(57)【要約】【課題】比較的短い時間で実施できる簡易な被検物質の検出方法を提供すること。【解決手段】（ｉ）中央領域が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子であって、被検物質に結合することが可能な物質ａが外殻領域に固定化された磁性粒子を用意すると共に、被検物質に結合することが可能な物質ｂが固定化された部材、および、被検物質を含んで成る試料を用意する工程、（ｉｉ）磁性粒子および試料を部材に供給し、磁性粒子の物質ａと部材の物質ｂとが被検物質を介して結合して形成された複合体を部材において得る工程、（ｉｉｉ）部材にて物質ｂが固定化されている領域の状態を測定する工程、ならびに（ｉｖ）測定した結果に基づいて、被検物質の有無または量を判断する工程を含んで成り、工程（ｉｉ）の複合体の形成を磁場の影響下で行うことを特徴とする被検物質の検出方法。【選択図】図２
2006308572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる被検物質を検出する方法であって、
（ｉ）中央領域が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子であって、前記被検物質に結合することが可能な物質ａが前記外殻領域に固定化された前記磁性粒子を用意すると共に、前記被検物質に結合することが可能な物質ｂが固定化された部材、および、前記被検物質を含んで成る試料を用意する工程、
（ｉｉ）前記磁性粒子および前記試料を前記部材に供給し、前記磁性粒子の前記物質ａと前記部材の物質ｂとが前記被検物質を介して結合して形成された複合体を前記部材において得る工程、
（ｉｉｉ）前記部材にて前記物質ｂが固定化されている領域の状態を測定する工程、ならびに
（ｉｖ）前記測定した結果に基づいて、前記被検物質の有無または量を判断する工程
を含んで成り、
前記工程（ｉｉ）の前記複合体の形成を磁場の影響下で行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程（ｉ）で用意される前記部材がプレート部材または容器であって、その表面の少なくとも一部の表面ａに前記物質ｂが固定化されており、
前記工程（ｉｉ）において、前記試料を前記表面ａに供給した後、前記表面ａ以外の前記部材の表面ｂに前記磁性粒子を供給し、前記表面ａの近傍から前記磁場を印加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｉ）で用意される前記部材が多孔質または繊維質から成る部材であって、その内部領域の少なくとも一部の内部領域ａに前記物質ｂが固定化されており、
前記工程（ｉｉ）において、前記内部領域ａ以外の前記部材の領域ｂに前記試料と前記磁性粒子とを供した後、前記内部領域ａの近傍から前記磁場を印加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｉ）で用意される前記部材がプレート部材または容器であって、その表面の少なくとも一部の表面ａに前記物質ｂが固定化されており、
前記工程（ｉｉ）において、前記表面ａ以外の前記部材の表面ｂに前記試料と前記磁性粒子とを供給した後、前記表面ａの近傍から前記磁場を印加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｉ）で用意される前記部材が多孔質または繊維質から成る部材であって、その内部領域の少なくとも一部の内部領域ａに前記物質ｂが固定化されており、
前記工程（ｉｉ）において、前記試料を前記内部領域ａに供給した後、前記内部領域ａ以外の前記部材の領域ｂに前記磁性粒子を供し、前記内部領域ａの近傍から前記磁場を印加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記磁場の印加は、前記表面ａまたは前記内部領域ａの近傍に磁石を配置すること、又は、前記表面ａまたは前記内部領域ａの近傍に配置された電磁石に電流を流すことによって実施することを特徴とする、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｉ）で用意される前記部材の一部の領域ａに前記物質ｂが固定化されており、
前記工程（ｉｉ）において、前記領域ａ以外の前記部材の領域ｂに前記試料および前記磁性粒子を供給し、前記領域ｂの近傍から前記領域ａの近傍へと磁石を移動させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｉ）で用意される前記部材の一部の領域ａに前記物質ｂが固定化されており、
前記工程（ｉｉ）において、前記試料を前記領域ａに供給した後、前記領域ａ以外の前記部材の領域ｂに前記磁性粒子を供給し、前記領域ｂの近傍から前記領域ａの近傍へと磁石を移動させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｉ）で用意される前記磁性粒子の前記磁性材料が、強磁性体または超常磁性体であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｉ）で用意される前記磁性粒子の前記貴金属材料が、金、白金、銀、および、これらの合金から成る群から選択される材料であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｉ）で用意される前記磁性粒子の平均粒径が５ｎｍ〜１００μｍであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｉ）で用意される前記磁性粒子の飽和磁化が０．５Ａ・ｍ２／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ２／ｋｇであることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記磁性粒子の保磁力が０ｋＡ／ｍ〜２８０ｋＡ／ｍであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記物質ａが、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記物質ｂが、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｉｉｉ）の前記領域の状態は、前記領域の色の変化であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記色が、前記複合体を構成する前記磁性粒子の呈色に起因することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｉ）で用いる前記磁性粒子が、
（１）中央領域が前記磁性材料から形成され、かつ、外殻領域が前記貴金属材料から形成されている磁性粒子ｐ、および、前記被検物質に結合可能な前記物質ａを用意する工程、
（２）前記磁性粒子ｐと前記物質ａとを接触させ、前記物質ａが固定化された磁性粒子ｐ’を含んで成る混合物を得る工程、ならびに
（３）前記混合物に磁場を印加して、前記混合物から前記磁性粒子ｐ’を分離する工程
を含んで成る方法でもって調製されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（３）では、前記磁場の印加によって、前記磁性粒子ｐ’がより多い相Ａと前記磁性粒子ｐ’がより少ない相Ｂとに前記混合物を分けた後、前記相Ｂを前記混合物から取り除くことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程（２）では、前記物質ａと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカーを前記磁性粒子ｐに結合させた後、前記リンカーに対して前記物質ａを結合させることによって、前記磁性粒子ｐ’を得ることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（２）では、前記物質ａと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカーを前記物質ａに結合させた後、前記リンカーを前記磁性粒子ｐに結合させることによって、前記磁性粒子ｐ’を得ることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、前記磁性粒子および前記部材を有して成る被検物質検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、貴金属コート磁性粒子を用いた被検物質の検出方法に関する。より詳細には、
被検物質に結合可能な物質が固定化された貴金属コート磁性粒子を用いて、試料中の被検物質を検出する方法に関している。また、本発明は、かかる検出方法に用いる検出キットにも関している。
【背景技術】
【０００２】
抗体と抗原との組合せ又は生体レセプターとリガンドとの組合せ等の特異的相互作用を利用することによって、試料中に含まれる微量の被検物質を定量分析する方法は数多く知られている。
【０００３】
その中でも特に、抗原と抗体とが特異的に相互作用する「抗原抗体反応」を利用した免疫学的測定方法が広く利用されている。かかる免疫学的測定方法の１つに、Enzyme-linked immunosorbent assay法、即ちELISA法（「酵素免疫測定法」とも呼ばれる）がある。この手法は、被検物質を抗体で特異的・選択的に捕捉する手法であり、粗抽出のみで分析を行うことができる。従って、試料の精製に際して複雑な多くのステップを経る必要がなく、また、微量な被検物質であっても、ほとんどの場合、水、リン酸バッファーまたはメタノール等で抽出することができ、培養液を試料として直接用いることができる。ELISA法は、その簡便さゆえに、臨床診断の分野で最も用いられており、昨今注目を浴びているPCR法やDNAチップを用いた分析よりも長い歴史と数多くの実績を有している。
【０００４】
かかるELISA法の１つにサンドイッチELIZA法がある。サンドイッチELIZA法では、プレート上に固定化された抗体ａと、試料中の抗原と、酵素を予め結合させた別の抗体ｂ（「抗体ｂ」を「抗体酵素複合体」とも呼ぶ）とによって、固定化抗体ａ−抗原−抗体ｂから成るサンドイッチ構造を構築している。ここで、試料中に抗原が含まれていない場合、抗体ｂは捕捉・結合すべき抗原がないために残存し、プレートの洗浄によって、抗体ｂがプレート上から除去されることになる。即ち、試料中に抗原が存在すれば、固定化抗体ａ−抗原−抗体ｂから成るサンドイッチ構造が構築される一方、試料中に抗原がなければ、抗体ｂが残存し、かかる抗体ｂがプレートから除去されることになる。このような原理を利用すると、試料中の抗原量の違いによって、プレート上に留まる酵素量（即ち、「抗体ｂに結合している酵素の量」）に差が生じることになる。従って、最終的には、プレート上に留まった酵素を発色させると、抗原の有無を判別したり、抗原量を求めたりすることができる。
【０００５】
しかしながら、かかるサンドイッチELIZA法では、通常用いられる酵素が無色であるために、酵素のみでは呈色を確認することができず、酵素を発色させるべく発色基質が別途必要となってくる。
【０００６】
