(57)【要約】      （修正有）【課題】最適なハイブリダイゼーション効率と金電極表面の良好なシールド効果を共に維持できるＤＮＡプローブ固定化法、及びその方法を用いて作製したＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを提供する。【解決手段】ＤＮＡプローブとリンカーを分子数比が１：２〜１：１００のＤＮＡ固定化溶液で、電界効果トランジスタのゲートと配線で接続された金電極にＤＮＡプローブを固定化することにより、固定化密度が4×１０１２個/ｃｍ２以下に制御でき、最適なハイブリダイゼーション効率維持を達成できる。その際問題となる延長ゲート型ＦＥＴセンサの金電極表面の溶液中のイオンの影響は、ＤＮＡ固定化溶液中のアルカンチオールの固定化密度を4×１０１４個/ｃｍ２以上に制御すれば、金電極表面のシールド効果が維持されて、取り除くことができる。その際のＤＮＡ固定化溶液中のアルカンチオールの濃度が0.５ｍＭ以上であれば、該アルカンチオールの固定化密度を制御できる。【選択図】  図１
2006308373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電界効果トランジスタのゲートと配線で接続された金電極にＤＮＡプローブを固定化してＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを作製する方法において、
金電極と結合する反応基を有するリンカーと結合したＤＮＡプローブと金電極と結合する反応基を有するリンカーのみを有する化合物を含む固定化溶液を調製する工程と、
前記固定化溶液を前記金電極表面に接触させる工程と
を有することを特徴とするＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法において、前記固定化溶液中のＤＮＡプローブとリンカーの分子数比が１：２〜１：１００であることを特徴とするＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法において、前記リンカーがアルカンチオールであることを特徴とするＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法において、前記アルカンチオールのアルキル基が炭素鎖６以上であることを特徴とするＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法。
【請求項５】
請求項１記載のＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法において、前記固定化溶液中の前記リンカーのみを有する化合物の濃度が0.５ｍＭ以上であることを特徴とするＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製方法。
【請求項６】
サンプル中のターゲットと結合するＤＮＡプローブとアルカンチオールとが表面に固定化された金電極を有し、
前記金電極表面に固定化された前記アルカンチオールの固定化密度が４×１０１４個/ｃｍ２以上であることを特徴とするＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサにおいて、前記金電極表面に固定化されたＤＮＡプローブの固定化密度が４×１０１２個/ｃｍ２以下であることを特徴とするＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ。
【請求項８】
表面にＤＮＡプローブとアルカンチオールとが固定化され、試料溶液と接触する金電極を有する電界効果型トランジスタと、
試料溶液と接触する参照電極と、
前記金電極と参照電極との間に交流電圧を印加する手段とを備えたことを特徴とするＤＮＡ測定装置。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡ測定装置において、前記金電極表面に固定化されたアルカンチオールの固定化密度が４×１０１４個/ｃｍ２以上であることを特徴とするＤＮＡ測定装置。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡ測定装置において、前記金電極表面に固定化されたＤＮＡプローブの固定化密度が４×１０１２個/ｃｍ２以下であることを特徴とするＤＮＡ測定装置。
【請求項１１】
サンプル中のターゲットと結合するＤＮＡプローブとアルカンチオールとが表面に固定化された電極を有する電界効果トランジスタの前記電極にバッファー溶液を接触させる工程と、
前記電極と、前記バッファー溶液に接触した参照電極との間に交流電圧を印加する工程と、
前記バッファー溶液中にサンプルを注入する工程と、
前記サンプル注入の前後における前記電界効果トランジスタの応答の変化を検出する工程と
を有することを特徴とするＤＮＡ測定方法。
【請求項１２】
