(57)【要約】      （修正有）【課題】植物に少なくとも一種の組み換え遺伝子産物またはその機能的フラグメントを導入する無種子繁殖方法の提供。【解決手段】シロイヌナズナに由来するＲＫＳ１０の核酸分子にハイブリッド形成可能な受容体様キナーゼをコードする核酸、またはその機能的フラグメントを植物材料に導入することにより根部および／または芽部の形成開始を促進し、培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略することを特徴とする植物の増殖方法、ならびに植物の増殖方法に使用する核酸、ベクタ、宿主細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１５に記載の、ＲＫＳ１０の核酸分子にハイブリッド形成可能な、受容体様キナーゼをコードする単離および／または組み換え核酸またはその、機能的フラグメントまたは機能的等価物。
【請求項２】
図１５に記載の、ＲＫＳ１０の核酸分子に対して少なくとも７５％相同であることを特徴とする請求項１記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸がシロイヌナズナに由来することを特徴とする請求項１または２に記載の単離および／または組み換え核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸を含むことを特徴とするベクタ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸または請求項４記載のベクタを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項６】
植物出発材料に少なくとも１種の組み換え遺伝子産物またはその機能的フラグメントを導入することにより根部および／または芽部の形成開始を促進し、培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略することを特徴とする、植物出発材料からの植物の増殖方法に使用するための、請求項１〜３にいずれか１項に記載の核酸、請求項４記載のベクタまたは請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
図１５に記載の、ＲＫＳ１０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、受容体様キナーゼ活性を有する単離および／または組み換え蛋白性物質。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸によってコードされることを特徴とする請求項７記載の蛋白性物質。
【請求項９】
請求項７または８記載の蛋白性物質を特異的に認識することを特徴とする単離または合成抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞の再生、（微）生物の自己復元、植物の組織又は器官のような植物の一部の栄養繁殖、例えば組織又は器官の培養物中で増殖する細胞の領域に関し、より具体的には植物体の無種子（ｓｅｅｄｌｅｓｓ）繁殖に関する。
【０００２】
植物および動物の細胞の、より多くの細胞、組織、器官、および完全な植物体および生物体への復元は、既に長い間、人間の気まぐれおよび望みの対象であった生物にとって中心的な過程である。特定の微生物スターター培養物の自己復元は、食品および飲料の発酵に使用されている。さらに、抗生物質又は酵素の製造のための最新の大規模発酵培養物により産生されるような、それらが産生する代謝物自体のため有用である培養物もある。動物細胞の範囲では、復元した培養細胞の使用は、かなり最近のことであるが、細胞又は組織の培養物におけるたとえばウイルスワクチンの製造で大きく飛躍した。さらに最近では、個体から採取し、培養物中で増殖および／又は分化させたドナー細胞が、移植目的のため使用されている。そのような細胞（たとえば骨髄細胞）は、十分に再生させられ分化させられた後、増殖させられるか、又は所望の特徴を付与され、医学的目的のためレシピエントへと移植される。簡単に述べると、そのような療法は、最新の組換え技術による形質転換により所望の特徴を付与され、そして移植されるトランスジェニック細胞すら含むであろう。
【０００３】
再生は、栄養繁殖においてそれが重要である植物においてきわめて多く研究されている。原則として、所望の植物体を得るためには、２つの様式、すなわち種子を介した様式、又は出発材料として種子を使用しない栄養的な様式、で繁殖させることができる。いずれの型の繁殖も、ある種の条件下では、不可能であるか又は望ましくない場合がある。種子を介した繁殖が不十分なものである場合（所望の種子が全く、もしくはほとんど形成されないか、又は所望の種が急速に発芽力を失う場合）には、無種子繁殖が採用されることが多い。また、有性交配によって、その強いヘテロ接合性のためにきわめて異質な子孫が得られるか、又は得られる可能性のある場合にも、種子を介した繁殖は不十分と見なされる場合が多い。当然、本質的に無種子の出発材料の無種子繁殖は、後の段階において所望の種子を生じる場合があり、それは、さらに、所望の植物体を得るために使用されうる。
【０００４】
植物体の無種子繁殖は、インビボ栄養繁殖およびインビトロ栄養繁殖という２つの主要な領域に区別されうる。インビボ栄養繁殖（たとえば、挿木、分割又は分裂、取木、土寄せ、接木又は芽接ぎ、および庭師又は園芸家に既知のその他の方法）は、長年、農業において、たとえばジャガイモ、リンゴ、ナシ、多くの観賞球根植物およびジャガイモのような塊茎植物、多くの樹木作物、カーネーション、キク等のため重要な役割を果たしてきた。栄養繁殖は、植物育種においてもきわめて重要であり、親系統は、種子製造のため栄養的に維持され繁殖させられなければならず、遺伝子バンクの構築のためにはクローニングが必要とされる場合が多く、突然変異誘導後に固体変異体を得るためには不定根形成が必要とされる。
【０００５】
しかしながら、古典的なインビボ栄養繁殖法は、要求される水準に達しないか（過度に遅い、過度に困難、もしくは過度に高価）、又は完全に不可能である場合が多い。最近２０年間で、植物はインビボよりもインビトロでの方が迅速にクローニングされうることが発見されて以来、栄養繁殖に関する知識は急速に増加した。このことは、温帯植物についても、亜熱帯植物についても、熱帯植物についても、同様である。インビボのクローニングが不可能である種を、インビトロ培養技術によりクローニングすることすら可能となった。植物出発材料からのインビトロ栄養又は無種子繁殖の様々な方法は、たとえば、外植片又はカルス組織のような出発材料における単一節挿木、腋性分枝、不定器官（根又はシュート）の再生、および出発材料として使用された細胞又はプロトプラストの懸濁液からの植物体の再生を使用している。ほとんどの植物形質転換系の基礎となるのは個々の植物細胞の多能性であるため、形質転換又はトランスジェニック植物体の生成のためには、インビトロ繁殖が必須であるとさえ考えられる。
【０００６】
インビトロで出発材料から植物体を繁殖させるには、原則として、出発材料中の少なくとも１個の細胞が再生能を有していることが必要である。再生能は、たとえば、遺伝子型、環境条件（栄養供給量、調節物質、および物理的条件）、もしくは植物の発達段階、又はこれらの組合せにより決定される。Ｓｏｌａｎａｃｅａ（Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄａｔｕｒａ、およびＬｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ）、Ｃｒｕｃｉｆｅｒａ（Ｌｕｎａｒｉａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、Ｇｅｎｅｒｉａｃｅａｅ（Ａｃｈｉｍｅｎｅｓ、Ｓａｉｎｔｐａｕｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃａｒｐｕｓ）、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ（Ｃｈｉｃｏｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ）、Ｌｉｌｉａｃｅａｅ（Ｌｉｌｉｕｍ、Ｈａｗａｒｔｈｉａ、Ａｌｌｉｕｍ、Ｏｒｎｉｔｈｏｇａｌｕｍ）のようないくつかの科および属が高い再生能を有することは周知であるが、多くの装飾植物、低木、針葉樹、又は高木、特に果樹、Ｒｏｓａｃｅａ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａのような樹木種、およびＴｕｌｉｐａのような球根植物等は、インビトロ技術を用いたとしても困難であることは有名である。
【０００７】
前述のように、再生（（微）生物の自己復元、および植物、動物、又はそれらの一部の自己復元、すなわち栄養生殖／繁殖）は、微生物種、動物種、および植物種の界全体に観察される修復戦略とも見なされる。たとえば、植物における再生は、個々の細胞又は細胞群からの、根およびシュート両方の分裂組織を含有する新組織、別々のシュート又は根の分裂組織、植物器官又は器官原基の形成を含む。再生は、一般に、植物体の発生中に起こり様々な植物器官を形成させる正常な細胞および器官の分化の過程と類似している。正常な発生においては、個体発生初期に、共通の系統の細胞および組織が、発生シグナルに応答して、しばしば対照的な発生進路へと分岐する。この特定のシグナルに応答して発生する能力は、細胞反応能又は細胞発生能としても既知である。反応能を有する細胞は、特定の分化進路へと運命付けられると、他の経路には容易には分岐しない。この細胞発生能の拘束は、決定とも呼ばれる。
【０００８】
通常の条件下で、ある種の植物器官、分裂組織、又は器官原基の形成を開始することができない植物の細胞又は細胞群は、細胞の分化段階を修飾する細胞外刺激により刺激される場合が多い。細胞外拡散性因子は、植物細胞における細胞再分化にとって不可欠であることが示されている（ＳｉｅｇｅｌおよびＶｅｒｂｅｋｅ，１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，５８０−５８２）。最終的には転写調節を変化させる、細胞表面におけるこれらのシグナルの認知および細胞内シグナル伝達は、そのような細胞外刺激に応答する能力を細胞に供給する。再生は、シュートのみを形成させる場合もあるし、又は根のみを形成させる場合もあるし、又はそれら両方を形成させる場合もある。成熟した所望の植物体が発生しうる、必要な新生植物体の３次元配置、頂部−基底部又はシュート−根正面線図を、分化した組織が再び含むようになる再生は、細胞又は組織の再分化の後にのみ、可能である。
【０００９】
実際、無種子繁殖のためのインビトロ技術の中心は、これらの細胞外刺激と類似した、培養培地に添加されることが多い植物ホルモンおよびその他の因子である。再び完全に分化した植物体をもたらす、細胞、組織、又は外植片の培養におけるインビトロの体細胞性の胚形成又は器官形成の基礎となり、それらに先行する、最初の出発細胞の多細胞多能性組織への再生の過程には、一般に、よくバランスのとれた、植物種によって異なることの多い、植物ホルモンの培養物への添加が必要とされる。全体的には、オーキシンとサイトカイニンとの間のバランスが必要とされる。外因性のオーキシン（たとえば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、クロラムベン（ｃｈｌｏｒａｍｂｅｎ）、もしくはジカムバ（ｄｉｃａｍｂａ））又はサイトカイニン（たとえば、６−ベンジルアミノプリンもしくはゼアチン）又はそれら両方への曝露の後、細胞又は組織は、シュート−根正面線図の発達により、たとえばシュートおよび／又は根の形成により、反応する。それは容易である場合もあるし、適切なホルモンバランスが適切に選択されていない場合には特に、不安定である場合もある。
【００１０】
インビトロ再生、特にインビトロ培養物の操作可能性は、主に、これらの２つの型のホルモンの施用に依存し、培養中の植物ホルモン変化に対する組織の応答能にも依存する。一般に、再生には３つの期が認識されうる。第１期において、培養中の細胞は、器官誘導のホルモンシグナルに応答する能力（許容量ではない）として定義される「反応能」を獲得する。器官形成反応能の獲得の過程は、器官形成反応能を獲得するための、分化した細胞の「脱分化」と呼ばれることが多い。培養中の反応能を有する細胞は、第２期において、休止期の細胞の細胞周期への再進入、並びに植物ホルモンバランスの影響下で特定の原基および分裂組織を形成させるためのシュート−根正面線図の線に沿った細胞分裂の組織化のため、特定の組織および器官の形成へと導かれ、決定される。特に、オーキシンは、不定根開始のための特定の再生シグナル伝達経路に関与していると考えられており、サイトカイニンは、不定シュート開始のための特定の再生シグナル伝達経路に関与していると考えられている。
【００１１】
次いで、第３期において、形態形成、完全に分化した状態への植物体の生長が、外因的に供給されたホルモンとは独立に進行する。
【００１２】
外因性植物ホルモンの添加を介した再生を支配する一般原理は、このようにきわめてよく理解されているが、きわめて多くの個々の種について、妥当なバランス、妥当な投与時間、又はホルモンの妥当な型もしくは亜型を見出すインビトロ培養プロトコルの設計作業は、依然として、多かれ少なかれ試行錯誤の過程である。しかしながら、前述のように、きわめて多くの植物種にとって、特に一般に繁殖が困難なものにとっては、インビトロ再生又は無種子繁殖は、きわめて重要である。
【００１３】
本発明は、再生過程における培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、植物出発材料からの植物体の繁殖のための培養法を提供する。本方法においては、特にシュート−根正面線図の発生期において、植物発達の調節に関与する１個以上の遺伝子に由来する少なくとも１個の組換え遺伝子産物又はその機能的断片を出発材料に導入することにより、たとえば根又はシュートの開始のための少なくとも１個のシグナル伝達経路を刺激することにより、根又はシュートの開始が刺激される。好ましい実施態様において、本発明は、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、出発材料の再生を含む、植物出発材料からの植物体の栄養繁殖のための培養法を提供する。本方法においては、出発材料の再生の間、不定根又はシュートの開始のための少なくとも１個の特異的シグナル伝達経路が、内因的に刺激され、特に、経路は、ホルモン産生に関与する遺伝子もしくは遺伝子産物、ホルモン産生にフィードバックを与える遺伝子もしくは遺伝子産物、又は再生へと至るイベントカスケードに関与する遺伝子もしくは遺伝子産物のような、再生の発生調節に関与する１個以上の遺伝子に由来する組換え遺伝子産物により内因的に刺激される。
【００１４】
オーキシン又はサイトカイニンが最も広く使用されているのはインビトロ培養であるため、多くの装飾用植物、低木、針葉樹、又は高木、特に果樹、Ｒｏｓａｃｅａ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａのような樹木種、およびＴｕｌｉｐａのような球根植物のような、栄養繁殖のための再生が困難であることが有名な植物については特に、好ましくは、本発明により提供されるような方法は、再生過程中に少なくとも１つのインビトロ培養工程を含む。しかしながら、明らかに、ホルモンは、インビボ培養においても一般的に使用されており（インビボ培養とは、農業において伝統的に使用されている本質的に全ての作物又は植物の培養法）、ここで、そのようなホルモンは、一般に、（根又は茎の）浸漬、噴霧、又は潅水により添加されている。特に、本質的に無種子の様式で繁殖する植物は、より容易な再生又は繁殖が可能であり、したがって、好ましい実施態様において、本発明は、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、出発材料の再生を含む、植物出発材料からの植物体の本質的に無種子の繁殖のための培養法を提供する。方法においては、再生中、不定根又はシュートの開始のための少なくとも１つの特異的シグナル伝達経路が、たとえば前記の遺伝子産物により内因的に刺激される。
【００１５】
本明細書において、本質的に無種子の繁殖とは、出発材料が本質的に種子を含んでいないか、少なくとも出発材料中に存在する可能性のある種子が、出発材料の再生の基礎となっていないか、もしくは所望の植物体へと発達しないことと定義される。しかしながら、本発明により提供されるような再生を含む培養法の１つの面として、本発明による再生又は繁殖の過程の間、又はその後に、種子は形成されてもよく、本発明による繁殖の基礎としてではなく、その結果として、それから所望の植物体を発達させることすら可能である。
【００１６】
特に、本発明は、出発材料が、植物ホルモンの添加が自明であると考えられるインビトロ培養法において一般的に使用されている材料、個々の植物細胞又はプロトプラスト又は外植片又は植物組織を含む、培養法を提供する。本方法においては、そのような添加はもはや必要でないか、又は減少させることが可能であり、そのような様々なホルモンの添加の複雑なバランスを考慮する必要がない、より容易なインビトロ培養様式が提供される。
【００１７】
