(57)【要約】【課題】血管における狭窄形成を阻害すること。【解決手段】血管の外傷部位での狭窄形成を阻害するための組成物であって、以下：微粒子キャリアに結合体化した抗再狭窄性化合物を含み；ここで、該抗再狭窄性化合物は、ラパマイシン、タクロリムス、パクリタキセル、それらの活性アナログまたは誘導体またはプロドラッグ、およびそれらの組合せからなる群から選択され、そして該微粒子キャリアは、薬学的に受容可能な液体ビヒクル中の不溶性ガスを含む微小気泡の懸濁物または生体適合性ポリマー微粒子を含み；該組成物は、投与に適している、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管の外傷部位での狭窄形成を阻害するための組成物であって、以下：
微粒子キャリアに結合体化した抗再狭窄性化合物を含み；
ここで、該抗再狭窄性化合物は、ラパマイシン、タクロリムス、パクリタキセル、それらの活性アナログまたは誘導体またはプロドラッグ、およびそれらの組合せからなる群から選択され、そして該微粒子キャリアは、薬学的に受容可能な液体ビヒクル中の不溶性ガスを含む微小気泡の懸濁物または生体適合性ポリマー微粒子を含み；該組成物は、投与に適している、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血管における過剰増殖性疾患（例えば、狭窄）を処置または予防する方法に関し、詳細には、微粒子に結合体化された抗再狭窄性薬物（例えば、ラパマイシン）を脈管の損傷部位に送達することによって、脈管損傷後の狭窄を予防することに関する。
【０００２】
【数１】
2006249100.tif 000002
2006249100.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
経腔的冠状動脈血管形成は、閉塞性冠状動脈疾患のための非外科的処置として１９７０年代後期に導入された。代表的に、この手順は、バルーンチップカテーテルを閉塞部位に配置し、そして、カテーテルのバルーンを膨張させることによって閉塞を崩壊させて閉塞された血管を拡げることを含む。その導入時から、機器および技術における大きな進歩は、冠状動脈疾患およびアンギナを処置するための方法の広範囲にわたる使用をもたらした。近年の研究によれば、多血管冠状動脈疾患を有する患者における経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）およびバイパス手術と同等の７年生存率が報告された。しかし、この方法は、血管の内皮内壁の損失を含め、血管壁に損傷を与える。頻繁に、この損傷に対する応答は、血管内膜過形成、線維芽細胞の増殖、結合組織マトリックス再形成および血栓形成を含む。これらの事象は、血管壁の外傷に対する部分的に制限された創傷治癒応答である、血管の再狭窄につながる。この治癒応答は、血管壁の管腔が狭くなることに、それゆえに、再狭窄の高い発生率（３０％〜５０％）につながる（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
様々な血管再生デバイス、抗血小板薬、抗血栓薬物および抗炎症剤を使用した再狭窄防止における臨床試験は、再狭窄の発生率の限られた改善を生じた。再狭窄の危険または重篤度を改善する試みは、脈管損傷部位での脈管内ステント（例えば、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）、放射線療法（非特許文献６）、および／または抗増殖性薬物の投与を使用した。後者のアプローチは代表的に、血管閉塞部位に治療薬剤を導入するため（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、Ａｌｆｋｅ、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）、または移植されたステントから薬物を放出するため（非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）にバルーンカテーテルを使用する。
【０００５】
冠状ステント移植の使用は、大きな動脈において血管造影的な再狭窄の割合を１０数％まで減らした。冠状ステントは、弾力性のある反跳および再形成を実質的に除去する管腔足場を提供する。しかしステントは、新内膜過形成を減少させず、実際に、再狭窄の増殖挙動の増加をもたらす（非特許文献１９）。
【０００６】
血管の管腔内に配置された、薬物でコーティングされたかまたは薬物が含浸されたステントは、薬物送達デバイスとして広く利用された。この薬物は、ステントから徐々に流出し、そして内膜から血管壁に拡散する。ステントをコーティングするために用いられる薬物の例としては、免疫抑制特性を有するマクロライド抗生物質である、ラパマイシン（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ  Ａｙｅｒｓｔ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびアクチノマイシンＤ（両方とも、化学療法薬）が挙げられる。これらの全ては、このような状況において平滑筋細胞増殖を阻害することが示された（特許文献１；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。
【０００７】
しかし、ステント移植の使用の増加にともない、ステント内再狭窄の頻度もまた、増加する。炎症およびその後の新内膜形成の程度が、ステント支柱による血管壁の貫通の程度に比例するという証拠が存在する（非特許文献２０）。治療戦略（例えば、ＰＴＣＡ、回転アテレクトミー、レーザー血管形成、切開バルーン血管形成術またはステントの繰り返し）に拘わらず、ステント内再狭窄の場合、再狭窄は、容認不可能に高い（２０％〜８０％）。
【０００８】
薬物放出するステントの他の制限としては、薬物充填容量の制限、および望ましくない薬物動態学をもたらす、薬物溶出の制御の不十分さが挙げられる。このデバイスは代表的に、生体適合性ポリマーでコーティングされており、そして、ポリマーコーティングの耐久性は問題がある。現在使用されているいくつかのコーティングの厚みは、これらのデバイスを非常に小さな血管には不適切にする。最後に、大部分の現在のコーティングは、慢性の炎症応答を引き起こす傾向がある。このデバイスの他の長期的影響としては、遅い血栓症、血管壁の脆弱化、または遅延再狭窄が挙げられる。従って、ポリマーの潜在的毒性をモニタリングするには長期追跡調査が必要である。コーティングされたステントを用いた処置はまた、（特に、複数のステント手順が計画される場合）高価であり得る。
【０００９】
冠状動脈内近接照射療法（非特許文献２４、非特許文献２５）は、血管形成またはステント配置後の動脈の再狭窄防止への現在の別のアプローチである。少量の放射線は、処置された領域（放射線を処置される領域に送達し、次いで取り除かれるカテーテルを介して、または適所に配置されたままである放射線放出ステントを介してのいずれでも）に送達される。ステント内再狭窄のさらなる処置の必要性を減らすことに有効なことが示されているにもかかわらず、この手順は、他の合併症に関連し得る。近接照射療法の数週間から数ヵ月後、再狭窄が処置領域の縁部で生じ得る。標的とされた処置領域を越えて貫通する低レベルの放射線は、軟組織の増殖を増加させ、狭窄をもたらす（これは、キャンディーの包装（ｃａｎｄｙ  ｗｒａｐｐｅｒ）または「縁部」効果として公知である）（非特許文献２６）。このような縁部効果はまた、薬物放出するステントを用いて生じ得る。なぜなら、この薬物は、ステントの縁部を越えて利用できないからである。
【００１０】
脈管閉鎖的な現象もまた、他の治療設定において生じる。例えば、自己静脈移植は、冠状動脈バイパス手順において広く使用される。米国だけでも、毎年約４００，０００〜約５００，０００の１回目の冠状移植手順が実施される。患者の生存率は処置後最初の５年にわたって９０％を上回るにもかかわらず、移植の約２０％〜約４０％は閉塞現象に起因してこの間に失敗する。従って、米国において毎年８０，０００〜１００，０００の移植置換手順が、尚早の死亡を避けるために必要である。
【００１１】
脈管閉塞現象はまた、腎臓透析のために使用される動脈−静脈吻合のような他の脈管移植の失敗および臓器移植の失敗につながる。腎臓透析の脈管アクセスモデルにおいて、外科的に形成された動脈−静脈吻合または短絡は、動脈への接近および透析のために使用される静脈を提供する。透析の間、静脈接合部における血流の速度、乱気流および応力は、通常の静脈においてよりもずっと高い。これらの圧力に対する繰り返された曝露は頻繁に、静脈内での過形成および狭窄に至り、透析アクセス機能の失敗を引き起こす。
