(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の治療および予防のためのワクチンとしての、２つの関係のない種のＩｇＥ分子のイプシロン重鎖のＦｃ部分由来の抗原性ペプチドの組成物および使用法。特に、１以上の抗原性ペプチドの免疫原性量を含む、ＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の治療および予防のための組成物を提供する。【解決手段】第１の種由来のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基；第２の関連性のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含む単離された抗原性ペプチドであり、ここで、第１の種由来のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインに保存され、第２の種由来のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインに保存されず、そして抗原性ペプチドは動物に投与するとき、アナフィラキシーを引き起こさない抗‐ＩｇＥ免疫反応を誘発する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＥ分子またはそのフラグメントのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ１以上の抗原性ペプチドおよび薬剤的に受容できるキャリアを含む、アナフィラキシーを引き起こさない抗‐ＩｇＥ免疫反応を誘発する医薬組成物。
【請求項２】
ＩｇＥ分子またはそのフラグメントのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ、１以上の抗原性融合蛋白質、異種キャリア蛋白質および薬剤的に受容できるキャリアを含むアナフィラキシーを引き起こさない抗‐ＩｇＥ免疫反応を誘発する医薬組成物。
【請求項３】
ＩｇＥ分子またはそのフラグメントのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ抗原性ペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチド配列を含む、アナフィラキシーを引き起こさない抗‐ＩｇＥ免疫反応を誘発する医薬組成物。
【請求項４】
ＩｇＥ分子またはそのフラグメントのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ抗原性融合蛋白質をコードする１以上のポリヌクレオチド配列および異種キャリア蛋白質を含む、アナフィラキシーを引き起こさない抗‐ＩｇＥ免疫反応を誘発する医薬組成物。
【請求項５】
ＩｇＥ分子またはそのフラグメントのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ１以上の抗原性ペプチドの免疫原的に有効な量を、ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の処置または予防が所望されるヒト以外の動物に投与することを含む、そのような疾患を処置または予防するための方法。
【請求項６】
ＩｇＥ分子またはそのフラグメントのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ１以上の抗原性融合蛋白質の免疫原的に有効な量および異種キャリア蛋白質を、ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の処置または予防が所望されるヒト以外の動物に投与することを含む、そのような疾患を処置または予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明はＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の治療および予防のためのＩｇＥ分子のイプシロン重鎖のＦｃ部分由来の抗原性ペプチドの組成物および使用法に関する。特に、本発明はＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の治療および予防のための２つの異なる種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来のアミノ酸配列を含む少なくとも１抗原性ペプチドを含む組成物に関する。本発明は異種キャリア蛋白質に結合した抗原性ペプチドを含み、そしてさらにアジュバントを含んでいてもよい組成物に関する。本発明の組成物はまた、血清および他の体液中の可溶性（遊離）ＩｇＥに結合する抗ＩｇＥ抗体を誘発し、肥満細胞および好塩基球上の高親和性受容体にＩｇＥが結合することを妨げ、そして受容体結合ＩｇＥに交差結合しない。本発明はさらに、ＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の治療および予防のために動物、好ましくは哺乳動物そして最も好ましくはヒトに本発明の組成物を投与する方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
免疫媒介アレルギー（過敏症）反応はアレルギー症状の発現を導くための基礎となる機序に従って４つの型（Ｉ−ＩＶ）に分類される。Ｉ型アレルギー反応は肥満細胞および好塩基球からのヒスタミンのような血管作用性物質のＩｇＥ媒介遊離により特徴付けられる。これらの物質の遊離およびその後のアレルギー症状の発現は、肥満細胞および好塩基球の表面上の受容体へのアレルゲン結合ＩｇＥの交差結合により開始される。
【０００３】
ＩｇＥ抗体はジスルフィド結合により“Ｙ”型構造中に一緒に含まれる２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖からなる複雑な分子である。各軽鎖は不変ドメイン（ＣＬ）に結合した可変（ＶＬ）ドメインからなり、各重鎖は１可変ドメイン（ＶＨ）および４不変ドメイン（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４であり、Cε４、Cε２、Cε３およびCε４としても知られる）からなる。ＩｇＥ抗体の２つのアームはＩｇＥ抗体がその特異的抗原（アレルゲン）に結合する部位を含み、各アームはＦａｂ（フラグメント‐抗体‐結合）フラグメントと呼ばれる。ＩｇＥ抗体の尾部は、適切な実験条件下で、抗体のＦａｂフラグメントから分離されると結晶を形成することができることからＦｃ（フラグメント‐結晶質）と呼ばれる。ＩｇＥ抗体のＦｃフラグメントはＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインからなり、ＩｇＥ抗体の生物学的に活性な構造（例えば、受容体結合部位）を含む。
【０００４】
ＩｇＥ抗体の産生には３種の細胞；抗原提示細胞(ＡＰＣ)、Ｔリンパ球（Ｔヘルパー細胞；Ｔｈ）および抗体産生細胞（Ｂリンパ球；Ｂ細胞）の相互作用と協力を必要とする。異物、アレルゲンが被験者の体内に（例えば、環境アレルゲンの吸入、ある食物の摂取、または皮膚経由により）初めて導入されると、アレルゲンはＡＰＣ（例えば、マクロファージ）に取り込まれて、消化されるか、またはより小さなフラグメント（エピトープ）に処理される。これらのフラグメントは主要組織適合複合体蛋白質として知られる特異的な分子と一緒にＡＰＣの表面に表示される。特異的Ｔリンパ球表面上の受容体は、ＡＰＣの表面に表示されたアレルゲン／ＭＨＣ複合体を認識し、結合する。この認識と結合がＴリンパ球を活性化し、続いてインターロイキン‐４（ＩＬ‐４）のようなサイトカインの発現および分泌が起こる。これらのサイトカインは問題のアレルゲンに特異的なＢ細胞（すなわち、表面上にアレルゲンに結合可能なイムノグロブリン受容体を発現するＢ細胞）の増殖、クローン拡大、および分化を誘導し、最終的にこれらのＢ細胞にＩｇＥ抗体を産生させる。活性化されたＴリンパ球およびＩｇＥ産生Ｂ細胞の一部は結局、その後のアレルゲン暴露時に、より速くアレルゲンを認識することができるＴおよびＢ記憶細胞と呼ばれる細胞のプールに送られる。
【０００５】
Ｉ型アレルギー反応を起こすヒトでは、２度目にアレルゲンに曝されるとＩｇＥ産生に必要な３細胞の相互作用でのＢおよびＴ記憶細胞の関与の結果、アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体が高濃度で産生される。産生された高濃度のＩｇＥ抗体は、アレルゲン結合ＩｇＥと肥満細胞および好塩基球上のＩｇＥ受容体との交差結合を増加させ、続いてこれらの細胞を活性化させてＩ型アレルギー疾患の臨床的徴候に関与する薬理学的メディエーターを遊離させる。
【０００６】
ＩｇＥに異なる親和性を持つ２種の受容体が同定され、性状が決定されている。高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）は肥満細胞および好塩基球の表面に発現される。低親和性受容体（ＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３）はＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球およびランゲルハンス細胞を含む多くの細胞型上に発現される。高親和性ＩｇＥ受容体は３サブユニット（アルファ、ベータおよびガンマ鎖）からなる。いくつかの研究は、アルファ鎖のみがＩｇＥの結合に関与し、ベータおよびガンマ鎖（それらは経膜または細胞質蛋白質のいずれかである）は細胞情報伝達に必要であることを示唆する。肥満細胞および好塩基球上のＦｃεＲＩへの結合に必要なＩｇＥ構造の同定は、ＩｇＥ媒介アレルギーの治療および予防の対策をたてる上で最も重要である。例えば、ＩｇＥ‐受容体結合部位の解明が、ｉｎ  ｖｉｖｏで受容体産生細胞へのＩｇＥの結合を阻害するペプチドまたは小分子の同定につながる。
【０００７】
過去１５年間にわたり、各種の方法がＩｇＥ上のＦｃεＲＩ結合部位を決定するために使用されてきた。これらの方法は５つの異なるカテゴリーに分類することができる。１つ目の方法では、ＩｇＥ分子のＦｃ部分の一部に対応する小ペプチドを産生し、受容体からＩｇＥを阻害する能力を分析した。例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ヨーロッパ特許０２６３６５５、１９８８年４月１３日発行、Ｂｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：４３７−４４０；Ｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：１８０−１８３；Ｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＰＮＡＳ  ８６：９４６５−９４６９；Ｖｅｒｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：６４９−６５１；Ｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２：２０３−２０８；Ｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１９：２２５−２２８；およびＮｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１４：２２９−２３１を参照されたい。これらの研究に記載されたペプチドの多くが、ＩｇＥの受容体への結合を阻害することが示されたが、種々の研究がＩｇＥ結合に関与するものとして、種々の配列を報告した。
【０００８】
Ｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：１８０−１８３）はＩｇＥのＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間の接合部にわたる７５アミノ酸ペプチドを同定し、このペプチドが天然のＩｇＥ分子の親和性に近い親和性でＩｇＥ受容体に結合することを示した。一方、Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６８：１３１１８−１３１２７）はＩｇＥ分子由来の各種フラグメントを明示し、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインを共に含むフラグメントのみがＩｇＥに結合可能で、ＣＨ２ドメインは必ずしも結合に必要でないことを発見した。Ｖａｎｇｅｌｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０３：１５７１−１５７８）はＩｇＥのＣＨ３ドメインのみを明示し、このドメインのみがＩｇＥ受容体に結合し、ＩｇＥの受容体への結合を阻害することができることを示した。Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，およびＶａｎｇｅｌｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，の結果は先に引用したＨｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，の結果と矛盾する。
【０００９】
ＩｇＥ上のＦｃεＲＩ結合部位を同定する２つ目の方法において、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインの一部に対応するペプチドに対するポリクローナル抗体を産生し、ＩｇＥ上の受容体結合部位を証明するために使用した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：１０３−１１８）。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，はＣＨ４ドメイン由来のペプチドにより定義されたアミノ酸残基は受容体結合に関与しないが、ＩｇＥのＣＨ３ドメイン由来のペプチドにより定義されたアミノ酸残基（アミノ酸３８７−４０１）がもっともＩｇＥ受容体‐結合部位に近いらしいと結論した。しかし、ＣＨ３ペプチドに反応して誘導された抗‐ＣＨ３ペプチド抗体はＩｇＥ負荷肥満細胞からヒスタミンを遊離し、ＣＨ３ペプチドにより定義されたアミノ酸は真のＩｇＥ受容体‐結合部位を定義しないこと、および抗‐ＣＨ３ペプチド抗体がアナフィラキシーを引き起こすことを示した。
【００１０】
ＩｇＥ上のＦｃεＲＩ結合部位を同定する３つ目の方法において、何人かの研究者はＩｇＥ変異体を作成し、受容体結合に関与するアミノ酸残基の同定を試みた（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９：１０１５−１０２３；Ｗｅｅｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４５：３８４９−３８５４；およびＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：２６３６８−２６３７３を参照されたい）。Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，はＣＨ４ドメインのアミノ酸残基４４２のヒスチジンのかわりに点突然変異プロリンを持つＩｇＥ抗体はＩｇＥ抗体への１／２に低下した親和性を持つことを示した。Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，はＩｇＥ抗体のＣＨ４ドメインがＩｇＥの受容体への結合に関与すると結論した。しかし、Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｍの結論はＩｇＥ高親和性受容体へのＩｇＥの結合はＩｇＥ抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインが関与し、ＣＨ４ドメインは関与しないというＷｅｅｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，の結論と矛盾する。さらに、Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，の結論は、ＦｃεＲＩへの結合に重要なＩｇＥ抗体のアミノ酸残基はＣＨ３ドメインにあるというＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，の結論と矛盾する。
【００１１】
ＩｇＥ上のＦｃεＲＩ結合部位を同定する４つ目の方法において、キメラＩｇＥ分子を構築し、ＦｃεＲＩに結合する能力を分析した。先のＷｅｅｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，は一連のキメラマウスＩｇＥ‐ヒトＩｇＧ分子を構築し、ＩｇＥ受容体へのそれらの結合を試験した。先のＷｅｅｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，は、ＣＨ４ドメインは受容体結合に関与せず、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは共に肥満細胞上の高親和性受容体への結合に必要であると結論した。別の研究において、Ｎｉｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１３６５−１３７４）は一連のヒトＩｇＥ‐マウスＩｇＥキメラがＦｃεＲＩに結合する能力を分析し、ＣＨ３ドメインのみがＦｃεＲＩへの結合に必要であると結論した。Ｎｉｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，の結論はＩｇＥのＣＨ３ドメインのみがＦｃεＲＩに結合するというＶａｎｇｅｌｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，の結論を確証した。しかし、Ｎｉｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，およびＶａｎｇｅｌｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，の結論はＷｅｅｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，の結論と矛盾する。
