(57)【要約】【課題】  発がん物質スクリーニングのためのDNAプローブを含むプローブ・プレート、その製造方法および該プローブ・プレートを用いるcDNAのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  本発明のDNAプローブ・プレート１０は、基板１２と、該基板上に付着したオリゴヌクレオチドを含むスポット１４とを有するプローブ・プレートであって、オリゴヌクレオチドは、5′末端および3′末端が、G（グアニン）、C（シトシン）、または5′末端および3′末端を含む２個の塩基配列がGG、GC、CG、CCの塩基構造である。また、本発明は、DNAプローブ・プレートの製造方法および該プローブ・プレートを用いるcDNAのスクリーニング方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板上に付着したオリゴヌクレオチドを含むスポット・アレイとを有するプローブ・プレートであって、前記オリゴヌクレオチドは、5′末端および3′末端が、G（グアニン）、C（シトシン）、または5′末端および3′末端を含むそれぞれ２個の塩基配列がGG、GC、CG、CCの塩基構造であることを特徴とする、プローブ・プレート。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、塩基鎖長が40-47merである、請求項１に記載のプローブ・プレート。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドは、発がん性に関与する遺伝子から選択される固有オリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載のプローブ・プレート。
【請求項４】
複数のオリゴヌクレオチド・スポットからなるスポット・アレイと、基板とを含むプローブ・プレートの製造方法であって、
オリゴヌクレオチドを固定する処理が行われた基板に、5′末端および3′末端が、G（グアニン）、C（シトシン）、または5′末端および3′末端を含むそれぞれ２個の塩基配列がGG、GC、CG、CCの塩基構造であるオリゴヌクレオチドの複数のスポットを形成させる段階と、
前記スポットを固定化する段階と、
を含むプローブ・プレートの製造方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、塩基鎖長が40-47merである、請求項４に記載のプローブ・プレートの製造方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、発がん性に関与する遺伝子から選択される固有オリゴヌクレオチドである、請求項４または５に記載のプローブ・プレートの製造方法。
【請求項７】
基板と、該基板上に付着したオリゴヌクレオチドを含むスポット・アレイとを有するプローブ・プレートであって、前記オリゴヌクレオチドは、5′末端および3′末端が、G（グアニン）、C（シトシン）、または5′末端および3′末端を含むそれぞれ２個の塩基配列がGG、GC、CG、CCの塩基構造であるプローブ・プレートを使用し、該プローブ・プレートに対して蛍光標識したcDNAをハイブリダイズさせ、蛍光パターンを検出することにより前記プローブ・プレートに対する前記標識したcDNAのハイブリダイズ性を判断する、cDNAスクリーニング方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは、発がん性に関与する遺伝子から選択される固有オリゴヌクレオチドである、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAプローブを利用するプローブ・プレートに関し、より詳細には、発がん性物質の高精度スクリーニングを可能とするオリゴヌクレオチドをDNAプローブとして用いるプローブ・プレート、その製造方法、および該プローブ・プレートを用いるcDNAのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医薬品の安全性については、一般薬理試験、薬効試験、単回投与毒性試験、反復投与毒性試験、生殖発生毒性試験、各種メカニズム確認試験、変異原性試験、ガン原性試験、二段階発ガン性試験、トランスジェニック・マウスを用いる短期発ガン性試験などにより、検討が行われている。
【０００３】
上述した従来の発がん性物質の安全性検査では、ラット・マウスといった動物を1群50匹とし、化学物質投与群と非投与群（対照群）として2年間飼育し、2年半後に解剖してガンの発生を病理学的に検査する方法が用いられている。この他にも、（バクテリア変異原生試験＋小核試験＋染色体異常試験）の3つを組み合わせて、DNAの損傷を調べる方法が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−２７６７７９号公報
【特許文献２】特開２００１−２９２７６７号公報
