(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質のリン酸化を測定するための方法を提供する。【解決手段】標的タンパク質のインビトロでのリン酸化を含むが、それは、このタンパク質（非リン酸化）を、タンパク質のリン酸化形態の作製を可能にするホスホキナーゼを含むすべての試薬を含んでなる反応混合物とすることを条件とする。このリン酸化タンパク質は、このリン酸化部位に特異性を持つ抗体との接合によって測定する。測定に有用な抗体を含む。特に、タウタンパク質、Ｒｂタンパク質およびＥＧＦＲタンパク質のリン酸化、ならびにタウタンパク質、Ｒｂタンパク質またはＥＧＦＲタンパク質のリン酸化の部位に特異性を持つ抗体からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質に対するホスホキナーゼ活性を測定するための方法であって、
（ａ）タンパク質をホスホキナーゼに供して、該タンパク質上のリン酸化部位をリン酸化するステップと、
（ｂ）該タンパク質上のリン酸化されるリン酸化部位に特異的な抗体を提供するステップと、
（ｃ）（ａ）由来のタンパク質を（ｂ）の抗体と接触させるステップと、
（ｄ）該リン酸化部位に結合した抗体を検出するステップと、
からなる方法。
【請求項２】
前記タンパク質がタウタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホスホキナーゼがＧＳＫ−３β、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＣＤＫ−５、ＭＡＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫまたはカゼインキナーゼＩＩであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、表ＩＩに示される部位から選択される前記タウタンパク質中の特定の位置におけるリン酸化部位に特異的であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が表１におけるタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がＥＧＦＲであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質がＲｂであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リン酸化セリンを有するポリペプチド免疫原から調製される抗体。
【請求項９】
リン酸化スレオニンを有するポリペプチド免疫原に対して惹起される抗体。
【請求項１０】
リン酸化チロシンを有するポリペプチド免疫原に対して惹起される抗体。
【請求項１１】
配列番号１に特異性を有する抗体。
【請求項１２】
配列番号２に特異性を有する抗体。
【請求項１３】
ＥＧＦＲリン酸化されたチロシン１１７３部位またはチロシン８４５部位に対する抗体。
【請求項１４】
リン酸化されたスレオニン８２１部位に対する抗体。
【請求項１５】
タンパク質に対するホスホキナーゼ活性の測定のためのキットであって、
（ａ）該タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態の両方に特異的かつ該タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態の両方に結合する第一のｐａｎ抗体と、
（ｂ）標識されることを特徴とする、該第一のｐａｎ抗体由来のタンパク質上の独立部位に結合する第二のｐａｎ抗体と、
（ｃ）非リン酸化タンパク質スタンダードおよびリン酸化タンパク質スタンダードと、
（ｄ）標識されることを特徴とする、該タンパク質上の標的部位がリン酸化される場合にのみ該タンパク質に結合するリン酸化部位特異的抗体（ＰＳＳＡ）と、
（ｅ）緩衝液と、
からなるキット。
【請求項１６】
前記タンパク質がタウであることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１７】
前記タンパク質が表Ｉに列挙されるタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１８】
リン酸化部位のプロフィールを定量することによる、タンパク質に対する異なるキナーゼ活性の測定のためのキットであって、
（ａ）該タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態の両方に結合する第一のｐａｎ抗体と、
（ｂ）標識されることを特徴とする、該第一のｐａｎ抗体由来のタンパク質上の独立部位に結合する第二のｐａｎ抗体と、
（ｃ）該タンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態についてのタンパク質スタンダードと、
（ｄ）抗体が存在するように標識されることを特徴とする、タンパク質上の標的部位がリン酸化される場合にのみ該タンパク質に結合する２つ以上のＰＳＳＡと、
（ｅ）緩衝液と、
からなるキット。
【請求項１９】
前記タンパク質がタウであることを特徴とする請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
前記タンパク質が表Ｉに規定される通りであることを特徴とする請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２０００年９月２７日に提出された、仮出願番号６０／２３５，６２０の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、インビトロでのプロテインキナーゼ活性の測定についてのアッセイおよび試薬に関する。
【０００３】
背景技術
薬物開発の努力は、分子の標的選択によって開始される活動の連続を伴う。あらゆる薬物が、細胞レベルで働くので、これらの標的は、通常、とにかく細胞伝達経路に関わり合うタンパク質である。シグナル伝達経路は、正常な細胞機能に不可欠である。細胞内分子の発現の異常、およびシグナル伝達経路の同等の相互作用は、種々の疾患に関連し、従って、薬物発見努力の焦点である。シグナル伝達経路におけるタンパク質のリン酸化は、多細胞生物に生じる重要な共有結合修飾の１つである。この修飾を行う酵素は、プロテインキナーゼであり、これは、リン酸のＡＴＰからタンパク質基質上のチロシン残基、セリン残基またはスレオニン残基への転移を触媒する。これらのアミノ酸残基のリン酸化は、酵素活性を調節し、そして下流のシグナリングタンパク質の補充についての結合部位を作製する。プロテインキナーゼは、細胞のシグナリング経路の重大な構成要素であるので、これらの触媒活性は、厳密に調節される。プロテインキナーゼ活性の異常は、リン酸化のパターンを変更し、結果として細胞機能に対して影響を及ぼす。多くの薬物発見努力は、選択的にプロテインキナーゼ活性を抑制する化学薬品の同定を伴う。本発明は、プロテインキナーゼ活性をモニターするためのアッセイおよび試薬を提供するように設計される。
【０００４】
リン酸化についての標的残基は、組換え起源または天然の起源の生物学的に活性のある分子の全長に含まれ得る。プロテインキナーゼ活性の測定について現在利用される大半の方法は、ペプチド基質を使用し、これは、標的されるリン酸化残基を含む。この分野は、本明細書中において参考として援用される米国第６，０６６，４６２号（個々のプロテインキナーゼ活性の定量）に教示される。この方法は、本発明と、ペプチド基質が、キナーゼによって作用されリン酸化され得るすべての部位を含まず、従って、天然のタンパク質に対する活性を正確には反映しないかもしれない点で異なる。本明細書中に記載される発明は、天然の起源または組換え起源の全体の分子またはフラグメントを用いて使用され得る。また、異なる残基部位での活性の記述は、本発明において、米国第６，０６６，４６２号における異なるペプチドとは対照的に、検出について異なるＰＳＳＡを必要とする。
【０００５】
キナーゼ活性の検出についての別の方法は、すべてのホスホチロシン残基に結合する一般的抗体の使用を伴う。この方法は、本明細書中で参考として援用される米国第５，７６６，８６３号（キナーゼレセプター活性化アッセイ）に記載される。この方法は、分子に対するリン酸化チロシン残基間を区別する能力がないことを欠点として有する。この方法はまた、ホスホセリン分子またはホスホスレオニン分子を検出することができない。なぜなら、この抗体は、このようなリン酸化残基を検出しないからである。対照的に、本明細書中に記載される方法は、抗体を使用し、この抗体は、リン酸化アミノ酸およびホスホ残基自身の周囲の配列特異的残基に結合する。本発明において使用される試薬は、リン酸化スレオニン分子、リン酸化セリン分子またはリン酸化チロシン分子を検出し得る。
【０００６】
３つの例が利用される；これらのすべては、疾患に向けられる薬学的研究において、現在興味深い重要な分子標的を含む。
【０００７】
