(57)【要約】      （修正有）【課題】  シクラメンの花色合成に係わる酵素としてのカルコノナリンゲニン  グルコシル  トランスフェラーゼをコードするDNAを提供する。【解決手段】  シクラメン花弁より調製したmRNAから3'RACE法及び5'RACE法を用いて、それぞれグルコシル基転移酵素の5'側上流域部位及び3'側下流域部位をコードする２つのcDNA部分断片を増幅する。得られた２つのDNA部分断片の塩基解析を行い、得られた知見を参考にして、シクラメンのmRNAから逆転写PCRにより、特定の配列を有する２種類のアミノ酸配列をコードするDNAを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、シクラメンのカルコノナリンゲニン  グルコシル  トランスフェラーゼであるタンパク質をコードするDNA。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の5'側の73番目のａから1515番目のｔの領域までの1443bpのサイズの塩基配列を、少なくとも含むDNAである、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の1605bpのサイズのDNAである、請求項２に記載のDNA。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列の5'側の72番目のａから1586番目のｔまでの領域の1515 bpのサイズのDNAである、請求項２に記載のDNA。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルコノナリンゲニン  グルコシル  トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする改変DNA。
【請求項６】
配列表の配列番号１の塩基配列の5'側の73番目のａから1515番目のｔまでの領域の1443bpのサイズの塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有して且つ配列番号１に記載の前記1443bpサイズの塩基配列に対して相同性を示すDNAであって、しかも配列表の配列番号１に記載の前記1443bpサイズの塩基配列を有するDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、カルコノナリンゲニン  グルコシル  トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、請求項４に記載の改変DNA。
【請求項７】
配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、カルコノナリンゲニン  グルコシル  トランスフェラーゼであるタンパク質。
【請求項８】
配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルコノナリンゲニン  グルコシル  トランスフェラーゼ活性を有する改変タンパク質。
【請求項９】
配列表の配列番号9に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、シクラメンのカルコノナリンゲニン グルコシル トランスフェラーゼタンパク質をコードするDNA。
【請求項１０】
配列表の配列番号8に記載の塩基配列の5'側の18番目のaから1463番目のｇの領域までの1446bpのサイズの塩基配列を少なくとも含むDNAである、請求項９に記載のDNA。
【請求項１１】
配列表の配列番号8に記載の1554bpのサイズのDNAである請求項９に記載のDNA。
【請求項１２】
配列表の配列番号8に記載の塩基配列の5'側の2番目のaから1500番目のgまでの領域の1499bpのサイズのDNAである、請求項９に記載のDNA。
【請求項１３】
配列表の配列番号9に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルコノナリンゲニン グルコシル トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする改変DNA。
【請求項１４】
配列表の配列番号8の塩基配列5'側の18番目のaから1463番目のｇまでの領域の1446bpサイズの塩基配列と部分的に異なる塩基配列を有して且つ、配列番号8に記載の前記1446bpサイズの塩基配列に対して相同性を示すDNAであって、しかも配列表の配列番号8に記載の前記1446bpサイズの塩基配列を有するDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、カルコノナリンゲニン グルコシル トランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、請求項13に記載の改変DNA。
【請求項１５】
配列表の配列番号9に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、カルコノナリンゲニン グルコシル トランスフェラーゼであるタンパク質。
【請求項１６】
配列表の配列番号９に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、カルコノナリンゲニン グルコシル トランスフェラーゼ活性を有する改変タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクラメンの花色合成酵素の一つであるタンパク質をコードする新規なDNA（複数のDNA）に関する。より詳しくは、本発明は、シクラメンの花色素カルコノナリンゲニンの水酸基にグルコシル基を転移する活性すなわち該水酸基をグルコシル化する活性を有する酵素タンパク質をコードする新規なDNA（複数のDNA）及びその利用に関するものであり、またそれらDNAでコードされるタンパク質（複数のタンパク質）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に植物において最も広く分布しているフラボノイド色素は黄色から、赤、紫、青色まで多種多様の花色が存在することが知られている。フラボノイド類の合成経路はよく研究されており、カルコン類のカルコノナリンゲニンはカルコンシンターゼによってクマロイルCoAとマロニルCoAを縮合して合成される色素であって、フラボノイド合成経路において最初に合成される色素である。さらにカルコノナリンゲニンはカルコンイソメラーゼにより異性化され、ナリンゲニンとなることが知られている。
【０００３】
また、一般に、黄色花カーネーションや黄色花シクラメンの花弁中の主要な黄色色素はカルコノナリンゲニンの２’位の水酸基にグルコシル基が結着したカルコノナリンゲニン2'−グルコシドであることが知られている。カルコノナリンゲニン2'−グルコシドは、前記のフラボノイド合成経路においてカルコノナリンゲニンがカルコノナリンゲニン  グルコシル  トランスフェラーゼ（以下「CGT」と略すこともある）によってカルコノナリンゲニンの２’位の水酸基にグルコシル基が転移、結合して合成されることが知られている。
【０００４】
近年の遺伝子工学技術を利用した花色の改良研究においては、これらの花色素成分を配糖化すなわちグリコシル化する酵素の遺伝子を利用して花色を操作できる可能性が期待されている。
【０００５】
これまで、花卉植物のCGTをコードする遺伝子の単離については次のものが知られている。
【０００６】
(1)  黄色カーネーションからのCGT遺伝子の単離（非特許文献１参照）
しかしながら，シクラメン植物のCGTをコードする遺伝子については知られていない。
【非特許文献１】「園芸学雑誌」第72巻、別冊１，pp.358−359 (2003年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、シクラメンのCGTをコードする新規なDNAを提供し、またCGT活性をもつタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。そして後述される遺伝子工学の手法によって、シクラメン花弁から調製したmRNAより、CGT酵素をコードする遺伝子DNAの5'側上流域部位と3'側下流域部位とのそれぞれのcDNA部分断片を増幅し、増幅されたそれら２つのcDNA部分断片の塩基解析を行い、その解析の結果を総合的に研究し、それによって、CGTのアミノ酸配列をコードするORFを含むところの配列表の配列番号１に記載される1605bpのサイズのDNAを知見することに成功した。この知見を利用することによって、シクラメンのcDNAライブラリーから、後記の実施例１、(７)(iii)に示すように、CGT酵素のアミノ酸配列をコードするORFを含むところの、配列番号１の5'側72番目のａから1586番目のｔまでの領域の塩基配列よりなる1515 bpサイズのDNA断片を、取得することに成功した。
【０００９】
さらに、配列番号１の1605bpのサイズのDNAの5'側の塩基番号73のaから塩基番号1515のｔまでの領域の塩基配列を有する1443 bpのサイズのDNA配列は、シクラメンCGTをコードする遺伝子のORF領域のDNA配列であることを知見した。また、配列番号１のDNAの5'側の塩基番号73のａから塩基番号1515のｔまでの領域の塩基配列を有する前記1443bpのサイズのORF領域は、配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列をコードするものと推定した。その結果、第１の本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、第1の本発明（請求項１）においては、配列表の配列番号2に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、CGTであるタンパク質をコードするDNAが提供される。
【００１１】
第1の本発明のDNAは、配列表の配列番号1の塩基配列の5'側の73番目のａから1515番目のｔまでの領域の1443bpのサイズの塩基配列を少なくとも含むDNAであることができる。もしくは配列表の配列番号１に記載の1605bpのサイズのDNAであることができる。
【００１２】
第１の本発明のDNAの一つの具体的な例は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の5'側の72番目のａから1586番目のｔまでの領域の1515 bpのサイズのDNA断片である。
【００１３】
第２の本発明（請求項５）では、配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、CGT活性を有するタンパク質をコードする改変DNAが提供される。
【００１４】
