(57)【要約】【課題】  各種動物幹細胞等の増殖培養及び分化誘導培養における培養動物細胞の増殖や分化誘導を促進して、その増殖中は動物幹細胞等の分化能を効果的に維持し、しかも、従来の培養方法と比較して顕著に多くの動物細胞を得る培養方法を提供すること。【解決手段】  間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞由来の細胞外基質の存在下において、動物細胞を培養することにより、各種動物細胞に対して、その培養動物細胞の増殖を促進することができ、しかも、その増殖中は動物幹細胞等の分化能を効果的に維持することができ、更に、分化誘導を促進して、動物幹細胞の優れた分化誘導培養が可能となる。更に、本発明の動物細胞の培養方法を用い、各種の添加物質を培地に加えることにより、低濃度の血清でも効果的に増殖させることができ、ヒト血清を用いて培養することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞由来の細胞外基質の存在下において、動物細胞を培養することを特徴とする哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項２】
動物細胞が、幹細胞であることを特徴する請求項１記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項３】
間葉系細胞が骨髄間葉系幹細胞、上皮系細胞が胎児羊膜細胞、軟骨前駆細胞が胚性幹細胞由来軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞が胎児由来繊維芽細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項４】
細胞外基質でコートした培養皿上で動物細胞を培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の哺乳動物の培養方法。
【請求項５】
細胞外基質が、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞を培養して形成したものであることを特徴とする請求項４記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項６】
細胞外基質が、ヒト骨髄間葉系細胞、ヒト胎児（羊膜）細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、又はマウスＡＴＤＣ５細胞を培養して形成したものであることを特徴とする請求項４又は５記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項７】
動物細胞の幹細胞の初代培養及び／又は継代培養を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び／又はヒト血清を含有する培地で行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項８】
動物細胞の幹細胞の初代培養及び／又は継代培養を、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含有する培地で行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項９】
培地中に、トランスフェリン、インスリン、セレン酸、及びリノール酸からなるグループの１種又は２種以上の添加剤を添加することよりなる請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項１０】
動物細胞の幹細胞の組織細胞への分化誘導培養を、分化誘導培地を用いて行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項１１】
動物細胞の幹細胞の骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞への分化誘導培養を、骨分化誘導培地、軟骨細胞分化誘導培地又は脂肪細胞分化誘導培地を用いて行うことを特徴とする請求項１０記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項１２】
動物細胞の幹細胞の分化誘導培養を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地で行うことを特徴とする請求項１０又は１１記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項１３】
動物細胞の幹細胞の培養を、ヒト血清の存在下に行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法。
【請求項１４】
動物細胞の培養器の培養面に、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞由来の細胞外基質のコート層を設けたことを特徴とする哺乳動物細胞用の培養器。
【請求項１５】
培養器が、細胞外基質でコートした培養皿であることを特徴とする請求項１４記載の哺乳動物細胞用の培養器。
【請求項１６】
