(57)【要約】【課題】            レチノールまたはその誘導体について、生体内への吸収性やターゲティングに優れた製剤を提供する。【解決手段】        レチノールまたはその誘導体、疎水基と陰イオン残基を持つ有機化合物および界面活性剤を含有する一次ナノ粒子を作製し、一次ナノ粒子含有溶液に２価または３価の金属塩を作用させ二次ナノ粒子とし、さらに、１価ないし３価の塩基性塩を分散させた三次ナノ粒子とし、これらのナノ粒子を用いることによって、レチノールまたはその誘導体について、皮膚などへの吸収性が改善され、徐放性やターゲティングに優れた製剤が提供される。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノールまたはその誘導体を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と作用させることからなるナノ粒子。
【請求項２】
レチノールまたはその誘導体を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と作用させることにより二次ナノ粒子とし、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を作用させることからなるナノ粒子。
【請求項３】
一次ナノ粒子が、レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤とを作用させることからなる請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤とを水性媒体中に分散させることにより調製される一次ナノ粒子に、２価または３価の金属塩を作用させてなるレチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子。
【請求項５】
レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤とを水性媒体中に分散させることにより調製される一次ナノ粒子に、２価または３価の金属塩を作用させて二次ナノ粒子とし、該二次ナノ粒子に、１価ないし３価の塩基性塩を作用させてなるレチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子。
【請求項６】
２価または３価の金属塩で少なくとも部分的ないし完全に被覆された、レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤を含有するナノ粒子。
【請求項７】
さらに、１価ないし３価の塩基性塩で少なくとも部分的ないし完全に被覆された請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項８】
水性媒体が水である請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項９】
２価または３価の金属塩が、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩からなる群から選択される１種以上である請求項１、２または４に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
１価ないし３価の塩基性塩が、炭酸水素塩、リン酸水素塩、炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩および尿酸塩からなる群から選択される１種以上である請求項２または５に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
疎水基と陰イオン残基を有する有機化合物が、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩である請求項３、４、５または６に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
炭素数６〜２４の脂肪酸またはそれらの塩が、不飽和脂肪酸または飽和脂肪酸またはそれらの塩からなる群から選択される１種以上であることからなる請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
不飽和脂肪酸またはその塩がオレイン酸、リノール酸、リノレン酸またはそれらの塩からなる群から選択される１種以上であることからなる請求項１２に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
飽和脂肪酸またはその塩がラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソステアリン酸またはそれらの塩からなる群から選択される１種以上であることからなる請求項１２に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
界面活性剤が、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビンタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン(８)オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油および脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体からなる群から選択される１種または２種以上のものである請求項３、４、５または６に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
