(57)【要約】【課題】  非特異的吸着を抑制して、検出すべき特異的吸着によるシグナルを高精度で検出できる表面プラズモン共鳴センサ用チップを提供する。【解決手段】  表面プラズモン共鳴センサ用チップは、金薄膜の上に測定物を配置し、前記金薄膜の前記測定物を配置した側と反対側の面に光を入射し、前記金薄膜で反射された反射光を観測し、前記測定物によって前記金薄膜に生じる表面プラズモン共鳴を測定する表面プラズモン共鳴センサ用チップであって、支持体の上に設けられた金薄膜と、金と結合可能な官能基を両端に有し、一方の前記官能基によって前記金薄膜と結合し、他方の官能基を前記金薄膜とは反対側に向けて前記金薄膜の表面に配置された架橋剤からなる層と、前記架橋剤の前記他方の官能基によって結合され、測定物を付着可能な金コロイド粒子とを備える。【選択図】      図１１
2006308321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金薄膜の上に測定物を配置し、前記金薄膜の前記測定物を配置した側と反対側の面に光を入射し、前記金薄膜で反射された反射光を観測し、前記測定物によって前記金薄膜に生じる表面プラズモン共鳴を測定する表面プラズモン共鳴センサ用チップであって、
支持体の上に設けられた金薄膜と、
金と結合可能な官能基を両端に有し、一方の前記官能基によって前記金薄膜と結合し、他方の官能基を前記金薄膜とは反対側に向けて前記金薄膜の表面に配置された架橋剤からなる層と、
前記架橋剤の前記他方の官能基によって結合され、測定物を付着可能な金コロイド粒子と
を備えたことを特徴とする表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項２】
前記架橋剤は、両端の官能基がそれぞれ硫黄を含む官能基であることを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項３】
前記金コロイド粒子は、平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍの範囲内であることを特徴とする請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項４】
光源と、
請求項１から３のいずれか一項に記載の前記表面プラズモン共鳴センサ用チップと、
前記光源から前記センサ用チップに光を入射させる導光手段と、
前記センサ用チップからの反射光を観測する観測手段と
を備えたことを特徴とする表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項５】
金薄膜の上に測定物を配置し、前記金薄膜の前記測定物を配置した側と反対側の面に光を入射し、前記金薄膜で反射された反射光を観測し、前記測定物によって前記金薄膜に生じる表面プラズモン共鳴を測定する表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法であって、
支持体の上に金薄膜を設けるステップと、
前記金薄膜の表面を、官能基を両端に有する架橋剤を含む液体に浸漬処理するステップと、
前記架橋剤への浸漬処理後、さらに前記金薄膜を、金コロイド粒子懸濁液に浸漬処理するステップと
を含むことを特徴とする表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法。
【請求項６】
前記架橋剤は、硫黄を含む官能基を両端に有することを特徴とする請求項５に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法。
【請求項７】
前記金コロイド粒子懸濁液は、１０１０個／ｍｌ〜１０１２個／ｍｌの範囲の粒子濃度を有することを特徴とする請求項５又は６に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の化学種、生化学種又は生物種を定性的、又は定量的に検出するための表面プラズモン共鳴センサ用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子等の生理活性物質間の相互作用を評価する試みが数多くなされている。その多くは、測定物としての生理活性物質を固相に固定化し、その測定物と相互作用すると考えられる反応物である生理活性物質を与えて、これらの生理活性物質間の相互作用を観察する。このとき、後者の反応物には蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質を結合させておき、ラベル物質を検出することで生理活性物質間の相互作用を評価する。しかし、ラベル操作は非常に煩雑であるとともに定量性に欠ける。また、相互作用をリアルタイムで観察するのは非常に困難である。最近では、ラベル物質が不要でかつ定量性があり、リアルタイムで評価可能な分析方法として、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）が注目を集めている。表面プラズモン共鳴法では、測定物である生理活性物質を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニタし、反応物との相互作用を共鳴角もしくは反射光強度の変化で測定する。
【０００３】
一般的な表面プラズモン共鳴センサでは、薄く蒸着した金フィルム上にカルボキシル化デキストランマトリックスが形成された基板上に核酸や、測定物としてペプチド、抗体などを固定して表面プラズモン共鳴シグナルの測定が行われる。なお、金属表面に複数の生理活性物質をアレイ状に作成し、２次元表面プラズモン共鳴法で複数アゴニストとアンダコニストの相互作用解析を行う方法も知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
表面プラズモン共鳴センサにおいて、これまで検出感度を上げる為の工夫は様々な方法で試みられている。表面プラズモン共鳴活性表面と試験溶液を接触させる場合、試験溶液にコロイド状のナノ粒子を付随させシグナルの増強を図っている場合もある（例えば、特許文献２、特許文献３参照。）。この場合、反応物側にコロイド粒子を付随させている為、シグナルの増加と共に非特異的吸着に起因するバックシグナルも増加するのでＳ／Ｎ比が十分に得られない可能性がある。
【０００５】
一方、金属基板の制限をなくし、通常の基板（ガラスやシリコン基板）に金属微粒子を固定し、局在化プラズモン共鳴法（ＬＰＲ）を用いたセンサも示されている（例えば、特許文献４、特許文献５参照。）。ＬＰＲでは、表面プラズモン共鳴と比較して感度面では同等であるが、低価格でセンサが作成できる、小型化ができるなどの利点を挙げている。
【０００６】
