(57)【要約】【課題】  生理活性物質の活性低下がほとんど無く、固定量の多いバイオセンサーを提供すること。【解決手段】  表面に金属層を有し、該金属層に、中間層を介して、下記式（１）で表される化合物を含有する親水性組成物が結合している基板から成るバイオセンサー。式（１）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ（式中、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に金属層を有し、該金属層に、中間層を介して、下記式（１）で表される化合物を含有する親水性組成物が結合している基板から成るバイオセンサー。
式（１）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）
【請求項２】
中間層の膜厚が０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである、請求項１または２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
式（１）において、ｌ＋ｎ＝２〜４、且つ、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１０〜１２である、請求項１から３のいずれかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
非電気化学的検出に使用される、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
表面に金属層を有する基板の表面を中間層で被覆する工程、及び該中間層に下記式（１）で表される化合物を含有する親水性組成物を化学的に結合する工程を含む、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
式（１）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）
【請求項８】
式（１）で表される化合物のカルボン酸末端に生理活性物質が共有結合により結合している、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項９】
請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項１０】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１１】
生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー、該バイオセンサーの製造方法、該バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法、及び該バイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で、免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来の方法では、操作が煩雑であり、また、標識物質が必要となる。そこで近年、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が報告または使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金などの微粒子の機能化表面を使用した測定技術などである。ＳＰＲ測定技術は、センサーチップの金属膜表面に接する媒質の誘電率変化、即ち、屈折率変化を、共鳴角度の変化として測定することが可能であり、金属膜表面近傍に固定化した生理活性物質と検体物質間の相互作用を、定量的に測定することが可能な方法である。ＱＣＭ測定技術は、水晶発振子の金電極上における物質の吸脱着を、発振子の振動数変化として測定することが可能であり、金電極表面に生理活性物質を固定化すれば、検体物質との相互作用を定量的に測定することができる。また、金などの微粒子表面に生理活性物質を固定させれば、検体物質との相互作用を、微粒子の沈降や色の変化として測定することができる。
【０００３】
このような測定技術は、いずれの場合も、使用する金属に結合する表層部の構成が重要である。以下、表層部の構成に関して、ＳＰＲを利用したバイオセンサーに使用する検出表面を例に説明する。
【０００４】
一般に、ＳＰＲを利用したバイオセンサーに使用する検出表面は、ガラスなどの透明基板上に金属薄膜層があり、さらにその上に、生理活性物質を固定化するための固定化層がある。該固定化層としては、カルボキシメチルデキストラン（例えば、非特許文献１参照）、アルキルアミンやアルキルジアミンのプラズマ重合物（例えば、特許文献１参照）、多糖類や膨潤性有機ポリマー（例えば、特許文献２参照）などがあった。
【０００５】
しかしながら、これらの検出表面においては、生理活性物質の表面固定化により、活性の低下が起きることがあった。このため、比較的、外部環境変化に強い、即ち、固定化しても活性の低下が起りにくい物質のみが試験材料として用いられ、測定の対象が非常に狭い範囲に限られていた。
【０００６】
【非特許文献１】「センサーチップガイド」ＢＩＡＣＯＲＥ社製カタログ
【特許文献１】特開平９−２６４８４３号公報（第２頁、特許請求の範囲第８項）
【特許文献２】特許第２８１５１２０公報（第１〜２頁、特許請求の範囲第４項）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、生理活性物質の活性低下がほとんど無いバイオセンサーを提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記バイオセンサーの製造方法、上記バイオセンサーの表面に生理活性物質を固定化する方法、並びに上記バイオセンサーを用いた生理活性物質と相互作用する物質を測定する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、金属層の表面に、中間層を介して、本明細書で定義する式（１）で表される化合物を含有する親水性組成物を結合することによって、生理活性物質の活性の低下を抑制しつつ、多量の生理活性物質を固定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、表面に金属層を有し、該金属層に、中間層を介して、下記式（１）で表される化合物を含有する親水性組成物が結合している基板から成るバイオセンサーが提供される。
式（１）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）
