(57)【要約】      （修正有）【課題】懸濁培養法において細胞培養過程で安定であり、かつトリプシン処理により容易に破壊され、トリプシン処理後に得られた細胞培養用微粒子並びにこの微粒子を用いた細胞培養方法を提供する。【解決手段】室温で液体である有機溶媒に界面活性剤を添加して界面活性剤溶液１１を調製する工程と、界面活性剤溶液にコラーゲン又は変性コラーゲン含有水溶液１２を所定の割合で添加混合することにより乳化させ、混合液中に平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を形成する工程と、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴を含む混合液に紫外線を照射して、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴の表層を硬化させることにより内部にコラーゲン又は変性コラーゲンを封入した平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン微粒子１４を作製する工程とを含む細胞培養用微粒子の製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
室温で液体である有機溶媒に界面活性剤を添加して界面活性剤溶液(11)を調製する工程と、
前記界面活性剤溶液(11)にコラーゲン又は変性コラーゲン含有水溶液(12)を所定の割合で添加混合することにより乳化させ、前記混合液中に平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン液滴(13)を形成する工程と、
前記コラーゲン又は変性コラーゲン液滴(13)を含む混合液に紫外線を照射して、前記コラーゲン又は変性コラーゲン液滴(13)の表層を硬化させることにより内部にコラーゲン又は変性コラーゲンを封入した平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン微粒子(14)を作製する工程と
を含むことを特徴とする細胞培養用微粒子の製造方法。
【請求項２】
コラーゲン又は変性コラーゲン液滴(13)を含む混合液への紫外線照射前に、前記コラーゲン又は変性コラーゲン液滴(13)を含む混合液を有機溶媒により洗浄する工程を更に含む請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
室温で液体である有機溶媒がイソオクタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、流動パラフィン、オレイン酸又はリノール酸であって、界面活性剤がグリセリン脂肪酸エステルである請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
コラーゲン又は変性コラーゲン液滴(13)を含む混合液への紫外線照射が波長２４０〜３６５ｎｍの紫外線を１０００μＷ／ｃｍ2以上の強度、１〜１０ｃｍの照射距離で１分〜１０時間照射することにより行われる請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
コラーゲン又は変性コラーゲン液滴(13)を含む混合液を洗浄する有機溶媒がヘキサンである請求項２記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５いずれか１項に記載の方法により製造され、直径１００〜８００μｍの微粒子(14)であり、前記微粒子(14)表層のコラーゲン又は変性コラーゲン成分が紫外線照射により変質硬化され、その内部にコラーゲン又は変性コラーゲンが封入されたことを特徴とする細胞培養用微粒子。
【請求項７】
請求項６記載の細胞培養用微粒子を細胞の細胞培養担体として用い、前記細胞を培養液中で培養することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養する際の細胞培養担体として好適な細胞培養用微粒子の製造方法及び該方法により得られた細胞培養用微粒子並びにこの微粒子を用いた細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は適当な硬い足場がなければ増殖しないことが知られている。そのため細胞の足場材料が適度な硬さを有する必要がある。また、細胞増殖速度を大きくするためには、その足場材料の表面積を大きく設ける必要がある。そのための方法として懸濁培養法が知られている。懸濁培養法は、足場材料、即ち細胞培養担体として適度な硬さと大きな比表面積を有する微粒子を用い、この微粒子に培養対象となる細胞を吸着又は固定化させ、この微粒子表面で細胞を培養するものである。細胞の培養を終えた後は、培養細胞に対してトリプシン含有溶液等の剥離剤を添加して細胞を微粒子から剥離する処理を施す。細胞培養用途として市販されている微粒子としては、Ｃｙｔｏｄｅｘ１（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】Microcarrier cell culture principle & method、アマシャムバイオサイエンス株式会社、１９９６年１０月１０日、ｐ２６〜２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記非特許文献１に示される市販の微粒子を細胞培養担体として用いた場合、培養を終えた細胞を微粒子から剥離するためのトリプシン処理を施すと、細胞は微粒子から剥離しても微粒子は破壊されずにそのまま残留してしまうため、細胞と微粒子とを遠心分離等の手段によって分離する必要があった。この分離操作によって培養した細胞の回収率が低くなる問題点があった。