【特許文献１】米国特許第６，４０３，６３５号明細書
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｍａｎ  ＤＬ，Ｌｅｏｎ  ＭＢ，Ｂａｉｍ  ＤＳら，「Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｔｅｎｔ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｂａｌｌｏｏｎ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｓｔｅｎｔ  Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  Ｓｔｕｄｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９４年，第３３１巻：４９６−５０１
【非特許文献２】Ｓｅｒｒｕｙｓ  ＰＷ，ｄｅ  Ｊａｅｇｅｒｅ  Ｐ，Ｋｉｅｍｅｎｅｉｊ  Ｆら，「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｂａｌｌｏｏｎ−ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  ｓｔｅｎｔ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂａｌｌｏｏｎ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９４年，第３３１巻：４８９−４９５
【非特許文献３】Ｓａｖａｇｅ  ＭＰら，「Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ」，１９９８年２月，第３１巻（２）：３０７−１１
【非特許文献４】Ｒｕｂａｒｔｅｌｌｉ  Ｐら，「Ｊ  ＡｍＣｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ」，１９９８年７月，第３２巻（１）：９０−６
【非特許文献５】Ｇｏｔｔｍａｎ  Ｄら，「Ｒｏｆｏ  Ｆｏｒｔｓｃｈｒ  Ｇｅｂ  Ｒｏｎｔｇｅｒａｓｔｒ  Ｎｅｕｅｎ  Ｂｉｌｄｇｅｂ  Ｖｅｒｆａｈｒ」，１９９９年１月，第１７０巻（１）：８４−８
【非特許文献６】Ｋｏｈ  ＷＪら，「Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．，１９９６年１１月１日，第３６巻（４）：８２９−３４
【非特許文献７】Ｄｉｃｋ  Ａら，「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ  Ｒａｄｉｏｌ」，１９９９年９月−１０月，第２２巻（５）：３８９−９３
【非特許文献８】Ｒｏｙ  Ｓら，「Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｒａｄｉｏｌ」１９９９年６月，第１０巻（６）：８１７−２４
【非特許文献９】Ｄｅｖ  ＮＢら，「Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｎ」，１９９８年１１月，第４５巻（３）：３３７−４５
【非特許文献１０】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＫＡら，「Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｎ」，１９９７年７月，第４１巻（３）：３４８−５３
【非特許文献１１】Ｂａｒａｔｈ  Ｐら，「Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｎ」，１９９７年７月，第４１巻（３）：３３３−４１
【非特許文献１２】Ｈｅｒｄｅｇ  Ｃ，Ｏｂｅｒｈｏｆｆ  Ｍ，Ｂａｕｍｂａｃｈ  Ａら，「Ｌｏｃａｌ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０００年；第３５巻（７）：１９６９−７６
【非特許文献１３】Ｐａｖｌｉｄｅｓ  ＧＳら，「Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｎ」，１９９７年７月，第４１巻（３）：２８７−９２
【非特許文献１４】Ｏｂｅｒｈｏｆｆ  Ｍら，「Ｃａｔｈｅｔ  ＣａｒｄｉｏｖａｓｃＤｉａｇｎ」，１９９７年７月，第４１巻（３）：２６８−７４
【非特許文献１５】Ｈｏｄｇｋｉｎ  ＤＤら，「Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ」，１９９７年１月，第２９巻（１）：３９−４４
【非特許文献１６】Ｔｅｏｍｉｍ  Ｄら，「Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ」１９９９年１月２８日，第６０巻（１）：１２９−４２
【非特許文献１７】Ｂａｒｔｏｒｅｌｌｉ  ＡＬら，「Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇ」，１９９７年１１月，第４２巻（３）：３１３−２０
【非特許文献１８】Ｒａｍａｎ  ＶＫら，「Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ」，１９９８年９月−１２月，第３巻（３−４）：１３３−７
【非特許文献１９】Ｅｄｅｌｍａｎ  ＥＲ，ＲｏｇｅｒｓＣ．，「Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｓｔｅｎｔｉｎｇ」Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  １９９８年，第８１巻：４Ｅ−６Ｅ
【非特許文献２０】Ｈｅｒｄｅｇ  Ｃら，「Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｓｌ，１９９７年７月，第４１巻（３）：３０８−１４
【非特許文献２１】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔら，「Ｓｔｅｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｎｅｏ−ｉｎｔｉｍａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｏｄｅｌ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１年９月４日；第１０４巻（１０）：１１８８−９３
【非特許文献２２】Ｄｒａｃｈｍａｎ  ＤＥら，「Ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｓｔｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ：ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｖｅｒ  ｓｉｘｍｏｎｔｈｓ」Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２０００年；第３６巻：２３２５−３２
【非特許文献２３】Ｈｉａｔｔ  ＢＬら，「Ｒｅｖ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２００１年，第２巻（４）：１９０−１９６
【非特許文献２４】Ｌｅｏｎ  ＭＢ，Ｔｅｉｒｓｔｅｉｎ  ＰＳ，Ｍｏｓｅｓ  ＪＷら，「Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｇａｍｍａ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒｓｔｅｎｔｉｎｇ」Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００１年；２５；第３４４巻（４）：２５０−６
【非特許文献２５】Ｍａｌｈｏｔｒａ  Ｓ，Ｔｅｉｒｓｔｅｉｎ  ＰＳ，「Ｔｈｅ  ＳＣＲＩＰＰＳ  ｔｒｉａｌ−ｃａｔｈｅｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ」Ｊ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０００年；第１２巻（６）：３３０−３２
