(57)【要約】      （修正有）【課題】化合物の変異原性・遺伝毒性の、高感度かつ効率的な測定手段の提供。【解決手段】４０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを含む組換え核酸配列であって、前記プロモーターが、光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に、遺伝子工学的操作によって連結されている組換え核酸配列。かかる核酸配列を含む宿主微生物、及び該微生物（バイオセンサー）を用いて遺伝毒性及び多数の遺伝毒性化合物の存在を測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを含む組換え核酸配列であって、前記プロモーターが光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている組換え核酸配列。
【請求項２】
プロモーターが組換え修復中に誘導されるプロモーターからなるＳＯＳ調節プロモーターの群から選択される請求項１に記載の組換え核酸配列。
【請求項３】
プロモーターがＲｅｃＦ，ＲｅｃＪ，ＲｅｃＮ，ＲｅｃＦ経路の特定のメンバー、ＲｅｃＯ，ＲｅｃＱ，ｒｕｖ，及びｕｖｒＤから選択される請求項１又は２のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項４】
プロモーターがＲｅｃＮ（配列番号３）である請求項１−３のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項５】
プロモーターがプロモーター強度又は調節を改良する突然変異を含む（ただし前記突然変異はＳＯＳ調節を破壊しない）請求項１−４のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項６】
プロモーターが少なくとも一つの活性のあるＬｅｘＡ結合部位を含み、かつ少なくとも一つの他のＬｅｘＡ結合部位に突然変異を持つ請求項１−５のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項７】
プロモーターが少なくとも一つの活性のあるＬｅｘＡ結合部位を含み、かつ少なくとも一つの他のＬｅｘＡ結合部位に突然変異を持つ（ただし前記突然変異は野生型プロモーター配列を変えない）請求項１−６のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項８】
プロモーターが以下の核酸配列番号７（すなわちＲｅｃ１−３）：
2006340723.tif 000017
を持つ突然変異したＲｅｃＮプロモーターである請求項１−７のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項９】
プロモーターがプロモーターアップ突然変異を含む請求項１−８のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項１０】
プロモーターが前記プロモーターの−３５領域にプロモーターアップ突然変異を含む請求項１−９のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項１１】
プロモーターが以下の核酸配列番号８（すなわちＲｅｃ２−４）：
2006340723.tif 000018
を持つ突然変異したＲｅｃＮプロモーターである請求項１−１０のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項１２】
プロモーターがｓｆｉＡである請求項１に記載の組換え核酸配列。
【請求項１３】
レポーターコード核酸配列がルシフェラーゼＡ及びＢ遺伝子を含む請求項１−１２のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項１４】
レポーターコード核酸配列がルシフェラーゼＡ及びＢ遺伝子、及び再生利用される制限脂肪酸基質の生産に要求されるルシフェラーゼＣ，Ｄ，及びＥ遺伝子を含む請求項１−１３のいずれかに記載の組換え核酸配列。
【請求項１５】
請求項１−１４のいずれかに記載の組換え核酸配列を含む宿主微生物。
【請求項１６】
宿主微生物がＥ．ｃｏｌｉである請求項１５に記載の宿主微生物。
【請求項１７】
宿主微生物がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである請求項１５に記載の宿主微生物。
【請求項１８】
宿主微生物が適切なエイムス試験微生物の特性を更に有する請求項１７に記載の宿主微生物。
【請求項１９】
宿主微生物がＴＡ９８，ＴＡ１００，ＴＡ１０２，ＴＡ１０４，ＴＡ１５３５，ＴＡ１５３８，ＴＡ７００１−ＴＡ７００６，及びＴＡ７０４１−ＴＡ７０４６から選択される請求項１７又は１８に記載の宿主微生物。
【請求項２０】
サンプル中の多数の遺伝毒性化合物の存在を測定する方法であって、以下の手順を含む方法：
−  宿主微生物を培養し（前記宿主微生物はＳＯＳ調節プロモーターを含む核酸配列を含み、前記プロモーターは光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている）、
−  培養物の発光を測定し（前記測定は様々な時点で、好ましくは連続的に行われる）、前記時点におけるシグナル対ノイズ比を測定し、データをプロットする（前記データは前記サンプルの遺伝毒性の速度を表し、多数のピークは異なる誘導の速度を持つ多数の遺伝毒性化合物の指標である）。
【請求項２１】
サンプル中の遺伝毒性化合物の存在を測定する方法であって、以下の手順を含む方法：
−  宿主微生物を培養し（前記宿主微生物は２０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを含む核酸配列を含み、前記プロモーターは光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている）、
−  様々な時点で、好ましくは連続的に培養物の発光を測定し、
−  培養物の発光が変化したかどうかを測定する（増加した発光は遺伝毒性化合物の存在の指標である）。
【請求項２２】
サンプルの遺伝毒性の速度を測定する方法であって、前記方法が発光の測定が多数の時点で、好ましくは連続的に行われる請求項２１に規定される手順、及びそれに加えて以下の手順：
−  前記時点で発光のシグナル対ノイズ比を測定し、
−  ノイズデータに対する発光シグナルをプロットする（前記プロットは前記サンプルの遺伝毒性の速度を表す）
を行うことを含む方法。
【請求項２３】
宿主微生物が請求項１５−１９のいずれかに記載の宿主微生物である請求項２０，２１，又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
サンプルの遺伝毒性及び変異原性の両方を測定する方法であって、前記方法が請求項２３に記載の方法に続いて古典的なエイムス試験の方法を行うことを含む方法。
【請求項２５】
サンプル中の毒性化合物の存在を測定する方法であって、前記方法が以下の手順：
−  宿主微生物を培養し（前記宿主微生物は請求項１５−１９のいずれかに記載の宿主微生物である）、
−  培養物の発光を測定し、
−  培養物の発光が変化したかどうかを測定する（減少した発光は毒性化合物の存在の指標である）
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
現在、微生物を用いた遺伝毒性及び／又は毒性化合物の様々なスクリーニング法がある。エイムス試験（Ｍａｒｏｎ及びＡｍｅｓ，１９８３年）は最も幅広く使用されている毒性化合物に対する試験であり、世界中で奨励されている。しかしながら試験の完了には約３日かかり、明らかに不都合を伴う。
【０００２】
いくつかの短期間で完了する方法が導入されている。それらにおいてはＤＮＡ損傷により生ずるＳＯＳ応答はＳＯＳ調節されるｕｍｕＤ，Ｃ又はｓｆｉＡストレス誘導プロモーターの下流に位置するｌａｃＺ遺伝子によって発現されるβ−ガラクトシダーゼの量として測定される。これらの試験はそれぞれ宿主微生物としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを用いるｕｍｕ試験（Ｏｄａら，１９８５年）、及び宿主微生物としてＥ．ｃｏｌｉを用いるＳＯＳ染色試験（Ｑｕｉｌｌａｒｄａｔら，１９８２年）として知られている。ｕｍｕ試験、及びＳＯＳ染色試験では宿主微生物は試験されるサンプルの存在下で培養され、続いて宿主微生物は粉砕される。次にβ−ガラクトシダーゼに対する基質が添加され、続く反応は約１０分後に阻害剤の添加によって停止され、続いて二波長でのＯＤ測定、及びβ−ガラクトシダーゼ活性の計算が行われる。これらの試験はエイムス試験の長い期間の問題を乗り越えるが、それら自体不都合を持つ。感度は低く、検出時間はそれでも７−８時間と長い。特にニトロアレン（ｎｉｔｒｏａｒｅｎｅｓ）及び多環式芳香族炭化水素の検出感度は低い。それに加えて、検出方法は多数の作用、及び様々な試薬の添加を必要とし、それによって方法を複雑かつ費用のかかるものにしている。いかなる誘導の検出を行うためにも細胞が粉砕されなければならないという事実のため、細胞について一つの測定を行うことのみが可能である。
【０００３】
ＥＰ−Ａ−０６４９９０５は上述の試験の不都合はルシフェラーゼの発現がＳＯＳ遺伝子の発現と同時に起こるようにＳＯＳ遺伝子をルシフェラーゼを発現する遺伝子の上流に配置することによって乗り越えることができるということを開示する。結果として変異原物質は発光の測定によって短時間で検出又は測定することができる。いかなるＳＯＳ遺伝子も有用であると述べられており、ｕｍｕＤ，Ｃ遺伝子（ｕｍｕ試験で使用されるものと同じである）が実施例で示されている。検出測定に必要なサンプル容量が小さいので、この試験の感度は従来の試験、すなわちＳＯＳ染色試験及びｕｍｕ試験、の感度と比べて増加していると述べられている。使用されるプロモーターに関してはそれがＳＯＳを誘導することができなくてはならないという事実以外には何の言及もされていない。発光の生産は即時であるので測定はｌａｃ系でよりも迅速に行うことができ、それによって検出時間が短縮される。
【０００４】
