(57)【要約】【課題】新規プラットホーム抗体組成物の提供。【解決手段】本発明は、キレート剤を含んでなるヒトＩｇＧ2抗体の新規な組成物を提供する。本発明はまた、改良された化学的および／または物理的安定性を示す、新規な抗体組成物も提供する。また、ヒトＩｇＧ2抗体の組成物による、炎症性疾患および新生物障害を含めた疾病および症状の治療法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のヒトＩｇＧ2抗体およびキレート化剤を含む組成物。
【請求項２】
該組成物が液状医薬組成物であり、該抗体がシグナル配列を含まない、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該組成物がＥＤＴＡである少なくとも１種のキレート化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該組成物がさらにバッファーを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
該組成物がＥＤＴＡである少なくとも１種のキレート化剤を含み、さらにヒスチジンである少なくとも１種のバッファーを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
該組成物がさらにバッファーおよび界面活性剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
該組成物がさらにバッファー、界面活性剤、および等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
該組成物がＥＤＴＡである少なくとも１種のキレート化剤を含み、さらにバッファー、界面活性剤、および等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
該組成物がＥＤＴＡである少なくとも１種のキレート化剤を含み、さらにヒスチジン、界面活性剤、および等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
該組成物がＥＤＴＡである少なくとも１種のキレート化剤を含み、さらにヒスチジン、ポリソルベート８０、および等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
該組成物が、
約０．１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌの抗体；
約０．００１ミリモルないし約５．０ミリモルのキレート化剤；および
約１ｍＭないし約１００ｍＭのヒスチジンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
該組成物が、
約１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌの抗体；
約０．０１ミリモルないし約５．０ミリモルのＥＤＴＡ；および
約１ｍＭないし約１００ｍＭのヒスチジンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
該組成物が、
約１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌの抗体；
約０．０１ミリモルないし約１．０ミリモルのキレート化剤；
約１ｍＭないし約１００ｍＭのバッファー；
約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌの界面活性剤；および
約１００ミリモルないし約４００ミリモルの等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
該組成物が、
約１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌの抗体；
約０．０１ミリモルないし約１．０ミリモルのＥＤＴＡ；
約１ｍＭないし約１００ｍＭのバッファー；
約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌの界面活性剤；および
約１００ミリモルないし約４００ミリモルの等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
該組成物が、
約１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌの抗体；
約０．０１ミリモルないし約１．０ミリモルのＥＤＴＡ；
約１ｍＭないし約１００ｍＭのヒスチジン；
約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌの界面活性剤；および
約１００ミリモルないし約４００ミリモルの等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
該組成物が、
約１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌの抗体；
約０．０１ミリモルないし約１．０ミリモルのＥＤＴＡ；
約１ｍＭないし約１００ｍＭのヒスチジン；
約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０；および
約１００ミリモルないし約４００ミリモルの等調化剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
該組成物が、
約１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌの抗体；
約０．０１ミリモルないし約１．０ミリモルのＥＤＴＡ；
約１ｍＭないし約１００ｍＭのヒスチジン；
約０．０１ｍｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０；および
約１００ミリモルないし約４００ミリモルのトレハロースを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体およびキレート化剤を含有してなる組成物であって、該組成物が約４０℃の温度で、少なくとも約２６週間、該組成物を安定化するための十分な量のキレート化剤を含む、組成物。
【請求項１９】
少なくとも１種のヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体および医薬的に許容し得るキレート化剤を含有してなる液状医薬組成物であって、該組成物中の抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモルないし約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート化剤のモル濃度が約０．００３ミリモルないし約５０ミリモルの範囲であり、この場合の抗体とキレート化剤のモル比が約０．００００１ないし約２０００の範囲である前記組成物。
【請求項２０】
抗体とキレート化剤のモル比が約０．０１ないし約５００の範囲である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
抗体とキレート化剤のモル比が約０．０５ないし約１００の範囲である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
抗体とキレート化剤のモル比が約０．１ないし約１０の範囲である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２３】
抗体とキレート化剤のモル比が約０．５ないし約４の範囲である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】
該組成物がさらに約１ミリモルないし約１００ミリモルの範囲のモル濃度のヒスチジンを含む、請求項１９記載の組成物。
【請求項２５】
少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体溶液と、少なくとも１種のキレート化剤とを混合することを特徴とする液状ヒトＩｇＧ２医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許および特許出願のクロス・リファレンス
本出願は米国仮特許出願番号６０／６５９，７６６号（２００５年３月８日出願）、米国仮特許出願番号６０／７２８，１６５号（２００５年１０月１９日出願）、米国仮特許出願番号６０／７５２，７１２号（２００５年１２月２０日出願）、および米国仮特許出願番号６０／７６２，４５６号（２００６年１月２６日出願）の利益を請求する；これらのすべてはその全体を参照により本明細書の一部とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
近年、バイオテクノロジーの進歩は治療に適用し得る様々な抗体薬物の生産を可能としている。数種の抗体薬物が多くの異なる疾患と障害の診断、予防、および処置に使用するために開発されている。しかし、抗体は伝統的な無生物薬物よりも大きく、またより複雑（すなわち、複雑な三次元構造に加えて、複数の官能基を保持する）なため、かかる抗体の組成物は特別の問題をもたらす。例えば、抗体を成功裏に市場に出すためには、その製品は長期間適切な安定性をもたねばならない。安定な抗体投薬の形状を開発することは、他のタンパク質組成物同様に、抗体組成物が長期にわたる組成物中の抗体の物理的・化学的分解に関して同じ懸念下にあるため、重大なチャレンジとなる。
【０００３】
物理的分解は高次タンパク質構造（二次、三次および四次）における変化であり、タンパク質の共有結合の変化は含まない。物理的分解の例は、凝集、断片化、吸着、変性、および沈降などである。それに対して、化学的分解はタンパク質の一次構造が結合の形成または切断で変化することであり、それによって新しい化学因子を生じることである。化学的分解の例は、脱アミド、ラセミ化、異性化、ベータ脱離、ジスルフィド交換および加水分解などである。一方、技術的に異なる物理的・化学的分解はしばしば相互に関係をもつ。例えば、部分的に変性したタンパク質（物理的に分解した）は酸化（化学的分解）を受け易くなる。一般に、抗体組成物は期待される範囲の貯蔵および使用条件下で許容し得る化学的・物理的安定性を示すべきである；すなわち、十分な貯蔵期限をもち、なお生物活性を保持すべきである。
【０００４】
ヒトでの使用を企図する多くの抗体製剤は、変性、凝集および他の変化を予防するために、製剤の使用に先立ち、タンパク質に様々の安定剤を加える必要がある。この不安定性は抗体製剤を長期間保存した場合、および輸送に際し、しばしば増大する。
【０００５】
例えば、米国公開出願番号２００５００５９１１３号は、ヒトＩｇＧ２抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、および１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する組成物（ｐＨ５．５）を報告している。
米国特許第６，６８２，７３６号はリン酸バッファー塩溶液中にヒトＩｇＧ２抗−ＣＴＬＡ−４抗体を含有する組成物を報告している。
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０００３７０は、ヒトＩｇＧ２抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、および１４０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．５）を含有する組成物を報告している。
【０００６】
ＷＯ２００４００７５２０は、酸化に脆弱なタンパク質が該タンパク質を保護するためのＤＴＰＡ、ＥＧＴＡおよび／またはＤＥＦなどの選択した金属キレート化剤により製剤化し得ることを報告している。しかし、ＷＯ２００４００７５２０は、金属キレート化剤ＥＤＴＡの添加が製剤化したタンパク質に対する酸化損傷およびその凝集を事実上増大させたと記している。
ＷＯ２００３０３９４８５は、１００ｍｇ／ｍｌのヒト化ＩｇＧ１抗−ＩＬ−２抗体、５０ｍＭのヒスチジン、１１５ｍＭの塩化ナトリウム、０．０３％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、および０．０５％ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）を含有する水性組成物を報告している。
【０００７】
ＷＯ９７／４５１４０は、１００ｍｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４抗体、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、および０．０５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）を含有する水性組成物を報告している。
米国公開出願番号２００４０１９１２４３号は、１００ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ２抗−ＩＬ８抗体、４０ｍＭのヒスチジン、４０ｍＭのアルギニン、１５０ｍＭのスクロース、および０．０４％ポリソルベート２０を含有する水性組成物を報告している。
米国特許第６，２６７，９５８号は、１００ｍｇ／ｍｌのヒト化ＩｇＧ１抗体、２０ｍＭのヒスチジン、３４０ｍＭのスクロース、０．０４％ポリソルベート２０、および０．９％ベンジルアルコール（ｐＨ６．０）を含有する再構築組成物を報告している。
【０００８】
米国特許第６，１７１，５８６号は、２５ｍｇ／ｍｌのヒト化ＩｇＧ１抗−ＣＤ２０抗体、２５ｍＭアセテート、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、および０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ５）含有する水性抗体組成物を報告している。
米国特許第５，６５４，４０３号は、ヒト化ＩｇＧ１抗−ＣＤ５２抗体、リン酸バッファー塩溶液、および０．０５ｍＭないし５ｍＭの銅イオンのキレート化剤を含有する液状組成物を報告している。
【０００９】
従って、抗体薬組成物開発の主目的は、タンパク質の安定性、溶解性、および生物活性を維持することにある。抗体製品を製造するために必要な時間と資源を仮定すれば、製品のロスを減少させる組成物が望ましい。従って、本出願は、文献にすでに開示された抗体組成物に比べて、改善された化学的および／または物理的安定性を示す新規抗体組成物を開示する。
【発明の開示】
【００１０】
要約
一態様において、本発明は少なくとも１種のヒトＩｇＧ2抗体およびキレート化剤とを含有してなる組成物を提供する。
本発明はまた少なくとも１種のモノクローナル・ヒトＩｇＧ２抗体およびキレート化剤とを含有してなる組成物であって、該組成物が約４０℃の温度で少なくとも約２６週間維持したときに、その組成物を安定化するために十分な量のキレート化剤を含有してなる組成物を提供する。
【００１１】
本発明は少なくとも１種のヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体および医薬的に許容し得るキレート化剤とを含有してなる液状医薬組成物であって、その抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモルないし約１．３５ミリモルの範囲であり、またキレート化剤のモル濃度が約０．００３ミリモルないし約５０ミリモルの範囲であり、さらに抗体とキレート化剤との比が約０．００００１ないし約４５０の範囲である組成物を提供する。
本発明はまた少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体溶液と、少なくとも１種のキレート化剤とを混合することを特徴とする液状ヒトＩｇＧ２医薬組成物の製造法を提供する。
【００１２】
本発明はまた少なくとも１種のモノクローナル・ヒトＩｇＧ２抗体およびキレート化剤とを含有してなる安定な組成物であって、該組成物を約４０℃の温度に約２４週間保存した後の、モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体およびキレート化剤とを含有してなる安定な液状医薬組成物の凝集塊クロマトグラムのピーク面積と、４０℃の温度に約２４週間保存したキレート化剤を欠く以外は同一である組成物の凝集塊クロマトグラムのピーク面積との間の減少が、少なくとも約２％である組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の方法および技術は技術上周知の常套的方法に従い、また特に断りのない限り、本明細書全般で引用し、考察した種々の一般的およびより具体的文献に記載されているように、一般に実施する。参照例：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992); and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)。酵素反応および精製法は、製造業者の説明書に従い、技術上一般に実施されるように、または本明細書に記載されているよう実施する。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、および医学薬学化学に関連して使用される用語、およびそれらの実験室手法と技法は、技術上周知の、また共通して使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬製剤、組成物、および被験対象への引渡しおよび処置については標準的技法が使用される。
【００１４】
定義
以下の詳細な説明を読者が理解するようにするために、以下の定義を提供する：
本明細書にて使用する場合、「抗体」という用語は、未処理抗体または特異結合する未処理抗体と競合する抗原結合部分をいう。一般参照文献：Fundamental Immunology, Ch.7(Paul,W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)。抗原結合部分は組換えＤＮＡ技法により、または未処理抗体の酵素もしくは化学的切断により産生し得る。一部の態様において、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ジアボデイ（ｄｉａｂｏｄｙ）、およびポリペプチドに特異的抗原を結合させるに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドなどである。Ｎ−末端からＣ−末端まで、成熟軽鎖および重鎖の可変ドメインは共に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４の領域を含んでなる。各ドメインに対するアミノ酸の割り振りは、文献(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (国立保健研究所、ベセスダ、メリーランド(1987 and 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), or Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989))の定義に従う。
【００１５】
一部態様において、抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、そのＶLおよびＶHドメインは一本のタンパク鎖を形成し得るような合成リンカーを介して対合し、一価の分子を形成する。(Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988))。一部態様において、抗体はジアボディ、すなわち、二価の抗体であり、そのＶHとＶLドメインは一本のポリペプチド鎖上に発現するが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合し得るには短すぎるリンカーを使用しているために、該ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位を創出する。（参照例:Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); and Poljak R.J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994))。一部態様において、本発明抗体からの１種以上のＣＤＲは、共有結合により、または共有結合によらずに分子内に取り込ませ、所望のヒト抗原に特異的に結合する免疫アドヘシンとすることができる。かかる態様において、ＣＤＲはより大きなポリペプチド鎖の一部として取り込むことが可能であるか、共有結合により他のポリペプチド鎖に連結し得るか、または共有結合によらずに取り込むことができる。シグナルポリペプチドを同定するＤＮＡ配列は、本明細書の配列アイデンティファイアー（配列番号）により同定し得るが、抗体ではシグナルポリペプチドが一般に翻訳後の修飾に際して除去されるため、シグナルポリペプチドを含まない。本発明の種々の態様において、ヒトＩｇＧ２抗体の重鎖および軽鎖の一方または両方は、シグナル配列（またはシグナル配列の一部）を含む。本発明の他の態様においては、ヒトＩｇＧ２抗体の重鎖も軽鎖もシグナル配列を含まない。
【００１６】
本明細書にて使用する場合、番号により言及する抗体は、同じ番号のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同じものである。例えば、モノクローナル抗体８．１０．３Ｆは、ハイブリドーマ８．１０．３Ｆから得られるものと同じ抗体である。従って、モノクローナル抗体８．１０．３Ｆは、ハイブリドーマ８．１０．３Ｆから得られるものと同じ重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する。従って、抗体８．１０．３Ｆというときは、配列番号２および４にそれぞれ示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する抗体を含む。これは、通常、製造に際して抗体の一部が失われているため、重鎖上の末端リジンを欠く抗体も包含する。
【００１７】
本明細書にて使用する場合、Ｆｄ  フラグメントはＶHおよびＣH１からなる抗体フラグメントを意味する；Ｆｖ  フラグメントは抗体の一本の腕のＶLおよびＶHドメインからなる；また、ｄＡｂ  フラグメント(Ward et al., Nature 341:544-546 (1989))はＶHドメインからなる。
本明細書にて使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、未変性の、もしくは人工のタンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドはモノマーであっても、ポリマーであってもよい。
【００１８】
「またはその抗原結合部分」という用語は、これを用語「抗体」と共に使用する場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失をもつポリペプチドであるが、残りのアミノ酸配列が天然産配列の対応する位置と同じであるポリペプチドをいう。一部の態様において、その抗原結合部分とはアミノ酸の長さが少なくとも１４個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、または少なくとも７０、８０、９０、１００、１５０個または少なくとも２００個のものである。
【００１９】
本明細書にて使用する場合、「特異的に結合し得る」という用語は、抗体が抗原に結合する場合、解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１ｎＭ、および最も好ましくは≦１０ｐＭであることをいう。特定の態様において、ＫDは１ｐＭないし５００ｐＭである。他の態様において、ＫDは５００ｐＭないし１μＭである。他の態様において、ＫDは１μＭないし１００ｎＭである。他の態様において、ＫDは１００ｍＭないし１０ｎＭである。
【００２０】
本明細書にて使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる１抗体、すなわち、該集団を構成する個々の抗体をいうが、ただし、少量存在し得る自然界で生じる可能性のある当然変異またはＣ末端リジンの欠失は例外とする。モノクローナル抗体は高特異性であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、常套の（ポリクローナル）抗体調製と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の抗原決定基に向けられる；ポリクローナル抗体は典型的に異なる抗体を含み、異なる抗原決定基（エピトープ）に向けられる。モデファイアー「モノクローナル」とは実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の性質を意味し、特定の方法による抗体の製造を必要とするものと解釈されるものではない。例えば、本発明に従い使用されるべきモノクローナル抗体はコーラーら(Kohler et al., Nature 256:495 (1975))が最初に記載したハイブリドーマ法により作製し得るか、または組換えＤＮＡ法（参照：米国特許第４，８１６，５６７号）により作製し得る。「モノクローナル抗体」はまたファージ抗体ライブラリーから、例えば、文献(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))記載の技法により単離し得る。
【００２１】
「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」または「単離抗体」という用語は、その由来の起源または出所によって、以下の４項目を有するタンパク質、ポリペプチドまたは抗体である：（１）その本来の状態においては、それを伴う天然関連成分と会合していない；（２）同じ種からの他のタンパク質を含まない；（３）異なる種からの細胞が発現する；または（４）自然界に存在しない。従って、化学的に合成されるか、または本来起源とする細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然関連成分から単離されこととなる。単離されたタンパク質／抗体は、技術上周知のタンパク質精製法を用いる単離により、天然関連細胞成分を実質的に含まないものとし得る。
【００２２】
単離／精製抗体の例は、ヒトＩｇＧ２抗体、例えば、抗−ＣＴＬＡ−４抗体であり、このものはＣＴＬＡ−４などの抗原を用いてアフィニティ精製したもの、および／またはハイブリドーマまたは他の細胞株により合成した抗−ＣＴＬＡ−４抗体、および／またはトランスジェニックマウスから誘導されるヒト抗−ＣＴＬＡ−４抗体である。従って、好適な態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は少なくとも約９５％の純度を有し（ｗ／ｗ−抗−ＣＴＬＡ−４抗体重量／医薬的に許容し得る賦形剤以外の成分重量）、さらなる態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は約９５％ｗ／ｗないし約９９．５％ｗ／ｗの純度を有する。
【００２３】
抗体はサンプルの少なくとも約６０〜７５％が単一種の抗体を有する場合、それは「実質的に純粋」であるか、「実質的に均一」であるか、または「実質的に精製」されている。抗体はモノマーでもマルチマーでもよい。実質的に純粋な抗体は一般的に、抗体サンプルの約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％ｗ／ｗを構成し、より一般的には約９５％、好ましくは９９％以上の純度である。抗体の純度または均一性は多くの周知の技術手段により示すことが可能であり、例えば、抗体サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、次いで、技術上周知の染色剤によりゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化する。特定の目的のために、ＨＰＬＣまたはその他の技術上周知の精製手段を用いることにより、高分解を達成することができる。
【００２４】
本明細書にて使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列から誘導される可変領域および定常領域をもつ抗体を含めることを意図する。本発明のヒト抗体は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３、がエンコードしないアミノ酸配列を含み得る（例えば、無作為もしくは部位特異的インビトロ変異誘発によるか、または体細胞インビボ突然変異により導入される突然変異）。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書にて使用する場合、マウスなど他の哺乳動物種の生殖系列から誘導されるＣＤＲ配列がヒト枠組み配列に移植されている抗体を含めようとするものではない。
【００２５】
本明細書にて使用する場合、「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、創出または単離するヒト抗体のすべてを包含するものとする；例えば、宿主細胞に形質移入した組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した動物（例えば、マウス）から単離した抗体（参照例:Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることからなる他の手段により調製、発現、創出または単離される抗体である。かかる組換えヒト抗体は、ヒトの生殖系列免疫グロブリン配列から誘導される可変領域および定常領域をもつ。しかし、特定の態様においては、かかる組換えヒト抗体はインビトロの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列を遺伝子導入した動物を使用する場合は、インビボ体細胞突然変異）に付され、従って、組換え抗体のＶHおよびＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶHおよびＶL配列から誘導され、関連するものではあるが、ヒト抗体生殖系列のインビボレパートリー内に当然に存在し得るものではない。
【００２６】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはＴ−細胞レセプターに特異的に結合し得るか、またはさもなくばある分子と相互作用し得るタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般にアミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基形成からなり、一般に特異的三次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。エピトープは「線状」または「立体配座」であり得る。線状エピトープでは、タンパク質とその相互作用分子（抗体など）間の相互作用点のすべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体配座エピトープでは、相互作用点が互いに分離するタンパク質上のアミノ酸残基にまたがって生じる。
【００２７】
本明細書にて使用する場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書では相互に使用され、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形状、すなわち、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドであるか、または両タイプのヌクレオチドの修飾形状を意味する。この用語は一本鎖および二本鎖の形状を包含する。「ポリヌクレオチド」または「核酸」配列は、特に断りのない限り、その相補鎖も包含する。従って、特定の配列をもつ核酸について言及する場合、それはその相補性配列をもつ相補鎖も包含すると理解すべきである。
【００２８】
本明細書にて使用する場合、「単離ポリヌクレオチド」または「単離核酸」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起源もしくはそのある種の組合わせのポリヌクレオチドを意味し、その誘導の起源または出所により、単離ポリヌクレオチドは以下の１ないし３の項目を有する：（１）自然状態で「単離ポリヌクレオチド」と共に見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合していない；（２）自然状態では結合していないポリヌクレオチドに操作可能に結合する；または（３）より大きな配列の一部として自然状態では存在しない。
【００２９】
本明細書にて使用する場合の「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然産および非天然産オリゴヌクレオチド結合により共につながった天然産および修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは一般に長さが２００個以下の塩基からなるポリヌクレオチドのサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは長さが１０〜６０個の塩基であり、好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば、プライマーおよびプローブ用には、通常一本鎖である；しかし、例えば、遺伝子変異体の構築に使用するオリゴヌクレオチドは二本鎖でよい。本発明のオリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドでもあり得る。
【００３０】
本明細書にて使用する場合、「天然産ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」という用語は、本明細書にて使用する場合、修飾した、または置換基を有する糖基などをもつヌクレオチドを含む。本明細書にて引用する「オリゴヌクレオチド連鎖」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド連鎖を含む。参照例：LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991));米国特許第５，１５１，５１０号;Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990)。オリゴヌクレオチドは、要すれば、検出用の標識を含み得る。
【００３１】
本明細書にて使用する場合、「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、検出可能に、また特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそのフラグメントは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄（非特異的核酸に検出可能に結合する認知可能量を最少とする）条件下に核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する。「高緊縮性」または「高緊縮性の」条件は、技術上既知の、本明細書で検討した選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用し得る。「高緊縮性」または「高緊縮性の」条件の一例は、ポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドとのインキュベーションであり、この場合、１ポリヌクレオチドを６×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５×デンハード試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡからなるハイブリダイゼーションバッファー中、膜などの固体表面に、４２℃のハイブリダイゼーション温度で１２〜１６時間貼着させ、次いで１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳからなる洗浄バッファーを用いて、５５℃で２回洗浄する。上記、Sambrook et al., pp. 9.50-9.55も参照。
【００３２】
ポリヌクレオチドに適用する場合、「実質的同一性」、「パーセント同一性」または「％同一」という用語は、第一の相接する配列を第二の相接する配列に比較し、最大に対応するように整列したときの残基のパーセントを意味する。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約１８個のヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約２４個のヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８個のヌクレオチド、さらに典型的には少なくとも約３２個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８個またはそれ以上のヌクレオチドの伸張に及び得る。「実質的同一性」、「パーセント同一性」または「％同一」という用語は、ポリヌクレオチド分子を適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失と共に、他のポリヌクレオチド分子（またはその相補性鎖）と直線状に整列した場合、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはギャップ（Ｇａｐ）などの配列同一性の周知のアルゴリズムにより測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％にポリヌクレオチド配列同一性が存在することを意味する。技術上既知の多くの異なるアルゴリズムが存在し、それらはポリヌクレオチドの配列同一性を測定するために使用し得る。例えば、ポリヌクレオチド配列はＦＡＳＴＡ、ギャップ、またはベストフィットなどを用いて比較し得る；これらはウィスコンシン・パッケージ・バージョン１０．０(Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin)のプログラムである。ＦＡＳＴＡは、例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含み、疑問とする配列と検索配列間の重なりが最善となる領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998))。特に断りのない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのためにデフォルト・パラメータを用いる。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＦＡＳＴＡを用い、そのデフォルト・パラメータ（ワードサイズ６およびスコアリング・マトリックス用のＮＯＰＡＭファクター）により、またはギャップを用い、ＧＣＧバージョン６．１に提供されているようなデフォルト・パラメータにより決定することができる；参照により本明細書の一部とする。
【００３３】
ポリペプチドに適用する場合、「実質的同一性」、「パーセント同一性」または「％同一」という用語は、２種類のペプチド配列が、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなど、該プログラムが備えているように、デフォルト・ギャップ・ウエイトを用いて最適に整列させた場合、少なくとも７０％、７５％または８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。特定の態様において、一致しない残基の位置は同類アミノ酸置換により異なる。「同類アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）をもつ側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基に置換わることである。一般に、同類アミノ酸置換はタンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が同類置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性は置換の保存的性質を訂正するために、上方調節することができる。これを調節する手段は当業者周知である。参照例：Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)。化学的性質が類似する側鎖をもつアミノ酸群の例は：１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；および７）イオウ含有側鎖：システインおよびメチオニン；である。同類アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、およびアスパラギン−グルタミンである。ポリペプチドの配列同一性は、一般に配列分析ソフトウエアを用いて判定する。タンパク質分析ソフトウエアは同一性評価を用いて配列を調和させ、種々の置換、欠失および他の修飾、例えば、同類アミノ酸置換などに割り振る。
【００３４】
例えば、ＧＣＧは「ギャップ」および「ベネフィット」などのプログラムを含むが、このプログラムはプログラムにより特定したデフォルト・パラメータと共に用い、密接に関連するポリペプチド、例えば、異なる種の生体からの相同性ポリペプチド間、または野生型タンパク質とその突然変異体間の配列相同性または配列同一性を決定し得る。参照例：ＧＣＧバージョン６．１。ポリペプチド配列はデフォルトまたは推奨されたパラメータを用いるＦＡＳＴＡを用いて比較することができる。参照：ＧＣＧバージョン６．１．（ウィスコンシン大学ＷＩ）ＦＡＳＴＡ（例：ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は問題の配列と検索配列間の最善の重なり領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する(Pearson, Methods Enzymol., 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000))。もう一つの好適なアルゴリズムは、異なる生体からの大量の配列を含むデータベースに本発明の配列を比較する場合のもので、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（ブラスト）、取分け、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎであり、該プログラムが提供するデフォルト・パラメータを使用する。参照例：Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschutl et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)。相同性について比較したポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６個のアミノ酸残基であり、通常少なくとも約２０残基、より一般的には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基であり、好ましくは約３５残基を超える。大量の異なる生体からの配列を含むデータベースを検索する場合には、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【００３５】
「操作可能に連結する」配列は、対象遺伝子と相接する発現調節配列、および対象遺伝子を制御するためにトランスに、または距離をおいて作用する発現調節配列の両方を含む。本明細書にて使用する場合の「発現調節配列」という用語は、ポリヌクレオチド配列が連結するコーディング配列の発現とプロセシングを実行するために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現調節配列は適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を上げる配列（すなわち、コザック・共通配列）；タンパク質安定性を高める配列；および必要な場合のタンパク質分泌を高める配列などである。かかる調節配列の性質は宿主生物により異なる；原核細胞では、かかる調節配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含む；真核細胞では、一般に、かかる調節配列はプロモーターおよび転写終止配列を含む。「調節配列」という用語は、少なくとも、存在することが発現とプロセシングにとって必須であるすべての成分を包含し、また存在することが有利となるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列をも包含する。
【００３６】
本明細書にて使用する場合、「ベクター」という用語は核酸分子であって、それが連結する別の核酸を輸送し得る分子を意味する。一部態様において、ベクターはプラスミド、すなわち、環状二本鎖ＤＮＡループであり、そこに追加のＤＮＡセグメントを連結し得る。一部の態様において、該ベクターはウイルスベクターであり、その場合、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結し得る。一部態様において、ベクターはベクターを導入した宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、バクテリアの複製起源をもつバクテリアベクターおよび遺伝子副体哺乳動物ベクター）。他の態様において、ベクター（例えば、非遺伝子副体哺乳動物ベクター）は宿主細胞に導入することにより、宿主細胞のゲノムに組込むことが可能であり、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらにある種ベクターは、それらが操作可能に結合する遺伝子の発現を指令し得る。かかるベクターは「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と本明細書ではいう。
【００３７】
本明細書にて使用する場合、「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫をも意味すると理解すべきである。突然変異または環境的影響のために次の代では特定の修飾が起こり得るので、かかる子孫は事実上親細胞に一致はしないが、本明細書で使用する場合の用語「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。
【００３８】
「治療有効量」とは所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量をいい、炎症性疾患および異常増殖障害などの症状の処置または予防的防御を達成する量である。投与量の数値は軽快すべき症状の重篤度により変わり得ることに留意すべきである。さらに理解すべきことは、特定の被験対象に対しては個々の必要性および該組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に応じて、長期にわたり特定の投薬計画を調整すべきこと、また本明細書に示す投与量範囲は単なる例示であって、請求項記載の組成物の範囲または実践を制限しようとするものではないことである。同様に、抗体または抗体部分の治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、個体において所望の応答を引き出す抗体または抗体部分の能力、および抗体組成物の所望の投与経路などのファクターにより変わり得る。また、治療有効量は、治療的に有益な作用が抗体または抗体部分の毒性作用または有害作用に勝る量を包含する。
【００３９】
本明細書にて使用する場合、処置を目的とする「被験対象」という用語は、いずれの対象をも含み、好ましくは、炎症性または異常増殖障害の処置を必要とする被験対象である。予防目的の場合、被験対象はいずれの対象をも含み、好ましくは、炎症性または異常増殖障害の発症する危険があるか、または罹患し易い状態にある被験対象である。「被験対象」という用語は、生物体、例えば、原核細胞および真核細胞などを含むものである。被験対象の例は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、および遺伝子導入非ヒト動物である。本発明の特定態様において、被験対象はヒトである。
【００４０】
本明細書にて使用する場合、「異常増殖」および「異常増殖障害」という用語は、本明細書では相互に使用可能であって、正常増殖調節に対する反応性を失ったことから生じる新しい細胞の増殖、例えば、「新生物」細胞増殖をいう。異常増殖はまた本明細書においては「癌」という用語と相互に使用可能であって、本発明の目的とするものである；癌は異常増殖のサブタイプである。本明細書にて使用する場合、「異常増殖障害」という用語は、過形成、組織分化および形成異常などの他の細胞性異常をも包含する。用語の異常増殖、組織分化、形成異常および過形成とは本明細書において相互に使用可能であり、一般には異常な細胞増殖を経験する細胞についていう。
【００４１】
本明細書にて使用する場合、「処置」という用語は治療処置および予防または防御的手段をいい、その目的は標的とする病状または症状を予防または減退（軽減）させることである。処置を必要とするものは、すでにその症状をもつもの、ならびにその症状をもつ傾向のあるもの、またはその症状を防御すべきものである。
【００４２】
本発明の要素または好適なその態様を導入する場合、不定冠詞および定冠詞はその要素が１つ以上あることを意味するものである。本明細書および請求項全体をとおして、用語「含んでなる」、「含有してなる」、「含有する」、「含む」および「有する」という用語は、包括的であるものとし、掲載した要素以外の要素も存在し得るものとする。
【００４３】
ヒトＩｇＧ２抗体：
本発明によると、モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体の安定性は、該抗体をエチレンジアミン四酢酸（“ＥＤＴＡ”）などのキレート化剤と混合することにより改善し得ることが発見された。
理論に囚われるつもりはないが、信じ得ることは、本発明組成物中のキレート化剤の存在が、以下の１つ以上の発生を低減させることにより、抗体ポリペプチドの安定性を改善する一助となることである：抗体の凝集、断片化、酸化、凍結／融解不安定性、変色、および／または脱アミノ化。本発明はすでに開示されている抗体組成物に比較して、化学的および／または物理的安定性の改善されたヒトＩｇＧ２抗体組成物を提供する。
【００４４】
従って、一定の局面において、本発明はＥＤＴＡなどのキレート化剤およびモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体またはその抗原結合部分を含有してなる組成物を提供する。さらに他の局面において、キレート化剤を含有してなる前記のヒトＩｇＧ２抗体組成物は、追加の医薬的に許容し得る添加剤、例えば、限定されるものではないが、バッファー、等調化剤、海面活性剤、抗酸化剤、およびその混合物から選択される１種以上の添加物を含有し得る。
【００４５】
十分理解されるように、抗原発現細胞を殺すことは一般に望ましいことではない。むしろ一般には抗原の結合を単に阻害することが望まれる。抗体が細胞を殺す主要メカニズムの一つは、補体の固定化とＣＤＣでの関与によるものである。抗体の定常領域は補体を固定し、ＣＤＣに関与する抗体能力と関連して重要な役割を演ずる。従って、補体固定化能力を提供するか、またはしないためには、イソタイプの抗体が一般に選択される。本発明の場合、一般には上に述べたように、細胞を殺す抗体を利用することは一般に好ましくない。補体固定化とＣＤＣに関わり得る多数のイソタイプ抗体が存在する；それらは限定されるものではないが、以下のものである：マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。対照的に、補体固定化とＣＤＣに関わり得ない好適なイソタイプは、限定されるものではないが、ヒトＩｇＧ２である。重鎖配列の相違に加えて、ＩｇＧ抗体はジスルフィド結合の数とヒンジ領域の長さに基づき、そのサブクラス内で異なっている。例えば、ＩｇＧ２サブクラスは他のサブクラスとは明瞭な幾つもの差異を有する。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラスはそのヒンジ領域内に４つのジスルフィド結合をもつことが知られているが、ＩｇＧ１は２つ、ＩｇＧ３は１１のジスルフィド結合を有する。ＩｇＧ２抗体についての他の相違はそれらが胎盤を通過する能力に劣ること、またＩｇＧ２抗体はリンパ球Ｆｃ受容体に結合し得ないことである。従って、特定の態様において、ヒト抗体はサブクラスのＩｇＧ２である。
【００４６】
また十分理解されるように、マウス、キメラまたはヒト化抗体に対比して、完全にヒトの抗体を利用することが一般的に望ましい。完全にはヒトのものでない抗体は、ヒト患者の免疫原性の増大と関連し、これが急速なクリアランスに導き、有効性を低下させ、注入反応の危険性を増大させる；これは比較的良性の発熱と発疹から心肺系およびアナフラキシー様有害事象の範囲に及び得る。参照例：Lonberg, N., Nature Biotechnology 23, 1117-1125 (2005)。
