(57)【要約】【課題】  表在性膀胱癌は、より高分化、高浸潤性の癌に進展していく可能性が高く、高浸潤性の癌は、リンパ節転移や他臓器への転移の頻度が上昇するため、再発や進展を予測する手段の開発が望まれている。本発明は、簡便で客観的に得られる膀胱癌患者の予後の判定方法を提供することを目的とする。【解決手段】  膀胱癌患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞について、その細胞の中心体複製異常を、蛍光たんぱく質を用いた２段階抗原抗体反応により検出し、予後不良の可能性ありと判定することを特徴とする膀胱癌患者の予後判定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱癌に侵食された臓器組織切除手術後の患者の予後の判定において、患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞について、その細胞の中心体複製異常の有無の検出により、予後不良の可能性ありなしを判定することを特徴とする膀胱癌患者の予後判定方法。
【請求項２】
細胞の中心体複製異常の検出は、蛍光たんぱく質を用いた２段階抗原抗体反応により行う請求項１に記載の膀胱癌患者の予後判定方法。
【請求項３】
細胞の中心体に対し、マウスあるいはウサギに感作して得られた抗体を一次抗体として結合させ、さらに、一次抗体に特異的に結合するＩｇＧ蛍光抗体を二次抗体として結合させ、蛍光顕微鏡下で、中心体数の数値を測定し、全細胞中に存在する中心体複製異常の存在率を算出し、再発および進展の指標とする請求項２に記載の膀胱癌患者の予後判定方法。
【請求項４】
膀胱癌に侵食された臓器組織切除手術後の患者の予後の判定において、患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞について、その細胞の中心体を２段階抗原抗体反応により標識し、標識された中心体数の数値を蛍光顕微鏡下で測定し、３個以上の中心体が存在する中心体複製異常細胞が全細胞中に５％以上存在する場合を、予後不良の可能性ありと判定することを特徴とする請求項１に記載の膀胱癌患者の予後判定方法。
【請求項５】
観察対象の膀胱癌患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞の中心体に対し、マウスあるいはウサギに感作して得られた抗体を一次抗体として結合させ、さらに、一次抗体に特異的に結合するＩｇＧ蛍光抗体を二次抗体として結合させ、蛍光顕微鏡で観察することを特徴とする観察対象細胞の中心体数の複製異常を検出する方法。
【請求項６】
少なくとも観察対象の膀胱癌患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞の中心体に結合する一次抗体と、一次抗体に特異的に結合するＩｇＧ蛍光二次抗体とを含有することを特徴とする膀胱癌患者の予後判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膀胱癌に侵食された臓器組織切除手術後の患者の予後判定方法に関し、特に細胞内の中心体複製異常を検出することによる膀胱癌の予後を判定する方法に関する。さらにまた、細胞内の中心体複製異常を検出する方法および検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は、泌尿器科領域では、前立腺癌に次いで２番目に頻度の高い癌で、発症年齢は６０‐７０歳が最も多く、男女比は約３：１と男性に多く見られる。日本では、２００３年度には、約１５０００例の発症があり、２０１５年には、約１００００例の増加が見込まれている。膀胱癌には、膀胱粘膜内に癌が留まっている表在性膀胱癌と膀胱の筋肉や膀胱外にまで癌が根を張るように発育した浸潤性膀胱癌に大別される。表在性膀胱癌は、膀胱を温存する経尿道的切除術による治療が施されることが多く、手術でも根治が可能であるが、浸潤性膀胱癌の場合は膀胱全摘出あるいは、部分切除と言った治療を必要とすることが多くなり、当然患者への負担も大きい。表在性膀胱癌の場合であっても、その後、５０〜７０％に再発が見られ、表在性膀胱癌から浸潤性膀胱癌へと進展するケースが１０〜２０％に認められる。浸潤の程度がひどくなればなるほど、リンパ節転移や他臓器への転移の頻度は上昇する。
【０００３】
