(57)【要約】      （修正有）【課題】養殖魚介類の色揚げに有用であり、健康食品としても利用されている天然のアスタキサンチンを、従来の酵母や緑藻等による製造法より簡便に生産し提供する。【解決手段】ブレバンディモナス属に属する微生物が、アスタキサンチンを選択性高く生産することを見出した。即ち、アスタキサンチンの製造法は、アスタキサンチンを生産する能力を有するブレバンディモナス属細菌を培養し、培養物からアスタキサンチンを採取することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロチノイド類を生産する細菌において、総カロチノイド中アスタキサンチン含量がヒドロキシアスタキサンチンおよびジヒドロキシアスタキサンチンより高くなるようなアスタキサンチン選択性を有するブレバンディモナス属細菌。
【請求項２】
カロチノイド類を生産する細菌において、総カロチノイド中アスタキサンチン含量が５０％以上となるような生産能力を有するブレバンディモナス属細菌。
【請求項３】
ブレバンディモナス属細菌が、以下の菌学的性質を示す請求項１または２記載のブレバンディモナス属細菌。
(１) グラム染色陰性
(２) 菌の形態：桿状
(３) 菌体色素：オレンジ色
(４) 生理的性質：カタラーゼ  陽性、オキシダーゼ  陽性、ゼラチン分解性  陽性、
エスクリン加水分解  陽性
(５) グルコース、マルトース及びリンゴ酸資化性
【請求項４】
ブレバンディモナス属  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５１６菌株。
【請求項５】
ブレバンディモナス属  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５１５菌株。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のブレバンディモナス属細菌又はその変異体を培地中で培養し、培養物からアスタキサンチンを採取することを特徴とするアスタキサンチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エビ、マダイなどの養殖魚介類の色揚げに有用であり、また抗酸化剤としても利用されるアスタキサンチンの微生物を利用した製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、アスタキサンチンは、サケ、エビ、マダイなどの養殖魚介類の色揚げの目的で広く用いられており、その製造法としてナンキョクオキアミ等の甲殻類からの抽出、酵母の一種ファフィア等の培養、緑藻の一種ヘマトコッカス等の培養、及び有機合成等が知られている。しかし、ナンキョクオキアミ等を用いる場合、その採取、抽出、及び脂質を始めとする夾雑物との分離等において多大な労力を要する（特許文献１）。また、酵母ファフィアの培養物においては、その細胞壁が強固であるため抽出時に細胞壁を分解する操作が必要となり困難である（特許文献２、３）。また、一般的に食品用途に使用されているアスタキサンチンの光学異性体は（3S,3S’）であるのに対しファフィア酵母の生産するアスタキサンチンは(3R,3R’)であり、立体構造が異なる（非特許文献１）。緑藻ヘマトコッカスの培養時には、光合成に欠くことのできない光を供給しなければならず、太陽光採取のための立地条件や人工光供給のための培養装置等の設備が必要（特許文献４）であるだけでなく、混在するクロロフィルとの分離が困難で精製工程が複雑である。細菌を培養した製造方法は、アグロバクテリウム、パラコッカス等の記載があるがいずれも生産性が低く、また、β−カロテンをはじめとする前駆体等の夾雑物が多く工業的な実施は困難である（特許文献５、６、７）。ブレバンディモナス属がアスタキサンチンを生産する報告もあるが、副生成物としてヒドロキシアスタキサンチンを著量蓄積するためアスタキサンチンの選択性は低く(非特許文献２、総カロチノイド中９．９％と記載)、分離が困難な上、アスタキサンチンの生産性が著しく低いと考えられる。一方、新菌Ｅ-３９６株および変異株Ｙ-１０７１によるアスタキサンチン生産菌の報告があるが、アスタキサンチンの選択性は５０％未満であり（特許文献８）、さらにアスタキサンチン選択性の高い菌株が望まれている。また、有機合成法においては、アスタキサンチン が魚介類の飼料や食品として用いられることを考慮すると、反応時に生ずる副生成物等問題が残る。以上のことよりアスタキサンチンの簡易な製造法の開発が望まれている。
【特許文献１】特開平02-255771号公報
【特許文献２】特開平08-214870号公報
【特許文献３】特開平08-000283号公報
【特許文献４】国際公開第99/50384号パンフレット
【特許文献５】特開平06-165683号公報
【特許文献６】特開平07-184668号公報
【特許文献７】特開平07-079796号公報
【特許文献８】特開2001-352995号公報