【非特許文献２６】Ａｌｂｉｅｒｏ  Ｒら，「Ｓｈｏｒｔ−ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｔｅｒｍ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ３２Ｐ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｂ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０００年，第１０１巻：１８−２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、再狭窄の発生率および処置に対する応答を予測することは、脈管血管形成および他の脈管外科的手順の深刻な危険因子のままである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する：
（項目１）  血管の外傷部位での狭窄形成を阻害する方法であって、以下：
上記血管に、微粒子キャリアに結合体化した抗再狭窄性化合物を含む組成物を投与する工程を包含し；
ここで、上記抗再狭窄性化合物は、ラパマイシン、タクロリムス、パクリタキセル、それらの活性アナログまたは誘導体またはプロドラッグ、およびそれらの組合せからなる群から選択され、そして上記微粒子キャリアは、薬学的に受容可能な液体ビヒクル中の不溶性ガスを含む微小気泡の懸濁物または生体適合性ポリマー微粒子を含む、方法。
（項目２）  上記投与が、バルーン血管形成術、ステント移植、および血管の外科的切開もしくは移植から選択される手順の前、上記手順の間、および／または上記手順の後に実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）  上記手順が、バルーン血管形成術および／またはステント移植を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）  上記手順が、ステント移植を含み、そして上記投与が、ステント内再狭窄を阻害するのに有効である、項目３に記載の方法。
（項目５）  上記投与が、投与の間または投与後の上記組成物への外部刺激の適用なしで実施される、項目１に記載の方法。
（項目６）  上記抗再狭窄性化合物が、ラパマイシン、タクロリムス、およびそれらの活性なアナログまたは誘導体またはプロドラッグから選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）  上記抗再狭窄性化合物が、ラパマイシンおよびタクロリムスからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）  上記抗再狭窄性化合物が、ラパマイシンである、項目７に記載の方法。
（項目９）  上記組成物が、抗炎症性化合物、血管壁のコラーゲン蓄積もしくは石灰化を阻害するに有効な化合物またはそれらの組合せを上記キャリアに結合体化された状態でさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）  上記キャリアが、不溶性ガスを含む微小気泡の水性懸濁物である、項目１に記載の方法。
（項目１１）  上記ガスが、ＳＦ６またはペルフルオロカーボンガスである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）  上記ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタンから選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）  上記水性懸濁物が、タンパク質、界面活性剤、脂質、多糖およびそれらの組合せから選択される少なくとも一つのフィルム形成性化合物を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）  上記キャリアが、水性ビヒクル中にペルフルオロカーボンガスを含む微小気泡の懸濁物である、項目８に記載の方法。
（項目１５）  上記水性ビヒクルが、タンパク質、界面活性剤、脂質、多糖およびそれらの組合せから選択される少なくとも一つのフィルム形成性化合物を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  上記ビヒクルが、ヒト血清アルブミンおよびデキストロースを含む項目１５に記載の方法。
（項目１７）  血管中の移植されたステントに近い領域および遠い領域におけるステント内狭窄形成を阻害する方法であって、以下：
上記ステントが移植された血管に、微粒子キャリアに結合体化した抗再狭窄性化合物を含む組成物を投与する工程を包含し、ここで、上記微粒子キャリアは、薬学的に受容可能な液体ビヒクル中の不溶性ガスを含む微小気泡の懸濁物または生体適合性ポリマー微粒子を含み、
ここで、上記投与する工程は、ステント内狭窄形成を阻害するに有効である、方法。
（項目１８）  上記抗再狭窄性化合物が、ラパマイシン、タクロリムス、パクリタキセル、それらの活性なアナログまたは誘導体またはプロドラッグ、抗増殖性効果を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの組合せからなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  上記投与が、ステントの移植前、移植の間、および／または移植後に実施される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）  上記投与が、投与の間または投与後の上記組成物への外部刺激の適用なしで実施される、項目１７に記載の方法。
（項目２１）  上記抗再狭窄性化合物が、ラパマイシン、タクロリムス、およびそれらの活性なアナログまたは誘導体またはプロドラッグから選択される項目１７に記載の方法。
（項目２２）  上記抗再狭窄性化合物がラパマイシンである、項目２１の方法。
（項目２３）  上記キャリアが、水性ビヒクル中にペルフルオロカーボンガスを含む微小気泡の懸濁物である、項目１７に記載の方法。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、一つの局面では、血管における狭窄形成を阻害する方法を含む。このような狭窄は代表的に、血管に対する外傷（例えば、切開、血管形成手順または他の過剰な圧力）から生じる。本発明の方法によれば、微粒子キャリアに結合体化された抗再狭窄性化合物を含む組成物は、血管における外傷の部位に投与される。抗再狭窄性化合物は、好ましくは、免疫抑制性または抗増殖性の化合物であり、好ましくは、ラパマイシン、タクロリムス、パクリタキセル、およびそれらの活性なアナログまたは誘導体からなる群から選択される。
【００１５】
この微粒子キャリアは、薬学的に受容可能な液体ビヒクル中の不溶性ガスを含む微小気泡の懸濁物または生体適合性ポリマー微粒子を含み、そして、結合体化された治療剤を血管の外傷部位に送達するに有効である。この組成物は、バルーン血管形成術、ステント移植。および血管の外科的切開もしくは移植から選択される手順の前に、この手順の間に、および／またはこの手順の後に投与され得る。手順がステント移植を含む一つの実施形態では、この組成物の投与は、ステント内再狭窄（すなわち、ステントに遠位の再狭窄および近位の再狭窄）を阻害するに有効である。
【００１６】
好ましくは、治療化合物は、投与後にこの組成物への外部刺激（例えば、超音波または熱）の適用なしで外傷部位で放出される。
【００１７】
選択された実施形態では、抗再狭窄性化合物は、ラパマイシン、タクロリムス、パクリタキセル、およびそれらの活性なアナログまたは誘導体またはプロドラッグからなる群から選択される。一つの実施形態では、この化合物はラパマイシンである。この組成物は、抗炎症性化合物（例えば、デキサメタゾンのようなステロイド）および／または血管壁のコラーゲン蓄積または石灰化を阻害するのに有効な化合物を、微粒子キャリアにまた結合体化された状態でさらに含み得る。
【００１８】
一つの実施形態では、このキャリアは、不溶性ガスを含む微小気泡の懸濁物であり、ここで、このガスは好ましくは、ＳＦ６またはペルフルオロカーボンガス（例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタンまたはペルフルオロペンタン）である。この液体ビヒクルは好ましくは、タンパク質、界面活性剤、脂質、多糖およびそれらの組合せから選択される少なくとも一つのフィルム形成性化合物を含む水性ビヒクルである。一つの実施形態では、この液体ビヒクルは、ヒト血清アルブミンおよびデキストロースの水溶液である。
【００１９】
