(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト非リンパ球系動物細胞を用いた天然型インターフェロンα（ＩＦＮ−α）の大量生産方法を提供すること。【解決手段】インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型の遺伝子を、ヒト細胞発現用ベクター等に組込んで、ヒト非リンパ球系細胞に導入し、発現することで、天然型のＩＦＮ−αを大量に生産する。該ＩＲＦ７の遺伝子として、特定のアミノ酸配列のＩＲＦ７の抑制領域をコードする塩基配列の領域を削除した遺伝子を用いることで、産生を高めることができる。トール様受容体アダプター分子であるＭｙＤ８８遺伝子、ＴＬＲ９のリガンド、或いは腫瘍壊死因子受容体因子ＴＲＡＦ６の遺伝子を、ＩＲＦ７遺伝子とヒト非リンパ球系細胞に共導入することにより、ＩＦＮ−αの誘導を高めることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト非リンパ球系動物細胞にインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子を導入することを特徴とする天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項２】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子が、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項３】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子が、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１又は２記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項４】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のコーディング領域を有する遺伝子であることを特徴とする請求項２又は３記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項５】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子が、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の抑制領域をコードする塩基配列の領域を削除した遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項６】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の抑制領域が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から４０８に相当する領域であることを特徴とする請求項５記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項７】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の抑制領域が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から２８５に相当する領域であることを特徴とする請求項５記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項８】
インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子が、請求項３〜７のいずれか記載の恒常的活性型遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型機能を有するインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の変異型遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項９】
ヒト非リンパ球系動物細胞が、ＨＥＫ−２９３細胞又は２９３−Ｆ細胞であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか記載のインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子を、ヒト細胞発現用ベクターに組込み、該組換えベクターをヒト非リンパ球系動物細胞に導入し、発現することを特徴とする天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項１１】
ヒト細胞発現用ベクターが、ｐＣＩｎｅｏ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ、又はｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯであることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項１２】
ヒト細胞発現用ベクターに、ＭｙＤ８８の遺伝子をコトランスフェクトした発現用ベクターを用いることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項１３】
ヒト細胞発現用ベクターに、ＭｙＤ８８及びＴＬＲ９の遺伝子をコトランスフェクトした発現用ベクターを用いることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項１４】
ヒト細胞発現用ベクターに、ＴＲＡＦ６の遺伝子をコトランスフェクトした発現用ベクターを用いることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか記載の方法により作出された天然型インターフェロンαを大量に産生するヒト非リンパ球系動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト非リンパ球系動物細胞を用いた天然型インターフェロンα（ＩＦＮ−α）の大量生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、動物細胞が作り出す抗ウィルス作用をもったタンパク質として定義される一連の物質であり、α，β，γ等のＩＦＮが見い出されている。インターフェロンα（ＩＦＮ−α）は、白血球やリンパ芽球様細胞が分泌するＩＦＮとして見い出されるもので、ＩＦＮ−αには多くのサブタイプが存在することが知られている（Biomedica, 6(14), 43-49、1991）。また、ＩＦＮには、抗ウィルス作用の他に抗腫瘍作用、免疫系細胞に対する作用等の多面的作用が知られている（小林茂保編 「インターフェロンの科学」講談社サイエンティフィク、44、1985）。
【０００３】
ＩＦＮ−αの製造法には、白血球やリンパ芽球様細胞をセンダイウィルスやニューキャッスル病ウィルスなどのウィルスで誘発する方法、遺伝子組換え微生物による生産、遺伝子組換え動物細胞による生産等が知られているが、リンパ芽球様細胞等の株化細胞による産生は多くのサブタイプ成分を含み、天然に存在するＩＦＮ−α（以下、「天然型」と記載する）に最も近く、かつ安全性が高いと考えられている。動物細胞培養法の産生細胞としては、産生能の観点から、リンパ芽球様細胞が挙げられる。リンパ芽球様細胞としては、特にナマルバ細胞株が好ましい。ナマルバ細胞株は、バーキットリンパ腫由来の株化細胞で、ＩＦＮ高産生の細胞株である（Develop. Biol. Standard., 38, 343-348(1978）。天然型ＩＦＮ−αの生産細胞株として、ヒトリンパ芽球細胞ＢＡＬＬ−１が挙げられる。該細胞株に、誘発剤としてセンダイウィルスを作用させて天然型ＩＦＮ−αを産生することが行われている。
【０００４】
天然型のＩＦＮ−αは、現在、ＩＦＮ製剤として、Ｂ型慢性活動性肝炎、Ｃ型急性及び慢性活動性肝炎、種々の悪性腫瘍の治療薬等として使用されているが、その大量生産に用いる方法としては、上記のように、産生細胞株を用いて、該細胞株を培養し、センダイウィルスを誘発剤として用いて製造する方法が効率的な天然型のＩＦＮ−αの製造法として知られている（Methods in Enzymology, 119, 35-38 ）。更に、センダイウィルス等の誘発剤でＩＦＮ−αを誘発する前に、酪酸、ジメチルスルホキシド、５−ブロモデオキシウリジン等の産生、増強剤であらかじめ細胞を処理することで、ＩＦＮ産生を増強する方法が知られている（Journal of Interferon Research, 2(2), 261-270,1982；特開平７−３１４９５号公報）。
【０００５】
ところで、ＩＦＮは、ウイルスに対する適応免疫応答において重要な役割を果たすタンパク質である。適応免疫系におけるＩＦＮの役割については詳細な研究がなされている。しかしながら、病原体に対する免疫応答の際に、生体内でＩＦＮがどのようなシグナル伝達経路を介して産生されるかについては、多くの報告がなされているが、まだ、その完全な解明はなされていない。近年、哺乳動物の自然免疫系において病原体を認識する受容体としてＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）が発見され、このＴＬＲに関する研究により、自然免疫系における病原体の認識に係わるシグナル伝達経路が明らかにされつつある。このシグナル伝達経路の解明とともに、ＩＦＮの誘導の関係についても、解明が行われている。
【０００６】
現在までに報告されている、ＩＦＮの誘導に関連したＴＬＲに関する研究について詳述すると、脊椎動物においてＴＬＲファミリーは、広い範囲の病原体の保存された構造を検知し、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）による炎症性サイトカイン、ケモカイン及び１型インターフェロン（ＩＦＮ）ＩＦＮα／βの産生を含む自然免疫応答を誘導する（Cell 91, 295-8, 1997、Annu Rev Immunol. 21, 335-76, 2003）。現在、ＴＬＲファミリーの１１のメンバー（ＴＬＲ１−１１）が同定され、各ＴＬＲが認識する病原体由来の構成要素が、遺伝学研究により明らかになっている（Nature 413, 732-8, 2001；Science 303, 1529-31, 2004；Nature 410, 1099-103, 2001；Science 303, 1526-9, 2004；Nat Immunol. 3, 196-200, 2002；Nature 408, 740-5, 2000；J Immunol. 162, 3749-52, 1999；Science 282, 2085-8, 1998；Immunity 11, 443-51, 1999；Int Immunol. 13, 933-40, 2001；J Immunol. 169, 10-4, 2002；Science 303, 1522-6, 2004）。
【０００７】
