(57)【要約】      （修正有）【課題】インクジェットプリンティングを利用した方法にも十分に対応できるヌクレオチド化合物の溶液、またそれを使用したヌクレオチドアレイの製造方法を提供する。【解決手段】ヌクレオチドを溶解する溶液が有機塩を含む。この有機塩が、置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含み、約６〜８のｐＫａを有し、溶液の反応特性を減少させず、溶液が、約３０〜４０度の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有する。有機塩は、特に、Ｎ置換ピリジンまたは１，３二置換イミダゾール有機カチオンである。【選択図】図１
2006308601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する方法であって、
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される第１のヌクレオチド化合物を準備することであって、該第１のヌクレオチド化合物を、第１の共溶媒および第２の共溶媒を含む第１の溶液中に溶解し、該第１の共溶媒が有機塩を含み、該有機塩が、置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含み、約６〜８のｐＫａを有し、前記第１の溶液の反応特性を減少させず、該第１の溶液が、約３０〜４０℃の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有する、第１のヌクレオチド化合物を準備すること、
基板上の第１の位置に前記第１の溶液を配置することであって、構造物を該第１の位置に配置し、該構造物が、その上に配置した第２のヌクレオチド化合物を有し、該第２のヌクレオチド化合物は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される、第１の溶液を配置すること、および
前記基板の第１の位置に第２の溶液を配置することであって、該第２の溶液が活性剤を含み、該活性剤が、前記第１のヌクレオチド化合物および前記第２のヌクレオチド化合物を含む第３のヌクレオチドの形成を開始させる、第２の溶液を配置すること、
を含む、アドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する方法。
【請求項２】
前記アニオンが、クロリドメチルスルフェート（ＣＨ３ＳＯ４−）、トリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯ２−）、ヘプタフルオロブタノエート（ＣＦ３（ＣＦ２）２ＣＯ２−）、トリフレート（ＣＦ３ＳＯ２−）、ノナフレート（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２−）、トシレートアニオン、ジシアニミドアニオン、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−）、ビス（ペルフルオロエチルスルホニル）イミド（（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２）２Ｎ−）、トリス（トリフルオロメチルスルホニル）メチド（（ＣＦ３ＳＯ２）３Ｃ−）およびこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオンが、式
【化１】
2006308601.tif 000009
［式中、Ｒはアルキルであり、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド基、アルキル基およびハロゲン基から選択される］を有するＮ置換ピリジンである、請求項１に記載の、アドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する方法。
【請求項４】
前記カチオンが、式
【化２】
2006308601.tif 000010
［式中、各Ｒは、独立して、アルキルから選択され、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド、アルキルおよびハロゲンから選択され、Ｒ’’は、ヒドリドおよびメチルから選択される］を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオンが、１，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−エチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ブチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ヘキシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−デシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ドデシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−オクチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−テトラデシル−イミダゾリウム、１，２−ジメチル−３−プロピル−イミダゾリウム、１−エチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−ブチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウムから選択される１，３二置換イミダゾール有機カチオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液は、約３０〜４０℃の温度で約１５〜２０ｃＰ（１．５〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２０〜３０ｍＮ／ｍの表面張力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の溶液を配置することを、インクジェットプリントヘッドを使用して行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の共溶媒が、アセトニトリル、プロピレンカーボネート、アジポニトリル、エチレンカーボネート、ジエチルカーボネートおよびこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の共溶媒が、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、アジポニトリル、トルエン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、スクシノニトリル、Ｎ−メチルピロリドン、スルホラン、ニトロメタン、ニトロベンゼンおよびこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）前記基板上の第１の位置に第４のヌクレオチド化合物を配置することであって、該第４のヌクレオチド化合を、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択し、該第４のヌクレオチド化合物を、前記第１の共溶媒および前記第２の共溶媒を含有する第４の溶液中に溶解し、該第１の共溶媒が有機塩を含み、前記第４の溶液が、約３０〜４０℃の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５の表面張力を有する、第４のヌクレオチド化合物を配置すること、
ｂ）前記基板の第１の位置に前記第２の溶液を配置することであって、前記活性剤が、前記第１のヌクレオチド化合物、前記第２のヌクレオチド化合物および該第４のヌクレオチド化合物を含む第５のヌクレオチドの形成を開始させる、第２の溶液を配置すること、および
ｃ）ステップａ）およびｂ）を繰り返して、標的ヌクレオチド化合物を形成する、繰り返すこと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性剤が有機塩であり、該有機塩が、置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記有機塩が、メチルイミダゾリウム（トリフルオロメチルスルホニル）イミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶液が、４５〜７０の接触角を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
アドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する方法であって、
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される第１のヌクレオチド化合物を準備することであって、該第１のヌクレオチド化合物を、第１の溶媒を含有する第１の溶液中に溶解し、該第１の溶媒が有機塩を含み、該有機塩が、置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含み、前記第１の溶液が、約３０〜４０℃の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有する、第１のヌクレオチド化合物を準備すること、
基板１４上の第１の位置に前記第１の溶液を配置することであって、構造物を該第１の位置に配置し、該構造物がその上に配置した第２のヌクレオチド化合物を有し、該第２のヌクレオチド化合物が、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される、第１の溶液を配置すること、および
前記基板１４の第１の位置に第２の溶液を配置することであって、該第２の溶液が活性剤を含み、該活性剤が、前記第１のヌクレオチド化合物および前記第２のヌクレオチド化合物を含む第３のヌクレオチドの形成を開始させる、第２の溶液を配置すること、
を含む、アドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する方法。
【請求項１５】
前記アニオンが、クロリドメチルスルフェート（ＣＨ３ＳＯ４−）、トリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯ２−）、ヘプタフルオロブタノエート（ＣＦ３（ＣＦ２）２ＣＯ２−）、トリフレート（ＣＦ３ＳＯ２−）、ノナフレート（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２−）、トシレートアニオン、ジシアニミドアニオン、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−）、ビス（ペルフルオロエチルスルホニル）イミド（（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２）２Ｎ−）、トリス（トリフルオロメチルスルホニル）メチド（（ＣＦ３ＳＯ２）３Ｃ−）およびこれらの組合せから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記カチオンが、式
【化３】
2006308601.tif 000011
［式中、Ｒはアルキルであり、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド基、アルキル基およびハロゲン基から選択される］を有するＮ置換ピリジンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記カチオンが、式
【化４】
2006308601.tif 000012
［式中、各Ｒは、独立して、アルキルから選択され、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド、アルキルおよびハロゲンから選択され、Ｒ’’は、ヒドリドおよびメチルから選択される］を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記カチオンが、１，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−エチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ブチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ヘキシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−デシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ドデシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−オクチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−テトラデシル−イミダゾリウム、１，２−ジメチル−３−プロピル−イミダゾリウム、１−エチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−ブチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウムおよびこれらの組合せから選択される１，３二置換イミダゾール有機カチオンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液が、約３０〜４０℃の温度で約１５〜２０ｃＰ（１．５〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２０〜３０ｍＮ／ｍの表面張力を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の溶液を配置することを、インクジェットプリントヘッドを使用して行う、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記有機塩が、約６〜８のｐＫａを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
