(57)【要約】【課題】  新規な複製系を有する自律複製可能なプラスミド、および大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターを提供する  【解決手段】  新規な複製系を有する自律複製可能なプラスミドは、例えば、自然界および分譲機関由来のロドコッカス（Rhodococcus）属細菌の中からプラスミドの有無を電気泳動等により確認し、選抜する。従来から知られているプラスミドと複製系が異なるプラスミドを取得するために、採取したプラスミドの塩基配列を、ColE2型プラスミドのファミリーに属するMycobacterium fortuitum由来のプラスミドpAL5000の複製タンパク質RepAのそれと比較する。ホモロジーが低い場合、採取したプラスミドはこれまで知られているプラスミドとは非類似の複製系を有していると判断する。【選択図】  図１
2006050967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の塩基配列からなるプラスミドまたはその誘導体。
【請求項２】
配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミド。
【請求項３】
配列番号３記載の塩基配列を有するプラスミド。
【請求項４】
配列番号４記載の塩基配列を有するプラスミド。
【請求項５】
ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内で自律複製可能な請求項１〜４のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のプラスミドまたはその一部と、大腸菌内で自律複製可能なプラスミドまたはその一部から構築され、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内および大腸菌内で自律複製可能なシャトルベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な複製系を有するプラスミドおよびそれを利用したシャトルベクターに関する。より具体的には、ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）由来の新規な複製系を有する自律複製可能なプラスミド、およびその複製系を利用した大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌は、多種類の有機化合物の変換反応に際し、微生物触媒として使用されている。例えば、ニトリル化合物を基質とするアミド化合物への変換反応に使用されており、現在、工業化されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
また、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌は、芳香属化合物、複素環化合物等、多種類の化合物を代謝、分解する能力を有していることも知られている（非特許文献２参照）。
このようにロドコッカス（Rhodococcus）属細菌は各種有機化合物に対して、幅広い触媒活性を有していることから、産業上での幅広い利用が期待できる。
【０００４】
このような背景から、ロドコッカス属細菌の微生物触媒としての機能をさらに改良するために、ロドコッカス属細菌を宿主とする宿主−ベクター系が開発されている。ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌の潜在性プラスミドについては、すでに数種類見出されている。その内、プラスミドpFAJ2600、pRC4およびpAK22については塩基配列が決定されている（非特許文献３、４、５参照）。それら塩基配列は、いずれもＣｏｌＥ２型プラスミドのファミリーに属するMycobacterium fortuitum由来のプラスミドpAL5000の複製タンパク質ＲｅｐＡと比較的ホモロジーが高い。よって、これらのプラスミドは類似の複製系を有していると推定できる。
【０００５】
【非特許文献１】Kobayashi M等,Trends Biotechnol,10,402-408(1992)
【非特許文献２】Bell KS等,J Appl Microbiol,85,195-210(1998)
【非特許文献３】De Mot R等,Microbiology,143,3137-3147(1997)
【非特許文献４】Matsui T等,Appl Microbiol Biotechnol,56,196-200(2001)
【非特許文献５】Kulakov,L.A.等,Plasmid,38,61-69(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、現在までに知られているプラスミドは、前述のように類似の複製系を有していると推定でき、そのようなプラスミドを同一菌体内に複数個存在させると、不和合性により、プラスミド同士の共存が困難となる。よって、同一菌体内で数種類の蛋白質を産生することが困難となる。
【０００７】