本発明の目的は、懸濁培養法において細胞培養過程で安定であり、かつトリプシン処理により容易に破壊され、トリプシン処理後に培養細胞と微粒子との分離操作を必要としない細胞培養用微粒子の製造方法及び該方法により得られた細胞培養用微粒子並びにこの微粒子を用いた細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
請求項１に係る発明は、図１に示すように、室温で液体である有機溶媒に界面活性剤を添加して界面活性剤溶液１１を調製する工程と、界面活性剤溶液１１にコラーゲン又は変性コラーゲン水溶液１２を所定の割合で添加混合することにより乳化させ、混合液中に平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を形成する工程と、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を含む混合液に紫外線を照射して、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３の表層を硬化させることにより内部にコラーゲン又は変性コラーゲンを封入した平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン微粒子１４を作製する工程とを含むことを特徴とする細胞培養用微粒子の製造方法である。
請求項１に係る発明では、上記工程を経ることで、微粒子表層のコラーゲン又は変性コラーゲン成分が紫外線照射により変質硬化され、その内部にコラーゲン又は変性コラーゲンが封入された直径１００〜８００μｍの細胞培養用微粒子が得られる。
【０００５】
請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明であって、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を含む混合液への紫外線照射前に、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を含む混合液を有機溶媒により洗浄する工程を更に含む製造方法である。
請求項２に係る発明では、この工程を施すことでコラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３の凝集を抑制することができる。
【０００６】
請求項３に係る発明は、請求項１に係る発明であって、室温で液体である有機溶媒がイソオクタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、流動パラフィン、オレイン酸又はリノール酸であって、界面活性剤がグリセリン脂肪酸エステルである製造方法である。
請求項４に係る発明は、請求項１に係る発明であって、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を含む混合液への紫外線照射が波長２４０〜３６５ｎｍの紫外線を１０００μＷ／ｃｍ2以上の強度、１〜１０ｃｍの照射距離で１分〜１０時間照射することにより行われる製造方法である。
請求項４に係る発明では、上記条件で紫外線照射することで、細胞培養に最適な条件の微粒子が得られる。
【０００７】
請求項５に係る発明は、請求項２に係る発明であって、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を含む混合液を洗浄する有機溶媒がヘキサンである製造方法である。
請求項６に係る発明は、請求項１ないし５いずれか１項に記載の方法により製造され、直径１００〜８００μｍの微粒子であり、微粒子表層のコラーゲン又は変性コラーゲン成分が紫外線照射により変質硬化され、その内部にコラーゲン又は変性コラーゲンが封入されたことを特徴とする細胞培養用微粒子である。
請求項６に係る発明では、細胞培養に最適な大きさであり、細胞の適度な吸着性を有し、変質硬化した表層は細胞培養後に施すトリプシン処理により容易に破壊されるため、トリプシン処理後に培養細胞の分離操作を必要としない。また、内部にコラーゲン又は変性コラーゲンを封入しているため、細胞培養の際にこの微粒子が浮遊状態を保てる程度の比重を有する。
【０００８】
請求項７に係る発明は、請求項６記載の細胞培養用微粒子を細胞の細胞培養担体として用い、細胞を培養液中で培養することを特徴とする細胞培養方法である。
請求項７に係る発明では、この方法により懸濁培養法において細胞を安定して培養することができる。また、担体として用いる本発明の細胞培養用微粒子は細胞培養後に施すトリプシン処理により容易に破壊されるため、トリプシン処理後に培養細胞と微粒子との分離操作を必要としない。従って、培養した細胞の回収率が大幅に向上する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養用微粒子の製造方法及び該方法により得られた細胞培養用微粒子並びにこの微粒子を用いた細胞培養方法は、懸濁培養法において細胞培養過程で安定であり、かつトリプシン処理により容易に破壊されるため、トリプシン処理後に培養細胞と微粒子との分離操作を必要としない。従って、細胞と微粒子とを分離する操作を施す必要がなくなるため、培養した細胞の回収率が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
