(57)【要約】【課題】印加する外部振動の周波数を、追従周波数限界に達するまで幅広い帯域で変化させる必要があり、計測に時間がかかる問題がある。【解決手段】リガンド及びレセプター及びリガンドとレセプターの複合体の追従周波数限界より低周波数領域に現れるレセプター及びレセプターと結合したサンプル中のリガンド及びレセプターとリガンドの複合体の固有振動周波数による計測光の反射光の強度変化を用いるので、印加する外部振動の帯域が従来の追従周波数限界を求めるために印加した帯域より狭くなるので計測時間の短縮が図れる。【選択図】図１
2006337038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを含むサンプルと、前記リガンドと結合しうるレセプターがその片面上に固定され、その裏面に光学プリズムが配置された、表面プラズモン共鳴を起しうる金属薄膜と、計測光を照射する照射手段と、前記計測光の反射光を受光する受光手段と、前記レセプターと結合したリガンドを分析する分析手段とを準備し、前記サンプルと前記金属薄膜とを接触させて前記サンプル中の前記リガンドを前記レセプターに結合させ、前記照射手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面と逆の面に、計測光を照射し、前記受光手段により、前記金属薄膜の面上で反射された前記計測光の反射光を受光し、前記分析手段により、前記反射光から、前記金属薄膜近傍の誘電率の変化により生じた表面プラズモン共鳴角の変化を検出する、サンプル中の前記リガンドの分析方法であって、前記レセプターが固定された領域に外部振動を印加する印加手段を準備し、前記照射手段により前記計測光を照射しながら、前記印加手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面に外部振動を印加し、前記分析手段により、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得、前記周波数特性に含まれる前記レセプター及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体の固有振動周波数から前記リガンドを分析することを特徴とした分析方法。
【請求項２】
前記周波数特性に含まれる前記レセプター及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体の固有振動周波数の変化による暗線の振れ幅の変化で前記リガンドを分析することを特徴とした請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記印加する外部振動の周波数帯域を、前記レセプターの固有振動周波数のうち、前記暗線の振れ幅の最大となる固有振動周波数と０Ｈｚの間に設定することを特徴とした請求項２記載の分析方法。
【請求項４】
レセプターとリガンドの少なくとも一方が電荷を帯びていることを特徴とした請求項１または２または３記載の分析方法。
【請求項５】
前記印加手段が、電気的振動、磁気的振動および機械的振動の少なくとも一つを印加する手段であることを特徴とした請求項１または２または３記載の分析方法。
【請求項６】
前記印加手段が、電気的振動を少なくとも印加する手段である請求項５に記載の方法であって、前記分析手段が、前記反射光から、前記リガンドの物理的物性を分析することを更に含むことを特徴とした分析方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法であって、前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドの量を分析することを特徴とした分析方法。
【請求項８】
レセプターとリガンドとの組み合わせが、抗原と抗体、抗体と抗原、ホルモンとホルモン受容体、ホルモン受容体とホルモン、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド受容体、ポリヌクレオチド受容体とポリヌクレオチド、酵素阻害剤と酵素、酵素と酵素阻害剤、酵素基質と酵素、酵素と酵素基質であることを特徴とした請求項１から７のいずれか記載の分析方法。
【請求項９】
請求項１から８記載のいずれかの分析方法を用いたサンプル中のリガンドを分析する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のリガンドの分析方法およびサンプル中のリガンドを分析する装置に関するものである。生化学的反応の対象になる液体試料の微量な質量変化を検出する免疫測定方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生化学的反応においては、レセプターとリガンドとの結合という反応が重要である。例えば、抗原抗体反応では、レセプターとして抗体が、リガンドとして抗原と結合する。また、例えば酵素反応では、レセプターとして酵素が、リガンドとして酵素基体と結合する。このような反応を利用すれば、サンプル中に含まれるリガンドを、検出することが可能である。例えば、金属薄膜表面に、レセプターを結合させておき、リガンドがレセプターに結合すると、その金属薄膜近傍の誘電率が変化する。表面プラズモン共鳴現象を利用して、その変化を検出し、リガンドとレセプターの結合量を分析する方法が知られている（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
