(57)【要約】【課題】  手間をかけずに短時間で生体分子の長さを正確に測定する（測長）ことができると共に該測長に加え生体分子の構造解析等の各種の観察も同時に行うこと。【解決手段】  一端Ｎが基板２上に固定され、他端Ｓが自由端とされた生体分子Ｐを巻き取り可能なものであって、生体分子Ｐの他端Ｓを外周面に固定可能であると共に、軸線Ｌ回りの外周が既知の長さとされた棒状の探針１５と、該探針１５を先端に有し、軸線Ｌを回転中心として軸線Ｌ回りに回転可能な探針保持部材１６とを備え、探針保持部材１６と基板２とが、基板表面２ａに平行な方向に向けて相対移動可能とされ、探針１５が、相対移動により生体分子Ｐを外周面の周囲に密着させた状態で螺旋状に巻回するプローブ４を提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一端が基板上に固定され、他端が自由端とされた生体分子を巻き取り可能なプローブであって、
前記生体分子の他端を外周面に固定可能であると共に、軸線回りの外周が既知の長さとされた棒状の探針と、
該探針を先端に有し、前記軸線を回転中心として軸線回りに回転可能な探針保持部材とを備え、
前記探針保持部材と前記基板とは、基板表面に平行なＸＹ方向に向けて相対移動可能とされ、
前記探針は、前記相対移動により前記生体分子を前記外周面の周囲に密着させた状態で螺旋状に巻回することを特徴とするプローブ。
【請求項２】
請求項１記載のプローブにおいて、
前記探針は、円柱状に形成されていることを特徴とするプローブ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプローブと、
前記探針保持部材を前記軸線回りに回転させる回転駆動部と、
前記探針保持部材の回転数を測定する回転数測定部と、
前記基板を載置するステージと、
該ステージと前記探針とを、前記ＸＹ方向及び該ＸＹ方向に垂直なＺ方向に向けて相対移動させる移動手段と、
前記回転駆動部及び前記移動手段の作動を制御する制御手段とを備え、
該制御手段は、前記回転駆動部を作動させる際に、前記ステージと前記探針とを前記ＸＹ方向に向けて相対移動するよう前記移動手段を制御すると共に、前記回転数測定部で測定された回転数と前記探針の外周の長さとに基づいて、前記生体分子の長さを算出する算出部を備えていることを特徴とする走査型プローブ顕微鏡。
【請求項４】
請求項３記載の走査型プローブ顕微鏡において、
前記探針保持部材の回転トルクを測定するトルク測定部を備え、
前記算出部は、前記トルク測定部で測定された測定結果に基づいて、前記生体分子を巻き取る際に必要な引張力を算出することを特徴とする走査型プローブ顕微鏡。
【請求項５】
請求項３又は４記載の走査型プローブ顕微鏡において、
前記制御部は、前記探針保持部材の回転速度が一定となるように前記回転駆動部を制御することを特徴とする走査型プローブ顕微鏡。
【請求項６】
一端が基板上に固定され、他端が自由端とされた生体分子を観察する生体分子観察方法であって、
軸線回りの外周が既知の長さとされた棒状の探針を前記生体分子に接近させて、外周面に生体分子の前記他端を固定する固定工程と、
該固定工程後、基板と前記探針とを基板表面に平行なＸＹ方向に相対移動させながら、探針を先端に有する探針保持部材を軸線回りに回転させて、前記生体分子を前記外周面の周囲に密着させた状態で螺旋状に巻回する巻回工程と、
該巻回工程後、前記探針保持部材の回転数と前記探針の外周の長さとに基づいて、前記生体分子の長さを算出する測長工程とを備えていることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項７】
請求項６記載の生体分子観察方法において、
前記巻回工程の際に、前記探針保持部材の回転トルクを測定するトルク測定工程と、
該トルク測定工程で測定された測定結果に基づいて、前記生体分子を巻き取る際に必要な引張力を算出する引張力測定工程とを備えていることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項８】
請求項６又は７記載の生体分子観察方法において、
前記巻回工程の際、前記探針保持部材の回転速度が一定となるように制御することを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか１項に記載の生体分子観察方法後に、前記生体分子を前記基板上に再度固定する生体分子固定方法であって、
前記巻回工程後、巻き取った前記生体分子の他端を再度基板上に固定すると共に、前記探針保持部材を軸線回りに逆回転させて巻き戻し、該巻き戻し後、生体分子の一端と前記探針の外周面との固定を解いて生体分子を切り離す固定工程を備えていることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１０】
請求項６から８のいずれか１項に記載の生体分子観察方法後に、前記生体分子を前記基板上に再度固定する生体分子固定方法であって、
前記巻回工程後、巻き取った前記生体分子の他端を再度基板上に固定すると共に、前記探針保持部材を軸線回りに逆回転させながら基板と探針とを前記ＸＹ方向に相対移動させて生体分子を伸長し、該伸長後、生体分子の一端を基板上に固定して、任意の形にパターニングした状態で両端を基板上に固定する固定工程を備えていることを特徴とする生体分子固定方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の生体分子固定方法において、
前記固定工程を、複数の生体分子について繰り返し行うことを特徴とする生体分子固定方法。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか１項に記載の生体分子固定方法により製造されたことを特徴とする生体分子チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の生体分子の測長（長さ測定）や構造解析等の各種の観察を行
えるプローブ及び該プローブを有する走査型プローブ顕微鏡並びに生体分子観察方法、更
には、観察後の生体分子を基板に固定した生体分子チップ及び生体分子固定方法に関する
ものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ＤＮＡ、ＲＮＡやタンパク質等の生体分子の長さを測定したり、幾何学的な構造や力学的な性質等の各種の機能を調べたりすることは、生体分子の解析（解明）に繋がるので、生化学、医学を始めとする多くの分野において非常に有益に行われている。
従来使用されている生体分子の測長方法の１つとして、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ；Scanning Probe Microscope）を用いた方法が知られている。この方法は、生体分子を走査型プローブ顕微鏡により観察し、観察した画像に基づいて生体分子の長さを測定する方法である。例えば、この走査型プローブ顕微鏡を使用した測長方法の一つとして、観察した画像から生体分子画像を二値化処理により抽出し、簡便に生体分子の長さを測定することができる分子測長方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
この分子測長方法は、平坦性を有するマイカ（雲母）等の基板上に生体分子を固定した後に、走査型プローブ顕微鏡による観察を行って、生体分子の画像化を行う。次いで、観察した画像のうち背景画像を一定の割合で補正することで生体分子画像のみを抽出する工程を行って、基板表面の凹凸等に起因する背景の濃淡を除去する。次いで、抽出された生体分子画像を閾値に基づいて二値化する工程を行うと共に、二値化された生体分子画像から生体分子の中心線を抽出する工程を行う。これらの工程で得られた画像は、点ノイズやＤＮＡの分岐等が存在する状態である。そこで、中心線を抽出された分子画像から測定対象の生体分子以外の画像を除去する工程を行って、測定に不要な画像を除去する。そして、最後に測定対象の生体分子の長さを表示画面の画素数に基づいて測定する工程を行う。これにより、より正確な生体分子の長さを簡便に測定することができる。
【０００４】
また、例えば、走査型プローブ顕微鏡を使用した測長方法の一つとして、生体分子を伸長固定して長さを測定する伸長固定化方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
この伸長固定化方法は、測定対象試料中のＤＮＡを、測定対象試料中に添加したカチオン性脂質と結合させ、ポリイオン複合体を形成させた後に、特定条件下で固定基板上にポリイオン複合体を伸長固定化し、当該固定化されたポリイオン複合体を画像解析することにより、ＤＮＡの分子長を測定するものである。
この方法によれば、数分間という短時間操作にて基板上にＤＮＡ分子を伸長固定化することが可能であり、短時間で正確にＤＮＡの分子長を測定することができる。
【０００５】
次に、上述した生体分子の測長ではなく、生体分子、例えば、立体構造をとっているタンパク質を両端末付近から引き伸ばして１本の直線状のプリペプチドとすることでタンパク質の力学的な性質を調べて構造解析を行うタンパク質ナノ力学法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
この方法は、図１７に示すように、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ；Atomic Force Microscope）等の走査型プローブ顕微鏡のプローブ３０を利用してタンパク質Ｔを引き伸ばす方法である。  
まず、図１７に示すように、基板３１とカンチレバー３２の先端に設けられた探針３３とを、シラン化剤等で活性化すると共に、架橋剤等を使用してタンパク質Ｔの両端末近傍を化学的結合により固定する。固定後、プローブ３０を基板表面から離間するようにゆっくりと移動させる。これにより、図１８に示すように、タンパク質Ｔが徐々に引き伸ばされる。この際、図１９に示すように、探針３３に作用する力（張力）の測定を行う。これにより、タンパク質Ｔの力学的な性質を調べることができ、タンパク質Ｔの構造解析を行うことができる。
【０００６】
特に、タンパク質Ｔは、その種類によっては、引き伸ばされる前の立体構造の段階において、局所的に高分子鎖が絡まった結び目（結合部分）（図１８で示すＡ、Ｂ）が生じる場合がある。この場合には、上述した引っ張り操作をしたときに、各結び目が離れる（結合が離れる）。この結び目が離れた場合には、図１９に示すように、探針３３に作用する張力が瞬間的に低減する。また、この際の張力の低減具合を見ることで、各結び目の結合力の大きさ等を検出することができる。
このように、タンパク質Ｔの力学的性質を調べることで、タンパク質Ｔを力学視点から見ることができ、より多角的な構造解析等を行うことができる。
【特許文献１】特開２０００−２３０８２３号公報
【特許文献２】特開２００３−１３５０６２号公報
【非特許文献１】竹安邦夫、「ナノバイオロジー  ナノテクノロジーによる生命科学」、初版、共立出版株式会社、２００４年７月１５日、ｐ.５２−６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところが、上記従来の方法では、以下の問題が残されていた。
即ち、上記特許文献１及び２記載の分子測長方法及び伸長固定化方法では、予めタンパク質の形状を観察する必要があり、タンパク質を明瞭に観察するために、非常に平らな（平坦性を有する）基板に適切な分散状態で固定したり、曲がっているタンパク質を予め伸長して固定したりする等の複雑な前処理が必要であり、手間と時間を要するものであった。
更に、曲がっているタンパク質をそのまま固定した場合には、長さを正確に測定するために、取得された画像に対して画像処理を行って解析する必要があった。この画像処理は、上述した前処理と別のシステムで行われるため、測定の難易度を高めてしまうものであった。また、画像処理による方法は、除去したいノイズ成分だけでなく、真の形状の情報も変えてしまう可能性があり、正確な計測を行うには適さないものであった。        
このように、従来の測長方法では、前処理が必須であるので、手間と時間がかかるものであると共に、測定の正確性が劣り、測定の難易度が高く扱い難いものであった。
【０００８】
また、上記従来のタンパク質ナノ力学法では、タンパク質を引き伸ばすことによって、タンパク質の力学的性質を測定することは可能であるが、この方法でタンパク質の長さを同時に測定することは困難なものであった。
