(57)【要約】【課題】  ヒト成長ホルモン変異体を提供する。【解決手段】  (a)hＧＨアミノ酸の１７２等が、(1)Ｒ、Ｓ、Ｆ、Ｒ等よりなる群から選択され、(b)アミノ酸１０等が、(1)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ等よりなる群から選択され、(c)アミノ酸の１７４がセリンであり、１７６がチロシンであり、そしてアミノ酸の１６７等が(1)Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ等よりなる群から選択され、(d)グルタメート174がセリン174によって置換され、フェニルアラニン176がチロシン176によって置換され、そして８個のアミノ酸が置換され、(e)(d)のhＧＨ変異体において、８個のアミノ酸Ｆ１０等が、(1)Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ等よりなる群から順に選択され、(f)(e)が、アルギニン15によって置換されたロイシン15およびアルギニン168によって置換され、(g)(e)が、フェニルアラニン176をさらに含有するヒト成長ホルモン変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸の１０、１４、１８および２１のそれぞれが、
（１）H、G、N、N；（２）A、W、D、N；（３）F、S、F、L；
（４）Y、T、V、N；および（５）I、N、I、N
よりなる群からグループとして順に選択されるヒト成長ホルモン変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルモン、薬物およびその他の小分子（特に、成長ホルモンなどの生物学的に活性な分子）などのタンパク質または非ペプチジル分子を模倣する治療用または診断用化合物の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
結合パートナーとは、通常は非共有性の相互作用によって互いに特異的に結合する物質である。結合パートナーの例には、リガンド−受容体、抗体−抗原、薬物−標的、および酵素−基質の相互作用が含まれる。結合パートナーは、治療および診断の両分野で極めて有用である。
【０００３】
過去において、結合パートナーは、天然からの収集（例えば、抗体−抗原、およびリガンド−受容体ペアリング）を含む種々の方法によって、および偶発的な同定（例えば、候補分子のランダムスクリーニングを用いる伝統的な薬物開発）によって調製されている。ある場合には、これら２種類の方法が組合せられている。例えば、結合に関与している鍵となる機能的残基を含むタンパク質またはポリペプチドの変異体（ポリペプチドフラグメントなど）が調製されている。次いで、これらのポリペプチドフラグメントは、伝統的な薬物開発と同種の方法によって誘導体化されている。このような誘導体化の例には、ポリペプチドフラグメントを立体配座的に制約して新規な候補結合パートナーを得るための環化などの方法が含まれるであろう。
【０００４】
従来の方法を用いたときの問題は、天然のリガンドがすべての治療学的応用に適した性質を有していないことがあることである。さらに、ポリペプチドリガンドは一部の標的物質に対して使用できないこともある。また、非天然の合成結合パートナーを製造するための方法は高価かつ困難であることが多く、通常はそれぞれの候補を得るために複雑な合成法を必要とする。候補分子をさらに最適化するために合理的な薬物設計法を適用することができるように、得られた候補の構造の特徴を調べることができないことが、これらの方法の一層の妨げとなっている。
【０００５】
これらの問題を克服しようとする試みにおいて、Geysen〔Immun.Today 6: 364-369 (1985)〕およびGeysenら〔Mol.Immun. 23: 709-715 (1986)〕は、体系的な反復結合パートナーの同定および製造のための骨組みを与えるポリペプチド合成の使用を提案した。Geysenら（同上）によると、初めにジペプチドなどの短いポリペプチドを、標的分子に結合する能力についてスクリーニングする。次いで、最も活性なジペプチドを次の試験用に選択する。この試験は、出発ジペプチドに別の残基を結合させ（または、最初の出発ジペプチドの構成成分を内部修飾することによる）、次いでこの一組の候補を所望の活性についてスクリーニングすることからなる。所望の性質を有する結合パートナーが同定されるまでこの過程を繰り返す。
【０００６】
Geysenらの方法は、その方法の基礎となっている化学、即ちペプチド合成が明白ではないかまたは変化に富んだ２次および３次構造を有する分子を生成するという不都合が障害となっている。選択の繰り返し回数が増えるにつれて、ランダムな相互作用がポリペプチドの種々の置換基の間で加速度的に増え、再現性ある高次構造を有する相互作用分子の真のランダム集団が得られなくなる。例えば、アミノ酸の側鎖（これらは配列的には大きく離れているが、空間的には隣接している）の間の相互作用が任意に起こる。さらに、立体配座的に安定な２次構造を促進しない配列は複雑なペプチド−側鎖の相互作用を与え、これがあるアミノ酸の標的分子との側鎖相互作用を妨げることもある。このような複雑な相互作用は、ポリペプチド候補のポリアミド骨格の柔軟性によって促進される。また、候補は多数の立体配座において存在することができ、最大の親和性または特異性を有する標的と相互作用するかまたはそれに結合する配座異性体の同定を困難にし、合理的な薬物設計を困難にする。
【０００７】
Geysenの反復ポリペプチド法を用いたときの最後の問題は、現在のところ、多様性の高い別種ペプチドを製造、スクリーニングおよび分析しうる実際的な方法が存在しないことである。２０種の天然アミノ酸を用いると、合成しなければならないヘキサペプチドのすべての組合せの合計数は６４,０００,０００である。このような多様性の高いペプチドを製造したとしても、このような多様性の高いペプチドの混合物を迅速にスクリーニングして標的分子に対して高い親和性を有するペプチドを選択することができる利用可能な方法が存在しない。現在のところ、それぞれの「付着」ペプチドは、タンパク質の配列決定を行なうに十分な多量で回収されなければならない。
【０００８】
Geysenの方法に固有の多くの問題を克服するために、生物学的な選択およびスクリーニングが代替法として選ばれた。生物学的な選択およびスクリーニングは、タンパク質機能の探索および所望の性質を有する変異タンパク質の単離のための強力な手段である〔Shortle, Protein Engineering, OxenderおよびFox編, A.R.Liss,Inc., NY, pp.103-108 (1988); およびBowieら, Science 247: 1306-1310 (1990)〕。しかし、得られる選択またはスクリーニングは、１つだけかまたは少数の関連タンパク質に適用できるにすぎない。
【０００９】
最近になって、Smithとその共同研究者〔Smith, Science 228: 1315-1317 (1985); およびParmleyおよびSmith, Gene 73: 305-318 (1985)〕は、短い遺伝子フラグメントをfdファージ（「融合ファージ」）の遺伝子III中に挿入することにより、小さなタンパク質フラグメント（１０〜５０アミノ酸）を線状ファージの表面に効率的に「表示（顕示）」させうることを示した。遺伝子IIIの副コートタンパク質（ビリオンの一方の末端に約５コピー存在する）は、適切なファージ組立ておよび大腸菌の線毛への付着による感染に重要である〔Raschedら, Microbiol.Rev. 50: 401-427 (1986)〕。最近、「融合ファージ」は、外性タンパク質〔Devlinら, Science 249: 404-406 (1990)〕または抗体〔Scottら, Science 249: 386-390 (1990); およびCwirlaら, Proc.Natl.Acad.USA 87: 6378-6382 (1990)〕と反応しうるペプチドを同定するための短い突然変異ペプチド配列を表示させるのに有用であることがわかった。
【００１０】
しかし、このような「融合ファージ」を、新規または増強された結合性を有する改変されたペプチドまたはタンパク質を同定するために使用する際には、いくつかの重要な制限が存在する。第１に、大きな挿入体は恐らくは遺伝子IIIの機能を破壊し、従ってファージの組立ておよび感染性を破壊するので、１００未満、好ましくは５０未満のアミノ酸残基のタンパク質を表示させるときにのみ融合ファージが有用であることが示されている〔Parmleyら, Gene 73: 305-318 (1988)〕。第２に、従来の方法は、標的分子に対して最大の結合親和性を有するライブラリーからペプチドを選択することができない。例えば、ランダムペプチドライブラリーを抗−βエンドルフィン モノクローナル抗体で徹底的に選別した後には、Cwirlaとその共同研究者はファージに融合させた高親和性ペプチド（Ｋd〜０.４μM）から中親和性ペプチド（Ｋd〜１０μM）を分離することができなかったであろう。さらに、極めて高い親和性（Ｋd〜７nM）を有する親のβ−エンドルフィンペプチド配列は、エピトープライブラリーから選別されなかった。
【００１１】
Ladner〔WO 90/02802〕は、ウイルス粒子および細胞の外側表面に表示された新規な結合タンパク質を選択するための方法を開示している（異種タンパク質は１６４個までのアミノ酸残基を有していてよいとされている）。この方法は、表示されたタンパク質を単離および増幅して標的分子に対して所望の親和性を有する新しい群の結合タンパク質を設計することを意図している。さらに具体的には、Ladnerは、Ｍ１３遺伝子IIIコートタンパク質に融合させた４６残基（クラムビン）から１６４残基（Ｔ４リソチーム）までの範囲の「最初のタンパク質結合ドメイン」を有するタンパク質を表示する「融合ファージ」を開示している。Ladnerは、比較的小さいアミノ酸配列に制限部位をアレンジするのは比較的容易であるので、「必要以上に大きくない」これらタンパク質の使用を教示し、５８アミノ酸残基のウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）を好んで用いている。ＢＰＴＩなどの小さい融合タンパク質は標的がタンパク質または巨大分子であるときに好ましく、一方、Ｔ４リソチームなどの比較的大きい融合タンパク質はステロイドなどの小さい標的分子に好ましいが、これはこのような大きいタンパク質が小さい分子を嵌め込むことができる裂け目および溝を有しているためである。この好ましいタンパク質ＢＰＴＩをSmithらまたはde la Cruzら〔J.Biol.Chem. 263: 4318-4322 (1988)〕が開示した遺伝子IIIの部位に、またはその末端の一方に、遺伝子IIIの第２の合成コピーと共に融合させて、「一部」の未改変遺伝子IIIタンパク質が存在するようにすることが提案されている。Ladnerは、従来技術の生物学的な選択およびスクリーニング法の障害となる、ランダムペプチドライブラリーから高親和性ペプチドを成功裏に選別する際の問題についてはふれていない。
【００１２】
ヒト成長ホルモン（hＧＨ）は、正常なヒトの成長および発達の調節に多大に関与している。この２２,０００ダルトンの脳下垂体ホルモンは、特に、線状成長（体形成）、泌乳、マクロファージの活性化、インスリン様および糖尿発生作用を含む多数の生物学的作用を示す〔Chawla,R.K., Ann.Rev,Med. 34: 519 (1983); Edwards,C.K.ら, Science 239: 769 (1988); Thomer,M.O.ら, J.Clin.Invest. 81: 745 (1988)〕。子供における成長ホルモンの欠損は小人症を導くが、これは１０年以上にわたるhＧＨの外部投与によって成功裏に治療されている。hＧＨは、胎盤ラクトゲン、プロラクチン、ならびに他の遺伝的および種的変異体または成長ホルモンを含む一群の相同ホルモンの一員である〔Nicoll,C.S.ら, Endocrine Reviews 7: 169 (1986)〕。hＧＨはこれらの中で独特であり、広い種特異性を示し、クローン化した体形成受容体〔Leung,D.W.ら, Nature 330: 537 (1987)〕またはプロラクチン受容体〔Boutin,J.M.ら, Ce 53: 69 (1988)〕に結合する。クローン化されたhＧＨの遺伝子は大腸菌において分泌型で発現されており〔Chang,C.N.ら, Gene 55: 189 (1987)〕、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告されている〔Goeddelら, Nature 281: 544 (1979); Grayら, Gene 39: 247 (1985)〕。hＧＨの３次元構造は利用することができない。しかし、ブタ成長ホルモン（pＧＨ）の３次元折り畳みパターンは普通の分解能および精度で報告されている〔Abdel-Meguid,S.S.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 6434 (1987)〕。ヒト成長ホルモンの受容体および抗体エピトープは、ホモログ-スキャニング突然変異誘発によって同定されている〔Cunninghamら, Science 243: 1330 (1989)〕。ヒスチジン１８とヒスチジン２１を含むヒト成長ホルモンのスプライスされた配列を含有する新規なアミノ末端メチオニル ウシ成長ホルモンの構造が示されている〔米国特許 No.4,880,910〕。
【００１３】
ヒト成長ホルモン（hＧＨ）は、種々の動物モデルにおいて線状骨格成長、泌乳、マクロファージの活性化、インスリン様および糖尿作用などを含む多種の生理学的および代謝作用を引き起こす〔R.K.Chawlaら, Annu.Rev.Med. 34: 519 (1983); O.G.P.Isakssonら, Annu.Rev.Physiol. 47: 483 (1985); C.K.Edwardsら, Science 239: 769 (1988); M.O.ThornerおよびM.L.Vance, J.Clin.Invest. 82: 745 (1988); J.P.HughesおよびH.G.Friesen, Ann.Rev.Physiol. 47: 469 (1985)〕。これらの生物学的作用は、hＧＨと特異的な細胞受容体の間の相互作用によって導かれる。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の目的は、成長ホルモン受容体および結合タンパク質に対してさらに強い親和性を示す成長ホルモン変異体の製造である。
【００１５】
上記の目的は、
(a)ポリペプチドをコードしている第１の遺伝子と天然または野生型ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子を含有する複製可能な発現ベクター（ここで、第１および第２の遺伝子は異種であり、転写調節要素が第１および第２の遺伝子に機能的に結合されており、従って融合タンパク質をコードしている遺伝子融合が得られる）を構築し；
(b)該ベクターの第１の遺伝子内の１またはそれ以上の選択した位置において突然変異を行なって一群の関連プラスミドを生成させ；
(c)該プラスミドで適当な宿主細胞を形質転換し；
(d)該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタンパク質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感染させ；
(e)該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換えファージミド粒子の形成に適切かつ宿主を形質転換しうる条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパク質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該条件を調節して、該形質転換して感染させた宿主細胞を培養し；
(f)該ファージミド粒子を標的分子と接触させて、ファージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合させ；そして
(g)結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離する；
ことからなる新規な結合ポリペプチドを選択するための方法を提供することによって達成した。この方法は、さらに、標的分子に結合する組換えファージミド粒子で適切な宿主細胞を形質転換し、工程(d)〜(g)を１またはそれ以上の回数繰り返す工程を含んでいるのが好ましい。
【００１６】
さらに、１を越えるサブユニットからなる新規な結合タンパク質を選択する方法を、次のように新規な結合ペプチドを選択することによって達成する：即ち、この選択法は、
・１またはそれ以上のサブユニットを含む所望のタンパク質をコードしているＤＮＡに機能的に結合させた転写調節要素を含有する複製可能な発現ベクター（ここで、該サブユニットの少なくとも１つをコードしているＤＮＡはファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしているＤＮＡに融合している）を構築し；
・１またはそれ以上の選択した位置において該所望のタンパク質をコードしているＤＮＡに突然変異を行なって一群の関連ベクターを生成させ；
・該ベクターで適当な宿主細胞を形質転換し；
・該形質転換した宿主細胞を該ファージコートタンパク質をコードしている遺伝子を有するヘルパーファージに感染させ；
・該プラスミドの少なくとも一部を含有する組換えファージミド粒子の形成に適切かつ宿主を形質転換しうる条件のもと、少量のファージミド粒子だけが融合タンパク質の１を越えるコピーを粒子の表面に表示するように該条件を調節して、該形質転換して感染させた宿主細胞を培養し；
・該ファージミド粒子を標的分子と接触させて、ファージミド粒子の少なくとも一部を該標的分子に結合させ；そして
・結合したファージミド粒子を未結合の粒子から分離する；
ことからなる。
【００１７】
本発明の方法においては、プラスミドが転写調節要素の厳格な制御下にあり、粒子の表面に融合タンパク質の１を越えるコピーを表示するファージミド粒子の量または数が約１％未満となるように培養条件が調節されているのが好ましい。      
【００１８】
また、融合タンパク質の１を越えるコピーを表示するファージミド粒子の量が、融合タンパク質の単一コピーを表示するファージミド粒子の量の１０％未満であるのが好ましい。最も好ましいのは、この量が２０％未満である。
【００１９】
通常、本発明の方法においては、発現ベクターはポリペプチドのそれぞれのサブユニットをコードしているＤＮＡに融合させた分泌シグナル配列をさらに含有し、転写調節要素はプロモーター系であろう。好ましいプロモーター系は、ＬacＺ、λPL、ＴＡＣ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスファターゼプロモーターならびにこれらの組合せから選択される。
【００２０】
また、第１の遺伝子は通常は哺乳動物タンパク質をコードしているであろう。好ましいタンパク質は次のものから選択されるであろう：ヒト成長ホルモン（hＧＨ）、Ｎ-メチオニル ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシン、糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）およびロイチナイジング（Leutinizing）ホルモン（ＬＨ）、糖タンパク質ホルモン受容体、カルシトニン、グルカゴン、因子VIII、抗体、肺表面活性物質、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、ボンベシン、因子IX、トロンビン、造血成長ホルモン、腫瘍壊死因子αおよびβ、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミン、ミュラー阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼ、組織因子タンパク質、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、ホルモンまたは成長因子の受容体；インテグリン、トロンボポエチン、プロテインＡまたはＤ、リウマトイド因子、神経成長因子、例えばＮＧＦ−β、血小板成長因子、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、インスリン様成長因子ＩおよびII、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ−４、ＤＮアーゼ、潜在性関連ペプチド、エリトロポエチン、骨誘導因子、インターフェロン、例えばインターフェロンα、βおよびγ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、スーパーオキシドジスムターゼ；崩壊促進因子、ウイルス抗原、ＨＩＶエンベロープタンパク質、例えばＧＰ１２０、ＧＰ１４０、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢまたはＣ、免疫グロブリン、ならびに上記タンパク質のいずれかのフラグメント。
【００２１】
好ましくは、第１の遺伝子は約１００以上のアミノ酸残基を含む１またはそれ以上のサブユニットのポリペプチドをコードしており、標的と相互作用しうる複数のアミノ酸を表示する複数の堅い２次構造を形成するように折り畳まれているであろう。好ましくは、第１の遺伝子は、堅い２次構造の完全性が保存されるように、標的と相互作用しうるアミノ酸にのみ対応するコドンのところで突然変異が為されているであろう。
【００２２】
通常、本発明の方法は、Ｍ１３ＫＯ７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３-ＶＣＳおよびＰhiＸ１７４から選択されるヘルパーファージを用いるであろう。好ましいヘルパーファージはＭ１３ＫＯ７であり、好ましいコートタンパク質はＭ１３ファージの遺伝子IIIコートタンパク質である。好ましい宿主は大腸菌であり、大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。本発明の方法によって選択される新規なhＧＨ変異体を検出した。このポリペプチドとファージコートタンパク質をコードしている核酸の間に機能的に設置した抑制可能な終止コドンを含有するファージミド発現ベクターを構築した。
【００２３】
以下の議論は、図１を参照することによって最も良く理解されるであろう。最も単純な形態においては、本発明の方法は、標的分子に対して所望の通常は高い親和性を有する新規な結合ポリペプチド（タンパク質リガンドなど）を構造的に関連した結合ポリペプチドのライブラリーから選択する方法からなる。ファージコートタンパク質に融合させた構造的に関連したポリペプチドのライブラリーは突然変異誘発によって調製し、好ましくはそれぞれの関連ポリペプチドの単一コピーを、該ポリペプチドをコードしているＤＮＡを含有するファージミド粒子の表面に表示（顕示）する。次いで、これらのファージミド粒子を標的分子と接触させ、標的に対して最も高い親和性を有する粒子を低親和性の粒子から分離する。次いで、高親和性の結合体を細菌宿主の感染によって増幅し、競合結合工程を繰り返す。所望の親和性のポリペプチドが得られるまでこの過程を繰り返す。
【００２４】
本発明の方法によって製造される新規な結合ポリペプチドまたはリガンドは、それ自体が生物学的有機体の処置において用いられる診断薬または治療薬（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）として有用である。また、選択したポリペプチドの構造分析を用いて合理的な薬物設計を進めることもできる。
【００２５】
本明細書において用いる「結合ポリペプチド」は、選択性の親和性でもって標的分子に結合するあらゆるポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドはタンパク質であり、最も好ましくは約１００以上のアミノ酸残基を含有するタンパク質である。通常、このポリペプチドはホルモンもしくは抗体またはそれらのフラグメントであろう。
【００２６】
本明細書において用いる「高親和性」は、生理学的条件下で＜１０-5M、好ましくは＜１０-7Mの親和定数（Ｋd）を意味する。
【００２７】
本明細書において用いる「標的分子」は、それに対してリガンドを製造するのが所望であるあらゆる分子であり、必ずしもタンパク質に限られない。しかし、この標的はタンパク質であるのが好ましく、最も好ましくは、この標的はホルモン受容体などの受容体である。
【００２８】
本明細書において用いる「ヒト化抗体」は、マウスまたは他の非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体のフレームワーク（枠組み構造）に結合している抗体を意味する。ヒト抗体のフレームワークはＣＤＲを除く全ヒト抗体を意味する。
【００２９】
Ｉ．ファージの表面に表示させるためのポリペプチドの選択
本発明の方法における第１の工程は、ファージの表面に表示させるためのポリペプチドの表面に露出される堅い２次構造を有するポリペプチドを選択することである。
【００３０】
本明細書において用いる「ポリペプチド」は、特異的なＤＮＡ配列によって発現させることができる任意の分子を意味する。本発明のポリペプチドは１を越えるサブユニットからなり、それぞれのサブユニットは別個のＤＮＡ配列によってコードされている。
【００３１】
本明細書において用いる「堅い２次構造」は、例えば、α−ヘリックス、３10ヘリックス、πヘリックス、平行および逆平行β−シート、ならびに逆ターンなどにおいて見い出される規則的な反復構造を示す任意のポリペプチドセグメントを意味する。また、認識しうる幾何秩序を欠くある種の「非秩序」構造も、それらが標的との相互作用が可能なアミノ酸残基のドメインまたは「パッチ」を形成し、構造の全体形状が構造中のアミノ酸の置換によって破壊されない限り、堅い２次構造の定義中に含まれる。ある種の非秩序構造は逆ターンの組合せであると考えられている。これら堅い２次構造の幾何は、ペプチド「骨格」のα−炭素のまわりのφおよびψねじれ角によって十分に定義される。
【００３２】
２次構造をポリペプチド表面に露出させるのに必要なことは、標的分子に対して露出され標的分子と結合することができるアミノ酸残基のドメインまたは「パッチ」を提供することである。これは基本的には突然変異誘発によって置換されるアミノ酸残基であり、この突然変異誘発によってファージの表面に表示される構造的に関連した（突然変異体）結合ポリペプチドの「ライブラリー」が得られ、これから新規なポリペプチドリガンドが選択される。通常、ポリペプチドの内部に向かうアミノ酸残基の突然変異誘発または置換は避けられ、これにより堅い２次構造の全体構造が保存される。堅い２次構造の内部領域のアミノ酸の、特に疎水性アミノ酸残基による置換の一部は、これら保存性の置換がポリペプチドの全体構造を歪めるようには考えられないので許容されるであろう。
【００３３】
「ポリペプチド」選択の繰返しサイクルを用い、複数の選択サイクルによって選択した複数のアミノ酸変化のファージミド選択によってさらに高い親和性の結合を選択する。第１ラウンドのファージミド選択（リガンドポリペプチド中のアミノ酸の選択または第１領域が関係する）に続いて、リガンドポリペプチドの他の領域またはアミノ酸において追加ラウンドのファージミド選択を行なう。リガンドポリペプチドの所望の親和性が達成されるまでこのファージミド選択サイクルを繰り返す。この方法を説明するために、実施例VIIIのhＧＨのファージミド選択をサイクルで行なった。第１サイクルにおいて、hＧＨのアミノ酸１７２、１７４、１７６および１７８に突然変異を行ない、ファージミドを選択した。第２サイクルにおいて、hＧＨのアミノ酸１６７、１７１、１７５および１７９をファージミド選択した。第３サイクルにおいて、hＧＨのアミノ酸１０、１４、１８および２１をファージミド選択した。先のサイクルからの最適アミノ酸変化は、次サイクルの選択の前にポリペプチド中に導入することができる。例えば、hＧＨのアミノ酸置換１７４（セリン）および１７６（チロシン）を、hＧＨのアミノ酸１６７、１７１、１７５および１７９のファージミド選択の前にhＧＨ中に導入した。
【００３４】
上記から、ポリペプチドの結合ドメインを形成するアミノ酸残基が連続的に結合したものではなく、ポリペプチドの異なるサブユニット上に存在していてよいことが理解されるであろう。即ち、結合ドメインは、結合部位における特定の２次構造をたどるものであって、１次構造をたどるものではない。従って、突然変異はポリペプチドの内部から外側へ向かう部位の特定の２次構造内のアミノ酸をコードしているコドンに導入して、それらが標的と相互作用する可能性を持つようにするのが普通である。説明のため、hＧＨ−結合タンパク質への結合を強力に変調させることが知られているhＧＨ中の残基の位置を図２に示す〔Cunninghamら, Science 247: 1461-1465 (1990)〕。即ち、突然変異誘発に適切な代表的な部位には、ヘリックス４の残基１７２、１７４、１７６および１７８、ならびに「非秩序」２次構造内の残基６４が含まれる。
【００３５】
ある標的に対するリガンドとして選択したポリペプチドが該標的に正常に結合する必要はない。即ち、例えばＴＳＨなどの糖タンパク質ホルモンをＦＳＨ受容体のリガンドとして選択することができ、突然変異ＴＳＨ分子のライブラリーを本発明の方法に用いて新規な薬物候補を得る。
【００３６】
即ち、本発明は標的分子に結合する任意のポリペプチドを意図したものであり、抗体を包含している。好ましいポリペプチドは医薬用途を有しているポリペプチドである。さらに好ましいポリペプチドには次のものが含まれる：即ち、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン、デス−Ｎ−メチオニル ヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンを含む）；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；チロキシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；ロイチナイジング ホルモン；グルカゴン；因子VIII；抗体；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子〔例えば、ウロキナーゼまたはヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）〕；ボンベシン；因子IX；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）；ミュラー阻害物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質（例えば、β−ラクタマーゼ）；組織因子タンパク質；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；ホルモンまたは成長因子の受容体；インテグリン；トロンボポエチン；プロテインＡまたはＤ；リウマトイド因子；神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板由来の成長因子；線維芽細胞成長因子（例えば、aＦＧＦおよびbＦＧＦ）；表皮成長因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様成長因子ＩおよびII；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−４；ＤＮアーゼ；潜在性関連ペプチド；エリトロポエチン；骨誘導因子；インターフェロン（例えば、インターフェロンα、βおよびγ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４）；スーパーオキシドジスムターゼ；崩壊促進因子；心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢまたはＣ；ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶエンベロープの一部）；免疫グロブリン；ならびに上記ポリペプチドのいずれかのフラグメントである。さらに、ポリペプチド上の１またはそれ以上の予め決定したアミノ酸残基に置換、挿入または削除を行なって、例えば改善された生物学的性質を有する生成物を得ることができる。また、これらポリペプチドのフラグメント、特に生物学的に活性なフラグメントが包含される。本発明のさらに好ましいポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢおよびＣ、エンドトキシン、スブチリシン、トリプシン、ならびに他のセリンプロテアーゼ類である。
【００３７】
さらに好ましいポリペプチドホルモンは、第１の細胞において産生される任意のアミノ酸配列であって、同じ細胞種（自己分泌ホルモン）または第２の細胞種（非自己分泌）上の受容体に特異的に結合し、受容体保持細胞に特徴的な生理学的反応を引き起こすアミノ酸配列として定義しうるポリペプチドホルモンである。このようなポリペプチドホルモンには、サイトカイン類、リンホカイン類、神経栄養ホルモンおよび脳下垂体腺ポリペプチドホルモン、例えば成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、チロトロピン、絨毛ゴナドトロピン、コルチコトロピン、αまたはβ−メラノサイト刺激ホルモン、β−リポトロピン、γ−リポトロピンおよびエンドルフィン類；視床下部放出抑制ホルモン、例えばコルチコトロピン放出因子、成長ホルモン放出抑制ホルモン、成長ホルモン放出因子；ならびに心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢおよびＣなどの他のポリペプチドホルモンが含まれる。
【００３８】
II．所望のポリペプチドをコードしている第１遺伝子（遺伝子１）の入手
所望のポリペプチド（即ち、堅い２次構造を有するポリペプチド）をコードしている遺伝子は、当分野で既知の方法によって得ることができる〔一般には、Sambrookら, Molecular Biology: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)を参照〕。この遺伝子の配列が既知である場合には、この遺伝子をコードしているＤＮＡを化学的に合成してもよい〔Merrfield, J.Am.Chem.Soc. 85: 2149 (1963)〕。この遺伝子の配列が未知である場合、またはこの遺伝子がそれまでに単離されていない場合には、cＤＮＡライブラリー（所望の遺伝子が発現される適当な組織から得たＲＮＡから調製する）から、または適当なゲノムＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。次いで、適当なプローブを用いて遺伝子を単離する。cＤＮＡライブラリーのための適当なプローブには、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体（ただし、ｃＤＮＡライブラリー発現ライブラリーであるとき）、オリゴヌクレオチド、および相補性もしくは相同性cＤＮＡまたはそれらのフラグメントが含まれる。ゲノムＤＮＡライブラリーから所望の遺伝子を単離するのに用いることができるプローブには、同一もしくは類似の遺伝子をコードしているcＤＮＡもしくはそのフラグメント、相同なゲノムＤＮＡもしくはＤＮＡフラグメント、およびオリゴヌクレオチドが含まれる。選択したプローブによるcＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrookら（上記）の第１０〜１２章に記載されている標準法を用いて行なう。
【００３９】
所望のタンパク質をコードしている遺伝子を単離するための別の方法は、Sambrookら（上記）のセクション１４に記載されているポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用することである。この方法は、所望の遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。即ち、オリゴヌクレオチドを得るために、この遺伝子のＤＮＡ配列の少なくと一部が既知でなければならない。
遺伝子を単離した後、これをSambrookら（上記）が一般的に記載しているように増幅用の適当なベクター（好ましくは、プラスミド）中に挿入することができる。
【００４０】
III．複製可能な発現ベクターの構築
いくつかの型のベクターが利用可能であり、本発明の実施に用いることができるが、プラスミドベクターが本発明において使用するに好ましいベクターである。これは、これらベクターを比較的容易に構築することができ、容易に増幅することができるためである。一般にプラスミドベクターは、当業者には既知のように、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位、および他の必要な成分を含む種々の構成成分を含有している。
【００４１】
原核性ベクターにおいて最も普通に用いられるプロモーターには、lacＺプロモーター系、アルカリホスファターゼphoＡプロモーター、バクテリオファージλＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、tacプロモーター（lacリプレッサーによって調節されるハイブリッドtrp-lacプロモーター）、トリプトファンプロモーター、およびバクテリオファージＴ７プロモーターが含まれる。プロモーターの全般的な説明については、Sambrookら（上記）のセクション１７を参照。最もよく用いられるプロモーターが存在するが、他の適当な微生物プロモーターも同様に用いることができる。
【００４２】
本発明の実施に好ましいプロモーターは、融合遺伝子の発現を制御しうるように厳格に調節することができるプロモーターである。従来技術において認識されないままであった問題は、ファージミド粒子の表面における融合タンパク質の複数コピーの表示がファージミドと標的との複数点結合を導くことであったと考えられる。「キレート作用」と呼ばれるこの作用は、融合タンパク質の複数コピーが互いにすぐ近接してファージミド粒子上に表示されて標的が「キレート化」されたときに、誤った「高親和性」ポリペプチドを選択する結果を与えると考えられる。複数点結合が起こったときには、有効または見掛けＫdは表示された融合タンパク質のそれぞれのコピーに対する個々のＫdの積と同程度に高いであろう。この作用が、Cwirlaとその共同研究者（上記）が比較的高親和性のペプチドから中親和性のペプチドを分離できなかった理由であるのかもしれない。
【００４３】
少量（即ち、約１％よりも少ない）のファージミド粒子だけが複数コピーの融合タンパク質を含有するように融合タンパク質の発現を厳格に調節することによって、「キレート作用」が克服され、高親和性のポリペプチドの適切な選択が可能になることを発見した。即ち、プロモーターに依存して、宿主の培養条件を調節して単一コピーの融合タンパク質を含有するファージミド粒子の数を最大にし、複数コピーの融合タンパク質を含有するファージミド粒子の数を最少にする。
【００４４】
本発明の実施に用いられる好ましいプロモーターは、lacＺプロモーターおよびphoＡプロモーターである。このlacＺプロモーターはlacリプレッサータンパク質lac iによって調節され、従って融合遺伝子の転写をlacリプレッサータンパク質の量の操作によって制御することができる。説明のためであるが、このlacＺプロモーターを含有するファージミドは、lacＺプロモーターのリプレッサーであるlac iリプレッサー遺伝子のコピーを含有する細胞株中で増殖させる。lac i遺伝子を含有する細胞株の例には、ＪＭ１０１およびＸＬ１-Blueが含まれる。別法によれば、リプレッサーlac iおよびlacＺプロモーターの両方を含有するプラスミドで宿主細胞を同時トランスフェクトすることができる。ときには上記方法の両方を同時に用いる。即ち、lacＺプロモーターを含有するファージミド粒子をlac i遺伝子を含有する細胞株中で増殖させ、この細胞株をlacＺおよびlac i遺伝子の両方を含有するプラスミドで同時トランスフェクトする。通常、上記のトランスフェクトされた宿主に遺伝子を発現させたいときには、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）などの誘導物質を加える。しかし、本発明においては、この工程を割愛して、(a)遺伝子III融合タンパク質の発現を最少にしてコピー数を最少にし（即ち、ファージミド数に対する遺伝子III融合体の数）、そして、(b)低濃度であってもＩＰＴＧなどの誘導物質によって引き起こされるファージミドの劣るかまたは不適切なパッケージングを防止する。通常、誘導物質を加えないときには、ファージミド粒子あたりの融合タンパク質の数は約０.１である（バルク融合タンパク質の数／ファージミド粒子の数）。本発明の実施に用いられる最も好ましいプロモーターはphoＡである。このプロモーターは細胞中の無機リン酸の量によって調節されると考えられており、このリン酸がプロモーターの活性を下方調節する。即ち、細胞のリン酸を減少させることによって、プロモーターの活性を高めることができる。所望の結果は、２ＹＴまたはＬＢなどのリン酸に富む培地で細胞を増殖させ、遺伝子III融合体の発現を制御することによって達成される。
【００４５】
本発明の実施に用いられるベクターの他の有用な成分はシグナル配列である。通常、この配列は融合タンパク質をコードしている遺伝子のすぐ５′側に位置しており、従って融合タンパク質のアミノ末端に転写される。しかし、ある種の場合には、このシグナル配列は、分泌させようとするタンパク質をコードしている遺伝子の他の５′の位置に存在することが示されている。この配列は、細菌細胞の内部膜を越えてこの配列が結合しているタンパク質を標的とする。このシグナル配列をコードしているＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードしている任意の遺伝子から制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして得ることができる。適当な原核性シグナル配列は、例えば、ＬamＢもしくはＯmpＦ〔Wongら, Gene 68: 193 (1983)〕、ＭalＥ、ＰhoＡおよびその他の遺伝子をコードしている遺伝子から得ることができる。本発明の実施に好ましい原核性シグナル配列は、Changら〔Gene 55: 189 (1987)〕が記載している大腸菌の熱安定性エンテロトキシンII（ＳＴII）シグナル配列である。
【００４６】
本発明の実施に用いられるベクターの別の有用な成分は、表現型選択遺伝子である。通常の表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードしている遺伝子である。説明のためのものであるが、アンピシリン耐性遺伝子（amp）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）がこの目的に使用するのが容易である。
【００４７】
上記の成分ならびに所望のポリペプチドをコードしている遺伝子（遺伝子１）を含有する適当なベクターの構築は、Sambrookら（上記）が記載している標準的な組換えＤＮＡ法を用いて行なう。ベクターを形成させるために結合される単離したＤＮＡフラグメントを切断し、加工し、そして特定の順序および配向で一緒に連結して所望のベクターを創製する。
【００４８】
適当な緩衝液中で適当な制限酵素または酵素群を用いてＤＮＡを切断する。通常、約２０μlの緩衝溶液において、約０.２〜１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約１〜２単位の適当な制限酵素と共に用いる。適当な緩衝液、ＤＮＡ濃度、ならびにインキュベート時間および温度は、制限酵素の製造元によって指定されている。通常、３７℃で約１または２時間のインキュベート時間が適切であるが、いくつかの酵素はさらに高い温度を必要とする。インキュベート後に、酵素および他の不純物をフェノールとクロロホルムの混合物による消化溶液の抽出によって除去し、ＤＮＡをエタノールによる沈澱によって水性分画から回収する。
【００４９】
ＤＮＡフラグメントを共に連結して機能的なベクターを得るためには、これらＤＮＡフラグメントの末端を互いに適合させなければならない。ある場合には、エンドヌクレアーゼ消化の後にこれら末端はそのままで適合性である。しかし、これらを連結に対して適合するようにするために、通常はエンドヌクレアーゼ消化によって生成する接着末端を初めに平滑末端に変換することが必要になることもある。末端を平滑にするために、ＤＮＡを、適当な緩衝液中、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下に１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（クレノウ）を用いて１５℃で少なくとも１５分間処理する。次いで、このＤＮＡのフェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈澱により精製する。
【００５０】
ＤＮＡゲル電気泳動を用いて、切断したＤＮＡフラグメントをサイズ分離し、選択することができる。アガロースまたはポリアクリルアミドマトリックスのどちらかによりＤＮＡを電気泳動することができる。マトリックスの選択は、分離しようとするＤＮＡフラグメントのサイズに依存するであろう。電気泳動の後、Sambrookら（上記）のセクション６.３０〜６.３３の記載のように、電気溶離によって、または、低溶融アガロースをマトリックスとして使用したときにはアガロースの溶融とそれからのＤＮＡの抽出によって、ＤＮＡをマトリックスから抽出する。
【００５１】
共に連結しようとするＤＮＡフラグメント（連結しようとするそれぞれのフラグメントの末端が適合するように適切な制限酵素により予め消化）を、ほぼ等しい量で溶液に入れる。この溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液およびリガーゼ、例えば０.５μgのＤＮＡあたり約１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼをも含んでいるであろう。ＤＮＡフラグメントをベクター中に連結するときには、最初にこのベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼ（群）で切断することによって直線化する。次いで、この直線化したベクターをアルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼで処理する。このホスファターゼ処理は連結工程中のベクターの自己連結を防止する。
【００５２】
連結の後、外来遺伝子が挿入されているベクターを適当な宿主細胞に導入する。原核生物が本発明に好ましい宿主細胞である。適当な原核性宿主細胞には、大腸菌株ＪＭ１０１、大腸菌Ｋ１２株２９４（ATCC No.31,446）、大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC No.27,325）、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC No.31,537）、大腸菌ＸＬ-１Ｂlue（stratagene）、および大腸菌Ｂが含まれるが、大腸菌の他の多数の株（例えば、ＨＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９）、ならびに他の多数の原核生物の属および種も同様に用いることができる。上に挙げた大腸菌株に加えて、バチルス（例えば、Bacillus Subtilis）、他の腸内細菌（例えば、Salmonella typhimuriumあるいはSerratia marcesans）、および種々のPseudomonas種もすべて宿主として使用することができる。
【００５３】
原核細胞の形質転換は、Sambrookら（上記）のセクション１.８２に記載の塩化カルシウム法を用いて容易に達成される。別法によれば、電気穿孔法〔Neumannら, EMBO J. 1: 841 (1982)〕を用いてこれら細胞を形質転換することができる。通常はテトラサイクリン（tet）またはアンピシリン（amp）などの抗生物質上で増殖させることによって、形質転換した細胞を選択する（形質転換細胞は、ベクター上のtetおよび／またはamp耐性遺伝子の存在によりこれら抗生物質に対して耐性になっている）。
【００５４】
形質転換細胞の選択の後、これら細胞を培養増殖させ、次いでプラスミドＤＮＡ（または、外来遺伝子が挿入された他のベクター）を単離する。プラスミドＤＮＡは当分野で既知の方法を用いて単離することができる。２つの適当な方法は、Sambrookら（上記）のセクション１.２５〜１.３３に記載されている小スケールのＤＮＡ調製および大スケールのＤＮＡ調製である。単離したＤＮＡは、Sambrookら（上記）のセクション１.４０に記載されている方法のような当分野で既知の方法によって精製することができる。次いで、この精製したプラスミドＤＮＡを、制限マッピングおよび／またはＤＮＡ配列決定によって分析する。通常、ＤＮＡの配列決定は、Messingら〔Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981)〕の方法またはMaxamら〔Meth.Enzymol. 65: 499 (1980)〕の方法のいずれかによって行なう。
【００５５】
IV．遺伝子の融合
本発明は、転写中に融合タンパク質が生成するように、所望のポリペプチドをコードしている遺伝子（遺伝子１）を第２の遺伝子（遺伝子２）に融合させることを意図している。通常、遺伝子２はファージのコートタンパク質遺伝子であり、ファージＭ１３の遺伝子IIIコートタンパク質またはそのフラグメントであるのが好ましい。遺伝子１および２の融合は、遺伝子１を含むプラスミド上の特定の部位に遺伝子２を挿入することによって、または遺伝子２を含むプラスミド上の特定の部位に遺伝子１を挿入することによって達成することができる。
【００５６】
プラスミド中への遺伝子の挿入は、遺伝子を挿入しようとする正確な位置においてプラスミドが切断されることを必要とする。即ち、この位置に制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない（制限エンドヌクレアーゼ消化中にプラスミドが１カ所でのみ切断されるように唯一の部位であるのが好ましい）。上記のようにプラスミドを消化し、ホスファターゼ処理し、精製する。次いで、２つのＤＮＡを共に連結することによって、この直線化したプラスミドに遺伝子を挿入する。プラスミドの末端が挿入しようとする遺伝子の末端に適合するときに、連結を達成することができる。制限酵素を用いてプラスミドを切断し、挿入すべき遺伝子を単離するときには（平滑末端または適合性の接着末端を創製する）、Sambrookら（上記）のセクション１.６８の記載のように、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを用い、ＡＴＰおよびリガーゼ緩衝液の存在下に混合物を１６℃で１〜４時間インキュベートすることによって、ＤＮＡを直接一緒に連結することができる。末端が適合性ではないときには、最初にこれらを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントあるいはバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（これらは、消化されたＤＮＡの突出１本鎖末端を充填するために４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸を必要とする）の使用によって平滑にしなければならない。別法によれば、これら末端を、ヌクレアーゼＳ１あるいは緑豆ヌクレアーゼ（これらは、ＤＮＡの突出１本鎖を後退切断することによって機能する）などのヌクレアーゼを用いて平滑にすることができる。次いで、ＤＮＡを上記のリガーゼを用いて連結する。ある場合には、暗号領域の読み枠が変化するので、挿入すべき遺伝子の末端を平滑にすることができないこともある。この問題を克服するために、オリゴヌクレオチドリンカーを用いてもよい。このリンカーは、プラスミドと挿入すべき遺伝子を接続する橋となる。これらリンカーは、常法を用いて２本鎖または１本鎖ＤＮＡとして合成により調製することができる。これらリンカーは、挿入すべき遺伝子の末端に適合する一方の末端を有しており、上記の連結法を用いて初めにこの遺伝子に連結する。リンカーの他の末端は、連結用のプラスミドに適合するように設計されている。リンカーを設計する際には、挿入すべき遺伝子の読み枠またはプラスミド上に含まれる遺伝子の読み枠を破壊しないように注意しなければならない。ある場合には、これらがアミノ酸の一部をコードするように、または１またはそれ以上のアミノ酸をコードするようにリンカーを設計することが必要になることもある。
【００５７】
遺伝子１と遺伝子２の間に終止コドンをコードしているＤＮＡを挿入することもできる。このような終止コドンはＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）およびＵＧＡ（オペル）である〔Davisら, Microbiology, Harper & Row, New York, pp.237, 245-47および274 (1980)〕。野生型宿主細胞において発現される終止コドンは、遺伝子２のタンパク質の結合していない遺伝子１のタンパク質産物の合成の結果を与える。しかし、サプレッサー宿主細胞中での増殖は検出可能な量の融合タンパク質の合成の結果を与える。このようなサプレッサー宿主細胞は、mＲＮＡの終止コドン位置にアミノ酸を挿入するように修飾されたtＲＮＡを含有しており、従って検出可能な量の融合タンパク質を産生する結果を与える。このようなサプレッサー宿主細胞は、例えば大腸菌のサプレッサー株〔Bullockら, Bio Techniques 5: 376-379 (1987)〕のように周知であり、開示されている。任意の受け入れられている方法を用いて、このような終止コドンを融合ポリペプチドをコードしているmＲＮＡ中に設置することができる。
【００５８】
この抑制可能なコドンを、ポリペプチドをコードしている第１の遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子の間に挿入することができる。別法によれば、この抑制可能な終止コドンを、ポリペプチド中の最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質中の最初のアミノ酸の置換によって融合部位に隣接して挿入することができる。この抑制可能なコドンを含有しているファージミドをサプレッサー宿主細胞中で増殖させると、ポリペプチドとコートタンパク質を含有する融合ポリペプチドが検出可能に産生される結果が得られる。このファージミドを非サプレッサー宿主細胞中で増殖させると、ＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡをコードしている挿入された抑制可能なトリプレットのところでの終止により、ファージコートタンパク質に融合していないポリペプチドが実質的に合成される。非サプレッサー細胞においては、ポリペプチドが合成され、融合したファージコートタンパク質（他の方法ではポリペプチドを宿主細胞に固定する）が存在しないことにより宿主細胞から分泌される。
【００５９】
Ｖ．選択した位置における遺伝子１の改変（突然変異）
所望のポリペプチドをコードしている遺伝子１を、１またはそれ以上の選択したコドンにおいて改変することができる。改変は、ポリペプチドをコードしている遺伝子中の１またはそれ以上のコドンの置換、削除または挿入と定義される。この改変によって、同じポリペプチドの未改変または天然の配列と比較してポリペプチドのアミノ酸配列が変化することになる。好ましくは、この改変は、分子の１またはそれ以上の領域において少なくとも１個のアミノ酸を他のいずれかのアミノ酸で置換することによる。この改変は、当分野で既知の種々の方法によって行なうことができる。これらの方法には、オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発およびカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定はされない。
【００６０】
Ａ．オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発
オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発は、遺伝子１の置換、削除および挿入変異体を調製するのに好ましい方法である。この方法は、Zollerら〔Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987)〕が記載しているように当分野で周知である。簡単に説明すると、未改変または天然のＤＮＡ配列の遺伝子１を含有するプラスミドの１本鎖形のＤＮＡ鋳型に所望の突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって遺伝子１を改変する。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、該オリゴヌクレオチドプライマーが導入されて遺伝子１中の選択した改変をコードしている、この鋳型の完全な第２相補鎖を合成する。
【００６１】
通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを用いる。最適オリゴヌクレオチドは、突然変異をコードしているヌクレオチド（群）の両側に鋳型に完全に相補性である１２〜１５ヌクレオチドを有するものであろう。これにより、オリゴヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡ鋳型分子に適切にハイブリダイズすることが確実になる。このオリゴヌクレオチドは、当分野で既知の方法、例えばCreaら〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75: 5765 (1978)〕が記載している方法を用いて容易に合成される。
【００６２】
このＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクター（市販品から入手可能なＭ１３mp１８およびＭ１３mp１９ベクターが適当である）から導かれるベクター、またはVeiraら〔Meth.Enzymol. 153: 3 (1987)〕が記載しているような一本鎖ファージ複製起点を含有するベクターによってのみ得ることができる。即ち、突然変異を行なうべきＤＮＡは、１本鎖の鋳型を創製するために、これらベクターのいずれかに挿入しなければならない。１本鎖鋳型の調製はSambrookら（上記）のセクション４.２１〜４.４１に記載されている。
【００６３】
天然のＤＮＡ配列を改変するために、このオリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条件のもとで一本鎖の鋳型とハイブリダイズさせる。次いで、ＤＮＡ重合酵素、通常はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを加え、このオリゴヌクレオチドを合成のためのプライマーとして用いて鋳型の相補鎖を合成する。このようにして、ＤＮＡの一方の鎖が遺伝子１の突然変異形をコードしており、他方の鎖（最初の鋳型）が遺伝子１の天然の未改変配列をコードしているヘテロ２本鎖分子が形成される。次いで、このヘテロ２本鎖分子を適当な宿主細胞、通常は大腸菌ＪＭ１０１などの原核生物に導入する。この細胞を増殖させた後、アガロースプレートにプレーティングし、３２-リン酸で放射標識したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングして、突然変異したＤＮＡを含有する細菌コロニーを同定する。
【００６４】
すぐ上に記載した方法を、プラスミドの両方の鎖が突然変異（群）を含むヘテロ２本鎖分子が創製されるように修飾することができる。この修飾は次のようである。１本鎖のオリゴヌクレオチドを上記のように１本鎖鋳型にアニールさせる。３種のデオキシリボヌクレオチド、即ちデオキシリボアデノシン（dＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（dＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（dＴＴＰ）の混合物を、dＣＴＰ-（aＳ）と呼ばれる修飾されたチオ-デオキシリボシトシン（Amershamから入手することができる）と混合する。この混合物を鋳型-オリゴヌクレオチドのコンプレックスに加える。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを加えると、突然変異した塩基を除いて鋳型と同一のＤＮＡ鎖が創製される。さらに、この新規なＤＮＡ鎖はdＣＴＰの代わりにdＣＴＰ-（aＳ）を含有しており、これがこの鎖を制限エンドヌクレアーゼ消化から保護するように働く。ヘテロ２本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、この鋳型鎖を、突然変異すべき部位（群）を含む領域を越えてＥxoIIIヌクレアーゼまたは別の適当なヌクレアーゼで消化することができる。次いで、この反応を停止させて一部だけが１本鎖である分子を残す。次いで、４種すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全なＤＮＡホモ２本鎖を形成させる。次いで、このホモ２本鎖分子を、上記のように大腸菌ＪＭ１０１などの適当な宿主細胞に導入することができる。
【００６５】
１を越える置換すべきアミノ酸を有する突然変異体は、いくつかの方法のいずれかにより創製することができる。これらアミノ酸がポリペプチド鎖中に互いに近接して存在しているときには、所望のアミノ酸置換のすべてをコードしている１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異させることができる。しかし、アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて存在しているときには（約１０以上のアミノ酸によって隔てられている）、所望の変化のすべてをコードしている単一のオリゴヌクレオチドを創製するのは比較的困難である。これに代えて、２種類の異なる方法のいずれかを用いることができる。
【００６６】
第１の方法においては、独立したオリゴヌクレオチドを置換すべきアミノ酸のそれぞれに対して創製する。次いで、これらオリゴヌクレオチドを１本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールさせると、この鋳型から合成される第２のＤＮＡ鎖は所望のアミノ酸置換のすべてをコードしているであろう。この第１のラウンドは単一突然変異について説明したものと同じである。即ち、野生型ＤＮＡを鋳型に用い、第１の所望のアミノ酸置換（群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせ、次いでヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子を創製する。突然変異誘発の第２ラウンドは、第１ラウンドの突然変異誘発で得られた突然変異ＤＮＡを鋳型として用いる。即ち、この鋳型は既に１またはそれ以上の突然変異を含んでいる。次いで、別の所望のアミノ酸置換（群）をコードしているオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールさせると、得られるＤＮＡ鎖は第１および第２ラウンドの突然変異誘発の両方に由来する突然変異をコードしている。この得られたＤＮＡを、第３ラウンドの突然変異誘発における鋳型などとして用いることができる。
【００６７】
Ｂ．カセット突然変異誘発
この方法も遺伝子１の置換、削除および挿入変異体を調製するのに好ましい方法である。この方法は、Wellsら〔Gene 34: 315 (1985)〕の記載の方法に基づいている。出発材料は、突然変異させようとする遺伝子である遺伝子１を含有するプラスミド（または、他のベクター）である。突然変異させようとする遺伝子１中のコドンは決定されている。決定された突然変異部位（群）の両側に唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない。このような制限部位が存在していなければ、上記のオリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発法を用いてこれら部位を創製し、遺伝子１中の適当な位置に導入することができる。プラスミド中に制限部位を導入した後、プラスミドをこれら部位のところで切断して直線化する。これら制限部位の間のＤＮＡ配列をコードしており、そして所望の突然変異を含んでいる２本鎖オリゴヌクレオチドを常法により合成する。この２本の鎖は別々に合成し、次いで常法により一緒にハイブリダイズさせる。この２本鎖のオリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。このカセットは直線化したプラスミドの両末端に適合する３′および５′末端を有するように設計して、これをプラスミドに直接連結できるようにする。これにより、このプラスミドは遺伝子１の突然変異ＤＮＡ配列を含むことになる。
【００６８】
VI．所望のタンパク質をコードしているＤＮＡの調製
別の態様においては、本発明は１またはそれ以上のサブユニットを含有する所望のタンパク質の変異体の製造を意図するものである。通常、それぞれのサブユニットは別の遺伝子によってコードされている。それぞれのサブユニットをコードしているそれぞれの遺伝子は、当分野で既知の方法によって得ることができる（例えば、セクションIIを参照）。ある場合には、セクションIIに記載した任意の方法から選択した独立した複数の方法を用いて、種々のサブユニットをコードしている遺伝子を得るのが必要であることもある。
【００６９】
所望のタンパク質が１を越えるサブユニットを含有している複製可能な発現ベクターを構築するときには、すべてのサブユニットを、通常はサブユニットをコードしているＤＮＡの５′側に位置する同一のプロモーターによって調節するか、または各サブユニットを、ベクター中で適切に配向された独立したプロモーターであってそれぞれのプロモーターが調節しようとするＤＮＡに機能的に連結されたプロモーターによって調節することもできる。プロモーターの選択は上記セクションIIIの記載のように行なう。
【００７０】
複数サブユニットを有する所望のタンパク質をコードしているＤＮＡを含有する複製可能な発現ベクターを構築する際には図１０を参照すべきであり、この図には説明のためにベクターが図示されており、抗体フラグメントの各サブユニットをコードしているＤＮＡが示されている。この図は、通常、所望のタンパク質のサブユニットの１つがＭ１３遺伝子IIIなどのファージコートタンパク質に融合されることを示している。通常、この遺伝子融合体はそれ自体のシグナル配列を含有しているであろう。別の遺伝子が他のサブユニットまたはサブユニット群をコードしており、各サブユニットが通常はそれ自体のシグナル配列を有していることがわかる。また、図１０は、単一のプロモーターが両サブユニットの発現を調節しうることを示している。これとは異なり、各サブユニットが異なるプロモーターによって独立して調節されていてもよい。所望のタンパク質サブユニット-ファージコートタンパク質の融合構築物は、上記セクションIVの記載のように調製することができる。
【００７１】
所望の複数サブユニットタンパク質の一群の変異体を構築するときには、ベクター中の各サブユニットをコードしているＤＮＡを、各サブユニット中の１またはそれ以上の位置において突然変異させてもよい。複数サブユニットの抗体変異体が構築されるときには、好ましい突然変異誘発部位は、軽鎖、重鎖または両鎖のいずれかの相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基をコードしているコドンに一致する。通常、このＣＤＲは超可変領域と呼ばれている。所望のタンパク質の各サブユニットをコードしているＤＮＡを突然変異させる方法は、実質的に上記セクションＶの記載のように実施する。
【００７２】
VII．標的分子の調製およびファージミドとの結合
受容体などの標的タンパク質は、当分野で既知の方法により、天然供給源から単離するかまたは組換え法によって調製することができる。例示すると、糖タンパク質ホルモン受容体はMcFarlandら〔Science 245: 494-499 (1989)〕が記載している方法によって調製することができ、大腸菌中で発現させた非グリコシル化型はFuhら〔J.Biol.Chem. 265: 3111-3115 (1990)〕が記載している。他の受容体は常法によって調製することができる。
【００７３】
精製した標的タンパク質を、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリル系コポリマー、メタクリル酸ヒドロキシアルキル、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸コポリマー、ナイロン、中性およびイオン性担体などの適当なマトリックスに結合させることができる。マトリックスへの標的タンパク質の結合は、文献〔Methods in Enzymology 44 (1976)〕に記載の方法によって、または当分野で既知の他の手段によって行なうことができる。
【００７４】
マトリックスに標的タンパク質を結合させた後、固定化した標的を、ファージミド粒子の少なくとも一部を固定化標的と結合させるに適切な条件下で、ファージミド粒子のライブラリーと接触させる。通常、ｐH、イオン強度、温度などを含む条件は生理学的条件に類似したものであろう。
【００７５】
固定化標的に対して高親和性を有する結合ファージミド粒子（「結合体」）を、洗浄により低親和性の粒子（従って、標的に結合しない粒子）から分離する。結合体は種々の方法によって固定化標的から解離させることができる。これら方法には、野生型リガンド、ｐHおよび／またはイオン強度の変更を用いる競合解離、ならびに当分野で既知の方法が含まれる。
【００７６】
適当な宿主細胞を結合体とヘルパーファージに感染させ、この宿主細胞をファージミド粒子の増幅に適切な条件下で培養する。次いで、ファージミド粒子を集め、標的分子に対して所望の親和性を有する結合体が選択されるまで選択工程を１またはそれ以上の回数繰り返す。
【００７７】
所望により、ファージミド粒子のライブラリーを、１を越える固定化標的に連続的に接触させて特定の標的に対する選択性を改善することができる。例えば、hＧＨなどのリガンドは１を越える天然受容体を有していることが多い。このhＧＨの場合には、成長ホルモン受容体とプロラクチン受容体の両方がhＧＨリガンドに結合する。hＧＨの選択性を、プロラクチン受容体に対する以上に成長ホルモン受容体に対して改善するのが望ましいであろう。これは、初めにファージミド粒子ライブラリーを固定化プロラクチン受容体と接触させ、これを低親和性（即ち、野生型hＧＨよりも低い）でプロラクチン受容体について溶離し、次いでこの低親和性プロラクチン「結合体」または非結合体を固定化成長ホルモン受容体と接触させ、高親和性成長ホルモン受容体結合体を選択することによって達成することができる。この場合、プロラクチン受容体に対して低親和性を有するhＧＨの突然変異体は、成長ホルモン受容体に対する親和性が野生型hＧＨの親和性よりも若干低いときであっても、治療用途を有しているであろう。これと同じ方法を用いて、特定ホルモンまたはタンパク質の、そのクリアランス受容体を凌ぐ１次機能受容体に対する選択性を改善することができる。
【００７８】
本発明の別の態様においては、改良された基質アミノ酸配列を得ることができる。これらは、タンパク質リンカーのためのより良好な「切断部位」を作成する際に、またはより良好なプロテアーゼ基質／阻害物質のために有用であろう。この態様においては、固定化しうる分子（例えば、hＧＨ-受容体、ビオチン-アビジン、またはマトリックスと共有結合しうる分子）をリンカーによって遺伝子IIIに融合させる。このリンカーは、好ましくは長さが３〜１０アミノ酸であり、プロテアーゼの基質として作用する。ファージミドを上記のように構築する（ここで、リンカー領域をコードしているＤＮＡにランダム突然変異を行なって、結合部位に異なるアミノ酸配列を有するファージミド粒子のランダムライブラリーを調製する）。次いで、このファージミド粒子のライブラリーをマトリックス上に固定化し、所望のプロテアーゼに暴露する。所望のプロテアーゼのライナー領域に好ましいかまたはより良好な基質アミノ酸配列を有するファージミド粒子が溶離され、好ましいリンカーをコードしているファージミド粒子の豊富化されたプールが最初に得られるであろう。次いで、さらに数回これらファージミド粒子を反復処理し、コンセンス配列（群）をコードしている粒子の豊富化されたプールを得る（実施例XIIIおよびXIVを参照）。
【００７９】
VIII．成長ホルモン変異体および使用方法
hＧＨのクローン化遺伝子がEschericha colaにおいて分泌型で発現され〔Chang,C.N.ら, Gene 55: 189 (1987)〕、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告されている〔Goeddelら, Nature 281: 544 (1979); Grayら, Gene 39: 247 (1985)〕。本発明は、ファージミド選択法を用いて得た新規なhＧＨ変異体を記載するものである。１０、１４、１８、２１、１６７、１７１、１７２、１７４、１７５、１７６、１７８および１７９位に置換を含むヒト成長ホルモン変異体が記載されている。比較的高い結合親和性を有する変異体を表VII、XIIIおよびXIVに記載している。これら変異体を記載するためのアミノ酸命名法は後記する。成長ホルモン変異体は、正規の成長ホルモンと同じように投与および製剤化してよい。本発明の成長ホルモン変異体は、天然またはmet hＧＨを発現しうる任意の組換え系において発現させることができる。
【００８０】
治療用投与のためのhＧＨの製剤は、所望の精製度のhＧＨを所望により生理学的に許容しうる担体、賦形剤または安定剤〔Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol,A.編 (1980)〕と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保存用に調製される。許容しうる担体、賦形剤または安定剤は使用される用量および濃度で受容対象に対して非毒性であり、これらには、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸の緩衝液）；抗酸化剤（アスコルビン酸を含む）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、あるいは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、あるいはリジン）；単糖類、二糖類およびその他の炭水化物（グルコース、マンノースあるいはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；二価の金属イオン（例えば、亜鉛、コバルトあるいは銅）；糖アルコール（例えば、マンニトールあるいはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；および／またはノニオン系界面活性化剤〔例えば、ツイーン、プルロニックあるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）〕が含まれる。本発明の製剤は、薬学的に許容しうる緩衝剤、アミノ酸、増量剤、および／またはノニオン系界面活性剤をさらに含有していてもよい。これらには、例えば緩衝液、キレート化剤、抗酸化剤、保存剤、共溶媒などが含まれる。これらの具体例には、トリメチルアマイン塩（「トリス緩衝液」）、および二ナトリウム・エデテートが含まれるであろう。本発明のファージミドを用いてファージタンパク質を含まない多量のhＧＨ変異体を製造することができる。融合体の遺伝子III部分を含まないhＧＨ変異体を発現させるために、単にpＳ０６４３および誘導体を１６Ｃ９などの非サプレッサー株中で増殖させることができる。この場合には、アンバーコドン（ＴＡＧ）が翻訳の終止を導き、独立したＤＮＡの構築を必要とすることなく遊離のホルモンが得られる。hＧＨ変異体は宿主から分泌され、これを培養培地から単離することができる。
【００８１】
８つのhＧＨアミノ酸Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７５およびＩ１７９のうちの１またはそれ以上のアミノ酸を、ここに示した天然hＧＨ中の該位置に見い出されるアミノ酸以外のいずれかのアミノ酸に置換することができる。即ち、ここに示したアミノ酸Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７５およびＩ１７９のうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個全部を、以下に挙げる２０アミノ酸のうちの他の１９アミノ酸のいずれかで置換することができる。好ましい態様においては、ここに挙げた８個全部のアミノ酸を別のアミノ酸で置換する。置換されるべき最も好ましい８個のアミノ酸は、実施例XII中の表XIVに示す。
アミノ酸の命名
Ａla（Ａ）
Ａrg（Ｒ）
Ａsn（Ｎ）
Ａsp（Ｄ）
Ｃys（Ｃ）
Ｇln（Ｑ）
Ｇlu（Ｅ）
Ｇly（Ｇ）
Ｈis（Ｈ）
Ｉle（Ｉ）
Ｌeu（Ｌ）
Ｌys（Ｋ）
Ｍet（Ｍ）
Ｐhe（Ｆ）
Ｐro（Ｐ）
Ｓer（Ｓ）
Ｔhr（Ｔ）
Ｔrp（Ｗ）
Ｔyr（Ｙ）
Ｖal（Ｖ）
１文字のhＧＨ変異体の命名法は、削除されるhＧＨアミノ酸（例えば、グルタメート１７９）を最初に記し、次に挿入されるアミノ酸（例えば、セリン）を記し、結果として（Ｅ１７９５Ｓ）となる。
【実施例】
【００８２】
さらに説明することなく、当業者なら以上の説明および例示の実施例を用いて本発明を完全に実施および利用することができると考えられる。即ち、以下の具体的な実施例は本発明の好ましい態様を示すものであり、いかなる意味においても開示の残部を限定するものとみなすべきではない。
【００８３】
実施例１  プラスミドの構築およびhＧＨ−ファージミド粒子の調製
プラスミドphＧＨ-Ｍ１３gIII（図１）を、Ｍ１３ＫＯ７7およびhＧＨ産生プラスミドpＢＯ４７３〔Cunningham,B.C.ら, Science 243: 1330-1336 (1989)〕から構築した。合成オリゴヌクレオチド：
5'-AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-TTA-GCA-TTT-AAT-GCG-GTA-3'
を用いて、pＢＯ４７３中のhＧＨの最後のＰhe１９１コドンの後に唯一のＡpaＩ制限部位（下線部）を導入した。オリゴヌクレオチド：
5'-TTC-ACA-AAC-GAA-GGG-CCC-CTA-ATT-AAA-GCC-AGA-3'
を用いて、唯一のＡpaＩ制限部位（最初の下線部）、およびＧlu１９７−アンバー停止コドン（２番目の下線部）をＭ１３ＫＯ７遺伝子III中に導入した。オリゴヌクレオチド：
5'-CAA-TAA-TAA-CGG-GCT-AGC-CAA-AAG-AAC-TGG-3'
により、遺伝子III暗号配列の３′末端の後に唯一のＮheＩ部位（下線部）を導入する。二重に突然変異させたＭ１３ＫＯ７の遺伝子III由来の得られた６５０塩基対（bp）のＡpaＩ−ＮheＩフラグメントを、pＢＯ４７３の大きいＡpaＩ−ＮheＩフラグメント中にクローン化してプラスミドpＳＯ１３２を創製した。これにより、ＡpaＩ部位からコードされるグリシン残基を挿入しつつhＧＨのカルボキシ末端（Ｐhe１９１）を遺伝子IIIタンパク質のＰro１９８残基に融合させ、この融合タンパク質を大腸菌アルカリホスファターゼ（phoＡ）プロモーターおよびstII分泌シグナル配列〔Chang,C.N.ら, Gene 55: 189-196 (1987)〕の支配下に置いた。豊富培地中での融合タンパク質の誘導可能な発現のために、このphoＡプロモーターをlacプロモーターおよびオペレーターで置換した。lacプロモーター、オペレーター、およびＣap結合部位を含有する１３８bpのＥcoＲＩ−ＸbaＩフラグメントを、オリゴヌクレオチド：
5'-CACGACAGAATTCCCGACTGGAAA-3' および 5'-CTGTTTCTAGAGTGAAATTGTTA-3'
〔これらは、所望のlac配列と境界を接し、ＥcoＲＩおよびＸbaＩ制限部位（下線部）を導入する〕
を用いるプラスミドpＵＣ１１９のＰＣＲによって調製した。このlacフラグメントをゲル精製し、pＳＯ１３２の大きいＥcoＲＩ−ＸbaＩフラグメントに連結してプラスミドphＧＨ-Ｍ１３gIIIを創製した。すべての加工したＤＮＡ連結点の配列はジデオキシ配列決定法によって確認した〔Sanger,F.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74: 5463-5467 (1977)〕。Ｒ６４Ａ変異hＧＨファージミドは次のようにして構築した。即ち、Ａrg６４のＡla置換（Ｒ６４Ａ）〔Cunningham,B.C., Wells,J.A, Science 244: 1081-1085 (1989)〕をコードしているhＧＨ〔Cunninghamら（上記）〕のＮsiＩ−ＢglII突然変異フラグメントを、phＧＨ-Ｍ１３gIIIプラスミド（図１）中の対応する制限部位の間にクローン化して野生型hＧＨ配列を置換した。このＲ６４Ａ hＧＨファージミド粒子を、野生型hＧＨ−ファージミドについて以下に記載したようにして増殖させ、滴定した。
【００８４】
プラスミドを大腸菌の雄性株（ＪＭ１０１）中に導入し、カルベニシリン・プレート上で選択した。単一の形質転換体を２ＹＴ培地（２ml）中にて３７℃で４時間増殖させ、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（５０μl）に感染させた。この感染培養物を２ＹＴ（３０ml）に希釈し、一晩培養し、ポリエチレングリコールによる沈澱によってファージミド粒子を集めた〔Vierra,J., Messing,J., Methods in Enzymology 153: 3-11 (1987)〕。通常、ファージミド粒子の力価は２〜５ｘ１０11cfu／mlの範囲内であった。この粒子をＣsＣl密度遠心〔Day,L.A., J.Mol.Biol. 39: 265-277 (1969)〕によって均質になるまで精製し、ビリオンに未結合のすべての融合タンパク質を除去した。
【００８５】
実施例II  融合ファージ上のhＧＨの免疫化学分析
hＧＨに対するウサギポリクローナル抗体をプロテインＡを用いて精製し、５０mM炭酸ナトリウム緩衝液（ｐH１０）中、２μg/mlの濃度にて４℃で１６〜２０時間、微量滴定プレート（Nunc）に被覆した。０.０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ中で洗浄した後、hＧＨまたはhＧＨ−ファージミド粒子を緩衝液Ａ〔５０mMトリス（ｐH７.５）、５０mM ＮaＣl、２mM ＥＤＴＡ、５mg/mlウシ血清アルブミン、および０.０５％ツイーン２０〕中で２.０〜０.００２nMに連続希釈した。室温（rt）で２時間の後、このプレートを十分に洗浄し、示したＭab〔Cunninghamら（上記）〕をrtで２時間、緩衝液Ａ中１μg/mlで加えた。洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲート化したヤギ抗-マウスＩgＧ抗体をrtで１時間結合させた。最後の洗浄の後、ペルオキシダーゼ活性を、基質o-フェニレンジアミンを用いて検定した。
【００８６】
実施例III  hＧＨ結合タンパク質のポリアクリルアミドビーズへの結合および結合の豊富化
オキシラン ポリアクリルアミドビーズ（Sigma）を、２３７位に部位指向性突然変異誘発により導入した余分のシステイン残基（hＧＨの結合に悪影響を及ぼさない；J.Wells：未公表）を含むhＧＨ受容体の精製した細胞外ドメイン（hＧＨbp）〔Fuh,G.ら, J.Biol.Chem. 265: 3111-3115 (1990)〕とコンジュゲート化した。このhＧＨbpは、供給元の推奨のように、樹脂に対する〔125Ｉ〕hＧＨの結合によって測定したときに１.７pモルhＧＨbp／mg乾燥オキシランビーズの量となるようにコンジュゲート化した。次いで、すべての未反応オキシラン基をＢＳＡおよびトリスでブロックした。ファージミド粒子の非特異的結合の対照として、ＢＳＡを同様にビーズに結合させた。吸着および洗浄のための緩衝液は、１０mMトリス-ＨＣl（ｐH７.５）、１mM ＥＤＴＡ、５０mM ＮaＣl、１mg/ml ＢＳＡおよび０.０２％ツイーン２０を含有していた。溶離緩衝液は、洗浄緩衝液に加えて２００nM hＧＨまたは０.２Mグリシン（ｐH２.１）を含有していた。親ファージＭ１３ＫＯ７をhＧＨファージミド粒子とほぼ３０００：１（最初の混合物）の比で混合し、５０μl容量中、室温でいずれかの吸収剤（５μlづつ；０.２mgのアクリルアミドビーズ）と８〜１２時間混合した。このビーズを遠心によってペレット化し、上清を注意深く除去した。このビーズを洗浄緩衝液（２００μl）に再懸濁し、室温で４時間混合した（洗浄液１）。２回目の洗浄の後（洗浄液２）、このビーズを２回、それぞれ２００nMのhＧＨで６〜１０時間溶離した（溶出液１、溶出液２）。最後の溶離はグリシン緩衝液（ｐH２.１）を用いて４時間行ない、残存するhＧＨファージミド粒子を除去した（溶出液３）。それぞれの分画を２ＹＴ培地で適切に希釈し、新鮮なＪＭ１０１と混合し、３７℃で５分間インキュベートし、そして２ＹＴ軟寒天（３ml）を用いてＬＢまたはＬＢカルベニシリンプレートにプレーティングした。
【００８７】
実施例IV  遺伝子III産物の混合物によるhＧＨ−ファージミド粒子の構築
遺伝子IIIタンパク質は４１０残基からなり、可変リンカー配列によって隔てられた２つのドメインに分かれている〔Armstrong,J.ら, FEBS Lett. 135: 167-172 (1981)〕。アミノ末端ドメインは大腸菌の線毛に付着するために必要であり、一方、カルボキシ末端ドメインはファージのコート（外殻）に組込まれ、適切なファージ組立てに必要である〔Crissman,J.W., Smith,G.P., Virology 132: 445-455 (1984)〕。遺伝子IIIのシグナル配列およびアミノ末端ドメインを、遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメイン中の残基１９８への融合により、stIIシグナルおよび全hＧＨ遺伝子〔Changら（上記）〕で置換した（図１）。このhＧＨ−遺伝子III融合体を、pＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子およびＣolＥ１複製起点ならびにファージf１の遺伝子間領域を含むプラスミド（phＧＨ-Ｍ１３gIII；図１）中のlacプロモーター／オペレーターの支配下に置いた。このベクターは、カルベニシリンによる選択によって小さなプラスミドベクターとして容易に維持することができ、これにより増殖のために機能的な遺伝子III融合体に依存することが回避される。また、このプラスミドは、Ｍ１３ＫＯ７〔Vieraら（上記）〕などのヘルパーファージによる感染によってビリオン（即ち、ファージミド粒子）に効率的にパッケージングされることができ、これによりファージ組立ての問題が回避される。この系におけるカルベニシリン耐性に対する形質導入に基づくファージミドの感染性力価は、２〜５ｘ１０11コロニー形成単位（cfu）／mlに変化した。これらのファージミド保存物におけるＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージの力価は〜１０10プラーク形成単位（pfu）／mlである。
【００８８】
この系を用いて、遺伝子IIIに融合した大きいタンパク質の均質発現がファージの生成に有害であるという以前の研究〔Parmley, Smith （上記）〕を確認した（データは示していない）。例えば、ＩＰＴＧの添加によるphＧＨ-Ｍ１３gIII中のlacプロモーターの誘導により、低いファージミド力価が得られた。さらに、遺伝子III中にアンバー突然変異を含むＭ１３ＫＯ７による同時感染によって得られたファージミド粒子は、極めて低いファージミド力価（＜１０10cfu／ml）を与えた。我々は、ファージミド表面に結合した複数コピーの遺伝子III融合体が、固定化標的タンパク質への融合ファージの複数点結合（「キレート作用」）を導きうるものと考えた。従って、融合タンパク質のコピー数を制御するために、構成的に高レベルのlacリプレッサータンパク質を含有する大腸菌ＪＭ１０１（laclＱ）中でプラスミドを培養することによって、hＧＨ−遺伝子III融合体の転写を制限した。phＧＨ-Ｍ１３gIIIを含有する大腸菌ＪＭ１０１培養物を最高に増殖させ、lacオペロン誘導物質（ＩＰＴＧ）の非存在下にＭ１３ＫＯ７に感染させた（しかし、この系は柔軟性を持っており、他の遺伝子III融合タンパク質の同時発現と平衡させることができる）。我々は、ビリオンあたりのhＧＨ量の比（ＣsＣl勾配で精製したファージミド中のhＧＨ免疫反応性物質に基づく）から、約１０％のファージミド粒子が１コピーのhＧＨ遺伝子III融合タンパク質を含有しているものと概算している。従って、hＧＨ遺伝子III融合体を表示する融合ファージの力価は約２〜５ｘ１０10／mlである。この数値は、これらを導いた培養物中の大腸菌の力価（〜１０8〜１０9／ml）よりも相当に大きい。即ち、平均的に全大腸菌細胞は、hＧＨ遺伝子III融合タンパク質で装飾されたファージを１０〜１００コピー生成する。
【００８９】
実施例Ｖ  hＧＨ−遺伝子III融合体の構造的完全性
hＧＨ−遺伝子IIIファージミドの免疫ブロット分析（図２）により、hＧＨ交差反応性物質がアガロースゲル中でファージミド粒子と同時移動することがわかる。このことは、hＧＨがファージミド粒子に強固に結合していることを示すものである。このファージミド粒子からのhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質は単一の免疫染色されるバンドとして移動し、hＧＨが遺伝子IIIに結合したときにhＧＨの分解がわずかしかないことを示す。約２５％のファージミド粒子が感染性であるので、野生型遺伝子IIIタンパク質が明らかに存在する。これは、ＵＶ吸収によって評価した濃度、および同様に精製（ＣsＣl密度勾配法による）した野生型Ｍ１３ファージに対して行なった比感染性評価に類似する〔Smith,G.P.（上記）およびParmley, Smith（上記）〕。即ち、野生型遺伝子IIIおよびhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の両方がファージプール中に表示される。
【００９０】
結合選択による結果が天然タンパク質に転換するという信頼性を得るために、表示されたhＧＨの３次構造が維持されていることを確認するのが重要であった。hＧＨに対するモノクローナル抗体（Ｍab）を用いて、表示されたhＧＨ遺伝子III融合タンパク質の構造的完全性を評価した（表Ｉ）。
表Ｉ．hＧＨおよびhＧＨファージミド粒子への８種の異なる
モノクローナル抗体（Ｍab）の結合 *                  
ＩＣ50（nM）                           
Ｍab               hＧＨ               hＧＨ−ファージミド
１                ０.４                ０.４
２                ０.０４              ０.０４
３                ０.２                ０.２
４                ０.１                ０.１
５                ０.２              ＞０.２
６                ０.０７              ０.２
７                ０.１                ０.１
８                ０.１                ０.１            
* 表中の値は、特定のＭabに対する半-最大結合を与えるhＧＨ
またはhＧＨ−ファージミド粒子の濃度（nM）を表す。これらの
測定の標準誤差は、通常、表示値の±３０％またはそれ以下
である。詳細については原材料および方法の項を参照。
【００９１】
これらＭabに対するhＧＨ上のエピトープはマッピングされており〔Cunninghamら（上記）〕、８種のＭabのうちの７種に対する結合はhＧＨが適切に折り畳まれることを必要とする。すべてのＭabのＩＣ50値は、Ｍab ５および６を除いて野生型hＧＨと等価であった。Ｍab ５および６の両方は、遺伝子III融合タンパク質中でブロックされるhＧＨのカルボキシ末端の近くに結合決定基を有していることが知られている。天然および変性hＧＨの両方と反応するＭab１の相対ＩＣ50値は、立体配座的に敏感なＭab ２〜５、７および８と比較して変わることがない。即ち、Ｍab１は、hＧＨ−遺伝子III融合体の濃度に対するhＧＨ標準の濃度を適合させる際のあらゆる過誤の良好な内部対照として働く。
【００９２】
実施例VI  受容体親和性ビーズに対する結合の豊富化
これまでの研究者〔Parmley, Smith（上記）；Smith（上記）；Cwirlaら（上記）；およびDevlinら（上記）〕は、ストレプトアビジン被覆したポリスチレン製ペトリ皿または微量滴定プレートで選別することによってファージを分画していた。しかし、クロマトグラフィー系は、異なる結合親和性を有する突然変異タンパク質を表示するファージミド粒子のさらに効率的な分画を可能にする。我々は、非多孔性のオキシランビーズ（Sigma）を選択してクロマトグラフィー樹脂中のファージミド粒子の捕捉を回避した。さらに、これらビーズは小さい粒子サイズ（１μm）を有しており、量に対する表面積の比が最大になる。遊離のシステイノ残基を含有するhＧＨ受容体の細胞外ドメイン（hＧＨbp）〔Fuhら（上記）〕はこれらビーズに効率的に結合し、ファージミド粒子はウシ血清アルブミンにのみ結合させたビーズに対して極めて低い非特異的な結合を示した（表II）。
【００９３】
表II．hＧＨbp被覆したビーズに対するホルモンファージの特異的な結合により
得られるＭ１３ＫＯ７ファージを凌ぐhＧＨ-ファージの豊富化*１      
試料         吸収物質*3    全pfu    全cfu    比(cfu／pfu)  豊富化*4 
最初の混合物*2              8.3x1011  2.9x108    3.5x10-4      (1)
上清            ＢＳＡ      7.4x1011  2.8x108    3.8x10-4      1.1
hＧＨbp     7.6x1011  3.3x108    4.3x10-4      1.2
洗浄液１        ＢＳＡ      1.1x1010  6.0x106    5.5x10-4      1.6
hＧＨbp     1.9x1010  1.7x107    8.9x10-4      2.5
洗浄液２        ＢＳＡ      5.9x107   2.8x104    4.7x10-4      1.3
hＧＨbp     4.9x107   2.7x106    5.5x10-2      1.6x102
溶出液１     (hＧＨ)ＢＳＡ  1.1x106   1.9x103    1.7x10-3      4.9
hＧＨbp     1.2x106   2.1x106    1.8          5.1x103
溶出液２     (hＧＨ)ＢＳＡ  5.9x105   1.2x103    2.0x10-3      5.7
hＧＨbp     5.5x105   1.3x106    2.4          6.9x103
溶出液３     (ｐH2.1)ＢＳＡ  4.6x105   2.0x103    4.3x10-3      12.3
hＧＨbp     3.8x105   4.0x106    10.5         3.0x104
*1 それぞれの分画中のＭ１３ＫＯ７およびhＧＨ−ファージミド粒子の力価は、それぞれプラーク形成単位（pfu）またはカルベニシリン耐性コロニー形成単位（cfu）の数値に希釈係数を掛けることによって測定した。詳細には実施例IVを参照。
*2 Ｍ１３ＫＯ７のhＧＨ−ファージミド粒子に対する比は最初の混合物において３０００：１に調節した。
*3 吸収物質はＢＳＡまたはhＧＨbpとコンジュゲート化した。
*4 豊富化は、各工程後のcfu／pfu比を最初の混合物のcfu／pfu比で割ることによって計算した。
【００９４】
代表的な豊富化実験（表II）において、１部のhＧＨファージミドを＞３,０００部のＭ１３ＫＯ７ファージと混合した。１サイクルの結合と溶離の後、１０6のファージが回収され、ファージミドのＭ１３ＫＯ７ファージに対する比は２：１であった。即ち、１回の結合選択工程によって、＞５０００倍の豊富化が得られた。残存するファージミドを除去するための遊離hＧＨまたは酸処理による追加の溶離によって、さらに高い豊富化が得られた。この豊富化は、被覆ポリスチレンプレートからのバッチ溶離を用いてSmithおよびその共同研究者が得た豊富化に匹敵した〔Smith,G.P.（上記）およびParmley, Smith（上記）〕。しかし、さらに少ない容量がビーズに対して用いられている（２００μl vs ６ml）。ＢＳＡにのみ結合させたビーズを用いたときには、Ｍ１３ＫＯ７を凌ぐhＧＨファージミドの豊富化はほとんど存在しなかった。対照ビーズに対して観察されたわずかな豊富化（ｐH２.１溶離に対して〜１０倍；表２）は、ビーズに結合するＢＳＡ中に存在するウシ成長ホルモン結合タンパク質の微量の不純物に由来するものであろう。それにもかかわらず、これらのデータは、hＧＨファージの豊富化がビーズ上のhＧＨbpの存在に依存することを示し、結合がhＧＨとhＧＨbpの間の特異的な相互作用によって起こることを示唆する。
【００９５】
我々は、融合ファージミド上のhＧＨの比較的弱い結合変異体を凌ぐ野生型hＧＨの豊富化を評価して、豊富化の特異性をさらに調べ、精製ホルモンに対する結合親和性の減少を融合ファージミド選別後の豊富化因子と関連させた。Ａrg６４がＡlaで置換されたhＧＨ突然変異体（Ｒ６４Ａ）を用いて融合ファージミドを構築した。このＲ６４Ａ変異ホルモンは、hＧＨと比べて受容体結合親和性が約２０倍減少している〔それぞれ、Ｋd値が７.１nMおよび０.３４nM；Cunningham, Wells（上記）〕。Ｒ６４Ａ hＧＨ−遺伝子III融合ファージミドの力価は、野生型hＧＨファージミドの力価と同等であった。１ラウンドの結合と溶離の後（表III）、野生型hＧＨファージミドは、２種類のファージミドとＭ１３ＫＯ７の混合物から、ファージミドＲ６４Ａに対しては８倍およびＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージに対しては〜１０4で豊富化された。
【００９６】
表III．比較的弱い結合のhＧＨ変異ファージミド以上にhＧＨファージミドを選択する
hＧＨbp被覆ビーズ                                              
対照ビーズ                      hＧＨbpビーズ  
試料    WTファージミド      WT／R64A    WTファージミド      WT／R64A
／全ファージミド    の豊富化    ／全ファージミド    の豊富化 
最初の混合物     ８／２０       (1)         ８／２０           (1)
上清               ＮＤ         −          ４／１０          １.０
溶出液１(hGH)    ７／２０       ０.８      １７／２０          ８.５*3
溶出液２(ｐH2.1)１１／２０      １.８      ２１／２７          ５.２  
*1 親Ｍ１３ＫＯ７ファージ、野生型hＧＨファージミドおよびＲ６４Ａファージミド粒子を１０4：０.４：０.６の比で混合した。結合選択は、表IIならびに原材料および方法の項の記載のように、ＢＳＡ（対照ビーズ）またはhＧＨbp（hＧＨbpビーズ）により結合させたビーズを用いて行なった。各工程の後、プラスミドＤＮＡをカルベニシリン耐性コロニーから単離し〔Birnboim,H.D., Doly,J., Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523 (1979)〕、制限分析によって分析して、このＤＮＡが野生型hＧＨまたはＲ６４Ａ hＧＨ遺伝子III融合体を含有しているか否か測定した。
*2 Ｒ６４Ａ突然変異体を越える野生型hＧＨファージミドの豊富化は、各工程後に存在するhＧＨファージミドの最初の混合物中に存在するファージミドに対する比（８／２０）に基づき、Ｒ６４Ａファージミドの対応する比で割ることにより計算した。
ＷＴ＝野生型；ＮＤ＝測定せず。
*3 全Ｍ１３ＫＯ７親ファージを越えるファージミドの豊富化は、この工程後に〜１０4であった。
【００９７】
ファージミド粒子上に野生型遺伝子IIIおよび遺伝子III融合タンパク質の混合物を表示させることにより、遺伝子IIIに対する融合体として大きな適切に折り畳まれたタンパク質を表示するビリオンを組立てそして増殖させることができる。遺伝子III融合タンパク質のコピー数を有効に制御して、ファージミドプールにおいて十分に高いレベルになお維持されている「キレート作用」を避け、大きいエピトープライブラリー（＞１０10）の選別をすることができる。我々は、hＧＨ（２２kＤのタンパク質）を天然の折り畳まれた形態で表示させうることを示した。遊離のhＧＨで溶離し、受容体親和性ビーズ上で行なった結合選択は、低い受容体結合親和性を有することが示された突然変異hＧＨファージミド以上に野生型hＧＨファージミドを効率的に豊富化した。即ち、結合定数がナノモル範囲で低下しているファージミド粒子を選別することができる。
タンパク質−タンパク質および抗体−抗原の相互作用は、不連続エピトープによって支配されている〔Janin,J.ら, J.Mol.Biol. 204: 155-164 (1988); Argos,P., Prot.Eng. 2: 101-113 (1988); Barlow,D.J.ら, Nature 322: 747-748 (1987); およびDavies,D.R.ら, J.Biol.Chem. 263: 10541-10544 (1988)〕。即ち、結合に直接関与している残基は３次構造において近接しているが、結合に関与していない残基によって隔てられている。本発明により提供されるスクリーニング系は、さらに好都合にタンパク質−受容体の相互作用を分析し、新規かつ高親和性の結合性を有するタンパク質中の不連続エピトープを単離することを可能にするものである。
【００９８】
実施例VII  hＧＨコドン１７２、１７４、１７６、１７８においてランダム化したライブラリーからのhＧＨ突然変異体の選択
鋳型の構築
hＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の突然変異体は、Kunkelら〔Meth.Enzymol. 154: 367-382 (1987)〕の方法を用いて構築した。鋳型ＤＮＡは、Ｍ１３-Ｋ０７ファージをヘルパーとして加えて、プラスミドpＳ０１３２（Ｍ１３遺伝子IIIのカルボキシ末端側半分に融合させた天然hＧＨ遺伝子をアルカリホスファターゼプロモーターの支配下に含有する）をＣＪ２３６細胞中で増殖させることによって調製した。１本鎖のウラシル含有ＤＮＡを突然変異誘発用に調製して、(1)hＧＨ結合タンパク質（hＧＨbp）に対する結合を大きく減少させるhＧＨ中の突然変異；および(2)親のバックグラウンドファージを検定し、それに対して選択するために使用しうる唯一の制限部位（ＫpnＩ）を導入した。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼおよび以下のオリゴデオキシヌクレオチド：
Gly  Thr
hGHコドン：                      178  179
5'-G  ACA  TTC  CTG  GGT  ACC  GTG  CAG  T-3'
< KpnI >
を用いてオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発を行なった。このオリゴは、hＧＨ中に突然変異（Ｒ１７８Ｇ、Ｉ１７９Ｔ）と共にＫpnＩ部位（上に示す）を導入する。突然変異誘発からのクローンをＫpnＩ消化によってスクリーニングし、ジデオキシＤＮＡ配列決定によって確認した。ランダム突然変異誘発の鋳型として使用されるこの得られた構築物をｐHＯ４１５と命名した。
【００９９】
hＧＨのヘリックス４中のランダム突然変異誘発
ここでもKunkelの方法を用いて、コドン１７２、１７４、１７６、１７８をhＧＨ中のランダム突然変異誘発の標的とした。上記のようにｐHＯ４１５から１本鎖鋳型を調製し、以下のオリゴ：
hGHコドン：                                 172       174
5'-  GC  TTC  AGG  AAG  GAC  ATG  GAC  NNS  GTC  NNS  ACA- 
Ile
176       178  179 
- NNS  CTG  NNS  ATC  GTG  CAG  TGC  CGC  TCT  GTG  G-3'
のプールを用いて突然変異誘発を行なった。上に示したように、このオリゴプールはコドン１７９を野生型（Ｉle）に復帰させ、ｐH０４１５の唯一のＫpnＩ部位を破壊し、そして１７２、１７４、１７６および１７８位にランダムコドン（ＮＮＳ；ここで、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、ＳはＧまたはＣである）を導入する。上記の配列に対してこのコドン選択を用いて、付加的なＫpnＩ部位を創製することはできない。このＮＮＳ同義性配列の選択により、４つの部位に３２種の可能なコドン（１つの「停止」コドンおよび少なくとも１つの各アミノ酸のためのコドン）が得られ、合計（３２）4＝１,０４８,５７６の可能なヌクレオチド配列（この１２％は少なくとも１つの停止コドンを含有する）、または（２０）4＝１６０,０００の可能なポリペプチド配列と３４,４８１の未成熟で終止した配列（即ち、少なくとも１つの停止コドンを含有する配列）が得られる。
【０１００】
最初のライブラリーの増殖
突然変異誘発産物をフェノール：クロロホルム（５０：５０）で２回抽出し、後の電気穿孔工程を面倒にする塩の添加を避けるために過剰のキャリアーtＲＮＡを用いてエタノール沈澱させた。約５０ng（１５fモル）のＤＮＡを、０.２cmキュベット中の全容量４５μlにおいて、単一パルスの電圧設定２.４９kＶ（時間定数＝４.７m秒）でＷＪＭ１０１細胞（２.８ｘ１０10細胞／ml）に電気穿孔導入した。
【０１０１】
この細胞を振盪しながら３７℃で１時間回復させ、次いで２ＹＴ培地（２５ml）、１００μg/mlカルベニシリン、およびＭ１３-Ｋ０７（感染の多重度＝１０００）と混合した。この培養物からの連続希釈物をカルベニシリン含有培地にプレーティングすることにより、８.２ｘ１０6の電気形質転換体が得られたことがわかった。２３℃で１０分間の後、培養物を振盪しながら３７℃で一晩（１５時間）インキュベートした。
【０１０２】
一晩インキュベートの後、細胞をペレット化し、pＬＩＢ１と命名した２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）をアルカリ溶解法によって調製した。この上清をもう一度遠心してすべての残存細胞を除去し、ファージプールφ１と命名したファージをＰＥＧ沈澱させ、ＳＴＥ緩衝液〔１０mMトリス（ｐH７.６）、１mM ＥＤＴＡ、５０mM ＮaＣl〕(１ml）に再懸濁した。ファージ力価は、hＧＨ-g３p遺伝子III融合（hＧＨ-g3）プラスミドを含有する組換えファージミドについてはコロニー形成単位（ＣＦＵ）として、そしてＭ１３-Ｋ０７ヘルパーファージについてはプラーク形成単位（ＰＦＵ）として測定した。
【０１０３】
固定化hＧＨbpを用いる結合選択
１．結合：ファージプールφ１（６ｘ１０9ＣＦＵ、６ｘ１０7ＰＦＵ）の一部を緩衝液Ａ〔リン酸緩衝食塩水、０.５％ＢＳＡ、０.０５％ツイーン２０、０.０１％チメロサール〕で４.５倍に希釈し、１.５mlのシラン処理したポリプロピレン試験管において、Ｓer２３７Ｃys突然変異を含むhＧＨbp（３５０fモル）と結合させたオキシラン-ポリアクリルアミドビーズの懸濁液（５μl）と混合した。対照として、等量のファージを、ＢＳＡだけで被覆したビーズと別の試験管で混合した。このファージを、ゆっくり回転（約７rpm）させながら室温（２３℃）で３時間インキュベートすることによって、ビーズと結合させた。以下の工程は、２００μlの一定容量を用い、室温で行なった。
【０１０４】
２．洗浄：ビーズを１５秒間回転させ、上清を除去した（上清１）。非特異的に結合したファージ／ファージミドを除去するため、このビーズを緩衝液Ａに再懸濁することにより２回洗浄し、次いでペレット化した。最後の洗浄は、緩衝液Ａ中で２時間、このビーズを回転させることにより行なった。
【０１０５】
３．hＧＨ溶離：ビーズに弱く結合したファージ／ファージミドを、hＧＨによる段階溶離によって除去した。最初の工程において、ビーズを２nM hＧＨ含有の緩衝液Ａを用いて回転させた。１７時間後に、このビーズをペレット化し、２０nM hＧＨ含有の緩衝液Ａに再懸濁し、３時間回転させ、次いでペレット化した。最後のhＧＨ洗浄において、このビーズを２００nM hＧＨ含有の緩衝液Ａに懸濁させ、３時間回転させ、次いでペレット化した。
【０１０６】
４．グリシン溶離：最も強固に結合したファージミド（即ち、hＧＨ洗浄後になお結合しているファージミド）を除去するため、ビーズをグリシン緩衝液〔１Mグリシン、ＨＣlでｐH２.０〕に懸濁させ、２時間回転させ、ペレット化した。この上清（分画「Ｇ」；２００μl）を、１Mトリス塩基（３０μl）の添加によって中和した。
【０１０７】
hＧＨbp-ビーズから溶出した分画Ｇ（１ｘ１０6ＣＦＵ、５ｘ１０4ＰＦＵ）は、実質的にＫ０７ヘルパーファージ以上にファージミドに富むことはなかった。我々は、これは、組換えファージミドの増殖中にパッケージされたＫ０７ファージがhＧＨ-g３p融合体を表示するということに起因するものと考えている。
【０１０８】
しかし、ＢＳＡ被覆された対照ビーズから溶出した分画Ｇと比較すると、hＧＨbp-ビーズは１４倍高いＣＦＵを与えた。これは、非特異的に結合したファージミド以上の、強固に結合したhＧＨを表示するファージミドの豊富化を反映するものである。
【０１０９】
５．増殖：hＧＨbp-ビーズから溶出した分画Ｇの一部（４.３ｘ１０5ＣＦＵ）を用いて対数増殖期のＷＪＭ１０１細胞を感染させた。形質導入は、分画Ｇ（１００μl）をＷＪＭ１０１細胞（１ml）と混合し、３７℃で２０分間インキュベートし、次いでＫ０７（感染の多重度＝１０００）を加えることによって行なった。培養物（２５mlの２ＹＴとカルベニシリン）を上記のように増殖させ、ファージの第２プール（ライブラリー１Ｇ、第１のグリシン溶離用）を上記のように調製した。
【０１１０】
ライブラリー１Ｇからのファージ（図３）を、上記のように、hＧＨbpビーズへの結合について選択した。hＧＨbpビーズから溶出した分画Ｇは、この選択においてＢＳＡビーズから溶出した分画Ｇに比べて３０倍高いＣＦＵを含んでいた。もう一度、分画Ｇの一部をＷＪＭ１０１細胞中で増殖させ、ライブラリー１Ｇ2（グリシン溶離によってこのライブラリーを２回選択したことを示す）を得た。また、２本鎖ＤＮＡ（pＬＩＢ １Ｇ2）をこの培養物から調製した。
dsＤＮＡのＫpnＩ検定および制限選択
【０１１１】
バックグラウンド（ＫpnＩ＋）鋳型の量を減少させるため、pＬＩＢ １Ｇ2の一部（約０.５μg）をＫpnＩで消化し、ＷＪＭ１０１細胞中に電気穿孔導入した。これらの細胞を、最初のライブラリーについて記載したようにＫ０７（感染の多重度＝１００）の存在下で増殖させ、新しいファージプールpＬＩＢ３を調製した（図３）。
【０１１２】
さらに、最初のライブラリー（pＬＩＢ１）由来のdsＤＮＡの一部（約０.５μg）をＫpnＩで消化し、ＷＪＭ１０１細胞中に直接電気穿孔導入した。形質転換体を上記のように回復させ、Ｍ１３-Ｋ０７に感染させ、一晩増殖させてファージライブラリー２と命名した新しいファージライブラリーを得た（図３）。
【０１１３】
連続ラウンドの選択
(1)過剰（ＣＦＵの１０倍）の精製Ｋ０７ファージ（hＧＨを表示しない）をビーズ結合カクテル中に添加した；および(2)hＧＨ段階溶離を緩衝液Ａ単独の短い洗浄に換えたことを除き、上記のようにしてpＬＩＢ２およびpＬＩＢ３の両方に由来するファージミドに対して連続ラウンドでファージミドの結合、溶離および増殖を行なった。また、一部においてはＸＬ１-Ｂlue細胞をファージミドの増殖に用いた。
【０１１４】
ＫpnＩによるdsＤＮＡの追加の消化を、最終ラウンドのビーズ結合選択の前にpＬＩＢ ２Ｇ3およびpＬＩＢ ３Ｇ5に対して実施した（図３）。
【０１１５】
選択したファージミドのＤＮＡ配列決定
ＬＩＢ ４Ｇ4由来の４種の独立して単離したクローンおよびＬＩＢ ５Ｇ6由来の４種の独立して単離したクローンを、ジデオキシ配列決定によって配列決定した。これら８種クローンのすべてが、同一のＤＮＡ配列：
hGHコドン：    172     174     176     178
5'-AAG GTC TCC ACA TAC CTG AGG ATC-3'
を有していた。即ち、これらのすべてがhＧＨの同一突然変異体（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）をコードしている。これらクローン中の残基１７２は野生型と同様にＬysである。また、１７２に対して選択されたコドンも野生型hＧＨと同一である。このことは、ＡＡＧが同義「ＮＮＳ」コドンのセットから可能な唯一のリジン-コドンであるので驚くには当たらない。さらに、残基１７８-Ａrgも野生型と同一であるが、ここではライブラリーから選択されたコドンはＡＡＧであって野生型hＧＨで見い出されるＣＧＣではなかった（後者コドンも「ＮＮＳ」コドンのセットを用いて可能である）。
【０１１６】
Ｋ０７感染の多重度
Ｋ０７感染の感染多重度は、組換えファージミドの増殖において重要なパラメーターである。Ｋ０７の感染多重度は、ファージミドで形質転換またはトランスフェクションされた実質的にすべての細胞が新しいファージミド粒子をパッケージしうることを確保するに十分に高いものでなければならない。さらに、それぞれの細胞中の野生型遺伝子IIIの濃度は高く維持されて、複数のhＧＨ−遺伝子III融合分子がそれぞれのファージミド粒子上に表示される可能性を減少させ、それによって結合におけるキレート作用を減少させるものであるべきである。しかし、Ｋ０７の感染多重度が高すぎるときには、Ｋ０７のパッケージングは組換えファージミドのパッケージングと競合するであろう。我々は、１〜１０％のバックグラウンドＫ０７ファージしか持たない許容しうるファージミド収量が、Ｋ０７の感染多重度が１００であるときに得られることを見い出した。
【０１１７】
表 IV