現在、神経生物学者らは、疾患に関連し得る脳のタンパク質に対する努力に集中している。１つのこのようなタンパク質は、タウ（主に軸索において見出される神経細胞の微小管結合タンパク質）と呼ばれる。タウの機能は、チューブリン重合を促進すること、および微小管を安定することであるが、また、特定のシグナリング経路を細胞骨格に関連させるのに役立つ。タウのリン酸化は、このタンパク質の正常機能および病理学的機能の両方を調節する。タウ（その過剰リン酸化（ｈｙｐｅｒ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）形態において）は、二重らせん状細線維（ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）（ＰＨＦ）（アルツハイマー病（ＡＤ）脳における神経原線維病変の基本成分）の主要な成分である。過剰リン酸化は、タウの微小管結合機能を損ない、ＡＤ脳における微小管の不安定性をもたらし、最後に、神経細胞変性を導く。過剰リン酸化タウはまた、他の中枢神経系障害の範囲において見出される。非常に多数のセリン／スレオニンキナーゼ（ＧＳＫ−３β、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＣＤＫ５、ＭＡＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫおよびカゼインキナーゼＩＩを含む）が、タウをリン酸化し得る。
【０００８】
インビトロでのキナーゼ活性の検出は、この活性を阻害しうる化合物のスクリーニングに限界があり、従って、それはタウのリン酸化が異常に高い種々の神経変性疾患の改善に有用であり得る。現在でも努力が続けられている、タウタンパク質に対してキナーゼ活性を抑制し得る薬物を同定する方法がある。しかし、これらの方法は、乏しい感受性および低い特異性を欠点として有する。タウタンパク質内部の個々のセリン残基またはスレオニン残基でのリン酸化は、疾患に相関することが示されている。本発明は、記載される「技術」におけるこれらの欠如の両方を克服する。
【０００９】
米国特許第５，６０１，９８５号は、異常にリン酸化されるタウタンパク質の検出方法に、米国特許第５，８４３，７７９号は、微小管結合タンパク質であるタウに対して指向されるモノクローナル抗体、およびこれらの抗体を分泌するハイブリドーマに、米国特許第５，７３３，７３４号は、アルツハイマー病または二重らせん状細線維の蓄積に関連する疾患についてのスクリーニング方法に、そして米国特許第６，０６６，４６２号は、個々のプロテインキナーゼ活性の定量に、関する。これらの特許は、本明細書中において参考として援用される。
【００１０】
キナーゼ活性のモニターについて、このような一般的適用性を示す他のモデルが存在する。例示の目的について、本発明者らは、細胞周期調節に重要な核内分子網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂタンパク質）、および細胞表面レセプター分子（ＥＧＦＲ）を取り巻くアッセイを設計した。
【００１１】
網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）（網膜芽細胞腫罹患性遺伝子の腫瘍抑制産物）は、１１０ｋＤａタンパク質であり、これは、細胞増殖および細胞分化の調節において重要な役割を果たす。その機能の欠如は、制御不能な細胞増殖および腫瘍発達を導く。このＲｂ遺伝子の変異的不活化は、すべての網膜芽細胞腫、および種々の他のヒト悪性腫瘍（乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、骨肉腫、軟部組織肉腫および白血病を含む）において見出される。癌抑制としてのＲｂタンパク質の役割の中心は、Ｒｂが、細胞周期のＧ１期において細胞を抑止することによって、不適当な増殖を抑制する能力である。Ｒｂタンパク質は、転写因子（Ｅ２Ｆ−１、ＰＵ．１、ＡＴＦ−２、ＵＢＦ、Ｅｌｆ−１およびｃ−Ａｂｌを含む）への結合によって、その増殖抑制機能を発揮する。Ｒｂタンパク質の結合は、そのリン酸化状態によって支配される。低リン酸化（ｈｙｐｏ−  ｏｒ  ｕｎｄｅｒ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）Ｒｂは、転写因子（最も顕著な転写因子は、Ｅ２Ｆ／ＤＰファミリー）を結合および封鎖し、Ｇ１期からＳ期境界へ横切ることが必要とされる遺伝子の転写を阻害する。この細胞周期阻害機能は、Ｒｂが、サイクリン／サイクリン依存性プロテインキナーゼ（ｃｄｋ）の複合体によって触媒されるリン酸化を受ける場合に阻止される。
【００１２】
Ｒｂは、ｃｄｋリン酸化について、少なくとも１６の共通のセリン／スレオニン配列を含むが、これらすべての部位の重要性は不明である。Ｒｂ上のスレオニン８２１のリン酸化が、ｃｄｋ２／複合体（例えば、サイクリンＥ／ｃｄｋ２およびサイクリンＡ／ｃｄｋ２）によって触媒されることが実証されている。このスレオニン８２１のリン酸化は、配列ＬＸＣＸＥを含むタンパク質とのＲｂの相互作用を分離する。このＲｂタンパク質の脱リン酸化は、Ｒｂをその活性な増殖抑制状態に戻す。Ｒｂ上のリン酸の除去は、有糸分裂の完了時に、プロテインホスファターゼ１型（ＰＰ１）および非触媒調節サブユニットの多重結合複合体によって行われるようである。特定のアミノ酸残基でリン酸化されるＲｂの定量は、キナーゼの活性、ならびにＲｂタンパク質自身の活性化の機能的状態に関する重要な情報を提供する。例示の目的について、本発明者らは、スレオニン８２１で特異的にリン酸化されるＲｂタンパク質の量を定量するアッセイを設計した。このＥＬＩＳＡは、［ｐＴ８２１］以外の部位でリン酸化されるＲｂ、または非リン酸化Ｒｂを認識しない。サンプルは、総Ｒｂの並列測定によって、Ｒｂ含量について制御され得る。
【００１３】
ＷＯ０１／１１３６７（網膜芽細胞腫（ＲＢ）タンパク質に対するサイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化活性を修飾する化合物の同定についてのこの活性のアッセイ）は、合成ペプチド、およびこのペプチドのリン酸化形態を認識するモノクローナル抗体を用いたＥＬＳＡによるキナーゼ活性の検出についての方法を記載する。この方法の基本原理は、キナーゼが作用する領域の共通配列を含む合成ペプチドを用いた固相のコーティングである。このペプチドは、キナーゼと接触するようになり、このキナーゼは、このペプチド上の特定の残基がリン酸化されるようになることを可能にする。このキナーゼの活性は、モノクローナル抗体の結合によって反映される。本発明は、ＷＯ０１／１１３６７と、キナーゼ活性についての基質として、天然のタンパク質を使用する能力が異なる。この特徴は、ペプチドの使用よりも優れている。なぜなら、すべての天然に存在するリン酸化部位が表されるからである。ホスホセリンを認識する１つのモノクローナル抗体（クローン２Ｂ９）の使用は、天然に存在するタンパク質上のリン酸化部位間の特定のリン酸化部位の任意の区別が不可能である。特定のＰＳＳＡの本発明者らの使用は、ホスホスレオニン残基およびホスホチロシン残基の識別ならびに検出を可能にする。
【００１４】
別の例において、細胞表面レセプターが研究され、そしてキナーゼ依存性アッセイが設計された。上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のファミリーに属し、これは、細胞成長、細胞生存、細胞増殖および細胞分化を調節する。ＥＧＦＲは全長で、１７０ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質として発現され、これは、細胞外のリガンド結合ドメイン、疎水性膜貫通領域、およびシグナル伝達に関連する高度に保存される細胞内の領域からなる。ＥＧＦＲの細胞外ドメインおよび細胞内ドメインにおけるいくつかの欠失が、腫瘍の集団において見出されている。例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡにおけるエキソン２〜７の欠失を含む１４５ｋＤａタンパク質である。細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）を含まない１００ｋＤａの短縮型ＥＧＦＲは、Ａ４３１細胞（ヒト上皮癌腫細胞株）由来の培養上清において観察される。
【００１５】
ＥＧＦＲは、多くのリガンド（例えば、ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）およびエピレギュリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ））の結合によって活性化される。この結合は、ＥＧＦＲホモダイマー化およびヘテロダイマー化、ならびにその内因性チロシンキナーゼの迅速な活性化、その後の細胞質ドメインにおける複数のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。この分子のＣＯＯＨ末端テイルにおけるチロシン残基のリン酸化は、サイトゾルのシグナリングタンパク質（Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインを含む）についての結合部位として役立つ。インビボでのリン酸化のいくつかの部位は、ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ８４５、Ｔｙｒ９９２、Ｔｙｒ１０６８、Ｔｙｒ１０８６およびＴｙｒ１１７３を含む）において同定されている。これらの部位は、種々の下流のシグナリングタンパク質を結合および活性化させ、このタンパク質は、ＳＨ２ドメイン（増殖因子レセプター結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）、Ｓｒｃホモロジーおよびコラーゲンドメインタンパク質（Ｓｈｃ）ならびにホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣγ）を含む）を含む。これらのシグナリングタンパク質もしくは他のシグナリングタンパク質のレセプターへの結合またはそのリン酸化もしくはその両方は、引き続くシグナリング事象の伝達をもたらし、この事象は、ＤＮＡ合成および細胞分裂となる。
