(57)【要約】【課題】細胞や導入薬液の種類および使用回数に左右されることなく、薬液の細胞内への注入を低コストで効率的におこなう薬液注入装置および薬液注入方法を提供すること。【解決手段】細胞２３内に薬液２２を注入する薬液注入装置および薬液注入方法であって、レーザを細胞２３の表面に光ファイバ２０を用いて導き、レーザにより細胞２３の表面に形成された開口部から薬液噴射ノズル２１を用いて薬液２２を注入することにより、細胞２３内に薬液２２を注入する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に物質を注入する物質注入装置であって、
レーザを細胞表面に導く導光手段と、
前記導光手段により細胞表面に導かれたレーザにより該細胞表面に形成された開口部から物質を注入する物質注入手段と、
を備えたことを特徴とする物質注入装置。
【請求項２】
前記物質注入手段は、細胞表面に形成された開口部に物質を噴射することにより前記細胞内に物質を注入することを特徴とする請求項１に記載の物質注入装置。
【請求項３】
前記導光手段を、前記物質注入手段の内部に配置したことを特徴とする請求項１または２に記載の物質注入装置。
【請求項４】
前記物質注入手段は、物質を噴射する噴射口の周囲に形成された吸引口により細胞の周囲にある流体を吸引することにより前記細胞を吸引口に吸着させることを特徴とする請求項３に記載の物質注入装置。
【請求項５】
前記導光手段により細胞表面に導かれたレーザの反射強度に基づいて前記導光手段の照射口と細胞表面との間の距離を判定する判定手段をさらに備えたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の物質注入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞内に物質を注入する物質注入装置および物質注入方法に関し、特に、細胞や導入物質の種類および使用回数に左右されることなく、物質の注入を低コストで効率的におこなうことができる物質注入装置および物質注入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフサイエンス分野、特に、再生医療やゲノム創薬等の分野において、細胞に、遺伝子や薬剤を注入し、細胞の性質を改変することが行われている。このような技術を用いることにより、遺伝子の役目を解明することができると共に、個人の遺伝的特定に応じた治療等を行うテーラーメード医療が可能になる。
【０００３】
そして、このような細胞を生産するため、多くの液体注入技術が提案されている。具体的には、エレクトロポレーション法等の電気的方法、リポフェクション法等の化学的方法、ウイルスベクター法等の生物的方法、マイクロインジェクション法等の機械的方法、および、レーザインジェクション法等の光学的方法が知られている。
【０００４】
このうち、エレクトロポレーション法は、電気パルスで細胞膜を破壊し、その穴から遺伝子や薬液を注入する方法である。この方法は、細胞と導入物質の組合せを選ばないという利点を有する一方、装置制御が難しく、細胞膜をうまく破壊できなかったり、逆に、細胞膜を大きく破壊し過ぎて細胞が死滅してしまったりするという欠点があり、導入成功率は数％のオーダにとどまっているという問題があった。
【０００５】
また、リポフェクション法は、荷電しているリポソームとＤＮＡとを混合し、これを細胞の表面に吸着させて、細胞内部にＤＮＡを入れる方法である。ウイルスベクター法は、ウイルスＤＮＡに導入遺伝子を組み込むことによって遺伝子組換えウイルスを作成し、この遺伝子組換えウイルスの感染機構を利用して、細胞に遺伝子導入を行う方法である。
【０００６】
しかしながら、このような化学的方法や生物的方法は、細胞と導入物質の組合せに制約が大きいという欠点がある。特に、ウイルスベクター法は、感染力の大きい細胞を用いるために感染症の危険性が比較的大きいという欠点がある。
【０００７】
マイクロインジェクション法は、１μｍ以下の径の細い針に薬液を満たし、この針を細胞に突き刺して薬液を注入する方法である(例えば、特許文献１参照)。図２１は、マイクロインジェクション法による薬液の注入方法を説明する図である。図２１に示すように、マイクロインジェクション法では、細胞３の細胞膜に針１を突き刺すと同時に、薬液２に圧力をかけ、核４のある方向に向けて薬液２を細胞３に注入する。
【０００８】
また、針１の先端は非常に細いため、薬液２を先端まで導くために、針１には細いガラスロッド５が挿入されている。これにより、ガラスロッド５と針１の内部とが作る鋭角部分で表面張力のバランスが崩れるために、薬液２が針１の先端まで導かれることになる。
【０００９】
レーザインジェクション法は、細胞の培養液中に薬液を溶かし、この細胞の細胞膜にレーザを照射することにより、針を使用しないで開口部を形成する。図２２は、レーザインジェクション法による薬液の注入方法を説明する図である。図２２に示すように、このレーザインジェクション法では、レーザ６を細胞７に照射することにより形成した開口部を介して、薬液をブラウン運動で細胞７内に侵入させる(例えば、特許文献２参照)。
【００１０】
【特許文献１】特開平８−２９０３７７号公報