本発明での使用に適したヒトＩｇＧ２抗体の幾つかの例は以下の抗体であるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
ヒトＩｇＧ２抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体：
特定態様において、本発明での使用に適したヒトＩｇＧ２抗体は抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体を含む。適切な抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体およびそれらを調製する方法は、米国公開出願番号２００５００５９１１３(Bedian, et al.)に記載されている。他の態様において、本発明での使用に適した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体、米国公開出願番号２００５００５９１１３(Bedian, et al.)に記載されている抗体番号２５２、８８、１００、３．８．３、２．７．３、１．１２０．１、９．１４．４１、９．７．２１Ｆ、９．１４．４、８．１０．３、９．７．２、９．７．２Ｃ−Ｓｅｒ、９．１４．４Ｃ−Ｓｅｒ、８．１０．３Ｃ−Ｓｅｒ、８．１０．３−ＣＧ２、９．７．２−ＣＧ２、９．７．２−ＣＧ４、９．１４．４−ＣＧ２、９．１４．４−ＣＧ４、９．１４．４−Ｓｅｒ、９．７．２−Ｓｅｒ、８．１０．３−Ｓｅｒ、８．１０．３−ＣＧ４、８．１０．３ＦＧ１または９．１４．４Ｇ１の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する抗−Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体の１種以上である。さらに他の態様において、本発明での使用に適した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体は、米国公開出願番号２００５００５９１１３(Bedian, et al.)に８．１０．３Ｆと命名される抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する抗−Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体を含む。
【００４８】
さらに、かかる抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はその重鎖の定常領域のアミノ酸配列の差異に基づき選択し得る。例えば、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はＩｇＧ２クラスから選択可能であり、このものは「ガンマ」タイプの重鎖をもつ。抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体のクラスおよびサブクラスは技術上既知の方法により決定し得る。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定し得る。かかる抗体は市販品として入手し得る。クラスおよびサブクラスはＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロットならびに他の技法により決定し得る。あるいは、クラスおよびサブクラスは抗体の重鎖および／または軽鎖の定常領域の全部または一部を配列決定し、そのアミノ酸配列を種々のクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの既知アミノ酸配列と比較し、その抗体のクラスおよびサブクラスを決めることにより決定し得る。
【００４９】
他の態様において、適切な抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はその重鎖のアミノ酸配列の差異に基づき選択し得る。例えば、本発明の抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体は、以下のヒトＶH生殖系列遺伝子：ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、またはＶH５のいずれかを利用するガンマタイプの重鎖を有し得る。特定の態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はヒトＶH３生殖系列遺伝子を利用する。さらなる態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はヒトＶH３−４８生殖系列遺伝子を利用する。なおさらなる態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はＤ１−２６ヒトＤH遺伝子を利用する。なおさらなる態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はＪH４ヒトＪH遺伝子を利用する。本発明の目的上、「重鎖可変領域」はしばしば用語（ＶH）と略記する。
【００５０】
さらなる態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はその軽鎖のアミノ酸配列の差に基づき選択し得る。例えば、適切な抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体は、ラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖を有し得る。しかし、特定の態様において、本発明の抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はカッパ軽鎖を有する。一部態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体がカッパ軽鎖を含む場合、軽鎖の可変領域をエンコードするポリヌクレオチドは、ヒトＶKＬ５、Ｏ１２、Ｌ２、Ｂ３、Ｌ１５、またはＡ２７遺伝子およびヒトＪK１、ＪK２、ＪK３、ＪK４、またはＪK５遺伝子を含む。一部の態様において、該抗体がカッパ軽鎖を含む場合、該軽鎖の可変領域（ＶL）はヒトＶKＡ２７遺伝子とヒトＪK４遺伝子に一部エンコードされている。本発明の特定態様においては、軽鎖可変領域がヒトＶKＡ２７／ＪK３遺伝子にエンコードされている。
表１は抗−Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体８．１０．３Ｆについての重鎖および軽鎖ヒト生殖系列遺伝子由来および配列を掲載する。
【００５１】
【表１】
2006249085.tif 000002
【００５２】
本発明による抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体の一部ものは、ヒトＶH３−４８重鎖可変領域を利用するバイアスがかかって生成された。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスにおいては、抗体の生成に関わる３０種を超える別個の機能的重鎖可変遺伝子が存在する。それ故、バイアスは抗原に対する結合と機能的活性の組合わさった性質に関して、抗体−抗原相互作用の好適な結合モチーフを暗示している。
【００５３】
一部態様において、核酸分子はヒトＶ、ＤまたはＪ遺伝子の生殖系列アミノ酸配列に比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２．１３、１４、１５、１６、１７または１８の突然変異を含むアミノ酸配列をエンコードする。一部態様において、当該突然変異は重鎖可変領域に存在する。一部態様において、当該突然変異はＣＤＲ領域に存在する。
【００５４】
一部態様において、核酸分子はモノクローナル抗体８．１０．３ＦのＶHに見出されるアミノ酸突然変異に一致する生殖系列配列に比較して、１個以上のアミノ酸突然変異をエンコードする。一部態様において、該核酸は上記掲載モノクローナル抗体の一つに見出される少なくとも３つのアミノ酸変異に一致する生殖系列配列に比較して、少なくとも３つのアミノ酸突然変異をエンコードする。
【００５５】
一部態様において、核酸分子は抗体８．１０．３Ｆの一つのＶLに見出される突然変異に一致する生殖系列配列に比較して、１つ以上の変異体を含んでなるＶLアミノ酸配列をエンコードする。
一部態様において、核酸分子は抗体８．１０．３のＶLに見出される生殖系列配列に比較して、少なくとも３つのアミノ酸突然変異をエンコードする。
【００５６】
一部態様において、該抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、そのＶLおよびＶHドメインは一本のタンパク鎖を形成し得るような合成リンカーを介して対合し、一価の分子を形成する。Bird et al., Science 242:423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)。一部態様において、抗体はジアボディ、すなわち、二価の抗体であり、そのＶHとＶLドメインは一本のポリペプチド鎖上に発現するが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合し得るには短すぎるリンカーを使用しているために、該ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位を創出する。参照例：Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); and Poljak R.J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)。一部態様において、本発明抗体からの１種以上のＣＤＲは、共有結合により、または共有結合によらずに分子内に取り込ませ、Ｍ−ＣＳＦに特異的に結合する免疫アドヘシンとすることができる。かかる態様において、ＣＤＲはより大きなポリペプチド鎖の一部として取り込むことが可能であるか、共有結合により他のポリペプチド鎖に連結し得るか、または共有結合によらずに取り込むことができる。
【００５７】
もう一つの態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体は他のポリペプチドに対する選択性よりも少なくとも１００倍大きいＭ−ＣＳＦに対する選択性（特異性）を有する。一部の態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はＭ−ＣＳＦ以外の他のいずれのタンパク質に対しても、認知し得る特異結合性を示さない。Ｍ−ＣＳＦに対する抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体の選択性は、技術上周知の方法を用いて、明細書の教示に従い判定することができる。例えば、その選択性はウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡなどにより判定し得る。従って、一部の態様において、モノクローナル抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体は抗原であるＭ−ＣＳＦに特異的に結合することができる。
【００５８】
一部の態様において、本発明抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体の重鎖のＣ末端リジンは存在しない。本発明の様々な態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体の重鎖および軽鎖は、任意にシグナル配列を含み得る。
表１は抗−Ｍ−ＣＳＦモノクローナル抗体８．１０．３Ｆの重鎖および軽鎖を構成する核酸および対応する予測されるアミノ酸配列の配列アイデンティファイアー（配列番号）を掲載する。シグナルペプチドをエンコードするＤＮＡ配列は、配列アイデンティファイアーで示されるが、シグナルポリペプチドは翻訳後修飾に際して一般に除去されるので、該抗体は典型的にはシグナルポリペプチドを含まない。本発明の様々な態様においては、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体の重鎖および軽鎖の一方または両方がシグナル配列（またはシグナル配列の一部）を含む。本発明の他の態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体の重鎖も軽鎖もシグナル配列を含まない。
【００５９】
一部の態様において、該核酸分子は軽鎖アミノ酸配列をエンコードし、その配列は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％、配列番号４の抗体８．１０．３Ｆの軽鎖アミノ酸配列または配列番号６のＶLアミノ酸配列に一致する。本発明の核酸分子は、上記に説明したような高度緊縮条件下で、配列番号４の軽鎖アミノ酸配列をエンコードする核酸配列にハイブリッド形成する核酸であるか、または配列番号３のポリヌクレオチド配列を有する核酸である。
【００６０】
一部の態様において、該核酸分子はモノクローナル抗体８．１０．３Ｆの軽鎖アミノ酸配列またはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。一部の態様において、該核酸分子は配列番号３のモノクローナル抗体８．１０．３Ｆの軽鎖ポリヌクレオチドまたはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。一部の態様において、該核酸分子は配列番号６のモノクローナル抗体８．１０．３ＦのＶLアミノ酸配列またはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。一部の態様において、当該部分は少なくともＣＤＲ２領域を含む。一部の態様において、該核酸は当該抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をエンコードする。一部の態様において、当該部分はＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含む隣接する部分である。
【００６１】
一部の態様において、該核酸分子は重鎖アミノ酸配列をエンコードし、その配列は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％、配列番号２の抗体８．１０．３Ｆの重鎖アミノ酸配列または配列番号５のＶHアミノ酸配列に一致する。本発明の核酸分子は、上記に説明したような高度緊縮条件下で、配列番号２の重鎖アミノ酸配列をエンコードする核酸配列にハイブリッド形成する核酸であるか、または配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する核酸である。
【００６２】
一部の態様において、該核酸分子はモノクローナル抗体８．１０．３Ｆの重鎖アミノ酸配列またはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。一部の態様において、該核酸分子は配列番号２のモノクローナル抗体８．１０．３Ｆの重鎖ポリヌクレオチド配列またはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。一部の態様において、該核酸分子は配列番号５のモノクローナル抗体８．１０．３ＦのＶHアミノ酸配列またはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。一部の態様において、当該部分は少なくともＣＤＲ２領域を含む。一部の態様において、該核酸は当該抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をエンコードする。一部の態様において、当該部分はＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含む隣接する部分である。
【００６３】
さらなる態様において、該核酸分子は８．１０．３ＦのＶHアミノ酸配列（配列番号５）の少なくとも一部または同類アミノ酸突然変異および／または全部で３個以下の非同類アミノ酸置換を有する当該配列をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。様々な態様において、該配列は、１つ以上のＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、３つすべてのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含む隣接部分、または全ＶH領域をエンコードする。
【００６４】
なおさらなる態様において、該核酸分子は配列番号１の重鎖アミノ酸配列またはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。なおさらなる態様において、該核酸分子は配列番号５の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列またはその一部をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。
【００６５】
もう一つの態様において、該核酸は８．１０．３Ｆから選択される抗体の全長軽鎖、または配列番号４のアミノ酸配列と軽鎖の定常領域とを含んでなる軽鎖、または突然変異を含んでなる軽鎖をエンコードする。さらに、該核酸は配列番号３の軽鎖ポリヌクレオチド配列および軽鎖の定常領域をエンコードするポリヌクレオチド配列を含み得るか、または軽鎖をエンコードする核酸分子は突然変異を含み得る。
【００６６】
一部の態様において、該核酸分子は８．１０．３ＦのＶHアミノ酸配列（配列番号５）の少なくとも一部または同類アミノ酸突然変異および／または全部で３個以下の非同類アミノ酸置換を有する当該配列をエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。様々な態様において、該配列は１つ以上のＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、３つすべてのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含む隣接部分、または全ＶH領域をエンコードする。
【００６７】
本発明のもう一つの側面において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体は、種および分子両方の選択性を示す。一部の態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はヒト、カニクイザルおよびマウスのＭ−ＣＳＦに結合する。本明細書の教示に従えば、技術上周知の方法を用いて抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体についての種選択性を決定し得る。例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、細胞増殖アッセイ、またはＭ−ＣＳＦレセプター−結合アッセイを用いて、種選択性を決定し得る。好適な態様において、種選択性は細胞増殖アッセイまたはＥＬＩＳＡを用いて決定し得る。
【００６８】
もう一つの態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はＧＭ−／Ｇ−ＣＳＦに対するその選択性よりも少なくとも１００倍大きいＭ−ＣＳＦに対する選択性を有する。一部の態様において、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体はＭ−ＣＳＦ以外のいずれの他のタンパク質に対しても認識し得る特異的結合性を示さない。Ｍ−ＣＳＦに対する抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体の選択性は、本明細書の教示に従い、技術上周知の方法を用いて決定し得る。例えば、選択性はウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡを用いて決定し得る。
【００６９】
ヒトＩｇＧ２抗−ＣＴＬＡ−４抗体：
他の態様において、本発明での使用に適したヒトＩｇＧ２抗体は抗−ＣＴＬＡ−４抗体である。適切な抗−ＣＴＬＡ−４抗体およびその調製方法は米国特許第６，６８２，７３６号(Hanson, et al.;1999年12月23日出願)に記載されている。他の態様において、本発明での使用に適した抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第６，６８２，７３６号の１１．２．１と命名される抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体である。他の態様において、本発明での使用に適した抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、抗体チシリムマブ(ticilimumab)およびイピリムマブ(ipilimumab)の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体である。他の態様において、本発明での使用に適した抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、抗体チシリムマブの重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体である。
【００７０】
本明細書にて使用する場合、番号で参照する抗体は同じ番号のハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体と同じ重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する。例えば、モノクローナル抗体１１．２．１はハイブリドーマ１１．２．１から得られるものと同じ重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する。従って、抗体１１．２．１というときは、抗体チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（商標）をいい、このものはそれぞれ配列番号２２および２４に示した重鎖および軽鎖アミノ酸配列、および配列番号２５に示す重鎖の可変領域および配列番号２６に示す軽鎖の可変領域を有する。また、このものは重鎖上に末端リジンを欠く抗体も包含する；末端リジンは通常製造に際し、抗体の一部で失われる。
【００７１】
さらに、かかる抗−ＣＴＬＡ−４抗体はその重鎖の定常領域におけるアミノ酸配列の差に基づき選択し得る。例えば、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は「ガンマ」型重鎖を有するＩｇＧクラスから選択し得る。抗−ＣＴＬＡ−４抗体のクラスおよびサブクラスは技術上既知の方法により決定し得る。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは特定のクラスおよびサブクラスの抗体に特異的な抗体を使用して決定し得る。かかる抗体類は市販品として入手し得る。クラスおよびサブクラスはＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロットならびに他の技法により決定し得る。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部の配列を決定し、そのアミノ酸配列を種々クラスおよびサブクラスの免疫グロブリンの既知アミノ酸配列に比較し、該抗体のクラスおよびサブクラスを決定することにより決定し得る。
【００７２】
他の態様において、適切な抗−ＣＴＬＡ−４抗体はその重鎖のアミノ酸配列の差異に基づき選択し得る。例えば、本発明の抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、以下のヒトＶH生殖系列遺伝子、すなわち、ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、またはＶH５のいずれかを利用するヒトガンマ型重鎖を有し得る。特定の態様において、該抗−ＣＴＬＡ−４抗体はヒトＶH３生殖系列遺伝子を利用する。さらなる態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はヒトＶH３生殖系列遺伝子とヒトＤＰ−５０またはＤＰ−４６重鎖可変領域を利用し、他の態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はヒトＤＰ−５０重鎖可変領域を利用する。ＤＰ−５０遺伝子はＶH３−３３ファミリー遺伝子ともいう。ＤＰ−４６遺伝子はＶH３−３０．３ファミリー遺伝子ともいう。なおさらなる態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はＤ１−２６、ＤＩＲ４およびＤＩＲ３から選択されるヒトＤH遺伝子を利用し、他の態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はＤ１−２６ヒトＤH遺伝子を利用する。なおさらなる態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、ＪH４およびＪH６から選択されるヒトＪH遺伝子を利用し、他の態様においては、抗−ＣＴＬＡ−４抗体がＪH６ヒトＪH遺伝子を利用する。
【００７３】
さらなる態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はその軽鎖のアミノ酸配列の差異に基づき選択し得る。例えば、好適な抗−ＣＴＬＡ−４抗体はラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖を有し得る。しかし、特定の態様においては、本発明の抗−ＣＴＬＡ−４抗体はカッパ軽鎖を有する。一部の態様において、該抗−ＣＴＬＡ−４抗体がカッパ軽鎖を含む場合、該軽鎖の可変ドメインをエンコードするポリヌクレオチドは、ヒトＶKＬ５、Ｏ１２、Ｌ２、Ｂ３、Ｌ１５、またはＡ２７遺伝子、およびヒトＪK１、ＪK２、ＪK３、ＪK４、またはＪK５遺伝子を含んでなる。一部の態様において、該抗体がカッパ軽鎖を含む場合、軽鎖可変ドメイン（ＶL）は一部ヒトＶKＯ１２またはＶKＡ２７遺伝子およびヒトＪK３またはＪK４遺伝子によりエンコードされる。本発明の特定態様において、軽鎖可変ドメインはヒトＶKＯ１２／ＪK３遺伝子によりエンコードされている。
【００７４】
さらに、該抗体はＶH３−３０または３−３３遺伝子に由来するヒトＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列、またはその同類置換もしくは体細胞突然変異を含み得る。該ＶH３−３３遺伝子は抗体分子の重鎖可変領域のＦＲ１からＦＲ３をエンコードすると理解される。従って、本発明は抗体チシリムマブのＦＲ１からＦＲ３の配列と、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９１％、なおより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、なおより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、そしてもっとも好ましくは１００％同一性を有する抗体を包含する。
【００７５】
該抗体はさらにＡ２７またはＯ１２遺伝子由来の軽鎖のＣＤＲ領域を含み得るか、または抗体チシリムマブのＣＤＲ領域を含み得る。
本発明の他の態様において、該抗体はＣＴＬＡ４とＢ７−１、Ｂ７−２、またはその両方との結合を阻害する。好ましくは、該抗体はＢ７−１との結合を阻害可能であり、そのＩＣ50は約１００ｎＭ以下、より好ましくは約１０ｎＭ以下、例えば、約５ｎＭ以下、さらにより好ましくは約２ｎＭ以下、またはなおより好ましくは、例えば、約１ｎＭ以下である。同様に、該抗体はＢ７−２との結合を阻害可能であり、そのＩＣ50は約１００ｎＭ以下、より好ましくは約１０ｎＭ以下、例えば、なおより好ましくは約５ｎＭ以下、さらにより好ましくは約２ｎＭ以下、またはなおより好ましくは約１ｎＭ以下である。
【００７６】
さらに、もう一つの態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ４に対する結合親和性を有し、その親和性は約１０-8以上、より好ましくは約１０-9以上、より好ましくは約１０-10以上、またさらにより好ましくは約１０-11以上である。
抗−ＣＴＬＡ−４抗体は抗体チシリムマブの重鎖および軽鎖アミノ酸配列をもつ抗体と結合競合する抗体を包含する。さらに、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は結合に対し、抗体イピリムマブと競合し得る。
【００７７】
もう一つの態様において、該抗体は、好ましくは、抗体チシリムマブの重鎖および軽鎖配列、可変重鎖および可変軽鎖配列、および／または重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と交差競合する。例えば、該抗体は、抗体チシリムマブの重鎖および軽鎖アミノ酸配列、可変配列、および／またはＣＤＲ配列を有する抗体が結合するエピトープに結合し得る。もう一つの態様において、該抗体はＭＤＸ−Ｄ０１０の重鎖および軽鎖配列、または抗原結合配列を有する抗体と交差競合する。
【００７８】
もう一つの態様において、本発明は抗体チシリムマブのＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列を含む重鎖、およびＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、およびＣＤＲ−３のアミノ酸配列、または同類変化、非同類置換、付加および欠失からなる群より選択されるＣＤＲ配列からの変化をもつ配列を含む軽鎖を含んでなる抗−ＣＴＬＡ−４抗体を用いて実施する；この場合、同類変化は、非極性残基と他の非極性残基との置換、極性荷電残基と他の極性非荷電残基との置換、極性荷電残基と他の極性荷電残基との置換、および構造的に類似の残基の置換からなる群より選択される；ただし、非同類置換は極性荷電残基と極性非荷電残基との置換および非極性残基と極性残基との置換からなる群より選択される。
【００７９】
本発明のさらなる態様において、該抗体は枠組みまたはＣＤＲ領域における生殖系列配列からの１０、７、５、または３未満のアミノ酸変化を含む。もう一つの態様において、該抗体は枠組み領域において５未満のアミノ酸変化と、ＣＤＲ領域において１０未満の変化を含む。好適な一態様において、該抗体は枠組み領域において３未満のアミノ酸変化と、ＣＤＲ領域において７未満の変化を含む。好適な態様において、枠組み領域における変化は保存的であり、ＣＤＲ領域における変化は体細胞突然変異である。
【００８０】
なおより好適には、該抗体は、抗体チシリムマブの重鎖および軽鎖に関し、または重鎖もしくは軽鎖と、それぞれ１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
もう一つの態様において、該抗体は生殖系列ＶKＡ２７、生殖系列ＶKＯ１２、および生殖系列ＤＰ５０（ＶH３−３３遺伝子座の対立遺伝子である）の配列と、重鎖および軽鎖全長配列に関し、または重鎖または軽鎖に関し、それぞれに、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性または配列類似性を共有する。なおより好ましくは、該抗体は生殖系列ＤＰ５０の重鎖配列に関し、および／または生殖系列Ａ２７または生殖系列Ｏ１２の軽鎖配列と１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８１】
一態様において、該抗体は、抗体３．１．１、４．１．１、４．８．１、４．１０．２、４．１３．１、４．１４．３、６．１．１、チシリムマブ、１１．６．１、１１．７．１、１２．３．１．１、１２．９．１．１、イピリムマブの配列と、重鎖および軽鎖可変領域配列に関して、または重鎖または軽鎖可変領域配列に関して、それぞれに、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の配列（例えば、アミノ酸、核酸、または両方）同一性または配列類似性を共有する。なおより好ましくは、該抗体は、抗体３．１．１、４．１．１、４．８．１、４．１０．２、４．１３．１、４．１４．３、６．１．１、チシリムマブ、１１．６．１、１１．７．１、１２．３．１．１、１２．９．１．１、イピリムマブから選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列に関して、または重鎖または軽鎖可変領域配列と、１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８２】
もう一つの態様において、該抗体は重生殖系列ＤＰ５０の重鎖可変配列（ＶH３−３３遺伝子座の対立遺伝子である）と、または生殖系列ＶKＡ２７もしくは生殖系列ＶKＯ１２の軽鎖可変配列と、重鎖可変領域配列に関して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性または配列類似性を共有する。なおより好ましくは、該抗体の重鎖領域配列は生殖系列ＤＰ５０の配列と、または生殖系列Ａ２７または生殖系列Ｏ１２の軽鎖配列と、１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８３】
本発明の一態様において、該抗体は、抗体チシリムマブのＦＲ１ないしＦＲ４領域配列と、ＦＲ１ないしＦＲ４の重鎖、軽鎖、またはその両方の配列で、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性または配列類似性を共有する。なおより好ましくは、該抗体は抗体チシリムマブと、ＦＲ１ないしＦＲ４の重鎖、軽鎖、またはその両方で、１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８４】
本発明のもう一つの態様において、該抗体は、生殖系列ＤＰ５０のＦＲ１ないしＦＲ３領域の配列と、ＦＲ１ないしＦＲ３の重鎖配列で、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、もっとも好ましくは１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８５】
本発明のさらにもう一つの態様において、該抗体は、生殖系列ＶKＡ２７または生殖系列ＶKＯ１２のＦＲ１ないしＦＲ４領域配列と、ＦＲ１ないしＦＲ４の軽鎖配列で、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、もっとも好ましくは１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８６】
本発明の一態様において、該抗体は、抗体チシリムマブの重鎖、軽鎖、またはその両方のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性または配列類似性を共有する。なおより好ましくは、該抗体は抗体チシリムマブと、重鎖、軽鎖、またはその両方のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３配列に関して、１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８７】
本発明のもう一つの態様において、該抗体は、生殖系列ＤＰ５０のＣＤＲ−１およびＣＤＲ−２配列と、重鎖ＣＤＲ−１およびＣＤＲ−２配列で、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、また、もっとも好ましくは約１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
【００８８】
本発明のさらにもう一つの態様において、該抗体は、生殖系列ＶKＡ２７または生殖系列ＶKＯ１２のＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３配列と、軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２およびＣＤＲ−３配列で、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、また、もっとも好ましくは約１００％の配列同一性または配列類似性を共有する。
一態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はチシリムマブとして知られる抗体である。
表２は抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体１１．２．１（すなわち、チシリムマブ）の重鎖および軽鎖ヒト生殖系列遺伝子の由来を掲載する。
【００８９】
【表２】
2006249085.tif 000003
【００９０】
本発明による抗体は、観察されるように、その生成にＤＰ−５０重鎖可変領域を利用する強いバイアスをもっていた。ＤＰ−５０遺伝子はＶH３−３３ファミリー遺伝子ともいう。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスには、抗体を生成するための３０種を超える機能的重鎖可変遺伝子が存在する。従って、バイアスは抗原に対する結合と機能的活性の組合わさった性質に関して、抗体−抗原相互作用の好適な結合モチーフについて暗示している。
【００９１】
一部の態様において、該抗体は、ＶLとＶHドメインが対合して、一本のタンパク鎖を形成し得るようにする合成リンカーを介し、一価の分子を形成する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。Bird et al., Science 242:423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)。一部の態様において、該抗体はジアボディ、すなわち、二価の抗体であり、そのＶHとＶLドメインは一本のポリペプチド鎖上に発現するが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合し得るには短すぎるリンカーを使用しているために、該ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位を創出する。参照例：Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), and Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994)。一部の態様において、本発明抗体からの１種以上のＣＤＲは、共有結合によるか、または非共有結合により分子に取り込まれ、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する免疫アドヘシンとなり得る。かかる態様において、ＣＤＲはポリペプチド鎖の部分として取り込まれ得るか、別のポリペプチド鎖に共有結合により結合するか、または非共有結合により取り込まれ得る。
【００９２】
もう一つの態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ−４に対し、他のいずれのポリペプチドに対する選択性よりも少なくとも１００倍大きな選択性を有する。一部の態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ−４以外の他のいずれのタンパク質に対しても認知し得る特異的結合性を示さない。ＣＴＬＡ−４に対する抗−ＣＴＬＡ−４抗体の選択性は、本明細書の教示に従い、技術上周知の方法を用いて決定し得る。例えば、選択性はウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡを用いて決定し得る。従って、一部の態様において、モノクローナル抗−ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ−４に特異的に結合し得る。
【００９３】
一部の態様においては、本発明の抗−ＣＴＬＡ−４抗体重鎖のＣ末端リジンが存在しない。本発明の様々な態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖および軽鎖はシグナル配列を任意に含み得る。
表３は抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体１１．２．１についての重鎖および軽鎖をエンコードする核酸および対応する予測されるアミノ酸配列の配列アイデンティファイアー（配列番号）を掲載する。
【００９４】
【表３】
2006249085.tif 000004
【００９５】
一部の態様において、核酸分子はモノクローナル抗体１１．２．１の軽鎖配列をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号２３）またはその一部を含んでなる。一部の態様において、該核酸分子はモノクローナル抗体１１．２．１のＶLアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号２６）またはその一部を含んでなる。一部の態様において、該核酸分子はモノクローナル抗体１１．２．１の軽鎖アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）またはその一部を含んでなる。一部の態様において、当該一部分は少なくともＣＤＲ２領域を含んでなる。一部の態様において、該核酸は当該抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をエンコードする。一部の態様において、当該一部分はＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含んでなる隣接部分である。特定の側面において、軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号３０により、また軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号３１により、また軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号３２により示される。
【００９６】
他の態様において、該核酸分子は配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖アミノ酸をエンコードする。
一部の態様において、該核酸分子はモノクローナル抗体１１．２．１の重鎖配列をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号２１）またはその一部を含んでなる。一部の態様において、該核酸分子はモノクローナル抗体１１．２．１のＶHアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列（配列番号２５）またはその一部を含んでなる。他の態様において、該核酸分子は配列番号２４の重鎖アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列またはその一部を含んでなる。本発明の核酸分子は本明細書に記載の条件など、高度緊縮条件下に、配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列をエンコードする核酸配列にハイブリッド形成する核酸を包含する。
【００９７】
さらなる態様において、該核酸分子は１１．２．１のＶHアミノ酸配列（配列番号２５）または同類アミノ酸変異および／または合計３以下の非同類アミノ酸置換をもつ当該配列の、少なくとも一部をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる。様々な態様において、該配列は１つ以上のＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、３つすべてのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含む隣接部分、または全ＶH領域をエンコードする。特定の側面において、重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列は配列番号２７により、また重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列は配列番号２８により、また重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列は配列番号２９により示される。
【００９８】
特定の側面において、本発明はＣＴＬＡ−４に結合する少なくとも１種の単離ヒト抗体（ただし、抗体はヒトＶH３−３３生殖系列遺伝子を利用するＶHアミノ酸配列を含んでなる）およびキレート化剤を含んでなる医薬的に許容し得る添加剤を含んでなる液状医薬組成物を提供する。
他の側面において、本発明はＣＴＬＡ−４に結合する少なくとも１種の単離ヒト抗体を含んでなる液状医薬組成物を提供する；ただし、該抗体は配列番号２２に少なくとも９０％の配列同一性をもつ重鎖アミノ酸配列および配列番号２４に少なくとも９０％の配列同一性をもつ軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。
【００９９】
他の側面において、本発明はＣＴＬＡ−４に結合する少なくとも１種の単離ヒト抗体を含んでなる液状医薬組成物を提供する；ただし、該抗体は配列番号２２に少なくとも９５％の配列同一性をもつ重鎖アミノ酸配列および配列番号２４に少なくとも９５％の配列同一性をもつ軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。
他の側面において、本発明はＣＴＬＡ−４に結合する少なくとも１種の単離ヒト抗体を含んでなる液状医薬組成物を提供する；ただし、該抗体は配列番号２２に少なくとも９９％の配列同一性をもつ重鎖アミノ酸配列および配列番号２４に少なくとも９９％の配列同一性をもつ軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。
【０１００】
さらに他の側面において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は配列番号２２の可変領域を含む重鎖アミノ酸配列および配列番号２４の可変領域を含む軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。さらなる側面において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は配列番号２５を含んでなる重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号２６を含んでなる軽鎖可変領域アミノ酸配列を含んでなる。さらなる側面において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は配列番号２２を含んでなる重鎖アミノ酸配列および配列番号２４を含んでなる軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。さらに他の側面において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列と枠内で操作可能に結合したヒトＶH３−３３遺伝子ファミリーを利用するヒトＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３配列を含んでなるＶHアミノ酸配列を含んでなる。
【０１０１】
一態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体はチシリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６としても知られる）であり、この抗体は抗体チシリムマブの重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する。本発明の一態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は特異的にヒトＣＴＬＡ−４上の立体配座エピトープに結合する。他の態様において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体は被験対象に投与後、ヒト腫瘍増殖を阻害する。
【０１０２】
ヒトＩｇＧ２抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体：
他の態様において、本発明での使用に適するヒトＩｇＧ２抗体は抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体である。適切な抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体およびその調製方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０００３７０（２００５年１月７日出願；２００５年７月２８日公開）に記載されている。他の態様において、本発明での使用に適する抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体は、抗−ＭＡｄＣＡＭモノクローナル抗体であり、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０００３７０の７．１６．６と命名される抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する。
【０１０３】
本発明での使用に適する抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体から選択し得る。特定の側面において、モノクローナル抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体はヒト抗体でもよい。さらなる態様において、モノクローナル抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体はヒトモノクローナル抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体である。抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体はヒトＩｇＧ２抗体でもよい。
【０１０４】
さらに、かかる抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体は、その重鎖の定常領域におけるアミノ酸配列の差異に基づき選択し得る。例えば、該抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体は「ガンマ」型重鎖を有するＩｇＧクラスから選択し得る。抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体のクラスおよびサブクラスは、技術上既知の方法により決定し得る。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて決定し得る。かかる抗体は市販品として入手し得る。該クラスおよびサブクラスはＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロットならびに他の技法により決定し得る。あるいは、クラスおよびサブクラスは該抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部を配列決定し、そのアミノ酸配列を種々クラスおよびサブクラスの免疫グロブリンに比較し、抗体のクラスおよびサブクラスを決定することにより決定し得る。
【０１０５】
一部の態様において、該抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、そのＶLおよびＶHドメインは一本のタンパク鎖を形成し得るような合成リンカーを介して対合し、一価の分子を形成する。(Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:: 5879-5883 (1988))。一部態様において、抗体はジアボディ、すなわち、二価の抗体であり、そのＶHとＶLドメインは一本のポリペプチド鎖上に発現するが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合し得るには短すぎるリンカーを使用しているために、該ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位を創出する。（参照例：Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); and Poljak R.J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994))。一部態様において、本発明抗体からの１種以上のＣＤＲは、共有結合により、または共有結合によらずに分子内に取り込ませ、ＭＡｄＣＡＭに特異的に結合する免疫アドヘシンとすることができる。かかる態様において、ＣＤＲはより大きなポリペプチド鎖の一部として取り込むことが可能であるか、共有結合により他のポリペプチド鎖に連結し得るか、または共有結合によらずに取り込むことができる。
