(57)【要約】【課題】  油脂又は脂肪酸エステルとアルコールによるエステル交換反応、又は脂肪酸とアルコールによるエステル化反応から環境面、操作面に優れた工程で、収率よく脂肪酸エステルを製造する方法を提供する【解決手段】  油脂又は脂肪酸エステル、アルコール、及び水からなるＯ／Ｗエマルジョン溶液中、又は脂肪酸、アルコール、及び水からなるＯ／Ｗエマルジョン溶液中で、化学修飾リパーゼを用いて、エステル交換反応又はエステル化反応を行うことにより、脂肪酸エステルを製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
油脂、脂肪酸エステル、又は脂肪酸のいずれか１種以上、アルコール、及び水からなるＯ／Ｗエマルジョン溶液中で、修飾リパーゼを用いて、油脂又は脂肪酸エステルとアルコールのエステル交換反応、又は脂肪酸のエステル化反応を行うことを特徴とする脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項２】
修飾リパーゼが、アルコール及び熱に対して安定性があり、かつ油相／水相に対して両親媒性を示すように化学修飾されたリパーゼである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
修飾リパーゼが、式（１）で示されるポリアルキレングリコールエ−テルに基づく構成単位（ア）、式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で示されるジカルボン酸又は無水マレイン酸に基づく構成単位（イ）、及び必要により共重合可能な他の単量体に基づく構成単位（ウ）を有する共重合体により化学修飾されたリパーゼである請求項１又は２記載の製造方法。
【化１】
2006050954.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を表し、但し、Ｒ１及びＲ３が同時にメチル基を表すことはなく、Ｒ４は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜２２の炭化水素基、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の１種又は２種以上を表し、ｍは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、ｍ＝１〜３００である。）
【化２】
2006050954.tif 000009
（式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は有機アンモニウムを表す。）
【請求項４】
共重合体が、式（１）で示されるポリアルキレングリコールエ−テルに基づく構成単位（ア）を２０〜８０モル％、式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で示されるジカルボン酸又は無水マレイン酸に基づく構成単位（イ）を２０〜８０モル％、及び共重合可能な他の単量体に基づく構成単位（ウ）を０〜３０モル％有する請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
油脂が、植物性油脂、動物性油脂又は廃油である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
油脂、アルコール、及び水からなるＯ／Ｗエマルジョン溶液中で、修飾リパーゼを用いて、油脂中の脂肪酸エステルとアルコールのエステル交換反応を行うことを特徴とするバイオディーゼル燃料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾リパーゼを用いた脂肪酸エステルの製造方法及びバイオディーゼル燃料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸エステルは、化粧品、医薬品、食品等の乳化剤、可溶化剤、分散剤、合成樹脂等の滑剤などに各種分野において用いられる有用な化合物である。また、近年、大豆や菜種等の植物やウシ等の動物の油脂をエステル交換して製造される脂肪酸エステルは、既存のディーゼル燃料と同じエンジンで使用でき、硫黄性排ガス放出量を大幅に削減することができ、しかも、再生産可能なバイオディーゼル燃料として注目を集めている。
脂肪酸エステルの製造法としては、各種脂肪酸とアルコールのエステル化反応、あるいは脂肪酸エステルとアルコールによるエステル交換反応などの化学合成によって製造する方法が一般的であり、バイオディーゼル燃料の多くも化学的合成法により生産されているが、反応後の触媒除去が難しく、副生成物のグリセリンの回収も容易ではなく、またその製造工程に多量のエネルギーを必要とするなど数々の問題点が指摘されている。
例えば、油脂（トリグリセリド）とエタノールにアルカリ触媒を加えて反応させる製造例が報告されている（非特許文献１）が、この反応系では副生成物として、未反応の油脂、アルコール、グリセリン、脂肪酸石鹸が生成する。このため、反応後にまず、エステルと原料アルコール及び副生成物グリセリンを分離精製し、さらに、分離したエステルはアルカリ触媒と脂肪酸石鹸を含むため、このアルカリ触媒と脂肪酸石鹸の除去を行うべく水洗浄を行う必要がある。