金属表面に金属粒子を固定した場合の表面プラズモン共鳴センサ、又はＬＰＲセンサの感度について報告がある（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。これらの報告では、金属表面に金属粒子を固定した場合、感度は低くなると述べられている。
【０００７】
表面プラズモン共鳴センサの感度向上の為には、測定におけるシグナル変化の増加を図る一方、測定物以外の場所に反応物が付着することによる非特異的吸着などによるバックシグナルを低くすることによりＳ／Ｎ比を上げることが重要である。しかし、上記従来技術では、感度の向上についての試みはされていても現実には成功していない。
【０００８】
また、近年、細胞内シグナル伝達に関する研究は飛躍的に進歩しており、様々な種類のプロテインキナーゼが複雑に関連しあいながら、シグナル伝達経路において重要な役割を果たしていることが知られている。これらプロテインキナーゼの活性を網羅的に解析し、その細胞内における動態を一度にプロファイリングすることができれば、細胞生物学、薬学の基礎的研究はもとより、創薬開発、臨床応用などの分野においても大きく寄与しうるものと期待されている。しかし、簡便で効率よく数々のプロテインキナーゼにおける動態データを同時にプロファイリングできるような技術は未だ確立されていない。
【０００９】
さらに、バイオ分野の生体分子相互作用解析に注目が集まっており、表面プラズモン共鳴法によるラベルフリーかつリアルタイム解析から動態データを得る試みがなされている。動態データは、結合、解離、反応などの速度を解析して得られ、平衡状態のみを評価する場合に比べて生体分子の機能を明らかにする上で非常に有用な情報となる。サンプル液中の測定対象の反応物が、金属表面上に固定化された測定物と結合すると、表面近傍の反応物の濃度が薄くなり、濃度勾配が生じる。動態データ測定においては、反応物が吸着飽和するまで、反応物が金属表面上の測定物に吸着する速度を経時的に測定する。その場合、表面の反応物の濃度は一定である必要がある。表面での反応物の濃度が変動すると、正確な動態データが得られないために好ましくない。そこで、濃度勾配を極力低減させる方法として、サンプル液を流し続ける方法や、攪拌する方法が一般的である。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６１２７１２９号
【特許文献２】特開２００２−２６７６６９号公報
【特許文献３】特表２００３−５１４２２４号公報
【特許文献４】特許第３３８０７４４号
【特許文献５】特開平１０−１６０７３７号公報
【非特許文献１】Ｗ．Ｒ．Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ．ａｌ，  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １９８３，１５  Ｊｕｎｅ，７７６５−７７６８
【非特許文献２】Ｔ．Ｋｕｍｅ  ｅｔ．ａｌ，  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ,  Ｖｏｌ．９３, Ｎｏ．２  ｐｐ１７１−１７５, １９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
表面プラズモン共鳴センサにおいて、感度向上の為には、シグナル変化の増強と共に、測定物以外の場所に反応物が付着することによる非特異的吸着などによるバックシグナル（ノイズ）を下げる工夫が必要である。特にサンプルが細胞抽出液や血液などの場合、非特異的吸着によるバックシグナルノイズやネガコントロールシグナルの上昇が顕著に見える場合がある。このような非特異的吸着を抑制するためにブロッキング剤を用いることが行われている。しかし、金表面に生体物質を固定する場合、対象が核酸、抗体、ペプチド、蛋白などのように大きさや立体構造が広範囲にわたるため、１種類のブロッキング剤で非特異的吸着を抑制することは困難である。また、２種類以上のブロッキング剤を使用する方法もあるが、センサ用チップの製造工程が複雑になりコストも高くつく。
【００１２】
本発明の目的は、非特異的吸着を抑制して、検出すべき特異的吸着によるシグナルを高精度で検出できる表面プラズモン共鳴センサ用チップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る表面プラズモン共鳴センサ用チップは、金薄膜の上に測定物を配置し、前記金薄膜の前記測定物を配置した側と反対側の面に光を入射し、前記金薄膜で反射された反射光を観測し、前記測定物によって前記金薄膜に生じる表面プラズモン共鳴を測定する表面プラズモン共鳴センサ用チップであって、
支持体の上に設けられた金薄膜と、
金と結合可能な官能基を両端に有し、一方の前記官能基によって前記金薄膜と結合し、他方の官能基を前記金薄膜とは反対側に向けて前記金薄膜の表面に配置された架橋剤からなる層と、
前記架橋剤の前記他方の官能基によって結合され、測定物を付着可能な金コロイド粒子と
を備えたことを特徴とする。
【００１４】
また、前記架橋剤は、両端の官能基がそれぞれ硫黄を含む官能基であることが好ましい。
【００１５】
前記金コロイド粒子は、平均粒子径が１ｎｍ〜１μｍの範囲内であることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る表面プラズモン共鳴センサは、光源と、
前記表面プラズモン共鳴センサ用チップと、
前記光源から前記センサ用チップに光を入射させる導光手段と、
前記センサ用チップからの反射光を観測する観測手段と
を備えたことを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る表面プラズモン共鳴センサの製造方法は、金薄膜の上に測定物を配置し、前記金薄膜の前記測定物を配置した側と反対側の面に光を入射し、前記金薄膜で反射された反射光を観測し、前記測定物によって前記金薄膜に生じる表面プラズモン共鳴を測定する表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法であって、
支持体の上に金薄膜を設けるステップと、
前記金薄膜の表面を、官能基を両端に有する架橋剤を含む液体に浸漬処理するステップと、
前記架橋剤への浸漬処理後、さらに前記金薄膜を、金コロイド粒子懸濁液に浸漬処理するステップと
を含むことを特徴とする。
【００１８】
前記架橋剤は、硫黄を含む官能基を両端に有することが好ましい。
【００１９】
