(57)【要約】【課題】試料中の複数の修飾タンパク質を同時検出するための新規な手段の提供。【解決手段】試料中の複数の修飾タンパク質を同時検出するための方法であって、a)特定標的タンパク質に結合できる複数の一次抗体と穏やかなタンパク質変性状態下にて試料を接触させる工程、；b)一次抗体の配座から未結合物質を除去する工程；c)1又は複数のニ次抗体と工程(b)からの物質を接触させる工程、そしてd)試料における複数の修飾タンパク質を検出及び／又は決定する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の複数の修飾タンパク質を同時検出するため及び／又は決定のための方法において、
(a)試料を、１〜10mMの濃度での硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤及び特異的標的タンパク質に結合できる複数の一次抗体と接触させることにより混合物を生成せしめ、そして４〜37℃の温度で、２〜72時間インキュベートし、ここで、前記一次抗体は、固体支持物質上に固定されており、それぞれの前記一次抗体が分別パラメーターによって他から区別することができ、これにより前記一次抗体が、試料中に存在する特定標的タンパク質に結合することができ；
(b)一次抗体の配位座から未結合物質を除去し；
(c)前記（ｂ）からの物質を1又は複数の二次抗体と接触させ、ここで、この1又は複数の二次抗体は、修飾タンパク質の種又は亜種に特異的であり、又は複数のニ次抗体のそれぞれが、修飾タンパク質に特異的であり、これにより、試料中の修飾タンパク質に1又は複数のニ次抗体を結合させ；そして
(d)試料中の複数の修飾タンパク質を検出及び／又は決定する；
ことを含む方法。
【請求項２】
100までの修飾タンパク質を検出及び／又は決定する請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記修飾タンパク質が、リン酸化タンパク質、糖鎖形成タンパク質、アセチル化タンパク質、メチル化タンパク質、ユビキノン化タンパク質、及びプレニレート化タンパク質から選択される請求項1記載の方法。
【請求項４】
修飾タンパク質が、リン酸化タンパク質である請求項3記載の方法。
【請求項５】
固体支持物質が、固体粒子の一連のサブセットを含む、前記サブセットのそれぞれが、特異的な性質又は特徴により他のサブセットと区別できる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記固体粒子が、特異的色、又は発光スペクトルにより区別できる請求項5記載による方法。
【請求項７】
前記固体粒子が、非極性ガラス、ポリスチレン、又はラテックスから形成される球体の形状を含む請求項5記載の方法。
【請求項８】
固体支持物質が、マイクロチップ、多重性ウエルを有するプレート、又はスライドである請求項1記載の方法。
【請求項９】
工程(b)からの物質を、1又は複数のニ次抗体で、その抗体のそれぞれが、あるクラスの修飾タンパク質に特異的である前記ニ次抗体と、工程(c)において接触する請求項1記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)からの物質を、あるクラスの修飾タンパク質に特異的であるニ次抗体と、工程(c)において接触する請求項9記載の方法。
【請求項１１】
工程(b)からの物質を、あるサブクラスの修飾タンパク質に特異的であるニ次抗体と、工程(c)において接触する請求項1記載の方法。
【請求項１２】
工程(b)からの物質を、リン酸化タンパク質に特異的な1又は複数のニ次抗体と工程(c)において接触する請求項1記載の方法。
【請求項１３】
工程(b)からの物質を、複数のニ次抗体で、その抗体のそれぞれが、修飾タンパク質に特異的である前記ニ次抗体と、工程(c)において接触する請求項1記載の方法。
【請求項１４】
工程(b)からの物質を、複数のニ次抗体で、その抗体のそれぞれが、リン酸化タンパク質に特異的である前記ニ次抗体と、工程(c)において接触する請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、リン酸化p38MAPK,リン酸化IkBα,リン酸化Erk2,リン酸化JNK及びリン酸化Aktから選択される請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ニ次抗体が、ビオチン化抗体である請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾タンパク質が、標識化成分と工程(c)の産生物とを接触させることにより、工程(d)において検出及び／又は決定される請求項1記載の方法。
【請求項１８】
標識化成分が、ヒコビリタンパク質を含む請求項17記載の方法。
【請求項１９】
標識化成分が、ヒコエリスリンを含む請求項17記載の方法。
【請求項２０】
標識化成分が、ストレプトアビジンと標識化成分との結合体を含む請求項17記載の方法。
【請求項２１】