【０００３】
このような副生物の問題を回避する方法としては、リパーゼ酵素を利用した油脂のエステル交換による脂肪酸エステルの製造方法が知られている。
リパーゼは、油脂(トリグリセリド)を脂肪酸とグリセリンへ加水分解する反応を触媒するとともに、脂肪酸とアルコールをエステル結合させる反応に関与することから、トリグリセリドとアルコールのエステル交換反応によって脂肪酸エステルを製造する方法に使用することができる。
【０００４】
リパーゼを水溶媒系で反応を行う場合には、リパーゼ自体は水溶性であるものの、その基質の大部分は水に対して不溶性であり、また、水が多量に存在する場合には加水分解が優勢となり、エステル交換反応が起こり難いという欠点があった。さらに、リパーゼは、低級アルコールによって活性が失われやすいため、反応において収率を向上させるには、アルコールが高濃度にならないようにアルコールを段階的に、すなわち、油脂１モルに対して、まず１モルのアルコールを加えてエステル化させ、その反応が終了した時点でさらに２モルのアルコールを１モルずつ順次に加える必要があり（非特許文献２参照）、このようなアルコールの段階的な添加は工業化において、操作面で問題となる。
【０００５】
これに対し、有機溶媒系でエステル化させる方法として、リパーゼを修飾することにより有機溶媒に可溶化し、かかる修飾リパーゼを用いて有機溶媒中でエステル交換反応を行うことが試みられている（例えば、特許文献１、２参照）。しかし、トリグリセリドの分解により生じたグリセリンが低級アルコールに分配されることによる生成物阻害を起こし、エステル化反応が妨害されることとなるという問題があった。また、抽出や濃縮等の工程により有機溶媒を除去する必要があり、工業化にあたり操作面、環境面において問題となる。
【０００６】
また、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属由来の特殊なリパーゼを用いて脂肪酸エステルの製造を行う方法が報告されている（特許文献３）。このリパーゼは、有機溶剤耐性を有し、エステル交換の逆反応である加水分解を抑え、水の存在下でもエステル化反応を行うことができるが、なおも有機溶媒中で反応を行っており、さらにこのリパーゼの構造は特殊であり、その基質特異性が異なるために、反応に用いる油脂の種類によっては用いることが出来ないという欠点がある。
【特許文献１】特開昭６０−１５６３９５号公報
【特許文献２】特開平６−４６８４７号公報
【特許文献３】特開２００２−２３３３９３号公報
【非特許文献１】「トランスエステリフィケーションプロセストゥマニュファクチャーエチルエステルオブレイプオイル」(“Transesterification Process to Manufacture Ethyl Ester of Rape Oil”)  Ｒｏｇｅｒ  Ａ．Ｋｏｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｇ．３０−Ｓｅｐ．２，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，（１９９３）
【非特許文献２】ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオエンジニアリング（Journal of Bioscience and Bioengineering）  Ｖｏｌ．８８，Ｎｏ．６，６２７−６３１，（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、油脂又は脂肪酸エステルとアルコールによるエステル交換反応、又は脂肪酸とアルコールによるエステル化反応において、環境面、操作面に優れた工程で、収率よく脂肪酸エステルを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、油脂又は脂肪酸エステルとアルコールによるエステル交換反応、又は脂肪酸とアルコールによるエステル化反応によって脂肪酸エステルを製造する際に、リパーゼを用い、Ｏ／Ｗエマルジョン系にて反応を行うことにより、脂肪酸エステルの生産性が顕著に向上することを見出して本発明を完成した。このように生産性が向上する理由は、反応をＯ／Ｗエマルジョン系で行うことにより、リパーゼがＯ／Ｗエマルジョン界面へ濃縮してエステル化反応を触媒し、該界面で生成した、エステル化反応を阻害する副生成物であるグリセリンが効率的に水相に排出される結果、脂肪酸エステルの生産性が向上するものと推定される。特に、同一分子中に酸無水物基とポリオキシアルキレン基を併せ持つ共重合体を化学的に結合させた修飾リパーゼを用いることにより、高濃度のアルコール存在下でも高い酵素活性が維持され、また、熱に対する安定性が向上し、かつＯ／Ｗエマルジョン界面への濃縮能もさらに向上して、脂肪酸エステルの生産性がより高められる。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  油脂、脂肪酸エステル、又は脂肪酸のいずれか１種以上、アルコール、及び水からなるＯ／Ｗエマルジョン溶液中で、修飾リパーゼを用いて、油脂又は脂肪酸エステルとアルコールのエステル交換反応、又は脂肪酸のエステル化反応を行うことを特徴とする脂肪酸エステルの製造方法。