ファージ           moi(K07)       豊富化        hGHbp／        分画KpnI
プール                           CFU／PFU       BSAビーズ              
ＬＩＢ１          １０００          ＮＤ         １４          ０.４４
ＬＩＢ１Ｇ        １０００          ＮＤ         ３０          ０.５７
ＬＩＢ３            １００          ＮＤ           １.７       ０.２６
ＬＩＢ３Ｇ3           １０          ＮＤ           ８.５       ０.１８
ＬＩＢ３Ｇ4         １００        ４６０       ２２０          ０.１３
ＬＩＢ５            １００          ＮＤ         １５          ＮＤ
ＬＩＢ２            １００          ＮＤ           １.７     ＜０.０５
ＬＩＢ２Ｇ            １０          ＮＤ           ４.１     ＜０.１０
ＬＩＢ２Ｇ2         １００      １０００         ２７          ０.１８
ＬＩＢ４            １００        １７０         ３８          ＮＤ    
【０１１８】
ファージプールを先に示したように標識した（図３）。感染多重度（moi）はファージミドの増殖の際のＫ０７感染の多重度（ＰＦＵ／細胞）を意味する。ＰＦＵを越えるＣＦＵの豊富化は、精製したＫ０７を結合工程に加えたときに示される。ＢＳＡビーズから溶出したＣＦＵを越える、hＧＨbpビーズから溶出されるＣＦＵの比が示されている。プール中に残存するＫpnＩ含有鋳型（即ち、ｐH０４１５）の分画は、dsＤＮＡをＫpnＩおよびＥcoＲＩで消化し、生成物を１％アガロースゲルで移動させ、陰性の臭化エチジウム染色ＤＮＡをレーザー-スキャニングすることによって測定した。
【０１１９】
ホルモンhＧＨ（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）の受容体結合の親和性
単一のクローンが２種類の異なる選択経路（図３）から単離されたという事実は、二重突然変異体（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）がhＧＨbpに強く結合することを示唆した。hＧＨbpに対するこのhＧＨ突然変異体の親和性を測定するために、我々はこのhＧＨ突然変異体を、プラスミドpＢ０７２０を用いる部位指向性突然変異誘発によって構築した。このプラスミドは、鋳型としての野生型hＧＨ遺伝子、ならびにコドン１７４および１７６を変化させる次のオリゴヌクレオチド：
hGHコドン：             172     174     176     178
Lys     Ser     Tyr     Arg
5'- ATG GAC AAG GTG TCG ACA TAC CTG CGC ATC GTG -3'
を含有している。得られた構築物ｐH０４５８Ｂを、突然変異ホルモンの発現のために大腸菌株１６Ｃ９に導入した。hＧＨbpに対するhＧＨ（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）と125Ｉ-hＧＨの競合結合のスカッチャード分析により、この（Ｅ１７４Ｓ、Ｆ１７６Ｙ）突然変異体が野生型hＧＨの結合親和性よりも少なくとも５.０倍強固な結合親和性を有していることがわかった。
【０１２０】
実施例VIII  ホルモン−ファージのヘリックス４ランダムカセットライブラリーからのhＧＨ変異体の選択
ヒト成長ホルモン変異体を、図９に記載のファージミドを用いる本発明の方法によって調製した。
【０１２１】
脱-融合性のホルモン−ファージベクターの構築
我々は、(1)ファージ上でhＧＨ部分の表示をさらに有利にするように、hＧＨと遺伝子III部分の間の結合を改良する；(2)実質的に「一価の表示」を得るために融合タンパク質の発現を限定する；(3)出発ベクターに対する制限ヌクレアーゼの選択を可能にする；(4)出発ベクターからの融合タンパク質の発現を排除する；および(5)あるhＧＨ−遺伝子III融合突然変異体からの対応する遊離ホルモンの容易な発現を達成する；という目的をもって、カセット突然変異誘発〔Wellsら, Gene 34: 315-323 (1985)〕およびhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の発現のためのベクターを設計した。
【０１２２】
pＢＲ３２２およびf１の複製起点を含有し、大腸菌phoＡプロモーター〔Bassら, Proteins 8: 309-314 (1990)〕の支配下にhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質（hＧＨ残基１〜１９１、これに１個のＧly残基が続き、遺伝子IIIのＰro-１９８に融合している）を発現する、pＳ０１３２のオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発〔Kunkelら, Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987)〕によってプラスミドpＳ０６４３を構築した（図９）。オリゴヌクレオチド：
5'-GGC-AGC-TGT-GGC-TTC-TAG-AGT-GGC-GGC-GGC-TCT-GGT-3'
を用いて突然変異誘発を行った〔このオリゴヌクレオチドは、hＧＨのＰhe-１９１に続いてＸbaＩ部位（下線部）およびアンバー停止コドン（ＴＡＧ）を導入する〕。得られた構築物pＳ０６４３においては、遺伝子IIIの一部が削除され、２つのサイレント突然変異誘発（下線部）が生じ、hＧＨと遺伝子IIIの間に次の連結点が生成する：
--- hＧＨ --------->            遺伝子III ----->
187 188 189 190 191 am*     249 250 251 252 253 254
Gly Ser Cys Gly Phe Glu     Ser Gly Gly Gly Ser Gly
GGC AGC TGT GGA TTC TAG     AGT GGC GGT GGC TCT GGT
これは、融合タンパク質の全体サイズをpＳ０１３２中の４０１残基からpＳ０６４３中の３５０残基まで短縮する。hＧＨに対するモノクローナル抗体を用いた実験により、ファージ粒子に組立てられる新しい融合タンパク質のhＧＨ部分は以前の長い融合体よりも接近しやすいことがわかった。
【０１２３】
ホルモンを表示するファージを増殖させるため、pＳ０６４３および誘導体をＪＭ１０１またはＸＬ１-Ｂlueなどの大腸菌のアンバー-サプレッサー株〔Bullockら, BioTechniques 5: 376-379 (1987)〕中で増殖させることができる。上に示したのは、supＥサプレッサー株中で起こるアンバーコドンにおけるＧluの置換である。また、他のアミノ酸による抑制が、周知かつ一般に入手可能な種々の大腸菌株において可能である。
【０１２４】
融合体の遺伝子III部分を含まないhＧＨ（または、突然変異体）を発現させるために、pＳ０６４３および誘導体を単に１６Ｃ９などの非サプレッサー株において増殖させることができる。この場合にはアンバーコドン（ＴＡＧ）は翻訳の終止を導き、独立したＤＮＡ構築を必要とすることなく遊離のホルモンを与える。
【０１２５】
カセット突然変異誘発のための部位を創製するため、pＳ０６４３をオリゴヌクレオチド：
(1)5'-CGG-ACT-GGG-CAG-ATA-TTC-AAG-CAG-ACC-3'
〔これは、pＳ０６４３の唯一のＢglII部位を破壊する〕；
(2)5'-CTC-AAG-AAC-TAC-GGG-TTA-CCC-TGA-CTG-CTT-CAG-GAA-GG-3'
〔これは、唯一のＢstＥII部位、１塩基のフレームシフト、および非アンバー停止コドン（ＴＧＡ）を挿入する〕；および
(3)5'-CGC-ATC-GTG-CAG-TGC-AGA-TCT-GTG-GAG-GGC-3'
〔これは、新規なＢglII部位を導入する〕
で突然変異させて出発ベクターｐH０５０９を得た。ＴＧＡ停止コドンと共にフレームシフトを加えることにより、出発ベクターから遺伝子III融合体が産生され得ないことが確保される。ＢstＥII−ＢglIIセグメントをｐH０５０９から切出し、所望のコドンのところで突然変異させたＤＮＡカセットで置換した。また、hＧＨ中の他の位置におけるカセット突然変異誘発のための他の制限部位も、このホルモン−ファージベクター中に導入した。
【０１２６】
hＧＨのヘリックス４内のカセット突然変異誘発
hＧＨのコドン１７２、１７４、１７６および１７８をランダム突然変異誘発の標的とした。この理由は、これらすべてがhＧＨの表面またはその近くに存在し、受容体結合に有意に寄与し〔CunninghamおよびWells, Science 244: 1081-1085 (1989)〕；これらすべてが十分に定義された構造内に存在し、ヘリックス４の同じ側の２「ターン」を占め；そして、これらのそれぞれがhＧＨの既知の進化変異体の中の少なくとも１つのアミノ酸で置換されているためである。
【０１２７】
我々は、それぞれの標的残基にＮＮＳ（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ）の置換を選択した。このＮＮＳ同義性配列の選択により、４つの部位に３２種の可能なコドン（少なくとも１つの各アミノ酸のためのコドン）が得られ、合計（３２）4＝１,０４８,５７６の可能なヌクレオチド配列、または（２０）4＝１６０,０００の可能なポリペプチド配列が得られる。唯一の停止コドンであるアンバー（ＴＡＧ）がこのコドン選択により可能であり、このコドンは大腸菌のsupＥ株においてＧlu１として抑制することができる。
【０１２８】
コドン１７２、１７４、１７６および１７８にＮＮＳを有する２種類の同義性（縮重）オリゴヌクレオチドを合成し、ホスホリル化し、アニールさせて突然変異カセットを構築した：
5'-GT-TAC-TCT-ACT-GCT-TTC-AGG-AAG-GAC-ATG-GAC-NNS-GTC-NNS-ACA-NNS-CTG-NNS-ATC-GTG-CAG-TGC-A-3'
および
5'-GA-TCT-GCA-CTG-CAC-GAT-SNN-CAG-SNN-TGT-SNN-GAC-SNN-GTC-CAT-GTC-CTT-CCT-GAA-GCA-GTA-GA-3' 。
ＢstＥIIに続いてＢglIIでｐH０５０９を消化することによってベクターを調製した。生成物を１％アガロースゲル上で移動させ、大きいフラグメントを切り出し、フェノール抽出し、エタノール沈澱させた。このフラグメントをウシ腸ホスファターゼ（Boehringer）で処理し、次いでフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、突然変異用カセットとの連結用に再懸濁した。
【０１２９】
ＸＬ１-Ｂlue細胞における最初のライブラリーの増殖
連結の後、反応生成物をＢstＥIIでもう一度消化し、次いでフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、水に再懸濁した〔ＢstＥII認識部位（ＧＧＴＮＡＣＣ）が、コドン１７２の３位にＧおよび１７４にＡＣＣ（Ｔhr）コドンを含むカセット内に創製される。しかし、この工程でのＢstＥIIによる処理は、あらゆる可能な突然変異カセットに対して選択しないはずである。この理由は、実質的にすべてのカセットがヘテロ２本鎖であり、この酵素によって切断され得ないためである〕。約１５０ng（４５fモル）のＤＮＡを、０.２cmキュベット中のＸＬ１-Ｂlue細胞（０.０４５ml中に１.８ｘ１０9細胞）に、単一パルスの電圧設定２.４９kＶ（時間定数＝４.７m秒）で電気穿孔導入した。
【０１３０】
この細胞を振盪しながらＳ.Ｏ.Ｃ.培地において３７℃で１時間回復させ、次いで２ＹＴ培地（２５ml）、１００mg/mlカルベニシリン、およびＭ１３-Ｋ０７（moi＝１００）と混合した。２３℃で１０分間の後、培養物を振盪しながら３７℃で一晩（１５時間）インキュベートした。この培養物からの連続希釈物をカルベニシリン含有培地にプレーティングすることにより、３.９ｘ１０7の電気形質転換体が得られたことがわかった。
【０１３１】
一晩インキュベートの後、細胞をペレット化し、ｐH０５２９Ｅ（最初のライブラリー）と命名した２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）をアルカリ溶解法によって調製した。この上清をもう一度遠心してすべての残存細胞を除去し、ファージプールφＨ０５２９Ｅ（最初のファージライブラリー）と命名したファージをＰＥＧ沈澱させ、ＳＴＥ緩衝液〔１０mMトリス（ｐH７.６）、１mM ＥＤＴＡ、５０mM ＮaＣl〕(１ml）に再懸濁した。ファージ力価は、hＧＨ-g３pを含有する組換えファージミドについてコロニー形成単位（ＣＦＵ）として測定した。出発ライブラリーから約４.５ｘ１０13ＣＦＵが得られた。
【０１３２】
出発ライブラリーの同義性（縮重）
電気形質転換体のプールからの５８のクローンを、ＢstＥII−ＢglIIカセットの領域において配列決定した。これらの中で、１７％が出発ベクターに対応しており、１７％が少なくとも１つのフレームシフトを含有しており、そして７％が４つの標的コドンの外側に非サイレント（非終止）突然変異を含有していた。我々は、４１％のクローンが上記基準のいずれかによる欠点を有しており、２.０ｘ１０7の当初形質転換体の合計機能的プールが残るものと結論した。それでもなお、この数は可能性あるＤＮＡ配列数をほぼ２０倍越えている。従って、我々は出発ライブラリーにおいて示されるすべての可能性ある配列を有することを確信している。
【０１３３】
我々は、選択されなかったファージの配列を調べて突然変異誘発におけるコドンの偏向度を評価した（表Ｖ）。これらの結果により、一部のコドン（および、アミノ酸）がランダムな予想に比べて多いかまたは少ないことが示されるが、このライブラリーは極めて多様性が高く、大量の「兄弟」縮重の証拠は存在しないことがわかった（表VI）。
【０１３４】
表Ｖ．選択されなかったホルモンファージのコドン分布（１８８コドンあたり）クローンを出発ライブラリー（ｐH０５２９Ｅ）から配列決定した。疑似突然変異および／またはフレームシフトを含有するクローンからのコドンを含むすべてのコドンを表にした。＊：アンバー停止コドン（ＴＡＧ）はＸＬ１-Ｂlue細胞においてはＧluとして抑制される。下線を引いたコドンは、５０％またはそれ以上に多い／少ないことが示された。