【００１６】
ＥＧＦＲの発現または増幅の上昇もしくはその両方は、乳癌、膀胱癌、神経膠腫癌、結腸癌、肺癌、扁平上皮癌、頭部および頸部癌、卵巣癌ならびに膵臓癌において見出されている。選択的化合物が開発されており、これは、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメイン、または細胞内チロシンキナーゼ領域のいずれかを標的し、マイトジェン応答および他の癌促進応答を調節するシグナリング経路の妨害をもたらす。これらの潜在的な抗癌因子は、多くの低分子であるチロシンキナーゼインヒビターを含む。
【００１７】
発明の要約
本発明は、タンパク質のリン酸化の定量についてのアッセイおよび試薬を記載する。本方法は、タンパク質を、タンパク質をリン酸化するホスホキナーゼに供するステップ、および、このリン酸化タンパク質をこのリン酸化部位に特異的な抗体に接触するステップ、ならびに、このリン酸化部位に結合した抗体を検出するステップを包含する。本発明は、本発明の方法の実施に有用な抗体を含む。本発明は特に、タウタンパク質、Ｒｂタンパク質およびＥＧＦＲタンパク質のリン酸化、ならびにこのタウタンパク質、Ｒｂタンパク質およびＥＧＦＲタンパク質のリン酸化の部位に特異的な抗体に関する。
【００１８】
各々の例において、この標的タンパク質（タウ、ＲｂまたはＥＧＦＲ）は、インビトロまたはインビボでリン酸化され、そしてこの特異的リン酸化事象は、高度に選択的なリン酸化部位特異的抗体（ＰＳＳＡ）を用いて検出される。この標的されるリン酸化事象の出現または消失は、各々の部位でリン酸化され得るタンパク質の合計のパーセンテージとして定量され得る。
【００１９】
このＰＳＳＡの高度に特異的な性能は、１つのタンパク質上の複数のリン酸化部位の並列した独立性測定を可能にする。さらに、異なるキナーゼは、異なるＰＳＳＡ（これは、このタンパク質における異なる部位を選択的に標的化する）を用いることによって、同時に測定されることができ、それによって、リン酸化部位プロフィールの作製についての道を提供する。リン酸化タンパク質を疾患の診断指標または予後指標として定量する現存の方法とは対照的に、本発明は、特定の部位でタンパク質のリン酸化をもたらすプロテインキナーゼの酵素活性を測定する。また、本方法は、現在、製薬会社およびバイオテクノロジー会社によって新規の薬物を発見するために使用されている、大規模の「ハイスループットスクリーニング」フォーマットに適応しやすい。
【００２０】
本明細書中で使用される用語、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント、遺伝子操作される抗体またはそのフラグメントをいう。例えば、ヒト化に改変されうる抗体は、交差種反応を最小化できる。ｐａｎ抗体は、この用語が、本明細書中で使用される場合、タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態に結合する抗体をいう。
【００２１】
発明の詳細な説明
タウ系：タウタンパク質系は、正常状態および病理学的状態において、細胞内および細胞外の両方で見出されるタンパク質に対する本発明の有用性を実証する。このタウタンパク質は、複数のプロテインキナーゼによって作用される複数のリン酸化部位を有する。ホスホセリン残基およびホスホチロシン残基が存在する。モノホスホ残基および二重（ｄｕａｌ）ホスホ残基の両方が、このモデル系において区別可能である。
【００２２】
タウ組換えタンパク質：全長のタウ−４４１タンパク質は、ヒトタウｃＤＮＡのクローニング由来であり、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現し精製される組換えタンパク質である。このタンパク質は、標準的な方法を介して精製される。このタンパク質は、複数の売り主から市販される。
【００２３】
タウｐＳ１９９ＰＳＳＡ：ウサギを、セリン１９９を含むタウタンパク質の最も長いアイソフォームの領域に対応する化学合成ホスホペプチドおよびＫＬＨ結合体化ホスホペプチドを用いて免疫した。この化学合成ホスホペプチド（ＲＳＧＹＳ（ｐＳ）ＰＧＳＰＧ）は、配列番号１である。このタウｐＳ１９９ＰＳＳＡを、連続したエピトープ特異性クロマトグラフィーによって、ウサギ血清から精製した。この抗体を、リン酸化部位に対応する非ホスホペプチドを用いて、ネガティブにあらかじめ吸着して、非リン酸化タウと反応性である抗体を除去した。
この最終産物は、セリン１９９でリン酸化されるペプチドを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって作製された。この抗体は、ウェスタンブロッティングアッセイ（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）におけるペプチド競合分析によって実証されるように、セリン１９９上でリン酸化される場合、タウタンパク質を特異的に認識する。セリン１９９は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）によって、インビトロおよびインビボでリン酸化される。この試薬は市販される。
【００２４】
ＰＳＳＡタウ特異性は、図１に示される。アフリカミドリザル腎臓（ＣＶ−１）細胞由来の細胞抽出物（ヒト４リピートタウおよびプロテインホスファターゼインヒビターを安定に発現させる）を、１０％  トリス−グリシンゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。このタンパク質を、ニトロセルロース（膜）に転移した。ペプチド免疫原の非存在下（ａ）またはペプチド免疫原の存在下（ｂ）、あるいはタウホスホペプチドに対応する非ホスホペプチドにおいて（ｃ）、あらかじめインキュベートした後、膜を、０．５０μｇ／ｍＬ  抗ホスホタウ［ｐＳ１９９］とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Ｔｒｏｐｉｘ  ＷｅｓｔｅｒｎＳｔａｒ（登録商標）検出方法を用いて検出した。図１におけるデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、このリン酸化部位についての抗タウ［ｐＳ１９９］抗体の特異性を例示することを示す。
【００２５】
タウ［ｐＳ２１４］ＰＳＳＡ。この抗体の作製についての手順は、タウｐＳ１９９ＰＳＳＡについての上記の手順と類似した。この化学合成ホスホペプチドは、セリン２１４を含むタウタンパク質の最も長いアイソフォームの領域（ＧＳＲＳＲＴＰ（ｐＳ）ＬＰＴＰＰ（配列番号２））に由来した。この抗体は、ウェスタンブロッティングアッセイにおけるペプチド競合分析によって実証されるように、セリン２１４上でリン酸化される場合、タウタンパク質を特異的に認識する。セリン２１４は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）によって、インビトロおよびインビボでリン酸化される。この試薬は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから市販される。
【００２６】
タウｐＳ２１４  ＰＳＳＡ特異性は、図２に示される。ＳＦ−９細胞抽出物（ヒト４リピートタウを発現する）を、１０％  トリス−グリシンゲル上で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。このタンパク質を、ニトロセルロース（膜）に転移した。ペプチド免疫原の非存在下（ａ）またはペプチド免疫原の存在下（ｂ）、あるいはタウホスホペプチドに対応する非ホスホペプチドにおいて（ｃ）、あらかじめインキュベートした後、膜を、０．５０μｇ／ｍＬ  抗ホスホタウ［ｐＳ２１４］とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Ｔｒｏｐｉｘ  ＷｅｓｔｅｒｎＳｔａｒ（登録商標）検出方法を用いて検出した。図２におけるデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、このリン酸化部位についての抗タウ［ｐＳ２１４］抗体の特異性を例示することを示す。他のタウ部位［ｐＳ２０２、ｐＳ３９６、ｐＴ１８１、ｐＳ１９９／ｐＳ２０２、ｐＳ４０４］に対するＰＳＳＡは、類似の方法を用いて特徴付けられる。
【００２７】
Ｐａｎ−タウポリクローナル抗体
ウサギを、組換えタウタンパク質を用いて免疫した。この抗体を、プロテインＡアフィニティーカラムを用いて、ウサギ血清から精製した。この抗体は、タウタンパク質上の複数の抗原性部位を認識する。この抗体は、タウタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【００２８】
タウ−５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
タウに対するマウスｍＡｂを、精製されたウシ微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）を免疫原として用いて惹起した。そして、免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞およびマウス骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞の融合によってハイブリドーマを産生した。これは、他のＭＡＰまたはチューブリンとの交差反応を示さない。これは、タウの非リン酸化形態、ならびにタウのリン酸化形態と反応し、そしてこの反応性エピトープは、残基２１０〜２３０をマッピングする。この試薬は、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから市販される。
