(57)【要約】      （修正有）【課題】固相担体を用いる被検物質測定方法における簡便な検出、定量測定手段を提供する。【解決手段】光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質（一次抗体）を結合させて固定化し、修飾若しくは標識された被検物質と被検物質に対する二次抗体とを細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることにより、被検物質の定量が可能とする被検物質の定量方法。【選択図】図２
2006337077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることを特徴とする被検物質の定量方法。
【請求項２】
分注器を用いて、細管中の固相担体中に被検物質を展開させる請求項１に記載の被検物質の定量方法。
【請求項３】
展開後に、細管中の固相担体を洗浄し、その後細管部の光透過性を利用して直接又は間接に被検物質を定量する請求項１又は２に記載の被検物質の定量方法。
【請求項４】
前記の被検物質を定量することのできる物質として、被検物質に対する特異的結合抗体（一次抗体）を使い、これを固相担体に固定化し、修飾若しくは標識された被検物質に対する特異結合抗体（二次抗体）を被検物質と接触、反応させ、当該反応産物を細管の固相担体中に展開させることを特徴とする請求項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
【請求項５】
前記の被検物質を定量することのできる物質として、被検物質に対する特異結合物質を使い、これを固相担体に固定化し、一方、修飾若しくは標識された測定対照物質（被検物質と同じ物質）と被検物質を含む検体を混合し、当該混合物を細管の固相担体中に競合的に展開させることを特徴とする請求項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
【請求項６】
前記の被検物質を定量することのできる物質として、「基質」及び「基質に対する酵素の作用による生成物質と反応して発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質」を使い、これらを固相担体に固定化し、被検物質と当該酵素を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と酵素を接触させることにより、被検物質による酵素活性の阻害作用によって、被検物質の定量を行うことを特徴とする請求項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
【請求項７】
一定量の基質に対する酵素と被検物質を事前に接触させたのち細管の固相担体中に展開させる請求項６に記載の被検物質の定量方法。
【請求項８】
前記の被検物質を定量できる物質として、被検物質に対する酵素の作用によって生産される生成物と反応して発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質を使い、これを固相担体に固定化し、被検物質に対する酵素の作用によって生産される当該生成物を細管の固相担体中に展開させて、当該生成物と該固定化物質と接触させることを特徴とする請求項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
【請求項９】
前記被検物質を定量するために、細管の固相担体中の展開量を、被検物質が低濃度の場合には増加、被検物質が高濃度の場合には減少変化させて検出可能とする請求項１〜８の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
【請求項１０】
光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることができることを特徴とする被検物質の定量用容器。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一に記載の方法に使用される少なくとも１の試薬及び光透過性の細管からなる容器を含む被検物質の定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの臨床検査、獣医検査、食品衛生検査など多くの分野で利用される技術に関する。詳しくは、光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることにより、被検物質の定量が可能であることを特徴とする被検物質の定量方法からなる新規な簡便測定法及びその測定に使用する測定試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ヒトの臨床検査をはじめとして、獣医検査、食品検査など多くの分野で、被検物質に対する特異結合物質と固相を用いて実施する測定法が広く普及している。例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、生理作用物質などの被検物質に対して、それぞれ抗体、抗原、被検ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ断片、受容体などの特異結合物質との複合体を固相上に形成させて、固相上の複合体を測定する測定法が広く使われている。
