(57)【要約】      （修正有）【課題】花粉症に関し、特異性の高いバイオマーカーを提供する。【解決手段】スギ花粉症者と健常者（無症状者）との血漿成分または血清成分につき、質量電荷比をバイオマーカーとしたスギ花粉症の検査・評価方法。また、スギ花粉症者と健常者との顆粒球において、有意に発現が変動する遺伝子の同定をＤＮＡチップにより見出し、それらをバイオマーカーとしたスギ花粉症の検査・評価方法とし、それに基づいた安全な抗スギ花粉症剤をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳの正イオン測定にて質量電荷比が448.301±10mmu、および432.310±10mmu、負イオン測定にて質量電荷比が528.262±10mmu、および995.587±10mmu、４つの血中バイオマーカーのいずれか一つ以上を指標とすることを特徴とする、花粉症の検査または評価方法。
【請求項２】
GenBank（NCBIの核酸配列データベース）におけるAccession  Ｎｏ．AF013611、X98263、AF112482、AK022904、AU118614、BC001338、AF156552、BC032338、X98126、Z46632、J03578、AF101044、BC010100、BC000260、AL713733、BC042914、M22538およびAJ512214の１８遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子を、血中バイオマーカーとして指標とすることを特徴とする、花粉症の検査または評価方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法で評価を行うことにより開発される花粉症低減、改善または予防を目的とした飲食品、医薬品、医薬部外品、または香粧品のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花粉症に関連する血中バイオマーカーとして質量電荷比によって特定される血液成分、ならびに顆粒球の遺伝子の発現を指標とした花粉症の検査または評価方法、および花粉症を低減および治療する医薬品、医薬部外品、または飲食品のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スギやダニに対するアレルギーの即時型アレルギーは、近年花粉症やアトピー性皮膚炎等の大きな問題となっている。即時型アレルギーはT細胞、B細胞、肥満細胞、好塩基球等の免疫系エフェクター細胞が抗原と抗原に対するIgE抗体により活性化され、ヒスタミン等のケミカルメディエーターを放出することにより発症すると考えられている。このため、抗アレルギー薬はステロイド剤や抗ヒスタミン剤などが治療に施されるが、副作用が強くアレルギー患者の状態を健全に保つことはできていない。
【０００３】
例えばスギ花粉症等のアレルギーにより発症する鼻炎の治療薬として現在用いられているもののほとんどが抗ヒスタミン剤である。抗アレルギー薬は眠気を引き起こす等の副作用を有し、副作用の無い飲食品、医薬品、医薬部外品等、花粉症に有効な抗アレルギー剤が望まれている。
一方、外的要因 （薬や食品の摂取、運動、病気など） によって生体内で起こる変化を示す生物指標をバイオマーカーと言われているが、花粉症の明確なバイオマーカーは現状では、特異的IgE抗体量、鼻汁中好酸球数、ヒスタミン濃度などが使用されている。しかしIgE抗体があっても発症しない事例も多く見出されており、鼻汁中好酸球数などは定量性に欠けており、またヒスタミンは花粉症に特異的ではなく、これらをマーカーとして花粉症に対する医薬品や食品の機能性を評価することは困難であり、また現行の抗アレルギー剤
（医薬品、飲食品） では十分満足されていないのが実際である。
【０００４】
また、スギ花粉症者に関して、T細胞の遺伝子に於いて有意に発現が高い遺伝子があることが報告されている （特許文献１−８参照） が、これらは、何れも花粉症発症時に生じる、Ｔ細胞の応答を見るための技術である。
さらにアトピー性皮膚炎に関し好酸球において有意に発現が高い遺伝子があることも報告されている（特許文献９−１３参照）。
【０００５】
最近では白血球画分へのアレルゲン作用による活性酸素発生量をルミノール発光で測定する系（特許文献１４）や、顆粒球画分にアレルゲンを作用させ、発生するラジカルとヒスタミン放出率を組み合わせ、より精度の高い検査系（特許文献１５）の報告がある。
【特許文献１】特開平２０００−１０６８７９号公報
【特許文献２】特願２０００−６１４３８５号
【特許文献３】特願２０００−６１４３８７号
【特許文献４】特願２０００−６１４３８６号
【特許文献５】特願２００１−５００７４８号