【００２９】
全体的タウＥＬＩＳＡおよびホスホタウＥＬＩＳＡ
炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．４における２．５μｇ／ｍＬの濃度のタウ−５モノクローナル抗体を、４℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいて、１ウェル当たり１００μＬでインキュベートした。このウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０溶液で３回洗浄し、その後、他の部位に対して、このプラスチック表面上で、関連のないタンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含む緩衝化溶液を用いて、室温で２時間ブロックした。ＧＳＫ−３βリン酸化タウ、ＰＫＡリン酸化タウおよび非リン酸化タウを、種々の濃度でウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液での３回の洗浄後、このウェルを、それぞれタウｐＳ２１４ＰＳＳＡ、タウｐＳ１９９ＰＳＳＡおよびＰａｎ−タウ抗体とともに、最適濃度で（０．１〜１μｇ／ｍＬの範囲）、室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄し、その後、室温で１時間、１：５０００希釈のＨＲＰ結合体化抗ウサギＩｇＧ二次抗体を添加した。洗浄後、１００μＬの安定化クロモゲンを、各々のウェルに添加し、次いで、室温、暗所で２０分間インキュベートした。４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．値を、各々のウェルへの停止溶液の添加後に測定した。
【００３０】
キナーゼ反応
ＰＫＡを用いたタウのリン酸化は、以下のように生じた。ＰＫＡを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより購入した。組換えタウタンパク質（１μｇ）を、種々の濃度のＰＫＡ酵素とともに、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１００μＭ  ＡＴＰを含む緩衝液において、３０℃で１時間インキュベートした。
【００３１】
ＧＳＫ−３βを用いたタウのリン酸化
ＧＳＫ−３βを、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．より購入した。組換えタウタンパク質（１μｇ）を、種々の濃度の酵素とともに、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μＭ  ＡＴＰおよび５０μｇ／ｍＬ  ヘパリンを含む緩衝液において、３０℃で１時間インキュベートした。
【００３２】
図３ａおよび３ｂは、ＥＬＩＳＡによるＰＫＡ／Ｓｅｒ２１４部位での全体的タウリン酸化および選択的タウリン酸化の評価を示す。図３ａにおいて、リン酸化タウをＥＬＩＳＡに配置し、タウｐＳ２１４に特異的なＰＳＳＡまたはｐａｎ−タウ抗体のいずれかによって検出した。両方の検出抗体は、等しいシグナルでリン酸化タウを検出した。図３ｂにおいて、非リン酸化タウを、同じアッセイに配置した。期待されるように、タウｐＳ２１４は、リン酸基を含まないタウタンパク質を検出できなかったが、一方、ｐａｎ−タウ検出器は、このタンパク質を定量した。
【００３３】
図４ａおよび４ｂは、ＥＬＩＳＡによるＧＳＫ−３β／Ｓｅｒ１９９／２０２部位での全体的タウリン酸化および選択的タウリン酸化の評価を示す。図４ａは、タウｐＳ１９９／２０２の検出器を用いたＥＬＩＳＡにおいて、非リン酸化タウまたはＧＳＫ−３βリン酸化タウのいずれかを使用する。非リン酸化タウは、ＥＬＩＳＡにおいて陽性に反応しないが、一方、リン酸化タウは、強力な結果を示す。ｐａｎ−タウが検出器として使用される場合、両方のタンパク質が、容易に検出される（図４ｂ）。
【００３４】
図５は、インビトロでの反応に添加されるキナーゼ活性の量の関係として、ＥＬＩＳＡによって検出されるホスホタウの量間の直接的関係を示す。種々の量のＰＫＡ酵素を使用して、タウタンパク質をリン酸化した。最も高い濃度のＰＫＡである５単位（ＰＫＡタウ１）で開始して、次いでＰＫＡ酵素を、示されるように、１：２で系列希釈し、その後１：１０００希釈し、次いでＥＬＩＳＡアッセイの各々のウェルに適用した。ホスホタウの検出を、タウに対するＰＳＳＡを用いて行い、このＰＳＳＡは、Ｓｅｒ２１４（ＰＫＡ部位）でリン酸化される。これらのデータは、この反応において、キナーゼの量が低い程、より低い量の産生ホスホプロテインが、ＥＬＩＳＡにおいて検出されることを示す。従って、このＥＬＩＳＡは、ホスホキナーゼ活性の間接的測定である。
【００３５】
図６ａおよび６ｂは、タウＰＳＳＡおよびＥＬＩＳＡを用いた、ＰＫＡ対ＧＳＫ３β酵素によって触媒されるタウタンパク質のリン酸化の検出における特異性を示す。この結果は、このタウｐＳ２１４ＰＳＳＡ  ＥＬＩＳＡが、ＰＫＡによってリン酸化される場合にタウのみを検出し、そしてタウｐＳ１９９ＰＳＳＡ  ＥＬＩＳＡが、ＧＳＫ３βによってリン酸化される場合にタウのみを検出することを実証する。
【００３６】
図７は、ＧＳＫ３β酵素が、タウタンパク質上の複数の部位をリン酸化し得、そしてＰＳＳＡが、タウｐＴ１８１、タウｐＳ２０２、タウｐＳ１９９／ｐＳ２０２、タウｐＳ３９６およびタウｐＳ４０４でのリン酸化部位を独立して検出し得ることを示す。これは、このＥＬＩＳＡが、キナーゼ酵素活性に供されるタンパク質に対するリン酸化事象のプロフィールの作製に有用であるという証拠を提供する。
【００３７】
図８は、２つの抗体（一方は、ＰＫＡリン酸化部位（ｐＳ２１４）に特異的であり、そして他方は、タウタンパク質上のＧＳＫ部位（ｐＳ１９９）に特異的である）を用いたプロフィールとして試験される場合のキナーゼ反応の特異性を示す。ＰＫＡ特異的阻害剤であるＰＫＩ（ｃ−ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの熱安定性阻害剤；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を、酵素（ＰＫＡまたはＧＳＫのいずれか）に対し阻害剤の種々の比で混合し、そして得られる混合物を、タウＰＳＳＡを用いたＥＬＩＳＡによって分析した。このＰＫＡ特異的阻害剤は、ｐＳ２１４部位単独のキナーゼ活性を変更させた。これらのデータは、ＥＬＩＳＡの特異性、および同じタンパク質に対する異なる部位でのキナーゼ活性を独立してモニターする能力を再び証明する。これらのデータはまた、キナーゼ活性の薬物妨害についてスクリーニングする能力を示す。
【００３８】
表ＩＩに示される他のタウ部位に対する抗体がまた、本発明の代表である。リン酸化部位のいくつかは、表ＩＩにさらに示されるように、疾患に関連することが公知である。
【００３９】
【表２】
2006225396.tif 000002
【００４０】
Ｒｂ系：このモデル系は、複数のプロテインキナーゼによって作用される複数のリン酸化部位を含む大きな核内タンパク質を与える。ホスホセリン残基およびホスホチロシン残基が存在する。モノホスホ残基および二重ホスホ残基の両方が、このモデル系において識別可能である。
【００４１】
Ｒｂタンパク質：全長Ｒｂタンパク質は、ヒトＲｂ  ｃＤＮＡのクローニング由来であり、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現される精製組換えタンパク質である。このタンパク質は、標準的な方法を介して精製される。このタンパク質は、複数の売り主から市販される。
【００４２】
Ｒｂ［ｐＴ８２１］ＰＳＳＡ：ウサギ抗血清を、スレオニン８２１を含むヒトＲｂの領域由来の化学合成ホスホペプチドに対して産生した。抗体を、連続したエピトープ特異的クロマトグラフィーによって、ウサギ血清から精製した。この抗体を、リン酸化部位に対応する非ホスホペプチドを用いて、ネガティブにあらかじめ吸着して、非リン酸化ｐＲｂと反応性を有する抗体を除去した。この最終産物を、スレオニン８２１でリン酸化されるｐＲｂ由来ペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって作製した。図９は、抗Ｒｂ［ｐＴ８２１］の特異性を規定する。７．５％  トリス−グリシンゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＭＣＦ−７細胞から調製される細胞抽出物を分解した。次いで、このタンパク質を、ＰＶＤＦに転移した。膜を、ペプチド免疫原の非存在下（ａ）またはペプチド免疫原の存在下（ｂ）、ＲＢホスホペプチドに対応する非ホスホペプチド（ｃ）、ホスホＲＢ上のスレオニン３５６に対応するホスホペプチド（ｄ）、ホスホＲＢ上のセリン８０７／８１１に対応するホスホペプチド（ｅ）、ホスホＲＢ上のセリン２４９／スレオニン２５２に対応するホスホペプチド（ｆ）、およびホスホＲＢ上のセリン７５１に対応するホスホペプチド（ｇ）において、あらかじめインキュベートした後、０．５μｇ／ｍＬ  抗ＲＢ［ｐＴ８２１］とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Ｔｒｏｐｉｘ  ＷｅｓｔｅｒｎＳｔａｒ（登録商標）検出方法を用いて検出した。このデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、従って、このリン酸化残基についての抗Ｒｂ［ｐＴ８２１］抗体の特異性を実証することを示す。