関連の局面では、本発明は、ステントの移植の前、移植の間、および／または移植後に、血管に、微粒子キャリアに結合体化した抗再狭窄性化合物を含む組成物を投与することによって、血管中の移植されたステントに近い領域および遠い領域におけるステント内狭窄形成を阻害する方法を提供し、ここでこのキャリアは、生体適合性ポリマー微粒子、または（好ましくは）薬学的に受容可能な液体ビヒクル中の不溶性ガスを含む微小気泡（例えば、ペルフルオロカーボンガスを含む微小気泡）の懸濁物を含む。この抗再狭窄性化合物は、例えば、ラパマイシン、タクロリムス、パクリタキセル、これらのいずれかの活性なアナログ、誘導体もしくはプロドラッグ、抗増殖性効果を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組合せであり得る。投与は好ましくは、投与の間または投与後のこの組成物への外部刺激の適用なしで実施される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．治療組成物）
（Ａ．キャリア組成物）
本発明の治療組成物は、薬物が被験体中の脈管損傷部位まで運ばれてそこで放出されるに充分な安定性を有する、微粒子キャリア（例えば、流体媒体中のガス微小気泡またはポリマー微粒子）に結合体化された薬物を含む。このような結合体化は代表的に、薬物と粒子との非共有結合または他の会合をいい、そして以下でさらに記載するような微小気泡懸濁物とのインキュベーションによって、または薬物とポリマー微粒子キャリアとの密接混合によって、もたらされ得る。
【００２１】
一つの実施形態では、薬学的組成物は、血液不溶性のガスを含む微小気泡の液体懸濁物（好ましくは水性懸濁物）を含む。この微小気泡は好ましくは、直径が０．１μ〜１０μである。一般に、非中毒性でかつ体温でガスであるいかなる血液不溶性ガスも使われ得る。この不溶性ガスは、窒素または酸素よりも低い拡散係数および血液溶解度を有すべきであり、これは、血管の内部雰囲気において拡散する。有用なガスの例は、貴ガス（例えば、ヘリウムまたはアルゴン）、ならびにフルオロカーボンガスおよび六フッ化硫黄である。一般に、ペルフルオロカーボンガス（例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタン）が好ましい。ペルフルオロブタンガスの、細胞膜を流動化するという特徴が、以下にさらに記載するように、露出した血管面と接触した泡の表面での薬物の細胞侵入を増強すると考えられる。
【００２２】
このガスの微小気泡は、癒着を予防し、そして微小気泡に分子結合界面を提供するために、流体のフィルム形成性（ｆｉｌｍｏｇｅｎｉｃ）コーティングによって安定化される。この流体は好ましくは、タンパク質、界面活性剤、脂質（リン脂質を含む）および多糖から選択される一つ以上の成分の水性の溶液または懸濁物である。好ましい実施形態では、この成分は、タンパク質、界面活性剤化合物および多糖から選択される。適切なタンパク質としては、例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、アポトランスフェリン、ヘモグロビン、コラーゲンおよびウレアーゼが挙げられる。ヒトタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））が好ましい。
【００２３】
従来の界面活性剤としては、化合物（例えば、高級なアルキル（例えば、６〜２０個の炭素原子）基、脂肪酸アルカノールアミドまたはそれらのアルキレン酸化物付加物を有する、アルキルポリエーテルアルコール、アルキルフェノールポリエーテルアルコール、およびアルコールエトキシレート、ならびに脂肪酸グリセロールモノエステル）が挙げられる。微小気泡造影剤組成物における使用が特に意図される界面活性剤は、例えば、Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇの特許ＵＳ６，２７４，１２０（脂肪酸、ポリヒドロキシアルキルエステル（例えば、ペンタエリスリトール、エチレングリコールまたはグリセロールのエステル）、脂肪アルコールおよび脂肪アミン、ならびにそれらのエステルまたはアミド（親油性のアルデヒドおよびケトン）；ショ糖などの親油性誘導体）、Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇの特許ＵＳ  ５，９９０，２６３（例えば、６−ヘキサデカノイルオキシヘキサデカノイルによってアシル化されたメトキシ末端ＰＥＧ）およびＮｙｃｏｍｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇの特許ＵＳ  ５，９１９，４３４において開示される。
【００２４】
他のフィルム形成性の合成ポリマーもまた、使われ得る；例えば、ポリマーが、例えば、ポリ乳酸、アクリレートポリマー、ポリアクリルアミド、ポリシアノアクリレート、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアミド、ポリシロキサン、ポリカーボネート、またはポリホスファゼンおよびそれらのコポリマー（例えば、乳酸−グリコール酸コポリマー）の様々な組合せから選択される、生分解性ポリマーシェルを有する微小気泡を記載する、米国特許第６，０６８，８５７号（Ｗｅｉｔｓｃｈｉｅｓ）および同第６，１４３，２７６（Ｕｎｇｅｒ）を参照のこと。
【００２５】
このような組成物は、診断用超音波のための造影剤として使われており、そしてまた、治療適用（例えば、薬物浸透の増強（Ｔａｃｈｉｂａｎａら、米国特許第５，３１５，９９８号）、血栓崩壊剤として（Ｐｏｒｔｅｒ、米国特許第５，６４８，０９８号）、および薬物送達について（以下を参照のこと）記載されている。後者の報告は、薬物を（代表的には、相変化を誘導するために温度を上昇させること（Ｕｎｇｅｒ，米国特許第６，１４３，２７６号）または微小気泡を超音波に曝露すること（Ｕｎｇｅｒ，米国特許第６，１４３，２７６号；Ｋｌａｖｅｎｅｓｓら，米国特許第６，２６１，５３７号；Ｌｉｎｄｌｅｒら（以下に引用），Ｕｎｇｅｒら（以下に引用）；Ｐｏｒｔｅｒら，米国特許第６，１１７，８５８号）によって）送達部位で放出するいくつかの外部方法を必要とする。
【００２６】
一つの実施形態では、このキャリアは、ＰＥＳＤＡ（ペルフルオエオカーボンに曝露されて超音波処理されたデキストロース／アルブミン）として公知の、ペルフルオエオカーボンを含むデキストロース／アルブミン微小気泡の懸濁物である。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、身体内で容易に代謝され、そして造影剤として広く使われている。この組成物は、共有に係る米国特許第５，８４９，７２７号および同第６，１１７，８５８号に記載されるとおりに調製され得る。手短に述べると、デキストロース／アルブミン溶液は、ペルフルオロカーボンガスを灌流しながら超音波処理される。この微小気泡は好ましくは、代表的には、Ｎ２が（室内空気と比較して）枯渇したかまたはＮ２を含まないガスを、超音波処理ホーンと溶液との間の界面に導入することによって、Ｎ２が枯渇した（好ましくはＮ２を含まない）環境において形成される。このようにして形成された微小気泡は、室内空気の存在下で形成された微小気泡よりも顕著に小さくかつ安定していることがわかっている（例えば、Ｐｏｒｔｅｒら、米国特許第６，２４５，７４７号を参照のこと）。
【００２７】
この微小気泡は、以下にさらに記載するように、ラパマイシンまたは別の適切な免疫抑制性薬物および／もしくは抗増殖性薬物によって結合体化される。一般に、微小気泡懸濁物は、必要に応じて攪拌しながら、薬物の液体処方物とともにインキュベートされる。好ましくは、薬物の液体処方物は、微小孔フィルターを通して最初に濾過および／または滅菌される。制限された水溶解度を有する薬物（これは、ラパマイシン、タクロリムス、およびパクリタキセルを包含する）は、製薬分野において公知の方法により、薬学的に受容可能なビヒクル中に可溶化または細かく分散され得る。例えば、ラパマイシンは、例えば、アルコール、ＤＭＳＯまたは油（例えば、ヒマシ油またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒＴＭ）中に溶解され得る。ラパマイシンの液体処方物はまた、Ｗｙｅｔｔ  Ａｙｅｒｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手可能であり、そして好ましくはガンマ放射線を用いた滅菌の後、結合体化のために使われ得る。他の可溶化処方物は、当該分野において公知である；例えば、トリグリセリドおよび界面活性剤の組合せを含む処方物を開示する、米国特許第６，２６７，９８５号（ＣｈｅｎおよびＰａｔｅｌ，２００１）を参照のこと。
