(57)【要約】【課題】  スズメバチ毒酵素をコードする核酸又はその断片、及びこれらの核酸又は断片を発現させた生産物並びにその使用を提供すること。【解決手段】  本発明は、スズメバチ毒酵素をコードする核酸又はその断片、その核酸を含む組換えベクター及びその組換えベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、組換えスズメバチ毒酵素又はその組換え断片、誘導体又は類縁体を生産する核酸の発現に関する。その組換え産物は、アレルギーの診断及びアレルギーの治療方法に有効である。具体的な実施態様においては、本発明は、スズメバチ毒ホスホリパーゼ、例えば、ドリコベスプラ・マクラータ (Dolichovespulamaculata) ホスホリパーゼ及びベスプラ・ブルガリス(Vespula vulgaris)ホスホリパーゼ及びスズメバチ毒ヒアルロニダーゼ、例えば、ドリコベスプラ・マクラータヒアルロニダーゼをコードする核酸並びに完全ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を提供するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６に示されたヌクレオチド配列を有する、スズメバチ毒ホスホリパーゼをコードする単離された核酸。
【請求項２】
高度にストリンジェントな条件下で請求項１の核酸にハイブリッド形成可能な単離された核酸、ここで該単離された核酸はスズメバチ毒ホスホリパーゼ特異的免疫応答をＢ細胞又はＴ細胞レベルで亢進又は低下することが可能なポリペプチドをコードする。
【請求項３】
スズメバチ毒ホスホリパーゼが、ベスプラ ブルガリス（Vespula vulgaris）種由来である請求項１記載の単離された核酸。
【請求項４】
配列番号２７に示されたアミノ酸配列を有するスズメバチ毒ホスホリパーゼをコードする請求項３記載の単離された核酸。
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれた、スズメバチ毒ホスホリパーゼをコードする核酸から誘導する単離された核酸：
（ａ）  配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５；
（ｂ）  ポリメラーゼ連鎖反応ヌクレオチド合成において上記断片の相補的な対をプライマーとして用いて増幅される核酸；及び
（ｃ）  配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４をコードする核酸。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項記載の単離された核酸がコードするスズメバチ毒酵素又はスズメバチ毒ホスホリパーゼ特異的免疫応答をＢ細胞又はＴ細胞レベルで亢進又は低下することが可能なポリペプチドと非スズメバチ毒酵素タンパク質の機能的に活性な部分を含む融合タンパク質。
【請求項７】
非スズメバチ毒酵素タンパク質の機能的に活性な部分がポリヒスチジン配列である、請求項６記載の融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号２７に示されたアミノ酸配列を有するスズメバチ毒ホスホリパーゼの形態にある請求項６記載の融合タンパク質。
【請求項９】
プロモーターが機能的に結合した請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸がコードするポリペプチドの生産方法であって、
（ａ）請求項９記載の発現ベクターで形質転換した細胞を培養し、該細胞によって該核酸がコードするポリペプチドを発現させる工程；及び
（ｂ）そのように発現したポリペプチドをその培養液から回収する工程：
を含む方法。
【請求項１１】
細胞が、細菌細胞又は酵母細胞である請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明にいたる研究は、合衆国公衆衛生局認可第AI 17021号によって助成されたものである。政府は、本発明にいくらかの権利を有する。
本発明は、スズメバチ毒アレルゲン、特にホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼのような毒酵素をコードする核酸又はその断片、その核酸を含む組換えベクター及びその組換えベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、更に、ホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼのような組換えスズメバチ毒酵素又はその組換え断片を生産するその核酸の発現に関する。かかるアレルゲン及びその断片は、アレルギーの診断及びアレルギーの治療方法に有効である。
【背景技術】
【０００２】
昆虫毒アレルゲンの生化学
ミツバチ及びスズメバチに対する昆虫刺症アレルギーは普通に起こることである。スズメバチとしては、クマンバチ、クロスズメバチ及びアシナガバチ(hornet 、yellowjacket及びwasp) が含まれる (Goldenら, 1989, Am. Med. Assoc. 262:240)。敏感な人は微量の毒タンパクの暴露で感作される；スズメバチによる１回の刺針でわずか２〜１０μg のタンパクが皮膚に注入される(Hoffman & Jacobson, 1984, Ann. Allergy. 52:276)。
北アメリカにはクマンバチ（ドリコベスプラ(Dolichovespula)属) 、クロスズメバチ (ベスプラ (Vespula)属) 及びアシナガバチ (ポリステス(Polistes)属) の種類が多い (Akreら, 1980, “Yellowjackets of America North of Mexico", Agriculture Handbook No. 552, US Department of Agriculture) 。スズメバチは、同様の毒組成を有する (Kingら, 1978, Biochemistry 17:5165; Kingら, 1983, Mol. Immunol. 20:297; Kingら, 1984, Arch. Biochem. Biophys. 230:1;Kingら, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:624; Kingら, 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 79:113; Hoffman, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:611)。それらの毒液は、各々３つの主要なアレルゲン、ホスホリパーゼ（３７ｋＤ）、ヒアルロニダーゼ（４３ｋＤ）及び今までのところ生物作用が不明の抗原５（ｋＤ）を含んでいる。
上記の昆虫毒アレルゲンの他に、種々の草(Perezら, 1990, J. Biol. Chem. 265:16210; Ansariら, 1989, Biochemistry 26:8665 ; Silvanovichら, 1991, J. Biol. Chem. 266:1204)、高木の花粉(Breiteneder, 1989, EMBO J. 8:1935 ; Valentaら, 1991, Science, 253:557)、雑草の花粉（Rafnarら, 1991, J. Biol. Chem. 266:1229; Griffithら, 1991, int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96:296)、ダニ (Chuaら, 1988, J. Exp. Med. 167:175) 、ネコの鱗屑(Griffithら, 1992, Gene. 113:263）及びカビ（Arudaら, 1990, J. Exp. Med. 172:1529; Hanら, 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87:327) からの数種の主要アレルゲンの完全アミノ酸配列が過去数年間に報告されてきた。これらの主要アレルゲンは１０〜４０ｋＤのタンパク質であり、非常に異なった生物作用を有する。既知の配列のアレルゲンは、ほとんど全て我々の環境における他のタンパクといろいろな程度の配列類似性を有する。
【０００３】
アレルゲンのＴ及びＢ細胞エピトープ
タンパク質に対する抗体反応には、Ｔヘルパー及びＢリンパ球と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との協力が必要である。Ｂ細胞の抗原レセプターは膜結合抗体（Ａｂ) 分子であり、直接免疫原を認識し結合する。Ｔ細胞の抗原レセプター（ＴＣＲ）は、抗原ペプチド−ＭＨＣクラスII分子の複合体のみ認識し結合する。免疫原は、まずＭＨＣクラスII分子と共にＡＰＣの表面に存在するペプチド内にＡＰＣによってプロセスされる(Unanue ＭＨＣ分子は個々に極めて多形であるので、抗原ペプチドを結合する種々の特異性(Rothbard & Gefter, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:527) を有する。これは、免疫応答の遺伝的調節の１機序である。
抗原レセプターがＡＰＣの表面でペプチド−ＭＨＣ複合体を結合すると、Ｔヘルパー細胞が活性化される。活性化されたＴ細胞は、リンホカインを分泌する。マウス(Street & Mosmann, 1991, FASEB J. 5:171)及び見掛け上ヒト (Wierengaら, 1990, J. Immunol. 144:4651; Parronchiら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:4538)においては、Ｔヘルパー細胞はリンホカイン産生パターンに基づいて種々のタイプに分類することができる。主として、Ｔヘルパー細胞は２つのグループ：ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを産生するＴＨ１細胞とＩＬ−４及びＩＬ−５を産生するＴＨ２細胞に分けられる。これらのリンホカインは、また、抗原活性化Ｂ細胞に影響して種々のイソタイプのＡｂを分泌するプラズマ細胞に分化し増殖する。ＩＬ−４は、ＩｇＥ合成に影響することが知られる１つのリンホカインである(Finkelmanら, 1990, Ann. Rev. Immunol. 8:303) 。
タンパク質分子の全接近表面はＢ細胞の抗原レセプターによってエピトープとして認識することができるが、全てのエピトープは必ずしも同じ可能性をもって認識されないと考えられる (Benjaminら, 1984, Ann. Rev. Immunol. 2:67)。タンパク質のＢ細胞エピトープは２つのタイプ：トポグラフィー状と線状を有する。トポグラフィー状タイプは、空間的に隣接するが連続的に隣接してもしなくてもよいアミノ酸残基からなる。線状タイプは、連続的に隣接した残基のみからなる。Ａｇ−Ａｂ複合体のＸ線結晶学的データは１６〜１７個のアミノ酸残基を有する相補的結合領域のサイズを示している (Amitら, 1986, Science 233:747)が、ペプチド地図作成は約８個未満の残基が線状エピトープの結合プロセスに著しく関与することを示している(Appelら, 1990, J. Immunol. 144:976)。
他のタンパク質抗原のように、アレルゲンはＢ細胞エピトープの両方のタイプ又は一方のみを有する。例えば、スズメバチ抗原５は両方のタイプを有する(King ら, 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 91:283) 。ミツバチの毒メリチンは、線状タイプのＢ細胞エピトープのみを有すると思われる (Kingら, 1984, J.Immunol. 133:2668)。
タンパク質のＴ細胞エピトープは、未知の特異性を有するプロテアーゼによってＡＰＣのリソソーム内でプロセスされたペプチドであるので線状タイプのみからなる(Unanue, 1992, Curr. Op. Immunol. 4:63) 。ＭＨＣクラスII分子に結合した天然にプロセスされた抗原ペプチドの分析はサイズが約１３〜１７個のアミノ酸残基の範囲にあることを示すが、Ｔ細胞増殖応答の合成ペプチド−ＭＨＣクラスII分子の分析は約８個のアミノ酸残基の最少サイズを示している (Rudenskyら, 1991, Nature 353:622参照) 。Ｔ細胞エピトープが全タンパク質分子中に分布されていることは実験により示されており、免疫化宿主のＭＨＣハプロタイプによって主要又は副決定基として機能する(Royら, Science 244:572 ; Gammonら, 1987, Immunol. Rev. 98:53; O'Hehirら, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:67)。
即時型過敏症は、アレルゲン特異的ＩｇＥの存在によって引き起こされることが知られている。ＩｇＥは循環内に見られ、肥満細胞及び好塩基性細胞上の特異的ＩｇＥ−Ｆｃレセプターに結合する。アレルゲンによる細胞結合ＩｇＥの架橋は、ヒスタミン、ロイコトリエン及びアレルギー症状を引き起こす化学仲介物質を放出することになる。ＩｇＥは、種々のイソタイプの免疫グロブリンの１つである。上で指摘したように、Ｔ細胞によって分泌されたリンホカインはＢ細胞内のイソタイプスイッチ因子に影響する。
Ｂ細胞のイソタイプスイッチ因子を決定するのにＴＨ２細胞に中心的な役割があることから、数種のアレルゲンのＴ細胞エピトープが記録された (上記O'Hehir ら参照) 。これらのアレルゲンとしては、サワギクAmb α III、ライ麦草 Lol P I、ネコ Fel d I、マウス尿 Mus m I、小昆虫 Chi t I、ミツバチ毒ホスホリパーゼ A2 (Dhillonら, 1992, J. Allergy Clin. Immunol. 90:42)メリチン(Fehlnerら, 1992, J. Immunol. 146:799）及びクマンバチ抗原５（Kingら, 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 91:283) が挙げられる。このデータは、異常な又は普通の構造上の特徴を明らかにしていない。しかしながら、これらのデータからの結論は、これらのデータが種々のハプロタイプのヒト及びマウスから集められているので適格である。
【０００４】
Ｔ及びＢ細胞応答のモジュレーション
本来宿主は、クローン欠失及びアネルギーにより自己タンパク質の優性Ｂ及びＴ細胞エピトープに寛容である。しかしながら、この寛容は、ある環境によって破壊される (Gammonら, 1991, Immunol. Today. 12:193 ; Bastnら, 1991, Immunol. Rev. 122:5)。自己寛容は、自己免疫疾患においては宿主タンパク質と類似の異種タンパク質との遭遇により破壊されることが示された。従って、アレルゲンとオートロガスタンパク質との配列類似性は綿密な研究として興味深いものである。
成熟Ｂ細胞は、細胞表面Ｉｇレセプターを架橋することができる多価抗原に対する応答で活性化され(DeFranco, 1987, Ann. Rev. Cell Biol. 3:143)、１価の抗原に対する応答でアネルギーになる (上記 Bastnら, 1991) 。Ｔ細胞の抗原活性化には、ＡＰＣ表面上でＴＣＲをペプチド−ＭＨＣ複合体だけでなく他の共刺激シグナルに組込むことが必要である(Schwartz, 1990, Science 248:1349; Jenkins & Miller, 1992, FASEB J. 6:2428)。共刺激シグナルがないときには、ＴＣＲとペプチド−ＭＨＣ複合体の相互作用はＴ細胞アネルギーになる。
Ｂ又はＴ細胞アネルギーの分子機序は、まだ理解されていない (上記Schwartz, 1990; 上記Jenkins & Miller, 1992 ; Ales-Martinezら, 1991, Immunol. Today12:201) 。Ｔ細胞クローンによる試験管内実験により、共刺激シグナルがないとき人工的ペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの占有はリンホカイン転写を妨げることができる細胞内シグナル導入及び／又はレプレッサー遺伝子活性化に変わることになることが示されている。
初期の研究から、免疫応答の結果を決定するのに免疫原の物理的状態及び免疫化の経路が重要な可変部分であることがわかった。我々の現在の理解を考慮すると、これらの可変部分はＴ及びＢ細胞活性化又はアネルギーを有するように抗原提示に十分に影響するものである。
アレルギー疾患を治療する１つの方法は、病原アレルゲンの皮下注射を患者に繰り返すことを含む免疫療法によるものである。注射することができるアレルゲンの量は、患者において望ましくない全身性アレルギー反応の危険によって制限される。免疫療法を行うほとんどの患者の場合、アレルゲン特異的ＩｇＥレベルは最初上昇した後に徐々に低下し、アレルゲン特異的Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションもある(P.S. Norman, 1993, Current Op. Immunol. 5:968) 。
