(57)【要約】  【課題】  本発明の目的は、生理活性ペプチドに対する活性遮蔽効果に優れ、光照射によってペプチド本来の生理活性を有効に発揮できるケージドペプチドを提供することである。  【解決手段】  抗体又はそのフラグメントが結合している式（Ｉ）で表される特定のニトロベンジル基が、(i)生理活性ペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の側鎖、又は(ii)生理活性ペプチドの主鎖、に連結した構造を有するケージドペプチドを調製する。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)生理活性ペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕ
からなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の側鎖、又は(ii)生理活性ペプチドの主鎖に、下式（Ｉ）で表される基が連結しており、更に該基に抗体又はそのフラグメントが結合している構造を有することを特徴とする、ケージドペプチド。
【化１】
2006199597.tif 000007
〔式中、Ａは、(i)ペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧ
ｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸側鎖の酸素原子又は硫黄原子、或いは(ii)ペプチドの主鎖のペプチド結合の窒素原子である。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、同一又は
異なって水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、水酸基またはシアノ基を示すか、あるいはＲ1、Ｒ2及びＲ3のいずれか２つが一緒になってメ
チレンジオキシ基を示す。Ｒは、水素原子又はメチル基を示す。〕
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載のケージドペプチド。
【請求項３】
前記抗体が、マウスハイブリドーマM60621株（FERM AP-20320）が産生するモノクロー
ナル抗体である、請求項１又は２に記載のケージドペプチド。
【請求項４】
生理活性ペプチドが、ヒト由来のポリペプチドである請求項１乃至３のいずれかに記載のケージドペプチド。
【請求項５】
生理活性ペプチドが、アンギオテンシンIである、請求項１乃至３のいずれかに記載の
ケージドペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケージドペプチドに関する。より詳細には、本発明は、抗体が結合している特定のニトロベンジル基によりペプチドの生理活性が効果的に遮蔽されており、光照射によって該ニトロベンジル基が除去されて、ペプチド本来の生理活性を有効に発揮できるように設計されているケージドペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ケージド化合物は、生理活性物質に光感受性保護基を導入してその活性を封じ込めたもので、光照射によって保護基を切断すれば本来の活性を発現する。このような特性を備えるために、ケージド化合物には、(1)光感受性保護基により生理活性が効果的に遮蔽され
ていること、及び(2)光照射によるケージ解除能（即ち、光照射により保護基が切断され
る効率）が高いことが必要とされている。
【０００３】
これまでに、生理活性ペプチドに関するケージド化合物として、生理活性ペプチドの特定のアミノ酸の側鎖にニトロベンジル基を結合させたケージドペプチドが報告されている（特許文献１参照）。このようなケージドペプチドは、光照射という瞬時かつ局所的に実施可能な手段により活性遮断効果を解除することができるため、生理活性ペプチドの生体反応のメカニズムを解明するツールとして有用であり、またポリペプチド鎖の構造形成の光による制御や、光による薬剤の局所的投与等への応用が期待されている。
【０００４】
しかしながら、生理活性ペプチドの特定のアミノ酸の側鎖にニトロベンジル基を導入したケージドペプチドでは、ペプチドの生理活性が減弱乃至微弱化されているものの、該ニトロベンジル基の導入位置やペプチドの種類によっては生理活性の遮蔽効果が十分でない場合があるという欠点がある。
【特許文献１】特開平１０−１２０６９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は上記従来技術の課題を解決することである。即ち、本発明は、生理活性ペプチドに対する活性遮蔽効果に優れ、光照射によってペプチド本来の生理活性を有効に発揮できるケージドペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、特定のニトロベンジル基を生理活性ペプチドの特定部位に導入し、更に該ニトロベンジル基に抗体又はそのフラグメントを結合させることによって、生理活性ペプチドに対する活性遮蔽効果が一層向上し、より有用なケージドペプチドが取得できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、下記に掲げるケージドペプチドである：
項１．  (i)生理活性ペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及び
Ｇｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の側鎖、又は(ii)生理活性ペプチドの主鎖に、下式（Ｉ）で表される基が連結しており、更に該基に抗体又はそのフラグメントが結合している構造を有することを特徴とする、ケージドペプチド。
【０００８】
【化１】
2006199597.tif 000002
【０００９】
〔式中、Ａは、(i)ペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧ
ｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸側鎖の酸素原子又は硫黄原子、或いは(ii)ペプチドの主鎖のペプチド結合の窒素原子である。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、同一又は
異なって水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、水酸基またはシアノ基を示すか、あるいはＲ1、Ｒ2及びＲ3のいずれか２つが一緒になってメ
チレンジオキシ基を示す。Ｒは、水素原子又はメチル基を示す。〕
項２．  抗体又はそのフラグメントが結合している下式（Ｉ）で表される基が、
(i)生理活性ペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕか
らなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の側鎖、又は
(ii)生理活性ペプチドの主鎖、
に連結した構造を有することを特徴とする、ケージドペプチド。
【００１０】
【化２】
2006199597.tif 000003
【００１１】
〔式中、Ａ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲは、前記と同じ。〕
項３．  前記抗体がモノクローナル抗体である、項１又は２に記載のケージドペプチド。項４．  前記抗体が、マウスハイブリドーマM60621株（FERM AP-20320）が産生するモノ
クローナル抗体である、項１乃至３のいずれかに記載のケージドペプチド。
項５．  式（Ｉ）で表される基に、マウスハイブリドーマM60621株（FERM AP-20320）が
産生するモノクローナル抗体又はそのフラグメントが結合している、項１乃至４のいずれかに記載のケージドペプチド。
項６．  生理活性ペプチドが、ヒト由来のポリペプチドである項１乃至５のいずれかに記載のケージドペプチド。
項７．  生理活性ペプチドが、アンギオテンシンIである、項１乃至６のいずれかに記載
のケージドペプチド。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明のケージドペプチドに使用される生理活性ペプチドとしては、その由来については制限されず、動物、植物、微生物由来のあらゆる生理活性ペプチドが対象となる。好ましくは、ヒト由来の生理活性ペプチドである。生理活性ペプチドは、通常３〜１０００個程度、好ましくは４〜２００個程度のアミノ酸から構成される。
【００１４】
生理活性ペプチドの具体例としては、オキシトシン、バゾプレッシン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンII、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＲＨ）、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、Ｍｅｔ−エンケファリン、Ｌｅ
ｕ−エンケファリン、エンドルフィン、ガストリン、グルカゴン、ニューロペプチドＹ、セクレチン、カルシトニン、成長因子放出ホルモン（ＧＲＦ）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＦ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、インシュリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ等の各種のペプチドが挙げられる。
【００１５】
生理活性ペプチドの側鎖に式（Ｉ）で表される基が連結される場合、該ペプチドは、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ及びＧｌｕよりなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を有することが必要である。この場合、上記アミノ酸を有しない生理活性ペプチドについては、生理活性が消失しない範囲で、上記アミノ酸の１又は２以上を置換又は付加することにより、本発明のケージドペプチドに使用される。
【００１６】
一方、生理活性ペプチドの主鎖に式（Ｉ）で表される基が連結される場合、該ペプチドの構成アミノ酸については特に制限されない。
【００１７】
本発明のケージドペプチドにおいて、上記生理活性ポリペプチドに連結されている基は、下式（Ｉ）で表されるものである。
【００１８】
【化３】
2006199597.tif 000004
【００１９】
式中、Ａは、(i)ペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧ
ｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸側鎖の酸素原子又は硫黄原子、或いは(ii)ペプチドの主鎖のペプチド結合の窒素原子である。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、同一又は