そこで、本発明は、新規な複製系を有する自律複製可能なプラスミド、および大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 21199株由来の潜在性プラスミドが新規な複製系を有することを見出し、本発明を完成させた。また、このようなプラスミドと大腸菌プラスミドを利用して新規な複製系を有する大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターを構築し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１記載の塩基配列からなるプラスミドまたはその誘導体。（２）配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミド。（３）配列番号３記載の塩基配列を有するプラスミド。（４）配列番号４記載の塩基配列を有するプラスミド。（５）ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内で自律複製可能な（１）〜（４）のいずれかに記載のプラスミド。（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のプラスミドまたはその一部と、大腸菌内で自律複製可能なプラスミドまたはその一部から構築され、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内および大腸菌内で自律複製可能なシャトルベクター。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内で既存のプラスミドおよびベクターと共存可能である新規な複製系を有するプラスミド、および大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、新規な複製系を有する自律複製可能なプラスミドである。配列番号１記載の塩基配列を有するプラスミドまたはその誘導体である。具体的には、ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC21199株より採取されるプラスミドpRC032が挙げられる。プラスミドpRC032は、配列番号１記載の塩基配列を有している。図１は、プラスミドpRC032の制限酵素地図を示したものである。
【００１２】
上記のプラスミドは、例えば、自然界および分譲機関由来のロドコッカス（Rhodococcus）属細菌の中からプラスミドの有無を電気泳動等により確認し、プラスミドの大きさが10 kb以下のプラスミドを選抜する。
【００１３】
従来から知られているプラスミドと複製系が異なるプラスミドを取得するために、採取したプラスミドの塩基配列を、ColE2型プラスミドのファミリーに属するMycobacterium fortuitum由来のプラスミドpAL5000の複製タンパク質RepAのそれと比較する。ホモロジーが低い場合、採取したプラスミドはこれまで知られているプラスミドとは非類似の複製系を有していると判断する。
【００１４】
ここでプラスミドの「誘導体」とは、菌株より採取されたプラスミドの複製必須領域（複製開始部位および複製タンパク質遺伝子（rep遺伝子））を必ず含んでいるものをいう。例えば、複製必須領域は保存され、それ以外の部分が挿入および／または削除されたものである。
【００１５】
複製必須領域の同定は、各種制限酵素を使用し、制限酵素で消化した配列断片を取り除いた欠失プラスミドを作成することにより行う。欠失プラスミドからの複製必須領域の同定を容易とするため、プラスミドは予め薬剤耐性遺伝子等を有していることが好ましい。
【００１６】
次に本発明の大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターに関して説明する。
本発明のシャトルベクターは、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌のプラスミド由来の複製必須領域と大腸菌のプラスミド由来の複製必須領域を有するものである。好ましくは、上記の複製必須領域に加え薬剤耐性遺伝子を有している。ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌のプラスミドであれば、前述のプラスミドpRC032が好適に使用される。好ましくは配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号３および４の塩基配列、特に好ましくは配列番号４の塩基配列を有するシャトルベクターを作成する。
【００１７】
本発明で使用される大腸菌由来のプラスミドとしては、pBR322、pSC101、pACYC184、pACYC177、pTrc99A、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pHSG298またはpHSG299等が挙げられる。好ましくは、薬剤耐性遺伝子を有するpUC系ベクター誘導体の、pTrc99A、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pHSG298またはpHSG299等が挙げられる。特に、カナマイシン耐性遺伝子を有するpHSG298が好ましい。
【００１８】