未変性アレルゲンによる免疫療法の望ましくない全身性反応のために、関心が修飾アレルゲンの開発に続けられ、免疫療法のアレルギー活性が低下した(T.P. King, 1993, “Bronchial Asthma", ed. E.B. Weiss & M. Stein, Little Brown,Boston, pp.43-49; 上記 R.E.O'Hehirら, 1991) 。
最近、アレルゲン特異的免疫応答を変えるＴ細胞エピトープペプチドの使用に関する２つのレポートが出た。１つは、主要ネコアレルゲン Fel d Iからの２種類のペプチドをマウスに皮下注射して全分子 Fel d Iに対するＴ細胞応答を低下させることについてのものである (Brinerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7608-12)。もう１つは、生まれつきの又は感作マウスにおけるアレルゲン特異的応答を抑制する主要ダニアレルゲン Der p Iからのペプチドによる鼻内療法についてのものである(Hoyneら, 1993, J. Exp. Med. 178:1783-1788) 。
いずれか１つのハプロタイプのＭＨＣクラスII分子が広範囲のペプチドをその結合溝において結合することができるので、ＭＨＣ分子へのアレルゲン誘導Ｔ細胞エピトープ結合を他のペプチドで阻害することによりＴ細胞応答を変えることが可能である。例えば、Ｈ−２k マウスにおいてそれだけで免疫原性のないマウスリゾチームペプチドは、鶏卵白リゾチームに対するＴ細胞応答を阻害する(Adorini & Nagy, 1990, Immunol. Today. 11:21) 。他の例は、インフルエンザＨＡペプチドによってダニアレルゲンに対するＴ細胞応答の生体内阻害である(O'Hehirら, 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87:1120)。
マウス又はラットにおける実験用自己免疫脳脊髄炎は、多発性硬化症の十分に研究されたモデルである。多くの実験により、この症状を誘発するために用いられるミエリン基礎タンパク質として免疫優性Ｔ細胞決定基が同定された。ミエリン基礎タンパク質の免疫優性エピトープに対応するペプチドは、同じペプチド抗原又は無傷ミエリン基礎タンパク質に対する寛容を誘導することができる。寛容を誘導した同じペプチドは、進行中の自己免疫応答におけるＴ細胞アネルギーを誘導することもできた (Gaurら, 1992, Science 259:1491-1494)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫原／アレルゲンに対する免疫応答は、宿主の遺伝的性質、免疫化の経路及び方法及び免疫原／アレルゲンに部分的に左右される。スズメバチ毒アレルゲンがＩｇＥ応答の結果を決定する程度は不明である。各スズメバチ毒アレルゲンはどれほどのＢ及びＴ細胞エピトープを有するのであろうか。感受性の異なる又は全身敏感な個体によって認識されるスズメバチ毒アレルゲンの免疫優性Ｂ又はＴ細胞エピトープがあるのであろうか。Ｂ細胞においてＩｇＥクラススイッチ因子を助けるＴ細胞エピトープがあるのであろうか。あるタンパク質がなぜ他のものよりアレルギーがあるかについてスズメバチ毒アレルゲンと宿主タンパク質との抗原交差反応性が役割を果たしているのだろうか。単一又は組合わせのＢ又はＴ細胞エピトープで治療することにより、多価スズメバチ毒アレルゲンに対する寛容は誘導することができるのであろうか。
従って、当該技術においては主要スズメバチ毒アレルゲンのＢ及びヘルパーＴ細胞エピトープを説明することが求められている。具体的にクマンバチ（例えば、ドリコベスプラ・アレナリア(Dolichovespula arenaria))、クロスズメバチ (例えば、ベスプラ・ブルガリス (Vespula vulgaris))及びアシナガバチ (例えば、ポリステス・アヌラリス (Polistes annularis))のＢ及びヘルパーＴ細胞エピトープを説明することが求められている。特に主要スズメバチ毒アレルゲンホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼは、重要なＢ及びＴ細胞エピトープを決定するのに適した標的である。スズメバチアレルゲンに対するアレルギー応答の根拠を十分に述べかつアレルゲンに基づく免疫療法を開発するために、数種の相同アレルゲンのｃＤＮＡ及びタンパク質配列を研究することを必要とする。更に、スズメバチアレルゲン又はそれらの断片の細菌及び真核細胞における高レベル発現に適したベクターを開発しなければならない。次いで、組換えスズメバチアレルゲン及びそれらの断片を用いてマウス、更に重要なことにはヒト系におけるそれらのＢ及びＴ細胞エピトープが各々抗体結合及びＴ細胞増殖試験によって記録されるように用いられる。
更に、スズメバチアレルゲンのＴ及びＢ細胞エピトープと他の環境的タンパク質及び／又はオートロガスタンパク質との交差反応があるかを決定することが求められている。即ち、スズメバチアレルゲンが他の環境的タンパク質、特にオートロガスタンパク質と部分的同一性を共有するかを決定し、更に重要なことには部分的同一性の領域の配列、特に部分的同一性のその領域の特定のアミノ酸配列を得ることが求められている。更に、スズメバチアレルゲンとＢ及びＴ細胞レベルの他のタンパク質との交差反応性のレベル、その交差反応性の関連性及びその交差反応性が病理に関するか、即ち、アレルギーに関与するかあるいは原因になるか又は利益を受けるか、即ちアレルギーの抑制を受けるかを決定することが求められている。
また、当該技術においては、スズメバチ毒アレルゲンのＴ又はＢ細胞エピトープを有するペプチドを用いてマウスにおける寛容及びヒトにおける寛容の誘導を研究することが求められている。
更に、修飾ペプチドがＭＨＣクラスII分子に結合するアレルゲンＴ細胞エピトープを阻害するかあるいはＴ細胞ネルギーを誘導するかあるいは両方かを試験することが求められている。
即ち、当該技術においてはスズメバチ毒アレルゲンについての配列情報並びに免疫学的研究用及びアレルギーの免疫学的治療用に豊富なそのアレルゲン源が求められている。
本明細書における参考文献の引用は、本発明に対する従来技術であるものとして解釈されなけばならない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、スズメバチ毒酵素、特にホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼをコードする核酸及びその免疫調節断片、誘導体又は類縁体を提供するものである。特に、本発明は、スズメバチ毒ホスホリパーゼ、例えば、ドリコベスプラ・マクラータ (Dolichovespula maculata)ホスホリパーゼ及びベスプラ・ブルガリスホスホリパーゼ並びにスズメバチ毒ヒアルロニダーゼ、例えば、D.マクラータヒアルロニダーゼをコードする核酸に関する。具体的な実施態様においては、本発明の核酸は、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼのようなスズメバチ毒酵素のＴ細胞エピトープの免疫調節部分をコードしている。他の具体的な実施態様においては、本発明の核酸は、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼのようなスズメバチ毒酵素のＢ細胞エピトープの抗原部分をコードしている。本発明の核酸の発現は、診断及び治療用に豊富なスズメバチ酵素源を提供するものである。
多数のスズメバチ毒酵素、特にホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼをコードする核酸を提供することが特に本発明の利点である。その核酸配列は、スズメバチ毒酵素のアミノ酸配列を演繹することを可能にする。そのアミノ酸配列の情報は、酵素の適切なＴ細胞及びＢ細胞エピトープの決定を可能にする。更に重要なことには、免疫優性Ｔ細胞及びＢ細胞エピトープは、各々の酵素アレルゲン感受性個体又は個体群、即ち、敏感なＭＨＣハプロタイプを共有するもの又はＴ細胞エピトープがＩｇＥクラス抗体に対するクラススイッチ因子を助けるものに決定することができる。そのＴ細胞及びＢ細胞エピトープが決定されると、即ち毒酵素特異的アレルギー症状、例えば、スズメバチ毒ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼ又はその両方に対する感受性のための免疫学的治療を考えることが可能である。
即ち、本発明は、更に、本発明の核酸によってコードされたポリペプチドを提供するものである。特に、本発明は、スズメバチ毒酵素、例えば、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼのＴ細胞エピトープの免疫調節部分を有するポリペプチドを提供するものである。別の実施態様においては、本発明は、スズメバチ毒酵素、例えば、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼのＢ細胞エピトープの抗原部分を有するポリペプチドを提供するものである。更に詳細には、本発明は、スズメバチ毒ホスホリパーゼ、例えば、ドリコベスプラマクラータホスホリパーゼ及びベスプラブルガリスホスホリパーゼＡ１のそのポリペプチド並びにスズメバチ毒ヒアルロニダーゼ、例えば、D.マクラータヒアルロニダーゼのポリペプチドを提供するものである。
更に、本発明は、操作上プロモーターを伴った本発明の核酸を含む発現ベクターを提供するものである。本発明は、また、本発明の核酸によってコードされたスズメバチ毒酵素、例えば、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼを生産する方法を提供するものである。特に、本発明は、スズメバチ毒酵素、例えば、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼが細胞によって発現されるように本発明の発現ベクターで形質転換された細胞を培養し、その培養物から発現したスズメバチ毒酵素を回収することを提供する。更に詳細には、本発明は、スズメバチ毒ホスホリパーゼ、例えば、ドリコベスプラ・マクラータホスホリパーゼ及びベスプラ・ブルガリスホスホリパーゼＡ１又はスズメバチ毒ヒアルロニダーゼ、例えば、D.マクラータヒアルロニダーゼをコードする核酸又はその断片、誘導体又は類縁体を含む発現ベクターの発現を提供するものである。
また別の実施態様においては、本発明は、スズメバチ毒酵素、例えば、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼのＴ細胞エピトープの免疫調節部分又はスズメバチ毒酵素、例えば、ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼのＢ細胞エピトープの抗原部分を有する本発明のポリペプチドを含むスズメバチ毒アレルゲン特異的アレルギー症状の治療に有効な医薬組成物を提供するものである。更に詳細には、本発明は、スズメバチ毒ホスホリパーゼ、例えば、ドリコベスプラ・マクラータホスホリパーゼ及びベスプラ・ブルガリスホスホリパーゼ又はスズメバチ毒ヒアルロニダーゼ、例えば、D.マクラータヒアルロニダーゼのポリペプチドを含む医薬組成物を提供するものである。
また更に別の実施態様においては、本発明は、本発明の医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含むスズメバチ毒アレルゲン特異的症状を治療する方法を提供するものである。
即ち、本発明の利点は、スズメバチ毒アレルゲン特異的症状の治療に治療上用いることができる多くのスズメバチ毒酵素、特にホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼの生産を提供することである。最も重要なことには、本発明が個体又は個体群において免疫調節活性を有するスズメバチ毒酵素ポリペプチドの生産を可能にするので、治療方法が非常に特異的かつ個体化することができる。
本発明の別の具体的な利点は、種間の類似酵素の相同性を比較することを可能にするために異なった種類のスズメバチからの多数のいろいろなスズメバチ毒酵素、特にホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼの核酸配列及び演繹したアミノ酸配列を有することである。この情報は、アレルギー反応及び治療方法に重要であるアレルゲンの交差反応性を評価するための根拠を与えるものである。
更に、本発明の利点は、環境的タンパク質及び／又はオートロガスタンパク質に対する多くのスズメバチ毒酵素、特にホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼの類似性の程度を評価することができることである。その環境的タンパク質及び特にオートロガスタンパク質に対するスズメバチ毒酵素の類似性は、アレルギー応答に重要な意味を有すると考えられる。
略語
Dol m ドリコベスプラ・マクラータ            クマンバチ(white face hornet)
Dol a D.アレナリア                          クロスズメバチ(yellow hornet) 
Pol a ポリステス・アヌラリス                アシナガバチ
Pol e P.エススクラマンス(exdlamans)         アシナガバチ
Ves m ベスプラ・マクリフロンス(maculifrons) クロスズメバチ
Ves v V.ブルガリス                          クロスズメバチ
PCR                                         ポリメラーゼ連鎖反応
RACE                                        ｃＤＮＡ端の急速増幅
TCR                                         抗原のＴ細胞レセプター
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、ホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼのようなスズメバチ毒酵素をコードする組換え核酸、その免疫調節断片、誘導体又は類縁体及びスズメバチ毒特異的アレルギーの診断及び治療に有効なその核酸によってコードされたポリペプチドに関する。具体的な実施態様においては、本発明は、スズメバチホスホリパーゼ、特にドリコベスプラ・マクラータ(white-face hornet) ホスホリパーゼ(Dol m I) 及びベスプラブルガリス (クロスズメバチ) ホスホリパーゼ(Ves v I)の免疫調節断片及びスズメバチ毒ヒアルロニダーゼ、特にD.マクラータヒアルロニダーゼの免疫調節断片に関する。
本発明は、更に、その核酸を含む発現ベクター及びその発現ベクターを発現しその発現したスズメバチ毒酵素ポリペプチドを回収することにより本発明のスズメバチ毒酵素ポリペプチドを生産する方法に関する。
本発明は、また、本発明のポリペプチドを含むスズメバチ毒アレルゲン特異的アレルギー症状の治療に有効な医薬組成物及び本発明の医薬組成物の治療上有効な量を投与することを含むそのアレルギー症状を治療する方法を提供するものである。
本発明のポリペプチドは、また、スズメバチ毒特異的アレルギー症状の診断に有効である。
【０００８】
本明細書に用いられる“スズメバチ毒アレルゲン”なる語は、スズメバチの毒液中に見出されたタンパク質を意味し、それに敏感な人はその昆虫の刺針の暴露で感作される。ほとんどの抗原は特異的ＩｇＧクラス抗体と反応性であることを特徴とするが、アレルゲンはＩｇＥ型の抗体と反応性であることを特徴とする。
ＩｇＥ型抗体は、アレルギー症状、即ち、即時型過敏症を仲介するのに関与する。
本明細書において“スズメバチ”なる語は、アレルギー分野での慣例に従って用いられ、世界的スズメバチ科(Vespidae)、即ち、クマンバチ、クロスズメバチ及びアシナガバチ(paper wasp)を含む社会性スズメバチに属する昆虫を意味する。特に、スズメバチは、ベスピネ(Vespidae)亜科及びポリスチネ(Polistinae)亜科を含む。更に詳細には、スズメバチは、ベスパ・リネウス(Vespa Linnaeus)属、ベスプラ・トムソン (Vespula Thomson)属、ドリコベスプラ・ローエル (Dolichovespula Rohwer) 属及びポリステス・ラトレイレ(Polistes Latreille)属を含む。ベスプラ属の種としては、V.ゲルマニカ (germanica)(Fab.)、V.スクアモサ(squamosa)(Drury) 、V.マクリフロン(maculifrons)(Buysson)、V.フラボピロサ (flavopilosa)(Jacobson)、V.ブルガリス(L.)及び V. ペンシルバニカ (pensylvanica)(Saussure)が挙げられるがこれらに限定されない。ポリステス属の種としては、P.アヌラリス(Linnaeus)、P.エクスクラマンス(exclamans) (Viereck) 、P.メトリクス (metricus)(Say)、P.フスカツス (fuscatus) (Fabricius) 及びP.アパクス(apachus)(Saussure) が挙げられるがこれらに限定されない。ドリコベスプラ属の種としては、D.マクラータ(L.)及び D. アレナリス(Fab.)が挙げられるがこれらに限定されない。ベスパ属の種としては、V.クラブロ(crabro)(L.)及びV.オリエンタリス(orientalis)(Linnaeus)が挙げられるがこれらに限定されない。
