(57)【要約】【課題】顕微鏡法における効率のよいデータマネージメントの方法試料画像捕捉のための方法【解決手段】３次元の試料範囲に対応する検出画像データが検出され保存される、その場合試料２３上で左右および上下に隣接する画像データが圧縮時に圧縮対象として考慮された上でデータの圧縮が行われる方法、有利なことに、画像スタックが撮像され、画像スタックの各隣接画像がデータ圧縮の対象にされる。時間別に、および／または分光別に検出および保存されたデータがデータ圧縮の対象にされる。【選択図】図１
2006072330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡による試料画像捕捉のための方法であって、ただし、３次元の試料範囲に対応する検出画像データが検出され保存され、その場合試料上で左右および上下に隣接する画像データが圧縮時に圧縮対象として考慮された上でデータの圧縮が行われる方法。
【請求項２】
画像スタックが撮像され、画像スタックの各隣接画像がデータ圧縮の対象にされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
時間別および／または分光別に検出および保存されたデータがデータ圧縮の対象にされる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項４】
データ圧縮の際に捕捉されるボリュームの予備設定が行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項５】
データ圧縮が、撮像された画像の経時変化速度および／または空間分解性に依存して行われる、特に先行請求項の１つに記載された、レーザ走査型顕微鏡による画像捕捉のための方法。
【請求項６】
異なる画像領域のデータ圧縮が別な仕方で行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項７】
圧縮レートがシリーズ画像の撮像に基づき自動的に作成される、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項８】
画像領域および／または時間区分別シリーズ画像の圧縮度を予備設定するための入力手段が配備されている、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項９】
ｘ、ｙ、ｚ、ｔデータレコードの保存が、異なったメモリ領域では異なった保存データ圧縮度を有するデータメモリ内で行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項１０】
共振型スキャナ、ニポースキャナまたは多点スキャナによる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項１１】
特に細胞結合面および有機体全体における、なかでも１/１０秒から時間単位までのダイナミックなプロセス等の生育過程、それも特に下記諸点、すなわち：
・  その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析、
・  例えばFRET実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
・  例えば３次元ＦＲＡＰ、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
・  例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析、
・  例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
・  例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
・  例えばCFP、GFP、YFP、DsRed、HcRedなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・  機能に依存して変色する、例えばCa+マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばGFPによる形質転換動物、
・  例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・  検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・  最終項目とそれ以前の項目との組み合せ、
のうちの少なくとも１つの研究のための、前記請求項の少なくとも１つに記載の装置および/または方法の使用。
【請求項１２】
特に、微小な運動構造体、例えばタンパク質の高速度描写に（殆どが１/１００秒の領域）、それも特にＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰなどに適用される、細胞内運搬過程の研究のための前記請求項の少なくとも１つに記載の装置および/または方法の使用。
【請求項１３】
例えば、副分子構造解明のためのＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＥＴなど、好ましくは間接的技術の使用下における、特に、非常に微小な構造の高速度描写など、分子およびその他副細胞の描写のための前記請求項の少なくとも１つに記載の装置および/または方法の使用。
【請求項１４】
