(57)【要約】【課題】ＦＥＴのゲート表面を改質して、核酸の電荷が表面に最も近く位置可能に誘導して感度を顕著に向上させたＦＥＴ型のバイオセンサーを提供する。【解決手段】核酸の側面に結合可能なリガンドをゲート表面に導入されてなることを特徴とするソース、ゲートおよびドレイン電極を有するＦＥＴ型のバイオセンサーを提供する。【選択図】図４Ａ
2006201178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の側面に結合可能なリガンドをゲート表面に導入されてなることを特徴とするソース、ゲートおよびドレイン電極を有するＦＥＴ型のバイオセンサー。
【請求項２】
前記核酸の側面に結合可能なリガンドは、インターカレーターまたはグルーブバインダーであることを特徴とする請求項１に記載のＦＥＴ型のバイオセンサー。
【請求項３】
前記インターカレーターは、非イオン性の芳香族化合物であることを特徴とする請求項２に記載のＦＥＴ型のバイオセンサー。
【請求項４】
前記グルーブバインダーは、二つ以上の水素結合部位を有することを特徴とする請求項２に記載のＦＥＴ型のバイオセンサー。
【請求項５】
前記ゲート表面は、Ａｕ、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２およびＡｌ２Ｏ３からなる群から選択されたいずれか一種の材質からなることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項に記載のＦＥＴ型のバイオセンサー。
【請求項６】
ゲート表面への核酸の側面に結合可能なリガンドの導入は、溶液中での前記核酸のハイブリダイゼーションの後に行われることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項に記載のＦＥＴ型のバイオセンサー。
【請求項７】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されたことを特徴とする請求項１〜６いずれか１項に記載のＦＥＴ型のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソース、ゲートおよびドレイン電極を有するＦＥＴ（電界効果トランジスタ（Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ））型のバイオセンサーに係り、特にゲート表面の改質により感度を向上させたＦＥＴ型のバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムプロジェクトの完成により、人間のＤＮＡ配列が知られるにつれて、各遺伝子の機能およびそれらによりコードされた蛋白質などについての研究がさらに活発になりつつあり、バイオ物質を容易に検出できるバイオセンサーについての必要性が増大している。
【０００３】
電気的なシグナルを使用してバイオ物質を検出できるバイオセンサーは、特許文献１〜４に開示されている。特許文献１は、特定の抗体に対して反応する抗原を備えるように設計された一般的なソースおよびドレインで構成されたＦＥＴを開示している。このＦＥＴを使用する場合ドレイン電流の変化を経時的に観察して、溶液中の抗原の濃度を測定することができる。
【０００４】
特許文献２は、ソースおよびドレイン領域にドーピングされており、ゲートがソースおよびドレイン領域にわたって形成されており、測定しようとするヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドがゲート上に結合されている形態のＦＥＴを開示している。
【０００５】
特許文献３は、化学的試片と反応して導電性に変わる性質を有する有機絶縁物質であるフタロシアニンの薄膜がゲートとドレインとを連結する構造のＦＥＴを開示している。
【０００６】
特許文献４は、相異なる結合の感度が向上するように、ゲートに分子受容体が結合しているＦＥＴの二つを並列に連結させたバイオセンサーを開示している。
【０００７】
図１は、従来のＦＥＴの基本構造を示す図面であって、ＦＥＴのゲート表面に目的のオリゴヌクレオチドを固定化することができ、図１ではｓｓＤＮＡが例示されている。図２は、従来のＦＥＴにおいて、ゲート表面に固定化したオリゴヌクレオチドが所望の相補的なＤＮＡと結合したときに発生する電荷量の増加を測定する過程を示す概略図である。図２では前記オリゴヌクレオチドとしてｓｓＤＮＡが例示されている。図３Ａおよび図３Ｂは、従来のイムノＦＥＴにおけるデバイ長の重要性を示す図面である。表面に固定化された分子が大きいほど、デバイ長内でシグナルを検出し難い。図３Ｂに示すように、（ａ）イオンの強度が高いときには、デバイ長ｄＡｂが短いためＡｇ−Ａｂ反応によるシグナルを検出し難いが、（ｂ）イオンの強度が低いときには、デバイ長ｄＡｂが長いためＡｇ−Ａｂ反応によるシグナルを検出できる。
