(57)【要約】【課題】ＮＡＤ依存酵素による１２−ケトケノデオキシコール酸の酵素的合成のための方法の提供。【解決手段】コール酸の水溶性塩を含有する水溶液に対して触媒量のＮＡＤ+と共にＮＡＤ依存１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）を添加することによって酸化反応がもたらされ、ＮＡＤ+はＮＡＤＨに還元され、ＮＡＤＨからＮＡＤ+への再生は、ＮＡＤ依存ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を使用するピルベートのラクテートへの変換によってもたらされる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コール酸の水溶性塩を水溶液中および触媒量のＮＡＤ+の存在下でＮＡＤ依存１２α−ＨＳＤＨと反応させる１２−ケトケノデオキシコール酸の酵素的合成のための方法であって、ＮＡＤＨからＮＡＤ+への再生がＮＡＤ依存ＬＤＨを使用するビルベートのラクテートへの変換によってもたらされることを特徴とする方法。
【請求項２】
コール酸の水溶性塩がナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩およびアンモニウム塩から選択され、好ましくはナトリウム塩であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コール酸の水溶性塩が重量／体積で１から６％、好ましくは２から５％、さらにより好ましくは３から４％の濃度を有することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＡＤ+が１から１０００μＭ、好ましくは１０から１００μＭの濃度を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ピルベートがピルビン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ビルベートがコール酸の塩に対して少なくとも等モル量、好ましくは過剰量であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＤ依存１２α−ＨＳＤＨが１から１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０から３０Ｕ／ｍｌの濃度を有することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＮＡＤ依存１２α−ＨＳＤＨがユーバクテリウムレンタム由来であることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＮＡＤ依存ＬＤＨが１から２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０から３０Ｕ／ｍｌの濃度を有することを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＡＤ依存ＬＤＨが、ウサギの筋肉由来、ウシの筋肉またはウシの心臓由来、ニワトリの心臓由来、ブタの心臓由来、ヒトの赤血球由来、リューコノストックメセンテロイデス由来、表皮ブドウ球菌由来、ライヒマン乳酸杆菌由来、バチルスステアロサーモフィラス由来であり、好ましくはウサギの筋肉由来であることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
水溶液のｐＨが６から９、好ましくは７．５から８．５であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１０から４０時間、好ましくは１８から３６時間、さらにより好ましくは２０から２４時間の時間にわたって実施されることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
１０から４０℃、好ましくは１８から３５℃で実施されることを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に従う１２−ケトケノデオキシコール酸の合成のための方法を含むことを特徴とするウルソデオキシコール酸の調製のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ウシの胆汁から抽出されるコール酸から化学的手段によって得られる１２−ケトケノデオキシコール酸（12-ketokenodeoxycholic acid）は、ケノデオキシコール酸の合成に使用され、ひいてはウルソデオキシコール酸の合成における中間体として使用される。ウルソデオキシコール酸は、その治療的特性で知られており、および肝区域の機能不全の治療において使用される。
【背景技術】
【０００２】
