(57)【要約】【課題】外部振動を利用した表面プラズモン共鳴センサー装置において、同一センサーチップ上で、少なくとも２以上の試料を含むサンプルの分析方法および装置を提供する。【解決手段】リガンドを固定化するスペーサー分子を異なる構成にすることにより、スペーサー分子毎に周波数特性が変化する。この周波数特性の違いによって同一センサーチップ上で、各リガンド分子に対応して結合するアナライト分子を含む複数種類のサンプルの多試料を測定可能となる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴法用法においてセンサー表面に外部振動を印加し、外部振動に対する共鳴角の周波数特性により、サンプル中の測定分子であるアナライト分子と前記アナライト分子と結合するリガンド分子の相互作用を分析する手段であって、前記リガンド分子を固定化するスペーサー分子の構成が異なることを特徴としたサンプルの測定方法。
【請求項２】
前記スペーサー分子がチオールまたはジスルフィドを有する自己組織化膜で、鎖長が異なることを特徴とした請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スペーサー分子は、分子密度が異なることを特徴とした請求項１に記載の方法。
【請求項４】
表面プラズモン共鳴法用法においてセンサー表面に外部振動を印加し、外部振動に対する共鳴角の周波数特性により、サンプル中の測定分子であるアナライト分子と前記アナライト分子と結合するリガンド分子の相互作用を分析する手段であって、前記アナライト分子は分子量が異なることを特徴としたサンプルの測定方法。
【請求項５】
振幅の減少幅を測定することで、請求項２または請求項３により前記アナライトの同定を行うことなく同一センサー上で少なくとも２以上の試料を含むサンプルの測定が可能であることを特徴とした請求項１または、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アナライトとリガンドの少なくとも一方が電荷を帯びていることを特徴とした請求項１または、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記印加手段が電気的および機械的振動の少なくとも一方を印加する手段であることを特徴とした請求項１または、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項１または、請求項４に記載の方法であって、前記レセプターと結合した前記サンプル中のアナライト量を分析することを特徴とした方法。
【請求項９】
結合した前記アナライト物質がタンパク質又はペプチドであることを特徴とした請求項１または、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
結合した前記反応物質が抗体又はその抗原結合性断片であることを特徴とした請求項１または、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析手段が、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較する比較手段を更に含む請求項１に記載の方法であって、前記周波数特性を得る行程が、前記比較手段により、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較して、前記周波数特性の変極点を検出することにより行われる方法を利用した少なくとも２以上の試料を含むことを特徴としたサンプルの測定方法。
【請求項１２】
前記印加手段が、電気的振動を少なくとも印加する手段である請求項７に記載の方法であって、前記分析手段から更に前記リガンドの物理学的物性を分析可能であることを特徴とした装置。
【請求項１３】
前記分析手段が、比較手段を更に含む請求項１２の装置であって、前記比較手段が前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較して、前記周波数特性の変極点を検出可能であることを特徴とした装置。
【請求項１４】
