(57)【要約】【課題】ラパマイシン対するモノクローナルを提供すること。【解決手段】ａ)活性化結合基を有するラパマイシンを免疫原性タンパク質と反応させ、免疫原性結合体を産生し、  ｂ)上記免疫原性結合体を好適な動物種に投与し、免疫原性チャレンジを行い、上記結合体に感受性の抗体−産生細胞を回収し、  ｃ)上記抗体−産生細胞を不死化し、および  ｄ)このように確立した不死化細胞系からモノクローナル抗体を回収する：ことにより得ることができるモノクローナル抗体により解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性タンパク質と、活性化結合基を有するラパマイシンを反応させることにより得られる、抗体の産生に有用な免疫原性結合体。
【請求項２】
免疫原性タンパク質がウシ血清アルブミン、オブアルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニンからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性結合体。
【請求項３】
活性化結合基が式−ＣＯ−Ｏ−Ｘ(ここで、Ｘはカルボキシ活性基である。)、式−Ｓ−Ｓ−Ｚ(ここで、Ｚはジチオ活性化基である。)、またはエポキシ基である、請求項１または２に記載の免疫原性結合体。
【請求項４】
活性化結合基がラパマイシンの２８位に結合している、請求項１に記載の免疫原性結合体。
【請求項５】
活性化結合基を有するラパマイシンが２８−Ｏ−(サクシンイミドオキシサクシニル)−ラパマイシンである、請求項１に記載の免疫原性結合体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、例えば医薬の血中濃度追跡のためのキットに有用なラパマイシンおよびラパマイシン誘導体に対するモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
ラパマイシンは、種々の適用において、特に、例えば器官移植拒絶反応および自己免疫疾患の処置および予防における使用のための免疫抑制剤として有用な、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)により産生されるマクロライド系抗生物質である。しかしながら、ラパマイシンは高投与量で副作用を示し、いくぶん変わりやすい生体内利用能を有する。ラパミシンで処置している患者の血中のラパマイシン濃度を追跡することは、従って、薬理学的活性のために充分な最少の濃度を維持し、副作用の過度の危険を避けるために、強く望まれている。臨床環境で素早く、容易に行うことができる感受性で信頼できる検定がないことが、医薬としてのラパマイシンの発展の主要な障害となっている。
【０００３】
ラパマイシンの臨床的追跡のための検定キットの開発のための以前の努力は特に成功していない。例えば、欧州特許第０４１７９５号は、ラパマイシン濃度が抗菌活性の関数として測定される微生物検定を記載している。ＷＯ９２／０２９４６は、マクロフィリンへの結合を競合測定することによりラパマイシン濃度を間接的に測定する検定系を提供する。これらの検定の両方とも扱いにくく特に感受性でない。更に重要なことに、これらの両方の検定は、僅かに異なった試験条件下で相当変化し得、異なった病院の試験結果の比較が難しい。
【０００４】
ラパマイシンを認識するモノクローナル抗体の先行報告はない。ラパマイシンが免疫原性でなく、それ自身非常に免疫抑制性であるため、ラパマイシンに対するモノクローナル抗体の製造は本来難しい。更に、ラパマイシンの代謝物が文献中で十分特徴付されていないため、ラパマイシンとその代謝物の間の識別が可能なモノクローナル抗体の同定は難しい。
【０００５】
本発明はラパマイシンに非常に感受性のモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、免疫原性タンパク質に結合したラパマイシンの新規誘導体を含む新規免疫原性結合体の接種に応答して産生される。これらの抗体を使用した検定キットは臨床環境での使用に非常に適しており、今まで可能であったものよりはるかに正確で再現性のある結果を提供する。抗体はラパマイシンの精製および単離にもまた有用である。
【０００６】
ラパマイシンの免疫抑制誘導体のための検定系の提供は、同様の課題が示される。特に興味のあるのは、例えば米国第５２５８３８９号およびＰＣＴ／ＥＰ９３／０２６０４(Ｏ−アリルおよびＯ−アルキルラパマイシン)(両方とも本明細書に引用して包含する)に開示されているようなラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体、即ちシクロヘキシル環のヒドロキシ(４０位)でＯ−置換されたラパマイシン；特に、４０−Ｏ−置換基がアルキルまたは置換アルキル；例えばヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである(ここで、「アルク−」または「アルキル−」は分枝鎖または直鎖状のＣ１−６アルキル、好ましくはＣ１−３アルキルを意味し、炭素鎖は所望によりエーテル(−Ｏ−)架橋で中断されていてもよい。)である４０−Ｏ−アルキル化ラパマイシン；最も好ましくは４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシプロピル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシンである。従って、本発明の更なる対象は、このような４０−Ｏ−誘導体に対するモノクローナル抗体の提供である。このような抗体は診断的検定およびまた本誘導体の精製および産生に有用である。
【０００７】
