(57)【要約】【課題】  パルスレーザ光源からの極短パルスレーザ光の光束が、音響光学素子の有効範囲外に外れることを防止して、多光子励起効果を効率的に発生させ、鮮明な多光子蛍光画像を得る。【解決手段】  極短パルスレーザ光Ｌを出射するパルスレーザ光源４と、発せられた極短パルスレーザ光Ｌを試料Ａに照射し、試料Ａにおいて発せられた蛍光Ｆを観察する観察装置本体３と、パルスレーザ光源４と観察装置本体３との間に配置され、パルスレーザ光源４から発せられる極短パルスレーザ光Ｌのオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置６と、音響光学装置６とパルスレーザ光源４との間に配置され、極短パルスレーザ光Ｌの光束径を音響光学装置６の有効範囲Ｘ内に入射可能に縮小させる入射補正装置１３とを備える多光子励起型観察装置１を提供する。【選択図】      図１
2006275916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、
該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、
前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置と、
該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察装置。
【請求項２】
前記入射補正装置が、複数のレンズを備えるとともに、該レンズのうち少なくとも１枚のレンズを光軸方向に移動させる移動機構を備える請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項３】
前記入射補正装置が、複数の凹面鏡を備えるとともに、該凹面鏡どうしの距離および角度を調節する移動機構を備える請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項４】
前記入射補正装置が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じて移動機構を作動させる制御装置を備える請求項２または請求項３に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項５】
前記制御装置が、前記極短パルスレーザ光の波長と、移動機構の作動状態とを対応づけて記憶するメモリ装置を備え、極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記メモリ装置に記憶されている作動状態に移動機構を調節する請求項４に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項６】
前記入射補正装置が、複数の波長の極短パルスレーザ光に対し、それぞれ調節された複数レンズまたは複数の凹面鏡からなる複数の補正光学ユニットと、該補正光学ユニットを切り替える切替機構とを備える請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項７】
前記入射補正装置が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じて切替機構を作動させる制御装置を備え、
該制御装置が、前記極短パルスレーザ光の波長と、補正光学ユニットとを対応づけて記憶するメモリ装置を備え、極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記メモリ装置に記憶されている各波長に対応する補正光学ユニットを選択するように切替機構を調節する請求項６に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項８】
前記入射補正装置が、絞り、ピンホール、スリット等の空間フィルタにより構成されている請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項９】
極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、
該パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置とを備え、
該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察用光源装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の表面下の比較的深い位置から発せられる蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の測定装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この特許文献１においては、試料に照射する励起光の強度を調節し、あるいはオンオフするための手段として、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acoust Optical
