(57)【要約】【課題】数μｍを超える大きさを有するたんぱく質や真核細胞などの特定物質が試料中に含まれる場合でも、蛍光顕微鏡画像を用いてその特定物質の質量を高感度で定量分析することができる定量分析方法を提供する。【解決手段】蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射した際の前記試料の蛍光状態が撮影された複数の画像データのうち、撮影焦点が一致していない画像データを棄却する画像データ選別工程と、前記画像データ選別工程で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出工程と、予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量工程と、を含む。【選択図】        図６
2006226916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射した際の前記試料の蛍光状態が撮影された複数の画像データのうち、撮影焦点が一致していない画像データを棄却する画像データ選別工程と、
前記画像データ選別工程で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出工程と、
予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量工程と、
を含むことを特徴とする定量分析方法。
【請求項２】
蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射して、前記試料の蛍光状態を撮影した複数の画像データを取得する画像データ取得工程と、
前記画像データのうち、撮影焦点が一致していない画像データを棄却する画像データ選別工程と、
前記画像データ選別工程で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出工程と、
予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量工程と、
を含むことを特徴とする定量分析方法。
【請求項３】
前記画像データ選別工程は、
前記画像データを２次元フーリエ変換して振幅スペクトルの大きさの２次元分布を計算し、２次元分布上の所定の位置におけるスペクトルデータを得るスペクトルデータ取得工程と、
前記スペクトルデータが高周波領域を含んでいるか否かを判定し、高周波領域を含んでいない場合に前記画像データを棄却する棄却判定工程と、
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の定量分析方法。
【請求項４】
前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、
前記スペクトルデータ取得工程は、ωｘ軸上とωｙ軸上のスペクトルデータを取得し、
前記棄却判定工程は、前記スペクトルデータの振幅が、ωｘ軸上とωｙ軸上のすべての空間周波数で所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする請求項３に記載の定量分析方法。
【請求項５】
前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、
前記スペクトルデータ取得工程は、ωｘ軸とωｙ軸との交点を中心とする所定の長さの半径の円周上のスペクトルデータを取得し、
前記棄却判定工程は、前記スペクトルデータ上のωｘ軸とωｙ軸に対応する角度の近傍で、それぞれ所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする請求項３に記載の定量分析方法。
【請求項６】
前記蛍光強度算出工程は、前記画像データの各画素について、所定値以下の明るさとなる画素を明るさ０の画素に変換した後に、各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする請求項１または２に記載の定量分析方法。
【請求項７】
前記蛍光強度算出工程は、前記画像データについて、所定値以上の明るさの画素からなる積算実行領域を抽出し、この積算実行領域内部の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする請求項１または２に記載の定量分析方法。
【請求項８】
前記特定物質は、蛍光染色されたタンパク質または真核細胞のいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載の定量分析方法。
【請求項９】
前記蛍光強度算出工程は、さらに前記画像データ中における全体の蛍光強度の積算値を算出し、
前記特定物質定量工程は、予め作成した前記特定物質の濃度と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−濃度対応情報に基づいて、前記画像データ中の全体の蛍光強度の積算値から前記特定物質の濃度をさらに算出することを特徴とする請求項１または２に記載の定量分析方法。
【請求項１０】
蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射した際の前記試料の蛍光状態を撮影した複数の画像データを用いて、前記試料中の前記特定物質の質量を定量する定量分析プログラムであって、
前記複数の画像データを取得する画像データ取得手順と、
取得した前記複数の画像データのうち、撮影焦点が一致していない画像データを棄却する画像データ選別手順と、
前記画像データ選別工程で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出手順と、
予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量手順と、
をコンピュータに実行させるための定量分析プログラム。
【請求項１１】
前記画像データ選別手順は、
前記画像データを２次元フーリエ変換して振幅スペクトルの大きさの２次元分布を計算し、２次元分布上の所定の位置におけるスペクトルデータを得るスペクトルデータ取得手順と、
前記スペクトルデータが高周波領域を含んでいるか否かを判定し、高周波領域を含んでいない場合に前記画像データを棄却する棄却判定手順と、
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の定量分析プログラム。
【請求項１２】
前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、
前記スペクトルデータ取得手順では、ωｘ軸上とωｙ軸上のスペクトルデータを取得し、
前記棄却判定手順では、前記スペクトルデータの振幅が、ωｘ軸上とωｙ軸上のすべての空間周波数で所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする請求項１１に記載の定量分析プログラム。
【請求項１３】
前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、
前記スペクトルデータ取得手順では、ωｘ軸とωｙ軸との交点を中心とする所定の長さの半径の円周上のスペクトルデータを取得し、
前記棄却判定手順では、前記スペクトルデータ上のωｘ軸とωｙ軸に対応する角度の近傍で、それぞれ所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする請求項１１に記載の定量分析プログラム。
【請求項１４】
