(57)【要約】      （修正有）【課題】選択結合性物質固定化用ピンを用いて、凸部に選択性結合物質が固定化される担体を製造する際の歩留まりを上げること。【解決手段】選択結合性物質の固定化用ピン２２を用いて、基材上の凹凸部の複数の凸部２４上面に選択結合性物質を固定化する方法であって、選択結合性物質の固定化用ピンヘッドの面積が凸部上面の面積よりも小さいことを特徴とする選択結合性物質固定化担体の製造方法。【選択図】  図２
2006201035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択結合性物質の固定化用ピンを用いて、基材上の凹凸部の複数の凸部上面に選択結合性物質を固定化する方法であって、選択結合性物質の固定化用ピンヘッドの面積が凸部上面の面積よりも小さいことを特徴とする選択結合性物質固定化担体の製造方法。
【請求項２】
固定化用ピンのピンヘッドの面積Ｓｐと凸部上面の面積Ｓｓの関係がＳｐ／Ｓｓ≦０．７であることを特徴とする請求項１記載の選択結合性物質固定化担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」）を固定化した担体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンハイブリダイゼーションに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間のハイブリダイゼーションに基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。
【０００４】
核酸を基板上に固定化するための技術としては、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、核酸固定化用のピンを有するスポッターと呼ばれる点着装置を用い、このピンを用いて各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
また、より良好なＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）を得るために平坦な基板に替わり凸部上にＤＮＡ等を固定化する担体も提案されている（例えば特許文献２参照）。このような基板は、スポット周りのノイズが抑えられ、高性能ではあるが、ピンを用いて凸部上面に選択結合性物質を固定化する際に、１００μｍ程度の直径のピンヘッド位置と直径１００μｍ程度の凸部上面の位置を合わせる必要があり、この位置あわせが不十分であると、凸部の一部にしかピンヘッドが接触しない凸部が生じ、その凸部においては、スポットの形がいびつになるといった問題点があった。スポットの形がいびつであると、後の解析に支障を来すため、このような基板は不良品となってしまう。
【０００６】
この問題点を解決するためには、例えば、カメラ等の撮像手段を具備したスポッターを用いて、この撮像手段からの画像情報から位置情報を算出し、この位置情報を元に、ピンヘッドの位置を制御するスポッターを利用することも考えられる（例えば特許文献３参照）。
【０００７】
しかし、このような撮影手段などを有するスポッターは複雑であり高価である。さらに、スポット時には生産性を上げるため、一度に複数のピンを使用してスポットすることが定法であるが、撮影手段と位置情報を算出する手段を備えたスポッターを用いても、この場合に発生する課題を解決することができなかった。この課題とは、以下のようなものである。すなわち、複数のピンは一般的にピンブロックと呼ばれる治具に固定化される。この固定化治具（ピンブロック）に固定化されたピンのピッチと、基材の凸部のピッチとは、同一に設計するが、ピンブロックや基板の数十ミクロン程度の作製誤差は避けられない。よって、複数ピンの内の一本のピンヘッドと凸部上面の位置を正確に合わせても、この誤差が原因で、図１のようにその他のピンと凸部上面との位置とが正確に合わず、凸部上面の一部分にしかＤＮＡなどを固定化できないスポットが生じ、これは不良スポットとなってしまうといった問題点があった。すなわち、生産時の歩留まりが非常に低いといった問題点があった。
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特開２００４−２６４２８９号公報（特許請求の範囲）
【特許文献３】特開２００３−１４９０９４号公報（特許請求の範囲）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、簡単な装置や方法にて、確実に凸部の上面にＤＮＡなどを正常なスポット形状で固定化できる方法を提供することである。さらに、上記のような、複数のピンを用いて凸部上面にＤＮＡなどを固定化する際、基板の製造誤差やピン位置の誤差によるピンヘッドの位置ずれによる、生産時の歩留まりの低下を改善するというものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち本発明は、選択結合性物質の固定化用ピンを用いて、基材上の凹凸部の複数の凸部上面に選択結合性物質を固定化する方法であって、選択結合性物質の固定化用ピンヘッドの面積が凸部上面の面積よりも小さいことを特徴とする選択結合性物質固定化担体の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、非特異的な検体の吸着が少なく、かつ、ハイブリダイゼーション効率が良好であり、結果的にＳ／Ｎ比が良好な選択結合物質が固定化された担体の効率的な製造方法を提供することができる。具体的には、基板上の凹凸部の複数の凸部上面の全面にＤＮＡに代表される選択結合性物質を正常なスポット形状で確実に固定化でき、生産時の歩留まりを著しく向上する製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の選択結合性物質の固定化担体の製造方法について説明する。
