(57)【要約】      （修正有）【課題】線虫、カエノラブディティスーエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）におけるｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の低分子量のモジュレーターのスクリーニングを容易にする。【解決手段】新規のカエノラブディティスーエレガンスからｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）遺伝子を提供し、さらにＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子を提供し、このＲＮＡ分子によってもたらされる関連する機能欠損の表現型を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群：
ａ］配列番号１のＤＮＡ配列；または、
ｂ］配列番号１に相補的なＤＮＡ配列；または、
ｃ］配列番号１のＤＮＡ配列、または、配列番号１に相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列；または、
ｄ］遺伝子コードの結果として、配列番号１のＤＮＡ配列の縮重であるＤＮＡ配列；または、
ｅ］ｐａｋ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
のいずれかから選択されるＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ｅ］のＤＮＡ配列は、配列番号７のアミノ酸配列からなるＣ．エレガンスのｐａｋ−３ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる、請求項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の群：
ａ］配列番号２、３、４、５または６のＤＮＡ配列；または、
ｂ］配列番号２、３、４、５または６のＤＮＡ配列の１つに相補的であるＤＮＡ配列；または、
ｃ］配列番号２、３、４、５もしくは６のＤＮＡ配列の少なくとも１つ、または、配列番号２、３、４、５もしくは６のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列の少なくとも１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列；または、
ｄ］遺伝子コードの結果として、配列番号２、３、４、５または６のＤＮＡ配列の少なくとも１つの縮重であるＤＮＡ配列；または、
ｅ］ｐａｋ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
のいずれかから選択されるＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ｅ］のＤＮＡ配列は、配列番号８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列の少なくとも１つからなるＣ．エレガンスのｐａｋ−３ポリペプチドをコードする、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２、３、４、５または６のＤＮＡ配列の少なくとも１つのポリヌクレオチドからなる、請求項４または５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
以下の群：
ａ］配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の１つのＤＮＡ配列；または、
ｂ］配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列
のいずれかから選択されるＤＮＡ配列を含む組換えベクター配列。
【請求項８】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の１つのＤＮＡ配列からなる、請求項７に記載の組換えベクター配列。
【請求項９】
請求項７または８に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
エシェリキア・コリ、または、サッカロミセス・セレビジエの細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号１のポリヌクレオチド配列でコードされた単離されたタンパク質。
【請求項１２】
配列番号７のアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１３】
ｐａｋ−３ａタンパク質の活性を示す、請求項１１または１２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１４】
配列番号２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列でコードされた単離されたタンパク質。
【請求項１５】
配列番号８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列からなる、請求項１４に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１６】
ｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を示す、請求項１４または１５に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質を製造するための、請求項９または１０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１８】
ｐａｋ−３ａタンパク質またはｐａｋ−３ｂタンパク質と相互作用する化合物を同定するためのスクリーニング分析における、請求項９または１０に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１９】
請求項９または１０に記載の宿主細胞を培養し、細胞を培地から分離し、これら細胞から溶解産物を製造し、および、タンパク質精製技術により溶解産物からタンパク質を精製する、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質の製造。
【請求項２０】
抗体を製造するための、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項２１】
哺乳動物のｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質の類似体タンパク質の欠乏または機能不全によって生じる病気を治療するための医薬品を製造するための、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項２２】
ｐａｋ−３ａタンパク質またはｐａｋ−３ｂタンパク質と相互作用する化合物を同定するためのスクリーニングプロセスにおける、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
【請求項２３】
ｐａｋ−３ａタンパク質および／またはｐａｋ−３ｂタンパク質と相互作用する化合物を同定する分析であって、
ａ］ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質を提供する、
ｂ］化合物を提供する、
ｃ］ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質と、化合物とを接触させる、
ｄ］ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質への化合物の結合を決定する、および／または、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を決定する、上記分析。
【請求項２４】
工程ａ］は、ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質を発現している請求項９または１０に記載の宿主細胞を提供することからなり、および、工程ｃ］は、請求項９または１０に記載の宿主細胞と、化合物とを接触させることからなる、請求項２３に記載の分析。
【請求項２５】
ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質は、請求項１１、１２、１３、１４、１５、１６または１９に記載のタンパク質からなる、請求項２３に記載の分析。
【請求項２６】
化合物は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性、または、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質への結合を、不活性化または活性化する、または、維持する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の分析。
【請求項２７】
ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質に関する機能欠損の表現型を示すＣ．エレガンス株。
【請求項２８】
機能欠損の表現型は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂの遺伝子コード配列の部分的または完全な欠失によって生じる、請求項２７に記載のＣ．エレガンス株。
【請求項２９】
機能欠損の表現型は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂの遺伝子コード配列へのポリヌクレオチド配列の挿入によって生じる、請求項２７に記載のＣ．エレガンス株。
【請求項３０】
機能欠損の表現型は、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、および、アンチセンスＤＮＡからなる群より選択されるポリヌクレオチドによって生じる、請求項２７に記載のＣ．エレガンス株。
【請求項３１】
機能欠損の表現型は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質の阻害剤によって生じる、請求項２７に記載のＣ．エレガンス株。
【請求項３２】
ＰＡＫシグナル伝達経路のタンパク質を同定するための、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のＣ．エレガンス株の使用。
【請求項３３】
ＰＡＫシグナル伝達経路のタンパク質と相互作用する化合物を同定するための、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のＣ．エレガンス株の使用。
【請求項３４】
ａ］Ｃ．エレガンスのｐａｋ１遺伝子、および／または、ｐａｋ１タンパク質を不活性化すること、および／または、同じＣ．エレガンスのｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質不活性化すること、および、
ｂ］不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンを示すＣ．エレガンスを同定すること、
による、不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンを特徴とする表現型を有するＣ．エレガンス株の作成方法。
【請求項３５】
ｐａｋ１遺伝子、および／または、ｐａｋ１タンパク質は、ｐａｋ−１をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子によって不活性化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子は、ｐＫＧ６１（配列番号２６）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）からなる群の少なくとも１つのベクターの使用によって得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ｐａｋ−１をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子を内包する細菌を、Ｃ．エレガンスにフィーディングする、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ｐＫＧ６１（配列番号２６）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）からなる群の少なくとも１つのプラスミドを含む１種または数種の細菌株をフィーディングする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質は、ｐａｋ−１ノックアウト株を用いることによって不活性化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