前記金コロイド粒子懸濁液は、１０１０個／ｍｌ〜１０１２個／ｍｌの範囲の粒子濃度を有することが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る表面プラズモン共鳴センサ用チップでは、金薄膜表面に架橋剤を用いて金コロイド粒子を固定しており、金コロイド粒子の表面に測定物である生理活性物質を固定する。このチップ上に測定物と相互作用する反応物を供給することによって、金コロイド粒子の表面に固定した測定物と反応物との相互作用による表面プラズモン共鳴のシグナル変化を得る。一方、金薄膜上には架橋剤を結合させているので、架橋剤がブロッキング剤の役割を果たすため、反応物は測定物以外の箇所への非特異的吸着が抑えられる。そこで、表面プラズモン共鳴シグナルの解析において非特異的吸着の低減によりＳ／Ｎ比が向上する。特に血液や細胞抽出液等の非特異的吸着が生じやすい反応物を対象とする測定において、顕著な感度向上が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴センサ及び該センサに用いるセンサ用チップ１０について添付図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２２】
実施の形態１
図１は、本発明の実施の形態１に表面プラズモン共鳴センサ５０の構成を示す概略図である。この表面プラズモン共鳴センサ５０は、表面プラズモン共鳴センサ用チップ１０と、光源１と、光源１からセンサ用チップ１０へ光を導く導光手段と、センサ用チップ１０から出射した光を観測する観測手段２０とを備える。
【００２３】
次に、この表面プラズモン共鳴センサ５０の詳細な構成について説明する。まず、光源には白色光源であるハロゲンランプ１を用いる。球面平凸レンズ２ａをレンズの平面側をハロゲンランプ１に向けて設置し、光源１からの光を平行光とする。前記球面平凸レンズ２ａからさらにもう一つの球面平凸レンズ２ｂの球面側を光源１に向けて設置する。この球面平凸レンズ２ｂによって集光され、その位置にピンホール３を置いて光束をピンホール３に通し、ピンホール３から平凸レンズ４によって再度平行光とし、近赤外偏光フィルタ５によって偏光平行光束を得る。この偏光平行光束を６０°分散プリズム（屈折率ｎＤ＝１．７２８：一辺２５ｍｍ、頂角６０°）に導入する。プリズムは、上記センサ用チップ１０の支持体であるＬａｋ１０スライド（屈折率ｎＤ＝１．７２０、１８ｍｍ角、厚さ２ｍｍ：松浪硝子工業社製）とマッチングオイル（カーギル社製Ｍシリーズ、屈折率ｎＤ＝１．７２０）を用いて接触させる。センサ用チップ１０で反射され、プリズム６を介して出射する反射光束を８３０ｎｍの光干渉フィルタ１１によって８３０ｎｍ近傍の波長光を取り出し、ＣＣＴＶレンズ１２を介して３／４インチ近赤外ＣＣＤカメラ１３で観察する。なお、球面平凸レンズ２ａ、２ｂ、４、ピンホール３、及び、近赤外偏光フィルタ５によって光源１からセンサ用チップ１０へ光を導く導光手段を構成する。また、光干渉フィルタ１１、ＣＣＴＶレンズ１２、及びＣＣＤカメラ１３によってセンサ用チップ１０から出射する光を観測する観測手段２０を構成する。また、プリズム６は、センサ用チップ１０の支持体（Ｌａｋ１０スライド）と接触して設けられ、センサ用チップ１０へ光を入射させるとともに、センサ用チップ１０で反射して出射する光を観測手段２０へ導く。
【００２４】
また、この表面プラズモン共鳴センサ用チップ１０は、プリズム６とマッチングオイルで接触させた支持体のガラス（例えば、Ｌａｋ１０スライド）と、ガラス上に設けられた金薄膜７と、金薄膜７の上に結合させた架橋剤からなる層と、架橋剤を介して固定された金コロイド粒子とを備える。なお、プリズム６と支持体のガラスとは分離した構成のものを例として挙げているが、これらは一体的に構成されていてもよい。また、測定物の生理活性物質は、金コロイド粒子の上に固定される。この測定物と相互作用する反応物がこのセンサ用チップ１０上に供給され、測定物と反応物との相互作用によって金薄膜７に生じる表面プラズモン共鳴を観測することができる。
【００２５】
以下にこのセンサ用チップ１０の各構成要素について説明する。
まず、金薄膜を支持する支持体は、入射する光について透明であることが好ましく、透明なガラスがより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、一定の強度を有すると共に、可視光領域を含む広範囲の波長域にわたって透明であり、表面プラズモン共鳴の測定に極めて適している。また、上述のように、支持体のガラスが上記プリズムの機能を有していてもよい。
【００２６】
次に、支持体の上に設ける金薄膜７は、酸・アルカリ・有機溶媒などに対して非常に安定であるため好ましい。なお、金はこの表面プラズモン共鳴法で多用される物質である。また、支持体の上に金薄膜を形成する方法としては、金薄層をコーティングする方法が好ましい。金薄膜をコーティングする方法は、特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金薄膜の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金薄層の厚さは特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金薄層の剥離を抑制するため、厚さ０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム薄膜やチタン薄膜を予め透明基材の上にコーティングしておいてもよい。なお、蒸着法、又はスパッタリング法によってクロムを厚さ１ｎｍ、金を厚さ４５ｎｍで積層させたものが表面厚みのムラがなく、金薄膜が剥がれ落ちにくいために好ましい。
【００２７】
金薄膜の表面に結合させる架橋剤としては、両端に金と結合可能な官能基、例えば、硫黄を含む官能基を有するものが好ましい。この硫黄を含む官能基としては、例えばメルカプト基がある。具体的な架橋剤としては、ジチオール化合物又はジスルフィド化合物が好ましい。金薄膜の表面に上記架橋剤を結合させておくことによって金コロイド粒子を固定できると共に、測定物を金コロイド粒子の上に固定するために介在させるアミノ基等が金薄膜の上に吸着することを防止できる。これによって、測定物と相互作用させる反応物が金薄膜上に吸着する非特異的吸着を防止できる。また、ジチオール化合物は金薄膜の表面を化合物が形成する非イオン性物質として吸着固定されるため、反応物の非特異的吸着を抑制することができる。
【００２８】
