(57)【要約】【課題】中性糖鎖と酸性糖鎖をＬＣ／ＭＳにより高感度に一斉分析する液体クロマトグラフ質量分析方法を実現する。【解決手段】ソニックスプレーイオン源６を用いて正負測定モード毎に溶離液条件を弱酸性、中性、塩基性と変化させて糖鎖成分を測定した。正イオン測定モードでは中性糖鎖信号強度は溶離液が塩基性の場合に全条件中で最も高い結果が得られたが中性糖鎖と酸性糖鎖との信号強度の差が大きく、酸性糖鎖の信号強度が小さい。負イオン測定モードでは溶離液条件に関わらず中性糖鎖と酸性糖鎖と互いの信号強度の差が小さく、溶離液を弱酸性にすることで中性糖鎖と酸性糠鎖のいずれも信号強度が高い。このため、送液ポンプ１で送液する溶離液のｐＨを弱酸性（ｐＨ３〜５）とし、ソニックスプレーイオン源６を用いて負イオンモードで質量分析を行なえば中性糖鎖と酸性糖鎖を高感度に一斉分析することができる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨが３〜５の溶離液により、中性糖鎖及び酸性糖鎖を含む試料を分離カラムに送液し、
上記分離カラムにより、上記試料を各成分に分離し、
各成分に分離された試料を、略高速で噴霧することにより、イオン化するイオン源に送液し、このイオン源を負イオン測定モードで動作させて、上記試料をイオン化し、
イオン化した試料を質量分析することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項２】
請求項１記載の液体クロマトグラフ質量分析方法において、上記分離カラムは、逆相系カラムであることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析方法。
【請求項３】
ｐＨが互いに異なる複数の溶離液を、ｐＨ３〜５となるように混合し、送液する送液ポンプと、
上記送液ポンプにより送液された溶離液に、中性糖鎖及び酸性糖鎖を含む試料を導入する試料導入手段と、
上記溶離液により送られる上記試料を各成分に分離する分離カラムと、
上記分離カラムにより分離された試料を、略高速で噴霧することにより、イオン化するイオン源と、
上記イオン源によりイオン化された試料を質量分析する質量分析手段と、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【請求項４】
請求項３記載の液体クロマトグラフ質量分析装置において、上記分離カラムは、逆相系カラムであることを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質などの酸性糖鎖及び中性糖鎖を分析する液体クロマトグラフ質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体成分中に存在する糖タンパク質の酸性糖鎖（シアル化糖鎖）および中性糖鎖は、最近多くの病気との関連で注目されてきている。
【０００３】
これら糖鎖の一斉分析法として、糖タンパク質の糖鎖を遊離させて、糖鎖の還元末端を２−アミノピリジンなどの試薬で誘導体化した後、溶出原理の異なる複数のカラムを用いた液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）により分析する方法がある。
【０００４】
この方法では、複数のカラムによる糖鎖の溶出時間をプロットし、既知の糖鎖の溶出時間と比較することで糖鎖の識別を行っている。
【０００５】
また、近年、液体クロマトグラフィーの検出器として質量分析装置を用いる液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）を用いた糖鎖の分析法も行われている（ジャーナルオブアメリカンソシエティマススペクトロメトリ、１３巻、１３２２〜１３３０頁（２００２年））。
【０００６】
質量分析装置は高感度であるばかりでなく、構造情報も同時に取得することができるため、複雑かつ類似した構造をもつ糖鎖の分析には適した装置である。
【０００７】
ＬＣ／ＭＳによる分析では、イオン化法にエレクトロスプレーイオン源（ＥＳＩ）を用いたＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳが広く使用されている。
【０００８】