【００２８】
インキュベーションは、薬物または微小気泡の安定性が損なわれない限り、室温でまたは適度により高い温度で行われ得る。治療化合物は、微小気泡のガス／流体界面で、非共有結合的に結合すると考えられる。化合物の結合程度は、必要に応じて、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９８／００１７２号に記載のとおり、微小気泡懸濁物と溶媒との間で標識化合物を分配することにより評価され得る。
【００２９】
微小気泡治療剤組成物はまた、例えば、米国特許第６，１４３，２７６号（Ｕｎｇｅｒ）、米国特許第６，２６１，５３７号（Ｋｌａｖｅｎｅｓｓら）、Ｌｉｎｄｌｅｒら，Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ  １８（４）：３２９、２００１年５月、Ｕｎｇｅｒら，Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ  １８（４）：３５５，２００１年５月、およびＰｒｉｃｅら，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（３）：１７１−８０，２００２年７月において以前に記載されている。これらの参考文献では、化合物は、放出の所望の点での超音波の適用によって、インビボで微小気泡から放出にされる。脂質でコーティングした微小気泡によって腫瘍を標的とすることは、Ｈｏら，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４０（６）：１２６０−６，１９９７年６月によって記載されていた。
【００３０】
本明細書において記載されているように、超音波も他の外部刺激のいずれも、血管形成によって損傷を受けた冠状動脈血管内の損害を受けた内皮への、微小気泡からの治療有効量のラパマイシンの送達のために必要でなかった。
【００３１】
ガスを充填した微小気泡に加えて、他の生体適合性微粒子（好ましくは、ポリマー分子）がまた、損害を受けた内皮に対する結合体化薬物（例えば、ラパマイシン）の送達のために使われ得る。なぜなら、非常に小さい粒子は、露出した血管表面（すなわち、損傷を受けた内皮を有する血管）に接着する傾向があるからである。
【００３２】
この意味で、「ナノ粒子」とは、ナノメートルサイズ範囲（例えば、５０ｎｍ〜７５０ｎｍ）の粒子をいい、一方、「微粒子」とは、マイクロメートルサイズ範囲（例えば、１〜５０μ）の粒子をいうが、これはまた、約０．１μまでの、マイクロメートル未満（ｓｕｂｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）の粒子を包含し得る。本明細書において記載されている方法での使用のために、約０．１μ〜１０μのサイズ範囲が好ましい。
【００３３】
薬物または抗原が固体溶液もしくは固体分散物の形態で組み込まれ得る薬物キャリア、またはこれらの材料が吸収もしくは化学的に結合され得る薬物キャリアとして使用されるポリマー粒子が記載されている。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ  １９９６；Ｒａｖｉ  Ｋｕｍａｒ  ２０００；Ｋｗｏｎ  １９９８を参照のこと。それらの調製のための方法としては、以下が挙げられる：乳化エバポレーション、溶媒置換、塩析、および乳化拡散（Ｓｏｐｐｉｍａｔｈら；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら）、ならびに直接重合（Ｄｏｕｇｌａｓら）および溶媒エバポレーションプロセス（Ｃｌｅｌａｎｄ）。
【００３４】
好ましくは、このポリマーは、インビボで生体浸食性である。当該分野で用いられている生体適合性および生体浸食性のポリマーとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ポリ無水物およびポリ（リン酸エステル）が挙げられる。薬物送達のために設計された、Ａ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．から入手可能なポリ（オルトエステル）ポリマーは、Ｈｅｌｌｅｒら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７８（１−３）：１３３−１４１  （２００２）に記載されている。一つの実施形態では、このポリマーは、ジオール−ジオールモノグリコリド−オルトエステルコポリマーである。このポリマーは、例えば、凍結粉砕または噴霧乾燥により粉末形態で産生され得、治療化合物と粉末形態で密接に混合され得、そして種々の形態（ミクロスフェアおよびナノスフェアを含む）で製造され得る。
【００３５】
（Ｂ．治療化合物）
治療組成物は、上記のキャリア組成物に結合体化されて送達される少なくとも一つの抗再狭窄剤（好ましくは、免疫抑制薬、抗増殖性および／または抗炎症性の薬物）を含む。顕著な抗増殖効果および／または免疫調節効果を有する薬物の例としては、ラパマイシン、パクリタキセルおよび他のタキサン、タクロリムス、アンジオペプチン（ａｎｇｉｏｐｅｐｔｉｎ）、フラバペリオドール（ｆｌａｖｏｐｅｒｉｄｏｌ）、アクチノマイシンＤ、メトトレキサート、アンジオペプシン（ａｎｇｉｏｐｅｐｓｉｎ）、マイトマイシン、シクロスポリン、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、ミコフェノール酸、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、ミゾリビン（ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ）、トラニラスト（ｔｒａｎｉｌａｓｔ）、およびこれらの化合物の活性なアナログ、誘導体またはプロドラッグが挙げられる。このような誘導体の１つの例は、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）（ラパマイシンの４２−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）誘導体）である。
【００３６】
また含まれるのは、抗増殖性効果を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、平滑筋増殖を媒介する酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するのに有効なオリゴヌクレオチド）である。好ましいオリゴヌクレオチドアナログとしては、米国特許第５，１８５，４４４号および同第５，１４２，０４７号に記載されるような、非荷電のリン含有結合を有するモルホリノベースのオリゴマーが挙げられる。ｃ−ｍｙｃに対してアンチセンスなオリゴヌクレオチドが用いられ得、好ましくは、米国出願第０９／４９３，４２７号を有する同時係属中の共有に係る出願、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／４４８９７号および米国出願公開２００１００２４７８３に記載されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３７】
再狭窄を阻害するために有益に用いられ得る他の治療薬剤としては、以下が挙げられる：抗炎症性ステロイド（例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾリン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｉｎｅ））；バセノイド（ｖａｓｓｅｎｏｉｄｓ）；エストロゲンのようなホルモン；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ））；プロテアーゼインヒビター；脂質低下性化合物；リボザイム（例えば、ＰＣＮＡリボザイム）；脈管細胞、骨髄細胞および幹細胞；ジルチアゼム；アクリジン；クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）；アンチトロンビン；抗凝血剤（例えば、ヘパリンまたはヒルジン）；ならびに移動インヒビター（例えば、ハロフジノン（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）およびプロブコール）。また含まれるのは、以下である：抗酸化剤；抗血小板物質；ＩＩＢＩＩＩＡアンタゴニスト；抗生物質；カルシウムチャネルブロッカー；変換酵素インヒビター；サイトカインインヒビター；増殖因子；増殖因子インヒビター；増殖因子隔離剤；組織因子インヒビター；平滑筋インヒビター；有機セレン化合物；レチノイン酸および他のレチノイド化合物；硫酸化プロテオグリカン；スーパーオキシドジスムターゼ模倣物；ならびに脈管治癒および再内皮形成を促進する化合物（例えば、ＮＯ、ＮＯ前駆体、およびＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子））。２つ以上の治療化合物の組合せが、使われ得る。
