(57)【要約】【課題】  官能基が形成された平滑性が高い表面を有する生体分子固定化プレートや、前記官能基を介して生体分子を固定化した生体分子固定化プレートと、これらの生体分子固定化プレートを安価で容易に得ることができる製造方法を提供する。【解決手段】  少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであり、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、官能基を有する生体分子固定化プレートである。また、高分子材料からなるプレート表面の平坦部分にオゾン雰囲気下で紫外線を照射して、平坦部分の一部に生体分子と結合能を有する官能基を形成することで、前記生体分子固定化プレートを製造する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、官能基を有することを特徴とする生体分子固定化プレート。
【請求項２】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、カルボキシル基を有することを特徴とする生体分子固定化プレート。
【請求項３】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、官能基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていない官能基を保護する保護基とを有することを特徴とする生体分子固定化プレート。
【請求項４】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の任意の形状を有する領域部分の一部に、官能基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていない官能基を保護する保護基とを有することを特徴とする生体分子固定化プレート。
【請求項５】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、カルボキシル基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていないカルボキシル基を保護する保護基とを有することを特徴とする生体分子固定化プレート。
【請求項６】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の任意の形状を有する領域部分の一部に、カルボキシル基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていないカルボキシル基を保護する保護基とを有することを特徴とする生体分子固定化プレート。
【請求項７】
前記高分子材料はポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、またはポリカーボネートであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の生体分子固定化プレート。
【請求項８】
前記保護基はアミノ基であることを特徴とする請求項３から６のいずれかに記載の生体固定化プレート。
【請求項９】
前記生体分子は核酸、タンパク質、またはペプチドであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の生体分子固定化プレート。
【請求項１０】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートの、算術平均粗さが０．１ｎｍ〜５ｎｍである前記平坦部分にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することにより、前記平坦部分の一部に生体分子と結合能を有する官能基を形成することを特徴とする生体分子固定化プレートの製造方法。
【請求項１１】
少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートの、算術平均粗さが０．１ｎｍ〜５ｎｍである前記平坦部分にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することにより、前記平坦部分の一部にカルボキシル基を形成し、前記カルボキシル基を介して前記平坦部分に生体分子を固定化し、前記生体分子が結合されなかったカルボキシル基を保護する保護基を付加することを特徴とする生体分子固定化プレートの製造方法。
【請求項１２】
前記平坦部分の任意領域のみを露出させるマスクを配置し、前記任意領域にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することを特徴とする請求項１０または１１に記載の生体分子固定化プレートの製造方法。
【請求項１３】
前記紫外線の照射エネルギーは、前記平坦部分を形成する高分子材料の炭素−炭素結合の結合エネルギーより大きいことを特徴とする請求項１０または１１に記載の生体分子固定化プレートの製造方法。
【請求項１４】
前記高分子材料はポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、またはポリカーボネートであることを特徴とする請求項１０または１１に記載の生体分子固定化プレートの製造方法。
【請求項１５】
前記保護基はアミノ基であることを特徴とする請求項１１に記載の生体分子固定化プレートの製造方法。
【請求項１６】
前記生体分子は核酸、タンパク質、またはペプチドであることを特徴とする請求項１０または１１に記載の生体分子固定化プレートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、タンパク質、ペプチドなどの生体分子をプレートに固定化した生体分子固定化プレートとその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸、タンパク質、ペプチド、酵素、レセプター、抗体、糖質、脂質、ビタミン、ホルモン、または、これらの類縁物質である生体分子を検出するために、生体分子を適当なプレートに固定化し、固定化した生体分子に対して高親和性を有する抗原、蛍光物質、発光物質等を滴下した後、抗原抗体反応、蛍光反応、発色反応、電気化学反応を利用して、吸光測定法、蛍光測定法または発光測定法などの光学的検出法によりプレートに固定化した生体分子を検出する方法が広く採用されてきた。生体分子をプレートに固定化して検出する方法は、生体分子を検出する際の試薬類の添加、排出を非常に容易にすることから、様々な固定化プレートが提案され実用化されている。
【０００３】