試料が細胞溶解体である請求項1記載の方法。
【請求項２２】
試料が、工程(a)における硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤と接触させる請求項1記載の方法。
【請求項２３】
前記洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウムである請求項22記載の方法。
【請求項２４】
試料における複数の修飾タンパク質の同時検出及び／又は決定するキットにおいて、
(a)複数の一次抗体において、その抗体のそれぞれが、特異的標的タンパク質に結合することができ、一次抗体のそれぞれが固体担体物質上に固定され、そして一次抗体のそれぞれが分化するパラメータにより他の物質から区別することのできる前記複数の一次抗体、
(b)アッセイされる細胞物質試料を溶解しそして洗浄するための1又は複数の緩衝液、
(c)緩衝液が1乃至10mMの硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤を含む、アッセイを行うための前記アッセイ緩衝液、及び
(d)修飾タンパク質のクラス又はサブクラスに、又は個々の特異的修飾タンパク質に特異的な1又は複数のニ次抗体、
を含む前記キット。
【請求項２５】
前記固体支持物質は、各サブセットが、特定特性又は特徴により他のサブセットと識別可能な固体粒子の一連のサブセットを含む請求項24記載のキット。
【請求項２６】
前記固体粒子が、色又は発光スペクトルにより識別可能な請求項25記載のキット。
【請求項２７】
固体粒子が、非極性グラス、ポリスチレン、又はラテックスから成形される球状粒子を含む請求項25記載のキット。
【請求項２８】
固体支持物質は、マイクロチップ、複数のウエルを有するプレート、又はスライドである請求項24記載のキット。
【請求項２９】
修飾タンパク質が、リン酸化タンパク質、グリコシル化タンパク質、アセチル化タンパク質、メチル化タンパク質、ユビキニエイト化タンパク質、およびプレニレート化タンパク質から選択される請求項24記載のキット。
【請求項３０】
修飾タンパク質が、リン酸化タンパク質である請求項24記載のキット。
【請求項３１】
前記ニ次抗体が、幾つかのクラスの修飾タンパク質に特異的である1又は複数の抗体を含む請求項24記載のキット。
【請求項３２】
前記ニ次抗体が、幾つかのサブクラスの修飾タンパク質に特異的である1又は複数の抗体を含む請求項24記載のキット。
【請求項３３】
前記ニ次抗体が、リン酸化タンパク質に特異的である請求項24記載のキット。
【請求項３４】
前記ニ次抗体が、複数の抗体を含み、そのそれぞれが、個々の修飾タンパク質に特異的である請求項24記載のキット。
【請求項３５】
標識化された成分をさらに含む請求項24記載のキット。
【請求項３６】
複数の修飾タンパク質に対し、試料を同時に分析する方法において、好ましくは約1乃至10mMの濃度で、約4と約37℃の間の温度で、そして約2から約72時間の時間で、硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤と試料とを接触させることを含む修飾タンパク質を変性する工程。
【請求項３７】
前記洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウムである請求項36記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の「サンドイッチ(sandwich)」アッセイを行う改良方法に関し、より詳細には複数の修飾タンパク質、特に試料における細胞の修飾タンパク質を同時に検出及び／又は決定する改良方法に関する。タンパク質の典型的な「サンドイッチ(sandwich)」アッセイにおいて、1又は複数のタンパク質を含めての物質の混合物を含む試料(一般的に生物的流体又は細胞抽出物)を、それぞれの標的タンパク質に結合する抗体と結合した(associated)一連の微粒子又はビーズと接触させる。特定抗体と微粒子のそれぞれの組み合わせは、たとえば色などの特性を有し、他の組み合わせと区別できる。洗浄し未結合物質を除去した後、抗体に結合するタンパク質を含む微粒子を、検出可能な特定タンパク質に特異的に結合するニ次抗体と接触させる。典型的にニ次抗体は、蛍光マーカなどの検出手段を含む。標的タンパク質が、そうした状況に対し適切な手段により検出され(たとえば蛍光発光を走査する)、定量的に決定される。
【背景技術】
【０００２】
大部分の細胞タンパク質は、休止(silent)状態から活性状態に変換するための修飾が必要である。こうした修飾は、リン酸化(たとえば、チロシン、トレオニン、及び／又はセリン残基)、グリコシル化(膜タンパク質に)、及びアセチル化、プレニール化(prenylation)、及びメチル化(リシン残基)を含む。現在行われている、こうした修飾タンパク質の検出及び測定に、複数の工程が関与するが、それぞれのアッセイでは、単一修飾タンパク質のみ決定可能な方法に限定される。たとえばリン酸化タンパク質を研究する現在の方法は、免疫沈降及びSDS-PAGEオウト・ラジオグラフィ又は標的タンパク質のリン酸化形状に特異的なウエスターン・ブロット分析を組み合わせ32P-標識化無機リン酸塩を使用する。しかしながら、この目的のためのウエスターン・ブロット法は、遅く時間がかかり、さらに同時には1つの分析体しか決定することができない。