特に筋肉系または神経系に関する研究における迅速な信号伝達過程のための、特に、１/１００秒から１／１０００秒以下に到るまでの領域で展開されるイオン介在活動に関係する、高い経時的分解能による神経生理学過程のための、前記請求項の少なくとも１つに記載の装置および/または方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
共焦点ならびに４Ｄ顕微鏡の一連の画像は空間的また時間的に関して１：１の情報密度で保存することが広く行われている。その結果として、データ量は、通常の充分に能力のある計算機をもってしても処理に苦労するほどの膨大な量に達する。一連の画像データのアーカイブ保存はＤＶＤ技術にもかかわらず困難であり、あるものはネットワーク経由の高価なファイルサーバにのみ保存可能である。ローカルなあるいはモバイル性のアーカイブもまたデータの安全性の理由から優先されることがある。それに加えて最近の並列共焦点ならびに４Ｄ顕微鏡の走査速度は著しく向上しており、これはデータ量がさらに拡大することを意味する。
【特許文献１】ＤＥ  １９７０２７５３Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
本発明は顕微鏡法における効率のよいデータマネージメントの方法を提案するものである。ある次元で事象密度が小さい場合は情報の削除ならびに圧縮により事象密度が高い他の次元における多くの情報の保存に必要な空間を作り出す。これに対応するデータフォーマットは高速の共焦点ならびに４Ｄ顕微鏡においては新しいものである。
【０００３】
この問題の解決のために共焦点ならびに４Ｄ顕微鏡において、新しい効率の良いデータマネージメントを利用しなければならない。これは、将来すべての３つの空間次元について高い時間的解像度を伴う長時間実験を行う（＝４Ｄ）ことになるから、特に必要である。
【０００４】
解は局面の事象密度に応じて情報密度を適合させることにある。つまりまず事象密度が小さい場合は情報を飛び越し、あとで内挿により回復する。さらにデータセットを圧縮するが、これも同様に情報密度に対応してさまざまな強さで行う。さらに互いに次元の重み付けを互いに行う。つまり時間的に事象密度が小さい場合には空間的情報はより高く解像し、これに対して時間的事象密度が大きい場合には低く解像する。空間的次元内部においてはまたＸ／Ｙ（面）はＺ（深さ）よりも高く重み付けする。
【０００５】
このような一連の画像データを円滑に圧縮、内挿、あとでの再現を行うためには、さらに使用する計算機にとって適度な負荷であることが必要である。これをフレームグラバーあるいはグラフィックボード上で実行する、あるいは少なくともこれらの部品を併用することが考えられる。
あとで行う内挿による情報復活を含む多様な画像情報に対して必要な不連続で処理能力の高いデータフォーマットはこれまで共焦点ならびに４Ｄ顕微鏡法には存在しなかった。
【０００６】
Ｄ．Ｒ．ほかが２００３年にＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎ．
３:８２７-８４１に、生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データの３空間次元における、ソフトウエアベースの動作分析を記述している。このデータセットは中庸の撮影速度にもかかわらず著しく大きくなり、結果は一部が数学的に表されただけで視覚的には表現されなかった。
【０００７】
Abdul-Karim, M.A.ほかは２００３年にMicrovasc., Res., ６６:１１３-１２５に生きている動物の血管変化の長時間分析を記述しているが、その際には数日にわたって間歇的に蛍光画像を撮影した。運動軌跡を図に表現するために３Ｄデータセットがアダプティブ・アルゴリズムを用いて評価された。データセットの大きさが問題となり、元々の構造が再構築できなかった。
【０００８】
Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｒ．ほかは２００２年にＧｌｉａ, ３７:２２９-２４０にラットの小グリア細胞の動作の３Ｄ分析について記述しているが、その際にデータを１０時間以上取得した。同時に外傷性の損傷のあと急速なグリア小細胞の反応が起こったのでデータレートが高くなり、それに対応してデータ量も増加した。
【０００９】
図１は事象に依存する４次元のデータ削減と再生の際の歪み修正の原理図を示す。
図１aは取り込んだ座標軸Ｘ、Ｙ、Ｚおよびそれに付随する取り込み時間ｔに関する多次元の完全な画像データセットを示す。いろいろな線の太さによって画像データセット内のデータ圧縮が異なっていることを示しており、たとえば太い線が細い線よりも高い圧縮率を表す。
図１ｂはユーザのために再生に用いられる、最終的に保存したデータセットを示す。
これは設定に従って時間的あるいは空間的にいろいろな解像度を設定して観察あるいは描画できるので好都合である。
【００１０】
図２は取り込みから最終的なデータ保存までのデータ削減の経過を示す。
ここでは適切なデータ削減が図示されている。
−  カメラあるいはフレーム・グラバーによる１：１データ取り込み
−  データの中間ファイル、たとえばＲＡＭあるいはグラフィックボード
−  ＣＰＵあるいはグラフィックボードによる圧縮/データ削減
−  画像データのハードディスクへの最終的な保存
【００１１】
原理的にデータ削減はいろいろな事前設定に従って行うことができる。
１．自動
時間的な事象密度が小さい場合には空間的情報を高い解像度で保存でき、一方で時間的な情報（たとえばクロックの省略により）は飛び越すことができる。
時間的に激しく変化する（試料が非常に速く動く）場合には時間的解像度は完全に維持し、空間的な解像度を減少させることができる。
【００１２】
２．ユーザによる指定