現在、膀胱癌は深達度（ｓｔａｇｅ）と分化度（ｇｒａｄｅ）という病理学的検査結果を中心として、その治療方針の決定や予後の判定が行われている（ＴＮＭ臨床分類）。深達度は程度によって、ｐＴａ（表在粘膜を越えず非浸潤で乳頭状に発育するもの）とｐＴ１（粘膜下層に浸潤がある）、ｐＴｉｓ（粘膜内に存在する平らな腫瘍）、ｐＴ２（筋層浸潤があるもの）、ｐＴ３（膀胱外の脂肪組織に浸潤があるもの）、ｐＴ４（膀胱外の臓器に浸潤する）に分類され、ｐＴａ、ｐＴ１、ｐＴｉｓは表在性、ｐＴ２以上を浸潤性膀胱癌とされる。表在性膀胱癌は１０〜２０％の症例に再発を繰り返すうちに、より高異型度、浸潤性の癌に進展していく可能性が示されている。そのため、再発や進展を予測する手段の開発が望まれている。
【０００４】
従来の膀胱癌の予後を予測する方法については、以下のものが知られている。膀胱癌患者から採取した血清中の可溶性Ｆａｓ濃度を、抗Ｆａｓ抗体を用いて測定することにより、膀胱癌患者の予後の良否を診断する方法があり、膀胱癌患者の血液又は血清中の可溶性Ｆａｓ濃度が健常者のそれと比較して高いこと、また、可溶性Ｆａｓ濃度の低い膀胱癌患者はその濃度の高い膀胱癌患者と比較して生存率が高くしかも非再発期間が長いことを明らかにしている（特許文献１）。他に、核小体に多く存在する真核ＤＮＡポリメラーゼα活性調節因子であるｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ／Ｂ２３タンパク質に関与するリボ核酸（ｍＲＮＡ）の発現状態を予後の指標として、膀胱癌が再発及び悪化してハイステージ症状になっているかを検査する方法も開示されている（特許文献２）。癌性腫瘍細胞内でのグルコース輸送たんぱく質であるＧＬＵＴ−１過剰発現の程度が腫瘍の進展度に相関することが見いだされ、ＧＬＵＴ−１過剰発現の程度で、癌性腫瘍を患う個体の予後判定が可能であるとしている（特許文献３）。しかしながら、これらのバイオマーカーの臨床的意義は明らかにされているとは言い難い。
【０００５】
本発明者らは、７、９、１７番染色体のコピー数異常が、膀胱癌患者の臨床背景と相関するばかりでなく、その予後とも関連することを報告した（非特許文献１、２）。
【０００６】
また、特殊遺伝子の変異を利用した膀胱癌の予後を予測する方法として、癌抑制遺伝子のひとつであるｐ５３遺伝子の異常により出現するｐ５３異常タンパクを、免疫組織染色法で測定して判定する方法が明らかにされているが（非特許文献３）、判定が主観的であり予後予測の確率も高いとは言えない。
【０００７】
中心体複製異常と癌との関わりは、子宮頚部癌、前立腺癌、乳癌において、前癌状態の病変で中心体複製異常が発見されている報告や（非特許文献４、５）、ラット乳癌の初期変化の段階で、中心体複製異常やＡｕｒｏｒａ‐Ａタンパクの過剰発現が見られるとの報告もある（非特許文献６）。
【特許文献１】特開２０００−１３１３２１公報
【特許文献２】特開２００４−３３７１２０公報
【特許文献３】特表平１１−５１１２４５公報
【非特許文献１】Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００２；１３４：４１‐４５．
【非特許文献２】Ｃａｖｅｎｅｅ  ＷＫ，ｅｔ  ａｌ．．Ｎａｔｕｒｅ  １９８３；３０５：７７９−８４．
【非特許文献３】Ｓａｒｋｉｓ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ．．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９３；８５：５３‐９．
【非特許文献４】Ｌｉｎｇｌｅ  ＷＬ，ｅｔ  ａｌ．．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２；９９：１９７８‐８３．
【非特許文献５】Ｐｉｈａｎ  ＧＡ，ｅｔ  ａｌ．．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：１３９８‐４０４．
