(57)【要約】【課題】  各種工業薬品、農薬及び医薬品の製造原料として広範な活用が期待され、産業上、重要な化合物である光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を得るための、効率的に優れた製造方法を提供する。【解決手段】  ＤＬ体の混合物である２−アルキルシステインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させて、反応生成物である２−アルキル−L−システインと、未反応物である光学活性２−アルキル−D−システインアミドの混合物となし、この混合物から光学活性２−アルキル−D−システインアミドを分取した後、アミド結合を加水分解して光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で示される２−アルキルシステインアミドに、２−アルキル−L−システインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させて、反応生成物である一般式（２）で示される２−アルキル−L−システインと、未反応物である一般式（３）で示される光学活性２−アルキル−D−システインアミドの混合物となし、この混合物から光学活性２−アルキル−D−システインアミドを分取した後、そのアミド結合を加水分解して一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システインを得ることを特徴とする、２−アルキルシステインアミドから光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法。
【化１】
2006000005.tif 000010
‥‥（１）
【化２】
2006000005.tif 000011
‥‥（２）
【化３】
2006000005.tif 000012
‥‥（３）
【化４】
2006000005.tif 000013
‥‥（４）
（一般式（１）、（２）、（３）、及び（４）中のＲは炭素数１〜４の低級アルキル基である。）
【請求項２】
一般式（１）で示される２−アルキル−Ｌ−システインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物が、キサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコプラナ属に属する細菌である、請求項１に記載の２−アルキルシステインアミドから光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法。
【請求項３】
一般式（１）、（２）、（３）、及び（４）においてＲがメチル基である、請求項１又は２に記載の２−アルキルシステインアミドから光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＬ体の混合物である一般式（１）で示される２−アルキルシステインアミドから、一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法に関する。詳しくは、一般式（１）で示される２−アルキルシステインアミドに、２−アルキル−L−システインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させて、反応生成物である一般式（２）で示される２−アルキル−L−システインと、未反応物である一般式（３）で示される光学活性２−アルキル−D−システインアミドの混合物となし、この混合物から光学活性２−アルキル−D−システインアミドを分取した後、そのアミド結合を加水分解して一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法に関する。光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩（以下、単に光学活性２−アルキル−D−システインと記すことがある）は、各種工業薬品、農薬、及び医薬品の製造中間体として重要な物質である。
【化１】
2006000005.tif 000002
‥‥（１）
【化２】
2006000005.tif 000003
‥‥（２）
【化３】
2006000005.tif 000004
‥‥（３）
【化４】
2006000005.tif 000005
‥‥（４）
（一般式（１）、（２）、（３）、及び（４）中のＲは炭素数１〜４の低級アルキル基である。）
【背景技術】
【０００２】
従来、光学活性２−アルキルシステインの製造方法としては、光学活性なL−システインメチルエステルを出発原料として、ピバルアルデヒドで環化、ホルムアルデヒドで保護し、リチウム試薬とヨウ化メチルでメチル化した後、塩酸で開環、脱保護して２−メチル−L−システインを塩酸塩として得る方法が知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。しかし、この方法は出発原料が光学活性体であり、工程数が多く煩雑であり、高価な試薬を必要とするため、工業的に優れた方法とは言いがたい。
【０００３】