インクジェットプリントヘッド用溶媒であって、
置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含む有機塩であって、該有機塩が約６〜８のｐＫａを有し、第１の溶液が、約３０〜４０℃の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有し、第１のヌクレオチド化合物が、該有機塩を含む該第１の溶液中に溶解されている、インクジェットプリントヘッド用溶媒。
【請求項２３】
前記カチオンが、式
【化５】
2006308601.tif 000013
［式中、Ｒはアルキルであり、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド基、アルキル基、およびハロゲン基から選択される］を有するＮ置換ピリジンである、請求項２２に記載のインクジェットプリントヘッド用溶媒。
【請求項２４】
前記カチオンが、式
【化６】
2006308601.tif 000014
［式中、各Ｒは、独立して、アルキルから選択され、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド、アルキルおよびハロゲンから選択され、Ｒ’’は、ヒドリドおよびメチルから選択される］を有する、請求項２２に記載のインクジェットプリントヘッド用溶媒。
【請求項２５】
前記カチオンが、１，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−エチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ブチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ヘキシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−デシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ドデシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−オクチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−テトラデシル−イミダゾリウム、１，２−ジメチル−３−プロピル−イミダゾリウム、１−エチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−ブチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウムおよびこれらの組合せから選択される１，３二置換イミダゾール有機カチオンである、請求項２２に記載のインクジェットプリントヘッド用溶媒。
【請求項２６】
前記アニオンが、クロリドメチルスルフェート（ＣＨ３ＳＯ４−）、トリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯ２−）、ヘプタフルオロブタノエート（ＣＦ３（ＣＦ２）２ＣＯ２−）、トリフレート（ＣＦ３ＳＯ２−）、ノナフレート（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２−）、トシレートアニオン、ジシアニミドアニオン、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−）、ビス（ペルフルオロエチルスルホニル）イミド（（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２）２Ｎ−）、トリス（トリフルオロメチルスルホニル）メチド（（ＣＦ３ＳＯ２）３Ｃ−）およびこれらの組合せから選択される、請求項２２に記載のインクジェットプリントヘッド用溶媒。
【請求項２７】
アセトニトリル、プロピレンカーボネート、アジポニトリル、エチレンカーボネート、ジエチルカーボネートおよびこれらの組合せから選択される共溶媒をさらに含む、請求項２２に記載のインクジェットプリントヘッド用溶媒。
【請求項２８】
テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、アジポニトリル、トルエン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、スクシノニトリル、Ｎ−メチルピロリドン、スルホラン、ニトロメタン、ニトロベンゼンおよびこれらの組合せから選択される共溶媒をさらに含む、請求項２２に記載のインクジェットプリントヘッド用溶媒。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドを合成する方法に関する。
関連する出願の参照
本出願の基礎出願は、同時係属中の米国出願、２００１年１０月３１日に出願された第１０／００１０４４号「Use of Ionic Liquids for Fabrication of Polynucleotide Arrays」、２００１年１０月３１日に出願された第０９／９９９６２３号「Method of Synthesizing Polynucleotides Using Ionic Liquids」、２００４年１１月２２日に出願されたMyersonらの「Use of Ionic Liquids for Fabrication of Polynucleotide Arrays」、および２００４年１１月２２日に出願されたMyersonらの「Method of Synthesizing Polynucleotides Using Ionic Liquids」の継続出願であり、またこれらの出願の優先権を主張するものであり、これらの出願は参照により本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
平らな基板上に固定されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、診断ツールまたはスクリーニングツールとしてますます有用になっている。ポリヌクレオチドアレイは、基板上の予め決められた構成で配置された、通常異なる配列のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの領域を有している。これらの領域（「フィーチャー（feature）」とも呼ばれる）は、基板上の各位置（「アドレス」）に配置されている。アレイは、試料に晒すと、観察可能な結合パターンを示す。この結合パターンは、アレイからデータを取り出すことにより（アレイをコンピュータ等で解析することにより）検出することができる。例えば、試料中のポリヌクレオチド標的（例えばＤＮＡ）の全ては適切な標識（蛍光化合物など）で標識されることが可能であり、試料に晒した後にアレイ上の蛍光パターンを正確に観察することができる。異なる配列のポリヌクレオチドが、予め決められた構成にしたがって正確に堆積されている（貼り付けられている）とすると、観察される結合パターンは、試料の１つ以上のポリヌクレオチド成分の存在および／または濃度を示すであろう。
【０００３】
ポリヌクレオチドアレイは、予め得られたポリヌクレオチドを基板上へ堆積させるかまたはインサイトゥ合成法によって製造することができる。ポリヌクレオチド合成については、種々の化学的スキームが知られている。通常、これらの方法は、式
【０００４】
【化７】
2006308601.tif 000003
【０００５】
［式中、
Ａは、Ｈまたは任意に保護されたヒドロキシル基を表し、
Ｂは、プリン塩基またはピリミジン塩基であり、その環外アミン官能基は任意に保護されており、
ＭまたはＱの一方は、３’もしくは５’−ＯＨ官能基のための従来の保護基であり、（または任意に、介在する（および任意に保護された）ポリヌクレオチド配列の末端の従来の３’もしくは５’−ＯＨ保護基であり）、例えば式（Ｉ）は修飾ポリヌクレオチドを表していてよく、もう一方は、式
【０００６】
【化８】
2006308601.tif 000004
【０００７】
［式中、ｘは０または１をとりうるが、但し、
ａ）ｘ＝１の場合、
Ｒ’はＨを表しかつＲ’’は負帯電した酸素原子を表すか、または
Ｒ’は酸素原子でありかつＲ’’は酸素原子または保護基を有する酸素原子のいずれかを表し、
ｂ）ｘ＝０の場合、
Ｒ’は保護基を有する酸素原子であり、Ｒ’’は水素基、ハロゲン基もしくは二置換アミン基のいずれかである）］］のヌクレオシド試薬を使用する。
【０００８】
ｘが１であり、Ｒ’が酸素原子であり、Ｒ’’が酸素原子である場合、この方法は、いわゆるホスホジエステル法となり、Ｒ’’が保護基を有する酸素原子である場合、この方法はいわゆるホスホトリエステル法である。
【０００９】
ｘが１であり、Ｒ’が水素原子であり、Ｒ’’が負帯電した酸素原子である場合、この方法は、Ｈ−ホスホネート法として知られている。
【００１０】
ｘが０であり、Ｒ’が保護基を有する酸素原子であり、Ｒ’’がハロゲンである場合、この方法は、亜リン酸塩法として知られ、Ｒ’’が二置換アミン型の離脱基である場合、方法はホスホアミダイト法として知られている。
【００１１】
式（Ｉ）のタイプの試薬を使用してオリゴヌクレオチドを調製するために使用される従来の手順は、基本的に以下の４つの異なるステップに従う。（ａ）保護されたヒドロキシル基も有する選択されたヌクレオシドを、亜リン酸結合によって、最初の繰り返しサイクルでは官能化された支持体に、または後続の繰り返しサイクルでは基板（例えばヌクレオシド修飾基板）に結合しているヌクレオシドにカップリングし、（ｂ）任意に、しかし好ましくは、ヌクレオシドを結合させている基板上の未反応のヒドロキシル基をブロッキングし、（ｃ）ステップ（ａ）の亜リン酸結合を酸化してリン酸結合を形成し、（ｄ）ステップ（ａ）でカップリングした、基板に結合しているヌクレオシドから保護基を除去して（「脱保護」）、これら一連のステップの次のサイクルのための反応部位を生成させる。官能化された支持体（第１のサイクルでの）または脱保護されカップリングされたヌクレオシド（後続のサイクルでの）は、ステップ（ａ）でカップリングされるべき次のヌクレオシドと亜リン酸結合を形成するための結合基を有する基板結合部分を提供する。ヌクレオシド塩基の最後の脱保護は、公知のように、水酸化アンモニウムなどのアルカリ条件を使用して行うことができる。
【００１２】
ポリヌクレオチドアレイを製造するインサイトゥ法は通常、フィーチャーが形成されるべき複数の異なるアドレスのそれぞれで、公知の化学的手段を用いて支持体上にポリヌクレオチドを形成する際に使用される同じ従来の繰り返しの手順に従って行われる。アレイの製造中、任意の１つの繰り返しサイクル中に異なるモノマーを支持体上の異なるアドレスに設けることができ、これにより、完成したアレイの異なるフィーチャーが、異なる所望のポリヌクレオチド配列を有するようになる。カップリングは、アレイのための特定の所望のフィーチャーの位置に、活性剤およびホスホアミダイトの液滴を堆積させる（貼り付ける）ことによって行うことができる。各繰り返しサイクルでは、１つ以上のさらなる中間ステップ、例えば従来の酸化ステップおよび洗浄ステップが必要となりうる。
【００１３】
前述のポリヌクレオチドの調製方法は公知である（例えば、非特許文献１〜４および特許文献１〜６を参照）。ホスホアミダイト法および亜リン酸トリエステル法は最も広範に使用されているが、他の手法としては、ホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、およびＨ−ホスホネート法がある。このような手法も公知である（例えば、非特許文献５を参照）。より最近のポリヌクレオチド合成の手法も知られている（２００１年４月２４日付けでDellingerらに付与された特許文献７を参照）。
【００１４】
多数の研究が、合成サイクル中の様々なステップの実現可能性および結果の改善を目指して行われているにも関わらず、基本的な戦略は、この２０年間で変化していない。方法論は、ある程度十分に確立され、時間をかけて有効性が証明されているようだが、活発な分子生物学および診断医学の分野における新規の研究の手段では、技術の新規の用途もしくは応用法を開拓し続けている。さらに、固有かつ多様な表面上に高純度の長いＤＮＡ配列の作製を可能にする、さらにより広範な合成方法のために、新規の応用法が差し迫って要求されている。また同様に、実際、固相ＤＮＡ合成の無数にある現在の応用法および未来の応用法は、確立された（しかし限られた）ホスホアミダイトに適合する試薬および溶媒の組に対応しない極端な物理的パラメータによって制限されることが多い。このような不適合の１つは、試薬と多数のＤＮＡマイクロアレイのために使用されるガラス表面との不都合な相互作用に起因する許容不可能なバックグラウンド蛍光として現れる。余剰の蛍光が生じる理由は十分に理解されていないが、最終的な結果として、ＤＮＡ結合の存在を知らせる蛍光に依存して行われるアッセイの感度の低下を招く。偽陰性結果または偽陽性結果が、この技術による利益を完全に否定しうるような状況は、診断医学分野では全く受け入れられない。