Modulator）のような音響光学素子を用いることが開示されている。
【特許文献１】特開平１０−５１２９５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
音響光学素子は、一般に約１ｃｍ角の二酸化テルルやモリブデン酸塩からなる結晶であり、入射されたレーザ光を変調させることができる有効範囲は比較的狭い。一方、音響光学素子に入射させる極短パルスレーザ光は、一般には略平行光であると考えられているが、厳密には、光軸方向に沿う特定の位置に光束径が最も小さくなるビームウエストを備えるとともに、該ビームウエストの位置から離れるに従って、所定の広がり角度で光束径が大きくなるビームダイバージェンスを備えている。
【０００４】
したがって、音響光学素子の位置にビームウエストの位置を一致させることができれば、極短パルスレーザ光全体を音響光学素子の有効範囲内に入射させることができる。
しかしながら、音響光学素子に入射される極短パルスレーザ光の位置がビームウエストの位置から大きく離れると、光束径が大きくなって音響光学素子の有効範囲外に外れ、迷光の混入等に起因してビーム形状が劣化するという問題がある。ビーム形状が劣化すると、試料の集光位置における点像分布関数(ＰＳＦ:Point Spread
Function)が悪化し、試料の集光位置における光子密度が低下し、多光子励起効果を効率よく発生させることができないという問題がある。
【０００５】
また、極短パルスレーザ光のビームウエストの位置は、パルスレーザ光源の個体差、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長、分散補償光学系による分散補償量等によっても大きく変動するため、その位置を音響光学素子に一致させることが困難であるという不都合もある。
【０００６】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、パルスレーザ光源からの極短パルスレーザ光の光束が、音響光学素子の有効範囲外に外れることを防止して、多光子励起効果を効率的に発生させ、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる多光子励起型観察装置および多光子励起観察用光源装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置と、該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光が観察装置本体に供給され、観察装置本体によって、試料に照射されると、試料における多光子励起効果によって、極短パルスレーザ光が集光させられた位置において多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は観察装置本体によって検出され、観察される。極短パルスレーザ光は、観察装置本体に入射される前に、音響光学装置を通過するので、音響光学装置によってオンオフあるいは出力調整される。
【０００９】
この場合において、本発明によれば、音響光学装置とパルスレーザ光源との間に、入射補正装置を備えているので、該入射補正装置の作動により、パルスレーザ光源から伝播されてくる極短パルスレーザ光の光束径が縮小されて音響光学装置に入射される。これにより、音響光学装置に入射される極短パルスレーザ光が、音響光学装置を構成する結晶の大きさにより設定される有効範囲から外れることなく完全に入射されるので、結晶の側面における反射光や、結晶に入ることができずに外れた光が迷光となって結晶から出射される極短パルスレーザ光に混合されてしまうことが防止される。その結果、音響光学装置から出力される強度変調等された極短パルスレーザ光の試料の集光位置における点像分布関数が悪化することが防止され、試料において効率的に多光子励起効果を発生させて鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００１０】
上記発明においては、前記入射補正装置が、複数のレンズを備えるとともに、該レンズのうち少なくとも１枚のレンズを光軸方向に移動させる移動機構を備えることが好ましい。
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、複数の凹面鏡を備えるとともに、該凹面鏡どうしの距離および角度を調節する移動機構を備えることとしてもよい。
【００１１】
