(57)【要約】【課題】非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを検出する手段を提供すること。【解決手段】以下の特性：（１）少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列が少なくとも一つの部位を有し、この部位は、上記少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列からなる配列中においても上記ポリペプチド中においても、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体によって結合され得ること；および（２）上記少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列が、本願明細書に開示されたアミノ酸配列から得られる少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列と少なくとも８０％の相同性を有すること、を有する、少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列を含む、ポリペプチドであって、ただし、上記ポリペプチドは、上記アミノ酸配列から得られる任意の少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列ではない、ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性を有する、少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列を含む、ポリペプチド：
(１)該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列が少なくとも一つの部位を含み、
該部位は、該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列からなる配列中においても該ポリペプチド中においても、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体によって結合され得；そして
(２)該少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列が、以下のアミノ酸配列：
【化１０１】
2006104207.tif 000025
【化１０２】
2006104207.tif 000026
【化１０３】
2006104207.tif 000027
中に１または数個の欠失、挿入、または置換を有するアミノ酸配列から得られ、
ただし、該ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
【化１０４】
2006104207.tif 000028
【化１０５】
2006104207.tif 000029
【化１０６】
2006104207.tif 000030
から得られ得る、少なくとも８個のアミノ酸の連続する配列を含まない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス（ＮＡＮＢＶ）伝染の流行を処置するための材料および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、診断用ＤＮＡ断片、診断用タンパク、診断用抗体、そしてＮＡＮＢ型肝炎の病因因子（すなわち、Ｃ型肝炎ウイルス）に対する防御抗原および防御抗体に関する。
【０００２】
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引用される特許
米国特許第４，３４１．７６１号
米国特許第４，３９９，１２１号
米国特許第４，４２７，７８３号
米国特許第４，４４４，８８７号
米国特許第４，４６６，９１７号
米国特許第４，４７２，５００号
米国特許第４，４９１，６３２号
米国特許第４，４９３，８９０号
【背景技術】
【０００３】
非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は，伝染性の疾患であるか，あるいはウイルスが誘発すると考えられている疾患群およびウイルスに関連する他の形態の肝臓疾患とは区別し得る疾患群に属する。これらの疾患には，周知の肝炎ウイルス（すなわち，Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ），Δ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ），およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））により引き起こされる疾患が包含される。ＮＡＮＢＨは輸血した個体において初めて同定された。ヒトからチンパンジーへの伝染およびチンパンジー間における一連の継代は，ＮＡＮＢＨが１種または複数種の伝染性感染因子によるという証拠を与える。しかしながら，ＮＡＮＢＨの原因である伝染性因子はまだ同定されておらず，疾患の原因となる因子の数も知られていない。
【０００４】
疫学的証拠によると，ＮＡＮＢＨには次の３つの型があると示唆される：つまり，飲料水媒介の流行型；血液または注射針に関連する型；および散発（集団獲得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ａｃｑｕｉｒｅｄ））型の３つの型である。しかしながら，ＮＡＮＢＨの原因となり得る因子の数は知られていない。
【０００５】
ＮＡＮＢＨの臨床における診断および同定は，他のウイルスマーカーを排除することにより，まず行われてきた。推定されるＮＡＮＢＶ抗原および抗体を検出するために用いられる方法には，寒天ゲル拡散法，対向免疫電気泳動法，免疫蛍光顕微鏡法，免疫電子顕微鏡法，放射性免疫検定法，および酵素結合免疫吸着検定法がある。しかしながら，これらの検定法はいずれも，ＮＡＮＢＨに関する診断検査として用いるのに充分感度が高く，特異的であり，かつ再現性があるとは示されていない。
【０００６】
これまで，ＮＡＮＢＨ因子に関連する抗原抗体系の同一性または特異性に関しては，明確ではなく，しかも一致することはなかった。これは，その少なくとも一部は，以下のことが原因である：つまり，個体におけるＨＢＶの前感染またはＮＡＮＢＶとの同時感染；ＨＢＶに関連する溶解性の粒子状抗原の周知の複雑さ；および肝臓細胞のゲノムへのＨＢＶＤＮＡの組込みである。さらに，ＮＡＮＢＨが１種より多くの病原体により引き起こされる可能性，およびＮＡＮＢＨが誤診されてきた可能性がある。また，血漿学的な検定法により，ＮＡＮＢＨ患者の血清中に何が検出されるかは不明であった。寒天ゲル拡散法および対向免疫電気泳動法によれば，血清検体間に時々生じる自動免疫反応または非特異的なタンパク相互作用は検出されるが，特異的なＮＡＮＢＶ抗原−抗体反応は示されないと考えられてきた。免疫蛍光法，酵素結合免疫吸着検定法，および放射性免疫検定法によれば，ＮＡＮＢＨ患者の血清中，ならびに他の肝臓疾患および非肝臓疾患を有する患者においても，しばしば存在するリウマチ因子様物質が低レベルで検出されるようである。検出された反応性のいくつかは，宿主により定まる細胞質抗原に対して抗体を表現し得る。
【０００７】
ＮＡＮＢＶの候補となるものは，数多く存在する。例えば，Ｐｒｉｎｃｅ（１９８３），ＦｅｉｓｔｏｎｅおよびＨｏｏｆｎａｇｌｅ（１９８４），そしてＯｖｅｒｂｙ（１９８５，１９８６，１９８７）による総説，ならびにＩｗａｒｓｏｎ（１９８７）による論文を参照にされたい。しかしながら，これらの候補がＮＡＮＢＨの病因因子に相当するという証拠はない。
【０００８】
ＮＡＮＢＶのキャリア，およびＮＡＮＢＶで汚染された血液または血液製剤をスクリーニングしかつ同定するための感度が高く特異的な方法が非常に要求されている。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は輸血された患者の約１０％において発生する。この場合，９０％までがＮＡＮＢＨである。この疾患における大きな問題は，しばしば慢性的な肝臓損傷へ進行することである（２５〜５５％）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
患者を看護し，血液および血液製剤によるＮＡＮＢＨの感染あるいは個体が緊密に接触することにより起こるＮＡＮＢＨの感染を予防するために，ＮＡＮＢＶに関する核酸、抗原、および抗体を検出する信頼性の高い診断手段および予診手段が必要とされている。さらに，この疾患を予防および／または処置するための効果的なワクチンおよび免疫療法剤も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（項目１）以下の特性を有する、少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列を含むポリペプチド：
（１）上記少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列が少なくとも一つの部位を有し、この部位は、上記少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列からなる配列中においても上記ポリペプチド中においても、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体によって結合され得；
（２）上記少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列が、以下のアミノ酸配列から得られる少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列と、少なくとも８０％の相同性を有する：
【００１１】
【化１】
2006104207.tif 000002
【００１２】
【化２】
2006104207.tif 000003
【００１３】
【化３】
2006104207.tif 000004
ただし、上記ポリペプチドは、上記アミノ酸配列から得られる任意の少なくとも１０個のアミノ酸の連続する配列ではない。
【００１４】
（項目２）上記相同性が少なくとも９０％である、項目１に記載のポリペプチド。
【００１５】
本発明は，新しく発見されたＮＡＮＢＶ病因因子であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の単離および特徴付けに関する。さらに詳しくは，本発明は，ＨＣＶゲノムの部分的なｃＤＮＡ複製物群を提供する。これらのｃＤＮＡ複製物は，以下の新規な工程を包含する方法により単離された：つまり，これまでに単離も特徴付けもされていないウイルス因子のゲノムから誘導される新しく合成された抗原を検出するために，ＮＡＮＢＨ患者の血清で感染した組織中の粒子状因子から調製されたｃＤＮＡライブラリー由来の発見産物をスクリーニングする工程；および非感染個体に比べて感染個体の血清とのみ免疫学的に反応する産物を生産するクローンを選択する工程である。
【００１６】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡから誘導されたプローブを利用したＨＣＶゲノムの性質，およびＨＣＶ  ｃＤＮＡ内に含まれる配列情報に関する研究は，ＨＣＶがフラビウイルスまたはフラビ様ウイルスであることを示唆している。
【００１７】
ＨＣＶから誘導されたｃＤＮＡ配列の一部は，試料中のウイルスの存在を診断するためのプローブとして，および天然に存在するウイルスの変異型を単離するためのプローブとして有用である。これらのｃＤＮＡを用いれば，ＨＣＶゲノム内にコードされているＨＣＶ抗原の有効なポリペプチド配列を調製し，診断検査における標準または試薬として，および／またはワクチンの成分として有用なポリペプチドを生産することができる。これらのポリペプチド配列内に含まれるＨＣＶエピトープに対する抗体は，ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれもが，診断検査に，治療薬として，抗ウイルス剤のスクリーニングに，そしてこれらのｃＤＮＡから誘導されるＮＡＮＢＶ因子の単離に有用である。さらに，これらのｃＤＮＡから誘導されるプローブを利用することにより，ＨＣＶゲノムの他の部分を単離し，かつ配列決定することができる。従って，ＮＡＮＢＨの診断および／または処置，予防および治療の両方に有用な追加のプローブおよびポリペプチドが提供される。
【００１８】
従って，ポリヌクレオチドに関する本発明のいくつかの局面は以下のとおりである：精製されたＨＣＶポリヌクレオチド；組換えＨＣＶポリヌクレオチド；ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ  ｃＤＮＡに由来する配列を有する組換えポリヌクレオチド；ＨＣＶのエピトープをコードする組換えポリヌクレオチド；上記の組換えポリヌクレオチドのいずれかを有する組換えベクター；およびこれらベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞。
【００１９】
本発明の他の局面は以下のとおりである：ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ  ｃＤＮＡに由来するＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する組換え発現系であって，該ＯＲＦが所望の宿主と適合し得る制御配列に対して作動可能なように連結されている，組換え発現系；該組換え発現系で形質転換された細胞；および該形質転換細胞により生産されるポリペプチド。
【００２０】
本発明のさらに他の局面は以下のとおりである：精製されたＨＣＶ；該精製ＨＣＶに由来するポリペプチドの調製物；精製されたＨＣＶポリペプチド；およびＨＣＶに含まれるエピトープと免疫学的に同一であるとみなし得るエピトープを有する精製されたポリペプチド。
【００２１】
本発明には以下の局面も包含される：組換えＨＣＶポリペプチド；ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶ  ｃＤＮＡに由来する配列を有する組換えポリペプチド；ＨＣＶエピトープを有する組換えポリペプチド；およびＨＣＶポリペプチドを有する融合ポリペプチド。
【００２２】
本発明には以下のものも包含される：ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体；およびＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体の精製された調製物。
【００２３】
本発明の他の局面は，ＨＣＶ感染に対して免疫原性の粒子であって，真核生物宿主内で生産される場合に粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非ＨＣＶポリペプチドと，ＨＣＶエピトープを有する粒子である。
【００２４】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶに対するポリヌクレオチドプローブである。
【００２５】
キットに関する本発明の局面は以下のようなキットである：ＨＣＶに由来するポリヌクレオチドの存在について試料を分析するためのキットであって，適当な容器内に，約８個またはそれ以上のヌクレオチドからなるＨＣＶ由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを有するキット；ＨＣＶ抗原の存在について試料を分析するためのキットであって，適当な容器内に，検出されるべきＨＣＶ抗原に対する抗体を有するキット；ＨＣＶ抗原に対する抗体の存在について試料を分析するためのキットであって，適当な容器内に，ＨＣＶ抗原に存在するＨＣＶエピトープを含むポリペプチドを有するキットである。
【００２６】
本発明の他の局面は，固体担体に付着させた，ＨＣＶエピトープを有するポリペプチド；および固体担体に付着させた，ＨＣＶエピトープに対する抗体である。
【００２７】
本発明のさらに他の局面は以下のような方法である：ＨＣＶエピトープを含むポリペプチドを生産する方法であって，ＨＣＶエピトープを含むポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を，該ポリペプチドを発現させる条件下でインキュベートすること，を包含する生産方法；およびこの方法により生産された，ＨＣＶエピトープを含むポリペプチド。
【００２８】
本発明はまた，以下のような方法も包含する：試料中のＨＣＶ核酸を検出する方法であって，該試料の核酸を，ＨＣＶポリヌクレオチドに対するプローブと，該プローブと該試料由来のＨＣＶ核酸との間にポリヌクレオチド二本鎖を形成する条件下で反応させること；および核プローブを含むポリヌクレオチド二本鎖を検出すること，を包含する検出方法。
【００２９】
免疫学的検定法もまた，本発明に包含される。これらの免疫学的検定法には，以下のような工程を包含するＨＣＶ抗原を検出するための免疫学的検定法が包含される：ＨＣＶ抗原を含んでいる疑いのある試料を，検出されるべきＨＣＶ抗原に対するプローブ抗体と共に，抗原−抗体複合体を形成する条件下でインキュベートすること；および該プローブ抗体を含む抗原−抗体複合体を検出すること。以下の工程を包含するＨＣＶ抗原に対する抗体を検出するための免疫学的検定法：抗ＨＣＶ抗体を含んでいる疑いのある試料を，ＨＣＶのエピトープを含むプローブポリペプチドと共に，抗体−抗原複合体を形成する条件下でインキュベートすること；および該プローブ抗原を含む抗体−抗原複合体を検出すること。
【００３０】
本発明には以下のものも包含される：ＨＣＶ感染を処置するためのワクチンであって，ＨＣＶエピトープを含む免疫原性ペプチド，不活性化されたＨＣＶ調製物，または弱毒化されたＨＣＶ調製物を含有するワクチン。
【００３１】
本発明の他の局面は，ＨＣＶに感染した組織培養増殖細胞である。
【００３２】
本発明のさらに他の局面は，ＨＣＶに対する抗体を生産する方法であって，ＨＣＶエピトープを含む単離された免疫原性ポリペプチドを，免疫反応を生ずるのに充分な量で個体に投与することを包含する生産方法である。
【００３３】
本発明のさらに他の局面は，未確認の感染因子のゲノムに由来するｃＤＮＡを単離する方法であって，該方法は以下の工程（ａ）〜（ｆ）を包含する：（ａ）該感染因子に感染した組織から単離された核酸から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含む発現ベクターで形質転換させた宿主細胞を用意し，該ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドを発現する条件下で該宿主細胞を増殖させること；（ｂ）該ｃＤＮＡの発現産物を，該感染因子に感染した個体の抗体含有身体構成部分と，免疫反応を起こす条件下で反応させ，その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること；（ｃ）該工程（ｂ）の抗体−抗原複合体を形成するポリペプチドを発現する宿主細胞を，個々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ，該クローンを単離すること；（ｄ）該工程（ｃ）のクローン由来の細胞を，該ｃＤＮＡ内にコードされたポリペプチドを発現する条件下で増殖させ，該発現産物を，該工程（ａ）の個体以外の個体であって該感染因子に感染している個体の抗体含有身体構成部分および該感染因子に感染していない対照個体と反応させ，その結果として形成される抗体−抗原複合体を検出すること；（ｅ）感染した個体および感染している疑いのある個体の抗体含有身体構成部分から抗体−抗原複合体を形成するが，対照個体の該部分からは抗体−抗原複合体を形成しないポリペプチドを発現する宿主細胞を，個々のクローンとして増殖する条件下で増殖させ，該クローンを単離すること；および（ｆ）該工程（ｅ）の宿主細胞クローンからｃＤＮＡを単離すること。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
発明を実施する方法
Ｉ．定義
「Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）」という用語は，非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の従来知られていなかった病原因子に対して，この分野の研究者が保留していた用語である。従って，本願で用いる場合，「Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）という用語はＮＡＮＢＨの病原因子を意味し，またこのＮＡＮＢＨは，以前にはＮＡＮＢ
および／またはＢＢ−ＮＡＮＢＶと呼ばれていたものである。本願では，ＨＣＶ，ＮＡＮＢＶおよびＢＢ−ＮＡＮＢＶという用語を互換性のある語として使用する。この用語法を拡張して，以前はＮＡＮＢ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼んでいたＨＣＶによって発病する疾患をＣ型肝炎と呼ぶ。本願では，ＮＡＮＢＨとＣ型肝炎という用語を互換性のある語として使用してもよい。
【００３５】
「ＨＣＶ」という用語は，本願で用いる場合，ＮＡＮＢＨを発病させるウイルス種および弱毒化されたウイルス株または後者由来の欠損干渉粒子を意味する。後に述べるように，ＨＣＶゲノムは，ＲＮＡで構成されている。ＲＮＡを含有するウイルスの偶発変異率が比較的高いということが知られており，すなわち約１０−３〜１０−４／ヌクレオチドであると報告されている〔フィールズとナイプ（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｋｎｉｐｅ）１９８６年〕。それ故，後に述べるＨＣＶ種の中には，多くのウイルス株がある。本願記載の組成物と方法によって，種々の関連ウイルス株の増殖，同定，検出および単離を行うことができる。さらに各種ウイルス株に対する診断薬とワクチンを製造することができ，また薬理学的用途の抗ウイルス剤を，ＨＣＶの複製を阻害するということによりスクリーニングすることができる。
【００３６】
本願で提供する情報は，ある種のＨＣＶ株由来のものであり，このウイルス株は以後ＣＤＣ／ＨＣＶ１と呼ぶが，ウイルス分離学者がこの種に属する他のウイルス株を同定するのに充分なものである。本願に記載するように，本願の発明者らは，ＨＣＶがフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）またはフラビ様ウイルス（Ｆｌａｖｉ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ）であることを発見した。フラビウイルス粒子の形態と組成は公知であり，ブリントン（Ｂｒｉｎｔｏｎ，１９８６年）が考察している。形態については，一般にフラビウイルス類は，脂質二重層で覆われた中心ヌクレオカプシドを有している。ビリオンは球形で直径が約４０〜５０ｎｍである。そのコアは直径が約２５〜３０ｎｍである。ビリオンのエンベロープの外面には，直径が約２ｎｍの端末ノブ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｎｏｂ）を有する約５〜１０ｎｍ長の突起を有する。
【００３７】
ＨＣＶは，本願に記載のｃＤＮＡが誘導されるＨＣＶゲノム内のエピトープと免疫学的に同定可能なエピトープをコードするが，このエピトープは本願に記載のｃＤＮＡ内にコードされることが好ましい。このエピトープは，他の公知のフラビウイルス類と比較した場合，ＨＣＶに特有のものである。このエピトープの独自性は，ＨＣＶとの免疫学的反応性と，他のフラビウイルス種との免疫学的反応性の欠如とによって決定することができる。免疫学的反応性を決定する方法は当該技術分野では公知であり，例えば，放射性免疫検定法，ＥＬＩＳＡ法，血球凝集反応法などがあり，分析技術の適切ないくつかの例を本願に示す。
【００３８】
上記に加えて，ウイルス株をＨＣＶとして同定する際に，単独もしくは組合わせて，下記のパラメータを利用することができる。ＨＣＶ株は，進化論的に関連しているので，ヌクレオチドレベルでのゲノムの全相同性は，約４０％以上であり，好ましくは約６０％以上で，さらに好ましくは約８０％以上であり，さらに少なくとも約１３のヌクレオチドの対応する連続配列があると考えられる。推定上のＨＣＶ株のゲノム配列とＣＤＣ／ＣＨ１  ＨＣＶのｃＤＮＡ配列との同一性は，当該技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば，推定上のＨＣＶ由来のポリヌクレオチドの配列情報と，本願に記載のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列とを直接比較することによって決定することができる。また例えば，相同領域間の安定な二本鎖を形成する条件下（例えば，Ｓ１消化の前に用いられる条件）でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし，次いで一本鎖に特異的なヌクアーゼの一種もしくは複数種で切断し，次に切断によって生成した断片の大きさを測定することによって決定することができる。
【００３９】
ＨＣＶ株の進化的類縁関係のために，推定上のＨＣＶ株は，ポリペプチドのレベルの，その相同性によって同定可能である。一般にＨＣＶ株は，ポリペプチドのレベルで，約４０％以上相同であり，好ましくは約６０％以上，さらに好ましくは８０％以上相同である。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は，当該技術分野で知られている。例えば，アミノ酸配列を直接決定して，本願に示した配列と比較することができる。また例えば，推定上のＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列を決定してもよく（通常，ｃＤＮＡ中間体を介して），これにコードされているアミノ酸配列は決定可能で，対応する領域を比較することができる。
【００４０】
本願で使用される場合，指定された配列（例えば，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ，特に第１〜４６図に例示した配列）か，またはＨＣＶゲノム「由来」のポリヌクレオチドは，少なくとも約６個の対応するヌクレオチド配列からなり，好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド，さらに好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド，さらに好ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチドの配列からなる対応するポリヌクレオチド配列を意味する。つまり，これらのヌクレオチドは，指定されたヌクレオチド配列の領域に相同か，または相補的である。上記ポリヌクレオチドが誘導される領域の配列は，ＨＣＶゲノムに特有の配列に相同または相補的であるのが好ましい。一つの配列がＨＣＶゲノムに特有のものであるか否かは当業者に公知の技術で決定することができる。例えば，その配列を，データバンク，例えばジーンバンク（ｇｅｎｅｂａｎｋ）の配列と比較して，未感染の宿主または他の生物に存在するか否かを決定する。またその配列は，公知の配列を有する他のウイルス因子，すなわち，肝炎，例えば，ＨＡＶ，ＨＢＶおよびＨＤＶを誘発することが知られているウイルス因子，ならびにフラビウイルス科のウイルス（Ｆｒａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）の他のメンバーと比較することもできる。また，誘導された配列が他の配列と一致しているかまたは一致していないかは，適切な厳密条件下でハイブリダイゼーションさせることによって決定することができる。核酸の配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は，当該技術分野で公知であり，後に検討する。例えば，マニアチスら（ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８２年）の文献を参照せよ。さらにハイブリダイゼーションによって形成された，不適正な二本鎖のポリヌクレオチドも公知の方法で決定することができ，この方法には，例えば，Ｓ１のようなヌクレアーゼによって，二本鎖のポリヌクレオチドの一本鎖領域を特異的に切断する方法がある。代表的なＤＮＡ配列が「誘導される」領域は，例えば，特異的なエピトープをコードする領域および転写されない領域および／または翻訳されない領域を含むが，これに限定されるものではない。
【００４１】
誘導されたポリヌクレオチドは，必ずしも，提示されたヌクレオチド配列が物理的に誘導されるとは限らず，いずれの方法で生成されていてもよい。例えば，化学合成法，ＤＮＡ複製法，逆転写法または転写法が挙げられ，これらの方法は，ポリヌクレオチドが誘導される一種もしくは複数の領域内の塩基配列が提供する情報に基づいて実施される。さらに，指定された配列の領域に対応する領域の組合わせは，当該技術分野で公知の方法で改変され，意図する用途に合致させることができる。
【００４２】
同様に，指定された核酸の配列（例えば，第１〜４６図に示す配列）またはＨＣＶゲノム「から誘導された」ポリペプチドもしくはアミノ酸配列は，上記の配列にコードされているポリペプチドのアミノ酸配列もしくはその一部分の配列（少なくとも３〜５のアミノ酸，好ましくは少なくとも８〜１０のアミノ酸，さらに好ましくは少なくとも１１〜１５のアミノ酸で構成された部分）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド，または上記の配列にコードされているポリペプチドと免疫学的に同定しうるポリペプチドを意味する。
【００４３】
組換え体ポリペプチドもしくは誘導されたポリペプチドは，指定された核酸配列（例えば第１〜３４図に示す配列），またはＨＣＶゲノムから必らずしも翻訳される必要はなく，例えば化学合成法もしくは組換え体発現系の発現もしくは変異ＨＣＶからの単離を含むいずれの方法でも生成され得る。
【００４４】
本願で用いる「組換え体ポリヌクレオチド」という用語は，ゲノム，ｃＤＮＡ，半合成もしくは合成の起源のポリヌクレオチドを意味し，その起源もしくは操作によって，（１）天然もしくはライブラリーの形態でポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と連結していないもの，および／または（２）天然にポリヌクレオチドが連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されているのを意味する。
【００４５】
本願で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は，任意の長さを持ったポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）を意味する。この用語は，分子の一次構造のみを意味する。したがって，この用語には，二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡ，および二本鎖と一本鎖のＲＮＡが含まれる。またこの用語には，例えばメチル化反応および／またはキャッピングによって修飾された形態のポリヌクレオチドと，未修飾のポリヌクレオチドが含まれる。
【００４６】
本願で用いる「ｃＤＮＡに対応する配列を有するＨＣＶ」という用語は，そのＨＣＶが指定されたＤＮＡの配列と相同もしくは相補的な関係にあるポリヌクレオチド配列をもっていることを意味し，ｃＤＮＡに対する相同性もしくは相補性の程度は，約５０％以上，好ましくは少なくとも約７０％，さらに好ましくは少なくとも約９０％である。対応する配列は，長さが，少なくとも約７０のヌクレオチド，好ましくは少なくとも約８０のヌクレオチド，さらに好ましくは少なくとも約９０のヌクレオチドである。ＨＣＶの配列とｃＤＮＡとの対応は，当該技術分野で公知の方法で決定することができ，例えば配列された物質と記載されたｃＤＮＡとを直接比較すること，またはハイブリダイゼーションし，一本鎖ヌクレアーゼで切断し，切断により生成した断片の大きさを測定するという方法がある。
【００４７】
「精製されたウイルスポリヌクレオチド」という用語は，ＨＣＶゲノムもしくはその断片を意味し，この断片は，本質的に遊離の形態で，すなわち，ウイルスのポリヌクレオチドが自然に連結されているポリヌクレオチドの約５０％未満，好ましくは約７０％未満，さらに好ましくは約９０％未満を含有している。ウイルス粒子からウイルスポリヌクレオチドを精製する方法は，当該技術分野で知られており，例えば，ウイルス粒子をカオトロピック剤で破壊する方法，およびイオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，および密度による遠心沈降法によってポリヌクレオチドとポリペプチドを分離する方法がある。
【００４８】
「精製されたウイルスポリペプチド」という用語は，ＨＣＶポリペプチドもしくはその断片を意味し，その断片は，本質的に遊離の形態で，ウイルスポリペプチドが天然に連結されている細胞成分の，約５０％未満，好ましくは約７０％未満，さらに好ましくは約９０％未満を含有している。ウイルスポリペプチドを精製する技術は当該技術で公知であり，この技術の例については後に考察する。
【００４９】
単細胞因子として培養される微生物もしくは高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」，「宿主細胞」，「細胞」，「細胞系」，「細胞培養物」などの用語は，組換え体ベクターもしくは他の転移ＤＮＡの受容体として使用可能か，または使用されてきた細胞を意味し，トランスフェクトされた元の細胞の後代が含まれる。単一の親細胞の後代は，偶発的または計画的な変異によって，形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補性が元の親細胞と，必らずしも完全に同一ではない。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するような適切な性質によって特徴づけられ，親細胞に充分類似している親細胞の後代は，上記定義の意味する後代に含まれ，上記用語で扱われる。
【００５０】
「レプリコン」は，遺伝要素であって，例えばプラスミド，染色体，ウイルスが含まれ，細胞内でポリヌクレオチドの複製の自律的な単位として挙動し，すなわち自ら制御しながら複製を行うことができる。
【００５１】
「ベクター」は，他のポリヌクレオチドのセグメントが結合しているレプリコンであって，複製を行い，および／または結合しているセグメントを発現する。
【００５２】
「制御配列」は，ある種のポリヌクレオチド配列を意味し，この配列が連結している，コード配列を発現するのに必要なものである。このような制御配列の性質は，宿主の生物によって異なり，このような制御配列には，原核細胞内では一般に，プロモーター，リボソーム結合部位およびターミネーターが含まれ，真核細胞内では一般に，プロモーター，ターミネーターおよびある場合にはエンハンサーが含まれる。「制御配列」という用語は，最小限発現に必要なすべての要素を包含し，さらに発現に有利な追加の要素，例えばリーダー配列を包含し得る。
【００５３】
「作動可能に連結された」という用語は，上記のような要素が，意図した方法で機能しうるような関係に並置されていることを意味する。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は，制御配列に適合した条件下でコード配列の発現が達成されるように，連結される。
【００５４】
「読み取り枠」（ＯＲＦ）は，ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり，この領域は，コード配列の一部またはコード配列全体を意味する。
【００５５】
「コード配列」は，適切な調節配列の制御下に置かれた場合に，ｍＲＮＡに転写され，および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は，５’末端の翻訳開始コドンと，３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は，ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡおよび組換え体ポリヌクレオチド配列を包含するが，これらに限定されるものではない。
【００５６】
「免疫学的に…と同定可能な」という用語は，指定されたポリペプチド（通常はＨＣＶタンパク）内に存在し，かつそのタンパクに特有であるエピトープおよびポリペプチドが存在することを意味する。免疫学的な同一性は，抗体の結合および／または結合における競争によって決定されるが，この技術は当業者には知られていることであり，後述する。エピトープの独自性も，エピトープをコードするポリヌクレオチド配列について，公知のデータバンク（例えば，ジーンバンク）をコンピュータで調査し，他の公知のタンパクとアミノ酸配列を比較することによって決定することができる。
【００５７】
本願で用いる“エピトープ”という用語は，ポリペプチドの抗原決定基を意味し，エピトープは，エピトープに特有の立体配置で３個のアミノ酸を含有し得るが，エピトープは，一般に少なくとも５個のこのようなアミノ酸で構成され，より一般的には少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸で構成されている。アミノ酸の立体配置の決定法は，当該技術分野では公知であり，例えば，Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴法がある。
【００５８】
ポリペプチドは，これに含まれている特異的なエピトープが抗体を認識することによって，抗体と結合する場合，抗体と「免疫学的に反応性がある」。免疫学的反応性は，抗体結合反応，特に抗体結合反応の速度論，および／または抗体が指向しているエピトープを含有する公知のポリペプチドを，競争者として用いる結合競争法によって決定される。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応性であるか否かを決定する方法は，当該技術分野で公知である。
【００５９】
本願に用いる場合，「ＨＣＶエピトープを含有する免疫原性を有するポリペプチド」という用語には，自然に発生するＨＣＶポリペプチドもしくはその断片，および他の手段（例えば，化学合成法または組換え体生物内でのポリペプチドの発現）によって調製されるポリペプチドが包含される。
【００６０】
「ポリペプチド」という用語は，アミノ酸の分子鎖を意味し，特定の長さの生産物を意味しない。したがってポリペプチドの定義には，ペプチド，オリゴペプチドおよびタンパクが包含される。またこの用語は，ポリペプチドの発現後修飾物，例えば，グリコシル化物，アシル化物，リン酸化物などを意味しない。
【００６１】
本願で用いる「形質転換」という用語は，外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することを意味し，挿入法はどんな方法でもよく，例えば，直接取込み法，形質導入法またはｆ−交配法がある。外因性ポリヌクレオチドは，組込まれていないベクター，例えば，プラスミドとして保持されるか，または代わりに宿主ゲノムに組込まれてもよい。
【００６２】
本願で用いる「処理」という用語は，予防および／または治療を意味する。
【００６３】
本願で用いる「個体」という用語は，脊椎動物，特に哺乳動物種のメンバーを意味し，家畜，競技用動物，霊長動物およびヒトを含むが，これに限定されるものではない。
【００６４】
本願で用いる場合，核酸の「正鎖」は，ポリペプチドをコードする配列を含有している。また「負鎖」は，「正鎖」の配列を相補する配列を含有している。
【００６５】
