(57)【要約】【課題】  安全性が高く、優れた美白効果を有し、極性の低いメラニン生成抑制剤及びこのメラニン生成抑制剤を含有する美白用皮膚外用剤を提供する。【解決手段】  クリプトキサンチンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤であり、好ましくはクリプトキサンチンが、かんきつ類果実および／または搾汁粕の酵素処理物またはその抽出物から得られるものであり、またメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤、さらにはクリプトキサンチンのほかに美白剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、抗炎症剤よりなる群から選ばれる薬効成分の一種または二種以上を含有すること特徴とする皮膚外用剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリプトキサンチンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
クリプトキサンチンが、かんきつ類果実及び／又はその搾汁粕の酵素処理物またはその抽出物から得られるものであることを特徴とする請求項１記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載のメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項４】
さらに、美白剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、抗炎症剤よりなる群から選ばれる薬効成分の一種又は二種以上を含有すること特徴とする請求項３記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素沈着・しみ・そばかす等の予防及び改善に有用な美白効果を有するメラニン生成抑制剤及びこれを含有する化粧料等の美白用皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、日焼け等により生じる皮膚の黒化や炎症、あるいは色素沈着によるしみ・そばかすの予防・改善効果並びに美白効果を目的として、様々のメラニン生成抑制剤が提案され、美白用皮膚外用剤に配合されてきた。例を挙げれば、ビタミンＣ（例えば、特許文献１参照）やハイドロキノン及びその誘導体（例えば、特許文献２参照）、コウジ酸（例えば、特許文献３、４参照）、アルブチン（例えば、特許文献５参照）、胎盤抽出物、植物抽出物等である。
【特許文献１】特開昭４９−８６５５４号公報
【特許文献２】特開昭６３−２４６３１１号公報
【特許文献３】特開昭５３−３５３８号公報
【特許文献４】特開平１−２７５５２４号公報
【特許文献５】特開昭６３−８３１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これらの美白剤は未だ満足いく美白効果が得られていない。また、ハイドロキノンは安全性の面で問題がありその使用が中止された。また、ビタミンＣ、コウジ酸、アルブチンは極性が高く、乳液、クリーム等の化粧料を製造する際には別途、界面活性剤をさらに配合する必要があった。
【０００４】
本発明の目的は、安全性が高く、優れた美白効果を有し、極性の低いメラニン生成抑制剤を提供することにある。また本発明の別の目的は、上記メラニン生成抑制剤を含有する美白用皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、このような状況を鑑み、従来技術の難点を改良せんとして鋭意研究を重ねた結果、クリプトキサンチンが優れた美白効果を有することを発見し、またその効果が他の薬効成分と組み合わせることにより相乗的に高まることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明の第一は、クリプトキサンチンを有効成分として含有するメラニン生成抑制剤を要旨とするものであり、好ましくはクリプトキサンチンが、かんきつ類果実および／または搾汁粕の酵素処理物またはその抽出物から得られるものである。
【０００７】
本発明の第二は、本発明の第一のメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤を要旨とするものであり、好ましくは、クリプトキサンチンのほかにさらに美白剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、抗炎症剤よりなる群から選ばれる薬効成分の一種または二種以上を含有すること特徴とする皮膚外用剤である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のメラニン生成抑制剤によれば、安全性が高いため、副作用や、使用量や使用頻度を気にすることなく日常で利用することができ、また極性が低いため、乳液やクリーム等の脂溶性化粧品に簡易に配合することができる。また、本発明の皮膚外用剤は、前記のメラニン生成抑制剤を含有しているため、日焼け等により生じる皮膚の黒化や炎症、あるいは色素沈着によるしみ・そばかすの予防・改善に優れた効果を発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明で用いられるクリプトキサンチンは、天然のカロテノイドの一種であり、α体でもβ体でもよい。また、脂肪酸エステル体でもよく、例えば、パルミトイルエステル、ミリストイルエステル、ラウリルエステルなどが挙げられる。クリプトキサンチンは公知の化合物であるが、その抽出、精製方法は特に限定されるものでなく一例を示せば特開２０００−１３６１８１号公報に記載された方法が挙げられる。すなわち、ミカン果汁の沈殿物および／または該沈殿物を脱水または乾燥した粉末からの溶剤抽出分を加水分解した後、該加水分解物を２種のカラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによってβ−クリプトキサンチンを９５重量％以上に含有するフラクションを分離する製造方法である。
