(57)【要約】【課題】本発明においては、必要な蛍光色素からの蛍光のみを簡単に撮像することができる。【解決手段】蛍光撮像装置１は、パルス光源としてのキセノンフラッシュランプ２と、光ファイバ３と、試料５に照射する照射手段６と、蛍光を撮像する撮像ユニット９とから構成されており、撮像ユニット９は、光を電子に変換すると共にこの電子を増幅させる増幅機能と、電気的なシャッター機能を有するイメージインテンシファイア３１を有し、任意の時間で蛍光を通過させることができる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第1の蛍光色素とこの第１の蛍光色素の蛍光寿命より長い蛍光寿命の第２の蛍光色素とが存在する試料からの蛍光を観察するための蛍光観察装置において、パルス光源と、このパルス光源からの光を前記試料へ照射する照射手段と、前記第２の蛍光色素からの蛍光を撮像する撮像手段と、前記第２の蛍光色素からの蛍光を前記撮像手段で撮像開始する撮像開始時間を任意に調整する調整手段とを具備することを特徴とする蛍光撮像装置。
【請求項２】
前記調整手段は、さらに、前記第２の蛍光色素の蛍光の撮像終了する撮像終了時間を任意に調整することができることを特徴とする請求項１記載の蛍光撮像装置。
【請求項３】
前記調整手段は、イメージインテンシファイアであることを特徴とする請求項１または２記載の蛍光撮像装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の蛍光色素からの蛍光を観察する蛍光撮像装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数の蛍光色素の蛍光を観察する場合、複数の蛍光色素からのそれぞれの蛍光を同時にカメラ等で撮像していた。
【０００３】
このような場合では、それぞれの蛍光色素は固有の吸収波長（励起波長）と蛍光波長を持っているので、この波長特性の違いを利用して光学フィルターで所望の蛍光波長を分離して観察している。しかし、観察する蛍光の波長が重なる場合は、光学フィルタでは波長分離することができないという問題点があった。
【０００４】
これに対して、各蛍光色素の蛍光寿命の違いによる時間領域に着目し、一方の蛍光色素からの蛍光の寿命が尽きた後に、所望の蛍光色素の蛍光を撮像する技術がある。
【０００５】
例えば、非特許文献１には、オプティカルチョッパと呼ばれる扇形状のスリットを複数個備えた円板を回転させ、検出器への受光を不連続的とするものについて記載されている。これは、一方の蛍光色素の蛍光寿命が尽きるまでは、オプティカルチョッパで遮光することで、検出器にその蛍光が到達しないようにし、寿命が尽きた後に、まだ存続している他方の蛍光が前述した扇形状のスリットを通過するものであり、蛍光寿命が長い蛍光色素の蛍光のみを撮像するというものである。
【非特許文献１】J.AM.CHEM.SOC.2004,126,4888-4896
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このようなオプティカルチョッパを用いる場合は、蛍光寿命が短い方の蛍光色素の寿命が尽きるのに合わせてスリットの大きさや、スリットが遮光している時間を制御しなければならい。
【０００７】
特に短時間の遮光と透過の切替えには、光束中にスリットが過ぎる状態での観察もあり、レスポンスのよい制御ができず、かつ観察光量のロスとなっている。また、オプティカルチョッパの回転は速度ムラや誤差を持っている為、μsecオーダーの短い時間での制御が難しいところがある。例えば、これらの遮光時間のずれにより、観察の都度遮光したはずの蛍光の光が混在する場合もあり、確実な分離が出来ない。逆に、確実性を求め遮光時間を遅らせた場合、励起直後に発する蛍光の光量が一番多いにも関わらず、後半の蛍光光量の少ない方を取得することになるので、トータルの光量の取得量が減り効率のよい取得方法とは言えない。また、さらにS/Nも悪くなってしまう。
【０００８】
また、遮光、又は透過時間の設定を変える場合、また蛍光色素を変える必要がある場合においては、それに合わせた複数のスリットを用意し、かつ交換する度に遮光するタイミングを調整し直さなければならないという欠点があった。