【００４３】
全体的なＲｂ［ｐａｎ］検出抗体：この検出抗体は、モノクローナルであり（クローンＧ３−２４５）、ＢＤ／Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販される。これは、Ｒｂタンパク質のアミノ酸３３２〜３４４間のエピトープを認識する。この抗体は、Ｒｂタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【００４４】
Ｒｂモノクローナル抗体：この捕捉抗体［固相に結合される］は、モノクローナルであり（クローン３Ｃ８）、ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販される。これは、Ｒｂタンパク質のＣ末端付近（ａａ８８６〜ａａ９０５）上のエピトープと反応する。この抗体は、Ｒｂタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【００４５】
全体的なＲｂ  ＥＬＩＳＡおよびＲｂ［ｐＴ８２１］ＥＬＩＳＡ：炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．４における１．２５μｇ／ｍＬの濃度のＲｂモノクローナル抗体を、４℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいて、１ウェル当たり１００μＬでインキュベートした。このウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０溶液で３回洗浄し、その後、他の部位に対して、このプラスチック表面上で、関連のないタンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含む緩衝化溶液を用いて、室温で２時間ブロックした。リン酸化Ｒｂまたは非リン酸化組換えＲｂを含むジャーカット細胞溶解物を、種々の濃度でウェルに添加し、そして室温で２時間インキュベートした。洗浄緩衝液での３回の洗浄後、このウェルを、それぞれＲｂ［ｐＴ８２１］ＰＳＳＡ、およびビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ｐａｎ−Ｒｂ抗体とともに、最適濃度で（０．１〜１μｇ／ｍＬの範囲）、室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄し、その後、室温で１時間、１：５０００希釈でのＨＲＰ結合体化抗ウサギＩｇＧ二次抗体、または０．２５μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを添加した。洗浄後、１００μＬの安定化クロモゲンを、各々のウェルに添加し、次いで、室温、暗所で２０分間インキュベートした。４５０ｎｍでのＯＤ値を、各々のウェルへの停止溶液の添加後に測定した。
【００４６】
図１０は、Ｒｂ［ｐＴ８２１］ＥＬＩＳＡの特異性を決定するための研究を示す。第一の研究において、ジャーカット、Ｕ２ＯＳおよびＣｏｌｏ２０５由来の２０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＲｂタンパク質を含む溶液を、２０ｎｇ／ｍＬの精製全長Ｒｂタンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される（非リン酸化））を含む溶液とともに、Ｒｂ［ｐＴ８２１］ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。図１１は、この細胞株から単離されるＲｂタンパク質が、強力に認識されたことを示す。これらのデータは、Ｒｂタンパク質の適切なリン酸化が、このアッセイにおける反応性に必要であるという証拠を提供する。
【００４７】
第二の研究において、スレオニン８２１に対する特異性を、ペプチド競合によって決定した。図１１に示されるデータは、スレオニン８２１周囲の領域に対応するペプチド（ホスホスレオニンを含む）のみが、このＥＬＩＳＡシグナルをブロックし得ることを示す。
【００４８】
Ｒｂについてのキナーゼ反応：Ｒｂについての天然の供給源を、これらの研究について、指数増殖細胞から得た。内因性の細胞性キナーゼは、天然のＲｂタンパク質のリン酸化を提供した。図１２は、キナーゼ反応を研究するためのこのＥＬＩＳＡの適用を示す。ジャーカット細胞を、溶解の前に、キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンの存在下で、種々の濃度で３６時間増殖させた。溶解物を、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｒｂ  ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＫＨＯ００１１）を用いて、全Ｒｂ含量について正規化した。スレオニン８２１でのＲｂリン酸化のレベルを決定した。これらのデータは、スタウロスポリンが、おそらくｃｄｋの阻害を通じてスレオニン８２１でのＲｂのリン酸化を阻害することを示す。
【００４９】
ＥＧＦＲ系：このモデル系は、細胞表面レセプタータンパク質を与える。このタンパク質は大きく、複数のリン酸化部位は、ホスホスレオニン残基、ホスホセリン残基およびホスホチロシン残基からなる。
【００５０】
ＥＧＦＲタンパク質：ヒトＥＧＦＲタンパク質を、アフィニティー精製によって、ヒト癌腫Ａ４３１細胞から精製した。この産物を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  カタログ番号Ｅ−２６４５）から購入する。
【００５１】
（ＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］ＰＳＳＡ）：ウサギ抗血清を、チロシン１１７３を含むＥＧＦＲの領域由来の化学合成ホスホペプチドに対して産生した。この配列は、ヒト、マウスおよびラットにおいて保存される。抗体を、連続したエピトープ特異的クロマトグラフィーによって、血清から精製した。この抗体を、（ｉ）  非リン酸化ＥＧＦＲ酵素と反応性である抗体を除去するために、リン酸化部位に対応する非ホスホペプチドを用いて、そして（ｉｉ）ホスホチロシンと反応性である抗体を除去するために、一般的チロシンリン酸化ペプチドを用いて（配列に関係なく）、ネガティブにあらかじめ吸着した。この最終産物は、チロシン１１７３でリン酸化される、ＥＧＦＲ由来ペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって作製される。図１３は、ＥＧＦＲ  ＰＳＳＡ［ｐＹ１１７３］の特異性を例示する。ＥＧＦＲを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製される細胞抽出物を、３０時間飢餓させ、次いで、３０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦを用いて１０分間刺激するか（＋）、または刺激しないままにし（−）、次いで、６％  トリス−グリシンゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、そしてニトロセルロースに転移した。膜を、ペプチド免疫原の非存在下（レーン１および２）またはペプチド免疫原の存在下（レーン３および４）、あるいはＥＧＦＲホスホペプチドに対応する非ホスホペプチド（レーン５および６）において、あらかじめインキュベートした後、０．５０μｇ／ｍＬ  抗ＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］抗体とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Ｔｒｏｐｉｘ  ＷｅｓｔｅｒｎＳｔａｒ（登録商標）検出方法を用いて検出した。このデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、このリン酸化残基についての抗ＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］抗体の特異性を実証することを示す。
【００５２】
ＥＧＦＲ［ｐＹ８４５］ＰＳＳＡ：ＥＧＦＲ［ｐＹ８４５］ＰＳＳＡとして本質的に調製されるが、チロシン８４５を含む領域由来の化学合成ホスホペプチドを用いた。
【００５３】
ＥＧＦＲ［ｐａｎ］モノクローナル抗体：この捕捉抗体は、マウスモノクローナル抗体であり（クローン１９９．１２）、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から市販される。これは、ヒトＥＧＦＲに特異的であり、そしてＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４と反応しない。この抗体は、ＥＧＦＲタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【００５４】
ＥＧＦＲ［ｐａｎ］検出抗体：このウサギ抗体を、ヒトＥＧＦＲのＣ末端に対応する合成ペプチドを用いた免疫によって調製した。この抗体を、プロテインＡアフィニティーカラムを用いて精製した。これは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４との交差反応性を示さない。
【００５５】
