(57)【要約】【課題】  剪定枝葉、枯損樹木等のナシ樹木廃材を効率的に分解できる分解剤を提供する。【解決手段】  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケの生菌体を含むナシ樹木廃材分解剤。  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケの生菌体をナシ樹木廃材に添加し、該廃材中で、温度２５〜３５℃、好気的条件下で静置培養し、該廃材を分解させることを特徴とするナシ樹木廃材分解方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケの生菌体を含むナシ樹木廃材分解剤。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケの生菌体をナシ樹木廃材に添加し、該廃材中で、温度２５〜３５℃、好気的条件下で静置培養し、該廃材を分解させることを特徴とするナシ樹木廃材分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はナシ樹木廃材分解剤及びナシ樹木廃材分解方法、特に微生物を用いたナシ樹木廃材分解剤及びナシ樹木廃材分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ダム工事や道路工事等に伴い発生する森林伐採木や、街路樹・公園等の剪定枝葉、枯損樹木、建築現場から発生する廃木材等は、主として焼却または埋め立てによって処分されていた。
しかしながら、焼却による処分は、二酸化炭素による環境破壊を助長し、また多量の煙が近隣に迷惑を及ぼすという問題がある。また、埋め立てによる処分は、木質有機物が土壌伝染病菌の温床となり植物に障害が発生する危険がある。
特に、千葉県では、ナシの農業産出額が全国第１位であり、約1750haの栽培園からは、年間約１万トンの剪定枝が排出されるため、該剪定枝の処分が難しい状況にあり、対応に苦慮していた。
【０００３】
近年では、木材を発酵して堆肥化する処理方法が提案されているが、木材は難分解性のセルロースやリグニン等を多量に含有しているので、木材をチップ化して堆積しておくだけでは堆肥化に極めて長い日数を要し、実用的ではない。
そこで、発酵を促進するために、例えば小麦フスマを添加することが提案されている（特許文献１）。
また、セルロースやリグニン等を分解する能力を有する微生物を利用した発酵促進剤の開発も行われている（特許文献２）。
【特許文献１】特開２００２−１２６０号公報
【特許文献２】特開２００３−１６０３９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記技術においては分解能が十分ではなく、未だ改良の余地があった。
本発明の目的は、剪定枝葉、枯損樹木等のナシ樹木廃材を効率的に分解できる分解剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために本発明者等が検討を行った結果、特定のアミスギタケの生菌体を用いることにより、短期間でナシ樹木廃材を分解できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の第一の主題は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケの生菌体を含むナシ樹木廃材分解剤である。
【０００６】
本発明の第二の主題は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケの生菌体をナシ樹木廃材に添加し、該廃材中で、温度２５〜３５℃、好気的条件下で静置培養し、該廃材を分解させることを特徴とするナシ樹木廃材分解方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のナシ樹木廃材分解剤によれば、特定のアミスギタケの生菌体を用いることにより、剪定枝葉、枯損樹木等のナシ樹木廃材を効率的に分解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明について詳細に説明する。
［アミスギタケ］
アミスギタケ（Polyporus arcularius）は、担子菌類、多孔菌科、タマチョレイタケ属に属する茸である。
なお、本発明において、最も好適に用いられるアミスギタケは、平成１６年１２月１５日付で、産業技術総合研究所に受託されており、識別のための表示をＣＮＣＢ−Ｌ１という。
科学的性質等は以下の通りである。
１．科学的性質
ＰＤＡ培地上で、白色の菌糸を形成する。通常の培養では胞子は形成しない。木質及び木質中に含まれるリグニンを効率よく分解する。
【０００９】
２．分類学上の位置…カビ、Polyporus arcularius
３．培養条件
（培地および培地組成）
ポテト・グルコース寒天培地
ジャガイモ  ２００ｇ
ブドウ糖      ２０ｇ
寒天          １５ｇ
水            １Ｌ
（培地の殺菌条件）
オートクレーブ  １２１℃、２０分間
（培地温度）
２５℃
（培地期間）
７日間
（酸素要求性）
好気
（培養方法）
好気、静地培養
（光要求性）
不要
（継代培養条件）
植え継ぎ間隔：３ヶ月
保管温度：２５℃
【００１０】
４．保管条件
流動パラフィン重層、常温保存。
凍結乾燥法による保管：不可
Ｌ−乾燥法による保管：不可
凍結法による保管（−８０℃付近）：不明
【００１１】
培養・形態学的性質
