(57)【要約】【課題】湖沼水又は河川水においてアオコ発生時のアオコ毒素であるシリンドロスパーモプシン（CYN）を検出又は定量可能なように簡便に精製する方法を提供する。【解決手段】被検試料をアルカリ性した後、疎水性物質を選択に吸着する固相で処理し、次に陰イオン交換能を持つ固定相で処理した後、目的物を陰イオン交換能を持つ固定相から酸性液で溶出することにより、簡易に、紫外光吸収スペクトル分析法でCYNを検出・定量測定できるようになる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリンドロスパーモプシン(CYN)検出又は測定用検体試料中のCYNの精製法において、疎水性物質に関して吸着除去処理が前処理で施されており且つアルカリ性の検体試料につき、陰イオン交換能を持つ固定相を使用してクロマトグラフィー処理することを特徴とする検体試料中のCYNの精製法。
【請求項２】
目的物を陰イオン交換能を持つ固定相に吸着せしめ、次に吸着物を酸性液又はアルコール含有酸性液で溶出することを特徴とする請求項１に記載のCYNの精製法。
【請求項３】
陰イオン交換能を持つ固定相が、第４級アンモニウム基をリガンドとして有するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のCYNの精製法。
【請求項４】
CYN検出又は測定用検体試料中のCYNの精製法において、アルカリ性の検体試料につき、疎水性物質を吸着する性能をもつ固定相を使用してクロマトグラフィー処理し、次に得られた溶出液を陰イオン交換能を持つ固定相を使用してクロマトグラフィー処理することを特徴とする検体試料中のCYNの精製法。
【請求項５】
目的物を陰イオン交換能を持つ固定相に吸着せしめ、次に吸着物を酸性液で溶出することを特徴とする請求項４に記載のCYNの精製法。
【請求項６】
採取されたCYN検出又は測定用検体試料をアルカリ性とした後、クロマトグラフィー処理に付すことを特徴とする請求項４又は５に記載のCYNの精製法。
【請求項７】
疎水性物質を吸着する性能をもつ固定相が、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）コポリマーで、陰イオン交換能を持つ固定相が、第４級アンモニウム基をリガンドとして有するものであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一に記載のCYNの精製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藍藻類のアオコが生体内で合成する有毒物質であるシリンドロスパーモプシン（cylindrospermopsin: CYN, CAS RN 143545-90-8）を容易に検出及び測定可能とするようにするための精製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
富栄養化の進んだ湖沼水や河川水では植物プランクトンである藍藻類が発生し、水面にアオコが形成される。このアオコを形成する藍藻類の中に毒素を生産する種がある。藍藻類が光合成する過程で毒素を生産する種としては、アナベナ(Anabaena)、ミクロシスチス(Microcystis)、ノデュラリア(Nodularia)、シリンドロスパーモプチス(Cylindrospermopsis)などがある。シリンドロスパーモプシスは、1992年にオーストラリアの飲料貯留池から分離されたものである。
シリンドロスパーモプシン（CYN）は、湖沼等で発生する藍藻、いわゆるアオコであるシリンドロスパーモプシスなどが生産する肝臓毒であり、アルカロイドの一種である。CYNは、Cylindrospermopsis raciborskii (オーストラリア、ハンガリー、米国など)、Aphanizomenon ovalisporum (オーストラリア、イスラエルなど)、そしてUmezakia natans (日本など)の藍藻類に見出されているが、それはLD50=200μg/kg (in mice)といったごく微量で毒性を示し、肝臓疾患を引き起こす。CYNは、次なる化学構造:
【０００３】
【化１】
2006308508.tif 000002
【０００４】
を有しており、構造に含まれる一部構造（化学構造の右側: ヒドロキシメチルウラシル部）が、核酸の構造の一部と同じであることから、CYNと、他の核酸を分離することが困難である。このことは、ため池などから採取した試料中にCYNが存在するかどうかの分析を難しくする。また、いくつかの同属体があることも知られている。
