(57)【要約】【課題】本発明は、捕捉体に標的的物質結合する量と結合状態との詳細情報を得ることを目的とする。【解決手段】  基板上に形成された金属薄膜に固定された化学物質を、基板の法線に対し角度Θで入射される入射光を、基板の法線に対し−Θで受光する光学系と、化学物質が固定された面に対向する位置に化学物質による散乱光を受光する光学系とを配し、表面プラズモン共鳴により化学物質の量に関する情報を、ラマン散乱により、化学物質の結合状態に関する情報を同時に得るとともに、ラマン散乱を表面プラズモン共鳴により増幅することを特徴とする化学物質分析装置である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
少なくとも前記基板上の一方の面に形成された金属薄膜と、前記金属膜上に固定された化学物質と、
前記基板表面に対し、基板と鉛直方向から角度Θで入射される入射光を発する光源を含む第１の光学系と、
前記第１の光学系からの入射光を受けて前記基板と鉛直方向から−θで前記化学物質により反射される反射光を受光する第２の光学系と、
前記基板の前記化学物質が固定された面に対向する位置に前記化学物質による散乱光を受光する第３の光学系とを有し、
第２の光学系による表面プラズモン共鳴により前記化学物質の量に関する情報を、第３の光学系によるラマン散乱により、前記化学物質の結合状態に関する情報を同時に得るとともに、前記ラマン散乱を表面プラズモンにより増幅することを特徴とする化学物質分析装置。
【請求項２】
前記入射光と基板表面に入射する角度θを変化させたときに、前記第２の光学系の基板と鉛直方向の角度を−θに保持するように前記基板と前記第２の光学系を維持する回転手段を有することを特徴とする請求項１に記載の化学物質分析装置。
【請求項３】
前記基板による反射が、前記基板上に形成された回折格子によるものであることを特徴とする請求項1に記載の化学分析装置。
【請求項４】
前記基板による反射が、三角プリズムの第１の辺上に載置された基板に対し、前記入射光が、前記三角プリズムの第２の辺から入射され、前記第１の辺で反射し、前記第３の辺から前記反射光が出射されることを特徴とする請求項１に記載の化学分析装置。
【請求項５】
前記化学物質が、自己組織化膜、有機材料、無機材料又は捕捉体−標的物質複合体であることを特徴とする請求項１に記載の化学物質分析装置。
【請求項６】
前記捕捉体−標的物質複合体が、抗原抗体複合体又はＤＮＡ−ｃＤＮＡ複合体であることを特徴とする請求項４に記載の化学物質測定装置。
【請求項７】
基板と、少なくとも前記基板上の一方の面に形成された金属薄膜と、前記金属膜上に固定された化学物質と、前記基板表面に対し第１の角度Θで入射される入射光を発する光源を含む第１の光学系と、前記第１の光学系からの入射光を受けて前記基板から−θで前記化学物質により反射される反射光を受光する第２の光学系と、前記基板の前記化学物質が固定された面に対向する位置に前記化学物質による散乱光を受光する第３の光学系とを有する化学物質測定装置を用いた化学物質の測定方法であって、
前記第１の角度を変化させて、前記第２の光学系を用いてプラズモン共鳴角を求める工程と、
前記第１の角度をプラズモン共鳴角に固定し、前記第３の光学系を用いてラマン散乱を測定する工程とを有する化学物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属薄膜上に付着する化学物質の量と化学結合状態に関する情報を同時に得る化学分析装置およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子や固体の化学結合状態を調べる手法として確立されているものに、ラマン分光法がある。ラマン分光法は、物質に光を照射すると、分子の分極率が変化することにより生じる、励起光と異なる振動数を持つ散乱光を測定・解析し、分子の状態を調べる手法である。
【０００３】
特許文献１には、プリズム底面と金属表面との間に空隙を有するＯｔｔｏ配置で、金・銀・銅または白金表面の銅フタロシアニン（ＣｕＰｃ）分子のラマン散乱を、プラズモン共鳴条件下で測定すると、ラマン活性なピークが増強された極大値をとることが示されている。
