(57)【要約】【課題】アデノウイルスベクターによって動物細胞内に導入された外来遺伝子が、細胞内で自律複製可能な形に変換し得るような組換えアデノウイルスベクターの系を構築すること。【解決手段】プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を発現する細胞に感染させ増殖させる工程を含む、動物細胞感染用の組換えアデノウイルスベクターの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を発現する細胞に感染させ増殖させる工程を含む、動物細胞感染用の組換えアデノウイルスベクターの製造方法。
【請求項２】
リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
プロモーターおよびポリＡ配列が、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）である請求項１又は２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクターに関する。さらに詳しくは、リコンビナーゼ遺伝子またはこのリコンビナーゼの認識配列をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡウイルスベクターと、該べクターを用いた外来遺伝子の細胞内導入法及び遺伝子治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで遺伝子導入のウイルスベクターとしてレトロウイルスが良く用いられたが、このウイルスは分裂している細胞にしか導入できないことや宿主細胞の染色体に組み込まれてしまうことにより、特に遺伝子治療においてはその安全性の観点より問題があり、その応用範囲は限られていると考えられている。
アデノウイルスベクターは、種々の動物培養細胞で１００％近い導入効率を示すこと、またレトロウイルスと異なり積極的な染色体組み込みの機構を持たないこと、さらに、休止期の細胞でも遺伝子導入出来るという利点もあり、外来遺伝子導入実験のベクターとしての応用範囲は極めて広く、近い将来は遺伝子治療の主要技術の一つとして確立するであろうと考えられている。
【０００３】
アデノウイルスベクターの利用は遺伝子治療技術の一つとして、また神経系などの高度に分化した細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。遺伝子治療技術としては、既に構築され機能している組織へ直接投与することにより機能を担っている生細胞へ直接欠損した遺伝子を補う、いわゆる in vivo遺伝子治療の方法として研究が精力的に進められている。既に嚢胞性繊維症では、米国で５グループが実際に患者への実験治療を認められており、筋ジストロフィー症、家族性高コレステロール血症、また脳腫瘍等に対して活発に研究されるようになった。一方でアデノウイルスベクターは休止期の細胞へも遺伝子導入が可能であり、分化した細胞や、特に神経系への遺伝子導入方法として、初代培養や動物個体への遺伝子導入実験が注目されている。以上より、アデノウイルスベクターは、神経系を含む多くの分化、未分化細胞への遺伝子治療導入だけでなく、動物個体への直接注入・投与による遺伝子発現が可能であることから、特に遺伝子治療への応用が期待されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、アデノウイルスはレトロウイルスと異なり、積極的な染色体組み込みの機構を持たないことから、発現が一時的である。その期間は１〜２週間から、長くても２ヶ月程度である。そのため治療効果を継続させる必要がある場合には、繰り返し投与による発現の継続が必要である。しかし、繰り返し投与では抗体の出現による治療効果の低減が懸念される。
従って、本発明の目的は、アデノウイルスベクターによって動物細胞内に導入された外来遺伝子が、細胞内で自律複製可能な形に変換し得るような組換えアデノウイルスベクターの系を構築することにあり、さらに、かかる系を遺伝子治療用に提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らは、上記の問題を解決するために鋭意検討し、動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターとして、アデノウイルスベクターを用いて細胞内に導入した外来遺伝子を含む遺伝子発現ユニットを、リコンビナーゼおよびその認識配列を利用することにより環状分子化するとともに、そこに複製起点を付与することにより、アデノウイルスベクターを用いて細胞内に導入した外来遺伝子を含む遺伝子発現ユニットを、自律複製可能な形に変換することに成功した。
【０００６】
即ち、本発明の要旨は、
（１）  プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を発現する細胞に感染させ増殖させる工程を含む、動物細胞感染用の組換えアデノウイルスベクターの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
ここに、リコンビナーゼとは、特異的なＤＮＡ組換え酵素で、数十塩基からなる特異的なＤＮＡ配列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断・鎖の交換と結合の全工程を行う。そこで、この酵素を発現する組換えアデノウイルスベクターと、この認識配列を同じ向きに２コピーを持つ組換えアデノウイルスベクターを作製し、両方を細胞に共感染させると、発現したリコンビナーゼにより２つの認識配列間の再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出される。従って、この部分に発現ユニットと複製起点を組み込んでおけば、環状分子は核内で複製され、細胞内において永続的に維持され、外来遺伝子の発現を続けることができる。従って、このような組換えアデノウイルスベクターの系を遺伝子治療に使用すれば、１回投与により、長期間の治療効果を持続させることが可能となる。
本発明は、かかる知見に基づいて、さらに研究を進めて完成するに至ったものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明における動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターは、アデノウイルスのように細胞に感染後染色体外でしか存在し得ないようなＤＮＡウイルス由来のベクターであれば、特に制限されることなく用いることができる。例えば、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、パポパウイルスベクター等が挙げられる。以下、リコンビナーゼ遺伝子又はリコンビナーゼ認識配列をもつ動物細胞感染用のＤＮＡウイルスベクターの好適な例として、アデノウイルスベクターを用いて本発明を説明する。
【０００９】
本発明に用いられるアデノウイルスは、動物を自然宿主とするものであり、特にヒトを宿主とするヒトアデノウイルスが好適に用いられる。ヒトアデノウイルスのゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡであって、ＤＮＡ鎖両端にはおよそ１００ｂｐからなる逆方向反復塩基配列があり、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパク質が共有結合しているという特異な構造をしている。
【００１０】
本発明に用いられるアデノウイルスのゲノムは、Ｅ１領域特にＥ１Ａ領域を欠失している。これは、アデノウイルスの細胞ガン化活性に関与するＥ１Ａ領域を欠失させることにより、アデノウイルスを無毒化し、ゲノム中に組み込んだ外来の遺伝子配列のみを発現させるためである。必ずしもＥ１Ａ領域の全てを欠失させる必要はなく、Ｅ１Ａ領域、特に１．３〜９．３％の断片を除去すれば、目的は達成される。
また、本発明に用いられるアデノウイルスのゲノムは、Ｅ３領域も欠失させてもよい。特に、Ｅ３領域の７９．６〜８４．８％を欠失させたものが好ましい。アデノウイルスの複製には不要であるからである。
したがってＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）を除き、宿主細胞内で増殖することができないという特徴を有する。
【００１１】
