(57)【要約】【課題】  患者から採取した間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させる。【解決手段】  肝細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した培地、肝細胞増殖因子を添加した培地内において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法および間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として肝細胞増殖因子を使用する肝細胞増殖因子の使用方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した培地。
【請求項２】
肝細胞増殖因子を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した請求項１に記載の培地。
【請求項３】
ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌの濃度で添加した請求項１に記載の培地。
【請求項４】
肝細胞増殖因子を４０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した請求項３に記載の培地。
【請求項５】
肝細胞増殖因子を添加した培地内において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項６】
前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである請求項５に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項７】
前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が２０ｎｇ／ｍｌである請求項６に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項８】
ビタミンＣを添加する請求項５から請求項７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項９】
前記培地内におけるビタミンＣの濃度が２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌである請求項８に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項１０】
前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が４０ｎｇ／ｍｌである請求項８または請求項９に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項１１】
培地内に骨髄液を投入して培養する請求項５から請求項１０のいずれかに記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項１２】
間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として肝細胞増殖因子を使用する肝細胞増殖因子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪等に分化可能な多分化能を有しているため、細胞治療や再生医療の細胞ソースとして注目を集めている。しかしながら、骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞はごく微量であるため、臨床治療に用いる場合には、骨髄液内から集めた間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることが重要である。
【０００３】
従来、間葉系幹細胞を効率よく増殖させる方法として、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている方法が知られている。
これらの方法は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として繊維芽細胞増殖因子を培地に添加するものである。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０２／２２７８８Ａ１号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０１／４８１４７Ａ１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これに対して、本発明者は、試験、研究の結果、間葉系幹細胞をさらに短期間で大量に増殖させる増殖因子を見いだした。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、患者から採取した間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることができ、大量の間葉系幹細胞を必要とする臨床治療に貢献し得る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、肝細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した培地を提供する。
上記発明においては、肝細胞増殖因子を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
【０００６】
また、上記発明においては、ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
ビタミンＣを添加した場合には、肝細胞増殖因子を４０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
【０００７】
また、本発明は、肝細胞増殖因子を添加した培地内において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
この方法においては、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
また、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が２０ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
【０００８】
また、上記発明においては、ビタミンＣを添加することが好ましい。
この場合には、前記培地内におけるビタミンＣの濃度が２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌであることが好ましい。
また、ビタミンＣを添加した場合には、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が４０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
【０００９】
さらに、本発明は、培地内に骨髄液を投入して培養することにしてもよい。骨髄液内に含まれる造血幹細胞の増殖が、間葉系幹細胞と同様に肝細胞増殖因子の作用によって促進される。造血幹細胞は間葉系幹細胞の増殖を促進することが知られているので、本発明によれば、患者から採取した骨髄液の初代培養においても効率的に間葉系幹細胞を増殖させることができる。
【００１０】
また、本発明は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として肝細胞増殖因子を使用する肝細胞増殖因子の使用方法を提供する。肝細胞増殖因子によって間葉系幹細胞の増殖を促進することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、間葉系幹細胞を効率的に増殖して、患者から採取した骨髄液等に含まれる微量の間葉系幹細胞から、短期に、かつ大量に間葉系幹細胞を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の第１の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法について説明する。
本実施形態に係る培地は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum ）またはヒト血清、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth
Factor：以下、単にＨＧＦという。）および抗生物質を混合したものである。
【００１３】
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、培地として上記培地を使用して所定の培養条件（例えば、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％）で間葉系幹細胞の培養を行う方法である。
また、本実施形態に係るＨＧＦの使用方法は、このような培養方法において、ＨＧＦを間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として使用する方法である。