【０００４】
特許文献２非特許文献１には、Ｋｒｅｔｃｈｍａｎｎ配置でゾルゲル法により形成したＴｉＯ2について、膜厚と結晶状態をプラズモン共鳴とラマン散乱を用いて測定した結果が開示されている。
【０００５】
一方、生物学的なリガンド−アナライト相互作用を利用して、特定の化合物を識別するセンサーが提案されている。血液中には、ガン・肝炎・糖尿病・骨粗しょう症など特定の疾患に対するマーカーが複数存在している。罹患した際には、平時より特定のタンパク質の濃度が増加する。これらを平時からモニターしておくことで、重大な病気を早期に発見することが出来るため、次世代の医療技術として期待されている。
【０００６】
センサーには、蛍光免疫法、プラズモン共鳴法、光干渉法など幾つかの方式があるが、どの場合もリガントをセンサー表面に固定し、検体中のアナライトを高感度にかつ選択性よく選別して結合することにより夾雑物を排除し、目的とするタンパク質のみを高効率に基板表面に固定化することが共通のステップとなる。
【０００７】
蛍光免疫法では、リガンド−アナライト複合体にさらに蛍光色素で標識した第２のリガントをさらに結合させ、蛍光色素を励起し、蛍光量を測定することでアナライトの濃度を測定する。プラズモン共鳴法では、金属プラズモンが界面物質の屈折率変化に高感度に反応することを利用して、金属薄膜や金属の微粒子の上に固定化されたリガンドに結合するアナライトの濃度を測定している。
【０００８】
例えば特許文献３には、回折格子を用いたプラズモン共鳴の測定手法が開示されており、抗原抗体反応の測定が示されている。これらセンサーでは、リガンドに吸着したアナライトの濃度の測定や、アナライトがリガントに吸着する反応速度などを測定することが出来る。しかしながら、どの部位が結合に関与しているのかという情報やどういうメカニズムで結合が生じているのかということは分からない。
【特許文献１】特開平０９−２５７５７８号公報
【特許文献３】特許第２５０２２２２号公報
【非特許文献１】Ａ．Ｂｒｉｏｕｄｅ、"Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｓｏｌ−ｇｅｌ  ｕｌｔｒａｔｈｉｎｆｉｌｍｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｐｏｌａｒｉｔｏｎｓ"、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｖｏｌ．８８，Ｎｏ．１１  ｐ．６１８７−６１９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
表面プラズモンとラマン散乱分光を同時におこなっている前記手法では、Ｏｔｔｏ配置ではプリズムと金属薄膜の空隙を厳密に制御する必要があり、Ｋｒｅｔｃｈｍａｎｎ配置ではサイズが大きくなり、工業製品として大量生産するには不向きであった。また、表面プラズモン共鳴法では、リガントにアナライトがどの程度結合するかという量を高感度に測定することは可能であるが、その結合状態を調べ、より詳細な情報を得ることは不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記に挙げた課題は、本発明の、基板と、少なくとも前記基板上の一方の面に形成された金属薄膜と、前記金属膜上に固定された化学物質と、前記基板表面に対し第１の角度Θで入射される入射光を発する光源を含む第１の光学系と、前記第１の光学系からの入射光を受けて前記基板から−θで前記化学物質により反射される反射光を受光する第２の光学系と、前記基板の前記化学物質が固定された面に対向する位置に前記化学物質による散乱光を受光する第３の光学系とを有し、第２の光学系による表面プラズモン共鳴により前記化学物質の量に関する情報を、第３の光学系によるラマン散乱により、前記化学物質の結合状態に関する情報を同時に得るとともに、前記ラマン散乱を表面プラズモンにより増幅することを特徴とする化学物質分析装置により解決される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、化学物質の量もしくは濃度を感度よく測定するのみならず、結晶状態など化学結合に関する情報も同時に得ることができるようになる。