(57)【要約】【課題】  ＳＰＲ分析方法を用いてクロマトグラムを得る方法を提供すること。【解決手段】  金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法において、金属膜表面に吸着する分子の絶対量が該分子の該金属膜表面への飽和吸着量より低い量となるような液量で送液することにより測定を行うことを特徴とする上記の測定方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法において、金属膜表面に吸着する分子の絶対量が該分子の該金属膜表面への飽和吸着量より低い量となるような液量で送液することにより測定を行うことを特徴とする上記の測定方法。
【請求項２】
金属膜表面に吸着する分子の濃度が、該分子の該金属膜表面への単位面積あたりの飽和吸着量を該流路の高さで除した値より低い濃度で測定することを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
該流路の上流から下流にかけて３個所以上の表面プラズモン信号を測定し、該吸着する分子の吸着の動きを測定することを特徴とする、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
該流路の一部の表面プラズモン信号を時間軸において連続的に測定し、該吸着する分子の吸着の動きを測定することを特徴とする、請求項１又は２に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００４】
一方、クロマトグラフィーとは、混ざり合った化合物（溶質）を個々の化合物に分離することである。サンプル中に含まれる個々の成分を分離することで、様々なサンプル化合物が何であるのか (定性)、どれぐらい含まれているのか (定量) 測定するのがより容易になる。
【０００５】
ＳＰＲを用いては従来、結合の有無とその結合状態の定量化のみが測定されてきた。特許文献１では２次元ＳＰＲが測定されているが、金属膜表面の飽和吸着量より低い量を送液しているわけではないので、クロマトグラムを得ることはできなかった。
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／６７０２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、ＳＰＲ分析方法を用いてクロマトグラムを得る方法を提供することを解決すべき課題とした。より詳細には、本発明は、ＳＰＲ分析法において、細胞抽出液などの混合物を分離する方法、及び単品であってもＳＰＲ信号のピーク面積、時間、位置による強度から物質の定量及び定性を行う方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法において、金属膜表面に吸着する分子の絶対量が該分子の該金属膜表面への飽和吸着量より低い量となるような液量で送液することにより測定を行うことによって、鮮鋭なクロマトグラムを取得できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置を用い、前記流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法において、金属膜表面に吸着する分子の絶対量が該分子の該金属膜表面への飽和吸着量より低い量となるような液量で送液することにより測定を行うことを特徴とする上記の測定方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、金属膜表面に吸着する分子の濃度は、該分子の該金属膜表面への単位面積あたりの飽和吸着量を該流路の高さで除した値より低い濃度で測定する。
【００１１】
好ましくは、流路の上流から下流にかけて３個所以上の表面プラズモン信号を測定し、該吸着する分子の吸着の動きを測定する。
【００１２】
好ましくは、流路の一部の表面プラズモン信号を時間軸において連続的に測定し、該吸着する分子の吸着の動きを測定する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＳＰＲ分析方法においてクロマトグラムを得ることが可能になった。本発明の方法を利用することにより、ＳＰＲ分析法において、細胞抽出液などの混合物を分離したり、単品であってもＳＰＲ信号のピーク面積、時間、位置による強度から物質の定量及び定性を行うことが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の測定方法は、表面プラズモン共鳴測定装置を用いて前記流路系内の液体を交換することで表面プラズモン共鳴の変化を測定する方法において、金属膜表面に吸着する分子の絶対量が該分子の該金属膜表面への飽和吸着量より低い量となるような液量で送液することにより測定を行うことを特徴とするものである。
【００１５】
クロマトグラフィーは、混ざり合った化合物（溶質）を個々の化合物に分離することである。サンプル中に含まれる個々の成分を分離することで、様々なサンプル化合物が何であるのか (定性)、どれぐらい含まれているのか (定量) 測定するのがより容易になる。
【００１６】
金属表面と吸着する分子は金属表面に時間とともに吸着する。
dθ/dt = ka・c・( 1 -θ) - kd・θ  式(1)
式中、θは吸着率(=吸着量/飽和吸着量)、kaは吸着速度係数、kdは離脱速度、cは吸着する分子の濃度を表す。
【００１７】
本発明では、該金属表面をいわゆる１次元もしくは２次元面プラズモン共鳴法で測定し、流路の上流から下流に向けて多点で測定した結果を繋ぎ合わせることで、距離、時間、強度の３次元情報を持ったクロマトグラムを得ることができる。ここで、一定時間後の距離に対する強度を表示することで、薄層クロマトグラフィーのごとくクロマトグラムが得られる。さらに、一点で測定強度を時間に対して表示することで時間対強度のクロマトグラムを得ることも可能である。距離軸、時間軸、強度軸の３次元表示することも可能である。
【００１８】
本発明における面プラズモン信号の測定点は連続でも断続的でもよいが、測定点数は５点以上であることが好ましく、さらに好ましくは８点以上である。
【００１９】
ここで、吸着する分子の溶液は金属表面を流れており、随時新たな金属表面と吸脱着を繰り返しながら上流から下流に流れることとなる。通常の面プラズモン信号測定法では測定面が同時かつ均一に吸脱着反応をするように、流路内の該吸着する分子数が吸着する面の飽和吸着量より多くかつ高速に送液することを特徴としている。
【００２０】
本発明においては、流路内の該吸着する分子数を、吸着する面の飽和吸着量より少なくすることにより、金属表面に対して該分子が吸脱着を繰り返すことでクロマトグラムを生成させることができる。
【００２１】
また、送液速度も各測定点の距離を１秒以上で移動する線速度より遅いことが好ましい。該飽和吸着量より吸着する分子の濃度が低く、該金属膜表面に吸着する分子の濃度が該分子の該金属膜表面への単位面積あたりの飽和吸着量を該流路の高さで除した値より低い濃度の場合は図１に示すような鮮鋭なクロマトグラムが得られる。また、該飽和吸着量より吸着する分子の濃度が高い場合は、図２に示すように、鮮鋭なクロマトグラムが得られない。
【００２２】
本発明における流路内の該金属表面の長さは１ｍｍ以上１００ｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上１０ｍ以下がさらに好ましい。
【００２３】
本発明における流路内の該金属表面の面積としては０．１ｍｍ2以上１００ｃｍ2が好ましく、１０ｍｍ2以上５０ｃｍ2以下がさらに好ましい。
【００２４】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。以下、本発明で用いる表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。
【００２５】
表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記金属膜上に形成されたセルを含む流路系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置である。