前記蛍光強度算出手順は、前記画像データの各画素について、所定値以下の明るさとなる画素を明るさ０の画素に変換した後に、各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする請求項１０に記載の定量分析プログラム。
【請求項１５】
前記蛍光強度算出手順は、前記画像データについて、所定値以上の明るさの画素からなる積算実行領域を抽出し、この積算実行領域内部の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする請求項１０に記載の定量分析プログラム。
【請求項１６】
前記蛍光強度算出手順は、前記画像データ中における全体の蛍光強度の積算値を算出する手順をさらに含み、
前記特定物質定量手順は、予め作成した前記特定物質の濃度と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−濃度対応情報に基づいて、前記画像データ中の全体の蛍光強度の積算値から前記特定物質の濃度をさらに算出する手順をさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の定量分析プログラム。
【請求項１７】
蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射した際の前記試料の蛍光状態を撮影した複数の画像データを用いて、前記試料中の前記特定物質の質量を定量する定量分析装置であって、
前記複数の画像データを取得する画像データ取得手段と、
前記画像データ選別手段で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出手段と、
予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量手段と、
を備えることを特徴とする定量分析装置。
【請求項１８】
前記試料に励起光を照射して、前記試料の蛍光状態を撮影する撮影手段をさらに備えることを特徴とする請求項１７に記載の定量分析装置。
【請求項１９】
前記画像データ選別手段は、
前記画像データを２次元フーリエ変換して振幅スペクトルの大きさの２次元分布を計算し、２次元分布上の所定の位置におけるスペクトルデータを得るスペクトルデータ取得機能と、
前記スペクトルデータが高周波領域を含んでいるか否かを判定し、高周波領域を含んでいない場合に前記画像データを棄却する棄却判定機能と、
を有することを特徴とする請求項１７に記載の定量分析装置。
【請求項２０】
前記蛍光強度算出手段は、前記画像データの各画素について、所定値以下の明るさの画素を明るさ０の画素に変換した後に、各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする請求項１７に記載の定量分析装置。
【請求項２１】
前記蛍光強度算出手段は、前記画像データについて、所定値以上の明るさの画素からなる積算実行領域を抽出し、この積算実行領域内部の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする請求項１７に記載の定量分析装置。
【請求項２２】
前記蛍光強度算出手段は、さらに前記画像データ中における全体の蛍光強度の積算値を算出する機能をさらに有し、
前記特定物質定量手段は、予め作成した前記特定物質の濃度と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−濃度対応情報に基づいて、前記画像データ中の全体の蛍光強度の積算値から前記特定物質の濃度を算出する機能をさらに有することを特徴とする請求項１７に記載の定量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるタンパク質や真核細胞などの特定物質を高感度で定量分析する定量分析装置、定量分析方法および定量分析プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
浮遊細胞および接着細胞を有するすべての体細胞などの細胞の抗体量（タンパク質量）を定量することは、ゲノム解析、タンパク質解析、タンパク質生産、再生医工学、細胞工学などの各研究分野や医療分野などで頻繁に用いられ、きわめて重要な技術である。たとえば、これら体細胞などの抗体量（タンパク質量）の定量では、酵素抗体法が一般的に用いられ、ピコグラムの精度でその質量を定量することができる。また、迅速で精度の高い方法として、フローサイトメータのように体細胞内の抗体に蛍光色素を染色してレーザを照射してその際発生する蛍光強度から細胞の抗体量を定量する方法が知られている。
【０００３】
しかし、酵素抗体法では、定量操作が複雑でかなりの分析技術を必要とし、また、分析に数時間を要するという問題点があった。また、フローサイトメータは、その処理工程でレーザ照射などを行うため、装置構成が複雑で、装置が高価になってしまうという問題点があった。
【０００４】
そこで、これらの酵素抗体法やフローサイトメータを使用しないメタン菌などの特定物質の測定方法として、微生物測定方法という技術が提案されている（たとえば、特許文献１参照）。図１２は、この従来の微生物測定方法を実施するための装置を模式的に示す図である。この装置構成は図１２に示すように、被検体を試料とするプレパラート９１が載置された蛍光顕微鏡９２に、高感度テレビカメラ９３が取付けられ、この高感度テレビカメラ９３からＶＴＲ９４、画像処理装置９５、およびモニタテレビ９６が直列に接続される。このような装置における微生物（メタン菌）内の含有蛍光物質濃度とその量の測定方法を、図１３のフローチャートを参照しながら説明する。まず、測定対象の微生物、すなわち、メタン菌を含む試料のプレパラート９１を試料厚み一定となるように作成し、これを蛍光顕微鏡９２にかけて光源からの励起光をフィルタで処理してプレパラート９１に照射する。試料からの蛍光は蛍光フィルタで処理した後、高感度テレビカメラ９３にて画像データとして取得される。このとき高感度テレビカメラ９３のＳ／Ｎ比対策として、メディアンフィルタによりスパイク性雑音を除去し、つぎに照明ムラ、カメラのシェーディング影響を補正するため、背景の合成、画像差演算による切出しを行う。これを予め定めたしきい値により２値化し、計測対象物の切出しを行う。さらに、計測対象物の切出し結果を島分けするためにラベリングし、きょう雑物排除のため、大きさなどの特徴量抽出を行い、メタン菌を識別する。そして、画面上でメタン菌と識別された箇所の蛍光輝度を、単位面積当たりについて積分することにより、培養液中の自己蛍光性補酵素Ｆ４２０の濃度を求めている。
【０００５】
【特許文献１】特許第２９４７３０５号公報（明細書第１７項、第１図および第２図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載された微生物測定方法では、プレパラート上での試料厚みを一定とする必要があるために、大きさが数μｍを超えるような真核細胞を定量する際に、カバーガラスをかけるなどして試料厚みを一定とすると、その試料が壊れてしまうという問題点があった。また、高感度テレビカメラのＳ／Ｎ比対策としてメディアンフィルタによりスパイク性雑音を除去しているが、精度はそれほど向上しないという問題点もあった。
【０００７】
図７−１は、ＩｇＭ抗体を蛍光染色した蛍光顕微鏡画像の蛍光強度と酵素抗体法によって定量した抗体量の関係を示す相関図である。この図７−１は、蛍光顕微鏡で撮影されたすべての画像データを使用して定量分析を行った結果を示すものである。この図において、蛍光強度と抗体量の間にはバラツキが見られ、両者のピアソンの積率相関係数は０．４７となるため、精度が良くないという問題点がある。