この方法ではまず、前記のような金属薄膜に、レセプターが結合されている表面の裏から、全反射条件を満たす角度で光を照射する。その入射光により励起された表面プラズモンの波数と、励起光に由来するエバネッセント波の波数が一致する特定の入射角の時だけに、入射光の光量の一部が表面プラズモンの励起に使われ、反射光の光量が減少する。金属薄膜近傍の誘電率の変化を、例えば、入射光の角度を変化させて反射光を計測し、吸収が最大になる入射光の角度を求める方法や、入射光の角度を一定に保ち、吸収が最大になる反射光の角度を求める方法が知られている。
【０００４】
また、レセプターが固定されている金属薄膜の裏面に電気的振動である電界を印加する事で金属薄膜に試料の分離及び移動制御する技術（例えば、特許文献1参照）や金属薄膜の屈折率の変化を利用して多量の試料を一度に計測する技術（特許文献２参照）や外部振動を印加して表面プラズモン共鳴を生じる角度変動の周波数特性を計測し、リガンドとレセプターの結合量を周波数特性の変極点の変化として現れる追従周波数限界を読み取る事により高感度で且つ振動に強い技術が提案されている。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，７０，２０１９−２０２４
【特許文献１】特開２００３−６５９４７号公報
【特許文献２】特開２００３−７５３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら従来の方法では、外部振動を印加して表面プラズモン共鳴を生じる角度変動の周波数特性を計測し、リガンドとレセプターの結合量を周波数特性の変極点の変化として現れる追従周波数限界を読み取っていた。そのため、印加する外部振動の周波数を、レセプター及びレセプターと結合したサンプル中のリガンド及びレセプターとリガンドの複合体の追従周波数限界に達するまで幅広い帯域で変化させる必要があり、計測に時間がかかる問題があった。また、計測時間が長いために、経時的な状態の変化を把握することが出来ない問題がある。
【０００６】
本発明は、従来の課題を解決するもので、追従周波数限界より低周波数領域に現れるリガンド及びレセプター及びリガンドとレセプターの複合体の固有振動周波数による計測光の反射光の強度変化を利用する事で計測時間の短縮を可能とし、経時的な状態の変化をより詳細に把握する事を可能とした免疫測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、リガンドを含むサンプルと、前記リガンドと特異的に結合しうるレセプターがその片面上に固定され、その裏面に光学プリズムが配置された、表面プラズモン共鳴を起しうる金属薄膜と、計測光を照射する照射手段と、前記計測光の反射光を受光する受光手段と、前記レセプターと結合したリガンドを分析する分析手段とを準備し、前記サンプルと前記金属薄膜とを接触させて前記サンプル中の前記リガンドを前記レセプターに結合させ、前記照射手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面と逆の面に、計測光を照射し、前記受光手段により、前記金属薄膜の面上で反射された前記計測光の反射光を受光し、前記分析手段により、前記反射光から、前記金属薄膜近傍の誘電率の変化により生じた表面プラズモン共鳴角の変化を検出する、サンプル中の前記リガンドの分析方法であって、前記レセプターが固定された領域に外部振動を印加する印加手段を準備し、前記照射手段により前記計測光を照射しながら、前記印加手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面に外部振動を印加し、前記分析手段により、さらに、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得、前記周波数特性に含まれる前記レセプター及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体の固有振動周波数から前記リガンドを分析することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
