(57)【要約】      （修正有）【課題】  光学顕微鏡下において、その焦点位置をオーバーシュートや振動を起こすことなく高速、かつ、安定に変位させることを可能にする顕微鏡ステージ、および焦点位置計測装置・システムを提供すること。【解決手段】  ピエゾ素子の電圧−伸長特性の校正表を用いることにより、フィードバック回路等を用いることなく高速にピエゾ素子を伸長・短縮させ、顕微試料を顕微鏡の光軸方向に高速に変位させる。また、ピエゾ素子の伸長軸と、光学顕微鏡の光軸を厳しく平行にさせるために、ピエゾ素子の伸長軸は、自在に調整できる。光学顕微鏡下において、開口数１.３以上の対物レンズ型全反射光学系を用いて、焦点位置、つまり、対物レンズに対する顕微試料の位置を計測する。【選択図】        図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡において、顕微試料標本を入れるためのガラスチャンバーと、該ガラスチャンバーを直接接着し、画像を得る焦点方向の深さ位置を指定し焦点位置を制御するためのピエゾ素子と、該ピエゾ素子の伸長・短縮方向を前記光学顕微鏡の光軸に並行に調節するあおりネジを具備し、前記ピエゾ素子の電圧に対する変位応答を計測した校正表を予め用意し、その校正表を用いて前記ピエゾ素子を駆動することにより、フィードバック回路を用いることなく、高速に焦点位置を走査することを特徴とする顕微鏡ステージ。
【請求項２】
前記ガラスチャンバーは、観察顕微試料を収納する、大きさ９ｍｍ×９ｍｍ以下、厚さ１５０〜４００μｍのガラス矩形板二枚を、９ｍｍ×９ｍｍ以下の面が５０μｍ以下の間隙を有するように対向して接着した構造を特徴とする請求項１記載の顕微鏡ステージ。
【請求項３】
前記ガラスチャンバーと、開口数１.３以上の対物レンズと、対物レンズの後焦点面にミラーを配置した光学顕微鏡において、前記ガラスチャンバー内の溶液とガラスとの界面を焦点として全反射するレーザー光学系を備え、焦点である前記界面の移動により全反射光の光路が変化し、該光路の変化が、前記対物レンズの後焦点面にミラーの位置で角度変化となり、前記角度変化を二分割、あるいは、四分割フォトダイオードにて検出し、顕微観察時の焦点位置を検出・調整することを特徴とする焦点位置計測装置。
【請求項４】
前記焦点位置計測装置において、焦点位置を確認しながら、請求項１、および２記載の顕微鏡ステージにて、顕微焦点を移動させることを特徴とする、請求項３記載の焦点位置計測装置。
【請求項５】
顕微試料標本を照射するレーザーと、ｘ、ｙ軸座標で表される二次元光学切片をビデオ信号に変換するビデオカメラと、前記ビデオ信号をデジタルデータとして記録する記憶媒体と、請求項１に記載の顕微鏡ステージと、前記ステージのピエゾ素子を電圧制御するための波形出力装置と高電圧アンプを備え、焦点位置を前記ビデオカメラの垂直同期信号毎にビデオフレームの撮影時間外に階段状に変位させ、前記ビデオフレームの撮影時間内では焦点を固定させることで、鮮明な光学切片の取得を可能にし、前記の取得した光学切片をｚ軸座標にならべて構成した三次元的なデジタル画像データを実時間で連続的に取得することを特徴とする共焦点顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡により三次元情報を得るための、焦点位置を移動させる顕微鏡ステージおよびそのような装置・システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の結像面にビデオレートカメラを設置することで、顕微試料標本を実時間で観察できる。共焦点顕微鏡によって、光学切片の薄い顕微試料標本の断面像を取得できるので、光軸方向に対物レンズを走査し、取得した光学切片を光軸方向に並べることで、三次元画像を取得することができる。光学ぼけの少ない画像を取得するために、カメラの撮影時間外に、対物レンズを階段状に移動させ、焦点移動を完了し、撮影時間内は焦点を固定させる手法が開示されている。（例えば、特許文献１参照）特許文献１では、ビデオレートカメラの垂直同期信号と同期させて、ピエゾアクチュエータにより対物レンズの焦点位置を制御する。従って、必要とする焦点位置での共焦点像をビデオフレームに合わせて取得できる。
【０００３】
