(57)【要約】【課題】本発明の目的は、酵素免疫反応におけるバックグランドを低減するための、高性能ブロッキング剤、およびそれを用いることによるより高感度な測定方法の提供にある。【解決手段】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを有するブロック共重合体をブロッキング剤として用いることを特徴とする、従来品より感度の優れたイムノアッセイ方法およびブロッキング剤を提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
〔化１〕Ｒ１−Ｌ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｌ２−Ｘ
［式中、Ｒ１は、水素原子、官能基、保護された官能基またはリガンドを表し、Ｌ１、Ｌ２は、相互に独立した連結基または原子価結合を表し、Ｘは、モノ−、もしくはジ−低級アルキル置換アミノ基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー、複数のイミノ基を主鎖に有するオリゴまたはポリイミンよりなる群から選ばれるモノマー単位を含むポリマーのセグメントである］で表されるカチオン性セグメントを有するブロックコポリマー誘導体の１種または２種以上であって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを含有するブロック共重合体をブロッキング剤として用いることを特徴とする酵素免疫測定方法、およびブロッキング剤。
【請求項２】
請求項１記載のブロック共重合体が、ＰＥＧセグメント、および酵素免疫測定用反応固相と共有結合、イオン結合、水素結合、または配位結合のいずれかの相互作用により、結合し得るセグメントを有することを特徴とする酵素免疫測定方法およびブロッキング剤。
【請求項３】
免疫測定用反応固相と結合し得るセグメントが、ヒドロキシル基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー主鎖部分、アミノ基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー主鎖部分、複数のイミノ基を主鎖に有するオリゴまたはポリイミン主鎖部分、オリゴまたはポリラクチド主鎖部分からなる群より選ばれる請求項２記載のブロッキング剤
【請求項４】
請求項１〜３記載の酵素免疫測定用反応固相が、固相化酵素免疫測定用プラスチックマイクロプレート、またはブロッティング用疎水性高分子膜であることを特徴とする酵素免疫測定方法およびブロッキング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、酵素免疫測定おいて用い得る、固相のブロッキング剤ならびに該ブロッキング剤を含む免疫測定方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】タンパク質や脂質などの生体分子混在下で特定の物質を検出する免疫診断では、共存する物質の固相表面への非特異的吸着がバックグラウンドとして特異的吸着を妨害し、高感度化の妨げとなっている。そのため、免疫測定においては、リガンド特異的に結合する物質以外の物質が免疫反応に使用する固相表面に非特異的に吸着することによる感度の低下を軽減するため、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の水溶性高分子をブロッキング剤として用いることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズレベルを低減させている。【０００３】しかしながら、従来法によるブロッキング操作を施しても、完全に固相表面への非特異的な吸着を防ぐことは難しく、また、ブロッキング剤への非特異的吸着が無視できないこと、さらに、生体由来のブロッキング剤を用いる場合、免疫グロブリン、ビオチン等の混入により、ブロッキング操作が免疫反応に影響を与え、抗体の動物種や酵素発色系に制限があるることなどから、生体由来ではない高性能のブロッキング剤の開発が望まれている。【０００４】従来、上記のような生体由来のタンパク性ブロッキング剤の他に、固相表面にリガンドを結合させた後に、固相表面の余分なタンパク質結合部位にグリコシルエチル（メタ）アクリレート由来のポリマーを付着させて、測定試料中に含まれ得る夾雑タンパク質等の非特異吸着を防止する方法（〔特許文献１〕特開平１０−１２３１３５）、また、上記のグリコシルエチルに代え、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと略記）鎖を有する（メタ）アクリレート由来のポリマーで固相表面を保護すること（〔特許文献２〕特開平１１−２８７８０２）が提案されている。【０００５】しかしながら、これらグラフト共重合体を用いるのは、非特異吸着を抑制すべき固相表面への固定化能が十分でなく、表面密度を上げることが困難であることから、更なる効率的なブロッキング剤の開発が求められてきた。【０００６】本発明者らは、以前ＰＥＧと略記のような水溶性高分子をセンサーチップ、あるいは診断粒子の表面上に、ブラシ状に固定化することにより、センサー表面の非特異吸着を抑制するだけでなく、診断粒子の分散安定性も向上させ、新しいバイオツールとして材料供給してきた。具体的には、これらの発明を記載するものとして、例えば、増大した密度のポリエチレンオキシドのブラシ様構造表面（〔特許文献３〕ＷＯ  ０３／０７６９３３Ａ１公報）、ポリエチレングリコールセグメントを含有するポリマー誘導体を担持するバイオセンサー表面（〔特許文献４〕特開２００３−１４９２４５公報）、分散安定化機能性金属微粒子及び半導体微粒子（〔特許文献３〕特開２００２−０８０９０３公報）を挙げることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】解決しようとする問題点は、従来技術において、十分ではなかった非特異吸着抑制効果の向上と、酵素免疫反応の高感度化であり、具体的には、酵素免疫反応におけるシグナル／ノイズ比（以下Ｓ／Ｎ比と略記）向上させることにある。