［２］  修飾リパーゼが、アルコール及び熱に対して安定性があり、かつ油相／水相に対して両親媒性を示すように化学修飾されたリパーゼである上記［１］記載の製造方法。
［３］  修飾リパーゼが、式（１）で示されるポリアルキレングリコールエ−テルに基づく構成単位（ア）、式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で示されるジカルボン酸又は無水マレイン酸に基づく構成単位（イ）、及び必要により共重合可能な他の単量体に基づく構成単位（ウ）を有する共重合体により化学修飾されたリパーゼである上記［１］又は［２］記載の製造方法。
【００１０】
【化１】
2006050954.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を表し、但し、Ｒ１及びＲ３が同時にメチル基を表すことはなく、Ｒ４は炭素数１〜３のアルキレン基を表し、Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜２２の炭化水素基、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の１種又は２種以上を表し、ｍは炭素数２〜４のオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、ｍ＝１〜３００である。）
【００１２】
【化２】
2006050954.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は有機アンモニウムを表す。）
［４］  共重合体が、式（１）で示されるポリアルキレングリコールエ−テルに基づく構成単位（ア）を２０〜８０モル％、式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で示されるジカルボン酸又は無水マレイン酸に基づく構成単位（イ）を２０〜８０モル％、及び共重合可能な他の単量体に基づく構成単位（ウ）を０〜３０モル％有する上記［３］記載の製造方法。
［５］  油脂が、植物性油脂、動物性油脂又は廃油である上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］  油脂、アルコール、及び水からなるＯ／Ｗエマルジョン溶液中で、修飾リパーゼを用いて、油脂中の脂肪酸エステルとアルコールのエステル交換反応を行うことを特徴とするバイオディーゼル燃料の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、環境面、操作面に優れた工程で、収率よく脂肪酸エステルを製造することができる。すなわち、Ｏ／Ｗエマルジョン系で反応を行うため、修飾リパーゼのＯ／Ｗエマルジョン界面への濃縮及びバルク水相へのグリセリンの排出により反応率が向上し、また、高濃度のアルコール存在下で反応を進められるので、従来のようにアルコールを段階的に添加する手間を必要とせず、操作面に優れている。また有機溶媒を使用しないため有機溶媒の除去工程も不要であり、水相と油相に分離した反応混合物より脂肪酸エステルを容易に回収することができるために、操作面、環境面において優れている。
さらに、脂肪酸エステル源として動植物油あるいは廃油を使用すれば、エステル交換反応後の反応液から水相を単に分離するだけで燃料として使用できることから、本発明はバイオディーゼル燃料の製造方法としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、油脂（又は脂肪酸エステル）又は脂肪酸、アルコール、及び水からなるＯ／Ｗエマルジョン溶液中で、修飾リパーゼを用いて、油脂（又は脂肪酸エステル）とアルコールとのエステル交換反応、又は脂肪酸とアルコールとのエステル化反応を行うことを特徴とする脂肪酸エステルの製造方法を提供するものである。
【００１６】
本発明で用いられる油脂としては、動物性油脂、植物性油脂及び合成油脂が挙げられ、例えば、パーム油、大豆油、菜種油、オリーブ油、ヤシ油、コーン油、綿実油、ひまわり油、サフラワー油、ピーナッツ油、トール油、バター、牛脂、ラード、魚油、鯨油、鰯油などが挙げられる。バイオディーゼル燃料用途という観点からは、動物性油脂、植物性油脂が好ましい。
【００１７】
本発明における脂肪酸エステルとは、例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、デセン酸、ウンデセン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、セトレイン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノレイン酸などの脂肪酸と一価ないし三価アルコールとのエステルが挙げられる。