ｐａｋ−１ノックアウト株は、ＲＢ６８９である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ｐａｋ−１遺伝子転写の阻害剤、または、ｐａｋ−１タンパク質の阻害剤によって不活性化される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質は、ｐａｋ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子によって不活性化される、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子は、ｐＫＧ６５（配列番号２７）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）、ｐＫＧ６３（配列番号２９）、ｐＫＧ６４（配列番号３０）からなる群の少なくとも１つのベクターの使用によって得られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｐａｋ−３をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子を内包する細菌を、Ｃ．エレガンスにフィーディングする、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ｐＫＧ６５（配列番号２７）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）、ｐＫＧ６３（配列番号２９）、ｐＫＧ６４（配列番号３０）からなる群の少なくとも１つのプラスミドを含む１種または数種の細菌株が用いられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質は、ｐａｋ−３ノックアウト株を用いることによって不活性化される、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質は、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ｐａｋ−３遺伝子転写阻害剤、または、ｐａｋ−３タンパク質の阻害剤によって不活性化される、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンの表現型を特徴とし、ならびに欠陥のある、または失われたｐａｋ−１機能、および、欠陥のある、または失われたｐａｋ−３機能を内包する、Ｃ．エレガンス株。
【請求項４９】
不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンの表現型を特徴とし、および請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の方法によって得られる、Ｃ．エレガンス株。
【請求項５０】
不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンの表現型を特徴とし、および請求項３４〜４７のいずれか一項に記載の方法によって得られた、Ｃ．エレガンス株。
【請求項５１】
ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３に関連する細胞内シグナル伝達カスケードを特徴とする、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のＣ．エレガンス株の使用。
【請求項５２】
ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３に関連するシグナル伝達カスケードの一部である１種または数種のタンパク質に干渉する化合物を同定するための、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のＣ．エレガンス株の使用。
【請求項５３】
ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３に関連するシグナル伝達カスケードの一部である１種または数種のタンパク質の転写に干渉する化合物を同定するための、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のＣ．エレガンス株の使用。
【請求項５４】
ｐＫＧ６１（配列番号２６）、ｐｋＧ６５（配列番号２７）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）、ｐＫＧ６３（配列番号２９）、ｐＫＧ６４（配列番号３０）、ｐＫＧ１６７（配列番号３１）、ｐＫＧ１６８（配列番号３２）の少なくとも１つのポリヌクレオチドで細菌株を形質転換し、そのベクターからＲＮＡを転写し、転写されたＲＮＡを単離および／または精製する、ＲＮＡ分子の製造方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法によって得られるＲＮＡ分子。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法によって得られたＲＮＡ分子。
【請求項５７】
ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉のための、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＲＮＡ分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＣ．エレガンスｐ２１活性化キナーゼ遺伝子、ｐａｋ−３遺伝子、および、関連する機能欠損の表現型に関する。これら表現型は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）におけるＰＡＫシグナル伝達経路を解明し、ＰＡＫシグナル伝達を調節する化合物をスクリーニングするのに用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
ｐ２１活性化キナーゼは、区別可能な構造的特徴を有するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ群を含み、これらは、数種の異なる細胞性プロセスおよび生物学的プロセスの重要な調節因子として登場したものである（Ｂｏｋｏｃｈ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００３年．７２：７４３〜８１に論説されている）。ＰＡＫファミリーは、ＰＡＫ１〜３サブクラスと、ＰＡＫ４−６サブクラスに細分され（ヒト／哺乳動物ＰＡＫの番号付けに基づき）、前者が本発明において興味の焦点である。ＰＡＫ１−３サブクラスのメンバーは、酵母のＳＴＥ２０キナーゼに強く関連しており、このタンパク質クラスおよび相同体の始祖的なメンバーはまた、ショウジョウバエやＣ．エレガンスのようなその他のモデル生物においても同定されている。
【０００３】
ＰＡＫ１〜３クラスの２種の最も重要な構造的特徴は、それぞれ高度に保存されたＣ末端触媒ドメインと、Ｎ末端調節ドメインである。ＰＡＫタンパク質の調節ドメイン中の独特のモチーフは、ＣＲＩＢドメイン（ｃｄｃ４２、および、Ｒａｃ相互作用ドメイン）であり、これは、自己阻害ドメインとオーバーラップしており、刺激シグナルの非存在下で触媒ドメインを不活性なままに保持する。ＰＡＫタンパク質に存在するその他のモチーフは、ＳＨ３結合ドメイン、および、調節ドメインと触媒ドメインとの間の酸性残基リッチなドメインである。加えて、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧβγサブユニットの結合部位は、ＰＡＫのちょうどＣ末端に存在することが報告されている。
【０００４】
最もよく説明されたＰＡＫの活性化因子は、ＲｈｏクラスのＧＴＰアーゼｃｄｃ４２およびＲａｃであり、これらは、ＣＲＩＢドメインへ結合することにより、自己阻害ドメインをブロックし、キナーゼドメインの活性化を起こす。ＰＡＫの活性化はまた、ＰＡＫが細胞質膜にリクルートされた後にＧＴＰアーゼ非依存性メカニズムによって生じることもあり、そこで、チロシンキナーゼ受容体が介在する活性化が起こる。ＰＡＫは、リン酸化で活性化されることがわかっており、部分的に、Ｔｈｒ４２３とＳｅｒ１４４（ヒトＰＡＫ１の番号付けに従う）での自己リン酸化によって活性化される。Ｔｈｒ４２３をリン酸化することがわかっている１種のキナーゼはＰＤＫ１（３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ）である。
【０００５】
多くのタンパク質は、ＰＡＫでリン酸化されることが報告されており、それらのうち数種は、細胞構造と細胞運動に関与するタンパク質である。例えば、ＬＩＭキナーゼ−１および−２、セリンキナーゼ（アクチン細胞骨格動力学に関与する）が、ＰＡＫでリン酸化されることが示されている。細胞運動に関与するその他の標的は、ミオシン軽鎖キナーゼ、および、調節ミオシン軽鎖である。加えて、ＰＡＫは、恐らくはスタスミンのリン酸化によって微小管動力学に関与する。
【０００６】
アクチン細胞骨格、ミオシンおよび微小管におけるそれらの調節作用によって、ＰＡＫ
は、生物レベルで、例えば神経形成と血管新生の際に、ＰＡＫにとって重要な役割であることがわかっている細胞運動や細胞移動のような細胞性プロセスに高い関与を示す。また、ＰＡＫは、アクチン細胞骨格動力学におけるそれらの調節作用を介して血小板活性化をもたらすシグナル伝達カスケードの一部であることも示されている。ＰＡＫは、問題のアイソフォームに依存した前アポトーシス促進作用とアポトーシス阻害作用の両方を有することがわかっている。ＰＡＫ２は、カスパーゼ３によって活性化され、従って、アポトーシスシグナル伝達カスケードの一部であり、それに対して、ＰＡＫ１は、細胞の生存を促進させる特定のシグナル伝達経路によって活性化される（例えばＩＬ−３シグナル伝達によって）ことが報告されている。
【０００７】
神経形成におけるＰＡＫの重要な役割は、遺伝病である非症候性のＸ染色体性精神遅滞によって例示され、これは、ＰＡＫ３（ヒトにおける脳特異的ＰＡＫアイソフォーム）の点変異によって生じる。
【０００８】
いくつかの研究により、ＰＡＫは、ガン転移に重要な役割を有する可能性があることが示されている。そこで、多くの乳ガン細胞系が、高いＰＡＫ１およびＰＡＫ２活性を示すことが報告されている。ヘレグリン（ガン細胞の成長の刺激物質）が、ＰＡＫ１活性を刺激することも示されている。加えて、ガン細胞モデルにおいて、Ｐａｋ１の優性阻害型は、運動と侵襲を阻害することができる。
【０００９】
ＰＡＫは、ＨＩＶがコードするＮｅｆタンパク質と関連する可能性があることが実証されており、このタンパク質は、ＨＩＶの病因において中心的な重要性を有するタンパク質である。Ｎｅｆと共に、ＰＡＫは、ウイルスの複製とＨＩＶの病因を促進させるとみられ、ＰＡＫは、感染した細胞の生存に必要である。
【００１０】
上述の研究で、Ｃ．エレガンスの１種のＰＡＫをコードする遺伝子（ＰＡＫ１と表記される）の存在が説明されている（Ｃｈｅｎ等，１９９６年，ＪＢＣ２７１，２６３６２〜６８，ＩｉｎｏおよびＹａｍａｍｏｔｏ，１９９８年，ＢＢＲＣ２４５，１７７〜８４）。インビトロでの生化学分析によって、ＰＡＫ１は、キナーゼ活性と、ＣｅＲａｃ１（現在、ＣＥＤ−１０として知られている）およびＣＤＣ４２Ｃｅ（ＣＤＣ−４２）との相互作用を示す真のＰＡＫタンパク質をコードすることが示された。免疫蛍光法では、胚体の伸長の際に、ＰＡＫ−１は、角皮下細胞の境界に局在していることが示され、これは、胚形成におけるｐａｋ−１の役割を示唆している。ｐａｋ−１プロモーター−レポーター遺伝子融合体を発現するトランスジェニック線虫の解析により、主に、胚組織、咽頭筋、ＣＡＮニューロン、腹神経索における運動ニューロン、受精嚢、および、発生中の性腺の遠端細胞（ＤＴＣ）における発生を通してｐａｋ−１が発現することが実証された。しかしながら、ノックアウトｐａｋ−１株（ＲＢ６８９）が公的に利用可能であるにもかかわらずｐａｋ−１のインビボの機能的特徴付けは報告されていない。これは、ｐａｋ−１の機能欠損の表現型は極めて微妙で、検出が困難であること、または、ｐａｋ−１は、その他のタンパク質により機能的に冗長であることを示唆している可能性がある。