計測手段を更に含む請求項１３に記載の装置であって、前記計測手段が、前記周波数特性の変極点の時間変化を計測することにより、前記アナライトと前記リガンドとの結合の度合いを検出可能であることを特徴とした装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外部より振動を印加する表面プラズモン共鳴装置により、リガンド分子とアナライト分子との相互作用を少なくとも２以上の試料を含むサンプルの測定方法ができる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法は、センサーチップ（ガラス基板上に、金等の金属を蒸着したもの)の下面に接触している溶液等の媒質の屈折率が変化すると、該金属薄膜の上面にプリズムを通して種々の角度で入射する光の反射光のうち、強度の低下した反射光の角度が変化することを利用して、媒質の屈折率の変化を測定する方法である。例えば、金属薄膜表面にリガンドを結合させておき、リガンドがアナライトに結合すると、その金属薄膜近傍の誘電率が変化する。表面プラズモン共鳴現象を利用して、その変化を検出し、リガンドとアナライトの結合量を分析法が知られている。（例えば、非特許文献１参照）。また、リガンドが固定化されている金属薄膜の裏面に電界を印加することで金属薄膜に試料の分離及び移動制御する技術（例えば、特許文献１参照）や金属薄膜の屈折率の変化を利用して多量の試料を一度に計測する技術が提案されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、これらの方法では、リガンドに結合したアナライトの量を表面プラズモンが励起して光量が減少する微小な角度変化量から解析している。また、リガンドが固定化された領域に外部振動を印加する印加手段に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性からリガンドと結合したアナライトを分析する方法が提案されている。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０，２０１９−２０２４
【特許文献１】特開２００３−６５９４７号公報
【特許文献２】特開２００２−７５３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来、表面プラズモン共鳴センサーによる多項目測定を行う場合では、測定項目に対応するセンシング分子、例えば抗体を、それぞれの項目ごとに独立させたセンサーに固定化する必要があった。同時多項目測定を行うために、二次元SPRセンサーが提案されているが、抗体の固定化法や測定感度の面で課題があった。本発明は、同一センサー上で同時多項目測定が可能な外部振動による表面プラズモン共鳴センサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の課題を解決するために、本発明の外部振動を用いる免疫測定装置は計測光を照射する手段と、前記計測光の反射光あるいは透過光を受光する手段と、固定したリガンド領域に外部振動を印加する手段と、リガンド分子の方向転換の周波数特性を計測する手段とを備えたもので、外部振動を印加しながら表面プラズモン共鳴を生じる角度変動の周波数特性を計測する。周波数特性はアナライトの分子量、結合量及びリガンドを固定化しているスペーサーの種類によって決まる。すなわち、低分子量と高分子量の測定では、アナライトの分子量が違うため、周波数特性が異なるため、同時測定が可能である。アナライトの分子量に差が少ない場合には、リガンドのスペーサーの質量差を用いることにより周波数特性を変化させることができ、同時多項目測定が可能な外部振動による表面プラズモン共鳴センサーを提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の分析法および装置では外部振動を与え、この外部振動に対しアナライトの分子量の差によって表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得る。このように分子量の差によって周波数特性が異なるため同一センサー上で、アナライトの測定が可能である。また、同一分子量のアナライトの測定にはスペーサーの質量を変えることにより、多試料測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に、本発明の免疫測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【実施例１】
【０００７】