【０００９】
本明細書に用いられる“ホスホリパーゼ”なる語は、リン脂質基質上で作用する、例えば、脂肪酸を加水分解する酵素の種類である。具体的な実施態様においては、合成ホスファチジルコリンの１位のアシル基の速い加水分解及び２位のアシル基の遅い加水分解を触媒する。即ち、本発明のスズメバチホスホリパーゼは、Ａ1 及びＢ型双方のホスホリパーゼ活性を有する。本発明のホスホリパーゼは、同様に低レベルのリパーゼ活性を有する。
本明細書に用いられる“ヒアルロニダーゼ”なる語は、Ｄ−グルコン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖単位で作用する酵素の種類を意味する。その酵素は、Ｄ−グルコン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む二糖類を反復するポリマーの加水分解を仲介する。そのポリマーの１例はヒアルロン酸である。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸からＮ−アセチルグルコサミンの還元基の遊離を触媒する。
本明細書に用いられる“免疫調節”なる語は、抗原特異的免疫応答をＢ細胞あるいはＴ細胞レベルで亢進又は低下する能力を意味する。免疫調節活性は、例えば、Ｔ細胞増殖分析、抗体産生測定、リンホカイン生産又はＴ細胞応答性で検出することができる。特に、本発明の免疫調節ポリペプチドは、Ｔ細胞応答への影響の他に、同様にＢ細胞の表面で免疫グロブリン（即ち、抗体）分子に結合しＢ細胞応答に影響する。
【００１０】
“核酸分子”は、一本鎖あるいは二本鎖らせんのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン;“ＲＮＡ分子")又はデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン;“ＤＮＡ分子")のリン酸エステル重合体を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子なる語は、分子の一次及び二次構造のみを意味し、特定の三次構造に限定されない。即ち、この語は、特に線状又は環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド及び染色体に見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。具体的な二本鎖ＤＮＡ分子の構造を述べるに当たり、本明細書においては転写されないＤＮＡ鎖（即ち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）
に沿って５’から３’の方向の配列のみを与える通例に従って配列が記載される。
“組換えＤＮＡ分子”は、分子生物学的操作を行ったＤＮＡ分子である。
核酸分子は、一本鎖の核酸分子が温度及び溶液イオン強度の適切な条件下他の核酸分子に対してアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡのような別の核酸分子に対して“ハイブリッド形成可能”である（下記Sambrookら, 1989参照）。温度及びイオン強度の条件がハイブリッド形成の“ストリンジェンシー”を決定する。ハイブリッド形成には、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要であるが、ハイブリッド形成のストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するのに適切なストリンジェンシーは、当該技術において周知の可変部分である核酸の長さ及び相補性の程度に左右される。
ＤＮＡ“コーディング配列”は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合生体内でポリペプチドに転写及び翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コーディング配列の境界は、５'(アミノ）末端の開始コドン及び３'(カルボキシ）末端の翻訳停止コドンで決められる。コーディング配列としては、原核配列、原核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列及び合成ＤＮＡ配列さえ挙げられるが、これらに限定されない。コーディング配列を原核細胞内で発現する場合には、通常、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列が３’からコーディング配列までに位置される。
転写及び翻訳制御配列は、宿主細胞内でコーディング配列を発現するプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等のＤＮＡ調節配列である。真核細胞においては、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
“プロモーター配列”は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合することができかつ下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列はその３’末端で転写開始部位によって結合され、上流（５’方向）に伸長し、上記のバックグラウンドの検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基又は要素を含む。プロモーター配列内には転写開始部位（便宜上例えばヌクレアーゼＳ１で地図作成することにより定義される）及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（共通配列）が見出される。真核プロモーターは、たいてい“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含むが、必ずしも含むとは限らない。
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそれがコーディング配列によってコードされたタンパク質に翻訳される場合に細胞内で転写及び翻訳調節配列の“制御のもとに”ある。
“シグナル配列”は、コーディング配列の前に含まれる。この配列は、宿主細胞がポリペプチドを細胞表面に輸送したりポリペプチドを培地に分泌するようにするＮ末端からポリペプチドまでのシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは、通常、輸送の際に細胞によって選択的に分解される。シグナル配列は、原核生物及び真核生物に固有の種々のタンパク質を伴って見出される。
【００１１】
本発明によれば、当該技術の範囲内で慣用の分子生物学、微生物学及び組換え
ＤＮＡ技術が用いられる。その技術は文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual", sec. ed.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (この中に “Sambrookら, 1989"); "DNA Cloning  A Practical Approach", vol.I & II(D.N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis"(M.J. Gait ed.1984); “Nucleic Acid Hybridization"[B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)]; “Transcription And Translation"[B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1984)]; “Animal Cell Culture"[R.I. Freshney, ed. (1986)]; “Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1986)]; B.Perbal,“A PracticalGuide To Molecular Cloning"(1984) 参照。
本発明は、部分的には、種々のスズメバチ毒ホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼのクローニング及び配列決定に基づくものである。これらのスズメバチ毒酵素のクローニング及び配列決定は、スズメバチ毒アレルギー症状が共通し、ある感受性のある個体においてはアレルギー反応がアナフィラキシーに進行し、致死の可能性があるので極めて重要である。従って、アレルギー症状の種類、特に特異的アレルゲン感受性についての正確な診断情報が決定されかつ基礎にあるアレルギー症状の効果的な治療方法を行うことができるように、スズメバチ毒アレルゲンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列情報を知ることは極めて重要である。
【００１２】
明瞭に説明するために、本発明は、スズメバチ毒酵素をコードする遺伝子の単離、スズメバチ毒酵素の免疫調節断片又はそのスズメバチ毒酵素の誘導体及び類縁体を含むポリペプチドの発現、組換えスズメバチ毒酵素又はその断片、誘導体又は類縁体による分析及び最後にスズメバチ毒酵素又はその断片、誘導体又は類縁体の治療及び診断使用に関する項で詳細に記載される。
【００１３】
スズメバチ毒酵素をコードする核酸の単離
本発明は、特に、スズメバチ毒酵素をコードする単離した核酸に関する。本発明は、更に、スズメバチ毒酵素をコードする組換え核酸を安定して含有しかつスズメバチ毒酵素のタンパク質又は免疫調節断片を産生する核酸を発現することができる細胞系に関する。
更に、スズメバチ毒酵素の誘導体、例えば断片及び融合タンパク質（下記参照)並びにそれをコードする核酸が提供される。
好適態様においては、本発明は、スズメバチ毒酵素の完全核酸配列を提供するものである。特に、本発明は、スズメバチホスホリパーゼ、特にドリコベスプラ・マクラータ(white-face hornet) ホスホリパーゼ(Dol m I) 及びベスプラ・ブルガリス (クロスズメバチ) ホスホリパーゼ(Ves v I) 及びヒアルロニダーゼ、特にD.マクラータヒアルロニダーゼを提供するものである。
具体的な実施態様においては、スズメバチ毒酵素をコードする核酸を得るために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を Frohmanら(1988 Sci. USA 85:8988-9002; Frohman Users 5:11も参照) に記載されているｃＤＮＡ端の急速増幅（ＲＡＣＥ）技術と組合わせてスズメバチ毒酵素を含む配列をコードする断片を増幅した後に選択する。本発明のスズメバチ毒酵素を示すオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲにおいてプライマーとして用いることができる。通常、そのプライマーは合成で調製される。そのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、アミノ酸配列情報から演繹することができる。そのオリゴヌクレオチド配列は縮重していないが、しばしば配列は縮重している。プライマーは、本明細書に開示されたスズメバチ毒酵素の核酸配列に基づくことが更に好ましい。オリゴヌクレオチドは、問題の可能性のある起源（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、好ましくはｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ配列によって増幅するためにプライマーとして使用される。例えば、ＰＣＲはスズメバチ酸分泌腺ｃＤＮＡライブラリーからのスズメバチ毒酵素コーディング配列を増幅するために用いることができる。ＰＣＲは、例えば、パーキン−エルマーセタスサーマルサイクラー及びＴａｑポリメラーゼ（ＧｅｎｅＡｍｐ- ) の使用により行うことができる。
【００１４】
本発明は、いかなる種類のスズメバチからもスズメバチ毒酵素の同族体を単離することを提供するものである。有用な、例えば、ＰＣＲ反応における数種類の異なる縮重プライマーを合成するために選ぶことができる。スズメバチ毒酵素の同族体と本明細書に開示された特定のスズメバチ毒酵素間のヌクレオチド配列類似性の程度の多少を可能にするＰＣＲ反応を開始するのに用いられるハイブリッド形成条件のストリンジェンシーを変動させることも可能である。スズメバチ毒酵素の同族体のセグメントをうまく増幅した後、そのセグメントをクローン化し、て使用される。また、これは、後述されるように、完全ヌクレオチド配列の決定、その発現の分析及び機能分析用にそのタンパク質産物の生産を可能にする。この方法で、更に、スズメバチ毒酵素をコードする遺伝子、特にホスホリパーゼ及びヒアルロニダーゼが同定及び発現される。
他の実施態様においては、スズメバチ毒酵素をコードする遺伝子はプローブでスクリーニングすることにより適切なライブラリーから単離することができる。スズメバチ毒酵素遺伝子を単離するのに有効なプローブは、本明細書に提供された配列情報から生成することができる。
発現ライブラリーは、当該技術において既知の方法で構築することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、スズメバチ毒酵素を発現する細胞又は組織、即ち、毒嚢近傍に位置した毒腺からの細胞から調製される。毒腺は、酸分泌腺と呼ばれることがある。例えば、ｍＲＮＡ又は全ＲＮＡを単離することができ、ｃＤＮＡを作成し、導入される宿主細胞によって発現することができるように発現ベクター（例えば、プラスミド又はバクテリオファージ誘導体）に結合する。次いで、確実なクローンを選択するために種々のスクリーニング分析を用いることができる。例えば、本明細書に提供された配列に基づいて合成することができる適切なプライマーと共にＰＣＲを用いることができる。増幅した生産を例えば、臭化エチジウム染色で直接検出することができるＰＣＲが好ましい。また、コロニーをスクリーンするために、本出願の核酸配列に由来する標識プローブを用いることもできる。
【００１５】
また、遺伝子の存在は、その発現した産物の物理的、化学的又は免疫学的性質に基づく分析により検出される。例えば、スズメバチ毒酵素として既知の類似の又は同一の電気泳動の泳動、等電点電気泳動の動き、タンパク質分解消化地図又は抗原性を有するタンパク質を産生する適当なｍＲＮＡをハイブリッド選択するｃＤＮＡクローン又はＤＮＡクローンを選択することができる。
細菌によって発現したある組換えタンパク質、例えば、スズメバチ毒ヒアルロニダーゼは、未変性タンパク質に特異的な抗体と反応する。細菌で発現した他の組換えタンパク質、例えば、スズメバチホスホリパーゼは、未変性タンパク質に特異的な抗体と反応しない。即ち、組換えタンパク質が免疫反応性である場合にはブロットして免疫反応で検出することにより確実なクローンを選択することが可能である。
別の実施態様においては、発現したスズメバチ毒ホスホリパーゼのリパーゼ活性のような酵素の特定の触媒活性を選択に用いることができる。しかしながら、細菌で発現した真核タンパク質は活性コンホメーションでは折りたたむことができない。
一般に、本発明によれば、確実なクローンをスクリーニングする方法を用いることができる。
スズメバチ毒酵素ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを単離する別の方法は、本明細書に提供された配列からの遺伝子配列自体を化学的に合成することを含むがこれに限定されない。
上記の方法は、スズメバチ毒酵素のクローンが得られる方法を限定することを意味しない。
【００１６】
当該技術において既知の多くのベクター−宿主系が用いられる。可能なベクターとしては、プラスミド又は修飾ウイルスが挙げられるがこれらに限定されるものではないが、ベクター系は使用宿主と適合できなければならない。そのようなベクターとしては、λ誘導体のようなバクテリオファージ又は種々のｐＢＲ３２２、例えば、ｐＵＣ、ＣＲ、ｐＧＥＸベクター、ｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧ等のプラスミドが挙げられるがこれらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクターにＤＮＡ断片を結合することにより達成することができる。本発明の好適態様においては、本発明のＰＣＲ増幅核酸は３’−突出Ａヌクレオチドを含み、適合できるＴヌクレオチド突出を有するｐＣＲベクターにクローニングするのに直接用いることができる(Invitrogen Corp., カルフォルニア州サンディエゴ）。しかしながら、ＤＮＡを断片化するために用いられる相補的制限部位がクローニングベクター内に存在しない場合には、ＤＮＡ分子の末端が酵素的に修飾される。また、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を結合することにより所望の部位が作製される；これらの連結リンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むものである。別の方法においては、切断ベクター及びスズメバチ毒酵素遺伝子はホモポリマーテーリングによって修飾される。組換え体分子は、遺伝子配列の多数のコピーを生成するように形質転換、移入、感染、エレクトロポレーション等を介して宿主細胞に導入することができる。