【００１０】
好ましくは、中間層の膜厚は０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。
好ましくは、金属は金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
好ましくは、式（１）において、ｌ＋ｎ＝２〜４、且つ、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１０〜１２である。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用される、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、表面に金属層を有する基板の表面を中間層で被覆する工程、及び該中間層に下記式（１）で表される化合物を含有する親水性組成物を化学的に結合する工程を含む、本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。
式（１）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、式（１）で表される化合物のカルボン酸末端に生理活性物質が共有結合により結合している、本発明のバイオセンサーが提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、生理活性物質の活性の低下が起こらないバイオセンサーを提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお本発明において、数値が物性値、特性値等を表す場合に、「（数値１）〜（数値２）」という記載は「（数値１）以上（数値２）以下」の意味を表す。また、以下の説明において、特に断りの無い限り、表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーを主眼において説明する。
【００１８】
本発明のバイオセンサーは、表面に金属層を有し、該金属層に、中間層（好ましくは、疎水性ポリマー層）を介して、下記式（１）で表される化合物を含有する親水性組成物が結合している基板から成ることを特徴とする。
式（１）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）
【００１９】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどに代表される分子間の相互作用を誘電率変化や振動数変化などとしてとらえ、対象となる測定物質を検出するセンサーを意味する。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を固定化して分子認識物質として用いることによって、対応するもう一方の物質を選択的に測定するという原理を利用している。
【００２０】
本発明で用いる金属は、自由電子を有し、空気中で容易に発火するなどの不安定性が無ければ、いずれの金属でも使用できるが、取り扱い易さの観点から、金、銀、銅、白金、アルミニウムが好ましく、耐酸化性などの安定性の観点から、金がより好ましい。これらの金属は単独、または組み合わせて使用してもよい。また、（基板）表面への付着性を上げるために、（基板）表面と金属との間に、クロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００２１】
金属層の厚さは特に限定されないが、例えば、表面プラズモン共鳴を利用する場合、５０００オングストローム（５００ｎｍ）を超えると、検出が困難になるため、センサーの高感度化の観点から、１オングストローム（０．１ｎｍ）以上５０００オングストローム（５００ｎｍ）以下が好ましく、１０オングストローム（１ｎｍ）以上２０００オングストローム（２００ｎｍ）以下がより好ましい。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚みは、１オングストローム（０．１ｎｍ）以上１００オングストローム（１０ｎｍ）以下であるのが好ましい。
【００２２】
本発明における、好適な金属層の形成方法としては、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法などが挙げられる。
【００２３】
表面プラズモン共鳴を利用したセンサーの場合、金属層は、基板上に配置されていることが好ましい。ここで、「基板上に配置される」とは、金属層が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、介在層を介して配置されている場合も含む。本発明において、好適に使用できる基板としては、例えば、ガラスや合成樹脂などが挙げられる。該合成樹脂の中でも、特に代表的なものとしては、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどの透明性樹脂が挙げられる。
【００２４】
中間層としては特に限定はないが疎水性ポリマー層が好ましい。
本発明で用いる疎水性ポリマーとは、スチレン類、マレイン酸ジエステル類、（メタ）アクリル酸エステル類、ビニルエステル類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類、アクリルアミド類などに代表される、モノマー類から１種類以上のモノマーを重合して成るポリマーであり、且つ、エステル結合を有するモノマー単位が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上である、非水溶性のポリマーを指称する。本発明で用いる疎水性ポリマーは、好ましくは水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２５】
本発明では、フッ素原子で置換されたアルキル基を有する疎水性ポリマーを使用することもできる。フッ素原子で置換されたアルキル基を有する疎水性ポリマーは、フッ素化アルキル基をエステルとして分子内に持つことが好ましい。特に、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステルが好ましい。フッ素化アルキル基は、炭素数１以上であって、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよい（以下、フッ素原子で置換されたアルキル基を「Ｒｆ」という）。
【００２６】
