(57)【要約】【課題】検出時のシグナルを増幅させる選択結合性物質固定化担体を提供すること【解決手段】固体表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該固体表面に重合体が共有結合で結合しており、該重合体中の官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該固体表面に重合体が共有結合で結合しており、該重合体に結合している官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
【請求項２】
該固体表面が樹脂からなる請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項３】
該固体表面が下記一般式（１）を構造単位として有する請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
【化１】
2006208012.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ３またはＣＨ2を表す。）
【請求項４】
該重合体に結合している官能基がアシル基である請求項１から３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項５】
該重合体がペプチドまたはペプチド誘導体由来のものである請求項１から３のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項６】
選択結合性物質が核酸である請求項１から５のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性
物質」）を固定化した担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティング法に代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の相互作用に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。また、抗原-抗体相互作用ではELISA法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)という、抗体と抗原及び酵素標識された抗原との結合により、標識酵素の活性を測定することで抗原を定性・定量分析する方法が主に用いられている。この手法においても標識体として蛍光物質が用いられ、この標識体からの蛍光を検出することで定性・定量が行われている。他には蛍光分子から他の分子へ励起エネルギーが移動する現象を利用した分析法、例えば、蛍光エネルギー移動法（FRET）や、分子ビーコン法などが挙げられるが、いずれも、検体に蛍光標識を施し、微弱な蛍光を高感度に検出することが必要不可欠になっている。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。
【０００４】
核酸を基板上に固定化するための技術としては、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
また、ＤＮＡチップに用いられる核酸プローブ（基板上に固定化された核酸）は、従来の数百〜数千塩基の長さのｃＤＮＡおよびその断片から、検出の際のエラーを下げることと、合成機で容易に合成できるという理由から、核酸プローブとしてオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡとは塩基数が１００塩基までのものをいう）を用いようとしている。この際、オリゴＤＮＡとガラス基板とを共有結合にて、結合させている（例えば特許文献２参照）。固体基板上にグラフトポリマーを介してのオリゴＤＮＡ固定化手法として、末端アミノ化ＤＮＡとグラフトポリマー共有結合させて固定化する方法がある。（例えば特許文献  ３および４）
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲）
【特許文献２】特開２００１−１０８６８３号公報（特許請求の範囲および実施例）
【特許文献３】特開２００３−１３０８７８号公報（特許請求の範囲および実施例）
【特許文献４】特開２００３−１３０８７９号公報（特許請求の範囲および実施例）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、検体DNAの濃度が非常に薄い場合、ハイブリダイゼーション後のシグナルが微弱になり、検出が困難になるという問題点がある。本発明が解決しようとする課題は、上記のような重合体を固体表面に固定化し、その重合体に結合しているアシル基と末端アミノ化されたＤＮＡとを共有結合させることにより、ＤＮＡが固定化された基板を作製し、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（１）固体表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、該固体表面に重合体が共有結合で結合しており、該重合体に結合している官能基と選択結合性物質が共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
（２）該固体表面が樹脂からなる(１)に記載の選択結合性物質固定化単体
（３）該固体表面が下記一般式（１）を構造単位として有する請求項１に記載の選択結合性物質固定化担体。
【０００８】
【化１】
2006208012.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ炭素数１から２０のアルキル基、炭素数６から１８のアリール基、又は水素原子を表す。また、Ｘは、Ｏ、ＮＲ３またはＣＨ2を表す。）
（４）該重合体に結合している官能基がアシル基である(１)から(３)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
（５）該重合体がペプチドおよびペプチド誘導体由来のものである(１)から(３)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
（６）選択結合性物質が核酸である(１)から(５)のいずれかに記載の選択結合性物質固定化担体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、固体表面に結合した重合体を介して選択結合性物質を固定化された選択結合性物質固定化担体を提供でき、選択結合性物質の選択的結合シグナルを増幅させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の選択結合性物質固定化担体およびその製造方法を具体的に以下に述べる。
【００１２】