具体的な実施態様においては、単離したスズメバチ毒酵素遺伝子、ｃＤＮＡ又は合成したＤＮＡ配列を組込む組換え体ＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換すると、その遺伝子の多コピーの生成が可能である。即ち、形質転換細胞を増殖し、その形質転換細胞から組換え体ＤＮＡ分子を単離し、場合によっては、単離した組換え体ＤＮＡから挿入遺伝子を回収することにより、その遺伝子が多量に得られる。
【００１７】
スズメバチ毒アレルゲンポリペプチド又は断片の発現
スズメバチ毒酵素をコードするヌクレオチド配列又はその免疫調節断片、誘導体又は類縁体は、適切な発現ベクター、即ち、挿入したタンパク質コーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。その要素は本明細書においては“プロモーター”と呼ばれる。即ち、スズメバチ毒酵素をコードする核酸は操作上プロモーターを伴う。発現ベクターは、また、複製起原を含むことが好ましい。必要な転写及び翻訳シグナルもまた、スズメバチ毒酵素をコードする未変性遺伝子及び／又はそのフランキング領域によって与えることができる。可能性のある宿主−ベクター系としては、ウイルスに感染した哺乳動物細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等);ウイルスに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス);酵母含有酵母ベクターのような微生物；又はバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡで形質転換した細菌が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターの発現要素は、それらの強度及び特異性で異なる。使用される宿主−ベクター系によって、多数の適切な転写及び翻訳要素のいずれか１つが用いられる。
別の実施態様においては、本発明の組換えスズメバチ毒酵素又はその免疫調節断片、誘導体又は類縁体が、組換えによってスズメバチ毒酵素コーディング配列に組込まれた後に染色体で発現される。この点で、高レベルの安定な遺伝子発現を得るために多くの増幅系のいずれかが用いられる (上記Sambrookら, 1989, sec. 16.28) 。
【００１８】
組換えベクターがスズメバチ毒酵素をコードする核酸を含む細胞は、細胞によってスズメバチ毒酵素を発現する条件下に適切な細胞培養基中で培養される。次いで、発現したスズメバチ毒酵素を当該技術において周知の方法に従ってその培養液から回収することができる。その方法は後に詳細に記載される。
別の実施態様においては、スズメバチ毒酵素−融合タンパク質を発現することができる。スズメバチ毒酵素−融合タンパク質は、スズメバチ毒酵素の少なくとも免疫調節部分に結合したペプチドを介して結合した非スズメバチ毒酵素タンパク質の少なくとも機能的に活性な部分を含んでいる。非スズメバチ毒酵素配列は、アミノ又はカルボキシル末端からスズメバチ毒酵素配列までとすることができる。
そのような融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子は、スズメバチ毒酵素のコーディング配列に枠内に結合した非スズメバチ毒酵素の少なくとも機能的に活性な部分をコードする配列を含み、好ましくは特定のプロテアーゼ、例えば、因子Ｘａの切断部位を、好ましくは２つのタンパク質の連結点でコードする。
別の具体的な実施態様においては、スズメバチ毒酵素の断片は遊離（非融合）タンパク質として発現される。
具体的な実施態様においては、スズメバチ毒ホスホリパーゼ及びその免疫調節断片は、約６個のヒスチジン残基を含む追加配列を用いて、例えば、ｐＱＥ１２ベクター (QIAGEN, カリフォルニア州チャッツワース) を用いて発現される。ヒスチジンの存在は、Ｎｉキレート化カラムによる組換えタンパク質の選択的単離を可能にする。
【００１９】
別の実施態様においては、融合タンパク質（シグナル配列を含む）のペリプラズム形態は、タンパク質を大腸菌(Escherichia coli)ペリプラズムに輸送するために作製することができる。そのペリプラズムへの輸送は、発現したタンパク質の適切な折りたたみを促進することができる。
前述のＤＮＡ断片をベクターに挿入するための方法はいずれも適切な転写／翻訳制御シグナル及びタンパク質コーディング配列からなる遺伝子を含む発現ベクターを構築するために用いられる。これらの方法は、生体外組換えＤＮＡ及び合成技術及び生体内組換え体（遺伝的組換え）が含まれる。スズメバチ毒酵素をコードする核酸配列又はその免疫調節断片の発現は、スズメバチ毒酵素タンパク質又はペプチドが組換え体ＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように二次核酸配列によって調節される。例えば、スズメバチ毒酵素タンパク質の発現は、当該技術において既知のプロモーター／エンハンサー要素によって制御されるが、これらの調節要素は発現に選択された宿主において機能しなければならない。スズメバチ毒酵素遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Benoist & Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター (Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター (Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A. 78:1441-1445) 、メタロチオネイン遺伝子の調節配列 (Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42);β−ラクタマーゼプロモーターのような原核発現ベクター (Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) 又はtac プロモーター (DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); “Useful proteins fromrecombinant bacteria" Scientific American, 1980, 242:74-94も参照; Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスホターゼプロモーターのような酵母又は他の菌類からのプロモーター要素；及び組織特異性を示しかつ形質転換した動物で使用した動物転写制御領域が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
スズメバチ毒酵素をコードする核酸を含む発現ベクターは、４つの一般的な方法：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡ又は特定のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブリッド形成、（ｃ）“マーカー”遺伝子機能の有無及び（ｄ）挿入された配列の発現によって同定することができる。第１の方法では、増幅産物を検出するために核酸をＰＣＲで増幅することができる。第２の方法では、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入したスズメバチ毒酵素遺伝子と相同である配列を含むプローブを用いて核酸ハイブリッド形成により検出することができる。第３の方法では、ベクター内での外来遺伝子の挿入によるある種の“マーカー”遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける吸収体の形成等) の有無に基づいて組換えベクター／宿主系を同定及び選択することができる。個々の実施例においては、融合タンパク質は、“マーカー”遺伝子産物とスズメバチ毒酵素を含んでいる。他の実施例においては、スズメバチ毒酵素をコードする核酸がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合には、マーカー遺伝子機能がないことによりスズメバチ毒酵素を含む組換え体を同定することができる。第４の方法では、発現したタンパク質が適切なコンホメーションに折りたためるのであれば、組換え体によって発現した遺伝子産物の活性を分析することにより組換え発現ベクターを同定することができる。その分析は、試験管内分析系におけるスズメバチ毒酵素遺伝子産物の物理的又は機能的性質、例えば、スズメバチ毒ホスホリパーゼのホスホリパーゼ又はリパーゼ活性又はスズメバチ毒ヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性もしくは抗体との結合に基づくことができる。
【００２１】
特定の組換え体ＤＮＡ分子が同定及び単離されると、当該技術において既知のいくつかの方法がそれを増殖するために用いられる。適切な宿主系及び増殖条件が決定されると、組換え発現ベクターは多量に増殖及び調製することができる。前に説明したように、使用することができる発現ベクターは、少しだけ名前を挙げるために次のベクター又はそれらの誘導体：ワクシニアウイルス又はアデノウイルスのようなヒト又は動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス; 酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λ）並びにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクターを含むがこれらに限定されない。
更に、挿入した配列の発現又は修飾因子を調節しかつ所望される具体的な方法で遺伝子産物をプロセスする宿主細胞染色が選ばれる。種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後プロセシング及び修飾（例えば、グリコシル化、切断[例えばシグナル配列の])に対して特徴的及び特定の機序を有する。発現した異種タンパク質の所望の修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞系又は宿主系を選ぶことができる。例えば、細菌系内での発現は、モノグルコシル化コアタンパク質産物を生成するために用いることができる。しかしながら、細菌内で発現した酵素タンパク質は、適切に折りたたまれない。酵母内での発現は、グリコシル化産物を生成することができる。昆虫細胞内での発現は、異種スズメバチ毒酵素の“未変性”グリコシル化及び折りたたみの可能性を高めるために用いることができる。更に、種々のベクター／宿主発現系は、タンパク質分解切断のようなプロセシング反応にもいろいろな程度まで影響する。細菌産生アレルゲンがＴ細胞増殖分析において活性であるので、グリコシル化及び適切な再折りたたみがスズメバチ毒アレルゲンの免疫調節活性に必須でないことを見出したことを留意することは興味深いことである。
【００２２】
ベクターは、当該技術において既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション（リソソーム融合）、ジーンガンの使用又はＤＮＡベクター輸送体によって所望の宿主細胞に導入される (例えば、Wuら, 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu & Wu, 1988,J. Biol. Chem. 263:14621-14624 ; Hartmutら, 1990年３月15日出願のカナダ特許出願第 2,012,311号参照) 。
ｃＤＮＡ及びゲノム配列の双方をクローン化及び発現することができる。
更に、本発明のスズメバチ毒酵素、その断片、誘導体又は類縁体を合成的に、例えば、固相ペプチド合成によって調製することができることも企図される。
組換えスズメバチ毒酵素タンパク質が同定されると、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、微分溶解を含む標準法又はタンパク質の精製のための他の標準手法によって分離及び精製される。
具体的な実施態様においては、スズメバチ毒酵素及びその断片を約６個のヒスチジル残基を含むように操作することができ、Ｎｉキレート化カラムにより組換えタンパク質を選択的に単離することを可能にする。好適態様においては、タンパク質は更に逆相クロマトグラフィーで精製される。
【００２３】
他の実施態様においては、組換えスズメバチ毒酵素酵素が融合タンパク質として発現される場合には、その融合タンパク質の非スズメバチ毒酵素部分をアフィニティー精製の標的にすることができる。例えば、融合タンパク質の非スズメバチ毒酵素部分に特異的な抗体を、固体支持体、例えば臭化シアン活性化セファロースに固定化し、融合タンパク質を精製するために用いることができる。別の実施態様においては、レセプター又はリガンドのような融合タンパク質の非スズメバチ毒酵素部分の結合パートナーを固定化し、融合タンパク質をアフィニティー精製するために用いることができる。
１実施態様においては、スズメバチ毒酵素融合タンパク質、好ましくは精製したものが修飾せずに、即ち、融合タンパク質の非スズメバチ毒酵素部分を切断あるいは除去せずに用いられる。好適実施態様においては、スズメバチ毒酵素融合タンパク質を治療上、例えば、免疫応答を調節するために用いることができる。
更に実施態様においては、精製融合タンパク質は非スズメバチ毒酵素タンパク質又はその部分をスズメバチ毒酵素から切断するために処理される。例えば、融合タンパク質がプロテアーゼ感受性切断部位を含むように調製された場合、融合タンパク質をプロテアーゼで処理してプロテアーゼ特異的部位を切断するとともにスズメバチ毒酵素を遊離することができる。具体的な実施態様においては、融合タンパク質は因子Ｘａで処理することにより切断される。
更に、実施態様においては、スズメバチ毒ホスホリパーゼタンパク質を再生することができる。
本発明の具体的な実施態様においては、その組換えスズメバチ毒酵素としては、
一次アミノ酸配列として実質的に図１（配列番号１７）、５（配列番号２７）又は６（配列番号５５）に示されたアミノ酸配列の全部又は一部並びにその断片、他の誘導体及び類縁体が含まれるがこれらに限定されない。
【００２４】
スズメバチ毒酵素の誘導体及び類縁体
本発明は、更に、スズメバチ毒酵素の誘導体及び類縁体に関する。スズメバチ毒酵素に関する誘導体及び類縁体の生産及び使用は、本発明の範囲内である。誘導体又は類縁体は免疫調節性である、即ち、抗原特異的免疫応答を調節することができる。他の実施態様においては、誘導体又は類縁体は、ＩｇＧ及びＩｇＥを含むスズメバチ毒酵素特異的免疫グロブリンに結合することができる。スズメバチ毒酵素の誘導体又は類縁体は、後述される分析を含むが限定されない当該技術において既知の手順により所望の免疫調節活性を試験することができる。
特に、スズメバチ毒酵素誘導体は、機能的に等価な分子を与えるによって本発明の核酸配列を変えることにより作成することができる。ヌクレオチドコーディング配列の縮重のために、本発明の実施ではスズメバチ毒酵素をコードする核酸と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が用いられる。これらは、配列内に同じアミノ酸をコードする別のコドンを置換することにより改変されるスズメバチ毒酵素をコードする遺伝子の全部又は部分を含み、もってサイレント交換を生じるヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない。同様に、本発明の誘導体は、一次アミノ酸配列として、配列内の残基を機能的に等価なアミノ酸残基に置換して保存アミノ酸置換を生じる改変配列を含むスズメバチ毒酵素のアミノ酸配列の全部又は一部を含むものが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、配列内の１個以上のアミノ酸残基は機能等価物として作用する同様の極性を有する別のアミノ酸に置換され、サイレント改変を生じる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のものより選ばれる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
【００２５】
スズメバチ毒酵素の誘導体又は類縁体は、スズメバチ毒酵素又はその断片に実質的に相同なもの又は核酸をコードするものがスズメバチ毒酵素をコードする核酸に対してハイブリッド形成することができるものが含まれるがこれらに限定されない。ハイブリッド形成は、当該技術において周知のように配列類似性の程度によって、中程度のストリンジェントから高度なストリンジェント条件下で起こる。
