形成しうる分子を意図する。適当な分子には、Ｅ２Ｆ−５自体以外に上記第１の態様の分子が含まれる。そのような分子は、Ｅ２Ｆ−５の突然変異体であってもよく、該分子は、当該技術分野ではしばしば、ドミナントネガティブ分子と称される。
【００５９】
本発明は、細胞の非制御増殖に基づく疾患、または非制御増殖が重要または必須の病理学的側面である疾患の治療または予防を意図する。これには、がん、ウイルス性疾患、自己増殖自体、および自己免疫疾患、例えば乾癬が含まれる。分裂細胞（例えば造血幹細胞および／または骨髄細胞）の成長を一時的に阻害したい場合があるかもしれない。これらの観点では、一般には、Ｅ２Ｆ−５の活性を予防、阻害または妨害することが求められる。
【００６０】
これに対して、Ｅ２Ｆ−５発現を増加させることにより、例えば、過剰発現を促進または誘導することにより、いくつかの疾患および状態を治療することができる。これは、好ましくは、アポトーシス（プログラムされた細胞死として知られていることもある）を引き起こす。Ｅ２Ｆ−５タンパク質の過剰発現は、細胞死を引き起こすことがある。したがって、この態様は、がんの治療にも用いることができる。よって、１つの目的は、Ｅ２Ｆ−５の活性を増加させることである。Ｅ２Ｆ−１でも同様の用途が公知である（Qinら, PNAS USA 91（印刷中））。
【００６１】
Ｅ２Ｆ−５遺伝子は腫瘍細胞中で突然変異しうることに留意すべきである。その場合には、突然変異遺伝子を、突然変異から生じる状態の診断に使用することができる。また、それは、突然変異遺伝子による治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
以下の２つの実施例では、それぞれ、ヒトおよびマウス源からの本発明の新規タンパク質およびＤＮＡの単離および特性決定について説明する。しかしながら、他の源（例えば哺乳動物源）も本発明の範囲内に包含され、上記タンパク質の他の哺乳動物同族体も同様の方法で単離されうる。本明細書に記載の実施例は例示にすぎず、本発明を何ら限定するものではない。
実施例１
概要
Ｅ２ＦＤＮＡ結合部位は、細胞周期中に発現が厳しく調節されている多数の遺伝子中で見いだされる。Ｅ２Ｆ転写因子の活性は、Ｅ２Ｆトランス活性化ドメインに結合しこれを阻害しうる特異的なリプレッサー分子との結合により調節される。Ｅ２Ｆ−１、２および３の場合、該リプレッサーは、網膜芽細胞腫遺伝子ｐＲｂの産物である。Ｅ２Ｆ−４は、ｐＲｂ関連ｐ１０７とは相互作用するが、ｐＲｂ自体とは相互作用しない。最近、網膜芽細胞腫遺伝子ファミリーの第３のメンバーであるｐ１３０をコードするｃＤＮＡが単離された。ｐ１３０も、主に細胞周期のＧ０期でＥ２ＦＤＮＡ結合活性と相互作用する。本発明者らは、本明細書において、Ｅ２Ｆ遺伝子ファミリーの第５のメンバーのクローニングを報告する。ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡは、３４６−アミノ酸のタンパク質（推定分子量３８kDa）をコードする。Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆ−１（５７％の類似度）よりもＥ２Ｆ−４（７８％の類似度）と密接に関連している。Ｅ２Ｆ−５は、ＤＰ−１と協同的にコンセンサスＥ２Ｆ部位へ結合する点で、他のＥ２Ｆと類似している。本発明者らは、特異的なＥ２Ｆ−５抗血清を使用することにより、生理学的条件下でＥ２Ｆ−５が優先的にｐ１３０と相互作用することを示す。
緒言
Ｅ２Ｆは、Ｅ２Ｆ様およびＤＰ様サブユニットよりなるヘテロ二量体転写因子のグループに与えられている名称である［27］。Ｅ２ＦＤＮＡ結合部位は、細胞周期中に発現が調節されるいくつかの遺伝子のプロモーター中に存在し、これらのＥ２Ｆ部位の存在がこれらの遺伝子の細胞周期調節発現に寄与することを示す証拠が存在する［13, 28, 38］。
【００６３】
Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）およびｐＲｂ関連ｐ１０７およびｐ１３０と複合していることが判明している［6, 10, 29, 37］。このグループのタンパク質は、保存モチーフである「ポケット」を共有しており、該ポケットは、細胞タンパク質およびウイルスタンパク質の両方に対する結合に関与している。このため、ｐＲｂ様タンパク質のグループは、一括して、ポケットタンパク質ファミリーとして知られている。Ｅ２Ｆと種々のポケットタンパク質との間の複合体は、その出現が細胞周期中で異なるため、細胞周期調節において異なる機能を有すると考えられる。ｐＲｂと複合体形成しているＥ２Ｆはほとんどが、細胞周期のＧ１期で見いだされる［5-7, 11］。これに対して、ｐ１０７とＥ２Ｆとの複合体は細胞周期中に残存するが、それらの組成は可変的である。Ｇ１では、Ｅ２Ｆおよびｐ１０７の他に、サイクリンＥおよびｃｄｋ２が存在する。Ｓ期では、Ｅ２Ｆ／ｐ１０７複合体において、サイクリンＥはサイクリンＡで置換される［29, 37］。ｐ１０７／Ｅ２Ｆ複合体中にこれらのサイクリン／ｃｄｋ複合体が存在する機能的意義は、現在のところ明らかではない。静止細胞では、Ｅ２Ｆとｐ１３０との複合体が、最も優勢なＥ２ＦＤＮＡ結合種である。細胞が静止状態から脱するにつれて、この複合体は消失するが、このことは、ｐ１３０と相互作用するＥ２Ｆ活性についての細胞周期進入における役割を示唆するものである［10］。
【００６４】
Ｅ２Ｆが転写を活性化する能力は、該ポケットタンパク質との複合体形成により調節される。Ｅ２ＦとｐＲｂとの間の複合体形成は、リン酸化による調節に左右される。ｐＲｂの低リン酸化種だけがＥ２Ｆと相互作用するが、このことは、サイクリン／ｃｄｋ複合体によるｐＲｂのリン酸化が、細胞周期中のＥ２ＦとｐＲｂとの間の相互作用を制御することを示す［5-7, 11］。
【００６５】
Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性の強制発現が、細胞周期のＧ１期からＳおよびＧ２／Ｍ期へ細胞を進行させ［3］、Ｅ２Ｆが静止細胞を刺激してＤＮＡ合成を開始させうる［23］という知見により、細胞周期調節におけるＥ２Ｆ転写因子の非常に重要な役割が強調される。重要なことは、Ｅ２Ｆの過剰発現が、活性化されたｒａｓ癌遺伝子と共に、初代げっ歯類繊維芽細胞の癌トランスフォーメーションを引き起こすことである［3］。
【００６６】
現在までに、４つの異なるＥ２Ｆ様ポリペプチドが単離されている。Ｅ２Ｆ−１、２および３は、ｐＲｂとの複合体として見いだされるにすぎないが、Ｅ２Ｆ−４はｐ１０７と優先的に相互作用する［3, 15, 19, 22, 24, 30, 36］。Ｅ２Ｆとｐ１０７との間およびＥ２Ｆとｐ１３０との間の複合体形成がどのように調節されるかについては現在のところ知られていない。Ｅ２Ｆ／ｐ１０７複合体およびＥ２Ｆ／ｐ１３０複合体の調節の検討を始めるために、本発明者らは、Ｅ２Ｆ遺伝子ファミリーの更に別のメンバーを探索した。本発明者らは、ここで、ｐ１３０と優先的に相互作用するＥ２Ｆ遺伝子ファミリーの第５のメンバーのクローニングを報告する。
材料および方法
酵母二ハイブリッドスクリーニング
「ベイト」プラスミドpPC97-p107を含有する酵母Ｙ１９０株［17］を、酢酸リチウム法［34］を用いて、１４.５日齢のＣＤ１マウス胎児ライブラリー［8］で形質転換した。ヒスチジンが無く２５mM３−アミノトリアゾールで補足されたプレート上での成長に関して２００万個の形質転換体を選択し、ついで、既に記載されている［12］とおりに、β−ガラクトシダーゼ活性に関して分析した。二重陽性酵母コロニーに由来するｃＤＮＡライブラリープラスミドを、種々のGal4-DBD融合プラスミド（pPC97-p107、pPC97-bmiおよびpPC97（挿入なし））による再形質転換により標的特異性に関して試験した。部分マウスＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡを用いて、更に別のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。本明細書に記載の完全長ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡを、Ｔ８４結腸癌ライブラリー（Stratagene）から単離した。
【００６７】
プラスミド
pPC97［8］のＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）とインフレーム（in frame）となっているｐ１０７のポケット領域（アミノ酸２４０〜８１６）をクローニングすることにより、pPC97-p107を得た。pGEX-2T中でアミノ酸８９〜２００（Ａ）またはアミノ酸８９〜３４６（Ｂ）をコードするヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡ断片をクローニングすることにより、pGST-E2F-5（Ａ）および（Ｂ）を構築した。トランスフェクション実験には、以下のプラスミドを使用した。pSG-Gal4-E2F-1は、ヒトＥ２Ｆ−１のアミノ酸２８４〜４３７を含有している［19］。pJ3-Gal4-E2F-4およびpJ3-Gal4-E2F-5は、pJ3Ω中、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとインフレームとなっているＥ２Ｆ−４またはＥ２Ｆ−５のヒトｃＤＮＡの断片（Ｅ２Ｆ−４の場合はアミノ酸２７６〜４１２をコードし、Ｅ２Ｆ−５の場合はアミノ酸２２２〜３４６をコードする）をクローニングすることにより得た［33］。pJ3-E2F-5は、完全長ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡ（３'非コーディング配列の最後の１８４ヌクレオチドを欠く）を哺乳動物発現ベクターpJ3Ω中にクローニングすることにより構築した。Ｅ２Ｆ−５の翻訳開始コドンの後には、モノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識される１０アミノ酸のエピトープ（ＨＡ）が続く。
【００６８】
pCMV-DP-1、pCMV-pRb、pCMV-p107、pCMV-p107DE、PCMV-pRb△22については、既に記載されている［20, 41］。
【００６９】
細胞系