このように構成することで、移動機構の作動によりレンズ間距離を調節し、あるいは、複数のレンズを移動させ、または複数の凹面鏡どうしの距離および角度を調節することにより、光束径の縮小率および／またはビームダイバージェンスを調節することができる。したがって、パルスレーザ光源の個体差、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長、分散補償光学系による分散補償量等の変動により、極短パルスレーザ光のビームウエストの位置が光軸方向に変動しても、移動機構の作動により光束径の縮小率および／またはビームダイバージェンスを調節することができ、音響光学装置の有効範囲内に確実に入射させて、効率的に多光子励起効果を発生させることが可能となる。
【００１２】
上記発明においては、前記入射補正装置が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じて移動機構を作動させる制御装置を備えることが好ましい。
さらに、上記発明においては、前記制御装置が、前記極短パルスレーザ光の波長と、移動機構の作動状態とを対応づけて記憶するメモリ装置を備え、極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記メモリ装置に記憶されている作動状態に移動機構を調節することとしてもよい。
【００１３】
このように構成することで、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長が変動しても、制御装置の作動により、移動機構が作動せられてレンズ間距離あるいは凹面鏡どうしの距離および角度が自動調節される。また、メモリ装置により、極短パルスレーザ光の波長を得ることで、記憶されている移動機構の作動状態に調節することができ、移動機構の作動状態を検出しながら調節する必要がなく、さらに簡易に鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、複数の波長の極短パルスレーザ光に対し、それぞれ調節された複数レンズまたは複数の凹面鏡からなる複数の補正光学ユニットと、該補正光学ユニットを切り替える切替機構とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、極短パルスレーザ光の波長が変更された場合には、切替機構の作動により、設定された波長の極短パルスレーザ光に対応する補正光学ユニットが選択され、パルスレーザ光源と音響光学装置との間に配置される。これにより、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光が、選択された補正光学ユニットを通過させられることにより、その波長に適した縮小率で光束径を縮小され、有効範囲からはみ出すことなく音響光学装置に入射される。したがって、迷光等の混入によるＰＳＦの悪化を防止して多光子励起効果を効率的に発生させることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長に応じて切替機構を作動させる制御装置を備え、該制御装置が、前記極短パルスレーザ光の波長と、補正光学ユニットとを対応づけて記憶するメモリ装置を備え、極短パルスレーザ光の波長に応じて、前記メモリ装置に記憶されている各波長に対応する補正光学ユニットを選択するように切替機構を調節することとしてもよい。
【００１６】
このように構成することで、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の波長が変更されても、制御装置の作動により、切替機構が作動せられて、変更後の波長に適した補正光学ユニットが自動的に選択される。このとき、極短パルスレーザ光の波長を得ることで、メモリ装置に記憶されている変更後の波長に対応する補正光学ユニットが選択され、簡易に鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００１７】
さらに、上記発明においては、前記入射補正装置が、絞り、ピンホール、スリット等の空間フィルタにより構成されていることとしてもよい。
このように構成することで、入射補正装置に入射される極短パルスレーザ光の光束径を簡易に縮小して、音響光学装置の有効範囲内に入射させることができる。
【００１８】
また、本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力調整を行う音響光学装置とを備え、該音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置とを備える多光子励起型観察用光源装置を提供する。
【００１９】