残基            予想数            実測数            実測／予想  
Ｌeu            １７.６            １８               １.０
Ｓer            １７.６            ２６               １.５
Ａrg            １７.６            １０               ０.５７
Ｐro            １１.８            １６               １.４
Ｔhr            １１.８            １４               １.２
Ａla            １１.８            １３               １.１
Ｇly            １１.８            １６               １.４
Ｖal            １１.８              ４               ０.３
Ｉle              ５.９              ２               ０.３
Ｍet              ５.９              １               ０.２
Ｔyr              ５.９              １               ０.２
Ｈis              ５.９              ２               ０.３
Ｔrp              ５.９              ２               ０.３
Ｐhe              ５.９              ５               ０.９
Ｃys              ５.９              ５               ０.９
Ｇln              ５.９              ７               １.２
Ａsn              ５.９            １４               ２.４
Ｌys              ５.９            １１               １.９
Ａsp              ５.９              ９               １.５
Ｇlu              ５.９              ６               １.０
アンバー *        ５.９              ６               １.０     
【０１３５】
表VI．オープン読み枠を有する選択されなかった
（ｐH０５２９Ｅ）クローン
表示、例えばＴＷＧＳは、hＧＨ突然変異体１７２Ｔ／１７４Ｗ／１７６Ｇ／１７８Ｓを示す。ＸＬ１-Ｂlue細胞においてＧluとして翻訳されたアンバー
（ＴＡＧ）コドンはεで示す。