【０１０６】
もう一つの態様において、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体は他のポリペプチドに対する選択性よりも少なくとも１００倍大きいＭＡｄＣＡＭに対する選択性（特異性）を有する。一部の態様において、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体はＭＡｄＣＡＭ以外の他のいずれのタンパク質に対しても認知し得る特異結合性を示さない。ＭＡｄＣＡＭに対する抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体の選択性は、技術上周知の方法を用いて、明細書の教示に従い判定することができる。例えば、その選択性はウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡなどにより判定し得る。従って、一部の態様において、モノクローナル抗−ＭＡｄＣＡＭ抗は抗原であるＭＡｄＣＡＭに特異的に結合することができる。
一部の態様においては、本発明抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖にＣ末端リジンが存在しない。本発明の様々な態様において、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を任意に含み得る。
【０１０７】
表４は抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体モノクローナル抗体７．１６．６についての重鎖および軽鎖をエンコードする核酸および対応する予測されるアミノ酸配列の配列アイデンティファイアー（配列番号）を掲載する。シグナルポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列は配列アイデンティファイアー（配列番号）に示すが、抗体は、シグナルポリペプチドが一般に翻訳後修飾に際して除去されるため、一般にはシグナルポリペプチドを含まない。本発明の種々の態様において、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖および軽鎖の一方または両方は、シグナル配列（またはシグナル配列の一部）を含む。本発明の他の態様においては、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体の重鎖も軽鎖もシグナル配列を含まない。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
一部の態様において、該核酸分子はモノクローナル抗体７．１６．６のＶLアミノ酸配列（配列番号４４）またはその一部をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる。一部の態様において、当該部分は少なくともＣＤＲ２領域を含む。一部の態様において、該核酸は当該抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をエンコードする。一部の態様において、当該部分はＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含む隣接する部分である。
【０１１０】
さらに他の態様において、該核酸分子はＶLアミノ酸配列をエンコードし、その配列は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、抗体７．１６．６のＶLアミノ酸配列または配列番号４４のアミノ酸配列に一致する。本発明の核酸分子は、上記に説明したような高度緊縮条件下で、配列番号４４の軽鎖アミノ酸配列をエンコードする核酸配列にハイブリッド形成する核酸である。
【０１１１】
さらなる態様において、該核酸分子は７．１６．６のＶHアミノ酸配列（配列番号４２）または同類アミノ酸変異および／または合計３以下の非同類アミノ酸置換をもつ当該配列の、少なくとも一部をエンコードするヌクレオチド配列を含んでなる。様々な態様において、該配列は１つ以上のＣＤＲ領域、好ましくはＣＤＲ３領域、３つすべてのＣＤＲ領域、ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含む隣接部分、または全ＶH領域をエンコードする。
【０１１２】
一部の態様において、該核酸分子はＶHアミノ酸配列をエンコードし、その配列は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、配列番号４２のＶHアミノ酸配列に一致する。本発明の核酸分子は、上記に説明したような高度緊縮条件下で、配列番号４２の重鎖アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸である。
【０１１３】
他の側面において、本発明はＭＡｄＣＡＭに結合する少なくとも１種の精製ヒト抗体を含有してなる組成物を提供する；ただし、該抗体は配列番号４２に少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号４４に少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。他の側面において、該抗体は配列番号４２に少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列、および配列番号４４に少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。さらに他の側面において、該抗体は配列番号４２の可変領域を含んでなる重鎖アミノ酸配列、および配列番号４４の可変領域を含んでなる軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。さらなる側面において、該抗体は配列番号４２を含んでなる重鎖アミノ酸配列、および配列番号４４を含んでなる軽鎖アミノ酸配列を含んでなる。
【０１１４】
本発明の一態様において、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体はヒトＭＡｄＣＡＭ上の立体配座エピトープに特異的に結合する。他の態様において、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体は被験対象に投与後、ヒトの腫瘍増殖を阻害する。
【０１１５】
モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体組成物の調製：
ヒトＩｇＧ２抗体は一般に被験対象に非経口投与するための医薬組成物として製剤化する。特定の態様において、該医薬組成物は液状組成物である。
一態様において、本発明はヒトＩｇＧ２抗体およびキレート化剤を含有してなる組成物を目的とする。もう一つの態様において、本発明はヒトＩｇＧ２抗体およびキレート化剤を含有してなる液状組成物を目的とする。もう一つの態様において、本発明はヒトＩｇＧ２抗体およびＥＤＴＡを含有してなる組成物を目的とする。もう一つの態様において、本発明はヒトＩｇＧ２抗体およびＥＤＴＡを含有してなる液状医薬組成物を目的とする。
【０１１６】
用語「医薬組成物」とは有効成分の生物活性を有効とするような形状の製剤をいう。一部の態様において、医薬組成物は液状医薬組成物である。「医薬的に許容し得る添加剤」（媒体、添加物）は、採用される有効成分の有効量を提供するために、被験対象に合理的に（すなわち、安全に）投与し得る添加剤である。用語「添加剤」または「担体」は、本明細書にて使用する場合、不活性な物質であり、通常、医薬用の希釈剤、媒体、保存剤、結合剤または安定剤として使用される物質である。本明細書に使用される場合、「希釈剤」という用語は、医薬的に許容し得る（ヒトへの投与に安全で非毒性の）溶媒をいい、本明細書の液状組成物の調製に有用である。例示となる希釈剤は無菌水および注射用静菌水（ＢＷＦＩ）であるが、限定されるものではない。
【０１１７】
本発明の組成物は、１種以上の本発明ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体を、キレート化剤を含んでなる医薬的に許容し得る添加剤と組合わせて含む。本発明の液状組成物は、１種以上の本発明ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体を、キレート化剤を含んでなる医薬的に許容し得る添加剤と組合わせて含む。一態様において、本発明はヒトモノクローナルＩｇＧ２抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する少なくとも１種の抗体とキレート化剤とを含有してなる組成物を包含する。もう一つの態様において、本発明はヒトモノクローナルＩｇＧ２抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する少なくとも１種の抗体、キレート化剤、および選択肢としてさらに追加の医薬的に許容し得る添加剤とを含有してなる液状組成物を包含する。
【０１１８】
本発明組成物におけるヒトＩｇＧ２抗体の濃度は、一般に、１ミリリットルあたり少なくとも約０．１ミリグラム（ｍｇ／ｍｌ）以上、少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌ以上、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ以上、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ以上、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ以上、少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ以上、または少なくとも約２００ｍｇ／ｍｌ以上である。特定の態様において、ヒトＩｇＧ２抗体の濃度は一般に約０．１ｍｇ／ｍｌないし約２００ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌないし約１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌないし約５０ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌないし約３５ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌないし約２５ｍｇ／ｍｌ、または約７ｍｇ／ｍｌないし約１５ｍｇ／ｍｌの範囲である。一態様において、本発明組成物におけるヒトＩｇＧ２抗体の濃度は、一般に約５ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約６５ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約８５ｍｇ／ｍｌ、または約１００ｍｇ／ｍｌである。もう一つの態様において、該組成物におけるヒトＩｇＧ２抗体の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌないし約５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。一態様において、該組成物におけるヒトＩｇＧ２抗体の濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌである。もう一つの態様において、ヒトＩｇＧ２抗体の濃度は、約７５ｍｇ／ｍｌである。
【０１１９】
もう１つの実施形態では、組成物中のヒトＩｇＧ２抗体の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。組成物が皮下送達用に意図される場合には、より高い抗体濃度を用いる実施形態もある。
【０１２０】
本明細書において、用語「キレート剤」とは、一般に、金属イオンと少なくとも１つの結合（例えば、共有、イオン、または別の）を形成し得る賦形剤を指す。キレート剤とは、通常、選択した液体組成物において、不安定性を促進し得る種を含む錯体に対して安定化剤として使用できる多座配位子である。キレート剤として作用し得る化合物は、電子が豊富な官能基を含むことが多い。適した、電子が豊富な官能機としては、カルボン酸基、ヒドロキシ基およびアミノ基が挙げられる。アミノポリカルボン酸、ヒドロキシポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸などにおけるこれらの基の配置によって、金属と結合する能力を有する部分が生じる。
【０１２１】
しかし、本発明は、主に、金属イオンと結合を形成するキレート剤の能力によるキレート剤に限定されるよう意図されるものではない。したがって、本発明は、本発明の組成物においてキレート剤が作用する、いずれかの具体的な機構によって限定されるよう意図されるものではなく、本明細書においてキレート剤と呼ばれる賦形剤は、金属イオンと結合を形成するキレート剤の能力とは全く無関係な機構によって特性を達成する場合もある。
【０１２２】
本発明に用いるのに適したキレート剤としては、それだけには限らないが、アミノポリカルボン酸、ヒドロキシアミノカルボン酸、Ｎ−置換グリシン、２−（２−アミノ−２−オキソクチル）アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、デフェロキサミン（ＤＥＦ）、クエン酸、ナイアシナミド、およびデスオキコレートが挙げられる。適したアミノポリカルボン酸の例としては、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノジ酢酸（ＡＤＡ）、ビス（アミノエチル）グリコールエーテル、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、トランス−ジアミノシクロヘキサンテトラ酢酸（ＤＣＴＡ）、グルタミン酸、およびアスパラギン酸が挙げられる。適したヒドロキシアミノカルボン酸の例としては、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノジ酢酸（ＨＩＭＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン（ビシン）およびＮ−（トリスヒドロキシメチルメチル）１０グリシン（トリシン）が挙げられる。適したＮ−置換グリシンの例としては、グリシルグリシンがある。適したデスオキシコレートの例としては、デスオキシコール酸ナトリウムがある。２種以上のキレート剤の混合物も本発明に包含される。
【０１２３】
本発明に用いるキレート剤は、可能であれば、化合物の遊離酸または遊離塩基の形（例えば、本明細書では、同義的に「ＥＤＴＡ」または「エデト酸塩」と呼ばれる）として、または対応する塩の形（例えば、対応する酸付加塩または塩基付加塩、例えば、エデト酸二ナトリウム）として存在し得る。適した酸付加塩としては、例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）が挙げられ、塩はその他の弱く結合される金属イオンを用いても調製できる。当技術分野では公知であるが、塩の性質および中和されるべき電荷数は、存在するカルボキシル基の数および安定化キレート剤が供給されるｐＨに応じて変わる。当技術分野では公知であるが、キレート剤は、個々の標的イオンが結合される様々な強さを有する。さらなる例示としては、ＥＤＴＡの適した塩として、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、およびエデト酸カリウムが挙げられ、デフェロキサミン（ＤＥＦ）の適した塩としては、デフェロキサミンメシレート（ＤＦＭ）がある。
【０１２４】
本発明に用いるキレート剤は、化合物または対応する塩の無水物の形、溶媒和物の形または水和物の形として存在する場合もある。キレート剤が溶媒和物の形または水和物の形である場合には、溶媒和または水和の種々の状態で存在し得る（例えば、無水物の形、水和物の形、二水和物の形、および三水和物の形を含む）。さらなる例示としては、ＥＤＴＡの適した水和物として、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物があり、クエン酸の適した形としては、無水クエン酸、クエン酸一水和物、およびクエン酸三ナトリウム二水和物が挙げられる。
【０１２５】
また、本発明の抗体組成物に用いる適したキレート剤としては、例えば、溶液中で金属イオンと結合し、それらを、利用可能なＯ2と反応できなくし、それによって、抗体と自由に反応し、分解するヒドロキシルラジカルの生成を最小化するか防ぐものが挙げられる。キレート剤は、本発明の組成物において、還元された酸素種の形成を低下させ、酸性種（脱アミド）形成を減少させ、抗体凝集を減少させ、かつ／または抗体断片化を減少させることができる。このようなキレート剤は、キレート剤で保護されずに製剤された抗体の分解を減少または阻止することができる。
【０１２６】
キレート剤の濃度が記載される場合には、記載された濃度は遊離酸または遊離塩基の形のキレート剤のモル濃度を表すものとする。例えば、特定の液体薬剤組成物では、キレート剤の濃度は、通常、約０．０１マイクロモル〜約５０ミリモル、約１マイクロモル〜約１０．０ミリモル、約１５マイクロモル〜約５．０ミリモル、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモル、約０．０３ミリモル〜約０．５ミリモルの範囲である。特定の実施形態では、液体薬剤組成物中のキレート剤の濃度は、約０．０１ミリモル、０．０２ミリモル、０．０２７ミリモル、０．０３ミリモル、約０．０４ミリモル、約０．０５ミリモル、約０．０６ミリモル、約０．０７ミリモル、約０．１０ミリモル、約０．２０ミリモル、約０．２６ミリモル、約０．２７ミリモル、約０．３０ミリモル、約０．３１ミリモル、約０．３４ミリモル、約０．４０ミリモル、約０．５０ミリモル、または約１．０ミリモルであり得る。特定の実施形態では、キレート剤の濃度は約０．０２７ミリモル、約０．０５ミリモル、約０．１３ミリモル、または約０．２７ミリモルである。一実施形態では、キレート剤の濃度は、約０．０５ミリモルである。もう１つの実施形態では、キレート剤の濃度は、約０．１３ミリモルである。
【０１２７】
特に断りのない限り、本明細書に列挙した濃度は周囲条件（すわなち、２５℃および大気圧）での濃度である。前記のキレート剤濃度の中間にある範囲も本発明の一部であるものとする。例えば、上限および／または下限として、いずれかの前記の値の組合せを用いる値の範囲も含まれるものとする。
【０１２８】
一実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＦＭ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。もう１つの実施形態では、キレート剤はＤＦＭである。もう１つの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。もう１つの実施形態では、キレート剤はＤＴＰＡである。もう１つの実施形態では、本組成物は、通常、約０．０１マイクロモル〜約５０ミリモル、約１マイクロモル〜約２０．０ミリモル、約１５マイクロモル〜約１０．０ミリモル、約０．０１ミリモル〜約５．０ミリモル、または約０．０３ミリモル〜約１ミリモルの範囲の量のＥＤＴＡを含んでなる。特定の実施形態では、組成物中のＥＤＴＡの濃度は、約０．０１ミリモル、０．０２ミリモル、０．０２７ミリモル、０．０３ミリモル、約０．０４ミリモル、約０．０５ミリモル、約０．０６ミリモル、約０．０７ミリモル、約０．１０ミリモル、約０．２０ミリモル、約０．２６ミリモル、約０．２７ミリモル、約０．３０ミリモル、約０．３１ミリモル、約０．３４ミリモル、約０．４０ミリモル、約０．５０ミリモル、または約１．０ミリモルであり得る。特定の実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は約０．０２７ミリモル、約０．０５ミリモル、約０．１３ミリモル、または約０．２７ミリモルである。一実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は約０．０５ミリモルである。もう１つの実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は約０．１３ミリモルである。
【０１２９】
前記のように、本発明の組成物は、キレート剤に加え、バッファーをさらに含んでなる場合もある。本明細書において、用語「バッファー」とは、液体抗体組成物がｐＨの変化に耐えるのを可能にする、添加される組成物を指す。
【０１３０】
特定の実施形態では、添加されるバッファーにより、組成物が（液体形態の場合には）、その酸−塩基共役成分の作用によってｐＨの変化に耐えることが可能となる。例えば、緩衝された組成物は、所望のｐＨに到達するのに適当な量のＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ（Ｌ−ヒスチジン−ヒドロクロリド）およびＬ−ヒスチジンを添加することによって調製できる。しかしながら、他の実施形態では、添加されるバッファーによって、液体抗体組成物が、その酸−塩基共役成分の作用によってｐＨの変化に耐えることが可能となる。第２の例として、緩衝された組成物は、所望のｐＨに到達するのに適当な量の酸、例えば、塩酸、およびＬ−ヒスチジンを添加することによって調製できる。
【０１３１】
適したバッファーの例としては、それだけには限らないが、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、クエン酸塩（例えば、および、それだけには限らないが、アミノ酸（例えば、ヒスチジン）、酢酸、リン酸およびリン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸塩、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、カルボン酸および重炭酸塩、コハク酸、安息香酸ナトリウムおよび安息香酸塩、グルコン酸塩、エデト酸塩（ＥＤＴＡ）、酢酸塩、リンゴ酸塩、イミダゾール、トリス、リン酸塩、およびそれらの混合物などのバッファーをはじめとするその他の有機酸バッファーが挙げられる。一実施形態では、バッファーは酢酸塩である。
【０１３２】
もう１つの実施形態では、バッファーはヒスチジンである。本発明の組成物を調製するために用いるヒスチジン出発物質は、種々の形で存在し得る。例えば、ヒスチジンは、ヒスチジンの鏡像異性体（例えば、Ｌ−またはＤ−鏡像異性体）またはラセミ体の形、ヒスチジンの遊離酸または遊離塩基の形、ヒスチジンの塩の形（例えば、一塩酸塩、二塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、または酢酸塩）、ヒスチジンの溶媒和物の形、ヒスチジンの水和物の形（例えば、一水和物）、またはヒスチジンの無水物の形であり得る。組成物を調製するために用いるヒスチジン塩基および／または塩の純度は、通常、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％であり得る。本明細書において、用語「純度」とは、ヒスチジンとの関連では、当技術分野で理解されるような、例えば、ザ・メルク・インデックス(The Merck Index)、第１３版、オニールら編（メルク社(Merck&Co.)、2001)に記載されるような、ヒスチジンの化学純度を指す。
【０１３３】
バッファーの濃度が記載される場合には、記載された濃度は遊離酸または遊離塩基の形のバッファーのモル濃度を表すものとする。例えば、特定の液体薬剤組成物中に存在する場合、バッファーの濃度は約０．１ミリモル（ｍＭ）〜約１００ｍＭの範囲であり得る。一実施形態では、バッファーの濃度は約１ｍＭ〜約５０ｍＭである。もう１つの実施形態では、バッファーの濃度は約５ｍＭ〜約３０ｍＭである。種々の実施形態では、バッファーの濃度は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭである。一実施形態では、本薬剤組成物中のヒスチジンの濃度は、約１０ｍＭである。もう１つの実施形態では、薬剤組成物は約１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（塩基の形の）を含む。もう１つの実施形態では、本薬剤組成物中のヒスチジンの濃度は、約２０ｍＭである。もう１つの実施形態では、本薬剤組成物は約２０ｍＭのＬ−ヒスチジン（塩基の形の）を含む。前記のヒスチジン濃度の中間にある範囲も本発明の一部であるものとする。例えば、上限および／または下限として、いずれかの前記の値の組合せを用いる値の範囲も含まれるものとする。
【０１３４】
一般に、バッファーは、組成物中の（抗体安定性に影響を及ぼし得る）許容されるｐＨレベルを維持するために用いる。通常、本組成物は、約４〜約８、約４．５〜約７、約５．０〜６．５、約５．２〜約５．８、または約５．２〜約６．３の範囲のｐＨを維持するよう緩衝される。前記のｐＨの中間にある範囲も本発明の一部であるものとする。例えば、上限および／または下限として、いずれかの前記の値の組合せを用いる値の範囲も含まれるものとする。一実施形態では、本組成物は約５．５のｐＨを維持するよう緩衝される。もう１つの実施形態では、本組成物は約６．０のｐＨを維持するよう緩衝される。
【０１３５】
前記のように、本発明の組成物は、キレート剤に加え、製薬上許容される等張化剤をさらに含んでなる場合もある。本明細書において、用語「等張化剤(tonicity agent)」または「等張化剤(tonicifier)」」とは、液体抗体組成物の浸透圧を調節できる賦形剤を指す。特定の実施形態では、等張化剤は液体抗体組成物の浸透圧を調節し、抗体組成物が、被験体の身体組織の細胞と生理学的に適合するよう等張にすることができる。さらにその他の実施形態では、「等張化剤」は、本明細書に記載した、いずれかのヒトＩｇＧ２抗体の安定性の向上に寄与し得る。「等張」組成物とは、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張組成物は、通常、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。用語「低張の」とは、浸透圧がヒト血液のものよりも低い組成物を説明する。これに対して、用語「高張の」とは、浸透圧がヒト血液のものよりも高い組成物を説明するために用いる。等張性は、例えば、蒸気圧浸透圧計またはアイス−フリージング浸透圧計を用いて測定できる。
【０１３６】
本発明の組成物を調製するために用いる等張化剤は、種々の形で存在し得る。等張化剤が記載される場合には、等張化剤の名称に、これら種々の形の全てが包含されるものとする。例えば、等張化剤は鏡像異性体の形（例えば、Ｌ−もしくはＤ−鏡像異性体）またはラセミ体の形；α、α、またはβ、β、またはα、β、またはβ、αをはじめとする、αまたはβなどの異性体；遊離酸または遊離塩基の形；水和物の形（例えば、一水和物）、または無水物の形であり得る。
【０１３７】
一実施形態では、等張化剤はサッカライドである。本明細書において、用語「サッカライド」とは、多価アルコールの誘導体である分子の種類を指す。サッカライドは、通常、糖質と呼ばれ、種々の量の糖（サッカライド）単位、例えば、単糖、二糖および多糖を含み得る。本発明において等張化剤として用いるのに適したサッカライドとしては、それだけには限らないが、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、水溶性グルカン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるサッカライドが挙げられる。
【０１３８】
もう１つの実施形態では、等張化剤はポリオールである。本明細書において、用語「ポリオール」とは、複数のヒドロキシル基を有する賦形剤を指し、これとしては、糖（還元糖および非還元糖）、糖アルコールおよび糖酸が挙げられる。一実施形態では、ポリオールの分子量は約６００ｋＤ未満（例えば、約１２０〜約４００ｋＤの範囲）である。「還元糖」とは、金属イオンを還元できるか、タンパク質中のリジンおよび他のアミノ基と共有結合的に反応できるヘミアセタール基を含むものとし、「非還元糖」とは、還元糖のこういった特性を持たないものとする。本発明において等張化剤として用いるのに適したポリオールとしては、それだけには限らないが、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、イソマルト、ラクチトール、マルチトール、キシリトール、グリセロール、ラクチトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イノシトールおよびそれらの混合物からなる群から選択されるポリオールが挙げられる。一実施形態では、等張化剤は、トレハロース、スクロース、およびそれらの混合物からなる群から選択される非還元糖である。一実施形態では、等張化剤は、塩化ナトリウムなどの塩である。
【０１３９】
一実施形態では、等張化剤はマンニトールである。もう１つの実施形態では、等張化剤はＤ−マンニトールである。もう１つの実施形態では、等張化剤はトレハロースである。もう１つの実施形態では、等張化剤はα−トレハロース二水和物である。もう１つの実施形態では、等張化剤はスクロースである。もう１つの実施形態では、等張化剤は、塩化ナトリウムである。
【０１４０】
一実施形態では、組成物中の等張化剤の濃度は、約１ミリモル〜約６００ミリモル、約１ミリモル〜約４００ミリモル、１ミリモル〜約３００ミリモル、または２００ミリモル〜約２７５ミリモルの範囲である。別の一実施形態では、等張化剤はマンニトールであり、液体薬剤組成物中に約２４７ミリモルの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はトレハロースであり、組成物中に約２２２ミリモルの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はトレハロースであり、組成物中に約２３８ミリモルの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はスクロースであり、組成物中に約２６３ミリモルの濃度で存在する。
【０１４１】
一実施形態では、組成物中の等張化剤の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約３００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。もう１つの実施形態では、等張化剤はマンニトールであり、組成物中に約４５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はトレハロースであり、組成物中に約８４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はトレハロースであり、組成物中に約９０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はトレハロースであり、組成物中に約１０４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はスクロースであり、組成物中に約９０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。もう１つの実施形態では、等張化剤はスクロースであり、組成物中に約９４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１４２】
一実施形態では、等張化剤が塩である場合、組成物中の塩の濃度は約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの範囲である。もう１つの実施形態では、等張化剤は塩化ナトリウムであり、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は約８．１８ｍｇ／ｍｌである。
【０１４３】
前記の等張化剤濃度の中間にある範囲も本発明の一部であるものとする。例えば、上限および／または下限として、いずれかの前記の値の組合せを用いる値の範囲も含まれるものとする。
【０１４４】
前記のように、本発明の組成物は、キレート剤に加え、製薬上許容される界面活性剤をさらに含んでなる場合もある。本明細書において、用語「界面活性剤」とは、液体抗体組成物の表面張力を変更することができる賦形剤を指す。特定の実施形態では、界面活性剤は液体抗体組成物の表面張力を低下させる。さらに他の実施形態では、「界面活性剤」は、本明細書に記載した、いずれかのヒトＩｇＧ２抗体の安定性の向上に寄与し得る。例えば、界面活性剤は製剤された抗体の凝集を減少させ、かつ／または組成物中の粒子の形成を最小化し、かつ／または吸着を減少させることができる。界面活性剤はまた、凍結／解凍サイクルの間およびその後の抗体の安定性を向上させることができる。
【０１４５】
適した界面活性剤としては、ポリソルベート界面活性剤、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８および４０７）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）などのトリトン界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）およびＴｗｅｅｎ８０（登録商標）などのポリソルベート界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリル−スルホベタイン、ミリスチル−スルホベタイン、リノレイル−スルホベタイン、ステアリル−スルホベタイン、ラウリル−サルコシン、ミリスチル−サルコシン、リノレイル−サルコシン、ステアリル−サルコシン、リノレイル−ベタイン、ミリスチル−ベタイン、セチル−ベタイン、ラウロアミドプロピル−ベタイン、コカミドプロピル−ベタイン、リノールアミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ベタイン、パルミドプロピル−ベタイン、イソステアラミドプロピル−ベタイン、ミリスタミドプロピル−ジメチルアミン、パルミドプロピル−ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル−ジメチルアミン、メチルココイルタウリン酸ナトリウム、メチルオレイルタウリン酸二ナトリウム、ジヒドロキシプロピルＰＥＧ５リノールアンモニウムクロリド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。
【０１４６】
一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート２１、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の賦形剤を含んでなるポリソルベート界面活性剤である。もう１つの実施形態では、本組成物はポリソルベート８０を含んでなる。
【０１４７】
界面活性剤の濃度は、組成物中に存在する場合は、通常、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、または約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．７ｍｇ／ｍｌの範囲である。もう１つの実施形態では、界面活性剤の濃度は、約０．０５ミリモル〜約１．０ミリモルの範囲である。もう１つの実施形態では、界面活性剤は約０．２ｍｇ／ｍｌである量で存在する。もう１つの実施形態では、界面活性剤は約０．４ｍｇ／ｍｌである量で存在する。もう１つの実施形態では、界面活性剤は約０．５ｍｇ／ｍｌである量で存在する。一実施形態では、本組成物は約０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む。もう１つの実施形態では、本組成物は約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む。もう１つの実施形態では、本組成物は約０．５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０を含む。
【０１４８】
前記の界面活性剤濃度の中間にある範囲も本発明の一部であるものとする。例えば、上限および／または下限として、いずれかの前記の値の組合せを用いる値の範囲も含まれるものとする。
【０１４９】
前記のように、本発明の組成物は、キレート剤に加え、製薬上許容される抗酸化剤をさらに含んでなる場合もある。適した抗酸化剤としては、それだけには限らないが、メチオニン、チオ硫酸ナトリウム、カタラーゼ、およびプラチナが挙げられる。例えば、本組成物は１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の、特に、約２７ｍＭである濃度のメチオニンを含み得る。
【０１５０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる組成物を包含する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と製薬上許容されるキレート剤とを含んでなる液体薬剤組成物を包含する。
【０１５２】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤とを含んでなり、さらなる製薬上許容される賦形剤を場合によって含む液体薬剤組成物を包含する。
【０１５３】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなり、抗体の純度が少なくとも約９０％、９５％または１００％である組成物を包含する。
【０１５４】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１５５】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなり、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌである抗体の濃度を含む組成物を包含する。
【０１５６】
一実施形態では、本発明は少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなり、少なくとも約６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも約９０ｍｇ／ｍｌである抗体の濃度を含む組成物を包含する。
【０１５７】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と約０．００１ミリモル〜約５．０ミリモルのキレート剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１５８】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と約０．００１ミリモル〜約１．０ミリモルのキレート剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである液体薬剤組成物を包含する。
【０１５９】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と約０．００１ミリモル〜約０．５ミリモルのキレート剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである液体薬剤組成物を包含する。
【０１６０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と約０．０１ミリモル〜約０．５ミリモルのＥＤＴＡとを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである液体薬剤組成物を包含する。
【０１６１】
本発明の一態様では、本組成物は少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とバッファーとを含んでなる。
【０１６２】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤と、バッファーと、等張化剤とを含んでなる。
【０１６３】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤と、バッファーと、スクロースを含んでなる等張化剤とを含んでなる。
【０１６４】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤と、バッファーと、マンニトールを含んでなる等張化剤とを含んでなる。
【０１６５】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤と、バッファーと、トレハロースを含んでなる等張化剤とを含んでなる。
【０１６６】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤と、バッファーと、塩化ナトリウムを含んでなる等張化剤とを含んでなる。
【０１６７】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤と、バッファーと、等張化剤と、界面活性剤とを含んでなる。
【０１６８】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、バッファーとを含んでなる。
【０１６９】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、酢酸塩とを含んでなる。
【０１７０】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、ヒスチジンとを含んでなる。
【０１７１】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、バッファーと、等張化剤とを含んでなる。
【０１７２】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、バッファーと、等張化剤と、界面活性剤とを含んでなる。
【０１７３】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、ヒスチジンと、等張化剤と、界面活性剤とを含んでなる。
【０１７４】
本発明のその他の態様では、本組成物、は少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、ヒスチジンと、トレハロースと、界面活性剤とを含んでなる。
【０１７５】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤と、ヒスチジンと、トレハロースと、ポリソルベート８０とを含んでなる。
【０１７６】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、ヒスチジンと、トレハロースと、ポリソルベート８０とを含んでなる。
【０１７７】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、ヒスチジンと、スクロースと、ポリソルベート８０とを含んでなる。
【０１７８】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、ヒスチジンと、マンニトールと、ポリソルベート８０とを含んでなる。
【０１７９】
本発明のその他の態様では、本組成物は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、ＥＤＴＡと、ヒスチジンと、塩化ナトリウムと、ポリソルベート８０とを含んでなる。
【０１８０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのキレート剤と、約１ミリモル〜約１００ミリモルのバッファーとを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８１】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのキレート剤と、約１ミリモル〜約５０ミリモルのヒスチジンとを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８２】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのＥＤＴＡと、約１ミリモル〜約５０ミリモルのヒスチジンを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８３】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのキレート剤と、約１ミリモル〜約５０ミリモルのバッファーと、約１００ミリモル〜約６００ミリモルの等張化剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８４】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのキレート剤と、約１ミリモル〜約５０ミリモルのヒスチジンと、約１００ミリモル〜約６００ミリモルの等張化剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８５】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのキレート剤と、約１ミリモル〜約５０ミリモルのバッファーと、約１００ミリモル〜約６００ミリモルの等張化剤と、約０．００５ミリモル〜約１０ミリモルの界面活性剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８６】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのＥＤＴＡと、約１ミリモル〜約５０ミリモルのバッファーと、約１００ミリモル〜約６００ミリモルの等張化剤と、約０．００５ミリモル〜約１０ミリモルの界面活性剤とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８７】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのキレート剤と、約１ミリモル〜約５０ミリモルのヒスチジンと、約１００ミリモル〜約６００ミリモルのトレハロースと、約０．００５ミリモル〜約１０ミリモルのポリソルベート８０とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８８】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルのＥＤＴＡと、約１ミリモル〜約５０ミリモルのヒスチジンと、約１００ミリモル〜約６００ミリモルのトレハロースと、約０．００５ミリモル〜約１０ミリモルのポリソルベート８０とを含んでなり、その抗体濃度が約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌである組成物を包含する。
【０１８９】
一実施形態では、本組成物は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、約１ｍＭ〜約１００ｍＭのヒスチジンとを含んでなる。
【０１９０】
本発明のその他の態様では、液体薬剤組成物は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌのモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭのヒスチジンと、約０．０５ミリモル〜約０．５ミリモルのポリソルベート８０と、約０．０１ミリモル〜約１ミリモルのＥＤＴＡと、約２００ミリモル〜約４００ミリモルのトレハロースとを含んでなる。
【０１９１】
本発明のその他の態様では、液体薬剤組成物は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌのモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭのヒスチジンと、約０．０５ミリモル〜約０．５ミリモルのポリソルベート８０と、約０．０１ミリモル〜約１ミリモルのＥＤＴＡと、約２００ミリモル〜約３００ミリモルのトレハロースとを含んでなる。
【０１９２】
もう１つの実施形態では、本発明は少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とＤＴＰＡとを含んでなる組成物を対象とする。
【０１９３】
本発明の特定の態様では、液体ヒトＩｇＧ２抗体組成物は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、約１ｍＭ〜約５０ｍＭのヒスチジンと、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０と、約０．００１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡと、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌのスクロースとを含んでなる。
【０１９４】
本発明のその他の態様では、ヒトＩｇＧ２抗体組成物は、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭのヒスチジンと、約０．０５ミリモル〜約１ミリモルのポリソルベート８０と、約０．０１ミリモル〜約１ミリモルのＥＤＴＡと、約１００ミリモル〜約４００ミリモルのスクロースとを含んでなる。
【０１９５】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０１ミリモル〜約２ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００１ミリモル〜約５ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００２〜約２０００、約０．０１〜約５００、約０．０５〜約１００、約０．１〜約５０、約０．５〜約１０、約１〜約５、約１〜約３の範囲、または約１．６である組成物を対象とする。
【０１９６】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０１ミリモル〜約２ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００１ミリモル〜約５ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００２〜約２０００、約０．０１〜約５００、約０．０５〜約１００、約０．１〜約５０、約０．５〜約１０、約１〜約５の範囲、または約３．８である組成物を対象とする。
【０１９７】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２とキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０１ミリモル〜約２ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約１ミリモル〜約１００ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００１ミリモル〜約５ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００２〜約２０００、約０．０１〜約５００、約０．０５〜約１００、約０．１〜約５０、約０．５〜約１０、約１〜約５の範囲、または約３．８である組成物を対象とする。
【０１９８】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２とキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０１ミリモル〜約２ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約５ミリモル〜約３０ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００１ミリモル〜約５ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００２〜約２０００、約０．０１〜約５００、約０．０５〜約１００、約０．１〜約５０、約０．５〜約１０、約１〜約５の範囲、または約３．８である組成物を対象とする。
【０１９９】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と製薬上許容されるキレート剤とを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００００１〜約４５０、約０．０００１〜約１００、約０．００５〜約５０、約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約１の範囲、または約０．５である組成物を対象とする。