金コロイド粒子は、平均粒径が１ｎｍ〜１μｍの範囲内にあることが好ましい。金コロイド粒子は、クエン酸ナトリウムを還元剤として用いる製造方法（例えば、Frents,:Nature Physical Sci. 241, ｐｐ20-22, (1973)）や、クエン酸ナトリウム及びタンニンを用いる製造方法（例えば、J.W.Slot, H.T.Geuze, :Eur. J. Cell. Biol. 38, ｐｐ87-93, (1985)）等によって製造することができる。前者の方法では、還元剤であるクエン酸ナトリウムの添加量によってコロイド粒子の直径を制御する。還元剤の添加量が少ないほど直径が大きくなる。なお、これらの方法以外にも、例えば、特開昭５５−１５１００号公報、特開平４−１４２４６０号公報、特開平４−２２１７６１号公報記載の方法等によっても製造できる。一般的な作成方法では通常球形となるが、本発明は金コロイドの形状に限定されるものではない。大きさは可能な限り小さい方が表面積を大きくする上で好ましい。現状で製造できる最小平均粒径は２ｎｍ程度である。なお、クエン酸ナトリウムを還元剤として用いる場合には、金コロイド粒子はクエン酸で被覆され、クエン酸がブロッキング剤として機能するため、金コロイド表面に導入されたアミノ基以外の箇所への反応物の吸着は抑制される。
【００２９】
具体的な金コロイド粒子溶液の製造方法は、例えば０．０１〜５％塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）の水溶液１０００容量部に煮沸した０．１〜５％クエン酸ナトリウム２〜１０容量部を素早く加え、さらに１５分間程煮沸した後、室温で冷却する方法が好ましい。
【００３０】
製造した金コロイド粒子溶液の濃度は、吸光度で正確に測定できる。この場合、０．３ｍＭの塩化金酸の波長２９０ｎｍにおける吸光度は０．８７８±０．００９であるので、これを基準として金コロイド粒子溶液の濃度を測定できる。なお、通常、金コロイド粒子溶液は、保存中の凝集を防ぐ為高濃度溶液状で保存する。使用前に、最適濃度となるように、高濃度金コロイド粒子溶液を滅菌水で希釈して使用する。希釈後の混合は、スターラで混合すると、金コロイド粒子と回転子が接触し金コロイド粒子の凝集が加速されるので、手で軽く振る程度としスターラなどで混合しないことが好ましい。
【００３１】
また、金コロイド粒子は、架橋剤を介して固定されている。金コロイド粒子は、金薄膜上にチオール化合物もしくはジスルフィド化合物を用いて、金−硫黄の結合を利用して固定されている。
【００３２】
金コロイド粒子上に固定する測定物である生理活性物質としては、成長因子レセプタ、ホルモンレセプタ、神経伝達物質レセプタ、カテコールアミンレセプタ、アミノ酸誘導体レセプタ、サイトカインレセプタ、細胞外マトリックスレセプタ、抗体、レシチン、サイトカイン、セルピン、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、転写因子、ＤＮＡ結合蛋白、細胞内シグナル伝達モジュレータ、及びエフェクタ、アポトーシス関連因子、ＤＮＡ合成因子、ＤＮＡ修飾因子、ＤＮＡ組換え因子、細胞表面抗原などを用いることができる。
【００３３】
測定物である生理活性物質は、複数の生理活性物質の相互作用を測定するために、アレイ状にすることが好ましい。金薄膜の上に架橋剤を介して固定した金コロイド粒子上に蛋白質もしくはペプチドを固定化し、２次元表面プラズモン共鳴法によって蛋白質もしくはペプチドが固定化された部位の抗体結合による反射光強度変化をリアルタイムで解析することにより、正確な動態データを測定することができる。
【００３４】
金コロイド粒子へ測定物である生理活性物質を固定化するには、まず、金コロイド粒子表面に官能基を導入する。官能基の種類としては、金コロイド粒子に所望の生理活性物質を固定できる物であればいかなる種類であってもよいが、アミノ基又はメルカプト基を使用することが好ましい。アミノ基は、特にアスパラギン酸、グルタミン酸等が一次構造に含まれる生理活性物質あるいは抗体、核酸などの生体関連物質のカルボキシ末端に対して、強固な結合を呈するという点で好ましい。一方、メルカプト基は、特にシステイン、メチオニン等が一次構造に含まれる生理活性物質に対して強固な結合を呈する点で好ましい。
【００３５】
金コロイド粒子の表面に官能基を導入するには、金コロイド粒子を固定した金薄膜上に、所望の官能基を有する試薬を分注するか、試薬中に金コロイド粒子を固定した金薄膜を浸漬すればよい。反応時間は、官能基の濃度と種類によるが、通常、室温３０分〜２時間程度でよい。官能基導入後、生理活性物質をピペットや自動スポッターを用いアレイ上にスポットし、室温で官能基と反応させ固定する。反応時間は、測定物である生理活性物質の種類によるが、長時間にわたっても問題ない。
【００３６】
次に、測定対象となる測定物と反応物との相互作用の例として、プロテインキナーゼによるリン酸化と、プロテアーゼによる加水分解の２つの場合を挙げる。
１）まず、プロテインキナーゼによるリン酸化を測定する場合には、各キナーゼに特異的な基質プローブを多種類用いることにより、細胞抽出液中の対象キナーゼがアレイ状の各プローブをリン酸化する。そこで、リン酸化された各プローブを抗リン酸化抗体と反応させることにより、２次元表面プラズモン共鳴法でシグナル変化をモニタして、プロテインキナーゼによるリン酸化を測定する。
２）また、プロテアーゼによる加水分解を検出する場合には、上記の場合と同様に、各プロテアーゼに特異的な切断配列を有するペプチドプローブを合成し、片末端にビオチンを導入する。細胞抽出液と反応すると、プロテアーゼにより切断反応を受けたペプチドプローブでは、ビオチン部位が除去されるため、その後、アビジンで処理することにより、２次元表面プラズモン共鳴シグナルを用いて切断反応を受けたプローブと受けなかったプローブの識別ができる。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明の実施例に係る表面プラズモン共鳴センサ用チップ及び該センサ用チップを用いた表面プラズモン共鳴法によるプロテインキナーゼによるリン酸化の検出について、具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３８】
（金コロイド粒子溶液の製造方法）
金コロイド粒子溶液は、以下のようにして製造することができる。
まず、０．３０ｍＭ塩化金酸２４３ｍｌを１５分間煮沸させる。そこへ３８．８ｍＭクエン酸ナトリウム７．５ｍｌを素早く加え、１５分間煮沸を続ける。液の色は初め青色であるが、やがて明るいワインレッドに変わる。これにより平均粒径１５ｎｍの金コロイド粒子溶液ができる。なお、濃度等の製造条件を変えることで平均粒径を変化させることができる。
【００３９】
（金コロイド粒子溶液の濃度の測定方法）
製造した金コロイド粒子溶液の濃度は、吸光度で正確に測定できる。０．３ｍＭの塩化金酸の波長２９０ｎｍにおける吸光度は０．８７８±０．００９である。これを基準として金コロイド粒子溶液の濃度を算出する。
【００４０】
（金コロイド粒子サイズ測定方法）
金コロイド粒子溶液中の金コロイド粒子の平均粒径は、以下の手順で測定できる。
