(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、各種の効果（特に皮膚に有用な）を発揮する物質を種々の安全性の高い植物より見出すことにある。【解決手段】  前記課題を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物に、抗老化、ＤＰＰＨラジカル補足、ＳＯＤ活性様作用、美白、Ｌ−ＤＯＰＡ自動酸化抑制、コラゲナーゼ活性阻害の各作用が非常に強いことがわかり、これらを用途とした各種の皮膚外用剤が得られることがわかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物を配合することを特徴とする抗酸化用皮膚外用剤
【請求項２】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物を配合することを特徴とするＤＰＰＨラジカル補足剤
【請求項３】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物を配合することを特徴とするＳＯＤ活性様作用剤
【請求項４】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物を配合することを特徴とする美白皮膚外用剤
【請求項５】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物を配合することを特徴とする美白剤
【請求項６】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物を配合することを特徴とするＬ−ＤＯＰＡ自動酸化抑制剤
【請求項７】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物を配合することを特徴とするコラゲナーゼ活性阻害剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の属の植物から抽出された抽出物が、DPPHラジカル捕捉剤、SOD活性様作用剤、美白剤、L-DOPA自動酸化抑制剤、コラゲナーゼ活性阻害剤の各作用を有した各薬剤および皮膚外用剤に関する。  
【背景技術】
【０００２】
ザクロ（Punica granatum）の花は、糖尿病の治療あるいは改善薬として血中グルコース低下作用があることが知られており（非特許文献１参照）、これに含まれる成分研究においても、ウルソール酸をはじめとする、マスリン酸やアシアティツク酸など多種有効化合物が見出されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
また、ザクロの花の抽出物に関する健康食品（例えば、特許文献１）が存在するが、糖尿病の治療あるいは改善効果をねらったもののみである。
【０００４】
皮膚の組成は大きく３つに分類され、外層から表皮、真皮、皮下組織の三層で形成されており、それぞれは身体の恒常維持、外界からの防御など、種々役割を担っているが、外界からの紫外線によって発生する活性酸素種（ROS）によって皮膚機能は低下する。活性酸素種は、生体内で種々のラジカル種に変換され、殺菌、体内への侵入物質の排除などを行う正の効果を持つ反面、その反応性の高さから、表皮細胞および組織の劣化や真皮の構成成分であるコラーゲン、エラスチン、線維芽細胞を攻撃し、コラーゲンやエラスチンの劣化、減少あるいは変性により、負の効果をもたらす。従って、日常の紫外線による負の効果が促進すると、ハリの消失、シワ、たるみなどの症状が現れる。
【０００５】
生体内において活性酸素を消去する機構にはいくつか解明されており、最初に生成される・O2-（スーパーオキサイド）はSOD（スーパーオキシドジスムターゼ）によって酵素的にH2O2とO2に不均化されることが判っている。しかしSOD量は加齢に伴って減少し、SOD量の減少によってスーパーオキサイドの濃度が上昇し障害をもたらすようになる。よってSODと同様の作用を持つ物質は皮膚における抗酸化剤として有効であると考えられる。
【０００６】
生体内で発生するラジカルを想定した際、DPPH（1，1-diphenyl-2-picryhydrazyl）は安定な有機ラジカルであり、DPPHの分解を指標としてフリーラジカル消去活性を評価することは、ラジカル捕捉因子の探索に有効であることが判っている。
【０００７】
皮膚機能の中で、表皮内のメラノサイトは紫外線を防御するのにメラニンを合成する機能を持っているが、そのメカニズムはチロシンを基質とし、チロシナーゼ酵素が働き、ドーパを経由しドーパキノンを経て、自動酸化することで、ついには、これら誘導体が複雑に重合化することでメラニンが作られることは良く知られている。したがって年齢を重ねると、紫外線などの外的およびその他内的な要因において、メラニンを過度に合成し、しみ、そばかす、くすみなどの症状が促進する。この黒色化のメカニズムの過程で合成される誘導体の生成を遮断、あるいは抑制することで、肌の黒色化は軽減され、外観上、つや、透明感のあるくすみのない肌にすることが出来る。
【０００８】
健常な真皮中ではコラーゲンおよびエラスチンは古くなったものは吸収・排出される一方、新たにコラーゲンおよびエラスチンが線維芽細胞から生産され、一定した質および量を恒常的に保っている。しかし、年齢を重ねると、種々の要因においてその恒常性は崩れ、線維芽細胞由来のコラゲナーゼが必要以上にコラーゲンを分解することにより、シワ、たるみといった症状が促進する。よってコラゲナーゼの活性を抑えてやることは症状を進行させない効果につながる。
【非特許文献１】Jafri MA, et al., J. Ethnopharmacology, 70 (3) 309-14, 2000
【非特許文献２】Batta AK and Rangaswami S, Phytochemistry, 12 (1) 214-6, 1973
【特許文献１】特開２００２−２０３０８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、各種効果（特に皮膚に有用な）を発揮する物質を種々の安全性の高い植物より見出すことにある。。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物に、抗老化、ＤＰＰＨラジカル補足、ＳＯＤ活性様作用、美白、Ｌ−ＤＯＰＡ自動酸化抑制、コラゲナーゼ活性阻害の各作用が非常に強いことがわかり、これらを用途とした各種の皮膚外用剤が得られることがわかった。