次に本発明を実施するための最良の形態を図面に基づいて説明する。
先ず、室温で液体である有機溶媒に界面活性剤を添加して界面活性剤溶液を調製する。室温で液体である有機溶媒としては、飽和又は不飽和炭化水素、高級アルコール、高級脂肪酸が適当である。本発明で室温で液体である有機溶媒とは、１５〜４０℃の範囲内において液体状態を示す溶媒を指す。また、界面活性剤は親水性親油性バランス（ＨＬＢ）が親油性側のものが適当である。このうち、有機溶媒がイソオクタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、流動パラフィン、オレイン酸又はリノール酸であって、界面活性剤がグリセリン脂肪酸エステルの組み合わせが好適である。グリセリン脂肪酸エステルのなかでもテトラグリセリン縮合リシノール酸エステルが特に好ましい。
【００１１】
次いで、図１（ａ）に示すように、界面活性剤溶液１１にコラーゲン又は変性コラーゲン水溶液１２を所定の割合で添加する。使用するコラーゲン又は変性コラーゲン水溶液はブタ由来ゼラチンやウシ由来ゼラチン、魚由来ゼラチン等を５〜２０重量％の水溶液としたものが好適である。界面活性剤溶液へのコラーゲン又は変性コラーゲン水溶液の添加割合は、界面活性剤溶液１００重量％に対して、コラーゲン又は変性コラーゲン水溶液０．３〜３重量％の範囲が好ましい。続いて図１（ｂ）に示すように、所定の割合で混合することにより乳化させ、混合液中に平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を形成する。この図１（ａ）及び図１（ｂ）に示すように、乳化しやすい試験管等により添加混合することが好ましい。
【００１２】
また、形成したコラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を含む混合液への紫外線照射前に、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴を含む混合液を有機溶媒により洗浄する工程を施しても良い。この工程を施すことで形成したコラーゲン又は変性コラーゲン液滴の凝集を抑制することができる。コラーゲン又は変性コラーゲン液滴を含む混合液を洗浄する有機溶媒としてはヘキサンが好適である。
【００１３】
次に、図３に示すように、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴を含む混合液に紫外線を照射して、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴の表層を硬化させることにより内部にコラーゲン又は変性コラーゲンを封入した平均粒径１００〜８００μｍのコラーゲン又は変性コラーゲン微粒子を作製する。この図１（ｃ）に示すように、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴１３を含む混合液をシャーレのような平皿に移し、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴に対して均一に、また均等な照射距離ｄで紫外線照射することが好ましい。細胞培養に最適な条件の微粒子を得るためには、コラーゲン又は変性コラーゲン液滴を含む混合液への紫外線照射の条件として、波長２４０〜３６５ｎｍの紫外線を使用し、紫外線の強度を１０００μＷ／ｃｍ2以上とし、照射距離ｄを１〜１０ｃｍとし、１分〜１０時間照射することが好適である。紫外線照射条件は、波長２５４ｎｍの紫外線を使用し、紫外線の強度を３０００〜５０００μＷ／ｃｍ2とし、照射距離ｄを３〜７ｃｍとし、１〜５時間照射することが特に好ましい。紫外線の強度が１０００μＷ／ｃｍ2未満では微粒子表層の硬化が培養環境に耐え得る程度にまで達しないため安定性が保てない。なお、紫外線の強度が１００００μＷ／ｃｍ2を越えると微粒子表層の架橋度を制御することが難しく、トリプシンで分解しない場合があるので、１００００μＷ／ｃｍ2以下の強度で紫外線照射することが好ましい。また、照射距離ｄが１ｃｍ未満では液滴によって架橋度にむらが生じてしまい、１０ｃｍを越えると微粒子表層が十分に硬化しない場合がある。紫外線照射時間が１時間未満では微粒子表層の硬化が培養環境に耐え得る程度にまで達しないため安定性が保てない。具体的には、コラーゲン又は変性コラーゲン微粒子が３７℃の水中で１週間保持することができない。また、紫外線照射時間が５時間を越えると、一旦表層が硬化して形成された微粒子が溶解してしまい、微粒子の原形を保つことができない。但し、紫外線照射距離を短くすれば照射時間は短くてすむので注意が必要である。
【００１４】
上記工程を経ることにより、微粒子表層のコラーゲン又は変性コラーゲン成分が紫外線照射により変質硬化され、その内部にコラーゲン又は変性コラーゲンが封入された直径１００〜８００μｍの細胞培養用微粒子が得られる。本発明の細胞培養用微粒子は、細胞培養に最適な大きさであり、細胞の適度な吸着性を有し、変質硬化した表層は細胞培養後に施すトリプシン処理により容易に破壊されるため、トリプシン処理後に培養細胞と微粒子との分離操作を必要としない。また、内部にコラーゲン又は変性コラーゲンを封入しているため、細胞培養の際にこの微粒子が浮遊状態を保てる程度の比重を有する。製造する際に使用するコラーゲン又は変性コラーゲンの種類によって変化するが、本発明の微粒子の比重は培養液と同程度、即ち、０．９〜１．１ｇ／ｍｌが好ましい。培養をシーソー型の攪拌装置で行う場合にはこの制限はより緩和される。
【００１５】