CYNの分離法としては、その化学構造が決定された際の方法〔非特許文献１〕が使用されているが、既存の精製法では疎水性の媒体を用いるため、環境水中に存在する多くの夾雑物を除くことができないという問題がある。
また、CYNを、通常、液体クロマトグラフィーを利用して紫外光吸収分析しようとしても、CYNの吸収波長である262nmのピークにおいて、他の物質によるピークによる干渉のため、CYNの定量・定性の分析を行うことが非常に困難である。さらに、CYNは単離されていないためにその標準試料が存在しない。特に、CYNの標準品は市販されていない。よって、対比するリファレンスが無いという問題もある。こうした理由に加えて、仮に標準試料があったとしても、一般には測定対象とする試料では夾雑物たる他の分子からのピークによる干渉によって、CYNの検出は不可能である。一方、紫外光吸収に代わる分析法として質量分析を用いることはできる、すなわち、質量分析によるCYN検出自体は可能であるが、夾雑物による影響で、CYNの検出感度が大きく低下することは避けられないという問題があり、さらに質量分析では、高価な装置が必要であるとか、試料採取場所ですぐさま測定をすることが困難であるなどの問題がある。
【０００５】
【非特許文献１】Ohtani, I. et al., Journal of the American Chemical Society, 114, 7941-7942 (1992)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
飲料などに利用される湖沼等で発生するアオコがその生体内で産生する毒性物質は、経口により家畜や人に摂取されると大きな害を及ぼす。特に、海外の上下水道インフラの未発達の地域では、人の生存を脅かす脅威となっている。有毒物質の中でもミクロシスチンは有名でその研究が進んでいるが、CYNは、その化学構造上の特性から分析手法の確立・物質の単離が難しい状況にある。そしてCYNは、その微量の混入で、動物に対して悪影響を及ぼすことから、その効率的な分析・単離法の開発が、衛生管理・環境対策の上でも強く求められている。特に、近年、アオコが湖沼等で頻繁に発生するが、そうした湖沼の水質調査において、CYNを分析できないという問題が生じている。
上記したような問題を有するCYNを含有する試料を、液体クロマトグラフィーを利用して紫外光吸収分析しようとする場合も質量分析しようとする場合も、どちらの分析方法を用いるにしても、CYNの検出を可能にする／または検出感度を向上させるためには、選択的にCYNを分離・濃縮する手法の開発が不可欠な状況である。また、より簡便に取り扱うことができる手法としては、質量分析のユニットでは高価であることから、その1/10程度の価格で手に入れられることができる紫外吸収のユニットにより検出できる程度の方法の開発が求められている。一般的に、CYNは、微量の混入で、動物への悪影響が及ぶため、求められる簡便な方法としては、溶液試料から、CYNを高濃度に濃縮する方法および／または単離する方法となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記問題点に鑑み鋭意研究を進めた結果、環境中から採取したCYN含有試料を、疎水性物質を選択に吸着する固相で処理し、次にイオン交換樹脂などを使用したクロマトグラフィーにより効率よく精製できることを見出し、それに基づいて本発明を完成した。本発明は、CYNが溶解した水溶液のpHをある値に一定に保つことにより、CYNの解離を促すことができ、その性質を利用することで、選択的にCYN類のみを濃縮できることを利用するにある。
本発明では、次のものが提供できる。
〔１〕シリンドロスパーモプシン(CYN)検出又は測定用検体試料中のCYNの精製法において、疎水性物質に関して吸着除去処理が前処理で施されており且つアルカリ性の検体試料につき、陰イオン交換能を持つ固定相を使用してクロマトグラフィー処理することを特徴とする検体試料中のCYNの精製法。
〔２〕目的物を陰イオン交換能を持つ固定相に吸着せしめ、次に吸着物を酸性液又はアルコール含有酸性液で溶出することを特徴とする上記〔１〕に記載のCYNの精製法。
〔３〕陰イオン交換能を持つ固定相が、第４級アンモニウム基をリガンドとして有するものであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載のCYNの精製法。