【００１５】
ＤＮＡマイクロアレイの製造に関する第２の懸念は、誘導化されたガラス基板上での迅速、有効、正確でかつ再現性のあるＤＮＡフィーチャーの合成である。マイクロアレイの大量生産の需要があることにより、産業界では基板上に試薬を割り当てることに関する新規のパラダイムの分析が押し進められている。現在の試薬を送達する（試薬を送り分配する）方法の１つによれば、インクジェットプリントヘッドから試薬を噴出させる。市販のインクジェットヘッドは、今のところ概念的な試験的生産の条件を満たしているが、速度および精度の要求が高まるにつれて、より有効でかつ信頼性の高いハードウェアが要求されていることは明らかである。より有用な産業用インクジェットヘッドは、より低い堅牢性というもの以外の全ての特性を提供するものの、残念ながら、操作には高粘度のインクが必要である。
【００１６】
粘度は、一般に、克服できない物理的な制限要素ではないが、満足のいく程度までホスホアミダイトカップリングで有用な溶媒の組はごくわずかであることを考えると、問題はより明白となろう。反応では、高極性の非プロトン性溶媒のみが有用であるが、これらの溶媒は、後続の各カップリングステップで９９％を超える効率が必要であることにより極めて著しく制約される。他の有用な溶媒は、最終オリゴマー製品が任意の欠失、変異または非効率的なカップリングを生じさせると考えられる他のエラーがあってはならない領域では役に立たない。有用な溶媒の粘度を増加させることが期待される大抵の溶媒または溶質はポリマー（エチレングリコール）またはポリオール（つまりグリセロール）のいずれかであるが、これらが反応を遅延させるか基質として作用してホスホアミダイトを消費してしまうということは、最も当惑させられる事実である。
【００１７】
したがって、上記欠陥および欠点を克服することが当分野で必要である。
【００１８】
【特許文献１】米国特許第４，４１５，７３２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４５８，０６６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５００，７０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，１５３，３１９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８６９，６４３号明細書
【特許文献６】欧州特許第０２９４１９６号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２２２，０３０号明細書
【非特許文献１】Caruthers、Science 230: 281-285、1985
【非特許文献２】Itakuraら、Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356
【非特許文献３】Hunkapillarら、Nature 310: 105-110、1984
【非特許文献４】Synthesis of Oligonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction of Oligonucleotide Derivatives、CRC Press、Boca Raton、Fla.１００頁以下
【非特許文献５】Beaucageら、Tetrahedron(1992)12:2223-2311
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
インクジェットプリンティングを利用した方法にも十分に対応可能な、ヌクレオチドアレイ製造のための溶液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決した本発明は、インクジェットプリントヘッド用溶媒およびアドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する方法を含む。特に、アドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する１つの例示的な方法は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される第１のヌクレオチド化合物を準備することであって、該第１のヌクレオチド化合物を、第１の共溶媒および第２の共溶媒を含む第１の溶液中に溶解し、該第１の共溶媒が有機塩を含み、該有機塩が、置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含み、該有機塩が約６〜８のｐＫａを有し、該有機塩が上記第１の溶液の反応特性を減少させず、該第１の溶液が約３０〜４０℃の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有する、第１のヌクレオチド化合物を準備することと、基板上の第１の位置に上記第１の溶液を配置することであって、構造物を該第１の位置に配置し、該構造物が、その上に配置した第２のヌクレオチド化合物を有し、該第２のヌクレオチド化合物が、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される、第１の溶液を配置することと、上記基板の第１の位置に第２の溶液を配置することであって、該第２の溶液が活性剤を含み、該活性剤が、上記第１のヌクレオチド化合物および上記第２のヌクレオチド化合物を含む第３のヌクレオチドの形成を開始させる、第２の溶液を配置することとを含む。
【００２１】
特に、アドレス可能なヌクレオチドアレイを形成する１つの例示的な方法は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される第１のヌクレオチド化合物を準備することであって、該第１のヌクレオチド化合物を、第１の溶媒を含む第１の溶液中に溶解し、該第１の溶媒が有機塩を含み、該有機塩が、置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含み、該第１の溶液が、約３０〜４０℃の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有する、第１のヌクレオチド化合物を準備することと、基板上の第１の位置に該第１の溶液を配置することであって、構造物を該第１の位置に配置し、該構造物が、その上に配置した第２のヌクレオチド化合物を有し、該第２のヌクレオチド化合物が、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから選択される、第１の溶液を配置することと、上記基板の第１の位置に第２の溶液を配置することであって、該第２の溶液は活性剤を含み、該活性剤が、上記第１のヌクレオチド化合物および上記第２のヌクレオチド化合物を含む第３のヌクレオチドの形成を開始させる、第２の溶液を配置することとを含む。
【００２２】
特に、１つの例示的なインクジェットプリントヘッド用溶媒は、置換された複素環式有機カチオンおよびアニオンを含む有機塩を含み、該有機塩は約６〜８のｐＫａを有し、第１の溶液は、約３０〜４０℃の温度で約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度および約２５〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有し、第１のヌクレオチド化合物は、該有機塩を含む該第１の溶液中に溶解されている。
【００２３】
本開示のさらなる目的、利点および新規の特徴は、以下の説明および実施例にその一部が記載されているが、これらは以下の明細書の試験により当業者に自明であるか、開示の実施によって習得することができる。本開示の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した装置、組合せ、組成物および方法によって理解され、達成されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
次に、本発明を、添付の図面を参照して詳説する。図面中の構成要素の縮尺は必ずしも正しくないことに留意されたい。
【００２５】
本開示の実施形態は、特に記載のない限り、当分野の範囲内の有機合成化学、生化学および分子生物学などの技術を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。
【００２６】
以下の実施態様は、本明細書中に開示されかつ特許請求の範囲に記載されている方法をどのようにして実施し、組成物をどのようにして使用するかを完全に開示し説明すると共に当業者に提供するために記載されている。数値（例えば量、温度等）に関して記載が正確になるよう努めたが、いくつかの誤差および偏差は存在するであろう。特に記載のない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧またはおおよそ大気圧である。標準温度および圧力は、２０℃および１気圧と定義する。
【００２７】
本開示の実施形態を詳述する前に、特に記載のない限り、本開示は、特定の材料、試薬、反応材料または製造プロセスなどに制限されず、変更可能であると理解すべきである。また、本明細書中で使用される用語が、特定の実施形態のみを説明することを目的とし、本発明を制限することを意図しないことも理解されたい。論理的に可能であれば、ステップを異なる順序で実施することも本開示では可能である。
【００２８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の単数形には、文脈上他で明確に示さない限り、複数の言及も含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「支持体」という言及には、複数の支持体が含まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲では、多数の用語について言及し、これらは、反対のものを意図することが明らかでない限り、以下の意味を有するように定義される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、一本または複数のストランドの構成が含まれ、この構成は１本または複数のストランドが別のストランドと完全に整列されていても、整列されていなくてもよい。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他のポリヌクレオチド型、および従来の骨格が天然に存在しない、すなわち合成の骨格に置換されているか、１つまたは複数の従来の塩基が天然に存在しない、すなわち合成の塩基に置換されている他のポリマーに属する。
【００３０】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、糖類および窒素含有塩基を含む核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体）のサブユニットならびにこのようなサブユニットの類似体をいう。
【００３１】
「ヌクレオシド」は、糖類および窒素含有塩基を含む核酸サブユニットをいう。「ヌクレオチド」という用語を、本明細書中で、開示の実施形態を説明するために使用するが、当業者は「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語はほとんどの例で交換可能であると理解していることに留意すべきである。当業者は、ヌクレオシドに対するさらなる修飾が必要であり、当業者はこのような知識を有すると理解するであろう。
【００３２】
「ヌクレオシド部分」は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオシドホスホアミダイトなどのより巨大な分子の一部として糖類および窒素含有塩基（ヌクレオシドなどの場合）を有する分子をいう。
【００３３】
「ヌクレオチドモノマー」は、より大きなオリゴヌクレオチド鎖またはポリヌクレオチド鎖中に組み込まれておらず、単一のヌクレオチドサブユニットに対応する分子を指し、ヌクレオチドモノマーはまた、活性化基または保護基がヌクレオチドモノマーの意図する使用に必要な場合、活性化基または保護基を有しうる。
【００３４】
「ポリヌクレオチド中間体」は、ポリヌクレオチドの化学合成工程の間に生じる分子をいい、ポリヌクレオチド中間体は、さらなる反応に供され、それにより意図する最終生成物（例えば、その後の合成工程でリン酸塩に酸化される亜リン酸中間体）または保護されたポリヌクレオチドが得られ、その後脱保護される。
【００３５】