溶液中に含まれる抗原を定量する方法としては、抗原と抗体との特異的な結合を利用するとともに、酵素反応による発色、発光、蛍光などのシグナル強度の程度により抗原（測定対象物質）を定量する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：enzyme-linked  immunosorbent  assay）が知られている（非特許文献１）。例えばガスクロマトグラフ質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）や高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）等の分析方法が非常に煩雑な操作や長時間の測定を必要とするのに対し、ＥＬＩＳＡは通常、96ウェルマイクロプレート等を用いることにより、従来の分析方法に比べて測定操作を大幅に簡略化でき、しかも高感度な検出を実現していることから現在幅広く普及している。従来のＥＬＩＳＡ、例えば競合法の一種である直接競合ＥＬＩＳＡは、マイクロプレートのウェルや試験管等の固相である担体表面に固定した抗体に、測定対象物質（サンプルや標準物質）及び酵素で標識した抗原を添加して競合反応させ、抗体に結合しなかった測定対象物質や標識抗原を洗浄除去した後、酵素基質を添加して酵素により蛍光物質を生成させ、すなわち酵素反応をさせ、ついで蛍光の程度を蛍光光度等で測定し、測定対象の標準品の蛍光強度と比較することにより測定対象物質の濃度を測定する方法である。直接競合法による検量特性は減衰曲線となる。ＥＬＩＳＡ法は従来の分析方法に比べて簡便であるが、抗体との反応、非特異的な抗体の洗浄を含めると最低でも２時間程度の時間を必要とする。医療の現場、工場の生産ラインで抗原を迅速に検出する必要がある場合には、より短時間で検出する方法が望まれている。
また、核酸の相補結合性を利用して捕捉・洗浄・乖離・測定する固相法による被検物質の改良定量方法等の特許（特許文献１）もあるが、洗浄・乖離・測定という工程を経ることにおいて、実験操作は繁雑なものとなる。
【特許文献１】日本特許第２９３５６４２号公報
【非特許文献１】臨床検査法提要改定第３１版（免疫学的定量方法３７ページ〜６３ページ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の解決しようとする課題は、固相担体を用いる被検物質の定量方法における簡便な手段を提供することである。つまり、微量成分の定量測定に対応できる十分に高い測定感度を有し、かつ必要とする試薬、検体量、及び固定化物質量が極めて少量ですみ、その上測定時間が従前にない短時間である被検物質の定量方法を提供することを課題とする。さらに、測定系の処理手順である定量、洗浄が一つの細管上で行うことが可能な被検物質の定量方法を提供することを課題とする。
また、従来、固相担体を用いる被検物質の定量方法は種々提案されているが、高感度の達成と、処理の簡便化及び処理の短時間化の課題を同時に解決した手段の提供はなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、光透過性の細管を用い、細管中に固相担体を保持し、この固相担体により被検物質を簡便に測定することを主要な特徴とする。
つまり本発明は以下よりなる。
「１．光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることを特徴とする被検物質の定量方法。
２．分注器を用いて、細管中の固相担体中に被検物質を展開させる前項１に記載の被検物質の定量方法。
３．展開後に、細管中の固相担体を洗浄し、その後細管部の光透過性を利用して直接又は間接に被検物質を定量する前項１又は２に記載の被検物質の定量方法。
４．前記の被検物質を定量することのできる物質として、被検物質に対する特異的結合抗体（一次抗体）を使い、これを固相担体に固定化し、修飾若しくは標識された被検物質に対する特異結合抗体（二次抗体）を被検物質と接触、反応させ、当該反応産物を細管の固相担体中に展開させることを特徴とする前項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
５．前記の被検物質を定量することのできる物質として、被検物質に対する特異結合物質を使い、これを固相担体に固定化し、一方、修飾若しくは標識された測定対照物質（被検物質と同じ物質）と被検物質を含む検体を混合し、当該混合物を細管の固相担体中に競合的に展開させることを特徴とする前項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
６．前記の被検物質を定量することのできる物質として、「基質」及び「基質に対する酵素の作用による生成物質と反応して発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質」を使い、これらを固相担体に固定化し、被検物質と当該酵素を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と酵素を接触させることにより、被検物質による酵素活性の阻害作用によって、被検物質の定量を行うことを特徴とする前項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
７．一定量の基質に対する酵素と被検物質を事前に接触させたのち細管の固相担体中に展開させる前項６に記載の被検物質の定量方法。
８．前記の被検物質を定量できる物質として、被検物質に対する酵素の作用によって生産される生成物と反応して発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質を使い、これを固相担体に固定化し、被検物質に対する酵素の作用によって生産される当該生成物を細管の固相担体中に展開させて、当該生成物と該固定化物質と接触させることを特徴とする前項１〜３の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
９．前記被検物質を定量するために、細管の固相担体中の展開量を、被検物質が低濃度の場合には増加、被検物質が高濃度の場合には減少変化させて検出可能とする前項１〜８の何れか一に記載の被検物質の定量方法。
１０．光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることができることを特徴とする被検物質の定量用容器。
１１．前項１〜９のいずれか一に記載の方法に使用される少なくとも１の試薬及び光透過性の細管からなる容器を含む被検物質の定量用キット。」