本発明に用いられる組換えアデノウイルスベクター粒子は、上記の２９３細胞に接種すると野性株同様に１０8 〜１０9 ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌの高力価になるまで増殖する。しかし、他の細胞や動物組織に接種すると、このウイルス粒子は細胞内へ高率に侵入し、ウイルスゲノムが核内へ注入されるものの、Ｅ１Ａ遺伝子が欠失しているため、この遺伝子産物により転写活性化される他のすべてのアデノウイルスプロモーターは働くことができない。一方、このアデノウイルスゲノム中に組み込まれた外来遺伝子は、ゲノムに組み込まれた外来のプロモーターから転写され発現することができる。従って、本発明に用いられる組換えアデノウイルス粒子を使用すれば、ベクターとしてのアデノウイルスゲノムの影響を最小限に抑えて、広範な動物細胞中で外来遺伝子を発現させることができる。
【００１２】
野性株のヒトアデノウイルスが感染後増殖できる細胞はほとんどヒト細胞に限られているにもかかわらず、本発明に用いられる組換えアデノウイルスで発現可能な細胞種・組織は、はるかに広い範囲にわたる。これは、本来のアデノウイルスが増殖できない細胞でも、本発明に用いられる組換えアデノウイルスの場合はウイルス粒子が感染・侵入さえできれば発現ベクターとして充分に機能し得るからである。
【００１３】
しかし、本発明に用いられる組換えアデノウイルスのゲノムは、染色体外の状態では複製しないため、２週間〜２ヶ月にわたって核内に存在するものの、長期間の目的遺伝子の発現が要求される場合には多数回の投与が必要となり、抗体の出現等の弊害が予想される。
そこで、本発明では、かかる組換えアデノウイルス外来遺伝子として後述のリコンビナーゼ遺伝子を組み込んだ新規組換えアデノウイルスを作製し、他方、このリコンビナーゼの基質となる塩基配列（認識配列）２ヶ所に挟まれた目的の外来遺伝子を組み込んだ別の新規組換えアデノウイルスを作製し、これら両者を動物細胞に感染させ、リコンビナーゼ遺伝子の発現により生ずるリコンビナーゼの作用によって他方の組換えアデノウイルスを切断し、切り出された部分が環状分子となり、細胞内で自律複製できるように他方の組換えアデノウイルスを構築する。
【００１４】
本発明に用いられるプロモーターとしては、動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺伝子プロモーターが挙げられる。前者の例としてはＳＶ４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝子プロモーター等があり、また、後者の例としては、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモーター等がある。しかし本発明には、ＣＡＧプロモーターが特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーターであり、高発現ベクターとして特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。その調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行および２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，ＨｉｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発明に利用することができる。
【００１５】
本発明に用いられるリコンビナーゼは、特異的なＤＮＡ組換え酵素で、特定の塩基配列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全工程を行う。かかる酵素としては、大腸菌のバクテリオファージＰ１がコードするもの（リコンビナーゼＣｒｅ）がある。これはバクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ（Abremskiら、J. Biol. Chem.1984、1509−1514；および Hoessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029）配列を基質とする。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認識配列となる。また、他のリコンビナーゼとして酵母の２μプラスミド由来のＦＬＰ遺伝子がコードするリコンビナーゼが挙げられる（James R. Broarchら、Cell、29、227-234)。さらに、チゴサッカロマイセス・ルーイイのｐＳＲ１プラスミド由来のものも使用できる。これはＲ遺伝子にコードされる（Matsuzaki ら、Molecular and Cellular Biology、８、955-962 (1988)) 。これらの中では、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼが本発明に特に好適である。
【００１６】
リコンビナーゼ遺伝子は、例えば、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子の場合は、バクテリオファージＰ１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分をポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を用いて増幅して本発明に使用することができる。その他のリコンビナーゼ遺伝子の場合も同様にＰＣＲ法を用いて調製することができる。この場合に使用するプライマーは、リコンビナーゼ遺伝子の全配列がカバーされるように選択され、さらに組換えアデノウイルスベクターの構築の便宜のため、各プライマーの外側に適当な制限酵素切断配列を付加したものを使用することが好ましい。
【００１７】
上記のリコンビナーゼの認識配列（基質となる配列）は数十ｂｐであり、例えばｌｏｘＰ配列は３４ｂｐであり、全て、塩基配列が知られているので（Abremskiら、J. Biol. Chem.1984、1509-1514 ；および Hoessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029) 、常法により化学合成して本発明に使用することができる。
【００１８】
本発明に用いられるポリＡ配列としては、特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来のものが特に好ましい。
【００１９】
本発明においては、リコンビナーゼ遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込む場合に、同時に核移行シグナル配列を組み込むことが好ましい。これは、アデノウイルスベクターにより感染細胞の核内で発現されたリコンビナーゼが核外に分泌されるため、リコンビナーゼがその認識配列を有するアデノウイルスベクターに作用するには、再び核内に移行する必要があり、核移行シグナル配列はこれを促進する（Daniel Kalderon ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からである。
【００２０】
本発明に用いられる動物細胞で働く複製起点としては、ウイルス由来のものおよび動物細胞由来のものが挙げられる。例えば、ウイルス由来のものとしてパポバウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス又はパルボウイルス由来の複製起点が挙げられる。パポバウイルス由来のものとしてＳＶ４０由来の複製起点があげられる。
これらの複製起点が本発明の組換えアデノウイルスベクターに組み込まれるのは、リコンビナーゼで切り出された環状分子が細胞内で自律複製できるようにするためである。
【００２１】
