(57)【要約】【課題】リガンドを高密度に固定化でき、さらには、高感度化および非特異的吸着が起こりにくいセンサーチップを提供する。【解決手段】センサーチップの表面を、カチオン性セグメントを有するブロックコポリマーで被覆し、さらにアニオン性高分子を結合することにより、残存する正電荷を遮蔽し、非特異吸着を低減した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサーチップ表面を被覆している親水性ポリマーが、式
【化１】
2006208352.tif 000003
［式中、Ｒ１は、水素原子、官能基、保護された官能基またはリガンドを表し、Ｌ１、Ｌ２は、相互に独立した連結基または原子価結合を表し、Ｘは、モノ−、もしくはジ−低級アルキル置換アミノ基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー、複数のイミノ基を主鎖に有するオリゴまたはポリイミンよりなる群から選ばれるモノマー単位を含むポリマーのセグメントである］で表されるカチオン性セグメントを有するブロックコポリマー誘導体の１種または２種以上であって、当該ブロックコポリマーにより被覆されたセンサーチップ表面を、さらにその正電荷を遮蔽するためにアニオン性高分子で被覆することを特徴とするセンサーチップ表面。
【請求項２】
請求項１記載のアニオン性高分子が、アニオン性官能基とセンサーチップ表面のカチオン性ブロックとのイオン結合、共有結合、水素結合、配位結合、または物理的相互作用のいずれかの相互作用により、センサーチップ上に固定化されていることを特徴とする請求項１記載のセンサーチップ表面。
【請求項３】
アニオン性高分子がカルボキシル基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ホウ酸基よりなる群から選ばれる官能基を含む物質であることを特徴とする請求項１，２に記載のセンサーチップ表面。
【請求項４】
アニオン性高分子が、ポリ（メタ）アクリル酸、カルボキシビニルポリマー、酸性アミノ酸を有するポリペプチドまたは合成高分子、酸性多糖類、核酸類よりなる群から選ばれる物質である請求項１〜３に記載のセンサーチップ。
【請求項５】
請求項１〜４記載のアニオン性高分子が、該高分子のアニオン性官能基、または該高分子内に化学的に導入された、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボニル基、エポキシ基、ビニル基、チオール基、マレイミド基、スクシニル基、リン酸基、及びイミダゾール基、並びにその誘導体よりなる群から選ばれる残基を介して、被検物質と特異的結合可能なリガンドを固定化できることを特徴とするセンサーチップ表面。
【請求項６】
請求項１〜７記載のセンサーチップの支持体が、金であることを特徴とするセンサーチップ表面。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のセンサーチップを用いることを特徴とする、生体物質の検出定量方法。
【請求項８】
表面プラズモン共鳴、水晶振動子、化学発光、電気化学発光のいずれかを用いる請求項７記載の生体物質の検出定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、バイオセンサーにおいて用い得る、センサーチップに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】バイオセンサーは、例えば、生物学的な試料を検体とした、特定の被検物質の検出に適しており、現在、様々なバイオセンサーが提案されている。【０００３】主要なバイオセンサの一つとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用するバイオセンサ（以下、ＳＰＲセンサーともいう）が提供されている。このＳＰＲセンサーは、プリズムの底面に金や銀等の金属薄膜を形成し、金属薄膜の裏面からレーザーなどの光を、入射角度を変えながら入射して、その反射光を測定し、金属表面プラズモンと共鳴して吸収される、特定入射角度の光を指標として、当該金属表面で起きている、抗原抗体反応等の反応を検出することが可能なバイオセンサであり、金属薄膜の表面およびその近傍における屈折率の変化に対して鋭敏であることが知られている（例えば、Ａ．Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｎｃｔ．Ｂｉｏｌ．５，６９９−７０５（１９９５））。【０００４】また、ＳＰＲセンサーでは、センサーチップ表面と複雑な生物学的溶液との間で生じる過程の、リアルタイムでの観察が可能である。