【０００９】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、波長幅が重なる複数の蛍光色素から必要な蛍光色素の蛍光のみを簡単に撮像することができる蛍光撮像装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の請求項１に係る蛍光撮像装置においては、少なくとも第1の蛍光色素とこの第１の蛍光色素の蛍光寿命より長い蛍光寿命の第２の蛍光色素とが存在する試料からの蛍光を観察するための蛍光観察装置において、パルス光源と、このパルス光源からの光を前記試料へ照射する照射手段と、前記第２の蛍光色素からの蛍光を撮像する撮像手段と、前記第２の蛍光色素からの蛍光を前記撮像手段で撮像開始する撮像開始時間を任意に調整する調整手段とを具備することを特徴とするものである。
【００１１】
請求項２に係る蛍光撮像装置においては、前記調整手段は、さらに、前記第２の蛍光色素の蛍光の撮像終了する撮像終了時間を任意に調整することができることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項３に係る蛍光撮像装置においては、前記調整手段は、イメージインテンシファイアであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明においては、必要な蛍光色素からの蛍光のみを簡単に撮像することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に図面を用いて実施例の説明をする。
【実施例１】
【００１５】
以下、本発明の実施例１を図１から図４を用いて説明する。
【００１６】
図１を用いて実施例１の構成について説明する。
【００１７】
図１は蛍光撮像装置の全体の説明をする図である。
【００１８】
図１に示すように、実施例１に係る蛍光撮像装置１は、蛍光励起用のパルス光源としてのキセノンフラッシュランプ２と、このキセノンフラッシュランプ２の射出側に配置され、光を伝達するための光ファイバ３と、この光ファイバ３からの光をカバーガラス４の上の試料５に照射する照射手段６と、試料５に存在する予め染色された蛍光染色からの蛍光を反射するミラー７と、このミラー７の射出側に配置され、必要な蛍光のみを通過させるバリアフィルタ８と、このバリアフィルタ８を通過した蛍光を撮像する撮像ユニット９とから構成されている。
【００１９】
照射手段６は、光ファイバ３からの光が通過し、キセノンフラッシュランプ２の光を励起するための励起フィルタ２１と、この励起フィルタ２１の射出側に配置され、励起フィルタ２１で励起した励起光を試料５側に反射し、試料５からの蛍光を撮像ユニット９側に透過するダイクロイックミラー２２と、このダイクロイックミラー２２の射出側に配置され、試料５に集光する対物レンズ２３とから構成されている。
【００２０】
また、撮像ユニット９は、バリアフィルタ８を通過した光を受けて電子に変換すると共にこの電子を増幅させる増幅機能と、電気的なシャッター機能を有するイメージインテンシファイア３１と、このイメージインテンシファイア３１を通過した光を集光させるリレーレンズ３２と、このリレーレンズ３２の集光位置に配置されるＣＣＤ等の個体撮像素子３３を有するカメラ３４とから構成されている。
【００２１】
また、イメージインテンシファイア３１は前述したように、増幅機能及びシャッター機能を有しており、容易に増幅量を変更することができ、また、観察光を透過、遮断といった光シャッター制御として利用することができるようになっている。
【００２２】
さらに、蛍光撮像装置１には、励起フィルタ２１及びバリアフィルタ８を必要に応じて光軸４１から挿脱するためのフィルタコントローラー４２と、イメージインテンシファイア３１の増幅機能及びシャッター機能を制御するＩＩコントローラー４３と、キセノンフラッシュランプ２の点灯タイミングの制御及びＩＩコントローラー４３の制御ためのタイミングコントローラー４４と、フィルタコントローラー４２、ＩＩコントローラー４３及びタイミングコントローラー４４を制御するためのコンピューター４５とが接続されている。
【００２３】
実施例１の作用について図２、３及び４を用いて説明する。
【００２４】
図２は蛍光寿命と撮像する蛍光の関係を示す図、図３は蛍光特性（通常の蛍光撮像時及び時間分解蛍光撮像時）を示す図、図４は顕微鏡観察画像（試料の同一部分のＤＩＣ顕微鏡観察画像、通常の蛍光観察画像及び時間分解蛍光観察画像）を示す図である。
【００２５】
