(57)【要約】  【課題】試料にレーザ光を照射することにより試料からの蛍光を受信して信号処理を行う際、信号処理により、多数の蛍光の種類を識別することができ、特に短時間で効率よく蛍光信号を識別する蛍光検出装置を提供する。  【解決手段】信号処理装置２０は、測定対象の試料１２に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部２２と、レーザ光の照射された試料１２から発する蛍光を受光し、その蛍光信号を出力する受光部２６と、レーザ光源部２２から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために所定の周波数の変調信号を生成する制御・処理部２８と、受光部２６で出力された蛍光信号から、変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する分析装置８０と、を有する。【選択図】図１
2006226698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、
レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部と、
時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力された蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部と、を有することを特徴とする強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
【請求項２】
前記処理部は、前記蛍光信号の前記変調信号に対する位相遅れ求めることにより、前記蛍光緩和時間を算出する請求項１に記載の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
【請求項３】
前記光源制御部は、１ビットの信号値が所定長さで符号化され、かつ互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された符号化系列信号をパルス制御信号として用い、かつ前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオンの時間が、前記レーザ光の前記時間変調の１周期よりも長くなるように、前記レーザ光の出射のオン/オフを設定して制御し、
前記処理部は、前記蛍光緩和時間を算出するとともに、前記受光部で出力された受光信号から、前記符号化系列信号を用いて測定対象物からの蛍光を識別する、請求項１又は２に記載の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
【請求項４】
前記複数の符号化系列信号は、１つの符号化系列信号をビット方向にシフトして構成されたものであり、このシフトによって符号化系列信号が互いに直交するように構成されている請求項３に記載の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
【請求項５】
前記レーザ光源部は、複数のレーザ光を出射する複数のレーザ光源を有し、
前記光源制御部は、複数のレーザ光源からのレーザ光の出射のオン／オフを、互いに直交する前記複数の符号化系列信号を用いて制御し、
前記処理部は、前記受光部において複数のレーザ光からの光信号が重なって出力された蛍光信号から、レーザ光の出射に用いた符号化系列信号を用いて、各レーザ光の照射により測定対象物が発する蛍光の蛍光信号をそれぞれ分離する請求項３または４に記載の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強度変調したレーザ光を測定対象物に照射するとともに、この照射による測定対象物から蛍光信号を受け、この信号について信号処理を行なう、強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に関する。特に、医療、生物分野で用いられるフローサイトメータ等のような細胞やＤＮＡやＲＮＡ等の測定対象物の識別を蛍光色素の発する蛍光を用いて行なって測定対象物の分析等を短時間に行なう分析装置に適用される蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を含む混濁液を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流してフローセルを形成する。このフローセル中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定するものである。
このフローサイトメータでは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
これの使用においてはより多くの測定対象物を短時間に蛍光の情報から特定することが要求されている。
【０００３】
下記非特許文献１では、例えば４８８ｎｍ、５９５ｎｍ、６３３ｎｍ等の波長帯域の異なる複数のレーザ光を照射して、各レーザ光によって蛍光色素から発する波長帯域の異なる複数の蛍光をバンドパスフィルタを用いて分離して光電子倍増管（ＰＭＴ）で検出するフローサイトメータが開示されている。
これにより、複数の蛍光試薬（蛍光色素）からの蛍光を識別して複数の測定対象物の種類を同時に特定することが可能となるとされている。
【０００４】
【非特許文献１】http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Fluorochrome_Absorption.shtml（２００５年１月２３日検索）
【０００５】
しかし、蛍光試薬から発する蛍光の波長帯域は略４００〜８００ｎｍ等と比較的帯域幅が広いものの、可視光波長帯域で３〜４程度の波長帯域の蛍光しか識別可能なラベルとして有効に用いることができない。複数の蛍光試薬を組み合わせて識別できる蛍光の数を増やそうとしても限界がある。
