(57)【要約】 【課題】  インスリン等の外来刺激に依存的なGLUT4の膜移行活性測定に極めて適している培養筋細胞を提供し、更に、その細胞を用いるGLUT4の膜移行活性の測定方法を提供すること。【解決手段】  野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞を混合培養することによって得られる、該組換え型GLUT4を構成的に発現する分化型培養筋管細胞、及び、該細胞用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法、特に外来刺激依存的な糖取り込み活性の測定方法。  【選択図】    図５
2006340637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞を混合培養することによって得られる、該組換え型GLUT4を構成的に発現する分化型培養筋管細胞。
【請求項２】
外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を有する請求項１記載の分化型培養筋管細胞。
【請求項３】
組換え型GLUT4の細胞内部位に更に標識物質が結合している、請求項１又は２記載の分化型培養筋管細胞。
【請求項４】
標識物質が抗原エピトープである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
【請求項５】
野生型筋芽細胞と、組換え型筋芽細胞との混合培養における細胞数の比が100:1〜1:100の割合である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
【請求項６】
更に、他のタンパク質を発現する外来性遺伝子が導入されている組換え型筋芽細胞を加えて混合培養することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
【請求項７】
筋芽細胞がマウス筋芽細胞株C2C12である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞を用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞を固定した後、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
【請求項９】
標識物質の量を該標識物質に対する抗体を用いた免疫染色法により測定することを特徴とする、請求８項に記載の測定方法。
【請求項１０】
分化型培養筋管細胞をヒト以外の動物体内に移植し、生着した後に再び取り出した該細胞を使用することを特徴とする、請求項８又は９記載の測定方法。
【請求項１１】
請求項１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞を用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4及び該細胞膜上に移行した後に再び細胞内に取り込まれた組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
【請求項１２】
標識物質に対する抗体を含む培養液中で分化型培養筋管細胞を培養し、その後、該細胞抽出液中に含まれる標識物質の量を測定することを特徴とする、請求項１１記載の測定方法。
【請求項１３】
標識物質の量を該標識物質に対する抗体との抗原抗体反応を利用して測定する、請求項１２記載の測定方法。
【請求項１４】
該分化型培養筋管細胞をヒト以外の動物体内に移植し、生着した後に再び取り出した該細胞を使用することを特徴とする、請求項１１記載の測定方法。
【請求項１５】
標識物質に対する抗体を動物血液中に注射し、生着した分化型培養筋管細胞の膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位にある標識物質と反応させる、請求１４に記載の測定方法。
【請求項１６】
請求項８〜１５の何れか一項に記載の膜移行活性の測定方法を用いる、外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法。
【請求項１７】
インスリン存在下での請求項１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞を培養することによりインスリン刺激を与えた後、標識物質の量を測定することを特徴とする、請求項１６記載の測定方法。
【請求項１８】
外来刺激が、請求項１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞の培養中に電気パルスを１〜１００V、０．０１〜１０Hz、０．０１〜５００ｍｓで０．５〜２００時間かけることで与えられる電気刺激である、請求項１６記載の測定方法。
【請求項１９】
動物にインスリンを投与することによって外来刺激を与える、請求項１６記載の測定方法。
【請求項２０】
