(57)【要約】【課題】一定温度、一段階操作で、迅速にＣＥＡｍＲＮＡを増幅、検出し、ＣＥＡ関連抗原のｍＲＮＡを検出しないことを特徴とする、ＣＥＡｍＲＮＡの測定方法の提供。【解決手段】ＣＥＡｍＲＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーによるＲＮＡ増幅工程と、増幅領域内のＣＥＡｍＲＮＡ配列と相同性が高く、ＣＥＡ関連抗原ｍＲＮＡ配列と相同性が低いインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて測定する工程を含む測定法によって、前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、以降ＣＥＡと略す）ｍＲＮＡの測定方法であり、かつ、ＣＥＡ関連抗原のｍＲＮＡを検出しない測定方法であって、
ＣＥＡｍＲＮＡ内の特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマーおよび特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（ここで第１または第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、
（１）ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、
（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列または特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、および、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）を行う、試料中のＣＥＡｍＲＮＡを増幅する工程と、該増幅工程において、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを作用させ、該オリゴヌクレオチドとＲＮＡ転写産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して、反応液の蛍光強度を測定することを含む測定方法であり、
第１のプライマーが配列番号３で示される塩基配列の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであり、第２のプライマーが配列番号２で示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドが配列番号４または５に示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、測定方法。
【請求項２】
第２のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＣＥＡｍＲＮＡの特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下で実施され、ここで該オリゴヌクレオチドは配列番号１に示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１のＣＥＡｍＲＮＡの測定方法。
【請求項３】
請求項１または２の方法において、試料が腫瘍細胞の原発巣以外から得られたものであることを特徴とする、腫瘍細胞の微小転移の検出方法。
【請求項４】
配列番号４または５で示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上、またはその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基以上、を含むことを特徴とするＣＥＡの核酸配列またはその相補配列に特異的なオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に示される、いずれかのオリゴヌクレオチドを含有するＣＥＡの核酸配列の測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定配列を利用した癌胎児性抗原ｍＲＮＡの測定方法、およびこれに使用するオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、以降ＣＥＡと略す）は、１９６５年Ｇｏｌｄらによりヒト大腸癌組織および胎児腸管に存在する癌特異抗原として報告された分子量１８０，０００の糖タンパク質であり、現在では消化器系上皮や多くの癌組織（結・直腸、乳房、肺、頚部、胃、膀胱、膵、食道等）中に存在が確認されている。一方、ＣＥＡはアミノ酸配列の相同性（７０〜９５％）から、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質で、ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ（以降、ＮＣＡと略す）やｂｉｌｉａｒｙ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（以降、ＢＧＰと略す）、ＣＥＡ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ（以降、ＣＧＭと略す）１、ＣＧＭ２、ＣＧＭ６、ＣＧＭ７、ＣＧＭ８、ＣＧＭ９等のＣＥＡ関連抗原とＣＥＡ遺伝子ファミリーを作っていることがわかっている。
【０００３】
ＣＥＡタンパク質は腫瘍の消長がその血中値の変動に反映されることなどから、免疫測定法によるＣＥＡタンパク質の測定が癌の診断および治療のモニターに最も広く利用されている。しかし、この免疫測定法に使用される抗ＣＥＡ抗体が、上記、アミノ酸配列の高い相同性から他のＣＥＡ関連抗原と交差反応性を示すことによる擬陽性が問題となっている。そこで、例えばＮＣＡと交差反応性を示さない抗ＣＥＡ抗体が報告されている（特許文献１）。