【非特許文献６】Ｇｏｅｐｆｅｒｔ  ＴＭ，ｅｔ  ａｌ．．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；６２：４１１５‐２２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述する従来の方法においては、膀胱癌患者の予後の判定となる方法については明らかにされていない。表在性膀胱癌は、より高分化、高浸潤性の癌に進展していく可能性が高く、高浸潤性の癌は、リンパ節転移や他臓器への転移の頻度が上昇するため、再発や進展を予測する手段の開発が望まれている。本発明は、簡便で客観的に得られる膀胱癌患者の予後の判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、膀胱癌患者の癌組織又は尿中の細胞について、中心体複製異常が、染色体不安定性を誘導していること、中心体複製異常細胞が多く存在する膀胱癌患者はその少ない膀胱癌患者と比較して再発率および進展の発生率が高いことを見出し、本発明をなした。
【００１０】
すなわち、本発明は、膀胱癌に侵食された臓器組織切除手術後の患者の予後を判定する方法であって、患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞について、その細胞の中心体複製異常を、予後不良の可能性ありと判定することを特徴とする膀胱癌患者の予後判定方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、細胞の中心体複製異常を、蛍光たんぱく質を用いた２段階抗原抗体反応により検出し、予後不良の可能性ありと判定することを特徴とする膀胱癌患者の予後判定方法を提供する。
【００１２】
上記の蛍光たんぱく質を用いた２段階抗原抗体反応は、細胞の中心体に対し、マウスあるいはウサギに感作して得られた抗体を一次抗体として結合させ、さらに、一次抗体に特異的に結合するＩｇＧ蛍光抗体を二次抗体として結合させ、蛍光顕微鏡下で、中心体数の数値を測定し、全細胞中に存在する中心体複製異常の存在率を算出し、再発および進展の指標とする膀胱癌患者の予後判定方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、膀胱癌に侵食された臓器組織切除手術後の患者の予後を判定する方法であって、患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞について、その細胞の中心体を２段階抗原抗体反応により標識し、標識された中心体数の数値を蛍光顕微鏡下で測定し、３個以上の中心体が存在する中心体複製異常細胞が全細胞中に５％以上存在する場合を、予後不良の可能性ありと判定することを特徴とする膀胱癌患者の予後判定方法を提供する。
【００１４】
本発明は、さらに、膀胱癌患者の予後判定のために、膀胱癌患者の切除組織あるいは、尿中に存在する細胞の中心体に対し、マウスあるいはウサギに感作して得られた抗体を一次抗体として結合させ、さらに、一次抗体に特異的に結合するＩｇＧ蛍光抗体を二次抗体として結合させ、蛍光顕微鏡下で中心体数の複製異常を検出する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、また、中心体に結合する一次抗体と、一次抗体に特異的に結合するＩｇＧ蛍光二次抗体及び電気泳動用の試薬・器具類を含有する膀胱癌患者の予後判定用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の細胞内中心体の複製異常を検出する方法および予後判定用キットを用いて、中心体複製異常の有無を検出することにより、膀胱癌患者の予後の治療方針を決定することが可能になる。例えば、膀胱癌において中心体複製異常が検出された場合、術後に抗がん剤の投与、膀胱内ＢＣＧ投与、放射線照射、内視鏡観察間隔の短縮など、再発および進展予防のための補助療法を処置することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の膀胱癌に侵食された臓器組織切除手術後の患者の予後を判定する方法は、患者の病理用組織細胞あるいは、尿中の細胞に存在する中心体の複製異常の存在率を指標として、再発や進展の判定をするものである。
【００１８】
中心体とは、動物細胞や植物細胞では精子をつくる精細胞内に見出され、細胞内に放射状にのびる微小管の中心に存在する。中心体は、細胞分裂時に分裂し、動物細胞における細胞分裂の前期では、二分した中心体が細胞の両極に移動し，それぞれから微小管を成長させる。（中心体間の微小管は紡錘糸，細胞膜にいたる放射状のものは星状糸とよばれ、それぞれの集まりを紡錘体，星状体という。）細胞分裂の中期では，染色体が紡錘体の中央の面（赤道面）に並び、染色体の中ほどにある動原体に、両中心体から伸びた紡錘糸が付着する。細胞分裂の後期では，各染色体が２つに分かれ，２つの極を形成している中心体に向かって移動する。この染色体移動は，中心体で紡錘糸が分解され短縮するので，自動的に中心体に向かうとされている。細胞分裂の終期では核膜が形成され，染色体は分散する。このようにして、細胞質分裂は終了し、細胞は２つの娘細胞に分かれる。