〔４〕CYN検出又は測定用検体試料中のCYNの精製法において、アルカリ性の検体試料につき、疎水性物質を吸着する性能をもつ固定相を使用してクロマトグラフィー処理し、次に得られた溶出液を陰イオン交換能を持つ固定相を使用してクロマトグラフィー処理することを特徴とする検体試料中のCYNの精製法。
〔５〕目的物を陰イオン交換能を持つ固定相に吸着せしめ、次に吸着物を酸性液で溶出することを特徴とする上記〔４〕に記載のCYNの精製法。
〔６〕採取されたCYN検出又は測定用検体試料をアルカリ性とした後、クロマトグラフィー処理に付すことを特徴とする上記〔４〕又は〔５〕に記載のCYNの精製法。
〔７〕疎水性物質を吸着する性能をもつ固定相が、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）コポリマーで、陰イオン交換能を持つ固定相が、第４級アンモニウム基をリガンドとして有するものであることを特徴とする上記〔４〕〜〔６〕のいずれか一に記載のCYNの精製法。
〔８〕アルカリ性の検体試料は、ｐH9.5以上のアルカリ性あるいはpH10.5以上のアルカリ性であることを特徴とする上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一に記載のCYNの精製法。
〔９〕検体試料をアルカリ性にするのに、炭酸カリウム水溶液を使用していることを特徴とする上記〔８〕に記載のCYNの精製法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、環境中のCYN類を単離・濃縮することが可能となり、CYN類の検出および定量分析が可能となる。また、毒性アセスメントに利用することが可能となる。本発明の手法では、多くの夾雑物を含む試料から、CYN類のみを選択的に濃縮でき、さらにはCYN標準品もその調製が可能且つ容易となり、分析・定量も簡単に且つ効率よく、そしてより正確に行うことができるようになる。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
近年、世界的に富栄養化した湖沼などに藍藻類などが異常発生する現象は世界各地に頻発しており、深刻な環境問題となっている。このように湖沼の藍藻類などが異常増殖をし、水面に薄皮又は塊状として浮いているものをアオコといっている。アオコを構成する藍藻の一部が有毒化合物を生産することが知られており、アオコ問題を更に複雑化している。家畜又は養魚などがアオコの発生した湖水を飲んで死亡した例が各国で報告され、湖水中のアオコ毒素量を測定する必要性が唱えられている。
本発明は、藍藻類のアオコが生体内で合成する有毒物質であるシリンドロスパーモプシン（CYN）を容易に検出及び測定可能とするようにするための精製法を提供する。
本発明技術により測定することのできる被検試料は、特に限定されるものではないが、例えば、藍藻が発生した、あるいは、発生する可能性のある天然水、例えば、湖沼水、河川水、又は運河水などを挙げることができる。被検試料は、環境水（例えば、問題の細胞から自然に分散せしめられたCYNを含んでいるもの）も包含される。該被検試料は、そのままCYN精製処理に付すこともできるし、不溶物質などを除いたり、液と藍藻細胞を分離したりした後にCYN精製処理に付すこともできる。
天然界あるいは自然界から採取した被検液体試料から藍藻細胞を分離する方法としては、例えば、ろ過、遠心操作、又は自然沈降などを挙げることができ、携帯可能な程度に軽量な装置で実施することができる点で、ろ過により分離することが好ましい。ろ過には、任意のフィルターを使用することができ、例えば、濾紙、ガラスフィルター、又はメンブレンフィルターなどを使用することができる。ろ過により被検試料から藍藻細胞を分離した場合には、ろ過により得られるろ液あるいは細胞を、あるいは、遠心操作又は自然沈降により被検試料から藍藻細胞を分離した場合には、その上清又は分離された細胞を、処理液あるいは出発細胞として使用することができる。代表的な場合、被検試料から藍藻細胞は、遠心操作によりペレットとして得ることができる。得られた細胞は、適宜、凍結乾燥などして置くこともできる。
【００１０】