本発明に使用される外来遺伝子としては、上記のハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）あるいはその他のプロモーターにより発現することができる遺伝子であれば、特に限定されるものではなく、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応する正常遺伝子の配列（例えばアデノシンデアミナーゼ、ジストロフィン、低密度リポ蛋白レセプター、α−１アンチトリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、ガラクトシダーゼα、もしくはβ）、サイトカイン類（例えばインターロイキン−１〜１２、インターフェロン−α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリン、インシュリン様成長ホルモン）、神経栄養因子類、非自己抗原遺伝子（例えばアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ７））、ウィルス抗原等をコードするヌクレオチド配列、ガン抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−１、ＮＭ２３、ＮＦ−１）、ガン遺伝子であるＲａｓ等のアンチセンス配列、またはチミジンキナーゼやシトシンデアミナーゼのような自殺遺伝子と呼ばれるものが挙げられる。
【００２２】
本発明の組換えアデノウイルスベクターに組み込まれる複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列は、二つのリコンビナーゼ認識配列の間にあって上流からこの順に配向しているのが通常である。
しかし、外来遺伝子、ポリＡ配列、複製起点およびプロモーターが上流からこの順に配向していてもよい。環状分子になれば上記の配列と同一になるからである。
【００２３】
本発明を遺伝子治療に使用する場合は、リコンビナーゼを発現可能な本発明の組換えアデノウイルスベクターと二つのリコンビナーゼ認識配列の間に動物で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクターとを共感染させることにより行う。感染は、同時でも、いずれかを先に感染させてもよい。感染により動物細胞内に注入されたＤＮＡは、１か月以上安定に存在するからである。
リコンビナーゼ発現可能な本発明の組換えアデノウイルスベクターは細胞内で一定期間発現を続け、リコンビナーゼが産生される。そして、このリコンビナーゼは、共感染させた他方の組換えアデノウイルスベクターすなわち二つのリコンビナーゼ認識配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクターに作用し、二つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれた部分を切り出し環状分子化する。この環状分子には動物細胞で働く複製起点が組み込まれているので、細胞内で自律複製する。従って、１回の共感染により、治療効果をほぼ永続的に持続させることができる。このように、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子治療に極めて有用性が高いと考えられる。
このような動物細胞としては、ヒトまたは哺乳動物の高度に分化した神経系、筋系、肝細胞から未分化な上皮細胞、繊維芽細胞に至る広範囲の細胞が挙げられる。
【００２４】
次に、本発明の組換えアデノウイルスの製造方法について説明する。
（１）  まず、プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法について説明する。
本発明の組換えアデノウイルスベクターの作成は、前述のとおりウイルスゲノムの両端にタンパク質が共有結合しているため、一般に極めて困難である。
そこで本発明においては、以下の方法を用いる。リコンビナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を使用した場合について述べるが、他のリコンビナーゼ遺伝子の場合もほぼ同様である。
【００２５】
（ｉ）  ＰＣＲ法で調製したリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびプラスミドｐＵＣ１９（宝酒造製）とをそれぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）で同時消化したのち混合・ライゲーションし、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＵＣＣｒｅを得る。
（ｉｉ）  細胞工学、１３、７６０−７６３（１９９４）に記載の方法により調製したＣＡＧプロモーターを含むカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを制限酵素ＳｗａＩ（Boehringer社製）で処理したものと、ｐＵＣＣｒｅを制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）で同時消化したのちＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両端を平滑化したものとを混合する。ついでカセットコスミドを沈澱させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで結合させ、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドを得る。
【００２６】
ＣＡＧプロモーター以外のプロモーターを使用する場合は、まず、アデノウイルスゲノム（３６ｋｂ）の全長のうち、複製に不要なＥ３領域（１．９ｋｂ）とＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ領域（２．９ｋｂ）を欠失させた約３１ｋｂのゲノムＤＮＡをもつカセットコスミドを作成し、他方、使用しようとするプロモーター、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびポリＡ配列を含むプラスミドを作製し、適当な制限酵素で処理してアデノウイルスゲノムのＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ欠失部位にリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現ユニットを組み込んだカセットコスミドを得る。
（ｉｉｉ）  次に、得られたカセットコスミドを、ラムダ・インビトロ・パッケージングキットであるギガパックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、インビトロ・パッケージングを行う。
【００２７】
（ｉｖ）  一方、アデノウイルスＤＮＡ−蛋白複合体（Ａｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製する。アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985) ）を用い、Ａｄ５ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ  １０本分）に感染させ、培養を行う。ウイルス粒子を回収し、塩酸グアニジン処理・超遠心によりＤＮＡ−ＴＰＣを分離・回収する。
こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣを次のステップの組換えアデノウイルス作製のため充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで処理する。
【００２８】
（ｖ）  最後のステップとして、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を組み込んだカセットコスミドとＥｃｏＴ２２Ｉで処理したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣを混合し、セルフェクト（ファルマシア社製）キットを用いてリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行う。ウイルスの増殖のため細胞が死滅したものからウイルス液を回収しプロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターを得る。
【００２９】
（２）次に、二つのリコンビナーゼ認識配列並びにその間に動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイルスベクターの製造方法について述べる。便宜上、プロモーターおよびポリＡ配列としては前記のＣＡＧプロモーターを、また複製起点としてＳＶ４０の複製起点を使用する場合について述べる。
【００３０】
（ａ）まず、目的の外来遺伝子を発現するカセットコスミドを作製する。
