(57)【要約】  【課題】プローブが表面に設けられたビーズの発する蛍光を用いて、ビーズの種類を識別する際、蛍光により識別可能なビーズの種類を増大させ、１回の計測で数１００種類のビーズを識別可能にする。  【解決手段】マイクロビーズ１２を、予め、蛍光緩和時定数の異なる２種類の蛍光色素を混合して染色しておき、蛍光検出の際、プローブに生体物質等が結合したマイクロビーズ１２の蛍光を検出して蛍光緩和時定数を計測することにより、生体物質が結合したマイクロビーズの種類を識別する。生体物質には、マイクロビーズに染色された蛍光色素と異なる種類の蛍光色素が設けられており、蛍光検出の際、ビーズをレーザ光で照射し、その時発する蛍光をフィルタリングして、生体物質に設けられた蛍光色素の蛍光を検出するとともに、マイクロビーズ１２の蛍光色素の蛍光緩和時定数を計測する。【選択図】図１
2006275858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられたビーズが発する蛍光を用いて、ビーズの種類を識別する蛍光検出方法であって、
前記ビーズを、予め、蛍光緩和時定数の異なる２種類の蛍光色素を混合して染色しておき、
蛍光検出の際、ビーズの蛍光を検出して蛍光緩和時定数を計測することにより、ビーズの種類を識別することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
前記プローブは、所定の物質が結合するものであり、所定の物質が結合したビーズの蛍光を検出して、所定の物質が結合したビーズの種類を識別する請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記所定の物質には、ビーズに染色された蛍光色素と異なる種類の蛍光色素が設けられており、
蛍光検出の際、ビーズをレーザ光で照射し、その時発する蛍光をフィルタリングして、前記ビーズに結合した所定の物質に設けられた蛍光色素の蛍光を検出するとともに、前記ビーズの蛍光色素の蛍光緩和時定数を計測する請求項２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられたビーズの作製方法であって、
レーザ光を照射したときの蛍光緩和時定数が異なる２種類の蛍光色素を混合して染色することにより、前記蛍光検出用ビーズが、前記２種類の蛍光緩和時定数のいずれとも異なる蛍光緩和時定数を有するように設定したことを特徴とする蛍光検出用ビーズの作製方法。
【請求項５】
蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられた蛍光検出用ビーズであって、
前記蛍光色素は、レーザ光を照射したときの蛍光緩和時定数が異なる２種類の蛍光色素を混合することにより、前記２種類の蛍光緩和時定数のいずれとも異なる蛍光緩和時定数を有することを特徴とする蛍光検出用ビーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられたビーズが発する蛍光を用いて、ビーズの種類を識別する蛍光検出方法、この蛍光検出に用いるビーズの作製方法及び蛍光検出用ビーズに関する。
【背景技術】
【０００２】
医療、生物分野で用いられるフローサイトメータでは、マイクロビーズにレーザ光を照射することにより、所定の物質が結合したマイクロビーズの発する蛍光を検出し、この蛍光により、その物質が結合するマイクロビーズのプローブの種類を識別することが行われている。ここで、マイクロビーズには、プローブ（相補的な配列を持つ遺伝子の断片や特定のタンパク質に結合する抗体などの選択的結合機能を有する物質）が表面に設けられている。
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質が測定対象物として含まれる混濁液に、識別可能な蛍光色素で染色されてラベル化されたマイクロビーズを蛍光試薬として混ぜた後、圧力を与えて毎秒１０ｍ程度の速度で管路内を流れるシース液にマイクロビーズを流してフローセルを形成する。このフローセル中のマイクロビーズにレーザ光を照射することにより、マイクロビーズが発する蛍光と、このマイクロビーズに結合した生体物質が発する蛍光とを受光する。そして、これらの蛍光からマイクロビーズの蛍光をラベルとして識別することで、その生体物質が結合するプローブの種類を特定することができる。
【０００３】
特に、マイクロビーズ毎に異なる種類のプローブを設け、プローブの種類毎に異なる蛍光色素で識別可能なようにマイクロビーズを染色することで、生体物質がどのようなプローブに結合するかを調べることができる。このような場合、種々のプローブを備える多数のマイクロビーズを、生体物質を含む混濁液に混ぜて、フローサイトメータで短時間に一度に分析することが望まれている。
【０００４】
下記非特許文献１には、異なる２種類の蛍光色素を種々の比率で混合して作製した１００種類の識別可能なポリスチレン製マイクロビーズを、フローサイトメータでの蛍光検出に用いることが開示されている（蛍光マイクロビーズアレイシステム）。マイクロビーズの識別は、マイクロビーズの発する蛍光の蛍光強度の分布を計測することにより行われる。これにより、蛍光強度の異なる１００種類のマイクロビーズを識別可能なように作製することができるとされている。