例えば、固定化プレートとして、核酸やタンパク質と疎水結合するニトロセルロース膜、ナイロン膜がある。このニトロセルロース膜、ナイロン膜を固定化プレートとして用いて、サザンブロッティング法や、ノーザンブロッティング法による核酸の検出、ウエスタンブロッティング法によるタンパク質の検出が現在でも行われている。
【０００４】
また、固定化プレートとして、プラスティック製のプレート（マイクロプレート）も用いられている。例えば、９６個の直径約７ｍｍ、深さ約１０ｍｍのくぼみを有する約８０×１２０ｍｍのマイクロプレートが用いられ、このプレートのくぼみ表面を疎水性にしたり、くぼみ表面に官能基を導入したりして、核酸またはタンパク質を疎水結合またはイオン結合により固定化する。このマイクロプレートを用いれば、多検体の同時処理が可能となるため、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）による生体分子の検出に利用されている。
【０００５】
また、疎水結合、イオン結合によって、生体分子をプレートに結合する方法が、近年考案されたマイクロアレイの技術にも採用されている。マイクロアレイとは、２５ｍｍ×７５ｍｍのスライドガラス程度の大きさのプレートに１０００以上の生体分子を固定化する技術である。例えば、スライドガラスにＤＮＡ断片を固定化し、固定化したＤＮＡ断片と標識されたターゲットＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることで、ターゲットＤＮＡを高速で高感度に検出できる（特許文献１、非特許文献１及び２）。マイクロアレイでは、プレートとして主にガラスが利用され、当初は、生体分子とのイオン結合を利用した固定化が採用されていた。しかし、疎水結合及びイオン結合を利用した固定化方法では、反応試薬の添加、洗浄、排出の処理過程で、固定化した生体分子がプレートから解離することがあり、結合安定性に劣る。このため、ガラスプレート表面に官能基を形成し、この官能基を介してガラスプレートと生体分子とを共有結合させる技術が提案されている。
【０００６】
例えば、ガラスプレート表面を酸化処理して親水基を導入した後、アミノシランカップリング剤を親水基と縮合反応させることで、ガラスプレート表面に官能基としてアミノ基を導入する方法が提案されている（特許文献２）。
【０００７】
また、ガラスプレート表面の水酸基と反応性が高いシラン化合物（シランカップリング剤）を用いて、カルボキシル基を官能基としてガラスプレート表面に導入する方法も提案されている（特許文献３）。シラン化合物は、ガラスへの反応性が高い物質であるためガラスプレート表面への官能基導入に繁用されており、シラン化合物処理後でもガラスプレート平滑性の変動量を３ｎｍ程度に維持できることが分かっている（例えば、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社ウェブサイト  http://www.arrayit.com/Products/Substrates/SMA/sma.html  参照、２００３年１２月検索）。
【０００８】
また、プレート表面に高分子重合体の被膜を形成することで、官能基を導入する方法（特許文献４）や、ガラスプレート表面をダイヤモンドライクガーボンで蒸着させて、官能基として炭化物を導入する方法（特許文献５及び６）も提案されている。
【０００９】
その他にも、遺伝子検出用のマイクロアレイを用いてプレート表面に生体分子である遺伝子を固定化する方法も提案されている。例えば、シリコン基板表面上にヌクレオチドを固定化した後、光重合官能基を有するヌクレオチドを半導体加工技術の応用により順次伸長させて、オリゴヌクレオチドを形成していく方法（特許文献７、非特許文献３）や、インクジェットプリンターの技術を応用してガラスプレート上にヌクレオチドを点着させて順次、ヌクレオチを伸長形成していく方法（特許文献８）が提案されている。
【特許文献１】特許３２７２３６５号公報
【特許文献２】特許１６４９３５１号公報
【特許文献３】特開２００１−１０８６８３号公報
【特許文献４】特表２００１−５１８６０４号公報
【特許文献５】特開２００２−８２１１６号公報
【特許文献６】特開２００２−３５０４４０号公報
【特許文献７】特表２０００−５０８５４２号公報
【特許文献８】特開２００１−５０９６０号公報
【非特許文献１】フォーダー，エス  ピー  エー（Ｆｏｄｏｒ．，Ｓ．Ｐ．Ａ．）外，「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９１年，第２５１巻，ｐ．７６７
【非特許文献２】シェーナ，エム（Ｓｃｈｅｎａ．，Ｍ．）外，「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９９５年，第２７０巻，ｐ．４６７
【非特許文献３】リプシュ，アール  ジェイ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ．，Ｒ．Ｊ．）外，「ネイチャー  ジェネティクス  サプルメント（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）」，１９９９年，第２１巻，ｐ．２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プレートへの生体分子の固定化は、プレート単位面積当たりの生体分子固定化量の均一性が要求されることに加え、固定化した生体分子を吸光測定法、蛍光測定法、発光測定法といった光学的な方法を利用して検出するため、プレート自身の光の透過性、光散乱、光吸収、光屈折等の光学特性が均一であることが要求される。さらに、プレート自身の表面の平滑性が一定であることも要求される。しかしながら、従来の技術では、これらの点に関して、以下に示す課題が生じる。
【００１１】
まず、マイクロプレート（プラスティックプレート）を固定化プレートとする場合、生体分子を固定化するくぼみ表面の光学特性及び平滑性を均一にしなければならない。しかし、この場合、くぼみ表面に固定化能を有するように適切な物理的処理あるいは化学的処理を施さなければならず、最終形態に達するまで、プレート表面の光学特性および平滑性を均一に保持することは困難であった。
【００１２】
また、ガラス等のプレートに生体分子を強固に固定化するために、プレートに官能基を形成する方法として、シラン化合物によりプレートを処理する方法、プレート表面に高分子重合体を被膜する方法、ガラス表面にダイヤモンドライクカーボンを蒸着させる方法が提案されているが、これらの方法においても課題がある。シラン化合物は反応失活性が高いため、官能基の導入が安定せず、生体分子の固定化量が均一にならない。また、プレート表面に高分子重合体を被膜すると、形成した被膜により凹凸が生じ、プレート表面の光特性、平滑性及び単位面積当たりの官能基数（生体分子固定化量）が均一にならない。また、ガラスプレート表面にダイヤモンドライクカーボンを蒸着させると、蒸着した炭化物が多結晶構造を形成するため、プレート表面が平滑になりにくい。