また。本発明を生物学的なセンサーであるリガント−アナライトの系に応用すると、吸着量のみならず結合に関する情報を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、図を参照しながら本発明に関わる実施形態につき述べる。ここでは本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明をおこなうが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
【００１３】
（第１の実施形態）
まず、本発明の第１の実施形態について、図１を参照しながら説明する。図１は、本実施形態の化学物質分析装置の概略構成を示す図で、基台１６上には樹脂製の基板１５が載置されている。基板１５は、表面に回折格子２５が形成され、少なくとも回折格子２５の表面には金属膜１４が形成されている。基板１５の法線方向からθの角度で設置された光源１１から発せられた入射光２３は、コリメートレンズ１２と偏光フィルター１３を介して、基板１５の回折格子２５に照射される。回折格子２５で回折された反射光２４は、基板１５の法線方向から−θの角度に反射し、基板１５の法線方向から−θの角度に配された、集光レンズ１８を介して検出器１９で検出される。
【００１４】
又、ラマン散乱光を検出するために、基板１５に対向して、集光レンズ２０、分光器２１、検出器２２がこの順で配置されている。
【００１５】
化学物質１７を固定する前にθを順次スキャンし、各角度における反射光２４の強度を測定することにより、表面プラズモン共鳴の測定をおこない参照となるプラズモン共鳴特性を測定する。次に回折格子表面の金属膜１４に化学物質１７を固定する。その後、同様のプロセスにより金属膜１４に化学物質を固定した状態での表面プラズモン共鳴の測定をおこなう。また、同時に基板１５対向して配された集光レンズ２０、分光器２１、検出器２２の構成により回折格子２５や吸着物質により散乱されたラマン散乱光の検出をおこない、吸着物質の結合状態を評価することが可能となる。
【００１６】
検出器１９は、反射光の強度を検出する光センサーで構成され、検出器２２は、分光器２１で各波長に分けられた反射光の波長ごとの強度を検出する光センサーである。
【００１７】
回折格子２５としては、ホログラフィー回折格子、ブレーズド回折格子２６、ブラッグ回折格子２７等を用いることができる。
【００１８】
本実施の形態では、金属膜１４に化学物質１７を固定した状態で、表面プラズモン共鳴状態で、ラマン散乱を測定すると通常のラマン散乱よりも１０2〜１０3増幅された状態でラマン散乱を観測することがでる。プラズモン共鳴状態は、表面プラズモン共鳴を測定し、得られた表面プラズモン共鳴角の状態でラマン散乱を検出することで得られる。この効果は、下記の実施の形態の場合でも同様の手順で測定を行なうことで得られることは言うまでもない。
【００１９】
（第２の実施形態）
次に本発明の第２の実施形態について、図２を参照しながら説明する。本実施形態ではプリズムを使用するので、図２（ｂ）を用いてプリズムを説明する。プリズムは直角プリズムを使用する。説明の便宜上、直角柱プリズム３７の各面をＡ、Ｂ、Ｃと名前を付ける。
【００２０】
直角プリズム３７のＡ面には、樹脂製の基板３５が配され、基板３５上に金属膜３６が形成され、金属膜上に化学物質３８が固定されている。更に、プリズムのＡ面の鉛直方向からθの角度に設置された光源１１から発せられた入射光２３は、コリメートレンズ１２、偏向フィルター１３を介して直角プリズム３７のＢ面にＡ面で全反射する角度で入射され、反射光２４は、直角プリズムのＣ面側に、Ａ面の鉛直方向から−θの角度に設置されている集光レンズ１８を介し光センサー２０に入射する。角度θをスキャンして実施例１と同様の手順で測定することで表面プラズモンの測定ができる。