ＴＬＲにより誘因されたシグナル経路は、過去数年にわたり明らかにされてきた（Annu Rev Immunol. 21, 335-76, 2003；Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004）。全てのＴＬＲは、病原体を認識するＮ末端ロイシンリッチリピート（leucine rich repeat）及び、ＴＬＲとＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＩＲＡＰ及びＴＲＡＭ等のＴＩＲドメインを含むアダプターと間のホモタイプ相互作用により細胞間シグナルを介するＣ末端ＴＩＲドメインを含む（Immunity 9, 143-50, 1998；Nature 424, 743-8, 2003；Nature 420, 329-33, 2002；Immunity 11, 115-22, 1999；J. Immunol. 167, 5887-94, 2001； Nature 420, 324-9, 2002；Science 301, 640-3, 2003；Nat Immunol. 4, 1144-50, 2003）。病原体由来の構成要素を認識するにあたり、個々のＴＬＲはアダプター分子の異なる組み合わせを漸加し、特徴的な応答を誘因する。ＭｙＤ８８は、通常全てのＴＬＲに使用されている。次に、ＴＬＲとＭｙＤ８８の会合は、デスドメイン間の相互作用を通してＩＬ−１受容体キナーゼ（ＩＬ−１receptor-associated kinase）（ＩＲＡＫ）ファミリーのメンバーを漸加する。
【０００８】
リン酸化後、ＩＲＡＫ１及び４は、受容体複合体から分離し、ＴＲＡＦファミリーの一員である腫瘍壊死因子受容体因子６（tumor necrosis factor receptor-associated factor-6 ）（ＴＲＡＦ６）と会合する。ＴＲＡＦ６はＵｂｃ１３及びＵｅｖ１Ａからなる複合体を形成し、リシン６３結合ポリユビキチン鎖（lysine 63-linked polyubiquitin chains）の合成を促進するユビキチンＥ３リガーゼとして作用する（Curr Opin Cell Biol. 16, 119-26, 2004）。生化学分析により、プロテインキナーゼＴＡＫ１を、ＴＲＡＦ６の１つのターゲットとして同定した（Nature 412, 346-51, 2001）。活性化したＴＡＫ１は、次に正準のＩκＢキナーゼ複合体（ＩＫＫα、β、γ）を伴うキナーゼカスケードを通じて転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を誘因し、炎症性サイトカインの誘導を引き起こす（Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004）。
【０００９】
Ｉ型ＩＦＮは、ＴＬＲのサブセットにより誘導される。ＩＲＦ３及びＩＲＦ７等のインターフェロン制御因子（ＩＲＦ）は、ウイルス又はＴＬＲリガンド誘発Ｉ型ＩＦＮの誘導に関与していると思われている。ウイルスにより活性化されたキナーゼにより、ＩＲＦ３及びＩＲＦ７は、Ｃ末端の複数のセリンクラスターのリン酸化により活性化されている（Mol Cell Biol. 20, 8803-14, 2000、EMBO J. 17, 1087-95, 1998）。このリン酸化は、かかるＩＲＦの二量体化及び核転移を誘因する。ＩＲＦ３は主に、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４がそれぞれ認識する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）及び細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）により、ＩＦＮβの誘導を制御している。ＴＬＲ３及びＴＬＲ４リガンドによるＩＲＦ３の活性化は、ＭｙＤ８８とは別個に起こるが、ＴＲＩＦに依存している（J. Immunol. 167, 5887-94, 2001；Science 301, 640-3, 2003；Immunity 17, 251-63, 2002）。
【００１０】
最近、ＴＢＫ１及びＩＫＫｉの２個のＩＫＫキナーゼがＩＲＦ３のリン酸化及び活性化に関与していることが示された（Nat Immunol. 4, 491-6, 2003；Science 300, 1148-51, 2003）。ＴＢＫ−１欠損マウス由来の細胞は、ＬＰＳによるＩＦＮβ遺伝子誘導により著しく減少し、ＴＲＩＦ−ＴＢＫ１−ＩＲＦ３依存性経路がＴＬＲ４によりＩＦＮβ導入を調節することを明らかにした（J Exp Med. 199, 1641-50, 2004；Proc Natl Acad Sci U S A 101, 233-8, 2004；J Exp Med. 199, 1651-8, 2004）。他方、ＩＲＦ７がＩＦＮα依存性プロモーターを活性化する能力を有していることが示されている（Mol Cell Biol. 20, 8803-14, 2000；J Biol Chem. 275, 34320-7, 2000）。ＩＲＦ３は広範に発現しているのに対し、大半の細胞はＩＲＦ７をほとんど又は全く発現せず、１型ＩＦＮ刺激によりＩＲＦ７を誘導的に発現する（J Biol Chem. 275, 34320-7, 2000；Immunity 13, 539-48, 2000）。
【００１１】
しかし形質細胞様樹状細胞（plasmacytoid DC）(ｐＤＣ)は、恒常的にＩＲＦ７を発現し、ウイルス感染、ＴＬＲ７／８リガンド（一重鎖ＲＮＡ及びimidazoquinoline）及びＴＬＲ−９リガンド（ＣｐＧ  ＤＮＡ）に応答してＩＦＮαを素早く産生する（Eur J Immunol. 34, 796-805, 2004；J Immunol. 170, 3059-64, 2003；J Leukoc Biol. 74, 1125-38, 2003；J Immunol. 170, 4465-74, 2003；J Leukoc Biol. 72, 1011-9, 2002）。これらのＴＬＲリガンドによるＩＦＮα誘導は、ＭｙＤ８８欠損細胞内では消失している。つまり、ＴＬＲ７、８及び９は、ＭｙＤ８８依存的にｐＤＣ内のＩＦＮα遺伝子を活性化する唯一のメカニズムを有しているようである（J Immunol. 170, 3059-64, 2003）。
【００１２】
上記のように、細菌性病原体を認識するのに重要な役割を演じ、抗ウイルス反応を誘導するトール様受容体（ＴＬＲ）と、そのリガンド及びアダプターとの相互作用、及び、Ｉ型ＩＦＮを誘導するＲＬＲのサブセット、及びインターフェロン制御因子ＩＲＦとの相互作用については、多くの報告がなされている。最近、該トール様受容体（ＴＬＲ）のシグナル伝達に関連して、ヒト由来のアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１が、哺乳動物のトール様受容体（ＴＬＲ）３に対して特異的に結合する性質を持ち、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導することが見い出され、該アダプタータンパク質をウイルス感染症の予防・治療薬等として用いることが開示された（２００４−１８０５４０号公報）。しかしながら、ＩＦＮαの産生を制御するメカニズムについては、まだ、完全には明らかにされておらず、これらのメカニズムを利用して、細胞株にＩＦＮの産生を誘発させ、天然型ＩＦＮ−αを高生産に産生する細胞株を構築することはできていない。
【００１３】
【特許文献１】特開平７−３１４９５号公報。
【特許文献２】特開２００４−１８０５４０号公報。
【非特許文献１】Biomedica, 6(14), 43-49、1991。
【非特許文献２】小林茂保編 「インターフェロンの科学」講談社サイエンティフィク、44、1985。
【非特許文献３】Develop. Biol. Standard., 38, 343-348(1978。
【非特許文献４】Methods in Enzymology, 119, 35-38。
【非特許文献５】Journal of Interferon Research, 2(2), 261-270,1982。
【非特許文献６】Cell 91, 295-8, 1997、Annu Rev Immunol. 21, 335-76, 2003。
【非特許文献７】Nature 413, 732-8, 2001。
【非特許文献８】Science 303, 1529-31, 2004。
【非特許文献９】Nature 410, 1099-103, 2001。
【非特許文献１０】Science 303, 1526-9, 2004。
【非特許文献１１】Nat Immunol. 3, 196-200, 2002。
【非特許文献１２】Nature 408, 740-5, 2000。
【非特許文献１３】J Immunol. 162, 3749-52, 1999。
【非特許文献１４】Science 282, 2085-8, 1998。
【非特許文献１５】Immunity 11, 443-51, 1999。
【非特許文献１６】Int Immunol. 13, 933-40, 2001
【非特許文献１７】J Immunol. 169, 10-4, 2002。
【非特許文献１８】Science 303, 1522-6, 2004。
【非特許文献１９】Annu Rev Immunol. 21, 335-76, 2003。
【非特許文献２０】Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004。
【非特許文献２１】Immunity 9, 143-50, 1998。
【非特許文献２２】Nature 424, 743-8, 2003。
【非特許文献２３】Nature 420, 329-33, 2002。
【非特許文献２４】Immunity 11, 115-22, 1999。
【非特許文献２５】J. Immunol. 167, 5887-94, 2001。
【非特許文献２６】Nature 420, 324-9, 2002。
【非特許文献２７】Science 301, 640-3, 2003。
【非特許文献２８】Nat Immunol. 4, 1144-50, 2003。
【非特許文献２９】Curr Opin Cell Biol. 16, 119-26, 2004。
【非特許文献３０】Nature 412, 346-51, 2001。
【非特許文献３１】Nat Rev Immunol. 4, 499-511, 2004。
【非特許文献３２】Mol Cell Biol. 20, 8803-14, 2000。
【非特許文献３３】EMBO J. 17, 1087-95, 1998。
【非特許文献３４】J. Immunol. 167, 5887-94, 2001。
【非特許文献３５】Immunity 17, 251-63, 2002。
【非特許文献３６】Nat Immunol. 4, 491-6, 2003。
【非特許文献３７】Science 300, 1148-51, 2003。
【非特許文献３８】J Exp Med. 199, 1641-50, 2004。
【非特許文献３９】Proc Natl Acad Sci U S A 101, 233-8, 2004。
【非特許文献４０】J Exp Med. 199, 1651-8, 2004。
【非特許文献４１】Mol Cell Biol. 20, 8803-14, 2000。
【非特許文献４２】J Biol Chem. 275, 34320-7, 2000。
【非特許文献４３】Immunity 13, 539-48, 2000。
【非特許文献４４】Eur J Immunol. 34, 796-805, 2004。
【非特許文献４５】J Immunol. 170, 3059-64, 2003。
【非特許文献４６】J Leukoc Biol. 72, 1011-9, 2002。
【非特許文献４７】J Leukoc Biol. 74, 1125-38, 2003。