【０００３】
単一操作にて試料中の2以上の修飾タンパク質を同時に検出し、そして所望であればそれを決定する方法が要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、所定の生物試料に複数の修飾タンパク質を同時検出し所望であれば定量的な決定方法及びキットを提供する。これらの方法及びキットは、ウエスターン・ブロットによる修飾タンパク質の決定のための満足のいく置き換えであると考えられる。
【０００５】
1つの観点における本発明は、試料中の複数の修飾タンパク質を同時に検出し及び／又は決定する方法を含む；
a)複数の一次抗体が特異的標的タンパク質に結合でき、その一次抗体が固体支持物質上に固定され、それぞれの一次抗体が分化するパラメータにより他から区別することができ、それにより一次抗体が試料中に存在するそれぞれの標的タンパク質に結合する、前記複数の一次抗体と緩やかなタンパク質の変性条件下にて試料を接触させる工程、
b)一次抗体の遺伝子座から未結合物質を除去する工程；
c)1又は複数の二次抗体のそれぞれが、修飾タンパク質の種又は亜種に特異的である前記1又は複数の二次抗体と、又は複数のニ次抗体のそれぞれが、修飾タンパク質に特異的である、前記複数の二次抗体と、試料中の修飾タンパク質に1又は複数のニ次抗体に結合されるよう、工程(b)からの物質と接触させる工程；及び
d)試料中の複数の修飾タンパク質を検出及び／又は決定する工程、
を含む方法。
【０００６】
別の観点における本発明は、以下の方法を行うためのキットを含む、すなわち；
a)複数の一次抗体のそれぞれが、特異的標的タンパク質に結合でき、それぞれの一次抗体は固体支持物質に固定され、そしてそれぞれの一次抗体が、分化するパラメーターにより他から区別できる前記複数の一次抗体； 
b)アッセイができるよう細胞物質試料を溶解し、洗浄するための1又は複数の緩衝液；
c)アッセイを行うためのアッセイ緩衝液が、約1乃至10mMの硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤を含む前記アッセイ緩衝液；および
d)修飾タンパク質の種又は亜種に対し、又は特異的個体の修飾タンパク質に特異的な1又は複数の二次抗体、
を含むこうした方法を行うためのキット。
【０００７】
さらなる観点における本発明は、試料に、硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤を、好ましくは約1乃至10mMの濃度、約4乃至37℃の温度、そして2乃至72時間にて接触させることを含む、試料から複数の修飾タンパク質を同時に分析するための全体的な過程で修飾タンパク質の変性化のための方法を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の方法を行う場合に試料となる物質を、分析のため選択される。一般的にその物質は、生物的流体又は細胞抽出物であり、たとえば細胞溶解質である。こうした溶解質は、組織培養細胞、血液から抽出される細胞、又はin vivoにおける固形組織試料を含む種々の資源から得ることができる。その溶解質を、標的タンパク質すなわち試料中に存在し及び／又はその定量が検出又は決定されるタンパク質の非修飾部分に特異的である複数の一次抗体と緩やかなタンパク質変性条件下で接触させる。
【０００９】
一次抗体が固体支持物質に固定され、それぞれの一次抗体は、分化パラメーターにより他から区別することができる。固体支持物質は、分化を可能にする複数のビーズ又は他の粒子で良く、そこに抗体を例えば結合を介し固定化される。選択肢として前記抗体を、固形物質又はデバイス上、たとえばマイクロチップ、プレート(たとえば96-ウエルのプレート)又はスライド上にて固定化しても良い。
【００１０】
異なる抗体と粒子の組み合わせとの間(さらに異なる抗体の間）を区別できる能力は、違った型の複数の粒子を提供し、そしてその１つの型の粒子上にそれぞれの一次抗体を固定化することにより行われる。すなわち、その粒子がサブセットに分割され、それぞれのサブセットが、特定の性質、1又は複数の特徴により他のサブセットから区別することができる。こうしたそれぞれのサブセットを、異なる一次抗体に結合させ、従って特定抗体と粒子の各組み合わせが、別の抗体と粒子との組み合わせと区別することができる。たとえば、前記粒子が、サブセットに分割することができ、そこで各サブサットが特定の色、又は発光スペクトルにより区別可能であり、それは、たとえば米国特許5,981,180に記載のように、その内部又はその上に組み込まれた単色蛍光色素又は蛍光色素類を組み合わせを提示することで提供することができる。ビーズ又は粒子に抗体を結合させることは、当業者に周知で、特許及び科学文献(たとえば、Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay,John E.Butler,CRC Press,1991 and Immobilized Enzymes,Antigens,Antibodies,and Peptides,editd by Howard H.Weetall,Marcel Dekker,Inc.New York,1975を参照)に記載された、共有結合又は吸着方法によって行われる。