ＫεＮＴ          ＫＴＥＱ          ＣＶＬＱ
ＴＷＧＳ          ＮＮＣＲ          ＥＡＳＬ
ＰεＥＲ          ＦＰＣＬ          ＳＳＫＥ
ＬＰＰＳ          ＮＳＤＦ          ＡＬＬＬ
ＳＬＤＰ          ＨＲＰＳ          ＰＳＨＰ
ＱＱＳＮ          ＬＳＬε          ＳＹＡＰ
ＧＳＫＴ          ＮＧＳＫ          ＡＳＮＧ
ＴＰＶＴ          ＬＴＴＥ          ＥＡＮＮ
ＲＳＲＡ          ＰＳＧＧ          ＫＮＡＫ
ＬＣＧＬ          ＬＷＦＰ          ＳＲＧＫ
ＴＧＲＬ          ＰＡＧＳ          ＧＬＤＧ
ＡＫＡＳ          ＧＲＡＫ          ＮＤＰＩ
ＧＮＤＤ          ＧＴＮＧ                    
【０１３６】
固定化hＧＨbpおよびhＰＲＬbpの調製
野生型hＧＨbp〔Fuhら, J.Biol.Chem. 265: 3111-3115 (1990)〕を用いたことを除き、文献〔Bassら, Proteins 8: 309-314 (1990)〕に記載のようにして固定化hＧＨbp（「hＧＨbp-ビーズ」）を調製した。〔125Ｉ〕hＧＨとの競合結合実験により、１μlのビーズ懸濁液あたり５８fモルの機能的hＧＨbpが結合することがわかった。
【０１３７】
プロラクチン受容体〔Cunninghamら, Science 250: 1709-1712 (1990)〕の２１１残基の細胞外ドメインを用いて、上記のように固定化hＰＲＬbp（「hＰＲＬbp-ビーズ」）を調製した。５０μMの亜鉛の存在下での〔125Ｉ〕hＧＨとの競合結合実験により、１μlのビーズ懸濁液あたり２.１fモルの機能的hＰＲＬbpが結合することがわかった。
【０１３８】
「ブランクビーズ」は、オキシラン-アクリルアミドビーズを０.６Ｍエタノールアミン（ｐH９.２）により４℃で１５時間処理することによって調製した。
【０１３９】
固定化hＧＨbpおよびhＰＲＬbpを用いる結合選択
ビーズに対するホルモン−ファージの結合を、次の緩衝液のいずれかにおいて実施した：hＧＨbpおよびブランクビーズを用いる選択に対しては緩衝液Ａ〔ＰＢＳ、０.５％ ＢＳＡ、０.０５％ツイーン２０、０.０１％チメロサール〕；亜鉛の存在下（＋Ｚn2＋）にhＰＲＬbpを用いる選択に対しては緩衝液Ｂ〔５０mMトリス（ｐH７.５）、１０mM ＭgＣl2、０.５％ ＢＳＡ、０.０５％ツイーン２０、１００mM ＺnＣl2〕；または、亜鉛の非存在下（＋ＥＤＴＡ）にhＰＲＬbpを用いる選択に対しては緩衝液Ｃ〔ＰＢＳ、０.５％ ＢＳＡ、０.０５％ツイーン２０、０.０１％チメロサール、１０mM ＥＤＴＡ〕。結合選択は、次の経路のそれぞれに従って実施した：(1)ブランクビーズに対する結合、(2)hＧＨbp-ビーズに対する結合、(3)hＰＲＬbp-ビーズに対する結合（＋Ｚn2＋）、(4)hＰＲＬbp-ビーズに対する結合（＋ＥＤＴＡ）、(5)hＧＨbpビーズによる２回の予備吸着とその後の未吸着分画のhＰＲＬbp-ビーズへの結合（「−hＧＨbp、＋hＰＲＬbp」選択）、または(6)hＰＲＬbp-ビーズによる２回の予備吸着とその後の未吸着分画のhＧＨbp-ビーズへの結合（「−hＰＲＬbp、＋hＧＨbp」選択）。後者の２つの操作は、それぞれhＰＲＬbpと結合するがhＧＨbpとは結合しない突然変異体、またはhＧＨbpと結合するがhＰＲＬbpとは結合しない突然変異体を豊富化するものと予想される。各サイクルにおけるファージの結合と溶離は、次のように実施した：
【０１４０】
１．結合：ホルモンファージの一部（通常は１０9〜１０10ＣＦＵ）を等量の非ホルモンファージ（pＣＡＴ）と混合し、適当な緩衝液（Ａ、ＢまたはＣ）で希釈し、１.５mlのポリプロピレン試験管において２００mlの総容量でhＧＨbp、hＰＲＬbpまたはブランクビーズの懸濁液（１０ml）と混合した。このファージを、ゆっくり回転（約７rpm）させながら室温（２３℃）で１時間インキュベートすることによってビーズと結合させた。以下の工程は、２００μlの一定容量を用い、室温で行なった。
【０１４１】
２．洗浄：ビーズを１５秒間回転させ、上清を除去した。非特異的に結合したファージ数を減少させるため、このビーズを適当な緩衝液に短時間再懸濁することにより５回洗浄し、次いでペレット化した。
【０１４２】
３．hＧＨ溶離：ビーズに弱く結合したファージを、hＧＨによる溶離によって除去した。このビーズを４００nM hＧＨ含有の適当な緩衝液と共に１５〜１７時間回転させた。この上清を「hＧＨ溶出液」およびビーズとした。このビーズを緩衝液に短時間再懸濁し、ペレット化することによって洗浄した。
【０１４３】
４．グリシン溶離：最も強固に結合したファージ（即ち、hＧＨ洗浄後になお結合しているファージ）を除去するため、ビーズをグリシン緩衝液〔緩衝液Ａに０.２Mグリシンを追加し、ＨＣlでｐH２.０にする〕に懸濁させ、１時間回転させ、ペレット化した。この上清（「グリシン溶出液」；２００μl）を、１Mトリス塩基（３０ml）の添加によって中和し、４℃で保存した。
【０１４４】
５．増殖：各組の条件のもと各組のビーズからのhＧＨ溶出液およびグリシン溶出液の一部を用いて対数増殖期のＸＬ１-Ｂlue細胞の独立した培養物を感染させた。形質導入は、ファージをＸＬ１-Ｂlue細胞（１ml）と混合し、３７℃で２０分間インキュベートし、次いでＫ０７（moi＝１００）を加えることによって行なった。培養物（２５mlの２ＹＴとカルベニシリン）を上記のように増殖させ、ファージの次のプールを上記のように調製した。
【０１４５】
ファージの結合、溶離および増殖を、上記のサイクルに従って、連続ラウンドで行なった。例えば、hＧＨbpビーズからのhＧＨ溶出液から増幅したファージをhＧＨbpビーズでもう一度選択し、hＧＨで溶離し、次いでＸＬ１-Ｂlue細胞の新鮮培養物の感染に用いた。上記の選択法のそれぞれに対して５ラウンドの選択および増殖の３ラウンドを実施した。
【０１４６】
選択したファージミドのＤＮＡ配列決定
各サイクルのhＧＨおよびグリシン溶離工程からのファージの一部をＸＬ１-Ｂlue細胞の接種に用い、これをカルベニシリンおよびテトラサイクリン含有のＬＢ培地にプレーティングして各ファージプールに由来する独立したクローンを得た。単離したコロニーから１本鎖ＤＮＡを調製し、突然変異カセット領域の配列決定を行なった。このＤＮＡ配列決定の結果を、図５、図６、図７および図８に推定アミノ酸配列としてまとめる。
【０１４７】
hＧＨ突然変異体の発現および検定
hＧＨbpに対する選択したhＧＨ突然変異体の一部の結合親和性を測定するため、配列決定したクローン由来のＤＮＡを大腸菌株１６Ｃ９に導入した。上記のように、この株は非サプレッサー株であり、hＧＨの最後のＰhe-１９１残基の後でタンパク質の翻訳を終止させる。１本鎖ＤＮＡをこれらの形質転換に用いたが、２本鎖ＤＮＡまたは全ファージであっても、遊離ホルモンの発現用の非サプレッサー株中に容易に電気穿孔導入することができる。
【０１４８】
hＧＨの突然変異体は、hＧＨについて記載されているように、硫酸アンモニウム沈澱により浸透圧ショックを与えた細胞から調製した〔Olsonら, Nature 293: 408-411 (1981)〕。また、タンパク質濃度は、hＧＨを標準として用いて、クーマシー染色ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルのレーザー・デンシトメトリーによって測定した〔CunninghamおよびWells, Science 244: 1081-1085 (1989)〕。
【０１４９】
各突然変異体の結合親和性は、抗-受容体モノクローナル抗体（Ｍab２６３）を用い、文献〔Spencerら, J.Biol.Chem. 263: 7862-7867 (1988); Fuhら, J.Biol.Chem. 265: 3111-3115 (1990)〕記載のように125Ｉ hＧＨを置換することによって測定した。
【０１５０】
異なる経路（図６）によって選択したhＧＨ突然変異体数の結果を表VIIに示す。これら突然変異体の多くが、hＧＨbpに対して野生型hＧＨよりも強い結合親和性を有している。最も改善された突然変異体であるＫＳＹＲは、野生型hＧＨよりも５.６倍高い結合親和性を有している。これら検定した突然変異体の中で選択された最も弱い突然変異体は、hＧＨに比べて結合親和性が約１０倍低いものでしかなかった。
【０１５１】
結合検定は、hＰＲＬbp-結合に対して選択した突然変異体について実施することもできる。
【０１５２】
表VII. hＧＨbpに対する競合結合
それぞれの突然変異体が見い出された選択したプールを、１Ｇ（第１のグリ
シン選択）、３Ｇ（第３のグリシン選択）、３Ｈ（第３のhＧＨ選択）、３*（第３の選択：hＰＲＬbpに結合しなかったがhＧＨbpに結合した）と表示する。配列決定したすべてのクローンの中に現れる各突然変異体の回数を（ ）に示す。