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、細管及び固相担体を用いることにより抗体と抗原の結合性又は酵素と基質の反応性を向上させるとともに、短時間で高感度の検出及び定量を可能としている。ＥＬＩＳＡでは、２時間程度必要とされる検出を５分で検出定量可能である。また、イムノテストストリップでは不可能であった濃度の検出・定量も担体の部分を通過させる検体量を制御させることで可能である。 
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は、光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることにより、被検物質の定量が可能となることを特徴とする被検物質の定量方法である。本発明では、固相担体に固定化する「被検物質を定量することのできる物質」を所望により種々変化させることにより、目的の被検物質の簡便な定量を可能とする。個々の文言の定義は、以下の説明により明らかとなる。
【０００７】
本発明の第１の態様は、「被検物質を定量することのできる物質」として、被検物質に対する特異結合抗体（一次抗体）を用いる。この被検物質に対する特異結合抗体（一次抗体）が、細管の先端部の固相担体に固定化される。この系では、被検物質と修飾若しくは標識された被検物質に対する特異結合抗体（二次抗体）を、被検物質を含む検体と接触、反応させ、これを細管中に展開させて、被検物質と二次抗体の複合体を固定化された一次抗体で捕捉し、捕捉された複合体の修飾若しくは標識をマーカーにして被検物質量を細管から直接測定する。ここで、修飾若しくは標識としては、金コロイド、ラテックスビーズ、蛍光物質、酵素などが例示され、金コロイドおよびその他金属ナノ粒子、ラッテクスビーズでは呈色反応、蛍光物質としてはFITC, QDを用いて蛍光反応、酵素では発光、蛍光、若しくは発色で検出・定量する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、「被検物質を定量することのできる物質」として、被検物質に対する特異結合物質を用いる。特異結合物質とは、抗原、抗体、レセプター、リガンド、レクチン、糖鎖化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ等が例示される。この特異結合物質が、細管の先端部の固相担体に固定化される。この系では、修飾若しくは標識された測定対照物質（被検物質と同じ物質）を、被検物質を含む検体と接触させ、これを細管中に展開させて、被検物質と修飾若しくは標識された測定対照物質（被検物質と同じ物質）を固定化された一次特異結合物質で競合的に捕捉し、捕捉された測定対照物質の修飾若しくは標識をマーカーにして被検物質を細管から直接定量測定する。修飾物質若しくは標識としては、前記と同じである。
【０００９】
本発明の第３の態様は、「被検物質を定量することのできる物質」として、「所望の酵素を認識する基質」と「基質に対する当該酵素の作用による生成物質と反応して発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質」を用いる。これらが、細管の先端部の固相担体に固定化される。この系では、当該酵素と被検物質の相互作用性を利用する。相互作用とは、当該酵素と被検物質の結合によって、当該酵素の活性が阻害されることが例示される。これにより、当該酵素と被検物質の複合体を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と当該酵素を接触させることにより、被検物質による酵素活性の阻害のレベルによって、被検物質の定量を行う（間接的定量）。この場合、一定量の当該酵素と被検物質を事前に接触させたのち細管の固相担体中に展開させることが好ましい。ここで、当該酵素が、被検物質と複合体を形成し、当該酵素が被検物質の量に応じてマスクされる。マスクされなかった当該酵素の量に応じて、固定化された当該酵素に対する基質の反応産物が細管中で産生され、この反応産物が発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質と反応する。反応した発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質をマーカーにして被検物質の濃度を細管から測定することができる。
【００１０】
本発明の第４の態様は、「被検物質を定量することのできる物質」として、被検物質に対する酵素の作用によって生産される生成物と反応して発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質を使う。ここで、当該酵素は、被検物質に対して酵素作用を有しており、その作用により所望の生成物が生産され、この生成物が発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質に作用して、発色、発光、若しくは蛍光を提示させうることが必要である。このような物質が、細管の先端部の固相担体に固定化される。この系では、展開前に、被検物質と当該酵素の接触を行い、酵素反応生成物を予め得、この生成物を細管中に展開させる。生成物と固定化された発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質は接触して反応し、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質は発色、発光、若しくは蛍光を提示することによって被検物質量を測定する。
【００１１】
（被検物質）
本発明における被検物質は、抗体認識物質、特異結合物質が存在しうる全ての物質、酵素と反応し発色、発光、若しくは蛍光等で検出できる物質、酵素と反応して酵素活性を阻害する機能を有する物質、又は酵素と反応性を有する基質である。
