(57)【要約】【課題】  目的とする形状に成形し易く、組織が再生されるまでの間、支持組織再生用スペースを確保するだけの強度を保つことができる上に所望の期間経過後は分解吸収される性質を備え、更に効率良く間葉系組織の再生を誘導する能力を備えた間葉系組織再生誘導用シート及びその製造方法を提供する。【解決手段】  有機溶媒に溶解された生体吸収性高分子材料を凍結した後に乾燥して作製した多孔質シート面に培養液を含ませ、生体組織より採取後増殖させた間葉系細胞を播種し、該間葉系細胞を間葉系組織前駆細胞へと分化させることより、培養液を含む多孔質シート面に生体組織より採取した間葉系細胞から分化した間葉系組織前駆細胞と該間葉系細胞が間葉系組織前駆細胞へ分化する過程で分泌する細胞外基質とが付着している間葉系組織再生誘導用シートとする。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性高分子材料から成る培養液を含む多孔質シート面に、生体組織より採取した間葉系細胞から分化した間葉系組織前駆細胞と、該間葉系細胞が間葉系組織前駆細胞へ分化する過程で分泌する細胞外基質とが付着していることを特徴とする間葉系組織再生誘導用シート。
【請求項２】
生体吸収性高分子材料が、ポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル，ポリリンゴ酸及びそれらの共重合体中から選択された少なくとも一種である請求項１に記載の間葉系組織再生誘導用シート。
【請求項３】
生体組織から採取した間葉系細胞が、間葉系幹細胞又は歯周靭帯細胞である請求項１又は２に記載の間葉系組織再生誘導用シート。
【請求項４】
間葉系組織前駆細胞が、骨芽細胞，軟骨芽細胞，脂肪芽細胞，筋芽細胞のいずれかである請求項１から４までのいずれか１項に記載の間葉系組織再生誘導用シート。
【請求項５】
有機溶媒に溶解された生体吸収性高分子材料を凍結した後に乾燥して作製した多孔質シート面に培養液を含ませ、生体組織より採取後増殖させた間葉系細胞を播種し、該間葉系細胞を間葉系組織前駆細胞へと分化させることを特徴とする間葉系組織再生誘導用シートの製造方法。
【請求項６】
生体吸収性高分子材料として、ポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル，ポリリンゴ酸及びそれらの共重合体中から選択された少なくとも一種を使用する請求項５に記載の間葉系組織再生誘導用シートの製造方法。
【請求項７】
生体組織から採取した間葉系細胞として、間葉系幹細胞又は歯周靭帯細胞を使用する請求項５又は６に記載の間葉系組織再生誘導用シートの製造方法。
【請求項８】
間葉系組織前駆細胞として、骨芽細胞，軟骨芽細胞，脂肪芽細胞，筋芽細胞のいずれかを使用する請求項５から７までのいずれか１項に記載の間葉系組織再生誘導用シートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨，軟骨，筋肉及び脂肪等の間葉系組織の欠損部を再生誘導法で治療する際に使用する間葉系組織再生誘導用シート及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実現が求められている。再生医療は、本来生体が持っている治癒能力では回復できなくなった生体組織を、細胞，生体材料及び細胞成長因子の三つを使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。
【０００３】
医科及び歯科医療においては、自家骨を用いた骨再生が汎用されているが、例えば広範囲の骨欠損を伴った歯周病に対する歯周組織の治療法として、組織再生誘導法の開発が進められている。組織再生誘導法では、歯周組織が再生する過程で細胞が生体内で増殖，分化及び機能を発現させるために、細胞がその周辺環境（細胞増殖因子や細胞外マトリックス）と良好な相互作用を保つことが必要である。そこで、再生過程の初期環境を適切に設定し、再生誘導に伴う組織の自己修復能力を発動させてやれば、欠損部は正常な姿に再生修復されるのである。ところが、歯周病で破壊された歯の支持組織（線維組織や骨）は、何もせずそのまま治癒を待つと、必要な支持組織が再生する前に上皮等の別の軟組織が入り込み、再生がうまく行かない現象が発生する。