(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞周期進行、成長促進段階、アポトーシスの調節、細胞の老化、および加齢に関与する遺伝子を同定するための方法および試薬、およびｐ２１によって調節される、細胞の老化を阻害または増強する化合物を同定する方法を提供する。【解決手段】誘導性ｐ２１遺伝子を含む哺乳動物繊維肉腫細胞。該細胞を使用した哺乳類細胞での老化を阻害する化合物の同定方法。老化を阻害する化合物と細胞を接触させることによる笹井棒の老化、加齢関連疾患または加齢関連遺伝子産物を阻害する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ２１が線維肉腫細胞中でそれによって発現される、哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含する、組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項２】
組換え発現構築物からのｐ２１の発現が、組換え細胞を、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤と接触させることによって、またはこのようなプロモーターから転写を阻害する剤を除去することによって仲介されることを特徴とする誘導性異型プロモーターによって転写で制御される哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含する組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項３】
ヒトＨＴ１０８０である請求項１または２に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項４】
哺乳類ｐ２１遺伝子が、ヒトｐ２１遺伝子またはそれらのＣＤＫ−結合断片である、請求項１または２に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項５】
転写を哺乳類プロモーターによって制御される哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物が、ラクトースレプレッサー応答性プロモーター要素を包含し、そしてｐ２１の転写が、該ラクトースレプレッサー応答性プロモーター要素によって制御され、そして組換え発現構築物からのｐ２１の発現が、組換え細胞を、ラクトースレプレッサー特異的誘導剤に接触させることによって仲介されることを特徴とする、さらに、細菌のラクトースレプレッサーをコードする組換え発現構築物を包含する、請求項２に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項６】
細胞が、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞である、請求項５に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項７】
細菌のラクトースレプレッサーをコードする組換え発現構築物が、３’ＳＳである、請求項５に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項８】
哺乳類ｐ２１遺伝子が、ヒトｐ２１遺伝子またはそれらのＣＤＫ−結合断片である、請求項５に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項９】
第二の発現構築物がＬＮｐ２１ＣＯ３である、請求項５に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項１０】
ラクトースレプレッサー特異的誘導剤が、β−ガラクトシドである、請求項５に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ受託番号 （ｐ２１−９）によって同定される請求項５に記載の組換え哺乳類線維肉腫細胞。
【請求項１２】
以下の段階を包含することを特徴とする、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）哺乳類細胞中でｐ２１の発現を生じる；
（ｂ）その発現が、ｐ２１によって調節される細胞の遺伝子の発現における変化について、化合物の存在下で細胞をアッセイする；および
（ｃ）サブパート（ｂ）の細胞の遺伝子の発現が、化合物の存在下でより少ない範囲まで変化される場合に、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節の阻害剤として化合物を同定する。
【請求項１３】
哺乳類細胞が請求項２に記載の細胞であり、ｐ２１発現が、細胞を誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤に接触させるか、またはプロモーターから転写を阻害する剤を除去することによって発生される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の遺伝子の発現がｐ２１により抑制される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の遺伝子が表Ｉに同定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞の遺伝子の発現がｐ２１により誘導される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞の遺伝子が表ＩＩに同定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞の遺伝子の発現が免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
細胞の遺伝子の発現が、細胞の遺伝子産物の活性についてのアッセイによって検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
細胞の遺伝子の発現が、相補的核酸に対しハイブリッド形成させることにより検出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についての、プロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする第一の組換え発現構築物、および哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする第二の組換え発現構築物を包含し、ｐ２１の発現が、それにより哺乳類細胞中で実験的に誘導されることを特徴とする哺乳類細胞。
【請求項２２】
哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物が、誘導性異種プロモーターの転写制御下にあり、組換え発現構築物から得たｐ２１の発現が、組換え細胞を、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤に接触させることによるか、またはこのようなプロモーターから転写を阻害する剤を除去することによって仲介される請求項２１に記載の哺乳類細胞。
【請求項２３】
レポーター遺伝子が、ホタル・ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリ性ホスファターゼをコードする請求項２１に記載の哺乳類細胞。
【請求項２４】
レポーター遺伝子は、その発現が、ｐ２１により抑制される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある請求項２１に記載の哺乳類細胞。
【請求項２５】
哺乳類遺伝子プロモーターが、表Ｉに同定される哺乳類遺伝子のプロモーターである、請求項２４に記載の哺乳類細胞。
【請求項２６】
レポーター遺伝子は、その発現が、ｐ２１により誘導される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項２１に記載の哺乳類細胞。
【請求項２７】
哺乳類遺伝子プロモーターが、表ＩＩに同定される哺乳類遺伝子のプロモーターである、請求項２６に記載の哺乳類細胞。
【請求項２８】
プロモーターが、遺伝子ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから得られることを特徴とする、発現がｐ２１によって阻害される哺乳類遺伝子についての、プロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする、組換え発現構築物を包含することを特徴とする哺乳類細胞。
【請求項２９】
プロモーターが、遺伝子血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから得られることを特徴とし、発現がｐ２１によって誘導される哺乳類遺伝子についての、プロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含する哺乳類細胞。
【請求項３０】
以下の段階を包含する、細胞の遺伝子発現のｐ２１−仲介調節を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在または不在下で、請求項２１に記載の哺乳類細胞におけるｐ２１の発現を生じること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の存在下でより小さな範囲に変化される場合に、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項３１】
レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって抑制される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類遺伝子プロモーターが、表Ｉに同定される哺乳類遺伝子のプロモーターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
レポーター遺伝子は、その発現がｐ２１により誘導される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳類遺伝子プロモーターが、表ＩＩに同定される哺乳類遺伝子のプロモーターである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
レポーター遺伝子の発現が、免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
レポーター遺伝子の発現が、レポーター遺伝子産物の活性についてアッセイすることによって検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
レポーター遺伝子の発現が、相補的核酸にハイブリッド形成させることにより検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
以下の段階を包含する、細胞の遺伝子発現のｐ２１−仲介調節を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在または不在下で、請求項２８に記載の哺乳類細胞におけるｐ２１の発現を生じること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の存在下でより小さな範囲に変化される場合に、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項３９】
以下の段階を特徴とする、細胞の遺伝子発現のｐ２１−仲介調節を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在または不在下で、請求項２９に記載の哺乳類細胞におけるｐ２１の発現を生じること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の存在下でより小さな範囲に変化される場合に、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項４０】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞における老化を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在および不在下で哺乳類細胞を剤で処理するか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）ｐ２１遺伝子発現により抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について哺乳類細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）化合物の不在でより化合物の存在下で、ｐ２１によって抑制される遺伝子が、より小さな範囲に抑制されるか、またはｐ２１によって誘導される遺伝子が、より小さな範囲に誘導される場合に老化の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項４１】
哺乳類細胞が、ｐ２１によって誘導される遺伝子についてアッセイされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
遺伝子が表ＩＩに同定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類細胞がｐ２１により抑制される遺伝子についてアッセイされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
遺伝子が表Ｉに同定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
細胞の遺伝子の発現が免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
細胞の遺伝子の発現が、細胞の遺伝子産物の活性についてのアッセイにより検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
細胞の遺伝子の発現が、相補的核酸にハイブリッド形成させることにより検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞中の老化を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）細胞は、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を包含することを特徴とする、化合物の存在または不在下にある哺乳類細胞を、剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養させること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下で小さな程度に変化される場合に、老化の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項４９】
レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって誘導される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳類遺伝子プロモーターが、表ＩＩに同定される哺乳類遺伝子のプロモーターである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
レポーター遺伝子は、その発現がｐ２１により抑制される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳類遺伝子プロモーターが、表Ｉに同定される哺乳類遺伝子のプロモーターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
細胞の遺伝子の発現が、免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
細胞の遺伝子の発現が、細胞の遺伝子産物の活性についてのアッセイにより検出される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
細胞の遺伝子の発現が、相補的核酸にハイブリッド形成させることにより検出される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞での老化を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在または不在下にある哺乳類細胞を、剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養させること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下で小さな程度に変化される場合に、老化の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項５７】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞中の老化を阻害する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在または不在下にある請求項２９に記載の哺乳類細胞を、剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で該哺乳類細胞を培養させること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下で小さな程度に変化される場合に、老化の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項５８】
請求項１２の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項５９】
請求項３０の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項６０】
請求項３８の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項６１】
請求項３９の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項６２】
請求項４０の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項６３】
請求項４８の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項６４】
請求項５６の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項６５】
請求項５７の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞の老化を阻害する方法。
【請求項６６】
請求項１２の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項６７】
請求項３０の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項６８】
請求項３８の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項６９】
請求項３９の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項７０】
請求項４０の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項７１】
請求項４８の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項７２】
請求項５６の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項７３】
請求項５７の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、哺乳類細胞中の疾病関連遺伝子産物の産生を阻害する方法。
【請求項７４】
以下の段階を包含する、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節の効果を増強する化合物を同定する方法。
（ａ）哺乳類細胞中でｐ２１の発現を生じること；
（ｂ）その発現が、ｐ２１で誘導または抑制される細胞の遺伝子の発現における変化について、化合物の存在および不在下にある細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）サブパート（ｂ）の細胞の遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下で大きな範囲に誘導または抑制される場合に、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節のポテンシエーターとして化合物を同定すること。
【請求項７５】
哺乳類細胞が、請求項２に記載の細胞であり、ｐ２１発現が誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤と細胞を接触させることによって発生される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
細胞の遺伝子の発現がｐ２１によって抑制される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
細胞の遺伝子が表Ｉに同定される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
細胞の遺伝子の発現がｐ２１によって誘導される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
細胞の遺伝子が表ＩＩに同定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
細胞の遺伝子の発現、免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
細胞の遺伝子の発現が細胞の遺伝子産物の活性についてのアッセイにより検出される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
細胞の遺伝子の発現が相補的核酸にハイブリッド形成させることにより検出される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
ｐ２１は、その効果が細胞中のｐ２１発現の最大効果より少ない範囲まで細胞中で産生される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８４】
以下の段階を包含する老化を増強する化合物を同定する方法。
（ａ）細胞は、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を包含することを特徴とする、化合物の存在または不在下にある哺乳類細胞を、剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養させること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下で大きな範囲に変化する場合に、老化のポテンシエーターとして化合物を同定すること。
【請求項８５】
哺乳類細胞が、請求項２に記載の細胞であり、老化が誘導性プロモーターからｐ２１転写を誘導する誘導剤と細胞を接触させることによって発生される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって誘導される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
遺伝子が表ＩＩに同定される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
レポーター遺伝子は、その発現がｐ２１により抑制される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
遺伝子が表Ｉに同定される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
レポーター遺伝子の発現が免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項８４に記載の方法。
【請求項９１】
レポーター遺伝子の発現が、細胞の遺伝子産物の活性についてのアッセイにより検出される、請求項８４に記載の方法。