被検物質は、抗原、抗体、レセプター、リガンド、レクチン、糖鎖化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡなどが挙げられる。被検物質の機能から分類すると、ホルモン、イムノグロブリン、凝固因子、酵素、薬剤、農薬などと呼ばれるものを含む。物質名では、血清アルブミン、マクログロブリン、フェリチン、α−フェトプロテイン、ＣＥＡ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ＨＩＶ−１ｐ２４などが被検物質の例として挙げられる。これらの被検物質は、血液、唾液、尿、鼻汁、涙液、糞便、組織抽出液、培養液、土壌中などに含まれる場合も多い。被検物質は、天然物、人工合成物、遺伝子組換産物などのいずれでもよく、その由来、存在状態などにより限定されるものではないと同時に例示によっても限定されない。なお、実施例では試料とも表示し、具体例として、hCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）、ダイアジノンを対象とした。
【００１２】
（特異結合物質）
本発明における特異結合物質は、被検物質と特異的に結合する物質をいう。抗原に対しては抗体、ＤＮＡに対してはハイブリダイズすることができるＤＮＡ、ビオチンに対してはアビジンあるいはストレプトアビジン、ホルモン受容体（例えばインスリン受容体）に対してはホルモン（例えばインスリン）、レクチンに対しては対応する糖鎖、などがそれぞれ特異結合物質の例として挙げられる。また、特異結合物質は、特異的結合能を有するそれらのフラグメントあるいはサブユニット、修飾あるいは標識された特異結合物質、修飾あるいは標識された特異的結合能を有するそれらのフラグメントあるいはサブユニットなどをも含む。例えば、ビオチン化抗原、ビオチン化抗体、ビオチン化Ｆａｂ'、酵素標識抗原、酵素標識抗体、酵素標識Ｆａｂ'、ハプテン化抗原、ハプテン化抗体、ハプテン化Ｆａｂ'、ビオチン化レセプター、ビオチン化ホルモン、ビオチン化ホルモン受容体、酵素標識ホルモンレセプターなどが例示されるが、これらに限定されるものではない。
なお、実施例では一次抗体とも表示し、具体例として、hαs抗体を使用した。
【００１３】
（基質）
本発明における基質は、所謂酵素の基質を意味する。特定の酵素を認識し、該酵素の作用で反応がおこり反応産物を産生する。なお、実施例では、アセチルチオコリン（ATCh）を基質として用い、被検物質をダイアジンとし、ダイアジンと結合性を有する酵素として、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）を用いた。さらに発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質に作用する基質から得られる反応産物としてチオコリン（TCh）を用いた。
【００１４】
（酵素）
本発明において使用する酵素という文言は、一般的な意味で使用する。被検物質に対して酵素作用を有する物質である。そして、この酵素作用によって、被検物質は発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質に作用する物質を産生する。
本発明における特別な意味の酵素は、目的とする被検物質との結合性を有し該被検物質との結合によって、当該酵素のもつ酵素機能を阻害する物質である。該酵素は、被検物質と基質に対して競合的に結合能を有する。また、該酵素は、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質に作用する物質を、基質に作用して産生させうることが必要である。このような酵素の例として、酵素アセチルコリンエステラーゼ（AChE）は、農薬（ダイアジノン）により酵素機能がマスクされる、また、アルコールがアルコール脱水酵素により、アセトアルデヒドに、また有機リン酸系農薬とエステラーゼの関係が例示される。実施例では、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）を酵素として用いた。
【００１５】
（発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質）
本発明における発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質は、被検物質量を直接的に又は間接的に発色、発光、若しくは蛍光というようなシグナルによって測定可能とする物質である。
例えば、酵素と基質との反応で得られる反応産物の作用によって、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質が例示される。この代表例として、実施例では、5,5'-dithiobis-2-nitrobenzonic acid (DTNB)を用いた。また、系によって、特異的結合抗体を修飾する物質、対照被検物質を修飾する物質として使われることもあり、さらに系を選択することによって反応産物（基質）自体が発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の場合もある。
【００１６】
（固相担体）
本発明における固相担体は、従来の固相測定法で使用されているものでも、あるいは新しいものでもよく、材質、形状などによって限定されない。例えば、種々の大きさのポリスチレン球、ナイロン球、ガラス球、ポリスチレン試験管内面、ラテックス粒子、各種磁性粒子などのいずれでもよい。好適な事例として、実施例では、シリカ又はメタルキレート樹脂を使用した。固相担体の大きさは、溶液通過可能なことを要件として、本発明の特徴である使用する細管との組み合わせで決定される。
【００１７】
（被検物質を定量することのできる物質の固相担体への固定）
本発明において固相担体への特異結合物質、基質、酵素、抗体、抗原、又は、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の固定は、物理的吸着、抗原抗体結合、イオン結合、ジスルフィド結合、ＤＮＡハイブリッド等既知の方法を利用して行うことができるが、簡便には物理的吸着法である。
実施例では最適例として、一次抗体固定化支持体例えば一次抗体（hαs抗体）固定化シリカ又はメタルキレート樹脂、アセチルチオコリン及びDTNB固定化シリカ又はメタルキレート樹脂を使用した。
【００１８】
（光透過性の細管）
