(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の測定すべき物質に特異的に結合する物質を用いる複数の物質の同時測定方法および測定試薬に関する。【解決手段】平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器に、それぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質にそれぞれ特異的に結合する物質と試料とを接触させ、多孔性支持体と複合体を形成した標識を生成させる工程、および多孔性支持体と複合体を形成した標識量を測定する工程を含む複数物質の測定方法。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器に、それぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質にそれぞれ特異的に結合する物質と試料とを接触させ、多孔性支持体と複合体を形成した標識を生成させる工程、および多孔性支持体と複合体を形成した標識量を測定する工程を含むことを特徴とする複数物質の測定方法。
【請求項２】
平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している反応容器に、それぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質と試料とを接触させ、多孔性支持体と複合体を形成した標識を生成させる工程、および多孔性支持体と複合体を形成した標識量を測定する工程を含むことを特徴とする複数物質の測定方法。
【請求項３】
標識量の測定がＣＣＤカメラを用いる画像処理により行われる請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
酵素がアルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼである請求項４の測定方法。
【請求項６】
発光物質がアクリジニウム化合物である請求項４の測定方法。
【請求項７】
測定すべき物質が抗体である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標識の測定が補助試薬を用いて行われる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体は、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器、およびそれぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質にそれぞれ特異的に結合する物質を含む複数物質の測定用試薬。
【請求項１０】
平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している反応容器、およびそれぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質を含む複数物質の測定用試薬。
【請求項１１】
多孔性支持体が平板上下両面を貫通している請求項９または１０記載の試薬。
【請求項１２】
多孔性支持体が中空糸である請求項９〜１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１３】
測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である請求項９〜１２のいずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
平板の厚みが０．０１〜１０ｍｍである請求項９〜１３のいずれか記載の試薬。
【請求項１５】
標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である請求項９〜１４のいずれかに記載の試薬。
【請求項１６】
補助試薬を含有する請求項９〜１５のいずれかに記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の測定すべき物質に特異的に結合する物質を用いる複数の物質の同時測定方法および測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断検査の領域では、従来から一つの検査項目に専用の試薬を用いて、各検査項目が別個の試薬や装置で測定されてきている。しかし、近年、臨床診断において、一種類の検査項目結果だけではなく、多数の検査項目を一度に測定したいという要求が高まっている。また、専用試薬では、幼児など少量の検体量しか採取出来ない場合は、限られた項目しか検査できない場合がある。
【０００３】
これを解決すべく、ＤＮＡチップなどの技術を使用して種々の抗原や抗体などをスライドガラス上に各ドットとして結合させ、検体と反応後、洗浄、蛍光標識を行って各ドットの蛍光強度をＣＣＤカメラを使用して測定し、この蛍光強度からイメージングにより各ドットに対応する抗体や抗原の濃度を概算する方法が知られている（非特許文献１）。
また、反応場の微量化のためにマイクロタイターウエルの底面に複数の小さなドットを印字する方法でそれぞれ別々の抗原または抗体を複数固定化し、通常のサンドイッチ免疫測定法で洗浄、標識、洗浄を行い、小さなドットの発光を高感度なＣＣＤカメラを使用して各ドットの発光強度を測定して、同時に複数の物質を検出または定量する方法が知られている（非特許文献２）。
