(57)【要約】【課題】血液凝固亢進状態が持続している疾患の予防又は治療剤。【解決手段】ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を有効成分とする、血液凝固亢進状態が持続している疾患、感染症に起因する血液凝固亢進状態、静脈血栓症、動脈血栓症、及び血管中膜肥厚に起因する疾患の、予防又は治療剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、血液凝固亢進状態が持続している疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
前記抗体が組換え型抗体である、請求項１又は３に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
前記抗体が改変抗体である、請求項１又は４に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項１，４又は５に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項６に記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
前記抗体が抗体修飾物である、請求項１又は４〜７のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【請求項９】
前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項８に記載の予防又は治療剤。
【請求項１０】
ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、感染症に起因する血液凝固亢進状態の予防又は治療剤。
【請求項１１】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１０に記載の予防又は治療剤。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の予防又は治療剤。
【請求項１３】
前記抗体が組換え型抗体である、請求項１０又は１２に記載の予防又は治療剤。
【請求項１４】
前記抗体が改変抗体である、請求項１０又は１３に記載の予防又は治療剤。
【請求項１５】
前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項１０，１３又は１４に記載の予防又は治療剤。
【請求項１６】
前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項１５に記載の予防又は治療剤。
【請求項１７】
前記抗体が抗体修飾物である、請求項１０又は１３〜１６のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【請求項１８】
前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１７に記載の予防又は治療剤。
【請求項１９】
ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、静脈血栓症の予防又は治療剤。
【請求項２０】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１９に記載の予防又は治療剤。
【請求項２１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の予防又は治療剤。
【請求項２２】
前記抗体が組換え型抗体である、請求項１９又は２１に記載の予防又は治療剤。
【請求項２３】
前記抗体が改変抗体である、請求項１９又は２２に記載の予防又は治療剤。
【請求項２４】
前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項１９，２２又は２３に記載の予防又は治療剤。
【請求項２５】
前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項２４に記載の予防又は治療剤。
【請求項２６】
前記抗体が抗体修飾物である、請求項１９又は２２〜２５のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【請求項２７】
前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項２６に記載の予防又は治療剤。
【請求項２８】
ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、動脈血栓の予防又は治療剤。
【請求項２９】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項２８に記載の予防又は治療剤。
【請求項３０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８に記載の予防又は治療剤。
【請求項３１】
前記抗体が組換え型抗体である、請求項２８又は３０に記載の予防又は治療剤。
【請求項３２】
前記抗体が改変抗体である、請求項２８又は３１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３３】
前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項２８，３１又は３２に記載の予防又は治療剤。
【請求項３４】
前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項３３に記載の予防又は治療剤。
【請求項３５】
前記抗体が抗体修飾物である、請求項２８又は３１〜３４のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【請求項３６】
前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項３５に記載の予防又は治療剤。
【請求項３７】
ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、血管中膜肥厚に起因する疾患の予防又は治療剤。
【請求項３８】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項３７に記載の予防又は治療剤。
【請求項３９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７に記載の予防又は治療剤。
【請求項４０】
前記抗体が組換え型抗体である、請求項３７又は３９に記載の予防又は治療剤。
【請求項４１】
前記抗体が改変抗体である、請求項３７又は４０に記載の予防又は治療剤。
【請求項４２】
前記改変抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、請求項３７，４０又は４１に記載の予防又は治療剤。
【請求項４３】
前記ヒト型化抗体が、バージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である、請求項４２に記載の予防又は治療剤。
【請求項４４】
前記抗体が抗体修飾物である、請求項３５又は４０〜４３のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【請求項４５】
前記抗体修飾物が、抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項４４に記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続的血液凝固亢進動物モデル及びその作製方法、血液凝固亢進状態が継続している疾患の予防又は治療剤、感染症に起因する血液凝固亢進状態の予防又は治療剤、静脈又は動脈の血栓症の予防又は治療剤、及び血管中膜肥厚に起因する、疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固反応はセリンプロテアーゼ前駆体が次々に活性型プロテアーゼにより活性化されて、最終的にトロンビンが生成することでフィブリンが形成される反応である。血栓症は、各種の病的状態の進展に伴い血漿中の凝固・線溶系の変化、血小板や白血球、血管内皮細胞の機能が変化することで血液凝固反応が開始され過剰に亢進した結果として生じる。血液凝固反応の開始因子が組織因子である。急性心筋梗塞や不安定狭心症などの急性冠動脈症候群では、動脈硬化が進展した結果生じたプラーク内に多く存在する組織因子がプラークの破綻にともなって血液に露出することで血液凝固反応が開始される。
【０００３】
また、敗血症や悪性腫瘍に随伴して生じる播種性血管内凝固症候群では、活性化された単球やマクロファージなどが組織因子を発現したり腫瘍細胞が組織因子を発現することで血液凝固反応を亢進させている。一旦、組織因子が血液に接触すると血液凝固反応は短時間の内に進み血栓を生成する。従って、血栓形成を予防するためには何時開始されるか分からない、あるいは常に生じている血液凝固反応を阻止する必要がある。従って、有効な抗血栓薬の開発には、持続的に凝固亢進状態を示す実験モデルが不可欠である。しかしながら、一般に知られている血栓モデルはいずれも短時間で血栓形成を誘発するモデルである。
【０００４】
そこで、本発明は１つの観点において、ヒト組織因子を持続的に血液に接触させることで凝固亢進状態が持続する実験モデルを提供しようとするものである。
【０００５】
血液凝固反応はセリンプロテアーゼ前駆体が次々に活性型プロテアーゼにより活性化されて、最終的にトロンビンが生成することでフィブリンが形成される反応である。血栓症は、各種の病的状態の進展に伴い血漿中の凝固・線溶系の変化、血小板や白血球、血管内皮細胞の機能が変化することで血液凝固反応が開始され過剰に亢進した結果として生じる。血液凝固反応の開始因子が組織因子（ＴＦ）である。
【０００６】
急性心筋梗塞や不安定狭心症などの急性冠動脈症候群では、動脈硬化が進展した結果生じたプラーク内に多く存在するＴＦがプラークの破綻にともなって血液に露出することで血液凝固反応が開始される。また、敗血症や悪性腫瘍に随伴して生じる播種性血管内凝固症候群では、活性化された単球やマクロファージなどがＴＦを発現したり腫瘍細胞がＴＦを発現することで血液凝固反応を亢進させており、これが持続する。一旦、ＴＦが血液に接触すると血液凝固反応は短時間の内に進み血栓を生成する。従って、血栓形成を予防するためには何時開始されるか分からない、あるいは常に生じている血液凝固反応を阻止する必要がある。従って、有効な抗血栓薬としては、血液凝固亢進状態の持続を阻止する医薬が必要である。
【０００７】
従って本発明は、第２の観点において、血液凝固状態が持続している疾患の新規な予防又は治療剤を提供しようとするものである。
【０００８】
重症感染症にはしばしば凝固異常症が伴い、多臓器不全や播種性血管内凝固症候群のような症状を引き起こし、患者の予後を悪化させる要因としてその対策が重要とされている。重症感染症、なかでも敗血症のような全身感染症においては、臓器障害の発生機序として、血管内皮細胞の障害が考えられている。敗血症、とくにグラム陰性菌敗血症ではその菌体成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）が重要な役割を演じている。
【０００９】
血液中に遊離したＬＰＳは、単球を活性化して組織因子（ＴＦ）を産生させることで凝固亢進状態を引き起こすとともに、ＴＮＦやＩＬ−１β，ＩＬ−８などのサイトカインを産生・放出させることで好中球や血管内皮細胞を活性化する。活性化された好中球は血管内皮細胞に接着して活性酵素やエラスターゼなどの細胞傷害物質を放出して血管内皮細胞を傷害する。サイトカインで活性化され、また好中球により傷害された血管内皮細胞ではＴＦの産生が高まり凝固亢進状態はさらに進行する。その結果、全身で微小血栓が多発し、臓器の循環不全が誘発されることで多臓器不全へと進展する。
【００１０】
このため、感染症に起因する血液凝固状態の予防又は治療剤の開発が望まれている。
従って本発明は、第３の観点において、感染症に起因する血液凝固状態の新規な予防又は治療剤を提供しようとするものである。
【００１１】
静脈血栓が発症する機序として、静脈血流の遅滞、静脈壁の損傷および血液凝固能の亢進が重要と考えられている。特に、手術や分娩、外傷などの侵襲は血管壁への物理的損傷や凝固・線溶系の異常を招き、術後の臥床は静脈血流の遅滞をもたらす。その結果生じた静脈血栓は四肢の循環不全を来すのみならず、血栓そのものが血流に乗って肺動脈に流入することで致死的な肺塞栓症を来すため、静脈血栓症そのものの予防が重要とされている。そこで、静脈血栓を有効に予防又は治療できる医薬の開発が望まれている。
従って本発明は、第４の観点において、静脈血栓症の新規な予防又は治療剤を提供しようとするものである。
【００１２】
動脈血栓症は硬化が進展した血管に血栓が生じる疾患であり、脳や心臓などの重要な臓器で発症するとしばしば致命的となる。特に、不安定狭心症や急性心筋梗塞などの冠動脈症候群は、突然死に移行しやすい危険な病態と考えられている。最近はその発症機序として動脈硬化プラークの破綻とそれに伴う血栓形成が重要な要因であることが明らかとなってきた。
【００１３】
さらに、血栓形成の開始因子である組織因子（ＴＦ）がプラーク内の細胞表面や細胞外間質に過剰に発現されていることが明らかとなり、プラークの破綻に伴う組織因子（ＴＦ）の血液への露出が血栓形成の主要な要因であると考えられている。
このため、動脈血栓症の予防又は治療のための新規な医薬の開発が望まれている。
従って本発明は、第５の観点において、動脈血栓症の新規な予防又は治療剤を提供しようとするものである。
【００１４】
経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）は虚血性心疾患の治療法として重要な位置を占めているが、処置後数ヶ月以降に発生する再狭窄がこの治療法の有用性を阻害し、問題となっている。再狭窄の成因として内皮細胞の傷害に起因した急性期、亜急性期の血栓形成の重要性が明らかとなってきている。傷害を受けた内皮細胞や内皮下組織の平滑筋細胞、線維芽細胞などが発現する組織因子（ＴＦ）の血液との接触が血栓形成には重要である。生じた血栓を覆うように新たに血管壁の細胞が増生し、血管内腔面積を狭小化する。また、血管組織自体の増生と血管径の収縮も血管内腔面積の狭小化には重要であり、これらが再狭窄の直接の要因となる。そこで、再狭窄を有効に予防又は治療することができる医薬が求められている。
【００１５】
従って本発明は、第６の観点において、血管中膜肥厚に起因する疾患の新規な予防又は治療剤を提供しようとするものである。
【発明の開示】
【００１６】
本発明者らは、前記第１の課題を解決すべく種々検討を行った結果、ヒト組織因子（ＴＦ）遺伝子を導入することによりヒト組織因子を恒常的に発現することができる動物細胞を実験動物に移植して動物中のヒト組織因子濃度を上昇せしめることにより、該動物における血液凝固亢進状態を長期間維持することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１７】
従って本発明は第１の観点において、ヒト組織因子（ＴＦ）又はその一部分をコードする遺伝子が挿入されていて該遺伝子を発現することができる動物細胞が移植されている実験動物であって、血液凝固亢進状態が長期間持続する非ヒト動物を提供する。
【００１８】
前記ヒト組織因子の一部分は、例えば細胞内領域を欠くヒト組織因子である。前記動物細胞は好ましくは哺乳動物細胞である。前記哺乳動物細胞は好ましくはヒト骨髄腫細胞である。前記動物は、好ましくはマウスである。前記血液凝固亢進状態は、ヒト組織因子血中濃度の上昇、血小板の減少、フィブリノーゲンの減少、可溶性フィブリンモノマー複合体濃度の上昇及びトロンビン−アンチトロンビンIII 複合体濃度の上昇の少なくとも１つの現象により表わされる。
【００１９】
本発明はまた、上記の動物の作製方法において、ヒト組織因子（ＴＦ）又はその一部分をコードする遺伝子が挿入されており該遺伝子を発現することができる動物細胞を非ヒト実験動物に移植し、そして血液凝固亢進状態が持続する動物を選択することを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、上記の動物を用いることを特徴とする抗血栓薬のスクリーニング方法を提供する。
前記第２の課題を解決すべく種々検討した結果、本発明者らは、ヒト組織因子に対する抗体（抗ヒトＴＦ抗体、又は抗ＴＦ抗体と称する場合がある）により、血液凝固亢進状態の持続を阻止することができることを見出した。
【００２１】
従って、本発明は、第２の観点において、ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、血液凝固亢進状態が持続している疾患の予防又は治療剤を提供する。
前記抗体は、例えばポリクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくは組換え型抗体である。前記抗体は、好ましくは改変抗体である。前記改変抗体は、好ましくはキメラ抗体又はヒト型化抗体である。前記ヒト型化抗体は、好ましくはバージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である。前記抗体は、例えば抗体修飾物である。前記抗体修飾物は、例えば抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である。
【００２２】
前記第３の課題を解決すべく種々検討した結果、本発明者らは、ヒト組織因子に対する抗体（抗ヒトＴＦ抗体、又は抗ＴＦ抗体と称する場合がある）により、感染症に起因する血液凝固亢進状態を予防又は治療することができることを見出した。
従って、本発明は、第３の観点において、ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、感染症に起因する血液凝固亢進状態の予防又は治療剤を提供する。
【００２３】
前記抗体は、例えばポリクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくは組換え型抗体である。前記抗体は、好ましくは改変抗体である。前記改変抗体は、好ましくはキメラ抗体又はヒト型化抗体である。前記ヒト型化抗体は、好ましくはバージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である。前記抗体は、例えば抗体修飾物である。前記抗体修飾物は、例えば抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である。
【００２４】
前記第４の課題を解決すべく種々検討した結果、本発明者らは、ヒト組織因子に対する抗体（抗ヒトＴＦ抗体、又は抗ＴＦ抗体と称する場合がある）により、静脈血栓症を予防又は治療することができることを見出した。
従って、本発明は、第４の観点において、ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、静脈血栓症の予防又は治療剤を提供する。
【００２５】
前記抗体は、例えばポリクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくは組換え型抗体である。前記抗体は、好ましくは改変抗体である。前記改変抗体は、好ましくはキメラ抗体又はヒト型化抗体である。前記ヒト型化抗体は、好ましくはバージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である。前記抗体は、例えば抗体修飾物である。前記抗体修飾物は、例えば抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である。
【００２６】
前記第５の課題を解決すべく種々検討した結果、本発明者らは、ヒト組織因子に対する抗体（抗ヒトＴＦ抗体、又は抗ＴＦ抗体と称する場合がある）により、動脈血栓症を予防又は治療することができることを見出した。
従って、本発明は、第５の観点において、ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、動脈血栓症の予防又は治療剤を提供する。
【００２７】
前記抗体は、例えばポリクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくは組換え型抗体である。前記抗体は、好ましくは改変抗体である。前記改変抗体は、好ましくはキメラ抗体又はヒト型化抗体である。前記ヒト型化抗体は、好ましくはバージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である。前記抗体は、例えば抗体修飾物である。前記抗体修飾物は、例えば抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である。
【００２８】
前記第６の課題を解決すべく種々検討した結果、本発明者らは、ヒト組織因子に対する抗体（抗ヒトＴＦ抗体、又は抗ＴＦ抗体と称する場合がある）により、血管中膜肥厚に起因する疾患を予防又は治療することができることを見出した。
従って、本発明は、第６の観点において、ヒト組織因子（ヒトＴＦ）に対する抗体を含んで成る、血管中膜肥厚に起因する疾患の予防又は治療剤を提供する。
【００２９】
前記抗体は、例えばポリクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。前記抗体は、好ましくは組換え型抗体である。前記抗体は、好ましくは改変抗体である。前記改変抗体は、好ましくはキメラ抗体又はヒト型化抗体である。前記ヒト型化抗体は、好ましくはバージョンｂ−ｂ，ｉ−ｂ、又はｉ−ｂ２のヒト型化抗体である。前記抗体は、例えば抗体修飾物である。前記抗体修飾物は、例えば抗体断片Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 もしくはＦｖ、又はシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
第１の観点の本発明において使用するためのヒト組織因子（ＴＦ）をコードする遺伝子はすでにクローニングされており、その塩基配列及びそれによりコードされるアミノ酸配列も知られている（H. Morrisseyら、Cell, Vol. 50, p.129-135 (1987) 。全長ヒト組織因子をコードする塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号：１０３及び１０４に示す。本発明においては、例えば細胞内領域が除去されたＴＦをコードする遺伝子でもよく、また血液凝固系を開始する活性を維持している部分をコードする遺伝子でもよい。
【００３１】
この遺伝子を動物細胞に導入し発現せしめるためのベクターとしては、動物細胞において機能する任意の発現ベクターを使用することができ、例えばｐＣＯＳ１，ｐＳＶ２−ｎｅｏ，ｐＭＡＭ−ｎｅｏ，ｐＳＧ５などを用いることができる。本発明では哺乳類細胞で常用される有用なプロモーター、ヒトＴＦ遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えば、プロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer ）や、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。発現ベクターには複製起源として、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス等の由来のものを用いることができ、さらに選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３’）IIまたはI （neo ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を含むことができる。