また、識別可能な蛍光の数を増やすために、蛍光の波長とともに、検出される蛍光の強度を用いて、識別可能な蛍光の数を増加させることもできる。しかし、この場合においても、蛍光の強度を用いたときの識別可能数は２〜５程度であり、上述した３〜４程度の波長帯域における識別可能数とともに組み合わせても、蛍光の識別可能数は、せいぜい２０程度である。
このため、このようなフローサイトメータを用いても、極めて多数の測定対象物について短時間に特定して分析を行なうことが難しい、といった問題があった。
【０００６】
例えば、ＤＮＡ等の生体物質をフローサイトメータで分析する場合、この生体物質に予め蛍光試薬により蛍光色素が付着される。そして、この生体物質は、後述するマイクロビーズに付着された蛍光色素と異なる蛍光色素でラベル化され、表面にカルボキシル基等の特異な構造体の設けられた、直径５〜２０μｍのマイクロビーズを含む液体に混ぜられる。上記カルボキシル基等の構造体は、ある既知の構造の生体物質に作用して結合（カップリング）する。したがって、マイクロビーズからの蛍光と生体物質の蛍光とを同時に検出した場合、生体物質は、マイクロビーズの構造体と結合していることがわかる。これにより、生体物質の特性を分析することができる。しかし、多種多様なカップリング用の構造体を備える多種のマイクロビーズを用意して生体物質の特性を短時間に分析するには、極めて多種類の蛍光色素が必要となる。しかし、同時に識別可能な蛍光試薬の種類が少ないことから一度に多種類のマイクロビーズを用いて短時間に効率よく生体物質を測定することができない。
【０００７】
また、測定対象物に照射して蛍光を測定する測定点を管路の長手方向に複数設け、各測定点にて照射されるレーザ光が互いに干渉しないようにする方法も考えられる。しかし、この場合、レーザ光や受光部を測定点の数に応じて多数設ける必要がある。また、フローセルを形成する管路も長くなるので管路を流れるシース液の流路抵抗は大きくなり、シース液に与えるべき圧力も大きくなる。このため、装置が大型化するといった問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物からの蛍光信号を受信して信号処理を行う際、この信号処理により多数のマイクロビーズ等から発する蛍光の種類を識別することができ、特に短時間で効率よく蛍光信号を識別する蛍光検出装置、例えば、フローサイトメータに好適に用いられる蛍光検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う検出装置を提供する。
この蛍光検出装置は、測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部と、時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力された蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部と、を有することを特徴とする。
【００１０】
前記蛍光検出装置において、前記処理部は、前記蛍光信号の前記変調信号に対する位相遅れ求めることにより、前記蛍光緩和時間を算出することが好ましい。
また、前記光源制御部は、１ビットの信号値が所定長さで符号化され、かつ互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された符号化系列信号をパルス制御信号として用い、かつ前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオンの時間が、前記レーザ光の前記時間変調の１周期よりも十分長くなるように、前記レーザ光の出射のオン/オフを設定して制御し、前記処理部は、前記蛍光緩和時間を算出するとともに、前記受光部で出力された受光信号から、前記符号化系列信号を用いて測定対象物からの蛍光を識別することが好ましい。その際、前記複数の符号化系列信号は、１つの符号化系列信号をビット方向にシフトして構成されたものであり、このシフトによって符号化系列信号が互いに直交するように構成されていることが好ましい。
【００１１】
また、前記レーザ光源部は、複数のレーザ光を出射する複数のレーザ光源を有し、前記光源制御部は、複数のレーザ光源からのレーザ光の出射のオン／オフを、互いに直交する前記複数の符号化系列信号を用いて制御し、前記処理部は、前記受光部において複数のレーザ光からの光信号が重なって出力された蛍光信号から、レーザ光の出射に用いた符号化系列信号を用いて、各レーザ光の照射により測定対象物が発する蛍光の蛍光信号をそれぞれ分離することが好ましい。
【００１２】
また、前記測定対象物は、レーザ光の照射により蛍光を発する蛍光色素を備え、前記光源制御部は、前記符号化系列信号の前記ビット方向のシフト量と前記符号化系列信号の時間分解幅との積が、レーザ光で前記測定対象物が照射される時間より十分短くなるように設定して前記符号化系列信号を生成することが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、マイクロビーズ等を測定対象物とし、この測定対象物に所定の周波数で強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光の蛍光緩和時間を求める。この蛍光緩和時間は、蛍光色素の種類によって異なっているため、この蛍光緩和時間を用いて、蛍光の種類、さらには測定対象物の種類を識別することができる。すなわち、従来、蛍光の識別に用いられる蛍光の波長及び蛍光の強度のほかに、蛍光緩和時間を蛍光の識別のために用いることができるので、識別可能な蛍光の数は増大する。特に多数の蛍光色素を用いて短時間に測定対象物を効率良く特定するフローサイトメータにとっては有効である。
また、複数のレーザ光を用いる場合、レーザ光毎に互いに直交する符号化系列信号をレーザ光のパルス制御信号として用いることで、受光した蛍光信号がどのレーザ光の照射に拠るものかを特定することができる。これにより、短時間に測定対象物を効率良く特定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