【非特許文献１】ゲノム・バイオロジー（Genome Biol.）、2 (2):Research 0004.1-0004.13、2001年
【非特許文献２】ドラッグ・ディスカバリー・アンド・デベロプメント（Drug Discovery & Development）、81頁、October、2001年   しかし、標識を用いて測定対象物を検出する方法においては、測定反応が微小な平面で行われるため、十分な検出感度が得られないとう問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、複数の測定すべき物質に特異的に結合する物質を用いる複数の物質の同時測定方法および測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）〜（１６）に関する。
（１）  平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器に、それぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質にそれぞれ特異的に結合する物質と試料とを接触させ、多孔性支持体と複合体を形成した標識を生成させる工程、および多孔性支持体と複合体を形成した標識量を測定する工程を含むことを特徴とする複数物質の測定方法。
【０００６】
（２）  平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している反応容器に、それぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質と試料とを接触させ、多孔性支持体と複合体を形成した標識を生成させる工程、および多孔性支持体と複合体を形成した標識量を測定する工程を含むことを特徴とする複数物質の測定方法。
【０００７】
（３）  標識量の測定がＣＣＤカメラを用いる画像処理により行われる前記（１）または（２）記載の方法。
（４）  標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  酵素がアルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼである前記（４）の測定方法。
【０００８】
（６）  発光物質がアクリジニウム化合物である前記（４）の測定方法。
（７）  測定すべき物質が抗体である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  標識の測定が補助試薬を用いて行われる前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体は、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器、およびそれぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質にそれぞれ特異的に結合する物質を含む複数物質の測定用試薬。
【０００９】
（１０）  平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している反応容器、およびそれぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質を含む複数物質の測定用試薬。
【００１０】
（１１）  多孔性支持体が平板上下両面を貫通している前記（９）または（１０）記載の試薬。
（１２）  多孔性支持体が中空糸である前記（９）〜（１１）のいずれかに記載の試薬。
（１３）  測定すべき物質に特異的に結合する物質が抗体である前記（９）〜（１２）のいずれかに記載の試薬。
【００１１】
（１４）  平板の厚みが０．０１〜１０ｍｍである前記（９）〜（１３）のいずれか記載の試薬。
（１５）  標識が酵素、発光物質、蛍光物質および色原体から選ばれる標識である前記（９）〜（１４）のいずれかに記載の試薬。
（１６）  補助試薬を含有する前記（９）〜（１５）のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、複数の測定すべき物質に特異的に結合する物質を用いる複数物質の同時測定方法および測定試薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法は、平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器を用いて、反応液中、それぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質にそれぞれ特異的に結合する物質と試料とを接触させ、多孔性支持体と複合体を形成した標識を生成させる工程、および多孔性支持体と複合体を形成した標識量を測定する工程を含むことを特徴とする試料中の測定物質の測定方法である。  
【００１４】
また、本発明の方法は、平板を有する反応容器であって、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している反応容器を用いて、反応液中、それぞれ標識された該異なる種類の測定すべき物質と試料とを接触させ、多孔性支持体と複合体を形成した標識を生成させる工程、および多孔性支持体と複合体を形成した標識量を測定する工程を含むことを特徴とする試料中の測定物質の測定方法である。
