(57)【要約】【課題】  高感度化が実現できるように改良された電気化学検出装置を提供することを目的とする。【解決手段】  電気化学検出装置は、その空間内で反応を起こさせる反応部３と、その空間内に電気化学的な検出を行うための電極１４を有する検出部４と、反応部３と検出部４とを繋ぐ流路７とを備える。検出部４の空間の深さは、反応部３の空間の深さおよび前記流路７の深さよりも浅くされている。【選択図】図１
2006337221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その空間内で反応を起こさせる反応部と、
その空間内に電気化学的な検出を行うための電極を有する検出部と、
前記反応部と前記検出部とを繋ぐ流路とを備え、
前記検出部の空間の深さは、前記反応部の空間の深さおよび前記流路の深さよりも浅くされていることを特徴とする電気化学検出装置。
【請求項２】
前記検出部において、その上面または下面の一方には、空間に向けて盛り上る凸部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の電気化学検出装置。
【請求項３】
前記検出部において、前記上面または下面の他方には、前記凸部に対向するように凹状の窪みが形成されていることを特徴とする請求項２に記載の電気化学検出装置。
【請求項４】
前記凸部の側面がテーパー状になっていることを特徴とする請求項２または３に記載の電気化学検出装置。
【請求項５】
前記凹状の窪みの側面がテーパー状になっていることを特徴とする請求項３または４に記載の電気化学検出装置。
【請求項６】
前記凸部の上面と、前記凹状の窪みが形成されている面とは同一平面上にあることを特徴とする請求項３から５のいずれかに記載の電気化学検出装置。
【請求項７】
前記検出部において、その上面または下面の他方に、前記凹状の窪みが形成されるように、開口部を有するフィルムまたは樹脂層が設けられており、該凹状の窪みに電気化学的な検出を行うための前記電極が形成されていることを特徴とする請求項３から６のいずれかに記載の電気化学検出装置。
【請求項８】
前記検出部において、その上面または下面の一方には、接続パッドに電気的につながった第１接続部が設けられており、
前記凸部は、その裏面に設けられ、前記第１接続部に電気的に接続される第２接続部と、該凸部を厚み方向に貫通する貫通孔と、その表面に設けられ、電気化学的な検出を行うための前記電極とを有し、
前記貫通孔を通して、前記電極と前記第２接続部が電気的に接続されていることを特徴とする請求項２から６のいずれかに記載の電気化学検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に微量の液体に含まれる物質の量の電気化学的測定または分析を行う電気化学検出装置に関し、より特定的には、高感度化が実現できるように改良された電気化学検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大気中の花粉、ダニ、カビ、揮発性有機化合物などの浮遊微小物質や化学物質によるアレルギー症状に多くの人が悩まされている。そこで、アレルギーの原因となるアレルゲン等のタンパク質の量を測定するためのマイクロ流路デバイスの開発が盛んである。このようなデバイスとして、図２５に示すようなマイクロ流路デバイスが提案されている（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
図２５に示すように、ガラス、シリコン等の基板１５１の上に、反応固相としての直径１ｍｍ以下の固体微粒子１５２とともに、この固体微粒子１５２の径よりも大きい縦断面積を有するマイクロチャンネル反応槽部１５３と、固体微粒子１５２の径よりも小さい縦断面積を有するマイクロチャンネル分離部１５４と、抗原および標識抗体を別々に反応槽部１５３へと導く導入部もしくはマイクロチャンネル流入部１５５、１５６と、第一抗体の導入のためのマイクロチャンネル流入部１５７と、バッファー液や洗浄液の導入のためのマイクロチャンネル流入部１５８が設けられている。各々のマイクロチャンネル流入部１５５、１５６、１５７、１５８の端部には、抗原、標識抗体（第二抗体）、第一抗体、そして洗浄液の注入穴部１５５Ａ、１５６Ａ、１５７Ａ、１５８Ａが設けられ、マイクロチャンネル分離部１５４の端部には、廃液部１５４Ａが設けられている。固体微粒子１５２は、免疫抗原−抗体反応のための反応固相としての役割を果たす。反応固相としての固体微粒子１５２は、マイクロチャンネル分離部１５４に流入することはなく、せき止められるように構成され、未反応物だけが、マイクロチャンネル分離部１５４に流入して分離される。
【０００４】
この従来例によれば、微量の試料等の使用によって、簡便に短い反応時間で免疫分析が可能となる。免疫分析の方法としては、反応固相としての固体微粒子１５２をマイクロチャンネル反応槽部１５３に導入し、導入部もしくはマイクロチャンネル流入部１５５、１５６より導入した抗原および標識抗体を、この固体微粒子１５２上で反応させる。次に未反応物をマイクロチャンネル分離部１５４で分離し、光熱変換分析により分析する。光熱変換分析については、熱レンズ顕微鏡によっている。
【０００５】
しかし、提案されているデバイスは、上述のように、検出方法として熱レンズ方式を用いており、装置小型化の観点からは問題となる。
【０００６】
一方、電気化学的な検出方法と組み合わせたデバイスの研究がなされており（例えば、特許文献２参照）、これを特許文献１のマイクロ流路デバイスと組み合わせることで、アレルゲン等のタンパク質を電気的に検出できる電気化学検出型マイクロ流路デバイスが実現できる。
【０００７】