このように、本発明の分析方法及び装置では、前記リガンド及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体に電気的外部振動である交流電界を印加すると前記リガンド及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体は交流電界に追従し、前記金属薄膜近傍の誘電率が変化し表面プラズモン共鳴角が振れ、前記印加する交流電界の周波数が前記リガンド及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体の固有振動周波数と同じ時に、前記リガンド及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体は前記印加する交流電界の周波数と共鳴し、表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅されることを利用している。従って、前記リガンド及び前記レセプター及び前記リガンドとレセプターの複合体の追従周波数限界より低周波数領域に現れる前記レセプター及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体の固有振動周波数による計測光の反射光の強度変化を用いるので、印加する前記外部振動の帯域が従来の前記追従周波数限界を求めるために印加した帯域より狭くなるので計測時間の短縮を図ることができる。また、計測時間の短縮が可能となるため、単位時間内における計測回数が増えるので、経時的な状態の変化を詳細に把握する事が出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の分析方法および装置において、レセプターとリガンドとしては、少なくとも一方が、電荷を帯びているのが好ましい。外部振動として電気的振動を与える際に、前記金属薄膜表面の誘電率が変化しやすくなるからである。レセプターとリガンドの組み合わせとしては、例えば、抗原と抗体、ホルモンとホルモン受容体、ホルモン受容体とホルモン、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド受容体、ポリヌクレオチド受容体とポリヌクレオチド、酵素阻害剤と酵素、酵素と酵素阻害剤、酵素基質と酵素、酵素と酵素基質等が挙げられる。
【００１０】
本発明者は、金属薄膜近傍の誘電率変化のメカニズムを以下のように推察している。前記レセプター及び前記リガンドに外部振動を与えると、外部振動に追従し、前記レセプター及び前記リガンドが前記薄膜表面に密集する。そうすると、前記金属薄膜におけるエバネッセント領域の分子密度が変化する。この分子密度の変化により、エバネッセント領域の誘電率が変化、すなわち前記金属薄膜近傍の誘電率が変化すると推察している。
【００１１】
本発明の分析方法において、前記印加手段は、電気的振動、磁気的振動及び機械的振動の少なくとも一つを印加する手段であるのが好ましく、少なくとも電気的振動を印加する手段であるのがより好ましい。更に、交流電界を用いるのが好ましい。
【００１２】
本発明者は、前記周波数特性に含まれる前記レセプター及び前記レセプターと結合したサンプル中のリガンド及び前記レセプターと前記リガンドの複合体の固有振動周波数から前記リガンドを分析することを以下のように推察している。
【００１３】
前記リガンドと前記レセプターが結合する前段階において、前記レセプターに電気的外部振動である交流電界を印加すると前記レセプターは交流電界に追従し、前記金属薄膜近傍の誘電率が変化し表面プラズモン共鳴角が振れ、印加する交流電界の周波数が前記レセプターの固有振動周波数と同じ時に、前記レセプターは前記交流電界の周波数に共鳴し、表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅される。前記リガンドと前記レセプターが結合しはじめると、前記印加する交流電界の周波数が、前記レセプター及び前記リガンドと前記レセプターの複合体の固有振動周波数と同じ時に、表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅される。前記リガンドと前記レセプターの結合が十分に行なわれると、前記印加する交流電界の周波数が、前記リガンドと前記レセプターの複合体の固有振動周波数と同じ時に表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅される。表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅される時の前記印加する交流電界の周波数は、前記リガンドと前記レセプターの結合状態に依存し、前記リガンド及び前記レセプター及び前記レセプターと前記リガンドの複合体の固有振動周波数の影響を受ける。表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅される時の前記印加する交流電界の周波数を検出することでリガンドを分析することが可能になる。
【実施例１】
【００１４】
