(57)【要約】【課題】膜部材への捕捉試薬塗布を効率よく行うことができるとともに、偽陽性の発生を防止することができる試薬塗布用治具およびそれを用いた試薬塗布方法を提供する。【解決手段】フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、捕捉試薬を塗布する試薬の塗布方法において、前記膜部材との当接面に突出部を備える塗布用治具を用いる。塗布用治具を用いることにより、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、捕捉試薬の塗布を効率よく行うことができる。また、捕捉試薬液がアダプターに残存しないため、偽陽性の発生を防止し、被測定物の精度の高い検出が可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、捕捉試薬を塗布する際に用いられる試薬塗布用治具であって、前記捕捉試薬が充填されたシリンジの先端に設けられた針を挿通するための貫通穴をその中心軸に沿って備えるとともに、前記膜部材との当接面に前記貫通穴を囲うように突出して形成された突出部を備えることを特徴とする試薬塗布用治具。
【請求項２】
前記試薬塗布用治具の材質が、プラスチック又は金属であることを特徴とする請求項１記載の試薬塗布用治具。
【請求項３】
請求項１又は２記載の試薬塗布用治具を用いた試薬塗布方法であって、前記試薬塗布用治具を、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に当接させ、前記試薬塗布用治具の突出部に試薬を分注することを特徴とする試薬塗布方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体試料中の被測定物を捕捉するための捕捉試薬が固定された膜部材を備えたフロースルー型アッセイ装置の製造において膜部材に捕捉試薬を塗布するための試薬塗布用治具およびそれを用いた試薬塗布方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特殊な設備，器具や技術を用いることなく目標のリガンドを簡便かつ正確に検出するために、免疫測定法が利用されている。免疫測定法という用語は免疫反応の特異性を利用して試料中の分析対象物を免疫学的手法により検出または定量する分析方法の総称として用いられ、具体的には免疫拡散法，酵素免疫測定法などの種々の方法が実用化されている。このような免疫測定法の中で、フロースルー式アッセイ法はラテラルフロー式，タンジェンタルフロー式などと並ぶメンブランを使用したイムノクロマトグラフィー法の一種であり、操作が簡便であるため一般的な検査の場に普及している。フロースルー式アッセイ法による免疫測定法についての詳細は、例えば非特許文献１及び特許文献１などに記載されている。
【０００３】
このフロースルー式アッセイ法において従来使用されているフロースルー型アッセイ装置の例としては、図６〜７に示すように、デバイス101とアダプター102とから構成されている。デバイス101には、検体試料中の被測定物を捕捉するための捕捉試薬を固定したニトロセルロース等の膜部材103と、この膜部材103の下部に配置されガラス孔フィルターからなるスペーサー104と、このスペーサー104の下部に配置され液体吸収能力に優れた吸収部材105とが収納されている。そして、デバイス101の上面には、開口部106が設けられ、この開口部106にはアダプター102が載置されている。アダプター102には、調製した検体試料を滴下するアダプター開口部107を有し、底面部108に検体試料が通過するための穴109を備えるとともに、検体中の異物などを取り除く目的でゴミ取りフィルター110が固定リング111を用いてアダプター開口部107に固定されている。
【０００４】
ところで、上記のようなフロースルー型アッセイ装置101を製造するにあたって、検体試料中の被測定物を捕捉するための捕捉試薬を膜部材103に塗布する方法としては、ゴミ取りフィルター110を介して塗布することができないためゴミ取りフィルター110が固定されていないアダプター102を載置後、捕捉試薬を塗布し、このアダプター102を一度取り外し、ゴミ取りフィルター110を固定リング111を用いてアダプター開口部107に固定し、再度デバイス101の上面にゴミ取りフィルター110付きのアダプター102を載置する方法が採用されていた。
【特許文献１】特公平７−３４０１６号公報
【非特許文献１】Guide to Diagnostic Rapid Test Device Components", 2nd edition, published by Schleicher & Schuell company, January 2000, Edited by Lisa Vickers, p6-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述の方法では捕捉試薬液が所望のスポット箇所以外のアダプター102の底面部108に拡散し、捕捉試薬液が底面部108に残存するため、検体試料の分析において、被測定物が検体中に存在しないにも係わらず陽性と判定してしまう、いわゆる偽陽性が生じる虞があった。また、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに効率よく塗布することができなかった。さらに、ゴミ取りフィルター110を取り付けるためこのアダプター102を一度取り外し、ゴミ取りフィルター110を固定したアダプター102を再度載置する煩雑な作業が必要であり、手間がかかり不便であった。