【００１１】
ｃ４５ｂ１１．１（ｐａｋ−４）
ｐａｋ−１遺伝子に加えて、Ｃ．エレガンスのゲノムにおいてその他の予想される遺伝子の１つであるｃ４５ｂ１１．１は、ＰＡＫタンパク質をコードするとみられ、これは、配列相同性に基づいて、ＰＡＫタンパク質のＰＡＫ４〜６サブクラスに属する。我々は、この遺伝子をｐａｋ−４と称することを提唱する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これまで同定されていないｐａｋ遺伝子を示すこと
ＰＡＫ様キナーゼドメインをコードする遺伝子に関する配列相同性の検索により、１つのオープンリーディングフレーム、ｙ３８ｆ１ａ．１０（配列番号３３）が同定され、これは、ＰＡＫタンパク質の特徴的な調節領域を含まないキナーゼドメインのみのタンパク質をコードしていると予想される。www.kinase.comにおけるキナーゼのデータベースにおいて、このＯＲＦは、推定のＣＲＩＢドメインが、ゲノム領域でさらに上流にコードされているという関連コメントと共に、名称ＰＡＫ３で示されている。しかしながら、この考えを支持する参考文献または実験データは、提供されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、以下の群のいずれかから選択されるＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する：
ａ］配列番号１のＤＮＡ配列；または、
ｂ］配列番号１に相補的なＤＮＡ配列；または、
ｃ］配列番号１のＤＮＡ配列、または、配列番号１に相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列；または、
ｄ］遺伝子コードの結果として、配列番号１のＤＮＡ配列、または、配列番号１に相補的なＤＮＡ配列の縮重であるＤＮＡ配列；または、
ｅ］ｐａｋ−３aポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【００１４】
本発明の一実施形態において、前記単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態において、前記ＤＮＡ配列でコードされたｐａｋ−３ａポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列からなるＣ．エレガンスのｐａｋ−３ａポリペプチドである。
【００１６】
ハイブリダイゼーションは、中程度または高いストリンジェンシー条件下で起こり得る。中程度または高いストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．編；コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（ＩＳＢＮ：０−８７９６９−３０９−６）」、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ  Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎｎ  Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ  Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．編，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（ＩＳＢＮ：０−４７１−５０３３８−Ｘ−ルーズリーフ）」のような教本で見出すことができる。
【００１７】
中程度のストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションの例：
ＤＮＡまたはＲＮＡは、サザンブロットまたはノーザンブロットによって、メンブレンフィルター（例えばナイロン、ニトロセルロース）にトランスファーする。
【００１８】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば配列番号１の配列を含むポリヌクレオチド）を含むメンブレンフィルターを、２０×ＳＳＣから水で希釈することによって製造した６×ＳＳＣで完全に湿潤させる。（２０×ＳＳＣ：０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸三ナトリウム・２Ｈ2Ｏ）。
【００１９】
次に、このメンブレンフィルターを、プレハイブリダイゼーション溶液０．２ｍｌを加えることによってプレハイブリダイズさせ、６８℃で１〜２時間インキュベートする。プレハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳお
よび１００μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡからなる。５×デンハルト試薬は、水で希釈することによって１００×デンハルト溶液から製造される。（１００×デンハルト溶液：水５００ｍｌ中、フィコール４００（１０ｇ）、および、ポリビニルピロリドン（１０ｇ）、および、ウシ血清アルブミン（１０ｇ））。
【００２０】
プレハイブリダイゼーションミックスに、１０〜２０μｇ／ｍｌの放射標識したプローブ（例えば、特異的活性＝１０9ｃｐｍ／μｇ）を加える。放射標識したプローブが二本鎖の場合、１００℃で５分間加熱し、０℃〜１０℃に迅速に冷却することにより変性させなければならない。
【００２１】
ハイブリダイゼーションミックスを６０℃で２〜１４時間インキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、まず、メンブレンフィルターを、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、室温で５分間洗浄する。次に、フィルターを、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、室温で１５分間洗浄する。次に、フィルターを、０．５％ＳＤＳを含む０．１％ＳＳＣで、３７℃で３０分間洗浄する。
【００２２】
次に、フィルターを、０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで、４２℃で３０分間洗浄する。この洗浄工程の後、フィルターを例えばＸ線フィルムに晒すか、または、ホスホイメージャー（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で解析する。
【００２３】
高いストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションの例：
中程度および高いストリンジェンシー条件は、特に、洗浄工程の温度および組成に関して異なる。それに対して、放射標識したプローブでのプレハイブリダイゼーション、および、インキュベーションは、中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーションの場合と同じ条件下で行われ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション下での洗浄工程は、以下の通りであり：まず、メンブレンフィルターを、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで室温で５分間洗浄する。次に、フィルターを、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、５０℃で３０分間洗浄する。次に、フィルターを、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで、６０℃で３０分間洗浄する。この最後の洗浄工程をもう１回繰り返し、その後、フィルターをＸ線フィルムに晒すか、または、ホスホイメージャーで解析する。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、以下の群のいずれかから選択されるＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する：
ａ］配列番号２、３、４、５または６のＤＮＡ配列；または、
ｂ］配列番号：２、３、４、５または６のＤＮＡ配列の１つにに相補的なＤＮＡ配列；または、
ｃ］配列番号２、３、４、５もしくは６のＤＮＡ配列の少なくとも１つ、または、配列番号２、３、４、５もしくは６のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列の少なくとも１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列；または、
ｄ］遺伝子コードの結果として、配列番号２、３、４、５または６のＤＮＡ配列の少なくとも１つの縮重であるＤＮＡ配列；または、
ｅ］ｐａｋ−３ｂポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【００２５】
本発明の一実施形態において、前記単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列からなる。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態において、前記ＤＮＡ配列でコードされたｐａｋ−３ｂポリペプチドは、配列番号８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列からなるＣ．エレガンスのｐａｋ−３ｂポリペプチドである。
【００２７】
ｐａｋ−３ｂを特定する配列に対するポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関して、ｐａｋ−３ａに関して上記で示したような条件を参照してなされる。ｐａｋ−３ａに関して特定したような条件は、ｐａｋ−３ｂに対しても適用可能である。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、以下の群のいずれかから選択されるＤＮＡ配列を含む組換えベクター配列に関する：
ａ］配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の１つのＤＮＡ配列；または、
ｂ］配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列。
【００２９】
ｐａｋ−３ａに関して明記したようなハイブリダイゼーションの条件は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列に対しても同様に適用可能である。
【００３０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の１つのＤＮＡ配列からなるベクター配列に関する。
【００３１】
本発明はまた、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８で明示された組換えベクター系を含む宿主細胞にも関する。
【００３２】
宿主細胞としては、ベクター配列によって形質転換可能なあらゆる細胞が可能である。宿主細胞の例は：エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス−ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロミセス・セレビジエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、哺乳動物細胞系（ＮＩＨ３Ｔ３；ＣＯＳ；Ｈｅｌａなど）などが挙げられる。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号１のポリヌクレオチド配列でコードされた単離されたタンパク質に関する。この単離されたタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列で構成され得る。この単離されたタンパク質は、ｐａｋ−３ａタンパク質の活性を示すことができる。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号２、３、４、５または６のポリヌクレオチド配列でコードされた単離されたタンパク質に関する。このような単離されたタンパク質は、配列番号８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列で構成され得る。この単離されたタンパク質は、ｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を示す可能性がある。
