(57)【要約】【課題】簡便で安全な細胞分離を行う細胞分離材の提供。【解決手段】(1)回収したい細胞種Aと除去したい細胞種Bを決定し、(2)AとBとの物理化学的性質を分析し、(3)AとBとのその差異を見出し、(4)この差異を転写した材料を調達し、(5)この材料を細胞分離材とする。細胞分離材は、基礎科学実験用器具、臨床医学の医療器具の研究開発に利用することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む細胞分離材の製造方法。
(1)  回収したい細胞種Ａ(以下、Ａという)と除去したい細胞種Ｂ(以下、Ｂという)を決定する工程。
(2)  ＡとＢの物理化学的性質を分析する工程。
(3)  ＡとＢで差異の出た物理化学的性質を選定する工程。
(4)  前記(3)の物理化学的性質の差異を転写した材料を調達する工程。
(5)  前記(4)で調達された材料を細胞分離材とする工程。
【請求項２】
前記(2)の物理化学的性質の差異が、大きさ、親水性、荷電及び粘弾性よりなる群から選択される物理化学的性質の少なくとも１つの差異である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記(2)の物理化学的性質の差異の分析において最初に行う分析が大きさの分析である請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３記載のいずれかの方法により製造された細胞分離材。
【請求項５】
請求項４により製造された細胞分離材を液体導入口と液体導出口を有する容器に収納した細胞分離器具。
【請求項６】
以下の工程を含む細胞分離材受注製作ビジネス方法
(1)  顧客から回収したい細胞種Ａと除去したい細胞種Ｂの情報の送信を受ける工程。
(2)  ＡとＢの物理化学的性質を分析する工程。
(3)  ＡとＢで差異の出た物理化学的性質を選定する工程。
(4)  前記(3)の物理化学的性質の差異を転写した材料を調達する工程。
(5)  前記(4)の材料を液体導入口と液体導出口を有する容器に収納し細胞分離器具を製造し顧客に提供する工程。
【請求項７】
前記(1)の情報の送信が、ウエブサイト上のフォーマットへの記入である請求項６に記載のビジネス方法。
【請求項８】
回収したい細胞種Ａと除去したい細胞種Ｂの細胞分離方法であって、以下の工程を含む細胞分離方法。
(1)  ＡとＢの物理化学的性質を分析する工程。
(2)  ＡとＢで差異の出た物理化学的性質を選定する工程。
(3)  前記(2)の物理化学的性質の差異を転写した材料を調達する工程。
(4)  前記(3)で調達された材料を細胞分離材として用いて、ＡとＢを分離する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離材を製造し、あるいはそれを使用する方法に関する。本発明により製造された細胞分離材を用いた細胞分離器具は基礎科学実験用器具や臨床医学における医療器具に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を積極的に活用して、生体の臓器組織の病変および／または欠損を治療する、いわゆる再生医療が大変注目を集めており、世界各国で研究開発が盛んに行われている（たとえば非特許文献１）。通常、これらの細胞が存在する部位には、しばしば不要な夾雑細胞が混在しており、夾雑細胞を除去し有用な細胞を濃縮分離する必要がある。通常、これらの細胞分離にはFicoll-Hypaque等を用いる比重遠心法や抗原抗体反応を利用し、磁性粒子などに固定されたモノクローナル抗体を用いる方法が用いられているが、いずれも操作が煩雑という問題点を有し、また、後者はさらにコスト高、当該抗体が市販されていなければ、新たに抗体を作成しなければならない等の問題点も有する。さらに、通常これらの細胞分離法はクリーンベンチ内で行われるものの、完全開放系の操作のため無菌性に難がありヒトへの臨床応用には安全上、問題を有する。モノクローナル抗体を用いる方法ではさらに、通常、モノクローナル抗体はヒト以外の動物タンパクであることによる安全上の問題点も有する。
【０００３】