サンドイッチELIZA法の類似法として、金コロイドを用いたサンドイッチイムノアッセイ法がある。かかるサンドイッチイムノアッセイ法は、上述の酵素の代わりに金コロイドを用いている。つまり、サンドイッチELIZA法の抗体酵素複合体（即ち「抗体ｂ」）の代わりに、「抗体金コロイド複合体」を用いている。この場合、プレート上に固定化された抗体ａ’と、試料中の抗原と、金コロイドを予め結合した別の抗体ｂ’（「抗体ｂ’」を「抗体金コロイド複合体」）とが、固定化抗体ａ’−抗原−抗体ｂ’のサンドイッチ構造を構築することになる。サンドイッチELIZA法と同様に、試料中に抗原が存在すれば固定化抗体ａ’−抗原−抗体ｂ’から成るサンドイッチ構造が構築される一方、試料中に抗原がなければ、抗体ｂ’が残存し、かかる抗体ｂ’がプレートから除去されることになる。従って、試料中の抗原量の違いに応じて、プレート上に留まる金コロイド量（即ち、「抗体ｂ’に結合している金コロイドの量」）に差が生じることになる。上述のサンドイッチELIZA法の場合は、最後に発色基質を加え、酵素量に応じた発色によって試料中の抗原量を定量するが、サンドイッチイムノアッセイ法の場合は、発色基質を加えずに、プレート上に留まる金コロイドの量に応じた金自体の呈色の違いで、試料中の抗原量を定量することができる。従って、金コロイドを用いたサンドイッチイムノアッセイ法は、発色基質の添加操作を省ける点でサンドイッチELIZA法よりも簡便な方法といえる。
【０００７】
サンドイッチイムノアッセイ法では、金コロイドの大きさに応じて、紫色、茶褐色といった可視領域の呈色を金コロイド自体から確認することができる。金コロイドが抗体を結合する担体として用いられている別の理由は、金コロイドでは、抗体金コロイド複合体を容易に調製できるからである。金と硫黄原子との間では、金属−硫黄結合に起因して、硫黄原子が金に化学吸着する性質がある。そのため、抗体の硫黄原子と金との結合に起因して、抗体金コロイド複合体を容易に構築することが可能である。なお、抗体が硫黄原子を含んでいない場合には、チオールやチオエーテルで抗体を修飾することによって、抗体に硫黄原子を導入することができる。
【０００８】
このように金コロイドを用いた方法は利点があるものの、サンドイッチイムノアッセイ法で用いられる金コロイドは非磁性であるために、「抗体金コロイド複合体」を調製する点で必ずしも好都合であるとは言えなかった。具体的には、金コロイドと抗体とを結合させる工程の後に、金コロイドに結合しなかった余分な抗体を除去する精製操作が必要となるが、かかる精製操作を遠心分離操作やフィルター操作で行っており、それらの操作自体が工程全体を自動化する上で好ましくなかった（特許文献１参照）。
【０００９】
その一方で、金コロイドの代わりに磁性微粒子を用いる手法も提案されている（特許文献２参照）。提案されている手法では、磁場を加えて磁性微粒子を移動させることを通じて、試料中の被検物質を定量している。しかしながら、かかる手法では、高分子物質で被覆された磁性微粒子の表面に対して、被検物質に特異的に結合可能な物質（以下「特異的結合物質」とも呼ぶ）を固定化している。そのため、疎水性の抗体等の特定の特異的結合物質は磁性微粒子に容易に固定化できるものの、それ以外のほとんどの特異的結合物質は磁性微粒子に直接固定化させることが難しい。なぜなら、そのような特異的結合物質には、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基又はそのような官能基の誘導体が含まれており、それらを磁性微粒子に直接結合させることができないからである。この場合、磁性粒子表面を官能基で修飾する必要があり、そのような官能基または架橋試薬を選択する点で煩雑な作業を伴っていた。また、磁性微粒子表面を、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基で修飾する場合、磁性粒子を被覆している高分子物質の点で制約を受け、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基以外の官能基などを有した架橋試薬が必要となる場合がある。
【特許文献１】特許第３１０８１１５号公報
【特許文献２】特開平９−２２９９３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものである。つまり、本発明の課題は、比較的短い時間で実施できる簡易な被検物質の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、試料中に含まれる被検物質を検出する方法であって、
（ｉ）中央領域（コア領域）が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子であって、被検物質に結合することが可能な物質ａが外殻領域に固定化された磁性粒子を用意すると共に、被検物質に結合することが可能な物質ｂが固定化された部材、および、被検物質を含んで成る試料を用意する工程、
（ｉｉ）磁性粒子および試料を部材に供給し、磁性粒子の物質ａと部材の物質ｂとが被検物質を介して結合して形成された複合体を部材において得る工程、
（ｉｉｉ）部材にて物質ｂが固定化されている領域の状態を測定する工程、ならびに
（ｉｖ）測定した結果に基づいて、被検物質の有無または量を判断する工程
を含んで成り、
工程（ｉｉ）の複合体の形成を磁場（または磁界）の影響下で行うことを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法に用いられる磁性粒子は、中央領域が磁性材料から形成されると共に、外殻領域が貴金属材料から形成されている。従って、かかる磁性粒子は、貴金属材料が磁性材料を被覆した形態を有しているので、本明細書では磁性粒子を「貴金属コート磁性粒子」とも呼ぶ。また、物質ａおよび物質ｂは、被検物質に対して親和性を有する物質であり、被検物質と特異的に相互作用して結合する物質である。従って、本明細書では、物質ａおよび物質ｂを「特異的結合物質」とも呼ぶ。
【００１３】
本明細書において「被検物質を検出する」とは、試料中に含まれる被検物質の有無を判断することのみならず、かかる被検物質の量を求めることも意味している。本発明の方法では、工程（ｉｉ）で形成される複合体の量が、試料中に含まれる被検物質の量に実質的に対応または比例するため、かかる複合体の存否またはその量に基づいて、被検物質の有無または量を調べることができる。具体的には、部材において物質ｂが固定化されている領域の状態を測定する。つまり、複合体の存否または複合体の量に起因して、かかる領域の状態が変化するので（例えば「物質ｂが固定化されている領域の色が変化する」）、その状態を測定すると被検物質の有無または量を調べることができる。なお、本明細書において「測定」とは、目視確認による測定のみならず、一般的な測定機器による測定をも意味している。
【００１４】
例えば、試料に含まれる被検物質が抗原（または抗体）であり、磁性粒子の物質ａおよび部材の物質ｂが、その抗原に特異的に結合する抗体（または抗原）である場合には、いわゆる「抗原抗体反応」によって複合体が形成される。このような「抗原抗体反応」を利用して複合体を形成する場合、本発明の被検物質の検出方法を特に「イムノアッセイ法」と呼ぶことができることを理解されよう。
【００１５】
なお、本明細書において「固定化」とは、一般的に、磁性粒子または部材の表面付近に「被検物質に結合することが可能な物質ａ」または「被検物質に結合することが可能な物質ｂ」が存在している態様を意味しており、必ずしも物質ａが磁性粒子の表面に直接取り付けられている態様のみ、または、物質ｂが部材に直接取り付けられている態様のみを意味するものではない。また、本明細書において「磁性粒子の物質ａと部材の物質ｂとが被検物質を介して結合して形成された」とは、磁性粒子の物質ａおよび部材の物質ｂの両者が被検物質に結合していることを意味しており、磁性粒子（物質ａ）−被検物質−部材（物質ｂ）から成るサンドイッチ構造が構築されることを実質的に意味している。
【００１６】
本発明の１つの特徴は、工程（ｉ）で用いる磁性粒子が、その中央領域に磁性材料を含んでおり、磁性を帯びていることである。従って、工程（ｉｉ）で磁場を印加すると、磁性粒子の移動が促進され、より短い時間で複合体を形成することができる。具体的には、部材の物質ｂが固定化されている領域の近傍に磁石を配置することによって、又は、そのような近傍に配置された電磁石に電流を流すことによって、「物質ｂが固定化されている領域」へと向かう磁性粒子の移動を促進させる。
【００１７】
本発明の別の特徴は、工程（ｉ）で用いる磁性粒子が貴金属コートを有しているため、本発明の方法で用いる磁性粒子を容易に調製できることである。具体的には、例えば物質ａが硫黄原子を含んで成る抗体または抗原であると、その硫黄原子と磁性粒子（物質ａが固定化されていない磁性粒子）の貴金属コートとが相互に容易に結合するので、工程（ｉ）で用いる磁性粒子を比較的容易に調製することができる。
【００１８】
また、この調製に際しては、磁性粒子が磁性を帯びているために、磁気分離操作で磁性粒子を比較的容易に回収することができることも本発明の特徴の１つである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法で用いる磁性粒子は、磁性を帯びているために、磁場の影響下で複合体の形成を実施すると、比較的短い時間で複合体を得ることができる。従って、本発明の方法は、比較的短い時間で被検物質を検出することが可能である。また、本発明の方法で用いられる磁性粒子は、貴金属コートを有するために、検出に先立って行われる磁性粒子の調製が比較的容易である。
【００２０】
更に、本発明の方法では、磁性粒子の調製および被検物質の検出に際して、遠心分離操作やフィルター操作を行っていないため、全工程を自動化しやすい。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下にて、本発明の被検物質の検出方法を詳細に説明する。図１Ａに本発明の検出方法のフローチャートを示す。
【００２２】
まず、工程（ｉ）においては、図１Ｂに示すように、中央領域２が磁性材料から形成され、外殻領域３が貴金属材料から形成されている磁性粒子１であって、被検物質７に結合することが可能な物質ａ（符号４）が外殻領域３に固定化された磁性粒子１を用意する。また、被検物質７を含んで成る試料７’を用意すると共に、被検物質７に結合することが可能な物質ｂ（符号５）が固定化された部材６も用意する。
【００２３】
《磁性粒子について》
工程（ｉ）で用意される磁性粒子は、中央領域が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている。中央領域の磁性材料は、磁性を有する材料であれば、いずれの種類の材料でもよい。磁性材料としては、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の金属、または、そのような金属を少なくとも含む合金を挙げることができる他、酸化鉄およびイットリウム鉄ガーネット等も挙げることができる。磁性粒子が強磁性体から成ると、飽和磁化が大きく磁気分離操作において捕集性に優れる利点がもたらされる。また、磁性粒子が超常磁性体から成ると、強磁性体ほど飽和磁化が大きくないが、磁場のない状態では磁化がなく、磁性粒子が凝集しにくい利点がもたらされる。従って、本発明では、強磁性体または超常磁性体から成る磁性材料で中央領域が形成されていることが好ましい。強磁性体としては、例えばマグヘマイト（γ-酸化鉄）、マグネタイト、ニッケル亜鉛フェライトまたはマンガン亜鉛フェライト等を挙げることができ、超常磁性体としては、例えばマグヘマイト（γ-酸化鉄）、マグネタイト、ニッケル亜鉛フェライトまたはマンガン亜鉛フェライト等の超微粒子を挙げることができる。
【００２４】
磁性粒子に外殻領域に含まれる貴金属材料は、一般的な貴金属材料であれば特に制限はないが、金、白金、銀、または、これらの合金などが好ましく、それらの混合物であってもよい。
【００２５】