藍藻細胞から有毒物質であるCYN類を抽出するには、藍藻細胞を含有している液体試料に超音波を照射する。超音波照射処理により、液体内で懸濁する細胞は超音波で破壊され、細胞内に含まれるCYN類が液体内に放出される。これによって、アオコ毒の成分を、細胞から液体中に分離して取り出すことができる。得られた液体がそのままでは希薄すぎる場合は、適宜濃縮されることができる。濃縮は減圧あるいは真空下に行うことができ、エバポレーターなどを使用して行うこともできる。液体試料は、濃縮して完全に乾燥した状態のものとしてもよい。該濃縮で得られた残留物は、適宜、水あるいは水性媒体に溶解又は懸濁されて、以下に説明する抽出・精製処理に付される。典型的な場合では、凍結乾燥されていた藍藻細胞を酸性の水溶液(例えば、5%酢酸水溶液など)に懸濁し、次に細胞懸濁液を超音波破砕処理し、得られた懸濁液を、遠心処理した後、上清液を集めて減圧下に濃縮する。得られた残留物は、アルカリ性の水溶液、好ましくはアルカリ性緩衝水溶液に懸濁せしめられる。
【００１１】
以下、本発明の実施の形態を図１を参照しながら説明する、図１は、本発明の実施の形態においてCYNを含む溶液試料から、CYNを抽出・精製するのに、便利に利用できる分離用カートリッジ式カラムの概略構成と分離操作の概略を概念的に示すものである。
図１において、CYNを含む溶液試料は、図１に示すような、２重になったカートリッジを通過させる。該カートリッジは、固相抽出法(solid phase extraction)の分野で広く利用され、市販品としても入手可能なものである。本発明では公知の固相抽出技術用に知られている固相抽出用固定相（特定の官能基あるいはリガンドを有していてよいマトリックス又は担体など）やその使用に適したカートリッジ等、あるいは市販のそれらのもの、さらにはそれらの改変物又は修飾物から適宜選択して使用できる。固相抽出法とは、化学結合型シリカゲル、ポーラスポリマー、アルミナ、活性炭等の固定相（固相）を用いながら複雑な組成を示す試料中から特定の目的成分のみを選択的に抽出し、分離・精製を行なう技術である。カラムクロマトグラフィーも本固相抽出法の一種である。固相抽出技術については、公知の文献、例えば、Nigel J.K. Simpson (Editor), "SOLID-PHASE EXTRACTION: Principles, Techniques, and Applications", Marcel Dekker Inc. (March, 2000, ISBN: 0-8247-0021-X); E.M. Thurman, M.S. Mills, "Solid-Phase Extraction: Principles and Practice" John Wiley & Sons (1998, ISBN: 0-471-61422-X); N. Simpson and K. C. Van Horne (Editors), "Handbook of Sorbent Extraction Technology", Varian Sample Preparation Products, Harbor City, CA, 1993などを参照することができ、そこに開示の内容はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる。
【００１２】
該カートリッジを通過させる前段階として、溶液試料はそれをアルカリ性にせしめておく。溶液試料は、上記したように、細胞からの抽出液だけでなく、例えば、環境水を直接に使用することもできる。アルカリ性とは、水溶液のpHが、pH7.0より大きな値を意味してよく、例えば、pH7.5以上、あるいはpH8.5以上、あるいはpH9.0以上であるか、好ましくはpH9.5以上、あるいはpH9.75以上、あるいはpH10.0以上であるか、より好ましくはpH10.25以上、あるいはpH10.5以上、あるいはpH10.75以上であってよい。これは、中性においては分子全体としては電気的にニュートラル（中性）になっているCYNを、溶液をアルカリ性にすることによって分子全体としてマイナスに荷電させるためである。本発明は、CYNをマイナスに荷電させることにより、陰イオン（アニオン）交換樹脂に吸着せしめることを特徴としている。