本発明は、たとえば植物組織の繁殖特徴の操作を提供する。多数の植物種が、比較的短かい時間で大量に得るため、組織培養において繁殖させられている。本発明を使用すれば、増倍率を数倍増加させることが比較的容易である。低木、高木、および様々な球根植物種のような、いくつかの困難であることが有名な種についても、本発明を使用すれば、本質的に無種子の繁殖、特にインビトロ培養を使用することが可能となる。これらの植物から単離された細胞又は組織の再生許容量は、核酸又は（修飾型）タンパク質のようなある種の生理活性分子の導入により、有意に増加し、したがって、増倍率が増加する。核酸又はタンパク質は、粒子銃、電気穿孔、微量注入、又は序論において記載されたその他の技術のような当分野において既知の方法により導入されうる。導入される分子は、ＲＮＡ、もしくはゲノムへ組み込まれる確率が低い裸のＤＮＡである核酸、又は（修飾型）タンパク質産物のいずれかである。分子は、一般に、再生過程中に失われ、したがって一時的にのみ存在するであろう。使用されうる核酸は、再生過程を刺激し、かつ外因的に添加される植物ホルモンの使用を減少させるか、又は排除するタンパク質を、コード又は産生する。添加されうるタンパク質は、これらの核酸のタンパク質産物又はそれらの修飾型である。前記の特徴を有する分子の例は、植物発達の調節又は植物ホルモンの認知に関与するタンパク質、又はそのようなタンパク質をコードする遺伝子である。本発明を使用することにより、増倍率は、より広い意味で、より困難な種についてもインビトロ繁殖技術を使用することを可能にするであろう程度に増加しうる。また、本発明を使用することにより、これらの植物のための繁殖特徴を永久的に増加させることも、比較的容易である。これらの植物の再生許容量は、植物発達の調節又は植物ホルモンの認知に関与するタンパク質をコードする遺伝子、又はより具体的には根もしくはシュートの開始のための１つのシグナル伝達経路を刺激もしくは誘導する産物をコードする遺伝子、又はさらに具体的には植物受容体キナーゼファミリーＲＫＳの代表をコードする遺伝子を導入することにより、これらの植物をトランスジェニックにした場合、有意に増加しうる。形質転換は、アグロバクテリウム媒介形質転換、粒子銃、前記のマーカーフリー形質転換系等のような、当分野において既知の技術を使用して達成されうる。そして、遺伝子の非致死的発現体が選択される。
【００１８】
１つの好ましい実施態様において、本発明は、出発材料が所望の体細胞性突然変異を含む、本発明に係る培養法を提供する。突然変異は、生存生物の任意の細胞において起こりうるが、この突然変異が、その生物の配偶体細胞が由来する細胞において起こった場合にのみ、子孫に受け継がれる。体細胞性突然変異は、突然変異が認められる組織が栄養繁殖しない場合、又はこの組織の細胞が再生し、完全な新たな生物体を形成する場合、通常失われる。本発明に記載の技術を使用すれば、植物における体細胞性突然変異の救出が提供される。体細胞系の組織のみならず、生殖系の組織も、本発明により提供されるような核酸又は（修飾型）タンパク質のような生理活性分子の導入により、再生するよう刺激される。核酸又はタンパク質は、粒子銃、電気穿孔、微量注入、又は記載されているその他の技術のような当分野において既知の方法により導入されうる。導入される分子は、ＲＮＡ、もしくはゲノムへ組み込まれる確率が低い（必ずではない）裸のＤＮＡである核酸、又は（修飾型）タンパク質産物のいずれかである。分子は、一般に、再生過程中に失われ、したがって一時的にのみ存在するであろう。使用されうる核酸は、再生過程を刺激し、かつ外因的に添加される植物ホルモンの使用を減少させるか、又は排除するタンパク質を、コードする。添加されうるタンパク質は、これらの核酸のタンパク質産物又はそれらの修飾型である。前記の特徴を有する分子の例は、植物発達の調節又は植物ホルモンの認知に関与するタンパク質、又はそのようなタンパク質をコードする遺伝子である。又は、体細胞性突然変異は、コルヒチン、ＥＭＳ、放射線、又は発癌性物質等のような突然変異誘発剤により種子を処理することにより作出されたものであってもよい。これらの処理された種子から生長したこれらのモザイク植物体の中のセクターが、所望の表現型に関してスクリーニングされよう。続いて、重要なセクターが単離され、これらの所望の形質のクローン性繁殖を得るため、前記の本発明により再生のための出発材料として使用されよう。
【００１９】
もう一つの好ましい実施態様において、本発明は、出発材料がトランスジェニック材料を含む、本発明に係る培養法を提供する。今日では、トランスジェニック植物は、数は限定されているものの、迅速に製造されている。圃場条件下でのさらなる繁殖のため十分な数の植物体を迅速に獲得するため、インビトロ培養技術が広く使用されている。本発明は、そのようなトランスジェニック植物培養物中の植物ホルモンレベルに、ほとんど又は全く注意を払う必要のない方法を提供する。
【００２０】
特に、本発明は、出発材料が所望の形質をコードする組換え核酸をさらに含む方法を提供した。本発明は、それにより、本質的にマーカーフリーの形質転換を提供するか、又は少なくとも形質転換および繁殖の後、本質的にマーカーフリーである植物体を提供する。植物体のゲノムへと組み込むべき所望の形質をコードする組換え核酸は、ベクター、粒子銃、電気穿孔、微量注入、又は当分野において記載されているその他の技術のような遺伝子輸送のための媒体又は方法により、出発材料の少なくとも一部に供給される。たとえば、たとえば植物発達の調節に関与する１個以上の遺伝子に由来する根又はシュートの開始のための少なくとも１個のシグナル伝達経路を刺激することにより、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、少なくとも１つの組換え遺伝子産物又はその機能的断片を有する、組換え核酸を含む細胞も、本発明により供給される。本発明は、培養物への外因的な植物ホルモンの添加の減少又は省略を可能にする、出発材料の再生を含む、所望の形質をコードする組換え核酸が供給された植物出発材料からの植物体の栄養繁殖のための培養法を提供する。本方法においては、出発材料の再生中、不定根又はシュートの開始のための少なくとも１つのシグナル伝達経路が、内因的に刺激され、特に、経路は、ホルモン産生に関与する遺伝子もしくは遺伝子産物、ホルモン産生にフィードバックを与える遺伝子もしくは遺伝子産物、又は再生へと至るイベントカスケードに関与する遺伝子もしくは遺伝子産物のような、再生の発生調節に関与する遺伝子に由来する組換え遺伝子産物により内因的に刺激される。
【００２１】
好ましい実施態様において、所望の形質をコードする組換え核酸には、核ターゲティングおよび／又は植物ゲノムへの組み込みのための手段が、さらに供給されている。そのような手段は、、核への適切なターゲティングおよび／又は適切な組み込みの刺激を処理する、所望の形質をコードする組換え核酸と結合させられた核酸シグナル、又はトランスポザーゼのようなタンパク質性の物質、又は細胞内の組換え核酸を保護するためのウイルスもしくは細菌のタンパク質（たとえば、Ｖｉｒタンパク質）であり得る。
【００２２】
さらに好ましくは、本発明は、出発材料が、とりわけ所望の形質をコードする組換え核酸を含む、形質転換すべき個々の植物細胞又はプロトプラスト又は外植片又は植物組織を含み、未形質転換出発材料から形質転換された材料が選択されなければならない方法を提供する。
【００２３】
一般に、たとえば植物形質転換の過程の一部として、トランスジェニック植物体を再生させうるトランスジェニック細胞を選択するため、優性選択可能マーカーが使用される。第１に、これらのマーカー遺伝子は、完全なトランスジェニック植物体が確立された後には、一般に、余分なものとなる。さらに、経済価値の高い遺伝子を作物へ導入するために使用される、たとえば抗生物質又は除草剤に対する耐性を与える選択可能マーカー遺伝子は、以下のような大きな問題を有している。修飾酵素の発現による選択剤の解毒が、未形質転換細胞の回避を可能にする可能性がある。死滅する未形質転換細胞が、毒性があり、形質転換細胞の再生を阻害する産物を放出する。選択剤は、細胞の増殖および分化に対する負の効果を有する可能性がある。多くの選択可能遺伝子の環境への影響に関して、不確実性が存在する。所望の遺伝子を徐々に増加させるために、同一の選択可能マーカーを使用した形質転換を繰り返し実施することは困難である。本発明は、培養物への選択剤の添加を減少させるか、又は省略する方法を提供する。
【００２４】
使用されたマーカー遺伝子が、その任務を果たした後、形質転換細胞から除去されるような、多様な植物種のマーカーフリー形質転換体を得るため、マーカー遺伝子の排除を可能にする形質転換系を設計しようという試みが以前になされた。１つの方法は、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）により媒介される細胞の、２つの異なるＴ−ＤＮＡを保持するバイナリーベクター（一方はたとえば薬剤耐性選択マーカー遺伝子を含み、もう一方は所望の遺伝子を含む）による共形質転換、それに続く、所望の遺伝子とは異なる遺伝子座に位置していると考えられる不要な薬物耐性遺伝子の交配による除去を含む。所望の遺伝子を含む薬物感受性形質転換体は、このようにして入手されうるが、これらの全ての形質転換体が実際に完全に選択マーカー遺伝子又はその断片についてフリー（非機能性又は部分的機能性）であるか否かは明らかでない。又、最初に使用された選択剤は、依然として、形質転換過程中の植物細胞の増殖および分化に対する望ましくない負の効果を有している。さらに、その方法は、有性交配を必要とするため、栄養生殖ではなく有性交配が実用的な生殖法である植物種に限定され、実務上は、十分に短い世代時間を有する植物種にさらに限定される。
【００２５】
植物を有性交配させる必要のない、細胞が形質転換された後、余分なマーカーを排除するための現在利用可能な１つの戦略は、ＭＡＴベクター系である。しかしながら、この系は、偶然的にしか起こらず、形質転換過程の最終効率を減少させるイベントである、トランスポザーゼ因子に含まれる選択遺伝子の内在性の形質転換後切り出しに依存している。
【００２６】
さらに別の戦略は、Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステムで見られるような部位特異的組換えを含み、これにより第一形質転換では、選択マーカー遺伝子を、予め決定した特異的部位に挿入し、これにより形質転換細胞の選択が可能となり、その後、部位特異的リコンビナーゼの導入を含む第二の形質転換において、選択マーカー遺伝子を再度ゲノムから切出す。
【００２７】
他の問題とは離れて、適切な部位を形質転換細胞に有する必要条件は、前記方法を、ゲノムが公知である生物に制限されることは言うまでもない。本発明はここで、インビトロ培養により形質転換細胞を得る方法を提供し、ここでの前記トランスジェニック物質は、選択物質に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子を欠いている。選択物質に対する耐性は、もはや必要ではない。なぜなら、本発明により、形質転換物質には、外来植物ホルモンの前記培養液への添加を減少または排除し、これにより前記遺伝子産物またはその機能的断片を提供されていない非形質転換細胞よりも、好ましい増殖条件を形質転換細胞に与えることを可能とする、植物の発達調節に関与する遺伝子から得られた、必要な組換え遺伝子産物または遺伝子産物群またはまたはその機能的断片（群）を備えているからである。特に、本発明は、前記出発物質の再生を含む形質転換植物出発物質からの植物の栄養的増殖の培養法を提供し、ここで、前記形質転換出発物質の再生中、不定根またはシュート開始のための少なくとも１つの特異的シグナル伝達経路は、内因的に刺激され、外来植物ホルモンの前記培養液への添加を減少または排除することが可能となり、特にここでは前記経路は、再生の発達調節に関与する遺伝子から得られた組換え遺伝子産物により内因的に刺激される。その美点は、選択物質に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子を全く前記物質に導入する必要がなく、よって後に前記マーカー遺伝子の形質転換物質を枯渇する必要がなくなる。特に、したがって本発明は、抗生物質または除草剤に対する耐性を利用せず、ここで関連した全ての欠点を有さない。
【００２８】
端的に言えば、大半の植物形質転換系は、除草剤または抗生物質耐性の選択に基づき、形質転換体の選択は、それ自体の特徴の他に追加の選択マーカー遺伝子の存在に基づく。本発明に記載の技術を使用して、植物でのマーカーを使用しない形質転換を提供する。この新しい形質転換／再生（ｔ／ｒ）系は、たとえば、２つの成分からなる（図２０）。本実施例の第一成分は、アグロバクテリアＴ−ＤＮＡの境界の間に存在し得るが、適切なプロモーター以外は他のＤＮＡは必要ではない特徴である。この第一成分は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得、ＶｉｒＥ２タンパク質および／またはＶｉｒＤ２の分子でインビトロでコーティングし得る（好ましくは、このＤＮＡの５’末端に共有結合している）。Ｖｉｒ−タンパク質は、植物細胞内のＤＮＡを保護するように存在し得、核に対して適切な標的化に注意し、植物ＤＮＡへの適切な組込みを刺激する。組織は、特定の生物活性分子の導入により再生するように刺激する。これらの生物活性分子は、第二成分として作用する。第二成分は、ゲノムまたは（修飾）タンパク質産物に組込まれる機会は少ない、核酸、ＲＮＡ、または裸ＤＮＡである。
【００２９】
核酸またはタンパク質（第二成分）は、微粒子銃衝撃、電気穿孔法、マイクロインジェクション、または序論で記載した他の技術のような、当分野で公知の方法により第一成分と混合して導入し得る。両方の成分が、植物細胞に一緒に十分量で存在しなければならないが、２つの成分の間の比は、植物ＤＮＡの種および特徴の組込みの好ましい数に応じて変化し得る。第二成分は、好ましくは、再生プロセス中に消失し、それ故、一過性にしか存在せず、一方、第一成分は、植物ゲノムに組込まれる確率が高い。第二成分は、再生プロセスを刺激し、再生プロセスを刺激し外的に添加した植物ホルモンの使用を低下または消失するタンパク質を産生する核酸または核酸混合物であるか、または、タンパク質産物またはこれらの核酸の産物のこの混合物またはその修飾形または両方の混合物である。上記の特徴を有する分子の例は、タンパク質、または、植物発達または植物ホルモンの知覚の調節に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。このｔ／ｒ−系の主な利点は、図２０の例を用いて説明したとおりである：
特徴のみを、植物ＤＮＡに導入する；Ｔ−ＤＮＡ境界とは別に（ＶＩＲタンパク質を使用する場合にのみ、Ｔ−ＤＮＡ境界を特徴ＤＮＡに含めることが必要である）、存在する場合、選択マーカーのような他の望まないＤＮＡは全く存在しない。植物ゲノム上で特徴ＤＮＡを対応する内因性ＤＮＡに相同的組換えするプロセスを可能とするために、Ａｔ  Ｒ５１、ＡｔＲＡＤ５１またはＲｅｃＡをコードする遺伝子または遺伝子産物、または類似の機能をもつ遺伝子産物を、第二成分に適用して、リコンビナーゼの一過性発現を生じることができる。特徴ＤＮＡの標的化および局在化組込み後、リコンビナーゼは欠失する。
再生の原理は全体的に適用可能である。
再生用の外的植物ホルモンの量は減少または排除できない。
主に形質転換細胞は再生するので、能動選択は必要ではない。
【００３０】
植物発達の調節に関与する前記遺伝子は、既に既知であるか、または再生に関与すると既に決定されている、非常に多くの遺伝子から選択できる。前記遺伝子の例は、不活性化された場合に再生を刺激する、ｃｌａｖａｔａ（Ｃｌａｒｋら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８９、５７５〜５８５）およびｐｒｉｍｏｒｄｉａ時期遺伝子（Ｍｏｒｄｈｏｒｓｔら、１９９８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４９、５４９〜５６３）、Ｌｅａｆｙ−Ｃｏｔｅｌｙｄｏｎ遺伝子（ＬＥＣ、Ｌｏｔａｎら、１９９８、Ｃｅｌｌ  ９３、１１９５〜１２０５）、ＫＡＰＰ遺伝子（Ｓｔｏｎｅら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６、７９３〜７９５；Ｓｔｏｎｅら、１９９８、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １１７、１２１７〜１２２５）、ＩＰＴ（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｏ．、１９８６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７、５０９〜５３８）、ＷＵＳＣＨＥＬ（Ｍａｙｅｒら、１９９８
Ｃｅｌｌ  ９５、８０５〜８１５；Ｓｃｈｏｏｆら、２０００  Ｃｅｌｌ  １００、６３５〜６４４）、ＫＮＡＴ１＆２（アラビドプシスｋｎ１様遺伝子）（Ｃｈｕｃｋら、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８、１２７７〜１２８９；Ｌｉｎｃｏｌｎら、１９９４  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６、１８５９〜１８７６）、ＳＨＯＯＴ  ＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ遺伝子（Ｅｎｄｒｉｚｚｉら、１９９６  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１０、９６７〜９７９）、ＣＵＰ−ＳＨＡＰＥＤ
ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ（Ａｉｄａら、１９９９、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６、１５６３〜１５７０）、ＣＹＣＬＩＮ  Ｄ（Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔら、２０００  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５、５７５〜５７９；Ｒｉｏｕ−Ｋｈａｍｌｉｃｈｉら、１９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３、１５４１〜１５４４）、ＣＫＩ１（Ｋａｋｉｍｏｔｏ  １９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４、９８２〜９８５）、ＡＩＮＴＥＧＵＭＥＮＴＡ（ＭｉｚｕｋａｍｉおよびＦｉｓｃｈｅｒ  ２０００  ＰＮＡＳ  ９７、９４２〜９４７；Ｋｒｉｚｅｋ  １９９９  Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５、２２４〜２３６）、ＳＢＰ−ボックスタンパク質（Ｃａｒｄｏｎら、１９９９  Ｇｅｎｅ  ２３７、９１〜１０４）、ＣＤＣ２ａ（Ｈｅｍｅｒｌｙら、１９９３、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５、１７１１〜１７２３）（これは誘導または過剰発現された場合に再生を刺激する遺伝子である）、または、分子レベルで植物胚発生または器官発生を研究することにより見出し得るような、広い意味で植物発達の調節に関与するそのアンタゴニストまたはその他である。特に、再生に関与する遺伝子産物の個体群は、ＲＫＳタンパク質により直接リン酸化され、それにより活性化される細胞内シグナル伝達因子により示される。
