(57)【要約】【課題】リン、ビタミンDが関与する疾患の治療または予防に利用できる、血中リンおよび／または血中活性型ビタミンDを低下させるklothoタンパク質ならびに血中リンおよび／または血中活性型ビタミンＤを上昇させる抗klothoタンパク質抗体を含む医薬組成物医薬組成物の提供。【解決手段】klothoタンパク質を有効成分として含む、血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を低下させるための医薬組成物、および抗klothoタンパク質抗体を有効成分として含む、血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を上昇させるための医薬組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
klothoタンパク質を有効成分として含む、血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を低下させるための医薬組成物。
【請求項２】
klothoタンパク質が可溶化klothoタンパク質である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗klothoタンパク質抗体を有効成分として含む、血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を上昇させるための医薬組成物。
【請求項４】
腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLH、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、低リン血症、クル病、骨軟化症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、高リン血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害および低1,25D血症からなる群から選択されるリンおよび／またはビタミンDが関与する疾患の治療および／または予防に使用される請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を変動させる物質をスクリーニングする方法であって、FGF23とklothoタンパク質を接触させ、FGF23とklothoタンパク質との相互作用による細胞内シグナルを検出することにより、スクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリン酸代謝、ビタミンD代謝を変化させるようなKlothoタンパク質、同Klothoタンパク質を認識する抗体、同Klothoタンパク質とFGF23ポリペプチドとの複合体、ならびにこれら物質の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体におけるリンは骨、細胞内、細胞外液中に存在し、骨の力学的強さの元や生体のエネルギー代謝、細胞機能維持等に不可欠な重要な役割を担っている。このような重要性から血清中のリン濃度はほぼ一定の濃度に保たれており、血中リン酸濃度の恒常性を維持する為の制御機構の存在が示唆されている。生体内のリンの出納は腎での排泄と腸管での吸収によって調節されているが、リン出納調節臓器としては腎臓が重要であると考えられている。具体的には腎臓の近位尿細管におけるリン酸輸送体タンパク質の調節が血中リン濃度調節に影響を与える。血清中のリン酸濃度の変化と調節に影響を与える物質としては副甲状腺ホルモン、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3、FGF23などの関与が現在のところ考えられているが、副甲状腺ホルモンや1α,25-ジヒドロキシビタミンD3は、リン代謝よりもむしろカルシウム代謝調節において重要な役割を果たしている。
【０００３】
FGF23は血清リン、血清1α,25-ジヒドロキシビタミンDを強力に低下させる因子として発見された物質である(WO 02/14504、およびShimada T , et al :Proc Natl Acad Sci USA, 2001 May 22;98(11):p6500-p6505)。血清リンの低下を伴う腫瘍性骨軟化症の腫瘍特異的に高発現している遺伝子を探索した結果発見された物質で、腎臓近位尿細管のリン酸輸送体を減少させることにより血清リン酸の低下を引き起こす。また、腎臓での1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（以下活性型ビタミンD3）の合成酵素である1α水酸化酵素の発現を抑制し、逆に活性型ビタミンD3の分解酵素である２４水酸化酵素の発現を増大させることにより、血中の活性型ビタミンD3濃度を低下させる。このように、FGF23は血清リン、血清1α,25-ジヒドロキシビタミンDを共に低下させる作用を持つことは明らかとなっているが、そのシグナルを伝達する物質や経路に関しては明らかにはなっていない。
【０００４】
一方、ヒトの老化症状に似た変異表現型をもつklothoマウスはklotho遺伝子座へのほかの遺伝子の挿入変異により様々な表現型を示すことが明らかになっており、その表現型は短寿命、成長遅延、老年性皮膚萎縮、肺気腫、難聴、心臓機能障害、メンケベルク型動脈硬化症、低回転性の骨密度の減少、異所性石灰化、不妊症、血糖制御異常、胸腺萎縮、B細胞分化障害などである（WO98/29544, Kuro-o M , et al :Nature 1997 Vol 390 p45-51）。また、これらの表現型はウイルスベクターを用いた全長klotho遺伝子のklothoマウスへの導入により回復することが示されている（WO98/29544, Kuro-o M , et al :Nature 1997 Vol 390 p45-51）。さらに、klothoの細胞外領域はKL1とKL2の二つの領域から構成されているが、KL１領域と免疫グロブリンを融合させたタンパク質をklothoマウスへ投与することにより、胸腺、脾臓、精巣の萎縮や異所性石灰化を抑制することが明らかとなっている（WO00/27885）。上記に挙げたklothoマウスの様々な症状の他に、klotho変異マウスは血清中のリン酸濃度の亢進、活性型ビタミンDの亢進が引き起こされていることが報告されており（Yoshida T , et al ：Endocrinology. 2002 Feb;143(2):683-9.）、また、リン、ビタミンDホメオスタシスが異常をきたすような状態である腎不全時でのklothoタンパクの発現は正常時の腎臓と比較して減少していることも報告されている（Koh H , et al ：Biochem Biophys Res Commun. 2001 Feb 2;280(4):1015-20.）。klotho変異マウスでは１α水酸化酵素の発現亢進が引き起こされていることが明らかとなっており、klotho遺伝子異常によるビタミンD代謝異常が考えられているが、klothoタンパク質自身の機能が未解明であることもあり、klotho遺伝子異常におけるリン酸代謝、ビタミンD代謝に関わる分子メカニズムは明らかとなっていない。
【０００５】
【特許文献１】
WO02/14504
【特許文献２】
WO98/29544
【特許文献３】
WO00/27885
【非特許文献１】
Shimada T , et al :Proc Natl Acad Sci USA, 2001 May 22;98(11):p6500-p6505
【非特許文献２】
Kuro-o M , et al :Nature 1997 Vol 390 p45-51
【非特許文献３】
Endocrinology. 2002 Feb;143(2):683-9
【非特許文献４】
Koh H , et al ：Biochem Biophys Res Commun. 2001 Feb 2;280(4):1015-20
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血中リンおよび／または血中活性型ビタミンDを低下させるklothoタンパク質ならびに血中リンおよび／または血中活性型ビタミンDを上昇させる抗klothoタンパク質抗体を含む医薬組成物の提供を目的とし、リン、ビタミンDが関与する腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLH、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、低リン血症、クル病、骨軟化症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、高リン血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害および低1,25D血症などの疾患の治療または予防のための医薬組成物の提供を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は血中リン濃度、血中活性型ビタミンD濃度をコントロールしうる物質とその用途を提供することにある。
【０００８】
本発明者らは全長klothoタンパク質、可溶化klothoタンパク質に関わらず、klothoタンパク質が存在する条件下においてFGF23による細胞内へのシグナル伝達（ERKリン酸化亢進やegr1発現上昇）が動物での腎臓と同様に引き起こされることを見出した。また、FGF23とklothoタンパク質とは結合することを明らかとした。また、FGF23とklothoタンパクとの相互作用がリン、ビタミンDの代謝調節に重要であることを見出した。また、klothoタンパク質を認識する抗体のマウスへの投与により血中のリン、活性型ビタミンDの濃度を上昇させることに成功し、また可溶化klothoタンパク質発現細胞のヌードマウスへの移植により、血中のリン濃度、活性型ビタミンD濃度を低下させることにも成功した。これらの結果から本発明を完結するに至り、本発明により血中リン、血中ビタミンDを制御することにより関係する疾患を治療することのできる薬剤となりうる、もしくは関連する疾患の診断を可能にしうるものと考える。従って、本発明は以下の通りである。
[１]  klothoタンパク質を有効成分として含む、血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を低下させるための医薬組成物、
[２]  klothoタンパク質が可溶化klothoタンパク質である、[１]の医薬組成物、
[３]  抗klothoタンパク質抗体を有効成分として含む、血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を上昇させるための医薬組成物、
[４]  腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLH、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、低リン血症、クル病、骨軟化症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、高リン血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害および低1,25D血症からなる群から選択されるリンおよび／またはビタミンDが関与する疾患の治療および／または予防に使用される[１]から[３]のいずれかの医薬組成物、および