【００１２】
先のＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，はＣγＨ２をヒトＩｇＥ由来のＣＨ３と置換したキメラヒトＩｇＧを作成した。受容体結合の試験では、このキメラは天然のＩｇＥと比べて１／４に低下した親和性でＦｃεＲＩに結合した。Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，の結果はＮｉｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，の結果を確証するように見えるが、先に引用したＷｅｅｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，およびＢａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，の結果と矛盾する。ＩｇＥの受容体への結合に関与する的確なアミノ酸残基を定義するための別の試みにおいて、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，はＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ部およびヒトＩｇＥのＣＨ３ドメイン由来の３ループに対応する特異的なアミノ酸残基をヒトＩｇＧ内のそれらに類似した位置に挿入し、これらの変異体をＩｇＧＥＬと呼んだ。あいにく、これらのＩｇＧＥＬ変異体の受容体への結合を調べたとき、全長ＩｇＥ  ＣＨ３ドメインが全長ＣγＨ２ドメインにとってかわった天然のＩｇＥまたはＩｇＧに比べて、それらは極小の結合を示した。ＩｇＥ上のＦｃεＲＩ結合部位を同定する５つ目の方法において、モノクローナル抗体を作製し、ＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合を阻害するそれらの能力を分析した。例えば、Ｄｅｌ  Ｐｒａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：８３９−８４４；Ｋｅｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：１１４９−１１５４；Ｈｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：６３１−６３９；Ｔａｋｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８：６３−７１；およびＢａｎｉｙａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２５：７０５−７１１を参照されたい。多くのモノクローナル抗体が作製されてきたが、それらは真のＩｇＥ受容体‐結合部位に関する情報をほとんど提供しなかった。なぜなら、多くの場合、これらのモノクローナル抗体によって認識されるアミノ酸配列は同定されなかったか、または同定できなかったからである。さらに、作製されたモノクローナル抗体は、直接受容体結合に関与するＩｇＥ残基の結合およびマスキングよりむしろ、立体障害またはＩｇＥ分子の著しいコンフォメーション変化の誘導によりＩｇＥがその受容体に結合することを阻害するのかもしれない。
【００１３】
ＩｇＥ上の受容体結合部位を同定するために考えられた方法が矛盾する結果を生じてきたことは、先の説明から明らかである。受容体結合に関与するＩｇＥのアミノ酸残基の同定が困難なことは、受容体結合に使用されるＩｇＥ上の部位が合成ペプチドが模倣可能な直線配列のアミノ酸でなくてもよいという可能性によりさらに複雑化された。それどころか、結合部位は天然のＩｇＥの３次元構造においてのみ近接し、ＩｇＥ蛋白質配列ではかなり離れている多数のアミノ酸により形成されるコンフォメーション決定因子であるかもしれない。ＩｇＥ変異体、ＩｇＥキメラ、およびモノクローナル抗‐ＩｇＥ抗体に関する研究は、結合部位がコンフォメーション決定因子であることを強く示唆する。
【００１４】
現在、ＩｇＥ媒介アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球から遊離される血管作用物質の作用を阻害することによりアレルギー反応に関連する症状を緩和するために抗ヒスタミン薬およびコルチコステロイドのような薬物で処置される。高用量の抗ヒスタミン薬およびコルチコステロイドは腎および胃腸毒性のような有害作用を及ぼす。従って、Ｉ型アレルギー反応を処置するための他の方法が必要である。
【００１５】
Ｉ型アレルギー性疾患の治療の一つの方法は、血清中の可溶性（遊離）ＩｇＥと反応して、肥満細胞および好塩基球上の受容体にＩｇＥが結合するのを阻害し、そして受容体結合ＩｇＥに結合しないモノクローナル抗体の産生であった（すなわち、それらは非‐アナフィラキシー誘発性である）。２種のそのようなモノクローナル抗体（ｒｈｕＭａｂ  Ｅ２５およびＣＧＰ５６９０１）はＩｇＥ‐媒介アレルギー反応治療のための臨床開発の進行した段階にある（例えば、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｗ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１５７−６２を参照されたい）。これらのモノクローナル抗体により認識されたＩｇＥ分子のアミノ酸残基の同一性はまだ未知であり、これらのモノクローナル抗体はＩｇＥ上のコンフォメーション決定因子を認識していると考えられている。
【００１６】
治療用の抗‐ＩｇＥモノクローナル抗体による臨床試験の初期の結果は、これらの療法がアトピー性アレルギーに効果的であるが、アレルギーの長期治療にモノクローナル抗体を使用するといくつか重大な欠点があるということを示唆する。第１に、これらのモノクローナル抗体は初めにマウスで産生されたため、マウスの配列を相当するヒトＩｇＧ配列と置き換えるために再設計しなければなかった（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：２６２３−２６３２）。この“ヒト化”処理は９５％のヒト配列をもつモノクローナル抗体を産生したが、部分的にマウス配列が残っている。これらの抗‐ＩｇＥ抗体療法は長期間にわたる抗体の頻繁な投与を必要とするため、何人かのアレルギー患者はこれらの治療用抗体内にまだ残っているマウス配列に対する抗体反応を起こした。治療用抗‐ＩｇＥに対する抗体の誘導は、少なくとも何人かの患者におけるこれらの抗‐ＩｇＥ抗体の治療的影響を無効にする。第２に、これらのモノクローナル抗体は治療効果を誘発するために高用量が必要であるため、これらの抗体による治療の経費が非常に高い。さらに、これらの抗体の投与頻度および投与経路は不便である。ＩｇＥ媒介疾患の治療のためのより魅力的な方法は抗‐ＩｇＥ抗体の産生を誘発するペプチドの投与である。
【００１７】
ＩｇＥ‐媒介アレルギー反応の最も有望な治療の一つは、内因性ＩｇＥ上の適切な非アナフィラキシー誘発性エピトープに対する能動免疫である。Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（米国特許第５，６０１，８２１号）はアレルギーワクチンとしての異種キャリア蛋白質に結合したヒトＩｇＥのＣＨ４ドメイン由来のペプチドの使用を含む方法を記載した。しかし、このペプチドは天然の可溶性ＩｇＥと反応する抗体の産生を誘発しないことが示された。さらに、Ｈｅｌｌｍａｎ（米国特許第５，６５３，９８０号）は異種キャリア蛋白質への全長ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（約２２０アミノ酸長）の融合に基づいた抗‐ＩｇＥワクチン組成物を提案した。しかし、ＩｇＥ分子のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一部に対する抗体は肥満細胞および好塩基球表面上のＩｇＥ受容体と交差結合し、アナフィラキシーのメディエーターの産生を起こすことが示されているため、Ｈｅｌｌｍａｎが提案した抗‐ＩｇＥワクチン組成物により誘発される抗体はアナフィラキシーを起こす可能性が高い（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０２：１２１−１２６を産生されたい）。従って、アナフィラキシー性抗体を誘発しないＩｇＥ‐媒介アレルギー反応治療用のワクチンの必要性は依然としてある。
【００１８】
アナフィラキシー誘発についての高い関心が、動物に投与したとき抗‐ＩｇＥポリクローナル抗体の産生を誘発できるミモトープからなるＩ型アレルギー性疾患の治療のための別の方法を開発させた（例えば、Ｒｕｄｏｌｆ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０：３３１５−３３２１を参照されたい）。Ｋｒｉｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，（国際公開公報ＷＯ／９７／３１９４８）は、ＩｇＥ受容体結合のコンフォメーションを模倣できるペプチドミモトープを同定するために、モノクローナル抗体ＢＳＷ１７によりファージディスプレイペプチドライブラリーをスクリーニングした。これらのミモトープはおそらく、ＩｇＥの受容体への結合を阻害するだけでなく、遊離した天然のＩｇＥと反応するが、受容体結合ＩｇＥとは反応しないポリクローナル抗体を誘発するために使用される。Ｋｒｉｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，はＩｇＥ分子の任意の部分に相同性でなく、従って本発明で開示したペプチドとは異なるペプチドミモトープを開示した。
【００１９】
抗‐ＩｇＥワクチンの開発が直面する主な障害は、アレルギー被験者の免疫に安全に使用可能で、非アナフィラキシー誘発性ポリクローナル抗体を誘発する、非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥ決定因子を表す明確なアミノ酸に関する情報の欠如である（すなわち、受容体‐結合ＩｇＥに結合しないポリクローナル抗ＩｇＥ‐抗体）。本発明のペプチド組成物は非アナフィラキシー誘発性であるように選択される；すなわち、ペプチド組成物が肥満細胞または好塩基球に結合したＩｇＥに結合または交差結合する抗‐ＩｇＥ抗体の産生を起こさない。従って、本発明のペプチドは優れた安全性を持ち、全長ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに基づく開示されたワクチン由来の配列組成物により識別される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明はＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療および予防のためのワクチンとしてのＩｇＥ分子のイプシロン重鎖のＦｃ部分由来の抗原性ペプチドの組成物および使用法を提供する。一態様において、本発明はＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療および予防に有効な２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来の１以上の抗原性ペプチドの免疫原性量を含む、ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療および予防のための組成物を提供する。好ましくは、本発明の組成物はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３，１０，１１，１２，１３もしくは１４または抗原性フラグメントのアミノ酸配列を含む１以上の抗原性ペプチド、その誘導体もしくは変異体の免疫原性量を含む。
【００２１】
抗原性ペプチドは体細胞遺伝子療法を使用して“プロドラッグ”として直接投与または間接的に供給することができる。
好ましい態様において、本発明は部分的に、第２の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインの可変アミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインの保存されたアミノ酸残基を含む抗原性ペプチドが、動物に投与したときにアナフィラキシーを起こさずに高力価の抗‐ＩｇＥ抗体を誘導することができるという発見に基づく。出願者は例えばラットＩｇＥおよびイヌＩｇＥのような異なる種のＩｇＥ分子の一次アミノ酸配列を比較し、異なる種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインに保存されたアミノ酸残基を同定した。出願者は、異なる種のＩｇＥ分子ＣＨ３ドメインの保存されたアミノ酸残基に、種毎に異なるアミノ酸残基が隣接していることも発見した（“可変アミノ酸残基”と呼ぶ）。
【００２２】
従って、一態様において、本発明は第２の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した、第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含む抗原性ペプチドを包含する。抗原性ペプチドを含む、第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、第２の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインに保存されている。しかし、抗原性ペプチドを含む、第２の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインに保存されない（すなわち、可変である）。従って、例えば、本発明の抗原性ペプチドはラットＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接したイヌＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインの保存されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。そのような抗原性ペプチドは好ましくはＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療または予防のためにイヌに投与されるであろう。本発明はさらに動物に投与したときにアナフィラキシーを起こさない、単一種由来の抗原性融合蛋白質を提供する。好ましくは、そのような抗原性融合蛋白質は配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７を持つ。
【００２３】
本発明は、同じ種または２以上の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来の免疫原的有効量の１以上の抗原性ペプチドを含む医薬組成物および１以上の薬剤的に受容できるキャリアも提供する。一態様において、本発明の医薬組成物は２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来の、免疫原的有効量の１以上の抗原性ペプチドおよび１以上の薬剤的に受容できるキャリアを含む。別の態様において、本発明の医薬組成物は１以上の薬剤的に受容できるキャリアおよび２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来の免疫原的有効量の１以上の抗原性ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３，および１０−１４）のおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：９および２３のような異種キャリア蛋白質を含む。
【００２４】
本発明は２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来の免疫原的有効量の１以上の抗原性ペプチド、薬剤的に受容できるキャリア、およびアジュバントも提供する。アジュバントは抗原に対する免疫反応を促進することができる任意の化合物を包含する。効果的と推察されるアジュバントの例としては以下のものを含むがこれらに限定されない：水酸化アルミニウム、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１′−２′−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、単純免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ＩＬ−１２，ＩＬ−２またはＩＬ−１のようなサイトカイン、サポニン、およびコレラ毒素のような微生物毒素、熱不安定性毒素および遺伝的に変化したそれらの誘導体。
【００２５】