本発明の誘導体及び類縁体は、当該技術において既知の種々の方法で生産することができる。生産を生じる操作は、遺伝子又はタンパク質レベルで起こる。例えば、クローン化スズメバチ毒酵素の核酸配列は、当該技術において既知の多くの戦略で修飾することができる(Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) 。配列は、試験管内で制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な部位で切断され、更に場合によっては酵素修飾され、分離され、結合される。スズメバチ毒酵素の誘導体又は類縁体をコードする遺伝子の生産では、修飾遺伝子が翻訳停止シグナルによって中断されないスズメバチ毒酵素と同じ翻訳読み枠内に保たれることを確実にすることに注意しなければならない。
更に、スズメバチ毒酵素をコードする遺伝子を、翻訳配列、開始配列及び／又は終結配列を作成及び／又は破壊するために又はコーディング領域の変異を作成するために及び／又は新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するために又は前から存在するものを破壊するために生体外又は生体内で突然変異して更に試験管内修飾を容易にすることができる。生体外部位特異的変異誘発 (Hutchinson, C.ら, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller & Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphantら Sci. U.S.A. 83:710) 、ＴＡＢ（登録商標）リンカーの使用(Phamacia)等を含む当該技術において既知の変異誘発のための手法を用いることができるがこれらに限定されない。ＰＣＲ法は部位特異的変異誘発に好ましい(Higuchi, 1989, “Using PCR to Engineer DNA" Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, p.61-70 参照) 。
【００２６】
組換えスズメバチ毒酵素の操作は、また、タンパク質レベルで行われる。翻訳中又は翻訳後に、例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、還元及びカルボキシメチル化、既知の保護／遮断基による誘導、タンパク質分解切断、抗体分子又は他の細胞リガンドへの連鎖等によって特異的に修飾される組換えスズメバチ毒酵素断片又は他の誘導体もしくは類縁体は本発明の範囲に包含される。多くの化学修飾のいずれもが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4 による特定の化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下の代謝合成等を含むがこれらに限定されない既知の手法で行われる。
具体的な実施態様においては、スズメバチ毒酵素又はその免疫調節断片は昆虫細胞発現系で、例えば、バキュロウイルス発現系を用いて発現される。上で指摘されたように、これにより、発現したポリペプチドの“未変性”グリコシル化及び構造、特に二次及び三次構造が得られなければならない。診断分析で検出される酵素特異的抗体が天然酵素、即ち、スズメバチの刺針によって導入されたものに特異的であるので、発現したポリペプチドの未変性グリコシル化及び構造は診断使用に非常に重要である。
【００２７】
本発明のペプチドによる活性分析
抗原の免疫調節活性を評価するための免疫学において多くの分析が既知である。例えば、本発明の核酸の発現によって生産されたスズメバチ毒酵素タンパク質は、アレルギー疾患のための診断分析に用いることができ、これは下記で詳細に記載される。一般に、酵素に特異的な抗体に対するタンパク質の結合能を試験することができる。好ましくは、その診断分析において検出される抗体はＩｇＥを有する。しかしながら、アレルゲン特異的自然抗体が変性スズメバチ毒酵素に弱く結合することを見出したことに留意することは重要である。真核発現系、特に昆虫細胞発現系において生産されたスズメバチ毒酵素は、抗体結合に正しい構造を有するものである。細菌発現系において発現したスズメバチ毒酵素は有しないので、抗体結合の診断分析に使用する前に再生が必要である。
他の実施態様においては、本発明のタンパク質はＴ細胞応答の増殖分析において試験することができる。そのＴ細胞応答分析の場合、酵素を生産するために用いられる発現系はタンパク質の免疫調節活性に影響しないと考えられる。一般に、感作された宿主からのリンパ球が入手される。宿主は、本発明に従って組換え体で生産されたスズメバチ毒ホスホリパーゼ又はヒアルロニダーゼのようなスズメバチ毒酵素に免疫化したマウスとすることができる。
好適実施態様においては、スズメバチ毒酵素に感受性のあるヒトから末梢血白血球が入手される。当該技術において周知の手法を用いて、そのタンパク質に対するＴリンパ球応答を試験管内で測定することができる。下記の具体的な実施態様においては、増殖に伴ったＤＮＡ合成と共に増加する 3Ｈ−チミジンの取込みを測定することによりＴ細胞応答が検出される。
【００２８】
細胞増殖はＭＴＴ分析を用いて検出することもできる(Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63; Niks & Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151)。当該技術において既知のＴ細胞増殖を検出する方法は、本発明に従って生産されたスズメバチ酵素と共に用いることができる。
同様に、リンホカイン産生分析も本発明に従って実施することができる。１実施態様においては、リンホカイン産生は免疫学的もしくは共刺激分析 (例えば、Fehlnerら, 1991, J. Immunol. 146:799 参照）又はＥＬＩＳＰＯＴ法 (Czerkinsky ら, 1988, J. Immunol. Methods 110:29) を用いて分析することができる。また、リンホカインのｍＲＮＡは、例えば、増殖(Brennerら, 1989, Biotechniques 7:1096) 又は in situハイブリッド形成 (例えば、Kasaian & Biron, 1989, J. Immunol. 142:1287 参照) によって検出することもできる。Ｔ細胞がＩｇＥイソタイプスイッチ因子、例えば、ＩＬ−４及びＩＬ−５を伴ったリンホカインを産生する個体が特に興味深い(Purkeson & Isakson, 1992, J. Exp. Med. 175:973-982)。また、ＩｇＥスイッチ因子に関与するＴ細胞によって認識されたエピトープを含むスズメバチ毒酵素のポリペプチド断片が興味深い。
即ち、好適態様においては、アレルギー応答、例えば、ＩＬ−４を通常伴ったリンホカインの分泌を検出するために、本発明に従って生産されたタンパク質をスズメバチ毒酵素感受性個体から得られた末梢血リンパ球又はより好ましくは末梢血リンパ球由来の細胞系と共に試験管内分析において用いることができる。その分析は、毒成分又は成分群がアレルギー症状に関与することを示すものである。
更に重要なことには、スズメバチ毒酵素の断片を試験することができる。このようにして、アレルギー応答を伴ったＴ細胞応答に関与する特定のエピトープを同定することができる。交差反応性の可能性を示す配列類似性があるかを求めるために、そのエピトープの配列を他のスズメバチ毒酵素及び環境的又はオートロガスタンパク質と比較することができる。ペプチドのＴ細胞アネルギー誘導能を、例えば、メガドース投与、エピトープ拮抗体を生じる修飾、適切な共刺激シグナルの存在しない投与及びＴ細胞アネルギーを生じると考えられる他の方法によって試験することができる。そのエピトープを含むペプチドは、治療に理想的な候補である。
更に、実施態様においては、本発明のポリペプチドは、配列類似性を共有する他の環境的タンパク質及び／又は相同タンパク質との交差反応性の程度を検出するために分析で直接用いることができる。特に、その環境的、更に詳細には相同タンパク質との配列類似性を有するスズメバチ毒酵素の断片の、そのタンパク質に特異的な抗体又はＴ細胞との交差反応性を評価することができる。具体的な実施態様においては、スズメバチ毒ホスホリパーゼとヒトリパーゼとの交差反応性を評価することができる。他の具体的な実施態様においては、スズメバチ毒ヒアルロニダーゼと精子膜タンパク質ＰＨ−２０との交差反応性が評価される。
【００２９】
スズメバチ毒酵素ポリペプチドの診断及び治療使用
本発明は、組換え技術によって生産された豊富な純スズメバチ毒酵素又はその断片、誘導体又は類縁体源を提供するものである。また、本発明によって提供された配列情報を示したスズメバチ毒酵素のポリペプチド断片、誘導体又は類縁体はペプチド合成によって有利に生産することができる。
本発明は、スズメバチ毒酵素アレルゲン特異的アレルギー症状の診断及び治療における使用のための診断又は治療用組成物の調製用スズメバチ毒酵素又はその免疫調節断片、誘導体又は類縁体の使用を企図する。特に、スズメバチホスホリパーゼ、更に詳細には、ドリコベスプラ・マクラータ(white-face hornet) ホスホリパーゼ(Dol m I) 及びベスプラ・ブルガリス(yellowjacket)ホスホリパーゼ(Ves v I) 又はスズメバチヒアルロニダーゼ、特にD.マクラータヒアルロニダーゼ又はホスホリパーゼもしくはヒアルロニダーゼの免疫調節断片、誘導体又は類縁体が本発明に従って診断及び治療における使用に企図される。
【００３０】
診断方法
本発明において用いられる診断なる語は生体外及び生体内診断分析を含む。一般に、その分析は与えられたアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体活性を測定するように設計される。その診断分析は、純アレルゲンの利用可能性に大いに左右される。これは、スズメバチ毒の特定のアレルゲン成分に対する感受性を決定するのに特に当てはまる。酵素感受性のための試験管内診断分析としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックイムノアッセイ（ＩＲＭＡ）、ラジオアレルゴソルベントテスト（ＲＡＳＴ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴ、磁気アレルゴソルベントアッセイ、イムノブロット、ヒスタミン遊離分析等が挙げられる。
更に、実施態様においては、本発明は、ＩｇＥ抗体又は他のイソタイプ、例えば、ＩｇＧと優先的に反応するエピトープの存在を決定することを提供するものである。そのエピトープは、重複しても異なってもよい。特に、本発明のスズメバチ毒酵素の断片は、その特定のＢ細胞エピトープを同定するために用いることができる。特定のエピトープの同定は、下記のように治療を開発するための根拠となるものである。
本発明は、前記のように、末梢血リンパ球による試験管内診断分析を企図するものである。その診断分析から、酵素特異的Ｔ細胞応答、Ｔ細胞応答の表現型、好ましくはＴ細胞応答に関与する酵素のＴ細胞エピトープについての詳細な情報を得ることができる。免疫優性エピトープ及びＩｇＥイソタイプクラススイッチ因子に関与するエピトープが同一でない場合には検出することができる。特に、ＩｇＥイソタイプクラススイッチ因子に伴った表現型のＴ細胞の増殖及び／又はリンホカイン分泌を刺激するスズメバチ毒酵素のＴ細胞エピトープを、特定の個体又はＭＨＣハプロタイプ又は優先的Ｔ細胞レセプター可変領域発現又はその両方を共有する個体の種類に対して同定することができる。
アレルギー発現性の生体内分析は、皮膚掻破感受性分析からなり、アレルゲンの連続希釈量を患者の皮膚に皮下あるいは皮内に投与し、ホイール及び紅斑反応が検出される。試験管内分析と比べると、純毒酵素の利用可能性はスズメバチ毒
酵素嚢から調製された抽出物中の不純物との交差反応を避けることができるので、
生体内診断分析の結果の価値を非常に高める。
【００３１】
治療法
本発明の治療組成物（下記参照）は、減感作療法とも呼ばれる免疫療法において用いることができる。免疫療法は、アレルギー疾患、特に昆虫アレルギーに有効であった。アレルゲンは、用量を徐々に増やすのに長期間にわたって非経口的に投与される。その治療は、患者が感受性のあるアレルゲン又はアレルゲン群が特異的に同定されており治療がそのアレルゲンを標的にする場合に特に効果的であるものである。即ち、アレルギーの免疫療法には多量の純スズメバチ毒酵素の利用可能性が重要である。
他の実施態様においては、本発明は、スズメバチ毒酵素の少なくとも免疫調節Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチドを使用してそのスズメバチ毒酵素に特異的なＴ細胞アレルギーを誘導することを企図するものである。そのペプチドの同定は前に記載されている。更に好ましくは、そのＴ細胞エピトープを含みかつＢ細胞エピトープを含まないペプチドを患者に投与することができる。
本発明の背景において述べられたように、アレルゲンにＢ細胞エピトープが存在すると、そのアレルゲンを免疫療法に用いた場合に望ましくない全身反応を引き起こすことがある。即ち、本発明の具体的な利点は、望ましくない全身作用を引き起こさないアレルゲンポリペプチドを与えることができることである。
１実施態様においては、例えば、 Brineら(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7608-12)に記載されているように１種以上のポリペプチド断片を皮下に注射すると全分子に対するＴ細胞応答を低下させることができる。
他の実施態様においては、１種以上のポリペプチドを生まれつきの及び感作された患者においてアレルゲン特異的応答を抑制するために鼻内に投与することができる (例えば、 Hoyneら, 1993, J. Exp. Med. 178:1783-88参照) 。
本発明のスズメバチ毒酵素ペプチドを投与するとアネルギーを誘導することが予想され、アレルゲン特異的抗体産生又はアレルゲン特異的Ｔ細胞応答又はその両方を停止させることになるので治療効果がある。
本発明の好適態様においては、Ｔ細胞アネルギーを誘導する治療に基づくペプチドは各個体又は個体群に対して特別に作られる。本発明の診断法を用いて、アレルギー応答に関与するスズメバチ毒酵素の特異的Ｔ細胞エピトープ又はエピトープ群を同定することができる。次いで、これらのエピトープを含むペプチドを個別化された免疫療法の投薬計画に用いることができる。
【００３２】
薬学的に許容しうる組成物
本発明の生体内診断又は治療組成物は、また、適切な薬学的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤及び補助剤を含んでもよい。本明細書に用いられる“薬学的に許容しうる”なる語は、好ましくは、政府の規制機関、特に中央政府又は連邦政府で認可されているか又は米国薬局方又は動物、更に詳細にはヒトに有用な一般に認められた他の薬物類に挙げられているものを意味する。適切な医薬担体は、E.W. Martin による“Remington's Pharmaceutical Sciences" に記載されている。
その薬学的に許容しうる担体は、水及び落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等の石油、動物、植物又は合成起原のものを含む油のような滅菌液体とすることができる。水は、医薬組成物を静脈内に投与する場合に好ましい担体である。生理的食塩水及びデキストロース及びグリセロール水溶液も液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。適切な医薬賦形剤としては、マンニトール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、穀分、石灰、シリカゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアリン酸、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。これらの組成物は、液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤等の剤形を取ることができる。
その組成物は、患者に適切な投与形態となるように活性化合物の診断又は治療に有効な量と共に適切な担体量を含む。静脈内注射は非常に有効な投与形態であるが、注入又は経口、経鼻又は非経口投与のような他の方法も用いることができる。
本発明を、更に、下記の実施例によって明らかにするが、これらは本発明を例示するためだけのものである。
【００３３】
実施例１：クマンバチ毒ホスホリパーゼ
タンパク質の免疫化学的性質がそのアレルギー発現性に関与することを理解する継続的な努力において、クマンバチ毒の二次主要アレルゲンをクローン化し配列決定した。容認されたアレルゲン命名系(Marshら, 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80:639)に従って、クマンバチ(white-faced hornet)ホスホリパーゼをDol m I と称する。
特に、クマンバチ(white-faced hornet) (ドリコベスプラ・マクラータ) からの毒アレルゲンホスホリパーゼの配列は、ｃＤＮＡ及びタンパク質配列決定によって求められた。この３００個のアミノ酸残基のタンパク質 (Dol m I)は、他の既知のホスホリパーゼと配列類似性をもたない。しかしながら、哺乳動物リパーゼと配列類似性；１２３個の残基を重複して約４０％同一性を有する。クマンバチ天然ホスホリパーゼも弱いリパーゼ活性をもつことが見出された。