【０２００】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約１ミリモル〜約１００ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００００１〜約４５０、約０．０００１〜約１００、約０．００５〜約５０、約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約１の範囲、または約０．５である組成物を対象とする。
【０２０１】
もう１つの実施形態では、本発明は、ヒトＩｇＧ２抗体と製薬上許容されるキレート剤とを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００００１〜約４５０、約０．０００１〜約１００、約０．００５〜約５０、約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約３の範囲、または約１．９である組成物を対象とする。
【０２０２】
もう１つの実施形態では、本発明は、ヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約１ミリモル〜約１００ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００００１〜約４５０、約０．０００１〜約１００、約０．００５〜約５０、約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約１の範囲、または約０．５である組成物を対象とする。
【０２０３】
もう１つの実施形態では、本発明は、ヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約５ミリモル〜約３０ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．０００１〜約１００、約０．００５〜約５０、約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約３の範囲、または約１．９である組成物を対象とする。
【０２０４】
もう１つの実施形態では、本発明は、ヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約５ミリモル〜約２０ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００５〜約５０、約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約３の範囲、または約１．９である組成物を対象とする。
【０２０５】
もう１つの実施形態では、本発明は、ヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約５ミリモル〜約２０ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約３の範囲、または約１．９である組成物を対象とする。
【０２０６】
もう１つの実施形態では、本発明は、ヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤と、ヒスチジンとを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、ヒスチジンのモル濃度が約２０ミリモルであり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．１〜約３の範囲、または約１．９である組成物を対象とする。
【０２０７】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体と製薬上許容されるキレート剤とを含んでなり、抗体のモル濃度が約０．０００６ミリモル〜約１．３５ミリモルの範囲であり、キレート剤のモル濃度が約０．００３ミリモル〜約５０ミリモルの範囲であり、抗体対キレート剤のモル比が約０．００００１〜約２０００、約０．０１〜約５００、約０．０５〜約１００、約０．１〜約１０の範囲、または約０．５〜約４である液体薬剤組成物を対象とする。
【０２０８】
ヒトＩｇＧ２抗体および抗体産生細胞株の作製方法
本発明にしたがう抗体は、ヒト抗体産生ゲノムの大部分が挿入されているが内因性マウス抗体の産生を欠損させられたトランスジェニックマウスを利用して調製できる。その結果、このようなマウスはヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生でき、マウス免疫グロブリン分子および抗体の産生を欠損している。これを達成するために利用する技術を以下に論じる。
【０２０９】
内因性免疫グロブリンの産生がなく、免疫すると、ヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。しかしながら、詳しくは、マウスのトランスジェニック作製およびそれに由来する抗体についてのいくつかの実施形態は、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）らの米国特許第６，６８２，７３６号、ベジアン（Ｂｅｄｉａｎ）らの米国公開出願第２００５００５９１１３号、および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０００３７０に開示されている。当業者であれば、このような技術を用いることによって、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４、およびＭＡｄＣＡＭなどのヒト抗原と結合する完全なヒト抗体、ならびにこのような抗体を産生するハイブリドーマを調製できる。
【０２１０】
ヒト抗体は、マウスまたはラット可変および／または定常領域を有する抗体と関連する、可能性ある問題を避ける。このようなマウスまたはラット由来タンパク質の存在は、抗体の急速なクリアランスをもたらす場合があり、またこのような抗体の投与を受ける被験体による、抗体に対する免疫応答の発生をもたらす場合もある。
【０２１１】
例えば、キメラの、生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすと記載されている。このような生殖細胞系突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原チャレンジ後にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)、90、2551頁(1993)、ジャコボビッツら、ネイチャー(Nature)、362、255〜258頁(1993)、ブリュッグマン(Bruggerman)ら、ザ・イヤー・イン・イミュノロジー(The year in Immunology)、7、33(1993)、およびドュショサル(Duchosal)ら、ネイチャー355、258(1992)参照。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから得ることもできる（ホーゲンブーム(Hoogenboom)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)、227、381頁(1991)、マークス(Marks)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、222、581〜597頁(1991)、ヴォーン(Vaughan)ら、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)14、309頁(1996))。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物、例えば、ゲノムにヒト免疫グロブリン遺伝子を含んでなり、その結果、組換えマウスによってヒト抗体が産生されるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスを免疫することによってヒトＩｇＧ２抗体を作製することができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスとは、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな断片を含んでなり、かつ、マウス抗体産生を欠損している、操作されたマウス株である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒト抗体を産生する。いくつかの実施形態では、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスには、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の、メガ塩基対の、生殖系列立体配置酵母人工染色体（ＹＡＣ）断片の導入によって約８０％のヒト抗体Ｖ遺伝子レパートリーが含まれている。その他の実施形態では、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスには、ほぼ全てのλ軽鎖遺伝子座がさらに含まれている。例えば、グリーン(Green)ら、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)7、13〜21頁(1994)および米国特許第５，９１６，７７１号、同５，９３９，５９８号、同５，９８５，６１５号、同５，９９８，２０９号、同６，０７５，１８１号、同６，０９１，００１号、同６，１１４，５９８号、同６，１３０，３６４号、同６，１６２，９６３号および同６，１５０，５８４号参照。また、ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９９／４５０３１、ＷＯ９９／５３０４９、ＷＯ００／０９５６０、およびＷＯ００／０３７５０４も参照。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含んでなる非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン「ミニローカス」を有する動物である。ミニローカスアプローチでは、Ｉｇ遺伝子座に由来する個々の遺伝子を含めることによって外来Ｉｇ遺伝子座を模倣する。したがって、１以上のＶH遺伝子、１以上のＤH遺伝子、１以上のＪH遺伝子、ｍｕ定常ドメイン、および第２の定常ドメイン（好ましくは、γ定常ドメイン）が、動物に挿入するための構築物に形成される。このアプローチは、特に、米国特許第５，５４５，８０７号、同５，５４５，８０６号、同５，５６９，８２５号、同５，６２５，１２６号、同５，６３３，４２５号、同５，６６１，０１６号、同５，７７０，４２９号、同５，７８９，６５０号、同５，８１４，３１８号、同５，５９１，６６９号、同５，６１２，２０５号、同５，７２１，３６７法、同５，７８９，２１５号、および同５，６４３，７６３号に記載されている。
【０２１４】
したがって、いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、ゲノムにヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座のいくらかまたはすべてを含んでなる非ヒト動物を、所望の抗原で免疫することによって産生され得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、所望の抗原を単離および／または精製する。好ましい実施形態では、抗原はヒト抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は所望の抗原の断片である。いくつかの実施形態では、断片は所望の抗原の少なくとも１つのエピトープを含んでなる。その他の実施形態では、抗原は、抗原またはその免疫原性断片を、その表面に発現または過剰発現する細胞である。さらにその他の実施形態では、抗原は抗原融合タンパク質である。所望の抗原は天然の供給源から既知の技術を用いて精製してもよい。さらに、多数の組換え体抗原が市販されている。
【０２１６】
好ましい実施形態では、非ヒト動物はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物（アブジェニックス社（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州、フレモント）である。使用できるもう１つの非ヒト動物としては、メダレックス（メダレックス社（Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州、プリンストン）製のトランスジェニックマウスがある。
【０２１７】
動物の免疫化は当業者に公知のいずれの方法で行ってもよい。例えば、ハーロ(Harlow)およびレーン(Lane)、アンチボディーズ(Antibodies)：ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、1990参照。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマなどの非ヒト動物を免疫する方法は当技術分野ではよく知られている。例えば、ハーローおよびレーン、上記および米国特許第５，９９４，６１９号参照。好ましい実施形態では、所望の抗原を、アジュバントとともに投与して免疫応答を刺激する。例示的アジュバントとしては、完全または不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が挙げられる。このようなアジュバントは、限局性沈着にポリペプチドを捕捉することによって急速な分散からそれを保護することができ、またはマクロファージおよび免疫系のその他の成分にとって走化性である因子を分泌するよう宿主を刺激する物質を含む場合もある。ポリペプチドを投与する場合には、免疫スケジュールが数週間にわたって展開する、２回以上のポリペプチドの投与を含み得ることが好ましい。
【０２１８】
動物を抗原で免疫した後、その動物から抗体および／または抗体産生細胞を得ることができる。いくつかの実施形態では、動物を出血させるか屠殺することによって動物から完全ヒトＩｇＧ２抗体含有血清を得る。血清は動物から得られるので用いることができ、血清から免疫グロブリン画分を得ることができ、または血清から抗体を精製できる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、免疫した動物から単離した細胞から抗体産生不死化細胞株を調製する。免疫化後、動物を屠殺し、リンパ節および／または脾臓Ｂ細胞を不死化する。細胞を不死化する方法としては、それだけには限らないが、それらをオンコジーンでトランスフェクトすること、それらに腫瘍ウイルスを感染させること、不死化細胞を選択する条件下でそれらを培養すること、それらを発癌性化合物または突然変異誘発性化合物に付すこと、それらを不死化細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合すること、および腫瘍抑制遺伝子を不活化することが挙げられる。例えば、ハーローおよびレーン、上記参照。好ましい実施形態では、免疫される動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、脾臓Ｂ細胞を、非ヒト動物と同種に由来する骨髄腫細胞株と融合する。より好ましい実施形態では、免疫される動物はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物であり、骨髄腫細胞株は非分泌性マウス骨髄腫である。さらに好ましい実施形態では、骨髄腫細胞株はＰ３−Ｘ６３−ＡＧ８−６５３である。骨髄腫細胞との融合を用いる場合、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しないこと（非分泌性細胞株）が好ましい。不死化細胞は所望の抗原、その一部、または所望の抗原を発現する細胞を用いてスクリーニングする。好ましい実施形態では、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイを用いて初期スクリーニングを実施する。ＥＬＩＳＡスクリーニングの一例は、ＷＯ００／３７５０４に提供されている。
【０２２０】
完全ヒトＩｇＧ２抗体産生細胞、例えば、ハイブリドーマを選択し、クローニングし、力強い増殖、高い抗体産生および以下にさらに論じるような望ましい抗体特性をはじめとする望ましい特性についてさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、同系動物において、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞培養物においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は、当業者にはよく知られている。
【０２２１】
理解されるであろうが、本発明にしたがう抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において組換え発現させることができる。個々の抗体のｃＤＮＡをコードする核酸配列またはゲノムクローンを用いて、適した哺乳類または非哺乳類宿主細胞を形質転換できる。
【０２２２】
本発明はまた、ヒトＩｇＧ２抗体をコードする核酸分子を包含する。いくつかの実施形態では、異なる核酸分子が、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードしている。その他の実施形態では、同一の核酸分子がヒトＩｇＧ２免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードしている。一実施形態では、核酸は本発明のヒトＩｇＧ２抗体をコードしている。
【０２２３】
ヒトＩｇＧ２抗体の重鎖もしくは全軽鎖をコードする核酸分子またはその一部は、このような抗体を産生するいずれかの供給源から単離できる。種々の実施形態では、核酸分子を、ヒトＩｇＧ２抗体を発現する、所望の抗原で免疫した動物から単離したＢ細胞から、またはこのようなＢ細胞に由来する不死化細胞から単離する。抗体をコードするｍＲＮＡを単離する方法は当技術分野ではよく知られている。例えば、サムブロック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)第３版、第３巻(1989)参照。ｍＲＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニングに用いるためのｃＤＮＡを作製できる。好ましい実施形態では、その融合パートナーの一方として非ヒトトランスジェニック動物に由来するヒト免疫グロブリン産生細胞を含むハイブリドーマから核酸分子を単離する。いっそうより好ましい実施形態では、ヒト免疫グロブリン産生細胞を、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物から単離する。もう１つの実施形態では、ヒト免疫グロブリン産生細胞は、前記のような非ヒト、非マウストランスジェニック動物に由来する。もう１つの実施形態では、核酸を非ヒト、非トランスジェニック動物から単離する。非ヒト動物から単離した核酸分子は、例えば、ヒト化抗体のために使用できる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明のヒトＩｇＧ２抗体の重鎖をコードする核酸は、いずれかの供給源に由来する重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列とインフレームで結合している、本発明のＶHドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなる場合もある。同様に、本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体の軽鎖をコードする核酸分子は、いずれかの供給源に由来する軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列とインフレームで結合している、本発明のＶLドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなる場合もある。
【０２２５】
本発明のさらなる態様では、重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）の可変ドメインをコードする核酸分子を全長抗体遺伝子に「変える」。一実施形態では、それぞれ、重鎖定常（ＣH）または軽鎖（ＣL）定常ドメインをすでにコードしている発現ベクターに、ベクター内でＶHセグメントがＣHセグメントに機能しうる形で結合されるように、またベクター内でＶLセグメントがＣLセグメントに機能しうる形で結合されるように挿入することによって、ＶHまたはＶLドメインをコードする核酸分子を、全長抗体遺伝子に変える。もう１つの実施形態では、標準的な分子生物学技術を用いて、ＶHおよび／またはＶLドメインをコードする核酸分子をＣHおよび／またはＣLドメインをコードする核酸分子に結合すること、例えば、連結することによって、ＶHおよび／またはＶLドメインをコードする核酸分子を全長抗体遺伝子に変える。ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン定常ドメイン遺伝子の核酸配列は当技術分野では公知である。例えば、カバット(Kabat)ら、シークエンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インテレスト(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第５版、ＮＩＨ刊行物番号91-3242、1991参照。次いで、全長重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を、それらが導入されている細胞から発現させ、ヒトＩｇＧ２抗体を単離することができる。
【０２２６】
本発明はまた、本発明のヒトＩｇＧ２抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を含んでなるベクターを提供する。本発明はまた、このような抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を含んでなるベクターを提供する。本発明は、融合タンパク質、改変された抗体、抗体断片およびそのプローブをコードする核酸分子を含んでなるベクターをさらに提供する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、前記のように得た、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、これらの遺伝子が転写および翻訳制御配列などの必要な発現制御配列に機能しうる形で連結されるように発現ベクターに挿入することによって、本発明のヒトＩｇＧ２抗体、または抗原結合部分を発現させる。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。抗体遺伝子を、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するというその意図される機能を果たすようにベクターにライゲーションする。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合するよう選択する。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入してもよい。好ましい実施形態では、両遺伝子を同一発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は標準法（例えば、抗体遺伝子断片とベクターの相補制限部位のライゲーション、または制限部位が全く存在しない場合には平滑末端来ゲーション）によって発現ベクターに挿入する。
【０２２８】
好都合なベクターとしては、機能的に完全なヒトＣHまたはＣL免疫グロブリン配列をコードし、前記のように、いずれのＶHまたはＶL配列も容易に挿入でき、発現させられるよう操作される適当な制限部位を含むものがある。このようなベクターでは、通常、スプライシングは、挿入されたＪ領域中のスプライスドナー部位とヒトＣドメインの前のスプライスアクセプター部位との間で、およびヒトＣHエキソン内に生じるスプライス領域でも起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体の部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドもコードできる。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端とインフレームで連結されるようベクターにクローニングしてもよい。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよいし、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。
【０２２９】
本発明の組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加え、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を保持する。当業者には当然であろうが、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等といった因子に応じて変わり得る。哺乳類宿主細胞発現にとって好ましい制御配列としては、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、レトロウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（レトロウイルスＬＴＲなど）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のもの（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス由来のもの（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマならびに天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどの強力な哺乳類プロモーターが挙げられる。ウイルス制御エレメント、およびその配列のさらなる説明については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、同４，５１０，２４５号、および同４，９６８，６１５号参照。プロモーターおよびベクター、ならびに植物の形質転換についての説明を含む植物において抗体を発現させる方法は当技術分野では公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５１７，５２９号参照。細菌細胞または真菌細胞、例えば、酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法もまた、当技術分野では周知である。
【０２３０】
本発明の組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および制御配列に加え、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子により、ベクターが導入されている宿主細胞を選択することが容易になる（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同４，６３４，６６５号および同５，１７９，０１７号参照）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、薬剤、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ＤＨＦＲ宿主細胞においてメトトレキサート選抜／増幅とともに用いるための）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８選抜用）およびグルタミン合成酵素遺伝子が挙げられる。
【０２３１】
完全ヒトＩｇＧ２抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含んでなるベクターを、適した哺乳類、植物、細菌または酵母宿主細胞の形質転換に使用できる。本発明の抗体は、注目する免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列についてトランスジェニックである哺乳類または植物の作製とそれからの修復可能な形の抗体の産生によって、遺伝子導入で作製することができる。
【０２３２】
形質転換は、米国特許第４，３９９，２１６号、同４，９１２，０４０号、同４，７４０，４６１号、および同４，９５９，４５５号によって例示されるような、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスに（またはウイルスベクターに）パッケージングし、宿主細胞をウイルス（またはベクター）を用いて形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための公知の方法であればいずれで行ってもよいし、当技術分野で公知のトランスフェクション手順によって行ってもよい。用いる形質転換手順は、形質転換される宿主に応じて変わる。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は当技術分野では周知であり、それだけには限らないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子衝突、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、ペプチドコンジュゲート、デンドリマー、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０２３３】
発現のための宿主として利用できる哺乳類細胞株は当技術分野では周知であり、これにはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)から入手できる多数の不死化細胞株が含まれ、それだけには限らないが、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、およびいくつかのその他の細胞株が挙げられる。それだけには限らないが、細菌、酵母、昆虫、および植物をはじめとする非哺乳類細胞を用いて組換え抗体を発現させることもできる。非ヒトグリコシル化に起因する、免疫原性、薬物動態、および／またはエフェクター機能のいずれかの変化を防ぐためには、グリコシル化を排除するための抗体ＣＨ２ドメインの部位特異的突然変異誘発が好ましい場合もある。発現方法は、どのシステムによって最も高い発現レベルが得られ、所望の抗原結合特性を有する抗体が産生されるかを調べることによって選択する。
【０２３４】
さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（またはそれら由来するその他の部分）の発現は、いくつかの既知の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素およびＤＨＦＲ遺伝子発現系は、特定の条件下で発現を増強するための、よくあるアプローチである。従来技術、例えば、限定希釈クローニングおよびマイクロドロップ技術を用いて高発現細胞クローンを同定できる。グルタミン合成酵素系は、全部または一部において、欧州特許第０２１６８４６号、同０２５６０５５号および０３２３９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４に関連して論じられている。
【０２３５】
哺乳類におけるトランスジェニック生産に関連して、抗体はヤギ、ウシまたはその他の哺乳類のミルクで生産し、それから回収することもできる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、同５，７５６，６８７号、同５，７５０，１７２号、および同５，７４１，９５７号参照。
【０２３６】
前記のような細胞株で発現されたヒトＩｇＧ２抗体は、関連する細胞物質から精製および／または単離できる。抗体は全細胞に存在する場合もあるし、細胞溶解物中に存在する場合もあるし、部分精製された形または実質的に純粋な形で存在する場合もある。精製は、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞核酸またはタンパク質を排除するために、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィーおよび当技術分野で周知のその他のものをはじめとする標準技術によって実施する。オースベル(Ausubel)、F.ら編、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、グリーン・パブリッシング・アンド・ウィレー・インターサイエンス(Greene Publishing and Wiley Interscience)、ニューヨーク(1987)参照。
【０２３７】
本発明では、種々の細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現された本発明のヒトＩｇＧ２抗体が互いに異なるグリコシル化パターンを有することが可能である。しかし、本明細書に提供される核酸およびアミノ酸によってコードされるヒトＩｇＧ２抗体のすべてが、そのグリコシル化パターンまたはその修飾もしくは欠失にかかわらず、本発明の一部と考えられる。したがって、本発明の目的上は、ヒトＩｇＧ２抗体はグリコシル化であっても、非グリコシル化であってもよい。ヒトＩｇＧ２抗体がグリコシル化されている場合には、それらはいずれの可能性あるグリコシル化パターンも有し得る。さらに、一抗体内の各重鎖が同一のグリコシル化パターンを有する場合もあるし、２つの重鎖が異なるグリコシル化パターンを有する場合もある。非ヒトグリコシル化に起因する、免疫原性、薬物動態、および／またはエフェクター機能のいずれかの変化を防ぐために、グリコシル化を排除するための抗体ＣＨ２ドメインの部位特異的突然変異誘発も本発明に包含される。
【０２３８】
本明細書において、用語「グリコシル化」とは、抗体に共有結合される糖質単位のパターンを意味する。本明細書においてヒトＩｇＧ２抗体が特定のグリコシル化パターンを有するという場合には、言及されるヒトＩｇＧ２抗体の大部分がその特定のグリコシル化パターンを有することを意味する。その他の態様では、本明細書においてヒトＩｇＧ２抗体が特定のグリコシル化パターンを有するという場合には、言及されるヒトＩｇＧ２抗体の５０％、７５％、９０％、９５％、９９％以上、または１００％がその特定のグリコシル化パターンを有することを意味する。
【０２３９】
本発明のヒトＩｇＧ２抗体はまた、そのグリコシル化変異体（例えば、適したアミノ酸残基の欠失、挿入または置換による、グリコシル化部位の挿入またはいずれかのグリコシル化部位の欠失による）も包含する。
【０２４０】
ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。抗体ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合型であり、二分岐構造を形成する。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への糖質部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリンを除くいずれかのアミノ酸である）が、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素による結合の認識配列である。したがって、抗体中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、可能性あるグリコシル化部位が生じる。
【０２４１】
二分岐グリカンの３つの別個の構造は、グリカンの非還元末端に、それぞれ０個、１個または２個の末端ガラクトース残基を有する「Ｇ０」、「Ｇ１」および「Ｇ２」と名づけられている。ジェフリーズ(Jefferis)ら、バイオケミカル・ジャーナル(Biochemical Journal)、268、529〜537頁(1990)参照。グリカン構造が、Ｎアセチルグルコサミンと結合しているフコース残基を含み、これが抗体中に見られるアスパラギンアミノ酸（例えば、２９７位）と共有結合する場合もある。フコース（Ｆ）が存在する場合には、二分岐グリカン命名を、末端ガラクトース残基の数に応じて「Ｇ０Ｆ」、「Ｇ１Ｆ」、または「Ｇ２Ｆ」に変更する。テイロード(Teillaud)、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー(Expert Opinion on Biological Therapy)、5（付録１）：S15〜S27(2005)参照。さらに、抗体が２つの重鎖を双方をも含む場合には、グリカン命名は２つの重鎖の各々について反復する。したがって、「Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｆ」グリコフォームとは、両重鎖が、結合されたＧ０グリカンを含み、各Ｇ０グリカンがＮ−アセチルグルコサミンと結合しているフコース（Ｆ）残基を含む種である。「Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ」グリコフォームとは、一方の重鎖が結合されたＧ０グリカンを含み、もう一方の重鎖は結合されたＧ１グリカンを含み、Ｇ０グリカンとＧ１グリカン各々が、Ｎ−アセチルグルコサミンと結合しているフコース（Ｆ）残基を含む種である。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ２抗体は、「Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｆ」、「Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ」、「Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ」、「Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ」およびそれらの混合物からなる群から選択されるグリコシル化パターンを有する。
【０２４２】
投与経路および投与量
本発明の組成物は液体溶液（例えば、注射用および注入用溶液）であり得る。好ましい形は、意図される投与様式および治療適用に応じて変わる。典型的な好ましい組成物としては、注射用または注入用溶液の形のもの、例えば、ヒトの受動免疫に用いるものと類似の組成物がある。好ましい投与様式は、無菌注射用液体または油性懸濁液の形で、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内、皮内、および胸骨内）、または注入技術によってである。当業者には当然であろうが、投与経路および／または様式は、所望の結果に応じて変わる。好ましい実施形態では、抗体を静脈内注入または注射によって投与する。もう１つの好ましい実施形態では、抗体を筋内または皮下注射によって投与する。治療用組成物は、通常、無菌であり、製造および保存条件下で安定である。
【０２４３】
本組成物は溶液、マイクロエマルション、分散剤、またはリポソームとして製剤できる。無菌注射用溶液は、必要量のヒトＩｇＧ２抗体を、必要に応じて、前記で列挙した成分の１種またはその組合せを含む適当な賦形剤に組み込み、その後、滅菌（例えば、濾過滅菌）することによって調製できる。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒と前記で列挙したものから必要なその他の成分を含む無菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。このような懸濁液は、湿潤剤および懸濁化剤またはその他の許容される薬剤の適した分散物を用いて当技術分野で公知の技術にしたがって製剤できる。無菌注射用調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口で許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であり得る。使用できる、許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液および生理食塩水がある。さらに、溶媒または懸濁媒として無菌の、不揮発性油を用いることが好都合である。この目的には、合成モノ−またはジグリセリドをはじめ、いずれの無刺激性不揮発性油も使用できる。さらに、ｎ−３ポリ不飽和脂肪酸も注射物質の調製に使用できる。
【０２４４】
無菌注射用溶液を調製するための無菌散剤の場合には、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した、有効成分およびいずれかのさらなる所望の成分の溶液から、その粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レクチンなどのコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持できる。
【０２４５】
注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、または組成物を持続的吸収形、例えば、デポー、リポソーム、高分子ミクロスフェア、高分子ゲル、およびインプラントに製剤することによって引き起こすことができる。
【０２４６】
本明細書に記載した抗体のその他の投与方法としては、直接被験体の皮膚に医薬を放出する皮膚パッチが挙げられる。このようなパッチは、接着剤中に溶解および／もしくは分散された、またはポリマー中に分散された、場合によっては緩衝された液体溶液中に本発明の抗体を含み得る。
【０２４７】
本明細書に記載した抗体のさらにその他の投与方法としては、眼用の液体眼科用液滴が挙げられる。
【０２４８】
抗体は１回投与してもよいが、複数回投与することがより好ましい。例えば、抗体は毎日１回〜６ヶ月またはそれより長い期間に１回投与してもよい。投与は、毎日３回、毎日２回、毎日１回、２日に１回、３日に１回、週１回、２週間に１回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回および６ヶ月に１回などの予定どおりであり得る。
【０２４９】
抗体はミニポンプを介して連続投与することもできる。抗体は身体の患部の部位で投与してもよいし、身体の患部から離れた部位で投与してもよい。抗体は１回、少なくとも２回または少なくとも疾病が治療、軽減、または治癒されるまでの期間投与してもよい。一般に、抗体は疾病が存在する限り投与できる。通常、抗体は、上記の薬剤組成物の一部として投与される。
【０２５０】
本発明の組成物は治療上有効量または予防上有効量の本発明の抗体または抗原結合部分を含み得る。本組成物の調製では、組成物中に存在する治療上有効量のヒトＩｇＧ２抗体は、例えば、所望の用量容積および投与様式、治療される状態の性質および重篤度、ならびに被験体の性別および大きさを考慮することによって決定できる。
【０２５１】
それだけには限らないが、本発明の薬剤組成物を被験体に投与するための例示的な用量範囲は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ（被験体の体重１キログラム（ｋｇ）当たりの投与されるヒトＩｇＧ２抗体ミリグラム（ｍｇ）という用語で表される）、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５ｍｇ／ｋｇである。本発明の目的上、平均ヒト被験体の体重は約７０ｋｇである。本明細書に記載したいずれかの投与量の中間にある範囲、たとえば、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜１９９ｍｇ／ｋｇも本発明の一部であるものとする。例えば、上限および／または下限として、いずれかの前記の値の組合せを用いる値の範囲も含まれるものとする。
【０２５２】
また、被験体に数回に分割した用量を時間をかけて投与することによって、投与計画を最適所望応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供するよう調整することもできるし、用量を、治療状況の要求によって示されるように比例的に減少または増加させてもよい。投与の容易性および投与量の均一性のためには、投与単位形の非経口組成物を製剤することが特に有利である。
【０２５３】
本明細書において投与単位形とは、治療される哺乳類被験体のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬剤担体と関連して所望の治療効果を生じるよう算出された所定量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形の仕様は、（ａ）ヒトＩｇＧ２抗体またはその一部の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体の感受性を治療するためのこのような抗体を混合する技術に特有の制限によって決定され、直接それらに応じて変わる。
【０２５４】
本発明の液体組成物は、単位投与形として調製できる。例えば、バイアルあたりの単位投与形は、１〜１０００ミリリットル（ｍｌ）の種々の濃度のヒトＩｇＧ２抗体を含み得る。その他の実施形態では、バイアルあたりの単位投与形は、約１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、３０ｍｌ、４０ｍｌ、５０ｍｌまたは１００ｍｌの種々の濃度のヒトＩｇＧ２抗体を含み得る。必要であれば、各バイアルに無菌希釈剤を添加することによってこれらの調製物を所望の濃度に調整することができる。本発明の液体組成物はまた、静脈投与ラインまたはカテーテルに接続するのに適している、無菌バッグまたは容器に入れた単位投与形として調製できる。
【０２５５】
安定性評価：
本発明は、本明細書に記載したようなヒトＩｇＧ２抗体と、製薬上許容されるキレート剤とを含んでなる安定な液体薬剤組成物を含んでなる。例えば、製品外観および完全性を維持し、その変化（生物学的活性の低下をもたらす可能性のある物理的または化学的分解を含む）に耐えるために、安定な組成物が望まれる。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技術および指標は文献で報告されており、これらの技術および指標のいくつかが、ペプチド・アンド・プロテイン・ドラッグ・デリバリー(Peptide and Protein Drug Delivery)、247〜301頁、ビンセント・リー(Vincent Lee)編、マーセル・デッカー社(Marcel Dekker, Inc.)、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．パブリケーションズ(Pubs)(1991)およびジョーンズ(Jones)、Ａ．推奨、ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Drug Delivery Revews)１０、２９〜９０頁(1993)に概説されている。一般に、本発明の液体薬剤組成物は、一定期間にわたって低い保存温度に付された場合に、および／または１回以上の凍結／解凍サイクルに付された場合に安定性の向上を示す。
【０２５６】
一実施形態では、本組成物は、約２℃〜約８℃の温度で少なくとも約１２ヶ月、好ましくは、少なくとも約１８ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約２４ヶ月保存した場合に、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物より安定である。
【０２５７】
もう１つの実施形態では、本組成物は、約２５℃〜約３０℃の温度で少なくとも約３ヶ月、好ましくは、少なくとも６ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約１２ヶ月保存した場合に、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物より安定である。
【０２５８】
もう１つの実施形態では、本組成物は、約４０℃の温度で少なくとも約１ヶ月、好ましくは、少なくとも約２ヶ月、より好ましくは、少なくとも約３ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約２６週間保存した場合に、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物よりも安定である。
【０２５９】
もう１つの実施形態では、本組成物は、約２℃〜約８℃の温度で少なくとも約１２ヶ月、好ましくは、少なくとも約１８ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約２４ヶ月保存した場合に、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠く等張組成物よりも安定である。
【０２６０】
もう１つの実施形態では、本組成物は、約２５℃〜約３０℃の温度で少なくとも約３ヶ月、好ましくは、少なくとも約６ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約１２ヶ月保存した場合に、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠く等張組成物よりも安定である。
【０２６１】
もう１つの実施形態では、本組成物は、約４０℃の温度で約１ヶ月、好ましくは、少なくとも約２ヶ月、より好ましくは、少なくとも約３ヶ月、およびさらにより好ましくは、少なくとも約２６週間保存した場合に、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠く等張組成物よりも安定である。
【０２６２】
本明細書において、用語「凍結／解凍サイクル」とは、サンプルの温度を液体サンプルを凍結するために０℃以下の温度に低下させ、次いで、サンプルをその液体状態を取り戻す温度に、サンプルの使用を可能にするのに十分な期間付し、その後、好ましくは０℃以下の温度での凍結保存に戻す、凍結保存後に液体抗体サンプルを使用するための技術を指す。本明細書ににおいて、用語「凍結保存」とは、先の液体抗体サンプルを０℃以下、好ましくは、−２０℃以下の温度で、凍結および維持することを指す。
【０２６３】
一実施形態では、本組成物は、少なくとも１回の凍結／解凍サイクル、好ましくは、少なくとも２回の凍結／解凍サイクル、より好ましくは、少なくとも３回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも４回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも５回の凍結／解凍サイクル、およびさらにより好ましくは、少なくとも６回の凍結／解凍サイクルに付された組成物は、同一の凍結／解凍条件に付される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物より安定である。
【０２６４】
もう１つの実施形態では、少なくとも１回の凍結／解凍サイクル、好ましくは、少なくとも２回の凍結／解凍サイクル、より好ましくは、少なくとも３回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも４回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも５回の凍結／解凍サイクル、およびさらにより好ましくは、少なくとも６回の凍結／解凍サイクルに付した組成物は、同一の凍結／解凍条件に付される、キレート剤を欠く等張組成物よりもより安定である。
【０２６５】
もう１つの実施形態では、本組成物は以下の条件の２以上を満たす：
（ａ）本組成物は、約２℃〜約８℃の温度で少なくとも約１２ヶ月、好ましくは、少なくとも約１８ヶ月およびより好ましくは、少なくとも約２４ヶ月保存した場合、同一条件下で同一時間の間保存されるキレート剤を欠く等張組成物よりもより安定である；
（ｂ）本組成物は、約２５℃〜約３０℃の温度で少なくとも約３ヶ月、好ましくは、少なくとも約６ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約１２ヶ月保存した場合、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠く等張組成物よりもより安定である；
（ｃ）本組成物は、約４０℃の温度で少なくとも約１ヶ月、好ましくは、少なくとも約２ヶ月、より好ましくは、少なくとも約３ヶ月、さらにより好ましくは、少なくとも約２６週間保存した場合、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠く等張組成物よりもより安定である；または
（ｄ）本組成物は、少なくとも１回の凍結／解凍サイクル、好ましくは、少なくとも２回の凍結／解凍サイクル、より好ましくは、少なくとも３回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも４回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも５回の凍結／解凍サイクル、およびさらにより好ましくは、少なくとも６回の凍結／解凍サイクルに付した場合、同一凍結／解凍条件に付される、キレート剤を欠く等張組成物よりもより安定である。
