(57)【要約】【課題】  血液内、特に患者自身の血液内に含有される多血小板血漿および血清を有効に利用することを可能とする。【解決手段】  抗凝固剤入りの血液から多血小板血漿および有形成分を分離した後の血漿６に、ガラス材料からなる吸着部材９を投入し、血漿６内の繊維素原１１を吸着除去する血清１２の分離方法を提供する。【選択図】    図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固剤入りの血液から多血小板血漿および有形成分を分離した後の血漿に、ガラス材料からなる吸着部材を投入し、血漿内の繊維素原を吸着除去する血清の分離方法。
【請求項２】
吸着部材が、ガラスビーズからなる請求項１に記載の血清の分離方法。
【請求項３】
吸着部材が、ガラス棒からなる請求項１に記載の血清の分離方法。
【請求項４】
抗凝固剤入りの血液から多血小板血漿および有形成分を分離した後の血漿に、抗血液凝固因子を吸着させた磁気ビーズを投入した後に、磁石を用いて磁気ビーズを回収する血清の分離方法。
【請求項５】
抗凝固剤入りの血液から分離した多血小板血漿および請求項１から請求項４のいずれかに記載の分離方法により分離した血清を培地に添加して培養する細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血清の分離方法および細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを吸収し、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
また、骨欠損部の早期修復を図るために、骨補填材に付着させた間葉系幹細胞を生体外において培養することにより骨芽細胞に分化させた培養骨が用いられる。培養骨によれば、骨欠損部に補填された後、骨形成作用が開始されるまでの時間を短縮でき、骨欠損部を早期に修復することができる。
【０００４】
一方、血液から抽出した多血小板血漿（platelete-rich plasma：ＰＲＰ）が、骨再生力を高めることについては、特許文献１に開示されている。多血小板血漿は、種々の成長因子および増殖因子を含んでおり、これを培養骨の培養に用いることにより、早期に培養骨を製造することができる。また、患者自身の血液に含有されている成分を利用できるので、未知の感染症による感染のおそれがないという利点もある。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【特許文献１】特開２００３−５５２３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血液から多血小板血漿を抽出するには、血液を２段の遠心分離にかけることにより抽出するが、このとき、血液内に含有されるフィブリノーゲン（血液凝固Ｉ因子）やプロトロンビン（血液凝固ＩＩ因子）、血液凝固Ｖ因子、血液凝固ＶＩＩＩ因子等の血液凝固因子の作用により血液が凝固してしまうことを防止するために、ヘパリンやクエン酸ベースの抗凝固剤を血液内に混合することが一般的である。
【０００６】
しかしながら、血液に抗凝固剤を混合してしまうと、血液凝固因子を凝固させることなく多血小板血漿を抽出することはできるが、多血小板血漿を抽出した残りの血漿内に含まれている血清を分離することができないという不都合がある。すなわち、血清は、血漿から該血漿内に含まれている種々の血液凝固因子を除去することにより分離されるが、抗凝固剤を混合してしまっているために、これらの血液凝固因子を凝固させることが困難になる。
【０００７】
逆に、高濃度の凝固剤を添加して血液凝固因子を凝固させることも可能であるが、この場合には、抽出された血清内に凝固剤が残存することになるため、これを細胞の培養に利用すると、培養途中に不溶解性の結晶が培地内に析出し、培養される細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。したがって、従来、血液から多血小板結晶を抽出する場合には、残りの血漿については廃棄せざるを得ず、血漿に含まれる血清を有効利用できないという問題があった。
【０００８】
この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、血液内、特に患者自身の血液内に含有される多血小板血漿および血清を有効に利用することを可能とする血清の分離方法および細胞の培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、抗凝固剤入りの血液から多血小板血漿および有形成分を分離した後の血漿に、ガラス材料からなる吸着部材を投入し、血漿内の繊維素原を吸着除去する血清の分離方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、血漿内にガラス材料からなる吸着部材を投入することにより、血漿内の繊維素原を吸着部材に吸着させることができる。繊維素原にはフィブリン等の血液凝固因子が含まれているため、これらを吸着した吸着部材を血漿内から除去することにより、血清を容易に分離することができる。したがって、血液に抗凝固剤を投入して多血小板血漿および有形成分を遠心分離等により分離除去した後の抗凝固剤を含有する血漿からも血清を分離することができ、血液内の有効成分を無駄なく有効利用することができる。