【０００８】
従来の技術は、ＦＥＴのゲート表面にオリゴヌクレオチドを固定化した状態を基本とした。この方法は、既存のマイクロアレイで多く使われた方法である。マイクロアレイでは問題とならないが、ゲート表面で起きるハイブリダイゼーション反応に起因した空乏領域が最も重要であるＦＥＴセンサーの場合、デバイ長内の電荷が最も重要であり、デバイ長内の電荷のみが空乏領域を誘導できる。効率的に空乏領域を誘導するためには、表面の構造が重要であり、ＤＮＡが直立した構造よりはゲート表面と水平をなしてＤＮＡとゲートとの接触面が多いほうが有利である。
【特許文献１】米国特許第４，２３８，７５７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７７７，０１９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４３１，８８３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８２７，４８２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、既存のＦＥＴセンサーは、前述したようにマイクロアレイで多く使われた表面固定化方法を利用するため、効率的な空乏領域を得難い。また、ＦＥＴのゲート表面に目的のオリゴヌクレオチドを固定化した形態であるため、ハイブリダイゼーション過程で問題が生ずる。表面にプローブを固定する場合、プローブの固定化に長時間かかり、さらに一本鎖とプローブとを溶液中でハイブリダイズさせるのにも長時間要する。ほとんどのＤＮＡハイブリダーゼーションは、溶液中で行われるが、ＦＥＴセンサーの場合、デバイ長を最大にするために低いイオン強度のバッファ溶液を利用する。かかるバッファの場合、センサー側面では有利であるかも知れないが、ＤＮＡハイブリダーゼーション効率を低下させる。すなわち、実際のゲート表面で起きるハイブリダーゼーションを阻害し、シグナルが低くなる。このため、前記問題点を解決する手段が求められている。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、ＦＥＴのゲート表面を改質し、核酸の電荷が表面に最も近く位置するように誘導することにより感度を顕著に向上させたＦＥＴ型のバイオセンサーを提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記従来技術の問題点を克服するために鋭意検討した結果、ＦＥＴセンサーのゲート表面を改質すれば、ＤＮＡ骨格が表面に吸着されてデバイ長内でシグナルを効果的に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
本発明の目的を達成するために、本発明は、核酸の側面に結合可能なリガンドをゲート表面に導入されてなることを特徴とするソース、ゲートおよびドレイン電極を有するＦＥＴ型のバイオセンサーを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ＦＥＴセンサーのゲート表面を核酸の側面に結合可能なリガンドで処理することにより、溶液中に存在する核酸をゲート表面に吸着させることを可能とした。吸着の形態も、従来技術のようにゲート表面に直立する形状ではなく、ゲート表面に水平に結合して効率的な空乏領域の誘導を可能にするものである。また、高いイオン強度でハイブリダイズされたサンプルをＦＥＴセンサーに注入できるので、ハイブリダイゼーション効率が低下するという既存センサーの短所を克服したという点で有利な効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、ＦＥＴは、従来のバイオセンサーまたはＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ））素子などに使用されるどんなＦＥＴも使用可能で、ｎ−ＭＯＳやｐ−ＭＯＳのいずれも使用可能である。前記ＦＥＴは、キャリア（自由電子または正孔）を供給するソース電極、前記ソースで供給されたキャリアが到達するドレイン電極、および前記ソースとドレインとの間のキャリアの流れを制御するためのゲート電極から構成され、基本構造は図１に示した構造を適用することができる。前記ＦＥＴタイプのバイオセンサーは、電解質内でＤＮＡのような核酸の固定化やハイブリダイゼーションの測定時に好ましくは使用され、最も望ましいバイオセンサーの形態は、前記核酸のハイブリダイゼーションを標識なしに検出できる。
【００１５】