【特許文献２】特開２００３−７０４６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、上述したマイクロインジェクション法の従来技術では、同一の針を繰返し使用すると、針に細胞膜の一部が付着し、針先が太くなって使用できなくなったり、薬液が針の先端に詰まって薬液が出なくなったりするため、ある程度針を使用すると針の交換が必要になるという問題があった。
【００１２】
また、レーザインジェクション法の従来技術では、細胞へのダメージを少なくするのに、できるだけビームを細くしてレーザの照射位置を精密に制御しなければならない。このため、大きな倍率の対物レンズを用いて細胞を観測する必要があり、作業効率が悪くなるという問題があった。
【００１３】
また、薬液は高価であり大量に使用することができないので、薬液の濃度を下げないよう細胞を入れる容器を小さくする必要がある。そのため、多数の細胞に薬液を注入する場合には、細胞を１つ１つ個別の容器に入れるなどして、薬液の注入作業や細胞の回収作業をおこなう必要があるため、作業効率が悪くなるという問題があった。
【００１４】
この発明は、上述した従来技術による問題点を解消するためになされたものであり、細胞や導入物質の種類および使用回数に左右されることなく、物質の注入を低コストで効率的におこなうことができる物質注入装置および物質注入方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上述した課題を解決し、目的を達成するため、本発明は、細胞内に物質を注入する物質注入装置であって、レーザを細胞表面に導く導光手段と、前記導光手段により細胞表面に導かれたレーザにより該細胞表面に形成された開口部から物質を注入する物質注入手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１６】
また、本発明は、前記物質注入手段は、細胞表面に形成された開口部に物質を噴射することにより前記細胞内に物質を注入することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明は、前記導光手段のレーザの照射口と、前記物質注入手段の噴射口とを並べて一体化したことを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は、前記導光手段を、前記物質注入手段の内部に配置したことを特徴とする。
【００１９】
また、本発明は、前記導光手段のレーザの照射口の位置が、前記物質注入手段の物質の噴射口の位置よりも凹んだ位置となるよう該導光手段を配置したことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は、前記物質注入手段は、物質を噴射する噴射口の周囲に形成された吸引口により細胞の周囲にある流体を吸引することにより前記細胞を吸引口に吸着することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明は、前記導光手段および物質注入手段を、前記細胞を収容する収容手段に配置したことを特徴とする。
【００２２】
また、本発明は、前記導光手段により細胞表面に導かれたレーザの反射強度に基づいて前記導光手段の照射口と細胞表面との間の距離を判定する判定手段をさらに備えたことを特徴とする。
【００２３】
また、本発明は、細胞内に物質を注入する物質注入方法であって、前記レーザを細胞表面に導く導光手段を用いて細胞表面にレーザを照射する照射工程と、前記照射工程により細胞表面にレーザを照射することにより形成された開口部から該細胞内に物質を注入する物質注入工程と、を含んだことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、レーザを細胞表面に導き、細胞表面に導かれたレーザにより細胞表面に形成された開口部から物質を注入することとしたので、細胞や導入物質の種類および使用回数に左右されることなく、物質の注入を低コストで効率的におこなうことができるという効果を奏する。
【００２５】
また、本発明によれば、細胞表面に形成された開口部に物質を噴射することにより細胞内に物質を注入することとしたので、物質に運動エネルギーを与えることにより物質の注入を効率的におこなうことができるという効果を奏する。
【００２６】
また、本発明によれば、レーザの照射口と、物質を噴射する噴射口とを並べて一体化したので、照射口および噴射口の位置あわせを別々に実行する必要がなくなり、物質の注入を効率的におこなうことができるという効果を奏する。
【００２７】
また、本発明によれば、レーザを細胞表面に導く導光手段を、物質を細胞内に注入する物質注入手段の内部に配置したので、導光手段と物質注入手段とを一体化し、物質注入処理を効率的におこなうことができるという効果を奏する。
【００２８】
また、本発明によれば、レーザを細胞表面に照射する照射口の位置が、物質を噴射する噴射口の位置よりも凹んだ位置となるよう配置したので、物質を細胞内に注入しやすくすることができるという効果を奏する。
【００２９】
また、本発明によれば、物質を噴射する噴射口の周囲に形成された吸引口により、細胞の周囲にある流体を吸引することにより細胞を吸引口に吸着させることとしたので、細胞が移動してしまうのを防止して、物質注入処理を容易におこなうことができるという効果を奏する。
【００３０】
