(57)【要約】【課題】ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型（ＵＣＨ−Ｌ１）の新規な機能に基づいた、神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ＵＣＨ−Ｌ１作用を有するか、または当該作用を増強する物質を選択することを特徴とする神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤のスクリーニング方法。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型作用を有するか、または当該作用を増強する物質を選択することを特徴とする神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤が脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症または糖尿病性末梢神経障害の予防及び／または治療剤である請求項１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型（ＵＣＨ−Ｌ１）は脱ユビキチン化酵素の一員であり、脳内で最も豊富な蛋白質の一つである。他のＵＣＨ系酵素は全身的に発現するのに対してＵＣＨ−Ｌ１は成人において神経や精巣・卵巣に特異的に発現する（非特許文献１）。ＵＣＨ−Ｌ１はＰＧＰ９．５としても知られており、細胞解剖学や神経病理学の研究における神経マーカとしても用いられている（非特許文献２、同３）。最近の研究によれば、ＵＣＨ−Ｌ１は神経変性への関与が指摘されている。例えば、ＵＣＨ−Ｌ１のＩ９３Ｍ変異体（Ｎ末９３番目のＩｌｅがＭｅｔに置換したもの）、Ｓ１８Ｙ多形体（Ｎ末１８番目のＳｅｒがＴｙｒに置換したもの）がパーキンソン病患者で見出されている（非特許文献４、同５）。ＵＣＨ−Ｌ１遺伝子に変異が生じた自然発症型変異マウスである軸索変性マウス（ｇａｄマウス）では後退性の神経変性が観察される（非特許文献６）。またＵＣＨ−Ｌ１はユビキチンに対して親和性を有し、インビボにおいて神経内での安定化に寄与することが知られている（非特許文献７）。
【０００３】
しかしながらＵＣＨ−Ｌ１は生体内で幅広い機能を有すると考えられているものの、その機能解明はまだ充分ではなく、ＵＣＨ−Ｌ１を介した医薬品の研究開発もほとんど行われていないのが実情である。
【０００４】
神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤は、損傷を受けた神経の修復、新生、再生を行う働きを有することから、神経が損傷を受けるような疾患、例えば、脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病性末梢神経障害等の予防及び／または治療に有用であると考えられる。
【非特許文献１】Science, (1989), vol.246, p670-673
【非特許文献２】Acta. Neuropathol. (Berl), (1994), vol.87, p269-276
【非特許文献３】J. Pathol., (1995), vol.176, p207-216
【非特許文献４】Nature, (1998), vol.395, p451-452
【非特許文献５】J. Neurol. Sci., (2001), vol.189, p113-117
【非特許文献６】Nat. Genet., (1999), vol.23, p47-51
【非特許文献７】Hum. Mol. Genet., (2003), vol.12, p1945-1958
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はＵＣＨ−Ｌ１の新規な機能に基づいた、神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の事情を考慮に入れて研究を行い、ＵＣＨ−Ｌ１の新規な機能として、神経（前駆）細胞の分化誘導作用を介して神経新生に関与することを実証した。この知見をふまえてさらに研究を進めた結果、神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤のスクリーニング方法として、ＵＣＨ−Ｌ１作用を有するか、または当該作用を増強する物質を選択する手法が有効であることを見出して、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、
１）ユビキチンＣ末端水解酵素Ｉ型作用を有するか、または当該作用を増強する物質を選択することを特徴とする神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤のスクリーニング方法、