撮像ユニット9の撮像期間の信号Expose signal が送られ、この信号がタイミングコントローラー４４の信号出力の開始信号となる。タイミングコントローラー４４では、キセノンフラッシュランプ２へ発光させるための信号Trigger signal1とそれと時間調整したＩＩコントローラー４３への信号Trigger signal2を送る。
【００２６】
信号Trigger signal1のタイミングで発光したキセノンフラッシュランプ２からの光は光ファイバ３を通過し、励起フィルタ２１で励起光として、波長選択した光を通しその励起光は、ダイクロイックミラー２２で反射され、対物レンズ２３を通過した後に試料５を照射する。
【００２７】
一方、試料５には図２に示す蛍光寿命に違いがある２種類の蛍光色素が存在している。これら２種類の蛍光色素のうちの一方の蛍光色素は図２のＡで示すようにＴ１に蛍光寿命が尽きるものである。他方はＢで示すようにＴ２に蛍光寿命が尽きるものである。
【００２８】
励起光が照射されると、このような2種類の蛍光色素Ａ，Ｂからの蛍光は対物レンズ２３を通過し、ミラー７を反射してバリアフィルタ８を通過した後イメージインテンシファイア３１に入射する。ＩＩコントローラー４３は信号Trigger signal2を受け、イメージインテンシファイア３１を駆動する信号Gate Signalとして変換し動作させる。信号Trigger signal2は、図２に示す通りＡの蛍光寿命が尽きる時間のＴ１に撮像を開始させる開始信号、及びＢの蛍光寿命が尽きる時間のＴ２に撮像を終了させる終了信号であり、一回のパルス照射に対する蛍光の撮像期間はＴ１からＴ２の期間となる。
【００２９】
イメージインテンシファイア３１は、Ｔ１まではシャッター機能が閉じた状態に制御され、Ｔ１からＴ２までの期間シャッター機能が開いた状態となるようにコンピューター４５及びＩＩコントローラー４３により制御される。つまり、Ｔ１からＴ２の期間のＢの蛍光のみがイメージインテンシファイア３１を通過する。
【００３０】
イメージインテンシファイア３１を通過したＴ１からＴ２までのＢの蛍光は、リレーレンズ３２を通過し、Ｔ１からＴ２の期間のＢのみの蛍光が固体撮像素子３３では撮像される。
【００３１】
ここで、蛍光画像について説明する。
【００３２】
例として、HeLa細胞に図２のＡとしてRhodamin6GとＢとして蛍光寿命が比較的長い化合物を注入した試料を用いて説明する。
【００３３】
このようなＡとＢを蛍光顕微鏡で励起光パルスを照射した後から800μsec（図２のＴ２に相当）までの期間撮像した場合の蛍光特性は図３（１）のようになる。
【００３４】
これに対して、励起光を照射後、約50μsec（図２のＴ１に相当）から800μsecの期間撮像した場合の蛍光特性は図３（２）のようになる。
【００３５】
Rhodamin6G（Ａ）は、300から400nmの紫外励起光で励起し、蛍光波長は約500から650nm付近であり、蛍光寿命は数nsec（Ｔ１）である。図３（１）では(ii)で示されてい
る。化合物（Ｂ）も300から400nmの紫外励起光で励起し、蛍光波長が約550から650nm付近であり、蛍光寿命は数msec（Ｔ２）である。図３（１）（２）では(iii)で示されて
いる。
【００３６】
このように、図３（１）では、ＡとＢの蛍光波長が重なっているために、Ａ，Ｂどちらの蛍光によるものか区別がつかないが、図３（２）では、ほぼＡの蛍光波長は図３（２）には現れず、(iii)のＢの蛍光波長のみが現れている。
【００３７】
つまり、ＡとＢとは蛍光波長は重なっているものの、蛍光寿命が数nsec（Ｔ１）と数msec（Ｔ２）の違いがあるために、撮像期間を変えることで図３（２）の蛍光特性を得ることができる。
【００３８】
ここで図３（１）と（２）では縦軸のスケールは異なっている。
【００３９】
次に、実際に撮像された蛍光画像を示す。
【００４０】
図４（１）は、上記試料をDIC顕微鏡観察法により撮像した画像である。この画像では、まず、細胞の全体の形態を捉えることができる。また、複数の細胞の輪郭が明確に捉えることができる。
【００４１】
図４（２）は、図３（１）に対応するもので、（１）と同一部分を、360±40nmの紫外光で励起した後から800μsec までの期間の617±37nmの波長領域の蛍光をカメラ３４で撮像したものである。この画像では、ＡとＢの蛍光が同時に撮像されているために、細胞全体の蛍光が撮像されてしまい、ＡとＢの区別をすることができない。
【００４２】