本発明の新規免疫原性結合体の製造に使用するラパマイシンの新規活性化誘導体は、ラパマイシン上のヒドロキシ基の一つ、好ましくはラパマイシンのシクロヘキシル部分(４０位)または２８位のヒドロキシを通して、活性結合基、即ちタンパク質との直接の反応が可能な基と結合し、タンパク質との反応を可能にし、作用しまたは促進する結合剤(例えばカルボジイミド試薬)を使用する必要なく共有結合を形成する。好ましくは、活性化結合基は、活性化エステルまたはカルボキシ基、即ち式−ＣＯ−Ｏ−Ｘ(ここで、Ｘはｏ−またはｐ−ニトロフェニル、１−ベンズトリアゾール、ペンタフルオロフェニルまたは(特に)Ｎ−サクシンイミドのようなカルボキシ活性基である。)を有する。他の好適な活性化結合基は、例えばｉ）例えば式−Ｓ−Ｓ−Ｚ(ここで、Ｚは、ラパマイシンに結合し得る２−ピリジルのようなジチオ活性化基)で示される活性化ジチオ基；またはii）例えばエポキシメチルのようなエポキシ基である。活性化結合基は、エステル、エーテル、アミド、チオまたは他の好適な結合によりラパミシンと結合し得るが、エステル結合が好ましい。最も好ましくは、活性化結合基は、一端にラパマイシンへのエステル結合を有し、他方の端に活性化エステルまたは活性化カルボキシ基を有するビス−エステル分子、例えばサクシニルを含む。
【０００８】
本発明の好ましいラパマイシン誘導体は、反応Ｉ：
【化１】
2006249090.tif 000002
反応Ｉ
〔式中、式Ｉはラパマイシンであり、それをａ）アシル化剤、例えば環状無水物またはジカルボン酸誘導体(所望によりヘミ−Ｏ−保護形である。)と、好適な反応条件下反応させ、必要であれば脱保護し、式II(ここで、Ｙはスペーサー分子、好ましくは低級アルキレン、例えばＣ２−６アルキレン、最も好ましくはエチレンである。)で示されるラパマシンを産生する。式IIで示されるラパマシンを、次いでｂ）例えば式ＨＯ−Ｘ(ここで、Ｘは上記で定義の意味である。)のようなカルボキシ活性化基との反応により活性化し、式IIIで示される活性化ラパマイシンを産生する。〕
によって製造される式IIIで示される化合物である。
【０００９】
ラパマイシンの好ましい活性化誘導体は、例えば反応II：
【化２】
2006249090.tif 000003
反応II
〔式中、式Ｉはラパマイシンであり、例えば、より完全に下記実施例１に記載したように、それをａ）ＤＭＡＰおよびピリジンの存在下、無水コハク酸を使用してＯ−アシル化し、式II'のラパマイシンヘミサクシネート(４０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパノイル−ラパマイシン)を形成する；それを、次いでｂ）ＥＤＣ、Ｅｔ３ＮおよびＣＨ２Ｃｌ２の存在下、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドで活性化して、式III'で示される４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニルラパマイシンを形成する。〕
により製造される上記式IIIのサクシンイミド誘導体である。４０位により結合しているこのようなハプテンを使用して製造したモノクローナル抗体は、通常ラパマイシンおよび上記のようなラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体と交差反応性である。このようなモノクローナル抗体は、下記に開示のように、下記のような例えばバインダードメインまたはエフェクタードメイン中のラパマイシンまたはラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体の特定の領域を認識する化合物に対して選択できる。
【００１０】
例えばラパマイシンと４０−Ｏ−ラパマイシン誘導体を区別する、またはシクロヘキシル領域における代謝物を同定するシクロヘキシル領域の修飾に高い感受性を有するモノクローナル抗体を有するのが好ましい場合がある。このような場合、ハプテンは好ましくは４０−Ｏ位置よりもむしろ２８−Ｏ位置で結合している。例えば、式Ａ：
【化３】
2006249090.tif 000004
【００１１】
式Ａ
〔式中、ＲはＯ−保護基または所望により保護形であり得る上記の置換基、例えばヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである。〕
で示されるラパマイシン誘導体を、反応Ｉにしたがって反応させ、必要であれば脱保護し、例えば式Ｂ：
【化４】
2006249090.tif 000005
式Ｂ
〔式中、Ｒ１はＨまたは上記のＯ−置換基、例えばヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキル、Ｙは上記のリンカー分子およびＸは上記で定義のカルボキシ活性化基である。〕
で示される化合物である類似の２８−Ｏ活性化ハプテンを得る。ＲがＯ−保護基またはＯ−保護置換基である本ハプテンの製造において、アシル化剤は、両方Ｏ−保護基の続くアシル化でカルボキシ活性化基を添加する１工程前に除去し得るように、所望により、例えばヘミ−Ｏ−保護形のジカルボン酸であり得る。例えば、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンの認識が可能なモノクローナル抗体の産生のためのハプテンは、例えば反応III：
【化５】
2006249090.tif 000006
反応III
に従った、第１級ヒドロキシの保護、ヒドロキシのヘミ−Ｏ−保護形のジカルボン酸による２８位のアシル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により製造できる。
【００１２】
同様に、ラパマイシンそれ自身は、例えば反応IV：