【００１９】
中心体複製異常とは、３個以上の中心体が存在する状態をいう。通常中心体は細胞分裂の際、一回のみ複製されて２個となり、細胞分裂極を形成するが、その複製は厳密にコントロールされている。しかし癌細胞ではこのコントロールが乱れ、３個以上の中心体が出現し、中心体複製異常が発生する。また、その際、染色体の分配が不安定となる。
【００２０】
したがって、本発明は、ヒト膀胱癌細胞では、１）中心体複製異常が染色体不安定性と関係があることを証明するために、中心体やＡｕｒｏｒａ  Ａの等タンパク発現を、間接的免疫蛍光法により測定し、染色体不安定性を、ＦＩＳＨ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）およびＣＧＨ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）により測定し、２）中心体複製異常がある癌患者の予後は、再発や進展の割合が高いことを明らかする。
【００２１】
（間接的免疫蛍光法）
細胞内の中心体やＡｕｒｏｒａ  Ａ等のタンパクの発現は、間接的免疫蛍光法を用いて確認することができる。例えば、観察対象の組織切片を液体窒素で冷却したイソペンタンなどに浸して凍結させる。次に、凍結組織をクリオスタットのチャンバーに移し、温度が平衡に達するまで静置させる。包埋剤を用いて組織ブロックをスタブにマウントした後、ブロックの表面を対象の組織に適した温度でトリミングを行い、切片の検体を作製する。作製した検体は、清浄なスライドグラス上に置き、室温で乾燥させる。
【００２２】
細胞を染色する場合には、スライドグラス又はカバーグラス上に対象の細胞を付着状態で成長させるか、浮遊細胞の場合は、スライドグラス上に遠心により付着させる。細胞を付着させたスライドグラス又はカバーグラスは、例えば、アルコール、アセトン、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどを用いて細胞内タンパク質の固定を行う。その後必要ならば、適当な界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００など）処理により細胞膜及び核膜の透過性を上げてもよい。中心体あるいは、Ａｕｒｏｒａ  Ａ等のタンパク質に対する一次抗体を至適濃度に希釈後、ブロッキング溶液を適量ライドグラス又はカバーグラス上の細胞に重層し、室温にて接触させる。次に、標識した二次抗体を至適濃度に希釈後、該希釈液を適量細胞上に重層し接触させる。インキュベートション後、ＰＢＳにて２〜３回程度スライドグラスを洗浄する。染色後、蛍光顕微鏡で観察を行う。
【００２３】
使用する一次抗体としては、マウスモノクローナル抗γチュブリン抗体、マウスモノクローナル抗αチュブリン抗体、マウスモノクローナル抗ＯｘＰｈｏｓ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｖ阻害タンパク質ＩｇＧ抗体、ウサギ抗ペリセントリンポリクローナル抗体など、中心体に結合し、二次抗体との結合性の優れたものを選ぶことが望ましい。
【００２４】
使用する二次抗体としては、一次抗体に特異的に結合する優れた蛍光抗体であることが望ましい。テトラフルオロフェニルエステルを標識したＡｌｅｘａ（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ（登録商標）５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ（登録商標）５９４抗ウサギＩｇＧ抗体が最も望ましいが、Ａｌｅｘａ（登録商標）４０５抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ（登録商標）５００抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ（登録商標）５１４抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ（登録商標）６１０抗マウスＩｇＧ抗体等を用いることもできる。