図１は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光を測定対象とするマイクロビーズ等の試料１２に照射し、試料１２中に設けられた蛍光色素の発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理する信号処理装置２０と、信号処理装置２０で得られた処理結果をから試料１２中の測定対象物の分析を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。
【００１５】
信号処理装置２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させるとともに、レーザ光の出射のオン／オフを制御する制御部、及び試料１２からの蛍光信号を識別する信号処理部を含んだ制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液に含ませて試料１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。フローサイトメータ１０には、レーザ光の照射により短時間内に試料１２中の特定の細胞等の生体物質を分離するためのセル・ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
【００１６】
レーザ光源部２２は、波長の異なる３つのレーザ光、例えばλ1＝４０５ｎｍ、λ2＝５３３ｎｍおよびλ3＝６５０ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路３０中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられ、この集束位置で試料１２の測定点を形成する。
【００１７】
図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域の波長を有し、強度変調し、かつ符号化変調したレーザ光を出射する部分である。
レーザ光源部２２は、主に赤色のレーザ光Ｒを強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射するＲ光源２２ｒ、緑色のレーザ光Ｇを強度が一定のＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射するＧ光源２２ｇおよび青色のレーザ光Ｂを、強度が一定のＣＷレーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射するＢ光源２２ｂと、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射するダイクロイックミラー２３ａ1、２３ａ2と、レーザ光Ｒ，ＧおよびＢからなるレーザ光を管路３０中の測定点に集束させるレンズ系２３ｃと、Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂのぞれぞれを駆動するレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂと、供給された信号をレーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂに分配するパワースプリッタ３５と、を有して構成される。
【００１８】
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。一方、レーザ光の強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
ダイクロイックミラー２３ａ1は、レーザ光Ｒを透過し、レーザ光Ｇを反射するミラーであり、ダイクロイックミラー２３ａ2は、レーザ光ＲおよびＧを透過し、レーザ光Ｂを反射するミラーである。
この構成によりレーザ光Ｒ，ＧおよびＢが合成されて、測定点の試料１２を照射する照射光となる。
【００１９】
レーザドライバ３４ｒ，３４ｇおよび３４ｂは、制御・処理部２８に接続されて、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの出射の強度及び出射のオン／オフが制御されるように構成される。ここで、レーザ光Ｒ，Ｇ，Ｂの各々は、後述するように変調信号、パルス変調信号によって、所定の周波数で強度が変調され、かつ出射のオン／オフが制御される。
【００２０】
Ｒ光源２２ｒ、Ｇ光源２２ｇおよびＢ光源２２ｂは、レーザ光Ｒ、ＧおよびＢが蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光Ｒ、ＧおよびＢによって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質やマイクロビーズ等の試料１２に付着されており、試料１２が測定対象物として管路３０を通過する際、測定点でレーザ光Ｒ、ＧおよびＢの照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
図３は、レーザ光の発振波長と、このレーザ光によって蛍光色素の発する蛍光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。例えば、Ｂ光源から出射する波長λ１１のレーザ光の照射により、異なる３つの蛍光色素によって中心波長をλ１２とする蛍光、中心波長をλ１３とする蛍光、および中心波長をλ１4とする蛍光の３種類の光を発する。同様に、Ｇ光源から出射する波長λ２１のレーザ光の照射により２種類の蛍光（λ２２，λ２３）を発する。また、Ｂ光源から出射する波長λ３１のレーザ光の照射により１種類の蛍光（λ３２）を発する。
【００２１】
受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過する試料１２によってレーザ光が前方散乱することにより、試料１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において試料１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００２２】
