(57)【要約】【課題】グルコースの良好な拡散を維持しつつ、少なくとも４０℃の温度までセンシング膜から酵素等が溶出するのを抑制した光学式グルコースセンサチップを提供する。【解決手段】ガラス基板と、この基板主面に形成され、その基板内に光を入射、放出させるための一対のグレーティングと、このグレーティング間に位置する前記基板主面に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１の酵素、この酵素による生成物と反応して発色剤を発色させる物質を発生する第２の酵素が、膜形成高分子化合物および架橋性高分子化合物により形成される膜体に保持されているグルコースセンシング膜とを備えることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板の主面に形成され、前記基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、
前記光学要素間に位置する前記基板主面に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１の酵素、前記酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２の酵素が、膜形成高分子化合物および架橋性高分子化合物により形成される膜体に保持されているグルコースセンシング膜と、
を備えることを特徴とする光学式グルコースセンサチップ。
【請求項２】
ガラス基板と、
前記ガラス基板の主面に形成され、前記ガラス基板内に光を入射させ、前記ガラス基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、
前記光学要素が形成された前記基板の主面に形成され、前記基板より高屈折率の樹脂からなる光反射路層と、
前記光反射路層上の前記光学要素間に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１の酵素、前記酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２の酵素が、膜形成高分子化合物および架橋性高分子化合物により形成される膜体に保持されているグルコースセンシング膜と、
を備えることを特徴とする光学式グルコースセンサチップ。
【請求項３】
前記架橋性高分子化合物は、親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体であることを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
【請求項４】
前記架橋性高分子化合物は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、イオン性官能基から選ばれる少なくとも１つに基を持つ親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体であることを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
【請求項５】
前記親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体であることを特徴とする請求項３または４記載の光学式グルコースセンサチップ。
【請求項６】
前記グルコースセンシング膜は、透水性を付与するためのポリエチレングリコールをさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
【請求項７】
前記第１の酵素は、グルコースオキシターゼであり、前記第２の酵素はペルオキシターゼであり、前記発色剤は、３，３，５，５−テトラメチルベンジジンまたはＮ，Ｎ’−ビス（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）トリジンの少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
【請求項８】
前記膜形成高分子化合物は、非イオン性セルロース誘導体であることを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
【請求項９】
前記非イオン性セルロース誘導体は、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびヒドロキアルキルアルキルセルロースの群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項８記載の光学式グルコースセンサチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学式グルコースセンサチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