そこで、必要な支持組織が再生するまでの間、支持組織再生用スペースを確保するために膜状の材料を用いて外からの不要な組織が侵入しないように防御し、歯の支持組織を再生させる対策が取られている（例えば、非特許文献１参照。）。この必要な支持組織が再生するまでの間、支持組織再生用スペースを確保するために用いられる膜状の材料としては、従来四フッ化エチレン樹脂膜やポリエチレン製フィルター等の半透明膜が使用されていたが、これらの材料は非生体吸収性であることから術後に取り除く必要があった。そこで近年では、生体吸収性高分子材料やコラーゲンで作製された生体吸収性材料から成る膜を使用することによって、治療後は異物として生体内に残存することなく速やかに分解吸収されて消失されるため、取り除く手術が不要となったので組織再生誘導法による治療が多用されるようになってきた（例えば、特許文献１及び２参照。）。
【０００４】
しかしながら、再生誘導に伴う組織は自己修復能力が低く、外からの不要な組織の侵入を防御しただけでは組織の再生誘導が起こり難い場合もある。その場合には、例えば、ポリグリコール酸不織布或いは多孔質ハイドロキシアパタイト内に細胞や細胞増殖因子、或いはその両者を組み合わせたものを含有させ、一定期間培養して調製したものを適用部位に埋入する方法などが行われている。
【０００５】
例えば、培地を貯留可能な容器内に、生体適合性及び／又は生体吸収性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せの材料からなる補填材層と、該補填材層の上面を被覆するゼラチン等からなる溶解層とを備える生体組織補填体の製造装置内に培地を貯留して、培地内に細胞を投入すると溶解層の表面に細胞が沈降して付着し、該溶解層の表面に沿って増殖し、時間が経過するにしたがい溶解層が培地に溶解して消滅することにより、溶解層上に付着していた細胞が溶解層の下方に存在する生体組織補填材からなる補填材層の上面に付着させられて増殖が継続させられ、その結果、細胞は生体組織補填材を足場として成長し、生体組織補填体が製造されるという技術が開示されている（例えば、特許文献３参照。）。しかしながら、リン酸カルシウム等を初めとする生体活性なセラミックスは、基材内で細胞が成育しにくいなどの問題がある上、ブロック形状とした補填材は、賦形性に乏しく欠損部位の形状に合わせてトリミング等の処理をするのが困難である。
【０００６】
また、ヒアルロン酸からなり、実質的に化学的架橋剤又は化学的修飾剤によって改質されておらず、中性水溶液に難溶性であるヒアルロン酸ゲルを含有する、シート状，フィルム状，破砕状，スポンジ状，塊状，繊維状，又はチューブ状からなる細胞組織再生用基材を組織の欠損部に充填できるよう各種の形態に成形し、軟骨細胞，幹細胞，骨髄細胞，骨芽細胞，又はＥＳ細胞などの細胞と必要に応じて細胞分化を誘導する物質を含ませておき、これを生体内の欠損部に充填して組織を再生することや、この際、増殖あるいは遊走してきた細胞の欠損部からの漏出を防ぐ目的で骨膜を保護する場合もあるという技術が開示されている（例えば、特許文献４参照。）。しかしながら、特に幹細胞を骨や軟骨へ分化させるには数週間を要するため、ヒアルロン酸からなる基材上で細胞を培養する間に基材の分解が生じ、欠損部へ移植するまで強度が保てないことが問題となっている。
【０００７】
更に、例えば歯槽骨を再生させる場合には、βリン酸三カルシウムとそれよりも軟質の生分解性材料との各々の顆粒を均一に混合したものをシート状に成形し、生分解性材料の融解温度付近まで加熱することにより、粒子間の間隙を残しつつ粒子どうしを融着させ多孔質のシート状に成形したものを二枚積層させた生体組織再生誘導用シートに、片側には抗生剤を含浸させ、他方側に成長因子を含浸させ、成長因子が含浸されている側を歯槽骨を再生したいスペース側に向け、抗生剤が含浸されている側を歯肉側に向けて配置すると、歯槽骨を再生誘導すべきスペースには外部の他の生体組織、例えば、歯肉組織等が侵入してくることを阻止することができ、歯槽骨が再生誘導される際に成長因子が再生誘導すべきスペースに染み出して作用し歯槽骨の成長を促進することが可能となり、歯槽骨を再生誘導すべきスペースの外側に存在する真菌や細菌等に対して抗生剤を作用させてこれらを死滅させる技術が開示されている（例えば、特許文献５参照。）。しかしながら、培養シャーレから剥がしてすぐの細胞はシートに接着するための基質産生が少なく、シートへ細胞を播種してシートごと欠損部へ移植して間もなく細胞がシートから剥離して体内へ分散する割合が高いという問題がある。