異なって水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、水酸基またはシアノ基を示すか、あるいはＲ1、Ｒ2及びＲ3のいずれか２つが一緒になってメ
チレンジオキシ基を示す。Ｒは、水素原子又はメチル基を示す。
【００２０】
式（Ｉ）において、Ａは、連結されるペプチドの部位により定められる。ポリペプチドのアミノ酸側鎖に連結される場合、Ａは、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒでは水酸基由来の酸素原子（Ｏ）、Ｃｙｓではメルカプト基由来の硫黄原子（Ｓ）、Ａｓｐ及びＧｌｕではカルボキシル基由来の酸素原子（Ｏ）、Ｌｙｓではニトロベンジル基がウレタン結合を介して導入されるため、Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ基由来の酸素原子（Ｏ）である。また、ポリペプチドの主鎖に連結される場合、Ａは、ポリペプチド主鎖のＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）基（ペプチド結合）由来の窒素原子（Ｎ）である。
【００２１】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3で表される低級アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、
イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの炭素数１〜４の低級アルキル基が挙げられる。
【００２２】
低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどの炭素数１〜４の低級アルコキシ基が挙げられる。
【００２３】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００２４】
好ましい式（Ｉ）の基は、Ａが(i)ポリペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、
Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸側鎖の酸素原子又は硫黄原子であり；Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、いずれか２つが水素原子で、残りの１つが
水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり；Ｒが水素原子である基である。
【００２５】
上記式（Ｉ）の基は、式（Ｉ）中のＡが示すように、(i)生理活性ポリペプチドのＴｙ
ｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の側鎖、又は(ii)生理活性ポリペプチドの主鎖に連結されている。(ii)生理活性ポリペプチドの主鎖に式（Ｉ）の基を結合させる場合、該基の導入部位は、プロリン以外のアミノ酸部分である限り特に制限されない。
【００２６】
本発明のケージペプチドにおいて、好ましくは、上記式（Ｉ）の基が、(i)生理活性ポ
リペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の側鎖に連結されているものである。
【００２７】
本発明のケージペプチドにおける上記式（Ｉ）の基の数としては、例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個が挙げられる。
【００２８】
上記式（Ｉ）の基の生理活性ポリペプチドへの連結は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２９】
例えば、上記式（Ｉ）の基を(i)生理活性ポリペプチドのＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔ
ｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸の側鎖に連結させる場合、以下の方法により行われる。
【００３０】
上記式（Ｉ）の基を有するアミノ酸を予め合成し、該アミノ酸を用いて、常法に従って、生理活性ペプチドを化学的又は生物学的に合成することができる。具体的には、得られた上記式（Ｉ）の基を側鎖に有するアミノ酸を用いて、化学的に生理活性ペプチドを合成するには、該アミノ酸に、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）基、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）基、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基などのアミノ保護基を導入し、これを用いて液相または固相合成により目的とするアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。以下、アミノ酸に上記式（Ｉ）の基を導入する方法の一例として、反応工程式１にＴｙｒに2−ニトロベンジル基を導入する方法を例示する。他のアミ
ノ酸についても、反応工程式１のＴｙｒを各々Ａｓｐ、Ｇｌｕに代えて同様の条件で反応させることにより、光感受性保護基を導入することができる。また、2−ニトロベンジル
ブロミドに代えて2−ニトロベンジル誘導体を用いることにより、他の式（Ｉ）の基を同