光学式グルコースセンサチップとしては、例えば皮下組織の体液抽出で血糖値を間接的に調べる低侵襲型血糖測定用のものが開発されている。このセンサチップは、ガラス基板と、この基板表面に形成され、その基板内に光を入射、放出させるための一対のグレーティングと、このグレーティング間に位置する前記基板表面に形成されるグルコースセンシング膜とを備えた構造を有する。このグルコースセンシング膜は、発色剤（例えば３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ））、グルコースを酸化または還元させる酵素（例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ））、この第１の酵素による生成物と反応して発色剤を発色させる物質を発生する第２の酵素（例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））、および膜形成高分子化合物（例えばカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体）を含有する。
【０００３】
このような構造のグルコースセンサチップにおいて、皮膚と前記センシング膜の間にシート状ゲルを配して電界をかけると、皮下組織液中のグルコースが皮膚からゲルを透過して前記センシング膜に到達する。このとき、前記センシング膜中の発色剤であるＴＭＢＺがグルコースとＧＯＤ，ＰＯＤの反応に起因して発色する。この状態で光を前記基板に入射しその基板表面と前記一方のグレーディングで屈折させると、その光は前記基板と発色したＴＭＢＺを含むセンシング膜の界面を伝播し、基板と他方のグレーティングの界面で屈折し、例えば受光素子で受光される。この受光したレーザ光強度は、前記グルコースセンシング膜の発色剤の発色により非発色時に受光素子で受光した光強度（初期強度）に比べて低下した値になり、その低下率から前記グルコースの濃度を検出する。
【０００４】
皮下組織液中のグルコースを皮膚からセンシング膜に到達させる方法として、リバースイオントフォレシス法も考えられる。このリバースイオントフォレシス法では、貫通穴（ウエル）を有するアダプタを皮膚に当接させ、このアダプタにセンサチップをそのセンシング膜がウエル側に位置するように取り付け、前記ウエル内に水を含む抽出媒体を満たし、外部から微小電圧を加えて皮下組織液中のグルコースを皮膚から抽出媒体に抽出させ、さらに前記センシング膜に到達させてグルコース量を検出する方法である。このようなリバースイオントフォレシス法では水を含む抽出媒体を用いることから次のような問題が生じる。
【０００５】
すなわち、前記グルコースセンサチップのセンシング膜は高分子量で水に溶けに難いくいＣＭＣのような膜形成高分子化合物をバインダとして含むため、室温では水を含む抽出媒体であっても溶解が抑制されてチップ感度が保たれる。しかしながら、前記抽出媒体が加温状態になると、センシング膜の溶解が促進されるためにセンシング膜から発色剤や酵素が溶出され、チップ感度が低下するという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、グルコースの良好な拡散を維持しつつ、少なくとも４０℃の温度までセンシング膜から発色剤や酵素等が溶出するのを抑制した光学式グルコースセンサチップを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、基板と、前記基板の主面に形成され、前記基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、前記光学要素間に位置する前記基板主面に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１の酵素、前記酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２の酵素が、膜形成高分子化合物および架橋性高分子化合物により形成される膜体に保持されているグルコースセンシング膜と、を備えることを特徴とする光学式グルコースセンサチップが提供される。
【０００８】
本発明によると、ガラス基板と、前記ガラス基板の主面に形成され、前記ガラス基板内に光を入射させ、前記ガラス基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、前記光学要素が形成された前記基板の主面に形成され、前記基板より高屈折率の樹脂からなる光反射路層と、前記光反射路層上の前記光学要素間に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１の酵素、前記酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２の酵素が、膜形成高分子化合物および架橋性高分子化合物により形成される膜体に保持されているグルコースセンシング膜と、を備えることを特徴とする光学式グルコースセンサチップが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、グルコースの良好な拡散を維持しつつ、センシング膜の溶解を抑制し、加温状態でも検体中のグルコース量を定量的に検出する光学式グルコースセンサチップを提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明に係る光学式グルコースセンサチップを図面を参照して詳細に説明する。