ＷＯ  ９４／１３８３１でＤｕＰｏｎｔは遺伝子工学的に操作された微生物を提供するための、発光遺伝子複合体と組合わせたストレスを誘導できるプロモーターの使用を開示する。彼らは「ストレス応答は様々な環境攻撃の存在を検出するために有用であると証明されているが、それでもそれは敏感かつ容易に検出されるレポーターに結び付けられなくてはならない」と述べている。ＤｕＰｏｎｔは彼らによれば有用であり得る、公知のストレスを誘導できるプロモーターの広範囲にわたる目録を提供しているが、本発明はそれに限定されるものではない。この目録は以下の調節回路（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ）からのプロモーターを含む：熱ショック、ＳＯＳ、過酸化水素、スーパーオキシド、脂肪酸欠乏、普遍的なストレス、休息状態、緊張、カタボライト活性化、Ｐ利用、Ｎ利用。実施例では彼らは以下のプロモーターを用いている：熱ショック調節タンパク質プロモーターｄｎａＫ及びｇｒｐＥ、ＳＯＳ調節プロモーターｒｅｃＡ及びｕｖｒＡ、酸化損傷調節プロモーターｋａｔＧ及びｍｉｃＦ、普遍的ストレスプロモーターｕｓｐＡ、静止期プロモーターｘｔｈＡ、アミノ酸欠乏回路からのｈｉｓプロモーター、炭素欠乏回路に関与するｌａｃプロモーター、リン酸制限回路からのｐｈｏＡプロモーター、及び窒素制限回路からのｇｌｎＡプロモーター。かかる広範囲の様々に調節されるプロモーターからのこの多数の実施例はそれらの系の幅広い適用性を明らかにするのに役立つだろう。プロモーターのいかなる個々の群又はいかなる個々のプロモーターについても好ましいものは表現されておらず、又は推論できない。特異なＳＯＳ調節プロモーターについての唯一の明白な参照は実施例の一つ（特許出願の実施例１２）でなされている。そこではＳＯＳ調節プロモーターｒｅｃＡでの結果が表されている。微生物を変異原であるエチジウムブロマイドを０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で含むサンプルに暴露した後、１．９の誘導比が変異原添加の１８０分後、一つの測定で測定された。０．５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣの添加後、誘導比は１００分後に測定された。用いた試験株に依存してそれらは４．７−２０の間で変化した。これはＤｕＰｏｎｔの出願の実施例１２から明らかである。
【発明の開示】
【０００５】
予期せぬことに私たちはストレス誘導プロモーターのサブグループを発見した。実際、ＳＯＳ調節プロモーターのサブグループは発光レポーターと組合わせて変異原性を評価するための微生物系で使用することができ、改良された結果を与える。このサブグループはＳＯＳ調節ＲｅｃＡプロモーターを含まない。このサブグループはＤｕＰｏｎｔのＲｅｃＡ−ルシフェラーゼ系及び公知の他の微生物毒性試験系にまさるいくつもの利点を提供する。特殊な方法でプロモーターを突然変異させることによるこれらの新しい系の更なる試験及び開発において、効能を更に一層改良することができた。それに加えて新規の試験方法が行われた。これらの新規の試験方法の結果、いかなる存在する微生物毒性試験についても今まで記述されていない、より多く、かつ、より良いデータが得られる。
【０００６】
本発明の主題は４０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを含む組換え核酸配列であって、前記プロモーターが光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）組換え核酸配列に向けられている。より高い誘導比、好ましくは５０以上の誘導比を持つプロモーターが本発明による組換え核酸配列中に存在することが好ましい。誘導比は例えばＭ．ＳｃｈｎｕｒｒらによってＢｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９９１）７３，４２３−４３１に開示されているように決定することができる。代わりにＰｅｔｅｒｓｏｎ  Ｋ．Ｒ．及びＭｏｕｎｔ  Ｄ．Ｗ．（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３，２７−４０によって開示される方法も使用できる。これらの開示は参考文献としてここに組入れる。ルシフェラーゼと組合わせた公知のｒｅｃＡプロモーターはこのカテゴリー内には入らない。何故ならｒｅｃＡの誘導比は目立って低いからである。それは３０℃（これは試験のインキュベート温度である）において１１である。誘導比は技術用語であり、当業者には本質的に知られている方法で確定される。文献においては実施例は多数のプロモーターについての数値と共に誘導比がどのようにして確立されるかということを与えられている。ｒｅｃＡの低い誘導比はたぶん、何故それがプロモーター誘導に基づいた感度の高い検出系に特に適さないかということの理由であろう。ＲｅｃＡプロモーターはＳＯＳ調節系において誘導される最も初期のプロモーターである。代謝の欠陥により生成されるシグナルはＲｅｃＡタンパク質によって感知される。それは損傷を回避するためにＤＮＡポリメラーゼを補助するという点で突然変異誘発において第二の機能を有するともいわれている。ＤＮＡ損傷後の最初の２０分間でｕｖｒＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ遺伝子は活性化され、除去修復を開始する。次にＲｅｃＦ組換え経路として知られている組換え修復経路が約４０分間極めて活性となる。最後にｕｍｕＤ，Ｃが関与するＳＯＳ突然変異誘発経路が誘導される。
【０００７】
上で引用した特許出願で明らかにされているとおり、ＤｕＰｏｎｔの系で使用されたマイトマイシンＣの最低レベルは５００ｎｇ／ｍｌであった。より低レベルの検出を指す又は示唆するものは与えられていない。供された系においては７ｎｇ／ｍｌのマイトマイシンが検出可能である。このように、この系はＤｕＰｏｎｔの系よりも約８０倍も感度が高いことが明らかにされた。私たちの系においては７．５ｎｇ／ｍｌの濃度から２以上の誘導比が見出された。
【０００８】
私たちはオンライン測定を初めて示す。オンライン測定はＳＯＳ又はエイムス試験では不可能であった。何故なら細胞の粉砕が要求されるからである。記述されている他の試験も単一点測定のためにのみ使用されている。サンプル中の多数の変異原の存在を区別することが可能であること、及びかかる物質の誘導の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を測定することが可能であることを私たちは今や発見した。遅れずに発光の進展をたどると多数の変異原の存在が異なるシグナルを検出可能に与えるということは全く予期せぬことであった。反対に、累加的な効果が生ずると予想されていた。しかし、ＳＯＳ調節プロモーターがかかる調節特性を示すプロモーターの群を形成すること、及び誘導パターンは様々な誘導化学物質について十分に異なり、区別された検出可能なシグナルを与えることが明らかにされた。新規の方法は極めて簡単に適用でき、シグナルの検出は自動化することができる。新規の方法は単に以下の手順を必要とするにすぎない：
−  ＳＯＳ調節プロモーターを含む微生物を培養し（前記プロモーターはレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されており、前記レポーターは光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずる）、及び微生物を試験されるサンプルと接触させ、続いて
−  培養物の発光を測定し（前記測定は様々な時点で行われる）、及び
−  前記時点でのシグナル対ノイズ比を測定し、
−  データをプロットする（前記データは前記サンプルの遺伝毒性の速度を表し、多数のピークは異なる誘導の速度を持つ多数の遺伝毒性化合物の指標である）。好ましくは発光測定は連続的である。好ましくは方法はオンラインで行われる。実施例及び添付の図は様々なピークが多数の変異原を含むサンプルで検出可能であるという事実を明らかにする。
【０００９】
好ましい具体例では発光測定は連続的に行われる。これは自動化及び多数の遺伝毒性物質の存在の測定の精度の観点から特に重要である。シグナル対ノイズ比が高いほど試験系の感度は高い。重要な他の要因は誘導スピード、発現の度合い、及びシグナル対ノイズ比の変動の度合いである。これらの要因は選択されたプロモーターのみならず宿主株及び遺伝毒性物質の性質にも依存して変化し得る。実際の使用のためにはシグナル対ノイズ比は遺伝毒性化合物の二つの濃度に対し２と等しいか又は２より高いであろう。当業者は一つ又は多数の上述の特性に基づいて彼らの状況に最も適する系を選択するだろう。以下の実施例は新規のバイオセンサー系の幅広い適用を明らかにする。結果はＥ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株での本発明による新規のＤＮＡ配列の様々な具体例からなる本発明による多数の新規のバイオセンサー系について示される。試験された全ての新規バイオセンサー系はＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＥ．ｃｏｌｉ株に基づく標準エイムス又はＳＯＳ染色試験より良好であった。本発明による系はより迅速かつ正確で感度が高かった。ＳＯＳ染色試験及びエイムス試験においてはにせの陰性の結果を与えることが知られている物質について本発明による新規の系は陽性の結果を与える（そこでは既知の試験はにせの陰性の結果を実際与える）ことを私たちは明らかにする。特にこれはノボビオシン、アジ化ナトリウム、マイトマイシンＣ、ナリジキシン酸、過酸化水素、ピレン、及びフェナントレンについて明らかにされる。本発明による試験系はＰＡＨ′ｓ（すなわち多環式芳香族炭化水素）の存在を検出するのに特に適している。
【００１０】
それに加えて本発明による系は測定を与えるために粉砕の必要がない。このことはそれらが更なる試験に続いて使用できる理由、及びより重要にはそれらがある期間の時間に渡って検出可能なシグナルを与えることができる理由である。このようにしてサンプルの誘導の速度が追跡及び測定可能である。
【００１１】
本発明の重要な具体例は今や初めてサンプル中の多数の遺伝毒性化合物の存在を測定する方法が利用可能になったという事実にあり、前記方法は以下の手順を含む：
−  宿主微生物を培養し（前記宿主微生物はＳＯＳ調節プロモーターを含む核酸配列を含み、前記プロモーターは光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている）、