【００１５】
本発明の方法においては、多孔性支持体と複合体を形成した標識の検出に補助試薬を添加し補助試薬と標識を反応させる工程を含有することが好ましい。また本発明の方法においては、洗浄液で洗浄することにより未結合の標識を多孔性支持体から除去する工程を含有することが好ましい。
試料中の測定対象物および標準品を測定する際の反応温度としては、特異的反応を行うことが出来る条件であれば特に制限はないが、通常０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。反応時間としては、特に制限はないが、１分間〜６時間が好ましく、２分間〜１時間がより好ましく、３分間〜３０分間が特に好ましい。
【００１６】
本発明において使用できる試料には特に制限はないが、例えば全血、血漿、血清、臍帯血、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液、涙等の生体試料や、食品、土壌等があげられる。
反応液としては、測定すべき物質と測定すべき物質に特異的に結合する物質とが反応できる溶媒であれば特に制限はないが、標識を補助試薬を用いて測定する場合は、さらに標識と補助試薬とが反応できる溶媒が好ましく、例えば水性媒体、有機溶媒およびこれらの混合物等があげられる。
【００１７】
水性媒体としては例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。
【００１８】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸［（Ｈ）ＥＰＰＳ］、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等があげられる。
【００１９】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
有機溶媒としては、アセトニトリル、ヘキサン、メタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【００２０】
反応液には、必要に応じて、無機塩類、防腐剤、非特異吸着反応を抑制する目的でタンパク質もしくは高分子化合物を含有したものがより好ましい。
タンパク質および高分子化合物としては、標識による非特異吸着反応を抑制できれば特に制限はないが、例えば、アルブミン、ゼラチン、カゼイン、免疫グロブリン等のタンパク質、ペブチドなどの高分子化合物があげられる。濃度としては、特に制限はないが、0.001〜10％が好ましく、0.01〜5%がより好ましく、0.05〜2%が特に好ましい。
【００２１】
本発明で測定すべき物質としては、特に制限はなく、例えば酵素反応を用いて測定される成分、抗原抗体反応を用いて測定される成分、その他の特異的反応により測定される成分等があげられ、例えば下記に例示する物質が任意に複数組み合わされて用いうる。
測定すべき物質としては、２種類以上であり、２以上３６種類以下の組み合わせが好ましく、３以上２５種類以下の組み合わせがより好ましく、４以上９種類以下の組み合わせが特に好ましい。
【００２２】
酵素反応を用いて測定される成分としては例えば、グルコース、１，５−アンヒドログルシトール、グリコアルブミン、ヘモグロビンＡ１ｃ、フコース、尿素、尿酸、アンモニア、クレアチニン、総コレステロール、遊離コレステロール、高密度リポタンパク中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、超低密度リポタンパク中のコレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）、レムナント様リポタンパク中のコレステロール（ＲＬＰ−Ｃ）、トリグリセライド、リン脂質、総蛋白、アルブミン、グロブリン、ビリルビン、胆汁酸、シアル酸、乳酸、ピルビン酸、遊離脂肪酸、セルロプラスミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、ホスホキナーゼ（ＰＫ）、アミラーゼ、リパーゼ、コリンエステラーゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルドラーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、グアナーゼ、モノアミンオキシダーゼ等があげられる。
【００２３】
抗原抗体反応により測定される成分としては、例えばインターロイキン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、アポ蛋白ＡＩ、アポ蛋白ＡＩＩ、アポ蛋白Ｂ、アポ蛋白Ｅ、リウマチファクター、Ｄ−ダイマー、酸化ＬＤＬ、糖化ＬＤＬ、グリコアルブミン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、総サイロキシン（Ｔ４）、抗テンカン剤等の薬剤、Ｃ−反応性蛋白（以下ＣＲＰと略記する。）