粒子の直径が１〜５００ｎｍである請求項１ないし１５のいずれかに記載のナノ粒子。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤。
【請求項１８】
外用剤が、軟膏剤、ゲル剤、舌下錠、口腔錠剤、液剤、口腔・下気道用噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、ハイドロゲル剤、ローション剤、パップ剤、貼付剤、点眼剤および点鼻剤からなる群から選択されるものである請求項１７に記載の外用剤。
【請求項１９】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のナノ粒子を含有する注射用剤。
【請求項２０】
（Ａ）レチノールまたはその誘導体、疎水基と陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた溶液を水に分散させる工程、および、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた溶液に、２価または３価の金属塩を混合させる工程、
を包含するナノ粒子の製造方法。
【請求項２１】
さらに、（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた溶液に１価ないし３価の塩基性塩を混合する工程を包含する請求項２０に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項２２】
有機溶媒が、アセトン、エタノール、プロパノール、およびブタノールからなる群から選択される１種以上である請求項２０または２１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子に関し、さらに詳細には、レチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子およびその製造方法、ならびに当該粒子を含有する外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイドはその名前が網膜（reteina）に由来するように、網膜細胞の保護に必要であるビタミンＡおよびその類縁体であり、欠乏すると夜盲症などの症状を生じることが知られている。さらに、近年では、遺伝子情報の制御に関わっていることが見出され、大きな関心を集めている。レチノイドはレチノール、レチナール、レチノイン酸およびそれらの誘導体などの総称であり、前骨髄球性白血病、カポジ肉腫、ニキビ、皮膚の光老化、角化性皮膚疾患（乾癬、魚鱗癬など）、ケロイド、色素沈着、小ジワ等の予防や治療に使用されており、また、レチノイドのガン細胞に対する分化誘導作用に期待して、種々の合成レチノイドの開発が進められている。
【０００３】
さらに、レチノイドの皮膚に対する作用としては、表皮に対しては、表皮細胞の分裂促進、表皮層の肥厚防止、表皮ヒアルロン酸の合成促進、表皮ＴＧＦ−βの発現誘導、角層剥離、さらに、真皮に対しては、真皮コラーゲンの産生促進、真皮乳頭層の血管新生、皮脂腺機能化抑制、ＭＭＰおよびコラーゲンの発現抑制、エラスチンの繊維損傷の修復が知られている。
【０００４】
特に、レチノイドのなかでもレチノールは生体内で自然に生じる内因性化合物であり、レチノールまたはその誘導体は、レチノイン酸に比べ、刺激性も低く炎症が起こりにくく安全である。そこで、レチノイドの中でも特にレチノールまたはその誘導体を配合した安全な皮膚外用製剤の開発が望まれている。
【０００５】
ところで、レチノイドは脂溶性物質であり、オイル、ワセリンなどの油性基剤を使用した外用剤では皮膚への浸透性が極めて悪く、また、レチノイン酸やレチノールなどは光、熱により分解され、安定性が悪いことが知られている。これらの理由から、レチノイドを安定に配合した製剤では、その効果を十分に発揮させるために、種々の製剤的な工夫が要求されている。
【０００６】
これまでに、レチノイドを安定して含有する製剤として、レチノイド自体を粒子化したり、基剤に工夫したりして皮膚浸透性や皮膚滞留性の向上や制御を目指した製剤化が検討されている。たとえば、レチノイド類を含有する非リン脂質リポソーム組成物（特許文献１：特表平１１−５０３１６５号公報）や、レチノイン酸を少量の極性の高い有機溶媒に溶解し、アルカリを含む水で分散させ、次に非イオン界面活性剤を添加することによりなる混合ミセルに、２価金属塩を添加し、さらに２価陰イオンを持つ塩を添加してなるレチノイン酸ナノカプセルが知られている（特許文献２：特開２００４−１６１７３９号公報）。
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示されるリポソーム製剤では、レチノイドの皮膚浸透性が高いものの、表皮および真皮に滞留せずに体内に吸収されるため、局所で効果を持続的に発揮させるのは難しものである。また、特許文献２に開示されるナノカプセルによる方法では、レチノールまたはその誘導体が遊離基を有さないため、アルカリによる可溶化ができないため十分に分散が行われず、安定的にナノ粒子の作成を行うことは難しいものである。