【０００８】
その他、間葉系幹細胞をシート状に培養した培養細胞シートと、生分解性物質をシート状に形成した生分解性シートとを積層してなる骨再生シートを欠損部へ移植し、欠損部へ欠損部周囲の組織細胞が侵入するのを遮断して骨形成作用を促進し、骨欠損部の修復速度を向上することができる骨再生シートも開示されている（例えば、特許文献６参照。）。この骨再生シートは、間葉系幹細胞を培養皿で培養後、培養皿の温度を培養温度より低い所定の温度まで低下させて培養皿より剥離して得た培養細胞シートと、例えばコラーゲン等から成る生分解性シートとを、例えばフィブリン糊等を用いて接着させることにより製造される。しかしながら間葉系幹細胞は多分化能を持ち、例えば動物実験では、骨，軟骨，脂肪，血管，心筋などに分化する能力が証明されており、間葉系幹細胞をそのまま欠損部へ移植した場合には目的とする組織へと分化されない虞がある。
【０００９】
間葉系幹細胞の他にも、軟骨細胞を、生体吸収性高分子から成る材料をスポンジ状に成型したものへ播種して増殖させた後に生体内へ埋め込み軟骨組織を再生する技術が開示されている（例えば、特許文献７参照。）。しかしながら軟骨組織の再生を誘導するために軟骨細胞を用いる場合、先ず患者の軟骨を採取しそれを培養して増殖させるが、軟骨細胞は培養系で増殖させることが難しい上、欠損部位の軟骨組織の再生効率も低いので、患者にかかる負担が大である。
【００１０】
【非特許文献１】田畑泰彦，「生体材料，生体組織工学を基盤とした再生医療の最前線」，日本歯科評論，株式会社ヒョーロン・パブリッシャーズ，2004年2月，第64巻，第2号，p.167-181
【特許文献１】特許第２７０９３４９号公報
【特許文献２】特開２００２−０８５５４７号公報
【特許文献３】特開２００４−１０５０４６号公報
【特許文献４】特開２００３−０１０３０８号公報
【特許文献５】特開２００４−０２４７０６号公報
【特許文献６】特開２００３−２７５２９４号公報
【特許文献７】特開平１０−２３４８４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明は、目的とする形状に成形し易く、組織が再生されるまでの間、支持組織再生用スペースを確保するだけの強度を保つことができる上に所望の期間経過後は分解吸収される性質を備え、更に効率良く間葉系組織の再生を誘導する能力を備えた間葉系組織再生誘導用シート及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、生体吸収性高分子材料から成る培養液を含む多孔質シート面に、生体組織より採取した間葉系細胞を播種し、該シート面で間葉系幹細胞や歯周靱帯細胞等の間葉系細胞を培養し、欠損部の再生を誘導するのに適した間葉系組織前駆細胞へ分化させると、分化の過程で分泌される細胞外基質により細胞はシート面にしっかりと固着され、欠損部へシートを埋入する際に細胞がシートから剥離して体内へ分散することもなく、細胞にとっても欠損部の組織の再生を誘導し易い状態のまま埋入することができ、効率良く組織再生を誘導する能力を有する間葉系組織再生誘導用シートを作製できることを究明して本発明を完成したのである。
【００１３】
即ち本発明は、生体吸収性高分子材料から成る培養液を含む多孔質シート面に、生体組織より採取した間葉系細胞から分化した間葉系組織前駆細胞と、該間葉系細胞が間葉系組織前駆細胞へ分化する過程で分泌する細胞外基質とが付着していることを特徴とする間葉系組織再生誘導用シートと、有機溶媒に溶解された生体吸収性高分子材料を凍結した後に乾燥して作製した多孔質シート面に培養液を含ませ、生体組織より採取後増殖させた間葉系細胞を播種し、該間葉系細胞を間葉系組織前駆細胞へと分化させることを特徴とする間葉系組織再生誘導用シートの製造方法とに関するものである。
【００１４】