[５]  血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を変動させる物質をスクリーニングする方法であって、FGF23とklothoタンパク質を接触させ、FGF23とklothoタンパク質との相互作用による細胞内シグナルを検出することにより、スクリーニングする方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は血中のリン濃度、活性型ビタミンD濃度を変化させるようなklothoタンパク質、klothoタンパク質を認識する抗体、FGF23とklothoタンパク質との複合体とそれら物質の用途に関するものである。
【００１０】
本発明を用いることにより、klothoタンパク質、klothoタンパク質を認識する抗体、FGF23とklothoタンパク質との複合体の少なくともいずれかを含む医薬組成物を、リン、ビタミンDが関与する病態、例えば、腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLH、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、低リン血症、クル病、骨軟化症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、高リン血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害および低1,25D血症などの疾患の治療または予防に用いることができる。
【００１１】
可溶化klotho
可溶化klotho cDNAとしては配列番号１(Genebank accession No. AB005142)に記載のヒト由来のklotho cDNAの配列を元にして公知の方法により調製することができる。例えば、klothoタンパク質を発現している細胞、臓器よりｃDNAライブラリーを作製し、klotho cDNAの配列（配列番号１）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行なうことにより調製できる。また、klothoタンパク質を発現している細胞、臓器よりRNAを調製し、逆転写酵素によりｃDNAを作製した後klotho cDNAの配列（配列番号１）に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、klotho cDNAを増幅させ調製することも可能である。
【００１２】
上記通り得られたklotho cDNAについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-ELMER社製373A DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
【００１３】
配列番号１にヒトklotho cDNAの塩基配列を、配列番号２にヒト全長klothoタンパク質のアミノ酸配列、配列番号３に可溶化ヒトklothoタンパク質のアミノ酸配列を例示するが、低リン酸血症誘導活性および／または低活性型ビタミンＤ血症誘導活性を有する限り、当該アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。また、ヒトKlothoタンパク質とマウスKlothoタンパク質のアミノ酸配列レベルでの相同性は８５％であり（配列番号２がヒトklothoタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２３がマウスklothoタンパク質のアミノ酸配列を示す）、マウスklothoタンパク質はヒトklothoタンパク質と同等の機能を有していると予測される。従って、本発明においてklothoタンパク質はヒト由来のklothoタンパク質だけではなく、マウス由来klothoタンパク質やヒトklothoタンパク質とアミノ酸の相同性が、80％以上、好ましくは85％以上の他動物種のklothoタンパク質も含まれる。これらヒト以外の動物種由来のklothoタンパク質のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、低リン酸血症誘導活性および／または低活性型ビタミンD血症誘導活性を有する限り、当該アミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。タンパク質が低リン酸血症誘導活性および／または低活性型ビタミンD血症誘導活性を有しているかは後述の実施例１３に記載の方法を参考にタンパク質を発現している細胞をマウスに移植、もしくは同タンパク質をマウス等に投与し、血清中のリン濃度または1,25ジヒドロキシビタミンD濃度を測定すればよい。
【００１４】
例えば、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号２３に示されるアミノ酸配列から１又は数個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号２３に示されるアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号２３で表わされるアミノ酸配列の１又は数個、好ましくは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００１５】
また、置換の方法としては、アミノ酸の特性をある程度保持したファミリー内での保存的置換を行っても良い。アミノ酸側鎖の側鎖の特性から一般的に分類されるファミリーは以下のものが挙げられる。
（１）酸性アミノ酸ファミリー：  アスパラギン酸、グルタミン酸
（２）塩基性アミノ酸ファミリー：  リジン、アルギニン、ヒスチジン
（３）非極性アミノ酸ファミリー：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン
（４）非帯電極性アミノ酸ファミリー：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン
（５）脂肪族ヒドロキシアミノ酸ファミリー：セリン、スレオニン
（６）アミド含有アミノ酸ファミリー：アスパラギン、グルタミン
（７）脂肪族アミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
（８）芳香族アミノ酸ファミリー：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
（９）疎水性アミノ酸ファミリー：ロイシン、イソロイシン、バリン
（１０）小型アミノ酸ファミリー：アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、グリシン
【００１６】
本発明において、本発明の可溶化klothoタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部に変異を導入するには、該アミノ酸をコードするDNAの塩基配列に変異を導入する手法が採用される。
【００１７】
DNAに変異を導入するには、Kunkel法若しくはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異誘発法に基づいて変異を導入するが、変異導入用キット（例えばMutan-K(TAKARA社製）、Mutan-G(TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットなど)を用いて変異を導入することもできる。
【００１８】
さらに、上記本発明のDNA（配列番号１）から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低リン血症誘導活性および／または低活性型ビタミンＤ血症誘導活性を有するタンパク質をコードするDNAも、本発明のDNAに含まれる。このようなDNAの配列は、配列番号１に示されるDNAの有する配列と相同性が70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上である。上記のようにこれらのDNA配列にはマウスklothoタンパク質等ヒト以外の動物種由来のklothoタンパク質も含まれる。プローブとは、配列番号１に示す配列の全長に対し相補配列を有するもの、あるいは長さが17塩基以上の連続する配列（部分配列）に対し相補配列を有するものをいう。
【００１９】
ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が750mM以上、好ましくは900mM以上であり、温度が40℃以上、好ましくは42℃の条件を満たすものをいう。具体的には、6×SSC、5×Denhardt、0.5% SDS、50% Formamide、42℃の条件をいう。なお、6×SSCとは、900mM NaCl、90mM クエン酸ナトリウムを意味する。デンハルト溶液（Denhardt）とは、BSA（ウシ血清アルブミン）、ポリビニルピロリドン及びFicoll400を含む溶液であり、50×Denhardtは1% BSA、1%  ポリビニルピロリドン、1% Ficoll 400の組成からなる（5×Denhardtは50×Denhardtの10分の１の濃度を意味する）。
【００２０】
また、本発明のDNAがコードするタンパク質が低リン酸血症誘導活性および／または低活性型ビタミンＤ血症誘導活性を有しているかは後述の実施例１３に記載の方法を参考にタンパク質を発現している細胞をマウスに移植、もしくは同タンパク質をマウス等に投与し、血清中のリン濃度または1,25ジヒドロキシビタミンD濃度を測定すればよい。
【００２１】
一旦本発明のDNAの塩基配列が決定されると、その後は、化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合成したプライマーを用いたPCRによって、本発明のDNAを得ることができる。
【００２２】
本発明のDNAを含む組換えベクター及び形質転換体の作製
(1) 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のDNAを連結(挿入)することにより得ることができる。本発明のDNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
【００２３】
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。さらに、GST、His-tagなどが連結された融合プラスミドを用いることもできる。
【００２４】
ベクターに本発明のDNAを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２５】
本発明のDNAは、そのDNAの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のDNAのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２６】
(2) 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、あるいはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられる。また、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞等の動物細胞や、Sf9、Sf21等の昆虫細胞を用いることもできる。
【００２７】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) JM109、HB101などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するT7プロモーターなどが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２８】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００２９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3細胞、又はヒトFL、HEK293、HeLa若しくはJurkat細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、β-アクチンプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３０】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３１】