本発明において光透過性の細管とは、細管の外部から容易に固相担体における反応における変化が直接測定或は確認できるために少なくとも光透過性である。細管の内径は、少量の検体量で十分な測定が達成できる大きさである。また、光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることができる定量用容器である。
円柱管形状の細管の場合、固相担体の充填は、片側の先端より充填することで行える。検体溶液の細管内への導入のため、好ましくは、細管内に流入される検体溶液量を制御可能であるピペッター等で使用されるチップが良い。
細管が先細のテーパー状の場合は、先細先端部から検体溶液の細管内への流入が可能でかつ固相担体の保持が可能な径の先端口を持つ。テーパー状形状の細管の場合、固相担体の充填は、広く空いた側から担体を充填し固定する。細管がテーパー状の場合は、分注器等に取り付け、検体溶液を細管内に流入させることが好適である。被検物質を定量することのできる物質が固定化された固相担体が細管に充填された後、被検物質を定量することのできる物質が変性されない条件で乾燥処理を行い製剤化が達成できる。乾燥処理は、従来公知の減圧乾燥、凍結乾燥等がある。
なお、ピペッター等で使用されるチップを細管として使用する場合には、市場で一般的であり、多くのメーカーから入手可能である従来公知のチップを用いることができる。例えば、種々のサイズのノーズピース（10,50,100,200μl）、ゴム製インサートおよび種々のサイズの使い捨てチップ（10,50,100,200μl）またはプラスチック製またはガラス製ピペット（10,50,100,200μl）を利用できるが、これらに限定されない。
【００１９】
（修飾若しくは標識された被検物質に対する特異結合抗体：二次抗体）
本発明の第１の態様においては、被検物質に対する特異結合抗体（二次抗体）を試薬として用いる。本発明における特異結合抗体（二次抗体）は、被検物質と特異的に結合する物質をいう。そして、少なくとも一次抗体との違いは、同じ被検物質の異なる特異的結合部位を有することである。この条件を満たす限り、特異結合抗体の定義は前記と同一である。そしてこの二次抗体は、修飾若しくは標識されている。この測定用修飾物質あるいは測定用標識物質として使われる物質は、例えば、酵素、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、金属など、具体的には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、Ｉ１３１、Ｉ１２５、フルオレセイン、エクオリン、アクリジニウム、ユーロピューム、金コロイドが例示されるが、より好適には金コロイド、蛍光標識物質が例示される。実施例では最適例として、金コロイド標識二次抗体（抗hCG抗体）を使用した。
【００２０】
（修飾若しくは標識された測定対照物質）
本発明の第２の態様においては、測定対照物質を試薬として用いる。本発明における測定対照物質は、被検物質と同じ物質をいう。そしてこの測定対照物質は、修飾若しくは標識されている。この測定用修飾物質あるいは測定用標識物質として使われる物質は、例えば、酵素、ラジオアイソトープ、蛍光物質、発光物質、金属など、具体的には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、Ｉ１３１、Ｉ１２５、フルオレセイン、エクオリン、アクリジニウム、ユーロピューム、金コロイドが例示されるが、より好適には金コロイド、蛍光標識物質が例示される。
【００２１】
修飾又は標識物質の二次抗体又は測定対照物質への結合は、物理的な結合、イオン的な結合、抗原抗体結合でもよいが、例えばリンカーを経ても結合可能である。修飾又は標識物質の活性化によって、化学結合を可能にし、ついで必要なリンカーを結合させ、さらには二次抗体又は測定対照物質を反応させることによっても調製できる。或は、予めリンカーと二次抗体又は測定対照物質の反応産物を調製しておき、最終的に活性化された修飾若しくは標識物質と結合させてもよい。反応条件は、各修飾又は標識物質に適合した自体公知の手法が適用可能である。
【００２２】
（本発明の第１の態様での測定）
検体中の被検物質の測定は以下のように行われる。
１）被検物質が、修飾若しくは標識された被検物質に対する特異結合抗体（二次抗体）で前処理される場合は、両者が接触し、被検物質は二次抗体で捕捉され「被検物質−二次抗体−修飾若しくは標識物質」の複合体が形成される。
２）ついで、一次抗体を固定化した固相担体を担持する細管の溶液導入口を前記複合体を含む溶液中に浸し細管内に前記複合体を展開させる。この展開は、分注器を用いておこなう事によって正確に定量できる。
３）展開された前記複合体は、細管内で被検物質と一次抗体との反応により固相に捕捉される（「固相」−「一次抗体」−「被検物質」−「二次抗体」−「修飾若しくは標識物質」）。かくして、前記複合体が固相に捕捉された結果、被検物質は固相に捕捉され、所望により洗浄される。そして、被検物質は修飾若しくは標識物質をマーカーとして細管で直接同定（測定）される。例えば修飾若しくは標識物質が、金コロイドの場合、金コロイドの集積による呈色がおこり、蛍光物質の場合は、蛍光がおこり、これらを、既知の被検物質濃度の呈色又は蛍光の強度（コントロール：検量線）と比較することによって被検物質の量（検体中の濃度）を決定できる。
なお、被検物質が、修飾若しくは標識された被検物質に対する特異抗体（二次抗体）で格別に前処理されることなく、被検物質、修飾若しくは標識された被検物質に対する抗体（二次抗体）を混合接触と同時に、本発明の一次特異結合物質を固定化した固相担体を担持する細管の溶液導入口を前記複合体を含む溶液中に浸し細管内に前記複合体を展開させてもよい。
【００２３】
（本発明の第２の態様での測定）
検体中の被検物質の測定は以下のように行われる。
１）被検物質が、修飾若しくは標識された測定対照物質（被検物質と同じ物質）と接触されている場合は、両者が検体中で並存している。