本発明によれば、パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光は、音響光学装置を通過させられることにより、音響光学装置によってオンオフあるいは出力調整される。この場合において、本発明によれば、極短パルスレーザ光が、音響光学装置に入射される前に入射補正装置を通過させられることにより、その光束径を縮小させられるので、ビームウエスト位置の如何に関わらず、極短パルスレーザ光全体を音響光学装置の有効範囲内に入射させることができる。その結果、音響光学装置から出力される強度変調等された極短パルスレーザ光の試料の集光位置における点像分布関数が悪化することが防止され、試料において効率的に多光子励起効果を発生させて鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、音響光学装置を通過させられる極短パルスレーザ光が、その有効範囲内に入射されるように入射補正装置によって補正されるので、音響光学装置による極短パルスレーザ光のオンオフあるいは出力変調の際に、迷光が発生して極短パルスレーザ光の試料の集光位置におけるＰＳＦが悪化することを防止できる。したがって、試料におけるビームウエスト位置の変動によるピントずれを防止でき、また、試料のビームウエスト位置における光子密度の低下を防止して、効率的に多光子励起効果を発生させ、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置について図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１は、多光子励起型顕微鏡であって、図１に示されるように、光源装置（多光子励起型観察用光源装置）２と、該光源装置２の後段に配置される蛍光顕微鏡本体（観察装置本体）３とを備えている。
【００２２】
前記光源装置２は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源４と、該パルスレーザ光源４から発せられる極短パルスレーザ光Ｌの群速度分散を補償する分散補償光学系５と、分散補償された極短パルスレーザ光Ｌのオンオフあるいは強度変調する音響光学装置６と、該音響光学装置６とパルスレーザ光源４との間に配置され、音響光学装置６に入射させる極短パルスレーザ光Ｌを調節する入射補正装置７と、音響光学装置６から出射され、前記蛍光顕微鏡本体３に入射される極短パルスレーザ光Ｌを調節する顕微鏡入射補正装置８とを備えている。
【００２３】
前記分散補償光学系５は、例えば、一対のプリズム９，１０とミラー１１とから構成されている。あるいはグレーティング対により構成されていてもよい。プリズム９，１０どうしの間隔あるいはグレーティングどうしの間隔を調節することで、波長ごとの光路長を調節して、パルスレーザ光源４から蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ３ａに至る全光学系における群速度分散を補償するようになっている。
【００２４】
前記入射補正装置７は、アライメント調節装置１２とビーム整形光学系１３とを備えている。
前記アライメント調節装置１２は、例えば、位置および角度を調節可能な２枚のミラーを備え、極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置と偏向を調節し、音響光学装置６に対して適正な位置と角度で精度よく入射させるように構成されている。図中、符号１４は、パルスレーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光Ｌを反射して分散補償光学系５に指向させる一方、分散補償光学系５から出力された極短パルスレーザ光Ｌの光軸から紙面に垂直方向に外れた位置に配置されているミラーである。
【００２５】
また、ビーム整形光学系１３は、分散補償光学系５を通過し、アライメント調節装置１２によって位置合わせされた極短パルスレーザ光Ｌの光束径を絞り、音響光学装置６の結晶１５（図２参照）の有効範囲Ｘ内に漏れなく入射させるように構成されている。
本実施形態においては、ビーム整形光学系１３は、例えば、両凸レンズ１６と平凹レンズ１７とを組み合わせたガリレイ型のビームエキスパンダにより構成されている。また、ビーム整形光学系１３は、パルスレーザ光源４と音響光学装置６との間に、その中央よりも音響光学装置６側に配置されていることが好ましい。また、ビーム整形光学系１３は、音響光学装置６の前方１００〜１０００ｍｍの位置に配置されていることがさらに好ましい。
【００２６】
前記音響光学装置６は、図２〜図４に示されるように、例えば、ＡＯＭであって、２酸化テルルからなる結晶１５と、該結晶１５を固定するケース１８と、結晶１５に接着された圧電素子からなるトランスデューサ１９と、該トランスデューサ１９に入力する電気信号Ｅを伝達する音響波発生用電気回路２０と、前記結晶１５に接着されたヒートシンク（放熱部材）２１とを備えている。結晶１５とケース１８との間、結晶１５とヒートシンク２１との間には、例えば、シリコーングリースのようなサーマルコンパウンドあるいはインジウム箔からなる界面材２２が介在させられている。また、図４中、符号２３は、トランスデューサ１９から発せられ、結晶１５内を伝播した音響波を吸収する吸音材である。
【００２７】
結晶１５を挟んで対向するケース１８の一対の側壁にはそれぞれ開口部２４が設けられており、一の開口部２４から極短パルスレーザ光Ｌを入射させ、結晶１５を通過した極短パルスレーザ光Ｌを他の開口部２４から出射させるようになっている。