図２６（ａ）は、このような電気化学検出型マイクロ流路デバイスの上面図であり、図２６（ｂ）は、図２６（a）におけるＢ−Ｂ線に沿う断面図である。これらの図を参照して、基板５０１の表面にマイクロチャネル注入穴５０４Ａ，排出孔５０５Ａ、マイクロ反応槽部５０３、マイクロ流路５０４、５０５が形成されており、それらの深さは１００μmであり、流路の幅は２００μmである。マイクロ反応槽部５０３と流路５０５の間には、微粒子の径よりも小さい幅の流路をもつ堰き止め部５０８を形成しており、抗体を固定化した微粒子５０２を堰き止めるようにしている。また、マイクロ流路５０５の上であって、蓋５１０の表面に電極５０６、接続パッド５０７及びそれらを電気的に接続する配線５０９が所望のパターンに形成されている。
【０００８】
例えば、アレルゲンを含む被検液を注入穴５０４Ａから外部ポンプなどを用いて注入し、アレルゲンと特異的に反応する抗体を固定化した微粒子５０２と反応させて、微粒子５０２の表面にアレルゲンを捕獲させる。緩衝液で洗浄後、酵素を標識として付けた抗体を含む液を注入穴部５０４Ａから注入し、微粒子５０２の表面に固定化抗体−アレルゲン−酵素付抗体からなる複合体を形成する。緩衝液で洗浄後、酵素により電極活性物質に変化する基質材料を流して、複合体の酵素により電極活性物質に変える。電極５０６が形成された領域での電極活性物質を電流あるいは電位の変化として接続パッド５０７から検出することで、微量な試料液体中の検出対象物質の濃度を知ることができる。
【０００９】
図２６と図２７を参照して、電極５０６は、特許文献３に提案されるような櫛型形状の作用電極５２０、参照電極５２１、対向電極５２２から構成される電極部が、蓋５１０の表面上に平面状に形成された構成であり、電極５０６の厚さは、１μｍ以下である。また、電極５０６が形成された領域の流路５０５の深さ（空間の厚み）は、約１５μｍから１０００μｍに設定される。
【００１０】
このようなデバイス構造では、作用電極５２０での酸化還元反応は、作用電極５２０付近の電極活性物質しか起こらず、作用電極５２０から離れたところにある電極活性物質は反応に寄与せずに流れていってしまう。その結果、得られる電流値または電圧値は小さなものであり、デバイスの検出感度が低いという問題があった。これを解決するため、液の流れを止めて、酸化還元反応を行うことも考えられるが、作用電極５２０には電極活性物質を引き寄せる作用はないので、作用電極５２０から離れた場所にいる電極活性物質が作用電極５２０付近に来るには拡散作用に頼るしかなく、大きな電流値または電圧値を得るには測定時間が非常に長くなるという問題があった。
【００１１】
特許文献４では、作用電極を３次元的に形成する電極構造が提案されている。電流値を大きくするには櫛型作用電極の本数を多くすることが必要であるが、本文献に開示されている電極構造では、所定の領域に多くの電極の壁を形成することになり、１枚の壁の高さと幅の比が大きくなり、微細加工プロセスでの歩留まりが著しく悪くなる懸念があること、形成した壁の強度が低下し、使用している間に欠陥が生じる懸念があるなどの問題があった。
【００１２】
【特許文献１】特開２００１−４６２８号公報
【００１３】
【特許文献２】特開２００３−２８５２９８号公報
【００１４】
【特許文献３】特開平１−２７２９５８号公報
【００１５】
【特許文献４】特開２００４−９３４０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
この発明は上記のような問題点を解決するためになされたもので、デバイスの検出感度を高めることができるように改良された電気化学検出装置を提供することを目的とする。
【００１７】
この発明の他の目的は、測定時間が短くなるように改良された電気化学検出装置を提供することにある。
【００１８】
この発明の他の目的は、量産性に優れた電気化学検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この発明にかかる電気化学検出装置は、その空間内で反応を起こさせる反応部と、その空間内に電気化学的な検出を行うための電極を有する検出部と、前記反応部と前記検出部とを繋ぐ流路とを備える。前記検出部の空間の深さは、前記反応部の空間の深さおよび前記流路の深さよりも浅くされている。
【００２０】
この発明の好ましい実施態様によれば、上記検出部において、その上面または下面の一方には、空間に向けて盛り上る凸部が設けられている。
【００２１】
この発明のさらに好ましい実施態様によれば、上記検出部において、前記上面または下面の他方には、前記凸部に対向するように凹状の窪みが形成されている。
【００２２】
この発明のさらに好ましい実施態様によれば、上記凸部の側面がテーパー状になっている。
【００２３】
この発明のさらに好ましい実施態様によれば、上記凹状の窪みの側面がテーパー状になっている。
【００２４】
この発明のさらに好ましい実施態様によれば、上記凸部の上面と、上記凹状の窪みが形成されている面とは同一平面上にある。
【００２５】
上記検出部において、その上面または下面の他方に、前記凹状の窪みが形成されるように、開口部を有するフィルムまたは樹脂層が設けられており、該凹状の窪みに電気化学的な検出を行うための前記電極が形成されていてもよい。
【００２６】
この発明のさらに好ましい実施態様によれば、上記検出部において、その上面または下面の一方には、接続パッドに電気的につながった第１接続部が設けられており、上記凸部は、その裏面に設けられ、上記第１接続部に電気的に接続される第２接続部と、該凸部を厚み方向に貫通する貫通孔と、その表面に設けられ、電気化学的な検出を行うための上記電極とを有し、上記貫通孔を通して、上記電極と上記第２接続部が電気的に接続されている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明では、少なくとも免疫反応、酵素反応などを生じさせる反応部、電気化学的な検出を行うための電極が形成された検出部及びそれらを繋ぐ流路を含む検出装置であって、検出部の空間の深さが反応部の空間の深さおよび流路の深さよりも浅くされているので、検出部付近での体積が小さくなり、拡散による濃度低下は従来に比べ小さくでき、結果として大きな電流量を得ることができる。
【００２８】
