(57)【要約】【課題】イチゴに関する育成者権保護および食品表示の偽造表示防止の観点から生育条件に影響されず正確に品種を識別する必要がある。しかし、従来の方法では、正確に識別するには操作が煩雑で、長時間を要するといった問題があった。【解決手段】イチゴからゲノムＤＮＡを抽出し、それを鋳型ＤＮＡに用い、３対、合計６種類のプライマーを混合してＰＣＲ法に供し、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動後、ＵＶ照射下で確認することでＤＮＡ断片の品種間多型が得られる。これにより、イチゴ品種「アスカルビー」を他の品種と識別することが可能である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチゴ品種のうち品種「アスカルビー」および「ダナー」に特異的に存在しないゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅することができるプライマー対。
【請求項２】
イチゴ品種のうち品種「あかねっ娘」、「ダナー」および「宝交早生」に特異的に存在するゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅することができるプライマー対。
【請求項３】
すべてのイチゴ品種に共通に存在するゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅することができるプライマー対。
【請求項４】
請求項１記載のプライマー対を使用し、ＰＣＲ法により増幅可能な配列表の配列番号７に示すゲノムＤＮＡ断片。
【請求項５】
請求項２記載のプライマー対を使用し、ＰＣＲ法により増幅可能な配列表の配列番号８に示すゲノムＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項３記載のプライマー対を使用し、ＰＣＲ法により増幅可能な配列表の配列番号９に示すゲノムＤＮＡ断片。
【請求項７】
イチゴの葉より抽出したＤＮＡを鋳型とし、請求項１及び／又は請求項２及び／又は請求項３記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅後、増幅したＤＮＡの多型を識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイチゴ品種「アスカルビー」を特異的に識別するためのＤＮＡ断片、プライマー及び識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、イチゴの品種識別は果実又は葉の外観および草型の比較により行われている。
【０００３】
また、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの多型及び増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を検出し、品種識別する方法がある（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特許公開２００３−３３９３９９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
果実又は葉の外観および草型の比較による品種識別方法では、生育条件による差を生じ、これらの比較による品種識別は極めて困難で正確性にも乏しかった。また、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの多型及び増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を検出する品種識別方法は、ＰＣＲ反応のあと、さらに制限酵素処理を実行するため、操作が煩雑で、相当の労力と時間を要する。
【０００５】
本発明は、これらのような従来の識別方法が有していた問題を解決しようとするものであり、生育途中のイチゴを試料として、生育条件に左右されず、また、制限酵素処理の過程を経ず、より迅速かつより簡便に、イチゴ品種「アスカルビー」を正確に識別することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するために、ＲＡＰＤ法によりイチゴ品種「アスカルビー」特異的に見られるＤＮＡ断片に着目し、「アスカルビー」とその他品種のゲノムＤＮＡの塩基配列の差異を発見し、これを利用することで本方法を発明するに至った。すなわち、本発明は「アスカルビー」および「ダナー」に特異的に存在しないゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅することができるプライマー対であり、それを使用するＰＣＲ法により増幅可能なゲノムＤＮＡ断片である。
【０００７】
また、本発明は「あかねっ娘」、「ダナー」および「宝交早生」に特異的に存在するゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅することができるプライマー対であり、それを使用するＰＣＲ法により増幅可能なゲノムＤＮＡ断片である。
【０００８】
さらに、本発明は、あらゆるイチゴ品種に共通に存在するゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅することができるプライマー対であり、それを使するＰＣＲ法により増幅可能なゲノムＤＮＡ断片である。
【０００９】
さらに、本発明はこれらのゲノムＤＮＡ断片を分析することによって、イチゴ品種「アスカルビー」を識別する方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の識別方法は、上述した３対のプライマーを反応液に混合し、１回のＰＣＲ反応および増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動で解析することで、正確に、より簡便かつ迅速にイチゴ品種「アスカルビー」を識別できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ゲノムＤＮＡをイチゴ試料から抽出する。これをＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅させる際の鋳型として用いる。ＰＣＲ法には３対のプライマーセットを使用する。それらは請求項１記載のプライマー対１９−３Ｆ（配列表の配列番号１）と１９−３Ｒ（配列表の配列番号２）、請求項２記載のプライマー対Ｇ３ＳＴＳＦ（配列表の配列番号３）とＧａｌ３Ｒ（配列表の配列番号４）および請求項３記載のプライマー対ＳＴＳ１Ｆ（配列表の配列番号５）とＳＴＳ１Ｒ（配列表の配列番号６）の合計６種類である。これらの鋳型ＤＮＡおよびプライマーとＴａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを混合して反応液を調製し、常法に従いＤＮＡ断片を増幅させる。
