(57)【要約】【課題】  腎毒性抑制剤として利用できる新規ペプチドおよびこれを用いた腎毒性抑制剤、並びにこれを用いた抗菌製剤を提供する。【解決手段】  分子内に、連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸を含み、かつ、分子内において塩基性アミノ酸に挟まれる領域に配列するアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸である塩基性ペプチドとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、上記ペプチドと［３Ｈ］ゲンタマイシンとを添加した腎上皮細胞を培養する。このときの上記ペプチドのＩＣ５０値は２．１μＭであり、従来の１８倍以上のゲンタマイシン取り込み阻害効果が確認された。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内に、連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸を含み、かつ、分子内において塩基性アミノ酸に挟まれる領域に配列するアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸であることを特徴とする塩基性ペプチド。
【請求項２】
上記連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸がリシンであることを特徴とする請求項１に記載の塩基性ペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のペプチドであることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたペプチド、または１個または数個の塩基性アミノ酸が挿入、及び／または付加されたペプチド。
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個の中性アミノ酸が他の中性アミノ酸または塩基性アミノ酸に置換されたペプチド、または、１個または数個の中性アミノ酸が挿入、及び／または付加されたペプチド。
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個あるいは数個の中性アミノ酸または１個あるいは数個の酸性アミノ酸が欠質したペプチド。
【請求項４】
分子内に少なくとも１個以上のＤ−アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の塩基性ペプチド。
【請求項５】
分子内のアミノ酸のいずれか１個以上にイヌリンおよび／またはパラアミノ馬尿酸が結合していることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の塩基性ペプチド。
【請求項６】
上記イヌリンおよび／またはパラアミノ馬尿酸がペプチド１分子あたり１分子以上結合していることを特徴とする請求項５に記載の塩基性ペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の塩基性ペプチドを含むことを特徴とする腎毒性抑制剤。
【請求項８】
アミノ配糖体系抗生物質と、請求項７に記載の腎毒性抑制剤とを含むことを特徴とする抗菌製剤。
【請求項９】
アミノ配糖体系抗生物質と、請求項７に記載の腎毒性抑制剤とからなることを特徴とする抗菌製剤。
【請求項１０】
上記アミノ配糖体系抗生物質が、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アルベカシン、イセパマイシン、ネチルマイシン、ジベカシン、シソマイシン、ミクロノマイシン、アストロマイシンの内の少なくとも一つからなることを特徴とする請求項８または９に記載の抗菌製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎毒性抑制剤として利用できる新規ペプチドおよびこれを用いた腎毒性抑制剤、並びにこれを用いた抗菌製剤に関し、特に、アミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する塩基性ペプチドおよびこれを用いた腎毒性抑制剤、並びにこれを用いた抗菌製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば緑膿菌などのグラム陰性菌等による感染症などにきわめて有効な殺菌力を発揮する医薬品の一つとして、アミノ配糖体（アミノグリコシド）系抗生物質が用いられている。
【０００３】
ところが、アミノ配糖体系抗生物質は、他臓器と比較して腎皮質にきわめて高濃度かつ長期間にわたって蓄積し、腎毒性を高頻度に誘発することが知られている。そのため、その使用量（一回あたりの投与量、連続投与日数等）が臨床において大幅に制限されており、アミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する有効な手段が求められている。
【０００４】
アミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する手段としては、例えば、特許文献１には、ホスホマイシンをアミノ配糖体系抗生物質と併用投与することによりアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する医薬品が開示されている。また、特許文献２には、水溶性ポリアニオン有機酸重合体をアミノ配糖体系抗生物質と併用投与することによりアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する方法が開示されている。
【０００５】
一方、本発明者は、アミノ配糖体系抗生物質の腎移行過程にメガリンと呼ばれる、種々の基質をエンドサイトーシスによって取り込むレセプターが関与することを見出している。すなわち、アミノ配糖体系抗生物質とメガリン結合物質とを共存させると、これらが腎皮質移行過程において競合し、メガリン結合物質がアミノ配糖体系抗生物質とメガリンとの結合体の生成を拮抗的に阻害、抑制するので、メガリンを分子標的としたアミノ配糖体系抗生物質の腎移行の制御、ひいては腎毒性の抑制が可能となることを見出している（特許文献３）。特許文献３には、メガリン結合物質であるリゾチームやチトクロームＣなどのタンパク質に加え、チトクロームＣの部分ペプチドや、アクチン調節タンパク質（Neutral Wiskott-Aldrich syndrome protein、以下Ｎ−ＷＡＳＰと称する）の部分ペプチドがアミノ配糖体系抗生物質の腎移行抑制効果を有することが開示されている。