一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３０中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されており、測定点にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。
図４は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
【００２３】
図４に示す受光部２６は、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２と、バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３と、光電子倍増管等の光電変換器２７ａ〜２７ｃと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３でフィルタリングして光電変換器２７ａ〜２７ｃで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー２６ｂ１，２６ｂ２の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
【００２４】
バンドパスフィルタ２６ｃ１〜２６ｃ３は、各光電変換器２７ａ〜２７ｃの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、図２に示す蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されており、例えばＢ光源から出射した波長λ１１のレーザ光の照射によって発する波長λ１３を中心とする一定の波長幅の帯域である。この場合、図３に示すようにＧ光源から出射した波長λ２１のレーザ光の照射によって発する波長λ２２を中心とする蛍光は波長λ１３の近傍に中心波長を持つため、波長λ１３を中心とする蛍光とともにバンドパスフィルタを透過する。しかし、波長λ２１を中心波長とする蛍光と波長λ１３を中心波長とする蛍光とは、後述する符号化系列信号（図７中のコード１〜３）で変調された信号情報を持った蛍光として光電変換器２７ａ〜２７ｃで受信されるので、この受光されて生成される蛍光信号から後述する信号処理を行うことにより、どのレーザ光により発する蛍光信号であるかを識別することができる。
【００２５】
光電変換器２７ａ〜２７ｃは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は信号情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、増幅器で増幅されて、制御・処理部２８に供給される。
【００２６】
制御・処理部２８は、図５に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０及びコントローラ４４は、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６、パワースプリッタ４８及びアンプ５０，５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のパワースプリッタ３５に供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜５０ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。
【００２７】
信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射によりマイクロビーズが発する蛍光の位相遅れに関する情報を抽出する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ〜２７ｃから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ〜５４ｃと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ５６と、この変調信号を参照信号として増幅された蛍光信号と合成するＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃと、を有して構成される。
【００２８】
ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃは、光電変換器２７ａ〜２７ｃから供給される蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として合成する装置である。具体的には、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃのそれぞれは、図６に示すように、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分と高周波成分を含む処理信号を算出する。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。
コントローラ４４は、信号生成部４０に所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御するとともに、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂを符号化系列信号を用いてレーザ光の出射のオン／オフを制御し、さらに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を求める部分である。
【００２９】
具体的には、コントローラ４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。
より具体的には、システム制御器６０は、レーザ光の強度変調のために、発振器４６の発振周波数を定める。さらに、システム制御器６０は、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂにレーザ光の出射のオン／オフを制御するパルス制御信号を生成する。このパルス制御信号は、互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された１つの符号化系列信号によって作られたものである。この符号化系列信号は、１ビットの信号値で構成され、所定の符号長さのビット数で符号化されている。