本発明のklothoタンパク質
本発明のklothoタンパク質とは、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはこれらのタンパク質と80％以上、好ましくは85％以上のアミノ酸配列の相同性を有するヒトおよびマウス以外の他動物種由来のklothoタンパク質のことであり、また前述の低リン酸血症誘導活性および／または低活性型ビタミンD血症誘導活性を有するものである。さらに、本発明におけるklothoタンパク質には、低リン酸血症誘導活性および／または低活性型ビタミンD血症誘導活性を有する限り、前述のアミノ酸配列中の１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び、または修飾されているアミノ酸配列を有するタンパク質も包含される。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加が複数の組み合わせの場合であってもよい。
【００３２】
本発明の低リン酸血症誘導活性および／または低活性型ビタミンD血症誘導活性を有するklothoタンパク質は、配列番号１に示す塩基配列もしくは配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１番〜２９３４番を含む配列、または他動物種のklothoタンパク質をコードするDNAの配列もしくはヒトklotho DNAの塩基配列の塩基番号1番〜２９３４番に相当する配列を含む配列を、発現できる形態で適当な宿主細胞に導入して形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞に導入したDNAを発現させることによって製造することができる。また、このように産生されたタンパク質は、宿主が持つタンパク質修飾機構により切断や糖鎖付加などのポリペプチド鎖の改変を受けることがある。
【００３３】
本発明のklothoタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３４】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００３５】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で4〜48時間行う。培養期間中、pHは6.0〜8.0に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３６】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導可能なT7プロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、 IPTG等を培地に添加することができる。また、インドールアクリル酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
【００３７】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で１〜10日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養後、本発明のklothoタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のポリペプチドを採取する。また、本発明のklothoタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のポリペプチドを単離精製することができる。
【００３８】
本発明のklothoタンパク質のin vivoでの活性は、本発明のklothoタンパク質を発現する上述の組み換え体細胞をヌードマウスの皮下に移植する実験により評価した。
【００３９】
本試験において移植した細胞は、ヌードマウスの皮下において増殖して腫瘍を形成する。これに伴い細胞が生産し、分泌する本発明のポリペプチドはマウスの体液中に放出されることを特徴としている。この実験において、図８（実施例１３）に示すように、本発明のklothoタンパク質を発現する細胞を移植したマウスは、本発明のDNAを導入していない対照のCHO細胞を移植して腫瘍を形成させた個体、又は腫瘍を形成していない個体と比較して、明らかな低リン酸血症を呈した。このことから、本発明のklothoタンパク質は低リン酸血症誘導活性を有していることが明らかとなった。
【００４０】
本発明においては、上記タンパク質を修飾することもできる。例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（N-ビニル−ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールなどを適宜選択して使用する。修飾方法は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば特表平10-510980号公報に詳細に開示されている。
【００４１】
抗klothoタンパク質抗体
本発明における抗klothoタンパク質抗体とは、前記に定義したようなklothoタンパク質またはその一部に反応性を有する抗体あるいは抗体の一部である。本発明の抗体には、抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／または軽鎖からなり、klothoタンパク質と結合し得るモノクローナル抗体も包含される。本発明の抗klothoタンパク質抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。これらの改変技術は当業者に周知であり、市販の突然変異導入キット等を使用することができる。
【００４２】
(1) klothoタンパク質の部分的構造を特異的に認識して結合する抗体
klothoタンパク質の検出や生物活性の調節に有用な抗体を取得するには、klothoタンパク質の構造的特徴を認識する抗体、高親和性を有する抗体、生物活性を中和できる抗体などの取得が有効である。Klothoタンパク質の構造や抗原性については不明であるので、klothoタンパク質の部分配列に相当する複数のペプチドを合成して、各ペプチドに対する抗体の取得を行った。これらを用いて発現細胞が分泌したklothoタンパク質の検出をウエスタンブロッティングにより行ない、発現細胞中および培養上清中には成熟型klothoタンパク質が発現していることを明らかにした。また、得られた抗体は成熟型klothoタンパク質とその切断により生じるペプチドに対して多様な結合特異性を示した。
【００４３】
(2) 抗体の製造
本発明の抗体は、例えば、下記のような製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、前記で定義したようなklothoタンパク質又はその一部、あるいは抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、bovine serum albumin等）との結合物を、必要に応じて免疫賦活剤（Freund's Adjuvant等）とともに、ヒト抗体産生トランスジェニックマウス等を含む非ヒト哺乳動物に免疫する。あるいは、klothoタンパク質をコードするDNAを組み込んだ発現ベクターを投与することにより免疫感作を行うことができる。ポリクローナル抗体は、免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００４４】
さらに具体的には下記のようにして製造することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature, 1975 Vol.256:495-497）及びそれに準じて行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃等、好ましくはリンパ節または脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞と細胞融合させることにより調製される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばELISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００４５】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することにより行える。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の腹水中等でのインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
【００４６】
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えば哺乳類細胞細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換型抗体を調製することができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。さらに、 トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００４７】
本発明のポリクローナル抗体は、実施例１０に示すように、化学合成したklothoタンパク質の部分ペプチドとキャリアタンパク質であるウシサイログロブリンと結合させたものを作製し、ウサギを免疫した。免疫により誘導された各ペプチドに対する抗体は、免疫に用いたペプチドを固相化したアフィニティーカラムで精製した。このようにして得た抗体の特性については、ウエスタンブロッティングにて検討しklothoタンパクタンパク質に対する反応性を明らかにした。
【００４８】
FGF23とklothoタンパク質の複合体
本発明でいうFGF23とklothoタンパク質の複合体とはFGF23分子（WO02/14504記載）と前記に定義したようなklothoタンパク質を混合することにより製造できる。本発明におけるFGF23分子は遺伝子組み換え技術の他、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる公知の方法又はその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。例えばFGF23は島田らの方法｛Endocrinology 143, 3179 (2002)｝により製造することができる。また、本発明におけるklothoタンパク質も同様に遺伝子組み替え技術の他、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる公知の方法又はその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
【００４９】
本発明の複合体は例えば下記のような製造方法によっても製造することができる。すなわち、前述したFGF23とklothoタンパク質を混合し、数分〜数時間、4℃〜室温条件下で静置することにより作製することが可能である。また、複合体の結合をより強固にする為に、Disuccinimidyl suberate , Bis(sulfosuccinimidyl)suberate などの架橋剤を用いることも可能である。また、FGF23とklothoタンパク質との結合遺伝子を遺伝子組み換え技術の他、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる公知の方法又はその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。また、生体内に存在するFGF23−klothoタンパク質複合体を抗FGF23抗体結合ビーズ、もしくは抗klothoタンパク質抗体結合ビーズを用いて精製することにより製造することも可能である。