様に導入することができる。Ｃｙｓには、直接2−ニトロベンジルブロミドまたはその誘
導体を用いて導入できる。Ｌｙｓは、2−ニトロベンジルブロミドまたはその誘導体に代
えて、2−ニトロベンジルオキシカルボニルクロリドまたはその誘導体を用いる以外はＴ
ｙｒと同様に反応させればよい。Ｓｅｒ及びＴｈｒには、α-アミノ基とカルボキシル基
の両方に保護基を導入した後、2−ニトロベンジルブロミドまたはその誘導体と、クロロ
ホルム、ベンゼン、酢酸エチル、ＤＭＦなどの溶媒中、必要に応じてトリエチルアミン、炭酸カリウム等の塩基の存在下に反応させることにより、式（Ｉ）の基を導入することができる。
＜反応工程式１＞
【００３１】
【化４】
2006199597.tif 000005
【００３２】
〔式中、Ｙは2−ニトロベンジル基を示す。〕
【００３３】
また、例えば、上記式（Ｉ）の基を(ii)生理活性ポリペプチドの主鎖に連結させる場合であれば、アミノ酸のα-アミノ基に、２−ニトロベンズアルデヒドと水素化ホウ素ナト
リウムを反応させ、還元的アルキル化反応により、α-アミノ基に式（Ｉ）の基を導入す
る方法により行うことができる。
【００３４】
本発明のケージドペプチドでは、上記式（Ｉ）の基に抗体が結合している。このように抗体が結合していることにより、ケージドペプチドにおける生理活性ペプチドに対する活性遮蔽効果を一層向上させることが可能になる。
【００３５】
本発明で使用される抗体は、上記2-ニトロベンジル基に選択的に結合できる限り特に制限されず、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。好ましくはモノクローナル抗体である。
【００３６】
上記抗体としては、例えば、IgG、IgA、IgM、IgE等が挙げられる。これらの中で好ましくは、IgGである。上記2-ニトロベンジル基に選択的に結合する抗体は、従来公知の方法
に従って製造される。
【００３７】
上記抗体として、好適には、マウスハイブリドーマM60621株（FERM AP-20320）が産生
するモノクローナル抗体（M60621抗体）が挙げられる。かかる抗体を使用することによって、より優れた遮蔽効果が得られる。
【００３８】
また、上記の抗体のフラグメントとしては、上記抗体のＦ（ab'）2、Ｆab’、Ｆab等が例示される。これらの抗体のフラグメントについても、従来公知の方法に従って製造される。具体的には、Ｆ（ab'）2については上記抗体をペプシン等のプロテアーゼで処理することにより得られる。また、Ｆab’についてはＦ（ab'）2をメルカプタンで還元することにより得られる。更に、Ｆabについては抗体をパパイン、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン等のプロテアーゼで分解することにより得られる。
【００３９】
上記抗体を上記式（Ｉ）の基に結合させるには、該抗体と該式（Ｉ）の基が連結されているペプチドを用いて、公知の方法により抗原抗体反応させればよい。より具体的には、上記抗体を０．５〜１０nmol／ml及び上記式（Ｉ）の基が連結されているペプチドを１〜１０nmol／mlとなる濃度で混合し、２５〜３７℃で５分以上反応させる方法が例示される。
【００４０】
本発明のケージドペプチドは、ペプチド本来の生理活性が遮断されているが、紫外線照射を受けることにより、抗体が結合したニトロベンジル基が切断されて、ペプチドが本来の生理活性を発揮することができる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のケージドペプチドは、抗体が式（Ｉ）の基に結合されていることにより、ポリペプチドの生理活性が効果的に遮蔽されている。そして、本発明のケージドペプチドは、光照射によって該基が容易に除去されて、ポリペプチド本来の生理活性を有効に発揮する。従って、本発明のケージドペプチドは、生理活性ペプチドの反応メカニズムの研究に有用である。
また、本発明のケージドペプチドは、ポリペプチド鎖の構造形成の光による制御や、光による薬剤の局所的投与等においても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下に、参考例及び実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下の参考例及び実施例にいおいて、2−ニトロベンジル基
を「NB基」及び２-ニトロベンジルオキシカルボニル基を「NBoc」基と表記することもあ
る。
【００４３】
参考例１  2−ニトロベンジルオキシカルボニル（NBoc）基導入ヘモシアニンの製造
ヘモシアニンを1mg/mlになるようにPBS(phosphate buffered saline)に溶解し、0.1M 2−ニトロベンジルオキシカルボニルクロリド／アセトン溶液を最終濃度1mMとなるように
加えた。室温、暗所で1時間反応させた後、水に対して透析し、凍結乾燥した。この方法
では２−ニトロベンジルオキシカルボニル（NBoc）基がヘモシアニンのアミノ基(Ｌｙｓ
側鎖又はN末端のいずれか)に導入される。
【００４４】
参考例２  2−ニトロベンジルオキシカルボニル(NBoc)基導入BSAの製造
ヘモシアニンの代わりにBSA(bovine serum albumin)を使用すること以外は、上記参考
例1と同様の方法で、2−ニトロベンジルオキシカルボニル(NBoc)基導入BSAを製造した。
【００４５】
参考例３  O-2-ニトロべンジル-L-チロシン塩酸塩（Tyr(NB)）の製造