１２−ケトケノデオキシコール酸をケノデオキシコール酸へ転化させるための方法は、例えば、参照によって本願明細書に組み込まれる非特許文献１および非特許文献２に記載されている（非特許文献１、２参照）；また、ケノデオキシコール酸をウルソデオキシコール酸へ転化するための方法は、例えば、同様に参照によって本願明細書に組み込まれる以下の刊行物に記載されている：非特許文献３、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４（非特許文献３、特許文献１から４参照）。
【０００３】
１２−ケトケノデオキシコール酸は、化学的手段および酵素的手段のいずれによって合成されてもよい。化学的方法は、コール酸のエステル化、Ｃ３およびＣ７におけるヒドロキシルの選択的アセチル化、およびＣ１２におけるヒドロキシルのケトンへの酸化をもたらす；しかしながら、化学的手段によって得ることができる収率および転化率は、産業的見地からは不満足である。代って、化学的合成の代替として実施される酵素の使用によるコール酸の酸化は、定量的な収率および１００％の転化率で１２−ケトケノデオキシコール酸を得ることを可能にする。グルタミン酸デヒドロゲナーゼのようなＮＡＤＰ依存酵素を利用する方法は、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８によって説明されている（非特許文献４から８参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開昭３９−２７２４８号公報
【特許文献２】特開昭５２−７８８６２号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開第００７２２９３Ａ２号明細書
【特許文献４】特開平５−３２６９２号公報
【非特許文献１】Fieser and Rajagopalan. JACS, 1950, 72, 5530-36
【非特許文献２】Alan F. Hofmann, Acta Chem. Scand.  17 (1963), 173-186
【非特許文献３】B. Samuelsson, Acta Chem. Scand., 14 (1960) n°1, 17-20
【非特許文献４】Carrea G., Bovara R., Creminesi P., Lodi R. Biotechnology and Bioengineering 1984, 26, 560-563
【非特許文献５】Carrea G., Bovara R., Longhi R. and Riva S. Enzyme Microb. Technol. 1985, 7, 597-600
【非特許文献６】Riva S., Bovara R., Pasta P. and Carrea G. J. Org. Chem., 1986, 51, 2902-2906
【非特許文献７】Bovara R., Carrea G., Riva S. and Secundo F.  Biotechnology letters 1996, 18, 305-308
【非特許文献８】Carrea G., Ottolina G., Pasta P. and Riva S.  Annals of the New York Academy of Sciences. 1996, 799, 642-648
【非特許文献９】Applied and Environmental Microbiology, May 1979, Vol. 37, no. 5, pages 992-1000
【非特許文献１０】Biochimica et Biophysica Acta, 489, 1977, pages 466-476
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上に示される酵素的方法もまた、α−ケトグルタル酸の使用に基づく補酵素をリサイクルするための系のコストが高いために、完全には満足できない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
今や、ＮＡＤ依存酵素を使用することによって補酵素をリサイクルする、以前のものよりも実質的に経済的である系を利用する、１２−ケトケノデオキシコール酸の酵素的合成のための新規な方法を見出した。
【０００７】
以下のスキーム１に示されるように、この新規な系に従って、コール酸の水溶性塩を含有する水溶液に対して触媒量のＮＡＤ+と共にＮＡＤ依存１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）を添加することによって酸化反応がもたらされ、ＮＡＤ+はＮＡＤＨに還元され、ＮＡＤＨからＮＡＤ+への再生は、ＮＡＤ依存ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を使用するピルベートのラクテートへの変換によってもたらされる。
【０００８】
【化１】
2006340718.tif 000002
【０００９】
本発明に従う方法は、目安として１０から４０時間、および好ましくは１８から３６時間、さらにより好ましくは２０から２４時間の期間にわたって実施される。