よって、ＳＰＲセンサーでは、標識を使用することなく、経時的、かつ、連続的に被検物質のデータを入手することが容易であり、動力学的および熱力学的なパラメーターを取得するのに適している。【０００５】このようなバイオセンサーの検出感度向上のため、センサーチップの表面設計を行うことは非常に重要である。特にセンサーチップ表面にリガンドと特異的に結合する物質以外の物質が非特異的に吸着しないことが重要である。【０００６】従来、リガンド特異的に結合する物質以外の物質が該表面に非特異的に吸着することによる感度の低下を軽減するため、アルブミンやカゼイン等のブロッキング剤により、センサーチップ表面を覆う必要があった。しかし、ブロッキング操作を施しても、完全にチップ表面への吸着を防ぐことは難しく、ブロッキング剤への非特異的吸着が無視できないこと、さらに、ブロッキング操作があらかじめ固定化してあったリガンドに影響を与えることなどから、さらに高性能の表面処理技術が望まれている。【０００７】  後述する本発明に関連する先行文献として、例えば、以下に掲げる文献が挙げられる。
１．特開２００４−２２６３８１号公報（特許文献１）
特許文献１には、センサーチップの表面の支持体と結合可能な官能基を有するモノマー単位とポリアルキレンオキシド誘導体を含むブロックポリマーを用いて、非特異吸着を低減する方法が公開されている。【０００８】  上記、特許文献の方法では、カチオン性セグメントを有するポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと略記）ブロック共重合体により、アニオンに帯電したセンサーチップ表面上をイオン的相互作用によって被覆し、ＰＥＧ鎖をブラシ状に固定することにより、非特異吸着を大幅に軽減することが出来た。【０００９】  ２．特願２００２−６５２９８（特許文献２）
ＰＥＧブロック共重合体単独で用いると、ＰＥＧ分子間の間隙に非特異的な吸着が生ずる場合があるため、固定化されたＰＥＧブラシの間隙をさらに鎖長の異なるＰＥＧ誘導体で被覆することにより、さらなる非特異吸着の軽減を達成している。【００１０】このように、バイオセンサーの検出感度を向上させることを目的とした、センサーチップに関する検討は、バイオセンサーの検出感度の、さらなる向上を目指してなされており、依然として、この課題が、バイオセンサーの分野においては重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】バイオセンサにおいて用いるチップにおける共通の課題の一つとして、バイオセンサーの検出感度の向上が挙げられる。【００１２】  従来のセンサーチップ表面には、リガンドに特異的に結合する物質以外の物質も非特異的に吸着してしまうため、高感度で、再現性に優れた検出をすることができなかった。【００１３】  従って本発明の課題は、従来技術の問題点を解消するため、機能性分子を高密度に固定化でき、さらに、非特異的吸着が起こりにくいセンサーチップを提供することにある。加えて、このセンサーチップにリガンドとしてタンパク質やＤＮＡを固定化して、プロテインチップあるいはＤＮＡチップとして提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】  本発明者らは、この課題を解決するために、非特異的な反応が抑制され得るセンサーチップの表面処理法について検討を行った。そして、その具体的な方策として、ブラシ構造に該当するブロックと、チップ表面に結合するカチオン性ブロックを有するブロックポリマー誘導体を用いてチップ表面を処理した後、結合したカチオン性ブロックの影響で、若干表面が正に帯電することに着目し、残存する正電荷をアニオン性の高分子で被覆して中和することにより、非特異的な反応を一層抑制することが可能ではないか、と考えた。また、アニオン性高分子の残存アニオンを介して、被検物質と特異的結合能を有するリガンドを固定化することが可能であることを見いだし、本発明を完成した。【００１５】すなわち、本発明は、センサーチップ表面に固定化されている親水性ポリマーが、式
【化１】
2006208352.tif 000002