【００５０】
本発明のklothoタンパク質を含む医薬組成物
本発明のklothoタンパク質は、血中リン酸濃度の上昇および／または血中活性型ビタミンD濃度の上昇が好ましくない疾患に対して医薬組成物として用いることができる。実施例１３のように本klothoタンパク質もしくは本klothoタンパク質を含有する医薬組成物は血中リン、血中活性型ビタミンD濃度を変化させる作用があるため、血中リン酸濃度、血中活性型ビタミンD濃度の変化が引き起こされるような疾患、例えば高リン血症、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、および成長障害などの治療に利用することができる。
【００５１】
本発明の抗klothoタンパク質抗体を含む医薬組成物
実施例１４にあるように本発明の抗体は血中リン酸濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を上昇させる作用がある。このことから血中リンおよび／または血中活性型ビタミンD濃度の変化が影響していると考えられる疾患、例えば腫瘍性骨軟化症、ADHR、XLHなどに対して医薬組成物として用いることができ、これらの疾患に共通して認められる低リン血症、骨石灰化不全、骨痛、筋力低下、骨格の変形、成長障害、低1,25D血症について改善効果が期待できる。またFGF-23が生理的条件下で重要な役割を果たしており、FGF-23のリン代謝調節作用やFGF-23が調節するビタミンD代謝を介したカルシウム代謝調節作用を本発明の抗体が制御することによって、骨粗鬆症、クル病、高カルシウム血症、低カルシウム血症、異所性石灰化、骨硬化症、パジェット病、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、掻痒等のミネラル代謝やビタミンD代謝の異常に起因する疾患に対して治療的および予防的に医薬組成物として用いることができる。
【００５２】
本発明のFGF23とklothoタンパク質の複合体を含む医薬品組成物
FGF23と可溶化klothoタンパク質は結合し（実施例１２）、klothoタンパク質存在下でのみFGF23添加により細胞内シグナル（ERKリン酸化亢進、EGR1発現上昇）が引き起こされること（実施例６，７、８）や、可溶化klothoタンパク質発現細胞の移植実験で血中リンおよび／または血中活性型ビタミンDの濃度が低下すること（実施例１３）などからFGF23とklothoタンパク質とはなんらかの相互作用により血中リンおよび／または血中活性型ビタミンDの濃度を変化させていることが考えられる。ゆえに、本発明のKlothoタンパク質とFGF23との複合体は、血中リン酸濃度の上昇および／または血中活性型ビタミンD濃度の上昇が好ましくない疾患に対して医薬組成物として用いることができる。すなわち血中リン酸濃度、血中活性型ビタミンD濃度の変化が引き起こされるような疾患、例えば高リン血症、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害などの治療に利用することができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物の使用
本発明のklothoタンパク質、抗klothoタンパク質抗体、およびklothoタンパク質とFGF23との複合体を有効成分として含む医薬組成物は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００５４】
本発明のklothoタンパク質、抗klothoタンパク質抗体、klothoタンパク質とFGF23との複合体を含む予防剤又は治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。
Klothoタンパク質とFGF23との複合体を投与する代わりに、夫々のタンパク質を同時に投与することも有効である。
【００５５】
経口的に投与する場合は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤などの固形製剤、あるいは液剤、シロップ剤などの液体製剤等とすればよい。特に顆粒剤及び散剤は、カプセル剤として単位量投与形態とすることができ、液体製剤の場合は使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
【００５６】
これら剤形のうち経口用固形剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有する。また、経口用液体製剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有する。
非経口的に投与する場合は、注射剤、坐剤等とすることができる。
【００５７】
注射の場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供され、使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよい。これらの剤形は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を含有する。注射手法としては、例えば点滴静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射が挙げられる。また、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。
【００５８】
この場合、本発明のklothoタンパク質、抗klothoタンパク質抗体、klothoタンパク質とFGF23との複合体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、klothoタンパク質、複合体にあっては、一回につき体重1kgあたり0.01〜100μg、好ましくは0.5〜20μgである。また、抗体にあっては、一回につき体重1kgあたり0.1μg〜2mg、好ましくは1〜500μgである。
【００５９】
スクリーニング系
血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度の異常は様々な疾患、例えば高リン血症、腎性骨異栄養症、透析骨症、骨粗鬆症、低リン血症、クル病、骨軟化症、尿細管機能障害、骨減少症、低カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、異所性石灰化、掻痒、骨硬化症、パジェット病、高カルシウム血症、副甲状腺機能低下症、骨痛、筋力低下、骨格変形、成長障害および低1,25D血症など、で確認されており、血中リンおよび／または血中活性型ビタミンD濃度を調節するような物質はこれらのような疾患の治療に有用であると考えられる。本発明によるFGF23とklothoタンパク質との相互作用を利用した系は上記疾患を治療する物質（例えばタンパク質、ペプチド、糖質、脂質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、生体物質）の探索に利用できる。このような物質の探索の指標としては、FGF23−klothoタンパク質相互作用による細胞内シグナルを検出する系（例えば細胞内タンパク質のリン酸化、初期応答遺伝子の活性化、細胞内カルシウム、cAMP , cGMP等の細胞内情報伝達分子濃度の変化、細胞膜電位の変化、細胞内pHの変化、細胞外情報伝達分子の遊離、細胞の形態変化等）をあげることができる。
【００６０】
例えば、全長klothoタンパク質を発現させた細胞系にFGF23を作用させ、細胞内ERKリン酸化が亢進することを確認する系を利用することにより、FGF23とklothoタンパク質相互作用を阻害する、または増強するような物質（低分子化合物、抗体、など）を探索することが可能である。また、可溶化klothoタンパク質とFGF23とを様々な細胞系に添加することにより細胞内ERKリン酸化が亢進することを確認する系を利用することによりFGF23−klotho相互作用（例えば血中リン濃度変化もしくは血中活性型ビタミンD濃度変化）を阻害、または増強するような物質の探索をすることが可能である。
【００６１】
また、例えば全長klothoタンパク質を発現させた細胞系にFGF23を作用させ、EGR1遺伝子の発現が上昇することを確認する系もしくはEGR1プロモータが活性化することをEGR1プロモータ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて検出する系など利用することにより、FGF23とklothoタンパク質相互作用を阻害する、または増強するような物質（低分子化合物、抗体、など）を探索することが可能である。また、可溶化klothoタンパク質とFGF23とを様々な細胞系に添加することにより、EGR1遺伝子の発現が上昇することを確認する系、もしくはEGR1プロモータが活性化することをEGR1プロモータ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて検出する系、を利用することによりFGF23−klothoタンパク質相互作用（例えば血中リン濃度変化もしくは血中活性型ビタミンD濃度変化）を阻害、または増強するような物質の探索をすることが可能である。
【００６２】
また、FGF23−klothoタンパク質相互作用により遺伝子発現変化が引き起こされると考えられるビタミンD１α水酸化酵素遺伝子、ビタミンD２４位水酸化酵素遺伝子、その他FGF23−klothoタンパク質相互作用により遺伝子変化が引き起こされると考えられる遺伝子やそれら遺伝子のプロモータを利用したレポーター遺伝子を利用することによりFGF23−klothoタンパク質相互作用（例えば血中リン濃度変化もしくは血中活性型ビタミンD濃度変化）を阻害、または増強するような物質の探索をすることが可能である。
【００６３】
本発明は、klothoタンパク質を体内に投与して、血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を低下させる方法ならびに抗klothoタンパク質抗体を体内に投与して血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を上昇させる方法も包含する。さらに、本発明は血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を低下させるための医薬組成物製造のためのklothoタンパク質の使用ならびに血中リン濃度および／または血中活性型ビタミンD濃度を上昇させるための医薬組成物製造のための抗klothoタンパク質抗体の使用をも包含する。
【００６４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕  FGF23のマウスへの投与による腎臓でのegr1発現上昇作用の確認
ヒトFGF23のマウスへの投与時に腎臓で発現変動する遺伝子を探索する為にメンブレンアレイAtlas mouse 1.2k、Atlas mouse 1.2kII（米国  クロンテック社）を用いて探索を行なった。メンブレンアレイは添付のプロトコールに従い行なった。使用したサンプルはヒトFGF23(5μg/head)投与1時間後マウス腎臓、ヒトFGF23投与8時間後マウス腎臓、媒体投与マウス腎臓。組み換えヒトFGF23の作製および精製は島田らの方法｛Endocrinology 143, 3179 (2002)｝に従って行った。マウスはBALB/c （雄  、6週齢）を使用して各n=2で行なった。その結果、ヒトFGF23投与後1時間で発現が上昇する遺伝子としてEGR1が見出された。
