(57)【要約】【課題】  発色性ペプチド基質、およびフィブリン重合化阻害剤を含み、凝固−診断試験に用いるために特に好適な発色性試験用試薬の提供。【解決手段】  この試薬は、ａ）発色性ペプチド基質、およびｂ）フィブリン重合化阻害剤を含み、調製物のｐＨが３.０から６.０の間であるものからなる。この試薬は高い安定性および／または液体状態での長期の貯蔵寿命を示すということで特徴づけられる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）発色性ペプチド基質、および
ｂ）フィブリン重合化阻害剤
を含み、調製物のｐＨが３.０から６.０の間である調製物。
【請求項２】
酢酸イオンが存在している、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
存在する発色性ペプチド基質がパラ−ニトロアニリン−共役型ペプチド基質である、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項４】
存在する発色性ペプチド基質が５−アミノ−ニトロ安息香酸−共役型ペプチド基質である、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項５】
トロンビンにより分解される発色性ペプチド基質が存在している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項６】
配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ1の発色性ペプチド基質（式中、Ｒ1は発色基である）が存在する、請求項５に記載の調製物。
【請求項７】
配列Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｒ1の発色性ペプチド基質（式中、Ｍｓｃはメチルスルホニルエチルオキシカルボニルであり、Ｒ1は発色基である）が存在する、請求項５に記載の調製物。
【請求項８】
共通ペプチド配列ＧＰＲＰ−Ｘ−ＮＨ2を有するペプチド（式中、Ｇはアミノ酸のグリシン、Ｐはアミノ酸のＬ−プロリン、Ｒはアミノ酸のＬ−アルギニンおよびＸはアラニンまたはグリシンである）のフィブリン重合化の阻害剤が存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項９】
１つまたはそれ以上の安定化剤がさらに存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１０】
調製物が液体調製物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項１１】
調製物のｐＨがプロトン供与体の添加により３.０から６.０の間の値に調節されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の調製物を製造するための方法。
【請求項１２】
調製物のｐＨが酢酸の添加により３.０から６.０の間の値に調節されている、請求項１１に記載の調製物を製造するための方法。
【請求項１３】
全血または血漿サンプル中の凝固パラメーターを測定するための試験方法における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の調製物の試験用試薬としての使用。
【請求項１４】
全血または血漿サンプル中のトロンビン生成を測定するための試験方法における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の調製物の試験用試薬としての使用。
【請求項１５】
全血または血漿サンプル中の内因性トロンビンポテンシャルを測定するための試験方法における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の調製物の試験用試薬としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固診断試験に用いるために特に好適な、発色性試験用試薬に関連し、この試薬は液体状態で高い安定性および／または長期の貯蔵寿命を示す。
【背景技術】
【０００２】