【００１３】
また、以上のように官能基をガラスプレートなどに導入して、生体分子を固定化する方法では、所望の生体分子と未反応な官能基が、意図しない生体分子と吸着または結合するおそれがあり、これが測定のノイズ成分となる可能性があった。
【００１４】
また、シリコン基板に半導体加工技術を応用して遺伝子を固定化する方法が提案されていて、この方法を用いれば高精度に遺伝子を固定化することができる。しかし、この方法は、基板上でのヌクレオチドの伸張形成を利用しているため、４種類の塩基の組み合わせで構成される遺伝子にのみ実現可能であり、他の生体分子の固定化に適用することは困難であった。また上述したインクジェット技術を応用して遺伝子を固定化する方法も同様の課題を有している。
【００１５】
また、ガラススライド大のガラスプレート上に１０００以上の検体を固定化するマイクロアレイでは、生体分子固定化プレートに固定化する単位面積当たりの検体数が非常に多いため一検体当たりのスポットの直径が数十μmとなり、一検体当たりの固定化量が非常に微量になる。このため、マイクロアレイを用いる場合、検出精度を向上させるためにはプレート自身の光学特性が均一であるだけでなく、プレートの位置ムラ、歪み、さらには微細な傷のない平滑性が高いプレートを作成することが要求される。よって、顕微鏡観察等で使用されるスライドガラスに比べて、非常に高価なプレートを用いる必要があった。例えば、プレートとしてシリコンを用いると、半導体製造法からも明らかなように高い平滑性を得ることが可能であるが、シリコンのプレートは高価である。よって、ガラスまたはシリコンにかわる安価に生産可能なプレートが望まれていた。さらに、マイクロアレイでは、ガラス等のプレートに生体分子を固定化する際、生体分子を含有する液滴をピンスポッター等で点着するため、プレート表面全体に予め官能基を導入してあると、スポットの位置ずれ及び形状の不均一が生じてしまい、検出精度を低下させるという課題を有していた。
【００１６】
以上のことから、本発明では、官能基が形成された平滑性が高い表面を有する生体分子固定化プレートや、前記官能基を介して生体分子を固定化した生体分子固定化プレートと、これらのプレートを安価で容易に得ることができる生体分子固定化プレートの製造方法とを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、官能基を有することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、カルボキシル基を有することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、官能基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていない官能基を保護する保護基とを有することを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の任意の形状を有する領域部分の一部に、官能基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていない官能基を保護する保護基とを有することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、カルボキシル基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていないカルボキシル基を保護する保護基とを有することを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の任意の形状を有する領域部分の一部に、カルボキシル基を介して結合した生体分子と、前記生体分子に結合されていないカルボキシル基を保護する保護基とを有することを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、前記高分子材料がポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、またはポリカーボネートであることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、前記保護基がアミノ基であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、前記生体分子が核酸、タンパク質、またはペプチドであることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートの、算術平均粗さが０．１ｎｍ〜５ｎｍである前記平坦部分にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することにより、前記平坦部分の一部に生体分子と結合能を有する官能基を形成することを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートの、算術平均粗さが０．１ｎｍ〜５ｎｍである前記平坦部分にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することにより、前記平坦部分の一部にカルボキシル基を形成し、前記カルボキシル基を介して前記平坦部分に生体分子を固定化し、前記生体分子が結合されなかったカルボキシル基を保護する保護基を付加することを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、前記平坦部分の任意領域のみを露出させるマスクを配置し、前記任意領域にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、前記紫外線の照射エネルギーが、前記平坦部分を形成する高分子材料の炭素−炭素結合の結合エネルギーより大きいことを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、前記高分子材料がポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、またはポリカーボネートであることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、前記保護基がアミノ基であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、前記生体分子が核酸、タンパク質、またはペプチドであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、官能基を有するようにした。これにより、官能基を介して生体分子を固定化しても、平滑性が高いため、固定化した生体分子の光学的検出を阻害することがない。
