(57)【要約】【課題】  親株由来の発酵能や高香気生成能の優良な特性を維持し、かつ親株よりも有機酸を適度に多く生成し、かつ清酒醪後半の高濃度エタノール存在下における酵母の死滅率の低い酵母の選抜・育種を行うこと、および当該酵母を使用して品質の改善された清酒を製造する方法を提供すること。【解決手段】  サッカロミセス・セレビシエ３Ｋ８−１５７Ａ株に由来し、２０％エタノール存在下で生育可能であり、かつ親株由来のアルコール発酵能と香気成分生成能を維持し、有機酸生成能が親株より高いサッカロミセス・セレビシエＫＭＡＬ−３５株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−４）並びに当該酵母を用いることを特徴とする清酒の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３Ｋ８−１５７Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４１）に由来し、２０％エタノール存在下で生育可能であり、かつ親株由来のアルコール発酵能と香気成分生成能を維持し、有機酸生成能が親株より高いサッカロミセス・セレビシエＫＭＡＬ−３５株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−４）。
【請求項２】
請求項１記載のサッカロミセス・セレビシエＫＭＡＬ−３５株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−４）を用いることを特徴とする清酒の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵母及びそれを用いた清酒の製造方法に関する。詳しくは、２０％エタノール存在下で生育可能であり、親株由来の発酵能と高香気生成能を維持し、かつ有機酸を親株より多く生成し、醪後半の高濃度エタノール存在下において死滅率が低い性質を有する酵母、および該酵母を用いた清酒の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、全国の大部分の清酒製造場では（財）日本醸造協会から販売されている「きょうかい酵母」を使用しており、吟醸酒、純米酒、本醸造酒、普通酒といった清酒の種類によって酵母を使い分けている。近年、清酒の多様化、差別化、そして、より一層の高品質化を目的として積極的に優良酵母の分離・改良・育種が広く行われており、実用株の開発が進められている。
特に、香りがフルーティで味の軽い吟醸酒（精米歩合６０％以下で、アルコール添加は白米重量の１０％以下で製造される）用酵母の研究開発が勢力的に行われおり、高香気生成酵母として「新規酵母及びその用途」（特許文献１参照）、「変異酵母」（特許文献２参照）、「酵母変異株およびそれを用いた酒類の製造方法」（特許文献３参照）等の多くの研究例があり、実用化に至っている。
【０００３】
近年の酵母開発例として、薬剤耐性や変異処理により、特定の香気成分を多く生産する酵母研究例があるが、ややもすれば、酵母が本来有している優良な性質が損なわれるケースも少なくない。例えば、アルコール発酵能の低下による清酒製造へのデメリット、醪後半の高濃度アルコール存在下での酵母の死滅による清酒の雑味やオフフレーバーの発生、または、有機酸生成能の低下などがある。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−１７３１４７号公報
【特許文献２】特開平８−０２３９５４号公報
【特許文献３】特開平７−２０３９５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
清酒醸造において、優れた酵母の有する性質としては、エタノール生成能が優れていることは勿論のこと、有機酸、アミノ酸、香気成分を適当量にバランスよく生産する能力を有していることが必須である。特に、純米吟醸酒は、上槽前にアルコール添加しないため、各成分の調整ができず、酵母の性質が直接清酒の品質に反映する。
上記した背景の基に、本発明は、清酒酵母を高濃度のエタノール存在下に馴養し、その中で生育した菌株から取得し、親株よりも有機酸を適度に多く生成する酵母の選抜・育種を目的とする。つまり、親株由来の発酵能や高香気生成能の優良な特性を維持し、かつ有機酸生成能を高める酵母の選抜・育種を目的とする。
また、清酒の製造において、当該酵母を使用することによって、有機酸の生成が少なく香味のバランスが不調和な清酒を改善することを目的とする。さらに、本発明は純米吟醸酒の製造を意図しているので、清酒醪後半の高濃度エタノール存在下における酵母の死滅率の低い菌株を選抜し、それに伴う発酵力の強化を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の問題を解決するため、高濃度のエタノール存在下で増殖能を有する新規清酒用酵母の分離を試みた。つまり、サッカロミセス・セレビシエ３Ｋ８−１５７Ａ（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４１）を供試株（親株）とし、２０％濃度のエタノール存在下で増殖能を有する清酒酵母の分離を試みた。
取得したエタノール耐性株について発酵試験を行い、親株由来の発酵能や香気生成能の特性を維持し、かつ有機酸生成能が適度に高い株を選抜・育種した。さらに、本酵母を用いて清酒を製造することにより前記の問題点を解決できることを確認した。
【０００７】