【００１１】
上記発明においては、吸着部材が、ガラスビーズからなることとしてもよい。
血漿内にガラスビーズを投入することにより、血漿内の繊維素原がガラスビーズの表面に付着するので、例えばフィルタによって血漿からガラスビーズを除去することにより、血液凝固因子を含まない血清を容易に分離することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、吸着部材が、ガラス棒からなることとしてもよい。
血漿内にガラス棒を投入して、該ガラス棒によって血漿を攪拌することにより、ガラス帽の表面に結晶内の繊維素原を付着させることができる。そして、ガラス棒を血漿内から取り出すことにより、血液凝固因子を含まない血清を容易に分離することができる。
【００１３】
また、本発明は、抗凝固剤入りの血液から多血小板血漿および有形成分を分離した後の血漿に、抗血液凝固因子を吸着させた磁気ビーズを投入した後に、磁石を用いて磁気ビーズを回収する血清の分離方法を提供する。
磁気ビーズに吸着させた抗血液凝固因子と血漿内の血液凝固因子とを反応させることにより、血液凝固因子を磁気ビーズに付着させることができる。その後、磁気ビーズに磁石を作用させて吸着、回収することで、血清を簡易に分離することができる。
【００１４】
また、本発明は、抗凝固剤入りの血液から分離した多血小板血漿および上記いずれかの分離方法により分離した血清を培地に添加して培養する細胞の培養方法を提供する。
本発明によれば、患者自身の血液から分離した多血小板血漿および血清を利用して細胞を培養することができる。したがって、未知の感染症による感染のおそれがなく、より安全かつ健全に細胞を培養することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、血液内の多血小板血漿を抽出した後の血漿から血清を効果的に抽出することができるので、いままで廃棄されていた血清を有効利用することができる。特に、患者自身の血液中に含まれる多血小板血漿および血清を有効利用できるので、未知の感染症による感染のおそれがなく、細胞をより安全かつ健全に培養することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の一実施形態に係る血清の分離方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る血清の分離方法は、患者自身から採取した血液から血清を分離する方法である。患者自身から採取された血液は、採取後に所定期間保存されるため、保存中に凝固することを防止しなければならない。そのため、例えば、輸血バッグ等の容器には、抗凝固剤が封入されており、採取された血液を収容すると、抗凝固剤と血液とが混合されて、血液中の血液凝固因子による凝固作用が抑制される。
【００１７】
本実施形態は、このようにして抗凝固剤の作用により、凝固しないように処理された血液から多血小板血漿および血清を分離する方法であって、図１に示されるように、血液から有形成分を分離する第１ステップＳ１と、残った血漿から多血小板血漿を分離する第２ステップＳ２と、さらに多血小板血漿を分離した血漿から血清を分離する第３ステップＳ３とを含んでいる。
【００１８】
血液１から有形成分２を分離する第１ステップＳ１は、血液１を２０００ｒｐｍで４分間遠心分離にかけることにより行われる。有形成分２には、例えば、間葉系幹細胞等の細胞や赤血球等が含有されている。第１ステップＳ１を実施することにより、図２に示されるように、血液１内の有形成分２は遠沈管３の底部に沈み、上澄み液４を採取することで、有形成分２を分離した血漿４を得ることができる。有形成分２は、患者に自己血液として戻してもよい。
【００１９】
血漿４から多血小板血漿５を分離する第２ステップＳ２は、血漿４を３３００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけることにより行われる。これにより、図３に示されるように、多血小板血漿５が遠沈管３の底部に沈むので、上澄み液６を採取することで、多血小板血漿５を分離した血漿６を得ることができ、かつ、遠沈管３内に残った多血小板血漿５を採取することができる。
【００２０】
次いで、第２ステップＳ２で採取された血漿６から血清７を分離する第３ステップＳ３は、図４に示されるように、血漿６を収容した容器８内に複数個のガラスビーズ９を投入することにより行われる。図中、符号１０は容器８を自転あるいは偏心回転させる加振機である。この第３ステップＳ３を実施することで、血漿６内に含有されている繊維素原１１、例えば、フィブリンがガラスビーズ９の表面に吸着されることになる。
【００２１】
そして、約１０分間にわたって加振すると、繊維素原１１が付着したガラスビーズ９が容器８内の底部に沈んだ状態となるので、この状態で、上澄み液１２を吸引ノズル（図示略）等によって吸引することにより、血清１２を採取することができる。なお、血清１２を回収した後には、繊維素原１１はガラスビーズ９に付着した状態で容器８内に残ることになる。
【００２２】