ＥＧＦＲ  ＰＳＳＡおよび全長ＥＬＩＳＡ：炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．４における２．５μｇ／ｍＬの濃度のｐａｎ−ＥＧＦＲモノクローナル抗体を、４℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいて、１ウェル当たり１００μＬでインキュベートした。このウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０溶液で３回洗浄し、その後、他の部位に対して、このプラスチック表面上で、関連のないタンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含む緩衝化溶液を用いて、室温で２時間ブロックした。自己リン酸化ＥＧＦＲまたは非リン酸化ＥＧＦＲを、種々の濃度でウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液での３回の洗浄後、このウェルを、それぞれＥＧＦＲ［ｐＹ８４５］ＰＳＳＡ、ＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］ＰＳＳＡおよびｐａｎ−ＥＧＦＲ抗体とともに、最適濃度で（０．１〜１μｇ／ｍＬの範囲）、室温で１時間インキュベートした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液を用いて３回洗浄し、その後、室温で１時間、１：２０００希釈で、ＨＲＰ結合体化抗ウサギＩｇＧ二次抗体を添加した。洗浄後、１００μＬの安定化クロモゲンを、各々のウェルに添加し、次いで、室温、暗所で２０分間インキュベートした。４５０ｎｍでのＯＤ値を、各々のウェルへの停止溶液の添加後に測定した。
【００５６】
チロシン残基１１７３についてのＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］ＥＬＩＳＡの特異性を、ペプチド競合によって決定した。図１４に示されるデータは、チロシン残基１１７３周囲の領域に対応するペプチド（ホスホスレオニンを含む）のみが、このＥＬＩＳＡをブロックし得ることを示す。
【００５７】
キナーゼ反応：（自己リン酸化）
ＥＧＦＲを、１μＭ  ＡＴＰを含む、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、６ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の緩衝液において、３０℃で３０分間インキュベートした（自己リン酸化）。
【００５８】
図１５は、１０分間の１〜５００ｎｇ／ｍＬでのＥＧＦを用いた処理後の、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲのリン酸化の応答曲線を実証する。ＥＧＦＲチロシンのリン酸化を、ＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］ＥＬＩＳＡを用いて検出した。
【００５９】
図１６は、本発明の使用を実証して、残基ｐＹ８４５でのＥＧＦＲに関連するプロテインキナーゼ活性、およびプロテインキナーゼ阻害機能によるこの活性の阻害を検出する。１バイアル当たり２ｎｇの精製ヒトＥＧＦＲを、１μＭ  ＡＴＰを含む、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、６ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の緩衝液において、３０℃で３０分間インキュベートした（自己リン酸化）。ＥＧＦＲ［ｐＹ８４５］のリン酸化阻害について、チロシンキナーゼインヒビターであるＰＤ１５８７８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５１３０３５）を、指示濃度でバイアルに添加した。ＥＧＦＲ［ｐＹ８４５］のリン酸化を、ＥＧＦＲ［ｐＹ８４５］リン酸化部位特異的ＥＬＩＳＡを用いて、４ｎｇ／ｍＬで測定した。
【００６０】
表１：シグナル伝達タンパク質を列挙し、このリン酸化は、本発明の方法によって決定され得る。
【００６１】
表１
シグナル伝達タンパク質の例
タンパク質
Ａ
α−アクチニン
α−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）
ＡＢＬ／ｃ−Ａｂｌ（エイブルソン非レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（Ａｂｅｌｓｏｎ  ｎｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ））
アセチルコリンレセプター
Ａｃｋ非レセプタータンパク質チロシンキナーゼ
Ａｋｔ／ＰＫＢ  セリン／スレオニンプロテインキナーゼ
ＡＰ−１（アクチベータータンパク質１ｊｕｎ／ｆｏｓ二量体転写因子）
ＡＰ−２（アクチベータータンパク質２転写因子）
Ａｐａｆ−１（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１）
Ａｐａｆ−２（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子２／シトクロムＣ）
Ａｐａｆ−３（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子３／カスパーゼ９）
Ａｒｐ２／３（アクチン関連（ｒｅｌａｔｅｄ）タンパク質）
Ａｔｆ−１（活性化転写因子１（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１）Ａｔｆ−２（活性化転写因子２）
Ａｔｆ−３（活性化転写因子３）
Ａｔｆ−４（活性化転写因子４）
ＡＴＭ（血管拡張性失調症変異タンパク質）
Ｂ
Ｂ−ＡＴＦ  核塩基性ロイシンジッパータンパク質／転写因子（ｎｕｃｌｅａｒ  ｂａｓｉｃ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）
Ｂａｄ
Ｂａｋ
Ｂａｘ
Ｂｃｌ−２（Ｂ細胞慢性リンパ性白血病２）
Ｂｃｌ−ｘＬ
Ｂｃｌ−ｘＳ
ＢＣＲ／ＡＢＬタンパク質チロシンキナーゼ
βカテニン
ＢＩＤ（ＢＨ−３相互作用性細胞死誘導領域（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ））
Ｂｌｋ（Ｂリンパ球Ｓｒｃ非レセプタータンパク質チロシンキナーゼファミリーメンバー）
ＢＭＫ−１（大ＭＡＰキナーゼ（Ｂｉｇ  ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ）／ＥＲＫ５）
Ｂｔｋ（ブルトンチロシンキナーゼ（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ）
Ｃ
カドヘリン
ＣＡＤＴＫ（カルシウム活性化タンパク質チロシンキナーゼ／Ｃａｋβ／Ｐｙｋ２／ＦＡＫ２／ＲＡＦＴＫ）
ＣＡＫ（Ｃｄｋ−活性化キナーゼ）
Ｃａｋ−β（細胞接着キナーゼβ／ＣＡＤＴＫ／Ｐｙｋ２／ＦＡＫ２／ＲＡＦＴＫ）
カルデスモン
カルモジュリン
カルパインシステインプロテアーゼ
ＣａＭキナーゼＩＩ（カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）
ＣＢ１（カンナビノイドレセプター１）
ＣＢ２（カンナビノイドレセプター２）
カスパーゼ２（システインアスパルチルプロテアーゼ２／ＩＣＨ−１／ＮＥＤＤ−２）
カスパーゼ３（システインアスパルチルプロテアーゼ３／ＬＩＣＥ／ＣＰＰ３２／ＹＡＭＡ／アポパイン（ａｐｏｐａｉｎ）／ＳＣＡ−１）
カスパーゼ８（システインアスパルチルプロテアーゼ８／ＭＡＣＨ／ＦＬＩＣＥ／Ｍｃｈ５）
カスパーゼ９（システインアスパルチルプロテアーゼ９／ＩＣＥ−ＬＡＰ６／Ｍｃｈ６／ＡＰＡＦ−３）
カベオリン１、２および３
ＣＤ４５膜貫通チロシンホスファターゼ
ＣＤ４５ＡＰ（ＣＤ４５結合タンパク質）
ｃ−ｆｏｓ転写因子
ＣＤＫ１／ｃｄｃ２（サイクリン依存性キナーゼ１）
ＣＤＫ２（サイクリン依存性キナーゼ２）
ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）
ＣＤＫ５（サイクリン依存性キナーゼ５）
ｃ−Ｊｕｎ転写因子
ｃ−ｍｙｃ転写因子
コルタクチン（Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ）
ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ２／プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２）
ｃ−ｋｉｔレセプタータンパク質
ｃ−ｒａｆタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ
ＣＲＥＢ転写因子
Ｃｒｋ  ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン含有アダプタータンパク質
ＣＳＫ（カルボキシル末端Ｓｒｃキナーゼ）
シトクロムｃ
Ｄ
ＤＡＰＫ（細胞死（Ｄｅａｔｈ）結合プロテインキナーゼ）
デスミン
ＤＮＡ−ＰＫ（ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ）
Ｅ
Ｅ２Ｆ−１  ＤＮＡ結合タンパク質
ＥＧＦ−Ｒ（上皮増殖因子レセプター）
ｅＩＦ−２α（真核生物転写開始因子２α）
ＥＲＫ１／ＭＡＰＫ（細胞外シグナル制御／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）
ＥＲＫ２／ＭＡＰＫ（細胞外シグナル制御／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ２）