２）神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤が脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症または糖尿病性末梢神経障害の予防及び／または治療剤である、１）のスクリーニング方法、
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＵＣＨ−Ｌ１を介した新たな作用機作に基づく新規の医薬品（神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤）を医療の場に供給することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明のスクリーニング方法はＵＣＨ−Ｌ１作用を有するか、または当該作用を増強する物質を選択することを特徴とする。具体的には後述のように、ＵＣＨ−Ｌ１そのもの、またはその活性を測定することにより実施できる。なお、本発明において「ＵＣＨ−Ｌ１作用を有する」とはＵＣＨ−Ｌ１としての活性を有する場合のみならず、ＵＣＨ−Ｌ１が存在する場合も含む。
【００１１】
ＵＣＨ−Ｌ１の存在の有無及びその程度を測定する方法としては、抗体（抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体など）を用いる方法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動などが挙げられる。また、ＵＣＨ−Ｌ１の活性の有無及びその強度を測定する方法としては、酵素活性を指標とする方法、ユビキチン結合試験などが挙げられる。
【００１２】
抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体は市販品を用いることができる。
【００１３】
酵素活性を指標とする場合は、例えば、ユビキチン（Ｕｂ）、好ましくは蛍光基質で標識したもの、等を反応させてＣ末側の分解産物の生成量を測定する方法などが例示される。蛍光基質で標識したＵｂとしては、ユビキチン−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ）などが例示される。
【００１４】
本発明において用いられるＵＣＨ−Ｌ１は公知の蛋白質であり、その由来は特に限定されるものではない。好ましくはヒト由来のものである。ＵＣＨ−Ｌ１は遺伝子組換え等により調製することができる。また市販品を使用することもできる。なお、本発明においてはＵＣＨ−Ｌ１の変異体などＵＣＨ−Ｌ１と実質的に同様の機能を有するものも使用することができる。
【００１５】
ユビキチン（Ｕｂ）も公知の蛋白質であり、その由来は特に限定されるものではない。好ましくはヒト由来のものである。Ｕｂ−ＡＭＣは市販品を使用することができる。
【００１６】
ユビキチン結合試験としては、例えば、ユビキチンとの結合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法などで確認する方法、免疫沈降、抗ユビキチン抗体および／または抗ＨＡ抗体の使用により分析する方法、蛍光基質などで標識したユビキチンを用いる方法（例えば、上述のＵｂ−ＡＭＣを用いる）などが例示される。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法の測定様式として以下の２種が挙げられる。
Ａ．試験物質そのもののＵＣＨ−Ｌ１作用を調べる
Ｂ．試験物質とＵＣＨ−Ｌ１の共存下にＵＣＨ−Ｌ１作用を調べ、その変化を確認する。
【００１８】
（Ａ．試験物質のＵＣＨ−Ｌ１作用を調べる）
様式Ａにおける神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤を選択する基準としては、試験物質がＵＣＨ−Ｌ１と比べて同等もしくはそれ以上のＵＣＨ−Ｌ１作用を有することが好ましい。
【００１９】
抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体を用いる場合は、試験物質が該抗体と反応するか否か、またその程度をＵＣＨ−Ｌ１と対比する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合は、試験薬物の泳動パターンをＵＣＨ−Ｌ１と対比する。
【００２０】
酵素活性を指標とする場合は、例えば、試験物質とＵｂ−ＡＭＣを反応させてＣ末側の分解産物の生成量を測定し、ＵＣＨ−Ｌ１と対比する。
【００２１】
反応条件としては、試験物質濃度およびＵＣＨ−Ｌ１濃度は０．０１〜１００ｎＭ、好ましくは０．１〜１０ｎＭ程度、Ｕｂ濃度は１〜５０００ｎＭ、好ましくは１０〜１０００ｎＭ程度が例示される。その他の条件としては、ｐＨ６〜９程度、温度１０〜３０℃程度、反応時間１０秒〜１時間程度が例示される。
【００２２】
Ｕｂ結合試験の場合は、試験物質とＵｂとを反応させてその結合の程度をＵＣＨ−Ｌ１と対比する。