培養器が、細胞外基質でコートした細胞移植用担体を収容した試験管であることを特徴とする請求項１４記載の哺乳動物細胞用の培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多分化能を有する動物幹細胞等の新規な培養方法に関する。特に、組織の再生医療のための移植材料の調製等に有用な多種類の動物幹細胞等の培養のために、細胞外基質（Extracellular matrix,ECM）を用いて、動物幹細胞等の増殖や分化誘導を促進する動物細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞のような動物細胞の幹細胞は、哺乳類の骨髄等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する多能性の幹細胞として知られている。該幹細胞は、その分化多能性の故に、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪、歯周組織など、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている（遺伝子医学、Vol.４、No．２（2000）ｐ５８−６１）。最近、間葉系幹細胞研究の現状と展望についての総説が発行され、間葉系幹細胞の採取や培養に関する報告がなされている（実験医学、Vol．19、No．3（2月号）2001、ｐ350−356）。また、近年、間葉系幹細胞の培養、分化等に関しいくつかの特許出願が公開されている。例えば、特表平１１−５０６６１０公報には、無血清環境下でヒト間葉前駆細胞の生存を維持する組成物及び方法について、特表平１０−５１２７５６号公報には、間葉系幹細胞の分化を誘導するために、プロスタグランジン、アスコルビン酸、コラーゲン細胞外基質等からなる骨誘導因子、分化付随因子、軟骨誘導因子等の生物活性因子と接触させることよりなる方法について、特開２０００−２１７５７６号公報には、プロラクチン又はその同効物の共存下で多能性間葉系幹細胞を培養し、間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化させる方法について、それぞれ発明が開示されている。
【０００３】
間葉系幹細胞のような幹細胞或いはその他の動物細胞を、組織の再生医療に利用するため、或いはその他のバイオ産業における動物細胞として利用するためには、まず、この動物細胞を生体組織から採取し、１）その細胞を大量の細胞数まで増殖させる、２）細胞増殖中に、将来分化できる能力を保持する、３）培養器（培養皿）上でその細胞を分化させる、ことが必要である。更にそれを用いて移植用の組織の調製を行うことが必要となる。
すなわち、間葉系幹細胞のような動物幹細胞は、骨髄や骨膜に存在するが、組織再生医療への実用化のためには、これらの組織から幹細胞を採取する安全で、手間のかからぬ方法を開発すること、且つ、培養等により幹細胞の十分な量を取得する方法を開発することが重要な課題となる。また、幹細胞の組織再生医療への実用化のためには、採取した幹細胞を分化能力を維持したまま培養増殖させることが重要である。更に、培養した幹細胞を目的の細胞へと試験管内で分化を誘導する技術があることが望ましい。
【０００４】
したがって、動物幹細胞の組織再生医療への実用化のために、これらの要求を満足した動物幹細胞の効果的な培養方法を開発することが必要となる。更に、組織再生医療のための幹細胞の培養のためには、被治療対象に安全な自己血清を用いるのが望ましく、その場合、低濃度の血清で培養することは困難であるため、採取個体から大量の血清を採取する必要がある。しかしながら、採取個体から大量の血清を取得すること自体困難であることから、低濃度の血清下でも培養することが可能となる方法を開発することが必要となる。或いは、培養期間を短縮する必要がある。また、幹細胞を分化誘導培養する際においても、分化誘導能力に優れた培養方法を開発する必要がある。このように、間葉系幹細胞のような動物幹細胞を組織の再生医療等へ利用するに際して、その培養方法に関して、多くの課題の解決が要望されている。
【０００５】
一方、細胞外基質は、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞の間に存在する物質で、単に組織の支持のみならず、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与しているものとして知られている。また、細胞外基質は、骨、歯、腱、皮膚などに多く含まれていることからもわかるように、組織の支持、結合、物理的境界、力の吸収、弾性要素といった物理的な役割が、その機能として古くから知られている。近年になって、これらの基質がその機能として、細胞増殖、細胞移動、細胞内代謝、細胞分化、細胞の形態などを細胞の外から調節する生理化学的役割などに関与し、その機能を担っていることが明らかになってきている。
【０００６】
近年、細胞外基質の利用としては、例えば、生体細胞接着性材料や組織移植片組成物としての利用が知られており（特開平５−１５５８３号公報、特表２０００−５０８９２２号公報、特表２００１−５０５９１７号公報）、また、初代培養肝細胞の培養方法において、細胞外基質としてＩ型コラーゲンを用いる方法（特開平９−１０３２９１号公報）のような培養方法への利用が知られている。また、最近になって、生検採取細胞の培養に際して、支持体表面に細胞の接着が良好に行われるようにするために、タイプＩコラーゲンやタイプＩＶコラーゲンのようなコラーゲン等からなる細胞外基質を層状に塗布しておく方法が開示されている（特開２００３−９８５３号公報）。基底膜の利用に関しては、基底膜細胞外基質でコートした培養皿上で、ある特定の細胞の増殖が亢進することが報告されているが(Gospodarowicz D, Cohen, DC, Fujii DK, Regulation of cell growth by the basal lamina and plasma factors, in Cold Spring Harvor Conferences on Cell Proliferation vol 9. G. Sato, A. Pardee, and D. Sirbasku eds, Cold Spring Harbor, New York. 1982)、間葉系幹細胞等の動物細胞への報告はなされていない。