また、光学活性２−アルキルシステインの製造法として、L−システインエチルエステルを出発原料として、ニトリル化合物で環化、ヨウ化メチルなどのメチル化剤を用いてメチル化を行いラセミ体のエステルとし、リパーゼ等を用いた酵素加水分解反応による光学分割により目的とする光学活性４−メチル−チアゾリン−４−カルボン酸を得て、さらに加水分解を施すことにより光学活性２−メチルシステインを得る方法が報告されている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。しかし、この方法は光学活性体を原料とするにもかかわらず、工程途中における中間体がラセミ体となり再び光学分割を行う必要があるため、工程が煩雑となり工業的には適しているとは言いがたい。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６,４０３,８３０号明細書
【非特許文献１】Gerald Pattenden, Stephen M. Thom and Martin F. Jones, Tetrahedron, Vol49, No.10, pp2131-2138, 1993
【特許文献２】特開２００３−２０１２８４号公報
【特許文献３】欧州特許第１３０２４６７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、各種工業薬品、農薬及び医薬品の製造原料として広範な活用が期待され、産業上、非常に有用な化合物である一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる実状に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行ったところ、一般式（1）で示される２−アルキルシステインアミドのアミド結合を生化学的に不斉加水分解して一般式（２）で示される光学活性２−アルキル−L−システインを生成せしめ、一般式（３）で示される未反応の光学活性２−アルキル−D−システインアミドを回収した後に、これを加水分解することにより一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システインを製造する方法を見出し、本発明に到達した。即ち、本発明は、以下の１）から３）に示す、一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩の製造法に関するものである。
１）一般式（１）で示される２−アルキルシステインアミドに、２−アルキル−L−システインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させて、反応生成物である一般式（２）で示される２−アルキル−L−システインと、未反応物である一般式（３）で示される光学活性２−アルキル−D−システインアミドの混合物となし、この混合物から光学活性２−アルキル−D−システインアミドを分取した後、そのアミド結合を加水分解して一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システインを得ることを特徴とする、２−アルキルシステインアミドから光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法。
【化５】
2006000005.tif 000006
‥‥（１）
【化６】
2006000005.tif 000007
‥‥（２）
【化７】
2006000005.tif 000008
‥‥（３）
【化８】
2006000005.tif 000009
‥‥（４）
（一般式（１）、（２）、（３）、及び（４）中のＲは炭素数１〜４の低級アルキル基である。）
２）一般式（１）で示される２−アルキル−Ｌ−システインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物が、キサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコプラナ属に属する細菌である、１）に記載の２−アルキルシステインアミドから光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法。
３）一般式（１）、（２）、（３）、及び（４）においてＲがメチル基である、１）又は２）に記載の２−アルキルシステインアミドから光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する方法。
【発明の効果】
【０００７】
各種工業薬品、農薬及び医薬品の製造原料として広範な活用が期待され、産業上、非常に有用な化合物である一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩を製造する効率的に優れた方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明の詳細について説明する。本発明の一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システインにおいて、式中のRは炭素数１〜４の低級アルキル基であればよく、特に制限はないが、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、secブチルおよびtertブチルなどの直鎖又は分枝した低級アルキル基が好適であり、メチル基が特に好適である。
【０００９】