【０００８】
このような実測値（実際の抗体量）とのバラツキ（誤差）が生じる原因は、ＩｇＭ抗体のような真核細胞は概ね１０〜２０μｍの大きさを有し、一方、蛍光顕微鏡はその焦点深度が試料厚みや真核細胞の大きさと比べて小さく、蛍光顕微鏡画像が焦点の合わないボケた画像となることが多いことによるものである。
【０００９】
本発明は、上述した課題に鑑みてなされたものであり、数μｍを超える大きさを有するたんぱく質や真核細胞などの特定物質が試料中に含まれる場合でも、蛍光顕微鏡画像を用いてその特定物質の質量を高感度で定量分析することができる定量分析装置、定量分析方法および定量分析プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した課題を解決するために、第１の発明の定量分析方法は、蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射した際の前記試料の蛍光状態が撮影された複数の画像データのうち、撮影焦点が一致していない画像データを棄却する画像データ選別工程と、前記画像データ選別工程で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出工程と、予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量工程と、を含むことを特徴とする。
【００１１】
また、第２の発明の定量分析方法は、蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射して、前記試料の蛍光状態を撮影した複数の画像データを取得する画像データ取得工程と、前記画像データのうち、撮影焦点が一致していない画像データを棄却する画像データ選別工程と、前記画像データ選別工程で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出工程と、予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量工程と、を含むことを特徴とする。
【００１２】
さらに、第３の発明の定量分析方法は、前記画像データ選別工程は、前記画像データを２次元フーリエ変換して振幅スペクトルの大きさの２次元分布を計算し、２次元分布上の所定の位置におけるスペクトルデータを得るスペクトルデータ取得工程と、前記スペクトルデータが高周波領域を含んでいるか否かを判定し、高周波領域を含んでいない場合に前記画像データを棄却する棄却判定工程と、を含むことを特徴とする。
【００１３】
また、第４の発明の定量分析方法は、前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、前記スペクトルデータ取得工程は、ωｘ軸上とωｙ軸上のスペクトルデータを取得し、前記棄却判定工程は、前記スペクトルデータの振幅が、ωｘ軸上とωｙ軸上のすべての空間周波数で所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする。
【００１４】
さらに、第５の発明の定量分析方法は、前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、前記スペクトルデータ取得工程は、ωｘ軸とωｙ軸との交点を中心とする所定の長さの半径の円周上のスペクトルデータを取得し、前記棄却判定工程は、前記スペクトルデータ上のωｘ軸とωｙ軸に対応する角度の近傍で、それぞれ所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする。
【００１５】
また、第６の発明の定量分析方法は、前記蛍光強度算出工程は、前記画像データの各画素について、所定値以下の明るさとなる画素を明るさ０の画素に変換した後に、各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする。
【００１６】
さらに、第７の発明の定量分析方法は、前記蛍光強度算出工程は、前記画像データについて、所定値以上の明るさの画素からなる積算実行領域を抽出し、この積算実行領域内部の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする。
【００１７】
また、第８の発明の定量分析方法は、前記特定物質は、蛍光染色されたタンパク質または真核細胞のいずれかであることを特徴とする。
【００１８】
さらに、第９の発明の定量分析方法は、前記蛍光強度算出工程は、さらに前記画像データ中における全体の蛍光強度の積算値を算出し、前記特定物質定量工程は、予め作成した前記特定物質の濃度と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−濃度対応情報に基づいて、前記画像データ中の全体の蛍光強度の積算値から前記特定物質の濃度をさらに算出することを特徴とする。
【００１９】
上述した課題を解決するために、第１０の発明の定量分析プログラムは、蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射した際の前記試料の蛍光状態を撮影した複数の画像データを用いて、前記試料中の前記特定物質の質量を定量する定量分析プログラムであって、前記複数の画像データを取得する画像データ取得手順と、取得した前記複数の画像データのうち、撮影焦点が一致していない画像データを棄却する画像データ選別手順と、前記画像データ選別工程で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出手順と、予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量手順と、をコンピュータに実行させることを特徴とする。
【００２０】
また、第１１の発明の定量分析プログラムは、前記画像データ選別手順は、前記画像データを２次元フーリエ変換して振幅スペクトルの大きさの２次元分布を計算し、２次元分布上の所定の位置におけるスペクトルデータを得るスペクトルデータ取得手順と、前記スペクトルデータが高周波領域を含んでいるか否かを判定し、高周波領域を含んでいない場合に前記画像データを棄却する棄却判定手順と、を含むことを特徴とする。
【００２１】
さらに、第１２の発明の定量分析プログラムは、前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、前記スペクトルデータ取得手順では、ωｘ軸上とωｙ軸上のスペクトルデータを取得し、前記棄却判定手順では、前記スペクトルデータの振幅が、ωｘ軸上とωｙ軸上のすべての空間周波数で所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする。
【００２２】
また、第１３の発明の定量分析プログラムは、前記画像データの互いに直交する２方向をｘ軸、ｙ軸として２次元フーリエ変換によって得られるｘ軸とｙ軸方向の空間周波数を表す軸をそれぞれωｘ軸、ωｙ軸としたときに、前記スペクトルデータ取得手順では、ωｘ軸とωｙ軸との交点を中心とする所定の長さの半径の円周上のスペクトルデータを取得し、前記棄却判定手順では、前記スペクトルデータ上のωｘ軸とωｙ軸に対応する角度の近傍で、それぞれ所定値以上の値をとる場合に高周波領域を含むものと判定することを特徴とする。
【００２３】
さらに、第１４の発明の定量分析プログラムは、前記蛍光強度算出手順は、前記画像データの各画素について、所定値以下の明るさとなる画素を明るさ０の画素に変換した後に、各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする。