アルカリ性にする方法としては、CYNにダメージを与えない限り、化学分野で知られている手法を使用でき、例えば、アルカリ性の水溶液にCYN含有試料を懸濁あるいは溶解せしめることにより行うことができるが、CYN含有水溶液に、アルカリ試薬を添加することによってもよい。アルカリ源又はアルカリ試薬としては、水溶性の塩基性試薬であればよく、CYNがマイナスに荷電するｐH9.5以上のアルカリ性にすることができる試薬であれば、どのようなものを用いてもよい。該アルカリ源又はアルカリ試薬としては、例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩あるいは有機酸塩、水酸化アンモニウムなどからなる群から選択されたものが挙げられる。代表的なものとしては、例えば、炭酸カリウム（K2CO3）、炭酸カルシウム（CaCO3）、炭酸ナトリウム（NaCO3）、水酸化カリウム（KaOH）、水酸化ナトリウム（NaOH）、水酸化マグネシウム（Mg(OH)2）などが挙げられ、好ましくは炭酸カリウムを添加し、0.1モル／リットル程度の濃度にしたものを使用することができる。
本発明で用いるアルカリの強さとしては、CYNが半分程度荷電するのがp=9.5であり、pHが10.5以上になると十分な割合でCYNが荷電する。pH=7.5程度の弱アルカリであっても、CYNが部分的にマイナスに荷電すれば、効率は劣るが選択的な抽出は可能と思われる。炭酸カリウムの添加では、緩衝作用によってpHが10.5程度で安定することから、効果的である。添加アルカリ試薬濃度についても、実験における炭酸カリウム0.1モル／リットルという希薄な濃度であっても十分な精製が可能であり、効率を考慮しなければ、更に希薄な濃度（結果して弱アルカリ性を呈す）であっても実施可能である。本発明では該アルカリ性にする場合に、適宜、必要に応じて、緩衝剤を添加することもできる。溶液試料をアルカリ性にし、CYN全体をマイナスに荷電させた後に２重にしたカートリッジを通過させる。
【００１３】
第１段目のカートリッジは、疎水性カートリッジであり、疎水性の物質を吸着させることによって、溶液試料から疎水性物質（例えば、CYNの分析において最も阻害要因となる疎水性のたんぱく質・核酸）を除去する目的で使用する。本実施においては、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）コポリマー(Resin based polystyrenedivinylbenzene: SDB)などのポリスチレン（スチレンポリマー）（商品名イナートセップ: InertSepTM、ジーエルサイエンス社(GL Science Inc.)製）を用いているが、疎水性物質を吸着する性能があれば、他の材料を用いてもよい。疎水性物質を吸着する性能を持つカラムの充填剤の有する官能基又はリガンドとしては、例えば、オクタデシル(C18)基、ポリスチレン、オクチル基、ブチル基、シクロヘキシル基、フェニル基、シアノプロピル基、ニトロフェニルエチル基などを有するものが挙げられるが、これには限定されない。
【００１４】
第二段目のカートリッジは、陰イオン（アニオン）交換樹脂であり、マイナスに荷電した物質を吸着する。本カートリッジにおいて、マイナスに荷電しているCYNが吸着される。
陰イオン交換樹脂は、市販の陰イオン交換カートリッジ（製品名：オアシスMAX: OasisTM MAX、ウオーターズ社(Waters Corp. USA)製）を用いたが、陰イオンを吸着する材質であれば、他の材料を用いてもよい。陰イオンを吸着する性能を持つカラムの充填剤の有する官能基又はリガンドとしては、例えば、第４級アンモニウム基、ジエチルアミノエチル基、ジエチルアミノプロピル基、トリメチルアミノプロピル基、アミノエチルアミノプロピル基などを有するものが挙げられるが、これには限定されない。
次のステップとして、CYNが吸着された陰イオン交換樹脂に、少量の酸性溶液を通過させる。これによって、陰イオン交換樹脂に吸着していたCYNが電気的に中性もしくはプラスに荷電することにより陰イオン交換樹脂から脱着し、酸性溶液中に含まれて、カートリッジの外に出る。
【００１５】
酸性溶液としては、酸性物質、例えば、1%濃度の蟻酸などの有機酸が含まれた、水溶液を使用できる。酸性溶液にするためには、蟻酸の他に、塩酸、酢酸などの有機酸、燐酸、硫酸、硝酸などの、溶液を酸性に変化させる試薬であれば、何を用いてもよい。
効率を上げるために、１％濃度で行ったが、微弱な酸性溶液でもCYNを脱着させることは可能であり、0.1%程度の濃度でも可能である。
酸性の水溶液は親水性の溶液であるため、第一段目のカートリッジに吸着されている疎水性物質が脱着して酸性溶液中に流出することはない。