第２の本発明による改変DNAは、配列表の配列番号１の塩基番号73〜1515の領域の塩基からなる1443bpサイズの塩基配列とは部分的に異なる塩基配列を有して且つ配列番号１に記載の前記1443bpサイズの塩基配列に対して相同性を示すDNAであって、しかも配列表の配列番号１に記載の前記1443bpサイズの塩基配列を有するDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、CGT活性を有するタンパク質をコードするDNAであることができる。
【００１５】
第３の本発明（請求項７）では、配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、CGTであるタンパク質が提供される。
【００１６】
第４の本発明（請求項８）では、配列表の配列番号２に示す481個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、CGT活性を有する改変タンパク質が提供される。
【００１７】
さらに本発明者らは、研究を重ねた。第１の本発明で用いたプライマーと異なる塩基配列のプライマーを用い且つ遺伝子工学的技法に多少の改良、工夫を加えることによって、CGTのアミノ酸配列をコードするORFを含むところの配列表の配列番号8に記載される1554bpのサイズのDNAを知見することに成功した。この知見を利用することによって、シクラメンのcDNAライブラリーから、後記の実施例２、（7）(iii)に示すようにCGT酵素のアミノ酸配列をコードするORFを含むところの、配列番号８の5'側の2番目のaから1500番目のｇの領域までの塩基配列よりなる1499bpのサイズのDNA断片を、配列番号１のDNAとは別に、取得することに成功した
さらに、配列番号８の1554bpのサイズのDNAの５’側の塩基番号18のaから塩基番号1463のｇまでの領域の塩基配列を有する１４４6bpのサイズのDNA配列は、シクラメンCGTをコードするDNA配列であることを知見した。また、配列番号8のDNAの5'側の塩基番号18のaから塩基番号1463のｇまでの領域の塩基配列を有する前記1446bpのサイズのORF領域は、配列表の配列番号9に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列をコードするものと推定した。また、配列番号９のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列とはアミノ酸配列の構造の点で明らかに違うことを認めた。
【００１８】
その結果、後記に示す第５の本発明を完成するに至った。
【００１９】
なお、本発明においては、「CGT活性」とは、カルコノナリンゲニンの水酸基にグルコシル基を転移させる反応すなわち該水酸基をグリコシル化する反応を触媒する活性を意味する。
【００２０】
第５の本発明（請求項９）においては、配列表の配列番号9に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、CGTであるタンパク質をコードするDNAが提供される。
【００２１】
第５の本発明のDNAは、配列表の配列番号8に記載の塩基配列5'側の18番目のaから1463番目のｇまでの領域の1446bpのサイズの塩基配列を少なくとも含むDNAであることができる。もしくは配列表の配列番号8に記載の1554bpのサイズのDNAであることができる。
【００２２】
第５の本発明のDNAの一つの具体的な例は、配列表の配列番号8に記載の塩基配列の5'側の2番目のaから1500番目のgまでの領域の1499bpのサイズのDNA断片である。
【００２３】
第６の本発明（請求項13）では、配列表の配列番号９に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、CGT活性を有するタンパク質をコードする改変DNAが提供される。
【００２４】
第６の本発明による改変DNAは、配列表の配列番号8の塩基番号18〜1463の領域の塩基からなる1446bpのサイズの塩基配列とは部分的に異なる塩基配列を有して且つ配列番号8に記載の前記1446bpサイズの塩基配列に対して相同性を示すDNAであって、しかも配列表の配列番号8に記載の前記1446bpサイズの塩基配列を有するDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、CGT活性を有するタンパク質をコードするDNAであることができる。
【００２５】
第７の本発明（請求項15）では、配列表の配列番号9に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、CGTであるタンパク質が提供される。
【００２６】
第８の本発明（請求項16）では、配列表の配列番号9に示す482個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、CGT活性を有する改変タンパク質が提供される。
【００２７】
シクラメンまたは他の花卉植物に、本発明によるCGTをコードするDNAを導入し、植物中で発現させることにより、カルコノナリンゲニンをグリコシル化させることができ、これによりシクラメン黄色品種の開発と育成を行うことが可能であり、これらを含めて花色改良の手法が提供される。
【００２８】
以下にシクラメン植物体から第１の本発明（請求項１）によるDNAを取得する方法を詳細に説明する。
【００２９】
第１の本発明のDNAは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、CGTであるタンパク質をコードするDNAである。
【００３０】
配列番号２のアミノ酸配列をコードする本発明のDNAの一例は、配列番号１に示す1605bpのサイズのDNAである。この第１の本発明による配列番号１の1605bpサイズのDNAは、本発明を完成するに際しては、後述されるようにして、後記の実施例１、（１）〜（６）の過程で知見されたものである。また、配列番号１の5'側72番目のａから1586番目のｔまでの領域の1515 bpのサイズのDNA断片は、後記の実施例１、（７）の過程において、シクラメンcDNAライブラリーから取得されたものである。
【００３１】
第１の本発明のDNAは、これの塩基配列が配列番号１で明らかにされたので、配列番号２に示すアミノ酸配列に基づいて、又は配列番号１に示す塩基配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。あるいは、前記の配列番号１の塩基配列に基づいて工夫、作成した合成オリゴヌクレオチドよりなるプローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いると、公知の遺伝子工学的手法でシクラメンのcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）より取得することも可能である。
【００３２】
以下に、シクラメン花弁の全RNAから調製されたmRNAを利用しながら、RT(逆転写)−PCRを応用した3'RACE (Rapid amplification of cDNA ends)法および5'RACE法により、CGT酵素をコードする遺伝子DNAの5'側上流域部位と3'側下流域部位とのそれぞれのcDNA部分断片を増幅し、増幅されたそれら２つのcDNA部分断片の塩基解析を行い、その解析の結果による知見に基づいて、CGTのアミノ酸配列をコードするORFを含むところの第１の本発明のDNAをシクラメンcDNAライブラリーから取得する方法を例示的に説明する。
【００３３】
なお、3'RACE法と5'RACE法は、例えば「Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America」、1988年、第85巻、pp.8998−9002；「Science」、1989年、第243巻、pp.217−220または「植物のPCR実験プロトコール」、第１刷、秀潤社、1995年、pp.98−101に解説されてある。
【００３４】
(1)  黄色シクラメンの全RNAの調製
黄色シクラメン（品種：ゴールデンボーイ）（Cyclamen persicum）の花弁から、定法により全RNAを抽出した。その後、その全RNAの抽出物からタンパク質、多糖類、その他の夾雑物を取り除いた。さらに夾雑物を含まない全RNAを、オリゴdTセルロースを充填したカラムを用いて処理するとPoly(A)+ RNAを精製することができ、これによって、mRNAを得ることができる。
【００３５】
(2)  3’RACE (Rapid amplification of cDNA ends)法によるグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3’側下流域部位のクローニング
次に、上記のmRNAから、任意の特異配列を5'側にもつオリゴdTプライマーを用いて逆転写酵素によりcDNAを合成する。さらに、公知のグルコシル トランスフェラーゼの塩基配列に基づき工夫、合成したオリゴヌクレオチドプライマーと、前記で合成したcDNAの3'側に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーとを組み合わせて用い且つ前記で合成したcDNAを鋳型として用いて、3’RACE（Rapid amplification of cDNA ends）法により、上記の全RNAからグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3’側下流域部位を増幅する。これら一連の操作は3’RACEキットが市販されているので、このキットを使用してもよい。ここで増幅したcDNA3'側下流部位として得られた複数種類のcDNA部分断片を単離してプラスミドベクター、例えばTAベクターなどに組み込み、得られた組換えプラスミドを大腸菌のコンピーテントセルに導入して、大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体大腸菌を培養して、前記組換えプラスミドに挿入された該cDNA3'側下流部位をクローニングする。
【００３６】
(3)  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3'側下流域部位のシークエンシングによる塩基配列の決定
形質転換体大腸菌中で上記のようにクローニングしたところの、該cDNA3'側下流域部位を保持する組換えプラスミドDNAを、大腸菌から抽出する。組換えプラスミドDNA中の挿入DNA断片が切り取れるように組換えプラスミドを制限酵素で処理する。その消化液をアガロースゲルで電気泳動にかけ、それぞれ分離されて得られた複数種類のDNA断片のサイズを調査する。その結果をもとに、いくつかのクローニングされた組換えプラスミドDNA内に内在する挿入DNA断片のDNAの塩基配列をジデオキシ法で決定する。その決定された塩基配列と公知のグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子との相同性を比較、検討することにより、グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3'側下流域部位を保持すると思われるところの挿入DNA断片を判別して、取得できる。