本発明では、前記ＦＥＴのゲート表面に核酸の側面に結合可能なリガンドを導入して、そのリガンドを通じて核酸がＦＥＴのゲート表面に平行になり、ＤＮＡ骨格がゲート表面にできる限り近いところで吸着されることによって、デバイ長内で核酸のハイブリダイゼーション反応のシグナル検出を容易に行うことができる。すなわち、ゲート絶縁層の下部に空乏領域を効果的に誘導することによって、ソース電極とドレイン電極との間にｎ型またはｐ型のチャンネルを形成する。
【００１６】
本発明のバイオセンサーにおいて、前記核酸の側面に結合可能なリガンドとは、一本鎖または二本鎖である核酸の鎖の末端に結合せずに核酸の側面に非共有結合的に結合するリガンドを意味し、好ましくは、核酸のスタッキングされた塩基対の間に疏水性相互作用などにより結合するインターカレーター、または核酸のらせん構造の主溝（メジャーグルーブ）または小溝（マイナーグルーブ）に水素結合などにより結合するグルーブバインダーである。それらのリガンドは、二本鎖だけでなく一本鎖にも結合するが、二本鎖との結合が熱力学的にさらに安定であるので、表面に一本鎖と二本鎖が混在する場合には二本鎖との結合のみが行われる。すなわち、ハイブリダイズされた二本鎖と、ハイブリダイズされていない一本鎖とが存在する場合に、リガンドはハイブリダイズされた二本鎖にのみ結合するので、本発明のＦＥＴがセンサーとしての役割を果たすことが可能なのである。
【００１７】
本発明のバイオセンサーにおいて、前記インターカレーターは、核酸のスタッキングされた塩基対の間に疏水性相互作用などにより結合できるいかなるリガンドも含むが、非イオン性の芳香族化合物であることが好ましい。もし、正電荷を有すれば、一本鎖と二本鎖を区別せずに負電荷を有するいずれの核酸とも結合し、負電荷を有すれば、同種の電荷間の排斥力により核酸の結合を妨害するおそれがあるので非イオン性であることが好ましい。また、スタッキングされた疏水性の塩基の間に挿入するために芳香族環を有する化合物であることが好ましい。前記インターカレーターの例としては、ナフタレン、アントラセン、ピレン、フェナントレン、アクリジン誘導体、またはダウノマイシンなどを挙げることができる。
【００１８】
本発明のバイオセンサーにおいて、前記グルーブバインダーには、核酸のらせん構造の主溝または小溝に水素結合などにより結合できるいかなるリガンドも含まれるが、円滑な結合のためには、二つ以上の水素結合部位を有することが好ましい。前記メジャーグルーブバインダーの例としては、メチルグリーンなどを挙げることができ、マイナーグルーブバインダーの例としては、ネトロプシン、ベレニル、ジスタマイシンＡ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）などを挙げることができる。
【００１９】
本発明のバイオセンサーにおいて、前記ゲート表面は、前記核酸の側面に結合可能なリガンドが結合されうるいかなる材質からも構成されうるが、好ましくは、Ａｕ、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、およびＡｌ２Ｏ３からなる群から選択されたいずれか一種の材質からなることを特徴とする。前記Ａｕは、インターカレーターやグルーブバインダーの変性チオール基と結合し、前記ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、またはＡｌ２Ｏ３は、インターカレーターやグルーブバインダーの変性シラン基またはカルボキシ基と結合して安定な薄膜を形成できる。
【００２０】
本発明のバイオセンサーにおいて、前記核酸が、好ましくは、溶液中でハイブリダイズした後、二本鎖の核酸の側面に結合可能なリガンドに結合し、ゲート表面に核酸は移動する。従来のバイオセンサーでは、ハイブリダイゼーションされる二本鎖の核酸のうち一本鎖のプローブ核酸をゲート表面に共有結合で固定化させた後でゲート表面上でハイブリダイゼーション反応を行うが、本発明のバイオセンサーでは、前記プローブ核酸をゲート表面に共有結合で直接固定化せず、同一あるいは他の容器中でプローブ核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションを行った後でゲート表面に導入することを特徴とする。
【００２１】
従来のバイオセンサーでは、プローブの固定化に長時間かかり、さらに一本鎖とプローブを溶液中でハイブリダイズさせるのにも長時間要した。デバイ長を考慮してほとんどのＦＥＴは、低いイオンの強度でシグナルを測定するが、低いイオンの強度では、ハイブリダイゼーションも円滑に行われ難い。したがって、ハイブリダイゼーション効率およびデバイ長の観点から本発明に従ったハイブリダイゼーションを行った。
【００２２】
本発明のバイオセンサーにおいて、前記核酸は、多様な核酸、類似核酸、またはそれらの組み合わせを意味するが、好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２３】