Ｕ２−ＯＳおよびＣＡＭＡ細胞を、それぞれ１０％または２０％のウシ胎児血清で補足されたダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco'smodified Eagle medium）（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【００７０】
リン酸カルシウム沈殿法［39］を用いてトランスフェクションを行った。
【００７１】
ＣＡＴアッセイ
５μg (Gal4)5-CAT［25］または２μg E2F4-CAT［20］、０.２μg ＲＳＶ−ルシフェラーゼおよびヘリング精子担体ＤＮＡ（全量を２０μg/１０cmプレートとする）と共に、示されている発現ベクターでＵ２−ＯＳ細胞を一過性にトランスフェクションした。既に記載されているとおりに［2, 3］、ＣＡＴおよびルシフェラーゼ活性に関して細胞をアッセイした。
【００７２】
ノーザンブロット分析
Ｅ２Ｆ−５発現分析のために、細胞系のパネルから全細胞質ＲＮＡを調製した。２０mgの全細胞ＲＮＡを、記載されているとおりに［4］、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動し、ニトロセルロースに移し、[32Ｐ]−標識部分ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡ（nt. ６６６〜１０３８）でプローブする。ついで、各レーンにローディングされるＲＮＡの量を制御するために、同じフィルターをラットα−チューブリンｃＤＮＡでプローブした。
【００７３】
免疫試薬および免疫沈降
Ｅ２Ｆ−５に対する抗体を産生させるために、GST-E2F-5（Ａ）および（Ｂ）（プラスミドの項を参照されたし）タンパク質を E. coli 中で産生させ、グルタチオン−セファロースビーズを用いて精製した。等量の両タンパク質をウサギに注射した。３回の免疫の後、ポリクローナル血清を得た。
【００７４】
Ｅ２Ｆ−１（ＫＨ２０）、Ｅ２Ｆ−４（ＲＫ１３）、ｐＲｂ（ＸＺ７７）およびｐ１０７（ＳＤ−４および９）に対するモノクローナル抗体については、既に記載されている［3, 20, 21, 41］。ｐ１３０（Ｃ２０）ウサギポリクローナル抗血清は Santa Cruz Biotechnology Inc. から入手した。既に記載されているとおりに［3］、ＣＡＭＡ細胞およびトランスフェクションされたＵ２−ＯＳ細胞を標識し、免疫沈降させた。
【００７５】
ゲル遅延アッセイ
一過性にトランスフェクションされたＵ２−ＯＳ細胞のゲル遅延アッセイを、既に記載されている方法［20］を少し改変することにより行った。２０μlの反応容量中、コンセンサスＥ２ＦＤＮＡ結合部位を特定する０.５ngの[32Ｐ]−標識オリゴヌクレオチド（Santa Cruz Biotechnology）と共に、２０mMＨＥＰＥＳ（pＨ７.４）、０.１M ＫＣl、１mMＭgＣl2、０.１mMＥＤＴＡ、７％グリセロール、１mMＮaＦおよび１μg 超音波処理サケ精子ＤＮＡを含有する結合緩衝液中で１０μgの全細胞抽出物を使用した。室温で２０分間インキュベーションする間に、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成させる。該反応生成物を、０.２５×ＴＢＥ中の３.５％ポリアクリルアミドゲル上、９０Ｖ、室温、２.５時間で分離した。ついで、前記ゲルを乾燥し、フィルムに露出させた。
結果
ｐ１０７結合タンパク質の単離
ｐ１０７と相互作用するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定するために、酵母二ハイブリッドスクリーニングを行った［14］。染色体に位置する２つのＧａｌ４誘導レポーター遺伝子（ＨＩＳ３およびＬａｃＺ）［12］を含有する酵母Ｙ１９０株［17］を、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合したｐ１０７のポケット領域（アミノ酸２４０〜８１６）を含有する「ベイト」プラスミド、および１４.５日齢ＣＤ１マウス胎児ｃＤＮＡライブラリー（ここで、それぞれのｃＤＮＡは、Ｇａｌ４のトランス活性化ドメインに個々に融合されている）［8］で同時形質転換した。合計２００万の形質転換体を、ヒスチジンを欠くプレート上での選択に付した。β−ガラクトシダーゼの発現に関して、８７個の生存コロニーをスクリーニングした。ｃＤＮＡ含有プラスミドを１６個の二重陽性酵母コロニーからレスキューした。他のＧａｌ４−ＤＢＤ融合体をコードするプラスミドで再形質転換することにより、ｐ１０７結合の特異性を確認した。１６個のハイブリッドタンパク質全てが、Ｇａｌ４−ｐ１０７と特異的に相互作用することが判明した。該酵母からレスキューされた１６個のｃＤＮＡライブラリープラスミドが１０個の異なる遺伝子に由来することが、ＤＮＡ配列分析により示された。３個のｃＤＮＡは、同じ遺伝子に由来しており、４個の公知Ｅ２Ｆに対して有意な相同性を示した。このため、本発明者らは、このｃＤＮＡによりコードされるタンパク質をＥ２Ｆ−５と命名した。
【００７６】
ついで、該部分マウスＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡを使用して、ヒト結腸癌ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、完全長ヒトｃＤＮＡクローンを得た。最長ｃＤＮＡ（２.１kb）を配列決定したところ、それは、３４６−アミノ酸のタンパク質（推定分子量３８kDa）をコードする１０３８bpのオープンリーディングフレームを含有していた。図１Ａは、Ｅ２Ｆ−５ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。
【００７７】
Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆ−１（５７％の類似度）よりもＥ２Ｆ−４（７８％の類似度）と密接に関連している。Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−４と比較すると、Ｅ２Ｆ−５中には相同な３つの領域が認められる（図１Ｂ）。該ＤＮＡ結合ドメイン（Ｅ２Ｆ−５のアミノ酸４３〜１１５）は、Ｅ２Ｆ−４ＤＮＡ結合領域と９３％の類似度を共有し、一方、並列するＤＰ−１二量化ドメインは、Ｅ２Ｆ−４とＥ２Ｆ−５との間で８１％類似する。最後に、Ｅ２Ｆ−４とＥ２Ｆ−５とのカルボキシル末端ポケットタンパク質相互作用ドメインは、８３％類似する。Ｅ２Ｆ−４およびＥ２Ｆ−５は、サイクリンＡ結合に関与するＥ２Ｆ−１のアミノ末端モチーフを両タンパク質が欠いている点で、Ｅ２Ｆ−１とは異なる。Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆ−４のセリン反復領域を欠いている点で、Ｅ２Ｆ−４とは異なる。
【００７８】
Ｅ２Ｆ−５のｍＲＮＡ発現レベルを分析するために、ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡを使用して、いくつかのヒト細胞系から全細胞質ＲＮＡを含有するノーザンブロットをプローブした。Ｅ２Ｆ−５プローブは、ほとんどの細胞系で、低レベルの単一の２.１kbの転写産物を検出した。ヒトＣＡＭＡ乳癌細胞系は、いくらか高いレベルのＥ２Ｆ−５を発現した（図２）。
【００７９】
Ｅ２Ｆ−５は、カルボキシル末端トランス活性化ドメインを含有する
Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−４は、ポケットタンパク質結合部位と重なるカルボキシル末端トランス活性化ドメインを含有する［3, 18］。Ｅ２Ｆ−５もトランス活性化ドメインを含有するか否かを調べるために、本発明者らは、哺乳動物発現ベクターpJ3Ω中でヒトＥ２Ｆ−５のカルボキシル末端をＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインと融合させた。Ｕ２−ＯＳ骨肉腫細胞を、５つの上流Ｇａｌ４部位を保持するＣＡＴレポーター遺伝子で一過性にトランスフェクションするか、あるいは、該レポーター遺伝子とGal4-E2F発現ベクターとで同時トランスフェクションした。図３に示すとおり、Ｇａｌ４レポータープラスミドとGal4-E2F-5 発現ベクターとの同時トランスフェクションにより、ＣＡＴレポーター遺伝子が５０倍活性化された。Gal4-E2F-1またはGal4-E2F-4による同時トランスフェクションでは、ＣＡＴレポーター遺伝子の活性化が２〜３倍高かった（図３）。本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５は、強力なカルボキシル末端トランス活性化ドメインを含有すると結論する。
【００８０】
Ｅ２Ｆ−５は、ＤＮＡ結合のためにＤＰ−１を必要とする
Ｅ２Ｆ−１とＥ２Ｆ−４とは共に、効率的なＤＮＡ結合のためには、ＤＰ−１との二量体形成を必要とする［1, 3, 20, 26］。Ｅ２Ｆ−５がコンセンサスＥ２ＦＤＮＡ結合部位に結合するか否か、およびＤＮＡに結合するためにＥ２Ｆ−５がＤＰ−１二量体形成を必要とするか否かを調べるために、本発明者らは、一過性トランスフェクション実験を行った。コアプロモーターが４つの上流Ｅ２Ｆ部位に結合しているＣＡＴレポータープラスミドで、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞をトランスフェクションした。図４に示すとおり、E2F-CATレポータープラスミドは、該骨肉腫細胞に単独でトランスフェクションされた場合には、低い活性しか有さない。ＤＰ−１またはＥ２Ｆ−５発現ベクターで別々にトランスフェクションしても、E2F-CATレポーターの活性化は生じなかった（図４、トラック２および６）。ＤＰ−１とＥ２Ｆ−５発現ベクターとの同時トランスフェクションにより、ＣＡＴレポーターの強力な用量依存的相乗活性化が生じた（図４、トラック３〜５）。これらのデータが示すとおり、Ｅ２Ｆ−５はコンセンサスＥ２Ｆ部位に結合でき、ＤＮＡ結合はＤＰ−１依存的である。これらの結果に基づき、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５がＥ２Ｆ遺伝子ファミリーの真のメンバーであると結論する。