この場合において、本実施形態に係る分離方法によれば、血液１内に抗凝固剤が混入していて、多血小板血漿５の分離回収後には通常の凝固剤による分離方法では分離できなかった血清１２を容易に分離回収することができる。一方、高濃度の凝固剤を添加することにより分離回収した血清とは異なり、血清１２内に凝固剤が混入していないので、その後の細胞の培養時に不溶解性の結晶が培地内に析出して細胞の培養に悪影響を与えることもない。
【００２３】
すなわち、本実施形態に係る分離方法によれば、血液１から多血小板結晶５および血清１２を分離回収することができるので、従来、多血小板結晶５を回収するときには廃棄されていた血清１２、血清１２を回収するときには廃棄されていた多血小板結晶５を有効に利用することができるという利点がある。特に、血液１が患者自身から採取した自己血液である場合には、自己血液由来の多血小板結晶５および自己血清１２を得ることができ、他家血液を使用する場合と比較すると、未知の感染症による感染のおそれがなく、より安全かつ健全な多血小板結晶５および血清１２を得ることができるという利点がある。
【００２４】
また、これら自己血液由来の多血小板結晶５および上記分離方法により得た自己血清１２を用いて細胞を培養する培養方法によれば、上記と同様、未知の感染症による感染のおそれがなく、より安全かつ健全に増殖させた細胞を得ることができるという効果がある。
【００２５】
なお、上記実施形態における血清１２の分離方法においては、容器８内にガラスビーズ９を投入して加振することとしたが、これに代えて、図５に示されるように、多血小板血漿５を分離回収した後の血漿６を収容した容器８内に、ガラス棒１３を挿入して、加振機１０により加振することにしてもよい。あるいは、容器８内に貯留した血漿６内に挿入したガラス棒１０を血漿６内において回転させることにより攪拌することにしてもよい。
【００２６】
このようにすることで、上記実施形態の場合と同様に、血漿６内に存在している繊維素原１１がガラス棒１３の表面に吸着されるので、所定時間攪拌した後にガラス棒１３を抜き去ることにより、容器８内に血清１２が分離回収されることになる。これにより、ガラスビーズ９を投入した場合と同様に、簡易に血清１２を回収することができるとともに、ガラスビーズ９の場合よりも容易に繊維素原１１を血清１２内から除去することができるという利点がある。
【００２７】
また、ガラスビーズ５やガラス棒１３のように、それ自体で繊維素原１１の吸着能力を有するガラス材料からなる吸着部材を使用する代わりに、図６に示されるように、抗血液凝固因子１４、例えば、抗フィブリノーゲン、抗プロトロンビン等を吸着させた磁気ビーズ１５を、多血小板血漿５を分離除去した後の血漿６内に投入することにしてもよい。磁気ビーズ１５は、例えば、フェライトのような磁性材料により構成されている。
この場合には、血漿６を収容した容器８内に磁気ビーズ１５を投入して加振機１０により所定時間攪拌することによって、磁気ビーズ１５の表面の抗血液凝固因子１４と血漿６内の血液凝固因子１１とを反応させて、血液凝固因子１１を凝固させ、磁気ビーズ１５に付着状態に保持することができる。
【００２８】
そして、その後に、図６（ｃ）に示されるように、容器８の外部から磁石１６を近接させることにより、磁石１６の磁力によって容器８内の磁気ビーズ１５を磁石１６側に吸着状態に配置することができる。このとき、磁気ビーズ１５に付着している血液凝固因子１１も磁石１６側に吸着状態に配される。
したがって、この状態で、容器８内の液体１２を吸引ノズル（図示略）等によって吸引することにより、容易に血清１２を分離、回収することができる。このようにすることで、吸引ノズルによる吸引時に血液凝固因子１１を容器８内に留め置くことができるので、さらに容易に血清１２を回収することができる。
また、抗血液凝固因子１４を磁気ビーズ１５の表面に固定しておくことにより、回収された血清１２内に抗血液凝固因子１４が混入することが防止される。
【００２９】
なお、本実施形態に係る細胞の培養方法において培養する細胞としては、任意の細胞でよいが、特に、骨髄由来の幹細胞、臍帯血由来の幹細胞、胎盤由来の幹細胞等を採用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施形態に係る血清の分離方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の分離方法における第１ステップを説明する図である。
【図３】図１の分離方法における第２ステップを説明する図である。
【図４】図１の分離方法における第３ステップを説明する図である。
【図５】図４の第３ステップの第１の変形例を示す図である。
【図６】図４の第３ステップの第２の変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００３１】
１  血液
２  有形成分
５  多血小板血漿
６  血漿
９  ガラスビーズ（吸着部材）
１１  繊維素原
１２  血清
１３  ガラス棒（吸着部材）
１４  抗血液凝固因子
１５  磁気ビーズ（吸着部材）
１６  磁石
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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