ユーザは自身の期待に基づいて空間的にあるいは時間的に大きく変化する事象をどのように計算するかを決定し、この事前設定をもとにして対応するデータ要素を削減あるいは保持する。
ユーザはまた特定のデータ圧縮を実行する、あるいは自動的に設定するための、１次元あるいは多次元の特定の画像範囲（関心領域）を決定する。
たとえばＣａ＋イメージングあるいはＫａｅｄｅ色素の場合、時間的情報（以下文章欠落、原文の４ページ目の４行目）
【００１３】
図３はたとえばこれまで非常に大規模に画像データを発生している基本的な高速顕微鏡システムを示す。
図示しているのは線状光源およびライン検出器を持つラインスキャナで、ここではＹスキャナによってＸ方向にある照明ラインを試料上で動かし、ソフトウエアレベルでライン検出器により検出した画像データを図２に示すように保存する。
ボードの設定あるいはフォーカシング装置のＺ方向の調節により垂直方向の調節を行い、これによってＸ、ＹおよびＺ方向の時間に依存する試料の座標を保存できる。
【００１４】
図４は主要部が５つのコンポーネント、すなわち、レーザ走査型顕微鏡検査のための励起光を生成する光源モジュール２、励起光をコリメートして試料上の走査のため然るべき偏向を行なう走査モジュール３、走査モジュールによって用意された走査ビームを顕微鏡光路内で試料の方向に向ける顕微鏡モジュール４および試料からの光線を受け止め検出する検出モジュール５から成るレーザ走査型顕微鏡１の模式図である。その場合検出モジュール５は、図４に描かれているように、スペクトル別のマルチチャネル型に構成することができる。
【００１５】
点状走査式のレーザ走査型顕微鏡に関する一般事項についてはＤＥ  １９７０２７５３Ａ１が参考になり、したがってその内容は本明細書の構成部分でもある。
光源モジュール２は、レーザ走査型顕微鏡検査に適した照明光、したがって特に蛍光を誘起し得るビームを生成する。適用法に対応させるため、光源モジュールは当目的用に複数の光源を有している。図示された実施態様では光源モジュール２に２つのレーザ６および７が配備されている。それらの後にはそれぞれ光バルブ８および減衰器９が接続されており、それらはビームを結合ポイント１０を通じて光ファイバ１１に連結させている。
光バルブ８は、レーザユニット６または７のレーザ自体の作動を遮断しなくてもビームを遮断させることのできるビーム偏向器として機能する。光バルブ８は、例えば、ビーム遮断のためレーザビームを光ファイバ１１へ連結する手前で、図示されていない光の落下方向に偏向させるＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）として形成されている。
【００１６】
図４のモデル例ではレーザユニット６は３つのレーザＢ、Ｃ、Ｄを有しているが、それに対しレーザユニット７はレーザＡを１つ持つのみである。したがって、単一波長用レーザと多種波長用レーザの組み合せモデルであり、個別に、または共同で１つまたは複数のファイバに連結されている。複数ファイバを通じてビームを同時連結することも可能であるが、その場合ではビームは後に、すなわち適合光学系の通過後にカラー結合器によって混合される。このようにして、励起光用に種々様々な波長または波長領域を使用することができる。
光ファイバ１１に通されたビームは、移動式のコリメーション光学系１２および１３によりビーム結合ミラー１４,１５を通じて合一化され、ビーム形成ユニット内でビームの特性が変更される。
【００１７】
コリメータ１２、１３は、光源モジュール２から走査モジュール３へ送られるビームが無限大光路にコリメートされるように作用する。これはそれぞれ、（図には描かれていない）中央制御ユニットの制御下のもと光軸に沿って移動することでフォーカシング機能を発揮する個別レンズで行うのが有利である。コリメータ１２、１３とそれぞれの光ファイバ末端との距離は変更可能なようになっている。
【００１８】
ビーム形成ユニットについては後にさらに詳しく説明するが、これは、ビーム結合ミラー１４、１５の後方に位置する回転対称なガウス型プロフィールのレーザビームから、もはや回転対称でない、長方形型照明フィールドの形成に適した横断面を持つ線形ビームを生成する。
線形ビームとも言われるこの照明光は励起光として用いられ、メインカラースプリッタ１７を通じてスキャナ１８に誘導される。メインカラースプリッタについては後ほど詳しく述べるので、ここでは顕微鏡モジュール４から戻ってきた試料光を励起光から分離させる機能を持つことだけを指摘しておく。
【００１９】
スキャナ１８は線形ビームを１軸または２軸方向に偏向させるので、ビームは走査対物レンズ１９および顕微鏡モジュール４の鏡筒レンズ、対物レンズを通って、プレパラートまたは試料内にある焦点２２に集束する。その場合光学結像は、試料が励起光により焦点で照明されるように行なわれる。
線形フォーカスで励起されたこのような蛍光ビームは顕微鏡モジュール４の対物レンズ、鏡筒レンズおよび走査対物レンズ１９を通ってスキャナ１８に戻るので、スキャナ１８に向かっての戻り過程の方向では再び定常ビームになっている。したがって、スキャナ１８は蛍光ビームをデスキャンするとも言われる。
メ
【００２０】
インカラースプリッタ１７は励起光とは別な波長領域にある蛍光ビームを通すことができるので、蛍光ビームは検出モジュール５の転向ミラー２４で転向させた後分析することができる。検出モジュール５は図４の実施態様では複数のスペクトルチャネルを有している。すなわち、転向ミラー２４のほうから来た蛍光ビームはサブカラースプリッタ２５により２つのスペクトルチャネルに分割される。
【００２１】