また、本構成では、従来の構成に比べ、液が検出部を流れる間に拡散力及び壁による衝突やそれによる液内の衝突拡散により電極表面にまで達する量が大きくなり、従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができるという利点が生じる。また、上記のように大きな電流量が得られるため装置として高感度検出が実現できるという効果が生じる。
【００２９】
また、本構成では、流路の深さは、電極表面とそれと対向する基板表面の距離と関係なく設定できるので、当該距離よりも大きい径の抗体付ビーズを用いることが併用でき、高効率の免疫反応及び酵素反応が同時に実現できるという効果も生じる。また、その効果により、酵素反応効率が向上するので、電極活性物質の量も多くなり、結果として従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができ、高感度化が実現できるという相乗効果が生じる。
【００３０】
本発明では、上記検出部において、その上面または下面の一方には、接続パッドに電気的につながった第１接続部が設けられており、上記凸部は、その裏面に設けられ、上記第１接続部に接続される第２接続部と、該凸部を厚み方向に貫通する貫通孔と、その表面に設けられ、電気化学的な検出を行うための上記電極とを有し、上記貫通孔を通して、上記電極と上記第２接続部が電気的に接続されているという構成なので、従来のように、検出部に設けられた電極と接続パッドとをつなぐ配線が段差により切断されるという問題がなくなるという効果が生じる。また、本構成では、上記凸部をフィルムなどで作製する場合、大きなフィルムに複数の電極、第２の接続部を設けた構造体を作製した後、１つ１つの構造体を切り出して貼り付けるということが可能となり、従来のバッチごとに電極を作製するという方法に対し、量産性の観点で利点が生じるという効果が生じる。
【００３１】
また、本発明では、検出部において、予め電極部、配線、接続パッドなどが形成された面に、少なくとも電極の一部が露出するような開口部を設けた、フィルムまたは樹脂層からなる層を形成したことを特徴とする構成なので、従来のように、検出部に設けられた電極と接続パッドとをつなぐ配線が段差により切断されるという問題がなくなるという効果が生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下本発明の実施の形態を図面を用いて説明する。
［実施の形態１］
【００３３】
図１は実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの上面図であり、図２は、図１におけるＩＩ−ＩＩ線に沿う断面図である。
【００３４】
図１に示すように、本発明にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスでは、基板１の表面と蓋２０の表面とが対向するように、基板１の上に蓋２０が設けられ、基板１の表面に、少なくとも、測定対象である検出対象物質を含む被検液、緩衝液を導入する導入孔２、免疫反応や酵素反応を生じさせる反応部３、検出部４、被検液、緩衝液を流出する排出孔５及びそれらを繋ぐ被検液、緩衝液が流れる流路６，流路７，流路８が形成されている。
【００３５】
検出部４において、基板１の表面には、段である凸部２２が設けられている。流路６，７，８を形成した基板１の構成は、従来のように流路パターンを形成した型に光または熱硬化性樹脂を流し込んで固めて一体構造のものとして作製してもよく、また、ポリメタクリル酸樹脂、ポリカーボネイト樹脂からなる基板に流路パターンを形成した型を用いてホットエンボス法により形成した一体構造のものでも良い。
【００３６】
また例えば、図３に示すような、支持基体１０に流路に対応したパターンの孔を空けたフィルム１１を貼り合わせたものでも良い。この場合、大面積のフィルムに所定の流路パターンの孔を複数個一度に形成して、その後所定の大きさに切って支持基体と貼り合わせればよいので、従来のようにバッチ毎に作製する方法に比べ、量産性の観点から利点が生じる。
【００３７】
図１を再び参照して、基板１の厚みは０．１ｍｍ〜５ｍｍ程度である。導入部２、流出部５は、直径が１０μｍ以上、深さが０．１μｍから１ｍｍの穴で良く、特に形状は問わない。反応部３には、アレルゲンと特異的に反応する抗体が設けられている。抗体はビーズ１２などの不溶性担体に固定化されていても良く、基板上に設けられていても良い。反応部３の形状は、円柱形状の穴、半球状の形状、直方体形状の穴または流路の一部を用いても良く、大きさは１０μｍ以上であれば良く、深さは０．１μｍから１ｍｍであれば良い。また、抗体をビーズ１２などの不溶性担体に固定化して、担体を基板に固定化しない場合は、流路７への接続口の断面積を不溶性担体の大きさよりも小さくした堰き止め部１３を設けた構成にすればよい。
【００３８】
この構成を用いれば、被検液や緩衝液が流路６を通って反応部３に流れ込んで流路７に流れ出す場合でも、担体が液といっしょに反応部３から流れ出してしまうことを防ぐことができる。また、別の方法としては、不溶性担体として磁性粒子を用いて、基板１または蓋２０の外に別途設けた磁石（図示せず）により反応部３に固定しても良い。本説明では、簡単のために抗体材料と記しているが、用いる材料としては、検出対象物質と特異的に反応して、これを捕獲するものであれば良く、例えば、モノクロール抗体、ポリクロール抗体など抗体材料やインプリンティングポリマー、アプタマー材料など人工抗体材料と呼ばれているものでも良い。
【００３９】
流路６、７、８は、幅０．１μｍから１ｍｍであり、深さは０．１μｍから１ｍｍに、好ましくは１μｍから５００μｍに形成される。その断面の形は、矩形、台形形状でも良く、流路の底は円の一部のように丸くなっていても良い。蓋２０は、光硬化性樹脂、ガラス、プラスチック材料、シリコン基板、金属基板、フィルムまたはそれらを組み合わせたものなどを用いることができる。蓋２０の表面には、凸部２２に対応した位置に検出用電極１４が形成されている。