一方、これらの問題点を克服するための技術開発も近年、散見されるようになった。たとえば特許文献１では繊維で構成された不織布にカルボキシル基および親水性鎖を導入した担体に、幹細胞の膜表面の抗原に対する抗体を固定化してなる幹細胞分離材が開示されている。確かに、本技術の幹細胞分離材を容器に詰め、フィルターを作成し細胞分離に用いれば操作が煩雑という問題点は解消されるが、抗体を用いるという点でコスト高、安全性という面の問題は未解決である。また特許文献２では平均孔径10〜1000μｍの連続気孔を有するポリビニルアセタール樹脂から成ることを特徴とするリンパ球からＴ細胞を分離回収する細胞分離材が開示されている。本技術は安全性に問題のある抗体を用いず合成高分子を用いるという点で画期的であり、Ｔリンパ球の分離という点に限って言えば大変優れた技術と言えるが、逆に、Ｔリンパ球にしか応用できず、他の細胞分離への汎用性の無い技術である。
【０００４】
ところで、輸血医療の分野では、比較的、簡便・安全な操作のため、フィルターを用いた細胞分離技術は発達しており、例えば、特許文献３には合成樹脂多孔質体からなる濾材を主要部とし、血液から実質的に白血球と共に血小板を除去する白血球および血小板除去フィルターであって、前記濾材は表面ゼーター電位が正電位になるように、カチオン性官能基を有する物質が化学反応によって導入されてなることを特徴とする白血球および血小板除去フィルターが開示されている。しかしながら同発明は、白血球と血小板を除去する方法を開示したのみで、広く細胞一般に通用する製造方法について言及したものではないため、本発明とは全く技術的思想を異にする。
【０００５】
さらに、特許文献４は、静電荷パターンによる血液、体液等の成分分離方法が記載されており、このなかには、次のことが記載されている；「細胞は、細胞膜上のムコ多糖タンパク質複合体、或いは糖鎖末端のシアル酸などにもとづき、全体として負電荷、上皮細胞系で-30~-40mVを有することが知られており、基質の荷電状態がその接着と増殖に影響を及ぼすと言われている」(2頁15〜20行)。しかしながら、同発明は、細胞分離材の製造方法に言及したものではなく、特許請求の範囲の「(1)導電性層を介在させて支持体上に光導電性層を形成した感光体と、導電性層を介在させて支持体上に絶縁層を形成した電荷保持媒体とを対向配置し、感光体および電荷保持媒体の導電性層間に電圧を印加しながら感光体側から画像露光を行って電荷保持媒体に画像状に電荷を蓄積させ、電荷保持媒体の電荷パターンに応じて細胞を増殖させることにより成分分離を行うことを特徴とする静電荷パターンによる血液、体液等の成分分離方法。」という記載から分かるように新規な細胞分離方法に関する発明であり、本発明のような細胞分離材の製造及びその使用については一切記載が無く、技術思想は全く異なる。
【０００６】
【特許文献１】特開平08-033708公報
【特許文献２】特開平02-227070号公報
【特許文献３】特開平06-142196号公報
【特許文献４】特開平02-245182号公報
【非特許文献１】（株）シーエムシー出版、「再生医療工学の最先端」、2002年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、簡便で安全な細胞分離を行うための細胞分離材の製造方法及びそれを使用する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはかかる課題を解決すべく鋭意検討を進めた。まずは、従来法であるモノクローナル抗体を用いた細胞分離法の根本にある主導原理について深く洞察した。すなわち、同方法は、細胞間の生物学的性質の差異である抗原の違いを、細胞表面抗原の分析により検出し、その生物学的性質の差異（ここでは抗原の違い）を反映させるために、その抗原に対する抗体を調達し、それを用いて細胞分離を行うものであるという結論に到達した。そして安全上、問題のあるモノクローナル抗体を用いないことを大前提に考えなければならないことに鑑み、表面抗原に代表される生物学的性質の差異を利用していては、本課題の抜本的解決には到達しないという仮説を立て、生物学的性質の対極にある物理化学的性質の差異を利用して主導原理を構築する方針を立て検討を重ね、本発明の完成に至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、次のとおりの細胞分離材の製造方法及び得られた細胞分離材の使用方法に関する。