なお、脱着の効率を上げるため、上記酸性溶液に、CYNが溶ける物質、例えば、アルコール（例えば、メタノールもしくはエタノール）を50%の割合で添加し、酸性溶液とすることも可能である。ただしこの際は、第一段目の疎水性物質がアルコールに溶け込み、最終的に得られる溶液に夾雑物として混入することがわかっているため、二つのカートリッジを切り離し、CYNが吸着している第二段目のカートリッジにのみ酸性溶液を通過させる。
上記では固相抽出法に、充填型カートリッジを使用した例につき説明してあるが、膜型カートリッジや膜タイプのものを使用することも可能と考えられる。また、上記カートリッジ内の液の移動は、自然落下方式、吸引方式、加圧方式、遠心分離方式のいずれであってもよい。
本固相抽出法における固相マトリックスは、適切な分離を達成できるものであれば特に限定されないが、当該分野では様々なものが知られており、例えば、シリカ、ポリスチレン（スチレン・ジビニルベンゼン共重合体）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（ヒドロキシメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、N-ビニルピロリドン・ジビニルベンゼン共重合体などが挙げられる。
【００１６】
原試料溶液の紫外光分析では全く検出できず、質量分析においても感度が低下した分析しかできなかったものが、上記の手順による方法により、CYNがほぼ単離した状態の水溶液として得ることができるようになる。
得られた水溶液にCYNしか存在しないことは、以下の実施例により確認されている。
本発明技術における測定工程では、アオコ由来のCYN以外の化合物であって、アオコが発生する以前から被検試料中に存在する前記化合物に起因する吸光度の影響を少なくするために、適当な対照液（例えば、アオコが発生するとき、又はそれ以前の天然水）をコントロールとして使用し、アオコ発生後の毒素量の変化を迅速に定量するようにしてもよい。
本発明技術における測定では、予め決定しておいたCYN量と前記の所定波長における吸光度との相関関係に基づいて、前記工程により得られる吸光度測定値からCYN量を決定することをしてもよい。前記相関関係は、種々のCYN量を含む複数の被検試料（通常、３〜10種類）を用いて、それぞれの被検試料中のCYN量と所定波長における吸光度とを測定し、その測定結果から、例えば、相関直線を利用した手法によって、あるいは、検量線を作成することによって決定することができる。
【００１７】
本発明の精製法により得られたCYN精製試料中のCYNの測定法としては、紫外光吸収スペクトル分析法で便利に行うことができるが、液体クロマトグラフィーと紫外光吸収スペクトル分析法を組み合わせてより好適に検出・定量測定することができるし、さらに、バイオアッセイ法、質量分析法、液体クロマトグラフィーと質量分析法を組み合わせたLC/MS法などを使用することも可能である。
本発明技術においては、被検試料の条件に応じて、CYN量と所定波長における吸光度との相関関係が変動することがあるので、測定対象である被検試料に適した相関直線を用いる必要がある。前記相関関係に影響を与える因子としては、例えば、アオコ細胞の種類若しくは構成比、採取場所の水温若しくは水質、又は被検試料の保存状態などを挙げることができる。
本発明の実施の態様によれば、試料液体の採取、植物プランクトンからのCYNの抽出、精製、分離を、一連の操作で行うことができ、また、自動操作で連続操作を行うこともできる。
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
【実施例１】
【００１８】
シリンドロスパーモプチス・ラシボルスキー(Cylindrospermopsis raciborskii (CRJ-1=AWT 205))毒性株は、独立行政法人国立環境研究所微生物系統保存施設 (MICROBIAL CULTURE COLLECTION; National Institute for Environmental Studies, 16-2 Onogawa, Tsukuba, Ibaraki, 305-8506 JAPAN; MCC-NIES)より入手し、10Lの培養用ボトル中で培養した。培養液は、Jaworski 培地〔100Lの蒸留水, pH8.5にCa(NO3)2-4H2O (4.0g), KH2PO4 (2.48g), MgSO4-7H2O (10.0g), NaHCO3 (3.18g), EDTA FeNa (0.45g), EDTA Na2 (0.45g), H3BO3 (0.496g), MnCl2-4H2O (0.278g), シアノコバラミン(8mg), チアミンHCl (8mg), ビオチン(8mg), NaNO3 (16.0g), (NH4)6Mo7O24-4H2O (0.2g), NaHPO4-12H2O (7.2g)を含有するもの〕を使用した。細胞を20℃で恒温条件下に生育せしめた（照射光強度：250μmolフォトンm-2s-1より少ない；通気速度、1.5L/分）。４週間後藻を遠心して収穫し、凍結乾燥した。凍結乾燥された藻の収量は平均0.11g/Lであった。