本発明のシャトルベクターは、上述のロドコッカス（Rhodococcus）属細菌のプラスミド、大腸菌由来のプラスミドおよび必要に応じて薬剤耐性遺伝子を連結することにより作成することができる。薬剤耐性遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子が好ましく、カナマイシン耐性遺伝子がより好ましい。
【００１９】
本発明の好ましいシャトルベクターとしては、pKR321、pKR322、pKR323、pKR324、pKR325、pKR326、pKR327またはpKR328が挙げられる。これらいずれのシャトルベクターも、大腸菌由来のプラスミドpHSG298およびロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC21199由来のpRC032を用いて作成することができる。
例えば、シャトルベクターpKR321は、プラスミドpHSG298をBamHI消化して得られる断片とプラスミドpRC032をBamHI消化して得られる断片とを連結することにより作成できる。シャトルベクターpKR321は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に平成16年５月３１日付で寄託されており、その受託番号はFERM P-20070である。また、シャトルベクターpKR322、pKR323、pKR324、pKR325、pKR326、pKR327またはpKR328は、プラスミドpRC032およびpHSG298またはpKR321を用いて作成することができる。
【００２０】
次に、シャトルベクターは宿主細胞に導入される。ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌および大腸菌のいずれでも機能するシャトルベクターの選別は、例えば、宿主細胞の薬剤耐性を指標に行う。宿主細胞への導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２１】
本発明で使用される、シャトルベクターが導入される宿主細胞としては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC999株、ATCC12674株、ATCC17895株、ATCC15998株、ATCC33275株、ATCC184株、ATCC4001株、ATCC4273株、ATCC4276株、ATCC9356株、ATCC12483株、ATCC14341株、ATCC14347株、ATCC14350株、ATCC15905株、ATCC15998株、ATCC17041株、ATCC19149株、ATCC19150株、ATCC21243株、ATCC29670株、ATCC29672株、ATCC29675株、ATCC33258株、ATCC13808株、ATCC17043株、ATCC19067株、ATCC21999株、ATCC21291株、ATCC21785株、ATCC21924株、IFO14894株、IFO3338株、NCIMB11215株、NCIMB11216株、JCM3202株、ロドコッカス・グロベルルス（Rhodococcus globerulus）IFO14531株、ロドコッカス・ルテウス（Rhodococcus luteus）JCM6162株、JCM6164株、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）IFO12538株、IFO12320株、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)IFO3730株またはJCM1313株等が挙げられる。好ましくは、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)ATCC19140株またはロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 17895株、特に好ましくはロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 12674株である。上記ATCC株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから容易に入手することができる。上記IFO株は財団法人発酵研究所から容易に入手することができる。上記NCIMB株はNCIMB  Japan  研究センターから容易に入手することができる。上記JCM株は微生物系統保存施設から容易に入手することができる。
【００２２】
上述のシャトルベクターの作成では、予めロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来のプラスミドの複製必須領域を特定し、その領域と大腸菌由来の複製必須領域を連結したが、先にロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来のプラスミドの適当な領域と大腸菌由来の複製必須領域を連結し、そのプラスミドに対して、欠失プラスミドを作成しても良い。欠失プラスミドを作成、評価することによりシャトルベクターのサイズの最適化、およびロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来のプラスミドの複製必須領域を特定することができる。