【００４０】
本発明の特徴である検出部を、図４を用いて詳細に説明する。本発明では、電極１４は、蓋２０の表面に、凸部２２に対向するように形成されている。液と接する電極１４の表面と、凸部２２の表面２１との距離（検出部の空間の深さ）が、少なくとも反応部３の深さ（空間の厚み）または検出部４に接続する流路７または８の深さ（空間の深さ）のなかの最小のものよりも小さいことを特徴としている。
【００４１】
基板１に形成される凸部２２の平面部の幅は、作用電極の液と接する領域の大きさ以上であれば良く、その流路に沿った方向の長さは特に限定されない。凸部２２が流路７と流路８の間に設けられる場合、凸部２２の形状は、図４のように液の流れる方向に対して垂直な壁面を有してもよい。また、図５のように、液がスムーズに流れるように凸部２２にテーパーを設けていても良い。テーパーを設けることで、凸部２２の側面付近で流れが止まったり、流速の分布が生じるという問題がなくなると共に、泡が発生した場合、凸部２２の側面付近で泡が止まって、液が流れなくなったり、送液時の圧力が高くなり装置を破損するという問題も生じなくなるという効果が生じる。凸部２２の幅及び長さは、電極活性物質の流路内での希釈の度合いを最小にし、電極での酸化還元反応による信号量を最大にするという観点や装置全体の強度、電極サイズから要請される検出部の大きさなどから最適に設計されるべきものである。また、電極１４の表面と、対向する基板表面２１との距離も同様に最適化されるべきものであるが、実際上は、加工精度の観点から０．０５μｍ以上になるよう設計される。
【００４２】
本発明の検出装置を用いて、例えば、アレルゲンなどの抗原を検出する方法を簡単に説明する。図１と図２を参照して、予め、検出装置の流路６、７、８、反応部３、検出部４を緩衝液で満たしておく。次に、導入孔２から緩衝液を注入して装置内を緩衝液で洗浄する。次に予め抗体材料を固定化した複数個のビーズ１２を緩衝液と共に導入孔２から注入し、その後に流路６、７、８、反応部３、検出部４の表面へのタンパク質の非特異的吸着を防ぐために、アルブミン水溶液を流して、表面にアルブミン膜を形成した。
【００４３】
次に、抗原を含む被検液を導入孔２から入れて反応部３に移動させ、被検液中の抗原を反応部３に設けられた抗体材料により捕獲させた後、被検液に代えて緩衝液を導入孔２より入れて流路６、７、８、反応部３、検出部４を洗浄する。
【００４４】
次に、酵素を標識として付けた抗体材料を含む緩衝液を導入孔２から注入し、反応部３に固定化された抗体に捕獲されている抗原と反応させることで、ビーズ１２の表面に固定化抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体を形成させる。酵素付抗体材料は捕獲されている抗原の量に比べ過剰の量を流すので、未反応の酵素付抗体材料を除去するために緩衝液を導入孔２より入れて流路６、７、８、反応部３、検出部４を洗浄する。
【００４５】
次に、標識として用いた酵素により電極活性物質に変化する基質材料を含む緩衝液を導入孔２から注入し、反応部に形成された固定化抗体―抗原−酵素付抗体材料からなる複合体と反応させることで、複合体の量に対応した電極活性物質を生じさせる。電極活性物質は反応部３から流路７を介して検出部４に入り、検出部４にて作用電極、対向電極に所定の電圧を印加することで酸化還元反応が起こり、電流が生じる。この電流を測定することで、アレルゲンの量が測定できる。標識として用いる酵素材料及び基質材料は、公知のもの（例えば特許文献３または特許文献５(特開平９−２４３５９０公報)に開示されるもの）が使用できる。
【００４６】
検出部４では、電極活性物質が作用電極において酸化還元反応を起こすことで電流が生じる。即ち、電流の大きさは電極１４付近での電極活性物質の濃度に依存する。通常、反応部３にて生じた電極活性物質は検出部４に至るまでに希釈される。従来の構成では、流路の深さと検出部の深さは同一であったので、例えば、反応部において免疫反応や酵素反応の効率をあげようとして、ビーズの表面に抗体材料などを固定化した系を応用した場合、検出部４の深さは少なくとも反応部のビーズの径以上になっていた。そのため、電極活性物質は、検出部においてその体積に比例して希釈されてしまい、電極付近の濃度は低くなり電流量も小さくなっていた。本発明では、電極表面とそれと対向する基板表面の距離は、流路の深さと関係なく、小さく設定した構成なので、検出部４付近での体積が小さくなり、拡散による濃度低下は従来に比べ小さくでき、結果として大きな電流量を得ることができる。
【００４７】
また、電極活性物質は、液が検出部４を流れる間に拡散力及び壁による衝突やそれによる液内の衝突拡散により電極１４表面にまで達する量が決定され、電極１４に達する確率は、電極とそれと対向する面との距離が小さいほど大きくなる。本発明では、従来の構成に比べ、当該距離を小さくした構成なので、電極１４に達して反応する電極活性物質の量は従来と比べ大きくなり、従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができるという利点が生じる。また、上記のように大きな電流量が得られるため、装置として高感度検出が実現できるという効果が生じる。
【００４８】
また、本発明では、流路３，７，８の深さは、電極表面とそれと対向する基板表面の距離（検出部の空間の深さ）と関係なく設定できるので、当該距離よりも大きい径の抗体付ビーズを用いることが併用でき、高効率の免疫反応及び酵素反応が同時に実現できるという効果も生じる。また、その効果により、酵素反応効率が向上するので、電極活性物質の量も多くなり、結果として従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができ、高感度化が実現できるという相乗効果が生じる。
【００４９】