【非特許文献１】Eric A.Johnsonら、“Astaxanthin from Microbial Sources”、Critical Reviews in Biotechnology、アメリカ合衆国、CRC  Press、1991年、第11巻、第4号、p.297-329
【非特許文献２】Akihiro Yokoyamaら、“New trihydroxy-keto-carotenoids isolatedfrom astaxanthin-producing marie bacterium”、Bioscience Biotechnology and Biochemistry、日本農芸化学会、1996年、第60巻、第2号 p200-2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、従来の酵母や緑藻等による製造方法より簡便かつ高効率に天然のアスタキサンチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、アスタキサンチンを生産する微生物について鋭意研究を行ったところ、ブレバンディモナス属に属する微生物がアスタキサンチンを高い選択性をもって生産することを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明のアスタキサンチンの製造方法は、アスタキサンチンを生産する能力を有するブレバンディモナス属細菌を培地中で培養し、培養物からアスタキサンチンを採取することを特徴とするものである。
１）カロチノイド類を生産する細菌において、総カロチノイド中アスタキサンチン含量がヒドロキシアスタキサンチンおよびジヒドロキシアスタキサンチンより高くなるような
アスタキサンチン選択性を有するブレバンディモナス属細菌。
２）カロチノイド類を生産する細菌において、総カロチノイド中アスタキサンチン含量が５０％以上となるような生産能力を有するブレバンディモナス属細菌。
３）ブレバンディモナス属細菌が、以下の菌学的性質を示す上記１）または２）記載の
ブレバンディモナス属細菌。
(１) グラム染色陰性
(２) 菌の形態：桿状
(３) 菌体色素：オレンジ色
(４) 生理的性質：カタラーゼ  陽性、オキシダーゼ  陽性、ゼラチン分解性  陽性、
エスクリン加水分解  陽性
(５) グルコース、マルトース及びリンゴ酸資化性
４）ブレバンディモナス属  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５１６菌株。
５）ブレバンディモナス属  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５１５菌株。
６）上記１）〜５）のいずれかに記載のブレバンディモナス属細菌を培地に培養し、培養物からアスタキサンチンを採取することを特徴とするアスタキサンチンの製造方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、従来、ナンキョクオキアミや酵母、緑藻の培養物より得られたアスタキサンチンを、ごく一般的な微生物の培養装置により、高収率で容易に得ることができる。また、バクテリアを使用することによりアスタキサンチンの抽出を容易に行うことが可能となり、また、当該バクテリアはアスタキサンチンを選択的に生産することからその精製も容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明について、以下具体的に説明する。アスタキサンチン生産菌株としては、ブレバンディモナス属に属し、アスタキサンチンを選択的に生産する菌株であれば、いずれの菌株でも用いることができる。ここで、選択的に生産するとは、ヒドロキシアスタキサンチンなどの副生成物よりアスタキサンチンを高収率で生産することを意味する。
また、本発明では、産生される総カロチノイド中、アスタキサンチンの含量が５０％以上である生産能力を有する菌株を用いる。
菌株としては、たとえば、自然界より土壌、海水、湖水などを採取し、殺菌水、生理的食塩水等に、懸濁または希釈したのち、シャーレに作成した寒天培地に塗布し、培養温度を２０℃〜４０℃、好ましくは２５℃〜３７℃で培養し、得られたコロニーから、赤〜黄色の色素を生産しているコロニーを選択する。選択したコロニーをさらに寒天培地もしくは液体培地で培養した後、菌体を回収し、アセトン、ＤＭＳＯ等の有機溶媒で色素を抽出する。抽出した色素をＨＰＬＣ等で分析することによりアスタキサンチンを生産する株を取得することができる。また、これらの菌株が人工変異方法、例えば紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘起剤処理などあるいは自然発生による変異株、また遺伝子操作、細胞融合による変異株でも、アスタキサンチンを選択的に生産するものであればいずれも本発明に用いることができる。
【０００７】