−  培養物の発光を測定し（前記測定は様々な時点で、好ましくは連続的に行われる）、前記時点におけるシグナル対ノイズ比を測定し、データをプロットする（前記データは前記サンプルの遺伝毒性の速度を表し、多数のピークは異なる誘導の速度を持つ多数の遺伝毒性化合物の指標である）。
【００１２】
新規のＤＮＡ配列の選択及び新規のバイオセンサー系を提供する宿主細胞におけるその使用によって、私たちは極めて感度が高く、かつ迅速なバイオセンサー系を作り出した。サンプルの遺伝毒性は５分−２時間以内で確かめることができる。
【００１３】
本発明の他の具体例はサンプル中の遺伝毒性化合物の存在を測定する方法を含み、前記方法は以下の手順を含む：
−  宿主微生物を培養し（前記宿主微生物は２０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを含む核酸配列を含み、前記プロモーターは光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている）、
−  様々な時点で培養物の発光を測定し、
−  培養物の発光が変化したかどうかを測定する（増加した発光は遺伝毒性化合物の存在の指標である）。
【００１４】
好ましくはプロモーターの誘導比は４０以上、好適には５０以上である。サンプル中の遺伝毒性化合物の存在を測定する上述の方法において、好ましい具体例は多数の時点で発光を測定することを含む。好ましくは測定は連続的に行われる。好ましくは以下の手順が加えられる：
−  前記時点で発光のシグナル対ノイズ比を測定し、
−  サンプルの遺伝毒性の速度を測定するためにノイズデータに対する発光シグナルをプロットする（前記プロットは前記サンプルの遺伝毒性の速度を表す）。
【００１５】
上述の方法は好ましくは本発明によるバイオセンサーで行われる。かかるバイオセンサーはこの明細書中で規定される本発明による新規の核酸配列を含む宿主株を含む。好ましくは宿主株はＥ．ｃｏｌｉ又はＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株の如き微生物である。特に標準のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  エイムス試験株が宿主株に適用され、本発明によるバイオセンサーの極めて好適な具体例を与える。本発明による株は遺伝毒性及び毒性試験の両方に適しているという魅力を与える。エイムス試験株の例はＴＡ９８，ＴＡ１００，ＴＡ１０２，ＴＡ１０４，ＴＡ１５３５，及びＴＡ１５３８，又は新規のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＴＡ７００１−ＴＡ７００６，及びＴＡ７０４６（Ｇｅｅら，１９９４年）である。また、エイムス株は製薬産業において世界中で受諾できる標準株である。宿主細胞としてエイムス株を含む本発明によるバイオセンサーの場合、株は本発明による遺伝毒性試験に使用することができるのみならず、エイムス試験にも続いて使用することができる。このように多機能性となることのできる他の好適な宿主株は当業者には明らかであろう。
【００１６】
本発明によるバイオセンサーでの適用に好適な本発明による核酸配列の様々な具体例は実施例で示されている。４０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを含む核酸配列であって、前記プロモーターが光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されている核酸配列は本発明の一部である。本発明によるバイオセンサーはここで開示される様々な具体例のいずれにおいてもかかる核酸配列を含む。更に、かかるＤＮＡ配列はここで開示されるように本発明によるすべての方法を行うのに好適である。
【００１７】
組換え修復プロモーターからの好適なプロモーターはＲｅｃＦ，ＲｅｃＪ，ＲｅｃＮ，ＲｅｃＯ，ＲｅｃＱ，ｒｕｖ，及びｕｖｒＤプロモーターの群からなる。ＲｅｃＮプロモーターは実施例で示されている。他の好適なプロモーターはＳｆｉＡプロモーターであり、それも実施例で示されている。それに加えて４０以上の誘導比を持つ組換え修復中に誘導されるＳＯＳ調節プロモーターの上述の群の突然変異したプロモーターは好適な具体例である。かかる突然変異体は増加したプロモーター強度又は調節を持つかもしれないが、ＳＯＳ制御が破壊されないことが必須である。極めて好適な突然変異の例は少なくとも一つのＬｅｘＡ結合部位に突然変異を含むが、少なくとも一つの他のＬｅｘＡ結合部位は活性のあるままである。このタイプの好ましい突然変異は少なくとも一つの他のＬｅｘＡ結合部位において野生型プロモーターの配列を変化させない突然変異を持つだろう。このタイプの突然変異体の例は配列番号７（ＲｅｃＮ１−３）を持つＲｅｃＮ突然変異体である。ＬｅｘＡ突然変異を持つ突然変異のタイプは明細書で開示されるように多数の遺伝毒性物質の存在の測定方法、及び本発明による方法でかかるサンプルの誘導の速度を測定する方法において特に有用である。又、かかる突然変異体は極めて感度が高く、迅速である。それらは遺伝毒性を持つ中間分解又は代謝産物の出現及び／又は蓄積の測定に特に有用である。これは汚染物質及び例えば土壌のバイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）によるその汚染物質の分解の分野で有用であり得る。又、これは薬剤試験において有用であり得る。
【００１８】
有用な特性を与えることが見出されている突然変異体の他のタイプはプロモーターアップ突然変異（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｕｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む突然変異である。プロモーターアップ突然変異は技術用語であり、その突然変異はプロモーター配列をＲＮＡポリメラーゼ結合部位の共通配列に類似するようにさせるものである。かかるタイプの突然変異はプロモーターの−３５領域における突然変異を含み得る。このタイプの突然変異のＲｅｃＮプロモーターの例は配列番号８を持つＲｅｃＮ２−４突然変異体の形で実施例で与えられている。又、配列番号９を持つＲｅｃＮ３−４突然変異体の形でＬｅｘＡ及びプロモーターアップ突然変異の両方と組合わされた突然変異体の例が与えられている。原則として、−１０プロモーター領域における突然変異、より好適には−３５と−１０領域の間の間隔における突然変異の如き他の改良が可能である。これら後者二つの選択はｒｅｃＮについては無関係であった。何故ならこのプロモーターはσ３５プロモーター配列に対して良好な対応を既に示しているからである。−３５領域が最適ではない場合、私たちはσ３５共通プロモーター配列に対してより近い対応を与える突然変異が改良を生ずることを明らかにした。
【００１９】
プロモーター配列に加えて、本発明による核酸配列は光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列をも含む。かかる配列は公知である。好適な具体例はルシフェラーゼＡ及びＢ遺伝子を含むレポーターコード核酸配列によって形成される。好ましい具体例では配列は再生利用される制限脂肪酸基質の生産に要求されるルシフェラーゼＣ，Ｄ，及びＥ遺伝子を更に含む。かかる配列の詳細はＰＣＴ／ＥＰ特許出願ＷＯ  ９２／１５６８７中に見出すことができる。
【００２０】
本発明による好ましい方法はエイムス試験株として好適な微生物を適用すること（前記微生物は古典的なエイムス試験を続いて行う、ここで述べられた本発明による方法のいずれかにおいて本発明による新規の核酸配列を更に含む）を含み、それによって同一株を使用して遺伝毒性、変異原性、及び毒性を試験する方法を提供する。
【００２１】
本発明による新規の核酸配列の他の適用は毒性測定のための前記配列を含む宿主微生物の使用である。好ましい宿主細胞は高いノイズシグナルを与えることができる細胞である。例えば上述のプロモーターアップ突然変異を持つ本発明による核酸配列はこの適用について極めて好適であるようにみえる。かかる適用は毒性化合物のＩＣ５０（５０％阻害濃度）計算に通じ得る。すなわち、サンプル中の毒性化合物の存在の測定方法であって前記方法が以下の手順を含むものは、本発明の範囲内に含まれる：
−  宿主微生物を培養し（前記宿主微生物は本願明細書中の具体例のいずれかで開示される本発明による宿主微生物である）、
−  培養物の発光を測定し、
−  培養物の発光が変化したかどうかを測定する（減少した発光は毒性化合物の存在の指標である）。
【００２２】
まとめると、以下のような本発明の利点が与えられる：
−  サンプル中の異なる誘導の速度を示す少なくとも二つの遺伝毒性化合物の存在を識別する可能性が生まれる；
−  例えばＳ９又はバイオレメディエーションにおける分解による遺伝毒性化合物の代謝中の中間遺伝毒性化合物の形成を遅れずに同定する可能性が生まれる；
−  遺伝毒性及び一般毒性の速度を同一細胞でオンラインで検出することができる；
−  明確な結果の迅速な試験を５分−４時間、好ましくは３時間以内、より好ましくは２時間以内の時間内で与えることができる；
−  シグナル検出に先立つ細胞培養物の予備処理は要求されない；
−  遺伝毒性化合物又は液体溶液の一般毒性のオンライン検出のために細胞の粉砕は要求されない；
−  ４時間、好ましくは３時間、より好ましくは２時間以内に遺伝毒性があるということが見出された選択された物質は本発明による株を用いて同一細胞を用いてエイムス試験の手順によってフレームシフト突然変異又は塩基対置換について更に試験することができる；
−  基本光生産における減少は一般毒性の指標であるので、毒性について内部制御する必要はない；
−  実験の限定された試験時間のため、厳しい無菌条件は不要である；
−  実験の限定された試験時間のため、試験サンプルについての化学的安定性試験は不要である。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１はプロモータープローブベクターｐＭＯＬ８７７（図１ａ）及びｓｆｉＡプロモーターがクローン化されているｐＭＯＬ８７７の誘導体ｐＭＯＬ８９０（図１ｂ）の制限酵素地図を示す。