このように、従来のものでは、タンパク質等の生体分子の測長と力学的性質等の構造解析とを同時に測定することは困難なものであった。
【０００９】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、手間をかけずに短時間で生体分子の長さを正確に測定する（測長）ことができると共に、該測長に加え生体分子の構造解析等の各種の観察も同時に行うことができるプローブ及び該プローブを有する走査型プローブ顕微鏡を提供すること、更には、観察終了後の生体分子を基板に固定した生体分子チップ及び生体分子固定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、この発明は以下の手段を提供している。
本発明のプローブは、一端が基板上に固定され、他端が自由端とされた生体分子を巻き取り可能なプローブであって、前記生体分子の他端を外周面に固定可能であると共に、軸線回りの外周が既知の長さとされた棒状の探針と、該探針を先端に有し、前記軸線を回転中心として軸線回りに回転可能な探針保持部材とを備え、前記探針保持部材と前記基板とが、基板表面に平行なＸＹ方向に向けて相対移動可能とされ、前記探針が、前記相対移動により前記生体分子を前記外周面の周囲に密着させた状態で螺旋状に巻回することを特徴とするものである。
【００１１】
この発明に係るプローブにおいては、まず、探針をシラン化剤等で活性化すると共に、架橋剤等を使用して外周面にタンパク質等の生体分子の他端を化学的結合により固定させる。生体分子の固定後、探針保持部材を軸線回りに回転させて、先端に設けられた探針を同様に軸線回りに回転させる。この回転により、生体分子は、探針の外周面の周囲に徐々に巻回される。また、この際、探針保持部材と基板とは、ＸＹ方向に向けて相対移動可能であるので、生体分子は２重３重に重なることなく、探針の外周面に密着した状態で螺旋状にきれいに巻回される。即ち、生体分子は、既知の長さとされた外周面に沿った状態で巻き取られる。
【００１２】
従って、探針保持部材の回転数、即ち、探針の回転数より、生体分子の長さを容易且つ正確に測定することができる。特に、従来のように、基板上に生体分子を予め適度な分散状態で固定したり、予め伸長した状態で固定化したりする等の複雑な前処理が不要であるので、手間をかけず時間の短縮を図ることができる。また、従来のように、別々のシステムで前処理と画像処理とを行う必要がないので、測定を容易にすることができる。
更には、複雑な構成ではなく、単に探針の外周面に生体分子を巻き取るだけで測長を行えるので、構成の単純化を図ることができ、設計が容易である。また、従来の画像処理方法とは異なり、生体分子を直接的に探針で測長できるので、測定感度が良く、高精度な測長を行うことができる。
なお、棒状の探針の断面形状は、外周を既知の長さに設定していれば特に制限されるものではなく、例えば、円や四角形等の多角形状でも構わない。
【００１３】
また、本発明のプローブは、上記本発明のプローブにおいて、前記探針が、円柱状に形成されていることを特徴とするものである。
【００１４】
この発明に係るプローブにおいては、棒状の探針が円柱状に形成されている、即ち、断面形状が円形に形成されているので、生体分子を巻き取る際に、該生体分子に局所的な荷重を与えることなく、均等の圧力で滑らかに巻き取ることができる。よって、生体分子に与える影響を極力低減することができる。
【００１５】
また、本発明の走査型プローブ顕微鏡は、上記本発明のプローブと、前記探針保持部材を前記軸線回りに回転させる回転駆動部と、前記探針保持部材の回転数を測定する回転数測定部と、前記基板を載置するステージと、該ステージと前記探針とを、前記ＸＹ方向及び該ＸＹ方向に垂直なＺ方向に向けて相対移動させる移動手段と、前記回転駆動部及び前記移動手段の作動を制御する制御手段とを備え、該制御手段が、前記回転駆動部を作動させる際に、前記ステージと前記探針とを前記ＸＹ方向に向けて相対移動するよう前記移動手段を制御すると共に、前記回転数測定部で測定された回転数と前記探針の外周の長さとに基づいて、前記生体分子の長さを算出する算出部を備えていることを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明の生体分子観察方法は、一端が基板上に固定され、他端が自由端とされた生体分子を観察する生体分子観察方法であって、軸線回りの外周が既知の長さとされた棒状の探針を前記生体分子に接近させて、外周面に生体分子の前記他端を固定する固定工程と、該固定工程後、基板と前記探針とを基板表面に平行なＸＹ方向に相対移動させながら、探針を先端に有する探針保持部材を軸線回りに回転させて、前記生体分子を前記外周面の周囲に密着させた状態で螺旋状に巻回する巻回工程と、該巻回工程後、前記探針保持部材の回転数と前記探針の外周の長さとに基づいて、前記生体分子の長さを算出する測長工程とを備えていることを特徴とするものである。
【００１７】
この発明に係る走査型プローブ顕微鏡及び生体分子観察方法においては、まず、探針をシラン化剤等で活性化した後、移動手段によりステージ上に載置された基板と探針とをＸＹ方向及びＺ方向に相対的に移動させて、探針の外周面と生体分子の他端とを接触させ、架橋剤等を使用して両者を化学的結合により固定する固定工程を行う。
固定工程後、巻回工程を行う。即ち、回転駆動部により探針保持部材を軸線回りに回転させて、先端に設けられた探針を同様に軸線回りに回転させる。この回転により、生体分子は、探針の外周面の周囲に徐々に巻回される。また、この際、制御部は、探針保持部材と基板とがＸＹ方向に向けて相対移動するように移動手段を制御する。これにより、生体分子は２重３重に重なることなく、探針の外周面に密着した状態で螺旋状にきれいに巻回される。即ち、生体分子は、既知の長さとされた外周面に沿った状態で巻き取られる。
【００１８】
この巻回工程後、探針保持部材の回転数、即ち、探針の回転数と探針の外周の長さとに基づいて、算出部より生体分子の長さを算出する測長工程を行う。この際、単に生体分子を巻き取るだけであるので測定を容易に行うことができ、また、直接的に長さを測定できるので、正確な測長を行える。特に、従来のように、基板上に生体分子を予め適度な分散状態で固定したり、予め伸長した状態で固定化したりする等の複雑な前処理が不要であるので、手間がかからず測定に必要な時間の短縮を図ることができる。また、従来のように、別々のシステムで前処理と画像処理とを行う必要がないので、測定を容易にすることができる。