【００１２】
本発明の選択結合性物質が固定化される担体には凹凸部があり、凸部上面に選択性適合物質が固定化されるものである。このような構造を取ることにより、検出の際、後述のように非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な選択結合性物質物質が固定化された担体を提供することができる。
この基材の凸部上面に選択結合性物質の固定化用ピンを用いて固定化するとき、本発明では、固定化用ピンのピンヘッドの面積が凸部上面の面積よりも小さいことが必要である。その効果について、図１と図２を用いて説明する。図１は複数のピンを用いてＤＮＡなどの選択結合性物質の溶液を基板の凸部上面にスポットする場合であり、ピンヘッドの面積と凸部上面の面積とが同一の場合を示している。１２ａのピンとその直下の凸部１４ａの上面との位置合わせを行った場合について示している。１２ａのピンヘッドと１４ａの基板の凸部上面との位置を合わせても、基板１３やピンを固定するピンブロック１１の誤差によりもう一つのピンヘッドの位置（１２ｂで示す）と１４ｂで示す凸部上面の位置がずれることが多い。このようにピンヘッドと凸部上面の位置がずれると、スポット形状が不良となり、製造時の歩留まりが非常に悪いといった問題点が生じる。凸部上面が円の場合その直径は概ね５０〜４００μｍであるので、ピンヘッドの位置や基板の位置に数十ミクロンの誤差があると上記で述べた問題点が生じる。
【００１３】
このような問題点は、図２で示すように、ピンヘッドの面積を小さくすれば一挙に解決できる。ピンヘッドの面積を凸部上面の面積より小さくすることにより、多少の位置誤差は吸収可能である。なお、ピンヘッドの面積Ｓｐと凸部上面の面積Ｓｓとの関係は、Ｓｐ／Ｓｓ≦０．７が好ましい。この数字は、仮に凸部上面の形状とピンヘッドの形状が円である場合、それぞれの直径のＲｐとＲｓの範囲は、概ねＲｐ／Ｒｓ≦０．８５となる。この範囲であれば、ピンブロックなどによる位置誤差をより吸収でき、歩留まりを向上できる。特に好ましくは、Ｓｐ／Ｓｓ≦０．５、すなわちＲｐ／Ｒｓ≦０．７である。このようにすることにより、凸部の上面内にピンヘッドの大きさとほぼ同じ大きさのスポットを打つことが可能となり、スポット形状の不良による歩留まりの低下を著しく抑えることが可能となる。
【００１４】
また、ピンの形状としては、万年筆のようにピン自体に毛管を形成し、その中に選択結合性物資の溶液を保持するようにしたもの使用可能であるし、このような毛管を形成していないピンも使用可能である。毛管を形成していないピンの場合は、凸部上面に一定の液量を滴下できるということから、ピンヘッドに一文字や十文字の溝を形成したものを好ましく用いることができる。
【００１５】
そして、実際にスポットする時は、多数の基板をスポット用装置（スポッター）のステージ上に並べる。次いで、ピン先を選択結合性物質の溶液（以下プローブ溶液）に浸し、そのピンを目的の凸部まで移動させ、ピン先と凸部上面を軽く接触させることにより、選択結合性物質のスポッティングを行う。毛管を形成していないピンの場合は、一箇所スポットするたびに、「ピン先をプローブ溶液に浸す→凸部上面にスポット」の動作を繰り返し、全ての基板に同一種類のプローブ溶液をスポットした後は、ピンの洗浄を行い、次のプローブ溶液のスポットを行う。一方、毛管を形成したピンの場合は、ピンをプローブ溶液に浸し、そして、毛管の中に溶液を保持する。しかし、このままで基板と接触させると大過剰のプローブ溶液が流れ出てしまうので、ダミーの基板を数回軽く叩き、余剰なプローブ溶液を捨てる（タッピング）。次いで、ピン先を所望の凸部まで移動し、凸部上面とピン先を軽く接触させることにより、プローブ溶液のスポットを行う。そして、連続して次の基板の凸部にスポットを行う。全ての基板に同一種類のプローブ溶液をスポットした後は、ピンの洗浄を行い残ったプローブ溶液を捨て、「毛管中に次のプローブ溶液の保持→タッピング→スポットDNAのスポット→洗浄」の動作を繰り返すことになる。
【００１６】
ピンヘッドと基板の凸部の位置合わせは、カメラ等の撮像手段を具備したスポッターを用いて、この撮像手段からの画像情報から位置情報を算出し、この位置情報を元に、ピンヘッドの位置を制御できるスポッターを使用しても良いし、マイクロカメラなどで、ピンヘッドと凸部上面の位置を撮影し、目視で確認しながら微調整を行っても良い。
【００１７】
プローブ溶液の組成としては、プローブとなる選択結合性物質をＳＳＣ（標準食塩-クエン酸緩衝液）などの緩衝液に溶かしたものを用いることができる。選択結合性物質の濃度としては、１〜１００μＭの範囲が好ましい。特に好ましくは１０〜５０μＭの範囲である。プローブ溶液中には、基板表面の官能基と選択結合性物質の官能基の組合せにより、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）等の縮合剤も好ましく含有させることができる。また、プローブ溶液にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤を含有させると、凸部上面でのプローブ溶液の「延び」が良くなり、ムラのないスポットを得ることが可能であることから、特に好ましく用いることができる。
【００１８】
ステージ上への基板の設置法しては、図３に示すような方法を好ましく用いることができる。すなわち、基板の基準となる面を３３のような突き当てに押しつける。突き当てへの押しつけは、例えば、３４で示すようなバネで基板を押しつけることにより達成できる。このような形状の突き当てとバネのセットを多数ステージ上に並べ、これに基板をセットすることが好ましく用いられる。
【００１９】