【００８１】
Ｅ２Ｆ−５トランス活性化は、ポケットタンパク質により抑制される
Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−４のトランス活性化ドメインはポケットタンパク質相互作用表面と重なるため、これらのＥ２Ｆのトランス活性化は、ポケットタンパク質結合により抑制される。Ｅ２Ｆ−５トランス活性化に対するポケットタンパク質発現の効果を調べるために、本発明者らは、一過性トランスフェクションアッセイを用いた。Ｅ２Ｆ−１とＥ２Ｆ−４とは共に、それらのそれぞれのポケットタンパク質に対する効率的な結合のためにはＤＰ−１二量体形成を必要とするため［3, 20］、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５およびＤＰ−１活性化転写に対するポケットタンパク質発現の効果を測定した。Ｅ２Ｆ−５およびＤＰ−１と共にE2F-CATレポータープラスミドでＵ２−ＯＳ細胞をトランスフェクションした。図５（トラック３）に示すとおり、Ｅ２Ｆ−５とＤＰ−１との同時トランスフェクションにより、E2F-CATレポーター遺伝子が１００倍以上活性化された。Ｅ２Ｆ−５刺激転写は、ｐＲｂ、ｐ１０７およびｐ１３０発現ベクターでの同時トランスフェクションにより、用量依存的に阻害された。無傷のポケットドメインを欠く、ｐＲｂの変異体（ｐＲｂΔ２２）およびｐ１０７の変異体（ｐ１０７ＤＥ）は、Ｅ２Ｆ−５トランス活性化を抑制する能力を有していなかった（図５、トラック６および９）。重要なことは、ｐＲｂおよびｐ１０７のこれらの変異形態が、成長阻害活性をも欠くことである［41］。したがって、この実験では、Ｅ２Ｆ−５の好ましい結合相手の明確な同定はできなかったが、該実験が示したところによると、ポケットタンパク質結合によりＥ２Ｆ−５トランス活性化が阻害され、ｐＲｂおよびｐ１０７が成長停止を起こす能力とそれらがＥ２Ｆ−５トランス活性化を阻害する能力との間に密接な相関が存在する。この実験で用いるＵ２−ＯＳ細胞がｐＲｂ−またはｐ１０７−誘導成長停止に不感受性である［41］ことを指摘しておくことは重要である。したがって、観察された、Ｅ２Ｆ−５トランス活性化に対する効果は、ｐＲｂまたはｐ１０７の非特異的細胞周期効果によるものではないらしい。
【００８２】
バンドシフトアッセイにおいて、Ｅ２Ｆ−５はｐ１３０と優先的に相互作用する
Ｅ２Ｆ−５によるポケットタンパク質結合の特異性をさらに調べるために、本発明者らは、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行った。Ｕ２−ＯＳ細胞を、ｐＲｂ、ｐ１０７またはｐ１３０発現ベクターと共に又はこれらを用いることなく、ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−５発現ベクターで一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、全細胞抽出物を、トランスフェクションされた細胞から調製し、コンセンサスＥ２Ｆ部位を特定する[32Ｐ]−標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした。ＤＮＡ−タンパク質複合体を、ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ラジオグラフィーにより可視化した。図６に示すとおり、Ｅ２Ｆ−５およびＤＰ−１発現ベクターのトランスフェクションは、模擬（mock）トランスフェクション細胞では観察されなかった新規複合体の出現につながる（図６、レーン１および２を比較されたし）。ｐ１３０発現ベクターの同時トランスフェクションにより、この複合体のスーパーシフト（supershift）が生じたが、ｐ１０７またはｐＲｂ発現ベクターの場合にはこれは生じなかった（図６、レーン３〜５）。これらのデータは、試験したこれらの３つのタンパク質のうちで、ｐ１３０がＥ２Ｆ−５／ＤＰ−１ヘテロ二量体に対して最も高い親和性を有することを示唆する。
【００８３】
Ｅ２Ｆ−５は、invivoでｐ１３０と優先的に相互作用する
生理学的条件下では、Ｅ２Ｆ−１はｐＲｂに、Ｅ２Ｆ−４はｐ１０７にそれぞれ優先的に結合する［3, 15, 19, 24］。しかしながら、一過性トランスフェクション実験では、Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−４活性化遺伝子発現は、ｐＲｂとｐ１０７との両方により抑制されうる［3, 40］。この特異性の喪失は、おそらく、これらのタンパク質の一過性の過剰発現により生じるのであろう。網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーの３つのメンバーのどれが、生理学的条件下でＥ２Ｆ−５と相互作用するかを検討するために、本発明者らは、ヒトＥ２Ｆ−５に対するポリクローナルウサギ抗血清を産生させた。in vitroで転写および翻訳されたＥ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−４およびＥ２Ｆ−５を用いる最初の免疫沈降実験において、ポリクローナルＥ２Ｆ−５血清がＥ２Ｆ−５を特異的に認識することが示された（データは示していない）。ついで、Ｅ２Ｆ−５抗血清を逐次免疫沈降実験で使用した。ＣＡＭＡ乳癌細胞を、[32Ｐ]−オルトホスフェートで代謝的に標識し、非イオン性デタージェントライゼートを調製した。これらのライゼートを、ｐＲｂ特異的抗体、ｐ１０７抗体またはｐ１３０特異的抗血清を用いる免疫沈降法に付した。ｐＲｂ、ｐ１０７またはｐ１３０で共免疫沈降させたタンパク質を、ＳＤＳ含有緩衝液中で煮沸することにより遊離させ、希釈し、Ｅ２Ｆ−５特異的抗血清で再免疫沈降させた。図６のパネルＢに示すとおり、ｐ１３０免疫沈降物からは、４７kDaのタンパク質がＥ２Ｆ−５抗血清により特異的に再免疫沈降されたが、ｐＲｂまたはｐ１０７免疫沈降物からは再免疫沈降されなかった。この４７kDaのタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上、一過性にトランスフェクションされたＥ２Ｆ−５と共移動する（データは示していない）。対照として、本発明者らは、ｐＲｂおよびｐ１０７免疫沈降物がそれらの各々のＥ２Ｆを含有するか否かを確認した。図６のパネルＣに示すとおり、ｐＲｂは確かにＥ２Ｆ−１と共免疫沈降し、ｐ１０７はＥ２Ｆ−４を沈降させた。総合すると、これらのデータからは、Ｅ２Ｆ−５がin vivoでｐ１３０と優先的に相互作用することが示される。
考察
本発明者らは、本明細書において、Ｅ２Ｆ遺伝子ファミリーの第５のメンバーの単離を報告する。Ｅ２Ｆ−５は、真のＥ２Ｆファミリーメンバーの特徴のすべてを有する。すなわち、それは、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン、ＤＰ−１二量化ドメインおよびカルボキシル末端トランス活性化ドメインを有する。さらに、Ｅ２Ｆ−５は、ＤＰ−１と協同的にコンセンサスＥ２ＦＤＮＡ結合部位に結合し、Ｅ２Ｆ部位含有レポーター遺伝子の発現を活性化しうる。
【００８４】
本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５が３つのポケットタンパク質のどれとin vivoで優先的に相互作用するのかを検討するために、３つのタイプの実験を行った。一過性トランスフェクション実験では、Ｅ２Ｆ−５トランス活性化は、網膜芽細胞腫タンパク質ファミリーｐＲｂ、ｐ１０７およびｐ１３０の３つすべてのメンバーにより抑制された。この点で、Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−４と類似している。なぜなら、Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−４トランス活性化は共に、一過性トランスフェクションアッセイで、ｐＲｂおよびｐ１０７により阻害されうるからである［3, 40］。このように一過性トランスフェクションアッセイで特異性が一見ないことは、おそらく、一過性トランスフェクション細胞におけるＥ２Ｆとポケットタンパク質との両方の高い一過性発現レベルの結果であろう。一過性トランスフェクション細胞では、ｐ１０７はｐ１３０と比べて１０倍高いレベルで発現されることが判明しているため（データは示していない）、該一過性トランスフェクション実験（図５）におけるｐ１３０によるＥ２Ｆ−５トランス活性化の比較的低レベルの阻害は、低いレベルのｐ１３０発現の結果である。Ｅ２Ｆ−５のポケットタンパク質特異性を検討するために、２つの更に別の実験を行った。その第１の実験では、全３つのポケットタンパク質の発現ベクターの存在下および不存在下、Ｅ２Ｆ−５およびＤＰ−１発現ベクターで細胞を一過性にトランスフェクションした。ついで、該トランスフェクション細胞からの抽出物と、コンセンサスＥ２Ｆ結合部位を特定するオリゴヌクレオチドとを用いて、バンドシフトアッセイを行った。ｐ１３０の同時トランスフェクションだけが、Ｅ２Ｆ−５／ＤＰ−１複合体のスーパーシフトを起こすことができた（図６）。該バンドシフトアッセイでは、ポケットタンパク質とＥ２Ｆ−５との間の長時間安定な複合体だけが、Ｅ２Ｆ／ポケットタンパク質「スーパーシフト」複合体として検出される。したがって、たとえｐ１３０がｐ１０７より低レベルで発現されたとしても、Ｅ２Ｆ−５とｐ１３０との複合体は、ｐ１０７／Ｅ２Ｆ−５複合体よりも安定であった（図６）。同様の実験で、本発明者らは、ｐ１０７とのＥ２Ｆ−４ＤＮＡ結合複合体を「スーパーシフト」させることはできたが、ｐＲｂとの複合体はできなかった（R.L.B.およびR.B., 未公開データ）。この結果が示唆するところによると、移動度シフト実験は、Ｅ２Ｆのポケットタンパク質特異性を検討するのに有用と考えられる。該移動度シフトアッセイの結果と一致して、本発明者らは、トランスフェクションされていない代謝標識ＣＡＭＡ乳癌細胞では、Ｅ２Ｆ−５は、ｐ１３０とは共免疫沈降しうるが、ｐ１０７またはｐＲｂとは共免疫沈降しないことを見いだした（図７）。総合すると、本発明者らのデータは、生理学的条件下では、Ｅ２Ｆ−５はｐ１３０と優先的に結合することを示す。
【００８５】