また、ピエゾアクチュエータにより、対物レンズを駆動させる場合、ピエゾアクチュエータの電圧に対する応答が線形ではなく、電圧の増減で応答が異なる履歴特性を持つ。そのため、前記ピエゾアクチュエータに、ピエゾ素子の歪み具合を知るセンサを備え、前記ピエゾアクチュエータの駆動を制御するピエゾドライバ内で、前記履歴特性を補正する技術が存在する。対物レンズを階段状に駆動させる場合、対物レンズは、その重量の為に必ず振動する。その振動を抑制する方法として、前記ピエゾドライバにフィードバック回路等を加えるなどして電気的な制動信号を与える方法が存在する。
【０００４】
顕微鏡の焦点位置を計測する方法には、顕微観察時により得られた顕微試料標本からの反射光、および、散乱光である戻り光を指標に、焦点位置を計算する方法が良く用いられている。（例えば、特許文献２参照）この技術は、低可干渉光源を用いて顕微試料標本を照射し、前記光源とその戻り光により生成させた干渉光を光検出素子で検出し、光の強度が最大、または、極大になるように焦点を調節する技術である。この技術では、干渉を発生させるため、光路長を可変にする必要があり、光学系が複雑になってしまう。これらの技術は、焦点位置の絶対位置を取得することは困難であるため、主に、顕微観察中の焦点位置のずれを修正するために用いられている。
【特許文献１】特開２００４−１８４６９９号  公報
【特許文献２】特開２００４−３２１６９６号  公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記のような三次元画像の取得方法では、焦点を階段状に変化させた場合、対物レンズの重量の為に、対物レンズがオーバーシュートを起こし振動してしまうという問題点があった。前記問題を解決しようと、物理的に粘性抵抗を上げる、あるいは、電気的にフィードバック回路を加える等の改良を施すと、オーバーシュートや振動はある程度抑えることができるが、階段駆動に時間遅れが生じ、階段の立ち上がりに少なくとも数ｍｓを有してしまう。また、前記のような、ピエゾの歪み具合を知るセンサを備え、前記ピエゾアクチュエータの駆動を制御するピエゾドライバを用いた場合、対物レンズを数ｎｍの誤差で正確に駆動させることができるが、上記同様に、階段駆動に時間遅れが生じる。更に、焦点を移動させた際に、その焦点位置を取得するための上記手段では、光学系が複雑になってしまうと言う問題点がある。また、顕微観察時により得られた顕微試料標本からの反射光、および、散乱光である戻り光から画像処理等により、焦点位置を計算する手法も存在するが、この方法では、計算に時間を有するため、高速に焦点位置を取得することが不可能である。
【０００６】
本発明は、光学顕微鏡下において、高速に焦点位置を走査することのできる装置と、その焦点位置を簡便な光学系にて、高速に取得できる手法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、光学顕微鏡において、顕微試料標本を入れるためのガラスチャンバーと、このガラスチャンバーを直接接着し、画像を得る焦点方向の深さ位置を指定し焦点位置を制御するためのピエゾ素子と、このピエゾ素子の伸長・短縮方向を前記光学顕微鏡の光軸に並行に調節するあおりネジを具備し、前記ピエゾ素子の電圧に対する変位応答を計測した校正表を予め用意し、その校正表を用いて前記ピエゾ素子を駆動することにより、フィードバック回路を用いることなく、高速に焦点位置を走査することを特徴とする顕微鏡ステージが得られる。
【０００８】
また、本発明によれば、前記ガラスチャンバーは、観察顕微試料を収納する、大きさ９ｍｍ×９ｍｍ以下、厚さ１５０〜４００μｍのガラス矩形板二枚を、９ｍｍ×９ｍｍ以下の面が５０μｍ以下の間隙を有するように対向して接着した構造を特徴とする顕微鏡ステージが得られる。
【０００９】
また、本発明によれば、前記ガラスチャンバーと、開口数１.３以上の対物レンズと、対物レンズの後焦点面にミラーを配置した光学顕微鏡において、前記ガラスチャンバー内の溶液とガラスとの界面を焦点として全反射するレーザー光学系を備え、焦点である前記界面の移動により全反射光の光路が変化し、この光路の変化が、前記対物レンズの後焦点面にミラーの位置で角度変化となり、前記角度変化を二分割、あるいは、四分割フォトダイオードにて検出し、顕微観察時の焦点位置を検出・調整することを特徴とする焦点位置計測装置が得られる。
【００１０】
また、本発明によれば、前記焦点位置計測装置において、焦点位置を確認しながら、前記本発明の顕微鏡ステージにて、顕微焦点を移動させることを特徴とする、焦点位置計測装置が得られる。