以下、図面を参照して、本発明をさらに具体的に説明する。
【００２４】
図４Ａは、本発明のＦＥＴ型のバイオセンサーの概略図であり、図４Ｂは、本発明のＦＥＴ型のバイオセンサーに二本鎖の核酸が結合した状態を示す概略図である。本発明のＦＥＴ型のバイオセンサーは、表面全体にＤＮＡが結合するＤＮＡ結合領域およびＤＮＡの電荷に起因した空乏領域のシグナルを測定するシグナル検出領域から構成される。ＤＮＡ結合領域は、インターカレーターやグルーブバインダーなどがＡｕやＳｉＯ２、ＴｉＯ２などのゲート表面に結合した領域であり、シグナル検出領域は、ソース、ドレインおよびその間のゲート電極を備えるＦＥＴを基本構造として有する領域である。本発明によれば、前記インターカレーターやグルーブバインダーを利用して、一本鎖または二本鎖ＤＮＡがゲート表面に水平に吸着するため、効率的な空乏領域の誘導を可能にする。
【００２５】
図５は、本発明のＦＥＴ型のバイオセンサーを利用して核酸のハイブリダイゼーションを検出する過程を概略的に示す順序図である。まず、ＦＥＴのゲート表面上にインターカレーターやグルーブバインダーを導入した後、プローブを注入し、ハイブリダイゼーションサンプルを注入して溶液中でハイブリダイゼーションを行った後、前記インターカレーターやグルーブバインダーに特異的に結合させる。これによってデバイ長内に電荷を集中させることができ、結果としてハイブリダイゼーションのＳＮＲ（シグナル−ノイズ比（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  Ｎｏｉｓｅ  Ｒａｔｉｏ））を効果的に改善できる。
【００２６】
本発明のバイオセンサーは、フォトリソグラフィを利用してシリコン基質の表面にエッチングにより形成するか、または別途に組み立てた後で基質の表面に付着させることによって生成されうる。本発明において、シリコン、ガラス、溶融シリカ、プラスチックおよびポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のような各種ポリマーなどの多様な物質をバイオセンサーの基質とすることができる。
【００２７】
具体的に、本発明のバイオセンサーを製造するために、好ましくは、まず、半導体基板の表面に酸化膜を形成する。次いで、前記基板の表面をエッチングして反応のための微細チャンバーや微細流路を形成した後、前記微細チャンバーや微細流路の側壁または底部に不純物をドーピングして不純物領域を形成し、前記基板をエッチング液で処理して前記側壁または底部に形成された不純物領域の一部を除去して、ＦＥＴのチャンネル領域を定める。次いで、前記チャンネル領域上に酸化膜を形成した後、前記チャンネル領域上に例えばＡｕからなるゲート電極を形成してバイオセンサーを完成する。例えば、前記ＦＥＴのゲート電極はＡｕ薄膜で形成され、前記ゲート電極の表面には、チオール基により核酸の側面に付着可能なリガンドが自己組立単層法により付着される。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明する。それらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲がそれらの実施例により制限されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
本実施例において、１０００Åの厚さのＳｉＯ２層を有するシリコン基板にカップリング剤（γ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ））を結合させた後、インターカレーターを導入した。インターカレーターの導入は、蛍光スキャナーを利用して確認し、オリゴヌクレオチドと相補的なシーケンスとをハイブリダイズさせ、インターカレーターを通じて基板上に固定させた後、蛍光スキャナーでハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドのインターカレーションを確認した。
【００３０】
１）シリコン基板上にカップリング剤（ＧＡＰＳ）を結合
まず、表面処理前に基板を洗浄した。洗浄は、純水アセトンと水とで行い、次いで、過酸化水素および硫酸（１：３）からなるピラニア溶液を使用して有機汚染物を除去した。最後に、多量の水とアセトンとで洗浄した後で乾燥した。前記基板洗浄過程は、半導体製造工程で利用されるウェットステーションを利用し、ピラニア溶液は硫酸槽を利用し、水で洗浄する過程はＱＤＲという工程を利用した。それぞれの基板をテフロン材質のシリコンウェーハキャリアに固定して洗浄工程を行った。洗浄が終わった基板を、スピンドライを利用して乾燥した。
【００３１】