【特許文献６】特願２００１−５００７５２号
【特許文献７】特願２００１−５００７５３号
【特許文献８】特願２００１−５６３９０３号
【特許文献９】特願２００２−５２９４９７号
【特許文献１０】特願２００２−５３０７２５号
【特許文献１１】特開２００２−１１９２８１号公報
【特許文献１２】特願２００２−５３６４３８号
【特許文献１３】特願２００２−５３６０９０号
【特許文献１４】特開２００１−２１５２２４号公報
【特許文献１５】特願２００４−２８３２０６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、花粉症に関する詳細な生体内メカニズムは十分に解明されておらず、生体の状態をより深く反映させた、特異性の高いバイオマーカーが求められている。
またそれら特異性の高いバイオマーカーを使用することにより、効率よく花粉症の治療または予防が可能な、新規抗花粉症メカニズムを持つ医薬品、医薬部外品、飲食品、香粧品などが求められている。
花粉症に相関した遺伝子発現バイオマーカーとしては前述の特許文献１−８があるが、これらはいずれも、花粉症発症前後で変化するマーカーであって、オフシーズンでも花粉症を判定できるものではない。そこで本発明者らは、健常者とスギ花粉症者との血液をスギ花粉が飛散していない時期に採取し、血中の顆粒球画分につき遺伝子発現解析、さらに血清中の代謝産物解析を行い、２群間に統計学的に有意なバイオマーカーを見出すに至った。
【０００７】
即時型アレルギー、特にスギ花粉症の検査は血清中のヒスタミン量を測定する方法、および、免疫系エフェクター細胞の活性化が細胞表面に存在するIgEレセプターにスギ特異的IgE抗体が結合することにより起こることから被験者の血清中のスギ特異的IgE抗体を検出する方法等が用いられているが、スギ特異的IgE抗体価が低くてもアレルギー症状が重い場合もあれば、抗体価が高くてもスギ花粉症の症状を発症しない場合もあることが知られている。またその治療または症状緩和のためには、一般的に抗ヒスタミン剤やステロイド剤が用いられるが、これらの医薬品には眠気や倦怠感を伴ったり、肝機能の低下やリバウンド等の副作用を引き起こしたりするため、安全なスギ花粉症の改善薬とは言えない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者らは、上記の問題を解決するため、スギ花粉症者と健常者（無症状者）との血漿成分または血清成分につき、有意に差異のある成分を分離し精密質量測定に基づく質量電荷比をＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳ（高速液体クロマトグラフ-飛行時間型質量分析計）で見出し、それらをバイオマーカーとしたスギ花粉症の検査・評価方法とし、それに基づいた安全な抗スギ花粉症剤をスクリーニングする方法を提供する。
また、スギ花粉症者と健常者との顆粒球において、有意に発現が変動する遺伝子の同定をＤＮＡチップにより見出し、それらをバイオマーカーとしたスギ花粉症の検査・評価方法とし、それに基づいた安全な抗スギ花粉症剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０００９】
すなわち、スギ花粉症者と健常者の抹消血から血漿を調整し、固相カラムで前処理後、日本電子社製のＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳで分離された血液成分のマスクロマトグラムを算出し、危険率５％未満で有意差がみられた成分を、正イオン測定にて質量電荷比が448.301±10mmu（mmuミリマスユニット：１ミリマス＝0.001AMU原子質量単位）
、および432.310±10mmuの２成分、負イオン測定にて質量電荷比が528.262±10mmu、および995.587±10mmuの質量電荷比の２成分、計４成分の質量電荷比を特定した。また、スギ花粉症者と健常者の抹消血から顆粒球を調整し、発現しているｍＲＮＡを取り出し、ＰＣＲで増幅させた後、ＤＮＡチップ（アフィメトリクス社製ジーンチップ）で発現マーカーを解析した。各群の平均蛍光強度比が２．０以上に変化し、かつＡＮＯＶＡ検定で５％未満の危険率で変化がみられ、かつ各群どちらかの平均蛍光強度測定値が１０．０以上を満たすものとして、GenBank（NCBIの核酸配列データベース） におけるAccession  Ｎｏ．でAF013611、X98263、AF112482、AK022904、AU118614、BC001338、AF156552、BC032338、X98126、Z46632、J03578、AF101044、BC010100、BC000260、AL713733、BC042914、M22538およびAJ512214で表される１８の遺伝子発現マーカーを特定した。