動物を強制的に運動させることによって外来刺激を与える、請求項１６記載の測定方法。
【請求項２１】
請求項８〜２０の何れか一項に記載の膜移行活性の測定方法を利用した、筋肉を標的とする薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞をヒト以外の動物に動物体内に移植し、生着した後に、薬剤を付加された、標識物質に対する抗体を動物に投与することから成る、該細胞が生着した組織又は臓器に該薬剤を運搬する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖輸送担体の膜移行活性が測定可能な筋管細胞、及び、該筋管細胞を用いるインスリン等の外来刺激依存的な糖輸送担体膜移行活性の測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉の生命維持や運動に必要なエネルギーは、主にインスリンや運動など様々な外来刺激に応答して取り込まれた糖を細胞内で代謝することで産生される。このような糖の細胞内への輸送は、これまでに１３種類ほど同定されている促通拡散型糖輸送担体（グルコーストランスポーター；ＧＬＵＴ）ファミリーを介して達成される。
【０００３】
特にインスリンによって誘導される糖の取り込み亢進は生理的に重要であり、現在、爆発的に患者数が増加している２型糖尿病では、この生理現象に著しい障害が惹起されていることが知られている。すなわち、インスリン刺激に応答した筋肉への糖取り込みが著しく減弱しており（インスリン抵抗性＝インスリン反応性の減弱）、これがその発症の引き金となっている場合が多い。また、食後に上昇する血糖の大部分(70-85%)は、インスリンの刺激により筋組織において取り込まれることからも、筋組織は生体全体の血糖のコントロールに非常に重要な役割を果たしている。
【０００４】
そのため、筋細胞でのインスリン依存的な糖取り込み活性を正確に測定することは、基礎研究の分野のみならず、インスリン感受性を増加させる薬剤の開発、さらにはインスリン感受性を低下させる原因の探索、糖尿病初期段階での診断など多岐にわたる産業への応用に必須となっている。
【０００５】
インスリンに反応して糖の取り込みの亢進が促進される筋組織や脂肪組織では、インスリンの刺激に反応して活性化されるGLUT4が臓器特異的に発現している。GLUT4は、インスリンの刺激がない場合は細胞膜上にはほとんど露出しておらず、細胞内の小胞群に組み込まれた状態で存在している。
【０００６】
一方、インスリンの刺激は、この細胞内小胞に存在するGLUT4蛋白の細胞膜上への運搬を促進することにより、細胞膜表面に露出するGLUT4蛋白の量を増加させることができる。すなわち、インスリンによる糖の取り込み亢進は、このインスリン依存的なGLUT4蛋白の細胞膜への移行（GLUT4の膜移行）によって達成されている。このインスリンに依存したGLUT4の膜移行は、他のGLUTファミリーにはないGLUT4蛋白に特有な特徴といえる。
【０００７】
従来、筋肉でのインスリン依存的な糖取り込み活性の測定は、筋全体での糖取り込みがインスリンによってどのように変化するかを、ラジオアイソトープラベルされた2デオキシグルコース取り込み量などを指標に測定する方法が用いられている。ところが、この方法では、筋肉など基礎的なエネルギー消費が高い組織・臓器で散見される、基底状態の糖取り込み、すなわちインスリン非依存的な糖取り込み活性が高い場合、純粋にインスリンに反応した糖の取り込み亢進量だけを正確に測定しづらい、あるいは測定できない欠点がある（非特許文献１、２）。
【０００８】
そこで、インスリン依存的な糖取り込み活性を、より正確に判定するためには、インスリン依存的なGLUT4の細胞膜への移行量を正確に測定することが最適の方法である。内在性GLUT4の細胞内局在変化をウエスタンブロット法などの技術を用いて追跡する方法もある。しかし、この方法は細胞抽出液をフラクション分画する高度で時間のかかる作業が必要であるという問題点がある。
【０００９】
このように、GLUT4の膜移行量だけを正確に測定することは容易ではないため、優れた培養細胞系の存在する培養脂肪細胞株(3T3L1)では、遺伝子工学的に各種のタグを導入したGLUT4蛋白を外来性に発現させるなどして、GLUT4の膜移行量を測定する技術が開発されている(非特許文献３)。
【００１０】
又、mycタグを有するGLUT4を発現する筋芽細胞C2C12を分化させた後に薬剤と処理してその糖取り込み促進活性を調べた研究もある（非特許文献４）。
【００１１】
しかしながら、複数の筋芽細胞が融合することによって形成される分化型の筋管細胞では、以下のような理由から遺伝子導入が難しく、インスリンに反応したGLUT4の膜移行を正確に測定できる優れた培養筋細胞系は未だ存在しないのが現状である。理由として、（１）多数の筋芽細胞が融合して形成され高度に分化した筋管細胞は、培養皿から剥離したあと元通り接着させることが不可能であり、一旦分散させた培養脂肪細胞でよく用いられるエレクトロポレーション法による遺伝子導入ができない。（２）未分化筋芽細胞への遺伝子導入は種々の方法で可能であるが、外来性に遺伝子を導入した筋芽細胞は分化能力が低下していることが多く、十分に発達しインスリン反応性を所有する筋管細胞にまで分化しない場合がある。また、ある程度まで分化したとしてもその外来遺伝子の発現が抑制されてしまうことも多く、分化筋管細胞での発現は期待できない。