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９（carbohydrate antigen 19-9）、ＣＡ１５−３（carbohydrate antigen 15-3）、ＣＡ−１２５（carbohydrate antigen 125）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（Protein induced by vitamin K absence-II）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン、Ｃ−ペプタイド、エストロゲン、抗グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）抗体、ペプシノーゲン、ＨＢＶ抗原、抗B型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗体、C型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、抗ＨＣＶ抗体、成人T細胞性白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）抗原、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、インフルエンザウイルス抗原、抗インフルエンザウイルス抗体、抗結核菌抗体、結核菌抗原（ＴＢＧＬ）マイコプラズマ抗体、ヘモグロビンＡ１ｃ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、トロポニンＴ、トロポニンＩ、クレアチニンキナーゼ−ＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、Ｈ−ＦＡＢＰ（ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白）、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、ニバレノール（ＮＩＶ）、Ｔ−２トキシン（Ｔ２）等のカビ毒類、ビスフェノールＡ、ノニルフェノール、フタル酸ジブチル、ポリ塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）類、ダイオキシン類、ｐ，ｐ’−ジクロロジフェニルトリクロロエタン、トリブチルスズ等の内分泌撹乱物質類、大腸菌等の菌類、卵、乳、小麦、そば、落花生等の食物アレルギー物質やコナヒョウダニやトヤヒョウダニ等のダニ類等のアレルギー物質、抗アレルギー物質抗体等があげられる。
【００２４】
また、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３等のインターロイキン、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等のインターフェロン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）等の腫瘍壊死因子等のサイトカイン類があげられる。
その他の特異的結合により測定される成分としては、核酸、レクチン等があげられ、例えばｒａｓ等のガン遺伝子、ｐ５３等のガン抑制遺伝子等をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド核酸、アプタマー、糖蛋白質等があげられる。
【００２５】
測定すべき物質に特異的に結合する物質としては、測定すべき物質に特異的に結合するものであれば特に制限はないが、例えば、前述の測定すべき物質に特異的に結合する抗体、抗原、アプタマー、レクチンまたはDNA等があげられる。
測定すべき物質に特異的に結合する物質の選択は、測定すべき物質の決定により、当業者は適宜選択することができる。
【００２６】
本発明で使用される標識としては、その量を測定出来るものであれば特に制限はなく、例えば発光物質、蛍光物質、色原体、酵素などがあげられるが、補助試薬との反応によりその量を測定できるものが好ましい。
発光物質としては、例えばルミジェン社のＡＰＳ−５、ＡＰＳ−３等のアクリジニウム化合物、４−（２−サクシニミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジウム−９−カルボン酸フルオロ硫酸（以下アクリジニウム−Ｉと略記する）等のアクリジウム誘導体、ジオキセタン類、ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、クマリン誘導体、ピラゾロピリドピリダジン誘導体、トロピックス社のアダマンチル化合物、ルミジェン社のPS-atto等があげられる。
【００２７】
蛍光物質としては、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸などがあげられる。
色原体としては、単独で色素を形成する化合物であっても、二つの化合物が結合して色素を形成する化合物であってもよい。
単独で色素を形成する化合物としては、例えば、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＣＣＡＰと略記する）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（以下、ＭＣＤＰと略記する）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（以下、ＤＡ−６４と略記する）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（以下、ＢＣＭＡと略記する）等があげられる。