【化６】
2006249090.tif 000007
反応IV
に従って、Ｃ４０ヒドロキシのＯ−保護、２８位のヒドロキシ基のヘミ−Ｏ−保護ジカルボン酸によるアシル化、脱保護およびカルボキシ基の活性化により、４０−Ｏよりむしろ２８−Ｏで活性化され得る。
【００１３】
活性化ラパマイシンまたはラパマシン誘導体は、次いで好適な免疫原性タンパク質、例えばウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、オブアルブミン(ＯＶＡ)またはキーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)に結合し、免疫原性結合体を形成する。モノクローナル抗体は、既知の方法、例えば新規免疫原性結合体を好適な動物種に投与し、免疫原性チャレンジを行い、上記結合体に感作させた抗体産生細胞を回収する；上記抗体産生細胞を、好適なミエローマと融合させることにより不死化する；およびこのようにして確立した選択した不死化細胞系からモノクローナル抗体を回収する：を使用して製造する。
【００１４】
本発明の抗体は、次いで、好適な検定に使用し得る。当業者には、幾つかの可能性が明確であろう。一つの試みは、例えば、ラパマイシンを含む可能性があると信じられている試験溶液、例えば患者の血漿または全血の存在下および非存在下で、マイクロタイタープレートを抗体で被覆し、標識(例えば、蛍光−または放射−標識、特にビオチニル化)ラパマイシンである競合物質に暴露する、抗体およびラパマイシントレーサーを使用した競合検定である。プレートをすすぎ、抗体に結合している標識競合物質の量を測定し、その量は試験溶液中に存在するラパマイシンの量に反比例して変化する。他の試みは、抗体、ラパマイシンタンパク質結合体、およびマウスＩｇＧを認識する標識(例えば、酵素−標識)トレーサー抗体を使用し、例えばマイクロタイタープレートをラパマイシン−タンパク質結合体(例えば、ラパマイシンまたは４０−Ｏ−アルキル化ラパマイシンに結合したタンパク質を含む上記の免疫原性結合体)で被覆し、試験溶液の存在下または非存在下、抗体に暴露し、すすぎ、ラパマイシン結合体に結合する抗体を、ラパマイシン結合体に結合する抗体のトレーサー抗体の結合により検出する。再び、結合抗体の量は、試験サンプル中のラパマイシンの量に反比例して変化する。いずれの場合も、検定は既知の濃度のラパマイシンを含む試験溶液で標準化する。(ｉ)好ましくは凍結乾燥形またはマイクロタイタープレート上に被覆させた本発明のモノクローナル抗体を含み、および(ii)所望によりプレートに被覆した形のラパマイシンタンパク質結合体および／または標識ラパマイシン誘導体のいずれかを所望によりまた含み、および(iii)標準化のためのラパマイシン溶液および使用説明書を所望により更に含む検定キットが従って提供される。このようなキットは、１０ng/ml以下、例えば１ng/ml以下、例えば０.２５−０.５ng/mlほど低い濃度でラパマイシンを検出できる。
【００１５】
本発明の抗体は、更に免疫抑制性アスコマイシン、例えばＦＫ−５０６への相対的結合親和性により、特徴付けることができる。ＦＫ−５０６は、結合ドメインでラパマイシンに幾つかの構造類似性を有する免疫抑制性マクロライドである。ラパマイシン類(例えば、ラパマイシンおよびその免疫抑制性誘導体)およびＦＫ−５０６の両方ともマクロフィリン(ＦＫＢＰ)に結合し、両方にとって、免疫抑制活性のために、マクロフィリン結合が必要であるが、充分な基準ではないと信じられている。しかしながら、ラパマイシンのエフェクター領域は、ＦＫ−５０６のものと全く異なっており、実際、２つの化合物は全く異なる活性機構を有している。(例えば、ＦＫ−５０６は主にＩＬ−２転写抑制により免疫抑制するように考えられるが、ラパマイシンはＩＬ−２転写に対する明確な効果を有していない。)従って、ラパマイシン類は、ＦＫＢＰ結合ドメインとエフェクタードメインを有するものとして特徴付けられ、ＦＫＢＰ結合ドメインが修飾されたラパマイシン代謝物を、エフェクタードメインが修飾されたものから区別することができる。この区別は、本発明のモノクローナル抗体により、本発明のモノクローナル抗体とＦＫ−５０６との相対的交差反応性（交差反応性は、例えば競合ＥＬＩＳＡにより測定される）を測定することにより行うことができる；高い（例えば５０％以上）交差反応性を有するモノクローナル抗体は、ＦＫ−５０６に類似した、ラパマイシンのＦＫＢＰ結合ドメインのエピトープを認識する；低い交差反応性（例えば２０％以下、好ましくは１０％以下）のモノクローナル抗体は、ラパマイシンに独特のエフェクター領域のエピトープを認識する。
【００１６】
本発明の抗体は、また、そのラパマイシンとラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体（例えば上記のような）とを区別する能力によりスクリーニングおよび特徴付けすることができる。ラパマイシンとラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体の区別をしない抗体が望まれる場合、ラパマイシンとその４０−Ｏ−誘導体の間の交差反応性が少なくとも７０％、好ましくは９０％以上のものを選択する。このような場合、モノクローナル抗体の調製に使用するハプテンは、好ましくは４０−Ｏ−活性化ラパマイシン、例えば反応Ｉの式IIIの化合物である。ラパマイシンとラパマイシンの４０−Ｏ−誘導体または代謝物との区別が望まれる場合、抗体は、それらに対する交差反応性が３０％以下、好ましくは１０％以下のものを選択する。この場合、抗体の製造に使用するハプテンは、好ましくは２８−Ｏ−活性化ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体、例えば式Ｂの化合物である。