上記のごとくプラスミドpRC032に対しても欠失プラスミドを作製し、複製必須領域を特定することができる。配列番号2は、図１の制限酵素部位XbaIおよびBglIIで消化して得られる約2kbの断片内に見出されるORF(Open Reading Frame)のアミノ酸配列である。配列番号3は、図１の制限酵素部位XbaIおよびBglIIで消化して得られる約2kbの断片内に見出されるORF(Open Reading Frame)の塩基配列である。配列番号４は、図１の制限酵素部位XbaIおよびBglIIで消化して得られる約2kbの断片の塩基配列である。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
[実施例１]
（１）ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus  rhodochrous）ATCC21199株からのプラスミドpRC032の調製および塩基配列の決定
ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC21199株を、MYK液体培地（ポリペプトン5g/L、Bacto-Malt extract 3g/L、Bacto-yeast extract 3g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L）を10 ｍｌ入れた試験管に植菌し、37℃で24時間振盪培養した。MYK液体培地80mlを入れた500ml容三角フラスコに該前培養液１ｍｌを植菌し、30℃で8時間振盪培養し、8mlの20％グリシンを添加後、さらに3日間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心管に移し、5000 rpm（約3700×g）で30分間遠心分離し、菌体を回収した。該回収菌体に5mlのリゾチーム（150mg）を含むTENS溶液（0.05M-Tris, 0.01M-EDTA, 0.05M-NaCl, 20% sucrose）を加え、37℃で一晩反応させた。その後、一旦、-20℃で凍結し、室温で解凍した。これに、750μlの10%SDSを加え、すぐにVortexで強く攪拌し、３７℃で30分間インキュベートし、10分間氷上に置いた。次に、750μlの2N-NaOHを加えすぐにVortexで攪拌し、10分間氷上に置いた。これに4mlの３Ｍ−酢酸ナトリウム（pH4.8）を加えVoretxで攪拌し、30分間氷上に置いた。該処理菌液を14000rpm（約20,000×g）で10分間遠心分離し10mlの上清を別の遠沈管に移し、25mlの冷エタノールを加え14000rpmで30分間遠心分離した。沈殿に、１ｍｌの  Sol IV（2μl RNase/7.5μl  Sol IVを調製）を加え、室温で20分間放置後、2.5mlの冷エタノールを加え14000rpmで30分間遠心分離し、5mlの冷70％エタノールを注ぎ、14000rpmで１分間遠心分離し、上清を除いた。
沈殿を乾燥後、100μlの滅菌水を加えプラスミド溶液とした。プラスミド溶液を０．７％アガロースゲル電気泳動により分析し、プラスミドの存在を確認した。該プラスミドをpRC032と命名した。該プラスミドの塩基配列の決定は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００を用いて行った。その結果、配列番号１に示される塩基配列が得られた。
【００２４】
（２）ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 21199株由来プラスミドの制限酵素地図の作製
プラスミドpRC032溶液1μlに、2μlの10xH Buffer、16μlの滅菌水および1μlの制限酵素（2種の制限酵素を組み合わせる場合は各1μlずつ）を加え、37℃にて４時間反応させた。生成したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分析し、制限酵素地図（図１）を作成した。
【００２５】
[実施例２]
大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターの構築
（１）プラスミドpRC032の制限酵素BamHIによる消化
上述の方法で調製したプラスミドpRC032溶液20μlに、3μlの10xH Buffer、5μlの滅菌水、2μlの制限酵素BamHIを加え、37℃にて４時間反応させた。反応終了後、反応液30μlに3μlの3M−酢酸ナトリウム（pH5.2）と75μlの冷エタノールを加えて、15000rpm（約21000×g）で30分間遠心により沈殿を得た。これに、200μlの70％冷エタノール溶液を加え、15000rpmで１分間遠心し、上清を除き沈殿を得た。該沈殿物を乾燥後、10μlの滅菌水に溶解し、2μlの10×loading buffer（2μl）を加え、全量を0.7％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動終了後、365nmの紫外線ランプを照射して目的とするバンド（ゲル）を切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）によりＤＮＡ断片を得た。