該一価アルコールとしては、炭素数１〜５のアルコールが挙げられ、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、２−プロパノール、アリルアルコール、ブチルアルコール、２−ブチルアルコール、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−２−プロパノール、３−ブテン−１−オール、３−ブテン−２−オール、シクロブタノール、シクロプロピルメタノール、２−メチル−２−プロペン−１−オール、メタリルアルコール、ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、アミルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、シクロペンタノール、２−メチル−３−ブテン−１−オール、２−ペンテン−１−オールなどが、二価アルコールとしては、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールなどが、三価アルコールとしては、グリセリンなどが挙げられる。
【００１８】
本発明で用いられる脂肪酸としては、例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、デセン酸、ウンデセン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、セトレイン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノレイン酸などが挙げられる。これらのうち、バイオディーゼル燃料用途という観点からは、天然、植物性油脂の主たる成分であるパルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸などの炭素数１６〜２０の脂肪酸が好ましい。
【００１９】
また、家庭などから排出される食用油などの廃油も用いることができ、廃油を原料に得られる脂肪酸エステルはバイオディーゼル燃料用途に用いることができるものである。特に該廃油には水分が多く含まれていることが多いが、本発明の方法によれば、その水分含有量に関わらず原料として使用することができる。
【００２０】
アルコールとしては、炭素数１〜５のアルコールが挙げられ、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、２−プロパノール、アリルアルコール、ブチルアルコール、２−ブチルアルコール、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−２−プロパノール、３−ブテン−１−オール、３−ブテン−２−オール、シクロブタノール、シクロプロピルメタノール、２−メチル−２−プロペン−１−オール、メタリルアルコール、ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、アミルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、シクロペンタノール、２−メチル−３−ブテン−１−オール、２−ペンテン−１−オールなどが挙げられる。これらのうち、炭素数１〜４の飽和アルコールが好ましく、より好ましくは、炭素数１〜３の飽和アルコールである。
【００２１】
本発明の方法に用いられる修飾リパーゼは、微小エマルジョンの形成及び安定したエマルジョンの形成という観点から、アルコール及び熱に対して安定性があり、かつ水相／油相に対して両親媒性を示すように化学修飾されていることが好ましい。
【００２２】
アルコールに対して安定性があるとは、溶液中でアルコール及び（修飾）リパーゼを共存させた場合に、通常のリパーゼに比して活性を失わないことをいう。例えば、アルコールに対する安定性の評価方法はこれに限定されるものではないが、ｐＨ８．０に調整された（修飾）リパーゼの水溶液にアルコール濃度が１０ｖ／ｖ％となるようエタノールを添加し、３０℃で２４０分間経過させた場合に、相対残存活性の値（時間２４０分での酵素活性／時間０分での酵素活性で表される比。酵素活性の測定方法は次に示す。）が、通常のリパーゼに比して大きければアルコールに対して安定性があるといえ、この場合の相対残存活性の値は、好ましくは、０．４５以上、より好ましくは、０．５以上、さらに好ましくは０．６以上である。
【００２３】
ここで、酵素活性は、時間０分と２４０分における（修飾）リパーゼの触媒活性を数値化して比をとるために便宜上用いられる指標であり、例えば、次のようにして測定される。ホウ酸溶液（０．２Ｍ、５０ｍＬ）にホウ砂溶液（０．０５Ｍ、４．９ｍＬ）を加え、蒸留水で２００ｍＬに希釈したホウ酸−ホウ砂緩衝溶液（ｐＨ８．０）に、（修飾）リパーゼ（１．０ｇ）を溶かした後、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈する。このリパーゼ溶液（５ｍＬ）に、基質として１００ｍＭ  ｐ−ニトロフェノールブチレート（ｐ−ＮＰＢ）溶液（溶媒：エタノール）（７５μＬ）を加え、加水分解反応を行う。反応溶液中の（修飾）リパーゼ濃度は５ｍｇ／Ｌ、基質濃度は１．４７ｍＭとし、反応温度は３０℃、反応ｐＨは８．０とする。反応には振とう機を用いるが、振とう速度は１２０ｒｐｍに設定する。反応を３０分間行った後、加水分解生成物であるｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）を定量するため、分光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｕ−３２１０）を用いてＶｉｓ−４００ｎｍにおける吸光度を測定する。生成したｐ−ＮＰ量は、ｐ−ＮＰの分子モル吸光係数ε＝１４７３３Ｍ−１・ｃｍ−１から計算して求める。この定量されたｐ−ＮＰ量が酵素活性に相当する。
