(57)【要約】【課題】生体試料中のカルシウムを測定するための試薬およびカルシウム測定方法を提供することを課題とする。【解決手段】バナジン酸イオンの存在下で、生体試料中のカルシウムを、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物と反応させ、反応生成物による光学的変化に基いて試料中のカルシウムを測定する方法は、高ｐＨに起因する炭酸ガス吸収の問題がなく、ヒ素由来の有毒な試薬を使用することの問題もなく、自動分析装置に適用できるので短時間で多数の検体を測定でき、かつ、検体ブランクが低いので測定できる範囲が広い、という種々の面において優れている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バナジン酸イオンとクロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物とを含むカルシウム測定用試薬。
【請求項２】
キレート化剤を含んでいてもよい生体試料中のカルシウムを測定するための試薬である請求項１のカルシウム測定用試薬。
【請求項３】
試料と反応させるときの反応液のｐＨが３．５〜７．５になるように調整された請求項１または請求項２のカルシウム測定用試薬。
【請求項４】
緩衝剤および必要に応じて界面活性剤を含む第一試薬と、バナジン酸イオンおよびクロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物を含む第二試薬とから構成される二試薬系である請求項１から３のいずれかのカルシウム測定用試薬。
【請求項５】
第一試薬と第二試薬とを合わせた時の液のｐＨが３．５〜７．５になるように調整された請求項４のカルシウム測定用試薬。
【請求項６】
バナジン酸イオンの存在下で、試料中のカルシウムを、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物と反応させ、反応生成物による光学的変化に基いて試料中のカルシウムを測定することを特徴とする試料中のカルシウムの測定方法。
【請求項７】
試料が、キレート化剤を含んでいてもよい生体試料である請求項６の測定方法。
【請求項８】
試料中のカルシウムを、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物と反応させるときのｐＨが３．５〜７．５である請求項６または請求項７の測定方法。
【請求項９】
キレート発色剤と金属イオンとを反応させて光学的変化に基いて金属イオンを測定する際に用いるキレート発色剤用ブランク抑制剤であって、キレート発色剤自体の発色を抑制するバナジン酸イオンを有効成分として含有するブランク抑制剤。
【請求項１０】
キレート発色剤が、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物である請求項１０のブランク抑制剤。
【請求項１１】
カルシウムイオンを測定する際に用いる請求項９または１０のブランク抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム測定用試薬および測定方法に関する。更に詳しくは生体試料、例えば、全血、血漿、血清などの血液試料、髄液、リンパ液、唾液、尿等の水性液体生体試料中のカルシウムを正確に測定することが可能で臨床診断に特に有用な改良されたカルシウム測定用試薬および測定方法に関するものである。更には、キレート発色剤と金属イオンとを反応させて金属イオンを測定する際に用いるキレート発色剤用ブランク抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中のカルシウムイオンの定量分析法としてキレート発色剤を用いた比色定量法が臨床検査および一般の化学分析分野で広く実施されている。キレート発色剤としては、例えば、特許文献１に記載されているように、カルシウムとのキレート結合が安定するアルカリ性、特にｐＨ１０以上の高ｐＨ領域に呈色最適ｐＨ値を有するｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ−ＣＰＣ）が主に用いられている。また、特許文献２に記載のように、キレート発色剤としてアルセナゾ−ＩＩＩを用い、８−ヒドロキシキノリンを含ませて安定化させた試薬も知られている。更に、特許文献３に記載のように、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−ＩＩＩを用い、光散乱性粒子を用いて測定域を広げたカルシウム分析用一体型多層分析要素も知られている。また、特許文献４には、キレート発色剤としてクロロホスホナゾ−ＩＩＩを用い、カルシウムとマグネシウムとの同時に定量できることが記載されている。
【特許文献１】特開昭５４−３６９９６号公報
