(57)【要約】【課題】  疾病の早期発見などの目的のために検査の高感度化が求められ診断薬の感度向上が大きな課題となっているなか、さらに多くの一次プローブを結合できる磁性粒子を得る。【解決手段】  免疫検査用の磁性粒子であって、検査対象物質と結合する一次プローブと磁性粒子との結合に用いる粒子表面の官能基量がパーキングエリアとして１５平方Å／官能基未満の値をしめすことを特徴とする免疫検査用磁性粒子。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫検査用の磁性粒子であって、検査対象物質と結合する一次プローブと磁性粒子との結合に用いる粒子表面の官能基量がパーキングエリアとして１５平方Å／官能基未満の値をしめすことを特徴とする免疫検査用磁性粒子。
【請求項２】
一次プローブとの結合に用いる粒子表面の官能基がカルボキシル基であることを特徴とする請求項１に記載の免疫検査用磁性粒子。
【請求項３】
一次プローブと磁性粒子の結合が、アビジン−ビオチンまたはプロテインＡまたはプロテインＧまたは一次プローブと反応する抗体を介したものであることを特徴とする請求項１または２に記載の免疫検査用磁性粒子。
【請求項４】
磁性粒子が核粒子の表面にＦｅ２Ｏ３およびＦｅ３Ｏ４の少なくとも一方を含む磁性体層が形成された母粒子に重合により該磁性体層上にポリマー層を形成する磁性粒子である請求項１または２または３に記載の免疫検査用磁性粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学・医薬品分野での免疫検査用磁性粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁性粒子は感染症・癌マーカー・ホルモンなどの検査のため、抗原抗体反応を利用した診断薬の反応固相として用いられている。このような診断薬の通常の形態としては、抗体または抗原等の検査用プローブ（一次プローブ）が磁性粒子上の官能基に共有結合的に固定化される。この際、一次プローブをビオチン標識し、磁性粒子にアビジンを結合し、アビジン−ビオチンの親和性を利用して磁性粒子に一次プローブを結合する方法や、一次プローブが抗体の場合には、プロテインＡやプロテインＧを結合した磁性粒子に抗体を結合する方法も利用されることがある。このように一次プローブ結合した磁性粒子上にサンプル中の検査対象物質が捕捉された後、第二の検査プローブと反応される。第二の検査プローブ（二次プローブ）は蛍光物質や酵素で標識されており、蛍光や酵素反応によって検出が行われる。
一次プローブの結合に用いられる磁性粒子上の官能基量は、官能基一個当たりが占める面積（パーキングエリア）で示される。一般的に、一次プローブの結合量はパーキングエリアの数値に反比例する。すなわち、パーキングエリアが大きいほど一次プローブ量は少なく、パーキングエリアが小さいほど一次プローブ量は多く結合できる。しかしながら、パーキングエリアが大きく一次プローブの量が少ないと検査に必用な十分な感度が得られない場合が多い。一方、パーキングエリアが小さく一次プローブが多く結合する場合は、粒子表面官能基が多すぎ、多数の粒子表面官能基と一次プローブ分子の多数箇所とが結合するため、一次プローブは多く結合できるが活性が失われ、結果的に感度が低下する場合がある。したがって、適度なパーキングエリアを持ち、一次プローブを高活性に保ったまま粒子表面に結合できる磁性粒子が要望されていた。
【特許文献１】特開平７−１３６５４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、このような従来の問題点を解決するために、従来に比較して一次プローブの活性を保って粒子表面に結合できる磁性粒子の提供を目的とするものである。
【発明の効果】
【０００４】
本発明の磁性粒子は、抗体やアビジンの結合量が中程度であるにもかかわらず、免疫測定において高いシグナル強度が得られ免疫検査用磁性粒子として優れている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち本発明は、免疫検査用の磁性粒子であって、検査対象物質と結合する一次プローブと磁性粒子との結合に用いる粒子表面の官能基量がパーキングエリアとして１５〜５０平方Å／官能基の値をしめすことを特徴とする免疫検査用磁性粒子である。
官能基のパーキングエリアＰＡ（平方Å／官能基）は、平滑な表面を持つ粒子の場合は、表面の官能基密度（Ｑ ｍｍｏｌ／ｇ粒子）、粒子径（Ｄ  μｍ）、粒子比重（ρ  ｇ／ｃｍ３）を用いて、式（１）であらわすことができる。
【０００６】
ＰＡ＝１／（Ｑ＊Ｄ＊ρ）  ・・・・・・・・・（１）
【０００７】
また、凹凸のある表面を持つ粒子の場合は、気体吸着法など公知の方法で測定した単位重量あたりの表面積Ｓ（ｃｍ２／ｇ粒子）を用いて、式（２）で表すことができる。
【０００８】
ＰＡ＝Ｓ／（６０＊Ｑ）  ・・・・・・・・・・（２）
【０００９】
本発明の磁性粒子はパーキングエリアが１５〜５０平方Å／官能基の値を示し、従来に比較して一次プローブの活性を保って粒子表面に結合できる。したがって、検査対象物質の捕捉効率が向上し、高感度な検出が可能である。
一次プローブと磁性粒子との結合に用いる官能基（以下、特定官能基という）としては、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、チオール基、水酸基、トシル基などをあげることができるが、特にカルボキシル基が好ましく用いることができる。