洗浄後、エタノール中のＧＡＰＳ溶液（濃度２０％（ｖ／ｖ））、またはγ−アミノプロピルジエトキシシラン（ＧＡＰＤＥＳ）溶液（濃度２０％（ｖ／ｖ））で基板をスピンコーティングした。スピンコーティングは、ＣＥＥ社のスピンコーターモデルＣＥＥ７０を利用した。スピンコーティングは、初期コーティング５００ｒｐｍ／１０ｓｅｃおよび主コーティング２０００ｒｐｍ／１０ｓｅｃにより行われた。スピンコーティングが完了した後、基板をテフロンウェーハキャリアに固定して１２０℃で４０分間硬化させた。硬化された基板を、水に１０分間浸漬させた後、１５分間超音波洗浄、再び水で１０分間浸漬した後で乾燥した。乾燥は、スピンドライを通じて行った。乾燥が完了した基板は、実験のために矩形にカットして利用した。これらの全過程は、ホコリ粒子が十分に除去されたクリーンルームクラス１０００で行った。
【００３２】
２）インターカレーターの導入
前記シラン化基板上にインターカレーターをコーティングした。インターカレーターはピレンを利用し、インターカレーターのコーティングは浸漬方法で行った。まず、塩化メチレン（ＭＣ）溶液に１−ピレン酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（以下、ピレン化合物とする）を溶かして浸漬溶液｛（０．５ｇピレン／２００ｍｌＭＣ）＋０．１ｍｌトリエチルアミン｝を製造した。浸漬溶液と基板とを反応容器に入れ、室温で５時間反応させた。反応が完了した後、浸漬溶液から基板を取り出し、基板を洗浄した。ＭＣで各１０分ずつ３回洗浄を行い、次にエタノールで各１０分ずつ３回洗浄を行い、その後乾燥した。基板と反応したピレンの量をＡｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ蛍光スキャナーを利用して定量した。このとき、５３２ｎｍの光を照射し、５７０ｎｍでの蛍光強度を得た。
【００３３】
３）基板に導入されたインターカレーターのオリゴヌクレオチドへのインターカレーション
前記２で製造されたピレン化合物がコーティングされた基板上にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを結合させる。Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドとそれに相補的なオリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション反応させた後、ピレンがコーティングされた基板上でインターカレーションさせる。Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドは、配列番号１：３’−ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＣＡ−５’で構成された１５個の塩基配列を有し、それと相補的なオリゴヌクレオチドは、配列番号２：３’−ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ−５’で構成された１５個の塩基配列を有する。前記二つのオリゴヌクレオチドを１時間程度ハイブリダイズさせた後、ピレン化合物がコーティングされた基板で３時間程度インターカレーションさせる。反応が終った後、基板を洗浄し、蛍光スキャナーでハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド量を測定する。図６は、ピレンの結合後の蛍光写真と、Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドの結合後の蛍光写真とを比較した図面代用写真である。図６よりピレンが効果的にインターカレーションされたことが分かる。図７Ａは、ｓｓＤＮＡが本発明のバイオセンサーのインターカレーターと塩基同士の積み重なり（ベーススタッキング）を起こすことを示す概略図であり、図７Ｂは、ｄｓＤＮＡが本発明のバイオセンサーのインターカレーターにインターカレーションされたことを示す概略図である。図７Ａに示すように、ｓｓＤＮＡのターゲットのみを添加してもある程度バックグラウンド蛍光があるため、ｓｓＤＮＡがベーススタッキングされることが分かる。図７Ｂに示すように、ｄｓＤＮＡがインターカレーションされたときには蛍光がさらに強く、本発明のインターカレーターは、二本鎖の核酸に非常によく結合することが分かる。
【００３４】
（実施例２）
本実施例において、ＦＥＴ素子のゲート表面にインターカレーターを導入して電気的シグナルの変化を観察した。ゲート表面を改質するために、本実施例では、Ｎ−ピレン−２−アミノエタンチオール（ピレンチオール）を合成して使用した。ピレンチオールは、チオール官能基とピレンを有し、チオール官能基によってゲート表面に固定され、ピレンによってオリゴヌクレオチドやＤＮＡをインターカレーションさせうる。本実施例に利用されたＦＥＴ素子は、三星半導体で製作し、本実施例に適するようにゲート上端をＡＵの材質で蒸着したものである。
