(57)【要約】【課題】  送液ポンプ等の分離カラム外での拡散を減少させて、試料の分離精度、分解能を改善すること。【解決手段】分離カラムで分離された試料を再度同一の分離カラムへ再循環させる液体クロマトグラフィーにおいて、それぞれ分離カラムを有する二つの流路と、流路の連結と切り離しを行う二つの流路切換バルブとを備えた構成とし、リサイクル分離時において、流路切換バルブの切り換えによって、二つの分離カラム間において試料の再導入の導入方向を切り換える。【選択図】図１
2006201039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離カラムで分離された試料を再度同一の分離カラムへ再循環させる液体クロマトグラフィーにおいて、
それぞれ分離カラムを有する二つの流路と、
前記流路の連結と切り離しを行う二つの流路切換バルブとを備え、
リサイクル分離時において、前記流路切換バルブの切り換えによって、二つの分離カラム間における試料の再導入の導入方向を切り換えることを特徴とする液体クロマトグラフィー。
【請求項２】
分離カラムと検出器とを接続してなる第１の流路と、
分離カラムと検出器とを接続してなる第２の流路と、
前記第１の流路の検出部と前記第２の流路の分離カラムとを連結する第１の流路切換バルブと、
前記第１の流路の分離カラムと前記第２の流路の検出器と連結する第２の流路切換バルブと、
前記流路切換バルブに接続する移動相供給部と、
前記移動相供給部と前記流路切換バルブの少なくとも一方の間に接続する試料導入部とを備え、
リサイクル分離時には前記流路切換バルブを通して第１の流路と第２の流路の間を直接接続して試料を再循環させることを特徴とする液体クロマトグラフィー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフィーに関し、特に試料を分離カラムに循環させるリサイクル分離方式の液体クロマトグラフィーに関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーでは、試料を溶媒により分離カラムに送り、試料を成分ごとに分離する。この分離において、試料によっては分離カラムを一回通過させただけでは十分な分離ができない場合がある。そのため、カラムの分解能を高めるために、長いカラムを用いたり、複数本のカラムを直列につないで用いることが行われている。
【０００３】
しかしながら、この構成では装置が複雑化する他、コストも増える。そこで、一度カラムを通過した試料を溶媒と共に送液流路に再循環させ、同じカラムに同試料を複数回通して理論段数を増やすことで分解能を高めるリサイクル分離が用いられている。このリサイクル分離を用いることで、各成分のピークを時間的に区分することが容易となる。
【０００４】
リサイクル分離を行う液体クロマトグラフィーのシステムとして、クローズドループリサイクルシステムと、オルタナティブリサイクルシステムが知られている。
【０００５】
クローズドループリサイクルシステムは、流路切換バルブを検出器の下流側に切り換えることにより、分離カラムからの溶出液を再度分離カラムに再導入する。カラム溶出液を繰り返して分離カラムに導入してリサイクルすることにより、分離不十分な成分の分離を行う。
【０００６】
図７はクローズドループリサイクルシステムの一構成例を示す図である。
【０００７】
図７において、クローズドループリサイクルは、移動相供給部、試料導入部、分離カラム、検出器、流路切換バルブ、及び各部を循環させる流路を備える。移動相供給部は移動相溶媒の貯槽１５及び送液ポンプ１４を備え、試料導入部は試料を流路内に導入するためのインジェクタ１６を備える。インジェクタ１６から流路内に導入された試料は、溶媒と共に分離カラム１１に導入される。試料に含まれる成分は分離カラム１１で分離され検出器１２で検出される。流路切換バルブ１３を図７（ａ）に示す状態とする場合には、検出器１２を通過した試料は排出される。