磁性粒子の表面に特定官能基を導入する方法としては、(1)磁性粒子の存在下で、特定官能基を有する（共）重合性モノマー、必要に応じてその他の共重合性モノマーを液体中で重合を行う方法、(2)磁性粒子表面に特定官能基を有する分子を結合させる方法等をあげることができる。
【００１０】
(1)の例としては、磁性粒子の存在下で、主原料としての特定官能基を有する（共）重合性モノマーや他の共重合性モノマー、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、界面活性剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加し、液体中で重合を行う方法をあげることができる。特定官能基を有する（共）重合性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのモノまたはジカルボン酸化合物、ヒドロキシエチルメタクリレートなどの水酸基含有モノマー；グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテルなどのエポキシ基含有モノマー、をあげることができる。これらのモノマーは一種単独でも、また二種以上を混合して用いることも可能である。他の共重合性モノマーとしては、スチレン、ジビニルベンゼンなどの芳香族ビニル単量体、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルをあげることができる。これらのモノマーも、一種または二種以上を混合して用いることが可能である。
【００１１】
(2)の例としては、磁性粒子表面に導入されたカルボキシル基または水酸基などに対し特定官能基を持つ分子を公知の方法により結合させる方法や、特定官能基を持つ分子と磁性粒子を乳化剤を含む水中に分散させ重合開始剤等のラジカル発生剤を作用させることにより特定官能基を持つ分子を粒子表面に導入する方法などあげることができる。特定官能基を持つ分子としては、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ビス-（３−アミノプロピル）アミンなどの多官能アミン、トシルクロリド、ポリ（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−アルキル（メタ）アクリレート共重合体などのカルボン酸含有ポリマー、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンなどのアミノ基含有ポリマー、ポリビニルアルコール、などを上げることができる。
本発明の免疫検査用磁性粒子の粒径は、0.5〜10μmの範囲が好ましく用いることができる。粒径が０．５μm以下では、磁気分離に時間がかかりすぎ、また１０μm以上では自然沈降の速度が速すぎるため免疫検査用としては好ましくない。
【００１２】
本発明の免疫検査用磁性粒子の実際の使用に当たって一次プローブを結合させる方法としては、特定官能基によって公知の方法を適宜選択して用いることができる。この際、一次プローブと特定官能基は直接結合されていてもかまわないし、アビジン−ビオチンの親和性を利用した結合法や、抗体とプロテインＡやプロテインＧの親和性を利用した結合法、一次プローブに対する抗体を利用した結合法を用いることも可能である。
【実施例】
【００１３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
実施例１
１．核粒子の作製
特公昭５７−２４３６９号公報記載の膨潤重合法、ジャーナル オブポリマーサイエンス ポリマーレター エディション（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ Ｅｄ．）記載の重合方法、あるいは本発明者らが先に提案した重合方法（特開昭６１−２１５６０２、同６１−２１５６０３、同６１−２１５６０４）を参考に下記核粒子を作製した。下記核粒子は、重合後遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥、粉砕した。
核粒子１；メチルメタクリレート／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
(平均粒子径１．５μｍ  ＣＶ値２．２％)
核粒子２；スチレン／ジビニルベンゼン＝８０／２０共重合体
（平均粒子径０．８μm  ＣＶ値３％）
２．核粒子への磁性体の被覆（磁性体層の形成）
油性磁性流体「ＦＶ５５」［松本油脂（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（平均粒子径：０．０２μｍ）を得た。なおこの磁性体は界面活性剤により疎水化処理された表面を有するものである。得られた磁性体をトルエン／水（重量比１：１）に添加し、十分に攪拌した後静置したところ、磁性体はトルエンのみに分散されており、表面が疎水化されたことを確認した。ついで、核粒子に、疎水化された磁性体を混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムNHS−０型（奈良機械製作所（株）製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度100m/秒（16200rpm）で３分間処理した。
３．母粒子の表面のコーティング重合（コーティングポリマー層の形成）