したがって、レチノールまたはその誘導体を安定的に含有し、皮膚ならびに粘膜も含め生体内への吸収性が良好であり、高いバイオアベイラビリティーを発揮し得るナノ粒子およびそれらの粒子を作成する方法の開発が期待されている。
【特許文献１】特表平１１−５０３１６５号公報
【特許文献２】特開２００４−１６１７３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の現状に鑑み、レチノールまたはその誘導体について、皮膚および粘膜経由の投与方法により、局所も含め生体内への吸収性に優れると共に、作用部位に効率的にレチノールまたはその誘導体を送達できる、優れた外用製剤を提供することを課題とする。
【０００９】
かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、２価または３価の金属塩で少なくとも部分的ないし完全に被覆された赤血球よりも遙かに小さい特殊なナノ粒子を利用し、それにレチノールまたはその誘導体を含有させ得ることを見出した。さらに、本発明者らは脂溶性薬物でありアルカリ水により可溶化しにくいレチノールまたはその誘導体を、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤と共に、水性媒体中に分散させることにより、一次ナノ粒子を作製することができ、当該金属塩での被覆に用いることができることを見出した。かかるナノ粒子は、各成分の割合を調節することで所望の粒子径に作成することができる。かくして得られたナノ粒子を皮膚および粘膜軽油による投与を検討した結果、当該ナノ粒子に含有されたレチノールまたはその誘導体について、生体内への高い吸収性が確認され、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、全身投与および局所投与を目的とした皮膚または粘膜投与により優れた経皮吸収性を有する、レチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子を提供する。また、当該ナノ粒子を含有する外用剤を提供する。さらに本発明のナノ粒子は、注射用としても有利に利用できる。
【００１１】
より具体的には、本発明は、
（１）レチノールまたはその誘導体を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と作用させることからなるナノ粒子；
（２）レチノールまたはその誘導体を含有する一次ナノ粒子を、２価または３価の金属塩と作用させることにより二次ナノ粒子とし、当該二次ナノ粒子に１価ないし３価の塩基性塩を作用させることからなるナノ粒子；
（３）一次ナノ粒子が、レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤とを作用させることからなる上記１または２に記載のナノ粒子；
を提供する。
【００１２】
より具体的には、本発明は、
（４）レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤とを水性媒体中に分散させることにより調製される一次ナノ粒子に、２価または３価の金属塩を作用させてなるレチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子；
（５）レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤とを水性媒体中に分散させることにより調製される一次ナノ粒子に、２価または３価の金属塩を作用させて二次ナノ粒子とし、該二次ナノ粒子に、１価ないし３価の塩基性塩を作用させてなるレチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子；
（６）２価または３価の金属塩で少なくとも部分的ないし完全に被覆された、レチノールまたはその誘導体、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤を含有するナノ粒子；
（７）さらに、１価ないし３価の塩基性塩で少なくとも部分的ないし完全に被覆された上記４に記載のナノ粒子；
（８）水性媒体が水である上記４に記載のナノ粒子；
（９）２価または３価の金属塩が、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩または銅塩からなる群から選択される１種以上である上記１、２または４に記載のナノ粒子；
（１０）１価ないし３価の塩基性塩が、炭酸水素塩、リン酸水素塩、炭酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩および尿酸塩からなる群から選択される１種以上である上記２または５に記載のナノ粒子；
（１１）疎水基と陰イオン残基を有する有機化合物が、炭素数６〜２４の脂肪酸またはその塩である上記３、４、５または６に記載のナノ粒子；
（１２）炭素数６〜２４の脂肪酸またはそれらの塩が、不飽和脂肪酸または飽和脂肪酸またはそれらの塩からなる群から選択される１種以上であることからなる上記１１に記載のナノ粒子；
（１３）不飽和脂肪酸またはその塩がオレイン酸、リノール酸、リノレン酸またはそれらの塩からなる群から選択される１種以上であることからなる上記１２に記載のナノ粒子；
（１４）飽和脂肪酸またはその塩がラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソステアリン酸またはそれらの塩からなる群から選択される１種以上であることからなる上記１２に記載のナノ粒子；