【００１０】
これらのことから本発明者らは、スギ花粉症者と健常者の血漿から、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳにより４成分の質量電荷比を代謝物バイオマーカーとして特定し、顆粒球からＤＮＡチップにより１８の遺伝子発現バイオマーカーを特定した。
本発明では、前記の質量電荷比の４成分を代謝物バイオマーカーおよび／または１８の遺伝子発現バイオマーカーを検査項目や評価対象とすることにより、スギ花粉症を低減、改善、あるいは予防する、飲食品、医薬品、医薬部外品、香粧品のスクリーニング法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、末梢血の血漿あるいは血清を、ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳで特定の質量電荷比で表される代謝物バイオマーカーを分析することにより、花粉症の検査・評価法が提供される。また、末梢血の顆粒球から得られるｍＲＮＡにつきＤＮＡチップ解析を行い、特定の遺伝子発現バイオマーカーを測定することにより、花粉症の検査・評価法が提供される。
さらに、本発明のバイオマーカーを検査項目や評価対象とすることにより、スギ花粉症を低減、改善、あるいは予防する、飲食品、医薬品、医薬部外品、香粧品のスクリーニング法を提供することができる。
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１２】
２２歳から３５歳までの男女２７名を被験者とし、スギ花粉症者１３名 （うち男性６名、女性７名） と健常者１４名 （うち男性７名、女性７名） に群分けを行い、抹消血をへパリンあるいはＥＤＴＡなどの抗凝固剤入り試験管に採血し、３０００ｒｐｍ、２０分間、４℃で遠心分離を行って上清を取り、血漿とした。得られた血漿のうち、１００μlをとり、メタノールと純水で前処理を施した固相抽出カラム（Waters社製、Sep−Pak  Light  C18）に負荷した。純水１ｍｌで２回洗浄後、５００μｌのメタノールで溶出させた。溶出液を冷却トラップ（東京理化器械社製UT-2000）付き遠心エバポレーター
（東京理化器械社製CVE-200D） で減圧乾燥させ、さらに１００μｌのメタノールに再溶解させ、分析用試料とした。
ＬＣ及びＭＳは、高感度/高分解能/高質量精度に微量成分の精密質量測定（ミリマス測定）を行うことができる日本電子社製の高速液体クロマトグラフ接続飛行時間型質量分析計ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣを用いた。試薬類はＬＣＭＳまたは特級グレードのものを用いた。内部標準試薬として合成アミノ酸（Ｚ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ，Ｔｏｓ−Ａｒｇ−ＯＭｅ：ペプチド研究所社製）を試料と混合し濃度を１ｐｐｍとなるように調整した。ＬＣ条件およびＭＳ条件は以下に示した。
【００１３】
［ＬＣ条件］
プレカラム：Opti  Guard  Fit  ODS（TCI社製） 
カラム：Cadenza  C18  ２×150mm（Imtakt社製） 
移動相：Ａ＝水（0.05％ギ酸）、Ｂ＝アセトニトリル
流速：0.2ml／分
グラジエントプログラム：５−95％（15分）−100％（５分） 
試料導入量：５μｌ
［ＴＯＦ  ＭＳ分析条件］
装置  アジレント社製Agilent  1100series（バイナリーポンプ、カラムヒーター、UV検出器、冷却機能つきオートサンプラー） 
オートサンプラー設定温度：4℃
イオン化法：ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化、ポジティブモードおよびネガティブモード） 
質量範囲：７０−１０００Ｄａ
オリフィス1電圧：１０〜５０Ｖ（掃引Ｐｏｓ、Ｎｅｇ） 
イオンガイド電圧：５００〜２５００Ｖ（掃引Ｐｏｓ、Ｎｅｇ） 
ＭＣＰ電圧：２８００Ｖ
スペクトル記録間隔２．５秒
［データ解析］
ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳにて分離された成分のピークをピックアップし、それぞれについて０．２Ｄａの質量幅でマスクロマトグラムを作成し面積計算を行った。分析毎のイオン化効率を補正するために内部標準として導入した２試料の擬分子イオン（Ｍ＋Ｈ）+、（Ｍ−Ｈ）-のマスクロマトグラムの平均値でそれぞれの面積値を割って相対面積値を計算した。
スギ花粉症群と健常者群に対してｔ検定（Ｔ−ｔｅｓｔ：ＥＸＣＥＬ）を行い危険率５％未満で有意差のみられたものを代謝物バイオマーカー候補とした。有意差の見出された4つの成分の平均値と標準誤差範囲を図１に示す。