前記ヒートシンク２１は、例えば、アルミニウムあるいはアルミニウム合金のような熱伝導率の高い材質からなり、図３に示されるように、平行間隔をあけて配置される複数の平板状のフィン２１ａを備えている。
【００２８】
前記顕微鏡入射補正装置８は、アライメント調節装置２５と、視準光学系２６とを備えている。
アライメント調節装置２５は、アライメント調節装置１２と同様の構造を有し、蛍光顕微鏡本体３に入射させる極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置と偏向を精度よく調節することができるようになっている。
【００２９】
また、視準光学系２６は、例えば、両凸レンズ２７と平凹レンズ２８とからなり、ビーム整形光学系１３と同様のガリレイ型のビームエキスパンダにより構成されている。視準光学系２６は、ビーム整形光学系１３により音響光学装置６の有効範囲Ｘを漏れなく通過するようにその光束径およびビームダイバージェンスを補正され、かつ、アライメント調節装置２５により光軸の位置および偏向を調節された極短パルスレーザ光Ｌが、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ３ａの前方の所定の位置（試料Ａの所定の位置）にビームウエストを形成するように、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを補正するようになっている。さらに具体的には、視準光学系２６は、対物レンズ３ａの瞳位置において、極短パルスレーザ光Ｌが、その瞳径と略同等の光束径を有するように、その光束径およびビームダイバージェンスを補正するようになっている。
【００３０】
前記蛍光顕微鏡本体３は、極短パルスレーザ光Ｌを２次元的に走査する一対のガルバノミラー２９、走査された極短パルスレーザ光Ｌを集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ３０、中間像を結像した極短パルスレーザ光Ｌを略平行光にする結像レンズ３１、略平行光にされた極短パルスレーザ光Ｌを集光して試料Ａに結像させる対物レンズ３ａ、試料Ａにおいて発せられ対物レンズ３ａにより集光された多光子蛍光Ｆを極短パルスレーザ光Ｌから分岐するダイクロイックミラー３２、分岐された多光子蛍光Ｆを集光する集光レンズ３３、集光された多光子蛍光Ｆを検出する光電子増倍管（ＰＭＴ）３４とを備えている。符号３５、３６はミラーである。
【００３１】
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１によれば、パルスレーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光Ｌが分散補償光学系５を通過させられることによって群速度分散を補償された状態で、入射補正装置７に入射される。
【００３２】
入射補正装置７においては、まず、アライメント調整装置１２によって、極短パルスレーザ光Ｌがその光軸の位置および偏向を調整される。次に、ビーム整形光学系１３により、光束径を縮小させられた状態で、音響光学装置６に一方の開口部２４から入射される。
【００３３】
この場合において、ビーム整形光学系１３は、極短パルスレーザ光Ｌの光束径を縮小して、音響光学装置６の結晶１５の有効範囲Ｘ内に入射させるように構成されているので、極短パルスレーザ光Ｌが漏れなく結晶１５を通過させられる。
音響光学装置６においては、音響波発生用電気回路２０の作動により、所定周波数の電気信号Ｅがトランスデューサ１９に入力され、トランスデューサ１９において発生させられた音響波によって、結晶１５内における極短パルスレーザ光Ｌの音響光学効果が発生する。また、トランスデューサ１９により発生する音響波の振幅を変更することにより、結晶１５内における極短パルスレーザ光Ｌの回折強度を変化させ、音響光学装置６から出射される極短パルスレーザ光Ｌの強度を、音響波の振幅に応じた所定の割合で変調する。
【００３４】
これにより、入射された極短パルスレーザ光Ｌが結晶１５を通過してケース１８の開口部２４から、所定の強度に変調された状態で出射されることになる。
この場合において、ビーム整形光学系１３によって極短パルスレーザ光Ｌが結晶１５の有効範囲Ｘ内に漏れなく入射されているので、結晶１５に入射されない極短パルスレーザ光Ｌや結晶１５の側面によって乱反射等される極短パルスレーザ光Ｌが存在しない。したがって、これらの極短パルスレーザ光Ｌが迷光となって、正常に結晶１５を通過する極短パルスレーザ光Ｌに混入することがない。
【００３５】
その結果、結晶１５から出射される極短パルスレーザ光Ｌにおける波面の乱れの発生が抑制され、試料Ａの集光位置におけるＰＳＦの悪化が抑制される。すなわち、対物レンズ３ａの前方に形成される試料Ａにおける集光位置において、光子密度の低下が防止され、多光子励起効果を効率的に発生させることが可能となる。
【００３６】