１００ｍｌナス型フラスコでＬ−チロシン１．８１ｇ（１０ｍｍｏｌ）を２Ｎ水酸化ナトリウム１０ｍｌに溶解させ、水４mlに溶解させた硫酸銅１．２５ｇ（５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら少量ずつ加えた。一時的に生成する沈殿が溶解した後、メタノール４０mlに溶解させた２−ニトロベンジルブロミド３．２４ｇ（１５ｍｍｏｌ）を少量ずつ滴下し、一夜撹拌した。析出した水色沈殿を濾取し、２５％メタノール水溶液及び１００％メタノール水溶液で洗浄後乾燥し、O-2-ニトロべンジル-L-チロシン銅錯体を得た。この錯体を乳
鉢で細かくすりつぶし、２００ｍｌナス型フラスコに入れ、１Ｎ塩酸１００mlを加えて２時間撹拌した後、白色沈殿を濾取し、１Ｎ塩酸、水、アセトンの順で洗浄し、標記化合物１．５ｇ（収率４２．５％）を得た。融点：１８９−１９０℃。
【００４６】
参考例４  Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-2-ニトロべンジル-L-チロシン（Fmoc-Tyr(NB)）の製造
１００ｍｌナス型フラスコに参考例３で得たTyr(NB)２．２０ｇ（６．２３ｍｍｏｌ）
を１０％炭酸ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）と1,2-ジメトキシエタン(１１．８ml)に溶解させ、1,2-ジメトキシエタン(２２．５ml)に溶解した9-フルオレニル-N-スクシンイミジ
ル炭酸塩３．０７g(９．１mmol)を滴下ロートで滴下後、一夜撹拌した。これに水３０ml
とエーテル５０mlを加え撹拌した。析出した白色沈殿を遠心分離機を用いて水及びエーテルで洗浄し、これを濾取後乾燥させ、標記化合物のナトリウム塩を得た。これを水２００mlに溶解し塩酸でｐＨ４にした後、酢酸エチル８０mlで抽出した。酢酸エチル層を水及び飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで脱水後濃縮し、ヘキサンを加え白色沈殿を析出させた。次いで、この白色沈殿を濾取し、ヘキサンで洗浄して乾燥させ、Fmoc-Tyr(NB)１．９２ｇを得た。濾液は減圧下乾燥後、酢酸エチルに再溶解し、ヘキサンによる再沈により更にFmoc-Tyr(NB)０．２ｇを得た。濾液を減圧下乾燥後、同様の操作により０．１８ｇのFmoc-Tyr(NB)を回収した。収率７１．３％。融点：１１４−１１６℃。
【００４７】
参考例５  S-2-ニトロベンジル-L-システイン塩酸塩（Cys(NB)）の製造
１００ｍｌナス型フラスコでＬ−システイン塩酸塩４．３９ｇ(25mmol)を３０mlの水と２０ｍｌのエタノールの混合液に溶解し、このフラスコをアルゴン雰囲気に置換し、氷浴下、ニトロベンジルブロミド５．４ｇ(25mmol)を溶かしたエタノール溶液５０ｍｌとトリエチルアミン１０．５ｍｌ(75mmol)を攪拌しつつ加え、１晩攪拌した。氷浴下、塩酸を滴下し、ｐHを６から７に調整し、析出した固形物を濾過し、水で３回洗浄し、表記化合物
４．９１ｇを得た。
【００４８】
参考例６  Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-S-2-ニトロべンジル-L-システイン（Fmoc-Cys(NB)）の製造
Tyr(NB)の代わりに、参考例５で得たCys(NB)を使用すること以外は、上記参考例４と同様の方法で、Fmoc-Cys(NB)を製造した。
【００４９】
参考例７  Lys(NBoc)-X-BSAの製造
Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ-ε-２−ニトロベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン（以下Fmoc-Lys(NBoc)、受託合成品、(株)ペプチド研究所製）、Ｎ-フ
ルオレニルメチルオキシカルボニル−6-アミノカプロン酸を用い、Lys(NBoc)−6−アミノカプロン酸−Cysのトリペプチドを固相法により合成した。具体的には、自動ペプチド合
成装置PSSM−8((株)島津製作所製)を使用し、この合成マニュアルに従い合成した。レジ
ンはH-Cys(Trt)-2-Cl-Trt レジン（ノバビナケム製）を用いた。合成スケールは、リアクションベッセル１個に対し、１００mgのレジンとFmoc化アミノ酸を２００μmol加えた。
合成終了後、リアクションベッセル内のペプチドレジンにメタノール及びｔ−ブチルメチルエーテルを加え順次洗浄した後、ペプチドレジンを1時間減圧乾燥した。乾燥後、クリ
ーベッジカクテル（レジン１００ｍｇのスケールに対してトリフルオロ酢酸(以下、TFAと略す)／チオアニソール／エタンジチオール＝０．９ｍｌ／０．０５ml／０．０５ml）を
リアクションベッセル内に注入し、2時間放置した。クリーベッジカクテルの濾液を遠沈
管に回収し、冷却したジエチルエーテルを加え、遠心操作を行い、析出した沈殿物を回収し、アルゴン気流中で乾燥し、更に減圧乾燥して、粗トリペプチドを得た。この粗トリペプチドをC18AR-IIカラム（φ20ｘ250ｍｍ、ナカライ製）を装着した逆相系液体クロマト
グラフィー（溶出液０．１％TFA水溶液と８０％アセトニトリル水溶液のグラジエント溶
出）により、単離した。目的物を含む画分の溶出時には、検出器をはずし、紫外線があたらないようにした。マトリックスにシナピン酸を用い、レーザーイオン化飛行時間質量分析装置(Kratos Kompact MALDI、(株)島津製作所製)により、分子量を測定し、同定した（観測値５４１、計算値５４１．６２）。精製したトリペプチド溶液を凍結乾燥することにより、乾燥した白色粉末の目的物を得た。