【００１１】
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る光学式グルコースセンサチップを示す断面図である。
【００１２】
ガラス基板１は、主面に例えば３ｎｍ以上の厚さのＳｉＯ2表層２を有する。光学要素は、前記ＳｉＯ2表層２の両端部付近表面にその基板１内に光を入射、あるいは基板１内の光を放出させるためにそれぞれ形成されているもので、一対のグレーティング３を用いている。なお光学要素はプリズムなどで代用してもよい。これらのグレーティング３は、前記ＳｉＯ2表層２より高い屈折率を有する例えば酸化チタンからなる。前記グレーティング３に比べて低屈折率を有する保護膜を、前記グレーティング３を覆うように形成してもよい。保護膜の材料は使用する薬液・検体と反応しないもの、例えばフッ素樹脂からなる。
【００１３】
グルコースセンシング膜４は、前記グレーティング３間に位置する前記基板１のＳｉＯ2表層２に形成されている。このグルコースセンシング膜４は、膜形成高分子化合物および架橋性高分子化合物による膜体で構成されており、この膜体は、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１の酵素、この酵素による生成物と反応して発色剤を発色させる物質を発生する第２の酵素を、活性を保ったままで保持している。
【００１４】
前記グルコースセンシング膜４中の酵素および発色剤は、例えば下記表１に示す組み合わせで用いられる。
【００１５】
【表１】
2006275994.tif 000003
【００１６】
前記グルコースセンシング膜４に用いる膜形成高分子化合物としては、例えばセルロース系高分子化合物を挙げることができる。セルロース系高分子化合物としては、イオン性セルロース誘導体または非イオン性セルロース誘導体を用いることができる。
【００１７】
イオン性セルロース誘導体は、例えばカルボキシメチルセルロース、硫酸セルロースまたはその塩化合物等のアニオン性セルロース誘導体およびその塩化合物、キチン、キトサン等のカチオン性セルロース誘導体またはそれらの塩酸塩などの塩化合物等を挙げることができ、これらは単体または混合物の形態で用いることができる。ここで、塩化合物としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。
【００１８】
非イオン性セルロース誘導体は、例えばメチルセルロース、エチルセルロースのようなアルキルセルロース；ヒドロキエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのようなヒドロキアルキルセルロース；ヒドロキプロピルメチルセルロース、ヒドロキプロピルエチルセルロース、ヒドロキジエチルセルロース、ヒドロキエチルメチルセルロースのようなヒドロキアルキルアルキルセルロース；およびミクロフィブロ化セルロース等を挙げることができ、これらは単体または混合物の形態で用いることができる。
【００１９】
前記グルコースセンシング膜４に用いる架橋性高分子化合物としては、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、イオン性官能基から選ばれる少なくとも１つに基を持つ親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体を挙げることができる。この親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体は、特に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体であることが好ましいことを実験にて確認している。
【００２０】
前記架橋性高分子化合物は、前記グルコースセンシング膜にこのグルコースセンシング膜の全組成物に関する重量比で１０-4〜１０重量％含有されることが好ましい。架橋性高分子化合物の含有量を全組成物に関する重量比で１０-4重量％未満にすると、加温状態で膜体の膜構造が溶解して崩壊したり、膜構造中の空隙に保持している発色剤や酵素等が外部媒体に溶出したりすることを防ぐことが困難になる。他方、架橋性高分子化合物の含有量が１０重量％を超えると、グルコースセンシング膜中の発色剤や酵素の量が相対的に低下してチップ感度が低下する虞がある。
【００２１】
前記グルコースセンシング膜４は、膜構造の空隙中に透水性を付与するためのポリエチレングリコールまたはエチレングリコールをさらに含むことを許容する。これにより親水性が高まり、水をグルコース導入用の媒体にする場合には反応感度が高まる。
【００２２】
次に、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップの作用を説明する。
【００２３】