【非特許文献４８】J Immunol. 170, 4465-74, 2003。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、ヒト非リンパ球系動物細胞を用いた天然型インターフェロンα（ＩＦＮ−α）の大量生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、哺乳動物の自然免疫系において病原体を認識し、抗ウイルス反応を誘導するトール様受容体（ＴＬＲ）が関与するシグナル伝達経路の解明とＩＦＮの誘導の関係について、特に、ＴＬＲのサブセット、ＴＬＲのリガンド、アダプターＭｙＤ８８、インターフエロン制御因子ＩＲＦ７等の相互作用及びＩＦＮ−αの産生誘導メカニズムの解明を目的に鋭意研究する中で、インターフエロン制御因子ＩＲＦ７が、ＩＦＮ−αの産生を誘導することを解明し、該ＩＲＦ７の恒常的活性を有する変異型遺伝子をヒト非リンパ球系細胞に導入することにより、ＩＦＮ−αの大量生産が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ＩＲＦ７の恒常的活性型の遺伝子を、ヒト細胞発現用ベクター等に組込んで、ヒト非リンパ球系細胞に導入し、発現することで、天然型のＩＦＮ−αを大量に生産することからなる。
【００１６】
本発明において、ＩＲＦ７の恒常的活性型の遺伝子として、ＩＲＦ７の抑制領域をコードする塩基配列の領域を削除した遺伝子、例えば、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から４０８に相当する領域、或いは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から２８５に相当する領域を削除した遺伝子を用いることで、更に、産生を高めることができる。また、本発明においては、本発明においてヒト非リンパ球系細胞に導入するＩＲＦ７の恒常的活性型の遺伝子として、上記のようなＩＲＦ７の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型機能を有するインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の変異型遺伝子を用いることができる。
【００１７】
更に、本発明においては、本発明においてインターフェロン制御因子ＩＲＦ７が、アダプターＭｙＤ８８、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ１９のようなＴＬＲ９リガンド、腫瘍壊死因子受容体因子ＴＲＡＦ６によって、活性化されることを解明したことにより、該アダプターＭｙＤ８８、ＴＬＲ９リガンド、或いは腫瘍壊死因子受容体因子ＴＲＡＦ６の遺伝子を、ＩＲＦ７とヒト非リンパ球系細胞に、コトランスフェクトすることにより、ＩＦＮの誘導を更に高めることができる。
【００１８】
すなわち具体的には本発明は、ヒト非リンパ球系動物細胞にインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子を導入することを特徴とする天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項１）や、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子が、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項２）や、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子が、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１又は２記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項３）や、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のコーディング領域を有する遺伝子であることを特徴とする請求項２又は３記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項４）や、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子が、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の抑制領域をコードする塩基配列の領域を削除した遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項５）からなる。
【００１９】
また本発明は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の抑制領域が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から４０８に相当する領域であることを特徴とする請求項５記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項６）や、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の抑制領域が、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から２８５に相当する領域であることを特徴とする請求項５記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項７）や、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子が、請求項３〜７のいずれか記載の恒常的活性型遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型機能を有するインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の変異型遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項８）や、ヒト非リンパ球系動物細胞が、ＨＥＫ−２９３細胞又は２９３−Ｆ細胞であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項９）や、請求項１〜８のいずれか記載のインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子を、ヒト細胞発現用ベクターに組込み、該組換えベクターをヒト非リンパ球系動物細胞に導入し、発現することを特徴とする天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項１０）からなる。
【００２０】
さらに本発明は、ヒト細胞発現用ベクターが、ｐＣＩｎｅｏ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ、又はｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯであることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項１１）や、ヒト細胞発現用ベクターに、ＭｙＤ８８の遺伝子をコトランスフェクトした発現用ベクターを用いることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項１２）や、ヒト細胞発現用ベクターに、ＭｙＤ８８及びＴＬＲ９の遺伝子をコトランスフェクトした発現用ベクターを用いることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項１３）や、ヒト細胞発現用ベクターに、ＴＲＡＦ６の遺伝子をコトランスフェクトした発現用ベクターを用いることを特徴とする請求項１０記載の天然型インターフェロンαの大量生産方法（請求項１４）や、請求項１〜１４のいずれか記載の方法により作出された天然型インターフェロンαを大量に産生するヒト非リンパ球系動物細胞（請求項１５）からなる。
【発明の効果】
【００２１】
従来、天然型ＩＦＮ−αは、リンパ球系の動物細胞を用い、センダイウィルスのような誘発剤を用いて製造されていたが、本発明により、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７を、ヒト非リンパ球系細胞に導入することで、ヒト非リンパ球系細胞によって、天然型ＩＦＮ−αの大量生産が可能となった。また、本発明によって、ヒト非リンパ球系細胞にＩＲＦ７の恒常的活性型の遺伝子として、ＩＲＦ７の抑制領域をコードする塩基配列の領域を削除した遺伝子を導入したり、或いは、ヒト非リンパ球系細胞にアダプターＭｙＤ８８、或いは腫瘍壊死因子受容体因子ＴＲＡＦ６の遺伝子を、ＩＲＦ７とコトランスフェクトすることにより、ＩＦＮの誘導を更に高めた天然型ＩＦＮ−αの大量生産方法を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、ヒト非リンパ球系動物細胞にインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子を導入することにより、天然型インターフェロンαを大量生産する方法よりなる。すなわち、本発明はインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の遺伝子、或るいは、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型機能を有するインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の変異型遺伝子を、ヒト細胞発現用ベクターに組込み、該組換えベクターをヒト非リンパ球系動物細胞に導入し、発現することにより、天然型インターフェロンαを大量生産する方法よりなる。本発明において用いられるインターフェロン制御因子ＩＲＦ７及びその遺伝子は、例えば配列表の配列番号２及び１に示されるアミノ酸配列及び塩基配列を有し、該遺伝子は、公知の遺伝子である（Nature 409(6821)685-690,2001）。該遺伝子の塩基配列及び該遺伝子のコードするアミノ酸配列については、ＮＣＢＩの遺伝子のデーターベースにおいて、アクセッションナンバー  ＮＭ_０１６８５０によりアクセスすることができる。
【００２３】
該恒常的活性型ＩＲＦ７の遺伝子は、上記配列に基いてプライマーを作製し、例えば、マウス脾臓細胞Ｃ５７／Ｂ６の遺伝子ライブラリーからＰＣＲ法を用いて取得することができる。本発明においては、ヒト非リンパ球系動物細胞に導入するインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子として、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の抑制領域をコードする塩基配列の領域を削除した遺伝子を用いることができ、該抑制領域をコードする塩基配列の領域を削除した遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から４０８に相当する領域を削除した遺伝子、或いは、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列の２３８から２８５に相当する領域を削除した遺伝子を用いることができる。また、本発明においては、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子として、前記遺伝子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型機能を有するインターフェロン制御因子ＩＲＦ７の変異型遺伝子を用いることができる。