＜ポテト・グルコース寒天培地（２５℃）での生育状態＞
５日目で旺盛な生育で、コロニー径は６７ｍｍ。白色で密な菌糸で、７日目でシャーレ全体に菌糸が生育。
＜最適生育温度＞
ポテト・グルコース寒天培地に直径５ｍｍの円盤状種菌を接種し、各温度で培養して、５日目に各コロニー径を測定したところ、最適生育温度は２０〜３５℃、特に３０℃付近であった。また、１５℃以下、４０℃以上では生育が低下し、１０℃以下ではほとんど生育しなかった。
＜最適生育ｐＨ＞
酸又はアルカリでｐＨを調整したポテト・グルコース寒天培地に直径５ｍｍの円盤状種菌を接種し、２５℃で培養して、６日目にコロニー径を測定したところ、最適生育ｐＨは６〜７．５であった。
【００１２】
［ナシ樹木分解剤］
本発明の分解剤は、特にバラ科ナシ属のナシ(Pyrus pyrifolia var.culta)に対して有効に用いられる。
本発明のナシ樹木廃材分解剤は、アミスギタケの生菌体を含むものである。アミスギタケとしては、上記受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケ株を用いることが好ましい。
ナシ樹木分解処理に使用する際は、培養液あるいは培養菌体をそのまま用いてもよく、または適切な基材と混合して使用することもできる。すなわち、アミスギタケの生菌体の培養液をそのまま、あるいは懸濁液状、泥状、スラリー状の培養物、または乾燥菌体や胞子として使用でき、その形態は液状、粉末状、顆粒状、またはペースト状の形態を有するものであってもよい。
また、基材と混合して使用する基材としては例えば鋸屑、籾殻、蕎麦殻、トウモロコシ外皮、米糠、落葉、腐葉土、珪藻土、バーミキュライト、バーライト、ベントナイト、ゼオライト、赤玉土、土、砂、泥炭、木炭、活性炭、石炭、コークスなどを挙げることができる。
【００１３】
［ナシ樹木廃材分解方法］
本発明のナシ樹木廃材分解方法は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２３のアミスギタケの生菌体をナシ樹木廃材に添加し、該廃材中で、温度２５〜３５℃、好気的条件下で静置培養し、該廃材を分解させることを特徴とする。バッチ法、連続法、半連続法等のいずれをも用いることができる。
また、分解には、木質分解性微生物として、本発明のアミスギタケの生菌体のみを用いることが好ましいが、他の木質分解性微生物又は分解助剤等を併用することも可能である。
【００１４】
分解処理は、アミスギタケの生菌体を好気的または嫌気的条件、好ましくは好気的条件下で培養することにより行う。好気培養は、通常の中温菌の培養に準じ、静地培養により行なえばよい。培養液のｐＨは２〜８、好ましくは５〜８である。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃である。処理期間は、ナシ樹木廃材中のリグニンを分解するのに十分な時間であればよく、通常は１０〜８０日間、好ましくは２ヶ月程度である。
【００１５】
培地は、通常の担子菌及び糸状菌の培養に用いるものであれば特に制限されない。例えば、麦芽汁（又は麦芽エキス）寒天培地、ポテト・グルコース寒天培地、ツアペック寒天培地、サブロー寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、YpSs寒天培地、グルコース・ドライイースト寒天培地、コーンミール寒天培地等が挙げられる。好ましくは、ポテト・グルコース寒天培地である。
【００１６】
培地には、木質、セルロースまたはリグニン等の木質成分を添加することができる。さらに必要に応じて各種の炭素源あるいは窒素源を添加することができる。炭素源としては、ブドウ糖、ショ類、マルトース、サッカロース、上白糖、黒糖、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ1塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。
【００１７】
本発明において、「廃材」とは、植物の根部、幹部、枝部、小枝部等の樹木に由来する材料を意味し、具体例としては、植栽樹木・緑地・街路樹・公園等の剪定枝葉、枯損樹木、さらには山間部でのダム工事や道路工事等に伴い発生する森林伐採木や伐採根、建築現場から発生する廃木材等を挙げることができる。
【００１８】
前記廃材を処理するに当たっては、均一に且つ速やかに分解するために、廃材をなるべく細かくして、分解剤との接触面積を広くしておくことが好ましい。具体的には約０．５〜３ｃｍの大きさのチップにしておくことが好ましい。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。配合量については特に断りのない限り質量％を示す。
【実施例１】
【００１９】
＜微生物の選抜＞
（１）サンプルの採集
１４県２４４地点の土壌、２県５１本の腐朽木、４県４５８個体のキノコから、菌の採集を行った（表１参照）。
（表１）                                              
サンプル数              
採集場所            土壌        腐朽菌        キノコ  
青森県                １            −            −
宮城県                ２            −            −
山形県                ４            −            −
