(57)【要約】【課題】  試料の空間中に散在する複数の観察対象に対し、三次元走査領域を直感的に設定可能で、各走査領域に対し詳細な走査を行うことができる共焦点走査型顕微鏡、及び三次元走査領域指定方法を提供する。【解決手段】  光源からの出射光を試料に対して集光させる対物レンズと、集束光を前記試料面に治って走査する機能と、集束光の光軸方向に治って対物レンズの焦光位置と試料の位置を相対的に移動させ、対物レンズの焦光位置と、共役な位置に配置されたピンホールを透過する光の強度を検出する光検出器を備えた共焦点走査型顕微鏡において、移動機構を移動させながら取得した複数の二次元画像から三次元画像を構成し、構成した三次元画像を表示し、表示した三次元画像に注目領域を指定する領域指定によって得られた情報に基づき、走査領域を設定できる。【選択図】  図１
2006023476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの出射光を集束して試料に沿って移動し、前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動する手段と、
前記試料からの光の強度を検出し取得した複数の二次元情報から三次元像を構築する三次元像構築手段と、
前記三次元像を表示する表示手段と、
前記表示手段で表示された前記三次元像の複数の位置を指定する指定手段と、
前記指定手段によって指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する走査領域設定手段と、
前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する走査手段と、
を具備することを特徴とする共焦点走査型顕微鏡装置。
【請求項２】
前記指定手段は、点の周辺を指定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
【請求項３】
前記指定手段は、二次元領域で指定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
【請求項４】
前記指定手段は、三次元領域で指定することを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡装置。
【請求項５】
光源からの出射光を集束して試料に沿って移動し、前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動し、
前記試料からの光の強度を検出し取得した複数の二次元情報から三次元像を構築し、
前記三次元像を表示し、
前記表示された前記三次元像の複数の位置を指定し、
前記指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する、
前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する、
ことを特徴とする走査領域指定方法。
【請求項６】
コンピュータに、
光源からの出射光を集束して試料に沿って移動し、前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動する機能と、
前記試料からの光の強度を検出し取得した複数の二次元情報から三次元像を構築する三次元像構築機能と、
前記三次元像を表示する表示機能と、
前記表示機能で表示された前記三次元像の複数の位置を指定する指定機能と、
前記指定機能によって指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する走査領域設定機能と、
前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する走査機能と、
を実現させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料を二次元走査して得られた複数の二次元情報を三次元画像として表示可能な共焦点走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点走査型顕微鏡は、レーザ光等の光で試料を二次元走査し、試料からの反射光、透過光、もしくは蛍光を対物レンズを含む光学系を通して光検出器により検出し、反射光、透過光、または蛍光の二次元の輝度情報を得る顕微鏡である。