【０００８】
一方、流路切換バルブ１３を図７（ｂ）に示す切換状態に切り換えると、分離カラム１１及び検出器１２を通過した試料はポンプ１４を介して流路に戻され循環する。
【０００９】
オルタナティブリサイクルシステムは、流路切換バルブにより直列に接続した２本の分離カラムの順序の入れ替えを行う。分離カラムからの溶出液を交互に双方の分離カラムに導入することによって、分離の改善を図る。
【００１０】
図８はオルタナティブリサイクルシステムの一構成例を示す図である。
【００１１】
図８において、オルタナティブリサイクルは、移動相供給部、試料導入部、分離カラム、検出器、流路切換バルブ、及び各部を循環させる流路を備え、移動相供給部は移動相溶媒の貯槽１５及び送液ポンプ１４を備え、試料導入部は試料を流路内に導入するためのインジェクタ１６を備える。
【００１２】
流路切換バルブ１３は、分離カラム１１Ａ及び検出器１２Ａを備える流路Ａと分離カラム１１Ｂ及び検出器１２Ｂを備える流路Ｂの流路の順序を切り換える。図８（ａ）は流路Ａ、流路Ｂの順に溶媒と共に試料を導入する場合を示し、図８（ｂ）は流路Ｂ、流路Ａの順に溶媒と共に試料を導入する場合を示している。
【００１３】
クローズドループリサイクルシステムでリサイクル分離を行う場合には、検出器１２の下流の流路切換バルブ１３を切り換え、流路を送液ポンプ１４側に切り換える。これによって、試料は溶媒と共に送液ポンプ１４を通して再び分離カラム１１に導入される。この際、検出器１２を通過した液が再び分離カラム１１に導入されるまでに、通常の分析時と同様にインジェクタ１６のバルブを通過する。従って、リサイクルとしては不要なバルブを通過することになり、配管等のカラム外の容積が大きくなる。
【００１４】
また、複数の移動相溶媒を用いてグラジェント分離を行う場合、リサイクル時にミキサーを短絡させるバルブを設けることも考えられるが、試料導入流路を経由せざるを得ず、この部分の試料の拡散を避けることができない。
【００１５】
したがって、従来の液体クロマトグラフィーでは、試料導入部分の配管によって余分な試料の拡散があるため、リサイクルを繰り返す毎に試料のピークの形状が悪くなってピーク幅が広くなる傾向がある。
【００１６】
このような試料導入部分等の配管で試料が拡散することによる問題を解決する液体クロマトグラフィーとして例えば特許文献１に開示されたものがある。
【００１７】
図９は、クローズドループリサイクルの試料導入部分の配管での試料拡散を改善する構成を説明するための図である。図９に示す構成では、送液ポンプ１４とインジェクタ１６との間に流路切換バルブ１７を設け、試料を分離カラム１１に導入した（図９（ａ））後、分離カラムから溶出液を再び導入する際に、流路を切り換えることによって（図９（ｂ））インジェクタ１６をバイパスする。これによって、溶出液がインジェクタを再度通過することを避けることにより、試料が拡散することを防いでいる。
【特許文献１】特開平７−３１１１８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
前記した特許文献の従来技術によれば、試料の再導入においてインジェクタをバイパスすることでインジェクタでの試料の拡散を防止することができるが、クローズドループリサイクルでは、分離カラムからの溶出液を送液ポンプに導入するため、分離カラムからの溶出液が送液ポンプのプランジャー、圧力センサー、ダンパー、ラインフィルター等を通過する際に試料が拡散するおそれがあり、リサイクルを実施しても十分な分離を得ることができないという問題が残っている。
【００１９】
したがって、送液ポンプには拡散を引き起こさない構造が望まれ、使用できる送液ポンプの種類が限定されることになる。
【００２０】
また、クローズドループリサイクルでは、溶媒の比率を変化させて溶出を行うグラジェント法を適用することができないため、試料を分離カラムに再導入することにより分離を改善するという効果を得ることができない。また、夾雑物を多く含む試料では、分離カラムへの保存が強い成分がリサイクル溶出成分と重なって溶出する場合がある。