本願で用いる，ウイルスの「正鎖ゲノム」は，ＲＮＡまたはＤＮＡにかかわらず，一本鎖のゲノムであり，ウイルスのポリペプチドをコードする。正鎖のＲＮＡウイルスの例としては，トガウイルス科ウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ），コロナウイルス科ウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ），レトロウイルス科ウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ），ピコルナウイルス科ウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａ−ｖｉｒｉｄａｅ）およびカリチウイルス科ウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）がある。またフラビウイルス科ウイルスも含まれるが，これは以前にトガウイルス科に分類されていた〔フィールドとナイプの文献（１９８６年）を参照〕。
【００６６】
本願で用いる「抗体を含有する身体成分」は，問題の抗体の起源である個体の身体の成分を意味する。抗体を含有する身体成分は，当該技術分野で知られており，例えば，血漿，血清，脊髄液，リンパ液，呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外部セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ），涙，唾液，乳，白血球および骨髄腫細胞が含まれるが，これに限定されるものではない。
【００６７】
本願で用いる「精製されたＨＣＶ」は，ウイルスが通常連結されている細胞構成要素および感染組織中に存在する他の種のウイルスから単離されたＨＣＶの製剤を意味する。ウイルスを単離する技術は，当業者には知られており，例えば，遠心分離法およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが，精製ＨＣＶの製法については後述する。
【００６８】
ＩＩ．発明の構成
本発明の実施においては，特に指示されない限り，当該分野で既知である分子生物学，微生物学，組み換えＤＮＡ，および免疫学の従来の手法が採用される。このような手法は，文献中に充分に説明されている。例えば，次の文献を参照されたい：Ｍａｎｉｓｔｉｓ，ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＩＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９８２）；ＤＮＡＣＬＯＮＩＮＧ，Ｉ  巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編集，１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集，１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集，１９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  および  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集，１９８４）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集，１９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集，１９８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ；Ｗｕ編集），ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集（１９８７）；ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ），Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）；ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．），およびＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）。
【００６９】
ここで述べられる前出および後述の特許出願および公報は参考文献としてここに取り入れられている。
【００７０】
本発明の有用な物質および方法は，ＨＣＶ感染チンパンジーの血漿中に存在する核酸配列由来のｃＤＮＡライブラリーから単離されたヌクレオチド配列と非常に相同なヌクレオチド配列群の供給により可能となる。このヌクレオチド配列群はヒトあるいはチンパンジーの起源ではない。なぜなら，このヌクレオチド配列群は，非感染個体から得られるヒトおよびチンパンジーのゲノムＤＮＡのいずれにもハイブリダイズせず，この配列群のヌクレオチドはＨＣＶ感染したチンパンジーの肝臓および血漿にのみ存在し，そして，この配列は遺伝子バンクには存在しないからである。さらに，この配列群は，ＨＢＶゲノム内に含有される配列に有意な相同性を示さない。
【００７１】
クローン５−１−１内に含有されるこの群のある配列は，およそ５０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする１つの連続的なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。ＨＣＶ感染者から得られた血清にはこのポリペプチドに結合する抗体が含有されている一方，非感染者から得られた血清には，このポリペプチドに対する抗体が含有されない。最終的に非感染チンパンジーから得られた血清には，このポリペプチドに対する抗体が含有されないが，この抗体は，急性ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーにおいて誘導される。さらに，このポリペプチドに対する抗体はＨＡＶおよびＨＢＶに感染したチンパンジーおよびヒトにおいては検出されない。これらの基準によると，この配列はウイルスの配列に対するｃＤＮＡであり，このウイルスにより生じ，ＮＡＮＢＨと関連する配列である。このｃＤＮＡ配列を第１図に示す。後述のように，クローン５−１−１におけるｃＤＮＡ配列は，単離された他のｃＤＮＡ（さらに２８個の塩基対を含有する）とは異なる。
【００７２】
他の同定されたＤＮＡ群（これらは，クローン５−１−１におけるｃＤＮＡの断片と同等な合成配列をプローブとして用い，単離された）との複合配列を第３図に示す。クローン８１におけるｃＤＮＡ由来の合成配列を用いて単離されたｃＤＮＡ群の構成要素を第５図に示し，クローン８１の配列とこの配列との複合配列を第６図に示す。ｃＤＮＡ群の他の構成要素は，クローン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，および３３ｇ，および３９ｃに存在する配列を含み，これらは，ＩＶ．Ａ節で詳細に説明される。これらクローン中のｃＤＮＡ複合配列はＩＶ．Ａ．１８節で詳細に説明されており，第２９〜３４図に示される。ｃＤＮＡ複合配列はひとつの連続したＯＲＦを含有し，従って，ポリタンパクをコードしていることが示される。このデータは，後に考察されるように，ＨＣＶがフラビウイルスあるいはフラビ様ウイルスであるという示唆と一致する。
【００７３】
第１図〜第４６図に包括して示すｃＤＮＡ群が入手可能となるため，ＤＮＡプローブの構築およびポリペプチドを得ることが可能となる。上記ポリペプチドは，ＨＣＶ感染によるＮＡＮＢＨの診断において，そして，供血者，供給された血液および血液産物が感染しているか否かについてスクリーニングすることにおいて，有用である。例えば，この配列から，約８〜１０個あるいはそれより長いヌクレオチドを有するＤＮＡオリゴマーを合成することが可能である。このＤＮＡオリゴマーは，例えばウイルスを保有している疑いがある被験者血清におけるウイルスゲノムの存在を検出するための，あるいは供給された血液についてウイルスの存在の有無をスクリーニングするための，ハイブリダイゼーションプローブとして，有用である。ｃＤＮＡ配列の群によりまた，ＮＡＮＢＨにおいて生じる抗体の存在を検出する診断用試薬として有用なＨＣＶに特異的なポリペプチドの設計および産生が可能となる。ｃＤＮＡ由来の精製ポリペプチドに対する抗体は感染個体および血液中のウイルス抗原を検出するためにも用いられ得る。
【００７４】
これらのｃＤＮＡ配列の知識により，ＨＣＶに対するワクチンとしてそして抗体産生のためにも用いられ得る，ポリペプチドの設計および調製が可能となる。そしてこのポリペプチドは，次に，ＨＣＶ疾患に対する保護および／またはＨＣＶ感染個体の治療に用いられ得る。
【００７５】
さらに，ｃＤＮＡ配列群によりＨＣＶゲノムを，より特徴づけることを可能にする。これらの配列から得られたポリヌクレオチドプローブは，重複している付加的なｃＤＮＡ配列についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられ得，このｃＤＮＡ配列はさらに，重複している別の配列を得るためにも用いられ得る。ゲノムが分割されており，そのセグメントが共通配列を欠いている限り，この手法はゲノム全体の配列を得るために用いられ得る。しかし，ゲノムが分割されているならば，ゲノムの他のセグメントは，ここで述べられているｃＤＮＡクローンを単離するために用いられたλ−ｇｔ１１の血清学的なスクリーニング工程を繰り返すことにより，あるいは，精製ＨＣＶ粒子からのゲノムを単離することにより得られ得る。
【００７６】
ｃＤＮＡ配列群およびこれら配列由来のポリペプチド，そして，これらペプチドに対する抗体もまた，ＢＢ−ＮＡＮＢＶ因子の単離および同定に有用である。例えば，ｃＤＮＡ由来のポリペプチドに含まれるＨＣＶエピトープに対する抗体は，アフィニティークロマトグラフィーをもとにした工程で，ウイルスを単離するために用いられ得る。あるいは，この抗体は他の手法により単離されたウイルス粒子を同定するために用いられ得る。単離されたウイルス粒子のウイルス抗原およびゲノム物質が，さらに特徴づけられ得る。
【００７７】
ＨＣＶゲノムをさらに配列決定することによって得られる情報により，およびＨＣＶ抗原がさらに特徴づけられ，ゲノムが特徴づけられることにより，付加的なプローブおよびポリペプチド，そして抗体の設計および合成が可能となる。これらは，ＨＣＶ誘発ＮＡＮＢＨの診断，予防，および治療に，そして感染血液および血液関連産物のスクリーニングに用いられ得る。
【００７８】
抗原および抗体を含むＨＣＶのプローブ，およびｃＤＮＡ群が誘導されるゲノム由来のポリヌクレオチドが利用可能であることにより，ＨＣＶの生物的性質を明らかにするにあたり主として用いられる組織培養系の発達が可能となった。このことにより，ＨＣＶ複製，あるいはＨＣＶ感染を選択的に阻害する抗ウイルス化合物に基づいた新しい治療法が開発され得る。
【００７９】
ＮＡＮＢＨの病因因子を同定および単離するために用いられる本法は新規であり，次のような今までに特徴づけられていない因子の同定および／または単離に適用され得る。上記因子はゲノムを含有し，ウイルス，ウィロイド，細菌類，菌類，および寄生虫によって引き起こされる疾患を包含するさまざまな疾患に関連する因子である。この方法ではｃＤＮＡライブラリーが，感染個体から得られる感染組織中に存在する核酸から，調製された。このライブラリーは，ｃＤＮＡをコードするポリペプチドを発現し得るベクター中に調製された。ベクターを含む宿主細胞のクローンは，病因因子のポリペプチドの免疫反応性断片を発現し，これは，推定される因子に以前に感染した別の個体由来の抗体含有体成分を有するこのライブラリーの発現産物を免疫学的にスクリーニングすることによって選択される。免疫学的なスクリーニング法における工程は，次の工程を包含していた：ベクターを含むｃＤＮＡの発現産物と，二次的に感染した個体の抗体含有体成分とを相互作用させる工程；および発現産物と二次感染個体の抗体との間の抗原−抗体複合配列の形成を検出する工程。単離されたクローンはさらに次のようにして免疫学的にスクリーニングされる：発現産物を，推定される因子に感染した他の個体および推定される因子に感染していない対照の個体の抗体含有体成分と相互に作用させること，および，感染個体由来の抗体との抗原−抗体複合配列の形成を検出すること。そして，感染個体および該因子に感染している疑いのある個体由来の抗体と免疫学的に反応するが，対照の個体由来のものとは反応しないポリペプチドをコードするｃＤＮＡ含有ベクターが，単離される。ｃＤＮＡライブラリーの構築および免疫学的なスクリーニングに用いた感染個体は同種である必要はない。
【００８０】
本法により単離されたＤＮＡ発現産物，そして該発現産物に対する抗体は，病因因子の特徴づけおよび／または捕捉に有用である。さらに，詳細に後述するように，この方法は，ＨＣＶゲノム由来のｃＤＮＡ群を単離するために，好適に利用される。
【００８１】
ＩＩ．Ａ．ｃＤＮＡ配列の調製
慢性ＨＣＶ感染チンパンジー由来の貯留血清であって，ウイルスを高力価で，つまり少なくとも１０６チンパンジー感染量／ｍｌ（ｃｈｉｍｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｄｏｓｅｓ／ｍｌ；ＣＩＤ／ｍｌ）を有する血清を，ウイルス粒子を単離するために用いた。そして，このウイルス粒子から単離した核酸を，ウイルスゲノムに対するｃＤＮＡライブラリーの構築においてテンプレートとして用いた。推定ＨＣＶ粒子の単離およびλ−ｇｔ１１におけるｃＤＮＡライブラリーの構築のための手順は，ＩＶ．Ａ．１節で考察されている。λ−ｇｔ１１は，β−ガラクトシダーゼを有する融合ポリペプチドとして挿入ｃＤＮＡを発現するために，そして，特定の抗原に対して生じた特異的な抗血清で多数の組み換え体ファージをスクリーニングするために，特に開発されたベクターである。およその平均サイズが２００塩基対のｃＤＮＡを有するｃＤＮＡプールからのλ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーが以前にＮＡＮＢ肝炎にかかったことのある患者由来の血清に特異的に結合し得るようなコードされたエピトープについてスクリーニングされた。Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．Ｖ．ら（１９８５）。約１０６個のファージがスクリーニングされ，５個の陽性ファージが同定，精製され，次に，ＨＣＶ因子に以前に感染した異なるヒトおよびチンパンジーから得た血清に対する結合の特異性がテストされた。このファージの１つである５−１−１が，テストしたヒト血清８個のうちの５個と結合した。７個の正常血清はこのような結合を示さなかったので，この結合は以前にＮＡＮＢ肝炎にかかった患者由来の血清に選択的であるらしい。
【００８２】
組換え体ファージ５−１−１におけるｃＤＮＡ配列が，決定され，それは第１図に示される。このクローン化されたｃＤＮＡによってコードされたポリペプチドは，融合ポリペプチドのＮ末端β−ガラクトシダーゼ部分として同一の翻訳枠内にあり，その配列は，該ヌクレオチド配列の上に示される。従って，翻訳ＯＲＦは，ＮＡＮＢ肝炎に感染した患者由来の血清によって特別に認識されるエピトープをコードする。
【００８３】
組換えファージ５−１−１においてｃＤＮＡが利用できるため，ウイルスゲノムに対するｃＤＮＡの付加的な断片および／または他の断片を有する他のクローンを単離することが可能となる。前出のλ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーは，クローン化された５−１−１ｃＤＮＡ配列由来の合成ポリヌクレオチドを用いてスクリーニングされた。このスクリーニングにより，８１，１−２，および９１として同定された３個の他のクローンが得られた。これらのクローン内にあるｃＤＮＡが配列決定された。ＩＶ．Ａ．３節およびＩＶ．Ａ．４節を参照されたい。４個の独立したクローン間の相同性を第２図に示す。第２図では相同性が縦線により示されている。クローン５−１−１，８１，および９１において独特のヌクレオチド配列を小文字で示す。
【００８４】
クローン５−１−１，８１，１−２，および９１における組換え体ファージにクローン化されたｃＤＮＡは，相同性が高く，わずかに２個の領域において異なるにすぎない。第一に，クローン１−２の６７番目のヌクレオチドはチミジンである一方，他の３個のクローンは，この位置にシチジンを有する。しかし，この置き変えにより，コードされたアミノ酸の性質は変化しない。
【００８５】
この４つのクローンの第２の違いは，クローン５−１−１が，他のクローンには存在しないような２８の塩基対を５’末端に有していることである。この特別な配列はクローニングにより５’末端に人工的に形成されたものである。クローニングにより５’末端に形成される人工的な配列は，通常，ｃＤＮＡ法の生成物中に観察される。クローン８１におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡの５’領域および３’領域由来の合成配列は，
クローン８１  ｃＤＮＡと重複するλ−ｇｔ１１のＮＡＮＢＶｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡのスクリーニングおよび単離に用いられた（ＩＶ．Ａ．５節）。クローン３６およびクローン３２の中にそれぞれ存在する得られたｃＤＮＡ配列は，第５図および第７図に示される。
【００８６】
同様に，クローン３６の５’領域に基づいた合成ポリヌクレオチドは，クローン３６ｃＤＮＡに重複するλ−ｇｔ１１  ＮＡＮＢＶｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡをスクリーニングし単離するのに用いられた（ＩＶ．Ａ．８節）。合成ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズする組換えファージ含有ｃＤＮＡの精製クローンはクローン３５と命名され，このクローンの中に含まれるＮＡＮＢＨｃＤＮＡ配列は第８図に示される。
【００８７】
重複ｃＤＮＡ配列を単離する手法を利用することによって，上流および下流にＨＣＶ  ｃＤＮＡの付加的な配列を有するクローンが得られた。これらクローンの単離はＩＶ．Ａ節で後述する。
【００８８】
単離されたクローン内にコードされたＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の分析により，複合ｃＤＮＡがひとつの長い連続したＯＲＦを有することが示される。第２９〜３４図に，これらのクローンからの複合ＤＮＡ配列を，それによりコードされた推定されるＨＣＶポリペプチドとともに，示す。
【００８９】
ｃＤＮＡ配列を得るための方法の記述は，歴史的に興味深い。得られた配列（およびその相補配列）は本発明により提供され，その配列あるいはその部分的な配列は合成法を用いて，あるいは，合成法と，ここに記載したのと同様の方法を用いた部分配列を得る方法とを組み合わせて，調製される。
【００９０】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーからの，そしてクローン５−１−１，８１，１−２および９１から複製されるλ−ｇｔ１１株は，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２，に，ブダペスト条約により寄託されており，次の受託番号を有する。
λ−ｇｔ１１         ＡＴＣＣ  Ｎｏ．      寄託日
ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリー    ４０３９４            １９８７年１２月  １日
クローン８１                    ４０３８８            １９８７年１１月１７日
クローン９１                    ４０３８９            １９８７年１１月１７日
クローン１−２                  ４０３９０            １９８７年１１月１７日
クローン５−１−１              ４０３９１            １９８７年１１月１８日
本出願が米国特許として許可され発行されると，これら寄託物を利用することに関する制限はすべて最終的に取り除かれる。そして上記命名された寄託物は，３７ＣＦＲ  １．１４および３５ＵＳＣ  １．２２によりコミッショナーによって権利を与えられた上記出願が係属している間は，入手可能である。さらに，その寄託物は，寄託日から３０年間，あるいは寄託物の最終要求から５年間；あるいは，米国特許の有効である期間のいずれか長い方の期間の間，維持される。これらの寄託物およびここで述べられている寄託物は便宜のためにのみ寄託されたものであり，ここでの記載された内容により本発明を実施することを意図していない。すべての寄託物におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，参考として，ここに述べられている。
【００９１】
ＨＣＶ  λ−ｇｔ１１ライブラリーからの重複ｃＤＮＡ配列を単離することによりゲノムを「ウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）」する上記記載により，全ＨＣＶゲノムに対するｃＤＮＡを単離し得る方法が提供される。しかし，本明細書で提供される情報が与えられたとしても，これらのｃＤＮＡを単離する他の方法は当業者には自明である。そのような方法のいくつかはこの後のＩＶ．Ａ節で述べられる。
【００９２】
ＩＩ．Ｂ．ウイルス性ポリペプチドおよびフラグメントの調製
第１〜４６図のｃＤＮＡ配列を利用して，後述のように単離されたｃＤＮＡ配列であっても，これらの図のｃＤＮＡ配列であっても，このようなｃＤＮＡ配列を利用し得るため，いずれかの鎖においてコードされているポリペプチドの抗原的に活性な領域をコードする発現ベクターの構築が可能となる。これらの抗原的に活性な領域はコートまたはエンベロープ（外被）抗原，あるいはコア抗原由来であり得，それには例えば，ポリヌクレオチド結合タンパク，ポリヌクレオチドポリメラーゼ，およびウイルス粒子の複製および／または構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に必要とされる他のウイルス性タンパクが包含される。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは従来の制限消化を用いてあるいは合成法により，ｃＤＮＡクローンから誘導され，例えばタンパクβ−ガラクトシダーゼあるいはスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）（好ましくはＳＯＤ）のような融合配列の一部を有するベクター中に連結される。ＳＯＤの融合配列を有するポリペプチドの産生に有用な方法およびベクターは，１９８６年１０月１日に公開されたヨーロッパ特許出願公開番号第０１９６０５６号に記載されている。ＳＯＤおよびＨＣＶポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするベクター（つまりＮＡＮＢ５−１−１，ＮＡＮＢ８１およびＣ１００−３；ＨＣＶ  ｃＤＮＡの複合配列中にコードされている）は，それぞれＩＶ．Ｂ．１，ＩＶ．Ｂ．２，およびＩＶ．Ｂ．４節に記載されている。どちらのセンス鎖においても，オープンリーディングフレームを有するＨＣＶ  ｃＤＮＡの所望の部分は，成熟タンパクあるいは融合タンパクのような組換えポリペプチドとして得られる。あるいは，このｃＤＮＡにコードされるポリペプチドは，化学合成により供給され得る。
【００９３】
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは，融合型であっても成熟型であっても，分泌を可能にするシグナル配列を有していてもいなくても，適当な宿主に適した発現ベクターに組み込まれ得る。真核生物および原核生物の両宿主が，組換えポリペプチドを形成するために現在用いられている。より一般的な制御系および宿主細胞系を，後述のＩＶ．Ａ節にまとめて示す。このポリペプチドは，次に，溶解した細胞あるいは培地から単離され，実際の使用に必要な程度にまで精製される。精製には，当該分野で公知の手法が用いられ得，それには例えば，塩分画，イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，遠心分離などがある。例えば，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの種々のタンパク精製法を参照されたい。このようなポリペプチドは，診断用として用いられ得るか，あるいは抗体を中和するようなポリペプチドはワクチンに処方され得る。これらのポリペプチドに対して生じた抗体もまた，診断薬として，あるいは受動免疫治療に用いられ得る。さらに，後述のＩＩ．Ｊ節で考察するように，これらポリペプチドに対する抗体は，ＨＣＶ粒子の単離および同定に有用である。
【００９４】
このＨＣＶ抗原はまた，ＨＣＶビリオンから単離され得る。このビリオンは，組織培養物中のＨＣＶ感染細胞，あるいは感染宿主中で増殖し得る。
【００９５】
ＩＩ．Ｃ．抗原性ポリペプチドの調製およびキャリアとの結合
ポリペプチドの抗原性領域は，通常は比較的小さく，代表的には８〜１０個あるいはそれを下まわる長さのアミノ酸である。せいぜい５個のアミノ酸フラグメントが抗原性領域を特徴づけている。これらのセグメントは，ＨＣＶ抗原領域に対応する。従って，このＨＣＶのｃＤＮＡを基本的に用いると，ＨＣＶポリペプチドの短いセグメントをコードするＤＮＡは，融合タンパクとして，あるいは単離ポリペプチドとして，組換え手法により発現させることができる。さらに，短いアミノ酸配列は，化学合成で都合よく得ることができる。合成ポリペプチドが正しいエピトープを提供するために正しく形成されているが，小さすぎて免疫原性がない場合には，このポリペプチドは，適当なキャリアと結合させることができる。
【００９６】
このような結合を得るための多くの手法が当該分野では公知であり，それにはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手されるＮ−サクシイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびサクシイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボネート（ＳＭＣＣ）を用いてジスルフィド結合を形成する方法が包含される（もしこのペプチドがスルフヒドリル基を欠いていれば，システイン残基を付加することにより，この方法が用いられ得る）。これらの試薬は，その試薬自身とあるタンパクのペプチドのシステイン残基との間のジスル
フィド結合，およびリジンのε−アミノ，あるいはその他の遊離のアミノ基によるアミド結合を生成する。このようなさまざまなジスルフィド／アミド形成試薬は公知である。例えば，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９８２）６２：１８５を参照されたい。他の二官能性カップリング試薬は，ジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形成する。これらのチオ−エーテル生成試薬の多くは市販されており，それには６−マレイミドカプロン酸，２−ブロモ酢酸，２−ヨード酢酸，４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルが包含される。このカルボキシル基は，そのカルボキシル基とコハク酸イミドとを，あるいは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩とを組み合わせることによって活性化される。上述の化合物の名称は，それが全てであることを意味せず，その化合物の修飾物もまた明らかに用いられ得る。
【００９７】
キャリアとしては，それ自身が宿主に対して有害な抗体の産生を誘導しないものであれば，いずれのキャリアもが用いられ得る。適当なキャリアは，典型的には，大きく，ゆっくり代謝される高分子物質であり，それには例えば，タンパク；ラテックス機能付与セファロース，アガロース，セルロース，セルロースビーズなどの多糖体；ポリグルタミン酸，ポリリジンなどのような重合アミノ酸；アミノ酸共重合体；および不活性ウイルス粒子がある（例えば，ＩＩ．Ｄ節を参照のこと）。特に有用なタンパク基質には，血清アルブミン，キーホールリンペットヘモシアニン，免疫グロブリン分子，サイログロブリン，オボアルブミン，テタヌス毒素，および当業者に公知の他のタンパクがある。
【００９８】
ＩＩ．Ｄ．ＨＣＶエピトープを有するハイブリッド粒子免疫原の調製
ＨＣＶのエピトープの免疫原性はまた，粒子形成タンパク（例えば，Ｂ型肝炎の表面抗原と結合するタンパク）と融合もしくは結合させた哺乳動物の系あるいは酵母の系で調製することによって増強される。ＮＡＮＢＶエピトープが粒子形成タンパクコード配列に直接結合している構築物は，ＨＣＶエピトープに関して免疫原性のハイブリッドを産生する。さらに，調製したすべてのベクターはＨＢＶに特異的なエピトープを有し，例えばプレＳペプチドのように異なる度合の免疫原性を有する。このように，ＨＣＶ配列を有する粒子形成タンパクから構築される粒子は，ＨＣＶおよびＨＢＶに関して免疫原性である。
【００９９】
肝炎の表面抗原（ＨＢＳＡｇ）は，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，（１９８２）），および例えば哺乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｐ．ら，（１９８４））において形成され，結合して粒子となることが示されている。このような粒子の形成は，単量体のサブユニットの免疫原性を増強することが示されてきた。この構築物はまた，ＨＢＳＡｇの免疫的に優性なエピトープを有し，それはプレ表面（プレＳ）領域の５５アミノ酸を含有する（Ｎｅｕｒａｔｈら，（１９８４））。酵母中に発現され得るプレＳ−ＨＢＳＡｇ粒子の構築物は，ヨーロッパ特許出願公開第１７４，４４４号（１９８６年３月１９日公開）に開示されている。酵母の発現のための異種ウイルス配列を有するハイブリッドは，ヨーロッパ特許出願公開第１７５，２６１号（１９６６年３月２６日公開）に開示されている。これらの出願の出願人は本出願人と同一であり，参考としてここに取り入れられている。
【０１００】
これらの構築物もまた，ＳＶ４０のジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞中で発現させることができる（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４））。
【０１０１】
さらに，粒子形成タンパクをコードする配列の部分は，ＨＣＶエピトープをコードするコドンで置き換えられ得る。この置き換えにおいては，酵母あるいは哺乳動物中で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒介するために必要とされない部分は削除され得，このようにして，ＨＣＶエピトープと競合する部分から付加的なＨＢＶ抗原部位が除去される。
【０１０２】
ＩＩ．Ｅ．ワクチンの調製
ワクチンは，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の免疫原性ポリペプチドおよび第１〜４６図のｃＤＮＡ配列由来の免疫原性ポリペプチド，あるいはこれらが対応するＨＣＶゲノム由来の免疫原性ポリペプチドの１種あるいはそれ以上から調製される。ＨＣＶおよびフラビウイルスの間に観察される相同性は，ワクチンとして最も有効でありそうなポリペプチドと，それらがコードされているゲノム領域に関する情報を提供する。フラビウイルスゲノムの一般的な構造は，Ｒｉｃｅら（１９８６）により考察されている。こフラビウイルスのゲノムＲＮＡは，ウイルス特異的ｍＲＮＡ種のみであると考えられ，これは，３つのウイルスの構造タンパク（つまり，Ｃ，ＭおよびＥ），そして，２つの大きな非構造タンパク（ＮＶ４およびＮＶ５）およびより小さな非構造タンパクの複合体の対に翻訳される。フラビウイルスの主要な中和エピトープは，Ｅ（外被：ｅｎｖｅｌｏｐｅ）タンパクに属することは公知である（Ｒｏｅｈｒｉｇ（１９８６））。対応するＨＣＶＥ遺伝子およびポリペプチドをコードする領域は，フラビウイルスに対する相同性に基づいて，予想され得る。このように，ワクチンは，ＨＣＶＥのエピトープを有する組換えポリペプチドを含有し得る。これらのポリペプチドは，細菌，酵母，あるいは哺乳動物細胞において発現するか，あるいは，ウイルス調製物から単離され得る。他の構造タンパクもまた，保護抗ＨＣＶ抗体を生じるエピトープを有し得ることが予期される。このように，Ｅ，Ｃ，およびＭのエピトープを有するポリペプチドもまた，単独であるいは組み合わせて，ＨＣＶワクチン中で用いられ得る。
【０１０３】
上記に加えて，ＮＳ１（非構造タンパク１）で免疫すると黄熱病から保護されることが示されている（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら（１９８６））。たとえ，その免疫により中和抗体が生じないとしてもこのことは正しい。このように，特に，このタンパクはフラビウイルスの間で高い度合で保持されるらしいので，ＨＣＶＮＳ１もまた，ＨＣＶの感染に対して保護作用を有するようである。さらに，たとえ非構造タンパクが中和抗体の産生を行わないとしても，非構造タンパクは，ウイルスの病原性に対して保護作用を提供し得ることもまた示される。
【０１０４】
上記の見解においては，ＨＣＶに対する多価のワクチンは１あるいはそれ以上の構造タンパク，および／または１あるいはそれ以上の非構造タンパクを含有し得る。これらのワクチンは，例えば，組換えＨＣＶポリペプチドおよび／またはビリオンから単離されたポリペプチドを含有し得る。さらに，ワクチンにおける不活性化ＨＣＶの使用を可能にする。不活性化は，ウイルス溶解物の調製によるか，あるいはフラビウイルスの不活性化を引き起こす当該分野で公知の他の方法（例えば，有機溶媒あるいは界面活性剤での処理，あるいはホルマリンでの処理）により行われ得る。さらに，ワクチンはまた，弱毒化ＨＣＶ株からも調製され得る。弱毒化ＨＣＶ株の調製は，後述される。
【０１０５】
フラビウイルスにおけるタンパクのいくつかは高度に保持された領域を有することは公知であり，従って，いくつかの免疫学的交差反応性がＨＣＶと他のフラビウイルスとの間に予想される。フラビウイルスとＨＣＶとの共有のエピトープは，これら病原因子によって引き起こされる１あるいはそれ以上の障害に対する保護抗体を生じる可能性がある。このように，この認識に基づく多目的ワクチンを設計することができる。
【０１０６】
活性成分として免疫原性のポリペプチドを含有するワクチンの調製は，当業者に公知である。代表的には，このようなワクチンは，液体溶液あるいは懸濁液のいずれかとして，注射できるように調製される。注射の前に液体に溶解あるいは懸濁させるのに適当な固形物の形態としても調製され得る。この調製物はまた，乳化することもでき，あるいは，リポソームにカプセル化されるタンパクであってもよい。この活性免疫原性成分は，薬学的に受容され得，この活性成分と適合性のある賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤としては，例えば，水，生理食塩水，デキストロース，グリセロール，エタノールなど，およびこれらの組み合わせがある。さらに必要に応じて，このワクチンには少量の補助物質が含有され得，それには，補湿剤あるいは乳化剤，ｐＨ緩衝剤，および／またはこのワクチンの効果を増強するアジュバントがある。効果的なアジュバントの例としては，次の物質があり，そしてこれらには限定されない：水酸化アルミニウム，Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ），Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７，ｎｏｒ−ＭＤＰとする），Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ，ＭＴＰ−ＰＥとする），およびＲＩＢＩ。上記ＲＩＢＩは細菌から抽出される３つの成分，モノホスホリル脂質Ａ，トレハロースジミコール酸，および細胞壁骨格成分（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ），を，２％スクアレン／トゥイーン８０乳液中に含んでいる。アジュバントの効果は，ＨＣＶ抗原配列を有する免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することによって決定され得る。このポリペプチドは，種々のアジュバントを含むワクチン中のこのポリペプチドを投与することにより生じる。
【０１０７】
このワクチンは，通常，非経口的に注射で投与され，その形態は，例えば，皮下注射であっても筋肉注射であってもよい。他の投与形態に適当な処方には座薬があり，場合によっては経口処方もある。座薬として従来のバインダーおよび担体が用いられ得，それには例えばポリアルキレングリコールあるいはトリグリセリドがある。このような座薬は，活性成分を０．５％〜１０％，好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成される。経口処方物には，通常使用される賦形剤が含有され，そのような賦形剤には例えば，製剤グレードのマンニトール，ラクトース，デンプン，ステアリン酸マグネシウム，サッカリンナトリウム，セルロース，炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は，溶液，懸濁液，錠剤，丸剤，カプセル剤，放出を維持するような処方，あるいは粉剤の形態を有し，活性成分を１０％〜９５％，好ましくは２５％〜７０％の割合で含有する。
【０１０８】
このタンパクは，そのままであるいは塩の形で，ワクチンに処方され得る。薬学的に受容され得る塩には，酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基により形成される）が包含され，この塩は，無機酸（例えば，塩酸あるいはリン酸）あるいは有機酸（例えば酢酸，シュウ酸，酒石酸，マレイン酸など）を用いて形成される。遊離のカルボキシル基により形成される塩は，無機塩基（例えば，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，アンモニア，水酸化カルシウム，あるいは水酸化鉄）および有機塩基（例えば，イソプロピルアミン，トリメチルアミン，２−エチルアミノエタノール，ヒスチジン，プロカインなど）からも誘導され得る。
【０１０９】
ＩＩ．Ｆ．ワクチンの用量および投与
このワクチンは投薬処方に適合するように，そして予防効果および／または治療効果が得られる量で，投与される。投与される量は，一般に１回の投与あたり抗原が５μｇ〜２５０μｇであり，この投与量は治療される個体，該個体の免疫系の抗体合成能，および所望する保護の度合に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は，医師の判断によるものであり，それぞれの個体に特有であり得る。
【０１１０】
このワクチンは，１回の投与計画で与えられるか，あるいは好ましくは複数回の投与計画で与えられ得る。複数回の投与計画では，最初のワクチン投与は，１〜１０回に分けて行なわれ，第２回目の投与では免疫応答維持もしくは強化するために第１回目とは別に所定の間隔をおいて引き続いて１〜４ヶ月投与され，そして必要であれば数ヶ月後にさらに引続き投与が行なわれる。この投与形態はまた，少なくとも部分的には，個人の必要量によって決定され，医師の判断による。さらに，免疫原性のＨＣＶ抗原を有するワクチンは，他の免疫調整因子，例えば免疫グロブリンと組み合わせて投与され得る。
ＩＩ．Ｇ．ＨＣＶエピトープに対する抗体の調製
上述のようにして調製される免疫原性のポリペプチドは，ポリクローナル，および，モノクローナルの両抗体を生産するのに用いられる。ポリクローナル抗体が所望であれば，選択される哺乳動物（例えば，マウス，ウサギ，ヤギ，ウマなど）はＨＣＶエピトープを有する免疫原性ポリペプチドを用いて免疫される。免疫された動物から得られる血清は回収され，公知の方法によって処理される。