【０００３】
また、この輝度情報をＣＲＴ等に輝度の二次元分布として表示することによって、試料の蛍光像を観察できる。このような共焦点走査顕微鏡はレーザ光などの点光源とピンホールを組み合わせ、試料をピンポイントで照射することで、測定点以外からの散乱光を抑制し、また、光検出器の前面に空間フィルタとしてのピンホールを配置し、測定点と同一面内にある光をピンホール周辺に結像させ、また、光軸方向にずれた面からの光は、ピンホールを通過できずにカットされる。
【０００４】
上記方法により、光学的なスライス像を取得できる。
また、共焦点走査型顕微鏡は、試料をスポット光で二次元走査し、かつ、光軸方向となるＺ軸方向に所定のピッチで焦点を移動して光軸方向に複数のスライス像を取得することで、結果的に三次元空間のスライス像（以下三次元画像と称す）が得られることになる。
【０００５】
このような共焦点走査型顕微鏡を用いて生体試料の三次元情報を得る場合は、ＣＲＴ等に表示されている二次元画像を確認しながら、試料を載せているステージを移動して、三次元の走査領域を検索し、決定している。
【０００６】
ここで、三次元の走査領域を決定する方法として、特許文献１に示す技術がある。この技術では細胞の樹状情報を得る場合を例としている。まず、立体試料に対してレーザ光を照射し、該試料の三次元画像を取得する。
【０００７】
次に、該三次元画像を例えばＸＹ面に投影した二次元データと、ＹＺ面に投影した二次元データと、ＺＸ面に投影したデータの少なくとも２つを使用し、この二次元データから試料に含まれる例えば神経細胞等の基線経路曲線データを取得する。
【０００８】
この基線経路曲線データに従って試料を走査することによって、試料内の神経細胞等の三次元情報を取得できる。
【特許文献１】特開2003-195174
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら上記の方法では、三次元画像から試料の基線経路曲線データを取得し、該基線経路曲線データに従って試料の注目領域を走査しているため、神経細胞の軸索のような空間中に連続的に存在する試料の観察に特化している。
【００１０】
従って、試料が空間中に離散的に存在する場合はこの方法を適用するのは困難である。
本発明は上記のような実情に鑑みてなされたものであり、上記のように指示することで、注目する領域を走査するときに、各々の三次元走査領域を直感的に設定可能で、各走査領域に対し詳細な走査を行うことができる共焦点走査型顕微鏡、及び三次元走査領域指定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１記載の発明は、光源からの出射光を集束して試料に沿って移動し、前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動する手段と、前記試料からの光の強度を検出し取得した複数の二次元情報から三次元像を構築する三次元像構築手段と、前記三次元像を表示する表示手段と、前記表示手段で表示された前記三次元像の複数の位置を指定する指定手段と、前記指定手段によって指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する走査領域設定手段と、前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する詳細走査手段と、を具備することを特徴とする
本発明によれば、利用者はプレビューした三次元画像を立体的に見ることで、詳細な観察を行う際に、注目する領域を三次元で認識し、立体的に指示することが容易にできる。
【００１２】
さらに、利用者は三次元走査領域の指示方法を変更することもでき、簡単に、直感的に、観察したい三次元走査領域を指定することが可能になる。
さらに、取得した三次元情報から三次元像を構築し表示することで利用者は試料の観察を、簡単にまた詳細まで行うことが可能である。
【００１３】
請求項２記載の発明は、前記指定手段は、点の周辺を指定することを特徴とする。本発明によれば、利用者は観察したい位置を点で指示することにより簡単にその周辺の観察範囲を指定することが可能である。