（ｉ）  ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Niwaら、Gene、108 、193-200 (1990)) のクローン化部位にＳｗａＩリンカーを挿入することにより得たｐＣＡＷＧをＳｗａＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理する。ついで目的の外来遺伝子とｐＣＡＷＧを混合し、リガーゼで処理し、大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９）を形質転換し、ＣＡＧプロモーターの制御下に発現し得る方向に外来遺伝子が挿入されたプラスミドを得る。
【００３１】
（ｉｉ）  次に、外来遺伝子の発現ユニット（ＣＡＧプロモーターの制御下に発現し得る方向に外来遺伝子が挿入されたもの）とＳＶ４０の複製起点とを含むＤＮＡ断片を作製する。（ｉ）で得られたプラスミドを制限酵素ＳａｐＩおよびＳａｌＩで同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により両端を平滑化し、電気泳動により目的のＤＮＡ断片を得る。これを、制限酵素ＳｍａＩで切断したのちアルカリホスファターゼ処理したｐＵＣ１８（宝酒造製）と混合し、リガーゼで処理して外来遺伝子発現ユニットとＳＶ４０の複製起点を組み込んだプラスミドを得る。
【００３２】
（ｉｉｉ）  次に発現ユニットとＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ配列を付加するため以下の操作を行う。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅｃｌ１３６ＩＩで切断し、アルカリホスファターゼ処理をした後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有し、これが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計されているｌｏｘＰ配列を含む合成ＤＮＡ断片（配列番号：３）とのリガーゼ反応に付し、この合成ＤＮＡ断片が二つ挿入されたプラスミドを得る。
このプラスミドを、制限酵素ＮｒｕＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理した後、（ｉｉ）で得られたプラスミドを制限酵素ＳａｌＩおよびＥｃｌ１３６ＩＩで同時消化し、平滑化して得られたＤＮＡ断片とリガーゼにより結合して、外来遺伝子発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を含むプラスミドを得る。
【００３３】
（ｉｖ）  次に、外来遺伝子発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を含む組換えコスミドを得るため以下の操作を行う。まず、（ｉｉｉ）で得られたプラスミドを制限酵素ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで同時消化し、両端をＫｌｅｎｏｗ酵素で平滑化し、電気泳動により精製して、外来遺伝子発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を用意する。一方、ｐＡｄｅｘ１ｃｗ（細胞工学、１３、７６０−７６３（１９９４））を制限酵素ＳｗａＩで切断したものを用意する。これら両者を混合し、カセットコスミドを沈澱させ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで結合させ、外来遺伝子発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を組み込んだカセットコスミドを得る。
【００３４】
（ｂ）二つのｌｏｘＰ配列およびその間に複製起点、ＣＡＧプロモーター、外来遺伝子を有する断片を組み込んだ組換えアデノウイルスベクターの作製
さらに、上記（１）の（ｉｉｉ）〜（ｖ）と同様な操作を行うことにより、ＳＶ４０の複製起点、目的の外来遺伝子発現ユニットおよびその両端にｌｏｘＰ配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。
【００３５】
本発明の方法により上記のようにして得られる、プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクターおよびＳＶ４０の複製起点、目的の外来遺伝子発現ユニットおよびその両端にｌｏｘＰ配列を有する本発明の組換えアデノウイルスベクターの高力価ウイルス溶液は、適宜希釈して局所注入（中枢神経系・門脈など）、経口（腸溶剤を用いる）投与、経気道投与、経皮投与等の投与方法により共感染させ、遺伝病を含む各種疾患の治療に用いることができる。
本発明の好ましい態様の具体的な例としては、
〔１〕  プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔２〕  ＤＮＡウイルスベクターがアデノウイルスベクターである前記〔１〕記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔３〕  リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である前記〔２〕記載のＤＮＡウイルスベクター、
〔４〕  二つのリコンビナーゼ認識配列並びにその間に動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔５〕  ＤＮＡウイルスベクターがアデノウイルスベクターである前記〔４〕記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔６〕  動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列が上流からこの順に配向している前記〔５〕記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔７〕  外来遺伝子、ポリＡ配列、動物細胞で働く複製起点およびプロモーターが上流からこの順に配向している前記〔５〕記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔８〕  リコンビナーゼ認識配列がリコンビナーゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰのＤＮＡ配列である前記〔４〕から前記〔７〕のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔９〕  動物細胞で働く複製起点がウイルス由来又は動物細胞由来のものである前記〔４〕から前記〔８〕のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔１０〕  動物細胞で働く複製起点がパポバウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、及びパルボウイルス由来のものからなる群より選ばれるものである前記〔９〕記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔１１〕  プロモーターおよびポリＡが、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）である前記〔１〕〜前記〔１０〕のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡウイルスベクター、
〔１２〕  プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクター、並びに二つのリコンビナーゼ認識配列及びその間に動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列を有する動物細胞感染用の組換えＤＮＡウイルスベクターを動物細胞に感染させ、二つのリコンビナーゼ認識配列間に存する動物細胞で働く複製起点、プロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配列を環状分子として切り出し、細胞内で自律複製させることによる外来遺伝子の細胞内導入法、
〔１３〕  ＤＮＡウイルスベクターがいずれもアデノウイルスベクターである前記〔１２〕に記載の外来遺伝子の細胞内導入法、並びに