【０２６６】
もう１つの実施形態では、本組成物は以下の条件の２以上を満たす：
（ａ）本組成物は、約２℃〜約８℃の温度で少なくとも約１２ヶ月、好ましくは、少なくとも約１８ヶ月およびより好ましくは、少なくとも約２４ヶ月保存した場合、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物よりもより安定である；
（ｂ）本組成物は、約２５℃〜約３０℃の温度で少なくとも約３ヶ月、好ましくは、少なくとも約６ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約１２ヶ月保存した場合、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物よりもより安定である；
（ｃ）本組成物は、約４０℃の温度で少なくとも約１ヶ月、好ましくは、少なくとも約２ヶ月、より好ましくは、少なくとも約３ヶ月、さらにより好ましくは、少なくとも約２６週間保存した場合、同一条件下で同一時間の間保存される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物よりもより安定である；または
（ｄ）本組成物は、少なくとも１回の凍結／解凍サイクル、好ましくは、少なくとも２回の凍結／解凍サイクル、より好ましくは、少なくとも３回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも４回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも５回の凍結／解凍サイクル、およびさらにより好ましくは、少なくとも６回の凍結／解凍サイクルに付した場合、同一凍結／解凍条件に付される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物よりもより安定である。
【０２６７】
もう１つの実施形態では、本組成物は直前に論じた条件の３以上を満たす。
【０２６８】
本願の目的上、例えば、抗体凝集、抗体断片化、および／または組成物変色を、組成物の安定性の指標として用いることができる。一般に、本発明の組成物は、前記の保存または凍結／解凍条件の１以上に付された場合に、同一条件に付される、キレート剤を欠く等張組成物と比較して、抗体凝集、抗体断片化および組成物変色のうち少なくとも１つが低レベルを示す。その他の実施形態では、本発明の組成物は、前記の保存または解凍／凍結条件の１以上に付された場合、同一条件に付される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物と比較して、抗体凝集、抗体断片化および組成物変色のうち少なくとも１つが低レベルを示す。
【０２６９】
組成物、例えば、液体薬剤組成物中のタンパク質凝集は、当技術分野で公知の種々の方法によって測定できる。このような方法としては、タンパク質をその分子量に基づいて分離するためのゲル濾過クロマトグラフィーが挙げられる。「ゲル」とは、水とポリマー、例えば、アガロースまたは重合アクリルアミドのマトリックスである。本発明はまた、ゲル濾過ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）の使用も包含する。その他の認められている凝集測定方法としては、陽イオン交換クロマトグラフィーが挙げられ、これは陰イオンカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーという一般的な液体クロマトグラフィー技術である。本発明において交換される陽イオンは、タンパク質分子に由来するものである。多価タンパク質凝集体は単鎖抗原結合タンパク質の正味荷電のいくらかの倍数を有し得るので、凝集体はより強固に保持され得、単鎖分子から分離できる。好ましい陽イオン交換体としてはポリアスパラギン酸カラムがある。したがって、単量体タンパク質は凝集体と容易に区別できる。しかし、当業者ならば、本発明の凝集アッセイは、タンパク質分子の２つの形を分離できる限りは、いずれかの特定の種類のクロマトグラフィーカラムに限定されるものではないということは理解されよう。
【０２７０】
液体薬剤組成物におけるタンパク質断片化は、当技術分野で公知の種々の方法によって測定することができる。このような方法としては、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、紫外検出（例えば、２１４ナノメートルでの）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ＭＳ）が挙げられる。（例えば、脱アミドの結果として起こる）荷電変更をもたらすタンパク質断片化は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは等電点電気泳動（ＩＥＦ）によって評価できる。
【０２７１】
組成物変色は、一般に、組成物自体の目視観察によって測定できる。キレート剤を含んでなる本液体薬剤組成物は、概して、組成物変色（例えば、ピンク色または黄色）を、キレート剤を含まないが、それ以外には同一の組成物と比較して軽減する。本発明の目的上、用語「変色」とは、色の変化（例えば、透明および無色からピンク色または黄色）と透明度の変化（例えば、透明および無色から不透明な、濁ったおよび／または粒子を含む）の双方を指す。組成物変色は、一般に、さらなる技術を用いて、例えば、２１４ナノメートルでの紫外検出によって、および／またはキレート剤を含む組成物と含まないものの標準カラースケールに対する目視比較によって測定できる。ＰｈＥｕｒ５．０、２００５モノグラフ２．２．２参照。
【０２７２】
一実施形態では、本組成物を以下の条件のうち少なくとも１つに付した後に抗体凝集を調べる：
（ａ）本組成物を約２℃〜約８℃の温度で、少なくとも約１２ヶ月、好ましくは、少なくとも約１８ヶ月およびより好ましくは、少なくとも約２４ヶ月保存する；
（ｂ）本組成物を約２５℃〜約３０℃の温度で、少なくとも約３ヶ月、好ましくは、少なくとも約６ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約１２ヶ月保存する；
（ｃ）本組成物を約４０℃の温度で少なくとも約１ヶ月、好ましくは、少なくとも約２ヶ月、より好ましくは、少なくとも約３ヶ月、およびさらにより好ましくは、少なくとも約２６週間保存する；または
（ｄ）本組成物を少なくとも１回の凍結／解凍サイクル、好ましくは、少なくとも２回の凍結／解凍サイクル、より好ましくは、少なくとも３回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも４回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも約５回の凍結／解凍サイクル、およびさらにより好ましくは、少なくとも６回の凍結／解凍サイクルに付す。次いで、抗体凝集体をクロマトグラフィーによって（例えば、ＨＰＬＣを用いて）組成物から分離し、得られたクロマトグラムから凝集度を求める。
【０２７３】
一実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなり、抗体が約５℃の温度で少なくとも約２６週間安定である組成物を提供する。
【０２７４】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなり、抗体が約２５℃の温度で少なくとも約２６週間安定である組成物を提供する。
【０２７５】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなり、抗体が約４０℃の温度で少なくとも約２６週間安定である組成物を提供する。
【０２７６】
本発明の安定組成物は、通常、以下のいずれか以下であるクロマトグラムでの凝集体ピーク面積を有する：クロマトグラムでの全ピーク面積の約８．０％、約７．５％、約７．０％、約６．５％、約６．０％、約５．５％、約５．０％、約４．５％、約４％、約３．５％、約３％、約２．５％、約２％、約１．５％、約１．０％、約０．９％、または約０．８％。
【０２７７】
凝集を測定するこの技術の一具体例では、組成物を４０℃で２６週間保存し、次いで、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いてクロマトグラフィー分離を実施し、２１４ナノメートルでの紫外検出を行う。凝集を測定するこの技術の一具体例では、組成物を４０℃で２４週間保存し、次いで、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いてクロマトグラフィー分離を実施し、２１４ナノメートルで紫外検出を行う。実施例１１−Ｂでは、この技術を用いて抗体凝集を測定し、例えば、組成物番号３７−Ｂ（キレート剤を含有する）は、約１．１％のクロマトグラムでの凝集体ピーク面積を示し、他方、組成物２６−Ｂ（キレート剤を欠く）は、約６．４％のクロマトグラムでの凝集体ピーク面積を示した。
【０２７８】
一般に、本発明の安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、同一条件に付される、キレート剤を欠く等張組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の差異は、少なくとも約８．０％以上であり、少なくとも約７．５％以上であり、少なくとも約７．０％以上であり、少なくとも約６．５％以上であり、少なくとも約６．０％以上であり、少なくとも約５．５％以上であり、少なくとも約５．０％以上であり、少なくとも約４．５％以上であり、少なくとも約４．０％以上であり、少なくとも約３．５％以上であり、少なくとも約３．０％以上であり、少なくとも約２．５％以上であり、少なくとも約２．０％以上であり、少なくとも約１．５％以下であり、少なくとも約１．０％以上であり、少なくとも約０．５％以上であり、少なくとも約０．３％以上であり、少なくとも約０．２％以上であり、または少なくとも約０．１％以上である。
【０２７９】
もう１つの実施形態では、本発明の安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、同一条件に付される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の差異は、少なくとも約８．０％以上であり、少なくとも約７．５％以上であり、少なくとも約７．０％以上であり、少なくとも約６．５％以上であり、少なくとも約６．０％以上であり、少なくとも約５．５％以上であり、少なくとも約５．０％以上であり、少なくとも約４．５％以上であり、少なくとも約４．０％以上であり、少なくとも約３．５％以上であり、少なくとも約３．０％以上であり、少なくとも約２．５％以上であり、少なくとも約２．０％以上であり、少なくとも約１．５％以下であり、少なくとも約１．０％以上であり、少なくとも約０．５％以上であり、少なくとも約０．３％以上であり、少なくとも約０．２％以上であり、または少なくとも約０．１％以上である。
【０２８０】
例えば、前記で論じたように、実施例１１−Ｃで調べた組成物３７−Ｂ（約１．１％のクロマトグラムでの凝集体ピーク面積）と組成物２６−Ｂ（約６．４％のクロマトグラムでの凝集体ピーク面積）間のこの差異は、約５．３％である。
【０２８１】
もう１つの実施形態では、本組成物を以下の条件のうち少なくとも１つに付した後に抗体断片化を調べる：
（ａ）本組成物を約２℃〜約８℃の温度で、少なくとも約１２ヶ月、好ましくは、少なくとも約１８ヶ月およびより好ましくは、少なくとも約２４ヶ月保存する；
（ｂ）本組成物を約２５℃〜約３０℃の温度で、少なくとも約３ヶ月、好ましくは、少なくとも約６ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約１２ヶ月保存する；
（ｃ）本組成物を約４０℃の温度で少なくとも約１ヶ月、好ましくは、少なくとも約２ヶ月、およびより好ましくは、少なくとも約３ヶ月保存する；または
（ｄ）本組成物を少なくとも１回の凍結／解凍サイクル、好ましくは、少なくとも２回の凍結／解凍サイクル、より好ましくは、少なくとも３回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも４回の凍結／解凍サイクル、さらにより好ましくは、少なくとも約５回の凍結／解凍サイクル、およびさらにより好ましくは、少なくとも６回の凍結／解凍サイクルに付す。次いで、抗体断片を組成物からクロマトグラフィー分離し（例えば、ゲル濾過を用いて）、得られたクロマトグラムから断片化度を求める。本発明の組成物は、通常、クロマトグラムでの全バンド量の約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、または約４．５％未満であるクロマトグラムでの断片バンド量を含む。断片化を測定するこの技術の一具体例では、本組成物を４０℃で２４週間保存し、次いで、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（γＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてクロマトグラフィに付し、モレキュラー・ダイナミクス・パーソナル・デンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）ＰＤＱＣ−９０またはバイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＧＳ８００イメージング・デンシトメーター（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）のいずれかでのスキャニングによってバンド量を求める。実施例１１−Ｂでは、この技術を用いて抗体断片化を測定し、例えば、組成物番号３７−Ｂ（キレート剤を含有する）は、約４．５％のクロマトグラムでの断片バンド量を示し、他方、組成物２６−Ｂ（キレート剤を欠く）は、約１０．１％のクロマトグラムでの断片バンド量を示した。
【０２８２】
一般に、本発明の安定液体薬剤組成物の断片バンド量と、同一条件に付される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の断片バンド量との間の差異は、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、または少なくとも約５％である。例えば、前記で論じたように、実施例１１−Ｂで調べた、組成物３７−Ｂ（約４．５％のクロマトグラムでの断片バンド量）と組成物２６−Ｂ（約１０．１％のクロマトグラムでの断片バンド量）間のこの差異は、約５．６％である。
【０２８３】
一実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後に、以下の条件の一方または双方が満たされる安定組成物を提供する：少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が少なくとも約１％である；または少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が少なくとも約０．５％である。
【０２８４】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後、以下の条件の一方または双方が満たされる安定組成物を提供する：少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約１％である；または少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約０．５％である。
【０２８５】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後に、以下の条件の一方または双方が満たされる安定組成物を提供する；少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約３．５％である；または少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約１．７％である。
【０２８６】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後に、以下の条件の一方または双方が満たされる安定組成物を提供する；少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約３．５％である；または少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、キレート剤とを含んでなる安定組成物の断片クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の断片クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約１．７％である。
【０２８７】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体と、安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２４週間の期間保存した後に、モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定液体薬剤組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、約４０℃で約２４週間の期間保存される、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約２％である、安定組成物を提供する。
【０２８８】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、抗体と安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後に、以下の条件の一方または双方が満たされる組成物を形成する方法を含んでなる、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体を安定化する方法を提供する：モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約１％である、またはモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約０．５％である。
【０２８９】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、抗体と安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後に、以下の条件の一方または双方が満たされる組成物を形成する方法を含んでなる、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体を安定化する方法を提供する：モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約１％である、またはモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約０．５％である。
【０２９０】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、抗体と安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後に、以下の条件の一方または双方が満たされる組成物を形成する方法を含んでなる、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体を安定化する方法を提供する：モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約１１．６％である、および／またはモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠く等張組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約４．９％である。
【０２９１】
もう１つの実施形態では、本発明はまた、抗体と安定化量のキレート剤とを含んでなり、組成物を約４０℃の温度で約２６週間の期間保存した後に、以下の条件の一方または双方が満たされる組成物を形成する方法を含んでなる、少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体を安定化する方法を提供する：モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約１１．６％である、および／またはモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体とキレート剤とを含んでなる安定組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積と、キレート剤を欠くが、それ以外には同一の組成物の凝集体クロマトグラムピーク面積間の減少が、少なくとも約４．９％である。
【０２９２】
したがって、本発明は、組成物中で抗体を、抗体の化学的および／または物理的不安定性を低下させる量のキレート剤と組み合わせることによって、少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体を安定化する方法を提供する。
【０２９３】
治療法
本明細書に記載された抗体のいずれのタイプも、治療上、被検者において使用され得る。好ましい実施態様において、被検者は、ヒト被検者である。あるいは、被検者は、ヒトＩｇＧ２抗体が交差反応をする抗原／蛋白質を発現する哺乳動物であっても良い。抗体は、獣医学的目的で、又はヒト疾患の動物モデルとして抗体が交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物（すなわち霊長類）に投与され得る。かかる動物モデルは、本発明の抗体の治療効力を評価するために有用であり得る。
【０２９４】
本発明は、被検者においていかなる公知の又は最近発見された疾患又は障害も、かつある実施態様では、被検者において炎症又は新生物形成疾患を治療する方法であって、ヒトＩｇＧ２抗体；及びキレート剤を、単独又は緩衝液、等張化剤、酸化防止剤又は界面活性剤、及びその混合物から選択される他の賦形剤と組み合わせて含む液体医薬組成物を被検者に投与することを含む方法を提供する。更なる実施態様において、前述の被検者は、新生物形成疾患の予防又は治療を必要とする者である。更なる実施態様において、前述の被検者は、炎症疾患の予防又は治療を必要とする者である。
【０２９５】
もう一つの実施態様において、本発明は、被検者において炎症疾患を治療する方法であって、少なくとも１種の医薬上許容し得るキレート剤及び少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体を含む治療上有効量の液体医薬組成物を被検者に投与することを含む方法も提供する。
【０２９６】
もう一つの実施態様において、本発明は、被検者において新生物形成疾患を治療する方法であって、少なくとも１種の医薬上許容し得るキレート剤及び少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体を含む治療上有効量の液体医薬組成物を被検者に投与することを含む方法も提供する。
【０２９７】
もう一つの実施態様において、本発明は、被検者において炎症又は新生物形成疾患を治療する方法であって、ヒトＩｇＧ２抗体；及びキレート剤を単独又は緩衝液、等張化剤、酸化防止剤又は界面活性剤、及びその混合物から選択される他の賦形剤と組み合わせて含む医薬上許容し得る賦形剤を含む液体医薬組成物を被検者に投与することを含む方法を提供する。
【０２９８】
更なる実施態様において、前述の被検者は、炎症疾患の治療を必要とする者である。他の実施態様において、本発明の方法及び組成物は、種々の炎症疾患の治療を包含し、その中で炎症疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、憩室疾患、胃炎、肝疾患、原発性胆汁性硬化症、硬化症胆管炎を含む胃腸管の炎症疾患であっても良いが、それらに限定されない。炎症疾患は、（腹膜炎、虫垂炎、胆道疾患を含む）腹部疾患、急性横断性脊髄炎、（アレルギー性皮膚、アレルギー性湿疹、皮膚アトピー、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、皮膚炎症、炎症性湿疹、炎症皮膚炎、ノミ皮膚(flea skin)、軍隊皮膚炎(military dermatitis)、軍隊湿疹(military eczema)、イエダニ皮膚を含む）アレルギー性皮膚炎、強直性脊椎炎（ライター症候群）、喘息、気道炎症、アテローム硬化症、動脈硬化症、胆道閉鎖、膀胱炎症、乳癌、（血管炎、リウマチ様爪郭梗塞、下腿潰瘍、多発性筋炎、慢性血管炎症、心膜炎、慢性閉塞性肺疾患を含む）心臓血管炎症、慢性膵炎、神経周囲炎症、（アメーバ性大腸炎、感染性大腸炎、細菌性大腸炎、クローン大腸炎、虚血性大腸炎、潰瘍性大腸炎、特発性直腸結腸炎、炎症性腸疾患、偽膜性大腸炎を含む）大腸炎、膠原血管障害（リウマチ様関節炎、ＳＬＥ、進行性全身性硬化症、混合結合組織病、真性糖尿病）、クローン病（局部性腸炎、肉芽腫性回腸炎、回結腸炎、消化器系炎症）、（脊髄炎、多発硬化症、散在性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、静脈周囲脱髄、ビタミンＢ１２欠乏症、ギラン−バレー症候群、ＭＳ関連レトロウイルスを含む）脱髄性疾患、皮膚筋炎、憩室炎、滲出性下痢、胃炎、肉芽腫性肝炎、肉芽腫性炎、胆嚢炎、インシュリン依存性真性糖尿病、肝炎疾患（肝線維症原発性胆汁性肝硬変、肝炎、硬化性胆管炎）、肺炎症（特発性肺線維症、肺の好酸球性肉芽腫、肺ヒスチオサイトーシスＸ、細気管支周囲炎症、急性気管支炎）、性病性リンパ肉芽腫、悪性黒色腫、（歯肉炎、歯周病を含む）口腔／歯疾患、粘膜炎、筋骨格系炎症（筋炎）、非アルコール性脂肪肝炎（非アルコール性脂肪肝疾患）、（ブドウ膜炎、視神経炎、末梢リウマチ様潰瘍、末梢角膜炎症を含む）眼球及び眼窩炎症、骨関節炎、骨髄炎、咽頭炎症、多発性関節炎、直腸炎、乾癬、放射線傷害、サルコイドーシス、鎌状赤血球、ニューロパシー、表在性血栓静脈炎、全身性炎症反応症候群、甲状腺炎、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病、急性熱傷、ベーチェット症候群及びシェーグレン症候群も含むが、それらに限定されない。
【０２９９】
もう一つの実施態様において、本発明の方法及び組成物は、アテローム硬化症、敗血症、喘息、自己免疫疾患、骨粗しょう症、リウマチ様関節炎、及び骨関節炎から選択される炎症疾患の治療を包含する。
【０３００】
もう一つの実施態様において、本発明の方法及び組成物は、筋ジストロフィー及び虚弱性の治療を包含する。
【０３０１】
もう一つの実施態様において、本発明は、被検者において新生物形成障害を治療する方法であって、ヒトＩｇＧ２抗体；及びキレート剤を単独又は緩衝液、酸化防止剤、等張化剤又は界面活性剤、及びその混合物から選択される他の賦形剤と組み合わせて含む医薬上許容し得る賦形剤を含む治療上有効量の液体医薬組成物を被検者に投与することを含む方法を提供する。更なる実施態様において、前述の被検者は、新生物形成障害の治療を必要とする者である。
【０３０２】
用語「新生物形成」、「新生物形成疾患」、及び「新生物形成障害」は、「新生物」又は腫瘍を指し、それは、良性、前悪性、転移性、又は悪性であり得る。良性、前悪性、転移性、又は悪性新生物形成が、同様に本発明に包含される。良性、前悪性、転移性、又は悪性腫瘍が、同様に本発明に包含される。従って全ての良性、前悪性、転移性、又は悪性新生物形成又は腫瘍が、本発明に包含され、かつ新生物形成、新生物又は新生物形成関連状態と、同義的に呼ばれ得る。腫瘍は、一般的に新生物形成又は「新生」細胞の腫瘤であることが技術的に公知である。とはいえ、１個の新生細胞でも、本発明の目的で、新生物、あるいは新生物形成と考えられることが理解されるべきである。
【０３０３】
本発明の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体によって治療され得る新生物形成障害は、いかなる組織又は器官も関係させることができ、かつ骨、脳、肺、扁平上皮細胞、膀胱、胃、膵臓、胸部、頭部、頚部、肝臓、腎臓、卵巣、前立腺、結腸直腸、食道、婦人科（例えば子宮頚部及び卵巣）、鼻咽頭、又は甲状腺癌を含むが、それらに限定されない。同様に、骨転移、黒色腫、リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫が、用語新生物形成障害に包含される。特に本発明の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体組成物は、胸部、前立腺、結腸及び肺の癌を治療するために有用である。
【０３０４】
他の実施態様において、本発明の方法及び組成物は、末端性ほくろ性黒色腫、光線性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、家族性腺腫様ポリープ症、家族性ポリープ、大腸ポリープ、ポリープ、腺肉腫、腺扁平上皮癌、副腎表皮細胞癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、星状細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腺癌、毛細管癌、カルチノイド、癌腫、卵管癌、子宮内膜癌、癌肉腫、海綿状、中枢神経系リンパ腫、脳星状細胞腫、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌、明細胞癌、皮膚癌、脳癌、大腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、嚢胞腺癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、類子宮内膜腺癌、上衣、類上皮、食道癌、ユーイング肉腫、性腺外胚細胞腫瘍、線維層板(fibrolamellar)、巣状結節性過形成、胆嚢癌、ガストリノーマ、胚細胞腫瘍、妊娠栄養膜腫瘍、グリア芽細胞腫、神経膠腫、グルカゴノーマ、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部及び視覚路神経膠腫、インシュリノーマ、上皮内新生物形成、上皮間扁平細胞新生物形成、眼内黒色腫、侵食扁平上皮細胞癌、大細胞癌、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、ほくろ悪性黒色腫、白血病関連状態、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、メルケル細胞癌、中皮、転移性癌、粘液性類表皮癌、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、脊髄形成異常症候群、骨髄増殖性状態、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌結節性黒色腫、中枢神経系新生物（例えば原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫又は下垂体腺腫）、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵癌、乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、胸膜肺芽細胞腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液癌、小細胞癌、小腸癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、有棘細胞癌、中皮下、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、甲状腺癌、未分化癌、尿道癌、子宮癌、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、膣癌、ビポーマ、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、分化癌、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される新生物形成障害の予防及び治療を包含する。
【０３０５】
より好ましい実施態様において、ヒトＩｇＧ２抗体は、乳癌、前立腺癌、肺癌又は大腸癌を有する被検者に投与される。更により好ましい実施態様において、方法は、癌が異常に増殖することを停止させるか、又は重量若しくは体積を増加させない、又は重量若しくは体積を減少させる。
【０３０６】
製造物品
本発明のもう一つの実施態様において、医薬上許容し得るキレート剤と組み合わせて本発明の少なくとも１種のモノクローナルヒトＩｇＧ２抗体を含む組成物を保持し、かつ任意で使用上の注意を提供する容器を含む製造品が、提供される。適切な容器は、例えば瓶、袋、バイアル及び注射器を含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような種々の材料から形成され得る。代表的な容器は、３〜２０ｃｃの使い捨てガラスバイアルである。あるいは、複数用量の組成物に関して、容器は３〜１００ｃｃのガラスバイアルであっても良い。容器は、組成物及びその上に又は付随してラベルを保持し、容器は、使用説明書を示しても良い。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器、並びに使用上の注意、禁忌及び／又は潜在的副作用一覧のある添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでも良い。
【０３０７】
本発明は、溶液中に少なくとも１種のヒトＩｇＧ２抗体を含む第１容器、及び医薬上許容し得るキレート剤を含む第２容器を含む、抗体の液体医薬組成物を調製するキットも提供する。
【０３０８】
次の実施例は、本発明の実施態様を記載する。ここでの請求項の範囲内の他の実施態様は、ここで開示されるような本発明の明細書の検討又は実践から、当業者にとって明らかであろう。明細書は、実施例と共に、単に代表的であると考えられ、本発明の範囲及び精神は、実施例の後に続く請求項によって示されることが意図される。実施例において、全ての率は、特に指示のない限り、重量ベースで表される。当業者は、実施例に列挙された重量及び／又は比重量が、列挙された成分の技術的に認められた分子量を使用して、モル及び／又はモル濃度に変換され得ることを認識するであろう。ここで例示される重量（例えばグラム）は、（例えば緩衝溶液、抗体組成物等の）列挙される容量用である。当業者は、異なる組成物容量が望まれる時に、重量が比例的に調整され得ることを認識するであろう。
【実施例】
【０３０９】
実施例１−Ａ
この実施例は、Bedian,et al.の米国特許出願公開第２００５００５９１１３号に記載されたような抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を生成するハイブリドーマ細胞系の発生を示す。
免疫化及びハイブリドーマ発生
生後８〜１０週のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）マウスが、ヒトＭ−ＣＳＦ（１０μｇ／用量／マウス）によって腹腔内又は後足蹠において免疫化された。この用量は、３から８週の期間にわたって５から７回反復された。融合の４日前に、マウスは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のヒトＭ−ＣＳＦの最終注入を与えられた。免疫化マウスの脾臓及びリンパ節リンパ球は、非分泌性骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞系と融合され、かつ融合細胞は、ＨＡＴ選択を受けた。Galfre,G.及びMilstein,C.,「Preparation of monoclonal antibodies:strategies and procedures.」Methods Enzymol.73:3-46(1981)を参照。全部がＭ−ＣＳＦ特異性ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体を分泌するハイブリドーマの集団が、回収された。抗体は同様に、Babcook,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-48,1996に記載されたようなＸＥＮＯＭＡＸ（商標）技術を使用して、発生した。本発明の抗体を生成するように設計された９つの細胞系が、更なる研究のために選択され、かつ２５２、８８、１００、３．８．３、２．７．３、１．１２０．１、９．１４．４、８．１０．３及び９．７．２と指定された。ハイブリドーマは、ブダペスト条約に従った条項に基づき、２００３年８月８日にAmerican Type Culture Collection(ATCC),10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209に寄託された。ハイブリドーマには、次の受け入れ番号が割り当てられた。
ハイブリドーマ３．８．３（ＬＮ１５８９１）        ＰＴＡ−５３９０
ハイブリドーマ２．７．３（ＬＮ１５８９２）        ＰＴＡ−５３９１
ハイブリドーマ１．１２０．１（ＬＮ１５８９３）    ＰＴＡ−５３９２
ハイブリドーマ９．７．２（ＬＮ１５８９４）        ＰＴＡ−５３９３
ハイブリドーマ９．１４．４（ＬＮ１５８９５）      ＰＴＡ−５３９４
ハイブリドーマ８．１０．３（ＬＮ１５８９６）      ＰＴＡ−５３９５
ハイブリドーマ８８−ガンマ（ＵＣ２５４８９）      ＰＴＡ−５３９６
ハイブリドーマ８８−カッパ（ＵＣ２５４９０）      ＰＴＡ−５３９７
ハイブリドーマ１００−ガンマ（ＵＣ２５４９１）    ＰＴＡ−５３９８
ハイブリドーマ１００−カッパ（ＵＣ２５４９２）    ＰＴＡ−５３９９
ハイブリドーマ２５２−ガンマ（ＵＣ２５４９３）    ＰＴＡ−５４００
ハイブリドーマ２５２−カッパ（ＵＣ２５４９４）    ＰＴＡ−５４０１
【０３１０】
実施例２−Ａ
この実施例は、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を生成する組換え哺乳動物細胞系の発生を示す。
モノクローナル抗体８．１０．３の重鎖及び軽鎖をコード化するＤＮＡは、それぞれのハイブリドーマ細胞系８．１０．３からクローニングされ、かつＤＮＡ配列は、当業者に公知の方法によって決定された。ハイブリドーマ細胞系８．１０．３からのＤＮＡは、８．１０．３Ｆを得るために、種々のドメイン中の特異フレームワーク領域で突然変異させられた。抗体８．１０．３Ｆの核酸配列及び予測されるアミノ酸配列から、各抗体鎖の遺伝子使用の同一性が（「ＶＢＡＳＥ」）によって決定された。表５は、本発明による抗体８．１０．３Ｆの遺伝子利用を示す。
【０３１１】
【表５】
2006249085.tif 000006
【０３１２】
抗体８．１０．３ＦのＤＮＡ配列インサートが、ハイブリドーマ細胞系から得られ、かつ発現ベクターにサブクローニングされた。次に発現ベクターは、８．１０．３Ｆの重鎖及び軽鎖配列を有する抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を生成する一次トランスフェクタント細胞系を発生させるために、マウス骨髄腫（ＮＳ０）宿主細胞系にトランスフェクトされた。最後に、ＮＳ０細胞系を生成する８．１０．３Ｆ抗体の試料は、凍結され、かつ液体窒素中に貯蔵された。
【０３１３】
実施例３−Ａ
この実施例は、実施例２−Ａにより発生したＮＳ０細胞系からの抗Ｍ−ＣＳＦ８．１０．３Ｆ抗体の生成を示す。
８．１０．３ＦサブクローニングＮＳ０細胞のバイアルは、実施例２−Ａに記載されたような液体窒素貯蔵器から除去された。凍結細胞は、最後の氷晶が見えなくなるまで３７℃で急速に解凍された。次に解凍されたバイアルの全含量（１ミリリットル）が、７５ｃｍ2のＴフラスコにピペットで移された。(Invitrogen,Carlsbad,CAから入手可能な）ウシ胎児血清を含む１０％Ｌｏｗ  ＩｇＧを含む１４ミリリットルの予熱された（３６．５℃±１．０℃）の(Invitrogen,Carlsbad,CAから入手可能な）ＣＤハイブリドーマ増殖培地が、Ｔフラスコにゆっくりとピペットで移された。
【０３１４】
フラスコは、約２．０×１０5から約５．０×１０5細胞／ｍｌの標的生細胞密度で植え付けられた。フラスコは、次に９％の二酸化炭素レベル及び３６．５℃の温度を有するインキュベータ内に置かれ、かつ細胞は約３日間培養された。この期間の終了時に、標的細胞数は、約１．０から３．０×１０5細胞／ｍｌであった。
【０３１５】
細胞は、約３日間培養された後、２．５×１０5＋／−０．５×１０5の標的細胞密度が、得られるように分割され、かつ次に使い捨て振盪フラスコ（すなわち、種子フラスコ(seed flasks)）が、細胞密度に基づき、接種された。各振盪フラスコは、ウシ胎児血清を含む１０％Ｌｏｗ  ＩｇＧを含むＣＤハイブリドーマ増殖培地を含んだ。フラスコは、次に約３日間、１００＋／−１０回転／分、３６．５℃±１．０℃で振り動かされた。この期間の終了時での各フラスコ内の細胞密度は、１．０から３．０×１０5細胞／ｍｌであり、かつ８０％を超える細胞が、生存可能であった。
【０３１６】
細胞が、約３日間培養された後、ブロスが採取された。清澄ブロスが、７０００回転／分で１５分の遠心分離、及び滅菌ＴＣ−Ｔｅｃｈ（商標）バッグへの滅菌０．２２μｍ４インチＯｐｔｉｃａｐ（商標）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）フィルタによるその後の濾過の後に得られた。
【０３１７】
実施例４−Ａ
この実施例は、実施例３−Ａの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の精製を示す。
清澄ブロスは、蛋白質Ａアフィニティカラム及び２つのイオン交換カラムを含む３つのクロマトグラフステップによって次に精製された。工程におけるいかなる潜在的ウイルスも取り除くために、低ｐＨ不活性化及びウイルス濾過も同様になされた。生成物は、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体組成物を作製するために、濃縮され、かつ組成物緩衝液へのダイアフィルトレーションが行われる。
【０３１８】
蛋白質Ａカラム(Amersham Pharmacia)は、３カラム容量の８Ｍ尿素によって洗浄すること、及びその後に２０ｍＭトリス（ｐＨ８）による平衡洗浄によって調製された。実施例３の最終濾液は、重力滴下方式によって蛋白質Ａカラムに装入される前に、２％ｖ／ｖの１ＭトリスｐＨ８．３及び０．０２％ＮａＮ3がスパイクされた。装入が完了した後、樹脂は、５カラム容量の２０ｍＭトリス（ｐＨ８）及びその後に５カラム容量の溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０）によって洗浄された。いかなる沈殿も観察され、かつ次に１０％ｖ／ｖスパイクの１ＭトリスｐＨ８．３が、溶出抗体に添加された。溶出蛋白質は、次に透析緩衝液（例えば１４０ｍＭ塩化ナトリウム／２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）の溶出材料の容量の１００倍に透析された。透析に続き、抗体は、０．２２μｍフィルタによって滅菌濾過され、かつ更に使用されるまで貯蔵された。
【０３１９】
実施例５−Ａ
モノクローナル抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆを含む液体組成物中の変色、凝集及び断片化に対するＥＤＴＡ及びヒスチジンの影響を評価するために、研究が行われた。かかる液体組成物中の変色及び凝集は、生成物の美的観点、生成物の完成性観点、又は両方から、一般的に望ましくない。
【０３２０】
組成物の調製
本発明の医薬組成物は、次の手順に従って作製された。組成物の調製に使用された材料には：氷酢酸９９．９％（分子量（ＭＷ）６０．０５）、濃縮水酸化ナトリウム１８．９４Ｎ（５０％ｗ／ｗ、ＭＷ４０．０）、濃縮塩酸３７．８％（１２．４４Ｎ、ＭＷ３６．４６）、ヒスチジン（ＭＷ１５５．１６）、塩化ナトリウム（ＭＷ５８．４４）、マンニトール（ＭＷ１８２．１７）、ポリソルベート８０（ｃｒｉｌｌｅｔ（登録商標）４ＨＰ）、酢酸ナトリウム三水和物（ＭＷ１３６．０８）、クエン酸ナトリウム二水和物（ＭＷ２９４．１）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物（ＭＷ２９２．２）、コハク酸（ＭＷ１１８．１）、抗体８．１０．３Ｆバルク溶液（実施例２−４により調製された、酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で約１０ｍｇ／ｍｌ）、及び注入用の水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）が含まれる。これらの溶液が、調製され、かつ次に１Ｌナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）ボトルに滅菌濾過され、かつ５℃で貯蔵された。
【０３２１】
評価された抗体組成物は、下記表６に一覧にする。各組成物を調製するために、最初に組成緩衝液が、緩衝液のみによってか、緩衝液及び（ポリソルベート８０のような界面活性剤の添加を除き）等張化剤のような追加の賦形剤によって（表６中で報告する）、及びその後にｐＨの所望のレベルへの調整によって作製された。緩衝溶液は、次に滅菌フィルタ（０．２２ミクロン孔径）を通して滅菌された容器に濾過された。実施例４−Ａに記載された精製工程の抗体バルク溶液は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５及び１４０ｍＭ塩化ナトリウム中で約１０〜１５ｍｇ／ｍＬで得られた。上記組成物溶液へのこのバルク溶液の緩衝液交換は、約４５００ｘｇで動かされるＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機上で（例えば３０ｋＤ遮断膜による）Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離濃縮機により実行された。それぞれの緩衝液中の各組成物に関して、少なくとも８回の容量交換がなされた。約２〜５ミリリットルの組成物１−Ａから１３−Ａが調製された。抗体濃度は、２８０ｎｍで１．４３（ｍｇ／ｍｌ）-1ｃｍ-1の減衰係数を使用して、紫外線可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）法によって決定された。抗体溶液の最終容量は、所望の抗体濃度を得るために、適切な希釈によって調整された。２０ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０（ＰＳ８０）溶液が、上記のように調製された適切な組成物緩衝液によるポリソルベート８０の希釈及び溶解によって調製された。組成物９−Ａから１３−Ａに関して、必要量の２０ｇ／Ｌポリソルベート８０溶液の添加が、抗体組成物中で０．２ｇ／Ｌポリソルベート８０を得るためになされた。その成分全部が含まれる組成物は、次に滅菌０．２２ミクロン膜フィルタを通した濾過によって滅菌された。
【０３２２】
組成物番号１１−Ａ（すなわち、ヒスチジン、マンニトール、ポリソルベート８０及びＥＤＴＡ）に関して、１モル（Ｍ）塩酸溶液が、注入用の水による濃塩酸からの適切な希釈によって最初に調製された。個々の溶液が次に、約９０％の注入用の水中で、次の事前に重量を測定した成分を溶解させることによって、調製された：４５グラム／リットル（ｇ／Ｌ）のマンニトール、１．５５ｇ／Ｌのヒスチジン、０．０２ｇ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物。ポリソルベート８０を除く賦形剤全部の添加後、溶解が得られ、かつ溶液のｐＨは、上記のように調製された１Ｍ塩酸溶液によってｐＨ６に調整された。塩酸溶液の添加後、最終量の水が添加された。緩衝溶液は次に、滅菌フィルタ（０．２２ミクロン孔径）を通して滅菌容器に濾過された。
【０３２３】
２０ｇ／Ｌポリソルベート８０溶液は、組成緩衝液（４５ｇ／Ｌのマンニトール、１．５５ｇ／Ｌのヒスチジン、０．０２ｇ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物、ｐＨ６）によるポリソルベート８０の適切な希釈によって調製された。
【０３２４】
濾過された組成物は、次にバイアルに充填された。バイアルは、１３ｍｍ  Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１血清栓のように、洗浄され、かつ加圧滅菌された。０．２５〜１ｍｌの充填容量は、２ｍｌタイプ１ガラスバイアル中で使用された。バイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、クリンプシールされ、かつ安定チャンバ内に置かれた。
【０３２５】
組成物外観分析
各組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して初期（すなわちゼロ時間）及びその後所望の試料採取間隔（週）で目視評価された。目視観察は、表６に報告した。外観検定は、白黒の背景を備えたライトボックス内で行われる目視検査によった。抗体濃度は、２８０ｎｍで１．３４（ｍｇ／ｍｌ）-1ｃｍ-1の減衰係数を使用して、紫外線可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）法によって決定された。
【０３２６】
【表６】
2006249085.tif 000007
【０３２７】
表６中の結果は、初期時点（すなわち時間＝ゼロ）で、全ての試験を受けた抗体８．３．１０Ｆ組成物に、有意な変色がなく、有意な濁り度がなく、かつ有意な粒子形成がないことを示す。
【０３２８】
実施例６−Ａ
種々の組成物及びｐＨの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ断片化に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０３２９】
断片化分析：
上述のように、表６及び実施例５−Ａにより調製された抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０（初期）、２、４及び６週に、４０℃の組成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して断片化に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取され、かつバイアルからのアリコートは、コロイド状青（クーマシー）染色を有するＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲルへ装入された。ゲル還元は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤の使用によって得られた。還元ゲル中の断片化率（すなわち１１キロダルトン（ｋＤ）ポリペプチド断片及び他の断片の存在）は、１００％−（重鎖％＋軽鎖％）によって濃度測定により推定され、かつ表７に報告された。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルから推定された断片化率（すなわち重鎖（約５０ｋＤ）及び軽鎖（約２５ｋＤ）以外のポリペプチドの存在）を示す線グラフを示す。還元断片化は、５．５〜６．０のｐＨ範囲で見られた。ゲルデータは、４０ｋＤ及び１１ｋＤのおおよその分子質量を有する断片バンドを示した。
【０３３０】
【表７】
2006249085.tif 000008
【０３３１】
図１は、表７に詳述した各試料組成物に関する断片化率（すなわち重鎖（約５０ｋＤ）及び軽鎖（約２５ｋＤ）以外のポリペプチドの存在）を示す。減少した断片化レベルが、５．５〜６．０のｐＨ範囲を有する組成物において見られた。減少した断片化レベルは、酢酸塩無しであるが、キレート剤を有する組成物においても見られた。
【０３３２】
実施例７−Ａ
種々の組成物及びｐＨの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ荷電種発生に対する影響を評価するために、研究が行われた。主要な等電点電気泳動（ＩＥＦ）バンド率が、６週間にわたって４０℃で貯蔵された抗体試料を有するＩＥＦゲルから推定された。
【０３３３】
酸性及び塩基性種の形成
表６及び実施例５−Ａにより調製された抗体組成物１−Ａから４−Ａが、４０℃の温度で貯蔵された。６週間貯蔵した後、各組成物は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を使用して酸性及び塩基性種の形成に関して分析された。撮像キャピラリー電気泳動が、荷電不均一性評価のためにＣｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉＣＥ280分析器を使用して行われた。Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｉＣＥ280は、撮像キャピラリー等電点電気泳動（ＩＥＦ）装置であり、使用者が、キャピラリー中に含まれる分離された試料を撮像することを可能にする。ＩＥＦ検定は、ｐＨ３〜１０．５ポリアクリルアミドゲル及びクーマシー青染色を使用して行われた。試料蛋白質成分は、それらの相対等電点（ｐｌ）に基づき、分離された。主要種は、初期試料における特定ｐｌでの最高濃度測定バンドの強度に基づき割り当てられた。主要種率の変化は、貯蔵期間に応じて起きた。初期値からの主要種率の損失は、酸性及び塩基性種の形成程度の尺度である。