請求項１１記載のＤＮＡ測定方法において、前記電極表面に固定化されたアルカンチオールの固定化密度が４×１０１４個/ｃｍ２以上であることを特徴とするＤＮＡ測定方法。
【請求項１３】
請求項１１記載のＤＮＡ測定方法において、前記電極表面に固定化された前記ＤＮＡプローブの固定化密度が４×１０１２個/ｃｍ２以下であることを特徴とするＤＮＡ測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質、特にＤＮＡを非修飾で計測するＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ、その作製方法、及びそれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の塩基配列解析技術の著しい進歩により、ヒトゲノムの全塩基配列がほぼ解析され、そのＤＮＡ塩基配列情報を医療等に幅広く利用しようとする動きが活発である。今後は生体中における遺伝子の発現状態を明らかにすることにより、個人レベルの疾患や個人の体質が遺伝子レベルで解明され、個人の体質に合わせたテーラーメイド医療が大きく発展すると期待されている。さらに、医療や医薬品以外に農産物の品種改良等の広範囲な分野で飛躍的な発展が進むものと思われる。これらの発展の基礎となるのが、塩基配列情報に加えて遺伝子発現情報や機能情報である。現在、ＤＮＡチップを用いて大規模に遺伝子の機能及び発現解析が行われ、データベースが構築されつつある。しかし、現状のＤＮＡチップは、蛍光検出法を基本原理としているので、レーザ光源や複雑な光学系を必要とし、計測システムが大型で高価であった。これらの装置は、大量のサンプル処理には適しているが、少数のサンプルを小規模な測定現場で測定することには適していない。そのため、今後の需要が増大する小規模な測定現場に適した小型で、操作が簡便な測定装置としてトランジスタの電気特性を利用した表面電位検出方式のＦＥＴセンサが報告されている。
【０００３】
ＦＥＴセンサは、ソース電極とドレイン電極の上に形成されたゲート絶縁層にＤＮＡプローブを固定化し、ターゲットＤＮＡのＤＮＡプローブへの結合（ハイブリダイゼーション）による絶縁膜上の表面電位（つまり、表面電荷密度）をソース電極とドレイン電極間の電流値の変化として検出する方式である（特表２００１−５１１２４５号公報）。ゲート絶縁物は、酸化シリコン、窒化シリコン、酸化タンタル等の材料を単独あるいは組み合わせて用い、通常はトランジスタ動作を良好に保つために、酸化シリコン等の上に窒化シリコン、酸化タンタル等を積層する二重構造としてある。ＤＮＡプローブの上記ゲート絶縁層上への固定化は、ゲート絶縁層表面をアミノプロピルシランやポリリジン等で化学修飾してアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネートを用いて、末端をアミノ基で化学修飾したＤＮＡプローブを反応させて行うため、煩雑な前処理を必要とした。さらに、本方式で採用している構造では、絶縁層がセンシング部を兼ねているため、センシング部の大きさや位置がトランジスタの構造に大きく左右される。近年、ＤＮＡプローブを固定化する金電極と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲートを導電性配線で接続した延長ゲート型ＦＥＴセンサ（特表２００３−３０６９０６号公報）が提案され、センシング部であるＤＮＡ固定化金電極を任意の場所に、かつ任意の大きさに形成できるようになった。また、金電極へのＤＮＡプローブの固定化もアルカンチオールをリンカーとして有するＤＮＡプローブを用いることにより、容易に行うことができる。
【０００４】
一方、ＤＮＡプローブの固定化密度に関しては、金電極表面のＤＮＡプローブの固定化密度が高い方がハイブリダイゼーションによって捕獲できるターゲットＤＮＡの量が増加し、センサの高感度化に有利である。しかし、ＤＮＡプローブの固定化密度が高くなり過ぎると、ＤＮＡプローブ間の間隔が狭くなり、ターゲットＤＮＡが近づき難くなり、ハイブリダイゼーション効率が低下する。すなわち、金電極表面のＤＮＡのハイブリダイゼーション効率は、ＤＮＡプローブの固定化密度に大きく依存する。最適なハイブリダイゼーション効率を示すようなＤＮＡプローブの配列制御または固定化密度制御方法として、金表面にＤＮＡプローブを固定化する際に、ＤＮＡプローブを固定化後にさらにアルカンチオールを固定化して配列制御させる方法（J. Am. Chem. Soc., 119, (1997) 8916-8920）や、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを一定分子数比で競合反応させて固定化する方法（特表２００４−１７０３６７号公報、特表２００４−２９４２４４号公報）が提案されている。いずれの方法も金表面のＤＮＡプローブ固定化密度を制御する方法として有効と考えられていた。
【０００５】
【特許文献１】特表２００１−５１１２４５号公報