また、本発明によれば、レーザを細胞表面に導く導光手段および物質を細胞内に注入する物質注入手段を、細胞を収容する収容手段に配置したので、細胞の固定と物質注入処理とを効率的におこなうことができるという効果を奏する。
【００３１】
また、本発明によれば、細胞表面に導かれたレーザの反射強度に基づいて、レーザの照射口と細胞表面との間の距離を判定することとしたので、細胞表面に開口部を形成するために細胞表面にレーザを照射するタイミングを容易に検出することができるという効果を奏する。
【００３２】
また、本発明によれば、レーザを細胞表面に導く導光手段を用いて細胞表面にレーザを照射し、細胞表面にレーザを照射することにより形成された開口部から細胞内に物質を注入することとしたので、細胞や導入物質の種類および使用回数に左右されることなく、物質の注入を低コストで効率的におこなうことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下に添付図面を参照して、本発明に係る物質注入装置および物質注入方法の好適な実施例を詳細に説明する。なお、ここでは、培養液中の細胞に薬液を注入する薬液注入装置および薬液注入方法について説明する。
【実施例１】
【００３４】
まず、実施例１に係る薬液注入装置の構成について説明する。図１は、実施例１に係る薬液注入装置における薬液注入部の構成を示す図であり、図２は、実施例１に係る薬液注入装置の全体構成を示す図である。図１に示すように、この薬液注入装置の薬液注入部は、光ファイバ２０と薬液噴射ノズル２１とを有している。
【００３５】
光ファイバ２０は、培養液２５に浸された細胞２３に開口部を形成するために照射される高出力のレーザを、細胞２３の表面近辺まで導く導光管である。この光ファイバ２０の先端は、細胞２３の核２４の方向に向けられている。レーザが細胞膜に照射されると、レーザが細胞膜で吸収されて表面温度が上昇し、細胞膜の一部が破れて開口部が形成される。
【００３６】
レーザには、Ｎｅ：ＹＡＧレーザや、Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅなどの高出力の赤外線パルスレーザを用いる。これ以外に、Ａｒガスレーザや半導体レーザなどを用いることとしてもよい。
【００３７】
薬液噴射ノズル２１は、光ファイバ２０により形成された細胞２３の開口部から、細胞２３内に薬液２２を噴射するノズルである。薬液噴射ノズル２１が薬液２２を噴射する噴射方向は、開口部を形成する光ファイバ２０の先端方向に向けて調整しておく。ここで、開口部の形成はレーザによりおこなわれるので、薬液噴射ノズル２１の先端部の径は、従来のマイクロインジェクション法の針の径よりも大きくできる。
【００３８】
レーザを照射し、薬液２２を注入する際には、細胞２３は、細胞２３を入れるシャーレ等の容器に細胞接着剤を用いて固定される。また、後で説明するように、培養液を吸引する吸引口に細胞２３を吸着させることにより細胞２３を固定することとしてもよい。
【００３９】
このように、光ファイバ２０を用いてレーザを細胞２３の表面直近にまで導き、そのレーザの照射により形成された開口部から薬液２２を注入することにより、従来のマイクロインジェクション法のように針を使用する必要がなく、また、従来のレーザインジェクション法のようなレーザの照射制御の困難さが軽減されるため、薬液２２の注入を低コストで効率的におこなうことができる。
【００４０】
さらに、細胞２３に注入する薬液２２は、薬液噴射ノズル２１内に蓄えられるため、培養液で希釈されてしまうのを防止し、少量の薬液２２で薬液注入処理を実行することができるようになる。
【００４１】
また、図２に示すように、この薬液注入装置は、光ファイバ２０、薬液噴射ノズル２１、ポンプ２６、顕微鏡２７、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ２８、光学系２９およびコントローラ３０を有する。
【００４２】
光ファイバ２０および薬液噴射ノズル２１は、すでに図１において説明したものである。ポンプ２６は、薬液噴射ノズル２１により薬液２２を排出する際に、薬液２２に圧力を加えるポンプである。顕微鏡２７は、細胞２３の位置を拡大して観察するための光学顕微鏡である。ＣＣＤカメラ２８は、顕微鏡２７により得られた細胞画像を撮影するカメラである。ＣＣＤカメラ２８により撮影された細胞画像は、パーソナルコンピュータ（図示せず）に送信され、解析される。
【００４３】
図３は、ＣＣＤカメラ２８により撮影された細胞画像３１の一例を示す図である。図３に示すように、この細胞画像３１には、細胞２３と光ファイバ２０の先端部とが映し出されており、この細胞画像３１をパーソナルコンピュータを用いて解析することにより、光ファイバ２０の先端部と細胞２３との間の距離の解析等が実行される。
【００４４】
図２の説明に戻ると、光学系２９は、細胞２３に開口部を形成する高出力のパルスレーザを生成する。また、この光学系２９は、細胞２３と光ファイバ２０の先端部との間の距離を測定するための、パルスレーザとは波長が異なる低出力のＣＷ（Continuous Wave）レーザを生成する。ＣＷレーザの波長としては、赤色波長、赤外波長などを用いることが、細胞２３にとっては好ましい。
【００４５】