図１は、本発明の第１の実施例における免疫測定装置の最適な形態を示す。図１において１は光源、２はプリズム、３は入射光、４は受光装置、５は反射光、６はＳＰＲ共鳴角、７は金属薄膜兼上部電極、８は下側電極、９は金属薄膜兼上側電極に固定されたリガンド分子、１０は交流源、１１及び１２は特定周波数のみを通すアクティブフィルター、１３は外部振動の位相（θ０）と、反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ１）を比較する検出器、１４は検出器１３により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター、１５は外部振動である。また、１６はサンプル中のアナライトである。光源１は、プリズム２に全反射の条件で光を照射する位置に配置される。その照射される金属薄膜兼上側電極７の照射面の裏面にはリガンド９が固定されている。受光装置４はプリズム２で反射された反射光５を受光できる位置に配置される。下側電極８は、金属薄膜兼上側電極７に固定されたリガンド９に、外部振動を印加しうるように配置される。図１において、金属薄膜兼上側電極７を装置の上側、下側電極８を装置の下側に配置したが、その上下を逆転しても、または、装置の左右側に配置しても有効であることは言うまでもない。受光装置４を用いて、ＳＰＲ共鳴角６を含むその反射光５の強度を検出する。さらに金属薄膜兼上側電極７及び下側電極８に交流源１０を接続する。交流源１０によりｆの周波数を持った外部振動１５が金属薄膜兼上側電極７に印加される。外部振動によりリガンド９が振動する。この振動により、リガンド９の誘電率を変化させ、共鳴角の変化を受光装置４で検出する。アクティブフィルター１２で外部振動の信号成分以外が除去され、検出器１３で外部振動の位相と反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相が比較される。なお、光源１としては、Ｈｅ−Ｎｅレーザー、Ａｒレーザー、色素レーザー等を用いることができ、例えば、ＡｌＧａＡｓダブルへテロ接合可視光半導体レーザー、（例えば、ＲＯＨＭ社製）、コリメートレンズ（例えば、松下日東社製）及び偏光ビームスプリッター（例えば、シグマ光機社製）から構成されてもよい。プリズムとしては、円錐形状、半球形状等を用いることができる。受光装置４は、ＣＣＤ、Ｓｉ、ＰＩＮ、フォトダイオード（例えば、浜松フォトニックス社製）等にオペアンプ（例えば、ナショナルセミコンダクター社製）及び抵抗素子を用いて反射光５の強度を電圧に変換する装置であってもよい。
【０００８】
図２に定量方法を示す。図２（ａ）は図１に示す外部振動装置８と反射光に含まれるレセプターの振動１２の信号成分の位相を比較することによって得られる。周波数特性の変極点（追従周波数限界）を検出することによって、測定精度の高い結果を得ることが可能となる。図２（ｂ）は周波数特性の変極点を時間変化として計測した結果である。変極点の時間変化を計測することによって、リガンドに結合したアナライトの量を測定可能となる。結合アナライトが増えるに従って、変極点の時間変化はｔ１からｔ３へと時間が長くなる。時間変化と結合アナライトは比例するため定量が可能となる。
【０００９】
図３にセンサー膜の作成方法を示す。金属膜上に自己組織化膜（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ，ＳＡＭ）を構成する分子としてアルキルチオールがある。本実施では、１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（アルドリッチ社製）をスペーサーとしてリガンドの固定化を行った。作成法は、チオール分子２．５ｍMエタノール溶液を調製し、ガラス基板上に金膜を形成した市販のＳＰＲ用センサーチップ（金膜厚５０ｎｍ、サイズ９ｍｍ×９ｍｍを有するガラス板）を各溶液中に室温下、２４時間浸漬しＳＡＭを形成させた。ＳＡＭ膜を形成させた後、エタノール溶液にて洗浄し、ＳＰＲ用センサーチップを得た。図３（ｂ）にチオール分子の構成が異なるセンサー膜を示す。また、図２（ａ）を作成するためには、ＳＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒを用いることが可能である。ｎは、１ないし３０の整数でＲはカルボキシル基またはアミノ基である。図３（ｃ）にＳＡＭとして使用可能なチオール分子の基本構造を示す。次にリガンド分子の固定化法を示す。