(57)【要約】【課題】運動器組織に係る再生医療において臨床応用可能な、適切なスカフォールドに共有結合した細胞増殖因子が長期徐放化を達成する化合物およびその製造方法を提供する。【解決手段】式１：Ｘ−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｐ（Ｘはグリコサミノグリカン、Ｐは細胞増殖因子を表し、ｎは任意の整数である。）で表される化合物。かかる化合物は、より物理的強度、生体適合性、細胞増殖促進能に優れ、機能改善に十分な組織が再生されるなど、再生医療分野において多大な貢献をするものと期待される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：Ｘ−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｐ（Ｘはグリコサミノグリカン、Ｐは細胞増殖因子を表し、ｎは任意の整数である）で表される化合物。
【請求項２】
Ｘがキトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラト硫酸、ケタラン硫酸およびキチンよりなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘがキトサンである請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｐが塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）よりなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｐが塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｐがヘパリンとの複合体である請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
下記式２で表される化合物（式中、ｎは任意の整数である）とグリコサミノグリカンとを反応させる工程と、前記工程によって得られた生成物と細胞増殖因子とを反応させる工程とからなる、請求項１に記載の化合物の製造方法。
式２
【化１】
2006104287.tif 000004
【請求項８】
グリコサミノグリカンが、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラト硫酸、ケタラン硫酸およびキチンからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
グリコサミノグリカンがキトサンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞増殖因子が、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される、請求項７に記載の製造方法。
【請求項１１】
細胞増殖因子がヘパリンとの複合体である、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカンと細胞増殖因子を共有結合によって結合した化合物およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会の到来、輸送手段の発達に伴う交通外傷、日常生活へのスポーツの浸透によるスポーツ外傷の増加等により、運動器疾患の発生頻度は増加し続けている。このような運動器疾患のなかで、発症頻度が最も高いものの一つは、軟骨、靭帯などの関節構成組織の損傷である。かかる関節構成組織は自己修復能力が極めて低いために、外科的治療の適応となる機会が非常に多い。
【０００３】
このような損傷に対する治療として、自家組織または人工物による再建・置換術が施行されているが、自己組織を使用するために、身体の他の部位に瘢痕が残る場合や、術後に人工物の劣化・ゆるみが生じるなどの、解決困難な問題が多く存在する。しかしながら、人工関節置換術の頻度は増加の一途をたどっており、医療経済に及ぼす影響も深刻化している。
【０００４】
これらの問題点を解決するために、運動器疾患領域においても再生医療による治療が要望されている。
【０００５】
再生医療においては、スカフォールド（ｓｃａｆｆｌｏｄ）と呼ばれる足場構造体に、細胞を播種し、インビトロ（生体外）にて培養・増殖させた後に細胞を生体内に戻し、生体内において当該細胞の機能を発現させることにより、生体が失った機能を再生させるという手法を用いる。また、細胞増殖因子を直接生体内に供給することで、組織の回復を促進する手法もある。
【０００６】
従来、細胞増殖因子それ自体に関する研究は数多く行われてきた。しかし、たとえ、細胞増殖因子の機能等の解明により、インビトロで該因子を大量に生産することができたとしても、インビボ（生体内）においては短い時間で失活するために、生体内において増殖因子としての効果を継続的に発揮させることは難しい。この欠点を補うために、同因子の大量、頻回投与が試みられているが、感染症の危険性を増大させる結果となり、臨床応用するのには適切ではない。
【０００７】
また、近年、再生医療の分野において、スカフォールドを患者の体内に供給することで、組織の回復を促進することができることが報告された。現在広く用いられているスカフォールド材料としては、コラーゲン、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリε―カプロラクタンなどが挙げられる。