次いで担体の形状について述べる。凹凸部の複数の凸部に選択結合性物質が固定化されるが、この高さに関しては、凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が１００μｍより小さいことをいい、より好ましくは５０μｍ以下である。
【００２０】
すなわち、一般にマイクロアレイは、蛍光標識化された検体と担体に固定化された選択結合性物質とを反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。この集光された光をマイクロアレイの表面に照射して、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、この条件のまま、対物レンズもしくは、マイクロアレイ自体を走査することによりマイクロアレイから発生する蛍光を読み込むような仕組みとなっている。
【００２１】
このような、スキャナーを用いて本発明の凸部上面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャンすると、凹凸部の凹部に非特異的に吸着した検体ＤＮＡの蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果を発揮する。この理由は、凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部ではレーザー光がデフォーカスされるからである。逆に言えば、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。なぜなら、凸部上面の高さにこれ以上のばらつきがあると、スキャナーの焦点深度の関係で正確な蛍光強度を測定できないことが起こりうるし、スポッティングの際の高さの差が、思わぬばらつきの原因となりうるからである。
【００２２】
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であれば良いが、３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
【００２３】
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された部分をいうのであって、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した部分は除く。
【００２４】
また、一般にスキャナーの焦点を調整する方法は、以下の通りである。すなわち、スキャナーがマイクロアレイの表面に励起光の焦点を合わせる際には、マイクロアレイの隅で励起光の焦点を合わせるか、図６に示すように、治具にマイクロアレイを突き当て、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、その条件のまま、マイクロアレイ全体をスキャンする。したがって、本発明の担体には、特に凹凸部と平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図４、図５に示す。４１が平坦部であり、かつ、４２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。このようにしておけば、選択結合性物質が固定化された担体をスキャンする場合は、いったん平坦部の上面で励起光の焦点を合わせたり、平坦部を治具に突き当てることが可能である。すなわち、スキャナーの焦点合わせが容易になる。このようにして、平坦部で励起光の焦点を合わせるので、選択結合性物質が固定化された凸部の上面は、平坦であり、かつ、凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。
【００２５】
凸部の上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍより大きいと、以下のような問題点が生じることがある。すなわち、励起光の焦点は平坦部の上面で調整されているので、凸部の上面の高さが異なると、凸部上面での励起光の焦点がぼやけてしまい、最悪の場合、選択結合性物質と検体が反応したことによる蛍光が全く検出されないことが起こりうる。同様なことは、凸部上面と高さが同じ平坦部が設けられていない場合でも起こりうる。
【００２６】
なお、凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差は、５０μｍ以下であればよいが、３０μｍ以下であることがより好ましく、凸部の上面の高さと平坦部分の高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
【００２７】
また本発明では、平面状の担体に選択結合性物質を点着するのではなく、凹凸部分の凸部上面にのみ選択結合性物質を固定化している。したがって、凸部上面以外の部分に非特異的に検体試料が吸着しても、凸部上面以外の部分では、励起光の焦点がぼやけてるため、望まざる非特異的な吸着をした検体試料からの蛍光を検出することがない。このため、ノイズが小さくなり、結果的にＳ／Ｎが良くなるという効果を発揮する。
【００２８】
また、凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。このようにすることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００２９】
凸部の上面の面積は、特に限定される物ではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、４ｍｍ２以下、１０μｍ２以上が好ましい。
【００３０】
凹凸部における凸部の高さとしては、０．０１ｍｍ以上、１ｍｍ以下が好ましい。凸部の高さがこれより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがある。また、凸部の高さが１ｍｍ以上であると、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合がある。