【００２４】
なお、上記本発明の変異遺伝子において、「遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２５】
本発明において、本発明の天然型インターフェロンαを大量生産するヒト非リンパ球系動物細胞株の構築は、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子を、ヒト細胞発現用ベクターに組込み、ヒト非リンパ球系動物細胞に導入することにより行なうことができる。該ヒト細胞発現用ベクターとしては、公知のヒト細胞発現用ベクターを用いることができる。例えば、pCIneo (Promega)、pFLAG-CMV (SIGMA)、及びpCDNA5/FRT/TO (invitrogen)などの市販の発現用ベクターを用いることができる。
【００２６】
本発明で用いるヒト非リンパ球系動物細胞としては、公知のヒト非リンパ球系動物細胞を用いることができる。例えば、ＨＥＫ−２９３細胞（Human Embrionic Kidney 293細胞；ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１５７３）、或いは２９３−Ｆ細胞（Invitrogen  Corp.）を挙げることができ、該細胞の保存機関或いは販売先から入手することができる。本発明において、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子のヒト細胞発現用ベクターへの組込み、及び、該組換えベクターのヒト非リンパ球系動物細胞への導入自体は、この分野で公知の方法を用いて行うなうことができる。
【００２７】
本発明においては、天然型ＩＦＮ−αを大量生産するヒト非リンパ球系動物細胞株の構築に、インターフェロン制御因子ＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子をヒト非リンパ球系動物細胞に導入するに際して、ヒト非リンパ球系細胞にアダプターＭｙＤ８８、或いは腫瘍壊死因子受容体因子ＴＲＡＦ６の遺伝子を、ＩＲＦ７とコトランスフェクトすることにより、ＩＦＮの誘導を更に高めることができる。
【００２８】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［ＩＲＦ７によるＩＦＮ−αの誘導、及び、ＭｙＤ８８、ＴＬＲ９リガンド、ＴＲＡＦ６によるＩＲＦ７の活性化］
（ＭｙＤ８８結合タンパク質としてのＩＦＲ７の同定）
ＭｙＤ８８依存性経路のダウンストリーム現象を解明するために、本発明者は、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーに、ＭｙＤ８８のデスドメインをベイトとして用いて、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。〜１×１０６の形質転換体をスクリーニングしたところ、７個のクローンを陽性と同定した。これらのクローンの内２個がＩＲＦ７タンパク質のＣ末端部分をコードすることが配列解析により明らかになった（アミノ酸２７９〜５０３、マウスＩＲＦ７の２３４−４５８に対応）。ＭｙＤ８８及びＩＲＦ７の相互作用を、まず酵母ツーハイブリッド法で分析し、免疫共沈降実験により哺乳類ＨＥＫ２９３細胞で確認した。酵母ツーハイブリッド法では、酵母をＭｙＤ８８−ＤＤ又はＴＩＲをコードするプラスミドと、スクリーニングにより得たＩＲＦ７のＣ末端領域をコードするプラスミド（図１ａ）とを同時形質転換した。
【００３０】
ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃでタグ標識したＭｙＤ８８をコードするプラスミドと、ＦＬＡＧでタグ標識したＩＲＦ７、ＦＬＡＧでタグ標識したＩＲＦ７△２３８−４０８又はＦＬＡＧでタグ標識したＩＲＦ３をコードするプラスミドとを、トランジェントにトランスフェクションした。ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７は、Ｍｙｃ−ＭｙＤ８８をトランスフェクトした細胞内の抗Ｍｙｃ抗体と免疫共沈降した。他方、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７△２３８−４０８もＦＬＡＧ−ＩＲＦ３のいずれも、抗Ｍｙｃ抗体と、免疫共沈降しなかった（図１ｂ）。アミノ酸２３８と４０８間の領域が、ＩＲＦ７の抑制領域に対応するため、これらの結果は、ＩＲＦ７の抑制領域がＭｙＤ８８との会合に必須であることを示唆している（Mol Cell Biol. 20, 8803-14, 2000）。
【００３１】
更に、ＩＲＦ７の欠失変異体を構築し、（図１ｃ、ＦＬ；全長、△１；１−３９７、△２；１−３２６、△３；１−２９４、△４；１−２８５、△５；１−２３７）、相互作用を調べた。ＨＥＫ２９３細胞で発現しているＦＬＡＧ−ＩＲＦ７ＦＬ、△１、△２、△３及び△４は、抗Ｍｙｃ抗体と免疫共沈降し、ＩＲＦ７のアミノ酸２３８と２８５の間の領域が相互作用に必須であることを示した（図１ｄ）。次に、内在性ＭｙＤ８８及びＦＬＡＧ−ＩＲＦ７の相互作用は、ＭｙＤ８８を認識する特異的抗体を用いて調べた。ＨＥＫ２９３細胞内にトランジェントなトランスフェクションで発現したＦＬＡＧ−ＩＲＦ７は、２個の異なる抗ＭｙＤ８８抗体（Ａｂ１、Ａｂ２）で免疫共沈降し、内在性ＭｙＤ８８と過剰発現したＩＲＦ７との相互作用を示唆した（図１ｅ）。同じ細胞可溶化液を、一定分量に二等分し、同量のタンパク質の付加を確実にした（図１ｅ、下）。
【００３２】
生細胞内のＭｙＤ８８及びＩＲＦ７の細胞内局在と物理的相互作用とをさらに分析した。ＨＥＫ２９３細胞にＭｙＤ８８−ＹＦＰ及びＩＲＦ７−ＣＦＰをトランスフェクトし、方法の章に記載の方法で、倒立蛍光顕微鏡で視覚化した。ＩＲＦ７−ＣＦＰ（青）は、細胞質内に散在して発現するが、ＭｙＤ８８−ＹＦＰは、細胞質内で凝縮して発現した（図２ａ）。細胞にＩＲＦ７−ＹＦＰ及びＭｙＤ８８−ＣＦＰとをトランスフェクトした時にも、同様の共在及び物理的相互作用を観察した（データは示されていない）。この観察は、さらに、ＭｙＤ８８とＣＦＰ又はＹＦＰのいずれかで融合したＩＲＦ７又はＩＲＦ３との間のＦＲＥＴをフローサイトメトリーで測定して、確認した。ＨＥＫ２９３細胞に、ＣＦＰ又はＹＦＰを発現する一対の分子をトランスフェクトしたときには、ＩＲＦ７とＭｙＤ８８を発現するが、ＩＲＦ３とは発現しない細胞だけが強いＦＲＥＴシグナルを示し、生細胞の細胞質内で、ＭｙＤ８８が、ＩＲＦ７とは直接相互作用するが、ＩＲＦ３とはしないことを示唆した（図２ｂ）。
【００３３】
（ＭｙＤ８８によるＩＲＦ７の活性化）
ＭｙＤ８８とＩＲＦ８８との相互作用を見い出したことにより、ＩＲＦ７がＭｙＤ８８依存性経路によるＩＦＮα／βの産生に関与していることを調査することを促した。そのため、先ず本発明者は、レポーターアッセイにより、ＩＲＦ７がＩＦＮα及びＩＦＮβを活性化するの能力があるかどうかを調べた。ＨＥＫ２９３細胞に、記載した量のＩＲＦ７又はＩＲＦ３をコードする発現プラスミドと、ＩＦＮα４−、ＩＦＮα６−又はＩＦＮβプロモーターにより決定したレポータープラスミドとを、トランジェントにコトランスフェクトし、トランスフェクションの３６時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＩＲＦ７の発現は、用量依存的にＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモータの活性化を誘因したが、ＩＲＦ３が過剰発現したときには、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターの導入は観察されなかった（図３a）。
【００３４】
他方、ＩＦＮβ依存性プロモーターはＩＲＦ３が過剰発現するときに活性化した。ＩＲＦ７の過剰発現は、ＩＦＮβプロモーターの活性も増加したが、ＩＲＦ３と比較すると活性は低かった。つまり、これらの結果は、ＩＲＦ７は選択的にＩＦＮαプロモーターを活性化させる能力を有していることを示唆している。次に、アミノ酸２３８〜２８５が欠損しているＩＲＦ７変異体を用いて、ＨＥＫ２９３細胞内のＩＦＮαプロモーター活性も測定した。図３ｂに示すように、ＩＲＦ７△２３８−２８５は、ＩＲＦ７  ＦＬよりも強力に、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーター活性を亢進した。これは、２３８〜２８５のアミノ酸を除去すると、常時活性型になるという報告と一致した。ＩＲＦ７の発現が内在性ＩＦＮα産生を誘導するかどうかを調べるために、ＥＬＩＳＡを行った。ＩＲＦ７△２３８〜２８５をトランスフェクトした細胞の培養上澄でＩＦＮαの産生が観察され、ＩＲＦ７の活性化が、少なくともＨＥＫ２９３細胞においてＩＦＮαの産生と関連していることを示した（図３ｃ）。
【００３５】
次に、本発明者は、ＭｙＤ８８がＩＲＦ７の転写活性を亢進するかどうか調べた。そのために、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＲＦ７、ＭｙＤ８８又はその組み合わせをコードするプラスミドと、ＩＦＮα４又はＩＦＮα６プロモーターをハーバリングするレポータープラスミドとをトランジェントにコトランスフェクトした。この実験では、ＩＦＮαプロモーターの活性化には、量が不足していたので、トランスフェクションに少量のＩＲＦ７プラスミド（１．０ｎｇ）を用いた。ＭｙＤ８８のみのトランスフェクションは、ＩＦＮα４もＩＦＮα６プロモーターのいずれも活性化しなかった（図３ｄ）。しかし、両方のプラスミドを同時にトランスフェクトすると、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターの活性化の相乗作用を観察した。他方、ＭｙＤ８８及びＩＲＦ３の共発現は、どのＩＦＮαプロモーターの活性も引き起こさなかった（図３ｄ）。次に、ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＭｙＤ８８をコードするプラスミドと、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７又はＦＬＡＧ−ＩＲＦ３とをトランジェントにトランスフェクトした。
【００３６】
細胞を溶解し、抗ＦＬＡＧ抗体と免疫沈降し、次に抗ＦＬＡＧ抗体とブロットした。特に、Ｍｙｃ−ＭｙＤ８８と共発現する細胞で、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７のslow migrating formを観察した（星印で示す）（図３ｅ）。可溶化液に脱リン酸酵素処理を行ったところ、これらのゆっくりと遊走するバンドが減少し、ＩＲＦ７は、可溶化液内に存在するＭｙＤ８８プロテイン質キナーゼにより、リン酸化することを示唆した。反対に、ＩＲＦ３タンパク質の遊走は、ＭｙＤ８８を共発現する細胞では観察されず、ＩＲＦ３がＭｙＤ８８依存性経路により活性化されることを示した結果と一致した。これらの結果は、ＭｙＤ８８がＩＲＦ７のリン酸化を誘導し、ＩＲＦ７の活性化に関与していることを示した。
【００３７】
（ＩＲＦ７のＴＬＲ９リガンドによる、ＭｙＤ８８依存的活性化）