検体、例えば人体の皮膚に貫通穴（ウエル）を有するアダプタ（図示せず）を当接させ、このアダプタに前述したセンサチップをそのグルコースセンシング膜４がウエル側に位置するように取り付ける。アダプタはグルコースセンシング膜４が検体と直接接触するのを回避させ、センシングの再現性を高めることに寄与する。これにより生じる空隙、前記ウエル内に抽出媒体（例えば水、生理食塩水などの液体、検体やセンシング膜と直接的に反応せず、馴染むもの）を満たし、外部から検体に微小電圧を加えることにより、皮下組織液中のグルコースは皮膚から抽出媒体に抽出され、さらに抽出媒体から前記センシング膜４に浸透する。グルコースセンシング膜４を構成する酵素（酸化または還元酵素）、および発色剤の組み合わせが、例えば前記表１に示すにグルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）および３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）である場合、センシング膜４に浸透されたグルコースはＧＯＤによりを分解して過酸化水素を発生し、ＰＯＤによりこの過酸化水素を分解して活性な酸素を放出し、この活性な酸素によりＴＭＢＺを発色させる。つまり、グルコース量に応じてＴＭＢＺの発色度合が変化する。
このような状態で、前記レーザ光源（例えばレーザダイオード）５からレーザ光を図示しない偏光フィルタを通して前記基板１裏面側に入射することにより、そのレーザ光が基板１のＳｉＯ2表層２と左側のグレーティング３の界面で屈折し、さらにＳｉＯ2表層２と発色した発色剤を含むグルコースセンシング膜４の界面で屈折してＳｉＯ2表層２を含む基板１を伝播する。この際、伝播する光のエバネッセント波は前記グルコースセンシング膜４でのグルコース量に基づく発色度合に応じて吸収される。前記基板１を伝播した光は、右側のグレーティング１２から放出され、受光素子（例えばフォトダイオード）６で受光される。受光したレーザ光強度は、センシング膜４の非発色時に受光した光強度（初期強度）に比べて低下した値になり、その低下率からグルコース量を検出することが可能になる。
【００２４】
第１実施形態の光学式グルコースセンサチップによるグルコース量の検出において、グルコースセンシング膜４は架橋性高分子化合を含み、高い耐膜溶解性を有するため、皮下組織液中のグルコースを皮膚から水を含む抽出媒体に抽出され、さらにグルコースセンシング膜４に浸透させる際、加温（例えば３６℃前後）された水がグルコースと共にセンシング膜４に浸透しても、溶解されず、その膜中の酵素等の溶出が抑制される。
【００２５】
特に、架橋性高分子化合物として例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、イオン性官能基から選ばれる少なくとも１つに基を持つ親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体を用いることによって、前記親水性モノマーによるグルコースセンシング膜での水の保持性を向上して、高い透水性を維持できると共に、疎水性モノマーによる高い耐膜溶解性を付与できる。このため、前記センシング膜において前記グルコースの存在による発色が十分になされて、良好な感度を維持しながら、膜構造の溶解や、加温状態での保持物質の溶解、酵素等の溶出をより確実に抑制できる。
【００２６】
したがって、第１実施形態によれば加温状態でも検体中のグルコース量を長期間に亘って高感度で検出することが可能な光学式グルコースセンサチップ提供することができる。
【００２７】
（第２実施形態）
図２は、第２実施形態に係る光学式グルコースセンサチップを示す断面図である。
【００２８】
ガラス基板１１主面の両端部付近には、光学要素である一対のグレーティング１２がその基板１１に光を入射、放出させるためにそれぞれ形成されている。これらのグレーティング１２は、前記基板１１より高い屈折率を有する例えば酸化チタンから作られている。前記基板１１より高屈折率の熱硬化性または光硬化性の樹脂からなる光反射路層１３は、前記グレーティング１２を含む前記基板１１の主面に形成されている。光反射路層１３の主面は、前記グレーティング１２を含む前記基板１１の主面に平行になるように形成されている。グルコースセンシング膜１４は、前記グレーティング１２間に対応する前記光反射路層１３部分の上に形成されている。このグルコースセンシング膜１４は、グルコースを酸化または還元させる酵素、この酵素による生成物と反応して発色剤を発色させる物質を発生する酵素、発色剤、膜形成高分子化合物および架橋性高分子化合物を含む。
【００２９】
前記光反射路層１３は、表面が平滑で、１０μｍ以上、より好ましくは１０〜２００μｍの厚さを有することが好ましい。１０μｍ以上の厚さを有する光反射路層は、光の伝播時における光強度の減衰を抑えることが可能になり、例えばレーザ光源のほかにＬＥＤ光源を用いることが可能になる。
【００３０】
前記グルコースセンシング膜１４中の酵素および発色剤は、例えば前記表１に示す組み合わせで用いられる。
【００３１】