【０１１１】
ＨＣＶエピトープに対するポリクローナル抗体を有する血清が他の抗原に対する抗体を含んでいる場合には，このポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナルな抗血清を産生し，処理する手法は，当該分野では公知であり，例えばＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（１９８７）を参照されたい。
【０１１２】
あるいは，ポリクローナル抗体は，あらかじめＨＣＶに感染させておいた哺乳動物から単離され得る。感染個体の血清から得られるＨＣＶエピトープに対する抗体を精製する方法の例は，Ｖ．Ｅ．節で述べられており，これは，アフィニティークロマトグラフィーに基づき，ＳＯＤとｃＤＮＡクローン５−１−１内にコードされたポリペプチドとの融合ポリペプチドを利用する方法である。
【０１１３】
ＨＣＶエピトープに対するモノクローナル抗体もまた，当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成する一般的な方法は公知である。永久増殖性の抗体産生細胞系は細胞融合によって作成することができ，さらに，腫瘍原性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換，あるいはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用いたトランスフェクションのような他の手法によってもまた作成することができる。例えば，Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）の文献を参照されたい。さらに，米国特許Ｎｏ．４，３４１，７６１；Ｎｏ．４，３９９，１２１；Ｎｏ．４，４２７，７８３；Ｎｏ．４，４４４，８８７；Ｎｏ．４，４６６，９１７；Ｎｏ．４，４７２，５００；Ｎｏ．４，４９１，６３２；およびＮｏ．４，４９３，８９０もまた，参照されたい。ＨＣＶエピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは，種々の目的（例えばアイソタイプ，エピトープ親和性など）に応じてスクリーニングされ得る。
【０１１４】
モノクローナルおよびポリクローナル両抗体は，ＨＣＶエピトープに対して形成され，特に診断において有用であり，中和抗体は受動免疫治療に有用である。特にモノクローナル抗体は抗イディオタイプの抗体を生じさせるために用いられ得る。
【０１１５】
抗イディオタイプ抗体は，それに対して保護が望まれる感染因子の抗原の「内的イメージ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｍａｇｅ）」を伴う免疫グロブリンである。例えば，Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．ら（１９８５）およびＤｒｅｅｓｍａｎら（１９８５）を参照されたい。
【０１１６】
抗イディオタイプ抗体を生じさせるための手法は，当該分野で公知である。例えば，Ｇｒｚｙｃｈ（１９８５），ＭａｃＮａｍａｒａら（１９８４），およびＵｙｔｄｅｈａａｇら（１９８５）を参照されたい。これらの抗イディオタイプ抗体は，ＮＡＮＢＨの治療，およびＨＣＶ抗原の免疫原性領域を解明するのにも有用である。
【０１１７】
ＩＩ．Ｈ．診断用オリゴヌクレオチドプローブおよびキット
単離されたＨＣＶ  ｃＤＮＡの開示部分（第１〜４６図に示される部分を包含する）を基本として用いて，約８個あるいはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴマーが切断あるいは合成によって調製され得る。このオリゴマーは，ＨＣＶゲノムとハイブリダイズし，このウイルス性因子の同定，さらにこのウイルス性ゲノムの特徴づけ，および疾患個体のウイルスの検出に有用である。ＨＣＶポリヌクレオチドプローブ（天然あるいは誘導された）は，ハイブリダイゼーションによって独特のウイルス配列を検出し得る長さである。６〜８個のヌクレオチドが，その機能を果たし得る長さであるが，１０〜１２個のヌクレオチド配列が好適であり，約２０のヌクレオチドが最も好適であると考えられる。好ましくは，これら配列は，異種性を欠いている領域由来である。これらプローブは自動化オリゴヌクレオチド合成法を含む，定型的な方法を用いて調製され得る。有用なプローブには，例えば，本明細書で開示されたクローン５−１−１および付加的なクローン，そして，ｃＤＮＡライブラリーをプローブする際に有用な後述の種々のオリゴマーがある。ＨＣＶゲノムのどの独特な部分の相補鎖も充分使用され得る。フラグメントの長さが長くなるにつれ完全に相補性を有する必要はなくなるのであるが，プローブとして使用するには完全な相補性が望まれる。
【０１１８】
診断用としてこのようなプローブを使用するには，血液あるいは血清のような分析されるべき生物学的試料は，必要であれば，そこに含有されている核酸を抽出するために処理される。この試料から得られた核酸は，ゲル電気泳動あるいは他のサイズ分離手段にかけられ得る。あるいは，この核酸試料は，サイズ分離を行うことなくドットブロットされ得る。次にこのプローブは標識化される。プローブを標識するための適当な標識物，および方法は当該分野では公知であり，それには例えば，ニックトランスレーションあるいはキナーゼ処理で取り込まれた放射性標識物，ビオチン螢光プローブ，および化学発光プローブが含まれる。試料から抽出された核酸は，次に，適当な厳密さのハイブリダイゼーション条件下で，標識されたプローブと共に処理される。
【０１１９】
このプローブは，ＨＣＶゲノムに完全に相補的に作成され得る。従って，偽陽性を防ぐために，通常，厳密性の高い条件が望まれる。しかし，プローブが異種性を欠くウイルスゲノム領域と相補性を有する場合のみに，厳密性の高い条件が使用される。ハイブリダイゼーションの厳密さは，ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程中の多くの因子（温度，イオン強度，時間の長さおよびホルムアルデヒドの濃度を含む）により決定される。これらの因子は，例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ（１９８２）により概説されている。
【０１２０】
一般に，このＨＣＶゲノム配列は，感染個体の血清中に比較的低レベル（つまり，１ｍｌあたり約１０２〜１０３個の配列）で，存在する。このレベルはハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅手法が用いられることが必要であり得ることを示している。そのような手法は当該分野では公知である。例えばＥｎｚｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの「Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ」システムでは，ＤＮＡプローブに未修飾の３’−ポリ−ｄＴテールを付加するために，末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いている。ポリｄＴテールを付加したプローブは標的となるヌクレオチド配列にハイブリダイズされ，ついで，ビオチン修飾ポリＡにハイブリダイズされる。ＰＣＴ出願８４／０３５２０およびＥＰＡ１２４２２１には次のような方法のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記述されている：（１）被分析物を，酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的な単鎖ＤＮＡプローブにアニールする；および（２）得られたテールが付加された二本鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。ＥＰＡ２０４５１は次のような方法のＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイが記述されている。この方法では，分析物であるＤＮＡを，例えば，ポリｄＴテールのようなテールを有するプローブと接触させ，次に増幅鎖と接触させる。この増幅鎖は，プローブのテールとハイブリダイズするポリＡ配列のような配列を有し，複数の標識鎖を結合することが可能である。特に望ましい方法では，まず血清中標的ＨＣＶ配列が約１０，０００倍，つまり約１０６配列／ｍｌとなるように，標的ＨＣＶ配列の増幅が行われる。これは，例えば，Ｓａｉｋｉら（１９８６）の方法によって行なわれ得る。この増幅された配列は，ハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて検出され得る。このハイブリダイゼーションアッセイ法は，本願出願人による係属中の米国出願（１９８７年１０月１５日出願；代理人のＤｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．２３００−０１７１）中に記載されており，これは，参考文献としてここに取り入れられている。１０６／ｍｌのレベルで配列を検出するこのハイブリダイゼーションアッセイ法では，単鎖の分析すべき核酸に結合し，多数の単鎖標識オリゴヌクレオチドにも結合する核酸多量体を利用する。標識されたポリヌクレオチドプローブを用いる，適当な溶液相のサンドイッチアッセイ，およびプローブの調製法は，１９８７年６月１６日に公開された本願出願人によるＥＰＯ  ２２５，８０７に記載されており，これを参考文献としてここに取り入れる。
【０１２１】
このプローブは診断用キット中に組み入れることができる。診断用キットは，プローブＤＮＡを有し，このプローブＤＮＡは標識されているか，あるいはこのプローブＤＮＡは標識されておらず，標識用の成分がキット中に入っている。このキットにはまた，特定のハイブリダイゼーションのプロトコールに必要な他の試薬および材料（例えば，標準品，およびこのテストを行なうための指示書）が適当に包装されて含まれる。
【０１２２】
ＩＩ．Ｉ．イムノアッセイおよび診断用キット
ＨＣＶ抗体を含有する血清と免疫的に反応するポリペプチド，およびこれらのポリペプチドのＨＣＶ特異的エピトープに対して生じる抗体は，イムノアッセイにおいて，例えば血液または血清試料を包含する生物学的試料におけるＨＣＶ抗体の存在，あるいはウイルスおよび／またはウイルス抗原の存在を検出するために有用である。上記ＨＣＶ抗体は，例えば，ＩＶ．Ａ節で記載されたクローン由来であり，あるいは，このクローン内にコードされ，そしてそれらの複合体である。上記ＨＣＶ特異的エピトープに対して生じる抗体については，例えば，ＩＶ．Ｅ節を参照されたい。このイムノアッセイの設計は多くの変更を行うことが可能であり，これらアッセイの多様性については当該分野では既知である。例えば，このイムノアッセイでは，１種のウイルス抗原が利用され得る。このウイルス抗原は，例えば，ＩＶ．Ａ節で記載のＨＣＶ  ｃＤＮＡを有するクローンのいずれか由来のポリペプチド，あるいはこれらクローンのｃＤＮＡ由来の複合ｃＤＮＡ由来のポリペプチド，あるいはこれらのクローンのｃＤＮＡが誘導されるＨＣＶゲノム由来のポリペプチドである。あるいは，このイムノアッセイには，これらの源由来のウイルス抗原の組合せが用いられ得る。例えば，ウイルスのエピトープに対する１種のモノクローナル抗体，ひとつのウイルスの抗原に対するモノクローナル抗体の組み合わせ，異なるウイルス抗原に対する複数のモノクローナル抗体，同一のウイルス抗原に対するポリクローナル抗体，あるいは異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体が使用され得る。プロトコールは，例えば，競合分析法，直接分析法，あるいはサンドイッチタイプ分析法を基本とすることができる。このプロトコールではまた，固体支持体を用いるか，あるいはこのプロトコールは，免疫沈澱法であり得る。ほとんどのアッセイは標識化抗体あるいはポリペプチドの使用を含む。この標識物には例えば，螢光分子，化学発光分子，放射性分子あるいは染色分子がある。このプローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である。その例としては，ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ，および酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば，ＥＬＩＳＡアッセイ）がある。
【０１２３】
ＨＣＶのフラビウイルスモデルにより，ビリオンの構造タンパクに対する診断用エピトープの位置の推定が可能となる。Ｃ，プレＭ，ＭおよびＥドメインはすべて，ウイルス抗原を検出するために，特に診断用に，有意な可能性のあるエピトープを含有していると考えられる。同様に，非構造タンパクのドメインは，重要な診断用エピトープ（例えば，推定のポリメラーゼをコードするＮＳ５；および推定の補体結合抗原をコードするＮＳ１）を有することが予想される。これらの特異的ドメイン由来のエピトープを有する組換えポリペプチドあるいはウイルスのポリペプチドは，感染血液提供および感染患者におけるウイルス抗体の検出に有用である。
【０１２４】
さらに，Ｅおよび／またはＭタンパクに対する抗体がＮＡＮＢＨによって引き起こされるＨＣＶ患者および感染血液提供者のウイルス抗原を検出するイムノアッセイにおいて用いられ得る。さらに，これら抗体は急性期のドナーおよび患者を検定するのに非常に有用である。
【０１２５】
免疫診断に適し，適切に標識された試薬を有するキットが，適切な材料を適当な容器中に包装することによって得られる。この適切な材料には，ＨＣＶエピトープを有する本発明のポリペプチド，あるいはＨＣＶエピトープに対する抗体，およびアッセイの遂行に用いられる他の試薬および物質，さらにアッセイの指示書のセットを含む。
【０１２６】
ＩＩ．Ｊ．ウイルスゲノムに対するｃＤＮＡのプローブを用いた，ＨＣＶゲノム，ビリオンおよびウイルス抗原の他の特性決定
ＩＶ．Ａ．節に記載したクローンのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の情報は，第１図〜第４６図に示すように，ＨＣＶゲノムの配列とＨＣＶ因子の同定と単離とについての情報をさらに得るために用いられ得，その結果，ゲノムの性質，ウイルス粒子の構造，およびウイルスが有する抗原の性質を含めたウイルスの特性決定の助けになる。さらに，この情報によって，付加的なポリヌクレオチドプローブ，ＨＣＶゲノム由来のポリペプチド，およびＨＣＶが原因のＮＡＮＢＨの診断および／または治療に有用なＨＣＶエピトープに対応する抗体が得られるようになる。
【０１２７】
上記クローンのｃＤＮＡ配列の情報は，ＩＶ．Ａ節に記載されたクローンのｃＤＮＡの起源であるＨＣＶゲノムの未確定領域由来の他のｃＤＮＡ配列を単離するためのプローブを設計するのに有用である。例えば，約８個またはそれ以上，好ましくは２０個またはそれ以上のヌクレオチドの配列を有する標識化プローブは，第１，第３，第６，第９〜１０，第１５〜１７および第４０〜４６図に示すＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の群の５’末端または３’末端に近い領域由来のものであり，ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーから重複ｃＤＮＡ配列を単離するのに用いられ得る。上記クローンのｃＤＮＡと重複するこれらの配列は，上記クローンのｃＤＮＡの起源でないゲノムの領域由来の配列も含んでいるが，ＩＶ．Ａ節に記載のクローンのｃＤＮＡと必らずしも重複しない，他の重複断片を同定するためのプローブを合成するのに利用することができる。ＨＣＶゲノムが切断され，そのセグメントが共通の配列を欠いていなければ，ウイルスゲノム由来の重複ｃＤＮＡを単離する技術を利用して，全ウイルスゲノムの配列を決定することができる。これとは異なり，ゲノムが切断されていて共通配列を欠いている場合は，ゲノムの配列は，ＩＶ．Ａ節に記載したクローンの単離および配列決定の技術を用い，クローン５−１−１を単離するのに用いたのと同様に，λｇｔ１１  ＨＣＶライブラリーを血清学的にスクリーニングし，ｃＤＮＡ単離物の配列を決定し，単離されたｃＤＮＡを利用して重複断片を単離することによって，決定することができる。あるいは，ゲノムセグメントの特性決定は，精製されたＨＣＶ粒子から単離されたウイルスゲノムで行うことができる。ＨＣＶ粒子を精製し，精製中の粒子を検出する方法は後述する。ポリヌクレオチドのゲノムのウイルス粒子からの単離工程は，当該技術分野では公知であり，利用される一方法を実施例ＩＶ．Ａ．１．に示す。単離されたゲノムのセグメントは，次に，クローン化され配列決定され得る。このように，ここで提供される情報によって，その性質にかかわりなく，ＨＣＶゲノムをクローン化し配列を決定することができる。
【０１２８】
ｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は，当該技術分野では公知であり，すでに記載し，あるいは後で述べられる。λｇｔ１１内にＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は，ＩＶ．Ａ．節ですでに述べられている。しかし，核酸プローブでスクリーニングするのに有用なｃＤＮＡライブラリーもまた，当該技術分野で公知の他のベクター内，例えばλｇｔ１０〔ヒュインら（Ｈｕｙｎｈ  ｅｔ  ａｌ），１９８５年〕内で構築することができる。第１〜４６図のｃＤＮＡ由来のプローブ，およびこれらｃＤＮＡ由来のポリヌクレオチドから合成されたプローブによって検出された，ＨＣＶ由来のｃＤＮＡは，単離されたポリヌクレオチドを，適当な制限酵素で切断することによって，クローンから単離し，配列を決定することができる。例えば，クローン５−１−１中のＨＣＶ  ｃＤＮＡと重複するＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離と配列決定とに使用される手法については，ＩＶ．Ａ．３節およびＩＶ．Ａ．４節を；クローン８１中のＨＣＶ  ｃＤＮＡと重複するＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離と配列決定とについては，ＩＶ．Ａ．５〜ＩＶ．Ａ．７節を；そして，他のクローン（クローン３６）およびクローン８１と重複するクローンの単離と配列決定とについては，ＩＶ．Ａ．８節およびＩＶ．Ａ．９節を参照されたい。
【０１２９】
これらの重複ＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の配列情報は，ウイルスゲノム内の相同領域と異なる領域とを決定するのに有用であり，このことにより，異なる種類のゲノムおよび／または欠陥粒子（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の集団の存在を示すことができる。ＩＩ．Ｇ．節に記載の手法を利用して，ＨＣＶの単離（後述する）中に，生物学的試料中のＨＣＶ，ＨＣＶ抗原またはＨＣＶ核酸を検出することはまた，ハイブリダイゼーションプローブを設計するのに有用である。さらに，重複ｃＤＮＡは，クローン５−１−１，３６，８１，９１および１−２内ならびにＩＶ．Ａ．節に記載の他のクローン内にコードされているポリペプチドをコードするＨＣＶゲノム由来のポリペプチドの発現ベクターを作製するのに利用できる。ＨＣＶエピトープを有するこれらのポリペプチドを作製する技術と，ポリペプチドに含有されているＨＣＶエピトープに対応する抗体とその用途に関する技術とは，クローン５−１−１，３２，３５，３６，１−２，８１および９１に含まれるＮＡＮＢＶｃＤＮＡ配列由来のポリペプチドについて記載され，すでに検討されまた後にも検討される技術と類似する。
【０１３０】
クローン５−１−１，３２，３５，３６，８１，９１，１−２およびＩＶ．Ａ．節に記載の他のクローンに含まれているｃＤＮＡ配列の群内に，ＨＣＶに特有のものと考えられるエピトープを含有する抗原がコードされている。つまり，これらの抗原に対する抗体がＨＡＶもしくはＨＢＶに感染した個体に欠けており，そしてＨＣＶに感染していない個体に欠けている（ＩＶ．Ｂ．節に示す血清学的データ参照）。さらに，これらのｃＤＮＡの配列情報と，ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＤＶの配列および遺伝子バンクのゲノム配列とを比較すると，これらのｃＤＮＡと上記の起源のポリヌクレオチドの配列とには最小の相同性が存在することが示されている。このように，これらクローンのｃＤＮＡ内にコードされている抗原に対する抗体は，感染した個体から単離したＢＢ−ＮＡＮＢＶ粒子を同定するのに用いることができる。さらに，この抗体は，ＮＡＮＢＨ因子の単離にも有用である。
【０１３１】
ＨＣＶ粒子は，ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染した個体由来の血清または細胞培養物から，以下のような当該技術分野で公知の方法で単離することができる。公知の方法としては，例えば，沈降法もしくは排除法のようなサイズ識別に基づく方法；密度勾配による超遠心分離法のような密度に基づく方法；ポリエチレングリコールのような試薬による沈澱法；またはアニオンもしくはカチオン交換物質，疎水性によって結合する物質のような種々の物質およびアフィニティカラムのカラムによるクロマトグラフィー法がある。この分離工程中に，ＨＣＶの存在は次のような方法で検出できる。すなわち，先に述べたＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来のプローブを用いて，抽出されたゲノムをハイブリダイゼーション分析する方法；または第１〜４６図に示すｃＤＮＡ配列の群内にコードされたＨＣＶ抗原に対する抗体および先に述べた重複ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列内にコードされたＨＣＶ抗原に対する抗体をプローブとして用いる免疫検定法（ＩＩ．Ｉ．節参照）がある。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく，免疫検定法にこれら抗体を使用する前に精製することが望ましい。クローン５−１−１内にコードされた抗原に対するポリクローナル抗体の精製法は，ＩＶ．Ｅ．節に記載されているが，類似の精製法を，他のＨＣＶ抗原に対する抗体に利用することができる。
【０１３２】
第１〜４６図に示すｃＤＮＡの群内にコードされたＨＣＶ抗原に対する抗体は，固体の支持体に固定されており，免疫アフィニティークロマトグラフィーによるＨＣＶの単離に有用である。免疫アフィニティークロマトグラフィーの手法は，当該技術分野で知られており，例えば，抗体を固体の支持体に固定しその免疫選択活性を保持する方法がある。この方法には，抗体が支持体に吸着されている方法〔例えば，カースタック（Ｋｕｒｓｔａｋ）のＥＮＺＹＭＥ  ＩＭＭＵＮＯＤＩＡＧＮＯＳＩＳ，３１〜３７頁参照〕および抗体が支持体と共有結合されている方法がある。一般に，これらの方法は，抗原を固体支持体に共有結合させて使用する方法と同様であり，それはＩＩ．Ｃ．節に概略記載されているが，スペーサー茎が二官能性のカップリング試薬に含まれ，抗体の抗原と結合する部位が近づきやすいようになっている。
【０１３３】
精製処理中に，ＨＣＶの存在が，すでに述べた第１〜４６図に示すＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の群および重複ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列由来のポリヌクレオチドをプローブとして利用する核酸ハイブリダイゼーション法によって検出および／または確認される。この場合，画分は，ウイルス粒子の崩壊を起こすような条件下で，例えば，キレート試薬の存在下およびＩＩ．Ｈ．節にも記載したハイブリダイゼーション法によって検出されるウイルス核酸の存在下で，界面活性剤によって処理される。単離された粒子がＨＣＶを誘発する因子であるということは，単離されたウイルス粒子をチンパンジーに感染させ，次いでＮＡＮＢＨの徴候が感染によるものであるか否かを決定することによって確認することができる。
【０１３４】
次に，精製された調製物から得たウイルス粒子は，さらに特性決定される。そのゲノム核酸が精製された。このゲノム核酸がＲＮａｓｅに対して感受性でＤＮａｓｅ  Ｉに感受性でないことから，そのウイルスがＲＮＡゲノムで構成されていることが明らかである（後述のＩＶ．Ｃ．２．節参照）。そのゲノム核酸のストランドの状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）および円形性（ｃｉｒｃｕ  ｌａｒｉｔｙ）であるか非円形性であるかということは，公知の技術，例えばそれを電子顕微鏡により視覚化すること，密度勾配により移動させること，および沈降特性を調べることによって測定される。捕捉されたＨＣＶゲノムがＨＣＶ  ｃＤＮＡの負のフトランドとハイブリダイズすることから，ＨＣＶは正のストランドのＲＮＡゲノムを含むことが明らかである（ＩＶ．Ｈ．１節参照）。このような手法は，例えば，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  に記載されている。さらに，精製された核酸は，クローン化され，公知の方法（例えば，ゲノム物質はＲＮＡなので逆転写法）によって配列を決定することができる。例えば，マニアティス（１９８２年），およびグローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）（１９８５年）の文献を参照されたい。ウイルス粒子由来の核酸を利用すれば，それが切断されていてもいなくても，全ゲノムの配列を決定することができる。
【０１３５】
１４ｉから３９ｃまでの結合クローン（第２９〜３４図参照）の連続ＯＲＦ内にコードされたポリペプチドの相同性の試験を行うと，ＨＣＶポリペプチドが，フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）の保存された領域内の対応するタンパクと相同性のある領域を有することが示される。この具体例は，ＩＶ．Ｈ．３．節に示されている。この知見には，多くの重要な効果がある。第１に，この情報は，ＨＣＶが正のストランゲノムを有し，その大きさが約１０，０００ヌクレオチドであることを示す試験結果とともに，ＨＣＶがフラビウイルスかまたはフラビ様ウイルスであることを示唆していると考えて矛盾しない。一般に，フラビウイルスのビリオンとゲノムとは，比較的変化しない構造と組織を有し，このことは公知である。ライスら（Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ）（１９８６年），およびブリントン  エム  エー（Ｂｒｉｎｔｏｎ  Ｍ．Ａ．），（１９８８年）を参照されたい。従って，ポリペプチドＣ．プレＭ／ＭおよびＥをコードする構造遺伝子は，クローン１４ｉの上流の遺伝子の５’末端に位置し得る。さらに，他のフラビウイルスと比較することによって，これらのタンパクをコードする配列の正確な位置を予想することができる。
【０１３６】
クローン１４ｉのゲノムの上流の配列の単離は，本明細書に示した多くの方法により達成され得，そのことは，当業者に自明である。例えば，ゲノム“ウォーキング法（ｇｅｎｏｍｅ  “Ｗａｌｋｉｎｇ  ”ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が，クローン１４ｉ内のゲノムの５’側にありそのクローンと重複する他の配列を単離するのに用いられ得るが，この方法によって，付加的な配列の単離が行われる。この手法は，後述のＩＶ．Ａ．節で十分に述べられている。例えば，フラビウイルスは，保存されたエピトープと保存された核酸配列の領域とを有することが知られている。保存された配列を含むポリヌクレオチドは，ＨＣＶゲノムを捕捉するプローブとして用いて，それを単離することができる。さらに，これらの保存された配列は，第２５図に示すＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の配列とともに，ポリメラーゼの連鎖反応の技術を用いて，クローン１４ｉの配列の上流のゲノム配列を増幅する系に使用するプライマーを設計するのに利用される。この例は後述される。
【０１３７】
ＨＣＶの構造もまた，決定され，その成分が単離され得る。その形態と大きさは，例えば電子顕微鏡によって決定され得る。コート抗原もしくはエンベロープ抗原のような特異的なウイルスポリペプチド抗原，または核酸結合タンパク，コア抗原のような内部抗原，およびポリヌクレオチドポリメラーゼの同定と位置決定とは，例えば，抗原が大きなもしくは小さなウイルス成分として存在するか否かを測定すること，および単離されたｃＤＮＡ内にプローブとしてコードされた特異的抗原に対する抗体を利用すること，によって行なわれ得る。この情報は，ワクチンを設計するのに有用である。例えば，ワクチン調製物に外部抗原を含有させることが好ましい。多価ワクチン（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）は，例えばＥのような構造タンパクをコードするゲノム由来のポリペプチド，および例えば非構造ポリペプチドもしくは構造ポリペプチドのような，ゲノムの別の部分由来のポリペプチドで構成されていてもよい。
【０１３８】
ＩＩ．Ｋ．ＨＣＶ複製用の細胞培養系と動物モデル系
ＨＣＶがフラビウイルスもしくはフラビ様ウイルスであるという示唆によって，ＨＣＶ増殖法についての情報が提供される。“フラビ様”という用語は，そのウイルスが，フラビウイルスの公知の保存された領域に対して有意の相同性を示し，そして，そのゲノムの大部分が単一のＯＲＦであることを意味する。フラビウイルスの培養法は，当業者に公知である〔例えば，ブリントン（１９８６年）およびストラー，ブイ（Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．）（１９８０年）の総論を参照されたい〕。一般に，ＨＣＶを培養するのに適切な細胞もしくは細胞としては，フラビウイルスの複製を維持することが知られているもの，例えば次のものがある：サル腎臓細胞系（例えば，ＭＫ２，ＶＥＲＯ）；ブタの腎臓細胞系（例えば，ＰＳ）；ベビーハムスターの腎臓細胞系（例えば，ＢＨＫ）；ネズミマクロファージ細胞系（例えば，Ｐ３８８Ｄ１，ＭＫ１，Ｍｍ１）；ヒトマクロファージ細胞系（例えば，Ｕ−９３７）；ヒト末梢白血球；ヒトの付着性単球；肝細胞もしくは肝細胞系（例えば，ＨＵＨ７，ＨＥＰＧ２）；胚もしくは胚細胞系（例えば，ニワトリの胚繊維芽細胞）；または無脊椎動物由来の細胞系。上記無脊椎動物由来の細胞系として好ましいのは昆虫由来のもの（例えば，ショウジョウバエの細胞系）であり，さらに好ましいのは節足動物由来のもので，例えば蚊の細胞系〔例えば，Ａ．アルボピクツス（Ａ．Ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ），イーデス  イージプチー（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ），クーテックス  トリテニオリンクス（Ｃｕｔｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）〕もしくはダニ細胞系〔例えば，ＲＭＬ−１４  ダーマセンター  パルマペルツス（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｐａｒｕｍａｐｅｒｔｕｓ）〕である。
【０１３９】
一次肝細胞を培養しついでＨＣＶに感染させてもよいし，あるいは肝細胞培養物を感染した個体（例えば，ヒトもしくはチンパンジー）の肝臓から得てもよい。後者の場合は，生体内で感染した細胞が生体外で継代された例である。さらに，種々の永久増殖細胞化法を，肝細胞培養物由来の細胞系を得るために用いることができる。例えば，一次肝臓培養物（肝細胞集団の集積の前後）は，種々の細胞と融合され，安定性を保持する。例えば，永久的または半永久的細胞系を創製するために，培養物を，形質転換ウイルスに感染させるか，または形質転換遺伝子でトランスフェクトさせる。さらに，例えば，肝臓培養物中の細胞は，融合されて，確立された細胞系（例えば，ＨｅｐＧ２）となり得る。細胞融合法は，当該技術分野で既知であり，例えば，ポリエチレングリコール，センダイウイルスおよびエプスタイン−バールウイルスのような融合因子が使用される。
【０１４０】
上記で述べたように，ＨＣＶはフラビウイルスもしくはフラビ様ウイルスである。従って，細胞系のＨＣＶ感染は，おそらく，細胞をフラビウイルスに感染させる当該技術分野で公知の方法によって達成することができる。これらの方法には，例えば，細胞内にウイルスが侵入しうる条件下で，細胞をウイルス調製物とともにインキュベートする方法がある。さらに，細胞を単離されたウイルスポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによってウイルスの産生物を得ることができる。トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）およびフラビウイルスのＲＮＡが，種々の脊椎動物の細胞系〔フェファーコーン（Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ）およびシャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ），１９７４年〕および蚊細胞系〔ペレーグ（Ｐｅｌｅｇ），１９６９年〕に感染性であることが知られている。組織培養細胞を，ＲＮＡ二本鎖，正のストランドのＲＮＡおよびＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）でトランスフェクトする方法は，当該技術分野では公知であり，例えば，エレクトロポーレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ），およびＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ）もしくはリン酸カルシウムによる沈降法を用いる手法がある。ＨＣＶ  ＲＮＡの多くの起源を，完全ゲノムに対応するＨＣＶ  ｃＤＮＡの転写を生体外で行うことによって得ることができる。この物質もしくはクローン化されたＨＣＶ  ｃＤＮＡを用いたトランスフェクションによって，ウイルスが複製されそしてウイルスが生体外で増殖するようになるはずである。
【０１４１】
培養細胞に加えて，動物モデル系がウイルス複製に使用できるが，フラビウイルスが動物系に存在するということは，当業者には公知である〔例えば，モナース（Ｍｏｎａｔｈ）による総説（１９８６年）参照〕。従って，ＨＣＶの複製は，チンパンジーで起こるだけでなく，例えば，マーモセットやサックリングマウスでも起こる。
【０１４２】
ＩＩ．Ｌ．ＨＣＶに対する抗ウイルス剤のスクリーニング
ＨＣＶの細胞培養物と動物モデル系とを利用することによって，ＨＣＶの複製を阻害する抗ウイルス剤，特に優先的に細胞を生育・増殖させる一方でウイルスの複製を阻害する抗ウイルス剤をスクリーニングすることができる。これらのスクリーニング法は，当業者には知られている。一般に，抗ウイルス剤は，ウイルスの複製を維持する細胞培養系でウイルスの複製を阻害する効果と，動物モデル系での感染性もしくはウイルス病原性を阻害する効果（および低レベルの毒性）について種々の濃度で試験される。
【０１４３】
ＨＣＶ抗原とＨＣＶポリヌクレオチドを検出するためのここに記載された方法と組成物は，ウイルス複製に対する抗ウイルス剤の効果を検出する方法として，細胞プラーク検定法もしくはＩＤ５０検定法の代わりにこれらの方法よりもおそらく高感度の方法を提供することから，抗ウイルス剤のスクリーニングに有用である。例えば，ここに記載したＨＣＶポリヌクレオチドプローブは，細胞培養で産生されたウイルス核酸を定量するのに利用できる。このことは，例えば感染した細胞の核酸と標識したＨＣＶポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションまたは競合ハイブリダイゼーションによって達成することができた。例えば，また抗ＨＣＶ抗体は，本明細書に記載の免疫検定法を利用して細胞培養物中のＨＣＶ抗原を同定および定量するのに利用できる。さらに，感染細胞の培養物中のＨＣＶ抗原を競合検定法で定量することは望ましいことであるから，本明細書に記載したＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされたポリペプチドは，これらの競合検定法に有用である。一般に，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の組換え体ＨＣＶポリペプチドに標識化し，この標識化ポリペプチドとＨＣＶポリペプチドとの結合が細胞培養系内に産生された抗原によって阻害されるのを監視する。さらに，これらの方法は，ＨＣＶが細胞系内で細胞死を起こすことなく複製できる場合，特に有用である。
【０１４４】
ＩＩ．Ｍ．弱毒化されたＨＣＶ株の調製
上記のことに加えて，組織培養系および／または動物モデル系を利用して弱毒化されたＨＣＶ株を単離することができる。これらの株は，ワクチン用もしくはウイルス抗原単離用に適している。弱毒化ウイルス株は，細胞培養および／または動物モデルでの複数の継代の後に単離可能である。感染した細胞もしくは固体の弱毒化株の検出は，当該技術分野で公知の方法で達成できる。それには，例えば，ＨＣＶにコードされたひとつまたはそれ以上のエピトープに対する抗体をプローブとして用いること，あるいは，少なくとも約８個のヌクレオチドのＨＣＶ配列を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いることが包含される。その代わりにあるいはそれに加えて，弱毒化株は，本明細書に記載のＨＣＶのゲノム情報と，組換え技術を利用して構築することができる。一般に，例えば病原に関連するポリペプチドをコードするがウイルスの複製は可能であるようなゲノム領域を除去することを試みることができる。さらに，このゲノム構築によって，ＨＣＶに対する抗体の中和を起こさせるエピトープの発現が可能になる。次いで，変化させたゲノムは，ＨＣＶ複製が可能な細胞と，ウイルス複製が可能な条件下で増殖する細胞を形質転換するのに利用できる。弱毒化ＨＣＶ株は，ワクチン製造のみならずウイルス抗原の商業的生産ソースとしても有用である。その理由は，これらウイルスの処理が，ウイルス生産を行う従業員に対してそれほど厳重な保護対策をとらなくてもよいからである。
【０１４５】
ＩＩＩ．一般的方法
ウイルスからのゲノムの抽出，ｃＤＮＡライブラリーの調製とプロービング，クローンの配列決定，発現ベクターの構築，細胞の形質転換，ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡ検定法のような免疫検定の実施，培地での細胞の培養などに用いられる一般的な方法は，当該技術分野で公知であり，これらの方法を記載した実験室のマニュアルを入手することができる。しかし，一般的な指針として，上記の方法およびこれを実施するのに有用な材料を現在入手できるいくつかの出所を以下に述べる。
【０１４６】
ＩＩＩ．Ａ．宿主および発現制御配列