【００１２】
分化筋管細胞へ高効率な遺伝子導入を行える公知技術として、アデノウイルスベクターを用いる方法もある。しかし、アデノウイルスベクターはヒトへも感染してしまうため、実験者の極めて熟練した技術とアデノウイルスベクターを用いるための研究施設が必須であり、簡便かつ安全に行うことが非常に困難である。また、アデノウイルスベクターの感染そのものが細胞の機能に悪影響を与える場合もおおく、インスリン反応性の正確な測定などには適さない場合がある。
【非特許文献１】Biochem. Pharmacol.、2003年、第65巻, 249-257頁
【非特許文献２】Am. J. Physiol. (Endoclinol Metab),2002年、第283巻、E514-524頁
【非特許文献３】J. Biol. Chem.、 2001年、第276巻（45号）,42436-42444頁
【非特許文献４】European J. Pharmacol., 2000年、第410巻,1-5頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、インスリン等の外来刺激に依存的なGLUT4の膜移行活性測定に極めて適している培養筋細胞を提供し、更に、その細胞を用いるGLUT4の膜移行活性の測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は鋭意研究の結果、遺伝子工学を用いて作製した細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4 (myc-GLUT4-ECFP:enhanced cyan fluorescent protein；図１)を恒常的に発現する組換え型筋芽細胞株を、野生型筋芽細胞株を適切な割合で混合培養することでmyc-GLUT4-ECFPを恒常的に発現し、なおかつ高いインスリン反応性を示す筋管細胞へと分化誘導させることに成功した。さらに、この培養筋管細胞を用いることにより、インスリン等の外来刺激に依存的なGLUT4の膜移行量の測定が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
即ち、本発明は以下の態様にかかる。
１．野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞を混合培養することによって得られる、該組換え型GLUT4を構成的に発現する分化型培養筋管細胞。
２．外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を有する上記１記載の分化型培養筋管細胞。
３．組換え型GLUT4の細胞内部位に更に標識物質が結合している、上記１又は２記載の分化型培養筋管細胞。
４．標識物質が抗原エピトープである、上記１〜３のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
５．野生型筋芽細胞と、組換え型筋芽細胞との混合培養における細胞数の比が100:1〜1:100の割合である、上記１〜４のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
６．更に、他のタンパク質を発現する外来性遺伝子が導入されている組換え型筋芽細胞を加えて混合培養することを特徴とする、上記１〜５のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
７．筋芽細胞がマウス筋芽細胞株C2C12である、上記１〜６のいずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞。
８．上記１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞を用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞を固定した後、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
９．標識物質の量を該標識物質に対する抗体を用いた免疫染色法により測定することを特徴とする、請求８項に記載の測定方法。
１０．分化型培養筋管細胞をヒト以外の動物体内に移植し、生着した後に再び取り出した該細胞を使用することを特徴とする、上記８又は９記載の測定方法。