ＥＲＫ３（細胞外シグナル制御／ｐ６２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３）
ＥＲＫ４（細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ４）
ＥＲＫ５（細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ５／大ＭＡＰキナーゼ１）
ＥＲＫ６（細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ６／ｐ３８γ）
ＥＲＫ７（細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ７）
ＥＲＫ５（細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ８）
Ｆ
Ｆアクチン
ＦＡＤＤ（Ｆａｓ結合細胞死誘導領域）
ＦＡＫ（フォーカルアドヒージョンキナーゼ／ｐｐ１２５ＦＡＫ）
ＦＡＳ（ＦＡＳリガンドレセプター）
Ｆｇｒ非レセプターＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ
ＦｏｓＢ
Ｆｒａ−１（Ｆｏｓ関連（ｒｅｌａｔｅｄ）抗原１）
Ｆｒａ−２（Ｆｏｓ関連抗原２）
ＦＲＫ（Ｆｏｓ制御（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）キナーゼ）
ＦＹＢ（Ｆｙｎ結合タンパク質）
Ｆｙｎ非レセプターＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ
Ｇ
Ｇａｂ１（Ｇｒｂ２結合バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）１）
Ｇａｂ２（Ｇｒｂ２結合バインダー２）
ＧＣＫ（胚中心キナーゼ）
ＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子）
Ｇｉα抑制性グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇｉα  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ｇｉβ抑制性グアニンヌクレオチド結合タンパク質
Ｇｉγ抑制性グアニンヌクレオチド結合タンパク質
Ｇｑ／１１グアニンヌクレオチド結合タンパク質
Ｇｑ／１１βグアニンヌクレオチド結合タンパク質
Ｇｑ／１１γグアニンヌクレオチド結合タンパク質
Ｇｒｂ２（増殖因子レセプター結合タンパク質２）
Ｇｒｋ２（Ｇタンパク質共役レセプターキナーゼ）
Ｇｓｋ−３α（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３α）
Ｇｓｋ−３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）
Ｈ
Ｈｃｋ（造血細胞キナーゼ）
ＨＧＦ−Ｒ（肝細胞増殖因子レセプター）
Ｈｒｋ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼキナーゼ）
Ｉ
ＩκＢαＮＦκＢ抑制性タンパク質
ＩκＢβＮＦκＢ抑制性タンパク質
ＩＫＫα（ＩｋＢキナーゼα）
ＩＫＫβ（ＩｋＢキナーゼβ）
ＩＫＫγ（ＩｋＢキナーゼγ／ＮＥＭＯ）
ＩＧＦ−１レセプター（インスリン様増殖因子Ｉレセプター）
インスリンレセプター
インテグリン
インテグリン結合タンパク質（ＩＡＰ／ＣＤ４７）
ＩＲＡＫ（インターロイキン−１レセプター結合キナーゼ）
ＩＲＫ（インスリンレセプターキナーゼ）
ＩＲＳ−１（インスリンレセプター基質１）
ＩＲＳ−２（インスリンレセプター基質２）
Ｊ
ＪＡＢ１（Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質１（Ｊｕｎ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １））
ＪＡＫ１（Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ１（Ｊａｎｕｓ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｓｅ１））
ＪＡＫ２（Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ２）ＪＡＫ３（Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ３）
ＪＮＫ１／ＳＡＰＫγ（ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ１／ストレス活性化プロテインキナーゼγ）
ＪＮＫ２／ＳＡＰＫβ（ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ２／ストレス活性化プロテインキナーゼβ）
ＪＮＫ３／ＳＡＰＫα（ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ３／ストレス活性化プロテインキナーゼα）
Ｌ
ＬＡＴ（Ｔ細胞の活性化のためのリンカー）
Ｌｃｋ非レセプターＳｒｃファミリータンパク質チロシンキナーゼ
Ｌｙｎ非レセプターＳｒｃファミリータンパク質チロシンキナーゼ
Ｍ
ＭＥＦ２ｃ転写因子
ＭＥＫ１（マイトジェン活性化ＥＲＫ活性化キナーゼ１）
ＭＥＫ２（マイトジェン活性化ＥＲＫ活性化キナーゼ２）
ＭＥＫ３（マイトジェン活性化ＥＲＫ活性化キナーゼ３）
ＭＥＫ４（マイトジェン活性化ＥＲＫ活性化キナーゼ４）
ＭＥＫ５（マイトジェン活性化ＥＲＫ活性化キナーゼ５）
ＭＥＫＫ１（ＭＥＫキナーゼ１）
Ｍｅｔ（ｃ−ｍｅｔ／ＨＧＦレセプター）
ＭＫＰ１（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ１）
ＭＫＰ２（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ２）
ＭＫＰ３（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ３）
ＭＫＰ４（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ４）
ＭＫＰ５（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ５）
ＭＫＰ６（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ６）
ＭＬＣＫ（ミオシン軽鎖キナーゼ）ＭｕＳＫ（筋特異的セリン／スレオニンキナーゼ）
ミオシン
ＭＬＣＫ  Ｐｐａｓｅ（ミオシン軽鎖キナーゼホスファターゼ）
Ｎ
βＮＡＰ（βニューロンアダプタータンパク質／ＡＰ−３）
ＮＡＴ１／ＤＡＰ−５（新規ＡＰＯＢＥＣ−１標的番号１／細胞死結合タンパク質５（Ｎｏｖｅｌ  ＡＰＯＢＥＣ−１  Ｔａｒｇｅｔ  ｎｏ．１／Ｄｅａｔｈ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−５））
ＮＣＫ  ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン含有トランスフォーミングタンパク質
Ｎｅｋ２（Ｎｉｍａ関連キナーゼ２（Ｎｉｍａ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ２））
ＮＦＡＴ−１（活性化Ｔ細胞の核因子（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ））
ＮｆκＢ（核因子κＢ転写因子）
ＮＩＫ（ＮＦκＢ誘導化（Ｉｎｄｕｃｉｎｇ）キナーゼ）
ＮＴＫ（神経組織およびＴ細胞キナーゼ）
Ｐ
ｐ１３０ｃａｓ
ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ  ＧＴＰａｓｅ
Ｐ２Ｙ２プリノセプター（ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ）
ｐ３６ＣＡＫアセンブリ／活性化因子（ａｓｓｅｍｂｌｙ／ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）
ｐ３８（ＥＲＫ６  ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ）
ｐ３８ｄ（ＳＡＰＫ４）
ｐ５３癌抑制遺伝子
ｐ５８ＩＰＫ（インターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ、ＰＫＲのインヒビター（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ，ＰＫＲ））
ｐ６２ｄｏｋ  ＧＡＰ結合タンパク質
ｐ６２ｌｃｋリガンド／ＺＩＰ
ｐ６８キナーゼ
ｐ９６
ＰＡＫ１（ｐ２１活性化プロテインキナーゼ１）
ＰＡＫ２（ｐ２１活性化プロテインキナーゼ２）
ＰＡＫ３（ｐ２１活性化プロテインキナーゼ３）
ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ）
パキシリン
ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）
ＰＤＧＦレセプター（血小板由来増殖因子レセプター）
ＰＤＫ１（ホスホイノシチド依存性キナーゼ１）
ＰＤＫ−２（ホスホイノシチド依存性キナーゼ２／インテグリン結合キナーゼ）ＰＥＣＡＭ−１（血小板内皮細胞接着分子１）
Ｐ１３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）