【０００７】
最近、本発明者は、基底膜様の細胞外基質にてコートした培養皿が、ヒト間葉系幹細胞の増殖を促進して、更に細胞寿命を延長し、しかも幹細胞としての多分分化能を保持したまま大量に増殖させることを見出して、特許出願を行った（特開２００３−５２３６０号公報）。また、最近、本発明者は、基底膜細胞外基質培養皿は、間葉系幹細胞としての多分化能を保持したまま大量の細胞数まで増殖させることを報告した（Matsubara-T. et al. Biochem Biophys Res Commun 313, 503-508, 2004）。しかし、１）基底膜細胞外基質培養皿を利用して、動物細胞の分化を直接促進できるか、２）基底膜細胞外基質以外の細胞外基質が、細胞増殖と分化を促進できるかどうか、については不明であったので、使用できるのは基底膜細胞外基質培養皿に限られていた。
【特許文献１】特開平５−１５５８３号公報。
【特許文献２】特開平９−１０３２９１号公報。
【特許文献３】特開２０００−２１７５７６号公報。
【特許文献４】特表平１０−５１２７５６号公報。
【特許文献５】特表平１１−５０６６１０公報。
【特許文献６】特表２０００−５０８９２２号公報。
【特許文献７】特表２００１−５０５９１７号公報。
【特許文献８】特開２００３−９８５３号公報。
【特許文献９】特開２００３−５２３６０号公報。
【非特許文献１】遺伝子医学、Vol.４、No．２、p58-61、2000。
【非特許文献２】実験医学、Vol．19、No．3（2月号）2001、ｐ350−356。
【非特許文献３】Gospodarowicz D, Cohen, DC, Fujii DK, Regulation of cell growth by the basal lamina and plasma factors, in Cold Spring Harvor Conferences on Cell Proliferation vol 9. G. Sato, A. Pardee, and D. Sirbasku eds, Cold Spring Harbor, New York. 1982。
【非特許文献４】Biochem Biophys Res Commun 313, 503-508, 2004。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、組織の再生医療のための間葉系幹細胞のような動物幹細胞の利用及びその他のバイオ産業における動物細胞の利用を目的として、各種動物幹細胞等の増殖培養及び分化誘導培養を行うに際して、その培養動物細胞の増殖や分化誘導を促進して、従来の培養方法と比較して顕著に多くの動物細胞を得ることができ、かつ、動物幹細胞の分化能力を維持したまま増殖させることができる動物細胞の培養方法を提供すること、更には、培養期間を短縮して血清使用量を少なくすること及び低濃度の血清でも増殖させることができ、ヒトの血清の使用も可能であり、そして、優れた分化誘導培養が可能な新規な動物幹細胞等の培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞由来の細胞外基質の存在下において、動物細胞を培養することにより、各種動物細胞に対して、その培養動物細胞の増殖を促進することができ、しかも、その増殖中は動物幹細胞等の分化能を効果的に維持することができること、更には、分化誘導を促進して、動物幹細胞の優れた分化誘導培養が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。更に、本発明の動物細胞の培養方法を用い、各種の添加物質を培地に加えることにより、培養期間を短縮できて、低濃度の血清でも効果的に増殖させることができ、ヒト血清を用いて培養することができ、しかも、培養によっても、増殖能力および分化能力が維持されることを見い出し、本発明をなした。
【００１０】
すなわち、従来、動物細胞の培養皿として一般には、プラスチック、ガラス製の培養皿が用いられ、特殊な場合、コラーゲン、フィブロネクチンなどの単一高分子でコートした培養皿が用いられていた。しかしこれらの培養皿を用いての動物幹細胞等の培養では、動物細胞の増殖、分化促進能は低く、しかも潜在的分化能力も培養中に著しく低下して、再生医療その他のバイオ産業における動物細胞の培養手段としては満足のいくものではなかった。
そこで、以前、本発明者は、基底膜様の細胞外基質にてコートした培養皿が、ヒト間葉系幹細胞の増殖を促進して、更に細胞寿命を延長し、しかも幹細胞としての多分化能を保持したまま大量に増殖させることができることを見出し、間葉系幹細胞の新規培養方法を開発した（特開２００３−５２３６０号公報）。しかし、基底膜以外の他の細胞外基質の影響や間葉系幹細胞以外で、再生医療やバイオ産業で役立つ各種の動物細胞の増殖に対する影響については不明であった。したがって、該増殖方法では、基底膜以外の他の細胞外基質の影響や間葉系幹細胞以外で、再生医療やバイオ産業で役立つ各種の動物細胞の増殖に対して適応ができず、これら各種の動物細胞の増殖に対応できる培養方法の開発が必要とされた。
【００１１】