【０００４】
最近、血中やリンパ節中の癌細胞を検出することによる、治療効果のモニタリングや微小転移の診断に関する研究が盛んに行われている。この場合、高い感度が要求されることから、癌細胞が産生するＣＥＡタンパク質ではなく、癌細胞が発現しているＣＥＡｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で増幅して、検出する方法が用いられている（非特許文献１、２）。これらの場合でも、ＣＥＡとＣＥＡ関連抗原のｍＲＮＡ配列の高い相同性に由来する交差反応性が原因となって生じる擬陽性は大きな問題となる。そこで、ＲＴ−ＰＣＲ法においてＣＥＡ関連抗原と交差反応性を示さない、ＣＥＡｍＲＮＡ増幅用プライマーが報告されている（非特許文献３，４）。これらの文献に記載のプライマーを使用することで、ＣＥＡｍＲＮＡのみを特異的に増幅、検出することが可能になった。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法はＣＥＡｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する工程が必要であり、操作に熟練を要し、検出結果を得るまでに長時間を要することから、例えば、手術中の微小転移診断に要求されるような迅速、簡便にＣＥＡｍＲＮＡを検出、定量することは困難である。
【０００５】
一方、以下の方法が知られている。
【０００６】
ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡに変換した後、反応液を昇降温してＤＮＡを増幅するいわゆるＰＣＲを実施するＲＴ−ＰＣＲ法とは異なり、反応液の昇降温なしにＲＮＡをＲＮＡとして増幅し検出する方法である（例えば特許文献２に記載されたＮＡＳＢＡ法、特許文献３に記載されたＴＭＡ法、特許文献４に記載された増幅・検出法等）。これらの方法では、例えば、その転写によって特定配列のＲＮＡ転写産物を生成する、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成することを含む方法である。
【０００７】
より具体的には、例えば、任意のＲＮＡに存在し、該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る特定配列に対して、（１）その３’端に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、（２）この逆転写によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解し、１本鎖ＤＮＡを生成させ、（３）この１本鎖の３’端に相補的で、それ自身がその５’端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記したプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、（４）この２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させてＲＮＡ転写産物（特定配列のＲＮＡ）を生成するのである。ＲＮＡ転写産物は特定配列のＲＮＡであるため、前記（１）の反応における鋳型となり、前記（１）反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（２）以降の反応が進行してＲＮＡ増幅の連鎖反応が引き起こされる。
【０００８】
これら方法の特徴は、ＰＣＲのように反応液を昇降温する必要がなく、またＲＮＡの逆転写とその後の連鎖的増幅反応を分けて実施することがない、という点にある。さらに、増幅された特定配列に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させ、特定配列またはそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる特許文献４に記載の増幅、検出法は一定温度、一段階操作で実施でき、迅速性に優れた定量法である。
【０００９】
この特許文献４の方法に適した、ＣＥＡｍＲＮＡ増幅用プライマー、検出用プローブは特許文献５に記載されている。この方法は、迅速、簡便に試料中のＣＥＡｍＲＮＡを測定することができ、例えば、手術中の微小転移診断等において有用な手段となり得る。しかし、特許文献５の実施例で使用している検出用プローブの配列は、増幅用プライマーで増幅される領域におけるＣＥＡ関連抗原、例えば、ＢＧＰｍＲＮＡ、ＮＣＡｍＲＮＡ配列と高い相同性があり、ＣＥＡ関連抗原ｍＲＮＡの発現が少ないと考えられるリンパ節等を試料とする場合は特に問題はないが、ＣＥＡ関連抗原ｍＲＮＡの発現量が多い大腸粘膜等を含む試料を測定する場合は、擬陽性を生じる可能性を否定できない。そこで、特許文献５の方法の有用性（簡便性、迅速性）を維持し、さらに、ＣＥＡ関連抗原ｍＲＮＡを検出せずに、ＣＥＡｍＲＮＡの増幅、検出を行い得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
【００１０】
【特許文献１】特開平１１−３１５１００号公報
【特許文献２】特許第２６５０１５９号
【特許文献３】特許第３２４１７１７号
【特許文献４】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献５】特願２００４−１３２７５２号
【特許文献６】特許第３５７２３４０号
【特許文献７】特開平７−０５９５７２号公報
【非特許文献１】Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒ．，Ｗａｌｋｅｒ  Ｍ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，７８１７−７８２３，２００２年
