(57)【要約】【課題】化学物質の薬物輸送トランスポーター（以下、ＴＰと記す。）基質輸送能の阻害に係る評価において、ＴＰの種類によっては必ずしも十分な評価結果が得られるものではなく、より一層精密な評価結果を得るための試験方法が求められていた。【解決手段】細胞におけるＴＰ基質の濃度の数をＴＰが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、及び前記基質の濃度別に被験化合物存在下での細胞におけるＴＰ基質輸送能の阻害度を測定する第二工程を有する、被験化合物が有する細胞における複数のＫｍ値を有するＴＰ基質輸送能の阻害試験方法、並びに、前記第二工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する第三工程を有する、前記ＴＰにおける反応部位での被験化合物が有する阻害能を評価する方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
薬物輸送トランスポーター基質がestrone-3-sulfateであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターにおける各反応部位での被験化合物が有する阻害能を評価する方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
（３）前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項６】
第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃであることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
薬物輸送トランスポーター基質がestrone-3-sulfateであることを特徴とする請求項５、６又は７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、医薬品等の薬物の有効成分となる新規化学物質においては、その薬効評価と同時にその安全性評価に際して、薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害に関する試験を実施し、当該化学物質が与える、薬物輸送トランスポーターによる当該トランスポーター基質を輸送する能力への影響を評価することが求められている。これは、新規化学物質が有する、薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するためである（例えば、非特許文献１及び２等参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Hashimoto et al., Characterization of the renal tubular transport of zonampanel, a novel alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptor antagonist, by human organic anion transporters, Drug Metab. Dispos., 32, 1096-1102, (2004)
【非特許文献２】Kimura et al., Metformin transport by renal basolateral organic cation transporter hOCT2, Pharm. Res., 22, 255-259, (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の試験方法では、このような化学物質の薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害に係る評価において、薬物輸送トランスポーターの種類によっては必ずしも十分な評価結果が得られるものではなく、より一層精密な評価結果を得るための試験方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する手法を確立することに成功し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、及び
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明試験方法と記すこともある。）；
２．第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することを特徴とする前項１記載の方法；
３．薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃであることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．薬物輸送トランスポーター基質がestrone-3-sulfateであることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターにおける反応部位での被験化合物が有する阻害能を評価する方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程、及び
（３）前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
６．第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することを特徴とする前項５記載の方法；