（１５）界面活性剤が、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビンタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン(８)オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油および脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体からなる群から選択される１種または２種以上のものである上記３、４、５または６に記載のナノ粒子；
（１６）粒子の直径が１〜５００ｎｍである上記１ないし１５に記載のナノ粒子；
を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、別の態様として、
（１７）上記１ないし１６のいずれかに記載のナノ粒子を含有する皮膚または粘膜適用型外用剤；
（１８）外用剤が、軟膏剤、ゲル剤、舌下錠、口腔錠剤、液剤、口腔・下気道用噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、ハイドロゲル剤、ローション剤、パップ剤、貼付剤、点眼剤および点鼻剤からなる群から選択されるものである上記１７に記載の外用剤；
（１９）上記１ないし１６のいずれかに記載のナノ粒子を含有する注射用剤；
を提供する。
【００１４】
また本発明は、さらに別の態様として、
（２０）以下に記載する、
（Ａ）レチノールまたはその誘導体、疎水基と陰イオン残基を有する有機化合物、および界面活性剤を有機溶媒または含水有機溶媒に溶解する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた溶液を水に分散させる工程、および、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた溶液に、２価または３価の金属塩を混合させる工程、
を包含するナノ粒子の製造方法；
（２１）さらに、（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた溶液に１価ないし３価の塩基性塩を混合する工程を包含する上記２０に記載のナノ粒子の製造方法；
（２２）有機溶媒が、アセトン、エタノール、プロパノール、およびブタノールからなる群から選択される１種以上である上記２０または２１に記載の製造方法；
を提供するものである。
【００１５】
本発明は、レチノールまたはその誘導体に、疎水基および陰イオン残基を有する有機化合物と混合させることにより、アルカリに可溶化できないレチノールまたはその誘導体を、安定的にナノ粒子中に含有し得る点に一つの特徴を有するものである。
また、かくして得られるレチノールまたはその誘導体を含有する一次ナノ粒子、さらに当該一次ナノ粒子から誘導される二次ナノ粒子および三次ナノ粒子の粒子径を、所望の粒子径とし得る点に、また別の特徴を有するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明が提供するナノ粒子は、そこに含有されるレチノールまたはその誘導体を、皮膚または粘膜経由により生体内に良好に吸収あるいは皮膚に滞留させることができ、また、注射投与によっても生体内投与することができ、いずれの場合にも、優れた徐放性と、目的作用部位へのターゲティングを示すものである。
したがって、これまで十分に達成されていなかったレチノールまたはその誘導体の経皮または経粘膜による生体内吸収を可能にする、画期的な効果を有し、高吸収性、徐放性を有するレチノールまたはその誘導体を含有する外用剤、注射剤が提供される。
【００１７】
また、本発明のナノ粒子を経皮投与することにより、表皮から深部まで良好に浸透し、真皮、皮下組織にレチノールまたはその誘導体を高濃度に分布することができるため、皮膚を形成する細胞に作用させるのに有用であり、ニキビ、色素沈着、小ジワ、皮膚の光老化などの肌トラブルを改善するのに極めて有用である。
【００１８】
また、本発明のナノ粒子は、粘膜下組織に対しても同様の効果が認められ、種々の疾患に対して応用することが可能である。さらに、刺激性が少ないが酸化されやすく安定性が低いレチノールまたはその誘導体を、本発明のナノカプセル粒子に含有させることにより、安定化させることが可能となった。したがって、本発明のナノ粒子は、医薬品、医薬部外品、化粧品として使用することができる。
【００１９】
本発明のレチノールまたはその誘導体を含有したナノ粒子を皮膚あるいは粘膜へ適用した場合、ナノ粒子やそこに含有されるレチノールまたはその誘導体の皮膚への浸透が高く、また、皮膚に高濃度に滞留しやすいため、皮膚におけるレチノールまたはその誘導体の効果の持続を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書において、単に％と記した場合は、％（Ｗ／Ｖ）を意味するものがある。
本発明が提供するレチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子（以下、単にナノ粒子と記載する場合もある）は、その平均直径（平均粒子径）は約１〜５００ｎｍであり、好ましくは約１〜３００ｎｍ、さらに好ましくは約１０〜２００ｎｍである。本発明のナノ粒子においては、その平均粒子径は目的に応じて選択できるが、安定性や吸収性の観点から、１〜３００ｎｍが好ましく、さらに約１０〜２００ｎｍが好ましい。