【００２１】
また、ラマン散乱は、直角プリズム３７のＡ面の上側に設けられた集光レンズ２０、分光器２１を介し検出器２２により検出される。ラマン散乱も、上述の実施の形態と同様表面プラズモン共鳴状態で測定することで増幅されることは同様である。
【００２２】
（第３の実施形態）
次に本発明の第３の実施形態について、図３を参照しながら説明する。基台１６上には、表面に複数の回折格子が４行４列の行列状に形成された回折格子領域３４が形成されている。
【００２３】
基板１５の法線方向からθの角度で設置された光源１１から発せられた入射光２３は、集光レンズ（不図示）により集光された後、ビームエキスパンダー２８、偏光フィルター１３を介して基板１５上に形成された回折格子２５に照射される。この際に照射光は、ビームエキスパンダー２８によりビーム径を広げられているので、基板１６の少なくとも回折格子領域３４全面を照射する。
【００２４】
基板１５の回折格子上には金属膜１４が形成され、金属膜１４上に、化学物質１７が固定されている。
【００２５】
入射光はこの行列状に配置された回折格子領域全体を照射し、回折格子２５で回折された反射光が集光レンズ２９を介して、２次元光検出器３０に入射する。
【００２６】
基板１５に対向して集光レンズ３１、分光器３２を介し２次元光検出器３３が配されている。
【００２７】
回析格子１５で反射されたラマン散乱光および表面プラズモン共鳴光は共に２次元検出器に入射するので、島状の回折格子に異なった化学物質を固定することで複数の化学物質のラマン散乱光による解析と表面プラズモン共鳴光による解析を同時に行うことができる。回折格子毎に上述の実施の形態と同様の手順で測定を行なう。
【００２８】
ラマン散乱および表面プラズモン共鳴による解析は、θを順次スキャンし、各角度におけるラマン散乱光および表面プラズモン共鳴光の強度を測定することにより行う。
【００２９】
本実施の形態の場合、各格子の位置を分析装置に記憶させ、回折格子毎に、表面プラズモン共鳴を測定し、表面プラズモン共鳴の角度θの位置でラマン散乱を測定するようにあらかじめ化学分析装置をプログラムしておくことで分析を自動化できることは言うまでもない。
【００３０】
回折格子アレイ３４には、ホログラフィー回折格子、ブレーズド回折格子、ブラッグ回折格子をパターニングして用いる構成が好ましい。基板３５は、金属膜３６は、厚さ１００ｎｍ以下のＡｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、もしくはその合金や金属間化合物が好ましく用いられ、本構成ではＡｕ、Ａｇあるいはそれらの合金を選択して用いることがより好ましい。Ａｕ，Ａｇなどの材料は、自由電子が充分に存在し、ある特定の条件下でフォトンとカップリングが生じ、材料の表面に電荷の粗密波を生じさせる。材料表面に生じた電磁波により、局所電場が生じるので、センサとして用いることが可能となる。
【００３１】
第１〜３の実施の形態で使用される光源１１は、波長が２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲のレーザーダイオードまたはガスレーザを選択して用いることができる。光源１１の波長は、解析する化学物質のラマン散乱が、効率よく生じる波長のものを選択して用いればよい。コリメートレンズ１２は、非球面レンズ、セルフォックレンズ、平凸もしくは両凸レンズ群、顕微鏡用対物レンズなどを用いることが出来る。
【００３２】
偏光フィルター１３は、偏向光だけを入射したいという理由で、消光比が高いものを用いることが好ましく、消光比１０-3以上が好ましい。１４の金属膜としてはＡｕ、Ａｇ，Ｃｕ、Ａｌあるいはその合金などの金属が用いることができる。本構成では、Ａｕ、Ａｇあるいはそれらの合金を選択して用いることがより好ましい。
【００３３】