１．  以下の工程を含む細胞分離材の製造方法。
(1)  回収したい細胞種Ａ(以下、Ａという)と除去したい細胞種Ｂ(以下、Ｂという)を決定する工程。
(2)  ＡとＢの物理化学的性質を分析する工程。
(3)  ＡとＢで差異の出た物理化学的性質を選定する工程。
(4)  前記(3)の物理化学的性質の差異を転写した材料を調達する工程。
(5)  前記(4)で調達された材料を細胞分離材とする工程。
２．前記(2)の物理化学的性質の差異が、大きさ、親水性、荷電及び粘弾性よりなる群から選択される物理化学的性質の少なくとも１つの差異である前記１に記載の製造方法。
３．前記（2）の物理化学的性質の差異の分析において最初に行う分析が大きさの分析である前記２に記載の製造方法。
４．前記１〜３記載のいずれかの方法により製造された細胞分離材。
５．前記４により製造された細胞分離材を液体導入口と液体導出口を有する容器に収納した細胞分離器具。
６．以下の工程を含む細胞分離材受注製作ビジネス方法
（1）顧客から回収したい細胞種Ａと除去したい細胞種Ｂの情報の送信を受ける工程。
(2)  ＡとＢの物理化学的性質を分析する工程。
(3)  ＡとＢで差異の出た物理化学的性質を選定する工程。
(4)  前記(3)の物理化学的性質の差異を転写した材料を調達する工程。
(5)  前記(4)の材料を液体導入口と液体導出口を有する容器に収納し細胞分離器具を製造し顧客に提供する工程。
７．前記(1)の情報の送信が、ウエブサイト上のフォーマットへの記入である前記６に記載のビジネス方法。
８．回収したい細胞種Ａと除去したい細胞種Ｂの細胞分離方法であって、以下の工程を含む細胞分離方法。
(1)  ＡとＢの物理化学的性質を分析する工程。
(2)  ＡとＢで差異の出た物理化学的性質を選定する工程。
(3)  前記(2)の物理化学的性質の差異を転写した材料を調達する工程。
(4)  前記(3)で調達された材料を細胞分離材として用いて、ＡとＢを分離する工程。
【発明の効果】
【００１０】
以上示したように本発明によれば、簡便で安全な細胞分離を行うための細胞分離材の製造方法を提供することが出来るので、基礎科学実験用器具や臨床医学における医療器具の設計開発に貢献し、再生医療の発展につながること極めて大である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいう回収したい細胞種Ａとはヒトまたは動物の細胞（真菌や細菌を含む。また生きている細胞だけでなく死んだ細胞も含む）で、分離回収して「何らかの用途」に用いる細胞を言い、たとえば、以下があげられるがこれらに限定されるものではない。有核細胞、単核球、多核細胞、白血球、赤血球、顆粒球、好中球、好塩基球、好酸球、骨髄球、赤芽球、リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、サプレッサーＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、造血幹／前駆細胞（以下、造血幹細胞と略す）、線維芽細胞、軟骨芽細胞、間葉系幹／前駆細胞（stroma stem cellまたはmesenchymal stem cell）、巨核球、血小板、脂肪細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、膵β細胞、膵α細胞、膵δ細胞、膵ＰＰ細胞、腎メサンギウム細胞、腎尿細管細胞、腎糸球体細胞、神経細胞、成人幹細胞（SP細胞、MAPCなど）、ＥＳ細胞、各種腫瘍細胞などがあげられる。また、単一の細胞だけでなく、細胞の集合体、たとえば内分泌細胞の集合体である膵島も含まれる。
【００１２】
本発明でいう除去したい細胞種Ｂとはヒトまたは動物の細胞（真菌や細菌を含む。また生きている細胞だけでなく死んだ細胞も含む）で、先述の、「何らかの用途」には不要であるか、または何らかの病因細胞である等の理由で、積極的に除去することが必要である細胞のことを言う。たとえば、以下があげられるがこれらに限定されるものではない。