(57)【要約】【課題】  近接場光を用いることにより、簡易な装置で信頼性の高い検出ができる蛍光共鳴検出装置を提供することを目的とする。【解決手段】  上記目的を達成するために、本発明の蛍光共鳴検出装置１００は、第１の蛍光標識と第２の蛍光標識との蛍光共鳴反応による蛍光を利用して検査対象５００中の被検出物質を検出する蛍光共鳴検出装置１００であって、光源５０と、光源５０から出射された出射光を反射する反射部材１０と、反射部材１０の反射面１４から出射した近接場光が形成される領域に設けられ、第１の蛍光標識と第２の蛍光標識と検査対象とが保持される検査対象保持部２２と、蛍光を検出する蛍光検出部７０、８０、９０と、を備えることを特徴とする。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の蛍光標識と第２の蛍光標識との蛍光共鳴反応による蛍光を利用して検査対象中の被検出物質を検出する蛍光共鳴検出装置であって、
光源と、
前記光源から出射された出射光を反射する反射部材と、
前記反射部材の反射面から出射した近接場光が形成される領域に設けられ、前記第１の蛍光標識と前記第２の蛍光標識と前記検査対象とが保持される検査対象保持部と、
前記蛍光を検出する蛍光検出部と、
を備えることを特徴とする蛍光共鳴検出装置。
【請求項２】
前記蛍光検出部は、前記反射部材の前記反射面に対向する位置に設けられることを特徴とする請求項１記載の蛍光共鳴検出装置。
【請求項３】
前記蛍光検出部は、前記蛍光のスペクトルを測定するスペクトル測定手段を有することを特徴とする請求項１または２記載の蛍光共鳴検出装置。
【請求項４】
前記反射部材と前記検査対象保持部とは、一体に構成されると共に、前記蛍光共鳴検出装置から着脱可能に設けられることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の蛍光共鳴検出装置。
【請求項５】
前記第１の蛍光標識と前記第２の蛍光標識とは、前記検査対象が前記検査対象保持部に導入される前に、前記検査対象保持部に保持されていることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の蛍光共鳴検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴検出装置に関し、具体的には、近接場光（Ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  Ｆｉｅｌｄ  Ｌｉｇｈｔ：ＥＦＬ）によって励起され、蛍光共鳴する検出対象を検出する蛍光共鳴検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品アレルギーや食中毒、成人病の日常検査への関心が高まり、抗原抗体反応などを用いる小規模医療機関、あるいは一般家庭を対象とする小型の検査装置が注目されている。この抗原抗体反応を用いる検出方法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法やＥＦＬ法（例えば、特許文献１参照）、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴）法などが代表的な検出方法であるが、それぞれ、検査に時間がかかったり、反応操作が複雑であったり、検査対象に制限があるなど、一般家庭向けの検査装置としては実用化には至っていない。
【特許文献１】特開２００４−２７９０４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
小規模医療機関、あるいは一般家庭における検査においては、検査結果の信頼性に加えて、迅速な判定時間、簡便な操作性、装置の小型化を達成することが重要である。この点において、ＦＲＥＴ法は理想的な検出方法であるが、血液（血漿）のように測定対象物以外の不純物を多く含む検体の測定に適しているとは言い難い（表１）。この問題を解決する方法として、金属錯体を用いた改良ＦＲＥＴ法が考案されているが、紫外線波長のレーザなど高価で複雑な光学機構が必要となることが問題である。
【０００４】
表１において、各検出方法のメリットを（○）、デメリットを（×）とする。
【０００５】
【表１】
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本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであって、近接場光を用いることにより、簡易な装置で信頼性の高い検出ができる蛍光共鳴検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明の蛍光共鳴検出装置は、第１の蛍光標識と第２の蛍光標識との蛍光共鳴反応による蛍光を利用して検査対象中の被検出物質を検出する蛍光共鳴検出装置であって、光源と、前記光源から出射された出射光を反射する反射部材と、前記反射部材の反射面から出射した近接場光が形成される領域に設けられ、前記第１の蛍光標識と前記第２の蛍光標識と前記検査対象とが保持される検査対象保持部と、前記蛍光を検出する蛍光検出部と、を備えることを特徴とする。これにより、簡易な装置で信頼性の高い検出ができる。