【００３５】
１）ＦＥＴ素子の洗浄
既存のＦＥＴ素子と異なり、ゲート部分をＡｕで処理したので、Ａｕ−Ｓ結合を利用してゲート表面にピレンチオールを導入した。まず、ＦＥＴ素子を過酸化水素および硫酸（１：３）からなるピラニア溶液を使用して有機汚染物を除去した。次に、多量の水で洗浄し、乾燥した。
【００３６】
２）ピレンチオールの結合を電気的シグナルで確認
乾燥したＦＥＴ素子をパラメータアナライザーに連結し、０．１×ＰＢＳ溶液にＦＥＴ素子を浸漬させて安定化させた。ＦＥＴ素子が安定化したら、ピレンチオールを０．１×ＰＢＳ溶液に添加する。ピレンチオールの末端のチオール官能基により、流れる電流量が増加し、シグナルが検出される。チオール結合によるシグナル変化が安定化したら、再び０．１×ＰＢＳ溶液を添加してＦＥＴ素子を洗浄する。洗浄後の電流量は、ピレンチオールが結合する前の電流量より増加した。これは、ゲート表面にピレンチオールが効果的に結合したことを意味する。図８は、ＦＥＴ表面にインターカレーター（ピレンチオール）を導入したときの電流の増加を測定したグラフである。
【００３７】
（実施例３）
本実施例において、ＦＥＴ素子のゲート表面をインターカレーターで改質し、ＤＮＡが表面に最も近く位置するように誘導することによって、シグナルが変化するかどうかを観察した。ゲート表面を改質するために、本実施例では、前記ピレンチオールを利用した。オリゴヌクレオチドの結合による電気的シグナルの変化を観察するために、相補的なオリゴヌクレオチド対および非相補的なオリゴヌクレオチド対を利用した。
【００３８】
１）ＦＥＴ素子にインターカレーターを導入
ＦＥＴ素子のゲート部分にインターカレーターを導入した。既存のＦＥＴ素子と異なり、ゲート部分をＡｕで処理したので、Ａｕ−Ｓ結合を利用してゲート表面にインターカレーターを導入した。まず、ＦＥＴ素子を過酸化水素および硫酸（１：３）からなるピラニア溶液を使用して有機汚染物を除去した。次に、多量の水で洗浄し、その後乾燥した。ピレンチオールとメルカプトプロパノールとを１：２の割合で混ぜた溶液に、洗浄乾燥したＦＥＴ素子を２０分間浸漬させ、ＭＣ溶液で２分間超音波洗浄した後、乾燥した。
【００３９】
２）ＦＥＴ素子を利用した電気的検出−相補的（ＰＭ）である場合
パラメータアナライザーにＦＥＴ素子を連結し、安定化のために０．１×ＰＢＳ溶液にＦＥＴ素子を浸漬させた。本実施例で利用したゲート印加電圧は、２Ｖである。ＦＥＴ素子が安定化したら、プローブオリゴヌクレオチドを注入する。プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号３：３’−ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ−５’塩基配列を有し、４００ｐＭ濃度をＦＥＴ素子に注入した。若干の電気的シグナルの変化が観察されるが、あまり大きくない。シグナルが安定化したら、０．１×ＰＢＳ溶液で洗浄する。洗浄後に電流量が安定化したら、相補的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションされた溶液を注入した。注入されたオリゴヌクレオチドは、配列番号３：３’−ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ−５’および配列番号４：３’−ＣＡＡ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＡＣＡ−５’の塩基配列を有し、それぞれ４００ｐＭ、４０ｎＭ濃度である。ハイブリダイゼーションされたオリゴヌクレオチドであるため、二本鎖の構造を有するので、インターカレーションが可能な構造である。このため、電流量は非常に増加した。安定化した後、０．１×ＰＢＳ溶液で洗浄する。図９は、インターカレーターが導入されたＦＥＴ表面に、互いに相補的な塩基配列を有するハイブリダイゼーションされたｄｓＤＮＡを添加した場合の、電流の増加を測定したグラフである。
【００４０】
３）ＦＥＴ素子を利用した電気的検出−非相補的（ＭＭ）である場合