【００３８】
本発明の組成物はまた、好ましくは血管壁のコラーゲン蓄積および／または石灰化を阻害する抗増殖剤との組み合わせで、薬剤を含み得る。例えば、ビタミンＫの局所送達は、脈管損傷と関連した石灰化効果を妨げることが報告されている（Ｈｅｒｒｍａｎｎら，２０００）。
【００３９】
異なる抗再狭窄性の機構を経て機能すると考えられる薬剤は、相乗作用的に作用すると期待され得る。それゆえ、これらの薬剤のうちの２つ以上を合わせること（例えば、抗増殖性剤および／または免疫抑制剤を抗炎症剤および／または抗石灰化剤と合わせること）は有用であり得る。
【００４０】
微粒子に結合体化された治療薬剤は、好ましくは、ラパマイシン（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））、タクロリムス（ＦＫ５０６）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、エポチロンＤ（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  Ｄ）、分画ヘパリンまたは未分画ヘパリン、およびフラボペリドール（ｆｌａｖｏｐｅｒｉｄｏｌ）、ならびにこれらの化合物の活性なアナログまたは誘導体（例えば、プロドラッグ）からなる群から選択される。より好ましくは、これは、ラパマイシン、タクロリムス、およびパクリタキセル、ならびにこれらの化合物の活性なアナログまたは誘導体（例えば、プロドラッグ）からなる群から選択される。
【００４１】
好ましい実施形態では、この薬剤は、ラパマイシンである。ラパマイシン（商品名Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）で入手可能）は、イースター島の土壌で見出された、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって産生される大環状ラクトンである。構造的に、これは、タクロリムスと似ており、そして、同じ標的（細胞内結合タンパク質またはＦＫＢＰ−１２として公知のイムノフィリン）に結合する。したがって、この標的を結合する他の分子もまた、意図される。ラパマイシンは、ＩＬ２依存性Ｔリンパ球増殖およびＣＤ２８の架橋によって生じる刺激をブロックすることにより（おそらく、細胞周期の進行に重要であるセリン−トレオニンキナーゼの活性化をブロックすることにより）機能すると報告されている。
【００４２】
（ＩＩ．治療方法）
再狭窄とは、脈管介入（例えば、ステント挿入を伴うかまたは伴わない、冠状動脈バルーン血管形成術）後の脈管管腔の狭窄をいう。これは、手順後に獲得された、最初の管腔直径の５０％を超える損失として臨床的に定義される。再狭窄は、手順後３〜６ヶ月以内に、血管形成術によって処置された病変の約３０％〜６０％において、およびステントで処置された病変の２０％において生じると考えられる（例えば、Ｄｅｖを参照のこと）。
【００４３】
狭窄はまた、冠状動脈バイパス手術の後に生じ得、ここで、心臓手術は、詰まった動脈の周囲の血液を再度開通、すなわち、「バイパス」し、そして心臓への血液および酸素の供給を改善するために行われる。このような場合、狭窄は、移植された血管セグメントにおいて、特に、交換された血管の接合部において起こり得る。上記したように、狭窄はまた、透析のために作製される吻合接続部において起こり得る。
【００４４】
本発明は、（特に、バルーン血管形成術および／もしくはステント移植後の、または他の血管外傷に応答した（例えば、動脈バイパス手術または血液透析後の））狭窄の危険性（発生率）または重篤度（程度）を減らす方法に関する。本明細書中で用いられる場合、「脈管損傷部位」または「外傷の部位」は、過剰な圧力、切開、剥離、もしくは放射線、または処置の不存在下では狭窄の発達をもたらす傾向がある他の現象に供された脈管の任意の領域と定義され得る。例としては、冠状血管系および／または末梢周囲の（ｐｅｒｉｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ）血管系における外科的介入または経皮的介入（例えば、ＰＴＣＡおよび／またはステント移植）が挙げられる。このような部位は代表的に、損害を受けた脈管内皮の存在下によって特徴付けられる。
【００４５】
さらに一般的には、本発明は、過剰増殖性脈管疾患を予防、抑制または処置するための方法に関する。この方法は、罹患した部位に、過剰増殖性疾患の危険性および／または重篤度を減らすのに有効な量の、上記の微小気泡または微粒子に結合体化された治療薬剤を投与することを含む。投与は、問題の手順の前に、その手順の間に、および／またはその手順の後に行われ得、そして、多数の処置が使用され得る。投与は、全身ｉ．ｖ．、全身動脈内、冠状動脈内（例えば、注入カテーテルを経て）、または壁内に（すなわち、血管壁に直接）のような経路を経てであり得る。治療薬剤がラパマイシンである場合、好ましい用量は、代表的に約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇの間である。別の好ましい実施形態では、罹患した領域１ｃｍ２あたり約５０ｍｇ〜４００ｍｇのラパマイシンが投与される。
【００４６】
治療薬剤は、単独でまたは組み合わせて、微粒子キャリア（好ましくは微小気泡組成物）に結合体化される。このキャリアは、薬剤を脈管損傷部位に送達する。上記の微粒子を経た化合物の送達は、損害を受けた内皮に対する微粒子の接着によって、脈管損傷部位での化合物の高い局在濃度を達成するに有効である。好ましい実施形態では、この薬剤は、外部刺激を用いずに部位で放出される。以下に記載のように、微小気泡を経た脈管損傷部位へのラパマイシンの送達は、外部の超音波の使用を必要とせず、先行技術に記載されたような微小気泡流体の相変化にも依存しなかった。しかし、所望の場合、薬剤の放出はまた、光、温度変化、圧力、超音波またはイオン化エネルギーもしくは磁場のような刺激の適用によって調節され得る。このような刺激の適用はまた、プロドラッグを活性形態の薬物に変換するために用いられ得、次いでこの薬物は放出される。
【００４７】
薬物でコーティングしたステントの使用は、ステント内（ステントに近いかまたは遠い）狭窄に関連した。例えば、ラパマイシンでコーティングされたステントを用いた、最近実施された複数の施設での二重盲検ランダム化研究（Ｃｏｒｄｉｓ  Ｊ  ＆  Ｊ  Ｂｘ  Ｖｅｌｏｃｉｔｙ）では、ステント内再狭窄は、被験体の９％において観察された。この効果は、ステントに隣接した血管セグメントにおいてステント移植の間に起こった脈管損傷に起因すると考えられる。バルーン送達システム（これは、実際のステントより常に長い）の長さ、ガイドワイヤの操作、および事前拡大（ｐｒｅｄｉｌａｔｉｏｎ）バルーン血管形成術、ならびに操作者のエラーまたは病変に関連して不適切なステント長の使用のような様々な要因は、このような損傷に関与し得る。一般に、薬物の拡散は、薬物を放出するステント（ここで、この薬物は、例えば、ラパマイシン、パクリタキセル、またはタクロリムスである）から、隣接した血管壁、移植されたステント付近および遠くへは生じない。それゆえ、抗狭窄性薬物は、これらの領域において利用できない。これらの領域は、ステント内再狭窄現象を起こしやすい。
【００４８】
類似した効果（縁部効果または「キャンディーの包装」効果として公知）はしばしば、脈管近接照射療法（しばしば、バルーン血管形成術および／またはステント移植後に行われる脈管放射線療法）後に観察される。
【００４９】
本明細書において記載されているように、上記の微粒子を経ての抗再狭窄性化合物の送達は、ステント移植および／または近接照射療法と組み合わせて、このように有利に用いられる。なぜなら、本発明の組成物は、ステントの境界を越えて処置を延長するからである。処置前、処置の直後、または後で都合の良いときの、薬物の微粒子送達は、上記の合併症を予防または低減し得、そして薬物放出する（または放射線を放出する）ステントの移植から得られる結果を大いに改善し得る。本発明の方法はまた、ステント移植の影響を受けない適用（コーティングしたステントの境界を越えた処置に加え、小さい脈管もしくは分岐した脈管、散在もしくは分岐した損傷、または不安定な斑の処置）において使われ得る。