１１．上記１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞を用いる組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法であって、該細胞膜上に存在する組換え型GLUT4及び該細胞膜上に移行した後に再び細胞内に取り込まれた組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することから成る、前記方法。
１２．標識物質に対する抗体を含む培養液中で分化型培養筋管細胞を培養し、その後、該細胞抽出液中に含まれる標識物質の量を測定することを特徴とする、上記１１記載の測定方法。
１３．標識物質の量を該標識物質に対する抗体との抗原抗体反応を利用して測定する、上記１２記載の測定方法。
１４．該分化型培養筋管細胞をヒト以外の動物体内に移植し、生着した後に再び取り出した該細胞を使用することを特徴とする、上記１１記載の測定方法。
１５．標識物質に対する抗体を動物血液中に注射し、生着した分化型培養筋管細胞の膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位にある標識物質と反応させる、請求１４に記載の測定方法。
１６．上記８〜１５の何れか一項に記載の膜移行活性の測定方法を用いる、外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性の測定方法。
１７．インスリン存在下での上記１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞を培養することによりインスリン刺激を与えた後、標識物質の量を測定することを特徴とする、上記１６記載の測定方法。
１８．外来刺激が、上記１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞の培養中に電気パルスを１〜１００V、０．０１〜１０Hz、０．０１〜５００ｍｓで０．５〜２００時間かけることで与えられる電気刺激である、上記１６記載の測定方法。
１９．動物にインスリンを投与することによって外来刺激を与える、上記１６記載の測定方法。
２０．動物を強制的に運動させることによって外来刺激を与える、上記１６記載の測定方法。
２１．上記８〜２０の何れか一項に記載の膜移行活性の測定方法を利用した、筋肉を標的とする薬剤のスクリーニング方法。
２２．上記１〜７いずれか一項に記載の分化型培養筋管細胞をヒト以外の動物に動物体内に移植し、生着した後に、薬剤を付加された、標識物質に対する抗体を動物に投与することから成る、該細胞が生着した組織又は臓器に該薬剤を運搬する方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明において、筋芽細胞が複数融合し、筋管細胞へと分化する筋細胞の特性を利用することにより、上記の組換え型筋芽細胞と野生型筋芽細胞を混合培養するという、従来のアデノウイルスを用いる方法と比較しても飛躍的に安全かつ容易な方法で、ほぼ１００％の筋管細胞に組換え型GLUT4遺伝子が導入された、高いインスリン反応性（インスリン刺激に応じた糖取り込み活性）を有する分化型培養筋管細胞を調製することができる。
【００１７】
また、混合培養の割合を変化させることによって、筋管細胞での組換えタンパク質の発現量を容易に変更することができる。さらに、他の外来遺伝子導入を行った筋芽細胞を第３、第４の筋芽細胞として混合培養、分化誘導することによって、複数種類の任意のタンパク質の共発現も容易に行える。
【００１８】
本発明によって得られる分化型培養筋管細胞を用いて、筋細胞におけるGLUT4の膜移行活性及びその細胞内への選択的取り込み活性の定量的解析が可能となり、これまで主に糖取り込み量の増減で評価されていた、糖の取り込み活性、特にインスリン等の外来刺激依存的な糖の取り込み活性（インスリン感受性）や運動刺激による血糖降下作用が、本発明によって正確且つ簡便に評価できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の分化型培養筋管細胞は、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現するものであり、又、外来刺激依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を有する。
【００２０】
本発明の分化型培養筋管細胞の作製において使用する「筋芽細胞」は当業者に公知の任意のものを使用することができる。由来する動物の種類又は組織等に特に制限はないが、ヒトを含む霊長類、マウス及びラット等の哺乳類細胞が好ましく、又、骨格筋、平滑筋及び心筋等に由来するもので良い。
【００２１】
又、「筋芽細胞」として細胞株化された当業者に公知の任意の細胞を使用することも出来る。このような細胞株の例として、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２（ATCC No.CRL1772）及びラット骨格筋由来の筋芽細胞株Ｌ６（ATCC No.CRL1458）及びラット心筋細胞Ｈ９Ｃ２（ATCC No.CRL1446）等を挙げることが出来る。