【０００６】
本発明にかかる課題に鑑みてなされたものであり、膜部材への試薬塗布を効率よく行うことができる試薬塗布用治具を提供することを目的とする。さらに、本発明は、膜部材への試薬塗布を効率よく行うことができるとともに、偽陽性の発生を防止することができる試薬塗布方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の請求項１記載の試薬塗布用治具は、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に対し、捕捉試薬を塗布する際に用いられる試薬塗布用治具であって、前記捕捉試薬が充填されたシリンジの先端に設けられた針を挿通するための貫通穴をその中心軸に沿って備えるとともに、前記膜部材との当接面に前記貫通穴を囲うように突出して形成された突出部を備えることを特徴とする。
【０００８】
本発明の請求項２記載の試薬塗布用治具は、請求項１において、前記試薬塗布用治具の材質が、プラスチック又は金属であることを特徴とする。
【０００９】
本発明の請求項３記載の試薬塗布方法は、請求項１又は２記載の試薬塗布用治具を用いた試薬塗布方法であって、前記試薬塗布用治具を、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材に当接させ、前記試薬塗布用治具の突出部に試薬を分注することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の請求項１記載の試薬塗布用治具によれば、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、試薬の塗布を効率よく行うことができる。また、捕捉試薬液がアダプターに残存しないため、偽陽性の発生を防止し、被測定物の精度の高い検出が可能である。
【００１１】
本発明の請求項２記載の試薬塗布用治具によれば、試薬塗布用治具の材質がプラスチック又は金属であるため、何度も使用可能である。また、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、試薬の塗布を効率よく行うことができる。
【００１２】
本発明の請求項３記載の試薬塗布方法によれば、捕捉試薬を塗布するための試薬塗布用治具を用いることにより、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、捕捉試薬の塗布を効率よく行うことができる。また、捕捉試薬液がアダプターに残存しないため、偽陽性の発生を防止し、被測定物の精度の高い検出が可能である。さらに、容易に且つ確実に試薬を塗布することができるため、フロースルー型アッセイ装置を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本明細書でいう被測定物を捕捉するための捕捉試薬とは、被測定物と抗原抗体反応のような特異的反応により結合して、被測定物と複合体を形成するものである。従って、被測定物により使用する捕捉試薬が異なることは当然であるが、一般には被測定物が細菌、ウイルス、ホルモン、その他臨床マーカー等の場合には、これらに対し特異的に反応して結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。その他、ウイルス抗原、ウイルス中空粒子、遺伝子組換え大腸菌発現タンパク質、遺伝子組換え酵母発現タンパク質等が挙げられる。
【００１５】
次に、本発明の試薬塗布用治具の一実施例を図１に示す。塗布用治具20は、直径が約２０ｍｍ、高さ約３０ｍｍの略円柱形状に形成されており、その長手方向の一端面の中央部に捕捉試薬を塗布するための突出部21を有し、シリンジの先端に設けられた針を挿通するための貫通穴22をその中心軸に沿って備えている。そして、シリンジの先端に設けられた針を貫通穴22に通過させ、突出部21の位置まで挿入し、捕捉試薬を突出部21に分注することによって膜部材に塗布できるようになっている。
【００１６】
また、突出部21は貫通穴22を囲うように突出して形成された任意の形状の枠体からなり、突出部21の形状は菱形に形成されているが、これに限定されるものではなく、例えば円、楕円、多角形、長方形、正方形、台形等の任意の形状に成形してもよい。また、塗布用治具20の材質としては、ある程度の強度を有し、非吸水性および保形性があり、洗浄後も使用可能であればいかなる材質であってもよく、好ましくはプラスチック又は金属が挙げられる。プラスチックであれば、例えばポリアセタール樹脂（デルリン（登録商標）など）、フッ素樹脂（テフロン（登録商標）など）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）樹脂、ポリプロピレン（ＰＰ）樹脂、ポリエチレン（ＰＥ）樹脂、６ポリアミド樹脂等が挙げられる。金属であれば、例えばステンレス、銅、アルミニウム等が挙げられる。