【特許文献３】特開２００３−１４４２００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した各種の方法は知られているものの、従来の化学物質の安全性を調べる長期動物発がん試験は、施設・動物・人件費を加えると、膨大な費用を要する。また、そのための期間は、数年間を要し、試験できる化学物質の数が制限されてしまうといった不都合がある。また、上述した（バクテリア変異原生試験＋小核試験＋染色体異常試験）の3つを組み合わせた試験は、比較的短期間で試験できるものの、治験化合物を、必ずしもがん原性物質と判断することができない場合もあることが知られて来ている。
【０００６】
また、近年では、DNAを基板に列状に付着させた、所謂、DNAマイクロアレイが提案され、例えば、特開平１０−２７６７７９号公報（特許文献１）、特開２００１−２９２７６７号公報（特許文献２）、特開２００３−１４４２００号公報（特許文献３）において各種の検査を行うことが開示されている。
【０００７】
上述したDNAマイクロアレイは、DNAプローブを極めて多数種使用した大集積DNAマイクロアレイとして実用化されており、例えば、Affymetrix社から市販されているGenechip_Mouse Expression Array430Aなどの１万種類以上の遺伝子を搭載したDNAマイクロアレイが知られている。しかしながら、このような大集積DNAマイクロアレイは、高価であること、およびその解析のためにかなりの時間が必要とされること、および発ガン性物質による影響を受けないプローブも含まれることから、充分に効率化を達成することができないといった不都合があった。
【０００８】
本発明は、上記従来技術の不都合を解決するためになされたものであり、本発明は、発ガン物質スクリーニングのための高感度DNAマイクロアレイとして使用することができるプローブ・プレートを提供することを目的とする。
【０００９】
すなわち、本発明の目的は、発がん性物質に対して高い選択を与えるオリゴヌクレオチドのみを選択してDNAマイクロアレイとして低コスト・短時間で試験可能なプローブ・プレートを作成する。本発明のプローブ・プレートは、標識されたcDNAと高感度にハイブリダイゼーションし、スクリーニングの高感度化・高効率化・低コスト化を実現する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を加えた結果、これまで発ガンに関与している可能性が報告されている遺伝子とその近縁の遺伝子から特定の末端構造を有するオリゴヌクレオチドをDNAマイクロアレイとしたプローブ・レートを使用することで、発ガン物質のスクリーニングを迅速に、且つ高効率・低コストに行うことができることを見出し、本発明に至ったものである。
【００１１】
本発明の上記目的は、本発明のプローブ・プレート、およびその製造方法、およびcDNAのスクリーニング方法を提供することにより達成される。
【００１２】
すなわち、本発明の請求項１の発明によれば、基板と、該基板上に付着したオリゴヌクレオチドを含むスポット・アレイとを有するプローブ・プレートであって、前記オリゴヌクレオチドは、5′末端および3′末端が、G（グアニン）、C（シトシン）、または5′末端および3′末端を含むそれぞれ２個の塩基配列がGG、GC、CG、CCの塩基構造であることを特徴とする、プローブ・プレートが提供される。
【００１３】
本発明の前記オリゴヌクレオチドは、塩基鎖長が40-47merである。前記オリゴヌクレオチドは、発ガン性に関与する遺伝子から選択される固有オリゴヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、複数のオリゴヌクレオチド・スポットからなるスポット・アレイと、基板とを含むプローブ・プレートの製造方法であって、オリゴヌクレオチドを固定する処理が行われた基板に、5′末端および3′末端が、G（グアニン）、C（シトシン）、または5′末端および3′末端を含むそれぞれ２個の塩基配列がGG、GC、CG、CCの塩基構造であるオリゴヌクレオチドの複数のスポットを形成させる段階と、前記スポットを固定化する段階と、
を含むプローブ・プレートの製造方法が提供される。
【００１５】
本発明の前記オリゴヌクレオチドは、塩基鎖長が40-47merである。前記オリゴヌクレオチドは、発がん性に関与する遺伝子から選択される固有オリゴヌクレオチドである。
【００１６】
本発明のさらに別の態様によれば、基板と、該基板上に付着したオリゴヌクレオチドを含むスポット・アレイとを有するプローブ・プレートであって、前記オリゴヌクレオチドは、5′末端および3′末端が、G（グアニン）、C（シトシン）、または5′末端および3′末端を含むそれぞれ２個の塩基配列がGG、GC、CG、CCの塩基構造であるプローブ・プレートを使用し、該プローブ・プレートに対して蛍光標識したcDNAをハイブリダイズさせ、蛍光パターンを検出することにより前記プローブ・プレートに対する前記標識したcDNAのハイブリダイズ性を判断する、cDNAスクリーニング方法が提供される。
【００１７】
前記オリゴヌクレオチドは、発がん性に関与する遺伝子から選択される固有オリゴヌクレオチドである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、特定種類の塩基配列構造を有するオリゴヌクレオチドを使用することにより迅速に発がん性物質のスクリーニングを行うことが可能となり、発がん性物質のスクリーニングの著しい効率化・高速化および低コスト化を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を図面に示した実施の形態をもって説明するが、本発明は、図面に示した実施の形態の限定されるものではない。