【００１２】
続いて、ＰＣＲ法に供した反応液の一部を電気泳動により分析する。この時の方法は常法に従えば良く、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル中で電圧をかけ、ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片を分離させ、得られたＤＮＡ断片のバンドパターンによりイチゴ品種「アスカルビー」を識別することができる。
【実施例】
【００１３】
以下に実施例を示し、具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
品種を識別するイチゴの各品種から新葉を採取し、Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ここでは、「アスカルビー」に加え、「章姫」、「さちのか」、「とちおとめ」、「とよのか」、「女峰」、「福岡Ｓ６号」、「あかねっ娘」、「レッドパール」、「メイヒャン」、「はるのか」、「ひみこ」、「さがほのか」、「アイベリー」、「アスカウェイブ」、「さつまおとめ」、「サマーベリー」、「サンチーゴ」、「ダナー」、「濃姫」、「はつくに」、「紅ほっぺ」、「宝交早生」及び「麗紅」の２４品種と１系統「奈良６号」を識別対象に用いた。抽出したゲノムＤＮＡはＰＣＲ法における反応の際の鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００１５】
調整したＤＮＡ溶液を鋳型とし、オペロン社製ランダムプライマーを使用してＲＡＰＤ解析をおこなった。そこで得られた「アスカルビー」に特異的に存在しないＤＮＡ断片を「とちおとめ」のゲノムを鋳型にして増幅させ、電気泳動で分離後、アガロースゲルから切り出し、東洋紡績（株）製のＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒを用いて精製した。精製したＤＮＡ断片はプロメガ社製のｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒを用いてプラスミドに組み込み、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲＩＩを用いてエレクトロポレーション法により大腸菌に導入した。この形質転換大腸菌を大量に増殖させた後、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出し、ＡＢＩ社製のシーケンサーＡＢＩ３１００を用いて塩基配列を解読しプライマーを設計し、作製した。
【００１６】
また、オペロン社製ランダムプライマーを使用したＲＡＰＤ解析の結果、あらゆるイチゴ品種に共通に増幅されたＤＮＡ断片を、同様の方法で塩基配列を解読し、プライマー対を設計、作成した。
【００１７】
これにより、イチゴ品種「アスカルビー」および「ダナー」特異的に増幅しないプライマー及びあらゆるイチゴ品種に共通に増幅可能なプライマー対を発明した。
【００１８】
さらに、イチゴ品種「アスカルビー」および「ダナー」のゲノムＤＮＡを鋳型に用い、βガラクタナーゼ遺伝子を増幅させ、塩基配列を解読、比較した結果、ＳＮＰｓを発見した。この塩基配列の差異をもとにプライマー対を作成した。その結果、イチゴ品種「あかねっ娘」、「ダナー」および「宝交早生」に特異的に存在するゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅することができるプライマー対を発明した。
【００１９】
これらのプライマー対を同時に混合し、ＰＣＲ反応に供した。
【００２０】
ＰＣＲ反応にはタカラバイオ（株）製のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして用いた。反応液組成は、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを０．５ｕｎｉｔｓ、添付の２×ＧＣ  ＢｕｆｆｅｒＩを１０μｌ、ｄＮＴＰｓを４ｍＭ、鋳型ＤＮＡを１０ｎｇ、プライマーとして１９−３Ｆ及び１９−３Ｒを各３ｐＭ、Ｇ３ＳＴＳＦ及びＧａｌ３Ｒを各６ｐＭ、そしてＳＴＳ１Ｆ及びＳＴＳ１Ｒを各３ｐＭずつ混合し、最後に滅菌水を用いて１サンプルあたりの反応液量を２０μｌにした。ＰＣＲ反応にはＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）社製Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００を使用した。反応サイクルは、最初に９４℃で５分反応させた後、９４℃３０秒、５４℃３０秒、７２℃１分の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させた。
【００２１】
ＰＣＲ反応終了後、反応液の一部をコスモ・バイオ（株）製のｉ−Ｍｕｐｉｄを用いて、１．５％アガロースゲルで５０Ｖ、５０分間電圧をかけて、ＤＮＡ断片を分離させた。泳動終了後のアガロースゲルはエチジウムブロマイド染色後、ＵＶ照射下でバンドパターンを確認し、多型を比較した（図１）。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ断片バンドパターンの写真
【符号の説明】
【００２３】
ａ    イチゴ品種のうち品種「アスカルビー」および「ダナー」に特異的に存在しないゲノムＤＮＡ断片
ｂ    すべてのイチゴ品種に共通に存在するゲノムＤＮＡ断片
ｃ    イチゴ品種のうち品種「あかねっ娘」、「ダナー」および「宝交早生」に特異的に存在するゲノムＤＮＡ断片
ｄ    １ｋｂ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ
１    「アスカルビー」
２    「章姫」
３    「さちのか」
４    「とちおとめ」
５    「とよのか」
６    「女峰」
７    「福岡Ｓ６号」
８    「あかねっ娘」
９    「レッドパール」
１０  「メイヒャン」
１１  「はるのか」
１２  「ひみこ」
１３  「さがほのか」
１４  「アイベリー」
１５  「アスカウェイブ」
１６  「さつまおとめ」
１７  「サマーベリー」
１８  「サンチーゴ」
１９  「ダナー」
２０  「濃姫」
２１  「はつくに」
２２  「紅ほっぺ」
２３  「宝交早生」
２４  「麗紅」
２５  「奈良６号」
【図１】
2006340685.tif 000003
【配列表】
2006340685000001.app