【００２１】
かかる粒子径は、含有させるレチノールまたはその誘導体に対する疎水基と陰イオン残基を有する有機化合物との配合比率、界面活性剤の添加量、塩基性塩の添加量、使用する溶媒量、攪拌の強度などによって調整することができる。粒子径の測定は、光散乱法あるいは電子顕微鏡下で測定することができる。
【００２２】
本発明に用いるレチノールまたはその誘導体としては、レチノールの各種異性体および／またはそのエステル類を例示することができる。異性体はオールトランス型または１,３−シス型が好ましい。さらに詳細には、レチノール、酢酸レチノール、酪酸レチノール、プロピオン酸レチノール、オクチル酸レチノール、ラウリル酸レチノール、パルミチン酸レチノール、オレイン酸レチノール、リノレン酸レチノールなどの脂肪酸エステル、リン酸エステル、燐脂質複合体、一価アルコールとのエーテル、多価アルコールとのエーテルなどが挙げられる。
【００２３】
これらのうち、好ましくは、レチノール、酢酸レチノール、レチノールの脂肪酸エステルであり、特に好ましくは、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノールである。レチノールまたはその誘導体は一種だけでなく混合物であっても良く、レチノールまたはその誘導体を含有する水産動物の組織から得た脂肪油や抽出液であっても良い。
【００２４】
本発明が提供するナノ粒子の調製においては、レチノールまたはその誘導体はそのまま加えることが可能であるが、水、有機溶媒または含水有機溶媒に溶解して使用するのが好ましい。そのような有機溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコールが使用でき、なかでもアセトン、エタノールが好ましい。本発明においてナノ粒子中のレチノールまたはその誘導体の含有量は、目的に応じて調整することができるが、通常０．００１％以上、好ましくは０．００５％以上、さらに好ましくは０．０１％以上、特に好ましくは０．０５％以上である。
【００２５】
本発明の一次ナノ粒子を製造するためには、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基などの陰イオン残基と、アルキル基など疎水基を有する有機化合物が必要であり、それらを有していればいずれでもよいが、陰イオン残基としてカルボキシル基を有した中長鎖有機化合物が好ましい。陰イオン残基と疎水基を有する有機化合物としては、さらに炭素数６〜２４の不飽和または飽和脂肪酸あるいはそれらの塩が好ましく、具体的には、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸またはそれらの塩；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソステアリン酸などの飽和脂肪酸またはそれらの塩が挙げられる。そのなかでも、オレイン酸、ミリスチン酸、イソステアリン酸またはそれらの塩が特に好ましい。塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩などが使用できる。
【００２６】
これらの陰イオン残基と疎水基を有する有機化合物は、粉末である場合にはそのまま加えることが可能であるが、水、有機溶媒または含水有機溶媒に溶解して使用するのが好ましい。そのような有機溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコールが使用でき、なかでもアセトン、エタノールが好ましい。含水有機溶媒としては、これらの有機溶媒に水を加えたものを使用することが可能であるが、水の添加量は最大８０重量％程度とすることが好ましい。
【００２７】
レチノールまたはその誘導体と、陰イオン残基と疎水基を有する有機化合物との重量比は、１：０．０３〜３０程度が好ましく、１：０．０５〜２０程度がさらに好ましく、１：０．２〜１０程度が特に好ましい。
【００２８】
この一次ナノ粒子や二次ナノ粒子を製造する段階で、微細な粒子を含有する良好な均一状態を得るために撹拌機、プローブ型ソニケーターなどを使用し十分に攪拌することにより、また、フレンチプレッシャー、マントゴーリーなどを使用し圧力を強めることにより微細な一次ナノ粒子や二次ナノ粒子を作製することができる。
【００２９】
本発明の一次ナノ粒子を製造するに際しては、生成したナノ粒子同士の凝集を避けるために、適量の界面活性剤を添加するのが好ましい。その配合量は、ナノ粒子同士が凝集しない程度で適宜選択することができ、陰イオン残基と疎水基を有する有機化合物と界面活性剤との配合比は、モル比で１：０．０１〜１０程度が好ましく、１：０．０５〜５程度がさらに好ましい。
【００３０】