【００５０】
（ＩＩＩ．インビボでの研究）
以下に示すように、ＰＥＳＤＡ（ペルフルオエオカーボンに曝露された、超音波処理されたデキストロースアルブミン）微小気泡に結合体化され、そして静脈内投与されたラパマイシンは、コントロールの群およびｃ−ｍｙｃアンチセンスで処置された群と比較して、バルーン血管形成術および組成物の投与の４時間後に、損傷を受けた脈管への浸透、ならびにかなり減少した動脈の狭窄の証拠を示した。
【００５１】
この研究では、以下の材料および方法の節に詳細に記載するように、７匹の未成熟な飼育ブタを、急性処置群および慢性処置群に分けた。２匹の急性動物を、バルーン血管形成術で処置し、続いて３つの別個の冠状動脈脈管にステントを移植した。１匹は、ラパマイシン（合計２ｍｇの用量）が吸着されたＰＥＳＤＡ微小気泡を受け、そして他方は、アンチセンスｍｙｃ剤が吸着されたＰＥＳＤＡ微小気泡を受けた。このアンチセンス薬剤は、配列５’−ＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＴＣＧＣ−３’（配列番号１）を有する、ホスホロジアミデート連結モルホリノオリゴマーであった（例えば、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７：６３−７０，１９９７を参照のこと）。この配列は、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡのＡＴＧ翻訳部位に標的化される（ＩｖｅｒｓｅｎおよびＷｅｌｌｅｒ，ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４８９７号を参照のこと）。
【００５２】
（Ａ．急性効果）
これらのブタを処置４時間後に屠殺し、そして脈管組織をｐ２１、ｐ２７、β−アクチンおよびｃ−ｍｙｃの発現について調べた。ラパマイシンは、ｐ２１およびｐ２７の発現を増強し、そしてβ−アクチンに対して何の影響も有さないはずである。アンチセンスｃ−ｍｙｃは、ｃ−ｍｙｃの発現を阻害すべきであり、β−アクチンに対して影響を有さず、そして、ｐ２１またはｐ２７に対して最小の効果を有する。それゆえ、ｃ−ｍｙｃアンチセンスの投与は、ラパマイシン処置についてのコントロールを表し、そして、ラパマイシンは、ｃ−ｍｙｃアンチセンス薬剤についてのコントロールを表す。
【００５３】
ｐ２１、ｐ２７およびβ−アクチンの発現のウェスタンブロット分析を、適切な分子量にて出現するバンドのデンシトメトリーによって決定した。β−アクチンに対するｐ２１のバンド密度およびβ−アクチンに対するｐ２７のバンド密度を、以下の表に提供する：
（ＬＣＸ＝左回旋動脈；ＬＡＤ＝左冠状動脈の前室間動脈；ＲＣＡ＝右冠状動脈）。
【００５４】
【表１】
2006249100.tif 000004
これらのデータは、微小気泡によって運ばれたラパマイシンで処置された脈管が、ラパマイシンの予期された効果である、ｐ２１およびｐ２７の両方の上昇した発現を有することを示す。３５〜４０ｋｇのブタにおける２ｍｇという用量は、この効果が、損傷を受けた血管部位でのラパマイシンの全身蓄積に起因するというにはあまりに少ない。これは、この微小気泡が、ラパマイシンを脈管損傷の部位へ有効に運び、そして、損傷部位にてラパマイシンを堆積させたという証拠を提供する。
【００５５】
（Ｂ．慢性効果）
残りの５匹のブタを、バルーン血管形成術およびステント移植で処置し、次いで（１）コントロール（薬物処置なし）、（２）ＰＥＳＤＡ／ラパマイシン処置、および（３）ＰＥＳＤＡ／アンチセンスｃ−ｍｙｃ（配列番号１）処置に分けた。ブタを、再狭窄の経口の分析のために、処置の４週間後に屠殺した。これらの研究の終点は、以下の材料および方法において記載した通りの、定量的血管造影法および組織形態計測を含んでいた。以下の実施例に記載した通りに測定した、手順後２８日目での組織形態計測データを、以下の表２および表３に示す。
【００５６】
心筋梗塞の証拠は、肉眼検査でも組織学的評価の後でも見られなかった。全ての動脈セグメントのＨ＆ＥおよびＶＶＧで染色した切片を調べた。全てのステントを血管内で充分に展開し、ステントの支柱に隣接した中膜の厚みを薄くした。外膜へのステントの突出を有する希な脈管では、血管周囲出血の証拠が存在した。処置したセグメントの血栓症の症例は、いずれの処置群においても観察されなかった。完全な治癒が、処置群において実質的に何の毒性も有さずに観察され、そして再内皮形成が全ての処置群において完全であった。
【００５７】
処置された動脈からの新内膜は、コントロールよりもサイズが小さかった。コントロールの動脈は、大部分がゆるい細胞外マトリックス内の本発明の糸状細胞および紡錘状細胞からなる、実質的心内膜を示した。アンチセンスで処置された動脈では、新内膜の細胞は、形態的にコントロールと類似した。
【００５８】
表２は、個々の脈管に関して、コントロールおよびラパマイシンのデータを示す（再狭窄が管腔面積を減らし、そして内膜面積および中膜面積を増やすことに留意されたい）。単位は、ｍｍおよびｍｍ２である。
【００５９】
【表２】
2006249100.tif 000005
ＬＡＤ管腔面積についての両方の測定値は、ラパマイシンでコーティングした微小気泡群において、コントロール群においてよりも大きく（４．６２および８．０４対３．５５）、そしてＲＣＡ管腔面積もまた、コントロールにおいてよりもずっと大きい（８．０４対２．５４）。それにもかかわらず、この研究では、このラパマイシン処置は、ＬＡＤにおける中膜の面積も内膜の厚さも、顕著には変更せず、中膜の厚みは、ＲＣＡにおいて大いに減少した（１．６４対６．２４）。
【００６０】
表３は、個々の脈管の測定値からの平均した組織形態計測的データを示す。コントロールに関して、ｎ＝３；ラパマイシンに関して、ｎ＝４〜６、そしてアンチセンスに関して、ｎ＝６。最初の１０個の変数（動脈直径〜管腔面積）についての値は、ｍｍまたはｍｍ２である。ＫｏｒｎｏｗｓｋｉらおよびＳｕｚｕｋｉら（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（１０）：１１８８−９３，２００１）によって記載された等級分けシステムを用いて、脈管壁および脈管修復程度を評価した（内膜血管分布；内膜フィブリン；内膜ＳＭＣ含有量；外膜線維症）。
【００６１】
損傷スコア（ＩＳ）および炎症スコアを、Ｋｏｒｎｏｗｓｋｉら（彼らは、移植されたステントが、損傷に比例して新内膜増殖を引き起こすことを観察した）によって記載されたスコア付けシステムから適応させた。新内膜面積／損傷スコア（ＩＡ／ＩＳ）の比は、脈管の損傷程度に関連した内膜面積の正規化した値を提供する。
【００６２】
内膜厚みおよび内膜面積の値、ならびにＩＡ／ＩＳの正規化した値は、両方の治療組成物が、コントロールと比較して狭窄を阻害し、ラパマイシン組成物は、ｃ−ｍｙｃ組成物に対して顕著に優れていたことを示す。これをまた、３つの処置群についてのＩＡ対ＩＳの回帰プロットである図１に示す。
【００６３】
【表３】
2006249100.tif 000006
（材料および方法）
（ラパマイシン／ＰＥＳＤＡ）
ＰＥＳＤＡ微小気泡を、例えば、米国特許第６，２４５，７４７号およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０００／０２５８８号に記載の通りに調製した。代表的手順では、商業的供給源から入手した５％ヒト血清アルブミンおよび５％デキストロースを、３５ｍＬのシリンジ内に１：３の比で吸い込み、６〜１０ｍＬのデカフルオロブタンで手動にて攪拌し、そして２０キロヘルツにて７５〜８５秒間超音波処理した。Ｕ．Ｓ．６，２４５，７４７に記載されるように、このような様式で生成されたＰＥＳＤＡ微小気泡の４つの連続サンプルの平均サイズは、血球計算法により測定したところ、４．６±０．４ミクロンであり、そして平均濃度は、Ｃｏｕｌｔｅｒ計数器によって測定したところ、１．４×１０９気泡／ｍＬであった。
【００６４】
薬学的に受容可能な溶媒（例えば、アルコール、ＤＭＳＯまたはヒマシ油）中のラパマイシンの溶液を、ＰＥＳＤＡ微小気泡とともに攪拌しながら室温でインキュベートした。この混合物を静置し、ラパマイシンが結合体化した微小気泡は頂部に上昇した。必要な場合、このラパマイシン溶液を、インキュベーションの前に微小孔フィルターを通して滅菌および／または濾過する。
【００６５】
（動物および実験プロトコル）