本発明の検出部は、図６に示すように、その幅が検出部４に接続する両方の流路７，８の幅よりも大きくても良い。検出部の幅が流路の幅と同じ場合は、流速が同じとき注入孔にかかる圧力は、検出部の入り口の断面積に反比例する。即ち、本発明の構成を用いて、電極表面とそれと対向する基板表面との距離（検出部の空間の深さ）を小さくすれば、検出される信号量は大きくなるが、流路内にかかる圧力は大きくなり、チップの破壊を生じるという懸念がある。本発明の構成は、検出部４の幅を大きくすることを特徴とし、そのことにより、電極表面とそれと対向する基板表面との距離を小さくするという本発明の特徴を活かしながら、流路内にかかる圧力の増加も防ぐことができるという利点が生じる。実際に設定する検出部４の幅は、装置全体の流路の形状、装置の耐圧性から設計されるものであるが、例えば流路の断面積が一定であれば、それとほぼ同一の断面積になるように、検出部４の幅と、電極表面とそれと対向する基板表面との距離を決定すればよい。この値は、検出部４の電極１４での反応性を最大にするように決定されることは言うまでもない。また、本構成では、形成する電極１４の幅も大きくでき、検出電流も大きくできるという効果も生じる。
【００５０】
このような検出部をもつ電気化学検出型マイクロ流路デバイスは、従来のフォトリソグラフィー法による型の作製と、その型に熱または光硬化性樹脂を組み合わせた方法またはホットエンボス法などによって作製できる。以下に従来のフォトリソグラフィー法による型の作製と、その型を用いて、熱または光硬化性樹脂を組み合わせて検出部を形成する工程の一例を図７から図９を参照して簡単に説明する。
【００５１】
図７（ａ）（ｂ）に示すように、第１ステップとして、ガラス基板６０１にネガ型の厚膜レジスト６０２ａを塗布する。次に、図７（ｃ）に示すように、所望の領域６０３を遮光したマスク６０４を介して、レジスト６０２ａを紫外線で露光する。図７（ｄ）に示すように、レジスト６０２ａを現像、ベークすることで検出部に対応した（電極表面と基板表面との距離に対応した）厚みをもつ凸部６０２を形成する。
【００５２】
図８（ａ）に示すように、第２ステップとして、凸部６０２を覆うようにガラス基板６０１の上に厚膜レジスト６０５を塗布する。次に、図８（ｂ）に示すように、流路パターン以外と検出部に対応した所定の領域６０６を遮光したマスク６０９を介してレジスト６０５を紫外線で露光する。図８（ｃ）に示すように、レジスト６０５を現像、ベークすることで、ガラス６０１の表面に、電極表面と基板表面との距離に対応した厚みを持つ凸部６０５と、流路の深さに対応した厚さを持つ凸部６０２とを形成した型６０７を得ることができる。
【００５３】
ステップ３として、図９（ａ）に示すように、型６０７の中にポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む粘性材料６０３ａを型に流し込み、次に図９（ｂ）に示すように、熱硬化させて型６０７から剥離して、注入孔、排出孔を空けることで基板６０８を得ることができる。次に、検出部領域に対応した位置に、図２７に示すような所定のパターンの櫛型作用電極５２０、参照電極５２１、対向電極５２２からなる電極１４及び配線１６、接続パッド１５を形成した蓋２０を、基板６０８に貼り付けることで、図１、図２に示すような検出装置が作製できる。
［実施の形態２］
【００５４】
本実施の形態は、以下に説明する検出部以外は、実施の形態１と同様の構成である。
【００５５】
本実施の形態の特徴である検出部を、図１０から図１３を用いて詳細に説明する。これらの図に示すように、本実施の形態の第１の特徴は、検出部において、基板１０１の表面に、空間に向けて盛り上る段である凸部１２２が設けられており、蓋１２０の表面には、凸部１２２に対向するように、所定の深さをもつ凹状の窪み１２３が形成されている。電極１１４は、蓋１２０の表面に形成された凹部領域１２３に、凸部１２２に対向するように形成されており、液と接する電極１１４表面と、この電極表面と対向する凸部１２２との距離（検出部の空間の厚み）が少なくとも反応部３の深さまたは検出部１０４に接続する流路１０７または１０８の深さの最小のものよりも小さいことを特徴としている。
【００５６】
また、第２の特徴は基板１０１に形成される凸部１２２の上面１２１が、蓋１２０の表面であって窪み１２３が形成されていない部分１２０ａと同一平面であることである。凸部１２２の平面部の幅は、作用電極の液と接する領域の大きさ以上であれば良く、その流路に沿った方向の長さは特に限定されない。凸部１２２の側壁の形状は、図１０、図１３のように液の流れる方向に対して垂直でもよく、図１１、１２のように液がスムーズに流れるようにテーパーを設けていても良い。また、蓋１２０の凹部領域の側壁の形状は、図１０、図１１のように液の流れる方向に対して垂直でもよく、図１２、図１３のように液がスムーズに流れるようにテーパーを設けていても良い。
【００５７】
凸部１２２の幅及び長さは、電極活性物質の流路内での希釈の度合いを最小にし、電極での酸化還元反応による信号量を最大にするという観点や装置全体の強度、電極サイズから要請される検出部の大きさなどから最適に設計されるべきものである。また、電極１１４表面と、これに対向する凸部１２２の表面との距離も同様に最適化されるべきものであるが、実際上は、加工精度の観点から０．０５μｍ以上になるよう設計される。
【００５８】
本発明の実施形態の構成の検出装置を用いた、例えば、抗原の検出方法は、実施形態１に述べた方法と同様である。また、その効果も実施形態１と同様であり、電極表面とそれと対向する基板表面の距離が、流路の深さと関係なく、小さく設定できる構成なので、従来の構成に比べ、検出部での電極活性物質の濃度低下を抑えることができ、また検出部を流れる間に拡散力、衝突確率の増大により電極表面にまで達する確率が増え、電極で反応する電極活性物質の量が大きくなるので、従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができるという利点が生じて、結果として高感度検出が実現できるという効果が生じるというものである。
【００５９】