【００２３】
様式Ａにおける試験物質はＵＣＨ−Ｌ１様物質である。本発明においてＵＣＨ−Ｌ１様物質とはＵＣＨ−Ｌ１に関連する物質であり、ＵＣＨ−Ｌ１と実質的に同等なものであれば、蛋白質または該蛋白質をコードする遺伝子のいずれでもよいことを意味する。また、ＵＣＨ−Ｌ１そのものも概念上含まれる。具体的には、ＵＣＨ−Ｌ１またはその変異体、それらをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）が挙げられる。
【００２４】
ＵＣＨ−Ｌ１の変異体としては、天然型のＵＣＨ−Ｌ１において、１または複数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されており、しかもＵＣＨ−Ｌ１と同等もしくはそれ以上の活性を有していればよい。例えば、ＵＣＨ−Ｌ１のＣ９０Ｓ変異体（Ｎ末９０番目のＣｙｓをＳｅｒに置換したもの）などが例示される。
【００２５】
具体的には、ヒト由来の天然型のＵＣＨ−Ｌ１は配列番号２の、そのＣ９０Ｓ変異体は配列番号４の、アミノ酸配列を有する。
【００２６】
また、遺伝子の場合は、上記のＵＣＨ−Ｌ１またはその変異体（蛋白質）をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではない。ＵＣＨ−Ｌ１またはその変異体をコードする遺伝子についての好ましい具体例は以下の表１のとおりである。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（Ｂ．試験物質とＵＣＨ−Ｌ１の共存下にＵＣＨ−Ｌ１作用を調べ、その変化を確認する）
様式Ｂにおける神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤を選択する基準としては、試験物質を添加することによりＵＣＨ−Ｌ１作用が増強していることが好ましい。
【００２９】
様式Ｂにおける試験物質は低分子化合物、蛋白質、遺伝子等のいずれにも限定されるものではなく、本発明のスクリーニングのために自由に選出することができる。
【００３０】
抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体を用いる場合は、試験物質が共存することにより、ＵＣＨ−Ｌ１と該抗体との反応の程度が変化するか否かを確認する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合は、試験物質が共存することにより、ＵＣＨ−Ｌ１の泳動パターンが変化するか否かを確認する。
【００３１】
酵素活性を指標とする場合は、試験物質の共存下にＵＣＨ−Ｌ１を、例えばＵｂ−ＡＭＣと反応させてＣ末側の分解産物の生成量が変化するか否かを確認する。
【００３２】
反応条件としては、ＵＣＨ−Ｌ１濃度は０．０１〜１００ｎＭ、好ましくは０．１〜１０ｎＭ程度、Ｕｂ濃度は１〜５０００ｎＭ、好ましくは１０〜１０００ｎＭ程度、試験物質濃度は１〜１０００μＭ、好ましくは１〜１００μＭ程度が例示される。その他の条件としては、ｐＨ６〜９程度、温度１０〜３０℃程度、反応時間１０秒〜１時間程度が例示される。
【００３３】
Ｕｂ結合試験の場合は、試験物質の共存下にＵＣＨ−Ｌ１とＵｂとを反応させてその結合の程度が変化するか否かを確認する。
【００３４】
本発明においてスクリーニングされた神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤は、脳梗塞、脊髄損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症または糖尿病性末梢神経障害に対する予防及び／または治療剤として有用である。
【実施例】
【００３５】
本発明をより詳細に説明するために以下に実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３６】
実施例
抗体と試薬：抗ネスチン・モノクローナル抗体（ベクトン・ディキンソン社；Ｒａｔ４０１、デベロプメンタル・スタデイズ・ハイブリドーマ・バンク）、抗神経性βチューブリンＩＩＩモノクローナル抗体（ＴｕＪ１、コバンス社）、抗ＵＣＨ−Ｌ１ポリクローナル抗体（ｐｇｐ９．５；ＲＡ９５１０１、ウルトラクローン社）、抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（シグマ・ケミカル社）、アレキサ・フロール・フルオレセイン標識二次抗体（モレキュラー・プローブ社）を用いた。
【００３７】