そこで本発明においては、これらの点について追求して、基底膜細胞外基質以外にも、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞などの産生する細胞外基質が、各種幹細胞を含む動物細胞に対して、その増殖を促進することを見出した。しかも、これらの細胞外基質は、単に潜在的分化能を維持したまま増殖させるだけにとどまらず、骨分化、脂肪分化などの細胞分化に対して直接促進的に作用することを見出した。したがって、本発明の細胞外基質コートを用いた動物細胞の培養方法（培養皿、担体など）は、各種細胞外基質コートを利用して（各種細胞外基質コート培養皿を用いて）、各種幹細胞等に対する新規でかつ強力な動物細胞の増殖促進方法、分化誘導方法の提供を可能とし、再生医療とバイオ産業において、各種の動物細胞の増幅のみならず、動物組織（培養骨組織など）の製作と供給に有力な手段を提供することを可能とした。更に、本発明においては、本発明の動物細胞の培養方法において、各種の添加物質を培地に加えることにより低濃度の血清で培養しても、増殖能力および分化能力が維持されることを見い出し、本発明をなした。
【００１２】
すなわち具体的には本発明は、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞由来の細胞外基質の存在下において、動物細胞を培養することを特徴とする哺乳動物細胞の培養方法（請求項１）や、動物細胞が、幹細胞であることを特徴する請求項１記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項２）や、間葉系細胞が骨髄間葉系幹細胞、上皮系細胞が胎児羊膜細胞、軟骨前駆細胞が胚性幹細胞由来軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞が胎児由来繊維芽細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項３）や、細胞外基質でコートした培養皿上で動物細胞を培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の哺乳動物の培養方法（請求項４）や、細胞外基質が、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞を培養して形成したものであることを特徴とする請求項４記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項５）からなる。
【００１３】
また本発明は、細胞外基質が、ヒト骨髄間葉系細胞、ヒト胎児（羊膜）細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、又はマウスＡＴＤＣ５細胞を培養して形成したものであることを特徴とする請求項４又は５記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項６）や、動物細胞の幹細胞の初代培養及び／又は継代培養を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び／又はヒト血清を含有する培地で行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項７）や、動物細胞の幹細胞の初代培養及び／又は継代培養を、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含有する培地で行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項８）や、培地中に、トランスフェリン、インスリン、セレン酸、及びリノール酸からなるグループの１種又は２種以上の添加剤を添加することよりなる請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項９）や、動物細胞の幹細胞の組織細胞への分化誘導培養を、分化誘導培地を用いて行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項１０）からなる。
【００１４】
更に本発明は、動物細胞の幹細胞の骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞への分化誘導培養を、骨分化誘導培地、軟骨細胞分化誘導培地又は脂肪細胞分化誘導培地を用いて行うことを特徴とする請求項１０記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項１１）や、動物細胞の幹細胞の分化誘導培養を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地で行うことを特徴とする請求項１０又は１１記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項１２）や、動物細胞の幹細胞の培養を、ヒト血清の存在下に行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物細胞の培養方法（請求項１３）や、動物細胞の培養器の培養面に、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞由来の細胞外基質のコート層を設けたことを特徴とする哺乳動物細胞用の培養器（請求項１４）や、培養器が、細胞外基質でコートした培養皿であることを特徴とする請求項１４記載の哺乳動物細胞用の培養器（請求項１５）や、培養器が、細胞外基質でコートした細胞移植用担体であることを特徴とする請求項１４記載の哺乳動物細胞用の培養器（請求項１６）からなる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の細胞外基質を用いた動物細胞の培養方法は、組織の再生医療のための間葉系幹細胞のような各種動物幹細胞の利用及びその他のバイオ産業における動物細胞の利用のために、動物幹細胞等の増殖培養及び分化誘導培養を行うに際して、各種幹細胞を含む動物細胞の増殖や分化誘導を促進して、従来の培養方法と比較して顕著に多くの動物細胞を得ることができ、かつ、その培養においては、動物幹細胞の分化能力を維持したまま増殖させることができる。しかも、これらの細胞外基質は、各種幹細胞において、単に潜在的分化能を維持したまま増殖させるだけにとどまらず、骨分化、脂肪分化などの細胞分化に対して直接促進的に作用することを可能とする。更には、低濃度の血清でも増殖させることができ、ヒトの血清の使用も可能であり、そして、優れた分化誘導培養が可能である。したがって、本発明の動物細胞の培養方法は、各種幹細胞等に対する新規でかつ強力な動物細胞の増殖促進方法、分化誘導方法の提供を可能とし、再生医療とバイオ産業において、各種の動物細胞の増幅のみならず、動物組織（培養骨組織など）の製作と供給に有力な手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞由来の細胞外基質の存在下において、動物細胞を培養することよりなる。本発明において、