また、生体由来でない高性能のブロッキング剤およびそれを用いた高感度酵素免疫診断法を構築することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】本発明者らは、この課題を解決するために、非特異的な反応が抑制され得るブロッキング剤およびそれを含む高感度免疫測定系の構築について検討を行った。そして、その具体的な方策として、ＰＥＧセグメントを含有するブロック共重合体が優れたブロッキング剤として働くことを見出し、これを用いることを特徴とする酵素免疫測定法の構築し、本発明を完成した。【０００９】すなわち、本発明は、ＰＥＧセグメントを有するブロック共重合体の１種または２種以上を用いて、反応固相をブロッキングすることにより、非特異吸着を著しく低減し、高感度に検出定量することを特徴とする酵素免疫診断系が提供される。【００１０】  上記発明の好ましい態様により、ＰＥＧセグメントを有するブロック共重合体が、酵素免疫測定用反応固相と、共有結合、イオン結合、水素結合、または配位結合のいずれかの相互作用により、結合し得るセグメントを有したブロッキング剤が提供される。【００１１】また、上記発明の好ましい態様により、ブロッキングに使用されるＰＥＧブロック共重合体は、ヒドロキシル基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー主鎖部分、複数のイミノ基を主鎖に有するオリゴまたはポリイミン主鎖部分、オリゴまたはポリラクチド主鎖部分よりなる群から選ばれる物質が好ましい。【００１２】また、本発明に用いられる酵素免疫測定用固相に、特に制限はないが、汎用されているプラスチック製マイクロプレート、プラスチック製容器、ガラス製容器、スライドガラス、ブロッティング用疎水性高分子膜に対して用いるのが好適である。
【発明の効果】
【００１３】本発明のブロッキング剤は、酵素免疫反応に従来用いられてきたブロッキング剤に比べて、非特異吸着抑制効果が高いと同時に、生体由来でないために、抗原、または抗体の動物種または発色検出系の制限がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】  酵素免疫測定において、当該ブロッキング剤を適用する固相表面は、本発明の目的に沿うものであれば、いかなるものでも良い。特に、ＥＬＩＳＡ用プラスチックプレート（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン製など）、ブロッティング用疎水性高分子膜（ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンなど）の表面が好ましい。【００１５】  このような表面のブロッキングに効果的に使用できるポリマーは、上記固相への付着性に優れ、試料中の夾雑物を排除するＰＥＧとのブロック共重合体であれば、特に限定されるものではないが、固相表面と共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合等の相互作用を形成し得るセグメントを有するポリマーが望ましい。具体的には、負電荷を有する表面に対してイオン的に吸着する複数のイミノ基を主鎖に有するオリゴまたはポリイミン、または、アミノ基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー、あるいは、水素結合性の表面に対して水素結合を形成しやすい、ヒドロキシル基を側鎖に有するオリゴマーまたはポリマー、オリゴまたはポリラクチドが好適に用いられる。
【実施例】
【００１６】以下、本発明の実施例を記載して、本発明をさらに具体的に説明するが、この記載は、本発明の範囲を限定するものではない。【００１７】実施例１：ポリスチレンプレートを用いた酵素免疫反応におけるブロッキング効果
タンパク質高吸着性ポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ナルジェヌンク社製、マキシソープ）を用いたα−フェトプロテイン（以下ＡＦＰ）の酵素免疫測定系を構築し、抗体固相化表面におけるＰＥＧ／ポリ乳酸ブロック共重合体（以下ＰＥＧ−ＰＬＡ）、およびＰＥＧ／ペンタエチレンヘキサミンブロック共重合体（以下Ｎ６−ＰＥＧ）のブロッキング効果およびＳ／Ｎ比を従来品（ゼラチン等）と比較した。【００１８】抗ＡＦＰモノクローナル抗体を０．２５μｇ／ｗｅｌｌの濃度で、プレートに固相化し、さらに所定濃度のブロッキング剤を５０μＬずつ加え、室温で１時間振盪しながらブロッキング処理を行った。この固相化プレートに対し、ＡＦＰ標準サンプル（０，２，２０ＩＵ／ｍＬ）を作成し、それぞれ５０μＬずつ加え、抗体と反応させた。ＴＢＳＴバッファーで３回洗浄の後、抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ウサギ）を１時間振盪反応させた。同じくＴＢＳＴバッファーで３回洗浄の後、アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体を加え、１時間振盪反応させ、同様に洗浄した後、基質溶液として、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を加えて３０分インキュベートし、０．５規定ＮａＯＨを用いて反応を停止した。定量は、パーキンエルマー社製マイクロプレートリーダーを用いて、３５５ｎｍで励起した４−ＭＵＰ特有の４６０ｎｍの蛍光強度により行った。【００１９】図１に示すように、ＰＥＧ−ＰＬＡ（５０００／５０００）が従来用いられてきた、ＢＳＡ、ミルクカゼイン、ゼラチン等より優れた非特異吸着抑制効果を示した。また図２に示すようにＳ／Ｎ比もＢＳＡに比べ、大きく改善された。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】種々のブロッキング剤におけるプレート表面への非特異吸着量の比較例
【図２】種々のブロッキング剤におけるＳ／Ｎ比の比較例
【図１】
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【図２】
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