中枢性ＮＰＣ（神経前駆細胞）の培養および分化条件：中枢性ＮＰＣを既報（文献１）に準じて培養した。妊娠中のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（クレア・ジャパン社）から胎児を採取し、形態学的基準により分類し妊娠日を確定した。発育途中のマウス大脳皮質を第１４胎児日の胎児（妊娠後１４日目の胎児のこと。以下、Ｅ１４胎児または単にＥ１４と表示する。なおＥは胎児Ｅｍｂｒｙｏの略である）から剥離した。ピペッティングにより細胞を機械的に解離させ、１５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン１０ｍｌおよび１μｇ／ｍｌのフィブロネクチン１０ｍｌでプレコートした１０ｃｍのディッシュにつき、３．０×１０６細胞の濃度で播種した。細胞を、Ｂ２７（インビトロゲン社）、０．５ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを配合した無血清ＮＢ（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培地（インビトロゲン社）中で５日間増殖させた。なお該培地は１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；ペプロテック社）を含有したものである。９５％空気−５％二酸化炭素の雰囲気下に３７℃で培養を維持した。
【００３８】
二次培養はｂＦＧＦ存在下で増殖させたＮＰＣを加温ハンクス平衡化塩溶液［ＨＢＳＳ（−）、ＧＩＢＣＯ社］で洗浄し、メカニカルピペッティングにより剥離して、Ｂ２７配合ｂＦＧＦ未配合ＮＢ培地に再懸濁した。細胞は各々の時点での免疫蛍光染色用に、１５μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−オルニチン５００μｌおよび１μｇ／ｍｌのフィブロネクチン５００μｌを用いてプレコートした２４ウェルプレート（１．５×１０６細胞／ウェル）に再播種した。
【００３９】
免疫組織化学：脳切片を既報（文献２）に準じて染色した。第１４胎児日（Ｅ１４）および第１６胎児日（以下Ｅ１６）のマウス脳を採取し４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ（等張リン酸塩緩衝液）中で、室温で２時間固定し、３０％ショ糖を含むＰＢＳ中で凍結保護を施した後にドライアイスで凍結した。切片（薄さ２０μｍ）をクライオスタット中でカットし、ＡＰＳコート・ガラススライド上に載せた。ＰＢＳで５分間洗浄する操作を３回行った後、３％牛血清アルブミン、２％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清、０．２％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて室温で１時間ブロックした。切片を一次抗体［抗ネスチン抗体（Ｒａｔ４０１）は１／１０希釈、抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体（ＲＡ９５１０１）は１／４０００希釈、抗ＴｕＪ１抗体は１／１０００希釈］とともに、４℃で一晩または室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄後、切片を希釈したフルオレセイン結合二次抗体（１／２００希釈）と２時間インキュベートした。共焦点式レーザ・スキャニングＴＣＳ  ＳＬ顕微鏡を用いて画像を得た。また詳細な分析はＬＳＣ共焦点式顕微鏡システム（ライカ社）を用いて実施した。免疫蛍光強度はＭａｃ  ＳＣＯＰＥソフトウエア（バージョン２．５９、三谷社）を用いて共焦点式画像から測定した。全ての蛍光値は蛍光信号の最低値に対して正常化され、得られた相対値を比較した。
【００４０】
免疫細胞化学：細胞を既報（文献３）に準じて染色した。インキュベーションおよび洗浄は室温で実施した。４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて細胞を１０分間固定し、さらに０．０２％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００／ＰＢＳを用いて５分間定着した。固定した細胞は３．３％ヤギ血清を用いて３０分間ブロックした。細胞を希釈一次抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、二重染色用には両方を用いる）と０．５〜１時間インキュベートした。さらに細胞を希釈フルオレセイン標識二次抗体と０．５〜１時間インキュベートした。なお抗体の希釈度は以下の通りであった；抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体は１／４０００希釈、抗ネスチン抗体、抗ＴｕＪ１抗体はいずれも１／５００希釈、二次抗体は１／２００希釈とした。また希釈操作は使用前に１％ヤギ血清／ＰＢＳを用いて行った。蛍光顕微鏡（ＩＸ７０顕微鏡、オリンパス社）を用いて画像を得た。
【００４１】
形質導入：細胞を２４ウェルプレートに再播種し、ｂＦＧＦとＢ２７を含む増殖培地中で一晩培養した後に、後述の発現プラスミドを、リポフェクトアミン２０００（インビトロゲン社）を用い、取扱説明書に準じて該細胞に形質導入した。