【特許文献１】特開昭５７−５０９１９号公報（昭和５７年（１９８２年）３月２５日公開）
【特許文献２】特開平２−２８９５２２号公報（平成２年（１９９０年）１１月２９日公開）
【特許文献３】特開２００３−２６１４５９号公報（平成１５年（２００３年）９月１６日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に記載されたホスホマイシンおよび上記特許文献２に記載された水溶性ポリアニオン有機酸重合体は、いずれも生体内に存在しない生体外異物であるという問題がある。
【０００７】
また、ホスホマイシンは副作用として、偽膜性大腸炎などの血便を伴う重篤な大腸炎を生じることが報告されており（日本医薬品総覧  １９９６年版、１５３３頁、メディカルレビュー社）、十分な量を用いることができないことから腎毒性抑制効果が期待できず、また、抗生物質であることから耐性菌が出現する可能性もある。
【０００８】
さらに、水溶性ポリアニオン有機酸重合体は、投与量が１日あたり１６ｇにも達することがあり、投与量が非常に多いという問題がある。また、上記ホスホマイシンおよび水溶性ポリアニオン有機酸重合体のいずれも、腎障害抑制の作用機序は明らかになっていない。
【０００９】
一方、上記特許文献３に記載の腎毒性抑制剤は、生体内で産生されるタンパク質またはその部分ペプチドを用いているため、上記特許文献１および２に記載された生体外異物が腎蓄積した場合に起こりうる副作用等の問題をクリアすることができる。さらに、上記部分ペプチドは分子量が小さく、モル濃度（量）基準で同等のアミノ配糖体系抗生物質の腎上皮細胞内移行抑制効果を持つことから、投与の絶対量を下げることができる。
【００１０】
しかしながら、上記特許文献３に記載のタンパク質またはその部分ペプチドを用いた腎毒性抑制剤においても、アミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制するために必要な投与量は、特許文献２に記載の上記水溶性ポリアニオン有機酸重合体より大幅に少ないものの、１日当たり数グラム程度に達するため、被投与生体への負担度やコストを考えた場合、未だ満足できるものではなく、さらに少ない投与量で腎毒性抑制効果を有する物質が求められていた。
【００１１】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、腎毒性抑制剤として利用できる新規ペプチドおよびこれを用いた腎毒性抑制剤、並びにこれを用いた抗菌製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、上記Ｎ−ＷＡＳＰの部分ペプチドの一次構造を改変した新規ペプチドを用いることにより、アミノ配糖体系抗生物質のメガリン等のレセプターへの結合を競合的に阻害することができ、従来技術よりも著しく低い投与量でアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制することができることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る塩基性ペプチドは、上記課題を解決するために、分子内に、連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸を含み、かつ、分子内において塩基性アミノ酸に挟まれる領域に配列するアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸であることを特徴としている。
【００１４】
ここで、メガリンは、塩基性ペプチドを認識しうることが知られている。また、メガリンにはセリン−アスパラギン酸−グルタミン酸の３つの酸性アミノ酸からなる配列（ＳＤＥモチーフ）が繰り返し出現する領域、いわゆるリガンド結合領域が存在し、アミノ配糖体系抗生物質はこのリガンド結合領域に結合すると考えられている。また、メガリンに加えて、アミノ配糖体系抗生物質の腎移行に関与するとされるレセプターとしては、他に酸性リン脂質がある。
【００１５】
上記構成によれば、分子内に、連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸を含むため、酸性アミノ酸からなる配列である上記ＳＤＥモチーフまたは酸性リン脂質への高い親和性を獲得することができる。また、分子内において塩基性アミノ酸に挟まれる領域に配列するアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸であるため、上記ＳＤＥモチーフまたは酸性リン脂質への結合を考慮した場合に不利となる塩基性領域内に存在する酸性アミノ酸の影響を排除することができる。
【００１６】
したがって、ペプチドのメガリンまたは酸性リン脂質への親和性を高めることができ、アミノ配糖体系抗生物質のメガリンまたは酸性リン脂質への結合を競合的に阻害することができるため、非常に少ない投与量で、効果的にアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制し、腎毒性を低減することができる。
【００１７】
また、本発明に係る塩基性ペプチドは、上記連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸がリシンであることが好ましい。後述するように、上記Ｎ−ＷＡＳＰの１８１位から２００位までの部分ペプチド（以下Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００と称する）の９位および１５位のリシンをグリシンに置換すると、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の腎毒性抑制効果が低下する。すなわち、連続して配列する３個以上のリシンはペプチドの腎毒性抑制に対して関与していることが示唆されている。したがって、上記構成によれば、非常に少ない投与量で、効果的にアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制し、腎毒性を低減することができる。