図１は、本発明の第１の実施例における外部振動を用いる装置の最良の形態を示す。
【００１５】
図１において、１は光源、２はプリズム、３は計測光、４は受光装置、５は反射光、６はプラズモンの励起により光量の一部が減少した反射光暗部、７は金属薄膜兼上側電極、８は下側電極、９は金属膜兼上側電極７に固定されたレセプター、１０は交流源、１１は交流源１０の周波数を１／ｎに変換する分周器、１２及び１６は特定周波数のみを通すアクティブフィルター、１３は外部振動、１４はコンデンサー、１５は増幅器、１７は外部振動の位相（θ０）と、反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ１）を比較する検出器、１８は検出器１７により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター、３５はリガンド、θは入射角である。
【００１６】
光源１はＲＯＨＭ社製ＡｌＧａＡｓダブルへテロ接合可視光半導体レーザ、松下日東社製コリメートレンズ及びシグマ光機社製偏光ビームスプリッターから構成されており、そこから発せられた計測光３はビームスプリッターによりｐ偏光の光のみで、入射角θを変化させながら日本電子レーザ社製のプリズム２を通して日本電子レーザ社製の金で構成されている金属薄膜兼上側電極７に照射される。入射角を変化させる方法として、光源１を駆動させ、計測光３を金属薄膜兼上側電極７上に走査させてもいいし、光源1を固定させポリゴンミラースキャナー等の反射鏡を駆動させ計測光３を走査させてもいい。
【００１７】
金属薄膜兼上側電極７に照射された計測光３は金属薄膜兼上側電極７で全反射し、反射光５が生じる。ある特定の入射角θで金属薄膜兼上側電極７に計測光３が照射されると、エバネッセント波が発生し、表面プラズモン共鳴と言われるプラズモン波の励起に光量の一部が使われ、光量が減少した反射光暗部６が発生する。浜松フォトニクス社製Ｓｉ  ＰＩＮ  フォトダイオードにナショナルセミコンダクター社製オペアンプ及び抵抗素子を用いて反射光５の強度を電圧に変換する受光装置４を用いてその反射光５の強度を検出する。光を検出素子として、浜松フォトニクス社製Ｓｉ  ＰＩＮ  フォトダイオードを用いたが、ＣＣＤ等の受光素子を用いても良い。
【００１８】
ここに金属薄膜兼上側電極７及び下側電極８に交流源１０と分周器１１からなるユニットを接続する。交流源１０によりｎｆの周波数が発生され、分周器１１によりｆの周波数に変換され、下側電極８によりｆの周波数を持った外部振動１３が印加され、レセプター９を分子の方向転換により振動させる。ここでエバネッセント波領域の計測光に対する誘電率を支配しているのはリガンドが有する電子分極成分であるので、外部振動１３により金属薄膜兼上側電極７表面のエバネッセント領域のレセプター９が方向転換すれば電子の密度中心も変化するので誘電率が変わり、よってプラズモン共鳴が生じる反射光暗部６の特定の角度も受光装置４を囲む範囲で変化する。
【００１９】
また、金属薄膜兼上側電極７近傍のレセプター９及びリガンド３５及びレセプター９とリガンド３５の複合体には外部振動１３と共鳴しあう固有振動周波数がある。印加する外部振動１３の周波数がレセプター９の固有振動周波数の時には、レセプター９は共鳴しレセプター９の方向転換による振動が最大になる。よってエバネッセント波領域の計測光に対する誘電率も変化し、プラズモン共鳴が生じる反射光暗部６の角度変化も最大となる。レセプター９とリガンド３５が結合するに従い分子量が増加するので、レセプター９とリガンド３５の複合体の固有振動周波数は、結合度合に応じて低周波数に変化する。リガンド３５とレセプター９の結合が十分に行なわれ、分子量が一定になればレセプター９の固有振動周波数も一定化する。レセプター９及びリガンド３５及びレセプター９とリガンド３５の複合体の固有振動周波数は、追従周波数より低周波数領域に現れる。従って印加する外部振動の周波数帯域が狭くなり計測時間の短縮につながる。また、計測時間が短縮できることから単一時間における計測回数を増やすことができるのでリガンド３５の経時的な状態を詳細に把握することができる。
【００２０】
図１の実施例は金属薄膜兼電極を上側、電極を下側にしたが、上下を逆転または左右に配置しても有効であることは言うまでもない。
【００２１】
図２に受光装置４を用いて照射する計測光３の入射角度に対する反射光５の強度を計測した実測値を示す。金属薄膜兼上側電極７の上に試料を置かず空気のみが存在する場合と、試料として水を置いた場合に得られる結果を図２（ａ）及び図２（ｂ）に示す。図２（ａ）及び図２（ｂ）のように、測定対象試料が変わると、金属薄膜近傍の誘電率が変化することにより、共鳴角が変化する。よって、この装置を用いた計測において表面プラズモン共鳴曲線が求められ、これにより十分な効果を得られる。
【００２２】