【００３１】
本発明の選択結合性物質の固定化担体は、選択結合性物質を固定化するため、担体表面が低自家蛍光樹脂からなることが好ましい。ここで、低自家蛍光樹脂とは、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂを用いて、厚み１ｍｍの清浄な平板を、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件で測定したとき、蛍光強度が１０００以下であるものを言う。これを満たさない樹脂は、検出の際のＳ／Ｎが悪化するので、好ましくない。このような低自家蛍光樹脂としては、例えば下記一般式（１）で表されるポリマーを挙げることができる。
【００３２】
【化１】
2006201035.tif 000003
【００３３】
（一般式（１）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
前記ポリマーとしては、単独重合体あるいは共重合体が用いられる。前記ポリマーは、少なくとも一つのタイプのモノマーを原料に用いており、そのモノマーは、重合に関与し得る二重結合および重縮合に関与し得る官能基ならびに、ケトンもしくはカルボン酸またはそれらの誘導体の形態で存在する。また前記ポリマーは、一般式（１）の構造を有することがより好ましい。
【００３４】
なお、前記ポリマーが共重合体の場合、一般式（１）で表される構造単位を全モノマー単位の１０％以上含有していることが好ましい。一般式（１）で表される構造単位の含有量が１０％以上であると、後に説明するようなステップにて、表面に多くのカルボキシル基を生成でき、プローブ核酸を多く固定化できるので、結果的にＳ／Ｎ比がより向上する。
【００３５】
本発明において、ポリマーとは、数平均重合度が５０以上のものを言う。このポリマーの数平均重合度の好ましい範囲は、１００から１万である。特に好ましくは、２００以上、５０００以下である。なお、数平均重合度はＧＰＣ（ゲルパーメイションクロマトグラフ）を用い定法にてポリマーの分子量を測定することにより、容易に測定できる。
【００３６】
一般式（１）において、Ｒ1およびＲ2はアルキル基、アリール基または水素原子を表し、それぞれ同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は直鎖状であってもまたは枝別れしていても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。前記アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基ＸはＯ、ＮＲ3 、またはＣＨ2の中から任意に選ばれる。Ｒ3は前記Ｒ1およびＲ2と同様に定義される官能基である。
【００３７】
前記各種のような官能基を含むポリマーで、好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で最も好ましいものは、射出成形やホットエンボス法にて成形が容易であり、かつ、比較的ガラス転移温度が高い点からポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、前記ポリマーの構成要素を組み合わせた、または前記ポリマーの構成要素に他の一種または複数種のポリマーの構成要素を加えた構造の、共重合体も用いることができる。前記他のポリマーとしては、ポリスチレン等がある。
【００３８】
共重合体の場合、各構成要素の比の範囲は、カルボニル基を含むモノマー、例えばメタクリル酸アルキルの割合は、１０モル％以上が好ましい。こうすることにより、表面に多くのカルボン酸を生成できプローブ核酸を多く固定化できるので、結果的にＳ／Ｎ比がより向上するからである。ポリマーの構造単位のうち、より好ましい該モノマーの割合は５０モル％以上である。
【００３９】
さらに本発明では、一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有するポリマーを有する担体に選択結合性物質を固定化するため、これにアルカリもしくは酸で前処理を施すことが好ましい。こうすることにより、担体表面にカルボキシル基を形成させることができる。担体表面にカルボキシル基を生成する手段としては、アルカリ、酸などで処理する方法を単独で用いるだけではなく、温中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に担体を晒す方法などと組み合わせても良い。これらの方法の中でも、担体の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点から温度を上げたアルカリ、もしくは酸に担体を漬け込んで表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に担体を漬け込み、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間の間保持すればよい。
【００４０】
上記の方法にて、カルボキシル基が担体表面に生成したかどうかは、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）にて確認できる。具体的には、フッ素を含むラベル化試薬（例えばトリフルオロエタノール）を用いてカルボキシル基をフッ素でラベル化する。そして、ラベル化後の試料でのＣ１ｓ、Ｆ１ｓピーク面積強度に反応率を考慮して官能基量を推定することが可能である。さらに精度を上げるためには、トリフルオロエタノールで標識化された試料の表面のフッ素分布をＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型二次イオン質量分析法）で観察することにより、カルボキシル基が担体表面に生成しているかどうかを確認すればよい。