【００３２】
また、細胞への遺伝子導入方法は、エレクトロポーレーション法の他、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。この発現ベクターを導入するための細胞としては、実験動物に移植可能なものであれば特に限定されない。このためには種々の培養細胞を使用することができ、例えば哺乳類細胞、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、モンキー等由来の培養細胞、特に腫瘍細胞が好ましい。細胞の具体例としては、ＫＰＭＭ２，ＡＲＨ−７７などのヒト骨髄腫細胞株、Ｐ８１５，Ｐ３８８，Ｌ１２１０などのマウス白血病細胞株等が使用できる。
【００３３】
本発明において使用する実験動物は、ヒト以外の哺乳類であり、好ましくは実験用小動物、例えばマウス、ラット、ハムスター等であり、マウスが特に好ましい。
【００３４】
第２の観点の本発明において、血液凝固亢進状態とは、ヒトＴＦにより惹起される身体状態であって、例えば、血小板数やフィブリノーゲン濃度の低下、可溶性フィブリンモノマー複合体（ｓＦＭＣ）やトロンビン−アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）濃度の上昇などの状態として現われる。
【００３５】
本発明において使用する抗体としては、ヒトＴＦに基く血液凝固亢進状態の持続を阻止することができる抗体であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。また、モノクローナル抗体に基くキメラ抗体、ヒト型化抗体、シングルチェインＦｖなどを使用することもできる。ヒト型化抗体が特に好ましい。
【００３６】
第３の観点の本発明において使用する抗体としては、ヒトＴＦに基く血液凝固亢進状態の持続を阻止することができる抗体であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。また、モノクローナル抗体に基くキメラ抗体、ヒト型化抗体、シングルチェインＦｖなどを使用することもできる。ヒト型化抗体が特に好ましい。
【００３７】
第４の観点の本発明において使用する抗体としては、ヒトＴＦに基く血液凝固亢進状態の持続を阻止することができる抗体であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。また、モノクローナル抗体に基くキメラ抗体、ヒト型化抗体、シングルチェインＦｖなどを使用することもできる。ヒト型化抗体が特に好ましい。
【００３８】
第５の観点の本発明において使用する抗体としては、ヒトＴＦに基く血液凝固亢進状態の持続を阻止することができる抗体であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。また、モノクローナル抗体に基くキメラ抗体、ヒト型化抗体、シングルチェインＦｖなどを使用することもできる。ヒト型化抗体が特に好ましい。
【００３９】
第６の観点の本発明において使用する抗体としては、ヒトＴＦに基く血液凝固亢進状態の持続を阻止することができる抗体であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。また、モノクローナル抗体に基くキメラ抗体、ヒト型化抗体、シングルチェインＦｖなどを使用することもできる。ヒト型化抗体が特に好ましい。
【００４０】
１．抗ヒトＴＦ抗体
本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体は、ヒトＴＦに基く血液凝固亢進状態の持続を阻止する効果を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。
本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００４１】
本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。この抗体はヒトＴＦと結合することにより、ヒトＴＦが血液凝固亢進の状態を惹起するのを阻害する抗体である。
【００４２】
２．抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ヒトＴＦ又はその一部分（断片）を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
【００４３】
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＴＦを、J.H.Morrissey ら、Cell, Vol.50, p.129-135 (1987)に開示されたヒトＴＦ遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ヒトＴＦをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＴＦタンパク質を公知の方法で精製する。この方法を、本明細書の参考例１に記載する。さらに、抗原として使用するヒトＴＦは参考例２に記載する方法によりヒト胎盤などのＴＦ含有生物材料から抽出、精製して使用することもできる。
【００４４】
次に、この精製ヒトＴＦタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ヒトＴＦのＣ−末端側の膜貫通領域を除去した可溶性ＴＦを例えば遺伝子組換えにより作製することもでき、これを感作抗原として使用することもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
【００４５】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントやフロイント不完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００４６】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００４７】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63Ag8.653)(Kearney, J.F. et al., J.Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Yelton, D.E. et al., Current Topi s in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler.G. and Milstein, C.Eur.J.Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies.D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St.Groth, S.F. and Scheidegger, D.J., J.Immunol.Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S.J.Exp.Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 等が好適に使用される。
【００４８】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler.G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００４９】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００５０】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００５１】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００５２】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００５３】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＴＦに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ヒトＴＦへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てまたは一部のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるヒトＴＦを投与して抗ヒトＴＦ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からヒトＴＦに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。
【００５４】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００５５】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００５６】
モノクローナル抗体の製造の例を参考例２に具体的に記載する。この例においては、ＡＴＲ−２，３，４，５，７及び８と称する６種類のモノクローナル抗体を得ており、いずれも本発明において使用することができるが、ＡＴＲ−５が特に好ましい。
【００５７】
３．組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Vandamme, A.M. et al., Eur.J.Biochem. (1990) 192, 767-775,参照）。
【００５８】
具体的には、抗ヒトＴＦ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ヒトＴＦ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal.Biochem. (1987) 162, 156-159)等により行って全ＲＮＡを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
【００５９】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit （生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５′-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）およびＰＣＲを用いた５′−ＲＡＣＥ法（Frohman, M.A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)等を使用することができる。
【００６０】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
【００６１】
目的とする抗ヒトＴＦ抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ヒトＴＦ抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００６２】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
【００６３】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。
組換え抗体の製造方法の一例を参考例３に具体的に記載する。
【００６４】
４．改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００６５】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００６６】
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
【００６７】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ  ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
【００６８】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。
【００６９】
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１，Ｃγ２，Ｃγ３，Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ，Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
【００７０】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
【００７１】
キメラ抗体の作製方法は参考例４に具体的に記載する。
また、ヒト型化抗体の作製方法を参考例５に具体的に記載する。この参考例においては、ヒト型化重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）として、表１及び表２に示すアミノ酸配列を有するバージョンａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｉ，ｊ，ｂ１，ｄ１，ｂ３及びｄ３を用いた。
【００７２】
【表１】
2006199712.tif 000002
【００７３】
【表２】
2006199712.tif 000003
【００７４】
また、ヒト型化軽鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域として、表３に示すアミノ酸配列を有するバージョンａ，ｂ，ｃ，ｂ１及びｂ２を用いた。
【００７５】
【表３】
2006199712.tif 000004
【００７６】
そして、上記のＨ鎖Ｖ領域の種々のバージョンと、Ｌ鎖Ｖ領域の種々のバージョンを組合わせて抗原結合能、及びＴＦ中和活性について評価した結果、参考例６及び参考例７に記載する通り、「Ｈ鎖Ｖ領域バージョン」−「Ｌ鎖Ｖ領域バージョン」として表示する場合「ｂ−ｂ」、「ｉ−ｂ」、及び「ｉ−ｂ２」が特に高活性を示した。なお、これらのヒト型化抗体の抗原結合能を図１に示し、ヒトＴＦ中和活性（ＴＦによるファクターＸａ産生阻害活性）を図２に示し、ヒトＴＦ中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）を図３に示し、そしてヒトＴＦ中和活性（ＴＦによる血漿凝固阻害活性）を図４に示す。
【００７７】
５．抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、ヒトＴＦに結合し、ヒトＴＦの活性を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ′）2 ，Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００７８】
具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これらの抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J.Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A.H.Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A.Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1986) 121, 663-669, Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。
【００７９】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J.S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００８０】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
【００８１】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
【００８２】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ヒトＴＦ抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００８３】
６．組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３′側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter／enhancer）を挙げることができる。
【００８４】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
【００８５】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature (1979) 277, 108-114) により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はMizushima らの方法（Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
【００８６】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はBetterらの方法（Science (1988) 240, 1041-1043)により発現することができる。
【００８７】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S.P. et al J.Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
【００８８】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００８９】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの真菌細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ，ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ，Ｖｅｒｏ，ＨｅＬａ細胞中で発現される。
【００９０】
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００９１】
７．抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia 製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
【００９２】
８−１．血液凝固亢進状態の持続の阻止作用の測定
本発明の血液凝固亢進状態が持続している疾患の予防又は治療の薬効の試験には、新規な動物モデル系が必要であり、この評価方法の詳細は、本件と同一出願人の「持続的血液凝固亢進動物モデル及びその作製方法」と題する特許出願の明細書に記載されている。その評価方法の具体例を本件明細書に実施例１として記載する。
【００９３】
また、上記のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」を用いた結果を実施例２及び図１１〜１３に示す。この実験においては、実施例１に示す動物モデル系において、ヒトＴＦ遺伝子を含有する腫瘍細胞を移植したマウスの血小板数が該腫瘍細胞を移植しなかったマウスの血小板数に比べて約半分に減少した後（移植後５〜６週間）１mg／kgのヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」を１週間に１回静脈内に反復投与したところ、投与開始後３週間で実験を終了するまで、血小板数は腫瘍を移植しなかったマウスの血小板数レベルに維持された。
【００９４】
また、本発明のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の投与により可溶性フィブリンモノマー複合体（ｓＦＭＣ）及びトロンビン−アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）濃度の上昇が抑制された。この結果、本発明の抗ヒトＴＦ抗体の投与により血液凝固亢進状態の持続が阻止され、正常な状態が維持されることが確認された。
【００９５】
８−２．感染症に起因する血液凝固亢進状態の治療効果の確認
血液凝固亢進状態は、プロトロンビン時間の延長、血漿中フィブリノーゲン濃度の低下、血清中フィブリン分解産物濃度の上昇などにより観察することができる。ＬＰＳの投与によりプロトロンビン時間の延長、血漿中フィブリノーゲン濃度の低下、及び血清中フィブリン分解産物濃度の上昇が生じるが、本発明の抗ヒトＴＦ抗体の投与によりそれらは抑制された。従って、本発明の抗ヒトＴＦ抗体は、感染症に起因する血液凝固亢進状態の予防又は治療に有効であることが確認された。
この効果を、実施例３に具体的に記載する。
【００９６】
８−３．静脈血栓の予防・治療効果の確認
本発明の抗ヒトＴＦ抗体が静脈血栓の予防・治療効果を有することを、実施例４において具体的に記載する。
８−４．動脈血栓症の予防・治療効果の確認
本発明の抗ヒトＴＦ抗体が動脈血栓症の予防・治療効果を有することを、実施例５において具体的に記載する。
８−５．血管中膜肥厚に起因する疾患の予防・治療効果の確認
本発明の抗ヒトＴＦ抗体が血管中膜肥厚に起因する疾患の予防・治療効果を有することを、実施例６において具体的に記載する。
【００９７】
９．投与方法および製剤
本発明の治療剤は、血液凝固亢進状態が持続する疾患、感染症に起因する血液凝固亢進状態、静脈血栓症、動脈血栓症、及び血管中膜の肥厚に起因する疾患の予防、治療又は改善を目的として使用される。
【００９８】
有効投与量は、一回につき体重１kgあたり０．００１mgから１０００mgの範囲で選ばれる。あるいは、０．０１〜１００mg／kg、好ましくは０．１〜１０mg／kgの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗ヒトＴＦ抗体を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
投与方法は特に限定されないが、静脈注射、点滴静脈注射等が好ましい。
本発明の抗ヒトＴＦ抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ（Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, 米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
【００９９】
このような担体および医薬添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【０１００】