（ａ）フィルムバール膜を張った銅のグリッドを１０％ＢＳＡ−ＰＢＳの小滴の上に５分間浮かべる。この時、膜側が溶液につくようにする。
（ｂ）グリッドをピンセットではさみ、蒸留水を入れた洗浄瓶からのジェット水流で液のついた側だけを洗う。
（ｃ）グリッドをテストする金コロイド溶液の小滴の上に浮かべて５分間静置する。
（ｄ）金コロイド粒子を付着させたグリッドを蒸留水のジェット水流で洗い、濾紙の上で乾燥する。
（ｅ）電子顕微鏡で直接倍率８０，０００倍の写真を撮る。これを引き伸ばして、最終倍率４０万倍の陽画を得る。
（ｆ）陽画中に含まれる数百個の金コロイド粒子の直径をそれぞれ測定する。
（ｇ）直径について０から最大値の間を等間隔に１０以上１６以下のクラスに分けて、クラスごとの出現頻度（％）を縦軸とし、横軸に直径（ｎｍ）に取り、クラスごとにブロットして、ヒストグラムを作る。
（ｈ）全体の分布から平均粒径ｄを求める。
以上によって、金コロイド粒子溶液中の金コロイド粒子の平均粒径を求めることができる。
【００４１】
実施例１
本発明の実施例１では、センサ用チップの金薄膜上に固定した金コロイド粒子の上にプロテインキナーゼを認識するペプチドを固定したアレイを用いて、アレイ上における生理活性物質間の相互作用を２次元表面プラズモン共鳴法により検出することで、様々なプロテインキナーゼ動態の迅速な解析を試みた。
【００４２】
この表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法について、図１０及び図１１を用いて説明する。
（ａ）支持体として１８ｍｍ四方で厚さ２ｍｍのＬａｋ１０スライド（屈折率１．７２、松浪硝子工業社製）を用意した。
（ｂ）この支持体であるＬａｋ１０スライド（透明基板）の上に厚さ３ｎｍのクロム薄膜を蒸着した後、その上に厚さ４５ｎｍの金薄膜を蒸着した。
（ｃ）上記金薄膜を蒸着したＬａｋ１０スライドを５ｍＭジチオール溶液（アルコールで溶解）に１．５時間以上浸漬した。これにより金薄膜の表面に架橋剤としてのジチオールを結合させることができる（図１０）。
（ｄ）ジチオール架橋剤を結合させた金薄膜を純水とアルコールで洗浄後、ジチオール架橋剤を固定した金薄膜表面に、最適な濃度に調製した金コロイド粒子溶液を４００μｌ添加し室温で反応させる。１５分〜３０分程度反応させた後、純水とアルコールで洗浄する。これによって、架橋剤によって金コロイド粒子を固定できる（図１１）。
以上によって表面プラズモン共鳴センサ用チップを得た。
【００４３】
次に、センサ用チップの金薄膜上に固定された金コロイド粒子の上に、プロテインキナーゼを認識する基質ペプチドを固定する方法の一例を図１２及び図１３を用いて説明する。
（ａ）上記金コロイド粒子を固定した金薄膜を、１ｍＭ  ＭＯＡＭ（8-amino-1-octanethiol, hydrochloride; 同仁化学製）溶液(エタノールで溶解)２０ｍｌ中に１．５時間浸漬して、金コロイド粒子の表面にアミノ基を導入した（図１２）。このとき、金コロイド粒子以外のジチオール架橋剤が結合した金薄膜の表面にはジチオール架橋剤がブロッキング剤として機能するためＭＯＡＭが結合しないと考えられる。
（ｂ）次に、ＳＳＭＣＣ（Sulfosuccinimidyl 4-［N-maleimidomethyl］cyclohexane-1-carboxylate）（ピアス製）をリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）に０．４ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解し、室温で１５〜３０分反応させた。これによって、ＭＯＡＭのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応し、未反応のマレイミド基を表面に導入することができた。
（ｃ−１）上記のようにして得られた表面に、プロテインキナーゼＡの基質となるペプチド（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＡ基質のネガティブコントロール（ｎＰＫＡ；セリン残基がアラニン残基に置換）、プロテインキナーゼＡのポジティブコントロール（ｐＰＫＡ；セリン残基がリン酸化）をいずれもリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）で１ｍｇ／ｍｌ濃度となるように溶解して、０．１μｌづつ数点をセンサ用チップ上にスポットしアレイを作成した。
（ｃ−２）また、上記の場合と同様に、チロシンキナーゼ酵素であるｃＳｒｃの基質となるペプチド（ｃＳｒｃ）、Ｓｒｃのネガティブコントロール（ｎＳｒｃ；チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換）、Ｓｒｃのポジティブコントロール（ｐＳｒｃ；チロシン残基がリン酸化）をいずれもリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ入り）に１ｍｇ／ｍｌ濃度となるよう溶解して、０．１μｌづつ数点をセンサ用チップ上アレイ上にスポットしアレイを作成した。
その後、ウエットな環境下で室温１６時間以上静置させて固定化反応を行った。センサ用チップ表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に固定化することができた（図１３）。
（ｄ）アレイ表面を純水で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングする為、ＰＥＧチオール（日本油脂製  SUNBRIGHT MESH-50H）を１ｍＭ濃度になるようリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）で溶解して、４００μｌをアレイ上に分注し室温で１時間反応させた。
以上によって、金コロイド粒子の上に測定物であるプロテインキナーゼＡの基質となるペプチド（ＰＫＡ）及びそのポジ／ネガ、又は、チロシンキナーゼ酵素であるｃＳｒｃの基質となるペプチド（ｃＳｒｃ）及びそのポジ／ネガを固定できた。
【００４４】
次に、センサ用チップのアレイ上でのＰＫＡのリン酸化反応と、ｃＳｒｃのリン酸化反応方法をそれぞれ説明する。
１）ＰＫＡのリン酸化反応：
ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上に分注して、３０℃２時間反応させた。ＰＫＡ溶液は、ＰＫＡ触媒ザブユニット（プロメガ製）を５０ｍＭトリスバッファｐＨ７．４（１００μＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２入り）で４００倍希釈して使用した。反応後、アレイ表面を純水で洗浄し、保管は４℃保存とした。