【００３４】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、カルボキシル基を有するようにした。これにより、カルボキシル基を介して生体分子を固定化しても、平滑性が高いため、固定化した生体分子の光学的検出を阻害することがない。
【００３５】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、官能基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていない官能基を保護する保護基とを有するようにした。これにより、官能基を介して生体分子を固定化しても、平滑性が高いため、固定化した生体分子の光学的検出を阻害することがない。さらに、生体分子と未反応な官能基を保護基で保護していることから、遊離状態の官能基が余分な生体分子と結合することがないので、官能基によって安定的に生体分子を固定化できる。
【００３６】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の任意の形状を有する領域部分の一部に、官能基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていない官能基を保護する保護基とを有するようにした。これにより、官能基を介して生体分子を固定化しても、平滑性が高いため、固定化した生体分子の光学的検出を阻害することがない。さらに、プレート表面上の任意の領域のみに生体分子を固定化するため、生体分子の固定化位置、形状を正確に限定することができる。また、生体分子と未反応な官能基を保護基で保護していることから、遊離状態の官能基が余分な生体分子と結合することがないので、官能基によって安定的に生体分子を固定化できる。
【００３７】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の一部に、カルボキシル基を介して結合した生体分子と、前記生体分子が結合されていないカルボキシル基を保護する保護基とを有するようにした。これにより、カルボキシル基を介して生体分子を固定化しても、平滑性が高いため、固定化した生体分子の光学的検出を阻害することがない。さらに、生体分子と未反応なカルボキシル基を保護基で保護していることから、遊離状態のカルボキシル基が余分な生体分子と結合することがないので、カルボキシル基によって安定的に生体分子を固定化できる。
【００３８】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートは、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートであって、前記平坦部分の算術平均粗さは０．１ｎｍ〜５ｎｍであり、前記平坦部分の任意の形状を有する領域部分の一部に、カルボキシル基を介して結合した生体分子と、前記生体分子に結合されていないカルボキシル基を保護する保護基とを有するようにした。これにより、官能基を介して生体分子を固定化しても、平滑性が高いため、固定化した生体分子の光学的検出を阻害することがない。さらに、プレート表面上の任意の領域のみに生体分子を固定化するため、生体分子の固定化位置、形状を正確に限定することができる。また、生体分子と未反応なカルボキシル基を保護基で保護していることから、遊離状態のカルボキシル基が余分な生体分子と結合することがないので、カルボキシル基によって安定的に生体分子を固定化できる。
【００３９】
本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートの、算術平均粗さが０．１ｎｍ〜５ｎｍである前記平坦部分にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することにより、前記平坦部分の一部に生体分子と結合能を有する官能基を形成するようにした。これにより、プレート表面に生体分子と結合能を有する官能基を、プレート表面の平滑性を損なうことなく形成できるため、官能基を介して固定化した生体分子の光学的検出を阻害しない生体分子固定化プレートを製造することができる。
【００４０】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、少なくとも一表面が高分子材料からなる平坦部分を有するプレートの、算術平均粗さが０．１ｎｍ〜５ｎｍである前記平坦部分にオゾン雰囲気下で紫外線を照射することにより、前記平坦部分の一部にカルボキシル基を形成し、前記カルボキシル基を介して前記平坦部分に生体分子を固定化し、前記生体分子が結合されなかったカルボキシル基を保護する保護基を付加するようにした。これにより、プレート表面に生体分子と結合能を有するカルボキシル基を、プレート表面の平滑性を損なうことなく形成できるため、カルボキシル基を介して固定化した生体分子の光学的検出を阻害しない生体分子固定化プレートを製造することができる。さらに、生体分子と未反応なカルボキシル基を保護基で保護していることから、遊離状態のカルボキシル基が余分な生体分子と結合することがないので、カルボキシル基によって安定的に生体分子を固定化できる。
【００４１】
また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、前記平坦部分の任意領域のみを露出させるマスクを配置し、前記任意領域にオゾン雰囲気下で紫外線を照射するようにした。これにより、プレート表面上での官能基形成領域を特定できるため、生体分子の固定化位置、形状を正確に限定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下に、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１に係る生体分子固定化プレートは、図１に示すように、基材１のみから構成され、基材１自体が高分子材料からなるものが好ましいが、高分子材料からなる平板２を基材１の表面に貼り合わせたもの、または基材１の表面に高分子材料３を塗布したものでも良い。
【００４３】
また、プレートの構造は、生体分子を固定化する少なくとも１つの平坦な表面を有する構造であればよく、スライドガラスのような平面プレート構造や、少なくとも１つの平坦な表面を有する凹構造や凸構造でも良い。なお、前記平坦な表面は、元々平坦であるものでも良いし、機械加工、化学研磨、塗布処理により平坦化処理されたものでも良い。
【００４４】
また、プレートの表面は光学的検出を行うために平坦性が高い程好ましく、光学散乱の影響が小さい算術平均粗さ０．１ｎｍ〜５ｎｍであることが好ましい。以下、その理由について説明する。
【００４５】