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗ヒトＴＦ抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
【実施例】
【０１０１】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１． 実験用マウスの作製
ヒト組織因子をコードする遺伝子（配列番号：１０３）を動物細胞用発現ベクターｐＣＯＳ１に挿入したベクター（ｈＴＦ−ｐＣＯＳ１）を制限酵素ＰｒｕＩで消化し、直鎖にしたものをヒト骨髄腫細胞株ＫＰＭＭ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１７０）にエレクトロポレーションにより導入した。
【０１０２】
なお、ｐＣＯＳ１はＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲ１およびＳｍａｌ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲ１−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨ１  Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造）を連結することにより構築した。これを、１mg／mLのＧ４１８を含有するＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＣＳ  ｈＩＬ−６：４ｎｇ／ｍｌ含有）培地に培養し、増殖してきた細胞について、抗ヒト組織因子抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて、ヒト組織因子を発現する細胞をフローサイトメトリーにより確認した。これにより、ヒト組織因子遺伝子を導入した細胞株ＫＰＭＭ２／ＴＦ２２６を得た。
【０１０３】
前記ヒト組織因子遺伝子を導入する前の親株（ＫＰＭＭ２／ｐａｒｅｎｔ）及び遺伝子を挿入した株ＫＰＭＭ２／ＴＦ２２６を、４ng／mLのヒトＩＬ−６及び２０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０において培養した。こうして増殖させたＫＰＭＭ２／ＴＦ２２６細胞及び親株ＫＰＭＭ２／ｐａｒｅｎｔ細胞を別々のＳＣＩＤマウス（入手先：日本クレア、雄、７週齢、体重平均約２２ｇ）の側腹部の皮下に１×１０7 個移植し、経時的に、腫瘍体種、血液中の血小板数、血漿中のヒト組織因子濃度、フィブリノーゲン濃度、可溶性フィブリンモノマー複合体（ｓＦＭＣ）濃度、及びトロンビン−アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）濃度の変化を調べた。
【０１０４】
この結果、図５に示す通り、いずれのマウスにおいても腫瘍体積は経時的に増加した。しかしながら、図６に示す通り、ヒト組織因子の血漿中濃度は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウスにおいては経時的に上昇したが該遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウスにおいては全く上昇しなかった。また、図７及び図８に示す通り、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウスにおいては、それぞれ血小板及びフィブリノーゲンが経時的に減少し、これらの血液凝固成分が消耗されたことが示された。これに対して、ヒト組織因子遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウスにおいては、これらの血液凝固成分の減少（消耗）は生じなかった。
【０１０５】
また、図９及び図１０に示す通り、それぞれ可溶性フィブリンモノマー複合体（ｓＦＭＣ）及びトロンビン−アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）の血漿中濃度は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウスにおいては経時的に上昇し、血液凝固亢進状態が進行していることが示された。これに対して、ヒト組織因子遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウスにおいては、前記の血液凝固−関連成分濃度の上昇は見られなかった。
【０１０６】
以上の結果、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウスにおいては、血液凝固亢進状態が長期間持続していることが確認され、本発明の動物が、持続的凝固亢進モデル動物として有用であることが確認された。
【０１０７】
実施例２．
実施例１に記載のモデルにおけるヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」の効果を検討した。ＫＰＭＭ２／ＴＦ２２６をＳＣＩＤマウス（日本クレア、雄、７週齢、体重平均約２２ｇ）に移植した５〜６週間後に血小板数が腫瘍非移植群の約半分ぐらいになり、凝固亢進状態の持続が確認されたので、移植後４５日後より１mg／kgのヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」を１週間に１回静脈内投与した。その結果、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」投与の３日後には血小板数は腫瘍非移植群以上にまで回復し、投与開始から実験を終了した３週間目までの間、血小板数は腫瘍非移植群のレベルを維持した（図１１）。
【０１０８】
また、３回目のヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」投与の６日目に血漿中の可溶性フィブリンモノマー複合体（ｓＦＭＣ）濃度およびトロンビン−アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）濃度を測定したところ、抗体投与によりこれらの上昇は抑制されていた（図１２および図１３）。これらの結果から、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」は凝固亢進状態が長期間持続するモデルにおいて、週１回の投与で凝固状態を安定して正常レベルに維持する作用を有していた。
【０１０９】
実施例３．
イソフルラン麻酔下のカニクイザル（中華人民共和国・南寧・広西霊長類実験動物研究センターより輸入、雌雄半々、推定年齢5-7歳、体重2.99-5.81 kg）に生理食塩水にて溶解したLPS を1 mg/kg/hr (2 ml/kg/hr) の用量で6 時間静脈内に持続注入した。ヒト型化抗ヒトTF抗体投与群の個体にはヒト型化抗ヒトTF抗体「バージョンi-b2」を0.3 mg/kg (1 ml/kg) 、対照群の個体には溶媒（20 mM sodium acetate/ 150 mM NaCl, pH 6.0 ）を1 ml/kg 、それぞれLPS持続注入開始の10分前に静脈内投与した。
【０１１０】
LPS持続注入終了時に大腿動脈に装着しておいたカテーテルよりクエン酸採血及び通常採血を行い、プロトロンビン時間、血漿中フィブリノーゲン濃度、血清中フィブリン分解産物濃度を測定した。その結果、表4 のようにLPS 注入によりプロトロンビン時間は延長し、血漿中フィブリノーゲン濃度は減少、血清中フィブリン分解産物濃度は上昇し、血液凝固亢進状態が惹起されたが、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体「バージョンｉ−ｂ２」を投与しておいた群ではこれらの変化は強く抑制された。このことから、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体「バージョンｉ−ｂ２」は感染症に由来する凝固亢進状態を抑制できることが明らかとなった。
【０１１１】
【表４】
2006199712.tif 000005
【０１１２】
実施例４．
静脈血流の鬱滞と静脈壁の傷害で誘発した静脈血栓モデルを用いて、静脈血栓症に対するヒト型化抗ヒトＴＦ抗体の効果を評価した。静脈血流の鬱滞は血管の結紮により作製した。静脈壁の傷害は、「ポリドカノール（食道静脈瘤治療薬、クロイスラー社）」を用いて惹起した。
【０１１３】
推定年齢 3〜4 歳、体重2.97〜3.99kgの雄のカニクイザル（広西霊長類実験動物研究センター、中華人民共和国より入手）を用いた。カニクイザルをイソフルラン及び笑気で麻酔し、左右内頸静脈を露出させた。血管露出部の心臓側を完全に結紮した。血管露出部の頭部側は可逆的に結紮した。両結紮部の間の血管に心臓側からカテーテルを挿入した。血管内の血液を除去し、内部を生理食塩水で洗浄した。血管内にカテーテルより0.5 % ポリドカノールを注入した。カテーテルを除去すると同時に、カテーテル挿入部位の直上流部を可逆的に結紮した。
【０１１４】
5 分後、心臓側の可逆的結紮部位を解除し、ポリドカノールを除いた。頭部側の可逆的結紮部位を解除し、少量の血液を流した後、心臓側の可逆的結紮部位を結紮した。血管内に血液が満たされた後、頭部側の可逆的結紮部位を結紮した。血栓作製部位の長さは1.5cmになるように調整した。30分後、形成された血栓湿重量を測定した。評価には左右内頸静脈内の血栓湿重量の合計を用いた。ヒト型化抗ヒトTF抗体バージョン「ｉ−ｂ２」は0.3 mg/kg 及び1.5 mg/kg の用量で、静脈血栓形成開始の2 時間前に静脈内投与した。
【０１１５】
結果を表５に示した。ヒト型化抗ヒトTF抗体の投与により形成される血栓重量は減少した。従って、ヒト型化抗ヒトTF抗体が静脈血栓形成の予防効果を有することが明らかになった。
【０１１６】
【表５】
2006199712.tif 000006
【０１１７】
実施例５．
血管狭窄と動脈壁傷害で誘発した動脈血栓モデルを用いて、動脈血栓症に対するヒト型化抗ヒトTF抗体の効果を評価した。血管狭窄及び動脈壁傷害は、先端を丸めた20G 針を挟んで血管を強く結紮し、その針を除去することで作製された。動脈硬化による血管狭窄とプラーク破綻に伴う動脈壁傷害を模したモデルである。
【０１１８】
推定年齢３〜５歳、体重3.55〜3.99kgの雄のカニクイザル（広西霊長類実験動物研究センター、中華人民共和国より入手）を用いた。カニクイザルを塩酸ケタミン（筋肉内投与）及びブトファノール（筋肉内投与）で麻酔し、右総頸動脈を露出した。血管にドップラー式血流計プローブを装着し、約5 分間血流量をモニターした。血流がほぼ一定であることを確認した後、プローブの下流にて血管狭窄及び動脈壁傷害を惹起した。
【０１１９】
その後15分間血流量を観察し、血栓形成による血管閉塞時間を測定した。右総頸動脈の結紮を除去した後、ヒト型化抗ヒトTF抗体投与を行う場合は投与を行った。左総頸動脈においても、同様に血栓形成による血管閉塞時間を測定した。ヒト型化抗ヒトTF抗体「ｉ−ｂ２」は0.3 mg/kg 及び1.5 mg/kg の用量で、左総頸動脈血栓形成開始の1 時間前に静脈内投与した。
結果を表６に示した。ヒト型化抗ヒトTF抗体の投与により、血管閉塞時間が減少した。従って、ヒト型化抗ヒトTF抗体が動脈血栓形成の予防効果を有することが明らかとなった。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
実施例６．
カニクイザル（（株）ケアリーより購入、ベトナム産繁殖サル、推定年齢４−５歳）をケタラール５〜１０mg／kg, imおよびペントバルビタール１５〜２０mg／kg, iv麻酔下に、頸部を切開して頸動脈を露出し、外頸動脈よりフォガティカテーテル（３〜５Ｆ）を挿入してバルーンを膨らませて５回血管内膜を擦過した。擦過後、カテーテルを抜き去り傷口を縫合し、１ヶ月後、安楽死させて頸動脈を摘出した。この時バルーン傷害を行わなかった対側の頸動脈についても同様に摘出した。
【０１２２】
ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」は０．３mg／kgの用量を血管傷害の１０分前に１分かけて静脈内投与した。摘出した頸動脈はホルマリン固定した後、組織標本を作製し、ＨＥ染色およびエラスチカワンギーソン染色を行い、画像解析により、中膜面積を測定した。その結果、表７に示す様に、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」は中膜の肥厚を強く抑制した。このことから、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ−ｂ２」は血管組織自体の増生を抑制することで遠隔期に生じる内腔面積の狭小化を防ぎ、有効に再狭窄を予防できることが示唆された。
【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
実施例７．
実施例１に記載のモデルにおけるヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ―ｂ２」と低分子量ヘパリンの効果を検討した。KPMM2/TF226 をＳＣＩＤマウス（日本クレア、雄、７週齢、体重平均約24g）に移植した６〜７週間後に血小板数が腫瘍非移植群の約半分ぐらいになり、凝固亢進状態の持続が確認されたので、移植後４９日目に1mg ／kgのヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ―ｂ２」を静脈内投与または低分子量ヘパリン601.5 IU/kg,1900.3 IU/kg, 6487.3 IU/kgを２４時間持続放出する浸透圧ポンプを皮下に埋め込むことにより持続投与した。その結果、ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体バージョン「ｉ―ｂ２」投与群では、投与の１日後から血小板数の回復が観られ３日後には腫瘍非移植群以上に達し７日後にも効果が残存した。これに対し、低分子量ヘパリンは6487.3 IU/kg投与群で持続投与開始１日後および２日後に血小板数の軽度の回復が観られたが３日後には効果が消失した（図１４）。
【０１２５】
参考例１． 可溶型ヒトＴＦの作製法
可溶型ヒトＴＦ（ｓｈＴＦ）は以下のように作製した。
ヒトＴＦの貫通領域（２２０番目のアミノ酸）以下をＦＬＡＧペプチドＭ２に置換したものをコードする遺伝子を、哺乳動物細胞用の発現ベクター（ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子を含む）に挿入し、ＣＨＯ細胞に導入した。ヒトＴＦのｃＤＮＡ配列はJames H. Morrisseyらの報告（Cell(1987) 50, 129-135）を参考にした。この可溶型ヒトＴＦの遺伝子配列とアミノ酸配列を配列番号１０１及び１０２に示した。Ｇ４１８により薬剤セレクションし、発現細胞を選抜し、さらにメトトレキサートで発現増幅をかけ、ｓｈＴＦ発現細胞を樹立した。
【０１２６】
この細胞を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII（ＧＩＢＣＯ）で培養し、ｓｈＴＦを含む培養上清を得た。同容量の４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で２倍に希釈し、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した Q-Sepharose Fast Flowカラム（１００ｍＬ，Pharmacia Biotech)に添加し、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄後、ＮａＣｌの濃度を０．３Ｍとし、ｓｈＴＦをカラムから溶出した。得られたｓｈＴＦ画分に終濃度２．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加え、遠心操作（１０，０００ｒｐｍ、２０分）により夾雑蛋白質を沈殿させた。上清をButyl TOYOPEARL （３０ｍＬ，ＴＯＳＯＨ）に添加し、２．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した。
【０１２７】
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）中、硫酸アンモニウム濃度を２．５Ｍから０Ｍまで直線的に下げ、ｓｈＴＦを溶出させた。ｓｈＴＦを含むピーク画分をCentri-Prep １０（アミコン）で濃縮した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＧカラム（２１．５×６００ｍｍ，ＴＯＳＯＨ）に濃縮液を添加し、ｓｈＴＦのピーク画分を回収した。これを０．２２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌し、可溶型ヒトＴＦ（ｓｈＴＦ）とした。試料の吸光度２８０ｎｍのモル吸光係数をε＝４０，１３０、分子量を４３，２１０として、試料の濃度を算出した。
【０１２８】
参考例２． 抗ＴＦモノクローナル抗体の作製
１．ヒトＴＦの精製
ヒト胎盤からのＴＦの精製は、Ｉｔｏらの方法（Ito,T.ら J.Biochem. 114, 691-696, 1993）に準じて行った。すなわち、ヒト胎盤を１０ｍＭ塩化ベンザミジン、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル、１ｍＭジイソプロピルフルオロフォスフェートおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ，pH７．５）中でホモジナイズ後、沈殿を冷アセトンで脱脂し、得られた脱脂粉末を２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む上記緩衝液に懸濁してＴＦを可溶化した。
【０１２９】
この上清から Concanavalin A-Sepharose 4Bカラム(Pharmacia）および抗ＴＦ抗体を結合させたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム(Pharmacia）を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、精製ＴＦを得た。これを限外濾過膜(PM-10, Amicon）で濃縮し、精製標品として４℃で保存した。
【０１３０】
精製標品中のＴＦ含量は、市販の抗ＴＦモノクローナル抗体（American Diagnostica）とポリクローナル抗体（American Diagnostica）を組合せたＳａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡで、組換え型ＴＦを標準にして定量した。
また精製標品の純度は、４−２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥしたものを銀染色することで確認した。
【０１３１】
２．免疫とハイブリドーマの作製
精製ヒトＴＦ（約７０μｇ／ml）を等容量のＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と混合し、乳化した後、５週齢のＢａｌｂ／ｃ系雄性マウス（日本チャールスリバー）の腹部皮下に、ＴＦとして１０μｇ／マウスとなるように免疫した。初回免疫の１２，１８及び２５日後にはＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントと混合したＴＦを５μｇ／マウスとなるように皮下に追加免疫し、最終免疫として３２日目にＰＢＳで希釈したＴＦ溶液を５μｇ／マウスで腹腔内投与した。
【０１３２】
最終免疫の３日後に４匹のマウスから脾細胞を調製し、細胞数で約１／５のマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１とポリエチレングリコール法を用いて融合させた。融合細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（以下ＲＰＭＩ−培地とする）(Lifetech oriental）に懸濁し、９６穴プレートに１匹のマウスにつき４００穴播種した。融合後、１，２，３，５日目に培地の半量をＨＡＴ（大日本製薬）およびcondimed H1(Boehringer Mannheim GmbH）を含むＲＰＭＩ−培地（以下ＨＡＴ−培地とする）に交換することで、ハイブリドーマのＨＡＴ選択を行った。
【０１３３】
下記のスクリーニング法で選択したハイブリドーマは２回の限界希釈を行うことでクローン化した。
限界希釈は、９６穴プレート２枚に一穴あたり０．８個の細胞を播種した。検鏡により単一コロニーであることが確認できた穴について、下記に示したＴＦ結合活性とＴＦ中和活性の測定を行いクローンを選択した。得られたクローンはＨＡＴ−培地からＲＰＭＩ−培地に馴化し、馴化による抗体産生能の低下が無いことを確認したうえで、再度限界希釈を行い、完全なクローン化を行った。以上の操作により、ＴＦ／ファクターＶＩＩａ複合体とファクターＸとの結合を強く阻害する抗体６種（ＡＴＲ−２，３，４，５，７及び８）を産生するハイブリドーマが樹立できた。
【０１３４】
３．腹水の作製および抗体の精製
樹立したハイブリドーマの腹水の作製は常法に従って行った。すなわち、in vitroで継代したハイブリドーマ１０6 個を、あらかじめ鉱物油を２回腹腔内に投与しておいたＢａｌｂ／ｃ系雄性マウスの腹腔内に移植した。移植後１〜２週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体の精製は、 Protein Aカラム（日本ガイシ）を装着した ConSepLC100システム(Millipore）を用いて行った。
【０１３５】
４．Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
ＴＦを高発現することで知られているヒト膀胱癌由来細胞株Ｊ８２(Fair D.S.ら、J.Biol.Chem., 262, 11692-11698, 1987）をＡＴＣＣより導入し、ＲＰＭＩ−培地中、３７℃、５％ＣＯ2 、１００％湿度の条件で継代・維持した。
【０１３６】
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ用プレートは、９６穴プレートにＪ８２細胞を１０5 個／穴の濃度で播種し、上記条件で１日培養後、培地を除いてリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液（ＰＦＡ）を加えて氷冷下で１０分静置することで固定化することによって作製した。ＰＦＡを除去し、ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝液（Blocking緩衝液）を加えて、使用時まで４℃で保存した。
【０１３７】
Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡは以下のように行った。すなわち、上記のように作製したプレートからBlocking緩衝液を除去し、抗ＴＦ抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清を加えて室温で１．５時間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、アルカリフォスファターゼを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）(Zymed）を１時間反応させ、洗浄後、１mg／mlのｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム(Sigma）を添加して１時間後に４０５／６５５nmにおける吸光度を測定することで、Ｊ８２細胞に結合した抗ＴＦ抗体量を定量した。