【０３３４】
酸性及び塩基性種の形成は、撮像キャピラリー電気泳動（ｉＣＥ）によっても観察された。ｉＣＥが、荷電不均一性評価のためにＣｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉＣＥ280分析器を使用して行われた。Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｉＣＥ280は、撮像キャピラリー等電点電気泳動装置であり、使用者が、キャピラリー中に含まれる分離された試料を撮像することを可能にする。試料は、電気泳動両性電解質、メチルセルロース、校正マーカー及び水の混合物中で調製された。試料は、ｉＣＥ280に導入され、かつ高電位／電圧が加えられた。試料蛋白質成分は、それらの相対等電点（ｐｌ）に基づき、分離された。相対量の各分離成分は、撮像ＣＣＤカメラによって観察された。データは次に、従来のクロマトグラフ統合ソフトウェアを使用して処理され、かつ主なピークの損失（すなわち酸性及び塩基性種の形成）として報告された。
【０３３５】
図２は、６週間にわたって４０℃で貯蔵された組成物１〜４を有するＩＥＦゲルから推定された主要ＩＥＦバンド率を示す。図２に見られるように、ｐＨ５．５及び６．０での主要ＩＥＦバンドのより小さな減少程度は、５．５〜６．０のｐＨでの改良された安定性を示唆した（すなわち組成物番号３−Ａ及び４−Ａ）。
【０３３６】
実施例８−Ａ
ＥＤＴＡの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ凝集に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０３３７】
特に、試料組成物番号３−Ａ、５−Ａ、６−Ａ、７−Ａ及び８−Ａが、表６及び実施例５−Ａに従って、ＥＤＴＡ有り及びＥＤＴＡ無しで調製され、かつ０（初期）、２、４及び６週間、４０℃で数個のガラスバイアル中に貯蔵された。ガラスバイアルは次に、０、２、４及び６週の時点で、組成物中の抗体８．１１．３Ｆ凝集レベルを測定するために、無菌で試料採取された。その上、組成物１１−Ａ（ＥＤＴＡ有り）も、表６に従って調製され、かつ２６週間、４０℃で数個のガラスバイアル中に貯蔵された。
【０３３８】
凝集分析：
０、２、４及び６週間後、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。サイズ排除クロマトグラフィ（すなわちＳＥ−ＨＰＬＣ）は、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。表８は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１１．３Ｆの凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表８参照）。
【０３３９】
【表８】
2006249085.tif 000009
【０３４０】
表８及び図３に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物（すなわち組成物８−Ａ）は、ＥＤＴＡ無しの組成物と比較して、時間が経っても低い凝集レベルを示した。図１１は、４０℃で２６週間、組成物１１−Ａ中に貯蔵されたモノクローナル抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆに関するサイズ排除クロマトグラムを示す。
【０３４１】
実施例９−Ａ
ＥＤＴＡの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ凝集及び断片化に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０３４２】
特に、試料組成物番号９−Ａ、１０−Ａ、１１−Ａ、１２−Ａ及び１３−Ａが、表６及び実施例５−Ａに従って、ＥＤＴＡ有り及びＥＤＴＡ無しで調製され、かつ０（初期）、４、６、８、１２及び２６週間、４０℃で数個のガラスバイアル中に貯蔵された。ガラスバイアルは次に、所定の時点で、組成物中の抗体８．１１．３Ｆ凝集レベルを測定するために、無菌で試料採取された。
【０３４３】
凝集分析：
０、４、６、８、１２及び２６週に、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。サイズ排除−高圧液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）は、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。表９は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１１．３Ｆの凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表９参照）。
【０３４４】
【表９】
2006249085.tif 000010
【０３４５】
表９及び図４に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物（すなわち組成物１０−Ａ、１１−Ａ、１２−Ａ及び１３−Ａ）は、ＥＤＴＡ無しの組成物（すなわち組成物９−Ａ）と比較して、時間が経っても低い凝集レベルを示した。
【０３４６】
断片化分析：
０、４、６、８、１２及び２６週に、組成物番号９−Ａ、１０−Ａ、１１−Ａ、１２−Ａ及び１３−Ａは、断片化に関して同様に分析された。
【０３４７】
有機サイズ排除−高圧液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）が、抗体の約１１ｋＤ断片に関する断片化率を決定するために、０、４、６、８、１２及び２６週の時点で試料に対して行われた。試料は、０．５０ｍＬ／分の流量での定組成移動相の４０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００サイズ排除カラムに注入された。溶出種率は、ピークの領域を積分することによって決定された。
【０３４８】
【表１０】
2006249085.tif 000011
【０３４９】
表１０及び図５に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物（すなわち組成物１０−Ａ、１１−Ａ、１２−Ａ及び１３−Ａ）は、ＥＤＴＡ無しの組成物（すなわち組成物９−Ａ）と比較して、時間が経っても低いレベルの１１ｋＤの断片を生む断片化を示した。その上、ヒスチジン含有組成物（すなわち組成物１１−Ａ）は、ヒスチジン無しの組成物（すなわち組成物９−Ａ、１２−Ａ及び１３−Ａ）と比較して、時間が経っても低いレベルの１１ｋＤの断片を生む断片化を示した。
【０３５０】
その上、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルも、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲル、及びコロイド状青（クーマシー）染色を使用して、０、４、６、８、１２及び２６週の時点で試料と共に流された。還元ゲルに関して、還元は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤によって得られた。還元ゲル中の断片化率は、１００％−（重鎖％＋軽鎖％）によって濃度測定により推定された。ゲルデータは、４０ｋＤ及び１１ｋＤのおおよその分子質量を有する断片バンドを示した。図６は、組成物試料によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルデータから推定された断片化率を示す。図７は、組成物試料によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元ゲルデータから推定された抗体のモノマー率を示す。
【０３５１】
図４〜７は、組成物９−Ａ、１０−Ａ、１２−Ａ及び１３−Ａと比較して、減少した凝集（図４）、１１ｋＤ断片化の減少した量（図５）、減少した断片化種（図６）、及び最高の無傷な抗体モノマー率を保持すること（図７）に関する組成物１１−Ａ（１０ｍＭヒスチジン、４５ｍｇ／ｍｌマンニトール、０．０２ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、及び０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０）の改良された抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の安定性を示す。
【０３５２】
実施例１０−Ａ
ＥＤＴＡ及びヒスチジンの抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ断片化に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０３５３】
抗体８．１０．３Ｆの数種の実験組成物は、図９に示すような、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真に現れる約４０ｋＤ及び１１ｋＤでのバンド形成によって観察されるように、６週間、４０℃の応力状態で、切断された種（すなわち断片）を発生させた。最も豊富なクリップ部位（ｃｌｉｐ  ｓｉｔｅ）の同一性は、分子の重鎖上の残渣Ａｓｐ９９及びＰｒｏ１００の間にあるように決定された。軽鎖中の幾つかの小さな切断部位が、一方は残渣Ｇｌｙ２１３及びＧｌｕ２１４の間で、かつ他方はＧｌｕ２１４及びＣｙｓ２１５の間で同様に観察された。切断レベルは、組成物によって変わり、かつこれまでは高温で（例えば４０℃）、すなわち応力状態でのみ観察された。
【０３５４】
酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム中で配合され、かつ２６週間、４０℃で貯蔵された抗体８．１０．３Ｆの試料（組成物番号９−Ａ）は、有機ＳＥ−ＨＰＬＣを使用して、ヒスチジン及びＥＤＴＡを含む組成物（組成物番号１１−Ａ）よりも高い１１ｋＤ断片の存在を有するように、観察された（図８参照）。
【０３５５】
この試料は次に、切断部位を決定するために、有機サイズ排除クロマトグラフィ／質量分光測定（ＳＥＣ／ＭＳ）によって分析された。試料は、０．５０ｍＬ／分の流量での定組成移動相の４０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡを使用して、サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＳＥＣ３０００、４．６×２５０ｍｍ）に注入された。カラムの溶出液は、流れのおおよそ半分がエレクトロスプレー質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ  Ｍｉｃｒｏ（商標）、Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．）のソースに向けられるように、分割された。各クロマトグラフピークの質量スペクトルは、オペレーティングソフトウェアに含まれるＭａｘＥｎｔアルゴリズムを使用して、解析された（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）。測定分子質量は、次に抗体８．１０．３Ｆの予想されたアミノ酸配列に基づく理論分子質量と比較された。
【０３５６】
質量分光同定が後に続く、２１４ｎｍ検出による有機ＳＥ−ＨＰＬＣ分離は、対照試料と比較して、６週間、４０℃で貯蔵された組成物番号１−Ａ中で抗体８．１０．３Ｆに関して実行された。図１０は、上部グラフとして４０℃の貯蔵を、かつ下部グラフとして５℃の対照を有する、結果として生じたクロマトグラムを示す。クロマトグラム測定質量は、集計され、かつ表１１の仮定種の理論質量と比較された。
【０３５７】
【表１１】
2006249085.tif 000012
【０３５８】
応力状態で、抗体８．１０．３Ｆは、開裂を受け、かつ切断種を発生させることができる。主な開裂部位は、１つ及び２つの切断生成物を引いた対応する親種と共に１０，８１６Ｄａ（すなわち約１１ｋＤ）種を発生させる、８．１０．３Ｆの重鎖中のＡｓｐ−Ｐｒｏ結合の開裂と一致する。
【０３５９】
実施例１１−Ａ
種々の緩衝液の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ凝集に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０３６０】
特に、試料組成物番号６−Ａ、３−Ａ、５−Ａ及び８−Ａが、表１１及び実施例５−Ａにより調製され、かつ６週間、４０℃でガラスバイアル中に貯蔵された。ガラスバイアルは次に、６週の時点での組成物中の抗体８．１１．３Ｆの凝集レベルを測定するために、無菌で試料採取された。
【０３６１】
凝集分析：
６週の時点で、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。サイズ排除クロマトグラフィ（すなわちＳＥ−ＨＰＬＣ）は、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。表１１は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１１．３Ｆの凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ抗体モノマーに先立って溶出した高分子量種ピーク（すなわち無傷の非凝集ポリペプチド）の積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表１１参照）。
【０３６２】
【表１２】
2006249085.tif 000013
【０３６３】
表１１に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物（すなわち組成物８−Ａ）は、ＥＤＴＡ無しの組成物（すなわち組成物６−Ａ、３−Ａ及び５−Ａ）と比較して、減少した凝集レベルを示した。
【０３６４】
実施例１２−Ａ
種々の賦形剤の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ凝集及び断片化に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０３６５】
特に、試料組成物番号１８−Ａ、１９−Ａ、２０−Ａ、２９−Ａ、３０−Ａ及び３１−Ａが、表１２及び実施例５−Ａにより調製され、かつ６週間、４０℃でガラスバイアル中に貯蔵された。ガラスバイアルは次に、６週の時点での組成物中の抗体８．１１．３Ｆの凝集及び断片化レベルを測定するために、無菌で試料採取された。
【０３６６】
凝集分析：
６週の時点で、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。サイズ排除クロマトグラフィ（すなわちＳＥ−ＨＰＬＣ）は、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。表１２は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１１．３Ｆの凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ抗体モノマーに先立って溶出した高分子量種ピーク（すなわち無傷の非凝集ポリペプチド）の積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表１２参照）。
【０３６７】
断片化分析：
６週の時点で、各組成物は、有機ＳＥ−ＨＰＬＣを使用して断片化に関しても分析された。有機ＳＥ−ＨＰＬＣは、全ポリペプチドの１１ｋＤ断片に関する断片化率を決定するために試料に対して行われた。試料は、０．５０ｍＬ／分の流量での定組成移動相の４０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００サイズ排除カラムに注入された。溶出種率は、ピークの領域を積分することによって決定され、かつ表１２に報告された。
【０３６８】
【表１３】
2006249085.tif 000014
【０３６９】
表１２に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物（すなわち組成物３０−Ａ、３１−Ａ、１９−Ａ及び２０−Ａ）は、ＥＤＴＡ無しの組成物（すなわち組成物２９−Ａ及び１８−Ａ）と比較して、減少した凝集及び断片化レベルを示した。
【０３７０】
実施例１３−Ａ
種々の賦形剤の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ断片化に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０３７１】
特に、試料組成物番号２１−Ａから２８−Ａが、表１３及び実施例５−Ａにより調製され、かつ２６週間、４０℃でガラスバイアル中に貯蔵された。ガラスバイアルは次に、２６週の時点での組成物中の抗体８．１１．３Ｆの断片化レベルを測定するために、無菌で試料採取された。
【０３７２】
断片化分析：
２６週の時点で、各組成物は、有機ＳＥ−ＨＰＬＣを使用して断片化に関して分析された。有機ＳＥ−ＨＰＬＣは、全ポリペプチドの１１ｋＤ断片に関する断片化率を決定するために試料に対して行われた。試料は、０．５０ｍＬ／分の流量での定組成移動相の４０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００サイズ排除カラムに注入された。溶出種率は、ピークの領域を積分することによって決定され、かつ表１３に報告された。
【０３７３】
【表１４】
2006249085.tif 000015
【０３７４】
表１３に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物（すなわち組成物２２−Ａから２８−Ａ）は、ＥＤＴＡ無しの組成物（すなわち組成物２１−Ａ）と比較して、減少した断片化レベルを示した。同様に、表１４に見られるように、ヒスチジン含有組成物（すなわち組成物２５−Ａから２８−Ａ）は、ヒスチジン無しの組成物（すなわち組成物２１−Ａから２４−Ａ）と比較して、減少した断片化レベルを示した。
【０３７５】
実施例１−Ｂ
この実施例は、Hanson,et al.の米国特許第６，６８２，７３６号に記載されたような抗ＣＴＬＡ−４抗体を生成するハイブリドーマ細胞系の発生を示す。
【０３７６】
本発明の抗体は、次のように調製され、選択されかつ検定された：
抗原調製：３つの異なる免疫原が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスの免疫化のために調製された：すなわち（ｉ）ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ融合蛋白質、（ｉｉ）ＣＴＬＡ−４ペプチド、及び（ｉｉｉ）細胞表面に構成性発現されるＣＴＬＡ−４（Ｙ２０１Ｖ）の突然変異体によってトランスフェクトされた３００．１９マウスリンパ腫細胞である。
ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１融合蛋白質：
【０３７７】
発現ベクター構造
ＣＴＬＡ−４の、ｃＤＮＡをコード化する成熟細胞外ドメインは、公開された配列（Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：１９０１−１９０５（１９８８））のために設計されたプライマーを使用して、ヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅された。断片は、ヒトオンコスタチンＭシグナルペプチド及びヒトＩｇＧガンマ１（ＩｇＧ１）ＣＨ１／ＣＨ２／ＣＨ３ドメインの間で、ｐＳＲ５、シンドビスウイルス発現プラスミド（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に、方向性サブクローニングされた。融合蛋白質は、ヒンジドメインを含まないが、共有結合ダイマーを形成するために、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン中にシステイン１２０を含む。結果として生じたベクターは、ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１／ｐＳＲ５と呼ばれた。ベクター中の完全なＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１  ｃＤＮＡは、両方のストランド中で確認された配列であった。アミノ酸配列ＣＴＬＡ４−Ｉｇ蛋白質を以下に示す。ＣＤ４４の成熟細胞外ドメインは、ヒトリンパ球ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅され、かつ同一のＩｇＧ１尾部を有する対照蛋白質を発生させるために、ｐＳｉｎＲｅｐ５にサブクローニングされた。
【０３７８】
【化１】
2006249085.tif 000016
【０３７９】
ＣＤ２８の成熟細胞外ドメインのｃＤＮＡは、ヒトリンパ球ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅され、かつ次にトロンビン開裂及びヒンジ領域の両方を含むヒトＩｇＧ１融合蛋白質を生成するために、ｐＣＤＭ８にサブクローニングされた（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５２６１−７１（１９９３））。マーモセット、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、及びアカゲザルＣＴＬＡ４は、標準的な縮退ＰＣＲ技術を使用して、ＰＨＡ刺激されたＰＢＭＣから分離されたｍＲＮＡからクローニングされた。配列決定は、アカゲザル及びカニクイザルアミノ酸配列が、同一であり、成熟ヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインと３個の相違がある（Ｓ１３Ｎ、Ｉ１７Ｔ及びＬ１０５Ｍ）ことを示した。マーモセットは、成熟ヒトＣＴＬＡ４細胞外ドメインと１０個のアミノ酸の相違を示した（Ｖ２１Ａ、Ｖ３３Ｉ、Ａ４１Ｔ、Ａ５１Ｇ、５４１、Ｓ７１Ｆ、Ｑ７５Ｋ、Ｔ８８Ｍ、Ｌ１０５Ｍ及びＧ１０６Ｓ）。部位特異的突然変位誘発が、ヒトＣＴＬＡ４−ＩｇＧとの抗体の相互作用に重要なアミノ酸をマッピングするため、マーモセットＣＴＬＡ４において異なる全てのアミノ酸の一点突然変異を作製するために使用された。エピトープマッピングのためのヒト及びマーモセットＣＴＬＡ−ＩｇＧの突然変異は、ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ部位特異的突然変異誘発（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって発生した。ＩｇＧ融合蛋白質は、Ｃｏｓ７細胞の一過性トランスフェクションによって生成され、かつ標準的な蛋白質Ａ技術を使用して精製された。突然変異体ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ蛋白質は、免疫ブロット法による抗体への結合に関して評価され、かつＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用した。
【０３８０】
組換え蛋白質発現／精製
組換えシンドビスウイルスは、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎによって記載されたようなＳＰ６インビトロ転写ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１／ｐＳＲ５  ｍＲＮＡ及びＤＨ−２６ＳヘルパーｍＲＮＡを有する仔ハムスター腎細胞を電気穿孔すること（Ｇｉｂｃｏ）によって発生した。４８時間後、組換えウイルスが、採取され、かつチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）における最適な蛋白質発現のために滴定された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、４ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中の懸濁液中で培養された。ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧを生成するために、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１×１０7細胞／ｍｌで再懸濁され、かつ室温で１時間、シンドビスウイルスと共にインキュベートされた。次に細胞は、蛋白質Ａセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してウシＩｇＧの放血された１％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、４ｍＭグルタミン、１２．５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１×１０6／ｍｌに希釈された。感染後４８時間の細胞は、ペレット化され、かつ馴化培地は、採取され、かつ完全なプロテアーゼ抑制因子タブレット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が補充され、７．５にｐＨ調整され、かつ０．２μの濾過（Ｎａｌｇｅｎｅ）がなされた。ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が、１０ｍｌ／分の流量で５ｍｌ蛋白質Ａ  ＨｉＴｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、融合蛋白質をアフィニティ精製するために使用された。カラムは、３０床容量のＰＢＳによって洗浄され、かつ１ｍｌ／分で０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．８により溶出された。分画（１ｍｌ）は、トリスｐＨ９によってｐＨ７．５に直ちに中和された。ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１を含む分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され、かつ次に、溶剤としてＰＢＳを使用して１ｍｌ／分でセファロース２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加えられる前にｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  ５０（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮された。ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１を含む分画は、貯留され、０．２μの滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）がなされ、かつアリコートが取られ、かつ−８０℃で凍結された。ＣＤ４４−ＩｇＧ１が、発現され、かつ同じ方法を使用して精製された。ＣＤ２８−ＩｇＧは、一過性トランスフェクトされたＣｏｓ７細胞からの馴化培地から精製された。
【０３８１】
ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１の特性決定：
精製ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１は、コロイド状クーマシー染色法（Ｎｏｖｅｘ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドとして移動した。非還元状態で、ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１は、ダイマー（１００ｋＤａ）であり、それは５０ｍＭ  ＤＴＴによって処理された時に５０ｋＤａモノマーに還元された。溶液中の精製ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１のアミノ酸配列決定は、ＣＴＬＡ−４のＮ末端（ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳ）、及びオンコスタチンＭシグナルペプチドが、成熟融合蛋白質から開裂されたことを確認した。ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１は、固定化Ｂ７．１−ＩｇＧに濃度依存的に結合し、かつ結合は、ハムスター−抗ヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体（ＢＮＩ３：ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）によって遮断された。滅菌ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧは、無エンドトキシンであり、かつ減衰係数として１．４を使用してＯＤ２８０によって定量された。精製ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧの収率は、０．５〜３ｍｇ／リットルのＣＨＯ−Ｋ１細胞の範囲であった。
【０３８２】
ＣＴＬＡ−４ペプチド：
次のＣＴＬＡ−４ペプチドが、下記のように調製された。
【０３８３】
【化２】
2006249085.tif 000017
【０３８４】
略語／材料：
ＮＭＰ、Ｎ−メチルピロリジノン；ＴＦＥ、２，２，２−トリフルオロエタノール；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＦＭＯＣ、フルオレニルメトキシカルボニル。全ての試薬は、次の例外を除き、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって供給された：ＴＦＥ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＰＭＣ）−ＯＨ；ＦＭＯＣ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（ＢＯＣ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、ＦＭＯＣ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ及びＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨは、側鎖保護基を必要とするアミノ酸に使用された。
【０３８５】
ペプチド合成：
ペプチド合成は、３０１ｎｍでの紫外線吸光度によるフィードバックモニタリングによって改良されたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ４３１Ａで行われた（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ７５９Ａ検出器）。ペプチド配列は、条件付二重結合サイクルを使用して、ＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂に集められた。強制二重結合は、サイクル１０、１１、１８、１９、２０及び２８から３３で行われた。樹脂は、各アシル化サイクルの完了時に、ＤＣＭ及びＴＦＥの５０％混合物によって洗浄され、その後にＮＭＰ中の無水酢酸による未反応アミノ基のキャッピングが続いた。樹脂は、サイクル４９を完了した後、反応装置から除去され、かつ残部は、完了まで留まった。樹脂からのペプチド開裂は、４１５ｍｇの樹脂に対して６時間、試薬Ｋを使用して行われ(King et al.International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266(1990))、１８６ｍｇの粗ＣＴＬＡ−４ペプチドをもたらした。
【０３８６】
ペプチドの特性決定：
粗ＣＴＬＡ−４ペプチドの２５ｍｇのアリコートが、ｐＨ６．４で５ｍｌの６ＭグアニジンＨＣｌ／１００ｍＭ  Ｋ2ＰＯ3中で溶解され、かつＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｈｉ  Ｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラム（１６ｍｍ×６００ｍｍ、１２０ｍｌ床容量）上に溶出され、２ＭグアニジンＨＣｌ／１００ｍＭ  Ｋ2ＰＯ3が、ｐＨ６．４、１８０分間、２ｍｌ／分で、５ｍｌの分画を収集した。分画は、１．７μｌの分画を、ＭＥＳ流動緩衝液によって流動するＮｕＰＡＧＥ  Ｌａｅｍｅｌｉゲルに装入し、かつＤａｉｃｈｉｉ銀染色手順によって視覚化することにより分析された。分子量標準に対して判断されたように、１２ｋＤａの分子量を示すこれらの分画は、一緒に貯留され、かつ４℃で貯蔵された。組み合わされた分画は、紫外線及びゲル電気泳動によって分析された。アミノ酸配列決定は、（ＰＶＤＦ膜に吸収される）ＰｒｏＳｏｒｂカートリッジ中で１００マイクロリットルの試料を吸収し、かつ緩衝塩を除去するために洗浄することによって行われた。配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４２０シーケンサーで行われた。予期されたＮ末端配列（ＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡ）が観察された。免疫ブロット法は、ペプチドが、ＢＮＩ３抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）によって認識されることを示した。脱塩するために、６４８μｇの材料を含むアリコートは、３５００Ｄａ  ＭＷＣＯ透析管中に置かれ、かつ撹拌して９日間、４℃で０．１％ＴＦＡ／Ｈ２０に対して透析された。透析バッグの全内容物は、凍結乾燥され、粉末になった。
【０３８７】
ＣＴＬＡ−４（Ｙ２０１Ｖ）ペプチド抗原によってトランスフェクトされた「３００．１９」細胞：
ＣＴＬＡ−４  ｃＤＮＡの全長は、ヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＰＣＲ増幅され、かつｐＩＲＥＳｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングされた。構成性細胞表面発現という結果になるＣＴＬＡ−４の突然変異は、ＭａｔｃｈＭａｋｅｒ突然変異誘発システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して導入された。チロシン、Ｙ２０１からバリンへの突然変異は、ＣＴＬＡ−４の急速なインターナリゼーションに関与するアダプチン蛋白質ＡＰ５０の結合を阻害する(Chuang,et al.J.Immunol.159:144-151(1997))。マイコプラズマの無い３００．１９マウスリンパ腫細胞は、１０％のウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、１２．５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、及び２５μＭベータ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０中で培養された。細胞は、２００Ｖ／１１８０ｕＦ（Ｇｉｂｃｏ  ＣｅｌｌＰｏｒａｔｏｒ）を使用して、２０μｇ  ＣＴＬＡ−４−Ｙ２０１Ｖ／ｐＩＲＥＳｎｅｏによって１ｍｌチャンバ中で電気穿孔された（３×１０6／０．４ｍｌ無血清ＲＰＭＩ）。細胞は、１０分間静止され、その後８ｍｌの予熱された完全ＲＰＭＩ培地。４８時間で、細胞は、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含む完全ＲＰＭＩ培地中で０．５×１０6／ｍｌに希釈された。耐性細胞は、拡大され、かつフィコエリトリン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と抱合されるＢＮＩ３抗体を使用して細胞表面にＣＴＬＡ−４を発現することが認められた。高レベル発現細胞が、滅菌選別によって分離された。
【０３８８】
免疫化及びハイブリドーマ生成：
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウス（生後８〜１０週）は、（ｉ）完全フロイントアジュバントによってリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁された、上記のようなＣＴＬＡ−４を発現するためにトランスフェクトされた１×１０7の３００．１９細胞によって、尾底に皮下で、又は（ｉｉ）完全フロイントアジュバントによって乳化された（ａ）１０μｇ  ＣＴＬＡ−４融合蛋白質又は（ｂ）１０μｇ  ＣＴＬＡ−４ペプチドによって尾底に皮下で免疫化された。各場合において、用量は、不完全フロイントアジュバント中で３又は４回反復された。融合の４日前に、マウスは、ＰＢＳ中の免疫原又は細胞の最終注入を受けた。免疫化マウスの脾臓及び／又はリンパ節リンパ球は、［マウス非分泌性骨髄腫Ｐ３細胞系］と融合され、かつ前記のように、ＨＡＴ選択を受けた(Galfre,G.及びMilstein,C.,「Preparation of monoclonal antibodies:strategies and procedures」Methods Enzymol.73:3-46(1981))。全部がＣＴＬＡ−４特異性ヒトＩｇＧ2Ｋ抗体を分泌するハイブリドーマの大きな集団が、回収された。
【０３８９】
次のように指定された抗ＣＴＬＡ−４抗体を生成する次のハイブリドーマは、２００３年４月２９日にAmerican Type Culture Collection,10801 University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209に寄託された。
クローン サブクローン ＡＴＣＣ寄託番号
１１．２．１  １１．２．１．４  ＰＴＡ−５１６９
４．１．１    ４．１．１．１    ＰＴＡ−５１６６
【０３９０】
実施例２−Ｂ
この実施例は、抗ＣＴＬＡ−４抗体を生成する組換え哺乳動物細胞系の発生を示す。
モノクローナル抗体１１．２．１の重鎖及び軽鎖をコード化するＤＮＡは、それぞれのハイブリドーマ細胞系１１．２．１からクローニングされ、かつＤＮＡ配列は、当業者に公知の方法によって決定された。抗体１１．２．１の核酸配列及び予測されるアミノ酸配列から、各抗体鎖の遺伝子使用の同一性が決定された。
【０３９１】
１１．２．１ＤＮＡ配列インサートが、次に発現ベクターにサブクローニングされた。その後発現ベクターは、抗ＣＴＬＡ抗体を生成する、種々の一次トランスフェクタント細胞系を発生させるために、マウス骨髄腫（ＮＳ０）宿主細胞にトランスフェクトされた。増殖及び生産性分析に基づき、リード（ｌｅａｄ）細胞系が、選択された。リード系は、クローン細胞系を発生させるために、その後サブクローニングされた。
【０３９２】
抗ＣＴＬＡ４抗体は、細胞培養培地を含むバイオリアクター中で細胞系を使用して、細胞培養によって生成された。培地は、生成中に栄養素が補われる。採取基準が達成された後、バイオリアクターは、濾過のみによって、又は遠心分離及びその後の濾過によって採取された。清澄上清が、蛋白質Ａアフィニティカラム及び２つのイオン交換カラムを含む３つのクロマトグラフステップによって次に精製された。工程におけるいかなる潜在的ウイルスも取り除くために、低ｐＨ不活性化及びウイルス濾過も同様になされた。生成物は、製剤原料を作製するために、濃縮され、かつ組成緩衝液へのダイアフィルトレーションが行われる。
【０３９３】
実施例３−Ｂ
４種の異なる緩衝液の抗体凝集及び断片化に対する影響を評価するために、研究が行われた。
特に、抗ＣＴＬＡ４抗体１１．２．１を含み、かつ酢酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン又はＥＤＴＡによって緩衝液処理される４種の液体組成物が、調製された。組成物は次に、４０℃で貯蔵され、かつ抗体凝集及び断片化測定が、０、２、５及び７週に行われた。
【０３９４】
緩衝溶液の調製：
４種の緩衝溶液は、表１３に記載されたように調製された。各溶液は、最初に水中で（表１３に一覧にした）大量の緩衝液種を溶解することによって調製された（標的の約８０％）。各緩衝溶液のｐＨは次に、表１３に記された、十分な量の酸性又は塩基性溶液の添加によって５．５に調整された。ｐＨの調整後、追加量の水が、２０ｍＭの最終緩衝液濃度を提供するために、添加された。２０ｍＭの緩衝液濃度は、５．５の選択されたｐＨで、妥当なｐＨ安定性を確実にするために選択された。次に、緩衝溶液は、その後に使用するため、滅菌フィルタ（０．２２ミクロン孔径）を通して滅菌容器に濾過された。
【０３９５】
【表１５】
2006249085.tif 000018
【０３９６】
１％ｖ／ｖ氷酢酸溶液は、水による氷酢酸（９９．９％）の適切な希釈（１ｍｌから１００ｍｌ）によって調製された。１モル（Ｍ）水酸化ナトリウム溶液が、１Ｌの水中に４０ｇの固体水酸化ナトリウムを溶解させることによって調製された。５モル（Ｍ）塩酸が、水による濃塩酸（３７．８％）の適切な希釈によって調製された。
【０３９７】
抗体組成物の調製：
評価された抗体組成物を、下記表１４に一覧にする。各組成物を調製するために、（表１４でｍｇ／ｍｌで報告する）大量の等張化剤(tonicifier)が最初に、示された緩衝溶液に添加され、かつ溶液は、等張化剤が溶解するまで撹拌された。実施例２−Ｂに記載された精製工程の抗体バルク溶液は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５＋１４０ｍＭ塩化ナトリウム中で１３．２ｍｇ／ｍＬで得られた。上記組成物溶液へのこのバルク溶液の緩衝液交換は、５℃で６５００回転／分で動かされるＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ２１Ｒ遠心分離機上で、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５  ＭＷＣＯ１０Ｋ（ＵＦＣ９０１０２４）遠心分離濃縮機により実行された。約８回の容量交換がなされ、かつ抗体溶液は、２７〜３０ｍｇ／ｍｌに濃縮された。約３〜４ｍｌの組成物１−Ｂから１８−Ｂが調製された。抗体濃度は、２８０ｎｍで１．４３（ｍｇ／ｍｌ）-1ｃｍ-1の減衰係数を使用して、紫外線可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）法によって決定された。
【０３９８】
２０ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０（ＰＳ８０）溶液が、上記のように調製された適切な組成緩衝液によるポリソルベート８０の希釈及び溶解によって調製された。次に下記表４の組成物に対応する組成物中で、２０ｍｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の最終溶液を得るために、ポリソルベート８０は、適切な量の緩衝液、抗体、等張化剤及び水と共に、２０ｍｇ／ｍｌ濃縮物として抗体及び緩衝溶液に添加された。
【０３９９】
表１４の組成物２−Ｂに関して、ＰＥＧ３３５０が、この時点で２００ｍｇ／ｍｌ濃縮物として添加された。
【０４００】
次に組成物は、０．２μ滅菌グレードフィルタを通して濾過され、かつバイアルに充填された。０．５から１ｍｌの充填容量が、２ｍｌタイプ１ガラスバイアル中で使用された。バイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、クリンプシールされ、かつ２、５及び７週間、４０℃で直立させて貯蔵された安定チャンバ内に置かれた。バイアルは、１３ｍｍ  Ｄａｉｋｙｏ７７７−１血清栓のように、洗浄され、かつ加圧滅菌された。重複したバイアルは、凝集及び断片化に関して直ちに分析された。
【０４０１】
【表１６】
2006249085.tif 000019
【０４０２】
凝集分析：
表１４の抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０、２、５及び７週に、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して凝集に関して分析された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。図１３は、各組成物に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体１１．２．１の凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（図１３参照）。図１３に見られるように、ＥＤＴＡ緩衝液処理された組成物は、最低凝集レベルを示し、その後にヒスチジン−、酢酸塩−及びコハク酸塩−緩衝液処理された組成物が、その順序で続く。
【０４０３】
断片化分析：
上述のように、表１４の抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０、２、５及び７週に、各組成物は同様に、ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して断片化に関して分析された。ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＮｕＰＡＧＥ４から１２％ビス−トリスゲル及びコロイド状青（クーマシー）染色を使用して行われた。還元ゲル（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に関して、還元は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤によって得られた。全加水分解不純物（すなわち、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体１１．２．１の断片）は、分子動力学個人濃度計ＰＤＱＣ−９０又はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００撮像濃度計を使用して、走査によって推定された。図１４は、各組成物に関して該当する時間で測定された断片化率を示す。断片化レベルは、全バンド容量率として計算された（図１４参照）。図１４に見られるように、ＥＤＴＡ緩衝液処理された組成物は、最低断片化レベルを示し、その後にヒスチジン−、酢酸塩−及びコハク酸塩−緩衝液処理された組成物が、その順序で続く。
【０４０４】
下記表１５（ａ）（０週間）、表１５（ｂ）（２週間）、表１５（ｃ）（５週間）及び表１５（ｄ）（７週間）は、図１３及び１４にグラフによって表した凝集及び断片化データを報告する。
【０４０５】
【表１７】
2006249085.tif 000020
【０４０６】
【表１８】
2006249085.tif 000021
【０４０７】
【表１９】
2006249085.tif 000022
【０４０８】
【表２０】
2006249085.tif 000023
【０４０９】
実施例４−Ｂ
モノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１を含む様々な液体組成物の複数の凍結及び解凍サイクルに耐える能力を評価するために、研究が行われた。
【０４１０】
複数の凍結／解凍サイクルに耐える液体組成物の能力は、後で使用するために組成物が貯蔵（かつ所望であれば運搬）、凍結及び次に解凍できるか決定するために、しばしば評価される。
【０４１１】
評価された組成物は、下記の表１６に一覧にした。組成物を調製するために使用した方法は、実施例３−Ｂに記載されたものと同じである。２．５ｍＬの各溶液は、５ｍＬタイプ１ガラスバイアル中に入れられ、栓をされ、かつ密封された。以下で番号１−Ｂから４−Ｂ、７−Ｂから８−Ｂ、１１−Ｂから１２−Ｂ、及び１５−Ｂから１６−Ｂとして識別される組成物は、実施例３−Ｂで同じ識別番号を有する組成物と同一であった。
【０４１２】
【表２１】
2006249085.tif 000024
【０４１３】
各組成物は、６回の連続した凍結／解凍サイクルを受けた。最初の３回のサイクルは、制御速度凍結器内で行われた。最後の３回のサイクルは、凍結器又は冷却器内に置かれる高い熱負荷に対応するために多数の水を充填したバイアルによって行われる遅いサイクルであった。サイクル１、２及び３に関して、組成物を含むバイアルは、制御速度凍結器（Ｐｌａｎｅｒ  Ｋｒｙｏ  ５６０−１６）内に置かれ、かつ次のサイクルを受けた：−７０℃の温度に達するまで、０．２℃／分の速度で組成物を冷却する、１．５から３時間−７０℃で保持する、及び５℃の温度に達するまで、０．３℃／分の速度で組成物を解凍する。サイクル４、５及び６に関して、バイアルは、他の水を充填したバイアルと共にボックス内に置かれた（各組成物に関して１つの試料バイアル、合計約３０の水を充填したバイアルと共に１７の組成物バイアル）。次にこのボックスは、最初に約１７時間−７０℃の温度に維持された凍結器内に、かつ次に約５０時間２〜８℃の温度に維持された冷却器内に置かれた。ボックス内に置かれた記録サーマルプローブは、凍結工程に関して０．０９℃／分の平均冷却速度を、かつ解凍工程に関して０．０３℃／分の平均加熱速度を測定した。
【０４１４】
各組成物は、各凍結／解凍サイクル後、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して目視評価された。各組成物のかかる目視観察は、白黒の背景に対するライトボックス内で行われ、他方で組成物は、各解凍後になおも冷たかった。（下記）表１７に、結果を報告する。
【０４１５】
【表２２】
2006249085.tif 000025
【０４１６】
塩化ナトリウム（すなわち塩化物イオン）のみを含む組成物は、トレハロース、ショ糖又はソルビトールを含む組成物よりも、凍結／解凍サイクル後に可溶性粒子レベルの大きな増加を示した。しかしながら、塩化ナトリウムを含む組成物へのＰＥＧ添加は、ＰＥＧを含まない対応する組成物に関する凍結／解凍サイクリング後に測定された可溶性粒子レベルを減少させるように見えた。
【０４１７】
凝集分析：
その上、可溶性粒子の増加率が、サイズ排除クロマトグラフィを使用して６回の連続する凍結／解凍サイクル後に、各組成物に関して測定された。
【０４１８】
６回目の凍結／解凍サイクル後、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。表１７は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体１１．２．１の凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表１７参照）。表１７に見られるように、ＥＤＴＡ緩衝液処理された組成物は、最低凝集レベルを示し、その後にヒスチジン−、酢酸塩−及びコハク酸塩−緩衝液処理された組成物が、その順序で続く。
【０４１９】
実施例５−Ｂ
ＥＤＴＡ、メチオニン及び嫌気条件の、モノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１を含む液体組成物中の変色及び凝集に対する影響を評価するために、研究が行われた。かかる液体組成物中の変色及び凝集は、生成物の美的観点、生成物の完成性観点、又は両方から、一般的に望ましくない。
【０４２０】
下記表８は、評価された組成物処理を一覧にする。組成物を調製するために使用された一般的方法は、実施例３に記載されたものと同じである。この実施例のために、モノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１（５ｍｇ／ｍｌ）、酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ）、塩化ナトリウム（８．２ｍｇ／ｍｌ）及びポリソルベート８０（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含み、かつｐＨ５．５を有する開始組成物が、調製され、かつ無菌試料採取を可能にするために密封頂部を含む幾つかの１０ｍＬガラスバイアルに添加された。
【０４２１】
種々の処理が、下記表１８による開始組成物に対して行われた。図１８に記されているように、メチオニンがバイアルの幾つかに添加された。２つの異なる濃度のＥＤＴＡが、他のバイアルに添加された。窒素ガスが、選択されたＥＤＴＡ又はメチオニンを含むバイアルのヘッドスペースに添加された。その上、未処理のままのバイアルの幾つかは、そのヘッドスペースへの窒素ガス注入に先立って脱気された。更に、残りのバイアルの幾つかは、実験対照となるために、未処理のままにされた。
【０４２２】
表１８の各処理の２つのバイアルが、０、２、４、６、８、１０、１４、１６及び１８週間、４０℃で貯蔵された。各時点での２つの貯蔵されたバイアルの一方は、目視色彩評価のために使用され、他方で他のバイアルは、貯蔵後の１１．２．１抗体凝集のレベルを測定するために、無菌で試料採取された。表１９及び２０に、結果を報告する。