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明に記載の方法を提供し、ここで、植物発達の調節に関与する前記遺伝子は、以下のようなアラビドプシスＲＫＳタンパク質ファミリーの細胞外ドメインに相同性を有する、植物データベース集合に存在するような、受容体様のキナーゼを含む、ロイシンリッチリピートをコードする：
ＧＢ：ＡＷ０１１１３４  ＡＷ０１１１３４  ＳＴ１７Ｂ０３Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ
ＧＢ：ＬＥＬＲＰＧＥＮＥ  Ｘ９５２６９  Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ７７５４４８  ＡＩ７７５４４８  ＥＳＴ２５６５４８  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ４９６３２５  ＡＩ４９６３２５  ｓｂ０５ｃ０９．ｙ１  Ｇｍ−ｃ１００４グリシン
ＧＢ：ＡＩ４８７２７２  ＡＩ４８７２７２  ＥＳＴ２４５５９４  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ４４１７５９  ＡＩ４４１７５９  ｓａ８２ｄ０８．ｙ１  Ｇｍ−ｃ１００４グリシンマックス
ＧＢ：ＡＩ７８２０１０  ＡＩ７８２０１０  ＥＳＴ２６２８８９  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ７７２０７９  ＡＩ７７２０７９  ＥＳＴ２５３１７９  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＳＢＵ６２２７９  Ｕ６２２７９  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ
ＧＢ：Ｃ２２６４５  Ｃ２２６４５  Ｃ２２６４５  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａＧＢ：Ｄ４９０１６  Ｄ４９０１６  ＲＩＣＳ１５６２５Ａ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ
ＧＢ：ＡＩ７７６３９９  ＡＩ７７６３９９  ＥＳＴ２５７４９９  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ７７６２０８  ＡＩ７７６２０８  ＥＳＴ２５７３０８  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ３５２７９５  ＡＩ３５２７９５  ＭＢ６１−１０Ｄ  ＰＺ２０４．ＢＮｌｉｂ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ
ＧＢ：ＡＱ５７８０７２  ＡＱ５７８０７２  ｎｂｘｂ００９２Ｃ１８ｆ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ
ＧＢ：Ｃ９５３１３  Ｃ９５３１３  Ｃ９５３１３  Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  Ｍｉｙａｇａｗａ
ＧＢ：ＡＩ１６２８９３  ＡＩ１６２８９３  Ａ０２６Ｐ３８Ｕ  Ｈｙｂｒｉｄ
ａｓｐｅｎ
ＧＢ：ＡＩ７８２０７６  ＡＩ７８２０７６  ＥＳＴ２６２９５５  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ７２６１７７  ＡＩ７２６１７７  ＢＮＬＧＨｉｓ５１６５Ｃｏｔｔｏｎ
ＧＢ：ＡＩ７７７９８２  ＡＩ７７７９８２  ＥＳＴ２５８８６１  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ７７４８８１  ＡＩ７７４８８１  ＥＳＴ２５５９８１  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ８９６７３７  ＡＩ８９６７３７  ＥＳＴ２６６１８０  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ６７６９３９  ＡＩ６７６９３９  ６０５０４７Ａ０７．ｘ１Ｚｅａ
ｍａｙｓ
ＧＢ：Ｄ４０５９８  Ｄ４０５９８  ＲＩＣＳ２６７４Ａ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ
ＧＢ：ＯＳＵ８２１６８  Ｕ８２１６８  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ
ＧＢ：ＳＢＲＬＫ１  Ｙ１４６００  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ
ＧＢ：ＡＩ４９５３５９  ＡＩ４９５３５９  ｓａ９７ａ０９．ｙ１  Ｇｍ−ｃ１００４グリシンマックス
ＧＢ：Ｃ９６０４１  Ｃ９６０４１  Ｃ９６０４１  Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、または、植物データベース集合に存在するような、アラビドプシスＲＫＳタンパク質ファミリーの細胞内ドメインに類似性を有する、たとえば
ＧＢ：ＡＩ８９６２７７  ＡＩ８９６２７７  ＥＳＴ２６５７２０  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＵ０５６３３５  ＡＵ０５６３３５  ＡＵ０５６３３５  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ
ＧＢ：ＡＡ７３８５４６  ＡＡ７３８５４６  ＳｂＲＬＫ４  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ
ＧＢ：ＡＡ７３８５４４  ＡＡ７３８５４４  ＳｂＲＬＫ２  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ
ＧＢ：ＡＡ７３８５４５  ＡＡ７３８５４５  ＳｂＲＬＫ３  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ
ＧＢ：ＳＢＲＬＫ１  Ｙ１４６００  Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ
ＧＢ：ＡＩ７２９０９０  ＡＩ７２９０９０  Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ９２０２０５  ＡＩ９２０２０５  Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ
ＧＢ：ＡＩ８９６１８３  ＡＩ８９６１８３  ＥＳＴ２６５６２６  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
ＧＢ：ＡＩ９６７３１４  ＡＩ９６７３１４  Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓＧＢ：ＡＩ７３０５３５  ＡＩ７３０５３５  ＢＮＬＧＨｉ７００７  Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ
ＧＢ：ＡＦ０７８０８２  ＡＦ０７８０８２  Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ
ＧＢ：ＣＲＰＫ１  Ｚ７３２９５  Ｃ．ｒｏｓｅｕｓ
ＧＢ：Ｃ２２５３６  Ｃ２２５３６  Ｃ２２５３６  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａＧＢ：Ｃ２２５３０  Ｃ２２５３０  Ｃ２２５３０  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａＧＢ：ＺＭＡ０１０１６６  ＡＪ０１０１６６  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｍＲＮＡ
ＧＢ：ＡＱ２７１２１３  ＡＱ２７１２１３  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、または、Ｓｃｈｍｉｄｔら（１９９７、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４、２０４９〜２０６２、第ＷＯ９７／４３４２７号）から公知であり、ここで、たとえば、ＳＥＲＫ（ＲＫＳＯ）での植物の選択での使用において再生や一過性発現ではなく、安定な形質転換を考える。また、本発明の方法に適用可能なのは、細菌遺伝子またはその断片、たとえばＡＫ−６ｂ遺伝子（Ｗａｂｉｋｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９６、９３９〜９５１）またはｒｏｌＡＢＣ遺伝子（Ｊａｓｉｋ  Ｊ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、５７〜６８）であるが、安定な形質転換による再生のみを目的とする場合、本明細書に開示したような植物遺伝子が好ましい。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明に記載の方法を提供し、ここで、植物発達の調節に関与する前記遺伝子は、受容体様のキナーゼを含むロイシンリッチリピートをコードし、ここでの前記受容体様キナーゼは、図３に示したような植物受容体キナーゼファミリーＲＫＳを示す。
【００３３】
特に、本発明は、前記遺伝子産物またはその機能的断片が、Ｎ末端シグナル配列、ロイシンジッパードメインを含む細胞外領域、ジスルフェート橋ドメイン、３〜５個のロイシンリッチリピートを含むロイシンリッチリピートドメイン、膜貫通ドメイン、アンカードメインを含む細胞内領域、セリン／トレオニンキナーゼドメインおよび／またはＣ末端ロイシンリッチリピートドメインを含む受容体様キナーゼから得られる方法を提供する。
【００３４】
これらの遺伝子は、シグナル伝達に特定の機能を有する膜貫通タンパク質をコードし、これにより、本発明の方法に使用する遺伝子産物またはその機能的断片を提供する主な候補遺伝子である。
【００３５】
特に、本発明は、前記の受容体様キナーゼが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａが、図４または８から２０のいずれか１つに示したような配列を含む、核酸によりコードされる方法を提供する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ以外の植物由来の適切な受容体キナーゼ様遺伝子、たとえばＤａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ、Ｒｏｓａ、Ｇｅｒｂｅｒａ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ａｌｓｔｒｏｕｍｅｒｉａ、Ｌｉｌｉｕｍ、Ｔｕｌｉｐａ、Ｄｙａｎｔｈｕｓ、Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ、Ｇｙｐｓｏｐａｙｓ、Ｆｉｃｕｓ、Ｃａｌａｎｇｏｅ、Ｂｅｇｏｎｉａ、Ｐｈａｌａｓｎｏｐｓｉｓ、Ｒｈｏｎｏｎｄｅｎｄｒｕｍ、Ｓｐａｔｉｐｈｉｌｕｓ、Ｃｕｃｕｂｉｔａｃｅａｅ、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、および穀物などの芝生は、容易に、当分野で公知の方法により本明細書で提供されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ配列を使用して見出される。一般に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａで同定された各ＲＫＳ遺伝子について、対応するＲＫＳ遺伝子は、単子葉並びに双子葉植物の両方の個々の種に存在する。本発明は、前記受容体様キナーゼが、核酸（ここでＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａは図４または８から２０のいずれか１つに示したような配列を含む）に対応するまたは相同な植物由来核酸によりコードされる、方法を提供する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ以外の植物種での対応するまたは相同なＲＫＳ遺伝子および遺伝子産物は、種々のアプローチにより単離される。たとえば、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＲＫＳｃＤＮＡプローブを使用して、上記したような低ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄条件下で、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーのスクリーニングにより、別法として変性ＲＫＳプライマーの使用により（所望の遺伝子のエキソン断片を増幅するために本明細書に示したようなＲＫＳＢ正およびＲＫＳＥ逆プライマー組合せ）。全長ｃＤＮＡクローンは、さらに、レースおよびテイルＰＣＲアプローチにより得ることができる。また、植物種内のＲＫＳ遺伝子ファミリーの異なるファミリー内の保存または別個および特異的領域を認識する抗体の産生により、所望の単離が可能となる。別法として、種々の植物種で１つの特異的ＲＫＳ遺伝子産物を認識する特異的抗体を作成する。これらの抗体を使用して、植物種のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーンする。さらに、電子データベースでＲＫＳ相同配列についてスクリーンが可能である。探索はヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方で実施する。別法として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ以外の植物種のＲＫＳ遺伝子および遺伝子産物を、たとえば、ＲＫＳクローンを用いて酵母で２または３重ハイブリッドスクリーニングにより単離し、類似または非関連植物種におけるこのＲＫＳファミリーの（ヘテロ）二量体メンバーを単離する。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、植物出発物質から植物を増殖する方法を提供し、ここで、前記出発物質の再生中、根またはシュート開始の少なくとも１つのシグナル伝達経路が、外的植物ホルモンの前記培養液への添加を可能とする、植物発達の調節に関与する遺伝子から得られた組換え遺伝子産物またはその機能的断片により刺激され、ここでの前記遺伝子産物またはその機能的断片は、形質転換により出発物質の少なくとも一部に導入される。本発明はまた、再生遺伝子作成物の細胞への導入を提供し、これにより細胞自体の再生または隣接細胞での再生プロセスの誘導が生じ得、さらには前記誘導細胞から生じた体細胞胚がここに提供される。周囲細胞の分化状態に不可欠な個々の形質転換細胞が作成される。ここに提供したような前記誘導再生因子の植物細胞への導入により、隣接細胞の増殖の形成、および、これらの増殖細胞塊からの新しい植物またはその一部の形成が起こる。最初に形質転換した植物は、増殖プロセスそれ自体に必ずしも含まれず、それ故、生じる再生植物またはその部分において必ずしも一部ではない。それに提供された隣接細胞の誘導再生の特異的形は、導入遺伝子または遺伝子産物を含まない植物を再生する選択肢を与え、それ故、遺伝子産物を最初の細胞個体群に導入し、それをコードするこれらの遺伝子産物または核酸を維持する必要なく、再生を誘導する方法を示す。誘導した誘導のプロセスの例は図６Ｆに示し、ここでの、１つのＧＵＳ陽性細胞は、衝撃を与えたＤＮＡ作成物の最初の誘導部位に印を付す。この細胞の上に、明らかにＧＵＳ陰性である増殖細胞塊が形成された。この誘導増殖細胞塊の上端に、我々は、体細胞胚を形態学的に示す数個の構造を検出できる。体細胞胚は、前記したような増殖細胞塊の境界から発達する（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４、１２０４９〜２０６２）。体細胞胚は、再生植物の優れた起源を提供する。なぜなら、全ての器官および植物部分が、接合胚発生中に起こるような類似のプロセスにより形成される。この観察により、明らかに、このクラスの再生分子が増殖中で形質転換されていない細胞塊（これから新しい植物を再生できる）を誘導する能力が示される。それは、予めインビトロ培養手順を導入する必要さえなく、生存植物組織上に直接的に体細胞胚を誘導する手段を提供する。
【００３７】