【０１３８】
５．ファクターＸａ活性を指標としたＴＦ中和活性測定系
５０μｌの５ｍＭＣａＣｌ2 および０．１％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ：pH７．６）に１０μｌのヒト胎盤由来トロンボプラスチン溶液（５mg／ml）（Thromborel S)(Boehring）と１０μｌのファクターＶＩＩａ溶液（８２．５ng／ml）（American Diagnostica）を添加し、室温で１時間反応させることでTF／Factor VIIa 複合体を形成させた後、１０μｌの所定濃度に希釈した抗ＴＦ抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清および１０μｌのFactor X溶液（３．２４５μｇ／ml）(Celsus Laboratorise）を添加して４５分間反応させ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１０μｌ添加することで反応を止めた。ここに２ｍＭ  Ｓ−２２２２溶液（第一化学薬品）を５０μｌ添加し、３０分間の４０５nmにおける吸光度変化をもってＴＦの Factor Xa産生活性とした。この方法では、TF／Factor VIIa 複合体とFactor Xとの結合を阻害する抗体の活性が測定できる。
【０１３９】
６．血漿凝固阻害活性測定系
市販の正常ヒト血漿（コージンバイオ）を用い、この１００μｌに適当に希釈した抗ＴＦ抗体溶液５０μｌを混和して３７℃で３分間反応させた後、５０μｌのヒト胎盤由来トロンボプラスチン溶液（１．２５mg／ml）を添加し、血漿が凝固するまでの時間を血漿凝固時間測定装置（CR-A：Amelung)で測定した。
【０１４０】
７．抗体のアイソタイプの決定
ハイブリドーマの培養上清もしくは精製抗体について、マウスモノクロナール抗体アイソタイピングキット（Amersham社製）を用いて抗体のアイソタイプを確認し、結果を表８に示した。
【０１４１】
【表８】
2006199712.tif 000009
【０１４２】
参考例３． ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ
のクローニング
（１）ｍＲＮＡの調製
参考例２で得たハイブリドーマＡＴＲ−５（ＩｇＧ１κ）からｍＲＮＡをQuick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech）を用いて調製した。キット添付の処方に従い、それぞれのハイブリドーマ細胞を抽出緩衝液で完全にホモジナイズし、オリゴ（ｄＴ）−セルローススパンカラムにてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿を行った。ｍＲＮＡ沈殿物を溶出緩衝液に溶解した。
【０１４３】
（２）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子のｃＤＮＡの作製及び増幅
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５′-RACE 法(Frohman, M.A.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al.,Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1989）により行った。５′−ＲＡＣＥ法にはMarathon cDNA Amplification Kit(CLONTECH）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。
【０１４４】
前記のようにして調製したｍＲＮＡ約１μｇを鋳型として、キット添付の cDNA synthesis primerを加え、逆転写酵素と４２℃、６０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。これをＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨで１６℃、１．５時間、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで１６℃、４５分間反応させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。
【０１４５】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで１６℃で一夜反応することにより、２本鎖ｃＤＮＡの両端にｃＤＮＡ  アダプターを連結した。反応混合液は１０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で５０倍に希釈した。これを鋳型としてＰＣＲによりＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を増幅させた。５′−側プライマーにはキット添付のアダプタープライマー１を、３′−側プライマーにはＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号１)(S.T.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88-89, 1991）を使用した。
【０１４６】
ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域に対するＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、３０〜５０ｐｍｏｌｅのアダプタープライマー１並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー、及びｃＤＮＡアダプターを連結したｃＤＮＡの反応混合物１〜５μｌを含有する。
【０１４７】
ＰＣＲはいずれもDNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
【０１４８】
（ｉｉ）Ｌ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＴＦに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５′-RACE 法（Frohman, M.A.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1989）により行った。５′−ＲＡＣＥ法にはMarathon cDNA Amplification Kit(CLONTECH）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約１μｇを鋳型としてｃＤＮＡ合成プライマーを加え、逆転写酵素と４２℃、６０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。
【０１４９】
これをＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨで１６℃、１．５時間、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで１６℃、４５分間反応させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。２本鎖ｃＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで１６℃で一夜反応することにより、２本鎖ｃＤＮＡの両端にｃＤＮＡ  アダプターを連結した。反応混合液は１０ｍＭ Tricine-KOH（ｐＨ８．５）、０．１ｍＭＥＤＴＡ溶液で５０倍に希釈した。これを鋳型としてＰＣＲによりＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を増幅させた。５′−側プライマーにはアダプタープライマー１を、３′−側プライマーにはＭＫＣプライマー（配列番号２)(S.T.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88-89, 1991）を使用した。
【０１５０】
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、３０〜５０ｐｍｏｌｅのアダプタープライマー１並びにＭＫＣプライマー、及びｃＤＮＡ  アダプターを連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。
【０１５１】
ＰＣＲはDNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
【０１５２】
（３）ＰＣＲ生成物の精製及び断片化
前記のＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｍａＩ(New England Biolabs）により３７℃で１時間消化した。ＸｍａＩ消化混合物を２％から３％のNuSieve GTG アガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、Ｈ鎖Ｖ領域として約５００ｂｐ長、Ｌ鎖Ｖ領域として約５００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（以下、ＴＥと称す）１０μｌに溶解した。
【０１５３】
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＸｍａＩ消化ＤＮＡ断片と、ＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９プラスミドベクターとをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。
【０１５４】
次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)（以下、ＬＢＡ寒天培地と称す）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有するＬＢ培地（以下、ＬＢＡ培地と称す）３ｍｌあるいは４ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行った。
【０１５５】
（４）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4(宝酒造）（配列番号３）及びM13 Primer RV(宝酒造）（配列番号４）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
【０１５６】
こうして得られたハイブリドーマＡＴＲ−５に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＡＴＲ−５Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名し、そしてＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＡＴＲ−５Ｌｖ／ｐＵＣ１９と命名した。プラスミドＡＴＲ−５Ｈｖ／ｐＵＣ１９に含まれる各マウス抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号５及び９９に、プラスミドＡＴＲ−５Ｌｖ／ｐＵＣ１９に含まれる各マウス抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号６及び１００に示す。
【０１５７】
参考例４． キメラ抗体の構築
マウスＡＴＲ−５抗体Ｖ領域をヒト抗体Ｃ領域に連結したキメラＡＴＲ−５抗体を作製した。ＡＴＲ−５抗体Ｖ領域をコードする遺伝子をヒト抗体Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結することにより、キメラ抗体発現ベクターを構築した。
【０１５８】
（１）キメラ抗体Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結するために、ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。５′−側プライマーｃｈ５ＨＳ（配列番号７）はＶ領域をコードするＤＮＡの５′−末端にハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Kozak, M.et al., J.Mol.Biol., 196, 947-950, 1987）及び制限酵素ＳａｌＩの認識配列を有するように設計した。３′−側プライマーｃｈ５ＨＡ（配列番号８）はＪ領域をコードするＤＮＡの３′−末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素ＮｈｅＩの認識配列を有するように設計した。
【０１５９】
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５０ｐｍｏｌｅのｃｈ５ＨＳプライマー並びにｃｈ５ＨＡプライマー、及び鋳型ＤＮＡとして１μｌのプラスミドＡＴＲ５Ｈｖ／ｐＵＣ１９を含有する。ＰＣＲはDNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
【０１６０】
ＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物を３％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
【０１６１】
クローニングベクターには制限酵素ＮｈｅＩ、ＳａｌＩ及びＳｐｌＩ、ＢｇｌIIの認識配列を導入した改変ｐＵＣ１９ベクター（以下、ＣＶＩＤＥＣと称す）を用いた。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子断片とＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０１６２】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１６３】
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4(宝酒造）及びM13 Primer RV(宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＳａｌＩ認識配列及びＫｏｚａｋコンセンサス配列、３′−側にＮｈｅＩ認識配列を持つプラスミドをｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。
【０１６４】
（２）キメラ抗体Ｌ鎖Ｖ領域の構築
ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域をコードする発現ベクターに連結するために、ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。５′−側プライマーｃｈ５ＬＳ（配列番号９）はＶ領域をコードするＤＮＡの５′−末端にハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Kozak, M.et al., J.Mol.Biol., 196, 947-950, 1987）及び制限酵素ＢｇｌIIの認識配列を有するように設計した。３′−側プライマーｃｈ５ＬＡ（配列番号１０）はＪ領域をコードするＤＮＡの３′−末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素ＳｐｌＩの認識配列を有するように設計した。
【０１６５】
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５０ｐｍｏｌｅのｃｈ５ＬＳプライマー並びにｃｈ５ＬＡプライマー、及び鋳型ＤＮＡとして１μｌのプラスミドＡＴＲ５Ｌｖ／ｐＵＣ１９を含有する。ＰＣＲはDNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer）を用い、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
【０１６６】
ＰＣＲ反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＢｇｌII（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物を３％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。
【０１６７】
上記のようにして調製したマウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌIIで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０１６８】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１６９】
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4(宝酒造）及びM13 Primer RV(宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＢｇｌII認識配列及びＫｏｚａｋコンセンサス配列、３′−側にＳｐｌＩ認識配列を持つプラスミドをｃｈＡＴＲ５Ｌｖ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。
【０１７０】
（３）キメラ抗体発現ベクターの構築
ＩＤＥＣ社より導入した抗体発現ベクターを用いてキメラ抗体発現ベクターを構築した。ベクターにはＩｇＧ１型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）及びＩｇＧ４型抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐを用いた。発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはＮ５ＫＧ４Ｐのヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域の直前にあるＳａｌＩ−ＮｈｅＩ部位にＡＴＲ−５のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を、ヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域の直前にあるＢｇｌII−ＳｐｌＩ部位にＡＴＲ−５のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによって、キメラＡＴＲ−５抗体発現ベクターを作製した。
【０１７１】
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域の導入
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化した。この消化混合物を１．５％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
【０１７２】
発現ベクターＮ５ＫＧ１（Ｖ）及びＮ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化し、次いで制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）により３７℃で３時間消化した。この消化混合物を１．５％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約９０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ６０μｌに溶解した。
【０１７３】
上記のようにして調製したＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳａｌＩ−ＮｈｅＩ  ＤＮＡ断片とＳａｌＩ及びＮｈｅＩで消化したＮ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはＮ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０１７４】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）、及びｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０１７５】
（ｉｉ）Ｌ鎖Ｖ領域の導入
プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｌｖ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＢｇｌII（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１．５時間消化した。この消化混合物を１．５％  ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、２０μｌのＴＥに溶解した。  プラスミドｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）及びｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＢｇｌII（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で１．５時間消化した。この消化混合物を１．５％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約９４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ２０μｌに溶解した。
【０１７６】
上記のようにして調製したＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌII  ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌIIで消化したｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０１７７】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ  ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含有する２×ＹＴ培地１ｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＡＴＲ−５抗体をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０１７８】
（４）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、キメラ抗体を一過性に発現させた。