図３（ａ）から（ｃ）に、本発明の装置中、外部振動の強度に応じた金属薄膜近傍の状態の一例を示す模式図を示す。  図３（ａ）は外部振動強度がゼロの状態、図３（ｂ）は外部振動強度が弱い状態、図３（ｃ）は外部振動強度が強い状態の模式図である。それぞれにおいて、１９，２４，３０は光源1により照射された計測光、２１，２６，３２は金属薄膜兼上側電極、２０，２５，３１は計測光１９，２４，３０が金属薄膜兼上側電極２１，２６，３２でプラズモン共鳴が生じた反射光暗部、２２，２７，３３は金属薄膜兼上側電極２１，２６，３２に固定されたレセプター、２９，３５は外部振動である。θ１１、θ１２、θ１３は表面プラズモン共鳴角である。
【００２３】
リガンド及びレセプターは電荷を有する。そのリガンド及びレセプターに外部振動を印加すると、金属薄膜兼上側電極側に追従し、リガンドが金属薄膜兼上側電極表面に密集する。そのため、金属薄膜兼上側電極におけるエバネッセント領域の分子密度が変化する。この領域の分子密度が変わる事で、エバネッセント領域の誘電率も変化し、プラズモン共鳴が生じる角度が変化する。
よって従来の表面プラズモン計測装置では、プラズモン共鳴は１つの角度でのみ生じていたが、外部振動を印加する事により、１つではなく経時的に複数の角度でプラズモン共鳴が生じる。よって、プラズモン共鳴による暗線には幅を有するようになる。
【００２４】
図４にレセプターとリガンドの複合体の追従周波数と固有振動周波数の関係を示す。横軸は印加する外部振動の周波数を表し、縦軸はレセプターとリガンドの複合体の振動の振れ幅を表す。印加する外部振動の周波数がレセプターとリガンドの複合体の追従周波数限界の時に、レセプターとリガンドの複合体は振動できなくなり、振れ幅がなくなる。従来の方法では、印加する外部振動の周波数はレセプターとリガンドの複合体の追従周波数限界までスイープさせていたので、帯域幅が広くなり計測に時間がかかっていた。レセプターとリガンドの複合体の固有振動周波数は、外部振動によりレセプターとリガンドの複合体が振動している周波数帯域に現れる。従って追従周波数限界より低周波数帯域に現れるので、印加する外部振動の周波数帯域は、従来の帯域幅より狭くなり計測時間の短縮が可能となる。
【００２５】
図５（ａ）から（ｄ）にレセプターとリガンドの複合体の固有振動周波数を外部振動の周波数として印加した時におけるレセプター及びレセプターとリガンドの複合体の状態とプラズモン共鳴による暗線の幅について示す。
【００２６】
図５（ａ）において、３８は金属薄膜兼電極、３７は金属薄膜兼電極３８に固定化されたレセプター、３９は下側電極、４０はレセプター３７とリガンドの結合を開始する前段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形である。図５（ａ）は、レセプター３７とリガンドの結合を開始する前段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形４０と印加する外部振動の周波数の状態を示す。プラズモン共鳴の暗線の幅の波形４０は、印加する外部振動の周波数がレセプター３７の固有振動周波数ｆａのところで最大値となる。
【００２７】
図５（ｂ）において、４３は金属薄膜兼電極、４１は金属薄膜兼電極４３に固定化されたレセプター、４２はレセプター４１と結合したリガンド、４４は下側電極、４５はリガンドとレセプターの結合度合がｘ％におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形、４６は図５（ａ）のプラズモン共鳴による暗線の幅の波形４０に（１００−ｘ）％を乗じた波形、４７は図５（ｃ）のプラズモン共鳴による暗線の幅の波形５２にｘ％を乗じた波形である。図５（ｂ）は、リガンド４２とレセプター４１の結合が行なわれている段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形４５と印加する外部振動の周波数の状態を示す。
【００２８】
レセプター４１とリガンド４２の複合体の固有振動周波数は、リガンド４２が結合する前のレセプター４１の固有振動周波数ｆａより低周波数になる。金属膜兼上側電極４３に固定化されたレセプター４１が全て同時にリガンド４２と結合することはないので、金属膜兼上側電極４３にはレセプター４１及びレセプター４１とリガンド４２の複合体が存在し、プラズモン共鳴による暗線の幅が最大となる周波数はリガンド４２とレセプター４１の結合度合に依存しながら低周波数領域に変化していく。リガンド４２とレセプター４１の結合度合がｘ％におけるプラズモン共鳴による暗線の幅４５は、図５（ａ）に示すリガンドとレセプターの結合が行なわれる前段階のプラズモン共鳴による暗線の幅の波形４０を（１００−ｘ）％と、図５（ｃ）に後述するリガンドとレセプターの結合が十分に行なわれた段階のプラズモン共鳴による暗線の幅の波形５２をｘ％とを合算した波形となる。
【００２９】