具体的には下記のように行った。マイクロ遠心管に切り出したゲルを移し、160μlのCapture Bufferを加え60℃でゲルが完全に溶けるまでインキュベートした。溶解液全量をGFX Columnに移し１分間静置した後、15000rpmで30秒間遠心し、collection tubeに溜まった液を除いた。さらに500μlのwash bufferをGFX Columnに加え、15000rpmで30秒間遠心し、同様にcollection tubeに溜まった液を除いた。フィルター部分をマイクロ遠心管の上に乗せ、そこに50μlの滅菌水を注ぎ15000rpmで30秒間遠心分離し、マイクロ遠心管にプラスミドpRC032-BamHI断片の溶液を回収した。
【００２６】
（２）プラスミドpHSG298の制限酵素BamHIによる消化
プラスミドpHSG298（タカラバイオ株式会社：図2参照）溶液10μlを用い制限酵素反応液を半量にした以外は上記(1)と同様の操作により、制限酵素ＢａｍＨＩによる消化、エタノール沈殿によるＤＮＡ断片の回収を行った。得られたDNA断片に４４μｌの滅菌水を加え、SAP（Shrimp Alkaline Phosphatase：アマシャムバイオサイエンス社）処理を行った。SAP処理は、該DNA断片溶液に5μlの10×SAP Buffer、1μlのSAPを加え、37℃にて15分間行った。処理後、SAPを失活させるため、60℃にて15分間インキュベートした。50μlのSAP処理済みＤＮＡ断片溶液に150μlの滅菌水を加え、200μlのTE緩衝液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA）飽和フェノールを分注し、よく攪拌した。これを15000rpm（約21,000×g）で2分間遠心し上層（水層）を別のマイクロ遠心管に移した。同様に200μlのＴＥ飽和フェノールを加え、よく攪拌して、15000rpmで遠心分離後上層180μlを別のマイクロ遠心管に移した。得られた上層液に200μlのクロロホルム（イソアミルアルコール含）を加えよく攪拌した後、15000rpmで遠心分離し上層160μlを別のマイクロ遠心管に移した。再度200μlのクロロホルム（イソアミルアルコール含）を加え、よく攪拌した後、15000rpmで遠心分離し上層140μlを別のマイクロ遠心管に移した。
該回収液に14μlの3M-酢酸ナトリウム（pH5.2）と350μlの冷エタノールを加えて、15000rpmで遠心分離し沈殿を得た。これに、500μlの70％冷エタノール溶液を注ぎ、15000rpmで遠心分離し、上清を除いた。沈殿を乾燥させた後、20μlの滅菌水に溶解し、SAP処理済みのpHSG298-BamHI断片を得た。
【００２７】
（３）pRC032-BamHI断片とpHSG298-BamHI断片との結合によるシャトルベクターの構築
ＳＡＰ処理済みのプラスミドpHSG298-BamHI断片溶液0.5μlおよびpRC032-BamHI断片溶液6μlをDNA Ligation Kit ver 2.1 （タカラバイオ株式会社）を用いて4℃で一晩ライゲーション反応を行った。大腸菌の形質転換は下記のように行った。大腸菌JM109株コンピテントは、野島らの方法（野島  博．  １９９１．  高効率コンピテントセル調製法．  村  松正美・岡山博人編，  遺伝子工学ハンドブック，ｐｐ４６−５１，  羊土社，  東京  ）により調製した。氷上に立てた試験管に、大腸菌JM109株コンピテントセルを100μl分注し、Ligation反応液を5μl加え30分間静置した。次に42℃の恒温槽に30秒間浸けて熱ショックを与え、その後2分間氷上で保冷した。SOC培地（Bacto-tryptone 20 g/L、Bacto-yeast extract 5g/Lに終濃度1 mM塩化ナトリウム、2.5 mM 塩化カリウム、5 mM 塩化マグネシウム、5 mM 硫酸マグネシウム、20 mM グルコースを添加）を0.4ml加え、37℃の振盪培養器で１時間培養した。100μlの培養液を100mg/Lのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（Bacto-Trypton 10g/L、Bacto-Yeast Extract 5g/L、（以上、Difco社製）、塩化ナトリウム  5g/L、寒天15g/L）に播き、37℃の培養器で一晩静置培養した。
翌日、プレート上に生えた白コロニーを任意に6個選び、LB液体培地（Bacto-Trypton 10g/L、Bacto-Yeast Extract 5g/L（以上、Difco社）、塩化ナトリウム  5g/L）1.5mlを入れた試験管に植菌し、37℃で9時間振盪培養した。培養終了後、マイクロ遠心管に移し遠心分離により菌体を回収した。菌体からのプラスミドの調製はFlexiPrep Kit（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて行った。
【００２８】