【０００５】
【非特許文献１】http://bio.hitachi-sk.co.jp/luminex/index2.html（２００５年１月６日検索）
【０００６】
上記蛍光マイクロビーズアレイシステムでは、マイクロビーズの識別が蛍光強度の違いによって行われるため、蛍光強度の差異を得るために、混合する蛍光色素の濃度差を大きくしなければならず、識別可能な蛍光を発するマイクロビーズの種類の数が制限されるといった問題があった。
【０００７】
また、蛍光検出では、２種類の蛍光色素の発する蛍光をフィルタリングで分離して、分離した蛍光の蛍光強度を計測し、そのときの蛍光強度の比率によってマイクロビーズの種類を識別する。さらに、マイクロビーズのプローブに結合した物質の発する蛍光強度も計測する。このため、それぞれの蛍光波長が近接している場合、マイクロビーズの種類の識別とマイクロビーズに結合した物質の蛍光とを分離することができず、蛍光強度を計測することはできない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、プローブが表面に設けられたビーズの発する蛍光を用いて、ビーズの種類を識別する際、蛍光により識別可能なビーズの種類を増大させ、１回の計測で数１００種類のビーズを識別可能にする蛍光検出方法及び、この方法に用いるビーズ及びこのビーズの作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられたビーズが発する蛍光を用いて、ビーズの種類を識別する蛍光検出方法であって、
前記ビーズを、予め、蛍光緩和時定数の異なる２種類の蛍光色素を混合して染色しておき、蛍光検出の際、ビーズの蛍光を検出して蛍光緩和時定数を計測することにより、ビーズの種類を識別することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
ここで、プローブは、例えばpHや酸化還元電位等の測定環境の状況に対して広く反応する物質や、ＤＮＡ、抗体等の所定の物質と結合する性質を持つもの（特異的な結合をするもの）が例示される。
【００１０】
前記プローブは、所定の物質が結合するものであり、所定の物質が結合したビーズの蛍光を検出して、所定の物質が結合したビーズの種類を識別することが好ましい。
その際、前記所定の物質には、ビーズに染色された蛍光色素と異なる種類の蛍光色素が設けられており、蛍光検出の際、ビーズをレーザ光で照射し、その時発する蛍光をフィルタリングして、前記ビーズに結合した所定の物質に設けられた蛍光色素の蛍光を検出するとともに、前記ビーズの蛍光色素の蛍光緩和時定数を計測することが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられたビーズの作製方法であって、レーザ光を照射したときの蛍光緩和時定数が異なる２種類の蛍光色素を混合して染色することにより、前記蛍光検出用ビーズが、前記２種類の蛍光緩和時定数のいずれとも異なる蛍光緩和時定数を有するように設定したことを特徴とする蛍光検出用ビーズの作製方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、蛍光色素で染色されており、プローブが表面に設けられた蛍光検出用ビーズであって、前記蛍光色素は、レーザ光を照射したときの蛍光緩和時定数が異なる２種類の蛍光色素を混合することにより、前記２種類の蛍光緩和時定数のいずれとも異なる蛍光緩和時定数を有することを特徴とする蛍光検出用ビーズを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、プローブが表面に設けられたビーズが発する蛍光を用いてビーズの種類を識別する場合、予め、蛍光緩和時定数の異なる２種類の蛍光色素を混合してビーズを染色する。蛍光検出の際、プローブに所定の物質が結合したビーズの蛍光を検出して蛍光緩和時定数を計測することにより、所定の物質が結合したビーズの種類を識別する。このため、蛍光緩和時定数により識別可能なビーズの数は蛍光強度による識別の場合に比べて増大し、１回の計測で数１００種類のビーズが識別可能となり、短時間に蛍光検出による分析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の蛍光検出方法、蛍光検出用ビーズの作製方法及び蛍光検出用ビーズについて、本発明の蛍光検出方法を好適に実施するフローサイトメータを基に詳細に説明する。
【００１５】
図１は、本発明の蛍光検出方法を実施するフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光をパルス変調方式で変調してマイクロビーズに照射するものである。
フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とするマイクロビーズ１２に照射し、マイクロビーズ１２を染色した蛍光色素の発する蛍光の光信号及びマイクロビーズ１２のプローブに結合した物質に設けられた蛍光色素の蛍光の光信号を検出して信号処理する信号処理装置（蛍光検出装置）２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果からマイクロビーズ１２のプローブに結合する物質の分析を行なう分析装置５０とを有する。なお、本実施形態では、プローブとして、ＤＮＡ、抗体等の所定の物質と結合する性質を持つもの（特異的な結合をするもの）を用いるが、本発明においては、この他にpHや酸化還元電位等の測定環境の状況に対して広く反応する物質を用いることもでき、又これらに限定されるものではない。
【００１６】
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、レーザ光源部２２のレーザ光の出射のオン／オフを制御する光源制御部およびマイクロビーズが発する蛍光の光信号と、マイクロビーズ１２のプローブに結合した生体物質等の物質に識別可能に設けられた蛍光色素が発する蛍光の光信号とを識別する信号処理部を含んだ制御・処理部２８と、励起光の照射や蛍光の検出のために、高速流を形成するシース液に含ませてマイクロビーズ１２を流したフローセルを有する管路３０と、を有する。管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内にマイクロビーズ１２に結合する特定の細胞等を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
【００１７】
レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ1＝４０５ｎｍ、λ2＝５３３ｎｍおよびλ3＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置でマイクロビーズ１２の測定点を形成する。
【００１８】
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光のパルスレーザ光を出射する部分で、主に赤色のレーザ光Ｒを極めて短時間のパルス幅でパルスレーザ光として断続的に出射するＲ光源２２ｒ、緑色のレーザ光Ｇを極めて短時間のパルス幅でパルスレーザ光として断続的に出射するＧ光源２２ｇおよび青色のレーザ光Ｂを極めて短時間のパルス幅でパルスレーザ光として出射するＢ光源２２ｂと、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー２３ａ1，２３ａ2と、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させるレンズ系２３ｃと、を有して構成される。
【００１９】
これらのパルスレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
パルスレーザ光のパルス幅は、蛍光色素の発する蛍光をバックグラウンドノイズと区別して効率よく検出できるように設定され、例えば０．５ナノ秒〜４ナノ秒である。
ダイクロイックミラー２３ａ1は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ2は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点のマイクロビーズ１２を照射する照射光となる。
【００２０】
Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、それぞれレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂによって駆動される。このレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、制御・処理部２８に接続されて、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの出射のオン／オフが制御されるように構成される。ここで、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの各々は、後述するように制御信号によって出射のオン／オフが制御されて変調される。
【００２１】
Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする物質やマイクロビーズ１２に染色されており、測定対象物として管路３０を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
【００２２】
図３は、レーザ光の発振波長と、このレーザ光によって蛍光色素の発する蛍光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。例えば、Ｂ光源から出射する波長λ１１のレーザ光の照射により、中心波長をλ１２とする蛍光を発する。同様に、Ｇ光源から出射する波長λ２１のレーザ光の照射により中心波長をλ２２とする蛍光を発する。また、Ｂ光源から出射する波長λ３１のレーザ光の照射により中心波長をλ３2とする蛍光を発する。