プレートに固定化された核酸量を定量的に検出する場合、表面に核酸を均一に固定化する必要がある。核酸の１塩基対あたりの上昇距離は０．２３ｎｍ、２重らせんの直径は２．５ｎｍである。核酸を検知する際、プローブ核酸は２０塩基程度必要である。これは、２０塩基中に４基の塩基種が存在することから４の２０乗の組み合わせが可能で、また、ヒトゲノムが約３０億の塩基から形成されることから、２０塩基のプローブ核酸であれば、まったく同じ配列は出現しないと考えられるからである。２０塩基の核酸長は、核酸の１塩基対あたりの上昇距離を考慮するとおよそ４.６ｎｍとなる。算術平均粗さがプレート表面の核酸長より大きくなると、プレート表面の凹凸部の壁面に核酸が固定化され、核酸の固定量、及び均一な励起光照射が困難になる。このことからも、算術平均粗さは５ｎｍ以下であることが望ましい。さらに好適には、光学散乱がほとんど影響しない、ガラス並みの算術平均粗さ（２ｎｍ以下）であるものが好ましい。ガラスであれば、算術平均粗さ０．１ｎｍ程度まで実現可能である。
【００４６】
プレート表面の算術平均粗さが大きいと、プレート上の生体分子を蛍光検出する際に、生体分子に照射する励起光の散乱が発生する。特に、微量な生体分子を検出する場合、励起光の散乱がノイズ成分となり、検出のＳ／Ｎを悪化させることから、プレートの平坦性を維持する必要がある。
【００４７】
図２（ａ）（ｂ）は、蛍光検出時に、プレートの表面粗さが大きいことで生じる励起光の散乱について説明するための概略図である。図２（ａ）に示すように、励起光源４は励起光５を発生し、ミラー６により反射された励起光５はプレート１１上の試料に照射される。励起光５によって発生した試料からの蛍光７は受光フィルター８を透過し受光素子９で検出される。この時、算術平均粗さが大きいプレート１１により励起光５は散乱し、散乱光１０となる。この散乱光１０が測定時のノイズ光となる。一方、図２（ｂ）の場合、プレート１２の算術平均粗さが小さいので、励起光５’は散乱せず、ノイズ光の影響は小さくなる。
【００４８】
なお、プレートの大きさは、任意の大きさで良いが、既存の検出装置に適応可能であるスライドガラス大の２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍが好適である。また、縦横の長さが１インチ（２５．４ｍｍ）×３インチ（７６．２ｍｍ）のものでも良い。
【００４９】
また、高分子材料としては、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートが好ましい。また、ポリアクリロニトリル、ポリイミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリフッ化エチレンのいずれか、またはこれらの混合物でも良い。特にポリメチルメタクリレートは、光透過性が非常に高く、光学的検出法を利用して生体分子を検出する場合に好適である。また、ガラス、シリコン等の基材上にこれら高分子材料を形成させることでも良い。
【００５０】
以下、実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法について詳細に説明する。
図３は、実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法を実現する装置の概略図である。図３に示す装置は、酸素ボンベ１３と、窒素ボンベ１４と、流量計１５と、オゾンジェネレーター１６と、チャンバー１７と、温度ヒーター付き試料台１９と、紫外線ランプ２０とを備え、プレート１８に紫外線を照射する。プレート１８は、上述のように、基材自体が高分子材料からなるもの、高分子材料を有する平板を基材の表面に貼り合わせたもの、または基材の表面に高分子材料を塗布したものである。
【００５１】
以上のように構成される装置による生体分子固定化プレートの製造工程について説明する。まず、プレート１８をチャンバー１７内の温度ヒーター付き試料台１９上に配置する。次に、酸素ボンベ１３から酸素ガスを流量計１５で流量を調整しながらオゾンジェネレーター１６に導入する。次に、オゾンジェネレーター１６内で無声放電により酸素からオゾンを発生させ、チャンバー１７内にオゾンを導入する。オゾンを導入した後、紫外線ランプ２０により紫外線をプレート表面に照射することで、プレート表面にカルボキシル基及び／またはカルボニル基を形成させる。所定時間経過後、オゾンの導入及び紫外線の照射を停止し、窒素ボンベ１４から窒素ガスをチャンバー１７内に導入する。導入した窒素ガスとチャンバー１７内の残ガスは排気孔２１を通じてチャンバー１７の外へ排出する。
【００５２】
プレート１８の表面処理のために照射する紫外線の光源としては、低圧水銀ランプ、エキシマランプ、エキシマレーザー等が挙げられる。なお、エキシマランプの放電方式としては、誘電バリア放電、ホロカソード放電、マイクロ波放電等が適用可能であり、放電ガスとしてはアルゴン、クリプトン、塩化クリプトン、キセノン等の従来用いられていたガスが使用可能である。また、エキシマレーザーとしては、フッ化クリプトンレーザー、フッ化アルゴンレーザー等の従来の方式で用いられていたものが適用可能である。
【００５３】
また、プレート１８に照射する紫外線の照射エネルギーは、プレート１８の表面を形成する高分子材料表面の炭素−炭素結合（結合エネルギー：３４８ＫＪ／ｍｏｌ）及び炭素−水素結合（結合エネルギー：４１３ＫＪ／ｍｏｌ）を切断するために、３４８ＫＪ／ｍｏｌ以上にする。なお、照射エネルギーが大きすぎると試料が損傷したり、プレートが変形したりする可能性があることから、照射エネルギーは５０００ＫＪ／ｍｏｌより小さくするのが良い。さらに好ましくは１０００ＫＪ／ｍｏｌ以下にするのが良い。
【００５４】
また、プレート１８の表面処理時に使用する気体は、酸素やオゾン以外に、窒素、アルゴン、キセノン、クリプトン、一酸化炭素、二酸化炭素、空気、または、これらの混合気体が使用可能である。
【００５５】
次に、生体分子固定化プレートの製造過程におけるプレート表面の変化について図４を用いて説明する。図４は、プレート表面を形成する高分子材料がポリメチルメタクリレートである場合のプレート表面の変化を示す模式図である。オゾン雰囲気下で紫外線をプレート２２に照射すると、プレート２２の表面を形成する高分子材料の炭素−炭素結合または炭素−水素結合が解離する。解離した炭素原子とチャンバー１７内の酸素原子とが結合すると、カルボニル基及びカルボキシル基が官能基としてプレート表面に形成され、プレート２３のようになる。図４中のｎは、１以上の任意の自然数である。
【００５６】