【００４１】
このようにカルボキシル基を担体の表面に生成すれば、これを足がかりに、担体側をビオチンもしくはアビチン修飾し、選択結合性物質をアビチンもしくはビオチン修飾して、アビチン・ビオチン相互作用にて選択結合性物質を担体に固定化する方法や、担体側をエチレンジアミン等のリンカーと反応させて、さらにこのリンカーと選択結合性物質を反応させ固定化することも考えられる。しかし、これらの方法では、２段階の反応を行うため、反応収率の関係から、担体に固定化できる選択結合性物質が少なくなりがちである。従って、担体のカルボキシル基と選択結合性物質との官能基とを直接反応させ、選択結合性物質を固定化することが好ましい。すなわち、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基や水酸基とを共有結合により固定化することが好ましい。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と担体表面のカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。その他、有望な縮合剤としては４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）がある。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に生成された担体を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、表面のカルボキシル基を活性化しておいても良い。
【００４２】
このような縮合剤を用い、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により担体表面と選択結合性物質が固定化されることになり、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により担体表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を担体に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。
【００４３】
前述した方法により、ポリマー表面に選択結合性物質を固定化することにより、スポット部分以外は、電荷がマイナスのカルボキシル基が存在しているので、検体（代表的にはＤＮＡ）の非特異的な吸着を抑え、さらに、共有結合で強固に、かつ、高密度に選択結合性物質を固定化でき、さらに、ガラスに比べ、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体とのハイブリダイゼーション効率が高い担体を得ることができる。空間的な自由度が高い利点は、特に固定化されている選択結合性物質がオリゴＤＮＡと呼ばれる塩基長が１０塩基から１００塩基のＤＮＡの場合に、検体とのハイブリダイゼーション効率が非常に向上するという優れた特性を与える。
【００４４】
上述の方法により得られた選択結合性物質固定化担体は、選択結合性物質を固定した後、適当な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された選択結合性物質を変性させることもできる。
【００４５】
また、選択結合性物質固定化担体は、蛍光標識化された検体と担体に固定化された選択結合性物質とをハイブリダイゼーション反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。しかし、担体表面から自家蛍光が生じる場合、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがある。これを防ぐため一般式（１）の構造単位を有するポリマーに黒色を呈し、またレーザー照射により発光を生じない物質を含有させて表面を黒色にすることにより、担体自身からの自家蛍光を低減させることができるので好ましい。このような担体を用いることにより、検出の際、担体からの自家蛍光を低減できるのでよりノイズが小さく、結果的にＳ／Ｎ比が良好な選択結合性物質物質が固定化された担体を提供することができる。  
【００４６】
ここで、担体が黒色とは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、担体の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、担体の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。
【００４７】
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。なお、ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２  条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。
【００４８】
黒色にする手段としては、担体に黒色物質を含有させることにより達成しうるが、この黒色物質の好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、ＣｏおよびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。
【００４９】
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラックを好ましく含有させることができ、ポリマーに一様に分散しやすいことから特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。