【０１７９】
プラスミドｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に形質導入した。ダルベッコＰＢＳ（−）（以下、ＰＢＳと称す）中に１ｘ１０7 細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．７８ｍｌに、プラスミド５０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
【０１８０】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を５％の Ultra Low IgGウシ胎児血清(GIBCO）を含有するＤＭＥＭ培地(GIBCO）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。２４時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地ＨＢＣＨＯ（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。
【０１８１】
（５）抗体の精製
ＣＯＳ−７細胞の培養上清からキメラ抗体を、rProtein A Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech）を用いて以下のように精製した。
１ｍｌのrProtein A Sepharose Fast Flowをカラムに充填し、１０倍量のＴＢＳを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにＣＯＳ−７細胞の培養上清をアプライした後、１０倍量のＴＢＳによってカラムを洗浄した。
【０１８２】
次に、１３．５ｍｌの２．５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出し、直ちに１．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることによって溶出液を中和した。
精製された抗体画分について、セントリプレップ１００（Ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過を２回行うことにより、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（以下、ＴＢＳと称す）に溶媒を置換し、最終的に約１．５ｍｌまで濃縮した。
【０１８３】
（６）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII無血清培地(GIBCO) に馴化したＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）に前記発現プラスミドを導入した。
【０１８４】
プラスミドｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ１（Ｖ）あるいはｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造）で切断して直鎖状ＤＮＡにし、フェノール及びクロロホルムで抽出の後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収した。直鎖状にしたプラスミドをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置(Bio Rad）を用いてエレクトロポレーションによりＤＧ４４細胞に形質導入した。ＰＢＳ中に１ｘ１０7 細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＤＧ４４細胞０．７８ｍｌに、プラスミド１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
【０１８５】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞をヒポキサンチン・チミジン（ＧＩＢＣＯ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地(GIBCO）に懸濁し、２枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、ヒポキサンチン・チミジン(GIBCO）及び５００μｇ／ｍｌ  GENETICIN (G418Sulfate、GIBCO)を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地(GIBCO）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、後述の抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
【０１８６】
参考例５． ヒト型化抗体の構築
（１）ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”の構築
ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Ｌ３９１３０（DDBJ, Gao L.ら、未発表、1995）由来のＦＲを有するヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｈ鎖バージョン“ａ”の作製のために７個のＰＣＲプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ（配列番号１１）、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ（配列番号１２）及びｈＲ５Ｈｖ４Ｓ（配列番号１３）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ３Ａ（配列番号１４）及びｈＲ５Ｈｖ５Ａ（配列番号１５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１８−３５ｂｐの相補的配列を有する。
【０１８７】
ｈＲ５Ｈｖ１ＳはＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）及びＳａｌＩ認識部位を有するように、またｈＲ５Ｈｖ５ＡはＮｈｅＩ認識部位を有するように設計した。また外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ（配列番号１６）はＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓと、ｈＲ５ＨｖＰｒＡ（配列番号１７）はＣＤＲグラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ５Ａとホモロジーを有する。
【０１８８】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ３Ａ、ｈＲ５Ｈｖ４Ｓ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａ、ならびに外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ及びｈＲ５ＨｖＰｒＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成及び精製された。
【０１８９】
ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、９８μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈＲ５Ｈｖ１Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ２Ｓ、ｈＲ５Ｈｖ３Ａ、ｈＲ５Ｈｖ４Ｓ及びｈＲ５Ｈｖ５Ａをそれぞれ５ｐｍｏｌｅを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーｈＲ５ＨｖＰｒＳ及びｈＲ５ＨｖＰｒＡを加え、１００μｌの系で同じ温度サイクルを２５回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のNu Sieve GTGアガロース（FMC Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０１９０】
約４３０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１７μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化することにより調製したプラスミドベクターＣＶＩＤＥＣに、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い添付の処方に従って反応させ連結した。
【０１９１】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１９２】
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4(宝酒造）及びM13 Primer RV(宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
【０１９３】
ＥｃｏＴ２２Ｉ認識部位の前もしくは後に変異、欠失が認められたため、それぞれ正しい配列を有する断片を連結して再度ＣＶＩＤＥＣにサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号１８に示す。また、バージョン“ａ”のアミノ酸配列を配列番号１９に示す。
【０１９４】
（ｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”の構築
バージョン“ｂ”及び“ｃ”をＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｂ”ではＦＲ３をヒト抗体Z34963 (DDBJ、Borretzen M.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 91, 12917-12921, 1994)由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＲＦＦＳ（配列番号２０）及びＦ３ＲＦＢＳ（配列番号２１）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＲＦＦＡ（配列番号２２）及びＦ３ＲＦＢＡ（配列番号２３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。
【０１９５】
Ｆ３ＲＦＦＳとＦ３ＲＦＦＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＢａｌＩ及びＸｈｏＩの認識配列を有する。Ｆ３ＲＦＢＳとＦ３ＲＦＢＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＸｈｏＩ及びＮｃｏＩの認識配列を有する。バージョン”ｃ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｐ０１８２５（SWISS-PROT、Poljak RJ.ら, Biochemistry, 16, 3412-3420, 1977)由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ３ＮＭＦＳ（配列番号２４）及びＦ３ＮＭＢＳ（配列番号２５）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＮＭＦＡ（配列番号２６）及びＦ３ＮＭＢＡ（配列番号２７）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。
【０１９６】
Ｆ３ＮＭＦＳとＦ３ＮＭＦＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＢａｌＩ及びＸｈｏＩの認識配列を有する。Ｆ３ＮＭＢＳとＦ３ＮＭＢＡは互いに相補的な配列を有し、両端にＸｈｏＩ及びＮｃｏＩの認識配列を有する。
【０１９７】
Ｆ３ＲＦＦＳ、Ｆ３ＲＦＢＳ、Ｆ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＡ、Ｆ３ＮＭＦＳ、Ｆ３ＮＭＢＳ、Ｆ３ＮＭＦＡ及びＦ３ＮＭＢＡはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成された。Ｆ３ＲＦＦＳとＦ３ＲＦＦＡ、Ｆ３ＲＦＢＳとＦ３ＲＦＢＡをアニールさせ、それぞれＢａｌＩ及びＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化した。これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号２８に示す。また、バージョン“ｂ”のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
【０１９８】
Ｆ３ＮＭＦＳとＦ３ＮＭＦＡ、Ｆ３ＮＭＢＳとＦ３ＮＭＢＡをアニールさせ、それぞれＢａｌＩ及びＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化した。これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｃ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号３０に示す。また、バージョン“ｃ”のアミノ酸配列を配列番号３１に示す。
【０１９９】
（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ”及び“ｅ”の構築
バージョン“ｄ”及び“ｅ”をＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン”ｄ”ではＦＲ３をヒト抗体M62723 (DDBJ、Pascual V.ら, J.Clin.Invest., 86, 1320-1328, 1990)由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを４個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳ（配列番号３２）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＥＰＡ（配列番号３３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
【０２００】
また外部プライマーＦ３ＰｒＳ（配列番号３４）及びＦ３ＰｒＡ（配列番号３５）はＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳ及びＦ３ＥＰＡとホモロジーを有し、他のＦＲ３のシャッフリングにも用いることができる。バージョン“ｅ”ではＦＲ３をヒト抗体Ｚ８０８４４（DDBJ、Thomsett AR.ら，unpublished)由来のものに置換するため、ＦＲ３をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＶＨＳ（配列番号３６）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＶＨＡ（配列番号３７）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＥＰＳ、Ｆ３ＥＰＡ、Ｆ３ＰｒＳ、Ｆ３ＰｒＡ、Ｆ３ＶＨＳ及びＦ３ＶＨＡは Pharmacia Biotechにより合成された。
【０２０１】
ＰＣＲは、KOD DNA Polymerase（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＥＰＳとＦ３ＥＰＡ、又はＦ３ＶＨＳとＦ３ＶＨＡをそれぞれ５μｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ2 、２．５ＵのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
【０２０２】
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のNu Sieve GTGアガロース(FMC Bio. Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
【０２０３】
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号３８に、バージョン“ｄ”のアミノ酸配列を配列番号３９に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｅ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号４０に、バージョン“ｅ”のアミノ酸配列を配列番号４１に示す。
【０２０４】
（ｉｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”及び“ｇ”の構築
バージョン“ｆ”及び“ｇ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｆ”はヒト抗体L04345 (DDBJ、Hillson JL.ら, J.Exp.Med., 178, 331-336, 1993）由来のＦＲ３に、バージョン“ｇ”はS78322 (DDBJ、Bejcek BE.ら, Cancer Res., 55, 2346-2351, 1995）由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｆ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＳＳＳ（配列番号４２）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＳＳＡ（配列番号４３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
【０２０５】
バージョン“ｇ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＣＤＳ（配列番号４４）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＣＤＡ（配列番号４５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＳＳＳ、Ｆ３ＳＳＡ、Ｆ３ＣＤＳ及びＦ３ＣＤＡは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＳＳＳ及びＦ３ＳＳＡもしくはＦ３ＣＤＳ及びＦ３ＣＤＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ＵのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
【０２０６】
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のNu Sieve GTGアガロース(FMC Bio. Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
【０２０７】
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｆ”アミノ酸配列を配列番号４６及び４７に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｇ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｇ”のアミノ酸配列を配列番号４８及び４９に示す。
【０２０８】
（ｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｈ”の構築
バージョン“ｈ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｈ”はヒト抗体Z26827 (DDBJ、Van Der Stoep ら, J.Exp.Med., 177, 99-107, 1993)由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｈ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＡＤＳ（配列番号５０）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＡＤＡ（配列番号５１）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
【０２０９】
Ｆ３ＡＤＳ及びＦ３ＡＤＡは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＡＤＳ及びＦ３ＡＤＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ2 、２．５ＵのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のＮｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
【０２１０】
４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｈ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号５２に示す。また、バージョン“ｈ”のアミノ酸配列を配列番号５３に示す。
【０２１１】
（ｖｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”の構築
バージョン“ｉ”及び“ｊ”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ａ”のＦＲ３を別のヒト抗体由来のＦＲ３に置換し作製した。バージョン“ｉ”はヒト抗体Ｕ９５２３９（DDBJ、Manheimer-Lory AJ., unpublished)由来のＦＲ３に、バージョン“ｊ”はＬ０３１４７（DDBJ、Collet TA.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 89, 10026-10030, 1992)由来のＦＲ３に置換するためＦＲ３をコードするプライマーを２個ずつ合成した。バージョン“ｉ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＭＭＳ（配列番号５４）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＭＭＡ（配列番号５５）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。
【０２１２】