【００２０】
＜セクションＡ＞プローブ・プレート
図１は、本発明のプローブ・プレートの概略を示した図である。本発明のプローブ・プレート１０は、基板１２と、基板１２上にアレイ状に付着したオリゴヌクレオチドの複数のスポット１４とを含んでいる。基板１２は、ガラス基板またはシリコン基板を使用することができ、本発明で使用する基板１２は、オリゴヌクレオチドの結合性を高めるため、アミノシラン処理、ポリカルボジイミド処理、Poly-L-Lysine処理などの処理を施すことができる。このような基板としては、例えば、松浪ガラス株式会社、日清紡績株式会社（日清紡）、Geneslide社、Clonetech社、Full Moon BioSystems社などから市販され、紫外線照射によりオリゴヌクレオチドを固定化可能な基板を使用することができる。
【００２１】
また、各スポット１４は、スポット径が100〜300μｍとされ、スポットのピッチは、200μｍ程度とされる。本発明の特定の実施の形態では、各スポット１４は、14行×14行がそれぞれサブブロックとして構成され、4つのサブブロックで、１つのブロックを構成させる。さらに、本発明の特定の実施の形態では、１つのプローブ・プレート上には、3つのブロック（12サブブロック）として形成することができる。
【００２２】
本発明において、オリゴヌクレオチドは、ライブ細胞から取得する方法、DNA合成装置により合成する方法など種々の方法により入手することができる。しかしながら、比較的大量に特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを入手するためには、合成装置を使用して製造されたオリゴヌクレオチドを用いる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、Invitrogen Co. (Yokohama, Tokyo)により合成され、指定した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００２３】
オリゴヌクレオチドを基板１２上にマイクロスポットとして付着させるために、種々の方法を使用することができる。本発明では、例えば、RIKENArrayer（特開２００３−０５７２３６号公報に記載の装置）を使用することにより、所定のオリゴヌクレオチドのサンプルを基板上に正確に配置させることができる。
【００２４】
基板１２に付着したオリゴヌクレオチドは、基板１２に対し、基板１２上にコーティングしたコーティング剤の種類に応じて適切な固定化方法により固定化される。多くの場合、固定化のためには紫外線照射による光化学反応を利用して、変成または未変成のオリゴヌクレオチドの適切なサイトを、コーティング剤の反応サイトに結合させることにより固定化が行われる。その後、オリゴヌクレオチドを付着させたプローブ・プレートは、真空下、低温で保管される。
【００２５】
＜セクションＢ＞オリゴヌクレオチドのスクリーニングおよびプローブ・プレート化
本発明においてプローブ・プレートに使用するオリゴヌクレオチドは、次のようにしてスクリーニングすることができる。まず、これまで発がんに関与している可能性が報告されている遺伝子約200種類をリストアップし、さらに市販のDNAマイクロアレイ（Affymetrix Green chip U74v2)で使用されていた遺伝子45種類を加えて、239種類の遺伝子を選択する。この他、housekeeping遺伝子約10種類と、陰性対照DNAプローブとして3種類の植物由来の遺伝子を含むDNAを選択することができる。
【００２６】
選択された遺伝子について、遺伝子データベース(National Center for Biotechnology Information:NBCI:http://www/ncbi.nlm.gov)を参照して40-47merのオリゴヌクレオチド・シーケンスを抽出する。ヌクレオチド・シーケンスの抽出は、下記の条件で行なう。
（１）5′末端および3′末端が、GまたはCであるか、または5′末端および3′末端のそれぞれの２つの塩基が、GG、GC、CG、CCを含むこと、
（２）A（アデニン）、T（チミン）、C（シトシン）、G（グアニン）の各塩基が偏在しないこと、
（３）NCBIの検索ソフトウェアであるBLASTを用いた検索で、他の遺伝子において部分配列として含まれていないこと、
である。（１）は、プローブ・プレートとした後にハイブリダイゼーションさせる際、ハイブリダイゼーションの効率を高めるものであり、（２）は、特定塩基が主要な構成塩基となることによる塩基配列の多様性を確保するためであり、（３）は、発がん性に関与している遺伝子に特徴的な、固有の部分配列を抽出するためである。
【００２７】
図２には、本発明において使用したDNAのスクリーニング・プロセスについての概略を示す。図２に示すように、まず、発ガンに関与している可能性が報告されている遺伝子から、40-47merのオリゴヌクレオチド・シーケンス（部分配列）を抽出する（ブロック１００）。このとき、末端がGまたはCであるDNAであって、特定の塩基が主要な塩基となっていない部分配列を選択する。この場合の基準としては、4種類の塩基は、統計的には40-47merの部分配列には10個から12個出現するので、4種類の塩基のうち少なくとも1種が1つ以上、より具体的には、少なくとも1種類の塩基が5個以上、２０個以下の範囲で含まれていること、および末端がGまたはC、または各末端のそれぞれ２つの塩基配列がGG、CG、GG、CCであることを基準として選択することができる。