【００５０】
このペプチドを、二価性架橋剤6−マレイミドカプロン酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル (EMCS)を用いてBSAにコンジュゲートした。具体的にはBSA １０mgを１０mMリ
ン酸緩衝液(pH ７．２) ０．５mlに溶解し、EMCS １．９mgを溶解したジメチルホルムア
ミド２５μlを混合した。室温で３０分攪拌後、５０mMリン酸緩衝液(pH ６．０)で平衡化したSephadex G-25カラムを通過させ、過剰のEMCSを除いた。このEMCSで修飾したBSA約5 mgを含む液をその半量の0.2Mリン酸2水素ナトリウムと混合した。前記トリペプチド１mg
を１mM酢酸２５μlに溶解してから混合し、室温で３時間攪拌した。未結合のトリペプチ
ドはSephadex G-25カラムを通過させて除いた。このようにして調製したコンジュゲート
をLys(NBoc)−X−BSAとした。なお、Xは
【００５１】
【化５】
2006199597.tif 000006
【００５２】
を示す。
【００５３】
参考例８  Tyr(NB)-X-BSAの製造
Fmoc-Lys(NBoc)の代わりに、参考例４で得たFmoc-Tyr(NB)を使用すること以外は、上記参考例７と同様の方法で、Tyr(NB)-6-アミノカプロン酸-Cysのトリペプチドを固相法により合成し（観測値５３１、計算値５３２．６１）、Tyr(NB)-X-BSAを製造した。なお、Xの構造は、前記の通りである。
【００５４】
参考例９  Cys(NB)-X-BSAの製造
Fmoc-Lys(NBoc)の代わりに、参考例６で得たFmoc-Cys(NB)を使用すること以外は、上記参考例７と同様の方法で、Cys(NB)−6−アミノカプロン酸−Cysのトリペプチドを固相法
により合成し（観測値４７１、計算値４７２．５８）、Cys(NB)-X-BSAを製造した。なお
、Xの構造は、前記の通りである。
【００５５】
参考例１０  Ser(NB)-X-BSAの製造
Fmoc-Lys(NBoc)の代わりに、Ｎ-α-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Ｏ-２-ニト
ロベンジル-Ｌ-セリン（受託合成品、(株)ペプチド研究所製）を使用すること以外は、上記参考例７と同様の方法で、Ser(NB)-6-アミノカプロン酸-Cysのトリペプチドを固相法により合成し（観測値４５５、計算値４５６．５１）、Ser(NB)-X-BSAを製造した。なお、Xの構造は、前記の通りである。
【００５６】
参考例１１  モノクローナル抗体の作成
１．モノクローナル抗体の作製
常法に従って、参考例１で製造したNBoc基導入ヘモシアニンをヌードマウス(Balb/c、
６週齢、チャールズリバー(株))に免疫した。参考例２で製造したNBoc基導入BSAを用い、ELISAで上記マウスの血清の力価を測定した。数回の免疫を行い、力価が上昇したことを
確認した後、当該マウスから脾細胞を取り出し、この脾細胞とミエローマ細胞(P3-X63-Ag8-U1、東レリーサーチセンター)を電気細胞融合法により融合した。この中から目的のハ
イブリドーマをNBoc基導入BSAでスクリーニングし、限界希釈によりクローニング後、陽
性ハイブリドーマM60621細胞株（FARM AP-20320）を得た。
【００５７】
次いで、5匹のヌードマウス(Balb/c、６週齢、日本エルエスシー(株))を用い、1匹あたり107個のハイブリドーマM60621細胞株を腹腔内に接種した。7日後に再び同数の細胞を接種し、それから８日後に腹水を採取した。腹水中の抗体を硫安塩析で精製し、M60621抗体（蛋白質量にして90mg）を得た。
【００５８】
２．M60621抗体の抗原認識性
M60621抗体を参考例７−１０で製造した４種のNB基結合BSAと反応させて、抗原認識性
を確認した。具体的には、参考例７−１０で製造した４種のNB基結合BSAを抗原として用
いて、ELISAを行い、M60621抗体の各NB基結合BSAに対する結合（認識）性を確認した。ELISAは、96穴プレートの各ウェルにNB基結合BSAをコーティング(１０μg／ml、１００μｌ、４℃、一夜)して行い、ブロッキング後、M60621抗体（０．０１〜６．２５μg／ml、１００μl）と反応させた。更にペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(１００μl)と反応
させた後、０．１％オルトフェニレンジアミン、０．００９％過酸化水素水、２５mMクエン酸−５０mMリン酸緩衝液(pH５、１００μl)を加えて室温で３０分間発色させた。２M硫酸(５０μｌ)で反応停止後、490nmの吸光度を測定した。  
【００５９】
得られた結果を図１に示す。この結果、M60621抗体は、NB基結合BSAに対して結合でき
ることが確認された。特に、M60621抗体は、Lys(NBoc)-X-BSA及びTyr(NB)-X-BSAに対して優れた結合性を有していることが明らかになった。
【００６０】
実施例１
アンギオテンシン変換酵素（以下、ACEと表記する）は10アミノ酸残基よりなるアンギ
オテンシンI(以下、AIと表記する)(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu)のC末端