ここでも、したがって、ここに提供したような形質転換は、安定な様式であり得、ここでの導入遺伝子情報または核酸は、核、葉緑体またはミトコンドリアゲノムに組込まれ、構成的または誘導的に発現されるが、好ましくは一過性であり、ここでの核酸は、ゲノムに導入されず、導入後の特定の期間後に欠失する。組換えＤＮＡまたはＲＮＡの細胞またはプロトプラストへの形質転換は、当分野で公知のプロトコルを使用して、粒子衝撃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルス媒介形質転換、細菌コンジュゲーション、電気穿孔法、浸透圧ショック、小胞輸送または直接的な遺伝子導入などの、種々の方法で、核酸分子に結合したタンパク質性基質を添加してまたは添加せずに起こり得る。タンパク質性基質の細胞またはプロトプラストへの組込みは、上記のような形質転換プロトコルの系に沿って促進できる。植物発達の調節に関与する遺伝子から得られた遺伝子産物（すなわちＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質性基質またはその機能的断片）を提供された細胞またはプロトプラストはここでそれ自体の上で再生でき、その細胞またはプロトプラストを含む培養液に加えて外来植物ホルモンを減少または排除することができる。栄養増殖のプロセスは、これにより非常に簡単となり、同一の遺伝子バックグラウンドを有する大量の植物をここで、所望の特徴を有する出発物質から開始して得ることができる。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明は、植物出発物質から植物を増殖する方法を提供し、ここで、前記出発物質は、所望の特徴を有する細胞またはプロトプラストから得られる生じるトランスジェニック植物を提供する目的の、所望の核酸配列で形質転換した細胞またはプロトプラストを含む。たとえば植物発達の調節に関与する遺伝子から得られた、遺伝子産物（すなわちＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質性基質またはその機能的断片）を提供された本発明に記載のかかる細胞またはプロトプラストは、ここでそれ自体の上で再生でき、形質転換細胞またはプロトプラストを含む培養液への外的植物ホルモンの添加を減少または排除することが可能である。所望の配列を産生遺伝子産物で形質転換した後の再生細胞または組織の選択により、好ましくは安定な様式で植物ゲノムに組込まれた、所望の核酸配列を含む植物または植物物質のみが、および、再生遺伝子産物が回収され、これにより、形質転換出発物質の選択的再生に基づいた所望のトランスジェニック植物の選択が提供される。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明は、再生遺伝子産物は、単に一過性に発現され、再生遺伝子産物またはそのコード配列は、ゲノムに導入されず、導入後の特定の期間後に失われ、これにより、所望のトランスジェニック核酸のみを含み、使用した選択マーカーをコードする核酸は含まない、最終産物として実質的にマーカーを含まないトランスジェニック植物が提供され、遺伝子産物を再生する方法を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、系に沿ってまたは本明細書に開示した方法を使用して、増殖した本発明に記載の方法により得ることのできる植物または植物物質を提供する。特に、本発明は、植物出発物質から本発明に記載のインビトロでの栄養または種子のない増殖により、たとえば、単一節カット、補助分岐、付属的器官の再生（根またはシュート）、または出発物質、たとえば外植片またはカルス組織またはその懸濁液、またはさらには単一細胞またはプロトプラストを使用して得ることのできる、植物または植物物質を提供し、特にここでは、前記出発物質はトランスジェニック物質を含み、本発明に記載の前記トランスジェニック植物または植物物質は好ましくは選択マーカー遺伝子を含まない。
【００４１】
更にまた本発明は、図８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の何れかに記載の核酸分子、またはその相補核酸に相当する、または、これとハイブリダイズできる、受容体用キナーゼをコードする単離および／または組み換え核酸またはその機能的フラグメントまたは機能的等価物を提供する。このような核酸は前述したとおり単離される。好ましい実施態様においては、このような核酸は、たとえばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来する、図８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の何れかに記載の核酸分子またはその機能的等価物または機能的フラグメントまたはその相補核酸に対して、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはもっとも好ましくは少なくとも９５％相同である。
【００４２】
更にまた本発明は本発明の核酸を含有するベクターを提供する。このようなベクターは好ましくは本発明の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）または核酸に由来する蛋白を細胞に提供することにより該細胞を安定してまたは一過性にトランスフォームすることができる。核酸または蛋白を細胞に与えるための方法は種々のものが知られており、たとえばエレクトロポレーション、リポソーム媒介転移、マイクロインジェクション、粒子銃衝突または細菌媒介転移が挙げられる。ＲＮＡはたとえばＳＰ６、Ｔ７またはＴ３のような部位を組み込んだ適切なベクター構築物からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。蛋白はたとえばコウボまたは細菌または昆虫細胞または他の適切な当該分野で知られた細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成する。ＤＮＡは、恐らくは増殖のための適当なベクター内に入れた状態で線状または環状ＤＮＡとして供給することができる。
【００４３】
１．更にまた、本発明は本発明の核酸またはベクターを含有する宿主細胞を提供する。好ましい実施態様においては、このような宿主細胞は、好ましくはそのゲノムに安定な状態で組み込まれた、所望の、ただし大部分の場合は全く無関係の、核酸配列を更に含有するトランスフォームされた細胞である。更に好ましいものは、本発明の核酸またはベクターが一過性にのみ発現される本発明の宿主細胞である。当然ながら、本発明により提供される培養方法において使用するためには、本発明の核酸、ベクターまたは宿主細胞を使用するのが好ましい。本発明はまた植物の発達段階を測定する方法を提供し、該方法は、該植物またはその一部において本発明の核酸または蛋白性物質を検出することを包含する。すなわち該検出はＲＫＳファミリーに属する受容体キナーゼ遺伝子または遺伝子産物またはそのフラグメントを植物発達のマーカーとして使用することを意図している。
【００４４】
本発明はさらにまた、図８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の何れかに示すアミノ酸配列またはその機能的等価物または機能的フラグメントを含有する単離されたまたは組み換えの蛋白性物質を提供する。本明細書においては蛋白性物質は、場合によりたとえばグリコシル化、ミリスチル化、ホスホリル化、脂質付加、同種または異種の２量体化または多量体化または当該分野で知られている何らかの他の（翻訳後の）修飾により修飾された、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白を含有する物質として定義される。
【００４５】
配列の組成に基づいて、ＲＫＳ遺伝子ファミリーの予測されるアミノ酸配列のＮ末端ドメインはシグナルペプチドを表し、このことは、蛋白のこの領域が細胞外であることを示している。このシグナル配列の長さおよび予測される切断部位は予測プログラム：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／を用いて明らかにされている。このドメインに引き続き、７アミノ酸残基で相互に分断されている、ロイシン残基に富む短いドメインが存在する。両親媒性のヘリックス内のこれらのロイシンの保存に基づけば、このドメインは短いコイルドコイルの構造の形成を通じて蛋白の２量体化を媒介するロイシンジッパードメインを表す（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚ  ＷＨ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＦ  ａｎｄ  ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｓＳＬ  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，  １７５９−１７６４）。ＲＫＳ蛋白においはこのロイシンジッパードメインは受容体のヘテロ／ホモ２量体化に関与していると考えられる。次のドメインはジスルフェート結合を形成する２個の保存されたシステイン残基を含んでいる。その後のドメインは各々約２４個のアミノ酸の３〜５個のロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）を有するＬＲＲ領域を表す。動物においては、このドメインは蛋白−蛋白相互作用に関与していることがわかっている（Ｋｏｂｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ  Ｊ  （１９９４）  ＴＩＢＳ  １９，  ４１５−４２０）。植物においては、細胞外ＬＲＲ領域はリガンドとエリシターの結合に必要であると推測されている。大部分のＲＫＳ蛋白のＬＲＲ領域のＣ末端部分では、システイン残基の他の保存された対が別のジスルフィド結合の形成に関与している。すなわち両末端において、ＬＲＲドメインは２個のジスルフィド結合により包囲されている。次のドメインは比較的多数のＰおよびＳアミノ酸残基を含んでおり、エクステンシンのような細胞壁蛋白と類似性を有する。ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／のような予測サーバープログラムによればこのドメイン内に複数のＯ−グリコシル化部位が存在することが示されている。このドメインはエクステンシンと同様の機能を有し、複数の細胞壁成分との相互作用部位を与え、これによりＲＫＳ蛋白の完全な細胞外領域が包埋されている細胞壁との安定な固定化相互作用を確立する。次のドメインはプログラムｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−１．０／により予測される単一の膜貫通へリカルドメインを表す。このドメインの末端および細胞内原形質ドメインの開始部には小数の塩基性ＫおよびＲ残基が含まれている。次のドメインは比較的酸性である。次の大型のドメインは植物セリン、スレオニン受容体キナーゼのファミリーと広範な相同性を示している。ＳＥＲＫに対する自己ホスホリル化実験（Ｓｃｈｍｉｄｔ等、１９９７）によれば、このドメインはセリン、スレオニンキナーゼ活性を示すことがわかっている。キナーゼドメイン内では、ＲＫＳ０およびＲＫＳ８のような幾つかのＲＫＳ蛋白がコア配列ＲｘｐＳｘＰ（式中ｘは何れかのアミノ酸を示す）により表される推定１４−３−３結合部位を含んでいる（Ｙａｆｆｅ  ＭＢ，  Ｒｉｔｔｉｎｇｅｒ  Ｋ，  Ｖｏｌｉｎｉａ  Ｓ，  Ｃａｒｏｎ  ＰＲ，  Ａｉｔｋｅｎ  Ａ，  Ｌｅｆｆｅｒｓ  Ｈ，  Ｇａｍｂｌｉｎ  ＳＪ，  Ｓｍｅｒｄｏｎ  ＳＪ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｌｅｙ
ＬＣ  （１９９７）  Ｃｅｌｌ  ９１，  ９６１−９７１）。すなわちリガンド媒介受容体キナーゼ活性化の結果としてのこの配列内でのＳ残基の（自己）ホスホリル化により１４−３−３蛋白の結合とその後の活性化が可能となる。次のドメインについては、ＷＤ対残基の保存が他の蛋白とのドッキング部位の機能を示唆しているものの、未知の機能を有している。Ｃ末端細胞内ドメインにはやはり単一のＬＲＲ配列の部分が含まれており、このため、蛋白−蛋白相互作用に関与していると考えられる。好ましくは、本発明のこのような蛋白性物質は本発明の核酸によりコードされるか、または、本発明の宿主細胞が産生するものである。
【００４６】
特に、本発明は本発明の培養方法において使用するための蛋白性物質を提供する。細胞またはプロトプラストへの蛋白性物質の導入は当該分野で知られているトランスフォームプロトコルにそって容易に行なうことができる。種々の方法が知られており、たとえばマイクロインジェクション、粒子銃衝突または細菌媒介転移などが挙げられる。すなわち植物の発達の調節に関与する遺伝子に由来する蛋白性物質またはその機能的フラグメントを付与された細胞またはプロトプラストはここでそれ自体を再生することが可能となり、これにより、その細胞またはプロトプラストを含有する培養物への外因性植物ホルモンの添加を低減ないしは省略することが可能となる。増殖の過程はこれにより極端に単純化でき、同一の遺伝的背景を有する多数の植物を所望の特性を有する出発材料から得ることが可能となる。ＲＫＳ遺伝子によりコードされる蛋白またはペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ、コウボ、バキュロウィルスまたは動物の細胞培養物中のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの発現系において相当するｃＤＮＡ配列またはその部分を発現することにより産生される。発現した蛋白配列は（ＨＩＳ）６タグのような蛋白に結合した組み換えＴａｇ配列を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製する。タグは蛋白分解により精製後に除去する。得られた蛋白配列は機能的に活性な受容体キナーゼまたはその誘導体をコードしている。好ましい実施態様においては、蛋白は（構造的）活性キナーゼドメインを含んでいる。精製された組み換え蛋白を植物細胞に導入することによりこれらの細胞からの再生を一過性に誘導することができる。蛋白はヌクレオチド配列の導入に関して記載した方法と同様にして、たとえばリポソーム媒介転移、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子銃衝突または細菌媒介転移等により導入する。所望によりグリコシル化、ジスルフェート結合形成、ホスホリル化などの組み換え蛋白の修飾を旨適化することにより、蛋白の安定性と活性において最適な効率を得ることができる。更にまた、本発明は本発明の蛋白性物質を特異的に認識する単離されたまたは合成された抗体を提供する。このような抗体はたとえば、本発明の蛋白性物質またはその免疫原性フラグメントまたはその等価物で実験動物を免疫化し、該免疫化動物からポリクローナル抗体を回収することにより得るか、または、当該分野で知られた他の方法、たとえばモノクローナル抗体または（１本鎖）抗体、またはたとえばファージディスプレイ法を介して得られる核酸ライブラリに由来する組み換え核酸から発現された結合蛋白を生成することにより得ることができる。このような抗体は、たとえば前述のとおり同定された再生遺伝子産物を含有する細胞を同定するために、本発明の培養方法において好都合に使用することができる。このようなんぼを使用することにより、本発明はまた、たとえば免疫沈降、ウエスタンブロットまたは当該分野で知られた他の免疫学的方法により得ることができる、本発明の上記抗体により特異的に認識され得る蛋白性物質を提供する。更にまた、植物種内のＲＫＳ遺伝子ファミリーの異なるメンバー内で保存された、または固有の特定の領域を認識する上記抗体を��生させることにより、所望のＲＫＳ相同体の単離が可能となり、また、種々の植物種中で特定のＲＫＳ遺伝子産物が認識される。これらの抗体はまたＲＫＳ相同体を得るスクリーニングのために植物種のｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングする際に使用される。本発明、および、本発明の方法における本発明の核酸、ベクター、宿主細胞、蛋白性物質または抗体の前述の使用について、以下に更に詳述するが、これにより本発明は制限されない。
【００４７】
詳細な説明
植物における再生の発生調節に関連する遺伝子を単離するために、その発現が発生する花序において存在した遺伝子のファミリーの異なるメンバーを同定した。この組織内で、多数の異なる器官原基が花序分裂組織から開始された。モデル植物種として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａが、多くの十分に特徴付けられた遺伝子変異の存在およびデータベースにおける遺伝子情報の利用可能性に基づいて選択された。
【００４８】
分化の段階はｉｎ  ｖｉｖｏで非常に安定であり、核移植または細胞融合の応答においてもなお、分化した細胞の核は、動物においておよび植物細胞においての両方で、変化する顕著な能力を示す（Ｂｌａｕ、１９８９）。分化の段階を変化する能力は、細胞および組織に、それらの環境に適応する能力を提供する。通常、少数の幹細胞のみが、異なる細胞型に分化する能力を有する。植物において、真に全能性である細胞のみが、融合された卵細胞および精子からなる接合体である。これらの二倍体全能性細胞に、全ての他の分化された細胞型が由来する。
【００４９】
再生は、多数の動物および植物種において観察される栄養性の再生および修復のストラテジーである。植物における再生は、根およびシュート分裂組織の両方、別々のシュートまたは根分裂組織、個々の細胞または細胞の群からの植物器官または器官原基を含む新規な組織の形成として規定される。再生は、植物の発生の間に行われる通常の細胞および器官の分化のプロセスを模倣し、そして異なる植物機関の形成を生じる。しかし、通常の条件下である植物器官、分裂組織、または器官原基の形成を開始し得ない植物細胞または細胞の群は、細胞外刺激または細胞の分化の段階の細胞内改変のいずれかによって刺激され得る。再生は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかの条件下で行われ得る。再生は、栄養性植物再生の特異的な形態が種子中で行われるアポミクシスのプロセスを誘導しない。細胞外の分散可能な因子は、植物細胞における細胞再分化に必要不可欠であることを示した（ＳｉｅｇｅｌおよびＶｅｒｂｅｋｅ、１９８９）。細胞表面でのこれらのシグナルの認知、および転写調節における変化を最終的に生じる細胞内シグナル伝達は、細胞に、このような細胞外刺激に応答する能力を提供する。
【００５０】
細胞分化を調節する能力を有する遺伝子産物についてのサーチにおいて、本発明者らは細胞内分化シグナル伝達の認知および伝達に関与する遺伝子に集中化した。動物細胞における細胞外シグナルは通常、高い親和性の結合化合物の、センサー分子によって認知される。
【００５１】
細胞外シグナル伝達分子はさらに、リガンドとして言及され、およびそれらの細胞結合対は、受容体として規定される。結合の際に、細胞外シグナルは受容体の改変を生じ得、細胞膜を超えるシグナルの伝達を生じる。細胞表面受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達成分へのシグナル伝達に関与する細胞内ドメインを含む（Ｗａｌｋｅｒ、１９９４）。ＳＥＲＫは、植物および動物において種々の機能を有する膜貫通受容体キナーゼの大きな群のメンバーを示す。これらの遺伝子産物の多くは、Ｃｌａｖａｔａ