上記で作製したセンサーチップのSAMのチオール分子のカルボキシル基に、抗体を結合した。この操作は具体的に次のようにして行った。０．４Ｍ  ＥＤＣ（アルドリッチ社製）／０．１Ｍ  ＮＨＳ（アルドリッチ社製）、（ＥＤＣ：Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド、ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）によりカルボキシル基を活性化させた。ＥＤＣ／ＮＨＳは、超純水（Ｍｉｌｉ  Ｑ水）に溶解させた。活性時間は７分間行った。活性化したカルボキシル基にタンパク質のアミノ基を利用して、カップリングさせた。牛血清アルブミン抗体（フナコシ社製）の濃度は１００μｇ／ｍｌで、１０ｍＭ 酢酸バッファーｐＨ４．５（和光純薬社製）に溶解させた。また、固定化時間は７分間とした。最後に未反応の活性化したカルボキシル基を１MエタノールアミンｐＨ９．０（和光純薬社製）を用いて不活性化した。
【００１０】
図４に低分子（薬物等）と高分子（タンパク質等）の同時定量の概念図を示す。センサー部は、図３（ａ）の単一スペーサーのみからなるセンサーチップである。外部振動（ｆ）、測定時間（ｔ）との相関関係を、図４を用いて以下に説明する。低分子としてアスピリン（分子量１８０）（アルドリッチ社製）、高分子として牛血清アルブミン（６６ｋＤａ）（アルドリッチ社製）をアナライトとする。図３（ａ）のセンサーチップには抗アスピリン抗体（フナコシ社製）及び抗牛血清アルブミン抗体（フナコシ社製）を前記方法にて固定化する。同一センサー上で同一スペーサーを用いてリガンド分子を固定化し、アナライトの分子量の異なる物質の相互作用は図４（ｂ）となり、このときの周波数特性は図４（ａ）となる。牛血清アルブミンの周波数特性は、図４（ａ）中に示す追従周波数限界ｆ２として得られる。これは、牛血清アルブミンのような高分子物質がリガンド分子に結合することによってリガンド分子の質量が増加し、外部振動に追従不可となることによる。一方、アスピリンの様な低分子化合物では、リガンド分子の質量増加が微量であるため、牛血清アルブミンに比べ高い周波数まで追従が可能となるため、周波数特性は、図４（ａ）中に示す追従周波数限界ｆ１として得られる。従って、アナライトの分子量の差が大きい場合には低分子及び高分子の追従周波数限界を同一のセンサー上で得ることが可能である。
【００１１】
図５にスペーサーの長さが異なるセンサーチップによる追従周波数を測定したときの概念図を示す。図５（ａ）は、牛血清アルブミン（６６ｋＤａ）、人血清アルブミン（６８ｋＤａ）の同時定量時に得られる追従周波数特性図である。追従周波数限界ｆ１は、牛血清アルブミンの周波数であり、追従周波数限界ｆ２が人血清アルブミンである。図５（ｂ）で示しているように、スペーサーの長さが異なるため、異なる周波数特性が得られる。図５（ｂ）中に示す追従周波数限界ｆ１は牛血清アルブミン抗体を固定化し、追従周波数限界ｆ２には人血清アルブミン抗体を固定化した。スペーサーの長さは、振り子の原理を利用するとスペーサーが１／ｎとなると周波数はｎ１／２倍となり、スペーサーが短くなる程、周波数が高くなるので同一チップ上でスペーサーの長さが異なる事で、多様の周波数特性を得ることが可能であるため、同時定量が可能となる。
【００１２】
図６にアナライトの分子量がほぼ同様で、スペーサー質量が異なる時の追従周波数を測定したときの概念図を示す。図３（ｂ）で作成したセンサーにリガンド分子を固定化させ、外部振動を印加したときに得られる概念図である。オボアルブミン（４５ｋＤａ）、牛血清アルブミン（６６ｋＤａ）、人血清アルブミン（６８ｋＤａ）を図６（ｂ）の様に測定を行った場合、周波数特性は図６（ａ）として得られる。従って、スペーサー質量に変化が無いときは、追従周波数を測定することは困難である。これは、同程度のアナライトの分子量でスペーサーの質量が同種であるときでは、追従周波数特性に差が無いことに起因する。そこで、スペーサーの密度が異なるセンサーチップ図６（ｄ）を用いることによって、リガンドの追従周波数を変化させることが可能となる。ＳＡＭに使用したＬ：ＳＨ−（ｄｅｘｔｒａｎ）−ＣＯＯＨにおいて、Ｌのデキストランの構成成分をグルコースとした場合、Ｓ：ＳＨ−（ＣＨ２）−ＣＯＯＨとの重量比は約１０倍、Ｌ鎖の方が重くなる。この重量比はチオール鎖が長くなるにつれ大きくなり、デキストランの重合割合を変化させることにより、スペーサーの重量比を任意に変化させることが可能である。また、Ｓ鎖より多少重くしたい場合には、Ｍ鎖を用いることにより、重量に変化を持たせることが可能である。