動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈによって処方された「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって準備され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって公開された「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ公開番号８５−２３，１９８５年改訂）を遵守したヒトの世話を受けた。
【００６６】
７匹の雌または雄の若いブタ（２５ｋｇ〜３０ｋｇ）を、筋肉内注射によるケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせによって鎮静させた。これらの動物に、ペントバルビタール（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）を与え、続いて挿管し、そして人工呼吸器を用いて酸素（２Ｌ／分）およびイソフルラン１％（１．５Ｌ／分）を通気した。十分な麻酔が、四肢引っ込め反射の欠如によって確認された。四肢−鉛心電図記録および血圧（ＭについてＨｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｅ）を、この手順の全体にわたってモニタリングした。
【００６７】
外科的切断による右頸静脈における８Ｆ導入器鞘の配置後、各動物は、ヘパリン（１５０単位／ｋｇ）を受けた。蛍光透視法による誘導の下で、８Ｆ誘導カテーテルを、左または右の冠状動脈口に配置した。冠状動脈血管造影法を、冠状動脈内ニトログリセリン（２００μｇ）投与の後に実施し、そしてシネフィルム（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｃａｒｄｉｏｄｉａｇｎｏｓｔ；Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）に記録した。
【００６８】
（ステント移植）
冠状動脈ステント法を、長さ１５ｍｍで、バルーン上に手で縮めて、高圧（１０〜１４  Ａｔｍ×３０秒間）に配置した、Ｖ−Ｆｌｅｘステント（Ｃｏｏｋ  Ｉｎｃ．，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ）を用いて送達部位にて実施した。このステントを、３．５〜４．０ｍｍの直径でかつ２０ｍｍの長さのバルーン上に載置した。ステント動脈比を、１：１．１〜１：１．２の間に保った。手順後すぐに、脈管の開存性を評価するために血管造影図を実施した。頸静脈鞘を除去し、頸静脈を結紮し、皮膚を閉じ、そして動物を回復させた。全ての動物を、屠殺まで、この手順の２４時間前に、３２５ｍｇのアスピリンおよび２５０ｍｇのチクロピジンを用いて前処置した。
【００６９】
（組織へのラパマイシン送達の効力）
ステント移植後のｐ２１発現およびｐ２７発現の際のラパマイシン送達の影響を評価するために、３０〜３５ｋｇの重さの２匹の若いブタは、大きすぎるステント移植（動物１匹あたり３箇所）を冠状動脈において受けた。この後、ラパマイシン／ＰＥＳＤＡ複合体（２ｍｇラパマイシン）のｉ．ｖ．注射を行った。この手順の４時間後、これらのブタを屠殺し、そして損傷を受けた組織を、ｐ２１発現およびｐ２７発現についてウェスタンブロットによって分析した。
【００７０】
（慢性研究）
残りの５匹のブタを、上記の通りにバルーン血管形成術およびステント移植によって処置し、そして（１）コントロール（薬物処置なし）、（２）ラパマイシン／ＰＥＳＤＡ処置（２ｍｇラパマイシン）および（３）アンチセンス−ｍｙｃ／ＰＥＳＤＡ処置に分けた。４週間目に、これらの動物を屠殺した。動脈を灌流固定し、そして損傷を受けたセグメントを、冠状動脈血管造影図の誘導装置とともに位置する心臓から切開して取り出した。このセグメントを１０％ホルマリン溶液中で固定し、そしてパラフィンまたは低温重合樹脂（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７１００；Ｈｅｒａｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｈｒｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に包埋した。切片（５μｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ  ＆  Ｅ）ならびにＶｅｒｈｏｅｆｆ  ｖａｎ−Ｇｉｅｓｓｏｎエラスチン（ＶＶＧ）染料によって染色した。
【００７１】
（組織学的および形態計測的な分析）
組織形態計測分析を、中膜の破壊の証拠を有する各セグメントについて行った。組織形態計測的パラメーターを、１本の脈管あたり５〜８個の切片について測定し、平均し、そして平均値±ＳＤとして表した。脈管切片を、処置群の割当を知らない経験豊かな調査者によって測定した。
【００７２】
組織病理特徴を、コンピュータ化されたＰＣ適合性画像分析プログラムを使用して測定した（Ｏｐｔｉｍａｓ  ６；Ｏｐｔｉｍａｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）。ＶＶＧ染色切片を７．５倍に拡大し、デジタル化し、そしてフレームグレバーボード（ｆｒａｍｅ−ｇｒａｂｂｅｒ  ｂｏａｒｄ）（ＤＡＧＥ−ＭＴＩ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃｉｔｙ，ＩＮ）において測定した。面積測定値を、管腔視野計（管腔面積、ＬＡ、ｍｍ２）、中膜視野計（中膜面積、ＭＡ、ｍｍ２）、新内膜視野計（内部弾性層、管腔、中膜および外部弾性層の境界によって規定した内膜面積、ＩＡ、ｍｍ２）および外部弾性層（血管面積、ＶＡ、ｍｍ２）をたどることによって得た。
【００７３】
損傷スコアおよび炎症スコアは、Ｋｏｒｎｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３１：２２４−３０  （１９９８）によって記載されるスコア付けシステムから適合させ、そしてＫｏｒｎｏｗｓｋｉらおよびＳｕｚｕｋｉらの等級付けスキーム（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（１０）：１１８８−９３，２００１）を用いて、脈管壁および脈管修復の程度を評価した。
【００７４】
内皮形成を、内皮細胞によって覆われた内膜表面のパーセントに基づいてスコア付けした：（１）０〜２５％；（２）２５〜７５％、および（３）＞７５％。
【００７５】
内膜フィブリン含有量を、以下の基準に基づいて等級分けした：（１）動脈のあらゆる部分を含む病巣に残ったフィブリン；脈管の周縁の２５％未満を含むステント支柱に隣接した中程度のフィブリン堆積；（２）脈管の周縁の２５％を超える、ステント支柱に隣接した中程度のフィブリン堆積；（３）脈管の周縁の２５％未満を含む重度のフィブリン堆積。
【００７６】
内膜ＳＭＣ含有量を、以下の基準に基づいて等級分けした：（１）動脈のあらゆる部分を含む低密度のＳＭＣ密度；脈管の周縁の２５％未満を含む新内膜の全層未満の中程度のＳＭＣ浸潤；（２）脈管の周縁の２５％を超える新内膜の全層未満の中程度のＳＭＣ浸潤または高密度のＳＭＣ含有量、脈管の周縁の２５％未満を含む新内膜の全層；（３）高密度のＳＭＣ含有量、脈管の周縁の２５％未満を超える新内膜の全層。
【００７７】
動脈除去の後、心臓を１ｃｍ間隔で横断切断し、そして心筋損傷の証拠について調べた。
【００７８】
（統計評価）
データ（平均±標準偏差）を、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を行って１方向ＡＮＯＶＡを用いて処置群間の全体的な差について分析した。０．０５未満のｐ値での平均値の比較を、統計学的に異なるとみなした。全ての統計学を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用ＳＰＳＳ  １０．０（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用して実施した。内膜面積と損傷スコアとを、線形回帰分析を用いて相関させた。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、バルーン血管形成術およびステント移植、続いて微小気泡に結合体化されたラパマイシン、微小気泡に結合体化されたｃ−ｍｙｃアンチセンス、またはビヒクルコントロールを用いた処置を受けた３つのブタ群における血管の組織形態計測分析から決定した、ＩＡ（内膜領域）対ＩＳ（損傷スコア）の回帰プロットである。
【図１】
2006249100.tif 000007
【配列表】
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