他の態様において、本発明の医薬組成物は薬剤的キャリア、アジュバントおよび２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来の抗原性ペプチドおよび異種キャリア蛋白質を含む免疫原的有効量の１以上の抗原性融合蛋白質を含む。好ましい態様において、本発明の医薬組成物は薬剤的キャリア、アジュバントおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３，および１０−１４のアミノ酸配列を含む免疫原的有効量の１以上の抗原性ペプチドを含む。
【００２６】
他の好ましい態様において、本発明の医薬組成物は薬剤的キャリア、アジュバント、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３，および１０−１４のアミノ酸配列を含む免疫原的有効量の１以上の融合蛋白質を含む。
【００２７】
本発明はＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療および予防のために、本発明の組成物を動物、好ましくは哺乳動物そして最も好ましくはヒトに投与する方法も提供する。本発明の組成物は、動物、好ましくはペット（例えば、イヌ、ネコおよびウマ）および家畜（例えば、ウシおよびブタ）のような哺乳動物、そして最も好ましくはヒトに投与するのに適した製剤中にある。本発明の組成物は、ＩｇＥ分子に特異的なポリクローナル抗体の産生のような、免疫反応を引き起こすために有効な量で投与される。一態様において、本発明の組成物は、ＩｇＥが受容体（すなわちＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン）に結合するために必要なＩｇＥ分子のＦｃ部分に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生を誘発するのに有効な量を投与する。好ましい態様において、本発明の組成物は血清および他の体液中の可溶性（遊離）ＩｇＥに結合し、肥満細胞および好塩基球上の高親和性受容体にＩｇＥが結合するのを阻害し、そして受容体‐結合ＩｇＥに交差結合しない抗‐ＩｇＥ抗体の産生を誘発するために有効な量が投与される。従って、本発明の組成物はＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療または予防のために、アナフィラキシーを誘発しないポリクローナル抗体の産生を誘発するために有効な量が投与される。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療および予防のためのワクチンとしてＩｇＥ分子のイプシロン重鎖のＦｃ部分由来の抗原性ペプチドの組成物および使用のための方法を提供する。特に、本発明はＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療および予防に有効な２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来の免疫原性量の抗原性ペプチドを含む組成物を提供する。好ましくは、本発明の組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−６および１０−１４のアミノ酸配列を含む免疫原性量の１以上の抗原性ペプチドを含む。
【００２９】
本発明の抗原性ペプチドは２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列を含み、アナフィラキシー性でない、抗‐ＩｇＥ抗体の産生を誘発する。特に、本発明の抗原性ペプチドは血清および他の体液中の可溶性（遊離）ＩｇＥに結合する抗‐ＩｇＥ抗体の産生を誘発し、肥満細胞および好塩基球上の高親和性受容体にＩｇＥが結合するのを妨げ、そして受容体‐結合ＩｇＥと交差結合しない。本発明の抗原性ペプチドは体細胞遺伝子療法を使用して“プロドラッグ”として直接投与または間接的に供給することができる。
【００３０】
一態様において、本発明の抗原性ペプチドは第２の、好ましくは関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含む、アミノ酸配列を含む。本発明の抗原性ペプチドは少なくとも第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも１０，第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも１５，第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも２０，または第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも２５含む。さらに、本発明の抗原性ペプチドは第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも１０，第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも１５，第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも２０、または第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を少なくとも２５含む。
【００３１】
具体的な態様において、本発明の抗原性ペプチドは少なくとも１０アミノ酸残基長、少なくとも１５アミノ酸残基長、少なくとも２０アミノ酸残基長、または少なくとも２５アミノ酸残基長、または少なくとも３０アミノ酸残基長である。好ましい態様において、本発明の抗原性ペプチドは第２の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含み、そして前記抗原性ペプチドは２８と３１アミノ酸残基の間である。本発明は、抗原性ペプチドおよび異種キャリア蛋白質を含む抗原性融合蛋白質も提供する。具体的な態様において、抗原性融合蛋白質は、第２の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基、および異種キャリア蛋白質を含む。好ましい態様において、本発明の抗原性ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３および１０−１４のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明は、１以上のアミノ酸置換、付加または欠失が導入されている、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質も含む。突然変異は、当業者に既知の標準技術により導入することができる。例えば、１以上のアミノ酸突然変異を起こすヌクレオチドレベルでの１以上の突然変異は、部位特異的突然変異またはＰＣＲ‐媒介変異誘発により導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は１以上の予想された非必須アミノ酸残基で行う。“保存的アミノ酸置換”は、アミノ酸残基を類似した側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えたものである。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されてきた。これらのファミリーには塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖、（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ‐分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。あるいは、例えば飽和突然変異により、突然変異をコーディング配列のすべてまたは一部にランダムに導入することができ、そして得られた突然変異がアナフィラキシーを誘発しない抗‐ＩｇＥ抗体を誘発する能力をスクリーニングすることができる。
【００３３】
本発明は、アナフィラキシーを誘発しない、医薬組成物を投与することを含む、動物、好ましくは哺乳動物そして最も好ましくはヒトのＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療または予防のための方法も提供する。本発明の方法に従って投与される医薬組成物は２つの関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来抗原性ペプチドを包含する。本発明の方法に従って投与される医薬組成物は以下のものも含む：（ｉ）第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ、組換え型抗原性ペプチド；（ｉｉ）第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基および異種キャリア蛋白質を含む、組換え型抗原性融合蛋白質；（ｉｉｉ）第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ、抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド組成物；および（ｉｖ）第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基および異種キャリア蛋白質を含む抗原性融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド組成物。
【００３４】
一態様において、第２の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ１以上の抗原性ペプチドを含む。好ましい態様において、本発明の医薬組成物は第２の関連のない種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が隣接した第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ２８および３１アミノ酸残基長間の１以上の抗原性ペプチドを含む。これらの態様に従って、医薬組成物はさらにアジュバントを含んでいてもよい。
【００３５】
本発明は１以上の抗原性融合蛋白質を含む医薬組成物も提供する。具体的な態様において、本発明の医薬組成物は本発明の抗原性ペプチドおよび異種キャリア蛋白質を含む１以上の抗原性融合蛋白質を含む。この態様に従って、医薬組成物はさらにアジュバントを含んでいてもよい。
【００３６】
本明細書で使用する“異種キャリア蛋白質”という用語は、本発明の組成物を投与されて免疫反応を引き起こす種で見られる蛋白質と高い相同性を持たない蛋白質を表す。２つのアミノ酸配列の比較のために使用される任意の既知の数学的アルゴリズムにより決定されるような、ある蛋白質が、ある蛋白質に少なくとも７５％以上同一、より好ましくは８５％以上同一、または少なくとも９０％以上同一以上であるとき、高い相同性がある（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７；Ｔｏｒｅｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｒｏｂｏｔｔｉ，１９９４，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３−５；ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｍ，１９８８，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，ｃｉ．８５：２４４４−８を参照されたい）。好ましくは、２つのアミノ酸配列の同一性の割合は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０，語長＝３をもつＢＬＡＳＴ蛋白質探索により決定される。異種キャリア蛋白質の例としてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：７，８または９，ＫＬＨ、ＰｈｏＥ、およびｒｍＬＴが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
異種キャリア蛋白質は本発明の抗原性ペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端または両末端に融合することができる。本発明の抗原性融合蛋白質は当業者に既知の技術、例えば、標準組換えＤＮＡ技術により産生することができる。例えば、抗原性融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列は自動ＤＮＡシンセサイザーを含む慣用の技術により合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハングを引き起こすアンカープライマーを使用して行うことが可能で、それらはその後アニーリングされ、再増幅されて抗原性融合蛋白質をコードする遺伝子配列を生成することができる（例えば、以下のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，を参照されたい）。さらに、融合部分をすでにコードする多くの発現ベクターが市販されている（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。本発明の抗原性ペプチドをコードする核酸は、そのような発現ベクター中にクローニングし、融合部分を本発明の抗原性ペプチドに対しインフレーム（ｉｎ  ｆｌａｍｅ）に結合させることができる。
【００３８】
具体的な態様において、本発明の医薬組成物はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３および１０−１４のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を持つ抗原性ペプチドを含む。
別の態様において、本発明の医薬組成物はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３および１０−１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を持つ抗原性融合蛋白質を含む。これらの態様に従って、本発明の医薬組成物はさらにアジュバントを含んでいてもよい。
【００３９】
本発明の医薬組成物はペット（例えば、イヌおよびネコ）および家畜（例えば、ブタ、ウシおよびウマ）のような動物およびＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療または予防のために投与するのに適した製剤である。
【００４０】
ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患はアレルギー性鼻炎／枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、ノミアレルギー、食物および吸入性アレルギーを含む。
好ましくは、本発明の抗原性ペプチドを含む本発明の医薬組成物は、ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患を治療または予防するために第１の種のＩｇＥ分子のＣＨ３ドメイン由来のアミノ酸残基として同じ種に投与される。ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患は喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーのような消化管アレルギー、好酸球増加症、および結膜炎を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療、予防または阻害に有効な量、またはアナフィラキシー性でない抗‐ＩｇＥ反応を誘発するために有効な量、またはヒスタミンのような血管作用性物質の遊離を阻害または抑制するために有効な量、またはＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患に関連した１以上の症状を軽減するために有効な量が被験者（動物）に投与される。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、ＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患を治療するための任意の既知の方法により使用することができる。一態様において、１以上の本発明の医薬組成物および１以上の抗ヒスタミン剤はＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療または予防のために動物に投与される。別の態様において、１以上の本発明の医薬組成物および１以上のコルチコステロイドはＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療または予防のために動物に投与される。さらに別の態様において、１以上の本発明の医薬組成物および１以上の抗ＩｇＥ‐モノクローナル抗体（例えば、ＢＳＷ１７）はＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患の治療または予防のために動物に投与される。
【００４３】