図４は、光ファイバ２０の先端部および細胞２３間の距離の判定方法を説明する図である。図４に示すように、光学系２９により生成されたＣＷレーザである照射光４０は、光ファイバ２０を介して細胞２３に照射される。
【００４６】
細胞２３に照射された照射光４０は、細胞膜４２により反射されるが、光ファイバ２０の先端が細胞２３に近づくにつれ、光ファイバ２０の内部を通過して戻ってくる反射光４１の強度がしだいに大きくなる。そのため、光ファイバ２０の内部を通過して戻ってきた反射光４１の強度を検出することにより、光ファイバ２０の先端部と細胞２３との間の距離の大小を判定することができる。
【００４７】
図５は、レーザの反射光４１の強度と光ファイバ２０の先端部および細胞２３間の距離との関係を示す図である。図５に示すように、光ファイバ２０の先端部および細胞２３間の距離が大きくなるにつれて、反射光４１の強度（反射光量）が小さくなる。
【００４８】
また、光ファイバ２０の先端が細胞２３に接触した場合の反射光量の閾値をあらかじめ調べておき、実際の反射光量がその閾値に達したか否かを検出することにより、開口部を形成し、薬液２２を噴射するタイミングを適切に判定することができる。
【００４９】
図６は、図２に示した光学系２９の詳細な構成を示す図である。図６に示すように、この光学系２９は、パルスレーザ発信部５０、ＣＷレーザ発信部５１、ビームスプリッタ５２、ビームスプリッタ５３、光検出器５４を有する。
【００５０】
パルスレーザ発振部５０は、細胞２３に開口部を形成する高出力のパルスレーザを発振する。ＣＷレーザ発振部５１は、細胞２３と光ファイバ２０の先端部との間の距離を測定するためのＣＷ（Continuous Wave）レーザを発振する。ビームスプリッタ５２およびビームスプリッタ５３は、パルスレーザ発振部５０およびＣＷレーザ発振部５１により発振されたパルスレーザおよびＣＷレーザを、光ファイバ２０内に導入し、また、細胞により反射されて戻ってきた反射光４１を光検出器５４まで導くビームスプリッタである。
【００５１】
光検出器５４は、図５に示したような、ＣＷレーザの反射光強度と光ファイバ２０の先端部および細胞２３間の距離との関係に基づいて、、開口部を形成し、薬液２２を噴射するタイミングを判定する。具体的には、光検出器５４は、図５に示したような所定の閾値を、反射光４１の反射光量が越えた場合に、パルスレーザ発振部５０に対してパルスレーザを発振するよう要求する信号を出力する。
【００５２】
図２の説明に戻ると、コントローラ３０は、この薬液注入装置を全体制御する制御部であり、ポンプ２６、顕微鏡２７、ＣＣＤカメラ２８、光学系２９を制御して、薬液注入処理を実現する。
【００５３】
つぎに、実施例１に係る薬液注入装置が実行する薬液注入処理の処理手順について説明する。図７は、実施例１に係る薬液注入装置が実行する薬液注入処理の処理手順を示すフローチャートである。
【００５４】
図７に示すように、まず、ＣＷレーザ発振部５１は、ＣＷレーザを発振し、光ファイバ２０を介してＣＷレーザを細胞２３に向けて照射する（ステップＳ１０１）。そして、光検出部５４は、細胞２３によりＣＷレーザが反射された反射光量を検知する（ステップＳ１０２）。
【００５５】
続いて、光検出部５４は、検知した反射光量が所定の閾値より大きいか否かを調べ（ステップＳ１０３）、反射光量が閾値より大きくない場合には（ステップＳ１０３，Ｎｏ）、反射光量が閾値より大きくなるまで検知処理を継続する。
【００５６】
反射光量が閾値よりも大きい場合には（ステップＳ１０３，Ｙｅｓ）、パルスレーザ発振部５０は、パルスレーザを発振し、光ファイバ２０を介してパルスレーザを細胞２３に向けて照射し（ステップＳ１０４）、細胞２３の表面に開口部を形成する。
【００５７】
そして、ポンプ２６は、薬液噴射ノズル２１内の薬液２２に圧力をかけ、開口部に向けて薬液２２を噴射することにより細胞２３内に薬液２２を注入する（ステップＳ１０５）。その後、コントローラ３０は、薬液２２の注入処理の終了指示を受け付けたか否かを調べ（ステップＳ１０６）、終了指示を受け付けていない場合には（ステップＳ１０６，Ｎｏ）、つぎに薬液２２を注入する細胞２３に対して、ステップＳ１０１以降の処理を継続する。
【００５８】
薬液２２の注入処理の終了指示を受け付けた場合には（ステップＳ１０６，Ｙｅｓ）、そのままこの薬液注入処理を終了する。
【００５９】
上述してきたように、実施例１では、レーザを細胞２３の表面に光ファイバ２０を用いて導き、レーザにより細胞２３の表面に形成された開口部から薬液噴射ノズル２１を用いて薬液２２を注入することとしたので、細胞２３や導入薬液２２の種類および使用回数に左右されることなく、薬液２２の注入を低コストで効率的におこなうことができる。
【００６０】
また、実施例１では、薬液噴射ノズル２１により細胞２３の表面に形成された開口部に薬液２２を噴射することにより、細胞内に薬液２２を注入することとしたので、薬液２２に運動エネルギーを与えることにより薬液２２の注入を効率的におこなうことができる。
【００６１】
また、実施例１では、光ファイバ２０を用いて細胞２３の表面に導かれたレーザの反射強度に基づいて、光ファイバ２０のレーザの照射口と、細胞２３の表面との間の距離を判定することとしたので、細胞２３の表面に開口部を形成するために細胞２３の表面にレーザを照射するタイミングを容易に検出することができる。
【００６２】