【００１１】
ここで、抽出に用いられる溶剤としては、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等）、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等）、飽和炭化水素類（ｎ−ヘキサン、ｎ−へプタン、ペンタン等）、ハロゲン化炭化水素類（クロロホルム等）、エステル類（酢酸メチル、酢酸エチル等）、芳香族炭化水素類（ベンセン、トルエン等）、アセトニトリル、エーテル類、ピリジン類、ポリエーテル類などが挙げられる。
【００１２】
また、加水分解する方法としては、抽出液にアルカリ金属の水酸化物水溶液（水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム等）とアルコール（メタノール、エタノール）を添加して行う方法が挙げられる。
【００１３】
カラムとしては、第一カラムに平均粒子径１０〜８０μｍのシリカ粉末が、第二カラムに平均粒子径１０〜８０μｍのオクタデシルシランシリカが充填されているものを用いる。また、第一カラムに導入する一次展開溶媒としては石油エーテルを主成分とする有機溶媒が好ましい。第二カラムに導入する二次展開溶媒としてはアセトニトリルを主成分とする有機溶媒が好ましい。（詳細は、特開２０００−１３６１８１号公報参照）。
【００１４】
また本発明で用いられるβ−クリプトキサンチンは、市販品を用いることもでき、例えば、精製品としてEXTRASYNTHESE S. A.社製のものがフナコシ株式会社から、DHI Water & Environment社製のものが和光純薬工業株式会社などから販売されているので、それらを入手して使用することもできる。
【００１５】
また本発明で用いられるクリプトキサンチンは高純度精製品に限られず、粗抽出物であっても、メラニン生成抑制剤に占めるクリプトキサンチン含有量が以下に記載する所定の範囲内であれば好適に使用することができる。この粗抽出物は、乾燥固形分だけでなく抽出液であっても、溶質であるクリプトキサンチンが所定の範囲内である限り使用することができる。
【００１６】
このような粗抽出物の好ましい例として、かんきつ類果実および／またはその搾汁粕の酵素処理物またはその抽出物が挙げられる。かんきつ類の果実の例としては、クリプトキサンチンを高含有する果実であれば特に限定されるものではなく、具体的には、温州みかんや柿、マンゴー、パパイヤなどが挙げられ、これらの搾汁粕であってもよい。更に、これらの果実または搾汁粕に、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、マレーションエンザイムなどの酵素を添加して、クリプトキサンチン濃度を高めたものを用いてもよい。更に、果実、果実の搾汁粕、それらの酵素処理物に対して有機溶剤を添加して抽出した抽出物を用いてもよい。ここで用いられる有機溶剤としては、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等）、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等）、飽和炭化水素類（ｎ−ヘキサン、ｎ−へプタン、ペンタン等）、ハロゲン化炭化水素類（クロロホルム等）、エステル類（酢酸メチル、酢酸エチル等）、芳香族炭化水素類（ベンセン、トルエン等）、アセトニトリル、エーテル類、ピリジン類、ポリエーテル類などが挙げられる。
【００１７】
本発明のメラニン生成抑制剤に含有されるクリプトキサンチンの含有量としては、乾燥固形分として０．０００００１質量％以上であれば効果の発現上何ら問題はなく、好ましくは０．０００００１〜５質量％であり、更に好ましくは０．００００１〜０．０５質量％である。
【００１８】
ここで、クリプトキサンチンの定量は、以下の通り高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定される値である。すなわち、ＨＰＬＣ装置として、島津製作所製ＬＣ−１０Ａを用い、ウォーターズ社製ＲｅｓｏｌｖｅＣ１８（φ３．９×１５０ｍｍ）カラムを接続し、メタノールを等量加えた試料を導入した。移動相には、メタノール：酢酸エチル＝７：３、カラム温度３０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長４５０ｎｍで含有量を分析した。
【００１９】
本発明のメラニン生成抑制剤の有効成分であるクリプトキサンチンは、強いメラニン生成抑制作用を有するためメラニン生成抑制剤として有用なものであるため、以下に説明する皮膚外用剤として使用することができるほか、経口用組成物として利用することもできる。
【００２０】
本発明の第二は、上記したメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤である。上述した本発明のメラニン生成抑制剤に、所望の皮膚外用剤の形態にするために必要な成分を配合すればよい。皮膚外用剤中にはメラニン生成抑制がおおよそ０．００００１〜０．０５質量％含有されていればよい。
【００２１】