【００４２】
ヒトＵＣＨ−Ｌ１変異体の発現プラスミド：Ｄ３０Ａ（ＵＣＨ−Ｌ１においてＮ末３０番目のＡｓｐをＡｌａに置換したもの）またはＣ９０Ｓ（ＵＣＨ−Ｌ１においてＮ末９０番目のＣｙｓをＳｅｒに置換したもの）置換を含むヒトＵＣＨ−Ｌ１をコードする変異ｃＤＮＡをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用いて調製した。その際に表２に示す変異用オリゴヌクレオチドを用いた。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
調製したプラスミド中の各々のシングル−ヌクレオチド変異を配列解析により確認した。ｐＣＩ−ｎｅｏ動物細胞発現用ベクタ（プロメガ社）を用いて、ＦＬＡＧ標識したヒト天然型ＵＣＨ−Ｌ１、Ｄ３０ＡまたはＣ９０Ｓ変異体を各々担持する動物細胞発現用プラスミドを構築した。
【００４５】
なお配列解析による確認用に微生物発現用プラスミドを別途構築した。すなわち、テトラサイクリン誘導型発現システムを用いて、６ＨＮ標識したヒト天然型ＵＣＨ−Ｌ１、Ｄ３０ＡまたはＣ９０Ｓ変異体を各々担持する微生物細胞発現用プラスミドを構築した。ｐＣＩ−ｎｅｏのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩｃＤＮＡ断片を調製し、構築物をＳａｌＩで消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＰＲＯｔｅｔＥ２３３（クロンテック社）中のＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位間で連結して、ｐＰＲＯｔｅｔＥ２３３  ６ＨＮ標識ＵＣＨ−Ｌ１系ベクタを作成した。
【００４６】
ヒトＵＣＨ−Ｌ１活性のインビトロ分析：精製ヒトＵＣＨ−Ｌ１および蛍光基質［ユビキチン−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ、ボストン・バイオケム社）］を用いて、既報（文献４）に準じて定常状態動力学的パラメータを測定した。
【００４７】
免疫沈降法：ＮＩＨ−３Ｔ３細胞はそのＮ末端にＨＡ−ｆｌａｇの二重標識を有するヒト天然型ＵＣＨ−Ｌ１、Ｃ９０ＳまたはＤ３０Ａ変異体を安定的に発現した。該細胞を１０ｃｍのディッシュ中で培養し、サブコンフルエンスになったところで、ＥＤＴＡフリー完全プロテアーゼ阻害剤入りカクテル（ロシュ社）を配合した、改変ＲＩＰＡ緩衝液［１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５］１ｍｌを用いて該細胞を溶解し、超音波処理し、さらに１８０００×ｇで遠心分離した。免疫沈降は既報（文献５）に準じて行った。
【００４８】
結果
胎児マウス脳におけるＵＣＨ−Ｌ１発現：抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体を用いた免疫染色法により、ｇａｄマウスではＵＣＨ−Ｌ１免疫活性は検出されないが、混血（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）群ではＵＣＨ−Ｌ１が免疫染色された（図１）。次に該抗体を用いて神経前駆体のマーカであるネスチンと早期のニューロンのマーカであるＴｕＪ１を伴うＵＣＨ−Ｌ１の分布と発現を比較した。ネスチンは第１３胎児日（Ｅ１３）のｇａｄマウス、混血マウス双方の脳の脳室帯（ＶＺ）で発現していた（図１）。ネスチン発現は領域を通して観察されたが、ＴｕＪ１の免疫反応は辺縁帯（ＭＺ）で検出された。混血マウスにおいてＵＣＨ−Ｌ１とネスチンの免疫染色はＶＺ中のほとんど全ての細胞で重複していた（図１Ａ）。ＴｕＪ１の発現はＭＺ中のＵＣＨ−Ｌ１と共存していた（図１Ｂ）ことからＵＣＨ−Ｌ１は胎児ニューロンでも同様に発現することとネスチン陽性神経前駆細胞に発現していることが示された。Ｅ１３のｇａｄマウス脳においてネスチン染色は混血群と比較すると異なって見えた。ネスチン染色は変異体において、放射状グリアと思われる多くの放射状長線維中に観察されたが、混血群での染色は放射状グリアと同様に各成長段階のニューロン細胞においても生じていた（図１Ａ）。
【００４９】
次にＵＣＨ−Ｌ１発現の成長途中における変化を確認した。非対称細胞分裂は、一つのニューロンと一つの神経前駆体を形成するものであるが、第１１胎児日（Ｅ１１）に始まり、Ｅ１４頃にピークとなり、Ｅ１６以降減少した。Ｅ１４には星状膠細胞も寡突起神経膠細胞もまだ存在しないが、Ｅ１６にはグリア細胞の形成が始まっていた。ネスチン、ＴｕＪ１とも領域上の発現量はＥ１４とＥ１６で変化がなかった（図２Ａ、２Ｂ）。Ｅ１４とＥ１６で、ネスチン免疫反応はＶＺでより強いものであった（図２Ａ）が、皮質板（ＣＰ）では放射状グリア線維に沿ってのみ僅かに検出された（図２Ａ、３Ａ）。ＴｕＪ１免疫反応はＥ１４とＥ１６のＭＺ、ＣＰ、中間帯、脳下室帯で優勢的に検出された（図２Ｂ、３Ｂ）。ＶＺ中ではＴｕＪ１免疫反応は遊走性ニューロンにおいてのみ検出された（図３Ｂ）。