【請求項９２】
レポーター遺伝子の発現が、相補的核酸にハイブリッド形成させることにより検出される、請求項８４に記載の方法。
【請求項９３】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞における老化の誘導を促進する化合物を同定する方法。
（ａ）哺乳類細胞を剤で処理するか、または化合物の存在下で老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）ｐ２１遺伝子発現により抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について哺乳類細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）化合物の存在下で、ｐ２１によって抑制される遺伝子が、さらに抑制されるか、またはｐ２１によって誘導される遺伝子が、さらに誘導される場合に老化の誘導を促進する化合物を同定すること。
【請求項９４】
哺乳類細胞が、ｐ２１により誘導される遺伝子についてのアッセイをうける、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
遺伝子が表ＩＩに同定される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
哺乳類細胞が、ｐ２１により抑制される遺伝子についてのアッセイをうける、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
遺伝子が表Ｉに同定される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
細胞の遺伝子の発現が免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
細胞の遺伝子の発現が、細胞の遺伝子産物の活性についてのアッセイにより検出される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
細胞の遺伝子の発現が、相補的核酸にハイブリッド形成させることにより検出される、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０１】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞中の老化の誘導を促進する化合物を同定する方法。
（ａ）細胞は、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を包含することを特徴とする、化合物の存在または不在下にある哺乳類細胞を、剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養させること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下で大きな範囲に変化する場合に、老化の誘導を促進する化合物を同定すること。
【請求項１０２】
レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって誘導される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
遺伝子が、表ＩＩに同定される請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
レポーター遺伝子は、その発現がｐ２１により抑制される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にある、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
遺伝子が表Ｉに同定される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
細胞の遺伝子の発現が免疫学上の試薬を使用して検出される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
細胞の遺伝子の発現が、細胞の遺伝子産物の活性についてアッセイすることによって検出される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
細胞の遺伝子の発現が、相補的核酸にハイブリッド形成させることにより検出される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞における老化の誘導を促進する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在または不在下で請求項２８に記載の哺乳類細胞を剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下でより大きな範囲に変化する場合に、老化の誘導を促進する化合物を同定すること。
【請求項１１０】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞における老化の誘導を促進する化合物を同定する方法。
（ａ）化合物の存在または不在下で請求項２９に記載の哺乳類細胞を剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下でより大きな範囲に変化する場合に、老化の誘導を促進する化合物を同定すること。
【請求項１１１】
請求項７４の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含する、細胞中の老化を促進する方法。
【請求項１１２】
細胞が、腫瘍細胞、増殖性細胞、または過剰増殖のため病原性であるか、あるいは疾病原因の細胞である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
請求項８４の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする、細胞中の老化を促進する方法。
【請求項１１４】
細胞が、腫瘍細胞、増殖性細胞、または過剰増殖のため病原性であるかあるいは疾病原因の細胞である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
請求項９３の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする、細胞中の老化を促進する方法。
【請求項１１６】
細胞が、腫瘍細胞、増殖性細胞、または過剰増殖のため病原性であるかあるいは疾病原因である細胞である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
請求項１０１の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする、細胞中の老化を促進する方法。
【請求項１１８】
細胞が、腫瘍細胞、増殖性細胞、または過剰増殖のため病原性であるかあるいは疾病原因である細胞である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
請求項１０９の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする、細胞中の老化を促進する方法。
【請求項１２０】
細胞が、腫瘍細胞、増殖性細胞、または過剰増殖のため病原性であるかあるいは疾病原因である細胞である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
請求項１１０の方法により生成される化合物と細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする、細胞中の老化を促進する方法。
【請求項１２２】
細胞が、腫瘍細胞、増殖性細胞、または過剰増殖のため病原性であるかあるいは疾病原因である細胞である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
以下の段階による方法で生成される、細胞の遺伝子発現のｐ２１調節を阻害する化合物。
（ａ）哺乳類細胞中のｐ２１の発現を誘導すること；
（ｂ）その発現が、ｐ２１によって調節される細胞の遺伝子の発現における変化について、化合物の存在または不在下にある細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）サブパート（ｂ）の細胞の遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下でより少ない範囲に変化される場合に、細胞の遺伝子発現のｐ２１−仲介調節の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項１２４】
以下の段階による方法で生成される、細胞の遺伝子発現のｐ２１調節を阻害する化合物。
（ａ）化合物の存在または不在下で、請求項２１に記載の哺乳類細胞中のｐ２１の発現を生じること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の存在下でより少ない範囲に変化される場合に、細胞の遺伝子発現のｐ２１−仲介調節の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項１２５】
以下の段階による方法で生成される、哺乳類細胞中の老化を阻害する化合物。
（ａ）化合物の存在下にある哺乳類細胞を剤で処理するか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）ｐ２１遺伝子発現により抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について哺乳類細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）化合物の存在下で、ｐ２１により抑制される遺伝子が、より少ない範囲に抑制されるか、またはｐ２１により誘導される遺伝子が、より少ない範囲に誘導される場合に、老化の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項１２６】
以下の段階による方法で生成される、哺乳類細胞における老化を阻害する化合物。
（ａ）細胞が、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子を包含することを特徴とする、化合物の存在または不在下で哺乳類細胞を剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の存在下でより少ない範囲に変化される場合に、老化の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項１２７】
以下の段階による方法で生成される、哺乳類細胞における老化を増強する化合物。
（ａ）哺乳類細胞中でｐ２１の発現を生じること；
（ｂ）その発現が、ｐ２１により誘導または抑制される細胞の遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）サブパート（ｂ）の細胞の遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下でより大きな範囲に誘導または抑制される場合に、老化の阻害剤として化合物を同定すること。
【請求項１２８】
以下の段階による方法で生成される、哺乳類細胞中の老化を増強する化合物。
（ａ）化合物の存在下にある哺乳類細胞を剤で処理するか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）ｐ２１遺伝子発現により抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について哺乳類細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）化合物の存在下で、ｐ２１により抑制される遺伝子が、より大きい範囲に抑制されるか、またはｐ２１により誘導される遺伝子が、より大きな範囲に誘導される場合に、老化のポテンシエーターとして化合物を同定すること。
【請求項１２９】
以下の段階による方法で生成される、哺乳類細胞における老化を増強する化合物。
（ａ）細胞が、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子を包含することを特徴とする、化合物の存在または不在下で哺乳類細胞を剤と接触させるか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）レポーター遺伝子の発現が、化合物の不在下でより化合物の存在下でより大きな範囲に変化する場合に、老化のポテンシエーターとして化合物を同定すること。
【請求項１３０】
哺乳類細胞でのｐ２１発現を生じ、そして抗アポトーシスまたは有糸分裂因子を産生するのに十分な時間、細胞培養用培地中で細胞を培養する段階を包含することを特徴とする、哺乳類細胞から抗アポトーシスまたは有糸分裂因子を生じる方法。
【請求項１３１】
哺乳類細胞が、請求項２に記載の哺乳類細胞であり、そしてｐ２１発現が、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤を含む培養用培地中で哺乳類細胞を培養するか、またはこのようなプロモーターからの転写を阻害する剤を除去することによって誘導される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
哺乳類細胞によって生じた抗アポトーシスまたは有糸分裂性化合物が、その発現がｐ２１によって誘導される化合物である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
ｐ２１を発現する哺乳類細胞の成長によって調節される哺乳類細胞の培養用培地。
【請求項１３４】
哺乳類細胞が、請求項２に記載の哺乳類細胞であり、そしてｐ２１発現が、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤を含む培養用培地中で哺乳類細胞を培養するか、またはこのようなプロモーターからの転写を阻害する剤を除去することによって誘導される、請求項１３３に記載の哺乳類細胞の培養用培地。
【請求項１３５】
以下の段階を包含する、細胞周期進行に関与する遺伝子について富化される複数の核酸種を得る方法。
（ａ）哺乳類細胞でのｐ２１の発現を誘導すること；
（ｂ）ｐ２１が段階（ａ）により誘導される前および後に、哺乳類細胞から細胞のｍＲＮＡを得ること；
（ｃ）ｐ２１が誘導される前に細胞から得られた細胞のｍＲＮＡの発現を、ｐ２１が誘導された後に細胞のｍＲＮＡの発現と比較すること；および
（ｄ）ｐ２１発現が誘導された後に、その発現が、細胞中で抑制される遺伝子について富化された複数の核酸種を得ること。
【請求項１３６】
以下の段階を包含する、パラ分泌機能を有する分泌タンパク質、ならびに老化および加齢関連疾病に関与するタンパク質をコードする遺伝子について富化される複数の核酸種を得る方法。
（ａ）哺乳類細胞でのｐ２１の発現を誘導すること；
（ｂ）ｐ２１が誘導される前および後に、哺乳類細胞から細胞のｍＲＮＡを得ること；および
（ｃ）ｐ２１が誘導された後に、その発現が細胞中で誘導される遺伝子について富化された複数の核酸種を得ること。
【請求項１３７】
以下の段階を包含する、細胞の老化のマーカーである複数の細胞の遺伝子を同定する方法。
（ａ）哺乳類細胞の第一の集団でのｐ２１の発現、および哺乳類細胞の第二の集団での静止を誘導すること；
（ｂ）細胞の各集団からｍＲＮＡを得ること；
（ｃ）ｐ２１が誘導される前および後の第一の集団中の細胞での遺伝子発現のパターンを、細胞が静止になる前および後の第二の集団中の細胞での遺伝子発現のパターンと比較すること；
（ｄ）ｐ２１誘導細胞で強力に誘導される複数の遺伝子を、静止している細胞で強力に誘導される複数の遺伝子と比較すること；および
（ｅ）静止している細胞で強力に誘導されはしないｐ２１誘導細胞で強力に誘導される遺伝子を同定すること。
【請求項１３８】
結合性組織成長因子、血清アミロイドＡ、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、Ｍａｃ２結合タンパク質、または組織トランスグルタミナーゼである遺伝子から構成される群から選択される遺伝子の発現を検出する段階を包含することを特徴とする哺乳類細胞中の老化を検出する方法。
【請求項１３９】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞中で老化を誘導する化合物を同定する方法。
（ａ）その発現がｐ２１によって調節される遺伝子の発現について、化合物の存在および不在下で哺乳類細胞のアッセイを行うこと；および
（ｂ）化合物の存在下で、ｐ２１によって抑制される遺伝子の発現が、細胞中で抑制されるか、ｐ２１によって誘導される遺伝子の発現が、細胞中で増加されるときに、老化を誘導する化合物を同定すること。
【請求項１４０】
遺伝子がｐ２１によって誘導される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
遺伝子が表ＩＩに同定される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
遺伝子がｐ２１によって抑制される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４３】
遺伝子が表Ｉに同定される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
遺伝子の発現が免疫学上の試薬を用いて検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
遺伝子の発現が細胞の遺伝子産物の活性についてアッセイすることによって検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４６】
遺伝子の発現が相補的核酸にハイブリッド形成することによって検出される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４７】
サブパート（ａ）でのアッセイが抗癌剤の存在で行われる、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４８】
哺乳類細胞が誘導性ｐ２１遺伝子を包含し、そしてサブパート（ａ）でのアッセイが、多量のｐ２１発現を誘導する剤の存在で行われ、それによりｐ２１誘導の範囲が、ｐ２１によって阻害される遺伝子の完全な阻害のためには不十分である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４９】
以下の段階を包含する、哺乳類細胞における老化を誘導する化合物を同定する方法。
（ａ）細胞が、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子を包含することを特徴とする、哺乳類細胞を化合物と接触させること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現における変化について細胞のアッセイを行うこと；および
（ｃ）細胞が、化合物と接触される場合に、レポーター遺伝子の発現が、ｐ２１によって抑制される遺伝子からプロモーターの転写制御下にあるときに減少されるか、またはレポーター遺伝子の発現が、ｐ２１によって誘導される遺伝子の転写制御下にあるときに増加される場合に老化を誘導する化合物を同定すること。
【請求項１５０】
レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって誘導される哺乳類細胞についてのプロモーターの転写抑制下にある、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
遺伝子が、表ＩＩに同定される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって抑制される哺乳類細胞についてのプロモーターの転写抑制下にある、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
遺伝子が、表Ｉに同定される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
レポーター遺伝子の発現が、免疫学上の試薬を用いて検出される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５５】
レポーター遺伝子の発現が、細胞の遺伝子産物の活性についてアッセイすることによって検出される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５６】
レポーター遺伝子の発現が、相補的核酸にハイブリッド形成することによって検出される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５７】
その発現がｐ２１によって阻害される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物。
【請求項１５８】
プロモーターが、遺伝子ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから得られたものである、請求項１５７に記載の組換え発現構築物。
【請求項１５９】
その発現が、ｐ２１によって誘導される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物。
【請求項１６０】
プロモーターが、遺伝子血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから得られる、請求項１５９に記載の組換え発現構築物。
【請求項１６１】
請求項１２の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【請求項１６２】
請求項３０の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【請求項１６３】
請求項３８の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【請求項１６４】
請求項３９の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【請求項１６５】
請求項４０の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【請求項１６６】
請求項４８の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【請求項１６７】
請求項５６の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする、哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【請求項１６８】
請求項５７の方法により生成される化合物と細胞を接触される段階を包含することを特徴とする、哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物の産生を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、１９９９年１１月２９日に提出された米国特許出願番号第０９／４４９，５８９号、および１９９９年４月９日に提出された米国特許出願番号第６０／１２８，６７６号に対する優先権を主張し、その各々の開示は、ここに参照して明白に組込まれる。
【０００２】
１．（発明の分野）
本発明は、細胞の老化および老化に付随する細胞の遺伝子発現における変化に関する。特に、本発明は、その発現が、老化の開始時に細胞中に誘導される細胞の遺伝子産物ｐ２１によって調節される遺伝子の同定に関する。さらに詳細には、本発明は、その発現が、ｐ２１によって誘導または抑制されている遺伝子である細胞の老化のマーカーを提供する。本発明は、これらのマーカー遺伝子の抑制または誘導の阻害を検出することによって細胞の老化を阻害または増強する化合物を同定する方法を提供する。さらに提供されるのは、実験的に誘導性であるｐ２１をコードする組換え発現構築物を含有する組換え哺乳類細胞、およびｐ２１に調節される遺伝子についてのプロモーターの転写制御下にレポーター遺伝子を発現する組換え発現構築物を含有する組換え哺乳類細胞である試薬である。
【背景技術】
【０００３】
２．（関連技術の要約）
ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１／ＳＤＨは、哺乳類細胞における成長停止および老化の重大なメディエーターである。ｐ２１は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を結合および阻害するタンパク質（Ｈａｒｐｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７５巻：８０５−８１６頁、１９９３年）として、野生型ｐ５３により上方調節された遺伝子（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５巻：２９１０−２９１９頁、１９９３年）として、および老化線維芽細胞で過剰発現される成長阻害遺伝子（Ｎｏｄａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２１１巻：９０−９８頁、１９９４年）として数種の群によって独立に同定された。ｐ５３で調節された成長停止におけるその中心的な役割のため、ｐ２１は、通常、腫瘍サプレッサーと考えられる。それにもかかわらず、ヒト癌におけるｐ２１突然変異はまれであり（ＨａｌｌおよびＰｅｔｅｒｓ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：６７−１０８頁、１９９６年）、そしてｐ２１ノックアウトマウスは、正常に発育し、そして腫瘍誘発の速度が増加したことを示さなかった（Ｄｅｎｇら、Ｃｅｌｌ  ８２巻：６７５−６８４頁、１９９５年）。
【０００４】
ｐ２１の細胞のレベルは、ＤＮＡ−損傷および分化剤を含めた多様な刺激に応答して増加される。これらの応答のいくつかは、ｐ５３によってｐ２１遺伝子の転写活性化を通して仲介されるが、しかしｐ２１は、多様なｐ５３独立因子によっても調節される（ＧａｒｔｅｌおよびＴｙｎｅｒ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２７巻：１７１−１８１頁、１９９９年で再検討）。ｐ２１発現が増加されたことで、細胞成長停止に至り（Ｎｏｄａら、１９９４年、上記）、そしてそれは、Ｇ１およびＧ２の両方で起こり（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕら、１９９８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８巻：６２９−６４３頁）、そして老化の形態学および表現型マーカーの開発に伴って起った（Ｖｏｇｔら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９巻、１９９８年：１３９−１４６頁；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８巻：３５１−３５４頁、１９９８年；Ｂａｔｅｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７巻：１６９１−１７０３頁、１９９８年；Ｆａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：２７８９−２７９７頁、１９９９年）。
【０００５】
ｐ２１の一過性誘導は、細胞にＤＮＡ損傷を修復させる一過性停止、ならびに生来の成長停止（「促進された老化」とも称される）を含めた、様々な形態の損傷誘導成長停止を仲介し、そしてそれは、正常な線維芽細胞（ＤｉＬｅｏｎａｒｄｏら、１９９４年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．８巻：２５４０−２５５１頁；ＲｏｂｌｅｓおよびＡｄａｍｉ、１９９８年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６巻：１１１３−１１２３頁）およびＤＮＡ損傷または癌遺伝子ＲＡＳ（Ｓｅｒｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ８８巻：５９３−６０２頁、１９９７年）の導入による腫瘍細胞（Ｃｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９巻：３７６１−３７６７頁、１９９９年）で誘導される。ｐ２１発現の高まりも、加齢の線維芽細胞の反復性老化の間の終結成長停止（Ｎｏｄａら、１９９４年、上記；Ａｌｃｏｒｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３巻：１３７４２−１３７４７頁、１９９６年；Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １９巻：２１０９−２１１７頁、１９９９年）および有糸分裂後の細胞の終結分化（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、１９９５年、上記；Ｇａｒｔｅｌら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２４６巻：２８０−２８９頁、１９９６年）の開始と同時発生する。ｐ２１（ｐ２１−／−同種接合体）を発現できない細胞の分析は、正常な線維芽細胞の反復性老化（Ｂｒｏｗｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７巻：８３１−８３４頁、１９９７年）における、および腫瘍細胞の促進された老化（Ｃｈａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：４８０４−４８１８頁、１９９９年）における、一過性Ｇ１およびＧ２停止（Ｄｅｎｇら、１９９５年、上記；Ｗａｌｄｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５巻：５１８７−５１９０頁、１９９５年；Ｂｕｎｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２巻：１４９７−１５０１頁、１９９８年）でのｐ２１の必要性を示した。
【０００６】
ｐ２１が、それ自身の転写因子でない場合、それは、それの細胞の機能における役割を果しうる遺伝子発現における間接的効果を示す。ｐ２１の最高の公知生化学的機能は、細胞周期の異なる相の間の一過性を調節するＣＤＫ複合体の阻害である（ＧａｒｔｅｌおよびＴｙｎｅｒ、１９９８年、ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＧＲＯＷＴＨ，ＰＲＯＧＥＳＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＳＵＢＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２０巻（Ａ．Ｍａｃｉｅｉｒ−Ｃｏｅｌｈｏ編）で、「ｐ２１の成長調節の役割（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）」、スプリンガー−ベルラグ：ベルリン・ハイデルベルグ、４３−７１頁で再検討）。ＣＤＫ阻害の結果の１つは、Ｒｂの脱リン酸化であり、そしてそれは、順次、ＤＮＡ複写および細胞周期進行に関与した多くの遺伝子を調節するＥ２Ｆ転写因子を阻害する（Ｎｅｖｉｎｓ、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９巻：５８５−５９３頁、１９９８年）。ｐ２１発現細胞（ｐ２１＋／＋）およびｐ２１−非発現細胞（ｐ２１−／−）の比較は、数種のＥ２Ｆ調節細胞の遺伝子における放射線誘導阻害にｐ２１に関係があるとした（ｄｅ  Ｔｏｌｅｄｏら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９巻：８８７−８９６頁、１９９８年）。ｐ２１によるＣＤＫ阻害の別の結果は、ＮＦκＢを増大する転写コファクターｐ３００の刺激である（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５巻：５２３−５２７頁、１９８８年）。多くの誘導性転写因子を増強するヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００の活性化は、遺伝子発現に多面発現性効果を示しうる（ＳｎｏｗｄｅｎおよびＰｅｒｋｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：１９４７−１９５４頁、１９８８年）。ｐ２１は、ＣＤＫ以外のタンパク質とのそれの相互作用を通して遺伝子発現に影響を及ぼし得る。例えば、ｐ２１は、ケラチン細胞分化マーカーの発現を阻害することが分かった；この効果は、ＣＤＫ阻害について必要とされないが、しかし増殖細胞核の抗原に結合することが知られているｐ２１のＣ−末端部分に依存した（Ｄｉ  Ｃｕｎｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０巻：１０６９−１０７２頁、１９９８年）。ｐ２１は、ＪＮＫキナーゼ（Ｓｈｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１巻：８０４−８０７頁、１９９６年）、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（Ａｓａｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８巻：１２２３−１２３４頁、１９９９年）およびＧａｄｄ４５（Ｋｅａｒｓｅｙら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１巻：１６７５−１６８３頁、１９９５年）に結合することも報告された；これらの相互作用は、対応の経路によって調節される遺伝子の発現に影響を及ぼしうる。
【０００７】
その発現が、ｐ２１遺伝子発現の誘導によって調節される遺伝子を同定する当業界における必要性が残る。細胞の老化、発癌および加齢関連疾患における化合物の効果を評価する標的を開発する当業界における必要性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の要約）
本発明は、その発現が、ｐ２１遺伝子発現の誘導により調節される遺伝子を同定する試薬および方法を提供する。本発明は、細胞の老化、発癌および加齢関連疾患を防止するため、または抗癌治療の効力を増加するための合理的薬剤設計での第一の段階として、細胞の遺伝子発現におけるｐ２１の効果を阻害または増強する化合物を同定する試薬および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第一の態様で、本発明は、誘導性ｐ２１遺伝子を含む哺乳類細胞を提供する。好ましい実施形態で、哺乳類細胞は、誘導性ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含する組換え哺乳類細胞である。さらに詳細には、構築物は、誘導性プロモーターの転写制御下で、ｐ２１、もっとも好ましくはヒトｐ２１をコードするヌクレオチド配列を包含する。選択的実施形態で、構築物は、ＣＤＫ結合ドメインを包含するｐ２１のアミノ−末端部分をコードするヌクレオチド配列を包含し、より好ましくはｐ２１アミノ酸配列のアミノ酸１から７８を包含する。より好ましい実施形態で、誘導性プロモーターは、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤、最も好ましくは生理学上の天然の誘導性薬剤と細胞を接触させることによって、またはこのようなプロモーターから転写を阻害する剤を除去することによって誘導されうる。好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、線維肉腫細胞である。
【００１０】
本発明の第一の態様の実施形態では、レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって調節される細胞の遺伝子から誘導されるプロモーターの転写制御下にある組換え発現構築物を含む組換え哺乳類細胞が提供される。好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現が、ｐ２１によって抑制される細胞の遺伝子から誘導される。これらの実施形態では、プロモーターは、表Ｉに同定される遺伝子から最も好ましく誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから誘導される。他の好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって誘導される細胞の遺伝子から誘導される。これらの実施形態では、プロモーターは、最も好ましくは、表ＩＩに同定される遺伝子から誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから誘導される。本発明の組換え発現構築物を包含する好ましいレポーター遺伝子としては、ホタル・ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。
【００１１】
別の好ましい実施形態で、本発明は、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする第一の組換え発現構築物、およびｐ２１の発現が、それにより哺乳類細胞で実験的に誘導される哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする第二の組換え発現構築物を含む哺乳類細胞を提供する。好ましい実施形態では、哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物は、組換え発現構築物からｐ２１の発現が、組換え細胞を、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤と接触させることによって、またはこのようなプロモーターから転写を阻害する剤を除去することによって仲介されることを特徴とする誘導性異種プロモーターの転写制御下にある。好ましくは、構築物は、ｐ２１、最も好ましくはヒトｐ２１をコードするヌクレオチド配列を包含する。代替の実施形態では、構築物は、ＣＤＫ−結合ドメインを含むｐ２１のアミノ末端部分をコードするヌクレオチド配列を包含し、さらに好ましくはｐ２１アミノ酸配列のアミノ酸１から７８を包含する。好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現が、ｐ２１によって抑制される細胞の遺伝子から誘導される。これらの実施形態では、プロモーターは、最も好ましくは、表Ｉに同定される遺伝子から誘導される。他の好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現が、ｐ２１によって誘導される細胞の遺伝子から誘導される。これらの実施形態では、プロモーターは、最も好ましくは、表ＩＩに同定される遺伝子から誘導される。本発明の組換え発現構築物を包含する好ましいレポーター遺伝子としては、ホタル・ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、線維肉腫細胞である。
【００１２】
第二の態様では、本発明は、培地が、ｐ２１を発現する細胞によって調整される調整細胞培養用培地、および上記調整培地を生成する方法を提供する。好ましい実施形態では、調整培地は、哺乳類細胞培養用培地、最も好ましくは血清添加剤を含有しない合成培地中でｐ２１発現細胞を培養することによって生成される。本発明のこの態様に有用なｐ２１発現としては、誘導性プロモーターの転写制御下でｐ２１をコードする組換え発現構築物の内在性ｐ２１発現および誘導性発現の両方が挙げられる。好ましい細胞としては、哺乳類細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、そしてさらに好ましくはマウスまたはヒト細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、さらに好ましくはヒト線維肉腫細胞および最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびそれらの誘導体である。
【００１３】
本発明のこの態様は、哺乳類細胞における有糸分裂または抗アポトーシス因子のｐ２１誘導発現を阻害する化合物を同定するスクリーニング法を提供する。好ましい実施形態では、その方法は、化合物の存在または不在下で、細胞中のｐ２１の発現を誘導すること、そして調整培地中で有糸分裂または抗アポトーシス性化合物あるいはそれらの複数の発現を比較することを包含する。阻害剤は、化合物の不在下でより、化合物の存在下で調整培地中に少ない量の有糸分裂または抗アポトーシス性化合物あるいはそれらの複数を有することによって同定される。本発明のこの態様で供される方法で、任意のｐ２１発現細胞が、有用であり、そしてこのような細胞におけるｐ２１発現は、内因性ｐ２１を誘導することによるか、または本発明による誘導性ｐ２１発現構築物を含有する細胞を使用することによって達成されうる。好ましい細胞としては、哺乳類細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、そしてさらに好ましくはマウスまたはヒト細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態では、線維肉腫細胞、さらに好ましくは、ヒト繊維肉腫細胞および最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびそれらの誘導体である。
【００１４】
代替の実施形態では、本発明は、細胞が、ｐ２１によって誘導される細胞の遺伝子のプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含することを特徴とする、哺乳類細胞中の有糸分裂または抗アポトーシス因子のｐ２１誘導発現を阻害する化合物を同定する方法を提供する。好ましい実施形態では、プロモーターとしては、ＣＴＧＦ、アクチビンＡ、エピセリン／グラヌリン、ガレクチン−３およびプロサポシンが挙げられる。好ましいレポーター遺伝子としては、それに限定されないが、ホタル・ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられる。これらの実施形態では、レポーター遺伝子発現のｐ２１仲介誘導の阻害は、ｐ２１発現細胞における有糸分裂または抗アポトーシス因子の誘導を阻害する化合物を同定するために使用される。
【００１５】
この実施形態では、本発明は、有糸分裂または抗アポトーシス因子の産生を阻害する化合物と細胞を接触させる段階を包含し、該化合物が、本発明のこの態様の前述の方法によって同定されることを特徴とする、哺乳類細胞での有糸分裂または抗アポトーシス因子または化合物の産生を阻害する方法も提供する。好ましい実施形態では、有糸分裂または抗アポトーシス因子の産生が、阻害される阻害化合物と接触される哺乳類細胞は、線維芽細胞、最も好ましくは間質の線維芽細胞である。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節を阻害する化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、哺乳類細胞におけるｐ２１を誘導またはさもなければ産生すること；その発現がｐ２１によって調節される細胞の遺伝子の発現における変化について、化合物の存在下で細胞を分析すること；および細胞の遺伝子の発現が、化合物の不在下でより、化合物の存在下で少ない範囲に変化される場合に細胞の遺伝子発現のｐ２１仲介調節を阻害する化合物を同定する段階を包含する。好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって抑制され、そして阻害剤は、ｐ２１が、化合物の不在下で発現されるときに検出されものより大きなレベルで、遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表Ｉに同定される。代替の好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって誘導され、そして阻害剤は、ｐ２１が、化合物の不在下で発現されるときに検出されものより少ないレベルで、遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表ＩＩに同定される。別の代替の実施形態では、その方法は、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から誘導されるプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子を包含する組換え哺乳類細胞を使用して行われる。ｐ２１によって抑制される遺伝子から誘導されるプロモーターを包含する構築物を使用するこれらの実施形態では、レポーター遺伝子産物は、化合物が、ｐ２１遺伝子発現調節の阻害剤であるときに化合物の不在下でより、存在下で大きなレベルで産生される。これらの実施形態では、プロモーターは、最も好ましくは、表Ｉに同定される遺伝子から誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから誘導される。ｐ２１によって誘導される遺伝子から誘導されるプロモーターを含む構築物を使用する場合、レポーター遺伝子産物は、化合物が、ｐ２１遺伝子発現調節の阻害剤であるときに化合物の不在より存在下で少ないレベルで産生される。これらの実施形態では、プロモーターは、最も好ましくは、表ＩＩに同定される遺伝子から誘導される。さらに好ましくは、プロモーターは、血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから誘導される。本発明の組換え発現構築物を含む好ましいレポーター遺伝子としては、ホタル・ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリ性ホスファターゼ���挙げられる。他の好ましい実施形態では、細胞は、その発現が、ｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする第一の組換え発現構築物、および哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする第二の組換え発現構築物を包含し、ｐ２１の発現が、それにより哺乳類細胞中で実験的に誘導される。ｐ２１により誘導または抑制されるレポーター遺伝子または内因性遺伝子の産生は、遺伝子産物の活性について分析することにより、または相補的核酸にハイブリッド形成することによって、免疫学上の試薬を用いて検出される。
【００１７】
第４の態様では、本発明は、哺乳類細胞での老化を阻害する化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、化合物の存在下で哺乳類細胞を、剤で処理するか、または老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；ｐ２１遺伝子発現により抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について哺乳類細胞を分析すること；および化合物の存在下で、ｐ２１によって抑制される遺伝子が、抑制されないか、またはｐ２１によって誘導される遺伝子が、誘導されない場合に老化の阻害剤として化合物を同定する段階を包含する。好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１により抑制され、そして老化阻害剤は、ｐ２１が、化合物の不在下で発現されるときに検出されるものより大きなレベルで、遺伝子の発現を検出することによって同定される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表Ｉに同定される。代替の好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって誘導され、そして老化阻害剤は、ｐ２１が化合物の不在下に発現されるときに検出されるものより少ないレベルで、遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表ＩＩに同定される。別の代替の実施形態では、方法は、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から由来したプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を包含する組換え哺乳類細胞を使用して行われる。これらの実施形態では、ｐ２１によって抑制される遺伝子から由来したプロモーターを含む構築物を使用したときに、化合物の不在下でより存在下で大きなレベルにあるか、またはｐ２１によって誘導される遺伝子から由来したプロモーターを含む構築物を使用したときに、化合物の不在下でより存在下で小さなレベルにあるレポーター遺伝子の産物の産生は、化合物が老化の阻害剤であるときに検出される。プロモーターは、好ましくは、表Ｉ（ｐ２１によって抑制される遺伝子については）または表ＩＩ（ｐ２１によって誘導される遺伝子については）で同定される遺伝子から誘導される。ｐ２１抑制遺伝子については、プロモーターは、最も好ましくは、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから誘導される。ｐ２１誘導遺伝子については、プロモーターは、最も好ましくは、アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから誘導される。他の好ましい実施形態では、細胞は、その発現が、ｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする第一の組換え発現構築物、および哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする第二の組換え発現構築物���包含し、そしてｐ２１の発現が、それにより哺乳類細胞中で実験的に誘導される。ｐ２１によって誘導または抑制されるレポーター遺伝子または内因性遺伝子の産生は、遺伝子産物の活性について分析することによるか、または相補的核酸にハイブリッド形成させることにより免疫学上の試薬を使用して検出される。