【００２２】
細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する組換え型筋芽細胞は、例えば、作製例１に記載の方法に準じて調製することが出来る。ここで、標識物質としては、タンパク質の標識するための物質として当業者に公知の任意の物質、例えば、myc, flag, HAおよびxpress等の「抗原エピトープ（アミノ酸配列）」として知られている物質、及び、「enhanced cyan fluorescent protein」のような各種の蛍光タンパク質を含む。
【００２３】
該標識物質をコードする塩基配列をGLUT4遺伝子の適当な部位に挿入して組換え遺伝子を作成する。このような部位としては、GLUT4が細胞膜上に移行した際に細胞外部に露出する部分、例えば、Ｎ末端からみて第一番目及び二番目の貫通部位の間の細胞外露出部位等に相当する塩基配列が好適である。こうして得られた組換え遺伝子を適当なベクターに連結して得られる発現ベクターで筋芽細胞を形質転換することによって、このような標識物質を有する組換え型GLUT4を構成的に発現する、組換え型筋芽細胞を作成することが出来る。尚、「構成的に発現する」とは、挿入遺伝子が「構成的プロモーター」の調節下にあり、特に細胞外からの刺激がない状態で、常に実質的に一定量の遺伝子産物が産生されることを意味する。
【００２４】
尚、組換え型GLUT4には、細胞外部位に加えて、細胞内部位に更に標識物質が結合していても良い。こうすることによって、組換え型GLUT4の細胞内における発現効率（細胞毎に発現量及び発現している細胞数）を視覚的に簡便に確認することが出来る。更に、細胞外部位と細胞内部位に結合させた標識物質が異なる場合には、例えば、夫々の標識物質に対する異なる抗体を使用することによって、細胞膜上に存在する組換え型GLUT4と細胞内に存在する組換え型GLUT4の量を個別に測定することが可能となる。尚、標識物質が結合させるGLUT4の細胞内部位としては、例えば、Ｃ末端の細胞内部位を挙げることが出来る。従って、このような場合には、GLUT4遺伝子の３‘末端に該標識物質をコードする塩基配列を誘導させた組換え遺伝子を作成することにより、細胞内部位に標識物質を結合させることができる。
【００２５】
野生型筋芽細胞と、細胞外部位に標識物質を有する組換え型GLUT4の他に、更に、他のタンパク質を発現する外来性遺伝子が導入されている組換え型筋芽細胞を加えて混合培養することも可能である。その結果、複数種類の任意のタンパク質が共発現される分化型培養筋管細胞を容易に作成することが出来る。
【００２６】
混合培養に使用される培地は細胞の種類等に応じて、公知の任意の種類から当業者が適宜選択することが出来る。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）及び最小必須培地（ＭＥＭ培地）等を挙げることが出来る。更にこれらの培地には、細胞の分化誘導を阻害しない範囲で、細胞の増殖を促進する等の目的で、各種因子、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、アルブミン、トランスフェリン、ホルモン、細胞成長因子、ビタミン等を適宜含有させることが出来る。
【００２７】
通常、播種細胞数１〜５ｘ１０５個（総数）／ウェル程度、湿度１００％、培養温度３７℃、培地のｐＨ7.2〜7.4程度で混合培養を実施するが、その他の培養条件は通常の範囲で当業者が適宜決めることが出来る。
【００２８】
野生型筋芽細胞と組換え型筋芽細胞との混合培養における細胞数の比は、筋芽細胞の種類、最終的に得られる分化型培養筋管細胞での組換えタンパク質の発現量等の諸条件に応じて、適宜選択することができるが、通常、100:1〜1:100の割合である。
【００２９】
混合培養は、まず、通常、１〜４日間程度、好ましくは、筋芽細胞が増殖してコンフルエント（培養容器表面全体に密になった状態）になるまで細胞を増殖させる。例えば、筋芽細胞株を１〜４日程度、10〜20%ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地にて密になるまで培養する。次に、筋芽細胞を分化誘導させるが、これは、筋芽細胞株を１〜２０日程度、１〜５％牛血清ＤＭＥＭ培地を用いた従来の方法に即した条件で行なうことができる。分化誘導効果を促進するために、使用する培地として高アミノ酸培地を用いたり、培養環境を高酸素分圧状態としたり、さらに１０〜５０V、０．１〜１０Hz、０．１〜２４msパルス幅にて０．５〜２００時間の条件で電気パルス刺激を行うこともできる。
【００３０】
又、筋管形成を促進させるための栄養源の補給及び老廃物の除去を目的とした培地交換は適当な間隔（例えば、１２〜２４時間おき）に実施することが好ましい。また、筋細胞の分化およびインスリン反応性に大きく影響を与える各種物質、例えば、アスコルビン酸、レチノイン酸、K252a(チロシンキナーゼの活性を修飾する薬剤)、PPAR(peroxisome proliferater-activated receptors)群のアゴニスト・アンタゴニスト等も添加することが出来る。