工程（ｉ）で用いる磁性粒子は、好ましくは５ｎｍ〜１００μｍの平均粒径を有していることが好ましい。なぜなら、磁性粒子の平均粒径が５ｎｍよりも小さくなると磁性粒子の集磁性が悪くなる一方、磁性粒子の平均粒径が１００μｍよりも大きくなると磁性粒子の分散性が悪くなるからである。特に２０ｎｍ〜１０μｍの平均粒径が好ましい。ここでいう「平均粒径」は、物質ａが固定化されていない状態の磁性粒子の直径を意味している。また、本明細書において「平均粒径」とは、例えば、電子顕微鏡や光学顕微鏡等で拡大した画像から１００個の粒子を無作為に選択し、それぞれの粒子について直径を読み取り、これらを平均することによって求めた場合の粒径をいう。ただし、直径が均一でない場合には、最大径と最小径を求めて平均したものを、各粒子の直径とする。なお、かかる磁性粒子の好ましい粒径は、被検物質または磁性粒子自体の形状および種類などに応じて変わり得ることを理解されよう。
【００２６】
工程（ｉ）で用いる磁性粒子の磁気特性としては、保磁力が０ｋＡ／ｍ〜２８０ｋＡ／ｍ（０エルステッド〜３５００エルステッド）の範囲を有し、飽和磁化が０．５Ａ・ｍ２／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ２／ｋｇ（０．５ｅｍｕ／ｇ〜１００ｅｍｕ／ｇ）の範囲を有するものが好ましい。これにより、磁場（または磁界）に対する磁性粒子の応答性が実用上十分となる。但し、磁性粒子の中央領域の磁性材料が金属鉄である場合には、保磁力が８．０ｋＡ／ｍ〜７１．７ｋＡ／ｍ（１００エルステッド〜９００エルステッド）の範囲を有し、飽和磁化が６０Ａ・ｍ２／ｋｇ〜１６０Ａ・ｍ２／ｋｇ（６０ｅｍｕ／ｇ〜１６０ｅｍｕ／ｇ）の範囲を有するものが実用上好ましい。なお、保磁力は大きすぎると磁性粒子の凝集性が必要以上に大きくなり、複合体の均一な形成に影響を及ぼす一方、保磁力が小さすぎると磁性粒子が磁場の影響を受けなくなるので、より好ましい保磁力は０ｋＡ／ｍ〜７１．７ｋＡ／ｍであり、更に好ましい保磁力は０．８ｋＡ／ｍ〜１５．９２ｋＡ／ｍである。
【００２７】
磁性粒子に固定化されている物質ａは、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることが好ましい。物質ａは、相互に特異的結合性を有する生体レセプターおよびリガンドのいずれか一方であってもよい。また、被検物質がヌクレオチド鎖の場合には、物質ａが、そのヌクレオチド鎖と相補的なヌクレオチド鎖であってもよい。
【００２８】
例えば、被検物質が抗原の場合には物質ａは抗体となり、被検物質が抗体の場合には物質ａは抗原となる。同様に、被検物質が生体レセプターである場合には物質ａはリガンドとなり、被検物質がリガンドの場合には物質ａが生体レセプターとなる。物質ａに用いる代表的な抗体または抗原としては、例えば抗インフルエンザウィルス抗体、インフルエンザウィルス抗原、心筋トロポニンT、抗心筋トロポニンT抗体等を挙げることができる。また、物質ａに用いる代表的な生体レセプターまたはリガンドとしては、例えばＬＤＬ、ＬＤＬレセプター、インスリン、インスリンレセプター等を挙げることができる。なお、「抗体・抗原」および「生体レセプター・リガンド」という用語は、あくまでも相互に特異的に結合する物質の組合せを実質的に意味しているので、物質によっては「抗体・抗原の組合せ」に属するだけでなく「生体レセプター・リガンドの組合せ」にも属するものがあり得ることに留意されたい。
【００２９】
工程（ｉ）で用意する磁性粒子には上述の物質ａが固定化されているが、かかる固定化には公知の物理的吸着法または化学的吸着法を利用することができる。例えば、物質ａが依然固定化されていない貴金属コート磁性粒子（以下「磁性粒子ｐ」と呼ぶ）と物質ａとを緩衝液等の溶液中または有機溶剤中で数秒〜数日ほど混合させると、物質ａと磁性粒子ｐとが吸着反応を起こすので、物質ａを磁性粒子ｐに固定化させることができる。用いる緩衝液または有機溶剤としては、例えばPBS緩衝液、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトン、ピリジン、トルエン、酢酸エチル、ヘキサン、エタノール、メタノール、クロロホルムまたはフェノールなどが挙げられる。また、例えば、コアセルべーション法のように、緩衝液等の溶液中または有機溶剤中で物質ａと磁性粒子ｐとを接触させると、磁性粒子ｐの表面に物質ａが析出するので、物質ａを磁性粒子ｐに固定化することができる。
【００３０】
なお、多くの抗体は（例えば蛋白質）は、その分子中にチオール基、チオエーテル基またはジスルフィド基等の硫化物官能基を有している。抗体の硫黄原子と貴金属材料とは結合し易いので、磁性粒子ｐに特別な前処理を施すことなく、磁性粒子ｐと抗体とを接触させることによって、抗体を磁性粒子ｐに直接固定化させることができる。
【００３１】
物質ａが固定化された磁性粒子は、緩衝液等の溶液中または有機溶剤中に存在した状態で得られるが、かかる溶液中または溶剤中には、固定化しなかった物質ａ等の余分な物質または成分が含まれ得る。従って、後記で詳細に説明するが、磁気分離操作を用いて、「物質ａが固定化された磁性粒子」を精製する。
【００３２】
このようにして本発明の検出方法で用いる磁性粒子を得ることができるが、得られた磁性粒子は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等の溶媒中に分散させた状態で使用されることが好ましい。
【００３３】
《部材について》
工程（ｉ）で用意される部材には、物質ｂが固定化されている。部材自体は、物質ｂを固定化できるものであれば、いずれの形状および構造でもよく、また、部材の材質も特に制限はない。
【００３４】
好ましい部材の１つの例は、プレート部材または容器である。かかる部材としては、例えばウェル、板状部材または球状部材等を挙げることができる。このような場合、部材の材質は、ガラス、石英、酸化チタン、ITO、金、白金、銀等の無機材料、カーボンブラック、グラッシーカーボン、カーボンナノチューブ、フラーレン等の炭素材料、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、セルロース、ニトロセルロース等の高分子材料等であることが好ましい。部材がプレート部材または容器であると、部材の表面に物質ｂを固定化させることができる。
【００３５】
また、好ましい部材の別の例は、多孔質または繊維質から成る部材である。かかる部材としては、例えば、不織布、濾紙、高分子膜、多孔質膜またはプレート等を挙げることができる。このような場合、多孔質または繊維質は、シリカ、アルミナ、ガラスウール、デキストラン、ポリフッ化ビニリデン、セルロース、ニトロセルロース等の材料から形成されていることが好ましい。多孔質または繊維質から成る部材では、部材自体が空隙を有する構造であるので、部材の内部領域に物質ｂを固定化させることができる。
【００３６】
工程（ｉ）で用意する部材には、部材の表面または内部領域に磁性粒子（具体的には「溶媒に分散した状態で存在する磁性粒子」）および／または液状の試料が流れる流路が設けられていることが好ましい。
【００３７】
本発明では、部材の一部の表面または一部の内部領域にだけ物質ｂが固定化されたものが好ましい。なぜなら、物質ｂが固定化された表面または内部領域の像と、物質ｂが固定化されていない表面または内部領域の像とを比較することができるからである。これにより、「陽性」と「陰性」との判別、即ち、試料中の被検物質の有無の判断が容易となる。
【００３８】
部材に固定化されている物質ｂは、物質ａと同様、相互に特異的結合性を有する抗体および抗原のいずれか一方であることが好ましい。物質ｂは、物質ａと同様、相互に特異的結合性を有する生体レセプターおよびリガンドのいずれか一方であってもよい。更には、被検物質がヌクレオチド鎖の場合には、物質ｂが、そのヌクレオチド鎖と相補的なヌクレオチド鎖であってもよい。
【００３９】
物質ａと同様、例えば、被検物質が抗原の場合には物質ｂは抗体となり、被検物質が抗体の場合には物質ｂは抗原となる。同様に、被検物質が生体レセプターである場合には物質ｂはリガンドとなり、被検物質がリガンドの場合には物質ｂが生体レセプターとなる。物質ｂに用いる代表的な抗体または抗原としては、例えば抗インフルエンザウィルス抗体、インフルエンザウィルス抗原、心筋トロポニンT、抗心筋トロポニンT抗体等を挙げることができる。また、物質ｂに用いる代表的な生体レセプターまたはリガンドとしては、例えばＬＤＬ、ＬＤＬレセプター、インスリン、インスリンレセプター等を挙げることができる。なお、物質ａと物質ｂとは、同一の物質であってもよいし、別の物質であってもよいことに留意されたい。
【００４０】
工程（ｉ）で用意する部材には上述の物質ｂが固定化されているが、かかる固定化には公知の物理的吸着法、化学的吸着法、架橋試薬による化学的結合法、または、これらの手法の組合せを等も利用することができる。
【００４１】
例えば、物質ｂが依然固定化されていない部材（以下「未固定化部材」と呼ぶ）および物質ｂを緩衝液等の溶液中または有機溶剤中で数秒〜数日ほど浸すと、物質ｂと未固定化部材とが吸着反応を起こすので、物質ｂを未固定化部材に固定化させることができる。固定化後は、PBS緩衝液、リン酸緩衝液、アセトンもしくはエタノールなどの緩衝液または有機溶剤等で部材ｂを洗浄することが好ましい。
【００４２】
なお、「一部の表面または一部の内部領域にだけ物質ｂが固定化された部材」は、溶液、懸濁または分散させた物質ｂをスポッター等を用いてを部材に滴下することによって得ることができる。
【００４３】
以下では、具体的な物質・官能基を挙げて、「未固定化部材に対する物質ｂの固定化」について詳細に説明する。
【００４４】
〈ヘテロ二価性架橋試薬を用いた固定化〉
ヘテロ二価性架橋試薬を用いることによって、化学的結合法で物質ｂを未固定化部材に固定化することができる。「ヘテロ二価性架橋試薬」としては、
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物と、
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物と
の組合せから成るヘテロ二価性架橋試薬が挙げられる。
なお、このようなヘテロ二価性架橋試薬を用いて、物質ｂを未固定化部材に固定化するには、「未固定化部材」自体が、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物質を有していることが好ましい。
同様に、「物質ｂ」には、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物、二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物質が含まれていることが好ましい。
【００４５】
上記のような未固定化部材および物質ｂをヘテロ二価性架橋試薬と接触・混合させることによって、ヘテロ二価性架橋試薬を介して、物質ｂを未固定化部材に固定化できる。例えば、まず、ヘテロ二価性架橋試薬と上記の未固定化部材とを緩衝液等の溶液中または有機溶媒中に浸すことにより、ヘテロ二価性架橋試薬と未固定化部材との反応により、未固定化部材にヘテロ二価性架橋試薬を結合させる。次いで、物質ｂを加える。これによって、ヘテロ二価性架橋試薬と物質ｂとの反応により、ヘテロ二価性架橋試薬を介して物質ｂが未固定化部材に固定化されることになる。最終的には、物質ｂが固定化された部材を緩衝液または有機溶剤等で洗浄すればよい。
【００４６】
〈ホモ二価性架橋試薬を用いた固定化〉