Ｒｆは、炭素数１以上の少なくとも１つのフッ素原子で置換されたアルキル基であり、Ｒｆは少なくとも１つのフッ素原子で置換されていればよく、直鎖状、分岐状および環状のいずれの構造であってもよい。また、フッ素原子以外の置換基でさらに置換されていてもよいし、フッ素原子のみで置換されていてもよい。Ｒｆのフッ素原子以外の置換基としては、アルケニル基、アリール基、アルコキシル基、フッ素以外のハロゲン原子、カルボン酸エステル基、カルボンアミド基、カルバモイル基、オキシカルボニル基、燐酸エステル基等が挙げられる。Ｒｆとしては、炭素数１〜１６のフッ素置換アルキル基が好ましく、炭素数１〜１２がより好ましく、炭素数４〜１０がさらに好ましい。Ｒｆとしてさらに好ましくは、末端がトリフルオロメチル基で置換された炭素数４〜１０のアルキル基であり、特に好ましくは−（ＣＨ2）n1−（ＣＦ2）n2Ｆで表される炭素数３〜１０のアルキル基である（ｎ1は１〜６の整数を表す。ｎ2は３〜８の整数を表す）。具体的には、−ＣＨ2−（ＣＦ2）2Ｆ、−（ＣＨ2）6−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）3−（ＣＦ2）4Ｆ、−ＣＨ2−（ＣＦ2）3Ｆ、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）3−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）6−（ＣＦ2）4Ｆ、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）6Ｆ、−（ＣＨ2）3−（ＣＦ2）6Ｆ、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）6Ｆ等が挙げられる。これらの中でも、特に、−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）4Ｆおよび−（ＣＨ2）2−（ＣＦ2）6Ｆが最も好ましい。
【００２７】
疎水性ポリマー層の形成方法としては、疎水性ポリマーを（基板）表面に塗布してもよいし、前記したモノマー類を（基板）表面で重合させてもよい。本発明において、好適な塗布の方法としては、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法などが挙げられる。
【００２８】
疎水性ポリマー層の厚みは特に限定されないが、センサーの高感度化と非特異吸着の抑制の観点から、１オングストローム（０．１ｎｍ）以上５０００オングストローム（５００ｎｍ）以下が好ましく、１０オングストローム（１ｎｍ）以上５００オングストローム（５０ｎｍ）以下がより好ましい。
【００２９】
本発明で用いる親水性組成物とは、下記式（１）で表される化合物を少なくとも１種含有する組成物であればよい。
式（１）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す。）
【００３０】
親水性組成物を構成する、式（１）で表される化合物以外の他の成分としては、例えば、ゼラチン類、キトサン類、デキストラン類、ポリビニルアルコール類、ポリエチレングリコール類、カラギーナン類、アガロース類、ポリ（メタ）アクリル酸類、ポリアクリルアミド類、または下記式（２）で表される化合物などが挙げられる。本発明で用いる親水性組成物には、これらの他の成分が１種類以上含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
式（２）：Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）l−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ
（式中、ｌ、ｍ、ｎは１以上の整数を表す。但し、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す場合は除く。）
【００３１】
式（１）において、ｌは１〜５の整数を表し、ｍは１〜１０の整数を表し、ｎは１〜５の整数を表す限り、ｌ、ｍ及びｎは任意の整数でよいが、非特異吸着の抑制、および高感度化の観点から、ｌ＋ｎ＝２〜４、且つ、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１０〜１２であることが好ましく、ｌ＝ｎ＝２、且つ、ｍ＝５であることがより好ましい。
【００３２】
本発明のバイオセンサーの製造方法としては、疎水性ポリマーと式（１）で表される化合物とを化学的に結合させればよい。本発明における好適な製造方法としては、例えば、疎水性ポリマー層を形成した後、該疎水性ポリマー層に酸またはアルカリ水溶液を接触させ、疎水性ポリマーが有するエステル結合を予め加水分解し、カルボキシル基を発現させる。その後、カルボジイミド類などの脱水縮合試薬を用いてカルボキシル基を活性化させた後、式（１）で表される化合物のアミノ基とを反応させることにより、本発明のバイオセンサーを得ることができる。
【００３３】
このようにして得られたバイオセンサーの表面に、種々の生理活性物質を固定化することができる。本発明における好適な固定化方法としては、例えば、一般式（１）で表される化合物のカルボキシル基をカルボジイミド類などの脱水縮合試薬を用いて活性化させた後、生理活性物質が有するアミノ基を反応させることにより、生理活性物質を固定化する方法がある。
【００３４】
本発明のバイオセンサーに固定化する生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００３５】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００３６】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００３７】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００３８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００３９】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４０】
即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明のバイオセンサーを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【００４１】