材料及び方法
Dol m I及びそのＣＮＢｒペプチドの単離及び確認。 Dol m Iを、記載されているようにクマンバチ(white-faced hornet)(Vespa Laboratory PA) の毒嚢抽出液から単離した (Kingら, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:621) 。そのタンパク質（0.６mg）を７５％ＨＣＯ2 Ｈ（0.２mg）中ＣＮＢｒ（１５mg）で２５℃において一晩切断した。切断した後、凍結乾燥した混合液をＰｅｐＲＰＣカラム(Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ) により0.１％トリフルオロ酢酸中１mlあたり0.１％の２−プロパノール勾配で１時間当たりの流速４０mlで分離した。選択した画分を、還元及びＳ−カルボキシメチル化後に同じ条件下に再クロマトグラフィー処理した (Fangら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.,USA. 85:895) 。回収したペプチドをApplied Biosystemsガスシークエンサーによるエドマン分解で確認した。
Dol m I特異的ｃＤＮＡ。グアニジンチオシアネート抽出法を用いてクマンバチ(white-faced hornet)の酸分泌腺から全ＲＮＡを単離した (上記Fangら, 1988) 。３’又は５’ｃＤＮＡ端の急速増幅（ＲＡＣＥ）のために Frohman(Frohman, 1990, Amplifications: A Forum for PCR Users, 5:11; Frohmanら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:8998-9002) の手順により全ＲＮＡからDol m I 特異的ｃＤＮＡを得た。
全反応容量３７μl 中鋳型としてＭｅＨｇＯＨ(Invitogen, カリフォルニア州サンディエゴ) 変性全ＲＮＡ（６μ）及び GMCO-BRL ( メリーランド州ゲイセルスバーグ) 製ｃＤＮＡ合成キット及びＲＮａｓｉｎ (Promega Biotech)の他の試薬を用いて一次ｃＤＮＡ鎖を調製した。５’ＲＡＣＥの場合、一本鎖ｃＤＮＡ（６μg の全ＲＮＡから）を末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(US Biochemical,オハイオ州クリーヴランド) でポリｄＡテイルをつなげた。３' 又は５’ＲＡＣＥは、ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼを用いてＧｅｎＡｍｐＰＣＲ試薬キット (Perkin-Elmer Cetus, コネチカット州ノルウォーク）で行い、３’はＶｅｎｔポリメラーゼ(New England Biolabs, マサチューセッツ州ビバリー) でも行った。第１ラウンドＰＣＲの場合、一次ｃＤＮＡ鎖の１／１００を鋳型として用いた。第２ラウンドＰＣＲの場合、第１ラウンドＰＣＲ産物の１／１０００を鋳型として用いた。
ＰＣＲ産物を、臭化エチジウム染色を用いて1.５％アガロースゲル中電気泳動及びサザンブロット分析により試験した。ＤＮＡをニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell,ニューハンプシャー州キーネ) に移し、次に、ＵＶ架橋により固定化した。膜を３０％ホルムアミド、６×ＳＳＰＥ (Sambrookら, 1989, Molecular Cloning. Vol.1 &2, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、５×デンハート溶液 (上記Sambrookら, 1989)、１００μg／mlサケ精子ＤＮＡ、 0.１％ＳＤＳの前ハイブリッド形成溶液に４２℃で２時間浸漬し、次に、32Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブ（前ハイブリッド形成溶液１ml当たり１×１０6 cpm ）と４２℃で一晩ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後の膜を、３M 塩化テトラメチルアンモニウム、0.２％ＳＤＳ及び0.０５M トリスＨＣｌ、ｐＨ8.０の溶液中６０℃で２０分間２回洗浄した (Woodら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:1585-1588) 。比活性５×１０7 〜１０8cpm／μg のオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs) の存在下にγ−32Ｐ−ＡＴＰ(New England Nuclear Corp)で標識した。標識化方法及び他の分子生物学的手順は、Sambrookら (上記1989) から採用した。
ＰＣＲ産物は、単一の３’突出Ａヌクレオチド(Clark, 1988, Nucl. Acids Res. 16:9677-9686)を含み、適合しうるＴヌクレオチド突出を有するＰＣＲベクターへクローン化するために直接用いた(Invitogen Corp.カリフォルニア州サンディエゴ) 。ＱＩＡＧＥＮプラスミドキット(QIAGEN,カリフォルニア州チャッツワース) を用いて、適切なクローンからプラスミドＤＮＡを単離した。
ＤＮＡ配列は、アルカリ変性プラスミドＤＮＡ及びシークエナーゼの変形2.０キット(US Biochemical,オハイオ州クレーブランド) を用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法によって決定した。
ホスホリパーゼのクローニング及び企図した発現。混成配列由来のプライマーを用いて、ホスホリパーゼの完全配列をコードするｃＤＮＡ、残基１〜３００をＰＣＲにより得た。そのプライマーを、突出ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位で合成した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、相補的付着末端を有する同様に切断されたｐＱＥ−１２プラスミドと結合した。コンピテントなＭ１５（ｐＲＥＰ）細菌を形質転換するために、組換えｐＱＥ−１２プラスミドを用いた。
ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ消化しないｐＣＲもｐＣＲベクター(Invitrogen)へ直接クローン化した。ＩＮＶαＦ’細菌を形質転換するために、組換えｐＣＲベクターを用いた。
ホスホリパーゼ及びリパーゼ分析。0.５％トリトンを含む0.２ＮＮａＣｌ中基質として１０％卵黄を用いて２５±１°及びｐＨ８において滴定法でホスホリパーゼ活性を測定した (Kingら, 1984, Arch. Biochem. Biophys.230:1) 。同様に、基質として２％合成トリグリセリドトリアセチン、トリブチン、トリカプリリン、トリオレイン又はトリステアリン(Sigma Biochemical, ミズーリ州セントルイス)のエマルジョンを用いて測定した。
結果
Dol m Iの部分アミノ酸配列。部分アミノ酸配列データをＣＮＢｒペプチドから得た。これらのペプチドの７つの部分又は完全配列は、図１のアンダーラインで示される分子の残基１〜１２、１４〜３０、３２〜５７、８５〜９６、９８〜１１２、１６１〜１７０、１８３〜１９４及び２４４〜２５１に対応する。最初の５つのペプチドは、メチオニン残基の前であるいはメチオニン残基で終結した場合のように予想された切断に対応する。後の３つのペプチドは、グルタミルペプチド結合の酸切断からの副生成物を示す。これらの部分アミノ酸配列データを、表１の配列番号５、６、９及び１１のオリゴヌクレオチドの設計及び合成に用いた。
【００３４】
表１
クマンバチホスホリパーゼをクローン化するためにプライマー又はプローブとして用いたオリゴヌクレオチド
配列番号         オリゴヌクレオチド*          注              
1       AAG GAT CCG TCG ACA TCG ATA ATA CGA  3'RACEの一次cDNA鎖合成用
CTC ACT ATA GGG ATT T15  (dT)17R1R0プライマー
2       AAG GAT CCG TCG ACA TC               3'RACEの第１ラウンド PCR用
R0アンチセンスプライマー
3       GAC ATC GAT AAT ACG AC               3'RACEの第２ラウンド PCR用
R1アンチセンスプライマー
4        D9  T   V   K   M  I14              3'RACEの第１ラウンド PCR用
5       GAY ACI GTI AAR ATG AT               センスプライマー
6       7K22 H   D   F   Y  T27              3'RACEの第２ラウンド PCR用
7       AAR CAY GAY TTY TAY AC               センスプライマー
8       I190Q   V   Y   H   A   D184         3'RACEの PCR産物のハイブリ
9       AT YTG IAC RTA RTG IGC RTC           ッド形成プローブ; 又は5'
RACE の一次cDNA鎖合成用プ
ライマー
10       P92 Y   E   D   T   C87              5'RACEの第１ラウンド PCR用
11       GG RTA YTC RTC IGT RCA               アンチセンスプライマー
12          M70 L   A   E   S66               5'RACEの第２ラウンド PCR用
13       G CAT AAG AGC CTC TGA C              アンチセンスプライマー
14          M31 T   D   L   T27               5'RACEの PCR産物用ハイブリ
15       T CAT TGT ATC TAG CGT A              ッド形成プローブ
* ＲはＡ又はＧを表し；ＹはＣ又はＴを表し；Ｉはイノシンを表す。
【００３５】
Dol m IのｃＤＮＡ配列。アミノ酸残基２２〜３００をコードするｃＤＮＡ及びその３’非翻訳領域を、Ａに略述されたようにＲＡＣＥ法によって毒ＲＮＡから増幅した。Ｒ1 ＋ＲO アダプターを含むｄＴプライマー（表１の配列番号１のオリゴヌクレオチド）を用いて、全ＲＮＡから一本鎖毒ｃＤＮＡを合成した。指定されたように組込まれたプライマーを用いるＰＣＲの２連続ラウンドにより、一本鎖毒ｃＤＮＡから二本鎖 Dol m I特異的ｃＤＮＡを増幅した。数種のＰＣＲ産物を検出し、配列番号９のオリゴヌクレオチド（表１）とのハイブリッド形成によるサザンブロットで試験した場合に予想された産物である約１ｋｂの主要バンド（図３）が出現した。図３に示されているように、１ｋｂバンドはＴａｑポリメラーゼを使用した場合に見られ、Ｖｅｎｔポリメラーゼでは見られなかった。
１ｋｂバンドを含むＰＣＲ産物をプラスミドへ直接クローン化した。細菌に形質転換した後、３コロニーからプラスミドを選択し、配列決定した。２コロニーの混成配列は、図１における１１５〜１０５０のヌクレオチド配列を示した。その１つは、３’非翻訳領域において９６８位のアデニン塩基の欠失及び１０２７位の９９ヌクレオチドの挿入によって示されたものと異なる。第３のコロニーは、８０７位（ＣからＴに置換；共にセリンをコードする）及び８１２位（ＡからＧに置換；アスパラギンをセリンに変える）に示されたものと異なる。
図１のｃＤＮＡデータを用いて、図１のヌクレオチド１１５の５’であるｃＤＮＡ領域を増幅するために表１の配列番号１３及び１５のオリゴヌクレオチドを合成した。図２Ｂに図式的に示されているように、プライマーとして配列番号９のオリゴヌクレオチドを用いて全ＲＮＡから一本鎖 Dol m I特異的ｃＤＮＡを合成し、次いで末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼでポリ−ｄＡテイルをつなげた。その指定したプライマーを用いてＰＣＲの２連続ラウンドによってポリ−ｄＡテイルをつなげた特異的ｃＤＮＡから二本鎖 Dol m I特異的ｃＤＮＡを増幅した。数種の産物が増幅の第２ラウンド後に生成し、表１の配列番号１５のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによるサザンブロットで検出した場合に予想された産物である約0.３２及び0.２５ｋｂｐ（図３）の２バンドが出現した。プラスミドへクローン化した後に、図１のヌクレオチド１〜２６２のｃＤＮＡ配列を含む0.３２ｋｂｐの産物を決定した。
図１の５２位のヌクレオチドの前にある領域は、 Dol m IのＮ末端アミノ酸残基のリーダー配列をコードする。 Dol m Iタンパク質は、５２位のヌクレオチドで開始することがエドマン分解で見られた。そのタンパク質配列は、残基８及び２１２で起こりうる２つのグリコシル化部位の存在を示す。残基８の部位は、おそらくエドマン分解によりこの残基を同定する試みが負の結果を繰り返すようにグリコシル化される。また、 Dol m Iタンパク質上の炭水化物の存在は演繹した配列から算出された分子量３３，７４５とＳＤＳゲル電気泳動から算出された約３７,０００の実測分子量の差で示される。
ホスホリパーゼの完全配列をコードするｃＤＮＡ、残基１〜３００を、下記の２つのプライマーを用いる毒ｃＤＮＡのＰＣＲによって得た。
【００３６】
プライマー 配列
BamHI  F1  S   V   C   P   F6  (配列番号５９）
センス        CGT GGA TCC TTC TCC GTA TGT CCC TTT  (配列番号６０）
BglII  I300I   K   G   N   N295(配列番号６１）
アンチセンス  CGT AGA TCT AAT TAT TTT CCC GTT GTT  (配列番号６２）
ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ消化後のＰＣＲ産物を、相補的付着端を有する同様に切断したｐＱＥ−１２プラスミドと結合した(QIAGEN,カリフォルニア州チャッツワース）。コンピテントなＭ１５（ｐＲＥＰ）細菌を形質転換するために、組換えｐＱＥ−１２プラスミドを用いた。しかしながら、所望の組換えタンパク質の発現は検出されなかった。
また、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ消化をしない上記ＰＣＲ産物をｐＣＲベクター(Invitrogen,カリフォルニア州サンディエゴ) へクローン化した。ＩＮＶαＦ' 細菌を形質転換した後、得られたプラスミドは３２２位の１つのヌクレオチドデオキシチミジル酸塩が検出されなかったことを除いてクマンバチホスホリパーゼの図１に示されたものと同一の配列を有するｃＤＮＡ挿入断片を含むことが見出された。
ｐＱＥ−１２系は、クマンバチ毒抗原５及びクマンバチ毒ヒアルロニダーゼの発現に巧く用いられた（実施例５参照）。組換えホスホリパーゼが細菌宿主に毒性である場合には、その宿主はその読み枠が変わるようにｃＤＮＡのヌクレオチドを欠失してもよい。これは、ホスホリパーゼを発現しないための可能な説明である。また、ＰＣＲ増幅がこの欠失変異を導入してもよいが見込みはない。
ＷＦＨ−ＰＬＡ−Ｅ４と称する組換えｐＣＲプラスミドを宿す細菌培養物を、1993年３月11日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションに寄託し受託番号ＡＴＣＣ６９２５４に指定された。その寄託物の作成に引き続いて、このＤＮＡの反復配列分析により、上記突然変異、図１に示された配列の３２２位のヌクレオチドデオキシチミジル酸塩の欠失がこのクローンに存在することが示された。
クマンバチ天然ホスホリパーゼのリパーゼ活性。スズメバチホスホリパーゼが合成ホスファチジルコリンの１位のアシル基の急速な加水分解及び２位のアシル基の緩慢な加水分解を触媒することは以前に報告されている (Kingら, J. Allergy Clin. Immunol. 75:621-628)。従って、スズメバチホスホリパーゼはＡ1 及びＢタイプ双方のホスホリパーゼ活性を有する。クマンバチホスホリパーゼとリパーゼとの配列類似性についての現在の知見は、リパーゼ活性の試験を容易にした。
毒液から単離された酵素試料のバッチは、基質として卵黄と試験した場合に１mg当たりホスホリパーゼ活性約２８０単位を有した。これは１mg当たり1,１００単位の以前に報告された比活性より低く (上記Kingら, 1985) 、その低活性は不注意な低ｐＨへの長時間の露出によるものである。この試料は、基質としてトリアセチン及びトリブチリンを用いて各々１３及び３３（±２０％）単位／mgのリパーゼ活性を有した。これらのデータは、クマンバチホスホリパーゼが弱いリパーゼ活性を有することを示している。