【００２８】
本発明において、末端がGまたはCであるDNAをDNAプローブとして使用する理由は、塩基対G-Cは、三本の水素結合を生成するので、2本の水素結合を生成するA-T間よりもG-C間では強固な水素結合が生成されることから、本発明のスクリーニング方法で使用する標識cDNAのハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリダイゼーションに際して、標識cDNAが固有オリゴヌクレオチドから構成されるDNAプローブとのハイブリダイゼーション可能距離内に接近した場合に、cDNAを効率的に捕捉することを可能とすることで、検査効率を高めることが期待されるためである。
【００２９】
その後、選択された部分配列が、他の遺伝子の部分配列として含まれていないことをBLAST検索エンジンを使用して確認し、もし、選択した部分配列が他の遺伝子の完全な部分配列となっている場合には、他の部分配列を選択してBLAST検索により他の遺伝子との重複がない部分配列を特定する（ブロック２００）。そして、再度、BLAST検索を使用して他の遺伝子配列の部分配列となっていないことが確認された段階で、選択されたオリゴヌクレオチドを、本発明のプローブ・プレートに使用するDNAプローブに使用されるオリゴヌクレオチドとして選択する（ブロック３００）。
【００３０】
本発明において、プローブ・プレートを作成する場合には、スクリーニングしたオリゴヌクレオチドを合成して用いる。得られたオリゴヌクレオチドは、セクションＡで説明した方法によりプローブ・プレートを作成するために使用される。
【００３１】
＜セクションＣ＞プローブ・プレートを使用したcDNAのスクリーニング方法
本発明のプローブ・プレートを使用する発がん物質の検査は、発がん性物質を投与したラット・マウスなどの実験動物と、対照群とした実験動物とを、所定の期間、例えば4時間、20時間、14日間、28日間で飼育する。治験期間期間終了後、実験動物からmRNAを公知の方法、例えばC. Furihata et. al., “Differentially expressed MHC Class II-associated invariant chain in rat stomach pyloric mucosa with N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine exposure”, Cancer Res. Vo. 57, 1416-1418 (1997)に記載した方法にしたがって分離し、逆転写酵素でcDNAとした後、それぞれCy3およびCy5で標識してCy3-cDNAとCy5-cDNAを生成する。
【００３２】
その後、本発明にしたがい作成したプローブ・プレートに対して標識cDNAをハイブリダイズさせて、スキャナーで蛍光を測定する。得られた蛍光パターンは、その蛍光強度分布から発現遺伝子のprofileを作成し、発がん性物質の生体遺伝子への影響を判断することにより発がん性についての検討を行なう。発現遺伝子のprofileデータは、さらに、entropy measures (J. R. Quinlan,:C4/5: Programs for Machine Learning: Morgan Kaufman Publishers Inc., San Francisco, USA, 1993)およびK-means methodおよびneural network (M. H. Dunham: DATA MINING Introductory and Advanced Topics: Prentice Hall, New Jersey, 2003)の方法により解析することができ、詳細遺伝子発現データを得ることができる。なお、より詳細な解析については、本発明はその要旨とするものではないので、これ以上の詳細な説明は行わない。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を具体的な実施例に基づいて説明するが、本発明は、後述する実施例／実験例に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例）
１．実験動物
週齢８週のオスのB6C3F1/Crjマウスを、Charles River社 (Yokohama, Japan)から購入した。実験動物を、プラスチック製のかご内で、23±2℃、55±5％で12時間周期で明／暗サイクルの環境で飼育した。飼料(Oriental MF, Oriental Yeast Co. Tokyo)および水を適宜与えた。
【００３５】
２．発がん物質