本発明は、本発明の抗原性ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３および１０−１４）、キャリア蛋白質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：７，８および９）または抗原性融合蛋白質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２，３および１０−１４をコードするポリヌクレオチド配列を包含する。本発明は、同一の抗原性ペプチドおよび抗原性融合蛋白質をコードする遺伝子コードの縮退により、異なるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。ＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインのポリヌクレオチド配列は科学文献、Ｇｅｎｂａｎｋ、または当業者に既知のクローニング技術の使用から得ることができる。特に、本発明は、それぞれ参照として本明細書に援用した、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号  Ｓ５３４９７、Ｘ００９２３、およびＬ３６８７２に開示されたヒト、ラットおよびイヌのＩｇＥ分子のＣＨ３ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。
【００４４】
本発明は２つの異なる種のポリヌクレオチド配列によりコードされた本発明の抗原性ペプチドおよび異なる種のポリヌクレオチド配列によりコードされた異種キャリア蛋白質を含む抗原性融合蛋白質も包含する。異種キャリア蛋白質のポリヌクレオチド配列は科学文献、Ｇｅｎｂａｎｋ、または当業者に既知のクローニング技術の使用から得ることができる。
【００４５】
本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列は、挿入した蛋白質コーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含む、適切な発現ベクター中に挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは天然のＩｇＥ遺伝子または隣接領域により供給されてもよい。各種宿主‐ベクター系は、蛋白質‐コーディング配列を発現するために使用してもよい。これらはウイルス感染哺乳動物細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、など）；ウイルス感染昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；イーストベクターを含むイーストのような微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡにより形質転換された細菌を含むが、それらに限定されない。ベクターの発現エレメントは強度および特異性が多様である。使用する宿主‐ベクター系に依存して、任意の適切な転写および翻訳エレメントの一つを使用してもよい。
【００４６】
ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入のために先に記載された方法のいずれかを、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および適切な転写および翻訳制御シグナルを構築するために使用してもよい。これらの方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え型ＤＮＡおよび合成法およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え体（遺伝子組換え）を含んでいてもよい。本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸配列の発現は第２の核酸配列により調節され、その結果組換え型ＤＮＡ分子により形質転換された宿主に抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質が発現されてもよい。例えば、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の発現は当技術分野で既知の任意のプロモーターまたはエンハンサーにより制御されていてもよい。本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の発現を制御するために使用してもよいプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター領域、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３′長反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β‐ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）のような原核細胞発現ベクター；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４の“Ｕｓｕｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”も参照されたい；ノパリンシンセターゼプロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１）を含む植物発現ベクター、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０）；Ｇａｌ４プロモーターのようなイーストまたは他の菌類のプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物に使用されてきた以下の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａ���．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞で活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）；リンパ細胞で活性なイムノグロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパおよび肥満細胞で活性なマウス乳ガンウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）；肝で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）アルファ‐フェト蛋白質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．５：１６３９−１６４８；およびＨａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝で活性なアルファ１‐アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞で活性なベータ‐グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；およびＫｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳のオリゴデンドログリアで活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖‐２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）；筋肉で活性なブタアルファ‐骨格アクチン制御領域（Ｒｅｅｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｎｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１０１−１２０）；および性腺刺激ホルモン放出ホルモン（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）を含むがこれらに限定されない。
【００４７】
具体的な態様において、抗原性ペプチドをコードする核酸に操作可能な結合をしたプロモーター、１以上の複製起源、および場合によっては１以上の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが使用される。別の具体的な態様において、抗原性融合蛋白質をコードする核酸に操作可能な結合をしたプロモーター、１以上の複製起源、および場合によっては１以上の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが使用される。
【００４８】
遺伝子挿入物を含む発現ベクターは３種の一般的方法により同定することができる；（ａ）核酸ハイブリダイゼーション；（ｂ）“マーカー”遺伝子機能の存在または欠如；および（ｃ）挿入された配列の発現。第１の方法では、発現ベクターに挿入された抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは抗原性融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの存在を、挿入されたポリヌクレオチド配列に相同性である配列を含むプローブを使用して核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第２の方法では、組換え型ベクター／宿主系を、ベクター中の遺伝子の挿入により引き起こされる、ある“マーカー”機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体形成など）の存在または欠如に基づいて同定および選択することができる。例えば、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入すると、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質挿入物をコードする核酸分子を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の欠如により同定できる。第３の方法では、組換え体発現ベクターを組換え体により発現される遺伝子産物をアッセイすることにより同定することができる。そのようなアッセイは、例えば、抗‐ＩｇＥ抗体と抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の結合のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系における抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の物理的または機能的性質に基づいていてもよい。
【００４９】
一旦、具体的な組換えＤＮＡ分子が同定，単離されるとそれを増殖させるために当技術分野で既知のいくつかの方法を使用することができる。一旦、適切な宿主系および成長条件を確立すれば、組換え体発現ベクターを増殖させ、たくさん調製することができる。先に説明したように、使用することができる発現ベクターは、ほんの２−３例をあげると以下のベクターまたはそれらの誘導体であるが、それらに限定されない：ワクシニアまたはアデノウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；イーストベクター；バクテリオファージ（例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【００５０】
本明細書で使用する“宿主細胞”という用語は組換えＤＮＡが導入される具体的な対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代または潜在的な後代を表す。突然変異または環境の影響により後継世代に何らかの変異が起こることがあるため、実際はそのような後継世代は親細胞と同一でなくてもよいが、依然として本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００５１】
所望する具体的な様式で、挿入された配列の発現を調節、または遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞系を選択してもよい。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質の存在下で上昇させることができる；従って、遺伝子工学的に発現を制御してもよい。さらに、異なる宿主細胞は翻訳および翻訳後処理および修飾（例えば、蛋白質のグリコシル化、リン酸化）のための特徴的で特異的な機序を有する。発現された異種蛋白質の所望する修飾および処理を保証するために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、細菌系での発現を非グリコシル化コア蛋白質産物を生成するために使用することができる。イーストにおける発現はグリコシル化産物を生成する。哺乳動物における発現は本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の“天然”のグリコシル化を保証するために使用することができる。さらに、異なるベクター／宿主発現系が異なる程度にプロセシング反応を実行してもよい。
【００５２】
組換え蛋白質を長期間、高収率で得るためには、安定な発現が好ましい。例えば、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質を安定して発現する細胞系を設計してもよい。ウイルス起源の複製物を持つ発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカーにより制御されたＤＮＡにより形質転換されてもよい。異種蛋白質の導入に続いて、設計された細胞は栄養強化培地で１−２日間培養してもよく、その後選択的培地に交換する。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択物に耐性を与え、細胞がクロモソーム中にプラスミドを安定して統合し、中心を形成して増殖し、その後クローニングして細胞系に拡大できるようにする。この方法は好都合には、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質を発現する細胞系を設計するために使用してもよい。そのように設計した細胞はＩｇＥ分子の受容体への結合に影響を与える抗‐ＩｇＥ抗体または他の因子（例えば、有機分子、無機分子、有機／無機複合体、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド類似体、多糖、糖、糖蛋白質、核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖およびオリゴヌクレオチドなど）のスクリーニングおよび評価に特に有用であってもよい。
【００５３】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチン‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋａ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４８：２０２６）およびアデニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）を含むが、それらに限定されない多数の選択系を使用してもよいが、遺伝子はそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞に使用してもよい。また、メトトレキセートに対する抵抗性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：３５６７；Ｏ′Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：１５２７）、ミコフェノール酸に抵抗性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に抵抗性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；およびヒグロマイシンに抵抗性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）遺伝子の選択の基礎として、代謝拮抗物質抵抗性を使用することができる。
【００５４】
具体的な態様において、本発明の抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子は、遺伝子療法によりＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患を治療または予防するために投与される。別の具体的な態様において、本発明の抗原性融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子は、遺伝子療法によりＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患を治療または予防するために投与される。さらに別の態様において、本発明の抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子、および本発明の抗原性融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を含む１以上の核酸分子は、遺伝子療法によりＩｇＥ‐媒介アレルギー性疾患を治療または予防するために投与される。遺伝子療法は、発現された、または発現できる核酸を被験者に投与することにより行われる療法を表す。本発明のこの態様において、核酸は抗‐ＩｇＥ抗体の産生のような免疫反応を引き起こすことにより治療効果を媒介する、コードされた抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質を産生する。