また、トランスデューサ１９により結晶１５に入力する音響波をオンオフすることにより、極短パルスレーザ光Ｌの出射と遮断とを切り替えてオンオフすることができる。例えば、蛍光顕微鏡本体３のガルバノミラー２９による極短パルスレーザ光Ｌの２次元的な走査と同期させて極短パルスレーザ光Ｌをオンオフすることにより、試料Ａに対して所定の走査範囲のみに極短パルスレーザ光Ｌを照射することが可能となる。
【００３７】
また、極短パルスレーザ光Ｌは音響光学装置６の結晶１５内を通過させられる際に音響光学効果によって回折させられる。このとき、結晶１５にはトランスデューサ１９から音響波が入力されるので、そのエネルギによって結晶１５が局所的に発熱する。
【００３８】
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１によれば、結晶１５自体の熱容量が小さいが、該結晶１５に熱容量の大きなヒートシンク２１が接着されているので、結晶１５において発生した熱はヒートシンク２１によって吸収される。また、ヒートシンク２１には複数のフィン２１ａが設けられているので、結晶１５から吸収した熱は、これらのフィン２１ａを介して外気に効率的に放散される。これにより、結晶１５の局所的な温度上昇が抑制され、結晶１５内の屈折率の変動が大幅に抑制されることになる。
【００３９】
結晶１５の屈折率が変動すると、結晶１５内における極短パルスレーザ光Ｌの回折が変化するため、音響光学装置６からの出射方向が変化する。したがって、何ら対策を施さない場合には、アライメント調節装置１２，２５によって極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置と偏向を厳密に調節しておいても、トランスデューサ１９から入力される音響波によって、結晶１５の温度が経時的に変化し、それによって結晶１５からの出射方向がずれて適正な位置に出射されなくなってしまうことになる。
【００４０】
また、結晶１５に入力する音響波の振幅は、その強度変調の程度やオンオフの頻度等の使用状態によって相違するため、使用状態ごとに極短パルスレーザ光Ｌの出射方向が変化する。
特に、ＡＯＭの場合には、音響波を発生させるためにトランスデューサ１９に入力する駆動電力が高いこと、および、極短パルスレーザ光Ｌを入射させる有効範囲の面積が小さいことにより、対策を施さない場合には結晶１５内は局所的に加熱される。
【００４１】
本実施形態によれば、熱容量の大きなヒートシンク２１によって結晶１５の温度変化が抑制されるので、音響波を発生させるためにトランスデューサ１９に入力する駆動電力が高くても、結晶１５における局所的な加熱状態が防止され、極短パルスレーザ光Ｌの出射方向を一定に維持することができる。その結果、結晶１５の経時的な温度変化を検出したり、検出された結晶１５の温度に基づいてアライメント調節装置２５をその都度調節したりする必要がなく、簡易な構成で、観察開始時に設定されたアライメント状態のままで、試料Ａの適正な照射範囲に極短パルスレーザ光Ｌを照射して、蛍光観察を行うことができる。
なお、本実施形態においては、ヒートシンク２１の形態として、平板状のフィン２１ａを備えるものを例示したが、これに代えて、他の任意の形態のヒートシンク２１を採用することができる。
【００４２】
音響光学装置６から出射された変調後の極短パルスレーザ光Ｌは、顕微鏡入射補正装置８に入射される。顕微鏡入射補正装置８においては、アライメント調節装置２５の作動により、その光軸の位置および偏向を調節された状態で、視準光学系２６に入射される。
視準光学系２６においては、パルスレーザ光源４から発せられ、分散補償光学系５、アライメント調節装置１２、ビーム整形光学系１３、音響光学装置６およびアライメント調節装置２５を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを再度補正し直すことにより、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ３ａの瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有するように補正する。これにより、パルスレーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光Ｌを最も無駄なく効率的に試料Ａに集光させ、試料Ａ内に形成されるビームウエスト位置における光子密度を向上させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。
【００４３】
なお、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１および多光子励起型観察用光源装置２においては、ガリレイ型のビーム整形光学系１３および視準光学系２６を採用したが、これに代えて、複数の両凸レンズを有するケプラー型のビーム整形光学系１３および視準光学系２６を採用してもよい。また、図５に示されるように、一対の凹面鏡３７，３８を対向配置することによりビーム整形光学系１３を構成してもよい。このように構成することで反射光学系によって極短パルスレーザ光Ｌの光束径を縮小させるので、ビーム整形光学系１３を通過する際に群速度分散を生じることがなく、パルス幅が広がることを防止できる。