各スペクトルチャネルは、試料２３に対して共焦点結合あるいは部分共焦点結合を実現するスリット絞り２６を有しており、その大きさがビームの検出を可能にする焦点深度を決定する。したがって、スリット絞り２６の幾何学構造は、蛍光ビームの検出がなされる（厚みのある）プレパラート内の切断面を決定づける。
【００２２】
スリット絞り２６の後方にはさらに、検出モジュール５に到達した歓迎されざる励起光をブロックするためのブロックフィルタ２７が配置されている。特定深度の切断面に由来する、このように分離され扇形に広がった線形ビームは、次に然るべき検出器２８によって分析される。上記のカラーチャネルと同様に、スリット絞り２６a、ブロックフィルタ２７ａおよび検出器２８ａを持つ第２スペクトル検出チャネルも構成されている。
【００２３】
検出モジュール５における共焦点スリット開口の使用はモデル例に過ぎない。もちろん、単点型スキャナの実現も可能である。その場合ではスリット絞り２６、２６aはホール型絞りに代えられ、ビーム形成ユニットは省くことができる。因みに、そのような構造様式にはすべての光学系が回転対称に構成される。もちろん、単点式の走査および検出に代えて、後に図６および７を手掛かりに改めて説明する点雲形式またはニポーディスク形式のコンセプトなど、原則として任意の多点型装置を使用することもできる。ただし、スキャナの通過時には複数の試料点が平行して捕捉されるので、検出器２８はスポット分解能を有していることが重要である。
【００２４】
図４から分かるように、可動式、すなわち移動可能なコリメータ１２および１３の後方にあるガウス光線束はビーム結合ミラー１４、１５形式のステップ型ミラーを通じて合一化され、続いて、図示された共焦点スリット絞り付き構造様式の場合では、長方形の横断面を持つ光線束に変換される。図１の実施例では、ビーム形成ユニット内には円筒型テレスコープ３７が使用されていて、その後ろには非球面ユニット３８、さらに円筒型光学系３９が配置されている。
ビーム変形後では、ビームはプロフィール平面にはほぼ長方形のフィールドを照らし出す。その場合フィールドの長軸に沿った強度分布はガウス形ではなくボックス形である。
【００２５】
非球面ユニット３８を持つ照明装置は、鏡筒レンズと対物レンズ間にあるひとみを均一充填させるのに用いられる。それによって、対物レンズの光学分解能を完全に発揮させることができる。したがって、このバリエーション法は単点走査式または多点走査式の顕微鏡システム、例えばライン走査システムにも有用である（後者の場合、当該軸に加えそれ以外にも、試料上または試料中にフォーカシングされる）。
例えば線形に整えられた励起光がメインカラースプリッタ１７の方向に偏向される。当カラースプリッタは、好ましい実施態様では分割ミラーとして、つまり本発明でもその内容を包括的に取り入れているＤＥ
１０２５７２３７ Ａ１記載のスペクトル中性な分割ミラーとして形成されている。したがって、「カラースプリッタ」の概念には非スペクトル的に作用する分割システムの意が含まれている。
【００２６】
記述のスペクトル非依存型カラースプリッタの代わりに、均一型中性スプリッタ（例えば５０/５０、７０/３０、８０/２０タイプなど）またはダイクロイックスプリッタを使用することができる。それにより、適用別に選択することが可能になるので、メインカラースプリッタとしては、交換可能な個別スプリッタを含む、例えば然るべきスプリッタ切換ダイヤルにより簡易交換のできる機構の備わっているのが好ましい。
例えば、反射、ストークス/反ストークスラマン分光法、高次数のコヒーレントラマンプロセスや、第２高調波発生、第３高調波発生、和周波混合発生などの一般的パラメトリック非線光学プロセス、２光子、多光子吸収および蛍光におけるコヒーレントビーム、すなわち特に方向づけられたビームを検出すべき場合はダイクロイックメインカラースプリッタが有利である。
【００２７】
これらの方法のうち、非線光学分光法のいくつかは、コリニヤ重畳をなす２つまたはそれ以上のレーザビームの使用を必要とする。この場合、図示されているような複数レーザビームの結合が特に有利であると実証されている。原則的には、蛍光顕微鏡検査で広く普及しているダイクロイックビームスプリッタであれば使用可能である。また、ラマン顕微鏡検査には、レイリー散乱成分の抑制のため検出器の前にホログラフィックノッチ・スプリッタまたはフィルタを設置するのが有利である。
【００２８】
図４の実施態様では、励起光または照明光はモータ制御式ズーム光学系４１を通じてスキャナ１８に送り込まれる。ズーム倍率は当方式で適合化させることができ、走査される視野は特定の調整領域内で連続的に変更することができる。ズーム光学系としては、連続的同調過程における焦点位置および結像倍率の適合化のあいだ、ひとみ位置が維持されたままであるようなタイプが特に有利である。
【００２９】
図４に矢印で示されたモータによるズーム光学系４１の自由移動度は、結像倍率、焦点位置、ひとみ位置の３つのパラメータの適合化に想定されている自由度の数値に精確に一致している。その出力側のひとみに固定式絞り４２の配置されたズーム光学系４１が特に好ましい。絞り４２を実地で簡単に実現するには、スキャナ１８鏡面幅の制限によって構成することもできる。
【００３０】
ズーム光学系４１を持つ出力側絞り４２により、ズーム倍率の設定如何に拘わらず常に一定したひとみ直径を走査対物レンズ１９上に結像させることが可能になる。このように、ズーム光学系４１を任意に設定した場合でも対物レンズのひとみは依然として完全に照らし出されたままである。スキャナ１８領域での願わしくない散乱光発生事態の阻止には独自型絞り４２の使用が好ましい。
【００３１】
ズーム光学系４１と共同作用をする円筒型テレスコープ３７は、同じくモータ作動式であり、非球面ユニット３８の前に配置されている。図２の実施態様ではコンパクト構造の理由からこれが選ばれているが、そのようにする必要はない。