すなわち、請求項１記載の本発明は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）３Ｋ８−１５７Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４１）に由来し、２０％エタノール存在下で生育可能であり、かつ親株由来のアルコール発酵能と香気成分生成能を維持し、有機酸生成能が親株より高いサッカロミセス・セレビシエＫＭＡＬ−３５株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−４）である。
請求項２記載の本発明は、請求項１記載のサッカロミセス・セレビシエＫＭＡＬ−３５株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−４）を用いることを特徴とする清酒の製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、アルコール耐性に優れ、親株の優良な性質が維持され、かつ、有機酸を適度に多く生成する性質を有する清酒用酵母を提供することができる。本酵母を用いた清酒の製造において、有機酸、アミノ酸、香気成分をバランスよく生産し、官能的にも良好な清酒の製造が可能となった。また、醪後半における高濃度エタノール存在下における酵母の死滅率の低下により、発酵力が強化され清酒の生産性向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に係る酵母は、清酒の製造、特に純米吟醸酒の製造に用いられるもので、この酵母は以下に示す方法によって取得することができる。
まず、サッカロミセス・セレビシエ３Ｋ８−１５７Ａ株（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４１）を親株とし、当該親株の培養酵母を２０％エタノール溶液（１％グルコース、０.１Ｍ  酢酸緩衝液を含む、ｐＨ４.２）に接種し、１５〜２０℃で７〜１４日間静置した後、酵母をＹ.Ｐ.Ｄ（１％イーストエキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）プレート上に塗抹し、この培地で増殖した菌株をアルコール耐性株として取得する。
【００１０】
次いで、アルコール耐性株について発酵試験を行い、アルコール発酵能と香気生成能が親株と同程度で、かつ有機酸生成能の高い菌株を選抜する。さらに、選抜した数株について純米吟醸酒の小仕込み製造試験を行い、親株由来の発酵能と高香気生成能を維持し、有機酸生成能が親株より高く、かつ醪後半での死滅率が低い酵母を選ぶ。このようにして、目的とする酵母を選抜し、これをサッカロミセス・セレビシエ  ＫＭＡＬ−３５株と命名した。本菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＮＩＴＥ  ＡＰ−４である。
【００１１】
本酵母を用いる清酒の製造は、基本的に通常の清酒製造法にしたがって行えば良い。特に本酵母の特性を発揮するには、精米歩合６０％以下、好ましくは５０％から４０％で、アルコール添加をしない純米吟醸酒の製造に適している。この清酒を製造するための発酵条件については、醪最高温度が１２℃以下、好ましくは９〜１１℃の３段仕込みが適当である。
本酵母を用いると、純米吟醸酒を製造する場合、３５日以内、通常３０〜３５日程度で上槽することができ、上記したように、各成分がバランス良く生成され、官能的にも良好な清酒の製造が可能となる。しかも、醪後半での酵母の死滅率が低いため、菌体成分のアミノ酸等の漏出による品質低下やオフフレーバーの発生を抑制できる。
【実施例】
【００１２】
以下に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
親株のサッカロミセス・セレビシエ ３Ｋ８−１５７Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４１）からエタノール耐性株を分離した。すなわち、３Ｋ８−１５７Ａ株の活性スラントより菌体を一白金耳とり、これを３ｍｌのＹ.Ｐ.Ｄ液体培地（１％イーストエキス、２％ポリペプトン、２％グルコース）に植菌した後、３０℃で３日間培養した。次いで、培養物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）して酵母菌体を得た後、２０％エタノール溶液（１％グルコース、０.１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４.２）３ｍｌに接種し、１５℃で７日間静置した。
その後、当該エタノール溶液を殺菌水で適宜に希釈（通常１〜１０万倍希釈）した後、Ｙ.Ｐ.Ｄプレート（１％イーストエキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）上に塗抹し、３０℃で３日間培養してプレート上で増殖した菌株を取得した。
【００１４】
得られた菌株中の５０株についてエタノール耐性試験を行った。すなわち、前記同様にＹ.Ｐ.Ｄ液体培地で培養した各酵母菌株を２０％エタノール存在下で１５℃にて７日間静置した後、前記の如く、Ｙ.Ｐ.Ｄプレート上での増殖試験を行い、増殖したコロニー数をａ、２０％エタノール溶液を入れる前の酵母数をｂとして、生存率（％）を以下の数式により求めた。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、５０株のうち３株は非常に高い生存率を示した。
【００１５】
【数１】
2006000025.tif 000002
【００１６】
実施例２