【００１１】
粒子それ自体は、典型的に球状(すなわち「ビーズ」又は「微小球体」)であり、面が荒いか、平滑かのいずれかの、そして周知な技術にて調製される。これらは、種々の物質から、通常非孔性ガラス、ポリスチレン、ラテックス又は他の重合物質から作成され、そして一般的に0.05μから90μの直径、好ましくは直径が0.5μから10μ、約1乃至2g/mLの範囲の密度、この好ましくは水に極めて近い密度である。
【００１２】
一旦一次抗体と粒子のサブセットの組み合わせが行われると、そのサブセットが、本発明のアッセイ方法及び／又はキットに使用するため組み合わされる。
【００１３】
粒子以外の固体支持体が、たとえばガラス、重合体の又はシリカ製チップ、プレート、スライドが使用されると、一次抗体が、技術的に周知の支持体表面の特定(たとえばプレートの特定ウエルに）場所に固定され、さらに分化することができ、そして支持体上のこれらの場所により同定することができる。
【００１４】
その細胞を溶解した後、硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤(好ましくは1乃至10mMの濃度に）を含む緩衝液が加えられる。その洗剤は、好ましくはSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)である、しかしながらアルキルの硫酸塩又はアルカンのスルホン酸塩など同様の洗剤を使用することができる。次にその試料を、穏やかな変性条件下(たとえば上記SDSの量、約4と約37℃の間の温度、及び約2乃至72時間の間の時間)にて固定化した一次抗体と接触させる。
【００１５】
米国特許第4,658,022では、一般的な型のタンパク質アッセイの先行技術を記載しており(1個体のタンパク質の決定にしか用いられない)、その技術におけるタンパク質の変性は、有意的に高い温度(50℃以上)で、そして有為的に短時間(1分又はそれ以下)で行われる。その特許によれば、一般的タンパク質の変性化は、タンパク質の良好な検出を可能にし、特に標的エピトープが隠れている場所のタンパク質を有意的に好適に検出することが可能である。さらに、その特許では、有意的に高い温度における変性が好適であり、その理由は、迅速に行うことができ、そのため全体的手順を短縮できる。しかしながら、本発明など複数タンパク質を同時に決定する過程におけるタンパク質において適切な決定を得るためには、こうした条件下での変性は適切でないことが、本発明者により明らかにされた。
【００１６】
従って、本発明の方法における本明細書に明示されたように穏やかな変性が用いられる。それと関連してなを注意すべきことは、SDSなどの洗剤が、穏やかな変性に有益であるという事実は、驚くべきことである。一般的にSDSは、標的タンパク質も捕獲抗体にも強力に変性できる強い洗剤である。たとえばSDSが、抗体を非特異性にさせ、所望のタンパク質より他の標的に前記抗体を結合できるように、前記抗体をある程度変性することができる。そうした理由のため、一般的タンパク質・サンドイッチ・アッセイにおいてその使用を避けている。
【００１７】
それ自体の変性方法は、本発明のもう1つの観点を構成し、そして試料中の複数の修飾タンパク質を同時アッセイのための本方法又は別の方法に使用することができる。
【００１８】
修飾タンパク質の穏やかな変性の後、それに一次抗体を結合させ、次にその物質を、試料中のタンパク質の修飾した位置に特異的で、そしてそこに結合する1又は複数のニ次抗体と接触させる。ニ次抗体は、一方で検出又は決定が求められる特定修飾タンパク質、たとえば修飾ErK2,JNK又はAktにそれぞれ特異的である抗体から選択することができる。そのためそうした場合に、こうした多重タンパク質を同時検出及び／又は決定できるように、こうしたニ次抗体の多重性が利用される。
【００１９】
しかしながら、別な例において1又は複数のニ次抗体は、クラス又はサブクラスの修飾タンパク質に特異的な抗体から選択される。「クラス」とは、1又は複数の任意の位置、任意の時間数で修飾群より修飾タンパク質の型の意味である。こうしたクラスは、たとえば一般的にリン酸化、グリコシル化、ユビキノン化、メチル化、アセチル化、又はプレニル化タンパク質を含む。
【００２０】