ｐ１３０とｐ１０７とは構造的に密接に関連しており、実際、ｐ１０７とｐ１３０とは共に、サイクリンＡおよびＥに結合する能力を有するため［16, 32, 41］、Ｅ２Ｆ−５がｐ１３０とは相互作用したが、ｐ１０７とはしなかったという知見は、いくらか予想外であった。一方、ｐ１０７だけが抗Ｄ型サイクリン抗体と共免疫沈降する（ｐ１３０はしない）ため［32］、ｐ１０７とｐ１３０とは、Ｄ型サイクリンとin vivoで相互作用する能力において異なる。重要なことは、ｐ１３０／Ｅ２Ｆおよびｐ１０７／Ｅ２Ｆ複合体の出現が、細胞周期で異なることである［9, 10, 29, 35, 37］。このことは、ｐ１０７とｐ１３０とは、細胞周期中、異なる機能を有することを示唆する。ｐ１３０によるＥ２Ｆ−５の優先的結合は、細胞周期調節におけるｐ１３０に関するそのような異なる役割と一致する。
【００８６】
Ｅ２Ｆ−５がコンセンサスＥ２Ｆ部位に結合しうるという本発明者らの知見は、Ｅ２Ｆ遺伝子ファミリーの残りのメンバーが結合するＥ２Ｆ部位とは異なるＥ２Ｆ部位の別個のサブセットと、Ｅ２Ｆ−５がin vivoで相互作用するという可能性を決して除外するものではない。チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター中およびｂ−ｍｙｂプロモーター中に存在するＥ２Ｆ部位がＥ２Ｆ／ｐ１０７複合体と優先的に相互作用するという知見［28, 31］は、種々のＥ２Ｆのそのような結合部位優先性と一致する。Ｅ２Ｆとｐ１３０との間の複合体は、ほとんどの場合、静止細胞中で見いだされ、細胞が静止から脱した後すぐに消失するため、Ｅ２Ｆ−５応答性遺伝子は、成長因子刺激に対する静止細胞の初期応答に関与していると考えられる［10］。ｐ１３０と相互作用するＥ２Ｆ−５が入手できれば、Ｅ２Ｆ−５応答性遺伝子の同定ができるはずである。
謝辞
マウス胎児ｃＤＮＡライブラリーおよび酵母発現ベクターを贈呈していただいたP. Chevray、酵母Ｙ１０９０株を贈呈していただいたS. Elledge、Gal4-bmi酵母発現ベクターを贈呈していただいたM. Alkema、ｐ１３０発現ベクターを贈呈していただいたG. Hannon、ヒト細胞系ＲＮＡを贈呈していただいたA. Bes-Gennissen、およびノーザンブロットを調製していただいたY. Ramosに感謝の意を表する。
【００８７】
この研究は、Netherlands Organization for Scientific Research（ＮＷＯ）からの助成により支援していただいた。
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実施例２
概要
転写因子ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは、それが細胞周期進行のキーとなるレギュレーター（例、網膜芽細胞腫抑制遺伝子産物および関連ポケットタンパク質、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ）と相互作用することにより、細胞増殖の制御に関与している。２つの異なるタンパク質ファミリー（ＤＰおよびＥ２Ｆ）のメンバーがＤＰ／Ｅ２Ｆヘテロ二量体として相互作用する場合に、ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性が生じる。ここでは、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５と称される、Ｅ２Ｆタンパク質ファミリーの新規メンバーの単離および特徴づけを報告する。Ｅ２Ｆ−５は、マウスＤＰ−１に対する結合能を有する分子に関して１４.５d.p.c.マウス胎児ライブラリーをスクリーニングする酵母二ハイブリッドアッセイにより単離されたが、ＤＰタンパク質ファミリーのすべての公知メンバーとも相互作用する。哺乳動物細胞抽出物に存在する一般的なＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性（Ｅ２Ｆ部位を介して協同的ＤＮＡ結合活性および転写活性化を起こす相互作用）により、Ｅ２Ｆ−５はＤＰ−１との生理学的ヘテロ二量体として存在する。強力な転写活性化ドメインは、酵母および哺乳動物細胞の両方で機能し、Ｅ２Ｆ−５のＣ末端領域に存在する。ｐＲｂよりむしろｐＲｂ関連タンパク質ｐ１０７の発現が、Ｅ２Ｆ−５の転写活性を不活性化する。Ｅ２Ｆ−５と該ファミリーの他のメンバーとの配列の比較から、Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆ−１、−２および−３よりも、Ｅ２Ｆ−４に対する類似度が大きいことが示される。Ｅ２Ｆ−５とＥ２Ｆ−４との構造的および機能的類似性は、Ｅ２Ｆタンパク質のサブファミリーを定義づけるものである。
緒言
細胞転写因子ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは、細胞周期進行と同調した転写に関与していることを示す証拠がかなり存在する。例えば、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆは、主要な標的の１つであり、それを介して、網膜芽細胞腫癌抑制遺伝子産物（ｐＲｂ）が、細胞増殖に対するその負の効果を奏すると考えられる（La Thangue, 1994）。したがって、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの転写活性および標的遺伝子［その多くは、細胞周期進行に必要なタンパク質をコードしている（Nevins, 1992）］の活性を調節することにより、ｐＲｂは、初期細胞周期を経る進行に影響を及ぼしうる。ヒト腫瘍細胞中に生じる、Ｒｂ中の天然の突然変異は、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆに結合しないタンパク質をコードする（Bandaraら, 1992; Heibertら, 1992; ZamanianおよびLa Thangue, 1992）が、このことは、調節解除するＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆと異常細胞成長との間の相関性を強調するものである。さらに、アデノウイルスＥ１ａ、ヒトパピローマウイルスＥ７、ＳＶ４０ラージＴ抗原などのウイルス性癌タンパク質の形質転換活性は、それらがｐＲｂおよび関連タンパク質の隔離によりＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆを調節解除する能力と相関しており（Nevins, 1992）、このことは、この見解をさらに支持するものである。
【００８８】
細胞周期において中心的な役割を果たす他の分子も、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆと相互作用する。サイクリンＡおよびＥは触媒サブユニットｃｄｋ２と共に、該転写因子中のＤＮＡ結合成分と接触することにより直接的に（Krekら, 1994）、あるいは、ｐＲｂ関連ポケットタンパク質ｐ１０７またはｐ１３０のスペーサー領域中で生じる接触を介して間接的に（Leesら, 1992; Cobrinikら, 1993）、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆに結合する。ｐ１０７およびｐ１３０と結合するサイクリン−ｃｄｋ複合体の役割については未だ解明されていないが、サイクリンＡ／ｃｄｋ２キナーゼ複合体とＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆとの間の直接的相互作用は、そのＤＮＡ結合活性に影響を及ぼすことが示されている（Krekら, 1994）。
【００８９】
ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの分子組成が明らかにされはじめている。始原型分子(prototypemolecules)がＤＰ−１（Girlingら, 1993）およびＥ２Ｆ−１（Helinら, 1992; Kaelinら, 1992; Shanら, 1992）である２つの異なるタンパク質ファミリーのメンバーがＤＰ／Ｅ２Ｆヘテロ二量体として相互作用する場合に（La Thangue, 1994）、一般的なＤＮＡ結合活性ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆが生じることが現在明らかとなっている。両タンパク質の間で類似する小さな領域が、現在単離されているすべてのＤＰおよびＥ２Ｆファミリーメンバーで保存されており（Girlingら, 1994）、この領域は、それらのタンパク質がヘテロ二量体として相互作用するのを可能にし（Bandaraら, 1993; Helinら, 1993; Krekら, 1993）、それにより、多様な組み合わせの相互作用の発生が可能となる。
【００９０】
それぞれ、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆとの相互作用の各々の特徴的なプロフィールを有するｐＲｂ、ｐ１０７およびｐ１３０の結合が、細胞周期進行中に一時的調節的に生じる（Shirodkarら, 1992; Schwarzら, 1993; Cobrinikら, 1993）。現在までに単離されているＥ２Ｆファミリーメンバーのうち、Ｅ２Ｆ−１、−２および−３はｐＲｂを（Ivey-Hoyleら, 1993; Leesら, 1993）、Ｅ２Ｆ−４はｐ１０７タンパク質を認識するが（Beijersbergenら, 1994; Ginsbergら, 1994）、その考えられる説明は、ポケットタンパク質の一時的な相互作用が、Ｅ２Ｆ／ＤＰヘテロ二量体中のＥ２Ｆファミリーメンバーの組成および／または利用性の調節を反映しているというものである。
【００９１】
多数の細胞型において、ＤＰ−１は、細胞周期進行中に生じる種々の形態で存在するＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの通常のＤＮＡ結合成分であるが（Bandaraら,1994）、ＤＰ−２などの他のＤＰファミリーメンバーは、組織限定的に発現される（Girlingら, 1994）。したがって、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの分子組成が、細胞周期進行および細胞表現型により影響を受ける可能性があると考えられる。