そして、本発明において、生体吸収性高分子材料としては、ポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル，ポリリンゴ酸及びそれらの共重合体中から選択された少なくとも一種が好適であり、生体組織から採取した間葉系細胞として、間葉系幹細胞又は歯周靭帯細胞が、また間葉系組織前駆細胞としては、骨芽細胞，軟骨芽細胞，脂肪芽細胞，筋芽細胞のいずれかが好適である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明方法を用いて作製した本発明に係る間葉系組織再生誘導用シートは、生体組織より採取した間葉系細胞を生体吸収性高分子材料から成る培養液を含む多孔質シート面に播種し、シート面で欠損部の再生を誘導するのに適した間葉系組織前駆細胞へ分化させているため、分化の過程で分泌される細胞外基質により細胞はシート面にしっかりと固着され、欠損部へシートを埋入する際に細胞がシートから剥離して体内へ分散することもなく、細胞にとっても欠損部の組織の再生を誘導し易い状態のまま欠損部へ埋入することができ、効率良く組織再生を誘導する能力を有した間葉系組織再生誘導用シートを作製することができるという効果を奏する。またシート状であるため、目的とする形状に成形し易く、組織が再生されるまでの間、支持組織再生用スペースを確保するだけの強度を保つことができる上、シートが生体吸収性であるため所望の期間経過後は生体内で分解吸収されるので撤去手術を行う必要もない。
本発明に係る間葉系組織再生誘導体シートを用いると、例えば頭蓋骨，顎骨，大腿骨等の長管骨，腸骨，脊椎等の間葉系組織の再生が誘導される。
また本発明に係る間葉系組織再生誘導用シートの製造方法は、有機溶媒に溶解された生体吸収性高分子材料を凍結した後に乾燥して作製した多孔質シート面に培養液を含ませ、生体組織より採取後増殖させた間葉系幹細胞や歯周靱帯細胞等の間葉系細胞を播種し、該間葉系細胞を間葉系組織前駆細胞へと分化させるという簡単な操作で間葉系組織再生誘導用シートを製造する方法であるので、容易且つ安価に製造できるという効果を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明で使用する間葉系細胞は、骨・軟骨・脂肪・筋肉細胞などの間葉系組織を再生し得るか又はそれらの再生を促進し得る能力を有する細胞で、例えば間葉系幹細胞や歯周靭帯細胞等を用いることができる。採取する方法としては通常医科で行われている方法が特に限定されずに使用でき、例えば、骨盤（腸骨）や手足の長管（大腿骨，脛骨）の骨髄及び／又は骨膜，歯槽骨等の骨髄，口蓋又は歯槽骨等の骨膜，歯周靱帯（歯根膜）等が挙げられる。中でも、採取の際、皮膚，筋肉の剥離切開が最小で済む簡易な手術で行うことが可能な腸骨，胸骨，歯槽骨等の骨髄，口蓋又は歯槽骨等の骨膜等を採取源とすることが好ましい。
【００１７】
本発明で作製した間葉系組織再生誘導用シートは以下のような症例に適用することができる。歯科領域では、例えば歯周病で失った間葉系組織の再建や口蓋裂及び顎骨，顎提の骨補填等に適用できる。外科領域では、骨折に伴う骨補填や、外科手術に伴う腸骨欠損等の骨補填に適用できる。また、心筋梗塞にも適用できる。脳外科領域では、外科処置に伴う頭蓋骨欠損等の骨補填に適用できる。整形外科領域では、整形外科手術に伴う腸骨欠損等の骨補填，脊椎骨の補填，椎間板の補填に適用できる。また、例えばスポーツ傷害等による膝軟骨欠損の補填，変形性関節症に適用できる。皮膚科領域については、例えば褥瘡等の難治性の皮膚疾患，火傷等による外傷の再建に適用できる。形成外科領域では、形成外科手術に伴う骨・軟骨及び筋肉欠揖に適用できる。例えば、交通事故に伴う顎顔面の再建，手指の再建等が挙げられる。また、胸部の形成や乳房の再建にも適用できる。美容・審美外科に伴う骨・軟骨・脂肪・筋肉欠換の補填，形成に適用できる。
【００１８】
採取した間葉系細胞は、組織培養用の培養容器で1〜２週間の間、超増幅培養される。培養に用いられる培地としては、適宜の培地が使用できるが、例えば自己血清，ウシ胎児血清（FBS）を含有した細胞培養用のDMEM（Dulbeco's Modified Eaqle Medium）培地が好適に使用できる。このとき、特定の成長因子（例えばbFGF）を作用させると、間葉系細胞は高い多分化能力を保ったまま増殖され、間葉系組織の再生を促進でき、顕著な再生能力を有する。
【００１９】