〔１４〕  遺伝子治療に際して、前記〔１２〕又は〔１３〕記載の細胞内導入法を用いることを特徴とするヒト遺伝子の細胞内導入法、
が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例、参考例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら編、第２版（１９８9 ）、Cold Spring Harbor Laboratory 」に記載の方法に準じて行った。また、ＤＮＡ制限酵素および修飾酵素は、宝酒造、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社から購入し、製造者指示書に従って使用した。
【００３７】
実施例１
＜リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子およびＣＡＧプロモーターを有する組換えアデノウイルスベクターの作製＞
（１）リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現用カセットコスミドの作製
（ｉ）  リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ（ＡＴＣＣ１１３０３−Ｂ２３）をテンプレートとし、５’−プライマーとして下記の（配列番号：１）のオリゴヌクレオチドを、３’−プライマーとして下記の（配列番号：２）のオリゴヌクレオチドを、耐熱性ポリメラーゼとしてＮＥＢ社製のＶｅｎｔR を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行い、生成物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１ｋｂのバンドを切り出し、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
5'-CGT  CTGCAG TGCA TCATGA GTAATTTACTGACCGTACACCAAAATTTGCCTGC-3'
PstI        BspHI
3'-GACCTTCTACCGCTAATCGGTAAT TCGCGAGATCT CGG-5'
Aor51HI;XbaI
（下線部分は、制限酵素の認識部位である。）
【００３８】
ＰＣＲ反応条件
緩衝液：  １０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２ｍＭのＭｇＳＯ4 、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＮＥＢ社添付の緩衝液を使用）
耐熱性ポリメラーゼ：  ２ユニット
ｄＮＴＰ：  ４００μＭ
プライマー：  １μＭ
Ｐ１ファージＤＮＡ：  １ｎｇ
２本鎖解離温度：  １．５分間
アニーリング温度：  １．５分間
伸長反応温度：  ２．０分間
反応サイクル：  ２０回
【００３９】
この断片およびｐＵＣ１９（宝酒造製）をそれぞれ制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造製製）およびＸｂａＩ（宝酒造製）により同時消化したのち、回収し、モル比が約３：１になるように混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）を用いてligation  反応を行った。さらに、この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転換株を拾い、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＣｒｅを得た。
【００４０】
次に、細胞工学、１３、７６０〜７６３（１９９４）に記載の方法により調製したＣＡＧプロモーターを含むカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔをＳｗａＩで切断したもの１μｇと、ｐＵＣＣｒｅをＰｓｔＩおよびＸｂａＩにより同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）により両端を平滑化して得た約１ｋｂの断片０．１μｇとを混合した。
ここに、ＣＡＧプロモーターとは、高発現ベクターとして特開平３−１６８０８７号公報に開示されているものであり、その調製は、同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行および２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，ＨｉｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発明に利用することができる。
【００４１】
（ｉｉ）  次に、混合液にエタノールを加えてコスミドを沈澱させた。沈澱物を遠心分離により取得し、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液（ＴＥ）の５倍希釈液に溶解した。
（ｉｉｉ）  得られたコスミドをリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中でＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量７μｌで一晩結合させた。ついで滅菌水、ＳｗａＩ反応ｂｕｆｆｅｒを加えて４８μｌとしてから７０℃１０分でリガーゼを熱失活させた。
この際、プラズミドと異なり、コスミドでは、環状ではなく直鎖状タンデムに結合した巨大分子が効率よくパッケージされる。
【００４２】
（ｉｖ）  ２μｌのＳｗａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）を加え、２５℃で１時間切断した。
ＳｗａＩ切断を行う意味は、カセットコスミドが発現ユニットをくわえ込むことなく再結合するとＳｗａｌ認識配列が再生されるため、このステップで発現ユニットの組み込まれていないコスミドを再切断し、コロニーを作らなくするためである。この方法はインサートをもつカセットコスミドだけを選択する強力な方法である。
（ｖ）  常法（Molecular Cloning vol.3 E.34）に従い、カセットコスミドのフェノール抽出、遠心分離、ついでゲル濾過を行った。
（ｖｉ）  再度、Ｓｗａｌ切断を行った。即ち、ＳｗａＩ反応ｂｕｆｆｅｒ中、５μｌのＳｗａＩを加え、２５℃で２時間切断した。その理由は上記の通りである。
【００４３】
（ｖｉｉ）  得られたコスミドの１μｌについてイン・ビトロ・パッケージングを行った。
即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を１／４スケールで用い、残りは−８０℃に凍結した。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなったコスミドをある程度選択することができる。本実験では、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的の向き（左向き）のクローンを容易に得ることができた。
コスミドの扱い方については、常法（斎藤  泉他、実験医学：７：183-187, 1989)に従って行った。
【００４４】
（ｖｉｉｉ）  パッケージングされたコスミドをＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）に感染させた。
即ち、３枚のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌのＡｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。
ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、全酵素切断によりインサートが入ったものの割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍｌのＡｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製した。
（ｉｘ）  次に、制限酵素切断により、発現ユニットの向きと構造を確認した。