【００１４】
請求項３記載の発明は、前記指定手段は、二次元領域で指定することを特徴とする。本発明によれば、利用者は観察したい位置を二次元領域で指示することにより簡単にその周辺の観察範囲を指定することが可能である。
【００１５】
請求項４記載の発明は、前記指定手段は、三次元領域で指定することを特徴とする。本発明によれば、利用者は観察したい位置を三次元で指示することにより簡単にその周辺の観察範囲を指定することが可能である。
【００１６】
請求項５記載の発明は、光源からの出射光を集束して試料に沿って移動し、前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動し、前記試料からの光の強度を検出し取得した複数の二次元情報から三次元像を構築し、前記三次元像を表示し、
前記表示された前記三次元像の複数の位置を指定し、前記指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する、前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する、ことを特徴とする
本発明によれば、利用者はプレビューした三次元画像を立体的に見ることで、詳細な観察を行う際に、注目する領域を三次元で認識し、立体的に指示することが容易にできる。
【００１７】
さらに、利用者は三次元走査領域の指示方法を変更することもでき、簡単に、直感的に、観察したい三次元走査領域を指定することが可能になる。
請求項６記載の発明は、コンピュータに、光源からの出射光を集束して試料に沿って移動し、前記集束した光の光軸方向に沿って焦光位置と前記試料の位置を相対的に移動する機能と、前記試料からの光の強度を検出し取得した複数の二次元情報から三次元像を構築する三次元像構築機能と、前記三次元像を表示する表示機能と、前記表示機能で表示された前記三次元像の複数の位置を指定する指定機能と、前記指定機能によって指定されたそれぞれの位置に基づいて、複数の走査領域を設定する走査領域設定機能と、前記複数の走査領域を順次走査し、各領域の試料の三次元情報を取得する詳細走査機能と、を実現させるためのプログラム。
【００１８】
本発明によれば、コンピュータで実行可能なプログラムで、利用者はプレビューした三次元画像を立体的に見ることで、詳細な観察を行う際に、注目する領域を三次元で認識し、立体的に指示することが容易にできる。さらに、利用者は三次元走査領域の指示方法を変更することもでき、簡単に、直感的に、観察したい三次元走査領域を指定することが可能になる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生物試料等の空間中に散在する複数の観察対象に対し、利用者は生物試料等をプレビューし三次元画像で立体的に見ることができる。また、詳細な観察を行う際に、複数の注目する三次元走査領域を三次元で認識し、立体的に指示することが容易にできる。
【００２０】
さらに、利用者は三次元走査領域の指示方法を変更することもでき、簡単に直感的に注目する三次元走査領域を指定することが可能になり、三次元走査領域の設定時間を短縮できる。
【００２１】
更に、三次元走査領域を設定する際にレーザ照射をしないため、レーザ照射による試料へのダメージを抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（実施形態１）
以下、本発明の第１の実施形態を図を用いて説明する。尚、実施例においては共焦点走査型顕微鏡を例とするが、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限りその他の共焦点走査型顕微鏡にも適用可能である。
【００２３】
図１は、本発明の共焦点走査型顕微鏡の構成実施例である。図１において１は光源であり、光源１から照射されるレーザ光は、顕微鏡本体２内のダイクロイックミラー３に照射される。ダイクロイックミラー３によって反射したレーザ光は、Ｘ方向及びＹ方向スキャナ４、５によって位置制御され、対物レンズ６に入射する。
【００２４】
対物レンズ６に入射したレーザ光は、上記位置情報に従ってステージ７上の試料８の焦点位置に照射され、蛍光が生じる。