【００５０】
また、担体の形状としてガラス、金属などの熱変形をし難い材料からなる支持体層の上に、一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有するポリマーからなる選択結合性物質固定化層を設けると、熱や外力による担体の形状変化を防げることから好ましい。支持体層としては、ガラスや、鉄、クロム、ニッケル、チタン、ステンレスなどの金属が好ましい。その他支持体層としては、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミドなどの比較的高温に耐えられる樹脂などを用いても良い。また、この支持体層と選択結合性物質固定化層との密着性を良くするため、支持体層の表面を、アルゴン、酸素、窒素ガスでのプラズマ処理やシランカップリング剤での処理を施すことが好ましい。このようなシランカップリング剤としては３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。支持体層の上に選択結合性物質固定化層を設ける手段としては、ポリマーを有機溶媒に溶解し、スピンコートやディッピングなどの公知の手段を用いることができる。より簡単には、支持体層に接着剤で貼り付けることもできる。
【００５１】
ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。
【００５２】
本発明の担体を用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。
【００５３】
固定化物質と被検物質を相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
【実施例】
【００５４】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（実施例１）
（ＤＮＡ固定化担体の作製および処理）
公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製の基板を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は１５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、基板は黒色である。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００５６】
基板の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部分を除き表面は平坦であった。基板の中央には、１３×１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を２５６箇所箇所設けた。２５６個の凸部の内訳は、６４（８×８）個の凸部を１ブロックとし、このブロックが４つある形になっている。凹凸部分の凸部上面の高さ（２５６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、５μｍ以下であった。また、２５６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ５μｍ以下であった。具体的な凸部のレイアウトを図７にしめす。図７で左上の網がけしている８×８の部分が１つのブロックに相当し、隣のブロックとのピッチは４．５ｍｍとなっている。
【００５７】
上記のＰＭＭＡ基板を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に６５℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成した。なお、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂを用いて、本実施例で用いたカーボンブラック入りのＰＭＭＡの平板を、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件で測定したとき、この板の自家蛍光強度は２５０であった。
（プローブ溶液の調製）
配列番号１（７０塩基、５’末端アミノ化）のＤＮＡを合成した。このＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ６．５)でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。さらに、スポットムラを減らすためドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．００５％で加えた。そして、これらの混合溶液を３８４ウェルマイクロタイタープレートの４箇所に３０μｌづつ分注した。
（スポッティング）
日本レーザー電子製のスポッター（Ｇｅｎｅ  ＳｔａｍｐII）のピンブロックに、４．５ｍｍの頂点の四隅にセットする形で、４本のステンレス製のピンをセットした。そして、上記で調製した基板２０枚をスポッターのステージに並べにプローブ溶液をスポットした。なお、ピンには毛管は設けていないが、ピンヘッドに幅５０μｍ、深さ３０μｍの一文字状の溝を刻んでいる。
【００５８】
そして、マイクロカメラで観察しながら、２０枚それぞれの基板について、ある一つの凸部上面をスポッティングする時にピンが下降する位置が、この凸部上面の中央となるように微調整を行った後、、先に述べた３８４ウェルマイクロタイタープレートに入れた４つのプローブ溶液に一度に４つのピン先を浸漬し、そして、一度に４つの凸部の上にプローブ溶液をスポットした。「ピン先をプローブ溶液に浸漬」→「凸部上面にスポット」を６４回繰り返し、計２５６個の凸部の上にプローブ溶液のスポッティングを行った。なお、ピンヘッドの大きさの検討のため直径１７０μｍ、１４０μｍ、１００μｍ、とピンヘッドの大きさを変えた。