【００６５】
この現象を確認するため、上述の3種のマウス腎臓総RNAを用いてFirst strand cDNAを作製し、RT-PCRを行なった。First strand cDNAの合成はFirst strand cDNA synthesis kit（米国  インビトロゲン社）を用いて添付のプロトコールにしたがって行なった。First strand cDNA作製にはヒトFGF23投与1時間後マウス腎臓、ヒトFGF23投与8時間後マウス腎臓、媒体投与マウス腎臓より抽出した総RNAを用いた。合成した。
【００６６】
First strand cDNAを鋳型に、下記に示すマウスEGR1特異的なプライマー（配列番号４および５）を用いて94度20秒、68度1分からなる工程を１サイクルとして25サイクルのPCRを実施した。
マウスEGR1 RT-PCR用FWプライマー：CTTAATACCACCTACCAATCCCAGC（配列番号４）
マウスEGR1 RT-PCR用RVプライマー：GTTGAGGTGCTGAAGGAGCTGCTGA（配列番号５）
【００６７】
図１に示したように、これらPCR産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところヒトFGF23投与後1時間のマウス腎臓でのみEGR1の発現上昇が確認された。一方、対象としたG3PDHプライマーを用いた場合ではどのサンプルも同程度の発現が認められた。この結果から、FGF23投与後1時間でマウス腎臓においてEGR1の発現上昇することが確認された。
【００６８】
〔実施例２〕  FGF23のラットへの投与による腎臓でのERKリン酸化亢進
EGR1発現上昇はMAPキナーゼカスケードの活性化により引き起こされることが知られている。そこで、ヒトFGF23投与時のラット腎臓におけるERKリン酸化亢進が引き起こされるかどうかを調べた。ラット（７週齢、ＳＤ，雄）にヒトFGF23を５μg/head投与し、5分後、10分後の腎臓を摘出。腎臓皮質部のみをかみそりにて切断した。切断したラット腎臓皮質部は液体窒素にて凍結した。凍結した腎臓は抽出バッファー（20mM Hepes(pH7.5) , 150mM NaCl , 1% NP-40 , 1mM EDTA , 0.1% SDS , 50mM sodium fluoride , 2mM sodium Vanadate , 1tab./7ml COMPLETE(米国  ロシュ社)）にてポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズを行なった。２時間氷上で静置後1000Gにて１０分間遠心を行ない、上清画分をその後の実験に用いた。上清画分のタンパク質濃度をBCAキット（米国  PIERCE社）にて測定し、全てのサンプルを22.7mg/mlのタンパク質濃度に抽出バッファーで調製した。このサンプルを抗リン酸化ERK抗体（米国  サンタクルーズ社）を用いてウエスタンブロッティングを行なった。図２に示した様に、ヒトFGF23を投与したラットでは、５分後、１０分後ともにERKリン酸化が亢進していることが確認された。
【００６９】
〔実施例３〕  マウスklotho遺伝子のクローン化
マウスklotho遺伝子の全長cDNAクローニングはPCR法にて行なった。GeneBankのデータ（Accession No. AB005141）を元に以下のプライマーを合成した。
マウスklotho遺伝子クローニング FWプライマー：
CCCGAATTCGCAGCATGCTAGCCCGCGCCCCTCCTC（配列番号６）
マウスklotho遺伝子クローニング RV1プライマー：
ATTTGCGGCCGCTTACTTATAACTTCTCTGGCCTTTCTT（配列番号７）
【００７０】
配列番号６のプライマーはマウスklotho遺伝子の5'側のプライマーで、開始コドンとその上流５塩基のコザック配列部分を含む。さらにEcoRIサイトが付加されている。
【００７１】
配列番号７のプライマーはマウスklotho遺伝子の3'側のプライマーで、終始コドンを含み、さらにNot Iサイトが付加されている。鋳型にはマウス腎臓cDNAを使用した。マウス腎臓cDNAの作製は実施例１の方法にしたがって行なった。PCR反応はLA Taq with GC Buffer（日本国  タカラ社）を使用した。すなわち、TaKaRa La Taq polymerase 0.5μl , 2XGC buffer 25μl , dNTP Mix 8μl(2.5mM)、配列番号６のプライマー（１μM）、配列番号７のプライマー（１μM）、上述のマウス腎臓cDNA 1μl、水を最終的に５０μlになるように加え、以下の条件でPCR反応を行なった。一次変性は９４℃で５分、次に９４℃２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４分を１サイクルとして３５サイクル行い、最後に伸長反応を７２℃で７分行った。PCRによる増幅産物は０．８％アガロース電気泳動にて確認した結果、約3kbp付近に単一バンドが確認されたため、ゲルからバンド部分の切り出しを行ないMinElute Gel extraction kit（ドイツ国  キアゲン社）を用いてゲルからの精製を行なった。精製したマウスklotho cDNA断片をEcoRI、NotIにて切断し、EcoRI,NotI切断したPEAK８ベクター（米国  エッジバイオシステム社）にライゲーション反応を行なった。ライゲーション反応はTaKaRa Ligation Kit version 2(日本国  タカラ社)を用い、添付のプロトコールに準じて行なった。クローン化されたマウスklotho cDNAの塩基配列を確認する為にマウスklotho遺伝子配列のGeneBankデータ（Accession No. AB005141）を基に以下のマウスklotho遺伝子配列確認用プライマーを合成した。
ACTACCGCTTCTCCATATCGTG（配列番号８）
TCGCCTTAAGCTCCCATTGGAT（配列番号９）
ATGGGGTCGACGTCATTGGGTACA（配列番号１０）
TCTTGCCTCTGGGTAACCAGAC（配列番号１１）
CTTGCAGGCTGACTGGATAGA（配列番号１２）
AGCAAGACTCACTGAGGATCTA（配列番号１３）
CACGATATGGAGAAGCGGTAGT（配列番号１４）
ATCCAATGGGAGCTTAAGGCGA（配列番号１５）
TGTACCCAATGACGTCGACCCCAT（配列番号１６）
GTCTGGTTACCCAGAGGCAAGA（配列番号１７）
TCTATCCAGTCAGCCTGCAAG（配列番号１８）
TAGATCCTCAGTGAGTCTTGCT（配列番号１９）
【００７２】
これらのプライマーを用いクローン化されたマウスklotho cDNAの塩基配列解析を行なった結果、マウスklotho遺伝子と完全に一致し、マウスklotho遺伝子のクローン化を完了した。以下このプラスミドをmklotho/pEAK8と記す。
【００７３】
〔実施例４〕  マウス可溶化klothoタンパク質をコードする遺伝子のクローン化
実施例３で作製したマウスklotho遺伝子を鋳型に可溶化klothoタンパク質を作製した。作製の為に以下のプライマーを合成した。
マウス可溶化klothoタンパク質コード遺伝子クローニング用 RV3プライマー：
ATTTGCGGCCGCTTAGGTTTGAAAAAATCCACATTCGGTGCA（配列番号２０）
【００７４】
配列番号２０のプライマーはマウスklotho遺伝子の2940塩基までを含み、TAA終始コドンを付加し、さらにNotIサイトを付加している。PCR反応は配列番号８と配列番号２０のプライマーとPyrobest Polymerase(日本国  タカラ社)を用いて行なった。すなわち、TaKaRa Pyrobest polymerase 0.5μl、10X Pyrobest Buffer 5μl、dNTP Mix 4μl(1.25mM)、配列番号８プライマー1μM、配列番号２０プライマー１μM、マウスklotho cDNA 10ng、を加え最終液量５０μlになるように水を加えた。PCR反応は以下の通りに行なった。一次変性は９４℃で５分、次に９４℃２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４分を１サイクルとして３５サイクル行い、最後に伸長反応を７２℃で７分行った。PCRによる増幅産物は０．８％アガロース電気泳動にて確認した結果、約2.7kbp付近に単一バンドが確認されたため、ゲルからバンド部分の切り出しを行ないMinElute Gel extraction kit（ドイツ国  キアゲン社）を用いてゲルからの精製を行なった。精製したマウスklotho cDNA断片をKpnI、NotIにて切断し、実施例３で作製したマウスklotho-PEAK８ベクターをKpnI,NotI切断したものににライゲーション反応を行なった。塩基配列の確認は実施例３に準じて行ない、可溶化マウスklothoタンパク質の作製を完了した。以下このプラスミドをsoluble-mklotho/pEAK8と記す。この可溶化マウスklothoタンパク質はアミノ酸番号１から980までをコードする。さらに、得られたマウス可溶化klotho cDNAをEcoRI,NotIで切断し、プラスミドpEAK8（米国エッジバイオシステム社）に分子内リボゾームエントリー部位（IRES）および増強型緑色蛍光タンパク質（EGFP）を連結することにより作製したベクターIRES-EGFP-pEAK8のEcoRI,NotI部位に挿入することによってsoluble-mklotho/ IRES-EGFP-pEAK8を得た。
【００７５】
〔実施例５〕  マウス可溶化klothoタンパク質安定発現細胞の作製
TransIT LT1（米国  MIRUS社）を用い、添付文書にしたがってCHOras clone1細胞にsoluble-mklotho/ IRES-EGFP-pEAK8プラスミドを導入した。5μg/mlピューロマイシン、１０％FBSを含むMEMα培地にて薬剤耐性細胞を選択し、FACS vantage（米国  ベクトンディッキンソン社）によってEGFP（Green Fluorescent Protein）の発光強度が強い細胞をソーティングによりクローン化した。クローン化した細胞がコンフルエントになったところで、血清を含まないDF（DMEM/F-12）培地に置換し２日後に上清を回収した。回収した上清を抗klothoタンパク質抗体（米国 ALPHA DIAGNOSTIC社）を用いてウエスタンブロッティングを行ない、130kDa付近のklothoタンパク質のバンドの強いクローンを選択した。
【００７６】
〔実施例６〕  マウス全長klothoタンパク質の一過性発現によるFGF23刺激でのERKリン酸化亢進
ERKリン酸化亢進確認
実施例３で作製したマウス全長klothoタンパク質発現プラスミドを用いてマウス全長klothoタンパク質をPEAKrapid細胞（米国  エッジバイオシステム社）に一過性に発現させてFGF23で刺激を加えたときの細胞内ERKリン酸化の亢進を検証した。１２ウェルプレートにPEAKrapid細胞に添付のプロトコールに従い実施例３で作製したmklotho/pEAK8プラスミドを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクト２４時間後に血清を含まないDMEM培地に培地交換し、さらに２４時間CO2インキュベーター内でインキュベートを行なった。ヘパリン（米国  シグマ社）を１０μｇ/mlになるように添加した後に、FGF23、bFGF、媒体を添加した。１０分３７℃でインキュベートを行なった後に上清を吸引しPBSで洗浄を行なった後SDS-PAGEサンプルバッファー（日本国  第一化学社）にて細胞を溶解した。このサンプルについて実施例２と同様にウエスタンブロッティングを行った。図３に示すようにマウス全長klothoタンパク質発現PEAKrapid細胞のみでFGF23によるERKリン酸化亢進が確認された。