【００１９】
また、本発明の走査型プローブ顕微鏡は、上記本発明の走査型プローブ顕微鏡において、前記探針保持部材の回転トルクを測定するトルク測定部を備え、前記算出部が、前記トルク測定部で測定された測定結果に基づいて、前記生体分子を巻き取る際に必要な引張力を算出することを特徴とするものである。
【００２０】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記巻回工程の際に、前記探針保持部材の回転トルクを測定するトルク測定工程と、該トルク測定工程で測定された測定結果に基づいて、前記生体分子を巻き取る際に必要な引張力を算出する引張力測定工程とを備えていることを特徴とするものである。
【００２１】
この発明に係る走査型プローブ顕微鏡及び生体分子観察方法においては、巻回工程の際に、トルク測定部により探針保持部材の回転トルクを測定するトルク測定工程を行う。そして、トルク測定工程後、測定結果に基づいて算出部により生体分子を巻き取る際に必要な引張力を算出する引張力測定工程を行う。
これにより、例えば、立体構造をとっているタンパク質（生体分子）を両端で引き伸ばして１本の直線状ポリペプチドとするのに必要な張力を測定することができる。また、タンパク質は、通常高分子鎖が絡まった結び目（結合部位）が存在している状態であるが、探針で巻き取られる際、これら結び目は解けてしまう。この際、例えば、結び目が解ける直前までは、その結合力により結び目が探針を引張る形になるので、回転トルクが上昇する。また、結び目が解けた瞬間は、回転トルクが急激に減少する。
このように、トルク測定工程及び引張力測定工程を行うことで、測長に加え、直線状ポリペプチドとするのに必要な張力や、結び目の結合力の大きさ等の力学的性質等を調べることができ、タンパク質の構造解析を同時に行える。従って、タンパク質等の生体分子をより多角的に観察することができる。
【００２２】
また、本発明の走査型プローブ顕微鏡は、上記本発明の走査型プローブ顕微鏡において、前記制御部が、前記探針保持部材の回転速度が一定となるように前記回転駆動部を制御することを特徴とするものである。
【００２３】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記巻回工程の際、前記探針保持部材の回転速度が一定となるように制御することを特徴とするものである。
【００２４】
この発明に係る走査型プローブ顕微鏡及び生体分子観察方法においては、巻回工程の際に、制御部が、探針保持部材の回転速度が一定となるように回転駆動部の制御を行う。このように、常に同じ回転速度で生体分子を巻き取ることができるので、より安定した状態で重ならないように生体分子を巻き取ることができる。
【００２５】
また、本発明の生体分子固定方法は、上記本発明のいずれかに記載の生体分子観察方法後に、前記生体分子を前記基板上に再度固定する生体分子固定方法であって、前記巻回工程後、巻き取った前記生体分子の他端を再度基板上に固定すると共に、前記探針保持部材を軸線回りに逆回転させて巻き戻し、該巻き戻し後、生体分子の一端と前記探針の外周面との固定を解いて生体分子を切り離す固定工程を備えていることを特徴とするものである。
【００２６】
この発明に係る生体分子固定方法においては、固定工程により、探針に巻き取った生体分子を再度基板上に巻き取る前の初期の状態で固定することができる。即ち、生体分子を巻き取った探針を基板に近づけて、生体分子の他端を基板上に化学結合等により固定する。固定後、探針保持部材を軸線回りに逆回転させて巻き戻す。これにより、探針から生体分子が引き出され、基板上に巻き取られる初期の状態に復元し始める。そして、最後に生体分子の一端を探針の外周面から（例えば、探針を微小振動させて）切り離すことで、該生体分子を初期状態を再現した形で基板上に固定することができる。
特に、長さが測定され、更には力学的性質等の構造解析がされた生体分子を元の状態で基板上に再固定できるので、該生体分子を、その後のより詳細な解明や観察等を行う際に有効に活用することができる。
【００２７】
本発明の生体分子固定方法は、上記本発明のいずれかに記載の生体分子観察方法後に、前記生体分子を前記基板上に再度固定する生体分子固定方法であって、前記巻回工程後、巻き取った前記生体分子の他端を再度基板上に固定すると共に、前記探針保持部材を軸線回りに逆回転させながら基板と探針とを前記ＸＹ方向に相対移動させて生体分子を伸長し、該伸長後、生体分子の一端を基板上に固定して、任意の形にパターニングした状態で両端を基板上に固定する固定工程を備えていることを特徴とするものである。
【００２８】
この発明に係る生体分子固定方法においては、固定工程により、探針に巻き取った生体分子を再度基板上に伸長した状態で固定することができる。即ち、生体分子を巻き取った探針を基板に近づけて、生体分子の他端を基板上に固定する。固定後、探針保持部材を軸線回りに逆回転させながら、基板と探針とをＸＹ方向に相対移動させる。これにより、探針から生体分子が伸長された状態で引き出され、基板上に配される。そして、最後に生体分子の一端を基板に固定することで、該生体分子を伸長した状態で両端末が基板上に固定される。また、この際、生体分子は、任意の形、例えば、一直線上に伸長した形や、弓形状の形や、波状の形にパターニングされた状態で固定される。このように、自由な形に生体分子をパターニングすることが可能である。
特に、長さが測定され、更には力学的性質等が算出された生体分子を伸長した状態で基板上に再度固定できるので、該生体分子を、その後のより詳細な解明や観察等を行う際に有効に活用することができる。
【００２９】
また、本発明の生体分子固定方法は、上記本発明の生体分子固定方法において、前記固定工程を、複数の生体分子について繰り返し行うことを特徴とするものである。
【００３０】
この発明に係る生体分子固定方法においては、複数の生体分子について、固定工程を繰り返し行うことで、複数の生体分子をそれぞれ巻き取られる前の初期状態で基板上に固定したり、任意の形で基板上にパターニングしたりすることができる。
【００３１】