実施例１で得られた５０株中の中から非常に高い生存率を示した３株を含む３４株（生存率が５％以上の株）について発酵試験を行った。すなわち、アルコール脱水麹を用いた培地（麹エキス〔ボーメ度（Be）６〕２０ｍｌ、アルコール脱水麹８ｇ）に酵母培養液１ｍｌを加え、１５℃で１４日間発酵させた。発酵終了後、培養物を遠心分離（３５００ｒｐｍ、３０分）して得た上清について、成分等の分析を行った。
発酵能は、日本酒度とアルコール生成量を指標とした。日本酒度は、振動式密度計により、アルコール生成量は、ガスクロマトグラフィーにより、それぞれ測定した。また、有機酸は、総酸度、つまり国税庁所定分析法注解に従い、遊離している有機酸の総量を中和滴定によって測定した。アミノ酸度は、国税庁所定分析法注解に従い、ホルモール滴定法により測定した。香気成分は、国税庁所定分析法注解に従い、ガスクロマトグラフィーを用いてヘッドスペース法で測定した。
【００１７】
３４株の発酵試験の結果から、発酵能と香気生成能が親株と同程度で、かつ有機酸生成能が親株よりも適度に高い株８株を選抜した。結果を表１に示す。
これらの酵母について、再度、上記と同様の発酵試験を行い、各成分と香気成分の分析値および官能試験の結果から１株（ＫＭＡＬ−３５株）を選抜した。
【００１８】
【表１】
2006000025.tif 000003
EtOAc：酢酸エチル、n-PrOH：n-プロパノール、I-BuOH：イソブチルアルコール、
I-AmOAc：酢酸イソアミル、I-AmOH：イソアミルアルコール、EtOCap：カプロン酸エチル
【００１９】
実施例３
実施例２で得られたＫＭＡＬ−３５株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−４）と、親株である３Ｋ８−１５７Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１４１）について総米１Ｋｇ（山田錦４０％精白米）の純米吟醸酒の小規模清酒製造試験（３段仕込みで、醪最高温度１１℃）を３３日間行った。試験終了後、各成分の分析などは、実施例２と同様に行った。その結果、ＫＭＡＬ−３５株は、親株の３Ｋ８−１５７Ａ株由来のアルコール発酵能と香気成分生成能を維持していて、有機酸生成能は親株より高いことが分かった。
この酵母は、純米吟醸酒小規模製造試験において、アルコールを１５〜２０％、アミノ酸を１．５〜２．０ｍｌ生成した。有機酸（総酸度）は１．７ｍｌ生成されており、親株の１．５ｍｌに比べ、０．２ｍｌ多く生成した。また、香気成分は、i-AmOH（イソアミルアルコール）が２００〜２５０ｐｐｍ程度、i-AmOAc（酢酸イソアミル）は８ｐｐｍ程度、EtOCap（カプロン酸エチル）が６〜８ｐｐｍ程度生成し、親株とほぼ同様の生成量となった。
アルコール生成量、酸度、アミノ酸度の測定結果を第２図（ａ)〜（ｃ）に、香気成分生成量の測定結果を第３図（ａ)〜（ｃ）に示す。
【００２０】
実施例４
実施例３における純米吟醸酒小規模製造試験の上槽前の醪中の酵母の生存率および生菌数を調べた。
まず、酵母の生存率は、メチレンブルー染色率を指標とした。すなわち、醪を酵母密度約２×１０8（酵母数/ｍｌ）になるように０．９％の生理食塩水で適宜希釈した。４．５ｍｌの０．０２％メチレンブルー溶液と４．５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ４．６）を混合し、これに前記酵母希釈液１ｍｌを加え、混合後、５分以内にトーマ氏血球計数器（EKDS社製）を用いて、一定容積の５０区画中の酵母数を顕微鏡で数えた。測定した全酵母数をＰｔ、青色に染色した酵母数をＰｓとすると、メチレンブルー染色率（％）は以下の数式で求められる。
【００２１】
【数２】
2006000025.tif 000004
【００２２】
また、生菌数は、醪を適宜殺菌した０．９％の生理食塩水で希釈し、前記のＹ.Ｐ.Ｄプレートに一定量塗抹し、３０℃で３日間培養後、増殖したコロニー数を数え、希釈倍率から逆算して生菌数を求めた。
【００２３】
その結果、メチレンブルー染色率は、親株である３Ｋ８−１５７Ａ株の３．１７％に比べ、ＫＭＡＬ−３５株は０．８９％となり、醪後半の高エタノール存在下における酵母の死滅率の低減が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明により、親株の持つ発酵能および香気成分生成能を維持し、さらに有機酸を親株よりも適度に多く生成する能力を有し、かつ、アルコール耐性に優れた新規の清酒用酵母を提供することができる。
本酵母を純米吟醸酒の製造に用いることにより、有機酸、香気成分をバランスよく生産し、官能的にも良好な清酒の製造が可能である。しかも、醪後半の酵母の死滅率の低下により、生産性の向上を図ることができる。
したがって、本発明は、酒造業界に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１におけるエタノール耐性試験の結果を示す。縦軸は、２０％エタノール存在下で１５℃、７日間静置したときの酵母の生存率（％）を表す。
【図２】実施例３の純米吟醸酒の小規模清酒製造試験の結果を示す。(a)はアルコール生成量、(b)は酸度、(c)はアミノ酸度の測定結果を示す。
【図３】実施例３の純米吟醸酒の小規模清酒製造試験の結果を示す。(a)はイソアミルアルコール、(b)は酢酸イソアミル、(c)はカプロン酸エチルの測定結果を示す。
【図１】
2006000025.tif 000005
【図２】
2006000025.tif 000006
【図３】
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