【特許文献２】特表平０６−５０５５６０号公報
【特許文献３】特開平０６−５０９７６号公報
【特許文献４】特開平０４−１２０４６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、従来のキレート発色剤を用いたカルシウム測定試薬には、おのおの改善すべき点がある。例えば、ｏ−ＣＰＣを用いる測定試薬においては、ｐＨが１０以上であるため改善すべき点がある。すなわち、この試薬は、高ｐＨであるため空気中の炭酸ガスの吸収により使用時のｐＨの低下が大きく、また長時間、溶液状態で保存すると試薬のｐＨが下がり、その結果、測定値が不正確になることもある。一方、アルセナゾ−ＩＩＩを用いたカルシウム測定試薬は、ｏ−ＣＰＣ法よりｐＨが低い点で有利であるが、アルセナゾ−ＩＩＩは有機ヒ素化合物であり、廃棄する際、環境汚染の問題も否定できない。クロロホスホナゾ−ＩＩＩについては変色の最適ｐＨ範囲は弱酸性であり、かつヒ素を含まない試料であるが故に、高ｐＨに起因する問題および毒性に関して有利である。しかし、カルシウム分析用一体型多層分析要素の場合は、液状での試薬ではなく、短時間に多数の検体を測定できるものではない。また、マグネシウムとカルシウムの同時定量では、試料にクロロホスホナゾ−ＩＩＩを加え、マグネシウムとカルシウムとのいずれをも結合させて発色させ、しかる後、ＥＧＴＡを加えることによりカルシウムを解離させ減色させて減色の度合いによりカルシウムを定量するものであるが、クロロホスホナゾーＩＩＩはブランクが高いので測定できる範囲が限定される。
【０００４】
すなわち、キレート発色剤を用いるカルシウム測定試薬としていくつか提案されているものの様々な問題点、つまり、高ｐＨに起因する炭酸ガス吸収の問題、有毒なヒ素化合物を使用する問題、短時間で多数の検体を測定できない問題、ブランクが高く測定できる範囲が狭いこと、これらをすべて解決できる試薬はまだ提案されていない。
従って、本発明の課題は、上記問題点を解決して保存性にすぐれ、環境汚染の問題がなく、かつ溶液状態で正確にカルシウムを測定できる試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる問題のあるカルシウム測定用試薬について研究したところ、意外にも、クロロホスホナゾ−ＩＩＩの溶液がバナジン酸イオンの存在下では、ブランク値を大幅に減少させることを発見した。その結果、カルシウムを測定する際、キレート発色剤として体液中のカルシウムが反応するのに十分なクロロホスホナゾ−ＩＩＩまたは類似化合物を用い、さらにバナジン酸イオンを併用することにより、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたは類似化合物を用いた場合の最大の欠点であった測定域がせまいこと、およびブランク値が高くて測定精度が悪いことが一挙に解決され検出種の測定域を広げ、かつ高精度で測定しうるという知見に基づいている。
【０００６】
従って、本発明は、バナジン酸イオンとクロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物とを含むカルシウム測定用試薬である。
更に、本発明は、バナジン酸イオンの存在下で、試料中のカルシウムを、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物と反応させ、反応生成物による光学的変化に基いて試料中のカルシウムを測定することを特徴とする試料中のカルシウムの測定方法である。
また更に、本発明は、キレート発色剤と金属イオンとを反応させて光学的変化に基いて金属イオンを測定する際に用いるキレート発色剤用ブランク抑制剤であって、キレート発色剤自体の発色を抑制するバナジン酸イオンを有効成分として含有するブランク抑制剤である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のカルシウム測定用試薬および測定方法は、高ｐＨに起因する炭酸ガス吸収の問題がなく、ヒ素由来の有毒な試薬を使用することの問題もなく、自動分析装置に適用できるので短時間で多数の検体を測定でき、かつ、検体ブランクが低いので測定できる範囲が広い、という種々の面において優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のカルシウム測定用試薬は、バナジン酸イオンとクロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物とを含む特徴を有する。
本発明のカルシウム測定用試薬では、カルシウムイオンと結合して光学的に検出可能な変化をしうる指示薬として、２，７−ビス［（４−クロロ−２−ホスホノフェニル）アゾ］−４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩（クロロホスホナゾ−ＩＩＩ）［１９１４−９９−４］またはその類似化合物を用いる。クロロホスホナゾ−ＩＩＩは、下記構造式を持つ化合物またはその塩である。塩としてはナトリウム塩が好ましい。