図５（ｃ）において、５０は金属薄膜兼電極、４８は金属薄膜兼電極５０に固定化されたレセプター、４９はレセプター４８と結合したリガンド、５１は下側電極、５２はリガンドとレセプターの結合が十分に行なわれた時のプラズモン共鳴による暗線の幅の波形、５３はレセプター４８とリガンド４９の結合を開始する前段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形である。図５（ｃ）はリガンド４９とレセプター４８の結合が十分に行なわれた段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅と印加する外部振動の周波数の状態を示す。リガンド４９とレセプター４８の結合が十分に行なわれれば、リガンド４９とレセプター４８の複合体の固有振動周波数ｆｂのところでプラズモン共鳴による暗線の幅が最大になる。
【００３０】
図５（ｄ）において、５４はプラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数を示す。図５（ｄ）は、プラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数の経時変化を示す。横軸を時間とし、縦軸は、プラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数である。プラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数は、リガンドとレセプターとの結合が行なわれる前段階では周波数ｆａであるが、リガンドとレセプターとの結合が進むにつれて低周波数に変化し、リガンドとレセプターとの結合が十分に行われれば固有振動周波数に変化が無くなり、プラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数は、リガンドとレセプターの複合体の固有振動周波数ｆｂとなる。プラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数に変化がなくなると計測を終了する。
【００３１】
図６（ａ）と（ｂ）では、印加する外部振動の周波数の変化のさせかたついて説明する。
【００３２】
図６（ａ）において、リガンドとレセプターの複合体の固有振動周波数を求める方法について説明する。
【００３３】
第１にリガンドとレセプターの結合が行なわれる前段階におけるレセプターの固有振動周波数ｆａを求める。印加する外部振動の周波数を０Ｈｚからレセプターの追従周波数限界までスイープさせ、プラズモン共鳴による暗線の幅が最大になる周波数を求める。もとめた周波数がレセプターの固有振動周波数ｆａとなる。
【００３４】
第２にリガンドとレセプターの結合がおこなわれている段階においては、印加する外部振動の周波数をレセプターの固有振動周波数ｆａと０Ｈｚの間でスイープさせ、プラズモン共鳴による暗線の幅が最大になる周波数を求める。リガンドとレセプターの結合が行なわれている間は、プラズモン共鳴による暗線の幅が最大になる周波数は変化するので、変化がなくなるまで外部振動の周波数をリガンドの固有振動周波数ｆａと０Ｈｚの間をスイープさせる。プラズモン共鳴による暗線の幅が最大になる周波数に変化がなくなると、プラズモン共鳴による暗線の幅が最大になる周波数がリガンドとレセプターの複合体の固有振動周波数ｆｂとなる。
【００３５】
図６（ｂ）において、縦軸は印加する外部振動の周波数を表し、横軸に時間を示す。従来はリガンドの追従周波数限界まで、印加する外部振動の周波数をスイープさせる必要があったが、今回は、リガンドとレセプターの結合が行なわれる前段階におけるレセプターの固有振動周波数ｆａまで外部振動の周波数をスイープさせるだけよいので、計測時間の短縮が可能となっている。
【００３６】
以上のように、本実施例１においては印加する外部振動の周波数と共鳴を起こすレセプター及びリガンド及びリガンドとレセプターの複合体の固有振動周波数によるプラズモン共鳴の暗線の幅の変化を用いることで、リガンドと特異的に結合するレセプターとの反応の計測時間の短縮が可能となった。
【００３７】
図７において、計測時間の短縮により計測回数が増え、測定精度が改善する事をしめす。横軸に時間を示し、縦軸にプラズモン共鳴の暗線の幅を示す。従来は白丸○６０で示す箇所でしか測定が出来なかったが、本発明により測定時間の短縮が可能となるので、黒三角▲６１で示す箇所での測定も行なえるようになり、より精度の高い測定が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の免疫測定装置のリガンドとレセプターの固有振動周波数による計測光の反射光の強度変化を測定に用いる測定方法によれば、追従周波数限界より低周波数領域に現れるリガンド及びレセプター及びリガンドとレセプターの複合体の固有振動周波数による計測光の反射光の強度の変化を用いるので、印加する外部振動の帯域が従来の追従周波数限界を求めるために印加した帯域より狭くなるので計測時間の短縮が可能となり、迅速な免疫測定が求められる分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の装置の一例を示した模式図