ヘテロ二価性架橋試薬と同様、ホモ二価性架橋試薬を用いることによっても、化学的結合法で物質ｂを未固定化部材に固定化することができる。「ホモ二価性架橋試薬」としては、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物または二重結合等の官能基または該官能基誘導体または無機物から成るホモ二価性架橋試薬が挙げられる。「未固定化部材」および「物質ｂ」は、ヘテロ二価性架橋試薬の場合と同様である。また、ホモ二価性架橋試薬を用いて未固定化部材に物質ｂを固定化する方法も、上述のヘテロ二価性架橋試薬と同様である。つまり、ホモ二価性架橋試薬と上記の未固定化部材とを緩衝液等の溶液中または有機溶媒中に浸すことにより、未固定化部材にホモ二価性架橋試薬を結合させる。次いで、物質ｂを加えて、ホモ二価性架橋試薬を介して物質ｂを未固定化部材に固定化させる。最終的には、物質ｂが固定化された部材を緩衝液または有機溶剤等で洗浄する。
【００４７】
なお、上記の「ヘテロ二価性架橋試薬を用いた固定化」および「ホモ二価性架橋試薬を用いた固定化」では、必要に応じて、部材への非特異的反応を抑制することが好ましい。従って、正常血清、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳などを部材に接触させること等の公知の手法によって、部材への非特異的吸着を抑えるブロッキングを行ってもよい。
【００４８】
《試料について》
工程（ｉ）で用意される試料には、被検物質が含まれている。試料としては、検出すべき被検物質が存在している可能性があるものであれば、いずれも種類の試料であってもかまわない。例えば、ヒトもしくは動物の尿、血液、血清、血漿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒトもしくは動物の臓器、毛髪、皮膚、爪、骨、筋肉もしくは神経組織等の懸濁液または抽出液；便懸濁液；培養細胞もしくは培養組織の懸濁液または抽出液；ウィルスの懸濁液または抽出液；菌体の培養液；土壌懸濁液または抽出液；植物の懸濁液または抽出液；食品・加工食品の懸濁液または抽出液；排水などを試料として挙げることができる。
【００４９】
試料は、検出に影響を与えない液体で希釈してもよい。例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液等の緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等を用いて試料を希釈してもよい。
【００５０】
試料中に含まれる被検物質は、例えば、蛋白質、糖蛋白質、ペプチド、核酸、糖、脂質、糖脂質、高分子化合物、低分子化合物、錯体、無機物、ベクター、細菌、真菌、酵母、ウィルスおよび細胞のような生体関連物質、食品関連物質または環境関連物質などである。
【００５１】
より具体的な被検物質としては、以下の物質を挙げることができる：
HA抗体、IgG型HA抗体、IgM型HA抗体、HBc抗体、HBe抗原、HBe抗体、HBs抗原、HBs抗体、HCVコア抗原、HCVコア抗体、HCV抗原、HCV抗体、HIV I抗原、HIV I抗体、HIV II抗原、HIV II抗体、インフルエンザウィルス抗原、インフルエンザA型抗体、インフルエンザB型抗体、風疹ウィルス抗体、単純ヘルペスI型抗体もしくは単純ヘルペスII型抗体等のウィルス関連の抗原または抗体；
マイコプラズマ抗原、抗マイコプラズマ抗体、結核菌抗原、抗結核菌抗体、クロストリジウム・ディフィシル抗原、アスペルギルス抗原、アスペルギルス抗体、ASO、カンジダ抗原、抗カンジダ抗体、オーム病抗体、クラミジア・トラコーマチス抗体IgA、クラミジア・トラコーマチス抗体IgM、クラミジア・トラコーマチス抗体IgG、クラミジア・ニューモニエ抗体IgA、クラミジア・ニューモニエ抗体IgG、抗抗酸菌抗体、抗ストレプトキナーゼ抗体、エンドトキシン、抗エンドトキシン抗体、レジオネラ抗原、百日咳菌抗体、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗体、梅毒トレポネーマ抗原、梅毒トレポネーマ抗体、淋菌抗原、抗淋菌抗体、レプトスピラ抗原、抗レプトスピラ抗体等の細菌関連の抗原または抗体；
ツツガ虫Gilliam IgG、ツツガ虫Gilliam IgM、ツツガ虫Karp IgG、ツツガ虫Karp IgM、ツツガ虫Kato IgG、ツツガ虫Kato IgM、トキソプラズマ抗体、トキソプラズマ抗体IgGもしくはトキソプラズマ抗体IgM等の微生物関連の抗原または抗体；
A抗原、抗A抗体、B抗原、抗B抗体、RhoD抗原、抗RhoD抗体もしくは不規則抗体等の血液型関連の抗原または抗体；
免疫グロブリンA(IgA)、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンM(IgM)、免疫グロブリンD(IgD)もしくは免疫グロブリンE(IgE)等の免疫グロブリンまたは免疫グロブリンスーパーファミリー；
顆粒球エラスターゼ、好酸球塩基性蛋白、CRP、フェリチン、コルチコトロピン放出因子、α1アシドグリコプロテイン、α1マイクログロブリン、α2マイクログロブリン、β2マイクログロブリン、α1アンチトリプシン、IV型コラーゲン、アミロイドA、アルブミン、心筋トロポニンT、心室筋ミオシン軽鎖I、肺サーファクタントプロテインD、ヒト心臓由来脂肪酸結合蛋白、プロコラーゲンIIIペプチド、ミオグロビン、IgG型リウマチ因子、LE因子、リウマトイド因子、血小板表面IgG、抗DNA抗体、抗dsDNA抗体IgG、抗dsDNA抗体IgM、抗Jo-1抗体、抗LKM-1抗体、抗RNP抗体、抗Scl-70抗体、抗Sm抗体、抗SS-A抗体、抗ssDNA抗体IgG、抗ssDNA抗体IgM、抗アセチルコリンレセプター結合抗体、抗アセチルコリンレセプター阻止抗体、抗胃壁細胞抗体、抗核抗体群、抗ガラクトース欠損IgG抗体、抗カルジオリピンβ2GPI複合体抗体、抗カルジオリピン抗体、抗血小板抗体、抗好中球細胞質抗体、抗好中球細胞質ミエロペルオキシダーゼ抗体、抗糸球体基底膜抗体、抗セントロメア抗体、抗内因子抗体、抗副腎皮質抗体、抗平滑筋抗体、抗ミトコンドリアM2抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体、ミエリンベイシック蛋白、免疫複合体、抗C3d抗体、補体C3もしくは補体C4等の炎症・臨床検査マーカー；または
I型コラーゲン-C-テロペプチド、I型コラーゲン架橋N-テロペプチド、αフェトプロテイン、BCA225、CA15-3、CA19-9、CA54/61、CA72-4、CA125、CA130、CA602、DUPAN2、HER2、NCC-ST-439、PIVKA-II、PSA-ACT、PSA、SCC抗原、Span-1抗原、γ-セミノプロテイン、エラスターゼ1もしくは塩基性フェトプロテイン等の腫瘍マーカー。
その他にも、各種のホルモン；各種のアレルギー関連の抗原または抗体；各種の血液凝固系関連物質；各種のウィルスのDNAまたはRNA；各種の真菌・細菌のDNAまたはRNA；ヒト等の各種の動物もしくは植物のDNAまたはRNA；各種の微生物のDNAまたはRNA；各種の食物アレルゲン；各種の環境ホルモン等を挙げることができる他、
PRTR法規制物質、化審法規制物質、労働安全衛生法規制物質、消防法規制物質、毒物劇物取締法規制物質、高圧ガス取締法規制物質、火薬類取締法規制物質、大気汚染防止法規制物質、水質汚濁防止法規制物質、悪臭防止法規制物質、海洋汚染防止法規制物質、薬事法規制物質、麻薬取締法規制物質、危規則規制物質、航空法規制物質、港則法規制物質、化学兵器禁止法規制物質、農薬取締法規制物質、オゾン層保護法規制物質、廃掃法規制物質もしくは輸出入貿易管理令規制物質等の各種の規制物質；
各種のカーボン材料；各種の無機材料；各種の細胞；各種の増殖因子；各種のウィルス；各種の細菌；各種の古細菌；各種の真菌；各種の放線菌；各種の糸状菌；または各種の酵母等を被検物質として挙げることができる。
【００５２】
工程（ｉ）にて、上記のような磁性粒子、部材および試料を用意した後、引き続いて、工程（ｉｉ）が実施される。工程（ｉｉ）では、磁性粒子および試料を部材に供給する。磁性粒子の物質ａおよび部材の物質ｂが共に被検物質に対して結合性を有しているので、磁性粒子および試料が部材に接触すると、物質ａと物質ｂとが試料の被検物質を介して結合した複合体（即ち、「磁性粒子の物質ａ−被検物質−部材の物質ｂから成るサンドイッチ構造」）が得られることになる。なお、複合体の形成に際しては、物質ａまたは物質ｂが被検物質に直接結合する態様のみならず、リンカーを介して被検物質に結合する態様であってもよい。
【００５３】
工程（ｉｉ）で供給される磁性粒子は、工程（ｉ）に関する記載で上述したが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等の溶媒中に分散させた状態で使用することが好ましい。同様に、工程（ｉｉ）で供給される試料は、必要に応じて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液もしくはTBS緩衝液などの緩衝液、生理食塩水、イオン交換水、滅菌水または超純水等で希釈した状態で使用することが好ましい。
【００５４】
工程（ｉｉ）では、試料中に被検物質が存在すると、サンドイッチ構造の複合体が、部材の物質ｂが固定化された領域で形成されることになる一方、試料中に被検物質がないと、サンドイッチ構造の複合体は形成されない。このように、試料中に被検物質が存在すると、形成される複合体に起因して、物質ｂが固定化されている部材領域の状態が変化する。従って、本発明では、複合体の形成に伴う磁性粒子の分布状態を、物理的特性または化学的特性の変化を利用して測定することによって、被検物質の有無または被検物質の量を判断することができる。例えば、被検物質が存在すると、形成される複合体に起因して、物質ｂが固定化されている部材領域の色が、物質ｂが固定化されていない部材領域の色と異なることになる。従って、工程（ｉｉｉ）において、かかる領域を目視確認することによって、試料中の被検物質の有無を判断することができる（工程（ｉｖ））。なお、被検物質が存在する場合、物質ｂが固定化されている部材領域の色は、例えば、複合体を構成する磁性粒子の呈色に起因する。
【００５５】
試料中に含まれる被検物質の量（または濃度）を判断したい場合には、工程（ｉｉｉ）において、物質ｂが固定化されている部材領域における、色の変化、膜厚（または「厚み」）の変化、重量変化、導電性変化、磁性変化または光散乱特性変化などのパラメーター変化を測定すればよい。この場合は、かかるパラメーターの変化量と被検物質量との関係を表す検量線（つまり、「変化量と被検物質量との相関関係」）を予め得ておくことが好ましい。これにより、工程（ｉｖ）において、検量線と工程（ｉｉｉ）で測定されたパラメーター変化量とに基づいて被検物質の量を求めることができる。なお、工程（ｉｉｉ）で上記のパラメーターの変化量が０の場合では、被検物質の量も０であるので、上記のパラメーター変化量の測定で被検物質の有無を判断することもできる。
【００５６】
次に、本発明の種々の実施形態について、図面を参照しながら説明する。なお、同様の構成要素については同じ符号を付し説明を省略する場合がある。
【００５７】
（第１実施形態）
第１実施形態は、本発明の方法の原理を主に示すものである。図２に、第１実施形態に係る複合体の形成過程を示す。なお、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質ａおよび物質ｂが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。
【００５８】