これらの蛍光は、マイクロビーズ１２の蛍光色素及びマイクロビーズ１２のプローブと結合する物質等に設けられた色素が発するものである。
【００２３】
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過するマイクロビーズ１２によってレーザ光が前方散乱することによりマイクロビーズ１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８においてマイクロビーズ１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００２４】
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中のマイクロビーズ１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射されたマイクロビーズ１２やマイクロビーズ１２に結合した物質に設けられた蛍光物質の蛍光を電気信号に変える光電変換器を備える。
図４は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【００２５】
図４に示す受光部２６は、マイクロビーズ１２やマイクロビーズ１２に結合した物質の蛍光の光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２と、バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した光信号を光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光の光信号を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
【００２６】
バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、図３に示す蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して、すなわち、マイクロビーズ１２の蛍光色素の発する蛍光及びマイクロビーズ１２に結合する物質に設けられている蛍光色素の発する蛍光に対応して、予め設定されており、例えばＢ光源から出射した波長λ１１のレーザ光の照射によって発する波長λ１２を中心とする一定の波長幅の帯域である。
バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３のうち、１つは、マイクロビーズ１２に結合する物質に設けられる蛍光色素の発する蛍光を透過し、他の２つのうち少なくとも１つは、マイクロビーズ１２の蛍光色素の発する蛍光を透過するように波長帯域が設定される。
【００２７】
光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は光信号として受光されるので、出力される電気信号は受光信号として、増幅器で増幅されて、制御・処理部２８に供給される。
【００２８】
制御・処理部２８は、図５に示すように、レーザ光源部２２のレーザ光の出射のオン／オフを制御する光源制御部２８ａ、およびマイクロビーズ１２やマイクロビーズ１２に結合した物質の発する蛍光の光信号を識別する信号処理部２８ｂを有して構成された部分である。
光源制御部２８ａは、受光部２４から出力される検出信号がトリガ信号として入力されると、瞬時にレーザ光の出射のオン／オフを制御するパルス制御信号を生成するように構成される。
光源制御部２８ａは、このパルス制御信号を巡回的に繰り返し生成し、レーザドライバ３４ｒ、レーザドライバ３４ｇ、レーザドライバ３４ｂの制御信号として供給されるように構成されている。
【００２９】
制御・処理部２８は、光源制御部２８ａにおけるコードの生成のタイミングに同期して一定のクロック信号で駆動して、受光信号のＡ／Ｄ変換を行うＡ／Ｄ変換器２８ｃおよび一定のクロック信号で駆動して受光信号に所定の演算処理を施す演算処理部２８ｄを備える。
Ａ／Ｄ変換器２８ｃは、受光部２６の光電変換器２７ａ〜２７ｃで生成されて増幅された受光信号をＡ／Ｄ変換によりサンプリングする。サンプリングされた受光信号は演算処理部２８ｄにて演算処理に供される。
【００３０】
演算処理部２８ｄは、パルス制御信号の生成のタイミングに同期して受光信号の演算処理を行うように構成され、受光部２６から出力された受光信号を、パルス制御信号の生成のタイミングに同期して時系列データとすることにより、マイクロビーズ１２のレーザ光の照射に対する蛍光色素の蛍光緩和特性（図７参照）を求める部分である。
【００３１】