【００３７】
(4)  5'RACE (Rapid amplification of cDNA ends)法によるグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位のクローニング
上記のようにして得たシクラメン  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子の3'側下流域部位の塩基配列に基づき工夫、合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、上記の(1)のmRNAから、逆転写酵素によりグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位としてのcDNA部分断片を合成する。更には、ここで5'側上流域部位として合成されたcDNA部分断片を鋳型として用いて、5'RACE (Rapid amplification of cDNA ends) 法により、グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位の増幅を行う。これら一連の操作は5'RACEキットが市販されているので、このキットを使用してもよい。ここで増幅されたcDNAの5'側上流域部位を単離して、プラスミドベクター、例えばTAベクターなどに連結して組み込み、得られた組換えプラスミドを大腸菌のコンピーテントセルに導入して形質転換し、得られた形質転換体大腸菌を培養して、前記組換えプラスミドに挿入されてある該cDNAの5'側上流域部位をクローニングする。
【００３８】
(5)  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位のシークエンシングによる塩基配列の決定
形質転換体大腸菌で上記の(4)のようにクローニングしたところの、該cDNA5'側上流域部位としてのcDNA部分断片を含むプラスミドDNAを、大腸菌から抽出する。組換えプラスミドDNA中の挿入DNA断片が切り取れるように組換えプラスミドを制限酵素で処理する。その消化液をアガロースゲルで電気泳動にかけ、それぞれ分離されて得られた各DNA断片のサイズを調査する。その結果をもとに、前記の組換えプラスミドDNA内に含有されていて且つグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位を保持すると思われるところの挿入DNA断片を選抜して取得でき、そしてそれの塩基配列をジデオキシ法で決定することができる。
【００３９】
(6)  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの塩基配列の解析
上記のようにして得られたグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位および3'側下流域部位での２つの塩基配列の共通する相同部分を調べることにより、グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子である全体一つとしての遺伝子cDNAのもつ塩基配列の具体的構造を知見することができる。その知見された全体一つとしての遺伝子cDNAの塩基配列中にある翻訳開始コドンと終止コドンの位置を調べることによって、タンパク質のコード領域（すなわちオープンリーディングフレームORF）を決定することができる。ついで、これから規定されるアミノ酸配列を調べることにより、シクラメンのグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子である全体一つとしてのcDNAがコードするアミノ酸配列を推定することができる。
【００４０】
(7)  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子のORF全長を含むcDNA断片の作製と取得、およびその遺伝子の同定
次に、配列番号５と配列番号７に示す２つの適当なプライマーを設計して用い、しかも上記(1)で取得したシクラメン全RNAをテンプレートに用いてRT−PCRを行うことにより、前記オープンリーディングフレーム全長を含む全体一つとしてのcDNA断片を増幅できる。その増幅されたcDNA断片を単離し、それをプラスミドベクター、例えばマーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を保持するTAベクターなどに連結して組み込み、得た組換えプラスミドを大腸菌のコンピーテントセルに導入して、形質転換体大腸菌を培養すると、これにより目的のORF全長を含むcDNAをクローニングすることができる。形質転換体大腸菌から抽出された前記の組換えプラスミドDNAに連結、保持された目的のcDNA断片の塩基配列を調べ、先に決定した配列番号１の塩基配列と比較し、PCRの転写ミスによる塩基配列の置換がないことを確認する。その後、そのクローニングされた遺伝子cDNAを、大腸菌などの遺伝子発現系を用いて発現させ、生成したタンパク質の酵素活性を測定することや、またはこの遺伝子cDNAを組込んだバイナリベクターを作成し、アグロバクテリウム法を用いて、フラボノイド合成経路をもつ植物に形質転換し、組換え体の花弁に蓄積するカルコノナリンゲニンの修飾基を調査することなどの手段によって、前記のクローニングで得られたcDNA断片は、目的とするところの、シクラメンCGTをコードする遺伝子DNA配列を内有するcDNA断片であるかを確認することができる。
【００４１】
なお、他方、一般に、特定の機能や生理活性を有するタンパクをコードするアミノ酸配列において、１個または複数のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質の場合であっても、その機能や生理活性が維持される場合であることは当業者において広く認識されているところである。本発明のDNAは、このような修飾が加えられたタンパク質で、かつCGT活性を有するタンパク質をコードするDNA配列を有するものであってもよい。
【００４２】
すなわち、第２の本発明（請求項５）のDNAは、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつCGT活性を有するタンパク質をコードする改変DNAである。そのような第２の本発明の改変DNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるように第１の本発明のDNAの塩基配列を改変することによって作製できる。
【００４３】
また、第1の本発明のDNAまたはこれを含有する細胞に対して変異処理を行い、その後に、変異されたDNA若しくはこれらを含む細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列の5'側から73番目のaから1515番目のｔまでの領域の塩基配列を有するDNAに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを選択的に分離することによっても、第2の本発明の改変DNAの断片を得ることができる。
【００４４】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このストリンジェントな条件は、これを明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い２つの核酸同士、例えば95%以上の相同性を有する２つのDNA同士がハイブリダイズするが、他方ではそれより相同性の低い２つの核酸同士がハイブリダイズしないという条件が挙げられる。
【００４５】
さらにシクラメン染色体それ自体から、第1の本発明のDNAまたはその一部領域のDNA断片をプローブDNAとして用いると、定法によってCGTをコードするDNA断片を取得することが可能である。しかし、シクラメン染色体から由来して得られたCGTをコードするDNA断片は、イントロンを含むことが予想される。このようなイントロンで分断されているDNA断片も、CGTをコードするDNAである限り、第2の本発明の改変DNAの一例に含まれる。
【００４６】
なお、後記の実施例1、(7)で得られたところのシクラメンのCGT遺伝子を含むcDNA断片は、pT7Blueプラスミドベクターに連結された。これで得られた組換えプラスミドを導入された形質転換体大腸菌はEscherichia  coli  DH5α（CpFGT-1）と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成16年2月2日より、寄託番号FERM P−19652として寄託されている。
【００４７】
このシクラメンCGTをコードする第1または第2の本発明のDNAを、適当な宿主例えば大腸菌で発現させることにより、CGTタンパク質を製造することができる。前記宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母、昆虫培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞等が挙げられる。宿主細胞内で機能するプロモーター等の発現調節配列の下流に発現可能に連結されたところの、CGTをコードする本発明DNAは、これを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させることができる。このような形質転換に際しては、本発明のDNAをプラスミドベクターに連結して組換えプラスミドを構築し、そして、その得られた組換えプラスミドを宿主に導入することによって宿主を形質転換することができる。あるいは、相同組換え等によって本発明DNAを宿主内の染色体DNAに組込むことによって、宿主を形質転換することもできる。得られる形質転換細胞を前記プロモーター発現調節配列が機能する条件で培養する事によってCGTタンパク質が産出される。
【００４８】
第５の本発明（請求項９）のDNAは、配列番号9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であって、CGTであるタンパク質をコードするDNAである。
【００４９】
配列番号9のアミノ酸配列をコードする第５の本発明のDNAの一例は、配列番号8に示す1554bpのサイズのDNAである。この第５の本発明による配列番号8の1554bpサイズのDNAは、第５の本発明を完成するに際しては、後述されるようにして、後記の実施例２、（1）〜（6）の過程で知見されたものである。
【００５０】
また、配列番号8の5’側の2番目のaから1500番目のgまでの領域の1499bpのサイズのDNA断片は、実施例２、（７）の過程においてシクラメンのcDNAライブラリーから取得されたものである。
【００５１】