まず、図２（ａ）に示すように、抗体５が固定化された部材６を用意する。次いで、被検物質７（即ち「抗原」）を含んだ試料を部材６に供給することによって、図２（ｂ）に示すように、部材６の抗体５と被検物質７とを抗原抗体反応で相互に結合させる。次いで、図２（ｃ）に示すように、磁性粒子１を部材６に供給すると共に、部材６の裏面側から磁場を印加する。具体的には、抗体５が固定化されている面の反対側の面の下方に磁石１１を配置する。これにより、磁性粒子１が磁場の影響下に置かれることになり、磁性粒子１が部材６の抗体５の方向へと移動することになる。最終的には、磁性粒子１の抗体８が被検物質７と結合することによって、図２（ｄ）に示すようなサンドイッチ構造の複合体９が形成される。複合体９が形成された後は、磁場の印加を停止し、抗体５が固定化されている部材面を洗浄することによって、複合体形成に寄与しなかった磁性粒子１を除去することが好ましい。
【００５９】
このような本発明の方法では、試料中に被検物質７が存在すると、抗体５が固定化されている部材６の領域ａ（図２（ａ）参照）に複合体９が形成されるので、かかる複合体９に起因した領域ａの状態変化から被検物質７の有無（即ち、「陽性」または「陰性」）を判断できる。それだけでなく、領域ａの状態変化を測定すると、被検物質７の量も求めることができる。
【００６０】
また、本発明の方法では、複合体９の形成を磁場の影響下で行っているので、比較的短い時間で複合体９を形成することができ、結果的に、比較的短い時間で被検物質７を検出できる利点がある。
【００６１】
（第２実施形態）
第２実施形態は、工程（ｉ）で用意される部材がプレート部材または容器であって、その表面の少なくとも一部の表面ａに物質ｂが固定化されている形態であり、工程（ｉｉ）において、試料を表面ａに供給した後、表面ａ以外の部材の表面ｂに磁性粒子を供給し、表面ａの近傍から磁場を印加する形態である。「表面ａの近傍から磁場を印加する形態」は、例えば、表面ａの近傍に磁石を配置する形態、または、表面ａの近傍に予め配置された電磁石に電流を流す形態が考えられる。図３Ａに、第２実施形態に係る複合体の形成過程を示す。第１実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質ａおよび物質ｂが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。
【００６２】
まず、図３Ａ（ａ）に示すように、プレート部材等の部材１０の一部の表面ａに抗体５を固定化する。次いで、被検物質７を含んだ試料を表面ａに供給することによって、図３Ａ（ｂ）に示すように、部材１０の抗体５と被検物質７とを抗原抗体反応で相互に結合させる。次いで、図３Ａ（ｃ）に示すように、表面ａ以外の部材の表面ｂに磁性粒子１を供給する。そして、図３Ａ（ｄ）に示すように、表面ａの近傍から磁場を印加して、磁性粒子１を磁場の影響下に置く。具体的には、磁性粒子１が表面ａを通過するように、供給された磁性粒子１と磁石１１とが表面ａを挟み込むように部材１０の裏面または側面に磁石１１を配置する。これにより、磁性粒子１が表面ｂから表面ａの方向へと移動することになる。最終的には、磁性粒子１の抗体８が被検物質７と結合するので、図３Ａ（ｅ）に示すように、部材１０の抗体５が固定化されている表面ａにおいて複合体９が形成される。従って、複合体９に起因した領域ａの状態変化から被検物質７の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質７の量を求めることができる。この実施形態でも、複合体９の形成を磁場の影響下で行っているために、磁性粒子１の移動が促進されており、比較的短い時間で複合体９を形成することができる。従って、比較的短い時間で被検物質７を検出することが可能である。なお、磁性粒子１が移動する部材１０の領域に溝部を設けて、磁性粒子が移動し易くなるようにしてもよい。
【００６３】
この実施形態から分かるように、本明細書では「表面ａの近傍から磁場を印加する」とは、「磁性粒子の表面ａへの移動が促進されるように磁場を印加する」ことを実質的に意味しており、表面ａに近接する位置だけから磁場を印加する形態のみに限定されないことに留意されたい。また、このような実施形態では、複合体形成に寄与しなかった磁性粒子は、最終的には、表面ａを通過して磁石付近へと吸引されるので、余分な磁性粒子を除去する操作が省ける点でも利点がある。
【００６４】
（第３実施形態）
第３実施形態は、工程（ｉ）で用意される部材がプレート部材または容器であって、その表面の少なくとも一部の表面ａに物質ｂが固定化されている形態であり、工程（ｉｉ）において、表面ａ以外の部材の表面ｂに試料と磁性粒子とを供給した後、表面ａの近傍から磁場を印加する形態である。図３Ｂに、第３実施形態に係る複合体の形成過程を示す。なお、第１実施形態および第２実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質ａおよび物質ｂが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。
【００６５】
まず、図３Ｂ（ａ）に示すように、プレート部材等の部材１０の一部の表面ａに抗体５を固定化する。次いで、図３Ｂ（ｂ）に示すように、表面ａ以外の部材の表面ｂに、被検物質７を含んだ試料を供給すると共に、磁性粒子１を供給する。次いで、図３Ｂ（ｃ）に示すように、表面ａの近傍から磁場を印加して、磁性粒子を磁場の影響下に置く。具体的には、磁性粒子が表面ａを通過するように、供給された磁性粒子１と磁石１１とが表面ａを挟み込むように部材１０の裏面または側面に磁石１１を配置する。これによって、図３Ｂ（ｃ）に示すように、磁性粒子１が表面ｂから表面ａの方向へと移動することになる。この際、磁性粒子１の抗体８と被検物質７との抗原抗体反応により磁性粒子１と被検物質７とが相互に結合する。最終的には、被検物質７が部材１０の抗体５と結合するので、図３Ｂ（ｄ）に示すように、部材１０の抗体５が固定化されている表面ａに複合体９が形成されることになる。従って、この複合体９に起因した領域ａの状態変化から被検物質７の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質７の量も求めることができる。この実施形態でも、複合体９の形成を磁場の影響下で行っているために、磁性粒子１の移動が促進されており、比較的短い時間で複合体９を形成することができる。従って、比較的短い時間で被検物質７を検出することが可能である。なお、第２実施形態と同様に、磁性粒子１が移動する部材１０の領域に溝部を設けて、磁性粒子１が移動し易くなるようにしてもよい。
【００６６】
（第４実施形態）
第４実施形態は、工程（ｉ）で用意される部材が多孔質または繊維質から成る部材であって、その内部領域の少なくとも一部の内部領域ａに物質ｂが固定化されている形態であり、工程（ｉｉ）において、内部領域ａ以外の部材の領域ｂに試料と磁性粒子とを供した後、内部領域ａの近傍から磁場を印加する形態である（イムノクロマト法）。「内部領域ａの近傍から磁場を印加する形態」は、例えば、内部領域ａの近傍に磁石を配置する形態、または、内部領域ａの近傍に予め配置された電磁石に電流を流す形態が考えられる。図４Ａに、第４実施形態に係る複合体の形成過程を示す。なお、第１実施形態〜第３実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質ａおよび物質ｂが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。
【００６７】
まず、少なくとも一部の内部領域ａに抗体５が固定化された部材１２を用意して、その部材１２の内部領域ａ以外の領域ｂに磁性粒子１および試料を供する。具体的には、図４Ａ（ａ）に示すように、磁性粒子１の分散液を含浸させた磁性粒子含浸部材（例えば多孔質または繊維質から成る部材）１３を領域ｂに配置すると共に、サンプルパッド（例えば多孔質または繊維質から成るサンプルパッド）１４を領域ｂに配置して、かかるサンプルパッド１４に試料を供給する。磁性粒子含浸部材１３とサンプルパッド１４とは相互に一部が重なり合って配置されることが好ましい。試料がサンプルパッド１４に供給されると、図４Ａ（ｂ）に示すように、試料中に含まれる被検物質７がサンプルパッド１４内に含まれた状態になる。次いで、試料中の被検物質７は、いわゆる毛管現象に起因して、サンプルパッド１４内から磁性粒子含浸部材１３内へと移動することになるので、図４Ａ（ｃ）に示すように、磁性粒子１の抗体８と被検物質７との抗原抗体反応で磁性粒子１と被検物質７とが相互に結合することになる。次いで、図４Ａ（ｄ）に示すように、内部領域ａの近傍から磁場を印加して、磁性粒子１を磁場の影響下に置く。具体的には、磁性粒子が内部領域ａを通過するように、供された磁性粒子１と磁石１１とが内部領域ａを挟み込むように部材１２の裏面または側面に磁石１１を配置する。これによって、磁性粒子１が、被検物質７と共に、領域ｂから内部領域ａに向かう方向に移動することになる。最終的には、被検物質７と部材１２の抗体５とが結合するので、図４Ａ（ｅ）に示すように、部材１２の抗体５が固定化されている内部領域ａにて複合体９が形成されることになる。従って、この複合体９に起因した内部領域ａの状態変化から被検物質７の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質７の量も求めることができる。この実施形態でも、複合体９の形成を磁場の影響下で行っており、比較的短い時間で複合体９を形成することができるので、結果的に、比較的短い時間で被検物質７を検出できる。なお、第４実施形態では、磁場を印加しない場合であっても磁性粒子１および被検物質７は毛管現象に起因して部材１２内を移動することができるが、磁場の影響下に置かれることによって、かかる移動が促進されていることに留意されたい。
【００６８】
また、この実施形態から分かるように、本明細書では「内部領域ａの近傍から磁場を印加する」とは、「磁性粒子の内部領域ａへの移動が促進されるように磁場を印加する」ことを実質的に意味しており、内部領域ａに近接する位置だけから磁場を印加する形態のみに限定されないことに留意されたい。また、「少なくとも一部の内部領域ａに抗体が固定化された部材」とは、抗体の全てが内部領域に固定化されている必要はなく、一部の抗体が表面に固体化されている形態であってもよいことにも留意されたい。このような実施形態でも、第２実施形態と同様、複合体形成に寄与しなかった磁性粒子は、最終的には、内部領域ａを通過して磁石付近へと吸引されることになるので、余分な磁性粒子を除去する操作が省ける点で利点がある。
【００６９】
（第５実施形態）
第５実施形態は、工程（ｉ）で用意される部材が多孔質または繊維質から成る部材であって、その内部領域の少なくとも一部の内部領域ａに物質ｂが固定化されている形態であり、工程（ｉｉ）において、試料を内部領域ａに供給した後、内部領域ａ以外の部材の領域ｂに磁性粒子を供し、次いで、内部領域ａの近傍から磁場を印加する形態である。図４Ｂに、第５実施形態に係る複合体の形成過程を示す。なお、第１実施形態〜第４実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質ａおよび物質ｂが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。
【００７０】