この蛍光緩和特性を特徴付ける蛍光緩和時定数が互いに異なる２種類の蛍光色素を混合して染色したとき、混合した蛍光色素は、上記２種類の蛍光緩和時定数とは異なる蛍光緩和時定数を有することを本発明者は見出している。これは、２種類の蛍光色素が互いに作用し合い、異なる蛍光緩和特性を作り出すためである。すなわち、２種類の蛍光色素を予め定められた比率で混合することで、この比率に応じた蛍光緩和時定数を作り出すことができる。
したがって、本発明では、蛍光緩和時定数の異なる２種類の蛍光色素の比率を変えて混合することにより、自在に蛍光緩和時定数が変化することを利用する。すなわち、マイクロビーズに、蛍光緩和時定数の異なる２種類の蛍光色素を予め定めた比率で混合して染色し、この染色されたマイクロビーズの蛍光緩和特性を調べ、蛍光緩和時定数によってそのマイクロビーズの種類を識別する。
【００３２】
蛍光緩和の過程においては、マイクロビーズにレーザ光の照射を開始した時点では、発する蛍光の蛍光強度が高いが、蛍光強度が時間とともに減少する。蛍光緩和時定数は、このときの、レーザ光の照射開始時点の蛍光強度（最大強度）に対して３７％（１／ｅ：ｅは自然対数の底）に蛍光強度が減衰したときの時間をいう。
なお、マイクロビーズ１２は、パルス制御信号の生成によって所定の周期で断続的にオン／オフが制御されるので、レーザ光の照射開始とともに蛍光を発し、時間の経過とともにその蛍光強度は減衰する。したがって、この蛍光強度の時系列データを得ることで、蛍光緩和時定数を知ることができる。これにより、レーザ光の照射するマイクロビーズ１２の種類を識別することができる。マイクロビーズ１２の種類ごとに、プローブの種類を変えることで、物質がどのプローブと結合したかを知ることができる。
【００３３】
図８には、２種類の蛍光色素Q-dot525（Quantum Dot社製）及びCascade Blue（Molecular Probes社製）の配合比率を変えたときの蛍光緩和時定数がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。
Q-dot525の基準濃度を２０ｎＭとした溶液Ａと、Cascade Blue の基準濃度を２０μＭとした溶液Ｂを、下記の比率で混合して、直径１．５ｍ、深さ３ｍｍのスポットサンプル収納部分にサンプル溶液１〜９を作製したものである。
【００３４】
【表１】
2006275858.tif 000003
【００３５】
サンプル溶液１〜９には、共通して１００μＭのCascade Blueを１μｌ追加している。レーザ光は、半導体レーザにより出射させ、波長４０５ｎｍ、出力４０ｍＷのレーザ光を用い、２０ＭＨｚでパルス変調した。
図８は、このとき発する蛍光の位相遅れの結果を示すグラフである。このグラフによると、位相遅れは蛍光緩和時定数に応じて変化し、しかも、溶液Ａと溶液Ｂの比率の順番に対応して位相遅れの大きさがサンプル溶液１〜９の順番になっている。このことから、蛍光色素の比率によって蛍光緩和時定数が変化することがわかる。
このように、異なる２種類の蛍光色素の比率を変化させることで、蛍光色素の蛍光緩和時定数を変化させることができる。
【００３６】
制御・処理部２８は、マイクロビーズ１２の識別結果の情報を分析装置５０に供給する。
分析装置５０は、制御・処理部２８から供給される識別結果の情報を用いて、物質が結合するマイクロプローブ１２の種類を識別し、マイクロビーズ１２に結合する物質の特性を分析する装置である。分析装置５０では、物質に設けた蛍光色素の種類が既知であり、この蛍光色素が励起されるレーザ光の波長帯域もわかっているので、制御・処理部２８から供給される情報を用いて、上記物質がどのプローブと結合するか、または結合しやすいかを知ることができる。
こうして、分析装置５０は短時間に分析をすることができる。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
【００３７】
このようなフローサイトメータ１０の信号処理装置２０では、まず、生体物質等の物質を含む混濁液に混合されたマイクロビーズ１２が管路３０を流れ、測定点でレーザ光による照射が成される。そのとき、受光部２４でマイクロビーズ１２の通過を検出する検出信号が制御・処理装置２８にトリガ信号として出力される。
マイクロビーズ１２は、蛍光緩和時定数が異なるように２種類の蛍光色素が比率を変えて混合され染色されており、しかも、異なる蛍光緩和時定数毎に、マイクロビーズ１２に異なるプローブを設けている。このため、蛍光色素の蛍光緩和時定数が既知となると、生体物質等の物質が結合するプローブの種類を特定することができる。このため、マイクロビーズ１２は、異なる蛍光緩和時定数を有する複数の種類が設定されている。
制御・処理装置２８では、マイクロビーズ１２が通過するときの検出信号をトリガ信号とし、このトリガ信号に同期して、図６に示すようなパルス変調信号を生成する。このパルス変調信号は、レーザ光源部２２からのレーザ光の出射のオン／オフを制御する制御信号として用いるために、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂに供給される。