【００１８】
第５の態様で、本発明は、本発明の前述の態様に供される方法を使用して測定される場合、老化を阻害する化合物と細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする細胞の老化、加齢関連疾患または加齢関連遺伝子産物を阻害する方法を提供する。
【００１９】
第６の態様で、本発明は、哺乳類細胞中の老化を増強する化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、化合物の存在および不在下で哺乳類細胞中の２１を誘導すること；ｐ２１遺伝子発現によって抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について哺乳類腫瘍細胞を分析すること；および化合物の存在下で、ｐ２１によって抑制される遺伝子が、より大きな範囲に抑制されるか、またはｐ２１によって誘導される遺伝子が、より大きな範囲まで誘導されるかで、老化のポテンシエーターとして化合物を同定する段階を包含する。好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって抑制され、そしてポテンシエーターは、ｐ２１が、化合物の不在下で発現される時に検出されるものより少ないレベルで、細胞の遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表Ｉに同定される。代替の好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって誘導され、そしてポテンシエーターは、ｐ２１が、化合物の不在下で発現される時に検出されるものより大きなレベルで、細胞の遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表ＩＩに同定される。別の代替の実施形態では、細胞が、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から由来したプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を有する構築物を包含することを特徴とする、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から誘導されるプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を含む組換え哺乳類細胞を使用して行われる。これらの実施形態では、ｐ２１によって抑制される遺伝子から由来したプロモーターを含む構築物を使用したときに、化合物の不在下でより存在下で低いレベルにあるか、またはｐ２１によって誘導される遺伝子から由来したプロモーターを含む構築物を使用したときに、化合物の不在下でより存在下で大きなレベルにあるレポーター遺伝子の産物の産生は、化合物が老化のポテンシエーターであるときに検出される。好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって抑制される遺伝子から誘導され、最も好ましくは表Ｉに同定される遺伝子である。最も好ましくは、プロモーターは、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから誘導される。代替の好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって誘導される遺伝子、最も好ましくは表ＩＩに同定される遺伝子から誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから誘導される���他の好ましい実施形態では、細胞は、その発現が、ｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする第一の組換え発現構築物、および哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする第二の組換え発現構築物を包含し、そしてｐ２１の発現が、それにより哺乳類細胞中で実験的に誘導される。ｐ２１によって誘導または抑制されるレポーター遺伝子または内因性遺伝子の産生は、遺伝子産物の活性について分析することによるか、または相補的核酸にハイブリッド形成させることにより免疫学上の試薬を使用して検出される。
【００２０】
第７の態様で、本発明は、本発明の前述の態様に供される方法を使用して測定されるときに、老化を増強する化合物と細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする、過剰増殖のため、腫瘍細胞、増殖性細胞または病理学または疾病原因である任意の細胞型で細胞の老化を促進または増強する方法を提供する。
【００２１】
第８の態様で、本発明は、ここに開示されるとおり本発明の方法のいずれかを使用して同定される化合物を提供する。
【００２２】
第９の態様で、本発明は、細胞周期進行に関与する遺伝子について富化される複数の核酸種を得る方法を提供する。これらの方法は、哺乳類細胞でのｐ２１の発現を誘導すること；ｐ２１誘導の前、およびｐ２１が誘導され、そして細胞成長が停止された後に、哺乳類細胞から細胞のｍＲＮＡを得ること；および細胞周期進行に関与する遺伝子について富化された複数の核酸種を得る段階を包含する。好ましい実施形態では、細胞周期進行遺伝子について富化された複数の核酸種は、当業界に知られる消去式ハイブリッド形成法によって得られ、それによりｐ２１を発現する細胞で過少表現される核酸種は、選択的に富化された。
【００２３】
第１０の態様で、本発明は、パラ分泌機能を有する分泌タンパク質および老化および加齢関連疾病に関与するタンパク質をコードする遺伝子について富化される複数の核酸種を得る方法を提供する。これらの方法は、哺乳類細胞でのｐ２１の発現を誘導すること；ｐ２１が誘導される前および後に、哺乳類細胞から細胞のｍＲＮＡを得ること；およびｐ２１が誘導された後に、その発現が細胞中で増加される遺伝子について富化された複数の核酸種を得る段階を包含する。好ましい実施形態では、タンパク質のパラ分泌機能は、有糸分裂および抗アポトーシス効果である。好ましい実施形態では、パラ分泌機能を有する分泌タンパク質および老化および加齢関連疾病に関与するタンパク質をコードする遺伝子について富化される複数の核酸種は、当業界で知られる消去式ハイブリッド形成方法によって得られ、それによりｐ２１を発現する細胞で過剰表現される核酸種は、選択的に富化される。
【００２４】
第１１の態様で、本発明は、哺乳類細胞の第一の集団でのｐ２１の発現を産生することにより老化を誘導し、そして哺乳類細胞の第二の集団での静止を誘導すること；細胞の各集団からｍＲＮＡを得ること；細胞中のｐ２１の誘導の前および後の細胞での遺伝子発現のパターンを、細胞が静止になる前および後の細胞での遺伝子発現のパターンと比較すること；ｐ２１が誘導された後の細胞で強力に誘導される複数の遺伝子を、静止している細胞で強力に誘導される複数の遺伝子と比較すること；および静止している細胞で強力に誘導されはしないｐ２１を産生する細胞で強力に誘導される遺伝子を同定する段階を包含することを特徴とする、細胞の老化のマーカーである遺伝子を同定する方法を提供する。
【００２５】
第１２の態様で、本発明は、哺乳類細胞における老化を検出する方法を提供する。これらの方法は、老化についてのマーカーである遺伝子の発現を検出する段階を包含する。好ましい実施形態では、老化の好ましいマーカーとしては、結合性組織成長因子（ＣＴＧＦ）、血清アミロイドＡ、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、Ｍａｃ２結合タンパク質、または組織トランスグルタミナーゼが挙げられる。
【００２６】
第１３の態様で、本発明は、哺乳類細胞中で老化の誘導を促進する化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、哺乳類細胞を剤で処理すること、または化合物の存在下で老化を誘導する条件下で哺乳類細胞を培養すること；ｐ２１遺伝子発現によって抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について哺乳類腫瘍細胞を分析すること；および化合物の存在下で、ｐ２１によって抑制される遺伝子が、さらに抑制される場合に、すなわち、より大きな範囲に、またはｐ２１によって誘導される遺伝子がさらに誘導される、すなわち、より大きな範囲に、老化のポテンシエーターとして化合物を同定する段階を包含する。好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって抑制され、そして老化の誘導を促進する化合物は、ｐ２１が、化合物の不在下で発現される場合に検出されるものより小さいレベルで、細胞の遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態で、遺伝子は、表Ｉに同定される。代替の好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって誘導され、そして老化の誘導を促進する化合物は、ｐ２１が、化合物の不在下で発現される場合に検出されるものより大きなレベルで、細胞の遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表ＩＩに同定される。さらに代替の好ましい実施形態では、その方法は、細胞が、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から得られるプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子を有する構築物を包含することを特徴とする、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から誘導されるプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子含む組換え哺乳類細胞を使用して行われる。これらの実施形態では、ｐ２１によって抑制される遺伝子から誘導されるプロモーターを含む構築物を使用する時に化合物の不在下でより存在下でより低いレベルで、またはｐ２１によって誘導される遺伝子から誘導されるプロモーターを含む構築物を使用する時に化合物の不在下でより存在下で大きいレベルで、レポーター遺伝子の産物の産生は、化合物が、老化の誘導を促進するときに検出される。好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって抑制される遺伝子、最も好ましくは表Ｉに同定される遺伝子から誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、ＯＲＣ１、ＰＲC１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから誘導される。代替の好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって誘導される遺伝子、最も好ましくは表ＩＩに同定される遺伝子から誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラ��リン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから誘導される。他の好ましい実施形態では、細胞は、その発現が、ｐ２１によって調節される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする第一の組換え発現構築物、および哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする第二の組換え発現構築物を包含し、そしてｐ２１の発現が、それにより哺乳類細胞中で実験的に誘導される。ｐ２１によって誘導または抑制されるレポーター遺伝子または内因性遺伝子の産生は、遺伝子産物の活性について分析することによるか、または相補的核酸にハイブリッド形成させることにより免疫学上の試薬を使用して検出される。
【００２７】
第１４の態様で、本発明は、哺乳類細胞中で老化を誘導する化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、ｐ２１遺伝子発現によって抑制または誘導される遺伝子の抑制または誘導について、化合物の存在および不在下で哺乳類細胞を分析すること；および化合物の存在下で、ｐ２１によって抑制される遺伝子が、抑制される場合に、またはｐ２１によって誘導される遺伝子が誘導される場合に、老化を誘導する化合物を同定する段階を包含する。好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって抑制され、そして老化を誘導する化合物は、化合物の不在下で検出されるものより小さいレベルで細胞の遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態で、遺伝子は、表Ｉに同定される。代替の好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって誘導され、そして老化を誘導する化合物は、化合物の不在下で検出されるものより大きなレベルで、細胞の遺伝子の発現を検出することによって検出される。好ましい実施形態では、遺伝子は、表ＩＩに同定される。さらに代替の実施形態では、その方法は、細胞が、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から得られるプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子を有する構築物を包含することを特徴とする、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子から誘導されるプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子を含む組換え哺乳類細胞を使用して行われる。これらの実施形態では、ｐ２１によって抑制される遺伝子から誘導されるプロモーターを含む構築物を使用する時に、化合物の不在下でより存在下で低いレベルで、またはｐ２１によって誘導される遺伝子から誘導されるプロモーターを含む構築物を使用する時に化合物の不在下でより存在下で大きいレベルで、レポーター遺伝子の産物の産生は、化合物が、老化を誘導するときに検出される。好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって抑制される遺伝子、最も好ましくは表Ｉに同定される遺伝子から誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから誘導される。代替の好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって誘導される遺伝子、最も好ましくは表ＩＩに同定される遺伝子から誘導される。最も好ましくは、プロモーターは、アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから誘導される。ｐ２１によって誘導または抑制されるレポーター遺伝子または内因性遺伝子の産物は、遺伝子産物の活性について分析すること、または相補的核酸にハイブ���ッド形成することによって免疫学上の試薬を使用して検出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の特に好ましい実施形態は、特定の好ましい実施形態および請求項の以下のいっそう詳細な説明から明らかになる。
【００２９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、ｐ２１で誘導した細胞の老化を仲介することに関与した遺伝子を同定する試薬および方法、および哺乳類細胞における老化または静止を阻害または増強する能力のある化合物を提供する。
【００３０】
本発明の目的について、「細胞」または「複数の細胞」に言及されるのは、等価であることが意図され、そして特に、哺乳類細胞成長のインビトロ培養を包含し、そして当業界で知られるとおり維持される。
【００３１】
本発明の目的について、複数で「細胞の遺伝子」に言及されるのは、単独遺伝子、ならびに２つまたはそれ以上の遺伝子を包含することが意図される。細胞の遺伝子発現の調節効果、または細胞の遺伝子から誘導されるプロモーターの転写制御下でレポーター構築物は、第一の遺伝子で検出でき、そしてその後、その効果は、第二または任意の数の追加の遺伝子、またはレポーター遺伝子構築物を試験することによって複製されることも、当業者によって理解される。代わりに、２つまたはそれ以上の遺伝子またはレポーター遺伝子の発現は、本発明の範囲内で同時に分析されうる。
【００３２】
本発明の目的について、語句「静止」は、血清不足の条件下で培養された哺乳類細胞で起こるような細胞成長およびＤＮＡ複製の一時的中止を包含すると解釈される。
【００３３】
本発明の目的について、語句「老化」は、正常な細胞の増殖性寿命の終点で、または細胞毒性薬剤、ＤＮＡ損傷または他の細胞のインサルト（ｉｎｓｕｌｔ）に応答して正常あるいは腫瘍細胞で起こるような、成長因子によって逆行されないＤＮＡ複製および細胞成長の恒常的中止を包含すると解釈される。
【００３４】
老化は、多数の方法により哺乳類細胞で誘導されうる。第一に、インビボまたはインビトロのいずれかで、正常な細胞成長の自然の結果である。正常な細胞が、老化になる前に受ける可能性のある限定された数の細胞分裂、継代または世代がある。正確な数は、細胞の型および起源の種によって変化する（ＨａｙｆｌｉｃｋおよびＭｏｏｒｈｅａｄ、１９６１年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５巻：５８５−６２１頁）。任意の細胞型に老化を誘導する別の方法は、ほとんどの抗癌薬剤、放射線および細胞の分化剤のような細胞毒性薬剤を用いた処理である。Ｃｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９巻：３７６１−３７６７頁、１９９９年参照。老化も、その細胞に、腫瘍サプレッサー遺伝子（ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６またはＲｂのような）を形質導入させ、そしてそこに遺伝子を発現させることによって任意の哺乳類細胞に迅速に誘導されうる。Ｓｕｇｒｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４巻：９６４８−９６５３頁、１９９７年；Ｕｈｒｂｏｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５巻：５０５−５１４頁、１９９７年；Ｘｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５巻：２５８９−１５９６頁、１９９７年；Ｖｏｇｔら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９巻：１３９−１４６頁、１９９８年参照。
【００３５】
本発明の試薬としては、任意の哺乳類細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、さらに好ましくはマウス細胞、および最も好ましくはこのような遺伝子が、遺伝子操作によって導入される内在性遺伝子または外来性遺伝子のいずれかであることを特徴とするｐ２１遺伝子の発現を誘導しうるヒト細胞が挙げられる。実施例は、このような誘導性ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含する組換え哺乳類細胞を開示するが、これらの実施形態が、単に実験的設計選択および都合よさの問題であるだけであること、および本発明が、内因性ｐ２１の誘導を十分に包含することが分かる。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明は、誘導性哺乳類ｐ２１遺伝子をコードする組換え発現構築物を含有する哺乳類細胞を提供する。好ましい実施形態では、ｐ２１遺伝子は、ここに参照して組込まれた米国特許番号第５，４２４，４００号に規定されるとおりヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するヒトｐ２１である。代替の実施形態では、ｐ２１遺伝子は、ヒトｐ２１遺伝子のアミノ末端部分であり、好ましくは生来のヒトｐ２１タンパク質のアミノ酸残渣１から７８を包含し（米国特許番号第５，８０７，６９２号で開示されるとおりであり、参照して組込まれる）、そしてさらに好ましくは生来のヒトｐ２１タンパク質のアミノ酸２１−７１を含むＣＤＫ結合ドメインを包含する（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４巻：５５５−５６３頁、１９９５年）。好ましい宿主細胞としては、哺乳類細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、そしてさらに好ましくはマウスまたはヒト細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、さらに好ましくはヒト線維肉腫細胞、そして最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびそれの誘導体である。最も好ましい培養細胞株は、２０００年４月６日に、受託番号第 号の下に米国バージニア州マナサスのジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されたｐ２１−９として同定されるＨＴ１０８０線維肉腫細胞株誘導体である。
【００３７】
組換え発現構築物は、当業者によって理解されるとおり、適切な哺乳類細胞に導入されうる。上記構築物の好ましい実施形態は、伝達性ベクター、さらに好ましくはウイルス性ベクター、そして最も好ましくは当業界で知られるとおりのレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターで産生される。一般に、ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｂｕｔｌｅｒ編）、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス：ニューヨーク、１９９１年、５７−８４頁参照。
【００３８】
さらに好ましい実施形態では、本発明の組換え細胞は、その遺伝子が、誘導性プロモーターの転写制御下にあることを特徴とする誘導性ｐ２１遺伝子をコードする構築物を含む。さらに好ましい実施形態では、誘導性プロモーターは、その効果が、誘導剤によって調節されうるトランス作用因子に応答性がある。誘導剤は、温度、そして最も好ましくは誘導剤の存在または不在を含めた実験的に操作されうる任意の因子でありうる。好ましくは、誘導剤は、化学的化合物、最も好ましくはトランス作用因子に特異的である生理学的に中性の化合物である。ここに開示されるとおり誘導性プロモーターを含む構築物の使用で、組換え発現構築物から得られるｐ２１の発現は、誘導性プロモーターから転写を誘導する誘導剤に、組換え細胞を接触させることによるか、またはこのようなプロモーターから転写を阻害する剤を除去することによって仲介される。細胞培養の温度を増加させることによって活性化されうるヒートショックプロモーター、そしてさらに好ましくは、ｔｅｔプロモーターおよび哺乳類転写因子（米国特許番号第５，６５４，１６８号、第５，８５１，７９６号、および第５，９６８，７７３号）とのそれの融合、そしてラクトースオペロンの細菌性ｌａｃプロモーターおよびそれの同族体ｌａｃＩレプレッサータンパク質のようなプロモーター／因子対を含めた多様な誘導性プロモーターおよび同族体トランス作用因子は、先行技術で知られている。好ましい実施形態では、組換え細胞は、ｌａｃＩレプレッサータンパク質、および１つまたは複数のｌａｃ−応答性要素を含むプロモーターの制御下でヒトｐ２１をコードする組換え発現構築物を発現し、ｐ２１の発現は、細胞を、生理学的に中性の誘導剤イソプロピルチオ−β−ガラクトシドと接触させることによって誘導されうることを特徴とする。この好ましい実施形態では、ｌａｃＩレプレッサーは、３’ＳＳ（ストラタジーンから市販で入手可能である、カリフォルニア州ラホーラ）として同定される組換え発現構築物によってコードされる。