【００１０】
コール酸の水溶性塩は、好ましくはナトリウム塩である；しかしながら、例えば、カリウム塩、リチウム塩およびアンモニウム塩のような他の水溶性塩を使用することができる。
【００１１】
コール酸の水溶性塩は、通常は、重量／体積で１％から６％の濃度で使用される；好ましくは２％から５％、およびさらにより好ましくは３％から４％の濃度が使用される。
【００１２】
水溶液のｐＨは、好ましくは６から９、さらにより好ましくは７．５から８．５である。例えば、リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ギ酸アンモニウムのような、当分野で一般的に使用されるバッファによって、そのｐＨを得ることができる。
【００１３】
反応温度は、好ましくは１０℃から４０℃、好ましくは１８℃から３５℃である。
【００１４】
ＮＡＤ+は、触媒量、好ましくは１から１０００μＭ、好ましくは１０から１００μＭの濃度で使用される。
【００１５】
ピルベートは、好ましくはナトリウム塩の形態で使用される；コール酸の塩に対して通常は少なくとも等モル量で、好ましくは過剰量で使用される（１０から２００％まで、好ましくは５０から１００％まで評価可能）。
【００１６】
ＮＡＤ依存１２α−ＨＳＤＨは、ユーバクテリウムレンタム（Eubacterium lentum）由来のものであってもよく、これは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる非特許文献９および非特許文献１０に記載されている（非特許文献９および１０参照）。
【００１７】
好ましく使用されるＮＡＤ依存ＬＤＨは、ウサギの筋肉由来のものである；しかし、例えば、ウシの筋肉またはウシの心臓由来のもの、ニワトリの心臓由来のもの、ブタの心臓由来のもの、ヒトの赤血球由来のもの、リューコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）由来のもの、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由来のもの、ライヒマン乳酸杆菌（Lactobacillus leichmanii）由来のもの、バチルスステアロサーモフィラス（Bacillus stearotermophilus）由来のもののような、他のＮＤＡ依存ラクテートデヒドロゲナーゼ類を使用してもよい；これらの試薬は、一般的に、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、商業的に入手可能である。
【００１８】
１２α−ＨＳＤＨは、通常は１から１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０から３０Ｕ／ｍｌの量で使用される；ＬＤＨは、通常は１から２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１０から３０Ｕ／ｍｌの量で使用される。
【００１９】
反応が完了した時点で、好ましくは２４時間を超過しない時間内に、酵素を限外ろ過によって分離してそれに続く工程でリサイクルし、および１２−ケトケノデオキシコール酸を酸性化およびそれに続く遠心分離によって回収する。
【００２０】
以下に続く実施例は、本発明の非制限的な説明であるとみなさなければならない。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
以下のものを使用する５００μｌの合計体積を用いて、周囲温度およびｐＨ８で反応を実施した：重量／体積で４％のコール酸のナトリウム塩（０．５Ｍのコール酸のナトリウム塩の水溶液を希釈することによって得られる０．１Ｍ、ｐＨ８）；０．２Ｍのピルビン酸ナトリウム（１Ｍのピルビン酸ナトリウムの水溶液からの１００μｌ、ｐＨ８）；１６単位（Ｕ）の、微生物起源由来のＮＡＤ依存１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ酵素（凍結乾燥された１２α−ＨＳＤＨ酵素／４００μｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファの２ｍｇ溶液からの４０μｌ、ｐＨ８（４０Ｕ／ｍｇ凍結乾燥物））；３０Ｕの、ウサギの筋肉由来のＮＡＤ−依存ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素（２ｍｇの凍結乾燥されたラクテートデヒドロゲナーゼ酵素／４００μｌの０．１Ｍのリン酸カリウムバッファの溶液からの４０μｌ、ｐＨ８（１７０Ｕ／ｍｇ凍結乾燥物））；１００μＭのＮＡＤ+（１０ｍＭのＮＡＤ+水溶液からの５μｌ）、０．１Ｍのリン酸カリウムバッファ、ｐＨ８（２１５μｌの０．２Ｍリン酸カリウムバッファ、ｐＨ８）。
【００２２】
１２−ケトケノデオキシコール酸へのコール酸の完全な転化は、２４時間の反応時間内に得られる。溶離液系としてクロロホルム／メタノール／酢酸（１０：１：０．５）を使用するＴＬＣ分析によって、転化の程度を評価した。