突然変異体            Ｋd (nM)      Ｋd（突然変異体）    プール
／Ｋd（hＧＨ）                    
ＫＳＹＲ(６)        ０.０６＋０.０１      ０.１８      １Ｇ、３Ｇ
ＲＳＦＲ            ０.１０＋０.０５      ０.３０      ３Ｇ
ＲＡＹＲ            ０.１３＋０.０４      ０.３７      ３*
ＫＴＹＫ(２)        ０.１６＋０.０４      ０.４７      Ｈ、３Ｇ
ＲＳＹＲ(３)        ０.２０＋０.０７      ０.５８      １Ｇ、３Ｈ、３Ｇ
ＫＡＹＲ(３)        ０.２２＋０.０３      ０.６６      ３Ｇ
ＲＦＦＲ(２)        ０.２６＋０.０５      ０.７６      ３Ｈ
ＫＱＹＲ            ０.３３＋０.０３      １.０        ３Ｇ
ＫＥＦＲ＝wt(９)    ０.３４＋０.０５      １.０        ３Ｈ、３Ｇ、３*
ＲＴＹＨ            ０.６８＋０.１７      ２.０        ３Ｈ
ＱＲＹＲ            ０.８３＋０.１４      ２.５        ３*
ＫＫＹＫ            １.１  ＋０.４        ３.２        ３*
ＲＳＦＳ(２)        １.１  ＋０.２        ３.３        ３Ｇ、*
ＫＳＮＲ            ３.１  ＋０.４        ９.２        ３*             
【０１５３】
結合に及ぼす加成および非加成効果
一部の残基において、特定アミノ酸の置換が周囲残基とは独立した実質的に同じ作用を有している。例えば、１７２Ｒ／１７４ＳのバックグラウンドにおいてＦ１７６Ｙの置換は結合親和性を２.０倍減少させる（ＲＳＦＲ対ＲＳＹＲ）。同様に、１７２Ｋ／１７４ＡのバックグラウンドにおいてＦ１７６Ｙ突然変異体（ＫＡＹＲ）の結合親和性は、対応する１７６Ｆ突然変異体〔ＫＡＦＲ；CunninghamおよびWells (1989)〕よりも２.９倍弱い。
【０１５４】
他方、いくつかの選択したhＧＨ突然変異体について測定した結合定数は、残基１７２、１７４、１７６および１７８における一部のアミノ酸置換の非加成性の効果を示す。例えば、１７２Ｋ／１７６Ｙのバックグラウンドにおいて、Ｅ１７４Ｓの置換は、Ｅ１７４Ａを含有する対応する突然変異体（ＫＡＹＲ）よりも３.７倍強固にhＧＨbpと結合する突然変異体（ＫＳＹＲ）を与える結果になる。しかし、１７２Ｒ／１７６Ｙのバックグラウンドにおいて、これらＥ１７４置換の効果は逆になる。この場合、Ｅ１７４Ａ突然変異体（ＲＡＹＲ）はＥ１７４Ｓ突然変異体（ＲＳＹＲ）よりも１.５倍強固に結合する。
【０１５５】
このような近接残基における置換の結合に及ぼす非加成性効果は、いくつかの位置においてランダム化されたライブラリーから最適突然変異体を選択する手段としてのタンパク質-ファージ結合選択の用途を示すものである。詳細な構造の情報が存在せず、このような選択法がないと、最適突然変異体の発見までに多数の置換の組合せが試されることになるであろう。
【０１５６】
実施例IX  ホルモン−ファージのヘリックス１ランダムカセットライブラリーからのhＧＨ突然変異体の選択
【０１５７】
実施例VIIIに記載した方法を用いて、hＧＨbpおよび／またはhＰＲＬbpへの結合に関与しているhＧＨの別の領域、即ちヘリックス１の残基１０、１４、１８、２１をphＧＨam-g３pベクター（pＳ０６４３としても知られている；実施例VIIIを参照）におけるランダム突然変異誘発の標的とした。
【０１５８】
我々は「アンバー」hＧＨ-g３構築物（phＧＨam-g３pと呼ぶ）の使用を選択したが、この理由はそれが結合に対してより接近しやすい標的タンパク質hＧＨを作成するようであるためである。このことは、モノクローナル抗体結合の比較ＥＬＩＳＡ検定からのデータによって支持される。pＳ０１３２〔S.Bass, R.Greene, J.A.Wells, Proteins 8: 306 (1990)〕およびphＧＨam-g３の両方から生成したファージを、hＧＨのカルボキシ末端の近くに結合決定基を有することが知られている３種の抗体（Medix２、１Ｂ５.Ｇ２、および５Ｂ７.Ｃ１０）〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989); B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989); L.JinおよびJ.Wells（未公表の結果）〕、ならびにヘリックス１および３中の決定基を認識する１種の抗体（Medix１）〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989); B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989)〕を用いて試験した。phＧＨam-g３からのファージミド粒子は、pＳ０１３２からのファージミド粒子よりも抗体Medix２、１Ｂ５.Ｇ２および５Ｂ７.Ｃ１０とさらに強く反応した。特に、pＳ０１３２粒子の結合は、Medix１に対する結合と比較して、Medix２および５Ｂ７.Ｃ１０の両方に対しては＞２０００倍減少し、１Ｂ５.Ｇ２に対しては＞２５倍減少した。一方、phＧＨam-g３ファージの結合は、Medix１に対する結合と比較して、Medix２、１Ｂ５.Ｇ２および５Ｂ７.Ｃ１０抗体に対してそれぞれ約１.５倍、１.２倍および２.３倍弱くなるにすぎなかった。
【０１５９】
カセット突然変異誘発によるヘリックス１ライブラリーの作成
アラニン-スキャニング突然変異誘発〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989); B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989)，15, 16〕によって以前に同定されていたヘリックス１中の残基に突然変異を行なって、hＧＨおよび／またはhＰＲＬ受容体（それぞれ、hＧＨbpおよびhＰＲＬbpと呼ぶ）の細胞外ドメインの結合を変調させた。カセット突然変異誘発は実質的に文献〔J.A.Wells, M.Vasser, D.B.Powers, Gene 34: 315 (1985)〕記載のように行なった。このライブラリーは、オリゴヌクレオチド：
5'-GCC TTT GAC AGG TAC CAG GAG TTT G-3' および
5'-CCA ACT ATA CCA CTC TCG AGG TCT ATT CGA TAA C-3'
をそれぞれ用いる突然変異誘発によって唯一のＫpnＩ（hＧＨコドン２７のところ）およびＸhoＩ（hＧＨコドン６のところ）制限部位（下線部）が挿入されたphＧＨam-g３〔T.A.Kunkel, J.D.Roberts, R.A.Zakour, Methods Enzymol. 154: 367-382〕の突然変異体を用いる、４残基を一度にすべて突然変異させるカセット突然変異誘発（実施例VIIIを参照）によって作成した。また、後者のオリゴは＋１のフレームシフト（下線部の最後のＧ）を導入し、これが出発ベクターからの翻訳を終止させ、ファージミドライブラリー中の野生型のバックグラウンドを最少にした。この出発ベクターをｐH０５０８Ｂと命名した。hＧＨ残基１０、１４、１８、２１を突然変異させたヘリックス１ライブラリーは、相補性オリゴヌクレオチド：
5'-pTCG AGG CTC NNS GAC AAC GCG NNS CTG CGT GCT NNS CGT CTT NNS CAG 
CTG GCC TTT GAC ACG TAC-3' および
5'-pGT GTC AAA GGC CAG CTG SNN AAG ACG SNN AGC ACG CAG SNN CGC GTT 
GTC SNN GAG CC-3'
から調製したカセットを、ｐH０５０８Ｂの大きいＸhoＩ−ＫpnＩフラグメントに連結することによって作成した。このＫpnＩ部位は連結生成物の連結部において破壊され、非突然変異バックグラウンドの分析に制限酵素消化を使用することを可能にした。
【０１６０】
このライブラリーは少なくとも１０7の別個の形質転換体を含んでおり、このライブラリーが完全にランダム（１０6の異なるコドン組合せ）であるときには、平均して約１０コピーのそれぞれ可能な突然変異hＧＨ遺伝子が得られる。ＫpnＩを用いる制限分析により、ヘリックス１ライブラリー構築物の少なくとも８０％が挿入されたカセットを含有していることがわかった。
【０１６１】
このライブラリーからのhＧＨ-ファージの結合豊富化を、既述（実施例VIII）のようにオキシラン-ポリアクリルアミドビーズ（Sigma Chemical Co.）上に固定化したhＧＨbpを用いて行なった。ヘリックス１中の４つの残基（Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８およびＨ２１）が同じように突然変異され、４および６サイクル後に非野生型コンセンサスが現れた（表VIII）。ヘリックス１の疎水性面の１０位は疎水性である傾向にあり、一方、親水性面の２１および１８位は傾向的にＡsnが優勢であり、１４位には明白なコンセンサスが認められなかった（表IX）。
【０１６２】
hＧＨbpに対するこれらhＧＨ突然変異体の結合定数は、非サプレッサー大腸菌株１６Ｃ９中で遊離のホルモン変異体を発現させ、このタンパク質を精製し、そしてhＧＨbpからの標識化wt-hＧＨの競合置換により検定することによって測定した（実施例VIIIを参照）。示したように、いくつかの突然変異体がwt-hＧＨが結合するよりもhＧＨbpに強く結合する。
【０１６３】
表VIII．hＧＨヘリックス１突然変異体の選択
ファージミド粒子上に発現されたhＧＨ変異体（残基Ｆ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１においてランダム突然変異）を、hＧＨbp-ビーズへの結合、およびhＧＨ（０.４mM）緩衝液と次いでグリシン（０.２M、ｐH２）緩衝液による溶離によって選択した（実施例VIIIを参照）。