【非特許文献２】Ｏｂｅｒｇ  ＡＮ．，Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ＧＥ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１１，１０１−１１０，２００４年
【非特許文献３】Ｋｉｎｕｇａｓａ  Ｔ．，Ｋｕｒｏｋｉ  Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７６，１４８−１５３，１９９８年
【非特許文献４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．，Ｍｏｓｓｉｎｇｅｒ  Ｓ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５５，３１１−３１９，１９９３年
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７，１９９６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明の目的は、試料に対し特許文献５のような方法を適用して、ＣＥＡｍＲＮＡを増幅、検出することにより、ＣＥＡ関連抗原のｍＲＮＡを検出せずに、ＣＥＡｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に測定可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するためになされた本願請求項１の発明は、試料に対して、ＣＥＡｍＲＮＡに存在する特定配列について、特定配列の一部と相補的な配列を有する第１のプライマー（配列番号３で示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上を含むことを特徴とする）および特定配列の一部と相同的な配列を有する第２のプライマー（配列番号２で示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上を含むことを特徴とする。ここで第１または第２のプライマーのいずれか一方はその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである）を用いて、
（１）ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列に相補的なｃＤＮＡの合成、
（２）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡの分解（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定配列または特定配列に相補的な配列とＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡの生成、および、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による該２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物の生成（このＲＮＡ転写産物は、前記（１）の反応における鋳型となる）、
を行うことによるＣＥＡｍＲＮＡに存在する特定配列の増幅工程と、該増幅工程において、
インターカレーター性蛍光色素で標識された配列番号４または５に示される、塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドを作用させ、該オリゴヌクレオチドとＲＮＡ増幅産物との相補結合によって、複合体を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化することを利用して、反応液の蛍光強度を測定することを含む、ＣＥＡ関連抗原のｍＲＮＡを検出せずにＣＥＡｍＲＮＡを測定する方法である。
【００１３】
本願請求項２の発明は、請求項１の方法において、ＣＥＡｍＲＮＡを特定配列の５’末端で切断する際に、配列番号１で示される塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする測定方法である。
【００１４】
本願請求項３の発明は、請求項１または２の方法において、試料が腫瘍細胞の原発巣以外から得られたものであることを特徴とする、腫瘍細胞の微小転移の検出方法である。
【００１５】
本願請求項４の発明は、配列番号４または５で示されるいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１０塩基以上、またはその相補鎖中の、少なくとも連続した１０塩基以上を含む、ＣＥＡの核酸配列またはその相補配列に特異的なオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本願請求項５の発明は、請求項４に示されるいずれかのオリゴヌクレオチドを含有するＣＥＡの核酸配列の測定キットである。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、ＲＮＡをＲＮＡとして増幅する方法を採用することにより、ＣＥＡｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に測定可能である。特にＲＮＡ転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させておけば、特定配列またはそれに相補的な配列の増幅と同時にその増幅の様子を検出（モニタリング）することができる。モニタリングに用いるプローブは、特定配列またはそれに相補的な配列と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドに、該オリゴヌクレオチドがＲＮＡ転写産物と相補結合すると、結合していない状態と比較して蛍光特性が変化するインターカレーター性蛍光色素を結合したものであり、本発明を実施するにおいて前記モニタリングは最も好適な形態である。なお、オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識方法は特に限定はないが、リン原子からリンカーを介して結合する方法が望ましい。結合方法としてはまず、オリゴヌクレオチドの鎖内または末端にアミノ基等の官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素にも必要であればオリゴヌクレオチドへ導入した官能基と反応または結合可能な官能基を導入し、双方の官能基同士を結合させることが例示できる。より詳細には、特許文献６または非特許文献５に記載されている。