【００１４】
また、Principle  Component  Analysis（ＰＣＡ）には、ＣＡＭＯ社のUnscrambler  9.1を用いて行った。上記の手順で見つけた４つのマーカー候補を用いてＰＣＡを行った。
１．エクセルワークシート上のデータを読み込む。
２．それぞれの成分を規格化する。
３．ＰＣＡを行う。
その結果を図２に示す。
【００１５】
図に示したように花粉症患者と健常人は４つのバイオマーカー候補の相対面積値を用いてＰＣＡによって分類することができた。従ってこれら代謝物バイオマーカーを検査あるいは評価を行うことにより、花粉が飛散していない時期における発症予測が可能となる。また、本代謝物バイオマーカーを測定することによる、花粉症を低減、改善または予防する飲食品、医薬品、医薬部外品または香粧品のスクリーニングが可能となると考えられた。
【実施例２】
【００１６】
２２歳から３５歳までの男女２７名を被験者とし、スギ花粉症者１３名（うち男性６名、女性７名）と健常者１４名（うち男性７名、女性７名）に群分けを行い、抹消血をへパリンあるいはＥＤＴＡなどの抗凝固剤入り試験管に採血し、末梢血に１／５量相当の６％デキストラン含有生理食塩水を加え、撹拌後室温で１時間静置し、上層の白血球画分を回収した。顆粒球（好中球）画分は、白血球画分５ｍｌを、６ｍｌフィコール液（アマシャム社製Ficoll−Paque  PLUS）入り遠心管に重層し、１５００ｒｐｍ、４５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去した。沈殿に０.２％のＮａＣｌ溶液を５ｍｌ加え、４５秒間スポイトを用いて沈殿を縣濁し、顆粒球に混入した赤血球を溶血させた。続いて１.６％ＮａＣｌ溶液を５ｍｌ加え、撹拌して浸透圧を生理食塩水状態へ戻した。もう一度この溶血操作を繰り返し、画分中の約９８％の細胞が好中球から成る顆粒球画分を得た。
【００１７】
顆粒球について、ＲＮＡ抽出カラム（キアゲン社製ＲＮｅａｓｙ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。そしてこれよりｃＤＮＡを合成し、イン・ヴィトロ転写にてｃＲＮＡを作成する際にビオチンラベルを施した。このビオチンラベルｃＲＮＡについて、約９０００種類の遺伝子プローブが搭載されているＤＮＡチップ（アフィメトリクス社製ジーンチップＨＧ−Ｆｏｃｕｓアレイ）を用いて、ハイブリダイゼーションを行った。
その後、洗浄を行いハイブリダイゼーションされているプローブのみにフィコエリスリン−アビジンと結合反応させ、共焦点アルゴンレーザースキャナー（アフィメトリクス社製ジーンチップスキャナー）によりフィコエリスリンを励起させ、その蛍光強度を計測した。
【００１８】
この蛍光強度が遺伝子発現量に相関するので、各々の遺伝子プローブの蛍光強度について「健常者群」と「花粉症者群」各々４人ずつのデータについて、各群の平均蛍光強度比が２．０以上に変化しかつＡＮＯＶＡ検定により５％未満の危険率で変化がみられかつ各群どちらかの平均蛍光強度が１０．０以上を満たす遺伝子プローブをピックアップし、花粉症を有意に反映する遺伝子発現バイオマーカーあるいはＲＮＡマーカーとして、GenBank（NCBIの核酸配列データベース）におけるAccession  Ｎｏ．においてAF013611、X98263、AF112482、AK022904、AU118614、BC001338、AF156552、BC032338、X98126、Z46632、J03578、AF101044、BC010100、BC000260、AL713733、BC042914、M22538およびAJ512214で表される１８の遺伝子を同定した。その結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2006308411.tif 000002
【００２０】
従ってこれらのバイオマーカーを指標とした検査あるいは評価を行うことにより、花粉が飛散していない時期における発症予測が可能となる。またこれらバイオマーカーを測定することによる、花粉症を低減、改善または予防する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品のスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１において健常人と花粉症の人との間の負イオン測定の結果を示すグラフである。
【図２】実施例１において代謝物バイオマーカーの検査・評価の結果を示す図である。
【図２】
2006308411.tif 000003
【図１】
2006308411.tif 000004