「オリゴヌクレオチド」は、一般に、約２〜１００のヌクレオチド長のヌクレオチド多量体をいう一方で、「ポリヌクレオチド」には、任意の数のヌクレオチドを有するヌクレオチド多量体が含まれる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語には、天然に存在するプリン塩基およびピリミジン塩基（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ））だけでなく、修飾されたプリン塩基およびピリミジン塩基ならびに修飾されている他の複素環式塩基を含む部分（これらの部分は、時折、本明細書中で集合的に「プリン塩基およびピリミジン塩基ならびにそれらの類似体」をいう）が含まれると認識されるであろう。このような修飾には、例えば、メチル化プリンまたはピリミジン、およびアシル化プリンまたはピリミジンなど、またはアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリルまたはベンゾイルなどの保護基の付加が含まれる。プリン塩基またはピリミジン塩基はまた、上記の類似体でありうる。適切な類似体は当業者にとって既知であり、関連するテキストおよび文献に記載されている。一般的な類似体には、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、１−メチルシュードウラシル、ケオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、および２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
「ヌクレオチド間結合」は、天然に見出される核酸中のホスホジエステル結合または核酸および核酸類似体合成分野で既知の結合などの２つのヌクレオシド部分の間の化学結合をいう。ヌクレオチド間結合には、ホスホ基または亜リン酸基が含まれ、ホスホ基または亜リン酸基の１つまたは複数の酸素原子が置換基で修飾されているか、別の原子（例えば、硫黄原子またはモノ−またはジ−アルキルアミノ基の窒素原子）と置換された結合が含まれ得る。
【００３８】
「アレイ」には、反対に意図しない限り、特定の化学的部分を有するアドレス可能（addressable）な領域またはその領域に関連する部分（例えば、ポリヌクレオチド配列）の任意の一次元、二次元、または三次元配置が含まれる。アレイは、アレイが異なる部分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）の複数の領域を有し、その結果、アレイ上の特定の所定の位置（「アドレス」）における領域（アレイの「フィーチャー」または「スポット」）が特定の標的または標的クラスを検出する（しかしながら、フィーチャーが偶然にそのフィーチャーの非標的を検出する可能性もある）という点で、「アドレス可能（もしくはアドレス指定可能）」である。アレイの場合、「標的」は、種々の領域で基板に結合するプローブ（「標的プローブ」）によって検出されるべき、移動相（典型的には、流体）中の部分をいう。しかし、「標的」または「標的プローブ」のいずれかは、他方によって評価されるべき一方でありうる（したがって、一方は、他方との結合によって評価されるべきポリヌクレオチドの未知の混合物でありうる）。本開示のプローブおよび標的は典型的に一本のストランドであるが、これは不可欠ではない。「アレイレイアウト」は、フィーチャーの位置付け、フィーチャーのサイズ、および所与の位置の部分のいくつかの表示などの１つまたは複数のアレイの特徴をいう。ポリヌクレオチドに関して、「ハイブリッド形成」および「結合」を、交換可能に使用する。
【００３９】
「基」には、置換形態および非置換形態の両方が含まれる。典型的な置換基には、１つまたは複数の低級アルキル、任意のハロゲン、ヒドロキシル基、もしくはアリール、または１つまたは複数の利用可能な炭素原子上でシアノ、ニトロ、ハロゲン、またはヒドロキシル基などの非ヒドロカルビル置換基に任意選択的に置換されている置換基が含まれる。任意の置換基を、典型的には、反応収率に実質的に悪影響を与えないように選択することができる（例えば、特定の置換基または置換基の組合せを使用せずに得られた収量の２０％以下（すなわち、１０％、５％または１％））。「酢酸」には、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）またはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）などの置換酢酸が含まれる。
【００４０】
「ホスホ」基には、ホスホジエステル基、ホスホトリエステル基、およびＨ−ホスホネート基が含まれる。ホスホ基または亜リン酸基のいずれかの場合、置換された５員フリル環以外の化学的部分がホスホ基または亜リン酸基のＯに結合し、それによりフリル環とＰ原子との間で結合することができる。
【００４１】
「保護基」を、所望の反応の特定の条件下で官能基を逆に反応させない基を指すために従来の化学的意味で使用する。所望の反応後、保護基を除去して保護された官能基を脱保護することができる。全ての保護基は、相当な比率の合成分子を分解しない条件下で除去されるべきである（したがって、不安定となる）。保護基と対照的に、「キャッピング基」は、分子のセグメントに恒久的に結合し、そのセグメントの任意のさらなる化学変化を防止する。
【００４２】
「ヒドロキシル保護基」は、保護基がヒドロキシル基である保護基をいう。「反応部位ヒドロキシル」は、３’−５’ポリヌクレオチド合成時の末端５’−ヒドロキシルであり、かつ５’−３’ポリヌクレオチド合成時の３’−ヒドロキシルである。「酸不安定性保護ヒドロキシル」は、酸性条件によって除去することができる保護基によって保護されたヒドロキシル基である。同様に、「酸不安定性保護基」は、酸性条件によって除去することができる保護基である。酸性条件で除去することができる好ましい保護基（「酸不安定性保護基」）には、テトラヒドロピラニル基（例えば、テトラヒドロピラン−２−イルおよび４−メトキシテトラヒドロピラン−２−イル）、ｎアリール基（ｎ＝１〜３）を有するアリールメチル基および任意選択的に置換されたトリチル基などの３−ｎアルキル基（例えば、オリゴリボヌクレオチド合成のためのモノメトキシトリチルおよびオリゴデオキシリボヌクレオチド合成のためのジメトキシトリチル（ピキシル））、イソブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチル、ならびにジメチルシリルなどの保護基が含まれる。トリチル基は、トリフェニルメチル基である。適切な保護基は、T. W. Greenによる「Protective Groups in Organic Synthesis」、Wiley Interscienceに記載されている。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「アルキル」という用語は、特に明記しない限り、飽和した、直鎖の、分岐したまたは環状の１〜２４個、典型的には１〜１２個の炭素原子の炭化水素基を指し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチルおよび２，３−ジメチルブチルなどである。「低級アルキル」という用語は、１〜８個の炭素原子のアルキル基を意図し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチルおよび２，３−ジメチルブチルが含まれる。「シクロアルキル」という用語は、環状アルキル基をいい、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルなどである。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「アリール」という用語は、１〜５個の融合または結合した芳香環を含み、置換されていないか、典型的には、アミノ、ハロゲンおよび低級アルキルからなる群から選択される１個または複数の置換基で置換された芳香族種をいう。好ましいアリール置換基は、１〜３個の融合した芳香環を含み、特に好ましいアリール置換基は１個の芳香環または２個の融合した芳香環を含む。本明細書中に記載の芳香族基は、複素環であっても複素環でなくてもよい。「アラルキル」という用語は、アルキル種およびアリール種の両方を含む部分であって、典型的には、その部分のアルキルセグメント中に約２４個未満の炭素原子、より典型的には約１２個未満の炭素原子を含み、典型的には、１〜５個の芳香環を含む部分を意図する。用語「アラルキル」を、通常、アリール置換アルキル基をいうために使用する。「アラルキレン」という用語を、類似の様式で、アルキレン種およびアリール種の両方を含み、典型的にはアルキレン部分中に約２４個未満の炭素原子を含み、アリール部分中に１〜５個の芳香環を含む部分、典型的にはアリール置換アルキルをいうために使用する。例示的なアラルキル基は、構造−（ＣＨ２）ｊ−Ａｒ［式中、ｊは１〜２４、より典型的には１〜６の範囲の整数であり、Ａｒは単環式アリール部分である］を有する。
【００４５】
本開示の実施形態は、アドレス可能な生体高分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）アレイの製造方法、生体高分子アレイを形成するために使用される有機塩を含む溶液、および溶液を使用して生体高分子アレイを製造するインクジェットシステムを含み、これらは全て、上述の従来の方法と比較して多くの利点を有する。一般に、上記方法は、溶媒または共溶媒の存在下での標的生体高分子（以下「標的ポリヌクレオチド」）の形成を含み、これらの溶媒または共溶媒のうちの１つが有機塩を含む。一般に、有機塩は、有機カチオンと、無機もしくは有機の対イオン（アニオン）のいずれかとを含む。この場合、有機塩は、溶液の物理的特性（例えば粘度、表面張力および／または接触角）を変化させるために使用することができるが、有機塩は、溶液の反応特性（例えば、ヌクレオチド化合物の反応性、ヌクレオチド化合物の反応速度、保護基の脱ブロッキングおよび別の反応部位の遊離ならびに酸触媒の緩衝または中和）を著しくは減少させない。本発明では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両方が本開示の実施形態に含まれることを意図しているが、説明を簡単にするために、以下の開示ではポリヌクレオチドを含む態様を示す。
【００４６】
特に、本開示の実施形態は、基板上のポリヌクレオチドのアドレス可能なアレイの形成方法を提供し、この場合、ポリヌクレオチド化合物を調製するために使用される１つ以上の溶液が、溶媒または共溶媒として有機塩を含む。本方法の実施形態は、有機塩を含む溶媒／共溶媒中に溶解されたヌクレオチド組成物（例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）を有する溶液を含む。さらに、溶液をアレイ基板に接触させて、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを形成し、繰り返し工程を行うことで、対象である（目的の）標的ポリヌクレオチドを、上記化合物の１つが溶解されている１つ以上の溶液を使用して製造することができる。
【００４７】
上述のように、上記の有機塩を含む溶液および方法は、アレイ基板上でのポリヌクレオチドのインサイトゥ合成による、アドレス可能なポリヌクレオチドアレイの製造に特に有用である。１つのこのような実施形態では、基板上の複数の異なるアドレス（例えば、少なくとも１００個、少なくとも１，０００個または少なくとも１０，０００個のアドレス）のそれぞれで、インサイトゥ合成のサイクルを繰り返し、これにより、基板上の１つ以上の異なるアドレスで同一のまたは異なるポリヌクレオチド配列を有する、アドレス可能なアレイが形成される。このアレイ形成方法では、各アドレスでカップリングすべき化合物を、有機塩を含有する溶媒／共溶媒中に溶解し、例えばインクジェットプリントシステムを使用して、これらのアドレスに液滴として堆積させる。特定の順序を有する特定のアドレス可能な位置へ、工程を繰り返して溶液（例えば、各溶液が異なるヌクレオチドを含む４つの溶液から選択される）を堆積させることによって、ポリヌクレオチドを製造することができる。
【００４８】
ポリヌクレオチド合成は十分に研究されており、これらの方法は、水性溶媒および有機溶媒の両方を利用する。反応系中で溶媒を変化させることが、反応の実施に影響を与えることがよくあり、時には多大な影響を与えることが知られている。有機塩のイオン特性は、ポリヌクレオチド合成サイクルの種々の工程で使用される水性溶媒または有機溶媒の分子的性質と根本的に異なる。潜在的な問題は、化学機構の変化、例えば、溶媒のイオン特性のために異なる生成物を優先してしまうことを含む。有機塩との相互作用に起因する荷電反応中間体または有機塩自体の成分との化学反応の安定化が予想されうる。
【００４９】