２）ｃＳｒｃのリン酸化反応：
ｃＳｒｃ溶液３００μｌをアレイ上に分注して、３０℃５時間反応させた。ｃＳｒｃ溶液は、ｃＳｒｃ  ａｃｔｉｖｅ（ｕｐｓｔａｔｅ製）を５０ｍＭ  ＭＥＳバッファｐＨ６．８（１００μＭ  ＡＴＰ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２入り）で５０倍希釈して使用した。反応後、アレイ表面を純水で洗浄し、保管は４℃保存とした。
【００４５】
次いで、２次元表面プラズモン共鳴測定装置による表面プラズモン共鳴解析方法について述べる。
図１に示す２次元表面プラズモン共鳴測定装置（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）５０を用いて、ＰＫＡ反応後のリン酸化解析、及び、ｃＳｒｃ反応後のリン酸化解析を行った。上記センサ用チップのように金薄膜にプリズムを通して入射された光は、金薄膜部で表面プラズモン共鳴現象が発生するとその反射光強度が変化する。この表面プラズモン共鳴現象発生後の反射光強度の変化が、金薄膜上での微小な物質の相互作用に依存することから、測定物と反応物の相互作用を検出することができる。
【００４６】
表面プラズモン共鳴センサ装置５０のフローセル８に流すランニングバッファとしては、５０ｍＭトリスバッファｐＨ７．４（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）を使用した。表面プラズモン共鳴シグナルの測定は以下のようにして行った。
（ａ）フローセル８にランニングバッファを０．１ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した。
（ｂ）ランニングバッファによるシグナルが安定したことを確認後、ＰＫＡ測定の場合は、リン酸化セリン抗体ＰＳＲ−４５（シグマ製）をランニングバッファで１０００倍希釈し、これをフローセル８に流して反応させ、シグナル変化を観測した。一方、ｃＳｒｃ測定の場合は、リン酸化チロシン抗体ＰＴ−６６（シグマ製）をランニングバッファで４０００倍希釈し、これをフローセル８に流して反応させ、シグナル変化を観測した。
（ｃ）シグナルがプラトーに達する（１０〜２５分）と、再度ランニングバッファを送液し、その後、純水でラインの洗浄を行った。
【００４７】
リン酸化シグナルの解析について説明する。
図２は、実施例１のＰＫＡ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化をグラフ化したセンサグラムである。図３は、実施例１のｃＳｒｃ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化をグラフ化したセンサグラムである。それぞれのセンサグラムは、スポット毎におけるシグナルの平均値をプロットしている。ブランク値は基質ペプチドの変わりにリン酸バッファのみをスポットした箇所である。また、バックグランド値は、基質ペプチドやリン酸バッファをスポットした部分以外の任意に選択した箇所を測定した物である。
１）ＰＫＡ測定においては、図２から、ポジティブコントロール（ｐＰＫＡ）に対しては抗体結合による強いシグナル上昇が認められ、ＰＫＡ基質においてもある程度の結合シグナル上昇が見られる。一方，ネガコントロール（ｎＰＫＡ）もシグナル上昇しているが基質シグナルとの有意なＳ／Ｎ比が認められる。バックグランドシグナル（ｂａｃｋ）は、ほとんどシグナル上昇を認められない。従って、本方法により特異的にＰＫＡ基質のリン酸化を検出することができていると考えられる。
２）ｃＳｒｃ測定においては、図３から、ポジティブコントロール（ｐＳｒｃ）に対しては抗体結合による強いシグナル上昇が認められ、ｃＳｒｃ基質においてもある程度の結合シグナル上昇が見られる。一方、ネガコントロール（ｎＳｒｃ）もシグナル上昇しているが基質シグナルとの有意なＳ／Ｎ比が認められる。ブランクシグナル（ｂｌａｎｋ）とバックグランドシグナル（ｂａｃｋ）は、ほとんどシグナル上昇を認められない。従って、本方法により特異的にｃＳｒｃ基質のリン酸化を検出することができていると考えられる。
【００４８】
比較例１
比較例として、２次元表面プラズモン共鳴法に使用されている一般的なセンサ用チップであるアレイ作成方法を記す。この比較例のセンサ用チップは、金薄膜の上に直接に測定物である生理活性物質を固定している。したがって、実施例１のセンサ用チップと比較すると、金薄膜の上に架橋剤を結合させておらず、さらに、金コロイド粒子を固定していない。
【００４９】
以下に、プロテインキナーゼを認識するペプチドの金薄膜上への固定方法の一例を図１４及び図１５を用いて説明する。
（ａ）金蒸着スライドを、末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ）の１ｍＭ溶液に２時間浸漬させ、金表面全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
（ｂ）この金蒸着スライド上に、１６個の直径１．５ｍｍ穴があるフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプで２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクの穴部分はパターン化され、照射されなかった部分は４ａｒｍＰＥＧチオールが残り、アレイのバックグランドとしてリファレンス部としての機能を有する。
【００５０】
（ｃ）１ｍＭ  ＭＯＡＭ（8-amino-1-octanethiol,hydrochloride;同仁化学製）溶液２０ｍｌ（エタノールで溶解）中に１．５時間浸漬して、パターン化した金蒸着スライドの表面にアミノ基を導入した（図１４）。このセンサ用チップの場合には、金薄膜の上に直接にアミノ基が導入されている。
（ｄ）次に、ＳＳＭＣＣ（Sulfosuccinimidyl 4-［N-maleimidomethyl］cyclohexane-1-carboxylate）（ピアス製）をリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）で０．４ｍｇ／ｍｌ濃度となるよう溶解し、室温で１５〜３０分反応させた。ＭＯＡＭのアミノ基とＳＳＭＣＣのＮＨＳ基が反応し、未反応のマレイミド基を表面に導入することができた。