図２はプロモータープローブベクターｐＭＯＬ８７７の誘導体ｐＭＯＬ１０６６（図２ａ）、ｐＭＯＬ１０６７（図２ｂ）、ｐＭＯＬ１０６８（図２ｃ）、及びｐＭＯＬ１０６９（図２ｄ）の制限酵素地図を示す。図２ａではｒｅｃＮプロモーター（ｐＭＯＬ１０６６，ｒｅｃＮ１−２），図２ｂでは不活性化されたＬｅｘＡ２部位を持つｒｅｃＮプロモーター（ｐＭＯＬ１０６７，ｒｅｃＮ１−３），図２ｃではプロモーターアップ突然変異持つｒｅｃＮプロモーター（ｐＭＯＬ１０６８，ｒｅｃＮ２−４），及び図２ｄではプロモーターアップ突然変異及び不活性化されたＬｅｘＡ２部位の両方を持つｒｅｃＮプロモーター（ｐＭＯＬ１０６９，ｒｅｃＮ３−４）がそれぞれクローン化されている。
図３は６４ｐｐｍのＭＭＳで攻撃されたｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。光生産は２時間測定された。
図４は６４ｐｐｍのＭＭＳで攻撃されたｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。光生産は５時間測定された。
図５はｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９についてのＭＭＳの濃度（濃度０．５−１２８ｐｐｍ）に対する最大シグナル／ノイズ比として表されたＭＭＳに関する用量効果曲線を表す。
図６はｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９１１０６についての紫外線照射時間（照射時間２−１０秒）に対する最大シグナル／ノイズ比として表された紫外線に関する用量効果曲線を表す。
図７は６４ｐｐｍのＭＭＳで攻撃されたｐＭＯＬ１０６７又はｐＭＯＬ１０６８を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８及びＴＡ１０４のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。光生産は５時間測定された。
図８は２５．６ｐｐｂの４−ＮＱＯで攻撃されたｐＭＯＬ１０６７又はｐＭＯＬ１０６８を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８及びＴＡ１０４のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。光生産は５時間測定された。
図９はＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）を用いたＭＭＳとノボビオシンの組合せの試験を示す。光誘導の速度はシグナル／ノイズ比として表された。凡例において最初の値はＭＭＳの量（ｐｐｍで）を表し、次にノボビオシンについての値（ｐｐｍで）が記されている。
図１０はＴＡ１０４（ｐＭＯＬ８９０）を用いたＭＭＳとノボビオシンの組合せの試験を示す。凡例において最初の値はＭＭＳの量（ｐｐｍで）を表し、次にノボビオシンについての値（ｐｐｍで）が記されている。
図１１は株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）を用いて得られた総シグナル／ノイズ比の関数でのＭＭＳとノボビオシンの組合せの遺伝毒性の順位を示す。
図１２は株ＴＡ１０４（ｐＭＯＬ８９０）を用いて得られた総シグナル／ノイズ比の関数でのＭＭＳとノボビオシンの組合せの遺伝毒性の順位を示す。
図１３は株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）が様々な濃度の毒性化合物Ｒ１１６と共に培養されるときＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）について見出されるシグナル／ノイズ比の時間における減少を示す。
図１４は株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）が様々な濃度の毒性化合物Ｒ１１６と共に培養されたときＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）について見出されるシグナル／ノイズ比の時間における減少を示す。
図１５はＰＡＨ′ｓで汚染された土壌のバイオレメディエーションの過程で調べられたサンプルの遺伝毒性値を示す。この実験についてのデータはＴＡ１０４（ｐＭＯＬ８９０）を用いて得られた。遺伝毒性はＳ９抽出物を用いた代謝活性化後に測定された。ＴＡ１０４（ｐＭＯＬ１０６７）又はＴＡ１０４（ｐＭＯＬ１０６８）を用いて同様のデータが得られた。
図１６は株ＬＢ２０８によるフルオランテンの分解中の遺伝毒性を持つ分解中間物の様子を示す。この実験についてのデータはＴＡ１０４（ｐＭＯＬ８９０）を用いて得られたが、ＴＡ１０４（ｐＭＯＬ１０６７）又はＴＡ１０４（ｐＭＯＬ１０６８）を用いても同様の結果が得られた。遺伝毒性における増加は遺伝毒性を持つ中間分解産物の生成を示す。遺伝毒性は最大Ｓ／Ｎ比として測定された。遺伝毒性を持つ中間産物はｐＨ２．５で抽出された。遺伝毒性は（＃）Ｓ９代謝活性化ありで又はなしで測定された。
【実施例】
【００２４】
実験データ
プロモーター−ｌｕｘ融合物の構築
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｓｆｉＡプロモーター：ｓｆｉＡ−ｌｕｘ融合物の構築
バクテリアのＳＯＳ応答は多数の調節タンパク質の制御下にある。調節タンパク質のうちＲｅｃＡタンパク質（プロテアーゼ）及びＬｅｘＡレプレッサーは最も重要である。遺伝毒性化合物の存在はＤＮＡ損傷を生ずる。これはＤＮＡ修復系を活性化し、この活性化の一部は不活性なＲｅｃＡタンパク質から活性のあるプロテアーゼへの変化である。このＲｅｃＡプロテアーゼはＬｅｃＡレプレッサーに対して高親和性を有し、ＬｅｘＡレプレッサーはＲｅｃＡのタンパク質分解作用のため不活性化される。ＬｅｘＡの不活性化及びそれに続くＬｅｘＡ調節プロモーターのＬｅｘＡ結合部位との解離はプロモーターの活性化及びそれらの対応する遺伝子の転写を生ずる。ＬｅｘＡの制御下にあるプロモーターの一つはｓｆｉＡプロモーターである。ｓｆｉＡプロモーターは−１０領域と部分的に重なる一つのＬｅｘＡ結合部位、及びこのプロモーターの転写開始点を持ち、転写の活性化はＬｅｘＡの解離を必要とする。ｓｆｉＡプロモータ−は１００の誘導比を持ち、バクテリアのＳＯＳ応答の制御下にある最も強いプロモーターの一つであることが知られている。ｓｆｉＡプロモーターはＰＣＲ断片としてクローン化された。プライマーはＰＣＲ断片がＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏ  ＲＩ制限酵素認識部位によってはさまれるような方法で、公表されたｓｆｉＡの配列に基づいて設計された（Ｂｅｃｋ及びＢｒｅｍｅｒ，１９８０年）。
【００２５】
プライマー９４Ｃ９７（配列番号１）はプラス鎖（ｐｏｓ．）の５９−８７位のｓｆｉＡ配列を認識する：
2006340723.tif 000002
Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素認識部位は下線を引かれ、一方ｓｆｉＡ配列は斜体で記されている。
【００２６】
プライマー９４Ｃ９６（配列番号２）はプラス鎖の４００−３７６位の相補的なｓｆｉＡ配列を認識する：
2006340723.tif 000003
Ｅｃｏ  ＲＩ制限酵素認識部位は下線を引かれ、一方、相補的なｓｆｉＡ配列は斜体で記されている。
【００２７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１染色体ＤＮＡにおけるＰＣＲ増幅は３５２ｂｐの平滑なＰＣＲ断片を生じた。この断片はｐＭＯＬ８７７の特異的Ｅｃｏ  ＲＩ認識部位でクローン化された。プラスミドｐＭＯＬ８７７はＩｎｃＱプラスミドＲＳＦ１０１０に基づいており、テトラサイクリン抵抗性マーカーに加えてプロモーターを持たないｌｕｘＣＤＡＢＥオペロンを含む。このオペロンの上流に特異的Ｅｃｏ  ＲＩ認識部位が位置している。Ｅｃｏ  Ｉ消化後、Ｅｃｏ  ＲＩ認識部位の粘着性末端はＫｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にされた。連結反応後、混合物はＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９の電気コンピテントの状態の細胞へ形質転換された（Ｍｕｒｒａｙ等，１９７７年）。形質転換体はテトラサイクリンでの成長について選択され、テトラサイクリンを含む栄養培地に二重につま楊枝で移され、続いて一枚のプレートは紫外線で照射された。紫外線誘導可能な光生産を示すポジティブなクローンはオートラジオグラフィーを用いて可視化された。四つのポジティブクローンのプラスミド内容は（制限酵素による分析及びＰＣＲを用いて）分析され、すべて同一の組換えプラスミドを含むことが示された。ｓｆｉＡプロモーターの転写制御下にあるｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子を含む、このｐＭＯＬ８７７に基づいた誘導体はｐＭＯＬ８９０と名付けられた。ｐＭＯＬ８７７及びｐＭＯＬ８９０の制限酵素地図はそれぞれ図１ａ及び１ｂに表されている。
【００２８】
ｓｆｉＡプロモーターの好適な代用として、ＬｅｘＡの制御下にありかつＳＯＳ応答中に活性化される他のプロモーター配列はｌｕｘレポーター系のクローン化された上流であり得る。これは光生産の関数として遺伝毒性を示す新しい構築物を生じ得る。特に、４０以上の誘導比を持つＳＯＳプロモーターは重要であるとみなされた。ＳＯＳ突然変異誘発には関与しないがＲｅｃＦ組換え修復経路の一部に関与するＳＯＳプロモーターは重要であるとみなされた。この群はｒｅｃＦ，ｒｅｃＪ，ｒｅｃＮ，ｒｅｃＯ，ｒｅｃＱ，ｒｕｖ，及びｕｖｒＤ（元のｒｅｃＬ）を含む。ＳＯＳ突然変異誘発プロモーターＲｅｃＡ及びｕｍｕは１１及び２８というそれらの低い誘導比の観点から重要だとはみなされなかった。文献的研究の後、以下の候補プロモーター配列が更なる研究のため選択された：
−  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｒｅｃＮプロモーター；
−  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｒｕｖプロモーター；
−  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのプラスミドｐＨＭ１０１のｍｕｃプロモーター。
【００２９】
これらの候補からｒｅｃＮプロモーターが更なる実験のため選択された。何故ならＲｅｃＮはＳＯＳの誘導後の細胞の主要な成分であり、ＬｅｘＡによるその厳重な調節について知られているからである（Ｆｉｎｃｈ等，１９８５年；Ｐｉｃｋｓｌｙ等，１９８５年）。