なお、Ｌ−ＤＯＰＡとはL-2,3-dihydroxyphenylalanineのことである。
【００１１】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物の形態はなんら限定されるものではないが、好ましくはザクロの花を陰乾し、粉砕後、抽出溶媒（例えばエタノール等のアルコール、水またはこれら混合）とともに、３日間浸漬または１時間１００度にて加温、冷却後、ろ過した液を使用する。
【００１２】
試験１：ＳＯＤ様活性試験
ＳＯＤ様活性試験はＳＯＤテストワコーキットを使用し評価した。ザクロ花抽出エキスを精製水で０．１％、０．５％および１．０％の各濃度に調製した検体液を１００μＬバイヤル瓶に分注後、発色液１．０ｍＬを加えた。その後、３７℃にて５分間インキュベーション後、酵素液（スーパーオキシドジアムスターゼ）を１ｍＬ加え、さらに、２０分間インキュベートする。ＳＤＳ水溶液を２ｍＬ加え、反応を停止させ、３０分間室温にて放置後、５６０nmの吸光度を測定した。
試験品は以下に示し、
Sample１：ザクロ花（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample２：ザクロ花（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample３：ザクロ花（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample４：ザクロ果実（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample５：ザクロ果実（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample６：ザクロ果実（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
試験の消去率の結果を表１に示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
試験２：ＤＰＰＨラジカル補足試験
ザクロ花抽出エキスを精製水で０．０２％の濃度に調製した検体液を１．０ｍＬバイヤル瓶に分注後、０．５Ｍ酢酸緩衝液０．２ｍＬ、エタノール０．８ｍＬおよび０．５ＭＤＰＰＨの５０％エタノール１ｍＬを添加した。その後、室温、暗所にて３０分間インキュベーション後、５１７nmの吸光度を測定した。
試験品は以下に示し、試験結果を表２に示す。
Sample１：ザクロ花（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample２：ザクロ花（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample３：ザクロ花（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample４：ザクロ果実（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample５：ザクロ果実（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample６：ザクロ果実（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
【００１５】
【表２】
2006225286.tif 000003
【００１６】
試験３：Ｂ−１６マウスメラノーマ細胞白色化試験
マウス由来Ｂ−１６マウスメラノーマ細胞白色化試験により、ザクロ花の抽出物についてメラニン生成抑制作用を調べた。１０％のＦＢＳを含むＥａｇｌｅ'ｓＭＥＭを培地として、２４ｗｅｌｌミクロプレートに２×１０３ｃｅｌｌ/ｗｅｌｌとなるようにＢ−１６細胞を分植し、２４時間培養した。２４時間後、先に、示したのと同様の培地で試験品を調製、添加し、３日間培養した。３日後に試験品を含む培地にて培地交換を行いさらに２日間培養した。分植後５日目に、ＥＤＴＡにて細胞を剥離し、浮遊細胞集団として回収し、ペレットの色および量を肉眼判定した。
＜肉眼判定基準＞
細胞毒性（細胞数）
無毒性；対象と同程度（約８０％）
弱毒性；対象の約７０〜８０％
中毒性；対象の約４０〜６０％
強毒性；対象の約３０％以下
白色度
−；対象と同程度
±；わずかに白色化傾向
＋；白色化傾向
＋＋；明らかな白色化傾向
＋＋＋；強い白色化傾向
試験品は以下に示し、試験結果を表３〜５に示す。
Sample１：ザクロ花（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample２：ザクロ花（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample３：ザクロ花（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
【００１７】
【表３】
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【００１８】
【表４】
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【００１９】
【表５】
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【００２０】
試験４：生体内黒色化（Ｌ−ＤＯＰＡ）の自動酸化阻害活性試験
０．０５％ドーパ-リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２．９ｍＬを５分間３７℃でインキュベーション後、チロシナーゼ酵素液２０μＬを添加し、１分間インキュベーションののち、１％水溶液に調製したザクロ花エキスを１００μＬ添加した。その後、９分間インキュベーションしたのち、475nmの吸光度を測定した。なお、陽性対象のアスコルビン酸およびトコフェロールについては、０．１％の調製液を使用した。
試験品は以下に示し、試験結果を表６に示す。
Sample１：ザクロ花（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample２：ザクロ花（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample３：ザクロ花（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample４：アスコルビン酸