なお、ＮｒｕＩとリガーゼを用いて、発現単位を含むが大部分のアデノウイルスＤＮＡを欠失したプラスミドを作製し、ＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡクローン化の最終確認をした。
【００４５】
（２）アデノウイルスＤＮＡ−蛋白複合体（Ａｄ５  ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製
（ｉ）  アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５  ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985))を用いた。Ａｄ５  ｄｌＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ  １０本分）に感染させ、培養を行った。
即ち、Ａｄ５−ｄｌＸのウイルス液（〜１０9 ＰＦＵ／ｍｌ）を０．２ｍｌ／Ｒｏｕｘ感染させ、３日後に、はがれた細胞を１５００ｒｐｍ、５分にて遠心分離して集めた。アデノウイルス粒子のほとんどはメディウム中ではなく細胞の核内にいるので感染細胞からウイルスを精製できる利点がある。（以下の操作は非無菌的に行った。）
【００４６】
（ｉｉ）  得られた細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の２０ｍｌに懸濁し、密封型ソニケーターを用い、２００Ｗ、２分（３０秒×４）で細胞を破砕し、ウイルスを細胞内から放出させた。
ウイルスを細胞内から放出させるには５ｍｌ以下なら凍結融解５回でもよいが、それ以上の容量ではソニケーターが便利である。ただし、必ず密封型（専用カップのあるもの）を用いる。通常の投げ込み型は、たとえ安全キャビネットの中でも危険性がある。
【００４７】
（ｉｉｉ）  得られた破砕物を遠心分離（１０ｋｒｐｍ、１０分）により沈澱を除いた後、超遠心機  ＳＷ２８チューブに１５ｍｌの塩化セシウム溶液（比重１．４３）を入れ、その上に上清を重層し、クッション遠心（２５ｋｒｐｍ、１時間、４℃）による濃縮を行った。
（ｉｖ）  界面直下のウイルス層をＳＷ５０．１チューブに移した。界面直下のウイルス層は通常目視でき、ウイルス層とその下層の塩化セシウムを５ｍｌ採取した。同時にもう一本に塩化セシウム溶液（比重１．３４）を満たした。
これらを、３５ｋｒｐｍ、４℃で一晩超遠心にかけた。次いで、白いウイルスのバンドを分取し、既に勾配ができたチューブに乗せ替えた。さらに、３５ｋｒｐｍ、４℃４時間以上超遠心にかけた。
【００４８】
（ｖ）  白いウイルスのバンドを分取し、等量の８Ｍ塩酸グアニジンと室温で混合し、４Ｍ塩酸グアニジン飽和塩化セシウムを加えてＶＴｉ６５チューブに満たした。４Ｍ塩酸グアニジンにより、粒子蛋白は変性を受けて解離し、ＤＮＡ−ＴＰＣが放出された。エチジウムブロミドは後で除く方法が確立されていないため利用できなかった。
【００４９】
（ｖｉ）  上記のチューブを、５５ｋｒｐｍ、１５℃で一晩超遠心にかけ、０．２ｍｌずつ分画し、その１μｌずつを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液２０μｌと混合し、蛍光染色することによりＤＮＡの有無を確認した。ＤＮＡを含む２〜３フラクションを集めた。
（ｖｉｉ）  ５００ｍｌのＴＥに一晩透析（２回）し、−８０℃に保存した。こうして得られたＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣの量をＯＤ260 から通常のＤＮＡと同様に算出した。
（ｖｉｉｉ）  得られたＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣを、第３ステップの組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＥｃｏＴ２２Ｉで２時間切断した後、−８０℃に保存した。
【００５０】
なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処理・エタノール沈澱はできなかった。濃縮法は塩化セシウム平衡遠心しかないのでなるべく濃厚状態に保った。１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ−ＴＰＣを得ることができた。
（ｉｘ）  一部を分取し、泳動用ＢＰＢ  ｂｕｆｆｅｒを１０μｌ加えた後に、１μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１０分間反応させて末端蛋白を消化した。フェノール抽出し、上清をアガロースゲル電気泳動で分離し、完全切断を確認した。
ＥｃｏＴ２２Ｉ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素ｂｕｆｆｅｒを、遠心ゲル濾過によって除いた後、分注し−８０℃に保存した。
【００５１】
（３）組換えウイルスの分離と高力価ウイルス液の作製
（ｉ）  １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。
（ｉｉ）  発現ユニットを組み込んだｐＡｄｅｘ１ｗ  ＤＮＡの８μｇ（３〜９μｇが適当である）とＥｃｏＴ２２Ｉで切断したＡｄ５ｄｌＸ  ＤＮＡ−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア社製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カルシウム法でトランスフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続けた。
一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直した。細胞数が各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播いた。
【００５２】
（ｉｉｉ）  ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９３細胞がやせてきたら早めに加えた。
ウイルスが増殖し細胞が死滅したウエルが７〜１５日の間に現れた。ウエルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペットで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチューブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存した。
（ｉｖ）  １５〜１８日で判定は終了した。比較的遅く細胞が死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選び、凍結融解６回後、５ｋｒｐｍ１０分遠心して得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃に保存した。
早めにウイルス増殖が起こったウエルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからである。
【００５３】
（ｖ）  ２４穴プレートに２９３細胞を用意し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。
（ｖｉ）  約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次ウイルス液作製と同様に６回の凍結融解と遠心で上清を得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０℃に保存した。２次ウイルス液の力価は１０7 〜１０8 ＰＦＵ／ｍｌ程度であった。他の１ウエルの死滅した細胞を５ｋｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てて細胞だけを−８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイルス株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌのcell DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの10%SDSを加えた。
【００５４】