具体的には、200μlのSolution Iを菌体に加えVortexでよく懸濁し、Solution IIを200μl加えゆっくりと撹拌した後、200μlの  Solution IIIを加えよく撹拌した。15000rpm（約21,000×g）で5分間遠心分離し上清を別のマイクロ遠心管に移した。これに420μlのイソプロパノールを加え混合し、10分間室温で静置した後、15000rpmで10分間遠心分離し沈澱を得た。該沈澱に150μlのSephaglas FPを加えよく攪拌して１分間静置し、15000rpmで15秒間遠心分離後沈澱を得た。これに200μlのWash Bufferを加えよく撹拌し、15000rpmで15秒間遠心分離し沈澱を得た。該沈殿に300μlの70％エタノールを加え混合した。そして、15000rpmで15秒間遠心分離し上清を除いた。沈殿物を崩し、蓋を空けたままで乾燥させた。50μlの滅菌水を加えよく混合し、5分間静置した。その後15000rpmで１分間遠心分離し上清45μlを別のマイクロ遠心管に移し、精製プラスミドとした。
こうして得られた精製プラスミドを、0.7％アガロースゲル電気泳動によりサイズを確認した。その際、数種の制限酵素による切断後、0.7％アガロースゲル電気泳動により断片サイズを調べることにより、得られたプラスミドが目的のものかどうかを調べた。その結果、挿入断片の向きが異なる目的のプラスミドを取得し、それぞれシャトルベクターpKR321およびpKR322と名付けた（図3）。
【００２９】
[実施例３]
シャトルベクターpKR321を用いたATCC12674株の形質転換
凍結保存しているロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC12674コンピテントセルを室温で解凍し、よく混合して、滅菌済みのマイクロ遠心管に20μl移した。なお、コンピテントセルは、ATCC 12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁し、-80℃で凍結保存している。次に、そこにpKR321溶液を0.5μl加え、氷上に10分間静置した。全量を0.1cmのエレクトロキュベット（greiner bio-one社）に移し、Gene Pulser（BIO-RAD  社）で2.00kV、200HMsの高電圧を掛けた。氷上に10分間静置後、37℃の培養器で10分間インキュベートし、MYK培地（ポリペプトン5g/L、Bacto-Malt extract  3g/L、Bacto-yeast extract  3g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L）を0.5ml加え、30℃で5時間静置培養した。培養終了後、エレクトロキュベット内をよくピペッティングし、100μlの培養液を75mg/Lのカナマイシンを含むＭＹＫ寒天培地（ポリペプトン5g/L、Bacto-Malt extract 3g/L、Bacto-yeast extract 3g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、寒天15g/L）に播き、30℃の培養器で2日間静置培養した。
生育したコロニーを50mg/Lのカナマイシンを含む10mlのMYK液体培地に植菌し、30℃で2日間前培養した。次に該培養液0.1mlをMYK(50ｍg/Lカナマイシン含む)液体培地10mlを入れた試験管に加え、８時間振盪培養した。さらに20％グリシンを1ml加え、16時間培養した。培養液から1.5mlをマイクロ遠心管に移し、15000rpm（約21,000×g）で5分間遠心分離し沈殿を得た。これに200μlのリゾチーム（30mg/ml）を含むTENS溶液を加え、37℃で一晩反応させ、一旦凍結させた後、室温で解凍した。これに、30μlの10％SDSを加えすぐに強く攪拌し、37℃で30分間インキュベートし、その後10分間氷上に置いた。次に、30μlの2N-NaOHを加えすぐに攪拌し、10分間氷上に置いた。これに160μlの3M−酢酸ナトリウム（pH4.8）を加え攪拌し、30分間氷上に置いた。15000rpmで10分間遠心分離し360μlの上清を別の遠沈管に移し、0.9mlの冷エタノールを加え15000rpmで30分間遠心分離した。沈殿に、100μlのSolIV(0．5μl  RNase/0.5mlSolIVを調製)を加え、３７℃で１時間放置した。これに、250μlの冷エタノールを加え15000rpmで30分間遠心分離し沈殿を得た。該沈殿に500μlの冷70％エタノールを注ぎ、15000rpmで１分間遠心分離し、沈殿を得た。沈殿を乾燥後、20μlの滅菌水を加えプラスミド溶液とした。
こうして得られたプラスミドのサイズ、および数種の制限酵素による切断後の断片サイズは、pKR321と同じであった。これらの結果より、pKR321はＡTCC12674株において複製する能力を有することが明らかとなった。
【００３０】
[実施例４]
pKR321からの欠失プラスミドの作製とそれを用いたATCC12674株の形質転換による複製必須領域の同定
（１）欠失プラスミドpKR323とpKR324の作製