からジペプチドを切断し、アンギオテンシンII(以下、AIIと表記する)（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）を生成する。本実施例では、AIを生理活性ペプチドのモデルとして用いて、下記試験を行った。
【００６１】
１．AIへのNB基導入
AIの9番目のHis及び10番目のLeuは、生成物のAIIに影響しないアミノ酸である。そこで、9番目のHisをLys(NBoc)に置換したAI（以下、[Lys(NBoc)9]AIと表記する）、及び10番
目のLeuをLys(NBoc)に置換したAI（以下、[Lys(NBoc)10]AIと表記する）を、下記方法に
従って固相合成により調製した。具体的には、自動ペプチド合成装置PSSM−8((株)島津製作所)を使用し、この合成マニュアルに従い合成した。レジンはＴＧＳ−ＰＨＢ−Ｌｅｕ
レジンを用いた。合成スケールは、リアクションベッセル１個に対し、１００mgのレジンとFmoc化アミノ酸を２００μmol加えた。合成終了後、リアクションベッセル内のペプチ
ドレジンにメタノール及びｔ−ブチルメチルエーテルを加え順次洗浄した後、ペプチドレジンを１時間減圧乾燥した。乾燥後、クリーベッジカクテル（レジン１００ｍｇのスケールに対してTFA／水／チオアニソール／エチルメチルスルフィド／エタンジチオール／チ
オフェノール＝０．８２５ｍｌ／０．０５ml／０．０５ml／０．０３ｍｌ／０．０２５ｍｌ／０．０２ｍｌ）をリアクションベッセル内に注入し、６時間放置した。クリーベッジカクテルの濾液を遠沈管に回収し、冷却したジエチルエーテルを加え、遠心操作を行い、析出した沈殿物を回収し、アルゴン気流中で乾燥し、更に減圧乾燥して、粗[Lys(NBoc)9]AIを得た。この粗[Lys(NBoc)9]AIをC18AR-IIカラム（φ２０×２５０ｍｍ、ナカライ製）を装着した逆相系液体クロマトグラフィー（溶出液０．１％TFA水溶液と８０％アセトニ
トリル水溶液のグラジエント溶出）により、単離した。目的物を含む画分の溶出時には、検出器をはずし、紫外線があたらないようにした。マトリックスにα-シアノ-４-ヒドロ
キシケイヒ酸を用い、レーザーイオン化飛行時間質量分析装置(Voyager DE-STR-D1、パーセプティブバイオシステムズ製)により、分子量を測定し、同定した（観測値１４６８．
４３、計算値１４６６．５３）。精製したペプチド溶液を凍結乾燥することにより、乾燥した白色粉末の目的物を得た。
【００６２】
[Lys(NBoc)10]AIの合成のレジンは、ClTrtレジン１００ｍｇに、Fmoc-Lys(NBoc)６８ｍｇをジメチルホルムアミド１００μｌとジクロロメタン１００μｌの混合溶媒に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン５３μlを加え、１時間反応させ、ジメチルホルムアミドで
洗浄したものを用いた。以下、上記[Lys(NBoc)9]AIと同様な方法で合成した（観測値１４９３．１３、計算値１４９０．５４）。
【００６３】
また、コントロールとして、AIの9番目のHisをLysに置換し、且つNB基を導入していな
いもの（以下、[Lys9]AIと表記する）、及びAIの10番目のLeuをLysに置換し、且つNB基を導入していないもの（以下、[Lys10]AIと表記する）についても、上記方法に準じて製造
した。
【００６４】
なお、以下、[Lys(NBoc)9]AI、[Lys(NBoc)10]AI、[Lys9]AI及び[Lys10]AIを纏めて、AIアナログと表記する。
【００６５】
２．NB導入AIに対するM60621抗体の結合
上記で調製したAIアナログを各１００pmolと、種々の量のM60621抗体を０．０５% Tween20を含むPBS溶液中で混合し、２５℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、混合液をMicrocon YM-30(分画分子量 30,000、ミリポア製)で濾過して、M60621抗体と結
合していないAIアナログをHPLCにより定量した。具体的には、Capcell pak C18 UG 120 5μm(φ４．６×１５０mm、資生堂製)を用い、０．１％TFA水溶液（A液）、０．１％TFAを含む８０％アセトニトリル水溶液（B液）を溶出液とし、グラジエントA液８５〜５０％／B液１５〜５０％、流速１ml／min、分析波長２２０nm、４０℃で単離した。
【００６６】
得られた結果を図２に示す。図２から分かるように、[Lys(NBoc)9]AI及び[Lys(NBoc)10]AIは、共にM60621抗体量が増すに従ってその遊離量が減少した。一方、NB基を導入して
いない[Lys9]AI及び[Lys10]AIでは、M60621抗体量が増加してもその遊離量に変化はなか
った。この結果から、M60621抗体は、NB基に特異的に結合し、M60621抗体がNB基に結合している[Lys(NBoc)9]AI、及び[Lys(NBoc)10]AIが製造されたことが確認された。
【００６７】
３．活性確認試験−１
NB基導入AIに対するACEの作用のM60621抗体による遮蔽効果を確認するために、下記条
件１−３下でACEを各種のAIに作用させ、AIIの生成量をHPLCにより上記と同じ条件で定量した。なお、AIアナログに作用させるACEを一定にするため、予めN-(3-[2-フリル]アクリロイル)-Phe-Gly-Gly(FAPGG)を基質としてACEの活性を測定した。即ち、0.2mM FAPGGを含む50mMトリス塩酸緩衝液（ｐH7.5、0.3M NaCl）0.5ml中、25℃において、ACEによるFAPGGの分解速度を測定した。この条件で1nmol／minの速度でFAPGGを加水分解するACEの量を1unitとした。AIアナログとの反応では2.5unitのACEを用い、溶媒を0.05% Tween20を含むPBS、総量を50μlとした。