「サブクラス」という用語は、こうしたクラスの亜群を指した意味であり、そこで修飾化が、特定の位置又はより典型的には、タンパク質における1又は複数のアミノ酸の位置に関係なく特定アミノ酸上に起こる。サブクラスは、特異的未修飾タンパク質のいずれにも限定されない。たとえばリン酸化タンパク質のサブクラスの例は、リン酸化チロシン、リン酸化セリン、及びリン酸化トレオニンを含む。リン酸化タンパク質の場合、二次抗体では、ビオチン化抗体が好ましい。
【００２１】
特異的修飾タンパク質に対するニ次抗体の例は、たとえばラビット・モノクロナール抗-リン酸-ERK2(Cell Signaling Technology)及び抗-リン酸-Lck(BioSources)(phosphorylation)を含む。
【００２２】
サブクラスのタンパク質に特異的である二次抗体は、たとえば、抗リン酸チロシン(SIGMA Chemical,clone PT66 cat 3 B1531又はTransduction Lab,Clone PY20-cat#P11123)、アセチル化-リシン・ポリクロナール抗体(Daiichi)(acetylation)、ラビット・抗-ユビキチン抗体(Institute Pasteur)(ubiquination)、及びマウスモノクロナール抗-メチル化アルギニン(Abcam)(methylation)を含む。
【００２３】
あるクラスのタンパク質に対し、すなわちリン酸化、又はユビキチン化タンパク質に特異的なニ次抗体を使用すると、単一のニ次抗体を使用するそのクラスの複数修飾タンパク質の同時決定を可能とする。さらなる例においてこうした複数のニ次抗体が利用され、それぞれが、異なるクラスの修飾タンパク質に対し選択性がある。すなわちニ次抗体の混合物が用いられると、その1種(又は複数種)がリン酸化タンパク質に対し、ユビキチン化タンパク質に対し別のものが、メチル化タンパク質に対しさらに別のものが、選択される。これは、試料中の一般的修飾タンパク質の、又は使用されるニ次抗体により幾つかのクラスの修飾タンパク質を検出し、及び／又は(定量的)決定することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
リン酸化タンパク質の場合、このクラスに対する現段階での利用可能な抗体の選択性は、要望されるより精度が低くなる傾向にある。その結果アッセイの目的が、修飾されたリン酸化タンパク質を、一般的に検出、又は決定することであるなら、サブクラスに対する抗体、すなわちセリン、トレオニン、及びチロシンのリン酸化に抗体を組み合わせることは、全体として上記クラスに対し単一抗体に優先して使用されるべきである。
【００２５】
アセチル化タンパク質に対し選択される抗体は、特異的アセチル化タンパク質に対し選択性のある抗体、及び一般的にアセチル化リシン残基を検出する(すなわち、アセチル化に対し選択されるクラス)選択性のある抗体を含む。グリコシル化タンパク質に対し選択性のある抗体は、特異的グリコシル化タンパク質、及びビオチン化レクチンに対し選択性のある抗体を含み、それは、グリコシル化タンパク質のクラスに対する選択性である。
【００２６】
当業者は、抗体に対し分析物を結合させることは、時間、温度、pH、試薬のイオン強度などインキュベーションの条件により影響され、そして所定のアッセイの条件は、試験の感受性及び特異性を最適にし、そして手順による容易な使用及び自動化への適合性に一般的に適するよう技術的に周知なように選択される。
【００２７】
ニ次抗体又は抗体の混合物を接触させた後、次に「サンドイッチ」物質は、たとえば、ストレプトアビジンなど、ニ次抗体に結合する成分を有する標識化成分と接触させることにより検出、及び/又は定量的に決定することができ、前記標識化成分が、ピコイレシリン(PE)、又は別の標識により標識化され、前記他の標識は、染料又は放射性活性標識など他の型の標識でよく、後者の決定が標準的な技術を使用している。幾つかの例で検出は、ニ次抗体の標識化成分に直接結合することにより行うことができる。
【００２８】
ストレプトアビジンに蛍光標識を共有結合させることは、前に特許及び科学文献(Haugland,R.P.,Bhalagat,M.K.,Preparation of avidin conjugates,Methods Mol.Biol.1998;80:185-96)に記載された種々の技術により行うことができる。典型的な蛍光成分が、前のManual of Clinical Laboratory Immunologyの3章に記載されている。選択肢として、結合物質が、市販供給資源から得ることができる。フルオレセインなどの蛍光染料、アリルスルホネート・シアニン染料、ピコビリタンパク質染料、ボデピー染料などを用いることができる。粒子のサブセットが、蛍光色素を組み入れることを基本にし、相互に識別されれば、標識成分に使用される染料が、粒子サブセットの発光スペクトルから区別され、且つそれにより干渉されない蛍光発光を有するように選択される。好ましい型の蛍光物質が、ヒコビリプロテインとして知られた種の化合物、より具体的にヒコエリセリン、ヒコシアニン、及びアロヒコシアニン、最も好ましくはヒコエリセリンである。
【００２９】