かくして特定の成長因子の存在下で多分化能力を保ったまま超増幅培養された間葉系細胞をトリプシン処理により培養容器から剥離し、生体吸収性高分子材料から成る培養液を含む多孔質シート面に播種する。生体吸収性高分子材料から成る多孔質シートを構成する生体吸収性高分子材料としては、ポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル，ポリリンゴ酸及びそれらの共重合体中から選択された少なくとも一種を挙げることができ、この多孔質シートはジオキサン，クロロホルム，ジクロロメタン，四塩化炭素，アセトン，テトラハイドロフランの如き有機溶媒に溶解した生体吸収性高分子材料を凍結した後に乾燥して作製する。このような多孔質シートとしては、例えば前記特許文献１に開示されているような、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体又は乳酸／グリコール酸共重合体のみから成る材料を生体分解吸収性高分子材料として用い、該共重合体は重量平均分子量が50,000〜500,000であり、組成モル比が95：5〜5：95モル％であって室温（25℃）における動的粘弾率が5×107〜5×109dyne／cm2、伸び率が100〜2,000％の範囲であり厚みが10〜500μmである多孔質で均一な構造のフィルム又はシート状のものが好適に使用できる。そして間葉系細胞を培養可能な培養液をこの多孔質シート面に含ませておくのであり、培養液を多孔質シート面に含ませる方法としては、多孔質シートを培養液中に一晩浸漬するような方法が好ましい。
【００２０】
かくして生体吸収性高分子材料から成る培養液を含む多孔質シート面に播種した後、間葉系細胞を目的とする欠損組織に適した間葉系組織前駆細胞へ分化させる。例えば欠損部が骨であれば、Science 284, 143-147, 1999記載の培地等を用いて３〜４週間培養し、骨芽細胞へと分化させればよい。すると、播種された間葉系細胞は、骨芽細胞へ分化するにしたがって骨芽細胞特有の細胞外基質を分泌し、例えば高いアルカリホスファターゼ活性や沈着カルシウム濃度、石灰化を示すアリザリン赤による染色性、更に骨芽細胞に特異的なオステオカルシンｍRNAを発現するようになる。
【００２１】
このように間葉系細胞が多孔質シート面で間葉系組織前駆細胞へ分化する過程で、分化した間葉系細胞は細胞が生殖するのに適した細胞外基質を産生し、多孔質シート面にしっかりと固着され、欠損部へ多孔質シートを埋入する際に細胞が多孔質シートから剥離して体内へ分散することもなく、細胞にとっても組織再生を誘導し易い状態のまま埋入することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
＜間葉系細胞の準備＞
間葉系細胞Ａ（ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞）
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を10％FBS，DMEM培地に懸濁した後、直径10cmの培養皿へ1×105個の有核細胞を播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換することによって非接着細胞（造血系細胞）を除去した。以後、３日に１回培地を交換した。５日目からはｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を３ng／mlの割合で培地に添加した。その結果、１０日前後で細胞はほぼ集密的にまで増殖した。この培養皿を（0.05％トリプシン＋0.2mMEDTA）で５分間インキュベートして細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5,000細胞個／cm2の密度で細胞を10％FBS，DMEM培地の直径10cmの培養皿へ播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を間葉系細胞Ａとした。
【００２４】
間葉系細胞Ｂ（ラットの大腿骨・脛骨の骨髄液から採取した間葉系幹細胞）