【００１７】
実施例１−４０−Ｏ−活性化ラパマイシンの製造
ａ）ラパマイシンの４０−Ｏ−ヘミサクシネートの製造
ピリジン１２ml中のラパマイシン１.５ｇ(１.６４mmol)および無水コハク酸０.５７７ｇ(５.７７mmol)の撹拌した溶液に、ＤＭＡＰ１９５mg(１.６４mmol)を加る。得られた混合物を環境温度で１９時間撹拌し、減圧下濃縮する。残渣を酢酸エチルに溶解し、３回水で洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。残渣を９：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。予期される生産物を含むフラクションを合わせ、もう１回１９：１ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、減圧下で溶媒を除去した後、４０−Ｏ−(３−カルボキシ)プロパノイル−ラパマイシン(前記式II'のラパマイシンヘミサクシネート)が白色泡状物として提供され、下記の特異的スペクトル特性を示す：
【００１８】
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２.６８(７Ｈ,ｍ,Ｈ３３,Ｈ２５およびＯ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ),３.１４(３Ｈ,ｓおよびｍ,ＯＣＨ３およびＨ３９),３.３４(３Ｈ,ｓ,ＯＣＨ３),３.３８(３Ｈ,ｓ,ＯＣＨ３),４.６８(１Ｈ,ｍ,Ｈ４０),４.７２(１Ｈ,ブロードｓ,１０−ＯＨ)；ＭＳ(ＦＡＢ）ｍ／ｚ１０３６([Ｍ＋Ｎａ]＋）,９８２([Ｍ−ＣＨ３Ｏ]＋),９６４([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋Ｈ２Ｏ)]＋),９４６([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋２Ｈ２Ｏ)]＋)。
【００１９】
ｂ）４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル−ラパマイシンの製造
ＣＨ２Ｃｌ２８ml中の工程ａ）のラパマイシンヘミサクシネート１２０mg(０.１１８mmol)、Ｅｔ３Ｎ１６.５μl(０.１１８mmol)およびＥＤＣ２２.７mg(０.１１８mmol)の撹拌した溶液に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド１３.６mg(０.１１８mmol)を加える。得られる混合物を１８時間室温で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、２回水で洗浄する。有機溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル)で精製し、４０−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル-ラパマイシ(即ち、前記反応IIの式III'で示される化合物)を白色泡状物として得、以下の特異的スペクトル特性を示す:
【００２０】
１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ)δ２.６７(２Ｈ,ｔ,Ｏ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２),２.８１(７Ｈ,ｓ,ＣＨ３ＯおよびサクシンイミドＣＨ２),２.９２(２Ｈ,ｔ,Ｏ２ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２),４.５５(１Ｈ,ｍ,Ｈ４０),５.２６(１Ｈ,ｄ,２８−ＯＨ),６.４３(１Ｈ,ｓ,１０−ＯＨ)；ＭＳ(ＦＡＢ)ｍ／ｚ１１３３([Ｍ＋Ｎａ]＋),１１１１([Ｍ＋Ｈ]＋),１０９２([Ｍ−Ｈ２Ｏ]＋),１０７９([Ｍ−ＣＨ３Ｏ]＋),１０６１([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋Ｈ２Ｏ)]＋),１０４３([Ｍ−(ＣＨ３Ｏ＋２Ｈ２Ｏ)]＋)。
【００２１】
実施例２−ラパマイシンの２８−Ｏ−活性化４０−Ｏ−誘導体の製造
ａ）４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンの２８−Ｏ−ヘミサクシネート
１０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中の４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン９５８mg(１.００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液に、アリルクロロギ酸０.１６０ml(１.５０mmol)を加える。撹拌を０℃で続け、ピリジン０.０８０ml(１.００mmol)およびアリルクロロギ酸各０.０５３ml(０.５０mmol)を２回それぞれ３および４時間後に加える。試薬の最後の添加の後、撹拌を更に１時間続け、反応を１Ｍ水性炭酸水素ナトリウムで停止させる。得られる混合物を３回酢酸エチルで抽出する。有機相を連続して１Ｎ水性塩酸、１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(５０：５０ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、アリルオキシカルボニル保護化合物(上記反応IIIの式２)が白色泡状物として得られる。
【００２２】