７．薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃであることを特徴とする前項５又は６記載の方法；
８．薬物輸送トランスポーター基質がestrone-3-sulfateであることを特徴とする前項５、６又は７記載の方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明試験方法は、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、及び
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程
を有することを特徴とする試験方法であり、当該試験方法では、薬物輸送トランスポーターにおける各反応部位での被験化合物が有する阻害能を区別して測定することができ、さらにはそれを評価することができるという新規な知見に基づいて見出されたものである。
【０００８】
本発明試験方法で測定の対象となる被験化合物は、いかなる化合物であってもよいが、好ましくは、例えば、薬物輸送トランスポーター基質輸送能に対しての阻害作用を有するような化合物等を挙げることができる。具体的には例えば、薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃ（Organic Anion Transporting Polypeptide-C、薬物輸送トランスポーターの一種であり、肝臓特異的に発現し、様々な物質の肝臓内への取り込みに関与している膜輸送タンパク質である。LST-1、OATP2、SLC21A6、SLCO1B1、OATP1B1とも称される。）である場合には、estrone-3-sulfate（エストラジオールの代謝産物であり、エストラジオールの３位に硫酸が抱合した物質である。）と類似する化学構造、立体構造等を有するような化合物、を挙げることができる。
【０００９】
「複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーター」（以下、本トランスポーターと記すこともある。）とは、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターであれば、いかなるものであってもよい。ここで「薬物輸送トランスポーター」とは、内在性物質や生体異物等を細胞外から細胞内へ、又は、細胞内から細胞外へ運搬する膜輸送タンパク質を意味し、また「Ｋｍ値」とは、酵素と基質との解離平衡の式における定数であり、ミカエリス定数とも呼ばれているものを意味する。Ｋｍ値は、反応速度Ｖを以下の式で表したときの、Ｖ＝Ｖmax／２となるときの基質濃度であり、Ｋｍが小さいほど、その酵素が作用する基質との親和性が高いことを示している。
Ｖ＝Ｖmax／（１＋Ｋｍ／Ｃ）（Ｖmax：最大速度、Ｃ：基質濃度）
例えば、２つのＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターの場合には、２つの反応部位を有しており、当該反応部位のうち一方の反応部位が高いaffinityかつ低いcapacityであり、他方の反応部位が低いaffinityかつ高いcapacityであることが一般的である。
薬物輸送トランスポーターの代表例としては、ＯＡＴＰ−Ｃ（２種のＫｍ値を有する）等を挙げることができる。
【００１０】
本発明において「トランスポーターを介した薬物相互作用」（以下、本薬物相互作用と記すこともある。）とは、例えば、ある薬物の薬物輸送トランスポーターによる輸送活性が、別の薬物の存在により低下する現象を意味する。
本薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害試験とは、被験化合物の存在下において、細胞への基質の取り込みを測定し、測定された値を対照と比較することにより、当該被験化合物による前記取り込みに係る阻害度を算出するための試験である。
【００１１】
本発明試験方法の第一工程では、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する。
本発明において「細胞における薬物輸送トランスポーター基質」（以下、本基質と記すこともある。）とは、細胞における薬物輸送トランスポーターが認識することにより、細胞外から細胞内へ、又は、細胞内から細胞外へ輸送される化合物を意味する。
薬物輸送トランスポーター基質の代表例としては、例えば、薬物輸送トランスポーターがＯＡＴＰ−Ｃである場合には、estrone-3-sulfate等を挙げることができる。
本濃度の数を本トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定するには、例えば、本トランスポーターが有するＫｍ値の数を当該技術分野における通常の方法に従って測定することにより決定し、決定されたＫｍ値の数に一致するように薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を設定すればよい。