【００９２】
Ｅ２Ｆタンパク質ファミリーの複雑性については、未だ解明されていない。この問題を検討するために、本発明者らは、酵母に基づく二ハイブリッドスクリーニングを行って、該ファミリーの新規メンバーを定義づけした。ここで、本発明者らは、Ｅ２Ｆファミリーの新規メンバーであるマウスＥ２Ｆ−５の単離および特徴づけを報告する。Ｅ２Ｆ−５は、ＤＰタンパク質ファミリーの公知メンバーのすべてと相互作用する。哺乳動物細胞抽出物中で、Ｅ２Ｆ−５はＤＰ−１との生理学的ヘテロ二量体として存在し、その相互作用は、Ｅ２Ｆ部位を介する協同的ＤＮＡ結合および転写活性化を起こす。Ｅ２Ｆ−５は、ポケット−タンパク質結合に際して特異的に不活性化される強力なトランス活性化ドメインを有する。Ｅ２Ｆ−５のタンパク質配列および分子構成は、Ｅ２Ｆ−４との関連性が、該ファミリーの他のメンバーとの関連性より密接であり、これは、機能的および構造的に関連しているＥ２Ｆタンパク質のサブファミリーを最初に定義づけるものである。
結果
Ｅ２Ｆ−５の単離
Ｅ２Ｆタンパク質ファミリーの多様性を調べるために、本発明者らは、酵母二ハイブリッドに基づく方法（FieldsおよびSong, 1989）により、新規メンバーを同定した（図８）。ＤＰ−１はＥ２Ｆファミリーメンバーの通常の生理学的反応の相手であるため（Bandaraら, 1993; Bandaraら, 1994）、本発明者らは、ベイトとしてＤＰ−１を使用することを選択した。１４.５d.p.c.マウス胎児（ChevrayおよびNathans, 1992）から調製された活性化ドメインタグ付きｃＤＮＡライブラリーを、ＬｅｘＡ−ＤＰ−１と相互作用する能力を有するハイブリッドタンパク質に関してスクリーニングした。同定されたクローンの１つは、いくつかの基準によりＬｅｘＡ−ＤＰ−１と特異的に相互作用するハイブリッドタンパク質をコードしていた。該ｃＤＮＡ配列の部分分析は、Ｅ２Ｆファミリーメンバーとの広範な類似性を示し、したがって、完全タンパク質配列をコードするｃＤＮＡクローンを、Ｆ９ＥＣｃＤＮＡライブラリーからさらに単離した。Ｅ２Ｆファミリーの他のメンバーとのタンパク質配列の比較により、該ｃＤＮＡクローンが新規メンバーをコードしていることが示された。Ｅ２Ｆ−１、−２、−３および−４として既に単離されているＥ２Ｆタンパク質に採用されている名称に従い、本発明者らは、このクローンをＥ２Ｆ−５と称する。
【００９３】
マウスＥ２Ｆ−５の予想サイズは、３３５残基である（図９ａ）。この予想は、考えられる最初の開始メチオニンの位置、および同じメチオニンから翻訳が開始されるヒトＥ２Ｆ−５配列に対して存在する広範な相同性に基づく（Hijmansら,投稿中）。Ｅ２Ｆ−５は、他のＥ２Ｆファミリーメンバーの間で保存されているドメインとの広範な配列類似性を含有する（Ivey-Hoyleら, 1993; Leesら,1993; Beijersbegenら, 1994; Ginsbergら, 1994）。例えば、該ＤＮＡ結合ドメインは、Ｅ２Ｆ−１に対して４８％、Ｅ２Ｆ−４に対して８７％の同一性を示す（図９ｂおよびｃ）。この領域内で、Ｃ末端サブドメインは、ＤＰファミリーのメンバーと類似する唯一の領域を含有する（図９ｂおよびｃに示す）。ＤＥＦボックスとして知られる（Girlingら, 1994; LamおよびLa Thangue, 1994）この領域は、ＤＰ／Ｅ２Ｆヘテロ二量体の形成に密接に関与している（Bandaraら, 1993; BandaraおよびLa Thangue, 投稿予定）。また、ＤＰとＥ２Ｆとのタンパク質間でＤＥＦボックス内で保存されている残基は、Ｅ２Ｆ−５内で完全に保存されており（図９ｃ）、このことは、ＤＰ／Ｅ２Ｆヘテロ二量体の形成におけるこのサブドメインの潜在的重要性を強調するものである。
【００９４】
Ｅ２Ｆ−５と残りのファミリーメンバーとの間では、いくつかの更に別の領域が保存されている。マークトボックス（marked box）（Leesら, 1993）およびポケット−タンパク質結合ドメインは、Ｅ２Ｆ−１中のこれらの領域と５８％および５０％の同一性を、Ｅ２Ｆ−４中の同じ領域と７５％および７２％の同一性を示す（図９ｂおよび９ｃ）。また、該ロイシンジップ領域中の疎水性残基の位置は、他のＥ２Ｆファミリーメンバーに対して保存されている（図９ｃ）。Ｅ２Ｆ−５中の疎水性残基は、２つのさらなるＣ末端位置（Ｌ１４４およびＶ１５１；図９ｃを参照されたし）で７個の反復と重なるため、実際に、Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆ−１、−２および−３より長いジップを形成しうる。
【００９５】
Ｅ２Ｆ−５の特徴は、Ｅ２Ｆ−１、−２および−３よりもＥ２Ｆ−４との密接な関係を示唆する。該タンパク質は、該ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端ほどは伸長せず、両タンパク質は、残りのＥ２Ｆ中に生じるＮ末端サイクリンＡ結合ドメインを欠く点で（図９ｂ）、Ｅ２Ｆ−５の構成はＥ２Ｆ−４のものと類似する。さらに、該タンパク質配列の比較により、Ｅ２Ｆ−５とＥ２Ｆ−４との関係は、その各々と該ファミリーの残りのメンバーとの関係よりも密接であることが示される。これは、Ｅ２Ｆ−５とＥ２Ｆ−４との間では多数の残基が共通であるがＥ２Ｆ−１、−２および−３間ではそうでない該保存ドメインから特に明らかである（図９ｃ）。全体的には、Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆ−４とは７０％、Ｅ２Ｆ−１とは３８％のアミノ酸残基が同一である。したがって、この類似性に基づくと、Ｅ２Ｆ−５および−４は、Ｅ２Ｆタンパク質ファミリーの１つのサブファミリーを代表し、Ｅ２Ｆ−１、−２および−３は、それらの密接な類似性のため、別のサブファミリーを代表する。
【００９６】
ＤＰファミリーメンバーとの結合および転写協同作用
ＤＰファミリーメンバーがＥ２Ｆファミリーメンバーと相互作用する場合に、一般的なＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性が生じる（La Thangue, 1994）。ＤＰ−１およびＥ２Ｆ−１では、該相互作用により協同的転写活性化、ＤＮＡ結合、およびｐＲｂとの相互作用が生じる（Bandaraら, 1993; Helinら, 1993; Krekら, 1993）。したがって、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５がＤＰファミリーメンバーと協同作用しうるか否かの判定に関心があった。
【００９７】
これらの問題に答えるために、本発明者らはまず、ＬｅｘＡ融合タンパク質として該ハイブリッドベイト中に提示されている種々のＤＰ分子を使用する酵母二ハイブリッドアッセイを用いた（図８）。Ｅ２Ｆ−５またはＥ２Ｆ−１のいずれかを、活性化ドメイン（ＧＡＤ）タグ付きハイブリッドタンパク質として発現させ、ＬｅｘＡレポーター構築物の転写活性化の程度を、β−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより評価した。Ｅ２Ｆ−５およびＥ２Ｆ−１は共に、ＤＰタンパク質ファミリーのすべての公知メンバー（すなわち、ＤＰ−１、−２、−３およびショウジョウバエＤＰ）と同等に相互作用する能力を有する（データは示していない）。
【００９８】
ついで、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５がＤＰ−１と協同して、Ｅ２Ｆ結合部位を介して転写を活性化しうるか否かを評価した。このために、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５およびＤＰ−１を一緒にまたは単独で発現させ、Ｅ２Ｆ部位レポーター構築物p4xWT CYC1の転写活性を測定する酵母アッセイを用いた（図１０ａ）。以前の研究では、このアッセイは、Ｅ２Ｆ−１とＤＰ−１との間の協同作用を測定するために使用されている（Bandaraら, 1993）。該ＤＰ−１ハイブリッドタンパク質の発現の後、該レポーターの転写活性は有意な影響を受けず、Ｅ２Ｆ−５ハイブリッドによりわずかに影響されたにすぎなかった（図１０ｂ）。しかしながら、両方を一緒に発現させた場合には、レポーター活性の刺激は６倍を越えた（図１０ｂ）。突然変異Ｅ２Ｆ結合部位を担持する、p4xWT CYC1の誘導体であるp4xMT CYC1（図１０ａ; Bandaraら, 1993）の活性は、同じ条件で影響を受けなかった（データは示していない）。したがって、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５がＤＰ−１と協同作用すると結論する。
【００９９】
Ｅ２Ｆ−５の転写活性化およびポケットタンパク質調節
酵母および哺乳動物細胞の両方で、Ｅ２Ｆ−５の転写活性化能を評価した。酵母で転写活性をアッセイするために、Ｅ２Ｆ−５のＣ末端領域（残基１９８〜３３５）をＬｅｘＡに融合し、ＬｅｘＡ結合部位により駆動されるレポーター構築物の活性を評価した（図１１ａ）。pLEX.E2F-5の存在下では、該ベクター単独で発現させた場合よりも、該レポーターの活性がかなり大きかったので（図１１ｂ）、Ｅ２Ｆ−５タンパク質は強力なトランス活性化ドメインを含有する。同様に、LexA E2F-1は、転写活性化能を有していた（図１１ｂ）。したがって、Ｅ２Ｆ−５は、酵母において転写を効率的に活性化する。
【０１００】
これらの結果を哺乳動物細胞で確認し、ポケット−タンパク質とＥ２Ｆ−５との相互作用の機能的影響を評価するために、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５の同じ領域をGal4 ＤＮＡ結合ドメインに融合し、一過性トランスフェクションアッセイを用いて、Ｇａｌ４結合部位により駆動されるレポーター構築物（pGAL-CAT）の転写活性を調べた（図１２ａ）。pGAL-E2F-5の存在下でpGAL-CATの転写活性はpG4と比べて１５倍大きかったので、３Ｔ３細胞では、Ｅ２Ｆ−５は、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン単独の活性と比べて、転写を効率的に活性化した（図１２ｂ）。種々の他の細胞型でも同様の結果が得られたが（データは示していない）、このことは、哺乳動物細胞中で機能するトランス活性化ドメインをＥ２Ｆ−５が含有することを示すものである。