【０００７】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の蛍光共鳴検出装置において、前記蛍光検出部は、前記反射部材の前記反射面に対向する位置に設けられることを特徴とする。これにより、不純物のバックグランド蛍光や検出対象からの蛍光が減衰しまう問題の影響を受けにくくなり、簡易な装置でより信頼性の高い検出ができる。
【０００８】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の蛍光共鳴検出装置において、前記蛍光検出部は、前記蛍光のスペクトルを測定するスペクトル測定手段を有することを特徴とする。これにより、検査対象中の被検出物質の存在（有無）を検出するだけではなく、定量的な検出も行うことができる。
【０００９】
請求項４記載に発明は、請求項１から３のいずれかに記載の蛍光共鳴検出装置において、前記反射部材と前記検査対象保持部とは、一体に構成されると共に、前記蛍光共鳴検出装置から着脱可能に設けられることを特徴とする。これにより、一体に構成された反射部材と検査対象保持部とを交換することで、複数の検査対象を短時間で検査することができる。
【００１０】
請求項５記載の発明は、請求項１から４のいずれかに記載の蛍光共鳴検出装置において、前記第１の蛍光標識と前記第２の蛍光標識とは、前記検査対象が前記検査対象保持部に導入される前に、前記検査対象保持部に保持されていることを特徴とする。これにより、検査対象を検査対象保持部に導入するだけで検査が可能となり、操作がより簡便になる。また、この第１の蛍光標識と第２の蛍光標識とが、凍結乾燥された状態で保持されると、保管が容易である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、簡易な装置で信頼性の高い検出ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明に係る蛍光共鳴検出装置１００の構成について、図を用いて詳細に説明する。
【００１３】
図１は、蛍光共鳴検出装置１００の構成を表した断面模式図である。蛍光共鳴検出装置１００は、導光プリズム１０とチャンバープレート２０とカバープレート３０などからなるサンプル保持部４０と、光源５０と、励起側コリメータレンズ６０と、受光側コリメータレンズ７０と、分光測定器８０と、分光測定器８０からの測定データの解析処理や蛍光共鳴検出装置１００内の各種部品の制御を行う制御部９０と、を備えている。
【００１４】
本実施の形態において、光源５０には青色発光ダイオード（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ社製：Ｂｌｕｅ  ＬＥＤ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ＬＳ−４５０）を用い、光源５０からの光を光ファイバ（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ社製：Ｐ４００−２−ＵＶ−ＶＩＳ）５２を介して励起側コリメータレンズ（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ社製：７４−ＶＩＳ）６０へ導く。光ファイバ５２から出射する光は、出射角２５°で広がっていくので、励起側コリメータレンズ６０によって平行光にして、導光プリズム１０へ入射させる。
【００１５】
導光プリズム１０の入射面１２は、反射面１４に対してθ（約６０°）傾斜させて形成されており、この角度θは、導光プリズム１０の屈折率ｎpと導光プリズム１０の反射面１４上に導入されるサンプル５００の屈折率ｎsによって、スネルの法則に基いて導出される。本実施の形態の場合、導光プリズム１０をアクリル材、サンプル５００を水と仮定すると、アクリル材の屈折率ｎpの方が、水の屈折率ｎsよりも大きいので、臨界角θcは数１より導出される。
【００１６】
【数１】
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ここで、導光プリズム１０の屈折率ｎpに１．６を、サンプル５００の屈折率ｎsに１．３３を代入し、臨界角θcを算出すると、５６．３°となるので、サンプル５００の屈折率ｎsの変動や導光プリズム１０の作製のしやすさなどを考慮して、本実施の形態の導光プリズム１０はθを約６０°とした。
【００１７】
導光プリズム１０の上部には、チャンバープレート２０とカバープレート３０が図２に示すように配置され、チャンバープレート２０の中央部には測定チャンバ２２が設けられている。サンプル５００は、カバープレート３０およびチャンバープレート２０に、貫通するように設けられたサンプル注入口３２およびサンプル注入路２４から注入され、チャンバープレート２０の測定チャンバ２２とサンプル注入路２４を接続するサンプル流通路２６を通って、測定チャンバ２２に導入される。サンプル５００の導入には、図示しないが、サンプル注入側にシリンジなどの加圧手段を設け、測定チャンバ２２へ加圧送液してもよいし、測定チャンバ２２から外部へ連通する排気路２８あるいはその排気側に排気ポンプを設け、排気ポンプにて吸引してサンプル５００を測定チャンバ２２に吸引送液してもよい。
