(57)【要約】【課題】  醸造用酵母の正確な判別、分類、同定を迅速且つ容易に行う方法の開発。【解決手段】  醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＦＬＯ遺伝子、ＩＧＳ領域の繰り返し配列を含む遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動し、又は制限酵素処理したのち電気泳動し、その電気泳動のパターンの違いにより酵母を判別する。この方法により、醸造用酵母の正確な分類、判別が、迅速且つ容易に可能となる。本判別方法は、再現性が高く、しかも極めて短期間に結果を得ることができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＦＬＯ遺伝子又はリボソーム遺伝子近傍のＩＧＳ領域のＴＴＣＣＧＣ配列を含むＤＮＡ配列の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動し又は制限酵素処理した後に電気泳動し、その電気泳動のパターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項２】
醸造用酵母がワイン酵母、焼酎酵母、泡盛酵母、清酒酵母の少なくとも一つの酵母であって、判別が同一用途間及び／又は異なった用途間での判別であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電気泳動のパターンの違いが、増幅された遺伝子断片の有無、又は、該遺伝子断片の数の違い、又は、該遺伝子断片の大きさの違いであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡを、
配列番号１（プライマーＡ）及び配列番号２（プライマーＢ）、
配列番号３（プライマーＣ）及び配列番号４（プライマーＤ）、
配列番号５（プライマーＥ）及び配列番号４（プライマーＤ）、
配列番号６（プライマーＦ）及び配列番号７（プライマーＧ）、
配列番号８（プライマーＨ）及び配列番号９（プライマーＩ）、
配列番号１０（プライマーＪ）及び配列番号１１（プライマーＫ）、
の少なくともひとつで示される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動して、その電気泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項５】
配列番号１〜１１の塩基配列でそれぞれ示される、醸造用酵母判別用プライマーＡ〜ＫのＤＮＡの少なくともひとつ。
【請求項６】
請求項５に記載のプライマーＤＮＡあるいは該プライマーを用いたＰＣＲ産物を含んでなること、を特徴とする醸造用酵母判別キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の判別に関し、さらに詳細には醸造用酵母の判別、分類、同定に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
醸造用酵母としては、ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母等いくつかの種類の酵母が使用されてきており、また更にこれらの各酵母の内、例えばワイン酵母は、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ社発売の２２３６酵母やＥＣ１１１８酵母が使用され、また清酒酵母も協会７号、９号が使用され、焼酎酵母も鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ等が使用されている。
【０００３】
しかしながら、これらの醸造用酵母はいずれもサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に分類され、更に清酒酵母及び焼酎酵母に関してはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に分類される。このように醸造用酵母は同一属又は同一種に属するため、通常の菌学的性質は共通しており、これらの酵母を短時間にかつ正確に区別することは極めて困難である。したがって、現時点においては、酵母を小仕込試験するなどして、その醸造特性から判別するなどの方法で酵母の判別を行わざる得ないのが実状である。しかしながら、これらの判別方法は、酵母を実際に培養し、仕込みを行って当該酵母の醸造特性を確認する必要があるため、判別に相当の時間を要しており、当業界においてその改善が求められている。
【０００４】
このように、実際の酒類製造の現場において、そしてまた試験研究機関において、短期間で正確且つ簡易な酵母の判別システムの確立は従来より重要な課題である。
【０００５】
そこで本発明者らは、このような技術の現状に鑑み、例えばブドウ酒酵母と焼酎酵母、ブドウ酒酵母と清酒酵母といった異なった用途の酵母間だけでなく、その判別が非常にデリケートで難しい、例えば協会ブドウ酒酵母１号、３号、４号といった同一用途の酵母間においても、それを短期間で正確且つ簡易に判別できるシステムの開発というきわめて解決困難な技術的課題をあえて新規に設定し、鋭意研究を行ってきた。そしてその成果について、既に特許出願をしたところである（特許文献１、２参照）。
【特許文献１】特開２００３−２４５０７７号公報
【特許文献２】特開２００４−３２９０８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先願に係る発明は、いずれも、すぐれたものであるが、本発明者らは、これらの成果に満足することなく、先願に係る発明を発展させ更に拡大、改良することとした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものである。
先ず、先願の発明は、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子、ＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子、ＭＵＣ１遺伝子の一部又は全部を増幅させ、その増幅される断片の長さ、数の違いにより、その醸造酵母の判別を行う点を基本的技術思想とするものである。
【０００８】