また、本発明の生体分子チップは、上記本発明のいずれかに記載の生体分子固定方法により製造されたことを特徴とするものである。
【００３２】
この発明に係る生体分子チップにおいては、基板上に長さが測定され、更には力学的性質等の構造解析がされた生体分子が、巻き取られる前の初期状態で基板に固定されたり、任意の形でパターニングされているので、より詳細な生体分子の解明や観察等に有効に活用することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係るプローブ、走査型プローブ顕微鏡及び生体分子観察方法によれば、既知の長さとされた外周面に生体分子を巻回可能な探針を備えているので、該探針の回転数より、生体分子の長さを容易且つ正確に測定することができる。また、従来のように、基板上に生体分子を予め適度な分散状態で固定する等の前処理が不要であるので、手間をかけず時間の短縮を図ることができる。また、測定を容易にすることができる。更に、構成の単純化を図ることができ、設計が容易であると共に、従来の画像処理方法とは異なり生体分子を直接的に測定できるので、測定感度が良く高精度な測定を行うことができる。
【００３４】
また、本発明に係る生体分子固定方法及び生体分子チップによれば、基板上に長さが測定され、更には力学的性質等の構造解析がされた生体分子が、巻き取られる前の初期状態で基板に固定されたり、任意の形でパターニングされているので、より詳細な生体分子の解明や観察等に有効に活用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明に係るプローブ、走査型プローブ顕微鏡及び生体分子チップ並びに生体分子観察方法及び生体分子固定方法の一実施形態について、図１から図１６を参照して説明する。なお、本実施形態では、生体分子として、タンパク分子を例にして説明する。
本実施形態の走査型プローブ顕微鏡１は、図１に示すように、タンパク分子Ｐを表面に保持する基板２を載置するステージ３と、基板２上に配されたプローブ４と、該プローブ４の後述する探針保持部材１６を軸線Ｌ回りに回転させるモータ（回転駆動部）５と、探針保持部材１６の回転数を測定するエンコーダ（回転数測定部）６と、ステージ３とプローブ４の後述する探針１５とを、基板表面２ａに平行なＸＹ方向及び該ＸＹ方向に垂直なＺ方向に向けて相対移動させる移動手段７と、探針保持部材１６の回転トルクを測定するトルクメータ（トルク測定部）８と、モータ５及び移動手段７を始めとする構成品を総合的に制御するパーソナルコンピュータ（以下、ＰＣ）（制御部）９とを備えている。
【００３６】
また、本実施形態の走査型プローブ顕微鏡１は、図１に示すように、ステージ３上に、上記基板２とは別にタンパク分子Ｐを任意の形にパターニングした状態で固定可能なチップ基板１０（基板）を備えている。このチップ基板１０は、生体分子チップ１１となる基板である。
【００３７】
上記プローブ４は、一端Ｎが基板２上に固定され、他端Ｓが自由端とされたタンパク分子Ｐを巻取り可能なものであって、図２に示すように、タンパク分子Ｐの他端Ｓを外周面に固定可能であると共に軸線Ｌ回りの外周が既知の長さとされた棒状の探針１５と、該探針１５を先端に有し、軸線Ｌを回転中心として軸線Ｌ回りに回転可能な探針保持部材１６とを備えている。また、探針保持部材１６と基板２とは、ＸＹ方向に向けて相対移動可能とされ、探針１５は相対移動によりタンパク分子Ｐを外周面の周囲に密着した状態で螺旋状に巻回するようになっている。
また、本実施形態では、探針１５は、円柱状に形成されており、その直径Ｄから軸線Ｌ回りの外周の長さが予め正確に算出されている。
【００３８】
上記モータ５は、図１に示すように、探針保持部材１６の基端側に設けられており、探針保持部材１６を、軸線Ｌを回転中心として２方向（正回転又は逆回転）に回転させる。また、モータ５から出力された各種の信号は、増幅された後、上記エンコーダ６及びトルクメータ８に送られ、探針保持部材１６の回転数及び探針保持部材１６に作用する回転トルクが測定されるようになっている。
【００３９】
上記ＰＣ９は、モータ５を作動させる際に、ステージ３と探針１５とをＸＹ方向に向けて相対移動するよう移動手段７を制御するようになっている。また、ＰＣ９は、エンコーダ６で測定された回転数と探針１５の外周の長さとに基づいて、タンパク分子Ｐの長さを算出する算出部９ａを有している。更に、この算出部９ａは、トルクメータ８で測定された測定結果に基づいて、タンパク分子Ｐを巻き取る際に必要な引張力（張力）の算出も行うようになっている。
また、ＰＣ９は、エンコーダ６で測定された回転数に基づいて、探針保持部材１６の回転速度が一定となるようにモータ５の制御を行っている。
【００４０】
上記ステージ３は、ＰＺＴ（チタン酸ジルコン酸鉛）等からなる圧電素子である３次元スキャナ１７上に設けられている。この３次元スキャナ１７は、ＸＹＺ駆動系１８から電圧を印加されるようになっており、電圧印加量及び極性等に応じてＸＹＺの３方向に微小移動するようになっている。即ち、これら３次元スキャナ１７及びＸＹＺ駆動系１８は、上記移動手段７を構成している。
なお、３次元スキャナ１７は、ＸＹＺの３方向に粗動移動する図示しない粗動機構上に設けられている。
【００４１】
このように構成されたプローブ４及び走査型プローブ顕微鏡１により、タンパク分子Ｐを観察する生体分子観察方法、及び、観察終了後のタンパク分子Ｐをチップ基板１０上に固定する生体分子固定方法、更には、生体分子固定方法により生体分子チップ１１を製造する場合について以下に説明する。
本実施形態の生体分子観察方法は、探針１５をタンパク分子Ｐに接近させて、外周面にタンパク分子Ｐの他端Ｓを固定する固定工程と、該固定工程後、基板２と探針１５とをＸＹ方向に相対移動させながら探針保持部材１６を軸線Ｌ回りに回転させて、タンパク分子Ｐを外周面の周囲に密着させた状態で螺旋状に巻回する巻回工程と、該巻回工程後、探針保持部材１６の回転数と探針１５の外周の長さとに基づいて、タンパク分子Ｐの長さを算出する測長工程とを備えている。
また、本実施形態の生体分子観察方法は、上記巻回工程の際に、探針保持部材１６の回転トルクを測定するトルク測定工程と、該トルク測定工程で測定された測定結果に基づいて、タンパク分子Ｐを巻き取る際に必要な引張力を算出する引張力算出工程とを備えている。これら各工程について、以下に詳細に説明する。