ＴＬＲ９リガンドであるＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ１９が、ｐＤＣによるＩＦＮαの産生を誘導する強い能力を有し、この誘導がＭｙＤ８８欠損マウスでは完全に消失していることが、以前に示されていた（J Immunol. 170, 3059-64, 2003）。本研究者らは、他のＣｐＧオリゴヌクレオチドであるＤ３５刺激によってｐＤＣからＩＦＮαを誘導するには、ＭｙＤ８８が必須であることを確認した（J Immunol. 166, 2372-7, 2001）。ｐＤＣを含む野生型（ＷＤ）又はＭｙＤ８８欠損マウス由来の脾細胞及びＦｌｔ３リガンド誘発骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５で刺激し、ＩＦＮαの産生をＥＬＩＳＡで測定した。図４ａで示すように、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５は、野生型の脾細胞及びＦｌｔリガンド誘発ＤＭＤＣの培養上澄で、ＩＦＮαの産生を誘導した。対照的に、ＭｙＤ８８欠損細胞では、ＩＦＮαの誘導は観察されなかった。つまり、ＴＬＲ９リガンドによるＩＦＮαの産生は、ＭｙＤ８８依存性経路により制御されている。
【００３８】
非刺激状態で、ＩＲＦ７が細胞質に存在することが示されていた。ウイルス感染すると、ＩＲＦ７はリン酸化し、核に転移し、ターゲット遺伝子の発現を制御する（Science 300, 1148-51, 2003、J Biol Chem. 275, 34320-7, 2000）。本研究者らは、ＩＲＦ７がＴＬＲ９リガンドにより活性化されているか否かを調べた。野生型及びＭｙＤ８８欠損マウスの脾細胞を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５で刺激し、抗ＩＲＦ７抗体又は抗ＮＦκＢｐ６５抗体を用いて、核タンパク質をウェスタンブロットにより分析した。図４ｂに示すように、Ｄ３５による刺激の１時間後に、野生型の細胞で、ＩＲＦ７の転移を観察した。対照的に、ＭｙＤ８８欠損細胞では、Ｄ３５に応答して、ＩＲＦ７は核に移動しなかった。この結果は、ＩＲＦ７はＴＬＲ９−ＭｙＤ８８依存性経路により活性化していることを示している。ＮＦ−κＢ  ｐ６５も、野生型細胞ではＤ３５に応答して、核に移動したが、ＭｙＤ８８欠損細胞では移動しなかった。
【００３９】
（ＴＲＡＦ６によるＩＲＦ７の活性化）
炎症性サイトカインの産出及びＮＦ−κＢ活性の点から見て、ＴＲＡＦ６欠損マウスの胎性繊維芽細胞は、ＩＬ−１及びＴＬＲリガンドが欠損していると報告されていた。しかし、ＬＰＳ誘発ＮＦ−κＢ活性は、遅延してたが、ＴＲＡＦ６欠損細胞内に残っていた。更に、ＩＦＮ誘導性遺伝子も、ＴＲＡＦ６／ＭｙＤ８８欠損細胞内のＬＰＳにより誘導されていた（J. Immunol. 167, 5887-94, 2001）。これらの表現型は、ＭｙＤ８８欠損マウスの表現型にかなり類似している。つまり、ＴＲＡＦ６は、ＭｙＤ８８依存性経路に関与しているようである。そこで本研究者らは、ＴＲＡＦ６がＩＲＦ７の活性化にも関与しているかどうか調べた。レポーターアッセイによる測定によると、ＴＲＡＦ６だけがＨＥＫ細胞に過剰発現しても、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６依存性プロモーターを増加するには、十分でなかった（図５ａ）。しかし、ＴＲＡＦ６とＩＲＦ７の共発現は、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６依存性プロモーター両方の活性を著しく増加した。ＩＲＦ７結合の欠失と同じく、ＴＲＡＦ２の共発現は、ＩＦＮα４、ＩＦＮα６プロモーターのいずれも活性化しなかった。さらに、ＴＲＡＦ６で共発現すると、ＩＲＦ３の発現は、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターの活性を誘因しなかった（図５ａ）。
【００４０】
Ｃ末端ＴＲＡＦドメイン（ＴＲＡＦ６Ｃ）だけをコードする切断型ＴＲＡＦ６変異体は、ＴＬＲによってＮＦ−κＢの活性化に干渉する優性抑制型変異体（dominant negative mutant）として作用することが報告されている。ＭｙＤ８８とＩＲＦ７との共発現によるＩＦＮα６プロモーターの活性化は、ＴＲＡＦ６ＣがＨＥＫ２９３細胞で共発現したときには、消失し、ＴＲＡＦ６がＭｙＤ８８によるＩＲＦ７活性化に必須であることを示唆した（図５ｂ）。ＩＦＮαプロモーターの活性化のＴＲＡＦ６依存性をさらに確認するために、野生型及びＴＲＡＦ６欠損マウスの胎性繊維芽（ＭＥＦ）細胞を用いてレポーターアッセイを行った。ＭＥＦ細胞に、ＩＦＮα６依存性プロモータープラスミドと、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７をコードする発現プラスミドの組み合わせとを、トランジェントにコトランスフェクトした。図５ｃに示すように、ＭｙＤ８８及びＩＲＦ７の共発現は、野生型ＭＥＦのＩＦＮα６プロモーターを活性化したが、ＴＲＡＦ６欠損ＭＥＦでは活性化しなかった。
【００４１】
ＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７の共発現は、野生型ＭＥＦ及びＴＲＡＦ６欠損ＭＥＦの両方で、同じ程度にＩＦＮα６プロモーターの活性化を増加した。つまり、これらの結果はＴＲＡＦ６がＭｙＤ８８が介するＩＲＦ７活性化に必須であることを示唆している。次に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７とＭｙＣ−ＴＲＡＦ６又はＭｙＣ−ＴＲＡＦ２とを、トランジェントにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いて、免疫共沈降の実験を行い、ＴＲＡＦ６もＩＲＦ７と結合するか否かを調べた。図５ｄに示すように、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７は、Ｍｙｃ−ＴＲＡＦ６を発現する細胞内で抗Ｍｙｃ抗体と共沈降したが、Ｍｙｃ−ＴＲＡＦ２を発現する細胞内では共沈降しなかった。更に、ＴＲＡＦ６を共発現する細胞で、ＩＲＦ７のゆっくりと遊走する形が観察されたが、ＴＲＡＦ２を共発現する細胞では観察されなかった（図５ｄ、星印で示す）。
【００４２】
ＩＲＦ７の一連の欠失変異体（deletion mutant）を用いて、ＴＲＡＦ６との相互作用に関与する領域を探した。Ｍｙｃ−ＴＲＡＦ６は、ＩＲＦ７  ＦＬ、△１、△２、△３及び△４と共沈降したが、△５とは共沈降せず、ＭｙＤ８８も相互作用するアミノ酸２３８〜２８５間の領域が、ＴＲＡＦ６との相互作用に必須であることを示唆した（図５ｅ）。ＴＲＡＦ６のＣ末端ＴＲＡＦドメインをコードするプラスミドが、ＩＲＦ７△４と共発現するときに、相互作用が観察され、ＴＲＡＦ６のＴＲＡＦドメインがＩＲＦ７と結合することを示した（データは示されていない）。
【００４３】
（ＴＲＡＦ６のユビキチンリガーゼ活性とＩＲＦ７の活性化）
ＴＲＡＦ６が共発現すると、ＩＲＦ７タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でゆっくりと移動することを見い出したことが、ＩＲＦ７の活性化には、いくつかのタンパク質の修飾が必須であることを示唆した。そこで、本発明者は、ゆっくりとした移動が、ユビキチン化によるものかを調べた。なぜならＴＲＡＦ６は、リシン６３結合ユビキチン化合成を触媒するユビキチンＥ３リガーゼ活性を有するとされてきたからである（Cell 103, 351-61, 2000）。そのために、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７とＭｙｃ−ＴＲＡＦ６又はＭｙｃ−ＭｙＤ８８とを、トランジェントにコトランスフェクトし、その後、抗ＦＬＡＧ抗体と免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ユビキチン抗体とウェスタンブロットを行った。図６ａに示すように、約１５０ｋＤａのＦＬＡＧ−ＩＲＦ７のゆっくりとした遊走は、ＴＲＡＦ６を過剰発現する細胞で、より強く誘導されていたが、ＭｙＤ８８を過剰発現する細胞では誘導されなかった。更に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７及びＭｙｃ−ＴＲＡＦ６を共発現する細胞から調製した抗ＦＬＡＧ抗体免疫沈殿物でもユビキチン化が観察された。
【００４４】
この結果は、ＴＲＡＦ６が、ＩＲＦ７のユビキチン化を誘導するか、又はユビキチン化したＴＲＡＦ６がＩＲＦ７と会合することを示唆している。ユビキチン化が、ＴＲＡＦ６が介するＩＲＦ７活性化に必須であるか否かを調べるために、本研究者らは、ｓｉＲＮＡ実験を行いＵｂｃ１３遺伝子をサイレントにした。図６ｂで示すように、ヒトＵｂｃ１３遺伝子に相当するｓｉＲＮＡオリゴの混合物とトランジェントにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で、Ｕｂｃ１３遺伝子の発現が減少した。この状況で、ＴＲＡＦ６を介したユビキチン化を調べた。図６ｃに示すように、ＩＲＦ７のゆっくりとした遊走は、Ｕｂｃ１３特異的ｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞（Ｕで示す）では、コントロールである細胞（Ｃで示す）と比較すると、著しく減少した。更に、ＴＲＡＦ６が介するユビキチン化は、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞でも減少した（図６ｃ、右パネル）。
【００４５】
次に、ＩＦＮαプロモーターの活性化に対するＵｂｃ１３遺伝子のノックダウンの効果を調べた。ＩＲＦ７及びＭｙＤ８８の共発現によるＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターの活性化は、Ｕｂｃ１３ｓｉＲＮＡ処理によって減少した（図６ｄ）。ＩＦＮα４及びＩＦＮα６プロモーターの活性化は、Ｕｂｃ１３特異的ｓｉＲＮＡで処理したＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７を共発現する細胞で減少した。つまり、これらの結果は、ＴＲＡＦ６のユビキチンリガーゼ活性がＩＲＦ７の活性化に必須であることを示している。
【００４６】
（ＩＲＦ７の活性化とＩＦＮの誘導）
上記のとおり、本発明者らの現在のデータは、ＴＲＡＦ６が、ユビキチン依存的に、ＩＲＦ７と会合し、活性化することを示している。したがって、ユビキチン化したＴＲＡＦ６及びＴＡＫ１からなる複合体によるＩＫＫ活性化と並行して、ＩＲＦ７は、ユビキチン化したＴＲＡＦ６及びＭｙＤ８８キナーゼからなる複合体により活性化されると思われる（図７）。ＴＬＲ７、８又は９のダウンストリームで作用するＩＲＦ７キナーゼを同定することは、将来的に必要であるが、本発明者らの現在の研究では、ＩＲＦ７が、ＭｙＤ８８及びＴＲＡＦ６との複合体形成を通して、ＴＬＲ７、８及び９が介するＩＦＮα導入における主要な制御因子として働くことを示した。
【００４７】
［試験方法及び材料］
（発現プラスミド）
ＩＦＮα４又はＩＦＮα６遺伝子のプロモーター領域を、ｐＧＬ３ベクター（Promega社製）に挿入して、ＩＦＮα４及びＩＦＮα６のレポーターコンストラクトを作出した。ＩＦＮα４及びＩＦＮα６の開始部位に相当する−４７６〜＋１９及び−４３２〜＋２２をコードするマウスゲノムＤＮＡからＰＣＲにより産出した断片を、ベクターのHindIII 及びNheI/HindIII部位にそれぞれクローニングした。ＩＦＮβプロモーターコンストラクトは、文献に記載されている（J Immunol. 169, 6668-72, 2002）。ヒトＭｙＤ８８、ＭｙＤ８８ＤＤ（ａａ１−１５１）、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６及びＴＲＡＦ６Ｃ（ａａ２９０−５２２）の断片を、ＲＴ−ＰＣＲにより入手し、ｐＥＦ−ＢＯＳに結合し、Ｍｙｃでタグ標識したタンパク質を発現した。マウスＩＲＦ７の全長、ＩＲＦ７の一連の欠失変異体、及びヒトＩＲＦ３の全長をＲＴ−ＰＣＲにより入手し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２ベクター（Sigma社製）のEcoRI及びSalI部位に結合した。２３８〜４０８が欠損した欠失ＩＲＦ７をＰＣＲにより合成し、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２に結合した。