Ｇly溶離
Ｆ１０        Ｍ１４        Ｈ１８        Ｈ２１  
４サイクル
Ｈ            Ｇ            Ｎ            Ｎ
Ａ            Ｗ            Ｄ            Ｎ(2)
Ｙ            Ｔ            Ｖ            Ｎ
Ｉ            Ｎ            Ｉ            Ｎ
Ｌ            Ｎ            Ｓ            Ｈ
Ｆ            Ｓ            Ｆ            Ｇ
６サイクル
Ｈ            Ｇ            Ｎ            Ｎ(6)
Ｆ            Ｓ            Ｆ            Ｌ
コンセンサス
Ｈ            Ｇ            Ｎ            Ｎ    
【０１６４】
表IX．選択したヘリックス１ライブラリーからのコンセンサス配列
観察された頻度は、表示したアミノ酸を有する配列決定した全クローンの分数である。名目頻度はＮＮＳの３２コドン縮重に基づいて計算した。最大豊富化因子は、ある残基に対する名目頻度値に依存して１１〜３２に変化する。単一のアラニン突然変異に対する〔Ｋd（Ａla突然変異体）／Ｋd（wt-hＧＨ）〕の値は、文献〔B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081(1989)；B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 247: 1461(1990)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407(1991)〕から採用した。

野生型    Ｋd(Ａla突然変異体)  選択した          頻度        
残基      ／Ｋd(wt-hＧＨ)    残基         観察       名目      豊富化
Ｆ１０         ５.９            Ｈ        ０.５０    ０.０３１    １７
Ｆ        ０.１４    ０.０３１      ５
Ａ        ０.１４    ０.０６２      ２
Ｍ１４         ２.２            Ｇ        ０.５０    ０.０６２      ８
Ｗ        ０.１４    ０.０３１      ５
Ｎ        ０.１４    ０.０３１      ５
Ｓ        ０.１４    ０.０９３      ２
Ｈ１８         １.６            Ｎ        ０.５０    ０.０３１    １７
Ｄ        ０.１４    ０.０３１      ５
Ｆ        ０.１４    ０.０３１      ５
Ｈ２１         ０.３３          Ｎ        ０.７９    ０.０３１    ２６
Ｈ        ０.０７    ０.０３１      ２ 
【０１６５】
表Ｘ．hＧＨbpに対する精製したhＧＨヘリックス１突然変異体の結合
競合結合実験は、〔125Ｉ〕hＧＨ（野生型）、hＧＨbp（細胞外受容体ドメイン、残基１〜２３８を含む）、およびＭab２６３〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989)〕を用いて行なった。数値Ｐは、１またはそれ以上の選択ラウンド後に配列決定した全クローン中の各突然変異体の発生率を分数で示すものである。

配列の位置          Ｐ     Kd(nM)＼f（Kd突然変異体）  Kd(wt-hGH)
１０ １４ １８ ２１
Ｈ   Ｇ   Ｎ   Ｎ     ０.５０     ０.１４±０.０４      ０.４２
Ａ   Ｗ   Ｄ   Ｎ     ０.１４     ０.１０±０.０３      ０.３０
wt＝  Ｆ   Ｍ   Ｈ   Ｈ     ０          ０.３４±０.０５      (1)
Ｆ   Ｓ   Ｆ   Ｌ     ０.０７     ０.６８±０.１９      ２.０
Ｙ   Ｔ   Ｖ   Ｎ     ０.０７     ０.７５±０.１９      ２.２
Ｌ   Ｎ   Ｓ   Ｈ     ０.０７     ０.８２±０.２０      ２.４
Ｉ   Ｎ   Ｉ   Ｎ     ０.０７     １.２  ±０.３１      ３.４    
【０１６６】
実施例Ｘ  ホルモン−ファージの豊富化により予め見い出した突然変異を含むヘリックス４ランダムカセットライブラリーからのhＧＨ変異体の選択
ホルモン−ファージを用いる反復選択による改善された結合性を有する突然変異タンパク質の設計
hＧＨ進化変異体の新入の非結合相同体を用いる我々の実験から、多数の独立したアミノ酸置換を組合せることによって特定受容体との結合に関してhＧＨの累積して改善された突然変異体を得ることができると示唆される〔B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 247: 1461 (1990); B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407 (1991); H.B.Lowman, B.C.Cunningham, J.A.Wells, J.Biol.Chem. 266, 印刷中 (1991)〕。
【０１６７】
hＧＨ受容体にさらに強固に結合することがわかったヘリックス４aライブラリーから選択したヘリックス４の二重突然変異体（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ；実施例VIIIを参照）をさらに改善する試みにおいて、ヘリックス４bライブラリーを作成した。Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ hＧＨ突然変異体をバックグラウンドの出発ホルモンとして用いて、ヘリックス４の親水性面上の１７４および１７６位の周りの残基に突然変異を行なった。
【０１６８】
カセット突然変異誘発によるヘリックス４bライブラリーの作成
実質的に文献〔J.A.Wells, M.Vasser, D.B.Powers, Gene 34: 315 (1985)〕記載のようにしてカセット突然変異誘発を行なった。唯一のＢstＥIIおよびＢglII制限部位が予め挿入されたphＧＨam-g３（実施例VIII）の突然変異体を用い、４残基を一度にすべて突然変異させるカセット突然変異誘発（実施例VIIIを参照）を用いて、Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙバックグラウンド内で残基１６７、１７１、１７５および１７９を突然変異させたヘリックス４bライブラリーを作成した。相補性オリゴヌクレオチド：
5'-pG TTA CTC TAC TGC TTC NNS AAG GAC ATG NNS AAG GTC AGC NNS TAC 
CTG CGC NNS GTG CAG TGC A-3' および
5'-pGA TCT GCA CTG CAC SNN GCG CAG GTA SNN GCT GAC CTT SNN CAT GTC 
CTT SNN GAA GCA GTA GA-3'
から調製したカセットを、ベクターのＢstＥII−ＢglII部位に挿入した。このＢstＥII部位は連結したカセットにおいて削除された。このヘリックス４bライブラリー由来の１５の選択されなかったクローンを配列決定した。これらのうち、カセット挿入体を欠くものはなく、２０％がフレームシフトしており、７％が非サイレント突然変異を有していた。
【０１６９】
hＧＨbp豊富化の結果
このライブラリーからのhＧＨ-ファージの結合豊富化を、既述（実施例VIII）のようにオキシラン-ポリアクリルアミドビーズ（Sigma Chemical Co.）上に固定化したhＧＨbpを用いて行なった。６サイクルの結合の後に、合理的かつ明白なコンセンサスが現れた（表XI）。興味あることに、すべての位置が極性の残基、特にＳer、ＴhrおよびＡsnを含有する傾向があった（表XII）。
【０１７０】
hＧＨ突然変異体の検定
hＧＨbpに対するこれらhＧＨ突然変異体の一部の結合定数を、非サプレッサー大腸菌株１６Ｃ９中で遊離のホルモン変異体を発現させ、このタンパク質を精製し、そしてhＧＨbpからの標識化wt-hＧＨの競合置換により検定することによって測定した（実施例VIIIを参照）。示したように、いくつかのヘリックス４b突然変異体のhＧＨbpに対する結合親和性はwt-hＧＨのものよりも強固であった（表XIII）。
【０１７１】
hＧＨ変異体の受容体選択性
最後に、我々は、hＰＲＬbpに結合する能力について、いくつかの一層強固なhＧＨbp結合突然変異体の結合親和性の分析を始めた。Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ突然変異体は、hＧＨに比べてhＰＲＬbpに２００倍弱く結合する。Ｅ１７４Ｔ／Ｆ１７６Ｙ／Ｒ１７８ＫおよびＲ１６７Ｎ／Ｄ１７１Ｓ／Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ／Ｉ１７９Ｔ突然変異体のそれぞれは、hＧＨに比べhＰＲＬbpに＞５００倍弱く結合する。即ち、ファージ表示法によってhＧＨの新規な受容体選択性突然変異体を得ることができる。
【０１７２】
ホルモン−ファージミド選択によって同定される特定残基の情報内容
３種のhＧＨ−ファージミドライブラリー（実施例VIII、IX、Ｘ）において突然変異させた１２残基のうち、４種が野生型残基の強い（他を排除するものではない）保存を示した（Ｋ１７２、Ｔ１７５、Ｆ１７６およびＲ１７８）。驚くべきことではないが、Ａlaに変換したときにhＧＨbpに対する結合親和性に最大の破壊（４〜６０倍）を引き起こす残基が存在した。Ａla置換が結合に対してより弱い作用（２〜７倍）を引き起こす一群の４個の他の残基（Ｆ１０、Ｍ１４、Ｄ１７１およびＩ１７９）が存在し、これらの位置はわずかの野生型コンセンサスしか示さなかった。最後に、hＰＲＬbpへの結合を促進したがhＧＨbpへの結合は促進しなかった別の４残基（Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７およびＥ１７４）は、hＧＨbp-ビーズによる選択によって野生型hＧＨ配列に対してどのようなコンセンサスも示さなかった。事実、２つの残基（Ｅ１７４およびＨ２１）は、Ａla置換したときにhＧＨbpに対する結合親和性を２〜４倍に高める〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989)；B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 247: 1461 (1990)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407 (1991)〕。即ち、アラニン-スキャニング突然変異誘発データは、それぞれの位置を置換する可変性と十分合理的に関係している。事実、アラニン置換によって引き起こされる結合親和性の減少〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989)；B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 247: 1461 (1990)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407 (1991)〕は、３〜６ラウンドの選択後にファージミドプール中に野生型残基が見い出される割合を合理的に予言するものとなる。アラニン-スキャニングの情報は結合を変調させる側鎖を標的化するのに有用であり、ファージ選択は側鎖の最適化に、および置換のための各部位（および／または部位の組合せ）の可変性を定義するのに適している。スキャニング突然変異法〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989)〕とファージ表示の組合せは、受容体−リガンドの界面の設計およびインビトロでの分子進化の研究に対する強力な手段である。
【０１７３】
ホルモン−ファージミドライブラリーの反復豊富化の変異
hＧＨ中の組合せ突然変異が受容体に対する結合親和性に加成効果を有している場合には、結合を改良するためのホルモン−ファージミド豊富化により既知となった突然変異を、単に制限フラグメントの切断と連結または突然変異誘発によって組合わせてhＧＨの累積して最適化された突然変異体を得ることができる。
【０１７４】
一方、受容体結合を最適化するhＧＨの１つの領域における突然変異が、分子の重なり合うかまたは別の領域における突然変異と構造的または機能的に適合しないこともある。このような場合には、以下に挙げる反復豊富化法のいくつかの変法のいずれかによってホルモン−ファージミド豊富化を行なうことができる：
(1)カセットまたは他の突然変異誘発法によって分子の２つ（または、恐らくはそれ以上）の領域のそれぞれにおいてランダムＤＮＡライブラリーを創製することができる：次いで、これら２つのＤＮＡライブラリーからの制限フラグメントの連結によって混合ライブラリーを創製することができる；(2)分子の１つの領域における突然変異により結合を最適化されたhＧＨ変異体を、ヘリックス４bライブラリーの例のように分子の第２の領域においてランダムに突然変異させることができる；(3)２またはそれ以上のランダムライブラリーを、ホルモン−ファージミド豊富化により、改善された結合について部分的に選択することができる：この最適化結合部位の「粗選択」の後、なお部分的な別のライブラリーを制限フラグメントの連結によって再混合して、分子の２またはそれ以上の領域において部分的に異なっている単一のライブラリーを得ることができ、次いでこのライブラリーをホルモン−ファージミド豊富化を用いて最適化結合についてさらに選択することができる。
【０１７５】
表XI．４および６サイクルの豊富化の後にヘリックス４bライブラリーから選択したhＧＨの突然変異ファージミド
それぞれがＥ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ二重突然変異を含むhＧＨヘリックス４b突然変異体（残基１６７、１７１、１７５、１７９においてランダム突然変異）を、hＧＨbp-ビーズへの結合、およびhＧＨ（０.４mM）緩衝液と次いでグリシン（０.２M、ｐH２）緩衝液による溶離によって選択した。１つの突然変異体（＋）が疑突然変異Ｒ１７８Ｈを含んでいた。
【０１７６】

Ｒ１６７      Ｄ１７１      Ｔ１７５      Ｉ１７９  
４サイクル
Ｎ            Ｓ            Ｔ            Ｔ
Ｋ            Ｓ            Ｔ            Ｔ
Ｓ            Ｎ            Ｔ            Ｔ
Ｄ            Ｓ            Ｔ            Ｔ
Ｄ            Ｓ            Ｔ            Ｔ＋
Ｄ            Ｓ            Ａ            Ｔ
Ｄ            Ｓ            Ａ            Ｎ
Ｔ            Ｄ            Ｔ            Ｔ
Ｎ            Ｄ            Ｔ            Ｎ
Ａ            Ｎ            Ｔ            Ｎ
Ａ            Ｓ            Ｔ            Ｔ
６サイクル
Ｎ            Ｓ            Ｔ            Ｔ(2)
Ｎ            Ｎ            Ｔ            Ｔ
Ｎ            Ｓ            Ｔ            Ｑ
Ｄ            Ｓ            Ｓ            Ｔ
Ｅ            Ｓ            Ｔ            Ｉ
Ｋ            Ｓ            Ｔ            Ｌ
コンセンサス
Ｎ            Ｓ            Ｔ            Ｔ
Ｄ            Ｎ     
【０１７７】
表XII．選択したライブラリーからのコンセンサス配列
観察された頻度は、表示したアミノ酸を有する配列決定した全クローンの分数である。名目頻度はＮＮＳの３２コドン縮重に基づいて計算した。最大豊富化因子は、ある残基に対する名目頻度値に依存して１１〜１６〜３２に変化する。単一のアラニン突然変異に対する〔Ｋd（Ａla突然変異体）／Ｋd（wt-hＧＨ）〕の値は、以下の文献から採用した；１７５位に対してはＴ１７５Ｓ突然変異体の値のみ〔B.C.Cunningham, P.Jhurani, P.Ng, J.A.Wells, Science 243: 1330 (1989)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Science 244: 1081 (1989)；B.C.Cunningham, D.J.Henner, J.A.Wells, Science 247: 1461 (1990)；B.C.CunninghamおよびJ.A.Wells, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 3407 (1991)〕。
【０１７８】

野生型    Ｋd(Ａla突然変異体)  選択した          頻度        
残基      ／Ｋd(wt-hＧＨ)      残基         観察       名目      豊富化
Ｒ１６７      ０.７５           Ｎ        ０.３５    ０.０３１    １１
Ｄ        ０.２４    ０.０３１      ８
Ｋ        ０.１２    ０.０３１      ４
Ａ        ０.１２    ０.０６２      ２
Ｄ１７１      ７.１             Ｓ        ０.７６    ０.０９３      ８
Ｎ        ０.１８    ０.０３１      ６
Ｄ        ０.１２    ０.０３１      ４
Ｔ１７５      ３.５             Ｔ        ０.８８    ０.０６２    １４
Ａ        ０.１２    ０.０３１      ４
Ｉ１７９      ２.７             Ｔ        ０.７１    ０.０６２    １１
Ｎ        ０.１８    ０.０３１      ６ 
【０１７９】
表XIII．hＧＨbpに対する精製したhＧＨ突然変異体の結合
競合結合実験は、〔125Ｉ〕hＧＨ（野生型）、hＧＨbp（細胞外受容体ドメイン、残基１〜２３８を含む）、およびＭab２６３(11)を用いて行なった。数値Ｐは、１またはそれ以上の選択ラウンド後に配列決定した全クローン中の各突然変異体の発生率を分数で示すものである。ヘリックス４b突然変異（*）はhＧＨ（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ）のバックグラウンドにあることに注意すべきである。このヘリックス４b突然変異のリストにおいて、１６７、１７１、１７５、１７９にwt残基を有するＥ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ突然変異体（*）は下線で示す。
【０１８０】