第５の本発明のDNAは、これの塩基配列が配列番号８で明らかにされたので、配列番号９に示すアミノ酸配列に基づいて、又は配列番号8に示す塩基配列に基づいて化学合成することによっても取得することができる。あるいは、前記の配列番号8の塩基配列に基づいて工夫、作成した合成オリゴヌクレオチドよりなるプローブ又はオリゴヌクレオチドプライマーを用いると、公知の遺伝子工学的手法でシクラメンのcDNAライブラリーからハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）より取得することも可能である。
【００５２】
以下に、シクラメン花弁の全RNAから調製されたmRNAを利用しながら、RT（逆転写）−PCRを応用した3'RACE（Rapid amplification of cDNA ends）法及び5'RACE法により、CGT酵素をコードする遺伝子DNAの5'側上流域部位と3'側下流域部位とのそれぞれのcDNA部分断片を増幅し、増幅されたそれら2つのcDNA部分断片の塩基配列解析を行い、その解析の結果による知見に基づいて、CGTのアミノ酸配列をコードするORFを含むところの第５の本発明のDNAをシクラメンcDNAライブラリーから取得する方法を例示的に説明する。
【００５３】
ここでの方法においては、第１の本発明のDNAをシクラメンcDNAライブラリーから取得した方法で行ったところの前記（１）〜（６）の過程を同様に先づ実施した。けれども、（７）のグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子のORF全長を含むｃDNA断片の作成と取得、およびその遺伝子の同定を行う過程は、下記のとおり改変した。
【００５４】
すなわち、配列番号12と配列番号14に示す２つの適当なプライマーを設計して用い、しかも上記（１）の過程で取得したシクラメン全RNAをテンプレートに用いてRT-PCRを行うことにより、前記オープンリーディングフレーム全長を含む全体一つとしてのｃDNA断片を増幅することができる。その増幅されたcDNA断片を単離し、それをプラスミドベクター、例えばマーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を保持するTAベクターなどに連結して組み込み、得た組換えプラスミドを大腸菌のコンピテントセルに導入して、形質転換体大腸菌を培養すると、これにより目的のORF全長を含むcDNAをクローニングすることができる。形質転換体大腸菌から抽出された前記の組換えプラスミドDNAに連結、保持された目的のｃDNA断片の塩基配列を調べ、先に決定した配列番号8の塩基配列と比較し、PCRの転写ミスによる塩基配列の置換がないことを確認する。その後、そのクローニングされた遺伝子ｃDNAを大腸菌などの遺伝子発現系を用いて発現させ、生成したタンパク質の酵素活性を測定することや、またはこの遺伝子ｃDNAを組込んだバイナリベクターを作成し、アグロバクテリウム法を用いて、フラボノイド合成経路を持つ植物に形質転換し、組換え体の花弁に蓄積するカルコノナリンゲニンの修飾基を調査することなどの手段によって、前記のクローニングで得られたcDNA断片は、目的とするところの、シクラメンCGTをコードする遺伝子DNA配列を内有するcDNA断片であるかを確認する事ができる。
【００５５】
さらに、第６の本発明（請求項13）のDNAは、配列表の配列番号9に示すアミノ酸配列において、1個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されることにより形成されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつCGT活性を有するタンパク質をコードする改変DNAである。そのような第６の本発明の改変DNAは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるように第５の本発明のDNAの塩基配列を改変することによって作製できる。
【００５６】
また、第５の本発明のDNAまたはこれを含有する細胞に対して変異処理を行い、その後に、変異されたDNA若しくはこれらを含む細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列の5'側から18番目のaから1463番目のｇまでの領域の塩基配列を有するDNAに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを選択的に分離することによっても、第６の本発明の改変DNAの断片を得ることができる。
【００５７】
さらにシクラメン染色体それ自体から、第５の本発明のDNAまたはその一部領域のDNA断片をプローブDNAとして用いると、定法によってCGTをコードするDNA断片を取得することが可能である。しかし、シクラメン染色体から由来して得られたCGTをコードするDNA断片は、イントロンを含むことが予想される。このようなイントロンで分断されているDNA断片も、CGTをコードするDNAである限り、第６の本発明の改変DNAの一例に含まれる。
【００５８】
なお、後記の実施例2、（７）で得られたところのシクラメンのCGT遺伝子を含むｃDNA断片はｐBluescriptII(SK-)プラスミドベクターに連結された。これで得られた組換えプラスミドを導入された形質転換の大腸菌はEscherichia  coli  DH5α/CpFGT-2と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１7年4月15日より、寄託番号ＦＥＲＭ P−20506として寄託されている。
【００５９】
このシクラメンのCGTをコードする第５または第６の本発明のDNAを適当な宿主例えば大腸菌で発現させることにより、CGTタンパク質を製造することができる。前記宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母、昆虫培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞等が挙げられる。宿主細胞内で機能するプロモーター等の発現調節配列の下流に発現可能に連結されたところの、CGTをコードする第５〜第６の本発明DNAは、これを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させることができる。このような形質転換に際しては、本発明のDNAをプラスミドベクターに連結して組換えプラスミドを構築し、そして、その得られた組換えプラスミドを宿主に導入することによって宿主を形質転換することができる。あるいは、相同組換え等によって本発明DNAを宿主内の染色体DNAに組込むことによって、宿主を形質転換することもできる。得られる形質転換細胞を前記プロモーター発現調節配列が機能する条件で培養する事によって, CGTタンパク質が産出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
以下に、第１の本発明を実施例１の例示により、また第５の本発明を実施例２の例示により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００６１】
以下の実験操作の手順は特に記述しない限り、「Molecular Cloning  第2版」（J．Sambrookら、Cold Spring Habor Laboratory Press，1989年）に記載されている方法に従った。
【００６２】
実施例１
(1)  黄色シクラメン花弁のmRNAの調製
黄色シクラメン（品種：ゴールデンボーイ）の開花中の花弁４ｇを液体窒素存在下で凍結後、凍結した花弁を乳棒乳鉢を用いて粉砕した。この粉砕物に２×CTAB溶液〔すなわち２％臭化セチルトリグルコシルアンモニウムと０.１M  Tris-HCl（pH9.5）と20mM  EDTAと１.４M  NaClと４％  β−メルカプトエタノールとの混合物〕40mlを加えた。得られた混合物を撹拌した後、65℃で10分間インキュベートした。次にインキュベートした該混合物をクロロフォルム抽出に２回かけた。得られたクロロフォルム抽出液に3/4容量のイソプロパノールを加えて核酸を析出させた。核酸よりなる沈澱を8000g、４℃で15分間遠心分離を行い、核酸を回収した。
【００６３】
その核酸をTE（10mM  Tris（pH8.0）と１mM  EDTAの混合物）４mlに溶解し、得られた溶液に10M  塩化リチウム溶液１mlを加えた。得られた混合液を氷上に２時間置いた後、19000g、４℃で10分間遠心分離すると、RNAが沈澱した。そのRNAを分け取り、蒸留水に溶解し、さらにそのRNA溶液をフェノール抽出およびエタノール沈殿することによりRNAを精製した。さらに、これで得られた全RNAの精製品から、mRNAの単離をmRNA精製キット（宝酒造(株)社製、Oligotex−Mag mRNA purification Kit）により行うと、シクラメン花弁のmRNAを約６μg得た。
【００６４】
(2)  3’RACE (Rapid amplification of cDNA ends)法によるグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3’側下流域部位のクローニング
(i)  3’RACE法を用いてグルコシル トランスフェラーゼの遺伝子cDNAの3’側下流域部位を増幅するために、プライマーの設計を先ず行った。すなわち、下記に示す塩基配列を有するデイジェネレート・プライマー型の２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーNo.１およびNo.２として設計して、化学合成により作製した。
【００６５】
(a)  プライマーNo.1（配列番号３に示す）
5’-gctcatggccacatgatccc-3’
(b)  プライマーNo.2（配列番号４に示す）
5’- aacmaccatcatcrccacycc-3’
但し、上記の２つの塩基配列においてm＝aまたはｃ；r＝gまたはa；y＝tまたはcを意味する。
【００６６】
なお、上記のプライマーNo.1およびNo.2のオリゴヌクレオチドの作製はDNA合成サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用した。
【００６７】
(ii)  次に、3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を用い、また上記のプライマーNo.1及びNo.2として構築された２種類の合成オリゴヌクレオチドの各10pmolをプライマーとして用いて、上記(1)で得たシクラメンmRNA0.1μgからグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3'側下流域部位の増幅を行った。上記した3’RACE法におけるシクラメンcDNA3'側下流域部位の増幅反応は、PCR反応装置（ASTEK社製、Program Temp Contol System PC-700）を用いて、変性を94℃で30秒間行い、アニーリングを52℃で１分間行い、また伸張（Extention）を72℃で１分間行う３つの反応操作を35回繰り返すことによって実施した。
【００６８】