【００２６】
誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える表面プラズモン共鳴測定装置を用いることもできる。
【００２７】
また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されていてもよい。
【００２８】
本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
【００２９】
例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。
【００３０】
なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。
【００３１】
その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００３２】
一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。
【００３３】
その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。
【００３４】
他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。
【００３５】
また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。
【００３６】
また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。
【００３７】
さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。
【００３８】
そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００３９】
あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。
【００４０】
測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。
【００４１】
他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。
【００４２】
また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。
【００４３】
さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。
【００４４】
また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。
【００４５】
他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。
【００４６】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。
【００４７】
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。
【００４８】
そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。
【００４９】
さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。
【００５０】
上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。
【００５１】
本発明で用いる測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。
【００５２】
金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００５３】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００５４】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００５５】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００５６】
金属膜は、最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。
【００５７】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００５８】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、例えば、それらの官能基の前駆体を含有する高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。
【００５９】
上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００６０】
本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００６１】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００６２】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００６３】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００６４】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００６５】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００６６】
上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００６７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
以下の実験は、GWC社製SPRimagerを用いた多点でのSPR信号を測定することで実験できる。
（１）測定チップの作製：
ガラス板(HOYA社製BSC7)を厚さ0.3mmに光学研磨したものに金属膜として50nmの金が蒸着し、Model-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、20nmの厚みとなるようにポリスチレンの２-ブタノン溶液をスピンコートする。
【００６９】
（２）牛血清アルブミン（BSA）溶液の評価：
上記（１）で得られる測定チップを表面プラズモン測定装置にセットする。予め屈折率のわかっているショ糖溶液を送液し、屈折率に対する表面プラズモン装置の出力との検量線を作成する。ここで、金属表面近傍の屈折率変化はBSAの吸着量と線形に相関する。この検量線を用いて表面プラズモン装置の出力値を屈折率に校正したものを表面プラズモン信号とする。
【００７０】
流路系内をバッファ２(10mM HEPES, 150mM NaCl)で満たす。流路系内にBSA溶液(バッファ２に溶解したもの)を液量は金属表面の流路体積の1/100量を送液し連続してバッファ２に置換する。このときのBSA溶液の濃度を金属表面への飽和吸着量を流路の高さで除した値の1/10としたとき図１と同様のクロマトグラムが得られ、10倍としたときは図２同様のクロマトグラムが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、本発明の方法（即ち、金属膜表面に吸着する分子の絶対量が該分子の該金属膜表面への飽和吸着量より低い場合）で測定した場合に得られるクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、比較例の方法（即ち、金属膜表面に吸着する分子の絶対量が該分子の該金属膜表面への飽和吸着量より高い場合）で測定した場合に得られるクロマトグラムを示す。
【図１】
2006226921.tif 000002
【図２】
2006226921.tif 000003