図４（３）は、図３（２）に対応するもので、同一部分に同一励起光を照射し約50μsec経過した後に800μsecまでカメラ３４で撮像した画像である。この画像では、Ｂのみを注入された部分の蛍光のみ撮像されており、Ａが注入された部分は撮像されていない。つまり、このように励起光を照射し発光後から約50μsecまでの期間撮像せず、その後の800μsecまで期間を撮像する方法（時間分解蛍光撮像）で不必要な蛍光や迷光などを撮像しないことで、目的とするＢの蛍光のみの画像を得ることができ、Rhodamin6G（Ａ）の蛍光に邪魔されず、画像観察及びその後の反応解析が可能となる。
【００４３】
また、一般的にRhodamin6Gのように人為的に染色した蛍光のみならず、細胞が本来持っている物質においても紫外線で光るもの、光学素子から発する迷光なども数nsecの時間領域に存在しており、これらも除去できる。
【００４４】
次に、第１の実施の形態の効果について説明する。
【００４５】
本発明の実施例１では、イメージインテンシファイア３１を制御することで、Ａの蛍光を撮像することなく、Ｂの蛍光のみを固体撮像素子３４で撮像することができるので、高精度な蛍光撮像が可能である。
【００４６】
また、本実施例１では、イメージインテンシファイア３１を用いたので、従来のオプティカルチョッパと比べると、コンピューター４５からの制御で、簡単にシャッター機能を閉じた状態から開いた状態に変えることができ、さらに、閉じた状態の時間及び開いた状態の時間を任意に変更することができ、必要に応じて、固体撮像素子で撮像する撮像開始時間及び撮像終了時間を任意に変えることができ使いやすい。
【００４７】
また、さらに、イメージインテンシファイア３１により簡単に電子を増幅する割合を必要に応じて変えることもできる。
【実施例２】
【００４８】
以下、本発明の実施例２について図５を用いて説明する。
【００４９】
図５は蛍光寿命と撮像する蛍光の関係を示す図である。
【００５０】
本発明の構成としては実施例１と同様な構成であり、図５のＸ，Ｙ，Ｚの期間の蛍光を撮像しするようにしたものである。
【００５１】
本実施例２では、図５のＸ，Ｙ，Ｚの期間のＢの蛍光がイメージインテンシファイア３１を通過するようにコンピューター４５で制御されている。
【００５２】
カメラ３４の固体撮像素子３３撮像された図５のＸ、Ｙ，Ｚのそれぞれの期間の蛍光は、期間毎差別して記憶されるようにコンピューター４５で制御されるようになっている。
【００５３】
本実施例２では、イメージインテンシファイア３１を通過する期間をＸ，Ｙ，Ｚとし、それぞれの期間で記憶したので、Ｂの蛍光の経時変化をより詳しく撮像することができ、蛍光の時間経過なども追跡できる。これらの期間は、複数回、かつ時間幅や間隔など任意に変えることができる。
【００５４】
尚、以上の実施例では、キセノンフラッシュランプとしたが、パルス発振可能なランプ光源、パルスレーザ光源としてもよい。また、例えば光源本体が連続光としても、照明光路中に光の透過／遮断が制御できる光学素子（AOTF,AO,EO等）を介しパルス光として導入してもよい。
【００５５】
また、実施例では光ファイバを介して顕微鏡に励起光を導入しているが、光ファイバなしでダイレクトに導入してもよいし、通常のレンズを用いたリレー系を用いてもよい。
【００５６】
また、実施例の励起フィルタ及びバリアフィルタを複数種類用意し、必要に応じて公知にの切り替え手段で切り替わるよう制御すれば、さらに、蛍光撮像装置で使用できる蛍光色素の種類を増やすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】蛍光撮像装置の全体の説明をする図である。
【図２】蛍光寿命と撮像する蛍光の関係を示す図である。
【図３】蛍光色素の蛍光特性を示す図である。
【図４】顕微鏡観察画像を示す図である。
【図５】蛍光寿命と撮像する蛍光の関係を示す図である。
【符号の説明】
【００５８】
１    蛍光撮像装置
２    キセノンパルスランプ
３    光ファイバ
３１  イメージインテンシファイア
３３  固体撮像素子
４３  ＩＩコントローラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
2006226848.tif 000006
【図４】
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