有核細胞、単核球、多核細胞、白血球、赤血球、顆粒球、好中球、好塩基球、好酸球、骨髄球、赤芽球、リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、サプレッサーＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、造血幹／前駆細胞（以下、造血幹細胞と略す）、線維芽細胞、軟骨芽細胞、間葉系幹／前駆細胞（stroma stem cellまたはmesenchymal stem cell）、巨核球、血小板、脂肪細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、膵β細胞、膵α細胞、膵δ細胞、膵PP細胞、腎メサンギウム細胞、腎尿細管細胞、腎糸球体細胞、神経細胞、成人幹細胞（SP細胞、MAPCなど）、ES細胞、各種腫瘍細胞などがあげられる。また、単一の細胞だけでなく、細胞の集合体、たとえば内分泌細胞の集合体である膵島も含まれる。
また、本発明でいう回収する細胞Ａと除去する細胞Ｂとは、別々の細胞種の場合もあるが、例えば、同一細胞種ではあるが何らかの違いがあるもの(例えば、同一細胞種で生細胞と死細胞の分離、同一細胞種で細菌やウイルスなど微生物に感染した細胞と感染していない細胞の分離、同一細胞種で遺伝子導入が行われた細胞と行われていない細胞の分離)も含まれる。
また、本発明でいう回収する細胞Ａと除去する細胞Ｂが含まれる原料としては例えば、骨髄、臍帯血（臍帯血だけでなく胎盤血管から採取されたものも含む）、末梢血(顆粒球コロニー刺激因子等の造血因子を投与して採血されたものも含む)およびこれらに遠心分離、培養（分化誘導、増幅）、凍結解凍、遺伝子導入等の何らかの処理を施したもの、あるいは膵臓、肝臓、腎臓、心臓、胃、腸、脾臓等の各種臓器や筋肉、血管、骨、皮膚等の各種組織から酵素消化法等により抽出した細胞を何らかの液体に再浮遊したもの及びこれらに何らかの前述の処理を施したものがあげられる。
【００１３】
本発明でいう物理化学的性質とは、たとえば、細胞の大きさ、親水性、荷電、粘弾性など、表面抗原など生物学的性質以外のものを言う。
本発明で言う物理化学的性質の分析とは、たとえば、大きさであれば顕微鏡や粒度分布測定装置（レーザー回折法や電気抵抗方式など各種ある）を用いての分析、親水性であれば水性２層分配法や原子間力顕微鏡（以下、AFMと略す）を用いての分析、荷電であれば水性２層分配法や細胞電気泳動装置、ゼータ電位測定装置、電位差滴定やAFMを用いての分析、粘弾性であれば、貝原眞著、バイオレオロジー、産業図書株式会社、１９９９年、ｐ129で開示されているマイクロピペット法での分析があげられるが、これらに限定されるものではない。通常、大きさの分析が最も簡便であり、また、後述する、「物理化学的性質の差異を転写した」材料の調達も最も容易であることから、大きさの分析を最初に行うことが好ましい。
【００１４】
本発明でいう、物理化学的性質の差異を転写した材料とは、ＡとＢで差の出た物理化学的性質によりＡとＢを分離できる材料のことであり、それぞれの物理化学的性質により異なるので、以下の例示により説明する。ＡとＢの大きさをたとえば粒度分布測定装置で測定し、Ａ＜Ｂという測定結果が出たならば、当該材料はＡの粒径を越えＢの粒径未満の孔径を有する材料（多孔膜やスポンジ状多孔質体など）となる。この場合、Ａはこの細胞分離材を通過し回収され、Ｂは捕捉され除去されることになる。また、逆に、Ａ＞Ｂという測定結果が出た場合もＡの粒径以下Ｂの粒径を越える孔径を有する材料（多孔膜やスポンジ状多孔質体など）があげられる。この場合は、Ａをいったんこの材料に捕捉させ、Ｂは通過させ、その後、捕捉されているＡを逆洗などで回収することで、結果的にはＢが除去されることになる。
【００１５】
測定結果がＡ≒Ｂの場合は、大きさという物理化学的性質では差異を見出せないということになるので、大きさ以外の物理化学的性質の分析にすすむ。例えば、荷電が挙げられる。ＡとＢの荷電の差をたとえば水性２層分配法で測定し、（細胞表面は負電荷であるのは周知なので、ここでの大きさは負電荷の絶対値を表す）Ａ＜Ｂという測定結果が出たならば、当該材料は正荷電を表面に有する材料、それもＢは静電相互作用により吸着するがＡは吸着しない、適度な正荷電表面を有する材料ということになる（極端に強い正荷電を有する材料では両方とも吸着してしまう）。この場合、Ａはこの細胞分離材を通過し回収され、Ｂは吸着され除去されることになる。また、逆に、Ａ＞Ｂという測定結果が出た場合も適度な正荷電表面を有する材料があげられる。ただし、この場合は、Ａをいったんこの材料に吸着させ、Ｂは通過させ、その後、吸着されているＡを逆洗などで回収することで、結果的にはＢが除去されることになる。測定結果がＡ≒Ｂの場合は、荷電という物理化学的性質では差異を見出せないということになるので、さらに別の物理化学的性質の分析にすすむ。