【００２５】
細胞１個あたりの中心体数は倍率１０００倍視野の蛍光顕微鏡（オリンパス社、東京）下１００個以上の細胞をカウントし、１細胞当たり３個以上の中心体が存在する場合を中心体複製異常細胞と判定する（参照文献：Ｏｋｕｄａ  Ｍ，Ｈｏｒｎ  ＨＦ，Ｔａｒａｐｏｒｅ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ／Ｂ２３  ｉｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ＣＤＫ２／ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ  ｉｎ  ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ２０００；１０３：１２７−４０．）。
Ａｕｒｏｒａ  Ａタンパクの過剰発現は１００個以上の細胞を観察し、２０個以上の細胞胞体が染色されていた場合と定義する（参照文献：Ｓｅｎ  Ｓ，Ｚｈｏｕ  Ｈ，Ｚｈａｎｇ  ＲＤ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００２；９４：１３２０‐９．）。
【００２６】
（染色体不安定性の測定）
染色体不安定性の測定は、２０番染色体長腕１３領域（２０ｑ１３）増幅の有無と、染色体不安定性の指標となるばらつきの割合を検討するため、２０ｑ１３（Ｖｙｓｉｓ社）および７，９，１７番染色体コピー数を二色または多色ＦＩＳＨ法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）を用いて検討する。スペクトラムオレンジで標識された２０ｑ１３プローベを、蛍光標識された２０番染色体特異的セントロメアプローベ（Ｄ２０Ｚ１）とともに検体にハイブリダイズさせ、スポット数をカウントする。７，９，１７番染色体については、コピー数の異常は、それぞれＣＥＰ７，ＣＥＰ９，ＣＥＰ１７（いずれもＶｙｓｉｓ社）プローベを検体にハイブリダイズさせてスポット数をカウントすることにより確認する。実験手技の詳細はプローベ販売業者の推薦する方法に従う。染色体不安定性の測定は、１００個以上の細胞について、３蛍光波長帯（ＤＡＰＩ／スペクトラム緑／スペクトラム赤）通過フィルターおよび１蛍光波長帯（スペクトラムアクア）通過フィルターを装着した蛍光顕微鏡下で観察して行なう。
【００２７】
２０ｑ１３増幅症例の判定は１細胞当たり６個以上のスポットを有する細胞が全体の６０％を超えた症例と定義とする（参照文献：Ｓｅｎ  Ｓ，Ｚｈｏｕ  Ｈ，Ｚｈａｎｇ  ＲＤ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００２；９４：１３２０‐９．）。
７番、９番および１７番染色体のコピー数を計測し、そのコピー数がモード（正常細胞では２）以外の染色体コピー数を有する細胞の割合が２５％を超える症例を染色体不安定性ありと判定する（参照文献：Ｌｅｎｇａｕｅｒ  Ｃ，Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８６：６２３‐７．）。
【００２８】
（ＣＧＨ法とデジタル画像解析法）
ゲノムＤＮＡを膀胱癌継代培養細胞株および健常人ボランテイア末梢血からDNA抽出キット（ＳｅｐａＧｅｎｅ，三光純薬、東京）を用いてそれぞれ抽出する。これらのＤＮＡを用いてＨａｒａｄａ等の方法（Ｈａｒａｄａ  Ｔ，Ｏｋｉｔａ  Ｋ，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｋ，Ｋｕｓａｎｏ  Ｎ，Ｋｏｎｄｏｈ  Ｓ，Ｓａｓａｋｉ  Ｋ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；６２：８３５−３９．）に従い、ＣＧＨ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）とデジタル画像解析をおこなう。腫瘍および正常ＤＮＡはニックトランスレーション法にてそれぞれスペクトラム緑、スペクトラム赤（Ｖｙｓｉｓ社、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ）で標識される。デジタル画像解析システムはＱＵＩＰＳ  ＸＬ（Ｖｙｓｉｓ社）を使用する。