【００５０】
対照的にＵＣＨ−Ｌ１の発現パターンはＥ１４とＥ１６の間で変化した（図２Ａ、２Ｂ）。双方の成長段階でＵＣＨ−Ｌ１はニューロン細胞と同様に神経前駆細胞でも発現していた。ＵＣＨ−Ｌ１免疫反応はＥ１４ではＣＰよりＶＺにおいてより強いものであったが、Ｅ１６ではＶＺよりもＣＰにおいて該免疫反応は強いものであった（図２Ａ、２Ｂ）。
【００５１】
Ｅ１４とＥ１６間のＵＣＨ−Ｌ１発現における領域上の変化をＭＺ／ＣＰおよびＶＺの共焦点式画像から免疫蛍光強度を測定することにより確認した。結果を図２Ａ、２Ｂ、表３に示す。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
ＵＣＨ−Ｌ１の免疫反応はＥ１４、Ｅ１６ともＶＺにおいてネスチンと共存するが、Ｅ１６ではＶＺにおけるＵＣＨ−Ｌ１の発現は比較的弱いものであった（図３Ａ）。Ｅ１４のＶＺにおいてネスチンの発現は均一であったが、ＵＣＨ−Ｌ１免疫反応のパターンは強度の強弱が混在していた（図３Ａ）。Ｅ１６のＣＰにおいてネスチン陽性放射状グリア線維が成熟ニューロンの間を縫っていることが観察され、成熟ニューロンはＵＣＨ−Ｌ１を強く発現していた（図３Ａ）。
【００５４】
培養ＮＰＣにおけるＵＣＨ−Ｌ１とネスチンの発現：培養ＮＰＣを用いてＵＣＨ−Ｌ１発現の移動を分析した。ｂＦＧＦ存在下ではＮＰＣは増殖途中にあるが、ＵＣＨ−Ｌ１／ネスチン複陽性細胞の割合は播種４８時間後まで変化しなかった。またほとんど全てのＮＰＣはＵＣＨ−Ｌ１を発現していた（図４Ａ）。培養細胞の大多数（９７．５±２．２％、平均±ＳＤ）はネスチン陽性であり、そのほとんどはｂＦＧＦ非存在下でＮＰＣ分化を誘発するが、播種２時間後で抗ＵＣＨ−Ｌ１抗体により染色された。ネスチン／ＵＣＨ−Ｌ１複陽性細胞は全ての時点で検出されたが、その数は分化が増加するに伴い、２時間目（９５．８±１．９％）から４８時間目（２１．５±５．８％）まで漸減した（図４Ａ、４Ｂ）。ＵＣＨ−Ｌ１単陽性細胞は２時間目ではまれにしか検出されなかったが、ｂＦＧＦ除去後２４時間目まで分化につれて割合が増加した。一方、ネスチン単陽性細胞は早期分化相の間、特に６時間目（総細胞数の２６．４±８．４％）と１２時間目（総細胞数の２７．０±１４．０％）、に着実に検出された。ＵＣＨ−Ｌ１強−／弱−発現ネスチン陽性細胞は分化ＮＰＣ中に存在した（図３Ａ）。これらのデータはＵＣＨ−Ｌ１が前駆細胞と同様に分化途中のＮＰＣで発現することを示す。ネスチン陽性細胞はＵＣＨ−Ｌ１発現をベースとして少なくとも２つの亜集団（亜群）に分類されうる（図４Ａ、４Ｂ）。
【００５５】
培養ＮＰＣにおけるＵＣＨ−Ｌ１とＴｕＪ１の発現：ｂＦＧＦの存在下ではＴｕＪ１陽性細胞はまれにしか検出されないが、ｂＦＧＦの非存在下では同細胞が誘発される。ｂＦＧＦ非存在下の培養においてＵＣＨ−Ｌ１単陽性細胞集団は時間とともに減少するが、ＴｕＪ１／ＵＣＨ−Ｌ１複陽性集団は増加した（図５Ａ、５Ｂ）。ＴｕＪ１／ＵＣＨ−Ｌ１複陰性細胞が６、１２、２４、４８時間目の分化相で検出されたことから、同細胞は６、１２時間目のときのネスチン単陽性細胞であったのかもしれない。ＴｕＪ１単陽性細胞は分化ＮＰＣにおいてごくまれに検出された。ｂＦＧＦ非存在下での培養条件で４８時間目において、ＮＰＣの７１．４±３．４％がＴｕＪ１陽性細胞に分化することから、ＵＣＨ−Ｌ１陽性前駆細胞のほぼ全てがＴｕＪ１陽性ニューロン細胞に分化すると考えられた（図５Ａ、５Ｂ）。
【００５６】
さらにＵＣＨ−Ｌ１強−／弱−発現ＴｕＪ１陽性細胞は分化ＮＰＣ中に存在した（図４Ａ）。これらのデータはＵＣＨ−Ｌ１陽性ＮＰＣがニューロン細胞に分化する高い潜在能力を有すること、ＴｕＪ１陽性ニューロン細胞は多様（不均一）であること、を示す。
【００５７】
ＵＣＨ−Ｌ１陽性ＮＰＣの形態分類：前述の培養条件下で、播種後１２時間と２４時間の間の分化ＮＰＣにおいて、実際に神経新生が起きていた（図５）。グリア分化はこの時点ではまだ始まっていなかった。播種後６時間目と１２時間目の分化ＮＰＣを収集しネスチン陽性細胞の形態を分析した（図６）。ＵＣＨ−Ｌ１／ネスチン複陽性細胞、ネスチン単陽性細胞ともに分化ＮＰＣ集団中に存在した。複陽性細胞集団は分化ニューロンの進行度を示すかもしれないので、これらの細胞の形態を調べた。
【００５８】
ネスチン陽性細胞を神経突起（プロセス）の長さに応じて（長形、短形、円形。図４参照）に分類した。ＵＣＨ−Ｌ１単陽性細胞および複陽性細胞は総細胞数中に含まれる。突起の全長が細胞核の４倍以上であれば該細胞を「長形」に分類した。４倍以下であれば「短形」に、突起を持たない細胞は「円形」に分類した。結果を図６および表４に示す。ネスチン単陽性細胞の主流は「長形」であった。対照的にＵＣＨ−Ｌ１／ネスチン複陽性細胞の主流は６時間目では「短形」であった。この割合は「長形」細胞や「円形」細胞よりも有意に高いものであった。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