【００３５】
本発明はまた、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質、および／または、ｐａｋ−３ａタンパク質の活性を示すタンパク質の製造、または、配列番号８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質、および／または、ｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を示すタンパク質の製造のための、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の組換えベクター系を含む宿主細胞の使用にも関する。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明は、ｐａｋ−３ａタンパク質またはｐａｋ−３ｂタンパク質と相互作用する化合物を同定するためのスクリーニング分析における、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の組換えベクター系を含む宿主細胞の使用に関する。本発明に関して化合物がタンパク質と相互作用する場合、その化合物は、タンパク質に結合する、または、タンパク質の活性を刺激する（活性化）、または、タンパク質の活性を減少させる（阻害）、または、タンパク質の活性を維持する、または、タンパク質の作用を安定させることを意味するといえる。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質、および／または、ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を示すタンパク質の製造に関し、本製造は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の組換えベクター配列を内包する宿主細胞の培養、培養の後の培地からの細胞の分離、その後、細胞の溶解、および、タンパク質精製技術によるタンパク質の精製による。このような、細胞の培養からタンパク質精製に至るタンパク質製造の方法を行うのに必要な全てのプロトコールは、当業者であれば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，Ｄｕｎｎ  Ｂ．Ｍ．，Ｐｌｏｅｇｈ  Ｈ．Ｌ，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ  Ｄ．Ｗ．，Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ  Ｐ．Ｔ．編；ジョン・ワイリー＆サンズ社（ＩＳＢＮ：０４７１１４０９８８）」のような教本で見出すことができる。
【００３８】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質、および／または、ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を示すタンパク質の使用、このようなタンパク質に結合特異性を示す抗体の製造に関する。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質、および／または、ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を示すタンパク質の使用、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３タンパク質の哺乳動物の類似タンパク質の欠乏、過活性化または機能不全によって生じる病気を治療するための医薬品の製造に関する。このような哺乳動物の類似タンパク質は、ヒト種由来のものでもよい。これは、キナーゼタンパク質で構成され得る。上記の病気は、代謝、心臓血管系、細胞分裂プロセス、またはその他の細胞性または全身性のプロセスの中枢神経系の機能不全に関連する可能性がある。
【００４０】
本発明はさらに、ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質と相互作用する化合物を同定するためのスクリーニングプロセスにおける、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質の使用に関する。このようなスクリーニングプロセスは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の形態で構成することができる。ＨＴＳは、実験室用ロボットシステムによる自動化スクリーニング様式に基づいている。
【００４１】
本発明の実施形態は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質と相互作用する化合物を同定する分析に関し、本分析において、
ａ］ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質を提供する、
ｂ］化合物を提供する、
ｃ］ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質と、前記化合物とを接触させる、
ｄ］ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質への前記化合物の結合を決定する、および／または、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を決定する。
【００４２】
ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質は、配列番号７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質で構成され得る。化合物は、化学者による実験室で行われる化学合成によって、または、工業的プロセスによって提供することができる。化合物はさらに、生物（例えば細菌、菌類、植物、哺乳動物など）からの単離によって提供することができる。
【００４３】
ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質は、配列番号１３、１４、１５、１６、１
７または１８の組換えベクターを内包し、ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を有するタンパク質を発現する宿主細胞の形態で提供することができる。本発明の一実施形態において、このような宿主細胞と、前記化合物とを接触させる。本発明のさらなる実施形態において、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質の活性を不活性化または活性化する、または、それに結合する、または、それを維持する化合物を同定するための分析が用いられる。
【００４４】
本発明はさらに、このような分析によって同定することができる化合物に関し、同様に、医薬的に活性な成分のような化合物の使用、または、医薬品を製造するための化合物の使用に関する。このような化合物は、分子量１００〜５００００ｋＤａで構成され得る。
【００４５】
さらなる実施形態において、本発明は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質に関する機能欠損の表現型を示すＣ．エレガンス株に関する。このような機能欠損の表現型は、遺伝子および／またはｍＲＮＡが発現されていない場合、サザンまたはノーザンブロットによって検出可能である。機能欠損の表現型はまた、タンパク質が発現されていない場合、ウェスタンブロットによっても検出可能である。生物が、タンパク質の機能的な形態を生産できないか、または、タンパク質を速やかに分解するか、または、タンパク質の阻害剤を含む場合、ｐａｋ−３ａまたはｐａｋ−３ｂタンパク質活性を測定することにより、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質に関する機能欠損の表現型が証明される。Ｃ．エレガンス株のｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質に関する機能欠損の表現型は、性腺の移動、胚の致死性または不妊に関連させることができる。
【００４６】
本発明の一実施形態において、Ｃ．エレガンス株の機能欠損の表現型は、突然変異、または、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂの遺伝子コード配列の部分的または完全な欠失によって生じる。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態において、Ｃ．エレガンス株の機能欠損の表現型は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂの遺伝子コード配列へのポリヌクレオチド配列の挿入によって生じる。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態において、Ｃ．エレガンス株の機能欠損の表現型は、以下の群より選択されるポリヌクレオチドによって生じる：ＲＮＡｉ；（干渉ＲＮＡ）、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ。
【００４９】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に晒した際の特異的ｍＲＮＡの不活性化は、Ｃ．エレガンスにおいて、数種の異なるアプローチによって達成することができる。主要なアプローチの簡単な概要を以下に示す。
【００５０】
フィーディングによる
フィーディングによるＲＮＡｉにおいては、対象の遺伝子からのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントを、プラスミドで、２つの反対向きのＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター部位の間にクローニングする。続いて、このプラスミドで、誘導性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むエシェリキア・コリ宿主株を形質転換し、得られたエシェリキア・コリ株をＣ．エレガンスの食物源として用いる（ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ，１９９８年，Ｎａｔｕｒｅ，３９５，８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓ等，２００１年，Ｇｅｎｅ  ２６３，１０３〜１１２；Ｋａｍａｔｈ等，２０００年，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，ｒｅｓｅａｒｃｈ０００２．１〜０００２．１０ｒｅｓｅａｒｃｈ０００２．１〜０００２．１０）。
【００５１】
このアプローチの利点は、比較的大量の線虫を数世代にわたってＲＮＡｉに関して処理することができることである。１つの欠点は、いくつかのＲＮＡは、エシェリキア・コリに対して毒性である可能性があることである。いくつかの表現型が場合によってはＰ０動物ですでに観察され得るとしても、表現型は通常、最初にＦ１世代でスコア付けされる。
【００５２】
マイクロインジェクションによる
最初に説明されたＣ．エレガンスにおけるＲＮＡｉアプローチは、動物体腔へのｄｓＲＮＡのマイクロインジェクションであった（Ｆｉｒｅ等，１９９８年，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０１〜８１１）。このアプローチに関して、ｄｓＲＮＡは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター部位を有するベクターにクローニングされたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメントをインビトロで転写することによって、または、適切なＲＮＡポリメラーゼのプロモーター部位と、対象の遺伝子からの配列との両方を含むハイブリッドＰＣＲ産物から得られる。通常、２つのＲＮＡ鎖は、別々に転写され、続いて共にアニールする。あるいは、両方の差を、１つの反応で転写することもでき（インサートが、同じプロモーター下流の両方の方向にクローニングされている場合）、すなわち、別々のアニーリング工程を省略することができることを意味する。続いて、インビトロで生産されたｄｓＲＮＡは、Ｃ．エレガンス動物の体にマイクロインジェクションされる。