そのような界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤を使用することができる。そのなかでも、皮膚または粘膜への刺激性が低い等の点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート（ポリソルベート80）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ポリソルベート20）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ポリソルベート60）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート40）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート（ポリソルベート85）などのソルビタン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などのポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体；ポリオキシエチレングリセリンモノステアレート、ポリオキシエチレングリセリンモノイソステアレートなどのポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類；モノステアリン酸グリセリンなどのグリセリン脂肪酸類；ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類；ポリオキシエチレン２−オクチルドデシルエーテルなどのポリオキシエチレンアルキルエーテル類；レシチン；脂質−ポリエチレングリコール；モノラウリン酸ポリエチレングリコール、モノオレイン酸ポリエチレングリコール、モノステアリン酸ポリエチレングリコールなどの脂肪酸−ポリエチレングリコール；オレイン酸−ポリエチレングリコール共重合体など脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体などを使用することができる。
【００３１】
これらの界面活性剤は１種または２種以上を選択して使用することができる。特に、レシチン、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体、脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体が好ましく、さらに具体的には、レシチン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、オレイン酸−ポリエチレングリコール共重合体が好ましい。この場合の脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などの不飽和脂肪酸；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソステアリン酸などの飽和脂肪酸を挙げることができる。界面活性剤の量が多くなるほど粒径は大きくなるが、少なすぎても粒子間の凝集や大きな粒子が形成される。
【００３２】
本発明の一次ナノ粒子の調製に際しては、さらに植物油を添加することもできる。この場合に使用される植物油としては、大豆油、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、各種サラダ油等の植物油を好ましく使用することができる。
【００３３】
本発明のナノ粒子は、上述により得られる一次ナノ粒子を２価または３価の金属塩と作用させることにより得られる二次ナノ粒子、およびこの二次ナノ粒子を１価ないし３価の塩基性塩と作用させることにより得られる三次ナノ粒子からなる。
【００３４】
本発明の二次ナノ粒子を得るための２価または３価の金属塩としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウムなどのカルシウム塩；酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛塩；塩化鉄、硫化鉄などの鉄塩；または塩化銅、硫化銅などの銅塩であり、なかでもカルシウム塩、特に塩化カルシウムが好ましい。
【００３５】
この金属塩は水和物でも使用することができる。金属塩の配合量は一概に限定し得ないが、レチノールまたはその誘導体と金属塩との重量比で、１：０．００１〜１０程度が好ましく、１：０．００２〜５程度がさらに好ましく、１：０．０１〜５程度が特に好ましい。
【００３６】
また、三次ナノ粒子を得るための１価ないし３価の塩基性塩をしては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの炭酸水素塩；リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウムなどのリン酸水素塩；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウムなどのリン酸塩；シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、シュウ酸カルシウムなどのシュウ酸塩；乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウムなどの乳酸塩；尿酸ナトリウム、尿酸カリウム、尿酸カルシウムなどの尿酸塩などを挙げることができる。そのなかでも炭酸水素塩、炭酸塩が好ましく、特に炭酸ナトリウムが好ましい。塩基性塩の配合量は一概に限定し得ないが、上記２価または３価の金属塩と塩基性塩とのモル比で、１：０．００２〜１０程度が好ましく、１：０．００１〜５程度がさらに好ましく、１：０．０２〜２程度が特に好ましい。
【００３７】
以下に、本発明のナノ粒子の製造方法について説明する。