［式中、Ｒ１は、水素原子、官能基、保護された官能基またはリガンドを表し、Ｌ１、Ｌ２は、相互に独立した連結基または原子価結合を表し、Ｘは、モノ−、もしくはジ−低級アルキル置換アミノ基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー、複数のイミノ基を主鎖に有するオリゴまたはポリイミンよりなる群から選ばれるモノマー単位を含むポリマーのセグメントである］で表されるカチオン性セグメントを有するブロックコポリマー誘導体の１種または２種以上の時、当該ブロックコポリマーにより被覆されたセンサーチップ表面を、さらにアニオン性の高分子で被覆することにより、その正電荷を遮蔽するを特徴とするセンサーチップ表面である。【００１６】  すなわち本発明により、非特異吸着を著しく低減し、高感度に検出定量することを特徴とするセンサーチップが提供される。【００１７】また、上記発明の好ましい態様により、被覆に使用されるアニオン性高分子は、予め被覆されたＰＥＧを含むブロックポリマーのカチオン性残基と結合し得る、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ホウ酸基よりなる群から選ばれる官能基ポリ（メタ）アクリル酸、カルボキシビニルポリマー、酸性アミノ酸を有するポリペプチド、または合成高分子、酸性多糖類、核酸類よりなる群から選ばれる物質である上記センサーチップが提供される。【００１８】また、上記発明の好ましい態様により、被覆に使用されるアニオン性高分子が、リガンドを結合し得る部位として、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボニル基、エポキシ基、ビニル基、チオール基、マレイミド基、スクシニル基、リン酸基、及びイミダゾール基、並びにその誘導体よりなる群から選ばれる残基である上記センサーチップが提供される。【００１９】本発明に用いられるセンサーは、チップ表面での分子間相互作用によって生ずる変化を検出ことが可能なセンサーであれば、特に限定されるものではなく、紫外可視分光、蛍光、化学発光、電気化学発光、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、水晶振動子（ＱＣＭ）等を挙げることができ、特に、化学発光、電気化学発光、ＳＰＲ、ＱＣＭを用いるバイオセンサーにおける検出に用いるのが好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】本発明のセンサーチップは、その表面上で生ずる相互作用に伴う物理的あるいは化学的変化を検出する際に使用されるものであり、特に限定はされないが、表面プラズモン波を誘起する金、銀、銅等の金属、およびそれらの合金、酸化物、電気化学的に検出可能な電極、あるいはＱＣＭセンサーに用いられる水晶発振子等が好適である。【００２１】一般に負に帯電したこれらのセンサーチップ表面に対し、前記カチオン性セグメントを有する親水性ブロックポリマーの被覆層を形成する。【００２２】この表面に結合したカチオンセグメントに対し、アニオン性高分子を結合させることにより、残存する正電荷を相殺して、より高い非特異吸着抑制効果を付与することができる。この場合の結合形態には特に制限はなく、イオン結合、共有結合、配位結合、水素結合等により、センサーチップ上に被覆される。【００２３】アニオン性高分子については、カチオンセグメントと結合可能は官能基を有していれば特に制限はなく、具体例としては、ポリ（メタ）アクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリスチレンスルホン酸等の合成高分子、核酸類、ヘパリン、カラギーナン、フコダイン、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、フコダイン、アラビアゴム、アルギン酸等に代表される酸性多糖類、および核酸等が挙げられる。中でも、入手しやすく、取り扱いが容易であることから、ポリ（メタ）アクリル酸、カラギーナン、アルギン酸、および、脂肪酸の群よりなる高分子物質から、選択することが望ましい。これらの高分子物質は、単独で用いても、２種以上組み合わせてもよい。【００２４】また、同時に、残存するアニオン性官能基または化学的に導入した反応性基を介して、特異的リガンドを導入することができる。特異的リガンドとして、具体的には酵素、抗体、レクチン等のタンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、糖、オリゴ糖、多糖等の糖鎖、脂質、低分子化合物、高分子有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、または、ウイルス、若しくは細胞を構成する分子などが挙げられる。これら機能性分子が、検体と機能性分子との結合性（相互作用）を測定する際の標的分子となる。
【発明の効果】
【００２５】  上述したように、本発明によれば、本発明のセンサーチップは、カチオンセグメントを有するＰＥＧブロックコポリマーで被覆した表面に対し、アニオン性分子を作用させることにより、さらに該表面への非特異的吸着が起こりにくいという特徴を有することから、高感度での測定を行うことが可能となる。
さらに、リガンドをアニオン性高分子を介して固定化できることから、該機能性分子と相互作用する分子を検出するためのバイオセンサーとして好適に使用できる。