塩化メチレン２ml中の本生産物２０８mg(０.２００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液に、ＤＭＡＰ２.４mg(０.０２０mmol)およびＤＣＣ８２mg(０.４００mmol)、続けて塩化メチレン０.５ml中のモノアリルサクシネート６３mg(０.４００mmol)の溶液を加える。反応混合物を０℃で１４時間撹拌し、得られた懸濁液をフリットガラス漏斗で濾過した。有機溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(３０：７０ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、白色泡状物として生産物を得る(上記反応IIIの式３)。
【００２３】
塩化メチレン５ml中の本生産物１７７mg(０.１５０mmol)の撹拌した溶液に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム１７.３mg(０.０１５mmol)およびトリブチリンハイドライド０.０８０ml(０.３mmol)を加える。黄色溶液を２時間環境温度で撹拌し、酢酸エチルで希釈し、１回冷２Ｎ水性クエン酸および３回飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(８５：１５酢酸エチル−メタノール)は、ヘミサクシネート(反応IIIの式４)を薄黄色油状物として提供する。
【００２４】
ｂ）２８−Ｏ−サクシンイミドオキシサクシニル−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン
塩化メチレン２.５ml中の工程ａ）のヘミサクシネート５３mg(０.０５０mmol)の溶液を、ＤＭＡＰ２mg、ＥＤＣ２４mg(０.１２５mmol)およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド１４mg(０.１２５mmol)で処理する。２時間環境温度で撹拌した後、反応を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。混合物を３回酢酸エチルで抽出する。有機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、無水炭酸水素ナトリムで乾燥し、濾過し、濃縮して標題活性化ハプテン(反応IIIの式５で示される化合物)を得、それを更に精製することなく、タンパク質−ハプテン結合体の製造に使用し、以下の特異的スペクトル特性を示す：
【００２５】
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２.４３(１Ｈ,ｄｄ,Ｈ３３ａ),２.５０−２.９８(１０Ｈ,ｍ,Ｈ２５,Ｈ３３ｂ,サクシネート水素,サクシンイミド水素),３.５８(２Ｈ,ｍ,Ｈ６ｂ,１ヒドロキシエチルＨ),３.６８(３Ｈ,ｍ,Ｈ１６,２ヒドロキシエチルＨ),３.８１(２Ｈ,ｍ,Ｈ１４,１ヒドロキシエチルＨ),３.９３(１Ｈ,ｄ,Ｈ２７),５.２８(２Ｈ,ｍ,Ｈ２,Ｈ３０),５.３４(１Ｈ,ｄ,Ｈ２８)；ＭＳ(ＦＡＢ)１１６１([Ｍ＋Ｌｉ]＋)。
【００２６】
実施例３−２８−Ｏ−活性化ラパマイシンの製造
ａ）ラパマイシンの２８−Ｏヘミサクシネート
１０：１塩化メチレン−ピリジン２.２ml中のラパマイシン９１４mg(１.００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液に、クロロギ酸アリル０.２１２ml(２.００mmol)を加える。３時間後、ピリジン０.０８０ml(１.０００mmol)およびクロロギ酸アリル０.０５３ml(０.５０mmol)を加える。撹拌を更に１時間続け、反応を１Ｍ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。得られる混合物を３回メチル−ｔ−ブチルエーテルで抽出する。有機溶液を連続して冷１Ｎ水性塩酸、１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(７０：３０ヘキサン−酢酸エチル)で精製し、アリルオキシカルボニル保護化合物(反応IVの式２)が白色泡状物として得られる。
【００２７】
塩化メチレン５ml中の本生産物４００mg(０.４００mmol)の撹拌した冷却(０℃)溶液にＤＭＡＰ４.８mg(０.０４０mmol)およびＤＣＣ１６４mg(０.８００mmol)、続いて塩化メチレン１ml中のモノアリルサクシネート１２７mg(０.８００mmol)の溶液を加える。反応混合物を−１５℃で１４時間撹拌し、得られた懸濁液をフリットガラス漏斗で濾過する。有機溶液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(４０：６０ヘキサン−メチル−ｔ−ブチルエーテル)で精製し、反応IVの式３を白色泡状物として得る。
【００２８】
塩化メチレン５ml中の本生産物２８５mg(０.２５０mmol)の撹拌した溶液に、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム２８.８mg(０.０２５mmol)およびトリブチルチンハイドライド０.１３３ml(０.５mmol)を加える。黄色溶液を１時間環境温度で撹拌し、メチル−ｔ−ブチルエーテルで希釈し、冷２Ｎ水性クエン酸および３回飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮する。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(９０：１０−６０：４０メチル−ｔ−ブチルエーテル−メタノール)により、薄黄色油状物として２８−Ｏラパマイシンヘミサクシネート(反応IV、式４の化合物)が得られる。