【００２１】
また、オルタナティブリサイクルでは、カラム溶出液を送液ポンプに導入しないことから、リサイクルにより高い分離効率を得ることができるが、クローズドループリサイクルと同様に、グラジェント法においてはカラム溶出液を繰り返しカラムに導入しても分離改善の効果を得ることができず、また、夾雑物を多く含む試料では、分離カラムへの保存が強い成分がリサイクル溶出成分と重なって溶出する場合がある。
【００２２】
そこで、本発明は上記課題を解決し、送液ポンプ等の分離カラム外での拡散を減少させて、試料の分離精度、分解能を改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記目的を解決するために、本発明は、高速液体クロマトグラフィーにおいて、分離カラムを備える二つの流路を連結あるいは切り離すことによって試料を再循環させる構成とすることによって、送液ポンプ等の分離カラム外での拡散を減少させ、試料の分離精度、分解能の改善を行う。
【００２４】
本発明の液体クロマトグラフィーは、分離カラムで分離された試料を再度同一の分離カラムへ再循環させる液体クロマトグラフィーにおいて、それぞれ分離カラムを有する二つの流路と、流路の連結と切り離しを行う二つの流路切換バルブとを備えた構成とし、リサイクル分離時において、流路切換バルブの切り換えによって、二つの分離カラム間において試料の再導入の導入方向を切り換える。
【００２５】
流路切換バルブを切り換えることで、一方の分離カラムから他方の分離カラムへの溶出液の導入方向を切り換える。このとき、溶出液は、送液ポンプを通過することなく他方の分離カラムへ再導入させることができるため、送液ポンプ等による試料の拡散を減少させることができる。
【００２６】
また、本発明の液体クロマトグラフィーは、より詳細には、分離カラムと検出器とを接続してなる第１の流路及び第２の流路と、第１の流路の検出部と第２の流路の分離カラムとを連結する第１の流路切換バルブと、第１の流路の分離カラムと第２の流路の検出器と連結する第２の流路切換バルブと、流路切換バルブに接続する移動相供給部と、移動相供給部と前記流路切換バルブの少なくとも一方の間に接続する試料導入部とを備えた構成とし、リサイクル分離時には、流路切換バルブを通して第１の流路と第２の流路の間を直接接続して試料を再循環させる。
【００２７】
第１の流路の分離カラムの溶出液は、第１の流路切換バルブを切り換えることで第１の流路から第２の流路に導かれる。また、第２の流路の分離カラムの溶出液は、第１の流路切換バルブを元に戻し、第２の流路切換バルブを切り換えることで第２の流路から第１の流路に導いて、第１の分離カラムに再導入する。この操作を繰り返すことによって、溶出液は送液ポンプを通すことなく二つの流路内を循環させることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の液体クロマトグラフィーによれば、送液ポンプ等の分離カラム外での拡散を減少させて、試料の分離精度、分解能を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について図を参照しながら詳細に説明する。
【００３０】
図１は、本発明を適用した液体クロマトグラフィーの流路を説明するための図である。
【００３１】
図１において、液体クロマトグラフィーは、分離カラム１Ａと検出器２Ａとを接続してなる第１の流路Ａと、分離カラム１Ｂと検出器２Ｂとを接続してなる第２の流路Ｂと、第１の流路Ａの検出部２Ａと第２の流路Ｂの分離カラム１Ｂとを連結する第１の流路切換バルブ３Ａと、第１の流路Ａの分離カラム１Ａと第２の流路Ｂの検出器２Ｂと連結する第２の流路切換バルブ３Ｂとを備える。
【００３２】