【００２８】
二つの化合物が結合して色素となるものとしては、例えば過酸化水素水とパーオキシダーゼとの共存下で、結合して色素を形成する化合物があげられる。
具体的には、４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡと略記する）や、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等のカプラ−と、アニリン化合物、例えばＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（以下ＥＭＳＥと略記する）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩２水和物（以下ＴＯＯＳと略記する）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリンプロピル−ｍ−アニジン等との組み合わせ等が挙げられる。その他、４−ＡＡとフェノールや３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード酢酸の組み合わせが挙げられる。
【００２９】
酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略記する。）などがあげられる。
補助試薬は、前述の標識を測定するために使用される試薬であり前述の標識の種類に応じて当業者であれば適宜選択できるが、例えば前述の発光物質、蛍光物質、色原体、酵素などを含有する試薬があげられる。また、アルカリ、過酸化水素等を含有する試薬もあげられる。標識がアクリジニウムエステル類のときは、例えばアルカリ、過酸化水素などが補助試薬として好適にあげられる。なお、標識が蛍光等の場合は補助試薬を用いないで行うこともできる。
【００３０】
測定すべき物質または測定すべき物質と特異的に結合する物質と標識または多孔性支持体とは、公知の方法を用いて結合させることができる。標識または多孔性支持体と測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質とを、例えば官能基を利用して化学的に結合させる方法、または表面に物理的に結合させる方法などがある。
また、本発明において標識または多孔性支持体と測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質との結合は、抗体、プロテインＡ、ビオチンまたはストレプトアビジン等の物質、糖鎖とレクチン、または化学的な相互作用を有する物質を介して行うことができる。
【００３１】
なお、標識された測定すべき物質または標識された測定すべき物質に特異的に結合する物質を含有する水溶液を標識溶液と称する。該標識液の水溶液としては、例えば前述の水性媒体をあげることができ、必要に応じてさらに無機塩等を含有させることができる。
洗浄液としては、未反応の抗原もしくは抗体を除去できるものであれば特に制限はないが、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。更に、緩衝液に界面活性剤を含有したものがより好ましい。界面活性剤は界面活性効果を有するものであれば特に限定されないが、例えば、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等があげられ、非イオン性界面活性剤等が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Ｔｗｅｅｎ２０）やポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等があげられる。界面活性剤の濃度としては、特に制限はないが、０．００１〜２０％が好ましく、０．０１〜１０％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好ましい。
【００３２】
多孔性支持体の洗浄方法は特に制限はなく、例えば必要に応じて洗浄液を添加した後、溶液吸収手段などにより吸引除去する方法、多孔性支持体に洗浄液を通過させ、必要に応じて更に溶液吸収手段により吸引する方法等があげられる。
標識量の測定は、反応液中の標識を直接物理化学的に測定することもできるが、補助試薬を用いて、標識と補助試薬との反応により得られる生成物を測定することが好ましい。
【００３３】
検出器は、標識の発生するシグナルを検出できるものであれば特に制限はないが、ウエルの全体像が輪郭良く検出できる電荷結合型撮像機（ＣＣＤ）が好ましい。特に微弱な蛍光や発光を検出できる高感度なものが特に好ましい。穴の配置とその強度が検出されると、あらかじめ各穴に結合された抗原や抗体に対応する測定対象の濃度が算出され、同時に複数の結果を得ることができる。蛍光または発光等の標識からのシグナルの検出は、平板上面から蛍光または発光等のシグナルの強度を検出してもよいが、平板下面から検出する方が好適である。
【００３４】
測定すべき物質の濃度は、予め既知濃度の測定すべき物質を用いて得られる検量線から求めることができる。
本発明に用いる反応容器は、平板を有し、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体は、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している。
【００３５】