【００２４】
また、第１５の発明の定量分析プログラムは、前記蛍光強度算出手順は、前記画像データについて、所定値以上の明るさの画素からなる積算実行領域を抽出し、この積算実行領域内部の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする。
【００２５】
さらに、第１６の発明の定量分析プログラムは、前記蛍光強度算出手順は、前記画像データ中における全体の蛍光強度の積算値を算出する手順をさらに含み、前記特定物質定量手順は、予め作成した前記特定物質の濃度と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−濃度対応情報に基づいて、前記画像データ中の全体の蛍光強度の積算値から前記特定物質の濃度をさらに算出する手順をさらに含むことを特徴とする。
【００２６】
上述した課題を解決するために、第１７の発明の定量分析装置は、蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射した際の前記試料の蛍光状態を撮影した複数の画像データを用いて、前記試料中の前記特定物質の質量を定量する定量分析装置であって、前記複数の画像データを取得する画像データ取得手段と、前記画像データ選別手段で棄却されなかった画像データについて、蛍光強度を積算する蛍光強度算出手段と、予め作成した前記特定物質の質量と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、前記蛍光強度の積算値から前記特定物質の質量を算出する特定物質定量手段と、を備えることを特徴とする。
【００２７】
また、第１８の発明の定量分析装置は、前記試料に励起光を照射して、前記試料の蛍光状態を撮影する撮影手段をさらに備えることを特徴とする。
【００２８】
さらに、第１９の発明の定量分析装置は、前記画像データ選別手段は、前記画像データを２次元フーリエ変換して振幅スペクトルの大きさの２次元分布を計算し、２次元分布上の所定の位置におけるスペクトルデータを得るスペクトルデータ取得機能と、前記スペクトルデータが高周波領域を含んでいるか否かを判定し、高周波領域を含んでいない場合に前記画像データを棄却する棄却判定機能と、を有することを特徴とする。
【００２９】
また、第２０の発明の定量分析装置は、前記蛍光強度算出手段は、前記画像データの各画素について、所定値以下の明るさの画素を明るさ０の画素に変換した後に、各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする。
【００３０】
さらに、第２１の発明の定量分析装置は、前記蛍光強度算出手段は、前記画像データについて、所定値以上の明るさの画素からなる積算実行領域を抽出し、この積算実行領域内部の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算することを特徴とする。
【００３１】
また、第２２の発明の定量分析装置は、前記蛍光強度算出手段は、さらに前記画像データ中における全体の蛍光強度の積算値を算出する機能をさらに有し、前記特定物質定量手段は、予め作成した前記特定物質の濃度と蛍光強度との関係を示す蛍光強度−濃度対応情報に基づいて、前記画像データ中の全体の蛍光強度の積算値から前記特定物質の濃度を算出する機能をさらに有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、複数ある画像データから撮影焦点が一致しない画像データを棄却して、撮影焦点が一致する画像データのみを用いて蛍光強度の算出を行う。特定物質の質量の定量にこの蛍光強度の積算値が使用されるので、試料中に含まれるタンパク質や真核細胞などの特定物質を高感度で定量分析することができるという効果を奏する。また、複数の画像データを用いるので、全ての画像データが撮影焦点の一致しない画像データとなる確率を低減させ、効率のよい定量分析を行うことができるという効果も有する。さらに、撮影焦点の一致した画像データがあればよいので、試料の大きさに関係なく、高精度で特定物質の定量を行うことができるという効果も有する。また、質量だけでなく、特定物質の濃度も同様に高感度で定量することができるという効果も有する。
【００３３】
また、本発明によれば、画像データを２次元フーリエ変換して得られた振幅の大きさのスペクトルデータを用いて撮影焦点の一致の有無の判定を行うようにしている。画像データを構成する画素値にステップ状の変化を含む撮影焦点の一致している画像データと、画像データを構成する画素値にステップ状の変化を含まない撮影焦点の一致しない画像データとでは、２次元フーリエ変換した場合の振幅のスペクトルデータにおいて、ωｘ軸近傍とωｙ軸近傍における振幅値で両者は異なる傾向を示すので、両者を容易に選別することができるという効果を有する。
【００３４】
さらに、本発明によれば、撮影焦点の一致している画像データの所定値以下の明るさの画素が明るさ０の画素に変換するようにしたり、または撮影焦点の一致している画像データの所定値以上の明るさとなる画素の領域を抽出したりしている。そのため、画像データの背景となっている部分のノイズなどを除去することができるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に添付図面を参照して、この発明にかかる定量分析装置、定量分析方法および定量分析プログラムの好適な実施の形態を詳細に説明する。なお、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
図１は、本発明にかかる定量分析装置の実施例１の構成を模式的に示す図である。この定量分析装置１は、図示しない蛍光染色された特定物質を含む試料に励起光を照射して、試料からの蛍光を撮影する撮影装置１０と、撮影装置１０によって撮影された画像データを処理して定量分析を行う演算装置２０と、を備えて構成される。
【００３７】
撮影装置１０は、試料に励起光を照射するための光学系を光学顕微鏡に備えた蛍光顕微鏡１１に、その励起光の照射によって試料から発生した蛍光の状態を撮影する撮影部１２を設けた構成を有している。この図１の例では、撮影部１２はデータを送受信するためのケーブルで演算装置２０と接続されている場合を示している。撮影部１２は、たとえばＣＣＤカメラなどの画像撮影手段によって構成され、蛍光顕微鏡１１の対物レンズによって拡大された画像を撮影する。対物レンズの倍率は、定量を行う対象物によって適宜選択されるものであり、任意のものでよいが、通常、４倍〜１００倍程度の倍率の対物レンズが使用される。
【００３８】
演算装置２０は、撮影装置１０の撮影部１２によって撮影された画像を取得する画像データ取得部２１と、取得した画像データを格納する画像データ格納部２２と、定量分析に用いる画像データの選別を行う画像データ選別部２３と、選別された画像データを用いて蛍光強度を求める蛍光強度積算部２４と、求めた蛍光強度から試料の特定物質の質量を求める質量算出部２５と、これらの各処理部を制御する制御部２６と、を備えて構成される。
【００３９】
画像データ取得部２１は、撮影装置１０の撮影部１２に対して蛍光染色された特定物質の蛍光画像を撮影するように指示を出し、その結果得られる画像データを画像データ格納部２２に格納する機能を有する。このとき、画像データ取得部２１は、対物レンズの拡大倍率とその撮影領域を固定した状態で試料の撮影を１回ではなく複数回行うようにして、複数の画像データを得るようにしている。この画像データ取得部２１は、試料の蛍光状態を撮影した複数の画像データを取得する機能を有するものであれば十分であるが、この機能のほかに、蛍光顕微鏡１１の励起光の照射、蛍光顕微鏡１１の焦点、撮影部１２による撮影のタイミングと撮影条件、撮影部１２で撮影した画像データの画像データ格納部２２への記録などの制御処理を行うように構成してもよい。また、画像データ格納部２２は、画像データ取得部２１によって取得された画像データを格納する機能を有する。