（ｅ−１）上記のようにして得られたセンサ用チップ表面に、プロテインキナーゼＡの基質となるペプチド（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＡ基質のネガティブコントロール（ｎＰＫＡ；セリン残基がアラニン残基に置換）、プロテインキナーゼのポジティブコントロール（ｐＰＫＡ；セリン残基がリン酸化）をいずれもリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）に濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解して、０．１μｌづつ数点をセンサ用チップ上にスポットしアレイを作成した。
（ｅ−２）上記と同様に、チロシンキナーゼ酵素であるｃＳｒｃの基質となるペプチド（ｃＳｒｃ）、Ｓｒｃのネガティブコントロール（ｎＳｒｃ；チロシン残基がフェニルアラニン残基に置換）、Ｓｒｃのポジティブコントロール（ｐＳｒｃ；チロシン残基がリン酸化）をいずれもリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）で濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解して、０．１μｌづつ数点をセンサ用チップ上にスポットしアレイを作成した。
その後、ウエットな環境下で、室温で１６時間以上静置させて固定化反応を行った。アレイ表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に固定化することができた（図１５）。
（ｆ）アレイ表面を純水で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングする為、ＰＥＧチオール（日本油脂製  SUNBRIGHT MESH-50H）を１ｍＭ濃度になるようリン酸緩衝液ｐＨ７．２（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ入り）で１ｍｇ／ｍｌ濃度となるよう溶解して、４００μｌをアレイ上に分注し室温で１時間反応させた。
【００５１】
なお、アレイ上でのＰＫＡのリン酸化反応方法、ｃＳｒｃの２次元ＳＰＲ測定装置によるＳＰＲ解析方法については、実施例１で示した方法と全く同じであるので説明を省略する。
【００５２】
リン酸化シグナルの解析
図４は、比較例１のセンサ用チップによるＰＫＡ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。図５は、比較例１のセンサ用チップによるｃＳｒｃ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
１）ＰＫＡ測定の場合、図４より、ポジティブコントロール（ｐＰＫＡ）、ＰＫＡ基質、ネガコントロール（ｎＰＫＡ）は、共に同程度の強いシグナル上昇が認められ、有意なＳ／Ｎ比が認められない。バックグランド（ｂａｃｋ）シグナルは、ほとんどシグナル上昇を認められない。従って、比較例１のセンサ用チップでは特異的にＰＫＡ基質のリン酸化を検出することはできていないと考えられる。
２）ｃＳｒｃ測定の場合には、図５より、ポジティブコントロール（ｐＳｒｃ）、ｃＳｒｃ基質は、共に同程度の強いシグナル上昇が認められる。通常、基質が１００％リン酸化されることはないので、基質シグナルは、非特異的吸着によるシグナルが重なっていると思われる。同様にネガティブコントロール（ｎＳｒｃ）のシグナル、ブランク（ｂｌａｎｋ）シグナルもポジティブコントロールや基質と有意なＳ／Ｎ比が認められるもののシグナル全体が高い。バックグランド（ｂａｃｋ）シグナルでは、ほとんどシグナル上昇が認められない。従って、比較例１のセンサ用チップではリン酸化シグナルは非特異的吸着によるシグナルが加算された結果であって、特異的にｃＳｒｃ基質のリン酸化を検出することができていないと考えられる。
【００５３】
実施例２
上記実施例１のセンサ用チップを用いた測定では、金蒸着スライド上に架橋剤を介して金コロイド粒子を固定した場合、ネガティブシグナルやブランクシグナルの非特異的吸着が抑えられる傾向にある。そこで、機能解明の為、以下の検討を実施した。
【００５４】
＜アルコール測定による感度の比較＞
金蒸着スライドに架橋剤を介して金コロイド粒子を固定したセンサ用チップ（実施例１）と、金蒸着スライドのままであって、架橋剤も金コロイド粒子も固定していないセンサ用チップ（比較例１）とを用いて、それぞれのセンサ用チップへのアルコールの吸着による表面プラズモン共鳴シグナルを検出し、感度を比較した。なお、金蒸着スライドへの金コロイド粒子の固定方法は、実施例１で示した方法で行った。表１にそれぞれのセンサ用チップによるアルコール測定について、下記式（１）で算出した感度の結果を示す。表１に示すように、架橋剤有り及び金コロイド粒子固定有（実施例１）／架橋剤無し及び金コロイド固定無し（比較例１）のいずれの場合も感度は同等であった。そこで、実施例１のように架橋剤を介して金コロイド粒子を固定することによって、光学的な表面プラズモン共鳴の感度は変わらないと考えられる。なお、表１の第１ロットと第２ロットは、それぞれのセンサ用チップのベースとなる金蒸着スライドの作成ロットの違いを示すものである。作成ロットごとにシグナルの大きさ及び感度が異なるので、同一のロットの金蒸着スライドを用いてシグナルの大きさ及び感度を比較する必要がある。
感度＝アルコール測定シグナル−ランニングバッファシグナル      （１）
【００５５】
【表１】
2006308321.tif 000003
【００５６】
＜ポリアクリル酸測定による金コロイド固定化量とシグナルとの相関＞
次に、センサ用チップの金薄膜上への架橋剤の有無、架橋剤を介して固定する金コロイド粒子の固定化量とセンサ用チップの表面へのアミノ基固定量との相関をポリアクリル酸測定によって検出されるシグナルの大きさとして調べた。具体的には、以下の手順で測定を行った。
（ａ）センサ用チップとして以下の６種類を用意した。
イ）金蒸着スライドのみ（比較例１）
ロ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理有り（金コロイド粒子固定無し）
ハ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理＋金コロイド粒子２０倍希釈溶液処理
ニ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理＋金コロイド粒子５０倍希釈溶液処理
ホ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理＋金コロイド粒子１００倍希釈溶液処理
ヘ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理＋金コロイド粒子２００倍希釈溶液処理
（ｂ）次に、上記６種類のセンサ用チップのそれぞれについて、実施例１と同様にＭＯＡＭ処理を行ってセンサ用チップの表面にアミノ基を導入した。なお、この測定では、アミノ基を測定物としている。