【０４２３】
【表２３】
2006249085.tif 000026
【０４２４】
組成物外観分析：
各組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して０（初期）、２、４、６、８、１０、１４、１６、及び１８週間後に目視評価された。目視観察は、表１９に報告した。
【０４２５】
【表２４】
2006249085.tif 000027
【０４２６】
表１９の結果は、ＥＤＴＡ及び／又はメチオニンの無い組成物が、４０℃で少なくとも４週間の貯蔵後にバイアル中でピンクの着色を発現したことを示している。いかなる特定の理論にもとらわれることを望まないが、本発明の１つの実施態様において、この変色は、少なくとも部分的に酸化工程に起因し得ると思われる。しかしながら、他の実施態様において、変色は、酸化に無関係な、任意の数の他の工程に起因し得る。
【０４２７】
バイアルのヘッドスペースへの窒素ガスの添加は、メチオニン及び／又はＥＤＴＡの添加よりも、変色を減少させることにおいて、少ない影響を有するように見えた。
【０４２８】
凝集分析：
表１８により処理された抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０、２、６、８、１０、１４、１６及び１８週に、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。表２０は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１の凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表２０参照）。
【０４２９】
【表２５】
2006249085.tif 000028
【０４３０】
表１９の結果は、ＥＤＴＡ及び／又はメチオニンの無い組成物が、４０℃で少なくとも４週間の貯蔵後にバイアル中でピンクの着色を発現し始めることを示している。表２０に見られるように、ＥＤＴＡ及び／又はメチオニン処理組成物は、最低凝集レベルを示し、その後に窒素ガス処理及び未処理の対照組成物が続く。
【０４３１】
実施例６−Ｂ
液体組成物としての貯蔵後の抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１中の数種のメチオニンアミノ酸残渣の酸化に対するメチオニン及びＥＤＴＡの影響を評価するために、研究が行われた。
【０４３２】
メチオニン酸化分析：
抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１中のアミノ酸位置２５６及び４３２でのメチオニン残渣の酸化レベルは、４０℃で８週間の貯蔵後、リシン−Ｃマッピング方法によって測定された。
【０４３３】
組成物番号２６−Ｂ、２９−Ｂ及び３３−Ｂ（表１８）、及び実施例５−Ｂのそれらの処理を含むガラスバイアルは、８週の時点で無菌で試料採取された。次に試料は、標準条件で、ｐＨ８．０、トリス緩衝液中でＬｙｃ−Ｃ酵素によって消化され、かつ逆相高速液体クロマトグラフィによって分析された。分離は、水中に０．１％のＴＦＡ、かつアセトニトリル勾配溶出中に０．０８５％のＴＦＡで、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４分析カラムを使用して遂行された。
【０４３４】
【表２６】
2006249085.tif 000029
【０４３５】
表１１の結果は、メチオニン又はＥＤＴＡの、１１．２．１抗体組成物への添加が、ＥＤＴＡ又はメチオニン無しで貯蔵された組成物と比較して、２つの示したメチオニン残渣で、酸化率を減少させることを示している。
【０４３６】
実施例７−Ｂ
抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１中の数種のトリプトファン及びチロシンアミノ酸残渣の酸化を評価するために、研究が行われた。
【０４３７】
時間が経つとピンクの変色を発現する抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１組成物は、紫外線／可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）を行った後に、５００ｎｍで特性吸収極大を有することが判った。
【０４３８】
組成物を調製するために使用される方法は、実施例３−Ｂに記載されたものと同じである。この実施例に関して、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中のモノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１の５ｍｇ／ｍｌ溶液、８．２ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、及び０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を含む組成物（ｐＨ５．５）が、４０℃で４週間、２つのガラスバイアル中に貯蔵され、その時点で組成物が、ピンクの変色を発現した。
【０４３９】
次に、変色したバイアル組成物の一方の中の溶液は、分子量（カットオフ）濾過を受け、それは、組成物賦形剤が、抗体を後に残して、濾過装置を通過することを可能にする。濾過溶出液（例えば水及び賦形剤）は、透明かつ無色であり、他方で収集された分画（例えば抗体１１．２．１）は、ピンクのままであった。それ故、濾過実験は、ピンクの変色が、組成物の賦形剤に起因することとは、全く異なり、抗体１１．２．１自体に関連することを示した。
【０４４０】
次に、ピンクの変色を有する第２バイアルは、標準条件でトリプシンによって消化され、かつ質量分析が併用される逆相高速液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＭＳ）によって分析された。分離は、水中に０．１％のＴＦＡ、かつアセトニトリル勾配溶出中に０．０８５％のＴＦＡで、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４分析カラムを使用して遂行された。５００ｎｍでの消化ペプチドＵＶ−Ｖｉｓ吸光度が、観察され、かつ対応するペプチドが、その分子量に基づき同定された。
【０４４１】
５００ｎｍ吸光度ピークと相関するトリプシンペプチドは、アミノ酸配列：ＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫを有した。ペプチド配列ＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫは次に、標準条件で、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼによって更に消化され、かつ５００ｎｍ吸光度（ＵＶ−Ｖｉｓ）ピークは、アミノ酸配列：ＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹを有するＡｓｐ−Ｎプロテアーゼ消化ペプチドと共に移動した。
【０４４２】
従って、いかなる特定の理論にもとらわれることを意図しないが、プロテアーゼ消化ペプチド（ＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹ）中のチロシン残渣（Ｙ）又は２種のトリプトファンアミノ酸残渣（Ｗ）のいずれか一方又は両方が、この実施例における抗体１１．２．１組成物のピンク変色に関与し得た、可能性のある酸化部位と思われる。特定の実施態様において、プロテアーゼ消化ペプチド（ＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹ）中の２種のトリプトファンアミノ酸残渣（Ｗ）のいずれか一方又は両方が、ピンク変色に関与し得た、可能性のある酸化部位と思われる。
【０４４３】
しかしながら、酸化以外のメカニズムが、ここで評価される種々の組成物中で見られる特定の変色（例えばピンク及び黄色）のいずれか一つ又はそれ以上に関与し得た可能性もある。
【０４４４】
実施例８−Ｂ
ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡの、抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１の変色、凝集及び断片化に対する影響を評価するために、研究が行われた。
【０４４５】
特に、ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡ有り、及び無しの抗体１１．２．１を含む３種の液体組成物が調製された。組成物は、４０℃で貯蔵され、かつ抗体の変色、凝集及び断片化の評価が０、２、４、６、８及び１０週で行われた。
【０４４６】
この実施例に関して、８．２ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、及び０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中の抗ＣＴＬＡ−４抗体の２０ｍｇ／ｍｌ溶液が調製され、かつ実施例３に記載されたように数個のガラスバイアルの中で分割され、かつ次にＥＤＴＡ又はＤＴＰＡの添加によって処理された。ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡは、固体として組成物バイアルに添加された。数個のバイアルは、変色、凝集及び断片化レベルに関して直ちに分析され、数個の他の重複したバイアルも、２、４、６、８及び１０週間、４０℃で直立させて貯蔵された。
【０４４７】
次に処理及び未処理のバイアルは、２、４、６、８及び１０週の時点での組成物中の抗体１１．２．１の凝集及び断片化レベルを測定するために、無菌で試料採取され、かつ変色に関して観察された。表２２及び２３に、結果を報告する。
【０４４８】
組成物外観分析：
各組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して０（初期）、２、４、６、８及び１０週間後に目視評価された。目視観察は、表２２に報告した。
【０４４９】
【表２７】
2006249085.tif 000030
【０４５０】
表２２の結果は、ＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ無しの組成物が、４０℃での少なくとも６週間の貯蔵後に、バイアル中でピンク着色を発現したことを示す。
【０４５１】
凝集分析：
表２２により処理された抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０、２、６、８及び１０週に、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して行われた。表２３は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１の凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表２３参照）。
【０４５２】
【表２８】
2006249085.tif 000031
【０４５３】
表２３に見られるように、ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡ含有組成物の両方とも、ＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ無しの組成物と比較して低い凝集レベルを示した。
【０４５４】
実施例９−Ｂ
ＥＤＴＡ及び窒素ガスの、抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１の安定性に対する影響を評価するために、研究が行われた。
特に、ＥＤＴＡ及び窒素ガスの抗体１１．２．１の安定性に対する衝撃が、トレハロース及びポリソルベート８０を含む、ヒスチジン緩衝液処理された組成物中での、変色、凝集、酸化、断片化及び荷電種形成に関して分析された。
【０４５５】
評価された組成物は、下記表２３に一覧にする。組成物を調製するために使用された方法は、後段で実施例１０−Ｂに記載されるものと同じである。組成物は、４０℃で貯蔵され、かつ安定性評価が０、４、８、１２及び２４週で行われた。
【０４５６】
この実施例に関して、８４ｍｇ／ｍｌトレハロース、及び０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０を有するｐＨ５．５での２０ｍＭヒスチジン緩衝液中の抗ＣＴＬＡ−４抗体の２０ｍｇ／ｍｌ溶液が、実施例１０−Ｂのように調製された。組成物の一部は、トレハロース及びポリソルベート８０の原液によって抗体の濃縮原液を、２０ｍｇ／ｍＬ抗ＣＴＬＡ−４抗体での最終組成物に希釈することによって調製された。組成物の第二部分は、０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得るために、Ｎａ2ＥＤＴＡ．２Ｈ2Ｏの１０ｍｇ／ｍＬ濃縮物を添加する追加ステップを除き、同様に調製された。次に組成物は、２ｍｌガラスバイアルにつき１ｍｌで分配された。次に各組成物のバイアルの半分は、凍結乾燥器内に置かれ、かつヘッドスペースは、排出後、窒素に代えられた。バイアルが窒素で充満された後、その酸素レベルを測定すると、約１．５％から１．６％の酸素が報告され、他方でヘッドスペース中に空気を有するバイアルでは、約１９．７％から２０％の酸素が報告された。
【０４５７】
数個のバイアルは、変色、凝集、断片化、酸化及び荷電種形成レベルに関して直ちに分析され、数個の他の重複したバイアルも、２、４、８、１２及び２４週間、４０℃で直立させて貯蔵された。各時点で、処理毎に２つの貯蔵バイアルが、組成物中の抗体１１．２．１の凝集、断片化、酸化及び荷電種形成レベルを測定するために、各条件から除去され、かつ変色に関して観察された。表２４から２８に結果を報告する。
【０４５８】
【表２９】
2006249085.tif 000032
【０４５９】
組成物外観分析：
各組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して０（初期）、４、８、１２及び２４週間後に目視評価された。目視観察は、表２４に報告した。
【０４６０】
【表３０】
2006249085.tif 000033
【０４６１】
表２４の結果は、ＥＤＴＡ又は窒素ガス無しの組成物が、４０℃での４週間の貯蔵後に、バイアル中でピンク着色を発現したことを示す。表２４は、窒素ガスと取り替えられるバイアルヘッドスペースの空気を有する組成物が、１２週までピンク変色の開始を遅延させたことも示す。ＥＤＴＡを含む両方の組成物は、少なくとも２４週間、目に見える変色がなかった。
【０４６２】
凝集分析：
表２３により調製された抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０、４、８、１２及び２４週に、各組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して、試料に対して行われた。表２５は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、溶出高分子量種（すなわち抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１の凝集塊）の率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表２５参照）。
【０４６３】
【表３１】
2006249085.tif 000034
【０４６４】
表２５に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物、窒素ガス組成物、及びＥＤＴＡプラス窒素ガス組成物は、ＥＤＴＡ無しで、ヘッドスペース中に空気を有する組成物と比較して時間が経っても低い凝集レベルを示した。
【０４６５】
断片化分析：
表２３により調製された抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０、４、８、１２及び２４週に、各組成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して全加水分解不純物（すなわち断片化）に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取され、かつコロイド状青（クーマシー）染色を有するＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲルへ装入された。ゲル還元は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤の使用によって得られた。還元ゲル中の各試料バンドの不純物（すなわち断片化）率は、分子動力学個人濃度計ＰＤＱＣ−９０又はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００撮像濃度計で走査によって推定された。断片化レベルは、全バンド容量率として計算された（表２６参照）。
【０４６６】
【表３２】
2006249085.tif 000035
【０４６７】
表２６に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物、窒素ガス組成物、及びＥＤＴＡプラス窒素ガス組成物は、ＥＤＴＡ無しで、ヘッドスペース中に空気を有する組成物と比較して時間が経っても低い断片化レベルを示した。
【０４６８】
酸性及び塩基性種の形成
表２３により調製された抗体組成物は、４０℃の温度で貯蔵された。０、４、１２及び２４週に、各組成物は、撮像キャピラリー電気泳動（ｉＣＥ）を使用して酸性及び塩基性種の形成に関して分析された。撮像キャピラリー電気泳動が、荷電不均一性評価のためにＣｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉＣＥ280分析器を使用して行われた。Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｉＣＥ280は、撮像キャピラリー等電点電気泳動（ＩＥＦ）装置であり、使用者が、キャピラリー中に含まれる分離された試料を撮像することを可能にする。
【０４６９】
組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取された。次に試料は、電気泳動両性電解質、メチルセルロース、校正マーカー及び水の混合物中で調製された。試料は、ｉＣＥ280に導入され、かつ高電位／電圧が加えられた。ＩＥＦ検定は、クーマシー青染色を使用する、手動で調製されたｐＨ３〜１０．５ポリアクリルアミドゲルを使用して行われた。試料蛋白質成分は、それらの相対等電点（ｐｌ）及びそれらの位置に基づき、分離された。相対量の各分離成分は、撮像ＣＣＤカメラによって観察された。データは次に、従来のクロマトグラフ統合ソフトウェアを使用して処理され、かつ主なピークの損失（すなわち酸性及び塩基性種の形成）として報告された（表２７参照）。
【０４７０】
【表３３】
2006249085.tif 000036
【０４７１】
表２７に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物、窒素ガス組成物、及びＥＤＴＡプラス窒素ガス組成物は、ＥＤＴＡ無しで、ヘッドスペース中に空気を有する組成物と比較して時間が経っても高いレベルの無傷の主なピークを示した。それ故、酸性及び塩基性種の形成量は、ＥＤＴＡ及び／又はヘッドスペース中の窒素を欠く組成物において、時間が経っても高い。
【０４７２】
アミノ酸酸化分析：
抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１中のアミノ酸位置２５６及び４３２でのメチオニン残渣の酸化レベルは、４０℃で１２週間の貯蔵後、リシン−Ｃマッピング方法によって測定された。
【０４７３】
表２３の組成物を含むバイアルは、１２週の時点で無菌で試料採取された。次に試料は、標準条件、ｐＨ８．０でトリス緩衝液中のリシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）酵素によって消化され、かつ逆相高速液体クロマトグラフィによって分析された。分離は、水中に０．１％のＴＦＡ、かつアセトニトリル勾配溶出中に０．０８５％のＴＦＡで、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４分析カラムを使用して遂行された。
【０４７４】
【表３４】
2006249085.tif 000037
【０４７５】
表２８の結果は、１１．２．１抗体組成物へのＥＤＴＡの添加、及び／又はバイアルヘッドスペースへの窒素の添加が、ＥＤＴＡ無しで、ヘッドスペース中に空気を有する組成物と比較して、２種の示されたメチオニン残渣での酸化率を減少させたことを示す。
【０４７６】
実施例１０−Ｂ
酢酸ナトリウム緩衝液及び塩化ナトリウム（すなわち塩化物イオン）を含む抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１組成物、対ヒスチジン緩衝液及びトレハロースを含む組成物の安定性に対する影響を比較するために、研究が行われた。
特に、抗体１１．２．１の安定性に対する衝撃が、変色、凝集、及び断片化に関して分析された。
【０４７７】
評価された組成物は、下記表２９に一覧にする。組成物を調製するために使用された方法は、実施例３−Ｂに記載されたものと同じである。
【０４７８】
表２９の組成物は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中の抗体１１．２．１の１１．９ｍｇ／ｍｌ原液、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを選び、かつＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＰＢＴＫ  ３０Ｋ  ５０ｃｍ2膜により、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂ  Ｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）ステップを受けさせることによって調製された。次に、抗体１１．２．１の濃縮溶液は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム又は２０ｍＭヒスチジン緩衝液中で３５から４０ｍｇ／ｍｌの範囲で調製された。
【０４７９】
等張化剤の濃縮物は、標的最終濃度の３倍で、酢酸ナトリウム又はヒスチジン緩衝液中で調製された。ポリソルベート８０の濃縮溶液が、２０ｍｇ／ｍｌで、かつＮａ2ＥＤＴＡ．２Ｈ2Ｏが、１０ｍｇ／ｍｌで、各緩衝液中で調製された。個別の組成物は、濃縮溶液を適切に希釈することによって調製された。次に組成物は、０．２μ滅菌グレードフィルタを通して濾過され、かつ数個の重複したバイアルに充填された。１ｍｌの充填容量が、２ｍｌタイプ１ガラスバイアル中で使用された。バイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、クリンプシールされ、かつ２５℃及び４０℃で安定チャンバ内に直立させて貯蔵された。もう一組のバイアルも、４週間、−２０℃に置かれ、かつもう一組は、実施例４−Ｂに記載したように、４×凍結／解凍サイクル（水を充填したバイアルボックス）を受けた。全ての組成物は、５．５のｐＨを有し、かつ抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１は、２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有した。
【０４８０】
数個のバイアルは、変色、凝集、及び断片化レベルに関して直ちに分析され、かつ数個の他の重複したバイアルも、４、８、１２、１８、２４及び３６週間、２５℃及び４０℃で直立させて貯蔵された。各時点で、組成物毎に２つの貯蔵バイアルが、抗体１１．２．１の凝集、断片化レベルを測定するために、各条件から除去され、かつ変色に関しても観察された。表３０から３４、並びに図１５及び１６に結果を報告する。
【０４８１】
【表３５】
2006249085.tif 000038
【０４８２】
組成物外観分析：
各組成物は、１）組成物を最初に混合した後、２）４週間、−２０℃で組成物を凍結させた後、及び３）（実施例４−Ｂに記載されたような水を充填したバイアルと共に、ボックス内で−７０℃から５℃の）４回の凍結／解凍サイクル後に目視評価された。各組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して０（初期）、８、１２及び２４週間後、目視評価された。組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して評価され、かつ表３０（凍結／解凍）、表３１（２５℃での貯蔵）及び表３２（４０℃での貯蔵）に報告された。
【０４８３】
【表３６】
2006249085.tif 000039
【０４８４】
【表３７】
2006249085.tif 000040
【０４８５】
【表３８】
2006249085.tif 000041
【０４８６】
表２０から２２の結果は、ＥＤＴＡを含む抗体１１．２．１組成物が、ＥＤＴＡを含まない組成物と比較して、変色減少、濁り度減少、かつ粒子形成減少があることを示す。全体として、塩化ナトリウムを含む組成物は、ＥＤＴＡを有するが、塩化ナトリウム無しの組成物と比較して、変色、濁り度及び粒子形成を増加させた。
【０４８７】
凝集分析：
表２９により調製された抗体組成物は、２５℃及び４０℃の温度で貯蔵された。０（初期）、４、８、１２、２４及び３６週に、２５℃の組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。４、８、１２及び２４週に、４０℃の組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して、試料に対して行われた。表３３（ａ）及び３３（ｂ）は、各組成物処理に関して該当する時間で測定された、抗体１１．２．１の凝集率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表３３（ａ）及び３３（ｂ）参照）。
【０４８８】
【表３９】
2006249085.tif 000042
【０４８９】
下記表３３（ｂ）に、図１５にグラフによって表した凝集データを報告する。
【０４９０】
【表４０】
2006249085.tif 000043
【０４９１】
表３３（ａ）、３３（ｂ）及び図１５に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物は、２５℃及び４０℃での貯蔵後に、ＥＤＴＡを欠くが、酢酸塩緩衝液及び塩化ナトリウムを有する組成物と比較して減少した凝集レベルを示した。その上、（ＥＤＴＡ無しで）ヒスチジン緩衝液を含む組成物は、ＥＤＴＡを欠くが、酢酸塩緩衝液及び塩化ナトリウムを含む組成物と比較して減少した凝集量を有した。
【０４９２】
断片化分析：
表２９により調製された抗体組成物は、２５℃及び４０℃の温度で貯蔵された。０（初期）、４、８、１２、１８及び３６週に、各組成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して全加水分解不純物（すなわち断片化）に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取され、かつコロイド状青（クーマシー）染色を有するＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲルへ装入された。ゲル還元は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤の使用によって得られた。還元ゲル中の各試料バンドの不純物（すなわち断片化）率は、分子動力学個人濃度計ＰＤＱＣ−９０又はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００撮像濃度計で走査によって推定された。断片化レベルは、全バンド容量率として計算された（表３４（ａ）及び３４（ｂ）参照）。
【０４９３】
【表４１】
2006249085.tif 000044
【０４９４】
下記表３４（ｂ）に、図１６にグラフによって表した断片化データを報告する。
【０４９５】
【表４２】
2006249085.tif 000045
【０４９６】
表３４（ａ）、３４（ｂ）及び図１６に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物は、２５℃及び４０℃での貯蔵後に、ＥＤＴＡを欠くが、酢酸塩緩衝液及び塩化ナトリウムを有する組成物と比較して減少した断片化レベルを示した。
【０４９７】
実施例１１−Ｂ
抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１組成物の安定性に対する様々な濃度のＥＤＴＡの影響を比較するために、研究が行われた。トレハロースの一部をマンニトールに置き換えることによって、ヒスチジン緩衝液−トレハロース組成物に代わるものの試験が、同様に行われた。
【０４９８】
特に、抗体１１．２．１の安定性に対する衝撃が、変色、凝集、断片化、及び酸化に関して分析された。
【０４９９】
評価された組成物は、下記表３５に一覧にする。組成物を調製するために使用された方法は、実施例１０−Ｂに記載されたものと同じである。
【０５００】
表３５の組成物は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中の抗体１１．２．１の１１．９ｍｇ／ｍｌ原液、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを選び、かつＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＰＢＴＫ  ３０Ｋ  ５０ｃｍ2膜により、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂ  Ｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）ステップを受けさせることによって調製された。次に、抗体１１．２．１の濃縮溶液は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム又は２０ｍＭヒスチジン緩衝液中で３５から４０ｍｇ／ｍｌの範囲で調製された。
【０５０１】
等張化剤の濃縮物は、標的最終濃度の３倍で、酢酸ナトリウム又はヒスチジン緩衝液中で調製された。ポリソルベート８０の濃縮溶液が、２０ｍｇ／ｍｌで、かつＮａ2ＥＤＴＡ．２Ｈ2Ｏが、１０ｍｇ／ｍｌで、各緩衝液中で調製された。個別の組成物は、濃縮溶液を適切に希釈することによって調製された。（Ｎａ2ＥＤＴＡ．２Ｈ2Ｏのような）ＥＤＴＡ濃度は、０〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲で検査された。次に組成物は、０．２μ滅菌グレードフィルタを通して濾過され、かつ数個の重複したバイアルに充填された。１ｍｌの充填容量が、２ｍｌタイプ１ガラスバイアル中で使用された。
【０５０２】
バイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、クリンプシールされ、かつ２５℃及び４０℃で安定チャンバ内に直立させて貯蔵された。もう一組のバイアルは、実施例１０−Ｂに記載したように、４×凍結／解凍サイクルを受けた。全ての組成物は、５．５のｐＨを有し、かつ抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１は、２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有した。
【０５０３】
数個のバイアルは、変色、凝集、断片化、及び酸化レベルに関して直ちに分析され、かつ数個の他の重複したバイアルも、４、８、１３、１８及び２４週間、２５℃及び４０℃で直立させて貯蔵された。各時点で、各条件からの組成物毎に２つの貯蔵バイアルが、抗体１１．２．１の凝集、断片化レベルを測定するために、除去され、かつ変色に関しても観察された。表３６から４１、及び図１７から２２に結果を報告する。
【０５０４】
【表４３】
2006249085.tif 000046
【０５０５】
組成物外観分析：
各組成物は、１）組成物を最初に混合した後、２）４回の凍結／解凍サイクル後、及び３）４、８、１３、１８及び２４週間、２５℃及び４０℃での貯蔵後に目視評価された。組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して評価され、かつ表３６から３８に報告された。
【０５０６】
【表４４】
2006249085.tif 000047
【０５０７】
【表４５】
2006249085.tif 000048
【０５０８】
【表４６】
2006249085.tif 000049
【０５０９】
表３６から３８の結果は、全ての試験を受けたＥＤＴＡ濃度を含む抗体１１．２．１組成物が、ＥＤＴＡを含まない組成物と比較して、変色減少、濁り度減少、かつ粒子形成減少があることを示す。
【０５１０】
全体として、塩化ナトリウムを含む組成物は、ＥＤＴＡを有するが、塩化ナトリウム無しの組成物と比較して、変色、濁り度及び粒子形成増加によって立証されるように、凍結／解凍保護を縮小した。
【０５１１】
凝集分析：
表３５により調製された抗体組成物は、２５℃及び４０℃の温度で貯蔵された。０（初期）、４、８、１３、１８及び２４週に、２５℃及び４０℃の組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して、試料に対して行われた。表３９（ａ）は、各組成物処理に関して該当する時間で、２５℃での貯蔵後に測定された、抗体１１．２．１の凝集率を示す。表３９（ｂ）は、４０℃での貯蔵後に測定された、抗体１１．２．１の凝集率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表３９（ａ）及び３９（ｂ）参照）。
【０５１２】
【表４７】
2006249085.tif 000050
【０５１３】
下記表３９（ｂ）に、図１７にグラフによって表した凝集データを報告する。
【０５１４】
【表４８】
2006249085.tif 000051
【０５１５】
表３９（ａ）、３９（ｂ）及び図１７に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物は、２５℃及び４０℃での貯蔵後に、ＥＤＴＡを欠くが、酢酸塩緩衝液及び塩化ナトリウムを有する組成物と比較して、全ての試験を受けたＥＤＴＡ濃度で減少した凝集レベルを示した。図１７に、ＥＤＴＡ濃度に応じた表３５の組成物に関する凝集率減少をグラフによって要約した。
【０５１６】
断片化分析：
表３５により調製された抗体組成物は、２５℃及び４０℃の温度で貯蔵された。０（初期）、４、８、１３、１８及び２４週に、２５℃及び４０℃の組成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して全加水分解不純物（すなわち断片化）に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取され、かつコロイド状青（クーマシー）染色を有するＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲルへ装入された。ゲル還元は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤の使用によって得られた。還元ゲル中の各試料バンドの不純物（すなわち断片化）率は、分子動力学個人濃度計ＰＤＱＣ−９０又はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００撮像濃度計で走査によって推定された。断片化レベルは、全バンド容量率として計算された（表４０（ａ）及び４０（ｂ）参照）。
【０５１７】
【表４９】
2006249085.tif 000052
【０５１８】
下記表４０（ｂ）に、図１８にグラフによって表した断片化データを報告する。
【０５１９】
【表５０】
2006249085.tif 000053
【０５２０】
表４０（ａ）、４０（ｂ）及び図１８に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物は、２５℃及び４０℃での貯蔵後に、ＥＤＴＡを欠くが、酢酸塩緩衝液及び塩化ナトリウムを有する組成物と比較して減少した断片化レベルを示した。その上、ＥＤＴＡ無しでヒスチジン及びトレハロースを含む組成物は、ＥＤＴＡ無しで塩化ナトリウムを含む組成物に対して減少した断片化を示した。
【０５２１】
図２０に、ＥＤＴＡ濃度に応じた表３５の組成物に関する断片化率減少をグラフによって要約した。
【０５２２】
アミノ酸酸化分析：
抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１中のアミノ酸位置２５６及び４３２での数種のメチオニン残渣の酸化レベルは、リシン−Ｃマッピング方法によって測定された。表３５の組成物を含むバイアルは、４０℃での貯蔵後、１８週及び２４週の時点で無菌で試料採取された。次に試料は、標準条件、ｐＨ８．０でトリス緩衝液中のリシルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）酵素によって消化され、かつ逆相高速液体クロマトグラフィによって分析された。分離は、水中に０．１％のＴＦＡ、かつアセトニトリル勾配溶出中に０．０８５％のＴＦＡで、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４分析カラムを使用して遂行された。表４１に結果を報告する。
【０５２３】
【表５１】
2006249085.tif 000054
【０５２４】
表４１に見られるように、抗体１１．２．１組成物中のＥＤＴＡの存在は、時間が経つにつれ発生するメチオニン酸化レベルを減少させる。
【０５２５】
実施例１２−Ｂ
抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１組成物の安定性に対するマンニトール及びソルビトールの影響を比較するために、研究が行われた。この実施例において、トレハロースの一部を様々な濃度のマンニトール及び／又はソルビトールに置き換えることによって、ヒスチジン−トレハロース組成物に代わるものの試験が、行われた（表３２）。（Ｎａ2ＥＤＴＡ．２Ｈ2Ｏのような）ＥＤＴＡ濃度は、０から０．１ｍｇ／ｍｌの範囲で検査された。
【０５２６】
特に、抗体１１．２．１の安定性に対する衝撃が、変色、凝集、断片化、及び酸化に関して分析された。
【０５２７】
評価された組成物は、下記表４２に一覧にする。組成物を調製するために使用された方法は、実施例１０−Ｂに記載されたものと同じである。
【０５２８】
表４２の組成物は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中の抗体１１．２．１の１１．９ｍｇ／ｍｌ原液、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを選び、かつＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ＰＢＴＫ  ３０Ｋ  ５０ｃｍ2膜により、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂ  Ｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）ステップを受けさせることによって調製された。次に、抗体１１．２．１の濃縮溶液は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム又は２０ｍＭヒスチジン緩衝液中で３５から４０ｍｇ／ｍｌの範囲で調製された。
【０５２９】
等張化剤の濃縮物は、標的最終濃度の３倍で、酢酸ナトリウム又はヒスチジン緩衝液中で調製された。ポリソルベート８０の濃縮溶液が、２０ｍｇ／ｍｌで、かつＮａ2ＥＤＴＡ．２Ｈ2Ｏが、１０ｍｇ／ｍｌで、各緩衝液中で調製された。個別の組成物は、濃縮溶液を適切に希釈することによって調製された。次に組成物は、０．２μ滅菌グレードフィルタを通して濾過され、かつ数個の重複したバイアルに充填された。１ｍｌの充填容量が、２ｍｌタイプ１ガラスバイアル中で使用された。
【０５３０】
バイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、クリンプシールされ、かつ２５℃及び４０℃で安定チャンバ内に直立させて貯蔵された。もう一組のバイアルは、実施例１０−Ｂに記載したように、４×凍結／解凍サイクルを受けた。全ての組成物は、５．５のｐＨを有し、かつ抗ＣＴＬＡ−４抗体１１．２．１は、２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有した。
【０５３１】
数個のバイアルは、変色、凝集、断片化、及び酸化レベルに関して直ちに分析され、かつ数個の他の重複したバイアルも、４、８、１３、１８及び２４週間、２５℃及び４０℃で直立させて貯蔵された。各時点で、組成物毎に２つの貯蔵バイアルが、抗体１１．２．１の凝集、断片化レベルを測定するために、各条件から除去され、かつ変色に関しても観察された。表４３から４７、並びに図２１及び２２に結果を報告する。
【０５３２】
【表５２】
2006249085.tif 000055
【０５３３】
組成物外観分析：
各組成物は、１）組成物を最初に混合した後、２）（実施例４のボックス内で水を充填したバイアルと共に、−７０℃から５℃の）４回の凍結／解凍サイクル後、及び３）８、１３及び２４週間、２５℃及び４０℃での貯蔵後に目視評価された。組成物は、粒子形成、変色、及び濁り度変化に関して評価され、かつ表４３から４５に報告された。
【０５３４】
【表５３】
2006249085.tif 000056
【０５３５】
【表５４】
2006249085.tif 000057
【０５３６】
【表５５】
2006249085.tif 000058
【０５３７】
表４３から４５の結果は、塩化ナトリウムを含むがＥＤＴＡ無しの抗体１１．２．１組成物が、ＥＤＴＡを有するが、塩化ナトリウム無しの組成物と比較して、変色、濁り度及び粒子形成増加によって立証されるように、縮小した凍結／解凍保護を有したことを示す。結果は、全ての試験を受けたＥＤＴＡ濃度を含む抗体１１．２．１組成物が、ＥＤＴＡを含まない組成物と比較して、変色減少、濁り度減少、かつ粒子形成減少があることも示す。
【０５３８】
凝集分析：
表４２により調製された抗体組成物は、２５℃及び４０℃の温度で貯蔵された。０（初期）、４、８、１３、１８及び２４週に、２５℃及び４０℃の組成物は、サイズ排除クロマトグラフィを使用して凝集に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取された。サイズ排除クロマトグラフィは、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、ｐＨ７．０、１ｍｌ／分の流量での移動相０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、及び２１４ｎｍでの紫外線検出を使用して、試料に対して行われた。表４６（ａ）は、各組成物処理に関して該当する時間で、２５℃での貯蔵後に測定された、抗体１１．２．１の凝集率を示す。表４６（ｂ）は、４０℃での貯蔵後に測定された、抗体１１．２．１の凝集率を示す。凝集レベルは、各組成物のクロマトグラムピークの領域を積分し、かつ高分子量種ピークの積分領域を全ピーク領域率として報告することによって計算された（表４６（ａ）及び４６（ｂ）参照）。
【０５３９】
【表５６】
2006249085.tif 000059
【０５４０】
下記表４６（ｂ）に、図２１にグラフによって表した凝集データを報告する。
【０５４１】
【表５７】
2006249085.tif 000060
【０５４２】
表４６（ａ）、４６（ｂ）及び図２１に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物は、２５℃及び４０℃での貯蔵後に、ＥＤＴＡを欠くが、酢酸塩緩衝液及び塩化ナトリウム等張化剤を有する組成物と比較して、全ての試験を受けたＥＤＴＡ濃度で減少した凝集レベルを示した。図２１に、表４２の組成物に関する凝集率減少をグラフによって要約した。
【０５４３】
断片化分析：
表４２により調製された抗体組成物は、２５℃及び４０℃の温度で貯蔵された。０（初期）、４、８、１３、１８及び２４週に、２５℃及び４０℃の組成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｒＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して全加水分解不純物（すなわち断片化）に関して分析された。組成物バイアルは、各時点で無菌で試料採取され、かつコロイド状青（クーマシー）染色を有するＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリスゲルへ装入された。ゲル還元は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）還元剤の使用によって得られた。還元ゲル中の各試料バンドの不純物（すなわち断片化）率は、分子動力学個人濃度計ＰＤＱＣ−９０又はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ８００撮像濃度計で走査によって推定された。断片化レベルは、全バンド容量率として計算された（表４７（ａ）及び４７（ｂ）参照）。
【０５４４】
【表５８】
2006249085.tif 000061
【０５４５】
下記表４７（ｂ）に、図２２にグラフによって表した断片化データを報告する。
【０５４６】
【表５９】
2006249085.tif 000062
【０５４７】
表４７（ａ）、４７（ｂ）及び図２２に見られるように、ＥＤＴＡ含有組成物は、２５℃及び４０℃での貯蔵後に、ＥＤＴＡを欠くが、酢酸塩緩衝液及び塩化ナトリウムを有する組成物と比較して減少した断片化レベルを示した。
【０５４８】
実施例１３−Ｂ
この実施例は、抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ(ticilimumab)、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物、αα−トレハロース二水和物及びポリソルベート８０を含む液状医薬組成物の生成を説明する。
【０５４９】
本発明の液状医薬組成物は、次の成分を得ることによって形成される：抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ（実施例１によるＡＴＣＣ受け入れ番号ＰＴＡ−５１６９で寄託されたハイブリドーマ細胞系１１．２．１．４から入手可能、又は実施例２による哺乳動物細胞系から組換えによって調製される）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから入手可能）、Ｌ−ヒスチジン（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから入手可能）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ＧｅｒｍａｎｙからＴｉｔｒｉｐｌｅｘ  ＩＩＩとして入手可能）、αα−トレハロース二水和物（Ｆｅｒｒｏ  Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ、Ｗａｕｋｅｇａｎ  ＩＬから製品番号Ｔ−１０４−１−ＭＣとして入手可能）、及びポリソルベート８０（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｌ  Ｈａｌｌ  ＰＡからＣｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰとして入手可能）。
【０５５０】
液状医薬組成物は、抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物、αα−トレハロース二水和物及びポリソルベート８０の幾つかの原液を最初に調製することによって、調製された。２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンを水中で溶解することによって調製された。１×組成物緩衝液は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジン、８４ｍｇ／ｍＬ（２２２ｍＭ）αα−トレハロース二水和物、０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び０．１ｍｇ／ｍＬ（０．２６８ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物を水中で溶解することによって調製された。２×組成物緩衝液は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジン、１６８ｍｇ／ｍＬ（４４４ｍＭ）αα−トレハロース二水和物、０．４ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び０．２ｍｇ／ｍＬ（０．５３６ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物を水中で溶解することによって調製された。抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブの原液は、実施例２により調製され、かつタイプ５０ｋＤの膜（Ｂｉｏｍａｘ  ＰＥＳ）により行われる限外濾過工程を使用して、ヒスチジン緩衝液中で４２から５５ｍｇ／ｍｌの間（標的４５ｍｇ／ｍＬ）に濃縮された。
【０５５１】
医薬組成物を生成するために、等量の抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ濃縮原液及び２×組成物緩衝液が、液体組成物を密接に混合させることに適した容器に添加される。混合後、少量の溶液が、除去され、かつ抗体濃度が、１．４３（ｍｇ／ｍＬ）-1ｃｍ-1の減衰係数を使用して、紫外線可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）法によって決定された（予測範囲２１から２７．５ｍｇ／ｍＬ、標的２２．５ｍｇ／ｍＬ）。最後に、抗体を２０ｍｇ／ｍＬ（１８〜２２ｍｇ／ｍＬの範囲）の標的濃度に至らせるために、適切に計算された量の１×組成物緩衝液が、添加され、かつ混合された。
【０５５２】
次に医薬組成物は、０．２μ滅菌グレードフィルタを通して濾過され、かつバイアルに充填された。２０ミリリットルの公称充填容量が、２０ミリリットルタイプ１ガラスバイアル中で使用された。バイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、かつクリンプシールされた。ガラスバイアルは、２０ｍｍ  Ｄａｉｋｙｏ７７７−１血清栓のように、滅菌された。
【０５５３】
各単一のバイアルユニットは、約４００ｍｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、６５．４ｍｇのＬ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、１３．６ｍｇのＬ−ヒスチジン、２ｍｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物、１６８０ｍｇのαα−トレハロース二水和物及び４ｍｇのポリソルベート８０を含む。
【０５５４】
実施例１４−Ｂ
この実施例は、抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、αα−トレハロース二水和物及びポリソルベート８０を含む液状医薬組成物の予期される生成を説明する。
【０５５５】
本発明の液状医薬組成物は、次の成分を得ることによって形成され得る：抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ（実施例１によるＡＴＣＣ受け入れ番号ＰＴＡ−５１６９で寄託されたハイブリドーマ細胞系１１．２．１．４から入手可能、又は実施例２−Ｂによる哺乳動物細胞系から組換えによって調製される）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから入手可能）、Ｌ−ヒスチジン（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから入手可能）、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、αα−トレハロース二水和物（Ｆｅｒｒｏ  Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ、Ｗａｕｋｅｇａｎ  ＩＬから製品番号Ｔ−１０４−１−ＭＣとして入手可能）、及びポリソルベート８０（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｌ  Ｈａｌｌ  ＰＡからＣｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰとして入手可能）。