この場合、ステージ７は焦点位置制御部９からの位置情報に従って、Ｚ方向に位置制御されるようになっている。
【００２５】
焦点位置制御部９は上記ＣＰＵ１４からの位置情報によって焦点位置の制御を行い、Ｘ方向スキャナ４にＸ方向の位置情報、Ｙ方向スキャナ５にＹ方向の位置情報、ステージ７にＺ方向の位置情報を出力することで制御を行う。
【００２６】
試料８からの蛍光は、上記と逆の経路を辿ってダイクロイックミラー３に達し、ダイクロイックミラー３を透過し、共焦点レンズ（図示なし）によって共焦点ピンホール（図示なし）に集光し、共焦点ピンホールを介して光検出器１０に達する。
【００２７】
光検出器１０はＡ／Ｄ変換器１１を介してＰＣ１２のＣＰＵ１４と接続されている。すなわち、試料８から生じた蛍光は光検出部１０で光電変換され、蛍光の強さに対応する電気信号がＡ／Ｄ変換器１１に送られる。Ａ／Ｄ変換器１１では該電気信号をデジタルデータ信号に変換し、ＰＣ１２に伝送する。
【００２８】
ＰＣ１２のＣＰＵ１４ではＡ／Ｄ変換器１１から供給されるデジタルデータに従って、例えばＣＧの可視化手法の一つであるボリュームレンダリング法等によって画像形成を行い、形成した画像データを表示装置１６に送り、表示装置１６に試料８の画像表示を行う。
【００２９】
また、ＣＰＵ１４は入力装置１７とも接続しており、入力装置１７の指示に従って、表示装置１６に注目領域を表示し、メモリ１５には、利用者が指示した注目領域を記憶する。記憶装置１３には、顕微鏡の動作制御をし、前記表示装置１６に描画した三次元画像中の注目領域を指定し、注目領域を基に走査領域の決定を行なうコンピュータプログラムが格納されている。
【００３０】
また、メモリ１５には、ＣＰＵ１４で生成される三次元の立体像や、注目領域の走査条件が記憶される。
ここでＣＰＵ１４、メモリ１５、記憶装置１３等は一般的なパーソナルコンピュータを利用してもかまわない。後述する処理はコンピュータプログラムにより処理可能で、その処理プログラムは記録媒体であるＣＤ−ＲＯＭやハードディスク等に記録されている。
【００３１】
そして、必要に応じて前記パーソナルコンピュータのメモリ上に前記処理プログラムを読み出し、ＣＰＵにより実行し、パーソナルコンピュータに接続されている各装置を制御する。
【００３２】
上記構成において本実施形態の処理動作の概要を図２を用いて説明する。
始めに、ステップＳ１で試料の全体象を把握するために、広域を走査し三次元画像を取得する。このとき、低解像度で走査することでメモリ容量を減らすことができ、走査時間を短縮することも可能である。次に、ステップＳ２において、ステップＳ１で取得した広域の三次元画像を基にＰＣ１２上で試料の三次元表示像を構築し、表示装置１６上に表示する。そして、ステップＳ３で表示装置１６に表示された三次元画像中に利用者は注目領域を指示する。
【００３３】
ステップＳ４では上記指示した注目領域に基づき詳細走査領域計算を行い、詳細走査領域の位置情報、走査条件をＰＣ１２中のメモリ１５に格納する。
ステップＳ５ではメモリ１５に記録した詳細走査領域の情報に基づき、詳細走査領域に沿って再走査を行うことで上記注目領域の三次元情報を取得する。
【００３４】
ステップＳ６ではＳ５で取得した三次元情報を三次元画像として表示装置１６に表示する。
次に、図２のフローチャートの各ステップを具体的に説明する。まず、図２のステップＳ１で広域の三次元像を取得する。
【００３５】
次にステップＳ２で三次元画像表示をする処理を行う。図３を用いて三次元画像表示処理の説明をする。
始めに、Ｓ２＿１で焦点位置制御部９にＸ方向、Ｙ方向、Ｚ方向の初期位置情報を設定する。この位置情報に従ってＸ方向スキャナ４とＹ方向スキャナ５とステージ７は初期位置である広域走査開始位置に移動する。次に、Ｓ２＿２で光源１からレーザ光を出力し、試料８にレーザ光を照射し、試料８から発せられる蛍光を検出する。蛍光の検出データは、前述のように光検出器１０、Ａ／Ｄ変換器１１を経てＰＣ１２に送られる。
【００３６】
次に、Ｓ２＿３のステップとＳ２＿４のステップによって、Ｘ方向への走査を完了するまでＸ方向スキャナ４をＸ方向に１ステップ移動しながら、試料８にレーザ光を照射し、  試料８から発せられる蛍光は光検出器１０で順次検出され、ＰＣ１２に伝送される。