【００１９】
本発明は、一定温度で実施することができるが、その温度は３５℃から６５℃（好ましくは４３℃）と比較的低温である。
【００２０】
本発明中の特定配列とはＣＥＡｍＲＮＡの少なくとも一部の塩基配列からなり、第１のプライマーおよび第２のプライマーによって規定される領域の配列を有する。本発明では、特定配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅される。
【００２１】
本発明の実施に当たっては、まずＣＥＡｍＲＮＡ中に存在する特定配列を決定する。次に、ＣＥＡｍＲＮＡ内の特定配列に基づいて本発明の実施に使用する第１および第２プライマー等の配列をデザインする。例えば配列番号３および２で示される塩基配列の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、実施例において述べるように、ＣＥＡｍＲＮＡの増幅用プライマーとして好適な配列を示したものであり、配列番号４または５で示される塩基配列またはその相補鎖中の、少なくとも１０の連続するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、検出用プローブとして好適な配列を示したものである。
【００２２】
ここで試料とは、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明では例えば、ヒト細胞や組織を材料として、特許文献７等に記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、前記例示したようなＲＮＡを直接的な増幅・検出対象とすることで、当該試料の由来元であるヒト細胞や組織中のＣＥＡｍＲＮＡの検出および定量を行うのである。
【００２３】
以下に本願発明をさらに具体的に説明する。試料中に、増幅・検出対象としたＣＥＡｍＲＮＡが存在した場合には、
（１）ＣＥＡｍＲＮＡ中に存在する特定配列を鋳型として、第１のプライマー（特定配列の３’末端領域に相補的な配列）が相補結合し、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応からｃＤＮＡを生成することによりＲＮＡ−ＤＮＡからなる２本鎖を形成し、
（２）次いでリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素によりＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡが分解されて１本鎖ＤＮＡを生成する。その後、
（３）該１本鎖ＤＮＡに対し第２のプライマー（特定配列の５’末端領域に相同的な配列で、その５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されている）が相補結合し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーターを有する２本鎖ＤＮＡを生成する。そして、
（４）該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素存在下で特定配列と相同的な配列からなるＲＮＡ転写産物が生成されるが、このＲＮＡ転写産物は特定配列からなるＲＮＡであるため（１）の反応における鋳型となり、結果として上記（１）から（４）の反応はＲＮＡやＤＮＡを生成する際の酵素基質が使い尽くされるか、または、上記の各種酵素が失活するまで連鎖的に生じることになる。
【００２４】
上記例は第２のプライマーとしてその５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたものを用いる例（以下第１形態という）である。本発明では、第１プライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加して使用しても良い（以下第２形態という）。第１形態で本発明を実施する場合には、特定配列の増幅効率を高めてその検出感度を向上させるために、前記（１）の反応に先立って、特定配列を含むＲＮＡを特定配列の５’末端で切断しておくことが好ましい（例えば特許文献４参照）。
【００２５】
ＲＮＡを切断する方法としては、例えば、特定配列の５’末端に重複して隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（切断用オリゴヌクレオチド）を共存させ、後の反応でも使用されるリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させて切断する方法を例示することができる。ＣＥＡｍＲＮＡの切断用オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す配列の少なくとも連続した１０塩基からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。ここで、切断用オリゴヌクレオチドの３’末端は、このオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能しないよう、例えばアミノ化等の処理を施しておくことが好ましい。