【実施例】
【００２６】以下、本発明の実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明するが、この記載は、本発明の範囲を限定するものではない。【００２７】実施例１：ＰＥＧ／ＰＡＭＡ−ポリアクリル酸固定化チップの作成
ＰＥＧ／ｐｏｌｙ（２−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（以下ＰＥＧ／ＰＡＭＡと略記）を精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）に溶解し、０．２ｍＭ溶液を作成した。本溶液を、表面プラズモンセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ビアコア社製）に、１０ｍｌ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，３７℃，ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ＭｉｌｌｉＱの条件で流し、まず、ＰＥＧ／ＰＡＭＡで被覆されたセンサーチップを装置上で作成した。次に、ポリアクリル酸（以下ＰＡＡと略記）の１００μＭ溶液を作成し、５μｌ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，２５℃，ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  １０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ３．０の条件で流し、ＰＥＧ／ＰＡＭＡ表面にＰＡＡが吸着した表面を作成した。その様子を図１に示した。１ＭＮａＣｌ溶液で脱離したことより、ＰＥＧ／ＰＡＭＡとＰＡＡの相互作用はイオン的相互作用であると予想された。【００２８】  実施例２：ＰＡＡへの抗体の導入
０．１μＭ  １−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ  ｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）、０．１μＭ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、および１００μＭＰＡＡを、それぞれ１０μＬずつ加え、室温で１０分間静置することにより、ＰＡＡのカルボキシル基を活性エステル化した。次に、本溶液に、１ｍＭ抗−ＢＳＡ抗体１００ｍＬを加え、室温で１０分間反応させることにより、ＰＡＡ／抗ＢＳＡ抗体コンジュゲートを作成した。【００２９】実施例３：ＰＥＧ／ＰＡＭＡ−ＰＡＡ−抗ＢＳＡ抗体固定化表面の作成
ＰＥＧ／ＰＡＭＡを精製水（ＭｉｌｌｉＱ水）に溶解し、０．２ｍＭ溶液を作成した。本溶液を、実施例１と同様、表面プラズモンセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００に、１０ｍｌ／ｍｉｎ，３０ｍｉｎ，８７℃，ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ＭｉｌｌｉＱの条件で流し、さらに、実施例２で作成したＰＡＡ／抗ＢＳＡ抗体コンジュゲート５ｍｌ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，２５℃，ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  １０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ３．０の条件で流し、ＰＥＧ／ＰＡＭＡ表面にＰＡＡ／抗ＢＳＡ抗体コンジュゲートが吸着した表面を作成した。このチップ表面に、抗原としてＢＳＡを流したところ、図２に示すように、抗ＢＳＡ抗体を固定化したＰＥＧ／ＰＡＭＡ−ＰＡＡ表面では、ＢＳＡの認識能が向上すると同時に、洗浄後の脱離量が極めて微小であり、非特異的吸着がほとんどないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】  未処理センサーチップおよび異なるＰＡＭＡ鎖長（分子量５０００、１００００）のＰＥＧ／ＰＡＭＡブロック共重合体で被覆したセンサーチップへのＰＡＡの吸着量をＳＰＲセンサーの共鳴角シフトで示す。
【００３１】
【図２】  ＰＥＧ／ＰＡＭＡブロック共重合体で被覆したＳＰＲセンサーチップに、抗ＢＳＡ抗体を固定化した場合の、ＢＳＡの吸着及び脱離挙動を示す。
【図１】
2006208352.tif 000004
【図２】
2006208352.tif 000005