【００４４】
また、図６に示すように、ビーム整形光学系１３として、絞り３９（あるいはスリットまたはピンホール等の空間フィルタ）を採用してもよい。このようにすることで、簡易な構成により極短パルスレーザ光Ｌの光束径を縮小させることができ、また調節も簡単であるという利点がある。
【００４５】
また、図７に示されるように、ビーム整形光学系１３および／または視準光学系２６を構成する両凸レンズ１６，２７および平凹レンズ１７，２８に、それぞれ、移動機構４０，４１を設け、両凸レンズ１６，２７または平凹レンズ１７，２８を光軸方向に移動させることとしてもよい。このように構成することで、パルスレーザ光源４の交換による個体差、パルスレーザ光源４から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長の変更あるいは、複数のパルスレーザ光源４を切り替える場合の極短パルスレーザ光Ｌの波長の変更等、または、これらの変更による分散補償量の変更等によって、ビーム整形光学系１３あるいは視準光学系２６に入射する極短パルスレーザ光Ｌの光束径とビームダイバージェンスとが変化しても、移動機構４０，４１を作動させて、両凸レンズ１６，２７または平凹レンズ１７，２８の少なくとも一方を光軸方向に移動させることで、出射される光束径とビームダイバージェンスとが一定となるように整形することができる。
【００４６】
したがって、波長等が変更されても、ビーム整形光学系１３から出射される極短パルスレーザ光Ｌを、音響光学装置６の結晶１５の有効範囲Ｘ内に漏れなく入射させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。また、波長等が変更されても、視準光学系２６から出射される極短パルスレーザ光Ｌを、対物レンズ３ａの前方の所定の位置に集光させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。また、異なる波長の極短パルスレーザ光Ｌのビームウエスト位置が光軸方向にずれるのを防止でき、波長にかかわらず、試料Ａの同一位置にピントを合わせることができる。
【００４７】
また、ビーム整形光学系１３が、２以上のレンズにより構成される場合には、移動機構４０，４１はその少なくとも１つのレンズを光軸方向に移動させるように構成されていればよい。
また、ビーム整形光学系１３が、２つの凹面鏡３７，３８により構成される場合には、移動機構４０，４１は、２つの凹面鏡３７，３８の距離を変更するのみならず、２つの凹面鏡３７，３８の角度をも変更するように構成されている必要がある。このように構成することで、上記と同様の効果を奏する。
【００４８】
さらに、移動機構４０，４１の作動により、レンズ１６，１７，２７，２８の位置や凹面鏡３７，３８の位置および角度等を調節する場合、手動により調節することとしてもよいが、極短パルスレーザ光Ｌの波長に基づいて移動機構４０，４１の作動状態を調節する制御装置４２を備えることにしてもよい。
図８に示される例は、波長可変のパルスレーザ光源４を備え、該パルスレーザ光源４から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が変更されたときに、分散補償光学系５、アライメント調節装置１２，２５、ビーム整形光学系１３、音響光学装置６、視準光学系２６等の各調節装置を制御装置４２によりそれぞれ調節する多光子励起型観察装置１である。
【００４９】
制御装置４２には、パルスレーザ光源４から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長λとその波長λが選択されたときの前記各調節装置の最適な作動状態Ｙ、例えば、分散補償光学系５の分散補償量（プリズムやグレーティングの間隔寸法）、アライメント調節装置１２，２５を構成するミラーの位置および角度、ビーム整形光学系１３および視準光学系２６を構成するレンズ１６，１７，２７，２８や凹面鏡３７，３８の位置や角度、音響光学装置６に入力する音響波の周波数等とを対応づけて記憶するメモリ装置４３が備えられている。各調節装置の作動状態Ｙは相互に関連している場合があるので、全ての調節装置に対して、波長λと作動状態Ｙとが設定されていることが好ましい。
【００５０】