【００７７】
〔実施例７〕  マウス全長klothoタンパク質の一過性発現によるFGF23刺激でのegr1発現上昇の確認
マウス全長klothoタンパク質をPEAKrapid細胞（米国  エッジバイオシステム社）へ一過性発現させたときのFGF23刺激によるEGR1の発現上昇を検証した。PEAK rapid細胞へ実施例６と同様にトランスフェクションを行なった。トランスフェクション４８時間後にヘパリン１０μｇ/mlになるように加え、さらにヒトFGF23（１００ng/ml）にて刺激を加えた。刺激３０分後に細胞をPBSで洗浄を行いISOGEN（日本国  ニッポンジーン社）を用いて懸濁させた。添付文書に従いトータルRNAを調製し、実施例１と同様にRT-PCRを行なった。実施例１の結果と同様にマウス全長klothoタンパク質発現PEAKrapid細胞ではFGF23  100ng/ml刺激でEGR1の有意な発現上昇が確認された。
【００７８】
〔実施例８〕  マウス可溶化klothoタンパク質発現細胞上清とFGF23添加によるCHOras clone1細胞でのERKリン酸化亢進確認
8-(1)  マウス可溶化klothoタンパク質発現細胞の培養上清の調製
実施例５で作製したマウス可溶化klothoタンパク質発現CHOras clone1細胞を組織培養用フラスコ（225cm2、米国  コーニング社）に播種した。２４時間培養後血清を含まないMEMα培地に置換し、５日間３７℃にて培養し、その培養上清を回収した。
【００７９】
8-(2)マウス可溶化klothoタンパク質発現細胞の培養上清とFGF23添加によるCHOras clone1細胞でのERKリン酸化亢進確認
CHOras clone1細胞、およびHEK293細胞を24ウェルプレート（米国  コーニング社）に播種した。２４時間培養後、8-(1)で調製したマウス可溶化klothoタンパク質発現CHOras clone1細胞培養上清に置換しさらに４時間培養を行なった。続いてヘパリン10μg/mlを添加したのちにヒトFGF23（100ng/ml）を添加した。１０分３７℃でインキュベートを行なった後に上清を吸引しPBSで洗浄を行なった後SDS-PAGEサンプルバッファー（日本国  第一化学社）にて細胞を溶解した。このサンプルについて実施例２と同様に抗ERK抗体（米国  サンタクルーズ社）を用いてウエスタンブロッティングを行った。図５に示すようにマウス可溶化klothoタンパク質を添加した細胞のみでFGF23によるERKリン酸化亢進が確認された。
【００８０】
〔実施例９〕  EGR１プロモータ・ルシフェラーゼを用いたklothoタンパク質発現PEAK細胞でのアッセイ
9-(1)  マウスEGR1プロモータ・ルシフェラーゼ融合遺伝子の作製
マウスEGR1の遺伝子発現上昇を調べる為、マウスEGR1プロモータ・ルシフェラーゼ融合遺伝子の作製を行なった。マウスEGR1プロモータ部分のクローニングはPCR法により行なった。プライマーは文献（Barbara, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vpl.85, pp.7857-7861）を元に以下の様に作製した。マウスEGR1プロモータクローニング用FWプライマー：
GGGGTACCAACAGATCCTGGCGGGGACTTAGGAC（配列番号２１）
マウスEGR1プロモータクローニング用RVプライマー：
CCCAAGCTTTCGCGACTCCCCGAATCGGCCTCTATT（配列番号２２）
【００８１】
配列番号２１のプライマーはマウスEGR1プロモータ部分の-1023塩基部分から開始するプライマーでさらにHindIIIサイトが付加されている。配列番号２２のプライマーはマウスEGR1 mRNA開始部位（+1）までを含むプライマーでKpnIサイトが付加されている。鋳型にはマウスGenomic DNA(米国 クロンテック社)を用いた。PCR反応はLA Taq GC Buffer（日本国  宝酒造社）を使用し、添付のマニュアルにしたがって行なった。PCRの反応条件は９４℃で５分を一次変性とし、次に９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃１分を１サイクルとして３０サイクル行い、最後に伸長反応を７２℃で７分行なった。PCRによる増幅産物は２％アガロースゲルによる電気泳動で確認した結果、約1kbp付近に単一バンドが確認された為、ゲルからバンド部分の切り出しを行い、GeneCleanキット（米国  バイオ１０１社）にて精製を行なった後、HindIII, KpnIにて切断を行なった。再度GeneCleanキット（米国  バイオ１０１社）にて精製を行い、同様にHindIII,KpnIにて切断したpGL3-Basic（米国  プロメガ社）にライゲーションを行なった。ライゲーション反応はTaKaRa Ligation kid version 2(日本国  宝酒造社)を用いて添付のプロトコールに準じて行なった。クローン化されたマウスEGR1プロモータは塩基配列の確認を行ないマウスEGR1プロモータ・ルシフェラーゼ融合遺伝子の作製を完了した。以下このプラスミドをmEGR1promoter-luc./pGL3Basicと記す。
【００８２】
9-(2)  マウスEGR1プロモータ・ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いたklotho発現PEAK細胞におけるヒトFGF23刺激時のルシフェラーゼ活性の上昇
上記9-(1)で作製したマウスEGR1プロモータ・ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてマウスklotho発現PEAK細胞でのEGR1のFGF23刺激時のEGR1発現変化を調べた。PEAK rapid細胞（米国  エッジバイオシステム社）に添付のプロトコールに準じて実施例３で作製したmklotho/pEAK8と実施例9-(1)で作製したmEGR1promoter-luc./pGL3Basicを同時にトランスフェクションした。トランスフェクションは10cm径の培養ディッシュ（米国  ベクトンディッキンソン社）に行なった。トランスフェクション４時間後に細胞を0.53mM EDTA含有PBSにて剥がし、白色９６ウェルプレート（米国  コーニング社）に播種した。２４時間培養後、ヒトFGF23を０〜１００ng/mlで添加し、ヘパリン（米国  シグマ社）も１０μg/mlになるように同時に添加した。さらに２４時間３７℃にて静置後、Steady-Glo Luciferase assay system（米国  プロメガ社）を用いてプロトコールに準じてルシフェラーゼ活性を測定した。測定はトップカウント(米国  パッカード社)を用いて行なった。結果は図４に示す。
【００８３】
〔実施例１０〕  抗マウスklothoタンパク質部分ペプチドポリクローナル抗体の作製
10−(1)  FGF-23部分配列に相当するペプチドの合成
配列番号２３（マウス全長klothoタンパク質）のタンパク質の部分についてDNASIS Macヴァージョン7．2の計算機能を用いて、疎水性度を予測し、ペプチド抗体作製に適した部位を予測した。親水性の程度が高く、かつ糖鎖修飾やリン酸化部位となりうる部位以外という観点からさらに抗体作製に適切と考えられる部分配列を抽出した。その結果、配列番号２３の残基番号97番目ヒスチジンから始まる16残基のアミノ酸からなるペプチドのC末端にシステイン残基を付加したペプチドmklotho-97(配列番号２４)、118番目プロリンから始まる21アミノ酸残基からなるペプチドのN末端にシステイン残基を付加したペプチドmklotho-118(配列番号２５)、299番目アラニンから始まる20アミノ酸残基からなるペプチドmklotho-299(配列番号２６)、941番目プロリンから始まる25アミノ酸残基からなるペプチドmklotho-941(配列番号２７)、を抗原として選択し化学合成した。
mklotho-97:  HHSGAAPSDSPIVVAPC  (配列番号２４)
mklotho-118:  CPPLSSTGDVASDSYNNVYRDT  (配列番号２５)
mklotho-299:  ALSSHWINPRRMTDYNIREC  (配列番号２６)
mklotho-941:  PSMKHYRKIIDSNGFLGSGTLGRFC  (配列番号２７)
【００８４】
10−(2)  抗FGF-23部分ペプチドに対するポリクローナル抗体の調製
上述の全てのペプチドはそれぞれの持つシステイン残基を介してキャリアタンパク質であるウシサイログロブリンと結合させ、免疫に供した。免疫は一つの抗原ペプチドに対して2羽のウサギを用いた。初回免疫は、1羽あたり100μgのキャリア蛋白に結合したペプチドをフロイト完全アジュバントでエマルジョンとしたものをウサギの皮内または皮下に投与した。初回免疫の1週間後に100μgのキャリア蛋白に結合したペプチドをフロイト不完全アジュバントでエマルジョンとしたものを同様に投与した。これと同じ投与を２週間間隔で6回実施し、最終投与の１週間後に全採血を行ない、抗血清を調製した。
【００８５】
ウサギ血清からの抗マウスklothoタンパク質の部分ペプチドに対する抗体を精製するためのアフィニティカラムを作製するために、免疫に用いたそれぞれのペプチドをSulfoLink Kit（米国、PIERCE社）を用いてゲル上に固相化した。吸着緩衝液としてPBS(-)を用いて抗血清をこのカラムに添加し、免疫に用いたペプチドと結合する抗体をカラムに保持した。次に溶出緩衝液として0.1Mグリシン緩衝液（pH2.8）を用いてカラムに結合した抗体を溶出させ、回収した。溶出画分は1M Tris-HCl（pH 9.0）を添加してpH7.2付近に調整した。調製された抗体溶液は、ゲルろ過カラムNAP25(米国、Amersham Pharmacia Biotech社)に供してPBS(-)に緩衝液を置換した後、孔径0.22μmのメンブランフィルターMILLEX-GV （米国、Millipore社）でろ過滅菌し、各ペプチドに対する抗体を得た。精製抗体の濃度は280 nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出した。このようにして得られた各精製抗体を、免疫に用いたペプチドの名前を用いて示すことにする。例えば配列番号２４のmklotho-97ペプチドを免疫して得られた抗体に関してはmklotho-97抗体と記載することにする。
【００８６】
10−(3)  抗マウスklothoタンパク質部分ペプチドに対する抗体によるマウスklothoタンパク質タンパク質の認識
上述の方法により取得したmklotho-97抗体、mklotho-118抗体、mklotho-299抗体およびmklotho-941抗体を用いて、実施例8によって作製した可溶化型マウスklothoタンパク質一過性発現PEAK rapid細胞上清中の可溶化型マウスklothoタンパク質タンパク質をウエスタンブロッティング法により解析を行った。図６に示すように、いずれの抗体でも130 kDa付近の可溶化型マウスklothoタンパク質タンパク質が検出された。したがって、これら4種類の抗体はマウスklothoを認識し得る抗体であることが判明した。
【００８７】
〔実施例１１〕  ビオチン標識抗体の作製