【図２】本発明の装置の一例中、金属薄膜上にレセプターを設置せずに測定した表面プラズモン共鳴曲線と、レセプターとして水を設置して測定した表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す図、（ａ）レセプター無しの場合の表面プラズモン共鳴曲線図、（ｂ）レセプターとして水を設置して測定した場合の表面プラズモン共鳴曲線図
【図３】本発明の装置中、外部振動の強度に応じた金属薄膜近傍の状態の一例を示す模式図、（ａ）外部振動強度がゼロの状態での表面プラズモン共鳴を示す模式図、（ｂ）外部振動強度が弱い状態での表面プラズモン共鳴を示す模式図、（ｃ）外部振動強度が強い状態での表面プラズモン共鳴を示す模式図
【図４】本発明におけるレセプターとリガンドの複合体の追従周波数と固有振動周波数の関係を説明する図
【図５】本発明におけるレセプターとリガンドの複合体の固有振動周波数を外部振動の周波数として印加した場合のレセプター及びレセプターとリガンドの複合体の状態とプラズモン共鳴による暗線の幅を示す模式図、（ａ）レセプターとリガンドの結合を開始する前段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形と印加する外部振動の周波数の状態を示す模式図、（ｂ）リガンドとレセプターの結合が行なわれている段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形と印加する外部振動の周波数の状態を示す模式図、（ｃ）リガンドとレセプターの結合が十分に行なわれた段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅と印加する外部振動の周波数の状態を示す模式図、（ｄ）プラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数の経時変化を示す模式図
【図６】本発明における印加する外部振動の周波数変化のさせ方を示す模式図、（ａ）リガンドとレセプターの複合体の固有振動周波数を求める方法を示す模式図、（ｂ）従来と本発明の周波数変化のさせ方を比較した模式図
【図７】本発明における測定回数が増えることによる測定精度が改善を説明した図
【符号の説明】
【００４０】
１  光源  
２  プリズム
３，１９，２４，３０  計測光
４  受光装置
５  反射光 
６，２０，２５，３１  プラズモンの励起により光量の一部が減少した反射光暗部
７，２１，２６，３２  金属薄膜兼上側電極
８  下側電極、
９，２２，２７，３３  金属膜兼上側電極に固定されたレセプター
１０  交流源、
１１  交流源の周波数を分ける分周器
１２，１６  特定周波数のみを通すアクティブフィルター
１３，２９，３５  外部振動
１４  コンデンサー
１５  増幅器
１７  表面プラズモン共鳴角の振動幅を検出する検出器
１８  検出器１７により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター
３６，４２，４９  リガンド
３７，４１，４８  レセプター
３８，４３，５０  金属薄膜兼電極
３９，４４，５１  下側電極 
４０  レセプター３７とリガンドの結合を開始する前段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形
４５  リガンドとレセプターの結合度合がｘ％におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形
４６  プラズモン共鳴による暗線の幅の波形４０に（１００−ｘ）％を乗じた波形
４７  プラズモン共鳴による暗線の幅の波形５２にレセプターとリガンドの結合度合ｘ％を乗じた波形
５２  リガンドとレセプターの結合が十分に行なわれた時のプラズモン共鳴による暗線の幅の波形
５３  レセプター４８とリガンド４９の結合を開始する前段階におけるプラズモン共鳴による暗線の幅の波形
５４  プラズモン共鳴の暗線の幅が最大となる時の外部振動の周波数
５５  従来の印加する周波数帯域
５６  結合が行なわれる前段階においてリガンドの固有振動周波数faを探すために印加する周波数帯域
５７  リガンドとレセプターが行なわれている段階において固有振動周波数fbを探すために印加する周波数帯域
５８  従来の印加する周波数帯域
５９  本発明で印加する周波数帯域
６０  従来から測定している箇所
６１  本発明で、新たに測定する箇所
θ    入射角
θ１１，θ１２，θ１３   表面プラズモン共鳴角
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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