具体的には、ブレバンディモナス属に属する菌株をブイヨン培地などの液体培養で培養温度  ２５℃〜３５℃で1〜３日間培養後、遠心分離等で菌体を集め、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンン）５０〜５００ｍｇ／Ｌ溶液に懸濁後、２５℃〜３５℃で１０〜１２０分間振とうする。その後、遠心分離により集菌し、生理的食塩水等で洗浄を行い、適当に希釈してシャーレに作成した普通寒天培地等に塗布し、２５℃〜３０℃で１〜７日間培養を行う。得られたコロニーを、さらに寒天培地もしくは液体培地で培養した後、菌体を回収し、アセトン、ＤＭＳＯ等の有機溶媒で色素を抽出する。抽出した色素をＨＰＬＣ等で分析することによりアスタキサンチンを選択的に生産する株を選択する。
【０００８】
本発明においては、自然界から多数のスクリーニングを行い、アスタキサンチンを選択的に生産する株を、また、突然変異の誘発により同じくアスタキサンチンを選択的に生産する株を得た。
代表的菌株としてＮ−５株およびＡ１−８株の変異株であるＭ２６Ｇ−４株が挙げられる。
今回本発明者らが自然界より単離したＮ−５およびＡ１−８株について、菌株の同定を１６ＳｒＤＮＡ及び下記の生化学的性質の分析に基づいて行った。Ｎ−５株の１６ＳｒＤＮＡ配列を、国際塩基配列データバンク（ＤＤＢＪ）に対する相同性検索の結果、基準株であるBrevundimonas vesicularis ＬＧＭ２３５０株に対し相同率９９．９％、Brevundimonas nasdae ＧＴＣ１０４２株に対し相同率９９．８％の高い相同率を示した。生化学性質からはゼラチン加水分解せず、β-ガラクトシダーゼ反応陽性であったことからB.nasdaeに近く、結局いずれに帰属するかは判断困難であった。一方、Ａ１−８株についても、１６ＳｒＤＮＡ配列を、国際塩基配列データバンク（ＤＤＢＪ）に対する相同性検索の結果、基準株であるBrevundimonas vesicularisＬＧＭ２３５０株に対し相同率１００％、Brevundimonas nasdaeＧＴＣ１０４２株し対し相同率９９．９%の高い相同率を示した。生化学性質からはゼラチン加水分解せず、β-ガラクトシダーゼ反応陽性であったことからB.nasdaeに近く、結局いずれに帰属するかは判断が困難であった。従って、いずれの株もブレバンディモナス属に属する菌株であることが判明したが、種の同定までには至らず、Brevundimonas sp. とすることが妥当と考えられた。これらは、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託され、各々受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５１６、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５１５として受託されたものである(受託日平成１７年４月２６日)。Ｎ−５株及びＡ１−８株の菌学的性質は以下の通りである。
【０００９】
2006340676.tif 000002
【００１０】
2006340676.tif 000003
【００１１】
2006340676.tif 000004
【００１２】
2006340676.tif 000005
【００１３】
本発明の製造法においては、上記微生物を一般に微生物の培養に用いられる培地で培養し、産生されるアスタキサンチンを常法により採取する。まず培養法について述べる。ブレバンディモナス属細菌の培養には通常の培養方法を用いることができる。培地としては、資化可能な炭素源、窒素源、無機物及び必要な生育、生産促進物質を程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地いずれでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単独又は組み合わせて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独又は組み合わせて用いられる。そのほか、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類や海水を必要に応じて加える。更に、使用菌の生育やアスタキサンチンの生産を促進する微量成分を適当に添加することができる。
【００１４】
培養法としては、液体培養法、特に攪拌培養法が最も適している。培養温度は２０〜４０℃、特に２５〜３７℃が適当であり、培養中の培地のｐＨはアンモニア水や炭酸アンモニウム溶液などを添加して、４〜１０、特に６〜８に維持することが望ましい。液体培養で通常１〜７日培養を行うと、目的物質のアスタキサンチンが菌体中に生成蓄積される。培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
【００１５】