【化１】
2006023182.tif 000002
【０００９】
類似化合物の例としては、例えば、下記の骨格を持つ化合物またはそれらの塩でカルシウムイオンと結合して発色するものであれば、特に限定されない。
【化２】
2006023182.tif 000003
そのようなもので従来知られている化合物として、３−［（４−クロロ−２−ホスホノフェニル）アゾ］−４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩（クロロホスホナゾ−Ｉ）［１９３８−８２−５］、３−３−［（アセチルフェニル）アゾ］−６−［（４−クロロ−２−ホスホノフェニル）アゾ］−４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸ジナトリウム塩（クロロホスホナゾ−ｍＡ）［８６１６７−８７−５］や、これらの塩を例示することができる。塩としてはナトリウム塩が好ましい。
【００１０】
本発明においては、これらのクロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物と共にバナジン酸イオンを用いる。バナジン酸イオンは、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物に対してブランク抑制剤として、すなわち、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物自体の発色を抑制するように有効に働くことができる。
本発明のカルシウム測定用試薬に用いるバナジン酸イオンとしては、本発明の目的に使用できるものであれば特に限定されないが、例えば、ＶＯ３−、ＶＯ４３−等の５価のバナジウムを含むものが好ましい。これらのバナジン酸イオンを実際に使用するときは、塩として、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩やアンモニウム塩等の塩として用いることが溶解性の面から好ましい。
【００１１】
本発明のカルシウム測定用試薬が測定対象とする試料は、いずれでもよいが、生体試料、すなわち、生体試料中のカルシウムを測定するのに好適である。生体試料としては、例えば、全血、血漿、血清などの血液試料、髄液、リンパ液、唾液、尿等の水性液体生体試料、これらの希釈液などを例示できる。本発明においては、生体試料としてＥＤＴＡのようなキレート化剤を含む血清などの試料を用いても試料中のカルシウムを正確に測定できる。ｏ−ＣＰＣ法ではそのような血清を用いると正確に測定できないので、本発明のカルシウム測定用試薬は、種々の試料に適用できる点からも有利である。
【００１２】
本発明のカルシウム測定用試薬は、バナジン酸イオンとクロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物とを含む試薬であれば、特に限定されないが、二試薬で構成される試薬（以下、二試薬系と記載するときもある）が、生化学自動分析装置に適用できる点から好ましい。本発明において、二試薬系の場合、第一試薬には、酢酸ナトリウム等の汎用されている緩衝剤や界面活性剤を含ませることが好ましい。また、第二試薬には、クロロホスホナゾ−ＩＩＩを必須成分として含み、酢酸ナトリウム等の汎用されている緩衝剤や界面活性剤を含ませておくことが好ましく、塩化ナトリウム等の塩類、アジ化ナトリウム等の防腐剤を含むことができる。二試薬系の場合、バナジン酸イオンは、クロロホスホナゾーＩＩＩと同じ第二試薬に含ませておくことが、試薬の安定性から好ましい。
【００１３】
本発明のカルシウム測定用試薬は、試料とクロロホスホナゾ−ＩＩＩとを反応させるときの液のｐＨ、例えば、二試薬で構成される試薬の場合、第一試薬と第二試薬とをあわせた液のｐＨが、好ましくは３．５〜７．５、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは４．８〜６．２となるように調整されると良い。その液のｐＨが３．５未満であると、カルシウム測定の際、試料中の蛋白質とクロロホスホナゾーＩＩＩとの結合が起こりやすくなり正確に測定できにくい。また、その液のｐＨが７．５を越すと試薬ブランク値が大きくなったりマグネシウムの影響が出たりして正確に測定できないこともある。二試薬系の場合、第一試薬および第二試薬は、独立にｐＨ２．０〜９．０であることが好ましく、その際も第一試薬と第二試薬を併せたときのｐＨが３．５〜７．５等にすると良い。なお、第二試薬は、クロロホスホナゾ−ＩＩＩやバナジン酸イオンの溶解性から、ｐＨ７．５〜９．０がさらに好ましく、ｐＨ７．７〜８．５が特に好ましい。