【００１８】
また、本発明に係る塩基性ペプチドは、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のペプチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたペプチド、または１個または数個の塩基性アミノ酸が挿入、及び／または付加されたペプチド。
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個の中性アミノ酸が他の中性アミノ酸または塩基性アミノ酸に置換されたペプチド、または、１個または数個の中性アミノ酸が挿入、及び／または付加されたペプチド。
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個あるいは数個の中性アミノ酸または１個あるいは数個の酸性アミノ酸が欠質したペプチド。
【００１９】
上記（ａ）は、上記Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の７位のグルタミン酸をリシンに置換したものである。これにより、塩基性アミノ酸に挟まれて存在する酸性アミノ酸のグルタミン酸が塩基性アミノ酸のリシンに置換され、上記Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の分子内に、連続する３個のリシン配列が生じることから、上記Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の上記ＳＤＥモチーフまたは酸性リン脂質への親和性をさらに高めることができる。
【００２０】
したがって、上記Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００よりもさらに高い腎毒性抑制能を持つペプチドを得ることができ、非常に少ない投与量で、効果的にアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制し、腎毒性を低減することができる。
【００２１】
また、本発明に係る塩基性ペプチドは、分子内に少なくとも１個以上のＤ−アミノ酸を含むことが好ましい。上記構成によれば、Ｄ−アミノ酸の働きにより、上記塩基性ペプチドのプロテアーゼ耐性を高めることができ、上記塩基性ペプチドの生体内投与後の分解を防ぐことができる。
【００２２】
したがって、上記塩基性ペプチドを、上記メガリンまたは酸性リン脂質が存在する部位である腎近位尿細管管腔に効率よく到達させることができるため、非常に少ない投与量の塩基性ペプチドで効果的にアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制し、腎毒性を低減することができる。
【００２３】
また、本発明にかかる塩基性ペプチドは、分子内のアミノ酸のいずれか１個以上にイヌリンまたはパラアミノ馬尿酸が結合していることが好ましい。イヌリンおよびパラアミノ馬尿酸は、腎指向性の高い化合物であるため、イヌリンおよび／またはパラアミノ馬尿酸を上記塩基性ペプチドに結合させることにより、上記塩基性ペプチドを腎近位尿細管管腔に効率よく到達させることができる。したがって、非常に少ない投与量の塩基性ペプチドで効果的にアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制し、腎毒性を低減することができる。
【００２４】
また、本発明にかかる塩基性ペプチドは、上記イヌリンおよび／またはパラアミノ馬尿酸がペプチド１分子あたり１分子以上結合していることが好ましい。
【００２５】
また、本発明にかかる腎毒性抑制剤は、本発明にかかる塩基性ペプチドを含むことを特徴としている。本発明にかかる塩基性ペプチドは、アミノ配糖体系抗生物質の腎移行を担うレセプターであるメガリンまたは酸性リン脂質との親和性を高めたものであるため、上記塩基性ペプチドを含む腎毒性抑制剤は、上記レセプターへのアミノ配糖体系抗生物質の結合を競合的に阻害することができる。したがって、非常に少ない投与量で効果的にアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制することができるとともに、臨床においてアミノ配糖体系抗生物質の使用量を増やすことができる。
【００２６】
また、本発明にかかる抗菌製剤は、アミノ配糖体系抗生物質と、本発明にかかる腎毒性抑制剤とを含むことを特徴としている。上記抗菌製剤は、本発明にかかる腎毒性抑制剤を含むので、アミノ配糖体系抗生物質が有する腎毒性を大幅に低下させることができる。したがって、臨床においてアミノ配糖体系抗生物質の使用量を増やすことができる。
【００２７】
また、本発明にかかる抗菌製剤は、アミノ配糖体系抗生物質と、本発明にかかる腎毒性抑制剤とからなることを特徴としている。上記抗菌製剤は、本発明にかかる腎毒性抑制剤を含むので、アミノ配糖体系抗生物質が有する腎毒性を大幅に低下させることができる。したがって、臨床においてアミノ配糖体系抗生物質の使用量を増やすことができる。
【００２８】
また、本発明にかかる抗菌製剤では、上記アミノ配糖体系抗生物質が、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アルベカシン、イセパマイシン、ネチルマイシン、ジベカシン、シソマイシン、ミクロノマイシン、アストロマイシンの内の少なくとも一つからなることが好ましい。上記構成によれば、臨床上非常に有用な効果を有するこれらのアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を低下させることができる。したがって、これらのアミノ配糖体系抗生物質の使用量を増やすことができ、その抗菌性を臨床上十分に利用することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明にかかる塩基性ペプチドは、以上のように、分子内に、連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸を含み、かつ、分子内において塩基性アミノ酸に挟まれる領域に配列するアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸である構成を備えている。