【０１０１】
ついで、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５の転写活性を用いて、ｐＲｂまたはｐ１０７のいずれかとの相互作用の機能的影響を評価した。野生型ｐＲｂおよびｐ１０７についての対照として、本発明者らは、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆとは相互作用しないＲｂの天然に存在する突然変異対立遺伝子によりコードされるタンパク質であるＲｂΔ２２の活性（ZamanianおよびLa Thangue, 1992）、およびアンチセンスｐ１０７ＲＮＡの活性（ZamanianおよびLa Thangue, 1993）を調べた。pCMVHRbまたはpCMVHRbΔ22の存在下でpGAL-CATの活性は影響を受けなかったため（図１２ｂ）、野生型ｐＲｂまたはＲｂΔ２２はいずれも、Ｅ２Ｆ−５の活性に有意な影響を及ぼさなかった。これに対して、Ｅ２Ｆ−５と共発現するｐ１０７（pCMV107から）はＥ２Ｆ−５の転写活性を減少させたが、アンチセンスｐ１０７（pCMV107ASから）は影響を及ぼさなかったため、この効果は特異的であった（図１２ｂ）。本発明者らは、哺乳動物細胞において、ｐ１０７はＥ２Ｆ−５の転写活性を不活性化すると結論する。同様の実験方法を用いて、ｐ１３０タンパク質がＥ２Ｆ−５の転写活性を不活性化することが示された（データは示していない）。
【０１０２】
Ｅ２Ｆ−５は、ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの生理学的ＤＮＡ結合成分である
Ｅ２Ｆ−５が、哺乳動物細胞から調製された抽出物中に限定される一般的なＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性の生理学的ＤＮＡ結合成分であるか否かを判定するために、異なるペプチド配列に対する２つの異なる抗Ｅ２Ｆ−５ペプチド血清（共に、ＧＳＴ−Ｅ２Ｆ−５融合タンパク質と特異的に反応する抗血清である）を調製した（データは示していない）。
【０１０３】
マウスＦ９胎児性癌（Ｆ９ＥＣ）細胞からの抽出物を用いて行うゲル遅延アッセイにより、ＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性に対するこれらの抗血清の効果を調べた。ＤＰ−１が、Ｆ９ＥＣ細胞抽出物中のＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性の通常の、おそらく普遍的な成分であることが、以前の研究で示されており（Girlingら,1993; Bandaraら, 1993）、その一例を、図１３（トラック１〜４）に示す。抗Ｅ２Ｆ−５血清は共にＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性を阻害したが、この効果は、相同性ペプチドの存在下では明らかでないため（図１３、トラック５〜１２）、特異的なものである。抗Ｅ２Ｆ−５はＤＮＡ結合活性の有意な減少を引き起こすが、この効果は、抗ＤＰ−１により生じるものほど顕著でないことは明らかである（図１３、トラック１〜４と５〜１２とを比較されたし）。これは、Ｆ９ＥＣ細胞抽出物中のＤＰ−１／Ｅ２Ｆヘテロ二量体の亜集団中にＥ２Ｆ−５が存在するためと考えられ、ＤＰ−１で観察されるものと対照的である。
【０１０４】
Ｅ２Ｆ−５のＤＮＡ結合特性
Ｅ２Ｆ−５のＤＮＡ結合特性を調べるために、本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ精製した。Ｅ２Ｆ−１は、単独でアッセイした場合には、有意なＤＮＡ結合活性を有していたが（図１４、トラック１〜４を比較されたし）、既に得られている結果（Bandaraら,1993）と一致して、ＧＳＴ−ＤＰ−１は、Ｅ２Ｆ部位に対する結合においてＧＳＴ−Ｅ２Ｆ−１と協同作用した。これに対して、Ｅ２Ｆ−５は単独では、ＤＮＡ結合活性はほとんど検出できなかった（図１４、トラック５〜７）。しかしながら、Ｅ２Ｆ−５とＤＰ−１との間の協同作用は、Ｅ２Ｆ−１とＤＰ−１との間のものよりも相当大きかった（図１３、トラック８〜１０）。したがって、Ｅ２Ｆ−５とＤＰ−１とはＤＮＡ結合活性について協同作用する。
【０１０５】
Ｅ２Ｆ−５ＲＮＡのレベル
本発明者らは、種々の細胞系でＥ２Ｆ−５ＲＮＡのレベルを測定し、さらに、Ｅ２Ｆ−５レベルとＥ２Ｆファミリーの他のメンバーとを比較することに関心があった。このために、種々の白血病細胞系およびＦ９ＥＣ細胞の非同時培養物からＲＮＡを調製し、ノーザンブロッティングによりＥ２Ｆ−５ＲＮＡのレベルを評価した。Ｅ２Ｆ−５ＲＮＡの量は、細胞系によってかなり異なっていた。Ｆ９ＥＣ細胞およびいくつかの白血病細胞系、例えばＤＡＵＤＩおよびＲＡＧＩは、高レベルで発現した（図１５、トラック１、７および８）。これに対して、ＨＬ６０およびＴＦ１は、低レベルのＥ２Ｆ−５ＲＮＡを含有していた（図１５、トラック４および６）。Ｅ２Ｆ−５ＲＮＡレベルのこのプロフィールは、Ｅ２Ｆ−１のレベルとかなり異なっていた。例えば、Ｋ５６２、ＨＬ６０およびＴＦ１細胞には、Ｅ２Ｆ−５と比べて、有意なレベルのＥ２Ｆ−１ＲＮＡが存在していた（図１５、トラック３、４および６）。ＥＬ４細胞では、明らかにこの逆であり、Ｅ２Ｆ−５レベルが高く、Ｅ２Ｆ−１が低かった（図１５、トラック１０）。Ｅ２Ｆ−５ＲＮＡレベルは細胞型に影響され、Ｅ２Ｆ−５とＥ２Ｆ−１との間のＲＮＡレベルには相関性がほとんどないと、本発明者らは結論する。
考察
Ｅ２Ｆ−５およびＥ２Ｆ−４は、Ｅ２Ｆタンパク質のサブファミリーである
本発明者らは、Ｅ２Ｆタンパク質ファミリーの第５のメンバーであるＥ２Ｆ−５の単離および特徴づけを報告する。潜在的ロイシンジップ、マークトボックス（marked box）およびポケットタンパク質結合領域などの、Ｅ２Ｆ−５中のドメインの多くは、Ｅ２Ｆファミリーの他のメンバーと保存されているが、ＤＮＡ結合ドメインの外のＮ末端配列が欠けていることは、Ｅ２Ｆ−４と同様の構造的構成を示すものである（Beijersbergenら, 1994; Ginsbergら, 1994）。Ｅ２Ｆファミリーの残りのメンバー、すなわちＥ２Ｆ−１、−２および−３は、伸長したＮ−末端を有し、その内部に、サイクリンＡと相互作用する能力を有するドメインが存在する（Krekら, 1994）。このドメインの役割は、サイクリンＡ／ｃｄｋ２キナーゼをＤＰ−１／Ｅ２Ｆヘテロ二量体へリクルートすることであり、ついでそれは、ＤＰ−１のリン酸化を引き起こし、その機能的影響は、ＤＰ−１／Ｅ２Ｆヘテロ二量体のＤＮＡ結合活性の減少であると示唆されている（Krekら, 1994）。そのような機構は、細胞周期進行のより後期におけるＥ２Ｆ部位依存性遺伝子の転写活性の調節に重要かもしれない。Ｅ２Ｆ−５（およびＥ２Ｆ−４）中にサイクリンＡ結合ドメインが存在しないことは、Ｅ２Ｆ−５／ＤＰ−１ヘテロ二量体のＤＮＡ結合活性が、他の機構によりダウンレギュレーションされうることを示唆する。確かに、これが達成される可能なシナリオは、ｐ１０７および／またはｐ１３０タンパク質によるものであろう。なぜなら、これらのタンパク質のスペーサー領域は、サイクリンＡ／ｃｄｋ２複合体またはサイクリンＥ／ｃｄｋ２複合体のいずれかに結合しうるからである（Leesら, 1993; Cobrinikら, 1993; Hannonら, 1993; Liら, 1993）。これらのポケットタンパク質が、サイクリンＡ結合Ｅ２Ｆファミリーメンバーの役割を代替し、サイクリン／ｃｄｋ複合体をＤＰ／Ｅ２Ｆヘテロ二量体へリクルートしている可能性がある。
【０１０６】
Ｅ２Ｆ−５のタンパク質配列をＥ２Ｆファミリーの他のメンバーのものと比較すると、Ｅ２Ｆ−１、−２および−３よりもＥ２Ｆ−４に対する密接な関係が示された。興味深いことに、Ｅ２Ｆ−４は、生理学的条件下でｐ１０７と相互作用する能力を有する該ファミリーの唯一の公知メンバーである（Beijersbergenら, 1994; Ginsbergら, 1994）。本発明者らは、Ｅ２Ｆ−５の転写活性が、ｐＲｂよりもむしろｐ１０７またはｐ１３０により不活性化されうることを示した。しかしながら、これは、ｐ１０７が、ｐＲｂよりもｐ１３０に対して密接な関係を有することを反映しているのかもしれず（Ewenら, 1991; Cobrinikら, 1993; Liら, 1993）、したがって、生理学的相互作用を完全には反映していないのかもしれない。ヒトＥ２Ｆ−５が生理学的条件下でｐ１３０と相互作用することが示されている結果（Hijmansら, 投稿中）は、この考え方と一致する。
【０１０７】
Ｅ２Ｆ−５とＤＰ−１との間の協同作用
ＤＮＡ結合および転写活性において、Ｅ２Ｆ−５はＤＰ−１と協同作用する。この点で、Ｅ２Ｆ−５は、Ｅ２Ｆファミリーの他のメンバーと同様の性質を有する。しかしながら、注目すべき興味深いことは、Ｅ２Ｆ−５とＤＰ−１との間の協同作用が、例えば同等の実験条件でＥ２Ｆ−１とＤＰ−１との間で観察される協同作用よりも、かなり大きいことである（例えば、図１４を参照されたし）。このアッセイが細胞内の機能的特性を反映するのであれば、過剰のＤＰ−１が存在する細胞内環境では、Ｅ２Ｆ−５およびＥ２Ｆ−１が同等に増加した場合、Ｅ２Ｆ−５／ＤＰ−１ＤＮＡ結合活性レベルの方が比較的大きくなると考えられる。さらに、特定のＥ２Ｆ／ＤＰヘテロ二量体にとって好ましい標的遺伝子があれば、ＤＮＡ結合活性のこれらの相違は、転写活性の相違を反映するかもしれない。
【０１０８】