【特許文献２】特表２００３−３０６９０６号公報
【特許文献３】特表２００４−１７０３６７号公報
【特許文献４】特表２００４−２９４２４０号公報
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 119, (1997) 8916-8920
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記したＤＮＡプローブ固定化密度を制御する方法を用いて、延長ゲート型ＦＥＴセンサのセンシング部である金電極上のＤＮＡプローブ固定化密度を最適化することは可能である。しかし、これらのＤＮＡプローブ固定化密度制御法は、蛍光法や表面プラズモン法等の光を用いた間接計測法用に考案されたものであり、ハイブリダイゼーション効率のみを考慮してある。ＦＥＴセンサの場合には直接的に金電極表面の電荷変化を検出するため、金電極表面での溶液中のイオンの影響を受けやすい問題があり、ハイブリダイゼーション効率に加えて、金電極表面での溶液中のイオンの影響の除去、すなわち金電極表面のシールドを行う必要があった。
【０００７】
本発明の目的は、最適なハイブリダイゼーション効率と金電極表面の良好なシールド効果を共に維持できるＤＮＡプローブの固定化法、及びその方法を用いて作製したＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、金電極と結合する反応基を有するリンカーと結合したＤＮＡプローブと金電極と結合する反応基を有するリンカーのみを有する化合物を一定の分子数比で含むＤＮＡ固定化溶液を用いて、電界効果トランジスタのゲートと配線で接続された金電極にＤＮＡプローブをリンカーのみを有する化合物との競合反応下で固定化することにより、最適なハイブリダイゼーション効率を維持することができる。延長ゲート型ＦＥＴセンサで問題となる金電極表面のシールド効果は、その際使用するリンカーのみを有する化合物を高濃度で用いればよい。その際の濃度は、使用するリンカーに依存する。特に、アルキル鎖の長さに大きく依存する。
【０００９】
通常、リンカーのみを有する化合物は、アルキル基が炭素鎖３以上であるアルカンチオールを用いる。その際使用できるアルカンチオールの末端は、アミノ基、水酸基、カルボキシル基である。
【００１０】
一般に、チオールを有する化合物は、金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合し、高密度・高配向な自己組織化単分子膜を形成することが知られている。その際の固定化密度は、4.6×１０１４個/ｃｍ２である。また、２本鎖ＤＮＡの直径は、約２．４ｎｍであるため、ハイブリダイゼーションを効率良く行わせるためには、ＤＮＡプローブの固定化密度は4×１０１２個/ｃｍ２以下が好ましい。測定感度を考慮すると、4×１０１０個/ｃｍ２〜4×１０１２個/ｃｍ２が好適である。この条件を満足すれば、最適なハイブリダイゼーション効率と金電極表面のシールド効果を共に維持することができる。その際に使用するＤＮＡ固定化溶液は、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを分子数比が１：２〜１：１００で、アルカンチオールの濃度が0.５ｍＭ以上であればよい。尚、ここで述べるＤＮＡプローブは、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うもので、例えば一本鎖であるＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＰＮＡ等である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを分子数比が１：２〜１：１００のＤＮＡ固定化溶液を用いて、電界効果トランジスタのゲートと配線で接続された金電極にＤＮＡプローブを固定化することにより、固定化密度が4×１０１２個/ｃｍ２以下に制御することができ、最適なハイブリダイゼーション効率を維持するＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを作製することができる。その際問題となる延長ゲート型ＦＥＴセンサの金電極表面の溶液中のイオンの影響は、ＤＮＡ固定化溶液中のアルカンチオールの固定化密度を4×１０１４個/ｃｍ２以上に制御すれば、金電極表面のシールド効果が維持されて、容易に取り除くことができる。その際のＤＮＡ固定化溶液中のアルカンチオールの濃度が0.５ｍＭ以上であれば、容易にアルカンチオールの固定化密度を4×１０１４個/ｃｍ２以上に制御できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明によるＦＥＴセンサのセンシング部である金電極へのＤＮＡプローブへの固定化法の操作フローを示している。図１（ａ）はＤＮＡ固定化溶液、図１（ｂ）はＤＮＡプローブの固定化密度が制御された様子、図１（ｃ）は固定化密度が制御されたＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った様子を示している。