【００５５】
当技術分野で利用できる遺伝子療法のいずれかの方法を本発明に従って使用することができる。以下に代表的な方法を記載する。
遺伝子療法の方法の一般的な総説としては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５を参照されたい。当技術分野でよく知られた、使用することができる組換えＤＮＡ技術の方法は、Ａｕｓｕｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（編），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  
ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに記載されている。
【００５６】
好ましい側面において、医薬組成物は本発明の抗原性ペプチドをコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は適切な宿主に抗原性ペプチドを発現する発現ベクターの部分である。特に、そのような核酸配列は抗原性ペプチドコーディング領域に操作可能な結合をしているプロモーターを持ち、前記プロモーターは誘発性または構成性で、場合によっては組織特異的である。別の好ましい側面において、医薬組成物は本発明の抗原性融合蛋白質をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は適切な宿主に抗原性融合蛋白質を発現する発現ベクターの部分である。特に、そのような核酸配列は抗原性融合蛋白質コーディング領域に操作可能な結合をしているプロモーターを持ち、前記プロモーターは誘発性または構成性で、場合によっては組織特異的である。別の具体的な態様において、本発明の抗原性ペプチドのコーディング配列および任意の他の所望する配列とゲノムの所望する部位での相同性組換えを促進する領域が隣接する核酸が使用され、抗原性ペプチドをコードする核酸の染色体内発現が提供される（Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  
８６：８９３２−８９３５；およびＺｉｊｌｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８）。別の具体的な態様において、本発明の抗原性融合蛋白質のコーディング配列および任意の他の所望する配列とゲノムの所望する部位での相同性組換えを促進する領域が隣接する核酸が使用され、抗原性蛋白質をコードする核酸の染色体内発現が提供される。
【００５７】
患者への核酸の送達は、直接（その場合、患者は直接、核酸または核酸運搬ベクターに曝される）、または間接（その場合、細胞は初めにｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸により形質転換され、その後患者に移植される）のいずれであってもよい。これらの２つの方法はそれぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子療法として知られている。
【００５８】
具体的な態様において、核酸は直接ｉｎ  ｖｉｖｏで投与され、そこでコード
された産物を産生するように発現される。このことは以下のような当技術分野で
既知の多数の方法により行うことができる：例えば、それらを適切な核酸発現ベ
クターの一部として構築し、例えば、欠損または弱毒化レトロウイルスもしくは
他のウイルスベクターを使用した感染（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または裸核ＤＮＡの直接注入、または微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション物質によるコーティング、リポソームへの封入、微粒子、もしくはマイクロカプセルの使用により、それらが細胞内になるように投与する、または核に入ることが既知のペプチドと結合させてそれらを投与する、受容体媒介エンドサイトーシスを受けるようにリガンドと結合させて投与する（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）（受容体を特異的に発現する細胞型を標的にするために使用することができる）などの方法がある。別の態様において、核酸リガンド複合体は、リガンドがエンドソームを破壊するためのフソジェニックウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を避けられるように形成することができる。さらに別の態様において、核酸は特異的受容体を標的にすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞特異的取り込みおよび発現の標的となることができる（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／０６１８０  １９９２年４月１６日発行（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，）；ＷＯ９２／２２６３５  １９９２年１２月２３日発行  （Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，）；ＷＯ９２／２０３１６  １９９２年１１月２６日発行（Ｆｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，）；ＷＯ９３／１４１８８  １９９３年７月２日発行（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，）；およびＷＯ９３／２０２２１  １９９３年１０月１４日発行（Ｙｏｕｇ）を参照されたい）。あるいは、相同性組み換えにより核酸を細胞に導入して、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませることができる（Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８）。
【００５９】
具体的な態様において、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸配列を含むレトロウイルスベクターを使用することができる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの統合に必要でないレトロウイルス配列を欠失している。遺伝子療法に使用される抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸配列は１以上のベクターにクローニングし、患者への遺伝子の送達を促進する。レトロウイルスベクターについてのより詳細はＢｏｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２から得られ、そこでは造血幹細胞が化学療法に、より抵抗性を持つように、幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載している。遺伝子療法でのレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献としては以下のものが挙げられる：Ｃｌｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１；およびＧｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４。
【００６０】
アデノウイルスベクターは遺伝子療法で使用できる他のウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは呼吸上皮に遺伝子を送達するために特に魅力的なベヒクルである。アデノウイルスは自然に呼吸上皮に感染し、そこで軽度の疾患を起こす。アデノウイルスを基にした送達系の他の標的は肝、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは非分割細胞に感染できるという利点を持つ。Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３はアデノウイルスを基にした遺伝子療法についての総説である。Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９１：２２５−２３４；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／１２６４９；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３に見ることができる。好ましい態様において、アデノウイルスベクターが使用される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子療法への使用を提案されてきた（例えば、Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００；および米国特許第５，４３６，１４６号を参照されたい）。
【００６１】
遺伝子療法の他の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法により、組織培養中の細胞へ核酸分子を導入することを含む。通常、導入には細胞への選択可能なマーカーの導入を含む。その後、導入された遺伝子を取り込み、発現している細胞を単離するために、細胞の選択を行う。次にそれらの細胞を患者に送達する。
【００６２】
この態様において、核酸分子は、結果として生じる組換え細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の前に細胞に導入される。そのような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクター、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、ミクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含む、当技術分野で既知の任意の方法により行うことができるが、それらの方法に限定されない。細胞への異種核酸分子の導入のための多数の方法が当技術分野で既知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８５，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照されたい）、受容細胞の必要な発達および生理的機能が破壊されていなければ、本発明に従って使用することができる。かかる技術は細胞に核酸の安定導入を提供するべきであり、その結果核酸は細胞により発現され、好ましくはその細胞後代に遺伝、発現可能である。
【００６３】
結果として生じる組換え細胞は、当技術分野で既知の各種の方法により被験者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹または前駆細胞）は好ましくは静脈内に投与される。使用のために予想される細胞量は所望する効果、被験者の状態などに依存し、当業者が決定することができる。
【００６４】
遺伝子療法の目的のために核酸を導入することができる細胞は、任意の所望された、利用可能な細胞型を包含し、そして上皮細胞、内皮細胞、ケラチン細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝から得られるような各種幹または前駆細胞、特に造血幹または前駆細胞などを含むが、それらに限定されない。
【００６５】
好ましい態様において、遺伝子療法に使用される細胞は患者本人由来のものである。
組換え細胞が遺伝子療法で使用される態様において、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸配列は、細胞またはそれらの後代によって発現可能なように細胞に導入され、そして組換え細胞は治療効果のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与される。具体的な態様において、幹または前駆細胞が使用される。単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持することができる任意の幹および／または前駆細胞は本発明のこの態様に従って潜在的に使用することができる（例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９４／０８５９８，１９９４年４月２８日発行；Ｓｔｅｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１９８０，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１Ａ：２２９；およびＰｉｔｔｅｌｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９８６，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：７７１を参照されたい）。
【００６６】
具体的な態様において、遺伝子療法のために導入される核酸はコーディング領域に操作可能に結合した誘導プロモーターを含みそのため、核酸の発現は転写の適切な誘導物質の存在の有無を制御することにより制御可能である。
【００６７】
本発明はまた、適切な培地中で本発明の細胞の培養物を増殖させ、そして培養物から蛋白質を精製することを含む、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質を産生するための方法に関する。例えば、本発明の方法は、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを含む宿主細胞（すなわち、原核細胞または真核細胞）が、コードされた抗原性ペプチドまたはコードされた抗原性融合蛋白質の発現が可能な条件下で培養される、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質を産生するための過程を含む。抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質は培養物、好都合には培地から回収し、さらに精製することができる。精製された抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質は、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質に結合する抗‐ＩｇＥ抗体を同定するために、当技術分野でよく知られたｉｎ  ｖｉｔｒｏイムノアッセイで使用することができる。
【００６８】
蛋白質はまた、１以上の昆虫発現ベクターの適切な制御配列に本発明の単離されたポリヌクレオチドを操作可能に結合させること、および昆虫発現系を使用することにより産生することができる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料と方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（ｔｈｅ  ＭａｘＢａｔ．ＲＴＭ．キット）からキット型として市販されていて、そのような方法はＳｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  第１５５５号（１９８７）（参照として本明細書に援用する）に記載されたように、当技術分野でよく知られている。本明細書で使用するような、本発明のポリヌクレオチドの発現が可能な昆虫細胞は“形質転換”されている。
【００６９】
あるいは、本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質は精製を促進する形状で発現されてもよい。例えば、抗原性ペプチドは、精製を促進するマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のような異種蛋白質を含む融合蛋白質として発現されてもよい。そのような融合蛋白質の発現および精製のためのキットはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）およびＩｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎからそれぞれ市販されている。蛋白質はエピトープで標識し、その後そのようなエピトープに対する特異的抗体の使用により精製することができる。そのようなエピトープ（“フラッグ”）の一つはＫｏｄａｋ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）から市販されている。
【００７０】
本発明の抗原性ペプチドまたは本発明の抗原性融合蛋白質は、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴付けられる、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジの乳汁成分のような、トランスジェニック動物の産物として発現されてもよい。
【００７１】