物質が、ニ次抗体にストレプトアビジンを結合させるための適切な条件下、インキュベートされる。この全体の方法において、蛍光的に標識化されたストレプトアビジンが、一次、及びニ次抗体を介し、そして修飾タンパク質に一次抗体を結合することにより粒子に結合する。従って修飾タンパク質が、選択された蛍光標識を励起するための選択された波長を有する励起エネルギーを印加することにより検出、及び測定することができ、ここで発生される発光スペクトルは、その粒子に組み入れられた発光スペクトルから区別される。
【００３０】
別の修飾タンパク質の検出は、たとえば、SPR(表面-プラスモン共鳴)技術の使用によって、標識を使用することなく行うことができる。
【００３１】
本発明の方法、及びキットを用いることにより、試料中の複数修飾タンパク質の同時決定を行うこともできる。その方法は、わずか50セル(cell)を用いて、単一試料中に、100以上もの修飾タンパク質を同時に検出、及び/又は決定することができる。しかしながら、注意すべきことは、そのセル濃度を、約0.2乃至900μg/mlにすべきである。
【００３２】
ホスファターゼによりタンパク質の脱リン酸化を防止するため、NaF又はNa3VO4などのホスファターゼ抑制剤を、全体的処理過程で検出工程を介して捕捉することから、提示すべきである。
【００３３】
本発明の他の観点は、本方法を行うためのキットである。キットは：
(a)複数の一次抗体、それぞれが、特異的標的タンパク質に結合でき、それぞれ一次抗体が、固体支持物質上に固定され、そしてそれぞれ一次抗体が、分化するパラメーターにより他から区別することができる、
(b)アッセイされる細胞物質からの試料をリンス、及び洗浄するための1又は複数の緩衝液、
(c)アッセイを行うためのアッセイ緩衝液で、前記緩衝液が、約3乃至10mMの硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤を含む；及び
(d)修飾タンパク質、すなわちクラス又はサブクラスの修飾タンパク質又は個々の特異的修飾タンパク質のいずれかに、特異的な1又は複数のニ次抗体、
を含む前記キット。
【００３４】
上記のように、一次抗体が、複数の分化可能なビーズに結合されるか、あるいはチップ、スライド、又はプレートなど固体表面又はデバイス上の異なる位置に固定されるかのいずれかにて可能である。
【００３５】
上記キットは、修飾タンパク質を検出及び/又は決定するための標識化成分を含む、下記のような追加成分を有することができる。
【実施例１】
【００３６】
以下は、本発明のキットの実例を、そして試料における複数のリン酸化タンパク質を同時に決定するための方法を示している。
【００３７】
キットは以下を含み調製される：
【００３８】
リンタンパク質・アッセイ(検出モジュラス(Detection Modules))
捕獲抗体-結合ビーズ(50X,250μl)
(各分析物=2.5ｘ106ビーズ/mL)
リンタンパク質検出抗体(SIGMA Chemical-clone PY54からの抗リン酸チロシン)
前混合Multi-Plex Assay(120μl)に対して50X
未混合Multi-Plex Assay(70μlの各分析物)に対して100X(各検出抗体=0.2mg/mL)
リン酸-JNK及びリン酸-p38MAPKに対するポジテブ・コントロール(200μg/mlにて250μl/vial)
リンタンパク質に対するポジテブ・コントロール(タンパク質当り、200μg/mlにて250μl/vial)
ネガテブ・コントロール(200μg/mlタンパク質にて250μl/vial)
【００３９】
細胞溶解キットA
細胞洗浄緩衝液A(1X,150ml)(20mM Tris-HCl,pH 7.35-7.45,0.9%NaCl)
細胞溶解緩衝液A(1X,25ml)(20mM Tris-HCl,pH 7.8-8.2,50-500mMNaCl,50-100mM NaF,0.02-0.08%NaN3,0.5-3%NP40 or TritonX-100,4-8mM EDTA)
細胞溶解緩衝液A、ファクター1(250X,100μl)(500-1000mM Na3VO4)
細胞溶解緩衝液A、ファクター2(500X,50μl)(1-2mg/ml  レウペプチン)
なお注意すべきことは、その細胞を洗浄し、そして細胞溶解緩衝液がSDSを含まないか、又は他のいずれかの硫酸塩又はスルホン酸塩の洗剤を含んでいないことである。
【００４０】
試薬キットB
アッセイ緩衝液B(1X,10ml)(20mM Tris-HCl,pH 7.8-8.2,50-500mMNaCl,50mM NaF,0.5-3%SDS,0.02-0.08%NaN3)
洗浄緩衝液B(1X,150ml)
検出抗体希釈液B(1X,10ml)
ビーズ再懸濁緩衝液B(1X,40ml)
ストレプトアビジン-PE(100X,70μl)
フィルター・プレート(96-ウエル)
接着プレートシーラ(Adhesive Plate Sealers)
リンタンパク質・アッセイ指示マニアル
【００４１】
追加品目
以下の追加品目には、こうしたキットを提供する必要はないが、この方法を行うためにキットを使用することが推奨される。これらの品目は、Bio-Rad,Hercules,CAから入手される。