ズーム倍率１.０未満が望まれる場合、円筒型テレスコープ３７は自動的に光学光路内に旋回挿入される。これは、ズーム対物レンズ４１が縮小された場合に開口絞り４２への照明が不完全になるのを防止する。したがって、旋回挿入の可能なこの円筒型テレスコープ３７により、ズーム倍率１未満の場合でも、すなわちズーム対物レンズ４１の設定の如何に拘わらず、対物レンズひとみの位置では常に一定長の照明光線の到達が保証される。それにより、単式視野ズームに比較して、照明光におけるレーザ出力損失が避けられる。
【００３２】
円筒型テレスコープ３７の旋回挿入時には照明光線による画像明度の急変が避けられないので、画像明度を一定に保つため、（図には描かれていない）制御ユニットでは、円筒型テレスコープ３７が作動している場合、スキャナ１８の送出し速度または検出モジュール５における検出器の増幅係数がそれ相応に適合するような設計がなされている。
【００３３】
図４のレーザ走査型顕微鏡では、モータ作動式ズーム光学系４１およびモータにより操作切換可能な円筒型テレスコープ３７のほか、検出モジュール５でも遠隔制御可能な調整素子が設置されている。例えば、色波長誤差の補正のため、スリット絞りの前に丸型光学系４４と円筒型光学系３９が、検出器２８の直前に円筒型光学系３９が設置されており、それらはモータによりそれぞれ軸方向に移動できるようになっている。
【００３４】
加えて、補償のため補正ユニット４０が配備されているが、それについては以下に簡単に説明する。
スリット絞り２６は、前方配置の丸型光学系４４、同様に前方配置の第１円筒型光学系３９および後方配置の第２円筒型光学系と共に検出システム５のピンホール対物レンズを形成するが、この場合のピンホールはスリット絞り２６によって実現される。システム内で反射した励起光の意図しない検出を避けるため、第２円筒型レンズ３９の前にはブロックフィルタ２７も設置されており、これは求める蛍光ビームだけを検出器２８、２８aに到達させるべく、それに適したスペクトル特性を有している。
【００３５】
カラースプリッタ２５またはブロックフィルタ２７を取り換えて旋回挿入した場合、幾分かの傾斜誤差または楔角誤差が発生するのは避けられない。カラースプリッタは試料領域とスリット絞り２６間の誤差を、ブロックフィルタ２７はスリット絞り２６と検出器２８間の誤差を持ち込む可能性がある。その場合に、スリット絞り２６または検出器２８の新たな位置調整が必要になることがないように、丸型光学系４４とスリット絞り２６の間に、すなわち試料と検出器２８間の結像光路内に、コントローラの制御下で様々な傾斜位置に設定することのできるオプチカルフラットのプレート４０が配置されている。オプチカルフラットのプレート４０は、その目的のために然るべきホルダ内に位置調整可能なように設置されている。
【００３６】
図５は、ズーム光学系４１を利用すれば提供された最大限の視野ＳＦ内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示している。例えば、共鳴スキャナの場合では必ず必要なことであるが、振幅に変化が起きないようにスキャナ１８を持続的に制御すれば、ズーム光学系においてセットされた１.０以上の倍率により走査フィールドＳＦの光軸を中心として選択されるＲＯＩ領域が狭められる。
【００３７】
共振型スキャナに関しては、例えばPawley著“Handbook of Biological Confocal
Microscopy”Plenum Press社１９９４年刊、４６１ページ以降に記述されている。
スキャナがフィールドを、光軸に対し、すなわち走査ミラーの定常位置に対し非対称に走査するように、スキャナの制御を行えば、ズーム作用との関連性から選定ＲＯＩ領域の補正移動ＯＦが得られる。既に触れたスキャナ１８のデスキャン作用およびズーム光学系４１の再通過により、検出器方向への検出光路における観察対象領域ＲＯＩの選択が改めて中断される。それにより、走査画像SF内のＲＯＩ領域に対し任意の選択が可能になる。
【００３８】
様々なＲＯＩ領域の選択毎に画像を追加獲得することができ、それらを高分解性画像に合成することができる。
選択ＲＯＩ領域を光軸に対する補正分OFだけ移動させるのでなく、それに加えて回転もさせたい場合は、メインカラースプリッタ１７と試料２３間の光路のひとみに、周知のとおり画像フィールドに対して回転作用のあるアッベ・ケーニッヒプリズムを配置した実施態様が目的に適っている。この場合も検出器方向で作業の中断を行う。
【００３９】
それにより、様々な補正シフトOFおよび様々な回転角を持つ画像が測定でき、続いて、例えば文献 “Three-dimensional
and multidimensional microscopy ; Image acquisition processing VII” Proceedings of SPIE第３９１９巻（２０００年）、１４１〜１５０ページのGustafsson, M.著“Doubling the lateral
resolution of wide-field fluorescence microscopy using structured illumination”に記載されているようなアルゴリズムに従って高分解性のある画像に修正することができる。
【００４０】
図６は、ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡１として考えられる別な構造様式を示している。図６では極端に簡略描画されている光源モジュールが、ミニレンズアレー６５からメインカラースプリッタ１７を通過して、例えばＵＳ