本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質を産生するために、当業者に既知の任意の方法が使用可能である。もっとも簡単な方法として、アミノ酸配列は市販のペプチドシンセサイザーを使用して合成することができる。これは小ペプチドおよびより大きなペプチドのフラグメントの産生に有用である。本発明の単離された抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質は、例えば、天然のポリペプチドに対する抗体の作製に有用である。
【００７２】
当業者は、本発明の単離された抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の一つを得るためにペプチドおよび蛋白質を単離するための既知の方法に容易に従うことができる。これらには、イムノクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ），逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィーなどが含まれるが、それらに限定されない。例えば、Ｓｖｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい。
【００７３】
本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質は、その蛋白質が由来する細胞または組織源の細胞物質または他の汚染蛋白質を実質的に含まないとき、または化学的に合成されたときは、実質的に化学的前駆物質または他の化学物質を含まないとき、“単離”または“精製”される。“細胞物質が実質的にない”という言い方は、蛋白質が単離される、または組換えにより産生される細胞の細胞成分から分離された、蛋白質調製物を含む。従って、細胞物質を実質的に含まない蛋白質は（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％または５％より少ない汚染蛋白質を持つ蛋白質調製物を含む。本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質が組換えにより産生されるとき、実質的に培地も含まないことが好ましい、すなわち、培地は蛋白質調製物の約２０％、１０％または５％より少ない容積に相当する。本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質が化学合成により産生されるとき、実質的に化学的前駆物質または他の化学物質を含まないことが好ましい、すなわち、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質がその合成に関与した化学的前駆物質または他の化学物質から分離される。従って、そのような蛋白質調製物は、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質以外の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％または５％より少ない化学的前駆物質または化合物を含む。本発明の組成物は、ヒトでの使用の前に、好ましくは所望する治療的または予防的活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、そして次にｉｎ  ｖｉｖｏで試験される。例えば、具体的な組成物の投与が必要性か否かを決定するために使用することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを含み、そのアッセイでは患者組織標本を培養物中で増殖させ、組成物を曝すか、さもなければ投与して、組織標本に対するそのような組成物の効果を観察する。
【００７４】
抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の発現は、イムノアッセイ、ゲル電気泳動とその後の可視化、または当業者に既知の任意の他の方法によりアッセイすることができる。
各種の具体的な態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、組成物が患者の疾患に関与する細胞型に対して所望する効果を持つかどうかを測定するために、そのような細胞型の代表的な細胞により行うことができる。本発明に従って、抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の機能的活性は、ヒスタミンのような血管作用物質の放出を誘発しないで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで肥満細胞または好塩基球上の受容体にＩｇＥが結合するのを阻害する抗‐ＩｇＥ抗体を誘導する能力により測定することができる。
【００７５】
治療に使用するための組成物は、ヒトで試験する前に、ブタ、ニワトリ、ウシまたはサルを含むがそれらに限定されない、適切な動物モデル系で試験することができる。
本発明は、アナフィラキシーを起こさない抗‐ＩｇＥ抗体の産生を引き起こすための本発明の組成物の有効量を被験生物に投与することによる治療（および予防）の方法を提供する。好ましい側面において、本発明の組成物は、実質的に精製されている（例えば、その効果を制限するか、または所望しない副作用を生じる物質が存在しない）。被験生物は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを含むが、それらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。
【００７６】
組成物が核酸を含むとき使用することができる製剤および投与法は先に記載されている；付加的な適切な製剤および投与経路は、本明細書で以下に記載したものの中から選択することができる。
【００７７】
各種送達系は既知であり、本発明の組成物を投与するために使用することができる：例えば、リポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、組成物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など。導入の方法は腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路などを含むがそれらに限定されない。組成物は任意の都合のよい経路、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜被膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収により投与してもよく、他の生物学的に活性な物質と一緒に投与してもよい。投与は全身または局所であってもよい。さらに、例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール剤との製剤により、肺投与を行うことができる。
【００７８】
具体的な態様において、本発明の医薬組成物を治療が必要な部位に局所的に投与することを所望してもよい；このことは、例えば、制限をするためではないが、局所注入、局所適用、注射、または移植の方法により行うことが可能で、前記移植物はシアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような、膜または線維を含む、多孔質性、非多孔質性、またはゼラチン様物質である。一態様において、投与はアレルギー反応の部位（先の部位）における直接注射によるものであってもよい。
【００７９】
他の態様において、本発明の組成物はベシクル、特にリポソームで送達することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；およびＬｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照されたい；一般に同書を参照されたい）。
【００８０】
さらに別の態様において、本発明の組成物は制御放出系により送達することができる。一態様において、ポンプを使用してもよい（例えば、先のＬａｎｇｅｒ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｆ，Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；およびＳａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の態様において、高分子材料を使用してもよい（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；およびＨｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。さらに別の態様において、制御放出系を治療標的に隣接して配置し、それにより全身投与量の一部のみが必要であるようにすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，先のＭｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２巻、ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。
【００８１】
他の制御放出系はＬａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）の総説中で説明されている。
本発明の組成物が本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質をコードする核酸である具体的な態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または直接注射により、または微小粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）、もしくは脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション物質によるコーティングの使用により、核酸が細胞内になるように投与することにより、または核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて核酸を投与する（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８を参照されたい）ことにより、核酸にコードされる抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質の発現を促進するために、それをｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入して、相同性組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませてもよい。
【００８２】
本発明は医薬組成物も提供する。そのような組成物は、本発明の治療的有効量の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質、および薬剤的に受容できるキャリアを含む。具体的な態様において、“薬剤的に受容できる”という用語は、連邦または州政府の規制局に認可されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に動物、およびより具体的にはヒトでの使用のためにリストに載せられることを意味する。“キャリア”という用語は、それらとともに治療薬が投与される希釈剤、賦形剤、またはベヒクルを表す。そのような薬剤的キャリアは、ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ごま油などのような、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水または油のような滅菌した液体であってもい。水は、医薬組成物を静脈内投与するときに好ましいキャリアである。生理食塩水および水性ブドウ糖およびグリセロール溶液も液体キャリアとして、特に注射溶液に使用することができる。適切な薬剤的賦形剤はデンプン、グルコース、ラクトース、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。もし所望するならば、組成物は少量の湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含んでいてもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、乳化剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放性製剤などの形状をとることができる。組成物はトリグリセリドのような慣用の結合剤およびキャリアとともに、坐剤として製剤することができる。経口製剤は薬剤的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、などのような標準キャリアを含むことができる。適切な薬剤的キャリアの例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形状を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、好ましくは精製された形状で、治療的有効量の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質を含むことになる。剤形は投与様式に適応するべきである。
【００８３】
好ましい態様において、組成物はヒトへの静脈内投与に適応した医薬組成物として、常法に従って製剤される。一般に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合は、組成物は可溶化剤および注射部位の疼痛を緩和するためのリグノカインのような局所麻酔剤も含んでいてもよい。一般に、処方成分は、例えば凍結乾燥粉末または、活性成分の量を示すアンプルまたはサシエ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封した容器中の、水を含まない濃縮物として、単位剤形中に別々に、または一緒に供給される。組成物を注入により投与する場合は、滅菌した薬剤的等級の水または生理食塩水を含む注入容器により投与することができる。組成物を注射により投与する場合は、処方成分が投与前に混合されるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供される。
【００８４】
本発明の抗原性ペプチドまたは抗原性融合蛋白質は中性または塩の形状として製剤することができる。薬剤的に受容できる塩は、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などに由来するもののような、遊離アミノ基により形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののような遊離カルボキシル基により形成されるものを含む。
【００８５】
以下の実施例は本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００８６】
抗原性ペプチドの選択および対応するポリヌクレオチド配列のクローニング
抗ＩｇＥワクチン開発が直面する主な障害は、アレルギー被験者に免疫接種するために安全に使用され、非アナフィラキシー誘発性ポリクローナル抗体（すなわち、受容体結合ＩｇＥに結合しないポリクローナル抗ＩｇＥ抗体）を誘発することができる非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥ決定因子を表す的確なアミノ酸に関する情報の欠如である。定義上は、それらの決定因子は理想的には、生理的にＩｇＥ受容体に接触するようなアミノ酸配列だけに対応する。明らかに、それらの配列の的確な同一性に関する情報は先行技術には見られない。実際、それらの配列が存在するＩｇＥ領域またはドメインに関してさえ、先行技術では一致しない。さらに、非アナフィラキシー誘発性決定因子の同一性はＩｇＥ‐受容体複合体の結晶構造を解析することのみにより正しく説明することができるが、残念ながら、それらはいまだ得られていなかった。結果として、本発明はこの障害にうち勝ち、治療的に所望されるポリクローナル抗体を宿主細胞内に誘発することができるＩｇＥ決定因子を提供し、それらは天然の血清ＩｇＥと反応し、肥満細胞および好塩基球上の受容体にＩｇＥが結合するのを妨害し、そして受容体結合ＩｇＥと反応しない。抗ＩｇＥワクチンへの含有に適した非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥエピトープを同定するために、効果的で安全なワクチンに適したＩｇＥ上の正確なアミノ酸の位置についての先駆的な仮定をせず、そしてそれらについての知識を必要としない方法に従う。ＩｇＥ抗体は例えばヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ラット、マウスおよびチンパンジーを含む動物界の多くの種に存在することが示されてきた。これらのＩｇＥ分子の一次アミノ酸配列の比較は、ＩｇＥ分子の多くの部位で共通のアミノ酸配列を共有していることを示す。これらの共通（保存された）配列には各種ＩｇＥ分子で異なるアミノ酸配列が隣接する。異なる種のＩｇＥ分子（例えば、ラットＩｇＥおよびイヌＩｇＥ）の一次配列の比較が非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥ決定因子の同定の手がかりを提供すると推論した。イヌ、ネコ、ラットＩｇＥはヒトＩｇＥ受容体に結合することは既知である。イヌおよびラットＩｇＥがヒトＩｇＥ受容体のような、他の関係のない種のＩｇＥ受容体に結合することから、イヌおよびラットの間に保存されたアミノ酸が受容体結合コンフォメーション決定因子を明示する情報を含むに違いないと仮定する。これらの保存された配列はイヌおよびラットＩｇＥの間で変化する配列とそれぞれのＩｇＥ分子内で隣接することから、イヌおよびラットいずれかのＩｇＥ分子の全受容体結合コンフォメーションに影響を与えないで、可変的なＩｇＥ配列はそれらのＩｇＥ間で交換することができるとさらに仮定する。この推論を使用して、安全で効果的なイヌのワクチンが本発明のペプチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１−６を使用することにより開発された。本発明の抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列は以下の方法を使用して構築された：
イヌＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）のクローニング
イヌＣＨ３ドメインをコードするポリヌクレオチド配列はＰＣＲ法に基づいた遺伝子合成法により構築した。一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表１に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【００８７】
【表１】
2006199701.tif 000002
【００８８】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でイヌＣＨ３ドメインを構築するために使用された：１）１８プライマー（Ｐ１７３−Ｓ１〜Ｓ９およびＰ１７３‐Ａ１〜Ａ９）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（０．６２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）および２つの末端プライマー（Ｐ１７３‐Ｓ１およびＰ１７３‐Ａ１）を使用したＰＣＲ１５サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズの遺伝子配列が増幅された。
部分的ヒトＣＨ３／部分的イヌＣＨ３ドメイン融合蛋白質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）をコードするヌクレオチド配列のクローニング
このＤＮＡ配列は、イヌＣＨ３ドメインの最後の５３アミノ酸配列に融合したヒトＣＨ３ドメインの初めの６３アミノ酸からなる蛋白質をコードする。この構築物をコードするポリヌクレオチド配列は以下の様に構築された：一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表２に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【００８９】
【表２】
2006199701.tif 000003
【００９０】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でヒトＣＨ３／イヌＣＨ３ドメイン融合体を構築するために使用された：１）１８プライマー（Ｐ１７４−Ｓ１〜Ｓ９およびＰ１７４‐Ａ１〜Ａ９）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（０．６２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）および２つの末端プライマー（Ｐ１７４‐Ｓ１およびＰ１７４‐Ａ１）を使用したＰＣＲ１５サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（３８４ヌクレオチド）の遺伝子配列が増幅された。
キメラヒト／イヌＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）のクローニング
このＤＮＡ配列は交互ヒト／イヌＣＨ３ドメイン配列からなる蛋白質をコードする。ヒトＣＨ３／保存されたイヌＣＨ３ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は以下のように構築された：一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表３に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【００９１】
【表３】
2006199701.tif 000004
【００９２】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でヒトＣＨ３／イヌＣＨ３キメラドメインを構築するために使用された：１）１８プライマー（Ｐ１７５−Ｓ１〜Ｓ９およびＰ１７５‐Ａ１〜Ａ９）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（０．６２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）および２つの末端プライマー（Ｐ１７５‐Ｓ１およびＰ１７５‐Ａ１）を使用したＰＣＲ１５サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（３８４ヌクレオチド）の遺伝子配列が増幅された。
ヒトＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）のクローニング
ヒトＣＨ３ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は以下のように構築された：一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表４に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【００９３】
【表４】
2006199701.tif 000005
【００９４】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でヒトＣＨ３ドメインを構築するために使用された：１）１８プライマー（Ｐ１７６−Ｓ１〜Ｓ９およびＰ１７６‐Ａ１〜Ａ９）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（０．６２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）および２つの末端プライマー（Ｐ１７６‐Ｓ１およびＰ１７６‐Ａ１）を使用したＰＣＲ１５サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（３８４ヌクレオチド）の遺伝子配列が増幅された。
ラットＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）のクローニング
ラットＣＨ３ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は以下のように構築された：一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表５に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【００９５】
【表５】
2006199701.tif 000006
【００９６】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でラットＣＨ３ドメインを構築するために使用された：１）１８プライマー（Ｐ１７７−Ｓ１〜Ｓ９およびＰ１７７‐Ａ１〜Ａ９）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（０．６２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）および２つの末端プライマー（Ｐ１７７‐Ｓ１およびＰ１７７‐Ａ１）を使用したＰＣＲ１５サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（３８４ヌクレオチド）の遺伝子配列が増幅された。
バキュロウイルスでの発現のためのヒトＣＨ３ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）のクローニング
ＩｇＥ  ＣＨ３ドメインをコードするポリヌクレオチド配列およびミツバチ毒のシグナル配列は以下のように構築された：一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表６に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【００９７】
【表６】
2006199701.tif 000007
【００９８】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でヒトＣＨ３ドメインを構築するために使用された：１）２０プライマー（Ｐ１５８−Ｓ１〜Ｓ１０およびＰ１５８‐Ａ１〜Ａ１０）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（１．２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）およびプライマー（Ｐ１５８‐Ｓ１およびＰ１５８‐Ａ１）を使用したＰＣＲ１０サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（４００ヌクレオチド）の遺伝子配列が増幅された。ＰＣＲにより増幅された４０９ｂｐフラグメントはＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩ酵素により分解され、ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩ酵素により分解されたｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドに連結された。連結混合物はＤＨ５大腸菌に形質転換され、プラスミドプラス４０９ｂｐ挿入物を含むコロニーが単離された。プラスミドＤＮＡは取り扱い説明書に従い、Ｑｕｉａｇｅｎカラムを使用して、ＤＨ５細胞から調製した。“ドナープラスミド”（ｐＦａｓｔＢａｃ１‐ＣＨ３）ＤＮＡは、Ｂａｃ‐Ｔｏ‐Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）への転位のために、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞に形質転換させた。組換えバクミドを含む白色コロニーを単離し、バクミドＤＮＡの単離のために増殖させた。バクミドＤＮＡを単離するために、製造業者に提供された方法に従い、Ｃｏｎｃｅｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｉｔｙ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ＣＨ３遺伝子がバクミドに転位したことを確かめるために、組換えバクミドのＰＣＲ分析を行った。ＰＵＣ／Ｍ１３増幅プライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、Ｂａｃ‐Ｔｏ‐Ｂａｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｍａｎｕａｌにより明示された反応条件で使用した。反応によりサイズが２７０９塩基対の単一の特定の産物が得られ、ＣＨ３ドメイン遺伝子がバクミド（ｐＦａｓｔＢａｃ１  ２３００ｂｐ＋ＣＨ３ドメイン４０９ｂｐ＝２７０９ｂｐにより転位されたバクミド）に挿入されたことを示した。
【実施例２】
【００９９】
蛋白質キャリアの選択および対応するポリヌクレオチド配列のクローニング
本発明の抗原性ペプチドは、ペプチドの免疫原性を増大させ、同時に適切な抗‐ＩｇＥ抗体を誘導するために必要なこれらのペプチドのコンフォメーション特性を保持する機能を持つ、キャリア蛋白質内に取り込まれた。この目的のために、ヒトＩｇＥの修飾されたＣＨ２およびＣＨ４ドメインの使用に基づいたキャリア系が開発された。ヒトＣＨ２およびＣＨ４ドメインの修飾はヒトＣＨ２−ＣＨ４蛋白質配列とイヌＣＨ２−ＣＨ４蛋白質配列間の免疫学的交差反応性を妨げるように導入された。キャリア蛋白質ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７−９の配列は以下の方法に従ってクローニングされた。
ヒトＣＨ２ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）のクローニング
シグナル配列：：ヒトＣＨ２ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は以下のような２ステップＰＣＲ法に基づいた遺伝子合成法により構築された：一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表７に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【０１００】
【表７】
2006199701.tif 000008
【０１０１】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でシグナル配列：：ヒトＣＨ２ドメインを構築するために使用された：１）２０プライマー（Ｐ１７１−Ｓ１〜Ｓ１０およびＰ１７１‐Ａ１〜Ａ１０）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（０．６２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）および２つの末端プライマー（Ｐ１７１‐Ｓ１およびＰ１７１‐Ａ１）を使用したＰＣＲ１５サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズの遺伝子配列が増幅された。増幅された遺伝子は、次にＴ／Ａクローニング部位において、（ｐＧＥＭ−Ｔ）ベクターにクローニングされた。増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列は自動蛍光ＤＮＡ配列決定法により決定した。
ヒトＣＨ４ドメイン（ＳＥＱＩＤ＃２２）のクローニング
ヒトＣＨ４ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は以下のような２ステップＰＣＲ法に基づいた遺伝子合成法により構築された：一連のオリゴヌクレオチドプライマー（表８に記載）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．で合成された。
【０１０２】
【表８】
2006199701.tif 000009
【０１０３】
これらのプライマーは以下のような２ステップＰＣＲ反応でヒトＣＨ４ドメインを構築するために使用された：１）１６プライマー（Ｐ１７２−Ｓ１〜Ｓ１０およびＰ１７２‐Ａ１〜Ａ８）の等モル混合物を使用した２５サイクル、続いて２）新規反応物へのステップ１の産物の希釈（０．６２５ｕｌを５０ｕｌ反応物に）および２つの末端プライマー（Ｐ１７２‐Ｓ１ｂおよびＰ１７２‐Ａ１ｂ）を使用したＰＣＲ１５サイクルの実行。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズの遺伝子配列が増幅された。増幅された遺伝子は、次にＴ／Ａクローニング部位において、（ｐＧＥＭ−Ｔ）ベクターにクローニングされた。増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列は自動蛍光ＤＮＡ配列決定法により決定した。
【実施例３】
【０１０４】
融合蛋白質ワクチンをコードする遺伝子のクローニング：
本発明のワクチンとしての使用のための融合蛋白質ワクチンをコードするポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４−２８）を以下のように構築した。
ＩｇＥ‐１ワクチン構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）のクローニング：