細胞外基質を形成するための間葉系細胞、上皮系細胞、軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞としては、間葉系細胞が骨髄間葉系幹細胞、上皮系細胞が胎児羊膜細胞、軟骨前駆細胞が胚性幹細胞由来軟骨前駆細胞、又は繊維芽細胞が胎児由来繊維芽細胞を挙げることができ、更に具体的には、ヒト骨髄間葉系細胞、ヒト胎児（羊膜）細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、又はマウスＡＴＤＣ５細胞を挙げることができる。本発明の細胞外基質を用いた動物細胞の培養方法において、増殖培養及び分化誘導培養を行う動物細胞としては、組織の再生医療のための間葉系幹細胞のような各種動物幹細胞、或いはその他のバイオ産業における動物細胞を挙げることができる。
【００１７】
本発明において、間葉系幹細胞のような動物幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、腱細胞、歯根膜、セメント質などの細胞へと分化しうる又はそれらの修復を促進しうる多能性を有する未分化な細胞である。間葉系幹細胞のような動物幹細胞は、該細胞を有する任意の骨髄または骨膜から採取することができるが、採取しうる該細胞の量及び採取の容易性の理由から、大腿骨、脛骨および骨盤（腸骨）から採取するのが好ましい。ヒト以外の哺乳動物については、腸骨及び脛骨などから間葉系幹細胞のような動物幹細胞を採取することができる。骨髄等からの採取方法は、例えば医療において用いられている公知の任意の採取方法を用いることができる。本発明者らは、最近、口腔組織から間葉系幹細胞を分離して、再生医療に移植細胞として利用できる細胞数まで培養して増やす技術を開発した。したがって、このような口腔組織から分離した間葉系幹細胞も本発明において有利に利用することができる。また、脂肪組織からも間葉系幹細胞を分離、培養できる。
【００１８】
本発明において、本発明の細胞外基質の存在下において、哺乳動物の幹細胞を培養する形態としては、培養器として公知の任意のものが利用できるが、細胞外基質でコートした培養皿上で細胞を培養する形態のものが特に有利に利用することが出来る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4094-4098, 1980）。また、細胞移植用担体（コラーゲン、リン酸カルシウム、生体吸収性高分子（ポリ乳酸など）、チタニウムブロック等）に細胞外基質をコートしたものに、動物細胞を播種して、試験管内で増殖或いは分化させて、再生医療用の移植用培養組織として用いることもできる。細胞外基質は、主として、プロテオグリカン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンなどの接着因子を構成成分として含有する。
【００１９】
動物幹細胞の初代培養及び／又は継代培養を行うには、採取分離した細胞を適当な培地（例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's  modified  Eagle's  medium）培地）を用い、組織培養用培養皿に細胞を播種して初代培養及び継代培養する。培養に用いる血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いることが出来る。本発明においては、培地への１０％以下の血清の添加量においても良好な増殖結果を得ることが出来る。また、ヒト血清を用いても、著明な増殖結果を得ることが出来る。更に、本発明においては、添加物質として、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を培地に添加することにより、本発明の培養方法の効果を高めることが出来る。
【００２０】
本発明において、動物幹細胞の分化誘導培養を行うには、初代培養及び継代培養した動物幹細胞を、分化誘導培地を用いて培養し、細胞を分化誘導することにより行うことができる。分化誘導培地としては、分化誘導する組織細胞によって、適宜公知の分化誘導培地を用いることができる。培養動物幹細胞の骨芽細胞への分化誘導培養を行うには、骨分化誘導培地として、（αＭＥＭ、ＦＢＳ、デキサメサゾン、β−グリセロールリン酸及びアスコルビン酸−２−リン酸）からなる組成の誘導培地を用いることができる。間葉系幹細胞のような動物幹細胞の骨芽細胞への分化誘導培養は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び／又は繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含有する培地で増殖させた細胞を骨分化誘導培地へ切りかえることで、分化誘導効果を達成することができる。更に、本発明においては、増殖用の培地中に、トランスフェリン、インスリン、セレン酸、及びリノール酸からなるグループの１種又は２種以上の添加剤を添加することより、低濃度の血清を用いた場合でも、通常の血清の使用量と同等及びそれ以上の増殖効果を得る事ができ、更に骨分化誘導培地へ切りかえた時に優れた分化能力を発揮することができる。