この流路Ａ，Ｂに対して試料を移動相と共に導入したり、流路間で溶出液の再導入を行う構成として、流路切換バルブに接続する移動相供給部と試料導入部を備える。
【００３３】
移動相供給部は、移動相溶媒の貯槽５と移動相溶媒を送液する送液ポンプ４とを備え、第１の流路切換バルブ３Ａには貯槽５Ａと送液ポンプ４Ａが接続され、第２の流路切換バルブ３Ｂには貯槽５Ｂと送液ポンプ４Ｂが接続される。
【００３４】
また、試料導入部は送液ポンプ４と流路切換バルブ３との間に接続されるインジェクタ６により構成することができ、図１に示すように流路切換バルブ３Ｂの一方に接続する構成とする他、流路切換バルブ３Ａの一方に接続する構成、流路切換バルブ３Ａ，３Ｂの両方に接続する構成としてもよい。
【００３５】
また、一つの移動相供給部において、二つの移動相溶媒の貯槽と二つの送液ポンプとを備え、この移動相供給部の下流側にミキサーを設ける構成とすることによって、二種の溶媒の混合率を調整し、グラジェントによる試料分離を行うことができる。
【００３６】
なお、流路切換バルブ３には、試料成分分取用のフラクションコレクタ（図示していない）を接続してもよい。フラクションコレクタでは、成分ごとに分取された試料がそれぞれに試料成分回収容器（図示していない）に貯留される。また、移動相溶媒の貯槽５内には溶媒フィルタを設け、送液ポンプ４とインジェクタ３との間にはカラム圧を測定する圧力計を設けることができる。
【００３７】
流路切換バルブ３Ａは、流路Ａの検出器２Ａと流路Ｂの分離カラム１Ｂとの連結及び切り離しを行い、また、流路切換バルブ３Ｂは、流路Ｂの検出器２Ｂと流路Ａの分離カラム１Ａとの連結及び切り離しを行う。
【００３８】
以下、図２を用いて本発明の液体クロマトグラフィーの操作例について説明する。図２（ａ）は試料を流路Ａに導入して溶出させた後、流路Ｂに導入する操作を示し、図２（ｂ）は流路Ｂから流路Ａに再導入する操作を示している。
【００３９】
インジェクタ６から試料を流路Ａに導入する流路、あるいは溶出液を流路Ａから流路Ｂに導入あるいは再導入する流路を形成する場合には、図２（ａ）に示すように、流路切換バルブ３Ａを切り換えることによって、流路Ａの検出器２Ａを流路Ｂの分離カラム１Ｂに連結し、流路切換バルブ３Ｂを切り換えることによって、流路Ａの分離カラム２Ａにインジェクタ６を接続する。
【００４０】
この流路切換バルブの切り換えによって、インジェクタ６から注入された試料は、送液ポンプ４Ａによって貯槽５Ａから送り出された移動相溶媒と共に、流路Ａの分離カラム２Ａ内に導入される。分離カラム２Ａで分離された溶出液は検出器２Ａで検出され、さらに検出器２Ａを出た溶出液は流路Ｂの分離カラム２Ｂに導入される。
【００４１】
一方、溶出液を流路Ｂから流路Ａに再導入する流路を形成する場合には、図２（ｂ）に示すように、流路切換バルブ３Ａを切り換えることによって、流路Ａの検出器２Ａと流路Ｂの分離カラム１Ｂとの連結を切り離すと共に、流路切換バルブ３Ｂを切り換えることによって、流路Ａの分離カラム１Ａとインジェクタ６との連結を切り離し、流路Ｂの検出器２Ｂと流路Ａの分離カラム１Ａとを連結する。
【００４２】
この切り離しと連結によって、分離カラム１Ｂには送液ポンプ４Ｂによって貯槽５Ｂから送り出された移動相溶媒が送られ、分離カラム１Ｂで分離された溶出液は検出器２Ｂで検出された後、流路切り換え３Ｂを経て分離カラム１Ａに再導入される。
【００４３】
上記操作を繰り返すことによって、溶出液を送液ポンプに通すことなく、溶出成分を二つの流路Ａ，Ｂ内で循環させることができる。
【００４４】
図３は、本発明の液体クロマトグラフィーによって、p-ヒドロキシン安息香酸-n-プロピルとp-ヒドロキシン安息香酸-iso-プロピルのリサイクル分離を実施したクロマトグラフ結果を示している。
【００４５】
なお、このときの条件は以下の通りである。
分離カラム：Chromoltith（登録商標） Performance RP-18e(100mmL×4.6mmI.D.)