以下、符号化系列信号について説明する。
【００３０】
コントローラ４４は、系列符号Ｃ＝｛ａ０，ａ１，ａ２，………，ａＮ−１｝（Ｎは自然数で符号長さを表す）を用いて基準となる符号化系列信号を生成するとともに、さらにこの系列符号Ｃをｑ1ビット、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔｑ１・ｃ（Ｔｑ１は、ビット方向にｑ1ビット、ビットシフトする作用素である）を用いて符号化系列信号を生成する。ここで、系列符号Ｔｑ１・Ｃは、{ａｑ１，ａｑ１＋１，ａｑ１＋２，………，ａｑ１＋Ｎ−１｝である。さらに、系列符号Ｃをｑ２ビット（例えば、ｑ２＝２×ｑ１）、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔｑ２・Ｃを用いて符号化系列信号を生成する。
この符号化系列信号を生成するために用いられる系列符号Ｃ，Ｔｑ１・Ｃ，Ｔｑ２・Ｃは、互いに直交する特性を有するので、生成される符号化系列信号も互いに直交する。
【００３１】
系列符号Ｃの一例として、下記に示すように、例えば係数ｈｊと（ｊ＝１〜８の整数）および初期値ａｋ（ｋは０〜７の整数）とを用いて符号化されるＰＮ系列（Pseudrandom Noise系列)が挙げられる。このＰＮ系列は、例えば下記式（１）により定義することができる。式（１）では次数を８次としている。ここで、Ｎは上記系列符号の符号長さであり、例えばＮ＝２５５（＝２8−１）ビットとされる。
【００３２】
【数１】
2006226698.tif 000003
【００３３】
系列符号ＣがＰＮ系列符号である場合、符号長さがＮの巡回符号となるので、ａN＝ａ0，ａN+1＝ａ1，………となる。また、系列符号Ｃと同じ符号長さＮの別の系列符号をＣ’＝｛ｂ0，ｂ1，ｂ2，………,ｂN-1｝}とし、上記作用素Ｔｑを系列符号Ｃ’作用させた系列符号Ｔｑ・Ｃ’＝｛ｂq，ｂq+1，ｂq+2，………,ｂq+N-1｝}として、系列符号ＣとＣ’との間の相互相関関数Ｒcc'(q)を下記式（２）のように定義する。ここで、ＮAは系列符号における項aiと項bq+iの（ｉは０以上Ｎ−１以下の整数）一致する数であり、ＮDは系列符号における項aiと項bq+iの不一致の数である。また、ＮAとＮDの和は符号長さＮとなる（ＮA＋ＮD＝Ｎ）。ここで、iとｑ＋iはｍｏｄ（Ｎ）で考える。
【００３４】
【数２】
2006226698.tif 000004
【００３５】
上記ＰＮ系列において２つの系列符号を項毎にｍｏｄ（２）で加算した結果はもとのＰＮ系列を巡回シフトしたＰＮ系列になる性質があり、ＰＮ系列の値が０となる個数は値が１となる個数より１つだけ少ないので、ＮA−ＮD＝−１となる。これより、ＰＮ系列において下記式（３）および（４）に示す値を示す。
【００３６】
【数３】
2006226698.tif 000005
【数４】
2006226698.tif 000006
【００３７】
上記式（３）よりビットシフト量が０、すなわちｑ＝０の場合、式（３）に示すようにＲｃｃ’（ｑ）の値は１となり、自己相関性を有する。一方、ビットシフト量が０でない、すなわちｑ＞０の場合、式（４）に示すようにＲｃｃ’（ｑ）は−（１／Ｎ）となる。ここで符号長さＮを大きくすることにより、Ｒｃｃ’（ｑ）（ｑ＞０）の値は０に近づく。
すなわち、系列符号ＣとＣ’は自己相関性を持ち、かつ直交性を有するといえる。
【００３８】
このような自己相関性および直交性を有する系列符号を用いて、値が０と値１の２値からなる符号化系列信号を生成する。
図７（ａ）は、生成される符号化系列信号の一例を示している。コード１の符号化系列信号は、符号長さＮ＝２５５ビットの信号であり、符号長さＮと時間分解幅Δｔとの積は、図７（ａ）中の時刻０〜ｔ３の時間となる。この信号において値が１のときレーザ光を出射し、値が０のときレーザ光を出射しないようにして断続的にレーザ光源の出射のオン／オフが制御される。
【００３９】
ここで、コード２の符号化系列信号の時刻０における信号は、コード１の時刻ｔ１における信号に対応しており、コード２の時刻０以降の信号が、コード１の時刻ｔ１以降の信号に対応して生成されている。同様に、コード３の符号化系列信号の時刻０における信号は、コード１の時刻ｔ２(例えば、ｔ２＝２×ｔ１）における信号に対応しており、コード３の時刻０以降の信号が、コード１の時刻ｔ２以降の信号に対応して生成されている。
光源制御部２８ａは、これらの信号を巡回的に繰り返し生成し、コード１はレーザドライバ３４ｒに、コード２はレーザドライバ３４ｇに、コード３はレーザドライバ３４ｂにパルス制御信号として供給されるように構成されている。
【００４０】
なお、本発明における符号化系列信号は上記ＰＮ系列の系列符号を用いて生成されるが、本発明における自己相関性および直交性を有する符号化系列信号の生成は、上記方法に限定されず、自己相関性および直交性を有する符号化系列信号を生成する限りにおいてどのような方法を用いてもよい。
【００４１】
図７（ｂ）は、符号化系列信号によるパルス変調と、レーザ光の周波数による強度変調との関係を示している。パルス変調によりレーザ光がオン状態の場合、レーザ光は少なくともオン状態の時間に比べて短い周期で強度が振動するように変調されている。
【００４２】
コントローラ４４のシステム制御器６０は、図７（ａ）に示すような系列符号を用いて符号化系列信号を生成し、各レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂにレーザ光の出射のオン／オフを制御するパルス制御信号として供給する。
【００４３】
なお、コントローラ４４のＡ／Ｄ変換器６６におけるサンプリングは、後述するように符号化系列信号と蛍光信号との相関関数を効率良く演算するために、サンプリングの時間分解幅（サンプリング間隔）を、符号化系列信号の時間分解幅に揃えられるのが好ましい。例えば符号化系列信号の時間分解幅が０．５マイクロ秒であれば蛍光信号のサンプリングの時間分解幅も０．５マイクロ秒あるいはその整数分の１とするのが好ましい。