本発明で二試薬系の測定用試薬を用いてカルシウムを測定する場合、用いる試料と第一試薬と第二試薬の体積比は、使用する自動分析装置等により異なるが、例えば、１：（１０〜１００）：（２〜２５）が好ましい。
【００１４】
次に、本発明の測定方法について説明する。本発明のカルシウムの測定方法は、バナジン酸イオンの存在下で、試料中のカルシウムを、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物と反応させることを特徴とする。
本発明において、カルシウムと反応する際の濃度（以下、終濃度と記載することもある）は、クロロホスホナゾーＩＩＩの場合、用いる試料の量等により調整されるが、例えば、０．０１〜１０ｍＭが好ましく、０．０５〜２ｍＭがさらに好ましく、０．１〜０．７ｍＭが特に好ましい。濃度が不十分であるとカルシウムに十分に結合しにくい場合もあり、濃度が大きすぎるとブランク値が高くなり正確に測定できにくい。
バナジン酸イオンの濃度（ｍＭ）は、終濃度として、クロロホスホナゾーＩＩＩの１〜３００倍が好ましく、３〜２００倍がさらに好ましく、５〜１００倍が特に好ましい。バナジン酸イオンの濃度が低すぎるとブランク値が高くなることもある。
【００１５】
本発明の二試薬系のカルシウム測定用試薬を用いて血漿中のカルシウムを測定する場合の具体例を以下に示す。
緩衝剤を含む第一試薬と生体試料とを一定温度、好ましくは２５〜３７℃で、かつ一定時間、例えば５分間混合した後、得られる液にクロロホスホナゾーＩＩＩとバナジン酸イオンとを含む第二試薬を加え、一定温度、好ましくは２５〜３７℃で、かつ一定時間、例えば５分間混合し、試料中のカルシウムとクロロホスホナゾーＩＩＩを発色反応させる。クロロホスホナゾーＩＩＩによる発色前後の反応液の吸光度を測定し、発色による吸光度の変化を求め、検量線との比較等により、生体試料中のカルシウムの濃度を測定できる。なお、吸光度は、通常、６６０ｎｍで測定できる。
本発明の測定試薬でカルシウムを測定する場合、日立７１５０型、日立７１７０Ｓ型のような生化学自動分析装置でも使用可能である。
【００１６】
次に、本発明のキレート発色剤用ブランク抑制剤について説明する。本発明のブランク抑制剤は、バナジン酸イオンを含むことに特徴がある。
クロロホスホナゾーＩＩＩ等は、カルシウム等の金属イオンと結合して各種金属イオンを測定することができるが、クロロホスホナゾーＩＩＩ自体の溶液状態でも強く着色しているので、金属イオンを測定する際、検体ブランクが高くなる。その結果、金属イオン測定域が狭くなるという問題があった。バナジン酸イオンは、クロロホスホナゾーＩＩＩ溶液の発色を抑制してブランクを抑制する効果がある。従って、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物を用いて、カルシウムイオンなどの金属イオンを測定するに際して、バナジン酸イオンは、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物用ブランク抑制剤として有用である。
本発明のバナジン酸イオンを有効成分とするブランク抑制剤は、クロロホスホナゾ−ＩＩＩまたはその類似化合物以外にも、例えば、ジメチルスルホナゾ−ＩＩＩ、アルセナゾ−Ｉなどのキレート発色剤を用いて、例えば、マグネシウム、バリウム、カルシウムなどの金属イオンを測定する場合にも適用できる。本発明のブランク抑制剤を実際に使用するには、上記した本発明のカルシウム測定方法の場合と同様に、バナジン酸イオンを、キレート発色剤と金属イオンとを反応させる際に存在させればよい。
【００１７】
実施例１および比較例１から４
バナジン酸イオン存在下におけるクロロホスホナゾ−ＩＩＩを用いたカルシウム測定
１．方法
生体試料中のカルシウムをバナジン酸イオン存在下でクロロホスホナゾ−ＩＩＩ（CPZ-３と記載することもある）を用いて正確に測定できるかを実験した。なお、比較としてタングステン酸ナトリウム、硫酸マンガン（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）および金属イオンが無い場合と比較した。試料および試薬は以下の第一試薬および第二試薬を用いた。
試料
カルシウムを７．９ｍｇ／ｄＬ含む生体試料（ｏ−ＣＰＣ法での測定値）
第一試薬
リン酸二水素ナトリウム    ５０ｍＭ    ｐＨ６．０
界面活性剤    １．０％
第二試薬
クロロホスホナゾーＩＩＩ（ＣＰＺ−３）  １．２５ｍＭ
塩化ナトリウム  １５０ｍＭ
バナジン酸アンモニウム  ４０ｍＭ
界面活性剤  １．０％
また、比較例としてバナジン酸イオンの代わりに、比較例１は金属添加無しとし、比較例２にタングステン酸ナトリウム４０ｍＭ、比較例３に硫酸マンガン（ＩＩ）４０ｍＭ、比較例４に硫酸銅（ＩＩ）４０  ｍＭを添加した。