（ｃ）測定物である上記アミノ基と相互作用する反応物としてカルボキシル基を持つ１００μｇ／ｍｌのポリアクリル酸を用いて、フローセル８に流して反応させ、二次元表面プラズモン共鳴法でシグナルを測定した。
以上によって得られた結果を表２に示す。また、図６は、センサ用チップハ）〜ヘ）の結果について、金コロイド粒子希釈倍率と表面プラズモン共鳴シグナルとの関係を示すグラフである。
【００５７】
【表２】
2006308321.tif 000004
【００５８】
図６を参照すると、金コロイド粒子原液の希釈倍率が高い場合、すなわち、金薄膜表面に固定されている金コロイド粒子が少ない程、シグナルが低い傾向にあることがわかる。また、表２を参照すると、ジチオール架橋剤処理のみを行っており、金コロイド粒子を固定していないセンサ用チップ（ロ）では、ほとんどシグナルが得られていない。以上の結果から、アミノ基は金コロイド粒子上に固定され、金蒸着スライド表面にはジチオール架橋剤が固定されている為、これがブロッキング剤として機能し、アミノ基がほとんど固定されていないと考えられる。
【００５９】
＜Ｓｒｃ（ポジティブコントロール／ネガティブコントロール）測定＞
次いで、上記６種類のセンサ用チップのうち、次の３種類を用いて実施例１と同様にしてＳｒｃ（ポジ／ネガ）の表面プラズモン共鳴シグナルの測定を行った。
ロ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理有り（金コロイド粒子固定無し）
ハ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理＋金コロイド粒子２０倍希釈溶液処理
ホ）金蒸着スライド＋ジチオール架橋剤処理＋金コロイド粒子１００倍希釈溶液処理
以上の各センサ用チップを用いて得られた表面プラズモン共鳴シグナル測定の結果をそれぞれ図７、図８、図９に示す。
【００６０】
図７によれば、ポジコントロール（ｐＳｒｃ）シグナルがほとんど得られていないことがわかる。このことから、基質ペプチドは金コロイド粒子表面に固定されていると考えられる。一方、図８及び図９では、ポジコントロール（ｐＳｒｃ）シグナルが大きく得られており、ネガティブコントロール（ｎＳｒｃ）とのポジ／ネガのＳ／Ｎ比は良好である。いずれの場合もネガティブコントロール（ｎＳｒｃ）シグナルの上昇はほとんどない為、金蒸着表面に固定されたジチオール化合物によって抗リン酸化抗体の非特異的吸着に対するブロッキングが行われていると考えられる。なお、未反応のマレイミド基のブロッキング剤としてＰＥＧ−ＳＨを使用しているが、このＰＥＧ−ＳＨは、架橋剤であるＳＳＭＣＣのマレイミド基のブロッキングとしてのみ機能していると考えられる。したがって、金薄膜表面のブロッキングはジチオールの効果であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明に係る表面プラズモン共鳴センサ用チップは、血液や細胞抽出液などの表面プラズモン共鳴シグナルの測定においても感度よく測定でき、正確な測定が可能となる。そこで、創薬開発のツールとして有用なプロテインチップとして大きく寄与することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施例における２次元表面プラズモン共鳴センサの構成を示す概略図である。
【図２】実施例１のセンサ用チップによるＰＫＡ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
【図３】実施例１のセンサ用チップによるｃＳｒｃ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
【図４】比較例１のセンサ用チップによるＰＫＡ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
【図５】比較例１のセンサ用チップによるｃＳｒｃ測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
【図６】金コロイド粒子希釈倍率と表面プラズモン共鳴シグナルとの関係を示すグラフである。
【図７】センサ用チップ（ロ）を用いた場合のＳｒｃ（ポジ／ネガ）測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
【図８】センサ用チップ（ハ）を用いた場合のＳｒｃ（ポジ／ネガ）測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
【図９】センサ用チップ（ホ）を用いた場合のＳｒｃ（ポジ／ネガ）測定におけるスポット毎の表面プラズモン共鳴シグナルの平均値をプロットしたシグナル変化のグラフである。
【図１０】金薄膜の表面に結合させた１，１０−デカンジチオールの層を示す概略図である。
【図１１】図１０の表面に１，１０−デカンジチオールの一部に金コロイド粒子を結合させた状態を示す概略図である。
【図１２】図１１の金コロイド粒子の上にアミノ基を付着させた表面状態を示す概略図である。
【図１３】図１２のアミノ基にマレイミド基を結合させ、さらにペプチドを結合させた状態を示す概略図である。
【図１４】金薄膜の上に直接にアミノ基を付着させた表面状態を示す概略図である。
【図１５】図１４の表面のアミノ基にマレイミド基を結合させ、さらにペプチドを結合させた状態を示す概略図である。
【符号の説明】
【００６３】
１  ハロゲンランプ、２ａ、２ｂ  平凸レンズ、３  ピンホール、４  平凸レンズ、５  近赤外偏光フィルタ、６  プリズム、７  金薄膜、８  フローセル、１０  表面プラズモン共鳴センサ用チップ、１１  干渉フィルタ、１２  ＣＣＴＶレンズ、１３  ＣＣＤカメラ、２０  観測手段、５０  表面プラズモン共鳴センサ
【図１】
2006308321.tif 000005
【図２】
2006308321.tif 000006
【図３】
2006308321.tif 000007
【図４】
2006308321.tif 000008
【図５】
2006308321.tif 000009
【図６】
2006308321.tif 000010
【図７】
2006308321.tif 000011
【図８】
2006308321.tif 000012
【図９】
2006308321.tif 000013
【図１０】
2006308321.tif 000014
【図１１】
2006308321.tif 000015
【図１２】
2006308321.tif 000016
【図１３】
2006308321.tif 000017
【図１４】
2006308321.tif 000018
【図１５】
2006308321.tif 000019