多くの数の診断用試験が、発色性基質の使用を基礎としている。発色性ペプチド基質は、特異的なオリゴペプチドまたはポリペプチド部分および発色基（色素担体）部分から構成されており、プロテアーゼ活性を有する因子の測定のため、例えば、血液および血漿サンプル中の凝固因子の測定のために、日常的に使用されている。発色性ペプチド基質は、最初は無色であり、サンプル中に存在するタンパク分解性因子の量または活性に依存して、開裂され、それにより発色基が遊離し、次いで分光学的に計測できるようになる。欧州特許公開公報ＥＰ３４１２２Ａ１および米国特許公報ＵＳ４,５０８,６４４には、多数の発色性ペプチド基質およびその診断試験での使用、例えば、凝固因子である凝固第ＩＩａ因子（トロンビン）および凝固第Ｘａ因子を測定するための使用が記載されている。欧州特許公開公報ＥＰ７８７６４Ａ１には凝固第ＸＩＩａ因子の測定のための発色性方法が記載されている。
【０００３】
パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）または５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ＡＮＢＡ）は、その黄色呈色がλ＝４０５ｎｍの波長で計測することができ、特に頻繁に用いられる発色団である。
【０００４】
凝固診断において、血液または血漿サンプル中の酵素的に活性な因子の活性測定は、通常可能なかぎり生理的な条件下で行われる。試験アッセイ系において、約７.４の生理的なｐＨが保持されていることを確かめることが特に重要である。この試験アッセイ系におけるあらゆるｐＨの変動を防止するために、血液または血漿サンプルと混合させる試験物質は、通常中性から弱アルカリ性ｐＨを有する緩衝液中に溶解される。
【０００５】
しかしながら、そうした試験デザインの欠点は、中性からアルカリ性の媒体中で、いくつかの試験成分の安定性が減少することである。例えば、ｐＮＡはｐＨが＞６.０において、より速やかに分解されてしまう。その結果のこのｐＮＡ基質溶液の黄色の呈色は、この溶液のさらなる使用、またはこの試験の信頼できる評価を不可能にする。このため、通常は、このｐＮＡ基質は長期保存のために凍結乾燥し、そして必要なときにのみ中性液体に溶解する。溶液中でｐＮＡ基質が分解することを防止するために、この基質溶液のｐＨを酸性の値に調整することが知られている。
【０００６】
各種の発色性凝固試験の場合は、血液凝固カスケードを活性化し、それによりトロンビンを生成するか、または、直接にこの試験アッセイ系にトロンビンを加えることが必要であり、また一方、それと同時に、サンプルの光度測定を妨害する濁りを避けるために、フィブリン塊の生成を防止する必要がある。このため、例えば、この試験アッセイ系で、フィブリン重合化の阻害剤を用いることが考えられる。これらの阻害剤は、しばしばオリゴペプチドであるが、凝固阻害剤と呼ばれており、トロンビンの作用下で生成するフィブリン単量体の重合化を抑制し、それにより塊形成を防止する（例えば、欧州特許公報ＥＰ０４５６１５２Ｂ１を参照）。
【０００７】
試験方法に必要な構成成分を提供する試薬の開発の際に、簡単な操作および可能なかぎりの長期の貯蔵寿命が、考慮に入れるべき基準の一部となる。凍結乾燥成分を使用者が再構成する場合に、試験方法全体の品質に負の影響を与えうるエラーが生じる可能性があるために、特に好ましいのは、長期にわたって安定な液体試薬の調製物である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、特に液体状態で、長期にわたって安定であり、そして発色性ペプチド基質および凝固阻害剤の両方を含み、それにより、測光法的に測定される発色性凝固試験で使用するためには特に好適な試薬を提供する目的に基づいている。
【０００９】
この目的は、特許請求の範囲に記載されている本発明に従った方法および物品を提供することによって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、本質的に、発色性ペプチド基質およびフィブリン重合化の阻害剤を含有し、そしてそのｐＨが３.０から６.０の間、好ましくは４.０から５.０の間であることによってさらに特徴付けられる調製物に関している。特に好ましい実施態様において、この試薬のｐＨは４.６±０.１である。
【００１１】
ｐＨを調整するために、プロトン供与体、すなわち、酸またはそれらの塩を、この液体水性調製物に添加する。無機もしくは有機の酸またはプロトン供与体を使用することが可能である。安定なｐＨを保持するため、および、例えば、二酸化炭素によるあらゆるアルカリ化を防止するために、適切な緩衝系が必要になりうる。
【００１２】
本発明による調製物の特に好ましい実施態様は、酢酸イオン（ＣＨ3ＣＯＯ-）を含んでいる。それゆえに、本発明は、また、試験用試薬の製造方法にも関しており、その中で発色性ペプチド基質およびフィブリン重合化の阻害剤が組み合わされ、そしてこの試薬のｐＨは、酢酸を用いて、３.０から６.０の間に、好ましくは４.０から５.０の間に、特に好ましくは、４.６±０.１の値に調整される。