本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法によれば、ＨＧＦの作用により、ＨＧＦを含まない場合と比較して間葉系幹細胞を大幅に増殖させることができるという効果がある。
【００１４】
次に、本発明の第２の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法について説明する。
本実施形態に係る培地は、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳまたはヒト血清、２５〜４０００μｇ／ｍｌのビタミンＣ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合したものである。
【００１５】
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、培地として上記培地を使用して所定の培養条件（例えば、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％）で間葉系幹細胞の培養を行う方法である。
また、本実施形態に係るＨＧＦの使用方法は、このような培養方法において、ＨＧＦを間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として使用する方法である。
本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法によれば、ＨＧＦおよびビタミンＣの作用により、ビタミンＣを含まない場合と比較して間葉系幹細胞を大幅に増殖させることができるという効果がある。
【実施例】
【００１６】
［第１の実施例］
第１の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第１の実施例を以下に説明する。
本実施例において使用された培地は、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合したものである。
【００１７】
本実施例においては、まず、対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁した。次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、６ウェルプレートに播いた。そして、上記のようにＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合した培地３ｍｌを加えた。
【００１８】
このように調製された間葉系幹細胞をＣＯ２インキュベータ内に投入し、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で１週間培養した。培養期間中、培地の交換を２回行った。培養３日目と７日目において細胞をトリプシンで回収して血球計算盤で細胞数を計測した。その結果を図１に示す。コントロールとして、ＨＧＦを含まない培地で同様の培養を行った結果を示す。
【００１９】
この実施例によれば、培地に２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを添加した場合の方が、添加しないコントロールの場合と比較して、培養３日目および７日目のいずれの場合も、約１．５倍も多く間葉系幹細胞を増殖させることができた。
【００２０】
［第２の実施例］
次に、第１の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第２の実施例を以下に説明する。この実施例は、ＨＧＦの濃度を変化させて培養したものである。
【００２１】
本実施例においては、まず、対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁した。次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、１２ウェルプレートに播いた。そして、上記のようにＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、抗生物質およびそれぞれ０，１０，２０，４０，６０，１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを混合した培地２ｍｌを加えた。
【００２２】
このように調製された間葉系幹細胞をＣＯ２インキュベータ内に投入し、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で培養し、培養４日目に、トリプシンで回収した間葉系幹細胞の細胞数を血球計算盤によって計測した。その結果を図２に示す。
この実施例によれば、ＨＧＦが間葉系幹細胞の増殖を促進していること、および、その増殖促進効果がＨＧＦの濃度に依存してことがわかった。
【００２３】
図２によれば、ＨＧＦ濃度が１０ｎｇ／ｍｌであっても、間葉系幹細胞の増殖促進効果が見られる。また、ＨＧＦ濃度が２０ｎｇ／ｍｌ以上となると、間葉系幹細胞の増殖促進効果はほぼ一定となっている。ＨＧＦ濃度があまりに高い場合には、間葉系幹細胞の健全性が害される可能性があり、現実的には１００ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
したがって、間葉系幹細胞の増殖促進効果を得るためのＨＧＦ濃度としては、１０〜１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、２０ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
【００２４】
［第３の実施例］
第２の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第２の実施例を以下に説明する。この実施例は、ＨＧＦの濃度を変化させて培養したものである。
【００２５】
本実施例においては、まず、対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁した。次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、１２ウェルプレートに播いた。そして、上記のようにＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、抗生物質、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣおよびそれぞれ０，１０，２０，４０，６０，１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを混合した培地２ｍｌを加えた。
【００２６】
このように調製された間葉系幹細胞をＣＯ２インキュベータ内に投入し、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で培養し、培養４日目に、トリプシンで回収した間葉系幹細胞の細胞数を血球計算盤によって計測した。その結果を図３に示す。
図３は、図２に示した第２の実施例の結果を併せて示している。
図３によれば、間葉系幹細胞の培養において、ＨＧＦに加えてビタミンＣを併用することで、ビタミンＣを併用しない場合と比較して、間葉系幹細胞の増殖促進効果が向上していることがわかる。
【００２７】
また、ビタミンＣを添加した場合には、ＨＧＦが４０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度において間葉系幹細胞の増殖促進効果が一定値となっている。したがって、ビタミンＣを添加した場合には、ＨＧＦの濃度を４０ｎｇ／ｍｌ以上とすることが好ましく、４０ｎｇ／ｍｌとすることがさらに好ましい。。
【００２８】
なお、ビタミンＣの濃度については、５０μｇ／ｍｌとした場合について実施したが、これに代えて、２５〜４０００μｇ／ｍｌの範囲において任意の濃度値を選択することにしてもよい。
また、上記各実施形態においては、対数増殖中の間葉系幹細胞について、ＨＧＦによる増殖促進効果を示したが、これに代えて、患者の体内から採取した骨髄液に対してＨＧＦおよび／またはビタミンＣを添加した培地を用いて、骨髄液内の間葉系幹細胞を培養することにしてもよい。この場合には、ＨＧＦによって骨髄液内に含有される造血幹細胞の増殖が促進され、これにより間葉系幹細胞の増殖が促進されることになる。このようにすることで、患者から採取した骨髄液の初代培養においても効率的に間葉系幹細胞を増殖させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法とその効果を説明する第１の実施例を示すグラフである。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法とその効果を説明する第２の実施例を示すグラフである。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法とその効果を説明する第３の実施例を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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