【００３０】
それゆえ、上記塩基性ペプチドのメガリンまたは酸性リン脂質への親和性を高めることができるとともに、アミノ配糖体系抗生物質のメガリンまたは酸性リン脂質への結合を競合的に阻害することができるため、非常に少ない投与量で、効果的にアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制し、腎毒性を低減することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の一実施形態について説明すれば、以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
＜塩基性ペプチド＞
一実施形態において、本発明に係る塩基性ペプチドは、分子内に、連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸を含み、かつ、分子内において塩基性アミノ酸に挟まれる領域に配列するアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸である塩基性ペプチドである。
【００３３】
ここで、「塩基性ペプチド」とは、等電点がアルカリ性側にあるペプチドのことであり、アルギニンやリシンなどの塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に比べて多く含まれている。
【００３４】
一実施形態において、本発明に係る塩基性ペプチドは、分子内に、連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸を含んでいる。「連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸」とは、ペプチドの一次構造において、酸性アミノ酸や中性アミノ酸を挟まずに塩基性アミノ酸が３個以上連続して配列しているものであればよい。
【００３５】
また、塩基性アミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、アルギニンであってもよく、リシンであってもヒスチジンであってもよいが、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の分子内に連続してリシンが３個配列する領域において、リシンをグリシンに置換するとＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００の腎毒性抑制効果が低下することが知られており（足立佳範、永井純也、齋藤正樹、村上照夫、高野幹久、第１９回日本薬物動態学会年会要旨集、２００４年）、連続して配列する３個以上のリシンはペプチドの腎毒性抑制に対して関与していると考えられるため、リシンであることが好ましい。
【００３６】
さらに、塩基性アミノ酸の配列順序は特に限定されるものではない。また、上記連続して配列する３個以上の塩基性アミノ酸がペプチドのアミノ酸配列中に占める位置は特に限定されるものではない。例えば、ペプチド分子中においてアミノ末端側に位置していてもよいし、カルボキシ末端側に位置していてもよい。また、ペプチドの鎖長も特に限定されるものではなく、塩基性ペプチドであれば、アミノ酸個数が１０以下のオリゴペプチドであってもよいし、アミノ酸個数が１０を超えるポリペプチドであってもよい。
【００３７】
また、「分子内において塩基性アミノ酸に挟まれる領域に配列するアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸」は、ペプチドの一次構造において、２つの塩基性アミノ酸に挟まれる単数または複数のアミノ酸が中性アミノ酸または塩基性アミノ酸であればよく、中性アミノ酸の種類、塩基性アミノ酸の種類は特に限定されるものではない。
【００３８】
また、一実施形態において、本発明に係る塩基性ペプチドは、天然の精製産物、化学合成産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組み換え技術によって産生された産物を含む。
【００３９】
さらに、上記塩基性ペプチドの合成方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、固相合成法、液相合成法などの化学合成法や、酵素合成法などの方法を用いればよい。後述する実施例では、Ｆｍｏｃ法による固相合成法を用いているが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００４０】
本実施形態に係る塩基性ペプチドは、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のペプチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたペプチド、または１個または数個の塩基性アミノ酸が挿入、及び／または付加されたペプチド。
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個または数個の中性アミノ酸が他の中性アミノ酸または塩基性アミノ酸に置換されたペプチド、または、１個または数個の中性アミノ酸が挿入、及び／または付加されたペプチド。
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個あるいは数個の中性アミノ酸または１個あるいは数個の酸性アミノ酸が欠質したペプチド。