【０００８】
スカフォールドに求められる運動器組織の再生に必要な特性として、細胞増力性は必須であるが、その他にも、生体親和性、生体吸収性、細胞接着性、力学的強度を備えていなければならない。かかる観点からすれば、コラーゲンは力学的強度および細胞接着性に優れるものの、免疫学的に拒絶反応を生じやすく、更に動物由来であるため、種々の感染症の危険性を常に有する等の問題点が指摘されていた。また、アルギン酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリε−カプロラクタンは、動物由来でないために、コラーゲンにおいて認められる危険性はないものの、細胞接着性が非常に低く、また力学的強度も低いなどの欠点を有していた。
【０００９】
このようなスカフォールドの欠点を克服すべく、アルギン酸繊維とキトサンからなるポリイオン複合繊維を軟骨細胞のスカフォールドとする試みが、報告されている（非特許文献１）。
【００１０】
また、スカフォールドと細胞増殖因子を組み合わせたものを生体内に導入することによって、組織を再生する方法も試みられている。Ｂｅｒｓｃｈｔらはメチルピロリジンオン  キトサン（ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ  ｃｈｉｔｏｓａｎ）に塩基性繊維芽細胞成長因子を混入し、フリーズドライすることにより、水分を凝固させ、スカフォールドを有穴化し、塩基性繊維芽細胞成長因子を放出することのできるスカフォールドを報告している（非特許文献２）。
【非特許文献１】イワサキら（Iwasaki, N et. al.）、バイオマクロモレキュール（Biomacromolecules）、米国、２００４年、第５巻、第８２８〜８３３頁
【非特許文献２】ベルシュットら（Berscht et. al.）、バイオマテリアルズ（Biomaterials）、米国、１９９４年、第１５巻、第８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、アルギン酸繊維とキトサンからなるポリイオン複合繊維を軟骨細胞のスカフォールドは、これを足場として増殖する細胞に対して、安定して増殖を促進する因子を供給する能力は有していない。また、Ｂｅｒｓｃｈｔらの方法も、基本となるスカフォールドと塩基性繊維芽細胞成長因子の結合力の低さから、わずか２５分間で２２％、６時間で５６％もの塩基性繊維芽細胞成長因子が流出してしまうため、短期的には十分としても、長期にわたる徐放化は期待できない。
【００１２】
本願発明の課題は、運動器組織に係る再生医療において臨床応用可能な、適切なスカフォールド、およびかかるスカフォールドを足場にして増殖する細胞に対して、細胞増殖因子を長期的に供給することのできる化合物およびその製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者らは、細胞増殖因子とスカフォールド材料とを、単なる混入ではなく共有結合させることで、より強固な足場を提供し、安定かつ正確な徐放化が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
即ち本発明は、式１：Ｘ−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｐ（Ｘはグリコサミノグリカン、Ｐは細胞増殖因子を表し、ｎは任意の整数である。）で表される化合物に関する。
【００１５】
また、本発明は、不活性ガス雰囲気下において、式２の化合物（ｎは任意の整数）とグリコサミノグリカンとを反応させる工程と、当該工程によって得られた生成物と細胞増殖因子とを反応させる工程からなる、上記式１の化合物の製造方法に関する。
【００１６】
式２：
【００１７】
【化２】
2006104287.tif 000002
【００１８】
本発明は、スカフォールド材料と細胞増殖因子とが、式２の化合物から誘導されるリンカーを介して、ジスルフィド結合により共有結合した化合物である。具体的には、スカフォールド材料であるグリコサミノグリカンに存するアミノ基が式２の化合物から誘導されるリンカーと結合しており、同リンカーの一方末端にあるＳＨ基が細胞増殖因子の分子内に存在するＳＨ基とジスルフィド結合を形成している構造からなる。
【００１９】
この様に、本発明の化合物を構成するＸとして表されるグリコサミノグリカンは、分子内に遊離のアミノ基を有している多糖類であれば何れも使用することができる。その様なグリコサミノグリカンは、例えばキトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラト硫酸、ケタラン硫酸およびキチンからなる群から選択することができる。特に、細胞増殖の足場としての機能から、キトサンの利用か好ましい。
【００２０】
本発明の化合物を構成するＰとして表される細胞増殖因子は、所望の細胞増殖を促すことのできる蛋白質性因子であれば、何れも利用することができる。その様な例としては、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、血管形成誘導因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）またはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）などを挙げることができる。
【００２１】