測定法は、以下のようにして行った。日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料２．５μＬと第一試薬２００μＬとを３７℃、５分間混合した後、得られる液に、第二試薬５０μＬを加え同温度で５分間、発色反応させる。発色反応前後の液の吸光度変化を主波長６６０ｎｍで測定した。カルシウム濃度は下記の式１より算出した。
【数１】
2006023182.tif 000004
EAbs : 測定値の吸光度
EBlank : ブランクの吸光度
ESTD : 標準液の吸光度
STD濃度 : 標準液の濃度
【００１８】
２．結果
得られた結果を表１に示す。
【表１】
2006023182.tif 000005
表１の結果から、生体試料中のカルシウムをＣＰＺ‐３と反応させて測定する際に、バナジン酸イオン存在下では正確に測定できることが判明した。また、添加無し、他の金属の存在下では正確に測定できないことが判明した。バナジン酸イオン存在下において、ＣＰＺ−３はバナジン酸イオンとキレート複合体を形成し、６６０ｎｍ近辺での吸光度が変化する。こうして形成されたＣＰＺ‐３とバナジン酸イオンとのキレート複合体は、蛋白質との非特異的反応をブロックし、かつ、ＣＰＺ‐３はバナジン酸イオンよりもＣａとの特異性の方が高いことから、ＣＰＺ‐３はバナジン酸イオン存在下において、Ｃａを正確に測定することができる。一方、金属添加無しでは生体試料のカルシウム測定においてＣＰＺ‐３と生体試料中の蛋白質との非特異的反応が起こった結果、吸光度が上昇し、正誤差となった。また、他の添加金属の存在下ではＣＰＺ‐３と添加金属のキレート複合体がＣａとＣＰＺ‐３の反応を阻害し、正確なカルシウム値を算出することができなかった。これらのことから、ＣＰＺ−３と各成分の結合の強さは以下のようになることが示唆される。
Ｃｕ２＋＞Ｃａ２＋＞ＶＯ３‐＞蛋白質＞ＷＯ４２‐、Ｍｎ２＋
【００１９】
実施例２
反応液中におけるｐＨの検討
バナジン酸イオン存在下のキレート反応中の液を種々のｐＨ（ｐＨ４．０，５．０，６．０）にして血清中のカルシウムを測定した。試料、第一試薬、第二試薬は、以下のものを用いた。
試料
カルシウムを７．６ｍｇ／ｄＬ含む生体試料
第一試薬
グリシン  １００ｍＭ（ｐＨ４．０の場合）または
酢酸ナトリウム  １００ｍＭ（ｐＨ５．０，  ６．０の場合）
界面活性剤  １．０％
第二試薬
ＣＰＺ‐３  １．２５ｍＭ
塩化ナトリウム    １５０ｍＭ
バナジン酸アンモニウム    ４０ｍＭ
界面活性剤    １．０％
得られた結果を表２に示す。
【表２】
2006023182.tif 000006
表２の結果から特にｐＨ５．０や６．０で反応すると、特にカルシウム測定に良いということが判明した。
【００２０】
実施例３および比較例５から７
ＥＤＴＡを含む生体試料中のカルシウム測定
ＥＤＴＡ（キレート化剤）を含む生体試料中のカルシウムを、キレート発色剤であるＣＰＺ‐３と反応させて測定する際、バナジン酸イオンの存在下で正確に測定できるかどうかを実験した。なお、比較例５としてタングステン酸イオンの存在下、比較例６として添加金属イオンが無い場合も検討した。また、従来、カルシウムを測定する場合の一般的な方法である、金属イオンを添加しないオルトクレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ‐ＣＰＣ）法も比較例７として検討した。なお、カルシウムを測定するための第一試薬および第二試薬の組成は以下のとおりである。
試料
ＥＤＴＡ  （０，７．５，１５ｍＭ）およびカルシウム７．６ｍｇ／ｄＬを含む生体試料
第一試薬
リン酸二水素ナトリウム  ５０ｍＭ    ｐＨ５．０
界面活性剤  １．０％
第二試薬
ＣＰＺ−３    １．２５ｍＭ
塩化ナトリウム  １５０ｍＭ
金属イオン    各  ４０ｍＭ
界面活性剤  １．０％
カルシウム測定値、相対値［（測定値Ｘ１００）／実量］の結果を表３に示す。
【表３】
2006023182.tif 000007
表３に示したように、ＥＤＴＡを含む生体試料中のカルシウムを、ＣＰＺ−３と反応させる際、バナジン酸イオンの存在下では、正確に測定できることが判明した。一方、バナジン酸イオンの代わりにタングステン酸イオンの存在下では正確に測定できないことが判明した。また、バナジン酸イオンを添加しない場合、ＣＰＺ‐３法、ｏ−ＣＰＣ（従来法）ではカルシウムを測定することはできなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明のカルシウム測定用試薬および測定方法により、試薬が長時間保存しても安定であり、有毒な問題もなく、短時間で多数の検体について正確にカルシウムを測定することが可能であり、臨床検査診断薬の分野で極めて有効である。