移動相    ：水／アセトニトリル＝6/4(v/v)
流量      ：0.8mL/min
カラム温度：40℃
検出器    ：254nm（UV検出器）
注入量    ：5μL
【００４６】
なお、図３中のｎ＝１、ｎ＝３、ｎ＝５は分離カラム１Ａで溶出された検出結果であり、ｎ＝２、ｎ＝４、ｎ＝６は分離カラム１Ｂで溶出された検出結果である。
【００４７】
検出結果から、本発明の液体クロマトグラフィーによるリサイクルを実施することによって、分離の改善を行うことができる。
【００４８】
また、本発明の液体クロマトグラフィーは、グラジェント法にも適用することができる。図４，５は本発明の液体クロマトグラフィーをグラジェント法に適用した場合の操作例を説明するための図である。
【００４９】
図４，５において、グラジェント法を適用するために、移動相５Ａは二種類の移動相５Ａaと移動相５Ａbを備え、各移動相５Ａa, ５Ａbは送液ポンプ４Ａa及び４Ａbを介してインジェクタ６に接続可能としている。
【００５０】
はじめに、グラジェント法によって溶出を行った後（図４（ａ））、２回目以降はアイソクラティク法によって溶出を行う（図４（ｂ），図５（ａ），（ｂ））。
【００５１】
グラジェント法による溶出では、図４（ａ）に示すように、流路切換バルブ３Ａを切り換えることによって、流路Ａの検出器２Ａを流路Ｂの分離カラム１Ｂに連結し、流路切換バルブ３Ｂを切り換えることによって、流路Ａの分離カラム２Ａにインジェクタ６を接続し、インジェクタ６に送液ポンプ４Ａa及び４Ａbを接続して、二種類の移動相５Ａaと移動相５Ａbの濃度比を変えながら送り込む。
【００５２】
送り込まれた試料及び移動相５Ａa，５Ａbは分離カラム１Ａに導入され、グラジェント法によって分離カラム１Ａで分離された溶出成分を検出器２Ａで検出する。検出器２Ａを出た未分離の成分は、分離カラム２Ｂに導入される。
【００５３】
以後はアイソクラティク法により分離を行う。図４（ｂ）では、溶出液を流路Ｂから流路Ａに再導入する流路を形成するために、流路切換バルブ３Ａを切り換えることによって、流路Ａの検出器２Ａと流路Ｂの分離カラム１Ｂとの連結を切り離すと共に、流路切換バルブ３Ｂを切り換えることによって、流路Ａの分離カラム１Ａとインジェクタ６との連結を切り離し、流路Ｂの検出器２Ｂと流路Ａの分離カラム１Ａとを連結する。
【００５４】
この切り離しと連結によって、分離カラム１Ｂには送液ポンプ４Ｂによって貯槽５Ｂから送り出された移動相溶媒が送られ、分離カラム１Ｂで分離された溶出液は検出器２Ｂで検出された後、流路切り換え３Ｂを経て分離カラム１Ａに再導入される。
【００５５】
次に、図５（ａ）では、流路切換バルブ３Ａを切り換えることによって、流路Ａの検出器２Ａを流路Ｂの分離カラム１Ｂに連結し、流路切換バルブ３Ｂを切り換えることによって、流路Ａの分離カラム２Ａに移動相５Ａを接続する。
【００５６】
この流路切換バルブの切り換えによって、分離カラム１Ａの溶出液は、送液ポンプ４Ａによって貯槽５Ａから送り出された移動相溶媒と共に、分離カラム２Ａで分離された溶出液は検出器２Ａに送られて検出され、さらに検出器２Ａを出た溶出液は流路Ｂの分離カラム２Ｂに再導入される。
【００５７】
次に、図５（ｂ）では、流路切換バルブ３Ａを切り換えることによって、流路Ａの検出器２Ａと流路Ｂの分離カラム１Ｂとの連結を切り離すと共に、流路切換バルブ３Ｂを切り換えることによって、流路Ａの分離カラム１Ａとインジェクタ６との連結を切り離し、流路Ｂの検出器２Ｂと流路Ａの分離カラム１Ａとを連結する。
【００５８】
この切り離しと連結によって、分離カラム１Ｂには送液ポンプ４Ｂによって貯槽５Ｂから送り出された移動相溶媒が送られ、分離カラム１Ｂの溶出液は検出器２Ｂで検出された後、流路切り換え３Ｂを経て分離カラム１Ａに再導入される。
【００５９】
上記操作を繰り返すことによって、グラジェント法で溶出した後、溶出液を送液ポンプに通すことなくアイソクラティク法で溶出成分を二つの流路Ａ，Ｂ内で循環させることができる。
【００６０】
図６は、本発明の液体クロマトグラフィーによって、アルデヒド・ケトン-DNPH誘導体混合15成分を試料とし、グラジェント溶出液のリサイクル分離を実施したクロマトグラフ結果を示している。
【００６１】
なお、このときの条件は以下の通りである。
分離カラム：Chromoltith（登録商標） Performance RP-18e(100mmL×4.6mmI.D.)