【００１１】
また、本発明によれば、顕微試料標本を照射するレーザーと、ｘ、ｙ軸座標で表される二次元光学切片をビデオ信号に変換するビデオカメラと、前記ビデオ信号をデジタルデータとして記録する記憶媒体と、請求項１に記載の顕微鏡ステージと、前記ステージのピエゾ素子を電圧制御するための波形出力装置と高電圧アンプを備え、焦点位置を前記ビデオカメラの垂直同期信号毎にビデオフレームの撮影時間外に階段状に変位させ、前記ビデオフレームの撮影時間内では焦点を固定させることで、鮮明な光学切片の取得を可能にし、前記の取得した光学切片をｚ軸座標にならべて構成した三次元的なデジタル画像データを実時間で連続的に取得することを特徴とする共焦点顕微鏡システムが得られる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、光学顕微鏡下において、高速に焦点位置を走査すること、および、その焦点位置を簡便な光学系にて、高速に取得することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら、詳細に説明する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡ステージと共焦点顕微鏡システムの構成を示した。図１に示したように、前記顕微鏡ステージは、顕微試料標本を入れたガラスチャンバー１を光軸方向に走査するためのピエゾ素子３、前記ピエゾ素子を固定するための台４、前記ピエゾ素子の走査軸を微調整するためのあおりネジ５、および、これらを対物レンズ上部に固定するための台６、および、台７から構成される。ピエゾ素子３の電圧−変位特性の校正表を予め備え付けてある波形出力装置９が高電圧アンプ８に１０Ｖ以内のアナログ電圧信号V１を送る。電圧アンプ８は、波形出力装置９から送られてきた電圧信号V１を増幅したアナログ電圧信号V２をピエゾ素子に与える。
【００１４】
また、前記共焦点顕微鏡システムは、前記顕微鏡ステージに加え、ガラスチャンバー１内の顕微試料標本を観察するための対物レンズ２、共焦点スキャナユニット１２、イメージインテンシファイア１３、ビデオカメラ１４、ビデオカメラ１４から送られるビデオ信号VIDEOを蓄積し、画像処理を行うための記録媒体１０から構成される。共焦点スキャナユニット１２には、マイクロレンズアレイや、ピンホールアレイや、ビームスプリッタや、マイクロレンズアレイとピンホールアレイを回転駆動する回転制御部が収容されている。波形出力装置９は、ビデオレートカメラ１４から同期信号SYNCを受け取り、前記SYNCに同期したアナログ電圧信号V１を高電圧アンプ８に送る。図２は、同期信号SYNCとピエゾ素子３の変位を同期させて、焦点位置を走査する場合の一例を示した。
【００１５】
記録媒体１０が、ビデオ信号VIDEOの取得を開始すると、波形出力装置９は、ビデオレートカメラ１４から同期信号SYNCを受け取り、前記SYNCに同期したアナログ電圧信号V１を高電圧アンプ８に送る。記録媒体１０に蓄積されたデジタルビデオ画像を、示すようにｚ軸方向にフレーム順に並べることによって三次元画像を構築し、実時間で取得できる。図３は、フレーム構成を示した。
【００１６】
電圧を振幅９６Vの１Ｈｚの三角波で５０回振動させ、その時のピエゾ素子３の伸長から得られた、ピエゾ素子３の電圧−変位特性を図４に示した。図４では、５０回繰り返し振動させたすべてのデータをプロットしてある。電圧を０Vから９６Vに増加させた場合と、９６Vから０Vに減少させた場合で、変位応答は異なった。しかしながら、反復による再現誤差は、与えた電圧が０Vの時に最大１０ｎｍ、９６Vの時に最大１６ｎｍと非常に小さい。従って、図４を校正表として、ピエゾ素子３に電圧信号を送ることにより、歪みセンサやピエゾドライバを用いることなく、正確にピエゾ素子を伸長、伸縮させることができる。
【００１７】