【００２４】
熱に対して安定性があるとは、溶液中、加熱下で（修飾）リパーゼを存在させた場合に、通常のリパーゼに比して活性を失わないことをいう。例えば、熱に対する安定性の評価方法はこれに限定されるものではないが、ｐＨ８．０に調整された（修飾）リパーゼの水溶液を、３０℃で２４０分間経過させた場合に、相対残存活性の値（上記と求め方は同じ。）が、通常のリパーゼに比して大きければ熱に対して安定性があるといえ、この場合の相対残存活性の値は、好ましくは、０．６５以上、より好ましくは、０．７以上、さらに好ましくは０．８以上である。
【００２５】
水相／油相に対して両親媒性を示すとは、通常のリパーゼと比して水および油脂に対して親和性を示すことをいう。例えば、後述のＡＯで示される炭素数２〜４のオキシアルキレン基を有する化学構造を持つ化合物によりリパーゼが修飾された場合には、水相／油相に対して両親媒性を示すよう化学修飾されているといえる。
【００２６】
本発明の方法に好適な修飾リパーゼとしては、式（１）で示されるポリアルキレングリコールエ−テルに基づく構成単位（ア）、式（２Ａ）又は式（２Ｂ）で示されるジカルボン酸又は無水マレイン酸に基づく構成単位（イ）及び必要により共重合可能な他の単量体に基づく構成単位（ウ）を有する共重合体により化学修飾されたリパーゼが挙げられる。
【００２７】
【化３】
2006050954.tif 000004
【００２８】
（式中、各記号は前記と同義である。）
【００２９】
【化４】
2006050954.tif 000005
【００３０】
（式中、各記号は前記と同義である。）
【００３１】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を表すが、Ｒ１及びＲ３が同時にメチル基を表すことはない。そのうち、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水素原子又はメチル基、Ｒ３が水素原子であるものが好ましい。
【００３２】
Ｒ４は炭素数１〜３の２価の炭化水素基を表し、例えば、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−などを挙げることができ、好ましくは−ＣＨ２−である。
【００３３】
Ｒ５は、水素原子又は炭素数１〜２２の炭化水素基を表し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、イソノニル基、デシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、イソセチル基、オクタデシル基、イソステアリル基、オクタデセニル基、オクチルドデシル基、ドコシル基などが例示され、炭素数１〜５の炭化水素基が好ましい。
【００３４】
ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられ、炭素数２〜３のオキシアルキレン基が好ましい。
【００３５】
ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、ｍ＝１〜３００、好ましくは６〜４６の数である。
【００３６】
（ＡＯ）ｍ、すなわちｍ個のオキシアルキレン基からなるポリオキシアルキレン鎖は、オキシアルキレン基を１種又は２種以上を含んでいてもよい。２種以上のオキシアルキレン基を含む場合には、そのオキシアルキレン単位の配列には制限はなく、ブロック状であっても、ランダム状であってもよい。
【００３７】
Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は有機アンモニウムを表し、アルカリ金属原子としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどが、アルカリ金属土類原子としては、カルシウム、マグネシウムなどが、有機アンモニウムとしては、有機アミン由来のもの、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン由来のものなどが挙げられる。
【００３８】
式（２Ａ）で示されるカルボン酸のＸ１及びＸ２は、共重合させた後に別のＸ１及びＸ２に変換されても良い。例えば、Ｘ１及びＸ２が水素原子である式（２Ａ）で表されるカルボン酸を用いて共重合させた後、Ｘ１及びＸ２をアルカリ金属原子や有機アンモニウム等に変換しても良い。
【００３９】
「共重合可能な他の単量体に基づく構成単位（ウ）」は、本発明の効果を損なわない範囲で共重合体に含まれる任意的構成単位であり、「共重合可能な他の単量体」の例としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸などの不飽和カルボン酸；不飽和カルボン酸のアルキルエステル；不飽和カルボン酸のアルキルアミド；スチレン、メチルスチレン等の芳香族ビニル化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン等のハロゲン化ビニル化合物；イソブチレン、ジイソブチレンなどのオレフィン；酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリルアミド等が挙げられる。