前記グルコースセンシング膜１４中の膜形成高分子化合物としては、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシセルロース等のセルロース系高分子化合物を挙げることができる。この親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体は、特に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体であることが好ましいことが実験で確認されている。
【００３２】
前記グルコースセンシング膜１４中の架橋性高分子化合物としては、第１実施形態で説明した例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、イオン性官能基から選ばれる少なくとも１つに基を持つ親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体を挙げることができる。
【００３３】
前記架橋性高分子化合物は、第１実施形態で説明した理由から前記グルコースセンシング膜に１０-4〜１０重量％含有されることが好ましい。
【００３４】
前記グルコースセンシング膜４は、透水性を付与するためのポリエチレングリコールをさらに含むことを許容する。
【００３５】
次に、前述した図２に示す光学式グルコースセンサチップの作用を説明する。
【００３６】
検体、例えば人体の皮膚に貫通穴（ウエル）を有するアダプタ（図示せず）を当接させ、このアダプタに前述したセンサチップをそのグルコースセンシング膜１４がウエル側に位置するように取り付ける。前記ウエル内に水を含む抽出媒体を満たし、外部から微小電圧を加えることにより、皮下組織液中のグルコースは皮膚から媒体に抽出され、さらに前記センシング膜１４に浸透する。グルコースセンシング膜１４を構成する酵素（酸化または還元酵素）および発色剤の組み合わせが、例えば前記表１に示すにグルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）および３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）である場合、センシング膜１４に浸透されたグルコースはＧＯＤによりを分解して過酸化水素を発生し、ＰＯＤによりこの過酸化水素を分解して活性な酸素を放出し、この活性な酸素によりＴＭＢＺを発色させる。つまり、グルコース量に応じてＴＭＢＺの発色度合が変化する。
このような状態で、前記光源（例えばレーザダイオード）１５からレーザ光を図示しない偏光フィルタを通して前記基板１１裏面側に入射することにより、そのレーザ光は基板１１を通してその主面と左側のグレーティング１２の界面で屈折されて光導波路層１３に入射され、さらにこの光導波路層１３と発色した発色剤を含むグルコースセンシング膜１４の界面で屈折されてその光導波路層１３を伝播する。この際、伝播される光のエバネッセント波は前記グルコースセンシング膜１４でのグルコース量に基づく発色度合に応じて吸収される。前記光導波路層１３を伝播した光は、右側のグレーティング１２から放出され、受光素子（例えばフォトダイオード）１６で受光される。受光したレーザ光強度はセンシング膜１４の非発色時に受光した光強度（初期強度）に比べて低下した値になり、その低下率からグルコース量を検出することが可能になる。
【００３７】
第２実施形態の光学式グルコースセンサチップによるグルコース量の検出において、グルコースセンシング膜１４は架橋性高分子化合を含み、高い耐膜溶解性を有するため、皮下組織液中のグルコースを皮膚から水を含む抽出媒体に抽出し、さらにグルコースセンシング膜１４に浸透させる際、加温（例えば３６℃前後）された水がグルコースと共にセンシング膜１４に浸透しても、膜体の膜構造が溶解されず、その膜体中に保持されている酵素等の溶出が抑制される。
【００３８】
特に、架橋性高分子化合物として例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、イオン性官能基から選ばれる少なくとも１つに基を持つ親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体を用いることによって、前記親水性モノマーによるグルコースセンシング膜での水の保持性を向上して、高い透水性を維持できると共に、疎水性モノマーによる高い耐膜溶解性を付与できる。このため、前記センシング膜において前記グルコースの存在による発色が十分になされて、良好な感度を維持しながら、加温状態での膜体の膜構造の崩壊、膜体保持されている発色剤や酵素の溶出をより確実に抑制できる。
【００３９】
したがって、第２実施形態によれば加温状態でも検体中のグルコース量を長期間に亘って高感度で検出することが可能な光学式グルコースセンサチップ提供することができる。
【００４０】
また、前述した第１、第２の実施形態において、センシング膜に配合される膜形成高分子化合物としてヒドロキシエチルセルロースのような非イオン性セルロース誘導体を用いることが有用である。
【００４１】
すなわち、カルボキシメチルセルロースのようなイオン性セルロース誘導体を膜形成高分子化合物としてセンシング膜に配合すると、抽出媒体の塩濃度の変化に伴って粘度等の物性値が変動するため、検体中のグルコース量の検出感度が変動する。前述した非イオン性セルロース誘導体は、抽出媒体の塩濃度が変化しても粘度等の物性値が変動しないため、抽出媒体に含まれる塩濃度変化に対する検体中のグルコース量の検出感度依存性を示さないセンシング膜を設計することが可能になる。