【００３９】
本発明は、レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子のプロモーターの転写制御下にあることを特徴とする組換え発現構築物も提供する。これらとしては、その発現がｐ２１によって誘導される遺伝子、およびその発現がｐ２１によって抑制される遺伝子が挙げられる。好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって抑制される遺伝子から由来し、そして表Ｉに同定される。最も好ましくは、プロモーターは、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから誘導される。別の好ましい実施形態では、プロモーターは、その発現がｐ２１によって誘導されるか、さもなければ増加される遺伝子から誘導され、そして表ＩＩＩで同定される。最も好ましくは、プロモーターは、アミロイドＡ、補体Ｃ３、結合性組織成長因子、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから誘導される。これらのレポーター遺伝子は、その後、ｐ２１誘導の効果の感受性および都合のよい指標として使用され、そして哺乳類細胞におけるｐ２１発現の効果を阻害または増強する化合物が、容易に同定されることを可能にする。これらの構築物についての宿主としては、ｐ２１遺伝子発現が誘導されうる任意の細胞が挙げられ、そして好ましくは、上に記述されるとおり誘導性ｐ２１遺伝子を含有する組換え発現構築物をも含む細胞が挙げられる。本発明のこの態様の実施に有用なレポーター遺伝子は、それに限定されないが、ホタル・ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明による細胞は、その発現がｐ２１によって調節される哺乳類細胞についてのプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードする第一の組換え発現構築物、およびｐ２１発現が、哺乳類細胞中でそれにより実験的に誘導性であることを特徴とする哺乳類細胞ｐ２１遺伝子をコードする第二の組換え発現構築物の両方を包含する。
【００４１】
代替の実施形態では、本発明は、プロモーターが、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｒａｄ５４、エキソヌクレアーゼＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼから得られることを特徴とする、その発現がｐ２１によって抑制される哺乳類細胞についてのプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物を含む哺乳類細胞を提供する。別の代替の実施形態では、本発明は、プロモーターが、遺伝子結合性組織成長因子、血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢから得られることを特徴とし、その発現がｐ２１によって誘導される哺乳類遺伝子についてのプロモーターの転写制御下での、レポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物を含む哺乳類細胞を提供する。
【００４２】
本発明は、培地が、ｐ２１を発現する細胞によって調整されることを特徴とする調整された細胞培養様培地、および上記調整培地を生成する方法を提供する。ここに使用される場合、語句「調整培地」は、有糸分裂または抗アポトーシス因子を含むｐ２１発現細胞の成長によって調整された細胞培養用培地を包含することが意図される。調整培地は、哺乳類細胞の培養用培地、最も好ましくは、血清添加物を含有しない合成培地中でｐ２１発現細胞を培養することによって好ましい実施形態で生成される。任意のｐ２１発現細胞は、上記調整培地の生成のために有用であり、そしてこのような細胞におけるｐ２１発現は、内因性ｐ２１を誘導することによる（ＤＮＡ損傷剤、放射線を用いた処理によるような）か、または本発明による誘導性ｐ２１発現構築物を含む細胞を使用し、そして生理学的に中性の誘導剤で細胞を培養することによって達成されうる。好ましい細胞としては、哺乳類細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、そしてされに好ましくはマウスまたはヒト細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、さらに好ましくはヒト線維肉腫細胞、そして最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびそれらの誘導体である。
【００４３】
本発明は、哺乳類細胞での有糸分裂または抗アポトーシス因子のｐ２１誘導発現を阻害する化合物を同定するスクリーニング法も提供する。好ましい実施形態では、ｐ２１発現は、有糸分裂または抗アポトーシス因子のｐ２１誘導発現の阻害剤として同定されるべき化合物の存在または不在下で哺乳類細胞培養物中において誘導される。化合物は、細胞中のｐ２１の発現を誘導し、そして化合物の存在下での有糸分裂または抗アポトーシス因子、あるいはそれらの複数の発現の範囲を、化合物の不在下での発現と比較することによって、阻害剤として同定され、そして阻害剤は、化合物の存在下で有糸分裂または抗アポトーシス因子、あるいはそれらの複数の発現の減少量を示す化合物として同定される。任意のｐ２１発現細胞は、上記調整培地の生成のために有用であり、そしてこのような細胞におけるｐ２１発現は、内因性ｐ２１を誘導することによる（ＤＮＡ損傷剤および他の細胞毒性化合物、および放射線を用いた処理によるような）か、または本発明による誘導性ｐ２１発現構築物を含有する細胞を使用し、そして生理学的に中性の誘導剤中で細胞を培養することによって達成されうる。好ましい細胞としては、哺乳類細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、そしてさらに好ましくはマウスまたはヒト細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、さらに好ましくはヒト線維肉腫細胞、および最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびそれの誘導体が挙げられる。哺乳類細胞のこの特に好ましい実施形態による例示の培養細胞株は、２０００年４月６日に、受託番号第 号の下に米国バージニア州マナサスのジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたｐ２１−９として同定されたＨＴ１０８０線維肉腫細胞株誘導体である。
【００４４】
代替の実施形態では、本発明は、細胞が、ｐ２１によって誘導される細胞遺伝子のプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含することを特徴とする、哺乳類細胞における有糸分裂または抗アポトーシス因子のｐ２１誘導発現を阻害する化合物を同定する方法を提供する。好ましい実施形態では、プロモーターは、ＣＴＧＦ、アクチビンＡ、エピセリン／グラヌリン、ガレクチン−３およびプロサポシンが挙げられる。好ましいレポーター遺伝子としては、それに限定されないが、ホタル・ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられ、その全ては、市販で入手できる。これらの実施形態では、ｐ２１発現は、その細胞で誘導され、そして化合物の存在下でのレポーター遺伝子の発現の範囲を、化合物の不在下での発現と比較する。阻害剤は、化合物の存在下でのレポーター遺伝子の発現の減少した量を供する化合物として同定される。任意のｐ２１発現細胞は、本発明のこの態様に有用であり、そしてこのような細胞におけるｐ２１発現は、内因性ｐ２１（例えば、ＤＮＡ損傷剤または他の細胞毒性化合物、または放射線での処理によって）を誘導することによって、または本発明による誘導性ｐ２１発現構築物を含有する細胞を使用し、そして生理学的に中性の誘導剤中で細胞を培養することによって達成されうる。好ましい細胞としては、哺乳類細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、およびさらに好ましくはマウスまたはヒト細胞が挙げられる。特に好ましい実施形態は、線維肉腫細胞、さらに好ましくは、ヒト繊維肉腫細胞および最も好ましくはヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびそれらの誘導体である。
【００４５】
本発明は、老化を阻害または促進する方法を提供し、それにより化合物の効果は、その化合物が、その発現がｐ２１によって調節される遺伝子の誘導または抑制を阻害または増強するかどうかを決定することによって分析される。本発明の方法の実施では、ｐ２１が誘導されうる培養哺乳類細胞が、例えば、放射線処理、または細胞毒性薬剤を用いた処理によって処理されてｐ２１を誘導するか、またはｐ２１をコードする伝達性ベクターで形質移入され。さらに好ましくは、ｐ２１が、ＩＰＴＧと細胞を接触させることによって誘導されうるｐ２１−９細胞が使用される。全般的に、細胞は、適切な培養用培地（例えば、ｐ２１−９細胞のための１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）で補足されたＤＭＥＭ）で育成される。ｐ２１遺伝子発現は、約５０μＭの濃度でＩＰＴＧを培養用培地に添加することによって、ｐ２１−９で誘導される。全般的に、ｐ２１は、哺乳類細胞の方法によって試験されるべき化合物の存在または不在下でこれらの細胞中に誘導される。その後、ｍＲＮＡは、ｐ２１が誘導される細胞から単離され、そしてｐ２１によって調節される遺伝子の発現が分析される。ｐ２１が化合物の存在下で誘導される発現を、化合物の不在下で誘導される発現と比較され、そして差異は、ここに規定される方法によって細胞の遺伝子発現に影響を及ぼす化合物を同定するために使用される。特定の実施形態では、細胞の遺伝子発現は、市販で入手可能であるような（例えば、ゲノム・システムズ，インク．（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ミズーリー州セントルイスから得られる）オリゴヌクレオチドまたは細胞のｃＤＮＡのマイクロアレイを使用して分析される。代替の実施形態では、ｐ２１によって誘導または抑制されることが知られている遺伝子が分析される。遺伝子発現は、細胞のｍＲＮＡまたはタンパク質を、１つまたは複数のいずれかのｐ２１調節遺伝子について分析することによって、分析されうる。最も好ましくは、これらのアッセイに使用される遺伝子は、表ＩおよびＩＩに同定される遺伝子である。
【００４６】
代替の実施形態では、このような化合物は、ｐ２１指向性実験的操作に独立して同定される。このようなアッセイで、細胞が処理されて、上に開示される方法のいずれかで老化を誘導し、それに限定されないが、細胞毒性薬剤、放射線または細胞の分化剤、または腫瘍抑制剤の導入が挙げられる。ｐ２１によって抑制または誘導される遺伝子の発現は、試験化合物の存在または不在下で分析される。最も好ましくは、これらのアッセイに使用される遺伝子は、遺伝子発現分析について上で検討されたｍＲＮＡおよびタンパク質アッセイの型を使用して、表ＩおよびＩＩで同定される遺伝子である。
【００４７】
代替の実施形態では、ｐ２１が誘導される細胞は、さらに、ｐ２１によって誘導または抑制される細胞遺伝子のプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードする組換え発現構築物を包含する。好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって抑制される遺伝子であり、そしてプロモーターは、表Ｉに同定される遺伝子から由来する。このような遺伝子についての公知プロモーターの例は、ＯＲＣ１、ＰＲＣ１、ＸＲＣＣ９、ＣＤＣ２、サイクリンＢ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＥＮＰ−Ｆ、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＭＣＡＫ、ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１、サイモポイエチンα、ＭＰＰ２、ＭＰＰ５、ＣＤＣ４７／ＭＣＭ７、ＣＤＣ２１／ＭＣＭ４、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼα、ＲＡＤ５４、ＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＰＬＫ１、ＤＨＦＲまたはシトロンキナーゼが挙げられる。好ましい実施形態では、細胞の遺伝子は、ｐ２１によって誘導される遺伝子であり、そして、プロモーターは、表ＩＩに同定される遺伝子から由来する。このような遺伝子についての公知プロモーターの例としては、結合性組織成長因子、血清アミロイドＡ、補体Ｃ３、インテグリンβ―３、アクチビンＡ、ナチュラルキラー細胞タンパク質４、プロサポシン、Ｍａｃ２結合タンパク質、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、グラヌリン／エピセリン、ｐ６６ｓｈｃ、リソソームのβ−ガラクトシダーゼ、またはカテプシンＢが挙げられる。好ましいレポーター遺伝子としては、ホタル・ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられ、その全ては、市販で入手可能である。
【００４８】
本発明は、ｐ２１で誘導された細胞の老化の効果を仲介する遺伝子を同定する方法も提供する。ｐ２１の誘導は、老化、末端分化および細胞の損傷に対する応答に関連した細胞成長停止の絶対に必要な部分であることがわかる。下の実施例で記述されるとおり、ｃＤＮＡアレイハイブリッド形成は、これらの効果が、遺伝子配列におけるｐ２１で誘導される変化によるかどうかを調査するために使用された。この分析は、ｐ２１が、有糸分裂の制御、ＤＮＡ複製、分離および修復に関与した複数の遺伝子を選択的に阻害することを示した。これらの実験でｐ２１によって誘導される多くのタンパク質は、老化および加齢に関連したか、または硬化症、アルツハイマー病、アミロイド症および関節炎を含めた加齢関連疾病に関与していることを示した。これらの知見は、ｐ２１誘導の累積効果が、癌および加齢関連疾病の病因に起因しうることを示唆する。さらに、多くのｐ２１活性化遺伝子は、細胞成長およびアポトーシスにおける強力なパラ分泌効果を示す分泌タンパク質をコードする。この観察と一致して、ｐ２１誘導細胞から得られる調整培地は、有糸分裂および抗アポトーシス活性を示した。
【００４９】
下の実施例で開示される分析は、細胞周期進行遺伝子の阻害が、単にｐ２１−誘導成長停止の結果でないことを示した。これらの遺伝子の内、いくつかの締め出しは、細胞成長停止と共に起こり、そしてｐ２１からの放出による全ての試験遺伝子の抑制は、細胞周期への細胞の再登場に先行した。ＯＲＣ１（ＤＮＡ複製の開始について必要とされる）、トポイソメラーゼＩＩ（Ｇ２でのＤＮＡ分離に重要である）、およびＰＬＫ１（有糸分裂の開始に関与した）のような即時応答遺伝子の特性は、それらの発現の阻害は、ｐ２１による成長停止の誘導における原因的役割を実際に果しうることを示唆した。これらの観察は、本発明の方法の一態様についての根拠を形成し、そしてそれは、哺乳類細胞での細胞周期進行に関与した遺伝子を同定する方法を提供する。
【００５０】
さらに、即時および早期応答遺伝子の両方についての生物学上の機能は、それらの閉じ込めが、ｐ２１で誘導された成長停止を維持する役割を果すことを示す。哺乳類細胞の試薬および方法の使用は、ｐ２１−誘導成長停止からの放出が、内性複製および有糸分裂の異常性を生じることを例示した。ＤＮＡ複製および有糸分裂は、全てのｐ２１−阻害遺伝子が、再発現されるまで、ＩＰＴＧからの放出の後に再び始まらず、そしてＤＮＡ複製は、有糸分裂の相当前に再び始まった。下の実施例で開示される結果は、長期化したｐ２１誘導が、複製または有糸分裂の「品質制御」に関与した多数のタンパク質を含めて、細胞周期進行に関与した多くのタンパク質の衰退に至ることを示す。細胞が、ｐ２１から放出された後に細胞周期に再登場した時間までに、このようなタンパク質の貯蔵を再生させるのに失敗している結果として、異常な複製および異常な有糸分裂が続いて起こった。例えば、倍数体細胞の産生は、長期化されたｐ２１誘導細胞成長停止から開放された後に観察される。細胞の倍数体化に至るプロセスである内性複製は、有糸分裂の確認点制御を廃止したことの結果であり得（Ｈｉｘｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８巻：６２２４−３７頁、１９９８年）、そしてそれは、ＭＡＤ２およびＢＵＢＲ１のようなｐ２１阻害確認点制御タンパク質の欠乏から生じうる。さらに、倍数体細胞は、細胞質分裂に関連したタンパク質Ｐｒｃ１、Ａｉｍ１およびシトロンキナーゼの欠乏によって誘発されうる細胞質分裂の不全により生じ得て、そしてそれは、ｐ２１によって阻害されることがわかった。
【００５１】
ｐ２１から放出された後に観察された、異なる有糸分裂の異常性は、ＭＡＤ２、ＢＵＢＲ１、ＰＬＫ１、ＡＩＫ１、ＣＥＮＰ−Ａ、ＣＨＬ１およびＭＣＡＫ（ＬｉおよびＢｅｎｅｚｒａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：１０４３６−１０４４０頁、１９９６年；Ｇｌｏｖｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．  １２巻：３７７７−３７８７頁、１９９８年；Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４６巻：９４１−９５４頁、１９９９年）のような、このようなｐ２１−阻害遺伝子の産物のような、適切な染色体整列および分離を制御するタンパク質の突然変異または阻害から生じることが先に見られた。ｐ２１−誘導有糸分裂の異常性におけるこのようなタンパク質の役割は、有糸分裂制御タンパク質の減退および再合成の時間経過の分析によって支持される。したがって、再開した有糸分裂の時間（放出の３６時間後）に、有糸分裂の開始について要求されるＣｄｃ２およびＰｌｋ１の貯蔵は、未処理細胞に匹敵するレベルまで再生される（図７Ｂに示されるとおり）。対照的に、その機能は、染色体が有糸分裂の紡錘体に適切に付着している限り、後期を防止するＭＡＤ２は、いっそう効率が低く再合成される（図７Ｂ）。さらに、ＩＰＴＧ処理の１日後に残るＭＡＤ２レベルは、３日またはそれ以上の後よりいっそう高く（図７Ｂ）、そしてそれは、ｐ２１誘導の１日後に放出される細胞中の異常な有糸分裂の頻度が低いことと一致する。
【００５２】
ｐ２１過剰発現は、ＤＮＡ修復を阻害することが報告されている（Ｐａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０巻：２２００８−２２０１６頁、１９９５年；Ｕｍａｒら、Ｃｅｌｌ  ８７巻：６５−７３頁、１９９６年）。我々の結果の点で、ｐ２１のこの効果は、ＸＲＣＣ９、ＲＡＤ５４、ＨＥＸ１／ＲＡＤ２、ＲＡＤ２１相同体およびＤＮＡリガーゼＩのようなＤＮＡ修復遺伝子の阻害に起因しうる。ＤＮＡ修復の阻害は、ｐ２１誘導成長停止から回復する細胞における突然変異の頻度を増加させるようでもあり、それにより、このような細胞の全体的な遺伝的不安定性に起因する。
【００５３】
正常な細胞におけるｐ２１誘導遺伝的動揺化は、強力な発癌効果をも示しうる。老化細胞の成長停止は、一過性ｐ２１誘導によって誘発される一方で、別のＣＤＫ阻害剤ｐ１６は、ｐ２１の衰退の後、成長停止を維持する原因であるようである（Ａｌｃｏｒｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：１３７４２−１３７４７頁、１９９６年）。ｐ１６（ｐ２１に対する強烈な対照で）は、本研究で使用されたＨＴ１０８０線維肉腫を含めてヒト腫瘍中で頻繁に突然変異される（ＨａｌｌおよびＰｅｔｅｒｓ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：６７−１０８頁、１９９６年）。ｐ１６突然変異の一次発癌効果が、発育不全の老化である場合、それにより突然変異ｐ１６を発現する細胞は、長期化したｐ２１有糸分裂に出会う。ここに開示される結果と一致して、これらの条件下の細胞周期への再登場は、核型の異常性の発生を生じると予想される。ｐ１６と異なり、ｐ２１は、このプロセスにおける腫瘍サプレッサーとしてより癌遺伝子としてより作用し、そして癌におけるｐ２１突然変異の希少性を説明できる。
【００５４】
したがって、本発明は、ｐ２１誘導細胞周期停止を阻害することによって、抗発癌性効果を示す化合物を同定する方法を提供する。これらの方法によって生成される化合物は、核型の異常性を示す細胞の発生を最小にできると予想され、そしてそれは、順次、このような細胞が、悪性疾病に発展する見込みを減じることが予想される。
【００５５】
本発明は、老化を誘導または促進する化合物を同定する方法を提供する。この態様では、本発明は、ｐ２１発現によって阻害される遺伝子の阻害を増加する化合物を提供する。細胞分裂および細胞周期進行制御遺伝子の阻害は、細胞がｐ２１誘導後の細胞周期の再登場することを防止し、そして不可逆の成長停止を生じることがここに示される。したがって、このような遺伝子のｐ２１誘導抑制を誘導または増強する化合物は、細胞老化および末端成長停止を促進する上で有効である。したがって、本発明は、細胞周期進行を制御する細胞の遺伝子、最も好ましくは表Ｉに同定される遺伝子を阻害する化合物を同定する方法を提供する。好ましい実施形態では、化合物は、哺乳類細胞、最も好ましくは腫瘍細胞、増殖性細胞または過剰増殖のため病理学または疾病を引起す任意の細胞型の老化を促進するために使用される。哺乳類細胞のこの態様の好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、化合物の存在または不在下で、哺乳類細胞中でｐ２１を誘導する；ｐ２１によって抑制される遺伝子の発現について細胞を分析する；そして遺伝子が、化合物の不在下でより化合物の存在下で大きな範囲に抑制される場合に、老化のポテンシエーターとして化合物を同定する段階を包含する。本発明の方法の他の態様では、哺乳類細胞中で老化を促進する化合物は、例えば、上に開示される方法のいずれかで細胞中の老化を誘導することによりｐ２１指向性の実験的操作から独立に同定される。老化が、ｐ２１不足細胞でさえ誘導されうること（Ｃｈａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：４８０８−４８１８頁、１９９９年、およびＰａｎｔｏｊａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：４９７４−４９８２頁、１９９９年）、および全てのトランスレチン酸を用いたＭＣＦ−７細胞の処理（Ｃｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９巻：３７６１−３７６７頁、１９９９年）のような、ある種の老化誘導処理が、ｐ２１の細胞のレベルにおける増加よりむしろ減少に関連すること（Ｚｈｕら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３４巻：２９３−２９９頁、１９９７年）は当業界で知られている。
【００５６】
本発明は、本発明の方法によって同定される化合物に細胞を接触させる段階を包含することを特徴とする、哺乳類細胞中の老化を増強する方法も提供する。好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、腫瘍細胞、増殖性細胞または過剰増殖により病理学または疾病を引起す任意の細胞型である。代替の実施形態では、方法は、放射線または抗癌、細胞毒性、または抗増殖性薬剤と細胞を接触させる追加の段階を包含する。
【００５７】