本発明者らは、鋭意実験を重ねた結果、図１に示すように重合体を固体表面に形成させ、その重合体に結合しているアシル基と核酸を共有結合により固定化し、ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させることを見いだした。本発明で重合体とは合成ポリマーでは、ポリメチルメタクリレート、セルロースアセテートブチレート、セルローストリアセテート、セルローストリブチレート、ポリアセタール、ポリエチレングリコール、ポリアミドなどが挙げられる。さらに、その他の樹脂材料として、エポキシ樹脂、アクリル樹脂、ウレタン樹脂、フェノール樹脂、スチレン系樹脂、ビニル系樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド系樹脂、メラミン系樹脂、フォルマリン樹脂などが挙げられ、生体物質としてはポリペプチドやポリヌクレオチド、糖鎖などが挙げられる。その他としてはアルキル鎖が挙げられる。これらの中で水溶液中での重合体の屈曲性の良さから、ポリエチレングリコール、ポリペプチドやポリヌクレオチド、糖鎖などの親水性ポリマーが好ましく用いることができる。これらの中でも特に固体表面への導入の容易さやコスト面からアミノ酸から形成されるオリゴペプチドまたはポリペプチドがより好ましく用いることができる。また、ペプチドはペプチド結合関与部位以外が、ホルミルメトキシカルボニルやｔ−ブトキシカルボニル等で保護されているペプチド誘導体でも良い。本発明で重合体の重合度は、特に制限はないが、作製の容易さから１〜１０００が好ましい。この重合体は次に挙げる反応経路で表面に形成することが可能である。まず、固体表面に足がかりとなる官能基を生成する。ついでこの官能基と結合できる官能基を有する重合体を結合させる。そして重合体に結合している中の官能基と結合できる官能基を有する選択結合性物質と反応させることにより、固体基板上に重合体を介して選択結合性物質を固定化することができる。重合体に結合されている官能基は重合体の主鎖末端でも良いし、側鎖末端でも良い。分岐構造を持つ重合体の場合は枝分かれ端でも良い。官能基の種類としては、特にアシル基（ＲＣＯ−：Ｒは炭化水素）が、その作製の容易さや選択結合性物質の固定化の観点から好ましく用いることができる。ここでアシル基を有するアシル化合物としては、アルデヒド基（ＲＣＯＨ）、カルボキシル基（ＲＣＯＯＨ）カルボシキル基の水素原子が置換した各種カルボン酸塩（ＣＯＯＭ：ＭはＮａやＫなど金属）やエステル（ＲＣＯＯＲ’）があり、またカルボキシル基のヒドロキシ基が置換した酸アミド（ＲＣＯＮＨ２）、酸アジド（ＲＣＯＮ３）、酸塩化物（ＲＣＯＣｌ）酸無水物、ニトリル（ＲＣＮ）などが挙げられる。また、アミノ基やチオール基と縮合反応を促進するアシル化合物としてアシル基にマレイミド基やスクシイミド基などが挙げられる。この固体基板上への重合体の固定化方法は、具体的には以下のようになる。すなわち、カルボキシル基を固体の表面に生成し、エステル活性化剤などでカルボキシル基を活性化し、その後、アミノ基およびカルボキシル基を持つアミノ酸のアミノ基を、表面の活性化カルボキシル基と反応させることにより、固体表面にカルボキシル基を生成させることができる。ここでエステル活性化剤の例としてはスクシンイミジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルフォツクシイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシクシイミド（ＮＨＳ）などが挙げられる。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３'−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)や４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と固体表面のカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に生成された固体表面を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、重合体に結合しているカルボキシル基を活性化しておいても良い。
【００１３】
本発明の選択結性物質固定化担体の基板としては特には限定されないが、例えば、ガラス、シリコン、金属としては金、銀、白金、銅、樹脂としてはポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルニトリル、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネートなどが挙げられる。ガラスやシリコンに官能基を生成させる方法としてはシランカップリング剤等の溶液に浸漬することにより、表面に水酸基やカルボキシル基、アミノ基を生成させることができる。金属基板上への官能基の導入は末端にチオール基を持つ化合物溶液に基板を浸漬することにより、容易に水酸基やカルボキシル基、アミノ基を生成させることが可能である。
【００１４】
また、樹脂担体の表面に官能基を生成する方法としては、プラズマ処理などで、強制的に酸化させることにより担体表面にカルボキシル基や、水酸基等を生成することもできる。その他の方法としては、樹脂担体の側鎖を加水分解するなどの方法を用いることができ、この方法は簡便な方法であることから好ましく用いることができる。
【００１５】
したがって、本発明の選択結合性物質固定化担体の樹脂としては、側鎖構造を有する樹脂であることが好ましく、側鎖構造を有する樹脂としては、具体的にはポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ酢酸ビニル等のビニル系樹脂等が挙げられるが、特に下記一般式（１）で表せられる構造を持つ樹脂が特に好ましい。
【００１６】
【化２】
2006208012.tif 000003
【００１７】
（一般式（１）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
上記の構造単位を持つ樹脂であると、酸やアルカリの加水分解にて、容易に側鎖がカルボキシル基となる。
【００１８】
本発明において、一般式（１）で表せられる樹脂の平均重合度の好ましい範囲は、１００から１万である。特に好ましくは、２００以上、５０００以下である。なお、数平均重合度はＧＰＣ（ゲルパーメイションクロマトグラフ）を用い定法にて樹脂の分子量を測定することにより、容易に測定できる。
一般式（１）において、Ｒ1およびＲ2はアルキル基、アリール基または水素原子を表し、それぞれ同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は直鎖状であってもまたは枝別れしていても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。前記アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基ＸはＯ、ＮＲ3 、またはＣＨ2の中から任意に選ばれる。Ｒ3は前記Ｒ1およびＲ2と同様に定義される官能基である。
【００１９】
前記各種のような官能基を含む樹脂で、好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で特に好ましいものは、ポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、前記樹脂構成要素を組み合わせた、または前記樹脂の構成要素に他の一種または複数種の樹脂の構成要素を加えた構造の共重合体も用いることができる。前記他の樹脂としては、ポリスチレン、ポリアクリロニトリルまたはポリアミド等がある。
【００２０】
このような材質からなる樹脂表面にカルボキシル基を生成する手段としては、アルカリ、酸などで処理するほか、温水中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に樹脂基板を晒す方法などが挙げられるが、樹脂表面の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点からアルカリ、もしくは酸に樹脂基板を漬け込んで表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に樹脂基板を漬け込み、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間の間保持すればよい。