(iii)  上記の(ii)で得られた増幅反応産物である複数種類のcDNA部分断片を、TAベクターpT7Blue Vector (Navagen社製)のTAサイトに連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌DH5αのコンピーテントセルに導入する処理を行った。その後に、そのように処理された大腸菌を、アンピシリン含有の寒天培地に撒いて培養した。これにより、増幅反応産物であるcDNA部分断片を保持する形質転換体の大腸菌のコロニー複数を寒天培地上に得た。上記で得られた増幅反応産物である複数種類のcDNA部分断片は、目的のもの以外のcDNAを含むことが予想された。そのため、目的とされるグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3'側下流部位を保持すると期待される形質転換体大腸菌の選抜を行った。この選抜は次のように行った。すなわち形質転換体大腸菌の前記コロニーから10数個のコロニーを選び、それぞれコロニー毎に別々に液体培地上で培養した。
【００６９】
このようにコロニー別に培養された形質転換体大腸菌のそれぞれの細胞内容物から、組換えプラスミドDNAをアルカリSDS法を用いて抽出した。抽出でそれぞれ別々に得られたプラスミドDNA１μlを、それぞれに、10μlのHバッファー中で制限酵素EcoRI  ５単位及び制限酵素PstI  ５単位で消化した。それぞれの消化反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて、先の増幅反応産物である前記の複数種類のDNA断片のサイズをそれぞれ確認した。既知のグルコシル基転位酵素から予想された該当のサイズを有して且つ目的のものと期待される増幅反応産物であるDNA断片の複数個を選抜した。更に、このように選抜されたこれら複数個のDNA断片を、それぞれ別々に制限酵素EcoRIおよびSalIにより消化し、それらの泳動パターンを比較したところ、前記の選抜で得られた複数個のDNA断片は1種類のもののみであることが判明した。
【００７０】
(3)  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3'側下流域部位のシークエンシングによる塩基配列の決定
上記の選抜されたDNA断片がクローニングされて保持された形質転換体大腸菌のクローンを、選抜した。選抜したクローンの形質転換体大腸菌が保持するプラスミドDNAを抽出し、次いでプラスミドDNAが保持するcDNA部分断片の塩基配列解析を行った。このプラスミドDNAの抽出と精製は、プラスミド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製））を用いて行い、塩基配列の決定はDNAシークエンス受託サービス（北海道システムサイエンス(株)）を利用して行った。その結果、前記の(2)(iii)で得た増幅反応産物であるDNA断片は、ポリＡシグナルを含む1434個の塩基からなるcDNAの3'側下流域部位であると決定された。このDNA下流域部位の塩基配列より予想されるアミノ酸配列を、これまで明らかにされている既知のグルコシル  トランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるcDNA部分断片は、シクラメンのグルコシル  トランスフェラーゼをコードする遺伝子cDNAの一部領域を含むDNA断片であることを確認した。
【００７１】
(4)  5’RACE (Rapid amplification of cDNA ends)法によるグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5’側上流域cDNAのクローニング
(i)  5'RACE法を用いて、上記で得られた前記1434個の塩基からなるcDNA部分断片として取得されたところのグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNA部分断片から、該遺伝子のORFを含む5'側上流域部位を得るためにプライマーの設計を先ず行った。すなわち、このグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3'側下流域部位の塩基配列を元にして、mRNAに相補的に結合するように下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーNo.3およびNo.4として設計して、化学合成により作製した。
【００７２】
(a)  プライマーNo.3（配列番号５に示す）
5’-agggcaagctataagatgcttaggaattc-3’
(b)  プライマーNo.4（配列番号６に示す）
5’- ttcctcttccaagagctgctc-3’
なお、上記のプライマーNo.3およびNo.4のオリゴヌクレオチドの作製はDNA合成サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用した。
【００７３】
(ii)  次に、5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を用い、また上記のプライマーNo.3及びNo.4として構築された２種類の合成オリゴヌクレオチドの各10pmolをプライマーとして用いて、上記(1)で得たmRNA 0.1μgから、グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNA5'側上流域部位の増幅を行った。上記した5’RACE法におけるシクラメンcDNAの増幅反応は、PCR反応装置（ASTEK社製、Program Temp Contol System PC-700）を用いて、変性を94℃で30秒間行い、アニーリングを55℃で１分間行い、また伸張（Extention）を72℃で１分間行う３つの反応操作を35回繰り返すことによって実施した。
【００７４】
(iii)  上記の(ii)で得られた増幅反応産物であるcDNA部分断片を、TAベクターpT7Blue Vector(Navagen社製)のTAサイトに連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌DH5αのコンピーテントセルに導入する処理を行った。その後、そのように処理された大腸菌をアンピシリン含有の寒天培地に撒いて培養した。このことにより、増幅反応産物であるcDNA部分断片を保持する形質転換体大腸菌のコロニーを寒天培地上に得た。上記で得られた増幅反応産物であるcDNA部分断片は、5'側上流域部位が不完全な長さのcDNA断片を含むこともあることが予想された。そのため、5'側上流域部位の完全長を保持すると期待される形質転換体大腸菌の選抜を行った。この選抜は次のように行った。
【００７５】
すなわち、形質転換大腸菌の複数コロニーから10数個のコロニーを選び、それぞれコロニー毎に別々に液体培地上で培養した。このようにコロニー別に培養された形質転換体大腸菌のそれぞれの細胞内容物から、組換えプラスミドDNAをアルカリSDS法を用いて抽出した。抽出でそれぞれ別々に得られたプラスミドDNA１μlを、それぞれに10μlのHバッファー中で制限酵素EcoRI  ５単位及び制限酵素PstI  5単位で消化した。それぞれの消化反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて、先の増幅反応産物であるDNA断片のサイズを確認した。既知のメチル基転位酵素から予想された該当のサイズを有して且つ目的のものと期待される増幅反応産物であるDNA断片を保持する組換えプラスミドDNAの複数個を選抜した。更に、ここで選抜されたこれら複数個のDNA断片をそれぞれ単独に制限酵素Bam HIおよびSalIにより消化し、それらの泳動パターンを比較したところ、前記の選抜で得たDNA断片が１種類であることを確認した。
【００７６】
(5)  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位のシークエンシングによる塩基配列の決定
上記(4)(iii)の選抜で得られたところの、1種類であるDNA断片がクローニングされて保持されてある形質転換体大腸菌のクローン一つを選抜し、このクローンの大腸菌が保持するプラスミドDNAを抽出した。次いでプラスミドDNAが保持するcDNA部分断片の塩基配列解析を行った。このプラスミドDNAの抽出と精製は、プラスミド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製））を用いて行い、またこの塩基配列の決定はDNAシークエンス受託サービス（北海道システムサイエンス(株)）を利用して行った。その結果、前記の(4)(iii)の選抜で得た増幅反応産物である１種類のDNA断片は393個の塩基からなるグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位であると決定された。
【００７７】
(6)  グルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの塩基配列解析
上記の(3)および(5)で決定されたグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5'側上流域部位および3'側下流域部位の両方の塩基配列を、つき合わせて、一つのオープンリーディングフレーム（ORF）をもち且つ遺伝子として機能する一つのcDNAの塩基配列の形で知見するために、Gene Works 2.5.1ソフトウェア（（株）帝人システムテクノロジー）を用い、塩基配列Alignmentファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、計1605個の塩基よりなる全体一つとしてのcDNAの塩基配列の具体的な構造を知見し得た。このように知見された計1605bpのサイズのcDNAはFGT-1-cDNAと命名した。このFGT-1-cDNAは1443個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ORF）のDNA配列を含むことが判った。このFGT-1-cDNAのORFのDNA配列より推定されるアミノ酸配列を、既知のグルコシル トランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較したところ、FGT-1-cDNAのORFのDNA配列はフラボノイドグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子と相同性が高く、フラボノイドグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子の一種と推測された。
【００７８】
(7)  FGT-1-cDNAのORF(1443bp)全長を含むcDNA断片の作製と取得
(i)  上記のFGT-1-cDNAのORF全長を保有するcDNAを作製、取得するためにプライマーの設計を先ず行った。すなわち、制限酵素サイトEcoRVを5’側に付加した下記に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーNo.５として設計して、化学合成により作製した。