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
（間葉系細胞、軟骨前駆細胞、繊維芽細胞の産生した細胞外基質によりコートされた培養皿の製作とそれらの細胞増殖の促進効果）
マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、マウスＡＴＤＣ５細胞、マウス３Ｔ３細胞は理化研の細胞バンクより得た。これらの培養細胞の産生する細胞外基質（Extracellular matrix,ＥＣＭ）でコートした培養皿については、基底膜細胞外基質コート培養皿の製作方法に準じて行った（特開２００３−５２３６０：文献（Gospodarowicz D, Cohen, DC, Fujii DK, Regulation of cell growth by the basal lamina and plasma factors, in Cold Spring Harvor Conferences on Cell Proliferation vol 9.G. Sato, A. Pardee and D. Sirbasku eds, 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4094-4098, 1980））。まず、上記の細胞を集密になるまで培養したのち、５％デキストラン（分子量２０万  Wako, Osaka, Japan）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸−２−リン酸(Sigma)、１０％ＦＢＳ存在下でさらに１週間培養した。そして細胞層へ希アンモンニア溶液（２０ｍＭ〜５０ｍＭ）を添加して、細胞成分のみを除去した後、培養ディッシュ下層に接着して残存している細胞外基質をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で数回洗浄したのち、４℃で保存した。細胞外基質がはがれやすい場合は、集密になる前にデキストラン処理をして、またアンモニア液も希釈した。
【００２３】
基底膜細胞外基質を産生するＰＹＳ−２細胞、ウシ角膜内皮細胞から細胞外基質でコートした培養皿が作成できることは判明していたが、間葉系細胞であるマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、軟骨前駆細胞であるマウスＡＴＤＣ５細胞、繊維芽細胞であるマウス３Ｔ３細胞を用いても、細胞外基質コート培養皿を製作することができた。これらは、顕微鏡下で基底膜細胞外基質よりも網の目の細い構造を示した。これらの細胞外基質コート培養皿上にヒト間葉系幹細胞を播種して（１０００個／ｃｍ2）、ほぼ集密的になるまで培養した。そして細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液にて５分間処理して、単離して、別のそれぞれの培養皿に播種した。このような継代を繰り返して、６５日まで培養した。図１の各点は、継代時での、培養日数（横軸）と積算細胞数（縦軸）を示す。
【００２４】
今回使用したヒト骨髄間葉系幹細胞株の成長因子と細胞外基質応答能は高くなかったものの、ｂＦＧＦ添加によりヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖は促進されたことは、以前の報告（Tsutsumi S. et al., Biochem Biophys Res Commun 288, 413-419, 2001）と一致している。またＰＹＳ−２細胞、牛角膜内皮細胞の細胞外基質も細胞増殖を促進した。これも以前の報告と一致している。しかし、今回は、間葉系細胞であるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、軟骨前駆細胞であるＡＴＤＣ５細胞、繊維芽細胞である３Ｔ３細胞の細胞外基質も、ヒト骨髄間葉系幹細胞の増殖を促進することが判明した（図１）。そしてこれらの新規細胞外基質は、ｂＦＧＦの作用よりも強く、またＣ３Ｈ１０Ｔ／２細胞の作用は、基底膜細胞外基質の作用に匹敵した（図１）。
【実施例２】
【００２５】
(細胞外基質による骨分化の直接促進効果−骨髄間葉系細胞に対する影響)
ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞は、すでに記載した方法で３−６代目まで培養したものを用いた（Tsutsumi S. et al., Biochem Biophys Res Commun 288, 413-419, 2001; Matsubara-T. et al. Biochem Biophys Res Commun 313, 503-508, 2004）。これらの細胞を、ヒト骨髄間葉系幹細胞、ＰＹＳ−２細胞、或いはヒト胎児（羊膜）細胞の産生した細胞外基質にてコートした、或いは対照としてコートしていない通常のプラスチック培養皿上に播種して（４００００個／16 mmシャーレ）、骨分化誘導に適する下記の培地（文献Science 284, 143-147, 1999に記載の培地）を用いて１４−２８日間培養した。いずれの細胞外基質（ＥＣＭ）コート培養皿も対照のプラスチック培養皿に比較して、骨分化を促進した。なおこの実験では、骨分化は、アリザリン赤で染まる石灰化で評価した。
【００２６】
骨分化誘導培地
αＭＥＭ
１０％     牛胎児血清
１００ｎＭ   デキサメサゾン
１０ｍＭ     β−グリセロールリン酸