配列の位置              Ｐ        Ｋd(nM)  Ｋd(Ａla突然変異体)
／Ｋd(wt-hＧＨ)    
＊     ＊     ＊     ＊
１６７ １７１ １７５ １７９
Ｎ     Ｓ     Ｔ     Ｔ    ０.１８    ０.０４±０.０２    ０.１２
Ｅ     Ｓ     Ｔ     Ｉ    ０.０６    ０.０４±０.０２    ０.１２
Ｋ     Ｓ     Ｔ     Ｌ    ０.０６    ０.０５±０.０３    ０.１６
Ｎ     Ｎ     Ｔ     Ｔ    ０.０６    ０.０６±０.０３    ０.１７
Ｒ Ｄ Ｔ Ｉ ０ ０.０６±０.０１ （０.１８）
Ｎ     Ｓ     Ｔ     Ｑ    ０.０６    ０.２６±０.１１    ０.７７    
【０１８１】
実施例XI  ファージミド表面におけるＦab分子の組立て
プラスミドの構築
プラスミドpＤＨ１８８は、ＨＥＲ-２受容体を認識する４Ｄ５と呼ばれるヒト化ＩgＧ抗体のＦab部分をコードしているＤＮＡを含有する。このプラスミドは大腸菌株ＳＲ１０１中に含まれ、ＡＴＣＣ〔Rockville, MD〕に寄託されている。
【０１８２】
簡単に説明すると、このプラスミドは次のようにして調製された。出発プラスミドは、上記のアルカリホスファターゼプロモーターを含有するpＳ０１３２である。ヒト成長ホルモンをコードしているＤＮＡを切り出し、プラスミドの末端を連結に適合するようにする一連の操作を行なった後、４Ｄ５をコードしているＤＮＡを挿入した。この４Ｄ５ ＤＮＡは２つの遺伝子を含有している。第１の遺伝子は、軽鎖の可変および不変領域をコードしており、その５′末端にstIIシグナル配列をコードしているＤＮＡを含有する。第２の遺伝子は４つの部分を含有し、その第１は５′末端のstIIシグナル配列をコードしているＤＮＡである。これに重鎖の可変ドメインをコードしているＤＮＡが続き、次いで重鎖不変領域の第１ドメインをコードしているＤＮＡが続き、さらにＭ１３遺伝子IIIをコードしているＤＮＡが続く。この構築物の顕著な特徴が図１０に示されている。４Ｄ５をコードしているＤＮＡの配列を図１１に示す。
【０１８３】
大腸菌の形質転換およびファージの生成
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および電気穿孔の両方を用いて、ＳＲ１０１細胞にプラスミドを導入した。ＰＥＧコンピテントな細胞は、ChungおよびMiller〔Nucleic Acids Res. 16: 3580 (1988)〕の方法に従って調製し、形質転換した。電気穿孔にコンピテントな細胞は、ZabarovskyおよびWinberg〔Nucleic Acids Res. 18: 5912 (1990)〕の方法に従って調製し、次いで電気穿孔により形質転換した。ＳＯＣ培地〔Sambrookら（上記）が記載〕(１ml)に細胞を蒔いた後、振盪しながら３７℃で１時間増殖させた。この時点で、細胞濃度をＯＤ600の光分散を用いて測定した。滴定したＫＯ７ファージストックを加えて感染多重度（ＭＯＩ）が１００となるようにし、このファージを室温で２０分間、細胞に付着させた。次いで、この混合物を２ＹＴブロス〔Sambrookら（上記）が記載〕(２５ml）中に希釈し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、５０００ｘｇで１０分間遠心することによって細胞をペレット化し、上清を集め、０.５Ｍ ＮaＣlおよび４％ＰＥＧ（最終濃度）を用いて室温で１０分間、ファージ粒子を沈澱させた。１０,０００ｘｇで１０分間遠心することによってファージ粒子をペレット化し、ＴＥＮ〔１０mMトリス（ｐH７.６）、１mM ＥＤＴＡ、および１５０mM ＮaＣl〕(１ml)に再懸濁し、４℃で保存した。
【０１８４】
抗原被覆したプレートの調製
０.１M炭酸水素ナトリウム（ｐH８.５）中のＢＳＡ（対照抗原）の０.５mg/ml溶液またはＨＥＲ−２抗原の細胞外ドメイン（ＥＤＣ）の０.１mg/ml溶液からの０.５mlづつを用いて、Falcon１２ウエル組織培養プレートのウエルを被覆した。溶液をウエルに適用した後、このプレートを揺れ台の上にて４℃で一晩インキュベートした。次いで、最初の溶液を除去し、ブロック緩衝液〔０.１M炭酸水素ナトリウム中に３０mg/ml ＢＳＡ〕(０.５ml）を適用し、そして室温で１時間インキュベートすることによって、プレートをブロックした。最後に、このブロック緩衝液を除去し、緩衝液Ａ〔ＰＢＳ、０.５％ＢＳＡ、および０.０５％ツイーン２０〕(１ml）を加え、そしてこのプレートをファージ選択に使用するまで４℃で１０日間まで保存した。
【０１８５】
ファージの選択法
約１０9のファージ粒子を１００倍過剰のＫＯ７ヘルパーファージおよび緩衝液Ａ（１ml）と混合した。この混合物を０.５mlづつ２つに分け、その１つをＥＣＤ被覆ウエルに適用し、他方をＢＳＡ被覆ウエルに適用した。これらのプレートを振盪させながら室温で１〜３時間インキュベートし、次いで緩衝液Ａ（１mlづつ）を用いて３０分間、３回洗浄した。プレートからのファージの溶離は次の２つの方法のいずれかにより室温で行なった：(1)０.０２５mg/mlの精製Ｍu４Ｄ５抗体（ネズミ）の最初の一晩インキュベートとそれに続いて酸溶離緩衝液〔０.２Mグリシン（ｐH２.１）、０.５％ＢＳＡ、および０.０５％ツイーン２０〕(０.４ml）による３０分間インキュベート、または(2)酸溶離緩衝液単独によるインキュベート。次いで、溶出液を１Mトリス塩基で中和し、ＴＥＮ（０.５mlづつ）を加えた。次に、これら試料を増殖させ、滴定し、４℃で保存した。
【０１８６】
ファージの増殖
溶出したファージの一部を２ＹＴブロス（０.４ml）に加え、約１０8の中間対数期雄性大腸菌株ＳＲ１０１と混合した。ファージを室温で２０分間、細胞に付着させ、次いで５０μg/mlカルベニシリンおよび５μg/mlテトラサイクリンを含有する２ＹＴブロス（５ml）に加えた。これら細胞を、中間対数相に到達するまで３７℃で４〜８時間増殖させた。ＯＤ600を測定し、細胞をファージ生成用のＫＯ７ヘルパーファージに重感染させた。ファージ粒子を得た後、これらを滴定してコロニー形成単位（cfu）数を測定した。これは、あるファージストックの連続希釈液の一部を取り、中間対数期のＳＲ１０１に感染させ、５０νg／mlカルベニシリン含有のＬＢプレートにプレーティングすることにより行なった。
【０１８７】
ＲＩＡ親和性の測定
ＥＣＤ抗原に対するＦabファージおよびh４Ｄ５ Ｆabフラグメントの親和性を、競合受容体結合ＲＩＡ〔Burt,D.R., Receptor Binding in Drug Research, O'Brien,R.A.（編）, pp.3-29, Dekker, New York (1986)〕を用いて測定した。このＥＣＤ抗原は連続クロラミン-Ｔ法〔De Larco,J.E.ら, J.Cell.Physiol. 109: 143-152 (1981)〕を用いて125Ｉで標識した。これにより、受容体１モルあたり０.４７モルのヨウ素が導入された１４μCi/μgの比活性を有する放射活性トレーサーが得られた。０.５ng（ＥＬＩＳＡによる）のＦabまたはＦabファージ、５０nCiの125Ｉ-ＥＣＤトレーサー、およびある範囲量の未標識ＥＣＤ（６.４ng〜３２７７ng）を含有する一連の０.２ml溶液を調製し、室温で一晩インキュベートした。標識化ＥＣＤ-ＦabまたはＥＣＤ-Ｆabファージ コンプレックスを、抗ヒトＩgＧ（Fitzgerald 40-GH23）と６％ＰＥＧ８０００の添加により誘導される集合コンプレックスを形成させることによって、未結合の標識化抗原から分離した。このコンプレックスを遠心（１５,０００ｘｇで２０分間）によってペレット化し、標識化ＥＣＤの量（cpm）をガンマカウンターで測定した。解離定数（Ｋd）は、スカッチャード分析〔Scatchard,G., Ann.N.Y.Acad.Sci. 51: 660-672 (1949)〕を用いるプログラムＬＩＧＡＮＤの改良バージョン〔Munson,P.およびRothbard,D., Anal.Biochem. 107: 220-239 (1980)〕を用いて計算した。このＫd値を図１３に示す。
【０１８８】
競合細胞結合の検定
ロドゲン法を用い、125Ｉによりネズミ４Ｄ５抗体を４０〜５０μCi/μgの比活性に標識した。一定量の標識化抗体と増加量の未標識変異Ｆabを含有する溶液を調製し、９６ウエル微量滴定皿中のほぼ全面のＳＫ-ＢＲ-３細胞培養物に加えた（標識化抗体の最終濃度は０.１nMであった）。４℃で一晩インキュベートした後、上清を除去し、細胞を洗浄し、細胞に結合した放射活性をガンマカウンターで測定した。プログラムＬＩＧＡＮＤの改良バージョン〔Munson,P.およびRothbard,D.（上記）〕を用いてデータを分析することによってＫd値を決定した。
【０１８９】
プラスミドpＤＨ１８８（ＡＴＣＣ Ｎo.６８６６３）の寄託は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびその規則（ブダペスト条約）のもとに為されている。これにより、寄託日から３０年間の生存微生物の維持が確保されている。この微生物は、ブダペスト条約の条項のもとで、およびジェネンテク，インコーポレイテッドとＡＴＣＣの間の同意のもとでＡＴＣＣから入手可能となるものであり、関連米国特許の発行またはいずれかの米国もしくは外国特許出願の公開のいずれか早い方により、だれでもこの培養物の子孫を永続的かつ制限されずに入手可能になることが保証されており、また、３５ ＵＳＣ §１２２に従って権利を付与された米国特許商標庁長官およびそれに従う規則（８８６ ＯＧ ６３８に具体的に言及している３７ ＣＦＲ §１.１４を含む）によって決定された者に該子孫が入手可能になることが保証されている。
【０１９０】
本出願の譲受人は、寄託微生物が適切な条件下で培養されたときに死滅しているか、失われているか、または破壊されているときには、通知により該培養物の生存試料と速やかに交換することに同意している。寄託培養物の入手可能性は、各国特許法に従っていずれかの政府の権限のもとに認可された権利に違反して本発明を実施するライセンスと解釈すべきではない。
【０１９１】
以上に既述した明細書は、当業者に本発明の実施を可能ならしめるに十分であると考えられる。寄託が為された態様は本発明の特定態様の独立した例示として意図されており、機能的に等価なあらゆる培養物が本発明の範囲内にあるので、本発明は寄託された微生物によってその範囲を限定されるものではない。本明細書中の物質の寄託は、本明細書中に含まれる既述が本発明のいずれかの態様（最良の態様を含む）の実施を可能にするに不適切であるということを認めたものではなく、また、特許請求の範囲をその特定の例示に限定することを意図するものでもない。実際には、本明細書中で説明および示したものに加えて本発明の種々の修飾が上記既述から当業者には明白になるものであり、これらは添付した請求の範囲内に入るものである。
【０１９２】
必然的に本発明を好ましい態様との関係で説明したが、上記明細書を読んだ後に当業者なら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載した対象に種々の変化、等価置換、変異を加えることができるであろう。即ち、本発明は本明細書に具体的に記載した方法以外の方法で実施することができる。従って、本願の特許証により認められる保護は添付した請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるものである。
【０１９３】
実施例XII  ヘリックス１およびヘリックス４ ホルモン−ファージ変異体の組合せ体からのhＧＨ変異体の選択
hＧＨの加成変異体の作成
加成性の原理〔J.A.Wells, Biochemistry 29: 8509 (1990)〕によると、タンパク質の異なる部分の突然変異が相互に作用を及ぼしていないときであっても、それらを組合せることによって、別の分子に対する結合の遊離エネルギーにおいて加成的な変化が得られることが予想される（変化はΔΔＧbindingの点で加法的であるか、またはＫd＝exp〔−ΔＧ／ＲＴ〕の点で乗法的である）。即ち、結合親和性において２倍の増加を与える突然変異は、３倍の増加を引き起こす第２の突然変異と組合せたときに、出発変異体の６倍増加した親和性を有する二重突然変異を与えることが予想される。
【０１９４】
hＧＨ-ファージ選択によって得た複数の突然変異がhＧＨbp（hＧＨ−結合タンパク質；hＧＨ受容体の細胞外ドメイン）結合において累積的に良好な効果を与えるか否かを試験するため、ヘリックス１ライブラリーに由来するhＧＨの最も強固に結合する３種の変異体（実施例IX：Ｆ１０Ａ／Ｍ１４Ｗ／Ｈ１８Ｄ／Ｈ２１Ｎ、Ｆ１０Ｈ／Ｍ１４Ｇ／Ｈ１８Ｎ／Ｈ２１Ｎ、およびＦ１０Ｆ／Ｍ１４Ｓ／Ｈ１８Ｆ／Ｈ２１Ｌ）に見い出される突然変異を、ヘリックス４bライブラリーにおいて見い出される最も強固に結合する３種の変異体（実施例Ｘ：Ｒ１６７Ｎ／Ｄ１７１Ｓ／Ｔ１７５／Ｉ１７９Ｔ、Ｒ１６７Ｅ／Ｄ１７１Ｓ／Ｔ１７５／Ｉ１７９、およびＲ１６７Ｎ／Ｄ１７１Ｎ／Ｔ１７５／Ｉ１７９Ｔ）に見い出される突然変異と組合せた。
【０１９５】
１ヘリックス変異体のそれぞれからhＧＨ−ファージミド２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）を単離し、制限酵素ＥcoＲＩおよびＢstＸＩで消化した。次いで、それぞれのヘリックス４b変異体から大きいフラグメントを単離し、それぞれのヘリックス１変異体からの小さいフラグメントと連結して表XIIIに示す新規な２ヘリックス変異体を得た。さらに、これら変異体のすべては先のhＧＨ-ファージ結合選択において得られたＥ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙの突然変異を含有していた（詳細には実施例Ｘを参照）。
【０１９６】
hＧＨの選択組合せライブラリーの作成
加成性の原理は多数の突然変異の組合せに当てはまるようであるが、一部の組合せ（例えば、Ｆ１７６Ｙを伴うＥ１７４Ｓ）は明らかに非加成性である（実施例VIIIおよびＸを参照）。例えば、ヘリックス１中に４つの突然変異とヘリックス４中に４つの突然変異を有する最も強固に結合する変異体を確実性をもって同定するためには、理想的には８残基全部を一度に突然変異させ、次いで全体的に最も強固に結合する変異体のプールを選別することになるであろう。しかし、このようなプールは、２.６ｘ１０10の異なるポリペプチドをコードしている１.１ｘ１０12のＤＮＡ配列（ＮＮＳコドンの縮重を用いて）からなる。全変異体（恐らく、１０13の形質転換体）の表示を確実にするに十分大きなランダムファージミドライブラリーを得ることは、現在の形質転換法によっては実際的ではない。
【０１９７】
我々は、第１に、連続ラウンドの突然変異誘発を用い、１つのライブラリーから最も強固に結合する変異を取り、次いで他の残基を突然変異させてさらに結合を改善することによってこの難題に取り組んだ（実施例Ｘ）。第２の方法において、我々は、加成性の原理を用いて２つの独立して選別したライブラリーからの最良の突然変異を組合わせて、改善された結合を有する複数の突然変異体を創製した（上記）。ここで我々は、ランダムまたは部分的ランダム突然変異体の組合せライブラリーを創製することによって、hＧＨ中の１０、１４、１８、２１、１６７、１７１、１７５、および１７９位における可能な突然変異の組合せをさらに探索した。ヘリックス１ライブラリーからのプールしたファージミド（独立して０、２または４サイクル選別；実施例IX）およびヘリックス４bライブラリーからのプール（独立して０、２または４サイクル選別；実施例Ｘ）を用いてhＧＨ−ファージミドの３つの異なる組合せライブラリーを作成し、この組合せ変異体プールをhＧＨbp結合について選別した。ある量の配列多様性がこれらプールのそれぞれに存在するので、得られる組合せライブラリーは手で作成しうる配列の組合せよりも多くの配列組合せを調べることができる（例えば、表XIII）。
【０１９８】
１ヘリックスライブラリーのプール（０、２または４ラウンド選択）のそれぞれからhＧＨ−ファージミドの２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）を単離し、制限酵素ＡccＩおよびＢstＸＩで消化した。次いで、それぞれのヘリックス１変異体プールから大きいフラグメントを単離し、それぞれのヘリックス４b変異体プールからの小さいフラグメントと連結して、３つの組合せライブラリーｐH０７０７Ａ（実施例IXおよびＸに記載の未選択のヘリックス１およびヘリックス４bプール）、ｐH０７０７Ｂ（２回選択したヘリックス１プールと２回選択したヘリックス４bプール）、およびｐH０７０７Ｃ（４回選択したヘリックス１プールと４回選択したヘリックス４bプール）を得た。さらに、より少ないＤＮＡを用いて同じ連結を行ない、ｐH０７０７Ｄ、ｐH０７０７ＥおよびｐH０７０７Ｆ（それぞれ、０、２および４ラウンドの出発ライブラリーに対応する）と命名した。また、これら変異体プールのすべては、先のhＧＨ-ファージ結合選択で得られた突然変異Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙを含有していた（詳細については実施例Ｘを参照）。
【０１９９】
hＧＨ-ファージ変異体の組合せライブラリーの選別
連結生成物ｐH０７０７Ａ〜Ｆを加工処理し、記載（実施例VIII）のようにＸＬ１-Ｂlue細胞に電気導入した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）に基づいて、それぞれのプールから得られた形質転換体の数は次のようであった：ｐH０７０７Ａから２.４ｘ１０6、ｐH０７０７Ｂから１.８ｘ１０6、ｐH０７０７Ｃから１.６ｘ１０6、ｐH０７０７Ｄから８ｘ１０5、ｐH０７０７Ｅから３ｘ１０5、およびｐH０７０７Ｆから４ｘ１０5。hＧＨ−ファージミド粒子を調製し、実施例VIIIの記載のように２〜７サイクルにわたってhＧＨbp-結合について選択した。
【０２００】
hＧＨ−ファージミドライブラリーの迅速な選別
平衡結合親和性によって測定したときの強固に結合するタンパク質変異体についてのファージミドライブラリーの選別に加えて、受容体あるいは他の分子に対する結合のオン-速度（ｋon）またはオフ-速度（ｋoff）のどちらかが変化した変異体を選別することも重要である。熱力学から、これら速度は平衡解離定数 Ｋd＝（ｋoff／ｋon）に関係している。我々は、特定タンパク質の一部の変異体は結合に対して類似したＫdを有しているが、非常に異なったｋonおよびｋoffを有しているものと想定している。逆に、ある変異体と別の変異体のＫdの変化は、ｋonに対する効果、ｋoffに対する効果、またはその両方によるものであろう。タンパク質の薬理学的性質は、結合親和性またはｋonもしくはｋoffに依存していることもある（作用の詳細な機序に依存する）。ここで我々は、より高いオン-速度を有するhＧＨ変異体を同定してｋonの変化の効果を調べようとした。我々は、結合時間を増加させることによって、ならびに同族リガンド（hＧＨ）による洗浄時間および／または濃縮を増加させることによって、選択をｋoffの方に選択的に加重することができると想定している。
【０２０１】
固定化hＧＨbpに対する野生型hＧＨ−ファージミド結合の経時分析から、最終のｐH２洗浄液中に溶出されうる全hＧＨ−ファージミド粒子（全体の結合および溶離プロトコールについては実施例VIIIを参照）のうち、１０％未満が１分間のインキュベートの後に結合するが、９０％以上は１５分間のインキュベート後に結合するようである。
【０２０２】
「迅速な結合選択」のために、ｐH０７０７Ｂプール由来のファージミド粒子（ヘリックス１および４に対して独立して２回選択）を固定化hＧＨbpと１分間だけインキュベートし、次いで結合緩衝液（１ml）で６回洗浄した〔hＧＨ洗浄工程は削除し、残存するhＧＨ−ファージミド粒子はｐH２（結合緩衝液中の０.２Mグリシン）洗浄液で溶離した〕。非表示粒子に対するhＧＨ−ファージミド粒子の豊富化は、短時間の結合を用い、同族リガンド（hＧＨ）チャレンジを用いないときであっても、hＧＨ−ファージミド結合選択がランダム化プールから強固に結合する変異体を選別することを示した。
【０２０３】
hＧＨ突然変異体の検定
これらhＧＨ突然変異体の一部のhＧＨbpに対する結合定数を、非サプレッサー大腸菌株１６Ｃ９または３４Ｂ８中で遊離のホルモン変異体を発現させ、このタンパク質を精製し、そして放射免疫沈澱検定法におけるhＧＨbpからの標識化wt-hＧＨの競合置換（実施例VIIIを参照）により検定することによって測定した。以下の表XIII-Ａにおいて、すべての変異体はセリン174によって置換されたグルタメート174およびチロシン176によって置換されたフェニルアラニン176（Ｅ１７４ＳおよびＦ１７６Ｙ）に加えて、hＧＨアミノ酸の１０、１４、１８、２１、１６７、１７１、１７５および１７９位に表中に示した追加の置換を有している。
【０２０４】
表XIII-A．ヘリックス１およびヘリックス４b突然変異の加算によるhＧＨ
変異体

ヘリックス１              ヘリックス４      
野生型残基：    F10 M14 H18 H21 R167 D171 T175 I179
変異体
H0650AD        H      G      N      N        N      S      T     T
H0650AE        H      G      N      N        E      S      T      I
H0650AF        H      G      N      N        N      N      T      T
H0650BD        A      W      D      N        N      S      T      T
H0650BE        A      W      D      N        E      S      T      I
H0650BF        A      W      D      N        N      N      T      T
H0650CD        F      S      F      L        N      S      T      T
H0650CD        F      S      F      L        E      S      T      I
H0650CD        F      S      F      L        N      N      T      T  
【０２０５】
以下の表XIVにおいて、hＧＨ変異体を、ファージミド結合選択法によって組合せライブラリーから選択した。表XIV中のすべてのhＧＨ変異体は２つのバックグラウンド突然変異（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ）を含んでいる。ライブラリーｐH０７０７Ａ（パートＡ）、ｐH０７０７ＢおよびｐH０７０７Ｅ（パートＢ）またはｐH０７０７Ｃ（パートＣ）からのhＧＨ−ファージミドプールを、hＧＨbpに対する結合について２〜７サイクルで選別した。数値Ｐは、それぞれのプールから配列決定した１組のクローン中のそれぞれの変異体型の分数発生率を示す。
【０２０６】
表XIV．組合せライブラリーのホルモン−ファージミド結合選択からの
hＧＨ変異体

ヘリックス１        ヘリックス４   
野生型残基：                    F10 M14 H18 H21 R167 D171 T175 I179
Ｐ   変異体
パートＡ：      ４サイクル：
0.60          H0714A.1        H    G    N    N      N    S    T    N
0.40          H0714A.4        A    N    D    A      N    N    T    N*
パートＢ：
２サイクル：
0.13          H0712B.1        F    S    F    G      H    S    T    T
0.13          H0712B.2        H    Q    T    S      A    D    N    S
0.13          H0712B.4        H    G    N    N      N    A    T    T
0.13          H0712B.5        F    S    F    L      S    D    T    T
0.13          H0712B.6        A    S    T    N      R    D    T    I
0.13          H0712B.7        Q    Y    N    N      H    S    T    T
0.13          H0712B.8        W    G    S    S      R    D    T    I
0.13          H0712E.1        F    L    S    S      K    N    T    V
0.13          H0712E.2        W    N    N    S      H    S    T    T
0.13          H0712E.3        A    N    A    S      N    S    T    T
0.13          H0712E.4        P    S    D    N      R    D    T    I
0.13          H0712E.5        H    G    N    N      N    N    T    S
0.13          H0712E.6        F    S    T    G      R    D    T    I
0.13          H0712E.7        M    T    S    N      Q    S    T    T
0.13          H0712E.8        F    S    F    L      T    S    T    S
４サイクル：
0.17          H0714B.1        A    W    D    N      R    D    T    I
0.17          H0714B.2        A    W    D    N      H    S    T    N
0.17          H0714B.3        M    Q    M    N      N    S    T    T
0.17          H0714B.4        H    Y    D    H      R    D    T    T
0.17          H0714B.5        L    N    S    H      R    D    T    I
0.17          H0714B.6        L    N    S    H      T    S    T    T
７サイクル：
0.57          H0717B.1        A    W    D    N      N    A    T    T
0.14          H0717B.2        F    S    T    G      R    D    T    I
0.14          H0717B.6        A    W    D    N      R    D    T    I
0.14          H0717B.7        I    Q    E    H      N    S    T    T
0.50          H0717E.1        F    S    L    A      N    S    T    V
パートＣ：
４サイクル：
0.67          H0714C.2        F    S    F    L      K    D    T    T
* ＝ 突然変異Ｌ１５Ｒ、Ｋ１６８Ｒをも含んでいた。
【０２０７】
以下の表XVにおいて、hＧＨ変異体を、ファージミド結合選択法によって組合せライブラリーから選択した。表XV中のすべてのhＧＨ変異体は２つのバックグラウンド突然変異（Ｅ１７４Ｓ／Ｆ１７６Ｙ）を含んでいる。数値Ｐは、４サイクルの迅速結合選択の後に配列決定した全クローン中の特定変異体の分数発生率である。
【０２０８】
表XV．hＧＨ−ファージミド組合せライブラリーの迅速hＧＨbp結合選択からの
hＧＨ変異体

ヘリックス１        ヘリックス４   
野生型残基：                   F10 M14 H18 H21 R167 D171 T175 I179
Ｐ   変異体
0.14          H07BF4.2        W    G    S    S      R    D    T    I
0.57          H07BF4.3        M    A    D    N      N    S    T    T
0.14          H07BF4.6        A    W    D    N      S    S    V    T≠
0.14          H07BF4.7          H    Q    T    S      R    D    T    I
≠ ＝ 突然変異Ｙ１７６Ｆをも含んでいた（野生型hＧＨもＦ１７６を含んでいる）。
【０２０９】
以下の表XVIにおいて、hＧＨbp（１〜２３８）およびＭab５またはＭab２６３のいずれかを用いる125Ｉ-標識化ホルモンＨ０６５０ＢＤまたは標識化hＧＨの競合置換によって結合定数を測定した。変異Ｈ０６５０ＢＤは野生型hＧＨよりも３０倍強固に結合するようである。
【０２１０】
表XVI．選択したhＧＨ変異体の平衡結合定数

hGH変異体   Kd(変異体)／Kd(H0650BD)  Kd(変異体)／Kd(hGH)     Kd(pM)   
hGH                ３２                   −１−         ３４０±５０
H0650BD            −１−                ０.０３１         １０±３
H0650BF            １.５                 ０.０４５         １５±５
H0714B.6           ３.４                 ０.０９９         ３４±１９
H0712B.7           ７.４                 ０.２２           ７４±３０
H0712E.2           １６                  ０.４８           ６０±７０
【０２１１】
実施例XIII  プロテアーゼ基質配列を含有するhＧＨ-ファージと非基質ファージの選択豊富化
実施例Ｉに記載したように、プラスミドpＳ０１３２は、余分のグリシン残基の挿入を伴って遺伝子IIIタンパク質の残基Ｐro１９８に融合したhＧＨの遺伝子を含有している。このプラスミドを用いて、hＧＨ−遺伝子III融合産物がファージ表面に１価で表示されるhＧＨ-ファージ粒子を得ることができる（実施例IV）。この融合タンパク質は、可変性リンカー配列によって遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメインに融合した全hＧＨタンパク質を含有している。
【０２１２】
あるタンパク質加水分解酵素の好ましい基質配列を選択するためにファージ表示法を使用することの可能性を調べるために、スブチリシンＢＰＮ'の遺伝子操作変異体を用いた〔Carter,P.ら, Proteins: Structure, function and genetics 6: 240-248 (1989)〕。この変異体（以下においてはＡ６４ＳＡＬスブチリシンと呼ぶ）は以下の突然変異：Ｓer２４Ｃys、Ｈis６４Ａla、Ｇlu１５６Ｓer、Ｇly１６９ＡlaおよびＴyr２１７Ｌeuを含んでいる。この酵素は必須の触媒残基Ｈis６４を欠いているので、その基質特異性が大きく制限されており、ある種のヒスチジン含有基質が優先的に加水分解される〔Carterら, Science 237: 394-399 (1987)〕。
【０２１３】
hＧＨ-基質-ファージベクターの構築
pＳ０１３２中のリンカー領域の配列を、オリゴヌクレオチド：
5'-TTC-GGG-CCC-TTC-GCT-GCT-CAC-TAT-ACG-CGT-CAG-TCG-ACT-GAC-CTG-CCT-3'
を用いて突然変異させ、Ａ６４ＳＡＬスブチリシンの基質配列を創製した。これにより、タンパク質配列：
Phe-Gly-Pro-Phe-Ala-Ala-His-Tyr-Thr-Arg-Gln-Ser-Thr-Asp
がhＧＨと遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメインの間のリンカー領域中に導入される結果が得られた（上記配列中の最初のＰhe残基はhＧＨのＰhe１９１である）。配列：
Ala-Ala-His-Tyr-Thr-Arg-Gln
はＡ６４ＳＡＬスブチリシンの良好な基質であることが既知である〔Carterら(1989)；上記〕。得られたプラスミドをpＳ０６４０と命名した。
【０２１４】
hＧＨ-基質-ファージの選択豊富化
pＳ０１３２およびpＳ０６４０から導かれるファージミド粒子を実施例Ｉの記載のように作成した。最初の実験において、それぞれのファージプール（１０μlづつ）を、２０mMトリス-ＨＣl（ｐH８.６）および２.５Ｍ ＮaＣlを含有する緩衝液（１００μl）中でオキシランビーズ（実施例IIの記載のように調製；３０μl）と別々に混合した。結合と洗浄工程は実施例VIIの記載のように行なった。次いで、このビーズを５０nMのＡ６４ＳＡＬスブチリシンを含むかまたは含まない同緩衝液（４００μl）に再懸濁した。１０分間インキュベートした後、上清を集め、ファージ力価（cfu）を測定した。表XVIIは、約１０倍多い基質含有ファージミド粒子（pＳ０６４０）が、酵素の非存在下よりも酵素の存在下において溶出され、また、酵素の存在下もしくは非存在下の非基質ファージミド（pＳ０１３２）の場合よりも多く溶出されることを示している。酵素、ファージミドまたはビーズ濃度の増加はこの比率を変えることはなかった。
【０２１５】
選択豊富化法の改良
固定化ファージミドの非特異的溶離を減少させる試みにおいて、強固に結合するhＧＨ変異体を野生型hＧＨ遺伝子の代わりにpＳ０１３２およびpＳ０６４０に導入した。使用したhＧＨ変異体は実施例XIに記載した変異体（ｐH０６５０bp）であり、突然変異Ｐhe１０Ａla、Ｍet１４Ｔrp、Ｈis１８Ａsp、Ｈis２１Ａsn、Ａrg１６７Ａsn、Ａsp１７１Ｓer、Ｇlu１７４Ｓer、Ｐhe１７６ＴyrおよびＩle１７９Ｔhrを含有している。これにより、２つの新規なファージミド：pＤＭ０３９０（強固に結合するhＧＨを含有し、基質配列を含まない）およびpＤＭ０４１１（強固に結合するhＧＨおよび基質配列Ａla-Ａla-Ｈis-Ｔyr-Ｔhr-Ａrg-Ｇlnを含有する）が構築された。また、結合の洗浄および溶離のプロトコールは次のように変えた：
(i) 結合：COSTAR １２ウエル組織培養プレートを、０.５ml／ウエルの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐH１０.０）中の２μg/ml hＧＨbpで１６時間被覆した。次いで、このプレートを、１ml／ウエルのブロック緩衝液〔０.１％w／vウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）〕とともに２時間インキュベートし、１０mMトリス-ＨＣl（ｐH７.５）、１mM ＥＤＴＡおよび１００mM ＮaＣlを含有する検定緩衝液で洗浄した。ファージミドを再び実施例Ｉの記載のように調製し、ファージプールを上記検定緩衝液で１：４に希釈し、ウエルあたり０.５mlのファージを２時間インキュベートした。
（ii）洗浄：このプレートをＰＢＳ＋０.０５％ツイーン２０で徹底的に洗浄し、この洗浄緩衝液（１ml）とともに３０分間インキュベートした。この洗浄工程を３回繰返した。
（iii）溶離：このプレートを、２０mMトリス-ＨＣl（ｐH８.６）＋１００mM ＮaＣlからなる溶離緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで５００nMのＡ６４ＳＡＬスブチリシンを含むかまたは含まない上記緩衝液（０.５ml）でファージを溶離した。
【０２１６】
表XVIIは、pＳ０６４０およびpＳ０１３２について先に記載した方法と比較して、特異的に溶出した基質-ファージミド粒子の割合が劇的に増加したことを示している。この結果は、強固に結合するhＧＨ突然変異体が、野生型hＧＨに比べてhＧＨ結合タンパク質への結合に対して有意に低いオフ-速度を有していることによるものと考えられる。
【０２１７】
表XVII．Ａ６４ＳＡＬスブチリシンによる基質-ファージミドの特異的溶離
ファージの１０倍希釈液（１０μl）を、５０μg/mlカルベニシリンを含有
するＬＢ寒天プレート上のＸＬ１-Ｂlue細胞の１０μlスポット上にプレー
ティングすることによってコロニー形成単位（cfu）を評価した。