図５は、顕微試料標本を入れるガラスチャンバーの実施の形態を示した。本発明では、ガラスチャンバー１をピエゾ素子３により走査するので、ガラスチャンバー１の重量が、焦点移動のオーバーシュートや振動の原因となる。できる限り、ガラスチャンバー１は小さくしたほうが良い。本実施の形態では、大きさ９ｍｍ×９ｍｍ、厚さ１７０μｍのガラス矩形板を二枚用意し、その間に、エナメル樹脂を挟みチャンバーを作製した。対物レンズ２に油侵レンズを選択する場合、ガラスチャンバー１がピエゾ素子により変位されると、前記油侵レンズとガラスチャンバーの間を埋めるイマージョンオイルの粘性より、厚さ１７０μｍのガラスを用いたガラスチャンバーでは、前記ガラスチャンバーにおける観測面が湾曲し、ガラス面に結合した顕微試料標本は、振動してしまう。従って、対物レンズ２に油侵レンズを選択する場合には、厚さ３４０μｍのガラスを用いてガラスチャンバーを使用すれば、前記湾曲による顕微試料標本の振動は軽減される。また、前記イマージョンオイルの粘性は、ガラスチャンバー１の駆動の立ち上がりの時間遅れや振動の原因にもなる。イマージョンオイルの代わりにイマージョンオイルより粘性が低い屈折率１.５０のシリコンオイルを用いても良い。
【００１８】
図５は、図１に示した顕微鏡ステージの実施形態例の立体模式図も示した。符号は、図１に対応している。ガラスチャンバー１とピエゾ素子３は、接着剤によって直接接着させる。接着剤の種類は、無蛍光性であれば、特に問わないが、ガラスチャンバー１とピエゾ素子３の接着、剥離を容易にするために、有機溶媒可溶性のものが好ましい。本実施の形態では、アセトン可溶性であるポリマー樹脂ＭＭＰ(Methyl Methacrylate Polymer)を利用し、アセトンを溶媒とした１０％ＭＭＰ溶液を接着剤として用いた。ピエゾ素子３を伸長・短縮させることにより、ガラスチャンバー１が移動し、焦点位置を走査するが、この走査軸は、光軸に対し厳しく平行である必要がある。顕微試料標本を観察しながら焦点を走査すると、もし、前記駆動軸と光軸が平行でなければ、観察される顕微鏡像は、焦点位置の走査と同時に光軸と垂直方向にも移動する。あおりネジ５を用いて、焦点位置を走査しても、観察される像が顕微視野内で左右、上下いずれにも動かないように前記駆動軸を調節すれば、前記駆動軸は、光軸と平行になる。また、焦点位置を階段状に変位させたい場合、ピエゾ素子に与える電圧を単純な矩形波にせず、矩形波の立ち上がりを正弦波とする。これにより、焦点位置の変位時のオーバーシュートや振動が軽減される。
【００１９】
図６は、本実施の形態に係る焦点位置計測装置の構成を示した。図示するように、焦点位置計測装置は、ガラスチャンバー２１と、無限遠系対物レンズ２２と、顕微試料標本を結像させるための結像レンズ２３と、結像レンズの焦点位置に置かれたミラー２４と、二分割、もしくは、四分割フォトダイオード２５から構成される。対物レンズ２２と結像レンズ２３は、一つの有限系対物レンズとして扱う。対物レンズ２２と結像レンズ２３の代わりに、一つの有限系対物レンズを用いても良い。ガラスチャンバー２１の底面にて、レーザーを全反射させるために、対物レンズ２２は、開口数が１．３以上の油侵レンズである。ガラスチャンバー２１と対物レンズ２２を埋めるオイルの屈折率はガラスの屈折率と等しくする。入射したレーザーがガラスチャンバー２１内の溶液とガラスの界面で全反射されるように、ミラー２４を調節する。点線で示したように顕微試料２１の位置が変化すると、全反射が起こる位置も変化する。前記の変化Aｄが、無限遠系対物レンズ２２と結像レンズ２３により構成される光学系の後焦点面に置かれたミラー上で近似的に角度変化Aeとなり、二分割、もしくは、四分割フォトダイオード２５に投影され、位置変化Aｘとして検出される。二分割、もしくは、四分割フォトダイオード２５は、位置変化Aｘを電圧として出力する。図７に、前記焦点位置計測装置によって計測した、焦点位置とニ分割フォトダイオードの電圧の相関を示した。AｄとAｘの関係は、理論上は、ほぼ直線性を示すのだが、実際には、光学系の収差や迷光等の影響により、直線性は示さない。焦点位置を、オーバーシュートや振動が発生しないように、１秒間に１００ｎｍずつゆっくりと動かした。図７をキャリブレーション校正表として、ピエゾ素子３を高速に駆動させたときの、焦点位置の動きを二分割、もしくは、四分割フォトダイオード２５の出力から計測できる。本実施の形態に係る焦点位置計測装置は、レーザーが、ガラスチャンバー２１内の溶液とガラスの界面で全反射されるため、前記レーザーが、ガラスチャンバー２１内の顕微試料標本を前記界面近傍約２００ｎｍ以外は照射せず、顕微観察時における余計な背景光が発生しないことを特徴としている。
【００２０】