原核および真核の宿主細胞は，指定された宿主に適合する適切な制御配列が用いられた場合に，所望のコード配列の発現に用いることができる。原核細胞宿主のうち，エシェリヒア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が最も汎用される。原核細胞の発現制御配列には，必要に応じてオペレーター部分を有するプロモーター，およびリボソーム結合部位が含まれている。原核細胞の宿主に適合するトランスファーベクターは，通常，例えば次のようなものに由来する。つまり，アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する耐性を与えるオペロンを有するプラスミドであるｐＢＲ３２２および抗生物質耐性のマーカーを与える配列を有する種々のｐＵＣ  ベクター由来である。これらのマーカーは，適宜選択することによって，好適な形質転換細胞を得るのに利用できる。通常用いられる原核細胞の制御配列には，β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系〔チャンら（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ），１９７７年〕，トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゴーデルら（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ），１９８０年〕およびλ由来ＰＬプロモーターおよびＮ  遺伝子リボソーム結合部位〔シマタケら（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ），１９８１年〕，およびｔｒｐおよびｌａｃ  ＵＶ５プロモーターの配列由来のハイブリッドｔａｃ  プロモーター〔ド  ボールら（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ），１９８３年〕がある。上記の系は，特にＥ．ｃｏｌｉに適合する。必要であれば，バシラスもしくはシュードモナス属の菌株のような他の原核宿主を，対応する制御配列とともに用いてもよい。
【０１４７】
真核宿主としては，酵母および培養系内の哺乳動物の細胞がある。サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびサッカロミセス  カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）が最も普通に用いられる酵母宿主であり，便利な真菌宿主である。酵母に適合するベクターは，栄養要求突然変異体に原栄養性を与えるかまたは野生型菌株に重金属に対する耐性を与えることによって成功裏に形質転換された形質転換体を選択することができるようにするマーカーを保有する。酵母に適合するベクターとしては，２ミクロンの複製起源〔ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ），１９８３年〕，ＣＥＮ３およびＡＲＳ１の組み合わせ，または確実に複製を行わせる他の手段（例えば，適切なフラグメントを宿主細胞のゲノムに組込ませるような配列を採用することができる。酵母ベクターの制御配列は，当該技術分野で公知であり，解糖酵素合成のプロモーター〔ヘスら（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ），１９６８年；ホーランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ），１９７８年〕を含み，このようなプロモーターには，３−ホスホグリセリン酸キナーゼ〔ハイツマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ），１９８０年〕に対するプロモーターが含まれる。ターミネーターには，例えばエノラーゼ遺伝子由来のターミネーター〔ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ），１９８１年〕が含まれ得る。特に有用な制御系は，グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーターもしくはアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）調節性プロモーター，ＧＡＰＤＨ由来のターミネーター，および分泌が所望の場合には，酵母α因子由来のリーダー配列を含む系である。さらに，作動可能に連結されている転写調節領域および転写開始領域は，野生型生物に本来関係しないものであってもよい。これらの系については，欧州特許公開第１２０，５５１号（１９８４年１０月３日公開）；同第１１６，２０１号（１９８４年８月２２日公開）；および同第１６４，５５６号）（１９８５年１２月１８日公開）に詳細に記載されており，これらはすべて本発明の出願人によるものであり，本願に引用文献として記載する。
【０１４８】
発現のために宿主として利用可能な哺乳類の細胞系は当該技術分野で知られており，ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの永久増殖化細胞系がある。それには，Ｈｅｌａ細胞，チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞，ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞および多くの他の細胞系がある。哺乳類の細胞に対する適切なプロモーターも当該技術分野では公知であり，それには，シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）（ＳＶ４０）〔フィアース（Ｆｉｅｒｓ），１９７８年〕，ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ），アデノウイルス（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）由来のプロモーターのようなウイルスプロモーターが含まれる。哺乳類細胞はまた，ターミネーター配列およびポリＡ付加配列を必要とし，発現を増大させるエンハンサー配列も含まれ，そして，遺伝子の増幅を引き起こす配列も望ましい。これらの配列は当該技術分野で公知である。哺乳類の細胞で複製させるのに適切なベクターには，ウイルスレプリコン，またはＮＡＮＢＶエピトープをコードする適当な配列を宿主ゲノムに確実に組込む配列が含まれる。
【０１４９】
ＩＩＩ．Ｂ．形質転換
形質転換は，ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知のいずれの方法によっても行なわれ得る。それには例えば，ポリヌクレオチドをウイルスにパッケージングし，次いでそのウイルスを宿主細胞に形質導入する方法およびポリヌクレオチドを直接取込む方法がある。使用される形質転換法は，形質転換すべき宿主に依存する。例えば，Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を，ＢＢ−ＮＡＮＢＶ配列を有するλｇｔ１１で形質転換することが後述の実施例の項で述べられている。直接取込み法による細菌の形質転換には，一般に，塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理が用いられる〔コーヘン（Ｃｏｈｅｎ），１９７２年；マニアティス，１９８２年〕。直接取込み法による酵母の形質転換は，ヒネンら（Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ），１９７８年，の方法を用いて行われ得る。直接取込み法による哺乳類の形質転換は，グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびファン  デル  エプ（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ）１９７８年，のリン酸カルシウム沈澱法またはこの方法の種々の公知の改変法を用いて行われ得る。
【０１５０】
ＩＩＩ．Ｃ．ベクターの構築
ベクターの構築には，当該技術分野で公知の技術が用いられる。部位特異的なＤＮＡの切断が，適切な制御酵素を用い，これら市販の酵素のメーカーによって一般に規定されている条件下で処理することによって，実施される。一般に，約１μｇのプラスミドもしくはＤＮＡ配列は，約２０μｌの緩衝溶液中で１単位の酵素を用いて３７℃の条件下で１〜２時間インキュベートすることにより切断される。制限酵素とともにインキュベートした後，タンパクを，フェノール／クロロホルムによって抽出して除去し，エタノールで沈澱させてＤＮＡが回収される。切断断片は，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５巻，４９９〜５６０頁，１９８０年，に記載された一般的な方法に従って，ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルを用いた電気泳動法により分離することができる。
【０１５１】
粘着末端を有する切断断片は，混合物に存在する適当なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）を用いて平滑末端とされ得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理も行なわれ得，一本鎖ＤＮＡ部分の加水分解が行われる。
【０１５２】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼとＡＴＰとを用いて標準の緩衝液および温度条件下で連結反応が行われる。粘着末端の連結には，平滑末端の連結よりも，ＡＴＰおよびリガーゼの必要量が少い。ベクター断片が連結混合物の一部として用いられる場合には，ベクター断片は，細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理され，５’末端のリン酸を除去して，ベクターの再連結を防止することが多い。あるいは，不必要な断片の制限酵素による切断を利用して連結を防止するのに利用することができる。
【０１５３】
連結混合物は，Ｅ．ｃｏｌｉのような適切なクローニング宿主に形質転換され，次いで，例えば，抗生物質耐性によって成功裏に形質転換された形質転換体が選択され，そして正しい構築物がスクリーニングされる。
【０１５４】
ＩＩＩ．Ｄ．所望のＤＮＡ配列の構築
合成オリゴヌクレオチドは，ワーナー（Ｗａｒｎｅｒ）（１９８４年）が発表した自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得る。必要に応じて，合成ＤＮＡ鎖は，反応の標準条件を用いて，３２Ｐ−ＡＴＰの存在下，ポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって３２Ｐで標識化され得る。
【０１５５】
ＤＮＡ配列は，ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものも含めて，公知の方法で修飾することができる。そのような方法としては，例えば，ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）（１９８２年）が発表した部位特異的変異誘発法がある。概略を述べると，修飾すべきＤＮＡを，一本鎖配列としてファージにパッケージングし，次にプライマーとして，修飾すべきＤＮＡの部分に相補的であり，それ自体の配列内に所望の修飾が含まれている合成オリゴヌクレオチドを用いて，ＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＤＮＡに変換する。得られた二本鎖ＤＮＡは，ファージを保持する宿主細菌に形質転換される。形質転換された細菌の培養物（ファージの各鎖の複製物を含む）は，寒天にプレートされてプラークが得られる。理論的には，新しいプラークの５０％が，変異した配列を有するファージを含有し，残りの５０％はもとの配列を有する。プラークのレプリカは，正しいストランドとハイブリダイゼーション可能であり，かつ未修飾の配列とはハイブリダイゼーションを行わない温度および条件下で，標識化された合成プローブとハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダイゼーションにより同定された配列は，回収されクローン化される。
【０１５６】
ＩＩＩ．Ｅ．プローブによるハイブリダイゼーション
ＤＮＡライブラリーは，グリンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）およびホッグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）（１９７５年）の方法を用いてプローブ化され得る。簡単にのべれば，この方法においては，プローブ化されるべきＤＮＡは，ニトロセルロースフィルター上に固定され，変性され，そして，０〜５０％ホルムアミド，０．７５Ｍ  ＮａＣｌ，７５ｍＭクエン酸ナトリウム，各々０．０２％（ｗｔ／ｖ）のウシ血清アルブミン，ポリビニルピロリドンおよびフィコール，５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５），０．１％  ＳＤＳ，そして１００μｇ／ｍｌキャリアの変性ＤＮＡを含有する緩衝液で，プレハイブリダイゼーションが行われる。緩衝液中のホルムアミドの濃度（％），およびプレハイブリダイゼーションおよびこれに続くハイブリダイゼーション工程の時間と温度条件は，必要とされる厳密さに依存する。厳密さがそれほど必要ではない条件下でのオリゴマーのプローブは，一般に，ホルムアミドが低い濃度であり，低温および長いハイブリダイゼーションの時間で用いられる。ｃＤＮＡもしくはゲノムの配列由来のような３０もしくは４０を越えるヌクレオチドを有するプローブを用いるときには，一般に，例えば，約４０〜４２℃のような高温，および５０％ホルムアミドのような高濃度が採用される。プレハイブリダイゼーションに続いて，５’末端３２Ｐで標識したオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し，この混合物中で，ハイブリダイゼーションの条件下にて，上記フィルターをインキュベートする。洗浄後，処理されたフィルターをオートラジオグラフィーに付すとハイブリダイズしたプローブの位置が示される。もとの寒天プレート上の，対応する位置のＤＮＡを所望のＤＮＡの起源として利用する。
【０１５７】
ＩＩＩ．Ｆ．構築物の確認および配列決定
常套手段により，ベクターを構築する際には，連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株もしくは他の適当な宿主を形質転換し，成功裏に形質転換された形質転換体は，抗生物質耐性もしくは他のマーカーによって選択される。次に，得られた形質転換体から，プラスミドが，クレウェルら（Ｃｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（１９６９年）の方法により調製され，通常，さらに，クロラムフェニコールによる増幅（クレウェル，１９７２年）が行なわれる。そのＤＮＡは，単離され，通常，制限酵素分析法および／または配列決定法により分析される。配列決定は，サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９７７）の，そしてさらにメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）らにより述べられた（１９８１年），ジデオキシ法，あるいはマキシムらの方法（１９８０年）により実施され得る。ＧＣに富んだ領域において時おり観察されるバンドコンプレッションの問題は，バールら（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ）（１９８６年）の方法に従って，Ｔ−デアゾグアノシン（ｄｅａｚｏ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を用いることによって克服された。
【０１５８】
ＩＩＩ．Ｇ．酵素連結イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法は，抗原もしくは抗体のいずれかの濃度を測定するのに利用され得る。この方法は，酵素と，抗原もしくは抗体との結合に依存し，定量の標識として，結合した酵素の活性を用いる。抗体を測定するには，既知の抗原を固相（例えば，マイクロプレートまたはプラスチック製カップ）に固定し，被検血清の希釈物とともにインキュベートし，洗浄し，酵素で標識した抗免疫グロブリンとともにインキュベートし，再び洗浄する。標識化するために好適な酵素は，当該技術分野で公知であり，例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼがある。固相に結合した酵素活性は，特異的な基質を添加し，そして生成物の生成または基質の利用率を比色法で測定することによって測定される。結合した酵素の活性は，結合した抗体の量の一次関数である。
【０１５９】
抗原を測定するには，既知の特異的抗体を固相に固定し，抗原を含む被検物質を添加し，インキュベートした後，固相を洗浄し，第２の酵素で標識した抗体を添加する。洗浄後，基質を添加し，次いで酵素活性を比色法で測定し，抗原濃度に換算する。
【実施例】
【０１６０】
以下に述べるのは本発明の実施例である。この実施例は説明のみを目的として提供するのであって，本発明の範囲を制限するものではない。本発明の開示内容を考慮すると，特許請求の範囲内の多くの実施態様が当業者に明らかである。例えば，ＩＶ．Ａ．節に述べる方法は，もし望まれるならば繰り返し得るが，特にその必要はない。なぜなら，本発明により提供される情報に基づいた所望のヌクレオチド配列の構築のための技術が使用可能であるためである。発現はＥ．ｃｏｌｉで例示されているが，ＩＩＩ．Ａ．節でより十分に述べたような他の系も使用され得る。ゲノム構造に由来する付加的なエピトープも生産され得，以下に述べるように抗体を生産するのに用いられる。
【０１６１】
ＩＶ．Ａ．ＨＣＶ  ｃＤＮＡの調製，単離および配列決定
ＩＶ．Ａ．１  ＨＣＶ  ｃＤＮＡの調製
ＮＡＮＢ因子の原材料は，慢性ＮＡＮＢＨのチンパンジーから得た血漿プールであった。このチンパンジーは，プールしたヒト血清由来の第８因子濃縮物混入バッチ中のＨＣＶで感染させて得られる別の慢性ＮＡＮＢのチンパンジー由来の血液で，実験的に感染させられている。このチンパンジーの血漿プールは，高レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼ活性（この活性はＨＣＶ感染による肝障害に起因する）を有する多くの個体の血漿試料を合わせて調製されたものである。静脈注射により投与されたこの血清プールの１０−６倍希釈液の１ｍｌは，別のチンパンジーにＮＡＮＢＨを引き起こしたので，そのＣＩＤは少なくとも１０６／ｍｌである。つまり，高いウイルス感染力価を有する。
【０１６２】
高力価血漿プール由来のｃＤＮＡライブラリーを，以下のようにして調製した。まず，ウイルス粒子を血漿から単離した。血漿の９０ｍｌを５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶液３１０ｍｌで希釈した。細胞破砕物を，１５，０００×ｇで２０分間，２０℃にて遠心分離することにより除去した。次いで，得られた上清液中のウイルス粒子を，ベックマンＳＷ２８ローターで２８，０００ｒｐｍ，５時間，２０℃にて遠心分離することによりペレットとした。ウィルスゲノムを遊離させるために，ペレットを１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），および２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する溶液１５ｍｌに懸濁し，その後４５℃にて９０分間インキュベートすることにより粒子を破砕した。キャリアとして０．８μｇのＭＳ２バクテリオファージＲＮＡを添加し，フェノール：クロロホルムの１：１混合液（フェノールは０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール，０．１％（ｗ／ｖ）ヒドロキシキノリンで飽和させたもの）で上記混合液を４回抽出し，その後クロロホルムで２回抽出することにより核酸を単離した。２．５倍容積の無水エタノールで−２０℃にて一晩沈澱させるのに先立って，水層を１−ブタノールで濃縮した。ベックマンＳＷ４１ローターで４０，０００ｒｐｍ，９０分間，４℃にて遠心分離することにより核酸を回収し，０．０５％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネート処理およびオートクレーブ処理してある水に溶解した。
【０１６３】
上記方法により得られた核酸（＜２μｇ）を，１７．５ｍＭ  ＣＨ３ＨｇＯＨで変性させた。この変性させた核酸を鋳型として用いてｃＤＮＡを合成し，Ｈｕｙｎｈ（１９８５）により記載されている方法を用いてファージλ−ｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ただし，逆転写酵素によりｃＤＮＡ第一鎖を合成する間，ランダムプライマーをオリゴ（ｄＴ）１２−１８で置き換えた（Ｔａｙｌｏｒら（１９７６））。得られた２本鎖ｃＤＮＡをセファロースＣＬ−４Ｂカラムでサイズに従って分画し；平均サイズ約４００，３００，２００，および１００塩基対の溶出された物質を，それぞれｃＤＮＡプール１，２，３，および４とした。プール３のｃＤＮＡから，λ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【０１６４】
プール３から作成したλ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーを，以前にＮＡＮＢＨにかかったことのある患者由来の血清と特異的に結合できるエピトープについてスクリーニングした。結合ヒト抗体を１２５Ｉで放射性標識したヒツジ抗−ヒトＩｇ抗血清を用いて検出したことを除いては，Ｈｕｙｎｈら（１９８５）の方法を用い，約１０６個のファージを患者血清を用いてスクリーニングした。５個の陽性ファージが同定され，精製された。次いで，この５個の陽性ファージを，同様の方法を用いて，以前ＮＡＮＢＨ因子に感染したことのある８人の異なるヒト由来の血清との結合の特異性について試験した。４個のファージが，たった一人のヒト（つまり，ファージライブラリーの最初のスクリーニングに用いられたヒト）の血清と免疫学的に反応するポリペプチドをコードしていた。５番目のファージ（５−１−１）は，８種の試験した血清のうち５種と免疫学的に反応するポリペプチドをコードしていた。さらに，このペプチドは，７人の正常な血液提供者由来の血清と免疫学的に反応しなかった。それゆえ，クローン５−１−１は，ＮＡＮＢの患者由来の血清により免疫学的に特異的に認識されるポリペプチドをコードすることがわかる。
【０１６５】
ＩＶ．Ａ．２．組換え体ファージ５−１−１におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，および該配列内にコードされるポリペプチドの配列
組換え体ファージ５−１−１のｃＤＮＡを，Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）の方法により配列決定した。本質的には，ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し，ゲル電気泳動を用いてサイズ分画することにより単離した。ＥｃｏＲＩ切断フラグメントをＭ１３ベクターであるｍｐ１８およびｍｐ１９にサブクローン化し（Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８３）），Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）のジデオキシ鎖終止法を用いて配列決定した。得られた配列を第１図に示す。
【０１６６】
第１図においてコードされるポリペプチドは，ＨＣＶ  ｃＤＮＡでコードされ，該ポリペプチドが融合しているＮ−末端のβ−ガラクトシダーゼ部分と同じ翻訳フレーム内にある。ＩＶ．Ａ．節で示したように，５−１−１の翻訳オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は，ＮＡＮＢＨに感染した患者およびチンパンジー由来の血清により特異的に認識されるエピトープをコードする。
【０１６７】
ＩＶ．Ａ．３  クローン５−１−１のｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離
クローン５−１−１のｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡを，第１図に示すようなクローン５−１−１のＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列由来の合成ポリヌクレオチドを用いて，ＩＶ．Ａ．１．節で記述したのと同様に作成したλ−ｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。スクリーニングに用いたポリヌクレオチドの配列は，次のようであった：
５’−ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＧＴ−３’。
Ｈｕｙｎｈ（１９８５）に記載の方法を用いて，λ−ｇｔ１１ライブラリーをこのプローブでスクリーニングした。約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンが，このプローブとハイブリダイズした。合成プローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する３個のクローンに，８１，１−２，および９１と番号をつけた。
【０１６８】
ＩＶ．Ａ．４．クローン５−１−１の  ｃＤＮＡにオーバーラップする  ＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
クローン８１，１−２，および９１の３つのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，ＩＶ．Ａ．２．節で述べたのと本質的に同様にして決定した。これらのクローンの配列は，ファージ５−１−１のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列に関連しており，第２図で示される。第２図は，検出されたＨＣＶエピトープをコードする鎖を示しており，ヌクレオチド配列における相同性が配列間の垂直線により示されている。
【０１６９】
クローン化されたＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列は，オーバーラップ領域で高い相同性を有する（第２図を参照のこと）。しかし，２つの領域には相違がある。クローン１−２の６７番目のヌクレオチドはチミジンであるが，他の３つのクローンはこの位置にシチジン残基を有する。しかし，この位置をＣまたはＴのいずれかが占める場合，同じアミノ酸がコードされるということは注意すべきである。
【０１７０】
第二の相違は，クローン５−１−１が，他の３つのクローンには存在しない２８塩基対を有することである。これらの塩基対は，５−１−１のｃＤＮＡ配列の開始部分に存在し，小文字で示されている。後述のＩＶ．Ｄ．節で論じるラジオイムノアッセイのデータに基づくと，ＨＣＶエピトープはこの２８ｂｐ領域でコードされ得るということが可能である。
【０１７１】
クローン８１，１−２，および９１に５−１−１の２８塩基対が存在しないということは，これらのクローンのｃＤＮＡは欠損したＨＣＶゲノムから得られたということを意味し得る；あるいは，２８ｂｐ領域はクローン５−１−１の末端が人工的に変化したものであり得る。
【０１７２】
クローン８１および９１のヌクレオチド配列における小文字の配列は，単にこれらの配列が他のｃＤＮＡで見い出されていないことを示す。なぜならば，これらの領域にオーバーラップするｃＤＮＡはまだ単離されていないからである。
【０１７３】
クローン５−１−１，８１，１−２，および９１のオーバーラップしているｃＤＮＡ由来のＨＣＶ  ｃＤＮＡ複合配列を，第３図に示す。しかし，この図では，クローン５−１−１に特有の２８塩基対は省略されている。この図は，複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡのＯＲＦ内にコードされるポリペプチドの配列も示す。
【０１７４】
ＩＶ．Ａ．５．クローン８１のｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離
クローン８１  ｃＤＮＡの配列の上流にあり，該配列とオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の単離を，以下のようにして行った。ＩＶ．Ａ．１．節に記述したようにして調製したλ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーを，クローン８１の５’末端配列と相同性を有する合成ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによりスクリーニングした。クローン８１の配列を第４図に示す。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は，次のようであった：
５’  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＣＣＧ  ＧＡＣ  ３’
方法は，Ｈｕｙｎｈ（１９８５）に記載されているのと本質的に同じであったが，厳密な条件下でライブラリーのフィルターを２回洗浄した。すなわち，５×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ中で５５℃にてそれぞれ３０分間洗浄を行った。約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンがこのプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する陽性組換え体ファージを単離・精製した。このファージにクローン３６という番号を付けた。
【０１７５】
クローン８１のカルボキシル末端にオーバーラップする下流ｃＤＮＡ配列を，上流ｃＤＮＡ配列の単離に用いたのと同様の方法を用いて単離した。ただし，合成オリゴヌクレオチドプローブをクローン８１の３’末端と相同性を有するように調製した。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドの配列は，次のようであった：    ５’  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ３’この後者の配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する陽性組換え体ファージを単離・精製し，クローン３２という番号を付けた。
【０１７６】
ＩＶ．Ａ．６．クローン３６のＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
クローン３６のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的に  ＩＶ．Ａ．２．節に記述したようにして決定した。このｃＤＮＡの二本鎖配列，クローン８１のＨＣＶ  ｃＤＮＡとオーバーラップする該ｃＤＮＡの領域，およびＯＲＦによりコードされるポリペプチドを第５図に示す。
【０１７７】
クローン３６のＯＲＦは，クローン８１でコードされるＨＣＶ抗原と同じ翻訳フレーム内にある。このように，組合せて，クローン３６および８１におけるＯＲＦは大きなＨＣＶ抗原の一部を表すポリペプチドをコードする。この推定  ＨＣＶポリペプチドの配列，ならびに該配列をコードする二本鎖  ＤＮＡ配列（クローン３６および８１のＨＣＶ  ｃＤＮＡの結合ＯＲＦ由来）を第６図に示す。
【０１７８】
ＩＶ．Ａ．７．クローン３２のＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
クローン３２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，クローン５−１−１の配列について  ＩＶ．Ａ．２．節で記述したのと本質的に同様にして決定した。配列のデータは，クローン３２組換え体ファージのｃＤＮＡが，二つの異なる材料原由来であることを示した。
【０１７９】
ｃＤＮＡの一つのフラグメントはＨＣＶゲノム由来の４１８ヌクレオチドを有し；他のフラグメントはバクテリオファージＭＳ２ゲノム由来の  １７２ヌクレオチドを有していた。このバクテリオファージＭＳ２ゲノムは，λ−ｇｔ１１血漿ｃＤＮＡライブラリーの調製の間キャリアとして用いたものである。
【０１８０】
ＨＣＶゲノムの配列に対応するクローン３２のｃＤＮＡの配列を，第７図に示す。クローン８１の配列とオーバーラップする配列の領域，およびＯＲＦによりコードされるポリペプチドもこの図に示す。この配列は，クローン８１によりコードされるＨＣＶ抗原と同じ翻訳フレーム内にある一つの連続したＯＲＦを有する。
【０１８１】
ＩＶ．Ａ．８．クローン３６のｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離
クローン３６  ｃＤＮＡの配列の上流にあり，該配列とオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の単離を，クローン８１のｃＤＮＡとオーバーラップする配列についてＩＶ．Ａ．５．節に記述したようにして行った。ただし，合成ポリヌクレオチドはクローン３６の５’領域に基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは，次のようであった：
５’  ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＴＧＴ  ＧＣＧ  ＣＴＡ  ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ３’
約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンが，このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する組換え体ファージを単離・精製したクローンを，クローン３５と命名した。
【０１８２】
ＩＶ．Ａ．９．クローン３５のＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
クローン３５の  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的にＩＶ．Ａ．２．節で記述したようにして決定した。この配列，クローン３６のｃＤＮＡ配列とオーバーラップした該配列の領域，および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを，第８図に示す。
【０１８３】
クローン３５は，明らかに一つの連続的なＯＲＦを有する。このＯＲＦは，クローン３６，クローン８１，およびクローン３２によりコードされるのと同じ翻訳フレーム内で，一つのポリペプチドをコードする。第９〜１０図は，クローン３５，３６，８１，および３２にわたって延びている長く連続したＯＲＦの配列を，該配列でコードされる推定ＨＣＶポリペプチドと共に示す。この配列は，この結合配列は，同じλ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリー由来の他の独立したｃＤＮＡクローンを用いて確認されている。
【０１８４】
ＩＶ．Ａ．１０．クローン３５のｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離
クローン３５  ｃＤＮＡの配列の上流にあり，該配列とオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の単離を，クローン３６のｃＤＮＡとオーバーラップする配列についてＩＶ．Ａ．８．節に記述したようにして行った。ただし，合成ポリヌクレオチドはクローン３５の５’領域に基づいたものであった。スクリーニングに用いた合成ポリヌクレオチドは，次のようであった：
５’  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ３’
約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンが，このプローブとハイブリダイズした。この配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡを有する組換え体ファージを単離・精製したクローンを，クローン３７ｂと命名した。
【０１８５】
ＩＶ．Ａ．１１．クローン３７ｂのＨＣＶのヌクレオチド配列
クローン３７ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的にＩＶ．Ａ．２．節で記述したようにして決定した。この配列，クローン３５のｃＤＮＡの配列にオーバーラップする該配列の領域，および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを，第１１図に示す。
【０１８６】
クローン３５の５’末端のヌクレオチドはＴであるが，クローン３７ｂの対応するヌクレオチドはＡである。ＩＶ．Ａ．１０．節に記述した，クローン３７ｂを単離した工程の間に単離された他の３つの独立したクローン由来のｃＤＮＡも，配列決定されている。これらのクローン由来のｃＤＮＡも，この位置にＡを有する。このように，クローン３５の５’末端のＴは，クローニング工程の人工産物であり得る。しばしばｃＤＮＡ分子の５’末端に人工的に変化したものが生じるということは，公知である。
【０１８７】
クローン３７ｂは明らかに，オーバーラップしているクローン３５，３６，８１および３２にわたって延びているＯＲＦにおいてコードされるポリペプチドの続きであるポリペプチドをコードする，一つの連続的なＯＲＦを有する。
【０１８８】
ＩＶ．Ａ．１２．クローン３２のｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離
クローン３２の下流のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の単離は，以下のようにして行った。まず，クローンｃｌａを，クローン３２のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列に基づいた合成ハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。方法は，本質的にＩＶ．Ａ．５．節に記述したとおりであった。ただし，合成プローブの配列は次のようであった：
５’  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ３’。
クローンｃｌａ  由来のヌクレオチド配列を用いて，別の合成ヌクレオチドを合成した。この合成ヌクレオチドは次の配列を有していた：
５’  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ３’。
クローンｃｌａ由来の配列をプローブとしてを用いたλ−ｇｔ１１ライブラリーのスクリーニングは，約５０，０００個の陽性コロニーのうち１個のコロニーをもたらした。このプローブとハイブリダイズしたクローンを単離・精製し，クローン３３ｂと命名した。
【０１８９】
ＩＶ．Ａ．１３．クローン３３ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
クローン３３ｂのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的にＩＶ．Ａ．２．節で記述したようにして決定した。この配列，クローン３２のｃＤＮＡの配列とオーバーラップする該配列の領域，および該配列においてコードされる推定ポリペプチドを，第１２図に示す。
【０１９０】
クローン３３ｂは明らかに，オーバーラップしているクローン３７ｂ，３５，３６，８１および３２のＯＲＦの延長である，一つの連続的なＯＲＦを有する。クローン３３ｂでコードされるポリペプチドは，これらのオーバーラップしているクローンの延長されたＯＲＦでコードされるのと同じ翻訳フレーム内にある。
【０１９１】
ＩＶ．Ａ．１４．クローン３７ｂのｃＤＮＡおよびクローン３３ｂのｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離