検討
ＦＡＳＴＡ法(Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444)による配列の比較により、 Dol m Iが文献において既知の他のホスホリパーゼと類似性を有しないが哺乳動物リパーゼと類似性を有することが示された。これは、ヒト及びマウスからのリポタンパク質リパーゼと肝リパーゼについて図４に示されている (Kirchgessnerら, 1987, J. Biochim. Biophys. Acta. 1089:13)。ヒト膵リパーゼ(Winklerら, 1990, Nature. 343:771)は、ヒト肝リパーゼとほぼ同じ程度の Dol m Iとの類似性を有する。哺乳動物リパーゼと Dol m Iの１２３残基の重複に約４０％の同一性がある。図４に示されたリパーゼの配列領域は、類似の配列が多くの他の哺乳動物及び原核リパーゼ並びにショウジョウバエ(Drosophila)タンパク質ビテロゲニンに見られるように高度に保存される(Perssonら, 1989, Eur. J. Biochem. 179:39 ; Bownesら, 1988, Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 85:1554) 。即ち、これらのタンパク質も、 Dol m Iとかなりの配列類似性を有する。
全リパーゼの最も強く保存された領域は、ヒトリポタンパク質リパーゼの残基１５３〜１６３のウンデカペプチド領域にあることが報告されている (上記 Persson ら, 1989) 。この領域はリパーゼ活性に重要であると考えられ、リパーゼ及び Dol m Iの最高の同一性を有する領域である。興味深いことに Dol m Iは合成トリグリセリドと弱いリパーゼ活性を有する。
全てのスズメバチアレルギー患者は、常に Dol m I及び Vの双方に特異的な抗体を有する。従って、我々はこれらの２つのタンパク質の配列を比較し、１つの類似したオクタペプチド配列： Dol m VA 及び Bの４５〜５２位の各々ＶＮＲＨＮＱＦＲ（配列番号２３）及びＬＫＲＨＮＤＦＲ（配列番号２４）及び Dol m Iの３１〜３８位のＭＮＲＨＮＥＦＫ（配列番号２５）を共有することを見出した。しかしながら、このオクタペプチド配列は、これらのホスホリパーゼが他のタンパク質と類似性を示す配列領域にはない。
アレルゲンと我々の環境における他のタンパク質との配列類似性を有する例がいくつかある。例としては、カバ花粉アレルギー Bet v Iとエンドウ疾患耐性応答遺伝子(Breitenederら, 1989, EMBO J.8:1935); オオアワガエリ及びヨモギ花粉からのBet v IIとその同族体とヒトプロフィリン(Valentaら, 1992, J. Exp. Med. 175:377);ダニアレルゲン Der p Iとヒトカテプシン及び他のシステインプロテアーゼ (Chuaら, 1988, J. Exp. Med. 167:175);ミツバチ毒アレルゲンホスホリパーゼＡ2 とヒト膵臓酵素；及びミツバチ毒アレルゲンメリチン Api m IIIとヒト補体Ｃ９ (Kingら, 1990, Protein Sequences and Data Analysis 3:263 参照) がある。しかしながら、ダニ (Chuaら, 1990, Int. Arch, Allergy Appl.Immunol. 91:124; Toveyら, 1989, J. Exp. Med. 170:1457)並びにサワギク及びクサ花粉 (Rafnarら, 1991, J. Biol. Chem. 266:1204; Singhら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:1384) からのいくつかの他の主要アレルゲンと我々の環境における他のタンパク質との配列類似性は不明である。
従って、スズメバチホスホリパーゼ、 Dol m Iをコードする遺伝子は、そのスズメバチホスホリパーゼの組換え体の発現が交差反応性を試験しかつ適切なＢ細胞及びＴ細胞エピトープを決定するのに十分なタンパク質源とならなければならないので、クローン化及び配列決定したことは極めて有益である。
【００３７】
実施例２：クロスズメバチホスホリパーゼ
上記実施例１に記載された手順を用いて、クロスズメバチ(Vespula vulgaris)ホスホリパーゼ(Ves v I) のｃＤＮＡ配列を得た。 Ves v Iの完全ｃＤＮＡ配列及び演繹したアミノ酸配列を図５に各々配列番号２６及び２７として示す。
上記実施例１に記載された配列分析を、図５に示された配列について行った。特に、この配列は Dol m Iの約２／３の残基と同一である。 Dol m Iと同様に、Ves v Iは哺乳動物リパーゼの１２３残基の重複で約４０％の同一性を有する（図４参照）。 Ves v Iと哺乳動物リパーゼのこのセグメントの同一性はアレルギーにおいて重要であると考えられる。
【００３８】
実施例３：クマンバチ (white face hornet)ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼは、クマンバチ (white face hornet)毒からの３種類の主要アレルゲンの１つである。ＳＤＳゲル電気泳動によって算出された約４３ｋＤのタンパク質である (Kingら, 1978, Biochem. 17:5165-74)。その酵素の特異性は、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの反復二糖のポリマーである、ヒアルロンからのＮ−アセチルグルコサミンの還元基の遊離を触媒するエンド−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼタイプ (Kingら, 1985, Allergy Clin. Immunol. 75:621-628)を有する。
部分アミノ酸配列データを、無傷タンパク質及びそのS.アウレウス(S. aureus) プロテアーゼ消化ペプチドのエドマン分解により得た。２つの縮重オリゴヌクレオチド、配列番号２９オリゴヌクレオチド３１（表２）を部分アミノ酸配列データに基づいて合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして用いて毒ｃＤＮＡからこれらのプライマーに特異的なｃＤＮＡを増幅した。タンパク質配列における配列番号２９のオリゴヌクレオチドの存在位置は既知であり、ヒアルロニダーゼの残基８〜１３をコードする（配列番号２８）。配列番号３１のオリゴヌクレオチドの存在位置は、ＰＣＲ産物の翻訳配列とヒアルロニダーゼの部分アミノ酸配列とを比較することにより決定され、残基４０〜４５をコードする（配列番号３０）。
【００３９】
表２
クマンバチヒアルロニダーゼのクローニング及び配列決定のための
オリゴヌクレオチドプライマー
配列
番号 プライマー 注
28                F8  N     I   Y     W   N13
29   CGT GGA TCC TCC AAC/T ATI TAC/T TGG AA      残基8-45の PCR及び配列
決定プライマー
30                D45G    Q     F     D     D40
31   CGT AGA TCT TC ICC T/CTG A/GAA A/GTC A/GTC  上記参照
32    W12 N   V   P   T   F   M18
33   TGG AAC GTT CCT ACC TTT ATG                 第１ラウンド3'RACE
34    G23 L   Y   F   D   E28
35   GGC CTA TAC TTC GAC GAG                     第２ラウンド3'RACE及び
配列決定プライー
36      Y182G   Y   Y   G   W177
37   G ATA TCC GTA ATA GCC CC                    5'RACEのcDNA合成
38    D107I   V   G   I   G102
39   TC  GAT CAC ACC GAT ACC G                   第１ラウンド5'RACE
40    L52P   L   L   A   P57
41   AG CGG CAA CAA TGC CGG G                    第２ラウンド5'RACE及び
配列決定プライマー
42   AAG GAT CCG TCG ACA TCG ATA ATA CGA         3'RACE又は第１ラウンド
43               CTC ACT ATA GGG ATT T15         5'RACEのcDNA合成
44   AAG GAT CCG TCG ACA TC                      第１ラウンド3'RACE又は
第２ラウンド5'RACE
45   GAC ATC GAT AAT ACG AC                      第２ラウンド3'RACE及び
配列決定プライマー
46            S1  E   R   P   K   R6
47   CGT GGA TCC GAG AGA CCG AAA AGA             残基 1-331のPCR 及び配
列決定プライマー
48                N331V   T   E   T   V326
49   CGT AGA TCT GTT GAC GGT TTC CGT CAC         上記参照
50    I106D   F   E   R   W111
51   ATC GAC TTT GAA AGA TGG                     配列決定プライマー
52                M161E   E   T   L   K166
53   CGT GGA TCC ATG GAG GAA ACT TTG AA          配列決定プライマー
ヒアルロニダーゼの残基８〜４５をコードするＤＮＡ配列データから、更に、オリゴヌクレオチドプライマー、配列番号３３及び３５（表２）を合成した。配列番号４４及び４５のオリゴヌクレオチドと共に用いてｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）として一般に知られる Frohmanらの方法(1988, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:8998-9002)によってヒアルロニダーゼをコードするｃＤＮＡの３’端を増幅した。この方法において、ヌクレオチド１２７〜１２２９（図６；配列番号５４）を含むｃＤＮＡ断片を得た。３’ＲＡＣＥのＤＮＡ配列に基づいて配列番号３７、３９及び４１（表２）の他のプライマーセットを合成した。配列番号４３及び４４のプライマーと共に用いてＲＡＣＥプロトコールに従ってｃＤＮＡの５’端を増幅し、ヌクレオチド１〜２４６を含むｃＤＮＡ断片を得た。
エドマン分解によって演繹した残基１〜４５のヒアルロニダーゼのＮ末端配列は、図６のヌクレオチド６１〜２０４位によってコードされる（配列番号５４）。ヌクレオチド１〜６０位の領域は、おそらくヒアルロニダーゼの“プレプロ”セグメントの一部をコードする。しかしながら、ヌクレオチド１９〜２１位の停止コドンの存在は予想されず、ｍＲＮＡの不完全なスプライシングを表すと思われる。図６のＤＮＡのコーディング領域は、停止コドンがその位置の後に続くので１０５３位で終わる。ヌクレオチド１０５７〜１２２９位の領域は、ポリＡテールを有するが AATAAA のポリアデニル化シグナル部位のない３’非翻訳領域を表す。
図６のデータ（配列番号５４）から配列番号４７及び４９のオリゴヌクレオチドプライマー（表２）を合成した。これらを用いて細菌中で発現させるための全長ヒアルロニダーゼをコードするｃＤＮＡを増幅した。ヒアルロニダーゼを発現するための３’及び５’ＲＡＣＥ及びＰＣＲからのＤＮＡ断片を、ｐＣＲベクター(Invitrogen Corp.,カリフォルニア州サンディエゴ) にクローン化した。プラスミドＤＮＡを適切なクローンから単離し、次いでシークエナーゼ変形2.０キット(U.S. Biochemical,オハイオ州クレーブランド) を用いてサンガージデオキシヌクレオチド鎖終結法により配列決定した。３’ＲＡＣＥからの５クローン、５' ＲＡＣＥからの４クローン及びヒアルロニダーゼの発現に特異的なＰＣＲからの１クローンのデータから、図６のＤＮＡ配列（配列番号５４）を構築した。これらのクローンの配列データの重複が十分であるので、図６のヌクレオチドの全ての位置（配列番号５４）が４クローン以上の共通を表す。唯一の例外は、２クローンから得られた１〜４５位の領域である。表３に挙げられるこれらのクローンの突然変異がいくつかある。それらのほとんどはサイレント突然変異であるが、２つはアミノ酸置換を生じる。これらの突然変異は、ＰＣＲにおける塩基取込みの不誠実によるものであるか又は対立遺伝子形態を表すものである。
【００４０】
表３
3'及び5'RACE及び発現 PCRからのクローンの配列突然変異*
起源／クローン          指定した位置におけるヌクレオチド
151  199  251  259  642  1064  1137  1154  1172  1184
5' RACE
# 9               A
#19               A   A
#32               A   A
#39               G   A
発現
#12               A   T    A     T    C 
3' RACE
# 1               A   A    G  C    A    T     G  G     A     T
# 2                   A    A     T    A    T     A     A     A     T
# 3                                        T     A     A     G     T
# 4                   A    A     T    A
# 7                                        C     A     A     A     A
共通              A    A    A     T    A    T     A     A     A    T
*共通配列は図６に示されている（配列番号５４）。１５１位の突然変異は、アスパラギンのＡＡＴからアスパラギン酸のＧＡＴに、１９９位はイソロイシンのＡＴＣからフェニルアラニンのＴＴＣにコドンの交換を生じる。２５１、２５９及び６４２位の突然変異はコドンの交換を生じない。残りの突然変異は３’非翻訳領域である。
図６のＤＮＡデータ（配列番号５４）から演繹したアミノ酸配列（配列番号５５）は、分子量３8,９２９ダルトンを有する３３１個のアミノ酸残基を有するヒアルロニダーゼを示す。ヒアルロニダーゼの分子量は、ＳＤＳゲル電気泳動データから４３ｋＤａであることが求められた。分子量の差は、おそらく、翻訳した配列が残基７９〜８１のＡｓｎ・Ｘ・Ｔｈｒ／ＳｅｒのＡｓｎグリコシル化モチーフの可能性があるので、ヒアルロニダーゼが糖タンパク質であることを示している。
上記の実験において必要な毒ＲＮＡ及び全ての実験手順は、クマンバチ抗原５及びホスホリパーゼに関する我々の以前の研究に記載されているものと同じである (上記実施例１及びFangら-899; Luら, 1993, J. Immunol. 150:2823-30; Soldatovaら, 1993, FEBS Lettr. 320:145-149)。
クマンバチ毒ヒアルロニダーゼ演繹アミノ酸配列の他のタンパク質のアミノ酸配列に対する類似性を評価した。配列の探索は、 BLASTネットワークサービスを用いて National Center for Biotechnology Informationで行った (Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)。探索により、クマンバチ毒ヒアルロニダーゼ（配列番号５７）が３５１個の残基を含むミツバチ毒ヒアルロニダーゼ（配列番号５６）と５４％の配列同一性を有することがわかった(Omachl & Kreil 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90-3569-73) 。両者の毒ヒアルロニダーゼは、モルモット精子の膜タンパク質（配列番号５８）とかなりの配列相同性を示す(Lathropら, 1990, J.Cell Biol. 111:2939-49) 。これらの配列の比較は図７に示されている。クマンバチとモルモットタンパク質の配列相同性は２５％である。ゲノムライブラリーによるハイブリッド形成実験により、ＰＨ−２０として既知のこの膜タンパク質はヒトを含む哺乳動物に広く分布されていることが示された。ＰＨ−２０は、精子−卵子の接着に役割を果たすと考えられた。
【００４１】
実施例４：クマンバチ及びミツバチ毒ヒアルロニダーゼの抗原交差反応性
ＢＡＬＢ／ｃ株のマウスにアジュバントとしてミョウバンの存在下にクマンバチ又はミツバチ未変性ヒアルロニダーゼを腹腔内経路により隔週に免疫した。４匹のマウス群に0.０５M リン酸塩バッファー、ｐＨ6.２中0.２mlの１０mg／mlヒアルロニダーゼ及び５mg／mlミョウバンを０、２、４及び６週目に免疫した。