【００１３】
驚くべきことに、液体状態の本発明の調製物はより安定であり、液体または凍結乾燥状態で中性ｐＨを有する同等の調製物と比べて、それによりさらに長期の貯蔵が可能となる。
【００１４】
本発明による液体状態の調製物は、６０週間にわたる期間において、貯蔵温度の４℃において、初期値から１０％以下の測定値の変動を示すことが観察された。この初期値は、この調製物が製造された日に、適切な試験方法の試験用試薬としてのこの調製物を用いて測定した時の、測定値、または試験結果として理解されるべきである。例えば、ＥＴＰ試験（欧州特許公報ＥＰ０４２０３３２Ｂ１、または下記の実施例２を参照されたい）は、例えば、トロンビンにより開裂される発色性ペプチド基質を含む試薬の安定性を測定するための方法として用いるために好適である。
【００１５】
本発明の意味の中で、発色性ペプチド基質は、発色基、すなわち開裂離脱が可能な発色もしくは蛍光基と共役している特異的なオリゴペプチドまたはポリペプチド部分から構成され、この発色基は、ペプチド基質から開裂された後、開裂前の発色性ペプチド基質とは異なった光学特性を示し、そして、それは吸収分光光度計または蛍光分光光度計を用いて測定できる。ペプチド基質に共役される発色基の例には、パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ＡＮＢＡ）、７−アミノ−４−メトキシクマリン（ＡＭＣ）、キノニルアミド（ＱＵＡ）、５−アミノイソフタル酸ジメチル（ＤＰＡ）およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００１６】
発色性ペプチド基質のオリゴペプチドまたはポリペプチド部分は、多数の基質から選択することができ、それらは当業者に周知であり、血液凝固第Ｘ／Ｘａ因子またはトロンビンのような血液凝固因子により開裂される。好ましい実施態様では、この試薬は、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ1または配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ1（ここでＲ1は発色基である）を有するペプチド基質のような、トロンビンにより認識され次いで変換される発色性ペプチド基質を含んでいる。トロンビンにより認識され次いで変換される、特に好ましいペプチド基質は、例えば、ｐＮＡと共役したペプチド基質Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Pefachrome(R)TG、ペンタファーム社、バーゼル、スイス）または、ＡＭＣと共役したペプチド基質Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（バーヘム社）である。トロンビンにより開裂される他の適切なペプチド基質は、一般式Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｒ1で表されるものであって、ここでＭｓｃはメチルスルホニルエチルオキシカルボニル、Ｖａｌはアミノ酸のバリン、およびＸａａはアミノ酸残基を表し、そのペプチド骨格から少なくとも炭素原子二個で分離されている末端グアニジノ基またはウレイド基を含み、ここでＲ1は発色基であり、特に好ましいのはペプチドＭｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｒ1またはＭｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡである（欧州特許公報ＥＰ０８０２９８６Ｂ１）。異なったプロテアーゼに特異性を有する発色性ペプチド基質の他の例は、例えば、米国特許公報ＵＳ４,５０８,６４４で見つけることができる。
【００１７】
好ましい実施態様において、この調製物はさらに１つまたはそれ以上の安定化剤、例えば、ウシ血清アルブミン、カオトロピック塩類、シャペロン類およびシャペロン様物質、デキストランならびに他の糖類を含有してもいい。
【００１８】
適切なフィブリン重合化の阻害剤はペプチド、特に好ましくは、共通したペプチド配列ＧＰＲＰ−Ｘ−ＮＨ2を有するペプチドであって、ここでＧはアミノ酸のグリシン、Ｐはアミノ酸のＬ−プロリン、Ｒはアミノ酸のＬ−アルギニンおよびＸはアラニンまたはグリシンである（欧州特許公報ＥＰ０４５６１５２Ｂ１参照）。
【００１９】