５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸−２−リン酸
【００２７】
【表１】
2006000059.tif 000002
なお、ヒト胎児細胞は、帝王切開した妊婦の羊膜間質あるいは上皮より得た（下の項で詳述）。これらの細胞をトリプシンとコラゲナーゼにて分散して、１０％血清＋bFGF含有DMEM培地にて培養したものを用いた。これらの細胞を用いて、上記の方法にしたがって、細胞外基質コート培養皿を作成した。
【実施例３】
【００２８】
(細胞外基質による骨分化の直接促進効果−ヒト胎児細胞とヒト間葉系幹細胞に対する影響の詳しい解析)
本実施例では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、対照としてヒト繊維芽細胞を用いた。更に、ヒト胎児細胞は、帝王切開した妊婦の羊膜間質より得た。これらの細胞をトリプシンとコラゲナーゼにて分散して、１０％血清＋ｂＦＧＦ含有ＤＭＥＭ培地にて培養したものを用いた。そして、これら三種類の細胞を、ヒト骨髄間葉系幹細胞、あるいはヒト胎児細胞の産生した細胞外基質（ＥＣＭ）にてコートした、あるいは対照としてコートしていない通常のプラスチック培養皿上に播種して（４００００個／16 mmシャーレ）、上記の骨分化誘導に適する培地を用いて３７℃、５％炭酸ガス存在下で７−２８日間培養した。培地は２日おきに交換した。
【００２９】
また、本実施例では、骨分化を評価するために、石灰化以外に、骨関連遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルも測定した。培養した細胞のtotal ＲＮＡをTRIzol(Life Technologies Inc.)で抽出した。さらに、骨芽細胞に特異的な遺伝子マーカー：オステオカルシン、オステオポンチン及びアルカリホスファターゼの発現をＲＴ−ＰＣＲにて検討した。ＲＴ−ＰＣＲ kit: ReverTra Dash（Toyobo Co., Ltd, Osaka, Japan）。ＰＣＲの条件は９４℃３０秒、６８℃３分間の反複を２８サイクルで行った。ＰＣＲ産物の分析を電気泳動にて行った。
Human osteocalcin: forward 5'-CCACCGAGACACCATGAGAG-3'、
reverse 5'-CCATAGGGCTGGGAGGTCAG-3'。
Human osteopontin: forward 5'- CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3'、
reverse 5'-CAGTGACCAGTTCATCAGATTCATC-3'
Human alkaline phoaphatase : forward 5'- AGGCTGGAGATGGACAAGTT-3'、
reverse 5'- TGGTCAATTCTGCCTCCTTC -3'
Human GAPDH: forward 5'-GTCAAGGCCGAGAATGGGAA-3'、
reverse 5'-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3'
（結果）
いずれの細胞外基質コート培養皿も対照と比較して、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞とヒト胎児細胞の骨分化を促進した。一方、対照として用いたヒト繊維芽細胞にはほとんど影響しなかった。図２は、ヒト胎児細胞が、対照のプラスチック培養皿では、骨分化しないのに対して、ヒト胎児細胞（羊膜間質由来）の細胞外基質でコートした培養皿上では、培養初期から（７日）骨分化が開始していたことを示す（図２の上図）。またアリザリン赤で染まる石灰化で評価しても、この細胞外基質は骨分化を促進していた（図２の下図）。更に、図３は、同じ細胞外基質培養皿で、ヒト胎児細胞において、骨関連遺伝子であるosteocalcin（ＯＣ）、osteopontin（ＯＰ）、alkaline phosphatase（ＡＬＰ）のｍＲＮＡの発現が、対照のプラスチック培養皿に比較して、上昇していることを示している。図４は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞が、ヒト胎児（羊膜間質由来）細胞の細胞外基質でコートされた培養皿上で、対照のプラスチック培養皿に比較して、骨分化（アリザリン赤による石灰化の評価）が培養２８日で亢進していることを示している。
【実施例４】
【００３０】
（ヒト胎児細胞由来細胞外基質コート培養皿での、間葉系幹細胞及び軟骨細胞の増殖の亢進）
使用するヒト胎児細胞としては、羊膜由来の細胞を用いた。インフォームドコンセントを得た妊婦の出産後（自然分娩、帝王切開を含む）の胎盤より羊膜を絨毛膜層からピンセットで剥離して分離した。羊膜細胞の分離はコラゲナーゼとトリプシン−ＥＤＴＡで２段階酵素分解法で行った。すなわち、得られた羊膜を１００ｍｌビーカーに入れて、リン酸緩衝液(ＰＢＳ)で３回洗った後、滅菌した手術用ハサミで細かく切って断片化し、それを１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ (Sigma社)、０．０８％ＤＮＡ分解酵素(Sigma社)を含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２培地(Sigma社)で３７℃、スターラーバーで回転（５００〜６００ｒｐｍ）しながら１時間振盪処理した。上皮細胞を除くために、回収した溶液を１００μｍ、４０μｍのフィルター網にそれぞれに通して、更に、２０００gで１０分間遠心して集め、間葉系細胞を分離した。
【００３１】