なお、実施例１では、図１に示したように、光ファイバ２０と薬液噴射ノズル２１とを別々に設置することとしたが、光ファイバと薬液噴射ノズルとを一体化してもよい。図８は、光ファイバと薬液噴射ノズルとを一体化した薬液注入部の構成を示す図である。
【００６３】
図８に示すように、この薬液注入部では、光ファイバ６０と薬液噴射ノズル６１とが並行に溶着され、一体化されている。光ファイバ６０は、培養液６５に浸された細胞６４に開口部を形成するために照射された高出力のパルスレーザ６３を、細胞６４の表面まで導く。薬液噴射ノズル６１は、光ファイバ６０により形成された細胞６４の開口部から、細胞６４内に薬液６２を噴射する。
【００６４】
このように、この実施例１の変形例では、光ファイバ６０のレーザの照射口と、薬液噴射ノズル６１の薬液６２を噴射する噴射口とを並べて一体化したので、照射口および噴射口の位置あわせを別々に実行する必要がなくなり、薬液６２の注入を効率的におこなうことができる。
【実施例２】
【００６５】
ところで、上記実施例１では、光ファイバを薬液噴射ノズルの外部に設置することとしたが、光ファイバを薬液噴射ノズルの内部に設置することにより、光ファイバと薬液噴射ノズルとを一体化し、薬液注入処理を効率的におこなうことができる。そこで、実施例２では、光ファイバを薬液噴射ノズルの内部に設置する場合について説明することとする。また、光ファイバと薬液噴射ノズルとを一体化した薬液注入部以外の薬液注入装置の構成は、図２に示したものと同様であるので説明を省略する。
【００６６】
まず、実施例２に係る薬液注入部の構成について説明する。図９は、実施例２に係る薬液注入部の構成について説明する図である。図９に示すように、この薬液注入部は、光ファイバ７０が、薬液噴射ノズル７１の内部に配置されている。
【００６７】
光ファイバ７０は、パルスレーザやＣＷレーザを細胞の表面に導き、また、ＣＷレーザの反射光を図２に示した光学系２９に導く導光管である。薬液噴射ノズル７１は、パルスレーザにより細胞の表面に形成された開口部に向けて薬液７２を噴射することにより、細胞内に薬液７２を注入するガラス管である。実施例２においては、光ファイバ７０の外側と薬液噴射ノズル７１の内側に挟まれた領域に薬液７２が充填される。
【００６８】
ここで、細胞の大きさを１５μｍ程度、細胞核の大きさを１〜２μｍ程度とすると、薬液噴射ノズル７１の直径は５〜１０μｍ程度、光ファイバ７０の直径は３〜５μｍ程度にするのが適当である。
【００６９】
図１０は、図９に示した薬液注入部を用いて薬液７２を注入する方法を説明する図である。なお、実際には、図１０の細胞７３の周囲に培養液が充填されているが、図１０ではそれを省略している。
【００７０】
図１０に示すように、光ファイバ７０の先端が細胞７３に接触すると、光ファイバ７０からパルスレーザ７４が照射される。そして、パルスレーザ７４の照射により細胞膜の表面温度が上昇すると細胞膜の一部が破れ、パルスレーザ７４の照射直前あるいはパルスレーザ７４の照射と同時に薬液噴射ノズル７１により噴射された薬液７２が細胞７３内に流入することになる。
【００７１】
その際、光ファイバ７０の先端が近づいたときの培養液の圧力で細胞７３が押し出され、薬液注入部の先端と細胞７３とが接触しない可能性が生じるので、吸着孔７５から培養液を吸引し、細胞７３を固定しておくことが望ましい。また、光ファイバ７０を薬液噴射ノズル７１の内部に設置することにより、図２１に示したような、薬液７２を毛管現象により吸い込むロッドの役割を光ファイバ７０に兼ねさせることもできる。
【００７２】
図１１は、図９に示した薬液注入部の作成方法について説明する図である。図１１に示すように、薬液注入部を作成する場合には、まず、ガラス管７６の中に光ファイバ７０を入れ、ガスバーナー７７等でガラス管７６を加熱・溶融させる。そして、ガラス管７６を一気に引っ張って、ガラス管７６の溶融した部分を細く延ばし、延ばした部分を切断することにより薬液注入部を作成する。このガラス管７６の部分が、図９に示した薬液噴射ノズル７１となる部分である。
【００７３】
つぎに、図９に示した薬液注入部に薬液を供給する薬液供給部について説明する。図１２は、図９に示した薬液注入部に薬液を供給する薬液供給部の構成を示す図である。図１２に示すように、この薬液供給部は、薬液噴射ノズル保持部８０および光ファイバ保持部８１を有する。
【００７４】
薬液噴射ノズル保持部８０と光ファイバ保持部８１とは、ねじ８５で一体化されており、薬液噴射ノズル７１と光ファイバ７０とをそれぞれ接着面８２で接着して保持し、薬液を注入する空間と、レーザを通過させる空間とを分離している。また、薬液噴射ノズル保持部８０は、薬液を注入するためのチューブ８３を接続する継ぎ手８４を有している。
【００７５】
上述してきたように、実施例２では、レーザを細胞７３の表面に導く光ファイバ７０を、薬液７２を細胞７３内に注入する薬液噴射ノズル７１の内部に配置したので、光ファイバ７０と薬液噴射ノズル７１とを一体化し、薬液注入処理を効率的におこなうことができる。
【００７６】
なお、実施例２では、図１０に示したように、光ファイバ７０の先端の位置と薬液噴射ノズル７１の先端の位置とがほぼ一致するように薬液注入部を構成したが、レーザにより形成された開口部に薬液が入りやすくするよう、光ファイバ７０の先端の位置を薬液噴射ノズル７１の先端の位置よりも凹ませて薬液注入部を構成するようにしてもよい。