また、増殖させようとする細胞に応じた細胞増殖因子を適宜選択して使用することが好ましく、例えば軟骨細胞の増殖にはｂＦＧＦを、あるいは繊維芽細胞の増殖にはＴＧＦ−βをそれぞれ選択して使用する。
【００２２】
この細胞増殖因子をスカフォールド材料に共有結合させるには、細胞増殖因子内に天然に存在するシステイン残基やメチオニン残基の側鎖にあるＳＨ基を利用することができる。また、蛋白工学的手法により、人為的に細胞増殖因子のアミノ酸配列を改変してＳＨ基を有するアミノ酸残基を新たに導入し、これを用いて本発明のジスルフィド結合を形成させても良い。かかる操作は、通常の遺伝子組換え手法により行うことができる。
【００２３】
本発明の化合物は、不活性ガス雰囲気下において、式２のイミノチオラン（ｎは任意の整数）化合物とグリコサミノグリカンとを反応させる工程と、当該工程によって得られた生成物と細胞増殖因子とを反応させる工程から、製造することができる。
【００２４】
式２
【００２５】
【化３】
2006104287.tif 000003
【００２６】
式２の化合物とグリコサミノグリカンとを反応させる工程は、不活性ガス下、室温〜４０℃程度の温度において、ｐＨ４．０〜９．０の適当な緩衝液中で１〜５時間、行えばよい。利用可能な緩衝剤としては、アミノ基を有しない緩衝剤の利用が好ましく、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、硼酸緩衝液などを挙げることができる。
【００２７】
また、前記工程によって得られた生成物と細胞増殖因子とを反応させる工程は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）、エタノール、ＤＭＦ、アセトニトリル等の適当な存在下で、不活性ガス雰囲気下、室温〜４０℃にて１〜５時間反応させればよい。反応終了後、必要に応じて透析により精製する。透析により化合物が沈殿する場合には、適用な溶媒に加えることにより再度可溶化する事ができる。
【００２８】
本発明では、細胞増殖因子を、その活性発現に好適な態様でスカフォールド材料に共有結合させることもできる。例えば、ｂＦＧＦに代表されるある種の細胞増殖因子の細胞膜受容体への結合効率は、ｂＦＧＦとヘパリンとの複合体を形成することによって上昇することが知られている。本発明でも、式1の化合物の細胞増殖因子としてｂＦＧＦを使用する場合には、ｂＦＧＦとヘパリン等とを室温のトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中に２時間程度おき、ｂＦＧＦとヘパリンとの複合体を予め形成させておき、これを前述の反応に使用することができる。
【００２９】
また、細胞増殖因子が、前記工程によって得られた生成物とのジスルフィド結合の形成に利用可能なＳＨ基を有するアミノ酸残基を有さない場合には、あらかじめシステイン残基あるいはメチオニン残基を、遺伝子組換え手法などによって細胞増殖因子に導入しておき、この改変体を細胞増殖因子として利用してもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、好適なスカフォールド材料であるグリコサミノグリカンに、細胞増殖因子をリンカーを介して共有結合させることによって、細胞増殖因子を活性型のままスカフォールド材料と結合させることができる。また、共有結合により、従来の細胞増殖因子とスカフォールド材料との単なる混合物に見られる、スカフォールド材料からの速やかな細胞増殖因子の流出が防止され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのみならず、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、当該細胞増殖因子が徐放化によって長期的な細胞増殖能の維持が可能となる。
【００３１】
上記共有結合されたグリコサミノグリカンと細胞増殖因子とからなる化合物は、再生医療における適切なスカフォールドとしての性質と細胞増殖因子の徐放化能を有し、その結果、物理的強度、生体適合性、細胞増殖促進能に優れ、機能改善に十分な組織が再生されるなど、再生医療分野において多大な貢献をするものと期待される。
【００３２】
さらに、本願発明に係る多糖−細胞増殖因子結合体は通常は水溶性であるため、再生医療のスカフォールド以外の目的で、治療に応用することが可能である。この場合における生体への投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与等がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本願発明において利用可能な不活性ガス、例えば窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオンなどを挙げることができ、これらは容易に入手可能である。
【００３４】
また、本発明において利用可能なグリコサミノグリカン、例えばキトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラト硫酸、ケラタン硫酸、キチンなどは、いずれも一般に市販されているものを使用することができる。例えば、前述のグリコサミノグリカンは、いずれも生化学工業株式会社より入手可能である。
【００３５】
本願において利用可能な細胞増殖因子、例えば塩基性繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、インシュリン様成長因子、神経成長因子などは、何れも市販されているものを使用することができ、また遺伝子組換え手法を用いて製造したものも利用可能である。例えば、前述の細胞増殖因子は、いずれも日本ベクトン・ディッキントン株式会社から入手可能である。