本発明はまた、全血または血漿サンプル中の凝固パラメーターを測定するための試験方法において、本発明による調製物を試験用試薬として使用することに関している。ヒトまたは動物起源の全血または血漿が適切なサンプル材料である。ＥＤＴＡおよび／またはクエン酸塩が添加されることがある血小板に富むまたは血小板に乏しい血漿が特に適切である。
【００２０】
好ましいのは、本発明による調製物を、血液または血漿中のトロンビン生成を測定するための試験方法において試験用試薬として用いることである。これらの試験方法の例は、欧州特許公開公報ＥＰ１３６７１３５Ａ１および欧州特許公報ＥＰ０４２０３３２Ｂ１に記載されている。特に好ましいのは、本発明による試薬を、トロンビン生成曲線から計算できる、または、発色性トロンビン基質〔欧州特許公報ＥＰ０４２０３３２Ｂ１、ＥＰ０８０２９８６Ｂ１、およびHemker等 (1993) Thromb. Haemostatis 70: 617-624を参照する〕の測定された変換反応速度から誘導できる、内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）および他の凝固パラメーターを測定するための試験方法において試験用試薬として用いることである。
【００２１】
さらに好ましいのは、本発明による調製物を、例えば、欧州特許公開公報ＥＰ００１４０３９Ａ１に記載された、発色性プロトロンビン時間（ＰＴ）凝固試験のような、凝固時間を測定するための発色性試験において、試験用試薬として用いることである。
【００２２】
本発明はまた、発色性試験方法を実施するための試験キットにも関しており、この試験キットは、発色性ペプチド基質およびフィブリン重合化の阻害剤を含み、そして、ｐＨが３.０から６.０の間である、少なくとも１つの調製物を含んでいる。この調製物は、液体試薬として、または、水もしくは緩衝液中で再構成できる凍結乾燥物として提供できる。凝固診断試験方法において使用するための好ましい試験キットは、さらに、１つまたはそれ以上の凝固活性化剤を含んでいる。例えば、トロンビン生成を誘導するために、この試験キットは、例えば、Ｃａ2+イオン、トロンボプラスチン、または、カオリン、リン脂質類、ヘビ毒もしくはトロンボモジュリンのような接触活性化剤、および活性化プロテインＣを含んでもいい。
【００２３】
以下の実施例は本発明を説明するためであって、制限するものとして理解されるべきではない。
【００２４】
〔実施例〕
実施例１：本発明の試薬の調製
本発明による、トロンビン活性を測定するための方法で使用するために適している試験用試薬の調製のために、発色性トロンビン基質としての凍結乾燥したＨ−β−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＡｃＯＨ（Pefachrome(R)、ペンタファーム社、バーゼル、スイス）、凝固阻害剤としての凍結乾燥したＨ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2（トリフルオロ酢酸塩として）、ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミンおよびデキストランを脱ミネラル水に溶解し、この溶液のｐＨを酢酸で４.６±０.１の値に調節した。この試薬は最終的に密閉可能な試薬容器に移し、そして液体状態で貯蔵した。
【００２５】
比較の目的で中性ｐＨの試薬を調製した。このために、発色性トロンビン基質として凍結乾燥したＭｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌ（ネオシステムグループＳＮＰＥ、ストラスブルグ、フランス）、凝固阻害剤として凍結乾燥したＨ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2（トリフルオロ酢酸塩として）、ＮａＣｌ、トリス／ＨＣｌ、ウシ血清アルブミンおよびデキストランを脱塩水に溶解し、この溶液のｐＨを７.４に調節した。この中性試薬の一部分を密閉可能な試薬容器に移し、そして液体状態で貯蔵し、一方他の部分は凍結乾燥用容器に移し、凍結乾燥しそして凍結乾燥物として保存した。
【００２６】
実施例２：本発明による試薬の、異なった条件下での長期保存後の、内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）測定のための試験方法における使用
本発明の酸性液体試薬の安定性を試験するために、この試薬の一部分を、９６週間まで、４℃、室温（ＲＴ、１５〜２５℃）、または、３７℃で保存し、そして、種々の保存期間後に、ＥＴＰ試験において使用した。同様の手順を、２つの中性の対照用試薬調製物を用いて行った。