【００１８】
説明を図１に戻し、測定チャンバ２２の寸法は、導光プリズム１０内を通る平行光Ｌpが反射面１４に当たる面積よりも大きいことが望ましい。これは、平行光Ｌpが反射面１４に当たる面積よりも測定チャンバ２２の寸法の方が小さい場合、測定チャンバ２２のエッジ部２３にて乱反射が起こり、測定ノイズとなってしまうことを防ぐためである。本実施の形態の場合、平行光Ｌpの断面の寸法が直径５ｍｍの円形であり、平行光Ｌpは入射面１２に対して垂直に入射しているので、反射面１４では長径が１０ｍｍ、短径が５ｍｍの楕円形で反射する。従って、測定チャンバ２２は直径１０ｍｍ以上に設定することが望ましい。また、エッジ部２３は面取りをすると、さらに良い。
【００１９】
測定チャンバ２２の中には、予め凍結乾燥された２種類の抗体を導入しておく。そして、この２種類の抗体のうち、一方の抗体Ａには標識ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を設け、他方の抗体Ｂには標識ＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）を設ける。図３に示すように、この測定チャンバ２２に、抗体Ａおよび抗体Ｂと接合する抗原Ｃが導入されると、抗原Ｃに抗体Ａと抗体Ｂとが接合する。この状態で、ＦＩＴＣの励起波長Ｅxf（ピーク波長：４９４ｎｍ）に近い４５０ｎｍの光が測定チャンバ２２に照射されると、ＦＩＴＣは５１８ｎｍをピーク（Ｅmf）として発光し、ＴＡＭＲＡの励起波長Ｅxtは５５５ｎｍであるので、ＦＩＴＣの発光によって、ＴＡＭＲＡが５８０ｎｍをピーク（Ｅmt）とする発光をする。
【００２０】
この現象は、蛍光共鳴反応あるいは共鳴エネルギ移転反応（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）として、公知の技術であるが、図７（ａ）および（ｂ）に示すようなサンプル５００を透過した励起光（透過励起光）あるいはサンプル５００中を透過した検出対象からの蛍光（透過蛍光）を検出する従来のＦＲＥＴによる検出装置では、サンプル５００がタンパク質、核酸あるいは金属錯体（例えばヘムポルフィリン）などの不純物を含む場合、透過励起光による不純物のバックグランド蛍光によってＳ／Ｎ比が小さくなったり、サンプル５００中で透過蛍光が減衰したりするなどの問題がある。
【００２１】
しかしながら、本発明では励起光である平行光Ｌｐが導光プリズム１０の反射面１４から漏れ出す近接場光により、サンプル５００中の近接場光が照射される部分（反射面１４から数百ｎｍの範囲）でＦＲＥＴを起こし、検出対象からの蛍光を反射面１４と対向する受光面１６において受光するので、不純物のバックグランド蛍光や検出対象からの蛍光が減衰しまう問題の影響を受けにくい。従って、紫外線波長レーザなどの光源を用いなくとも測定することが可能となる。
【００２２】
また、ＦＲＥＴは、１〜１０ｎｍ程度の範囲内に、所定の角度を持って対向している一次蛍光標識（ＦＩＴＣ）と二次蛍光標識（ＴＡＭＲＡ）が存在しないと起こらないので、図４に示すように、抗原Ｃの量によって、発光のスペクトルが変化する。従って、本実施の形態のように、スペクトルを測定できる分光測定器８０を受光側に備えることにより、抗原Ｃの有無だけではなく、その量も推定することが可能となる。
【００２３】
導光プリズム１０を介して、測定チャンバ２２の対向する位置には受光側コリメータレンズ７０を配置する。この受光側コリメータレンズ７０を配置する受光面１６と反射面１４とは平行にすると効率がよい。受光側コリメータレンズ７０により集光した光は、光ファイバ（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ社製：Ｐ４００−２−ＵＶ−ＶＩＳ）８２を介して分光測定器（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ社製：Ｐｌｕｇ−ａｎｄ−Ｐｌａｙ  Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  ＵＳＢ２０００）８０に導入され、スペクトル測定が行われる。
【００２４】
サンプル保持部４０およびコリメータレンズ６０、７０などの部分は、外部の光がノイズとして入らないように、また、導光プリズム１０の反射面１４を反射した光が、外部へ影響を及ぼさないように、図示しない遮光された筐体の中に配置されることが望ましい。この場合、筐体には、サンプル保持部４０を出し入れする蓋付の出入口を設け、サンプル注入口３２から測定チャンバ２２へサンプル５００を導入したサンプル保持部４０を筐体の出入口から筐体内部の所定の位置に固定する。そして、出入口の蓋を閉め、測定スタートボタンを押すことにより、制御部９０から光源５０へ光を出力する指令が出され、次いで、制御部９０から分光測定器８０へスペクトル測定する指令が出されるようにすると、一連の測定を自動的に行うことができる。