Sample５：トコフェロール
【００２１】
【表６】
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本発明の皮膚外用剤は、常法に従い、通常の皮膚外用剤として知られる種々の形態の基材に配合して調製することができる。
【００２２】
試験５：コラゲナーゼ阻害活性試験
コラゲナーゼ阻害活性試験はヤガイ製コラゲナーゼ活性測定キットを使用し評価した。エッペンチューブに中和液50μL、ザクロ花抽出エキスを精製水で０．００１％および０．０１％の各濃度に調製した検体液を50μL、コラゲナーゼ溶液（1 unit/mL）50 μL加え、37℃で2時間反応させた。停止液 200 μL加え、30分室温で反応後、2000 x g、15分間遠心分離し上澄みを水で10倍に希釈してEx 495 nm、Em 520 nmで蛍光強度を測定した。
（エッペンチューブ、中和液、停止液はキット付属のものを使用。コラゲナーゼは「コラゲナーゼ  アマノ」1000 Unit/mgを2倍希釈した中和液にて溶解した。）
試験品は以下に示し、試験結果（阻害率）を表７に示す。
Sample１：ザクロ花（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample２：ザクロ花（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample３：ザクロ花（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample４：ザクロ果実（１０g）の熱水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample５：ザクロ果実（１０g）の５０％エタノール-水（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
Sample６：ザクロ果実（１０g）のエタノール（２００mL）エキス（凍結乾燥物）
【００２３】
【表７】
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【００２４】
外用剤の形態としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、水溶液、パック等の任意の剤形を選択することができる。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤には、上記した必須成分の他に通常の外用剤に配合される成分、例えば、油剤、粉体、精製水、高分子化合物、ゲル化剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、酸化防止剤、色素、防腐剤、香料、美容成分を本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択して用いることができる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。また、使用した薬剤の抽出液についての抽出方法は何ら限定されるものではない。
実施例及び比較例の処方を表８から表１０に示す。作成方法は常法により行った。なお、表８はローション、表９は美容液、表１０はクリームの処方であり、配合量は重量部で示す。
【００２７】
【表８】
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【００２８】
【表９】
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【００２９】
【表１０】
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【００３０】
（注１）ザクロ花抽出液はザクロの花１０ｇに精製水２００ｍｌを加えて１時間煮沸した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注２）ザクロ花抽出液はザクロの花１０ｇに精製水１００ｍｌとエタノール１００ｍｌを加えて３日間攪拌した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注３）ザクロ花抽出液はザクロの花１０ｇにエタノール２００ｍｌを加えて３日間攪拌した後、ろ過した抽出液を用いた。
（注４）加水分解コンキオリン液はコンキオリンを硫酸分解し、分子量１０００以下のものを用いた。
（注５）タブノキ抽出液はマチルス抽出液 [丸善製薬（株）製]を用いた。
（注６）ホオノキ抽出液はファルコレックスホオノキE[一丸ファルコス（株）製]を用いた。
（注７）グァバ抽出液はグァバの葉１０ｇにエタノール３００ｍｌを加えて５日間放置後、ろ過した抽出液を用いた。
（注８）西河柳抽出液は西河柳エキス[日本精化株]製]を用いた。
（注９）海藻抽出液はマリンパージ[一丸ファルコス（株）製]を用いた。
（注10）アカシア樹皮抽出液は樹皮１０ｇにエタノール３００ｍｌを加えて５日間放置後、ろ過した抽出液を用いた。
（注11）ムラヤコエンギイ抽出液はムラヤコエンギイ]抽出液[山川貿易（株）製を用いた。
（注12）オオバナサルスベリ抽出液はオオバナサルスベリ抽出液 [山川貿易（株）製]を用いた。
【００３１】
表８〜表１０記載の実施例１〜１２、比較例１〜３の効果試験を実施した。試験方法は２５〜５５才の女性３０名を３群に分け、パネルとし、毎日朝と夜の２回、１２週間にわたって洗顔後に被験外用剤の適量を顔面に塗布した。塗布による効果の結果を表１１〜１３に示す。
【００３２】
【表１１】
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【００３３】
【表１２】
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【００３４】
【表１３】
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【００３５】
ザクロ（Punica granatum）の花の抽出物はコラゲナーゼ阻害活性、ＳＯＤ様活性、ＤＰＰＨラジカル補足、Ｌ−ＤＯＰＡ自動酸化阻害活性、Ｂ−１６マウスメラノーマ細胞白色化の各試験で有効な結果を得、抗老化剤、ＤＰＰＨラジカル補足剤、ＳＯＤ活性様作用剤、美白剤、自動酸化抑制剤、コラゲナーゼ活性阻害剤としての用途を見出した。