プラスミドpKR321溶液5μlを用い、制限酵素BamHIおよびBglIIを使用し、反応液量を1/4量とした以外は実施例2の（1）と同様にして消化した。反応終了後、これに160μlの滅菌水を加え全量を200μlとし、200μlのＴＥ飽和フェノールを分注し、よくVortexで攪拌して、15000rpm（約21,000×g）で2分間遠心し上層（水層）を別のマイクロ遠心管に移した。同様に200μlのTE飽和フェノールを加え、よくVortexで攪拌して、15000rpmで2分間遠心し上層（水層）を別のマイクロ遠心管に移した。得られた上層液に200μlのクロロホルム（イソアミルアルコール含）を加えよく懸濁したのち15000rpmで30秒間遠心し上層を別のマイクロ遠心管に移した。再度200μlのクロロホルム（イソアミルアルコール含）を加えよく懸濁したのち15000rpmで30秒間遠心し、上層170μlを別のマイクロ遠心管に移した。これに17μlの3M-酢酸ナトリウムと425μｌの冷エタノールを加え、15000rpmで30分間遠心して沈殿を得た。該沈殿に500μlの冷70％エタノールを加え15000rpmで１分間遠心し、上清を除いた。沈殿を乾燥させた後、10μlの滅菌水に溶解し、BamHI-BglII消化プラスミドpKR321溶液を得た。この溶液には、4.2ｋｂ、2.2ｋｂ、2.7ｋｂの3断片が含まれている。この溶液5μlを用い、DNA Ligation Kit ver 2.1 （タカラバイオ株式会社）を用いて4℃で一晩ライゲーション反応を行った。実施例2の（3）と同様に大腸菌JM109株の形質転換を行い、得られたコロニーよりプラスミドを調製した。
得られたコロニーから調製したプラスミドを調べたところ、このプラスミドはpKR321から約2.2kbのBamHI-BglII断片が除かれたものであった。これをプラスミドpKR323と名付けた。また挿入断片が逆向きにあたるプラスミドも得られた。これをプラスミドpKR324と名付けた。
【００３１】
（２）欠失プラスミドpKR327とpKR328の作製
プラスミドpKR323溶液5μlをXbaIおよびNotIで消化し、アガロース電気泳動によりXbaI断片（約1.9kb）を精製した。本断片とＳＡＰ処理済みのpHSG298-XbaI断片でDNA Ligation Kit ver 2.1 （タカラバイオ株式会社）を用いて4℃で一晩ライゲーション反応を行った。実施例2の（3）と同様に大腸菌JM109株の形質転換を行い、得られたコロニーよりプラスミドを調製した。
得られたコロニーのひとつから調製したプラスミドを調べたところ、このプラスミドはpKR323から約2.3ｋｂのXbaI-BamHI断片が除かれたものであった。これをプラスミドpKR327と名付けた。また挿入断片が逆向きにあたるプラスミドも得られた。これをプラスミドpKR328と名付けた。
【００３２】
（３）欠失プラスミドpKR329の作製
プラスミドpKR323溶液10μlをSacIで切断し、SacI断片溶液を得た。この溶液は、約1.3ｋｂ、1.5ｋｂ、4.1ｋｂの3断片の混合物からなる。該溶液1μlを用い、DNA Ligation Kit ver 2.1 （タカラバイオ株式会社）を用いて4℃で一晩ライゲーション反応を行った。実施例2の（3）と同様に大腸菌JM109株の形質転換を行い、得られたコロニーよりプラスミドを調製した。得られたコロニーのひとつから調製したプラスミドを調べたところ、このプラスミドはpKR323から約2.8ｋｂのSacI断片が除かれたものであった。これをプラスミドpKR329と名付けた。
【００３３】
（４）欠失プラスミドpKR325の作製
プラスミドpKR321溶液1μlをXbaIで消化した。反応終了後、該反応液を65℃にて15分間の処理によりXbaIを失活させ、エタノール沈殿によりXbaI断片混合物を得、滅菌水に溶解した。この溶液は、約0.6ｋｂ、1.7ｋｂ、6.8ｋｂの3断片の混合物からなる。
該溶液１μｌを用い、DNA Ligation Kit ver 2.1 （タカラバイオ株式会社）を用いて4℃で一晩ライゲーション反応を行った。実施例2の（3）と同様に大腸菌JM109株の形質転換を行い、得られたコロニーよりプラスミドを調製した。
得られたコロニーのひとつから調製したプラスミドを調べたところ、このプラスミドはpKR321から約2.3kbのXbaI断片が除かれたものであった。これをプラスミドpKR325と名付けた。
【００３４】
（５）欠失プラスミドpKR326の作製
プラスミドpKR325溶液5μlをBamHIおよびBglIIで消化し、BamHI-BglII断片混合物を得、滅菌水に溶解した。この溶液は2.2ｋｂ、4.6ｋｂの2断片の混合物からなる。該溶液5μlを用い、DNA Ligation Kit ver 2.1 （タカラバイオ株式会社）を用いて4℃で一晩ライゲーション反応を行った。実施例2の（3）と同様に大腸菌JM109株の形質転換を行い、得られたコロニーよりプラスミドを調製した。
得られたコロニーのひとつから調製したプラスミドを調べたところ、このプラスミドはpKR325から約2.2ｋｂのBamHI-BglII断片が除かれたものであった。これをプラスミドpKR326と名付けた。
【００３５】
（６）欠失プラスミドpKR3211の作製