バイオ-プレックスタンパク質アッセイ系(Bio-Plex Protein Array System)
Bio-Rad catalog #171-000001,171-000003,又は171-000005
バイオ-プレックスタンパク質アッセイ系アクセサリー(Bio-Plex Protein Array System Accessories)
Bio-Plex validation kit,Bio-Rad catalog #171-203000
Bio-Plex validation kit,Bio-Rad catalog #171-203060
バイオ-ラッドDCタンパク質アッセイKit II(Bio-Rad DC Protein Assay Kit II)
Bio-Rad catalog #500-0112(BSA基準により)
【００４２】
接着分子に対する細胞溶解質の調製
本特定リンタンパク質アッセイの最適性能として、ウエル当り150μlの細胞溶解質(タンパク質濃度、300-900μg/ml)が求められる。その細胞溶解緩衝液に2mMのPMSF(フェニルメチルスルフォニル・フルオリド)が、さらに求められる。250xのストック溶液(500mMのPMSF)を調製するために、5mlのDMSOに0.436gのPMSFを溶解し、試験管当り0.2-0.5mlに等分し、そして-20℃にて保存した。
【００４３】
上記細胞を、96-ウエルの培養プレート、又は適切な培養容器にて培養した。最終細胞溶解緩衝液を、ファクター1及び2、及びDMSOに500mMのPMSFの溶液を、細胞溶解緩衝液Aに付加するが、細胞を溶解するわずか5-10分前に調製される。(総量10mlの最終細胞溶解緩衝液のため、40μlのファクター1、20μlのファクター2、及び500mMのPMSF40μlを、9.9mlの1x細胞溶解緩衝液Aに付加する。攪拌により混合ウエルとする)。次に培養培地を吸入した後、その細胞を1x細胞洗浄緩衝液A、200μlにより迅速に洗浄(rinsing)することにより、その反応を停止させる。
【００４４】
次に溶解緩衝液が、それぞれウエル又は培養容器に直ちに加えられる。加えられた細胞溶解緩衝液の量を、各ウエルの細胞濃度に依存する。プレートを氷上に置く。ピペット処理を、複数チャネルピペット・セットにて、50μlで、5回上下に行い、その後プレート振動装置にて、300rpm、4℃で20分間前記プレートを振動させた(他の型の培養容器に対しても、その容器を氷上に保持し、細胞スクラッパーにてすり潰された単層化された細胞を15mlの遠心分離管に入れ換えて、さらに4℃で20分間回転させる)。
【００４５】
次に細胞の破片屑を、例えば4℃にて、2,000g、30分間、又は4,500g、15分間遠心分離により除去する。上清液をアッセイのため収集する。アッセイを直ぐには実施せず、細胞溶解質を-70℃にて保存すべきである。
【００４６】
懸濁細胞に対する細胞溶解質の調製
細胞は上記のように培養し、処理される。反応を停止し、そして物質を4℃にて、300g、5分間遠心分離にかける。遠心分離中、細胞溶解緩衝液を上記のように調製する。上清液を吸引し、そして氷冷した溶解緩衝液を直ちに各ウエル又は培養容器に加える。加えられた溶解緩衝液の量を、各ウエルの細胞濃度に依存する。プレートを氷上に置いて、上記のように吸引及び振動させる、細胞破片屑を除去し、そして上清液を上記アッセイのため収集した。
【００４７】
前混合・マルチ-プレックス・アッセイ(Premixed Multi-Plex Assays)のためのアッセイ法
捕獲抗体-結合ビーズ(前混合(premixed))
96ウエルのプレートを使用する場合、使用されないいずれの画分も接着シーラでシールすべきである。前混合捕捉抗体-結合ビーズ(25X)を、バーテックスにより30分間激しく混合し、さらに洗浄緩衝液Bを用いて1X濃度まで希釈する。各ウエルには、1X捕捉抗体結合ビーズ(すなわち1μLの捕捉抗体結合ビーズ(50X))及び49μlの洗浄緩衝液B)が必要とされる。
【００４８】
アッセイ方法(前混合された）
捕捉抗体-結合ビーズ(1X)を、上記対象にように調製する。アッセイ緩衝液Bを、使用前に室温又は別に37℃とされ、全ての成分を確実に生成するよう攪拌混合により十分に溶解される。細胞溶解質の試料が凍結保存されていた場合、これらは氷上にて解凍される。次にその装置が校正される(アッセイを行うために適切な装置は、Millipore MultiScreenTM Separstions Systemである)。
【００４９】
96ウエルフイルター・プレートの所望のウエル数は、100μLの1X洗浄緩衝液Bにて前もって湿らせた。フイルター・プレートを、校正されたフイルター・プレート真空マニホールド上に置かれる。そして緩衝液は、真空濾出により除去される。緩衝液の除去は、共通的な実施として、全体のアッセイ方法の工程間にて行われる。
【００５０】