【００４２】
まず、初期設定として、図２に示すように、基板表面２ａをシラン化剤等で活性化する共に、架橋剤等によりタンパク分子Ｐの一端Ｎを基板表面２ａに化学的結合により固定させた状態で、タンパク分子Ｐを基板２上に保持する。また、同様に探針１５の外周面についても、シラン化剤等で活性化し、架橋剤等を利用して外周面とタンパク分子Ｐとが化学的結合するように予め準備する。次いで、粗動機構を作動させて探針１５と基板２とを所定の距離まで接近させる。
【００４３】
上述した初期設定の終了後、図３に示すように、３次元スキャナ１７により基板２と探針１５とをＸＹ方向及びＺ方向の３方向に微小移動させて、探針１５の外周面とタンパク分子Ｐの他端Ｓとを接触させ、両者を化学的結合により固定する固定工程を行う。
該固定工程後、図４に示すように、３次元スキャナ１７により探針１５を基板表面２ａから所定距離ｄだけ離間させた後、巻回工程を行う。即ち、図５に示すように、モータ５を作動させて探針保持部材１６を軸線Ｌ回りに回転させて、先端に設けられた探針１５を同様に軸線Ｌ回りに回転させる。
この際、本実施形態では、探針１５を基端側（探針保持部材１６側）から先端側を見たときに、該探針１５が反時計回りに回転するようにモータ５を駆動させる。この探針１５の回転により、タンパク分子Ｐは、探針１５の外周面に徐々に巻回され、図６に示すように、探針１５に全て巻き取られる。なお、巻き取りの最後、即ち、生体分子の一端Ｎを基板２上から離間させる瞬間には、探針１５を基板表面２ａに近接させることが好ましい。
【００４４】
また、巻回工程の際、ＰＣ９は、探針保持部材１６と基板２とがＸＹ方向に向けて相対移動するように移動手段７の制御を行う。これにより、タンパク分子Ｐは、２重３重に重なることなく、探針１５の外周面に密着した状態で螺旋状にきれいに巻回される。つまり、タンパク分子Ｐは、既知の長さとされた探針１５の外周面に沿った状態で巻き取られる。
また、この巻回工程の際、ＰＣ９は、探針保持部材１６の回転速度が一定となるようにモータ５の制御を行っている。よって、常に同じ速度でタンパク分子Ｐを巻き取ることができ、より安定した状態で重ならないようにタンパク分子Ｐを巻き取ることができる。
【００４５】
巻回工程後、算出部９ａは、トルクメータ８で測定された探針保持部材１６の回転数、即ち、探針１５の回転数と、予め決められた探針１５の外周の長さとに基づいて、タンパク分子Ｐの長さを算出する測長工程を行う。この際、従来の画像処理方法とは異なり、単にタンパク分子Ｐを巻き取るだけであるので、測定を容易に行うことができると共に、直接的に長さを測定できるので、正確な測長を行える。
特に、従来のように、基板２上にタンパク分子Ｐを予め適度な分散状態で固定したり、予め伸長した状態で固定化したりする等の複雑な前処理が不要であるので、手間がかからず測定に必要な時間の短縮化を図ることができる。また、従来のように、別々のシステムで前処理と画像処理とを行う必要がないので、測定を容易にすることができる。
【００４６】
更に、複雑な構成ではなく、単に探針１５の外周面にタンパク分子Ｐを巻き取るだけで、測長を行えるので、構成の単純化を図ることができ、設計が容易である。また、タンパク分子Ｐを直接的に探針１５で測長できるので、図７に示すように、拡大機構２０を利用することで、検出力を容易に拡大することが可能であり、測定感度の向上化を図れて高精度な測長を実現することができる。
具体的に説明すると、小さな歯車から大きな歯車に力が伝達するように、検出力を容易に拡大することができる。力のモーメント（Ｎ）は、Ｎ＝ｒ（回転半径）×Ｆ（回転させる向きに働く力）で表される。この式で表されるように、歯車の半径（ｒ）が大きくなると、探針１５を回転させる力（Ｆ）に対して、力のモーメント（Ｎ）も大きくなる。また、速度一定で回転させる場合には、力のモーメント（Ｎ）を検出し、歯車の径（ｒ）から逆算することで探針１５を回転させる力（Ｆ）を求めることができる。
上述したように、タンパク分子Ｐを直接的に測長できるので、小さな歯車から大きな歯車に力を伝達することができ、検出力を容易に拡大することが可能である。        
【００４７】
また、本実施形態の探針１５は、断面が円形に形成されているので、タンパク分子Ｐを巻き取る際に、該タンパク分子Ｐに局所的な荷重を与えることなく、均等の圧力で滑らかに巻き取ることができる。よって、タンパク分子Ｐに与える影響を極力低減することができる。
【００４８】
更に、本実施形態においては、上記巻回工程の際に、上記トルク測定工程及び引張力算出工程を行う。
これにより、図８に示すように、立体構造をとっているタンパク分子Ｐを両端で引き伸ばして１本の直線状ポリペプチドとするのに必要な張力を測定することができる。ここで、探針１５に一定の力（Ｆａ）が作用している場合には、図９に示すように、回転トルクは常に同じ値となる。よって、この回転トルクの変位を検出することで、タンパク分子Ｐの力学的性質を調べることができる。
例えば、タンパク分子Ｐは、図８に示すように、通常高分子鎖が絡まった結び目Ａ、Ｂ（結合部位）が存在している状態であるが、探針１５で巻き取られる際にこれら結び目Ａ、Ｂは解けてしまう。この際、例えば、結び目Ａ、Ｂが解ける直前までは、その結合力により結び目Ａ、Ｂが探針１５を引っ張る形になるので、図１０に示すように回転トルクが変化する。また、結び目Ａ、Ｂが解けた瞬間も同様に、回転トルクが急激に変化する。
【００４９】
このように、トルク測定工程及び引張力測定工程を行うことで、タンパク分子Ｐの長さ測定（測長）に加え、直線状ポリペプチドとするのに必要な張力や、結び目Ａ、Ｂの結合力の大きさ等の力学的性質を調べることができ、タンパク分子Ｐの構造解析を同時に行える。よって、タンパク分子Ｐをより多角的に観察することができる。
なお、回転トルク一定（力一定）で測定した場合には、図１１に示すように、結び目Ａ、Ｂの位置で回転方向に反する力を受けるので、回転速度（Ｖ）が遅くなる。よって、回転速度の変位を検出することで、上述した場合と同様に、直線状ポリペプチドとするのに必要な張力や、結び目Ａ、Ｂの力学的性質を調べることができ、タンパク分子Ｐの構造解析を同時に行うことができる。なお、回転速度Ｖは、単位時間の回転数から検出する。
【００５０】
