(57)【要約】【課題】  細胞操作が容易で作業効率が高く、培養条件の変化を伴わない細胞操作用基板、およびこの細胞操作用基板を用いる灌流培養装置を提供する。【解決手段】    細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーと、チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路と、チャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路とを有する細胞操作用基板のチャンバーが設けられた側に、チャンバーの内容物が実質的に流出しないようにさらにフィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板を接合した細胞操作用基板、および該細胞操作用基板用いる灌流培養装置。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーと、チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路と、チャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路とを有することを特徴とする細胞操作用基板。
【請求項２】
チャンバーの底部面積が、播種時における細胞長辺方向の断面積の２倍以上であることを特徴とする請求項１記載の細胞操作用基板。
【請求項３】
細胞操作用基板が、透明であることを特徴とする請求項１または２記載の細胞操作用基板。
【請求項４】
細胞操作用基板のチャンバーが設けられた側に、チャンバーの内容物が実質的に流出しないようにさらにフィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板を接合したことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞操作用基板。
【請求項５】
フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板が、透明であることを特徴とする請求項４に記載の細胞操作用基板。
【請求項６】
フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板が、細胞操作治具を貫通させて操作した後に抜去してもチャンバーの内容物を実質的に流出しないことを特徴とする請求項４または５記載の細胞操作用基板。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項記載の細胞操作用基板を用いることを特徴とする灌流培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞操作用基板およびそれを用いる灌流培養装置に関し、より詳細には、ライフサイエンス分野、再生医療およびゲノム創薬に関連する分野、食品分野などにおいて利用される細胞内への遺伝子導入や薬剤導入等の細胞操作を行うための基板、およびにそれを用いる灌流培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内に遺伝子や薬剤等を導入する細胞操作技術は、従来から生物の品種維持、品種改良、細胞の機能解析等に利用されている。その際、顕微鏡により対象細胞を観察して細胞操作を行うために、培養液等の溶液を導入できる細胞操作用基板が利用されている。
【０００３】
この細胞操作用基板は、平板状の基板や、機械切削、フォトリソグラフィー、エッチング、形状転写等によって加工された基板などが用いられており、一時的な操作用基板としての利用がほとんどである（特許文献１および２参照）。従って、操作細胞を培養する際には、充分な量の培養液を導入可能な別の培養用容器を用いて別途培養が行われるため、作業効率が悪いといった問題があった。また初期培養に充分な量の培養液を導入可能な基板に対しても、長期培養を行う際には培養液のバッチ式交換が必要となり作業効率が悪いといった問題があった。
【０００４】
一方、一連の培養操作において細胞操作を必要としない通常の細胞培養の場合には、培養液のバッチ式交換を必要とせず自動的に培養液を交換できる培養装置が提案されている（特許文献３および４）。そしてこれらの方法により、作業効率の向上をはじめ、細胞の増殖速度および／または分化速度を高めることが期待できる。しかしながら、細胞操作用基板にこの培養装置を組み合わせた場合には、非常に大掛かりな装置となるため汎用性が低下すると共に、培養器とポンプとの位置関係から細胞操作が困難であったり、細胞操作用基板上部の蓋を取り外して培養液の供給を停止した状態でなれば細胞操作ができなかったりして、作業効率の低下や培養条件の変化が生じるといった問題があった。
【０００５】
【特許文献１】特開平２−１１７３８０号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献２】特開平８−３３４７７号公報（特許請求の範囲、第３頁等）
【特許文献３】特開平８−１７２９５６号公報（特許請求の範囲、図１等）