次に、紫外線照射によりプレートを表面処理した後の、プレート表面への官能基形成の評価について説明する。本発明では、官能基として親水基をプレート表面に形成することから、プレート表面の水（親水基）に対する接触角を測定することにより、評価を行う。なお、接触角の変化は、化学的な変化だけでなく物理的変化にも寄与することから、紫外線の照射による表面処理後に算術平均粗さを測定した。その結果、処理前と処理後とで、算術平均粗さは不変であった。このことから、紫外線の照射による表面処理後の接触角の変化は、化学的な表面変化、すなわち、プレート表面の疎水基が親水基に変化したことのみに起因することが明らかになった。以上のことから、紫外線の照射によりプレート表面を処理することで、表面を粗化させることなく、接触角を変化させることができ、接触角を見ることで官能基形成の評価を行うことができると言える。
【００５７】
紫外線の照射によるプレート表面の処理は、表面処理後の接触角が表面処理前の接触角に対して０．５から０．０１倍になるように行うことが望ましい。接触角が０．５倍になった場合は、５０％の疎水基が親水基に変化したことを示している。実際に生体分子を固定化するとき、５０％以上の疎水基を親水基に変化させることが望ましいが、プレートに高密度に生体分子を固定化する場合には、接触角が０．３倍以下になるように表面処理することが望ましい。
【００５８】
以上のようにして、プレートに紫外線を照射して官能基を形成させるが、プレートに紫外線を照射するときに、図５に示すように、紫外線ランプとプレートとの間に任意の形状を有する紫外線遮蔽マスク２５を配置するようにしても良い。これにより、プレート表面の任意の形状を有する領域２７に紫外線２４を照射することができるので、生体分子を固定化する領域を正確に規定することができる。よって、プレート表面に官能基を導入する際に課題となるスポット位置の規定及びスポット形状の均一化が容易となり、検出の精度を向上させることができる。
【００５９】
次に、以上のように表面処理をして官能基を導入したプレートに生体分子を固定化させる処理について図６を用いて説明する。図６は、生体分子をプレートに固定化する処理の反応模式図である。図４に示すように表面処理をしたプレート２３に対し、アミノ基を有する生体分子とプレート表面のカルボキシル基（図中、−ＣＯＯＨ）とを、カルボジイミド化合物２８（図中、Ｒ1−Ｎ=Ｃ=Ｎ−Ｒ2：Ｒ1、Ｒ2はそれぞれジ−ｐ−トルオイル、シクロヘキシル等の適当な炭化水素基を示す）を触媒にして、溶液が乾燥しないように室温で一昼夜反応させる。すると、カルボジイミド化合物２８が結合したプレート２９が形成され、そして、アミド結合により生体分子３０のアミノ基とプレート表面のカルボキシル基とが共有結合し、生体分子３０が固定化されたプレート３１が得られる。なお、プレート表面のカルボキシル基が遊離状態になることを防止するため、この反応の前に予め０．１Ｎ程度の塩酸でプレートを処理するか、または反応条件を弱酸性にすることが好ましい。これにより、上記反応によりプレートに固定化した生体分子を、プレートから遊離させることなく安定的に固定化できる。
【００６０】
カルボニル基（図中、−ＣＨＯ）への生体分子の固定化は、生体分子のアミノ基とのシッフ塩基（−ＣＨ＝ＮＨ−）を形成させる方法、ヒドラジン基（Ｈ2ＮＮＨ−）を生体分子に導入させる処理等により実現できる。
【００６１】
なお、生体分子は、核酸、タンパク質、ペプチドが好ましく、抗体、酵素、レセプター、糖質、脂質、ビタミン、ホルモン及びこれらの類縁物質や合成オリゴ糖などが適応可能である。
また、生体分子にアミノ基が存在しない場合は、予め適当な修飾処理を施すことで生体分子にアミノ基を導入すればよい。
【００６２】
次に、プレートへの生体分子の固定化後、生体分子のアミノ基と未反応なカルボキシル基に対して、アミノ基及び水酸基を有するアミノエタノール等の物質を反応させ、この物質のアミノ基（保護基）を未反応のカルボキシル基に付加してに、遊離状態のカルボキシル基を遮蔽する。カルボキシル基のような親水性官能基は生体分子が含有する水またはバッファーなどの溶液と親和性があり、生体分子の結合がスムーズに行われる利点がある。しかし、プレートに固定化する親水性官能基としてカルボキシル基を用いた場合、所望の生体分子と未反応なカルボキシル基が、意図しない生体分子に吸着または結合してしまい、測定のノイズ成分となる。このため、未反応なカルボキシル基に保護基（アミノ基）を付加し、意図しない物質の非特異な結合を抑制する。以上のような処理により、遊離状態のカルボキシル基が余分な生体分子のアミノ基と結合することが無くなり、安定的に生体分子を固定化できる。
【００６３】
以上のように実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法では、プレート表面を形成する高分子材料にオゾン雰囲気下で紫外線を照射し、高分子材料の炭素−炭素結合、炭素−水素結合を解離させて、プレート表面に官能基としてカルボキシル基を形成し、この官能基と生体分子とを共有結合させることで、生体分子固定化プレートを製造するようにした。これによりプレート表面の平滑性及び光学特性を変化させることなく、容易に、安価で、生体分子を固定化するための官能基をプレート表面に形成することができる。その結果、吸収、蛍光、発光等の光学的検出法や、電気化学的方法、表面プラズモン共鳴法、水晶発振振動子法、テラヘルツ時間分光法等の様々な検出方法により、プレートに固定化した生体分子を、精度良く検出することができる。
【００６４】
さらに、実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法では、生体分子のアミノ基と未反応なカルボキシル基に保護基（アミノ基）を付加するようにした。これにより、遊離状態のカルボキシル基が余分な生体分子と吸着または結合することがないので、プレートに生体分子を安定的に固定化することができる。
【００６５】
なお、実施の形態１においては、平坦な表面を有するプレートを用いて生体分子固定化プレートを製造する方法について記載したが、本発明はこれに限らず、例えば、マイクロプレートにも適用可能である。
【実施例１】
【００６６】
（実施例１）
実施例１では、本発明の生体分子固定化プレートの製造方法において、プレート表面に官能基を形成する処理について例示する。プレートとしてポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）プレート（日東樹脂工業株式会社製  商品名クラレックス  厚さ０．２ｍｍ）を用い、図３に示した通り、このプレートを紫外線照射装置（ＳＡＭＣＯ社製）のチャンバー内の試料台に設置した。試料台にあるヒーターでプレートの温度を５０℃にし、オゾン雰囲気下、出力１１０Ｗ、低圧水銀ランプ（波長２５４ｎｍ及び１８５ｎｍ）を光源とし、１０分間紫外線（以下、Ｏ3／ＵＶという）を照射した。なお、オゾン源となる酸素流量は１ｌ／ｍｉｎとした。
【００６７】
オゾン雰囲気下での紫外線照射後のプレート表面の状態を、接触角の変化で評価し、原子間力顕微鏡で観察し、さらに、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定した。これらの結果を以下に示す。