また、本発明に用いる反応容器は、平板を有し、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している。
具体的容器の形状としては、例えば図１〜７に示す容器が例示できる。ここで、記号Ａは測定すべき物質、記号Ｂは測定すべき物質に特異的に結合する物質、Ｔは、多孔性支持体を示し、Ａ、ＢおよびＴに付随する数字１、２およびｎは測定対象物の種類にそれぞれ対応していることを示している。ここで、ｎは２以上の正数であり、ｎの上限は特に制限はないが、好ましくは２以上３６以下でありより好ましくは３以上２５以下であり、特に好ましくは４以上９以下である。
【００３６】
平板を有する反応容器としては、平板を有するもので有れば特に制限はなく、例えば図６に示すような平板そのもの、例えば図７に示すような平板部分が容器の凹部となっているような容器などがあげられる。平板は立方体、円柱体、多角柱体など形状には特に制限はない。
多孔性支持体としては、反応液や反応に関与する物質を保持しかつ支持体に結合していない物質が移動可能であるもので有れば特に制限はない。多孔性支持体としては、例えば線維、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン等の中空糸、ガラス、ニトロセルロース、セルロース、ナイロン、架橋デキストラン等のフィルター、多孔性樹脂等があげられる。
【００３７】
多孔性支持体は、標識が生成する光、蛍光または色素等のシグナルを透過する性質を有する。透過率としては、特に制限はないが５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。
平板の材質としては、標識が生成する光、蛍光または色素等のシグナルを透過する性質を有し、多孔性支持体を保持する適度な強度を有するものであれば特に制限はない。シグナルの透過率としては、特に制限はないが５０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９９％以上が特に好ましい。平板の厚みとしては、特に制限はないが、０．０１〜１０ｍｍが好ましく、０．１〜５ｍｍがより好ましく、０．２〜２ｍｍが特に好ましい。
平板上の多孔性支持体以外の部分は、例えば図４および５に示すような多孔性であっても、例えば図１、２および３に示すような多孔性でなくてもよい。多孔性でない部材としては樹脂等があげられる。多孔性支持体以外の部分が多孔性のときは、多孔性支持体と同一の種類でもよいが異なっていてもよい。
【００３８】
多孔性支持体の形状としては、円柱、楕円柱、多角柱、角柱等制限はなく、また穴の配置が特定できる様に形状のある部分に切り込みを設けたり、逆に突起が設けられていてもよい。多孔性支持体は、例えば図１、２および４に示すように平板の表面に埋め込まれるように形成されていても、また例えば図３および５に示すように平板を貫通するように設けられていてもよい。また反応容器には、多孔性支持体に接してまたは離れて、溶液吸収手段が組み込まれていてもよい。
本発明に使用される反応容器の作成方法は、例えば図８〜１１に示すように樹脂等の素材からなる円盤状の支持体を貫通してあけられた複数の小孔に、多孔性支持体として一定の径を有する中空糸の束を通し、該小孔と中空糸の間隙を樹脂で固めてた後、平板状に切り出す方法があげられる。
【００３９】
多孔性支持体に測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質を結合させる方法は特に制限はなく、例えば中空糸等多孔性支持体に疎水結合などの物理的な結合で結合させる方法、中空糸等の多孔性支持体の表面のアミノ基あるいはカルボキシル基、Ｎ−ヒドロサクシイミド基、メルカプト基、マレイミド基などの官能基と測定すべき物質および測定すべき物質に特異的に結合する物質とを、必要であれば架橋剤を使用して反応させ化学的に結合する方法があげられる。
【００４０】
多孔性支持体に、抗体、抗原等の測定すべき物質または測定すべき物質に特異的に結合する物質を結合した後、該多孔性支持体をさらに各々の樹脂を牛血清アルブミン等でブロッキング処理するのが好ましい。ブロッキングに使用するのは標識による非特異吸着反応を抑制できれば特に制限はないが、例えば、アルブミン、ゼラチン、カゼイン、免疫グロブリン等のタンパク質、ペブチドなどの高分子化合物があげられる。濃度としては、特に制限はないが、０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜５％がより好ましく、０．０５〜２％が特に好ましい。
【００４１】
本発明の試薬は、標識を結合した複数の測定すべき物質に特異的に結合する物質、平板を有し、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体は、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器を含む。
【００４２】
また本発明の試薬は、標識を結合した複数の測定すべき物質、および、平板を有し、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している反応容器を含む。