これをフローチャートで例示したものを図１に示す。
【００１６】
本発明でいう物理化学的性質の差異を転写した材料の調達とは、市販の材料を入手する、あるいは自作することがあげられ、適宜選択する。たとえば、前述したＡの粒径以上Ｂの粒径未満の孔径を有する材料（多孔膜やスポンジ状多孔質体など）を調達する場合、当該孔径を有するメッシュ（たとえば、ＮＢＣ株式会社製）を購入するか、あるいは第２４回日本バイオマテリアル学会大会予稿集、p150、2002年で開示されている方法を用いて、自作する。
【００１７】
物理化学的差異が親水性である場合、各種親水性の異なる材料（しばしば、接触角が参考になる場合が多い）を、筏義人監修、バイオマテリアルの最先端、シーエムシー社、1989年、p110を参考にして、市販の材料から選択して入手するか、あるいは自作することがあげられる。
また、物理化学的性質の差異が荷電である場合、各種電荷の異なる材料（しばしば、材料のゼータ電位が参考になる場合が多い）を上記バイオマテリアルの最先端、p112を参考にして、市販の材料を入手するか、あるいは自作することがあげられる。
【００１８】
本発明による細胞分離材は、細胞分離器具に収納する前の、細胞の分離・捕捉に関わる原料部材を細胞分離材と言う。この部材を容器に収納できるように、例えば平板やメッシュ、不織布であれば寸断などの加工、粒子であれば計量を行う）は前述した製造方法により得られたものであるが、大きさ以外の場合、当該材料そのもので細胞分離材を調製しなくても、当該材料が少なくとも表面（細胞と接触する）に有していれば良い。この場合、当該材料を何らかの方法で基材に被覆することになるが、その被覆方法としてはコーティング、各種グラフト処理などがあげられ、適宜選択する。また、基材の材質としては入手しやすさや基材そのものの安定性、安全性の観点からは以下が好ましいが、これらに限定されるものではない。ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニム等の金属。また、基材の形状としては平板、メッシュ、織布、不織布、スポンジ状構造体、粒子集合体等があげられ、これらをそのまま、あるいは積層体、袋状、３次元成型体（ブロック状）等の形態で用いる。
【００１９】
本発明による細胞分離器具は、図２にその縦断面図（概念図）を示すように当該細胞分離材(2)を液体導入口(3)と液体導出口(4)を有する容器(1)に収納したものである。ここで、液体導入口と液体導出口とは、液体が導出入されれば、いかなる形状でもよく、単なるチューブ、スパイク、金属針、オス、メスルアー等が挙げられる。また、原料懸濁液保存用、ドレイン用、回収用に、血液バッグ等の回路を直接接続したものでもよい。これらの液体導入口および液体導出口は、容器に、直接、存在していても、チューブを介して接続されていてもよい。液体導入口と液体導出口の位置は、液体導入口から細胞懸濁液が入り、濾材（細胞分離材）を経て液体導出口に至るものであれば、容器における位置は限定されない。容器の材質としては、成形性および滅菌性に優れ、細胞毒性が低いという点で好ましい。このようなものを例示すると、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、塩化ビニル等の合成高分子、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
また、原料液中に存在する凝集塊（しばしば目詰まりの原因となる）を排除するために、いわゆるプレフィルターを容器内あるいは容器外に具備させておいても良い。
【００２１】
本発明では、この細胞分離器具をビジネスに使用する。
すなわち、まず顧客から回収したい細胞種Aと、除去したい細胞種Bの情報の送信を受ける。この送信は、ウエブサイト上のフォーマットへの記入等記録媒体を用いて行われる。このフフォーマットとして[表1]のような例が挙げられる。このようにして受信した情報に基づいてAとBの物理的化学的性質を分析し、その差異を見出す。そしてその物理化学的性質の差異を転写した材料を調達する。この転写は、従来この物理化学的性質の差異があるとして知られている材料を選択するかあるいは自作して行われる。