【００３７】
Ｘ方向の走査が完了すると、Ｓ２＿５でＹ方向スキャナ５をＹ方向に１ステップ移動し、Ｓ２＿６でＹ方向への走査が全て完了したか判断する。
そして、Ｙ方向への走査が終了するまで上記蛍光の検出処理を繰り返し、Ｙ方向への走査が完了すると二次元スライス像が取得され、Ｓ２＿７でステージ７を駆動し、Ｚ方向に１ステップ移動する。
【００３８】
Ｚ方向に１ステップ移動したら、Ｚ移動終了か判断し、ＮｏならばＳ２＿２〜Ｓ２＿７のステップを再度行う。
Ｚ方向の走査が完了していれば、Ｓ２＿９でＰＣ１２に入力した情報をメモリ１５に格納する。このとき、試料の蛍光情報と共に、広域走査終了時の焦点位置情報Ｐ＿ｅｎｄをメモリ１５に格納しておく。
【００３９】
Ｓ２＿１０ではＣＰＵはメモリ１５に格納した情報に基づき試料８の三次元画像を作成し、表示装置１６に表示する。
ここで、三次元画像は上記Ｚ方向に１ステップ移動するごとに取得した複数の二次元スライス像を光軸方向に重ねた二次元スライス画像の束である。
【００４０】
尚、図４は上記処理によって得られた試料８の三次元画像の例である。同図のＸ軸は、試料のＸ軸方向を表し、焦点位置制御部９のＸ方向の位置情報出力によって動作するＸ方向スキャナ４の走査方向に対応する。また、図中のＹ軸は、試料のＹ軸方向を表し、焦点位置制御部９のＹ方向の位置情報出力によって動作するＹ方向スキャナ４の走査方向に対応する。
【００４１】
同図のＺ軸は試料のＺ軸方向を表し、焦点位置制御部のＺ方向の位置情報出力によって動作するステージ７の移動方向に対応する。
また、表示装置１６に表示する三次元画像の全ての軸には、原点である広域走査開始位置からの相対座標値が表示されており、各軸のサイズは走査領域のＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸を走査した距離と相似に表示することができる。つまり、Ｘ軸に２０ｎｍ走査したのであれば画像上に２０ｎｍに対応した長さのＸ軸が表示される。尚、表示の仕方はこの表示方法に限るものではなく、三次元像を的確に示す表示であればよい。例えば、各軸上に目盛りを表示してもよいし、利用者がマウス等で指示した座標を表示してもよい。
【００４２】
尚、図４の上記Ｘ軸方向、Ｙ軸方向、Ｚ軸方向の初期位置情報は（ｘ０，ｙ０，ｚ０）で示され、広域走査の開始位置とし、上記Ｐ＿ｅｎｄは（ｘＰ，ｙＰ，ｚＰ）として広域走査の終了位置として示される。
【００４３】
ここで、示した（ｘ０，ｙ０，ｚ０）、（ｘＰ，ｙＰ，ｚＰ）はハードウェアから取得した絶対位置に対応している。
また、ステップＳ１で行った広域の走査によって表示される画像は、試料の三次元形状が確認できるものであればよく、その構築方法や、表示手段は問わない。
【００４４】
次に図２のステップＳ３おける注目領域設定について具体的に説明する。このステップでは、ステップＳ２で得られた三次元表示像ａに注目領域を描画している。すなわち、広域の三次元画像の中に、詳細に走査する領域を設定する。
【００４５】
本実施例では、２つの注目領域を描画する例を示す。指定する注目領域の数とサイズは任意に選択可能である。
また、ＰＣ１２に接続した入力装置１７としてコンピュータのマウスを使って指定する例を示したが、指定方法はマウスに限定されるものではなく、注目領域を指示する他の方法に種々変形可能である。
【００４６】
例えば図５にステップＳ２で表示された三次元表示像に、ＸＹ平面と平行な断面ｂをマウスで指定すると、断面ｂ上と三次元表示像ａが交差する位置の輝度情報が断面図ｃとして表示される。
【００４７】
これにより、前記利用者である観察者はＰＣ１２に接続されたマウスで断面ｂを移動させながら注目領域を検索することができる。
次に、観察者はマウスを使用して、表示装置１６に表示された断面図ｃ上に注目領域ｄを描画する。注目領域は、長方形、円など任意の形状でよい。ここでは長方形として説明する。
【００４８】
注目領域の位置情報はＣＰＵ１４に伝送され、メモリ１５に記憶されている三次元表示像ａの位置情報に変換される。この情報を基にＣＰＵ１４は表示装置１６に表示した三次元表示像ａに注目領域を表示する。
【００４９】