先願発明においては、醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子、ＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子、ＭＵＣ１遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅した遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動又は制限酵素処理した後アガロースゲル電気泳動することで、その泳動パターンを観察すればよいので作業が容易かつシンプルである。また、特定の遺伝子（この場合はＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子、ＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子、ＭＵＣ１遺伝子の一部又は全部）を増幅させるプライマーを用いることで、ＰＣＲ法での増幅で得られるＤＮＡ断片の種類も安定している点など、優れた点が多い。
【０００９】
また先願では、初めにＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子及びＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子に着目し、それらの遺伝子が酵母の増殖に必須遺伝子でないこと、当該遺伝子にコードされているタンパク質は分子内に繰り返される短いアミノ酸配列を有することなど共通した特徴を有することに着目し、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子及びＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子と相同性を有しない遺伝子の中から、これらの特徴を有する遺伝子を検索した結果、ＭＵＣ１遺伝子を見出し、更にこれが醸造用酵母の判別法に利用可能であることを確認した。
【００１０】
そして、本発明者らは、上記した先願の発明について更に検討を加えた結果、酵母の凝集性に関与するＦＬＯ遺伝子でも判別が可能であることを見出した。ＦＬＯ遺伝子自体は既知であるが（インターネット（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）にて公開されており入手に格別の困難性はない）、ＦＬＯ遺伝子に着目した酵母の判別は行われておらず、ましてや、ＦＬＯ遺伝子の特定の一部をプライマーを用いて増幅させ、増幅された遺伝子断片を利用して酵母を判別する点については、全く報告されておらず、本発明が最先である。
【００１１】
また、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の遺伝子又は当該遺伝子近傍のＩＴＳ領域は、酵母の判別に利用されてはいるが、この配列は、わずかに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の種別判別に用いられているにすぎず、きわめてデリケートな同一種（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属するが用途の異なる酵母（例えば、清酒酵母と焼酎酵母）、あるいは、更にデリケートな同一用途の酵母間（例えば、各種清酒酵母）での判別に用いることはできない。
【００１２】
しかしながら、本発明者らは、改めて上記配列に着目して更に研究を続け、ＩＴＳ領域とは異なるＩＧＳ領域で、詳細に遺伝子配列を検討した結果、ＩＧＳ領域には醸造用酵母間特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ間でも６ｂｐ（ＴＴＣＣＧＣ）の繰り返し回数が異なることを新しく見出した。当該配列に着目したプライマーを設計し、ＰＣＲ反応を行うことで増幅するＤＮＡ断片が醸造用酵母間で異なり、醸造用酵母の判別に利用可能であることを見出した。リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）遺伝子、その近傍領域は既知であるが（インターネット（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）にて公開されており入手に格別の困難性はない）その特定の一部をプライマーを用いて増幅させ、増幅された遺伝子断片を利用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ間での酵母の判別について成功した例は本発明が最先であって、従来報告された例は見当らない。
【００１３】
すなわち本発明は、醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＦＬＯ遺伝子、ＩＧＳ領域の繰り返し配列を含む遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動し、又は制限酵素処理したのち電気泳動し、その電気泳動のパターンの違いにより酵母を判別する方法を基本的技術思想とするものである。そして上記の方法により、醸造用酵母の正確な分類・判別が、迅速且つ容易に可能となる。本判別方法は、再現性が高く、しかも極めて短期間に結果を得ることができるという著効を奏するものである。
【００１４】
本発明の実施にあたり、プライマーとして、今回本発明者らが初めて開発するのに成功したプライマーＡ〜Ｋ（それらの塩基配列を配列表の配列番号１〜１１に示す）を選択、使用し、酵母のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うと良い。プライマーとしてはＡ〜Ｋ以外のプライマーをＦＬＯ遺伝子から若しくはＩＧＳ領域の繰り返し配列を含むＤＮＡ断片が増幅するように設計して用いてもよい。ＰＣＲは常法に従って行えばよく、その結果、目的としたＤＮＡ断片を得ることが出来る。
【００１５】
このように増幅して得た遺伝子断片は、これを直接電気泳動して、その泳動パターンを観察することにより、酵母の判別をすることができる。プライマーの種類、組み合わせを選択することにより、酵母に特有な明確な泳動パターンが得られる。また所望するのであれば、ＰＣＲにて増幅された遺伝子断片を制限酵素で切断後、電気泳動を行い、その泳動パターンを観察することによっても、酵母の判別を簡便且つ明確に行うことができる。