ここで、ＥＳＩは、特許文献１に記載されているように、キャピラリとサンプリングオリフィスとの間に高電圧が印加されるため、感電防止対策が必要であり、装置構造が複雑となる。
【０００９】
そこで、キャピラリ先端に高電圧を印加してイオン化するものではなく、溶離液を高速で噴霧することで、イオン化を行なうソニックスプレーイオン源が記載されている。
【００１０】
【特許文献１】特開平８−６２２００号公報
【非特許文献１】アナリティカルバイオケミストリー、１７１巻、７３〜９０頁（１９８８年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ところで、分析時間の短縮化を図るため、酸性糖鎖と中性糖鎖とを一斉分析することが要求されている。
【００１２】
しかしながら、上記ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳにより酸性糖鎖と中性糖鎖とを一斉分析するには、ＥＳＩによる酸性糖鎖と中性糖鎖とのイオン化効率に大きな差があるためにそのままでは両方の成分を同時に高感度分析することが出来ない。
【００１３】
この問題を解決する手段として、酸性糖鎖を完全メチル化法あるいはメチルエステル化法などの誘導体化を行うことで、中性糖鎖と酸性糖鎖のイオン化効率を同等にする方法がある。
【００１４】
しかしながら、この方法は、誘導体化に試料量を必要とすることや、シアリダーゼによる酵素消化ができなくなるため構造情報が得られにくいなどの欠点がある。
【００１５】
また、上記のような誘導体化をせずに、中性糖鎖は正イオン測定モード、酸性糖鎖は負イオン測定モードによりそれぞれをＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳで分析する方法もある。
【００１６】
この場合、糖鎖の誘導体化は行わないため構造情報も得られやすいが、中性糖鎖と酸性糖鎖をイオン交換カラム等により分離した後に分析する必要が生じるため、分析時間の短縮化を図ることはできない。
【００１７】
また、強酸性の溶離液条件（例えば０．１５％ギ酸溶液、ｐＨ２．５程度）を用いて中性糖鎖と酸性糖鎖を正イオン測定モードで一斉分析する方法も行われている。強酸性条件下では中性糖鎖および酸性糖鎮のいずれも水素イオンの解離が抑えられ、正イオン測定モードで分析する場合に水素付加イオンが生成しやすくなる。
【００１８】
しかしながら、強酸性条件下では一般にＥＳＩでのイオン化効率が低下することが知られており、高感度分析の実現は困難である。また、強酸性条件では酸性糖鎖の部分構造であるシアル酸の脱離が起こる可能性があり、酸性糖鎖の分析条件としては実用的ではない。
【００１９】
また、上述したソニックスプレーイオン源を用いた方法でも、中性糖鎖と酸性糖鎖とを高感度に一斉分析すること考慮されておらず、従来技術においては、中性糖鎖と酸性糖鎖とを高感度に一斉分析する技術の実現は困難であった。
【００２０】
本発明の目的は、中性糖鎖と酸性糖鎖をＬＣ／ＭＳにより高感度に一斉分析する液体クロマトグラフ質量分析方法を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記目的を達成するため、本発明は、ＬＣ／ＭＳのイオン化法にソニックスプレーイオン源（ＳＳＩ）を用い、中性糖鎖及び酸性糖鎖共に得られる信号強度が高く、かつ、両信号強度の互いの差が小さくなる条件を見出すことができた。
【００２２】
これにより、中性糖鎖と酸性糖鎖をＬＣ／ＭＳにより高感度に一斉分析する方法を実現することができた。
【００２３】
つまり、本発明は次のように構成される。
【００２４】
（１）液体クロマトグラフ質量分析方法において、ｐＨが３〜５の溶離液により、中性糖鎖及び酸性糖鎖を含む試料を分離カラムに送液し、上記分離カラムにより、上記試料を各成分に分離し、各成分に分離された試料を、略高速で噴霧することにより、イオン化するイオン源に送液し、このイオン源を負イオン測定モードで動作させて、上記試料をイオン化し、イオン化した試料を質量分析する。
【００２５】
（２）液体クロマトグラフ質量分析装置において、ｐＨが互いに異なる複数の溶離液を、ｐＨ３〜５となるように混合し、送液する送液ポンプと、上記送液ポンプにより送液された溶離液に、中性糖鎖及び酸性糖鎖を含む試料を導入する試料導入手段と、上記溶離液により送られる上記試料を各成分に分離する分離カラムと、上記分離カラムにより分離された試料を、略高速で噴霧することにより、イオン化するイオン源と、上記イオン源によりイオン化された試料を質量分析する質量分析手段とを備える。