【００４４】
分析装置８０は、蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求め、さらに、この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求めるとともに、受光部２６から出力された蛍光信号は、どのレーザ光の照射によるものかを、特定する部分である。分析装置８０は、本発明における蛍光緩和時間（蛍光緩和時定数）を算出する処理部を形成し、コンピュータにより構成される。
【００４５】
蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号には、符号化系列信号の情報が含まれているので、分析装置８０では、この処理信号に対して、まず、符号化系列信号の自己相関性及び直交性を用いて、符号化識別変換を行い、各レーザ光毎の蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値を抽出する。このｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の値を用いて蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求める。この位相遅れ角度から蛍光緩和時定数（蛍光緩和時間）を求め、蛍光色素を識別することにより、試料１２の種類を特定する。
さらに、上記符号化識別変換において用いられた符号化系列信号を知ることにより、蛍光信号がどのレーザ光の照射によるものかを、特定する。
【００４６】
なお、求められた位相ずれ角度は、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数に依存しており、例えば１次緩和過程で表した場合、ｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分は、下記式（５），（６）で表される。
【００４７】
【数５】
2006226698.tif 000007
【数６】
2006226698.tif 000008
ここで、θは位相ずれ角度であり、ωはレーザ光の変調周波数であり、τは蛍光緩和時定数である。蛍光緩和時定数τは、図８に示すように初期蛍光強度をＩ0とすると、この時点から蛍光強度がＩ0／ｅ（ｅは自然対数の底、ｅ≒２．７１８２８）となる時点までの時間をいう。
【００４８】
蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の比ｔａｎ（θ）から位相ずれ角度θを求め、この位相ずれ角度θを用いて、上記式（５）、（６）から、蛍光緩和時定数τを求めることができる。
この蛍光緩和時定数τは、上述したように、蛍光色素の種類によって変わるものであり、また、２種類の蛍光色素の比率を変えて混合すると、比率に応じてみかけの蛍光緩和時定数τも変わる。このため、蛍光緩和時定数τを求めることで、２つの蛍光色素の比率を特定することができる。
このように、蛍光検出用マイクロビーズに、強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を検出することにより、発する蛍光の種類を識別することができ、これによりマイクロビーズ等の試料１２の種類を特定することができる。
【００４９】
試料１２中の蛍光色素から発する蛍光の信号は、システム制御器６０で生成された既知の符号化系列信号に従って変調された（出射を制御した）レーザ光による蛍光信号である。このため、この蛍光信号もシステム制御器６０で生成された符号化系列信号に従って光強度が変調した信号となっている。したがって、システム制御器６０で生成された入力信号であるコード（符号化系列信号）と応答信号である蛍光信号とを同期させて相関関数を調べることにより、蛍光信号がどのコードによって変調されたレーザ光による蛍光信号を含んでいるかを知ることができる。すなわち、システム制御器６０で生成されたコードと蛍光信号との相関関数を演算し、蛍光信号と高い相関値を持つコードがある場合、蛍光信号は、このコード（符号化系列信号）によって変調されたレーザ光による蛍光信号として含んでいるといえる。一方、相関が極めて低いか、無相関を示すコードは、このコードによって変調されたレーザ光による蛍光信号として含んでいないといえる。したがって、レーザ光源毎に異なるコードで変調したレーザ光を出射させることで、受光した蛍光がどのレーザ光により発したものであるかを知ることができる。
分析装置８０は、入力信号であるコードと応答信号である蛍光信号との相関関数を、巡回するコードの周期にしたがって繰り返し平均化処理することにより、安定した値として求める。求めた値によって、受光した蛍光がどのレーザ光により蛍光したものであるかを特定する。また、各光電変換器２７ａ〜２７ｃが受光する光の波長帯域もわかっているので、蛍光の種類も特定することができる。
こうして、蛍光信号から、試料１２中の蛍光色素がどのレーザ光の照射によりどの波長帯域で放射した蛍光の信号を含んでいるかを識別し、特定することができる。
【００５０】
分析装置８０は、上述したように、蛍光色素の発する蛍光緩和時定数と、蛍光信号がどのレーザ光によるものかの情報とを用いて、マイクロビーズ等の試料１２に設けられた蛍光色素を特定して、管路３０を通過する試料１２の種類等を特定することができる。
マイクロビースの場合、マイクロビーズの蛍光色素に対応させて、例えば、所定のＤＮＡ断片を設けているので、蛍光色素を特定することで、マイクロビーズのＤＮＡ断片の種類を知ることができる。これにより、マイクロビースの蛍光とともに被検体のＤＮＡ断片に設けられた蛍光を同時に計測した場合、マイクロビーズの特定のＤＮＡ断片に被検体のＤＮＡ断片が作用して結合したものと判断する。このようにして、被検体のＤＮＡ断片がどのマイクロビーズに結合するかを分析することができる。
こうして、分析装置８０は試料１２中の生体物質の種類のヒストグラムや各種特性を短時間に求める。