7種類の発がん物質、1種類の発がんプロモーターおよび非発がん性毒性物質としてエタノール（EtOH）を使用し、合計9種類の化合物について検討した。使用した化合物は、dimethylnitrosoamine (DMN)、diethylnitrosoamine (DEN)、dipropylnitrosoamine (DPN)（以上、東京化成工業株式会社、Tokyo, Japan製)、ethylnitrosourea (ENU)（ナカライテスク株式会社、 Kyoto, Japan製)、 dibenzo-[a,l]pyrene (DBP)(Supleco Inc., Bellefonte, PA, USA製)、7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA: Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA製)、o-aminoazotoluene(AAT)、phenobarbital sodium (PB)、エタノール（以上、和光純薬株式会社、Osaka, Japan製)である。実験対照群にはそれぞれの溶媒を投与した。
【００３６】
３．化合物の投与
各治験化合物および対照溶媒（蒸留水、オリーブオイルまたは生理食塩水）を、週齢9週のマウスの治験群（5匹）に腹腔内投与した。化合物の投与量および溶媒を、下記表１に示す。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
対応する対照群のマウスには、それぞれの溶媒のみを、同様に腹腔内投与した。それぞれの群のマウスの肝臓を4時間（4h）、20時間（20h）、14日（14d）、28日（28d）後に切除し、試料として直ちに冷凍し、検査するまで−80℃で保存した。なお、遺伝子毒性を有する発がん物質の投与量は、トランスジェニック・マウス(MutaMouseまたはBiG Blue mice)における突然変異を生じさせる用量を選択した(T.Suzuki et. al., “Initial experience and future directions for transgenic mouse mutation assays”, Mutat. Res. 307, pp.489-494, (1994); X. Wang et. al., “Specific mutational spectrum of dimethylnitrosoamine in the lacI transgene of BiG. Blue C57BL/6 mice”, Mutagenesis, 13, pp. 625-630 (1998); T. Suzuki et. al., “Target organ time-course in the mutagenicity of five carcinogens in MutaMouse: a summary report of the second collaborative study of the transgenic mouse mutation assay by JEMS/MMS”, Mutat. Res. 444, pp. 259-268 (1999); A. Kohara et. al., “Mutation spectrum of o-aminoazotoluene in the cII gene of lamda/LaCZ transgenic mice (MutaMouse)”, Mutat. Res. 491, pp. 211-220 (2001))。また、PBおよびEtOHの投与量は、致死量の1/2（1/2 LD50)とした。
【００３９】
４．mRNAの分離
治験群および対照群のそれぞれ5匹のマウスの肝臓の冷凍右葉を、直接TRIzol試薬(Invitrogen Corp. CA, USA)に浸漬して解凍し、氷冷下で、2minホモジェナイズして、C. Furihata et. al., “Differentially expressed MHC class II-associated invariant chain in rat stomach pyloric mucosa with N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine exposure”, Cancer Res. Vo. 57, 1416-1418 (1997)に記載された方法にしたがって、total RNAを分離した。また、リアルタイムPCR用にはtotal RNAを、Isogen-LS(Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan）で、さらに精製を行った。
【００４０】
OliGotex-dT30(Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan)を用いてtotal RNAからmRNAを分離した。RNAは、溶液における260nmの吸収に基づいて定量し、RNAの品質を、260nm:280nmの吸収比を測定することによって確認し、アガロース変成ゲル上で28S RNAと 18S RNAが分解していないことを確認した。
【００４１】
５．プローブ・プレートの製造