【００６８】
表１に、Ｏ3／ＵＶ照射処理したＰＭＭＡプレートの親水基に対する接触角の変化（ぬれ性の変化）を測定した結果を示す。さらに、Ｏ3／ＵＶ照射処理したＰＭＭＡプレートの表面を原子間力顕微鏡（デジタルインストルメンツ社製  ＤＩ３０００）を用いて観察し、５００ｎｍ四方の算術平均粗さを測定した結果も示す。Ｏ3／ＵＶ照射時間に従い、接触角は７０度程度から２０度以下に減少した。なお、このプレート表面の親水性への変化は、接触角が１週間後もほとんど変化していなかったことから、Ｏ3／ＵＶ照射によるプレート表面処理の効果は、持続的であったと言える。接触角の変化は、プレート表面の疎水性から親水性への変化、または、プレート表面の凹凸の形成により生じるため、プレートの実表面を観察した。その結果、表１に示す通り、Ｏ3／ＵＶ照射処理によりＰＭＭＡプレート表面の平滑性に変化が認められなかったことから、接触角の変化は、プレート表面への親水性官能基の形成にのみ起因することが示唆される。
【００６９】
【表１】
2006337285.tif 000003
【００７０】
次に、図７に、上記Ｏ3／ＵＶ照射によるＰＭＭＡプレート表面の化学組成の変化をＸ線光電子分光分析装置（島津製作所株式会社、ＡＸＩＳ−ＨＳＵ）を使用して、解析した結果について示す。Ｘ線アノードＭｇＫα線１２５３．６ｅＶ、加速電圧１．５ｋＶ−３００Ｗで、分析領域直径１．１ｍｍの円形領域に対して測定を行った。なお、エネルギー補正はＣ１ｓスペクトルの２８４．８ｅＶを用いて測定をした。図７（ａ）は未処理のＰＭＭＡプレート表面のＣ１ｓスペクトルを、図７（ｂ）は１０分間Ｏ3／ＵＶ照射したＰＭＭＡプレート表面のＣ１ｓスペクトルを各々示している。図７（ａ）に示すように未処理のプレートでは、約２８５ｅＶと約２８９ｅＶにピークエネルギーが存在し、約２８５ｅＶのピークは炭素−炭素間結合及び炭素−水素間結合に、約２８９ｅＶのピークはカルボキシ結合に起因している。なお、ＰＭＭＡは、その構造において、側鎖にカルボキシメチルが存在するため２８９ｅＶのピークが出現した。一方、Ｏ3／ＵＶ照射したＰＭＭＡプレート表面では、図７（ｂ）に示すように、約２８５ｅＶのピークが減少し、約２８９ｅＶのピークが増加した。これは、炭素−炭素間結合及び炭素−水素間結合が解離し、プレート表面にカルボキシル基が形成されたことを示唆している。また、約２８７ｅＶ付近のピークショルダーも増加を示した。これは、プレート表面にカルボニル基も形成されたことを示唆している。
【００７１】
以上のように、Ｏ3／ＵＶ照射処理したプレート表面を、接触角の変化で評価し、原子間力顕微鏡で観察し、さらに、ＸＰＳで測定した結果から、プレート表面には平滑性を保持した状態でカルボキシル基、カルボニル基等の官能基が形成されたことは明らかである。
【００７２】
（実施例２）
実施例２では、実施例１でＯ3／ＵＶ照射処理したＰＭＭＡプレートに対する生体分子の固定化について例示する。
【００７３】
実施例２では生体分子としてオリゴヌクレオチドを用いることとする。また、検体試料を以下に示す２本鎖オリゴヌクレオチドとする。すなわち、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ＣＹＰ２Ｃ１９の遺伝子配列の５’末端から６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴ（京都大学化学研究所ゲノムネットＷＷＷサーバー  http://www.genome.ad.jp  ２００３年４月検索）の配列を有し、５’末端のリン酸基を介してアミノヘキシル基を修飾した４０塩基のオリゴヌクレオチド（以下、主鎖と表す。タカラバイオ社に合成を委託）と、５’末端のリン酸基を介してビオチンヘキシル基で修飾した、主鎖と相補的な、５’末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、相補鎖と表す。タカラバイオ社に合成を委託）とを混合し、４０塩基対の２本鎖オリゴヌクレオチドを形成させて検体試料とした。なお、オリゴヌクレオチドの配列のＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃは、アデニン、グアニン、チミン、シトシンの各塩基を示す。
【００７４】
生体分子を固定化する際、まず、実施例１でＯ3／ＵＶ照射処理した１００×２５×０．２ｍｍのＰＭＭＡプレート上に、直径６ｍｍの貫通孔を１２個有する６０×２４×８．５ｍｍのシリコンラバー（ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ社製）を密着させ、検体試料の固定化領域を規定した。次に、上述の２本鎖の４０塩基対オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）に溶解し、この反応混合液５０μlをシリコンラバーで規定した固定化領域内に滴下し、室温で一昼夜反応させ、主鎖の５’末端に存在するアミノ基とプレート表面に存在するカルボキシル基とを共有結合させた。一昼夜反応後、反応混合液を除去し、２００ｍＭの２−アミノエタノール、１０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、及び５０ｍＭの２−モルホリノエタンスルフォン酸−水酸化ナトリウムの反応混合液（ｐＨ５．５）を５０μl滴下し、室温で２時間反応させ、遊離状態のカルボキシル基を遮蔽させた。次に固定化領域を規定したシリコンラバーをプレートから外し、プレートを０.５％の牛血清アルブミン、０．６Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸の溶液（ｐＨ７．５）中に室温で３０分間浸漬させる。次に、プレートを２５μｇ／ｍｌの西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ標識抗ビオチン抗体（シグマ社製）、０.５％の牛血清アルブミン、０．６Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸の溶液（ｐＨ７．５）中に室温で３０分間浸漬させ、プレートに固定化した４０塩基対のオリゴヌクレオチドの相補鎖側に存在するビオチンとビオチン抗体とを反応させた。次に、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、０．６Ｍの塩化ナトリウム、０．１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸の溶液（ｐＨ７．５）中に室温で１０分間、３回浸漬させ、未反応の抗体を除去した。最後に溶液からプレートを取り出し、軽く水分を除いた後、ルミノール−過酸化水素溶液（ＥＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、アマシャムバイオサイエンス社製）を滴下し、抗体を標識したペルオキシダーゼとの反応による発光を化学発光用フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ、アマシャムバイオサイエンス社製）に感光させることで、Ｏ3／ＵＶ照射処理したＰＭＭＡプレート表面への４０塩基対の２本鎖オリゴヌクレオチドの固定化を検出した。