【００３０】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｒｅｃＮプロモーター：ｒｅｃＮ−ｌｕｘ融合物の構築
ｒｅｃＮプロモーターは三つのＬｅｘＡ結合部位を持つ。一つは−３５領域と部分的に重なり、一つは−１０領域及びこのプロモーターの転写開始点と部分的に重なる。第三のＬｅｘＡ結合部位はコード領域内に位置すると考えられている。この点でｒｅｃＮプロモーターは唯一つのＬｅｘＡ結合部位を持つｓｆｉＡプロモーターとは異なる。ｒｅｃＮプロモーターは以下の配列（配列番号３，Ｒｏｓｔａｓ等，（１９８７年））を持ち、その中に−３５及び−１０領域（斜体で記されている）の位置、及び二つのＬｅｘＡ結合部位（下線を引かれている）の位置が示されている：
2006340723.tif 000004
プロモーターは共通プロモーター配列（配列番号４）“ＴＴＧＡＣＡ−１６／１７ｂｐ−ＴＡＴＡＡＴ”  に類似しているが、−３５領域の重要なＧがＴで置換されている。それ故、誘導条件下でのｒｅｃＮプロモーターの発現は−３５領域に配列  ＴＴＧＡＴＣ  を持つｓｆｉＡプロモーターに比べてかなり弱い。
【００３１】
この情報に基づいて以下のクローニング実験が行われた：
−  野生型ｒｅｃＮプロモーターをＰＣＲ増幅によってクローン化する。二つのプライマー（プロモーター領域の上流のプライマー１（配列番号５）及び下流のプライマー２（配列番号６））が合成された。両方ともＥｃｏ  ＲＩ制限酵素認識部位を導入する。プライマー１はｒｅｃＮ配列の２８−４９位に位置する。プライマー２はｒｅｃＮ配列（相補的）の５５０−５２６位に位置する。プライマー中のＧＡＡＴＴＣ  はＥｃｏ  ＲＩ認識部位を示す。ｒｅｃＮ配列はＲｏｓｔａｓ等（１９８７年）によって開示されている。これらの制御酵素認識部位はｐＭＯＬ８７７ｌｕｘレポーターベクターでプロモーター断片をクローン化するために必要である。
−  プロモーター配列からＬｅｘＡ２結合部位を削除する。この目的のため、ＬｅｘＡ２結合部位の最後の３塩基対で配列を修飾する配列番号７
2006340723.tif 000005
を持つプライマー３が選択された。これらの３塩基対は共通であり、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのすべてのＬｅｘ結合部位で保存されている。斜体で記されたプライマー３の５′未満の塩基対は野生型ＤＮＡ配列と適合せず、Ｅｃｏ  ＲＩ制限酵素認識部位を導入するために選択された。このプライマーはｒｅｃＮプロモーターのＰＣＲ増幅のためのプライマー１と組合せて使用されなければならない。プライマー３は３６０−３３８位でｒｅｃＮ配列に相補的である（Ｒｏｓｔａｓ等，１９８７年）。
−  配列番号８（Ｒｏｓｔａｓ等，（１９８７年）によればｒｅｃＮの２９４−３３１位である）
2006340723.tif 000006
を持つプライマー４を使用して「プロモーターアップ」突然変異を導入する。このプライマーは−３５領域の共通位置でＧ（太字で記されている）を導入し、プライマー領域の５′末端でＥｃｏ  ＲＩ制限酵素認識部位を導入する。そのため、プライマー４の５′末端にある斜体で記された塩基対は野生型ＤＮＡ配列と適合しない。このプライマーはｒｅｃＮプロモーターのＰＣＲ増幅のためのプライマー２と組合せて使用されなければならない。
−  プロモーター配列からＬｅｘＡ２結合部位を削除し、「プロモーターアップ」突然変異を導入する。これはｒｅｃＮプロモーターのＰＣＲ増幅のためのプライマー３及び４を組合せて使用することによってなし得る。
【００３２】
ｒｅｃＮ遺伝子のプロモーター領域は上述のプライマーのセットを使用して増幅された。余分の突然変異も導入された。この結果、以下のＰＣＲ断片が得られた：
＊  ｒｅｃＮ１−２；野生型ｒｅｃＮプロモーター（すなわち配列番号３）
＊  ｒｅｃＮ１−３；ＬｅｘＡ２部位を欠くｒｅｃＮプロモーター（すなわち配列番号９）
＊  ｒｅｃＮ２−４；プロモーターアップ突然変異を持つｒｅｃＮプロモーター（すなわち配列番号１０）
＊  ｒｅｃＮ３−４；プロモーターアップ突然変異を持ち、かつＬｅｘＡ２部位を欠くｒｅｃＮプロモーター（すなわち配列番号１１）。
【００３３】
これらのＰＣＲ断片はすべてＥｃｏ  ＲＩで消化され、Ｅｃｏ  ＲＩで直線化されたｐＭＯＬ８７７（ｌｕｘＣＤＡＢＥ発現ベクター）にクローニングされた。連結反応混合物はＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９（Ｍｅｔ−，ＲｅｃＡ＋）へ形質転換された。ＲｅｃＡ＋表現型はプロモーター−ｌｕｘ融合物のＳＯＳ誘導される発現を得るために必要である。必要とされるプロモーター−ｌｕｘ融合物を含む形質転換体はｓｆｉＡ−ｌｕｘ融合物について前に記述したように紫外線照射を使用して光放射の誘導によって同定された。各プロモーター構築物について紫外線誘導される光放射を示すポジティブクローンが同定された。この結果、以下のプラスミド及びＥ．ｃｏｌｉ株が得られた：
＊  株ＣＭ２０８１中のｐＭＯＬ１０６６（ｒｅｃＮ１−２  ｌｕｘ融合物（野生型ｒｅｃＮプロモーター）を含む）
＊  株ＣＭ２０８２中のｐＭＯＬ１０６７（ｒｅｃＮ１−３  ｌｕｘ融合物（ＬｅｘＡ２部位を欠くｒｅｃＮプロモーター）を含む）
＊  株ＣＭ２０８３中のｐＭＯＬ１０６８（ｒｅｃＮ２−４  ｌｕｘ融合物（プロモーターアップ突然変異を持つｒｅｃＮプロモーター）を含む）
＊  株ＣＭ２０８４中のｐＭＯＬ１０６９（ｒｅｃＮ３−４  ｌｕｘ融合物（プロモーターアップ突然変異を持ち、かつＬｅｘＡ２部位を欠くｒｅｃＮプロモーター）を含む）。
【００３４】
ｒｅｃＮ−ｌｕｘ融合物プラスミドｐＭＯＬ１０６６−ｐＭＯＬ１０６９の制限酵素地図は図２ａ−ｄに示されている。
【００３５】
プロモーター−ｌｕｘ構築物を使用したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでの発光試験
バクテリアのＳＯＳ系による様々なプロモーター構築物の誘導能力を調べるため、誘導実験が後ほど与えられるプロトコールに従って６４ｐｐｍのＭＭＳを使用して行われた。コントロールとして誘導されていない細胞が用いられた。シグナル／ノイズ比としての結果は図３及び４に示されている。
【００３６】
結果から以下のことが結論できる：
＊  野生型ｓｆｉＡプロモーターを含むｐＭＯＬ８９０（ｓｆｉＡ）はＳＯＳ誘導後極めて良好に誘導され発現された（図３及び図４）。それに加えて、誘導のプロフィールはｒｅｃＮ−ｌｕｘ融合物ｐＭＯＬ１０６６（ｒｅｃＮ１−２）及びｐＭＯＬ１０６７（ｒｅｃＮ１−３）で得られたプロフィールに極めて類似している（図４参照）。
＊  野生型ｒｅｃＮプロモーターを含むｐＭＯＬ１０６６（ｒｅｃＮ１−２）はＳＯＳ誘導後その誘導体ほどは良好に発現されない（総光生産に関しても同様である）（図３及び図４）。誘導のプロフィールはｓｆｉＡ−ｌｕｘ融合物ｐＭＯＬ８９０及びｐＭＯＬ１０６７（ｒｅｃＮ１−３）で得られたプロフィールに極めて類似している（図４参照）。
＊  ＬｅｘＡ２部位を欠くｒｅｃＮプロモーターを含むｒｅｃＮ１−３はＳＯＳ誘導後極めて良好に誘導され、発現される。それに加えて誘導のプロフィールはｓｆｉＡ−ｌｕｘ融合物で得られたプロフィールに極めて類似している（図３及び図４）。
＊  プロモーターアップ突然変異を持つｒｅｃＮプロモーターを含むｒｅｃＮ２−４はＳＯＳ誘導後極めて良好に誘導され、発現される。この構築物での総光生産及び初期誘導の速度はｐＭＯＬ８９０及びｐＭＯＬ１０６７で得られたものより更に迅速である（図３参照）。しかし、シグナル／ノイズ比によって示されるとおり、誘導パターンはｐＭＯＬ８９０及びｐＭＯＬ１０６７についてよりも多くの変動を示す（図４参照）。従って、この構築物は遺伝毒性化合物の存在を検出するのに極めて良好な候補であり得るが、混合物中の個々の遺伝毒性化合物の存在を検出するにはたぶんそれほど好適でないようにみえる。
＊  プロモーターアップ突然変異を持ち、かつＬｅｘＡ２部位を欠くｒｅｃＮプロモーターを含むｒｅｃＮ３−４は極めて強い光生産を持つが、シグナル／ノイズ比は貧弱である。従ってこの構築物は遺伝毒性のバイオセンサーとしては好適ではない（図３及び図４）。
【００３７】
他の一連の実験ではｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  １１０６についての用量効果曲線はＭＭＳ（０．５−１２８ｐｐｍの濃度）及び紫外線照射（２−１０秒の照射時間）について測定された。これらの実験の結果は図５及び６に示されている。
【００３８】
両方の実験において、最も良好な結果はｐＭＯＬ１０６８（ｒｅｃＮ２−４）で得られ、一方ｐＭＯＬ１０６９（ｒｅｃＮ３−４）は最低のシグナル／ノイズ比を与えた。ｐＭＯＬ８９０中のｓｆｉＡ−ｌｕｘ融合物で同様の結果が得られた。結果に基づいて四つのｒｅｃＮプロモーター−ｌｕｘ融合構築物（ｐＭＯＬ１０６６−ｐＭＯＬ１０６９）及びｓｆｉＡ−ｌｕｘ融合物（ｐＭＯＬ８９０）をＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍエイムス試験株ＴＡ９８，ＴＡ１００，ＴＡ１０４，ＴＡ１５３５，及びＴＡ１５３８に導入すること、及び遺伝毒性化合物の存在によって誘導されるＳＯＳ応答の関数としてそれらの誘導を試験することが決定された。
【００３９】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍへのプロモーター−ｌｕｘ融合構築物の導入及び試験
ｐＭＯＬ８９０，及びｐＭＯＬ１０６６−ｐＭＯＬ１０６９の五つのプラスミドすべてがエイムス試験Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＴＡ９８，ＴＡ１００，ＴＡ１０４，ＴＡ１５３５，及びＴＡ１５３８に導入された。これは一般的なエイムス試験株の形質転換の一般的な実行可能性を示す。
【００４０】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍでの変異原性試験
ｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９の導入が変異原性試験（変異原性化合物の存在及び不在下のＨｉｓ−からＨｉｓ＋表現型への復帰突然変異頻度として測定される）に関するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  株の特性に影響を与えるかどうかを調べるため、標準エイムス試験が元のエイムス試験株及び上述のプラスミドを含むそれらの誘導体の両方で行われた。この試験のため、Ｍａｒｏｎ及びＡｍｅｓ（１９８３年）によって記述されているプロトコールが用いられた。試験はＭＭＳ，４−ＮＱＯ，フラゾリドン，２−ＡＦ，及びベンゾ−α−ピレンで行われた。結果は表１Ａ−１Ｇに示されている。元のエイムス試験で得られたすべての結果が示されているわけではないが、表及び表１Ａと１Ｂ、及び１Ｃと１Ｄとの比較からプラスミドの導入は組換え株のＨｉｓ復帰突然変異特性を変化させなかったと推論することができる。従って、組換え株は古典的エイムス試験を行うのに用いることができる。
2006340723.tif 000007
2006340723.tif 000008
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【００４１】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍでの発光試験
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのバクテリアのＳＯＳ系による様々なＥ．ｃｏｌｉプロモーター構築物の誘導能力を調べるため、誘導実験が後ほど開示されるプロトコールに従って６４ｐｐｍのＭＭＳ又は２５．６ｐｐｂの４−ＮＱＯを用いて行われた。コントロールとして誘導されていない細胞が用いられた。ｒｅｃＮ−ｌｕｘ融合物ｐＭＯＬ１０６７及びｐＭＯＬ１０６８について得られたシグナル／ノイズ比としての結果は図７及び８に示されている。
【００４２】
これらの図（図７及び図８）から、ｐＭＯＬ１０６８  ＲｅｃＮ２−４での誘導の速度はｐＭＯＬ１０６７（ＲｅｃＮ１−３）について得られたものよりわずかに速いが、最大シグナル／ノイズ比はｐＭＯＬ１０６８（ＲｅｃＮ２−４）でよりもｐＭＯＬ１０６７（ＲｅｃＮ１−３）での方が高いと推論することができる。従って両方の構築物は重要であり、遺伝毒性試験について相互に補足する。ｐＭＯＬ８９０（ｓｆｉＡ）ではｐＭＯＬ１０６７で得られたものに類似する結果が見出された。
【００４３】
最小検出可能濃度（ＭＤＣ，ｎｍｏｌ／アッセイで表す）が１３化合物について測定された。これはｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍエイムス試験株を用いて行われた。ｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ１０４，及びｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８を用いて得られた結果は表２に示されている。それに加えてＳＯＳ染色試験及びエイムス試験を用いて見出された文献的ＭＤＣ値も示されている。ある種の化合物についてはエイムス試験のＭＤＣ値を計算することは不可能であった。これらの化合物について陽性（ｐｏｓ）又は陰性（ｎｅｇ）反応が示されている。
【００４４】
カザミノ酸及びＣｄＣｌ２という二つの化合物は陰性のコントロールとして選択された。カザミノ酸はヒスチジンを含むため、この化合物はエイムス試験で試験することが不可能であった。
【００４５】
表２から最も良好な結果はｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含む株を用いて得られたと推論することができる。すべての構築物で得られた結果はＳＯＳ染色試験で見出されたものより常に良好であった。これは同様の結果を与えるＩＣＲ１９１という例外を有していた。又、結果はエイムス試験で見出されたものよりずっと良好であった。これは２，４，５，７−テトラニトロ−９−フルオレノンという例外を有していた。
【００４６】
従って、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍエイムス試験株におけるｓｆｉＡ及びｒｅｃＮ−ｌｕｘ遺伝子融合物（ｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９）の使用はＳＯＳ染色試験及びエイムス試験よりも遺伝毒性を検出するための一層迅速かつ感度の高い方法を与えると推論することができる。
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【００４７】
表３はｐＭＯＬ１０６７又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いて行われた遺伝毒性試験の結果を示す。これらの株を用いて見出された結果は類似しているので、試験の最終結果のみが示されている（陽性又は陰性）。同様の結果がＳＯＳ染色試験（ＳＯＳ）及びエイムス試験について与えられている。試験された薬剤は以下のカテゴリーからの一般的に認められた代表的な薬剤である：医薬、殺菌剤、殺虫剤、除草剤、無機化合物、多環式芳香族炭化水素、実験室用化学薬品、溶媒、燃料、及び電磁線。この表から雑種のＴＡエイムス試験株がすべてのカテゴリーの試験された化合物について遺伝毒性を検出するのに使用することができるということ、及びＳＯＳ染色試験及びエイムス試験について見出された結果ではほんの少数の相違が観察されたということが推論される。
【００４８】
ｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いて得られた結果をＳＯＳ染色試験で得られた結果と比較すると、以下のことが推論される：ある化合物がｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いた試験で陰性の場合、それはＳＯＳ染色試験でも陰性である。しかし、潜在的に遺伝毒性を持つノボビオシン及びアジ化ナトリウムはＳＯＳ染色試験では陰性であるが、ｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴ１０４株を用いた試験では陽性である。従って、ｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いた試験はＳＯＳ染色試験よりも遺伝毒性の試験に関してはより正確であると推論できる。何故ならにせの陰性の結果は得られないからである。ある化合物がｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いた試験で陰性の場合、その化合物はエイムス試験でも陰性である。唯一の例外はｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いた試験で陰性であったシクロホスファミド及びエチレンチオ尿素である。しかし、これは驚くべきことではない。何故ならこれらの化合物はバクテリアのＳＯＳ応答を誘導しないからである。
【００４９】
マイトマイシンＣ、ナリジキシン酸、過酸化水素、ピレン、及びフェナントレンの如きエイムス試験でにせの陰性の結果を与える遺伝毒性化合物はｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いた試験で陽性であることがわかった。従って、ｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４株を用いた試験は単にエイムス試験ほど良好ではないが、ＰＡＨ′ｓの如き環境汚染物質の試験に関しては一層正確であると推論することができる。
【００５０】
遺伝毒性化合物の組合せの試験
２以上の遺伝毒性化合物が試験サンプル中に存在する場合の様々な構築物の反応が調べられた。環境からのサンプルは２以上の遺伝毒性汚染物質を含むことが多いので、このことは重要な側面である。又、この点で遺伝毒性について試験される必要がある多くの薬物は様々な活性のある遺伝毒性物質の組合せであり得る（例えば抗ガン剤又は抗ＡＩＤＳ薬）。実験はｐＭＯＬ１０６７又はｐＭＯＬ８９０のいずれか一方を含むＴＡ９８及びＴＡ１０４を用いて行われた。これらの二つの構築物はこれらがＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ中で類似の誘導速度及び最良のシグナル／ノイズ比を示すので選択された（図７及び図８参照）。試験化合物として、ＭＭＳとノボビオシンのいくつかの組合せが用いられた。これらの化合物が用いられた理由はこれらが異なる誘導速度を持つ（例えば、ｐＭＯＬ１０６７ではＭＭＳは２時間後に最大シグナル／ノイズ比を与えるが、一方ノボビオシンでは最大シグナル／ノイズ比は４時間後に観察される）ことが私たちによって発見されたからである。これらの実験の結果の例は図９及び１０に示されている。
【００５１】
これらの結果からｐＭＯＬ８９０（ｓｆｉＡ−ｌｕｘ）又はｐＭＯＬ１０６７（ｒｅｃＮ１，３−ｌｕｘ）を含む株の両方で少なくとも二つの個々の遺伝毒性化合物の存在は遺伝毒性化合物の混合物中で測定可能であると推論することができる。このことは予想に全く反するものであった。何故なら二つの個々の最大シグナルではなく最大シグナルの一つの増加が予想されていたからである。
【００５２】
又、ＭＭＳ及びノボビオシンの組合せを用いた前の実験で得られたデータが用いられた様々な組合せについての遺伝毒性の順位を生ずるかどうか、及び順位が異なる試験株で（例えばＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）及びＴＡ１０４（ｐＭＯＬ８９０）で）同一であるかどうかが調べられた。これを試験するため、総シグナル／ノイズ比が試験される各々の組合せについて計算され、続いてそれらは低い値から高い値へと順位付けられた。これは異なる試験株について論理的かつ同一の順位を生じた。一例が図１１及び１２に示されている。
【００５３】
毒性試験
様々な構築物が遺伝毒性化合物の不在下でバックグラウンドの光シグナルを生ずる。これはノイズと呼ばれる。このノイズシグナルは遺伝毒性化合物ではなく、毒性化合物の存在についての尺度として用いることができる。特に比較的高いノイズを示すｐＭＯＬ８９０及びｐＭＯＬ１０６８を含む株はこの毒性試験に極めて適しているとみなされる（それらのノイズは４時間の実験中に１００から１３０００相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ  ）へと増加する）。一方、低ノイズを持つｐＭＯＬ１０６６又はｐＭＯＬ１０６７を含む株は有用性が低い（それらのノイズは４時間の実験中に２０から７５０相対光単位へと増加する）。このことは図１３及び１４に示されており、そこでは光生産の減少がｐＭＯＬ１０６７又はｐＭＯＬ１０６８を含むＴ９８についてそれらが様々な濃度の毒性化合物Ｒ１１６で攻撃されたとき観察された。