ついで、本発明の選択結合性物質固定化担体の具体的な使用方法の好ましい形態について述べる。本発明の選択結合性物質固定化担体は、選択結合性物質が多数固定化されている、マイクロアレイと呼ばれる固体に用いることが好ましい。ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びFabフラグメントやF(ab')2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、固体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。核酸の末端修飾可能な官能基にはアミノ基の他に、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基あるいはチオール基も好ましく導入することができる。オリゴ核酸の末端修飾の際、これら官能基と核酸の間にアルキル鎖を導入するが、一般的にはそのアルキル基の炭素数は３〜１８である。
【００２１】
本発明の固体表面とこのような選択結合性物質とを固定化するためには、先に述べたＥＤＣやＤＭＴ−ＭＭのような縮合剤を用いて固定化すればよい。そして固体表面の重合体分子のアシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により固体表面と選択結合性物質が固定化されることになり、固体表面の重合体のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により固体表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を固体表面に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。
【００２２】
前述した方法により、固体表面に重合体を介して選択結合性物質を固定化することにより、固体表面に直接固定化した場合に比べ、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体と高いハイブリダイゼーション効率を提供する選択結合性物質固定化担体を得ることができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
（DNA固定化基板１、２の作製）
重合体分子固定化PMMA基板の作製スキームを図２に示す。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（（株）クラレ製；コモグラス押し出し板、厚さ１mm、平均分子量３万）を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１５時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、基板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。次いで（Ａ）Ｎ−ヒドロキシスルホツクシイミド（以降Sulfo-NHSと略す）１００ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)３５０ｍｇを２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）バッファー（０．１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．０に調整）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。（Ｂ）１時間撹拌後、上記基板をアミノ酸の一種であるグリシン８０ｍｇを含むホウ酸水溶液（１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．３に調整）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。１時間攪拌後、ＤＮＡ固定化基板１を作製した。また、上記（Ａ）、（Ｂ）の操作をさらに３回繰り返すことにより、ＰＭＭＡ表面にグリシン４分子結合した、ＤＮＡ固定化基板２を得た。
実施例２
（DNA固定化基板３の作製）
重合体分子固定化PMMA基板の作製スキームを図３に示す。
実施例１と同様の方法でＰＭＭＡ基板表面にカルボキシル基を生成させた。次いで（ａ）Sulfo-NHS１００ｍｇ、ＥＤＣ３５０ｍｇをＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）に溶解させた。これらの混合溶液に上記加水分解後のＰＭＭＡ基板を浸漬し、マイクロスターラーで１時間撹拌撹拌した。（ｂ）ＭＥＳ（ｐＨ８．３）にグリシン８０ｍｇを溶解させ、ＥＤＣ３５０ｍｇを加え１時間攪拌し、ポリペプチドであるグリシン重合体を作製した。（ｃ）上記基板を（ｂ）で調整したグリシン重合体溶液に浸漬し、２時間攪拌した後、ＤＮＡ固定化基板３を得た。
【００２５】
実施例３
（DNA固定化基板４の作製）
実施例２で作製した重合体分子固定化ＰＭＭＡ基板に再び操作（ａ）を施し、重合体末端にスクシンイミド基を修飾し、ＤＮＡ固定化基板４を得た。
【００２６】
実施例４
（DNA固定化基板５の作製）
実施例１と同様の操作でＰＭＭＡ基板上にカルボキシル基を生成させた。次いで（Ａ）の操作の後、１時間撹拌後、上記基板をアミノ酸の一種であるアラニン８０ｍｇを含むホウ酸水溶液（１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．３に調整）に浸漬し、マイクロスターラーで撹拌した。１時間攪拌後、ＤＮＡ固定化基板５を作製した。
【００２７】
実施例５
（DNA固定化基板６の作製）
DNA固定化基板としてガラス基板を用いた。重合体分子固定化ガラス基板の作製スキームを図４に示す。
【００２８】
スライドガラスを１０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液に１時間浸漬したあと、純水で十分に洗浄した。ついで、ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量％の割合で純水に溶解した後、上記のスライドガラスを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにして、ガラスの表面にアミノ基を導入した。
【００２９】
ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた。１Ｍの５０ｍｌのホウ酸ナトリウム（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）に上記コハク酸溶液に加えた。この混合液に上記のガラス基板を２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラス基板の表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラス表面にカルボン酸を導入した。実施例２と同様の操作でグリシン重合体と反応させＤＮＡ固定化基板６とした。この反応スキームを図３に示す。  