凍結乾燥された細胞(5.0g)を5%酢酸水溶液とともに超音波処理（ソニケーション処理）を５分間行ってシリンドロスパーモプシン（CYN）を抽出した。遠心処理した後、上清液を集めて減圧下に濃縮した。得られた残留物を0.1M炭酸カリウム緩衝液(pH10.5, 100Ml)ととも懸濁処理した。
【００１９】
CYNを分画処理する目的で、カラムクロマトグラフィー処理にかけた。カラムは、固相抽出法用充填型固相カートリッジを上下に連結して使用することができる形態となっている市販の２重カートリッジカラム（図１参照）を使用して行った。図1の上側のカートリッジ（図１の２）は、市販のスチレンポリマーカートリッジ（商品名イナートセップ RP-1: InertSepTM RP-1、ジーエルサイエンス社(GL Science Inc.)製）であり、下側のカートリッジ（図１の３）は、市販の陰イオン交換カートリッジ（商品名オアシスMAX: OasisTM MAX、ウオーターズ社(Waters Corp. USA)製））である。上記でCYN含有残留物の懸濁により得られた液体試料を上側のカートリッジ側から流す（図１の１）。第一のカートリッジ（図１の２）で該溶液中の疎水性の化合物を除去し、次に第一のカートリッジからの溶出液を第二のカートリッジ（図１の３）に流し、陰イオン交換カートリッジにCYN及びデオキシ-CYNを吸着せしめる。２重カートリッジカラムに水を流して（図１の１）カートリッジを洗浄した後、上下に連結しているカートリッジを分離して、第二のカートリッジ（図１の３）に50%メタノールを含有している1.0%ギ酸水溶液を流してCYN及びデオキシ-CYNを溶出せしめた。この溶出液を減圧下にロータリーエバポレーターにより濃縮して乾燥した状態にせしめた。残留物を液体クロマトグラフィー(LC)分析用に50%メタノール含有水溶液(5.0mL)でもって溶解せしめた。
【００２０】
この液体試料を使用してそれぞれ測定を行なった。
高速液体クロマトグラフィー(high performance liquid chromatography: HPLC)は、次のような条件下に行なった。
カラム: Amide-80 (100mm×2.0mm内径(I.D.)、東ソー（株）、日本、移動相; 90〜60%のMeCN水溶液のリニアーグラジエント(90〜60%、20分間；60%、20〜30分間)、流速; 0.2Ml/min、カラム温度; 40℃、検出; ホトダイオードアレイ(photodiode array: PDA)
質量分析(mass spectrometry: MS)は、次のような条件下に行なった。
ネガティブモード(デオキシ-CYNに対してはM/Z 398, CYNに対してはM/Z 414); イオン化; エレクトロスプレイイオナイゼーション(ESI)
クロマトグラフィーのデータは、ポンプとしてLC-10ADを、PDS検出器としてSPD-M10Aを、カラムオーブンとしてCTO-10ACを、そしてMS検出体としてLC-MS 2010を備えているHPLCシステム（島津、日本）を使用して取得した。
【００２１】
図２は液体クロマトグラフィーによる262nmの紫外吸収の分析結果である。本発明の精製法により得られた試料溶液の紫外光吸収の結果（図２−Ｂ）においては、主にCYNのメインのピークと、オキシ基（−OH基）が脱離したデオキシCYNのピークのみが観測された。
一方、原試料溶液をオクタデシルシリカ(octadecyl silica: ODS)カートリッジなどの疎水性カートリッジ（上記の第一段目のカートリッジに相当）のみを通過させた溶液のにおいては、多くのピークが現れ（図２−Ａ）、どこにCYNのピークが存在するのかを見ることはできない。すなわち、本クロマトグラムからは、CYNを定量分析することは困難である。
【００２２】
また、図３は、本実施例で分離されたデオキシCYNの分画の溶液とCYNの分画の溶液（紫外光吸収の分析を行った結果）とについて、それぞれ質量分析を行った結果である。本実験の意図は、他の物質が混入していないことを確認するというものである。