【特許文献４】特開平１０−２８５７６号公報（特許請求の範囲、）図１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は，上述した問題点を解決するため、細胞操作が容易で作業効率が高く、培養条件の変化を伴わない細胞操作用基板、およびこの細胞操作用基板を用いる灌流培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記問題点について鋭意検討した結果、細胞操作用基板において，同一のチャンバー内で細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーを有し、チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路とチャンバーから老廃物を含む培養液が排出される流路を基板上に形成させた細胞操作用基板、およびその細胞操作用基板を用いる灌流培養装置によって、チャンバー内の培養条件を変えることなく、作業効率を向上させ、細胞の増殖速度および／または分化速度を向上可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーと、新鮮な培養液を供給する流路とチャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路を有する細胞操作用基板である。
また、本発明は、チャンバーの底部面積が、播種時における細胞長辺方向の断面積の２倍以上である上記細胞操作用基板、および細胞操作用基板が透明である上記細胞操作用基板を好ましい態様として包含する。
【０００８】
そして、本発明は、細胞操作用基板のチャンバーが設けられた側に、チャンバーの内容物が実質的に流出しないようにさらにフィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板を接合した上記細胞操作用基板、フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板が透明である上記細胞操作用基板、およびフィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板が、細胞操作治具を貫通させて操作した後に抜去してもチャンバーの内容物を実質的に流出しない上記細胞操作用基板をも好ましい態様として含む。
さらに、本発明は、フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板を接合した上記細胞操作用基板を用いることを特徴とする灌流培養装置である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞操作用基板は、チャンバーと、そこへ新鮮な培養液を供給する流路と、チャンバーから老廃物を含む培養液が排出される流路とを基板上に形成したものであり、フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板をこの細胞操作用基板に接合したものと微小送液ポンプなどから培養装置を形成することができ、これを用いることにより、常に操作細胞に新鮮な培養液を供給できる灌流培養装置として使用することが可能である。また細胞操作用基板に操作治具が貫通可能な基板を接合させることでチャンバー内の培養条件を変える必要がなくなるので、一連の作業効率が向上すると共に、細胞の増殖速度および／または分化速度も向上可能となる。
また、本発明の細胞操作用基板は、上記のように細胞内に遺伝子や薬剤等を導入する細胞操作用基板として用いることもできるし、同時に細胞培養用基板としても用いることができるという機能がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細胞操作用基板は、細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーと、新鮮な培養液を供給する流路と、チャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路を有する。そして、さらに、例えば、細胞操作用基板のチャンバーが設けられた側に、チャンバーの内容物が実質的に流出しないようにさらにフィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板を接合した細胞操作用基板として用いることもできる。
【００１１】
同一のチャンバー内で細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーとしては、流路との関係でその形態を種々選択することができるが、具体例として次のものを挙げることができる。
１）図１に示すように流路の底部よりチャンバーの底部が低い位置に存在する形態
図１（ａ）には、新鮮な培養液を供給する流路１と、丸型形状のチャンバー３と、チャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路２とから構成される細胞操作用基板が示されており、この細胞操作用基板は、上記図１（ａ）の平面図においてＡ−Ａ’で切断した断面図である図１（ｂ）から流路１および流路２の底部よりチャンバー３の底部が低い位置に存在する形態のものであることが分かる。流路１の底部と流路２の底部とは同じ深さでもよいし、異なった深さであってもよい。