本発明の試薬は、標識を結合した複数の測定すべき物質に特異的に結合する物質を含む試薬および平板を有し、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体は、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質または測定すべき物質を担持している反応容器を含む試薬からなるキットの形態でもよい。
【００４３】
本発明の試薬は、標識を結合した複数の測定すべき物質を含む試薬および平板を有し、該平板上の相互に分別認識可能な位置に、標識を検出するためのシグナルが透過可能な一定の厚みをもつ２以上の多孔性支持体を有し、該多孔性支持体には、それぞれ異なる種類の測定すべき物質に特異的に結合する物質を担持している反応容器を含む試薬からなるキットの形態でもよい。
【００４４】
これら試薬およびキットには、必要により、前記の補助試薬、緩衝剤、補助試薬、塩類、タンパク質等を含有していてもよい。
【実施例１】
【００４５】
アレルゲン結合反応容器の調製
アドバンテック社製の中空糸ナイロンメンブランカートリッジフィルター      ＴＣＮ０２０ＳＢＭＥを分解して中空糸を取り出し、水洗後、５０℃にて真空乾燥機にて一昼夜乾燥した。これを１％グルタルアルデヒド溶液中にて４０℃で１晩反応させ、表面にアルデヒド基を形成させた後、洗浄し乾燥した。次にこの中空糸の束を、図８に示すように４個の穴が配置されている円柱形の樹脂に通し、市販のエポキシ系接着剤で樹脂と中空糸を接着した。接着剤が硬化した後、該樹脂の両表面をスライスした後、図９に示すように多孔性支持体部分に１μｇ／ｍｌの濃度の杉花粉抗原混合物の溶液、ソバ由来の抽出抗原溶液、鶏卵の白身由来の抽出抗原溶液およびダニ由来の抗原溶液をそれぞれ通過させた。これを室温、一昼夜放置して抗原を結合させた後、１％ＢＳＡ溶液を通過させてブロッキングした。次いで、該樹脂を鋭利なカッターで約０．２ｍｍの厚さでスライスして円盤状の内部に中空糸メンブランフィルターを持った平板を形成し、これを１％ＢＳＡ溶液中に約１５℃で５日間保存しブロッキングして、図９に示す様な反応容器を製造した。
【実施例２】
【００４６】
下記の検体希釈液、洗浄液、標識液を調製した。
＜検体希釈液（pＨ  ７．４）＞
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン    ６ｍｇ／ｍＬ
塩酸（pＨ調整用）                         適量
塩化ナトリウム                            ８．８ｍｇ／ｍＬ
牛血清アルブミン                          １０ｍｇ／ｍＬ
アジ化ナトリウム                          １ｍｇ／ｍＬ
【００４７】
＜洗浄液（pＨ７．４）＞
リン酸二水素ナトリウム                    ０．０２３ｍｇ／ｍＬ
リン酸水素二ナトリウム                    ０．１２ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム                            ０．８２ｍｇ／ｍＬ
水酸化ナトリウム（pＨ調整用）             適量
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ−ト（ＴＷＥＥＮ−２０）
５ｍｇ／ｍＬ
【００４８】
＜標識液（pＨ７．４）＞
アルカリフォスファタ−ゼ標識抗ヒトイムノグロブリンＥ  マウスモノクローナル抗体
１μｇ／ｍＬ  
リン酸二水素ナトリウム                    ０．２３ｍｇ／ｍＬ
リン酸水素二ナトリウム                    １．２ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム                            ８．２ｍｇ／ｍＬ
水酸化ナトリウム（ＰＨ調整用）            適量
牛血清アルブミン                          １ｍｇ／ｍＬ
【００４９】
実施例１で得られた円盤をマイクロプレートに入れ、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液２００μＬを添加して室温下で１時間放置し、容器をブロッキング処理した。液を吸引廃棄後、検体希釈液にて４１倍希釈した杉花粉アレルギー患者と思われる血清検体を１００μＬを添加して３０℃にて１時間反応させた。液を吸引、洗浄液にて洗浄後、さらにアルカリフォスファターゼ標識された抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体を含有する標識液を１００μＬ添加し、３０℃にて３０分間反応させた。液を吸引、洗浄後、ルミジェン（Lumigen） 社製ＡＰＳ−５溶液を１００μＬ添加し、すぐに富士フィルム社製化学発光画像解析システム、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ にて、底面より撮像し、各ドットの発光強度を検出し、データをコンピュータに取り込んだ。また、別途標準液として臨床的にカットオフ値付近の血清サンプルを同様に操作した。標準となる血清サンプルからの光の強度と、アレルギー患者血清検体の各ドットの光の強度を比較し、標準となる血清サンプルからの光の強度を１としたときの患者血清検体の強度比を第１表に示す。
【００５０】
【表１】
2006226938.tif 000003
【００５１】