福島県            １１７          ４１          ４３
群馬県                −            −        １６２
栃木県                ６            −            −
千葉県              ９５          １０        ２４６  
長野県                ３            −            −
新潟県                −            −            ７
石川県                ３            −            −
愛媛県                ３            −            −
大分県                ２            −            −
宮崎県                ３            −            −
熊本県                １            −            −
鹿児島県              ２            −            −
沖縄県                ２            −            −  
合計              ２４４          ５１        ４５８        計  ７５３
【００２０】
（２）選抜方法
採集したサンプルから分離した生菌体をナシ剪定枝乾燥木粉に添加して培養し、培養開始時に対する残存量が少ない生菌体を選抜した。
a.土壌及び腐朽木の場合
採集した土壌及び腐朽木(粉砕)各２ｇを２０ｍＬの滅菌水＋０．０５％Tween20にそれぞれ添加し、１５０ｒｐｍで１時間振とうした。これを滅菌水で１０倍及び１００倍に希釈した液を作成し、この液をＧＵ培地＋木粉（ナシ剪定枝乾燥木粉0.2％、寒天1.6％、グアイアコール0.01％、ｐＨ５．０）に１００μＬずつ塗布し、２５℃で４〜５日間培養し、着色帯の形成の有無を調べた。赤色の着色帯を形成したコロニーの一部をかき取り、テトラサイクリンを添加したＰＳＡ平板培地に移植し、２５℃で４〜５日間培養した。
１００ｍＬの三角フラスコに、ナシ剪定枝乾燥木粉２ｇと純水５ｍＬを入れ、オートクレーブした。これに分離した菌をそれぞれ接種し、２５℃で３０日間培養後、６０℃で５日間乾燥した。残存した木粉の重量を測定し、培養開始時に対する残存量（質量％）を算出した。
【００２１】
b.キノコの場合
採集したキノコの子実体を洗浄し、子実体の一部を、テトラサイクリンを添加したＰＳＡ平板培地に移植した。純粋な菌体を得た後、ＧＵ培地＋木粉（ナシ剪定枝乾燥木粉0.2％、寒天1.6％、グアイアコール0.01％、ｐＨ５．０）に菌そうを移植し、２５℃で４〜５日間培養し、着色帯の形成の有無を調べた。
１００ｍＬの三角フラスコに、ナシ剪定枝乾燥木粉２ｇと純水５ｍＬを入れ、オートクレーブした。これに着色帯を形成した菌株をそれぞれ接種し、２５℃で３０日間培養後、６０℃で５日間乾燥した。残存した木粉の重量を測定し、培養開始時に対する残存量（質量％）を算出した。
【００２２】
上記表１に示す７５３個のサンプルから、赤色の着色帯を形成した糸状菌１３０４菌株を分離することができた。
以下に、それぞれの菌株を用いた場合の培養開始時に対する木粉の残存量（質量％）を示す。
（表２）                                    
木粉残存量（質量％）              菌株数  
５０〜５５                          １  
５５〜６０                          ０  
６０〜６５                          ６  
６５〜７０                        ２０  
７０〜７５                        ９９  
７５〜８０                      １０８  
８０〜８５                      ３８３  
８５〜９０                      ４７１  
９０〜９５                      １２６  
９５〜１００                      ９０  
合計                          １３０４
【００２３】
表２に示すように、１３０４菌株中１菌株（千葉県農業総合研究センター病理研究室ナシ園場の腐朽木から分離）のみが、培養３０日目でナシ木粉の重量を５０〜５５質量％にまで減少させることができた。
よって、この株を選抜菌株とし、ＣＮＣＢ−Ｌ１菌株と命名した。
【実施例２】
【００２４】
＜選抜菌株の同定＞
選抜菌株ＣＮＣＢ−Ｌ１菌株のゲノムＤＮＡから、リボソームＲＮＡ遺伝子の５．８Ｓを含むinternal transcribed spacer(ITS1-5.8S-ITS2rRNA)領域をＰＣＲにより増幅させ、塩基配列を決定した。ＰＣＲによる増幅には、ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）及びITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）プライマーを用いた。決定した塩基配列は、相同性検索（プログラム；BLAST）を行った。
結果を以下に示す。