【００５４】
図１３と１４の比較により、ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）で見出されたシグナル／ノイズ比はＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）について見出されたものより一層一定であることが明らかである。株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）についての一層高い基本光生産の結果として、光生産の測定における誤差の重要性はより少なく、計算されたシグナル／ノイズデータにおけるより少ない変動を生ずる。株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）のみならずｐＭＯＬ８９０又はｐＭＯＬ１０６８を含む他の株も毒性化合物のＩＣ５０計算値に関して極めて有用である。好ましい株はＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）と少なくとも同様の基本光生産を示すだろう。
【００５５】
環境からのサンプルの試験
純粋な化合物についての試験はｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含む株が（ＰＡＨ′ｓの如き）潜在的な環境汚染物質の試験について古典的なエイムス試験よりも感度が高いことを示したので、これらの株は環境からのサンプルの試験に用いられた。示された例は：
−  ＰＡＨ′ｓで汚染された土壌のバイオレメディエーションの評価、及び
−  水溶性ＰＡＨ分解産物の出現、である。
【００５６】
土壌サンプルは５００ｐｐｍの混合物（ナフタレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、ピレン、及びベンゾ−α−ピレンを含むＢｏｒｎｅｆｆの混合物）で汚染された。続いて土壌はバイオリアクターで処理され、ＰＡＨ′ｓのバクテリアによる分解が刺激された。土壌のバイオレメディエーションを評価するため、及び遺伝毒性の減少を調べるため、１０ｇの土壌サンプルが３週間採取された。これらのサンプルはヘキサン（１ｍｌ／ｇ土壌）で抽出され、抽出物は１００倍に濃縮された。濃縮された抽出物は１−８倍に稀釈され、（代謝活性化ありで又は代謝活性化なしで）遺伝毒性の試験に用いられた。各サンプルについて遺伝毒性値が（最高陽性希釈度での２より高いシグナル／ノイズ比）×（希釈度）の積として計算された。例えばもし４ｘの希釈度で２．８のＳ／Ｎ比が見出されたなら、このサンプルは遺伝毒性値として１１．２を得る。遺伝毒性値はプロットされ、これは汚染された土壌の遺伝毒性の良好な概略及び評価を与える。かかる実験のデータが図１５に示されている。
【００５７】
図１５からＰＡＨ′ｓで汚染された土壌の遺伝毒性の減少が遅れずにあると推論することができる。このことはｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含む株が遺伝毒性化合物で汚染された土壌のバイオレメディエーションの追跡及び評価にとって極めて有用であることを明らかにする。一般的に、４０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを有する配列を含む株であって、前記プロモーターが光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されているものは、好ましい具体例において用いることができる。特許請求の範囲に記載されたいずれの宿主微生物もかかる試験において好適に用いることができる。
【００５８】
水溶性中間ＰＡＨ分解産物の生成を分析するため、フェナントレン、フルオレン、及びフルオランテンの分解が調べられた。そのため、余分の炭素源を含まない最小Ｍ９培地が０．１％のＰＡＨで飽和され、ＰＡＨを分解できる株で接種された。３日ごとにサンプル（２００ｍｌ）は採取され、Ｇｒｉｆｏｌｌ等（１９９４年）の手順に従って濃縮された。抽出はｐＨ２．５又はｐＨ７で行われ、サンプルは５ｍｌまで濃縮され、各サンプルのうち１ｍｌが３７℃で乾燥され、１００μｌのＤＭＳＯに再懸濁された。このうち１μｌが遺伝毒性の試験に用いられた。フェナントレンについては遺伝毒性の増加及びそれに続く減少が観察され、フルオレンについては遺伝毒性の有意な増加は観察されなかったが、フルオランテンについては遺伝毒性の増加が観察された。これは遺伝毒性を持つ中間産物の生産及び蓄積を示した。株ＬＢ２０８によるフルオランテン分解の評価の結果は図１６に示されている。ｐＨ２．５で行われた抽出についてのデータのみが示されている。
【００５９】
この実験からｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６７，又はｐＭＯＬ１０６８を含む株は遺伝毒性を持つ汚染化合物の分解の評価及び遺伝毒性を持つ中間分解産物の出現及び蓄積の評価に有用であると推論できる。一般に、２０、好ましくは４０、最も好ましくは５０以上の誘導比を持つＳＯＳ調節プロモーターを有する配列を含む株であって、前記プロモーターが光生産としてアッセイ可能なシグナルを生ずるレポーターをコードするレポーターコード核酸配列に遺伝子工学的操作によって連結されているものは好ましい具体例において用いることができる。特許請求の範囲に記載されたいずれの宿主微生物もかかる試験において好適に用いることができる。ガソリンで汚染された土壌のＤＭＳＯ抽出物について明らかにされているように毒性試験も環境からのサンプルについて可能であった。抽出物の濃度が高いほど毒性は増加した（データは示されていない）。
【００６０】
ｒｅｃＮ−ＬＵＸバクテリアを用いた遺伝毒性試験のための標準操作プロトコール
１．概論
試験はＳＯＳ系の一部である、ｒｅｃＮ遺伝子の転写制御下にあるＶｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉのｌｕｘオペロンを含むバクテリアに基づいている。遺伝毒性化合物と共に細胞を培養した後、ｒｅｃＮプロモーターは抑制されｌｕｘオペロンを発現させる。発現は遺伝毒性の関数で光生産を生ずる。しかし、同じプロトコールはｓｆｉＡ−ｌｕｘ株を用いて行われる試験に用いることもできる。本発明による系を含む他のＳＯＳ調節プロモーターについて、当業者ならこのプロトコールを用いることもできるであろう。
【００６１】
２．株
−  ＴＡ１０４  ｒｅｃＮ１−３
−  ＴＡ１０４  ｒｅｃＮ２−４
−  ＴＡ９８  ｒｅｃＮ１−３
−  ＴＡ９８  ｒｅｃＮ２−４
【００６２】
３．材料
３．１  培地
３．１．１  培地８６９（ｐＨ＝７）
脱イオン水１リットル当たり：
トリプトン  １０ｇ
酵母抽出物  ５ｇ
ＮａＣｌ  ５ｇ
Ｄ−グルコース  １ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．３４５ｇ
システイン  ３０ｍｇ
培地は１２０℃で２０分間オートクレーブにかけて滅菌する。テトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加える。培地は４℃で貯蔵する。
３．１．２  貧栄養８６９培地（ｐＨ＝７）
脱イオン水１リットル当たり：
トリプトン  ２ｇ
酵母抽出物  １ｇ
ＮａＣｌ  ５ｇ
Ｄ−グルコース  １ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．３４５ｇ
システイン  ３０ｍｇ
３．２  Ｓ９成分
３．２．１  Ｓ９
ラット肝臓からのアロクロー誘導される（Ａｒｏｃｈｌｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ミクロソーム画分Ｓ９は標準的プロトコールを用いて得られる。それは製薬工場から入手することができる。
３．２．２  ＫＣｌ／ＭｇＣｌ２溶液
ＫＣｌ  ６．１５ｇ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ４．７ｇ
蒸留水で１００ｍｌにする。
オートクレーブにかけ、室温で貯蔵する。
３．２．３  ０．１Ｍ  β−ＮＡＤＰ
β−ＮＡＤＰ  ５００ｍｇ
滅菌蒸留水  ６．５３ｍｌ
低温用試験管に５００μｌずつ小分けし、−２０℃で貯蔵する。
３．２．４  １Ｍ  グルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）
Ｇ６Ｐ  ２８２ｍｇ
滅菌蒸留水  １ｍｌ
低温用試験管で−２０℃で貯蔵する。
３．２．５  リン酸緩衝液  ０．２Ｍ（ｐＨ＝７．４）
６０ｍｌ  ０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ
４４０ｍｌ  ０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４
ｐＨを７．４に調整し、１００ｍｌずつに小分けしてオートクレーブにかけ室温で貯蔵する。
３．３  化学薬品
−  ＤＭＳＯ：疎水性化合物用の溶媒
−  ＭＭＳ：代謝活性化なしでの試験のためのポジティブコントロール
−  ４ＮＱＯ：代謝活性化なしでの疎水性化合物の試験のためのポジティブコントロール
−  ２ＡＦ：Ｓ９代謝活性化ありでの試験のためのポジティブコントロール
３．４  設備
分布シート（ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ）におけるデータの貯蔵でコンピューター制御される９６ウェルのマイクロプレート発光測定装置
【００６３】
４．  試験手順
４．１  培養物の維持及び培養の開始
４．１．１  維持
凍結バクテリア永久標本（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）を少しけずり取り、２５ｍｌの８６９培地（３．１．１参照）に接種する。３７℃で回転振蘯機（１７０ＲＰＭ）で一晩（ＯＮ）培養する。翌朝２．５ｍｌのＤＭＳＯを添加する。バクテリア懸濁液は低温用試験管に分注し、−８０℃で保存する。エイムス試験株として推奨されるバクテリア（ｒｆａ，ｐＫＭ１０１等）の試験のために一つの試験管を用いる。