【００１３】
図７（ａ）に縦軸に振幅（Ａ）を横軸に追従周波数限界（ｆ）をとった図を示す。ｆ３、ｆ２、ｆ１の振幅は、それぞれ、図６（ｄ）のセンサーチップのスペーサーＬ、Ｍ、Ｓの追従周波数限界を示している。Ｆ３の周波数印加時には、Ｌが追従不可となるため、Ｌ分の振幅が減少し、この減少分は図７（ａ）のＡ１に相当し、このときの状態は図７（ｂ−１）となる。続いてｆ２の周波数印加時にはＭが追従不可となるため、Ｍ分の振幅が減少し、この減少分は図７（ａ）のＡ２に相当し、このときの状態は図７（ｂ−２）となる。同様にｆ１の周波数印加時には、Ｓが追従不可となるため、Ｓ分の振幅が減少し、この減少分は図（ａ）のＡ３に相当し、このときの状態は図７（ｂ−３）となる。また、このとき分子が受ける力Ｆは、次式の様に示される。Ｆ＝１／２ρＳＶ２、ここでρはスペーサーの密度、Ｓはスペーサーの断面積、Ｖはアナライトの速度を示している。従ってスペーサーの断面積が大きく、密度が高いほど力Ｆを受け外部振動に追従不可となるＬ鎖に結合したアナライトは、スペーサー質量が重く密度が高いため周波数特性は、Ｍ，Ｓ鎖に比べ低くなり、図６（ｃ）中に示す追従周波数限界ｆ３となる。一番軽いスペーサーＳ鎖は、密度が低いため最後まで外部振動の影響を受け、周波数特性はＬ，Ｍ鎖に比べ高くなる。Ｍ鎖はＬ，Ｓの中間値を示す。Ｌ，Ｍ，Ｓ鎖が追従不可となるにつれ、振幅の幅は減少し、それぞれの周波数特性が得られる。従って、スペーサーの質量を変化させることによって密度が異なり、多数の追従周波数限界を得ることができ、同一チップ上で同時多項目測定が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
以上のように、本発明の分析法および装置は、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を測定するのであり、測定物質によって異なる周波数特性を得る事によって、従来困難であった同一センサー上での多項目測定が可能となる。従って、本発明の分析方法および装置は、サンプル中の多項目を分析するのに有用であり、例えば、生物学、医学、薬学、農学等の分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の装置の一例を示した模式図
【図２】変極点（追従周波数限界）を用いた定量法の説明図
【図３】本発明のセンサーチップの構成図および構造式を示す図、（ａ）同一チオール分子によるセンサーチップの構成図、（ｂ）スペーサーの構成が異なるチオール分子によるセンサーチップの構成図、  （ｃ）センサーチップを構成することが可能なチオール分子の構造式を示す図
【図４】分子量の異なるアナライトの同時測定の概念図、（ａ）分子量の異なる物質から得られる周波数特性を示す図、（ｂ）センサー表面上の概念図
【図５】スペーサーの長さが異なるセンサーチップの構成図、（ａ）同程度のアナライトから得られる周波数特性を示す図、（ｂ）センサーチップの概念図
【図６】分子量の差が無いアナライト測定図、（ａ）同一スペーサーのセンサーチップから得られる周波数特性を示す図、（ｂ）その時のセンサー表面上の概念図、（ｃ）スペーサーの種類を変えたときに得られる周波数特性を示す図、（ｄ）センサー表面上の概念図
【図７】スペーサーの種類を変えたときの振幅変化を示す図、（ａ）スペーサーの種類を変えたときに得られる振幅の変化図、（ｂ−１）振幅Ａ１におけるセンサー表面上の概念図、（ｂ−２）振幅Ａ２におけるセンサー表面上の概念図、（ｂ−３）振幅Ａ３におけるセンサー表面上の概念図
【符号の説明】
【００１６】
１  光源
２  プリズム
３  入射光
４  受光装置
５  反射光
６  ＳＰＲ共鳴角
７  金属薄膜兼上部電極
８  下部電極
９  リガンド分子
１０  高周波源
１１、１２  アクティブフィルター
１３  位相検出器
１４  Ａ／Ｄコンバーター
１５  外部振動
１６  アナライト分子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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