【００７９】
(a)  プライマーNo.5（配列番号７に示す）
5’-gatatcaatggataatgttcatgtgatg-3’
(ii)  次に、シクラメンcDNAライブラリーの生成のために、上記(1)で得た全RNA１μgをテンプレートとして用いて、このテンプレートとしての全RNAを逆転転写反応液〔10mM Tris-HCl（pH8.3）と50mM KClと5mM MgCl２と１mMのdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物と2.5μM オリゴ（dT）プライマーOligo(dT)12-18 primer（ライフテックオリエンタル（株）製）、RNase阻害剤（RNase Inhibitor、宝酒造（株）製20単位および逆転写酵素AMV Reverse Transcriptase XL （宝酒造（株）製）５単位〕に加えることによって液量を20μlとし、逆転写反応を行った。逆転写反応は30℃  10分間、50℃  30分間、99℃  ５分間、４℃  ５分間インキュベートする条件で行い、生成されたシクラメンのcDNAライブラリーを含む反応液を得た。
【００８０】
(iii)  更に上記のプライマーNo.5及びNo.3として構築された2種類の合成オリゴヌクレオチドの各0.2μMをプライマーとして用い、上記で得られたシクラメンのcDNAライブラリーを含む逆転写反応液1μlをテンプレートとして用いて、これらをPCR反応液〔10mM Tris-HCl（pH8.3）と50mM KClと１.5mM MgCl２と0.2mMのdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混合物およびTaq DNA Polymerase TaKaRa Taq（宝酒造（株）製）１単位〕に加え、総量を50μlとし、DNAの増幅反応を行った。
【００８１】
上記したPCR法によるシクラメンcDNAライブラリーの増幅反応は、PCR反応装置（ASTEK社製、Program Temp Contol System PC-700）を用いて、変性を94℃で30秒間行い、アニーリングを55℃で１分間行い、また伸張（Extention）を72℃で１分間行う３つの反応操作を35回繰り返すことによって実施した。
【００８２】
上記で得られた増幅反応産物であるcDNA断片は約1.6kbpのサイズを有すると認められるものであり、そして前記FＧT−１−cDNAのORF全長を含むものであると予想された。この増幅反応産物cDNA断片を、TAベクターpT7Blue Vector（Navagen社製）のTAサイトに連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌DH5αのコンピーテントセルに導入する処理を行った。その後に、そのように処理された大腸菌をアンピシリン含有の寒天培地に撒いて培養した。このことにより、増幅反応産物である前記DNA断片を保持する形質転換体大腸菌のコロニー複数を寒天培地上に得た。
【００８３】
これらの大腸菌のコロニー複数から数個のコロニーを選び、それぞれコロニー毎に別々に液体培地上で培養した。このようにコロニー別に培養された大腸菌の内容物それぞれから、組換えプラスミドDNAをアルカリSDS法で抽出した。各コロニー毎に得られたDNA  １μｌを、それぞれに10μｌのＨバッファー中で制限酵素EcoRI  ５単位および制限酵素PstI  ５単位で消化した。それぞれの消化反応液をアガロース電気泳動にかけ、先の増幅反応産物であるDNAのサイズを確認した。FＧT−1−cDNAのORF全長を有して且つ目的のものと期待されるDNA断片をプラスミドに挿入されて保持する形質転換体大腸菌のクローンの複数を選抜した。これら複数の選抜したクローンの形質転換体大腸菌から別々にプラスミドDNAを抽出した。更に、FＧT−1−cDNAの塩基配列を内部で切断する制限酵素を用いて、その抽出したプラスミドDNAを消化した。その泳動パターンを比較することにより、形質転換体大腸菌の組換えプラスミドDNAに挿入されたシクラメン由来DNA断片が１種類であり、前記FＧT−1−cDNAのORF(1443bp)全長を含むところのDNAに相違ないことを確認した。
【００８４】
これら選抜した形質転換体大腸菌のうち１つのクローンを選び、その保持する組換えプラスミドDNAの抽出を行い且つ抽出されたプラスミドのTAサイトに挿入されたDNA断片の塩基配列解析を行った。このDNA断片のORFから推定されるアミノ酸配列を調査して、配列番号２のアミノ酸配列と相違ないことを確認した。この挿入されたDNA断片を、FＧT−１(ORF)−cDNAと命名した。このDNA断片は、配列表の配列番号１の塩基番号72番目のａから1586番目のｔまでの領域の塩基配列サイズ(1515 bp)を有する。この前記したプラスミドの抽出と精製は、プラスミド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製））を用いて行い、また塩基配列の決定はDNAシークエンス受託サービス（北海道システムサイエンス（株））を利用し行った。
【００８５】
前記のFGT−１−cDNAのORFに相当するところの配列番号のアミノ酸配列をコードするDNA配列(1443bp)を保有するFGT−１(ORF)−cDNAを、組換えプラスミド上に保持している形質転換体大腸菌のクローンは、独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている大腸菌DH5α（Cp FGT−1）（FERM  P−19652）と同一のものである。
【００８６】
(8)  FGT-1(ORF)-cDNAの発現とコードされる酵素の活性の調査
上記の(7)で得られたシクラメン由来のFGT-1(ORF)-cDNAの酵素活性について大腸菌発現システムを用いて調査した。すなわち、大腸菌発現ベクターとしてpQEベクター（QIAGEN社製）を用い、発現ベクターのSmaIサイトに開始コドンとFGT-1(ORF)-cDNAのORFのフレームが合うように連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌M15に導入して形質転換することにより、菌体内でFGT-1(ORF)-cDNAがコードするタンパク質を生産することのできる形質転換体大腸菌を得た。FGT-1(ORF)-cDNAのコードするタンパクの発現は、LB培地(Bactotrypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%)において一晩培養した上記の形質転換体大腸菌の培養液を新鮮なLB培地に1/20量接種し、25℃で1時間振とう培養を行った後、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を終濃度0.1mMになるように添加し、更に3時間振とう培養することによって行った。
【００８７】
培養液4mlを8000g、4℃で5分間遠心することにより大腸菌を沈澱とし、培養液を取り除いた後、その菌体を酵素アッセイ溶液(50mM TrisHCl(pH7.5)，2mM DTT) 150μlに懸濁した。超音波破砕機を用いて氷温下で、酵素アッセイ溶液に懸濁した大腸菌の膜を破砕し、その破砕溶液を8000g、4℃で5分間遠心した。抽出酵素を含む上清100μlを回収し、UDP-glucose(終濃度0.5mM)およびカルコノナリンゲニン (2mg/ml)を5μl加えて反応混合物を作った。これで30℃で30分間酵素反応をさせた。反応の停止は0.1％HCl-MeOH 50μlを加えることによって行った。反応液を8000g、室温で5分間遠心し、その上清50μlをHPLCによって解析した。
【００８８】
得られたクロマトグラフ図を添付図面の図１の図１−Ｂに示す。また、対照区として、標品のカルコノナリンゲニン2’-O-グルコシドとカルコノナリンゲニンのクロマトグラフ図を図１−Ａに示す。この図で横軸は保持時間（分）を示し、縦軸は濃度単位を示す。酵素反応生成物のピークは２本認められ、メインのピークの保持時間は、対照区のカルコノナリンゲニン2’-O-グルコシドの保持時間と一致した。もう一方の生成物における配糖化部位については判明しなかったが、FGT-1(ORF)-cDNAはカルコノナリンゲニンの複数の水酸基を配糖化（グリコシル化）する酵素を発現する活性を示し、FGT-1(ORF)-cDNAが目的とするCGT遺伝子を保有することが判明した。
【００８９】
なお、図１−Ｂ〜Ｃにおいて、「ＣＧ」は、カルコノナリンゲニンO-グルコシドのうちでカルコノナリンゲニン2’-O-グルコシド以外のものを示す。
【００９０】
よって、前記のFGT-1-cDNAとFGT-1(ORF)-cDNAとは、シクラメンのCGTをコードする遺伝子を含有するものである。該遺伝子は、配列番号１に記載の全長1605bpサイズのDNAの内部における73番目のａから1515番目のｔまでの領域の単一のオープンリーディングフレームである1443個の塩基の配列からなるものである。該遺伝子は第１の本発明DNAの中に保有される。前記のORFは配列番号１の1605bpのDNA配列内に在る72個の塩基よりなる5'非翻訳領域と90個の塩基よりなるDNA配列の3'非翻訳領域とに挟まれて存在する。また、第１の本発明によるシクラメンのCGTをコードするDNAは、配列番号２に示される481個のアミノ酸残基からなる第３の本発明のタンパク質をコードしている。
【００９１】
実施例2
（１）黄色シクラメン花弁ｍRNAの調製
実施例１、（１）と同様に行った。
【００９２】
（２）3’RACE (Rapid amplification of cDNA ends)法によるグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3’側下流域部位のクローニング
（i）3’RACE法を用いてグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子のcDNAの３’側下流域部位を増幅するために、プライマーの設計を先ず行った。すなわち、下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーNo.6およびNo.7として設計して、化学合成により作製した。
【００９３】
（a）プライマーNo.6（配列番号10に示す）
5’- acwcaytgyggrtggaaytc -3’
（b）プライマーNo.7（配列番号11に示す）
5’- ttgkgtsccmwtg -3’
但し、上記の2つの塩基配列においてw＝aまたはt；r＝gまたはa；ｓ＝ｃまたはｇ；y＝tまたはcを；ｋ=ｇまたはｔ；ｍ=aまたはｃを意味する。
【００９４】
なお、上記のプライマーNo.6およびNo.7のオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用した。
【００９５】