まず、レチノールまたはその誘導体と、陰イオン残基と疎水基をもつ有機化合物と界面活性剤とを有機溶媒または含水有機溶媒に溶解し、この溶液を多量の水性媒体、好ましくは水に分散させ、この溶液を１〜３０分間程度攪拌することにより一次ナノ粒子が作製される。
【００３８】
かくして作製された一次ナノ粒子を含有する溶液に、２価または３価の金属塩を作用させ、二次ナノ粒子を調製する。具体的には、一次ナノ粒子を含有する溶液に、２価または３価の金属塩を加え、１〜３０分間撹拌して二次ナノ粒子を調製する。
【００３９】
次いで、かくして得られた二次ナノ粒子の溶液に１価ないし３価の塩基性塩を作用させ、三次ナノ粒子が調製される。具体的には、二次ナノ粒子の溶液に１価ないし３価の塩基性塩を加え、１分〜２４時間攪拌することにより三次ナノ粒子を得ることができる。
【００４０】
なお、ここで使用する水性媒体とは、好ましくは水であるが、水以外の含水有機溶媒、例えば、含水アルコール等であっても何等差し支えない。要は、ナノ粒子として分散し得る水性媒体であればよい。
【００４１】
かくして製造された本発明のレチノールまたはその誘導体を含有する二次ナノ粒子または三次ナノ粒子は、その粒子を含有する溶液をそのまま使用するか、または、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等をすることにより溶媒を除去し乾燥物として使用できる。これらの溶液または乾燥物と、適宜製剤基剤、添加剤等を使用することにより、所望の非経口投与用製剤である皮膚・粘膜適用型外用剤または注射用剤を調製することができる。
【００４２】
本発明は、また、そのような皮膚・粘膜適用型外用剤または注射用剤を提供するものである。そのような外用剤としては、全身および局所投与・治療を目的として局所へ塗布、貼付、滴下、噴霧などの形態で投与しうるものであり、具体的には、軟膏剤、ゲル剤、舌下剤、口腔錠剤、液剤、口腔・下気道用噴霧剤、吸引剤、懸濁剤、ハイドロゲル剤、ローション剤、パップ剤、貼付剤等を挙げることができる。液剤としては点鼻剤、点眼剤が好ましい。
【００４３】
また、皮膚または粘膜への塗布、下気道への噴霧などが有効な投与形態である。注射用剤としては、静脈注射、皮下注射、筋肉注射のいずれの投与形態も可能である。
【００４４】
これらの外用剤、注射剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に外用剤、注射剤の調製に使用されている基剤、成分を挙げることができる。具体的には、ワセリン、プラスチベース、パラフィン、流動パラフィン、軽質流動パラフィン、サラシミツロウ、シリコン油などの油脂性基剤；水、注射用水、エタノール、メチルエチルケトン、綿実油、オルーブ油、落花生油、ゴマ油などの溶剤；ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、ゼラチン、アルブミンなどの増粘剤；ジブチルヒドロキシトルエンなどの安定化剤；グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、尿素、ショ糖、エリスリトール、ソルビトールなどの保湿剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｐ−クレゾールなどの防腐剤であり、剤型に応じて適宜選択して使用することができる。
【００４５】
また、点鼻剤の場合、ヒドロキシプロピルセルロースなどの経鼻吸収促進剤の配合が好ましい。さらに、ハイドロゲル剤とするには、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのゲル化剤を使用するのがよい。例えば、本発明のナノ粒子を有効成分として含有する軟膏剤の場合には、基剤等の成分としてワセリンを使用し、懸濁安定化するために０．０５〜０．５％のカルボキシメチルセルロースナトリウムを一緒に使用するのがよい。
【実施例】
【００４６】
以下に本発明の実施例、試験例について記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例１：ナノ粒子の作製
精製水８５０μＬにオレイン酸ナトリウム水溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加えて攪拌した。さらに、ポリソルベート８０水溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）２０μＬおよびレチノールのエタノール溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加えて、攪拌し、一次ナノ粒子を含有する溶液を作製した。この一次ナノ粒子を含有する溶液に、１Ｍ塩化カルシウム水溶液を２５μＬ加えて攪拌し、二次ナノ粒子を含有する溶液を作製した。さらに、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液を５μＬ加え、三次ナノ粒子を含有する溶液とした。
【００４８】
得られた粒子の粒子径を、動的光散乱式粒度分布測定器（NICOMP 380ZLS、米国Particle Sizing Systems社）で測定したところ、三次ナノ粒子の平均粒子径は９．２２ｎｍであった。さらに、１０，０００ｒｐｍ／１０分間遠心し、上清（三次ナノ粒子溶液）中のレチノール濃度を、高速液体クロマトグラフィーを用い定法に従って定量したところ、三次ナノ粒子のレチノール含有率は、投入量に対して８０．８％であった。三次ナノ粒子のレチノール含有率は、下記の式により算出した。