２）ついで、一次抗体を固定化した固相担体を担持する細管の溶液導入口を前記両者（被検物質、修飾若しくは標識された測定対照物質）が並存している検体溶液中に浸し細管内に展開させる。この展開は、分注器を用いておこなう事によって正確に定量できる。
３）展開された前記両者は、細管内で固定化された一次抗体で競合的に捕捉され、所望により洗浄される。かくして、前記両者が固相に競合的に捕捉された結果、捕捉された測定対照物質の修飾若しくは標識をマーカーとして細管で直接同定（測定）される。例えば、検体中に被検物質がない場合あるいは低濃度の場合には、修飾若しくは標識された測定対照物質が固相担体に多く捕捉される。これにより、修飾若しくは標識物質が、金コロイドの場合、金コロイドの集積による濃い呈色がおこり、蛍光物質の場合は、強い蛍光がおこり、これらを、既知の被検物質濃度の呈色又は蛍光の強度（コントロール：検量線）と比較することによって被検物質の量（検体中の濃度）を決定できる。
逆に、検体中に被検物質が多い場合（すなわち高い濃度）には、修飾若しくは標識された測定対照物質が固相担体にわずかにしか捕捉されない。これにより、修飾若しくは標識物質が、金コロイドの場合、金コロイドの集積による呈色がおこらない又は薄い、蛍光物質の場合は、弱い蛍光がおこり、これらを、既知の被検物質濃度の呈色又は蛍光の強度（コントロール：検量線）と比較することによって被検物質の量（検体中の濃度）を決定できる。
なお、被検物質が、修飾若しくは標識された測定対照物質と接触されることなく、被検物質、修飾若しくは標識された測定対照物質を混合接触と同時に、本発明の一次抗体を固定化した固相担体を担持する細管の溶液導入口を前記両者を含む溶液中に浸し細管内に前記両者を展開させてもよい。
【００２４】
（本発明の第３の態様での測定）
検体中の被検物質の測定は以下のように行われる。
１）被検物質と触媒機能を有する物質（酵素）との反応を前処理する場合は、両者の接触によって、被検物質と酵素の複合体が形成される。ここで、酵素の機能は、複合体形成により、阻害される。
２）ついで、当該酵素に対して反応性を有する基質及び発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質を固定化した固相担体を担持する細管の溶液導入口を前記複合体を含む溶液中に浸し細管内に前記複合体を展開させる。この展開は、分注器を用いておこなう事によって正確に定量できる。
３）展開された前記複合体は、固定化された基質とはもはや反応しないので、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質への作用はない。しかし、被検物質と複合体を形成しなかった酵素は、固定化された基質と反応し、基質から酵素の作用で得られる反応産物が発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質と反応する。
かくして、被検物質は、反応した発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質をマーカーとして細管で同定（測定）される。例えば、検体中に被検物質がない場合あるいは低濃度の場合には、細管中を展開する複合体を形成しない酵素の量が多い。そのため、多量の酵素が、固定化された基質と反応する。これにより、多量の発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質に作用する反応産物が細管中に産生され、反応産物の発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質への作用によって、強い発色を示す。かくして、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の発色、発光、若しくは蛍光の強度を測定し、既知の被検物質濃度の発光、若しくは蛍光の強度（コントロール：検量線）と比較することによって被検物質の量（検体中の濃度）を決定できる。逆に、検体中に被検物質が多い場合（すなわち高い濃度）には、細管中を展開する複合体を形成しない酵素の量が少ない。そのため、少量の酵素が、固定化された基質と反応する。これにより、少量しか発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質へ作用する反応産物が細管中に産生されず、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質への作用も十分でなく、弱い発色しか示さない。かくして、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の発色、発光、若しくは蛍光の強度を測定し、既知の被検物質濃度の発光、若しくは蛍光の強度（コントロール：検量線）と比較することによって被検物質の量を決定できる。
なお、被検物質が、酵素で格別に前処理されることなく、被検物質、酵素を混合接触と同時に、本発明の基質及び発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質を固定化した固相担体を担持する細管の溶液導入口を前記複合体を含む溶液中に浸し細管内に前記複合体を展開させてもよい。
【００２５】
（本発明の第４の態様での測定）
検体中の被検物質の測定は以下のように行われる。
１）被検物質と酵素との反応を前処理する場合は、両者の接触によって、被検物質から酵素の作用で生成物が形成される。ここで、被検物質は、当該酵素に対する基質である。
２）ついで、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質を固定化した固相担体を担持する細管の溶液導入口を前記生成物を含む溶液中に浸し細管内に前記生成物を展開させる。この展開は、分注器を用いておこなう事によって正確に定量できる。
３）展開された前記生成物は、固定化された発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質に作用して、発色、発光、若しくは蛍光を提示させる。