前述の潜在的問題にもかかわらず、本開示の実施形態は、有機塩を含む溶媒中でヌクレオチド間結合の形成によってヌクレオチド部分のカップリングを達成する。有機塩を含む溶媒中でのカップリング反応を実施することには、様々な利点がある。１つの利点は、有機塩の疎水性により、反応環境内の水に起因する反応物質の加水分解に関する問題が減少することを含む。先行技術の方法に比べて、カップリングステップ間の洗浄に使用される溶媒はより少なくなり、有機塩溶媒の回復をより容易に行うことができる。このことは、多数の洗浄ステップおよび比較的大量の溶媒を必要とする大規模の合成で有用となりうる。有機塩を、増強剤（例えば増粘剤として）使用することができる。種々の有機塩がホスホアミダイト親和性の溶媒の粘度を増加させるように作用するだけでなく、純粋な溶媒としても共溶媒としてもカップリング反応を助ける。また、有機塩は容易に改質されて、溶媒として使用するための他の好ましい性質が付加される。その性質とは、特に、広範な粘度および表面張力、ならびに制御された基板への送達をもたらす標準的なガラス基板との接触角である。いくつかの有機塩類はまた、ホスホアミダイト化合物の補助となる標準的な有機溶媒、例えばアセトニトリル、プロピレンカーボネートおよびジメチルカーボネートと完全に混和する。多数の有機塩はまた、室温で測定不可能な（ほんのわずかな）蒸気圧を有する液体として存在し、この有機塩は、ピコリットルサイズの液体の送達が可能であり、噴出時に蒸発しない。有効なホスホアミダイトカップリングに必要な酸触媒として作用するいくつかの有機塩が開発されている。これらの活性化有機塩はまた、理想的な溶媒／共溶媒が取扱える好ましい粘度、表面張力、および溶解特性によって特徴づけられる。
【００５０】
上記のように、溶液は、ヌクレオチド組成物を溶解することができる有機塩を含有する。さらに、溶液は、１つ以上のさらなる溶媒（共溶媒）を含有しうる。溶液は、約２０〜３０℃の温度で約１〜１０００ｃＰ（１×１０−３〜１Ｐａ・ｓ）、約１〜２００ｃＰ（１×１０−３〜０．２Ｐａ・ｓ）、約５〜２０ｃＰ（５×１０−３〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）および約１５〜２０ｃＰ（１．５〜２．０×１０−２Ｐａ・ｓ）の粘度を有する。さらに、溶液は、約２０〜３０℃の温度で約２５〜４５ｍＮ／ｍ、約２５〜４０ｍＮ／ｍ、約３０〜４０ｍＮ／ｍおよび約３０〜３５ｍＮ／ｍの表面張力を有する。さらに、溶液は、接触角θを有し、これは、表面によって形成された平面に対する、液滴が表面に接触した場合に測定される入射角(incident angle)である。接触角は、それぞれの溶媒／表面の組に固有のものであり、接触角を、溶媒組成物または表面の表面エネルギーのいずれかの変化によって変化させることができる。（例えば、平面ガラスとの）接触角は、約２０℃〜３０℃の温度で約２０〜１００°、約３０〜９０°および約４５〜７０°である。有機塩と共溶媒との比を変更することによって、粘度、表面張力および／または接触角を調整する（すなわち、調節する）ことができることに留意されたい。
【００５１】
有機塩は、溶液の反応特性（例えば、ヌクレオチド化合物の反応性、ヌクレオチド化合物の反応速度、保護基の脱ブロッキングおよび別の反応部位の遊離、ならびに酸触媒の緩衝化または中和）を減少させない。１つの実施形態では、有機塩は、別の共溶媒（すなわち、プロピレンカーボネート）を有する共溶媒であり、有機塩は溶液の粘度および表面張力を改変させるにも関わらず、溶液の反応特性にはあまり影響を与えない。
【００５２】
有機塩は、約６〜８、約６．５〜７．５、約６．８〜７．２のｐＫａを有する。
【００５３】
有機塩には、有機カチオン、および無機または有機対イオン（アニオン）のいずれかが含まれる。有機カチオンは、好ましくは、式
【００５４】
【化９】
2006308601.tif 000005
【００５５】
［式中、Ｒはアルキル（例えば、Ｃ２〜Ｃ１０）であり、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド、アルキル（例えば、Ｃ２〜Ｃ１０）またはハロゲンから選択される］を有するＮ置換ピリジンである（のカチオンである）か、以下の構造
【００５６】
【化１０】
2006308601.tif 000006
【００５７】
［式中、Ｒは、独立して、アルキルから選択され、各Ｒ’は、独立して、ヒドリド、アルキル（例えば、Ｃ２〜Ｃ１０）、またはハロゲンから選択され、Ｒ’’は、ヒドリドまたはメチルから選択される］を有する１，３二置換イミダゾールである（のカチオンである）。
【００５８】
１，３二置換イミダゾール有機カチオンには、１，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−エチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ブチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ヘキシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−デシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ドデシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−オクチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−テトラデシル−イミダゾリウム、１，２−ジメチル−３−プロピル−イミダゾリウム、１−エチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウム、１−ブチル−２，３−ジメチル−イミダゾリウムおよびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。特に、１，３二置換イミダゾール有機カチオンには、１−エチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ブチル−３−メチル−イミダゾリウム、１−ドデシル−３−メチル−イミダゾリウム、１−メチル−３−オクチル−イミダゾリウムおよびこれらの組合せが含まれる。
【００５９】
Ｎ置換ピリジン有機カチオンには、Ｎ−エチルピリジニウム、Ｎ−ブチルピリジニウム、Ｎ−ヘキシルピリジニウム、４−メチル−Ｎ−ブチル−ピリジニウム、３−メチル−Ｎ−ブチル−ピリジニウム、４−メチル−Ｎ−ヘキシル−ピリジニウム、３−メチル−Ｎ−ヘキシル−ピリジニウム、４−メチル−Ｎ−オクチル−ピリジニウム、３−メチル−Ｎ−オクチル−ピリジニウム、３，４−ジメチル−Ｎ−ブチル−ピリジニウムおよび３，５−ジメチル−Ｎ−ブチル−ピリジニウムが含まれるが、これらに限定されない。特に、Ｎ置換ピリジン有機カチオンには、Ｎ−エチルピリジニウム、Ｎ−ブチルピリジニウムおよびこれらの組合せが含まれる。
【００６０】
有機塩アニオンの実施形態には、メチルスルフェート（ＣＨ３ＳＯ４−）、トリフルオロアセテート（ＣＦ３ＣＯ２−）、ヘプタフルオロブタノエート（ＣＦ３（ＣＦ２）２ＣＯ２−）、トリフレート（ＣＦ３ＳＯ２−）、ノナフレート（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２−）、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−）、ビス（ペルフルオロエチルスルホニル）イミド（（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２）２Ｎ−）、トシレートアニオン、ジシアニミドアニオン、トリス（トリフルオロメチルスルホニル）メチド（（ＣＦ３ＳＯ２）３Ｃ−）が含まれるが、これらに限定されない。特に、アニオンは、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−）およびこれらの組合せでありうる。有機塩を、Covalent Associates（Woburn, Mass.）、Aldrich Chemical Company（Milwaukee、WI.）、Solvent Innovation（Koeln、ドイツ）およびAcros Organics（Geel、ベルギー）から入手することができる。
【００６１】
有機塩の使用量は、一つには、特定の実施形態のために使用される粘度に依存することに留意すべきである。溶液の重量％の下限は、０．０１、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０および９０でありうる一方で、上限は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２および１でありうる。
【００６２】
上述のように、有機塩は、１つ以上の他の共溶媒と混合することができる共溶媒でありうる。他の共溶媒には、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、プロピレンカーボネート、アジポニトリル、トルエン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、エチレンカーボネート、ジエチルカーボネート、スクシノニトリル、Ｎ−メチルピロリドンおよびこれらの組合せなどの溶媒が含まれる。典型的なポリヌクレオチド合成で使用しないスルホラン、ニトロメタン、ニトロベンゼンおよびこれらの組合せなどの溶媒を、本開示の実施形態では共溶媒として使用できることに留意すべきである。特に、共溶媒には、アセトニトリル、プロピレンカーボネート、アジポニトリル、エチレンカーボネートおよびこれらの組合せが含まれる。収率が低く、ほとんどの場合それが許容不可能な収率であるために典型的なポリヌクレオチド合成で典型的には使用されないさらなる共溶媒には、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、アジポニトリル、トルエン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、スクシノニトリル、Ｎ−メチルピロリドン、スルホラン、ニトロメタン、ニトロベンゼンおよびこれらの組合せが含まれる。
【００６３】
有機酸と同様に、共溶媒の使用量は、特定の実施形態のために粘度にある程度依存することに留意すべきである。溶液の重量％の下限は、０．０１、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０および９０でありうる一方で、上限は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２および１でありうる。
【００６４】
当技術分野で既知のように、溶液に活性剤を添加し、通常、高反応性中間体の形成によってヌクレオチド間結合の形成を触媒する。ホスホジエステルでは、ホスホジエステルおよびＨ−ホスホネート化合物、ルイス酸活性剤、例えばスルホニルハライド、スルホニルアゾール、ピバロイルハライド、ピバロイルアゾールおよびアダマンタンカルボニルハライドを使用して混合無水物を形成させ、これを新たなヌクレオチド間結合のために反応させる。ホスホアミダイト化合物の場合、プロトン酸触媒を使用して、リン−窒素結合の置換速度を増大させる。この速度は、酸性プロトンを含むアゾール触媒の使用によってさらに増大させることができる。プロトン酸アゾール活性剤には、テトラゾール、Ｓ−エチル−チオテトラゾール、４−ニトロトリアゾール、５−ベンジルチオ−テトラゾールまたはジシアノイミダゾールなどの化合物が含まれるが、これらに限定されず、他の酸性アゾールを使用することもできる。活性剤化合物は、典型的には、約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で含まれる。これらの活性剤の濃度は、ホスホアミダイトカップリングを補助する溶媒中のアゾールの溶解性に少なくともある程度は依存する。しかし、いくつかのこれらの活性剤は、種々の有効なカップリング溶媒の濃度で溶解することができる。高濃度では、これらの試薬の酸性の性質により、典型的には、酸不安定性保護基の除去などの望ましくない副反応が引き起こされる。
【００６５】
ある実施形態では、活性剤には、上記の有機塩が含まれうる。特に、有機塩活性剤には、メチルイミダゾリウムトリフルオロメチルスルホニルイミドおよびその組合せなどの有機塩が含まれるが、これらに限定されない。有機塩活性剤化合物は、典型的には、約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で含まれる。
【００６６】
アレイの製造では、異なるヌクレオチドモノマーおよび活性剤を、任意の１つのサイクル中に基板上の異なるアドレスに堆積させることができ、その結果、完成したアレイの異なるフィーチャーが、異なる配列を有するポリヌクレオチドを有する。ポリヌクレオチドアレイのインサイトゥ製造の場合、従来の酸化工程、キャッピング工程および洗浄工程などの１つ以上のさらなる中間工程が各サイクルで必要でありうる（例えば、これらの工程を、適切な試薬にアレイ表面を浸すことによって行うことができる）。
【００６７】
開示の別の実施形態を、合成サイクルの他の工程での酸化および脱保護時の水の存在を減少または実質的に消失させるための溶媒としての有機塩の使用に拡大することができる。したがって、例えば、ポリヌクレオチドアレイ合成では、この実施形態によってアレイ表面上の全てのアドレスにわたる洗浄工程（非水性溶媒を使用）の回数を減少させるので、時間および溶媒を潜在的に同時に節約できる。
【００６８】
方法の実施形態により、３’→５’方向または５’→３’方向のいずれかでアレイ基板上にポリヌクレオチドが合成される。前者の場合、合成プロセスの最初のステップは、最初のヌクレオチドの３’位でのアレイ基板への結合を含み、次なるモノマーの共有結合に利用可能な５’位を残す。後者の場合、合成プロセスの最初のステップは、最初のヌクレオチドの５’位でのアレイ基板への結合を含み、次なるモノマーの共有結合に利用可能な３’位を残す。合成後、所望ならば、ポリヌクレオチドを固相支持体から切断することができる。３’→５’方向または５’→３’方向のいずれかでの合成の詳細は、先行技術および本明細書中に含まれる開示に基づいて当業者に自明である。