【００２６】
ＣＥＡｍＲＮＡを検出および定量するためには、上記のようにして増幅された特定配列の存在を検出してその存否を確認し、または、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定する必要がある。特定配列の検出は、例えば一定時間上記反応を行った反応液に対して、特定配列に対して相補的に結合し得る固定化および標識化プローブを用いるサンドイッチアッセイ法を適用することもできるが、前述したように、特定配列に特異的に結合する、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することが好ましい。またこのプローブは前記（１）から（４）の反応を阻害しないため、その存在下で上記特定配列の増幅を実施して、特定配列の増幅の様子をモニタリングすることが特に好ましい。なお、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定配列の増幅を行う場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸やビオチンを付加する等しておくことが好ましい。そして増幅反応中にこのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが特定配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出機によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した増幅反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、その存否を確認し、または、増幅された特定配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定配列量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。ＣＥＡｍＲＮＡ検出用のインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列としては、配列番号４または５に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基、またはその相補鎖中の少なくとも連続した１０塩基からなる配列であることが好ましい。第１のプライマーが配列番号３で第２のプライマーが配列番号２で増幅される領域において、配列番号４または５の配列のＣＥＡｍＲＮＡに対する配列相同性は１００％だが、ＣＥＡ関連抗原、例えば、ＢＧＰｍＲＮＡ、ＮＣＡｍＲＮＡに対する配列相同性は３０％である。したがって、本願発明のオリゴヌクレオチドプライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを用いることで、ＣＥＡ関連抗原は検出せずにＣＥＡｍＲＮＡを高感度に測定可能な方法を提供することができる。
【００２７】
以上に記載した本発明の方法は、予め検出キットを用意しておくことにより、極めて簡単に実施することが可能である。検出キットは、好ましくは、第１のプライマー、第２のプライマー、（第１形態で本発明を実施するのであれば）切断用プライマー、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、及びこれら酵素の基質等の特定配列を増幅し検出するために必要な全ての試薬を含むものであるが、これら全ての試薬を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。すなわち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＣＥＡｍＲＮＡを増幅し検出することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいれば良く、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションの防止のうえで特に好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
以上の説明のように、本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜６５℃、好ましくは４３℃）の条件下で、増幅反応から検出までを完全に一段階の操作で、短時間に、ＣＥＡ関連抗原との交差反応性は示さずに、ＣＥＡｍＲＮＡを測定することができる。したがって、反応の開始時にも反応温度以上に温度を上昇させる必要がなく、操作を簡便なものとし、反応装置の複雑化を防ぐことができる。また、短時間の検出を達成することで、癌細胞の微小転移を迅速に捕らえることも可能となる。本発明では、試料中のＣＥＡｍＲＮＡをもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源になり、さらに合成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することによる蛍光増加を測定する工程において、蛍光特性が変化する過程を解析することにより、簡便かつ、短時間に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。したがって本発明は、手術中における癌細胞の微小転移を検出することに適した方法である。
【００２９】