構築物ＩｇＥ‐１の挿入物は、シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、続いてイヌＣＨ３ドメイン、続いてヒトＣＨ４ドメインからなる。ＩｇＥ‐１挿入物の構築は、１ＰＣＲ反応のための鋳型としてシグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、および２番目のＰＣＲ反応のための鋳型としてヒトＣＨ４ドメインを使用することからなる。これらの２反応において、末端プライマーをイヌＣＨ３ドメインと相同性領域を作製するために使用し、その結果イヌＣＨ３ドメインＤＮＡフラグメントの２つの末端が２つのヒトドメインＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そして３つのフラグメントがＰＣＲ反応における“メガプライマー”になる。イヌＣＨ３ドメインは、２つのヒトドメインフラグメントに応じたいずれかの末端上の重複配列（５′末端上のＣＨ２相同性および３′末端上のＣＨ４相同性）を含むように設計された。次に全長産物を作製するために、末端プライマーを使用して、３つのＰＣＲフラグメント（ヒトＣＨ２、イヌＣＨ３およびヒトＣＨ４）を最終ＰＣＲ反応で混合した。以下に方法を概説する：フラグメント１：プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７３‐Ａ４０２によるヒトＣＨ２ドメインの増幅により得られた（シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン）４１３ｂｐフラグメント：；フラグメントはＰＣＲ３５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。フラグメント２：先に記載した（イヌＣＨ３ドメイン）３８４ｂｐフラグメント；ゲル精製したフラグメント３：プライマーＰ１７３−Ｓ７１２およびＰ１７２‐Ａ１ｂによるヒトＣＨ４ドメインの増幅により得られた（ヒトＣＨ４ドメイン）３４０ｂｐ；フラグメントはＰＣＲ３５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。３つのフラグメントは、２つの末端プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７２‐Ａ１ｂを使用した最終ＰＣＲ反応に約等モル量添加され、ＰＣＲを３５サイクル行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（１．１ｋｂ）の遺伝子配列が増幅された。得られたフラグメントは、ＥｃｏＲ１およびＮｈｅＩで分解され、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏの対応する部位にサブクローニングされた。増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列は自動蛍光ＤＮＡ配列決定法により決定した。
構築物ＩｇＥ‐２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）のクローニング：
構築物ＩｇＥ‐２の挿入物は、シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、続いてヒトＣＨ３／イヌドメイン、続いてヒトＣＨ４ドメインからなる。ＩｇＥ‐２挿入物の構築は、１ＰＣＲ反応のための鋳型としてシグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、および２番目のＰＣＲ反応のための鋳型としてヒトＣＨ４ドメインを使用することからなる。これらの２反応において、末端プライマーをヒトＣＨ３／イヌＣＨ３ドメインと相同性領域を生成するために使用し、その結果ヒトＣＨ３／イヌＣＨ３ドメインＤＮＡフラグメントの２つの末端が２つのヒトドメインＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そして３つのフラグメントがＰＣＲ反応における“メガプライマー”になる。ヒトＣＨ３／イヌＣＨ３ドメインは、２つのヒトドメインフラグメントに応じたいずれかの末端上の重複配列（５′末端上のＣＨ２相同性および３′末端上のＣＨ４相同性）を含むように設計された。次に全長産物を作製するために、末端プライマーを使用して、３つのＰＣＲフラグメント（ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３／イヌＣＨ３およびヒトＣＨ４）を最終ＰＣＲ反応で混合した。以下に方法を概説する：フラグメント１：プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７４‐Ａ４０４によるヒトＣＨ２ドメインの増幅により得られた（シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン）４１４ｂｐフラグメント；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。フラグメント２：先に記載した（ヒトＣＨ３／イヌＣＨ３ドメイン）３８４ｂｐフラグメント；ゲル精製したフラグメント３：プライマーＰ１７４−Ｓ７２１およびＰ１７２‐Ａ１ｂによるヒトＣＨ４ドメインの増幅により得られた（ヒトＣＨ４ドメイン）３４０ｂｐフラグメント；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。３つのゲル精製したフラグメントは、２つの末端プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７２‐Ａ１ｂを使用した最終ＰＣＲ反応に約等モル量添加され、ＰＣＲを３５サイクル行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（１．１ｋｂ）の遺伝子配列が増幅された。得られたフラグメントは、ＥｃｏＲ１およびＮｈｅＩで分解され、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏの対応する部位にサブクローニングされた。増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列は自動蛍光ＤＮＡ配列決定法により決定した。
ＩｇＥ‐３ワクチン構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）のクローニング：
構築物ＩｇＥ‐３の挿入物は、シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、続いてヒトＣＨ３／保存されたイヌＣＨ３配列、続いてヒトＣＨ４ドメインからなる。ＩｇＥ‐３挿入物の構築は、１ＰＣＲ反応のための鋳型としてシグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、および２番目のＰＣＲ反応のための鋳型としてヒトＣＨ４ドメインを使用することからなる。これらの２反応において、末端プライマーをヒトＣＨ３／保存されたイヌＣＨ３配列と相同性領域を作製するために使用し、その結果中間（ヒトＣＨ３／保存されたイヌＣＨ３配列）のＤＮＡフラグメントの２つの末端が２つのヒトドメインＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そして３つのフラグメントがＰＣＲ反応における“メガプライマー”になる。ヒトＣＨ３／保存されたイヌＣＨ３配列は、２つのヒトドメインフラグメントに応じたいずれかの末端上の重複配列（５′末端上のＣＨ２相同性および３′末端上のＣＨ４相同性）を含むように設計された。次に全長産物を作製するために、２つの末端プライマーを使用して、３つのＰＣＲフラグメント（ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３／保存されたイヌＣＨ３配列およびヒトＣＨ４）を最終ＰＣＲ反応で混合した。以下に方法を概説する：フラグメント１：プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７５‐Ａ４０４によるヒトＣＨ２ドメインの増幅により得られた（シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン）４１４ｂｐフラグメント；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。フラグメント２：先に記載した（ヒトＣＨ３／保存されたイヌＣＨ３配列）３８４ｂｐフラグメント；ゲル精製したフラグメント３：プライマーＰ１７５−Ｓ７１５およびＰ１７２‐Ａ１ｂによるヒトＣＨ４ドメインの増幅により得られた（ヒトＣＨ４ドメイン）３４０ｂｐフラグメント；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。３つのゲル精製したフラグメントは、２つの末端プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７２‐Ａ１ｂを使用した最終ＰＣＲ反応に約等モル量添加され、ＰＣＲを３５サイクル行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（１．１ｋｂ）の遺伝子配列が増幅された。得られたフラグメントは、ＥｃｏＲ１およびＮｈｅＩで分解され、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏの対応する部位にサブクローニングされた。増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列は自動蛍光ＤＮＡ配列決定法により決定した。
ＩｇＥ‐４ワクチン構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）のクローニング：
構築物ＩｇＥ‐４の挿入物は、シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、続いてヒトＣＨ３ドメイン、続いてヒトＣＨ４ドメインからなる。ＩｇＥ‐４挿入物の構築は、１ＰＣＲ反応のための鋳型としてシグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、および２番目のＰＣＲ反応のための鋳型としてヒトＣＨ４ドメインを使用することからなる。これらの２反応において、末端プライマーをヒトＣＨ３ドメインと相同性領域を作製するために使用し、その結果中間（ヒトＣＨ３ドメイン）のＤＮＡフラグメントの２つの末端が２つのヒトドメインＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そして３つのフラグメントがＰＣＲ反応における“メガプライマー”になる。ヒトＣＨ３ドメインは、２つのヒトドメインフラグメントに合わせたいずれかの末端上の重複配列（５′末端上のＣＨ２相同性および３′末端上のＣＨ４相同性）を含むように設計された。次に全長産物を作製するために、２つの末端プライマーを使用して、３つのＰＣＲフラグメント（ヒトＣＨ２、ヒトＣＨ３およびヒトＣＨ４）を最終ＰＣＲ反応で混合した。以下に方法を概説する：フラグメント１：プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７６‐Ａ４０４によるヒトＣＨ２ドメインの増幅により得られた（シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン）４１４ｂｐフラグメント；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。フラグメント２：先に記載した（ヒトＣＨ３ドメイン）３８４ｂｐフラグメント；ゲル精製したフラグメント３：プライマーＰ１７６−Ｓ７１０およびＰ１７２‐Ａ１ｂによるヒトＣＨ４ドメインの増幅により得られた（ヒトＣＨ４ドメイン）３４０ｂｐフラグメント；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。３つのゲル精製したフラグメントは、２つの末端プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７２‐Ａ１ｂを使用した最終ＰＣＲ反応に約等モル量添加され、ＰＣＲを３５サイクル行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（１．１ｋｂ）の遺伝子配列が増幅された。得られたフラグメントは、ＥｃｏＲ１およびＮｈｅＩで分解され、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏの対応する部位にサブクローニングされた。増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列は自動蛍光ＤＮＡ配列決定法により決定した。
ＩｇＥ‐５ワクチン構築物（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）のクローニング：
構築物ＩｇＥ‐５の挿入物は、シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、続いてラットＣＨ３ドメイン、続いてヒトＣＨ４ドメインからなる。ＩｇＥ‐５挿入物の構築は、１ＰＣＲ反応のための鋳型としてシグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン、および２番目のＰＣＲ反応のための鋳型としてヒトＣＨ４ドメインを使用することからなる。これらの２反応において、末端プライマーをラットＣＨ３ドメインと相同性領域を作製するために使用し、その結果中間（ラットＣＨ３ドメイン）のＤＮＡフラグメントの２つの末端が２つのヒトドメインＤＮＡフラグメントにハイブリダイズし、そして３つのフラグメントがＰＣＲ反応における“メガプライマー”になる。ラットＣＨ３ドメインは、２つのヒトドメインフラグメントに応じたいずれかの末端上の重複配列（５′末端上のＣＨ２相同性および３′末端上のＣＨ４相同性）を含むように設計された。次に全長産物を作製するために、２つの末端プライマーを使用して、３つのＰＣＲフラグメント（ヒトＣＨ２、ラットＣＨ３およびヒトＣＨ４）を最終ＰＣＲ反応で混合した。以下に方法を概説する：フラグメント１：プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７７‐Ａ４０１によるヒトＣＨ２ドメインの増幅により得られた（シグナル配列‐ヒトＣＨ２ドメイン）４１１ｂｐフラグメント；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。フラグメント２：先に記載した（ラットＣＨ３ドメイン）３８４ｂｐフラグメント；ゲル精製したフラグメント３：プライマーＰ１７７−Ｓ７１１およびＰ１７２‐Ａ１ｂによるヒトＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ‐６（３′））の増幅により得られた（ヒトＣＨ４ドメイン）３４１ｂｐ；フラグメントはＰＣＲ２５サイクルで増幅し、ゲル精製を行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。３つのゲル精製したフラグメントは、２つの末端プライマーＰ１７１−Ｓ１ｂおよびＰ１７２‐Ａ１ｂを使用した最終ＰＣＲ反応に約等モル量添加され、ＰＣＲを３５サイクル行った。すべての反応はＢＭＢ  Ｅｘｐａｎｄ  ＨＦ  ポリメラーゼ混合物および説明書に明示された条件を使用した。このＰＣＲ反応により正しいサイズ（１．１ｋｂ）の遺伝子配列が増幅された。得られたフラグメントは、ＥｃｏＲ１およびＮｈｅＩで分解され、プラスミドｐＣＩ−ｎｅｏの対応する部位にサブクローニングされた。増幅されたフラグメントのヌクレオチド配列は自動蛍光ＤＮＡ配列決定法により決定した。
【実施例４】
【０１０５】
抗‐イヌＩｇＥ抗体を持つワクチンのトランスフェクション、発現および反応性。
昆虫細胞におけるＩｇＥＣＨ３ドメインの発現：
スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳｆ９細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、Ｂａｃ‐Ｔｏ‐Ｂａｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｔｏｃｏｌに従ったＣｅｌｌ  ＦＥＣＴＩＮ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して組換えバクミドＤＮＡによりトランスフェクションされた。７２時間後に、上清を新鮮なサブコンフルエントＳｆ９細胞に継代した。７日目に感染後細胞変性効果（ＣＰＥ）は明らかであった。上清を採取し、４℃で遮光して保存した。標本は電気泳動（４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  還元条件）により分析した。デュプリケートゲルの一つはクマシーブルーで染色し、他は標準ウェスタンブロット転位法を使用して、ＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ）にトランスファーした。膜はウサギ＃１４５  ＲＢＳ‐２ポリクローナル抗血清およびＡＰ−ｒｅｃＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Ｚｙｍｅｄ）により分析した。明確な約１４．５ｋＤａのバンドがクマシー染色ゲル（図１）およびウェスタンブロット（図２）でともに明らかで、ＣＨ３蛋白質の発現を示した。
【０１０６】
本発明の配列は表９に記載される。
【０１０７】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】還元条件下で４−１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した、バキュロウイルス発現ヒトＣＨ３ドメイン。１１ｋＤＡ  ＣＨ３ドメインはレイン４に見ることができる。ｓｆ−９細胞対照（レイン２）または野生型バキュロウイルス（レイン３）では、対応するバンドは観察されなかった。分子量標準（ｋＤａ）の位置はレイン１に示す。
【図２】ウサギＡ＃１４５ＲＢＳ−２抗血清によるバキュロウイルス発現ヒトＣＨ３ドメインのイムノブロッティング。標本は還元条件下で４−１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。１１ｋＤＡ  ＣＨ３ドメインはレイン４に見ることができる。ｓｆ−９細胞対照（レイン２）または野生型バキュロウイルス（レイン３）では、バンドは見られなかった。分子量標準（ｋＤａ）の位置はレイン１に示す。
【図１】
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【図２】
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