さらに本発明の皮膚外用剤の好ましい様態として、クリプトキサンチンと組み合わせた場合に、相乗的な効果が期待される薬効成分、例えば美白剤、活性酸素除去剤、抗酸化剤、抗炎症剤からなる一種または二種以上を配合した皮膚外用剤を挙げることができる。好適な薬効成分の具体例としては、それぞれ以下に示すものが挙げられる。
【００２２】
美白剤としては、アルブチン、エラグ酸、コウジ酸、プラセンタエキス、ルシノール、チラミン、ビタミンＣ及びその誘導体並びにそれらの塩、システイン及びその誘導体並びにそれらの塩、グルタチオン及びその誘導体並びにそれらの塩、リコペン等が挙げられる。上記美白剤のうち、特に好ましいものとして、ビタミンＣ及びその誘導体並びにそれらの塩、システイン及びその誘導体並びにそれらの塩、プラセンタエキスが挙げられる。このような美白剤はその種類により相違するが、本発明の皮膚外用剤に０．００００１〜１０質量％程度含有させればよい。
【００２３】
活性酸素除去剤としては、アスタキサンチン、β−カロテン等のカロテノイド類、カテキン等のフラボノイド類及びそれらの誘導体、マンニトール、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオン、尿酸、ビリルビン等が挙げられる。上記活性酸素除去剤のうち、特に好ましいものとして、マンニトール、アスタキサンチンが挙げられる。これらの活性酸素除去剤はその種類により相違するが、本発明の皮膚外用剤に０．００００１〜５質量％程度含有させればよい。
【００２４】
抗酸化剤としては、コエンザイムＱ１０等のユビキノン類、ビタミンＡ類及びそれらの誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＢ類及びそれらの誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＤ類及びそれらの誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＥ類及びそれらの誘導体並びにそれらの塩等が挙げられる。上記抗酸化剤のうち、特に好ましいものとして、ビタミンＥ類及びそれらの誘導体並びにそれらの塩が挙げられる。これらの抗酸化剤はその種類により相違するが、本発明の皮膚外用剤に０．００００１〜５質量％程度含有させればよい。
【００２５】
抗炎症剤としては、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、メフェナム酸、フェニルブタゾン、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、アラントイン、グアイアズレン及びそれらの誘導体並びにそれらの塩、コンドロイチン硫酸及びその塩、ε−アミノカプロン酸、ジクロフェナクナトリウム、トラネキサム酸等が挙げられる。上記抗炎症剤のうち、特に好ましいものとして、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、グアイアズレン及びそれらの誘導体並びにそれらの塩、ε−アミノカプロン酸が挙げられる。これらの抗炎症剤はその種類により相違するが、本発明の皮膚外用剤に０．００００１〜５質量％程度含有させればよい。
【００２６】
本発明の皮膚外用剤は、これをメラニン生成抑制作用による美白・美肌成分として常法に従い、種々の形態の皮膚外用剤に成型することができる。皮膚外用剤の配合形態の例としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水、パック、洗浄料、メーキャップ化粧料、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等の、いずれの剤形であってもよい。
【００２７】
本発明の皮膚外用剤の使用方法は、特に制限されるものでないが、乳液、クリーム、化粧水、分散液、軟膏、液剤等であれば、１日１〜２回気になる部位に薄く塗布するのが好ましい。また、パックや貼付剤等であれば、1日1回患部に１５〜３０分ほど貼付してやればよい。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、クリプトキサンチンの定量は上述した高速液体クロマトグラフィー法を利用した。
実施例１（培養細胞によるメラニン生成抑制試験）
２４穴プレートにマウス由来B16メラノーマ細胞（RCB1283）を5×10４cells/wellになるように適量の培地とともに接種し、３７℃、二酸化炭素濃度５％中にて静置培養する。１日後、培地を吸引除去し、DMSOに溶解した市販のクリプトキサンチン（EXTRASYNTHESE S. A.社製）を所定の最終濃度になるように添加した培地を投与した。上記と同条件で３日間培養後に培地を除去し、PBSにて３回洗浄した後トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞をPBSで遠心洗浄(2000rpm、5min)し、培地を除去した。さらに遠心し上清を除去し細胞ペレットを得た。このペレットに２N NaOHを400μl添加し、よく懸濁した後超音波処理を30分間行った。このようにして得られたメラニン粗抽出液を96wellマイクロプレートに100μl/well、3well/サンプルで添加し、マイクロプレートリーダーで405nm、690nmにおける吸光度を測定した。メラニン合成阻害率は以下のように算出した。
【００２９】
【数１】
2006104089.tif 000002
O.D.405C：クリプトキサンチン無添加時の細胞からの粗抽出液の405nmにおける吸光度
O.D.690C：クリプトキサンチン無添加時の細胞からの粗抽出液の690nmにおける吸光度