本発明は、一段階操作でＣＥＡｍＲＮＡを測定するためのオリゴヌクレオチドの組合せを提供すること、すなわち高次構造を変性させることなくＣＥＡｍＲＮＡに相補的結合可能で、ＣＥＡ関連抗原ｍＲＮＡを検出しない増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー、および検出用のオリゴヌクレオチドプローブの組合せを提供する。したがって、ＣＥＡ関連抗原ｍＲＮＡの検出による擬陽性を防ぎ、簡便、迅速かつ高感度なＣＥＡｍＲＮＡ発現細胞の測定方法ならびに測定キットを医療分野に提供する。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを２種作製した。
【００３２】
１種は配列番号５（第１のプライマーが配列番号３で第２のプライマーが配列番号２で増幅される領域においてＣＥＡｍＲＮＡに対する配列相同性は１００％、ＢＧＰｍＲＮＡ、ＮＣＡｍＲＮＡに対する配列相同性は３０％）に記載の配列中の５’末端から６番目の塩基（Ｇ）と７番目の塩基（Ａ）の間のリン原子に、非特許文献５の方法によりインターカレーター性蛍光色素として公知の色素であるオキサゾールイエローを標識した、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブである。もう１種は、同様の方法で、配列番号６（第１のプライマーが配列番号３で第２のプライマーが配列番号２で増幅される領域においてＣＥＡｍＲＮＡに対する配列相同性は１００％、ＢＧＰｍＲＮＡ、ＮＣＡｍＲＮＡに対する配列相同性は１００％）に記載の配列中の５’末端から８番目の塩基（Ｇ）と９番目の塩基（Ａ）の間のリン原子に、インターカレーター性蛍光色素として公知の色素であるオキサゾールイエローを標識した、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブである。
【００３３】
実施例２
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わせを用いて、ＣＥＡ  ＲＮＡの様々な初期コピー数における検出を行った。
【００３４】
（１）ＣＥＡ  ＲＮＡの調製を行った。
ＣＥＡ  ＲＮＡとは、ＣＥＡの塩基配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｍ２９５４０の２９７４塩基中の６１番目〜２３７２番目の２３１２塩基の２本鎖ＤＮＡをクローニング後、鋳型としてインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。
ＣＥＡ  ＲＮＡ（２３１２ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い１．０×１０６コピー／５μｌ〜３０コピー／５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（ｎｅｇａ）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【００３５】
（２）以下の組成の反応液２０．０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＰＣＲ  ｔｕｂｅ  ｗｉｔｈ  ｄｏｍｅ  ｃａｐ、フナコシ製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３６】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１８．０ｍＭ  塩化マグネシウム
１００．０ｍＭ  塩化カリウム
１．０ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ  ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各１．０μＭの第１のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３）と第２のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２）。なお、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列の５’末端には配列番号７（Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター配列）を付加して使用した。
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１；ＣＥＡ  ＲＮＡを第２のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド。３’末端はアミノ化）
６ユニット  リボヌクレアーゼ  インヒビター（タカラバイオ製）
１３．０％  ＤＭＳＯ
容量調製用蒸留水
１２．０ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（実施例１で調製した配列番号５の配列）。
【００３７】
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、かつ、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μｌを添加した。
【００３８】
酵素液の組成（反応時の最終濃度）
２．０％  ソルビトール
６．４ユニット  ＡＭＶ逆転写酵素  （タカラバイオ製）
１４２ユニット  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （タカラバイオ製）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
容量調製用蒸留水。
【００３９】