クローン３７ｂおよびクローン３３ｂのｃＤＮＡにオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡを単離するために，これらのクローンのｃＤＮＡ由来の次の合成オリゴヌクレオチドプローブを用い，本質的にＩＶ．Ａ．３．節に記述した方法を用いて，λ−ｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングした。それぞれ，クローン３７ｂおよび３３ｂの配列にオーバーラップするＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を有するコロニーを検出するためのプローブは，次のようであった：
５’  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  Ｃ  ３’
および
５’  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ３’
約５０，０００個のクローンのうち１個のクローンが，それぞれのプローブを用いて検
出された。クローン３７ｂのｃＤＮＡの上流にあり，該ｃＤＮＡにオーバーラップするｃＤＮＡを有するクローンを，クローン４０ｂと命名した。クローン３３ｂのｃＤＮＡの下流にあり，該ｃＤＮＡにオーバーラップするｃＤＮＡを有するクローンを，クローン２５ｃと命名した。
【０１９２】
ＩＶ．Ａ．１５．クローン４０ｂおよびクローン２５ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
クローン４０ｂおよびクローン２５ｃのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，ＩＶ．Ａ．２．節で記述したのと本質的に同様にして決定した。４０ｂおよび２５ｃの配列，クローン３７ｂおよび３３ｂのｃＤＮＡにオーバーラップする該配列の領域，およびそこでコードされる推定ポリペプチドを，第１３図（クローン４０ｂ）および第１４図（クローン２５ｃ）に示す。
【０１９３】
クローン４０ｂの５’末端のヌクレオチドはＧである。しかし，ＩＶ．Ａ．１４．節で記述した，クローン４０ｂを単離した工程の間に単離された他の独立した５個のクローン由来のｃＤＮＡも配列決定されている。これらのクローン由来のｃＤＮＡもまた，この位置にＴを有する。このように，Ｇはクローニングの結果人工的に変化したものであることを意味し得る（ＩＶ．Ａ．１１．節の考察を参照のこと）。
【０１９４】
クローン２５ｃの５’末端はＡＣＴであるが，クローンｃｌａ（配列は示していない），およびクローン３３ｂのこの領域の配列はＴＣＡである。この違いはまた，クローン５−１−１の２８個の過剰の５’末端ヌクレオチドのように，クローニングの人工産物を意味し得る。
【０１９５】
クローン４０ｂおよび２５ｃはそれぞれ，明らかに，以前に配列決定したクローンの連続的なＯＲＦの延長であるＯＲＦを有する。クローン４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，および２５ｃにわたって延びているＯＲＦのヌクレオチド配列，および該配列においてコードされる推定ポリペプチドのアミノ酸配列を，第１５〜１７図に示す。この図では，可能性のある人工的に変化したものは配列から省かれており，その代わりに，オーバーラップする複数のクローンの非５’末端領域の対応する配列が示されている。
【０１９６】
ＩＶ．Ａ．１６．クローン３６，８１，および３２のｃＤＮＡからの複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡの調製
複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡであるＣ１００は，以下のようにして構築した。まず，クローン３６，８１，および３２由来のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて切り出した。各クローン由来のｃＤＮＡのＥｃｏＲＩフラグメントを，ベクターｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ）のＥｃｏＲＩ部位に個々にクローン化した。クローン３６，８１，および３２由来のｃＤＮＡを有する得られた組換え体ベクターを，それぞれｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／３６，ｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／８１，およびｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／３２と命名した。適当な方向性を有するｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／８１組換え体をＮａｅＩおよびＮａｒＩで切断し，大きい（約２８５０ｂｐ）フラグメントを精製した。そしてこのフラグメントを，ｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／３６から得た小さな（約５７０ｂｐ）ＮａｅＩ／ＮａｒＩ制限フラグメント精製物と連結した。このクローン３６および８１由来のｃＤＮＡの複合配列を，これらのクローンのオーバーラップしているｃＤＮＡに含まれる，連続的なＨＣＶＯＲＦを有する他のｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅベクターを作成するのに用いた。次いで，約６８０ｂｐのフラグメントを切り離すために，この新しいプラスミドをＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。次いで，このフラグメントを適当な方向性を有するｐＧＥＭ３−ｂｌｕｅ／３２プラスミドから単離した小さな（５８０ｂｐ）ＰｖｕＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントと連結した。そして，クローン３６，８１，および３２由来の複合ｃＤＮＡを，ＩＶ．Ｂ．１．節に記述されているベクターｐＳＯＤｃｆ１をＥｃｏＲＩで直線化させたものに連結し，これを細菌においてクローン５−１−１を発現するのに用いた。複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡの約１２７０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント（Ｃ１００）を有する組換え体を選択し，プラスミド由来のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し，精製した。
【０１９７】
ＩＶ．Ａ．１７．クローン  １４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，および３９ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離およびヌクレオチド配列
クローン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，および３９ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡを，ＩＶ．Ａ．１．節に記述したＨＣＶ  ｃＤＮＡのλ−ｇｔ１１ライブラリー由来のオーバーラップしたｃＤＮＡフラグメントを単離する方法により単離した。使用した方法は，ＩＶ．Ａ．３．節に記述したのと本質的に同様であった。ただし，使用したプローブは，最後に単離したクローンのヌクレオチド配列の，複合ＨＣＶ配列の５’末端および３’末端から設計されたものである。以下に記述するプローブとハイブリダイズするクローンの頻度は，それぞれの場合で約５０，０００個につき１個であった。
【０１９８】
クローン  １４ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，および３９ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的にＩＶ．Ａ．２．節に記述したのと同様にして決定した。ただし，クローン５−１−１から単離したｃＤＮＡの代わりにこれらのファージから切り出したｃＤＮＡを用いた。クローン３３ｃは，クローン４０ｂのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。クローン４０ｂのヌクレオチド配列は，第１３図に示されている。３３ｃを単離するのに用いたプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ３’。
クローン３３ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびクローン４０ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列とのオーバーラップを，第１８図に示す。この図は，該配列でコードされるアミノ酸も示す。
【０１９９】
クローン８ｈは，クローン３３ｃのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  Ｃ  ３’。
クローン８ｈのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，およびクローン３３ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列とのオーバーラップ，ならびに該配列でコードされるアミノ酸を，第１９図に示す。
【０２００】
クローン７ｅは，クローン８ｈのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ３’。
クローン７ｅのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，クローン８ｈとのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２０図に示す。
【０２０１】
クローン１４ｃは，クローン２５ｃのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。クローン２５ｃの配列を第１４図に示す。クローン１４ｃの単離に用いたプローブは，次の配列を有していた：
５’  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ  ＧＧＣ  ３’。
クローン１４ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列のクローン２５ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２１図に示す。
【０２０２】
クローン８ｆは，クローン１４ｃのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  ＴＡＡ  ３’。
クローン８ｆの  ＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列のクローン１４ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２２図に示す。
【０２０３】
クローン３３ｆは，クローン８ｆに存在するヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ３’。
クローン３３ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列のクローン８ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２３図に示す。
【０２０４】
クローン３３ｇは，クローン３３ｆのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＣＣＧ  ３’。
クローン３３ｇのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列のクローン３３ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２４図に示す。
【０２０５】
クローン７ｆは，クローン７ｅのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＴＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  Ｔ  ３’。
クローン７ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列のクローン７ｅとのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２５図に示す。
【０２０６】
クローン１１ｂは，クローン７ｆの配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＴＧＴ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ３’。
クローン１１ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列のクローン７ｆとのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２６図に示す。
【０２０７】
クローン１４ｉは，クローン１１ｂのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ３’。
クローン１４ｉのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列の１１ｂとのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２７図に示す。
【０２０８】
クローン３９ｃは，クローン３３ｇのヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＴＡ  ３’。
クローン３９ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡの配列，該配列のクローン３３ｇとのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２８図に示す。
【０２０９】
ＩＶ．Ａ．１８．ＨＣＶ  ｃＤＮＡを有する単離クローン由来の複合  ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列
複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を作成するために，前述の単離クローンのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を並べた。５’から３’の方向に並べた単離クローンは：１４ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇおよび３９ｃである。
【０２１０】
単離クローン由来の複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，および該配列でコードされるアミノ酸を，第２９〜３４図に示す。
【０２１１】
複合配列を作成するにあたり，以下の配列の異質性が考慮されている。クローン３３ｃは，クローン４０ｂおよび３７ｃのｃＤＮＡとオーバーラップする８００塩基対のＨＣＶ  ｃＤＮＡを有する。クローン３３ｃにおいては，他の５つのオーバーラップしているクローンと同様に，７８９番目のヌクレオチドはＧである。しかし，クローン３７ｂにおいては（ＩＶ．Ａ．１１．節を参照のこと），対応するヌクレオチドはＡである。この配列の違いは，該配列でそれぞれＧまたはＡに対してコードされるアミノ酸は，ＣＹＳまたはＴＹＲのいずれかであるという明らかな異質性をもたらす。この異質性は，タンパクの折りたたみに関する重要な分枝を有し得る。
【０２１２】
クローン８ｈのＨＣＶ  ｃＤＮＡの２番目のヌクレオチド残基はＴである。しかし，以下に示すように，クローン７ｅの対応する残基はＡであり；さらに，この位置のＡは，他の３つのオーバーラップしている単離クローンでも見い出される。このように，クローン８ｈのＴ残基は，クローニングの人工的な変化を意味し得る。それゆえ，第２９〜３４図では，この位置の残基は  Ａとされる。
【０２１３】
クローン８ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡの３’末端ヌクレオチドはＧである。しかし，クローン３３ｆおよび他の２つのオーバーラップするクローンの対応する残基はＴである。それゆえ，第２９〜３４図では，この位置の残基はＴとされる。
【０２１４】
クローン３３ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡの３’末端配列はＴＴＧＣである。しかし，クローン３３ｇおよび他の２つのオーバーラップするクローンの対応する配列はＡＴＴＣである。それゆえ，第２９〜３４図では，対応する領域はＡＴＴＣで示される。
【０２１５】
クローン３３ｇのＨＣＶ  ｃＤＮＡの４番目のヌクレオチド残基はＴである。しかし，クローン３３ｆおよび他の２つのオーバーラップするクローンの対応する残基はＡである。それゆえ，第２９〜３４図では，対応する残基はＡで示される。
【０２１６】
クローン１４ｉの３’末端はＡＡである。しかし，クローン１１ｂおよび他の３つのクローンの対応するジヌクレオチドはＴＡである。それゆえ，第２９〜３４図では，ＴＡ残基が示されている。
【０２１７】
他の配列の異質性の解明については，前述で考察している。
【０２１８】
複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡを調べると，該ｃＤＮＡが一つの大きなＯＲＦを有することが示される。このことは，ウイルスのゲノムが，翻訳と同時に，またはその後プロセッシングされる大きなポリペプチドに翻訳されるということを示唆する。
【０２１９】
ＩＶ．Ａ．１９．クローン  １２ｆ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，および１５ｅの  ＨＣＶ  ｃＤＮＡの単離およびヌクレオチド配列
クローン  １２ｆ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，および１５ｅのＨＣＶ  ｃＤＮＡを，本質的にＩＶ．Ａ．１７．節に記述した方法により単離した。ただし，プローブは以下に示すようであった。クローンがこのプローブとハイブリダイズする頻度は，それぞれの場合で約５０，０００個につき１個であった。これらのクローンのＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は，本質的にＩＶ．Ａ．２．節に記述したようにして決定した。ただし，クローン５−１−１から単離したｃＤＮＡの代わりに，指示したクローン由来のｃＤＮＡを用いた。
【０２２０】
第２９〜３４図のＨＣＶ  ｃＤＮＡの上流のｃＤＮＡを有するクローン１２ｆの単離は，クローン１４ｉのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＣＴＡ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ３’。
クローン１２ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，該配列のクローン１４ｉとのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第３５図に示す。
【０２２１】
第２９〜３４図のＨＣＶ  ｃＤＮＡ下流のｃＤＮＡを有するクローン３５ｆの単離は，クローン３９ｃのヌクレオチド配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ３’。
クローン３５ｆの配列，該配列のクローン３９ｃの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第３６図に示す。
【０２２２】
クローン１９ｇの単離は，クローン３５ｆの３’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＴＴＣ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ３’。
クローン１９ＧのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，該配列のクローン３５ｆの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第３７図に示す。
【０２２３】
クローン２６ｇの単離は，クローン１９ｇの３’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＴＡＧ  ＴＣＧ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ３’。
クローン２６ｇのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，該配列のクローン１９ｇの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第３８図に示す。
【０２２４】
クローン１５ｅは，クローン２６ｇの３’配列に基づいたハイブリダイゼーションプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は，次のようであった：
５’  ＣＡＣ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ３’。
クローン１５ｅのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，該配列のクローン２６ｇの配列とのオーバーラップ，および該配列でコードされるアミノ酸を，第３９図に示す。
【０２２５】
この節で記述したクローンは，ＩＩ．Ａ．節で記述した期間および条件でＡＴＣＣに寄託されており，以下の受託番号が授与されている。
【０２２６】
λ−ｇｔ１１ ＡＴＣＣ番号 寄託日
クローン１２ｆ
クローン３５ｆ
クローン１５ｅ
前述の単離クローンのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を作成するのに並べられている。５’から３’の方向に並べられた単離クローンは：１２ｆ，１４ｉ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，３３ｇ，３９ｃ，３５ｆ，１９ｇ，２６ｇ，および１５ｅである。
【０２２７】
単離クローン由来の複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，および該配列でコードされるアミノ酸を，第４０〜４６図に示す。
【０２２８】
ＩＶ．Ａ．２０．クローン１２ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列上流のｃＤＮＡ配列を単離する別の方法
上流の配列の逆転写を開始させるために，クローン１２ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の第４０〜４６図の５’ＨＣＶ配列のほとんどに基づいて，逆転写酵素の小さな合成オリゴヌクレオチドプライマーを合成し，ＨＣＶゲノムＲＮＡ中の対応する配列に結合させるのに用いる。プライマー配列はクローン１２ｆの既知の５’末端配列に近いが，プライマー配列上流のプローブ配列の設計を許容するのに十分に下流である。プライミングおよびクローニングの公知の標準法が用いられる。得られたｃＤＮＡライブラリーは，プライミング部位（クローン１２ｆの明らかにされた配列から推定される）の上流の配列を用いてスクリーニングされる。ＨＣＶゲノムＲＮＡは，ＮＡＮＢＨのチンパンジー由来の血漿または肝臓試料，またはＮＡＮＢＨのヒト由来の類似の試料のいずれかから得られる。
【０２２９】
ＩＶ．Ａ．２１．ＨＣＶゲノムの５’末端領域から配列を単離するための，尾部付加（ｔａｉｌｉｎｇ）を利用した別の方法
ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの５’最末端配列を単離するために，逆転写の初回ｃＤＮＡ生成物（これは，鋳型ＲＮＡにより二本鎖とされる）を，オリゴＣで尾部付加処理する。これは，この生成物をＣＴＰ存在下でターミナルトランスフェラーゼとインキュベートすることにより行われる。ｃＤＮＡの第一鎖の相補鎖を生成させる第２回のｃＤＮＡ合成は，逆転写酵素反応のプライマーとしてオリゴＧを用いて行われる。ゲノムＨＣＶ  ＲＮＡの材料源は，ＩＶ．Ａ．２０．節で記述したのと同様である。ターミナルトランスフェラーゼを用いた尾部付加処理，および逆転写酵素反応のための方法は，Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）と同様である。次いで，ｃＤＮＡ生成物をクローン化し，スクリーニングし，そして配列決定する。
【０２３０】
ＩＶ．Ａ．２２．ＨＣＶゲノムの３’末端領域から配列を単離するための，尾部付加を利用した別の方法
この方法は，フラビウイルスのＲＮＡのｃＤＮＡをクローニングするために以前に使用された方法に基づいている。この方法では，ＲＮＡは，３’末端の二次構造を除去するために変性条件に置かれる。そして，その後ｒＡＴＰを基質として用い，ポリＡポリメラーゼで尾部付加処理される。ポリＡを尾部付加処理したＲＮＡの逆転写は，オリゴｄＴをプライマーとして用い，逆転写酵素により触媒される。ｃＤＮＡの第２鎖を合成し，ｃＤＮＡ生成物をクローン化し，スクリーニングし，そして配列決定する。
【０２３１】
ＩＶ．Ａ．２３  大きなｃＤＮＡインサートを有するλ−ｇｔ１１  ＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーの作成
λ−ｇｔ１１ライブラリーを作成し，スクリーニングするのに用いた方法は，ＩＶ．Ａ．１．節に記述したのと本質的に同様である。ただし，ライブラリーはセファロースＣＬ−４Ｂ  カラムから溶出した大きなサイズのｃＤＮＡのプールから作成した。
【０２３２】
ＩＶ．Ａ．２４．プライマーとして合成オリゴマーを用いたＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーの作成
新しいＨＣＶ  ｃＤＮＡライブラリーは，ＩＶ．Ａ．１．節に記述した感染チンパンジーの血漿プール由来のＲＮＡから，ならびにこの感染動物の肝臓由来のポリＡ＋ＲＮＡ画分から調製されている。ｃＤＮＡは，ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）により記述されているのと本質的に同様にして構築した。ただし，最初のｃＤＮＡ鎖合成のためのプライマーは，前述のＨＣＶゲノムの配列に基づいた二つの合成オリゴマーであった。クローン１１ｂおよび７ｅの配列に基づいたプライマーは，それぞれ，
５’  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ３’
および
５’  ＡＧＴ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＧＣ  ３’
であった。得られたｃＤＮＡは，λバクテリオファージベクターにクローン化し，配列が第４０〜４６図のＨＣＶ配列に基づいた種々の他の合成オリゴマーを用いてスクリーニングした。
【０２３３】
ＩＶ．Ｂ．ＨＣＶ  ｃＤＮＡでコードされるポリペプチドの発現および発現された生成物のＨＣＶ誘導抗原としての同定
ＩＶ．Ｂ．１．クローン５−１−１においてコードされるポリペプチドの発現
クローン５−１−１においてコードされるＨＣＶポリペプチド（ＩＶ．Ａ．２．節を参照のこと，前出）を，スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）との融合ポリペプチドとして発現させた。これは，以下のように，クローン５−１−１のｃＤＮＡインサートを発現ベクターｐＳＯＤｃｆ１（Ｓｔｅｉｍｅｒら（１９８６））にサブクローン化することにより行った。
【０２３４】
まず，ｐＳＯＤｃｆ１から単離したＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理し，これらの制限酵素により作られる直線状のＤＮＡに以下のリンカーを結合させた：
５’  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＡＴＡ  Ａ      ３’
３’      ＧＡ  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＧＡＣ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＡＡ  ５’
クローニングの後，インサートを有するプラスミドを単離した。
【０２３５】
インサートを有するプラスミドを，ＥｃｏＲＩで切断した。クローン５−１−１のＨＣＶ  ｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩで切断し，このＥｃｏＲＩ直線化プラスミドＤＮＡに連結した。このＤＮＡ混合物を，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｄ１２１０株（Ｓａｄｌｅｒら（１９８０））を形質転換するのに用いた。第１図に示した，ＯＲＦの発現について正しい方向性を有する５−１−１ｃＤＮＡでの組換え体は，制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配列決定により同定した。
【０２３６】
ＩＰＴＧの存在下で細菌を生育させることにより，１個のクローン由来の組換え体細菌が，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドを発現するように誘導された。
【０２３７】
ＩＶ．Ｂ．２．クローン８１においてコードされるポリペプチドの発現
クローン８１に含まれるＨＣＶ  ｃＤＮＡを，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１融合ポリペプチドとして発現させた。この融合ポリペプチドをコードするベクターを調製するための方法は，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１をコードするベクターを作製するのに用いたのと類似の方法であった。ただし，ＨＣＶ  ｃＤＮＡの材料源はクローン８１であり，これはＩＶ．Ａ．３節で記述したように単離され，ｃＤＮＡ配列がＩＶ．Ａ．４節で記述したように決定されたものである。クローン８１のＨＣＶ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列，および該配列でコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列を，第４図に示す。
【０２３８】
クローン８１のＨＣＶ  ｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩで切断し，リンカー（ＩＶ．Ｂ．１．節を参照のこと）を有し，かつＥｃｏＲＩでの処理により直線化されたｐＳＯＤｃｆ１に連結した。このＤＮＡ混合物を，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｄ１２１０株を形質転換するのに用いた。第４図に示されるＯＲＦの発現について正しい方向でクローン８１  ＨＣＶ  ｃＤＮＡを有する組換え体を，制限酵素切断地図作製およびヌクレオチド配列決定により同定した。
【０２３９】
ＩＰＴＧの存在下で細菌を生育させることにより，１個のクローンからの組換え体細菌が，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１ポリペプチドを発現するように誘導された。
【０２４０】
ＩＶ．Ｂ．３．クローン５−１−１においてＨＣＶおよびＮＡＮＢＨ関連抗原としてコードされるポリペプチドの同定
クローン５−１−１のＨＣＶ  ｃＤＮＡ内にコードされるポリペプチドを，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーおよびヒトの血清が融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１と免疫学的に反応することを証明することにより，ＮＡＮＢＨ関連抗原として同定した。このＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１は，そのＮ末端にスーパーオキサイドジスムターゼを，そしてそのＣ末端にフレーム内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）の５−１−１抗原を有する。この同定は，以下のような“ウェスタン”ブロッティング法（Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９））により行った。
【０２４１】
ＩＶ．Ｂ．Ｉ．節で記述した，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１をコードする発現ベクターで形質転換した細菌の組換え体株を，ＩＰＴＧの存在下で生育させることにより融合ポリペプチドを発現するように誘導した。全部の細菌溶解物を，Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従って，ＳＤＳ存在下でポリアクリルアミドゲルに通して電気泳動を行った。分離されたペプチドは，ニトロセルロースフィルターに移した（Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９））。次いで，このフィルターを細片に切断し，この細片を異なるチンパンジーおよびヒトの血清と個々にインキュベートした。結合した抗体は，ＩＶ．Ａ．１．節に記述したように，１２５Ｉ−標識ヒツジ抗ヒトＩｇと共にさらにインキュベートすることにより検出した。
【０２４２】
ウェスタンブロットに用いたチンパンジー血清の特徴付け，およびオートラジオグラフィーを行った細片の写真に示される結果を，第４７〜４８図に示す。ポリペプチドを含むニトロセルロース細片を，急性ＮＡＮＢＨ（ハッチンソン株）感染（レーン１−１６），Ａ型肝炎感染（レーン１７−２４），およびＢ型肝炎感染（レーン３４−４４）の間の異なった時期におけるチンパンジーから得た血清とインキュベートした。レーン２５および４５は，陽性の対照を示す。該対照では，免疫ブロットを，λ−ｇｔ１１  ｃＤＮＡライブラリーのオリジナルスクリーニングにおいて組換え体クローン５−１−１を同定するのに用いた（ＩＶ．Ａ．１．節を参照のこと）患者由来の血清とインキュベートした。
【０２４３】
第４８図の対照レーン２５および４５における目視しうるバンドは，抗体がＳＯＤ融合ポリペプチドのＮＡＮＢ５−１−１部分に結合していることを示す。これらの抗体は，単独のＳＯＤとの結合を示さない。なぜならば，単独のＳＯＤもこれらの試料における陰性の対照として含まれており，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１融合ポリペプチドよりも有意に速く移動するバンドとして現れるからである。
【０２４４】
第４７〜４８図のレーン１−１６は，４匹のチンパンジーの血清試料中の抗体の結合を示し；この血清は，ＮＡＮＢＨに感染する直前およびその後の急性感染の期間中に得たものである。図からわかるように，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドと免疫学的に反応する抗体は，感染性のＨＣＶ接種材料の投与前および感染の急性期の早い時期に得た血清試料には存在しなかった。ところが，４匹の動物は全て，急性期後期またはその後の時期に，最終的にこのポリペプチドに対する循環抗体を誘導した。番号３および４のチンパンジーの場合の免疫ブロットで観察される付加的なバンドは，宿主の細菌タンパクに結合したバックグラウンドによるものであった。
【０２４５】
ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジー由来の血清で得られた結果とは対照的に，融合ポリペプチドのＮＡＮＢ５−１−１部分に対する抗体の発生は，ＨＡＶに感染した４匹のチンパンジーまたはＨＢＶに感染した３匹のチンパンジーでは観察されなかった。これらの場合における唯一の結合は，ＨＣＶに感染した試料でも生じる，宿主の細菌タンパクに結合したバックグラウンドであった。
【０２４６】
ウェスタンブロットに用いたヒト血清の特徴付け，およびオートラジオグラフを行った細片の写真に示される結果を，第４９〜５０図に示す。ポリペプチドを含むニトロセルロース細片を，ＮＡＮＢＨ（レーン１−２１），ＨＡＶ（レーン３３−４０），およびＨＢＶ（レーン４１−４９）に感染している間の異なった時期におけるヒトから得た血清とインキュベートした。レーン２５および５０は，陽性の対照を示す。該対照では，免疫ブロットを，前述のλ−ｇｔ１１ライブラリーのオリジナルスクリーニングで用いた患者由来の血清とインキュベートした。レーン２２−２４および２６−３２は，血清を“正常な”血液提供者から得た，“非感染の”対照を示す。
【０２４７】
第４９〜５０図からわかるように，λ−ｇｔ１１ライブラリーをスクリーニングするのに用いた血清を含む９人のＮＡＮＢＨ患者由来の血清は，融合ポリペプチドのＮＡＮＢ５−１−１部分に対する抗体を含有していた。ＮＡＮＢＨの３人の患者由来の血清は，これらの抗体を含有しなかった。これらの患者に抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体が将来発生する可能性はある。異なったＮＡＮＢＶ因子に起因するこの反応の欠如が，非反応血清を採取した個体に病気を引き起こし得ることもまた，可能である。
【０２４８】
第４９〜５０図はまた，ＨＡＶおよびＨＢＶに感染した多くの患者由来の血清が抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を含有していないこと，およびこれらの抗体は“正常な”対照由来の血清にも存在しないことも示す。あるＨＡＶ患者（レーン３６）は抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を有するように見えるが，この患者は以前にＨＣＶに感染していたということが可能である。なぜならば，ＮＡＮＢＨの発生率は非常に高く，しばしば潜在性であるからである。
【０２４９】
これらの血清学的な研究は，ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染した患者および動物由来の血清により特異的に認識されるエピトープを，クローン５−１−１のｃＤＮＡがコードすることを示している。さらに，ｃＤＮＡは霊長類のゲノム由来ではないらしい。クローン５−１−１またはクローン８１から作製されたハイブリダイゼーションプローブは，唯一のシングルコピー遺伝子が検出され得る条件下で，非感染個体由来の対照のヒトおよびチンパンジーのゲノムＤＮＡの“サザン”ブロットにハイブリダイズしなかった。これらのプローブはまた，対照のウシのゲノムＤＮＡのサザンブロットにもハイブリダイズしなかった。
【０２５０】
ＩＶ．Ｂ．４．クローン３６，８１および３２の複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡにおいてコードされるポリペプチドの発現
クローン３６，８１および３２にわたるＯＲＦでコードされるＨＣＶポリペプチドを，ＳＯＤとの融合ポリペプチドとして発現させた。これは，複合ｃＤＮＡであるＣ１００をヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する発現カセットに挿入すること，発現カセットを酵母の発現ベクターに挿入すること，および酵母でポリペプチドを発現させることにより行った。