【００７７】
図１３は、光ファイバ９０の先端位置を薬液噴射ノズル９１の先端位置よりも凹ませた薬液注入部の構成を示す図である。図１３に示すように、この薬液注入部では、光ファイバ９０の先端位置が薬液噴射ノズル９１の先端位置よりも内側に凹んでいる。この凹み量は、１μｍ程度が適切である。
【００７８】
図１４は、図１３に示した薬液注入部を用いて薬液を注入する方法を説明する図である。図１４に示すように、光ファイバ９０の先端位置が薬液噴射ノズル９１の先端位置よりも内側に凹んでいるため、光ファイバ９０の先端と細胞９２との間に隙間が生じる。
【００７９】
このように、この実施例２の変形例では、光ファイバ９０のレーザの照射口の位置が、薬液噴射ノズル９１の薬液の噴射口の位置よりも凹んだ位置となるよう光ファイバ９０を配置したので、薬液を細胞９２内に注入しやすくすることができる。
【００８０】
この場合、光ファイバ９０の先端が近づいたときの培養液の圧力で細胞９２が押し出され、細胞９２が移動してしまう可能性が生じるので、細胞９２を入れるシャーレ等に形成された吸着孔９３から培養液を吸引し、細胞９２を固定しておくことが望ましい。
【実施例３】
【００８１】
ところで、実施例２では、薬液注入部の先端が近づいたときの培養液の圧力で細胞が移動してしまうのを防止するために、細胞を載せるシャーレ等に吸着孔を形成し、その吸着孔から培養液を吸引することにより細胞を固定することとしたが、薬液注入部に培養液の吸引部を形成して培養液を吸引し、細胞を固定することとしてもよい。
【００８２】
これにより、レーザ照射時の衝撃により細胞が移動してしまうのを防止することができる。また、シャーレ内の培養液の吸引をおこないながら薬液注入部の先端を移動させることにより、シャーレ内の培養液の動きを乱すことなく薬液注入部を移動させることができる。
【００８３】
そこで、実施例３では、薬液注入部に液体吸引管を形成して培養液を吸引し、細胞を固定する場合について説明する。また、培養液の吸引部が形成された薬液注入部以外の薬液注入装置の構成は、図２に示したものと同様であるので説明を省略する。
【００８４】
まず、実施例３に係る薬液注入部の構成について説明する。図１５は、実施例３に係る薬液注入部の構成について説明する図である。図１５に示すように、この薬液注入部は、光ファイバ１００が、薬液噴射ノズル１０１の内部に配置され、薬液噴射ノズル１０１が、液体吸引管１０２の内部に配置されている。
【００８５】
光ファイバ１００は、パルスレーザやＣＷレーザを細胞の表面に導き、また、ＣＷレーザの反射光を図２に示した光学系２９に導く導光管である。薬液噴射ノズル１０１は、パルスレーザにより細胞の表面に形成された開口部に向けて薬液を噴射することにより、細胞内に薬液を注入するガラス管である。薬液は、光ファイバ１００の外側と薬液噴射ノズル１０１の内側に挟まれた領域に充填されている。
【００８６】
また、液体吸引管１０２は、細胞を入れたシャーレ等に蓄えられている培養液を吸引するガラス管である。この液体吸引管１０２には、図２に示したポンプ２６が接続され、薬液噴射ノズル１０１の外側と液体吸引管１０２の内側に挟まれた領域から培養液が吸引される。
【００８７】
図１６は、図１５に示した薬液注入部を用いて薬液を注入する方法を説明する図である。なお、実際には、図１６の細胞１０３の周囲に培養液が充填されているが、図１６ではそれを省略している。
【００８８】
図１６に示すように、薬液注入部を細胞１０３に近づける際、液体吸引管１０２と薬液噴射ノズル１０１との間の領域から、シャーレ内の培養液が吸引され、細胞１０３が薬液注入部の先端の方に吸引される。
【００８９】
そして、光ファイバ１００の先端が細胞１０３に接近すると、光ファイバ１００からパルスレーザ１０４が照射される。その後、パルスレーザ１０４の照射により細胞１０３の表面温度が上昇すると細胞膜の一部が破れ、薬液噴射ノズル１０１により噴射された薬液が細胞１０３内に流入する。
【００９０】
この薬液注入部は、図１７に示すように、シャーレの底部に形成することとしてもよい。図１７は、シャーレ１１１の底部に形成された薬液注入部を示す図である。図１７に示すように、薬液注入部１１０によりシャーレ１１１内の培養液が吸引されると、細胞１０３が薬液注入部１１０の先端部分に吸着されることになる。この場合には、細胞１０３の位置が容易に変化して薬液注入部１１０の先端部分に細胞１０３が吸着するよう、シャーレ１１１内に培養液の流れをつくることが望ましい。
【００９１】
図１８は、細胞１０３を含んだ培養液の流れをシャーレ１１１内につくる方法を説明する図である。図１８に示すように、この方法では、細胞供給ノズル１１２から細胞１０３を含んだ培養液を円形のシャーレ１１１の縁をめがけて噴射することにより、シャーレ１１１内に培養液の渦をつくる。
【００９２】
これにより、細胞１０３は培養液よりもやや重いので、薬液注入部１１０が形成されたシャーレ１１１底部の中央に集まり、細胞１０３の吸着が容易にできるようになる。薬液の注入がなされた細胞１０３は、ピペット１１３により取り出され、培養用のシャーレ（図示せず）に移されることになる。
【００９３】