【００６９】
１つの実施形態では、モノマーヌクレオチドホスホアミダイトを、有機塩を含む溶媒中に溶解し、得られた溶液を、平面基板表面上に堆積させ、従来のポリヌクレオチド合成と同様にこのプロセスを複数回繰り返し、それにより対象である標的ポリヌクレオチドを形成する。
【００７０】
開示は、２つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの間またはポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの間のヌクレオチド間結合の形成も含み、これにより、アレイ表面上に固定した伸長ポリヌクレオチドが得られる。このような場合、一方のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが有機塩を含む溶媒に溶解され、溶液に接触させるべき基板は他方のポリヌクレオチドまたがオリゴヌクレオチドを有する。
【００７１】
当業者は、ホスホアミダイトと同様に、一方のヌクレオチド部分を活性化させることを理解するであろう。このような修飾は当技術分野で既知である。開示はまた、溶媒中に溶解されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに、修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾ポリヌクレオチドが含まれる実施形態、詳細には、修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾ポリヌクレオチドが「活性化」されるか、結合形成しやすい実施形態を含む。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドこのような修飾を、不溶性基板へのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの固定のために以前に使用された既知の化合物を使用して行うことができる。このような修飾の例は、Polymer-supported Reactions in Organic Chemistry、Hodge, P. & Sherrington, D.C.、（John Wiley & Sons、New York、NY、1980）、Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids、Shabarova, Z. & Bogdanov, A.、（VCH、Weinheim、ドイツ1994）、531〜545頁に記載されている。
【００７２】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブを、固定（例えば、前合成されたプローブの共有結合）または基板上でのプローブの合成（インサイトゥ合成）のいずれかによって基板上に配置する。ポリヌクレオチドアレイの製造では、典型的には、アレイが形成されるか形成された基板表面上の各領域（「アレイ領域」）を、１つ以上の試薬に完全に晒す。例えば、アレイ領域を、しばしば１つ以上の試薬に晒して、それにより表面上に基板およびポリヌクレオチドの両方に結合する適切な層を形成する。インサイトゥ合成では、アレイ領域を、典型的には、酸化試薬、脱ブロッキング試薬および任意選択的なキャッピング試薬にも晒す。同様に、特に予め得たオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを堆積させることによる製造では、アレイ領域を適切なブロッキング試薬に晒して、標的への非特異的結合由来のフィーチャーが存在しない表面上の位置をブロッキングすることが望ましい。
【００７３】
アレイには、非常に多数のフィーチャーを含むことができ、一般に、少なくとも何十ものフィーチャー、通常には少なくとも数百ものフィーチャー、より通常には数千ものフィーチャー、数十万またはそれ以上ものフィーチャーが含まれてもよい。全てのフィーチャーが異なっていていもよく、いくつかまたは全部が同一であってもよい。各フィーチャーは、予め規定された（決められた）部分または部分の予め規定された混合物、例えば、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドの予め規定された混合物を有する。アレイのフィーチャーを、任意の所望のパターン（例えば、フィーチャーの規則正しい行および列（例えば、基板表面を横切るフィーチャーのグリッド）、基板表面を横切る一連の曲線の行（例えば、フィーチャーの一連の同心円または半円など））に配置することができる。非常に小さなフィーチャーの寸法が望ましい実施形態では、基板上のフィーチャーの密度は、１平方センチメートルあたり少なくとも約１０個のフィーチャー、１平方センチメートルあたり少なくとも約３５個のフィーチャー、１平方センチメートルあたり少なくとも約１００個のフィーチャー、１平方センチメートルあたり約１，０００個のフィーチャーまで、１平方センチメートルあたり約１０，０００個のフィーチャーまで、または１平方センチメートルあたり約１００，０００個のフィーチャーまでの範囲でありうる。各フィーチャーは、予め規定されたヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列の混合物の場合も含む）を有する。
【００７４】
１つの実施形態では、約１０〜１００個のこのようなアレイを、１つの基板（ガラスなど）上に形成することができる。このような実施形態では、基板の表面上にポリヌクレオチドを設けた後、基板を基板セグメントに切断することができ、これらはそれぞれ１つまたは２つのアレイを有しうる。アレイを互いに分離させるいかなる空隙も必要ないことも認識される。アレイパターンが望ましい場合、例えばアレイの組織化された行および列（例えば、基板表面を横切るアレイのグリッド）および基板表面を横切る一連の曲線の行（例えば、アレイの一連の同心円または半円）などを含む、任意の種々の幾何学構造を構成することができる。
【００７５】
アレイ基板は、単純な構成から複雑な構成まで任意の種々の構成を取ることができる。したがって、基板は、一般に、例えば、スライドまたは平面構成、例えば長方形、正方形または平円形などとしての平らな形態を有しうる。多数の実施形態では、基板を、一般に、長方形の固体として成形し、その長さが約４ｍｍ〜３００ｍｍ、通常は約４ｍｍ〜１５０ｍｍ、より通常には約４ｍｍ〜１２５ｍｍの範囲であり、幅が約４ｍｍ〜３００ｍｍ、通常は約４ｍｍ〜１２０ｍｍ、より通常には約４ｍｍ〜８０ｍｍの範囲であり、厚みが約０．０１〜５．０ｍｍ、通常は約０．１ｍｍ〜２ｍｍ、より通常には約０．２ｍｍ〜１ｍｍの範囲である。ポリヌクレオチドが結合する基板表面は、滑らかであるか実質的に平面でもあり、また、くぼみまたは隆起などの凹凸を有しうる。アレイの構成は、製造、操作および用途を検討して選択することができる。
【００７６】
アレイの製造では、利用可能なポリヌクレオチドの量は、通常は、非常に少量でありかつ高価である。さらに、試験に利用可能な試料の量も通常は非常に少量であり、したがって、アレイ上の非常に多数の異なるプローブに対して同一の試料を同時に試験することが望ましい。したがって、本発明の１つの実施形態は、非常に多数の非常に小さな密集したフィーチャーを使用したアレイの製造を提供する。アレイを、最小で約１０μｍから最大で約１．０ｃｍの範囲の幅（円形スポットについては直径）を有することができるフィーチャーを使用して製造することができる。非常に小さなスポットまたはフィーチャーが望ましい実施形態では、本発明にしたがって、小さいスポット中に材料を堆積させることができ、この小さいスポットは、約１．０μｍ〜１．０ｍｍの範囲の幅、通常約５．０μｍ〜０．５ｍｍ、より通常には約１０μｍ〜２００μｍの範囲の幅である。典型的には（しかし不可欠ではない）、いかなるポリヌクレオチドも含まないフィーチャー間領域が存在する。フィーチャー間領域は、種々の大きさおよび構成でありうることが理解されるであろう。
【００７７】
適切な基板は、種々の形態および組成を有することができ、天然に存在する材料、天然に存在する材料を合成的に修飾したもの、または合成材料に由来しうる。適切な支持材料の例には、ニトロセルロース、ガラス、シリカ、テフロンおよび金属（例えば、金およびプラチナなど）が含まれるが、これらに限定されない。適切な材料には、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびこれらの配合物など）、多糖類、例えばアガロース（例えば、PharmaciaからSepharose（登録商標）として市販されているアガロース）およびデキストラン（例えば、PharmaciaからSephadex（登録商標）およびSephacyl（登録商標）という商品名で市販されているデキストランなど）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびヒドロキシメチルメタクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマーなどを含む高分子材料も含まれる。
【００７８】
図１は、特に、ポリヌクレオチドアレイの製造のために適切な（上記のような）基板へのヌクレオチド化合物の堆積の適用で有機塩溶媒／共溶媒を使用するアレイ合成システム１０の実施形態を示す。図１に示すアレイ合成システム１０を使用して、不溶性平面基板を、有機塩を含む溶媒中に溶解したヌクレオチド組成物に接触させることができる。図１に示すアレイ合成システム１０は、基板１４に取り付けることができる基板ステーション１２を有している。基板ステーション１２は、基板１４がガラス製であることが多いので、基板１４上で過剰に加圧することなく基板１４を保持するための適切な真空供給源（図示せず）に連結された真空チャックを具備しうる。さらに、アレイ合成システム１０は、分注ヘッド１６を具備する。分注ヘッド１６を、システムを位置付けることで基板ステーション１２に対面するように位置付けることができる。位置付けシステムは、基板ステーション１２に連結されたキャリッジ、プロセッサによって制御される第１の運搬装置、およびプロセッサによって制御される第２の運搬装置を具備する。第１の運搬装置およびキャリッジを使用して、ｘ軸方向への基板ステーション１２の移動によって分注ヘッド１６に対面する基板ステーション１２の１つの軸の位置付けを実行し、第２の運搬装置を使用して、ｙ軸およびｚ軸方向を調整する。さらに、一旦基板ステーション１２が分注ヘッド１６に対面して位置付けられると、位置付けシステムは、取り付けられた基板１４を典型的にはライン毎に横切って分注ヘッド１６をスキャンするように使用されるが、他のスキャニング構成を使用することもできる。
【００７９】
分注ヘッド１６は、一般にプリンタのインクジェットで使用されているタイプのものであってよく、例えば、溶媒／共溶媒として有機塩を含む予め得たいずれかの溶液の保持のための１つ以上のチャンバと連通する複数の液滴吐出オリフィスを有しうる。噴出装置は、１以上のチャンバ中に、対応するオリフィスの反対側にそれぞれ位置付けられる。例えば、各噴出装置は、プロセッサの制御下で加熱素子として動作する電気抵抗器の形態でありうる（しかし、代わりに圧電素子を使用することもできる）。関連する噴出装置およびチャンバの一部を具備する各オリフィスは、対応するパルスジェットを規定する。この様式では、排出装置への単一電気パルスの印加により、対応するオリフィスから液滴が吐出する。特に、分注ヘッドは、産業用インクジェットプリントヘッドである。
【００８０】
上記のように、ヌクレオシド組成物が基板上の生体分子または基板自体と反応するのに十分な時間および条件下で、溶媒／共溶媒として有機塩を含む溶液への基板を接触させた後、得られたアレイの表面を、望むようにさらに処理して、使用するためのアレイを製造することができる。例えば、インサイトゥ合成のために合成サイクルを反復することができる。別の例として、アレイ表面を洗浄して、非結合試薬（例えば、未反応のポリマーなど）を除去することができる。任意の好適な洗浄溶液およびプロトコル（例えば、水性洗浄液、例えば水、メタノールおよびアセトニトリルなどを流すこと）を、アレイの表面全域でなどで使用することができる。表面を乾燥させ、その後の使用のために保存することなどもできる。
【００８１】