【００１７】
次に、本発明の試薬塗布方法の実施に使用するフロースルー型アッセイ装置の一実施例について添付した図２〜３を参照しながら説明する。
【００１８】
１は装置の下部外郭をなす下部デバイスであり、２は装置の上部外郭をなす上部デバイスである。下部デバイス１は、略長方形の底面１ａとこの底面１ａの周縁部から略垂直に上方へ延設された側壁１ｂとを有する容器状に形成されている。この下部デバイス１の中には、フィルター部材３が収容，支持されている。このフィルター部材３は、ニトロセルロースを含有するメンブランフィルターからなる膜部材３ａと、この膜部材３ａの下部に配置されガラス孔フィルターからなるスペーサー３ｂと、このスペーサー３ｂの下部に配置され液体吸収能力に優れた吸収部材３ｃとから構成されている。なお、スペーサー３ｂは、吸収体３ｃからの色戻りをなくし膜部材３ａの着色による判定を正確に行うために設けられるものであって、省略してもよい。
【００１９】
一方、上部デバイス２は、下部デバイス１の形状に対応して上面２ａとこの上面２ａから略垂直に下方へ延設された側壁２ｂとを有する蓋状に形成されている。そして、上部デバイス２には水平方向の断面が略円形の開口部４が設けられており、この開口部４には検体を導入するためのアダプター開口部５と孔部６を有するアダプター７が載置されている。また、開口部４には内壁８が上部デバイス２と一体に形成されており、アダプター７はこの開口部４の形状に対応した形状に形成され、開口部４に取り外し自在に設けられている。また、アダプター７の底部９には、孔部６が設けられている。また、アダプター開口部５について１つの孔部６が設けられている。また、アダプター開口部５へ着脱自在に、検体中の異物などを取り除くためのゴミ取りフィルター10を支持する固定リング11が備えられている。
【００２０】
そして、下部デバイス１の側壁１ｂの上端と上部デバイス２の側壁２ｂの下端とを嵌合させることで、下部デバイス１と上部デバイス２とで装置の外郭をなすように構成されている。また、下部デバイス１と上部デバイス２とを組み合わせたときに開口部４がフィルター部材３のほぼ中央部に位置するように構成され、開口部４の内壁８の下端はフィルター部材３の上面を下方に向かって押さえ込むようになっており、アダプター７の下端はフィルター部材３の上面に接している。また、12はリガンドの検出に用いられる金コロイドパッドであり、アダプター開口部５に設けられた挿入ガイド13に金コロイドパッド12を挿入することにより設置される。
【００２１】
次に、上記装置および本発明の塗布用治具20を用いる本発明の試薬塗布方法の一実施例について説明する。なお、本発明の塗布方法を適用する際のフロースルー型アッセイ装置としては、上述の最終的に組立てられた装置ではなく、フィルター部材３が収納され下部デバイス１と上部デバイス２とが組み合わされたものである。すなわち、アダプター７が載置される前工程の状態のものである。
【００２２】
本発明の塗布方法は、塗布用治具20をフロースルー型アッセイ装置の開口部４に入れ、塗布用治具20の突出部21をフロースルー型アッセイ装置の膜部材３ａに当接させ、次いで捕捉試薬液が充填されたシリンジの先端の針を貫通穴22に挿入し突出部21の位置まで下降させ、突出部21に所定量の捕捉試薬液を分注することによって、膜部材３ａに塗布する方法である。
【００２３】
突出部21を備えた塗布用治具20を用いることにより、捕捉試薬液を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、捕捉試薬の塗布を効率よく行うことができる。また、従来のアダプターを用いた試薬塗布方法と比較し、捕捉試薬液がアダプターに残存しないため、偽陽性の発生を防止し、被測定物の精度の高い検出が可能である。さらに、フロースルー型アッセイ装置の製造において、従来のようなアダプターを介した捕捉試薬の塗布方法ではアダプターを載置し、捕捉試薬を塗布し、アダプターを取り外し、アダプターにゴミ取りフィルターを固定後、再度アダプターを載置するといった煩雑な工程を要していたが、本発明の試薬塗布方法によればアダプターの取り外しの工程を必要とせず製造工程を簡略化することができる。
【００２４】
さらに、突出部21の内側をサンドブラストで表面を荒くすることにより、突出部21の内側に捕捉試薬液を充填する工程で、突出部21の内側に気泡が残らずに捕捉試薬液を充填できる作用を有する。これにより膜部材３ａに塗布する際に吐出部21の外郭の鋭角を持つ形状が保持された状態で捕捉試薬が塗布される効果を有し、判定時に着色される形状も鋭角を持つ形状となることで、判定する際の目視判断が容易になる。
以下、本発明の実施例を添付図を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
捕捉試薬の塗布方法の一実施形態を図面に基づいて説明する。図４は、本発明の試薬塗布方法の一実施例であって、図１に示す本発明の一実施形態の塗布用治具を備えた自動塗布装置を用いた場合の各工程が模式的に示されている図である。なお、フロースルー型アッセイ装置は図２〜３に示すものと同じ構成を有するものを用いた。