（ｉ）野生型hＧＨ遺伝子：hＧＨbp-オキシランビーズへの結合
ファージミド ＋５０nM Ａ６４ＳＡＬ 酵素なし
pＳ０６４０（基質）     ９×１０6cfu／１０μl   １.５×１０6cfu／１０μl
pＳ０１３２（非基質）    ６×１０5cfu／１０μl     ３×１０5cfu／１０μl
（ii）ｐH０６５０bp突然変異体hＧＨ遺伝子：hＧＨbp被覆プレートへの結合
ファージミド ＋５０nM Ａ６４ＳＡＬ 酵素なし
pＤＭ０４１１（基質）  １.７×１０5cfu／１０μl   ２×１０3cfu／１０μl
pＤＭ０３９０（非基質）   ２×１０3cfu／１０μl   １×１０3cfu／１０μl
【０２１８】
実施例XIV  基質配列ライブラリーの選択豊富化を用いるＡ６４ＳＡＬスブチリシンの好ましい基質の同定
実施例XIIIに記載した選択的豊富化法を用いてランダム基質配列のライブラリーから良好な基質配列を同定しようとした。
ランダム化基質カセットの挿入のためのベクターの構築
ランダム化基質カセットの導入およびその後の基質配列ライブラリーの発現に適したベクターを設計した。出発点は実施例VIIIに記載したベクターpＳ０６４３であった。オリゴヌクレオチド：
5'-AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-GCC-GCC-GCG-TCG-ACT-GGC-GGT-GGC-TCT-3'
を用いて部位指向性の突然変異誘発を行ない、これによってhＧＨと遺伝子IIIの間にＡpaＩ（ＧＧＧＣＣＣ）およびＳalＩ（ＧＴＣＧＡＣ）制限部位が導入された。この新規な構築物をpＤＭ０２５３と命名した（pＤＭ０２５３の実際の配列は、
5'-AGC-TGT-GGC-TTC-GGG-CCC-GCC-CCC-GCG-TCG-ACT-GGC-GGT-GGC-TCT-3'
であり、下線を引いた塩基の置換は突然変異オリゴヌクレオチド中の偽錯誤によるものである）。また、pＤＭ０４１１（実施例XIII）由来のフラグメントを交換することによって、実施例中に記載した強固に結合するhＧＨ変異体を導入した。得られたライブラリーベクターをpＤＭ０４５４と命名した。
【０２１９】
ライブラリーカセットベクターの調製および突然変異カセットの挿入
ライブラリーカセットを導入するために、pＤＭ０４５４をＡpaＩ、次いでＳalＩで消化し、次に１３％ＰＥＧ８０００＋１０mM ＭgＣl2で沈澱させ、７０％エタノールで２回洗浄し、再懸濁した。これによりベクターが効率的に沈澱するが、小さいＡpaＩ−ＳalＩフラグメントが溶液中に残る〔Paithankar,K.R.およびPrasad,K.S.N., Nucleic Acids Research 19: 1346〕。この生成物を１％アガロースゲル上を移動させ、ＡpaＩ−ＳalＩ消化したベクターを切り出し、Bandprepキット（Pharmacia）を用いて精製し、そして突然変異カセットとの連結用に再懸濁した。
【０２２０】
挿入するカセットはpＳ０６４０およびpＤＭ０４１１のリンカー領域中のＤＮＡ配列と同様の配列を含有していたが、ランダム化コドンによって置換された基質配列中のヒスチジンおよびチロシン残基のコドンを有していた。実施例VIIIに記載したようにランダム化位置のそれぞれにおいてＮＮＳ（Ｎ＝Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ）を置換することを選択した。突然変異カセット中に用いたオリゴヌクレオチドは、
5'-C-TTC-GCT-GCT-NNS-NNS-ACC-CGG-CAA-3'（暗号鎖）および
5'-T-CGA-TTG-CCG-GGT-SNN-SNN-AGC-AGC-GAA-GGG-CC-3'（非暗号鎖）
であった。また、このカセットはＳalＩ部位を破壊し、従ってＳalＩによる消化を用いてベクター バックグラウンドを減少させることができる。これらオリゴヌクレオチドはＡpa−Ｓalカセット部位への挿入の前にホスホリル化しなかった。この理由は、続いて起こるカセット小集団のオリゴマー化が複数カセット挿入体による偽の結果を導くことがあることを恐れたためである。アニールと連結の後、反応生成物をフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、そして水に再懸濁した。最初は、バックグラウンドベクターを減少させるためのＳalＩによる消化を行なわなかった。実施例VIIIに記載したように、約２００ngをＸＬ１-Ｂlue細胞に電気穿孔導入し、ファージミドライブラリーを調製した。
【０２２１】
基質ライブラリーからの切断されやすい基質の選択
使用した選択法は、実施例XIIIにおいてpＤＭ０４１１およびpＤＭ０３９０について記載した方法と同じである。各ラウンドの選択の後、実施例VIIIにおいてhＧＨ-ファージについて記載されているように、新鮮なＸＬ１-Ｂlue細胞の培養物に形質導入し、新しいファージミドライブラリーを増殖させることによって、溶出したファージを増殖させた。選択法の進行は、溶出ファージの力価の測定および各ラウンドの選択後の個々のクローンの配列決定によってモニターした。
【０２２２】
表Ａは、１、２および３ラウンドの選択後の酵素の存在下および非存在下での溶離に対する連続ファージ力価を示すものである。特異的に溶出したファージ：非特異的に溶出したファージ（即ち、酵素を用いて溶出したファージ：酵素を用いずに溶出したファージ）の比がラウンド１からラウンド３まで劇的に増加しているのが明らかであり、このことは、良好な基質集団が各選択ラウンドにつれて増加していることを示唆する。
【０２２３】
出発ライブラリーからの１０個の単離体の配列決定は、これらのすべてが野生型pＤＭ０４６４配列からなることを示した。このことは、ＡpaＩによる消化の後にＳalＩ部位がＤＮＡフラグメントの末端に非常に近接しており、従って低効率の消化を導くことに起因している。それにもかかわらず、ライブラリー中に４００の可能な配列が存在しているにすぎず、従ってこの集団はなお特筆されるべきである。
【０２２４】
表Ｂ１およびＢ２は、ラウンド２およびラウンド３の選択後に得られた単離体の配列を示すものである。２ラウンドの選択の後に、ヒスチジン残基の高い発生が明確に存在する。これは正に予想されていたことである（実施例XIIIに記載したように、Ａ６４ＳＡＬスブチリシンは基質中にヒスチジン残基を必要とするが、この理由はそれが基質-助力の触媒機序を使用するためである）。３ラウンドの選択の後に、配列決定した１０個のクローンのそれぞれがランダム化カセット中にヒスチジンを有している。しかし、これら配列の２つはpＤＭ０４１１のものであり、出発ライブラリー中に存在していなかったものであり、従って不純物であることに注意すべきである。
【０２２５】
表Ａ．最初のファージプールおよび３ラウンドの選択豊富化からの溶出
ファージの滴定
ファージの１０倍希釈液（１０μl）を、５０μg/mlカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上のＸＬ１-Ｂlue細胞の１０μlスポット上にプレーティングすることによってコロニー形成単位（cfu）を評価した。

ラウンド１
出発ライブラリー：          3×1012cfu/ml
ライブラリー：          +500nM A64SAL      ：      4×103cfu/10μl
酵素なし           ：      3×103cfu/10μl
pＤＭ０４１１：         +500nM A64SAL      ：      2×106cfu/10μl
(対照)               酵素なし           ：      8×103cfu/10μl
ラウンド２
ラウンド１ライブラリー：    7×1012cfu/ml
ライブラリー：          +500nM A64SAL      ：      3×104cfu/10μl
酵素なし           ：      6×103cfu/10μl
pＤＭ０４１１：         +500nM A64SAL      ：      3×106cfu/10μl
(対照)               酵素なし           ：    1.6×104cfu/10μl
ラウンド３
ラウンド２ライブラリー：    7×1011cfu/ml
ライブラリー：          +500nM A64SAL      ：      1×105cfu/10μl
酵素なし           ：      <103cfu/10μl
pＤＭ０４１１：         +500nM A64SAL      ：      5×106cfu/10μl
(対照)               酵素なし           ：      3×104cfu/10μl
【０２２６】
表Ｂ１．２ラウンドの選択豊富化の後の溶出ファージの配列
すべてのタンパク質配列はＡＡ＊＊ＴＲＱの形態にあるはずである（ここで、＊はランダム化コドンを表す）。以下の表においては、ランダム化コドンおよびアミノ酸に下線を引く。

ラウンド２後：
配  列 発生数 
*   *
A   A   H Y   T   R   Q
... GCT GCT CAC TAC ACC CGG CAA ...          ２
A   A   H M   T   R   Q
... GCT GCT CAC ATG ACC CGG CAA ...          １
A   A   L H   T   R   Q
... GCT GCT CTC CAC ACC CGG CAA ...          １
A   A   L H   T   R   Q
... GCT GCT CTG CAC ACC CGG CAA ...          １
A   A   H T   R   Q
... GCT GCT CAC ACC CGG CAA ...              １ #
A   A   ? H   T   R   Q
... GCT GCT ??? CAC ACC CGG CAA              １ ##
... 野生型 pＤＭ０４５４                     ３    

#  カセット内の１コドンの偽削除
## アンビギュアス配列
表Ｂ２．３ラウンドの選択豊富化の後の溶出ファージの配列
すべてのタンパク質配列はＡＡ＊＊ＴＲＱの形態にあるはず
である（ここで、＊はランダム化コドンを表す）。以下の表に
おいては、ランダム化コドンおよびアミノ酸に下線を引く。

ラウンド３後：
配  列 発生数 
*   *
A   A   H Y   T   R   Q
... GCT GCT CAC TAT ACG CGT CAG ...          ２ #
A   A   L H   T   R   Q
... GCT GCT CTC CAC ACC CGG CAA ...          ２
A   A   Q H   T   R   Q
... GCT GCT CAG CAC ACC CGG CAA ...          １
A   A   T H   T   R   Q
... GCT GCT ACG CAC ACC CGG CAA ...          １
A   A   H S   R   Q
... GCT GCT CAC TCC CGG CAA ...              １ 
A   A   H H   T   R   Q
... GCT GCT CAT CAT ACC CGG CAA              １ ##
A   A   H F   R   Q
... GCT GCT CAC TTC CGG CAA ...              １
A   A   H T   R   Q
... GCT GCT CAC ACC CGG CAA ...              １

#  pＤＭ０４１１由来の汚染配列
## 「違法」コドンＣＡＴを含有する：Ｔがコドンの３番
目の位置に現れるはずがない
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】線状ファージの表面に大きいタンパク質を表示（顕示）させるための方法および改変された受容体結合性を豊富化する方法を示すものである。hＧＨの全暗号配列をＭ１３遺伝子IIIのカルボキシ末端ドメインに融合させたプラスミドphＧＨ-Ｍ１３gIIIを構築した。この融合タンパク質の転写はlacプロモーター／オペレーター配列の支配下にあり、分泌はstIIシグナル配列によって指令されている。ファージミド粒子は「ヘルパー」ファージＭ１３ＫＯ７による感染によって得られ、hＧＨを表示する粒子はhＧＨ受容体を含む親和性マトリックスに結合させることによって豊富化することができる。野生型遺伝子III（Ｍ１３ＫＯ７ファージから導く）はファージの先端の４〜５コピーの複数矢印により図示し、融合タンパク質（ファージミドphＧＨ-Ｍ１３gIIIから導く）はhＧＨの折り畳み図形（矢印の頭部を置換）によって図示した。
【図２】全ファージ粒子の免疫ブロットはhＧＨがファージと同時移動することを示す。塩化セシウム勾配で精製したファージミド粒子を二重のウエルに付し、３７５mMトリス、４０mMグリシン（ｐH９.６）緩衝液中、１％アガロースゲルで電気泳動を行なった。このゲルを、２％ＳＤＳおよび２％β−メルカプトエタノールを含む移転緩衝液〔２５mMトリス（ｐH８.３）、２００mMグリシン、２０％メタノール〕中に２時間浸漬し、次いで移転緩衝液中で６時間すすいだ。次いで、ゲル中のタンパク質をイモビロン膜（Millipore）上に電気ブロットした。１組の試料を含む膜はクーマシーブルーで染色してファージタンパク質の位置を示した（Ａ）。二重の膜をポリクローナルウサギ抗-hＧＨ抗体と反応させ、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲート化したヤギ抗-ウサギＩgＧ抗体と反応させることによって、膜のhＧＨを免疫染色した（Ｂ）。レーン１はＭ１３ＫＯ７親ファージを含み、これはhＧＨを欠いているのでクーマシーブルー染色した膜においてのみ観察することができた。レーン２および３はホルモン ファージミド粒子の別の調製物を含んでおり、クーマシーおよびhＧＨ免疫染色の両方で観察することができた。親のＭ１３ＫＯ７ファージとホルモン ファージミド粒子の間の移動距離の差異は、内部にパッケージされたゲノムの大きさの相違を反映するものである（それぞれ、８.７kbと５.１kb）。
【図３】コドン１７２、１７４、１７６および１７８のところをランダム化したhＧＨ-ファージライブラリーの選択法における各工程をまとめる図である。hＧＨ（Ｒ１７８Ｇ、Ｉ１７９Ｔ）遺伝子および唯一のＫpnＩ制限部位を含有する鋳型分子ｐH０４１５を本明細書に記載のように突然変異誘発し、大腸菌株ＷＪＭ１０１中に電気導入して最初のファージミドライブラリー（ライブラリー１）を得た。ライブラリー１の一部（約２％）を、本明細書に記載のように最初の選択ラウンドに直接用いてライブラリー１Ｇを得た。一方、２本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）をライブラリー１から調製し、制限酵素ＫpnＩで消化して鋳型のバックグラウンドを排除し、ＷＪＭ１０１中に電気導入してライブラリー２を得た。これらに続く選択ラウンド（または、ＫpnＩ消化；陰影を付けた箱）とその後のファージミドの増殖は、本明細書に記載した方法に従い、矢印で示したように行なった。ライブラリー４Ｇ4からの４種の独立したクローンおよびライブラリー５Ｇ6からの４種の独立したクローンをジデオキシ配列決定法によって配列決定した。これらクローンのすべてが、hＧＨ突然変異体（Ｇlu １７４ Ｓer、Ｐhe １７６ Ｔyr）に一致する同一ＤＮＡ配列を有していた。
【図４】結晶学により決定したブタ成長ホルモンの２.８Å折り畳み図から導いたhＧＨの構造モデルを示すものである。hＧＨ−結合タンパク質への結合を強く変調させるhＧＨ中の残基の位置を陰影を付けた円内に示した。結合親和性において１０倍以上の減少（黒丸）、４〜１０倍の減少（・）、増加（○）、または２〜４倍の減少（・）を引き起こすアラニン置換が示されている。α−ヘリックス領域におけるらせん輪投影により、これらの両極性が明らかになった。黒くした、陰影を付けた、あるいは陰影を付けていない残基は、それぞれ荷電、極性、または非極性を示す。ヘリックス４において、突然変異のための最も重要な残基は親水性の面上にある。
【図５】表示した経路（hＧＨ溶離、グリシン溶離、または予吸着後のグリシン溶離）に対するラウンド１および３の選択工程からの多数のクローンを配列決定した後にわかったhＧＨの１７２、１７４、１７６および１７８位のアミノ酸置換を示すものである（例えば、ＫＳＹＲという表示はhＧＨ突然変異体１７２Ｋ／１７４Ｓ／１７６Ｙ／１７８Ｒを表す）。非機能的な配列（即ち、ベクター バックグラウンド、または他の未成熟に終わった突然変異体および／またはフレームシフトした突然変異体）は「ＮＦ」として示している。非サイレントの疑似突然変異（即ち、上に挙げた組の標的残基以外）を含む機能的な配列は「＋」で示している。すべての配列決定クローンの中で１回を越えて現れたが異なるＤＮＡ配列を有するタンパク質配列は「＃」で示している。配列決定クローンの中で１回を越えて現れ、そして同じＤＮＡ配列を有するタンパク質配列は「＊」で示している。３ラウンドの選択の後に２種の異なる汚染配列が見い出されたことに注意すべきである（これらのクローンはカセット突然変異体に一致しなかったが、先に構築したホルモン ファージに一致した）。pＳ０６４３汚染体は野生型hＧＨ-ファージに一致する（hＧＨ「ＫＥＦＲ」）。第３ラウンドのグリシン選択したファージのプールに多いｐH０４５７汚染体は、先に同定したhＧＨの突然変異体「ＫＳＹＲ」に一致する。これら汚染体の増幅は、まれにしか発生しない突然変異体を選択するためのホルモン−ファージ選択法の能力を強調するものである。また、これらの配列の集中性は３種すべての経路において顕著であった（即ち、ＲまたはＫは１７２および１７８位に最も多く発生し、ＹまたはＦは１７６位に最も多く発生し、そしてＳ、Ｔ、Ａおよびその他の残基は１７４位に発生する）。
【図６】亜鉛の存在下にhＰＲＬbp-ビーズ上で選択したファージからの配列を示すものである。表示は図５で説明したものと同じである。ここでは、配列の集中性は予測できないが、最もストリンジェントな（グリシン）選択条件下で疎水性配列への偏りがあるようである（Ｌ、ＷおよびＰ残基がこのプールに多く見い出される）。
【図７】亜鉛の非存在下にhＰＲＬbp-ビーズ上で選択したファージからの配列を示すものである。表示は図５で説明したものと同じである。図６の配列とは対照的に、ここでの配列は比較的親水性が高いようである。hＧＨ溶離による４ラウンドの選択の後、２種類のクローン（ＡＮＨＱおよびＴＬＤＴ／１７１Ｖ）がプールに多く存在する。
【図８】ブランクのビーズ上で選択したファージからの配列を示すものである。表示は図５で説明したものと同じである。グリシン溶離による３ラウンドの選択の後、同胞体は観察されず、非機能的な配列のバックグラウンド水準が保持された。
【図９】ｐHＯ４１５からのファージミドfl起点（ori）の構築を示すものである。カセット突然変異誘発およびhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質の発現のためのこのベクターを次のように構築した。pＢＲ３２２およびflの複製起点を含有し、大腸菌phoＡプロモーターの制御下にhＧＨ−遺伝子III融合タンパク質（hＧＨの残基１〜１９１に１個のＧly残基が続き、これが遺伝子IIIのＰro-１９８に融合している）を発現する、pＳ０１３２のオリゴヌクレオチド指向性の突然変異誘発によって、プラスミドpＳ０６４３を構築した。以下のオリゴヌクレオチド：        5'-GGC-AGC-TGT-GGC-TTC-TAG-AGT-GGC-GGC-GGC-TCT-GGT-3'を用いて突然変異誘発を行なった。このオリゴヌクレオチドは、hＧＨのＰhe-１９１に続いてＸbaＩ部位（下線部）とアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を導入した。
【図１０】Ａは、ＨＥＲ-２受容体に指向性のＦabヒト化抗体の軽鎖および重鎖（可変および不変ドメイン１）をコードしているＤＮＡを含有するプラスミドpＤＨ１８８挿入体を図示したものである。ＶＬおよびＶＨはそれぞれ軽鎖および重鎖の可変領域である。Ｃｋはヒトκ軽鎖の不変領域である。ＣＨ１Ｇ1はヒトγ１鎖の最初の不変領域である。両暗号領域は細菌性のstIIシグナル配列から始まっている。Ｂは、５Ａに示した挿入体を含有する全プラスミドpＤＨ１８８を図示するものである。このプラスミドを大腸菌ＳＲ１０１細胞に導入し、ヘルパーファージを添加した後、このプラスミドはファージ粒子にパッケージされる。これら粒子の一部はＦab-pIII融合体を表示する（ここで、pIIIはＭ１３遺伝子III ＤＮＡによってコードされているタンパク質である）。このプラスミド図中のセグメントは５Ａに示した挿入体に対応している。
【図１１Ａ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１１Ｂ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１１Ｃ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１１Ｄ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１１Ｅ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１１Ｆ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１１Ｇ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１１Ｈ】ファージミド表面に発現された４Ｄ５ Ｆab分子をコードしているＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示すものである。軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）も、重鎖pIII融合体のアミノ酸配列（配列番号２７）と同様に示されている。
【図１２】変異Ｆabファージミドからの野生型４Ｄ５ Ｆabファージミドの豊富化を示すものである。１：１,０００の比の野生型ファージミドと変異４Ｄ５ Ｆabファージミドの混合物を、ＨＥＲ-２受容体の細胞外ドメインタンパク質で被覆したプレートで選択した。各ラウンドの選択の後、溶離したファージミドの一部を大腸菌に感染させ、プラスミドＤＮＡを調製した。次いで、このプラスミドＤＮＡをＥcoＲＶおよびＰstＩで消化し、５％ポリアクリルアミドゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。バンドをＵＶ光のもとで可視化した。野生型および変異プラスミドに起因するバンドは矢印で示した。第１ラウンドの選択は酸条件のもとでのみ溶離した。以後のラウンドは、酸溶離（図の左側）または実施例VIIIに記載した方法を用いるヒト化４Ｄ５抗体洗浄工程とその後の酸溶離（図の右側）のいずれかによって溶離した。３種の変異４Ｄ５ Ｆab分子を調製した。即ち、Ｈ９１Ａ（ＶＬ鎖の９１位のアミノ酸ヒスチジンをアラニンに突然変異させた；図中の「Ａ」レーンに示す）、Ｙ４９Ａ（ＶＬ鎖の４９位のアミノ酸チロシンをアラニンに突然変異させた；図中の「Ｂ」レーンに示す）、ならびにＹ９２Ａ（ＶＬ鎖の９２位のアミノ酸チロシンをアラニンに突然変異させた；図中の「Ｃ」レーンに示す）である。アミノ酸位置の数え方はKabatらに従った〔「免疫学的挿入体のタンパク質の配列」, 第4版, U.S.Dept of Health and Human Services, Public Health Service, Nat'l.Institute of Health, Bethesda, MD (1987)〕。
【図１３】実験プロトコール中に記載したＲＩＡ親和性測定のスカッチャード分析が示されている。結合した標識化ＥＣＤ抗原の量がｘ軸に示されており、結合量を遊離量で割った数値がｙ軸に示されている。線の傾きはＫaを示し、計算したＫdは１／Ｋaである。
【図１】
2006104205.tif 000002
【図２】
2006104205.tif 000003
【図３】
2006104205.tif 000004
【図４】
2006104205.tif 000005
【図５】
2006104205.tif 000006
【図６】
2006104205.tif 000007
【図７】
2006104205.tif 000008
【図８】
2006104205.tif 000009
【図９】
2006104205.tif 000010
【図１０】
2006104205.tif 000011
【図１１Ａ】
2006104205.tif 000012
【図１１Ｂ】
2006104205.tif 000013
【図１１Ｃ】
2006104205.tif 000014
【図１１Ｄ】
2006104205.tif 000015
【図１１Ｅ】
2006104205.tif 000016
【図１１Ｆ】
2006104205.tif 000017
【図１１Ｇ】
2006104205.tif 000018
【図１１Ｈ】
2006104205.tif 000019
【図１２】
2006104205.tif 000020
【図１３】
2006104205.tif 000021
【配列表】
2006104205000001.xml