【００５３】
このアプローチを用いて、解析に利用可能な動物の数は、フィーディング方法よりかなり少ない。しかしながら、場合によっては、マイクロインジェクションのほうがより高い成功率を示すと言われている。
【００５４】
ソーキングによる
インビトロで転写されたｄｓＲＮＡのマイクロインジェクションの代わりに、線虫をｄｓＲＮＡ高濃度でインキュベート（「ソーキング」）することができる（Ｍａｅｄａ等，２００１年，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１，１７１〜１７６）。
【００５５】
このアプローチは、マイクロインジェクションより必要な労力が少なくて済むが、それほど一般的に用いられてはいない。
【００５６】
トランスジェニックにより
また、ｄｓＲＮＡは、線虫でインサイチュで、それ自体がｄｓＲＮＡにフォールドするヘアピンＲＮＡ分子を発現するトランスジェニック動物を作製すること、または、２種の異なるＲＮＡ鎖を発現する２種のトランスジェニックコンストラクトを使用することのいずれかによって作成することもできる。労力がかかるとしても、このアプローチは、安定してノックダウンされたＲＮＡ、同様に、組織特異的および誘導性のＲＮＡｉ（ＲＮＡ発現を促すために選択されたプロモーターに依存性の）に関する可能性を開くものである（Ｔａｖｅｒｎａｋｉｓ等，２０００年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１８０〜１８３）。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態において、Ｃ．エレガンス株の機能欠損の表現型は、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂタンパク質の阻害剤によって生じる。
【００５８】
本発明はまた、ＰＡＫシグナル伝達経路のタンパク質を同定するための機能欠損の表現型を示すＣ．エレガンス株の使用にも関する。このようなタンパク質としては、キナーゼ、ホスファターゼ、転写エンハンサー、転写リプレッサー、または、細胞内シグナル伝達カスケードと相互作用することができるその他のあらゆるタンパク質が可能である。
【００５９】
本発明はさらに、ＰＡＫシグナル伝達経路のタンパク質と相互作用する化合物を同定す
るための、機能欠損の表現型を示す株の使用に関する。
【００６０】
本発明はさらに、不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンを特徴とする表現型を有するＣ．エレガンスの作成方法に関し、本方法は、以下による：
ａ］Ｃ．エレガンスにおいて、ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質を不活性化すること、および／または、同じＣ．エレガンスにおいて、ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質を不活性化すること、および、
ｂ］不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンの表現型を示すＣ．エレガンスを同定すること。
【００６１】
本願に関して、用語「ｐａｋ−３」は、ｐａｋ−３ａと、ｐａｋ−３ｂとを含むものとする。ｐａｋ−３と言及される場合、ｐａｋ−３ａおよび／またはｐａｋ−３ｂに関して言及するものとする。
【００６２】
ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質、ならびに、ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質の不活性化は、同じＣ．エレガンス生物で行われなければならない。両方の遺伝子の不の活性化は、同時に行われてもよいし、または、連続的に順次行われてもよい。機能欠損の表現型を得るための、ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３の不活性化の全ての場合において、ｐａｋ−３の化学阻害および／または遺伝学的な不の活性化は、ｐａｋ−１の化学阻害および／または遺伝学的な不の活性化の前に、または、その後に続いて行われるが、どちらも差はない。
【００６３】
不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンの表現型を示すＣ．エレガンスの同定は、Ｆ１および／またはＦ２の子孫、および／または、さらにその後の世代で生じ得る。
【００６４】
ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質の不活性化は、ｐａｋ−１をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子によって達成することができる。このようなＲＮＡ分子は、少なくとも１つの以下の群のベクターから得ることができる：ｐＫＧ６１（配列番号２６）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）。この目的のために、対応するベクターをエシェリキア・コリのような細菌株に導入し、ＲＮＡをプラスミドのプロモーターから転写し、その後、細菌から単離し、精製する。次に、精製したＲＮＡを、Ｃ．エレガンス細胞、または、Ｃ．エレガンス生物の一部、または、完全なＣ．エレガンス生物と接触させる。
【００６５】
ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質を不活性化させるさらなる可能性は、細菌をＣ．エレガンスにフィーディングすることにあり、この細菌は、ｐａｋ−１をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子を含む。このような、Ｃ．エレガンスのフィーディングのための細菌は、ｐＫＧ６１（配列番号２６）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）の群の少なくとも１つのプラスミドを内包し得る。ＲＮＡは、細菌内でこれらベクターから転写される。
【００６６】
ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質の不活性化は、ｐａｋ−１ノックアウトＣ．エレガンス株の使用によって行うことができる。このようなノックアウト株は、例えばＣ．エレガンスＲＢ６８９である。
【００６７】
ｐａｋ−１遺伝子および／またはｐａｋ−１タンパク質は、対応するアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ｐａｋ−１遺伝子転写の阻害剤、または、ｐａｋ−１タンパク質の阻害剤によって不活性化することができる。
【００６８】
ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質の不活性化は、ｐａｋ−３をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子によって達成することができる。このようなＲＮＡ分子は、ｐＫＧ６５（配列番号２７）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）、ｐＫＧ６３（配列番号２９）、ｐＫＧ６４（配列番号３０）の群の少なくとも１つのベクターから得ることができる。この目的のために、対応するベクターを、エシェリキア・コリのような細菌株に導入し、ＲＮＡをプラスミドのプロモーターから転写し、その後、細菌から単離し、精製する。次に、精製したＲＮＡを、Ｃ．エレガンス、または、Ｃ．エレガンス生物の一部、または、完全なＣ．エレガンス生物の細胞と接触させる。ｐａｋ−３遺伝子、および／または、ｐａｋ−３タンパク質を不活性化させるさらなる可能性は、細菌をＣ．エレガンスにフィーディングすることにあり、この細菌は、ｐａｋ−３をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に適したＲＮＡ分子を含む。このような、Ｃ．エレガンスのフィーディングのための細菌は、ｐＫＧ６５（配列番号２７）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）、ｐＫＧ６３（配列番号２９）、ｐＫＧ６４（配列番号３０）の群の少なくとも１つのプラスミドを内包し得る。ＲＮＡを、細菌内でこれらベクターから転写する。ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質の不活性化は、ｐａｋ−３ノックアウトＣ．エレガンス株の使用によって行うことができる。ｐａｋ−３遺伝子および／またはｐａｋ−３タンパク質は、対応するアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ｐａｋ−３遺伝子転写の阻害剤、または、ｐａｋ−３タンパク質の阻害剤によって不活性化することができる。
【００６９】
本発明はさらに、不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動の表現型を特徴とし、欠陥のあるまたは失われたｐａｋ−１の機能、および、欠陥のあるまたは失われたｐａｋ−３の機能を内包するＣ．エレガンス株に関する。本願に関して、用語「機能」は、遺伝子、および／または、タンパク質に対して言及されるものとする。不妊、および／または、胚の致死性、および／または、不完全な性腺の移動パターンの表現型を特徴とする本発明のＣ．エレガンス株は、前記表現型を有するＣ．エレガンスを作成するための１種または数種の方法によって、得ることができる。このような株は、ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３に関連する細胞内シグナル伝達カスケードを特徴付けるためにその他のことに対しても用いることができる。また、このような株は、ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３に関連するシグナル伝達カスケードの一部である１種または数種のタンパク質を干渉する化合物を同定するために用いることもできる。このような株はさらに、ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３に関連するシグナル伝達カスケードの一部である１種または数種のタンパク質の転写を干渉する化合物を同定するのに用いることができる。
【００７０】
本発明はまた、ＲＮＡ分子の作成に関し、本製造において、ｐＫＧ６１（配列番号２６）、ｐＫＧ６５（配列番号２７）、ｐＫＧ７１（配列番号２８）、ｐＫＧ６３（配列番号２９）、ｐＫＧ６４（配列番号３０）、ｐＫＧ１６７（配列番号３１）、または、ｐＫＧ１６８（配列番号３２）の少なくとも１つのポリヌクレオチドで細菌株を形質転換し、ＲＮＡをベクターから転写し、転写されたＲＮＡを単離および／または精製する。また、本発明は、このような方法によって得ることができるＲＮＡ分子、または、このような方法によって得られたＲＮＡ分子にも関する。これらＲＮＡ分子は、ｐａｋ−１および／またはｐａｋ−３タンパク質をコードするポリヌクレオチドのＲＮＡ干渉に、個々の種を一種ずつ用いてもよいし、合わせた様式で用いてもよい。
【００７１】
配列番号の説明
配列番号１は、ｐａｋ−３ａのｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を開示する。ｐａｋ−３ａ遺伝子は、キナーゼドメインのコード情報からなる。
【００７２】
配列番号２は、ｐａｋ−３ｂのｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を開示する。ｐａｋ−３ｂ遺伝子は、ｐａｋ−３ａと同じ配列組成のキナーゼドメインと、キナーゼドメインに５’で連結したさらなるＣＲＩＢドメイン（ｃｄｃ４２／Ｒａｃ相互作用結合ドメイン）とのコード情報からなる。
【００７３】