【００２７】
低温で凍結していた血小板に乏しいヒト血漿（正常血漿プール）のバッチの一部分を、それぞれの試験の時点で解凍し、全ての実験においてサンプル材料として用いた。
【００２８】
本発明による酸性試薬を、以下の手順でのＥＴＰ試験を行うために用いた：
最初に血漿１３５μＬと緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４）の４０μＬとを混合した。本発明による試薬の４０μＬを次に加えた。７分間のインキュベーションの後、トロンビン生成を活性化するために、ＣａＣｌ2（２５０ｍＭ）の１５μＬ、および、Innovin(R)（組換えヒト組織因子および合成リン脂質類の混合物；デード・ベーリング・マールブルグ社、マールブルグ、ドイツ）の３０μＬを、混合液の中に添加した。試験混合物の吸光度を、λ＝４０５ｎｍの波長で、連続して２０分間にわたって測定した。このようにして測定された発色性トロンビン基質の変換反応速度を次に、ドイツ国特許出願ＤＥ１０２００４０５９０５５.９に記載された解析方法を用いて、サンプルのＥＴＰ値を測定するために用いた。
【００２９】
試薬とサンプルの混合、吸光度の測定、およびＥＴＰ値の自動測定は、ＢＣＳ(R)凝固
分析機（デード・ベーリング・マールブルグ社、マールブルグ、ドイツ）を用いて、完全自動式で行った。
【００３０】
中性対照用試薬を、以下の手順でのＥＴＰ試験を行うために用いた（欧州特許公報ＥＰ０４２０３３２Ｂ１も参照する）：
凍結乾燥試薬を脱ミネラル水を用いて、それぞれの試験の時点で、用時に溶解した。血漿２００μＬと、液体中性試薬の８０μＬ、または、用時に再構成した凍結乾燥試薬の８０μＬとを混合した。７分間のインキュベーションの後、ＣａＣｌ2（２５０ｍＭ）の３０μＬ、および、Innovin(R)（デード・ベーリング・マールブルグ社、マールブルグ、ドイツ）の６０μＬを、トロンビン生成の活性化のために、混合液の中に添加した。吸光度の計測およびＥＴＰ値の測定は、上記のように行った。
【００３１】
試験結果を、図１〜３に、試薬を、それぞれ異なった貯蔵温度、４℃（図１）、室温（１５〜２５℃）（図２）および３７℃（図３）で、それぞれ保存した期間に従ってプロットした。
【００３２】
これらの図から理解できるように、本発明による試薬調製物は、６０週間にわたって高い安定性を示した。全ての貯蔵温度において、およびそれぞれの時点において、ｔ＝０の時点（調製日）で測定した初期値からの最大の差異は１０％より著しく少なく、ほとんどの部分で５％より少なかった。４℃で６０週間貯蔵した後、凍結乾燥した中性試薬調製物は、初期値からの測定値の差異が１０％以上を示し、そして、さらに高い温度（３７℃）では、４週間後で既に１５％までの差異があった。液体の中性試薬調製物では、全ての貯蔵温度において２０％を超えるまでの非常に大きな変動を示し、それゆえに不安定である。液体中性試薬の貯蔵期間は１日またはせいぜい２日間に制限される。
【００３３】
表１は、異なった保存条件による異なった試薬調製物の時点ｔ0で最初に測定されたそれぞれの値からの、差異パーセントを列記している。この異なった試薬調製物は、それぞれ、２から８℃、室温、または、３７℃で、９６週間にわたって貯蔵された。２から８℃での貯蔵温度では、本発明による調製物（液体、ｐＨ４.６）を用いて測定した測定値は、全期間を通して５％を超える差異はみられなかった。試験した全ての貯蔵温度において、酸性液体調製物は、最も小さな差異を示し、したがって最も高い安定性を示した。中性液体調製物（液体、ｐＨ７.４）の場合は、室温でまたは３７℃で、貯蔵期間が長くなるに従って、黄色が濃くなっていく様子が見られた。
【００３４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明による酸性液体調製物（ｐＨ４.６）または中性調製物（ｐＨ７.４）を用いて得られた＋４℃での調製物の保存試験結果（絶対的測定値）を示すプロットである。
【図２】本発明による酸性液体調製物（ｐＨ４.６）または中性調製物（ｐＨ７.４）を用いて得られた室温での調製物の保存試験結果（絶対的測定値）を示すプロットである。
【図３】本発明による酸性液体調製物（ｐＨ４.６）または中性調製物（ｐＨ７.４）を用いて得られた＋３７℃での調製物の保存試験結果（絶対的測定値）を示すプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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