１（Ｃｌａｒｋら、１９９７）またはＥｒｅｃｔａ（Ｔｏｒｉｉら、１９９６）のように細胞分化プロセスに関与することが知られる。植物におけるこれらの遺伝子の過剰発現は、植物器官または植物細胞において形態学的な変化を生じる。
【００５２】
体細胞胚発生受容体様キナーゼ（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  Ｋｉｎａｓｅ）ＳＥＲＫは元来、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方での胚発生細胞についてのマーカーとして同定された（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７ａ）。ＳＥＲＫ遺伝子の発現は、体細胞胚を形成する能力、植物が、接合体胚と同じ形態学的な、細胞学的な、および分子的な胚発生の段階の順序を介して体細胞細胞から形成されるプロセスと相関する。
【００５３】
受容体キナーゼのような膜貫通タンパク質は、器官または細胞分化に関与される候補の重要な調節遺伝子産物のセットを提供する。分化を調節する能力を有する遺伝子産物についてのサーチにおいて、本発明者らは、非常に多様な細胞分化プロセスをともなう植物組織、花序分裂組織中で発現される受容体キナーゼ遺伝子についてサーチした。細胞の分化の段階の調節に関与する遺伝子産物についてのスクリーニングにおいて、本発明者らは、受容体様キナーゼの完全なファミリーを同定した。
【００５４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおけるレセプター様キナーゼの新規なファミリー、ＲＫＳ遺伝子ファミリーの同定
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのゲノムデータベース（アクセス  http://genome-www2.
stanford.edu/cgi-bin/AtDB/nph-blast2atdb）において、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＳＥＲＫ配列（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７ｂ）に対する相同性を有する少数の配列が同定された。これらの配列は、ヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸レベルに対して相同性を示し、そして受容体キナーゼ様ＳＥＲＫ（ＲＫＳ）遺伝子としてさらに規定された。最初に同定された配列はさらに、ＲＫＳ1〜5として同定された。これらの５つのＲＫＳ配列に基づいて、縮重されたＤＮＡプライマーのセットが設計され、これはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの可能なＲＫＳ遺伝子フラグメントの増幅を許容した。
【００５５】
プライマーＲＫＳ  Ｂ正方向：
５'−ＣＣ［Ｃ/Ｇ］  ＡＡＧ  ＡＴ［Ｃ／Ｔ］  ＡＴ［Ａ／Ｔ］  ＣＡＣ  ＣＧ［Ａ/Ｃ/Ｔ］  ＧＡＴ  ＧＴ［Ａ／Ｃ／Ｇ］  ＡＡ［Ａ／Ｇ］  ＧＣ−３'
プライマーＲＫＳ  Ｅ逆方向：
５'−ＣＣ［Ａ／Ｇ］  ［Ａ／Ｔ］Ａ［Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ］  ＣＣ［Ａ／Ｇ］  ＡＡ［Ａ／Ｇ］  ＡＣＡ  ＴＣＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＴＣ−３'
【００５６】
これらの配列は、キナーゼドメインの１つのエクソンをコードするヌクレオチド内の保存された部分に基づく。ＰＣＲ増幅反応（６０秒、９４℃；６０秒、５０℃；９０秒、７２℃）×４０サイクルを、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行った。得られるＰＣＲ産物は、２０９ｂｐ  ＤＮＡフラグメントから構成された。ｐＧＥＭ-Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクター中でのクローン化後、合計２１個の異なるクローンを増幅したヌクレオチド配列を同定するために分析した。縮重されたプライマー配列の除去は、１５４ヌクレオチドの配列を生じた。ＲＫＳ１〜４およびＳＥＲＫ遺伝子の配列を除いて、合計４つの新規な未同定のＲＫＳ相同配列が同定され、ＲＫＳ６〜１０としてさらに規定された。ＲＫＳ遺伝子からの配列は、このスクリーニングにおいて同定されなかった。ＲＫＳ５遺伝子からの配列はこのスクリーニングにおいて同定されなかった。
【００５７】
異なるＲＫＳ遺伝子についての単離されおよび配列決定されたクローンの数、続いて単回（複数回）のゲノムＰＣＲにおいて同定されたクローンの数
ＲＫＳ１    １
ＲＫＳ２    ４
ＲＫＳ３    ２
ＲＫＳ４    ５
ＲＫＳ５    ０
ＲＫＳ６    ２
ＲＫＳ７    １
ＲＫＳ８    ２
ＲＫＳ１０３
ＳＥＲＫ／ＲＫＳＯ  １
【００５８】
これらの結果は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムにおいて予測されるＲＫＳ遺伝子（ＳＥＲＫ以外）の保存されたキナーゼドメインに対する相同性を伴う少なくとも９つの異なる配列の存在を示した（図１）。これらのデータを確認するために、単離されたＲＫＳ遺伝子の１つのフラグメントを、サザンブロットにおいてプローブとして使用した（図２）。低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、プローブフラグメントに関連する多くの配列の存在を確認した。使用されたストリンジェンシー（材料および方法を参照のこと）の下、合計約５個のハイブリダイズするバンドが観察され得、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける小さなＲＫＳ遺伝子ファミリーの存在を示す。
【００５９】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ花序組織におけるＲＫＳ遺伝子発現
ＲＫＳ遺伝子が、原基および器官の形成が開始される組織において発現されるか否かを試験するために、ＲＴ−ＰＣＲ反応を、花序に対して行った。ＲＫＳフラグメント増幅について、ＰＣＲプライマーの、ゲノムＰＣＲ反応について記載されるのと同じ組合せを使用した。記載されるヌクレオチドフラグメントにおけるイントロン配列の不在に起因して、得られる産物は再び２０９ｂｐであった。第１鎖ｃＤＮＡから開始して、標準的なＰＣＲ反応を（６０秒間、９４℃；６０秒間、５０℃；９０秒間、７２℃）×４０サイクルについて行った。十分に大量の増幅産物を得るために、最初のＲＴ-ＰＣＲ増幅反応混合液からの１０％の混合液を鋳型として使用して、再増幅を類似の条件下で行った。ｐＧＥＭ−Ｔベクター中でのクローニング後、合計２１個の異なるクローンを、増幅された配列を同定するために配列決定した。縮重されたプライマーの除去は、１５４ヌクレオチドの配列を生じた（図１）。
【００６０】
異なるＲＫＳ遺伝子について単離および配列決定されたＲＴ−ＰＣＲクローンの数、続いて花序組織から同定された単回（複数回）のＲＴ−ＰＣＲ産物の数
ＲＫＳ１    ０
ＲＫＳ２    ０
ＲＫＳ３    ２
ＲＫＳ４    ５
ＲＫＳ５    ０
ＲＫＳ６    ０
ＲＫＳ７    １
ＲＫＳ８    ２
ＲＫＳ１０４
ＲＫＳ１１２
ＲＫＳ１２３
ＲＫＳ１３１
ＲＫＳ１４１
ＳＥＲＫ／ＲＫＳＯ  ０
ＲＫＳ１４
【００６１】
これらの結果は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムにおける予測されるＲＫＳ遺伝子（ＳＥＲＫ以外）の保存されたキナーゼドメインに対して相同性を伴う、少なくとも１４個の異なる配列の存在を示す（図１）。花序内で、少なくとも９つのＲＫＳ様遺伝子が発現された。この実験内で、花序におけるＲＫＳ０、１、２、５、および６の発現は確認され得なかった。異なるＲＫＳ配列間の相同性は、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ２．２からのＡＬＬＩＧＭＥＮＴソフトウェアを使用して行われた（図３）。少なくとも３つの異なる亜群が、ＲＫＳ遺伝子ファミリーを視覚化し、亜群１においてＲＫＳ２およびＲＫＳ６、亜群２においてＲＫＳ４、１１、１、５、１４、および７、ならびに亜群３においてＲＫＳ０、８、１０、１２、および１３を示す。これらの結果は、ハイブリダイゼーションパターンを確認し、ＲＫＳ亜群３のメンバーとハイブリダイズされるゲノミックサザンを用いて観察した（図２）。合計５つのハイブリダイズするバンドが観察され得、これらは、ＲＫＳ０、８、１０、１２、および１３からの遺伝子を示すようであった。
【００６２】
単離されたＰＣＲフラグメントが完全なＲＫＳ遺伝子の部分を示したか否かを研究するために、これらのＰＣＲフラグメントに相同な完全長のおよび部分的なｃＤＮＡクローンを単離し、そして特徴付けた。
【００６３】
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＲＫＳ遺伝子産物の単離および特徴づけ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌｏｍｂｉａ野生型からのｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲ増幅されたＲＫＳ遺伝子フラグメントとハイブリダイズするｃＤＮＡクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリーは、異なる植物器官（長角果、花、幹、ロゼッタ、葉、および根を含む）からのｃＤＮＡインサートに連結されたＳａｌＩ、ＮｏｔＩを含有するＢＲＬλＺｉｐＬｏｘベクターからなった。
【００６４】
フィルターハイブリダイゼーション、異なるＲＫＳフラグメントプローブとストリンジェントな条件（６５℃、０．１ＳＳＣ）下でハイブリダイズするプラークの精製、および最後にヌクレオチド配列分析は、多くのＲＫＳ  ｃＤＮＡクローンの特徴づけを生じた。これらのクローンの予測されるアミノ酸配列は、遺伝子産物が、ＲＫＳ植物受容体キナーゼファミリーＲＫＳのメンバーを示すことを確認した。ｃＤＮＡライブラリーによって同定されたクローンからの配列は、データベースhttp://arabidopsis.org/blast/からの配列情報と比較されそして組合された。１４個の異なる完全長のｃＤＮＡクローン以外に、多くの４つの異なる部分的なクローンが同定された。
【００６５】
トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＲＫＳ遺伝子産物の過剰発現
植物細胞へのプラスミドＤＮＡの形質転換を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８Ｃ１を使用して行った。使用されたバイナリベクターは、ｐＧＲＥＥＮ、ｐＧＲＥＥＮＩＫ、またはＲＫＳ発現構築物からなった。細菌コロニーを、２０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、５０ｍｇ/Ｌカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌラパマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で増殖した。５つのコロニーを、５０ｍｇ/Ｌカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌラパマイシンを含有する５０ｍｌのＬＢ培地を接種するために使用した。３０℃にて１６時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離によって濃縮し、そして１０ｍｌの浸潤培地（水中の５％スクロースおよび０．０５％  Ｓｉｌｗｅｔｔ  Ｌ−７７からなる）中に再懸濁した。形質転換に必要な、ヘルパープラスミドは、ベクターｐＪＩＣ  Ｓａ−Ｒｅｐからなり、およびｐＧＲＥＥＮベクターとともに同時形質転換された。エレクトロポレーションおよび２時間３０℃でのインキュベーション後、細胞を５０ｍｇ／Ｌラパマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢプレート上にプレートした。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ野生型ＷＳ品種を花浸漬プロトコル（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）に従って形質転換した。簡潔には、長日条件（１６時間明所、および８時間暗所）下で生長されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＷＳ幼植物の花序を、１０ｍｌの浸潤溶液中で１０秒間浸漬した。植物をさらに、長日条件のもとで生長させ、そしてさらに３〜５週間後、種子を採集した。種子を、４％漂白溶液中で１５分間滅菌し、そして滅菌水中での徹底的な洗浄後、６０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する１／２ＭＳプレート上にプレートした。長日条件下での１０日間のインキュベーション後、トランスジェニックカナマイシン耐性芽生えを単離し、そして標準的な長日温室条件下でのさらなる非滅菌生長のために土壌に植えた。この浸潤プロトコルは日常的に、使用されたそれぞれのＲＫＳ遺伝子構築物について約１％の形質転換された種子を生じた。
【００６６】
ＲＫＳ形質転換後のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の再生
空のｐＧＲＥＥＮベクター、または３５Ｓプロモーターの制御下でＲＫＳ遺伝子を含むｐＧＲＥＥＮ１Ｋベクターを含有する、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで浸潤された植物から得られた、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｔ２種子を、表面滅菌し、そして１ｍｇ/Ｌ  ２、４−Ｄが添加された４０ｍｌの１／２ＭＳ培地培養液に添加した。４℃での層別化の３日後、培養物を細胞増殖を誘導するために、０〜１８日間、２０℃の気候室中で長日条件下、振盪器上でインキュベートした。異なる時間の間隔で、芽生えを培養物から単離し、洗浄し、そして２、４−Ｄも任意の他のホルモンも含有しない１／２寒天プレート上に移した。気候室でのインキュベーションを、長日条件下、さらに４週間続けた。形質転換されたバイナリーベクター中のＲＫＳ遺伝子の不在下、植物の再生は何ら観察され得なかった（図５Ｃ）。しかし、ＲＫＳ遺伝子発現の存在下、増殖する細胞塊に起源する再生化植物が観察され得た（図５Ａ、Ｂ）。異なるＲＫＳ遺伝子構築物は、シュート分裂組織および葉を再生する能力を示した。再生を誘導する能力は、個々の取り込み事象間、およびＲＫＳ遺伝子構築物間で変化した（図５Ａ対５Ｂ）。４週間の再生のこの時点で、植物は、非滅菌土壌に直接移され、そして長日条件下でさらに４〜６週間生長された。肥沃な種子を備える植物が、図５ＡおよびＢにおいて示されるように、再生された植物から得られた。
【００６７】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ組織への微粒子銃ＤＮＡ送達のための２０μｇのベクターＤＮＡを、バリスティック懸濁混合液：１０ｍｇの金（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏ．  Ｇｏｌｄ  １．５〜３ミクロン）、３０μｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ、５μｌ  ２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８，９６５μｌ水、１００μｌ  ０．１Ｍスペルミジン、１００μｌ  ２５％  ＰＥＧ、１００μｌ  ２．５Ｍ  ＣａＣｌ２とともに混合した。懸濁液を室温で１０分間インキュベートし、そして遠心分離した。得られるペレットをエタノールで２回洗浄し、そして２００μｌの氷冷された９９．８％エタノール中に再懸濁した。各マイクロプロジェクタイルボンバードメントについて、１０μｌの金でコートされたＤＮＡを使用した。ＨＥＬＩＵＭ  ＧＵＮ  ４６１についてのボンバードメント条件は以下のようであった：ヘリウム圧６ｂａｒ、５０ｍｂａｒへの減圧、およびフィルターから組織の９ｃｍの距離。０．１ｍｍメッシュサイズのスクリーンを、組織とフィルターとの間で、フィルターからスクリーンの３ｃｍの距離で使用した。ボンバードメント後、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を、長日条件下で３週間の期間培養した。
【００６８】
再生を刺激する遺伝子産物の発現によって誘導されるＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍにおける再生
２０μｇのプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡでコートされた金粒子とともに微粒子銃ボンバードメントを使用して、タバコ（ＮＴＳＲ１）葉の細胞に移した。葉切片を続いて、１ｍｇ／ｌカイネチンを含有する液体ＭＳ３０培地（ＭＳ培地３０ｇ／スクロース／ｌ、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）培地中に浸し、そして回転振盪器（２５０ｒｐｍ）上で１４日間インキュベートした。次いで、葉をＭＳ３０プレート、０．８%寒天でプレートするために移した。全てのインキュベーションは、２０℃にて１６時間明所、８時間暗所で行われた。空のまたはコントロールベクターを用いるコントロール実験は、シュート形成を決して生じなかった。再生する小植物は、図６Ａ〜Ｃにおいて示されるような再生化ＤＮＡ構築物でのパーティクルボンバードメントの結果として出現した。導入された構築物の一過性の性質は、ボンバードメントされた組織から得られた１０個の異なる再生体のうちの９個について確認され得た（図６Ｄ）。
【００６９】
再生を誘導する遺伝子産物の発現によるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおける細胞増殖の誘導