【００２９】
ｂ）２８−Ｏ−サクインイミドオキシサクシニル−ラパマイシン
塩化メチレン２ml中の工程ａ）の生産物５１mg(０.０５０mmol)の溶液をＤＭＡＰ２mg、ＥＤＣ２４mg(０.１２５mmol)およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド１４mg(０.１２５mmol)で処理する。４時間環境温度で撹拌した後、反応を１Ｎ水性炭酸水素ナトリウムで停止する。混合物をメチル−ｔ−ブチルエーテルで３回抽出する。有機溶液を水性炭酸水素ナトリウムおよび食塩水で洗浄し、無水炭酸水素ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、活性化標題混合物を得、それを更に精製することなくタンパク質−ハプテン結合体の製造に使用し、それは以下の特異的スペクトル特性を示す：
【００３０】
１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ２.４３(１Ｈ,ｄｄ,Ｈ３３ａ),２.５５−３.０２(１１Ｈ,ｍ,Ｈ２５,Ｈ３３ｂ,Ｈ３９,サクシネート水素、サクシンイミド水素),３.５６(１Ｈ,ｍ,Ｈ６ｂ),３.６８(１Ｈ,ｄｄ,Ｈ１６),３.８３(１Ｈ,ｍ,Ｈ１４),３.９３(１Ｈ,ｄ,Ｈ２７),５.２８(２Ｈ,ｍ,Ｈ２,Ｈ３０),５.３４(１Ｈ,ｄ,Ｈ２８)；ＭＳ(ＦＡＢ)１１１７([Ｍ＋Ｌｉ]＋)。
【００３１】
実施例４−免疫原性結合体の製造
ａ）４０−Ｏ−架橋ラパマイシン結合体
実施例１の４０−Ｏ−活性化ラパマイシン１７.４mgをＤＭＦまたはＤＭＳＯ４００μlに溶解する。本溶液１２０μl(即ち活性化ラパマイシン５.２２mgを含む)を０.１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液(ｐＨ７.７)２ml中のＫＬＨ８mgを含む激しく撹拌した溶液に滴下する。反応混合物を室温で２時間撹拌し、得られるラパマイシン−ＫＬＨ結合体を４℃でＰＢＳ５ｌ、３×に対して４８時間にわたって透析して精製する。本結合体を、所望により、マイクロコンセントレーター管を使用した遠心により更に濃縮する。ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＯＶＡ結合体は、上記方法のＫＬＨをそれぞれＢＳＡおよびＯＶＡに変えて同様の方法で製造する。
【００３２】
ｂ）２８−Ｏ−架橋(所望により４０−Ｏ−アルキル化)ラパマイシン結合体
実施例２の２８−Ｏ−活性化化合物５mgをＤＭＳＯ２mlに溶解し、５０mMリン酸緩衝液(ｐＨ７.３)１ml中のＫＬＨ５mgを含む激しく撹拌した溶液に滴下する。反応混合物を室温で２時間撹拌し、得られる結合体を４℃でＰＢＳ２ｌ、３×に対して４８時間にわたって透析して精製する。ＢＳＡおよびＯＶＡとの結合体は、同様の方法で製造する。実施例３の２８−Ｏ活性化化合物を使用して、同様の方法に従って、ラパマイシンはＫＬＨ、ＢＳＡおよびＯＶＡと２８位で結合する。
【００３３】
実施例５−モノクローナル抗体の製造
ａ）ラパマイシンに対するモノクローナル抗体
モノクローナル抗体を、本質的にケーラーおよびミルスタインら、Nature256:49に記載の方法に従って既知の技術を使用して、製造する。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス(２０−２５ｇ)は、各々、フロインド完全アジュバント０.２ml中の実施例４ａ）の４０−Ｏ−架橋ラパマイシン−ＫＬＨ免疫原性結合体１０または５０μgを、４カ所に皮下注射により投与される。２週間後、フロインド不完全アジュバント０.２mlに乳化した同量の免疫原性結合体を含む２回目のブースター注射を、再び皮下注射により投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体の存在は、下記実施例６に記載の直接ＥＬＩＳＡにより確認する。マウスは、所望により、エフェクター領域(ＦＫ−５０６との低い交差反応性)およびＦＫＢＰ結合領域(ＦＫ−５０６との高い交差反応性)に対する抗体について更に選択し得る。例えば、図１は、ラパマイシン結合ドメインに対する高濃度の抗体を有するマウス(Ｍ１)およびエフェクタードメインに対する相対的に高い濃度の抗体を有する他のマウス(Ｍ７)の力価曲線を示す。好適な特異性の抗体の最大血清濃度を示すマウスは、抗原１０μgを半分腹腔内および半分静脈内で−３日、静脈内で−２日および−１日にブースター注射を受ける。０日において、マウスを屠殺し、その脾臓細胞を単離し、ＰＡＩ−０細胞または他の好適なミエローマ系と融合する。得られるハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを使用して、ラパマイシンに高親和性を有する抗体の発現について選択する。
【００３４】
ｂ）４０−(ヒドロキシエチル)−ラパマイシンに対するモノクローナル抗体
雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、フロインド完全アジュバンド０.２ml中の４０−(ヒドロキシエチル)−ラパマイシンＫＬＨ免疫原性結合体１０または５０μgを、皮下注射により４カ所に投与される。２週間後、フロインド不完全アジュバント０.２mlに乳化した同量の免疫原性結合体を含む２回目の注射(ブースター)を、再び皮下注射により投与する。動物血清中の抗原に対して反応性の抗体の存在を、下記の直接ＥＬＩＳＡにより試験する。加えて、マウスは、ＢＳＡ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンの結合体よりもＢＳＡ−ラパマイシンの結合体に結合することにより４０−Ｏ領域が修飾されたラパマイシン分子の領域に対する抗体を選択し得る。４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン結合体に結合するが、ラパマイシン結合体に結合しない抗体および４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンおよびラパマイシン結合体の両方に結合する抗体の両方が得られる。好適な特異性の抗体の最大血清濃度を示すマウスは、抗原１０μgを半分腹腔内および半分静脈内で、−３日、静脈内で−２日および−１日にブースター注射を受ける。０日において、マウスを屠殺し、その脾臓細胞を単離し、ＰＡＩ−０細胞と融合する。得られるハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを使用して、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンに高親和性を有する抗体の発現について選択する。
【００３５】
実施例６−固相酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)
ａ）ラパマイシンのＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１−２μg／mlラパマイシン−ＢＳＡ結合体で２時間３７℃で被覆し、次いでＰＢＳ中の２％ＢＳＡで飽和し、０.０５％ツイン−ＰＢＳで３×洗浄する。スクリーニングすべきハイブリドーマ上清をＰＢＳ中の１％ＢＳＡ溶液で希釈し、一晩室温(または１８時間４℃または３７℃２時間)でインキュベーションする。結合抗体の濃度を、基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェートと一緒にアルカリホスファターゼが結合した抗−マウスＩｇＧヤギグロブリンにより測定する。３７℃で２時間インキュベーションした後、酵素基質を加水分解(１時間室温)し、４０５nmの吸光度を測定する。ハイブリドーマを、高親和性モノクローナル抗体の産生に対して選択する。
【００３６】
選択した抗体のラパマイシンに対する相対的親和性を決定するための標準曲線は、既知の濃度のラパマイシン(例えば、血清中１から１４０ng／ml)を含む溶液を使用して調製する。例えば、図２は、我々のモノクローナル抗体Ｍ７−９１の標準曲線を示し、ラパマイシンに非常に特異的であるとして選択したモノクローナル抗体が、濃度が０.２５ng／mlほど低くてもラパマイシンを検出可能であることを証明する。
【００３７】
抗体は、更に、ラパマイシン−ＢＳＡ結合体と同様に製造できるＦＫ−５０６−ＢＳＡ結合体で被覆したマイクロタイタープレートを使用した類似の直接ＥＬＩＳＡでＦＫ−５０６との交差反応性を測定することにより、ラパマイシンのエフェクターまたはＦＫＢＰ結合ドメインに結合するものとして特徴付け得る。例えば、１７個の選択したモノクローナル抗体のラパマイシン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較を図３に示す；パーセントとしての交差反応性は図４に示す。このラパマイシン−ＢＳＡ対ＦＫ−５０６−ＢＳＡの結合の比較において、非常に低い親和性のモノクローナル抗体が検出される。
【００３８】
上記の直接ＥＬＩＳＡは、コンペティターを、モノクローナル抗体溶液に加え、競合物質存在下および非存在下でのモノクローナル抗体の結合体への結合を測定する競合的ＥＬＩＳＡに変え得る。競合物質ーがＦＫ−５０６またはラパマイシンである場合、例えば１mg／mlのエタノール性溶液中の競合物質をモノクローナル抗体溶液に直接加え(例えば２μl／２００μl／ウェル)、マイクロタイタープレート中で更に希釈する。例えば図５は、異なった濃度の遊離ラパマイシンの存在下でのＭ７−９１抗体(Ｍ７.９１.１３)のＢＳＡ−ラパマイシンへの結合の阻害曲線を示す。このようなモノクローナル抗体の遊離ＦＫ−５０６対遊離ラパマイシンへの結合を比較する競合的ＥＬＩＳＡにおいて、ラパマイシンおよびＦＫ−５０６の間の直接ＥＬＩＳＡよりも低い交差反応性が見られる。あるモノクローナル抗体が、遊離形のその抗原に結合するには低すぎる親和性を有するが、それにもかかわらず巨大タンパク質分子上で違いに緊密に近接して結合した多くのハプテンから成る多量体抗原への二価または多価結合を示すと信じられているため、このような競合的検定はモノクローナル抗体の選択に好ましい。競合的検定は、このような低親和性抗体を除外する。このような競合的検定の結果を図６に示し、それは、相対的に低い交差親和性を有するＭ７−９１抗体(Ｍ７.９１.１３)と、相対的に高い交差反応性を有するＭ１−３０３(Ｍ１.３０３.３)を比較する。
【００３９】
ｂ）４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンのＥＬＩＳＡ
本ＥＬＩＳＡは、ａ）に記載の方法と同様に行う。マイクロタイタープレートをマイクロタイタープレートを、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡで被覆し、次いでＢＳＡで飽和し、洗浄する。スクリーニングすべきハイブリドーマ上清を１８時間４℃、または２時間３７℃でインキュベーションする。結合抗体の濃度を、基質としてのパラ−ニトロフェニルホスフェートを伴ったアルカリホスファターゼが結合した抗−マウスＩｇＧヤギグロブリンで測定する。平衡ＥＬＩＳＡを、結合ラパマイシン−ＢＳＡを使用して行い、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンをラパマイシンと分けることができるモノクローナル抗体を選択する。例えば図７は、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡ(図中ではＢＳＡ−２８−ＲＡＤと呼ぶ)へ特異的に結合するハイブリドーマＢ３−２０３(図７Ａ)、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＢＳＡ結合体を２８位により認識するハイブリドーマＢ３−１１３(図７Ｂ)および加えて４０位によりＢＳＡに結合したラパマイシンを認識するハイブリドーマＢ３−１６４(図７Ｃ)の上清を示す。