【００４２】
したがって、非イオン性セルロース誘導体を膜形成高分子化合物としてセンシング膜に配合することによって、抽出媒体に含まれる塩濃度が変化（例えば０．００００１ｗｔ％から１ｗｔ％にＮａＣｌの濃度が変化）しても検体中のグルコース量を安定した感度で検出することが可能な光学式グルコースセンサチップ提供することができる。
【００４３】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００４４】
（実施例１）
イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）１４３６μＬ、純水９５６μＬ、０．０１モル／Ｌ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液２１０μＬ、１体積％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のイソプロピルアルコール溶液６０μＬ、１ｍｇ／ｍＬの３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、のイソプロピルアルコール溶液６００μＬ、２重量％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液６４０μＬ、１重量％の架橋高分子化合物（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体）水溶液８μＬ、０．６７ｍｇ／ｍＬのペルオキシターゼ（ＰＯＤ）溶液（０．０１モル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ：６．０）に溶解）および５．３３ｍｇ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）溶液（０．０１モル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ：６．０）に溶解）を混合、撹拌してグルコースセンシング膜生成用塗布液４０００μＬを調製した。
【００４５】
次いで、主面に厚さ１０ｎｍのＳｉＯ2表層を有する屈折率１．５２の無アルカリガラス基板を用意し、この基板のＳｉＯ2表層に屈折率２．２〜２．４、厚さ５０ｎｍの酸化チタン膜をスパッタリングにより成膜した。つづいて、この酸化チタン膜に上にレジストの塗付、乾燥、リソグラフィーによりレジストパターンを形成した。ひきつづき、レジストパターンをマスクとしてリアクティブイオンエッチングにより酸化チタン膜を選択的に除去することにより、前記ＳｉＯ2表層の両端部付近表面にグレーティングを形成した後、レジストパターンをアッシングにより除去した。
【００４６】
次いで、前記基板を酸素ＲＩＥによりドライ洗浄した後、ダイシングにより１７ｍｍ×６．５ｍｍの寸法に裁断してチップ形状にした。つづいて、前記グルコースセンシング膜生成用塗布液を前記基板のグレーティング間に位置するセンシング膜形成領域の表面に８μＬ滴下する。不活性ガスのパージ、真空乾燥により乾燥させて多孔質（透水性）で厚さ０．８μｍの膜体を形成し、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップを製造した。なお、滴下されたグルコースセンシング膜生成用塗布液の液滴は以下の組成を有するものであった。
【００４７】
・リン酸緩衝液：０．０００５２５モル／Ｌ
・ＰＥＧ：０．１５体積％
・ＴＭＢＺ：０．１５ｍｇ／ｄＬ
・ＰＯＤ：０．００１５ｍｇ／ｍＬ
・ＧＯＤ：０．０１２ｍｇ／ｍＬ
・ＣＭＣ：０．３２重量％
・２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体：０．００２重量％
貫通穴（ウエル）を有するアダプタを適切な平板（例えばガラス板）に当接させ、このアダプタに前述したセンサチップをそのグルコースセンシング膜がウエル側に位置するように取り付け、ウエルを区画した。グルコースを０ｍｇ／ｄＬ（含まない），０．０５ｍｇ／ｄＬ，０．２ｍｇ／ｄＬ，０．５ｍｇ／ｄＬ，１ｍｇ／ｄＬを含む各々の水溶液を、各ウエル内に満たし、温度２５℃、３７℃の下で前記水溶液を前記センシング膜に浸透させた。このとき、グルコースセンシング膜の膜構造はグルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）および３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を活性を保ったまま保持しているため、浸透されたグルコースはＧＯＤによりを分解して過酸化水素を発生し、ＰＯＤによりこの過酸化水素を分解して活性な酸素を放出し、この活性な酸素によりＴＭＢＺが発色した。事実、グルコース量に応じてＴＭＢＺの発色度合が変化したことが確認された。
【００４８】