【００５９】
（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号２のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。
【００６０】
配列番号３と配列番号４のＤＮＡを合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐKＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号３および配列番号４のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。
【００６１】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ExTaq ２μｌ、 10×ExBuffer ４０μｌ、 dNTP Mix ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号５の溶液を２μｌ、配列番号６の溶液を２μｌ、 テンプレート（配列番号７）を０．２μｌを加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号２（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
【００６２】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液にに２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号２（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００６３】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量体積％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物２２．１ｇを純水にとかし、１ｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物２２．１ｇを純水にとかし、５ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量体積％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量体積％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。
【００６４】
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化した基板に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブ核酸が固定化されている担体にハイブリダイゼーション用の溶液を５０μｌ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。これを、プラスチック容器の中に入れ、６５℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。
【００６５】
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix ４０００Ｂ）に上記処理後の担体をセットし測定を行った。そして、スポットに欠けがある場合、すなわち、ピンヘッドが凸部上面の一部にしか接触していない場合については、それを不良スポットとしてカウントした。ピンの直径１種類について、２０×２５６＝５１２０個のスポットをについて観察した結果を表１に示す。
（比較例１）
ピンヘッドの直径を２００μｍとした以外は、実施例１と全く同様な実験を行った。実施例１と同様にスポットの形状を観察した結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
2006201035.tif 000004
【００６７】
このように、凸部上面の面積よりピンヘッドの面積を小さくすると、正常スポット率が明らかに向上する。また、ピンヘッドと凸部上面の面積比を０．７倍以下にすると特に効果的なことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】凸部とピンヘッドの面積が同じ時の様子を示す図
【図２】凸部上面面積よりもピンヘッドの面積が小さい場合の様子を示す図
【図３】スポッターのステージに担体をセットしたときの模式図
【図４】本発明に用いる担体の模式図
【図５】本発明に用いるの担体の断面模式図
【図６】担体を突け当てるための治具の例
【図７】実施例で用いた担体の凸部のレイアウトを示す図
【符号の説明】
【００６９】
１１  ピンブロック
１２  固定化用ピン
１３  基板
１４  凸部
２１  ピンブロック
２２  固定化用ピン
２３  基板
２４  凸部
３１  平坦部
３２  凸部
３３  突き当て部
３４  突き当て用バネ
４１  平坦部
４２  凹凸部
６３  ＤＮＡチップ
６４  対物レンズ
６５  励起光
６６  ＤＮＡチップを治具につき充てるためのバネ
７１  凸部
【図１】
2006201035.tif 000005
【図２】
2006201035.tif 000006
【図３】
2006201035.tif 000007
【図４】
2006201035.tif 000008
【図５】
2006201035.tif 000009
【図６】
2006201035.tif 000010
【図７】
2006201035.tif 000011
【配列表】
2006201035000001.app