配列番号３は、対応するタンパク質の対応するＡｌａが未変化のままになるサイレント多型（ｇｃｔからｇｃｃへの変化）を内包するｐａｋ−３ｂのｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を開示する。
【００７４】
配列番号４は、配列番号３に記載のサイレント多型を内包し、キナーゼドメイン内にさらに６ｂｐのインサートをインフレームで内包するｐａｋ−３ｂのｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を開示する。
【００７５】
配列番号５は、ＣＲＩＢドメイン内に９ｂｐのインサートをインフレームで内包し、対応するエキソン７配列が欠失したｐａｋ−３ｂのｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を開示する。
【００７６】
配列番号６は、ＣＲＩＢドメイン内に対応するタンパク質のＩｌｅがＶａｌに変化する多型（ａｔｃからｇｔｃへの変化）を内包し、キナーゼドメインに６ｂｐのインサートをインフレームで内包する（配列番号４と同じ）ｐａｋ−３ｂのｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列を開示する。
【００７７】
配列番号７は、配列番号１の対応するタンパク質のアミノ酸配列（キナーゼドメイン）を開示する。
【００７８】
配列番号８は、配列番号２の対応するタンパク質のアミノ酸配列（キナーゼドメインとＣＲＩＢドメイン）を開示する。
【００７９】
配列番号９は、配列番号３の対応するタンパク質のアミノ酸配列（キナーゼドメインとＣＲＩＢドメイン）を開示する。
【００８０】
配列番号１０は、配列番号４の対応するタンパク質のアミノ酸配列（６ｂｐのインサートを有するキナーゼドメインとＣＲＩＢドメイン）を開示する。
【００８１】
配列番号１１は、配列番号５の対応するタンパク質のアミノ酸配列（キナーゼドメインと、９ｂｐのインサートを有するＣＲＩＢドメイン、および、エキソン７が欠失）を開示する。
【００８２】
配列番号１２は、配列番号６の対応するタンパク質のアミノ酸配列（６ｂｐのインサートを有するキナーゼドメインと、ＩｌｅがＶａｌに変化したＣＲＩＢドメイン）を開示する。
【００８３】
配列番号１３は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を包含するベクターｐＫＧ４０のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図１３のヘッダーに示す。
【００８４】
配列番号１４は、配列番号２のポリヌクレオチド配列を包含するベクターｐＫＧ１２３のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図１４のヘッダーに示す。
【００８５】
配列番号１５は、配列番号３のポリヌクレオチド配列を包含するベクターｐＫＧ４３のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図１５のヘッダーに示す。
【００８６】
配列番号１６は、配列番号４のポリヌクレオチド配列を包含するベクターｐＫＧ４４のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図１６のヘッダーに示す。
【００８７】
配列番号１７は、配列番号５のポリヌクレオチド配列を包含するベクターｐＫＧ５８のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図１７のヘッダーに示す。
【００８８】
配列番号１８は、配列番号６のポリヌクレオチド配列を包含するベクターｐＫＧ５９のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図１８のヘッダーに示す。
【００８９】
配列番号１９は、プライマー配列ｋｇ１を開示する。
【００９０】
配列番号２０は、プライマー配列ｋｇ２を開示する。
【００９１】
配列番号２１は、プライマー配列ｋｇ２５を開示する。
【００９２】
配列番号２２は、プライマー配列ｋｇ２６を開示する。
【００９３】
配列番号２３は、プライマー配列ｋｇ３７を開示する。
【００９４】
配列番号２４は、プライマー配列ｋｇ２７を開示する。
【００９５】
配列番号２５は、プライマー配列ｋｇ５０を開示する。
【００９６】
配列番号２６は、ベクターｐｋＧ６１／ｄＴ７−ｐａｋ−１のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図２６のヘッダーに示す。
【００９７】
配列番号２７は、ベクターｐｋＧ６５／ｄＴ７−ｐａｋ−３のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図２７のヘッダーに示す。
【００９８】
配列番号２８は、ベクターｐｋＧ７１／ｄＴ７−ｐａｋ−３／ｐａｋ−１のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図２８のヘッダーに示す。
【００９９】
配列番号２９は、ベクターｐｋＧ６３／ｄＴ７−ｐａｋ−３ａのポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図２９のヘッダーに示す。
【０１００】
配列番号３０は、ベクターｐｋＧ６４／ｄＴ７−ｐａｋ−３ｂのポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図３０のヘッダーに示す。
【０１０１】
配列番号３１は、ベクターｐｋＧ１６７／ｄＴ７−ｃｅｄ−１０のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図３１のヘッダーに示す。
【０１０２】
配列番号３２は、ベクターｐｋＧ１６８／ｄＴ７−ｍｉｇ−２のポリヌクレオチド配列を開示する。ベクターの説明は、図３２のヘッダーに示す。
【０１０３】
配列番号３３は、Ｃ．エレガンスの発現配列タグ（ＥＳＴ）ｙ３８ｆ１ａ・１０のポリヌクレオチド配列を開示する。
【０１０４】
配列番号３４は、Ｃ．エレガンスのＥＳＴのｙｋ６５１４１  ５’のポリヌクレオチド配列を開示する。
【０１０５】
配列番号３５は、Ｃ．エレガンスのＥＳＴのｙｋ６５１４１  ３’のポリヌクレオチド配列を開示する。
【０１０６】
配列番号３６は、Ｃ．エレガンスのＥＳＴのＦ１８ａ  １１・４のポリヌクレオチド配列を開示する。
【０１０７】
図面の説明：
図１は、配列番号１を示す。
図２は、配列番号２を示す。
図３は、配列番号３を示す。
図４は、配列番号４を示す。
図５は、配列番号５を示す。
図６は、配列番号６を示す。
図７は、配列番号７を示す。
図８は、配列番号８を示す。
図９は、配列番号９を示す。
図１０は、配列番号１０を示す。
図１１は、配列番号１１を示す。
図１２は、配列番号１２を示す。
図１３は、配列番号１３を示す。
図１４は、配列番号１４を示す。
図１５は、配列番号１５を示す。
図１６は、配列番号１６を示す。
図１７は、配列番号１７を示す。
図１８は、配列番号１８を示す。
図１９は、配列番号１９を示す。
図２０は、配列番号２０を示す。
図２１は、配列番号２１を示す。
図２２は、配列番号２２を示す。
図２３は、配列番号２３を示す。
図２４は、配列番号２４を示す。
図２５は、配列番号２５を示す。
図２６は、配列番号２６を示す。
図２７は、配列番号２７を示す。
図２８は、配列番号２８を示す。
図２９は、配列番号２９を示す。
図３０は、配列番号３０を示す。
図３１は、配列番号３１を示す。
図３２は、配列番号３２を示す。
図３３は、配列番号３３を示す。
図３４は、配列番号３４を示す。
図３５は、配列番号３５を示す。
図３６は、配列番号３６を示す。
図３７は、性腺のパスファインディング表現型（Ａ）、および、性腺の欠損の強度を示す。
【０１０８】
略語
ＮＧＭ−線虫成長培地、
エシェリキア・コリＯＰ５０−エシェリキア・コリのウラシル要求株；線虫の食物源と
して用いられる、
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド。
【０１０９】
プラスミドＤＮＡの寄託
本発明のプラスミドは、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｉｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＧｍｂＨ）Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに、以下の番号で寄託されている：
プラスミドｐＫＧ４０＝ＤＳＭ１６１４７（配列番号１３、および、図１３も参照）、
プラスミドｐＫＧ４３＝ＤＳＭ１６１４８（配列番号１５、および、図１５も参照）、
プラスミドｐＫＧ４４＝ＤＳＭ１６１４９（配列番号１６、および、図１６も参照）、
プラスミドｐＫＧ５８＝ＤＳＭ１６１５０（配列番号１７、および、図１７も参照）、
プラスミドｐＫＧ５９＝ＤＳＭ１６１５１（配列番号１８、および、図１８も参照）、
プラスミドｐＫＧ１２３＝ＤＳＭ１６１５２（配列番号１４、および、図１４も参照）。
【実施例】
【０１１０】
株、一般的な株の培養、分子学的および遺伝学的な方法
Ｂｒｅｎｎｅｒ（１９７４年）に従って、線虫の培養を行った。株は、Ｃ．エレガンス・ゲノミックセンター（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＣＧＣ）と、Ｃ．エレガンス・ノックアウト協会（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）から得た。
【０１１１】
ｐａｋ−３のクローニング
ｐａｋ−３ｃＤＮＡの様々なアイソフォームを、ＲＴ−ＰＣＲで、Ｎ２（Ｃ．エレガンス野生型）のトータルＲＮＡからクローニングした。全てのプライマーは、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニングを可能にする５’アダプター配列を含む。５’ゲートウェイアダプター配列を含むＲＴ−ＰＣＲ産物を、ＡｔｔＢ配列プライマー
ｋｇ１；ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ（配列番号１９）、
ｋｇ２；ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ（配列番号２０）、
を用いて再増幅し、製造元（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の説明に従って、ＢＰ反応によってベクターｐＤＯＮＲ２０１にクローニングした。
【０１１２】
配列アライメントをレーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）ソフトウェアパッケージを用いて行った。Ｂｌａｓｔデータベース検索を、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔツール（内部設定）を用いて行った。配列モチーフを、ワークベンチ（Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）Ｐｆａｍ  ＨＭＭデータベース検索ツール（ジーンデータ社（ＧｅｎｅＤａｔａ  ＡＧ））を用いて同定した。
【０１１３】
ｙ３８ｆ１ａ．１０に関する遺伝子予想に基づいた遺伝子特異的プライマーを用いることによって、ｐＫＧ４０（ｐａｋ−３ａ野生型；ＤＳＭ１６１４７）をクローニングした（配列番号３３）。（５’：ｋｇ２５；ａａａａａｇｃａｇｇｃｔｃａａａａＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＧＴＣＣＧＡＴＧＡＴ（配列番号２１）；３’：ｋｇ２６；ａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔＣＴＡＣＴＴＴＴＣＴＣＧＧＡＣＧＧＣＴＣＴ（配列番号２２））。（１種のｐａｋ−３ａクローンを、５’ＳＬ１プライマーｋｇ３７をｋｇ２６と組み合わせて用いることによって単離した［以下を参照］。このクローンは、ｐＫＧ４０と同一なＯＲＦを有することがわかり、保持されなかった）。
【０１１４】
ｐＫＧ４３（ｐａｋ−３ｂ  ＳＬ１ｔ１６８０ｃ；Ａｌａ−Ａｌａ；ＤＳＭ１６１４８）を、ＳＬ１トランススプライスリーダー配列に対応する５’プライマー（ｋｇ３７；ａａａａａｇｃａｇｇｃｔＧＧＴＴＴＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＧ，配列番号２３）、それと共に、３’プライマーｋｇ２６（ａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃＴＡＣＴＴＴＴＣＴＣＧＧＡＣＧＧＣＴＣＴ，配列番号２４）によってクローニングした。