【００１３】
一般に、チオールを有する化合物は、金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合し、高密度・高配向な自己組織化単分子膜を形成することが知られている。本発明ではその性質を利用して、ＤＮＡプローブ１１とリンカー１２との競合反応を行い、ＤＮＡプローブの固定化密度を制御し、さらに金電極１３の表面のシールドを行った。固定化されるＤＮＡプローブとリンカーの分子数比は、ＤＮＡ固定化溶液中のＤＮＡプローブとリンカーの分子数比に大きく依存するため、ＤＮＡプローブ溶液とリンカー溶液の混合比を変えることにより、容易に制御することができる。すなわち、固定化溶液中のＤＮＡプローブとリンカーの分子数比は、固定化反応前に別々に一定濃度に調整したＤＮＡプローブ溶液とリンカー溶液を混合して容易に調整できる。その後、調整した固定化溶液を金電極表面にデップするだけで容易に所定の密度でのＤＮＡプローブの固定化及び金電極表面のシールドを行うことができる。その後、ターゲットＤＮＡを添加してハイブリダイゼーションを行うことにより、２本鎖ＤＮＡ１４を形成することができる。
【００１４】
ＤＮＡプローブの固定化は、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを分子数比が一定の分子数比（例えば、１：１０）のＤＮＡ固定化溶液を用いて行った。その際使用するバッファーは、10mM Tris-HCl, 5mM Mg, pH7.2を使用した。固定化時間は約１時間とした。本発明において用いるＤＮＡプローブの長さは、目的に応じて異なるが、通常は２０塩基以上の１本鎖ＤＮＡが用いられる。好適には２０〜３０塩基の１本鎖ＤＮＡである。また、リンカーとしては通常は炭素鎖６〜１１個のアルカンチオールが用いられる。
【００１５】
本発明で使用したＤＮＡプローブは、リンカーとして炭素鎖６個のアルカンチオールを使用した。その際の競合反応をさせるアルカンチオールは、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール(６ＨＨＴ)である。一般に、ＤＮＡを固定化する場合には、ＤＮＡが負に帯電しているため、アミノ基を有するアルカンチオールを使用すると相互作用によりＤＮＡ断片が表面に横たわった状態になり測定安定性（安定化時間及び測定値のゆらぎ）が低下するので、水酸基、またはカルボキシル基を有するアルカンチオールを使用した方が良い。このように使用するアルカンチオールは、例えば末端基に水酸基を有するメルカプトエタノール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール、８−ヒドロキシ−１−オクタンチオール、１１−ヒドロキシ−１−ウンデカンチオール等を用いることができるが、また、測定対象物の有する電荷に応じて、末端基にアミノ基、カルボキシル基、水酸基を用いれば問題ない。
【００１６】
図２は、本発明の他の実施例である絶縁ゲート電界効果トランジスタの構造例を示す図である。図２（ａ）、（ｂ）は、各々断面構造及び平面構造を表わしている。絶縁ゲート電界効果トランジスタ２１は、シリコン基板の表面にソース２２、ドレイン２３、及びゲート絶縁物２４を形成し、金電極２５を設けてある。検出プローブを固定化する金電極２５と絶縁ゲート電界効果トランジスタのゲート２６を導電性配線２７で接続してある。本構造を採用することにより、プローブを固定化する金電極２５を任意の場所に、かつ任意の大きさに形成できる。測定対象に応じて、測定感度を向上させるためにプローブ固定化電極面積を大きくすることも容易である。さらに、測定対象の違う様々なセンサチップを作製する場合にも個別に作製する必要がなく、従来の半導体プロセスを用いてプローブ固定化電極以外の部分を共通に作製し、最後に測定対象に合わせてプローブ固定化電極及び測定対象物の固定化を行うことができ、大幅に製作コストが低減できる。
【００１７】
本発明で使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタは、ＳｉＯ2（厚さ；１７．５ｎｍ）を用いた絶縁層を有するデプレション型ＦＥＴであり、金電極を４００μｍ×４００μｍの大きさで作製してある。通常の測定は、水溶液を使用するため、本素子は溶液中で動作しなければならない。溶液中で測定する場合には、電気化学反応を起こし難い−0.５〜0.５Ｖの電極電位範囲で動作することが必要である。そのため、本実施例ではデプレション型ｎチャネルＦＥＴの作製条件、すなわち閾値電圧（Ｖｔ）調整用イオン打ち込み条件を調整し、ＦＥＴの閾値電圧を−0.５Ｖ付近に設定してある。
【００１８】