２）図２に示すように流路の底部よりチャンバーの底部が高い位置に存在する形態
図２（ａ）には、新鮮な培養液を供給する流路１と、長方形形状のチャンバー３と、チャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路２とから構成される細胞操作用基板が示されており、この細胞操作用基板は、上記図２（ａ）の平面図においてＡ−Ａ’で切断した断面図である図２（ｂ）から流路１および流路２の底部よりチャンバー３の底部が高い位置に存在する形態のものであることが分かる。流路１の底部と流路２の底部とは同じ深さでもよいし、異なった深さであってもよい。
３）図３に示すように流路の底部とチャンバーの底部とが同一の高さの位置に存在する形態
図３（ａ）には、新鮮な培養液を供給する流路１と、長方形形状のチャンバー３と、チャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路２とから構成される細胞操作用基板が示されており、この細胞操作用基板は、上記図３（ａ）の平面図においてＡ−Ａ’で切断した断面図である図３（ｂ）から流路１および流路２の底部とチャンバー３の底部とが同一の高さに存在する形態のものであることが分かる。
これらのチャンバーを有する細胞操作用基板では、流路１によりチャンバーへ新鮮な培養液を供給し、流路２によりチャンバーから老廃物を含む培養液を排出することが可能となる。
【００１２】
同一のチャンバー内で細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーの形状は、特に制限されるものではないが、円形、正方形、長方形以外にも種々の形状を採用することができる。またチャンバーの底部面積としては特に限定されないが、例えば、制限細胞の安定化を図るために、播種時における細胞長辺方向の断面積の２倍以上でありことが好ましく、長時間培養して増殖した際の細胞の大きさを考慮すると、５倍以上（例えば２０μｍ以上）であることがより好ましい。
また、チャンバーは基板中に１個である場合もあるが、通常は機能向上のため、多数個設けることが好ましい。
【００１３】
また、チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路およびチャンバーから老廃物を含む培養液を排出する流路については、その形状は特に制限されるものではないが、例えば、長方形であったり、大きい長方形と小さい長方形との混合タイプであってもよい。また、新鮮な培養液を供給する流路と老廃物を含む培養液を排出する流路の機能が同一の流路で発揮されていてもよい。流路の形状寸法としては、特に限定されるものではないが、例えば、幅が０．１μｍ〜５０００μｍ、長さが１μｍ〜２０ｍｍ、深さが０．１μｍ〜１５００μｍ、流路の幅と深さとの比（幅：深さ）が１：３０〜３０：１程度から適宜選択され、流路形成の難易度の観点からからは、幅が０．５μｍ〜４０００μｍ、長さが３μｍ〜１０ｍｍ、深さが０．５μｍ〜１０００μｍ、流路の幅と深さとの比（幅：深さ）が１：２０〜２０：１程度であることが好ましい。この範囲で選択することにより、増殖速度および／または分化速度を向上させることができるなど有利となる場合がある。また、チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路および老廃物を含む培養液を排出する流路は、各々の流路が別々に設けられ培養液が別々に流れて混合することがない場合や、チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路と老廃物を含む培養液を排出する流路とが当初別々に設けられ途中で合流（同一）状態となり新鮮な培養液と老廃物を含む培養液とが混合する場合など、チャンバーと流路との配置状況に応じて適宜配置されていてもよい。
上記のようにチャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路と老廃物を含む培養液を排出する流路とが当初別々に設けられ途中で合流（同一）状態となり新鮮な培養液と老廃物を含む培養液とが混合するような細胞操作用基板としては、例えば、後述する図５のような形状を挙げることができるが、この場合には、新鮮な培養液を供給する大きい流路から小さい流路に分割され、各チャンバーを小さい流路が取り囲む状態を経て、老廃物を含む培養液を排出する大きい流路を有する構成が採用される。このような細胞操作用基板においては、大きい流路と小さい流路との配置はチャンバーの配置状況により適宜選択され、さらにより小さい流路が設けられていてもよい。
チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路および老廃物を含む培養液を排出する流路の数は特に限定されず、通常チャンバーへ新鮮な培養液を供給する流路と老廃物を含む培養液を排出する流路の機能を働く流路が少なくとも各1本設けられている。また細胞操作用基板の形態によっては、チャンバーや流路、あるいは流路同士が接合する部位に、培養液の流れにより細胞操作を損なわないため、あるいは細胞の増殖速度および／または分化速度を向上させるため、流量や流速をコントロールする微小バルブなどを配置することもできる。