【００２９】
ＤＮＡ配列コピー数の増加と減少は緑（腫瘍ＤＮＡ）と赤（正常ＤＮＡ）の比がそれぞれ１．２以上、０．８未満と定義して判定する。
【００３０】
（統計解析）
統計解析はＪＭＰ４．０ソフトウェアー（ＳＡＳ社、Ｃａｒｙ）をもちいて行い、グループ毎の再発、腫瘍進展までの期間はＫａｐｌａｎ‐Ｍｅｉｅｒ法を用いて計算され、統計学的有意差の検定はｌｏｇ‐ｒａｎｋ  ｔｅｓｔを用いる。カテゴリー変数の単変量解析にはカイ二乗検定またはＦｉｓｈｅｒ直接確率統計法をもちいて有意差検定をおこない、多変量解析にはＣｏｘ比例ハザードモデルをもちいて全ての因子が有意となるまで有意でない因子を順次外していくステップダウン法をおこなう。全ての検定においてｐ値が０．０５未満の場合を有意とする。
【００３１】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
１．ヒト膀胱癌継代培養細胞検体
８種類のヒト膀胱癌継代培養細胞株（ＫＫ４７，ＲＴ‐４，Ｔ２４，ＥＪ‐１，５６３７，Ｊ８２，ＴＣＣ‐ＳＵＰ，ＳＣａＢＥＲ）を基礎実験に用いた。３×１０５個の細胞を７５ｃｍ２細胞培養用フラスコ（Ｃｏｎｉｎｇ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に播種後１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培養液（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス）で培養（３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気下）、対数増殖期（播種後４‐５日目）に細胞を回収し、ＤＮＡを抽出後ＣＧＨ法の検体に供した。また、分割チャンバーを有するスライドグラス（４．０ｃｍ２，Ｎｕｎｃ社、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ）を用いて、同一細胞数となるように調節された癌細胞を細胞株毎にチャンバー内に播種し、Ａｕｒｏｒａ  Ａタンパク発現および中心体数計測のための免疫蛍光実験と、２０ｑ１３の増幅、および７，９，１７番染色体コピー数異常の検討のためのＦＩＳＨ法の実験に用いた。
【００３３】
２．中心体複製異常の検出
中心体とＡｕｒｏｒａ  Ａタンパクの発現を免疫蛍光法で検討するため、検体は１０％ホルマリン／メタノール液で固定（２５℃、２０分間）後、ＰＢＳで洗浄、ＰＢＳ溶解０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ液にて透徹（２５℃、５分間）させた後ブロッキング溶液（ＰＢＳ溶解１０％ヤギ血清）に１時間接触させ実験に用いた。中心体免疫蛍光染色にはマウスモノクローナル抗γチュブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社）を一次抗体として使用した。Ａｌｅｘａ４８８または５６８を蛍光色素とするヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社、Ｅｕｇｅｎｅ）を二次抗体として３７℃１時間接触させることにより、上記の抗原‐抗体複合物に特異的に結合させた。結合体は、倍率１０００倍視野の蛍光顕微鏡（オリンパス社、東京）により検出した。
【００３４】
３．中心体複製異常の定義
ヒト膀胱癌継代細胞培養株８株の基礎検討結果を表１に示す。間接的免疫蛍光法により測定した結果、２つの細胞株（ＫＫ４７，ＲＴ‐４）はＣＨ（中心体複製異常）を有する細胞の割合が５％以下であり、他の６株（Ｔ２４，ＥＪ‐１，５６３７，Ｊ‐８２，ＴＣＣ‐ｓｕｐ，ＳＣａＢＥＲ）は５％以上であった。５％以上の６株ではＣＧＨ法にて２０ｑ（２０番染色体長腕）コピー数増加、ＦＩＳＨ法にて２０ｑ１３コピー数増加、Ａｕｒｏｒａ‐Ａタンパク過剰発現を共通して認めたが５％以下の２株ではこれらの変異を認めなかった。図１ＡはＫＫ４７株細胞で２個の中心体数（正常）、７番および９番染色体コピー数２本でｄｉｓｏｍｙ（正常コピー数）であることを示している。一方図１ＢはＴＣＣ‐ｓｕｐ株細胞で中心体複製異常と７番および９番染色体コピー数異常を示している。これらの基礎検討結果を基に中心体複製異常症例（以下ＣＨ＋）の定義を、中心体複製異常を有する細胞の割合が５％以上の症例と定義した。