一般に使用されるＤＮＡチップは、蛍光体を使用したレーザ蛍光が一般的である。その際問題となるのは、ハイブリダイゼーション効率に大きく依存するＤＮＡプローブの固定化密度である。本発明で使用するＦＥＴセンサでは、ＤＮＡプローブの固定化密度の他に金電極表面のシールド、すなわち金電極表面での溶液中のイオンの影響の除去が問題となる。そのため、本発明では、ＤＮＡプローブ固定化密度とリンカーであるアルカンチオールの固定化密度の両方を考慮している。
【００１９】
アルカンチオールが金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合し、高密度・高配向な自己組織化単分子膜を形成する場合の固定化密度は、4.6×１０１４個/ｃｍ２である。アルカンチオールの固定化に要する時間を調べた結果を図３に示す。アルカンチオール溶液として、１ｍＭの６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオールを用いた。その結果、１０分以内に金表面に固定化することが分かった。その際の固定化密度が、4.4×１０１４個/ｃｍ２であり、理論値とほぼ同じ値を示した。金電極表面に固定化したアルカンチオールの固定化量は、 強アルカリ条件下におけるサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）によって求めた。強アルカリ溶液中でのＣＶにより、金電極表面からのチオールアニオンの脱離反応に由来する不可逆なカソード電流が生じ、そのカソード電流の積分値（電荷量）から、金電極表面の固定化量(表面密度)を見積もることができる。以下に、その際の測定条件を示す。
【００２０】
測定に使用する溶液は、測定前に１５分間窒素バブリングを行い、溶存酸素を除去し、ＣＶ測定は窒素雰囲気下で行った。
測定条件
測定装置：ALSモデル611B電気化学アナライザー(Bioanalytical System, Ltd.，)
作用電極：アルカンチオール固定化金電極
対極：Ｐｔカウンター電極，BAS製
参照電極：Ag/AgCl，RE-1C参照電極，BAS製
測定溶液：0.５Ｍ水酸化カリウム溶液
【００２１】
同様にＤＮＡプローブの固定化に要する時間を調べた結果を図４に示す。ＤＮＡプローブ溶液として、１０μＭの１本鎖ＤＮＡ（5'-HS-(CH2)6- CACACTCACAGTTTTCACTT -3'，ALDH２遺伝子と相補的な配列）を用いた。その結果、１０分以内に金表面に固定化することが分かった。その際の固定化密度が、4.1×１０１３個/ｃｍ２であった。固定化密度は、強アルカリ溶液中でのCVにより求めた。
【００２２】
この値は、理想的な固定化密度の一桁以上大きな値であり、ハイブリダイゼーションの効率が悪くなると考えられる。すなわち、ハイブリダイゼーションの効率は、固定化されたＤＮＡプローブの配向性とハイブリダイゼーションに必要な間隔で決まる。そのため、ＤＮＡプローブが高密度で固定化されると、ハイブリダイズする鋳型ＤＮＡが接近出来ないことや２本鎖形成に伴う隣同士のリン酸基の反発により、ハイブリダイゼーションの効率が悪くなるからである。
【００２３】
そこで本発明では、ＤＮＡプローブとアルカンチオールを競合反応させて、ＤＮＡプローブの固定化密度を制御する方法を採用した。実験で使用した固定化溶液中のＤＮＡプローブと６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール（６ＨＨＴ）の分子数比は、１：０、１：１、１：２、１：５．１：１０、１：５０、１：１００である。ＤＮＡプローブの固定化は、10mM Tris-HCl, 5mM Mg, pH7.2で約１５分間行った。
【００２４】
金電極へのＤＮＡの固定化量は、ＣＶにより見積もることができる。しかし、固定化されたＤＮＡプローブがハイブリダイゼーション可能な状態で固体化されているかどうかは分からない。固定化ＤＮＡの状態を把握するためには、直接ハイブリダイゼーションの有無を観測できれば良いが、実際には困難である。そこで、ハイブリダイゼーション後の一塩基伸長反応を生物発光検出法で計測することにより、間接的に固定化ＤＮＡの状態を調べた。生物発光検出法を用いた一塩基反応の実験手順を以下に示す。
【００２５】
作製したＤＮＡ固定化金電極は、バッファー(10mM Tris-HCl, 5mM Mg, pH7.2)で洗浄した。洗浄したＤＮＡ固定化金電極を投入したサンプルチューブに、鋳型ＤＮＡ(3.65M，200μL)を添加し、シールで密閉状態にしてハイブリダイゼーション(95℃、30s → 50℃、15分 → 氷冷)を行った。その後、ＤＮＡ固定化金電極は、バッファー(10mM Tris-HCl, 5mM Mg, pH7.2)で洗浄し表面の溶液を取り除いて、二本鎖ＤＮＡ固定化金電極を得た。一塩基伸長の発光測定は、調整した二本鎖ＤＮＡ固定化金電極上に発光試薬(ＡＴＰスルフリラーゼとルシフェラーゼを用いたピロリン酸測定溶液；Anal. Chem., 244 (1997) 367-373、Science 281 (1998) 363,365、またはMeas. Sci. Technol., 13, 1-7 (2002)を参照)とポリメラーゼ溶液(0.8μL；Klenow fragment)を加えて発光検出装置(検出器；サイドオン型光電子増倍管、R6357、浜松ホトニクス製)内に設置し、自動分注装置(定圧加圧式ディスペンサー)を用いて基質溶液(8μL；1μM dNTP)を吐出して発光反応を開始させて行った。発光検出装置からの出力は、電流・電圧変換増幅器(C2719、浜松ホトニクス製)及びローパスフィルター(3316、NF回路設計ブロック製)を介して、ＡＤコンバータ(ADC-16，Picotech  Ltd.)を用いて測定した。その結果を図５に示す。