【００３６】
式２のイミノチオランは、和光純薬工業株式会社より入手可能な化合物である。
【００３７】
（実施例）
以下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願の発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
キトサン（１％酢酸に溶解）３．５ｇを４４ｍｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ  リン酸カリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解し、続いて２−イミノチオランを１１２ｍｇ加えた。窒素雰囲気下、室温にて３時間攪拌により反応後、未反応の２−イミノチオランを１週間の透析にて除去し、キトサンにＳＨ基が導入されたスカフォールド材料（キトサン−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）3−ＳＨ）を得た。
【００３９】
１０ｍｇのヘパリンを３０ｍｌのトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍｇ  ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に溶解する。これに１ｍｇの塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を加え、室温にて２時間反応させ、ｂＦＧＦ−ヘパリン複合体を得た。
【００４０】
１０ｍｌのキトサン−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）3−ＳＨ（ｐＨ７．０）に２ｍｌのｂＦＧＦ−ヘパリン複合体（ｐＨ７．４）を加え、ｐＨを５．０に調整後、２ｍｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を加え、窒素下、室温にて４時間反応させる。１週間の透析により、未反応のｂＦＧＦとヘパリンを除去し、最終反応物（キトサン−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）3−ｂＦＧＦ−ヘパリン）を得た。
【００４１】
上記により得られた、キトサン−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）3−ｂＦＧＦ−ヘパリン結合体をアミノ酸解析によって分析したところ、グルコサミン１４３２分子につき１分子の塩基性繊維芽細胞成長因子が導入されていることが示された（図１）。ｂＦＧＦの換算濃度は、３７．３μｇ/ｍｌである。
【実施例２】
【００４２】
実施例１で調製した本発明の化合物の細胞増殖効果を２種類の細胞を使用して評価した。軟骨細胞としては、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｌｅｒ社の「Ｈｕｍａｎ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｎｅｅ（ＮＨＡＣ−ｋｎ（登録商標））」、繊維芽細胞として、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ社の「Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｔｓ（ＮＨＤＦ（登録商標））」を使用した。
【００４３】
細胞増殖の評価としては、同人化学研究所の「Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８」を用いた。実施例１で調製した本発明の化合物５０μｌをＮＵＮＣ社の９６穴プレートに加え、１００μｌの軟骨細胞浮遊液（１．２７×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）、繊維芽細胞浮遊液（１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）をそれぞれ加え、２４時間、３７℃で培養する。培養後、ＷＳＴ−８を含む作業溶液を１０μｌ加え、３７℃で２時間培養後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、細胞増殖性を評価した。
【００４４】
本願発明の化合物によって、軟骨細胞および繊維芽細胞ともに、細胞の増殖が観察された。軟骨細胞の場合、本発明の化合物を１／１０に希釈した場合において最も細胞増殖性が認められた。繊維芽細胞の場合、本発明の化合物を１／１００に希釈した場合において最も細胞増殖が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、本発明のキトサン−ＣＨＮＨ＋−（ＣＨ２）3−ｂＦＧＦ−ヘパリン結合体のアミノ酸解析結果を示す。
【図２】図２は、軟骨細胞を用いた本発明の化合物の細胞増殖能の評価結果を示す。
【図３】図３は、繊維芽細胞を用いた本発明の化合物の細胞増殖能の評価結果を示す。
【図１】
2006104287.tif 000005
【図２】
2006104287.tif 000006
【図３】
2006104287.tif 000007