プラスミドpKR321溶液１μｌをXhoIで消化し、XhoI断片混合物を得、滅菌水に溶解した。この溶液は4断片の混合物からなる。該溶液１μｌを用い、DNA Ligation Kit ver 2.1 （タカラバイオ株式会社）を用いて4℃で一晩ライゲーション反応を行った。実施例2の（3）と同様に大腸菌JM109株の形質転換を行い、得られたコロニーよりプラスミドを調製した。得られたコロニーのひとつから調製したプラスミドを調べたところ、このプラスミドはpKR321から計約2.9kbの3つのXhoI断片が除かれたものであった。これをプラスミドpKR3211と名付けた。
【００３６】
（７）  欠失プラスミドを用いたATCC12674株の形質転換
欠失プラスミドを用いたロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC12674株の形質転換は実施例3と同様にして行った。その結果、形質転換に必須な領域はXbaI部位とBglII部位に挟まれる約2kbの断片にあることが明らかとなった。なお、図4は、上記のようしにて作製した、プラスミドpKR321からの欠失プラスミドの作製の流れを示している。図5には、プラスミドpKR321からの欠失プラスミドのロドコッカスロドクロウス（Rhodococcus  rhodochrous）ATCC12674株における複製の可否を示している。
【００３７】
（８）複製必須領域の塩基配列
上述のXbaI部位とBglII部位に挟まれる約２ｋｂ断片の塩基配列の決定は、ABI PRISM 3100を用いて行った。その結果、配列番号４に示される塩基配列が得られた。また、本配列中にひとつのORF(Open Reading Frame)が見いだされた。該ORFの塩基配列（配列番号3）およびアミノ酸配列（配列番号2）について、GenBankに対してホモロジー検索を行った結果、有意なホモロジーは見出されなかったことから、全く新規な複製系であると考えられた。
【００３８】
[実施例５]
2種のシャトルベクターpTP014とpKR326のロドコッカス（Rhodococcus）属細菌における共存
トリメトプリム耐性シャトルベクターpTP014を、実施例3と同様にしてロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC12674株に導入した。選択培地としては、トリメトプリム（200μg/ml）を含むM9-カザミノ酸寒天培地（KH2PO4 3g/L、Na2HPO4 6g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1g/L、グルコース 4g/L、チアミン−塩酸塩 2mg/L、MgSO4 (1mM)、カザミノ酸 2g/L、寒天15g/L）を用いた。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、プラスミドが導入されていることを確認した。pTP014は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に平成16年５月２６日付で寄託されており、その受託番号はFERM P-20065である。
次に、該形質転換体の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作成した。該コンピテントセルは-80℃で凍結保存した。該コンピテントセルを使用した以外は、実施例3と同様にしてプラスミドpKR326を用いて形質転換を行った。選択培地には75mg/lのカナマイシンを含むＭＹＫ寒天培地を用いた。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、両プラスミドの存在を確認した。
本シャトルベクターは、異なる複製系を有すると考えられるシャトルベクターpTP014と、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内で共存可能であることを確認した。
【００３９】
大腸菌とロドコッカス（Rhodococcus）属細菌において相互複製が可能な新規な複製系を有するシャトルベクターは、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌において、既存のベクターと共存可能なベクターであった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】プラスミドpRC032の制限酵素地図である。
【００４１】
【図２】プラスミドpHSG298の制限酵素地図である。
【００４２】
【図３】大腸菌−ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌シャトルベクターｐＫＲ３２１およびpKR322の制限酵素地図である。
【００４３】
【図４】プラスミドpKR321からの欠失プラスミドの作製の流れを示す図である。
【００４４】
【図５】プラスミドpKR321からの欠失プラスミドのロドコッカスロドクロウス（Rhodococcus  rhodochrous）ATCC12674株における複製の可否を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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