(57)【要約】【課題】  アガリクス・ブラゼイの新規な医薬用途を提供すること。【解決手段】  本発明によれば、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスを有効成分とする低分子量GTP結合蛋白質RhoA活性化抑制剤を提供することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガリクス・ブラゼイの抽出エキスを有効成分としてなる低分子量GTP結合蛋白質RhoA活性化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アガリクス・ブラゼイの新規な医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アガリクス・ブラゼイ（Agaricus blazei）は、ブラジル原産の担子菌類キノコであり、多糖の一種であるβ-グルカンを多く含むことで知られている。このβ-グルカンは、免疫賦活能力が高く、NK（ナチュラルキラー）細胞などの免疫細胞を活性化させることにより、癌細胞を攻撃して殺滅させる効果を有することから、アガリクス・ブラゼイは、癌やその他の成人病などに対して優れた効果を有し、健康食品などとして重宝されている。
【０００３】
しかしながら、アガリクス・ブラゼイが有する生物学的作用機序については未解明な部分が多い。アガリクス・ブラゼイの抗癌作用を例にとってみても、これまで免疫学的側面からの検討は種々行われているものの、それ以外には、下記の特許文献1において癌転移抑制作用などが報告されているに過ぎない。
【特許文献１】特開２００４−９１４４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、アガリクス・ブラゼイの生物学的作用機序の解明に基づく新規な医薬用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意検討を重ねた結果、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスに、低分子量GTP結合蛋白質RhoA活性化抑制作用があることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の低分子量GTP結合蛋白質RhoA活性化抑制剤は、請求項1記載の通り、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスを有効成分としてなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、アガリクス・ブラゼイの新規な医薬用途として、低分子量GTP結合蛋白質RhoA（以下単に「RhoA」と称する）活性化抑制剤を提供することができる。RhoAは、低分子量G蛋白質のRhoファミリーに属する。Rhoファミリー蛋白質及びその活性制御因子は、細胞骨格分子の変化や細胞骨格の構築に関与し、その結果として、癌細胞の浸潤や炎症細胞の遊走や創傷治癒における細胞移動、血小板凝集による血栓形成などに密接に関わっていることが知られている。例えば、RhoAの活性化は、アクチンの重合とミオシン軽鎖のリン酸の亢進を介して、結果として、アクトミオシン系を活性化して細胞移動の駆動力を発生することで癌細胞の浸潤能を高める。また、血管平滑筋の収縮は、細胞内Ca濃度の上昇がきっかけとなるが、ホルモンなどにより少量のCaで強い収縮が生じる現象であるCa感受性亢進作用に低分子量G蛋白質が関係していることが知られている。すなわち、RhoAの活性化は、細胞内Ca濃度の上昇を介して血管平滑筋を収縮させ、血圧を上げる作用がある（Circ. Res.,92(4),411-418(2003)）。従って、本発明のアガリクス・ブラゼイの抽出エキスを有効成分としてなるRhoA活性化抑制剤は、癌細胞浸潤抑制剤の他、抗炎症剤や血圧降下剤などとしても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のRhoA活性化抑制剤の有効成分となるアガリクス・ブラゼイの抽出エキスは、例えば、凍結乾燥後に粉砕したアガリクス・ブラゼイの子実体や菌糸体（天然物であってもよいし自体公知の方法による栽培物や培養物であってもよい）を、水や熱水、エタノールやブタノールをはじめとするアルコールなどの抽出溶媒に浸漬し、室温放置や加熱還流することで抽出液を得た後、得られた抽出液を減圧濃縮や凍結乾燥して抽出溶媒を除去することで調製することができる。このようにして調製されたアガリクス・ブラゼイの抽出エキスは、顆粒や錠剤やカプセル剤などに製剤化され、服用すればよい。その服用量は、服用者の年齢、性別、体重、体調などに応じて適宜決定することができる。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明のRhoA活性化抑制剤について実施例によって更に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１０】