（ii）次に、3’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を用い、また上記のプライマーNo.6及びNo.7として構築された2種類の合成オリゴヌクレオチドの各10pmolをプライマーとして用いて、上記（１）で得たシクラメンｍRNA0.1μgからグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの3’側下流域部位の増幅を行った。上記した3’RACE法におけるシクラメンcDNAの3’側下流域部位の増幅反応は、PCR反応装置（ASTEK社製、Program Temp Contol System PC‐700）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを５２℃で１分間行い、また伸張（Extention）を７２℃で１分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【００９６】
(iii) 上記の(ii)で得られた増幅反応産物である複数種類のcDNA部分断片をTAベクターpT7Blue Vector(Navagen社製)のTAサイトに連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入する処理を行った。その後に、そのように処理された大腸菌をアンピシリン含有の寒天培地に撒いて培養した。これにより、増幅反応産物であるｃDNA部分断片を保持する形質転換体の大腸菌のコロニー複数を寒天培地上に得た。上記で得られた増幅反応産物である複数種類のcDNA部分断片は目的のもの以外のｃDNAを含むことが予想された。そのため、目的とされるグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子ｃDNAの3’側下流域部位を保持すると期待される形質転換体大腸菌の選抜を行った。この選抜は次のようにして行った。すなわち形質転換体大腸菌の前記のコロニーから１０数個のコロニーを選び、それぞれコロニー毎に別々に液体培地上で培養した。
【００９７】
このようにコロニー別に培養された形質転換体大腸菌のそれぞれの細胞内容物から、組換えプラスミドDNAをアルカリSDS法を用いて抽出した。抽出でそれぞれ別々に得られたプラスミドDNA１μlを１０μlのKバッファー中で制限酵素BamHI ５単位及び制限酵素Hind III 5単位で消化した。それぞれの消化反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて、先の増幅反応産物である前記の複数種類のDNA断片のサイズをそれぞれ確認した。既知のグルコシル基転位酵素から予想された該当サイズを有して且つ目的のものと期待される増幅反応産物であるDNA断片の複数個を選抜した。更にこのように選抜されたこれら複数個のＤＮＡ断片をそれぞれ別々に制限酵素EcoRIおよびPstIにより消化し、それらの泳動パターンを比較したところ、前記の選抜で得られたDNA断片は1種類のもののみであることが判明した。
【００９８】
（３）グルコシル トランスフェラーゼ遺伝子ｃDNAの3’側下流域部位のシークエンシングによる塩基配列の決定
上記の選抜されたDNA断片がクローニングされて保持された形質転換体大腸菌のクローンを選抜した。選抜したクローンの大腸菌が保持するプラスミドDNAを抽出し、次いでプラスミドDNAが保持するcDNA部分断片の塩基配列解析を行った。このプラスミドDNAの抽出および精製は、プラスミド精製キット（QIAfilter  Plasmid  Midi  Kit（QIAGEN社製））を用いて行い、塩基配列の決定はDNAシークエンス受託サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用して行った。その結果、前記の（２）(iii)で得た増幅反応産物であるDNA断片は、ポリＡシグナルを含む433個の塩基からなるｃDNAの3’側下流域部位であると決定された。このDNA下流部位の塩基配列より予想されるアミノ酸配列を、これまで明らかにされている既知のグルコシル トランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することにより、上記の増幅反応産物であるcDNA部分断片はシクラメンのグルコシル トランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃDNAの一部領域を含むDNA断片である事を確認した。
【００９９】
（4）5’RACE (Rapid amplification of cDNA ends)法によるグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5’側上流域部位のクローニング
（i）5’RACE法を用いて、上記で得られた前記433個の塩基からなるcDNA部分断片として取得されたところのグルコシル  トランスフェラーゼ遺伝子ｃDNA部分断片から、該遺伝子のORFを含む5’側上流域部位を得るためにプライマーの設計を先ず行った。すなわち、このグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子ｃDNAの3’側下流域部位の塩基配列を元にして、mRNAに相補的に結合するように下記に示す塩基配列を有する２種類のオリゴヌクレオチドをプライマーNo.8およびNo.9として設計して、化学合成により作製した。
【０１００】
（a）プライマーNo.8（配列番号12に示す）
5’- ctatgaaagtccaatgaaacttgtccg -3’
（b）プライマーNo.9（配列番号13に示す）
5’- atagtccagactgatctcgaccg -3’
なお、上記のプライマーNo.8およびNo.9のオリゴヌクレオチドの作製はＤＮＡ合成サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用した。
【０１０１】
（ii）次に、5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen社製）を用い、また上記のプライマーNo.8及びNo.9として構築された2種類の合成オリゴヌクレオチドの各10pmolをプライマーとして用いて、上記（１）で得たシクラメンｍRNA0.1μgからグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5’側上流域部位の増幅を行った。上記した5’RACE法におけるシクラメンcDNA断片の増幅反応は、PCR反応装置（ASTEK社製、Program Temp Contol System PC‐700）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを55℃で１分間行い、また伸張（Extention）を７２℃で１分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【０１０２】
(iii) 上記の(ii)で得られた増幅反応産物であるｃDNA断片をTAベクターpT7Blue Vector(Navagen社製)のTAサイトに連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌DH5αのコンピーテントセルに導入する処理を行った。その後、そのように処理された大腸菌をアンピシリン含有の寒天培地に撒いて培養した。このことにより、増幅反応産物であるｃDNA部分断片を保持する形質転換体大腸菌のコロニーを寒天培地上に得た。上記で得られた増幅反応産物であるcDNA部分断片は5’側上流域部位が不完全な長さのｃDNA断片を含むこともあることが予想された。そのため、5’側上流域部位の完全長を保持すると期待される形質転換体大腸菌の選抜を行った。この選抜は次のように行った。
【０１０３】
すなわち、形質転換体大腸菌の複数コロニーから１０数個のコロニーを選び、それぞれコロニー毎に別々に液体培地上で培養した。このようにコロニー別に培養された形質転換体大腸菌のそれぞれの細胞内容物から、組換えプラスミドDNAをアルカリSDS法を用いて抽出した。抽出でそれぞれ別々に得られたプラスミドDNA１μlをそれぞれに１０μlのHバッファー中で制限酵素EcoRI ５単位及び制限酵素PstI 5単位で消化した。それぞれの消化反応液をアガロースゲル電気泳動にかけて、先の増幅反応産物であるDNA断片のサイズを確認した。既知のグルコシル基転位酵素から予想された該当のサイズを有して且つ目的のものと期待される増幅反応産物であるDNA断片を保持する組換えプラスミドDNAの複数個を選抜した。更に、ここで選抜されたこれら複数個のDNA断片をそれぞれ別々に制限酵素BamHIおよびHind IIIにより消化し、それらの泳動パターンを比較したところ、前記の選抜で得たDNA断片が１種類であることを確認した。
【０１０４】
（5）グルコシル トランスフェラーゼ遺伝子ｃDNAの5’側上流域部位のシークエンシングによる塩基配列の決定
上記（４）(iii)の選抜で得られたところの、1種類であるDNA断片がクローニングされて保持されてある形質転換体大腸菌のクローン一つを選抜し、このクローンの大腸菌が保持するプラスミドDNAを抽出した。次いでプラスミドDNAが保持するcDNA部分断片の塩基配列解析を行った。このプラスミドDNAの抽出および精製は、プラスミド精製キット（QIAfilter  Plasmid  Midi  Kit（QIAGEN社製））を用いて行い、この塩基配列の決定はDNAシークエンス受託サービス(北海道システムサイエンス(株))を利用して行った。その結果、前記（４）(iii)で得た増幅反応産物である1種類のDNA断片は1265個の塩基からなるグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子cDNAの5’側上流域部位であると決定された。
【０１０５】
（６）グルコシル トランスフェラーゼ遺伝子ｃDNAの塩基配列解析
上記の（３）および（５）で決定されたグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子ｃDNAの5’側上流域部位および3’側下流域部位の両方の塩基配列をつき合わせて一つのオープンリーディングフレーム（ORF）をもち且つ遺伝子として機能する一つのｃDNAの塩基配列の形で知見するために、Gene Works 2.5.1ソフトウェア（（株）帝人システムテクノロジー）を用い、塩基配列Alignmentファイルをソフトウェアの初期設定条件で作成することによって、計1554個の塩基よりなる全体一つとしてのｃDNAの塩基配列の具体的な構造を知見し得た。このように知見された計1554bpのサイズのｃDNAはFGT-2-ｃDNAと命名した。FGT-2-ｃDNAは1446個の塩基よりなる単一のオープンリーディングフレーム（ORF）のDNA配列を含むことが判った。このFGT-2-ｃDNAのORFの塩基配列より推定されるアミノ酸配列を、既知のグルコシル トランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較したところ、FGT-2-ｃDNAのORFのDNA配列はフラボノイド グルコシル トランスフェラーゼ遺伝子と相同性が高く、フラボノイドグルコシル トランスフェラーゼ遺伝子の一種と推測された。