【００２６】
（３）好ましくは、上記（１）、（２）において、上記分離カラムは、逆相系カラムである。
【発明の効果】
【００２７】
中性糖鎖と酸性糖鎖をＬＣ／ＭＳにより高感度に一斉分析する液体クロマトグラフ質量分析方法及び装置を実現することができる。
【００２８】
中性糖鎖と酸性糖鎖の一斉分析が可能となるため、分析効率が向上する。また試料消費量を少なくすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態について、添付図面を参照して詳細に説明する。  
図１は、本発明による一実施形態が適用される液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）の概略構成図である。
【００３０】
図１において、送液ポンプ１により、２種類の溶離液２および３が測定開始と共にその混合比を変化させながら、送液される。中性糖鎖および酸性糖鎖を含むサンプル溶液は、試料導入手段４により導入され、溶離液により分離カラム５に送られる。
【００３１】
サンプル溶液中の糖鎖成分は、分離カラム５で吸着・分配などの相互作用により各成分毎に分離され、イオン化手段であるソニックスプレーイオン源６に送られる。
【００３２】
ソニックスプレーイオン源６では、糖鎖成分を含む溶離液を略音速のガス流（ソニックスプレー）で噴霧する事により糖鎖成分のイオン化を行う。
【００３３】
ソニックスプレーイオン源６には、駆動電源である高圧電源７により電圧（０から１ｋＶ程度）を印加することが可能である。このソニックスプレーイオン源６によりイオン化された糖鎖成分は、質量分析装置８で質量数とその信号強度とが検出される。
【００３４】
ここで、分析カラム５に、Ｃ１８シリカカラムあるいはＣ３０シリカカラムなどの逆相カラムを用いる場合、溶離液としては水及びアセトニトリルなどの有機溶媒を混合させながら使用することが多いが、分離および質量分析装置８での信号強度に、溶離液２及び３のｐＨが大きく影響する。
【００３５】
糖鎖成分について、ソニックスプレーイオン源６を用いて負イオン測定モードで測定する場合、酸性糖鎖はその構造中のシアル酸を含むため、溶離液が中性条件下では容易に負イオンである水秦脱離イオンが生成され、質量分析装置８で高感度検出が可能である。
【００３６】
一方、溶離液が酸性になると、溶離液中の水素イオン濃度が高いため水素脱離イオンが生成されにくくなり、それだけ質量分析装置８での高感度検出が困難になる。
【００３７】
そこで、本願発明者は、溶離液中のｐＨと、中性糖鎖及び酸性糖鎖の信号強度について検討した。
【００３８】
その結果、分離カラム５にＣ３０シリカカラムを備え、溶離液２に１ｍｍｏ１／Ｌの酢酸アンモニウム水溶液、溶離液３に１ｍｍｏ１／Ｌの酢酸アンモニウムを含む１０％アセトニトリル水溶液、ｐＨを弱酸性条件（例えばｐＨ４．３付近）に調整したものを用いることで、負イオン測定モード及び印加電圧０ｋＶで中性糖鎖および酸性糖鎖の分離を損なうことなく同時に高感度分析する条件が得られる事を見出した。
【００３９】
図２は、上述した測定条件を見出すにおいて行った検討実験結果の一例を示すグラフであり、縦軸が信号強度、横軸が測定モード及びｐＨを示す。
【００４０】
図２中の、２００．４は中性糖鎖の一成分の名称であり、２Ａ１−２００．４は酸性糖鎖の一成分の名称である（図３に各糖鎖成分の構造式を示す）。
【００４１】
図２の左側の棒グラフ（中性糖鎖、酸性糖鎖のそれぞれについて３データ）は、図１に示した液体クロマトグラフ質量分析装置を正イオン測定モードで用いた場合の、中性糖鎖および酸性糖鎖各成分の信号強度を示す。
【００４２】
また、図２右側の棒グラフ（中性糖鎖、酸性糖鎖のそれぞれについて３データ）は、図１に示した液体クロマトグラフ質量分析装置を負イオン測定モードで用いた場合の、中性糖鎖および酸性糖鎖各成分の信号強度を示す。
【００４３】
なお、図２は、各測定モード毎に、溶離液条件を弱酸性（ｐＨ４．３）、中性（ｐＨ６．５）、塩基性（ｐＨ８．６）と変化させて糖鎖成分を測定した結果である。
【００４４】
正イオン測定モードの結果では、中性糖鎖（２００．４）の信号強度は溶離液条件が塩基性（ｐＨ８．６）の場合に全条件中で最も高い結果が得られた。