フローサイトメータ１０は以上のように構成される。
【００５１】
このようなフローサイトメータ１０の信号処理装置２０は、まず、コントローラ４４からの指示により、所定の周波数の信号を発信器４６に発生させ、この信号がアンプ５０により増幅されて、レーザ光源部２２及び信号処理部４２に供給される。
この状態で、試料１２が管路３０を流れ、フローが形成される。フローは、例えば１００μｍの流路径に１〜１０ｍ／秒の流速を有する。また、試料１２としてマイクロビーズを用いる場合、マイクロビーズの球径は数μｍ〜３０μｍである。
測定点でレーザ光による照射が成されると、受光部２４で試料１２の通過を検出する検出信号がコントローラ４４にトリガ信号として出力される。
コントローラ４４では、この検出信号をトリガ信号とし、このトリガ信号に同期して、自己相関性を有し、かつ他の符号化系列信号と直交性を有する符号化系列信号を生成し、これを巡回的に繰り返し生成する。この符号化系列信号は、レーザ光源部２２からのレーザ光の出射のオン／オフを制御するパルス制御信号として用いるために、レーザドライバ３４ｒ，３４ｇ，３４ｂに供給される。
レーザ光源部２２では、このパルス制御信号に従って各レーザ光の出射のオン／オフが制御され、符号化系列信号によってパルス変調した信号情報を備えるレーザ光が生成される。このレーザ光は測定点を通過する試料１２中の蛍光色素を励起させるために用いられ、このレーザ光の照射により蛍光色素が発する。ここで発する蛍光は、受光部２６にて受光される。出射がオン状態のレーザ光は、所定の周波数で強度が変調している。
このようなレーザ光で照射されて発する蛍光色素からの蛍光は、位相遅れ角度を持って所定の周波数で強度変調するとともに、レーザ光のオン／オフに応じて、レーザ光に励起して発する蛍光もオン／オフの信号となっている。
【００５２】
このようにして、受光部２４による試料１２の通過の検出から変調されたレーザ光を照射するまでの時間は極めて短く、試料１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、所定の周波数で振幅変調しつつ、巡回的に繰り返す符号化系列信号によってオン／オフが制御されたレーザ光が試料１２に照射される。
ここで、レーザ光の変調周波数は、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
また、符号化系列信号は、約１μ秒の時間分解幅、例えば１μ秒の時間分解幅で生成される場合、符号長さＮが７ビットの符号化変調信号とすると、７μ秒(＝１．０×７)を１周期として符号化系列信号が繰り返し巡回して生成される。この繰り返し生成される符号化系列信号に基づいてレーザ光が変調される。したがって、試料１２が測定点を通過する数μ〜数１０μ秒の間に、レーザ光は、７μ秒を１周期とする符号化系列信号が数回〜数１０回巡回される。
【００５３】
受光部２６の光電変換器２７ａ〜２７ｃで受光されて出力される蛍光信号は、アンプ５４ａ〜５４ｃで増幅され、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃにより、信号生成部４０から供給された正弦波信号である変調信号と合成される。
ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃでは、正弦波信号である変調信号（参照信号）と蛍光信号を乗算した合成信号が生成されるとともに、正弦波信号である変調信号（参照信号）に対して位相を９０度シフトさせた信号と蛍光信号を乗算して合成した信号が生成される。
次に、生成された２つの合成信号は、コントローラ４４のローパスフィルタ６２に送られ、高周波成分が除去されて、蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号が取り出される。
この蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分の信号は増幅され、Ａ／Ｄ変換され、分析装置８０に送られる。Ａ／Ｄ変換は、受光部２４からのトリガ信号のタイミングで同期が取られ、符号化系列信号の時間分解幅Δｔと同じ時間分解幅で、蛍光信号のサンプリングが行われる。サンプリングは例えば１６ビットのサンプリング（０〜±３２７６７の階調のサンプリング）である。なお、蛍光信号は、符号化系列信号によってパルス変調されたレーザ光によって発するものであるため、この蛍光信号から得られるサンプリングされたデータは、符号化系列信号の情報が含まれている。
【００５４】
例えば、ｉ番目（ｉ＝１〜３の自然数）のレーザ光源部２２から出射される時間変調したレーザ光の強度振幅Ａi（ｔ）を下記式（７）のように定め（ｐi（ｔ）はＰＮ符号化変調信号による時間変調成分、ωは変調周波数）、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃに供給される参照信号（変調信号）Ａ０（ｔ）を下記式（８）で定める。このとき、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃで用いられる、正弦波信号である変調信号（参照信号）に対して位相を９０度シフトさせた信号Ａ９０（ｔ）は下記式（９）のように定まる。一方、蛍光信号の振幅を下記式（１０）で定めると、ＩＱミキサ５８ａ〜５８ｃで合成されて得られる合成信号は下記式（１１）のように表される。この２つの合成信号のうち高次成分はローパスフィルタ６２を用いて除去され、この後、Ａ／Ｄ変換されデジタル信号が生成される。
【００５５】
【数７】
2006226698.tif 000009
【数８】
2006226698.tif 000010
【数９】
2006226698.tif 000011
【数１０】
2006226698.tif 000012
【数１１】
2006226698.tif 000013
【００５６】