６,０２８,３０６、ＷＯ ８８ ０７６９５またはＤＥ ２３６０１９７ A１に記載されているようなニポーディスク６４を照明する。ミニレンズアレー６５を通じて照明されたニポーディスクのピンホールは顕微鏡モジュール４内の試料に結像する。ここでも試料側の画像サイズを変更できるように、ズーム光学系４１が設置されている。
【００４１】
ニポースキャナの場合、図４の構造様式からは変更部分があり、照明はメインカラースプリッタ１７を通過させて行われ、検出光は反射分離される。さらに、ニポーディスク６４による多点照明の場合では、それに対応した平行な走査が行われるように、検出器２８はスポット分解能を持つように作られている。そのほか、ニポーディスク６４とズーム光学系４１の間には、ニポーディスク６４のピンホールを通り抜ける発散光を適当な束直径に
変換させる、正の屈折力を持った然るべき固定型光学系６３が配置されている。
【００４２】
メインカラースプリッタ１７は、図３のニポー式構造の場合では旧来型のダイクロイックビームスプリッタであり、したがってスリット状または点状の反射領域を持つ上記ビームスプリッタではない。
ズーム光学系４１は上段で説明した構造様式に対応しているが、この場合はニポーディスク６４があるため、もちろんスキャナ１８は不要になる。しかし、図５を基に説明したＲＯＩ領域の選択を行いたい場合は、これを設置することができる。同じことがアッベ・ケーニッヒプリズムについても言える。
【００４３】
多点走査による別法が模式図として図７に示されているが、その方法では複数の光源がスキャナのひとみに対して斜めに照射される。この場合でもメインカラースプリッタ１７とスキャナ１８間での結像にズーム光学系４１を使用することにより、図５に描かれたようなズーム機能を実現することができる。ひとみに共役な平面に様々な角度から光線束を同時入射することにより、光点が対象物平面に共役な平面に形成され、それがスキャナ１８により同時に対象物フィールド全体のうちの一部領域上に誘導される。スポット分解性のあるマトリックス検出器２８では部分画像全体の評価を通して画像情報が生成される。
【００４４】
その他の実施態様としては、ＵＳ
６,０２８,３０６に記載されているような多点走査があるが、その開示内容の中で関連事項は本発明に包括的に取り入れられている。ここでもスポット分解性のある検出器２８を設置することができる。その場合では試料は多点光源によって照明されるが、それは、多点光源が実現されるようにマルチ開口プレートを照明する、マイクロレンズアレーの後続配置されたビームエキスパンダによってなされる。
【００４５】
以下に本発明に従う有利な方法をより詳しく説明する：
本実施は、顕微鏡システムにより画像データを保存する際に、３Ｄおよび４Ｄデータを本来損失という欠点のあるデータ圧縮をするための方法を記述する。３次元ｘ、ｙおよびｚにおいて画像スタックをデータ圧縮することが、３Ｄデジタル余弦変換の２ステップおよび３Ｄデジタル余弦変換の結果の量子化によって達成される。
３次元デジタル余弦変換およびそれに続く量子化を使用することによって、圧縮されたデータのデータ量に対する画像品質の状況は、画像スタックの中の個別平面についての２次元の方法に対して本質的に改善されている。
【００４６】
３Ｄ画像スタックは隣接するボクセルの立方体へ区分される。１つの立方体がｘ方向にｍ個のボクセル、ｙ方向にｎ個のボクセルおよびｚ方向にｏ個のボクセルを持つ。このとき個々の立方体は対応する次元で異なる数のボクセルをも持つことができる。
第１のステップでは各立方体について値Ｓ（ｗ，ｖ，ｕ）が算出される：
【数１】
2006072330.tif 000003
と
【数２】
2006072330.tif 000004
Ｃｕ，Ｃｖ，Ｃｗ＝１／Ｖ２    ｕ，ｖ＝０ のとき
Ｃｕ，Ｃｖ，Ｃｗ＝１          それ以外のとき
【００４７】
ｉ（ｚ，ｙ，ｘ）は立方体の第１のボクセルに相対的な座標ｘ、ｙおよびｚを用いたボクセル強度である。ｎ＊ｍ＊ｏ浮動小数点値Ｓ（ｗ，ｖ，ｕ）は続いて量子化因子Ｑ（ｗ，ｖ，ｕ）で乗ぜられ、整数Ｚ（ｗ，ｖ，ｕ）に変換される。
次のステップでは値Ｚ（ｗ，ｖ，ｕ）はアレー
Ｔ（ｉ）＝Ｚ（Ｓｗ（ｉ），Ｓｖ（ｉ），Ｓｕ（ｉ））                  （III）
ｉ = ０．．． ｎ＊ｍ＊ｏ−１
へと記述される。値Ｓｗ（ｉ），Ｓｖ（ｉ）およびＳｕ（ｉ）は、Ｚの各要素へ正確にＴの要素を与えるように選ばれる。Ｓｗ（ｉ）、Ｓｖ（ｉ）およびＳｕ（ｉ）の選択の際にｉの低い値についてＳｗ（ｉ）、Ｓｖ（ｉ）およびＳｕ（ｉ）も低い値を使用するのは理に適っている。
【００４８】
最後のステップでは、値Ｔ（ｉ）はフフマン符号化、算術符号化およびランレングス符号化のような損失のない圧縮法を用いてさらに圧縮することができる。
データの圧縮を解く際には、まず損失のない圧縮は逆順に行われる。続いてデータは（III）の逆関数を用いて再びＺ（ｗ，ｖ，ｕ）へ変換される。
量子化因子Ｑ（ｗ，ｖ，ｕ）で除することによってＧｅｌｉ小数点値Ｓ’（ｗ，ｖ，ｕ）を得る。
【００４９】
圧縮を解かれたデータはそこで３Ｄ逆デジタル余弦変換を通じて決定される：
【数３】
2006072330.tif 000005
と
【数４】
2006072330.tif 000006
Ｃｕ，Ｃｖ，Ｃｗ＝１／Ｖ２     ｕ，ｖ＝０ のとき
Ｃｕ，Ｃｖ，Ｃｗ＝１
それ以外のとき
圧縮の強度は量子化因数Ｑ（ｗ、ｖ、ｕ）を通じて制御することができる。
本方法は、画像スタックの時系列が圧縮されるならばそのときも使用される。その際選択された時系列の画像スタックのみを圧縮することも可能である。
【００５０】