図８は、前記顕微鏡ステージ、前記焦点位置計測装置を用いて計測した、ピエゾ素子３を階段状に伸長させた時の焦点位置を示した。前記焦点位置計測装置で用いた二分割フォトダイオード２５からの電圧信号は、２４ｋＨｚのサンプリングレートで計測した。高速駆動による前記焦点位置のオーバーシュートや振動はほとんど見られない。前記焦点位置の立ち上がり時間は、２８０iｓであった。比較として、図９は、従来の焦点移動方法と同様に、ピエゾアクチュエータを用いて光軸方向に対物レンズを階段状に駆動させたときの焦点位置を示した。ピエゾアクチュエータに電圧を与えるピエゾドライバにフィードバック回路を使用しない場合(破線)には、対物レンズをステップ駆動させた直後に激しいオーバーシュートが見られ、３０ｍｓ後にもまだ振動が減衰していない。上記ピエゾドライバにフィードバック回路を使用した場合(実線)においては、フィードバック回路を使用しない場合に比べ、オーバーシュートや振動の振幅は減少したが、振動の減衰に約２０ｍｓ間を有した。従って、本発明の顕微鏡ステージは、焦点移動方法として、従来の方法より著しく有効である。
【００２１】
図１０は、ビデオカメラ１４からカメラの撮影のオン、オフを同期信号ＳＹＮＣとして出力させ、前記ＳＹＮＣに同期させて、前記顕微鏡ステージによって焦点を移動させた実施例を示した。ビデオカメラ１４の撮影時間は４ｍｓであり、撮影時間外１ｍｓで画像信号を記録媒体１０に送信した。図１０の上部のパネルは、ピエゾ素子３に与えた電圧Ｖ２を示す。前記ＳＹＮＣに同期させてＶ２信号を送ることにより、上記撮影時間外１ｍｓ内にオーバーシュートも振動もなく焦点の移動を完了している。従って、本発明によれば、従来の焦点移動法を用いた場合に比べ、より高速に光学ぼけの少ない画像を取得できる。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明によって製造された顕微鏡ステージ、焦点位置計測装置、および、共焦点顕微鏡システムは、上下微動機構を備えた光学顕微鏡に関する各種産業機器に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施の形態による顕微試料を光軸方向に走査できる顕微鏡ステージの構成と上記ステージを用いた共焦点顕微鏡システムのブロック図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る顕微試料の走査シーケンスを示す図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る二次元光学切片から三次元に構築する概念図である。
【図４】本発明の実施の形態に係るピエゾ素子の電圧−変位特性図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る顕微試料を加えるガラスチャンバーと図１に示す顕微鏡ステージの実施形態例の立体模式図
【図６】本発明の実施の形態に係る焦点位置計測装置の簡単な光路図を示す。
【図７】本発明の実施の形態に係る焦点位置計測装置で用いる、二分割フォトダイオードから出力される電圧と焦点位置の相関を示す。
【図８】本発明の実施の形態に係る前記顕微鏡ステージ、前記焦点位置計測装置を用いて計測した、ピエゾ素子を階段状に伸長させた時の焦点位置を示す。
【図９】従来の焦点移動方法と同様に、ピエゾアクチュエータを用いて光軸方向に対物レンズを階段状に駆動させたときの焦点位置を示す。
【図１０】本発明の実施の形態に係る上記共焦点顕微鏡システムを用いて、ビデオカメラのフレームに同期させて焦点を移動させた時の、ピエゾ素子に与えた電圧、カメラから出力される同期信号(露光タイミング)と前記焦点位置計測装置を用いて計測した焦点位置を示す。
【符号の説明】
【００２４】
１  ガラスチャンバー
２  対物レンズ
３  ピエゾ素子
４  台１
５  あおりネジ
６  台２
７  台３
８  高電圧アンプ
９  波形出力装置
１０  記憶媒体
１１  レーザー光源
１２  共焦点ユニット
１３  イメージインテンシファイア
１４  ビデオカメラ
１５  ミラー
２１  ガラスチャンバー
２２  対物レンズ
２３  結像レンズ
２４  ミラー
２５  二分割、もしくは、四分割フォトダイオードの受光面
【図１】
2006308709.tif 000003
【図２】
2006308709.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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