【００４０】
画像データ選別部２３は、画像データ格納部２２に格納される複数の画像データのうち、定量分析に用いることができる画像データと用いることができない画像データとを選別し、定量分析に用いることができない画像データを棄却し、定量分析に用いることができる画像データまたはその画像データを識別する情報を蛍光強度積算部２４に渡す機能を有する。このような機能を、２次元フーリエ変換を利用して実現する場合の画像データ選別部２３の構成の一例が図１に示されている。すなわち、この実施例１では、画像データ選別部２３は、画像データを２次元フーリエ変換して所定のスペクトルデータを得るスペクトルデータ取得機能２３１と、得られたスペクトルデータから画像データの棄却の要否を判定する棄却判定機能２３２と、を有して構成される。以下に、画像データ選別部２３による画像データの選別の詳細について、蛍光染色されたＩｇＭ（Immunoglobulin M type）抗体を含んだ試料を使用した場合を例に挙げて説明する。
【００４１】
スペクトルデータ取得機能２３１は、画像データ格納部２２から読み出した画像データについて２次元フーリエ変換を行い、振幅スペクトルについてのスペクトルデータを取得する機能を有する。図２−１は、焦点の一致した鮮明な画像データの一例を示し、図２−２は、焦点の一致しない不鮮明な画像データの一例を示している。スペクトルデータ取得機能２３１は、これらのような画像データを受取ると、２次元フーリエ変換によって、その振幅スペクトルの座標分布（２次元分布）を計算する。図３−１〜図３−２は、それぞれ図２−１〜図２−２の画像データを２次元フーリエ変換して、その振幅スペクトルの大きい座標の分布を２次元表示させたものである。ここで、ωｘ軸は、図２−１〜図２−２に示されるｘ軸方向の空間周波数を表し、ωｙ軸は、同じくｙ軸方向の空間周波数を表している。また、図４−１〜図４−２は、それぞれ図３−１のωｘ軸上とωｙ軸上における振幅スペクトルを示し、図４−３〜図４−４は、それぞれ図３−２のωｘ軸上とωｙ軸上における振幅スペクトルを示している。
【００４２】
図２−１のように焦点の一致した画像データの場合は、画像データにｘ軸方向とｙ軸方向のステップ状の変化を含んでいるので、２次元フーリエ変換されたωｘ軸上とωｙ軸上の振幅スペクトルは、図４−１と図４−２に示されるように空間周波数の全体にわたって所定値（α）以上の大きさを有するものとする。その結果、振幅スペクトルの２次元分布には、図３−１に示されるように、ωｘ軸近傍とωｙ軸近傍の領域３００に十文字上の分布が表れる傾向にある。
【００４３】
一方、図２−２のように焦点の一致しない画像データの場合は、画像データにｘ軸方向とｙ軸方向のステップ状の変化を含まないので、２次元フーリエ変換されたωｘ軸上とωｙ軸上の振幅スペクトルは、図４−３と図４−４に示されるように小さな値を持つ領域（所定値（α）未満となる領域）が存在するものとする。その結果、振幅スペクトルの２次元分布には、図３−２に示されるように、ωｘ軸近傍とωｙ軸近傍の領域３００に十文字上の分布が表れない傾向にある。
【００４４】
棄却判定機能２３２は、スペクトルデータ取得機能２３１によって取得されたωｘ軸とωｙ軸上の振幅スペクトルの振幅を観察し、ωｘ軸上とωｙ軸上の全ての領域でそれぞれ所定値（α）以上の値をとる場合に、画像データに高周波領域を含むもの（すなわち、画像データの撮影焦点が合っているもの）と判定し、その画像データを定量分析用に残す処理を行う。また、棄却判定機能２３２は、ωｘ軸上とωｙ軸上の全ての領域でそれぞれ所定値以上の値をとるものでない場合には、高周波領域を含まないもの（すなわち、画像データの撮影焦点が合っていないもの）と判定し、その画像データを棄却する処理を行う。つまり、撮影焦点の合っていない画像データを定量分析用の画像データとして用いないようにしている。そして、定量分析用の画像データとして選別された画像データまたはその画像データを識別する情報を蛍光強度積算部２４に渡す機能を有する。
【００４５】
たとえば、上記の図２−１〜図４−４の例では、定量分析用の画像データとして用いる場合の判定に用いるωｘ軸上とωｙ軸上の所定値をαとすると、全ての周波数で振幅スペクトルが所定値α以上である図４−１と図４−２の基となる図２−１の画像データは、定量分析用の画像データとして用いられる。一方、全ての周波数で振幅スペクトルが所定値α以上とならない図４−３と図４−４の基となる図２−２の画像データは、定量分析用の画像データとして用いられずに棄却される。
【００４６】
蛍光強度積算部２４は、画像データ選別部２３から得られた画像データまたはその画像データを識別する情報から得られる画像データを用いて、蛍光強度を積算する機能を有する。具体的には、棄却されなかった画像データについて、所定値以下の明るさとなる画素を明るさが０の画素に変換する。その後、計測対象となる個々の特定物質を切り出して積算実行領域とし、この積算実行領域内の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算し、積算した蛍光強度を質量算出部２５に出力する。ここで、所定値以下の明るさとなる画素を明るさが０の画素とすることで、画像データの背景となっている部分のノイズなどが除去される。
【００４７】
質量算出部２５は、予め求められた蛍光強度の積算値とその蛍光染色された特定物質の質量との間の対応関係を示す蛍光強度−質量対応情報に基づいて、蛍光強度積算部２４から得られた蛍光強度を用いて個々の特定物質の（単位面積あたりの）質量を定量する機能を有する。図５−１は、質量算出部の有する蛍光強度−質量対応情報の一例を示す図である。この蛍光強度−質量対応情報は、横軸に特定物質の質量（ここでは、ＩｇＭ抗体の質量）をとり、縦軸に画像の蛍光強度をとっている。このような蛍光強度−質量対応情報が予め定量を行う特定物質ごとに作成されている。なお、図５−１の例では、蛍光強度−質量対応情報はグラフとなっているが、グラフに限られず計算式であってもよいし、表であってもよい。また、質量算出部２５に、画像データ取得部２１によって同じ倍率で同じ撮影範囲で撮影された複数の画像データのうち定量可能な画像データによって定量した結果の平均値を求める機能をさらに持たせるようにしてもよい。このようにすることで、撮影した試料の単位面積あたりの質量を一層高精度で求めることが可能となる。
【００４８】
この図１の例では、蛍光強度積算部２４は、画像データ中から特定物質を一つ一つ抽出し、それぞれの蛍光強度を積算し、質量算出部２５は、その蛍光強度から個々の特定物質の質量を定量するようにしていたが、蛍光強度積算部２４に、画像データ中に含まれる全ての特定物質の蛍光強度の総和を求める蛍光強度総和算出機能をさらに設け、質量算出部２５に、全ての特定物質の蛍光強度の総和から特定物質の濃度を求める特定物質濃度算出機能をさらに設けるようにしてもよい。この場合には、質量算出部２５は、図５−２に示されるような蛍光強度−濃度対応情報を特定物質ごとに有している。この蛍光強度−濃度対応情報は、図５−１の横軸が特定物質の濃度に置き換わったものであり、定量分析を行う前に予め作成されるものである。
【００４９】