【００２３】
コール酸のナトリウム塩の０．５Ｍ溶液、ｐＨ８の調製
塩が完全に溶解するまで重量／体積で１０％の水酸化ナトリウムを添加することによって、２．４ｇのコール酸を１２ｍｌの最終体積の二度蒸留した水に溶解させた。次いで、０．１ＭのＨＣｌの添加によって、溶液のｐＨを８にした。
【００２４】
ピルビン酸ナトリウムの０．５Ｍ溶液、ｐＨ８の調製
１．１ｇのピルビン酸ナトリウムを１０ｍｌの最終体積の二度蒸留した水に溶解させた。次いで、０．１ＭのＮａＯＨの添加によって、溶液のｐＨを８にした。
【００２５】
１０ｍＭのＮＡＤ+溶液の調製
１３．３ｍｇのＮＡＤ+を２ｍｌの二度蒸留した水に溶解させた。
【００２６】
(実施例２）
さまざまな開始濃度のコール酸を用いて、実施例１を繰り返した：重量／体積で４％、４．５％、５％、５．５％または６％。
【００２７】
２０時間以内に、重量／体積で４％のコール酸を含有する反応において、単一生成物への基質の完全な転化が得られた。また、４０時間以内に、重量／体積で４．５％のコール酸を含有する反応において、完全な転化が得られた。しかしながら、４．５％超の濃度のコール酸を含有する反応においては、４０時間実施されたコントロールにおいて、転化の程度に有意な増大が観察されなかった。従って、コール酸の最適濃度は、重量／体積で４％を含有するものであることが見出された。
【００２８】
（実施例３）
さまざまなｐＨ値において、実施例１を繰り返した：ｐＨ６．５、７、７．５、８、８．５または９。
【００２９】
２０時間以内に、ｐＨ７．５、８および８．５における反応において、生成物への基質の完全な転化が得られた。他の反応はより緩慢であることが見出され、および実際に、ｐＨ７における反応に関しては４０時間以内、およびｐＨ６．５ならびにｐＨ９における反応に関しては５日以内に、完全な転化が得られた。従って、反応のための最適ｐＨ範囲は、７．５から８．５であることが見出された。
【００３０】
（実施例４）
ｐＨ８のさまざまな０．１Ｍのバッファ溶液を用いて、実施例１を繰り返した：リン酸カリウム、重炭酸ナトリウム、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ギ酸アンモニウム。２０時間以内に、使用されるバッファを問わず、全ての反応混合物において、１２−ケトケノデオキシコール酸への基質の完全な転化が得られた。
【００３１】
（実施例５）
さまざまな反応温度において、実施例１を繰り返した：周囲温度（１８℃）、２５℃、３５℃または４５℃。周囲温度（１８℃）、２５℃および３５℃で実施された反応において、２０時間以内に、１２−ケトケノデオキシコール酸への基質の完全な転化が得られた。しかしながら、４５℃で実施された反応においては、およそ５０％の最大転化率が得られた。反応混合物における酵素活性のコントロールから、２４時間後に、４５℃におけるラクテートデヒドロゲナーゼ酵素の活性は、周囲温度で実施される反応の間に測定される同じ酵素の活性の１／１０であり、および上述の反応における１２α−ＨＳＤＨ酵素の活性は、同程度であることが見出された。従って、４５℃における、より低い程度の転化は、その温度におけるＬＤＨ酵素の活性の減少に起因する。従って、最適反応温度は３５℃超であってはならない。
【００３２】
(実施例６）
さまざまな（ＮＡＤ+）補因子濃度を使用して、実施例１を繰り返した：１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ。２０時間以内に、全ての反応混合物において、生成物への基質の完全な転化が得られた；ＴＬＣ分析によって検証を実施した（溶離溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸１０：１：０．５）。従って、１００００回のオーダーのＮＡＤ+の多数回のリサイクル工程を用いて、１２−ケトケノデオキシコール酸を形成するためのコール酸の位置選択的な酸化を得ることが可能である。
【００３３】
（実施例７）
さまざまな量の２つの酵素を使用して、実施例１を繰り返した：５Ｕの１２α−ＨＳＤＨおよび１０ＵのＬＤＨ；１０Ｕの１２−ＨＳＤＨおよび２０ＵのＬＤＨ；１５Ｕの１２α−ＨＳＤＨおよび３０ＵのＬＤＨ；１５Ｕの１２α−ＨＳＤＨおよび１５ＵのＬＤＨ。２０時間以内に、全ての反応混合物において、生成物への基質の完全な転化が得られた。５Ｕの１２α−ＨＳＤＨおよび１０ＵのＬＤＨの存在下で実施される反応が最も緩慢であることが見出された：実際に、１４時間の反応時間の後に、ＴＬＣにおいては少量の基質が依然として目に見えたが、これは、他の反応混合物においては完全に消費された（溶離溶液：クロロホルム／メタノール／酢酸１０：１：０．５）。しかしながら、２０時間以内に完全な転化を得るためには、５Ｕの１２α−ＨＳＤＨおよび１０ＵのＬＤＨの量へ低減させることが可能である。
【外国語明細書】
2006340718000001.pdf