本発明は、迅速作業性のある共焦点レーザ走査型顕微鏡の適用可能性を大幅に拡大するものである。このような改良開発の重要性は、細胞生物学的に関する標準文献およびそこに記述されている細胞、副細胞の迅速な変化過程１、さらには多数の色素を用いた検査方法２を手掛かりに読み取ることができる。
【００５１】
例えば下記の文献が参考になる :                                                 
１ B. Alberts他著（２００２年）: Molecular Biology of the Cell ; Garland
Science刊
１,２ G. Karp著（２００２年）: Cell and Molecular Biology ; Concepts and
Experiments ; Wiley Text Books刊
１,２ R. Yuste他著（２０００年）: Imaging neurons &#8211; a laboratory Manual ; Cold Spring Harbor
Laboratory Press刊、 ニューヨーク
２ R.P. Haugland著（２００３年）: Handbook of fluorescent
Probes and research Products第１０版 ; Molecular Probes
Inc. and Molecular Probes Europe BV刊
【００５２】
本発明は次のプロセスおよび変遷にとって非常に重要な意味を持っている :
有機体の生育
記述の本発明は、なかでも１/１０秒から時間レベルまでのダイナミックな変遷を特徴とする生育過程の研究に適している。ここでは細胞結合面および有機体全体への適用例について記述する :
・  Abdul-Karin、M. A.他は２００３年“Microvasc. Res.”第６６巻、１１３〜１２５ページに動物生体における血管の変化に関する長期分析結果を記録した。その場合、蛍光画像は数日間隔で撮影された。運動の定角軌道を模式的に描くために、３次元のデータ記録が適合アルゴリズムで評価されている。
・  Soll、D. R.他は２００３年“Scientic World
Journ.”第３巻８２７〜８４１ページに３次元空間全体における生体細胞の核および偽足に関する顕微鏡データのソフトウェアベースによる運動分析について記述している。
・  Grossmann,
R他は２００２年“Glia”第３７巻２２９〜２４０ページにラットの微小神経膠細胞における運動の３次元分析について記述している。そのデータは１０時間以上に亘って記録されたものである。神経膠細胞にはトラウマ性傷害の後に同時に迅速反応が発現するので、高いデータ収得率およびそれ相応のデータ量が得られる。
これに関しては特に次のことが重要なポイントである :
・  その隣接細胞がレーザ照明に敏感に反応するので３次元ＲＯＩ照明から保護されねばならない３次元領域での生細胞の分析、
・  例えばFRET実験などにおいて、３次元のレーザ照準照明下で退色するマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
・  例えば３次元ＦＲＡＰ、FLIP実験などにおいて、レーザ照準照明下で退色する、同時にＲＯＩ外の観察も必要なマーカーによる生細胞の３次元領域での分析、
・  例えば３次元伝達物質の活性化など、レーザ照明下での操作原因により変化するマーカーおよび薬剤による生細胞の３次元領域での照準分析、
・  例えばpaGFP、Kaedeなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
・  例えばコンフォーカル性と検出感度との最適バランスが要求される微弱マーカーによる生細胞の３次元領域での照準分析、
・  例えばＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄなど可変性多重マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・  機能に依存して変色する、例えばＣａ＋マーカーなどでマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・  生育に起因して変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、例えばＧＦＰによる形質転換動物、
・  例えばｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなど、レーザ照明下での操作原因により変色するマーキングのなされた３次元組織結合における生細胞
・  検出感度に有利なようにコンフォーカル性の制限を要求する微弱マーキングのなされた３次元組織結合における生細胞、
・  最終項目とそれ以前の項目との組み合せ、
【００５３】
細胞内の運搬過程
記述の本発明は細胞内運搬過程の研究にはこの上なく適している。この場合では正しく非常に微小な運動構造体、例えばタンパク質を高速度で（殆どが１/１００秒の領域）描写しなければならないからである。複雑な運搬過程のダイナミックスを捕捉するためには、ＲＯＩブリーチングを伴うＦＲＡＰもしばしば適用される。そのような研究例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・  Umenishi,
F.他が２０００年“Biophys
J.”第７８巻１０２４〜１０３５ページに、GFP変換された培養細胞におけるアクアポリンの空間運動性についての分析結果を記述している。その場合、細胞膜の照準点を局部ブリーチングして、周辺における蛍光拡散の分析を行っている。
・  Gimpl,
G.他が２００２年“Prog.