４週齢のラットの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断し、10%FBS，DMEM培地で骨髄内を洗浄し、その洗浄液中でよく懸濁して骨髄液をほぐした後、300Ｇで５分間遠心分離して、細胞を分離して約7×107個の有核細胞を得た。この骨髄から採取した3.75×107個の有核細胞を前記と同様のDMEM培地の75cm2培養フラスコへを播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換することによって非接着細胞（造血系細胞）を除去した。以後３日に１回培地を交換した。５日目からはｂＦＧＦを３ng／mlの割合で培地に添加した。その結果、１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。この培養フラスコを（0.05%トリプシン＋0.2mMEDTA）で５分間インキュベートして細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5,000細胞個／cm2の密度で細胞を10％FBS，DMEM培地の75cm2培養フラスコへ播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を間葉系細胞Ｂとした。
【００２５】
間葉系細胞Ｃ（ヒト抜去歯から採取した歯周靭帯細胞）
矯正治療上の理由などから便宜抜去された健全な歯を70%エタノール溶液で３秒間消毒し、歯冠側1/3及び根尖側1/3の歯周靭帯をメスを用いて除去した後，2.0mg／mlコラゲナーゼ及び2.5mg／mlトリプシンを含むDMEM中に浸漬し、３７℃にて３０分間振盪下で作用させた。その後、遠心（150Ｇ×5min）によって細胞を洗浄し、得られた細胞成分を10%FBS，DMEM培地に懸濁した後、直径10cmの培養皿に1×106個の有核細胞を播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換することによって非接着細胞（造血系細胞）を除去した。以後３日に１回培地を交換した。５日目からはｂＦＧＦを３ng／mlの割合で培地に添加した。その結果、１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。この培養皿を（0.05%トリプシン＋0.2mMEDTA）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5,000細胞個／cm2の密度で細胞を10％FBS，DMEM培地の直径10cmの培養皿へ播種した。この操作を繰り返して、ほぼ集密的（コンフルエント）になった二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を間葉系細胞Ｃとした。
【００２６】
＜多孔質シートの準備＞
多孔質シートＸ（高分子材料：乳酸−グリコール酸共重合体）
ジオキサン中に乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸：グリコール酸＝７５：２５，重量平均分子量約2×105）を１０％の濃度となるように入れ、撹拌機で撹拌し溶解した。その後、ガラス型内に注ぎフリーザーにて−３０℃の条件で凍結させ、次いで真空乾燥機にて減圧下で４８時間乾燥させることによりジオキサンを取り除いた後、型より取り出して加圧することにより、膜厚250μmの多孔質シートを得た。この多孔質シートをγ滅菌後、10％FBS，DMEM培地中に一晩浸漬することによって、培養液を含む多孔質シートＸを作製した。
【００２７】
多孔質シートＹ（高分子材料：ポリ乳酸）
ジクロロメタン中にポリ乳酸（重量平均分子量約2×105）を６％の濃度となるように入れ、撹拌機で撹拌し溶解した。その後、ガラス型内に注ぎフリーザーにて−３０℃の条件で凍結させ、次いで真空乾燥機にて減圧下で４８時間乾燥させることによりジクロロメタンを取り除い取り除いた後、型より取り出して加圧することにより、膜厚250μmの多孔質シートを得た。この多孔質シートをγ滅菌後、10％FBS，DMEM培地中に一晩浸漬することによって、培養液を含む多孔質シートＹを作製した。
【００２８】
多孔質シートＺ（高分子材料：乳酸−ε−カプロラクトン共重合体）