遺伝子発現におけるｐ２１誘導の観察される効果は、細胞老化および生物の加齢に関連した変化との膨大な相互関係を示す。これらの相互関係は、ｐ２１で阻害される遺伝子の分析から来る。したがって、老化線維芽細胞は、我々がｐ２１誘導によっても観察されたとおり、低いＲｂのレベルを表すことが報告された（Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９巻：２１０９−２１１７頁、１９９９年）。３つのｐ２１阻害遺伝子ＣＨＬ１、ＣＤＣ２１およびＲＡＤ５４は、ヘリカーゼファミリーの構成員をコードすることも興味がある。ヘリカーゼ基の別のタンパク質における欠乏は、ワーナー症候群、早発の加齢に関連した臨床的症状の原因、そして細胞のレベルで、培養物中の細胞の促進された老化として同定された（Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７巻：１００−１０３頁、１９９７年）。
【００５８】
しかし、老化表現型との最強の相互関係は、ｐ２１誘導遺伝子の同定から来て、そしてその多くは、複製的老化または生物加齢の間、それらの濃度を増加することが知られている。ＥＣＭタンパク質の過剰発現は、反復性老化の公知優良の証明であり、これらの群中の２つのｐ２１誘導遺伝子フィブロネクチン１およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１（ＰＡＩ−１）は、細胞の老化に頻繁に関連してきた（ＣｒｉｓｏｆａｌｏおよびＰｉｇｎｏｌｏ、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｍｏｌ．３１巻：１１１−１２３頁、１９９６年で再検討）。老化線維芽細胞で過剰発現されるとも報告された他のｐ２１誘導遺伝子としては、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）（Ｗｅｓｔら、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３１巻：１７５−１９３頁、１９９６年）、カテプシンＢ（ｄｉＰａｏｌｏら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１巻：５００−５０５頁、１９９２年）、インテグリンβ３（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４０巻：８８−９２頁、１９９７年）、およびＡＰＰ（Ａｄｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８巻：１６−２０頁、１９９１年）が挙げられる。数種のｐ２１誘導タンパク質の発現は、ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．４６巻：６２５−６３３頁、１９８７年）、カテプシンＢ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ  ２４巻：４３−５４９頁、１９９０年）、アクチビンＡ（Ｌｏｒｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １３９巻：４８７−４９２頁、１９９８年）、プロサポシン（Ｍａｔｈｕｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３４巻：１０６３−１０７１頁、１９９４年）、ＡＰＰ（Ｏｇｏｍｏｒｉら、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４３巻：Ｂ１５７−Ｂ１６２頁、１９８８年）、ＳＡＡ（ＲｏｓｅｎｔｈａｌおよびＦｒａｎｋｌｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５巻：７４６−７５３頁、１９７５年）およびｔ−ＴＧエース（Ｓｉｎｇｈａｌら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．４５巻：５６７−５７５頁、１９９７年）を含めた生物加齢に相互関係することが示された。
【００５９】
細胞老化の最も一般的に使用されるマーカーは、ＳＡ−β−ｇａｌ活性である（Ｄｉｍｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２巻：９３６３−９３６７頁、１９９５年）。この遺伝子は、ＩＰＴＧで処理されたｐ２１−９細胞で強力に上昇される（Ｃｈａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：４８０４−４８１８頁、１９９９年）。ＳＡ−β−ｇａｌは、活性が増加され、そしてリソソームのβ−ガラクトシダーゼの改変配置を示すことが示唆され（Ｄｉｍｒｉら、１９９５年、上記）、そして他の研究は、老化細胞中のリソソーム活性が上昇されたことを記述した（ＣｒｉｓｔｏｆａｌｏおよびＫａｂａｋｉｊａｎ、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖ．４巻：１９−２８頁、１９９５年）。５つのリソソームの酵素は、表ＩＩに表され、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルフェートスルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、カテプシンＢ、酸α―グルコシダーゼ、酸リパーゼＡおよびリソーマル（ｌｙｓｏｍａｌ）ペプスタチン−不感受性プロテアーゼが挙げられる。ｐ２１も、ミトコンドリアのタンパク質ＳＯＤ２、メタジンおよび２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼの遺伝子を上方調節し、そしてそれらは、老化細胞中で過剰発現される、異なるミトコンドリアの遺伝子の報告に相互に関係している（Ｄｏｇｇｅｔｔら、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖ．６５巻：２３９−２５５頁、１９９２年；Ｋｏｄａｍａら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１９巻：８２−８６頁、１９９５年；Ｋｕｍａｚａｋｉら、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖ．１０１巻：９１−９９頁、１９９８年）。
【００６０】
以下の実施例で開示されるとおり、ｐ２１−９細胞でのｐ２１誘導の効果と、正常な線維芽細胞での老化と関連した変化との間に多くの類似性がある。特に、老化細胞は、転移を促進しうる様々な成長因子およびＥＣＭタンパク質を過剰生成することが示された（Ｃａｍｐｉｓｉら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．３巻：１−５頁、１９９８年）。数種の成長因子および成長因子レセプターは、強力なｐ２１誘導の条件下で、ｐ５３−依存性手段での照射により誘導される遺伝子の中でも同定された（Ｋｏｍａｒｏｖａら、Ｏｎｇｏｇｅｎｅ  １７巻：１０８９−１０９６頁、１９９８年）。興味深いことに、これら遺伝子の内のほとんどは、それらのプロモーター中にｐ５３−結合部位を含まなかった。我々の結果は、ｐ５３による成長因子の誘導が、ｐ２１誘導を通して仲介される間接的効果でありうることを示唆する。
【００６１】
したがって、本発明は、細胞の老化に関係する遺伝子、特に、老化の間に、そして特にｐ２１発現により誘導される遺伝子を同定する方法を提供する。本発明は、このような遺伝子のｐ２１−仲介誘導を阻害しうる化合物を同定する方法も提供する。このような化合物は、遺伝子配列のｐ２１−仲介誘導におけるそれらの効果により細胞の老化を減少、抑制または逆行させる許容性を示すことが予想される。
【００６２】
印象的なことに、我々がｐ２１により誘導されると知見した多くの遺伝子の産物は、アルツハイマー病、アミロイド症、硬化症および関節炎を含めた加齢関連疾病に繋がった。したがって、ＡＰＰは、アルツハイマーのアミロイドプラークの主要成分であるβ−アミロイドペプチドを生み出す。補体Ｃ３（Ｖｅｅｈｕｉｓら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４２６巻：６０３−６１０頁、１９９５年）およびＡＭＰデアミナーゼ（Ｓｉｍｓら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １９巻：３８５−３９１頁、１９９８年）は、アルツハイマー病で役割を果すことも示唆された。ｐ２１によって最も迅速に誘導され、そして細胞分化、癌誘発、アポトーシスおよび加齢の多面発現性メディエーターとして記述されたｔ−ＴＧエース（Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．５４巻：Ｂ７８−Ｂ８３頁、１９９９年）が、アルツハイマー病およびアミロイド症の両方に関連したプラークの形成に関与している（ＤｕｄｅｋおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６５１巻：１２９−１３３頁、１９９４年）ことは特に興味深い。後者の疾病は、別のｐ２１誘導異性体産物ＳＡＡの沈殿作用により、そしてそれは、硬化症、変形性関節症、リューマチ様関節炎に係わり合いになってもいた（ＪｅｎｓｅｎおよびＷｈｉｔｅｈｅａｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４巻：４８９−５０３頁、１９９８年）。２つの他のｐ２１−上方調節された分泌タンパク質、結合性組織成長因子（ＣＴＧＦ）およびガレクチン３は、硬化症に関与する（Ｏｅｍａｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９５巻：８３１−８３９頁、１９９７年；Ｎａｃｈｔｉｇａｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２巻：１１９９−１２０８頁、１９９８年）。さらに、カテプシンＢ（Ｈｏｗｉｅら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５巻：３０７−３１４頁、１９８５年）、ＰＡＩ−１（Ｃｅｒｉｎｉｃら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６３巻：４４１−４５３頁、１９９８年）、フィブロネクチン（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ、Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２２巻：３０７−３１８頁、１９９３年）、ＧＡＬＮＳおよびＭａｃ−２結合タンパク質（Ｓｅｋｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４１巻：１３５６−１３６４頁、１９９８年）は、変形性関節症および／またはリューマチ様関節炎に関連した。さらに、ＰＡＩ−１発現が増加したことのような、ＥＣＭタンパク質での老化関連の変化は、皮膚および他の組織の構造における年齢特異的な破壊を生じることが提案された（Ｃａｍｐｉｓｉら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．３巻：１−５頁、１９９８年）。加齢細胞によるフィブロネクチン産生が増加したことも、ＥＣＭにおけるフィブロネクチンネットワークの密度を増加することが示唆され、そしてそれは、高齢の個人におけるゆっくりとした創傷治癒に寄与しうる（Ａｌｂｉｎｉら、Ｃｏｌｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．８巻：２３−３７頁、１９８８年）。
【００６３】
ここに開示される結果は、ｐ２１誘導が、癌または加齢関連疾病の発生の可能性を増加しうる方法で、細胞の遺伝子発現に影響を及ぼすことを示す。ｐ２１発現の高まりは、正常な反復性老化でのみならず、細胞損傷に応答しても起こる；両方の場合に、ｐ２１誘導の歓迎されない効果は、年齢依存性手段で促進することが予想される。遺伝子発現におけるｐ２１のこれらの効果に起因する特異的分子の相互関係および調節経路の説明は、癌および加齢関連疾病の防止に対する新たなアプローチ法を示唆しうる。
【００６４】
したがって、本発明は、加齢関連疾病に関連した遺伝子を同定する方法を提供する。本発明は、このような遺伝子のｐ２１仲介誘導を阻害しうる化合物を同定する方法をも提供する。このような化合物は、加齢関連疾病を防止、妨害または逆行する治療的許容性を示すことが予想される。
【００６５】
その発現がｐ２１によって調節される遺伝子を同定する方向に向けられた本発明の方法は、ｐ２１発現を実験的に誘導する能力を利用する。誘導性ｐ２１遺伝子を含む本発明により提供される場合の細胞は、ｐ２１発現による誘導、抑制および開放された遺伝子の発現状況に反映する細胞のｍＲＮＡを単離するために使用されうる。ｐ２１が、誘導されない投薬を受けたことのない細胞は、細胞のｍＲＮＡの比較、対照源を供する。複数の核酸、最も好ましくは、消去式ハイブリッド形成法を用いて分化ｃＤＮＡライブラリーを構築することによって誘導または抑制遺伝子のいずれかについて特異的である細胞のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーが得られうる。例えば、Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３巻：６０２５−６０３０頁、１９９６年参照。ｐ２１誘導の前後に単離されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、アレイ化または非アレイ化ｃＤＮＡライブラリーのいずれかを使用することによりハイブリッド形成分析のためのプローブとしても使用でき、そして分化的に発現された遺伝子は、このようなハイブリッド形成から同定されうる。一般に、Ｓａｍｂｒｏｃｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、１９９０年参照。代わりに、消去されたｃＤＮＡ集団の示差表示が行われて、ｐ２１発現によって上方調節または下方調節のいずれかをされる遺伝子の集団を生じうる。
【００６６】
追加の実施形態では、ｐ２１発現によって上方調節または下方調節される遺伝子は、当業界で十分に知られた分子クローニング技術を使用して単離されうる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記。上に記述されるとおり生成された示差ｃＤＮＡライブラリーは、適切なｃＤＮＡ集団についてのプローブを富化する消去式ハイブリッド形成法を使用して、ｐ２１により誘導または抑制される遺伝子に特異的なプローブを用いてスクリーニングしうる。代わりに、このようなプローブは、全長または全長に近いｃＤＮＡを含むコロニーの含有率を最大にし、ｐ２１で調節された遺伝子、特に本発明の方法を使用して同定された新規遺伝子のクローニングを促進するために構築された従来的に作成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用されうる。上記遺伝子も、本発明の範囲内に入ることが意図される。
【００６７】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態をさらに例示するが、特性で制限しないことが意図される。
【実施例１】
【００６８】
誘導性ｐ２１遺伝子を含む哺乳類細胞の産生
ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０の組換え誘導体ｐ２１−９を、Ｃｈａｎｇら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：４８０８−４８１８頁、１９９９年）により基本的に生成された。この培養細胞株は、イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により調節されるプロモーターの転写制御下でｐ２１コーディング配列を含有した。ｐ２１の発現は、十分な量のＩＰＴＧの存在下でこれらの細胞を培養し、それによりｐ２１発現の後遺症を、内因性ｐ２１遺伝子の誘導が、刺激する可能性あるあらゆる追加の効果の不在下で研究させうる。この培養細胞株は、２０００年４月６日に、受託番号第 号の下に米国バージニア州マナサスのジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）に寄託された。
【００６９】
簡便には、プラスミド３’ＳＳ（ストラタジーン）（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ  ３３巻：７０３−７０９頁、１９９６年に記述され、参照して組込まれる）によってコードされるネズミの環境親和性レトロウイルスレセプターおよび修飾された細菌性ｌａｃＩリプレッサーを発現するＨＴ１０８０のサブラインを、その構造が図１に示される組換えレトロウイルスＬＮｐ２１ＣＯ３を含むレトロウイルスの粒子で感染させた。このレトロウイルスベクターは、レトルウイルスの長い末端反復プロモーターの転写制御下で、細菌のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含有する。ｐ２１コード化配列は、ｎｅｏ遺伝子の転写方向と反対の方向で、そして修飾されたヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制御下でクローン化する。特にＣＭＶプロモーターは、細胞中で発現されるｌａｃＩリプレッサーに感受性のあるプロモーターから発現させる細菌のｌａｃオペレーター配列と比べて、３倍の反復を含む。ＬＮｐ２１ＣＯ３は、本来のベクターＬＮＸＣＯ３（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、上記で開示された）のＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩ部位に２１ｐコーディング配列を含む４９２ｂｐのＤＮＡの断片をクローニングすることによって構築された。
【００７０】
感染後、ＬＮＸＣＯ３ベクターで感染した細胞が、４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（メリーランド州ゲーザースバーグのＢＲＬ−ＧＩＢＣＯから得た）の存在下で細胞を培養することによって選択された。クローナルラインｐ２１−９は、クローナル細胞株が得られるまで終点希釈によってＬＮｐ２１ＣＯ３形質導入Ｇ４１８耐性細胞株から誘導された。
【実施例２】
【００７１】
細胞成長アッセイ
実施例１で記述されたとおり産生されたｐ２１−９細胞は、ｐ２１が細胞中で発現されたときに、細胞成長におけるどのような変化が起こったかを決定する細胞成長アッセイで使用された。
【００７２】
ｐ２１−９細胞でのＬＮｐ２１ＣＯ３ベクターから得られるｐ２１発現が、１０％牛胎児血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ユタ州ローガン）およびＩＰＴＧを含有するＤＭＥＭ培地中で細胞を培養することによって誘導された。これらのアッセイの結果は、図２Ａおよび２ｂで示された。図２Ａは、５０μＭ  ＩＰＴＧの存在下で培養された細胞中のｐ２１タンパク質産物の時間経過を示す。ｐ２１遺伝子発現は、成長培地中へのＩＰＴＧの導入の後、６および１２時間の間、増加し、そしてその発現は、約２４時間誘導後にピークに達した。ＩＰＴＧ含有培地から細胞を取出すことによって、ｐ２１発現は、それが生じたのとほとんど同じくらい迅速に上昇し、ＩＰＴＧが除去された後の約２４時間にレベル予め誘導に戻した（図２Ｂ）。
【００７３】
ＩＰＴＧの存在下で細胞成長は、３つの方法で分析された：３Ｈ−チミジン取込み（「標識指数」と称される）を測定すること；顕微鏡により培養物中の有糸分裂細胞の数（「有糸分裂指数」と称される）を観察すること、および様々な比率の細胞周期で、培養細胞の分布（「細胞周期分布」と称される）を測定すること。これらの結果は、図３Ａから３Ｃに示される。
【００７４】
３Ｈ−チミジン取込みアッセイは、Ｄｉｍｒｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２巻：９３６３−９３６７頁、１９９５年）によって記述されるとおり実質的に行われた。細胞は、３時間、３Ｈ−チミジンの存在下で培養され、そしてその後、オートラジオグラフィーによって分析された。オートラジオグラフィーによって測定されるときのＤＮＡ複製は、培養用培地にＩＰＴＧを添加した９時間後までに全体的に起こった（図３Ａ）。有糸分裂指数は、細胞を顕微鏡下で観察し、そして５μｇ／ｍＬの４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した後に有糸分裂中の細胞の数を計算することによって測定され、そして画像は、ライカＤＭＩＲＢ蛍光顕微鏡およびバイテク（Ｖａｙｔｅｋ）（アイオワ州フェアーフィールド）の画像システムを使用して収集された。顕微鏡で検出可能な有糸分裂細胞は、２つの段階で、ＩＰＴＧの存在下でこれらの培養物から消えた：第一は、ＩＰＴＧ添加の０−４時間の間（有糸分裂指数は、未処理細胞で約１５％から、ＩＰＴＧ−処理細胞で約５％まで下降した）に、そしてその後再びＩＰＴＧ添加の約１０−１４時間後の間（有糸分裂指数は、ＩＰＴＧ添加の約１３時間後にゼロに下降した）に起こる（図３Ｂ）。
【００７５】
細胞周期分布は、ベクトン・ディキンソンのＦＡＣＳｏｒｔを使用して、Ｊｏｒｄａｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６巻：８１６−８２５頁、１９９６年）により記述されるとおりヨウ化プロピジウムで染色した後、ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ分析を使用して測定された。細胞周期分布は、ＩＰＴＧ処理の２４時間後に安定化した（図３Ｃで示された）。この時までに、４２−４３％のＩＰＴＧ処理細胞は、それぞれ、Ｇ１およびＧ２で停止され、そして約１５％の細胞は、Ｓ期ＤＮＡ含量で停止された。
【００７６】
ｐ２１発現の効果は、ｐ２１の効果から細胞を開放し、細胞培養用培地からＩＰＴＧを除去することによっても調査された。ＩＰＴＧ−処理ｐ２１−９細胞は、形態学上の老化マーカーを示すことが知られている（Ｃｈａｎｇら、上記、１９９９年）。図２Ｂに示されるとおり、ｐ２１−９細胞におけるｐ２１遺伝子発現レベルは、ＩＰＴＧの除去後の２４時間以内に基本のレベルに返った。ここで、ＩＰＴＧ−処理ｐ２１−９細胞が、ＩＰＴＧの除去後にクローン性許容量の全ての損失を示すかどうかが決定された。これらの実験の結果は、図４Ａから４Ｄに示される。
【００７７】
ＩＰＴＧ処理からの回収についてのコロニーアッセイは、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で、そしてＩＰＴＧの存在または不在下で１０ｃｍ培養皿当たり約２、０００のｐ２１−９細胞を平板に載せることによって行われた。それらのコロニー許容量が測定され前に１０日間、細胞にコロニーを形成させた。ｐ２１−９細胞を、３つの濃度のＩＰＴＧ：０．５μＭ、５μＭおよび５０μＭで処理した。これらの処理は、ｐ２１遺伝子発現で、それぞれ、基本のｐ２１レベル（０．５μＭ）、半分−極大（５μＭ）または極大の増加（５０μＭ）よりなんら測定可能な増加を誘導しなかった。図４Ａで示されるとおり、０．５μＭ  ＩＰＴＧを用いたｐ２１−９細胞の処理は、コロニー形成を阻害しなかった。対照的に、５μＭまたは５０μＭのＩＰＴＧへの細胞の継続的露出は、ｐ２１−９細胞のコロニー誘発性を、それぞれ８０％および１００％まで減少させた。ＩＰＴＧが、１２または１４時間後に除去されるときに、５μＭ  ＩＰＴＧで処理した細胞は、実質的に低下していないコロニー形成を示した。しかし、５０μＭ  ＩＰＴＧ−処理細胞は、コロニー誘発性で５８−６３％の減少を示した。３−５日の処理後、５μＭ  ＩＰＴＧで培養される細胞は、５５−５８％の減少したコロニー誘発性を示し、そして５μＭ  ＩＰＴＧで処理した細胞は、９５−９９％の減少したコロニー誘発性を示した。これらの結果は、ｐ２１遺伝子発現が衰退した後に回復する細胞の能力が、誘導されたｐ２１のレベルに、そしてｐ２１誘導の期間に逆に関連したことを示す。この結果は、他の細胞培養システムで他方によって得られる結果と一致した（Ｆａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：２７８９−２７９７頁、１９９９年）。
【００７８】
コロニー誘発性の損失の原因は、以下のとおり調査された。ＤＮＡ複製の再開は、上に記述されるとおり、３Ｈ−チミジン取込みアッセイを用いてＩＰＴＧから開放された約２０時間後に最初に検出された。これらの結果は、図４Ｂに示される。これらの細胞における有糸分裂の再開は、上に記述されるとおり、有糸分裂指数から測定されるとおり、ＩＰＴＧ開放の約３０時間後に最初に検出された。これらの結果は、図４Ｃに示される。細胞周期のＳまたはＭ期に入る細胞の率は、５日間より１日間（図４Ｂおよび４Ｃでそれぞれについての曲線を比較する）、ＩＰＴＧで処理された細胞でより高かったが、しかし差異は、図４Ａで示されるとおりクローン性回復での対応の差異を占めるほど明らかに十分ではなかった。