【００２６】
１：１００，１：５０，１：１０と、６ＨＨＴに対するＤＮＡプローブの比率が高くなり相対的にＤＮＡプローブの量が多くなるにつれて発光強度は上昇し、ＤＮＡ固定化密度によるハイブリダイゼーション効率の阻害はない。しかし、更にＤＮＡプローブの比率を増やして固定化溶液中のＤＮＡプローブと６ＨＨＴとの分子数比が１：１になると発光強度が低下した。この結果は、ＤＮＡプローブと６ＨＨＴとの混合比率が１：１以上である固定化溶液を用いて作製した金電極の場合は、固定化したＤＮＡプローブの固定化密度が高すぎてハイブリダイズする鋳型ＤＮＡが接近出来ないか、固定化したＤＮＡの配向性が悪くハイブリダイズできないためと考えられる。以上の結果は、固定化溶液中のＤＮＡプローブと６ＨＨＴとの分子数比が１：２の場合がハイブリダイゼーション効率を維持する限界であることを示している。また、ＤＮＡプローブの固定化密度は高い方が測定感度は向上するため、一塩基伸長反応の発光量から見積もった値を考慮すると、ＤＮＡプローブの固定化密度は4×１０１０個/ｃｍ２〜4×１０１２個/ｃｍ２が好適である。その際に使用する固定化溶液は、ＤＮＡプローブとアルカンチオールの分子数比が１：２〜１：１００である。
【００２７】
本発明で使用するＦＥＴセンサの他の問題である金電極表面のシールド効果のＤＮＡプローブと競合反応に使用するアルカンチオールの濃度依存性を図６に示す。電流曲線６１，６２，６３，６４，６５は、各々固定化溶液中のアルカンチオールの濃度が１０００μＭ、５００μＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭの場合の酸化還元電流曲線を表している。電流曲線６６は、未処理の金電極の酸化還元電流曲線を表している。使用したアルカンチオールは６ＨＨＴである。金表面のシールド効果は、酸化還元物質であるK3[Fe(CN)6]を用いて測定した。測定原理は、金電極表面をアルカンチオールが密閉構造で固定化されていれば金電極表面で酸化還元反応が起こらないが、密閉性が崩れる（例えば、ピンホール等）と酸化還元電流が流れることを利用している。測定条件を以下に示す。
【００２８】
測定条件
測定装置：ALSモデル611B電気化学アナライザー(Bioanalytical System, Ltd.，)
作用電極：アルカンチオール固定化金電極
対極：Ｐｔカウンター電極，BAS製
参照電極：Ag/AgCl，RE-1C参照電極，BAS製
測定溶液：0.1M Na2SO4溶液
【００２９】
ＤＮＡプローブと競合反応に使用する固定化溶液中の６ＨＨＴの濃度が５００μＭ（電流曲線６２）以上の場合にはほとんど酸化還元反応が起きていない。６ＨＨＴの濃度が１００μＭ（電流曲線６３）以下になると金電極表面で酸化還元反応が少し起き、１μＭ（電流曲線６５）の場合ではシールド効果がほとんど見られなくなる。すなわち、ＤＮＡプローブと競合反応に使用するアルカンチオールの濃度が５００μＭ以上であれば、シールド効果は維持できる。
【００３０】
ＤＮＡプローブとの競合反応に使用するアルカンチオールの炭素鎖とシールド効果を調べた結果を図７に示す。電流曲線７１，７２，７３は、各々５−カルボキシ−１−ペンタンチオール、７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、１０−カルボキシ−１−デカンチオールの場合の酸化還元電流曲線を表している。電流曲線７４は、未処理の金電極の酸化還元電流曲線を表している。使用したアルカンチオール溶液の濃度は１ｍＭである。金表面のシールド効果は、酸化還元物質であるK3[Fe(CN)6]を用いて測定した。その結果、炭素鎖６個の場合には、少し金電極表面で電流が流れるが、酸化還元反応によるピークは見られないため、シールド効果が維持できていると考えられる。
【００３１】
ＤＮＡプローブのみを固定化した場合とＤＮＡプローブとアルカンチオールを競合反応した場合のシールド効果の違いを測定した結果を図８に示す。電流曲線８１，８２，８３は、各々未処理の金電極、ＤＮＡプローブのみを固定した金電極、ＤＮＡプローブと８−ヒドロキシ−１−オクタンチオール（固定化溶液中の分子数比、１：１０）を固定化した金電極の場合の酸化還元電流曲線を表している。使用した８−ヒドロキシ−１−オクタンチオール溶液の濃度は１ｍＭである。金表面のシールド効果は、酸化還元物質であるK3[Fe(CN)6]を用いて測定した。その結果、ＤＮＡプローブのみ場合は、未処理の場合と同じ挙動を示し。シールド効果が無いことを示している。ＤＮＡプローブと８−ヒドロキシ−１−オクタンチオールを競合反応で固定化することにより、金電極表面のシールド効果を維持することが可能になった。