例えば、注目領域のＺ方向の大きさを変更するときは、観察者が図６の注目領域ｅの上辺操作点ｅ＿ｕｐ、下辺操作点ｅ＿ｄｏｗｎ等をマウスでつかみ上下方向に移動することで、注目領域は伸縮することが可能で、変更後の注目領域のデータはメモリ１５に随時格納される。尚、注目領域の保持する情報として、Ｘ軸方向の走査回数、Ｙ軸方向の走査回数、Ｚ軸方向のスライス数、注目領域走査時のサンプリング波長などの走査情報も同時に関連付けて格納してもよい。
【００５０】
別の注目領域についても上記操作をもう一度行い、同図の注目領域ｆが三次元表示像ａに注目領域として追加して描画できる。
次に図２のステップＳ４における詳細走査領域計算について説明する。以下では代表例として、上記説明した注目領域ｅの詳細走査領域計算について、他の注目領域を除き、注目領域ｅに注目した図７を用いて説明をする。
【００５１】
注目領域ｅの走査開始位置を求める方法は、ステップＳ３で説明した方法により求め、メモリ１５に格納されている、三次元表示像ａ内の注目領域ｅの走査開始位置ｉと走査終了位置ｊを使用する。
【００５２】
図７において、注目領域ｅの走査開始位置にレーザ焦点を合わせるための計算は、次の、三次元表示像走査開始位置ｇ（０，０，０）（三次元表示像ａの取得時の走査開始位置（ｘ０，ｙ０，ｚ０）と対応する）と、三次元表示像走査終了位置ｈ（ｘｈ，ｙｈ，ｚｈ）（三次元表示像取得時の走査終了位置（ｘＰ，ｙＰ，ｚＰ）に対応する）を用いて、上記三次元表示像走査開始位置ｇと三次元表示像走査終了位置ｈの関係から、注目領域ｅの走査開始位置ｉまでのベクトルＶｈを算出する。ここで、Ｖｈは式１で表され、三次元表示像走査開始位置ｇからの相対位置である。
【００５３】
Ｖｈ＝ｉ−ｈ  ・・・  （１）
また、メモリ１５には三次元表示像取得時の走査終了位置情報Ｐ＿ｅｎｄと、現在のレーザ焦点位置Ｐが、ハードウェアから取得した絶対位置で記憶されている。よって、注目領域ｅ走査開始位置ｉまでの移動ベクトルＶは式１を利用することで以下の式２で得られる。式２で求めたＶに基づきレーザ焦点を注目領域の走査開始位置に移動することができる。
【００５４】
Ｖ＝（Ｐ＿ｅｎｄ−Ｐ）＋（ｉ−ｈ）  ・・・  （２）
次に注目領域ｅの走査におけるＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸の走査幅を制御するために、Ｘ方向スキャナ４、Ｙ方向スキャナ５、ステージ７の動作を制御する電気信号の変動を設定する。
【００５５】
例えば、図８中では、三次元表示像のＸ軸方向の画素数Ｗ、Ｙ軸方向の画素数Ｈと、三次元表示像中の注目領域ｅのＸ軸方向画素数Ｓ、Ｙ軸方向画素数Ｔから、Ｓ／ＷをＸ軸方向の変動とし、（Ｓ／Ｗ）＊（Ｔ／Ｗ）をＹ軸方向の変動とする。三次元表示像ａ取得時のＸ方向スキャナ制御用の電圧幅Ｖｘ、Ｙ方向スキャナ制御用の電圧幅Ｖｙはメモリ１５に記憶されているので、詳細走査時のＸ方向スキャナ制御用、Ｙ方向スキャナ制御用の電圧幅Ｖ'ｘ、Ｖ'ｙは以下の式３で得る。
【００５６】
Ｖ'ｘ＝Ｖｘ＊（Ｓ／Ｗ）
Ｖ'ｙ＝Ｖｙ＊（Ｓ／Ｗ）＊（Ｔ／Ｈ）  ・・・  （３）
同様にＺ軸に対しても三次元表示像ａのＺ方向の画素数Ｄ、注目領域ｅのＺ方向の画素数ｕ、三次元表示像ａ取得時のステージ７制御用の電圧相Ｖｚから、詳細走査時のステージ７制御用の電圧幅Ｖ'zは以下の式４で得る。
【００５７】
Ｖ'ｚ＝Ｖｚ＊（ｕ／Ｄ）  ・・・  （４）
さらに、メモリ１５に記憶しているＺ方向のサンプリング数ｎ（Ｚ軸のスライス枚数）と、注目領域のＺ方向距離Ｄｚから１ステップ辺りのステージ移動距離Ｄｚ／ｎを算出する。
【００５８】
また、走査時の中心位置も移動する必要があるので、三次元表示像ａの取得時の走査中心位置から、注目領域ｅの中心位置までの位置情報を取得する。以上求めた算出結果情報（各軸の走査回数、各軸に走査振り幅等のデータ）をメモリ１５に格納して注目領域ｅに対する走査領域計算処理を終了する。
【００５９】
複数の注目領域がある場合、例えば、注目領域ｆがあれば、上記処理を注目領域ｆに対しても同様に行い、注目領域ｆの詳細走査領域を取得する。
次に、図２のＳ５、Ｓ６における詳細走査の処理を図９を用いて具体的に説明する。
【００６０】
まず、ステップＳ３＿１において、図２のＳ４で詳細走査領域計算によって算出された走査条件をメモリ１５から読み出す。