【００７９】
クローン誘発アッセイから得られる培養平板の顕微鏡実験は、３またはそれ以上の日数５０μＭ  ＩＰＴＧで処理した平板は、コロニーに発達することに失敗した膨大な単細胞および小型細胞クラスターを含有することを示した。さらに、ＩＰＴＧからの開放は、ＩＰＴＧ開放後の最初の２日間は、浮遊する細胞の外観に繋がり、そして細胞が、１日後よりＩＰＴＧの３日後に放出されたときにより高かった（図４Ｄに示されるとおり）。これらの浮遊細胞のほとんどは、トリパンブルー染色およびコロニー誘発性における１００−１，０００倍減少によって示されるとおり、死滅した。
【００８０】
これらの細胞におけるｐ２１誘導の効果は、長期化したＩＰＴＧ処理からの放出の後、現れた成長妨害および死滅細胞のＤＮＡ計数を実験することによって、さらに研究された。成長妨害された細胞は、細胞膜に安定に組込み、そして娘細胞の間に均等に分割される親油性発蛍光団であるＰＫＨ２の滞留が増加されたことに基づいて、ＦＡＣＳを使用して単離された：これは、細胞分裂の各経路で細胞の蛍光における比例した減少に、そして非分裂または死滅細胞における減少に至る（ＨｏｒａｎおよびＳｌｅｚａｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４０巻：１６７−１６８頁、１９８９年）。これらのアッセイは、Ｃｈａｎｇら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９巻：３７６１−３７６７頁、１９９９年）に記述されるとおりに行われた。未処理ｐ２１−９細胞および５日間、５０μｍ  ＩＰＴＧで処理した細胞を、ＰＫＨ２で標識し、ＩＰＴＧ不含培地に載せ、そしてそれらのＰＫＨ２蛍光を、連続した日に分析した。図５Ａに示されるとおり、ＩＰＴＧ−処理細胞は、対照細胞より後に分裂を開始し、そして増殖細胞の発生ピーク、および高いＰＫＨ２蛍光を示す成長を妨害された細胞の肩を伴い、異種ＰＫＨ２プロファイルを発生した。成長妨害細胞は、老化細胞について特徴づけられる上昇した側面散乱を示した（Ｃｈａｎｇら、１９９９年、上記）。増殖（ＰＫＨ２ｌｏＳＳｌｏ）および成長妨害（ＰＫＨ２ｈｉＳＳｈｉ）細胞集団は、ＩＰＴＧからの放出の６日後ＦＡＣＳによって分離され、そしてそれらのＤＮＡ含量は、ＰＩ染色によって分析された。成長妨害フラクションは、高いＧ２／Ｍフラクションおよび４Ｃ  ＤＮＡ含有量より大きいことを示す多数の細胞を示す上で増殖細胞と異なった（図５Ｂに示される）。後者の細胞の倍数体特性は、染色体１８および２１について特異的なプローブを用いて、間期核の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）によって確認された；これらの実験は、Ｃｈａｎｇら（１９９９年、上記）で記述されるとおり行われた。高い倍数体およびＧ２／Ｍフラクションも、ＩＰＴＧからの開放の後に収集された浮遊する死滅細胞の中で観察された（図５Ｃで示された）；顕微鏡分析は、これらの死滅細胞の多くが、有糸分裂中であることを示した。
【００８１】
倍数体細胞の起源を調査するために、ＩＰＴＧからの開放の後に全体の細胞集団のＤＮＡ含量における変化の時間経過を測定した。倍数体細胞の数は、ＤＮＡ合成の再開と同時に（図４Ｂを比較）、放出の２４−２８時間後に非常に増加した（図５Ｄに示されるとおり）。この結果は、放出細胞の多くが、ＤＮＡ複製の不定期経路である内性重複を受けていることを示した。しかし、内性重複の時間経過および規模は、ＩＰＴＧの１日後（図５Ｄ）に、または３−５日後に放出された細胞の非常に類似した。
【００８２】
しかし、５日間阻害されたものと比較して、１日間、ＩＰＴＧによって阻害された細胞の間の主要な差異は、ＩＰＴＧから開放された１−２日後に生じる付着した有糸分裂細胞の形態学が、試験されたときに発生した。これらの結果は、図６に示された。未処理の細胞における圧倒的主要な有糸分裂図が、形態学的に正常に見えた（図６、左）一方で、ＩＰＴＧ処理の後に放出された細胞における有糸分裂図のほとんどは、多数の中心を持つ有糸分裂、不均一な染色体分布および前期停止を含めた膨大な異常性を示した（図６、右）。１日および５日ＩＰＴＧで処理された細胞における正常な有糸分裂の含有率は、それぞれ、４５％および２％であり、そしてそれは、クローン性回復についての対応する値に密接である（３８％および１％）。これらの結果は、異常な有糸分裂が、内性重複と一緒に、ｐ２１から放出された後のコロニー誘発性の損失に起因することを示唆する。
【００８３】
これらの結果は、ｐ２１の誘導した発現が、遺伝子が発現されるときの細胞における激しい効果でのみならず、細胞周期および成長への細胞の正常な回復になかなか消えず、そして干渉する効果も示すことを示した。
【実施例３】
【００８４】
ｐ２１遺伝子発現により調節された遺伝子発現の分析
実施例２で開示された結果は、ｐ２１誘導の形態学上のおよび細胞周期の結果は、細胞周期進行を制御する遺伝子の抑制の結果でありうることを示唆した。細胞の遺伝子発現におけるｐ２１誘導の効果は、以下のとおり実験された。
【００８５】
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析は、細胞周期調査点進行の制御に関与することが知られた遺伝子の発現を調査するために行われた。細胞周期制御およびＤＮＡ複製に関与した２７の遺伝子の予備ＲＴ−ＰＣＲ分析は、これらの遺伝子の内の８つが、ｐ２１−９細胞中のＩＰＴＧによって阻害されることを示した。総ＲＮＡは、様々な時点で、ＩＰＴＧ処理および開放の間に収集されたｐ２１−９細胞から抽出された。下方調節された遺伝子についての遺伝子発現における変化のＲＴ−ＰＣＲ分析は、基本的に、Ｎｏｏｎａｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７巻：７１６０−７１６４頁、１９９０年）によって記述されるとおり行われた。
【００８６】
いっそう総括的な分析が、未処理ｐ２１−９から、および３日間、５０μｍ  ＩＰＴＧで処理された細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離することによって行われた。ｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから製造され、そしてヒトＵｎｉＧＥＭ  Ｖ  ｃＤＮＡマイクロアレイを用いたディフィレンシャルハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用され（ミズーリー州セントルイスのゲノム・システムズ，インク．により行われるとおり）、そしてそれは、４，０００配列以上で実証された公知ヒト遺伝子および３，０００ＥＳＴを含む。２，５００以上の遺伝子およびＥＳＴは、未処理およびＩＰＴＧ処理ｐ２１−９細胞の両方から得られたプローブを用いた測定可能なハイブリッド形成シグナルを示した。平衡差次的発現２．５で下方調節されるか、または平衡差次的発現２．０で上方調節された遺伝子は、それぞれ、表ＩおよびＩＩに列記される。
【００８７】
これら遺伝子のうち６９の発現が、マイクロアレイに存在するｃＤＮＡクローンの挿入物から誘導されるプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリッド形成によって個別に試験された；これらのｃＤＮＡは、ゲノム・システムズ，インク．から得られた。さらに、ｐ２１タンパク質の酵素連結免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）測定が、記述された（Ｃｈａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８巻：４８０８−４８１８頁、１９９９年）とおり、ＷＡＦ１  ＥＬＩＳＡキット（ニューヨーク州ユニオンドールのオンコジーン・サイエンスから得られた）を用いて行われた。以下の一次抗体を、免疫ブロッティングのために使用した：Ｃｄｃ２（サンタ・クルーズ）、サイクリンＡ（ネオマーカー）、Ｐｌｋ  １（ザイムド（Ｚｙｍｅｄ））およびＲｂ（ファルミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ））に対するマウスのモノクローナル抗体；ＭＡＤ２（ＢａｄＣｏ）、ｐ１０７（サンタ・クルーズ）、ＣＴＧＦ（図１２；Ｌ．Ｌａｕ博士の寄贈）、Ｐｒｃ１（Ｗ．Ｊｉａｎｇ博士およびＴ．Ｈｕｎｔｅｒ博士の寄贈）およびトポイソメラーゼＩＩα（Ａｂ０２８４；Ｗ．Ｔ．Ｂｅｃｋ博士の寄贈）に対するウサギのポリクローナル抗体、およびＳＯＤ２（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））に対するヒツジのポリクローナル抗体。使用された西洋ワザビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合二次抗体は、ヤギ抗−マウスおよびヤギ抗−ウサギＩｇＧ（サンタ・クルーズ）およびウサギ抗−ヒツジＩｇＧ（ＫＰＬ）であった。全てのサンプルにおけるタンパク質濃度は、バイオラッドのタンパク質アッセイキットを用いた測定の後に等しくされた。免疫ブロッティングは、標準手段によって行われ、そしてシグナルは、ＬｕｍｉＧｌｏ（ＫＰＬ）を用いて化学発光によって検出された。
【００８８】
これらの結果は、図７Ａから７Ｃに示される。上に記述されるマイクロアレイアッセイによって推定された遺伝子発現における変化は、３８／３９下方調節および２７／３０上方調節された遺伝子について確認された。試験遺伝子のほとんどについてのノーザンハイブリッド形成またはＲＴ−ＰＣＲにおける観察されたシグナル差異（図７Ａから７Ｃ）は、ｃＤＮＡアレイから測定される平衡差異発現の値（表ＩおよびＩＩ）より高いように見え、それによりｃＤＮＡアレイハイブリッド形成は、遺伝子発現におけるｐ２１効果の規模を過少概算する傾向にあることが示唆された。６つの下方調節および４つの上方調節遺伝子の発現における変化は、免疫ブロッティング（図７Ｂ）またはザイモグラフィー（示されず）によりタンパク質レベルでも試験され、そして試験された全ての場合で確認された。
【００８９】
遺伝子発現におけるｐ２１−仲介変化が、ｐ２１−誘導細胞成長停止に続く近々の効果および長期の効果から構成されることが確認された。この目的のために、ＩＰＴＧの添加および除去の後のｐ２１−阻害（図７Ｂ）およびｐ２１−誘導遺伝子（図７Ｃ）の副集団のＲＮＡレベルにおける変化の時間経過が測定された。免疫ブロッティングは、Ｒｂリン酸化（電気泳動移動性により示されるとおり）における、そしてｃＤＮＡアレイによりｐ２１によって阻害されるＲｂおよび数種のタンパク質の細胞レベルにおける、ｐ２１−誘導された変化の時間経過を分析するために使用された；これらの結果は、図７Ｂに示される。Ｒｂは、ＩＰＴＧの添加の１．６時間後と同じくらい早くに、脱リン酸化を受けることが分かった。さらに、Ｒｂタンパク質レベルは、１２−２４時間の間鋭く減少した（図７Ｂで示された）が、しかし、明らかな変化は、ＲＢ  ｍＲＮＡレベルで検出されなかった（データは示されず）。同様の減少が、Ｒｂ−関連タンパク質ｐ１０７について観察された（図７Ａで示された）。
【００９０】
１．ｐ２１によって阻害された遺伝子発現
全ての試験されたｐ２１阻害遺伝子は、ｐ２１誘導および放出に迅速な応答を示した。これらの遺伝子の内５つ（トポイソメラーゼＩＩα、ＯＲＣ１、ＰＬＫ１、ＰＲＣ１およびＸＲＣＣ９）は、ＩＰＴＧの添加の４および８時間後の間にＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で明らかな阻害を示した（図７Ｂ）。このパターンは、細胞成長停止およびＲｂ脱リン酸化の速度論に匹敵する「即時応答」と称された。他のｐ２１−阻害遺伝子（ＣＤＣ２またはＤＨＦＲのような）は、ＩＰＴＧの添加のわずか１２時間後に検出可能なｍＲＮＡレベルにおける主要な減少を伴い、ＤＮＡ複製および有糸分裂の休止の後わすかに遅れる「早期応答」パターンを示した。しかし、全てのｐ２１−阻害遺伝子は、細胞がなお成長停止されているとき、およびＤＮＡ複製および有糸分裂の再開の前に、ＩＰＴＧの除去の２１−１６時間後にそれらの発現を再開した。この分析は、ｐ２１−阻害遺伝子の発現における変化が、ｐ２１誘導および放出の近々の効果であり、そして細胞成長停止および回復の結果ではないことを示した。
【００９１】
要約すれば、６９の遺伝子および３つのＥＳＴは、２．５−１２．６の平行分化発現と共に、ｐ２１−誘導細胞で下方調節されるときにｃＤＮＡマイクロアレイによって同定された（表１Ａ）；ＩＰＴＧ処理細胞で下方調節されるときに我々の早期アッセイにより同定される５つの別の遺伝子は、表１Ｂに列記される。ｃＤＮＡアレイによって同定された下方調節された遺伝子の目だって高いフラクション（６９の内４３）は、有糸分裂、ＤＮＡ複製、分離および修復、そしてクロマチン構築に関連し、それにより、遺伝子発現のｐ２１−仲介阻害の非常に選択的特性を示した。
【００９２】
ｐ２１−下方調節された遺伝子の最大の群は、有糸分裂のシグナル発生、実行および制御にかかわり合いになっていたことである。これらの遺伝子としては、有糸分裂開始複合体を形成するＣＤＣ２およびサイクリンＢ１、有糸分裂、有糸分裂観察点制御および細胞質分裂（Ｃｌｏｖｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１２巻：３７７７−３７８７頁、１９９８年）の発生における役割を果すポロ様キナーゼ（ＰＬＫ１）、および有糸分裂観察点制御の標的（Ｈｉｘｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８巻：６２２４−３７頁、１９９８年）であるＣＤＣ２−相互作用タンパク質ＣＫｓＨｓ１が挙げられる。この群にある他の遺伝子は、キセノプス・コンデンシンタンパク質ＸＣＡＰ−Ｈの相同体、娘染色分体凝集力に関与したＲａｄ２１修復タンパク質の相同体（Ｌｏｓａｄａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１２巻：１９８６−１９９７頁、１９９８年）、および有糸分裂組換え（ＭｃＫａｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３６巻：３０５−３１５頁、１９９６年）、紡錘体形成に関与した中心体結合キナーゼＡＩＫ１（Ｋｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻：１３７６６−１３７７１頁、１９９７年）、動原体タンパク質ＣＥＮＰ−ＡおよびＣＥＮＰ−Ｆ、ならびに紡錘体観察点制御で中心的役割を果すＭＡＤ２およびＢＵＢＲ１タンパク質（ＬｉおよびＢｅｎｅｚｒａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４巻：２４６−２４８頁、１９９６年；Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４６巻：９４１−９５４頁、１９９９年）、有糸分裂の動原体結合キネシン（ＭＣＡＫ）、間期中心体および有糸分裂の紡錘体に配置されるキネシン様タンパク質ＨＳＥＴ、ＣＨＬ１ヘリカーゼ（有糸分裂の間に適切な染色体分布における役割を果す酵母タンパク質の相同体；Ｇｅｒｒｉｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９巻：４３４７−４３５８頁、１９９０年）、および細胞質分裂に関与した３つのタンパク質、Ｐｒｃ１、Ａｉｍ１／Ａｉｋ２およびシトロンキナーゼ（Ｊｉａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２環：８７７−８８５頁、１９９８年；Ｔｅｒａｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７巻：６６７−６７６頁、１９９８年；Ｍａｄａｕｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４巻：４９１−４９４頁、１９８８年）をコードする。ｐ２１は、核のエンベロープ遺伝子ラミンＢ１およびラミンＢ２、核の構築に関与したラミン関連ポリペプチドα（サイモポイエチンα）、およびＭ期ホスホタンパク質ＭＰＰ２およびＭＰＰ５をコードする遺伝子も阻害する。上記タンパク質の多くでの欠乏は、我々がＩＰＴＧからの放出の後のｐ２１−９細胞で観察した同じ事象である、異常な染色体分離および倍数体化を生じることが知られている。
【００９３】
多くのｐ２１阻害遺伝子は、ＤＮＡ複製および分離、クロマチン構築およびＤＮＡ修復に関与する。これらの遺伝子のいくつかは、リボヌクレオチドレダクターゼサブユニットＭ１およびＭ２、チミジンキナーゼ、チミジン酸シンターゼ、ウリジンホスホリラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを含めたヌクレオチド生合成に関与した酵素をコードする。他のタンパク質は、ＤＮＡ複製に関与し、それにより複製認可因子Ｃｄｃ４７／Ｍｃｍ４、Ｃｄｃ４５相同体、起点認識複合体のＯｒｃ１タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼα、Ｂ−Ｍｙｂ、３７ｋＤサブユニットの複製因子Ｃ、およびＤＮＡリガーゼＩの成分を包含する。この群としては、複製ＤＮＡの分離に関与した遺伝子（トポイソメラーゼＩＩα）、後成的に決定される染色体の状態の遺伝形質（クロマチン構築因子−Ｉのｐ６０サブユニット）、および高移動性群タンパク質１および２のような他のクロマチン成分も挙げられる。数種のｐ２１阻害遺伝子は、ＤＮＡ後複製修復または細胞周期観察点制御（ｄｅＷｉｎｔｅｒら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０巻：２８１−２８３頁、１９９８年）に関与しうるＸＲＣＣ９、Ｒａｄ５４組換え修復タンパク質、エキソヌクレアーゼＨｅｘ１／Ｒａｄ２、および上記Ｒａｄ２１相同体およびＤＮＡリガーゼＩを含めたＤＮＡ修復に関連する。
【００９４】
ｃＤＮＡアレイ中のｐ２１阻害遺伝子の６０％以上は、有糸分裂、ＤＮＡ複製、分離および修復に関与する。このような生理学上の選択性は、大規模発現プロファイル研究で先例がない。この観察に対する推論は、その機能が今のところ知られていないｐ２１阻害遺伝子が、細胞周期進行で役割を果すようであることである。実際に、６つのｐ２１阻害遺伝子は、ＥＳＴまたは未知機能を示す遺伝子としてｃＤＮＡアレイに元来列記されていたが、しかし、データベース調査は、ＤＮＡ修復の細胞分裂にそれらの産物の３つを結合させた。１つの場合には、元来同定されたＥＳＴは、シトロンキナーゼのコーディング配列にゲノムクローン３’で地図作成することが分かった；その後、ｐ２１によるシトロンキナーゼ遺伝子の阻害は、そのコーディング配列に基づいてＲＴ−ＰＣＲによって例示された。追加のｐ２１阻害遺伝子のクローニングは、哺乳類細胞の分裂に役割を果す新規遺伝子を得るようである。
【００９５】
これらの結果も、治療上の介入のための標的であるｐ２１誘導老化の細胞プログラムの成分を発見するさらなる機会を示唆する。遺伝子発現のｐ２１介在阻害が、Ｅ２Ｆ阻害の結果であることが示唆された（ｄｅ  Ｔｏｌｅｄｏら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９巻：８８７−８９６頁、１９９８年）。この解釈と一致して、我々のｐ２１−阻害遺伝子（例えば、ＣＤＣ２、ＯＲＣ１、ＤＨＦＲ、サイクリンＡ１）の小集団は、それらのプロモーター中にＥ２Ｆ部位を含む。他方、Ｅ２Ｆ部位は、いくつかのｐ２１−阻害遺伝子（例えば、サイクリンＢ１）のプロモーターで見出される可能性があり、そしていくつかのＥ２Ｆ−依存性遺伝子（例えば、サイクリンＥ）は、ｐ２１誘導により影響を受けなかった（データは示されず）。したがって、Ｅ２Ｆに加えて、まだ同定されていない調節因子としていくつかは、遺伝子発現のｐ２１−仲介阻害に関与しうる。このような追加の因子は、新規製薬学上の標的を表し、上記標的の存在および同定は、哺乳類細胞によって提供される方法および試薬を使用した説明のために利用できる。
【００９６】
２．ｐ２１により誘導される遺伝子発現
ｐ２１発現により抑制される遺伝子に加えて、上に記述されるアッセイは、ｐ２１によって誘導される遺伝子を検出した。ｐ２１−誘導遺伝子の遺伝子発現のパターンは、表７Ｃに示される。ｐ２１−阻害遺伝子とは対照的に、ｐ２１−上方調節された遺伝子は、ＩＰＴＧの添加、すなわち、全ての細胞での成長停止の開始後の４８時間後にそれらの発現を増加した。１つの試験遺伝子、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧエース）が、ＩＰＴＧの添加の１２時間後に、検出可能な増加を示したが、しかしその発現は、ただ４８時間まで極大に達した（図７Ｃで示されるとおり）。さらに、全ての試験遺伝子（ｔ−ＴＧエース以外に）の上昇した発現は、ＩＰＴＧから開放された後少なくとも３日間、細胞周期の再開の十分に後に、続いた（示されず）。この「後期応答」速度論は、このような遺伝子のｐ２１誘導は、ｐ２１仲介成長停止に比べて遅延した効果であることを示した。
【００９７】
４８個の公知遺伝子および６個のＥＳＴまたは未知機能を示す遺伝子は、ｐ２１−誘導細胞で、２．０−７．８の平衡差次的発現と共に、ｐ２１−誘導細胞で上方調節されたときに同定された（表ＩＩ）。この群の同定可能な遺伝子の非常に高いフラクション（２０／４８）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（例えば、フィブロネクチン１、ラミニンα２、Ｍａｃ−２結合タンパク質）、他の分泌タンパク質（例えば、アクチビンＡ、結合組織成長因子、血清アミロイドＡ）、またはＥＣＭレセプター（インテグリンβ３のような）をコードする。これらの分泌タンパク質の内数種、ならびにｐ２１−誘導細胞内タンパク質の大きな群（表ＩＩ）は、ストレス応答性の様々な形態で誘導されるか、またはストレス関連シグナル形質導入で役割を果すことが知られている。注目すべきことに、ｐ２１によって誘導されることが分かった多くの遺伝子も、細胞の老化、生物の加齢、または様々な加齢関係疾病で上方調節される。
【００９８】
ｐ２１−阻害遺伝子と対照的に、ｐ２１によって誘導されることが分かった遺伝子で、細胞成長停止を誘発しうる任意の公知機能を示すものはない。さらに、このような遺伝子の誘導は、成長停止の開始のはるか後に遅れる後期応答である。興味深くは、数種のｐ２１−誘導遺伝子は、スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）（Ｊｏｎｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７巻：６９７０−６９８１頁、１９９７年）、ｔ−ＴＧエース（Ｍｉｒｚａら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２巻：Ｇ２８１−Ｇ２８８頁、１９９７年）、アルツハイマー病のβアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（Ｇｒｉｌｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１巻：１５００２−１５００７頁、１９９６年）および炎症タンパク質血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）（ＪｅｎｓｅｎおよびＷｈｉｔｅｈｅａｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３４巻：４８９−５０３頁、１９９８年）を含めたＮＦκＢにより積極的に調節される。ｐ２１は、転写コファクターｐ３００におけるその効果を通してＮＦκＢ依存性転写を活性化する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５巻：５２３−５２７頁、１９９７年）ので、ｐ３００または関連転写コファクターの活性化が、上方調節された遺伝子のいくつかにおけるｐ２１の効果に起因しうることが可能である。しかし、遺伝子発現のｐ２１−仲介誘導の遅延した速度論は、この誘導が、ｐ２１の即時効果のかなり下流で起こることを示唆する。
【００９９】
これらの結果、および表ＩＩで規定される遺伝子の特性は、これらの遺伝子の発現が、ｐ２１の成長停止機能に関与しないことを示す。しかし、豊富なｐ２１−活性化遺伝子の産物の中で我々が見出した分泌タンパク質が、重要な生理学上の結果を示す。下の実施例５に開示されるとおり、ｐ２１−誘導細胞から得られる調整培地は、ｐ２１−上方調節遺伝子の特性によって推定される２つの生物学上の効果を示す：細胞成長の刺激およびアポトーシスの抑制。ｐ２１−誘導細胞での上で検討された遺伝的不安定と一緒にして、この知見は、ｐ２１の「パラ分泌」効果が、近隣細胞における腫瘍促進効果を通して、癌誘発に寄与しうることを示唆する。これは、ｐ２１で仲介された遺伝子誘導の抑制が、抗癌誘発効果を達成する方法を提供しうるという、そしてｐ２１−仲介遺伝子誘導経路が、癌防止薬剤の新たな発生のための合理的薬剤設計の標的であるという可能性を生じる。