そして、この調達した材料を液体導入口と液体導出口を有する容器に収納し細胞分離器具を製造する。このAとBの物理化学的性質の分析〜細胞分離器具の製造は、前述の方法で行われる。そして、得られた細胞分離器具を顧客に提供する。この提供は、情報の伝達あるいは細胞分離器具の送付等によって行われる。
【００２２】
【表１】
2006050964.tif 000002
【００２３】
本発明による細胞分離器具は基礎科学における実験用器具や臨床医学における医療器具として用いられ、分離された細胞はそのまま、または必要に応じて、さらなる分離精製（洗浄を含む）、培養（分化誘導、増幅）、活性化、遺伝子導入、凍結保存等の処理が施された後、生体への移植や細胞生物学や免疫学等の基礎科学実験に用いられる。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
本実施例では、回収したい細胞種Ａ＝膵臓由来細胞、除去したい細胞種Ｂ＝線維芽細胞の場合において、粒度分布と水性２相分配法を用いて、両細胞の物理化学的性質の差異を分析したものである。
水性２相分配法とは、ある種の水溶性高分子の水溶液を混合した場合に、互いに混じり合わない２液の相に分離する現象を利用して、上の相あるいは下の相と細胞との親和性の相違を検出する方法である。水溶性高分子の種類・濃度・塩組成・pHなどを変化させることによって、上の相と下の相との間に親水性・疎水性や荷電の差異などを付与することが出来るため、細胞表面の物理化学的差異を見積もることが出来る（生化学実験法13、細胞分離法、東京化学同人、1991年）。
(1)  回収したい細胞種Ａと除去したい細胞種Ｂの決定
ここでは、回収したい細胞種Ａを膵臓由来細胞（モデルとしてラット膵腫瘍（Mashima H, et al:J Clin Invest 97:1647-1654,1996）に記載の細胞株AR42J-B13を用いた）とし、除去したい細胞種Ｂを線維芽細胞(モデルとしてマウス線維芽細胞株NIH-3T3(ATCC CRL-1658))とした。
【００２５】
(2)  ＡとＢの物理化学的性質の差異の分析
(2)-1  大きさの分析
細胞Ａ（AR42J-B13）は、HEPES-NaOH(20mM)(Sigma社製)、5mMのNaHCO3(Sigma社製)、ペニシリンーストレプトマイシン（米国、GIBCO-BRL社製）、および10%のFCS(GIBCO-BRL社製)を含むDMEM培地(pH7.4)(Sigma社製D-5523)で継代培養した。細胞Ｂ（NIH-3T3）は、HEPES-NaOH(20mM)(Sigma社製)、ペニシリンーストレプトマイシン（米国、GIBCO-BRL社製）、および10%のFCS(GIBCO-BRL社製)を含むDMEM培地(pH7.4)(GIBCO BRL社製11995-065)で継代培養した。細胞Ａは、ピペッティングのみで、細胞Ｂはトリプシン-EDTA（GIBCO-BRL社製）処理にて組織培養用ディッシュからそれぞれ剥離し回収した。該細胞の懸濁液をビュルケルチュルク型血球計算盤に導入し、写真撮影を行った。前記写真より細胞の直径を測定したところ、細胞Ａ：18.8±1.6μm、細胞Ｂ：20.6±2.2μmであり、細胞Ａと細胞Ｂの間には大きさの相違は実質的に無かった。
【００２６】
以上より、大きさでは分離不可能なことが判明した。そこで、次ステップとして親水性の差異を分析した。
(2)-2  親水性の分析
水性２相分配法により、細胞表面の親水性の分析を行った。
21.5wt% デキストラン(Dextran-T500;アマシャムファルマシア)水溶液1.045g、40wt% ポリエチレングリコール(PEG8000；SIGMA)の水溶液0.5g、1M 塩化ナトリウム0.05g、200mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.4) 0.25gおよび蒸留水3.155gを混合して、終濃度4.5% デキストラン,4.0%ポリエチレングリコール,10mM塩化ナトリウム,10mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH=7.4の水性２相分配系(組成１)を作製した。