まず、図４Ｂ（ａ）に示すように、少なくとも一部の内部領域ａに抗体５が固定化された部材１２を用意する。次いで、被検物質７を含んだ試料を内部領域ａに供すことによって、図４Ｂ（ｂ）に示すように、部材１２の抗体５と被検物質７とを抗原抗体反応で相互に結合させる。次いで、図４Ｂ（ｃ）に示すように、内部領域ａ以外の部材の領域ｂに磁性粒子１を供する。この際、第４実施形態と同様に、磁性粒子１の分散液を含浸させた磁性粒子含浸部材（例えば多孔質または繊維質から成る部材）１３を領域ｂに配置することが好ましい。次いで、図４Ｂ（ｄ）に示すように、内部領域ａの近傍から磁場を印加して、磁性粒子１を磁場の影響下に置く。具体的には、磁性粒子１が内部領域ａを通過するように、供された磁性粒子１と磁石１１とが内部領域ａを挟み込むように部材１２の裏面または側面に磁石１１を配置する。これにより、磁性粒子１が領域ｂから内部領域ａの方向へと移動することになる。最終的には、内部領域ａの被検物質７と磁性粒子１の抗体８とが結合するので、内部領域ａに複合体９が形成される。従って、この複合体９に起因した領域ａの状態変化から被検物質７の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質７の量も求めることができる。この実施形態でも、複合体９の形成を磁場の影響下で行っているために、比較的短い時間で複合体９を形成することが可能であり、比較的短い時間で被検物質７を検出することができる。なお、この実施形態でも、第４実施形態と同様に、磁場を印加しない場合であっても磁性粒子１は毛管現象に起因して部材１２内部を移動することができるが、磁場の影響下に置かれることによって、かかる移動が促進されていることに留意されたい。
【００７１】
（第６実施形態）
第６実施形態は、工程（ｉ）で用意される部材の一部の領域ａに物質ｂが固定化されている形態であり、工程（ｉｉ）において、領域ａ以外の部材の領域ｂに試料および磁性粒子を供給し、領域ｂの近傍から領域ａの近傍へと磁石を移動させる形態である。図５Ａに、第６実施形態に係る複合体の形成過程を示す。なお、第１実施形態〜第５実施形態と同様、試料中に含まれる被検物質が抗原であって、物質ａおよび物質ｂが、かかる抗原と特異的に結合できる抗体である場合を例にとって説明する。また、部材の領域ａおよび領域ｂを部材の表面ａおよび表面ｂとして説明する。
【００７２】
まず、図５Ａ（ａ）に示すように、部材１０の一部の表面ａに抗体５を固定化する。次いで、図５Ａ（ｂ）に示すように、表面ａ以外の部材の表面ｂに、被検物質７を含んだ試料を供給すると共に、磁性粒子１を供給する。次いで、図５Ａ（ｃ）に示すように、表面ｂの近傍から表面ａの近傍へと矢印Ａの方向に磁石１１を移動させる。これによって、磁性粒子７が表面ｂから表面ａの方向に向かって移動することになる。この際、磁性粒子１の抗体８と被検物質７との抗原抗体反応により磁性粒子１と被検物質７とが相互に結合する。最終的には、図５Ａ（ｄ）に示すように、部材１０の抗体５が固定化されている表面ａに複合体９が形成されることになる。従って、この複合体９に起因した表面ａの状態変化から被検物質７の有無を判断できると共に、かかる変化量から被検物質７の量も求めることができる。この実施形態でも、複合体９の形成を磁場の影響下で行っているために、磁性粒子１の移動が促進されており、比較的短い時間で複合体９を形成することが可能である。従って、結果的に比較的短い時間で被検物質７を検出することができる。なお、第２実施形態または第３実施形態と同様に、磁性粒子１が移動する部材１０の領域に溝部を設けて、磁性粒子１が移動し易くなるようにしてもよい。
【００７３】
第６実施形態では、試料を表面ｂに供給したが、第２実施形態（即ち、図３Ａに示す形態）と同様に、試料を表面ａに供給して、部材１０の抗体５と予め結合させておく形態であってもよい（この形態を「第７実施形態」と呼ぶ）。この第７実施形態の場合は、図５Ｂに示すように、工程（ｉ）で用意される部材の一部の領域ａ（図示する形態では「表面ａ」）に物質ｂが固定化されている形態であり、工程（ｉｉ）において、試料を領域ａに供給した後、領域ａ以外の部材の領域ｂ（図示する形態では「表面ｂ」）に磁性粒子を供給し、次いで、領域ｂの近傍から領域ａの近傍へと磁石を移動させる形態である。第７実施形態の複合体の具体的な形成過程については、第２実施形態および第６実施形態と重複するので説明を行わない。
【００７４】
第６実施形態および第７実施形態で用いられる部材は、第２実施形態または第３実施形態のようなプレート部材または容器のみならず、第４実施形態または第５実施形態のような多孔質または繊維質から成る部材であってもよい。部材が多孔質または繊維質から成る場合では、部材の内部領域の一部に物質ｂを固定化することになる。更に、第６実施形態および第７実施形態では、移動させる磁石が電磁石であってもよい。電磁石を用いる場合には、領域ｂの近傍に予め電磁石を配置しておき、磁性粒子の供給後に電磁石に電流を流すと共に、領域ａの方向へと電磁石を移動させることになる。
【００７５】
以上、本発明の検出方法に関する種々の形態を説明してきたが、本発明の検出方法はこれに限定されず、種々の改変が為され得ることを当業者は理解されよう。
【００７６】
例えば、複合体の形成に、アビジン−ビオチン反応を利用してもよい。この場合には、次のような態様になる。ちなみに、アビジンとビオチンとは相互に結合しやすい性質を有している。また、アビジンはストレプトアビジン、ニュートラビジンでもかまわない。
【００７７】
（ケース１）
ケース１は図６Ａを参照して説明する。まず、図６Ａ（ａ）に示すように、特異的結合物質２０（即ち「物質ｂ」）を部材２１に固定化する。次に試料を供給して、図６Ａ（ｂ）に示すように、被検物質２２を特異的結合物質２０に結合させる。次いで、図６Ａの（ｃ）および（ｄ）に示すように、アビジン２３で修飾した特異的結合物質２４を被検物質２２に結合させる。次いで、図６Ａ（ｅ）に示すように、ビオチン２５を固定化した貴金属コート磁性粒子２６を、アビジン−ビオチン反応を介して、上記アビジン２３に結合させる。これにより、図６Ａ（ｆ）に示すようなサンドイッチ構造の複合体２７を得ることができる。
【００７８】
（ケース２）
ケース２は図６Ｂを参照して説明する。まず、図６Ｂ（ａ）に示すように、特異的結合物質２０（即ち「物質ｂ」）を部材２１に固定化する。次に試料を供給して、図６Ｂ（ｂ）に示すように、被検物質２２を特異的結合物質２０に結合させる。次いで、図６Ｂの（ｃ）および（ｄ）に示すように、ビオチン２５で修飾した特異的結合物質２４を被検物質２２に結合させる。次いで、図６Ｂ（ｅ）に示すように、アビジン２３を固定化した貴金属コート磁性粒子２６を、アビジン−ビオチン反応を介して、上記ビオチン２５に結合させる。これにより、図６Ｂ（ｆ）に示すようなサンドイッチ構造の複合体２７を得ることができる。
【００７９】
（ケース３）
ケース３は図６Ｃを参照して説明する。まず、図６Ｃ（ａ）に示すように、特異的結合物質２０（即ち「物質ｂ」）を部材２１に固定化する。次に試料を供給して、図６Ｃ（ｂ）に示すように、被検物質２２を特異的結合物質２０に結合させる。次いで、図６Ｃ（ｃ）に示すように、アビジン−ビオチン反応を介して、アビジン２３で修飾した特異的結合物質２４を、ビオチン２５が固定化された貴金属コート磁性粒子２６と予め結合させる。次いで、特異的結合物質２４を特異的結合物質２０上の被検物質２２へと結合させることによって、図６Ｃ（ｄ）に示すようなサンドイッチ構造の複合体２７を得ることができる。
【００８０】
（ケース４）
ケース４は図６Ｄを参照して説明する。まず、図６Ｄ（ａ）に示すように、特異的結合物質２０（即ち「物質ｂ」）を部材２１に固定化する。次に試料を供給して、図６Ｄ（ｂ）に示すように、被検物質２２を特異的結合物質２０に結合させる。次いで、図６Ｄ（ｃ）に示すように、アビジン−ビオチン反応を介して、ビオチン２５で修飾した特異的結合物質２４を、アビジン２３が固定化された貴金属コート磁性粒子２６と予め結合させる。次いで、特異的結合物質２４を特異的結合物質２０上の被検物質２２へと結合させることによって、図６Ｄ（ｄ）に示すようなサンドイッチ構造の複合体２７を得ることができる。
【００８１】
これまでの説明は、部材の物質ｂ−被検出物質−磁性粒子の物質ａから成る複合体を形成するサンドイッチ法に基づいているが、必ずしもこれに限定されない。例えば競合法、イムノブロット法、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等において酵素と発色基質との組合せを用いる代わりに、本発明の工程（ｉ）で用意される磁性粒子を用いると、好適に被検物質の検出を行うことができる。更に、例えばラテックス凝集比濁法、ラテックス近赤外比濁法、粒子凝集法等においても、本発明の工程（ｉ）で用意する磁性粒子を用いると、好適に被検物質の検出を行うことができる。
【００８２】
次に、以下において、本発明の検出方法の工程（ｉ）で用意される磁性粒子の調製方法について更に詳細に説明する。
【００８３】
工程（ｉ）で用いる磁性粒子は、以下の（１）〜（３）の工程を含んで成る方法で調製されることが好ましい：
（１）中央領域が磁性材料から形成され、かつ、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子ｐ、および、被検物質に結合可能な物質ａを用意する工程；
（２）磁性粒子ｐと物質ａとを接触させ、物質ａが固定化された磁性粒子ｐ’（即ち、「工程（ｉ）で用いる磁性粒子」）を含んで成る混合物を得る工程；ならびに
（３）得られた混合物に磁場を印加して、混合物から磁性粒子ｐ’を分離する工程（即ち「磁気分離工程」）。
【００８４】
工程（２）および工程（３）は、緩衝液（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、PBS  衝液、HEPES緩衝液またはMOPS緩衝液）などの溶液中または有機溶媒中で実施することが好ましい。
【００８５】
このような調製方法では、磁場の影響下で磁性粒子ｐ’を混合物から分離するため、比較的短い時間で、工程（ｉ）で用いる磁性粒子を得ることができる。また、磁性粒子ｐ’の分離に際して遠心分離操作やフィルター操作を行っていないため、全工程を自動化し易い利点がある。更に、物質ａが硫黄原子を含んでいると、その硫黄原子と磁性粒子ｐの貴金属材料とが容易に結合するので、比較的容易に物質ａを磁性粒子ｐに固定化できる。
【００８６】
工程（３）では、図７に示すように、磁場の印加によって、工程（２）で得られた混合物を磁性粒子ｐ’がより多い相Ａと磁性粒子ｐ’がより少ない相Ｂとに分けた後、相Ｂを混合物から取り除くことが好ましい。
【００８７】
また、工程（２）では、「物質ａと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカー」を磁性粒子ｐに結合させた後、そのリンカーに対して物質ａを結合させることによって、磁性粒子ｐ’を得てもよい。同様に、工程（２）では、「物質ａと結合可能な官能基および硫黄原子を含んで成るリンカー」を物質ａに予め結合させた後、そのリンカーを磁性粒子ｐに結合させることによって、磁性粒子ｐ’を得てもよい。なお、リンカーに硫黄原子が含まれる理由は、硫黄原子が磁性粒子ｐに含まれる貴金属と結合し易い性質があるからであり、その性質を利用して、リンカーを磁性粒子へと容易に結合させるためである。「物質ａと結合可能な官能基」としては、チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、二重結合等の官能基または該官能基誘導体などを挙げることができる。
【００８８】
リンカーとしては、例えば「ヘテロ二価性架橋試薬」または「ホモ二価性架橋試薬」を用いることができる。
「ヘテロ二価性架橋試薬」は、例えば、
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基または該官能基誘導体と、
チオール基、チオエーテル基もしくはジスルフィド基等の硫化物官能基、アルデヒド基、エポキシ基、トシル基、アジド基、スクシンイミド基、マレイミド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、カルボキシル基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、酸塩化物または二重結合等の官能基または該官能基誘導体と