実験1：アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのRhoA活性化抑制作用について（その1）
RhoA活性化抑制作用の評価は、AH130ラット腹水肝癌細胞の高浸潤性クローンであるMM1細胞において、RhoA活性化作用があるLPA（1-oleoyl-lysophosphatidic acid）処理で活性化するRhoAを、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスが抑制するかどうかを以下の方法により調べることで行った。
アガリクス・ブラゼイの子実体原末を水中に1〜9時間浸漬して得られた上清画分を凍結乾燥することで抽出エキス粉末を得た。1.5mlマイクロチューブにこの抽出エキス粉末を15mg秤りとり、300μlの滅菌済みPBSを加えて3分間懸濁した後、15,000rpmで15分間の遠心分離を行って上清を回収し、これを試験サンプルとした（この試験サンプルをKDと称する）。また、子実体原末のかわりに菌糸体原末を用いて試験サンプルを調製した（この試験サンプルをKEと称する）。以上の2種類の試験サンプルを用いて以下の実験を行った。
【００１１】
（実験方法）
MM1細胞は10%FCS含有DMEM培地で継代維持したものをDMEM培地で2回洗浄し、更に40mlのDMEM培地を加えて37℃で2〜3時間incubateした。その後試験管中に各1×106個/mlになるように細胞を調製し、各試験サンプルあたり2本の試験管に4mlずつ調製した。
試験サンプルは、40μlを上記試験管2本にそれぞれ添加し、よく撹拌して10分間静置した。更にそのうちの1本に5mMのLPAを20μlずつ添加し、37℃で5分間静置した。その後遠心分離を行い、細胞をペレットとして回収した。
次にRhoAのpull down assayを行った。細胞ペレットが入った試験管にRhoA assay用bufferAを1ml添加して懸濁後氷中で超音波破砕器で10秒間処理した。上清の蛋白量を測定し、うち一部はそのままLysate（細胞破砕物）とした。蛋白量をそろえてRhoA beads（Rhotekin Rho Binding Domain,upstate,#14383）を40μlずつ加えて4℃で45分間振とうし、上清を除去して3回washしたビーズをBeads（活性型RhoA結合ビーズ）として回収した。これらのLasate及びBeadsにSDSを含むsample bufferを加えて95℃で5分間処理した後にSDS-PAGEを行った。SDS-PAGEはPEGminiを使用し、泳動は、Tris-glycine bufferで40mAで行った。
SDS-PAGEで得られたゲルをWestern blottingでメンブレンに転写した。ブロッティング装置にblotting bufferAに浸した濾紙とblotting bufferBに浸した濾紙を載せた。その上からblotting bufferCに浸したPVDFメンブレン（以下メンブレン）と更にその上にゲルを載せ、最後にblotting bufferCに浸した濾紙を載せた。Blottingは90mAで40分間行った。
Western blotting後のメンブレンをBlocking bufferで1時間処理後、RhoAの一次抗体で1時間処理した。0.1%Tween含有TBSで洗浄後、メンブレンを2000倍希釈した二次抗体で30分間処理した。0.1%Tween含有TBSで洗浄後、メンブレンを発色試薬（Amasham ECL western blotting detection Reagent、Amasham社製）で1分間処理後に感光板を用いてフィルムに感光させ、自動現像機で現像してバンドとして検出した。
【００１２】
（実験結果）
KDとKEについての実験結果を図１に示す。なおcontrolはサンプル抽出に使用した滅菌済みPBSを用いた。図1から明らかなように、RhoAの蛋白量は、LPA添加の有無にかかわらず、controlとKDとKEの三者間で違いは見られなかった（写真上）。一方、RhoAの活性はLPA添加によるcontrolの濃いバンドに対して、KD及びKEではバンドの濃度は明らかに低く、LPAによるRhoAの活性化が抑制されていることを示した（写真下）。このことから、KD及びKEにはRhoA活性化抑制作用があることがわかった。
【００１３】
実験2：アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのRhoA活性化抑制作用について（その2）