４．１．２  試験培養の開始
培地８６９（３．１．１参照）５ｍｌに４０μｌのバクテリアのストック（４．１．１参照）を接種し、３７℃で振蘯機（１７０ＲＰＭ）で一晩培養する。翌朝２０μｌのＯＮ培養物を２．５ｍｌの貧栄養８６９培地（３．１．２参照）に接種する。（１７０ＲＰＭで）振蘯しつつ３７℃で１時間培養する。
４．２  試験化合物の希釈
４．２．１  ストック溶液
ストック溶液の濃度は溶解性及び要求される最高濃度の関数で選択される。バイアル中で数ｍｇの試験化合物（Ａｍｇ）を計量し、必要な容量（Ｖｍｌ）の溶媒を加え、所望の濃度（Ｓｍｇ／ｍｌ）を式Ｖ＝Ａ／Ｓを用いて得る。
４．２．２  試験化合物の希釈
８つのバイアル（＃１−８）に５０μｌの溶媒（Ｈ２Ｏ又はＤＭＳＯ）を加える。
１つのバイアル（＃９）に１００μｌのストック溶液を加える。
バイアル＃９から５０μｌをバイアル＃８に移し、ピペットで５回混合し、５０μｌをバイアル＃７に移し、．．．バイアル＃２に移す。混合後、５０μｌをバイアル＃２から捨てる。
各バイアルに４５０μｌの貧栄養８６９培地を加える。
各バイアルの１０μｌを９６ウェルプレートに移す：
−  バイアル＃１からカラム１，２，及び３へ（溶媒のコントロール）
−  バイアル＃２からカラム４へ、バイアル＃３からカラム５へ、．．．カラム１１へ。
４．２．３  ポジティブコントロールの調製
適用についてはセクション３．３を参照されたい。
２ＡＦ（８ｐｐｍ）：ＤＭＳＯで６４００ｐｐｍの溶液を作る；１／２を５０μｌのＤＭＳＯで希釈し、８００ｐｐｍとする；４５０μｌの貧栄養８６９培地を加える（＝８０ｐｐｍ）；１０μｌをウェルＥ１２，Ｆ１２，Ｇ１２，Ｈ１２に移す。
４−ＮＱＯ（４ｐｐｂ）：ＤＭＳＯで１０００ｐｐｍの溶液を作る；このうち４０μｌを９６０μｌのＤＭＳＯに加える（＝４０ｐｐｍ）；このうち１０μｌを９９０μｌのＤＭＳＯに加える（＝０．４ｐｐｍ）；０．４ｐｐｍ溶液の５０μｌを４５０μｌの貧栄養８６９培地に加える（＝４０ｐｐｂ）；１０μｌをウェルＡ１２，Ｂ１２，Ｃ１２，Ｄ１２に移す。
ＭＭＳ（１６ｐｐｍ）：５μｌのＭＭＳを９９５μｌのＨ２Ｏに加える（＝６４００ｐｐｍ）；１／２を５０μｌのＨ２Ｏで希釈し、１６００ｐｐｍにする；４５０μｌの貧栄養８６９培地をこの１６００ｐｐｍ溶液の５０μｌに加える；１０μｌをウェルＡ１２，Ｂ１２，Ｃ１２，Ｄ１２に移す。
４．３  Ｓ９混合物あり又はなしでの実験
４．３．１  Ｓ９混合物あり
−  Ｓ９混合物はバクテリアに加える前に常に新しく調製される。
試験管中でおだやかに混ぜる：
１００μｌ  ＫＣｌ：ＭｇＣｌ２（３．２．２）
１００μｌ  β−ＮＡＤＰ（３．２．３）
５０μｌ  Ｇ６Ｐ（３．２．４）
２５００μｌ  リン酸緩衝液（３．２．５）
２５００μｌ  貧栄養８６９培地（３．１．２）
１３２μｌ  Ｓ９
−  バクテリアを加える
おだやかに混ぜる：
１４０μｌ  バクテリア懸濁液（４．１．２）
８６０μｌ  貧栄養８６９培地
４００μｌ  Ｓ９混合物
−  ９０μｌを以下のウェルに移す
ウェル  Ｅ１−Ｅ１２：ＴＡ１０４  ｒｅｃＮ１−３
ウェル  Ｆ１−Ｆ１２：ＴＡ１０４  ｒｅｃＮ２−４
ウェル  Ｇ１−Ｇ１２：ＴＡ９８  ｒｅｃＮ１−３
ウェル  Ｈ１−Ｈ１２：ＴＡ９８  ｒｅｃＮ２−４
４．３．２  Ｓ９混合物なし
１２６０μｌの貧栄養８６９培地を１４０μｌのバクテリア懸濁液（４．１．２）に加える。
９０μｌを以下のウェルに移す：
ウェル  Ａ１−Ａ１２：ＴＡ１０４  ｒｅｃＮ１−３
ウェル  Ｂ１−Ｂ１２：ＴＡ１０４  ｒｅｃＮ２−４
ウェル  Ｃ１−Ｃ１２：ＴＡ９８  ｒｅｃＮ１−３
ウェル  Ｄ１−Ｄ１２：ＴＡ９８  ｒｅｃＮ２−４
【００６４】
５．測定
９６ウェルプレートを発光測定装置に置き、測定を開始する（１秒／ウェル；サイクル時間３００秒；６０サイクル；３０℃）
【００６５】
６．計算
測定の終了後、データはワークシートフォーマットで保存される。このデータの固まりはマクロシートに移され、それはシグナル対ノイズ比を自動的に計算し、グラフを作成し、最終報告を行う。
【００６６】
７．評価
化合物は以下の場合、遺伝毒性があるとみなされる：
１）  シグナル対ノイズ比が少なくとも２つの濃度について２と等しいか又は２より高い場合
２）  明らかな用量効果応答がある場合。
2006340723.tif 000015
2006340723.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１ａ】プロモータープローブベクターｐＭＯＬ８７７（図１ａ）の制限酵素地図を示す。
【図１ｂ】ｓｆｉＡプロモーターがクローン化されているｐＭＯＬ８７７の誘導体ｐＭＯＬ８９０（図１ｂ）の制限酵素地図を示す。
【図２ａ】プロモータープローブベクターｐＭＯＬ８７７の誘導体ｐＭＯＬ１０６６（図２ａ）の制限酵素地図を示す。
【図２ｂ】プロモータープローブベクターｐＭＯＬ８７７の誘導体ｐＭＯＬ１０６７（図２ｂ）の制限酵素地図を示す。
【図２ｃ】プロモータープローブベクターｐＭＯＬ８７７の誘導体ｐＭＯＬ１０６８（図２ｃ）の制限酵素地図を示す。
【図２ｄ】プロモータープローブベクターｐＭＯＬ８７７の誘導体ｐＭＯＬ１０６９（図２ｄ）の制限酵素地図を示す。
【図３】６４ｐｐｍのＭＭＳで攻撃されたｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。
【図４】６４ｐｐｍのＭＭＳで攻撃されたｐＭＯＬ８９０，ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。
【図５】ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９についてのＭＭＳの濃度（濃度０．５−１２８ｐｐｍ）に対する最大シグナル／ノイズ比として表されたＭＭＳに関する用量効果曲線を表す。
【図６】ｐＭＯＬ１０６６，ｐＭＯＬ１０６７，ｐＭＯＬ１０６８，又はｐＭＯＬ１０６９を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＥＤ８７３９１１０６についての紫外線照射時間（照射時間２−１０秒）に対する最大シグナル／ノイズ比として表された紫外線に関する用量効果曲線を表す。
【図７】６４ｐｐｍのＭＭＳで攻撃されたｐＭＯＬ１０６７又はｐＭＯＬ１０６８を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８及びＴＡ１０４のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。
【図８】２５．６ｐｐｂの４−ＮＱＯで攻撃されたｐＭＯＬ１０６７又はｐＭＯＬ１０６８を含むＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８及びＴＡ１０４のシグナル／ノイズ比として表された光誘導の速度を表す。
【図９】ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）を用いたＭＭＳとノボビオシンの組合せの試験を示す。
【図１０】ＴＡ１０４（ｐＭＯＬ８９０）を用いたＭＭＳとノボビオシンの組合せの試験を示す。
【図１１】株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）を用いて得られた総シグナル／ノイズ比の関数でのＭＭＳとノボビオシンの組合せの遺伝毒性の順位を示す。
【図１２】株ＴＡ１０４（ｐＭＯＬ８９０）を用いて得られた総シグナル／ノイズ比の関数でのＭＭＳとノボビオシンの組合せの遺伝毒性の順位を示す。
【図１３】株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）が様々な濃度の毒性化合物Ｒ１１６と共に培養されるときＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６７）について見出されるシグナル／ノイズ比の時間における減少を示す。
【図１４】株ＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）が様々な濃度の毒性化合物Ｒ１１６と共に培養されたときＴＡ９８（ｐＭＯＬ１０６８）について見出されるシグナル／ノイズ比の時間における減少を示す。
【図１５】ＰＡＨ′ｓで汚染された土壌のバイオレメディエーションの過程で調べられたサンプルの遺伝毒性値を示す。
【図１６】株ＬＢ２０８によるフルオランテンの分解中の遺伝毒性を持つ分解中間物の様子を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１はｓｆｉＡプライマー９４Ｃ９７の配列である。
配列番号２はｓｆｉＡ相補鎖プライマー９４Ｃ９６の配列である。
配列番号４は共通プロモーター配列であり、配列の第７塩基〜第２３塩基はあらゆるヌクレオチドの組合せを示す。
配列番号５はｒｅｃＮ  ＰＣＲプライマー３の配列である。
配列番号６はｒｅｃＮ  ＰＣＲプライマー４の配列である。
【図１ａ】
2006340723.tif 000019
【図１ｂ】
2006340723.tif 000020
【図２ａ】
2006340723.tif 000021
【図２ｂ】
2006340723.tif 000022
【図２ｃ】
2006340723.tif 000023
【図２ｄ】
2006340723.tif 000024
【図３】
2006340723.tif 000025
【図４】
2006340723.tif 000026
【図５】
2006340723.tif 000027
【図６】
2006340723.tif 000028
【図７】
2006340723.tif 000029
【図８】
2006340723.tif 000030
【図９】
2006340723.tif 000031
【図１０】
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【図１１】
2006340723.tif 000033
【図１２】
2006340723.tif 000034
【図１３】
2006340723.tif 000035
【図１４】
2006340723.tif 000036
【図１５】
2006340723.tif 000037
【図１６】
2006340723.tif 000038
【配列表】
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