【０１１５】
ｐＫＧ４４（ｐａｋ−３ｂ  Ｉｎｓ１５８１ｔ１６８６ｃ；ＤＳＭ１６１４９）、ｐＫＧ５８（ｐａｋ−３ｂ  Ｉｎｓ２２８  Ｄｅｔａ  エキソン７）、および、ｐＫＧ５９（ｐａｋ−３ｂ  ａ４３ｇ  Ｉｎｓ１５８１）を全て、ｐＫＧ４３からの配列情報から得た遺伝子特異的５’プライマーのｋｇ５０（ａａａａａｇｃａｇｇｃｔｃａａａａＡＴＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＡＧ，配列番号２５）と、３’プライマーｋｇ２６（配列番号２２）とを合わせることによってクローニングした。
【０１１６】
ｐＫＧ１２３（ｐａｋ−３ｂ野生型；ＤＳＭ１６１５２）を、野生型配列との差異を含むｐＫＧ４４におけるＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ制限フラグメント（キナーゼドメインのＣ末端部分）を、ｐＫＧ５８からの対応する野生型フラグメントで置換することによって構築し、それにより、全長の野生型ｃＤＮＡクローンを作製した。
【０１１７】
ＲＮＡｉ
ＲＮＡ干渉は、以前にＦｒａｓｅｒ等，２０００年、および、Ｋａｍａｔｈ等，２０００年で説明された通りにフィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ）方法を用いて行われた。ダブルＲＮＡｉは、プレートにシードする前に細菌培養を混合すること、または、２つのｃＤＮＡフラグメントを含むベクターコンストラクトの作製のいずれかによって行われた。
【０１１８】
フィーディングによるＲＮＡｉのためのベクターは、全長または部分的ｃＤＮＡを、ダブルＴ７ベクターｐＰＤ１２９．３６（ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９５，８５４）の誘導体にクローニングすることによって作製された。標準的なゲートウェイのプロトコール（インビトロジェン）に従ってクローニングするためにゲートウェイを取り入れたバージョン（ｐＫＧ１４）を用いるか、または、既知のＰＣＲ産物のダイレクトクローニング（Ｓｃｈｌｏｔｔｅｒｅｒ，Ｃ．およびＷｏｌｆｆ，Ｃ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，１９９６年．１２，２８６〜２８７）のためにポリリンカー（ｐＫＧ９０）に付加したＳｒｆＩ部位を有するバージョンを用いた。
【０１１９】
ＲＮＡｉベクター：
−ｐＫＧ６１（ｄＴ７−ｐａｋ−１）；ベクター：ｐＫＧ１４；インサート：ｐａｋ−１のｂｐ１〜１７１０；ＲＮＡは、配列番号２６の８９〜１７５３（ＯＲＦ全体）にコードされる（配列番号２６）、
−ｐＫＧ６５（ｄＴ７−ｐａｋ−３）；ベクター：ｐＫＧ１４；インサート：ｐａｋ−３ｂのｂｐ１１４１〜１９４１（キナーゼドメイン）；ＲＮＡは、配列番号２７の８４〜８８３にコードされる；ｐａｋ−３ａとｐａｋ−３ｂの両方に特異的（配列番号２７）、
−ｐＫＧ７１（ｄＴ７−ｐａｋ−３／−１）；ベクターｐＫＧ１４；インサート：ｐａｋ−３ｂのｂｐ１１４１〜１９４１（キナーゼドメイン）、および、ｐａｋ−１のｂｐ９２１〜１７１０（キナーゼドメイン）；ＲＮＡは、配列番号２８の８４〜８８４（ｐａｋ１）、および、８８５〜１６７４（ｐａｋ３）にコードされる；ｐａｋ−１／ｐａｋ−３に対するダブルＲＮＡｉ用（配列番号２８）、
−ｐＫＧ６３（ｄＴ７−ｐａｋ−３ａ）；ベクターｐＫＧ１４；インサート：ｐａｋ−３ａのｂｐ１〜１２８（Ｎ末端）；ＲＮＡは、配列番号２９の８９〜２１６にコードされる；ｐａｋ−３ａに特異的（配列番号：２９）、
−ｐＫＧ６４（ｄＴ７−ｐａｋ−３ｂ）；ベクターｐＫＧ１４；インサート：ｐａｋ−
３ｂのｂｐ１〜７８８（Ｎ末端）；ＲＮＡは、配列番号３０の８９〜８７６にコードされる；ｐａｋ−３ｂに特異的（配列番号３０）、
−ｐＫＧ１６７（ｄＴ７−ｃｅｄ−１０）；ベクターｐＫＧ９０；インサート：ｃ０９ｇ１２．８ｂのｂｐ４０〜５６２（ｃｅｄ−１０）；ＲＮＡは、配列番号３１の１３６〜６５８にコードされる
−ｐＫＧ１６８（ｄ７−ｍｉｇ−２）；ベクターｐＫＧ９０；インサート：ｃ３５ｃ５．４のｂｐ１３〜５６６（ｍｉｇ−２）；ＲＮＡは、配列番号３２の１３７〜６８９にコードされる。
【０１２０】
表現型解析の分析
産卵をスコア付けは、５または１０匹［１．ｐａｋ−１（ＲＮＡｉ）；２．ｐａｋ−１（ｏｋ４４８）；ｐａｋ−３（ＲＮＡｉ）３．ｐａｋ−１（ｏｋ４４８）；ｐａｋ−３ｂ（ＲＮＡｉ）用に］の成虫Ｆ１世代の線虫（最初にＲＮＡｉ処理に晒したＰ０親からの第１世代子孫）を、プレート（ＲＮＡｉ処理あたり５枚のプレート）に２０℃で５時間置き、続いて、成虫の線虫を取り除いた後に手動で卵をカウントすることによってなされた。胚の致死性は、産卵された卵の総数に対する成虫の線虫を取り除いてから２４時間後に残存する卵の数と定義された。
【０１２１】
性腺の形態と遠端細胞（ＤＴＣ）の移動を、主として以前に説明された通りにスコア付けした（Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，１９９９年，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２，９８５〜９９７；Ｓｕ等，２０００年，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，５８５〜５９４）。簡単に言えば、Ｆ１世代の後期Ｌ４の幼虫または若い成虫を、ノルマスキー（ＤＩＣ）オプティクスでアクシオプラン（Ａｘｉｏｐｌａｎ）２顕微鏡（ＳｕｌｓｔｏｎおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９７７年，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ５６，１１０〜１５６）を用いて観察し、ＤＴＣの軌跡を性腺のアームの形状から推測した。ネガティブコントロールとして、線虫を、空のＴ７ベクターを発現する細菌に晒した。ＤＴＣ移動の表現型を、５つの異なるクラスにまとめた（図１ａ）：Ｉ）野生型、正常な第１および第２ターンを有する典型的なＣ型の性腺を示す；ＩＩ）Ｒａｃ型、典型的には、ｃｅｄ−１０およびｍｉｇ−２突然変異において観察され、これは、正常な第１および第２ターンを有するが、追加の第３のターンを有するために性腺の先端が中央体からそれた方向を向く（ＲｅｄｄｉｅｎおよびＨｏｒｗｉｔｚ，２０００年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，１３１〜１３６）；ＩＩＩ）Ｐａｋ型、正常な第１のターンを有するが、第２のターンが中央体からそれた間違った方向を向く（以前に、類似の表現型が突然変異ｍｉｇ−１４で説明されている［Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，１９９９年］）；ＩＶ）直線型、性腺が、中央体からそれて腹側に沿ったターンを全く有さずに発達する；Ｖ）その他の型、主に、性腺の成長が完全にないか、または、性腺が破裂している（体内に遊離の浮遊した生殖細胞を含む）。
【０１２２】
化合物の試験
ｐａｋ−３阻害剤候補化合物をスクリーニングするために、同調させたＲＢ６８９（ｐａｋ−１，ｏｋ４４８）Ｌ１幼虫を、主に説明された通りに（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ．Ｈｏｐｅ編，１９９９年）、受胎した成虫のＮａＯＨ／次亜塩素酸ナトリウム処理、続いて得られた卵をＭ９緩衝液Ｏ／Ｎで２０℃で撹拌しながらインキュベートすることによって得た。ＮＧＭ培地中の３０匹のＬ１の幼虫を、平底の９６−ウェルプレートの１ウェルあたり最終用量５０μｌで、２ＯＤ６００のエシェリキア・コリＯＰ−５０、１００μＭ試験化合物、１％ＤＭＳＯ（化合物のストック溶液から）と混合し、２０℃で３〜４日間インキュベートした。アクシオバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００顕微鏡を用いて、性腺の表現型の予備的なウェル内でのスコア付けを行った。最終的なスコア付けのために、線虫をウェルからピペットで取り出し、マウントし、ノルマスキー（ＤＩＣ）オプティクスで解析した。ネガティブコントロールとして、線虫を１％ＤＭＳＯでインキュベートした。
【０１２３】
ｐａｋ−３のｃＤＮＡのクローニングおよびｐａｋ−３遺伝子の同定
これまで未知のＣ．エレガンスのｐａｋ遺伝子の初期の指標は、ｐａｋ型キナーゼドメインと高い相同性を有するキナーゼドメインをコードする推定されたオープンリーディングフレームのｙ３８ｆ１ａ．１０（配列番号３３）の同定から得た。（キナーゼドメインはまた、ｐａｋ型キナーゼドメインとして、ｗｗｗ．ｋｉｎａｓｅ．ｃｏｍウェブサイトで分類される）。しかしながら、推定されたＯＲＦのｙ３８ｆ１ａ．１０は、ＰＡＫ遺伝子ファミリーで保存された調節ドメインであるＣＲＩＢ−ドメインをコードしない。我々は、配列の比較から、ｙ３８ｆ１ａ．１０  ＯＲＦをカバーしているＥＳＴのｙｋ６５１ｈ１（配列番号３４、３５）は、また、ｙ３８ｆ１ａ．１０上流に位置する推定されたＯＲＦのｆ１８ａ１１．４（配列番号３６）の部分も含むことを見出した。すなわち、これら２つの推定されたＯＲＦは、実際には単一の遺伝子である可能性をを示している。これを試験するために、我々は、ＲＴ−ＰＣＲを、ｙ３８ｆ１ａ．１０の３’末端に対応する３’遺伝子特異的プライマー、および、トランススプライスされたＳＬ１リーダー配列に対応する５’プライマーを、多くのＣ．エレガンスｍＲＮＡに用いて行った。Ｃ．エレガンスのｐａｋ−１のｍＲＮＡがＳＬ１トランススプライスであると報告されていることから、我々は、これが、その他のＣ．エレガンスｐａｋ遺伝子からのｍＲＮＡにも当てはまる可能性があると考えた。
【０１２４】
得られたＲＴ−ＰＣＲ産物の配列解析により、２つの異なるｍＲＮＡクラスが明らかになった。第１のクラス（アイソフォームａ）は、推定されたＯＲＦのｙ３８ｆ１ａ．１０に大体相当するが、キナーゼドメイン上流に追加のエキソンを有していた。第２のクラス（アイソフォームｂ）は、ＯＲＦのｙ３８ｆ１ａ．１０およびｆ１８ａ１１．４の両方を含み、従って、これら２種のＯＲＦは、単一の遺伝子に属することを実証している。しかしながら、ｍＲＮＡは、ｆ１８ａ１１．４で推定されたものよりより長く、また、ＥＳＴのｙｋ６５１ｈ１より長い５’領域を有する。配列解析により、ＯＲＦのｆ１８ａ１１．４とは異なるスプライシングパターン、および、最も重要には、ＣＲＩＢドメインと相同性を有するドメインが明らかになった。ｃＤＮＡアイソフォームｂを用いたＢｌａｓｔ配列データベース検索により、ヒトおよびげっ歯動物ＰＡＫ３に対して最大の類似性スコア、および、ヒトおよびげっ歯動物ＰＡＫ１に対してそれに次ぐスコアが得られた。
【０１２５】
総合すれば、これは、２つの推定されたＯＲＦのｙ３８ｆ１ａ．１０（配列番号３３）、および、ｆ１８ａ１１．４（配列番号３６）は、実際には１つの遺伝子であり、２つの異なるｍＲＮＡスプライシング変異体、すなわち主にｐａｋ型キナーゼドメインからなるタンパク質をコードする短い型、および、典型的なＰＡＫタンパク質をコードする５’のより長い型をコードすることを示す。配列類似性および生物学的機能（以下参照）に基づき、我々は、この新規のｐａｋ遺伝子を、ｐａｋ−３ａ示す短いスプライシング変異と、長い型のｐａｋ−３ｂを含むｐａｋ−３と呼ぶことを提唱する。
【０１２６】
Ｃ．エレガンス株Ｎ２（野生型）、および、ＲＢ６８９（ｐａｋ−１）のＲＮＡｉ
ｐａｋ−３の生物学的機能を評価するために、フィーディング実験によるＲＮＡｉを行った。しかしながら、Ｎ２野生型の線虫をＲＮＡｉに用いた場合、明確な表現型は検出できなかった。同様に、ｐａｋ−１機能をＲＮＡｉで分析した際にも、表現型は観察されなかったが、これは、形態および挙動において完全な野生型を示すｐａｋ−１ノックアウト株ＲＢ６８９の観察によって確認された。
【０１２７】