【００３０】
比較例１
（DNA固定化基板７の作製）
比較として、実施例１と同様の操作でＰＭＭＡ基板上に加水分解によりカルボキシル基を生成させ、ＤＮＡ固定化基板７とした。
【００３１】
比較例２
（DNA固定化基板８の作製）
実施例４と同様の操作でアミノ基を導入したガラス表面に無水コハク酸を反応させることによりカルボキシル基を生成させＤＮＡ固定化基板８とした。
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（６０塩基、５'末端アミノ化）、のＤＮＡを合成した。5'-ACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCATCTGGA-3この配列番号１のＤＮＡは５'末端がアミノ化されている。
【００３２】
これらのＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ(ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５)でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(ＥＤＣ)を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をおよそ２００ｎｌ取り出して、これを基板に点着した。次いで、基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。
（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号５のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。
【００３３】
検体DNAとして、上記DNA固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つDNA（９６８ｂ.ｐ.）を用いた。調整方法を以下に示す。
以下の配列の核酸を合成した。
5'-GGGCGAAGAAGTTGTCCATA-3'  （配列番号２：20塩基）
5'-GCAGAGCGAGGTATGTAGGC-3'  （配列番号３：20塩基）
これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐKＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号４：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Polymerase Chain Reaction）により増幅を行った。
【００３４】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ExTaq ２μｌ、 10×ExBuffer ４０μｌ、 dNTP Mix ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製；製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、 配列番号２の溶液を２μｌ、配列番号３の溶液を２μｌ、 テンプレート（配列番号４）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。
【００３５】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（dATP、dTTP、dGTPの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、dCTPの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡ（配列番号５：９６８塩基）を得た。さらにこれをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００３６】
この標識化された検体DNAを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇの純水にとかし、２００ｍｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化したそれぞれの基板に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブ核酸が固定化されている担体にハイブリダイゼーション用の溶液を１０μｌ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。また、カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを、プラスチック容器の中に入れ、６５℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Axon Instruments社のGenePix 4000A）に上記処理後の基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧を５００Ｖに設定した状態で測定を行った。その結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2006208012.tif 000004
【００３８】
表１は種々の手法により作製したＤＮＡ固定化基板を用いた核酸ハイブリダイゼーション後の蛍光シグナルを示したものである。
【００３９】
比較例１のＤＮＡ固定化基板７と比較して、グリシン１分子、グリシン４分子やポリグリシンを介してＤＮＡ固定化したＤＮＡ固定化基板１、２、３は高効率なハイブリダイゼーションが観察された。また、ＤＮＡ固定化基板４の結果から、重合体の末端がスクシンイミド基で修飾されていてもほぼ同様の効果が確認された。ＤＮＡ固定化基板５の結果からアミノ酸がアラニンの場合においてもグリシンと同様の効果あることが確認された。さらに、ＤＮＡ固定化基板６と８を比較して、ガラス基板を用いた場合でも、重合体を介してＤＮＡを固定化することによりハイブリダイゼーションの高効率化が確認された。これらのことからいずれの基板においても、固体基板上に重合体を固定化し、重合体に結合したアシル基とＤＮＡのアミノ基を縮合させて固定化することにより、ハイブリダイゼーション効率が飛躍的に向上することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】固体基板上での重合体を介して選択結合星物質の固定化
【図２】ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム１
【図３】ＰＭＭＡ表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム２
【図４】ガラス表面への選択結合性物質（ＤＮＡ）の固定化反応スキーム４
【符号の説明】
【００４１】
１  固体基板
２  重合体
３  選択結合性化合物
４  ＰＭＭＡ基板
５  スクシンイミド基
６  グリシンまたはアラニン
７  末端アミノ化ＤＮＡ
８  グリシン重合体
９  ガラス基板
１０  無水コハク酸
【図１】
2006208012.tif 000006
【図２】
2006208012.tif 000007
【図３】
2006208012.tif 000008
【図４】
2006208012.tif 000009
【配列表】
2006208012000001.app