本実施例では最初にメモリ１５から読み出す走査条件を注目領域ｅとして説明するが、走査条件を読み出す順序は任意選択可能である。
【００６１】
次にステップＳ３＿２において、読み出した注目領域ｅの走査条件はＣＰＵ１４によって焦点位置制御部９へと伝送される。焦点位置制御部９は、Ｘ方向スキャナ４、Ｙ方向スキャナ５、及びステージ７に走査開始位置情報を伝送する。
【００６２】
Ｘ方向スキャナ４、Ｙ方向スキャナ５とステージ７は入力された走査開始位置に移動される。ステップＳ３＿３では試料８の注目領域ｅに従って走査を行い、注目領域ｅの三次元情報を取得し、メモリ１５に取得した情報を格納する。
【００６３】
ここで、Ｘ、Ｙ、Ｚ軸方向の各走査回数は、前記詳細走査領域計算で得られた回数だけ行い、三次元表示像ａの走査回数とは別であり独立している。すなわち、広域走査で得た三次元画像はプレビューであってもかまわないため、走査回数が少なくてもよい。しかし、注目領域の走査は、注目領域を詳細に走査するため走査回数が広域走査と必ずしも同じではない。
【００６４】
次に、ステップＳ３＿４では、未走査の注目領域が存在するか判定する。本実施例の場合、注目領域ｆが未走査であるので、ステップＳ３＿１に戻り、注目領域ｆの走査条件をメモリ１５から読み出す。読み出した走査条件は再び焦点位置制御部９に伝送され、次の走査開始位置情報がＸ方向スキャナ４、Ｙ方向スキャナ５、ステージ７にそれぞれセットされる。以降、上記詳細走査を注目領域ｆに対して行い、全ての注目領域の三次元情報を取得したら、詳細走査を完了する。
【００６５】
上記方法によって、三次元画像中の注目領域を複数指定し、その各注目領域に対し詳細に走査できる。従って、観察者は、直感的に三次元注目領域を設定できる。
尚、上記構成において、Ｚ方向の移動はステージ７を用いていたが、対物レンズを移動してもよい。
【００６６】
また、上記実施形態では、注目領域を設定する際の基準となる断面をＸＹ平面（二次元領域）としたが、 ＹＺ平面、ＸＺ平面など任意の方向の断面でもよい。また、断面を使用せず、空間中に三次元注目領域を指示してもよい。また、点で指示しその周辺を注目領域として指定してもよい。
【００６７】
さらに、本実施形態においては、光源１からのレーザ光を単一波長としたが、複数のレーザ光源を使用してもよい。この場合、複数の対象の高輝度情報を取得することができる。
【００６８】
実施例においては共焦点走査型顕微鏡を用いて説明したが、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限りその他の共焦点走査型顕微鏡にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】実施例１の実施形態を示す図である。
【図２】実施例１の実施形態の動作を説明するためのフローチャートである。
【図３】実施例１の三次元画像取得の動作を説明するためのフローチャートである。
【図４】実施例１の三次元画像取得処理によって得られた三次元画像である。
【図５】実施例１の注目領域設定の例である。
【図６】実施例１の注目領域設定の例である。
【図７】実施例１の広域走査による三次元画像と、注目領域の位置関係を説明する図である。
【図８】実施例１の詳細走査領域計算を説明する図である。
【図９】実施例１の詳細走査領域による三次元画像取得を説明するためのフローチャートである。
【符号の説明】
【００７０】
１  ・・・  光源
２  ・・・  顕微鏡本体
３  ・・・  ダイクロイックミラー
４  ・・・  Ｘスキャナ
５  ・・・  Ｙスキャナ
６  ・・・  対物レンズ
７  ・・・  ステージ
８  ・・・  試料（標本）
９  ・・・  焦点位置制御部
１０  ・・・  光検出器
１１  ・・・  Ａ／Ｄ変換器
１２  ・・・  ＰＣ
１３  ・・・  記憶装置
１４  ・・・  ＣＰＵ
１５  ・・・  メモリ
１６  ・・・  表示装置
１７  ・・・  入力装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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