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃に保温して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図１に示した。なお、バックグラウンドの蛍光強度値は各サンプルの酵素添加時から９０、１２０、１５０秒後の蛍光強度値の平均値とした。ＲＮＡサンプル濃度は１０６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌである。図１より、ＣＥＡ  ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファイルが得られ、未知試料中に存在するＣＥＡｍＲＮＡ量を検出、定量することが可能であることが示唆された。また、増幅産物生成量に依存した蛍光強度比の増加開始時間（検出時間）は、１０２コピー／３０μｌで約１０分だった。なお、検出時間は、酵素添加時から蛍光強度比が１．２に達した時間を意味する。
【００４０】
実施例３
本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーの組合わせを用いて、ＣＥＡ関連抗原のｍＲＮＡを検出しないことを確認した。
【００４１】
（１）ＢＧＰ  ＲＮＡ、ＮＣＡ  ＲＮＡの調製を行った。
ＢＧＰ  ＲＮＡとは、ＢＧＰの塩基配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００１７１２の３４６４塩基中の６１番目〜３１７５番目の３１１５塩基の２本鎖ＤＮＡをクローニング後、鋳型としてインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。
ＢＧＰ  ＲＮＡ（３１１５ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い１．０×１０７コピー／５μｌ〜１．０×１０５コピー／５μｌとなるよう希釈した。
ＮＣＡ  ＲＮＡとは、ＮＣＡの塩基配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＢＣ００５００８の２２４９塩基中の５８番目〜２０８２番目の２０２５塩基の２本鎖ＤＮＡをクローニング後、鋳型としてインビトロ転写により合成、精製されたＲＮＡである。
ＮＣＡ  ＲＮＡ（２０２５ｍｅｒ）を試料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用い１．０×１０１０コピー／５μｌ〜１．０×１０８コピー／５μｌとなるよう希釈した。
【００４２】
（２）ＢＧＰ  ＲＮＡ、ＮＣＡ  ＲＮＡの測定
上記で作製したＢＧＰ  ＲＮＡ、ＮＣＡ  ＲＮＡを測定した。また、同時にＣＥＡ  ＲＮＡ  １．０×１０２コピー／５μｌを測定した。試薬組成、測定方法は実施例２と基本的に同様であるが、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、実施例１で作製した２種類を使用した。試薬Ａでは、配列番号５（第１のプライマーが配列番号３で第２のプライマーが配列番号２で増幅される領域においてＣＥＡｍＲＮＡに対する配列相同性は１００％、ＢＧＰｍＲＮＡ、ＮＣＡｍＲＮＡに対する配列相同性は３０％）で作製したオリゴヌクレオチドプローブを使用した。試薬Ｂでは、配列番号６（第１のプライマーが配列番号３で第２のプライマーが配列番号２で増幅される領域においてＣＥＡｍＲＮＡに対する配列相同性は１００％、ＢＧＰｍＲＮＡ、ＮＣＡｍＲＮＡに対する配列相同性は１００％）で作製したオリゴヌクレオチドプローブを使用した。
表１に各ＲＮＡ測定時の検出時間を示した。
【００４３】
【表１】
2006340663.tif 000002
【００４４】
表１において、ＢＧＰ１０＾５はＢＧＰ  ＲＮＡ  １０５コピー／３０μｌ、ＢＧＰ１０＾６はＢＧＰ  ＲＮＡ  １０６コピー／３０μｌ、ＢＧＰ１０＾７はＢＧＰ  ＲＮＡ  １０７コピー／３０μｌ、ＮＣＡ１０＾８はＮＣＡ  ＲＮＡ  １０８コピー／３０μｌ、ＮＣＡ１０＾９はＮＣＡ  ＲＮＡ  １０９コピー／３０μｌ、ＮＣＡ１０＾１０はＮＣＡ  ＲＮＡ  １０１０コピー／３０μｌ、ＣＥＡ１０＾２はＣＥＡ  ＲＮＡ  １０２コピー／３０μｌであることを示す。
試薬Ａでは、ＣＥＡ  ＲＮＡ  １０２コピー／３０μｌの検出時間は約１０分だった。しかし、ＢＧＰ  ＲＮＡは１０７コピー／３０μｌが非検出、また、ＮＣＡ  ＲＮＡは１０１０コピー／３０μｌでも非検出だった。非検出とは、酵素添加後３０分以内に蛍光強度比が１．２に達しなかったことを意味する。一方、試薬Ｂでは、ＣＥＡ  ＲＮＡ  １０２コピー／３０μｌの検出時間は約９分だった。ＢＧＰ  ＲＮＡ  １０６コピー／３０μｌの検出時間は１５．１分、３０．０分、ＮＣＡ  ＲＮＡ  １０８コピー／３０μｌの検出時間は１０．７分、１１．３分だった。この結果から、本願発明によるオリゴヌクレオチドプライマーとインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブの組合わせによる測定方法は、ＣＥＡ  ＲＮＡは高感度に検出するが、ＢＧＰ  ＲＮＡ、ＮＣＡ  ＲＮＡは検出しないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】初期ＣＥＡ  ＲＮＡ量１０６コピー／３０μｌから３０コピー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加率のグラフである。ｃａｌ３０はＣＥＡ  ＲＮＡ  ３０コピー／３０μｌ、ｃａｌ１０＾２はＣＥＡ  ＲＮＡ  １０２コピー／３０μｌ、ｃａｌ１０＾３はＣＥＡ  ＲＮＡ  １０３コピー／３０μｌ、ｃａｌ１０＾４はＣＥＡ  ＲＮＡ  １０４コピー／３０μｌ、ｃａｌ１０＾５はＣＥＡ  ＲＮＡ  １０５コピー／３０μｌ、ｃａｌ１０＾６はＣＥＡ  ＲＮＡ  １０６コピー／３０μｌである。ｎｅｇａはＲＮＡ試料の代わりにＲＮＡ希釈液のみを用いた。
【図１】
2006340663.tif 000003
【配列表】
2006340663000001.app