【０２５１】
クローン３６，８１および３２由来の複合Ｃ１００  ｃＤＮＡを有する発現カセットを，約１２７０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをベクターｐＳ３−５６（ｐＳ３５６とも呼ばれる）のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより構築し，プラスミドｐＳ３−５６Ｃ１００を作製した。Ｃ１００の構築は，前述のＩＶ．Ａ．１６節に記述されている。
【０２５２】
ｐＢＲ３２２の誘導体であるベクターｐＳ３−５６は，ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子上流のＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッド酵母プロモーター，および下流のＧＡＰＤＨ転写終結信号を含む発現カセットを有する。これらの制御要素およびスーパーオキサイドジスムターゼ遺伝子を有する同様のカセットは，Ｃｏｕｓｅｎｓら（１９８７），および本発明の出願人による同時係属のヨーロッパ特許出願第１９６，０５６号（１９８６年１０月１日公開）に記載されている。しかしながら，ｐＳ３−５６のカセットはＣｏｕｓｅｎｓら（１９８７）のカセットとは異なる。ｐＳ３−５６のカセットには，異種のプロインシュリン遺伝子および免疫グロブリンのヒンジが欠失しており，かつスーパーオキサイドジスムターゼのｇｌｎ１５４にＥｃｏＲＩ部位を有するアダプター配列が続いている。このアダプターの配列は次のようである：
５’−ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＡＡ  ＴＧＡ  Ｇ      −３’
ＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴ。
ＥｃｏＲＩ部位は，カセットを有するベクターから発現する場合には，次のアミノ酸配列を有するオリゴペプチドリンカーを介してスーパーオキサイドジスムターゼに融合するポリペプチドを生じる，異種配列の挿入を可能にしている：
−ａｓｎ−ｌｅｕ−ｇｌｙ−ｉｌｅ−ａｒｇ−。
【０２５３】
ｐＳ３５６の試料は，ブタペスト条約のもとに１９８８年４月２９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５３に寄託されており，受託番号第６７６８３号が与えられている。寄託物を入手し得る期間および寄託物の入手方法，ならびに寄託物の保持については，ＮＡＮＢＶ−ｃＤＮＡを有する株についてＩＩ．Ａ．節で明記したのと同様である。この寄託は便宜のみを意図しており，本明細書の記述により本発明を実施するためのものではない。この寄託物を，参照としてここに引用する。
【０２５４】
正しい方向でＣ１００  ｃＤＮＡインサートを有する組換え体を単離した後，Ｃ１００  ｃＤＮＡを有する発現カセットをｐＳ３−５６Ｃ１００からＢａｍＨＩで切り出し，このカセットを有する約３４００ｂｐのフラグメントを単離・精製した。次いで，このフラグメントを酵母ベクターｐＡＢ２４のＢａｍＨＩ部位に挿入した。
【０２５５】
重要な特徴を第５１図に示すプラスミドｐＡＢ２４は，複製のための完全な２μ配列［Ｂｒｏａｃｈ（１９８１）］およびｐＢＲ３２２配列を有する酵母シャトルベクターである。このプラスミドは，プラスミドＹＥｐ２４［Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）］由来の酵母ＵＲＡ３遺伝子，およびプラスミドｐＣ１／１由来の酵母ＬＥＵ２ｄ遺伝子も有する。ＥＰＯ公開第１１６，２０１号公報。プラスミドｐＡＢ２４は，部分的な２μ配列を除去するためにＹＥｐ２４をＥｃｏＲＩで消化し，このベクターを再連結することにより構築した。得られたプラスミドＹＥＰ２４ｄｅｌｔａＲＩを，ＣｌａＩで切断することにより直線化し，ＣｌａＩで直線化されている完全な２μプラスミドと連結した。次いで，得られたプラスミドｐＣＢｏｕをＸｂａＩで切断し，８６０５ｂｐのベクターフラグメントをゲルで単離した。この単離されたＸｂａＩフラグメントを，ｐＣ１／１から単離されたＬＥＵ２ｄ遺伝子を有する４４６０ｂｐのＸｂａＩフラグメントと連結した。このＬＥＵ２ｄ遺伝子の方向は，ＵＲＡ３遺伝子と同じ方向である。発現の挿入は，ｐＢＲ３２２配列の唯一のＢａｍＨＩ部位であった。従って，テトラサイクリンに対する細菌の抵抗性についての遺伝子を阻止している。
【０２５６】
ＳＯＤ−Ｃ１００発現カセットを有する組換え体プラスミドｐＡＢ２４Ｃ１００−３を，酵母ＪＳＣ  ３０８株およびその他の株に導入した。細胞をＨｉｎｎｅｎら（１９７８）により記載されているように形質転換し，ｕｒａ−選択プレートにプレーティングした。単一のコロニーをｌｅｕ−選択培地に接種し，飽和状態となるまで増殖させた。この培養物は，１％グルコースを含有するＹＥＰで生育させることにより，ＳＯＤ−Ｃ１００ポリペプチド（Ｃ１００−３と呼ぶ）を発現するように誘導された。
【０２５７】
ＪＳＣ  ３０８株は，ＡＤＲ１遺伝子座に組み込まれている遺伝子型がＭＡＴ  ＠，ｌｅｕ２，ｕｒａ３（ｄｅｌ）ＤＭ１５（ＧＡＰ／ＡＤＲ１）である。ＪＳＣ  ３０８においては，正の活性化遺伝子産物ＡＤＲ１の過剰な発現は，発現された異種タンパクがＡＤＨ２  ＵＡＳ調節システムにより合成される場合には，過度の抑制解除（ｈｙｐｅｒｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＡＤＲ１野生型対照に関連する）と，そのようなタンパクの非常に高い収量とをもたらす。酵母ＪＳＣ  ３０８株の構築は，係属中の米国特許出願番号（代理人Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．２３００−０２２９）に開示されており，この特許出願を本願と同時に出願し，これを参照文献としてここに引用する。ＪＳＣ  ３０８の試料は，ブタペスト条約の下に１９８８年５月５日に，ＡＴＣＣに寄託されており，受託番号第２０８７９号が与えられている。寄託物を入手し得る期間および寄託物の入手方法，ならびに寄託物の保持については，ＨＣＶ  ｃＤＮＡを有する株についてＩＩ．Ａ．節で明記したのと同じである。
【０２５８】
ｐＡＢ２４Ｃ１００−３でコードされる完全なＣ１００−３融合ポリペプチドは，アミノ末端にヒトＳＯＤの１５４個のアミノ酸と，ＥｃｏＲＩ部位を有する合成アダプター由来の５個のアミノ酸残基と，Ｃ１００  ｃＤＮＡ由来の３６３個のアミノ酸残基と，クローン３２のＨＣＶ  ｃＤＮＡに隣接したＭＳ２ヌクレオチド配列由来の５個のカルボキシ末端アミノ酸とを有するはずである。（ＩＶ．Ａ．７．節を参照のこと）。ＳＯＤの最後から２つ目のＡｌａ残基で始まる，このポリペプチドのカルボキシ末端の推定アミノ酸配列を，第５２〜５３図に示す。このポリペプチドのこの部分をコードするヌクレオチド配列も同様に示す。
【０２５９】
ＩＶ．Ｂ．５．Ｃ１００内にコードされるポリペプチドのＮＡＮＢＨ関連抗原としての同定
酵母ＪＳＣ  ３０８株内のプラスミドｐＡＢ２４Ｃ１００−３から発現するＣ１００−３融合ポリペプチドを，サイズについて特徴付けした。そして，Ｃ１００内にコードされるポリペプチドを，その慢性ＮＡＮＢＨのヒト由来の血清との免疫学的反応性によりＮＡＮＢＨ−関連抗原として同定した。
【０２６０】
ＩＶ．Ｂ．４．節で記述したように発現するＣ１００−３ポリペプチドは，以下のようにして分析した。酵母ＪＳＣ  ３０８細胞をｐＡＢ２４またはｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形質転換し，外来プラスミドがコードするポリペプチドを発現するように誘導した。培養物（ＯＤ６５０ｎｍが約２０）１ｍｌ中の誘導酵母細胞を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによりペレットとし，それらを２容量の溶液および１容量のガラスビーズ（直径０．２ミリミクロン）とともに激しく渦巻攪拌（１０×１分）することにより細胞溶解させた。この溶液は，５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ），および１μｇ／ｍｌペプスタチンを含有していた。Ｃ１００−３ポリペプチドを含有する細胞溶解物中の不溶性物質を，遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，５分間）により集め，ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ試料緩衝液中で５分間煮沸することにより溶解させた。〔Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）を参照のこと〕。誘導された酵母培養物０．３ｍｌ中の量に相当する量のポリペプチドを，Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従い，ＳＤＳ存在下で１０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。タンパク標準物質を一緒にゲル電気泳動した。発現されたポリペプチドを含有するゲルは，クマシーブリリアントブルーで染色するか，またはｐＡＢ２４およびｐＡＢ２４Ｃ１００−３から発現されたポリペプチドの免疫学的反応性を決定するために慢性ＮＡＮＢＨの患者由来の血清を用いて，ＩＶ．Ｂ．２．節で記述したような“ウェスタン”ブロットに供した。
【０２６１】
結果を第５４図に示す。第５４図Ａでは，ポリペプチドをクマシーブリリアントブルーで染色した。ｐＡＢ２４で形質転換したＪＳＣ３０８由来の不溶性ポリペプチド，およびｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形質転換したＪＳＣの異なる二つのコロニー由来の不溶性ポリペプチドを，それぞれレーン１（ｐＡＢ２４），ならびにレーン２および３に示す。レーン２および３とレーン１との比較は，ｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形質転換したＪＳＣ  ３０８由来の分子量が約５４，０００ダルトンに相当するポリペプチドの，誘導された発現を示す。このポリペプチドは，ｐＡＢ２４で形質転換したＪＳＣ  ３０８では誘導されない。このポリペプチドを矢印で示す。
【０２６２】
第５４図（ｂ）は，ｐＡＢ２４（レーン１）またはｐＡＢ２４Ｃ１００−３（レーン２）で形質転換したＪＳＣ  ３０８で発現される，不溶性ポリペプチドのウェスタンブロットの結果を示す。ｐＡＢ２４から発現されるポリペプチドは，ＮＡＮＢＨのヒト由来の血清と免疫学的な反応性を示さなかった。しかしながら，矢印で示したように，ｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形質転換したＪＳＣ  ３０８は，ヒトＮＡＮＢＨ血清と免疫学的に反応する約５４，０００ダルトンのポリペプチドを発現した。レーン２の，免疫学的に反応性のあるその他のポリペプチドは，この約５４，０００ダルトンのポリペプチドの分解産物および／または凝集物であり得る。
【０２６３】
ＩＶ．Ｂ．６．融合ポリペプチドＣ１００−３の精製
Ｎ末端にＳＯＤを，そしてＣ末端にフレーム内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のＣ１００  ＨＣＶ−ポリペプチドを有する融合ポリペプチドＣ１００−３を，ポリペプチドが発現された宿主酵母細胞抽出物の不溶性画分を分別抽出することにより精製した。
【０２６４】
融合ポリペプチドＣ１００−３を，ＩＶ．Ｂ．４．節に記述したように，ｐＡＢ２４Ｃ１００−３で形質転換した酵母ＪＳＣ  ３０８株で発現させた。次いで，酵母細胞をホモジナイズすることにより溶解させ，溶解物中の不溶性物質をｐＨ  １２．０で抽出した。そして，残った不溶性画分中のＣ１００−３を，ＳＤＳを含有する緩衝液に可溶化した。
【０２６５】
酵母溶解物を，本質的にＮａｇａｈｕｍａら（１９８４）に従って調製した。２０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），１ｍＭ  ジチオスレイトール，および１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有する溶液（緩衝液Ａ）中に，３３％細胞（ｖ／ｖ）の割合で，酵母細胞懸濁液を調製した。この懸濁液の所定量（１５ｍｌ）を等量のガラスビーズ（直径０．４５−０．５０ｍｍ）と混合し，この混合物をＳｕｐｅｒ  Ｍｉｘｅｒ（Ｌａｂ  Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）の最高速度で８分間渦巻攪拌した。このホモジネートおよびガラスビーズを分離し，もとの細胞沈澱物と同様に，ガラスビーズを等量の緩衝液Ａで３回洗浄した。洗浄液とホモジネートとを合わせた後，ホモジネートを７，０００×ｇで１５分間，４℃で遠心分離し，ペレットをもとの細胞沈澱物の２倍量に相当する量の緩衝液Ａに再懸濁し，７，０００×ｇで１５分間遠心分離して物質を再びペレットとすることにより，溶解物中の不溶性物質を得た。この洗浄工程を３回繰り返した。
【０２６６】
溶解物からの不溶性物質は，以下のようにしてｐＨ  １２．０で抽出した。ペレットを０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液に懸濁した。ここで，懸濁液の容量は，もとの細胞沈澱物の１．８倍量に相当した。懸濁液のｐＨは，０．２容量の０．４Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  １２．０）を添加することにより調整した。混合した後，懸濁液を７，０００×ｇで１５分間，４℃で遠心分離し，上清を除去した。この抽出を２回繰り返した。抽出したペレットは，もとの細胞沈澱物の２倍量に相当する懸濁液量を用い，該ペレットを０．５Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し，次いで７，０００×ｇで１５分間，４℃で遠心分離することにより洗浄した。
【０２６７】
ペレット抽出物中のＣ１００−３ポリペプチドは，ＳＤＳで処理することにより可溶化した。このペレットをもとの細胞沈澱物の容量の０．９容量に相当する量の緩衝液Ａに懸濁し，０．１容量の２％ＳＤＳを添加した。懸濁液を混合した後，７，０００×ｇで１５分間，４℃で遠心分離した。得られたペレットをＳＤＳで３回以上抽出した。Ｃ１００−３を含有する，得られた上清をプールした。
【０２６８】
この工程により，Ｃ１００−３は酵母ホモジネートの不溶性画分から１０倍以上精製され，ポリペプチドの回収率は５０％以上を越える。融合ポリペプチドの精製調製物は，Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）に従い，ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。この分析に基づくと，ポリペプチドはその純度が８０％を越え，見かけの分子量約５４，０００ダルトンを有していた。
【０２６９】
ＩＶ．Ｃ．ＨＣＶ  ｃＤＮＡにハイブリダイズする，感染個体のＲＮＡの同定
ＩＶ．Ｃ．１．ＨＣＶ  ｃＤＮＡにハイブリダイズする，ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓内のＲＮＡの同定
以下のように，ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓由来のＲＮＡは，ノーザンブロットによりクローン８１に含有されるＨＣＶ  ｃＤＮＡとハイブリダイズする種類のＲＮＡを含有することが示された。
【０２７０】
ＲＮＡを，高力価の血漿が得られたチンパンジーの肝臓の生検材料から単離した（ＩＶ．Ａ．１．節を参照のこと）。これには，哺乳動物細胞からの全ＲＮＡの単離，ならびに該ＲＮＡのポリＡ＋画分およびポリＡ−画分への分離についてＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載された技術を用いた。これらのＲＮＡ画分を，ホルムアルデヒド／アガロースゲル（１％  ｗ／ｖ）での電気泳動に供し，ニトロセルロース膜に移した。（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２））。ニトロセルロースフィルターを，クローン８１  由来の放射性標識  ＨＣＶ  ｃＤＮＡ（インサートのヌクレオチド配列については，第４図を参照のこと）とハイブリダイズさせた。放射性標識プローブを調製するために，クローン８１から単離したＨＣＶ  ｃＤＮＡインサートを，ＤＮＡポリメラーゼＩを用いたニックトランスレーション（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２））により３２Ｐで放射性標識した。ハイブリダイゼーションは，１０％（ｗ／ｖ）デキストランスルフェート，５０％（ｗ／ｖ）脱イオン化ホルムアミド，７５０ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム，２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ６．５），０．１％ＳＤＳ，０．０２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．０２％（ｗ／ｖ）フィコール−４００，０．０２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン，１００μｇ／ｍｌの超音波処理および変性処理によりせん断したサケ精子ＤＮＡ，および１０６ＣＰＭ／ｍｌのニックトランスレーションしたｃＤＮＡプローブを含有する溶液中で１８時間，４２℃で行った。
【０２７１】
プローブで処理したフィルターのオートラジオグラフを，第５５図に示す。レーン１は，３２Ｐ−標識した制限フラグメントマーカーを含有する。レーン２−４は，以下のようなチンパンジー肝臓のＲＮＡを含有する：レーン２は，３０μｇの全ＲＮＡを含有し；レーン３は，３０μｇのポリＡ−ＲＮＡを含有し；そしてレーン４は，２０μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含有する。第５５図に示すように，ＮＡＮＢＨのチンパンジーの肝臓は，ＨＣＶ  ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズし，かつ約５０００ヌクレオチドから約１１，０００ヌクレオチドの大きさと考えられる，ポリＡ＋ＲＮＡ分子関連の異種集団を含有する。ＨＣＶ  ｃＤＮＡにハイブリダイズするこのＲＮＡは，細菌ゲノムおよび／または細菌ゲノムの特異的転写物を意味し得る。
【０２７２】
以下のＩＶ．Ｃ．２．節に記述した実験は，ＨＣＶは一つのＲＮＡゲノムを有するという示唆と一致する。
【０２７３】
ＩＶ．Ｃ．２．感染個体から得た血清中のＨＣＶ由来ＲＮＡの同定
ＩＶ．Ａ．１．節で記述したように，核酸を，高力価のチンパンジーＮＡＮＢＨ血漿から単離した粒子から抽出した。単離した核酸の一定量（もとの血漿の１ｍｌに相当する）を，２０μｌの５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．５），１ｍｍ  ＥＤＴＡ  および１６μｇ／ｍｌ酵母可溶性ＲＮＡに再懸濁した。試料は，５分間煮沸した後，直ちに凍結することにより変性させ，ＲＮａｓｅ  Ａ（５μｌ；２５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液，４０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．５）に０．１ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａを含有する）またはＤＮａｓｅＩ（５μｌ；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．５）中に１単位の  ＤＮａｓｅＩを含有する）で処理した。対照の試料は，酵素なしでインキュベートした。インキュベーションの後，２μｇ／ｍｌ酵母可溶性ＲＮＡを含有する２３０μｌの氷冷２×ＳＳＣを添加し，試料をニトロセルロースフィルターで濾過した。このフィルターを，ニックトランスレーションにより３２Ｐ−標識したクローン８１由来のｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。第５６図は，このフィルターのオートラジオグラフを示す。ハイブリダイゼーションのシグナルは，ＤＮａｓｅ処理試料および対照試料（それぞれ，レーン２および１）で検出されたが，ＲＮａｓｅで処理した試料（レーン３）では検出されなかった。このように，ＲＮａｓｅ  Ａ処理により粒子から単離した核酸が分解され，ＤＮａｓｅ処理は何の影響もなかったので，この証拠により，ＨＣＶゲノムがＲＮＡにより構成されるということが強く示唆される。
【０２７４】
ＩＶ．Ｃ．３．ＮＡＮＢＨを有するチンパンジーから得られる肝臓および血漿試料におけるＨＣＶ核酸配列由来の増幅ＨＣＶ核酸配列の検出
ＮＡＮＢＨを有するチンパンジーの肝臓および血漿中に存在するＨＣＶ核酸，および対照のチンパンジーにおけるＨＣＶ核酸は，基本的にＳａｉｋｉら（１９８６）が記述したポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の手法を用いて増幅された。このプライマーオリゴヌクレオチドは，クローン８１，あるいはクローン３６および３７におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来であった。この増幅された配列は，適当なｃＤＮＡオリゴマー（これは，２つのプライマーの間の領域を有するが２つのプライマーを含まない）をプローブとして用い，ゲル電気泳動およびサザンブロッティングによって検出された。
【０２７５】
増幅系によって調べられるＨＣＶ配列を含むＲＮＡ試料は，ＮＡＮＢＨを保有する３匹のチンパンジーおよび２匹の対照のチンパンジーの肝臓の生体試料から単離された。ＲＮＡ画分の単離は，ＩＶ．Ｃ．１節に記載したグアニジウムチオシアネート法により行なった。
【０２７６】
増幅系によって調べられるべきＲＮＡ試料もまた，２匹のＮＡＮＢＨ保有チンパンジーおよび１匹の対照チンパンジー，さらに対照のチンパンジーから得られる貯留した血漿から単離された。１匹の感染チンパンジーは，１０６と同等かそれを越えるＣＩＤ／ｍｌを有し，他の感染チンパンジーは，１０５と同等かそれを越えるＣＩＤ／ｍｌを有する。
【０２７７】
この核酸は，次のようにして血漿から抽出した。血漿の０．１ｍｌのもしくは０．０１ｍｌを１０μｇ／ｍｌのポリアデニル酸を含有するＴＥＮＢ／プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ溶液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．００１  Ｍ  ＥＤＴＡ，０．１  Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ，および０．５％  ＳＤＳ）で最終体積が１．０ｍｌになるように希釈し，３７℃にて６０分間インキュベートした。このプロテイナーゼＫによる分解の後，フェノール飽和ＴＥ（１０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いた抽出により，脱タンパクした。遠心分離によりフェノール層を分離し，０．１％のＳＤＳを含むＴＥＮＢで再抽出した。それぞれの抽出で得られる水相をプールし，等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール〔１：１（９９：２）〕溶液で２度抽出し，その後等容量のクロロホルム／イソアミルアルコール（９９：１）の混液を用いて，２度抽出した。遠心分離により相分離し，水相を，酢酸ナトリウムの最終濃度が０．２  Ｍとなるようにし，エタノールを２倍量添加することにより核酸を沈澱させた。沈澱した核酸は，ＳＷ４１のローターで３８Ｋにて４℃で６０分間超遠心分離を行なうことにより回収した。
【０２７８】
上記に加えて，高力価のチンパンジーの血漿およびプールされた対照の血漿のどちらか一方を，ＣｈｏｍｃｙｚｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）の方法により，５０μｇのポリＡ担体を用いて抽出した。この方法では，酸グアニジウムチオシアナート（ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）抽出を使用する。ＲＮＡを，エッペンドルフ  マイクロフュージ中で，４℃にて１０分間，１０，０００ＲＰＭにて遠心分離することにより，回収した。
【０２７９】
２つの場合においては，ＰＣＲ反応におけるｃＤＮＡの合成に先立って，プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ／フェノール法によって血漿から抽出された核酸は，さらにＳおよびＳエルチップ−Ｒ（Ｓ  Ｅｌｕｔｉｐ−Ｒ）カラムに結合させ，このカラムから溶出させることにより精製した。それに続く工程は製造者の指示により行なった。
【０２８０】
ＰＣＲ反応の鋳型として用いられたｃＤＮＡは，上述のように調製された核酸（全核酸または全ＲＮＡ）から誘導された。エタノール沈澱に続き，沈澱した核酸を乾燥し，蒸留水処理したＤＥＰＣに再懸濁した。核酸の２次構造を，試料を６５℃にて１０分間加温することによって引き離し，そして，速やかに試料を氷で冷却した。ｃＤＮＡは，肝臓，あるいは１０〜１００μｌの血漿から抽出された核酸（あるいはＲＮＡ）から得られる総チンパンジーＲＮＡ１〜３μｇを用いて合成された。この合成は逆転写酵素を利用し，製造者ＢＲＬによって詳細に述べられているプロトコールを用い，２５μｌの反応液中で行われた。ｃＤＮＡ合成用のプライマーは，後述のＰＣＲ反応でもまた利用されているプライマーであった。ｃＤＮＡ合成のすべての反応混合物には，ＲＮＡａｓｅ阻害剤であるＲＮＡＳＩＮＴＭ（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｐｒｏｍｅｇａ）を２３Ｕ含有していた。ｃＤＮＡ合成に続き，この反応混合物を水で希釈し，１０分間煮沸し，氷上ですばやく冷却した。
【０２８１】
このＰＣＲ反応は，１μｇのＲＮａｓｅ  Ａの添加を除いては，製造者（Ｃｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の指示に従って行なった。この反応は，最終容量が１００μｌとなるように行なわれた。このＰＣＲは，３７℃，７２℃，および９４℃の条件下で，３５サイクルにわたって行なわれた。
【０２８２】
ｃＤＮＡ合成用プライマーおよびＰＣＲ反応プライマーは，クローン８１，クローン３６，あるいはクローン３７ｂのいずれかにおけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列から得られた。（クローン８１，３６および３７ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，第４図，第５図および第１１図にそれぞれ示されている。）クローン８１由来の２個の１６量体プライマーの配列は次のとおりである：
５’  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  Ｇ  ３’  
および
５’  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  Ａ  ３’。
クローン３６から得られるプライマーの配列は次のとおりである：
５’  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  Ｔ  ３’。
クローン３７ｂ  から得られるプライマーの配列は次のとおりである：
５’  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  Ｃ  ３’。
このＰＣＲ反応において，このプライマーの対は，クローン８１由来の２つの１６量体プライマー対；あるいはクローン３６由来の１６量体プライマーとクローン３７ｂ由来の１６量体プライマーとの対のいずれによっても構成される。
【０２８３】
このＰＣＲ反応生産物は，該生産物をアルカリゲル電気泳動にかけサザンブロッティングを行い，プライマーと重複しないＨＣＶ  ｃＤＮＡ領域由来の３２Ｐ標識内部のオリゴヌクレオチドプローブにより増幅されたＨＣＶ−ｃＤＮＡ配列を検出することによって分析された。このＰＣＲ反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し，核酸を，塩およびエタノールを用いて水相から沈澱さた。沈澱させた核酸を遠心分離で回収し，蒸留水に溶解させた。試料の一部は，１．８％アルカリアガロースゲルで電気泳動を行った。６０，１０８および１６１のヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡを，分子量マーカーとして，同時に電気泳動にかけた。電気泳動後，このゲル中のＤＮＡを，Ｂｉｏｒａｄ  Ｚｅｔａ  ＰｒｏｂｅＴＭ紙に移した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション，および洗浄条件は，製造者（Ｂｉｏｒａｄ）によって規定される条件に従った。
【０２８４】
増幅されたＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列のハイブリダイゼーション検出に用いられたプローブは次のとおりである。ＰＣＲプライマーの対がクローン８１由来であるときには，２つのプライマーの配列の間の領域に位置する配列に対応する配列を有する１０８量体であった。このＰＣＲプライマー対がクローン３６および３７ｂ由来であるとき，このプローブはクローン３５由来の，ニック翻訳されたＨＣＶ  ｃＤＮＡ挿入物であった。このプライマーはクローン３７挿入物の１５５〜１７０ヌクレオチドおよびクローン３６挿入物の２０６〜２６８ヌクレオチド由来である。クローン３５におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ挿入物の３’末端は，クローン３６の挿入物の１〜１８６のヌクレオチドと重複しており，そして，クローン３５挿入物の５’末端はクローン３７ｂの挿入物の２０７〜２６９ヌクレオチドと重複する。（第５，第８，および第１１図を比較されたい。）このように，クローン３５中のｃＤＮＡの挿入物は，クローン３６および３７ｂ由来のプライマーの配列間の領域部分にまでおよび，これらプライマーを含む増幅配列のためのプローブとして有用である。
【０２８５】
肝臓試料由来のＲＮＡの分析は，プライマーおよびプローブの両セットを利用する上記方法に従って行なった。３匹のＮＡＮＢＨ保有チンパンジーの肝臓由来のＲＮＡは，予期されるサイズの増幅配列（８１および３６および３７ｂにおいて，それぞれ１６１および５８６ヌクレオチド）については，ハイブリダイゼーションの結果が陽性であり，他方，対照のチンパンジーについては，ハイブリダイゼーションの結果が陰性であった。この実験を３回繰りかえしたところ同じ結果が得られた。
【０２８６】
血漿から得られる核酸およびＲＮＡの分析もまた，クローン８１由来のプライマーおよびプローブを利用する上記方法により行なわれた。この血漿は，２匹のＮＡＮＢＨ保有チンパンジー由来の血漿，対照のチンパンジー由来の血漿，そして対照のチンパンジーから得られるプールされた血漿である。両ＮＡＮＢＨ血漿は，核酸／ＲＮＡを有し，ＰＣＲ増幅アッセイで陽性の結果が得られ，他方，両対照血漿は陰性の結果が得られた。これらの結果は数回繰り返して得られた。
【０２８７】
ＩＶ．Ｄ．感染個体由来の血清中のＨＣＶ抗体を検出するためのラジオイムノアッセイ
ＨＣＶ抗原に対する抗体を検出する固相ラジオイムノアッセイは，ＴｓｕおよびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ（１９８０）の方法を基にして開発された。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２，Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌｓｔｒｉｐｓ）をＨＣＶエピトープを有する精製ポリペプチドで被覆する。この被覆プレートは，ＨＣＶエピトープに対する抗体を有する疑いのあるヒト血清試料，あるいは適当な対照試料とともにインキュベートされる。インキュベートを行なう間に，抗体が存在するのであれば，該抗体は固相抗原に免疫学的に結合する。非結合物質を除去し，そしてこのマイクロタイタープレートを洗浄後，ヒト抗体−ＮＡＮＢＶ抗原複合体は，１２５Ｉ標識ヒツジ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベートすることによって検出される。結合しなかった標識抗体を吸引によって除去し，そしてプレートを洗浄する。個々のウェルの放射能が測定される。結合ヒト抗ＨＣＶ抗体の量はウェル中の放射能に比例する。
【０２８８】
ＩＶ．Ｄ．１．融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１の精製
ＩＶ．Ｂ．１．節に記載の組換え体細菌中で発現する融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１は，組換え体Ｅ．ｃｏｌｉから，尿素で細胞抽出物を分画抽出することによって，次いで，次のように陰イオンおよび陽イオン交換カラムでのクロマトグラフィーにかけることによって精製された。
【０２８９】
１リッターの培養物から得られる溶解細胞を，０．０１Ｍ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０  ，を含有する１０ｍｌの２０％（Ｗ／Ｖ）シュークロース中に再懸濁し，０．４ｍｌの０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，を添加した。０℃にて５分後，この混合物を４，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。得られたペレットを０．０５Ｍ  トリス−ＨＣＬ，ｐＨ  ８．０，１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およびペプスタチンＡ  １μｇを含有する１０ｍｌの２５％（Ｗ／Ｖ）シュークロース液に懸濁させ，次いで，０．５ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し，０℃で１０分間インキュベートした。０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  中に１％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ−１００を含む溶液１０ｍｌを添加後，この混合液を，時々振盪しながらひきつづき０℃にて１０分間インキュベートした。得られた粘稠な溶液を，２０ゲージの滅菌皮下注射針を６回通すことにより，ホモジナイズし，１３，０００×ｇにて２５分間遠心分離した。ペレット化した物質を，０．０１Ｍ  トリス−  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５ｍｌに懸濁させ，この懸濁液を，４，０００×ｇにて１０分間遠心分離した。ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１融合タンパクを含有するペレットを，０．０２Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭジチオスレイトール（緩衝液Ａ）中に６Ｍ尿素を含む溶液５ｍｌに溶解させ，緩衝液Ａで平衡化したＱ−セファロース  ファースト  フローカラムにかけた。ポリペプチドは，緩衝液ＡのＮａＣｌ中０．０〜０．３Ｍのリニアグラジエントで溶出した。溶出後，各画分を，ＳＯＤの存在下，ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分析し，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１の含量を決定した。このポリペプチドを含有する画分をプールし，０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０），１ｍＭジオチスレイトール，に６Ｍ尿素を含む緩衝液（緩衝液Ｂ）に対して透析した。この透析試料を，緩衝液Ｂで平衡化したＳ−セファロース  ファースト  フローカラムにかけ，ポリペプチドを緩衝液Ｂ中でＮａＣｌ  ０．０〜０．３  Ｍのリニアグラジエントで溶出させた。この画分を，ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１の存在を調べ，適当な画分をプールした。このＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドの最終調製物を，ＳＤＳの存在下で，ポリアクリルアミド電気泳動にかけて調べた。この分析によれば，この調製物は，８０％を越える純度であった。
【０２９０】
ＩＶ．Ｄ．２  融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１の精製
ＩＶ．Ｂ．２．節で記載の組換え体細菌中で発現した融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１は，組換え体Ｅ．ｃｏｌｉから，尿素を用いた細胞抽出物の分画抽出により，次いで，融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１を単離するために記載された工程（ＩＶ．Ｄ．１．節を参照されたい）を用いて，陰イオンおよび陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行なうことにより精製された。
【０２９１】
ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１ポリペプチドの最終調製物は，ＳＤＳの存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べられた。この分析によれば，この調製物は５０％を越える純度であった。
【０２９２】
ＩＶ．Ｄ．３．固相ラジオイムノアッセイによるＨＣＶエピトープに対する抗体の検出
ＮＡＮＢＨを有すると診断された３２人の患者から得られる血清試料を，ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって分析し，融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１中に存在するＨＣＶエピトープに対する抗体が検出されるか否か決定した。
【０２９３】
マイクロタイタープレートをＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１あるいはＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１（それぞれ，ＩＶ．Ｄ．１節およびＩＶ．Ｄ．２節に従って，部分精製されている）で被覆した。この分析は，次のようにして行なわれた。
【０２９４】