次いで、観察が終了し、探針１５に全て巻き取ったタンパク分子Ｐをチップ基板１０上に生体分子固定方法により再度固定して生体分子チップ１１を製造する場合について説明する。
本実施形態の生体分子固定方法は、上記巻回工程後、巻き取ったタンパク分子Ｐの他端Ｓを再度チップ基板１０上に固定すると共に、探針保持部材１６を軸線Ｌ回りに逆回転させながらチップ基板１０と探針１５とをＸＹ方向に相対移動させてタンパク分子Ｐを伸長し、該伸長後、タンパク分子Ｐの一端Ｎをチップ基板１０上に固定して、任意の形にパターニングした状態で両端Ｎ、Ｓをチップ基板１０上に固定する固定工程を備えている。
【００５１】
即ち、図１２に示すように、３次元スキャナ１７によりチップ基板１０をＸＹＺの３方向に移動させて基板表面１０ａと探針１５とを接触させ、巻き取ったタンパク分子Ｐの他端Ｓを再度チップ基板１０上に化学的結合により固定させる。固定後、３次元スキャナ１７よりチップ基板１０をＸＹ方向に移動させると共に、モータ５を駆動させて探針保持部材１６及び探針１５を逆回転（時計回り）に回転させる。これにより、タンパク分子Ｐは、チップ基板１０上に伸長された状態で探針１５から引き出される。そして、最後にタンパク分子Ｐの一端Ｎをチップ基板１０上に固定することで、図１３に示すように、タンパク分子Ｐを一直線上に伸長した状態で両端末Ｎ、Ｓがチップ基板１０上に固定された生体分子チップ１１を製造することができる。
また、一直線状に限らず、図１４に示すように、湾曲した状態でタンパク分子Ｐをチップ基板１０上に固定した生体分子チップ１１を製造しても構わない。
更には、図１５に示すように、固定工程を複数のタンパク分子Ｐについて繰り返し行うことで、図１６に示すように、複数のタンパク分子Ｐが固定された生体分子チップ１１を製造することができる。
【００５２】
上記生体分子固定方法においては、長さが測定され、力学的性質が算出されたタンパク分子Ｐを、一直線状に伸長した状態や、湾曲した状態等の様々な形状でチップ基板１０上に固定して生体分子チップ１１を製造できるので、タンパク分子Ｐを、その後のより詳細な解明や観察等を行う際に有効に活用することができる。
特に、タンパク分子Ｐを一直線状に固定することが可能であるので、タンパク分子Ｐをより詳細に観察する際に、従来のように、タンパク分子Ｐを複数に切断して観察し、観察後、複数に分けたものを再度１つになるように結合するといった作業を行う必要がなく、一度（一括）でタンパク分子の構造を読み取ることができる。よって、再結合時の誤差がなくなるので、高精度な観察を実現することができる。特に、生体分子として、ＤＮＡを採用した際には、特に顕著なものである。
【００５３】
なお、タンパク分子Ｐの固定後、探針１５を用いて該タンパク分子Ｐの形状観察を行うことも可能である。例えば、探針１５の根元にレーザ光を反射する反射面を形成し、該反射面にレーザ光を照射すると共に、反射したレーザ光の位置変化から探針１５の高さの変位を検出できるように構成する。そして、探針１５と基板との距離が一定になるようにフィードバック制御を行いながら、ＸＹ方向にスキャンさせる。これにより、タンパク分子Ｐの凹凸に応じた三次元形状を画像化することができ、形状観察を行うことができる。
また、上述したレーザ光を利用した光てこ方式ではなく、探針１５の根元に、自身の上下方向の変位を検出するための抵抗体を設け、探針１５と基板との距離が一定になるようにフィードバック制御を行いながらＸＹ方向にスキャンさせても構わない。この場合には、レーザ光が不要であるので構成の単純化を図ることができる。
【００５４】
また、生体分子チップ１１は、チップ基板１０上にタンパク分子Ｐの両端末Ｎ、Ｓが固定された状態であるので、チップ基板１０の影響によりタンパク分子Ｐの活性を低下させる恐れがない。そのため、活性酵素等を使用してタンパク分子Ｐを観察することも可能であるので、さらに多角的な観察を実現できる。
【００５５】
上述したように、本実施形態のプローブ４、走査型プローブ顕微鏡１及び生体分子観察方法によれば、既知の長さとされた外周面にタンパク分子Ｐを巻回可能な探針１５を備えているので、探針１５の回転数よりタンパク分子Ｐの長さを容易且つ正確に測定することができる。また、従来のように、基板２上にタンパク分子Ｐを予め適度な分散状態で固定する等の前処理が不要であるので、手間をかけずに時間の短縮を図ることができる。
【００５６】
また、本実施形態の生体分子固定方法及び生体分子チップ１１によれば、長さが測定されていると共に力学的性質等の構造解析がされたタンパク分子Ｐが任意の形状でチップ基板１０上にパターニングされているので、より詳細なタンパク分子Ｐの解明や観察等に有効に活用することができる。
【００５７】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
【００５８】
例えば、上記実施形態においては、生体分子としてタンパク分子Ｐを例にしたが、タンパク分子Ｐに限られるものではない。また、探針１５を円柱状としたが、円柱に限定されるものではなく、外周が既知の長さであれば、断面が四角形等の多角形状でも構わない。
【００５９】
また、生体分子チップ１１を製造する際に、タンパク分子Ｐを伸長した状態でチップ基板１０上にパターニングしたが、伸長した状態に限られるものではない。即ち、巻回工程後、巻き取ったタンパク分子Ｐの他端Ｓを再度チップ基板１０上に固定すると共に、探針１５を軸線Ｌ回りに逆回転させて巻き戻し、該巻き戻し後、タンパク分子Ｐの一端Ｎと探針１５の外周面との固定を解いてタンパク分子Ｐを切り離す固定工程を行えばよい。
こうすることで、タンパク分子Ｐは、基板２上に巻き取られる初期の状態に復元し始め、最後に探針１５が、例えば、微小振動されることで探針１５から切り離される。その結果、チップ基板１０上に、長さが測定されると共に構造解析されたタンパク分子Ｐが、巻き取られる初期の状態を再現した状態で固定される。
【００６０】
また、本実施形態の生体分子固定方法では、巻き取ったタンパク分子Ｐをチップ基板１０上に固定したが、チップ基板１０に限定されるものではなく、タンパク分子Ｐが最初に固定されていた基板２上に固定された生体分子チップでも構わない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の一実施形態に係る走査型プローブ顕微鏡の構成図である。