レーザ光源部２２では、この制御信号に従って各レーザ光の出射のオン／オフが制御され、レーザ光が出射される。このレーザ光は測定点を通過するマイクロビーズ１２中の蛍光色素及びマイクロビーズ１２に結合した生体物質等の物質に付けた蛍光色素の蛍光を励起させるために用いられ、このレーザ光の照射により蛍光色素が発する蛍光は、受光部２６にて受光される。その際、蛍光色素からの蛍光は、パルス変調されたレーザ光に励起して生じるため、レーザ光のパルス変調に対応して蛍光強度も変調して蛍光を発する。
【００３８】
このようにして、受光部２４によるマイクロビーズ１２の通過の検出からレーザ光を照射するまでの時間は極めて短く、マイクロビーズ１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、パルス変調信号によって変調されたレーザ光が巡回的にマイクロビーズ１２に照射される。
ここで、パルス変調されるレーザ光は、マイクロビーズ１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、０．５１０μ秒を１周期とする、一連のパルス変調の制御信号が数回〜数１０回、断続的に巡回される。
【００３９】
受光部２６の光電変換器２７ａ〜２７ｃで受光されて出力される受光信号は、Ａ／Ｄ変換器２８ｃにおいて受光部２４から出力されたトリガ信号のタイミングで同期が取られ、生成されたパルス変調信号の時間分解幅Δｔと同じ時間分解幅で、受光信号のサンプリングが行われる。サンプリングは例えば８ビットのサンプリング（０〜２５５の階調のサンプリング）である。
このサンプリングされた受光信号から、巡回して生成されるパルス変調信号に対応させて、蛍光強度の時系列データを平均化処理することにより、図７に示すような蛍光緩和特性が求められる。
この蛍光緩和特性の波形において、最大となる蛍光強度に対して、蛍光強度が３７％になる時間が蛍光緩和時定数として求められる。この蛍光緩和時定数の値から、マイクロビーズ１２の蛍光色素の混合する比率を特定して、どの種類のマイクロビーズ１２を計測したのかを知ることができる。
【００４０】
なお、光電変換器２７ａ〜２７ｃは、バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３により波長帯域別に受光して受光信号を出力するので、受光信号がどの波長帯域の蛍光の信号なのかを知ることもできる。したがって、マイクロビーズ１２から蛍光を発する蛍光色素の蛍光緩和時定数と波長帯域とを用いて、マイクロビーズ１２をより正確に識別することができる。
このような、マイクロビーズ１２は、レーザ光を照射したときの蛍光緩和時定数が異なる２種類の蛍光色素を予め定めて混合する比率を定めて染色することにより、２種類の蛍光緩和時定数のいずれとも異なる蛍光緩和時定数を有するようにすることができる。
２種類の蛍光色素の例として、１つの種類は、FITC（同仁化学社他製）、PE（和光純薬工業社他製）、Alexa Fluor（Molecular Probes社製）、Cy Dye（Amersham Biosciense社製）、Rhodamine（和光純薬工業社他製）、Cascade Blue（Molecular Probes社製）、Cascade Yellow（Molecular Probes社製）、Naphtofluorescein（Sigma社製）の中から選択される蛍光色素であり、他の種類は、Q-Dot（Quantum Dot社製）、Evic-Tag（Ocean Optics社製）の中から選ばれる半導体量子蛍光色素であることが好ましい。前者の蛍光色素は、後者の蛍光色素に比べて蛍光緩和時定数が長い。この２種類の蛍光色素の混合する比率を変えることで、蛍光緩和時定数を大きく変化させることができる。
【００４１】
なお、マイクロビーズ１２の表面を蛍光色素で染色する場合、蛍光色素の官能基とマイクロビーズ１２表面の官能基を化学的に結合させることで、マイクロビーズを作製することができる。また、マイクロビーズ１２の内部に蛍光色素を設け染色する場合、モノマー溶液に対して所定の比率で配合された２種類の蛍光色素を混合し、重合開始剤を加えて重合させることで、マイクロビーズを作製することができる。
【００４２】
上述したフローサイトメータ１０は、レーザ光をパルス変調してマイクロビーズを照射することで、蛍光緩和時定数を計測するものであるが、レーザ光の強度を所定の周波数で変調してマイクロビーズに照射して、蛍光緩和時定数を計測するものであってもよい。以下、この方法について説明する。
【００４３】
例えば、波長４０５ｎｍのレーザ光の強度を２０ＭＨｚで変調し、このレーザ光をフローセル中の測定点を通過するマイクロビーズに照射する。変調したパルス光の照射に対して発する蛍光を光電変換器等で受光する。
光電変換器から出力される蛍光信号を増幅し、レーザ光の変調に用いた変調信号とミキシングし、ローパスフィルタを通して検波する。これにより、蛍光信号のｃｏｓ成分の信号が抽出される。さらに、蛍光信号は、レーザ光の周波数変調に用いた変調信号に対して位相を９０度ずらした信号とミキシングし、ローパスフィルタを通して検波する。これにより、蛍光信号のｓｉｎ成分の信号が抽出される。