また、本実施形態の構成でも、流路の深さは、電極表面とそれと対向する基板表面の距離と関係なく設定できるので、当該距離よりも大きい径の抗体付ビーズを用いることが併用でき、高効率の免疫反応及び酵素反応が同時に実現できるという効果も生じ、その効果により酵素反応効率が向上するので、電極活性物質の量も多くなり、結果として従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができ、ひいては高感度化が実現できるという相乗効果が生じるという、実施形態１と同様のものである。
【００６０】
また、検出部１０４の幅が検出部１０４に接続する両方の流路の幅よりも大きくても良いことも実施の形態１と同様である。検出部１０４の幅を広くすることで、実施形態１に述べた効果と同様に、電極表面とそれと対向する基板表面との距離を小さくするという本発明の特徴を活かしながら、流路内にかかる圧力の増加も防ぐことができるという利点が生じる。
【００６１】
本実施形態の構造の他の利点は、作製方法の簡便化にある。例えば、基板側の検出部の加工は、実施形態１と同様に、従来のフォトリソグラフィー法による型の作製と、その型に熱または光硬化性樹脂を充填する方法により行うことができるが、図１４に示す方法によっても行うことができる。すなわち、図１４（ａ）（ｂ）に示すように、第１ステップとして、ガラス基板６０１に厚膜レジスト６０５を塗布する。次に、図１４（ｃ）に示すように、所望の領域６０６を遮光したマスク６０９を介して、レジスト６０５を紫外線で露光する。図１４（ｄ）に示すように、レジスト６０５を現像、ベークすることで型を形成する。後は熱または光硬化性樹脂を用いた実施形態１の図９（ａ）（ｂ）と同様のステップのみで基板１０１を作製することができる。それゆえ、実施形態１の図８に相当する工程が必要ないため、２枚目のフォトマスクの位置合わせ（図８（ｂ）の工程）による位置ずれの懸念もなくなるので、歩留まりの点から利点が生じる。
【００６２】
蓋側の加工は従来のフォトリソグラフィー法にエッチング法を組み合わせて、図１０を参照して、蓋１２０の所定の領域に凹部１２３を形成し、その後形成した蓋１２０の凹部１２３に図２７に示すような所定のパターンの櫛型作用電極５２０、参照電極５２１、対向電極５２２からなる電極１１４を形成すれば良い。同時に、配線、接続パッドを形成しても良い。その後、液と接する領域以外を絶縁膜で覆い、基板と貼り合わせることで完成する。しかしながら、この方法では、凹部１２３に形成した電極１１４と接続パッドを繋ぐ配線が凹部１２３の段差により切断されるという懸念が生じる。
【００６３】
このような懸念をなくす方法として、図１５に示すように、蓋１２０として使用するシリコンウエハ、ガラス基板、プラスチック基板などの表面であって、基板１０１の凸部１２２に対応した位置に、従来のフォトリソグラフィー法にエッチング法を組み合わせた工程により、図２７に示すような所定のパターンの櫛型作用電極５２０、参照電極５２１、対向電極５２２からなる電極部１１４、配線（図示せず）、接続パッド（図示せず）を形成し、検出部１０４を構成する。この場合、平面上に形成されるので、配線が切断される懸念はなくなる。次に、電極部を含む所定の大きさの穴を開けた、所定の厚さのフィルム１２５を貼り付けて、さらに凸部１２２、流路１０６、１０７、１０８、注入孔１０２、排出孔１０５を設けた基板１０１と貼り合わす事で、本発明の構成の検出装置を作製できる。
【００６４】
また、図１６から図１９に示すように、フィルムを貼り合わせる代わりに、従来のフォトリソグラフィー工程により、電極部、配線、接続パッドを形成した蓋１２０に例えば光硬化性の樹脂を所定の厚さだけ塗布し、電極部の一部を少なくとも含む領域を遮光したマスクを介して紫外線で露光して、現像、ベークして光硬化性樹脂膜１２５を形成することで図１０から図１３に対応するものが得られ、凸部、流路、注入、排出孔を設けた基板１０１と貼り合わす事で、図１５に示すものと同様の構成の検出装置を作製できる。図１６は図１０に対応し、図１７は図１１に対応し、図１８は図１２に対応し、図１９は図１３に対応する。
［実施の形態３］
【００６５】
本実施の形態は、検出部以外は、実施形態１と同様の構成である。
【００６６】
次に本実施の形態の特徴である検出部を、図２０、図２１を用いて詳細に説明する。本実施の形態の第１の特徴は、電極２１４が、蓋２２０の表面に設けられた所定の高さを持つ凸部領域２２２に、基板２０１に対向するように形成されており、液と接する電極表面２２１と、電極表面２２１と対向する基板表面２０１ａとの距離(検出部の空間の厚み)が少なくとも反応部の深さまたは検出部に接続する流路またはの深さの最小のものよりも小さいことを特徴としている。
【００６７】
凸部領域２２２の側壁の形状は、図２０のように液の流れる方向に対して垂直でもよく、また図２１に示すように、液がスムーズに流れるようにテーパーを設けていても良い。また、凸部領域２２２に対向する面に、実施形態２に記載したような凹部の窪みを形成してもよく、窪みの側面にテーパーを形成しても良い。
【００６８】
凸部領域２２２の幅及び長さは、電極活性物質の流路内での希釈の度合いを最小にし、電極での酸化還元反応による信号量を最大にするという観点や装置全体の強度、電極サイズから要請される検出部の大きさなどから最適に設計されるべきものである。また、電極表面２２１と、電極表面２２１と対向する基板表面２０１ａとの距離も同様に最適化されるべきものであるが、実際上は、加工精度の観点から０．０５μｍ以上になるよう設計される。
【００６９】
本実施形態の構成の検出装置を用いた、例えば、抗原の検出方法は、実施形態１に述べた方法と同様である。また、その効果も実施形態１と同様であり、電極表面とそれと対向する基板表面の距離が、流路の深さと関係なく、小さく設定できる構成なので、従来の構成に比べ、検出部での電極活性物質の濃度低下を抑えることができ、また検出部を流れる間に拡散力、衝突確率の増大により電極表面にまで達する確率が増え、電極で反応する電極活性物質の量が大きくなるので、従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができるという利点が生じて、結果として高感度検出が実現できるという効果が生じるというものである。