＜条件１＞
AIアナログ100pmolにACE2.5unitを添加し、25℃で5分間インキュベートした。
＜条件２＞
AIアナログ100pmolと、M60621抗体25μgを混合し、25℃で5分間プレインキュベートし
た後、これにACE2.5unitを添加し、25℃で5分間インキュベートした。
＜条件３＞
AIアナログ100pmolと、M60621抗体25μgを混合し、25℃で5分間プレインキュベートし
た後、これに300〜400nmのUV光(0.29W/cm2)を2分間照射し、次いでACE2.5unitを添加し、25℃で5分間インキュベートした。
【００６８】
得られた結果を図３に示す。[Lys(NBoc)9]AI又は、[Lys(NBoc)10]AIにACEを作用させると、NB基を導入したにもかかわらずACEが作用し、AIIを生成した（条件１）。一方、[Lys(NBoc)9]AI又は[Lys(NBoc)10]AIをM60621抗体とプレインキュベートし、M60621抗体を[Lys(NBoc)9]AI又は[Lys(NBoc)10]AIに結合させることによって、AIIの生成が著しく抑制さ
れた（条件２）。また、M60621抗体が結合した[Lys(NBoc)9]AI又は[Lys(NBoc)10]AIに紫
外線を照射することにより、AIIが生成することが認められた（条件３）。
【００６９】
以上の結果から、AIにNB基を導入するだけでは遮蔽効果が不十分であり、ACEの作用を
受けるが、M60621抗体がNB基に結合するとAIが不活化されACEが作用できなくなるため、AIIの生成が抑えられることが確認された。また、NB基に結合したM60621抗体はUV照射によるNB基切断とともに除去され、元の通りACEが作用しAIIを生成するようになることも確認された。
【００７０】
４．活性確認試験−２
更に、NB基導入AIに対するACEの作用のM60621抗体による遮蔽効果を確認するために、
以下の条件でACEを各種のAIに作用させ、AIIの生成量をHPLCにより、経時的に測定した。反応のおけるACE量、溶媒は、上記活性確認試験−１と同じである。
＜反応条件＞
[Lys(NBoc)10]AI 100pmolとACE2.5unitを混合し、25℃で4分間インキュベートした。その後、これにM60621抗体25μgを添加して混合し、25℃で10分間インキュベートした。次
いで、これに300〜400nmのUV光(0.29W/cm2)を2分間照射して、更に25℃で2分間インキュ
ベートした。
【００７１】
得られた結果を図４に示す。[Lys(NBoc)10]AIとACEをインキュベートするとAIIが生成
し、そこにM60621抗体を添加するとAIIの生成が抑制された。更に、この混合液にUV光を
照射すると再びAIIの生成がみられた。この結果から、(1)AIとACEの反応系において、光
感受性保護基であるNB基を導入しても、ACEの作用に対する遮蔽効果が十分ではないが、
該NB基に対するモノクローナル抗体を組み合わせると遮蔽効果が得られること、及び(2)
該抗体は光照射により保護基とともに容易に除去され、ACEの活性を復元できること、が
確認された。
【００７２】
これは光感受性保護基（NB基）の抗体によるケージド増強のモデル系の提示であり、光感受性保護基（NB基）とその抗体の組み合わせは他の反応系にも応用でき、種々の反応制御に有用なツールになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】M60621抗体の抗原認識特性を示す図である。図中、ＡはLys(NBoc)-X-BSA、ＢはTyr(NB)-X-BSA、ＣはCys(NB)-X-BSA、及びＤはSer(NB)-X-BSA、に対するM60621抗体の抗原認識特性を示す。縦軸は、Lys(NBoc)-X-BSA、Tyr(NB)-X-BSA、Cys(NB)-X-BSA又はSer(NB)-X-BSAに結合したM60621抗体の量を反映した値（490nmの吸光度）を示し、横軸はM60621抗体の濃度を示す。
【図２】AIアナログに対するM60621抗体の結合特性を示す図である。図中、Ａにおいて、○は[Lys(NBoc)9]AI、△は[Lys9]AIに対するM60621抗体の結合特性を示す。また、図中、Ｂにおいて、○は[Lys(NBoc)10]AI、△は[Lys10]AIに対するM60621抗体の結合特性を示す。縦軸は抗体が結合していない各AIアナログ（遊離AIアナログ）の量を示し、横軸はM60621抗体の量を示す。
【図３】実施例１の活性確認試験−１において、各条件下における各AIアナログからAIIの生成量を示す図である。図中、Ａにおいて、斜線地は[Lys(NBoc)9]AI、白地は[Lys9]AIを使用した際のAIIの生成量を示す。また、図中、Ｂにおいて、斜線地は[Lys(NBoc)10]AI、白地は[Lys10]AIを使用した際のAIIの生成量を示す。また、図中、Ａ及びＢにおいて横軸に記載の数値１、２及び３は、ぞれぞれ実施例１の活性確認試験−１における条件１、条件２及び条件３に対応する。
【図４】実施例１の活性確認試験−２において、[Lys(NBoc)10]AIから生成したAII量の経時変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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