【００４５】
しかしながら、いずれの溶離液条件においても中性糖鎖（２００．４）と酸性糖鎖（２Ａ１−２００．４）との信号強度の差が大きい。また、酸性糖鎖の信号強度が小さいため、中性糖鎖と酸性糖鎖の一斉分析に適しているとはいえない。
【００４６】
これに対して負イオン測定モードの結果では、溶離液条件に関わらず中性糖鎖と酸性糖鎖と互いの信号強度の差が小さい。また、溶離液を弱酸性（ｐＨ４．３）にすることで中性糖鎖と酸性糠鎖のいずれも、信号強度が高く感度良く検出される結果が得られた。
【００４７】
したがって、本発明の一実施形態においては、中性糖鎖及び酸性糖鎖を、負イオン測定モードで、かつ、溶離液のｐＨを弱酸性（ｐＨ４．３）として、質量分析を行なう。
【００４８】
本発明の一実施形態を用いて、血清中の糖タンパク質の糖鎖を遊離させて、糖鎖の還元末端を２−アミノピリジン試薬で誘導体化して得られた中性糖鎖および酸性糖鎖の混合溶液を測定した結果を図４に示す。
【００４９】
図４の（ａ）は、質量分析装置で得られた全イオンクロマトグラムであり、図４の（ｂ）は中性糖鎖及び酸性糖鎖に該当する質量数のイオンを抽出したマスクロマトグラムである。
【００５０】
保持時間２２分から４２分の間に、中性糖鎖３成分（ｍ／ｚ８５０に２成分）と、酸性糖鎖５成分との合計８種の糖鎖を一回の測定で検出する事ができた。
【００５１】
このように、本発明によれば従来技術では困難であった中性糖鎖と酸性糖鎖との高感度一斉分析を実現することが可能となった。
【００５２】
なお、本発明者の検討結果によれば、負イオン測定モードにおいて、ｐＨ３〜５の範囲で、中性糖鎖と酸性糖鎖との信号強度が高く、かつ、両信号強度の互いの差が小さく、高感度で一斉分析可能である。
【００５３】
本発明の他の実施形態としては、測定対象に応じて、溶離液のｐＨを調整可能な液体クロマトグラフ質量分析装置がある。
【００５４】
図１に示すように、ポンプ１は、溶離液２、３の混合比を変化させることができる。したがって、溶離液２、３のｐＨが予め設定されているものであれば、その混合比を適切なものに設定すれば、溶離液のｐＨを調整することができる。
【００５５】
具体的には、図示しない設定手段（キーボード等）、コントローラにより、溶離液のｐＨが設定されると、送液ポンプ１は、そのｐＨとなるように、予め定められた混合比で溶離液を混合させる。
【００５６】
または、ｐＨ測定センサーにより、混合された溶離液のｐＨを測定し、所望のｐＨとなるように、溶離液の混合比を送液ポンプ１が調整することも可能である。
【００５７】
本発明による液体クロマトグラフ質量分析装置によれば、溶離液のｐＨを試料の分析対象に合わせて、最適な範囲に調整可能であるので、中性糖鎖と酸性糖鎖をＬＣ／ＭＳにより高感度に一斉分析することができるのみならず、中性糖鎖のみ、又は酸性糖鎖のみを対象とする場合にも、その対象に合わせて、溶離液を最適なｐＨとして、高感度に分析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明が適用される液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）の概略構成図である。
【図２】糖鎖成分について、ソニックスプレーイオン源を用いて正負イオン測定モードで、ｐＨを変化させて測定した結果を示すグラフである。
【図３】図２に示す測定結果が得られた中性糖鎖および酸性糖鎖の構造式を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態を用いて、血清を処理して得られた中性糖鎖および酸性糖鎖の一斉分析結果を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１          送液ポンプ
２、３      溶離液
４          試料導入手段
５          分析カラム
６          ソニックスプレーイオン源（ＳＳＩ）
７          高圧電源
８          質量分析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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