ｐａｋ−１とｐａｋ−３との類似性に基づき、ＲＮＡｉ実験における表現型の欠如は、ｐａｋ−１とｐａｋ−３の補足機能によって説明できるといえる。これを確認するために、ダブルＲＮＡｉ実験を、Ｎ２バックグラウンド、および、ｐａｋ−３のＲＮＡｉをｐａｋ−１ノックアウト株ＲＢ６８９（ｏｋ４４８）で行った。両方のアプローチで同様の結果が得られ、数種の明確な表現型：不妊、胚の致死性、および、性腺の移動パターンにおける欠陥を示した。不妊は、完全には浸透していなかったが、極めて強く、容易に肉眼で確認できる再現性が示された。代表的な定量実験の結果を表Ｉに示す。擬似ＲＮＡｉ処理に晒したコントロール線虫と比較して、ｐａｋ−１；ｐａｋ−３のダブルＲＮＡｉに晒した動物によって産卵された卵の相対数は、ｐａｋ−１とｐａｋ−３のＲＮＡｉ細菌培養を混合することによってダブルＲＮＡｉが行われた場合、わずか１７％であった。ハイブリッドｐａｋ−１／ｐａｋ−３ダブルＲＮＡ分子を発現する細菌を用いてダブルＲＮＡｉを行った場合、その効果は、いくぶん強く、１１％であり、これは、培養物を混合することによるダブルＲＮＡｉは、それ専用のダブルＲＮＡｉベクターを使用した場合の効果とほんのわずかな差しかないことを示す。
【０１２８】
ｐａｋ−１ｌｇ（ｏｋ４４８）；ｐａｋ−３（ＲＮＡｉ）において、動物の不妊は、ｐａｋ−１ｌｆ（ｏｋ４４８）；擬似（ＲＮＡｉ）と比較すると３％だけさらに浸透していた。これは、Ｎ２バックグラウンドで得られた結果と比較すると、ｐａｋ−１のＲＮＡｉは、完全なノックアウトほど浸透しないことを示唆している。
【０１２９】
胚の致死性は、まず、長期のインキュベーションで孵化しなかった小さい丸型の卵の存在によって観察された。これら卵のより詳しい試験により、高度の細胞分化、例えば筋肉および咽頭組織が確かに起こったことが示された。しかしながら、胚全体の形態は、中程度から、形態学的特徴が保存されない極めて重症な範囲で変形していた。定量解析（表Ｉ）により、Ｎ２動物においては２０％超の胚の致死性を示し、および、ＲＢ６８９バックグラウンドにおいてはほとんど４０％の胚の致死性を示した。
【０１３０】
興味深いことには、ＲＮＡｉに晒した線虫の第１世代（Ｐ０）では、表現型は、観察できず、Ｆ１世代で初めて不妊と性腺の欠陥が観察された。胚の致死性は、Ｆ２世代の胚で初めて観察され、これは、Ｆ１世代での母系のレスキューを示す。
【０１３１】
ｐａｋ−３のｃＤＮＡのクローニングにより、２つの異なるスプライシング変異体、ｐａｋ−３ａおよびｐａｋ−３ｂの存在が明らかになった。この２つの形態の機能的な重要性は、ＲＢ６８９バックグラウンドでアイソフォーム特異的なＲＮＡｉを行うことにより実証された。不妊、および、胚の致死性の両方の表現型から分析した結果、より長いアイソフォームのｐａｋ−３ｂは、観察された表現型に関して主要な役割を果たす可能性があるようである（表Ｉ）。
【０１３２】
第３のｐａｋ遺伝子は、ヒトＰＡＫ４によく似た推定された遺伝子ｃ４５ｂ１１．１でコードされる。哺乳動物ＰＡＫ４は、ＰＡＫ１およびＰＡＫ３とは調節および機能において顕著に異なることがわかっている。これに一致して、ｃ４５ｂ１１．１とｐａｋ−１またはｐａｋ−３とのダブルＲＮＡｉ実験でさらなる表現型は観察されなかった。
【０１３３】
ｐａｋ−３およびｐａｋ−１は、ＤＴＣパスファインディングに必要である
Ｃ．エレガンス雌雄同体において、２葉の性腺の形態は、性腺の遠端細胞（ＤＴＣ）の細胞移動のパスによって決定される。野生型動物において、２つの性腺アームは、中央体の腹側に位置する性腺原基から発生する。一方のＤＴＣが前方に移動し、他方が腹側の正中線に接近して後方に移動する。続いて、ＤＴＣの移動は、２回のターンを経るが、第１のターンは背面に向かって、および、第二のターンは、中央体に向かう。これら移動の結果により、２つの対称的なＣ型の成虫の性腺アームが形成される。上述したように、我々は、ＤＴＣ移動の欠陥を示す野生型の性腺の形からの逸脱を、ｐａｋ−３（ＲＮＡｉ）；ｐａｋ−１（ＲＮＡｉ）、および、ｐａｋ−３（ＲＮＡｉ）；ＲＢ６８９（ｏｋ４４８）動物において認めたが、単一のｐａｋ−３（ＲＮＡｉ）；ｐａｋ−１（ＲＮＡｉ）、または、ＲＢ６８９株それ自体では認めなかったことを特記する。従って、この表現型に関し
ても、ｐａｋ−１およびｐａｋ−３は補足的に作用するとみられる。観察した性腺の半分以上において、第１のターンは正常にみえたが、それに対して、第２のターンは誤った方向であり、すなわち中央体に向かってターンするのではなく、後部の性腺は後部のままであり、前部の性腺は前部のままである（図１）。場合によっては、まったくターンがない性腺が観察され、性腺はそれぞれ腹側の正中線に沿って動物の後部および前部末端に向かったままである。
【０１３４】
また、ＲＢ６８９バックグラウンドにおける、ｐａｋ−３ｂおよびｐａｋ−３ａのＲＮＡｉによるＤＴＣ移動に対する、ｐａｋ−３アイソフォーム特異的な作用も解析した。結果より、不妊および胚の致死性の表現型の場合と同様に、ｐａｋ−３ｂアイソフォームだけがＤＴＣ移動にとって重要であることが示される（表ＩＩ）。
【０１３５】
Ｐａｋ−Ｒａｃ相互作用
これまでに、Ｃ．エレガンスの３種のＲａｃ  ＧＴＰアーゼのうち２種の、ｃｅｄ−１０およびｍｉｇ−２が、ＤＴＣパスファインディングに関与することが説明されている（ＲｅｄｄｉｅｎおよびＨｏｒｗｉｔｚ，２０００年，Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ等，２００１年）。ｃｅｄ−１０およびｍｉｇ−２突然変異において、性腺は、第２のターンの後に第三の余分なターンを経て、性腺先端が中央体からそれた方向を向く。この表現型は、すでに第２のターンが不完全であるｐａｋ−１；ｐａｋ−３突然変異動物で観察された表現型とは異なる。その上、インビトロでの研究と哺乳動物細胞系（例えばＢｉｓｈｏｐおよびＨａｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２０００年）から、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ（Ｒａｃタンパク質が属する）が、ＰＡＫの上流の調節因子であることがわかっている。Ｃ．エレガンスｐａｋもまた、ＤＴＣパスファインディングに重要であることを考慮して、Ｃ．エレガンスの性腺発生において、ｐａｋ−１とｐａｋ−３との相互作用、ならびに、２種のＲａｃｓ  ｃｅｄ−１０およびｍｉｇ−２が存在すると推論した。これを実証するために、様々な遺伝学的なバックグラウンドで一連のＲＮＡｉ実験を行った（表ＩＩにまとめる）。様々な実験の組み合わせによって、ｍｉｇ−２またはｃｅｄ−１０の機能欠損は、ｐａｋ−３との組み合わせで、別の単一の機能欠損の突然変異より強い表現型を生じなかったことが矛盾なく示された。しかしながら、ｐａｋ−１突然変異との組み合わせでは、性腺の移動の欠陥の浸透度と重症度は、劇的に増加した。ｐａｋ−１およびｐａｋ−３が補足的に作用するため、これら結果により、ｃｅｄ−１０およびｍｉｇ−２は、ｐａｋ−３上流の調節因子として作用するが、ｐａｋ−１上流の調節因子としては作用しないか、したとしてもほんのわずかであることが示される。興味深いことには、ｃｅｄ−１０；ｍｉｇ−２；ｐａｋ−１の三重突然変異動物は、ｐａｋ−１；ｐａｋ−３二重突然変異よりいっそう強い作用を受けたが、これは、２つのＲａｃはまた、平行してｐａｋ−３以外のその他の経路を介して作用することを示す。その上、ＤＴＣパスファインディングの欠陥の浸透度が、ｃｅｄ−１０；ｍｉｇ−２；ｐａｋ−１動物よりも高いことだけでなく、表現型の範囲がより深刻なパスファインディングおよび移動欠陥にシフトしたことも観察された。ターンも性腺移動の欠陥もない性腺を高い頻度で観察した。これは、ＰａｋとＲａｃはいずれも、数種の段階およびＤＴＣパスファインディングの形態に関与することを実証しているが、これらの機能は、単一または二重突然変異では明確ではなく、恐らくはこれら遺伝子の冗長な機能の作用のためである。
【０１３６】
ＲＮＡｉ表現型をミミックする化合物
性腺の移動が欠陥の表現型を、低分子量のＰＡＫ−３阻害剤のレポーターとして用いることができるかどうかを調査するため、９６−ウェル分析様式で、化合物コレクションから得られた一連の可能性のあるＰＡＫ阻害剤に線虫を晒した。同調させたＲＢ６８９（ｐａｋ−１，ｏｋ４４８）Ｌ１幼虫を、ＮＧＭ（培地）中で、試験化合物、および、食物源としてのエシェリキア・コリＯＰ−５０と共にインキュベートした。化合物をＤＭＳＯ溶液として加え、ＤＭＳＯに晒した線虫をコントロールとして用いた。後期Ｌ４または初期
の若い成虫期で、性腺の表現型をスコア付けした。
【０１３７】
試験した１４種の物質うちいくつかが、性腺の移動に部分的な作用を示し、ｐａｋ−１；ｐａｋ−３（ＲＮＡｉ）動物で観察された表現型に類似した表現型が生じた。特に、試験された１種の化合物、Ａ００００２５７０６は、性腺の移動の欠陥が再現性よく生じることが示された（表ＩＩＩ）。解析された１００の性腺のうち７４は、性腺の移動の欠陥を有することがわかった。
【０１３８】
観察された欠陥の型は、ＲＮＡｉで観察されたものとはやや異なるという観察は恐らく、薬理学的な化合物特性（例えば吸収や安定性）によるものである。性腺の発生およびその他の発生プロセスに関与するその他のキナーゼも、Ａ００００２５７０６で阻害されることも考えられる。実際に、我々は、この化合物で処理した線虫における全般的な成長の遅延を観察したが、これは、ある程度のＡ００００２５７０６の非特異的な作用を示す。しかしながら、その他の分析でＡ００００２５７０６がＰＡＫ阻害剤であると確認された（データ示さず）が、我々は、観察されたほとんどの、または全ての性腺の移動の欠陥は、ＰＡＫ−３の特異的阻害によるものと考えている。
【０１３９】
Ｃ．エレガンスベースの分析でＰＡＫ阻害剤を同定することができるという観察は、薬理学的な研究のためのツールとしてのこのモデル生物の有用性を実証する。成長の遅延が観察されたことも、特異的分析の情報と平行して可能性のある副作用を同定することができること、すなわち、Ｃ．エレガンスベースの分析は、ハイスループットスクリーニングシステムとして有用であり得ることを例示している。
【０１４０】
【表１】
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【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】配列番号１を示す。
【図２】配列番号２を示す。
【図３】配列番号３を示す。
【図４】配列番号４を示す。
【図５】配列番号５を示す。
【図６】配列番号６を示す。
【図７】配列番号７を示す。
【図８】配列番号８を示す。
【図９】配列番号９を示す。
【図１０】配列番号１０を示す。
【図１１】配列番号１１を示す。
【図１２】配列番号１２を示す。
【図１３−１】配列番号１３を示す。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１４−１】配列番号１４を示す。
【図１４−２】図１４−１の続きである。
【図１５−１】配列番号１５を示す。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１６−１】配列番号１６を示す。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１７−１】配列番号１７を示す。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１８−１】配列番号１８を示す。
【図１８−２】図１８−１の続きである。
【図１９】配列番号１９を示す。
【図２０】配列番号２０を示す。
【図２１】配列番号２１を示す。
【図２２】配列番号２２を示す。
【図２３】配列番号２３を示す。
【図２４】配列番号２４を示す。
【図２５】配列番号２５を示す。
【図２６−１】配列番号２６を示す。
【図２６−２】図２６−１の続きである。
【図２７−１】配列番号２７を示す。
【図２７−２】図２７−１の続きである。
【図２８−１】配列番号２８を示す。
【図２８−２】図２８−１の続きである。
【図２９−１】配列番号２９を示す。
【図２９−２】図２９−１の続きである。
【図３０−１】配列番号３０を示す。
【図３０−２】図３０−１の続きである。
【図３１−１】配列番号３１を示す。
【図３１−２】図３１−１の続きである。
【図３２−１】配列番号３２を示す。
【図３２−２】図３２−１の続きである。
【図３３】配列番号３３を示す。
【図３４】配列番号３４を示す。
【図３５】配列番号３５を示す。
【図３６】配列番号３６を示す。
【図３７】性腺のパスファインディング表現型（Ａ）、および、性腺の欠損の強度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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