【００４８】
ＩＲＦ７又はＭｙＤ８８−ＣＦＰ又はＹＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドを、本質的に文献記載の通り、構築した（Nature 411, 1065-8, 2001）。要約すると、ＭｙＤ８８をコードするヒトｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ｃＤＮＡ断片を、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｌａｇ−ｍ１ＳＥＣＦＰ又はｐＣＡＧ−Ｈｉｓ−ＶｅｎｕｓのXhoI又はNoti部位に導入した。ＰＣＲにより入手したヒトＭｙＤ８８、ＩＲＦ３又はＩＲＦ７を、挿入遺伝子のアミノ末端及びカルボキシ末端で黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）をコードするｐＣＡＧ及びｐＣＡＧＧＳベクターXhoI-NotI部位に挿入した（Mol Cell Biol. 22, 6582-91, 2002）。全てのコンストラクトの配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems社製)により確認した。
【００４９】
（細胞、抗体及び試薬）
野生型（１２９、Ｂ６  バックグランド）及びＭｙＤ−／−マウス由来の脾単細胞懸濁液を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Gibco BRL社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco BRL社製）内で４８時間培養した。マウス骨髄細胞（１×１０５細胞／ウェル）をＦｌｔ３リガンド（１０ｎｇ／ｍｌ；R & D Systems社製）と、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地内で、９日間培養した。野生型及びＴＲＡＦ６−／−欠損マウス由来ＭＥＦ細胞は、文献記載の通り調製した。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。抗ＭｙＤ８８抗体及び抗ＴＲＡＦ６抗体は、それぞれProSci及びSanta Cruzより購入した。抗ＩＲＦ７抗体及び抗Ｕｂｃ１３抗体をZymedより入手した。ＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５は、文献記載の通り合成した。
【００５０】
（酵母ツーハイブリッドスクリーニング）
酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、文献（J Immunol. 171, 4304-10, 2003）記載の通り、Matchmaker two-hybrid system 3（Clontech Laboratories）を用いて行った（J Immunol. 171, 4304-10, 2003）。ヒトＭｙＤ８８８（ａａ１〜１５１）のＮ末端デスドメインは、ｐＧＢＫＴ７のＧａｌ４  ＤＮＡ結合領域にインフレームでクローニングして、ベイトプラスミドを構築した。酵母株ＡＨ１０９をバイトプラスミド及びヒト脾臓Matchmaker cDNAライブラリーとで、同時形質転換した。１×１０６クローンをスクリーニングした後、陽性のクローンを集め、ｐＡｃＴ２ライブラリープラスミドを、個々のクローンから回収し、大腸菌で膨張した。挿入ｃＤＮＡをシークエンシングし、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて特徴を示した。
【００５１】
（ＦＲＥＴ）
コラーゲンでコーティングしたグラス皿に載せたＨＥＫ２９３細胞を、文献記載の通り、撮像した。要約すると、細胞を、冷却ＣＣＤカメラを装備し、MetaMorph softwareにより制御された倒立顕微鏡で撮像した（Universal Imaging社製）。ＹＦＰ又はＣＦＰで融合した、一対のタンパク質が、ＨＥＫ−２９３細胞で発現した。以下のフィルターセットを用いて、細胞を撮像した：ＣＦＰ画像には、ＭＸ０４２０励起フィルター及びＢＰ４７０−４９０発光フィルター（オリンパス社製）；ＦＲＥＴ画像には、ＭＸ０４２０励起フィルター及び５３５ＤＦ３５発光フィルター（Omega Optical Inc社製）；ＹＦＰ画像には、５１０ＤＦ２３励起フィルター及び５６０ＤＦ１５発光フィルター（Omega Optical Inc社製）。ＸＦ２０５２二色性鏡（Omega Optical Inc社製）を実験を通して使用した。露出時間は、ＣＦＰ及びＦＲＥＴ画像には２００ｍｓｅｃで、ＹＦＰ画像には１００ｍｓｅｃであった。データを入手後、ＣＦＰ、ＦＲＥＴ及びＹＦＰの平均強度を測定し、ＦＲＥＴコンポーネント（“訂正”ＦＲＥＴ、ＦＲＥＴＣ）からなるＦＲＥＴフィルターセットを通して蛍光を計算した。非ＦＲＥＴコンポーネントを、文献（Curr. Biol. 10, 1395-1398, 2000）記載の通り差し引いた。
【００５２】
本発明者の実験の条件として、次の方程式を使用した：ＦＲＥＴＣ＝ＦＲＥＴ−（０．３４×ＣＦＰ）−（０．０２×ＹＦＰ）。ＦＲＥＴのフローサイトメトリー分析用に、ＣＦＰ及び／又はＹＦＰ融合タンパク質と、上記記載の通りトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、２９３発現培地（Invitrogen社製）に再懸濁し、ＦＡＣ  aria（ＢＤ）及びＢＤ  ＦＡＣＳＤｉＶａ softwareを用いて、ＹＦＰ（励起：４８８ｎｍ；発光：５３０ｎｍ）、ＣＦＰ（励起：４０７ｎｍ；発光：５１０ｎｍ）、ＦＲＥＴ（励起：４０７ｎｍ；発光：５３５ｎｍ）を測定した。ＦＲＥＴは、ＣＦＰ励起をＣＦＰ発光で割り、ＣＦＰ励起で割って入手したＹＦＰ励起として示す。
【００５３】
（トランスフェクション、免疫沈降及びウェストブロット分析）
１００万個のＨＥＫ２９３細胞を１００ｍｍ皿に蒔いた。１２時間後、細胞に、Lipofectamine 2000 (Invitrogen社製)を用いて、合計６．０μｇの空又は記載した量のプラスミドをトランジェントにトランスフェクトした。免疫沈降及びウエスタンブロット分析を、文献（J Immunol. 171, 4304-10, 2003）記載の通り行った。
【００５４】
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
２４ウェルプレートに蒔いたＨＥＫ２９３細胞（１×１０５細胞／ウェル）又６ウェルプレートにまいたＭＥＦ細胞（２×１０５細胞／ウェル）に、ルシフェラーゼレポータープラスミド１００ｎｇと、合計９００ｎｇ記載した発現ベクターとを、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、Dual-luciferaseレポーターアッセイシステム（Promega社製）を用いて、全細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性を測定した。Renilla-luciferaseレポーター遺伝子５０ｎｇを、同時にトランスフェクトし、内部コントロールとして用いた。
【００５５】
（ＥＬＩＳＡ）
脾単細胞懸濁液（５×１０５細胞／ウェル）又はＦｌｔ−Ｌ誘発骨髄細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、３μＭのＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５で、２４時間刺激した。ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７又はＩＲＦ７△２３７−４０８をトランジェントにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、２４時間培養した。上澄のサイトカインＩＦＮαを、から製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡで測定した（ＰＢＬ  Bio. Lab,社製）。
【００５６】
（ＲＮＡインターフェランス）
６０ｍｍ皿に蒔いたＨＥＫ２９３細胞は２１−ヌクレオチド相補ＲＮＡと、対称的な２個のヌクレオチドオーバーハングで、Lipofectamine 2000を用いて、製造者の指示に従って、トランスフェクトした。Ｕｂｃ１３遺伝子をターゲットした４個のｓｉＲＮＡ（UCAAAGCCGAACCAGAUGA、AAGUACGUUUCAUGACCAA, UCCUAAUGUAGACAAGUUG、 GAUCCGCACAGUUCUGCUA）
を混合した（Nature 427, 167-71, 2004）。４８時間後、細胞にプラスミドをトランスフェクトし、更に、３６時間培養した。
【００５７】
［図の説明］
図１．ＭｙＤ８８のＩＲＦ７との会合を示す。
（ａ）ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインまで融合したＭｙＤ８８又はＭｙＤ８８ＴＩＲを発現するプラスミドと、ＧＡＬ４トランス活性化ドメインまで融合したＩＲＦ７Ｃを発現するプラスミドとを、同時形質転換した。トリプトファン、ロイシン及びヒスチジンを欠失した培地（Ｗ−Ｌ−Ｈ−）で細胞が成長する能力により、相互作用を検知した。トリプトファン及びロイシンを欠失したプレート（Ｗ−Ｌ−）上で細胞が成長する能力が、トランスフェクションの効率を示している。
【００５８】
（ｂ）ＨＥＫ細胞に、ＦＬＡＧでタグ標識したＩＲＦ７、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７△２３８−４０８、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ３及びＭｙｃ−ＭｙＤ８８を記載した組み合わせで、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液は、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で免疫沈降（ＩＰ）し、その後抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＭｙＣ抗体でウェスタンブロット（ＷＢ）した。
【００５９】
（ｃ）ＩＲＦ７欠失変異体の模式図
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７欠失変異体及びＭｙｃ−ＭｙＤ８８の記載した組み合わせを、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液は、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で免疫沈降（ＩＰ）し、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＭｙＣ抗体でウェスタンブロット（ＷＢ）した。
【００６０】