パーティクルボンバードメント後の再生のより早い段階を同定するために、細胞増殖の形成が、再生化遺伝子産物の活性の結果として研究された。単一の再生化構築物またはこのようなＤＮＡ構築物の組合わせを、ＭＳ寒天プレート上で生長されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの２週齢の芽生え上にボンバードメントした。１〜３週間後、ボンバードメントされたロゼッタ葉の表面から生じる多細胞構造の形成が観察され得た（図６Ｅ〜Ｈ）。空のコントロールベクターでのボンバードメントは、これらの構造の形成を決して生じなかった。興味深いことに、ＧＴ−Ｗ−２０Ｓ構築物でのボンバードメントに起源する増殖する細胞塊は、体細胞胚発生のプロセスによる再生の明らかな同定として体細胞胚を発達した。体細胞胚発生は従って、起源する組織の組織培養状態に依存しないが、親植物になお付着される成葉において直接的に開始され得る。ボンバードメントの前に同じ金粒子上にコートされた異なる再生化構築物の組合せはまた、細胞性増殖のプロセスが開始されることを許容した（図６Ｇ）。増殖された組織の複数の遺伝子座が、異なる再生構築物後に個々の葉において観察され得（図６Ｈ）、再生の頻度が、個々の再生化物でのボンバードメントに比較して再生化構築物の組合せを使用する場合に比較的高かったことを示す。
【００７０】
材料および方法
サザンブロッティング
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ野生型からの１０μｇのゲノムＤＮＡを異なる制限酵素で消化した。フラグメントＤＮＡを、０．９％アガロースゲル上でサイズ分離した。ＤＮＡ精製を、０．４Ｍ  ＮａＯＨを含有する０．６Ｍ  ＮａＣｌ中で行った。キャピラリーブロッティングを、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ+メンブレン上で行った。メンブレンをＣ＆Ｇハイブリダイゼーションミックス（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９８５）中、６５℃にて一晩ハイブリダイズし、そして続いて６５℃にて、５ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで洗浄した。放射活性の検出のために、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ４２５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を、ホスホスクリーン露光カセットおよびＩｍａｇｅＱｕａＮＴソフトウェアと組合せて使用した。
【００７１】
ＤＮＡフラグメント精製
ＤＥ８１濾紙（Ｗｈａｔｍａｎｎ）を、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの単離のために使用した。濾紙切片を、所望されるＤＮＡフラグメント（これは、エチジュームブロミド染色を用いて長波長ＵＶの下に可視化される）の丁度後ろに、アガロースゲルに導入した。電気泳動を、１０分間、１０Ｖ／ｃｍゲルにて行い、そしてＤＮＡが結合されたＤＥ８１濾紙をゲルから取り出した。濾紙切片を低塩緩衝液（Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＬＳＢ）中で徹底的に洗浄し、そして続いてＤＮＡを少量の高塩緩衝液（Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＳＢ）中に濾紙から回収した。
ＬＳＢ（低塩緩衝液）：              ＨＳＢ（高塩緩衝液）：
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５      １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５
１ｍＭ  ＥＤＴＡ                    １ｍＭ  ＥＤＴＡ
１００ｍＭ  ＬｉＣｌ２              １Ｍ  ＬｉＣｌ２
２０％エタノール
【００７２】
放射活性プローブ
精製されたＤＮＡフラグメントを、ランダムにプライムされる放射標識に従って３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射標識した：
２７μｌ水中の５０ｎｇのフラグメントＤＮＡを５分間、１００℃にて変性した。氷上で、２１μｌのＧＡＴミックスを添加した：０．６７Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、０．１７Ｍ  Ｔｒｉｓ、１７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３３ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、２５ｍｇ／ｍｌランダムヘキサマープライマー、３３ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール、５ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｇ＋Ａ＋Ｔ）非含有ｄＣＴＰ、２μｌ  ｄＣＴＰ、および２μｌ  Ｋｌｅｎｏｗ（１Ｕ／μｌ）を添加し、混合し、そしてインキュベーションを６０分間、２５℃にて行った。
【００７３】
ゲノムＰＣＲ
ゲノムＤＮＡを、Ｋｌｉｍｙｕｋら（１９９３）のプロトコルを使用して野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物から単離した。全てのＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒからのＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを使用して行った。ＰＣＲ増幅反応を以下のミックスを使用して標準的な条件下で行った：５分間１００℃にて変性された、５μｌ水中の１００ｎｇゲノム鋳型ＤＮＡ。氷上で以下の成分を添加した：２μｌプライマーＢ（１０μＭ）および２ｍｌプライマーＥ（１０μＭ）、１μｌ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、５μｌ  １０×Ｔａｑ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、０．１ｍｌ  Ｔａｑポリメラーゼ、５単位／μｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、３５μｌ水。パラフィンオイルを２０μｌの容量において表面に添加し、そして増幅を以下の条件下で行った：（６０秒間、９４℃、６０秒間、５０℃、９０秒間、７２℃）×４０サイクル。ＰＣＲ産物をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ−ＰＣＲ産物精製キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して日常的に精製した。精製されたＤＮＡを、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に５倍モル過剰にクローン化した。
【００７４】
ＲＴ−ＰＣＲ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからの花序を、ＳｉｅｂｅｒｔおよびＣｈｅｎｃｈｉｋ（１９９３）のプロトコルに従って全ＲＮＡを単離するための供給源材料として使用した。１０μｌの水中の２．５μｇの全ＲＮＡを、１００℃での１分間のインキュベーションによって線状化し、続いて氷上で以下の成分を添加した：
−２μｌ（１０ｐｍｏｌ）ｄＴレースプライマー５'-ＧＡＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ-３'
−１μｌ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
−４μｌ  ５×ＲＴ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
−０．８μｌ逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｅｘｐａｎｄ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
−２μｌ  １００ｍＭ  ＤＴＴ
【００７５】
インキュベーションを６０分間４２℃で行い、等量のＲＮアーゼ非含有水で希釈し、そして−２０℃にて保存した。ＲＫＳ変性化プライマーＢおよびＥ、２μｌのプライマーＢ（１０μＭ）および２μｌのプライマーＥ（１０μＭ）、１μＭ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、５μｌ  １０×Ｔａｑ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、０．１ｍｌ  Ｔａｑポリメラーゼ、５単位／μｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、３８μｌ水を用いて、２μｌの第１鎖（＝１２５ｎｇ）をＰＣＲ反応において使用した。
【００７６】
パラフィンオイルを２０μｌの容量において表面に添加し、そして増幅を以下の条件下で行った：（６０秒間、９４℃、６０秒間、５０℃、９０秒間、７２℃）×４０サイクル。ＰＣＲ産物をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍからのＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ−ＰＣＲ産物精製キットを使用して日常的に精製した。精製されたＤＮＡを、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に５倍モル過剰にクローン化した。
【００７７】
Ｅ.ｃｏｌｉおよびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換
コンピテント細菌へのプラスミドＤＮＡの形質転換を、Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、エレクトロポレーション（Ｄｏｗｅｒら、１９８８）によって行った。エレクトロポレーションについての条件は以下のようであった：標準的なキュベット中の１．５ｋＶ、２５ｍＦおよび２００Ｗ。形質転換直後に、細胞をＳＯＣ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）中で９０分間、３７℃にてインキュベートした。細菌懸濁液を、選択的な寒天プレート上にプレートし、そしてトランスジェニック細菌コロニーを可視化するために、一晩３７℃にて（Ｅ.ｃｏｌｉ）、または２日間３０℃にて（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）インキュベートした。
【００７８】
ヌクレオチド配列解析
プラスミドＤＮＡを、標準的な煮沸法プロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によってＥ.ｃｏｌｉから単離した後、続いてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍからのＰＣＲ産物精製キットで精製した。プラスミドを、４８０
ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒについて設計されたような標準的なプロトコルを用い、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒからのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔを使用して配列決定した。ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動後、結果を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して解析した。データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３.０、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ２．２、およびＤＮＡ−ｓｔｒｉｄｅｒ１．２プログラムを使用して解析した。
【００７９】
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
ｃλＺｉｐＬｏｘ  ｃＤＮＡライブラリーのプレーティングを、供給者のプロトコル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）によって記載されるように行い、そしてプレートリフティングおよび精製を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載されるように行った。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを、２０個の複製のフィルターを使用して行い、それぞれは約２５０，０００個の個々のプラークを含んだ。フィルターを、２０９ｂｐの増幅されたＰＣＲフラグメントを示す異なるＲＫＳ  ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。標識化の前に、ＤＮＡフラグメントを消化によってｐＧＥＭ−Ｔベクターから単離し、アガロースゲルからのＤＥ８１精製によって２回精製した。フィルターを、ストリンジェントな条件（０．１ＳＳＣ、６５℃）下でハイブリダイズした。両方のフィルターにハイブリダイズするプラークを単離し、そしてその後の２回のさらなる精製のために使用した。得られるｃＤＮＡクローンを、λＺｉｐＬｏｘベクターのマルチクローニング部位のプライマー結合領域からのＴ７およびＳＰ６プライマーを使用して配列決定した。内部オリゴを、ＲＫＳクローンの完全なｃＤＮＡクローンを配列決定するために消化した。同定された各ＲＫＳ遺伝子産物について、１つのｃＤＮＡのみが完全に配列決定された。ＲＫＳ遺伝子からｃＤＮＡを同定し、続いて単離するための代替のアプローチは、そしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムデータベース（アクセスhttp://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/AtDB/nph-blast2atdb）から得られる配列データに基づいて、ＲＫＳに相同な遺伝子についてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムデータベースをスクリーニングすること、これらのＲＫＳ遺伝子産物に特異的なプライマーを使用した、上記のようなＲＴ−ＰＣＲアプローチにより、ｃＤＮＡクローンを増幅することであった。精製されたＲＴ−ＰＣＲ産物を、標準的なプロトコルおよび反応キット内に提供されるような反応ミックスに従って、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に５倍モル過剰にクローン化した。
【００８０】
再生化遺伝子産物の発現構築物
−３４３／−９０ｂｐ領域の複製によって増強されるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｋａｙら、１９８７）を、ＮｏｔＩ消化によりＮＯＳターミネーターとともにベクターｐＭＯＮ９９９から単離した。得られる構築物をベクターｐＧｒｅｅｎ（Ｂｅａｎら、１９９７）にクローン化し、そして得られるバイナリーベクターをさらに、ｐＧｒｅｅｎ１Ｋとして規定した。ＲＫＳｃＤＮＡクローン（図２）を、ＥｃｏＲＩ消化によりｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターから、またはＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化によりλＺｉｐＬｏｘベクターからのいずれかから単離した。得られるｃＤＮＡフラグメントをそれぞれ、ＥｃｏＲＩ消化されたｐＧｒｅｅｎ１ＫまたはＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化されたｐＧｒｅｅｎ１Ｋにクローン化した。ヌクレオチド配列解析を、完全性およびｐＧｒｅｅｎ１ＫにおけるＲＫＳｃＤＮＡの方向を試験するために行った。異なるＲＫＳ0~14が、３５Ｓプロモーターに関してセンス配座にライゲーションされた得られる構築物はさらに、ＲＫＳ発現構築物として規定される。以前に言及された他の再生遺伝子産物は、３５Ｓプロモーターの制御下、ｐＧｒｅｅｎ発現構築物に類似の様式においてクローン化された。
【００８１】
ＲＫＳ遺伝子産物の一過性の発現により誘導される再生
長日条件下で生長された３週齢のＡｒａｂｄｏｐｓｉｓ植物からのロゼッタ葉およびシュート分裂組織を、１%漂白溶液中で２０分間表面滅菌し、徹底的に滅菌水で洗浄し、そして０．８％寒天で固化された１／２ＭＳプレート上に置いた。
【００８２】
パーティクルボンバードメント
植物組織への微粒子銃ＤＮＡ送達のために、２０μｇのベクターＤＮＡをバリスティック懸濁ミックス：１０ｍｇの金（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ、Ｃｏ．Ｇｏｌｄ  １．５〜３ミクロン）、３０μｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ、５μｌ  ２M Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、９６５μｌ水、１００μｌ  ０．１Ｍスペルミジン、１００μｌ  ２５％  ＰＥＧ、１００μｌ  ２．５Ｍ  ＣａＣｌ２とともに混合した。懸濁液を室温で１０分間インキュベートし、そして遠心分離した。得られるペレットをエタノールで２回洗浄し、そして２００μｌの氷冷された９９．８％エタノール中に再懸濁した。各マイクロプロジェクタイルボンバードメントについて、１０μｌの金でコートされたＤＮＡを使用した。ＨＥＬＩＵＭ  ＧＵＮ  ４６１についてのボンバードメント条件は以下のようであった：ヘリウム圧６ｂａｒ、５０ｍｂａｒへの減圧、およびフィルターから組織の9ｃｍの距離。０．１ｍｍメッシュサイズのスクリーンを、組織とフィルターとの間で、フィルターからスクリーンの3ｃｍの距離で使用した。