【００４１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、上記特許文献３に記載されたＮ−ＷＡＳＰの１８１位から２００位までの部分ペプチド（Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００：配列番号２）の７位のグルタミン酸をリシンに置換したものである。Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００は、等電点１０．８７の塩基性ペプチドであり、アミノ配糖体系抗生物質の腎移行を担うレセプターであるメガリンが塩基性ペプチドを認識しうることと、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００が、メガリンとともにアミノ配糖体系抗生物質の腎移行に関与するとされるレセプターである酸性リン脂質と結合しうることとから、アミノ配糖体系抗生物質の上記レセプターへの結合を競合的に阻害し、アミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する効果を奏する。
【００４２】
そこで、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の上記レセプターへの親和性をさらに高め、アミノ配糖体系抗生物質の上記レセプターへの結合をより効果的に阻害すれば、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００が有するアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する効果をさらに高め得ると考えられる。
【００４３】
Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の上記レセプターへの親和性を高めることを考えた場合、ＳＤＥモチーフを構成する酸性アミノ酸は負に荷電しているため、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の塩基性領域内に存在し、負に荷電した酸性アミノ酸である７位のグルタミン酸の存在は、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００とＳＤＥモチーフとのイオン結合のしやすさを考えた場合、好ましくないと推察される。そこで、本発明者は、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の上記グルタミン酸をリシンに置換し、上記ＳＤＥモチーフとの親和性をＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００よりもさらに高めるべく、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを設計した。
【００４４】
それゆえ、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の１アミノ酸を置換して設計したものであるが、ＳＤＥモチーフへの親和性を著しく向上させることができた。また、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００よりも塩基性を高めたものであるから、上記酸性リン脂質への親和性も向上している。したがって、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、アミノ配糖体系抗生物質のＳＤＥモチーフまたは酸性リン脂質への結合をＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００よりもさらに効果的に阻害し、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００よりも非常に少ない投与量でアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を低下させることができる点で、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００とは明確に区別される。
【００４５】
上記（ｂ）〜（ｄ）に記載のペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの変異体である。上記「１個または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。このような変異ペプチドは、点変異導入法等の公知の変異ペプチド作製法により作製することができるが、このような人為的に導入された変異を有するペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００４６】
これらの変異は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの塩基性アミノ酸の数を減少させるものではなく、酸性アミノ酸の数を増加させるものでもないため、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの腎毒性抑制効果を維持することができる。
【００４７】
別の実施形態において、本発明に係る塩基性ペプチドは、分子内に少なくとも１個以上のＤ−アミノ酸を含むことが好ましい。Ｄ−アミノ酸は、本発明に係る塩基性ペプチドにプロテアーゼ耐性を付与し、生体内投与後の分解を防ぐ働きをするものである。
【００４８】
本発明に係る塩基性ペプチドによるアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性抑制は、腎近位尿細管の管腔側膜に存在する上記レセプターへのアミノ配糖体系抗生物質の結合を、塩基性ペプチドを用いて競合的に阻害することによるものであるため、上記塩基性ペプチドにプロテアーゼ耐性を付与することにより、上記塩基性ペプチドの生体内投与後の分解が抑制され、上記塩基性ペプチドを腎近位尿細管管腔に効率よく到達させることが可能となり、より低投与量で腎毒性抑制効果を発揮させることができる。
【００４９】
上記Ｄ−アミノ酸の種類としては、特に限定されるものではない。また、Ｄ−アミノ酸の存在形態としては、上記塩基性ペプチドの一次構造中に含まれていれば特に限定されるものではない。例えば、上記塩基性ペプチドに含まれるアミノ酸のいずれかがＤ体になっているものでもよく、上記塩基性ペプチドに１個以上のＤ−アミノ酸を挿入、及び／または付加したものであってもよい。
【００５０】