【００４０】
上記構成単位（ア）、（イ）及び（ウ）の組成比は、好ましくは上記構成単位（ア）２０〜８０モル％、上記構成単位（イ）２０〜８０モル％、上記構成単位（ウ）０〜３０モル％であり、より好ましくは、上記構成単位（ア）３０〜７０モル％、上記構成単位（イ）３０〜７０モル％、上記構成単位（ウ）０〜１０モル％であり、さらに好ましくは、上記構成単位（ア）４０〜６０モル％、上記構成単位（イ）４０〜６０モル％、上記構成単位（ウ）０モル％である。
【００４１】
リパーゼの修飾に用いる共重合体は、上記構成単位（ア）、（イ）及び必要により（ウ）の単量体を、公知の方法によりラジカル共重合させることにより、容易に得ることができる。本発明で用いる共重合体は、重合開始剤の種類あるいは重合条件等を変化させることにより、種々の重合度の共重合体を得ることができ、その重量平均分子量は、通常５０００〜１００万、好ましくは５０００〜１５万である。また、リパーゼの修飾に用いる共重合体は市販のものを用いることもできる。
【００４２】
本発明に用いられる修飾リパーゼは、リパーゼ中のリジン残基のアミノ基あるいは末端アミノ基を利用し、共重合体とリパーゼを公知の方法（例えば、特開平５−２８４９６７号公報、特開平７−２２２５８６号公報記載の方法と同様の方法）により反応させることにより得ることができる。
【００４３】
リパーゼの共重合体による修飾率としては、１０〜８０％が好ましく、２０〜６０％が特に好ましい。修飾率はこれらの範囲外であってもよいが、修飾率が８０％より高いと酵素単位（１ユニット）あたりの比活性が低下して、所望する酵素の触媒効果を得るために多くの酵素量を必要とすることになるおそれがあり、１０％より低いと修飾リパーゼのアルコールや熱に対する安定性が、不十分となるおそれがある。
【００４４】
かかる修飾により、共重合体部分がリパーゼ表面を被覆して、リパーゼのアルコール及び熱に対する安定性及び界面張力が高められる。これらの安定性の向上により、アルコール濃度の高いＯ／Ｗエマルジョン系での持続的なエステル化が可能となり、バイオディーゼル燃料の生産においても脂肪酸生成を抑制して、バイオディーゼル燃料を高い選択率で得ることができる。
【００４５】
本発明に係るＯ／Ｗエマルジョンは、油相である油脂、脂肪酸エステル、又は脂肪酸からなる分散相、水相であるアルコールを溶かした水又は水性緩衝溶液からなる連続相、さらにＯ／Ｗ界面におけるリパーゼからなる界面層から構成される。
【００４６】
Ｏ／Ｗエマルジョン系では、油脂、脂肪酸エステル、又は脂肪酸とアルコールとの接触面積が増加し、かつ界面積の増加に伴う界面への多量のリパーゼの濃縮によりその反応が促進されるという優れた性質を持つ。さらに、界面層のリパーゼの濃縮に伴い、リパーゼの耐アルコール安定性の増加という性質も持つ。加えて、油脂を用いたエステル交換反応においてはグリセリンが生じ、生成グリセリンの蓄積によりリパーゼによるエステル化反応は妨げられることになるが、Ｏ／Ｗエマルジョン系ではエステル化反応がＯ／Ｗ界面に濃縮されたリパーゼからなる界面層で起り、グリセリンがバルク水相に排出される為、このような反応阻害が起らない。
【００４７】
反応においてＯ／Ｗエマルジョン系は、例えば次のようにして調製される。
まず、修飾リパーゼの水溶液に油脂、脂肪酸エステル又は脂肪酸を加え、超音波処理を行うことによりエマルジョン化を行う。
【００４８】
修飾リパーゼの水溶液の濃度としては、特に限定されることはないが、０．１〜２０ｇ／Ｌが好ましく、０．５〜１０ｇ／Ｌがより好ましい。
油脂、脂肪酸エステル又は脂肪酸は、例えば、酵素の１ｇ／Ｌ溶液においては、０．５〜２０ｖ／ｖ％の濃度となるよう添加される。
超音波処理は、通常化学反応に用いられる超音波装置を用いて行うことができる。エマルジョン化は、通常、２０〜５０ｋＨｚの超音波を１〜１０分間照射することにより行なうことができる。また、超音波処理は、系の温度が上昇して修飾リパーゼが変性しないように、温度を４℃以上〜室温以下に冷却して行うことが好ましい。
【００４９】
次に、このエマルジョン溶液にアルコールを添加し、再度超音波処理を行う。
反応はｐＨ４〜９の範囲で行うのが好ましく、ｐＨ７〜９の範囲で行うのが特に好ましい。従って、ｐＨを調整するために、アルコールを添加する前に、所望するｐＨ領域の緩衝液（例、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液等）を添加するのが好ましい。
アルコールは、例えば、酵素の１ｇ／Ｌ溶液においては５〜５０ｖ／ｖ％、好ましくは５〜３０ｖ／ｖ％の濃度となるよう添加される。
再度超音波処理を行う際の処理条件については上記と同様である。
【００５０】
超音波処理の代わりに、マグネチックスターラーや、攪拌羽を備えたモーター等、公知の攪拌器を用いてエマルジョン化することもできる。
【００５１】
エステル交換における反応温度としては、通常５〜６０℃、好ましくは２５〜４０℃である。
エステル交換における反応時間としては、通常３〜７２時間、好ましくは６〜４８時間である。
【００５２】