抽出されたｓｉｎ成分及びｃｏｓ成分の信号を用いて、蛍光信号の、変調信号に対する位相ずれ角度（位相遅れ角度）を求めることができる。
【００４４】
求められた位相ずれ角度は、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数に依存しており、例えば１次緩和過程で表した場合、ｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分は、下記式（１），（２）で表される。
ｃｏｓ（θ）＝１／（１＋（ωτ）2）(1/2)          （１）
ｓｉｎ（θ）＝ωτ／（１＋（ωτ）2）(1/2)        （２）
ここで、θは位相ずれ角度であり、ωはレーザ光の変調周波数であり、τは蛍光緩和時定数である。
【００４５】
蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の比から求められる位相ずれ角度θを用いて、上記式（１）、（２）から、蛍光緩和時定数τを求めることができる。
この蛍光緩和時定数τは、上述したように、蛍光色素の種類によって変わるものであり、また、２種類の蛍光色素の比率を変えて混合すると、比率に応じて蛍光緩和時定数τも変わる。このため、蛍光緩和時定数τを求めることで、２つの蛍光色素の比率を特定することができる。
このように、蛍光検出用マイクロビーズに、所定の周波数で強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を計測することにより、発する蛍光の種類を識別することができ、これによりマイクロビーズの種類を識別することができる。
【００４６】
このような蛍光検出用マイクロビーズは、上記実施形態のようなフローサイトメータに使用されるが、フローサイトメータに使用が限定されるわけではない。
しかし、フローサイトメータでは、マイクロビーズ１２の染色された蛍光色素の蛍光緩和時定数を求めることで、マイクロビーズを数１００種類に識別可能とすることができることから、本発明のマイクロビーズは、短時間に生体物質の特性を分析するフローサイトメータに好適に用いることができる。
このような数１００種類のマイクロビーズを、マイクロビーズの種類ごとに種類の異なるプローブを設けておき、このマイクロビーズを検査対象とする生体物質等を含む混濁液に混ぜ、フローサイトメータで蛍光検出することにより、一度の処理で多数の種類のプローブに生体物質が結合するか否かを調べることができる。
【００４７】
以上、本発明の蛍光検出方法、蛍光検出用ビーズの作製方法及び蛍光検出用ビーズについて詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の蛍光検出方法を実施するフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】図１に示すフローサイトメータに用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。
【図３】図２に示すレーザ光源部から出射されるレーザ光と蛍光色素の発する光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。
【図４】図１に示すフローサイトメータに用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。
【図５】図１に示すフローサイトメータに用いられる光源制御部および信号処理部の一例を示す概略構成図である。
【図６】図１に示すフローサイトメータで生成されるパルス変調信号の例を示す図である。
【図７】蛍光色素が発する光の蛍光強度の特性を説明する図である。
【図８】２種類の蛍光色素を混合して、パルス変調のレーザ光を照射したときの蛍光の位相遅れの結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４９】
１０  フローサイトメータ
１２  マイクロビーズ
２０  信号処理装置
２２  レーザ光源部
２２ｒ  Ｒ光源
２２ｇ  Ｇ光源
２２ｂ  Ｂ光源
２３ａ1，２３ａ2，２３ｂ1，２３ｂ2  ダイクロイックミラー
２３ｃ．２６ａ  レンズ系
２４，２６  受光部
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ３  バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ  光電センサ
２８  制御・処理部
２８ａ  光源制御部
２８ｂ  信号処理部
２８ｃ  Ａ／Ｄ変換器
２８ｄ  演算処理部
３０  管路
３２  回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂ  レーザドライバ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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