【００２６】
工程１では、アダプター７が載置されておらず、膜部材３ａと、スペーサー３ｂと、吸収体３ｃとが収納されているデバイスＸを一列に多数配列し、塗布ライン方向へ間欠的に移送する。
【００２７】
工程２では、デバイスＸの開口部４と塗布用治具20とが対向する所定の位置でデバイスＸを停止する。
【００２８】
工程３では、塗布用治具20の突出部21をデバイスＸに収納された膜部材３ａに当接する所定の位置まで下降する。そして、シリンジ31の先端に設けられた針30を塗布用治具20の中心軸に沿って設けられた貫通穴22に通過させ、突出部21の位置まで挿入する。なお、塗布用治具20及びシリンジ31は、昇降手段たる可動アーム（図示せず）に保持されており、可動アームの昇降動作に伴って下降及び上昇が可能である。
【００２９】
工程４では、捕捉試薬液を充填したシリンジ31の針30から塗布用治具20の突出部21に捕捉試薬液を分注し、膜部材３ａに塗布する。なお、捕捉試薬が塗布された面積Ａは、図５に示すように、塗布用治具20の突出部21の菱形をなしている。
【００３０】
工程５では、塗布用治具20およびシリンジ31が上昇し、元の位置に戻る。
【００３１】
以上のように、本実施例では請求項１に対応して、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材３ａに対し、捕捉試薬を塗布する際に用いられる試薬塗布用治具20であって、前記捕捉試薬が充填されたシリンジ31の先端に設けられた針30を挿通するための貫通穴22をその中心軸に沿って備えるとともに、前記膜部材３ａとの当接面に前記貫通穴22を囲うように突出して形成された突出部21を備えることを特徴とする試薬塗布用治具20である。
【００３２】
この構成によれば、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、試薬の塗布を効率よく行うことができる。また、捕捉試薬液がアダプター７の底部９に残存しないため、偽陽性の発生を防止し、被測定物の精度の高い検出が可能である。
【００３３】
また、本実施例では請求項２に対応して、前記試薬塗布用治具20の材質が、プラスチック又は金属であることを特徴とする試薬塗布用治具20である。
【００３４】
この構成によれば、試薬塗布用治具20の材質がプラスチック又は金属であるため、何度も使用可能である。また、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、試薬の塗布を効率よく行うことができる。
【００３５】
また、本実施例では請求項３に対応して、請求項１又は２記載の試薬塗布用治具20を用いた試薬塗布方法であって、前記試薬塗布用治具20を、フロースルー型アッセイ装置に備えられる検体試料中の被測定物を捕捉するための膜部材３ａに当接させ、前記試薬塗布用治具20の突出部21に試薬を分注することを特徴とする試薬塗布方法である。
【００３６】
この構成によれば、捕捉試薬を塗布するための試薬塗布用治具20を用いることにより、捕捉試薬を所望のスポット箇所のみに塗布することができ、捕捉試薬の塗布を効率よく行うことができる。また、捕捉試薬液がアダプター７の底部９に残存しないため、偽陽性の発生を防止し、被測定物の精度の高い検出が可能である。さらに、容易に且つ確実に試薬を塗布することができるため、フロースルー型アッセイ装置を効率よく製造することができる。
【実施例２】
【００３７】
次に、上記フロースルー型アッセイ装置を用いたリガンド検出方法について、免疫測定法を用いたインフルエンザウイルスの検出を例に説明する。
【００３８】
（１）金コロイド標識用抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol.256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いてインキュベーター中で３７℃に維持した。その後、ＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からアフィニティクロマトグラフィー法によってＩｇＧを精製した（クローン名８Ｄ２）。
【００３９】
（２）固相用Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
上記（１）の方法と同様にして作製した（クローン名Ｂ４０）。
【００４０】
（３）金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の作製
９ｍＬの金コロイド溶液（ＢＢＩ社、濃度０．０１（Ｗ／Ｖ）％の水溶液、ｐＨ７．１）に対して、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を１ｍＬ加えｐＨを８．５に合わせた。上記（１）で精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名８Ｄ２）を２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）で透析後、蒸留水で希釈し０．１ｍｇ／ｍＬに調製した。この抗体１ｍＬを上記金コロイド溶液に撹拌しながら滴下し５分間静置し結合させた。その後１０％ＢＳＡを１ｍＬ加え１０分間穏やかに攪拌した。つぎに遠心管へ全量移し５０００ｇで３０分間遠心し上清を吸引廃棄した。沈渣を５％のシュークロースを含む２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）０．９ｍＬで浮遊させた。