なお、この図１では、撮影装置１０と演算装置２０とは一体的に構成されている場合を示しているが、撮影装置１０と演算装置２０とを別々に構成するようにしてもよい。この場合には、撮影装置１０に撮影部１２で撮影した画像データを記憶する手段を設けておき、この記憶された画像データを持ち運び可能な記憶媒体などに移して、演算装置２０に読込ませたり、演算装置２０に設けられる画像データ格納部２２に移してから読込ませたりするようにすればよい。
【００５０】
ここで、このような定量分析装置による定量分析方法について図６のフローチャートを参照しながら説明する。まず、蛍光染色した特定物質を含んだ図示しない試料を撮影装置１０の所定の位置に設置し、この試料に励起光を照射して、画像データ取得部２１による指示に基づいて、試料の蛍光状態が撮影部１２によって撮影される（ステップＳ１１）。画像データ取得部２１は、撮影部１２によって撮影された画像を画像データとして取得し（ステップＳ１２）、画像データ格納部２２に格納する。その後、画像データ取得部２１は、予め設定された所定の回数分の撮影（ただし、２回以上）を行ったか否かを判定し（ステップＳ１３）、所定の回数分の撮影が終了していない場合（ステップＳ１３でＮｏの場合）には、再びステップＳ１１へと戻って、所定の回数分の撮影が完了するまで上記の処理を繰り返し実行する。以上のステップＳ１１〜Ｓ１３を画像データ取得工程とする。
【００５１】
また、所定の回数分の撮影が終了した場合（ステップＳ１３でＹｅｓの場合）には、画像データ選別部２３のスペクトルデータ取得機能２３１は、画像データ格納部２２に格納された画像データから２次元フーリエ変換を行って、ωｘ軸上とωｙ軸上の振幅スペクトルを取得する（ステップＳ１４）。ついで、画像データ選別部２３の棄却判定機能２３２は、この振幅スペクトルが高周波領域を含んでいるか否かを判定する（ステップＳ１５）。高周波領域を含んでいないと判定された場合（ステップＳ１５でＮｏの場合）には、画像データ選別部２３の棄却判定機能２３２は、その振幅スペクトルの基となる画像データを棄却する（ステップＳ１６）。一方、高周波領域を含んでいると判定された場合（ステップＳ１５でＹｅｓの場合）には、画像データ選別部２３の棄却判定機能２３２は、その振幅スペクトルの基となる画像データを定量分析用の画像データとして用いることを決定し、蛍光強度積算部２４に渡す。以上のステップＳ１４〜Ｓ１６を画像データ選別工程とする。
【００５２】
ついで、蛍光強度積算部２４は、渡された画像データにおいて、輝度が所定値以下となる画素の輝度を０に変換した後（ステップＳ１７）、画像データ中の積算実行領域中における各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算する（ステップＳ１８）。以上のステップＳ１７〜Ｓ１８を蛍光強度算出工程とする。なお、蛍光強度の算出においては、個々の積算実行領域を識別可能なようにラベルを付し、その座標と面積に関する情報を求めた上で蛍光強度の算出を行っているが、これらは画像データを用いて定量分析を行う従来の方法と同様であるのでその詳細な説明は省略している。
【００５３】
ついで、質量算出部２５は、蛍光強度積算部２４によって算出された蛍光強度から、蛍光強度−質量対応情報に基づいて特定物質の個々の単位面積あたりの質量を定量する（ステップＳ１９）。このステップＳ１９を特定物質定量工程とする。
【００５４】
その後、撮影したすべての画像データに対して、定量分析を行ったか否かを判定し（ステップＳ２０）、全ての画像データの定量分析が終わっていない場合（ステップＳ２０でＮｏの場合）には、ステップＳ１４へと戻り、上述した処理が繰り返し実行される。また、全ての画像データの定量分析が終了した場合（ステップＳ２０でＹｅｓの場合）には、定量分析が終了する。
【００５５】
なお、この図６のフローチャートでは、撮影装置１０と演算装置２０とが一体に構成された定量分析装置を例に挙げて説明したが、撮影装置１０と演算装置２０とが別々の場所に設置される場合には、画像データ取得工程で撮影された画像データを、フレキシブルディスクやＣＤ−Ｒ／ＲＷ（Compact Disc Recordable/ReWritable）、メモリカードなどの持ち運び可能な記憶媒体などに演算装置２０に移して、この演算装置２０で、画像データ選別工程以下の処理を行うようにすればよい。また、上記のステップＳ２１で、質量算出部２５が、定量可能な画像データによって定量した結果の平均値を求めるようにしてもよい。
【００５６】
以下に、本実施例１による定量分析方法でＩｇＭ抗体を特定物質としてその（単位面積あたりの）質量の定量分析を行った結果を以下に示す。なお、このＩｇＭ抗体は、ブロッキングした抗体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ；Phosphate Buffered Saline）で１回洗浄し、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）／ＰＢＳを３μｌ、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）標識抗ヒトＩｇＭ抗体を３μl加えて懸濁し、暗室下４℃で１時間程度放置して蛍光作用を呈するようにしてから、上述した図６のフローチャートに示した処理を実施した。
【００５７】
図７−１〜図７−２は、ＩｇＭ抗体を蛍光染色した蛍光顕微鏡画像の蛍光強度と酵素抗体法によって定量した抗体量の関係を示す相関図であり、図７−１は、本実施例１の定量分析方法によらずに蛍光顕微鏡で撮影されたすべての画像データを使用して定量分析を行った結果を示す相関図であり、図７−２は、本実施例１の定量分析方法によって定量分析を行った結果を示す相関図である。図７−１に示されるように、本実施例１によらない場合には、焦点の合っていない画像データも定量分析に用いるために、蛍光強度と抗体量との間にバラツキが見られ、両者のピアソンの積率相関係数は０．４７となり、精度が非常に悪いものとなっている。一方、図７−２に示されるように、本実施例１による定量分析方法を用いる場合には、蛍光強度と抗体量との間でバラツキが小さく、両者のピアソンの積率相関係数は０．９９まで向上され、定量分析の信頼性を飛躍的に向上させることができた。
【００５８】
この実施例１によれば、同一の倍率で同一の領域を撮影した試料の蛍光状態を示す複数の画像データから撮影焦点が一致しない画像データを棄却し、棄却されなかった画像データについて画像の蛍光強度を積算して、この積算値に応じて特定物質の質量を定量するので、大きさが数μｍを超えるたんぱく質や真核細胞などの特定物質でも、蛍光顕微鏡１１によって撮影した画像データを用いてその特定物質の質量を高感度で定量分析することができるという効果を有する。また、画像データ中の所定の値以下の輝度を有する画素を明るさが０の画素に変換した後に、蛍光強度を算出するようにしたので、画像データの背景となっている部分のノイズなどを除去することができるという効果も有する。さらに、画像データを用いて分析を行うので、特定物質を単一分離する必要がなく、高精度で定量を行うことができるという効果も有する。
【実施例２】
【００５９】
実施例１では、図３−１〜図３−２に示されるように、ωｘ軸近傍とωｙ軸近傍における振幅スペクトルを用いて、画像データの棄却判定を行っていた。しかし、この棄却判定は、これに限定されるものではなく、他の方法を用いても可能である。そこで、この実施例２では、他の棄却判定の方法の一例について説明する。なお、この実施例２で用いる定量分析装置の構成は、実施例１の図１で説明したものと同一であるが、画像データ選別部２３の機能のみが異なる。そこで、以下では、実施例１と機能の異なる画像データ選別部２３のみを説明して、実施例１と同一である他の構成要素についてはその説明を省略する。