つぎに、図１５に示した薬液注入部に薬液を供給する薬液供給部について説明する。図１９は、図１５に示した薬液注入部に薬液を供給する薬液供給部の構成を示す図である。図１９に示すように、この薬液供給部は、液体吸引管保持部１１４、薬液噴射ノズル保持部１１５および光ファイバ保持部１１６を有する。
【００９４】
液体吸引管保持部１１４、薬液噴射ノズル保持部１１５および光ファイバ保持部１１６は、ねじ１２２およびＯリング１２３を用いて一体化されており、液体吸引管１０２、薬液噴射ノズル１０１および光ファイバ１００をそれぞれ接着面１１７で接着して保持し、培養液を吸引する空間と、薬液を注入する空間と、レーザを通過させる空間とを分離している。
【００９５】
また、液体吸引管保持部１１４は、培養液を吸引するためのチューブ１２０を接続する継ぎ手１２１を有し、薬液噴射ノズル保持部１１５は、薬液を注入するためのチューブ１１８を接続する継ぎ手１１９を有している。
【００９６】
つぎに、実施例３に係る薬液注入装置が実行する薬液注入処理の処理手順について説明する。図２０は、実施例３に係る薬液注入装置が実行する薬液注入処理の処理手順を示すフローチャートである。
【００９７】
図２０に示すように、まず、ＣＷレーザ発振部５１は、ＣＷレーザを発振し、光ファイバ１００を介してＣＷレーザを細胞１０３に向けて照射する（ステップＳ２０１）。そして、ポンプ２６は、液体吸引管１０２を介して培養液の吸引を開始し（ステップＳ２０２）、細胞１０３を薬液注入部の先端に吸引する。続いて、光検知器５４は、ＣＷレーザが細胞１０３により反射された反射光量を検知する（ステップＳ２０３）。
【００９８】
その後、光検出部５４は、検知した反射光量が所定の閾値より大きいか否かを調べ（ステップＳ２０４）、反射光量が閾値より大きくない場合には（ステップＳ２０４，Ｎｏ）、反射光量が閾値より大きくなるまで検知処理を継続する。
【００９９】
反射光量が閾値よりも大きい場合には（ステップＳ２０４，Ｙｅｓ）、パルスレーザ発振部５０は、パルスレーザを発振し、光ファイバ１００を介してパルスレーザを細胞１０３に向けて照射し（ステップＳ２０５）、細胞１０３の表面に開口部を形成する。
【０１００】
そして、ポンプ２６は、薬液噴射ノズル１０１内の薬液に圧力をかけ、開口部に向けて薬液を噴射することにより細胞１０３内に薬液を注入する（ステップＳ２０６）。その後、コントローラ３０は、薬液の注入処理の終了指示を受け付けたか否かを調べ（ステップＳ２０７）、終了指示を受け付けていない場合には（ステップＳ２０７，Ｎｏ）、つぎに薬液を注入する細胞１０３に対して、ステップＳ２０１以降の処理を継続する。
【０１０１】
薬液の注入処理の終了指示を受け付けた場合には（ステップＳ２０７，Ｙｅｓ）、そのままこの薬液注入処理を終了する。
【０１０２】
上述してきたように、実施例３では、薬液噴射ノズル１０１の薬液噴射口の周囲に形成された液体吸引管１０２の吸引口により、細胞１０３の周囲にある培養液を吸引することにより細胞１０３を吸引口に吸着させることとしたので、細胞１０３が移動してしまうのを防止して、薬液注入処理を容易におこなうことができる。
【０１０３】
また、実施例３では、薬液を細胞１０３内に注入する薬液注入部１１０を、細胞１０３を収容するシャーレ１１１に配置したので、細胞１０３の固定と薬液注入処理とを効率的におこなうことができる。
【０１０４】
（付記１）細胞内に物質を注入する物質注入装置であって、
レーザを細胞表面に導く導光手段と、
前記導光手段により細胞表面に導かれたレーザにより該細胞表面に形成された開口部から物質を注入する物質注入手段と、
を備えたことを特徴とする物質注入装置。
【０１０５】
（付記２）前記物質注入手段は、細胞表面に形成された開口部に物質を噴射することにより前記細胞内に物質を注入することを特徴とする付記１に記載の物質注入装置。
【０１０６】
（付記３）前記導光手段のレーザの照射口と、前記物質注入手段の物質を噴射する噴射口とを並べて一体化したことを特徴とする付記２に記載の物質注入装置。
【０１０７】
（付記４）前記導光手段を、前記物質注入手段の内部に配置したことを特徴とする付記１または２に記載の物質注入装置。
【０１０８】
（付記５）前記導光手段のレーザの照射口の位置が、前記物質注入手段の物質の噴射口の位置よりも凹んだ位置となるよう該導光手段を配置したことを特徴とする付記４に記載の物質注入装置。
【０１０９】
（付記６）前記物質注入手段は、物質を噴射する噴射口の周囲に形成された吸引口により細胞の周囲にある流体を吸引することにより前記細胞を吸引口に吸着させることを特徴とする付記４または５に記載の物質注入装置。
【０１１０】
（付記７）前記導光手段および物質注入手段を、前記細胞を収容する収容手段に配置したことを特徴とする付記６に記載の物質注入装置。
【０１１１】
（付記８）前記導光手段により細胞表面に導かれたレーザの反射強度に基づいて前記導光手段の照射口と細胞表面との間の距離を判定する判定手段をさらに備えたことを特徴とする付記１〜７のいずれか１つに記載の物質注入装置。
【０１１２】
（付記９）細胞内に物質を注入する物質注入方法であって、
前記レーザを細胞表面に導く導光手段を用いて細胞表面にレーザを照射する照射工程と、
前記照射工程により細胞表面にレーザを照射することにより形成された開口部から該細胞内に物質を注入する物質注入工程と、
を含んだことを特徴とする物質注入方法。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