本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００４３】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４４】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４５】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００４６】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリア
センサによって検出することができる。
【００４７】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお
上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００４８】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００４９】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００５０】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５１】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５２】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５３】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００５４】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００５５】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００５６】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００５７】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例１：
以下の方法で、本発明のセンサチップを作成した。
（１）プラスチックプリズム上への金製膜
ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズム（図１）の上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
（１−１）金製膜
スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理（基板エッチング、逆スパッタとも呼ばれる）する。プラズマ照射後の光学ブロックの光反射面の表面粗さがRa≦30nmであった。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。Auの粒子サイズは、20nm程度である。得られた試料をチップＡと呼ぶ。
【００５９】
（２）ポリマー塗布
チップＡの金薄膜上に以下の方法でポリマー薄膜を製膜した。
（２−１）ポリマー溶液Ａの調製
ポリマー(F-1) 1.5gを脱水MiBK（メチルイソブチルケトン） 100mLに溶解し、孔径0.45μmのミクロフィルターで濾過する。脱水MiBKの含水率は20ppm。
【００６０】
【化１】
2006214796.tif 000002
【００６１】
（２−２）スピンコート
チップＡをスピンコーター（SC-408S試料密閉型スピンコーター、有限会社押鐘製）にセットする。チップＡはスピンコーターの中心から135mmの位置に図２に示すように固定する。ポリマー溶液Ａ 200μLをチップＡの金膜全面を覆うようにキャストする。次に、チップＡを完全に覆うように風よけカバーをセットする。その後、200rpmで60秒間スピンする。回転が停止した後、5分間そのまま静置する。
【００６２】
（２−３）真空乾燥
ポリマーをスピンコートしたチップＡを16時間真空乾燥する。得られた試料をチップＢと呼ぶ。
【００６３】
（３）ポリマー表面の加水分解
以下の方法で、チップＢのポリマー薄膜表面を加水分解して、最表面にCOOH基を発生させた。
（３−１）加水分解
1N NaOH溶液にチップＢを浸漬し、60℃の恒温槽で16時間保管する。
（３−２）洗浄
60℃の恒温槽から取り出した後、15分間自然冷却し、その後、超純水で洗浄する。得られた試料をチップＣと呼ぶ。
【００６４】
以下に示す方法で、チップＣの表面処理を行った。
【００６５】
（４）5アミノ吉草酸結合
以下の方法で、チップの表面に存在するCOOH基に5アミノ吉草酸反応を共有結合させた。
（４−１）活性化液、5アミノ吉草酸溶液の調製
0.1M NHS溶液：  1.16gのNHS（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）を超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDC（塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を超純水で溶解し100mLにする。
1M 5アミノ吉草酸溶液：  11.7gの5アミノ吉草酸を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
【００６６】
（４−２）活性化
エアガンでチップの水切りを行う。チップを湿箱（濡れ布を敷いたタイトボックス、密封した状態で湿度90%RH以上に保つ）にセットし、0.1M NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【００６７】
（４−３）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップX1と呼ぶ。
【００６８】
（４−４）5アミノ吉草酸反応
5アミノ吉草酸反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップX1の水切りを行う。チップX1を湿箱にセットし、1M 5アミノ吉草酸溶液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は24である。湿箱を密閉して、25℃で90分静置する。
【００６９】
（４−５）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップX2と呼ぶ。
【００７０】
（５）リガンド非結合部のパターン形成
以下の方法で、チップX2の表面に、リガンドが結合できない部分のパターンを形成した。具体的には、チップX2の特定の場所において、5アミノ吉草酸のCOOH基にPEG5000（α-アミノ-ω-メトキシ-ポリエチレングリコール）を共有結合させた。PEG5000の末端はメトキシ基なので、リガンドと共有結合を形成することができない。この部分は、アナライトの結合測定時にリファレンス部として計測される。