【図２】図１に示す走査型プローブ顕微鏡の構成品で本発明に係るプローブを示す図であって、（ａ）は全体図、（ｂ）は探針先端の拡大図である。
【図３】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を巻き取って長さ及び構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、探針の外周面をタンパク分子に接触させて、外周面にタンパク分子の他端を固定した状態を示す図である。
【図４】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を巻き取って長さ及び構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図３に示す状態から、探針を基板表面から所定距離離間させた状態を示す図である。
【図５】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を巻き取って長さ及び構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図４に示す状態から、探針を軸線回りに回転させてタンパク分子を巻き取っている状態を示す図である。
【図６】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を巻き取って長さ及び構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図５に示す状態から、全てのタンパク分子を探針の外周面に巻き取った状態を示す図である。
【図７】図２に示すプローブに、該プローブで検出した力を拡大する拡大機構を組み合わせた概念図である。
【図８】探針でタンパク分子を巻き取る際に、タンパク分子に結び目（結合部位）が存在している状態を示す図である。
【図９】探針でタンパク分子を巻き取る際に、該探針に一定の力が作用している際の回転トルクの変位を示した図である。
【図１０】速度一定の状態でタンパク分子を巻き取る際に、図８に示す結び目により回転トルクがどのように変位したかを示す図である。
【図１１】力一定の状態でタンパク分子を巻き取る際に、図８に示す結び目により回転速度がどのように変位したかを示す図である。
【図１２】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を全て巻き取った後、チップ基板上に再度タンパク分子を固定する生体分子固定方法の一例を示した工程図であって、巻き取ったタンパク分子の他端をチップ基板に固定した状態を示す図である。
【図１３】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を全て巻き取った後、チップ基板上に再度タンパク分子を固定する生体分子固定方法の一例を示した工程図であって、図１２に示す状態からタンパク分子を一直線状に伸長した状態でチップ基板上にパターニングし、生体分子チップを製造した状態を示す図である。
【図１４】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を全て巻き取った後、チップ基板上に再度タンパク分子を固定する生体分子固定方法の一例を示した工程図であって、図１２に示す状態からタンパク分子を曲線状に伸長した状態でチップ基板上にパターニングし、生体分子チップを製造した状態を示す図である。
【図１５】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を全て巻き取った後、チップ基板上に再度タンパク分子を固定する生体分子固定方法の一例を示した工程図であって、図１４に示す状態から再度別のタンパク分子の他端を基板上に固定した状態を示す図である。
【図１６】図１に示す走査型プローブ顕微鏡により、タンパク分子を全て巻き取った後、チップ基板上に再度タンパク分子を固定する生体分子固定方法の一例を示した工程図であって、図１５に示す状態から別のタンパク分子を曲線状に伸長した状態でチップ基板上にパターニングし、生体分子チップを製造した状態を示す図である。
【図１７】タンパク質の構造解析を行う従来のナノ力学法を説明する図であって、カンチレバー先端の探針にタンパク質の一方の端末を固定させた状態を示す図である。
【図１８】図１７に示す状態から探針を離間させて、タンパク質を引き伸ばした状態を示す図である。
【図１９】タンパク質を引き伸ばす際に、探針に作用する引張力（張力）の変位を示す図である。
【符号の説明】
【００６２】
L    軸線
N    一端
P    タンパク分子（生体分子）
S    他端
１    走査型プローブ顕微鏡
２    基板
３    ステージ
４    プローブ
５    モータ（回転駆動部）
６    エンコーダ（回転数測定部）
７    移動手段
８    トルクメータ（トルク測定部）
９    パーソナルコンピュータ（制御手段）
９ａ    算出部
１０    チップ基板（基板）
１１    生体分子チップ
１５    探針
１６    探針保持部材
【図１】
2006201019.tif 000003
【図２】
2006201019.tif 000004
【図３】
2006201019.tif 000005
【図４】
2006201019.tif 000006
【図５】
2006201019.tif 000007
【図６】
2006201019.tif 000008
【図７】
2006201019.tif 000009
【図８】
2006201019.tif 000010
【図９】
2006201019.tif 000011
【図１０】
2006201019.tif 000012
【図１１】
2006201019.tif 000013
【図１２】
2006201019.tif 000014
【図１３】
2006201019.tif 000015
【図１４】
2006201019.tif 000016
【図１５】
2006201019.tif 000017
【図１６】
2006201019.tif 000018
【図１７】
2006201019.tif 000019
【図１８】
2006201019.tif 000020
【図１９】
2006201019.tif 000021