目的生成物である脂肪酸エステルは、反応系が水相と油相に分離するため、水相を除去することにより容易に回収することができる。得られた脂肪酸エステルを含む油相は、そのままバイオディーゼル燃料として使用できるが、脂肪酸エステルを他の各種用途に使用する場合には、必要に応じて、脱水、蒸留などの公知方法により精製してもよい。
【００５３】
本発明の方法により得られる脂肪酸エステルは、公知の用途、例えば化粧品、医薬品、食品等の乳化剤、可溶化剤、分散剤、合成樹脂等の滑剤に適用することができ、また、植物性の油脂や動物性の油脂をエステル交換して製造される脂肪酸エステルは、バイオディーゼル燃料として有用である。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００５５】
参考例１
LipaseFをホウ酸-ホウ砂緩衝液(pH8.0)中に溶解させ、20g/Lリパーゼ溶液を調製した。その後、20g/Lリパーゼ溶液25mlに対しAKM-0530、AGM-0530若しくはAEM-0530（日本油脂株式会社製、構造と共重合組成比を以下に示す。）を0.25gから6.0g加えて、2℃で2時間攪拌することにより修飾リパーゼを得た（以下、AKM-0530により修飾されたリパーゼをAKM修飾リパーゼ、AGM-0530により修飾されたリパーゼをAGM修飾リパーゼ、AEM-0530により修飾されたリパーゼをAEM修飾リパーゼという。）。修飾率(DM)は、TNBS法により求めた。修飾率は、次の式で定義される。
修飾率=(全アミノ基−残存アミノ基数)×100／全アミノ基数
得られた修飾率は、10%から60%であった。
【００５６】
【化５】
2006050954.tif 000006
【００５７】
【表１】
2006050954.tif 000007
※Ａ’Ｏはエチレンオキシド（ＥＯ）単位及びプロピレンオキシド（ＰＯ）単位がランダムに配列したアルキレンオキシド鎖である。表の値は全アルキレンオキシド単位中のエチレンオキシド単位の割合を示す。
【００５８】
参考例２
参考例１で作成した修飾リパーゼを用いてアルコール安定性試験を行った。Tris-HCl緩衝溶液(pH8.0)にアルコールを添加することにより得られたアルコール濃度10v/v%の酵素保存液に修飾リパーゼを30℃の恒温水槽中で0-240分間保存し、その後、基質として100mMp-NPBを用いて活性測定を行った。アルコール安定性試験の結果を図1,2に示す。図1,2より明らかなように、修飾リパーゼがリパーゼよりも高いアルコール安定性を有していることがわかる。
【００５９】
参考例３
参考例１で作成した修飾リパーゼを用いて熱安定性試験を行った。Tris-HCl緩衝溶液(pH8.0)に修飾リパーゼを30℃の恒温水槽中で0-240分間保存し、その後、基質として100mM p-NPBを用いて活性測定を行った。熱安定性試験の結果を図3,4に示す。図3,4より明らかなように、修飾リパーゼがリパーゼよりも高い熱安定性を有していることがわかる。
【００６０】
実施例１
参考例１で作成したAGM修飾リパーゼ(修飾率58%)を用いてマグネチックスターラーによる攪拌又は超音波照射(温度6℃、出力120W、周波数38kHz、処理時間2分、2回)により作成されたＯ／Ｗエマルジョン系にてトリオレインとエタノール又はブタノールよりオレイン酸エチルエステルを合成する反応を行った。反応温度は30℃、反応pHは8.0、反応時間は0-72時間とした。Ｏ／Ｗエマルジョン系での各成分濃度は、酵素1g/L、水分78-88v/v%、トリオレイン2v/v%、エタノール10-20v/v%、又はブタノール10v/v%とした。オレイン酸エステルの収率を図5,6に示す。図5,6より明らかなように、修飾リパーゼを用いた系の方が、収率が高いのがわかる。
【００６１】
実施例２
参考例１で作成したAGM修飾リパーゼ(修飾率58%)を用いて、Ｏ／Ｗエマルジョン系にて、トリオレインとエタノールからオレイン酸エチルエステルを合成する反応を行った。反応温度は30℃、反応pHは8.0、反応時間は0-48時間とした。Ｏ／Ｗエマルジョンは超音波照射(温度6℃、出力120W、周波数38kHz、処理時間2分、2回)にて作成した。Ｏ／Ｗエマルジョン系での各成分濃度は、酵素1g/L、水分88v/v%、トリオレイン2v/v%、エタノール10v/v%とした。反応開始12時間毎に、段階的にトリオレインを2v/v%添加していった。その添加毎に、上記超音波照射を行った。生成したオレイン酸エステルの定量は、GC法にて行った。オレイン酸エチルエステルの生成量を図7に示す。図7から明らかなように、時間が経過するにつれ、修飾リパーゼを用いた系のオレイン酸エチルエステル生産量の方が高くなっていくのがわかる。
【００６２】
実施例３
参考例１と同様の方法で作成されたAKM、AGM、及びAEM修飾リパーゼを用いてＯ／Ｗエマルジョン系にて、トリオレインをエタノールからオレイン酸エチルエステルを合成する反応を行った。いずれの修飾リパーゼも修飾率は50%程度であった。反応温度は30℃、反応pHは8.0、反応時間は0-24時間とした。Ｏ／Ｗエマルジョンは超音波照射(温度6℃、出力120W、周波数38kHz、処理時間2分、2回)により作成した。Ｏ／Ｗエマルジョン系での各成分濃度は、酵素1g/L、水分88v/v%、トリオレイン2v/v%、エタノール10v/v%とした。この反応の経時変化を図8に示す。生成したオレイン酸エチルエステルの定量は、GC法にて行った。図8から明らかなように、時間が経過するにつれ、修飾リパーゼを用いた系の収率の方が高くなっていくのがわかる。