移動相    ：一回目溶出；グラジェント
移動相5Aa：水/THF=8/2(v/v)
移動相5Ab：水／アセトニトリル=6/4(v/v)
移動相5B ：25％(0min)→46％(16min)→40％(16.01min)
：二回目以降溶出；アイソクラティク
流量      ：1.0mL/min
カラム温度：40℃
検出器    ：365nm（UV検出器）
注入量    ：5μL
【００６２】
上記条件によって、アルデヒド・ケトン-DNPH誘導体混合をグラジェントで分離カラムＡから溶出させて、p-tolualdehyde-DNPHとm-tolualdehyde-DNPHの未分離ピークを分離カラムＢに導き、その後は、すべてアイソクラティク法にて溶出させ、分離の改善を図る。
【００６３】
なお、図６中のｎ＝１、ｎ＝３は分離カラム１Ａで溶出された検出結果であり、ｎ＝１はグラジェント溶出区間での結果を示している。また、ｎ＝２、ｎ＝４、ｎ＝６〜ｎ＝３４の偶数回目６は分離カラム１Ｂで溶出された検出結果である。
【００６４】
検出結果から、本発明の液体クロマトグラフィーによるリサイクルを実施することによって、p-tolualdehyde-DNPHとm-tolualdehyde-DNPHが分離されていくことが確認される。
【００６５】
上記の分析条件で用いた分析カラムは、低負圧のモノリス型カラムを用いることで検出セルにかかる負荷圧を抑制することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、試料の成分を検出する他、目的試料の分取にも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明を適用した液体クロマトグラフィーの流路を説明するための図である。
【図２】本発明の液体クロマトグラフィーの操作例を説明するための図である。
【図３】本発明の液体クロマトグラフィーによるクロマトグラフ結果を示す図である。
【図４】本発明の液体クロマトグラフィーをグラジェント法に適用した場合の操作例を説明するための図である。
【図５】本発明の液体クロマトグラフィーをグラジェント法に適用した場合の操作例を説明するための図である。
【図６】本発明の液体クロマトグラフィーによるクロマトグラフ結果を示す図である。
【図７】クローズドループリサイクルシステムの一構成例を示す図である。
【図８】オルタナティブリサイクルシステムの一構成例を示す図である。
【図９】クローズドループリサイクルの試料導入部分の配管での試料拡散を改善する構成を説明するための図である。
【符号の説明】
【００６８】
１，１Ａ，１Ｂ…分離カラム、２，２Ａ，２Ｂ…検出器、３，３ａ，３ｂ…流路切換バルブ、４，４Ａ，４Ｂ…送液ポンプ、５，５Ａ，５Ｂ，５Ａa，５Ａb…移動相、６…インジェクタ、１１…分離カラム、１２…検出器、１３…流路切換バルブ、１４…送液ポンプ、１６…インジェクタ。
【図１】
2006201039.tif 000003
【図２】
2006201039.tif 000004
【図３】
2006201039.tif 000005
【図４】
2006201039.tif 000006
【図５】
2006201039.tif 000007
【図６】
2006201039.tif 000008
【図７】
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【図８】
2006201039.tif 000010
【図９】
2006201039.tif 000011