O.D.405S：クリプトキサンチン添加時の細胞からの粗抽出液の405nmにおける吸光度
O.D.690C：クリプトキサンチン添加時の細胞からの粗抽出液の690nmにおける吸光度
また、96穴プレートにメラノーマ細胞を５×10３cells/wellとなるように接種し、上記と同条件で培養した。培養3日目に450nmと690nmの吸光度を測定した後、CCK-8（同人堂）を10μｌ添加し軽く振とうし37℃、二酸化炭素濃度5%中にて２時間静置培養した。培養後、450nmと690nmにおける吸光度を再度測定し以下の式により細胞生存率を算出した。
【００３０】
【数２】
2006104089.tif 000003
OD450ｔ=2h：クリプトキサンチン添加時のCCK添加2時間後の450nmにおける吸光度
OD450ｔ=0：クリプトキサンチン添加時のCCK添加前の450nmにおける吸光度
OD690t＝2h：クリプトキサンチン添加時のCCK添加2時間後の690nmにおける吸光度
OD690t＝0：クリプトキサンチン添加時のCCK添加前の690nmにおける吸光度
OD450ｔ=2hC：クリプトキサンチン無添加時のCCK添加2時間後の450nmにおける吸光度
OD450ｔ=0C：クリプトキサンチン無添加時のCCK添加前の450nmにおける吸光度
OD690t＝2hC：クリプトキサンチン無添加時のCCK添加2時間後の690nmにおける吸光度
OD690t＝0C：クリプトキサンチン無添加時のCCK添加前の690nmにおける吸光度
なお、陽性対照としてはβ-カロテンを用いた。
【００３１】
以上の結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
2006104089.tif 000004
表1の結果から明らかなごとく、クリプトキサンチンは高いメラニン生成抑制効果を示し、かつB16メラノーマ細胞に対し毒性が極めて低いことが示された。
【００３３】
実施例２（培養細胞によるメラニン生成抑制試験）
クリプトキサンチン（EXTRASYNTHESE S. A.社製）と美白剤であるシステイン（和光純薬工業製）の同時投与のメラニン生成効果について試験した。マウス由来B16メラノーマ細胞（JCRB0202）を用いた以外は実施例1と全く同様の方法で試験を実施した。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2006104089.tif 000005
表２の結果から明らかなごとく、クリプトキサンチンとシステインの同時投与により、そのメラニン合成抑制効果は飛躍的に上昇した。
【００３５】
実施例３（ヒト皮膚３次元モデルによるメラニン生成抑制試験）
黒人由来ヒト皮膚３次元モデル（クラボウ）にβ-クリプトキサンチンを、陽性対照としてリコペンを添加し、３７℃、二酸化炭素濃度５％中にて１３日間静置培養した。維持培地は1日おきに交換し、７日目に添加クリプトキサンチンを交換した。培養終了後、皮膚モデルをリン酸バッファー（PBS）で３回以上洗浄し、１％SDS、10mMTris  HCｌ、0.05mM  EDTA溶液(pH6.8)に浸した後、プロテアーゼK（5mg/ml）を添加し４５℃で一晩静置した。さらにプロテアーゼKを添加し４時間４５℃で静置した後過酸化水素水及び炭酸ナトリウムを添加し、８０℃で３０分間反応させた。反応後十分に冷却しクロロホルム‐メタノール（２：１）を添加、よく懸濁し10,000gで１０分間遠心した。遠心後得られる水層を用いて４０５nmにおける吸光度を測定し、メラニン量を測定した。細胞毒性はMTTアッセイにより測定した。結果を表3に示す。
【００３６】
【表３】
2006104089.tif 000006
表３の結果から明らかなごとく、β−クリプトキサンチンはヒトの３次元皮膚モデルに対しても高いメラニン生成抑制効果を示し、かつ細胞毒性がきわめて低いことが示された。
【００３７】
実施例４（クリーム）
温州みかんから果汁を絞った後の残さ（ミカンジュース粕、水分率約９０％）８ｋｇを凍結乾燥し、これにエタノール５Ｌを加えて、１時間撹拌し、β−クリプトキサンチンを抽出した。ろ過して、エタノール画分を回収し、エバポレーターを用いてエタノールを留去し、温州みかんエキスを得た。このエキス中には、β―クリプトキサンチン（フリー体換算）が５質量％含まれていた。
【００３８】
イオン交換水にプロピレングリコールと温州みかんエキスと苛性カリを下記用量で加え溶解し、加熱して７０℃に保ち、他の成分を下記組成で混合し加熱融解して７０℃に保つ。水相に油相をゆっくり加え、その後、ホモミキサーで均一に乳化し、その後冷却してクリームを製造した。
【００３９】
温州みかんエキス                                ５．０質量％
ステアリン酸                                    ５．０
ステアリルアルコール                            ４．０
イソプロピルミリステート                      １８．０
グリセリンモノステアリルリン酸エステル          ３．０
プロピレングリコール                          １０．０
パラアミノ安息香酸                              ０．５
苛性カリ                                        ０．２
エチルパラベン                                  ０．３
香料                                            ０．２
イオン交換水                                    残余