【００６３】
実施例４
参考例１と同様の方法で、AGM-0530を用いてのリパーゼの化学修飾を行った。修飾リパーゼの修飾率は25%から60%程度であった。これらの酵素を用いてＯ／Ｗエマルジョン系にてトリオレインとエタノールからオレイン酸エチルエステルを合成する反応を行った。反応温度は30℃、反応pHは8.0、反応時間は0-24時間とした。Ｏ／Ｗエマルジョンは超音波照射(温度6℃、出力120W、周波数38kHz、処理時間2分、2回)により作成した。Ｏ／Ｗエマルジョン系での各成分濃度は、酵素1g/L、水分88v/v%、トリオレイン2v/v%、エタノール10v/v%とした。この反応の経時変化を図9に示す。生成したオレイン酸エチルエステルの定量は、GC法にて行った。図9から明らかなように、時間が経過するにつれ、修飾リパーゼを用いた系の収率の方が高くなっていくのがわかる。
【００６４】
比較例１
LipaseF(天野エンザイム)をホウ酸-ホウ砂緩衝溶液(pH8.0)中に溶解させ、20g/Lリパーゼ溶液を調整した。このリパーゼ溶液を用いてＯ／Ｗエマルジョン系にて、トリオレインとエタノールからオレイン酸エチルエステルを合成する反応を行った。反応温度は30℃、反応pHは8.0、反応時間は24時間とした。Ｏ／Ｗエマルジョンは、マグネチックスターラーによる攪拌により作成した。Ｏ／Ｗエマルジョン系での各成分濃度は、酵素1g/L、水分88v/v%、トリオレイン2v/v%、エタノール10v/v%とした。生成したオレイン酸エステルの定量は、GC法にて行った。オレイン酸エチルエステルの収率を図5に示す。
【００６５】
比較例２
比較例１のリパーゼ溶液を用いて、Ｏ／Ｗエマルジョン系にて、トリオレインとエタノールからオレイン酸エチルエステルを合成する反応を行った。反応温度は30℃、反応pHは8.0、反応時間は0-72時間とした。Ｏ／Ｗエマルジョンは、 超音波照射(温度6℃、出力120W、周波数38kHz、処理時間2分、2回)により作成した。Ｏ／Ｗエマルジョン系での各成分濃度は、酵素1g/L、水分78-88v/v%、トリオレイン2v/v%、エタノール10-20v/v%とした。生成したオレイン酸エステルの定量は、GC法にて行った。オレイン酸エチルエステルの収率を図5,6に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】リパーゼ及びＡＧＭ修飾リパーゼのエタノール（濃度１０ｖ／ｖ％）に対する安定性試験の結果を示すグラフである。相対残存活性は、時間０における各リパーゼの初期活性に対する保存時間ｔにおける残存活性の割合である。
【図２】リパーゼ及び各種修飾リパーゼのエタノール（濃度１０ｖ／ｖ％）に対する安定性試験の結果を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。
【図３】３０℃で行われたリパーゼ及びＡＧＭ修飾リパーゼの熱に対する安定性試験の結果を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。
【図４】３０℃で行われたリパーゼ及び各種修飾リパーゼの熱に対する安定性試験の結果を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。
【図５】リパーゼ及びＡＧＭ修飾リパーゼ（修飾率５８％）を用いて、Ｏ／Ｗエマルジョン系でオレイン酸エチルエステルを合成した際の収率（反応時間２４時間）を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。１は、超音波を使用せずにエタノール濃度１０％で実施した系の結果であり、２は、超音波を使用しエタノール濃度１０％で実施した系の結果であり、３は、超音波を使用しエタノール濃度２０％で実施した系の結果であり、４は、超音波を使用しブタノール濃度１０％で実施した系の結果である。
【図６】リパーゼ及びＡＧＭ修飾リパーゼ（修飾率５８％）を用いて、Ｏ／Ｗエマルジョン系でオレイン酸エチルエステルを合成した際の収率の経時変化を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。
【図７】リパーゼ及び各種修飾リパーゼを用いて、Ｏ／Ｗエマルジョン系でオレイン酸エチルエステルを合成した際の生成量を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。縦軸はリパーゼに対する生成したオレイン酸エチルの相対重量比を示す。
【図８】リパーゼ及びＡＧＭ修飾リパーゼを用いて、Ｏ／Ｗエマルジョン系でオレイン酸エチルエステルを合成した際の収率の経時変化を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。
【図９】リパーゼ及び各種修飾リパーゼを用いて、Ｏ／Ｗエマルジョン系でオレイン酸エチルエステルを合成した際の収率の経時変化を示すグラフ（ｎ＝２で測定）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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