そして、パルスレーザ光源４から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長λが、例えば、パルスレーザ光源Ｌから出力される波長情報（あるいは、外部から入力される極短パルスレーザ光の波長情報）λによって取得されると、制御装置４２は、取得された波長情報λに基づいてメモリ装置４３内を検索し、波長λに対応する作動状態Ｙとなるように各調節装置を自動調節する。これにより、パルスレーザ光源４の波長λの変化にかかわらず、簡易かつ精度よく極短パルスレーザ光Ｌを漏れなく音響光学装置６の結晶１５の有効範囲Ｘ内に通過させ、あるいは、対物レンズ３ａの瞳位置に瞳径と略同等の極短パルスレーザ光Ｌを入射させて、試料Ａにおける多光子励起効果を効率的に発生させることができる。
【００５１】
なお、採用し得る波長λが予め定められている場合には、上述したように、メモリ装置４３に波長λと作動状態Ｙとを対応づけて記憶しておくことにより、最も簡易かつ精度よく制御できる。しかしながら、この発明は、これに限定されるものではなく、ビーム整形光学系１３に入力される極短パルスレーザ光Ｌあるいはビーム整形光学系１３から出力される極短パルスレーザ光Ｌの光束径を測定し、その測定結果に基づいて、ビーム整形光学系１３による光束径の縮小率やビームダイバージェンスが達成できるように制御装置４２により移動機構４０，４１を自動調節することにしてもよい。
【００５２】
また、制御装置４２による調節は、波長λの変更により生ずるアライメントのずれ、ビームウエスト位置の移動、ビームダイバージェンスの変動を検出し、それぞれ所望のアライメント、ビームウエスト位置およびビームダイバージェンスが達成できるように各調節装置に対して行われてもよい。
【００５３】
さらに、極短パルスレーザ光Ｌの採用し得る波長λが有限個に限られる場合には、図９に示されるように、各波長λに適合する距離や角度に予め調節された状態に固定されたレンズ群あるいは凹面鏡からなる複数の補正光学ユニット１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃと、該補正光学ユニット１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃを切り替える切替機構４４とを備えるものとしてもよい。この場合においても、波長λと補正光学ユニット１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃとを対応づけてメモリ装置４３に記憶しておき、得られた波長情報λに基づいてメモリ装置４３内を検索して対応する補正光学ユニット１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃを選択し、切替機構４４により切り替えることとすれば、上記と同様に、簡易に高精度の多光子蛍光画像を取得することが可能となる。
【００５４】
なお、同様にして、視準光学系２６についても、複数の補正光学ユニットとこれらを切り替える切替機構とを有する構造のものを採用することとしてもよい。
また、視準光学系２６，ビーム整形光学系１３のレンズ構成は、いずれも図示のような両凸レンズと平凹レンズとの組合せに限られるものではなく、正または負のパワーを持つ任意のレンズの組合せにより構成されるものであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の一実施形態に係る多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の多光子励起型観察装置に用いられるビーム整形光学系および音響光学装置を拡大して示す図である。
【図３】図１の多光子励起型観察装置に用いられる音響光学装置の一例を示す斜視図である。
【図４】図３の音響光学装置の内部構造を示す縦断面図である。
【図５】図２のビーム整形光学系の変形例を示す図である。
【図６】図２のビーム整形光学系の他の変形例を示す図である。
【図７】図２のビーム整形光学系の変形例であって、各レンズを光軸方向に移動させる移動機構を備えるビーム整形光学系を示す図である。
【図８】図１の多光子励起型観察装置の変形例を示す全体構成図である。
【図９】図２のビーム整形光学系の変形例であって、予め調節された複数の補正光学ユニットを交換する切替機構を備えるビーム整形光学系および音響光学装置を示す図である。
【符号の説明】
【００５６】
Ａ  試料
Ｆ  蛍光
Ｌ  極短パルスレーザ光
Ｘ  有効範囲
Ｙ  作動状態
λ  波長
１  多光子励起型観察装置
２  多光子励起型観察用光源装置
３  蛍光顕微鏡本体（観察装置本体）
４  パルスレーザ光源
６  音響光学装置
７  入射補正装置
１３  ビーム整形光学系（入射補正装置）
１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃ  補正光学ユニット
１６，１７  レンズ
３７，３８  凹面鏡
３９  絞り（空間フィルタ）
４０，４１  移動機構
４２  制御装置
４３  メモリ装置
４４  切替機構
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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