（ｖｉｉ）  ５０℃で１時間処理した後、フェノール・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、ついでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。
その１５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列にＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミドカセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのアガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較した。発現ユニット内の切断点からアデノウイルスゲノムの左端までのバンドが正確に出現しているものを選択した。また、説明できないバンドが薄く見えるクローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があるので廃棄した。
アデノウイルスＤＮＡは細胞あたり１０，０００コピーに増殖するので、細胞ＤＮＡと一緒に全ＤＮＡを抽出し制限酵素切断によりウイルスＤＮＡのバンドをみることができる。Ｘｈｏｌなどのように認識配列にＣＧを含む酵素は、細胞ＤＮＡを切断しないので、パターンが見やすい。これ以外の酵素を用いるときは、非感染２９３細胞ＤＮＡをコントロールにおくことが必要であった。（ヒト細胞の反復配列由来のバンドが出現した）。
【００５５】
（ｘｉｉｉ）  Ｘｈｏｌ切断で同定された目的のウイルス株の２次ウイルス液の０．１ｍｌを、コラーゲンコートした１５０ｃｍ2 ボトル（培地は２５ｍｌ）の２９３細胞へ感染させた。
３日後に細胞が死滅したら、死細胞ごと２５ｍｌの培地を無菌的に密閉型ソニケーター２００ｗ最高出力２分（３０秒×４回）で破砕してウイルスを遊離させた。
３ｋｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して沈澱を除去し、５ｍｌ凍結用チューブに２ｍｌずつ１３本に分注し、ドライアイスで急凍して−８０℃に保存し、３次ウイルス液を調製した。３次ウイルス液は本発明の組換えアデノウイルスを含む液であり、１０9 ＰＦＵ／ｍｌ程度の高力価のものであった。
なお、３次ウイルス液５μｌを２４穴プレートの２９３細胞１ウエルに感染し、増殖したウイルスＤＮＡの酵素切断パターンを上記の方法で確認した。もし、欠失ウイルスあるいは親ウイルスとの混合物であることが疑われたら、２次ウイルス液の段階で既にわずかに混在していた欠失ウイルスが増殖が早いため見えてきた可能性があるので、全ての３次シードを廃棄して、別の２次ウイルス液から改めてやり直すか、その１次ウイルス液から限界希釈法により、目的のウイルスを純化した。
【００５６】
参考例
＜本発明の組換えアデノウイルスの簡便力価測定法＞
本発明の組換えアデノウイルスは、以下の方法により、簡便に測定することができる。
（ｉ）  ２９３細胞を１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。
組換えアデノウイルス液（３次ウイルス液）を５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用いて１０-1〜１０-4まで段階希釈する。例えば０．９ｍｌＤＭＥ＋０．１ｍｌウイルス液。チップをすべて替える。
（ｉｉ）  コラーゲンコート９６穴各１枚のすべてのウエルに５０μｌずつ５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを入れる。
第１列目に、１０-4に希釈した組換えウイルスを２５μｌずつ加える。
８ウエル用マルチチャンネルピペットを用いて２５μｌを２列目のウエルに移す。以下同じ操作を１１列目まで繰り返し最後の２５μｌを捨てる。結果として３n の段階希釈列を３11×１０-4まで作製することができる。１２列目は非感染細胞のコントロールとする。
この時用いるチップはその度に替える。
【００５７】
実施例２
＜二つのｌｏｘＰ配列、並びにその間にＳＶ４０の複製起点、ＣＡＧプロモーター、およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）を有する組換えアデノウイルスベクターの作製＞
（１）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）発現用カセットコスミドの作製
（ｉ）  ＨＢｓ  ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＨＢＶａｄｒ４（Fujiyama et. al., Nucleic Acids Res., 11,4601-4610,1983)を制限酵素Ｐｓｐ１４０６ＩおよびＸｈｏＩで同時消化した後、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により両端を平滑化し、アガロースゲル電気泳動により７１０ｂｐの断片を回収した。
【００５８】
（ｉｉ）  ＣＡＧプロモーターの制御下でＨＢｓｃＤＮＡを発現させるための発現ユニットを得るために以下の操作を行った。
ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ(Niwa et. al. Gene、 Vol. 108、 P193-200) のクローン化部位にＳｗａＩリンカーを挿入することにより得たｐＣＡＷＧをＳｗａＩで切断しアルカリホスファターゼ処理を施した。次に、これとＩで得た断片をモル比約１：３で混合しＴ４ＤＮＡリガーゼ反応を行い、反応混液により大腸菌ＤＨＩ株（ＡＴＣＣ３３８４９）を形質転換した。アンピシリンを添加したＬＢ寒天プレートから形質転換体を拾い、ＣＡＧプロモーターの制御下でＨＢｓｃＤＮＡが発現する方向に断片が挿入されたプラスミドｐＣＡＧ・ＨＢｓを得た。
【００５９】
（ｉｉｉ）  ＨＢｓ発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片を得るため、以下の操作を行った。
ｐＣＡＧ・ＨＢｓを制限酵素ＳａｐＩおよびＳａｌＩで同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により３．６ｋｂの断片を回収した。制限酵素ＳｍａＩで切断した後アルカリホスファターゼ処理を施したｐＵＣ１８（宝酒造製）と３．６ｋｂ断片をモル比約１：３で混合しligation反応を行い、目的とするプラスミドｐＵＣ１８ＣＡＨＢｓＳを得た。
【００６０】
（ｉｖ）  次にＨＢｓ発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を付加するため以下の操作を行った。
ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計されているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配列番号：３）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得た。
5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCGAGTCG-3'
3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGCTCAGC-5'
（下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
上記の（ｉｉｉ）で得られたｐＵＣ１８ＣＡＨＢｓＳを制限酵素ＳａｌＩおよびＥｃｌ１３６IIで同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により３．６ｋｂの断片を回収した。ｐＵＬＬ２ｒを制限酵素ＮｒｕＩで切断しアルカリホスファターゼ処理を施した後、３．６ｋｂ断片とのligation反応を行い目的とするプラスミドｐＵＬＣＡ・ＨＢｓＳを得た。
【００６１】
（ｖ）  ＨＢｓ発現ユニットおよびＳＶ４０の複製起点を含むＤＮＡ断片の両端にｌｏｘＰ部位を有する断片を含む組換えコスミドを得るため次の両ＤＮＡを調製した。
（ａ）ｐＵＬＣＡ・ＨＢｓＳを制限酵素ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで同時消化し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により両端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により回収した３．７ｋｂの断片０．３μｇ。