上述の精製した4種のマウスklothoタンパク質の部分ペプチドに対するポリクローナル抗体を用いてビオチン標識を行った。50mM炭酸水素ナトリウム溶液で1mg/mlの濃度に希釈した抗体溶液1mlに、Biotin-AC5-Osu(日本、同仁化学社)をジメチルホルムアミドに1.82mg/mlの濃度で溶解した溶液を10μl添加し、4℃において2時間転倒混和した。その後、この反応液をNAP10カラム(米国、Amersham Pharmacia Biotech社)に供し、未反応のBiotin-AC5-Osuを除き、溶媒をPBS(-)に置換し、4種類のビオチン標識抗FGF23部分ペプチドポリクローナル抗体を得た。
【００８８】
〔実施例１２〕  FGF-23とklothoタンパク質の結合実験
FGF-23タンパク質とklothoタンパク質が結合することを以下の実験によって確かめた。
12-(1)  FGF-23固定化レジンの作製
組換えFGF-23RQHの作製および精製は後述の実施例１５に従って行った。本精製物をNHS活性化セファロース4FF（米国、Amersham Pharmacia Biotech社）に常法に従いレジン1mlあたり3.3mg固定化した。
【００８９】
12-(2)  FGF-23RQH固定化レジンへの可溶化klothoタンパク質の結合
実施例８で作製した8mlの可溶化マウスklothoタンパク質一過性発現PEAK rapid細胞上清もしくは対照として親株のPEAK rapid細胞の上清に対して、上記FGF-23固定化レジン50μlを添加し、4℃において1時間転倒混和して可溶化マウスklothoタンパク質とFGF-23を反応させた。その後PBSでレジンを4回洗浄し、未反応物を除去した。それぞれのレジンに300μlのサンプルバッファー（50mM Tris-HCl pH6.8、0.4% SDS、6%グリセロール、0.002%ブロムフェノールブルー、2%βメルカプトエタノール）を添加し、95℃で5分間加熱したのち、遠心分離して得た上清を回収した。これらの上清および細胞上清を実施例１０で取得したmklotho-118抗体およびmklotho-941抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法により解析を行った。その結果を図７に示す。また同様のサンプルを2D-銀染色試薬・II「第一」（日本国、第一化学薬品株式会社）を用いて銀染色した結果についても図７に示す。これらの結果より、FGF-23RQH固定化カラムに可溶化マウスklothoタンパク質が結合し、濃縮されることが示された。よってFGF-23とklothoタンパク質が結合することが明らかにされた。
【００９０】
〔実施例１３〕  可溶化klothoタンパク質発現CHO細胞の移植試験
13-(1)  血清1,25ジヒドロキシビタミンD濃度の検討
可溶化klothoタンパク質組換え体の生物活性を検討するため、実施例５で得られた可溶化klothoタンパク質安定発現CHO細胞をヌードマウスへ皮下移植することにより、可溶化klothoタンパク質組換え体を恒常的に分泌する移植細胞由来の腫瘍を保持した可溶化klothoタンパク質高発現モデルマウスを作成した。実験動物には7週齢の雄性BALB/cヌードマウスを用い、細胞移植は以下の要領で実施した。マウスはその入荷より解剖に到る全ての期間中、プラスチックケージにて飼育し市販のげっ歯類用固形餌ならびに水道水を自由摂取させた。
【００９１】
可溶化型klothoタンパク質発現CHO細胞ならびに対照として親株CHO細胞をそれぞれ1×108 cells/mLとなるようPBSバッファーに分散しこれら細胞懸濁液をヌードマウスの背部皮下二箇所へそれぞれ0.1mLずつ注入した（対照CHO細胞移植群n=5、可溶化型klothoタンパク質発現CHO細胞移植群n=5）。細胞移植後14日目において、エーテル麻酔下、心採血により血液を採取し、マイクロテイナ（Becton Dickinson、米国）を用いて血清を調製した。得られた血清中の1,25ジヒドロキシビタミンD濃度を1,25(OH)2D RIAキット（TFB、米国）を用いて測定した。
その結果、可溶化型klothoタンパク質発現細胞移植群の1,25ジヒドロキシビタミンD濃度は、対照CHO細胞移植群のそれに比し有意に低下していた（図８）。
【００９２】
13-(2)  血清リン濃度の検討
上述の方法と同様の方法で、可溶化klothoタンパク質発現CHO細胞ならびに対照CHO細胞を5週齢の雄性BALB/cヌードマウスに皮下移植し（対照CHO細胞移植群n=6、可溶化klothoタンパク質発現CHO細胞移植群n=6）、27日目における血清リン濃度をピーテストワコー（和光純薬、日本）を用いて測定した。
その結果、図８に示すように、可溶化klothoタンパク質発現細胞移植群の血清リン濃度は、対照CHO細胞移植群のそれに比し有意に低下していた。
【００９３】
以上の結果から、可溶化klothoタンパク質組換え体は、血清リン濃度ならびに1,25ジヒドロキシビタミンD濃度を低下させる生理活性を有していることが証明された。この活性はすでに報告されているFGF-23のそれと同様のものである。
【００９４】
〔実施例１４〕  抗klothoタンパク質抗体のマウス投与によるリン、ビタミンD上昇作用
BALB/c、雄、7週齢の正常マウスに実施例１０で取得した抗klothoタンパク質抗体p118を腹腔内へ1匹あたり200μg/0.2mLずつ単回投与した。対照群へは、溶媒(PBS)を0.2mLずつ腹腔内へ投与した。投与9時間後にガラス製キャピラリを用いて眼窩より採血し、マイクロテイナ（ベクトンディッキソン社、米国）を用いて血清を分離、さらに24時間後に腹大静脈より採血し、同じくマイクロテイナを用いて血清を分離した。得られた9時間後の血清で1,25-ジヒドロキシビタミンD濃度を1,25(OH)2D RIAキット「TFB」(テイエフビー社、日本国)を用いて測定した。また24時間後の血清でリン酸濃度をリン-テストワコー(和光純薬、日本国)を用いて添付文書に従い、決定した。抗klothoタンパク質抗体および対照群はそれぞれ6匹のマウスから構成され、水道水および1.03％の無機リン酸および1.18%のカルシウムを含んだ固形食CE2 (日本クレア社、日本国)を自由摂取させた。
その結果、p118抗体投与9時間後の1,25-ジヒドロキシビタミンD、24時間後の血清リン酸濃度ともに媒体投与群に比べて有意に上昇していた（図９）。
以上の結果より、抗klothoタンパク質抗体は血清リン濃度、血清活性型ビタミンD濃度を上昇しうることが示された。
【００９５】
〔実施例１５〕  FGF-23、FGF-23H、FGF-23RQHタンパク質タンパク質の取得
15-(1)  FGF-23Hタンパク質発現ベクターの構築
FGF-23をコードするcDNAは、腫瘍性骨軟化症の責任腫瘍のcDNAライブラリーを鋳型とし、F1EcoRIプライマー（配列番号２８）とLHisNotプライマー（配列番号２９）とLA-Taq DNA polymeraseを用いて96℃で1分間保温した後、96℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒からなる工程を１サイクルとした35サイクルのPCRを実施することにより増幅した。F1EcoRIプライマーはFGF-23をコードする塩基配列のさらに5'側上流に存在する配列にアニールし、その増幅断片のFGF-23をコードする領域の5'側にEcoRI制限酵素部位を付加する。LHisNotプライマーはFGF-23をコードする配列の終始コドンの5'側の配列とアニールする配列とHis6-tag配列（His-His-His-His-His-His）をコードする配列に続く終始コドンとNotI制限酵素配列を含む。その結果、増幅断片はFGF-23タンパク質タンパク質のC末端にHis6-tag配列を付加したものをコードすることになり、その下流にNotI制限酵素部位を有する。この増幅断片をEcoRIとNotIで消化し、同様にEcoRIとNotIで消化した動物細胞発現ベクターであるpcDNA3.1Zeo（米国  Invitrogen社）と連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のHis6-tag配列が付加されたFGF-23タンパク質タンパク質をコードしていることを確認した。このベクターをpcDNAFGF-23Hと称す。
F1EcoRI： CCGGAATTCAGCCACTCAGAGCAGGGCACG（配列番号２８）
LHisNot：ATAAGAATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGATGAACTTGGCGAA（配列番号２９）
【００９６】
15-(2)  FGF-23タンパク質発現ベクターの構築
pcDNA/FGF-23Hを鋳型としてF1EcoRIプライマーとLNotプライマー（配列番号３０）とLA-Taq DNA polymeraseを用いて94℃で1分間保温した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分からなる工程を１サイクルとした25サイクルのPCRを実施することにより増幅した。反応終了後、PCR産物の末端をT4 DNA polymerase（スイス、Roche社）により平滑化したのち、Polynucleotide kinase  （スイス、Roche社）を用いてDNA末端のリン酸化を行うことでFGF-23タンパク質をコードするcDNA断片を調製した。発現ベクターpCAGGS（Niwa H, et al., Gene. 1991, 108:193-199）をEcoRIで消化しKlenow断片（スイス、Roche社）を用いて末端を平滑化し、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（日本、宝酒造社）を用いて脱リン酸化を行った。このように調製したFGF-23をコードするcDNA断片とpCAGGSベクターを連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のFGF-23タンパク質をコードする配列が的確に挿入されていることを確認した。このベクターをpCAGGS/FGF-23と称す。
【００９７】
また上述のF1EcoRIプライマーとLNotプライマーで増幅したFGF-23をコードする断片をEcoRIとNotIで消化したのち精製した。これを、発現ベクターであるpEAK8（米国、Edge Biosystem社）に分子内リボゾームエントリー配列（IRES）と増強型緑色蛍光タンパク質（EGFP）を連結したpEAK8/IRES/EGFPベクターのEcoRIとNotI制限酵素部位に挿入してクローニングした。取得したプラスミドの塩基配列を決定し、FGF-23タンパク質をコードしていることを確認した。このベクターをpEAK8/IRES/EGFP/FGF-23と称す。
LNot：  ATAAGAATGCGGCCGCTCAGATGAACTTGGCGAA（配列番号３０）
pCAGGS/FGF-23をEcoRIで消化して直鎖化したのち、Klenow断片（スイス、Roche社）を用いて末端を平滑化した。これをさらにBamHIで消化してFGF-23のcDNAを含むDNA断片をアガロース電気泳動で分離精製した。また、発現ベクターINPEP4をBglIIで消化した後、Klenow断片（スイス、Roche社）を用いて末端を平滑化した。さらにBamHIで消化したのちアガロース電気泳動でベクターを精製した。これらのFGF-23 cDNAを含む断片とベクターを連結した。このように作製した発現ベクターをクローニングし、塩基配列を決定して目的のFGF-23タンパク質をコードする配列が的確に挿入されていることを確認した。このベクターをINPEP4/FGF-23と称す。
【００９８】
15-(3)  FGF-23RQHタンパク質発現ベクターの構築