また、一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システインの塩の種類は、実用上許容できる塩であれば特に制限はないが、例えば塩酸や硫酸等の無機酸、ギ酸や酢酸等の有機酸、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属、マグネシウムやカルシウム等のアルカリ土類金属、トリメチルアミンやテトラメチルアンモニウム等の有機アルカリ、或いはアンモニア等が上げられる。得られる２−アルキルシステインの安定性という意味で特に塩酸塩、硫酸塩が好適である。
【００１０】
本発明の一般式（４）で示される光学活性２−アルキル−D−システイン又はその塩は、一般式（１）で示される２−アルキルシステインアミドのアミド結合を生化学的に不斉加水分解して一般式（２）で示される光学活性２−アルキル−L−システインを生成せしめ、一般式（３）で示される未反応の光学活性２−アルキル−D−システインアミドを回収した後、さらにそのアミド結合の加水分解を行うことにより製造することができる。本発明で使用する一般式（１）で示される２−アルキルシステインアミドは、その製法及び品質等に特に制限はなく、例えば４−アルキルチアゾリジンカルボン酸アミド誘導体を加水分解する方法などによって得ることができる。
【００１１】
本発明の一般式（１）で示される２−アルキルシステインアミドの生化学的不斉加水分解に使用される微生物は、２−アルキル−L−システインアミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有する微生物であればよく、このような微生物として例えば、キサントバクター属、プロタミノバクター属及びミコプラナ属等に属する微生物、具体的にはキサントバクター  フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ）ＮＣＩＢ  １００７１、プロタミノバクター  アルボフラバス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ８４５８、ミコプラナ  ラモサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓｅ）ＮＣＩＢ９４４０、ミコプラナ  ディモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ４２７９が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、或いは細胞融合若しくは遺伝子組換え法等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等の何れの株であっても上記能力を有するものであれば、本発明に使用できる。
【００１２】
これらの微生物の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須の無機塩、栄養等を含有させた培地を用いて行われる。培養時のｐHは、４〜１０の範囲であり、温度は２０〜５０℃である。培養は1日〜１週間程度好気的に行われる。このようにして培養した微生物は、生菌体又は該生菌体処理物、例えば培養液、分離菌体、菌体破砕物、さらには精製した酵素として反応に使用される。また、常法に従って菌体又は酵素を固定化して使用することもできる。
【００１３】
２−アルキルシステインアミドの生化学的不斉加水分解反応の条件は、２−アルキルシステインアミド濃度０．１〜４０ｗｔ％、２−アルキルシステインアミドに対する微生物の使用量は、乾燥菌体として重量比０．０００１〜３、反応温度１０〜７０℃、ｐH４〜１３の範囲であることが好ましい。なお、２−アルキルシステインアミドの濃度が高い場合には、前記微生物の使用量比が、好ましい範囲の上限である３以下であって、反応が好適に実施できる比率を適宜選択すればよい。本反応に用いる２−アルキルシステインアミドや生成する２−アルキルシステインは酸化を受けやすく、酸素存在下で放置すると2量化したジスルフィド（２，２’−ジアルキルシスチン誘導体）となる。これを防止するため、生化学的不斉加水分解反応は防酸化雰囲気で行なうのが好ましい。ここで言う防酸化雰囲気とは、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気、或いは反応系内に２−メルカプトエタノール等の還元性物質を共存させる方法を示す。反応を行う際、さらにＭｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏ等の金属イオンを酵素触媒の活性化剤として添加してもよい。添加する量は使用する培養菌体の菌株の種類、添加する金属イオンの種類によって異なり一概には言えないが、通常は１〜５０ｐｐｍとなる濃度の金属イオンを添加することにより、不斉加水分解速度を向上させることができる。例えば、２価のＭｎイオンを５〜２０ｐｐｍ加えた場合、反応速度は、無添加の場合に比較して２〜５倍と大幅に向上する。
【００１４】