突起を有するＮＰＣを「単極」、「双極」、「多極」に細分類した。結果を図６、表５に示す。ＵＣＨ−Ｌ１／ネスチン複陽性細胞において、「単極」集団は「双極」集団よりも有意に高いものであった。「多極」集団は６時間目では観察されなかった。しかし、ネスチン単陽性細胞においては多くのＮＰＣは「単極」よりも「双極」であった。１２時間目の結果は６時間目と類似していた。こうして多くのＵＣＨ−Ｌ１／ネスチン複陽性細胞はより短い突起を有し、しかも単極であった。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
ネスチン陽性神経突起に関するＵＣＨ−Ｌ１の影響：一過性の形質導入法を用いて増殖ＮＰＣの形態に関するＵＣＨ−Ｌ１の影響を調べた。ＮＰＣを形質導入後４８時間増殖させ、次いで１２時間分化誘導した。細胞を固定し、ネスチン陽性突起の長さを調べた。ＵＣＨ−Ｌ１発現と突起形成の関係を定量化するためにネスチン陽性突起の全長を測定した。未形質導入のＮＰＣは主に「長形」「双極」の突起を有する（図４Ａ）。緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）発現ベクタを形質導入した細胞（陰性コントロール）は未形質導入細胞と類似の形態を有した（図７Ａ）。対照的に天然型ＵＣＨ−Ｌ１ｃＤＮＡを形質導入した細胞はモック形質導入細胞よりも有意に短い突起を有していた。
【００６３】
次に形態誘導についてＵＣＨ−Ｌ１の構造と活性の関係を調べた。２種のＵＣＨ−Ｌ１変異体（Ｄ３０Ａ、Ｃ９０Ｓ）を調製した。活性は水解酵素活性とＵｂ結合親和性を指標とした。水解酵素活性は基質としてＵｂ−ＡＭＣを用いて脱ユビキチン化活性を比較した。Ｄ３０Ａ変異体はわずかながら水解酵素活性を有していたが、Ｃ９０Ｓ変異体の同活性は検出されなかった（図７Ｂ）。
【００６４】
免疫沈降法により天然型ＵＣＨ−Ｌ１とＣ９０Ｓ変異体はモノＵｂと相互作用を生じたが、Ｄ３０Ａ変異体はコントロールとして用いたＧＦＰと同様にＵｂと相互作用を生じなかった（図７Ｃ）。
【００６５】
Ｄ３０Ａ変異体で形質導入した細胞はＧＦＰ発現ベクタを形質導入した細胞に比べてより長いネスチン陽性突起を有する傾向にあった。対照的にＣ９０Ｓ変異体で形質導入した細胞は有意に短い線維を有していた（表６）。これらを合せると、これらのデータはＮＰＣの形態に関するＵＣＨ−Ｌ１の影響がモノＵｂとＵＣＨ−Ｌ１の相互作用に依存していることを示唆するものであった。
【００６６】
【表６】
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【００６７】
上記実施例の結果より、ＵＣＨ−Ｌ１作用を有するか、または当該作用を増強する物質を選択することにより、神経細胞分化誘導剤または神経新生作用剤のスクリーニングが可能であることがわかる。
【００６８】
実施例における引用文献の詳細は以下のとおりである。
文献１：Science, (1999), vol.284, p479-482
文献２：Biochem. Biophys. Res. Commun., (2003), vol.301, p1011-1015
文献３：J. Neurosci., (2002), vol.22, p10751-10760
文献４：Biochem. Biophys. Res. Commun., (2003), vol.304, p176-183
文献５：Science, (2002), vol.296, p1132-1136
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】抗体特異性とＥ１３の脳室帯（ＶＺ）におけるＵＣＨ−Ｌ１の発現に関する。ＵＣＨ−Ｌ１の発現は抗ｐｇｐ９．５抗体を用いて免疫組織化学的に検出された。ＵＣＨ−Ｌ１はＥ１３のｇａｄマウス（ｇａｄ／ｇａｄ）脳では検出されなかったが、混血群（＋／ｇａｄ）において強く発現した。ｇａｄマウス、混血マウスの冠状縫合切片の共焦点式顕微鏡画像は、（Ａ）では前駆体マーカであるネスチンとＵＣＨ−Ｌ１（ｐｇｐ９．５）に対する抗体を用いて、（Ｂ）では早期のニューロンのマーカであるβチューブリンＩＩＩ（ＴｕＪ１）とＵＣＨ−Ｌ１（ｐｇｐ９．５）に対する抗体を用いて二重染色した。（Ａ）では放射状長線維を△で、各相の前駆細胞を→で示す。（Ｂ）ではＴｕＪ１陽性の遊走性ニューロン細胞を△で示す。ＭＺは辺縁帯を、ＶＺは脳室帯を示す。スケールバーは４０μｍである。