本発明の細胞培養方法は、本発明の細胞培養用微粒子を細胞の細胞培養担体として用い、細胞を培養液中で培養することを特徴とする。この方法により懸濁培養法において細胞を安定して培養することができる。また、本発明の微粒子は細胞培養後に施すトリプシン処理により容易に破壊されるため、トリプシン処理後に培養細胞と微粒子との分離操作を必要としない。従って、培養した細胞の回収率が大幅に向上する。
【実施例】
【００１６】
次に本発明の実施例を比較例とともに詳しく説明する。
＜実施例１＞
室温で液体である有機溶媒として鎖状飽和炭化水素であるイソオクタンを、界面活性剤としてテトラグリセリン脂肪酸エステル（坂本薬品工業株式会社製；商品名ＳＹグリスターＣＲ−３１０）をそれぞれ用意した。次いで、イソオクタン１００重量％に対しグリセリン脂肪酸エステルを５重量％の割合で加えて界面活性剤溶液を調製した。また変性コラーゲン水溶液としてブタ由来の１０重量％ゼラチン水溶液（新田ゼラチン株式会社製；商品名タイプＡＰＨ−２５０）を用意した。次に、界面活性剤溶液にこのブタ由来の１０重量％ゼラチン水溶液０．５ｍｌを添加し、この添加液を４０℃に加温しながら攪拌混合して乳化させ、混合液中に変性コラーゲン液滴を形成した。形成した変性コラーゲン液滴を含む混合液を１５℃に保ちながらしばらく攪拌し、混合液にヘキサンを添加して変性コラーゲン液滴を洗浄した。続いてヘキサンを含む混合液に対して、紫外線ランプ（コスモバイオ社製；ＣＳＬ−１００Ｃ）を用い、波長２５４ｎｍ、出力１００Ｗ、強度３４００μＷ／ｃｍ2、照射距離５．５ｃｍの条件で３時間紫外線照射して変性コラーゲン微粒子を作製した。この変性コラーゲン微粒子は光学顕微鏡により確認したところ、内部に変性コラーゲンが内包した平均粒径３００μｍのマイクロカプセルとなっていることが判った。また、得られた変性コラーゲン微粒子は３７℃の水中で１週間の安定性を持つことが確認された。
【００１７】
＜実施例２＞
紫外線照射時間を５時間とした以外は実施例１と同様にして細胞培養用微粒子を製造した。得られた変性コラーゲン微粒子は３７℃の水中で１週間の安定性を持つことが確認された。
【００１８】
＜比較例１＞
市販されている細胞培養媒体（Ｃｙｔｏｄｅｘ１；アマシャムバイオサイエンス社製）を細胞培養用微粒子として用意した。
【００１９】
＜比較試験１＞
実施例１及び２で得られた微粒子並びに比較例１で用意した微粒子を用いて、以下の細胞培養試験を行った。
培養させる細胞として正常のヒト繊維芽細胞（ＷＩ−３８）と、癌化した細胞（ＷＩ−３８−ＶＡ−１３）をそれぞれ用意した。また培養液として１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清を含むＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅを用意し、シャーレには接着系細胞培養用シャーレと浮遊系細胞培養用シャーレの双方を用いた。接着系細胞培養用シャーレは細胞が付着しやすいようにシャーレの内面に表面コーティング処理されているものであり、浮遊系細胞培養用シャーレには、そのような細胞接着処理が施されていない。
【００２０】
先ず、シャーレ内に培養液を満たし、細胞と微粒子とを培養液内に入れて、３７℃で２〜３日間保持して細胞を培養した。シーソー型の攪拌機を用い、培養開始後最初の６時間は３０分おきに２分攪拌し、その後は連続攪拌を行った。図２に実施例１の微粒子に細胞を接着させた様子を示す。この図２より明らかなように、実施例１の微粒子表面に細胞が接着しており、実施例１の微粒子は適度な吸着性を有していることが判る。また、実施例２の微粒子についても同様の傾向が得られた。ＷＩ−３８並びにＷＩ−３８−ＶＡ−１３の双方の細胞において培養過程で各微粒子は安定であり、実施例１及び２の微粒子を用いた場合では、細胞接着処理を施していない浮遊系細胞培養用シャーレにおいてＷＩ−３８の細胞が高い増殖傾向を示すことが判った。この結果から、本発明の微粒子は浮遊系細胞培養用シャーレを使用して懸濁培養をするのが適していると考えられる。
【００２１】
続いて、細胞培養後にトリプシン水溶液により細胞と微粒子との剥離処理を施した。実施例１の微粒子を用いたシャーレのトリプシン処理を施した後の様子を図３に示す。図３より明らかなように、トリプシン処理後のシャーレ内には微粒子が存在しておらず、トリプシン水溶液により実施例１の微粒子は破壊されたものと考えられる。一方、比較例１のＣｙｔｏｄｅｘ１はトリプシン処理後でも存在しており、この比較例１の微粒子を用いた場合、トリプシン処理後に細胞と微粒子とを分離する手段が必要となる。
【００２２】
実施例１の微粒子を用いて培養した細胞について、トリプシン処理後に再び培養したところ、図４に示すように、接着系細胞培養用シャーレによって再び培養が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の細胞培養用微粒子の製造方法を示す図。
【図２】実施例１の微粒子に細胞を接着させた様子を示す図。
【図３】実施例１の培養後にトリプシン処理を施した後のシャーレ内の様子を示す図。
【図４】実施例１の再度培養したシャーレ内の様子を示す図。
【符号の説明】
【００２４】
１１  界面活性剤溶液
１２  コラーゲン又は変性コラーゲン含有水溶液
１３  コラーゲン又は変性コラーゲン液滴
１４  コラーゲン又は変性コラーゲン微粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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