【００８３】
本発明は、次の実施の形態が可能である。
（１）植物出発材料からの植物の増殖方法であって、該出発材料に少なくとも１種の組み換え遺伝子産物またはその機能的フラグメントを導入することにより根部および／または芽部の形成開始を促進し、これにより該培養物への植物ホルモンの添加を低減または省略する、植物出発材料からの植物の増殖方法。
【００８４】
（２）該少なくとも１種の遺伝子産物またはその機能的フラグメントが該出発材料中一過性にのみ存在する方法。
【００８５】
（３）該遺伝子産物が植物発達の調節に関与する遺伝子に由来する遺伝子産物である方法。
【００８６】
（４）該遺伝子産物をコードする核酸により該出発材料の少なくとも部分をトランスフォームすることを更に包含する方法。
【００８７】
（５）該核酸が該部分で一過性に発現する方法。
（６）該培養がｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養を包含する方法。
【００８８】
（７）該増殖が本質的に非種子増殖である方法。
（８）該出発材料が個々の植物細胞またはプロトプラストまたは移植片または植物組織を含有する方法。
【００８９】
（９）該出発材料が更に所望の性質をコードする組み換え核酸を含有する方法。
（１０）所望の性質をコードする該組み換え核酸が、植物ゲノム内で核ターゲティングおよび／または組込みのための手段を更に付与されている方法。
【００９０】
（１１）該培養物への選択薬剤の添加を低減または省略可能とする方法。
（１２）選択薬剤への耐性を付与する選択性マーカーを該出発材料が含有しない方法。
【００９１】
（１３）選択薬剤が抗生物質または除草剤である方法。
（１４）植物発達の調節に関与する該遺伝子がロイシンリッチ反復配列含有受容体様キナーゼをコードする方法。
【００９２】
（１５）該受容体様キナーゼが図３に示す植物受容体キナーゼファミリーＲＫＳの代表である方法。
【００９３】
（１６）該受容体様キナーゼがＮ末端シグナル配列、ロイシンジッパードメインを有する細胞外領域、ジスルフェート結合ドメイン、ロイシンリッチ反復配列ドメイン、プロリンリッチドメイン、膜貫通ドメイン、アンカードメインを有する細胞内領域、セリン／スレオニンキナーゼドメインおよび／またはＣ末端ロイシンリッチ反復配列ドメインを含有する方法。
【００９４】
（１７）該受容体様キナーゼがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて図４、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の何れかに１つに記載の配列を有する核酸によりコードされる方法。
【００９５】
（１８）前記方法により得られる植物または植物材料。
（１９）図８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の何れかに１つに記載の核酸分子またはその相補核酸にハイブリダイズすることのできる、受容体様キナーゼをコードする単離および／または組み換え核酸またはその機能的フラグメントまたは機能的等価物。
【００９６】
（２０）図８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の何れかに１つに記載の核酸分子またはその機能的等価物または機能的フラグメントまたはその相補核酸に対して少なくとも７５％の相同性を有する核酸。
【００９７】
（２１）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来する核酸。
（２２）前記核酸を含有するベクター。
【００９８】
（２３）前記核酸または前記ベクターを含有する宿主細胞。
（２４）前記方法において使用するための核酸、ベクターまたは宿主細胞。
【００９９】
（２５）図８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の何れかに１つに記載のアミノ酸配列またはその機能的等価物または機能的フラグメントを含有する単離または組み換え蛋白性物質。
【０１００】
（２６）前記核酸によりコードされる、または、前記宿主細胞により産生される蛋白性物質。
【０１０１】
（２７）前記記載の方法において使用するための蛋白性物質。
（２８）前記蛋白性物質を特異的に認識する単離または合成抗体。
【０１０２】
（２９）前記方法において使用するための抗体。
（３０）前記方法における、核酸、ベクター、宿主細胞、蛋白性物質または抗体の使用。
【０１０３】
（３１）植物またはその部分中において前記核酸または前記蛋白性物質を検出することを包含する、植物の発達段階を測定する方法。
【０１０４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１−１】材料と方法に記載の通り、縮重したフォワードおよびリバースＲＫＳプライマーＢおよびＥによって増幅した種々の１５４ｂｐのＰＣＲ断片を表す。ＲＫＳ０断片の配列はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＳＥＲＫ遺伝子の対応領域と一致する。この図中、プライマー配列を示すヌクレオチド配列は２０９ｂｐのもとのＰＣＲ生成物から削除されている。
【図１−２】材料と方法に記載の通り、縮重したフォワードおよびリバースＲＫＳプライマーＢおよびＥによって増幅した種々の１５４ｂｐのＰＣＲ断片を表す。ＲＫＳ０断片の配列はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＳＥＲＫ遺伝子の対応領域と一致する。この図中、プライマー配列を示すヌクレオチド配列は２０９ｂｐのもとのＰＣＲ生成物から削除されている。
【図２】異なる制限酵素で消化されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａゲノムＤＮＡのゲノムサザンブロット。１０μｇの消化されたゲノムＤＮＡを、各レーンに負荷した。低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション（６５℃、５ＳＳＣ）を、ＲＫＳ０のキナーゼドメインの部分をコードする２０９ｂｐ  ＰＣＲフラグメントを用いて行った。
【図３】図１において示される、縮重されたＲＫＳプライマーＢおよびＥを用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから増幅された、１５４ｂｐフラグメント間の相同性。ＲＫＳ遺伝子ファミリーの少なくとも３つの異なる亜群が、視覚化され得、亜群１においてＲＫＳ２およびＲＫＳ６、亜群２においてＲＫＳ４、１１、１、５、１４、および７、ならびに亜群３においてＲＫＳ０、８、１０、１２、および１３を示す。アラインメントを、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ１．２ソフトウエアを使用して行った。
【図４ａ−１】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＲＫＳ０  ｃＤＮＡ  開始コドンが、太字によって示された。
【図４ａ−２】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＲＫＳ０  ｃＤＮＡ  開始コドンが、太字によって示された。
【図４ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−０タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、規則正しく間隔をあけた４個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に５回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。Ｃ末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図５】ＲＫＳ遺伝子の異なる過剰発現する構築物で（ＡおよびＢ）またはＲＫＳ遺伝子を含有しないコントロールｐＧＲＥＥＮ１Ｋベクターで形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の増殖された細胞塊。２，４−Ｄの存在下での１８日間の増殖後、組織を４週間、ホルモンの不在下で生長させた。再生された小植物および緑色シュートは明らかに、形質転換された組織ＡおよびＢ中で可視できるが、空のｐＧＲＥＥＮベクターで形質転換されたコントロール組織（Ｃ）において不在である。
【図６Ａ】０日目、ＧＴ−Ｗ−２０Ｓとともにタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）リーフディスクをバリスティック・ボンバードメントの後、キネチン１ｍｇ／Ｌを加えたＭＳ液体培地で２週間、液内培養する。その後、ホルモン剤を含まないＭＳ寒天平板でディスクを培養する。空のベクターを用いた対照実験ではまったく増殖が誘発されなかった。ボンバードメントの後、葉の培養組織片から再生の形成が認められる。
【図６Ｂ】０日目、ＧＴ−ＳＢＰ５−１６Ｓとともにタバコリーフディスクをバリスティック・ボンバードメントした後、キネチン１ｍｇ／Ｌを加えたＭＳ液体培地で２週間、液内培養する。その後、ホルモン剤を含まないＭＳ寒天平板でリーフディスクを培養する。ボンバードメントの後、葉の培養組織片から再生組織の形成が認められる。空のベクターを用いた対照実験ではまったく新芽が現れなかった。
【図６Ｃ】０日目、ＧＴ−ＳＢＰ５−１６Ｓとともにタバコのカルスをボンバードメントした。カルスは２，４−Ｄオーキシン１ｍｇ／Ｌを補充したＭＳ３０、０．８％寒天で６週間タバコの葉をインキュベートして形成された。葉に形成され、根のような特徴（カルスから根または根毛が伸びる）を有するカルスをさらにＭＳ３０、０．８％寒天ペトリ皿で培養した。インキュベーションは２０℃で、１６時間光を当て、８時間暗所にした。空のベクターを用いた対照実験ではまったく新芽が形成されなかった。ボンバードメントから４０日間、ボンバードメントしたカルス組織の上部に再生植物を特定することができる（植物１および植物２）。
【図６Ｄ】再生した植物のなかでボンバードメントしたＤＮＡの再生作成物の存在を調べるために、図６Ａ〜Ｃの説明に記載した実験で得た１０個の再生組織から組織標本を採取した。２つの対照植物と同じく全標本からもゲノムＤＮＡを単離した。このＤＮＡで、ＮｐｔII遺伝子に特異なプライマーを用いてＰＲＣ反応を実施した。対照として、ＮｐｔII遺伝子を含有するふたつのプラスミドＤＮＡでもＰＣＲを実施した。このふたつは実験Ｉから得た作成物１および３である。ＮｐｔII特異的増幅用オリゴは次の通りである。フォワードオリゴ：５’−ＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧ−３’  リバースオリゴ：５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧ−３’。  得られたＰＣＲ生成物をアガロースゲルで分析した。レーン１および２は図６Ｃからの再生物であり、レーン３〜６は図６Ａからの再生物である。レーン７〜１０は図６Ｂからの再生物である。レーン１〜１０のために単離した組織材料から得た１０個の植物を下に示すが、これはＤＮＡ単離直前の状態である。レーン１１は対照ベクター（ｐＧ１Ｋ−ＧEＰ）によって安定的に形質転換した陽性対照の植物である。レーン１２は陰性対照であり、形質転換していない野生型ＮＴＳＲ１植物である。レーン１３および１４は陽性対照のＥ．ｃｏｌｉで精製し、ＰＣＲ分析に用いたＤＮＡであり、ＭはマーカーＤＮＡである。結果は、レーン８の再生植物のみが安定して組み込まれたＮｐｔII配列を含んでおり、すべての対照でベクターＤＮＡバンドが得られることを示している。
【図６Ｅ】０日目にＭＳ平板寒天上で１４日間育成したシロイヌナズナＷＳの苗に、ＤＮＡを被覆した金粒子をボンバードメントした。これを２０℃で、１６時間光を当て、８時間暗室にしてさらにインキュベートした。金粒子は１８μｇの作成物ＧＴ−ＲＫＳ１３で被覆した。このボンバードメント法で、ＧＵＳ発現ベクターはモル比１０％（ＧＵＳ対ＧＴ−ＲＫＳ１３）でＧＴ−Ｗ−２０Ｓ作成物と組み合わせて共ボンバードメントした。写真撮影の前に、ボンバードメントした組織にＧＵＳ染色を施した。ロゼットの葉の表面に細胞増殖（矢印）を認めることができる。空のベクターを用いた対照実験ではまったく増殖組織が得られなかった。
【図６Ｆ】ＧＴ−Ｗ−２０Ｓ作成物とともにシロイヌナズナをバリスティック・ボンバードメントすることによって、ロゼットの葉の上部で細胞増殖した（左）。体細胞胚の形態的特徴を有する構造が、カルス形成物に現れている（中央、右、白の矢印）。このボンバードメント法で、ＧＵＳの発現ベクターはモル比１０％（ＧＵＳ対ＧＴ−Ｗ−２０Ｓ）でＧＴ−Ｗ−２０Ｓ作成物とともに共ボンバードメントした。ＧＴ−Ｗ−２０Ｓ作成物は隣接細胞の細胞増殖を誘導し、発現細胞自身の（脱）分化に関わる細胞増殖を誘導することができない。そのため、得られた増殖細胞塊は形質転換させることができず、導入した再生作成物の断片またはＧＵＳ発現作成物を含まない。しかし、ＧＵＳ染色後、増殖細胞塊を基に１細胞が明らかにＧＵＳ陽性であり（中央、右、黒の矢印）、この基底細胞がボンバードメントされた作成物によって形質転換していることが示された。図６Ｅに示したものと類似のプロセスが生じており、ＧＴ−ＲＫＳ１３を導入した発現作成物によって、ＧＵＳ陽性基底細胞の上部にＧＵＳ陰性増殖細胞塊が形成されている。空の対照ベクターを用いたボンバードメント試験ではまったく細胞増殖に至らなかった。
【図６Ｇ】ＧＴ−ＣＵＣ２−Ｓ、ＧＴ−ＫＮＡＴ１−ＳおよびＧＴ−ＣＹＣＤ３−ＳとともにシロイヌナズナＷＳをバリスティク・ボンバードメントした。ボンバードメントから１週間以内には、すでに細胞増殖が明らかに確認できる（矢印）。空のベクターを用いた対照ボンバードメント試験は細胞増殖に至らなかった。
【図６Ｈ】ＧＴ−ＣＵＣ２−Ｓ、ＧＴ−ＫＮＡＴ２−ＳおよびＧＴ−ＣＹＣＤ３−３ＳとともにシロイヌナズナＷＳをバリスティク・ボンバードメントした。ボンバードメントから１週間以内には、すでに個々のロゼット葉の内部に細胞増殖の別個の領域が明らかに確認できる（矢印）。空のベクターを用いた対照ボンバードメント試験では細胞増殖に至らなかった。
【図７−１】図３に基づく３つの異なるＲＫＳサブファミリーＩ。予測されるタンパク質産物が示され、そしてアラインメントは予測されるドメイン構造に基づく。二硫酸架橋形成における保存されたシステイン残基が下線される。Ｎ−末端からＣ末端に向かって、これらのドメインはシグナル配列、それぞれロイシンジッパードメイン、二硫酸架橋ドメイン、３〜５個のロイシンリッチ反復を伴うロイシンリッチ反復ドメイン、Ｏ−グリコシル化に関与する推定のヒドロキシプロリンドメイン、単一の膜貫通ドメインからなる細胞外領域、それぞれアンカードメイン、セリン／スレオニンキナーゼドメイン、未知の機能を伴うドメインからなる細胞内領域、およびＣ末端での細胞内ロイシンリッチ反復を模倣する配列として規定され得る。
【図７−２】図３に基づく３つの異なるＲＫＳサブファミリーＩＩ。予測されるタンパク質産物が示され、そしてアラインメントは予測されるドメイン構造に基づく。二硫酸架橋形成における保存されたシステイン残基が下線される。Ｎ−末端からＣ末端に向かって、これらのドメインはシグナル配列、それぞれロイシンジッパードメイン、二硫酸架橋ドメイン、３〜５個のロイシンリッチ反復を伴うロイシンリッチ反復ドメイン、Ｏ−グリコシル化に関与する推定のヒドロキシプロリンドメイン、単一の膜貫通ドメインからなる細胞外領域、それぞれアンカードメイン、セリン／スレオニンキナーゼドメイン、未知の機能を伴うドメインからなる細胞内領域、およびＣ末端での細胞内ロイシンリッチ反復を模倣する配列として規定され得る。
【図７−３】図３に基づく３つの異なるＲＫＳサブファミリーＩＩＩ。予測されるタンパク質産物が示され、そしてアラインメントは予測されるドメイン構造に基づく。二硫酸架橋形成における保存されたシステイン残基が下線される。Ｎ−末端からＣ末端に向かって、これらのドメインはシグナル配列、それぞれロイシンジッパードメイン、二硫酸架橋ドメイン、３〜５個のロイシンリッチ反復を伴うロイシンリッチ反復ドメイン、Ｏ−グリコシル化に関与する推定のヒドロキシプロリンドメイン、単一の膜貫通ドメインからなる細胞外領域、それぞれアンカードメイン、セリン／スレオニンキナーゼドメイン、未知の機能を伴うドメインからなる細胞内領域、およびＣ末端での細胞内ロイシンリッチ反復を模倣する配列として規定され得る。
【図８ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ１のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図８ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ１のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図８ｂ】シロイヌナズナＲＫＳ−１タンパク質の予測されるアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、３個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に３回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図９ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ２のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図９ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ２のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図９ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１４タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、２個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に４回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１０ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ３のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１０ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ３のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１０ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−３タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、３個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に４回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【０１０６】