以上のように、本発明にかかる物質注入装置および物質注入方法は、細胞や導入物質の種類および使用回数に左右されることなく、物質の注入を低コストで効率的におこなうことができる物質注入システムに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】実施例１に係る薬液注入装置における薬液注入部の構成を示す図である。
【図２】実施例１に係る薬液注入装置の全体構成を示す図である。
【図３】ＣＣＤカメラにより撮影された細胞画像の一例を示す図である。
【図４】光ファイバの先端部および細胞間の距離の判定方法を説明する図である。
【図５】レーザの反射光の強度と光ファイバの先端部および細胞間の距離との関係を示す図である。
【図６】図２に示した光学系の詳細な構成を示す図である。
【図７】実施例１に係る薬液注入装置が実行する薬液注入処理の処理手順を示すフローチャートである。
【図８】光ファイバと薬液噴射ノズルとを一体化した薬液注入部の構成を示す図である。
【図９】実施例２に係る薬液注入部の構成について説明する図である。
【図１０】図９に示した薬液注入部を用いて薬液を注入する方法を説明する図である。
【図１１】図９に示した薬液注入部の作成方法について説明する図である。
【図１２】図９に示した薬液注入部に薬液を供給する薬液供給部の構成を示す図である。
【図１３】光ファイバの先端位置を薬液噴射ノズルの先端位置よりも凹ませた薬液注入部の構成を示す図である。
【図１４】図１３に示した薬液注入部を用いて薬液を注入する方法を説明する図である。
【図１５】実施例３に係る薬液注入部の構成について説明する図である。
【図１６】図１５に示した薬液注入部を用いて薬液を注入する方法を説明する図である。
【図１７】シャーレの底部に形成された薬液注入部を示す図である。
【図１８】細胞を含んだ培養液の流れをシャーレ内につくる方法を説明する図である。
【図１９】図１５に示した薬液注入部に薬液を供給する薬液供給部の構成を示す図である。
【図２０】実施例３に係る薬液注入装置が実行する薬液注入処理の処理手順を示すフローチャートである。
【図２１】マイクロインジェクション法による薬液の注入方法を説明する図である。
【図２２】レーザインジェクション法による薬液の注入方法を説明する図である。
【符号の説明】
【０１１５】
１    針
２，２２，６２，７２    薬液
３，７，２３，６４，７３，９２，１０３    細胞
４，８，２４    核
５    ガラスロッド
６    レーザ
９    薬液＋培養液
２０，６０，７０，９０，１００    光ファイバ
２１，６１，７１，９１，１０１    薬液噴射ノズル
２５，６５    培養液
２６    ポンプ
２７    顕微鏡
２８    ＣＣＤカメラ
２９    光学系
３０    コントローラ
３１    細胞画像
４０    照射光
４１    反射光
４２    細胞膜
５０    パルスレーザ発振部
５１    ＣＷレーザ発振部
５２，５３    ビームスプリッタ
５４    光検知器
６３，７４，１０４    パルスレーザ
７５，９３    吸着孔
７６    ガラス管
７７    ガスバーナー
８０，１１５    薬液噴射ノズル保持部
８１，１１６    光ファイバ保持部
８２，１１７    接着面
８３，１１８，１２０    チューブ
８４，１１９，１２１    継ぎ手
８５，１２２    ねじ
１０２    液体吸引管
１１０    薬液注入部
１１１    シャーレ
１１２    細胞供給ノズル
１１３    ピペット
１１４    液体吸引管保持部
１２３    Ｏリング
【図１】
2006000016.tif 000003
【図２】
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【図３】
2006000016.tif 000005
【図４】
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【図５】
2006000016.tif 000007
【図６】
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【図７】
2006000016.tif 000009
【図８】
2006000016.tif 000010
【図９】
2006000016.tif 000011
【図１０】
2006000016.tif 000012
【図１１】
2006000016.tif 000013
【図１２】
2006000016.tif 000014
【図１３】
2006000016.tif 000015
【図１４】
2006000016.tif 000016
【図１５】
2006000016.tif 000017
【図１６】
2006000016.tif 000018
【図１７】
2006000016.tif 000019
【図１８】
2006000016.tif 000020
【図１９】
2006000016.tif 000021
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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