第１表から、本患者のアレルギーは杉花粉の他、ダニにも感作されている可能性が認められる。
【実施例３】
【００５２】
炎症関連抗原結合反応容器の調製
図１０に示す様に９個の穴が配置されている樹脂製の円盤を用い、１μｇ／ｍＬのサイトカイン 抗ヒトＩＬ−２マウスモノクローナル抗体の溶液、抗ヒトＩＬ−４マウスモノクローナル抗体溶液、抗ヒトＩＬ−５マウスモノクローナル抗体溶液、抗ヒトＩＬ−８マウスモノクローナル抗体溶液、抗ヒトＩＬ−１０マウスモノクローナル抗体溶液、抗ヒトＩＬ−１２マウスモノクローナル抗体溶液、抗ヒトＩＬ−１３マウスモノクローナル抗体溶液、抗ヒトＩＦＮ−γマウスモノクローナル抗体溶液、抗ヒトＴＮＦ−αマウスモノクローナル抗体溶液を用いる以外は実施例１と同様にして、図１１に示す様な反応容器を製造した。
【実施例４】
【００５３】
サイトカイン同時測定（１）
実施例３で得られた円盤をマイクロプレートに入れ、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液２００μＬを添加して室温下で１時間放置し、容器をブロッキングした。液を吸引廃棄後、実施例２で調製した検体希釈液にて１０１倍希釈した炎症患者と思われる血清検体を１００μＬを添加して３０℃にて１時間反応させた。液を吸引、洗浄液にて洗浄後、さらにアルカリフォスファターゼ標識された抗ヒトＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αマウスモノクローナル抗体混合物を含む標識液を１００μＬ添加し、３０℃にて３０分間反応させた。液を吸引、洗浄後、ルミジェン社製ＡＰＳ５溶液を１００μＬ添加し、すぐに富士フィルム社製化学発光画像解析システム、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ  にて、底面より撮像し、各ドットの発光強度を検出し、データをコンピュータに取り込んだ。また、別途標準液として健常人の血清サンプルを同様に操作した。標準となる血清サンプルからの光の強度と、炎症性患者血清検体の各ドットの光の強度を比較し、標準となる血清サンプルからの光の強度を１としたときの患者血清検体の強度比を第１表に示す。
【００５４】
【表２】
2006226938.tif 000004
【００５５】
第２表から、本患者は、炎症性の疾患である可能性が示唆される。
【実施例５】
【００５６】
サイトカイン同時測定（２）
実施例３で得られた円盤をマイクロプレートに入れ、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液２００μＬを添加して室温下で１時間放置し、容器のブロッキングをかねてエージングした。液を吸引廃棄後、実施例２で調製した検体希釈液にて１０１倍希釈した炎症患者と思われる血清検体を１００μＬを添加して３０℃にて１時間反応させた。液を吸引、洗浄液にて洗浄後、さらにアクリジニウムエステル標識抗ヒトＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αマウスモノクローナル抗体混合物を含む標識液を１００μＬ添加し、３０℃にて３０分間反応させた。液を吸引、洗浄後、過酸化水素溶液５０μＬ、アルカリ溶液５０μＬを添加し、すぐに富士フィルム社製化学発光画像解析システム、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓにて、底面より撮像し、各ドットの発光強度を検出し、データをコンピュータに取り込んだ。また、別途標準液として健常人の血清サンプルを同様に操作した。標準となる血清サンプルからの光の強度と、白血病患者血清検体の各ドットの光の強度を比較し、標準となる血清サンプルからの光の強度を１としたときの患者血清検体の強度比を、第３表に示す。
【００５７】
【表３】
2006226938.tif 000005
【００５８】
第３表から、本患者は、炎症性の疾患である可能性が示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の反応容器の横断面を示す図である。
【図２】本発明の反応容器の横断面を示す図である。
【図３】本発明の反応容器の横断面を示す図である。
【図４】本発明の反応容器の横断面を示す図である。
【図５】本発明の反応容器の横断面を示す図である。
【図６】本発明の反応容器を示す図である。
【図７】本発明の反応容器を示す図である。
【図８】実施例１の反応容器を示す図である。
【図９】実施例１の反応容器を示す図である。
【図１０】実施例３の反応容器を示す図である。
【図１１】実施例３の反応容器を示す図である。
【図１】
2006226938.tif 000006
【図２】
2006226938.tif 000007
【図３】
2006226938.tif 000008
【図４】
2006226938.tif 000009
【図５】
2006226938.tif 000010
【図６】
2006226938.tif 000011
【図７】
2006226938.tif 000012
【図８】
2006226938.tif 000013
【図９】
2006226938.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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