レーザ光の時間変調に用いた符号化系列信号は自己相関性を有し、他の符号化系列信号に対して直交性を有するので、符号化系列信号とＡ／Ｄ変換されたデジタル信号との間の相関関数を算出することで、レーザ光毎に上記デジタル信号を分解する符号化識別変換が行われる。すなわち、符号化識別変換により、式（１１）における１／２・ｒi・ｃｏｓ（θi）及び１／２・ｒi・ｓｉｎ（θi）が得られる。ここでθiは、ｉ番目のレーザ光源部２２から出射されるレーザ光により発する蛍光の、レーザ光に対する位相遅れ角度を表す。したがって、１／２・ｒi・ｃｏｓ（θi）及び１／２・ｒi・ｓｉｎ（θi）の値を用いてｔａｎ(θi)を求めることができる。このｔａｎ(θi)の値と上述した式（１）及び（２）とを用いて、蛍光緩和時定数τが求められる。
【００５７】
この蛍光緩和時定数τは、蛍光色素によって異なるので、マイクロビーズ等の試料１２の種類が異なる（試料１２に付着している生体物質の種類が異なる）ものには異なる種類の蛍光色素を用いることで、蛍光色素の種類を特定することができる。これにより、試料１２の種類を特定することができる。したがって、試料１２の発する蛍光から、試料１２の種類を特定する。これとともに、所定の蛍光色素を設けた生体物質の発する蛍光を検出する場合、生体物質がどの種類の試料１２に設けられた構造体に結合するか否かを特定することができ、さらに分析することができる。
特に、異なる２種類の蛍光色素を異なる比率で混合すると、この比率に応じてみかけの蛍光緩和時定数τも変化する。このため、混合する比率を変えることで極めて多数の蛍光緩和時定数を設定することができる。したがって、マイクロビーズの種類毎に異なる蛍光緩和時定数を有する蛍光色素を用いることで、発する蛍光が識別可能なマイクロビーズの種類を多数設定することができる。
【００５８】
さらに、上述した符号化識別変換を行う際に、自己相関性を有する符号化系列信号を知ることができるので、蛍光信号がどのレーザ光によるものかを特定することができる。従来においては、レーザ光を変調して信号情報を含ませることは行わないので、どのレーザ光の励起による蛍光であるかを特定することができない。
このように本発明では、同一の波長で放射する蛍光であっても、励起に用いるレーザ光の符号化系列信号を変えることで、異なる蛍光信号として受光することができるので、直交性を有する符号化系列信号を多数用いることで、蛍光色素の励起に用いられる多数のレーザ光を短時間のうちに特定することができる。したがって、蛍光の波長帯域が近接する多数の蛍光色素であっても、たとえ多数のレーザ光を合成して一度に照射しても、照射するレーザ光の信号情報が蛍光に含まれ、この信号情報が受光信号の中で識別できる限りにおいて、試料中に付着する蛍光色素を特定することができる。
【００５９】
このように本発明では、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数を算出することで、識別可能な蛍光色素の種類を増大させることができる。特に、蛍光緩和時定数が異なる２種類の蛍光色素を予め定めて混合する比率を定めて用いることにより、２種類の蛍光緩和時定数のいずれとも異なる蛍光緩和時定数を有するようにすることができ、識別可能な蛍光色素が極めて多数に増大する。２種類の蛍光色素の例として、１つの種類は、Cascade Blue,Cascade Yellow, Alexa Fluor405, DAPI, Dapoxyl, Dialkylaminocoumarin, Hydroxycoumarin, Marine Blue, Pacific Blue, PyMPOの中から選択される蛍光色素であり、他の種類は、Q-Dot（Quantum Dot社製商品名）、Evic-Tag（Evident Technology社製商品名）の中から選ばれる半導体量子蛍光色素であることが好ましい。前者の蛍光色素は、後者の蛍光色素に比べて蛍光緩和時定数が短い。この２種類の蛍光色素の混合する比率を変えることで、蛍光緩和時定数を大きく変化させることができる。例えば、Q-Dotは、２０〜４０ナノ秒の蛍光緩和時定数を有する。
【００６０】
以上、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられるレーザ光源部の一例を示す概略構成図である。
【図３】図２に示すレーザ光源部から出射されるレーザ光と蛍光色素の発する光のスペクトル強度分布を模式的に示す図である。
【図４】本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる受光部の一例を示す概略構成図である。
【図５】本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる制御・処理部の一例を示す概略構成図である。
【図６】図５に示す制御・処理部のＩＱミキサを説明する図である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置で生成される各信号の例を示す図である。
【図８】蛍光色素が発する光の蛍光強度の特性を説明する図である。
【符号の説明】
【００６２】
１０  フローサイトメータ
１２  試料
２０  信号処理装置
２２  レーザ光源部
２２ｒ  Ｒ光源
２２ｇ  Ｇ光源
２２ｂ  Ｂ光源
２３ａ1，２３ａ2，２６ｂ1，２６ｂ2  ダイクロイックミラー
２３ｃ．２６ａ  レンズ系
２４，２６  受光部
２６ｃ1，２６ｃ2，２６ｃ３  バンドパスフィルタ
２７ａ〜２７ｃ  光電センサ
２８  制御・処理部
３０  管路
３２  回収容器
３４ｒ，３４ｇ，３４ｂ  レーザドライバ
３５，４８，５６  パワースプリッタ
４０  信号生成部４０
４２  信号処理部
４４  コントローラ
４６  発信器
５０，５２，５４ａ，５４ｂ，５４ｃ，６４  アンプ
５８ａ，５８ｂ，５８ｃ  ＩＱミキサ
６２  ローパスフィルタ
６６  Ａ／Ｄ変換器
８０  分析装置
【図１】
2006226698.tif 000014
【図２】
2006226698.tif 000015
【図３】
2006226698.tif 000016
【図４】
2006226698.tif 000017
【図５】
2006226698.tif 000018
【図６】
2006226698.tif 000019
【図７】
2006226698.tif 000020
【図８】
2006226698.tif 000021