かくして、被検物質は、反応した発色、発光、若しくは蛍光をマーカーとして細管で直接同定（測定）される。例えば、検体中に被検物質がない場合あるいは低濃度の場合には、細管中を展開する生成物の量が少ない。そのため、小量の生成物が、固定化された発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質と反応する。これにより、小量の生成物の発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質への作用によって、弱い発色、発光、若しくは蛍光を示す。かくして、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の発色、発光、若しくは蛍光の強度を測定し、既知の被検物質濃度の発色、発光、若しくは蛍光強度（コントロール：検量線）と比較することによって被検物質の量（検体中の濃度）を決定できる。逆に、検体中に被検物質が多い場合（すなわち高い濃度）には、細管中を展開する生成物の量が多い。そのため、多量の生成物が、固定化された発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質と反応する。これにより、多量の生成物によって、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質への作用も十分であり、強い発色、発光、若しくは蛍光を示す。かくして、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の発色、発光、若しくは蛍光の強度を測定し、既知の被検物質濃度の発色、発光、若しくは蛍光強度（コントロール：検量線）と比較することによって被検物質の量を決定できる。
【００２６】
修飾若しくは標識物質並びに発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の測定は、細管の光透過性を利用して行われる。呈色又は蛍光は、自体公知の方法で定量可能である。金コロイドの場合は、例えば、イムノテストストリップ法が利用できる。また、発色試薬の場合は、例えば、 ペルオキシダーゼに対するテトラメチルベンヂジン（TMB）等が利用できる。
本発明では、被検物質と修飾若しくは標識物質の複合体が細管内を展開し、一次抗体による捕捉で被検物質と修飾若しくは標識物質の複合体が被検物質の濃度に応じて集積し、呈色或は蛍光が増大する。この増大によって、被検物質の検出及び定量を可能にする。
また、本発明では、被検物質と酵素の複合体が細管内を展開し、複合体を形成しなかった酵素と基質が反応し、続いて反応した基質と発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質が反応し、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質の発色、発光、若しくは蛍光が被検物質の濃度に応じて呈色或は蛍光が減少する。あるいは、酵素と被検物質の反応により、発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質に作用する生成物が生成され、被検物質の濃度に応じて呈色あるいは蛍光が増加する。
本発明では、細管に分注器を取り付けて測定するので、被検物質を含んだ溶液（検体）を定量しながら、細管内の固相担体中を展開させることが可能であり、低濃度の被検物質溶液でも細管内の固相担体中の展開量を増加させることで検出限界を上げること、さらには微量濃度の定量測定が可能である。また、高濃度の被検物質溶液でも細管内の固相担体中の展開量を減少変化させることで定量測定が可能である。
さらに、細管内の固相担体に被検物質を捕捉後に、リン酸緩衝液等を通過させることによって固相担体中の非特異的な標識抗体を洗い流し、バックグランドを下げて測定することも可能である。
加えて、上記洗浄前又は後において、銀染色を行うことにより、低濃度の被検物質を検出することができる。なお、銀染色の方法は、組織検査で用いられる従来公知の金コロイドの増感法に従って行える。
【００２７】
また、図１のようにマルチピペッター等の分注器を用いることで、多検体を一度に自動化して測定することができる。
【００２８】
（キット）
本発明の被検物質測定方法に使用される少なくとも１の試薬又は容器を被検物質測定用キットとすることができる。被検物質測定者は、被検物質を選択し、被検物質に対応する特異結合物質又は酵素、基質を用意し、本発明のキットを用いることで、簡便に被検物質測定用装置を作成することができる。なお、キット中の試薬例としては、固相担体としてのビーズ、メンブレン、シリカ又はメタルキレート樹脂等が挙げられ、容器例としては、細管である従来公知のピペッター用チップ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
以下で本発明を実施例によって説明するが、本発明は、光透過性の細管の先端部に物質が結合可能な固相担体を有し、該固相担体に被検物質を定量することのできる物質を結合させて固定化し、被検物質を細管の固相担体中に展開させて当該固定化された物質と被検物質を接触させることにより、被検物質の定量が可能であることを特徴とする被検物質の定量方法であって、この基本原理を含む限り本発明はその対象を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の測定系
本発明の実施例について図面を参照して説明する。図２は本発明の一実施例である一次抗体固定化固相担体が詰められた細管を用いて簡便に定量可能な免疫測定法を示す図である。被検物質として、妊娠検査に用いられるヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）の測定系を用いて説明する。抗体固定化固相担体を充填した細管を用いて測定する。細管内の固相担体に一次抗体（hαs抗体）が固定化されている。抗体の固定化方法は細管を分注器に取り付け10 μl（100 μg/ml）の一次抗体を５回吸い吐きして固定した。非特異的吸着を防ぐために100μlの1%牛血清アルブミンでブロッキングした。被検物質と金コロイド標識二次抗体（抗hCG抗体）を反応させ、細管を分注器に取り付けて吸い吐きして固相担体内に一定量通過させた。固相担体上に凝集した金コロイドによる発色を白黒撮影した写真画像の濃さの数値化によって測定した。