０．１２５  Ｍホウ酸緩衝液，ｐＨ８．３，０．０７５  Ｍ  ＮａＣｌ（ＢＢＳ）中  に０．１〜０．５μｇのＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１あるいはＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１を含む１００μｌを，マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２  Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐｓ）の各ウェルに添加した。このプレートを湿潤チャンバー内で４℃にて一晩インキュベートし，その後，このタンパク溶液を除去し，０．０２％トリトンＸ−１００を含有するＢＢＳ（ＢＢＳＴ）で３度このウェルを洗浄した。非特異的な結合を防ぐために，このウェルを牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で被覆した。この操作は，ＢＳＡを５ｍｇ／ｍｌの割合でＢＢＳに溶解させた溶液１００μｌ添加し，次いで，室温で１時間インキュベートすることによって行なった。このインキュベートの後，ＢＳＡ溶液を除去した。被覆されたウェル中のポリペプチドを血清と反応させ，該血清含有ウェルを３７℃にて１時間インキュベートした。上記血清との反応は，１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含有する含０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ＰＢＳ）中に１：１００の割合に希釈された血清試料１００μｌを添加することにより行なった。インキュベートの後，この血清試料を吸引除去し，このウェルをＢＢＳＴで５回洗浄した。この融合ポリペプチドに結合した抗ＮＡＮＢ５−１−１およびＮＡＮＢ８１は，１２５Ｉ標識Ｆ’（ａｂ）２ヒツジ抗ヒトＩｇＧをこの被覆ウェルに結合させることにより，決定された。標識プローブ（比活性５〜２０μＣｉ／μｇ）１００μｌを各ウェルに添加し，このプレートを，３７℃にて１時間インキュベートした。次いで，過剰のプローブを吸引除去し，ＢＢＳＴで５回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量を，γ線を検出するカウンターでカウントし決定した。
【０２９５】
ＮＡＮＢＨ保有個体における抗ＮＡＮＢ５−１−１および抗ＮＡＮＢ８１の検出結果を，表１および表２に示す。
【０２９６】
【表１】
2006104207.tif 000005
【０２９７】
【表２】
2006104207.tif 000006
表１および表２からわかるように，ＮＡＮＢＨを保有していると診断された患者か
ら得られた３２の血清のうち１９が，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１に存在するＨＣＶエピトープに対する抗体について陽性であった。
【０２９８】
しかし，陽性であった血清試料は，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１と同様に免疫学的に反応性を有しているわけではなかった。Ｎｏ．１の患者から得られた血清試料は，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１に対しては陽性であったがＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１に対しては陽性ではなかった。Ｎｏ．１０，１５および１７の患者から得られた血清試料はＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１に対しては陽性であったが，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１に対しては陽性ではなかった。Ｎｏ．３，８，１１および１２の患者から得られた血清試料はＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１の両融合ポリペプチドと同程度に反応するが，これに対してＮｏ．２，４，７および９の患者から得られる血清試料においては，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１に対するよりもＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１に対する反応の方が，２〜３倍反応性が高かった。これらの結果によりＮＡＮＢ５−１−１およびＮＡＮＢ８１が少なくとも３個の異なるエピトープを有し得ることが示唆される。つまり，各ポリペプチドが少なくとも１個の独特のエピトープを有し，そして，２個のポリペプチドが少なくとも１個のエピトープを共有していることが可能である。
【０２９９】
ＩＶ．Ｄ．４．ＮＡＮＢＨについての固相ＲＩＡの特異性
ＮＡＮＢＨについての固相ＲＩＡの特異性は，ＨＡＶあるいはＨＢＶに感染した患者から得られる血清および対照個体から得られる血清の分析を行なうことにより試験された。部分精製されたＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１を使用する分析は，実施例ＩＶ．Ｄ．３節に記載した方法により行なわれた。但し，血清は，ＨＡＶあるいはＨＢＶを有しているとあらかじめ診断された患者から得られた血清であるか，あるいは血液バンクの提血者である個体から得られた血清である。ＨＡＶおよびＨＢＶ感染患者からの血清についての結果を表１および表２に示す。ＨＡＶ感染患者から得られた１１個の血清試料，およびＨＢＶ感染患者から得られた２０個の血清試料を用いて，ＲＩＡにより試験が行なわれた。表１および表２に示すように，これら血清のいずれもがＢＢ−ＮＡＮＢＶエピトープを有する融合ポリペプチドとの陽性の免疫反応を行わなかった。
【０３００】
ＮＡＮＢ５−１−１抗原を用いたＲＩＡが，対照個体から得られる血清の免疫学的反応性を決定するために用いられた。正常血液提供者集団から得られる２３０個の血清検体のかち，２個だけがＲＩＡにおいて陽性反応を示した（データは示されていない）。これら血清サンプルの源である２人の血液提供者は，以前にＨＣＶにさらされた可能性がある。
【０３０１】
ＩＶ．Ｄ．５．ＮＡＮＢＨ感染進行中におけるＮＡＮＢ５−１−１の反応性
２人の患者および４匹のチンパンジーのＮＡＮＢＨ感染進行中における抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体の存在が，ＩＶ．Ｄ．３節に記載されたＲＩＡ法を用いて追跡された。さらに，感染チンパンジーにおいて，ＨＡＶおよびＨＢＶの感染進行中における抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体の有無を決定するためにＲＩＡが用いられた。
【０３０２】
その結果を表３および表４に示す。この結果により，チンパンジーおよびヒトにおいては，抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体は，ＮＡＮＢＨ感染の急性症状の発現に従って検出された。抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体は，ＨＡＶあるいはＨＢＶに感染したチンパンジーから得られる血清試料では検出されなかった。このように，抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体は，個体がＨＣＶにさらされたことを示すマーカーとしての働きを有する。
【０３０３】
【表３】
2006104207.tif 000007
【０３０４】
【表４】
2006104207.tif 000008
【０３０５】
ＩＶ．Ｅ．ＮＡＮＢ５−１−１に対するポリクローナル血清抗体の精製
ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチドと，ＮＡＮＢＨの患者由来の血清試料中の抗体との特異的な免疫学的反応性に基づいて，ＮＡＮＢ５−１−１中のエピトープと免疫学的に反応する血清抗体の精製法が開発された。この方法はアフィニティークロマトグラフィーを利用する方法である。精製されたＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１ポリペプチド（ＩＶ．Ｄ．１．節参照）を，不溶性の支持体に結合させたが，その結合は，固定されたポリペプチドが，ＮＡＮＢ５−１−１に対する抗体の親和性を保持するような結合である。血清試料中の抗体は，マトリックスに結合したポリペプチドに吸収される。洗浄して，非特異的に結合した物質と未結合の物質を除去した後，ｐＨの変更および／またはカオトロピック試薬（例えば尿素）によって，結合した抗体を，これが結合しているＳＯＤ−ＨＣＶポリペプチドから脱離させる。
【０３０６】
結合ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１を含有するニトロセルロース膜を下記のようにして調製した。ニトロセルロースの膜〔２．１ｃｍのザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ），微細孔の径：０．２μｍ〕を，ＢＢＳで３分間ずつ３回洗浄した。精製した製剤を，ＢＢＳ中，室温で２時間かまたは４℃で一夜インキュベートすることによってＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１を上記の膜に結合させた。未結合の抗原を含有する溶液を除去し，フィルターをＢＢＳで３分間ずつ３回洗浄した。膜に残っている活性部位を，５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液とともに３０分間インキュベートすることにより，ＢＳＡでブロックした。得られた膜を，ＢＢＳで５回，蒸留水で３回洗浄して，過剰のＢＳＡを除去した。ウイルス抗原とＢＳＡを含有する膜を，次に，０．０５Ｍの塩酸グリシン（ｐＨ  ２．５），０．１０Ｍ  ＮａＣｌ（Ｇｌｙ  ＨＣｌ）で１５分間処理し，次いでＰＢＳで３分間ずつ３回洗浄した。
【０３０７】
ＮＡＮＢＨに感染した個体由来の血清との融合ポリペプチドを含有する膜を，２時間インキュベートすることによって，ポリクローナル抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を単離した。インキュベーション後，フィルターをＢＢＳで５回，蒸留水で２回洗浄した。次いで結合している抗体を，各フィルターから，ＧｌｙＨＣｌを５回，３分間ずつ用いて溶離した。各溶離液を，２．０ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）の入っている試験管に集めて，溶離液のｐＨを８．０に調整した。アフィニティークロマトグラフィーで処理した後の抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体の回収率は約５０％である。
【０３０８】
結合ウイルス抗原を含有するニトロセルロース膜は，結合容量はそれほど減少することなしに数回使用することができる。膜を再使用するには，抗体を溶離した後，膜をＢＢＳで３回３分間ずつ洗浄する。次いでＢＢＳ中，４℃で貯蔵する。
【０３０９】
ＩＶ．Ｆ．精製ヒトポリクローナル抗−ＨＣＶ抗体を用いて感染血漿からＨＣＶ粒子を捕獲する方法；捕獲された粒子中の核酸のＨＣＶ  ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション
ＩＶ．Ｆ．１．ヒトポリクローナル抗−ＨＣＶ抗体を用いて感染血漿からＨＣＶ粒子を捕獲する方法
ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの感染性血漿中に存在するタンパク−核酸複合ｆ
体を，ポリスチレンビーズに結合させた精製ヒトポリクローナル抗ＨＣＶ抗体を用
いて精製した。
【０３１０】
ポリクローナル抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体は，クローン５−１−１にコードされたＳＯＤ−ＨＣＶポリペプチドを用いて，ＮＡＮＢＨに感染したヒト由来の血清から精製した。精製法はＩＶ．Ｅ．節に記載の方法を用いた。
【０３１１】
精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を，ポリスチレンビーズ（直径１／４”，鏡面仕上げ，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｂａｌｌ  Ｃｏ．，シカゴ，イリノイ）に，各々，室温で一夜，１ｍｌの抗体〔ホウ酸緩衝食塩水（ｐＨ  ８．５）中１μｇ／ｍｌ〕とともにインキュベートすることによって結合させた。一夜インキュベーションした後に，ビーズを，ＴＢＳＴ（５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０  緩衝液，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１回洗浄し，次に１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を全ヒト免疫グロブリンと取替えること以外は，同様にして対照のビーズを調製した。
【０３１２】
ビーズに結合させた抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を用いて，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの血漿から，ＨＣＶを次のようにして捕獲した。使用した，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの血漿についてはＩＶ．Ａ．１．節に記載してある。ＮＡＮＢＶに感染したチンパンジーの血漿の一部（１ｍｌ）を，抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体または対照の免疫グロブリンでコートした５個のビーズの各々と，３７℃で３時間インキュベートした。得られたビーズをＴＢＳＴで３回洗浄した。
【０３１３】
ＩＶ．Ｆ．２．捕獲された粒子中の核酸のＮＡＮＢＶ−ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーション
抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体によって捕獲された粒子から遊離した核酸成分を，クローン８１由来のＨＣＶ  ｃＤＮＡとハイブダイゼーションさせて分析した。
【０３１４】
ＩＶ．Ｆ．１．節に記載したのと同様にして，ＨＣＶ粒子をＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの血清から捕獲した。該粒子から核酸を遊離させるために，洗浄したビーズを，プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ），１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５  緩衝液，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ，１０μｇ／ｍｌの可溶性酵母ＲＮＡを含有する溶液の  ０．２ｍｌ／ビーズとともに，３７℃で６０分間インキュベートし，次いで上澄み溶液を取出した。この上澄み液をフェノールとクロロホルムで抽出し，次いで核酸をエタノールで，一夜−２０℃にて沈殿させた。この核酸の沈殿を，遠心分離して集め，乾燥し，５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．５  に溶解させた。抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体でコートされたビーズから得た試料および全ヒト免疫グロブリンを含有する対照ビーズで得た試料からの可溶性核酸の二つの部分をニトロセルロースフィルターに吸い取らせた。これらのフィルターを，クローン８１中の精製ＨＣＶ  ｃＤＮＡ断片で作製した，３２Ｐで標識し，ニックトランスレーションを行ったプローブとハイブッドさせた。プローブ調製法およびハイブリダイゼーション法は，ＩＶ．Ｃ．１．節に記載してある。
【０３１５】
抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を含有するビーズによって捕獲された粒子由来の核酸を含有するプローブされたフィルターのオートラジオグラフを第５７図に示す。抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を用いて得た抽出物（Ａ，Ａ）から，対照の抗体抽出物（Ａ，Ａ）および対照の酵母  ＲＮＡ（Ｂ，Ｂ）に比べて明確なハイブリダイゼーションシグナルを得た。精製クローン８１  ｃＤＮＡ断片の１ｐｇ，５ｐｇおよび１０ｐｇからなる標準物をそれぞれＣ１−３に示す。
【０３１６】
これらの結果は，抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体によってＮＡＮＢＨ血漿から捕獲された粒子が，クローン８１内のＨＣＶ  ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションする核酸を含有することを示し，その結果これらのクローン中のｃＤＮＡは，ＮＡＮＢＨの病原体から誘導されるという別の証拠を提供している。
【０３１７】
ＩＶ．Ｇ．Ｃ１００−３と精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体との免疫学的反応性
Ｃ１００−３融合ポリペプチドと抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体との免疫学的反応性を，放射性免疫検定法によって測定したが，この検定法では，固相に結合した抗原が，精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体に投与され，生成した抗原抗体複合物が，１２Ｉで標識したヒツジ抗ヒト抗体で検出された。Ｃ１００−３ポリペプチドの免疫学的反応性を，ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１抗原のそれと比較した。
【０３１８】
融合ポリペプチドＣ１００−３を，ＩＶ．Ｂ．５．節とＩＶ．Ｂ．６．節にそれぞれ記載したのと同様にして合成し精製した。融合ポリペプチドＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１をＩＶ．Ｂ．１．節とＩＶ．Ｄ．１．節にそれぞれ記載したのと同様にして合成し精製した。精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体を，ＩＶ．Ｅ．節に記載したのと同様にして得た。
【０３１９】
０．１２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．３），０．０７５Ｍ  ＮａＣｌ（ＢＢＳ）中，種々の量の精製Ｃ１００−３抗原を含有する１００μｌのアリコットを，マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ２  Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐｓ）の各ウェルに添加した。このプレートを加湿チャンバー内で，一夜４℃にてインキュペートした。次いでタンパク溶液を除き，ウェルを０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有のＢＢＳ（ＢＢＳＴ）で３回洗浄した。非特異的結合を防止するために，５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＢＢＳ溶液を１００μｌ添加することによって，ウェルをＢＳＡでコートし，次いで室温で１時間インキュベートした後，過剰のＢＳＡ溶液を除去した。ウェル当り１μｇの抗体を添加することによって，コートされたウェル内のポリペプチドを，精製抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体と反応させ，次いでその試料を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後，過剰の溶液を吸引によって除去し，ウェルをＢＢＳＴで５回洗浄した。１２Ｉで標識したＦ’（ａｂ）２ヒツジ抗ヒトＩｇＧを，コートされたウェルに結合させることによって，融合ポリペプチドに結合した抗ＮＡＮＢ５−１−１を測定した。標識したプローブ（比放射能：５〜２０μＣｉ／ｍｇ）の１００μｌずつを各ウェルに添加し，そのプローブを３７℃で１時間インキュベートし，過剰のプローブを吸引で除去し，ＢＢＳＴで５回洗浄した。各ウェルに結合した放射能の量は，γ線を検出するカウンターで計数することによって測定した。
【０３２０】
Ｃ１００の精製抗ＮＡＮＢ５−１−１との免疫学的反応性を，ＮＡＮＢ５−１−１の精製抗体との免疫学的反応性と比較した結果を表５に示す。
【０３２１】
【表５】
2006104207.tif 000009
表５の結果は，抗ＮＡＮＢ５−１−１が，Ｃ１００−３ポリペプチドのＣ１００の部分内のエピトープを認識するということを示している。したがってＮＡＮＢ５−１−１とＣ１００は共通のエピトープをもっている。これらの結果は，このＮＡＮＢＶエピトープをコードするｃＤＮＡ配列が，クローン５−１−１とクローン８１の両者に存在する配列であるということを示唆している。
【０３２２】
ＩＶ．Ｈ．ＨＣＶの特性決定
ＩＶ．Ｈ．１．ＨＣＶゲノムのストランドの状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）の特性決定
抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体でコートしたポリスチレンビーズに捕獲された粒子から核酸の画分を単離し，次に単離した核酸が，ＨＣＶ  ｃＤＮＡの正鎖および／または負鎖とハイブリダイゼーションするか否かを測定することによって，ＨＣＶゲノムをそのストランドの状態について特性決定した。
【０３２３】
ＩＶ．Ｆ．１．節に記載したようにして，免疫学的に精製した抗ＮＡＮＢ５−１−１抗体でコートしたポリスチレンビーズを用いて，ＨＣＶに感染したチンパンジーの血漿から，粒子を捕獲した。粒子の核酸成分を，ＩＶ．Ｆ．２．節に記載した方法を用いて遊離させた。３ｍｌの高力価血漿と当量の単離されたゲノム核酸のアリコットを，ニトロセルロースフィルターに吸い取らせた。対照として，クローン８１由来の変性ＨＣＶ  ｃＤＮＡ（２ｐｇ）のアリコットを同じフィルターに吸い取らせた。そのフィルターを，ＨＣＶ  ｃＤＮＡからクローン化された一本鎖ＤＮＡの，正鎖または負鎖の３２Ｐで標識した混合物でプローブした。なお該ｃＤＮＡは，クローン４０ｂ，８１および２５ｃから切り出されたものである。
【０３２４】
ＥｃｏＲＩでクローン８１，４０ｂおよび２５ｃからＨＣＶ  ｃＤＮＡを切り出し，そのｃＤＮＡ断片をＭ１３ベクターのｍｐ１８とｍｐ１９内でクローン化することによって，一本鎖のプローブを得た〔メシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）１９８３年〕。そのＭ１３クローンの塩基配列を決定し，そのクローンがＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来のＤＮＡの正鎖もしくは負鎖をもっているかどうかを決定した。塩基配列の決定は，サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ）（１９７７年）のジデオキシチェーンターミネーション法で行った。
【０３２５】
捕獲された粒子から単離されたＨＣＶゲノムの一部を含有する二重のフィルターの各セットを，ＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来の正鎖または負鎖のプローブとハイブリダイゼーションさせた。第５８〜６０図は，ＮＡＮＢＶゲノムを，クローン８１，４０ｂおよび２５ｃ由来のプローブの混合物でプローブして得たオートラジオグラフを示す。この混合物は，ハイブリダイゼーション検定法の感度を増大させるために用いた。パネルＩの試料を，正鎖プローブの混合物とハイブリダイゼーションさせた。パネルＩＩの試料を，負鎖のプローブ混合物でハイブリダイゼーションさせることによってプローブした。免疫ブロット法に付したパネルの試料を表６に示す。
【０３２６】
【表６】
2006104207.tif 000010
第５８〜６０図の結果から分かるように，負鎖のＤＮＡプローブだけが，単離されたＨＣＶゲノムとハイブリダイゼーションする。この結果は，ゲノムがＲＮａｓｅには感受性であるがＤＮａｓｅには感受性でないという結果（ＩＶ．Ｃ．２．節参照）と併せて，ＮＡＮＢＶ  のゲノムが正鎖のＲＮＡであることを示唆している。
【０３２７】
これらのデータと，推定上のＮＡＮＢＶの物理化学的性質に関する他の実験室のデータは，ＨＣＶがフラビウイルス科に属する可能性があることを示している。しかし，ＨＣＶが，新種のウイルス因子に相当する可能性も無視できなかった。
【０３２８】
ＩＶ．Ｈ．２．ＰＣＲ  で増幅された場合，クローン８１由来のＨＣＶ  ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションする捕獲粒子の塩基配列の検出法
捕獲粒子のＲＮＡを，ＩＶ．Ｈ．１．節に記載したのと同様にして得た。クローン８１由来のＨＣＶ  ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションする塩基配列の分析を，第ＩＶ．Ｃ．３節に記載したのと同様にしてＰＣＲ  増幅法を利用して行ったが，ハイブリダイゼーションプローブはクローン８１  ｃＤＮＡ塩基配列由来のキナーゼで活性化されたオリゴヌクレオチドを用いた。試験結果は，増幅された塩基配列がクローン８１由来のＨＣＶ  ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションすることを示した。
【０３２９】
ＩＶ．Ｈ．３  デング熱フラビウイルス（ＭＮＷＷＶＤ１）の非構造タンパクと，３９Ｃに結合されたクローン１４ｉ  のＯＲＦによってコードされるＨＣＶポリペプチドとの間の相同性
３９Ｃによって結合されたクローン１４ｉのＨＣＶ  ｃＤＮＡは，第２９〜３４図に示すように一つの連続ＯＲＦを含有している。これにコードされたポリペプチドを，デング熱フラビウイルス（ＭＮＷＶＤ１）の非構造ポリペプチドの領域との配列相同性について分析した。この分析は，デイホッフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）のタンパクデータベースを用い，コンピュータで行った。結果を第６１図に示すが，図中，記号（：）は厳密な相同性を示し，記号（．）は塩基配列が若干置換されていることを示し，ダッシュ記号は，最大の相同性を得るため塩基配列中に挿入されたスペースを示す。この図から分かるように，ＨＣＶ  ｃＤＮＡにコードされた塩基配列と，デング熱フラビウイルス非構造タンパクとの間には有意な相同性がある。第６１図に示す相同性に加えて，ｃＤＮＡの３’末端の領域にコードされたポリペプチドセグメントには，分析した結果，デング熱ポリメラーゼの塩基配列と相同性の塩基配列が含まれていた。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対して必須であると考えられる標準的なＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（ＧＤＤ）配列が，ＨＣＶ  ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドに含まれ，その位置がデング熱２ウイルス内の位置と一致しているということは重要なことである（データは記載していない）。
【０３３０】
ＩＶ．Ｈ．４．ＨＣＶ−ＤＮＡは，ＮＡＮＢＨに感染した組織内には検出できない
２種の研究結果は，ＨＣＶ−ＤＮＡが，ＮＡＮＢＨに感染した個体由来の組織内には検出できないことを示唆している。これらの結果は，ＩＶ．Ｃ．とＩＶ．Ｈ．１．とＩＶ．Ｈ．２．の各節に記載した結果と併せて，ＨＣＶがＤＮＡを含有するウイルスではなく，その複製にはｃＤＮＡを含まないという証拠を提供している。
【０３３１】
ＩＶ．Ｈ．４．ａ．サザンブロット法
ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの肝臓が，検出可能なＨＣＶ−ＤＮＡ（もしくはＨＣＶ−ｃＤＮＡ）を含有しているか否かを決定するために，この起源から単離したＤＮＡの制限酵素による断片をサザンブロット法に付して，ブロット物を３２Ｐで標識したＨＣＶ  ｃＤＮＡでプローブした。上記の標識したＨＣＶ  ｃＤＮＡは，感染チンパンジーの肝臓由来のブロットされたＤＮＡとハイブリダイゼーションをしないという結果を示した。また同じ標識ＨＣＶ  ｃＤＮＡは，正常なチンパンジーの肝臓由来の対照のブロットされたＤＮＡともハイブリダイゼーションをしなかった。これに対して，陽性対照においては，β−インターフェロン遺伝子の標識したプローブが，制御酵素で切断したヒト胎盤ＤＮＡのサザンブロット法に付したものと強くハイブリダイゼーションした。これらの系は，標識したプローブで検出すべき遺伝子の単一コピーを検出するために設計された。
【０３３２】
ＮＡＮＢＨに感染した２頭のチンパンジーの肝臓からＤＮＡを単離した。対照のＤＮＡを，未感染のチンパンジー肝臓とヒト胎盤から単離した。ＤＮＡの抽出は，基本的にはマニアティスら（１９８２年）の方法によって行い，そのＤＮＡ試料は，単離工程中，ＲＮＡｓｅで処理した。
【０３３３】
各ＤＮＡ試料は，メーカーの説明書に従って，ＥｃｏＲＩ，ＭｂｏＩまたはＨｉｎｃＩＩ（１２μｇ）で処理した。切断したＤＮＡを１％中性寒天ゲルで電気泳動し，ニトロセルロース上にサザンブロットし，次いでブロットされた物質は，適当なニックトランスレーションされたプローブｃＤＮＡとハイブリダイゼーションした（３×１０ｃｐｍ／ｍｌのハイブリダイゼーションミックス）。感染チンパンジーの肝臓と正常な肝臓由来のＤＮＡは，クローン３６と８１由来の３２Ｐで標識したＨＣＶ  ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションし，またヒト胎盤由来のＤＮＡはβ−インターフェロン遺伝子由来の３２Ｐで標識したＤＮＡとハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後，ブロットしたものを，厳密条件下，すなわち，０．１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液を用い６５℃で洗浄した。
【０３３４】
β−インターフェロン遺伝子ＤＮＡを，ホートンら（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ）（１９８１年）が記述しているのと同様にして調製した。
【０３３５】
ＩＶ．Ｈ．４．ｂ．ＰＣＲ法による増幅
ＨＣＶ−ＤＮＡが，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの肝臓内に検出できるか否かを決定するために，ＤＮＡをその組織から単離し，プライマーとクローン８１のＨＣＶ  ｃＤＮＡ由来のプローブポリヌクレオチドを用いて，ＰＣＲ増幅検出法に付した。陰性対照は，未感染ＨｅｐＧ２組織の培養細胞と，未感染と思われるヒト胎盤とから単離したＤＮＡ試料を用いた。陽性対照は，陰性対照にクローン８１由来のＨＣＶ  ｃＤＮＡ挿入物の比較的少ない既知量（２５０分子）を添加した試料を用いた。
【０３３６】
さらに，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの同じ肝臓から単離したＲＮＡ画分が，ＨＣＶ−ｃＤＮＡプローブに対して相補的な配列をもっていることを確認するために，ＰＣＲ増幅検出法を，単離したＲＮＡ試料にも用いた。
【０３３７】
この研究では，ＤＮＡはＩＶ．Ｈ．４．ａ節に記載の方法で単離し，ＲＮＡは，チャーギンら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ）（１９８１年）が記述しているのと同様にして抽出した。
【０３３８】
ＤＮＡの試料を，２頭の感染チンパンジーの肝臓，未感染のＨｅｐＧ２細胞およびヒト胎盤から単離した。各ＤＮＡの１μｇをメーカーの説明書にしたがってＨｉｎｄＩＩＩで切断した。逆転写酵素工程を省略したことを除いて，ＩＶ．Ｃ．３節に記載と基本的に同様にして，上記の切断試料を，ＰＣＲ増幅法に付し，増幅したＨＣＶ  ｃＤＮＡを検出した。ＰＣＲプライマーとプローブは，ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローン８１由来のものであり，ＩＶ．Ｃ．３．節に記載されている。増幅する前に，陽性対照については，各ＤＮＡの試料１μｇは，クローン８１から単離したＨＣＶ  ｃＤＮＡ挿入物の２５０分子を添加することによって「スパイク」された。
【０３３９】
ＨＣＶ配列が，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジーの肝臓から単離したＲＮＡに存在しているか否かを決定するために，０．４μｇの全ＲＮＡを含有する試料を，陰性対照試料のいくつかから逆転写酵素の工程を省略すること以外は，ＩＶ．Ｃ．３．節に記載したのと同様の増幅法に付した。ＰＣＲプライマーとプローブは，上記の記載と同様に，ＨＣＶ  ｃＤＮＡクローン８１由来のものであった。
【０３４０】
その結果，ＨＣＶ  ｃＤＮＡプローブに相補的な増幅された配列は，感染チンパンジーの肝臓由来のＤＮＡ中には検出できず，また陰性対照にも検出できなかった。これとは異なり，感染チンパンジーの肝臓由来のＤＮＡを含む試料が増幅される前にＨＣＶ  ｃＤＮＡでスパイクされた場合，クローン８１の配列がすべての陽性対照の試料に検出された。さらに，ＲＮＡの研究では，増幅されたＨＣＶ  ｃＤＮＡクローン８１の配列が，逆転写酵素を用いた時にのみ検出されたが，これは，この結果がＤＮＡ汚染が原因でないことを強く示唆している。
【０３４１】
これらの結果は，ＮＡＮＢＨに感染したチンパンジー由来の肝細胞が，ＨＣＶＤＮＡを全く含有しないか，または検出不可能な濃度で含有していることを示している。スパイク法の研究によれば，ＨＣＶＤＮＡが存在する場合，それは０．０６コピー／肝細胞よりはるかに低い濃度である。これに対し，同じ肝臓試料由来の全ＲＮＡのＨＣＶ配列は，ＰＣＲ法によって容易に検出された。
【０３４２】
ＩＶ．Ｉ．試験抗原としてＨＣＶ  ｃ１００−３を用いる，ＨＣＶ感染のＥＬＩＳＡ  法による決定
全試料を，ＨＣＶ  ｃ１００−３  ＥＬＩＳＡ法を用いて検定した。この検定法は，ＨＣＶ  ｃ１００−３抗原（ＩＶ．Ｂ．５節に記載したのと同様にして合成し精製した）と，マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体とを利用する。
【０３４３】
ＨＣＶ  ｃ１００−３抗原でコートしたプレートを次のようにして調製した。コーティング緩衝液（５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム，ｐＨ９．０）の２１ｍｌ／プレート，ＢＳＡ（２５μｇ／ｍｌ）およびｃ１００−３（２．５０μｇ／ｍｌ）を含有する溶液を，Ｒｅｍｏｖｅａｗｅｌｌ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  Ｉプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）に添加する直前に調製した。５分間混合後，上記溶液０．２ｍｌ／ウェルをプレートに添加した。プレートをカバーし２時間３７℃でインキュベートし，次いで溶液を吸引して除去した。ウェルを４００μｌの洗浄緩衝液〔１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），１４０ｍＭ塩化ナトリウム，０．１％（Ｗ／Ｖ）カゼイン，１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ〕で１回洗浄した。洗浄液を除いた後，後コート溶液２００μｌ／ウェル〔１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２），１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．１％（Ｗ／Ｖ）カゼインおよび２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）〕を添加し，プレートをゆるくカバーして蒸発を防止し，室温で３０分間放置した。次にウェルから吸引して溶液を除き，保存加熱せずに一夜凍結乾燥した。得られたプレートを，密封したアルミニウムパウチ内に２〜８℃で貯蔵する。
【０３４４】
ＥＬＩＳＡ法で決定するために，２０μｌの血清試料または対照試料を，２００μｌの試料希釈剤〔１００  ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），５００ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％（Ｗ／Ｖ）カゼイン，０．０１５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｈｅｒｏｓａｌ），１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１００μｇ／ｍｌ酵母エキス〕の入ったウェルに添加した。プレートを密封し，３７℃で２時間インキュベートし，その後溶液を吸引して除き，４００μｌの洗浄緩衝液〔０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）〕でウェルを洗浄した。洗浄したウェルを，２００μｌのマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ  複合体を含有する，オルト複合体希釈剤〔１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２），１５０ｍＭ塩化ナトリウム，５０％（Ｖ／Ｖ）胎仔ウシ血清，１％（Ｖ／Ｖ）熱処理ウマ血清，１ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．０２％（Ｗ／Ｖ）Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ〕の溶液で処理した。３７℃で１時間処理を行い，溶液を吸引によって除去し，ウェルを洗浄緩衝液で洗い，緩衝液を吸引で除去した。結合した酵素接合体の量を測定するために，２００μｌの基質溶液（１０ｍｇの０−フェニレンジアミン二塩酸塩／５ｍｌの展開剤溶液）を添加した。展開剤溶液は，リン酸によってｐＨ５．１に調節された５０ｍＭのクエン酸ナトリウムと，０．６μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を含有している。基質溶液が入ったプレートを，暗所内で，３０分間室温でインキュベートし，反応は５０μｌ／ｍｌの４Ｎ硫酸を添加して停止させ，ＯＤを測定した。
【０３４５】
下記の実施例は，ＨＣＶ  Ｃ１００−３抗原を利用するマイクロタイタープレートのスクリーニングＥＬＩＳＡ法が高い特異性を有することを示す。このことは，初期反応率が約１％で，反復反応率が任意のドナーについて約０．５％であることによって証明されている。この検定法は，感染の急性期後および疾患の慢性期の両方における免疫応答を検出することができる。さらに，この検定法は，ＮＡＮＢＨに対する代理試験についてマイナスの評価をされているいくつかの試料を検出することができる。なおこれらの試料は，ＮＡＮＢＨの病歴を持つ個体またはＮＡＮＢＨ伝染に関係があるドナー由来のものである。
【０３４６】
以下の実施例では，次の略号が用いられる。
【０３４７】
ＡＬＴ              アラニンアミノ転移酵素
抗−ＨＢｃ          ＨＢｃに対する抗体
抗−ＨＢｓＡｇ    ＨＢｓＡｇに対する抗体
ＨＢｃ              Ｂ型肝炎コア抗原