【００３５】
【表１】
2006275989.tif 000003
（上記表中、ＣＨ：中心体複製異常（カッコ内の数字は１細胞あたり３個以上の中心体を有する細胞の割合を示す）＋：ＣＨを有する細胞の割合が５％を超える。‐：ＣＨを有する細胞の割合が５％以下である、２０ｑ１３増加：カッコ内の数字は１細胞あたり２０ｑ１３（２０番染色体１３領域）のシグナルが５個をこえる細胞を示す。＋：２０ｑ１３増加を示す細胞の割合が６０％を超える。‐：２０ｑ１３増加を示す細胞の割合が６０％以下である）
【実施例２】
【００３６】
１．臨床検体
組織学的に移行上皮癌と診断され、本研究に対する文書による同意が得られた臨床検体５０例を臨床検討に用いた（表２）。非浸潤性（ｐＴ１以下）は４３例、浸潤癌（ｐＴ２以上）は７例であった。経尿道的腫瘍切除術による膀胱温存治療は４６例、膀胱全摘術は４例に行われた。いずれの患者も過去に放射線治療や抗癌剤による化学療法の既往はなかった。腫瘍の分化度はＷＨＯ基準により、腫瘍の病期はＴＮＭ分類により分類された。膀胱温存治療をうけた患者は３ヶ月毎の膀胱鏡検査および尿細胞診検査、膀胱全摘術をうけた患者は６ヶ月毎の胸腹部のＣＴによる画像診断、１年に一度の骨シンチグラムにより経過観察された。
【００３７】
腫瘍再発は膀胱鏡または各種画像診断にて新病変が発見された場合と定義された。腫瘍進展は再発腫瘍が原発腫瘍より病期が進展した時（局所進展）、または遠隔転移が出現したとき（遠隔進展）と定義された。腫瘍組織は採取後研究実験に使われるまで‐８０℃で凍結保存された。タッチ生検標本は組織を愛護的にスライドグラスに押しつけて作成し、室温で３０分間自然乾燥した。
【００３８】
２．中心体複製異常の検出
タッチ検体は１０％ホルマリン／メタノール液で固定（２５℃、２０分間）後、ＰＢＳで洗浄、ＰＢＳ溶解０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ液にて透徹（２５℃、５分間）させた後ブロッキング溶液（ＰＢＳ溶解１０％ヤギ血清）に１時間接触させ実験に用いた。中心体免疫蛍光染色にはウサギ抗ペリセントリンポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ社、Ｂｕｒｋｅｌｙ）を一次抗体として使用した。Ａｌｅｘａ５９４を蛍光色素とする抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社、Ｅｕｇｅｎｅ）を二次抗体として３７℃１時間接触させることにより、上記の抗原−抗体複合物に特異的に結合させた。結合体は、倍率１０００倍視野の蛍光顕微鏡（オリンパス社、東京）により検出した。
【００３９】
３．臨床結果
患者臨床背景因子と臨床検討結果のまとめを表２に示す。合計５０例（男性４１、女性９、平均年齢６６．９歳［３３歳から８８歳まで］）について検討した。病理組織学的分化度はｇｒａｄｅ  １：５，ｇｒａｄｅ  ２：３１，ｇｒａｄｅ  ３：１４例であり、病理組織学的病期（深達度）はｐＴａ：９，ｐＴ１：３４，ｐＴ２：７例である。
【００４０】
ＣＨ＋，２０ｑ１３コピー数増加、染色体不安定性、ＤＮＡ  ａｎｅｕｌｏｉｄｙはそれぞれ３０例（６０％）、１８例（３６％）、２２例（４４％）、１９例（３８％）に認めた。
【００４１】
ＣＨ＋症例における中心体複製異常細胞の割合は１５．５±６．５％（平均±標準偏差）に対しＣＨ＋を認めない症例（ＣＨ‐）における中心体複製異常細胞の割合はわずか１．７±１．２％であり、統計学的に有意差を認めた（Ｐ＜０．０００１）。
【００４２】
２０ｑ１３コピー数増加と判定された症例における２０ｑ１３コピー数が５個より多い細胞の割合は８７．２±１０．４％（平均±標準偏差）に対して同コピー数増加なしと判定された症例における割合はわずか４．８±８．０％であり、両群間に有意差を認めた（Ｐ＜０．０００１）。また、２０ｑ１３コピー数増加症例１８例は全例ＣＨ＋症例であることより膀胱癌においては２０ｑ１３コピー数増加がＣＨを誘導していることが示唆された。
【００４３】
【表２】
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（上記表中、‐：陰性（偽陽性症例は陰性と判定）、＋：陽性、ＮＤ：検査未施行、再発・進展は、手術から腫瘍再発または最終経過観察日までの観察期間（月数）を示す。ＣＩＮ：染色体不安定性（７，９，１７番染色体の平均ばらつき割合が２５％以上）、ばらつきの割合：染色体コピー数がモード数をはずれた細胞の割合、略語解説Ｃｈｒ：染色体、Ｄ：ｄｉｐｌｏｉｄ（ＤＮＡ量２倍体）、Ａ：ａｎｅｕｐｌｏｉｄ）