実施例１  核粒子１の５０ｇに磁性体５０ｇを複合化した磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５重量％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５重量％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート１５ｇ、メタクリル酸３．７５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．７ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５重量％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は２．１μm、比重１．６ｇ／ｃｍ３であった。得られた粒子は気体収着法により平滑な表面を持っていた。
【００１４】
実施例２
核粒子１の５０ｇに磁性体５０ｇを複合化した磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５重量％水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート３０ｇ、メタクリル酸１．５ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）１．５ｇの混合物を、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は２．１μm、比重１．６ｇ／ｃｍ３であった。得られた粒子は気体収着法により平滑な表面を持っていた。
【００１５】
実施例３
核粒子２の５０ｇに磁性体１００ｇを複合化した磁性体被覆粒子３０ｇと、モノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート６ｇ、メタクリル酸０．３ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇの混合物を、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５％水溶液３７５ｇを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた後、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ２ガス気流下、２５℃で１時間攪拌した。ついで、温度を６０℃とし2時間反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は１．１μm、比重１．９ｇ／ｃｍ３であった。得られた粒子は気体収着法により平滑な表面を持っていた。
【００１６】
実施例４
核粒子１の５０ｇに磁性体１００ｇを複合化した磁性体被覆粒子３０ｇと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５重量％水溶液３７５ｇと、アニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５重量％水溶液３７５ｇとを１Ｌセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。ついで、イカリ型撹拌羽２００ｒｐｍ撹拌、Ｎ２ガス気流下６０℃とした。これに、モノマーとしてスチレン１４ｇ、ジビニルベンゼン１ｇ、メタクリル酸２．０ｇ、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ２−エチルヘキサネート（日本油脂社製；パーブチルＯ）０．６ｇ、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン１５０」（花王製）の０．５重量％水溶液７５ｇおよびアニオン性乳化剤ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５重量％水溶液７５ｇの混合物を１０℃以下において超音波微分散により乳化させて、２時間にわたり連続添加して反応させた。その後、さらに温度を８０℃とし３時間継続し反応を完結させた。その後、室温に冷却し５００メッシュステンレス製網で粗大物を除去し、さらに磁気精製において非磁性成分を除去した。粒径は１．１μm、比重１．９ｇ／ｃｍ３であった。得られた粒子は気体収着法により平滑な表面を持っていた。
【００１７】
比較例１
実施例１においてメタクリル酸を７ｇとした以外は全て実施例１の方法に基づいて実施した。粒径は２．１μm、比重１．６ｇ／ｃｍ３であった。得られた粒子は気体収着法により平滑な表面を持っていた。
比較例２
実施例１においてメタクリル酸を０．９ｇとした以外は全て実施例１の方法に基づいて実施した。粒径は２．１μm、比重１．６ｇ／ｃｍ３であった。得られた粒子は気体収着法により平滑な表面を持っていた。
比較例３
実施例３においてメタクリル酸を２ｇとした以外は全て実施例５の方法に基づいて実施した。粒径は１．１μm、比重１．９ｇ／ｃｍ３であった。得られた粒子は気体収着法により平滑な表面を持っていた。
【００１８】
実施例１〜５および比較例１〜３の粒子径、粒子比重、表面カルボン酸濃度、パーキングエリアを表１に示す。
抗体直接結合法による免疫測定評価