【００１６】
したがって、本発明によれば、プライマー、鋳型に用いるゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ断片、その制限酵素消化物の少なくともひとつについて、その種類を変えることによって、各種の醸造用酵母の判別、同定が可能となり、あるいは、逆に特定の醸造用酵母の判別、同定するためには、プライマー等を選別すればよく、酵母のバリエーションが出るようにあるいはそれに対応するようにプライマー等についてもバリエーション設計すればよい。
【００１７】
このようにして本発明によれば、醸造用酵母の判別、同定、分類の少なくとも一つが可能となるので、上記したプライマー等の少なくともひとつを用いて酵母の判別、同定、分類用キットを組むことができる。したがって、例えばプライマーＡ及びＢを用い、そして更にマーカー等の電気泳動に必要な試薬類を適宜セットして協会焼酎酵母２号（ＳＨ４）の判別、同定、分類用キットを組むことができる。
【００１８】
本発明において、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母であればすべての酵母が使用可能であり、例えば清酒酵母、ワイン酵母、焼酎酵母等の実用酵母に使用できる。本発明は清酒酵母とワイン酵母の判別、ワイン酵母と焼酎酵母の判別といった異なった用途の酵母間の判別が可能であることはもとより同じ焼酎酵母間の判別も可能となるものである。
【００１９】
本発明において、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母が判別可能であり、例えば清酒酵母（協会７号酵母、協会９号酵母、協会１０号酵母）、ワイン酵母（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ社発売２２３６酵母、ＥＣ１１１８酵母、２３２３酵母、ＢＭ４５酵母）、焼酎酵母（鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ、協会ブドウ酒１号、同３号、同４号酵母、焼酎酵母ＳＨ−４、泡盛酵母１号Ａｗ１）等の実用酵母に使用できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する等従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００２１】
更に本発明によれば、異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別、例えばブドウ酒酵母間の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・同定・判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１：醸造用酵母の判別法）
サッカロマイセスに属する２２３６酵母、ＥＣ１１１８酵母、２３２３酵母、ＢＭ４５酵母等、鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ、協会焼酎酵母ＳＨ−４、泡盛酵母１号、宝酒造（株）の「じえんとる君」を用いて精製したゲノムＤＮＡを、プライマーＡ〜Ｋ（配列番号１〜１１、図１）の各々の組み合わせでＰＣＲ法にて増幅したのち、電気泳動を行った。（電気泳動結果を表１に示す）
【００２４】
すなわち、表１に示した各種ワイン酵母ゲノムＤＮＡ及び各種焼酎酵母ゲノムＤＮＡに対して、表１に示したプライマーをそれぞれ用いて、ＰＣＲを行った。プライマーＣ及びプライマーＤ、プライマーＥ及びプライマーＤ、プライマーＦ及びプライマーＧ、プライマーＨ及びプライマーＩ、プライマーＪ及びプライマー及びプライマーＫを用いた場合の反応条件は、次のとおりである。
【００２５】
（ＰＣＲ条件）
９４℃      ３ｍｉｎ      １ｃｙｃｌｅ
９４℃      １ｍｉｎ    ２５ｃｙｃｌｅ
５７℃      １ｍｉｎ    ２５ｃｙｃｌｅ
７２℃      ６ｍｉｎ    ２５ｃｙｃｌｅ
７２℃      ３ｍｉｎ      １ｃｙｃｌｅ
【００２６】
また、同じく、プライマーＡ及びプライマーＢを用いた場合のＰＣＲ反応条件は、次のとおりである。
【００２７】
（ＰＣＲ条件）
９４℃      ３ｍｉｎ        １ｃｙｃｌｅ
９４℃      １ｍｉｎ        ２５ｃｙｃｌｅ
６０℃      １ｍｉｎ        ２５ｃｙｃｌｅ
７２℃      １ｍｉｎ        ２５ｃｙｃｌｅ
７２℃      ３ｍｉｎ        １ｃｙｃｌｅ
【００２８】
電気泳動の結果を表１（ＰＣＲ法により増幅されるＤＮＡ断片の長さ（ｂｐ））に示す。なお、表中、＊は、増幅されるＤＮＡ断片が検出されないことを示す。
【００２９】
【表１】
2006340671.tif 000002
【００３０】
なお、表中の各記号はそれぞれ次のことを表す。
２２３６：    Ｌａｌｌｅｍａｎｄ社発売  ２２３６酵母
ＥＣ１１１８：    〃                    ＥＣ１１１８酵母
２３２３：        〃                    ２３２３酵母
ＢＭ４５：        〃                    ＢＭ４５酵母
ＭＫ：        宮崎酵母
Ｋ２：        鹿児島酵母
ＳＨ４：      協会焼酎酵母
ＡＷ１：      泡盛酵母
【００３１】
上記から明らかなように、プライマーの組み合わせを各種選択し、増幅されるＤＮＡ断片の有無、及び／又は増幅されるＤＮＡの長さを各種検討することによって、各酵母を判別することができる。
【００３２】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００３３】
更に本発明によれば、異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類、同定、判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】プライマーＡ〜Ｋの塩基配列を示す。
【図１】
2006340671.tif 000003
【配列表】
2006340671000001.xml