【００７０】
また、本実施形態の構成でも、流路の深さは、電極表面とそれと対向する基板表面の距離と関係なく設定できるので、当該距離よりも大きい径の抗体付ビーズを用いることが併用でき、高効率の免疫反応及び酵素反応が同時に実現できるという効果も生じ、その効果により酵素反応効率が向上するので、電極活性物質の量も多くなり、結果として従来の検出装置に比べ大きな電流量を得ることができ、高感度化が実現できるという相乗効果が生じるという、実施形態１と同様のものである。
【００７１】
また、検出部の幅が検出部に接続する両方の流路の幅よりも大きくても良いことも実施の形態１と同様である。検出部の幅を広くすることで、実施形態１に述べた効果と同様に、電極表面とそれと対向する基板表面との距離を小さくするという本発明の特徴を活かしながら、流路内にかかる圧力の増加も防ぐことができるという利点が生じる。
【００７２】
本実施形態の構造は、蓋２２０を従来のフォトリソグラフィー法にエッチング法を組み合わせた方法で凸部領域２２２を形成し、その後所定のパターンの櫛型作用電極、参照電極、対向電極からなる電極２１４、配線、接続パッド（図示せず）を形成して流路、反応部、検出部（図示せず）を形成した基板２０１と貼り合わせれば得ることができる。しかしながら、この方法では、凸部領域に形成した電極２１４と接続パッド（図示せず）を繋ぐ配線（図示せず）が凸部領域２２２の段差により切断されるという懸念が生じる。
【００７３】
このような懸念をなくす方法として、例えば、図２２に示すように、その表面に櫛型作用電極、参照電極、対向電極からなる所定のパターンの電極部２１４と複数の貫通孔２５１を形成した基材片２５０を蓋２２０に接着剤２５２で貼り合わせた構成がある。電極部２１４の各電極は貫通孔２５１を介して基材片２５０の裏面に形成した第１接続部２５３と電気的に繋がっており、第１接続部２５３は蓋２２０の表面に形成された第２接続部２５４、配線（図示せず）を通して接続パッド（図示せず）と電気的につながっている。この方法の利点は、一度に多くの電極形成フィルム片２５０が作製できるので、それを切り出して蓋と貼り合わせれば良いので、量産性の観点から効果がある。
（実施例）
【００７４】
図２３を参照して、本発明の実施例にかかる装置の製造方法について具体的に説明する。図７、図８に示す工程と同様にして、ガラス基板上に、厚膜レジストＳＵ-８を用いて型を形成し、その型を用いて、図９と同様の方法で熱硬化性樹脂ＰＤＭＳで流路、液の注入、排出孔を形成した凸部４２２を有する基板４０１を作製した。基板４０１の大きさは２５ｍｍ×５０ｍｍで、流路４０６、４０７，４０８の幅は０．２ｍｍ、深さは０．０５ｍｍに設定した。検出部４０４に形成した凸部４２２の高さは０．０４ｍｍ、即ち、ＰＤＭＳ基板表面から０．０１ｍｍの深さ、幅、長さとも３ｍｍに設定した。蓋４２０の表面の検出部に対応する位置には、図２７に示すような櫛型作用電極５２０、対向電極５２１、参照電極５２２からなる電極４１４と、液に接触する部分だけ残して絶縁膜４２３を形成した。ＰＤＭＳ基板４０１と蓋４２０を貼り合わせて検討装置とした。電極形成及び材料については、公知の技術（特許文献４）を用いた。各電極は、蓋表面に形成した取出し端子４１７と配線４１８で電気的に接続される。流路４０７と検出部４０４との間には、図２４に示すような拡散部４０９を設けて、電極４１４全体に液が接触するようにしている。
【００７５】
次に、本発明の効果について説明する。ｐＨ７．４に調整したリン酸緩衝液に電極活性物質であるパラアミノフェノールを０．１μＭ濃度入れたものをポンプ４６０を用いて注入孔４０２から入れて、流路４０６、４０７、４０８および検出部４０４を満たした後、３分後に電極４１４からの電流値を測定した。尚、作用電極の櫛型電極の一方で、パラアミノフェノールは電子を櫛型電極の一方に渡してパラキノンイミンに変化する。また、パラキノンイミンは他方の櫛型電極から電子を受け取ってパラアミノフェノールに戻り、この反応が繰り返されて、大きな電流値が検出される。
【００７６】
比較として、検出部４０４に段４２２を設けず、深さを流路と同じ０．０５ｍｍにした以外は、上記と同じ構成の従来型の検出装置で上記と同様の実験を行ったところ、得られた電流値は、本発明の構成の１００分の１以下になった。
【００７７】
このことから、本発明の構成が大きな検出電流を得るために非常に有効であることが分かった。
【００７８】
今回開示された実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
上述したように、本発明によると、大きな検出信号を得ることができ、高感度の電気化学検出型のマイクロ流路検出装置を提供でき、また、本発明はタンパク質の検出だけでなく、電気化学的に検出できるものすべてに応用ができることから、その産業上の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの上面図である。
【図２】図１におけるＩＩ−ＩＩ線に沿う断面図である。
【図３】実施の形態１の変形例にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの断面図である。
【図４】実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの検出部の拡大断面図である。
【図５】実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの変形例にかかる検出部の拡大断面図である。
【図６】実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスのさらなる変形例にかかる検出部の上面図である。