【図１１ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ４のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１１ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ４のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１１ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−４タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、２個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に５回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１２ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ５のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１２ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ５のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１２ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−５タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、２個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に４回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは明確な機能がない。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１３ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ６のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１３ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ６のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１３ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−６タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、３個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に５回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１４ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ８のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１４ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ８のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１４ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−８タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、４個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に５回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域を表しており（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートを１つ表しており、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１５ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ１０のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１５ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ１０のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１５ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１０タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、４個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に４回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１６ａ】シロイヌナズナＲＫＳ１１のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１６ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１１タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、３個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に３回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１７ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ１２のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１７ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ１２のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１７ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１２タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、２個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に４回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１８ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ１３のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１８ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ１３のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１８ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１３タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、４個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に４回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１９ａ−１】シロイヌナズナＲＫＳ１４のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１９ａ−２】シロイヌナズナＲＫＳ１４のｃＤＮＡ  開始コドンを太字で示す。
【図１９ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１４タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。予測される細胞外領域では、最初のドメインがシグナル配列を表している。２番目のドメインはロイシンジッパーモチーフをひとつ含み、２個のロイシン残基が含まれており、それぞれ７個の他のアミノ酸によって区切られている。３番目のドメインは保存されたシステイン残基を含み、ジスルフィド架橋形成に関与する。４番目のドメインはロイシンリッチリピート領域をひとつ含み、約２４個のアミノ酸残基が完全に４回繰り返されて構成されている。５番目のドメインは多数のセリンおよびプロリン残基を含み、ヒドロキシ−プロリン残基を含んでいるように思われ、O−グリコシル化のための部位である。６番目のドメインは膜貫通領域をひとつ含み、その後ろに予測される細胞内領域が位置する。７番目のドメインは機能が不明である。８番目のドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。９番目のドメインは機能が不明である。C末端にある最後の１０番目のドメインは、ロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図２０Ａ】シロイヌナズナＲＫＳ７の部分的ｃＤＮＡ配列  ５’末端とふたつのｃＤＮＡ断片間の領域（…）とは図示しない。
【図２０Ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−７タンパク質の部分的アミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。このタンパク質配列は部分的なｃＤＮＡ配列から得ている。最初に得られるドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域の一部であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。次のドメインは機能が不明である。Ｃ末端にある最後のドメインはロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図２１Ａ】シロイヌナズナＲＫＳ９の部分的ｃＤＮＡ配列  ５’末端は図示していない。
【図２１Ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−９タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。このタンパク質配列は部分的なｃＤＮＡ配列から得ている。最初に得られるドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域の一部であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。次のドメインは機能が不明である。Ｃ末端にある最後のドメインはロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図２２Ａ】シロイヌナズナＲＫＳ１５の部分的ｃＤＮＡ配列  ５’末端は図示していない。
【図２２Ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１５タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。このタンパク質配列は部分的なｃＤＮＡ配列から得ている。最初に得られるドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域の一部であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。次のドメインは機能が不明である。Ｃ末端にある最後のドメインはロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図２３Ａ】シロイヌナズナＲＫＳ１６の部分的ｃＤＮＡ配列  ５’末端は図示していない。
【図２３Ｂ】予測されるシロイヌナズナＲＫＳ−１６タンパク質のアミノ酸配列である。異なるドメインはスペースを空けており、Ｎ末端からＣ末端方向に図示する。全体的なドメイン構造はＳｃｈｍｉｄｔらが記述したのとほぼ同じである（１９９７年）。このタンパク質配列は部分的なｃＤＮＡ配列から得ている。最初に得られるドメインはセリン／トレオニンプロテインキナーゼ領域の一部であり（Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７年）、タンパク質、タンパク質相互作用のための配列も含んでいるように思われる。次のドメインは機能が不明である。Ｃ末端にある最後のドメインはロイシンリッチリピートであり、タンパク質、タンパク質相互作用に関与していると思われる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ−１】
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【図４ａ−２】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８ａ−１】
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【図８ａ−２】
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【図８ｂ】
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【図９ａ−１】
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【図９ａ−２】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ−１】
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【図１０ａ−２】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ−１】
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【図１１ａ−２】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ−１】
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【図１２ａ−２】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ−１】
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【図１３ａ−２】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ−１】
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【図１４ａ−２】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ−１】
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【図１５ａ−２】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ−１】
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【図１７ａ−２】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ−１】
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【図１８ａ−２】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ−１】
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【図１９ａ−２】
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【図１９ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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