1X捕捉抗体結合ビーズを、15秒間攪拌混合し、各ウエルに50μを加える。100μの1X洗浄緩衝液Bを、各ウエルに加える。50μLのポジテブ・コントロール及びネガテブ・コントロールを、コントロールとして指定されたウエルに加える。(ポジテブ及びネガテブ細胞溶解コントロールが、1Xアッセイ緩衝液Bにより予備混合される。)
【００５１】
次に、ウエル当り25μLの1xアッセイ緩衝液Bを加える(コントロールを除いて)。25μLの未知の細胞溶解試料が加えられる；そのプレートをシールし、そしてカバーし、室温で一昼夜振動させる。1X検出抗体混合物を、次の工程の前に5-10分間調製される。予備混合された1X検出抗体希釈物Bにて1X濃度に希釈される。必要なリン酸タンパク質検出抗体の総量が、用いられるウエル数に基づき、ウエル当り50μLを採用している。次にシールテープをプレートから取り除き、そしてその緩衝液を真空濾過で除去する。そのプレートを1X洗浄緩衝液で洗浄し、緩衝液を除去する。
【００５２】
検出抗体をゆっくりと攪拌(vortex)混合し、そして各ウエルに50μLを加える。プレートをシール及びカバーし、それを室温にて振動させた。
【００５３】
次にストレプトアビジン-PE結合(100X)体を、使用する前に1X洗浄緩衝液Bにて1X濃度に希釈する。そのプレートを洗浄しシールを取り、そして緩衝液を取り除く。1Xストレプトアビジン-PE結合体を攪拌(vortex)混合し、そして各ウエルに50μLを加える。プレートをカバーしシールし、次に振動する；次に前のようにカバーを取りそして洗浄する。
【００５４】
各ウエルのビーズを、125μの1Xビード再懸濁緩衝液(Bead Resuspension Buffer B)にて再懸濁する。修飾タンパク質の内容の決定は、Bio-Plex  System(Bio-Radから入手)を用い、特定マイクロタイター・プレート読み取り装置を用いて行われる。
【実施例２】
【００５５】
複数の修飾タンパク質のためのアッセイ
【００５６】
上記方法が、5種のリン酸化タンパク質、つまりリン酸化p38MAPK、IkBα、Erk2,JNK及びAkt1を含む、細胞溶解質の試料を同時に分析するために用いられる。前記タンパク質が、以下の部位すなわちp38MAPK-Thr180,Tyr182; IkBα-Ser32,Ser36;Erk2-Thr202,Tyr204;JNK-Thr183,Tyr185;Akt1-Ser473の部位にてリン酸化される。細胞溶解質は、UV,EGF,Fetal Bovine Serum(FBS)又はTNF-αにより刺激されるHeLa及びHEK-293であった。さらに誘発されないHeLa細胞溶解質を、ネガテブ・コントロールとして調製し、使用した。全ての工程を、96-ウエル・フイルター・プレート上にて行った。細胞溶解質の試料を、上記方法にて分析し、ウエスタン・ブロッテング(Western blotting)を介してリン酸化タンパク質の発現を検証した。その結果は、(1)上記5種のリン酸化タンパク質全てを同時検出；(2)その分析には、ウエル当り5-10μgしか細胞溶解質を必要としない；(3)プレート間及びプレート内の変数係数が、10%より少ない、そして(4)厳格な定量、及びウエスタン・ブロッテング・データ(Western blotting data)との定量的関係を実証している。
【００５７】
たとえば、リン酸化IkBαの検出における上記アッセイが、TNF-αで刺激されるHeLa細胞溶解質のリン酸化IkBの発現を検出したがUV,EGF又はFBSで刺激されるHEK293において検出しなかった。さらにIkBαに対するウエスタン・ブロット・プローブ(Western blot probe)が、TNFαに刺激されたHeLa細胞溶解質にて強いバンドを示したが、その他のものにて刺激されたHEK細胞溶解質の全てに対するバンドが見受けられなかった。別の実験において、リン酸化-Erk刺激細胞溶解質を、分析当り50-5000ng範囲の希釈物を、上記方法を用いそしてウエスタン・ブロット(Western blot)によりアッセイした。細胞溶解質の濃度が増大するにつれ、リン酸化-Erkのバンド・シグナルが増大することが、観察された。同様に本発明によるアッセイのためのシグナルが、細胞溶解質濃度が増大するにつれ増大する。図1に示すように、上記シグナルが、ウエスタン・ブロッテング(Western blotting)から(X-軸)から誘導され、複数の修飾タンパク質のための上記アッセイがプロットされると、線状曲線に適合する関係係数(R2)では0.9804が得られた。このことは、単一修飾タンパク質のためのウエスタン・ブロッテング(Western blotting) (先行技術)から得られた結果と、本発明の新規な多重分析を用いて得られた結果との間に厳密な定量的相互関係があることを実証している。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図1は、本発明による方法、及びウエスタン・ブロット分析を用いた、修飾タンパク質リン酸-Erk2の分析比較を示している。
【図１】
2006201193.tif 000002