【００６０】
この実施例２の演算装置２０の画像データ選別部２３は、実施例１と同様にスペクトルデータ取得機能２３１と棄却判定機能２３２とを有する。スペクトルデータ取得機能２３１は、画像データを２次元フーリエ変換して、図３−１〜図３−２に示されるように、振幅スペクトルの大きさの２次元分布図を計算し、この図においてωｘ軸とωｙ軸との交点である原点を中心とする所定の長さの半径を有する円の円周上における振幅スペクトルを取得する機能を有する。
【００６１】
図８−１〜図８−２は、振幅スペクトルの大きさの２次元分布図に、振幅スペクトルを得るための所定の長さａの半径を有する円を描いた状態を示す図である。この図８−１〜図８−２は、それぞれ図２−１〜図２−２の画像データを２次元フーリエ変換したものであり、その内容はそれぞれ図３−１〜図３−２と同一である。これらの振幅スペクトルの大きさを示す２次元分布図に、所定の長さａを半径とする円８００が、ωｘ軸とωｙ軸の交点を中心にして描かれている。
【００６２】
また、図９−１〜図９−２は、それぞれ図８−１〜図８−２の円周上における振幅スペクトルを示す図である。これらの振幅スペクトルは、横軸に位相（ｒａｄｉａｎ）がとられ、縦軸に振幅スペクトルの大きさがとられている。ここで、位相は、図８−１〜図８−２においてωｘ軸の正方向を基準として、半時計回り（左回り）に正の値をとるものとする。上述したように、図２−１のような焦点の一致した鮮明な画像データは、画像データのｘ軸方向とｙ軸方向にステップ状の変化を含んでいるので、図９−１の振幅スペクトルの振幅は、θ＝０，π／２，π，３π／２［ｒａｄｉａｎ］の近傍で、それぞれ所定値（α）以上の値をとるという傾向を有している。一方、図２−２のような焦点の一致しない不鮮明な画像データは、画像データのｘ軸方向とｙ軸方向にステップ状の変化を含まないので、図９−２の振幅スペクトルの振幅は、θ＝０，π／２，π，３π／２［ｒａｄｉａｎ］の近傍でも所定値（α）より大きい値をとることがないという傾向を有している。
【００６３】
棄却判定機能２３２は、スペクトルデータ取得機能２３１によって得られた振幅スペクトルを用いて、所定の位相における振幅スペクトルの値が所定値以上であるか否かを判定し、それぞれの位相でそれぞれ所定値以上の値をとる場合に、画像データに高周波領域を含むもの（すなわち、画像データの撮影焦点が合っているもの）と判定し、その画像データを定量分析用に残す処理を行う。また、それ以外の時には高周波領域を含まないもの（すなわち、画像データの撮影焦点が合っていないもの）と判定し、その画像データを棄却する処理を行う。つまり、撮影焦点の合っていない画像データを定量分析用の画像データとして用いないようにしている。そして、定量分析用の画像データとして選別された画像データまたはその画像データを識別する情報を蛍光強度積算部２４に渡す機能を有する。
【００６４】
たとえば、図９−１の場合には、棄却判定機能２３２は、θ＝０，π／２，π，３π／２［ｒａｄｉａｎ］の近傍で、それぞれしきい値α以上の値を有しているので、高周波領域を含む（すなわち、画像データの撮影焦点が合っている）ものと判断し、この画像データを定量分析用に使用する画像データと判定する。一方、図９−２の場合には、棄却判定機能２３２は、θ＝０，π／２，π，３π／２［ｒａｄｉａｎ］の近傍で、それぞれしきい値α未満の値を有しているので、高周波領域を含まない（すなわち、画像データの撮影焦点が合っていない）ものと判断し、この画像データを定量分析用には使用できない棄却する画像データと判定する。
【００６５】
なお、上記の例における棄却判定機能２３２によって判定が行われる位相は、上述したようにωｘ軸の正方向を基準とした場合であり、他の部分を基準にした場合は判定が行われる位相の位置は異なる。ただし、いずれの場合においても、ωｘ軸近傍とωｙ軸近傍における振幅値を求めることに変わりはない。
【００６６】
また、この実施例２における定量分析方法は、実施例１の図６で示したフローチャートの画像データ選別工程において、ステップＳ１４で画像データを２次元フーリエ変換して振幅の大きさを２次元分布図にした後にωｘ軸とωｙ軸の交点から所定の長さの半径を有する円周上の振幅スペクトルを得て、ステップＳ１５で振幅スペクトルのωｘ軸近傍とωｙ軸近傍となる位相における振幅値が所定値以上か否かによって、高周波領域を含んでいるか否かを判定する点が異なるのみで、他の工程は同一である。
【００６７】
この実施例２によれば、実施例１の効果に加えて、画像データを２次元フーリエ変換して得られるスペクトルデータの２次元分布図から、ωｘ軸とωｙ軸との交点から所定の長さの半径の円周上におけるスペクトルデータの振幅を得て、そのωｘ軸近傍とωｙ軸近傍に対応する位相での振幅値によって、画像データの棄却の要否を判定するようにしたので、判定に用いるスペクトルデータが１つで済む。その結果、判定に用いるデータ量を実施例１の場合に比して少なくすることができるとともに、判定の時間を短縮することができるという効果を有する。
【実施例３】
【００６８】
実施例１，２では、選別された焦点の一致した画像データのうち、所定値未満の輝度の画素を明るさ０の画素に変換するようにして蛍光強度の算出を行う場合を示したが、この実施例３では、所定値以上の輝度を有する画素の領域を画像データ中から切り出して、その画素領域についてのみ定量分析を行う場合を説明する。なお、この実施例３で用いる定量分析装置の構成は、実施例１の図１で説明したものと同一であるが、蛍光強度積算部２４の機能のみが異なる。そこで、以下では、実施例１と機能の異なる蛍光強度積算部２４のみを説明して、実施例１と同一の機能を有する他の構成要素についてはその説明を省略する。
【００６９】
この実施例３の演算装置２０の蛍光強度積算部２４は、画像データ選別部２３によって選別された焦点の一致している鮮明な画像データにおいて、所定値以上の明るさの画素からなる領域を積算実行領域として抽出し、この積算実行領域内の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算する機能を有する。
【００７０】
図１０は、焦点の一致している鮮明な画像データにおける蛍光強度積算部によって抽出された積算実行領域の一例を示す図である。蛍光強度積算部２４は、所定値以上の明るさの画素からなる積算実行領域（図中、わかりやすくするために境界線１０１で囲んでいる）１０００を抽出し、この抽出した積算実行領域１０００内の各画素の明るさの総和を算出して蛍光強度を積算する。なお、この積算実行領域１０００は、概ね定量分析の対象である特定物質と一致している。
【００７１】
ここで、実施例３における定量分析方法の処理手順について図１１のフローチャートを参照しながら説明する。実施例１の図６のフローチャートのステップＳ１１〜Ｓ１６と同様に、撮影装置１０によって撮影された同一の撮影領域の複数の画像データのうち撮影焦点が一致しない画像データを棄却し、撮影焦点が一致する画像データのみを選別する（ステップＳ５１〜Ｓ５６）。すなわち、撮影装置１０によって、蛍光染色された特定物質の蛍光状態を複数回撮影して画像データを取得し、その画像データのうち画像データ選別部２３によって撮影焦点が一致しない画像データを棄却し、撮影焦点が一致する画像データのみを定量分析用に残す。
【００７２】
ついで、蛍光強度積算部２４は、撮影焦点が一致する画像データからしきい値以上の輝度となる領域を積算実行領域として抽出し（ステップＳ５７）、この積算実行領域内部の画素の明るさを積算して蛍光強度を算出し（ステップＳ５８）、その結果を質量算出部２５に渡す。