リンパ球増殖分析用に免疫したマウスからの脾臓を得た。２回免疫の３週間後の増殖分析により、クマンバチヒアルロニダーゼで免疫したマウスからの脾臓細胞がクマンバチ又はミツバチタンパク質による刺激に等しく十分に応答しかつミツバチタンパク質で免疫したマウスからの脾臓細胞がミツバチタンパク質による刺激に強くクマンバチタンパク質による刺激に弱く応答することが示された（図８Ａ及びＢ）。これらの分析において刺激抗原としてクマンバチタンパク質の代わりにクロスズメバチ (V. vulgaris)又はアシナガバチ(P. annularis)からのヒアルロニダーゼを用いた場合に酷似した結果を得た。これらの知見は、ミツバチ及びスズメバチヒアルロニダーゼのＴ細胞エピトープの抗原交差反応を示すものである。
また、免疫に対する長期応答を実験した。９週間目にクマンバチヒアルロニダーゼを免疫したマウスからの脾臓細胞は試験管内で変化した応答を示し、ミツバチヒアルロニダーゼに比べてクマンバチヒアルロニダーゼに応答して増殖の程度が著しく増大した。クマンバチヒアルロニダーゼに対する脾臓細胞応答の大きさは３週から９週まで増大するが、ミツバチヒアルロニダーゼに対する応答の大きさはほぼ同じままであることがわかった（図９Ａ）。
ミツバチヒアルロニダーゼを免疫したマウスからの脾臓細胞は、ミツバチヒアルロニダーゼで刺激した場合には試験管内で増殖し続けたがクマンバチヒアルロニダーゼで刺激した場合には応答が不十分であった（図９Ｂ）。
また、マウスの抗体応答を評価した。０、５、７週目に血清を採り、ミツバチ又はクマンバチヒアルロニダーゼで被覆したマイクロタイターウェルでＥＬＩＳＡにより抗体を分析した。ＥＬＩＳＡの結果を表４に示す。
【００４２】
表４
2006000119.tif 000002
７週目及び９週目で採取した血清は、クマンバチ毒ヒアルロニダーゼ特異的抗体がそれ自体と強く反応し毒ヒアルロニダーゼと弱く反応することを示した。ミツバチ毒ヒアルロニダーゼ特異的抗体は、免疫原とのみ反応した。
これらの２つの毒タンパク質の抗原交差反応性の情報は、患者においてスズメバチとミツバチ感受性の関連があることが知られるように臨床上興味深いものである。
【００４３】
実施例５：機能性クマンバチ毒ヒアルロニダーゼの発現
表３のｐＣＲベクター内のクローン１２は、クマンバチヒアルロニダーゼの残基１〜３３１をコードするｃＤＮＡ挿入断片を含んでいる。ｃＤＮＡ挿入断片は、その５’及び３’端において各々ＨａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位が隣接している。その挿入断片を、ＨａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩ消化によってベクターから切り出し、相補的付着部位を有する切断ｐＱＥ１２プラスミド(QLAGEN,カリフォルニア州チャッツワース) に挿入した。イソロイシンにフェニルアラニンの導入を生じる（表３の注参照）クローン１２におけるヌクレオチド１９９位の突然変異（Ａ→Ｔ）により、ヒアルロニダーゼのコーディング領域のＢｇｌＩＩ部位が偶然に除去された。
組換えｐＱＥ１２プラスミドを用いてコンピテントなＭ１５（ｐＲＥＰ）細菌を形質転換した。形質転換した細菌のイソプロピルチオガラクトシドによる誘導で、約４３及び２５ｋＤの２つの組換えタンパク質が発現した。タンパク質は共にウェスタンブロットによりクマンバチヒアルロニダーゼに特異的な抗体と反応した。ウェスタンブロットに用いた抗体は、上記実施例４に記載されるＢＡＬＢ／ｃマウスの９週目の採血から得た。
ｐＱＥ１２プラスミドは、組換えタンパク質が配列：ＭＲＧＳ挿入ＳＲＨ6 を有するように設計される。組換えタンパク質中にヘキサヒスチジン配列が存在すると、金属イオンキレート化クロマトグラフィー、次に逆相クロマトグラフィーにより他の細菌タンパク質からの精製を可能にする。
精製した組換えタンパク質は、ヒアルロニダーゼ活性がなかった。その組換えタンパク質をｐＨ7.４の0.０５M トリスＨＣｌバッファー中５mM２−メルカプトエタノール、１mMＥＤＴＡ及び２M グアニジン塩酸塩中で再生すると、未変性ヒアルロニダーゼの約５０％の比活性を有する産物を得た。精製した組換えヒアルロニダーゼの量は、ＵＶ吸光度により算出した。精製した試料が２３ｋＤ及び４６ｋＤの両方のタンパク質を含むので、機能性組換え酵素の実際の酵素活性は未変性ヒアルロニダーゼの５０％より大きいものである。
上記の実験は、４３ｋＤ組換えタンパク質がクマンバチヒアルロニダーゼであるという論文を強く支持するものである。２６ｋＤ組換えタンパク質は、３’から所望の部位まで翻訳を開始するために生じる。そのような内部状態は、５’から内部ＡＴＧ又はＧＵＧコドンまで共通配列（シャイン・ダルガルノ配列）を結合するリボソームがある場合に生じる。
【００４４】
微生物の寄託
ＷＦＨ−ＰＬＡと称するクマンバチ(white face hornet) をコードする核酸を有する組換えプラスミドｐＣＲを含む細菌株ＩＮＦαＦ’を、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の規定によって1993年３月11日アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、20852 メリーランド州、ロックビル、パークラウンドライブ12301 に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号６９２５４に指定された。
本発明は、本明細書に記載された寄託微生物又は個々の実施態様によって範囲が限定されるべきでなく、その実施態様は本発明の１態様を具体的に説明するだけのものであり機能上等価な微生物は本発明の範囲内にある。実際に、本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の種々の変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。その変更は、次の請求の範囲の範囲内に包含されるものである。
また、ヌクレオチドに示された塩基対のサイズは全て近似値であり説明のために用いられることは理解されなければならない。
種々の参考文献が本明細書中に言及されており、その開示はすべて本明細書に参考として引用される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】クマンバチホスホリパーゼ(Dol m I) のｃＤＮＡ（配列番号１６）及びアミノ酸（配列番号１７）配列。ヌクレオチド及びアミノ酸の位置の番号は右につけられている。アミノ酸残基のナンバリングは、ヌクレオチドの位置５２〜５４及び９４９〜９５１に対応する各々フェニルアラニン及びイソロイシンのＮ末端及びＣ末端で開始し終わる；これらのアミノ酸残基及びヌクレオチドは太字で示されている。また、アンダーラインのあるアミノ酸残基は、ＣＮＢｒペプチドのエドマン分解で決定された。
【図２Ａ】Dol m I の３’ｃＤＮＡ端の急速増幅（ＲＡＣＥ）の図式。中のあいた及びつまった棒は、各々ＲＮＡ及びＤＮＡを表す。オリゴヌクレオチドプライマーに番号をつけ、それらの配列を表１に示す。
【図２Ｂ】Dol m I の５’ｃＤＮＡ端の急速増幅（ＲＡＣＥ）の図式。中のあいた及びつまった棒は、各々ＲＮＡ及びＤＮＡを表す。オリゴヌクレオチドプライマーに番号をつけ、それらの配列を表１に示す。
【図３】クマンバチ(white-faced hornet)ホスホリパーゼ特異的ｃＤＮＡの３’及び５’ＲＡＣＥ。パネルのＡ及びＢは、各々３’ＲＡＣＥのアガロースゲル電気泳動及びサザンブロット分析産物を示す。レーンの１及び３は、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼで得られたＰＣＲの第１及び第２ラウンドからの産物を示し、レーンの２及び４はＶｅｎｔポリメラーゼで得られた同様の産物を示し、レーン５は１ｋｂＤＮＡラダー（ＢＲＬ）を示す。パネルのＣ及びＤは、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼで得られた５’ＲＡＣＥ産物（レーン１）の同様の結果（パネルＡ及びＢのように）を示し、レーン２（パネルＣ）は１ｋｂＤＮＡラダーを示す。パネルＢ及びＤの矢印は、所望の産物を示す。ハイブリッド形成プローブを表１に示す。
【図４】Dol m I と哺乳動物リパーゼの配列類似性。アミノ酸の位置の番号は右につけられている。使用略語：Ｈｕ、ヒト；Ｍｏ、マウス；ＬＰＬ、リポタンパク質リパーゼ；ＨＬ、肝リパーゼ；Ｄｍ、クマンバチ (white face hornet)；及びＰＬＡ、ホスホリパーゼ。Ｐ＋Ｌ及びＰ＋Ｈは、各々ヒトリポタンパク質又は肝リパーゼに同じクマンバチホスホリパーゼの残基を示す。ＨｕＬＰＬ−配列番号１８；ＭｏＬＰＬ−配列番号１９；ＨｕＨＬ−配列番号２０；Ｍｏｈｌ−配列番号２１；ＤｍＰＬＡ−配列番号２２。
【図５Ａ】クロスズメバチホスホリパーゼのｃＤＮＡ（配列番号２６）配列。ヌクレオチドの位置の番号は、右につけられている。ヌクレオチド１〜１５２は、５’非翻訳領域及びリーダー配列に対応する。ヌクレオチド１５３〜１０５２は、成熟タンパク質をコードする。ヌクレオチド１０５３〜１３４１は、３’非翻訳領域に対応する。また、アミノ酸配列のアンダーラインのある部分は、ＣＮＢｒペプチドのエドマン分解によって決定された。自然毒液のＮ末端配列はＦＰＫＣＰ．．．であることが見出されたが、ｃＤＮＡから翻訳されたＮ末端はＧＰＫＣＰ．．．であることに留意されたい。
【図５Ｂ】クロスズメバチホスホリパーゼの演繹アミノ酸（配列番号２７）配列。ヌクレオチドの位置の番号は、右につけられている。ヌクレオチド１〜１５２は、５’非翻訳領域及びリーダー配列に対応する。ヌクレオチド１５３〜１０５２は、成熟タンパク質をコードする。ヌクレオチド１０５３〜１３４１は、３’非翻訳領域に対応する。また、アミノ酸配列のアンダーラインのある部分は、ＣＮＢｒペプチドのエドマン分解によって決定された。自然毒液のＮ末端配列はＦＰＫＣＰ．．．であることが見出されたが、ｃＤＮＡから翻訳されたＮ末端はＧＰＫＣＰ．．．であることに留意されたい。
【図６Ａ】クマンバチヒアルロニダーゼ(Dol m II)のｃＤＮＡ（配列番号５４）。ヌクレオチド及びアミノ酸の位置の番号は右につけられている。アミノ酸残基のナンバリングは、ヌクレオチドの位置６１〜６３及び１０５１〜１０５３に対応する各々Ｎ及びＣ末端残基セリン及びアスパラギンで開始し終わる。また、アンダーラインのあるアミノ酸配列は、エドマン分解で決定された。
【図６Ｂ】クマンバチヒアルロニダーゼ(Dol m II)のアミノ酸（配列番号５５）。ヌクレオチド及びアミノ酸の位置の番号は右につけられている。アミノ酸残基のナンバリングは、ヌクレオチドの位置６１〜６３及び１０５１〜１０５３に対応する各々Ｎ及びＣ末端残基セリン及びアスパラギンで開始し終わる。また、アンダーラインのあるアミノ酸配列は、エドマン分解で決定された。
【図７Ａ】ミツバチ（配列番号５６）及びクマンバチ毒（配列番号５７）ヒアルロニダーゼ並びにモルモット精子タンパク質ＰＨ−２０（配列番号５８）の配列比較。列は、両ヒアルロニダーゼの残基１及びＰＨ−２０の残基４で開始する。ミツバチ毒ヒアルロニダーゼ及びＰＨ−２０は、各々３４９個及び４９５個の残基を含む。ハイホンで示される欠落を加えて配列相同性を最大にした。黒丸は、これらのタンパク質に共通するアミノ酸残基を強調している。
【図７Ｂ】ミツバチ（配列番号５６）及びクマンバチ毒（配列番号５７）ヒアルロニダーゼ並びにモルモット精子タンパク質ＰＨ−２０（配列番号５８）の配列比較。列は、両ヒアルロニダーゼの残基１及びＰＨ−２０の残基４で開始する。ミツバチ毒ヒアルロニダーゼ及びＰＨ−２０は、各々３４９個及び４９５個の残基を含む。ハイホンで示される欠落を加えて配列相同性を最大にした。黒丸は、これらのタンパク質に共通するアミノ酸残基を強調している。
【図８Ａ】（Ａ）クマンバチ (white-face hornet)毒液及び（Ｂ）ミツバチ毒液からのヒアルロニダーゼを２回免疫した後の一次脾臓細胞による増殖分析。脾臓細胞は、５mg／mlミョウバン中１０mg／ml毒ヒアルロニダーゼを２週間の間隔をあけて２回i.p.免疫した１０日後に得た。脾臓を取り出し、９６ウェル培養皿中白血球（４〜５×１０-6細胞／ml）にクマンバ(white face hornet) 毒ヒアルロニダーゼ（〇）又はミツバチ毒ヒアルロニダーゼ（▲）を指定された濃度で試験管内刺激した。各培養液の最終容量は２００mlであった。増殖分析は、抗生物質及びウシ胎児血清で補足した１０Ｒ培地中で行った。３日間インキュベートした後、各培養液に0.５〜１μＣｉの 3Ｈ−チミジンを加え、２０時間後に細胞を収集した。バックグラウンドの 3Ｈ−Ｔｈｙ取込みは、（Ａ）の場合７３２０±９％ｃｐｍ及び（Ｂ）の場合８５００±１５％ｃｐｍであった。
【図８Ｂ】（Ａ）クマンバチ (white-face hornet)毒液及び（Ｂ）ミツバチ毒液からのヒアルロニダーゼを２回免疫した後の一次脾臓細胞による増殖分析。脾臓細胞は、５mg／mlミョウバン中１０mg／ml毒ヒアルロニダーゼを２週間の間隔をあけて２回i.p.免疫した１０日後に得た。脾臓を取り出し、９６ウェル培養皿中白血球（４〜５×１０-6細胞／ml）にクマンバ(white face hornet) 毒ヒアルロニダーゼ（〇）又はミツバチ毒ヒアルロニダーゼ（▲）を指定された濃度で試験管内刺激した。各培養液の最終容量は２００mlであった。増殖分析は、抗生物質及びウシ胎児血清で補足した１０Ｒ培地中で行った。３日間インキュベートした後、各培養液に0.５〜１μＣｉの 3Ｈ−チミジンを加え、２０時間後に細胞を収集した。バックグラウンドの 3Ｈ−Ｔｈｙ取込みは、（Ａ）の場合７３２０±９％ｃｐｍ及び（Ｂ）の場合８５００±１５％ｃｐｍであった。
【図９Ａ】（Ａ）クマンバチ (white-face hornet)毒ヒアルロニダーゼ及び（Ｂ）ミツバチ毒ヒアルロニダーゼを５回免疫した後の一次脾臓細胞による増殖分析。図面の鍵は、図８Ａ及び図８Ｂに対応し、免疫は２週間の間隔をあけて図８Ａ及び図８Ｂに記載されたように行った。増殖分析も図８Ａ及び図８Ｂで記載されたように行った。応答の大きさが２回免疫したマウスに比べて約２倍だけ増大したが、ブランク値はほぼ同じままであったことに留意されたい。バックグラウンドの 3Ｈ−Ｔｈｙ取込みは、（Ａ）の場合１１１８７±４％ｃｐｍ及び（Ｂ）の場合６０８４±２６％ｃｐｍであった。
【図９Ｂ】（Ａ）クマンバチ (white-face hornet)毒ヒアルロニダーゼ及び（Ｂ）ミツバチ毒ヒアルロニダーゼを５回免疫した後の一次脾臓細胞による増殖分析。図面の鍵は、図８Ａ及び図８Ｂに対応し、免疫は２週間の間隔をあけて図８Ａ及び図８Ｂに記載されたように行った。増殖分析も図８Ａ及び図８Ｂで記載されたように行った。応答の大きさが２回免疫したマウスに比べて約２倍だけ増大したが、ブランク値はほぼ同じままであったことに留意されたい。バックグラウンドの 3Ｈ−Ｔｈｙ取込みは、（Ａ）の場合１１１８７±４％ｃｐｍ及び（Ｂ）の場合６０８４±２６％ｃｐｍであった。
【００４６】
2006000119.tif 000003
2006000119.tif 000004
2006000119.tif 000005
2006000119.tif 000006
2006000119.tif 000007
2006000119.tif 000008
2006000119.tif 000009
2006000119.tif 000010
2006000119.tif 000011
2006000119.tif 000012
2006000119.tif 000013
2006000119.tif 000014
2006000119.tif 000015
2006000119.tif 000016
2006000119.tif 000017
2006000119.tif 000018
2006000119.tif 000019
2006000119.tif 000020
2006000119.tif 000021
2006000119.tif 000022
2006000119.tif 000023
2006000119.tif 000024
2006000119.tif 000025
2006000119.tif 000026
2006000119.tif 000027
2006000119.tif 000028
【図１】
2006000119.tif 000029
【図２Ａ】
2006000119.tif 000030
【図２Ｂ】
2006000119.tif 000031
【図３】
2006000119.tif 000032
【図４】
2006000119.tif 000033
【図５Ａ】
2006000119.tif 000034
【図５Ｂ】
2006000119.tif 000035
【図６Ａ】
2006000119.tif 000036
【図６Ｂ】
2006000119.tif 000037
【図７Ａ】
2006000119.tif 000038
【図７Ｂ】
2006000119.tif 000039
【図８Ａ】
2006000119.tif 000040
【図８Ｂ】
2006000119.tif 000041
【図９Ａ】
2006000119.tif 000042
【図９Ｂ】
2006000119.tif 000043