同様にして、終濃度4.5%デキストラン,4.0%ポリエチレングリコール,50mM塩化ナトリウム,10mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH=7.4の水性２相分配系(組成２)、終濃度4.5% デキストラン,4.0%ポリエチレングリコール,150mM塩化ナトリウム,10mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH=7.4の水性２相分配系(組成３)を作製した。組成１、組成２、組成３の相違は塩化ナトリウム(NaCl)の濃度である。前記と同様にして調製した細胞Ａおよび細胞Ｂの懸濁液を、生理的リン酸緩衝食塩液(以下PBS(-)と記載)に5.0×106 個/mlになるように再懸濁した。これをそれぞれの水性２相分配系に50μlずつ添加した後、相系を混合、室温にて40分静置して２相に分離させた。分配した上相および下相を一定量サンプリングし、それぞれの相に分配された細胞数を仕込んだ全細胞数に対するパーセントとして、CyQUANT（モレキュラープローブ社）を用いて添付の取扱説明書に従って定量した。この際、上相および下相のどちらにも分配されていない細胞は界面に存在している。上相(ポリエチレングリコール相)は下相(デキストラン相)に比べて疎水性であり、したがって上相への分配が少なく下相の分配が多い細胞ほど表面が親水性であると判断できる。塩化ナトリウム濃度を高くするにしたがって、一般的に上相から下相への細胞の分配が増えていくが、細胞の親水性が高いほど、低い塩濃度で上相から下相への分配が増えていく。これらの結果を[表２]に示す。
【００２７】
【表２】
2006050964.tif 000003
【００２８】
中間の塩化ナトリウム濃度の組成２では両者の相違は無く、塩化ナトリウム濃度の低い組成１では、細胞Ａの方が親水的(細胞Ｂの方が疎水的)と考えられるが、塩化ナトリウム濃度の高い組成３では細胞Ｂの方が親水的(細胞Ａの方が疎水的)と判断される結果となった。このように塩化ナトリウム濃度を変化させた水性２相分配相系において、細胞Ａと細胞Ｂの分配効率に一定の傾向が得られないことより、両細胞間の親水性の差異は極めて小さいことが判った。以上より、親水性の差異では分離不可能なことが判明した。そこで、次ステップとして荷電の差異を分析した。
【００２９】
(2)-3  荷電の差異の分析
水性２相分配法の組成を変更することにより、細胞表面の負荷電の分析を行った。
21.5wt% デキストラン(Dextran-T500;アマシャムファルマシア)の水溶液1.045g、40wt% ポリエチレングリコール(PEG8000；SIGMA)の水溶液0.5g、1M 塩化ナトリウム0.25g、200mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=7.4) 0.25gおよび蒸留水2.955gを混合して、終濃度4.5% デキストラン,4.0% ポリエチレングリコール,50mM 塩化ナトリウム,10mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH=7.4の水性２相分配系(組成２)を作製した。同様にして、終濃度4.5% デキストラン,4.0% ポリエチレングリコール,50mM 塩化ナトリウム,30mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH=7.4の水性２相分配系(組成４)、終濃度4.5% デキストラン,4.0% ポリエチレングリコール,50mM 塩化ナトリウム,60mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH=7.4の水性２相分配系(組成５)を作製した。前記と同様にして調製した細胞Ａおよび細胞Ｂの懸濁液を、PBS(-)に5.0×106 個/mlになるように再懸濁した。これをそれぞれの水性２相分配系に50μlずつ添加した後、相系を混合、室温にて40分静置して２相に分離させた。分配した上相および下相を一定量サンプリングし、それぞれの相に分配された細胞数を仕込んだ全細胞数に対するパーセントとして、CyQUANT（モレキュラープローブ社）を用いて定量化した。組成２、組成４、組成５の相違はリン酸ナトリウム緩衝液の濃度である。デキストラン水溶液とポリエチレングリコール水溶液の２相分配系において、リン酸イオンは、デキストラン相に分配されやすいことが知られている（Reitherman R et al:Biochem. Biophys. Acta 297 ,193,1973）。