【図２】成長途中のマウス脳でのＵＣＨ−Ｌ１発現パターンの変化に関する。Ｅ１４、Ｅ１６の脳の凍結切片ＵＣＨ−Ｌ１とネスチン（Ａ）またはＴｕＪ１（Ｂ）で二重染色した。ＵＣＨ−Ｌ１とは異なり、ＴｕＪ１、ネスチンの発現パターンはＥ１４とＥ１６の間で変化しなかった。ＵＣＨ−Ｌ１の発現はＭＺよりＶＺより高いものであった。Ｅ１６でＵＣＨ−Ｌ１のより高い発現が皮質板（ＣＰ）において相反して検出された。対照的にＥ１４、Ｅ１６の双方において、ネスチンはＶＺで高く発現した。ＴｕＪ１の発現はＭＺ／ＣＰでより高いものであった。一視野（１７００μｍ２）当たりの蛍光強度をＥ１４、Ｅ１６の各層で測定し右側の図で示した。ＣＰは皮質板を、ＩＺは中間帯を、ＳＶＺは脳下室帯を示す。ＭＺ、ＶＺは前記と同意義。スケールバーは８０μｍである。
【図３】高倍率で取得したＥ１４、Ｅ１６の脳での最高強度のＵＣＨ−Ｌ１発現に関する。図２の画像の一部が高倍率で取得され示されている。（Ａ）はＵＣＨ−Ｌ１とネスチンを、（Ｂ）はＵＣＨ−Ｌ１とＴｕＪ１を各々示す。ＵＣＨ−Ｌ１とネスチンはＥ１４、Ｅ１６のＶＺにおいて共発現していた。ネスチンはニューロンではなく放射状グリア線維でのみ発現した（△）。ＵＣＨ−Ｌ１の発現量は高いものであった。ＵＣＨ−Ｌ１の高い発現量を有する代表的な細胞を→（上部）で、低い発現量のものを→（下部）で示した（Ａ）。ＴｕＪ１は遊走性ニューロン（△）、成熟ニューロンともに発現した（Ｂ）。ＣＰ、ＶＺは前記と同意義。スケールバーは４０μｍである。
【図４】未分化および分化ＮＰＣにおける２、６、２４、４８時間目のネスチン、ＵＣＨ−Ｌ１の発現に関する。ＮＰＣは増殖相（ｂＦＧＦあり、４８時間目）または分化相（ｂＦＧＦなし、Ａ）におけるネスチンとＵＣＨ−Ｌ１に対する抗体で免疫標識した。増殖相でほとんど全てのネスチン陽性細胞がＵＣＨ−Ｌ１をともに発現した。細胞の定量化を促進するため、培養物をヘキスト核色素でカウンタ標識した。  Ｂは各抗体で染色した細胞の割合を定量分析したものに関する。ネスチン陽性細胞は分化相において漸減した。ＵＣＨ−Ｌ１単陽性細胞を△で、ネスチン単陽性細胞を→で示す。各実験は指定時刻に３つの別個のウェルで細胞を計数することで分析した。実験は少なくとも２回繰り返した。スケールバーは５０μｍである。
【図５】神経新生におけるＵＣＨ−Ｌ１発現に関する。ＮＰＣをＴｕＪ１とＵＣＨ−Ｌ１に対する抗体で免疫標識した。細胞の定量化を促進するために培養物をヘキスト核色素でカウンタ標識した。各抗体で染色した細胞の割合を定量分析した。増殖相（ｂＦＧＦあり）、分化相（ｂＦＧＦなし）において、ほとんどのＴｕＪ１陽性細胞はＵＣＨ−Ｌ１を共発現した（Ａ）。ＴｕＪ１陽性細胞数は分化相（ｂＦＧＦなし、Ｂ）において漸増した。各実験は指定時刻に３つの別個のウェルで細胞を計数することで分析した。実験は少なくとも２回繰り返した。スケールバーは５０μｍである。
【図６】分化誘導６、１２時間後の培養ＮＰＣにおいて形態学的に同定した亜集団に関する。分化ＮＰＣはＵＣＨ−Ｌ１とネスチンで二重染色した。（Ａ）で描写した定量化については、ＵＣＨ−Ｌ１とネスチンで染色した分化ＮＰＣを「長形」「短形」「円形」に分類した。（Ｂ）で描写した別の定量化については、分化ＮＰＣを３種の細胞形態、すなわち、単極、双極、多極をベースとして分類した。
【図７】短形突起の誘導はＵＣＨ−Ｌ１とモノＵｂの相互作用に依存した。ＦＬＡＧ標識天然型ＵＣＨ−Ｌ１、Ｃ９０ＳまたはＤ３０Ａ変異体、ＧＦＰ（いずれもｐＣＩ−ｎｅｏベクタ中に担持したもの）をＮＰＣに形質導入した。形質導入されたＵＣＨ−Ｌ１を検出するためにＦＬＡＧ標識に対する抗体を用いた。緑色染色は形質導入細胞を、赤色染色は内在性ネスチンを示す。各構築物の一過性の形質導入が増殖条件下で実施された。形質導入の２４時間後にｂＦＧＦを除去した。なお培養物を免疫染色する１２時間前に再度ｂＦＧＦを添加した。免疫染色細胞中のネスチン陽性突起の長さを測定した（Ａ）。アスタリスクはＧＦＰ形質導入ＮＰＣの値との有意差を示す。＊は危険率５％未満を、＊＊＊は危険率０．１％未満を示す。スケールバーは８０μｍである。  各種組換え６ＨＮ標識ＵＣＨ−Ｌ１類を、クーマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により測定した（Ｂ左図）。  各種組換え体のＵＣＨ−Ｌ１水解酵素活性をＵｂ−ＡＭＣ水解実験により測定した。酵素濃度を４．３ｎＭ、基質濃度を７００ｎＭとした。初期速度データを用いてＵＣＨ−Ｌ１の水解活性の相対値を決定した（Ｂ右図）。  各種組換え体をＵｂと共免疫沈降させた。ＨＡ標識天然型ＵＣＨ−Ｌ１および変異体を安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株からの細胞可溶性の抽出物を、Ｕｂを用いて免疫沈降させ、抗ＨＡ抗体または抗Ｕｂ抗体でイムノブロットした（Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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