ジオキサン中に乳酸−ε−カプロラクトン共重合体（乳酸：ε−カプロラクトン＝75：25，重量平均分子量約2×105）を６％の濃度となるように入れ、撹拌機で撹拌し溶解した。その後、ガラス型内に注ぎフリーザーにて−３０℃の条件で凍結させ、次いで真空乾燥機にて減圧下で４８時間乾燥させることによりジオキサンを取り除いた後、型より取り出して加圧することにより、膜厚250μmの多孔質シートを得た。この多孔質シートをγ滅菌後、10％FBS，DMEM培地中に一晩浸漬することによって、培養液を含む多孔質シートＺを作製した。
【００２９】
＜実施例１＞
骨分化用培養液（αMEM，Ｌ−グルタミン2mM，10%FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg／mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に懸濁させた間葉系幹細胞Ａを、約20,000細胞個／cm2の密度で多孔質シートＸに播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で３日に１回培地を交換しながら４週間培養して間葉系組織前駆細胞である骨芽細胞と細胞外基質が付着した骨組織再生誘導用シートを作製した。
【００３０】
＜実施例２＞
骨分化用培養液（αMEM，Ｌ−グルタミン2mM，10%FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg／mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に懸濁させた間葉系幹細胞Ｂを、約20,000細胞個／cm2の密度で多孔質シートＺに播種し，３７℃にて５％炭酸ガス存在下で３日に１回培地を交換しながら３週間培養して間葉系組織前駆細胞である骨芽細胞と細胞外基質が付着した骨組織再生誘導用シートを作製した。
【００３１】
＜実施例３＞
軟骨分化用培養液（αMEM，Ｌ−グルタミン2mM，グルコース4.5mg／ml，10-7Mデキサメサゾン，50μg／mlアスコルビン酸２リン酸，10ng／mlTGF-β，6.25μg／mlインスリン，6.25μg／mlトランスフェリン，6.25ng／mlセレン酸，5.33μg／mlリノレイン酸，1.25mg／mlウシ血清アルブミン）に懸濁させた間葉系幹細胞Ａを、約20,000細胞個／cm2の密度で多孔質シートＸに播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で３日に１回培地を交換しながら４週間培養して間葉系組織前駆細胞である骨芽細胞と細胞外基質が付着した軟骨組織再生誘導用シートを作製した。
【００３２】
＜実施例４＞
脂肪分化誘導用培養液（DMEM，Hiグルコース，10%FBS，10μg／mlインスリン，0.2mMインドメタシン，10-6Mデキサメサゾン，0.5mM３−イソブチル−１−メチルキサンチン）に懸濁させた間葉系幹細胞Ａを、約20,000細胞個／cm2の密度で多孔質シートＹに播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で培養し，２日後に脂肪分化維持培地（DMEM，Hiグルコース，10%FBS，10mg／mlインスリン）に培地交換をした。以後脂肪分化誘導培地２日間、脂肪分化維持培地３日間の培地交換を交互に行いながら２０日間培養して間葉系組織前駆細胞である骨芽細胞と細胞外基質が付着した脂肪組織再生誘導用シートを作製した。
【００３３】
＜実施例５＞
骨分化用培養液（DMEM，Ｌ−グルタミン2mM0，10%FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg／mlアスコルビン酸２リン酸，10mMグリセロリン酸）に懸濁させた間葉系幹細胞Ｃを約20,000細胞個／cm2の密度で多孔質シートＸに播種し、３７℃にて５％炭酸ガス存在下で３日に１回培地交換をしながら４週間培養して間葉系組織前駆細胞である骨芽細胞と細胞外基質が付着した骨組織再生誘導用シート作製した。
【００３４】
上記各実施例に記載した組織再生誘導用シートは、間葉系細胞から分化した間葉系組織前駆細胞がその間葉系細胞が間葉系組織前駆細胞へ分化する過程で分泌する細胞外基質により多孔質シート面にしっかりと固着されており、柔軟で欠損部の組織の再生を誘導し易い状態であり、医療に貢献するところ極めて大なるものであることが判った。