添付する表2〜表7に、本発明において使用したDNAプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。表2〜表7には、NCBIデータベースを使用して決定したDNAのAccession No.と、遺伝子の名称（由来）と、その塩基配列（プライマー配列）とをそれぞれ示す。また、陰性対照遺伝子として、植物遺伝子である、クロロフィルa/b結合タンパクであるA.thaliana Gene (LHCP AB 140)、Gossypium hirsutum Cellulose synthase (celA2)mRNA、およびクロロフィルのphotosystem II結合タンパクのA.thaliana Lhb1B2遺伝子のそれぞれ40-47merのプローブを、cds領域から選択した。また、Sequence Listingには、表2〜表7に示したオリゴヌクレオチド配列をリストする。表2〜表7およびSequence Listingの配列番号は、それぞれ対応させて表示してある。その後、それぞれについてBLAST検索(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov)を行い、重複性を排除し、固有のオリゴヌクレオチドを決定した。決定した40-47merのオリゴヌクレオチドを、Invitrogen社（Invitrogen Japan KK., Tokyo, Japan)から入手した。
【００４２】
得られたオリゴヌクレオチド50μMをポリカルボジイミドでコーティングしたスライド・ガラス(CarboStation-U, Nisshinbo Ind., Inc., Tokyo, Japan)上に、RIKEN arrayerを使用してスポットした。オリゴヌクレオチドのマイクロアレイを、3ブロックから構成させた。各ブロックは、4つのサブブロックから構成し、各サブブロックを、14行×14列のスポットから構成し、トータルで2184スポットのDNAマイクロアレイとして構成させた。スポットしたマイクロアレイを、再水和し、ＵＶクロスリンカー(CL-100, 600mJ/cm2)を使用して100μJ/cm2で固定化し、MilliQWaterで洗浄した。実験のごとに48枚のプローブ・プレートを作成し、作成したプロープ・プレートを、使用するまで真空下、４℃で保存した。
【００４３】
得られたマウス由来のmRNA (1ｇ)を、CyScribe cDNA post labeling kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)を用いて蛍光ラベルした。すなわちmRNAを逆転写酵素によって逆転写してcDNAを生成した。この時にamino allyl dUTPを取り込ませてamino allyl dUTP-modified cDNAとした。GFX columnを通して過剰の試薬を除去してamino allyl dUTP-modified cDNAを単離した。次にCyDye溶液と混ぜてamino allyl dUTPをCyDyeで蛍光ラベルした。通常、治験群はCy3で対照群はCy5でラベルした。再度GFX columnを通して過剰の試薬を除去してCyDye-labeled amino allyl dUTP-modified cDNAを単離した。治験群と対照群のプロダクトを約１：１で混合した溶液（150μｌ）を、Gene Tac Hybridization Station (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI, USA)を使用して、55℃で約16時間、プローブ・プレート上に固定されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。プローブ・プレートを、その後45℃の2xSSC-0.1%SDS、40℃の1xSSC-0.1%SDS、40℃の0.2xSSCで洗浄し、遠心乾燥させ、DNAscope（Gene Focus, Waterloo, Ontario, Canada)によりスキャンした。各サンプルについて少なくとも3回実験を繰り返した。
【００４４】
（比較例）
比較例として、旭テクノグラス株式会社製のpoly-L-lysineでコートされたガラス基板上に、特に5′末端および3′末端を選択せずにBD Biosciences社製のT71007 Atlas cDNA Cloneをスポットして作成したcDNAプローブ・プレートを入手した。発がん性物質をdiethylnitrosoamine(DEN)とし、4時間投与および28日間投与の治験群と対照群を使用して実験例と同様の実験を行った。
【００４５】
（結果）
（実験例１）
図３には、実施例１において得られたプローブ・プレートに、標識したcDNAをハイブリダイズさせて得られた蛍光パターンを示す。なお、図３は、発がん性物質としてDENを使用し、治験群として4時間（4h）投与したマウスについて得られた蛍光パターンである。蛍光パターンは、DNAプローブに対してCy3またはCy5ラベルされたcDNAがハイブリダイズすることにより得られる。なお、DNAscopeはCy3またはCy5を片方ずつスキャンした結果を表示する。後から他のソフトを用いてパソコン上で2色を重ね合わせることが出来る。またCy3/Cy5比を計算することができる。
【００４６】
図４は、得られたスポットについて、Cy3およびCy5の蛍光強度を、解析して得られたCy3およびCy5の蛍光強度分布としてプロットした図である。図４に示されるように、本発明で得られたCy3（治験群）およびCy5（対照群）のスポットは、Cy3/Cy5が2以上（治験群で発現が増加）のスポットが約145で、1/2（治験群で発現が減少）のスポットが約40あることを示した。すなわち、本発明の発がん性に関与するDNAに由来するオリゴヌクレオチドからなるプローブ・プレートは、僅かに4時間の投与後であっても治験群と、対照群とを分離することができることが示された。