レチノール含有率（％）＝（上清中のレチノール濃度×上清容量）／投入量×１００
【００４９】
試験例１：カルシウムおよび界面活性剤がナノ粒子形成に及ぼす影響について
５．０ｍｇ／ｍＬオレイン酸ナトリウム水溶液と、下記表１、２に記載した塩化カルシウム水溶液、ポリソルベート８０水溶液を調製し、実施例１の方法に従い、三次ナノ粒子を作製し、粒子径と三次ナノ粒子のレチノール含有率を測定した。
それらの結果を下記表１および２に示した。
【００５０】
【表１】
2006249010.tif 000002
【００５１】
＊１：オレイン酸とポリソルベート８０とのモル比（［ポリソルベート８０］／［オレイン酸］）は、ポリソルベート８０水溶液濃度が２、１０、２０ｍｇ／ｍＬにおいて、それぞれ０．９３、０．４７、０．９３である。
【００５２】
【表２】
2006249010.tif 000003
【００５３】
表中に示した結果からも判明するように、レチノール含有率ならびに粒子径の測定値より、いずれの条件においても、レチノールを含有する三次ナノ粒子が作製されたことが確認された。
【００５４】
実施例２〜４／比較例１、２：三次ナノ粒子の調製
下記表３に示した処方により、三次ナノ粒子を調製した。三次ナノ粒子の調製は、実施例１の調製方法に準じ、精製水に、オレイン酸ントリウムまたはラウリン酸ナトリウムを溶解した後、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０と、エタノールに溶解したレチノールとを攪拌し、１Ｍ塩化カルシウムおよび１Ｍ炭酸水素ナトリウムを順次撹拌しながら添加することにより調製した。
【００５５】
【表３】
2006249010.tif 000004
【００５６】
試験例２： レチノール含有ナノ粒子の安定性試験
表３の処方により調製した実施例および比較例の三次ナノ粒子溶液において、平均粒子径、濁度およびレチノール含有量を、調製直後および４０℃１４日間保存後に測定した。平均粒子径は動的光散乱式粒度分布測定器にて、濁度は５５０ｎｍの吸光度にて測定し、また、レチノール含有量は高速液体クロマトグラフィーを用い定法に従ってレチノール含量を定量し残存率を算出した。
その結果を下記表４にまとめて示した。
【００５７】
【表４】
2006249010.tif 000005
【００５８】
表中に示した結果からも判明するように、本発明のナノ粒子にすることによって、レチノールの保存安定性は著しく向上していた。
【００５９】
試験例３： ナノ粒子の吸収性試験
本発明の三次ナノ粒子の皮膚への吸収性について評価した。
まず、６週齢のヘアレスマウス（雌、ＨＲ−１系、日本ＳＬＣ株式会社）を安楽死させた後、背部から皮膚を摘出した。これを平板膜用透過実験装置（容量：５ｍＬ、有効面積：０．６４ｃｍ２、ＶＩＤＲＥＸ社製）に装着し、レセプター（真皮側）溶液に５０％エタノールを満たした。平板膜用透過実験装置のウォータージャケットに水を還流することでセル内を３７℃に一定とし、被検体として実施例１および比較例１のサンプルを用い、各５ｍＬをドナー（角質層）側に満たして吸収試験を行った。２４時間経過した後に平板膜用透過実験装置から皮膚を取り外し、精製水で洗浄して皮膚表面に付着したレチノールを除去した後に、皮膚をホモジナイズした後、レチノールを抽出して、皮膚中のレチノール含有量を液体クロマトグラフィーにより定法に従って定量した。
その結果を下記表５に示した。
【００６０】
【表５】
2006249010.tif 000006
【００６１】
表中に示した結果からも判明するように、レチノールの皮膚への吸収性は、本発明のナノ粒子にすることによって、著しく向上していることが理解される。
【００６２】
実施例５／比較例３：外用クリーム
下記表６に従い、（１）〜（５）の油相成分を混合、溶解して７５℃に保った。別に、（６）〜（７）の水相成分を混合して７５℃に保った。この水相成分の混合物に前記油相成分の混合物を添加して、ホモミキサーにて均一に乳化し、４０℃に冷却した後、さらにこれに（８）〜（９）の成分を添加して均一に混合し、皮膚用クリームを得た。
【００６３】
【表６】
2006249010.tif 000007
【００６４】
上記の実施例５で得た皮膚外用クリームについて、顔面に顕著なシワの発生が認められる被験者に３ヶ月間用いた結果、シワ改善効果を認められた。
【００６５】
以上の結果から、本発明のナノ粒子にはレチノールが安定的に含有されており、高い経皮吸収性が確認できた。本発明のレチノールナノ粒子を含有する皮膚外用剤では、より多くのレチノールを皮膚内に届けることができるため、レチノールの抗シワ効果などの有効な作用を十分に発揮することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上記載のように、本発明により、全身投与および局所投与を目的とした皮膚または粘膜投与により優れた経皮吸収性を有する、レチノールまたはその誘導体を含有するナノ粒子が提供される。
本発明のナノ粒子は、経皮投与することにより、表皮から深部まで良好に浸透し、真皮、皮下組織にレチノールまたはその誘導体を高濃度に分布することができるため、皮膚を形成する細胞に作用させるのに有用である。
したがって、本発明のナノ粒子を含有する外用剤は、ニキビ、色素沈着、小ジワ、皮膚の光老化などの肌トラブルを改善するのに極めて有用であり、その産業上の利用可能性は多大なものである。