ＡＢｓＡｇ        Ｂ型肝炎表面抗原
ＩｇＧ              免疫グロブリンＧ
ＩｇＭ              免疫グロブリンＭ
ＩＵ／Ｌ            国際単位／ｌ
ＮＡ                入手不能
ＮＴ                試験せず
Ｎ                  試料の大きさ
Ｎｅｇ            陰性
ＯＤ                光学密度
Ｐｏｓ            陽性
Ｓ／ＣＯ          シグナル／カットオフ
ＳＤ                標準偏差
ｘ                  平均値
ＷＮＬ            標準限界内。
【０３４８】
ＩＶ．Ｉ．１．任意のドナー集団におけるＨＣＶの感染
任意のドナーから得た１，０５６試料（新鮮な血清）を，Ｉｒｗｉｎ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｄ（米国，カリフォルニア州，サンフランシスコ）から得た。これらの試料によって得た試験結果を，ＯＤ値の分布を示すヒストグラムにまとめる。（第６２図）。第６２図から分かるように，４試料が３より大きい値を示し，１試料が１と３の間，５試料が０．４と１の間，および残りの１，０４６試料が０．４より小さい値を示し，これらの試料の９０％以上が０．１より小さい。
【０３４９】
反応性であった任意試料についての試験結果を表７に示す。平均値＋５標準偏差に等しいカットオフ値を用いた場合，１，０５６試料中の１０試料（０．９５％）が最初反応性であった。これらの試料中５試料（０．４７％）は，前記のＥＬＩＳＡ法を用いて２回目の検定を行ったところ繰り返し反応性を示した。また表７は，繰り返し反応性を示した各試料に対してＡＬＴおよび抗ＨＢｄ状態を示している。特に興味深いのは，繰り返し反応性であった５試料全部が，ＮＡＮＢＨに対する両代理試験で陰性であり，一方ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡ法では陽性であったということである。
【０３５０】
【表７】
2006104207.tif 000011
【０３５１】
ＩＶ．Ｉ．２．チンパンジー血清試料
１１匹のチンパンジーから得た血清試料を，ＨＣＶ  ｃ１００−３を用いたＥＬＩＳＡ法により試験した。これらのチンパンジーのうち４匹には，疾患管理センター（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ）のＤａｎｉｅｌ  Ｂｒａｄｌｅｙ博士と共同して確立された方法に従って，第ＶＩＩＩ因子の汚染バッチに由来する  ＮＡＮＢＨ（お  くは，ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）株であると推測される）を感染させた。対照として，他の４匹のチンパンジーにはＨＡＶを，そして３匹にはＨＢＶを感染させた。血清試料は，感染後の様々な時期に採取した。
【０３５２】
これらの結果は，表８および表９に要約されているが，ハッチンソン株のＮＡＮＢＨ  に感染させたすべてのチンパンジーにおいて実証された抗体の血清転換を示している。感染の急性期（ＡＬＴレベルが有意に上昇し，続いて正常レベルに戻ることから示される）の後は，ＨＣＶ  ｃ１００−３に対する抗体がＮＡＮＢＨに感染させた４匹のチンパンジーのうち４匹の血清中で検出し得るようになった。これら試料は，すでにＩＶ．Ｂ．３節で考察したように，ウェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析および放射性免疫検定法（ＲＩＡ）により陽性であることが示されている。これとは対照的に，ＨＡＶまたはＨＢＶに感染させた対照のチンパンジーはＥＬＩＳＡ法における反応性を示した。
【０３５３】
【表８】
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【０３５４】
【表９】
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【０３５５】
ＩＶ．Ｉ．３．パネル１：慢性ヒトＮＡＮＢＨキャリアから得られた保証感染性血清
コードされたパネルは，２２個の独自の試料から構成されていた。ただし，これらの試料は，各々につき二重検定を行うので，合計で４４個であった。これらの試料は，慢性ＮＡＮＢＨキャリアから得た保証感染性血清，関係供血者から得た感染性血清，および急性ＮＡＮＢＨ患者から得た感染性血清からのものであった。さらに，非常に由来が明確な陰性対照群，および他の疾患対照群からも試料を得た。このパネルは，国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙ−ｌａｎｄ）のＨｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ部のＨ．Ａｌｔｅｒ博士から提供された。このパネルは，数年前にＡｌｔｅｒ博士により構築され，推定ＮＡＮＢＨ検定の適合パネルとして，Ａｌｔｅｒ博士により使用されてきた。
【０３５６】
上記の全パネルをＥＬＩＳＡ法で２度分析し，その結果を評価するためにＡｌｔｅｒ博士に送付した。評価の結果を表１０に示す。この表には，二重検定の一方の組の結果が示されているが，二重検定試料の各々について同じ値が得られた。
【０３５７】
表１０に示すように，チンパンジーモデルにおいて感染性であると証明された６個の血清は非常に陽性であった。７番目の感染性血清は，急性ＮＡＮＢＨの場合の試料に対応しており，このＥＬＩＳＡにおいて反応性ではなかった。正常ＡＬＴレベルを有し，かつチンパンジーでの研究結果が不明確であった関係供血者から得た試料は，上記の分析において反応性ではなかった。急性ＮＡＮＢＨの１個体から得た３個の他の一連の試料も反応性ではなかった。非常に由来が明確な陰性対照群からの全ての試料は，少なくとも１０回の献血で肝炎の疑いがなかった供血者から得たものであるが，上記のＥＬＩＳＡにおいて反応性ではなかった。最後に，検査試料のうち４個は，他人により開発された推定ＮＡＮＢＨ検定において陽性であると以前は評価されていたが，これらの分析では確定できなかった。これらの４個の試料は上記のＨＣＶ  ＥＬＩＳＡ法では陰性と判定された。
【０３５８】
【表１０】
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【０３５９】
ＩＶ．Ｉ．４．パネル２：供血者／受血者のＮＡＮＢＨ
前記のコードされたパネルは，輸血に関連するＮＡＮＢＨについて供血者および受血者が明確な１０事例からなり，試料の合計は１８８であった。各事例は，受血者に対する数人またはすべての供血者の試料，およびこの受血者から得た（輸血後，３ヵ月，６ヵ月，および１２ヵ月目に採血した）一連の試料からなるものであった。また，輸血前に予め受血者から採血された血液試料も含まれていた。コードされたパネルは，ＮＩＨのＨ．Ａｌｔｅｒ博士により提供されたものであり，結果は評価を行うために同博士へ送付した。
【０３６０】
これらの結果は，表１１に要約したが，ＥＬＩＳＡ法により，輸血に関連するＮＡＮＢＨの１０事例のうち９事例において，抗体血清転換が検出されたことを示している。事例４の試料（血清転換が全く検出されなかった）は，前記ＥＬＩＳＡ法において，一貫して反応性に乏しかった。１０個の受血者試料のうち２個は，輸血後３ヵ月で反応性があった。１２ヵ月では，事例４を除いて，すべての試料が反応性であった。さらに，少なくとも１人の抗体陽性供血者が１０事例のうち７事例に見い出され，事例１０には２人の陽性供血者が存在した。また，事例１０では，輸血前に採血した受血者の血液はＨＣＶ抗体について陽性であった。この受血者から得た１ヵ月目の採血試料は反応性レベルの境界線まで低下したが，４ヵ月および１０ヵ月目の採血試料では陽性レベルにまで上昇した。一般に，Ｓ／ＣＯが０．４であれば，陽性であると考えられる。従って，この事例では，個体が事前にＨＣＶ感染していたことを示している。
【０３６１】
反応性である（すなわち，陽性である）すべての試料に対するＡＬＴおよびＨＢｃの状態を表１２に要約する。この表から明らかなように，供血者試料の１／８は，代理マーカーに対しては陰性であったが，ＨＣＶ抗体ＥＬＩＳＡ法では反応性であった。他方，受血者試料（輸血後１２ヵ月まで引き続き採血された）は，高いＡＬＴを有するか，または抗ＨＢｃが陽性であるか，あるいはその両方であった。
【０３６２】
【表１１】
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【０３６３】
【表１２】
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【０３６４】
ＩＶ．Ｉ．５．高危険率グループの試料におけるＨＣＶ感染の決定
高危険率グループから得られた試料は，ＨＣＶ  ｃ１００−３抗原に対する反応性を決定するＥＬＩＳＡ法を用いてモニターされた。これらの試料は，Ｇａｒｙ  Ｔｅｇｔｍｅｉｅｒ博士（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ）から得られた。結果を表１３に要約する。
【０３６５】
この表に示されているように，反応性の最も高い試料は，血友病者から得られる（７６％）。さらに，ＡＬＴが上昇し，抗ＨＢｃについて陽性の個体から得られた試料は，５１％が反応性であると評価されたが，この値は，臨床データから予想される値と一致しており，このグループ内にはＮＡＮＢＨが流行していた。ＨＣＶに対する抗体の発生率は，ＡＬＴが高いだけの供血者，Ｂ型肝炎コアに対する抗体について陽性であるだけの供血者，そして任意の志願供血者に比べてＡＬＴが高いか，あるいは抗コア抗体を有するということ以外の理由で拒否された供血者においても高かった。
【０３６６】
【表１３】
2006104207.tif 000017
【０３６７】
ＩＶ．Ｉ．６．ＨＣＶ  ｃ１００−３  ＥＬＩＳＡ法における第２抗体として抗ＩｇＧ または抗ＩｇＭ  モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いた比較研究
抗ＩｇＧモノクローナル複合体を用いたＥＬＩＳＡ法の測定感度は，抗ＩｇＭモノクローナル複合体を用いるか，あるいはこれら両者をＨ鎖およびＬ鎖の両方に特異的であると報告されたポリクローナル抗血清で置き換えることにより得られる測定感度と比較された。以下の研究が行われた。
【０３６８】
ＩＶ．Ｉ．６．ａ．血清転換者から得られた一連の試料
ＮＡＮＢ血清転換者の３つの事例から得られた一連の試料を，ＨＣＶ  ｃ１００−３  ＥＬＩＳＡ法で研究した。このＥＬＩＳＡ法では，酵素複合体に抗ＩｇＧモノクローナル抗体だけを用いるか，または抗ＩｇＭモノクローナル抗体と組合わせて用いるか，あるいはポリクローナル抗血清を用いた。これらの試料は，Ｃｌａｄｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ  博士（Ｎ．Ｙ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．Ｃ．，Ｎ．Ｙ．）により提供された。試料の歴史を表１４に示す。
【０３６９】
抗ＩｇＧモノクローナル抗体−酵素複合体を用いて得られた結果を表１５に示す。これらのデータは，事例１，２，および３の各試料１−４，２−８，および３−５において，最初に強い反応性が検出されることを示している。
【０３７０】
抗ＩｇＧモノクローナル複合体および抗ＩｇＭ複合体の組合わせを用いて得られた結果を表１６に示す。抗ＩｇＭに対する抗ＩｇＧの３つの異なる割合で試験した；抗ＩｇＧの希釈率１：１０，０００は終始一定であった。抗ＩｇＭモノクローナル複合体の試験された希釈率は，１：３０，０００，１：６０，０００，および１：１２０，０００であった。これらのデータは，抗ＩｇＧだけを用いた研究と同様に，試料１−４，２−８，および３−５において，最初の強い反応性が検出されることを示している。
【０３７１】
抗ＩｇＧモノクローナル複合体（希釈率１：１０，０００），またはＴａｇｏポリクローナル複合体（希釈率１：８０，０００），あるいはＪａｃｋｓｏｎポリクローナル複合体（希釈率１：８０，０００）を用いたＥＬＩＳＡ法で得られた結果を表１７に示す。これらのデータは，３種類の形態をすべて用いると，試料１−４，２−８，および３−５において，最初の強い反応性が検出されることを示している：Ｔａｇｏのポリクローナル抗体は最も低いシグナルを与えた。
【０３７２】
上に与えた結果は，（ＡＬＴ上昇により明らかとなる）疾患の急性期後の同時期に，３種類の形態により，反応性の試料が検出されることを示している。また，これらの結果は，抗ＩｇＧモノクローナル−酵素複合体を用いたＨＣＶ  ｃ１００−３ＥＬＩＳＡ法の感度が，該酵素複合体について試験された他の形態と同等またはそれ以上であることを示している。
【０３７３】
【表１４】
2006104207.tif 000018
【０３７４】
【表１５】
2006104207.tif 000019
【０３７５】
【表１６】
2006104207.tif 000020
【０３７６】
【表１７】
2006104207.tif 000021
【０３７７】
ＩＶ．Ｉ．６．ｂ．任意抽出の供血者から得られた試料
任意抽出の供血者から得られた試料（ＩＶ．Ｉ．１．節参照）を，ＨＣＶ感染について，ＨＣＶ  ｃ１００−３  ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。このとき，抗体−酵素複合体は，抗ＩｇＧモノクローム複合体またはポリクローナル複合体のいずれかであった。スクリーニングされた試料の総数は，ポリクローナル複合体およびモノクローナル複合体に対して，それぞれ１０７７個および１０５６個であった。スクリーニング結果の要約を表１８に示す。また，試料の分布を第６３図のヒストグラムに示す。
【０３７８】
平均値および標準偏差の計算は，シグナルが１．５を超えるような試料を除いて行った。すなわち，ポリクローナル複合体を利用した場合の計算には１０７３個のＯＤ値を用い，抗ＩｇＧモノクローナル複合体を利用した場合の計算には１０５１個のＯＤ値を用いた。表１５から明らかなように，ポリクローナル複合体を用いた場合には，平均値が０．０４９３から０．０９３１にシフトし，標準偏差は０．０７４から０．０９３３に増加した。また，これらの結果は，ｘ＋５ＳＤという基準を用いて分析のカットオフ値を定義すれば，ＥＬＩＳＡ法におけるポリクローナル酵素複合体の形態が，より高いカットオフ値を必要とすることを示している。このことは，モノクローナル系に比べて分析特異性が低いことを示している。さらに，第６３図のヒストグラムから明らかなように，抗ＩｇＧモノクローナル複合体を用いたＥＬＩＳＡ法で任意抽出の供血者をスクリーニングした場合には，市販のポリクローナル標識を用いた分析に比べて，陰性および陽性の結果の分布間が大きく分離する。
【０３７９】
【表１８】
2006104207.tif 000022
【０３８０】
ＩＶ．Ｊ．様々な地域のＮＡＮＢＨ患者におけるＨＣＶ血清転換の検出
高いＡＬＴ値に基づくとＮＡＮＢＨ保持の疑いがあるが，ＨＡＶおよびＨＢＶ試験においては陰性である患者から得られた血清を，ＨＣＶ  ｃ１００−３抗原をマイクロタイタープレートのスクリーニング抗原として用いたこと以外は実質的にＩＶ．Ｄ．節で述べたように，ＲＩＡ法を用いてスクリーニングした。表１９に示された結果から明らかなように，ＲＩＡにより，陽性試料が高い割合で検出された。
【０３８１】
【表１９】
2006104207.tif 000023
【０３８２】
ＩＶ．Ｋ．「集団獲得型」ＮＡＮＢＨの患者におけるＨＣＶ血清転換の検出
明白でない（すなわち，輸血，静脈注射による薬剤使用，乱婚などが危険因子として同定されない）１００人のＮＡＮＢＨ患者から得た血清は，Ｍ．Ａｌｔｅｒ博士（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＪ．Ｄｉｅｕｓｔａｇ  博士（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供された。これらの試料を，ＨＣＶ  ｃ１００−３抗原をマイクロタイタープレートに付着させるスクリーニング用抗原として用いたこと以外は実質的にＩＶ．Ｄ．節で述べたように，ＲＩＡ法を用いてスクリーニングした。得られた結果は，１００個の血清試料のうち５５個の試料が，ＨＣＶ  ｃ１００−３抗原と免疫学的に反応する抗体を有することを示した。
【０３８３】
上述の結果は，「集団獲得型」ＮＡＮＢＨもまた，ＨＣＶにより引き起こされることを示唆している。また，ＨＣＶがフラビウイルス属（その大部分は節足動物により伝染する）と関係のあることがここで示されているので，「集団獲得型」の場合におけるＨＣＶの伝染もまた，節足動物による伝染に起因することが示唆される。
【０３８４】
ＩＶ．Ｌ．ＮＡＮＢＨの伝染に関係のある供血者のＨＣＶ抗体および代用マーカーの発生率の比較
ＮＡＮＢＨ陽性の疑いのある供血者から輸血され，ＮＡＮＢＨとなった受血者が，抗ＨＣＶ抗体陽性に血清転換するかどうかを決定し得る見込みがある研究を実施した。ＮＡＮＢＨ感染のマーカーとして現在使われている代用マーカー（すなわち，高いＡＬＴ値および抗コア抗体の存在）の異常について供血者を試験した。さらに，抗ＨＣＶ抗体の存在についても供血者を試験した。抗ＨＣＶ抗体の存在は，ＩＶ．Ｋ．節で述べた放射性免疫検定法を用いて決定した。この研究の結果を表２０に示す。この表には以下の項目が示されている：患者の番号（第１列）；患者の血清中における抗ＨＣＶ抗体の存在（第２列）；患者の輸血回数，各輸血は異なる供血者によるものである（第３列）；供血者の血清中における抗ＨＣＶ抗体の存在（第４列）；そして，供血者の代用マーカーの異常（第５列）（ＮＴ，すなわち…試験していないことを意味する）（ＡＬＴは高いトランスアミナーゼであり，抗ＨＢｃは抗コア抗体である）。
【０３８５】
表２０の結果は，ＨＣＶ抗体試験が，感染供血者を検出するのに，代用マーカー試験より正確であることを示している。ＮＡＮＢＨの症状を示す１０人の患者のうち９人を試験したところ，抗ＨＣＶ抗体血清転換に関して陽性であった。陽性の疑いのある１１人の供血者のうち（ＮＡＮＢＨキャリアである疑いのある２人の別々の個体から輸血されたのは患者６であるが），９人は抗ＨＣＶ抗体に関して陽性であり，１人は陽性の境界線上であり，（患者１に対する供血者は）不明確であった。これに対し，高ＡＬＴ試験を用いると，１０人の供血者のうち６人が陰性であり，抗コア抗体試験を用いると，１０人の供血者のうち５人が陰性であった。しかしながら，非常に重要なことは，３つの場合（患者８，患者９，および患者１０に対する供血者の場合）において，ＡＬＴ試験および抗ＨＢｃ試験の結果が一致しなかったことである。
【０３８６】
【表２０】
2006104207.tif 000024
【０３８７】
ＩＶ．Ｍ．フラビウイルスのゲノム配列の保存領域から誘導されたＰＣＲおよびプライ
マーを利用したＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列のクローニングの増幅
ＨＣＶがフラビウイルスまたはフラビ様ウイルスであることを示唆している上記の結果は，ＰＣＲ技術と，フラビウイルスの保存アミノ酸配列をコードする領域から誘導されたプライマーとを利用して，特徴付けられていないＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列をクローニングすることを可能にする。一般に，プライマーの一方は定義されたＨＣＶゲノム配列から誘導され，配列決定されていないＨＣＶポリヌクレオチド領域に隣接する他方のプライマーはフラビウイルスゲノムの保存領域から誘導される。フラビウイルスゲノムは，フラビウイルスゲノムの５’側領域にコードされるＮＳ１ポリペプチドおよびＥポリペプチド内に保存配列を有することが知られている。これらの領域をコードする対応配列は，第２９〜３４図に示すＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の上流にある。従って，ＨＣＶゲノムのこの領域から誘導されたｃＤＮＡ配列を単離するには，これらのフラビウイルスポリペプチド内の保存配列から誘導される上流プライマーが設計される。下流プライマーはＨＣＶ  ｃＤＮＡの既知部分の上流側端部から誘導される。
【０３８８】
コードが縮重しているので，フラビウイルスプローブと，対応するＨＣＶゲノム配列との間には不一致が存在し得る。従って，Ｌｅｅ（１９８８）により述べられた方法と同様の方法を用いる。Ｌｅｅの方法は，アミノ酸配列の逆転写産物に相補的な混合オリゴヌクレオチドプライマーを利用する；混合プライマーの配列は保存アミノ酸配列に関するすべてのコドン縮重を考慮したものである。
【０３８９】
３組のプライマー混合物は，デング熱−２，４（Ｄ−２，４），日本脳炎（ＪＥＶ），黄熱病（ＹＦ），および西ナイルウイルス（ＷＮ）を包含する数種のフラビウイルスに見い出されるアミノ酸相同性に基づいて生じたものである。最も上流の保存配列から誘導されたプライマー混合物（５’−１）はアミノ酸配列ｇｌｙ−ｔｒｐ−ｇｌｙに基づいており，このアミノ酸配列は，Ｄ−２Ｐ  ＪＥＶ，ＹＥ，およびＷＮのＥタンパク中に見い出される保存配列ａｓｐ−ａｒｇ−ｇｌｙ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ａｓｐＮの一部である。次のプライマー混合物（５’−２）はＥタンパク中にある下流保存配列ｐｈｅ−ａｓｐ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｉｌｅｕ−ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｉｌｅｕに基づいており，ｐｈｅ−ｇｌｙ−ａｓｐから誘導される；保存配列は，Ｄ−２，ＪＥＶ，ＹＥ，およびＷＮに存在する。第３のプライマー混合物（５’−３）はアミノ酸配列ａｒｇ−ｓｅｒ−ｃｙｓに基づいており，このアミノ酸配列は，Ｄ−２，Ｄ−４，ＪＥＶ，ＹＦ，およびＷＮのＮＳ１タンパク中にある保存配列ｃｙｓ−ｃｙｓ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｃｙｓの一部である。５’−３中で混合物を形成する各プライマーを第６４図に示す。保存領域から誘導された様々な配列に加えて，各混合物中の各プライマーもまた，制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｍｂｏ  Ｉ，およびＥｃｏＲＩに対す部位をコードする配列を含む５’末端の定常領域を有する。
【０３９０】
下流プライマーｓｓｃ５ｈ２０Ａはクローン５ｈのヌクレオチド配列から誘導されており，この配列はクローン１４ｉおよび１１ｂの配列と重複する配列を有するＨＣＶ  ｃＤＮＡを含む。ｓｓｃ５ｈ２０Ａの配列は，    ５’  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡ  ３’  である。他方のプライマーｓｓｃ５ｈ３４Ａもまた，使用し得る。このプライマーはクローン５ｈの配列から誘導され，さらに制限酵素部位を形成する５’末端のヌクレオチドを有する。従って，クローニングが容易になる。ｓｓｃ５ｈ３４Ａの配列は，    ５’  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  Ａ  ３’である。
【０３９１】
Ｓａｉｋｉら（１９８６）により最初に述べられたＰＣＲ反応は，ｃＤＮＡの鋳型が，ＩＶ．Ｃ．２．節で述べたようにＨＣＶ感染したチンパンジーの肝臓から単離されたＲＮＡであるか，あるいはＩＶ．Ａ節で述べたようにＨＣＶ感染したチンパンジー血清から単離されたウイルス粒子から単離されたＲＮＡであること以外は，実質的にＬｅｅら（１９８８）が述べたようにして行われる。さらに，アニール条件は第１回目の増幅ではあまり厳密でなくてもよい（０．６Ｍ  ＮａＣｌ，および２５℃）。なぜなら，ＨＣＶ配列とアニールするプライマー部分は，わずか９個のヌクレオチドであり，不一致が存在し得るからである。また，ｓｓｃ５ｈ３４Ａを用いた場合には，ＨＣＶゲノムから誘導されなかった付加配列はプライマー−鋳型ハイブリッドを不安定化する傾向がある。第１回目の増幅後は，アニール条件は非常に厳密である（０．０６６ＭＮａＣｌ，および３２℃〜３７℃）。なぜなら，増幅される配列は，この段階では，プライマーに相補的な領域またはプライマーの重複部分である領域を有するからである。さらに，最初の１０サイクルの増幅は，クレノー酵素Ｉを用い，この酵素に適したＰＣＲ条件下で実施される。これらのサイクルが完了した後，試料を抽出し，Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒにより供給されているキット指示書に従って，Ｔａｇポリメラーゼで処理する。
【０３９２】
増幅後，増幅されたＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列は，クローン５ｈから誘導されたプローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出される。このプローブは，プライマーを誘導するのに用いた配列の上流にある配列から誘導されるが，プライマーを誘導したクローン５ｈの配列とは重複しない。このプローブの配列は，    ５’  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＴＣ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＧＣ  ３’である。
【産業上の利用可能性】
【０３９３】
産業上の応用性
本発明は，ここに開示された様々な表現で，多くの産業上の用途を有する。これらの用途のいくつかは次のとおりである。ＨＣＶ  ｃＤＮＡは，試料中のＨＣＶ核酸を検出するためのプローブの設計に用いられる。ｃＤＮＡから誘導されたプローブは，例えば化学的な合成反応においてＨＣＶ核酸を検出するのに用いられる。これらのプローブはまた，培養細胞系または動物モデル系においてウイルスの複製を阻害する際に抗ウイルス剤の効果を決定するためのスクリーニングプログラムに用いられる。ＨＣＶポリヌクレオチドプローブは，ヒトにおいてウイルス核酸を検出するのにも有用であり，従ってヒトにおけるＨＣＶ感染の診断薬の主成分として役立ち得る。
【０３９４】
上記のことに加えて，ここで与えられるｃＤＮＡは，ＨＣＶのエピトープを有するポリペプチドを合成するための情報および手段を提供する。これらのポリペプチドはＨＣＶ抗原に対する抗体を検出するのに有用である。ＨＣＶ感染に対する一連の免疫検定法は，ＨＣＶエピトープを有する組換え体ポリペプチドに基づくものである。これらの免疫検定法は，ここで説明されており，ＮＡＮＢＨを誘発するＨＣＶを診断したり，ＨＣＶにより引き起こされる伝染性肝炎について血液銀行における供血者をスクリーニングしたり，また伝染性の供血者に由来する汚染された血液を検出したりする産業上の用途が見い出される。ウイルス抗原はまた，動物モデル系における抗ウイルス剤の効力をモニターするのにも有用である。さらに，ここに開示されたＨＣＶ  ｃＤＮＡから誘導されたポリペプチドは，ＨＣＶ感染を処置するためのワクチンとして有用である。
【０３９５】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡから誘導されたポリペプチドは，上述の用途の他にも，抗ＨＣＶ抗体を生じさせるのにも有用である。従って，これらのペプチドは抗ＨＣＶワクチンに使用され得る。しかしながら，ＨＣＶポリペプチドで免疫した結果，生産される抗体もまた，試料中のウイルス抗原の存在を検出するのに有用である。従って，これらのペプチドは，化学系におけるＨＣＶポリペプチドの生産を分析するために用いられ得る。抗ＨＣＶ抗体はまた，抗ウイルス剤が組織培養系で試験されるスクリーニングプログラムにおいて，これらの抗ウイルス剤の効力をモニターするのに用いられる。これらの抗ＨＣＶ抗体はまた，受動免疫療法や，供血者および受血者の両方においてウイルス抗原を検出することにより，ＮＡＮＢＨを引き起こすＨＣＶを診断するのにも用いられる。抗ＨＣＶ抗体の他の重要な用途には，ウイルスおよびウイルスポリペプチドを精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにおける使用がある。精製されたウイルスおよびウイルスポリペプチドの調製物はワクチンに用いられ得る。しかしながら，精製されたウイルスはまた，ＨＣＶを複製する細胞培養系の開発に有用である。
【０３９６】
ＨＣＶに感染した細胞を有する細胞培養系は多くの用途を有する。これらの細胞培養系は，通常は力価の低いウイルスであるＨＣＶの比較的大規模な生産に用いられ得る。これらの培養系はまた，このウイルスの分子生物学的な解明にも有用であり，抗ウイルス剤の開発をもたらす。これらの細胞培養系はまた，抗ウイルス剤の効力をスクリーニングする際にも有用である。さらに，ＨＣＶ許容性の細胞培養系は，弱毒化したＨＣＶ株の生産に有用である。
【０３９７】
便宜的には，抗ＨＣＶ抗体およびＨＣＶポリペプチドは，天然物であっても組換え体であっても，キットに組み込まれ得る。
【０３９８】
ＨＣＶ  ｃＤＮＡを単離するのに用いられる方法は，個体の感染組織から誘導されたｃＤＮＡライブラリーを発現ベクター中に調製すること，および非感染個体ではなく他の感染個体に由来する抗体含有身体構成成分中の抗体と免疫学的に反応する発現産物を生産するクローンを選択することを包含する。この方法は，ゲノム成分からなる，これまで特徴付けられていない他の疾患関連因子から誘導されたｃＤＮＡの単離にも適用できる。この方法により，次には，これらの因子が単離され，かつ特徴付けられ，またこれらの他の疾患関連因子に対する診断用の薬剤およびワクチンがもたらされ得る。
【図面の簡単な説明】
【０３９９】
【図１】クローン５−１−１におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ挿入物の二本鎖ヌクレオチド配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図２】クローン５−１−１，８１，１−２，および９１の重複ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列の相同性を示す。
【図３】重複するクローン８１，１−２，および９１に由来するＨＣＶ  ｃＤＮＡの複合配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸配列を示す。
【図４】クローン８１におけるＨＣＶ  ｃＤＮＡ挿入物の二本鎖ヌクレオチド配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図５】その一部がクローン８１のＮＡＮＢＶｃＤＮＡと重複するクローン３６のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチド配列を示す。
【図６】クローン３６および８１のＨＣＶ  ｃＤＮＡの結合ＯＲＦ，およびこのＯＲＦ内にコードされたポリペプチドを示す。
【図７】その一部がクローン８１と重複するクローン３２のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列にコードされたポリペプチドを示す。
【図８】その一部がクローン３６と重複するクローン３５のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。
【図９】クローン３５，３６，８１，および３２のＨＣＶ  ｃＤＮＡの結合ＯＲＦ，およびこのＯＲＦ内にコードされたポリペプチドを示す。
【図１０】図９のつづき
【図１１】その一部がクローン３５と重複するクローン３７ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。
【図１２】その一部がクローン３２と重複するクローン３３ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。
【図１３】その一部がクローン３７ｂと重複するクローン４０ｂのＨＣＶ配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。
【図１４】その一部がクローン３３ｂと重複するクローン２５ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。
【図１５】クローン４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，および２５ｃの広がるＯＲＦのヌクレオチド配列，およびこの配列内にコードされたポリペプチドを示す。
【図１６】図１５のつづき
【図１７】図１６のつづき
【図１８】その一部がクローン４０ｂおよび３３ｃと重複するクローン３３ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図１９】その一部がクローン３３ｃと重複するクローン８ｈのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２０】その一部がクローン８ｈと重複するクローン７ｅのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２１】その一部がクローン２５ｃと重複するクローン１４ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２２】その一部がクローン１４ｃと重複するクローン８ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２３】その一部がクローン８ｆと重複するクローン３３ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２４】その一部がクローン３３ｆと重複するクローン３３ｇのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２５】その一部がクローン７ｅと重複するクローン７ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２６】その一部がクローン７ｆと重複するクローン１１ｂのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２７】その一部がクローン１１ｂと重複するクローン１４ｉのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２８】その一部がクローン３３ｇと重複するクローン３９ｃのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図２９】クローン１４ｉ，１１ｂ，７ｆ，７ｅ，８ｈ，３３ｃ，４０ｂ，３７ｂ，３５，３６，８１，３２，３３ｂ，２５ｃ，１４ｃ，８ｆ，３３ｆ，および３３ｇの整列したｃＤＮＡに由来する複合ＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列を示す。さらに，この誘導された配列の拡張ＯＲＦ内にコードされたポリペプチドのアミノ酸配列が示されている。
【図３０】図２９のつづき
【図３１】図３０のつづき
【図３２】図３１のつづき
【図３３】図３２のつづき
【図３４】図３３のつづき
【図３５】その一部がクローン１４ｉと重複するクローン１２ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図３６】その一部がクローン３９ｃと重複するクローン３５ｆのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図３７】その一部がクローン３５ｆと重複するクローン１９ｇのＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図３８】その一部がクローン１９ｇと重複するクローン２６ｇの配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図３９】その一部がクローン２６ｇと重複するクローン１５ｅの配列，およびこの配列内にコードされたアミノ酸を示す。
【図４０】クローン１２ｆから１５ｅを５’から３’の方向に整列させることにより誘導された複合ｃＤＮＡの配列を示す；さらに，この連続ＯＲＦ内にコードされたアミノ酸を示す。
【図４１】図４０のつづき
【図４２】図４１のつづき
【図４３】図４２のつづき
【図４４】図４３のつづき
【図４５】図４４のつづき
【図４６】図４５のつづき
【図４７】ＢＢ−ＮＡＮＢ，ＨＡＶ，およびＨＢＶに感染したチンパンジー由来のチンパンジー血清を用いた融合タンパクＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１のウェスタンブロットの写真である。
【図４８】図４７のつづき
【図４９】ＮＡＮＢＶ，ＨＡＶ，ＨＢＶに感染したヒト由来の血清，および対照のヒト由来の血清を用いた融合タンパクＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１のウェスタンブロットの写真である。
【図５０】図４９のつづき
【図５１】ベクターｐＡＢ２４の有意な特徴を示す地図である。
【図５２】融合ポリペプチドＣ１００−３のカルボキシル末端の推定アミノ酸配列，およびこの配列をコードするヌクレオチドを示す。
【図５３】図５２のつづき
【図５４】Ａは，酵母内で発現されたＣ１００−３を同定する，クーマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルの写真である。  Ｂは，ＮＡＮＢＶに感染したヒトに由来する血清を用いたＣ１００−３のウェスタンブロットを示す。
【図５５】ＢＢ−ＮＡＮＢＶに感染したチンパンジーの肝臓から単離され，クローン８１のＢＢ−ＮＡＮＢＶ  ｃＤＮＡでプローブされたＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラフを示す。
【図５６】ＲＮａｓｅ  ＡまたはＤＮａｓｅ  Ｉで処理され，クローン８１のＢＢ−ＮＡＮＢＶｃＤＮＡでプローブされたＮＡＮＢＶ核酸のオートラジオグラフを示す。
【図５７】抗ＮＡＮＢ５−１−１を有する感染血漿から得たＮＡＮＢＶ粒子から抽出され，クローン８１由来の３２Ｐ標識化ＮＡＮＢＶｃＤＮＡでプローブされた核酸のオートラジオグラフを示す。
【図５８】クローン８１のＮＡＮＢＶｃＤＮＡから誘導された３２Ｐ標識化（＋）鎖および（−）鎖ＤＮＡプローブでプローブされた，単離ＮＡＮＢＶ核酸を有するフィルターのオートラジオグラフを示す。
【図５９】ＨＣＶ  ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドと，デング熱フラビウイルス由来のＮＳタンパクとの相同性を示す。
【図６０】図５９のつづき
【図６１】ＨＣＶ  ｃＤＮＡにコードされたポリペプチドと，デング熱フラビウイルス由来のＮＳタンパクとの相同性を示す。
【図６２】ＥＬＩＳＡ  スクリーニング法で決定される，任意抽出試料におけるＨＣＶ感染の分布ヒストグラムを示す。
【図６３】ＥＬＩＳＡ  検定法において免疫グロブリン−酵素結合体の２つの形態を用いた，任意抽出試料におけるＨＣＶ感染の分布ヒストグラムを示す。
【図６４】フラビウイルスのＮＳ１  における保存配列から誘導されたプライマー混合物の配列を示す。
【図６５】図２９のｃＤＮＡと重複するセグメントである，クローンｋ９−１中のＨＣＶ  ｃＤＮＡ配列およびそれにコードされるアミノ酸を示す。
【図６６】図６５のつづき
【図６７】５’から３’の方向に，ｋ９−１から１５ｅにわたる並列したクローンに由来する複合ｃＤＮＡの配列，および連続するＯＲＦ中にコードされるアミノ配列を示す。
【図６８】図６７のつづき
【図６９】図６８のつづき
【図７０】図６９のつづき
【図７１】図７０のつづき
【図７２】図７１のつづき
【図７３】図７２のつづき
【図７４】図７３のつづき
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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