【００７５】
以下、Ｏ3／ＵＶ照射処理して表面に親水基を形成させたＰＭＭＡプレートに対する上記２本鎖オリゴヌクレオチドの固定化能を評価した結果を図８、図９に示す。
【００７６】
図８は、プレートに固定化したオリゴヌクレオチドを検出した結果を示した図で、（Ａ）は２００ｎＭ、（Ｂ）は１００ｎＭ、（Ｃ）は５０ｎＭ、（Ｄ）は０ｎＭの濃度の２本鎖オリゴヌクレオチドを５０μl滴下し、固定化処理を各々施したものである。なお、滴下したオリゴヌクレオチドの総量は、それぞれ、１０、５、２．５、０ｐｍｏｌである。図８に示すように、固定化するオリゴヌクレオチド濃度に従い、発光強度が増加し、フィルムの感光の度合いが高くなることが明らかである。
【００７７】
図９は、プレートへ滴下したオリゴヌクレオチド量に対する発光強度を定量化したグラフ図である。発光強度の定量化は、感光フィルムをデジタルデータ化し、ＲＧＢ値の測定（Ａｄｏｂｅ社Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖｅｒ．６）により求めた。横軸は固定化するために滴下したオリゴヌクレオチドの絶対量、縦軸はオリゴヌクレオチド滴下量１０ｐｍｏｌの発光強度に対する相対強度を示したものである。図９に示すように、発光強度は、オリゴヌクレオチドの滴下量１０ｐｍｏｌの時に最大に達することから、単位面積当たりのオリゴヌクレオチドの固定化量は、３５ｐｍｏｌ／ｃｍ2である事がわかる。
【００７８】
また、プレートの表面処理時間を変えた時の、単位面積当たりのオリゴヌクレオチドの固定化量を表２に示す。表２は、表面処理時間に比例して、固定化量が増加することを示している。すなわち、処理時間を増加させることで表面の官能基が増加することを示している。以上のように、表１、表２から、プレート表面に生成した官能基の増加に伴いオリゴヌクレオチドの固定化量が増加することは明らかである。
【００７９】
【表２】
2006337285.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明に係る生体分子固定化プレートは、吸光法、蛍光法、または発光法といった光学的検出方法により検出する生体分子を固定化するプレートとして有用である。また、本発明に係る生体分子固定化プレートの製造方法は、吸光法、蛍光法、または発光法といった光学的検出方法により生体分子を検出する際に使用する生体分子固定化プレートを製造する方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法を示す概略図である。
【図２（ａ）】算術平均粗さが大きいプレートに励起光を照射して蛍光測定を行ったときの、励起光の散乱を示す概略図である。
【図２（ｂ）】算術平均粗さが小さいプレートに励起光を照射して蛍光測定を行ったときの、励起光の状態を示す概略図である。
【図３】本発明の実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法を実現する装置の概略図である。
【図４】本発明の実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法における、プレート表面処理時のプレート表面の反応様式を示す模式図である。
【図５】本発明の実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法において、マスクキングを施してプレート表面を処理する工程を説明するための図である。
【図６】本発明の実施の形態１に係る生体分子固定化プレートの製造方法において、表面処理を施したプレートへ生体分子を固定化するときの、プレート表面の反応様式を示した模式図である。
【図７（ａ）】本発明の実施例１において、紫外線未処理のプレート表面の官能基の変化をＸ線光電子分光法により測定したときの、Ｘ線光電子分光スペクトル図である。
【図７（ｂ）】本発明の実施例１において、オゾン雰囲気下で紫外線照射したプレート表面の官能基の変化をＸ線光電子分光法により測定したときの、Ｘ線光電子分光スペクトル図である。
【図８】本発明の実施例２において、プレートに固定化した２本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを化学発光法により検出したときの、フィルム感光写真である。
【図９】本発明の実施例２における、プレートに対する２本鎖オリゴデオキシヌクレオチド固定化量の測定図である。
【符号の説明】
【００８２】
１  基材
２  高分子材料からなる平板
３  高分子材料からなる塗布材料
４、４’  励起光源
５、５’  励起光
６、６’  ミラー
７、７’  蛍光
８、８’  受光フィルター
９、９’  受光素子
１０  励起光の散乱光
１１  算術平均粗さが大きいプレート
１２  算術平均粗さが小さいプレート
１３  酸素ボンベ
１４  窒素ボンベ
１５  流量計
１６  オゾンジェネレーター
１７  チャンバー
１８  表面処理するプレート
１９  ヒーター付試料台
２０  紫外線ランプ
２１  排ガス孔
２２  表面処理前のＰＭＭＡプレート
２３  表面処理後のＰＭＭＡプレート
２４  照射紫外線
２５  紫外線を部分的に遮蔽するマスク
２６  プレート
２７  プレート上で紫外線照射により表面処理される領域
２８  カルボジイミド化合物
２９  カルボジイミド化合物が反応した表面処理後のＰＭＭＡプレート
３０  アミノ基を有する生体分子
３１  アミノ基を有する生体分子が固定化した表面処理後のＰＭＭＡプレート
【図１】
2006337285.tif 000005
【図２（ａ）】
2006337285.tif 000006
【図２（ｂ）】
2006337285.tif 000007
【図３】
2006337285.tif 000008
【図４】
2006337285.tif 000009
【図５】
2006337285.tif 000010
【図６】
2006337285.tif 000011
【図７（ａ）】
2006337285.tif 000012
【図７（ｂ）】
2006337285.tif 000013
【図８】
2006337285.tif 000014
【図９】
2006337285.tif 000015
【配列表】
2006337285000001.app