具体的には例えば、２つのＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターの場合には、前記の如く、２つの反応部位を有しており、当該反応部位のうち一方の反応部位（以下、ポケットＡと記す。）が高いaffinityかつ低いcapacityであり、他方の反応部位（以下、ポケットＢと記す。）が低いaffinityかつ高いcapacityであることが一般的である。ポケットＡにおけるＫｍ値、Ｖmax値をＫｍ1、Ｖmax1とし、またポケットＢにおけるＫｍ値、Ｖmax値をＫｍ2、Ｖmax2とした場合には、ポケットＡにおける反応速度はＶ1＝（Ｖmax1×Ｃ）／（Ｋｍ1＋Ｃ）となり、またポケットＢにおける反応速度はＶ2＝（Ｖmax2×Ｃ）／（Ｋｍ2＋Ｃ）となり、さらにトータルの反応速度はＶtotal＝［Ｖmax1／（Ｋｍ1＋Ｃ）＋Ｖmax2／（Ｋｍ2＋Ｃ）］×Ｃと表される。ここでＫｍ値の数「２」に一致するように薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を「２」に設定し、それぞれをＣ1及びＣ2とすればよい。
【００１２】
第一工程において、細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度を、当該濃度が濃度順にＫｍ値と交互に順列されるように設定することが好ましい。
具体的には例えば、２つのＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターの場合には、前記のＣ1を「Ｃ1＜Ｋｍ1」となるように設定し、かつ、前記のＣ2を「Ｋｍ1＜Ｃ2＜Ｋｍ2」となるように設定すればよい。
【００１３】
本発明試験方法の第二工程では、前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する。
本発明において「被験化合物存在下」とは、当該阻害度を検討する際、薬物輸送トランスポーターによる前記基質の輸送能に与える被験化合物の影響を検討するために、前記基質と被験化合物を系内に共存させる状態を意味する。
細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定するには、適当な濃度の被験物質の存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能を被験物質非存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能とを比較すればよい。尚、ここで「適当な濃度」とは、例えば、被験物質が医薬品開発における新規化合物の場合には、臨床血中濃度を参考に設定すればよい。
【００１４】
本発明評価方法は、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターにおける各反応部位での被験化合物が有する阻害能を評価する方法であって、
（１）細胞における薬物輸送トランスポーター基質の濃度の数を前記トランスポーターが有するＫｍ値の数に一致するように設定する第一工程、
（２）前記基質の濃度別に、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定する第二工程、及び
（３）前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する第三工程
を有することを特徴とする。
本発明評価方法の第一工程及び第二工程は、本発明試験方法の第一工程及び第二工程と同様であり、前記の説明等を参照すればよい。
本発明評価方法の第三工程では、前記工程（即ち、第二工程）で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する。ここで「前記工程で測定された濃度別での阻害度に基づき、各Ｋｍ値に対応する反応部位での被験化合物が有する前記阻害能を評価する」には、各濃度での阻害度の変化の有無又はその程度を評価すればよい。その際には統計学的に有意であるかを検討することが好ましい。
【００１５】
本発明は、上記の知見や当該知見に基づいた本発明方法等を利用する種々の発明（例えば、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定するシステムや、そのためのプログラム等）を包含している。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明をより詳細に説明するため、実施例を挙げて説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
OATP-C発現細胞として２つのＫｍ値（「Ｋｍ1」：94.0ｎＭ、「Ｋｍ2」：5.34μＭ）を有する薬物輸送トランスポーター（「Ｖｍax1」：0.151pmol/oocyte/30min、「Ｖｍax2」：0.751pmol/oocyte/30min）であるOATP-Cトランスポートサイト（OATP-Cを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞、BD GENTEST社の登録商標）を、またコントロール細胞として水注入コントロール卵母細胞をBD GENTEST（USA）から購入して使用した。購入後はインキュベーター（設定温度：16℃）に入れ保管し、入手後４日以内に試験に使用した。
[３Ｈ]estrone-3-sulfate （PerkinElmer Life Sciences, Inc. (USA)より購入）およびestrone-3-sulfate（SIGMA-ALDRICH Corp. (USA)より購入）を各々Na+ buffer（組成：100mM のNaCl、2mM のKCl、1mM のMgCl２、1mM のCaCl２及び10mM のHEPES、pH 7.4）で希釈した後、これら化合物をモル量として1:100の割合で混合することにより、20mMの[３Ｈ] estrone-3-sulfate溶液を調製した（以下、溶液Ａと記す。）。また、[３Ｈ]estrone-3-sulfateをNa+ bufferで希釈することにより、200nMの[３Ｈ]estrone-3-sulfate溶液を調製した（以下、溶液Ｂと記す。）。