アガリクス・ブラゼイの子実体原末を沸騰水中で3時間還流抽出する操作を5回繰り返して得られた上清画分を凍結乾燥することで抽出エキス粉末を得た。1.5mlマイクロチューブにこの抽出エキス粉末を15mg秤りとり、300μlの滅菌済みPBSを加えて懸濁した後、遠心分離により上清を回収し、これを試験サンプルとした（この試験サンプルをKD-Hと称する）。実験1に記載のKDとこのKD-Hを用いて実験1と同様の実験を行い、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスの調製方法が、RhoAの蛋白量及び活性にどのように影響するか調べた。Controlとして、サンプル抽出に使用した滅菌済みPBSを用いた。図2から明らかなように、RhoAの蛋白量はcontrolとKDとKD-Hの三者間で違いは見られなかった（写真上）。一方、RhoAの活性は、LPA添加によるcontrolの濃いバンドに対して、KD及びKD-Hではほぼ同様にバンドの濃度が薄く、LPAによるRhoAの活性化が同程度抑制されていることを示した（写真下）。このことから、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスの調製方法の違いによるRhoA活性化抑制作用の違いは認められなかった。
【００１４】
実験3：アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのin vitro癌細胞浸潤抑制作用について（その1）
組織へ浸潤する癌細胞にアガリクス・ブラゼイの抽出エキスが及ぼす影響を、ラット中皮細胞を用いたin vitro癌細胞浸潤抑制モデルを用いて調べた。
（実験方法）
H.Akedo et.al,Cancer Res.,46,2416（1986）及びM.Mukai et al,ibid.,47,2167（1987）に記載の方法に準じて、正常ラットの腸間膜を0.25%トリプシンで処理し、遊離する単細胞（腹膜中皮細胞）を35mmの培養シャーレに移し、ダルベッコ培地に10%ウシ胎児血清を添加した培養液存在下で培養してモノレイヤーを形成させた。この中皮細胞層上にMM1細胞（2×105個）をLPA（25μM）の存在下、非存在下で重層した。20時間後、上清を除き、残ったモノレイヤーを10%ホルマリンで固定化して中皮細胞下に侵入した癌細胞数を顕微鏡下でカウントした。LPA非存在下では侵入癌細胞はほとんど認めないが、LPA存在下では多数の侵入癌細胞を認めた。
実験1に記載のKDとKEのそれぞれ20μlまたは40μlをMM1細胞に添加しよく撹拌した後、10μlの5mM LPAを添加し、腹膜中皮細胞層上に重層し、20時間後の侵入癌細胞数を測定した。各試験サンプル添加時の侵入細胞数を以下の式により阻害率として求めた。
【００１５】
阻害率(%)=(1-(A/B))×100
A：試験サンプル添加時の浸潤細胞数，B：試験サンプル非添加時の浸潤細胞数
【００１６】
（実験結果）
図3に示す。図3から明らかなように、KEよりもKDの方が高い阻害率を示し、癌細胞浸潤抑制作用に優れることがわかった。
【００１７】
実験4：アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのin vitro癌細胞浸潤抑制作用について（その2）
実験1に記載のKDと、アガリクス・ブラゼイの子実体原末のかわりにメシマコブの子実体原末を用いて実験1に記載のKDと同様の調製方法で調製した試験サンプル（この試験サンプルをKAと称する）を用いて実験3と同様の実験を行い、アガリクス・ブラゼイの抽出エキス及びメシマコブの抽出エキスの癌細胞浸潤抑制作用の違いを調べた。Controlは、抽出に使用した滅菌済みPBSを用いた。図4から明らかなように、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスの癌細胞浸潤抑制作用は、メシマコブの抽出エキスの癌細胞浸潤抑制作用に比べてはるかに優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明は、アガリクス・ブラゼイの新規な医薬用途としてRhoA活性化抑制剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例における、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのRhoA活性化抑制作用を示すグラフである。
【図２】同、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのRhoA活性化抑制作用を示す別のグラフである。
【図３】同、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのin vitro癌細胞浸潤抑制作用を示すグラフである。
【図４】同、アガリクス・ブラゼイの抽出エキスのin vitro癌細胞浸潤抑制作用を示す別のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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