バージョン“ｊ”のＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＢＭＳ（配列番号５６）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ３ＢＭＡ（配列番号５７）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、プライマーの３′−末端は１８ｂｐの相補的配列を有する。Ｆ３ＭＭＳ、Ｆ３ＭＭＡ、Ｆ３ＢＭＳ及びＦ３ＢＭＡは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。ＰＣＲは、Ampli Taq Gold (Perkin-Elmer）を用い、１００μｌの反応混合液に１μＭのＦＲ−シャッフリングプライマーＦ３ＭＭＳとＦ３ＭＭＡ、又はＦ３ＢＭＳとＦ３ＢＭＡをそれぞれ５μｌずつ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、２．５ＵのAmpli Taq Goldを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７４℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーＦ３ＰｒＳ及びＦ３ＰｒＡを加え、同じ温度サイクルを２５回行った。
【０２１３】
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を２％のNu Sieve GTGアガロース（FMC Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２４ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、３倍量（ｍｌ／ｇ）のＴＥを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、その３分の１量を水１４μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化し、これらをＢａｌＩ及びＮｃｏＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣ（ＢａｌＩ／ＮｃｏＩ）に導入し、塩基配列を決定した。
【０２１４】
正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｉ”アミノ酸配列を配列番号５８及び５９に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｊ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｊ”のアミノ酸配列を配列番号６０及び６１に示す。
【０２１５】
（ｖｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”の構築
バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ｂ”及び“ｄ”のＦＲ２を別のヒト抗体由来のＦＲ２に置換し作製した。ヒト抗体P01742 (SWISS-PROT、Cunningham BA.ら, Biochemistry, 9, 3161-3170, 1970）由来のものに置換するため、ＦＲ２をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ２ＭＰＳ（配列番号６２）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ２ＭＰＡ（配列番号６３）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。また、互いに相補的な配列を有し、両端にはＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩの認識配列を有する。
【０２１６】
Ｆ２ＭＰＳ、Ｆ２ＭＰＡは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。Ｆ２ＭＰＳとＦ２ＭＰＡをアニールさせ、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化した。これをＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ１”アミノ酸配列を配列番号６４及び６５に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｄ１”のアミノ酸配列を配列番号６６及び６７に示す。
【０２１７】
（ｖｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”の構築
バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”はＦＲ−シャッフリング法によってバージョン“ｂ”及び“ｄ”のＦＲ２を別のヒト抗体由来のＦＲ２に置換し作製した。ヒト抗体Z80844 (DDBJ、Thomsett AR.ら，unpublished)由来のＦＲ２に置換するため、ＦＲ２をコードするＤＮＡプライマーを２個作製した。ＦＲ−シャッフリングベクターＦ２ＶＨＳ（配列番号６８）はセンスＤＮＡ配列を有し、Ｆ２ＶＨＡ（配列番号６９）はアンチセンスＤＮＡ配列を有する。また、互いに相補的な配列を有し、両端にはＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩの認識配列を有する。Ｆ２ＶＨＳ、Ｆ２ＶＨＡは Pharmacia Biotechに合成、精製を委託した。
【０２１８】
Ｆ２ＶＨＳとＦ２ＶＨＡをアニールさせ、ＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化した。これをＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢａｌＩで消化することにより調製したプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ（ＥｃｏＴ２２Ｉ／ＢａｌＩ）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ３”アミノ酸配列を配列番号７０及び７１に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｄ３”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｄ３”のアミノ酸配列を配列番号７２及び７３に示す。
【０２１９】
（２）ヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域の構築
（ｉ）バージョン”ａ”
ヒト型化ＡＴＲ５抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Z37332 (DDBJ、Welschof Mら, J.Immunol.Methods, 179, 203-214, 1995)由来のフレームワーク領域を有するヒト型化抗体Ｌ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために７本のＰＣＲプライマーを使用した。
【０２２０】
ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ（配列番号７４）及びｈ５Ｌｖ４Ｓ（配列番号７５）はセンスＤＮＡ配列を、ＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ２Ａ（配列番号７６）、ｈ５Ｌｖ３Ａ（配列番号７７）及びｈ５Ｌｖ５Ａ（配列番号７８）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、各プライマーの両端に２０ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーｈ５ＬｖＳ（配列番号７９）及びｈ５ＬｖＡ（配列番号８０）はＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ及びｈ５Ｌｖ５Ａとホモロジーを有する。ＣＤＲ−グラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ、ｈ５Ｌｖ４Ｓ、ｈ５Ｌｖ２Ａ、ｈ５Ｌｖ３Ａ、ｈ５Ｌｖ５Ａ、ｈ５ＬｖＳ及びｈ５ＬｖＡは Pharmacia Biotechに合成、精製を委託した。
【０２２１】
ＰＣＲ溶液は、１００μｌ中に１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２．５ユニットのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）、５ｐｍｏｌｅのＣＤＲグラフティングプライマーｈ５Ｌｖ１Ｓ、ｈ５Ｌｖ２Ａ、ｈ５Ｌｖ３Ａ、ｈ５Ｌｖ４Ｓ、及びｈ５Ｌｖ５Ａを含有する。
【０２２２】
ＰＣＲはＤＮＡ  Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer) を用い、９４℃にて３０秒間、５０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを５回行うことにより、５本のＣＤＲグラフティングプライマーをアセンブルした。この反応混合液に１００ｐｍｏｌｅの外部プライマーｈ５ＬｖＳ及びｈ５ＬｖＡを加え、９４℃にて３０秒間、５２℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを３０回行うことにより、アセンブルしたＤＮＡ断片を増幅した。
【０２２３】
ＰＣＲ反応混合液を３％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts) を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿により回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｌＩ（宝酒造）及びＢｇｌII（宝酒造）により３７℃で４時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥ１０μｌに溶解した。上記のようにして調製したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌII  ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌIIで消化することにより調製したＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０２２４】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０２２５】
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５′−側にＢｇｌII認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３′−側にＳｐｌＩ認識配列を持つプラスミドをｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン”ａ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号８１に示す。また、バージョン“ａ”のアミノ酸配列を配列番号８２に示す。
【０２２６】
（ｉｉ）バージョン“ｂ”及び“ｃ”
バージョン“ｂ”及び“ｃ”を、バージョン“ａ”のＦＲ３を置換（ＦＲ−シャッフリング）することにより作製した。バージョン“ｂ”にはヒト抗体S68699 (DDBJ、Hougs L ら，Exp.Clin.Immunogen et., 10, 141-151, 1993)由来のＦＲ３を、バージョン“ｃ”にはヒト抗体P01607 (SWISS-PROT、Epp O ら，Biochemistry, 14, 4943-4952, 1975)由来のＦＲ３をそれぞれ使用した。
【０２２７】
バージョン“ｂ”のＦＲ３をコードするプライマーＦ３ＳＳ（配列番号８３）とＦ３ＳＡ（配列番号８４）、あるいはバージョン“ｃ”のＦＲ３をコードするプライマーＦ３ＲＳ（配列番号８５）とＦ３ＲＡ（配列番号８６）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩの認識配列を有する。Ｆ３ＳＳ、Ｆ３ＳＡ、Ｆ３ＲＳ、Ｆ３ＲＡは Pharmacia Biotechに合成、精製を委託した。各１００ｐｍｏｌｅのＦ３ＳＳとＦ３ＳＡ、あるいはＦ３ＲＳとＦ３ＲＡを９６℃にて２分間、５０℃にて２分間処理することによりアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
【０２２８】
これら２本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
【０２２９】
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物を１．５％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約３０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
【０２３０】
上記のようにして調製したバージョン“ｂ”あるいは“ｃ”のＦＲ３をコードするＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片とＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで消化することによりＦＲ３を除去したｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０２３１】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地３ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０２３２】
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4(宝酒造）及びM13 Primer RV(宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
【０２３３】
これらヒト型化抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”のＦＲ３を置換したバージョン“ｂ”あるいはバージョン“ｃ”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“ｂ”アミノ酸配列を配列番号８７および８８に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｃ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列およびバージョン“ｃ”のアミノ酸配列を配列番号８９および９０に示す。
【０２３４】
（ｉｉｉ）バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”
バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”を、バージョン“ｂ”のＦＲ２を置換することにより作製した。バージョン“ｂ１”にはヒト抗体S65921 (DDBJ、Tonge DWら，Year Immunol., 7, 56-62, 1993)由来のＦＲ２を、バージョン“ｂ２”にはヒト抗体X93625 (DDBJ、Cox JPら，Eur.J.Immunol., 24, 827-836, 1994)由来のＦＲ２をそれぞれ使用した。
【０２３５】
バージョン“ｂ１”のＦＲ２をコードするプライマーＦ２ＳＳ（配列番号９１）とＦ２ＳＡ（配列番号９２）、あるいはバージョン“ｂ２”のＦＲ２をコードするプライマーＦ２ＸＳ（配列番号９３）とＦ２ＸＡ（配列番号９４）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素ＡｆｌII及びＳｐｅＩの認識配列を有する。Ｆ２ＳＳ、Ｆ２ＳＡ、Ｆ２ＸＳ及びＦ２ＸＡは Pharmacia Biotechにより合成された。各１００ｐｍｏｌｅのＦ２ＳＳとＦ２ＳＡ、あるいはＦ２ＸＳとＦ２ＸＡを９６℃にて２分間、５０℃にて２分間処理することによりアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡ断片を作製した。
【０２３６】
これら２本鎖ＤＮＡ断片を制限酵素ＡｆｌII（宝酒造）及びＳｐｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
【０２３７】
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＡｆｌII（宝酒造）及びＳｐｅＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。消化混合物を１．５％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約３０００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
【０２３８】
上記のようにして調製したバージョン“ｂ１”あるいは“ｂ２”のＦＲ２をコードするＡｆｌII−ＳｐｅＩ  ＤＮＡ断片とＡｆｌII及びＳｐｅＩで消化することによりＦＲ２を除去したｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣベクターをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０２３９】
この連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をＬＢＡ培地４ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
【０２４０】
プラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4(宝酒造）及びM13 Primer RV(宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
【０２４１】
これらヒト型化抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”のＦＲ２を置換したバージョン“ｂ１”あるいはバージョン“ｂ２”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣと命名した。プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“ｂ１”アミノ酸配列を配列番号９５及び９６に示す。また、プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣに含まれるヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“ｂ２”のアミノ酸配列を配列番号９７及び９８に示す。
【０２４２】
（３）ヒト型化抗体の発現ベクターの構築
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖とキメラＬ鎖との組合せ
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖａ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２４３】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２４４】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｃ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｄ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｅ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２４５】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｆ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｈ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２４６】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｊ−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２４７】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ｃｈＡＴＲ−５抗体発現プラスミドベクター、ｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｃｈＡＴＲ５／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ１−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ１−ｃｈＬｖ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２４８】
（ｉｉ）ヒト型化Ｌ鎖とキメラＨ鎖との組み合わせ
抗体発現ベクターＮ５ＫＧ４Ｐを用いて、キメラＨ鎖との組み合わせでヒト型化抗体を発現させることにより、ヒト型化Ｌ鎖の評価を行った。
【０２４９】
プラスミドｈＡＴＲ５Ｌｖａ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｃ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｌｖｂ２／ＣＶＩＤＥＣを制限酵素ＢｇｌII（宝酒造）及びＳｐｌＩ（宝酒造）により３７℃で２〜３時間消化した。消化混合物を１．５％または２％ NuSieve GTGアガロース(FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約４００ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡ断片をエタノールで沈殿させた後、ＴＥに溶解した。
【０２５０】
これら各バージョンのヒト型化Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＳｐｌＩ−ＢｇｌII  ＤＮＡ断片とＳｐｌＩ及びＢｇｌIIで消化したｃｈＡＴＲ５Ｈｖ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。
【０２５１】
連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間、４２℃にて１分間静置した。次いで３００μｌのHi-Competence Broth(ニッポンジーン）を加え３７℃にて１時間インキュベートした後、ＬＢＡ寒天培地上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【０２５２】
この形質転換体をＬＢＡ培地２５０ｍｌまたは５００ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からPlasmid Maxi Kit (QIAGEN）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。これらキメラＨ鎖とヒト型化Ｌ鎖をコードする遺伝子を導入したプラスミドをそれぞれｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｃ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２５３】