【００７１】
（５−１）反応液の調製
20％ PEG5000溶液：  4.5gのPEG5000を超純水18.5mLと1N NaOH 4mLで溶解する。
0.2M NHS溶液：  2.32gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
【００７２】
（５−２）パターン化反応
エアガンでチップX2の水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに20％ PEG5000溶液1mLと0.2M NHS溶液１mLと0.4M EDC溶液2mLの混合液を投入する。チップX2に18mm間隔で15μLづつ6点、前記混合液をスポッティングする。液滴の直径は約4mmとなる。スポッティングを行ったチップX2を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【００７３】
（５−３）洗浄
湿箱から取り出した試料を1Nクエン酸水溶液で洗浄し、さらに純水で洗浄する。得られた試料をチップX3と呼ぶ。
【００７４】
（６）PEGリンカー結合
以下の方法で、チップX3の表面に存在する5アミノ吉草酸のCOOH基にリンカー化合物を共有結合させた。リンカー化合物はパターン化した表面には結合しない。
【００７５】
（６−１）活性化液、リンカー化合物溶液の調製
0.1M Sulfo-NHS溶液：  2.04gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液：  7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
10％ PEGリンカー溶液：  10gのリンカー化合物（以下の３種類のリンカー化合物を用いた）を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
【００７６】
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）75-80−（ＣＨ2）2−ＣＯＯＨ
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）1−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）10−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨ
Ｈ2Ｎ−（ＣＨ2）2−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）5−（ＣＨ2）2−ＣＯＯＨ
【００７７】
（６−２）活性化
エアガンでチップX3の水切りを行う。チップX3を湿箱にセットし、0.1M Sulfo-NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
【００７８】
（６−３）洗浄
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップX4と呼ぶ。
【００７９】
（６−４）PEGリンカー反応
リンカー化合物反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップＧの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに10％PEGリンカー溶液5mLを投入する。チップX4に18mm間隔で8μLづつ6点、10％リンカー化合物溶液をスポッティングする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのＰＥＴフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は90である。この試料を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
【００８０】
（６−５）洗浄
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップY1〜Y3と呼ぶ。
（６−６）保管
エアガンでチップY1〜Y3の水切りを行い保管する。
【００８１】
試験例１：
上記処理を施したチップX3、Y1〜Y3について以下の方法でリガンド蛋白を固定し、固定量を評価した。蛋白固定量測定は図３に示すSPR装置を用いた。測定には、図１の部品４１のタフセレン製の流路を用いた。
（１）リガンド溶液の調製：トリプシン0.5mgを酢酸バッファー(pH5.5) 1mlに溶解。
（２）センサチップ表面の活性化：NHS(0.1M)/EDC(0.4M)=1/1、25℃、30分
（３）リガンドの固定：上記のリガンド溶液、25℃、30分
（４）ブロッキング：1Mエタノールアミン溶液(pH8.5)、25℃、30分
【００８２】
結果を表１に示す。本発明の化合物は、長鎖のリンカー化合物を用いた場合と比較して固定量が増大したことがわかる。
【００８３】
試験例２：
試験例１でトリプシンを固定したチップをそのまま用いて、酵素活性測定を行った。タフセレン製の流路を外して、表面を０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０、０．０２ＭＣａＣｌ２）にて３回洗浄した後、Bz-Arg-MCA（（株）ペプチド研究所）0.1mM溶液１００μｌを固定部を覆うようにチップ上に載せた。１８０分後に測定プレート上に９０μl移して、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）にて検出波長４６０ｎｍ（励起波長３８０ｎｍ）で蛍光測定を行った。測定値をトリプシン固定量（ＲＵ）で割った値を酵素活性値とした。結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
2006214796.tif 000003
【００８５】
表１に示す通り、本発明の構成により、固定量と酵素活性を両立するセンサー表面を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、実施例で使用したプラスチックプリズムを示す。
【図２】図２は、実施例におけるスピンコートを行う際の位置を示す。
【図３】図３は、本発明のスクリーニング方法を行うためのＳＰＲシステムの一例を示す。
【図１】
2006214796.tif 000004
【図２】
2006214796.tif 000005
【図３】
2006214796.tif 000006