【００４１】
（４）金コロイド含有乾燥パッドの作成
（３）で作製した金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を蒸留水で１０倍に希釈し、ＢｉｏＤｏｔ社XYZPlatfom  Dispensing  Systemを用いて、１．０ｃｍ２のパッドに１０μＬの金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を含浸させ、真空乾燥機にて３０分間乾燥させた。その後、１ｃｍ×０．６ｃｍに切断した。
【００４２】
（５）フロースルー型アッセイ装置の組み立て
膜部材３ａとしてＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルローストランスファーメンブラン（孔径０．４５μｍ）、スペーサー３ｂとしてワットマン社製Ｆ０７５−１４、吸収体３ｃとしてワットマン社製ＣＤ４２７−０７を重ね合わせ、下部デバイス１に設置し、上部デバイス２で閉じた。
【００４３】
（６）膜部材３ａへの固相
上記（５）で組み立てたフロースルー型アッセイ装置を上記実施例１に示した試薬の塗布方法により、（２）で作製・精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名Ｂ４０）をクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）で希釈した液１２μＬを膜部材３ａに塗布し、４５℃の乾燥室で４０分間乾燥を行った。
【００４４】
（７）フロースルー型アッセイ装置の最終作製
サンプル（検体）と金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッドとの非特異的な凝集物を取りの除く為のゴミ取りフィルター10を、固定リング11を用いてアダプター７のアダプター開口部５に固定し、（６）で抗体を塗布済みのフロースルー型アッセイ装置の上部デバイス２へ装着した。その後、このフロースルー型アッセイ装置のアダプター開口部５へ金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッド（金コロイドパッド12）を挿入ガイド13に沿って挿入し１枚入れた。
【００４５】
（８）検出方法
Ａ型インフルエンザウイルスを含むと思われるサンプル（検体）を１％ＢＳＡ，５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，１５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）緩衝液０．５ｍＬに浮遊させ、０．２２μｍのフィルターで濾過した後、フロースルー型アッセイ装置の上部アダプター７へ全量滴下した。サンプルが吸収体３ｃに全量吸収されたらアダプター７を上部デバイス２から外し膜部材３ａへの着色の有無を判定した。膜部材３ａが金コロイドの色（赤色）に着色していたら、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていた事になる。膜部材３ａの色が白色のままであれば、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていなかった事になる。
【００４６】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。例えば、開口部４を複数設けたフロースロー型アッセイ装置においては、開口部４の個数に合わせて塗布用治具20を複数個設け塗布するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】（ａ）本発明の試薬の塗布方法の実施に用いる塗布用治具の一実施例を示す断面図であり、（ｂ）は塗布用治具の下面図である。
【図２】本発明の試薬の塗布方法の実施に用いるフロースルー型アッセイ装置の一実施例を示す上面図である。
【図３】同上断面図である。
【図４】本発明の試薬の塗布方法の一実施例である工程を示す説明図である。
【図５】本発明の試薬の塗布方法を適用後のフロースルー型アッセイ装置の上面図である。
【図６】従来のフロースルー型アッセイ装置を示す上面図である。
【図７】同上断面図である。
【符号の説明】
【００４８】
３ａ  膜部材
20    塗布用治具
21    突出部
22    貫通穴
30    針
31    シリンジ
【図１】
2006275933.tif 000003
【図２】
2006275933.tif 000004
【図３】
2006275933.tif 000005
【図４】
2006275933.tif 000006
【図５】
2006275933.tif 000007
【図６】
2006275933.tif 000008
【図７】
2006275933.tif 000009