培養物からのアスタキサンチンの単離精製は、微生物代謝生産物をその培養物から単離精製するために常用される方法に従って行われる。例えば、培養物を濾過により培養濾液と菌体に分け、菌体を有機溶剤 (例えば、ヘキサン、ベンゼン、クロロホルム、アセトン、エーテル、酢酸エチルなど) で抽出する。ついで濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過 (SephadexLH-20)等でアスタキサンチンを分離、精製する。なお、培養、精製操作中のアスタキサンチンの動向は薄層クロマトグラフィーによるアスタキサンチン の赤色を目安として追跡することができる。
【００１６】
菌体内のカロチノイドを定量分析するためのカロチノイド抽出方法は、下記、［カロチノイドを分析するための抽出方法］に示す。
【００１７】
アスタキサンチンおよびアスタキサンチン前駆体の同定、定量は、ＨＰＬＣによる市販品との溶出時間を比較することおよび、フォトダイオードアレイ検出器による可視光吸収スペクトルの比較することにより行うことができる。具体的な方法は、下記、［ＨＰＬＣ分析条件１］に示す。
【００１８】
ヒドロキシアスタキサンチンの同定は、ＬＣ／ＭＳ分析法でおよびＨＰＬＣ分離ピークの可視光吸収スペクトルの分析で行うことができる。ＬＣ／ＭＳ分析は、（表１）に示す条件で行うことが出来る。また、ＨＰＬＣ分析の具体的な方法は、下記、［ＨＰＬＣ分析条件２］に示す。
【００１９】
アスタキサンチンの立体異性体および光学異性体の同定はSaleh Abu-lafiらのキラルＨＰＬＣ法（Enantiomer,Vol.2,p17-25）による。具体的には、下記、［ＨＰＬＣ分析条件３］に示す。
【００２０】
［カロチノイドを分析するための抽出方法］
培養液２ｍｌを採り、遠心分離を行い菌体を回収し、得られた湿菌体にＤＭＳＯ  ０．３ｍｌを加え、５０℃、１時間抽出を行う。その後、アセトニトリル／メタノール／イソプロピルアルコール（８５／１０／５）混合溶媒を０．３ｍｌ加え、遠心分離により上清を抽出液として得る。
【００２１】
［ＨＰＬＣ分析条件１］
分離カラムとしてCAPCELL PAC C18（3μm  4.6mmφ×35mm  資生堂）を使用し、アセトニトリル／メタノール／イソプロピルアルコール（８５／１０／５）の溶離液を流速  １．０ｍｌ／ｍｉｎで通液する。検出はフォトダイオードアレイ検出器を使用し、４７８ｎｍクロマトチャートより得られるピークの溶出時間および可視光吸収パターンを測定し、市販の試薬と比較することにより同定、定量を行うことが出来る（図１）。
【００２２】
［ＨＰＬＣ分析条件２］
分離カラムとしてCAPCELL PAC C18（3μm  4.6mmφ×35mm  資生堂）を使用し、アセトニトリル／水（９０／１０）の溶離液を流速  １．０ｍｌ／ｍｉｎで通液する。検出はフォトダイオードアレイ検出器を使用し、４７８ｎｍクロマトチャートより得られるピークの溶出時間および可視光吸収パターンを測定することにより同定、定量を行うことが出来る（図２）。
【００２３】
［ＨＰＬＣ分析条件３］
分離カラムとしてSumichiral OA-2000を使用し、ｎ−ヘプタン：塩化メチレン：イソプロピルアルコール（７０／２５／５）の溶離液を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで通液する。検出はフォトダイオードアレイ検出器を使用し、４７８ｎｍクロマトチャートおよび得られるピークの可視光吸収パターンを測定する。
上記、ＨＰＬＣで標準品として用いたカロチノイドおよびヒドロキシアスタキサンチンの構造式を示す。
【００２４】
【化１】
2006340676.tif 000006
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではないことはいうまでもない。
［実施例１］
Nutrient agar(Difco社製)スラント培地にブレバンディモナス  Ｎ−５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５１６）を移植し、３０℃、４８時間培養後、Nutrient Broth(Difco社製)を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注しオートクレーブ殺菌を行った培地に一白菌耳植菌し、３０℃で、４８時間培養を行った。培養終了液を遠心分離し、菌体を回収したのち、上記、［カロチノイドを分析するための抽出方法］に従い、抽出した。抽出液をＬＣ／ＭＳにて分析することにより、アスタキサンチンおよび、ヒドロキシアスタキサンチンを生産していることを確認した（図３）。なお、ＬＣ／ＭＳの分析条件を表１に示す。さらに、抽出液を前述［ＨＰＬＣ分析条件１］、［ＨＰＬＣ分析条件２］により分析を行った。市販アスタキサンチン、アスタキサンチン前駆体と比較し、溶出時間、可視光吸収スペクトルが一致することを確認すると同時に、アスタキサンチン、アスタキサンチン前駆体、ヒドロキシアスタキサンチンの定量を行った。結果を表２に示す。
【００２６】
［実施例２］