パラメータアナライザーにＦＥＴ素子を連結し、安定化のために０．１×ＰＢＳ溶液にＦＥＴ素子を浸漬させた。本実施例で利用したゲート印加電圧は、２Ｖである。ＦＥＴ素子が安定化したら、プローブオリゴヌクレオチドを注入する。プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号３：３’−ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ−５’塩基配列を有し、４００ｐＭ濃度をＦＥＴ素子に注入する。若干の電気的シグナルの変化が観察されるが、あまり大きくない。シグナルが安定化したら、０．１×ＰＢＳ溶液で洗浄する。洗浄後に電流量が安定化したら、非相補的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションされた溶液を注入する。注入されたオリゴヌクレオチドは、配列番号３：３’−ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ−５’および配列番号５：３’−ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＣ−５’の塩基配列を有し、それぞれ４００ｐＭ、４０ｎＭ濃度である。ハイブリダイゼーション過程を経たが、非相補的な塩基配列を有するので、二重鎖の構造をなさずにインターカレーションが不可能な構造である。電流量はほとんど変化がなかった。安定化した後、０．１×ＰＢＳ溶液で洗浄する。図１０は、インターカレーターが導入されたＦＥＴ表面に非相補的な塩基配列を有する２種のｓｓＤＮＡを注入した場合の電流の増加を測定したグラフである。
【００４１】
図１１は、本発明のインターカレーターなどが導入されていない既存のＦＥＴを有し、本実施例と同一に実験したデータである。チオール＋ＤＮＡ反応後に電流が２０２μＡ増加し、スペーサ（チオール）反応後に電流が４０μＡ増加し、ハイブリダイゼーション以後に電流が２８μＡ減少した。デバイ長内で起きた反応であれば、電流量が増加せねばならないが、本発明と異なり、電流が減少する結果を表せた。すなわち、チオール＋ＤＮＡは、デバイ長内で反応が誘導されて電流が減少する正常的な挙動を表すが、ハイブリダイゼーション後のシグナル変化は、正常的な挙動ではない。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、バイオ物質検出関連の技術分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】従来のＦＥＴの基本構造を示す図面である。
【図２】従来のＦＥＴにおいて、ゲート表面に固定化されたオリゴヌクレオチドが所望する相補的なＤＮＡと結合する過程を示す概略図である。
【図３Ａ】従来のイムノＦＥＴにおいて、デバイ長の重要性を示す図面である。
【図３Ｂ】従来のイムノＦＥＴにおいて、デバイ長の重要性を示す図面である。
【図４Ａ】本発明のＦＥＴ型のバイオセンサーの概略図である。
【図４Ｂ】本発明のＦＥＴ型のバイオセンサーに二本鎖の核酸が結合した状態を示す概略図である。
【図５】本発明のＦＥＴ型のバイオセンサーを利用して核酸のハイブリダイゼーションを検出する過程を概略的に示す順序図である。
【図６】ピレンの結合後の蛍光写真と、Ｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドの結合後の蛍光写真とを比較した図面である。
【図７Ａ】ｓｓＤＮＡが本発明のバイオセンサーのインターカレーターにベーススタッキングされたことを示す概略図である。
【図７Ｂ】ｄｓＤＮＡが本発明のバイオセンサーのインターカレーターにインターカレーションされたことを示す概略図である。
【図８】ＦＥＴの表面にインターカレーター（ピレンチオール）を導入した場合の電流の増加を測定したグラフである。
【図９】インターカレーターが導入されたＦＥＴの表面に互いに相補的な塩基配列を有するハイブリダイゼーションされたｄｓＤＮＡを注入した場合の電流の増加を測定したグラフである。
【図１０】インターカレーターが導入されたＦＥＴの表面に非相補的な塩基配列を有する２種のｓｓＤＮＡを注入する場合、電流の増加を測定したグラフである。
【図１１】本発明のインターカレーターなどが導入されていない既存のＦＥＴの実験データである。
【図１】
2006201178.tif 000003
【図２】
2006201178.tif 000004
【図３Ａ】
2006201178.tif 000005
【図３Ｂ】
2006201178.tif 000006
【図４Ａ】
2006201178.tif 000007
【図４Ｂ】
2006201178.tif 000008
【図５】
2006201178.tif 000009
【図８】
2006201178.tif 000010
【図９】
2006201178.tif 000011
【図１０】
2006201178.tif 000012
【図１１】
2006201178.tif 000013
【図６】
2006201178.tif 000014
【図７Ａ】
2006201178.tif 000015
【図７Ｂ】
2006201178.tif 000016
【配列表】
2006201178000001.app