得られた細胞の数を細胞計数分析装置（Ｚ１シングル、コールター社製）で計測した。間葉系細胞は、以上の方法で通常1グラム羊膜組織からおよそ１．０×１０6〜２×１０6 個の細胞が採取できた。初代培養は細胞を４×１０4個／ｃｍ2の密度で１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ペニシリン:１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン: １００μｇ／ｍｌ）で１０ｃｍ直径組織培養ディッシュに播種し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で行った。
【００３２】
羊膜の上皮細胞は、間質細胞が完全に取り除かれた羊膜より分離した。フィルター網上に残された羊膜を０．０５％トリプシン＋０．２ｍＭ  ＥＤＴＡで３７℃で５分間処理して、遠心して集め、上皮細胞を分離した。上皮細胞は、以上の方法で通常1グラム羊膜組織からおよそ８×１０6〜１×１０7の細胞が採取できた。得られた上皮細胞を５×１０4個／ｃｍ2の密度で１０ｃｍ直径組織培養ディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ペニシリン: １００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン: １００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。これらの細胞を用いて、上記の方法によって細胞外基質（ＥＣＭ）コート培養皿を製作した。
【００３３】
そしてヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、ヒト胎児由来細胞（ＡｍＥ）ＥＣＭ或いは、ＰＹＳ−２基底膜ＥＣＭ培養皿あるいは対照として通常のプラスチック培養皿（ＰＬ）に播種して（５０００個／ｃｍ2）、ほぼ集密的になるまで培養した。そして細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液にて５分間処理して、単離して、別のそれぞれの培養皿に播種した。このような継代を繰り返して、６０日まで培養した。その結果、ヒト胎児細胞ECM上で培養したヒト腸骨骨髄由来間葉系幹細胞は、最初の細胞数と比較して、１０9倍以上に増殖した。この増殖能は従来法より優れており、更に、１２継代以上持続した。ヒト胎児細胞ＥＣＭは、基底膜ＥＣＭよりも強力にヒト間葉系幹細胞の増殖を促進した。図５では、ヒト胎児（羊膜上皮）ＥＣＭの強力な増殖促進作用を示した。なお図５の各点は、継代時での、培養日数（横軸）と積算細胞数（縦軸）を示す。
【００３４】
次に、ウサギ肋軟骨から軟骨細胞を分離した（Kato-Y et al. J.Clin. Invest. 92:2323-2330, 1993）。そしてこれらの細胞を一旦凍結保存したものを、今回の実験に用いた。軟骨細胞は各種の培養皿に、（５０００個／ｃｍ2）で播種した。ヒト胎児細胞ＥＣＭで培養したウサギ軟骨細胞は、最初の細胞数と比較して、１０9倍以上に増殖した。この増殖能は従来法より優れており、更に、７継代以上持続した。図６は、凍結保存した軟骨細胞は、通常のプラスチック培養皿やＰＹＳ−２基底膜ＥＣＭ培養皿上では、増殖速度が遅いものの、ヒト胎児（羊膜上皮）ＥＣＭ培養皿では増殖が著しく亢進したことを示す。従って、ヒト胎児ＥＣＭを使用する細胞培養法は、様々な種類の細胞増殖に応用可能であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の実施例において、各種動物細胞ＥＣＭ培養皿上でのヒト骨髄間葉系細胞の増殖についての試験結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、羊膜上皮細胞由来細胞外基質（ＥＣＭ）上での羊膜間葉系細胞の骨分化誘導(４  weeks)についての試験の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、細胞外基質培養皿において、ヒト胎児細胞において、骨関連遺伝子であるosteocalcin（ＯＣ）, osteopontin（ＯＰ）, alkaline phosphatase（ＡＬＰ）のｍＲＮＡの発現（骨分化遺伝子マーカーの発現）が、対照のプラスチック培養皿に比較して、上昇していることを示す、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の、ヒト胎児細胞（羊膜間質由来）の細胞外基質（ＥＣＭ）でコートされた培養皿上での骨分化誘導についての試験の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、ヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、ヒト胎児由来細胞（ＡｍＥ）、ＰＹＳ−２基底膜の細胞外基質（ＥＣＭ）培養皿、及び対照として通常のプラスチック（ＰＬ）培養皿に播種して培養した場合の、細胞外基質（ＥＣＭ）による細胞増幅効果試験の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、軟骨細胞を、ヒト胎児由来細胞（ＡｍＥ）、ＰＹＳ−２基底膜細胞外基質（ＥＣＭ）培養皿、及び対照として通常のプラスチック（ＰＬ）培養皿に播種して培養した場合の、細胞外基質（ＥＣＭ）による細胞増幅効果試験の結果を示す図である。
【図１】
2006000059.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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