【００１４】
本発明の細胞操作用基板を構成する材料としては、自己支持性を有するものであれば特に制限されず、例えば、合成樹脂、シリコン、ガラス等が挙げられる。コスト面や顕微鏡観察による細胞操作性の観点から、透明な合成樹脂を細胞操作用基板の材料とすることが好ましい。
透明な合成樹脂としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体等のアクリル系樹脂；ポリスチレンなどのスチレン系樹脂；シクロオレフィン等のオレフィン系樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸等のエステル系樹脂；ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系樹脂；ポリカーボネート樹脂等が挙げられる。このような樹脂には、透明性を損なわない範囲で着色剤、拡散剤、増粘剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明の細胞操作用基板は、基板表面の親水性、生体適合性、細胞親和性などを向上させることを目的として、チャンバーや流路が設けられている細胞操作用基板面側に改質層および／またはコーティング層が配されていてもよい。上記改質層を設ける方法としては、自己支持性を失う方法や１００μｍ以上の極端な表面荒れを起こす方法でなければ特に制限はないが、例えば、薬品処理、溶剤処理、表面グラフト重合によるグラフトポリマーの導入等の化学的処理、コロナ放電、オゾン処理、プラズマ処理等の物理的処理等の方法が挙げられる。またコーティング層を設ける方法としては、特に制限されるものではないが、例えば、スパッタ、蒸着等のドライコーティング、無機材料コーティング、ポリマーコーティング等のウェットコーティングなどの方法が挙げられる。
また、細胞親和性を考慮した場合には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞親和性タンパク質をコーティングすることがより好ましい。細胞操作用基板の改質を行い、ヒドロキシル基、カルボキシル基等の官能基を導入した後に、上述した細胞親和性タンパク質をコーティングすると、コーティング層と基材との接着性が向上して安定的な長期培養が可能となるため、特に好ましい場合がある。
【００１６】
上記細胞操作用基板の大きさは、特に制限されないが、幅２ｍｍ〜１００ｍｍ，長さ５ｍｍ〜１５０ｍｍが好ましく，作製の難易度，操作性，およびコストの観点から幅４ｍｍ〜５０ｍｍ，長さ１０ｍｍ〜４０ｍｍであることがより好ましい。またその厚みは、特に制限されるのではないが、０．１ｍｍ〜２０ｍｍが好ましく、自己支持性とコスト面の観点から０．２ｍｍ〜１５ｍｍがより好ましい。
【００１７】
本発明の細胞操作用基板を製造する方法としては、特に限定されないが、例えば、モールドを用いた転写成形、３次元光造形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等の方法が挙げられる。細胞操作用基板の用途、要求される加工精度、コスト等を考慮してこれらの製造方法を適宜選択することが好ましい。
【００１８】
モールドを用いる転写成形方法の具体例としては、金属構造体を型として樹脂成形で細胞操作用基板を形成する方法が挙げられる。この方法は金属構造体の形状を高い転写率で細胞操作用基板に再現することが可能であり、また汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので好ましい。このような金属構造体の型を用いる方法は、低コストであり、高い寸法精度を満足できる点で優れている。
【００１９】
上記金属構造体の製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィーによって作製されたレジストパターンや３次元光造形によって作製された樹脂パターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等が挙げられるが、用途、要求される加工精度、コスト等を考慮して適宜選択することが好ましい。
【００２０】
上記で得られた金属構造体を型として用いて細胞操作用基板を成形する方法としては、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等の方法を挙げることができるが、生産性および型転写性の観点から射出成形を採用することが好ましい。
【００２１】
金属構造体を型として用いた場合には、例えば射出成形で細胞操作用基板を形成する場合、１枚の金属構造体で１万枚〜１０万枚、場合によっては１００万枚もの細胞操作用基板を得ることができるので、金属構造体の製作にかかる費用負担を大幅に解消することが可能である。また，射出成形１サイクルに必要な時間は５秒〜３０秒と短く、生産性の面で極めて効率的である。射出成形１サイクルで同時に複数個の細胞操作用基板を形成可能な成形金型を使用すれば、更に生産性を向上することが可能となる。上記成形方法では金属構造体を金属型として用いても，金属構造体を予め用意した金属型内部にセットして用いても構わない。