【００３１】
本発明の測定方法は、上記の分化型培養筋管細胞を用いて、組換え型GLUT4の膜移行活性を測定するものである。具体的には、例えば、該細胞を固定した後、細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量、即ち、組換え型GLUT4の細胞膜への移行量、を測定することから成る。この場合には、ある時点で細胞膜上に存在する組換え型GLUT4の量を測定することになる。この方法では、例えば、当業者に公知の方法により、該標識物質に対する抗体を用いた免疫染色法により標識物質の量を測定することが出来る。より具体的には、ローダミンなどの蛍光色素を結合させた二次抗体を反応させて、その蛍光量を共焦点顕微鏡など使用して測定する。
【００３２】
更に、分化型培養筋管細胞として、ヒト以外の動物（例えば、マウス及びラット等の齧歯類）体内に移植し、生着し一定期間経過した後に、再び取り出した該細胞を固定して以後の測定に使用することによって、生体内環境下での膜移行活性を測定することも可能となる。
【００３３】
外来の刺激などによって細胞膜上に移行したGLUT4は、その後、エンドサイトーシスによって細胞内に再び移動することが知られている。従って、組換え型GLUT4の膜移行活性を測定するための別の方法として、細胞膜上に存在する組換え型GLUT4、及び細胞膜上に移行した後に再び細胞内に取り込まれた組換え型GLUT4の細胞外部位の標識物質の量を測定することもできる。この場合には、ある一定期間中に細胞膜上に移行した組換え型GLUT4の総量を測定することが可能となる。この方法、例えば、当業者に公知の方法により、標識物質に対する抗体を適当量、例えば、０．０１〜５００μｇ／ｍｌ含む培養液中で分化型培養筋管細胞を培養し、その後、該細胞抽出液中に含まれる標識物質の量を抗体との抗原抗体反応を利用して測定することが出来る。標識物質の量は、例えば、標識物質が放射性物質である場合には、液体シンチレーションカウンター又はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて直接測定することができ、又、細胞免疫染色法、ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)、免疫沈降法、及びウェスタンブロット法等の当業者に公知の任意の方法で測定することが出来る。
【００３４】
この方法においても、分化型培養筋管細胞を上記の動物体内に移植し、生着し一定期間経過した後に、再び取り出した該細胞を使用することが可能である。例えば、生着した後に、標識物質に対する抗体を動物血液中に注射し、生着した分化型培養筋管細胞の膜上に存在する組換え型GLUT4の細胞外部位にある標識物質と反応させることが出来る。
【００３５】
以上の膜移行活性の測定方法を利用し、外来刺激に依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を測定することが出来る。即ち、当業者に公知の適当な方法・手段によって、インビトロ又はインビボで分化型培養筋管細胞に外的刺激を与え、その後、上記測定方法によって、標識物質の量、即ち、組換え型GLUT4の膜移行活性の測定する。外来刺激としては、例えば、インスリン等の化学物質、電気刺激、運動、活性酸素、低酸素刺激等を挙げることが出来る。
【００３６】
従って、外来刺激に依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性を測定に際しては、例えば、インスリン存在下での本発明の分化型培養筋管細胞を培養することによりインスリン刺激を与えたり、該細胞の培養中に、例えば、１〜１００V、０．０１〜１０Hz、０．０１〜５００ｍｓの電気パルスを０．５〜２００時間かける等の手段によって適当な電気刺激を与えたり、又は、動物にインスリンを投与することによってインスリン刺激を与える。
【００３７】
本発明の分化型培養筋管細胞を用いる上記の各測定方法によって、組換え型GLUT4の膜移行活性、即ち、糖の取り込み活性を測定することが可能となる。又、各種の外来刺激に依存的な組換え型GLUT4の膜移行活性及び糖の取り込み活性を測定することが出来る。
【００３８】
従って、本発明の膜移行活性の測定方法を利用した、筋肉を標的とする薬剤（糖尿病治療薬、インスリン抵抗性改善薬、糖の取り込み亢進薬、代謝能改善薬、分化誘導促進薬、収縮増強薬など）のスクリーニングを非常に簡便、容易（ハイスループット）かつ正確に実施することが可能となる。このようなスクリーニングは当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、試験対象となる薬剤などの化学物質の存在下又は非存在下で、且つ、外来刺激の存在下又は非存在下で、本発明の測定を行い、その結果得られる組換え型GLUT4膜移行活性を比較すること等により行うことが可能である。