実施例１と同様にＮ−５株を培養した培養終了液１００ｍｌを遠心分離し、集菌した菌体を凍結乾燥した。乾燥菌体から色素を酢酸エチル５ｍｌで抽出し、抽出液を得た。溶媒をヘキサンで充填したシリカゲルカラム（シリカゲル６０、メルク株式会社製  ２０ｍｍ径×２００ｍｍ高さ）に抽出液をチャージし、５０ｍｌヘキサンで洗浄した後、ヘキサン／アセトン（６０／４０）で溶出し、溶出液を５ｍｌごとのフラクションに分画し、［ＨＰＬＣ分析条件１］で分析することにより、アスタキサンチンの画分を得た。さらに、アスタキサンチン画分を［ＨＰＬＣ分析条件３］にて分析することにより、アスタキサンチンの立体構造が(3S,3'S)-3,3'-ジヒドロキシ-β,β-カロチン-4,4'-ジオンであることを確認した（図４）。
【００２７】
［実施例３］
Nutrient agar(Difco社製)スラント培地にブレバンディモナス  Ａ１−８株を移植し、３０℃、４８時間培養後、Nutrient Broth(Difco社製)を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注し、オートクレーブ殺菌を行った培地に一白菌耳植菌し、３０℃で、４８時間培養を行った。得られた培養終了液を遠心分離し、菌体を得た。得られた菌体を１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２ｍｌに１０６個／ｍＬになるよう懸濁し、さらにＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンン）を２５０ｍｇ／Ｌ濃度になるよう添加し、３０℃、１時間振とうすることにより変異処理を施した。この菌体懸濁液から遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）でよく洗浄し、Nutrient agar培地に平板あたり１００〜３００胞子になるように希釈し、塗布した。３０℃、4日間培養した後、得られたコロニーをさらにNutrient brothに移植し、３０℃、４８時間培養したのち、遠心分離により菌体を得た。得られた菌体を凍結乾燥し、メタノールで色素を抽出後、ＴＬＣ（シリカゲル６０,ＴＬＣアルミニウムプレート（メルク社製）展開溶媒  ヘキサン：アセトン＝６０：４０）によりモノヒドロキシアスタキサンチン（Ｒｆ値  ０．２５）およびジヒドロキシアスタキサンチン（Ｒｆ値  ０．１５）のスポットがなくなり、アスタキサンチン（Ｒｆ値  ０．４）のスポットが濃くなった菌株としてＭ２６Ｇ−４株を得た。
【００２８】
［実施例４］
実施例１と同様に培養を行う際、菌株として、実施例３で取得したＭ２６Ｇ−４株を使用し、培養を行った。培養終了液を遠心分離し、菌体を回収したのち、上記、［カロチノイドを分析するための抽出方法］に従い、抽出したのち、［ＨＰＬＣ分析条件１］［ＨＰＬＣ分析条件２］により分析を行い、アスタキサンチン、アスタキサンチン前駆体、ヒドロキシアスタキサンチンの定量を行った。結果を表２に示す。
【００２９】
［比較例］
実施例１と同様に培養を行う際、Ａ１−８株、Brevundimonas aurantiaca (ＤＭＳＺ  ４７３１)、B. bacteroides (ＤＭＳＺ４７２６)、B. Subvibrioides (ＤＭＳＺ４７３５)、B. valiabilis (ＤＭＳＺ７２３７)、B. vesicularis (ＤＭＳＺ７２３３)、またはB. vesicularis (ＤＭＳＺ７２２６)株を使用し培養を行った。培養終了液を遠心分離し、菌体を回収したのち、上記、［カロチノイドを分析するための抽出方法］に従い、抽出を行い抽出液を得た。［ＨＰＬＣ分析条件１］［ＨＰＬＣ分析条件２］により分析を行い、アスタキサンチン、アスタキサンチン前駆体、ヒドロキシアスタキサンチンの定量を行った。結果を表２に示す。
一般的なブレバンディモナス属菌株は本発明の菌株と比較し、発酵生産時のアスタキサンチン選択性が低いことがわかる。
【００３０】
【表１】
2006340676.tif 000007
【００３１】
【表２】
2006340676.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、アスタキサンチンの製造方法にかかわるものであり、アスタキサンチンはエビ、マダイなどの養殖魚介類の色揚げに有用であり、また近年、健康食品として利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】アスタキサンチンおよびアスタキサンチン前駆体の［ＨＰＬＣ分析条件１］によるＨＰＬＣ分析チャート
【図２】アスタキサンチンおよびヒドロキシアスタキサンチンの［ＨＰＬＣ分析条件２］によるＨＰＬＣ分析チャート
【図３】実施例１における抽出液のＬＣ／ＭＳ分析チャート
【図４】実施例１における抽出液の［ＨＰＬＣ分析条件３］によるＨＰＬＣ分析チャート
【図１】
2006340676.tif 000009
【図２】
2006340676.tif 000010
【図３】
2006340676.tif 000011
【図４】
2006340676.tif 000012