【００３２】
図９は、本発明によるＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡ計測装置の構成を示す図である。本発明に使用する絶縁ゲート電界効果トランジスタ９１は、シリコン基板の表面にソース９２、ドレイン９３、及びゲート絶縁物９４を形成し、ソース９２、ドレイン９３間のゲート絶縁物表面に金電極９５を設けてある。金電極９５の表面には、ＤＮＡプローブ９６とアルカンチオール９７が固定化されている。実際の測定の際には、金電極９５、及び金電極９５の表面上に固定化されたＤＮＡプローブ９６とアルカンチオール９７と参照電極９８が測定セル９９中の試料溶液１００中に配置し、参照電極９８に電源１０１により高周波電圧を印加し、試料溶液１００中に含まれるターゲットＤＮＡとＤＮＡプローブ９６との結合の前後で変化する絶縁ゲート電界効果トランジスタ９１の電気特性変化、すなわちソース９２とドレイン９３との間を流れる電流値の変化を検出することにより、試料溶液１００中に含まれるターゲットＤＮＡの有無を検出することができる。参照電極９８は、試料溶液１００中の金電極９５の表面で起こる平衡反応あるいは化学反応に基づく電位変化を安定に測定するために、基準となる電位を与える。通常は参照電極としては、飽和塩化カリウムを内部溶液に使用している銀・塩化銀電極、あるいは甘こう（カロメル）電極が用いられるが、測定する試料溶液の組成が一定の場合には、疑似電極として銀・塩化銀電極のみを使用しても問題はない。参照電極９８に所定の電圧を印加することにより、絶縁ゲート電界効果トランジスタ９１の電気的特性の動作点（すなわち、しきい電圧）を調整することができる。好ましくは、絶縁ゲート電界効果トランジスタ９１は、シリコン酸化物を絶縁膜として用いる金属酸化物半導体（Metal-insulator-semiconductor）電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であるが、薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）を用いても問題はない。
【００３３】
実際に測定した結果を図１０に示す。試料を導入後（ＤＮＡプローブとのハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡ）のドレイン電流１１１は、試料を導入前（１本鎖ＤＮＡ）のドレイン電流１１２に比べて減少した。この結果は、２本鎖ＤＮＡ形成により、金薄膜表面の負の電荷が増加したためであると考えられる。本発明で使用するＦＥＴ化学センサのＤＮＡ計測の原理は、ハイブリダイゼーション前後に変化するゲート表面の電位により、ソース・ドレイン間の電流が変化することに基づいている。そのため、金電極表面に固定化されたＤＮＡプローブの側鎖にはリン酸基を有し、全体的に負電荷を帯びている。ハイブリダイゼーションに伴い、測定対象のＤＮＡ断片の長さに応じた負電荷が増加し、それに伴いドレイン電流値が減少する。使用したＤＮＡプローブは、２０塩基の１本鎖ＤＮＡ（5'-HS-(CH2)6- CACACTCACAGTTTTCACTT -3'，ALDH２遺伝子と相補的な配列）を、ターゲットＤＮＡは５０塩基の１本鎖ＤＮＡ（5'-TGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTG-3'、ALDH２遺伝子と相補的な配列）を使用した。また、ＤＮＡプローブと８−ヒドロキシ−１−オクタンチオールの濃度比が１：１０である混合溶液を用いてＤＮＡプローブの固定化を行った。本測定は、ゲート側の参照電極（Ag/AgCl参照電極）に周波数；１ＭＨｚ、中心電圧；５０ｍＶ、振幅電圧；５０ｍＶの交流電圧を印加して行った。
【００３４】
図１１は、本発明によるＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡ計測の結果を示す図である。図中左のbare、６ＡＨＴ、６ＨＨＴ、及び５ＣＰＴは、各々未処理の金電極、６−アミノ−１−ヘキサンチオール、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール、および５−カルボキシ−１−ペンタンチオールのゲート電位の値を示している。本測定は、ゲート側の参照電極（Ag/AgCl参照電極）に周波数；１ＭＨｚ、中心電圧；５０ｍＶ、振幅電圧；５０ｍＶの交流電圧を印加して行った。ＦＥＴセンサの特性は、ドレイン電流値をゲート電圧（Ｖｇ）に換算した値で比較した（ＶＤＳ＝１．０Ｖ）。その結果、未処理の金電極に末端の官能基の違うアルカンチオールを固定化することにより、電荷の違いに応じて電位の変化が見られ、ＦＥＴセンサが正常に駆動していることが確認できた。