【０１０６】
（７）FGT-2-ｃDNAのORF(1446bp)全長を含むcDNA断片の作製と取得
(i) FGT-2-ｃDNAのORF全長を保有するcDNAを作製、取得するためにプライマーの設計を先ず行った。すなわち、制限酵素サイトXbaIを5’側に付加した下記に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーNo.10として設計して、化学合成により作製した。
【０１０７】
（a）プライマーNo.10（配列番号14に示す）
5’- tctagaaccaaagagaaaaatggagagg -3’
(ii)次に、シクラメンcDNAライブラリーの生成のために、上記（１）で得た全RNA１μgをテンプレートとして用いて、このテンプレートとしての全RNAを逆転転写反応液（10mM  Tris‐HCl（pH8.3）と50mM  KClと5mM  MgCl２と１mMのdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物と2.5μM  オリゴ（dT）プライマーOligo(dT)12-18 primer（Invitrogen社製）、RNase阻害剤（RNase Inhibitor、タカラバイオ（株）製 ２０単位および逆転写酵素AMV Reverse Transcriptase XL （タカラバイオ（株）製）５単位に加えることによって液量を２０μlとし、逆転写反応を行った。逆転写反応は３０℃  １０分間、５０℃  ３０分間、９９℃  ５分間、４℃  ５分間インキュベートする条件で行い、生成されたシクラメンcDNAライブラリーを含む反応液を得た。
【０１０８】
（iii）更に上記のプライマーNo.10及びNo.8として構築された2種類の合成オリゴヌクレオチドの各0.2μMをプライマーとして用い、上記で得られたシクラメンのcDNAライブラリーを含む逆転写反応液1μlをテンプレートとして用いて、これらをPCR反応液（10mM  Tris‐HCl（pH8.3）と50mM  KClと１.5mM  MgCl２と０．２ｍMのdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物およびTaq DNA Polymerase TaKaRa  Taq（タカラバイオ（株）製）１単位）に加え、総量を５０μlとし、DNAの増幅反応を行った。
【０１０９】
上記したPCR法によるシクラメンcDNAライブラリーからの増幅反応は、PCR反応装置（ASTEK社製、Program Temp Contol System PC‐700）を用いて、変性を９４℃で３０秒間行い、アニーリングを５5℃で１分間行い、また伸張（Extention）を72℃で1分間行う３つの反応操作を３５回繰り返すことによって実施した。
【０１１０】
上記で得られた増幅反応産物であるcDNA断片は約1.5kbのサイズを有すると認められるものであり、そして前記FGT-2-ｃDNAのORF全長を含むものであると予想された。この増幅反応物cDNA断片の末端を平滑化及びリン酸化した後、プラスミドベクターpBlueskriptII(SK-)(STRATAGENE社製)のHind IIサイトに連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌DH5αのコンピーテントセルに導入する処理を行った。その後、そのように処理された大腸菌をアンピシリン含有の寒天培地に撒いて培養した。このことにより、増幅反応産物である前記DNA断片を保持する形質転換体大腸菌のコロニー複数を寒天培地上に得た。
【０１１１】
これらの大腸菌のコロニー複数から数個のコロニーを選び、それぞれコロニー毎に別々に液体培地上で培養した。このようにコロニー別に培養された大腸菌の内容物それぞれから、プラスミドDNAをアルカリSDS法を用いて抽出した。各コロニー毎に得られたDNA１μlを各個に１０μlのKバッファー中で制限酵素BamHI ５単位及び制限酵素Hind III 5単位で消化した。それぞれの消化反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、先の増幅反応産物であるDNAのサイズを確認した。FGT-2-ｃDNAのORF全長を有して且つ目的と期待されるDNA断片をプラスミドDNAに挿入されて保持する形質転換体大腸菌のクローンの複数を選抜した。更にFGT-2-ｃDNAの塩基配列を内部で切断する制限酵素を用いて、その抽出したフ゜ラスミト゛ＤＮＡを消化した。その泳動パターンを比較することにより、形質転換体大腸菌の組換えフ゜ラスミト゛DNAに挿入されたシクラメン由来のDNA断片が１種類であり、前記のFGT-2-ｃDNAのORF（1446bp）を含むところのDNAに相違ないことを確認した。
【０１１２】
これらの選抜した形質転換体大腸菌のうち1つのクローンを選び、その保持する組換えプラスミドDNAの抽出を行い且つ抽出されたのフ゜ラスミト゛ベクターのHind IIサイトに挿入されたDNA断片の塩基配列解析を行った。このDNA断片のORFより推定されるアミノ酸配列を調査して、配列番号9のアミノ酸配列と相違ないことを確認した。この挿入されたDNA断片をFGT-2(ORF)-ｃDNAと命名した。このDNA断片は、配列表番号8の塩基番号2番目のaから1500番目のgまでの領域の塩基配列サイズ（1499bp）を有する。この前記したフ゜ラスミト゛の抽出及び精製はプラスミド精製キット（QIAfilter  Plasmid  Midi  Kit（QIAGEN社製））を用いて行い、また、塩基配列の決定は、DNAシークエンス受託サービス(北海道システムサイエンス（株）)を利用し行った。
【０１１３】
前記のFGT-2-ｃDNAのORFに相当するところの配列番号のアミノ酸配列をコート゛するDNA配列(1446bp)を保有するFGT-2(ORF)-ｃDNAを組換えフ゜ラスミト゛上に保持する形質転換体大腸菌のクローンは独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センターに寄託されている大腸菌DH5α/CpFGT-２）（FERM P-20506）と同一のものである。
【０１１４】
（8）FGT-2(ORF)-ｃDNAの発現とコードされる酵素活性の調査
上記の（7）で得られたシクラメン由来のFGT-2(ORF)-ｃDNAの酵素活性について大腸菌発現システムを用いて調査した。すなわち、大腸菌発現ベクターとしてpQEベクター（QIAGEN社製）を用い、発現ベクターのSmaIサイトに開始コドンとFGT-2(ORF)-ｃDNAのORFのフレームが合うように連結した。得られた組換えプラスミドを大腸菌JM109に導入して形質転換することにより、FGT-2(ORF)-ｃDNAがコードするタンパク質を生産することのできる形質転換体大腸菌を得た。FGT-2(ORF)-ｃDNAのコードするタンパク質の発現は、LB培地（Bactotrypton 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%）において一晩培養した上記の形質転換体大腸菌の培養液を新鮮なLB培地に1/20量接種し、25℃で1時間振とう培養を行った後、IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を終濃度0.1mMになるように添加し、さらに3時間振とう培養することによって行った。
【０１１５】
培養液4mlを8000g、4℃で5分間遠心することにより大腸菌を沈澱とし、培養液を取り除いた後、菌体を酵素アッセイ溶液(50mM TrisHCl(pH7.5)，2mM DTT)150μlに懸濁した。超音波破砕機を用いて氷温下で 酵素アッセイ溶液に懸濁した大腸菌の膜を破砕し、その溶液を8000g、4℃で5分間遠心した。抽出酵素を含む上清100μlを回収し、UDP-glucose(終濃度0.5mM)および基質のカルコノナリンゲニン (2ｍｇ/ml)を5μl加えて反応混合物を作った。それで30℃で30分間酵素反応をさせた。反応の停止は0.1％HCl-MeOH 50μlを加えることによって行った。反応液を8000g、室温で5分間遠心し、その上清50μlをHPLCによって解析した。得られたクロマトグラフ図を図１の図１−Ｃで示す。その結果、反応生成物のピークは２本認められた。そのピークの保持時間は、FGT-1(ORF)-cDNAの発現酵素による反応生成物の保持時間とは異なった。しかしながら、反応生成物における配糖化部位については判明しなかった。これらのことから、FGT-2(ORF)-ｃDNAでコードされたCGTはナリンゲニンカルコンに対し、FGT-１(ORF)-ｃDNAでコードされるCGTとは異なる配糖化酵素の活性を示し、FGT-2-ｃDNAはFGT-1-cDNAとは異なる別のCGTをコードした事が判明した(図1-B,Cの比較)。
【０１１６】
よって、前記のFGT-2-ｃDNAとFGT-2(ORF)-ｃDNAとは、シクラメンのCGTをコードする遺伝子を含有するものである。該遺伝子は配列番号8に記載の全長1554bpサイズのDNAの内部におけるに18番目のaから1463番目のgまでの領域の単一のオープンリーディングフレームである1446個の塩基の配列からなるものである。該遺伝子は第5の本発明のDNAに保有される。前記のORFは配列番号8の1554bpのDNA配列内にある17個の塩基よりなる５’非翻訳領域と91個の塩基よりなるDNA配列の３’非翻訳領域とにはさまれて存在する。また第５の本発明によるシクラメンのCGTをコードするDNAは、配列番号9に示される482個のアミノ酸残基からなる第７の本発明タンパク質をコードしている。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明により提供される、シクラメンのCGTをコードするcDNAは、これを公知の方法に従い、シクラメンと同種または異種の植物体に単独または他のDNAと組み合わせて導入すると、該植物中でのアントシアニン合成に関与するグリコシル化酵素反応を調節することができ、これによって花色の多様性を計るための植物の開発に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１−Ａは、対照試験における標品のカルコノナリンゲニンとカルコノナリンゲニン2’-O-グルコシドとのHPLCクロマトグラフ図である。
【０１１９】
図１−Ｂは、実施例１、（8）において、第１の本発明のDNAのコードするCGTを反応させた後の酵素反応上清のHPLCクロマトグラフ図である。
【０１２０】
図１−Ｃは、実施例2、（8）において、第５の本発明のDNAのコードするCGTを反応させた後の酵素反応上清のHPLCクロマトグラフ図である。
【図１】
2006000112.tif 000002
【配列表】
2006000112000001.app