それらの種々のＥ２Ｆタンパク質の細胞周期制御における正確な役割は、未だ確定されていない。しかしながら、それらは、細胞周期進行の異なる時期で標的遺伝子の転写活性を調節すると考えられる。例えば、Ｅ２Ｆ−１、−２および−３がｐＲｂと相互作用することは（Helinら, 1992; Kaelinら, 1992; Ivey-Hoyle ら, 1993; Leesら, 1993）、それらが、Ｇ１を経る細胞周期進行を調節することを示唆する。これに対して、Ｇ１の終わりに向かってｐ１０７はＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆと結合し、そしてＳ期でピークを迎えるが（Shirodkarら, 1992）、ｐ１３０は、細胞周期進行の初期に、ほとんどはＧ０の間に優先的に結合する（Cobrinikら, 1993）。しかしながら、種々の細胞型中のＥ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−５のレベルは、Ｅ２Ｆファミリーメンバーの発現が、細胞周期の時期だけでなく、表現型によっても影響されることを示唆する。細胞は、その細胞周期要件に最も適した、Ｅ２Ｆタンパク質の好ましいサブセットを利用するという可能性がある。
【０１０９】
ここで報告しているＥ２Ｆ−５の分子的および機能的特徴、およびＤＰファミリーメンバーとのその相互作用から示されることは、Ｅ２ＦとＤＰファミリーメンバーとの間の種々のヘテロ二量体が理論的に可能なことである。将来の研究の大きな目標は、細胞周期制御におけるこれらの転写因子のそれぞれの生理学的役割を理解することである。
材料および方法
酵母株、培地および方法
この研究で使用したサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株は、以下のとおりであった：W3031a（Mata ade2-100trp1-1 leu2-3, 112 his3-11 ura3）; CTY10-5d（Matα ade2 trp1-901 leu2-3, 112 his3-200 gal4 gal80 URA3::lexAop-lacZ）およびPCY2（Matαgal14 gal80 URA3::GAL1-lacZ lys2-801 his3-200 trp1-63 leu2 ade2-101 ）およびJZ1（Joossら, 1994; Matα lys2-801 ade2-10 leu2Δ1 trpΔ63 his3Δ200 URA3::lexAop-CYC1-lacZ）。酵母株をＹＰＤまたはＹＮＢ培地中で増殖させ、酢酸リチウム法の改変法により形質転換した。コロニー着色β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ（colony colourβ-galactosidase activity assay）を通常の方法で行った。少なくとも３つの別個の形質転換体について、中期対数期培養物中、個々の形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ活性を定量した。
【０１１０】
ライブラリーＤＮＡ、プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
pPC67は、ＧＡＬ４タンパク質のトランス活性化ドメインをコードする酵母配列の下流と融合した１４.５d.p.c.のＣＤ−１マウス胎児オリゴｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーである（GAD; ChevrayおよびNathans, 1992）。特異的にクローニングしたポリｄＴプライミングｃＤＮＡのλZapII Ｆ９ＥＣライブラリーから、完全なｃＤＮＡクローンを単離した（Scholerら, 1990）。
【０１１１】
プラスミドpTR27は、ポリリンカー配列が伸長しているpBTM116（Bandaraら, 1993）の誘導体であり、pLEX.DP-1、pGAD.E2F-1、p4xWT CYC1およびp4xMT CYC1については、既に記載されている（Bandaraら, 1993）。pLEX(HIS).DP-1は、プラスミドpLEX(HIS)（これは、TRP1がHIS3で置換されているpBTM116の誘導体）中のＤＰ−１（アミノ酸残基５９〜４１０）と完全細菌ＬｅｘＡタンパク質との融合体をコードする。pGAD.E2F-5は、プラスミドpACTII（Durfeeら, 1993）中の酵母ＧＡＬ４タンパク質（７６８〜８８１）の活性化ドメインを有するハイブリッドタンパク質として発現されるＥ２Ｆ−５の完全コーディング配列を含有する。pLEX.E2F-5は、プラスミドpTR27中のＬｅｘＡタンパク質の完全コーディング配列の下流に、ハイブリッドタンパク質として発現されるアミノ酸残基１９８〜３３５のＥ２Ｆ−５コーディング配列を含有する。pLEX.E2F-1は、pTR27中に完全長Ｅ２Ｆ−１（１〜４３７）を担持する。プラスミドpG4（以前はpG4mポリIIと呼ばれていた; Websterら, 1989）は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（１〜１４８）をコードする。プラスミドpGAL4.E2F-5は、pG4中のＧＡＬ４配列の下流で融合した残基１９８〜３３５のＥ２Ｆ−５コーディング配列を含有する。プラスミドpCMVHRb、pCMVHRb△22、pCMV107およびpCMV107ASについては、既に記載されている（ZamanianおよびLa Thangue, 1992; 1993）。
【０１１２】
ライブラリースクリーニング
４０μg pPC67ライブラリーＤＮＡを、４０μg pLEX(HIS).DP-1と共にCTY10-5d中に同時形質転換した。選択寒天プレート上で成長している約４００,０００の形質転換体を、in situ濾紙β−ガラクトシダーゼアッセイによりスクリーニングした。該ライブラリープラスミドをレスキュー(rescue)するために、青色のコロニーを単離し、ヒスチジンの存在下で選択液体培地中で飽和するまで成長させ、pLEX(HIS).DP-1をキュアリングした。選択最少寒天上にレプリカプレーティングした後、β−ガラクトシダーゼについてアッセイした場合に青色を与えないTrp＋His-コロニーからのプラスミドＤＮＡを、E. coli ＨＷ８７中にエレクトロポレーションした。プラスミドを回収し、pLEX(HIS).DP-1または対照プラスミド（pLEX(HIS)）のいずれかでCTY10-5d中に再度形質転換した。pLEX(HIS).DP-1が存在する場合にのみ青色コロニーを与えるTrp＋表現型を付与するプラスミドを、さらなる分析のために選択した。完全長ｃＤＮＡを得るために、該挿入物を切り出し、放射能標識し、これを用いて、λZapII F9ECライブラリーからの約１０５のプラークをスクリーニングし、それから完全長Ｅ２Ｆ−５ｃＤＮＡを単離し、pBluescript中にレスキューした。
【０１１３】
３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクション
既に記載されている通常のリン酸カルシウム沈殿法により（ZamanianおよびLa Thangue, 1992）、トランスフェクションおよびアッセイを行った。内部対照としてのpCMV-βgalに由来するβ−ガラクトシダーゼ活性を、既に記載されているとおりに測定した（ZamanianおよびLa Thangue, 1992）。
【０１１４】
抗血清およびゲル遅延分析
Ｅ２Ｆ−５に由来する２つの異なるペプチド配列に対して産生させたウサギ抗血清（抗−Ｅ２Ｆ−５（１）、抗−Ｅ２Ｆ−５（２）と称する）を調製し、Ｆ９ＥＣ細胞抽出物中のＤＲＴＦ１／Ｅ２ＦＤＮＡ結合活性に対する効果を評価した［既に記載されているとおりに行った（Girlingら,1993）］。Ｅ２Ｆ結合部位は、アデノウイルスＥ２ａプロモーターから取った（La Thangueら, 1990）。相同性（＋）または無関係な（−）ペプチドのいずれかを該ＤＮＡ結合アッセイへ加えて、既に記載されているとおりに（Girlingら, 1993）特異性を評価した。ＤＰ−１のＣ末端配列由来のペプチドに対して、抗ＤＰ−１（２４）抗血清を産生させた。ＧＳＴ融合タンパク質を用いて行うＤＮＡ結合アッセイは、既に記載されているとおりである（Bandaraら, 1993; 1994）。通常の方法により、ＧＳＴ−ＤＰ−１、−Ｅ２Ｆ−１（Bandaraら, 1993）および−Ｅ２Ｆ−５（アミノ酸残基２〜３３５）を発現させ精製した。
【０１１５】
ノーザン分析
通常の方法により、示されている細胞系から調製したＲＮＡ上で、ＲＮＡレベルのノーザン分析を行った。Ｅ２Ｆ−５プローブは、３'非翻訳領域中に伸長する８４０のヌクレオチドを含有していた。Ｅ２Ｆ−１プローブは、ＰＣＲにより調製された遺伝子の完全コーディング配列を含有していた。ＧＡＰＤＨ用のプローブは、内部対照として使用した。
実施例２の参照文献
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【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１Ａ−１】図１A-1はヒトＥ２Ｆ−５の構造を示す図であり、ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１Ａ−２】図１A-2はヒトＥ２Ｆ−５の構造を示す図であり、ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】図１Bは、Ｅ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−４と比較してＥ２Ｆ−５を示す図であり、該保存ドメインの境界をアミノ酸番号で示す。Ｅ２Ｆ−４中のＳＳは、セリンに富むモチーフを示す。
【図２】図２は、ヒト細胞系でのＥ２Ｆ−５の発現パターンを示す図である。  （Ａ）示されているヒト細胞系からの全細胞質ＲＮＡを含有するノーザンブロットを、ヒトＥ２Ｆ−５ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。以下のヒト細胞系からのＲＮＡを使用した：ＣＡＭＡ、ヒト乳がん；Ａ５４９、肺がん；ＭＤＡ、ＭＤＡ−ＭＤ１５７乳がん；ＯＶＣＡＲ、卵巣がん；ＨＳ５７８Ｔ、乳がん；ＬＵＣＹ、卵巣がん；ＨＴ２９、結腸がん；ＣＥＭ、Ｔ−細胞白血病；Ｋ５６２、赤白血病。（Ｂ）ラットα−チューブリンプローブとハイブリッド形成させた同じフィルター。
【図３】図３は、Ｅ２Ｆ−５は、カルボキシル末端トランス活性化ドメインを有することを示す図である。Gal-4-E2F発現ベクター（１μg）および０.２μg pRSV-ルシフェラーゼ（内部対照）の存在下または不存在下、上流のＧａｌ４部位を保持するＣＡＴレポータープラスミド（５μg）で、Ｕ−２ＯＳ細胞をトランスフェクションした。それぞれのサンプルのＣＡＴ活性を、ルシフェラーゼ活性に対して標準化した。トランスフェクションの２日後に、ＣＡＴ活性をアッセイした。ＣＡＴレポーター遺伝子単独に対するGal4-E2Fの活性化倍率を表す。データは、少なくとも３つの独立した実験を２回行った結果を表す。