有機塩を含有する溶液を使用したポリヌクレオチドアレイの製造のためのさらに別の方法および装置は、例えば、Schleifferらに対する米国特許第６，２４２，２６６号に記載されており、該特許は、基板上への液滴を分注するための液体分注ヘッドおよび基板に対するヘッドの位置付け方法を記載している。Cattellに対する米国特許第６，１８０，３５１号およびPerbostに対する米国特許第６，１７１，７９７号は、ポリヌクレオチドアレイを製造する有用な別の方法を記載している。アレイの製造方法には、例えば、各フィーチャーのための試薬溶液の液滴を堆積するためのインクジェットタイプのヘッドなどのパルスジェットの使用が含まれる。このような技術は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２５１１６号およびＷＯ９８／４１５３１号などに記載されている。このような方法では、ヘッドは、流体の液滴を基板に分注することができる少なくとも１つのジェット、オリフィスを具備するチャンバおよび作動時にオリフィスから液滴が排出される排出装置を含むジェットを有する。ヘッドは、複数のパルスジェット（熱排出装置または圧電排出装置を有するパルスジェットなど）を使用し、ヘッドの共通の前面部上にオリフィスを具備するインクジェットプリンタで一般的に使用されるタイプであってよい。ヘッドは、基板に対面するオリフィスと共に位置付ける。複数の流体の液滴（流体は、イオン性液体を含む溶媒中に溶解されたヌクレオチドモノマー、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む）を、ヘッドオリフィスから分注し、これにより、基板上に液滴のアレイが形成される（この形成されたアレイは、所望の最終アレイと同一であっても同一でなくてもよく、それというのは、例えば複数のヘッドが最終アレイの形成のために使用可能であり、ヘッドの複数の流路がアレイの完成に必要でありうるからである）。
【００８２】
インクジェットプリントの技術分野で既知のように、パルスジェットの１回の作動事象で吐出される流体の量を、特にオリフィスの直径、オリフィスの長さ（オリフィスでのオリフィス部材の厚み）、堆積チャンバのサイズおよび加熱素子のサイズを含む、多数のパラメータのうちの１つ以上の変更によって制御することができる。１回の作動事象で吐出される流体の量は、一般に、約０．１〜１，０００ｐＬ、通常には約０．５〜５００ｐＬ、より通常には約１．０〜２５０ｐＬである。流体がチャンバから吐出される典型的な速度は、約１ｍ／ｓより大きく、通常には約１０ｍ／ｓより大きく、約２０ｍ／ｓまたはそれ以上ともなりうる。十分理解されるように、排出装置の受容表面に対して移動してオリフィスが作動する場合、実際の材料の堆積部位は、作動の瞬間にオリフィス対する視線方向にある（オリフィスから透視線上にある）位置ではなく、所与の距離および速度に対して予想可能な位置となっている。
【００８３】
しかしながら、本開示がパルスジェット堆積システムに制限されないことを特に理解すべきである。特に、米国特許第５，８０７，５２２号などに記載のものを含む、基板を溶媒／共溶媒として有機塩を含む溶液に接触させるための任意のタイプのアレイ製造装置を使用することができ、または米国特許第５，１４３，８５４号および米国特許第５，４０５，７８３号などに記載のアレイ部分を形成するためのフォトリソグラフィ技術を使用できる装置、またはアレイの部分の製造に使用できる任意の他の適切な装置を使用することができる。例えば、支持体表面の個別の位置へ所定体積の水溶液を正確に堆積させるための自動装置、すなわちアレイヤー（arrayer）も、Genetic Microsystems、Cartesian Technologies、Beecher Instruments、Genomic SolutionsおよびBioRoboticsを含む多数の業者から市販されている。他の方法および装置は、米国特許第４，８７７，７４５号、同第５，３３８，６８８号、同第５，４７４，７９６号、同第５，４４９，７５４号、同第５，６５８，８０２号および同第５，７００，６３７号に記載されている。生体高分子化合物のアレイおよび生体高分子化合物のアレイの製造方法を記載した特許および特許出願には、米国特許第５，２４２，９７４号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４２９，８０７号、同第５，４３６，３２７号、同第５，４４５，９３４号、同第５，４７２，６７２号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５２９，７５６号、同第５，５４５，５３１号、同第５，５５４，５０１号、同第５，５５６，７５２号、同第５，５６１，０７１号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３９，６０３号、同第５，６５８，７３４号、国際公開パンフレット第９３／１７１２６号、同第９５／１１９９５号、同第９５／３５５０５号、同第９７／１４７０６号、同第９８／３０５７５号、欧州特許第７４２  ２８７号および同第７９９  ８９７号が含まれる。Beierら「Versatile derivatisation of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips」、Nucleic Acids Research(1999) 27、1970〜1977も参照されたい。
【実施例】
【００８４】
ホスホアミダイト法にも産業用プリントヘッドからのジェットプロセスにも対応する新規の溶媒系を規定するために、増強剤、例えば増粘剤として有機塩溶液を使用するいくつかの組成物を開発した。種々の単純な有機塩がホスホアミダイト親和性溶媒の粘度を増加させるように作用するだけでなく、有機塩は純粋な溶媒または高濃度の溶質のいずれかとしてカップリング反応を補助する。また、有機塩は、溶媒として使用するための他の好ましい質を付与するために容易に修飾される。特に、同族系のＮ，Ｎ−ジアルキルイミダゾリウムおよびＮ−アルキルピリジニウム塩については、広範な粘度および表面張力ならびに制御された基板への送達をもたらす標準的なガラス基板との接触角を有することが見いだされた。いくつかのこれらのイミダゾリウム塩およびピリジニウム塩類はまた、アセトニトリル、ジエチルカーボネート、プロピレンカーボネート、ブチロニトリル、プロパンニトリル、アジポニトリル、Ｎ−メチルピロリジノンおよびこれらの組合せなどのホスホアミダイト法を助ける標準的な有機溶媒と完全に混和する。多数の有機塩はまた、室温で極めて低い蒸気圧を有する液体として存在し、この有機塩は、ピコリットルの量の液体の送達が可能であり、噴出時に蒸発しない。最後に、効率の良いホスホアミダイトカップリングに必要な酸触媒として作用するイミダゾリウム塩が開発されている。これらの活性化有機塩は、これが、好ましい粘度、表面張力および溶解特性を有する理想的な溶媒／共溶媒であることによっても特徴付けられる。
【００８５】
有機塩の合成
いくつかの場合、所望のイミダゾリウムカチオンまたはピリジニウムカチオンの臭化物塩または塩化物塩は市販されており、これらを出発材料として使用した。他の塩は、１−メチルイミダゾールおよび種々のアルキルハライドからの調製を必要とした。典型的な調製では、２．０Ｌフラスコ中で、１−メチルイミダゾール３０９ｇ（３００ｍＬ、３．７６ｍｏｌ）を、１−クロロドデカン１１６０ｇ（１．５当量、５．６５ｍｏｌ）および１，４−ジオキサン約２００ｍＬと組合せた。反応フラスコを冷却塔に取り付け、アルゴンでパージし、９０〜１００℃にまで６日間加熱した。次いで、反応物を冷却し、ロータリーエバポレーターによって過剰なジオキサンを除去した。得られた粘性のあるオイルを、約１．０Ｌのメタノールに溶解し、そのうちの３００ｍＬを１．０Ｌのヘキサンで５回以上洗浄した。１Ｈ−ＮＭＲが１−クロロドデカンの完全な除去を示すと、メタノール溶液をプールし、ロータリーエバポレーターで濃縮して、オフホワイトの固体を得た（９６１ｇ、約８９％）。この固体の半分（４８０ｇ）を、脱イオン水に溶解し、２．０Ｌの分液漏斗に移した。この溶液に、リチウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（１．１当量、５３０ｇ）の第２の水溶液を添加した。瞬時に二相系が得られ、この二相系は、水相と、イオン性液体としての３−ドデシル−１−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド（１２ｍｉｍＴＦＳＩ）塩からなるより密度の高い相とからなる。ジクロロメタン約６００ｍＬを添加し、分液漏斗を激しく震盪した。有機相を回収し、脱イオン水で５回洗浄した。次いで、洗浄した有機相を回収し、ロータリーエバポレーターによって過剰なジクロロメタンを除去して粘性のある褐色液体が得られ、高真空下（５００μｍＨｇ未満）にて６０℃で２時間さらに乾燥させた。バルク液体を、ナルゲンボトル(nalgene bottle)に移し、活性化した３Åの分子篩により、カールフィッシャー滴定でＨ２Ｏ量が３０ｐｐｍ未満を示すまで乾燥させた。
【００８６】
別の調製では、１．０Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中で、１−メチルイミダゾール１５０ｍＬ（１．８８ｍｏｌ）を、１−ブロモブタン１．５当量（３９０ｇ、３０３ｍＬ）に溶解した。溶液を、ボイルし始めるまで（約３０分まで）ドラフト内で超音波処理した。超音波処理を停止し、反応混合物を３０分間冷却した。超音波処理をさらに４５分間繰り返し、得られた粘性のある液体を丸底フラスコに移した。過剰な１−ブロモブタンをロータリーエバポレーターによって除去し、得られたオイルを脱イオン水に溶解し、酢酸エチルで２回洗浄して未反応の１−メチルイミダゾールを除去した。ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド塩への変換は、前述のように行い、１−メチルイミダゾールの３−ブチル−１−メチルイミダゾリウムブロミドへの８５％変換（酢酸エチルでの洗浄前に、超音波処理された粗生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって測定した収率）が得られた。最終生成物（ｂｍｉｎＴＦＳＩ）は透明な粘性液体であった。
【００８７】
活性化塩（１−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド）（ＨｍｉｍＴＦＳＩ）を、類似の様式で、分液漏斗中のＮａＨ２ＰＯ４水溶液１．２当量（６２２ｇ、４．５１ｍｏｌ）へ１−メチルイミダゾール３００ｍＬ（３．７６ｍｏｌ）を溶解することによって調製した。上記のように、この溶液を、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド塩への変換に直接使用した。最終生成物（ＨｍｉｍＴＦＳＩ）を透明な粘性液体として単離したが、数日間静置すると予測不能な様式で結晶性のワックスを形成することが認められた。ワックスは、６０℃の加熱によって容易に融解した。
【００８８】
物理的特性
一連の３−アルキル−１−メチルイミダゾリウム塩（アルキル基はエチルからドデシルまでの長さで変動する）について、いくつかの物理的特性を試験した。これらのカチオンは、所定のアニオンと対合した場合に室温で有機塩を形成する傾向があるので、これらのカチオンを最初に追跡した。
【００８９】
追跡した他の有機塩は、ホスホアミダイト法で有用な既知の溶媒に容易に溶解し、試薬と反応しないかまたは試薬を分解し、容易に乾燥することができ、試料調製において最小限の注意深さで使用することができた。
【００９０】
例示的なアニオンによって、上記要件を満たすだけでなく、種々の溶媒の粘度、表面張力および接触角が有用に変更された塩が得られた。ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドアニオン（以後、ＴＦＳＩと呼ぶ）の場合、３−アルキル−１−メチルイミダゾリウムカチオンと対合した場合に、上記の全ての性質が得られ、室温の液体が常に生じた。ＴＦＳＩアニオンにより、室温で固体のピリジニウム塩も得られ、これは、粘度、表面張力および接触角の改質剤として種々の溶媒に添加することができた。プロトン化１−メチルイミダゾリウムカチオンのＴＦＳＩ塩により、物理的特性（すなわち、粘度、表面張力および接触角）の改質剤およびホスホアミダイトカップリングの活性剤として作用可能な低融解固体も得られる。
【００９１】
ここで、３−アルキル−１−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロスルホニル）イミド（ＡｍｉｍＴＦＳＩ）塩を、単純な有機塩の物理的特性の範囲の例として示す。３−エチル−１−メチルイミダゾリウムＴＦＳＩ（ＥｍｉｍＴＦＳＩ）、３−ブチル−１−メチルイミダゾリウムＴＦＳＩ（ＢｍｉｎＴＦＳＩ）、３−オクチル−１−メチルイミダゾリウムＴＦＳＩ（ＯｍｉｍＴＦＳＩ）および３−ドデシル−１−メチルイミダゾリウムＴＦＳＩ（１２ｍｉｍＴＦＳＩ）を含む、いくつかの前記塩を調製し、評価した。前述のように、活性化塩である１−メチルイミダゾリウムＴＦＳＩ（ＨｍｉｍＴＦＳＩ）も調製した。いくつかの塩の温度依存性粘度を測定し、同様に、ガラス基板上の表面張力および接触角を測定した。各パラメータを順に検討する。
【００９２】
種々の溶媒の粘度を、ＴｈｅｒｍｏＨａａｋｅＶＴ５５０回転バレル粘度計の絶縁されたスリーブに取り付けられたＢｒｉｎｋｍａｎｎＬａｕｄａＲＣ６ＣＳ温度制御水循環浴を使用して指示された条件下で測定した。表１に示すように、純粋なＡｍｉｍＴＦＳＩイオン性液体の粘度は、温度によって様々に変化し、アルキル鎖の長さにも依存することが認められた。これらの塩とプロピレンカーボネートおよびジエチレンカーボネートなどの溶媒との混合物では、モル／モル比に基づくほぼ平均の粘度が得られる。これらの混合物を使用して、カップリングで有用でかつプリントヘッドから首尾よく噴出する粘度範囲（約８〜１２ｃＰ（８×１０−３〜１．２×１０−２Ｐａ・ｓ））に収まる溶媒を得ることができる。より短い鎖の誘導体（ＥｍｉｍおよびＢｍｉｍ）は、試験範囲の温度変化に対してより安定性が高く、温度安定性の配合物の開発でより有用でありうる。温度に対する可変性の高い、より長い鎖の誘導体（Ｏｍｉｍおよび１２ｍｉｍ）は、温度によって溶媒の性質を変化させなくてはならない用途で有用でありうる。