回折格子を形成する基板１５は、樹脂製の基板でよく、樹脂の材質としては、透明でかつ可塑性であれば良く、本実施形態ではエポキシ樹脂を用いた。基板１６は、ガラス、シリコン、樹脂などを用いられるが、本構成では、製造コストを下げられるという理由で、表面研磨したガラスを用いることが好ましい。解析対象となる化学物質１７は、抗原抗体複合体、ＤＮＡ−ｃＤＮＡ複合体、自己組織化膜、各種有機材料、各種無機材料が解析可能である。集光レンズ１８は、平凸シリンダーレンズ、平凹シリンダーレンズ、非球面レンズ、平凸もしくは両凸球面レンズ群、顕微鏡用対物レンズ、セルフォックレンズを用いることが出来る。本構成では、製造コストを下げられるという理由で、平凸シリンダーレンズまたは平凹シリンダーレンズを用いることが好ましい。光センサー１９および光センサー２２は、各種フォトダイオード、低ノイズＣＣＤ、光電子増倍管などを用いることができ、反射光の強度によって適宜選択すればよい。集光レンズ２０は、Ｆ値の小さなカメラ用レンズが用いられる。分光器２１は、ツェルニターナ型のダブルモノクロメータ、トリプルモノクロメータ、高分散プリズム、誘電体フィルターなどを用いることができる。本構成では、高分解能であるという理由で、ツェルニターナ型モノクロメータもしくは誘電体フィルターを用いる構成が好ましい。回折格子２５は、ホログラフィー回折格子、ブレーズド回折格子、ブラッグ回折格子を選択して用いることができる。ビームエキスパンダー２８は、センシング領域にコリメート光が均一に照射されるものを用いることが好ましい。集光レンズ２９は、集光レビームエキスパンダーリンダーレンズ、平凹シリンダーレンズ、非球面レンズ、平凸もしくは両凸球面レンズ群、顕微鏡用対物レンズ、セルフォックレンズ、カメラ用レンズを用いることが出来る。本構成では、高解像度で画像を取り込みたいという理由で、カメラ用の高解像タイプのレンズを用いることが好ましい。
【００３４】
基板上に複数の回折格子を形成する場合、検出器として、２次元光検出器を用いることが好ましく、二次元光検出器３０、３３としては、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイを用いることができる。光学系３１，３２，３３は、ラマン散乱光の二次元イメージングが可能である構成が好ましく、フォトダイオードアレイやＣＣＤアレイを用いることが好ましい。
【００３５】
プリズムを用いる構成の場合、基台には、各種ガラス材料を用いることができる。本構成では、プリズムと屈折率が実質的に同じ物を用い、プリズムとの密着にはインデックスマッチングオイルを用い間隙の屈折率もプリズムの屈折率と同じになるようにすることが好ましい。
【００３６】
プリズム３７は、屈折率１．４〜２．０の材料を用い、Ａ面の精度がλ／４以上であり、Ｂ，Ｃ面には反射防止コーティングが施してあるものが好ましい。
【実施例】
【００３７】
以下本発明の実施例を述べるが、本発明はここに記述した内容だけに制限を受けるものではない。
（実施例１）
図６を参照しながら説明する。出射側の第１の光学系は、光源１１、コリメータレンズ１２および偏光フィルター１３をこの順に並べ盤上に固定する。光源１１は、三洋電機製、ＤＬ３０３８−０３３レーザーダイオード、コリメートレンズ１２は、シグマ光機製、平凸レンズ５ｍｍφおよび偏光フィルター１３は、平凸レンズ（シグマ光機製、平凸レンズ５ｍｍφ）を用い、１３の偏光フィルターは、シグマ光機製、ＳＰＦ−３０Ｃ−３２可視光偏光フィルターを用いた。
【００３８】
表面プラズモン共鳴を解析する反射光を受光する第２の光学系は、反射光を受光する側から、集光レンズ１８、光センサー１９をこの順に並べ、アーム３９に固定した。集光レンズ１８は、シグマ光機製、平凸レンズ５ｍｍφを、光センサー１９は、アドバンテスト製、ＴＱ８２１０  パワーメータを用いた。
【００３９】
ゴニオメータ３８は、シグマ光機製、ＳＫＩＤＳ−６０ＹＡＷ（θｚ）−Ａθ（Ｖｅｒ２．０）２軸小型自動回転ステージを用いた。
【００４０】