【実施例１】
【００２５】
次に、本発明の実施例１に係るサンプル保持部１４０の構成について、図５を用いて詳細に説明する。図５は細胞培養液の無菌検査に用いるサンプル保持部１４０を示す分解斜視図であり、本実施例では、シリンジ１０２に、一次蛍光標識が設けられ、凍結乾燥された抗体Ａ1と、二次蛍光標識が設けられ、凍結乾燥された抗体Ｂ1と、検査対象の細胞培養液と、が導入され、シリンジ１０２から、攪拌してよく混合された状態のサンプル５００が、サンプル注入口１３２、サンプル注入路１２４およびサンプル流通路１２６を介して、測定チャンバ１２２へ加圧送液される。
【００２６】
そして、測定後は蛍光共鳴検出装置１００からサンプル保持部１４０を取り外し、サンプル保持部１４０を交換する。交換する際に、サンプル保持部１４０の配置位置がずれ、蛍光共鳴検出装置１００の平行光Ｌpがサンプル保持部１４０に当たる位置がずれてしまうことを防止するために、図示しない位置決め用の切欠きを導光プリズム１１０の底面（受光面１１６）に設けたり、サンプル保持部１４０を載置するステージを可動ステージにし、サンプル保持部１４０を載置したときに、位置調整を行えるようにしたり、するとなお良い。また、洗浄液をサンプル注入口１３２から導入し、サンプル注入口１３２、サンプル注入路１２４、サンプル流通路１２６および測定チャンバ１２２を洗浄して、サンプル保持部１４０を繰り返し使用できるようにしても良い。
【実施例２】
【００２７】
次に、本発明の実施例２に係るサンプル保持部２４０の構成について、図６を用いて詳細に説明する。図６は血液による検査に用いるサンプル保持部２４０を示す分解斜視図であり、本実施例では、測定チャンバ２２２に、一次蛍光標識が設けられ、凍結乾燥された抗体Ａ２と、二次蛍光標識が設けられ、凍結乾燥された抗体Ｂ２と、が予め導入されており、サンプル注入口２３２からサンプル５００が、サンプル注入路２２４およびサンプル流通路２２６を介して、測定チャンバ２２２へ送液される。このとき、排気路２２８に接続される図示しないエアポンプによって、測定チャンバ２２２内を負圧にすることにより、サンプル５００は測定チャンバ２２２内へ吸引送液される。
【００２８】
血液検査に用いる本実施例のサンプル保持部２４０には、サンプル流通路２２６に１μｍメッシュのフィルタ２０４が設けられており、血液中の固体成分（赤血球、白血球、血小板）はこのフィルタ２０４に捕捉される。そして、血漿などの液体成分と１μｍメッシュのフィルタ２０４に捕捉されない微小な固体成分のみが測定チャンバ２２２へ導入され、検査対象となる。本実施例のようなフィルタ付のサンプル保持部２４０は、フィルタ２０４が目詰まりを起こすので、検査対象ごとにサンプル保持部２４０を交換する方が適しており、洗浄して繰り返し使用する場合には、排気路２２８から洗浄液を導入する必要がある。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、尿による妊娠検査を含む体液（血液、尿、消化液など）の抗原抗体反応検査をはじめ、核酸の相補性や、酵素の活性を利用するあらゆる検査に利用可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係る蛍光共鳴検査装置の構成を模式的に示したシステム構成図である。
【図２】本発明に係る蛍光共鳴検査装置のサンプル保持部の構成を示した分解斜視図である。
【図３】抗原抗体反応による蛍光共鳴の原理を示した模式図である。
【図４】抗原抗体反応による蛍光共鳴の出力の違いを示した模式図である。
【図５】本発明の一実施例に係るサンプル保持部の構成を示した分解斜視図である。
【図６】本発明の他の実施例に係るサンプル保持部の構成を示した分解斜視図である。
【図７】ＦＲＥＴ法を用いた従来の検出装置を模式的に示したシステム構成図である。
【符号の説明】
【００３１】
１０、１１０、２１０  導光プリズム
１２、１１２、２１２  入射面
１４、１１４、２１４  反射面
１６、１１６、２１６  受光面
２０、１２０、２２０  チャンバープレート
２２、１２２、２２２  測定チャンバ
２３、１２３、２２３  エッジ部
２４、１２４、２２４  サンプル注入路
２６、１２６、２２６  サンプル流通路
２８、１２８、２２８  排気路
３０、１３０、２３０  カバープレート
３２、１３２、２３２  サンプル注入口
４０、１４０、２４０  サンプル保持部
５０  光源
５２、８２  光ファイバ
６０  励起側コリメータレンズ
７０  受光側コリメータレンズ
８０  分光測定器
９０  制御部
１００  蛍光共鳴検出装置
１０２  シリンジ
２０４  フィルタ
５００  サンプル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2006308412.tif 000008
【図５】
2006308412.tif 000009
【図６】
2006308412.tif 000010
【図７】
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