また、別の実施形態において、本発明に係る塩基性ペプチドは、分子内のアミノ酸のいずれか１個以上にイヌリンおよび／またはパラアミノ馬尿酸が結合していることが好ましい。イヌリンは、尿細管で再吸収や分泌が行われない多糖体であり、パラアミノ馬尿酸は、尿細管で分泌される代表的な物質である。このような腎指向性の高い化合物を上記塩基性ペプチドに結合させることにより、上述のように、上記塩基性ペプチドを腎近位尿細管管腔に効率よく到達させることができ、より低投与量で腎毒性抑制効果を発揮させることができる。
【００５１】
また、上記イヌリンおよび／またはパラアミノ馬尿酸の結合量は特に限定されるものではないが、イヌリンおよび／またはパラアミノ馬尿酸がペプチド１分子あたり１分子以上結合していることが好ましく、上記結合量が多すぎると上記塩基性ペプチドの体内動態に影響を与える可能性があるため、ペプチド１分子あたり１分子以上２０分子以下結合していることがさらに好ましい。
【００５２】
＜腎毒性抑制剤および抗菌製剤＞
一実施形態において、本発明に係る腎毒性抑制剤は、本発明にかかる塩基性ペプチドを含んでいる。上記腎毒性抑制剤において、アミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する効果を奏するのは、上述のように上記塩基性ペプチドであるため、他の成分は上記塩基性ペプチドの腎毒性抑制効果を阻害しないものであれば特に限定されるものではない。
【００５３】
例えば、他の成分としては、リゾチーム、アプロチニン、チトクロームＣ等のような、生体内で産生され、メガリンを基質としてアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する効果を有することが知られているタンパク質を含んでいてもよい。これらのタンパク質は、いずれも生体内で産生されるものであるため、上記ホスホマイシン等の生体外異物による副作用等の腎蓄積以降の問題を起こす心配がないという点で好適に用いることができる。チトクロームＣについては、腎障害時に低下した腎尿細管上皮細胞機能を改善するという効果も期待できるため、特に好ましい。
【００５４】
また、チトクロームＣの部分ペプチドや、上記Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００等のようなアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性抑制効果を有する他のペプチドを含んでいてもよい。さらに、上記塩基性ペプチドの腎毒性抑制効果を阻害しないものであれば、従来公知の成分を含んでいてもよい。例えば薬剤を製造する上で用いられる通常用いられる従来公知の医薬品添加物（保存剤、安定剤など）等を含んでいてもよい。上記医薬品添加物の量は適宜設定すればよい。
【００５５】
また、一実施形態において、本発明に係る抗菌製剤は、アミノ配糖体系抗生物質と、本発明に係る腎毒性抑制剤とを含んでいる。上述のように、アミノ配糖体系抗生物質は、グラム陰性菌等による感染症などにきわめて有効な殺菌力を発揮する。上記抗菌製剤は、本発明に係る腎毒性抑制剤を含んでいるので、アミノ配糖体系抗生物質が持つ腎毒性を抑制することができるとともに、アミノ配糖体系抗生物質が有する殺菌力を十分に発揮させることができる。
【００５６】
上記抗菌製剤は、上記アミノ配糖体系抗生物質と、上記腎毒性抑制剤以外の成分としては、上記アミノ配糖体系抗生物質の殺菌力および上記腎毒性抑制剤の腎毒性抑制効果を阻害するものでなければ特に限定されるものではない。例えば薬剤を製造する上で用いられる従来公知の医薬品添加物（保存剤、安定剤など）等を含んでいてもよい。上記医薬品添加物の量は適宜設定すればよい。
【００５７】
また、上記抗菌製剤を用いる場合、生体内での吸収、分布、代謝、排泄などを改善するために、上記抗菌製剤の構造を修飾してもよい。
【００５８】
上記アミノ配糖体系抗生物質と、上記腎毒性抑制剤との含有量の比は、特に限定されるものではないが、上記腎毒性抑制剤の含有量は、腎毒性抑制効果を示す限り、低いほど好ましい。
【００５９】
また、他の実施形態において、上記抗菌製剤は、上記アミノ配糖体系抗生物質と、上記腎毒性抑制剤とからなるものであってもよい。さらに、上記抗菌製剤は、予め腎毒性抑制剤を投与して、その後に抗菌製剤を投与するように用いるアミノ配糖体系抗生物質と腎毒性抑制剤とを組み合わせた抗菌製剤としてもよい。
【００６０】
本実施形態において、本発明に係る抗菌製剤に含まれるアミノ配糖体系抗生物質の種類は、特に限定されるものではないが、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アルベカシン、イセパマイシン、ネチルマイシン、ジベカシン、シソマイシン、ミクロノマイシン、アストロマイシンの内の少なくとも一つを含んでいることが好ましい。
【００６１】
以上のように、本発明に係る塩基性ペプチド、腎毒性抑制剤、抗菌製剤を用いることにより、Ｎ−ＷＡＳＰ等の従来技術よりも効果的にアミノ配糖体系抗生物質のメガリン等のレセプターへの結合を阻害することができ、従来よりも大幅に少ない投与量でアミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制することができる。
【００６２】
その結果、アミノ配糖体系抗生物質の臨床における使用量を増加させることができ、臨床上、その抗菌性を十分に利用することができる。アミノ配糖体系抗生物質が一旦生体内に取り込まれた場合、様々な細胞障害が生じるため、その第一段階である細胞表面へのアミノ配糖体系抗生物質の結合および細胞内への取り込みを抑制することは腎毒性防御において最善の方法と思われる。また、本発明において、アミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する効果を有するのはペプチドであるため、副作用の心配がなく、抗生物質ではないため、上記特許文献１に記載の医薬品のように耐性菌が出現する問題もない。したがって、本発明の有用性は非常に高いものであるといえる。
【００６３】
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６４】
以下、本発明について、実施例および比較例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【実施例】
【００６５】
＜ペプチドの合成＞