ゴニオメータ３８上に、基板を介して回折格子２５を設けた。回折格子２５は、エドモンドオプティクス製、格子周波数１２００本／ｍｍ、ブレーズ波長７５０ｎｍ、サイズ１２．５ｘ１２．５ｍｍの反射型のブレーズド回折格子を用いた。回折格子の表面には、厚さ５０ｎｍの金の薄膜が形成され、金の薄膜上に、測定しようとする化学物質を固定化させて用いた。
【００４１】
基板上には、ラマン散乱による解析を行う為の第３の光学系が配されている。第３の光学系は、基板側から、集光レンズ２０、分光器２１および検出器２２が配され、検出器２２のデータを計測する計測装置が検出器２２に接続されている。集光レンズは、Ｆ値の小さな明るいレンズを用いた。分光器２１と検出器２２とデータ計測装置４１は、浜松フォトニクス社製、ＰＭＡ１１  マルチチャネル検出器を用いた。
【００４２】
まず参照用として、回折格子２５の金の薄膜に化学物質を固定化させず、表面プラズモン共鳴を測定する。測定では、入射光学系とラマン散乱測定光学系の角度をθに、入射と反射光学系の角度を２θに保つようにして、角度をスキャンして測定をおこなった。
【００４３】
得られたプラズモン共鳴特性は、図７（ａ）のようになる。次に、回折格子表面の金の薄膜に銅フタロシアニン（ＣｕＰｃ）を固定化し、プラズモン共鳴特性、ならびにラマン散乱を測定する。プラズモン共鳴では、図７（ｂ）のような特性が得られ、共鳴角のシフト量からＣｕＰｃの膜厚が求められる。次に、プラズモン共鳴を起す角度で、ラマン散乱スペクトルを測定する。ラマン散乱スペクトルでは、ラマン活性なバンド１５３０ｃｍ-1，１４５５ｃｍ-1，１３４５ｃｍ-1が確認された。
【００４４】
（実施例２）
ゾルゲル法により得られたＴｉＯ２を、ディップコート法により形成し、約１００℃で乾燥させる。さらに、結晶化処理の為、酸素雰囲気下で約６５０℃の熱処理をおこない回折格子上の金の薄膜に固定し、実施例１で用いた光学系を用い、実施例１と同様の手順で、プラズモン共鳴とラマン散乱分光の測定をおこなった。
【００４５】
プラズモン共鳴法により、膜厚が５ｎｍであることを確認することができた。さらにラマン散乱スペクトルにより、アナターゼ由来とされる活性バンド（１４４ｃｍ-1，３９５ｃｍ-1，５１４ｃｍ-1）を確認し、結晶状態を評価することができた。
【００４６】
（実施例３）
環状ペプチドであるオキシトシン水溶液を回折格子上の金の薄膜に固定し、実施例１で用いた光学系を用い、実施例１と同様の手順で、プラズモン共鳴とラマン散乱分光の測定を
おこなった。
【００４７】
プラズモン共鳴法により、濃度が１０μｇ／ｍＬであることを確認することができ、さらにラマン散乱スペクトルにより、活性バンド（１２６０ｃｍ-1（アミド結合）、１３４７ｃｍ-1（Ｃ−Ｈ）、１４５５ｃｍ-1（Ｃ−Ｈ2））を確認し、化学結合状態を評価することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の実施形態１を表す図である。
【図２】本発明の実施形態２を表す図である。
【図３】本発明の実施形態３を表す図である。
【図４】本発明の実施例を説明するための図である。
【図５】本発明の実施例を説明するための図である。
【符号の説明】
【００４９】
１１  光源
１２  コリメートレンズ
１３  偏光フィルター
１４  金属膜
１５  基板
１６  基台
１７  化学物質
１８  集光レンズ
１９  検出器
２０  集光レンズ
２１  分光器
２２  検出器
２３  入射光
２４  反射光
２５  回折格子
２７  回折格子
２８  ビームエキスパンダー
２９  集光レンズ
３０  ２次元光検出器
３１  集光レンズ
３２  分光器
３３  ２次元光検出器
３４  回折格子アレイ
３５  基板
３６  金属膜
３７  プリズム
３８  ゴニオメータ
３９  アーム
４０  アーム
４１  計測装置
【図１】
2006308511.tif 000003
【図２】
2006308511.tif 000004
【図３】
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【図４】
2006308511.tif 000006
【図５】
2006308511.tif 000007