次いで、被験物質（阻害剤）であるプラバスタチン（和光純薬工業株式会社より購入）をNa+ bufferに溶解することにより、5556mMのプラバスタチン溶液を調製した（以下、溶液Ｃと記す。）。また、他の被験物質（阻害剤）であるシクロスポリンＡ（和光純薬工業株式会社より購入）をメタノールに溶解することにより、6667μMのシクロスポリンＡ溶液を調製した後、当該溶液をNa+ bufferで希釈することにより、約33.3μMのシクロスポリンＡ溶液を調製した（以下、溶液Ｄと記す。）。
[３Ｈ]estrone-3-sulfate溶液（溶液Ａまたは溶液Ｂ）と被験物質（阻害剤）溶液（溶液Ｃまたは溶液Ｄ）とを1:9 (v/v) の割合で混合することにより、基質溶液を調製した（[３Ｈ]estrone-3-sulfate濃度は20nM（＝「Ｃ1」）または2μM（＝「Ｃ2」）、プラバスタチン濃度は5mM、シクロスポリン濃度は30μM）。また、被験物質（阻害剤）溶液の代わりにNa+ bufferを用いること以外は同様な操作により、被験物質（阻害剤）を含まない基質溶液を調製した（[３Ｈ]estrone-3-sulfate濃度は20nM（＝「Ｃ1」）または2μM（＝「Ｃ2」））。
約１０個の前記OATP-Cトランスポートサイトを約0.5 mLのND96 medium（96mMのNaCl、2 mMのKCl、1.8mMのCaCl２、1mMのMgCl２、5mMのHepes/Trisおよび50 mg/LのGentamicin、pH 7.4）と共に5mL 容の試験管に移した。試験管内のND96 medium を吸引除去した後、すぐに室温のNa+ Buffer約3mL で3回洗浄した。3回目の洗浄を終えNa+ Bufferを除去した後、これに100μL の前記基質溶液を加えることにより、OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込み、即ち、薬物輸送トランスポーター基質輸送能を開始させた。室温で60分間インキュベートした後、基質溶液を除去することにより、前記取り込みを停止させた。これに約3mL のNa+ Buffer を加えて洗浄した後、再びNa+ Bufferを除去した。この洗浄操作を更に2回繰り返した後、OATP-Cトランスポートサイトを1 個ずつバイアルに取り分けた。各バイアルに 10% SDS sodium buffer を150mLずつ加えて得られる混合物を、室温で30分間以上放置することにより、OATP-Cトランスポートサイトを溶解させた。各バイアルに液体シンチレーションカクテルを約5mL入れ、混合した後、液体シンチレーションカウンターを用いて当該カクテル中の放射能を測定した。ネガティブコントロールとして、被験物質（阻害剤）を含まない基質溶液について、水注入コントロール卵母細胞を用いた前記同様な操作を行った。
OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込みに対する被験化合物（阻害剤）による阻害結果（即ち、細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送の阻害度）を図１および図２に示した。基質濃度が20nM（＝「Ｃ1」）であった場合、OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込みはプラバスタチン（阻害率：５９％）およびシクロスポリンＡ（阻害率：９３％）のいずれによっても阻害された（図１参照）。尚、阻害率は、被験物質（阻害剤）なしのときの当該取り込み活性と比較した値である。
基質濃度が2μM（＝「Ｃ2」）であった場合、OATP-C発現細胞への[３Ｈ]estrone-3-sulfateの取り込みはシクロスポリンＡによって阻害されたが（阻害率：86%）、プラバスタチンによっては阻害されなかった（図2参照）。即ち、シクロスポリンＡでは両濃度（＝「Ｃ1」及び「Ｃ2」）において前記取り込みが阻害されたことから、シクロスポリンＡはestrone-3-sulfateの高親和性反応部位（＝「ポケットＡ」）と低親和性反応部位（＝「ポケットＢ」）との両部位での阻害能を持つことが判明した。また、プラバスタチンは、基質濃度が20nM（＝「Ｃ1」）の場合に前記取り込みを阻害したが、一方、基質濃度が2μM（＝「Ｃ2」）の場合に前記取り込みを何ら阻害することなく影響を与えることはなかったことから、プラバスタチンはestrone-3-sulfateの高親和性反応部位（＝「ポケットＡ」）のみで阻害能を持つことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明により、被験化合物が有する、複数のＫｍ値を有する薬物輸送トランスポーターを介した薬物相互作用を評価するための、被験化合物存在下での細胞における薬物輸送トランスポーター基質輸送能の阻害度を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、OATP-Cトランスポートサイトでの [３Ｈ]estrone-3-sulfate（基質濃度：20nM（＝「Ｃ1」））の取り込みの阻害結果を示す図である。
【図２】図２は、OATP-Cトランスポートサイトでの[３Ｈ]estrone-3-sulfate（基質濃度：2μM（＝「Ｃ2」））の取り込みの阻害結果を示す図である。
【図１】
2006340610.tif 000002
【図２】
2006340610.tif 000003