以下に示す実施例および比較例において、ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ法による固相合成によって行った。Ｆｍｏｃ法は、アミノ酸のアミノ保護基として９−fluorenylmethyloxycarbonyl（Ｆｍｏｃ）基を用いる方法である。
【００６６】
まず、合成しようとするペプチドのカルボキシル基末端のアミノ基をＦｍｏｃ誘導体としたアミノ酸を樹脂に結合させる。次に、カルボキシル基末端のアミノ酸を結合した樹脂をカラムに詰め、Ｆｍｏｃ保護基を取り除き、アミノ基を遊離させる（脱保護）。これにＦｍｏｃアミノ酸の活性エステルを反応させてペプチド結合を形成させる（結合）。以上の脱保護と結合を繰り返すことで、目的とするアミノ酸配列を持ったペプチドをカルボキシル基末端からアミノ基末端に向けて合成する。本実施例および比較例においては、上記ペプチド合成は、ペプチド合成機（島津製作所製、ＰＳＳＭ−８）を用いて行った。
【００６７】
また、合成したペプチドは、混合物となるので、定法にしたがってＨＰＬＣを用いて精製した。合成したペプチドの純度は、飛行時間型質量分析計（パーセティブバイオシステム社製、ＶｏｙｇｅｒＲＰ−３）を用いて確認した。
【００６８】
［実施例１］
＜培養細胞へのゲンタマイシンの取り込み抑制実験＞
培養細胞としては、メガリンが発現している培養腎上皮細胞であるＯＫ細胞を用いた。上記ＯＫ細胞を２４穴マルチプレート上に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５%ＣＯ２−９５％ａｉｒ）内で培養した。培養液には１０％牛胎児血清を含むｍｅｄｉｕｍ １９９を用いた。細胞がコンフルエントに到達後、ペプチドによる［３Ｈ］ゲンタマイシン取り込み阻害実験を行った。
【００６９】
ペプチドによる［３Ｈ］ゲンタマイシン取り込み阻害実験は、［３Ｈ］ゲンタマイシン (５μＭ)を含む等張リン酸緩衝溶液 （ＰＢＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、 ５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ）を上記培養液に添加し、各濃度のＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下「Ｎ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）」と称する）を上記［３Ｈ］ゲンタマイシンを含む ＰＢＳに共存させてインキュベーション (３７℃，６０分間) することによって行った。
【００７０】
ペプチドによる［３Ｈ］ゲンタマイシン取り込み阻害は、上記培養終了後の細胞を氷冷した上記ＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍ  ＮａＯＨで細胞を溶解した後、［３Ｈ］ゲンタマイシンの細胞内移行量を測定することで評価した。［３Ｈ］ゲンタマイシンの放射活性は、液体シンチレーションカウンター法で測定した。
【００７１】
結果を図１、表１、および表２に示す。図１は、上記ＯＫ細胞における［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込み量と、併用したＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００あるいはＮ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）の濃度との関係を示した図である。図１の縦軸は、ペプチドを添加しないＯＫ細胞（対照群）の［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込みを１００とした場合の、ペプチドを横軸に示した濃度だけ添加したＯＫ細胞の［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込みを表すものである。つまり、縦軸の値が小さいほど、［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込みが阻害されていることになる。
【００７２】
図１に示すように、ＯＫ細胞への［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込みは、Ｎ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）を用いた場合も、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００を用いた場合も、ともにペプチドの濃度に依存して阻害された。
【００７３】
しかしながら、図１よりＮ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）のＩＣ５０値（最大阻害度の５０％阻害を与えるペプチドの濃度）は、２．１μＭと算出され、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００のＩＣ５０値は３８．３μＭと算出されたことから、Ｎ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）はＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００に比べて、１８倍以上強いゲンタマイシン取り込み阻害効果を有することが確認された。すなわち、Ｎ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）は、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の１８分の１以下という著しく少ない投与量でＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００と同じ腎毒性抑制効果を得ることができ、非常に効率よくゲンタマイシンの腎毒性を抑制できることが確認された。
【００７４】
表１は、図１に表した結果の測定値を表したものである。数値は、平均値並びに標準誤差として示した。表２は、図１および表１に示した結果を、上記ＯＫ細胞に取り込まれた［３Ｈ］ゲンタマイシンの絶対値で表現したものである。数値は、平均値並びに標準誤差として示した。