【００７３】
質量算出部２５は、蛍光強度積算部２４によって算出された蛍光強度から、蛍光強度−質量対応情報に基づいて特定物質の質量を算出し、単位面積あたりの質量を定量する（ステップＳ５９）。その後、撮影したすべての画像データに対して、定量分析を行ったか否かを判定し（ステップＳ６０）、全ての画像データの定量分析が終わっていない場合（ステップＳ６０でＮｏの場合）には、ステップＳ５４へと戻り、上述した処理が繰り返し実行される。また、全ての画像データの定量分析が終了した場合（ステップＳ６０でＹｅｓの場合）には、定量分析が終了する。
【００７４】
なお、この図１１のフローチャートでは、撮影装置１０と演算装置２０とが一体に構成された定量分析装置を例に挙げて説明したが、撮影装置１０と演算装置２０とが別々の場所に設置される場合には、画像データ取得工程で取得された画像データを、フレキシブルディスクやＣＤ−Ｒ／ＲＷ、メモリカードなどの持ち運び可能な記憶媒体などに演算装置２０に移して、画像データ選別工程以下の処理を行うようにすればよい。また、上記のステップＳ６０で、質量算出部２５が、定量可能な画像データによって定量した結果の平均値を求めるようにしてもよい。
【００７５】
この実施例３によれば、実施例１の場合と同様に、撮影焦点の一致する鮮明な画像データについて、しきい値以上の明るさの画素からなる積算実行領域を抽出して、その積算実行領域の内部について、その各画素の明るさの総和を算出することで蛍光強度を積算するようにしたので、画像データの背景となっている部分のノイズなどを除去することができるという効果を有する。
【００７６】
なお、上述した実施例１〜３では、蛍光染色されたタンパク質や真核細胞の質量や濃度の定量分析に適用する場合を例に挙げて説明したが、これらに限られるものではなく、蛍光染色された物質であれば、同じ方法によって実施することが可能である。
【００７７】
また、上述した実施例１〜３に示される演算装置２０は、撮影装置１０によって撮影された画像データを通信手段または記憶媒体を介して読込む手段と、ハードディスクドライブなどの記憶手段やメモリ、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を有するパーソナルコンピュータなどの情報処理装置によって構成することができる。この場合に、上述した実施例１〜３で示した定量分析方法をコンピュータに実行させるための定量分析プログラムとして情報処理装置の記憶手段に格納させ、メモリ上に呼び出して実行させることによって、上記処理を実行させることが可能となる。この定量分析方法をコンピュータに実行させるためのプログラムは、インストール可能な形式または実行可能な形式のファイルでＣＤ−ＲＯＭ（Compact Disk Read Only Memory）、フレキシブルディスク、ＤＶＤ（Digital Versatile DiscまたはDigital Video Disc）、メモリカードなどのコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。また、実施例１〜３で示した定量分析方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを、インターネットなどのネットワークに接続されたコンピュータ上に格納し、ネットワーク経由でダウンロードさせることにより提供するように構成してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上のように、本発明にかかる定量分析方法は、タンパク質や真核細胞のほか広く蛍光物質を含む特定物質の定量分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明による定量分析装置の実施例１の構成を模式的に示す図である。
【図２−１】焦点の一致した鮮明な画像データの一例を示す図である。
【図２−２】焦点の一致しない不鮮明な画像データの一例を示す図である。
【図３−１】図２−１の画像データを２次元フーリエ変換した結果得られる振幅スペクトルの２次元分布図である。
【図３−２】図２−２の画像データを２次元フーリエ変換した結果得られる振幅スペクトルの２次元分布図である。
【図４−１】図３−１のωｘ軸上における振幅スペクトルを示す図である。
【図４−２】図３−１のωｙ軸上における振幅スペクトルを示す図である。
【図４−３】図３−２のωｘ軸上における振幅スペクトルを示す図である。
【図４−４】図３−２のωｙ軸上における振幅スペクトルを示す図である。
【図５−１】質量算出部の有する蛍光強度−質量対応情報の一例を示す図である。
【図５−２】質量算出部の有する蛍光強度−濃度対応情報の一例を示す図である。
【図６】定量分析方法の処理手順を示すフローチャートである。
【図７−１】本実施例１の定量分析方法によらずに定量分析を行った結果を示す相関図である。
【図７−２】本実施例１の定量分析方法によって定量分析を行った結果を示す相関図である。
【図８−１】図２−１の画像データを２次元フーリエ変換した結果得られる振幅スペクトルの２次元分布図に、所定の長さの半径を有する円を重ねた図である。
【図８−２】図２−２の画像データを２次元フーリエ変換した結果得られる振幅スペクトルの２次元分布図に、所定の長さの半径を有する円を重ねた図である。
【図９−１】図８−１の円周上における振幅スペクトルを示す図である。
【図９−２】図８−２の円周上における振幅スペクトルを示す図である。
【図１０】蛍光強度積算部によって抽出された積算実行領域の一例を示す図である。
【図１１】定量分析方法の処理手順を示すフローチャートである。
【図１２】従来の微生物測定方法を実施するための装置を模式的に示す図である。
【図１３】従来の微生物測定方法の処理手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００８０】
１  定量分析装置
１０  撮影装置
１１  蛍光顕微鏡
１２  撮影部
２０  演算装置
２１  画像データ取得部
２２  画像データ格納部
２３  画像データ選別部
２４  蛍光強度積算部
２５  質量算出部
２６  制御部
２３１  スペクトルデータ取得機能
２３２  棄却判定機能
【図１】
2006226916.tif 000003
【図４−１】
2006226916.tif 000004
【図４−２】
2006226916.tif 000005
【図４−３】
2006226916.tif 000006
【図４−４】
2006226916.tif 000007
【図５−１】
2006226916.tif 000008
【図５−２】
2006226916.tif 000009
【図６】
2006226916.tif 000010
【図７−１】
2006226916.tif 000011
【図７−２】
2006226916.tif 000012
【図９−１】
2006226916.tif 000013
【図９−２】
2006226916.tif 000014
【図１１】
2006226916.tif 000015
【図１２】
2006226916.tif 000016
【図１３】
2006226916.tif 000017
【図２−１】
2006226916.tif 000018
【図２−２】
2006226916.tif 000019
【図３−１】
2006226916.tif 000020
【図３−２】
2006226916.tif 000021
【図８−１】
2006226916.tif 000022
【図８−２】
2006226916.tif 000023
【図１０】
2006226916.tif 000024