このため相系のリン酸Na緩衝液濃度を増加させると、上相(ポリエチレングリコール相)は下相(デキストラン相)に比べて正に帯電しその割合は増加していくことになる。ここに細胞が含まれていた場合、細胞表面の負荷電が強い細胞ほど上層(ポリエチレングリコール相)への分配が増すため、細胞間の負荷電量を見積もることが出来る。組成2,4,5の水性２相分配系に細胞Ａおよび細胞Ｂを添加して分離した場合の上相(PEG相)および下相(Dextran相)への分配を[表３]に示す。
実験は３回繰り返し行い、平均値±標準偏差として示した。
【００３０】
【表３】
2006050964.tif 000004
【００３１】
組成2,4,5とリン酸緩衝液濃度を増加させるにしたがって、細胞Ｂの方が細胞Ａに比べて、上相への分配割合が多くなっており、下相の分配割合が減っている。これは表面負荷電が強い細胞ほど反対の電荷を帯びた上相に分配されやすくなる事に基づいている。以上より負電荷の強さはＡ＜Ｂであることが明らかになった。
【００３２】
(3)  差異の出た物理化学的性質の決定
上記(2)より、負電荷の強さがＡ＜Ｂであることが明らかになっため、
物理化学的性質として「電荷」と決定した。
【００３３】
(4)  物理化学的性質の差異を転写した材料の調達
組織培養用ではない未処理のポリスチレン製FalconTM96穴プレート351172(ベクトンディッキンソン社製)表面へ正荷電を付与するために、第一級アミノ基を有する多塩基性ポリアミノ酸で、神経細胞の培養になど使用されるポリ-L-リジン（以下：Poly-L-Lysと表記する）をコーティングした。Poly-L-Lys・HBr(シグマ社製 品番P-1274(Mw 83,800))をPBS(-)で0.01wt%〜0.1wt%に溶解したコーティング液を調製した。上記96穴プレートに100μl/wellで添加した。これを室温で16hr放置してPoly-L-Lysを物理吸着させた。コーティングに用いた溶液を取り除き、蒸留水150μlで２回洗浄した後、室温で乾燥した。比較の為に,牛血清アルブミン(以下BSAと表記)の0.01wt% PBS(-)溶液で同様にコーティングしたものを対照とした。BSAの等電点(pI)はpH=4.7〜4.9とされており、BSAをコーティングした表面は、下記の接着実験のDMEM培地中(pH=7.4)では、若干負荷電を有していると考えられる。
前記と同様にして調製した細胞Ａおよび細胞Ｂの懸濁液を、血清を添加していないDMEM培地(pH7.4)(シグマ社製D-5523)に2.5×105 個/mlになるように再懸濁した。これを上記コーティング済み96穴プレートに100μl/wellで播種した。遠心分離器にて50G １分遠心して細胞を底面に沈めて接触させ、37℃ 5% CO2飽和水蒸気下25分インキュベーションした。材料表面非吸着の細胞を上清とともにデカンテーションし、PBS(-)150μlを用いて２回リンスした。上清を吸引し、一旦-80℃にて凍結・解凍後、底面に接着している細胞数をCyQUANTを用いて定量した。接着細胞数を仕込みの細胞に対するパーセンテージとして[表４]に示す。
【００３４】
【表４】
2006050964.tif 000005
【００３５】
負荷電が強い細胞Ｂの方が、Poly-L-Lysにより正荷電を付与した材料表面に接着しやすいことが示された。また、比較として示した正荷電を付与されていないBSAコート材料表面には細胞Ａおよび細胞Ｂは接着しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の物理化学的性質の差異を順次分析して細胞分離材を調達する例を示すフローチャート。
【図２】本発明の細胞分離器具の縦断面概念図を示す。
【符号の説明】
【００３７】
(1):細胞分離器具
(2):細胞分離材
(3):液体導入口
(4):液体導出口
【図１】
2006050964.tif 000006
【図２】
2006050964.tif 000007