２−アルキルシステインアミドの生化学的不斉加水分解反応で生成した光学活性２−アルキル−L−システインと、本発明の目的物である未反応の光学活性２−アルキル−D−システインアミドとの分離は、反応終了液から、例えば遠心分離或いは濾過膜などの通常の固液分離手段により微生物菌体を除いた母液を、ｐH７〜１４、好ましくはｐH８〜１２に調整した後、非水溶性有機溶媒で抽出し、その抽出液を濃縮すると光学活性２−アルキル−D−システインアミドが得られる。この際に用いる非水溶性有機溶媒としては特に限定されず、目的とする２−アルキル−Ｄ−システインアミドの溶解性を見て決定されれば良く、通常に用いられるジエチルエーテルやジイソプロピルエーテル等のエーテル類、塩化メチレンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素等が使用可能であるが、中でも２−アルキル−Ｄ−システインアミドの溶解性の点でジエチルエーテルやジイソプロピルエーテル等のエーテル類、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類が好適に用いられる。得られた２−アルキル−Ｄ−システインアミドは、その物性に合わせて再結晶やカラムクロマトグラフィー等の通常に行なわれる精製方法で精製できる。また、この抽出操作や精製操作においても酸化を防止するために、窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気で操作することが好ましい。
【００１５】
次に、得られた2−アルキル−Ｄ−システインアミドの水溶液を窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で、酸触媒を用いて加熱還流すると、ほぼ定量的に加水分解反応が進行して、対応する２−アルキル−Ｄ−システインが得られる。この際に用いられる酸としては、通常に加水分解触媒として用いられる一般的な酸で特に問題はないが、揮発性の酸である塩酸が反応後の処理が容易であり、コスト的にも安価であることから好適である。また酸の使用量は、２−アルキル−Ｄ−システインアミドに対して同等モル以上であればよく、上限は限定されないが、過剰の酸の後処理などに掛かるコスト的な観点から、好ましくは２〜１５倍モルの範囲が好適である。このようにして得られた反応液から過剰の酸、アンモニウム塩を除去すると目的とする２−アルキル−Ｄ−システインと使用した酸の塩が得られる。過剰の酸及びアンモニウム塩と、目的とする２−アルキル−Ｄ−システインの分離は、再結晶や脱塩透析、イオン交換樹脂等、一般的に用いられる手法で適宜実施されれば良く、その方法は限定されない。
【００１６】
本発明の方法によって得られる光学活性２−アルキル-Dーシステインの具体例を挙げるならば、例えば２−メチル−D−システイン、２−エチル−D−システイン等の光学活性２−アルキル−D−システインがある。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げ、本発明について更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
実施例１
次の組成を有する培地を調製し、この培地２００ｍＬを１Ｌの三角フラスコに入れ、滅菌後、キサントバクター  フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ）ＮＣＩＢ  １００７１を接種し、３０℃で４８時間振とう培養を行い、培養液から、遠心分離により乾燥菌体１．０ｇに相当する生菌体を得た。
培地組成（ｐH７．０）
グルコース          １０ｇ
ポリペプトン          ５ｇ
酵母エキス            ５ｇ
KH2PO4                １ｇ
MgSO4・７H2O      ０．４ｇ
FeSO4・７H2O    ０．０１ｇ
MnCl2・４H2O    ０．０１ｇ
水                    １Ｌ
次いでラセミ体の２−メチルシステインアミド塩酸塩１０．０ｇ（０．０５９ｍｏｌ）を水３００ｍＬに溶かした後、５００ｍＬフラスコに入れ、乾燥菌体１．０ｇに相当する生菌体を加えて、窒素気流下、４０℃で２４時間攪拌して加水分解反応を行った。反応後、反応液から遠心分離によって菌体を除去して上清を得た。この上清液に、脱気後に不活性ガス置換した活性炭２ｇを加えて２時間攪拌した後活性炭を濾別した。濾液に４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３０ｍＬを加えて、ｐＨ１０とした後、２００ｍＬのジエチルエーテルで５回抽出した有機相を無水硫酸ナトリウムで５時間乾燥し、沈殿物を濾別した濾液をエバポレーターで濃縮して白色ペースト状固体を得た。このペースト状固体を少量のエタノールを用いて窒素雰囲気下で再結晶し、結晶３．５ｇ（０．０２６ｍｏｌ）濾取した。得られた２−メチル−Ｄ−システインアミド３．５ｇ（０．０２６ｍｏｌ）を濃塩酸（３６％）２０ｍＬに溶解し、窒素気流下で１時間加熱還流した。反応液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した後、得られた固体をエタノールで再結晶させた。得られた結晶は真空乾燥を行い、２−メチル−Ｄ−システイン塩酸塩  ４．３ｇ（０．０２５ｍｏｌ）の白色結晶を得た。反応に仕込んだラセミ混合物中の２−メチル−D−システインアミド塩酸塩からの単離収率は８３ｍｏｌ％、２−メチル−D−システインアミドのラセミ混合物からの単離収率は４２ｍｏｌ％であった。得られた結晶を学異性体分離カラムを用いた液体クロマトグラフィーによって分析した結果、光学純度は９７％ｅ．ｅ．以上であった。