の組み合わせから成るヘテロ二価性架橋試薬を挙げることができる。
また、「ホモ二価性架橋試薬」は、例えば、チオール、チオエーテル、ジスルフィド等の硫化物官能基または該官能基誘導体から成るホモ二価性架橋試薬を挙げることができる。
【００８９】
一例として、「ヘテロ二価性架橋試薬」をリンカーとして用いる形態について説明する。まず、緩衝液中または有機溶剤中で物質ａとヘテロ二価性架橋試薬とを加えて、攪拌する。これによって、両者が反応して、物質ａとヘテロ二価性架橋試薬との結合体が得られる。次いで、この結合体を抽出して、磁性粒子ｐと接触させることによって、ヘテロ二価性架橋試薬の介在により物質ａが磁性粒子ｐ’に固定化される。最終的には、磁性粒子ｐ’を磁気分離した後、緩衝液または有機溶剤などで洗浄することが好ましい。
【００９０】
上記の「ヘテロ二価性架橋試薬」および「ホモ二価性架橋試薬」などのリンカーを用いて物質ａを磁性粒子ｐに結合させる際、必要に応じて、磁性粒子ｐへの非特異的反応を抑制することが好ましい。従って、正常血清、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン、脱脂粉乳などを磁性粒子ｐに接触させること等の公知の手法によって、磁性粒子ｐへの非特異的吸着を抑えるブロッキングを行ってもよい。
【００９１】
以上、貴金属コート磁性粒子を用いた被検物質の検出方法、および、その貴金属コート磁性粒子の調製方法について説明してきた。本発明においては、かかる検出方法のみならず、その検出方法に用いることができる被検物質検出キットも提供される。
【００９２】
本発明の被検物質検出キットは、磁性粒子および部材を有して成る。この「磁性粒子」および「部材」とは、それぞれ、上記の本発明の被検物質の工程（ｉ）で用意される「中央領域が磁性材料から形成され、外殻領域が貴金属材料から形成されている磁性粒子であって、被検物質に結合することが可能な物質ａが外殻領域に固定化された磁性粒子」および「被検物質に結合することが可能な物質ｂが固定化されている部材」のことを意味している。従って、被検物質検出キットに含まれる「磁性粒子」および「部材」は、既に上記で詳細に説明してきたので、重複を避けるべく更なる説明は行わない。なお、本発明の検出キットには、磁場の印加に用いる磁石または電磁石を含めてもよい。
【実施例】
【００９３】
本発明の検出方法の効果を確認すべく、以下の実施例１〜３および比較例１〜３を実施した。実施例１〜３は、貴金属コート磁性粒子を用いた例であり、比較例１〜３は、金コロイドを用いた例である。
【００９４】
《実施例１》
（貴金属コート磁性粒子の製造および調製）
実施例１では、本発明の検出方法の工程（ｉ）で用意される磁性粒子を製造・調製した。磁性材料としてＦｅ５０Ｐｔ５０合金（以下では単に「Ｆｅ５０Ｐｔ５０」と呼ぶ）を用い、貴金属材料としてＡｕを用い、また、「被検物質に結合することが可能な物質ａ」として卵白アルブミン抗体を用いた。
【００９５】
貴金属コート磁性粒子の製造では、中央領域の材料としてＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子を使用し、その表面を置換メッキ法によりAu層で被覆した。得られた粒子をアクリル樹脂で包埋し、ミクロトームを用いて超薄切片を作製して電子顕微鏡で観察した。その結果、貴金属コート磁性粒子の直径が５０ｎｍであり、その外周を厚さ２０ｎｍのＡｕが被覆していることが分かった。また、試料振動型磁力計（東英工業製、型式VSM−５）を用いて、得られた粒子の磁気特性を測定した結果、飽和磁化が６０emu/gであり、保磁力が８００エルステッドであることが分かった。
【００９６】
まず、卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。次いで、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子をPBS緩衝液に分散させて、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子分散液を得た。次いで、５ｍｇ／ｍｌのＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子分散液に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加えた後、その１ｍｌに濃度１０ｍｇ／ｍｌのBSAを０．１ｍｌ加えた。そして、図７に示すような磁気分離に付し、上澄み液を除去した。BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBSを用いることによって、磁気分離操作により３回洗浄した。以上の操作によって、卵白アルブミン抗体が固定化されたＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子の分散液を得た。
【００９７】
《比較例１》
（金コロイドの製造および調製）
実施例１の「卵白アルブミン抗体が固定化されたＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子」と比較するために、「卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイド」を製造・調製した。
【００９８】
まず、０．０１重量％の塩化金水溶液２００ｍｌを沸騰させ、濃度１重量％のクエン酸ナトリウム水溶液を加え、溶液の色が薄い黄色から紫色あるいは赤色に変わるまで加熱沸騰させることによって、金コロイド分散液を調製した（金コロイドの平均粒子径：０．０４μｍ）。
【００９９】
卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。次いで、５ｍｇ／ｍｌの金コロイド分散液に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、金コロイド分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加えた後、その１ｍｌに濃度１０ｍｇ／ｍｌのBSAを０．１ｍｌ加えた。次いで、遠心分離に付し、上澄み液を除去した。BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBSを用いることによって、遠心分離操作により３回洗浄した。以上の操作によって、卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイドの分散液を得た。
【０１００】
《実施例２》
（貴金属コート磁性粒子を用いたイムノクロマト法による卵白アルブミンの検出）
図４Ａに示すようなイムノクロマト法で本発明の検出方法を実施した。貴金属コート磁性粒子としては、実施例１で得られた「ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子の分散液」を用いた。被検物質は卵白アルブミンである。
【０１０１】
まず、卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。次いで、５ｍｇ／ｍｌの「ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子の分散液」に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加えた後、その１ｍｌに濃度１０ｍｇ／ｍｌのBSAを０．１ｍｌ加えた。次いで、磁気分離に付し、上澄み液を除去した。BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBSを用いて磁気分離操作により３回洗浄した後、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子を上記PBS１ｍｌに再分散させた。次いで、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子を不織布に含浸させて凍結乾燥に付すことによって、「ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子標識抗体含有不織布」を調製した。
【０１０２】
市販のニトロセルロース（ミリポア製）より１０ｍｍ×５０ｍｍのクロマトグラフ・ストリップを裁断し、その端部ａから２ｃｍの位置にて展開方向と垂直方向に２μｌの卵白アルブミン抗体の溶液を１０ｍｍ長さで塗布した。
【０１０３】
１０ｍｍ×８０ｍｍの粘着樹脂上にクロマトグラフ・ストリップの短辺の端部を揃えて重ね、更にその上に１０ｍｍ×６０ｍｍの濾紙を重ね、固定した。クロマトグラフ・ストリップの端部ａとは別の端部ｂの近傍領域に「ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子標識抗体含有不織布」を配置した。更に、その「ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子標識抗体含有不織布」に重なるように１０ｍｍ×２０ｍｍの不織布をサンプルパッドとして配置した。
【０１０４】
市販の卵白アルブミン（CALBIOCHEM製）を、BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBS緩衝液で希釈して２０ｎｇ／ｍｌの卵白アルブミン試料を調製した。
【０１０５】
その卵白アルブミン試料の２００μｌをサンプルパッドに滴下し、展開させた。１０分経過後、「卵白アルブミン抗体の溶液を塗布したクロマトグラフ・ストリップ領域」を観察した。その結果、卵白アルブミンの存在を示すライン（即ち「色の変化」）を確認することができた。
【０１０６】
次に、同様のイムノクロマト法を、図４Ａに示すような位置に磁石を配置する態様で実施した。つまり、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子を磁場の影響下おいた状態でイムノクロマト法を行った。この場合でも、「卵白アルブミン抗体の溶液を塗布したクロマトグラフ・ストリップ領域」において、卵白アルブミンの存在を示すラインを確認することができた。
【０１０７】
《比較例２》
（金コロイドを用いたイムノクロマト法による卵白アルブミンの検出）
貴金属コート磁性粒子ではなく金コロイドを用いることによって、図４Ａに示すようなイムノクロマト法を実施した。金コロイドとしては、比較例１で得られた金コロイドの分散液を用いた。被検物質は、実施例２と同様、卵白アルブミンである。
【０１０８】
まず、卵白アルブミン抗体をPBSに溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌの卵白アルブミン抗体の溶液を調製した。次いで、５ｍｇ／ｍｌの金コロイドの分散液に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入した卵白アルブミン抗体の溶液を、金コロイド分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加えた後、その１ｍｌに濃度１０ｍｇ／ｍｌのBSAを０．１ｍｌ加えた。次いで、遠心分離に付し、上澄み液を除去した。BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBSを用いて遠心分離操作により３回洗浄した後、金コロイドを上記PBS１ｍｌに再分散させた。次いで、金コロイドを不職布に含浸させて凍結乾燥に付すことによって、「金コロイド標識抗体含有不織布」を調製した。
【０１０９】
市販ニトロセルロース（ミリポア製）より１０ｍｍ×５０ｍｍのクロマトグラフ・ストリップを裁断し、その端部ａから２ｃｍの位置にて展開方向と垂直に２μｌの卵白アルブミン抗体の溶液を１０ｍｍの長さで塗布した。