【００２２】
チャンバー内の内容物の流出を防ぐために細胞操作用基板に接合する基板としては、特に限定されないが、細胞操作治具が貫通可能であることが好ましいため、フィルム状あるいはシート状の高分子材料であることが好ましい。さらに、上部から顕微鏡観察を行いながら細胞操作治具を貫通でき、細胞操作後に治具を抜去した後にも、チャンバー内の内容物の流出を防ぐことが好ましいため、透明でかつ柔軟性を有する高分子材料であることがより好ましい。このような高分子材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系材料；寒天ゲル、ゼラチンゲル、コラーゲンゲル、ヒアルロン酸ゲル、アルギン酸ゲル等の天然高分子ゲル系材料；ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールゲル等の合成高分子ゲル系材料等が挙げられる。これらのうち、コスト面とガス透過性の観点から、ポリジメチルシロキサンを用いることがより好ましい。
【００２３】
チャンバー内の内容物の流出を防ぐため、細胞操作用基板に接合する上記基板の厚みとしては、自己支持性があり、細胞操作治具の貫通が可能であり、かつ細胞操作治具を抜去した後であってもチャンバー内の内容物の流出が起らなければ特に制限はないが、自己支持性および接合操作性の観点から３０μｍ以上が好ましい。基板としてポリジメチルシロキサンを用いた場合には、コスト面、接合操作性および操作治具の貫通や操作治具抜去後の閉塞性などの観点などから、１００μｍ以上２００ｍｍ以下であるのが特に好ましい。
【００２４】
チャンバー内の内容物の流出を防ぐため、細胞操作用基板に接合する高分子材料からなる基板と細胞操作用基板との接合方法としては、自己粘着性を示さない基板の場合、熱圧着、超音波接着、溶剤接着、溶剤ガス接着、バインダー接着、プラズマ処理等の物理的処理方法；表面グラフト化等の化学的処理により自己粘着性を持たせた接着方法等が挙げられる。これらのうちコスト、細胞親和性などの観点から、生体糊と称されるフィブリン糊、ゼラチン等をバインダーとして用いるバインダー接着方法がより好ましい。一方、自己粘着性を示す基板の場合は，重ね合わせることで接合できる。
【００２５】
本発明の灌流培養装置は、細胞操作用基板のチャンバーが設けられた側に、チャンバーの内容物が実質的に流出しないようにさらにフィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板を接合した上記細胞操作用基板を用いることを特徴とする。このような灌流培養装置としては、新鮮な培養液を保管する容器、培養液を送液する微小ポンプなどのポンプ、フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板が接合された上記細胞操作用基板、老廃物を含む培養液を保管する排出液保管容器、これらを繋ぐシリコンゴムチューブなどの配管などで通常構成されるが、必要に応じてこれらの要素を繋ぐ際液漏れ等を防止するためのコネクター、流量や流速を調整するためのバルブ、流量計などを設けても良い。
上記灌流培養装置を用いることにより、例えば、通常顕微鏡ステージに固定された細胞操作用基板内の細胞を、顕微鏡の対物レンズを通して観察しながら、細胞操作冶具を用いて、細胞操作用基板にトラップされている細胞内へ遺伝子導入、薬剤導入などの操作を行い、同時に乃至は操作前後に細胞の培養を行うことができる。この際に、フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板が、透明であると細胞の状況を容易に観察することができるし、また、フィルム状あるいはシート状の高分子材料からなる基板が細胞操作治具を貫通させて操作した後に抜去してもチャンバーの内容物を実質的に流出させない材質のものである場合には効率よく細胞操作が可能であり、有用である。
【実施例】
【００２６】
以下，本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
なお、以下の説明は、本発明の好適な実施形態を示すものであって，本発明の範囲が以下の実施の形態に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