【図４】図４は、Ｅ２Ｆ−５およびＤＰ−１はトランス活性化で協同することを示す図である。示されているとおり、増加する量のpJ3-E2F-5発現ベクター（１、２または５μg）および１００ngのpCMV-DP-1で、Ｕ２−ＯＳ骨肉腫細胞をトランスフェクションした。それぞれのトランスフェクションでは、２μgのレポーター構築物（E2F4-CAT）および０.２μgのpRSV-ルシフェラーゼを加えた。それぞれのサンプルのＣＡＴ活性を、ルシフェラーゼ活性に対して標準化した。データは、少なくとも３つの独立した実験を２回行った結果を表す。
【図５】図５は、ポケットタンパク質によるＥ２Ｆ−５トランス活性化の阻害を示す図である。５μgのpJ3-E2F-5および１００ngのpCMV-DP-1と、pCMV-Rb（５０および１００ng）、pCMV-RbΔ22（１００ng）、pCMV-p107（５０および１００ng）、pCMVp107DE（１００ng）またはpCMV-HA-p130（５０、１００および５００ng）とを組み合わせて、ＵＳ−ＯＳ細胞をトランスフェクションした。発現プラスミドと共に２μgのE2F4-CATおよび０.２μgのpRSV-ルシフェラーゼで、上記細胞をトランスフェクションした。ルシフェラーゼ内部対照に対して、ＣＡＴ活性を標準化した。E2F4-CATの基準レベル（これを１.０とする）に対する活性化倍率を計算した。データは、少なくとも３つの独立した実験を２回行った結果を表す。
【図６】図６は、一過性にトランスフェクションされたＵ２−ＯＳ細胞中のＥ２Ｆ含有複合体を示す図である。示されているとおり、pRb-p107またはp130発現ベクターの存在下または不存在下、Ｅ２Ｆ−５およびＤＰ−１発現ベクターで、Ｕ２−ＯＳ骨肉腫細胞を一過性にトランスフェクションした。２日後、全細胞抽出物を調製し、コンセンサスＥ２ＦＤＮＡ結合部位を含有する[32Ｐ]−標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションし、ゲル電気泳動に供した。遊離プローブ、Ｅ２Ｆ−５／ＤＰ−１ＤＮＡ複合体およびＥ２Ｆ−５／ポケットタンパク質複合体の位置を示す。
【図７】図７は、Ｅ２Ｆ−５は、in vivoでｐ１３０と優先的に相互作用することを示す図である。ヒトＣＡＭＡ乳がん細胞を[32Ｐ]−オルトホスファートで標識し、非イオン性デタージェントライゼートを逐次免疫沈降法に供した。第１の免疫沈降法では、ライゼートを、示されているとおり、ｐＲｂ、ｐ１０７またはｐ１３０抗体と共にインキュベーションした。パネルＡは、ＣＡＭＡ細胞からのｐＲｂ−ｐ１０７およびｐ１３０特異的抗体による第１の免疫沈降法を示す。ｐＲｂ、ｐ１０７およびｐ１３０結合タンパク質を、ＳＤＳ含有緩衝液中で煮沸することにより、その免疫沈降したポケットタンパク質から遊離させ、Ｅ２Ｆ−５特異的抗血清で再度免疫沈降させた（パネルＢ）。対照として、ｐＲｂおよびｐ１０７免疫沈降物から遊離したタンパク質を、抗Ｅ２Ｆ−１（ＫＨ２０）またはＥ２Ｆ−４（ＲＫ１３）抗体で再度免疫沈降させた（パネルＣ）。免疫沈降したタンパク質を７.５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、該ゲルを乾燥し、タンパク質をオートラジオグラフィーで検出した。
【図８】図８は、マウスＥ２Ｆ−５を単離するための戦略を示す図である。「餌」となるLEXA DP-1を使用して、１４.５d.p.c.のマウス胎児活性化ドメイン標識（tagged）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【図９Ａ−１】図９A-1は、マウスＥ２Ｆ−５の配列およびＥ２Ｆファミリーの他のメンバーとの比較を示す図であり、Ｅ２Ｆ−５のヌクレオチド配列および推定アミノ酸残基配列を示す図である。
【図９Ａ−２】図９A-2は、マウスＥ２Ｆ−５の配列およびＥ２Ｆファミリーの他のメンバーとの比較を示す図であり、Ｅ２Ｆ−５のヌクレオチド配列および推定アミノ酸残基配列を示す図である。
【図９Ｂ】図９Bは、Ｅ２Ｆ−５（中段）を、Ｅ２Ｆ−１（上段）およびＥ２Ｆ−４（下段）と比較して示す図であり、Ｅ２Ｆ−５とＥ２Ｆ−１との間およびＥ２Ｆ−５とＥ２Ｆ−４との間のタンパク質配列レベルの同一性の割合（％）を示す。Ｅ２Ｆファミリーメンバーの間で共有されているドメインを示す。（Leesら, 1993）
【図９Ｃ】図９Cは、Ｅ２Ｆファミリーメンバー内での保存ドメイン中のアミノ酸残基配列の比較を示す図である。ハイライトが付されている残基はすべてのファミリーメンバーに共通であり、枠で囲まれている残基はＥ２Ｆ−４とＥ２Ｆ−５とで共通である。ロイシンジップ領域中の太字の残基は、７個からなる反復中の疎水性残基を示す。Ｅ２ＦファミリーメンバーとＤＰ−１との間で共有されているＤＥＦボックス領域中の残基を、線により示す。
【図１０】図１０は、酵母におけるＥ２Ｆ−５およびＤＰ−１によるＥ２Ｆ部位依存的転写の活性化を示す図である。  （ａ）レポーターおよびエフェクター構築物の概要  （ｂ）示されているＥ２Ｆ−５およびＤＰ−１発現ベクターを、単独で（レーン２および３）または一緒に（レーン４）、酵母中に形質転換し、４つの野生型Ｅ２Ｆ部位を保持するp4xWT CYC1の活性を評価した。平行実験において、p4xMTCYC1の活性は、いずれの条件においても影響を受けなかった。示しているデータは、３回の読み取りから得たものである。
【図１１】図１１は、酵母におけるＥ２Ｆ−５による転写活性化を示す図である。  （ａ）レポ−ターおよびエフェクター構築物の概要  （ｂ）pLexA-CYC1-lacZの活性をアッセイすることにより、pLEX.E2F-1（トラック２）またはpLEX.E2F-5（トラック３）のいずれかの転写活性を酵母で評価した。示しているデータは、３回の読み取りから得たものである。
【図１２】図１２は、ポケットタンパク質調節Ｅ２Ｆ−５を示す図である。  （ａ）レポーターおよびエフェクター構築物の概要。  （ｂ）野生型ｐＲｂ（トラック３）、ｐＲｂΔ２２（トラック４）、ｐ１０７（トラック５）およびｐ１０７ＡＳ（トラック６）の存在下、Gal-E2F-5（トラック２）の転写活性を評価した。比較のために、ｐＧ４（トラック７〜１０）で同様の処理を行った。示しているデータは、３回の読み取りから得たものである。
【図１３】図１３は、Ｅ２Ｆ−５は、Ｆ９ＥＣ細胞中のＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆの生理学的ＤＮＡ結合成分であることを示す図である。Ｅ２Ｆ−５内の異なる領域からの別個のペプチドに対して産生させた２つのタイプの抗血清がＦ９ＥＣ細胞ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆ ＤＮＡ結合活性に及ぼす効果について評価した。抗Ｅ２Ｆ−５血清、抗ペプチド１（トラック５〜８）および抗ペプチド２（トラック９〜１２）を、相同性（＋；トラック５、７、９および１１）または無関係な（−；トラック６、８、１０および１２）ペプチドのいずれかの存在下で評価した。比較のために、相同性（トラック１および３）または無関係なペプチド（トラック２および４）のいずれかの存在下、抗ＤＰ−１（２４）（トラック１〜４）の効果を評価した。それぞれの対またはトラック（＋および−）は、異なる抗血清調製物での処理を表す。ＤＲＴＦ１／Ｅ２Ｆｂ／ｃＤＮＡ結合複合体（La Thangueら, 1990）について示す。
【図１４】図１４は、Ｅ２Ｆ−５のＤＮＡ結合特性を示す図である。Ｅ２Ｆ−５、Ｅ２Ｆ−１およびＤＰ−１をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、精製し、それらのＤＮＡ結合活性をゲル遅延法により評価した。Ｅ２Ｆ−１またはＥ２Ｆ−５を単独で（それぞれ、トラック１および２、並びに５、６および７）または一定濃度のＤＰ−１（トラック３および４、並びに８、９および１０）と共にアッセイした。トラック１１は、プローブ単独の場合を示す。Ｅ２Ｆ−１として加えたタンパク質は、全体で、約５０ng（トラック１および３）または１００ng（トラック２および４）、Ｅ２Ｆ−５としては２５ng（トラック５および８）、５０ng（トラック６および９）または１００ng（トラック７および１０）、およびＤＰ−１としては５０ngであった。
【図１５】図１５は、Ｅ２Ｆ−５ＲＮＡのレベルを示す図である。示されている細胞系で、Ｅ２Ｆ−５ＲＮＡのレベルをＥ２Ｆ−１と比較した。内部対照として、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡのレベルを評価した。
【図１Ａ−１】
2006340730.tif 000002
【図１Ａ−２】
2006340730.tif 000003
【図１Ｂ】
2006340730.tif 000004
【図２】
2006340730.tif 000005
【図３】
2006340730.tif 000006
【図４】
2006340730.tif 000007
【図５】
2006340730.tif 000008
【図６】
2006340730.tif 000009
【図７】
2006340730.tif 000010
【図８】
2006340730.tif 000011
【図９Ａ−１】
2006340730.tif 000012
【図９Ａ−２】
2006340730.tif 000013
【図９Ｂ】
2006340730.tif 000014
【図９Ｃ】
2006340730.tif 000015
【図１０】
2006340730.tif 000016
【図１１】
2006340730.tif 000017
【図１２】
2006340730.tif 000018
【図１３】
2006340730.tif 000019
【図１４】
2006340730.tif 000020
【図１５】
2006340730.tif 000021
【配列表】
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