【００４４】
表３に、ＣＨと他のパラメーターとの関連を示す。ＣＨ＋症例とＣＨ‐症例との間に腫瘍数（Ｐ＜０．０５）、腫瘍分化度（Ｐ＜０．０１）、腫瘍再発（Ｐ＜０．０１）、腫瘍進展（Ｐ＜０．０１）、２０ｑ１３コピー数増加（Ｐ＜０．０００１）、染色体不安定性（Ｐ＜０．０００１）、７番および１７番染色体コピー数ばらつきの割合（Ｐ＜０．０００１）、９番染色体コピー数ばらつきの割合（Ｐ＝０．０００５）、ＤＮＡ  ｐｌｏｉｄｙ（Ｐ＜０．０００１）に関して単変量解析においてすべて有意差をみとめた。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
４．ＣＨと患者予後との関連
平均４３．３ヶ月（範囲４−９４ヶ月）の観察期間中に、非浸潤性膀胱癌患者（ｐＴａまたはｐＴ１）４３例中２３例（５３．５％）に腫瘍再発をみとめた。ＣＨ‐症例はＣＨ＋症例に比べ有意に非再発期間の延長を認めた（図２Ａ，Ｐ＝０．００２８，ｌｏｇ‐ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）。腫瘍分化度ｇｒａｄｅ２と判定された非浸潤性膀胱癌患者においてもＣＨ‐症例はＣＨ＋症例に比べ有意に非再発期間の延長を認めた（図２Ｂ，Ｐ＝０．０１２９，ｌ  ｇ‐ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）。多変量解析においてＣＨ＋は非浸潤性膀胱癌の再発予測における最も強い予後予測因子であることが証明された（表４，ハザード比１．８８２，９５％信頼限界１．１６１‐３．３２５，Ｐ＝０．００９４）。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
平均４０．８ヶ月（範囲１−９４ヶ月）の観察期間中に腫瘍進展は、表２に示す膀胱癌患者５０症例中１０例（２０％，遠隔進展６，局所進展４）に認めた。進展様式にかかわらず全ての腫瘍進展例はＣＨ＋症例であった。ＣＨ‐症例はＣＨ＋症例に比べ有意に非進展期間の延長を認めた（図３，Ｐ＝０．００７０，ｌｏｇ‐ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）。
【００４９】
術後補助療法として、放射線併用抗癌剤化学療法が行われた症例番号１８、１９、２６、２９、３５、４５において、ＣＨ＋症例４例（症例番号２６、２９、３５、４５）は、腫瘍再発および進展を来したが、ＣＨ‐症例２例（症例番号１８、１９）は再発、進展を来さなかった。
【００５０】
５．考察
ＣＨ＋症例で染色体不安定性を有しない症例は３０％であったが、染色体不安定性を有しＣＨ＋であった症例は９５．５％であり、ＣＨ‐であった症例は４．５％であったことより、中心体過剰複製の発生は染色体不安定性に先行することが示唆される。これらの所見を総合すると中心体過剰複製は癌発生の初期段階より出現する変異であり、染色体不安定性を惹起する事により最終的に悪性度のより高い腫瘍を誘導するのではないかと推定される。
術後補助療法として、放射線併用抗癌剤化学療法をうけた患者のデータは中心体複製異常の確認が術後補助療法の治療方針決定に応用できることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
中心体複製異常は腫瘍再発の独立予後因子であることが証明され、中心体複製異常の検出方法は、患者の予後の治療方針を決定する重要な情報を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】染色体７、９番における中心体複製が正常な細胞（Ａ）、中心体複製が異常な細胞（Ｂ）を示す図面に代わる写真である。
【図２】表在性膀胱癌患者（Ａ）と深層性膀胱癌患者（Ｂ）について、中心体複製異常と再発の関係を説明する図面である。
【図３】膀胱癌患者について、中心体複製異常と進展の関係を説明する図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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