hCGの測定の詳細について説明する。10μl対応の抗体固定化固相担体充填細管（チップ）を分注器に取り付け、リン酸緩衝液と金コロイド標識二次抗体（抗hCG抗体）を混ぜた溶液100μlを吸い上げ反応させた。これを撮影し、白黒写真画像の濃さの値を得てコントロールとした。被検物質を含む検体と金コロイド標識二次抗体（抗hCG抗体）を混ぜた複合体を含む溶液100μlを測定した。
0〜50ng/mlの濃度のhCG抗原溶液を被検物質として測定したところ、抗体固定化固相担体部分に金コロイドの集積による呈色が濃度に応じてみられた。呈色の度合いを画像解析で調べたところ、図３に示すような検量線が得られた。2ng/mlの濃度のhCGが検出できた。これは、市販の妊娠検査用のイムノクロマトと同等またはそれ以上である。
同様に0〜5ng/mlの濃度のhCG抗原を同様の方法で測定後、PBS溶液で洗浄し金コロイドの銀染色を行った。濃度に応じて銀染色による金コロイドが染色され、画像解析を用いてチップ先端の担体の色変化で検量線を作製した。図４に示すように、銀染色を行うことにより0.5ng/ml以上の濃度が検出できるようになった。
【実施例２】
【００３１】
ダイアジノン検出系
本発明の実施例について図面を参照して説明する。被検物質としてリン酸系有機農薬の一種であるダイアジノンを用いた。図５に、ダイアジノン検出の原理を示す。ダイアジノン検出試薬には、アセチルコリンエスエステラーゼ(AChE)が入っている。検体中にダイアジノン（被検物質）があれば、AChEとダイアジノンが、結合し、複合体を形成する。これにより、AChEがアセチルチオコリン（ATCh）と反応しない。よって、チオコリン（TCh）が生成されず、TChと発色試薬5,5'-dithiobis-2-nitrobenzonic acid (DTNB)の反応が起こらない。検体中にダイアジノンがない場合、AChEとATChが反応する。これにより、ATChがTChとなり、TChが発色試薬5,5'-dithiobis-2-nitrobenzonic acid (DTNB)と反応し、5'-mercapto-2'-nitrobenzonic acidとなり検体溶液の色は黄色に変色する。
図６は本発明の一実施例である。細管（チップ）の先端には、基質、及び「発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質」を固定化するための固相担体が充填されている。固相担体に、基質であるATChと発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質であるDTNB(5,5'-dithiobis-2-nitrobenzonic acid)を固定化した。ダイアジノン検出溶液に検体溶液を加え、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)とダイアジノンを反応させ、チップに検体溶液を一定量吸引することでダイアジノンの検出を行うことができる。
ダイアジノンの検出方法の詳細について説明する。固相担体を充填したチップに10mMの2μl のDTNBと2.0mMのATChを7.5μlを混合して、チップを分注器で吸い吐きさせることによってDTNBとATChを固相担体に固定化した。完全に固定化させるために4℃で18時間放置し、ダイアジノン検出用のチップ（細管）とした。2.4U/mlのAChEに調製した検出溶液2μlをチップに吸わせて20分待ったところ、図７に示すように、チップ内の検体溶液が黄色に発色した。0.1ppmのダイアジノン溶液（検体：試料溶液）と検出溶液を等量混合し、5分後に2μlを吸い20分後に検出溶液の色を観察したところ薄い黄色に発色していた。同様に1.0ppmのダイアジノン溶液と検出溶液を等量混合し、5分後に2μlを吸い20分後にチップ内の検出溶液の色を確認したところ色の変化は、見られなかった。
以上により、本実施例では、固相担体に基質と「発色、発光、若しくは蛍光を提示する物質」を固定化し、農薬（ダイアジン）の検出を行った。また、チップに充填した固相担体を酵素反応の場として用いており、2μlという微小量を吸引するだけで農薬（ダイアジン）の検出が行えた。これにより、固相担体に固定化させる物質を検討することで様々な被検物質の検出が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明では従来法であるELISA,MEIA(microparticle enzyme-based immunoassay)に比べ短時間かつ簡便に被検物質の検出、濃度測定が可能となる。ELISAでは２時間程度必要とされる検出を５分で検出可能であり、迅速な検出を求められる医療現場、工場生産ラインなどの要求に応えることができる。
また、細管を分注器に取り付けて測定するため、イムノテストストリップでは不可能であった被検物質の濃度の検出も細管に展開させる液量を制御することで可能である。細管の形状は広く用いられているチップ型であるので多項目、多検体の同時測定に応用できる。また検体溶液を反応させた後にリン酸緩衝液等を通過させることでバックグランドを軽減させることが出来る。また、蛍光物質をマーカーとして使用することで感度の向上も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】多検体測定
【図２】実施例１の細管
【図３】実施例１のhCGの測定結果
【図４】実施例１の銀染色後のhCGの測定結果
【図５】実施例２の反応原理
【図６】実施例２の細管
【図７】実施例２のダイアジノンの検出結果
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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