【００４７】
図５は、実施例１において得られた治験群として28日飼育した場合に得られたCy3とCy5との蛍光パターンの強度分布を、図４と同様にしてプロットした図である。図５に示されるように、Cy3/Cy5が2以上（治験群で発現が増加）のスポットが約67で、1/2（治験群で発現が減少）のスポットが約55あることを示した。図５に示されるように、本発明で得られたCy3（治験群）およびCy5（対照群）のスポットは、28日間投与を行った治験群についても対照群を分離することができ、良好なプローブ性が示された。
【００４８】
（実験例２〜８）
同様の実験を、図１に示した治験化合物を使用して行った実験例２〜８についても同様にして実験を行い、良好な結果が得られた。
【００４９】
図６は、実験例1、2と実験例5〜8で得た蛍光パターンを使用して、各化合物に対するcDNAの発現を、二次元的に示した図である。横軸方向に、実験群（投与化合物および投与期間）を示し、縦軸にそれぞれのDNAプローブとして使用した遺伝子（オリゴヌクレオチド）を示す。図６に示されるように、本発明のプローブ・プレートによれば、比較的短時間の実験でも、良好な遺伝子発現プロファイルが得られているのが示された。なお、図６中、他の箇所よりも白く観察される部分は、治験群から得られたmRNAを標識したCy3の蛍光成分をより強く与えた遺伝子（オリゴヌクレオチド）を示している。図６に示されるように、本発明のプローブ・プレートを使用することにより、発がん性物質の遺伝子発現プロファイルを、迅速、且つ高効率で行うことができることが示され、ひいては発がん性物質のスクリーニング試験を低コストに行うことができることが示される。
【００５０】
（比較例）
比較例で入手したプローブ・プレートを使用し、発がん性物質としてDENを用い、マウスに4時間および28日間投与した治験群および対照群から精製したmRNAを実験例１と同様にしてハイブリダイゼーションさせた。その後、プローブ・プレートをスキャナーにより蛍光を読み取り、蛍光強度分布を得た。実施例と同様に、治験群は、Cy3で標識し、対照群は、Cy5で標識した。図７にはその結果を示す。図７（ａ）は、4時間飼育した治験群（DEN-4h）の結果を示し、図７（ｂ）は、28日間飼育した治験群（DEN-28d）について得られた結果を示す。図７に示すように、比較例で使用したプローブ・プレートでは、4時間投与群および28日間投与群の両方の実験に対して、充分な数のCy3/Cy5比2以上または1/2以下のスポットが得られておらず、cDNAの有為な解析には充分な感度を有していないことがわかる。これは、比較例で使用したプローブ・プレートでは、ハイブリダイゼーションの効率が悪く治験群および対照群について得られたcDNAを効率よく捕捉することができないためと考えられる。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
【表３】
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【００５３】
【表４】
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【００５４】
【表５】
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【００５５】
【表６】
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【００５６】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上説明したように、本発明のプローブ・プレートを使用することにより、比較的短期間でも充分な解析を可能とする蛍光スポット数を提供することができるプローブ・プレートが提供でき、発がん性物質のスクリーニングを著しく改善することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明のプローブ・プレートの概略図。
【図２】本発明のオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法を示したフローチャート。
【図３】本発明により得られた蛍光パターン。
【図４】本発明により得られた蛍光強度分布をプロットした図。
【図５】本発明により得られた蛍光強度分布をプロットした図。
【図６】本発明により得られた蛍光強度分布を使用して、発ガン性物質とオリゴヌクレオチドに対して二次元的にプロットした図。
【図７】比較例により得られた蛍光強度分布をプロットした図。
【符号の説明】
【００５９】
１０…プローブ・プレート
１２…基板
１４…スポット
１６…サブブロック
３０、５０…対照群の蛍光スポット
４０、６０…治験群のスポット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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