【図７】実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの検出部の製造方法の第１ステップを示す断面図である。
【図８】実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの検出部の製造方法の第２ステップを示す断面図である。
【図９】実施の形態１にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの検出部の製造方法の第３ステップを示す断面図である。
【図１０】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの検出部の拡大断面図である。
【図１１】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの変形例にかかる検出部の拡大断面図である。
【図１２】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスのさらなる変形例にかかる検出部の拡大断面図である。
【図１３】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスのさらなる変形例にかかる検出部の拡大断面図である。
【図１４】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの検出部の製造方法を示す断面図である。
【図１５】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの変形例にかかる断面図である。
【図１６】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの他の検出部の拡大断面図である。
【図１７】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスのさらに他の変形例にかかる検出部の拡大断面図である。
【図１８】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスのさらに他の変形例にかかる検出部の拡大断面図である。
【図１９】実施の形態２にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスのさらに他の変形例にかかる検出部の拡大断面図である。
【図２０】実施の形態３にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの検出部の拡大断面図である。
【図２１】実施の形態３にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの他の検出部の拡大断面図である。
【図２２】実施の形態３にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスのさらに他の検出部の拡大断面図である。
【図２３】（ａ）  実施例にかかる電気化学検出型マイクロ流路デバイスの上面図である。  （ｂ）  図２３（ａ）におけるＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
【図２４】実施例に用いる拡散部の上面図である。
【図２５】従来の電気化学検出装置の斜視図である。
【図２６】（ａ）  他の従来の電気化学検出装置の上面概略図である。  （ｂ）  図２６（ａ）におけるＢ−Ｂ線に沿う断面図である。
【図２７】従来の電気化学検出用の電極の構成を示す概略図である。
【符号の説明】
【００８１】
１、１０１、２０１、４０１、５０１、６０８  基板
２、１０２、４０２、５０４Ａ  導入孔
３、５０３  反応部
４、１０４、４０４    検出部
５、１０５、４０５、５０５Ａ  排出孔
６、７、８、１０６、１０７、１０８、４０６、４０７、４０８、５０４、５０５  流路
１２、１１２、５０２  ビーズ
１３，５０８  堰き止め部
１４、１１４、２１４、４１４、５０６  電極
１５、４１７、５０７  接続パッド
１６、４１８、５０９  配線
２０、１２０、２２０，４２０、５１０  蓋
２２、１２２、２２２  凸部
２５１  貫通孔
２５２  接着層
２５３  第１接続部
２５４  第２接続部
４０９  拡散部
５２０  作用電極
５２１  参照電極
５２２  対向電極
６０１  ガラス基板
６０２、６０５  レジスト
６０３、６０６  遮光領域
６０４、６０９  マスク
６０７  型
【図１】
2006337221.tif 000003
【図２】
2006337221.tif 000004
【図３】
2006337221.tif 000005
【図４】
2006337221.tif 000006
【図５】
2006337221.tif 000007
【図６】
2006337221.tif 000008
【図７】
2006337221.tif 000009
【図８】
2006337221.tif 000010
【図９】
2006337221.tif 000011
【図１０】
2006337221.tif 000012
【図１１】
2006337221.tif 000013
【図１２】
2006337221.tif 000014
【図１３】
2006337221.tif 000015
【図１４】
2006337221.tif 000016
【図１５】
2006337221.tif 000017
【図１６】
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【図１７】
2006337221.tif 000019
【図１８】
2006337221.tif 000020
【図１９】
2006337221.tif 000021
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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