オキシ基が脱離したデオキシCYN（図３の上の図）については、398のピークのみが検出された。これはCYNからOH基が脱離した値に相当する。他の物質が存在するピークは無い。
CYN（図３の下の図）については、CYNに相当する414のピーク、および質量分析のために高電圧で荷電させたためにCYNの一部が欠落した313のピークが検出された。これらのピークは、いずれもCYNに由来するものと考えられるが、フラグメントの帰属を単純に行うには問題のあることが認められるものであった（欠落した部分は、O3SO-の硫酸か、核酸と同じ構造を持つベンゼン環1個全体かのいずれかと推測されるが、どちらも質量の減少が一致しないものであった）。
【００２３】
上記のことから、本方法においては、CYNおよびOH基が離脱したデオキシ（脱オキシ基）CYNのみが検出されることがわかった。
同様な操作を自然の池から採取したシリンドロスパーモプチス種の細胞から得られた試料につき行なった結果、同様の結果が得られた。例えば、シリンドロスパーモプチス種(Cylindrospermopsis sp.)の細胞は、茨城県Kohnoike Pondより採取し、凍結乾燥し、-20℃で保存した。また、自然の池から採取した環境水を直接試料として使用しても、精製・単離を目的どおり達成できてCYN測定が可能であった。
本発明の２重カートリッジカラムを使用したクロマトグラフィーにより、当該凍結乾燥された細胞(5.0g)から高純度のCYN及びデオキシ-CYNが得られ、収量はCYNについては55.0mg、デオキシ-CYNについては25.0mgであった。
核磁気共鳴分析(nuclear magnetic resonance analysis: NMR)及び高分解能高速原子衝撃法(high resolution fast-atom-bombardment: HR-FAB)MSで単離されたCYNを解析した結果、得られたデータはOhtani, I. et al., Journal of the American Chemical Society, 114, 7941-7942 (1992)〔非特許文献１〕に示されているものと良好な一致を見た。
本発明の分画法の回収効率を確認するため、CYN溶液(5mmol)を本実施例の方法で分画したところ、CYNは完全に回収できた。またCYNを含有する藻抽出液に本実施例の分画法を行なったところ、その回収率は、75±1%(±SD, n=3)であった。この結果から、藍藻類抽出液に含有される化合物の何かがCYNの単離を妨害していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、湖沼水や河川水等に含まれるアオコ毒、特にはCYN類の濃縮及び精製方法に関し、飲料水，工業用水，養殖池等におけるアオコ毒であるCYN類の分析に適用することができるものである。本発明の技術によれば、湖沼水や河川水等の液体試料からCYN類を効率よく、簡単な操作で抽出・分析できる。また、多量の液体試料の処理をより精度よく行うことができる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のCYNの簡易精製法に利用される２重カートリッジカラムとそれに適用される液体試料の流れを示す。図１中、1はCYNを含有しているかあるいは含有している可能性のある液体試料の適用を示し、2はPSポリマーカートリッジ（無極性相を固相とするカラム）であり、3は陰イオン交換可能なポリマーカートリッジ（陰イオン交換相を固相とするカラム）であり、4は溶出液を高速液体クロマトグラフィー分析などにかけられるものであることを示している。
【図２】液体クロマトグラフィーによる262nmの紫外吸収の分析結果である。図２−Ａは原試料溶液をODSカートリッジのみを通過させた溶液の紫外光吸収の結果で、図２−Ｂは本発明の精製法により得られた試料溶液の紫外光吸収の結果である。
【図３】本発明の精製法により得られた試料溶液を液体クロマトグラフィーによる分析を行った際に得られたデオキシCYNの分画の溶液とCYNの分画の溶液とについて、それぞれ質量分析を行った結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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