【０１１０】
１０ｍｍ×８０ｍｍの粘着樹脂上にクロマトグラフ・ストリップの短辺の端部を揃えて重ね、更にその上に１０ｍｍ×６０ｍｍの濾紙を重ね、固定した。クロマトグラフ・ストリップの端部ａとは別の端部ｂの近傍領域に「金コロイド標識抗体含有不織布」を配置した。更に、その「金コロイド標識抗体含有不織布」に重なるように１０ｍｍ×２０ｍｍの不織布をサンプルパッドとして配置した。
【０１１１】
市販の卵白アルブミン（CALBIOCHEM製）を、BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBS緩衝液で希釈して２０ｎｇ／ｍｌの卵白アルブミン試料を調製した。
【０１１２】
その卵白アルブミン試料の２００μｌをサンプルパッドに滴下し、展開させた。１０分経過後、「卵白アルブミン抗体の溶液を塗布したクロマトグラフ・ストリップ領域」を観察した。その結果、卵白アルブミンの存在を示すライン（即ち「色の変化」）を確認することができた。
【０１１３】
《実施例３》
（貴金属コート磁性粒子を磁気誘導させたサンドイッチイムノアッセイ法によるC反応性たんぱく質（CRP）の検出）
図３Ａに示すような磁気誘導を用いたサンドイッチイムノアッセイ法で本発明の検出方法を実施した。貴金属コート磁性粒子としては、実施例１で得られた「ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子の分散液」を用いた。被検物質はたんぱく質（ＣＲＰ）である。
【０１１４】
まず、CRP抗体をPBSに溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌのCRP抗体の溶液を調製した。５ｍｇ／ｍｌの「ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子の分散液」に対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入したCRP抗体の溶液を、ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加えた後、その１ｍｌに濃度１０ｍｇ／ｍｌのBSAを０．１ｍｌ加えた。次いで、磁気分離に付し、上澄み液を除去した。BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBSを用いて、磁気分離操作により３回洗浄した。以上の操作によって、CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子の分散液を得た。
【０１１５】
市販のスライドガラス（松浪ガラス製）をシランカップリング処理し、スライドガラス表面をアミノ化した。次いで、グルタルアルデヒドをスライドガラス表面に加え、反応させた後、洗浄した。次いで、CRP抗体をＰＢＳ緩衝液に溶かした溶液をスライドガラス表面の一部分に塗布した後、一晩静置し、PBSで洗浄した。このような操作によって、表面の一部にCRP抗体が固定化されたプレート基板を得た。なお、CRP抗体が固定化されているプレート領域を「CRP抗体固定化部位」と呼び、CRP抗体が固定化されていないプレート領域を「CRP抗体非固定化部位」と呼ぶ。
【０１１６】
市販のCRP（CHEMICON製）を、BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBS緩衝液で希釈して２００ｎｇ／ｍｌのCRP試料を調製した。
【０１１７】
そのCRP試料の２００μｌをプレート基板上に滴下、静置し、洗浄を行った後、更に、「CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子の分散液」を、CRP抗体非固定化部位に滴下した。次いで、「CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子」がCRP抗体固定化部位を通過するように、供給された貴金属コート磁性粒子と磁石とがCRP抗体固定化部位を挟み込むようにプレート基板の側面に磁石を配置した。これにより、「CRP抗体が固定化された貴金属コート磁性粒子」を磁場の影響下に置いて磁気誘導に付した。その後、CRP抗体固定化部位を観察した。その結果、ＣＲＰの存在を示す色の変化を確認することができた。
【０１１８】
《比較例３》
（金コロイドを用いたサンドイッチイムノアッセイによるC反応性たんぱく質（CRP）の検出）
貴金属コート磁性粒子ではなく金コロイドを用いることによってサンドイッチイムノアッセイ法を実施した。金コロイドは、比較例１と同様に調製した。被検物質は、実施例３と同様にたんぱく質（ＣＲＰ）である。
【０１１９】
まず、比較例１で説明した方法で金コロイド分散液を調製した（金コロイドの平均粒子径：０．０４μｍ）。
【０１２０】
次いで、CRP抗体をPBSに溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌのCRP抗体の溶液を調製した。次いで、５ｍｇ／ｍｌの金コロイドに対して、S-アセチル酢酸活性エステルによりチオール基を導入したＣＲＰ抗体の溶液を、金コロイド分散液１ｍｌ当り１０μｇとなる割合で加えた後、その１ｍｌに濃度１０ｍｇ／ｍｌのBSAを０．１ｍｌ加えた。次いで、遠心分離に付し、上澄み液を除去した。BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBSを用いることによって、遠心分離操作により３回洗浄した。以上の操作によって、「ＣＲＰ抗体が固定化された金コロイドの分散液」を得た。
【０１２１】
市販のスライドガラス（松浪ガラス製）をシランカップリング処理し、スライドガラス表面をアミノ化した。次いで、グルタルアルデヒドをスライドガラス表面に加え、反応させた後、洗浄した。次いで、CRP抗体をＰＢＳ緩衝液に溶かした溶液をスライドガラス表面の一部分に塗布した後、一晩静置し、更にPBSで洗浄した。このような操作によって、表面の一部にＣＲＰ抗体が固定化されたプレート基板を得た。なお、実施例３と同様、CRP抗体が固定化されているプレート領域を「CRP抗体固定化部位」と呼び、CRP抗体が固定化されていないプレート領域を「CRP抗体非固定化部位」と呼ぶ。
【０１２２】
市販のCRP（CHEMICON製）を、BSAを１ｍｇ／ｍｌで含有するPBS緩衝液で希釈して２００ｎｇ／ｍｌのCRP試料を調製した。
【０１２３】
そのＣＲＰ試料の２００μｌをプレート基板上に滴下、静置し、洗浄を行った後、更に、「CRP抗体が固定化された金コロイドの分散液」を、基板上のCRP抗体非固定化部位に滴下した。次いで、「CRP抗体が固定化された金コロイド」がCRP抗体固定化部位へと流れるようにプレート基板を傾けた。その後、CRP抗体固定化部位を観察した。その結果、ＣＲＰの存在を示す色の変化を確認することができた。
【０１２４】
（まとめ）
（１）ＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子を調製した実施例１の場合と、金コロイドを調製した比較例１の場合とで洗浄時間を比較した。結果を表１に示す。実施例１は磁気分離操作で精製した例であり、比較例は遠心分離操作で精製した例である。
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
表１から分かるように、「卵白アルブミン抗体が固定化されたＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子」の調製時間は、「卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイド」の調製時間よりも短くなっており、本発明の方法で用いる磁性粒子は比較的短時間で調製できることが分かった。
【０１２７】
（２）「卵白アルブミン抗体が固定化されたＡｕコートＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子」を用いて磁気輸送に付した実施例２の場合と、「卵白アルブミン抗体が固定化された金コロイド」を用い、磁気輸送を行わなかった比較例２の場合とで、被検物質の検出時間を比較した。結果を表２に示す。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
表２から分かるように、実施例２の検出時間は比較例２の検出時間よりも短く、本発明の検出方法が短時間で被検物質を検出できる方法であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明の被検物質の検出方法は、臨床検査分野等の生命科学分野、ならびに、食物アレルゲンやBSE検査等の食品安全性分野において有用であるだけでなく、土壌、水質汚染検査等の環境測定分野等においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の検出方法のフローチャートを示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の検出方法に用いる磁性粒子、部材および試料を模式的に表した断面図である。
【図２】図２は、第１実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、第２実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、第３実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。
【図４Ａ】図４Ａは、第４実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、第５実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。
【図５Ａ】図５Ａは、第６実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、第７実施形態に係る本発明の検出方法を模式的に示した断面図である。
【図６Ａ】図６Ａは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である（ケース１）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である（ケース２）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である（ケース３）。
【図６Ｄ】図６Ｄは、複合体の形成にアビジン−ビオチン反応を利用する態様を模式的に示した断面図である（ケース４）。
【図７】図７は、磁性粒子の調製時の洗浄操作を模式的に示した断面図である。
【符号の説明】
【０１３２】
１…物質ａが固定化された貴金属コート磁性粒子、２…中央領域、３…外殻領域、４…物質ａ、５…部材に固定化された抗体、６…部材、７…被検物質、７’…試料、８…貴金属コート磁性粒子に固定化された抗体、９…複合体、１０…部材（プレート部材または容器）、１１…磁石または電磁石、１２…部材（多孔質または繊維質から成る部材）、１３…磁性粒子含浸部材、１４…サンプルパッド、２０…特異的結合物質（物質ｂ）、２１…部材、２２…被検物質、２３…アビジン、２４…アビジンまたはビオチンで修飾した特異的結合物質、２５…ビオチン、２６…貴金属コート磁性粒子、２７…複合体、３０…磁性粒子ｐ’、３１…磁性粒子ｐに固定化されなかった物質ａ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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