フォトリソグラフィー法および機械切削などにより、図４に示すような、流路１と、流路２と、同一のチャンバー内で細胞培養と細胞操作が可能なチャンバー３と、チャンバーを取り巻く流路１と流路２の機能を果たす小さな流路４を有する細胞操作用基板（但し、この段階では供給口５および排出口６は形成されていない）が得られるような型を作製した。この基板型にニッケルメッキを行い、成形用金型構造体を作製した。次いで、得られた成形用金型構造体にシート状のポリメタクリル酸メチルをホットエンボス成形して形状を転写し、供給口５と排出口６が形成されていない図４に示す形状の細胞操作用基板（幅４．５ｍｍ、長さ１２．８ｍｍ、厚み１．５ｍｍ）を得た。そして、炭酸ガスレーザー切削加工により、細胞操作用基板への培養液の供給口５と基板からの培養液の排出口６を作製した。供給口を有する流路１および排出口を有する流路２は、チャンバーへの新鮮な培養液の安定供給のためあるいは老廃物を含む培養液の安定排出のため、それぞれ幅４０００μｍ、長さ３５２０μｍ、深さ２００μｍである。チャンバーを含む配置の流路４は、幅３０μｍ、長さ１６０μｍおよび深さ１００μｍの小流路と、幅３００μｍ、長さ３７７０μｍおよび深さ１００μｍの中流路とで構成されている。またチャンバー内寸法は、それぞれ幅１００μｍ、長さ１００μｍおよび深さ１００μｍである。得られた細胞操作用基板の平面図を図４（ａ）に、そのＡ−Ａ’断面図を図４（ｂ）に、そしてチャンバー１個の概略図を図４（ｃ）にそれぞれ示す。そして、得られた細胞操作用基板は、細胞親和性を付与するためにコラーゲンをコーティングした。
次に、図５に示すように、培養液の供給口および排出口にポリプロピレン製のコネクターを上記細胞操作用基板に接合し、得られた細胞操作用基板、微小送液ポンプ（旭テクノグラス社製：ＳＤＫ−０３ＲＣ）、１Ｌ容量の培養液容器および１Ｌ容量の排出液容器をそれぞれシリコーンゴムチューブ（外径４ｍｍ、内径２ｍｍ）で接続した。そして、チャンバー内の内容物の流出を防ぐため、厚み１ｍｍのポリジメチルシロキサンシートを用い、マウス皮膚由来線維株Ｌ９２９細胞播種後にこれと上記細胞操作用基板の外周部とをバインダー接着して灌流培養装置を形成した。送液量は０．１ｍＬ／ｍｉｎとした。
【００２８】
上記細胞播種後、１時間、６時間、１２時間および２４時間後での接着細胞数から増殖状態を観察し、得られた結果から増殖曲線を作成して図７に示す。
また、細胞を２週間培養した結果、Ｌ９２９細胞は繊維状の凝集した形状を示しチャンバー表面を完全に被覆した状態で接着しており，充分に生育している模様が位相差顕微鏡により観察された。
さらに、細胞播種２週間後のＬ９２９細胞に対して遺伝子導入操作（細胞操作）を行ったところ、細胞操作用基板上部と接合したシート状の基板を細胞操作治具が速やかに貫通し、抜去後も培養液の漏れなどチャンバー内の内容物の流出は観察されなかった。細胞操作２週間後も細胞はチャンバー底部に伸展した状態で良好に接着していた。
【００２９】
比較例１
フォトリソグラフィー法により、図６に示すように、チャンバー内で細胞培養と細胞操作が可能なチャンバーのみを有する実施例１と同形状のチャンバーを有する細胞培養チャンバーアレイを得ることのできる基板型を作製し、実施例と同様にしてニッケルメッキにより金型構造体を作製後にホットエンボス成形して細胞培養チャンバーアレイを得た。この細胞培養チャンバーアレイに実施例と同様のコラーゲンコーティングを行い、次いで、１ｍｍのポリジメチルシロキサンシートを用いて、細胞播種後にこれと細胞培養チャンバーアレイと接合した。
次いで、実施例１と同様に評価したところ、比較例１では、実施例１と比較して著しい増殖速度の向上を得ることはできなかった（図７参照）。また、比較例１では、Ｌ９２９細胞を２週間培養したところ、該細胞は部分的に異形な凝集塊を形成してチャンバー表面上に斑状に接着あるいは浮遊していた。また、細胞操作２週間後の観察では、細胞は部分的に異形な凝集塊を形成してチャンバー表面上に斑に接着あるいは浮遊していた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
以上から明らかなように、本発明の細胞操作用基板およびそれを用いた灌流培養装置は、操作効率が高くかつ長期培養が可能であり、細胞増殖速度および／あるいは分化速度を高めることができ有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の一態様における細胞操作用基板の微細構造概略図である。
【図２】本発明の一態様における細胞操作用基板の微細構造概略図である。
【図３】本発明の一態様における細胞操作用基板の微細構造概略図である。
【図４】本発明の他の一態様における細胞操作用基板の微細構造概略図である。
【図５】本発明の一態様における細胞操作用還流装置の概略図である。
【図６】従来例における細胞培養チャンバーアレイの微細構造概略図である。
【図７】実施例１および比較例１の細胞増殖曲線を示す図である。
【符号の説明】
【００３２】
１  流路１
２  流路２
３  同一のチャンバー内で細胞培養および細胞操作が可能なチャンバー
４  流路４（混在した流路１および流路２）
５  培養液の供給口
６  培養液の排出口
７  ポリジメチルシロキサン製シートで接合した細胞操作用基板
８  培養液供給口コネクター
９  培養液排出口コネクター
１０  送液ポンプ
１１  培養液容器
１２  排出液容器
１３  シリコーンゴムチューブ
１４  細胞操作治具
１５  対物レンズ
１６  顕微鏡ステージ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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