（ｂ）制限酵素ＳｗａＩで切断したｐＡｄｅｘｌｃｗ（細胞工学、１３、７６０−７６３、（１９９４））１μｇ。
両者を混合し、実施例１の（１）（ｉｉ）〜（ｉｘ）と全く同様の操作により目的とする組換えコスミドを得た。
さらに実施例１の（２）〜（３）と同様な操作により、目的の、二つのｌｏｘＰ配列、並びにその間にＳＶ４０の複製起点、ＣＡＧプロモーター、およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）を有する組換えアデノウイルスベクターＡｄｅｘｌＬＣＡＨＢｓＳＬを得た。
【００６２】
実施例３（感染実験）
ＣＯＳ−１細胞またはＣＶ−１細胞を、６ｃｍシャーレのほぼ底面を覆う程になるまで培養する。
実施例１および実施例２で得られたアデノウイルスベクターのそれぞれを、m.o.i.＝５で下記のプロトコールに従って１時間吸着させた。
３日後にハーベストしてサザン解析した。
即ち、組換えアデノウイルスベクターＡｄｅｘｌＬＣＡＨＢｓＳＬは、約６．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を有し、また、リコンビナーゼＣｒｅによりｌｏｘＰ部位で切断されると３．５ｋｂの環状分子となる。この環状分子はＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を１箇所有するので、感染後ハーベストしたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで処理して電位泳動にかけ、サザンブロットを行った。プローブは、ＨＢｓフラグメント（７１０ｂｐ）を用いた。
その結果を図１に示す。
【００６３】
図１から明らかなように、実施例１および実施例２で得られたアデノウイルスベクターの組み合わせで感染させた場合のみ、環状分子のＨｉｎｄＩＩＩ切断により生じる３．５ｋｂの線状ＤＮＡが観察された（レーン４およびレーン８）。  また、実施例２で得られたアデノウイルスベクターとリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を有しないアデノウイルスベクターとを感染させた場合（レーン３およびレーン７）は、３．５ｋｂのバンドは認められず、ＡｄｅｘｌＬＣＡＨＢｓＳＬからＨｉｎｄＩＩＩによって切り出されて生ずる６．０ｋｂのバンドのみが認められる。
【００６４】
さらに、レーン７とレーン８のバンドの濃度の比較から、環状分子がＣＯＳ−１細胞内で約４０倍に複製されたことが分かる。一方、レーン３とレーン４のバンドの濃度がほぼ同程度であることから、ＣＶ−１細胞内では、環状分子は複製されないことが分かる。これは、ＳＶ４０由来の複製起点がＣＶ−１細胞内では働かない事実と合致する。
以上の結果は、実施例１および実施例２で得られた本発明のアデノウイルスベクターの組み合わせを用いて動物細胞に感染させることにより、二つのリコンビナーゼ認識配列に挟まれた部分が細胞内で切り出され、環状分子を形成し、かつ細胞内で自律複製することを明らかに証拠づけるものである。
【００６５】
なお、上記の感染実験は以下のように行うのが便宜である。
培地の血清がＦＣＳでない場合（例えばＣＳ）は、培養細胞を無血清の培地で２度を洗い培地を除く。
ウイルス液（無血清またはＦＣＳ添加の培地で希釈）を、以下の操作中に細胞面が乾いてしまわない程度に加える。９６穴で３０〜４０μｌ、２４穴で５０〜７０μｌ、１０ｃｍシャーレで１００〜２００μｌくらいであるが、ウイルス液を加える前の培地を意図的に少し残しておき、ウイルス液を加えて、この程度の容量にする方が実際的である。
プレートを数回、シーソーのように数秒周期で振ることにより、ウイルス液を細胞にまんべんなくいきわたらせる。この操作を２０分ごとに３回行う。この間、細胞はＣＯ2 インキュベートにおく。
３回目の操作が終わった後に（感染１時間後）、培養液を通常量加えて、通常のように培養する。感染時間は通常１時間、長くても２時間程度で充分である。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明により、広範な動物細胞において自律複製可能な形で外来遺伝子を動物細胞に導入することのできる組換えＤＮＡウイルスベクターを提供することができる。また、本発明はこの組換えＤＮＡウイルスベクターの簡易な製造方法を提供する。特に、本発明の組換えアデノウイルスベクターは遺伝病の治療に有用である。
【００６７】
配列表
配列番号：１
配列の長さ：５３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意のＤＮＡ）
ハイポセティカル配列：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
CGTCTGCAGT GCATCATGAG TAATTTACTG ACCGTACACC AAAATTTGCC TGC      53
【００６８】
配列番号：２
配列の長さ：３８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意のＤＮＡ）
ハイポセティカル配列：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
GGCTCTAGAG CGCTTAATGG CTAATCGCCA TCTTCCAG                       38
【００６９】
配列番号：３
配列の長さ：５２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意のＤＮＡ）
ハイポセティカル配列：ＹＥＳ
アンチセンス：ＮＯ
起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を決定した方法：Ｓ
配列
CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG       52
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、各種の組換えアデノウイルスベクターの組み合わせを用いてＣＯＳ−１細胞またはＣＶ−１細胞に感染させた後回収されたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで処理し、電気泳動により分画し、サザンブロットで解析した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００７１】
Ｍ  マーカー
１  ＣＶ−１細胞に、培地のみを添加した対象区
２  ＣＶ−１細胞に、Ｅ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域を欠失させ、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイルスベクターと実施例１で調製したリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とＣＡＧプロモーターとを組み込んだ組換えアデノウイルスベクターとを感染させた区
３  ＣＶ−１細胞に、Ａｄｅｘ１ＬＣＡＨＢｓＳＬ（実施例２で調製したもの）とＥ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域を欠失させ、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイルスベクターとを感染させた区
４  ＣＶ−１細胞に、Ａｄｅｘ１ＬＣＡＨＢｓＳＬ（実施例２で調製したもの）と実施例１で調製したリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子とＣＡＧプロモーターとを組み込んだ組換えアデノウイルスベクターとを感染させた区
５  ＣＯＳ−１細胞に、１と同様な処理を施した区
６  ＣＯＳ−１細胞に、２と同様な処理を施した区
７  ＣＯＳ−１細胞に、３と同様な処理を施した区
８  ＣＯＳ−１細胞に、４と同様な処理を施した区
【図１】
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【配列表】
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