Brain Res.”第１３９巻４３〜５５ページに、ＲＯＩブリーチングによる実験、運動性分析のための蛍光撮像およびGFPマーキングされたオキシトシン受容体の線維芽細胞内での分布について記述している。その場合、空間位置設定、分解能およびブリーチングと撮像との直接的な時間的連続性に関して高い要求が課されている。
・  Zhang他が２００１年“Neuron”第３１巻２６１〜２７５ページに、GFP変換された神経細胞における生細胞の撮像について記述している。その場合、顆粒の運動がブリーチングと蛍光撮像との組み合せにより分析された。神経細胞のダイナミックスに起因して、撮像速度には高い要求が課される。
【００５４】
分子間の相互作用
記述の本発明は、特に分子間およびその他副細胞間の相互作用の描写に適している。これらの場合では非常に微小な構造が高速度（１/１００秒レベル）で描出されねばならない。相互作用に必要な分子の空間ポジションの解明には、例えばＲＯＩブリーチングを伴うFRETなどの間接的な技術を使用することもできる。適用される例として、ここでは以下のものを挙げておく :
・      
Petersen, M. A.およびDalley, M. E.が２００４年“Glia”第４６巻１９５〜２０６ページに、ラット海馬角の培養における２チャネル撮影について記述している。この場合は、マーカーとしてのレクチンとシトックスについて３次元空間において長時間に亘り２チャネルで記録される。
・      
Yamamoto, N.他が２００３年“Clin. Exp. Metastasis”第２０巻６３３〜６３８ページに、ヒトの線維肉腫細胞の２色撮影について記述している。この場合では緑色と赤色の蛍光タンパク質（GFPおよびRFP）が同時にリアルタイムで観察された。
・      
Bertera, S.他が２００３年“Biotechniques”第３５巻７１８〜７２２ページに、合成後色が緑から赤に変化するタイムレポータプロテインによってマーキングされた転換マウスのマルチカラー撮影について記述している。撮像は生体動物の組織内３次元空間で迅速シリーズとして行われる。
【００５５】
細胞間の信号伝達
記述の本発明は、殆どが極端に迅速になる信号伝達過程の研究には他に抜きん出て適している。殆どが神経生理学に関するこの過程では経時的分解能に最大限の要求が課される。それは、イオンによって媒介される活動が１/１００秒から１/１０００秒以下の範囲で起こるからである。筋肉系または神経系の検査への適用例として、ここでは次のものを挙げておく :
・  Brum
G他が２０００年“J
Physiol”第５２８巻４１９〜４３３ページに、伝達物質としてのカフェインによる刺激後のカエルの筋肉細胞における迅速なCa+活動の位置確認について記述している。この位置確認およびマイクロメータ単位の精度を持つ分解能は、迅速型の共焦点顕微鏡の使用下でないと達成されない。
・  Schmidt
H他が２００３年“J
Physiol”第５５１巻１３〜３２ページに、転換マウスの神経細胞突起におけるＣａ＋イオンの分析について記述している。変化するCa+に結合するタンパク質による、マウス内での迅速なCa+変化状況についての研究は、高分解能を持つ共焦点顕微鏡により初めて行うことができた。それは、神経細胞内におけるCa+活動の位置確認およびその精確な経時的動力学が重要な役割を果たしているからである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】４次元データの削減と再生の際の歪み修正の原理図、（a）多次元の完全な画像データセット（ｂ）最終的に保存したデータセット
【図２】取り込みから最終的なデータ保存までのデータ削減の経過
【図３】大規模に画像データを発生している基本的な高速顕微鏡システム
【図４】レーザ走査型顕微鏡の模式図
【図５】最大限の視野ＳＦ内で如何にしてＲＯＩ（観察対象領域）が選択できるかを示す
【図６】ニポーディスク方式を実現するレーザ走査型顕微鏡の別な構造様式
【図７】多点走査による別法の模式図
【符号の説明】
【００５７】
１      レーザ走査型顕微鏡
２      光源モジュール
３      走査モジュール
４      顕微鏡モジュール
５      検出モジュール
６，７      レーザユニット
８      光バルブ
１０      結合ポイント
１１      光ファイバ
１２，１３      コリメータ
１４，１５      ビーム結合ミラー
１７      カラースプリッタ
１８      スキャナ
１９      走査対物レンズ
２０      鏡筒レンズ
２１      対物レンズ
２２      焦点
２３      試料
２４      転向ミラー
２６      スリット絞り
２７      ブロックフィルタ
２８      検出器
２９      ハロゲンランプ
３４      水銀蒸気ランプ
３６      ビームスプリッタ
３７      円筒形テレスコープ
３８      非球面ユニット
４０      補正ユニット
４１      ズーム光学系
４２      固定式絞り
６４      ニポーディスク
ＳＦ      視野（走査フィールド）
【図１】
2006072330.tif 000007
【図２】
2006072330.tif 000008
【図３】
2006072330.tif 000009
【図４】
2006072330.tif 000010
【図５】
2006072330.tif 000011
【図６】
2006072330.tif 000012
【図７】
2006072330.tif 000013