【００３９】
更に、GLUT4を発現する筋芽細胞と野生型筋芽細胞との混合比率や培養条件を適切に調節することにより、培養筋細胞のGLUT4発現量や発現している筋管細胞の割合をコントロールできる。そのため、該スクリーニングによって開発された薬剤の作用・効果が、GLUT4の発現量によってどのように変化するかを追跡することも可能となる。このことは、健常者・代謝病患者のGLUT4発現量の個人差を考えると極めて重要である。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例に則して本発明を更に説明するが、これはあくまで本発明の一例であり、本発明の技術的範囲はこれらによって限定されるものではなく、本明細書の記載に基づき、当業者が容易に想到し得る任意の変型・修飾法も本発明の範囲である。尚、方法又は手段に関して特に記載のない場合には、当業者に公知の周知方法で実施した。
【００４１】
作製例１：
mycタグを付加したGLUT4-ECFP組換えタンパク質(myc-GLUT4-ECFP)を以下の様に調製した。まず、J. Biol. Chem.、2004年、第279巻,30622-30633頁に記載されたpcDNA3-myc-GLUT4-EGFPプラスミドのmyc-GLUT4インサート部分を利用してpECFP-myc-GLUT4を作製後、Nucleic Acids Res.、1990年、第18巻,3587-3496頁に記載されたpBABE（ピューロマイシン抵抗性レトロウイルス作製ベクター）に導入してpBABE-myc-GLUT4-ECFPを構築した。構築したプラスミドは、レトロウイルスパッケージング細胞であるPlat E細胞にトランスフェクションしてレトロウイルスを産生させた。作製したレトロウイルスを回収・精製した後、野生型C2C12筋芽細胞へインフェクションした。その後、2 μg/mlのピューロマイシン存在下で継続培養を行い、単一の細胞から増殖したピューロマイシン抵抗性C2C12変異クローンを２０個以上単離した。これらのクローンについて、myc-GLUT4-ECFP融合タンパク質を適量発現し、かつ該目的に最も適したクローンを、各種の細胞生物学的および生化学的手法を用いて選別し、以下の作製例に用いた。
【００４２】
野生型マウス筋芽細胞株C2C12細胞（１）と上記で得られたmycタグを付加したGLUT4-ECFP組換えタンパク質(myc-GLUT4-ECFP)を発現するC2C12筋芽細胞（２）をそれぞれ２x １０４個/ウェル（カバーグラスを底面に設置した６ウェルプレート）となるように混合播種した。その後、筋芽細胞がコンフルエントとなるまで3日間ダルベッコ改変イーグル培地＋10%牛胎児血清を用いて培養した。
【００４３】
その後、ダルベッコ改変イーグル培地＋2%牛血清に置換して８日間培養を行い、筋管細胞へと分化誘導させた。また、栄養源の供給ならびに老廃物の除去を目的に培地交換は分化誘導後、24時間おきに行った。（２）の筋芽細胞単独では、野生型筋芽細胞を分化誘導した際に見られる筋管形成（図３Ａ）はほとんど観察されないが（図３Ｂ）、混合培養することによって筋管形成が誘導されていることが判った（図３Ｃ）。
【００４４】
測定例１：
作製例１に従って作製した、myc-GLUT4-ECFPを発現するC2C12筋管細胞（分化型培養筋管細胞）を終濃度１００ｎＭのインスリンで６０分間刺激した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄したあと、２％パラホルムアルデヒドを添加したＰＢＳ（−）で１５分間振とうすることで細胞固定を行った。ＰＢＳ（−）で３回ｘ１０分間洗浄後、５％牛血清を添加したＰＢＳ（−）で１時間振とうしてブロッキングを行った。次に、一次抗体として抗mycモノクローナル抗体を１％牛血清アルブミンを添加したＰＢＳ（−）で２００倍希釈したものを用いて１時間振とうした。ＰＢＳ（−）で５回ｘ１０分間洗浄後、二次抗体としてローダミンを結合した抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson Laboratory社）を１％牛血清アルブミンを添加したＰＢＳ（−）で２０００倍希釈したものを用いて１時間振とうした。その後、カバーグラスを取り出し、Ｖｅｃｔａ  Ｓｈｉｅｌｄを滴下したスライドグラス上にのせ、共焦点顕微鏡下でローダミン、ＥＣＦＰの発現を観察した。
【００４５】
その結果、図４に示したように、インスリンで処理しない筋管細胞はＥＣＦＰの発現は観察されるものの（図４Ａ）膜上のｍｙｃは検出されない（図４Ｃ）が、インスリンで処理した筋管細胞は、ＥＣＦＰの発現（図４Ｂ）とともに膜上のｍｙｃが検出される（図４Ｄ）、すなわちGLUT4が膜上に移動していることが判った。尚、両染色を同時に観察した際の蛍光を (図４Ｅ, Ｆ)に示した。
【００４６】
測定例２：