（ｅ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７をコードするプラスミド２．０μｇを、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液は、コントロールウサギ抗マウスＩｇ血清（ＣＮＴＬ）、抗ＭｙＤ８８抗体（Ａｂ１）または他の抗ＭｙＤ８８抗体（Ａｂ２）と免疫沈降した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離し、ニトロセルロースに移動し、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体でブロットした（上パネル）。一定分量の全細胞可溶化液に、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットを同時に行った（下パネル）。
【００６１】
図２．ＦＲＥＴ分析により決定したＭｙＤ８８及びＩＲＦ７の共存を示す。
（ａ）ＭｙＤ８８−ＹＦＰ（黄）及びＩＲＦ７−ＣＦＰ（青）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、及びＦＲＥＴ（擬似色）により決定したこれら２つの分子の物理的相互作用を、「方法」の項に記載の通りに視覚化した。
（ｂ）記載された通りに、ＣＦＰ又はＹＦＰのいずれかで融合したＭｙＤ８８、ＩＲＦ７及びＩＲＦ３を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。上パネル：ＣＦＰ発光とＣＦＰ励起による蛍光強度、単細胞のＣＦＰ励起によるＹＦＰ発光をＸ軸、Ｙ軸それぞれに点で示した。ＣＦＰ励起により、ＹＦＰ及びＣＦＰ両方に対し陽性の細胞は、ＦＲＥＴとしてgated areaに示した。下パネル：ＩＲＦ３又はＩＲＦ７−ＣＲＰ及びＭｙＤ８８−ＹＦＰの算出したＦＲＥＴを示した。
【００６２】
図３．ＭｙＤ８８によるＩＲＦ７の活性化
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＲＦ７をコードする０、１、１０、１００、５００ｎｇの発現プラスミド（レーン１〜５）、又は１、１０、１００、５００ｎｇのＩＲＦ３（レーン６〜９）と、ＩＦＮα４−、ＩＦＮα６−又はＩＦＮβ依存性プロモータープラスミドとを、トランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。
【００６３】
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１００ｎｇのＩＲＦ７ＦＬ又はＩＲＦ７△２３８〜４０８と、ＩＦＮα４−又はＩＦＮα６−依存性プロモータープラスミドとを、トランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα４−、ＩＦＮα６−依存性プロモーター活性化を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。
【００６４】
（ｃ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＲＦ７  ＦＬ又は△２３８〜４０８をトランジェントにトランスフェクトした。２４時間後、培養上澄のＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００６５】
（ｄ）２４ウェルプレート上に蒔いたＨＥＫ２９３細胞に、１．０ｎｇのＩＦＲ７、１．０ｎｇのＩＲＦ３、１００ｎｇのＭｙＤ８８の組み合わせと、１００ｎｇのＩＦＮα４−及びＩＦＮα６レポータープラスミドとを、トランジェントにコトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα４及びＩＦＮα６依存性プロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。
【００６６】
（ｅ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＭｙＤ８８、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７及びＦＬＡＧ−ＩＲＦ３の記載された組み合わせを、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、その後抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＭｙＣ抗体でウェスタンブロットした。星印はＩＲＦ−７及びＭｙＤ８８でコトランスフェクトした細胞で、ゆっくりと遊走しているバンドを示す。
【００６７】
図４．ＴＬＲ９リガンドによる、ＩＲＦ７のＭｙＤ８８依存性活性を示す。
（ａ）脾細胞（左）Ｆｌｔ３誘発骨髄ＤＣ（右）を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５で刺激した。２４時間後、培養上澄のＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
（ｂ）野生型及びＭｙＤ８８欠損マウスの脾細胞を１又は３時間、Ｄ３５で刺激した。核タンパク質を調製し、抗ＩＲＦ７抗体（左）及び抗ｐ６５５抗体（右）を用いて、ウェスタンブロットを行った。
【００６８】
図５．ＴＲＡＦ６によるＩＲＦ７の活性化を示す
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、１．０ｎｇのＩＦＲ７、１．０ｎｇのＩＲＦ３、５０ｎｇのＴＲＡＦ２又は５０ｎｇのＴＲＡＦ６のプラスミドの組み合わせと、１００ｎｇのＩＦＮα４−及びＩＦＮα６レポータープラスミドとを、トランジェントにコトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα４及びＩＦＮα６依存性プロモーター活性をレポーター遺伝子アッセイにより、分析した。
【００６９】
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、１．０ｎｇのＩＲＦ７、５０ｎｇのＭｙＤ８８及び５０ｎｇのＴＲＡＦ６Ｃのプラスミドの組み合わせと、ＩＦＮα６プロモーターを有するレポータープラスミドとを、トランジェントにコトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα６依存性プロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。
【００７０】
（ｃ）野生型又はＴＲＡＦ６欠損マウスのＭＥＦ細胞に、１．０ｎｇのＩＲＦ７、１００ｎｇのＭｙＤ８８及び１００ｎｇのＴＲＡＦ６の記載された組み合わせと、ＩＦＮα６プロモーターをハーバリングするレポータープラスミドとを、トランジェントにトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα６依存性プロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した。
【００７１】
（ｄ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＴＲＡＦ６及びＦＬＡＧ−ＩＲＦ７欠失変異体の記載された組み合わせを、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液は、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、その後抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体でウェスタンブロットを行った。
【００７２】
図６．ＩＦＲ７活性化と、ＴＲＡＦ６のユビキチンＥ３リガーゼ活性について示す。
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７、Ｍｙｃ−ＭｙＤ８８及びＭｙｃ−ＴＲＡＦ６をコードするプラスミドの記載された組み合わせを、トランジェントにトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を調製し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した。免疫沈降物を２本の管に分け、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ユビキチン抗体（Ｕｂ）を用いて、ウェスタンブロットを行った。
【００７３】
（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、Ｕｂｃ１３遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの混合物をリポフェクションにより、トランジェントにトランスフェクトした。４８時間後、Ｕｂｃ１３の発現を、全細胞可溶化液のウェスタンブロット分析で、抗Ｕｂｃ１３モノクローナル抗体を用いて分析した。
【００７４】
（ｃ）コントロール又はＵｂｃ１３特異的ｓｉＲＮＡの混合物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、更に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７及びＭｙｃ−ＴＲＡＦ６をコードするプラスミドの指定された組み合わせでトランスフェクトした。３６時間後、細胞可溶化液を、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｕｂ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
【００７５】
（ｄ）コントロール又はＵｂｃ１３特異的ｓｉＲＮＡの混合物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７をコードするプラスミドの記載した組み合わせと、ＩＦＮα４又はＩＦＮα６プロモーターをハーバリングするレポータープラスミドとを、更にトランスフェクトした。３６時間後、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した。
【００７６】
図７．ＴＬＲ７、８及び９のダウンストリームのＩＲＦ７活性化モデルについて示す。
ＴＬＲ７、８、９リガンドで刺激する時に、ＩＲＦ７をＭｙＤ８８に漸加し、ＭｙＤ８８と会合するプロテインキナーゼでリン酸化する。ＴＲＡＦ６は、ユビキチン依存的に、ＩＲＦ７に会合し、活性化させる。活性化したＩＲＦ７は細胞質から核に移動し、そこでＩＦＮα遺伝子発現を誘導する。 
【実施例２】
【００７７】
（ヒト非リンパ球系細胞へのＩＲＦ７導入による天然型ＩＦＮ−αの大量生産）
マウスＩＲＦ７の恒常的活性型遺伝子をマウス脾臓細胞Ｃ５７／Ｂ６からクローニングした。マウス脾臓細胞Ｃ５７／Ｂ６を１０％ＦＣＳ入りＤＭＥＭ培養液中で培養し（５×１０６／ｍｌ））、ＴＬＲ７アゴニストであるＲ８４８（３Ｍ）１０μＭで刺激し２４時間後にＲＮＡを採取（TRIzol,  Invitrogen）、ＲＴ−ＰＣＲにてＰＣＲを行った。
【００７８】
ＰＣＲの条件：９０Cx3min、（90Cx30sec-60Cx30sec-72Cx60sec）x35cy、72Cx10min
プライマーの塩基配列：
primerＩ   5'-g gaattc atg gct gaa gtg agg ggg gtc cag-3'    (sense)
（配列番号３）
primer II   5'-c ctg gat ccc ctg aat tgt ctt ggc -3'             (anti-sense)
(ＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩまでの断片)
（配列番号４）
primer III  5'-ggg atc cag ttg atc cgc ata agg -3'                (sense)
（配列番号５）
primer IV  5'-g ccatgg ctc ggt gag agc tgg ctg ttg agg -3'    (anti-sense)
(ＢａｍＨＩ〜Ｎｃｏｌまでの断片)
（配列番号６）
primerV   5'-g ccatgg tat gca agg cat acc t  -3'                 (sense)
（配列番号７）
primer VI   5'-ggtcgac tga agg cca ctg acc cag gtc gat -3'    (anti-sense)
(Ｎｃｏｌ〜ＳａｌＩまでの断片)
（配列番号８）
（ＩＲＦ７の遺伝子と制限酵素サイトを図８に示す）
上記ＲＴ−ＰＣＲにて増幅した遺伝子断片を、ヒト細胞用発現ベクターpCIneo (Promega)に組込み、ヒト非リンパ球系細胞ＨＥＫ２９３−細胞（ＣＲＬ−１５３７にトランスフェクト（BioRad）した。該形質転換ヒト非リンパ球系細胞を、下記培地を用いて培養し、導入したＩＲＦ７遺伝子の発現を行ない、下記ＩＦＮの力価の測定方法を用いて、ＩＦＮ力価の測定を行なった。
【００７９】
（形質転換ヒト非リンパ球系細胞の培養培地）
Ａ）ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ
Ｂ）Seurm free media (２９３ expression media)
（ＩＦＮの力価の測定方法）
Ａ）   Human ＩＦＮ−α ELISA kit (PBL)or Human ＩＦＮ−α multi species ELISA kit
Ｂ）   Luciferase Assay for ＩＦＮ alpha promoter activity
［結果］  
（IＮＦ−αの産生量）
ＨＥＫ２９３細胞（５×１０５／ｍｌ）に１μｇ  ＩＲＦ−７ wild type (wt)もしくはconstitutive active form (cst) を導入後２４時間で上清中のＩＦＮをＥＬＩＳＡで測定した。結果を図９に示す。
同様の実験系にてＩＦＮ−α４のプロモータを共導入した細胞を２４時間後にLuciferase 活性を測定した。結果を図１０に示す。ＩＲＦ−３をコントロールとして使用した。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の実施例において、ＭｙＤ８８のＩＲＦ７との会合についての試験の結果について示す図である。（ａ）は、ＭｙＤ８８とＩＲＦ７Ｃを組込んだプラスミドのトランスフェクションの効率を、（ｂ）は、プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＭｙＣ抗体でウェスタンブロット（ＷＢ）した結果を、（ｃ）は、ＩＲＦ７欠失変異体の模式図を、（ｄ）は、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７欠失変異体及びＭｙｃ−ＭｙＤ８８の記載した組み合わせで、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＭｙＣ抗体でウェスタンブロット（ＷＢ）した結果を、（ｅ）は、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７をコードするプラスミド２．０μｇを、トランジェントにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットを同時に行った結果を示す。
【図２】本発明の実施例において、ＦＲＥＴ分析により決定したＭｙＤ８８及びＩＲＦ７の共存についての試験の結果を示す図である。（ａ）は、ＭｙＤ８８−ＹＦＰ（黄）及びＩＲＦ７−ＣＦＰ（青）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、視覚化した図を、（ｂ）は、該ＨＥＫ２９３細胞について、ＣＦＰ発光とＣＦＰ励起による蛍光強度、単細胞のＣＦＰ励起によるＹＦＰ発光の関係を、及び、ＣＦＰ励起により、ＹＦＰ及びＣＦＰ両方に対し陽性の細胞を、ＦＲＥＴとしてgated areaに示した。
【図３】本発明の実施例において、ＭｙＤ８８によるＩＲＦ７の活性化についての試験の結果を示す図である。（ａ）は、ＩＲＦ７をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のプロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した結果を、（ｂ）は、該ＨＥＫ２９３細胞について、トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα４−、ＩＦＮα６−依存性プロモーター活性化を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した結果を、（ｃ）は、該ＨＥＫ２９３細胞について、トランスフェクトした２４時間後、培養上澄のＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した結果を、（ｄ）は、２４ウェルプレート上に蒔いたＨＥＫ２９３細胞に、トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα４及びＩＦＮα６依存性プロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した結果を、（ｅ）は、該ＨＥＫ２９３細胞に、トランスフェクト３６時間後、細胞可溶化液を、抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、その後抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＭｙＣ抗体でウェスタンブロットした結果を示す。
【図４】本発明の実施例において、ＴＬＲ９リガンドによる、ＩＲＦ７のＭｙＤ８８依存性活性についての試験の結果を示す図である。（ａ）は、脾細胞（左）Ｆｌｔ３誘発骨髄ＤＣ（右）を、ＣｐＧオリゴヌクレオチドＤ３５で刺激、２４時間後、培養上澄のＩＦＮα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した結果を、（ｂ）は、野生型及びＭｙＤ８８欠損マウスの脾細胞を１又は３時間、Ｄ３５で刺激し、抗ＩＲＦ７抗体（左）及び抗ｐ６５５抗体（右）を用いて、ウェスタンブロットを行った結果を示す。
【図５】本発明の実施例において、ＴＲＡＦ６によるＩＲＦ７の活性化についての試験の結果を示す図である。（ａ）は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＲ７とＴＲＡＦ６とをコトランスフェクトし、トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα４及びＩＦＮα６依存性プロモーター活性をレポーター遺伝子アッセイにより、分析した結果を、（ｂ）は、該ＨＥＫ２９３細胞に、ＩＦＮα６プロモーターを有するレポータープラスミドとを、コトランスフェクトし、トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα６依存性プロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した結果を（ｃ）は、野生型又はＴＲＡＦ６欠損マウスのＭＥＦ細胞に、ＩＲＦ７、ＭｙＤ８８及びＴＲＡＦ６の組み合わせと、ＩＦＮα６プロモーターをハーバリングするレポータープラスミドとを、トランスフェクトし、トランスフェクションの３６時間後、細胞のＩＦＮα６依存性プロモーター活性を、レポーター遺伝子アッセイにより分析した結果を、（ｄ）は、ＨＥＫ２９３細胞に、Ｍｙｃ−ＴＲＡＦ６及びＦＬＡＧ−ＩＲＦ７欠失変異体の記載された組み合わせを、トランスフェクトし、３６時間後、細胞可溶化液は、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、その後抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｍｙｃ抗体でウェスタンブロットを行った結果を示す。
【図６】本発明の実施例において、ＩＦＲ７活性化と、ＴＲＡＦ６のユビキチンＥ３リガーゼ活性についての試験の結果を示す図である。（ａ）は、ＨＥＫ２９３細胞に、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７、Ｍｙｃ−ＭｙＤ８８及びＭｙｃ−ＴＲＡＦ６をコードするプラスミドの記載された組み合わせを、トランスフェクトし、３６時間後、細胞可溶化液を調製し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した結果を、（ｂ）は、ＨＥＫ２９３細胞に、Ｕｂｃ１３遺伝子特異的ｓｉＲＮＡの混合物をリポフェクションにより、トランスフェクトし、４８時間後、Ｕｂｃ１３の発現を、全細胞可溶化液のウェスタンブロット分析で、抗Ｕｂｃ１３モノクローナル抗体を用いて分析した結果を、（ｃ）は、コントロール又はＵｂｃ１３特異的ｓｉＲＮＡの混合物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞、ＦＬＡＧ−ＩＲＦ７及びＭｙｃ−ＴＲＡＦ６をコードするプラスミドの指定された組み合わせでトランスフェクトし、３６時間後、細胞可溶化液を、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗Ｕｂ抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果を、（ｄ）は、コントロール又はＵｂｃ１３特異的ｓｉＲＮＡの混合物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＩＲＦ７をコードするプラスミドの記載した組み合わせと、ＩＦＮα４又はＩＦＮα６プロモーターをハーバリングするレポータープラスミドとを、更にトランスフェクトし、３６時間後、ルシフェラーゼレポーター活性を測定した結果を示す。
【図７】本発明の実施例において、ＴＬＲ７、８及び９のダウンストリームのＩＲＦ７活性化モデルについての試験の結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例において、ＰＣＲのプライマーと、ＩＲＦ７の遺伝子の制限酵素サイトの位置を示す図である。
【図９】本発明の実施例において、IＮＦ−αの産生量を、ＥＬＩＳＡで測定した      結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、IＮＦ−αの産生量を、ＥＬＩＳＡで測定した      結果を示す図である。
【図１】
2006050999.tif 000002
【図２】
2006050999.tif 000003
【図３】
2006050999.tif 000004
【図４】
2006050999.tif 000005
【図５】
2006050999.tif 000006
【図６】
2006050999.tif 000007
【図７】
2006050999.tif 000008
【図８】
2006050999.tif 000009
【図９】
2006050999.tif 000010
【図１０】
2006050999.tif 000011
【配列表】
2006050999000001.app