（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖とヒト型化Ｌ鎖の組合せ
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖａ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖａ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２５４】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｃ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ａ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｃ−ｈＬｖａ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２５５】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｄ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｅ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｄ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｅ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２５６】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｆ／ＣＶＩＤＥＣ、ｈＡＴＲ５Ｈｖｇ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｈ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｆ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｇ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｈ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２５７】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｊ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｊ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２５８】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ１／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ１／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ１−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ１−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２５９】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ３／ＣＶＩＤＥＣ及びｈＡＴＲ５Ｈｖｄ３／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ３−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｄ３−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２６０】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｂ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）及びｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２６１】
Ｈ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＡＴＲ５Ｈｖｉ／ＣＶＩＤＥＣをＮｈｅＩ及びＳａｌＩで消化し、ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ断片を回収し、ヒト型化ＡＴＲ−５抗体Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｃｈＨｖ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４ＰをＮｈｅＩ及びＳａｌＩにて消化することにより調製したｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）及びｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐ（ＳａｌＩ／ＮｈｅＩ）に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ１／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐと命名した。
【０２６２】
（４）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ヒト型化抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
構築した発現プラスミドベクターをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に形質導入した。ＰＢＳ中に１×１０7 細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．７８ｍｌに、プラスミド５０μｇあるいは２０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
【０２６３】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を５％の Ultra Low IgGウシ胎児血清(GIBCO) を含有するＤＭＥＭ培地(GIBCO）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿あるいは１５ｃｍ培養皿を用いてＣＯ2 インキュベーターにて培養した。２４時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地ＨＢＣＨＯ（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに７２時間もしくは９６時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。
【０２６４】
（５）抗体の精製
ＣＯＳ−７細胞の培養上清からの抗体の精製をAffiGel Protein A MAPSIIキット(Bio-Rad）、あるいはrProtein A Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech）を用いて行った。AffiGel Protein A MAPSIIキットを用いた精製はキット添付の処方に従って行った。rProtein A Sepharose Fast Flowを用いた精製は以下のように行った。
【０２６５】
１ｍｌのrProtein A Sepharose Fast Flowをカラムに充填し、１０倍量のＴＢＳを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにＣＯＳ−７細胞の培養上清をアプライした後、１０倍量のＴＢＳによってカラムを洗浄した。次に１３．５ｍｌの２．５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出した。１．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることによって溶出液を中和した。
精製された抗体画分について、セントリプレップ３０もしくは１００（ａｍｉｃｏｎ）を用いた限外濾過を２〜３回行うことにより、ＴＢＳに溶媒を置換し、最終的に約１．５ｍｌまで濃縮した。
【０２６６】
参考例６． 抗体の定量及び活性評価
（１）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Maxisorp, NUNC）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3 、０．０２％  ＮａＮ3 、ｐＨ９．６）（以下、ＣＢと称す）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％  ＮａＮ3 、１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ８．１）（以下ＤＢと称す）でブロッキングの後、抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して各穴に加えた。
【０２６７】
１時間室温にてインキュベートし０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むダルベッコＰＢＳ（以下ＲＢと称す）で洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体(BioSource）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳｉｇｍａ１０４（ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を基質バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、ｐＨ９．８）に溶解したもの（以下、基質溶液と称す）を加え、４０５／６５５ｎｍでの吸光度をmicroplate reader (Bio Rad）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてＩｇＧ４κ（The Binding Site）を用いた。
【０２６８】
（２）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞Ｊ８２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１）を用いた。細胞培養用９６穴プレートの６０穴に１×１０5 個のＪ８２細胞を播き込んだ。これをＣＯ2 インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清(GIBCO）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄した。４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（以下、ＰＦＡ／ＰＢＳと称す）を各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化した。
【０２６９】
ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングした。培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して１００μｌを各穴に加えた。室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体(BioSource）１００μｌを加えた。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をMicroplate Reader (Bio-Rad）で測定した。
【０２７０】
（３）中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体及びヒト型化抗体の中和活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S(Behringwerke AG) による Factor Xa産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、１．２５ｍｇ／ｍｌのThromborel S  １０μｌと適当な濃度に希釈した抗体１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ2 、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で１時間反応させた。これに３．２４５μｇ／ｍｌのヒトファクターＸ（セルサス・ラボラトリーズ）及び８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトファクターＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ１０μｌ加え、さらに室温で１時間反応させた。
【０２７１】
０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Microplate Reader(Bio Rad)で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で１時間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の１時間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
【０２７２】
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添付文書に従い溶解し、精製水で２倍希釈した後、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ  ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
【０２７３】
（４）活性の評価
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とキメラＬ鎖との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体（ａ−ｃｈ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた。ＦＸａ産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体（ｃｈ−ｃｈ）に比べて弱い活性であった。よってヒト型化Ｈ鎖はＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
【０２７４】
（ｉｉ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”とキメラＨ鎖との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”とキメラＨ鎖を組み合わせた抗体（ｃｈ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、キメラ抗体と同等以上の抗原結合活性が認められた。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて弱い活性であった。よってヒト型化Ｌ鎖もＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
【０２７５】
（ｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ａ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”を組み合わせた抗体（ａ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた。ＦＸａ産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体に比べてかなり弱い活性であった。よってヒト型化Ｈ鎖及びＬ鎖のＦＲ−シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
【０２７６】
（ｉｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”、“ｃ”及び“ｄ”とキメラＬ鎖との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｃｈ”、“ｃ−ｃｈ”、及び“ｄ−ｃｈ”）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、“ｄ−ｃｈ”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“ｂ−ｃｈ”及び“ｃ−ｃｈ”はわずかに劣る抗原結合活性を示した。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“ｂ−ｃｈ”はほぼ同等、“ｄ−ｃｈ”はわずかに弱い活性であった。またバージョン“ｃ−ｃｈ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。よってヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｄ”がヒト型化Ｈ鎖で高い活性を示すと考えられるバージョンであった。
【０２７７】
（ｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ａ”を組み合わせた抗体（ｂ−ａ）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、高濃度で抗原に対する結合量が低下していた。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、かなり弱い活性であった。よって“ｂ−ａ”が“ａ−ａ”より高い活性を示すバージョンであった。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＯＳ−７細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。
【０２７８】
（ｖｉ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”、“ｃ”とキメラＨ鎖との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”をキメラＨ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ｃｈ−ｂ”、“ｃｈ−ｃ”）を作製したところ、いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体と同等の活性を示した。よってバージョン“ｂ”及び“ｃ”をヒト型化抗体Ｌ鎖の候補とした。マウス抗体由来のアミノ酸残基数が１つ少ないバージョン“ｂ”の方がバージョン“ｃ”より抗原性の点で優れていると考えられる。なお、ここで用いたキメラ抗体はＣＨＯ細胞ＤＧ４４で発現させ精製した抗体を用い評価したもので、これ以降の評価でもこの抗体を陽性対照に用いた。
【０２７９】
（ｖｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”
との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”及び“ｃ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｂ”及び“ｂ−ｃ”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体よりわずかに劣る活性を示した。
【０２８０】
（ｖｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”及び“ｄ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ
”との組合せ
ＦＲ−シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化Ｈ鎖とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”を組み合わせた抗体（それぞれ“ｂ−ｂ”及び“ｄ−ｂ”）を作製し、ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにて抗原結合能を調べたところ、“ｄ−ｂ”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“ｂ−ｂ”は高濃度でわずかに劣る抗原結合活性を示した。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“ｂ−ｂ”はわずかに弱い活性で、“ｄ−ｂ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。よって“ｂ−ｂ”は抗原活性中和能の高いバージョン、“ｄ−ｂ”は抗原結合能の高いバージョンであることが示された。
【０２８１】
（ｉｘ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｅ”とキメラＬ鎖及びヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ
”との組合せ
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｅ”をキメラＬ鎖及びヒト型化バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｅ−ｃｈ”及び“ｅ−ｂ”）を作製したところ、“ｅ−ｃｈ”の抗原結合能はキメラ抗体と同等の活性を示したが、“ｅ−ｂ”は抗体の発現量が非常に低く、且つ抗原結合能も殆ど喪失していた。また“ｅ−ｃｈ”の抗原活性中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。よってＨ鎖バージョン“ｅ”はＬ鎖バージョン“ｂ”との組合せが悪いと考えられた。
【０２８２】
（ｘ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”、“ｇ”及び“ｈ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“
ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｆ”、“ｇ”及び“ｈ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｆ−ｂ”、“ｇ−ｂ”及び“ｈ−ｂ”）作製したところ、“ｆ−ｂ”及び“ｈ−ｂ”の抗体は抗体の発現量が非常に低くかった。なお、バージョン“ｆ”、“ｈ”についてはキメラＬ鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。“ｇ−ｂ”は低い濃度から飽和状態に達し、キメラ抗体より弱い抗原結合能を示した。“ｇ−ｂ”の抗原中和能は、キメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。
【０２８３】
（ｘｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ
”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｄ１”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｂ１−ｂ”及び“ｄ１−ｂ”）作製したところ、ともに抗体は殆ど発現されなかった。なお、これらについてはキメラＬ鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。
【０２８４】
（ｘｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“
ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ３”及び“ｄ３”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体を（それぞれ“ｂ３−ｂ”及び“ｄ３−ｂ”）作製したところ、“ｄ３−ｂ”の抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っており、“ｂ３−ｂ”の抗原結合能はさらに劣っていた。“ｂ３−ｂ”の抗原中和能は“ｂ−ｂ”より上回る活性を示したものの、キメラ抗体の活性には及ばず、“ｄ３−ｂ”は“ｂ−ｂ”と同程度の活性にとどまった。
【０２８５】
（ｘｉｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”とキメラＬ鎖及びヒト型化Ｌ鎖
バージョン“ｂ”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”及び“ｊ”をキメラＬ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｃｈ”及び“ｊ−ｃｈ”）とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｂ”及び“ｊ−ｂ”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はいずれの抗体もキメラ抗体とほぼ同等の活性を示した。“ｉ−ｃｈ”にはキメラ抗体の活性を上回る抗原中和能が認められ、“ｊ−ｃｈ”の抗原中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。“ｉ−ｂ”はキメラ抗体と同等の活性が認められ、“ｊ−ｂ”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった。
【０２８６】
（ｘｉｖ）ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”
ヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”をキメラＨ鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ｃｈ−ｂ１”及び“ｃｈ−ｂ２”）を作製したところ、いずれの抗体もキメラ抗体と同等の抗原結合能を示した。抗原中和能については、“ｃｈ−ｂ１”ではキメラ抗体と同等の活性を示し、“ｃｈ−ｂ２”では高濃度側でキメラ抗体を若干上回る活性が認められた。バージョン“ｂ１”及び“ｂ２”ともにヒト型化抗体Ｌ鎖の候補になり得るが、より強い活性を有するという点でバージョン“ｂ２”の方が優れている。
【０２８７】
（ｘｖ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｂ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ２”と組み合わせた抗体（“ｂ−ｂ２”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っていた。抗原中和能は“ｂ−ｂ”の活性を上回ったものの、“ｉ−ｂ”の活性には及ばなかった。
【０２８８】
（ｘｖｉ）ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”とヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”又は“ｂ
２”との組合せ
ヒト型化Ｈ鎖バージョン“ｉ”をヒト型化Ｌ鎖バージョン“ｂ１”又は“ｂ２”と組み合わせた抗体（それぞれ“ｉ−ｂ１”及び“ｉ−ｂ２”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。“ｉ−ｂ２”の抗原結合能はキメラ抗体とほぼ同等で、“ｉ−ｂ１”はわずかに劣る程度であった。また、“ｉ−ｂ１”及び“ｉ−ｂ２”の抗原中和能はキメラ抗体や“ｉ−ｂ”を上回る活性を示し、“ｉ−ｂ２”＞“ｉ−ｂ１”の順に強かった。
【０２８９】
参考例７． ＣＨＯ細胞産生ヒト型化抗体の作製及び活性評価
（１）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体（ｂ−ｂ、ｉ−ｂ及びｉ−ｂ２）の安定産生細胞株を樹立するため、無血清培地に馴化したＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）に抗体発現遺伝子ベクターを導入した。
【０２９０】
プラスミドＤＮＡ、ｈＨｖｂ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ、ｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ／Ｎ５ＫＧ４Ｐ及びｈＨｖｉ−ｈＬｖｂ２／Ｎ５ＫＧ４Ｐを制限酵素ＳｓｐＩ（宝酒造）で切断して直鎖状にし、フェノール及びクロロフォルム抽出した後、エタノール沈殿により精製した。エレクトロポーレーション装置（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ；Ｂｉｏ  Ｒａｄ）により、直鎖状にした発現遺伝子ベクターをＤＧ４４細胞に導入した。ＤＧ４４細胞をＰＢＳに１×１０7 ／ｍｌの細胞密度で懸濁し、この懸濁液約０．８ｍｌに前記のＤＮＡを１０もしくは５０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。
【０２９１】
室温にて１０分間の回復期間の後、ヒポキサンチン−チミジン（ＧＩＢＣＯ）（以下、ＨＴ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地に処理された細胞を懸濁し、２枚の９６穴平底プレート（Falcon）に１００μｌ／穴となるように播種し、ＣＯ2 インキュベーターにて培養した。培養開始８〜９時間後にＨＴ及び１ｍｇ／ｍｌのGENETICIN (GIBCO）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地を１００μｌ／穴加え、５００μｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ選択培地に変換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。３〜４日に一度１／２量の培地を新鮮な培地と交換し、選択培地への変換から約２週間経過した時点で、その４〜５日後に細胞の順調な増殖が観察された穴の培養上清の一部を回収した。この培養上清中に発現された抗体濃度を前述の抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにより測定し、抗体産生量の高い細胞を選出した。
【０２９２】
（２）ヒト型化抗体の大量精製
前記のように選出したヒト型化抗体（“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”）発現ＤＧ４４細胞株を２Ｌローラーボトル（CONING）を用い、５００ｍｌ／ボトルのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地中で数日培養後、培養液を回収して新鮮なＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地を加え、再び培養した。培養液は遠心分離により細胞破片を除去し、０．２２μｍもしくは０．４５μｍのフィルターで濾過した。これを繰り返し、それぞれ全量約２Ｌの培養上清を得た。得られた培養上清を Protein Aアフィニティーカラム(Poros）を接続したConSep LC100システム（ミリポア）にて抗体を精製した。
【０２９３】
（３）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Maxisorp, NUNC）の各穴をＣＢで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体(BioSource）１００μｌで固相化し、２００μｌのＤＢでブロッキングの後、抗体を発現させたＣＨＯ細胞の培養上清あるいは精製抗体をＤＢにて段階希釈して各穴に加えた。
【０２９４】
１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体(BioSource）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＲＢで洗浄の後、基質溶液を１００μｌ加え、４０５／６５５ｎｍでの吸光度をmicroplate reader(Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてＩｇＧ４κ（The Binding Site）を用いた。
【０２９５】
（４）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞Ｊ８２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１）を用いた。細胞培養用９６穴プレートに１×１０5 個のＪ８２細胞を播き込んだ。これをＣＯ２インキュベーターで１日培養し（１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、ＰＢＳで各穴を２回洗浄した。ＰＦＡ／ＰＢＳを各穴に１００μｌ加え、氷上で１０分間静置し、細胞を固相化した。
【０２９６】
ＰＦＡ／ＰＢＳを捨て、３００μｌのＰＢＳで各穴を２回洗浄後、２５０μｌのＤＢでブロッキングした。精製抗体を上測定結果をもとに、ＤＢにて１０μｇ／ｍｌより公比２で段階希釈して１００μｌを各穴に加えた。室温にて２時間インキュベートしＲＢで洗浄後、ＤＢで１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧγ抗体(BioSource）１００μｌを加えた。室温にて１時間インキュベートしＲＢで洗浄ののち、基質溶液を１００μｌ加え、次に４０５／６５５ｎｍでの吸光度をMicroplate Reader (Bio-Rad）で測定した。
【０２９７】
（５）ＴＦ中和活性（ファクターＸａ産生阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のファクターＸａ産生阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S(Behringwerke AG）による Factor Xa産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのThromborel S  １０μｌと抗体１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ2 、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で１時間反応させた。抗体は緩衝液で２００μｇ／ｍｌより公比５で段階希釈した。
【０２９８】
これに３．２４５μｇ／ｍｌのヒトファクターＸ（セルサス・ラボラトリーズ）及び８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトファクターＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ１０μｌ加え、さらに室温で４５分間反応させた。０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Microplate Reader (Bio Rad）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で３０分間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の３０分間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
【０２９９】
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２(Chromogenix）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ  ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
【０３００】
（６）ＴＦ中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のファクターＸ結合阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S(Behringwerke AG）を用い、予めＴＦとＦａｃｔｏｒ VIIａの複合体を形成させ、その複合体の Factor Xa産生阻害活性を指標にファクターＸ結合阻害活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのThromborel S  １０μｌと８２．５ｎｇ／ｍｌのヒトＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ（エンザイム・リサーチ）１０μｌに緩衝液（５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＢＳＡを含むＴＢＳ）６０μｌを加え、９６穴プレート中で室温で予め１時間反応させた。
【０３０１】
これに抗体溶液を１０μｌ加え、室温で５分間反応させた後、３．２４５μｇ／ｍｌのヒトＦａｃｔｏｒ  Ｘ（セルサス・ラボラトリーズ）を１０μｌ加え、さらに室温で４５分間反応させた。なお抗体は緩衝液で２００μｇ／ｍｌより公比２で段階希釈した。０．５ＭのＥＤＴＡを１０μｌ加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を５０μｌ加え、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。室温で３０分間反応させ、再度４０５／６５５ｎｍの吸光度を測定した。抗体無添加の３０分間の吸光度変化を１００％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
【０３０２】
発色基質溶液はテストチーム発色基質Ｓ−２２２２(Chromogenix）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（０．６ｍｇ／ｍｌ  ヘキサジメチリンブロマイド、ＳＩＧＭＡ）と１：１で混和し調製した。
【０３０３】
（７）ＴＦ中和活性（血漿凝固阻害活性）の測定
ヒト型化抗体のＴＦ中和活性（血漿凝固阻害活性）はヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S(Behringwerke AG）を用いたプロトロンビン時間を指標に測定した。すなわち、サンプルカップにヒト血漿（コスモ・バイオ）１００μｌを入れ、これに様々な濃度に希釈した抗体を５０μｌ加え、３７℃で３分間加温した。予め３７℃に加温しておいた１．２５ｍｇ／ｍｌのThromborel Sを５０μｌ加え、血漿凝固を開始させた。この凝固時間はAmelung CR-Aを接続したAmelung KC-10A（ともにエム・シー・メディカル）にて測定した。
【０３０４】
抗体は８０μｇ／ｍｌより公比２で０．１％のＢＳＡを含有するＴＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＴＢＳ）にて段階希釈した。測定した抗体無添加の凝固時間を１００％のＴＦ血漿凝固活性とし、Thromborel Sの濃度と凝固時間をプロットした検量線により抗体を添加した際のそれぞれの凝固時間からＴＦ残存活性を算出した。
【０３０５】
検量線は様々なThromborel Sの濃度とその凝固時間を測定することにより作成した。適当に希釈したThromborel S、５０μｌに５０μｌのＢＳＡ−ＴＢＳを加え、３７℃で３分間加温し、予め３７℃に加温しておいたヒト血漿を１００μｌ加えて凝固を開始させ凝固時間を測定した。Thromborel Sは６．２５ｍｇ／ｍｌより公比２で２５ｍＭのＣａＣｌ２を含むハンクス緩衝液（ＧＩＢＣＯ）にて段階希釈した。横軸にThromborel S濃度、縦軸に凝固時間を両対数グラフにプロットし、これを検量線とした。
【０３０６】
（８）活性の評価
“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”のヒト型化抗体すべてはキメラ抗体と同等以上の活性を有していた（図１）。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ結合阻害活性及び血漿凝固阻害活性においても、ヒト型化抗体“ｂ−ｂ”、“ｉ−ｂ”及び“ｉ−ｂ２”はキメラ抗体と同等以上の活性を有しており、“ｉ−ｂ２”＞“ｉ−ｂ”＞“ｂ−ｂ”の順に活性が強かった（図２、３及び４）。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】図１は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。
【図２】図２は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ＴＦによるファクターＸａ産生阻害活性）を比較したグラフである。
【図３】図３は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ファクターＸ結合阻害活性）を比較したグラフである。
【図４】図４は、Ｈ鎖キメラ／Ｌ鎖キメラ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｂ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、Ｈ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ抗体、及びＨ鎖ヒト型化バージョンｉ／Ｌ鎖ヒト型化バージョンｂ２抗体の、ヒトＴＦに対する中和活性（ＴＦによる血漿凝固阻害活性）を比較したグラフである。
【０３０８】
【図５】図５は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウス（点線）及び該遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウス（実線）における腫瘍体積の、腫瘍細胞移植後の経時変化を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウス（点線）及び該遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウス（実線）における、ヒト組織因子の血漿中濃度の、腫瘍細胞移植後の経時変化を示すグラフである。
【図７】図７は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウス（点線）及び該遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウス（実線）における、血小板の数の、腫瘍細胞移植後の経時変化を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウス（点線）及び該遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウス（実線）における、フィブリノーゲンの血漿中濃度の、腫瘍細胞移植後の経時変化を、腫瘍細胞を移植してない対照マウス（Ｎｏｒｍａｌ）におけるフィブリノーゲンの濃度を１００％とした相対値として示すグラフである。
【図９】図９は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウス（点線）及び該遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウス（実線）における、可溶性フィブリンモノマー複合体（ｓＦＭＣ）の血漿中濃度の、腫瘍細胞移植後の経時変化を示すグラフである。
【０３０９】
【図１０】図１０は、ヒト組織因子遺伝子が導入された細胞を移植したマウス（点線）及び該遺伝子が導入されていない細胞を移植したマウス（実線）における、トロンビン−アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）の血漿中濃度の、腫瘍細胞移植後の経時変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ヒトTF遺伝子を導入した腫瘍細胞を移植したマウスに、移植45日目から抗ヒトTF抗体を1mg/kgで週１回、3 週間にわたって投与した場合の血小板数の経時的変化を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ヒトTF遺伝子を導入した腫瘍細胞を移植したマウスに、移植45日目から抗ヒトTF抗体を1mg/kgで週１回、3 週間にわたって投与した場合の、最終投与の６日後のフィブリンモノマー複合体（sFMC）の血漿中濃度を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ヒトTF遺伝子を導入した腫瘍細胞を移植したマウスに、移植45日目から抗ヒトTF抗体を1mg/kgで週１回、3 週間にわたって投与した場合の、最終投与の６日後のトロンビンーアンチトロンビンIII 複合体（TAT ）の血漿中濃度を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ヒトTF遺伝子を導入した腫瘍細胞を移植したマウスに、移植49日目に抗ヒトTF抗体1mg/kgを単回投与、または低分子量ヘパリン601.5 IU/kg,1900.3 IU/kg, 6487.3 IU/kgを浸透圧ポンプで２４時間持続投与した場合の、血小板数の経時的変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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