作製例１に従って作製した、組換えGLUT4を発現するC2C12筋管細胞を終濃度１００ｎＭのインスリンで６０分間刺激した。インスリン刺激開始３０分後より終濃度４μg/mlの抗ｍｙｃモノクローナル抗体を培地中に添加した。インスリン刺激終了後、ＰＢＳ（−）で５回洗浄して、細胞膜上に存在する抗ｍｙｃ抗体を除去した後、Laemmli｀s bufferを用いて細胞抽出液を調製した。細胞抽出液は、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ホースラディッシュパーオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。なお、検出はウエストスーパーフェムトディテクションキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて行った。
【００４７】
その結果、インスリン刺激によって細胞内に取り込まれた抗ｍｙｃ抗体の量が著しく増加していることが判った（図５Ａ）。更に、この効果は、インスリン信号を阻害するＷｏｒｔｍａｎｎｉｎによって阻害されていることも判った（図５Ｂ）。このようなウエスタンブロット解析の結果は、公知であるNIH imageなどのコンピュータソフトウェアを使って容易に定量化することが可能であり、本実施例の場合、インスリンによってGLUT4の活性が約３倍に上昇していることが判った（図５Ｃ）。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明を用いれば、GLUT4と複合体を形成するタンパク質（IRAPなど）の動態を、例えばプロテオミクス技術を用いて解析することも可能となり、GLUT4やGLUT4複合体の安定性の測定をも容易に可能とする。これらの応用も全て筋肉を標的とした新しい様々な薬剤のスクリーニングにおいて、基礎的な情報を提供するものである。
【００４９】
又、本発明の分化型培養筋管細胞のインスリン刺激や電気パルスによる収縮活動は人為的にコントロールすることができるため、例えば、生体における運動（筋肉の収縮伸展活動）刺激がいかにしてインスリン抵抗性を改善しているのかなど、培養細胞の利点を生かした研究（例えば、分子生物学、細胞生物学、生化学、遺伝子工学的手法を用いた研究）が可能になる。
【００５０】
更に、本発明の分化型培養筋管細胞はマウスなど齧歯類に生着させることもできる。そこで、どのような薬剤投与、栄養投与や運動刺激などが、インスリン依存的・非依存的なGLUT4膜移行活性を制御しているかを動物の筋肉の部位別に解析することも可能となり、これらの基礎知見は、ヒトへの応用を考える上で極めて重要な情報を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明によるGLUT4を恒常的に発現する筋管細胞作製に用いた、細胞外第２ループ部位にMycエピトープを持ち、細胞内C末端部位にECFPを持つGLUT4の構造である。このGLUT4は、野生型GLUT4とまったく同一の機能を果たすことがわかっている。
【図２】本発明の一具体例の簡単な説明である。まず、myc-GLUT4-ECFPを恒常的に発現する筋芽細胞 (A)と若い継代数で高いインスリン反応性を示す野生型筋芽細胞 (B)を混合培養し、分化誘導を行うことにより、myc-GLUT4-ECFPを恒常的に発現する筋管細胞(C)を作製する。この細胞では、インスリン刺激にともない、myc-GLUT4-ECFPが細胞膜上に移行する (D)。この刺激によって、細胞膜に露出したmyc-GLUT4-ECFPだけを抗c-myc抗体によって選択的に標識することができる(E)。このようにして標識されたmyc-GLUT4-ECFPは、蛍光などで標識した２次抗体により、顕微鏡下で検出・定量が可能である。また、細胞に結合あるいは取り込まれた抗Myc抗体量をイムノブロット法などで測定することもできる。
【図３】野生型筋芽細胞とMyc-GLUT4-ECFPを恒常的に発現する筋芽細胞とをそれぞれ単独 (A, B)あるいは混合して(C) 10%牛胎児血清を添加したDMEMでコンフルエントとなるまで培養し、その後2%牛血清を添加したDMEMを用いて６日間分化誘導した際の筋管細胞の形成の結果を示す写真（倍率：ｘ20）である。
【図４】Myc-GLUT4-ECFPを恒常的に発現する筋芽細胞と野生型筋芽細胞を混合培養した筋管細胞におけるGLUT4の発現とインスリン刺激による膜移行を示す、共焦点顕微鏡下でローダミン、ＥＣＦＰの蛍光を観察した写真（倍率：ｘ60）である。
【図５】ウエスタンブロット解析による本発明の筋管細胞を用いたインスリン刺激によるGLUT4活性の測定の結果を示す電気泳動の写真（図５Ａ,Ｂ）である。又、インスリンに応答してGLUT4の活性が約３倍に上昇すること示すグラフ(Ｃ)である。
【図１】
2006340637.tif 000003
【図２】
2006340637.tif 000004
【図３】
2006340637.tif 000005
【図４】
2006340637.tif 000006
【図５】
2006340637.tif 000007