ＰＩＡＳ（活性化ＳＴＡＴのタンパク質インヒビター）
ＰＩＴＰα（ホスファチジルイノシトール転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）タンパク質α）
ＰＫＡα／ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ
ＰＫＢ（プロテインキナーゼＢ）
ＰＫＣα（プロテインキナーゼＣα）
ＰＫＣβ（プロテインキナーゼＣβ）
ＰＫＣδ（プロテインキナーゼＣδ）
ＰＫＣγ（プロテインキナーゼＣγ）
ＰＫＤ（プロテインキナーゼＤ）
ＰＫＲ（プロテインキナーゼＲまたは二本鎖ＡＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ）
ＰＬＣγ１（ホスホリパーゼＣ−γ１）
ＰＲＫ（増殖関連キナーゼ）
ＰＴＥＮ（ＭＭＡＣ１癌抑制遺伝子／タンパク質ホスファターゼ）
Ｐｙｋ２（ＣＡＫβ／ＦＡＫ２／ＲＡＦＴＫ）タンパク質チロシンキナーゼ
Ｒ
Ｒａｃ／ｃｄｃ４２  ＧＴＰａｓｅ
Ｒａｆ１（Ｃ−ｒａｆ）セリン／スレオニンプロテインキナーゼ
A-    Ｒａｆセリン／スレオニンプロテインキナーゼ
Ｂ−ｒａｆセリンスレオニンキナーゼ
Ｖ−Ｒａｆウイルス性セリン／スレオニンプロテインキナーゼ
ＲＡＦＴＫ（関連性接着フォーカルチロシンキナーゼ（Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｆｏｃａｌ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ））
ＲＡＩＤＤ（ＲＩＰ結合ＩＣＨ−１／細胞死誘導領域とのＣＥＤ−３相同タンパク質（ＲＩＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＩＣＨ−１／ＣＥＤ−３  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ））
Ｒａｐ２  ＧＴＰａｓｅ
Ｒａｐ−１のＲａｐ１−ＧＡＰ（Ｃ３Ｇ）インアクチベーター（Ｒａｐ１−ＧＡＰ（Ｃ３Ｇ）ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｒａｐ−１）
ラプシン（Ｒａｐｓｙｎ）
Ｒａｓ  ＧＴＰａｓｅ
Ｒｂ（網膜芽細胞腫癌抑制タンパク質）
Ｒｈｏ低分子量ＧＴＰａｓｅ
ＲＩＰ（レセプター相互作用タンパク質）
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ活性化キナーゼ）
Ｓ
Ｓ６ｋ（Ｓ６キナーゼ）
ＳｈｃＳＨＩＰ（ＳＨ２ドメイン含有イノシトールホスファターゼ）
ＳＨ−ＰＴＰ１タンパク質チロシンホスファターゼ
ＳＨ−ＰＴＰ２タンパク質チロシンホスファターゼ
ＳＩＲＰα１（シグナル関連タンパク質α）
ＳＩＰ１（Ｓｍａｄ相互作用タンパク質１）
Ｓｍａｄ２（ＳｍａおよびＭａｄ関連２（Ｓｍａ  ａｎｄ  Ｍａｄ−ｒｅｌａｔｅｄ２）
Ｓｍａｄ３（ＳｍａおよびＭａｄ関連３）
Ｓｍａｄ５（ＳｍａおよびＭａｄ関連５）
Ｓｍａｄ７（ＳｍａおよびＭａｄ関連７）
ＳＯＣＳ−１（サイトカインシグナリング１のサプレッサー（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−１））
ＳＯＣＳ−２（サイトカインシグナリング２のサプレッサー）
ＳＯＣＳ−３（サイトカインシグナリング３のサプレッサー）
ＳＯＳ（セブンレスの息子（Ｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ））
Ｓｒｃ非レセプターチロシンキナーゼ
ＳＲＦ（血清応答因子）
ＳＲＰＫ１（ＳＲタンパク質特異的キナーゼ１）
ＳＲＰＫ２（ＳＲタンパク質特異的キナーゼ２）
ＳＴＡＴ１α（転写１のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  １））
ＳＴＡＴ２（転写２のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）
ＳＴＡＴ３（転写３のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）
ＳＴＡＴ４（転写４のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）
ＳＴＡＴ５α（転写５αのシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）
ＳＴＡＴ５β（転写５βのシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）
ＳＴＡＴ６（転写６のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）
Ｓｙｋ（脾臓チロシンキナーゼ）
シンデカン膜貫通プロテオグリカン
Ｔ
Ｔａｋ１（ＴＧＦ−ｂ１活性化キナーゼ）
テーリン
ＴＡＮＫ／Ｉ−ＴＲＡＦ（ＴＮＦレセプター活性化因子）
タウ微小管結合タンパク質
ＴＢＫ−１／Ｔ２Ｋ（ＴＡＮＫ結合キナーゼ１）
テンシン（Ｔｅｎｓｉｎ）
ＴＮＦ−ＲＩ（腫瘍壊死因子レセプターＩ）
ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦレセプター結合細胞死誘導領域タンパク質）
ＴＲＡＦ１（ＴＮＦレセプター結合因子１）
ＴＲＡＦ２（ＴＮＦレセプター結合因子２）
ＴＲＡＦ３（ＴＮＦレセプター結合因子３）
ＴＲＡＦ４（ＴＮＦレセプター結合因子４）
ＴＲＡＦ５（ＴＮＦレセプター結合因子５）
ＴＲＡＦ６（ＴＮＦレセプター結合因子６）
ＴｒｋＡタンパク質チロシンレセプターキナーゼＡ
ＴｒｋＢタンパク質チロシンレセプターキナーゼＢ
ＴｒｋＣタンパク質チロシンレセプターキナーゼＣ
Ｖ
ＶＥＧＦレセプター（血管内皮増殖因子レセプター１型、２型、３型）
ビンキュリン
Ｗ
ＷＡＳＰ（ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質）
Ｚ
ＺＩＰ（ζ相互作用タンパク質）
ＺＩＰキナーゼ（ジッパーセリン／スレオニンキナーゼ）
ＺＲＰ−１（ジキシン関連タンパク質）
ジキシン
【００６２】
本発明の抗体はまた、治療目的についてのリン酸化ポリペプチドの不活化に有用である。本実施例は、本発明を例示し、そして趣旨または範囲において、本発明を限定するように意図されない。同様に、これらの試薬および方法の説明は、逆の機能において使用されて、タンパク質特異的ホスファターゼ（特定のアミノ酸残基からリン酸基を除去する酵素）の活性を分析し得る。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、抗ホスホタウ［ｐＳ１９９］リン酸化部位特異的抗体（ＰＳＳＡ）の特異性を例示する。
【図２】図２は、抗ホスホタウ［ｐＳ２１４］ＰＳＳＡ特異性を例示する。
【図３】図３ａおよび３ｂは、ＥＬＩＳＡによる全体的タウ対ＰＫＡ／セリン２１４部位でリン酸化されるタウの検出を例示する。
【図４】図４ａおよび４ｂは、ＥＬＩＳＡによるＧＳＫ−３β／セリン１９９／２０２でリン酸化されるタウ（４ａ）対全体的タウ（４ｂ）部位の検出を例示する。
【図５】図５は、タウセリン２１４ＰＳＳＡを用いたＥＬＩＳＡにおいて作製される用量反応曲線を例示する。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡにおけるタウＰＳＳＡの特異性を例示して、ＰＫＡ対ＧＳＫ−３β酵素によって触媒されるタウリン酸化を検出する。
【図７】図７は、タウ上の複数のＧＳＫ−３βリン酸化部位が、タウＰＳＳＡを用いたＥＬＩＳＡによって検出され得ることを例示する。
【図８】図８は、ＰＫＡ活性の特異的インヒビターが、タウのセリン２１４に対するリン酸化を選択的に阻害するが、ＥＬＩＳＡによって検出されるように、タウ［ｐＳ２１４］ＰＳＳＡおよびタウ［ｐＳ１９９］ＰＳＳＡを用いて実証されるように、ＧＳＫ酵素活性を妨害しないことを例示する。
【図９】図９は、抗Ｒｂ［ｐＴ８２１］の特異性を規定する。
【図１０】図１０はＲｂ［ｐＴ８２１］ＥＬＩＳＡの特異性を決定するための研究を示す。
【図１１】図１１は、ペプチド競合によって決定されるように、スレオニン８２１についてのＲｂ［ｐＴ８２１］ＥＬＩＳＡの特異性を示す。
【図１２】図１２は、ジャーカット細胞におけるキナーゼ活性の評価におけるＲｂ［ｐＴ８２１］ＥＬＩＳＡの適用が、キナーゼインヒビターであるスタウロスポリンの存在下で増加したことを示す。
【図１３】図１３は、ＥＧＦＲ  ＰＳＳＡ［ｐＹ１１７３］の特異性を例示する。
【図１４】図１４は、ペプチド競合によって決定されるように、チロシン残基１１７３についてのＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］ＥＬＩＳＡの特異性を示す。
【図１５】図１５は、ＥＧＦＲ［ｐＹ１１７３］ＥＬＩＳＡを使用したＥＧＦでの処理後の、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲのリン酸化の応答曲線を実証する。
【図１６】図１６は、Ａ４３１細胞におけるキナーゼ活性の評価におけるＥＧＦＲ［ｐＹ８４５］ＥＬＩＳＡの適用が、チロシンキナーゼインヒビターであるＰＤ１５８７８０の存在下で増加したことを示す。
【図１】
2006225396.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【外国語明細書】
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