【０５５６】
液状医薬組成物は、抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物、αα−トレハロース二水和物及びポリソルベート８０の幾つかの原液を最初に調製することによって、調製され得る。２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍＬ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンを水中で溶解することによって調製され得る。１×組成物緩衝液は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジン、８４ｍｇ／ｍｌ（２２２ｍＭ）αα−トレハロース二水和物、０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び０．１００３ｍｇ／ｍＬ（０．２６８ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウムを水中で溶解することによって調製され得る。２×組成物緩衝液は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジン、１６８ｍｇ／ｍｌ（４４４ｍＭ）αα−トレハロース二水和物、０．４ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び０．２００６ｍｇ／ｍＬ（０．５３６ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウムを水中で溶解することによって調製され得る。抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブの原液は、実施例２−Ｂにより調製され、かつタイプ５０ｋＤの膜（Ｂｉｏｍａｘ  ＰＥＳ）により行われる限外濾過工程を使用して、ヒスチジン緩衝液中で４２から５５ｍｇ／ｍｌの間（標的４５ｍｇ／ｍＬ）に濃縮され得る。
【０５５７】
医薬組成物を生成するために、等量の抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ濃縮原液及び２×組成物緩衝液が、液体組成物を密接に混合させることに適した容器に添加され得る。混合後、少量の溶液が、除去され、かつ抗体濃度が、１．４３（ｍｇ／ｍＬ）-1ｃｍ-1の減衰係数を使用して、紫外線可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）法によって決定され得る（予測範囲２１から２７．５ｍｇ／ｍＬ、標的２２．５ｍｇ／ｍＬ）。最後に、抗体を２０ｍｇ／ｍＬ（１８〜２２ｍｇ／ｍＬの範囲）の標的濃度に至らせるために、適切に計算された量の１×組成物緩衝液が、添加され、かつ混合され得る。
【０５５８】
次に医薬組成物は、０．２μ滅菌グレードフィルタを通して濾過され、かつバイアルに充填され得る。２０ミリリットルの公称充填容量が、２０ミリリットルタイプ１ガラスバイアル中で使用され得る。次にバイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、かつクリンプシールされ得る。ガラスバイアルは、２０ｍｍ  Ｄａｉｋｙｏ７７７−１血清栓と同様に、滅菌され得る。
【０５５９】
各単一のバイアルユニットは、約４００ｍｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、６５．４ｍｇのＬ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、１３．６ｍｇのＬ−ヒスチジン、２．００６ｍｇのエチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、１６８０ｍｇのαα−トレハロース二水和物及び４ｍｇのポリソルベート８０を含み得る。
【０５６０】
実施例１５−Ｂ
この実施例は、抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、αα−トレハロース二水和物及びポリソルベート８０を含む液状医薬組成物の予期される生成を説明する。
【０５６１】
本発明の液状医薬組成物は、次の成分を得ることによって形成された：抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ（実施例１によるＡＴＣＣ受け入れ番号ＰＴＡ−５１６９で寄託されたハイブリドーマ細胞系１１．２．１．４から入手可能、又は実施例２−Ｂによる哺乳動物細胞系から組換えによって調製される）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから入手可能）、Ｌ−ヒスチジン（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから入手可能）、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）、αα−トレハロース二水和物（Ｆｅｒｒｏ  Ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ、Ｗａｕｋｅｇａｎ  ＩＬから製品番号Ｔ−１０４−１−ＭＣとして入手可能）、及びポリソルベート８０（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｌ  Ｈａｌｌ  ＰＡからＣｒｉｌｌｅｔ  ４  ＨＰとして入手可能）。
【０５６２】
液状医薬組成物は、抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、エチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、αα−トレハロース二水和物及びポリソルベート８０の幾つかの原液を最初に調製することによって、調製された。２０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンを水中で溶解することによって調製される。１×組成物緩衝液は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジン、８４ｍｇ／ｍｌ（２２２ｍＭ）αα−トレハロース二水和物、０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び０．０９６ｍｇ／ｍＬ（０．２６８ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸三ナトリウムを水中で溶解することによって調製される。２×組成物緩衝液は、３．２７ｍｇ／ｍｌ（１５．６ｍＭ）Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ一水和物、及び０．６８ｍｇ／ｍｌ（４．４ｍＭ）Ｌ−ヒスチジン、１６８ｍｇ／ｍｌ（４４４ｍＭ）αα−トレハロース二水和物、０．４ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び０．１９２ｍｇ／ｍＬ（０．５３６ｍＭ）エチレンジアミン四酢酸三ナトリウムを水中で溶解することによって調製される。抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブの原液は、実施例２−Ｂにより調製され、かつタイプ５０ｋＤの膜（Ｂｉｏｍａｘ  ＰＥＳ）により行われる限外濾過工程を使用して、ヒスチジン緩衝液中で４２から５５ｍｇ／ｍｌの間（標的４５ｍｇ／ｍＬ）に濃縮される。
【０５６３】
医薬組成物を生成するために、等量の抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ濃縮原液及び２×組成物緩衝液が、液体組成物を密接に混合させることに適した容器に添加される。混合後、少量の溶液が、除去され、かつ抗体濃度が、１．４３（ｍｇ／ｍＬ）-1ｃｍ-1の減衰係数を使用して、紫外線可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）法によって決定される（予測範囲２１から２７．５ｍｇ／ｍＬ、標的２２．５ｍｇ／ｍＬ）。最後に、抗体を２０ｍｇ／ｍＬ（１８〜２２ｍｇ／ｍＬの範囲）の標的濃度に至らせるために、適切に計算された量の１×組成物緩衝液が、添加され、かつ混合される。
【０５６４】
次に医薬組成物は、０．２μ滅菌グレードフィルタを通して濾過され、かつバイアルに充填される。２０ミリリットルの公称充填容量が、２０ミリリットルタイプ１ガラスバイアル中で使用された。バイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コーティングされた栓によって閉鎖され、かつクリンプシールされた。ガラスバイアルは、２０ｍｍ  Ｄａｉｋｙｏ７７７−１血清栓のように、滅菌された。
【０５６５】
各単一のバイアルユニットは、約４００ｍｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体チシリムマブ、６５．４ｍｇのＬ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、１３．６ｍｇのＬ−ヒスチジン、１．９２ｍｇのエチレンジアミン四酢酸三ナトリウム、１６８０ｍｇのαα−トレハロース二水和物及び４ｍｇのポリソルベート８０を含む。
【０５６６】
実施例１−Ｃ
抗ＭＡｄＣＡＭ生成ハイブリドーマの発生
本発明の抗体は、本実施例に従って調製された。ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０００３７０を参照せよ。
【０５６７】
一次免疫原の調製：
２種の免疫原が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスの免疫化のために調製された：（ｉ）ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質、及び（ｉｉ）ＭＡｄＣＡＭによって安定的にトランスフェクトされた細胞から調製された細胞膜である。
【０５６８】
（ｉ）ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質
発現ベクターの構造：
ＭＡｄＣＡＭの成熟細胞外、免疫グロブリン様ドメインをコード化するＥｃｏＲＩ／ＢｇＩＩＩ  ｃＤＮＡ断片は、インフレームＩｇＧ1  Ｆｃ融合を発生させるために、ｐＩＮＣＹ  Ｉｎｃｙｔｅクローン（３２７９２７６）から切除され、かつｐＩＧ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングされた（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｄ．Ｌ．（１９９３）ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｄ．Ａ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ），ｐｐ．９３−１２７．））。結果として生じたインサートは、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩによって切除され、かつｐＣＤＮＡ３．１＋（インビトロゲン）にクローニングされた。ベクター中のＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ  ｃＤＮＡは、確認された配列である。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質のアミノ酸配列を以下に示す：
【０５６９】
【化３】
2006249085.tif 000063
【０５７０】
組換え蛋白質発現／精製
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ細胞は、６００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８及び１００ｎｇ／ｍＬメトトレキセートを含むＩｓｃｏｖｅ培地中で選択された安定クローン発現ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質及びＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質ｃＤＮＡを含むｐＣＤＮＡ３．１＋ベクターによってトランスフェクトされた。蛋白質発現のために、ホローファイバーバイオリアクターは、１０％ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８及び１００ｎｇ／ｍＬメトトレキセートを含むＩｓｃｏｖｅ倍地中の安定発現ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ  ＣＨＯが細胞接種され、かつ濃縮培地上清を発生させるために使用された。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質は、アフィニティクロマトグラフィにより採取された上清から精製された。簡潔に言えば、上清は、ＨｉＴｒａｐ蛋白質Ｇセファロース（５ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（２ｍＬ／分）に加えられ、２５ｍＭトリスｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５カラム容量）によって洗浄され、かつ１００ｍＭグリシンｐＨ２．５（１ｍＬ／分）によって溶出され、１ＭトリスｐＨ８によって分画をｐＨ７．５に直ちに中和させた。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質を含む分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され、一緒に貯留され、かつセファクリルＳ１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加えられ、３５ｍＭビストリスｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌによって予め平衡にされた。ゲル濾過は、０．３５ｍＬ／分で行われ、約３×５ｍＬ分画中にＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質のピークを収集した。これらの試料は、貯留され、かつＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（６ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに加えられ、３５ｍＭビストリスｐＨ６．５中で予め平衡にされた。カラムは、５カラム容量の３５ｍＭビストリスｐＨ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（６ｍＬ／分）によって洗浄され、かつＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1  Ｆｃ融合蛋白質は、３５ｍＭビストリスｐＨ６．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌによって４〜６ｍＬ分画に溶出した。この段階で、蛋白質は、９０％純粋であり、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約６８ｋＤで単一バンドとして移動した。免疫原及びその後のあらゆるアッセイとして使用するために、材料は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％グリセロールに緩衝液交換され、かつ−８０℃でアリコートとして貯蔵された。
【０５７１】
（ｉｉ）ＭＡｄＣＡＭを安定的に発現する細胞膜
公開されたＭＡｄＣＡＭ配列（シャイジャン(Shyjan AM)ら著、「ジャーナル・オブ・イムノロジー(J. Immunol.)」、1996年、第156巻、p.2851−7）のヌクレオチド６４５〜１２２２を含んでなるＳａｃＩ／ＮｏｔＩフラグメントは、結腸ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ増幅され、ｐｌＮＤ−Ｈｙｇｒｏベクター（インビトロジェン(Invitrogen)）のＳａｃＩ／ＮｏｔＩ部位へクローン化された。付加的な５′コード配列を含んでなるＳａｃＩフラグメントは、ｐＣＤＮＡ３．１  ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1Ｆｃからのこの構築物中へサブクローン化され、完全長のＭＡｓＣＡＭｃＤＮＡを生成した。ＭＡｄＣＡＭｃＤＮＡを含有するＫｐｎＩ／ＮｏｔＩフラグメントは次に、ｐＥＦ５ＦＲＴＶ５ＧＷＣＡＴベクター（インビトロジェン）中の対応する部位へクローン化され、ＣＡＴコード配列を置換えた。ｃＤＮＡインサートは配列確認され、トランスフェクションに使用されて、Ｆｌｐリコンビナーゼ技術により、製造業者の使用説明書に従って、Ｆｌｐｌｎ  ＮＩＨ３Ｔ３細胞（インビトロジェン）において単一の安定した発現クローンを生成した。安定に発現しているクローンは、下文に概説された、α4β7+ＪＹヒトＢリンパ芽球様細胞株（チャン（Ｃｈａｎ  ＢＭ）ら著、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)」、1992年、第267巻、p.8366−70）の結合を支持するそれらの能力によって選択された。ＭＡｄＣＡＭを発現するＣＨＯ細胞の安定なクローンは、同様の方法で、ＦｌｐｌｎＣＨＯ細胞を用いて調製された。
【０５７２】
ＭＡｄＣＡＭ発現性のＦｌｐｌｎ  ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、２ｍＭＬ−グルタミン、１０％ドナー（Ｄｏｎｏｒ）仔ウシ血清（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、および２００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂ（インビトロジェン）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ギブコ）中で増殖され、ローラーボトル内で拡大された。ＭＡｄＣＡＭ発現性のＦｌｐｌｎ  ＣＨＯ細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ドナー仔ウシ血清（ギブコ）、および３５０μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシンＢ（インビトロジェン）を含有するハム（Ｈａｍ）Ｆ１２／ダルベッコ変法イーグル培地（ギブコ）中で増殖され、ローラーボトル内で拡大された。細胞は非酵素的な細胞分離溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および、かき落とし、遠心分離によるリン酸緩衝食塩水中での洗浄の使用により収穫された。細胞膜は、細胞ペレットから、２５ｍＭビス−トリスｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１５％（ｗ／ｖ）アプロチニン、１００Ｕ／ｍＬバシトラシン中でのポリトロンによるホモジナイゼーションと、遠心分離との２回りによって調製された。最終的なペレットは、同じ緩衝液中に再懸濁され、５０ｘ１０5細胞当量が肉厚のエッペンドルフ内へ分取され、＞１００，０００ｇで回転されて、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの免疫化のための細胞膜ペレットを生じた。上清はデカンテーションされ、膜はエッペンドルフ中で−８０℃において、必要とされるまで貯蔵された。細胞膜におけるタンパク質発現の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび、ＭＡｄＣＡＭのＮ−末端残基（［Ｃ］−ＫＰＬＱＶＥＰＰＥＰ）に対して高められた、ウサギ抗ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングにより決定された。
【０５７３】
免疫化およびハイブリドーマ発生：
８〜１０週齢のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、精製された組換えＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1Ｆｃ融合タンパク質（１０μｇ／用量／マウス）かまたは、安定に発現しているＭＡｄＣＡＭ−ＣＨＯまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞（１０ｘ１０6細胞／用量／マウス）から調製された細胞膜を用いて、膜副腔内または後肢足蹠内へ免疫化された。この用量は、３〜８週間の期間にわたり、５〜７回反復された。融合の４日前に、マウスはＰＢＳ中のヒトＭＡｄＣＡＭの細胞外ドメインの最後の注射を受けた。免疫化されたマウスからの脾臓およびリンパ節リンパ球は、非分泌型骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８，６５３細胞株と融合され、先に記述されたようにＨＡＴ選択にかけられた（ガルフレ(Galfre)およびミルステイン(Milstein)著、「メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods Enzymol.)」、1981年、第73巻、p.3−46）。ＭＡｄＣＡＭ特異ヒトＩｇＧ2κを分泌しているハイブリドーマのパネル株は回収され、サブクローン化された。
【０５７４】
以下のように指定された抗ＭＡｄＣＡＭ抗体を産生する以下のハイブリドーマは、２００３年９月９日、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）、ウィルトシャー州ＳＰ４  ０ＪＧ、ソールズベリ、ポートンダウン、ＣＡＭＲに寄託された：ハイブリドーマ７．１６．６、寄託番号０３０９０９０９。
【０５７５】
実施例２−Ｃ
抗体組成物
以下の組成は、以下の実施例において参照される：
【０５７６】
【表６０】
2006249085.tif 000064
【０５７７】
【表６１】
2006249085.tif 000065
【０５７８】
【表６２】
2006249085.tif 000066
【０５７９】
【表６３】
2006249085.tif 000067
【０５８０】
【表６４】
2006249085.tif 000068
【０５８１】
実施例３−Ｃ
研究は、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の凝集に対する、いくつかの異なる緩衝剤の影響を評価するべく行われた。
【０５８２】
緩衝液の調製：
緩衝液は、まず、ある量の緩衝剤種を水（ターゲットの約９０％）へ溶解することにより調製された。次いで各々の緩衝液のｐＨは、充分量の酸または塩基溶液の添加により５．５に調整された。ｐＨの調整後、追加量の水が添加され、最終的な緩衝剤濃度を２０ｍＭとした。２０ｍＭの緩衝剤濃度は、選択されたｐＨ５．５における妥当なｐＨ安定性を確保するべく選択された。緩衝液は次に、その後の使用のため、滅菌フィルタ（ポアサイズ０．２２ミクロン）を通して、滅菌された容器内へ濾過された。
【０５８３】
抗体組成物の調整：
抗体組成物は以下のように調製された。抗体のバルク溶液は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５＋１４０ｍＭ塩化ナトリウム中の、１０．５ｍｇ／ｍｌとして得られた。このバルク溶液の、組成物溶液への緩衝剤交換は、４５００ｘｇでの遠心分離により、限外濾過膜（たとえば、３０ｋＤ）を用いて行われた。約８体積の交換が行われ、最終的な抗体溶液は約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製された。抗体濃度は紫外−可視分光（ＵＶ−Ｖｉｓ）法により、２８０ｎｍにおける吸光係数１．５６（ｍｇ／ｍｌ）-1ｃｍ-1を用いて測定された。全ての成分をもつ組成物は次いで、無菌の０．２２ミクロンの膜フィルタを通した濾過により滅菌された。濾過された組成物は次に、洗浄およびオートクレーブされたバイアルへ注がれ、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コートされたストッパーで閉じられ、クリンプシールされ、スタビリティ・チャンバー内に静置された。
【０５８４】
特に、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６を含んでなり、酢酸塩か、ＥＤＴＡか、または、酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩の組合せを用いて緩衝化された、三つの液体組成物が調製された。組成物は４０℃において６週間貯蔵され、凝集測定が行われた。
【０５８５】
【表６５】
2006249085.tif 000069
【０５８６】
凝集分析：
抗体組成物は４０℃において貯蔵された。６週間で、各組成物はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、凝集について分析された。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ−Ｇ２０００ＳＷＸＬカラム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７の移動相、０．７ｍＬ／分の流速、および２１４ｎｍにおけるＵＶ検出を用いて行われた。凝集レベルは、クロマトグラムのピーク下の面積を各組成物について積算すること、および高分子量種のピーク下にある積算された面積を全ピーク面積のパーセントとして記録することにより計算された。表４８に示されたように、ＥＤＴＡ緩衝化組成物は、最も低いレベルの凝集および、凝集の最も低い相対増加を示した。
【０５８７】
実施例４−Ｃ
研究は、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の断片化に対する、緩衝剤濃度および、他の賦形剤の存在／不在の影響を評価するべく行われた。
【０５８８】
表４９に示された組成物は、実施例２−Ｃに記述された方法によって調製され、実施例３−Ｃの方法によって評価された。
【０５８９】
【表６６】
2006249085.tif 000070
【０５９０】
表４９に示されたように、液体組成物中のＥＤＴＡの存在は、ＥＤＴＡを含まない組成物におけるものよりも少ないＬＭＭ形成を生じる結果となる。
【０５９１】
実施例５−Ｃ
研究は、凝集および断片化に対する、液体の抗ＭＡｄＣＡＭ抗体組成物中のＥＤＴＡの影響を評価するべく行われた。
【０５９２】
緩衝液は、実施例３−Ｃに記述された方法によって調製された。抗体組成物は以下のように調製された。抗体のバルク溶液は２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中の９．６ｍｇ／ｍｌとして得られた。このバルク溶液の、組成物溶液への緩衝剤交換は、５０００ｘｇにおける遠心分離により、限外濾過膜（たとえば、３０ｋＤ）を用いて行われた。約８体積の交換が行われ、最終的な抗体溶液は、約８ｍｇ／ｍｌまたは約３０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で調製された。抗体濃度は、紫外−可視分光（ＵＶ−Ｖｉｓ）法により、２８０ｎｍにおける吸光係数１．５６（ｍｇ／ｍｌ）-1ｃｍ-1を用いて測定された。ポリソルベート８０（ＰＳ８０）（典型的には２０ｍｇ／ｍｌ）の濃縮液は、適当な緩衝液によるＰＳ８０の希釈および溶解により調製された。ＰＳ８０濃縮液は次に、抗体溶液へ添加され、記述された最終組成物を得た。すべての成分をもつ組成物は次に、滅菌フィルタ（ポアサイズ０．２２ミクロン）を通した濾過により滅菌された。濾過された組成物は次に、洗浄およびオートクレーブされたバイアルへ注がれた。このバイアルは、Ｄａｉｋｙｏ  ７７７−１  Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）コートされたストッパーで閉じられ、クリンプシールされ、スタビリティ・チャンバー内に静置された。
【０５９３】
表５０の組成物は４０℃で２６週間貯蔵され、実施例３−Ｃに記述されたＳＥＣ法により評価された。
【０５９４】
【表６７】
2006249085.tif 000071
【０５９５】
表５１の組成物は２５℃で２６週間貯蔵され、実施例３−Ｃに記述されたＳＥＣ法により評価された。
【０５９６】
【表６８】
2006249085.tif 000072
【０５９７】
この実施例は、液体組成物中のＥＤＴＡの存在が、少ない凝集および少ないＬＭＭ種の形成を生じる結果となることを示している。
【０５９８】
実施例６−Ｃ
研究は、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の凝集および断片化に対する、酢酸塩およびヒスチジンの影響を比較するべく行われた。表５２および５３に示された組成物は、実施例５−Ｃに記述された方法により調製された。表５２の組成物は４０℃で２６週間貯蔵され、実施例３−Ｃに記述されたＳＥＣ法により分析された。
【０５９９】
【表６９】
2006249085.tif 000073
【０６００】
表５３の組成物は２５℃で５２週間貯蔵され、実施例３−Ｃに記述されたＳＥＣ法により分析された。
【０６０１】
【表７０】
2006249085.tif 000074
【０６０２】
この実施例は、緩衝剤としてヒスチジンを用いた組成物が、同じｐＨでは酢酸塩を用いた組成物よりも少ない凝集体を形成することを示している。
【０６０３】
実施例７−Ｃ
研究は、種々の抗体濃度における抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の、凝集傾向を評価するべく行われた。この研究では、実施例５−Ｃに記述された方法により、表５４の組成物が調製された。表５４の組成物は５℃、２５℃、または４０℃において２６時間貯蔵され、次いで実施例３−Ｃに記述されたＳＥＣ法により分析された。
【０６０４】
【表７１】
2006249085.tif 000075
【０６０５】
表５４に示されたように、凝集する傾向は抗体濃度の増加とともに増加する。しかしながら、２６週間の貯蔵の後、表５４に示された組成物の安定化効果は、促進された条件のデータ（２５℃および４０℃での貯蔵）によって実証されており、高い濃度の組成物を用いて相対的に低いレベルの凝集を示す。
【０６０６】
実施例８−Ｃ
研究は、種々のレベルのＥＤＴＡを用いた組成物における、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６抗体の凝集傾向を評価するべく行われた。組成物は、最終的な抗体濃度が８０±１０ｍｇ／ｍｌに調整（された）ことを除いて、上記の実施例５−Ｃにおいて記述されたように調製された。表５５の組成物は、５℃または２６℃において２６週間貯蔵され、次いでＳＥＣにより上記のように分析された。
【０６０７】
【表７２】
2006249085.tif 000076
【０６０８】
示されたように、０．０２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡに比較して、０．０５ｍｇ／ｍｌおよび０．１０ｍｇ／ｍＬにおいては改善があり、かつ各々の場合に、ＥＤＴＡの存在下での凝集は、５℃で２６週間の貯蔵後では低い。
【０６０９】
実施例９−Ｃ
研究は、様々なレベルのポリソルベ−ト８０を用いた抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の組成物の安定性を評価するべく行われた。組成物は、最終的な抗体濃度が８０±ｍｇ／ｍｌに調整されたことを除いて、上記のように調製された。表５６の組成物は、２５℃または４０℃において２６週間貯蔵され、次いでＳＥＣにより上記のように分析された。
【０６１０】
【表７３】
2006249085.tif 000077
【０６１１】
表５７の組成物は、３００ｒｐｍでの軌道振盪による振盪ストレスに、周囲温度において２４時間さらされた。組成物は、最終的な抗体濃度が８５±ｍｇ／ｍｌに調整されたことを除いて、上記のように調製された。
【０６１２】
【表７４】
2006249085.tif 000078
【０６１３】
上記の貯蔵安定性の研究、ポリソルベート８０のレベルを増加することで、可溶性の凝集レベルにわずかな増加を示しているが、振盪ストレス研究は、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０が振盪ストレスからの適切な防御を提供することを示している。
【０６１４】
実施例１０−Ｃ
研究は、様々な緩衝剤を用いた組成物中の、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の凝集傾向を評価するべく行われた。組成物は上記のように調製され、抗体の終濃度は８０±１０ｍｇ／ｍｌに調整された。表５８の組成物は、２５℃または４０℃において２６週間貯蔵された。
【０６１５】
【表７５】
2006249085.tif 000079
【０６１６】
凝集のレベルは、ヒスチジン緩衝剤を用いた組成物において最も低かった。
【０６１７】
実施例１１−Ｃ
研究は、種々の糖およびポリオールを用いた組成物中の、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の凝集傾向を評価するべく行われた。組成物は上記のように調製され、抗体の終濃度は８０±１０ｍｇ／ｍｌに調整された。表５９の組成物は、４０℃で２６週間貯蔵された。
【０６１８】
【表７６】
2006249085.tif 000080
【０６１９】
凝集のレベルは、トレハロースを含有する組成物では、より低かった。
【０６２０】
実施例１２−Ｃ
研究は、種々の界面活性剤およびＰＥＧを用いた組成物中の、抗ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６の凝集傾向を評価するべく行われた。組成物は上記のように調製され、抗体の終濃度は８０±１０ｍｇ／ｍｌに調整された。抗体組成物中の界面活性剤（または）ＰＥＧの終濃度は、界面活性剤またはＰＥＧの濃縮ストック溶液からの適当な量の添加により達成された。表６０の組成物は、４０℃において２６週間貯蔵された。
【０６２１】
【表７７】
2006249085.tif 000081
【０６２２】
ＰＳ８０およびポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７を含有する組成物は、他の界面活性剤および両親媒性物質よりもわずかに良好に働いた。
【０６２３】
実施例１３−Ｃ
研究は、トレハロースまたはスクロースを用いた組成物中の、Ｍｅｔ２５６酸化を評価するべく行われた。組成物は上記のように調製され、抗体の終濃度は８０±１０ｍｇ／ｍｌに調整された。表６１の組成物は５℃または４０℃で２６週間貯蔵された。メチオニン酸化は、リシルエンドプロテアーゼを用いてタンパク質を酵素的に消化することにより測定され、結果として得られたペプチドフラグメントは、逆相ＨＰＬＣにより２１４ｎｍの吸光度測定を用いて分離された。メチオニンまたはその酸化型を含有するペプチドフラグメントはモニターされた。ペプチド酸化は、元のメチオニンのものに比較した、酸化メチのピーク面積によって計算された。
【０６２４】
【表７８】
2006249085.tif 000082
【０６２５】
トレハロースを含有する組成物は、スクロースを含有するものに比較して、低いメチオニン酸化の傾向を示す。
【０６２６】
実施例１４−Ｃ
研究は、抗体濃度の高い組成物の、化学的安定性能を評価するべく行われた。表６２および６３の組成物は上記のように調製され、最終的な抗体濃度は８０±１０ｍｇ／ｍｌに調整された。表６２の組成物は５℃で２６週間貯蔵された。化学的安定性はｉＣＥにより測定された。測定は、ｐＩマーカー、メチルセルロース、およびファルマライトを用いてタンパク質混合物を調製し、最終的なタンパク質濃度を約０．２２μｇ／μＬとすることにより行われた。電気泳動の作業は、３０００ボルトにおける６分間のフォーカシング時間、および２８０ｎｍの吸光プローブを用いて行われた。様々な荷電化学種の相対的なパーセントは、それらの各々のピーク下の面積によって測定された。
【０６２７】
【表７９】
2006249085.tif 000083
【０６２８】
表６２の組成物は、主要な化学種ならびに、全酸性種または全塩基性種において有意な変化がないことから、良好な化学的安定性を示している。
【０６２９】
表６３の組成物は、５℃で２６週間貯蔵され、純度を測定するべく還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、およびコロイダルブルー（クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルー）染色を用いて作業された。還元ゲル用には、還元はＮｕ−ＰＡＧＥ還元剤により達成された。還元ゲル中のパーセント純度は、デンシトメトリーにより：
％純度＝（％重鎖＋％軽鎖）
によって測定された。
【０６３０】
【表８０】
2006249085.tif 000084
【０６３１】
表６３の組成物は、５℃で２６週間の貯蔵後に有意な純度の変化を示さず、良好な化学的安定性を示している。
【０６３２】
実施例１５−Ｃ
研究は、凍結−融解のストレスに対する高濃度組成物の性能を評価するべく行われた。
【０６３３】
表６４の組成物は上記のように調製され、最終的な抗体濃度は５０±１０ｍｇ／ｍｌに調整された。表６４の組成物は、−７０℃／５℃か、または−２０℃／５℃における３回の凍結−融解サイクルを受けた。研究は、２ｍｌのガラスバイアルに１ｍｌを入れて行われた。ＳＥ＿ＨＰＬＣ測定は、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７の移動相、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬカラム、０．７ｍｌ／分の流速で、２１４ｎｍのプローブを用いて行われた。凝集物の量は、抗体モノマーに先立って流出される抗体関連のピークを合計することによって測定された。
【０６３４】
【表８１】
2006249085.tif 000085
【０６３５】
表６４の組成物は、−７０℃／５℃か、または−２０℃／５℃における３回の凍結−融解サイクルの後、何ら凝集の増加を示さない。
【０６３６】
表６５の組成物は上記のように調製され、最終的な抗体濃度は７５±１５ｍｇ／ｍｌに調整された。表６５の組成物は、−２０℃／５℃における４回の凍結−融解サイクルを受けた。これらの凍結−融解の研究は、１０ｍｌのガラスバイアルに１０ｍｌを入れて行われた。ＳＥＣ測定は、本実施例において前文に示されたように行われた。
【０６３７】
【表８２】
2006249085.tif 000086
【０６３８】
表６５の組成物は、−２０℃／５℃における４回の凍結−融解サイクルの後に、何ら凝集の増加を示さない。
【０６３９】
実施例１６−Ｃ
研究は、凍結貯蔵の間の、高濃度組成物の安定性を評価するべく行われた。表６６の組成物は上記のように調製され、最終的な抗体濃度は約７５ｍｇ／ｍｌに調整された。表２１の組成物は−２０℃において１３週間貯蔵され、凝集は実施例１５−Ｃに記述されたように評価された。
【０６４０】
【表８３】
2006249085.tif 000087
【０６４１】
高濃度（７５ｍｇ／ｍｌ抗体）の組成物は、−２０℃における１３週間の貯蔵の後、何ら凝集の増加を示さない。
【０６４２】
実施例１７−Ｃ
研究は、高濃度組成物の粘性を評価するべく行われた。表６７の組成物は上記のように調製され、最終的な抗体濃度は約７５ｍｇ／ｍｌに調整された。粘性測定は、レオメーターのプレート上に置かれた組成物に対し、３００B-1の平均剪断速度を適用することによって行われた。
【０６４３】
【表８４】
2006249085.tif 000088
【０６４４】
組成物は、皮下投与に適した粘性を示している。
【０６４５】
本明細書において引用された全ての参考文献は、制限なく全ての論文、出版物、特許、特許出願、プレゼンテーション、テキスト、リポート、原稿、パンフレット、本、インターネットポスティング、雑誌記事、定期刊行物などを含め、その全てが参考として本明細書に含まれる。本文における参考文献についての議論は、それらの筆者によって作られた主張を要約することを意図したものに過ぎず、任意の参考文献が先行技術を構成することは認められていない。出願人は、引用された参考文献の正確さおよび適切さに対し、チャレンジする権利を保有する。
【０６４６】
上記の方法および組成物においては、本発明の範囲から離れることなく、多様な変更が行われることが可能であることから、上記の記述に含まれる全ての物質は、制限する意味においてではなく例証として解釈されよう。さらに、種々の態様についての観点は、全体又は部分の双方において相互に交換されてよいことが理解されるべきである。
【０６４７】
【化４】
2006249085.tif 000089
【０６４８】
【化５】
2006249085.tif 000090
【０６４９】
【化６】
2006249085.tif 000091
【０６５０】
可変領域（配列番号２５）は、［括弧の間］に描かれており、ＣＤＲには下線が付されている。ＣＤＲ１は配列番号２７により、ＣＤＲ２は配列番号２８により、ＣＤＲ３は配列番号２９によって示されている。
【０６５１】
【化７】
2006249085.tif 000092
【０６５２】
可変領域（配列番号２６）は、［括弧の間］に描かれており、ＣＤＲには下線が付されている。ＣＤＲ１は配列番号３０により、ＣＤＲ２は配列番号３１により、ＣＤＲ３は配列番号３２によって示されている。
【０６５３】
【化８】
2006249085.tif 000093
【０６５４】
【化９】
2006249085.tif 000094
【０６５５】
【化１０】
2006249085.tif 000095
【図面の簡単な説明】
【０６５６】
【図１】４０℃に６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物による、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲル中でのパーセント・フラグメンテーションを示す線グラフを示す。
【図２】４０℃に６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物による、ＩＥＦゲル中でのパーセントメジャー（等電点焦点）ＩＥＦバンドを示す線グラフを示す。
【図３】４０℃に６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物による、ＳＥ−ＨＰＬＣデータから決定されるパーセント凝集を示す線グラフを示す。
【図４】４０℃に２６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物による、ＳＥ−ＨＰＬＣデータから決定されるパーセント凝集を示す線グラフを示す。
【図５】４０℃に２６週までの間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物による、有機ＳＥ−ＨＰＬＣデータから決定されるパーセント・フラグメンテーション（約１１ｋＤ）を示す線グラフを示す。
【図６】４０℃に２６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物による、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルからのパーセント・フラグメンテーションを示す線グラフを示す。
【図７】４０℃に２６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物による、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元ゲルからの残存する抗体モノマーのパーセントを示す線グラフを示す。
【図８】４０℃に２６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物１１および９の有機ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム（ｙ軸に拡大して示す）を示す。
【図９】４０℃に６週間保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆ組成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルの写真を示す。
【図１０】４０℃に６週間保存した組成物１（最上段）における抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３Ｆの有機ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを対照サンプル（最下段）と比較して示す。
【図１１】４０℃に２６週間組成物１１中に保存した抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１０．３ＦのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム示す。
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｄからなり、抗−Ｍ−ＣＳＦ抗体８．１１．３Ｆの核酸およびアミノ酸配列を示す。図１２Ａは８．１１．３Ｆ重鎖（配列番号１）の全長核酸配列を示す。図１２Ｂは８．１１．３Ｆ重鎖（配列番号２）の全長アミノ酸配列を示し、８．１１．３Ｆ重鎖可変領域のアミノ酸配列は大文字で、かつ括弧内“［  ］”に指定する（配列番号５）。各８．１１．３Ｆ重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列には下線を引き、小文字とする。重鎖ＣＤＲアミノ酸配列は以下のとおりである：ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＦＳＭＴ（配列番号７）；ＣＤＲ２：ＹＩＳＳＲＳＳＴＩＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８）；およびＣＤＲ３：ＤＰＬＬＡＧＡＴＦＦＤＹ（配列番号９）。
【図１２−２】図１２Ｃは全長８．１１．３Ｆ軽鎖（配列番号３）の核酸配列を示す。図１２Ｄは全長８．１１．３Ｆ軽鎖（配列番号４）のアミノ酸配列を示し、８．１１．３Ｆ軽鎖可変領域は大文字で、かつ括弧内“［  ］”に指定する（配列番号６）。各軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は以下に示すとおりである：ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１０）；ＣＤＲ２：ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１１）；およびＣＤＲ３：ＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号１２）。
【図１３】４０℃で７週まで保存した後の種々試験組成物におけるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるパーセント凝集を示す棒グラフである。
【図１４】４０℃で７週まで保存した後の種々試験組成物における還元型ＳＤＳＰＡＧＥ（ｒＳＤＳＰＡＧＥ）によるパーセント総加水分解（フラグメンテーション）不純物形成を示す棒グラフである。
【図１５】４０℃で２４週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を示す線グラフである。
【図１６】４０℃で２４週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるｒＳＤＳＰＡＧＥによるパーセント総加水分解性（フラグメンテーション）不純物形成を示す線グラフである。
【図１７】４０℃で２４週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を示す線グラフである。
【図１８】４０℃で２４週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるｒＳＤＳＰＡＧＥによるパーセント総加水分解（フラグメンテーション）不純物形成を示す線グラフである。
【図１９】４０℃で２４週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるパーセント凝集を、ＳＥＣによるＥＤＴＡレベルの関数として示す棒グラフである。
【図２０】４０℃で２４週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるパーセント総加水分解（フラグメンテーション）不純物形成を、ｒＳＤＳＰＡＧＥによるＥＤＴＡレベルの関数として示す棒グラフである。
【図２１】４０℃で１３週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるパーセント凝集をＳＥＣにより示す線グラフである。
【図２２】４０℃で１３週までの加速条件下の保存に対する種々試験組成物におけるパーセント総加水分解（フラグメンテーション）不純物形成をｒＳＤＳＰＡＧＥにより示す線グラフである。
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｄを含み、現在チシリムマブ（ticilimumab）と言われる抗−ＣＴＬＡ４抗体１１．２．１のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図１１Ａは１１．２．１重鎖（配列番号２１）の全長ヌクレオチド配列を示す。図１１Ｂは１１．２．１重鎖（配列番号２２）の全長アミノ酸配列を示し、該１１．２．１重鎖可変領域のアミノ酸配列は括弧“［  ］”で示す（配列番号２５）。各１１．２．１重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列には下線を付す。ＣＤＲ配列は以下のとおりである：ＣＤＲ１：ＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨ（配列番号２７）；ＣＤＲ２：ＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶ（配列番号２８）；およびＣＤＲ３：ＤＰＲＧＡＴＬＹＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号２９）。
【図２３−２】図２３Ｃは１１．２．１軽鎖（配列番号２３）のヌクレオチド配列を示す。図２３Ｄは全長１１．２．１軽鎖（配列番号２４）のアミノ酸配列を示し、該１１．２．１軽鎖可変領域は括弧“［  ］”で示す（配列番号２６）。各ＣＤＲのアミノ酸配列は以下のとおりである：ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＩＮＳＹＬＤ（配列番号３０）；ＣＤＲ２：ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３１）；およびＣＤＲ３：ＱＱＹＹＳＴＰＦＴ（配列番号３２）。
【図２４】４０℃で２６週まで保存後の、モノクローナル抗体濃度の異なる種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を説明するグラフを示す。
【図２５】４０℃で２６週まで保存後のＥＤＴＡ濃度の異なる種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を説明するグラフを示す。
【図２６】４０℃で２６週まで保存後のポリソルベート８０濃度の異なる種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を説明するグラフを示す。
【図２７】４０℃で２６週まで保存後のバッファー種の異なる種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を説明するグラフを示す。
【図２８】４０℃で２６週まで保存後の安定剤／等調化剤種の異なる種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を説明するグラフを示す。
【図２９】４０℃で２６週まで保存後の界面活性剤種の異なる種々試験組成物におけるＳＥＣによるパーセント凝集を説明するグラフを示す。
【図３０−１】図３０Ａ〜３０Ｅからなり、抗−ＭＡｄＣＡＭ抗体７．１６．６のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。図３０Ａは７．１６．６重鎖（配列番号４１）のヌクレオチド配列を示す。図３０Ｂは７．１６．６重鎖（配列番号４２）のアミノ酸配列を示す。
【図３０−２】図３０Ｃは７．１６．６軽鎖（配列番号４３）のヌクレオチド配列を示す。図３０Ｄは全長７．１６．６軽鎖（配列番号４４）のアミノ酸配列を示す。図３０ＥはＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧ1Ｆｃ融合タンパク質（配列番号４５）のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【外国語明細書】
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