【０１００】
観察されたｐ２１誘導のパラ分泌、抗−アポトーシス効果は、プロサポシンおよびガレクチン−３、我々がｐ２１によって誘導されると知見した分泌タンパク質（表ＩＩ）の報告された活性と一致する。抗−アポトーシス活性は、ｐ２１−誘導された細胞内タンパク質ＳＯＤ２（Ｍａｎｎａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３巻：１３２４５−１３２５４頁、１９９８年）およびＲ−Ｒａｓ（Ｓｕｚｕｋｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３７巻：１１２−１１６頁、１９９８年）に関連した。逆説的に、ｐ２１−誘導ｔ−ＴＧエースおよびカテプシンＢ（Ｓｉｎｇｈａｌら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．４５巻：５６７−５７５頁、１９９７年）は、後アポトーシス機能にあるとされた。アポトーシスにおけるｐ２１の効果に関する文献に反対する報告がある。ある種のシステムでは、ｐ２１過剰発現は、アポトーシスを誘導した（Ｐｒａｂｈｕら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２巻：１２２１−１２２９頁、１９９６年；Ｔｓａｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３巻：４９８３−４９９０頁、１９９９年）が、しかし他の研究では、ｐ２１は、数種の型の処理によって誘導されるアポトーシスから細胞を保護した（Ｇｏｒｏｓｐｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４巻：９２９−９３５頁、１９９７年；Ｌｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６巻：７０５−７１２頁、１９９８年；ＢｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅおよびＨｕｎｔｉｎｇ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６巻：３４６１−３４６９頁、１９９８年）。ここに開示される結果は、抗−アポトーシスおよび後アポトーシスの遺伝子の両方が、アポトーシスにおけるｐ２１の効果における矛盾した報告を説明しうることを誘導する。
【実施例４】
【０１０１】
ＩＰＴＧ−処理および血清−不足ｐ２１−９細胞を比較することによるｐ２１誘導の特異斉の同定
細胞成長停止の結果であるようである細胞の遺伝子発現におけるｐ２１−誘導された変化の同一性は、以下の通り決定される。類似の実験は、ｐ２１の切断形態（アミノ酸１−９０を包含する）を使用することによって行われ、そして同一の結果が得られた。
【０１０２】
成長停止（静止）は、４日間、血清不含培地中で細胞を培養することによって生じた血清不足によって、ｐ２１−９細胞で誘導された。血清不足細胞で、ＩＰＴＧ処理ｐ２１−９細胞と異なり、細胞は、老化形態学を発生せず、そしてただ非常に弱いＳＡ−β−ｇａｌ発現を示した。血清不足細胞におけるｐ２１レベルは、ＩＰＴＧ処理細胞で見られる１５−２０倍増加に対峙するように、ほんの約２倍に増加された。図７Ｄは、血清不含培地で４日、または５０μＭ  ＩＰＴＧの存在下で３日後に成長が停止されたｐ２１−９細胞でのｐ２１−阻害およびｐ２１−誘導遺伝子の群の発現について、上に記述されるとおりに行われたＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。培養用培地が、５０μＭ  ＩＰＴＧを含有する場合に、ｐ２１−９細胞で完全に阻害された遺伝子は、血清不足細胞でも阻害されたが、しかしこれらの細胞のほとんどは、ＩＰＴＧ−処理細胞でより小さな範囲に阻害された。
【０１０３】
その発現がｐ２１に誘導される遺伝子は、３つの固有のパターンを示した。第一の群は、その発現が、老化を示す細胞でと同じくらい静止細胞で強力に誘導される遺伝子である。これらとしては、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、補体Ｃ３およびプロサポシンが挙げられ、それによりそれらの導入は、細胞成長停止の結果であったこと、またはこのような遺伝子が、わずかに上昇したｐ２１レベルに見事に感受性があったことを示す。第二の群は、静止細胞で上方調節されたが、老化を示す細胞でと同様に強力でない遺伝子である。これらの遺伝子としては、フィブロネクチン−１、Ｍａｃ２結合タンパク質およびアルツハイマー前駆体タンパク質血清アミロイドＡが挙げられる。第三の群は、静止細胞で検出可能には誘導されないが、老化を示す細胞で強力に誘導される遺伝子である。これらの遺伝子としては、ＣＴＧＦ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１、組織トランスグルタミナーゼまたはナチュラルキラー細胞マーカータンパク質ＮＫ４、インテグリン・ベータ３およびアクチビンＡが挙げられる。
【０１０４】
血清不足による静止の誘導に対するある種の遺伝子の応答と、ｐ２１のＩＰＴＧ−誘導過剰発現を通した細胞の老化との間の差異は、老化の診断用マーカーとしてこれらの遺伝子を同定した。さらに新規老化マーカーは、現在は、ｐ２１−発現と静止細胞の間でのそれらの発現を比較することによって同定できる。
【実施例５】
【０１０５】
有糸分裂因子を含む調整培地の生成および有糸分裂の活性アッセイ
数種のｐ２１−上方調節された分泌タンパク質は、ＣＴＧＦ（Ｂｒａｄｈａｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４巻：１２８５−１２９４頁、１９９１年）、アクチビンＡ（Ｓａｋｕｒａｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：１４１１８−１４１２２頁、１９９４年）、エピセリン／グラヌリン（Ｓｈｏｙａｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７巻：７９１２−７９１６頁、１９９０年）およびガレクチン−３（Ｉｎｏｈａｒａら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４５巻：２９４−３０２頁、１９９８年）を含めた成長因子として、そして小さな範囲のクルステリン（Ｋｏｃｈ−ＢｒａｎｄｔおよびＭｏｒｇａｎｓ、Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｓｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６巻：１３０−１４９頁、１９９６年）、プロスタサイクリン−刺激因子（ＰＳＦ；Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３巻：５９１−５９８頁、１９９４年）、血管の上皮成長因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ；Ｊｏｕｋｏｖら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１５巻：２９０−２９８頁、１９９６年）、ゲルソリン（Ｏｈｔｓｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６巻：４６５０−４６５６頁、１９９７年）およびメタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１；Ｈａｙａｋａｗａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９８巻：２９−３２頁、１９９２年）組織阻害剤に作用する。これらの結果は、ｐ２１誘導が、パラ分泌有糸分裂効果を引起しうることを示唆した。さらに、ガレクチン−３（Ａｋａｈａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７巻：５２７２−５２７６頁、１９９７年）およびプロサポシン（Ｈｉｒａｉｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４巻：４７７８−４７８１頁、１９９７年）は、抗−アポトーシス活性を示すことが示された。ＩＰＴＧ−処理ｐ２１−９細胞から得た調整培地を、それが、細胞成長およびアポトーシスにおける効果を示すかどうかを調べるために試験された。
【０１０６】
これらの実験で、調整培地は、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳの存在下で１５ｃｍ平板当たり１０６個のｐ２１−９細胞を載せることによって製造した。次の日に、ＩＰＴＧを、５０μＭの最終濃度に添加し、そしてこの培地を、３日後に、０．５％ＦＣＳおよび５０μＭ  ＩＰＴＧで補足したＤＭＥＭに交換した。２日後（ＩＰＴＧ処理の３−５日後）、この調整培地を、収集し、そして使用の１５日前まで４℃で保存した。未処理細胞成長に、ＩＰＴＧ−処理細胞と同じ密度までＩＰＴＧ不含ＤＭＥＭ／０．５％ＦＣＳを添加し、そしてその２日後に培地を収集することによって、対照培地を製造した。
【０１０７】
ゆっくりと成長するヒト線維肉腫細胞株ＨＳ１５．Ｔは、これらの調整培地での有糸分裂活性に向けるために使用された。有糸分裂活性アッセイについて、両方の型の調整培地、ならびに新鮮培地、および調整培地および新鮮培地の１：１混合物を、有糸分裂活性を試験するために使用した。これらの実験で、調整培地は、１％または２％ＦＣＳで補足された。簡便には、ＨＳ１５．Ｔ細胞を、ウエル当たり１５．０００細胞で１２−ウエル平板に載せた。２日後、これらの細胞を、様々な型の培地で培養した。細胞を、調整培地で、６０時間育成し、そして３．１３μＣｉ／ｍＬの濃度で３Ｈ−チミジンを添加し、そして２４時間インキュベートした。その後、細胞を収集し、そしてそれらの３Ｈ−チミジン組込みを、Ｍｏｓｃａら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２巻：４３７５−４３８３頁、１９９２年）によって記述されるとおり測定した。
【０１０８】
新鮮培地にＩＰＴＧを添加することは、このアッセイに効果を示さなかった（示されず）。図８Ａに示されるとおり、新鮮培地でと、未処理ｐ２１−９細胞から得られる調整培地での細胞成長の明らかな差異はなかった。対照的に、ＩＰＴＧ−処理細胞から得られた調整培地は、３倍まで３Ｈ−チミジン組込みを増加した（図８Ａ）。ＩＰＴＧ−処理細胞から得られる調整培地によるＨＳ１５．Ｔの成長刺激が、メチレンブルー染色によっても検出可能であった（データは示されず）。
【０１０９】
アポトーシスにおけるこの調整培地の効果も、測定された。これらの実験は、マウス胚線維芽ラインＣ８を使用し、Ｅ１Ａによって固定した。この細胞株は、血清不足（Ｌｏｗｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１巻：２０２６−２０３０頁、１９９４年）を含めた様々の刺激によって誘導されるアポトーシスを非常に受けやすい（Ｌｏｗｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６巻：８０７−８１０頁、１９９４年；Ｎｉｋｉｆｏｒｖら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３巻：１７０９−１７１９頁、１９９６年）。アポトーシスは、６ｃｍ平板当たり３×１０５個Ｃ８細胞を載せ、そして続く日に、その培地を、０．４％血清で補足した新鮮培地、または調整培地（新鮮な血清は添加されず）に交換することによって分析された。ＤＮＡ含量の分析およびＤＡＰＩ染色を、２４時間および４８時間後に行い、そして相対的細胞数を、低血清培地中で４８時間の後に、メチレンブルー染色（Ｐｅｒｒｙら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２７６巻：１８９−１９７頁、１９９２年）によって測定した。
【０１１０】
ＩＰＴＧ−処理または未処理細胞から得た低血清新鮮培地または調整培地の添加は、ＤＡＰＩ染色後に、細胞の大半で検出可能な細胞脱離およびアポトーシス形態学により明らかにされるとおり（示されず）、Ｃ８細胞でのアポトーシスを迅速に誘導した。しかし、ＩＰＴＧ−処理細胞から得た調整培地が、４８時間後に付着したままであった細胞のメチレンブルー染色によって測定されるとおり、未処理細胞から得られる新鮮培地および調整培地に比べて生存の細胞を強力に増加した（図８Ｂで示されるとおり）。ｐ２１−誘導細胞から得られる調整培地の効果は、細胞のＤＮＡ含量のＦＡＣＳ分析でよりいっそう明らかであり、そしてそれは、培地交換の２４時間および４８時間後に付着および浮遊Ｃ８細胞を合せて行った（図８Ｂ）。多くの他の培養細胞株と異なり、Ｃ８細胞のアポトーシスは、ＤＮＡの（ｓｕｂ−Ｇ１）量を減少しながら、ただ少数の細胞を生成し、そしてＧ２／Ｍ  ＤＮＡ含量で細胞の選択的消失によって特徴づけられる（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、１９９６年、上記）。ＩＰＴＧ−処理した細胞から得られる調整培地中の血清不足の細胞は、Ｇ２／Ｍフラクションを保持し、そして血清富化培地での対照細胞成長に類似する細胞周期プロファイルを示した（図８Ｂ）。それ自身によるＩＰＴＧの添加は、Ｃ８細胞でのアポトーシスにおける効果をなんら示さなかった。したがって、ＨＴ１０８０細胞におけるｐ２１誘導は、ｐ２１−未調節遺伝子の特性により推定されるとおり、有糸分裂および抗−アポトーシス因子の分泌を生じる。
【実施例６】
【０１１１】
ｐ２１−応答性プロモーターにより発現されるレポーター遺伝子を含む組換え発現構築物の産生
プロモーター−レポーター構築物を、以下のとおり、ヒトＰＬＫ１．ＮＫ４およびＳＡＡプロモーターから作成した。プロモーター特異的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を、テンプレートとしてＨＴ１０８０ｐ２１−９細胞を用いて、ゲノムＤＮＡを用いて行った。ＰＣＲを、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）および表ＩＩＩａに列記されるプライマー・セットを使用して行った。各プライマーセットについてのＰＣＲ条件は、表ＩＩＩｂに記述される。ＰＣＲ産物が得られ、そしてＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ（ＰＬＫ１およびＳＡＡについては）またはｐＣＲＩＩ／ＴＯＰＯ（ＮＫ４については）にクローニングした。これらの構築物は、配列決定によって認証され、そしてその後、正しい方向でプロモーターを含むＫｐｎ  Ｉ−Ｘｈｏ断片を、標準組換え遺伝子技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）を用いて、ルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ２基本（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）中のＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入した。
【０１１２】
各プロモーター構築物の２つの別々に単離されたプラスミドクローンを、一過性形質移入アッセイによって、ｐ２１−調節について試験した。各プロモーター−ルシフェラーゼ構築物を、１：１比でｐＣＭＶ−β−ｇａｌ（プロメガ）プラスミドと共に混合し、そしてＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（リポフェクタミン２０００）（ライフ・テクノロジーズ，インク、メリーランド州ゲーザースバーグ）によってＨＴ１０９０ｐ２１−９細胞に導入した。６から８時間後に、５０μＭ  ＩＰＴＧを伴うか、または伴わない培地を、形質移入細胞に添加し、そして細胞抽出物を、これらの細胞６０−７２時間後から作成し、そしてルシフェラーゼ活性について分析した（ルシフェラーゼ・アッセイ・システム、プロメガ）。β−ガラクトシダーゼアッセイを、形質移入効率についての補正対照として使用した。
【０１１３】
図９は、これらの実験の結果を示す。形質移入細胞中のｐ２１−誘導により、ｐ２１−阻害遺伝子ＰＬＫ１から作成されるプロモーター構築物から得られる発現が減少され（３から５倍）、そしてｐ２１−誘導遺伝子ＮＫ４およびＳＡＡから作成されたプロモーター構築物からの発現は、増加された（ＮＫ４については７から１０倍、そしてＳＡＡについては３０倍）。このような結果は、ｐ２１が、それらのプロモーターを調節することによって、これらの遺伝子の発現を上方調節または下方調節すること、およびこのような遺伝子のプロモーター構築物は、遺伝子発現のｐ２１−仲介調節について分析するために使用されうることを示す。
【表１】
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【０１１４】
前述の開示は、本発明のある種の特別の実施形態を包含すると、そして全ての修飾またはそれらの代替的等価物は、付随の請求項に規定されるとおり本発明の概念および範囲内にあると解釈されるべきである。
【表２】
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【０１１５】
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【表３】
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【０１１６】
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【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ヒトＨＴ１０８０線維肉腫培養細胞株異性体ｐ２１−９を産生するために使用されるＩＰＴＧ調節レトロウイルス性ベクターＬＮｐ２１ＣＯ３の模式図である。
【図２】図２Ａは、ｐ２１レベルが、ＥＬＩＳＡによって測定される、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加後のｐ２１誘導の時間経過のグラフである。図２Ｂは、ＩＰＴＧの除去後のｐ２１衰退の時間経過のグラフである。
【図３】図３Ａは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加後の３Ｈ−チミジン標識指数（オートラジオグラフィーによって測定されるとおり）における変化の時間経過のグラフである。図３Ｂは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加後の有糸分裂指数（ＤＡＰＩ染色後に顕微鏡によって測定されるとおり）における変化の時間経過のグラフである。図３Ｃは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加後の細胞周期分布（ヨウ化プロピジウムに続く蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって測定される）における変化の時間経過のグラフである；−●−：細胞周期のＧ１期にある細胞；−○−：細胞周期のＧ２／Ｍ期にある細胞；−▼−：細胞周期のＳ期にある細胞。
【図４】図４Ａは、ｐ２１−９細胞によるコロニー形成での様々な用量のＩＰＴＧを用いた処置の期間の効果を示すグラフである；−●−：０．５μＭ  ＩＰＴＧ；−○−：５μＭ  ＩＰＴＧ；−▼−：５０μＭ  ＩＰＴＧ。図４Ｂは、５０μＭ  ＩＰＴＧの除去後の３Ｈ−チミジン標識指数（オートラジオグラフィーによって測定されるとおり）における変化の時間経過のグラフである；−●−：１日；−○−：５日。図４Ｃは、５０μＭ  ＩＰＴＧの除去後の有糸分裂指数（顕微鏡によって測定されるとおり）における変化の時間経過のグラフである；−●−：１日；−○−：５日。図４Ｄは、１日または３日の処置に続く５０μＭ  ＩＰＴＧの除去後の浮遊細胞の含有率における変化の時間経過のグラフである；未処置；−●−：１日；−○−：−▼−：３日。
【図５】図５Ａは、ＦＡＣＳによって測定されるとおり、未処理細胞（左）、および５日間、５０μＭ  ＩＰＴＧで処理され、そしてＩＰＴＧ不含培地に放出された細胞（右）のＰＫＨ２蛍光プロファイルにおける変化を示す度数分布図である。図５Ｂは、５０μＭ  ＩＰＴＧを用いた５日間の処理、ＰＫＨ２標識、およびＩＰＴＧなしの６日の成長の後、ＦＡＣＳによって単離されたＰＫＨ２ｌｏＳＳｌｏ（細線）およびＰＫＨ２ｈｉＳＳｈｉ（太線）細胞集団のＤＮＡ含有量のＦＡＣＳプロファイルの図形表現である。図５Ｃは、５０μＭ  ＩＰＴＧを用いた３日間の処理（左）から、そして未処理の細胞（右）から放出された４８時間後、収集される浮遊細胞のＤＮＡ含有量のＦＡＣＳプロファイルの図形表現である。図５Ｄは、１日のＩＰＴＧ処理から放出された後、０時間、１２時間、２４時間、２８時間、３６時間および４８時間で付着した細胞のＤＮＡ含有量のＦＡＣＳプロファイルの図形表現である。
【図６】図６は、ＩＰＴＧから放出された１−２日後に観察された正常な（左）および異常な（右）の有糸分裂図の例を示す顕微鏡写真である（ＤＡＰ１染色；１，０００×倍率で撮影された）。
【図７Ａ−Ｃ】図７Ａは、注目される遺伝子の発現におけるＩＰＴＧで誘導された変化についての、ＲＴ−ＰＣＲ実験（左）、細胞のｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析（中央）および免疫ブロッティングアッセイのゲル電気泳動パターンの写真である；Ｃ：対照の未処理ｐ２１−９細胞；Ｉ：５０μＭ  ＩＰＴＧで３日間処理した細胞。β２−マイクログロブリン（β２−Ｍ）は、ＲＴ−ＰＣＲについての補正対照，およびノーザンハイブリッド形成についてのＳ１４リボソームのタンパク質遺伝子として使用された。図７Ｂは、ＩＰＴＧ添加および放出による、注目されるｐ２１で阻害された遺伝子の発現における変化の時間経過を示すＲＴ−ＰＣＲ実験（左）および免疫ブロッティング分析（右）のゲル電気泳動の写真である。図７Ｃは、ＩＰＴＧ添加による、注目されるｐ２１で誘導された遺伝子の発現における変化の時間経過のＲＴ−ＰＣＲ実験（左）、およびノーザンハイブリッド形成分析（右）のゲル電気泳動パターンの写真である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、未処理対照ｐ２１−９細胞（Ｃ）、血清不足静止細胞（Ｑ）およびＩＰＴＧ処理老化細胞（Ｉ）における遺伝子発現の比較である。
【図８】図８Ａは、ＨＳ１５．Ｔ細胞による３Ｈ−チミジン組込みにおける、新鮮な培地（Ｆ）、ＩＰＴＧ処理から得た調整培地（Ｉ）または未処理ｐ２１−９細胞（Ｕ）、および１％または２％血清で補足した調整ならびに新鮮培地の１：１混合物（Ｉ／ＦおよびＵ／Ｆ）の効果を示す度数分布図である。図８Ｂは、１０％血清（対照）で、低血清新鮮培地（Ｆ）で、またはＩＰＴＧ処理（Ｉ）から、または未処理（Ｕ）ｐ２１−９細胞で得られる調整培地での２４時間または４８時間インキュベーション後の付着および浮遊の合せたＣ８細胞のＤＮＡ含有量のＦＡＣＳプロファイルの図形表現である。同じ培地中の４８時間のインキュベーション後の付着細胞（メチレンブルー染色により測定されるとおり）の相対数は、各集合の度数分布図の下に列記される。
【図９】図９は、ルシフェラーゼの発現がｐ２１によって調節される遺伝子から得られるプロモーターの転写制御下にある構築物を含む、細胞中のルシフェラーゼ活性の度数分布図である。ｐ２１発現の不在（ＩＰＴＧなし、空の棒線として示される）および存在（５０μＭ  ＩＰＴＧの添加で、影付棒線で示される）下における発現は、ポロ様キナーゼ（ＰＬＫ１）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（ＮＫ４）、および血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）から得られるプロモーターを含む実施例６により製造される構築物について示される；各プロモーター構築物は、２つの独立の構築物クローンを使用して試験された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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