【００７５】
【表１】
2006199668.tif 000003
【００７６】
【表２】
2006199668.tif 000004
【００７７】
［比較例１］
Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の９位および１５位のリシンをグリシンに置換したペプチド（以下Ｎ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）と称する）と、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００とを用いて、実施例１と同様に培養細胞へのゲンタマイシンの取り込み抑制実験を行った。上記Ｎ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）は、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００に存在する塩基性領域のほぼ中心に位置する９位および１５位のリシンをグリシンに置換することで、塩基性アミノ酸が３個以上連続した領域をペプチド配列内から消失させたものである。
【００７８】
結果を図２に示した。図２は、上記ＯＫ細胞における［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込み量と、併用したＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００あるいはＮ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）の濃度との関係を示した図である。Ｎ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）の上記ＩＣ５０値は、１２１μＭと算出され、Ｎ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）のゲンタマイシン取り込み阻害効果はＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００（ＩＣ５０値３８．３μＭ）の約１／３であることが確認された。
【００７９】
Ｎ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）は、上述のように、塩基性アミノ酸が３個以上連続した領域をペプチド配列内から消失させたものであるため、このことによってＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００よりも上記ＳＤＥモチーフまたは酸性リン脂質に対する親和性が低下し、アミノ配糖体系抗生物質とレセプターとの結合を阻害する効果が低下したものと考えられる。
【００８０】
このように、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の２アミノ酸を置換したＮ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）の腎毒性抑制効果がＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００よりも大きく低下する一方、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の１アミノ酸を置換したＮ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）は、実施例１に示したように、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の１８倍以上の腎毒性抑制効果を示し、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の一次構造の改変の相違によって対照的な結果が得られた。
【００８１】
したがって、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の一次構造を改変し、より腎毒性抑制効果の高いペプチドを得るためには、上記メガリン等のレセプターとの親和性等の要素を考慮して分子設計を行う必要があるため、本発明に係る塩基性ペプチドは、Ｎ−ＷＡＳＰ１８１−２００の構造から容易に得られるものとはいえない。すなわち、Ｎ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）においてＮ−ＷＡＳＰの１８倍以上の腎毒性抑制効果が得られた本発明の効果は、従来の技術水準から予測し得ない顕著な効果であるということができる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上のように、本発明では、アミノ配糖体系抗生物質のメガリン等のレセプターへの結合を効果的に阻害することができるため、従来技術よりも著しく低い投与量でアミノ配糖体系抗生物質の腎移行を抑制することが可能となり、アミノ配糖体系抗生物質の使用量を大幅に増加させることができる。そのため、本発明は、アミノ配糖体系抗生物質の腎毒性を抑制する優れた薬剤として利用できるだけでなく、アミノ配糖体系抗生物質の殺菌力を利用した抗菌製剤としても利用でき、広く製薬産業に応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＯＫ細胞における［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込み量と、併用したＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００あるいはＮ−Ｗ（Ｅ７Ｋ）の濃度との関係を示した図である。
【図２】ＯＫ細胞における［３Ｈ］ゲンタマイシンの取り込み量と、併用したＮ−ＷＡＳＰ１８１−２００あるいはＮ−Ｗ（Ｋ９Ｇ，Ｋ１５Ｇ）の濃度との関係を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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