【００９３】
【表１】
2006308601.tif 000007
【００９４】
接触角を、ガラス基板と測定値を得たい溶媒の１〜３ｍｍの液滴との間の接合部分を、高倍率で直接観察することによって測定した。金表面上の溶媒の接触角の測定も試みたが、金基板は質に問題があり、得られた数値も疑わしかった。インクジェットヘッドのオリフィスを金の不活性層でコーティングする場合、金に対する接触角は噴出プロセスで重要である。ガラス基板では（表２）、約９０°までの接触角（°）が理想的であり、角度が低すぎると基板へのプリント制御が不十分となり、角度が高すぎると表面への接触が不適切になる。接触角が約７０〜１１０°の範囲の溶媒系が、プリントのプロセスでより高い有用性を示すと予想できる。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
種々の３−アルキル−１−メチルイミダゾリウムＴＦＳＩ塩の表面張力は、これまでに文献で報告されている（Dzyuba, S.V.、Bartsch, R.A.、Chem. Phys. Chem.、3、161-166、2002）。表面張力は、長鎖アルキル誘導体（ＯｍｉｍＴＦＳＩ、１２ｍｉｍＴＦＳＩ）の３０ｍＮ／ｍ未満から、ＥｍｉｍＴＦＳＩ塩の約４０ｍＮ／ｍまで変化することが認められる。この傾向は、アルキル鎖が長くなるにつれて増加する、粘度で認められた傾向と逆である。活性作用のあるＨｍｉｍＴＦＳＩ塩の表面張力を、ドゥニュイ円環法を利用したＤａｔａｐｈｙｓｉｃｓＤＣＡＴ張力計を使用して測定した。その値（３８．２ｍＮ／ｍ）は、アルキル置換１−メチルイミダゾリウム塩の範囲の中間に収まる。効率の良い噴出のために、３５〜４５ｍＮ／ｍの範囲の表面張力が、今のところ本発明者らの目的で許容される値であろう。溶媒系の表面張力を、可溶性有機塩とホスホアミダイトカップリングを支持する他の溶媒との種々の比での混合によって容易に改変することができる。例えば、種々の比率のプロピレンカーボネート（表面張力は約４５ｍＮ／ｍ）、ジエチレンカーボネート（表面張力は約２８ｍＮ／ｍ）およびＨｍｉｍＴＦＳＩ（表面張力は約３８ｍＮ／ｍ）により、許容範囲の粘度を有すると同時に３５ｍＮ／ｍ〜４５ｍＮ／ｍの表面張力を有する溶媒が得られることが示された。
【００９７】
３１Ｐ−ＮＭＲによるカップリング研究
ＡＳＷ多核プローブおよびＳＵＮワークステーションを具備した４００ＭＨｚＶａｒｉａｎＵｎｉｔｙＩｎｏｖａ分光計にてデータを得た。典型的な実験では、ホスホアミダイトを、過剰な５’−ジメトキシトリチルチミジンまたは３’−アセチルチミジンの存在下で、純粋なイオン性液体または有機塩と共溶媒との適切な混合物のいずれかに１００ｍＭの濃度に溶解した。３１Ｐ−ＮＭＲを使用して、これらの条件下でのホスホアミダイトの安定性を測定した。この混合物の安定性が測定した後、活性剤（ＨｍｉｍＴＦＳＩ）を、純粋な塩としてまたは共溶媒との溶液中で約５〜１０％の最終濃度まで添加した。次いで、３１Ｐ−ＮＭＲを使用して、カップリング反応効率を測定した。
【００９８】
図２は、ホスホアミダイトカップリングを支持する溶媒系の典型的な結果を示す。イミダゾリウムカチオンおよびピリジニウムカチオンベースの種々の塩が、カップリング反応を支持することが認められた。また、いくつかのアニオンが、ホスホアミダイトカップリングに適合することも見出された。以下の例では、Ｎ−エチルピリジニウムＴＦＳＩが、Ｂｍｉｍカチオンのトリフルオロメタンスルホニル（トリフレート）塩と同様に、カップリングを支持することが示されている。全体として、上で概説した可溶性、反応性または安定性を制限せずに試験した全ての塩は、カップリング反応を支持した。ホスホアミダイトは、カップリングを支持することが見出された全ての純粋なイオン性液体、ならびに有機塩および共溶媒からなる全ての混合溶媒系において、少なくとも１００ｍＭの濃度に溶解可能であることが見出された。
【００９９】
図２は、Ｎ−エチルピリジニウムＴＦＳＩイオン性液体中に溶解した、チミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す。約１４８ｐｐｍで認められたピークは、未反応のホスホアミダイトに対応する。
【０１００】
図３は、５％（ｖ／ｖ、体積％）のＨｍｉｍＴＦＳＩ活性剤の添加後、Ｎ−エチルピリジニウムＴＦＳＩイオン性液体中に溶解したチミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す。約１４０ｐｐｍのピークは、亜リン酸トリエステル生成物に対応する。約１５ｐｐｍのピークは、Ｈ−ホスホン酸塩に対応する。
【０１０１】
図４は、３−ブチル−１−メチルイミダゾリウムトリフレートイオン性液体中に溶解したチミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す。約１４８ｐｐｍで認められたピークは、未反応のホスホアミダイトに対応する。
【０１０２】
図５は、５％（ｖ／ｖ）のＨｍｉｍＴＦＳＩ活性剤の添加後、３−ブチル−１−メチルイミダゾリウムトリフレートイオン性液体中に溶解したチミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す。約１４０ｐｐｍのピークは、亜リン酸トリエステル生成物に対応する。約１５ｐｐｍのピークは、Ｈ−ホスホン酸塩に対応する。
【０１０３】
純粋な有機塩および溶媒混合物中でのオリゴマーＤＮＡの合成
固相ホスホアミダイトカップリングのための溶媒としての有機塩の安定性を実証するために、２つの方法を使用した。まず、手動での合成を行い、シリンジを使用してホスホアミダイト、有機塩および活性剤からなる送達溶液を機能化されたＣＰＧ−５００合成カラムに送達した。典型的な合成では、ホスホアミダイトを、純粋なイオン性液体または有機塩と共溶媒との混合物のいずれかに１００ｍＭの濃度で溶解し（水含有量３０ｐｐｍ未満まで乾燥）、「溶液Ａ」を得た。次いで、活性剤（ＨｍｉｍＴＦＳＩ）を、同一のイオン性液体または共溶媒に５〜５０％の濃度に溶解し（水含有量３０ｐｐｍ未満まで乾燥）、「溶液Ｂ」を得た。３００μＬのアリコート（試料分割分量）を、溶液Ａおよび溶液Ｂから採って２つの異なるシリンジに入れ、これらのシリンジを、１．０μｍｏｌのＤＮＡ合成カラムの末端に取り付けた。次いで、２つのシリンジ上のプランジャを交互に押し引きして、ＣＰＧ（微細孔性ガラス）基板に１．０〜２．０分間連続して試薬を流し込んだ。カップリングステップの完了後、ＣＰＧを、５ｍＬのアセトニトリルで洗浄し、後述のように、残りの合成サイクルをＡＢＩ３９２ＤＮＡ合成装置で完了した。他の手動によるカップリング実験では、ホスホアミダイトを、ＨｍｉｍＴＦＳＩ活性剤を含む溶液に溶解し、この活性化溶液をカップリングに直接使用した。
【０１０４】
第２の方法では、一連の合成の全体についてＡＢＩ３９２ＤＮＡ合成装置を使用した。ホスホアミダイトを有機塩および適切な共溶媒の溶液に溶解し、合成装置のチャネルを容易に通過することのできる十分に低い粘度（約１０ｃＰ（０．０１Ｐａ・ｓ））の溶液を得た。いくつかの実験では、活性剤を、ホスホアミダイト溶液に添加し、その後に個別の活性剤溶液と混合する必要はなかった。各ステップ後には、十分な溶媒洗浄およびチャネルのフラッシングを行う標準的な合成プロトコルを使用した。各合成で異なるステップは、カップリングステップ試薬の反応カラムへの充填に割り当てた時間だけであった。各溶媒混合物の粘度は、試薬の送達に必要な時間を変化させるのに十分な範囲に変動していた。したがって、各試薬混合物について、反応カラムを完全に充填するための所要時間が決まるように時間設定をした。次いで、この予め測定された時間を、一連の合成における各カップリングステップのために使用した。いかなる合成においてもキャッピングステップを使用しなかった。一連のカップリング以外の全ての他のステップを、上記の手動カップリング基板にも使用した。典型的な合成は、以下のステップを含んでいた。
―トリチル脱ブロッキング ８５秒
―ホスホアミダイト送達 溶媒粘度によって決定した種々の充填時間
―静電結合   １．０〜３．０分
―ヨウ素酸化  ２０秒
―４０％アンモニア水溶液での６０℃で１２時間の処理によって達成された、固体支持体からの切断
【０１０５】
逆相ＨＰＬＣを使用して、生成物を分析した。データを、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアパッケージを実行するワークステーションで収集した。アセトニトリルおよび５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムまたは５０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウムの勾配を使用して、４．０×２５０ｍｍＡｇｉｌｅｎｔＨｙｐｅｒｃｉｌＯＤＳ（登録商標）の５μｍ逆相カラムから生成物を溶離した。以下は、純粋なイオン性液体（２−エチル−１−メチルイミダゾリウムＴＦＳＩ）中または有機塩とジエチレンカーボネートまたはプロピレンカーボネートとの混合物中で調製したＤＮＡオリゴマーのいくつかの例である。
【０１０６】
図６に、上記の手動によるカップリングプロトコルによって調製されたＴ４のＮＭＲスキャンを示す。ホスホアミダイトを、１２ｍｉｍＴＦＳＩとプロピレンカーボネートとの約１：１（ｖ／ｖ）混合物に１００ｍＭまで溶解した。成長中のオリゴマーへのカップリングを、ホスホアミダイト溶液２００μＬと、ＨｍｉｍＴＦＳＩおよびプロピレンカーボネートの１：１（ｖ／ｖ）混合物２００μＬとを同時に導入して、その後２．０分間溶媒を連続的にカラムに流過させることによって活性化した。
【０１０７】
図７は、上記プロトコルによるＡＢＩ３９２ＤＮＡ合成装置によって調製されたＴ１２のＮＭＲスキャンを示す。ホスホアミダイトを、共溶媒および活性剤として作用する７５％ジエチレンカーボネートおよび２５％ＨｍｉｍＴＦＳＩ（ｖ／ｖ）に１００ｍＭまで溶解した。溶媒系は、約７ｃＰ（７×１０−３Ｐａ・ｓ）の最終粘度を有し、さらなる希釈または活性化を行わずにカラムに直接送った。２．０分間のカップリング時間を使用して、アセトニトリル中でのカップリングに匹敵する結果を得た。
【０１０８】
図８は、上記の手動によるカップリングプロトコルによって調製されたＴ４のＮＭＲスキャンを示す。ホスホアミダイトを、純粋なＥｍｉｍＴＦＳＩイオン性液体３００μＬ中に１００ｍＭまで溶解した。この溶液を、ＥｍｉｍＴＦＳＩ中に溶解した０．２５Ｍジシアノイミダゾール活性剤溶液３００μＬと共に合成カラムに送った。
【０１０９】
上記実施形態は、本発明の完全な開示を目的として極めて詳細に記載しているが、開示の精神および原理を逸脱することなくこのような詳述の多数の変更形態が可能であることが当業者に明らかである。したがって、開示は、添付の特許請求の範囲のみに制限されるべきである。
【０１１０】
本明細書中に記載の全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本願に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】アレイ合成系の実施形態を示す図である。
【図２】Ｎ−エチルピリジニウムトリフルオロメチルスルホニルイミド（ＴＦＳＩ）イオン性液体中に溶解したチミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す図である。
【図３】５％（ｖ／ｖ）のメチルイミダゾリウム（Ｈｍｉｍ）ＴＦＳＩ活性剤の添加後、Ｎ−エチルピリジニウムＴＦＳＩイオン性液体中に溶解したチミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す図である。
【図４】３−ブチル−１−メチルイミダゾリウムトリフレートイオン性液体中に溶解したチミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す図である。
【図５】５％（ｖ／ｖ）のＨｍｉｍＴＦＳＩ活性剤の添加後、３−ブチル−１−メチルイミダゾリウムトリフレートイオン性液体中に溶解したチミジンホスホアミダイト（１００ｍＭ）および過剰な３’−アセチルチミジンのＮＭＲスキャンを示す図である。
【図６】上記の手動によるカップリングプロトコルによって調製したＴ４のＮＭＲスキャンを示す図である。
【図７】上記のプロトコルによってＡＢＩ３９２ＤＮＡ合成装置で調製したＴ１２のＮＭＲスキャンを示す図である。
【図８】上記のプロトコルによるマニュアルカップリングによって調製したＴ４のＮＭＲスキャンを示す図である。
【符号の説明】
【０１１２】
１０  アレイ合成システム
１２  基板ステーション
１４  基板
１６  分注ヘッド
【図１】
2006308601.tif 000015
【図２】
2006308601.tif 000016
【図３】
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【図４】
2006308601.tif 000018
【図５】
2006308601.tif 000019
【図６】
2006308601.tif 000020
【図７】
2006308601.tif 000021
【図８】
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