【００２５】
相同性第１位
(AF516524)Polyporus arculsrius CulTENN7883 SBI 2 18S ribosomal．．． 1259  0.0
相同性第２位
(AF516523)Polyporus arculsrius CBS224.91 18S ribosomal RNA gen．．． 1118  0.0
相同性第３位
(AB070863)Polyporus arculsrius genes for ITS1, 5.8S rRNA, ITS2．．． 1102  0.0
相同性第４位
(AF516528)Polyporus brumalis 'Audet's P.cf.tricholoma'18Sr．．．     1096  0.0
相同性第５位
(AB070864)Polyporus arculsrius genes for ITS1, 5.8S rRNA, ITS2．．． 1094  0.0
【００２６】
相同性第６位
(AY494980)Trametes hirsuta 18s ribosomal RNA gene, partial seq．．． 1082  0.0
相同性第７位
(AB070865)Polyporus arculsrius genes for ITS1, 5.8S rRNA, ITS2．．． 1074  0.0
相同性第８位
(AF516523)Polyporus arculsrius genes for ITS1, 5.8S rRNA, ITS2．．． 1072  0.0
相同性第９位
(AF516523)Polyporus arculsrius genes for ITS1, 5.8S rRNA, ITS2．．． 1070  0.0
相同性第１０位
(AF516531)Polyporus brumalis CulTENN10147 18S ribosomal RNA ge．．． 1068  0.0
【００２７】
選抜菌株のITS1-5.8S-ITS2rRNA領域の塩基配列を決定し、相同性検索を行った結果、上位３位がアミスギタケであり、且つ上位１０菌株中７菌株がアミスギタケであったことから、選抜菌株をアミスギタケであると同定した。
【実施例３】
【００２８】
＜対照菌株との分解能力の比較＞
１００ｍＬの三角フラスコに、ナシ剪定枝乾燥木粉２ｇと純水５ｍＬを入れ、オートクレーブした。これに選抜菌株ＣＮＣＢ−Ｌ１菌株を接種し、２５℃で３０日間培養後、６０℃で５日間乾燥して、残存した木粉の重量を測定し、培養開始時に対する残存量（質量％）を算出した。
なお、分解能力の高い対照菌株として、最も代表的な木材腐朽菌であるカワラタケＭＡＦＦ４２０００２を用いた。
【００２９】
図１に、各培養日数時における培養開始時に対する木粉全重量の重量比（％）を示す。
図１に示されるように、対照菌株では培養１ヶ月で６５．５％、３ヶ月で３８．５％であったのに対し、選抜菌株では培養１ヶ月で５１．７％、３ヶ月で２３．９％であった。これにより、上記選抜菌株は、最も代表的な木材腐朽菌である対照菌株と比較しても、ナシ樹木分解能力が高いことが確認された。
【００３０】
また、選抜菌株ＣＮＣＢ−Ｌ１菌株を用いて２５℃で１ヶ月及び３ヶ月培養後の、木粉中のリグニン量をＡＤＦ−リグニン法により測定した。図２に培養開始時に対するリグニンの重量比（％）を示す。
図２に示されるように、選抜菌株は、木質中に含まれる難分解性のリグニンの重量を培養１ヶ月で５７．９％、３ヶ月で７９．６％減少させることができた。これにより、上記選抜菌株は、リグニン量においても、ナシ樹木分解能力が高いことが確認された。
【実施例４】
【００３１】
＜最適培養温度の検討＞
１００ｍＬの三角フラスコに、ナシ剪定枝乾燥木粉２ｇと純水５ｍＬを入れ、オートクレーブした。これに選抜菌株ＣＮＣＢ−Ｌ１菌株を接種し、各温度下で３０日間培養後、６０℃で５日間乾燥して、残存した木粉の重量を測定した。また、木粉中のリグニン量をＡＤＦ−リグニン法により測定した。
結果を図３に示す。
図３に示されるように、上記選抜菌株の分解能力は、３０℃で最も高く、培養１ヶ月で全重量は４０．３％、リグニン重量は３３．５％にまで減少させることができた。
また、さらに検討したところ、１０〜４０℃の範囲において、培養可能であることがわかった。
以上より、培養温度は１０〜４０℃であり、好ましくは２０〜３５℃、最も好ましくは３０℃付近であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明のナシ樹木分解剤及びナシ樹木分解方法を用いることにより、燃焼廃材等を減らすことができ、環境に無害な形で廃棄することができる。また、廃材の処理が労力的、経済的にも軽減できるため、分解産物等が有効に利用可能である。また、本発明のナシ樹木分解剤及びナシ樹木分解方法は、製紙工業、産業廃棄物処理工業、土壌改良などの分野で有効に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】選択菌株あるいは対照菌株を用いた場合の、各培養日数時における培養開始時に対する木粉の残存量を示した図である。
【図２】選択菌株を用いた場合の、各培養日数時における培養開始時に対するリグニンの残存量を示した図である。
【図３】各温度下における木材分解能を木粉の全重量とリグニン量により示した図である。
【図１】
2006272114.tif 000002
【図２】
2006272114.tif 000003
【図３】
2006272114.tif 000004