【００３５】
また、ＤＮＡプローブの固定化密度の違うセンサチップを作製し、ＤＮＡのハイブリダイゼーションの検出を行った結果を図１１の右に示す。ＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサ作製に使用した固定化溶液中のＤＮＡプローブと６ＨＨＴの分子数比は、１：１０、１：５０、１：１００（以下、ssDNA(1:10)，ssDNA(1:50)、ssDNA(1:100)と略す）の３種類である。ＤＮＡプローブの固定化量を制御したセンサチップのＶｇの大きさは，６ＨＨＴ，ssDNA(1:100)，ssDNA(1:50)，ssDNA(1:10)，５ＣＰＴの順番であった(図１１)。この順番は、負電荷の少ない順番であり、ＦＥＴセンサの特性を良く表している。次に、ssDNA(1:100)，ssDNA(1:50)，ssDNA(1:10)を固定化したＤＮＡプローブの配列と相補的な配列を有するＤＮＡ断片とハイブリダイズさせてＶｇ値を測定した。固定化溶液中のＤＮＡプローブと６ＨＨＴの分子数比が１：１０，１：５０，１：１００で作製したＦＥＴ化学センサの場合のハイブリダイズ後のデータを各々dsDNA(1:10)，dsDNA(1:50)，dsDNA(1:100)と図中では示している。一本鎖ＤＮＡの場合と同様に、Ｖｇの大きさは６ＨＨＴ，dsDNA(1:100)，dsDNA(1:50)，dsDNA(1:10)，５ＣＰＴの順番であった。dsDNA(1:100)，dsDNA(1:50)，dsDNA(1:10)の値は，全てssDNA(1:100)，ssDNA(1:50)，ssDNA(1:10)の値より低下した。このハイブリダイゼーション前後のＶｇ値の変化は、ハイブリダイゼーションに伴う固定化ＤＮＡ上の負電荷の増加を反映していると考えられる。金電極の面積(0.16mm2；0.4×0.4mm)と２本鎖ＤＮＡの直径(2.4nm)を考慮した理想的な固定化ＤＮＡ密度(4×10-2個/nm2)を用いると、本測定では約１０fmolのＤＮＡのハイブリダイゼーション変化を検出できたことになる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明によるＦＥＴセンサのセンシング部である金電極へのＤＮＡプローブへの固定化法の操作フローを示す図であり、（ａ）はＤＮＡ固定化溶液、（ｂ）はＤＮＡプローブの固定化密度が制御された様子、（ｃ）は固定化密度が制御されたＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った様子を示す図。
【図２】本発明による絶縁ゲート電界効果トランジスタの構造例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は断面図。
【図３】アルカンチオールの固定化に要する時間を調べた結果を示す図。
【図４】ＤＮＡプローブの固定化に要する時間を調べた結果を示す図。
【図５】ＤＮＡプローブと６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール（６ＨＨＴ）の混合比率とハイブリダイゼーション効率を一塩基伸長反応で測定した結果を示す図。
【図６】金電極表面のシールド効果のＤＮＡプローブと競合反応に使用するアルカンチオールの濃度依存性を示す図。
【図７】ＤＮＡプローブと競合反応に使用するアルカンチオールの炭素鎖とシールド効果を調べた結果を示す図。
【図８】ＤＮＡプローブのみを固定化した場合とＤＮＡプローブとアルカンチオールを競合反応した場合のシールド効果の違いを測定した結果示す図。
【図９】本発明によるＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡ計測装置の構成を示す図。
【図１０】延長ゲートＦＥＴを用いて１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡを検出した一例を示す図。
【図１１】本発明によるＤＮＡ固定化ＦＥＴセンサを用いたＤＮＡ計測の結果を示す図。
【符号の説明】
【００３７】
１１，９６…ＤＮＡプローブ、１２…リンカー、１３，２５，９５…金電極、１４…２本鎖ＤＮＡ、２１，９１…絶縁ゲート電界効果トランジスタ、２２，９２…ソース、２３，９３…ドレイン、２４，９４…ゲート絶縁物、２６…ゲート、２７…導電性配線、６１，６２，６３，６４，６５，６６，７１，７２，７３，７４，８１，８２，８３…サイクリックボルタンメトリの電流曲線、９７…アルカンチオール、９８…参照電極、９９…測定セル、１００…試料溶液、１０１…電源、１１１，１１２…ドレイン電流。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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