【００４０】
抗体の４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン対ラパマイシンへの相対的親和性を、被覆４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡ結合体の、溶液中の４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンまたは遊離ラパマイシンへの結合を比較して更に測定する。例えば、図８は、ラパマイシンと低い交差反応性で４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンと強く反応するハイブリドーマＢ３−２０３により産生された抗体(図８Ａ)および４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンおよびラパマイシンと同等に結合するハイブリドーマＢ３−１１３およびＢ３−１６４により産生された抗体(図８Ｂおよび８Ｃ)を示す。ラパマイシンと比較して、少なくとも１０−１００倍４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンに結合する抗体を産生する他のハイブリドーマは、Ｂ３−２２、Ｂ３−１２７およびＢ３−１５６を含む。Ｂ３−２９、Ｂ３−２６５およびＢ３−５３９のような他のハイブリドーマは、ラパマイシンおよび４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンに結合する抗体を産生する。
【００４１】
一度所望の抗体を選択したら、同じＥＬＩＳＡを使用して、患者のラパマイシンの血中濃度を測定する。本実施例の検定キットは、凍結乾燥形の１個またはそれ以上の選択した抗体、ラパマイシン結合体(例えばラパマイシン−ＢＳＡ結合体または４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡ結合体)で被覆したマイクロタイタープレート、ラパマイシン標準および使用説明書を提供する。所望により、キットは、競合検定に使用するための標識ラパマイシン誘導体を更に含む。上記のような抗−マウスＩｇＧ−酵素結合体および基質は、付加的に提供され得る。別法として、消費者は、本発明のモノクローナル抗体を、彼ら自身が確立したＥＬＩＳＡまたは他の検定系中で使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ラパマイシン結合ドメインに対する高濃度の抗体を有するマウス(Ｍ１)およびエフェクタードメインに対する相対的に高い濃度の抗体を有する他のマウス(Ｍ７)の力価曲線を示すグラフである。
【図２】我々のモノクローナル抗体Ｍ７−９１の標準曲線を示すグラフである。
【図３】１７個の選択したモノクローナル抗体のラパマイシン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較を示すグラフである。
【図４】１７個の選択したモノクローナル抗体のラパマイシン−ＢＳＡおよびＦＫ−５０６検定における比較を図３に示す；パーセントとしての交差反応性を示すグラフである。
【図５】異なった濃度の遊離ラパマイシンの存在下でのＭ７−９１抗体(Ｍ７.９１.１３)のＢＳＡ−ラパマイシンへの結合の阻害曲線を示すグラフである。
【図６】競合的検定の結果を示すグラフである。
【図７】４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡ(図中ではＢＳＡ−２８−ＲＡＤと呼ぶ)へ特異的に結合するハイブリドーマＢ３−２０３(図７Ａ)、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン−ＢＳＡおよびラパマイシン−ＢＳＡ結合体を２８位により認識するハイブリドーマＢ３−１１３(図７Ｂ)および加えて４０位によりＢＳＡに結合したラパマイシンを認識するハイブリドーマＢ３−１６４(図７Ｃ)の上清の吸光度を示すグラフである。
【図８】ラパマイシンと低い交差反応性で４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンと強く反応するハイブリドーマＢ３−２０３により産生された抗体(図８Ａ)および４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンおよびラパマイシンと同等に結合するハイブリドーマＢ３−１１３およびＢ３−１６４により産生された抗体(図８Ｂおよび８Ｃ)の相対的親和性を示すグラフである。
【図１】
2006249090.tif 000008
【図２】
2006249090.tif 000009
【図３】
2006249090.tif 000010
【図４】
2006249090.tif 000011
【図５】
2006249090.tif 000012
【図６】
2006249090.tif 000013
【図７】
2006249090.tif 000014
【図８】
2006249090.tif 000015