ウエルにグルコースを含まない水を満たした形態（温度２５℃、３７℃）において、図１に示すようにレーザダイオード５からレーザ光を偏光フィルタを通して前記基板１裏面側に入射することにより、そのレーザ光を基板１のＳｉＯ2表層２と左側のグレーティング３の界面で屈折させ、さらにＳｉＯ2表層２と発色した発色剤を含むグルコースセンシング膜４の界面で屈折してＳｉＯ2表層２を含む基板１を伝播させ、右側のグレーティング３と基板１の界面での屈折により伝播したレーザ光をフォトダイオード６で受光し、その光強度（初期光強度）を検出した。
【００４９】
また、ウエルにグルコースを含む水を満たした形態（温度２５℃、３７℃）において、同様な方法によりレーザ光をＳｉＯ2表層２と発色した発色剤を含むグルコースセンシング膜４の界面で屈折してＳｉＯ2表層２を含む基板１を伝播させた後、そのレーザ光強度（測定光強度）を検出した。
【００５０】
前記グルコースセンサチップで得られた２５℃、３７℃での初期光強度および測定光強度から次式に従って低下率（感度）を求めた。
【００５１】
低下率（％）＝［（初期光強度−測定光強度）／初期光強度］×１００
その結果を図３に示す。
【００５２】
図３から明らかように実施例１のセンサチップは、グルコース濃度０．０５〜１．０ｍｇ／ｄＬでその感度がグルコース濃度依存性を示し、かつ測定時の温度が２５℃と３７℃の間で一定の感度を示すことがわかる。すなわち、加温状態でも検体中のグルコース量を高感度で検出することが可能であることがわかる。
【００５３】
（実施例２）
実施例１のＣＭＣの代わりにヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）をグルコースセンシング膜生成用塗布液の液滴中に０．３２重量％になるように配合した以外、実施例１と同様にセンシング膜を形成し、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップ（以下、センサチップＡと称す）を製造した。
【００５４】
得られたセンサチップＡと実施例１と同様なグルコースセンサチップ（以下、センサチップＢと称す）を用い、ウエル内にグルコースを０．２５ｍｇ／ｄＬを含み、０〜１５４ｍモルの異なるＮａＣｌ濃度の水溶液（温度３７℃）をそれぞれ満たした以外、実施例１と同様な方法でＮａＣｌ濃度に対する感度を求めた。その結果を図４に示す。
【００５５】
図４から明らかようにカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を膜形成高分子化合物として含むセンシング膜を有するセンサチップＢは、感度が０〜１５４ｍモルのＮａＣｌ濃度範囲でその濃度に依存して変動することがわかる。
【００５６】
これに対し、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）を膜形成高分子化合物として含むセンシング膜を有するセンサチップＡは、感度が０〜１５４ｍモルのＮａＣｌ濃度範囲でその濃度に依存せず、一定であることがわかる。すなわち、センサチップＡは抽出媒体のＮａＣｌ濃度が変化しても検体中のグルコース量を安定した感度で検出することが可能であることがわかる。
【００５７】
なお、基板より高屈折率の熱硬化性樹脂または光硬化性樹脂からなる光反射路層を有する図２に示すグルコースセンサチップをおいても、実施例１と同様に加温状態で検体中のグルコース量を高感度で検出することが可能で、実施例２と同様にＮａＣｌ濃度（塩濃度）が変化しても検体中のグルコース量を安定した感度で検出することが可能であった。
【００５８】
また、前記実施形態・実施例においてはひとつのグルコースセンシング膜が保持する第１の酵素・第２の酵素・発色剤はそれぞれ一種の材料のみが選択され加えられているが、使用目的に応じて複数の材料を混在させてもよい。架橋性高分子化合物、膜形成高分子化合物においても同様、本発明の趣旨の範囲内で、使用目的に応じて複数の材料を混在させてもよい。
【００５９】
さらに、前記実施形態においては基板としてガラスを用いているが、参照光を伝播し透過する特性を有していれば、この材質は限定されない。単結晶による膜体や、熱硬化性樹脂材料、熱可塑性樹脂材料、光硬化性樹脂材料など、種々の樹脂材料を用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】第１実施形態に係るグルコースセンサチップを示す断面図。
【図２】第２実施形態に係るグルコースセンサチップを示す断面図。
【図３】実施例１のグルコースセンサチップにおける２５℃、３７℃での異なるグルコース量の測定感度を示す線図。
【図４】実施例２の各グルコースセンサチップにおけるＮａＣｌ濃度の変化に対するグルコース量の測定感度を示す線図。
【符号の説明】
【００６１】
１，１１…ガラス基板、２…ＳｉＯ2表層、３，１２…グレーディング、４，１４…グルコースセンシング膜、５，１５…レーザ光源（レーザダイオード）、６，１６…受光素子（フォトダイオード）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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