実施例１〜４および比較例１〜３で得られた診断薬用粒子の１００ｍｇを１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６）１０ｍLに分散させ、水溶性カルボジイミド  ２０ｍｇを加え、室温で回転攪拌機にて３０分間攪拌した。磁性粒子を磁気分離にて２回洗浄後、１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６）１０ｍLに分散させ、これに抗ＡＦＰマウスIgG抗体溶液（１ｍｇ/ｍL、１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６））を５ｍL加え、室温で回転攪拌機にて２時間間攪拌した。上清を除去し、上清中の残存抗体量から抗体結合量を求めた。次に、粒子に０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝塩溶液（ｐH 7.4）を１０ｍL加え室温で回転攪拌機にて2時間攪拌した。２時間後、実施例、比較例ともにリン酸緩衝液（ｐH 7.4）で４回洗浄後、粒子濃度が０．５重量％となるように０．１重量％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ｐH 7.4）に再分散し、抗ＡＦＰＩｇＧ結合磁性粒子（免疫測定用粒子）とした。
この免疫測定用粒子１０μLに１００ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを含むサンプル５０μLを加えて攪拌し、室温で５分放置した。磁気分離法により免疫測定用粒子をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄を行った。
次に、アルカリフォスファターゼコンジュゲート抗ＡＦＰ抗体（抗体濃度２．５μg／ｍＬ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μL加えて攪拌し、室温で１０分放置した。これを前述の磁気分離法により洗浄を行った。この粒子にＡＭＰＰＤ２００μg／ｍＬを含む基質液１００μLを加え攪拌の後、１０分間放置後、ルミノメータ（ベルトールド社製）で測定した。図１に抗体結合量と化学発光強度を示す。
【００１９】
アビジン-ビオチン法による免疫測定評価
実施例１〜３および比較例１で得られた診断薬用粒子の１００ｍｇを１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６）１０ｍLに分散させ、水溶性カルボジイミド  ２０ｍｇを加え、室温で回転攪拌機にて３０分間攪拌した。磁性粒子を磁気分離にて２回洗浄後、１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６）１０ｍLに分散させ、これにアビジン溶液（１ｍｇ/ｍL、１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６））を５ｍL加え、室温で回転攪拌機にて２時間間攪拌した。2時間後、上清を除去し、粒子に０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝塩溶液（ｐH 7.4）を１０ｍL加え室温で回転攪拌機にて2時間攪拌した。その後、実施例、比較例ともにリン酸緩衝液（ｐH 7.4）で４回洗浄後、粒子濃度が５重量％となるように０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ｐH 7.4）に再分散し、アビジン結合磁性粒子とした。
このアビジン結合磁性粒子１ｍｇ（０．２ｍＬ）にＦＡＭ標識したビオチン溶液（１０００ｐｍｏｌ／ｍＬ）０．５ｍＬを加え、室温で回転攪拌機にて１時間攪拌した。上清に残ったＦＡＭの蛍光量からアビジン結合磁性粒子のビオチン結合量を求めた。
次に、上で得られたアビジン結合粒子を用いて免疫測定用粒子を調製した。アビジン結合粒子１０ｍｇ（２ｍＬ）に、ビオチン標識抗ＡＦＰマウスIgG抗体溶液（１ｍｇ/ｍL、１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６））を０．５ｍL加え、室温で回転攪拌機にて２時間間攪拌した。２時間後、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で４回洗浄後、粒子濃度が５重量％となるように０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ｐH 7.4）に再分散し、抗ＡＦＰＩｇＧ結合磁性粒子（免疫測定用粒子）とした。    
この免疫測定用粒子１０μLに１００ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを含むサンプル５０μLを加えて攪拌し、室温で５分放置した。磁気分離法により免疫測定用粒子をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄を行った。
次に、アルカリフォスファターゼコンジュゲート抗ＡＦＰ抗体（抗体濃度２．５μg／ｍＬ、０．１重量％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μL加えて攪拌し、室温で５分放置した。これを前述の磁気分離法により洗浄を行った。この粒子にＡＭＰＰＤ２００μg／ｍＬを含む基質液１００μLを加え攪拌の後、１０分間放置後、ルミノメータ（ベルトールド社製）で測定した。図２にＦＡＭ標識ビオチン結合量と化学発光強度を示す。
【００２０】
【表１】
2006226689.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例および比較例の化学発光強度と抗体結合量との関係を示すグラフ
【図２】実施例および比較例の化学発光強度とビオチン結合量との関係を示すグラフ
【図１】
2006226689.tif 000003
【図２】
2006226689.tif 000004