FGF-23タンパク質は、179番目のArg残基と180番目のSer残基の間でタンパク質切断を受けやすいことが見出された。この切断部位のN末側アミノ酸配列はタンパク質変換酵素の認識配列であるArg-X-X-Arg配列に一致するArg176-His177-Thr178-Arg179（配列番号３１）であり、またADHRでのミスセンス変異がこの176番目又は178番目のArg残基の置換変異であることが知られている。そこで我々は、タンパク質変換酵素による切断に耐性を示し、尚かつADHRに見られる変異FGF-23のモデルとしてC末端にHis6-tagを有し、176番目と179番目のArg残基をGln残基に置換した変異FGF-23タンパク質（以下FGF-23RQHという）を実験的に作製するためのベクター構築を行った。
【００９９】
作製方法は、ArgをGlnに置換するための塩基置換配列を含む順方向プライマーであるRQF（配列番号３２）と逆方向プライマーであるRQR（配列番号３３）を合成した。
【０１００】
さらに、この塩基置換プライマーと組み合わせて変異導入部位の5'側と3'側のFGF-23配列を増幅するためのプライマーであるME1（配列番号３４）とHNt（配列番号３５）を作製した。ME1はFGF-23 cDNAがコードする開始コドンを含む部分の順方向のプライマーでありEcoRI制限酵素配列を有する、HNtはFGF-23 cDNAがコードする終始コドンの前にHis6-tag配列をコードするコドン配列を挿入でき、NotI制限酵素配列を付加することができる逆方向プライマーである。
RQF：  ATACCACGGCAGCACACCCAGAGCGCCGAG（配列番号３２）
RQR：  CTCGGCGCTCTGGGTGTGCTGCCGTGGTAT（配列番号３３）
ME1：  ATGAATTCCACCATGTTGGGGGCCCGCCTCAGG（配列番号３４）
HNt：  ATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGATGAACTTGGCGAAGGG（配列番号３５）
【０１０１】
10 ngのpGAGGS/FGF-23を鋳型としてRQFとHNtの組み合わせとME1とRQRの組み合わせのプライマー（各200nM）でPCR反応を実施した。反応はpfu DNA polymerase（米国、Promega社）を用い、94℃で1分間保温した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分からなる工程を１サイクルとした25サイクル実施した。この様にして得た２種類の反応液を10倍に希釈し、そのうちの1μlずつを混和して鋳型とし、これにME1とHNtが終濃度200nMとなるように添加した50μlのPCR反応液を調製し、94℃で1分間保温した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分からなる工程を１サイクルとした25サイクルのPCR反応を実施した。ここではLA Taq DNA polymerase（日本、宝酒造社）を使用した。得られた約800bpの増幅産物を、EcoRIとNotIで消化したのちに精製してインサートDNAを取得した。これを、発現ベクターであるpEAK8（米国、Edge Biosystem社）に分子内リボゾームエントリー配列（IRES）と増強型緑色蛍光タンパク質（EGFP）を連結したpEAK8/IRES/EGFPベクターのEcoRIとNotI制限酵素部位に挿入してクローニングした。取得したプラスミドの塩基配列を決定し、目的の176番目と179番目のArgがGlnに変換され、C末端にHis6-tag配列が付加された変異FGF-23タンパク質をコードしていることを確認した。このベクターをpEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQHと称す。
【０１０２】
15-(4) FGF-23H発現細胞、FGF-23発現細胞、およびFGF-23RQH発現細胞の取得、精製
(i)  FGF-23H発現細胞の取得
約20μgのpcDNAFGF-23Hをベクター中のアンピシリン耐性遺伝子内にあるFspI制限酵素部位で切断して直鎖化し、精製した。これを10μlの純水に溶解し、1×107個のCHO Ras clone-1細胞（ Shirahata, S., et al. Biosci Biotech Biochem, 59: 345-347, 1995 ）と混和してGene Pulser II（米国、Bio Rad社）を用いて電気穿孔法にて細胞への遺伝子導入を行った。この細胞10% FCSを含むMEMα培養液（米国、Gibco BRL社）で24時間培養したのち、終濃度0.5mg/mlとなるようにZeocin（米国、Invitrogen社）を添加して１週間培養した。接着し増殖した細胞をトリプシンで遊離して、終濃度0.3mg/mlのZeocin存在下で限界希釈法によるクローニングを行い、35種のクローン化細胞を得た。これらの細胞の中でFGF-23Hタンパク質を最もよく発現する細胞を以下に示すウエスタンブロッティングにて同定した。各クローン化細胞の培養上清を採取して、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動を行ったのち、PVDF膜（米国、Millipore社）にタンパク質を転写し、抗His-tag（C末）抗体（米国、Invitrogen社）とECL発光システム（米国、Amersham Pharmacia Biotech社）を用いて約32kDa付近のFGF-23Hタンパク質に由来するシグナルを検出した。その結果、#20と称すクローンにおいて最も高い発現が認められ、これをCHO-OST311と命名して独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託した（受託番号：FERM BP-7273）。本明細書では、CHO-OST311をCHO-FGF23Hと称する。
【０１０３】
(ii)  FGF-23およびFGF-23RQH発現細胞の取得
pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23と pEAK8/IRES/EGFP/FGF-23RQHベクターのCHO Ras clone-1細胞への導入は膜融合脂質を用いた遺伝子導入法により行った。CHO Ras clone-1細胞を6-well plateに底面の約60％を細胞が覆う程度に培養する。そして培養液を除去し、血清を含まないMEMα培養液を１ml添加する。導入するベクター2.5μgと10μlのTransfectam（登録商標）（米国、Promega社）をそれぞれ50μlの血清を含まないMEMα培養液と混和して、両者を混合して10分間静置したのち、両者を混合して準備しておいた6-well plateに添加した。2時間培養した後、このDNAを含む培養液を除去して10％のFCSを含む培養液に置換して終夜培養した。翌日、終濃度が5μg/mlとなるようにPuromycin（米国、Sigma社）を添加して、薬剤耐性細胞を選択した。この様にして得られた薬剤耐性細胞は前述のFGF-23H発現細胞の取得と同様に限界希釈法にてクローン化を行った。さらにウエスタンブロッティングにより目的のタンパク質を最もよく発現する細胞株を取得した。これらの細胞をそれぞれ、CHO-FGF23、CHO-FGF23RQと称す。
【０１０４】
(iii)  組換え体タンパク質の精製
CHO-FGF23Hの培養上清中の組換え体をC末端のHis6-tag配列に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにて検出すると、図１０Aに示すように32kDa付近のバンドと10kDa付近のバンドが認められた。この二つのバンドをゲルから切り出しN末端側のアミノ酸配列を決定したところ、分子量の大きい方のバンドは配列番号３６の25番目からのアミノ酸配列が検出され、FGF-23タンパク質から分泌過程でシグナル配列が除去されたものと考えられた。一方、分子量の小さいバンドからは配列番号３６の180番目からのアミノ酸配列が確認され、179番目と180番目の間での切断により生じた断片であることが判明した。また、FGF-23のN末側を認識するポリクローナル抗体を用いて検出することで、179番目までの配列を持つと考えられるペプチドの存在も認められた。
【０１０５】
CHO-FGF23H細胞の培養上清1000mlを16,200gで15分間、4℃で遠心分離し、浮遊細胞を除去した後、上清を内径30 mm  X長さ200 mmのカラムに充填したSP-sepharose FF(登録商標)（米国、Amersham Pharmacia Biotech社）に通すことで、配列番号３６の180から251番目に相当するペプチドにHis6-tagが付加したペプチドが素通りし、25〜251番目のペプチド（以下、全長FGF-23タンパク質ということがある）にHis6-tag配列を付加したものはカラムに吸着した。このカラムに50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.7）中で0から0.7 MまでのNaCl濃度勾配で吸着物質を溶出させたところ、約0.3MのNaClで溶出される画分にHis6-tagが付加した全長FGF-23タンパク質が認められ、約0.4Mで溶出される画分に配列番号３６の179番目よりN末側の配列を持つと考えられるペプチドが確認された。このようにSP-Sepharoseカラムで分離された画分は次に、金属アフィニティカラム、Talon Superflow（登録商標）（米国、Clontech社）にかけることでさらに分離する事が出来た。179番目よりN末側の配列についても金属カラムとの親和性を有しており、精製に有効であった。さらにSP-Sepharoseカラムにて精製を行い、CBB染色で単一のバンドとして全長のFGF-23Hを取得することができた。この結果を図１０Bに示す。
【０１０６】
FGF-23タンパク質も同様の方法で精製することができる。CHO-FGF23の培養上清をポアサイズが0.2μmのメンブレンであるSuperCap（登録商標）（米国、Pall Gelman Laboratory社）でろ過し、ろ過された溶液をSP-Sepharose FF（米国、Amersham Pharmacia Biotech社）に通した。カラムとの親和性が弱い物質を50mMのリン酸ナトリウム緩衝液,pH6.7で洗浄、溶出させた。カラム保持されたタンパク質を0から0.7MまでのNaCl濃度勾配で溶出させたところ、約0.3MのNaClで溶出される画分に全長FGF-23タンパク質が認められた。これを金属アフィニティカラムであるTalon Superflow（登録商標）（米国、Clontech社）に吸着させたのち、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液,pH6.7で洗浄したのち、Imidazoleの濃度を変化させて添加しタンパク質を溶出精製した。さらに、目的のタンパク質を含む画分をSP Sepharose FFカラムに吸着、溶出させて精製した。同様な方法でCHO-FGF23RQ上清より全長FGF-23RQタンパク質を精製した。
【０１０７】
〔実施例１６〕  ヒトFGF-23に対するヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの取得
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行 1991）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。被免疫動物は、BALB/cマウスを用い、ヒトFGF-23の免疫は免疫原の違いにより以下の2種類の方法で行なった。
【０１０８】
16-(1)  ベクター投与と組換え体タンパク質投与の組み合わせによる免疫
BALB/cマウスに、実施例15-(1)で作製したINPEP4/FGF-23ベクター（10または50μｇ/匹）をTrans IT（登録商標）In Vivo Gene Delivery System試薬（日本、宝酒造社）を静脈より導入して初回免疫を実施した。初回免疫から同ベクターを１週間後に１回導入し追加免疫した。さらに、実施例15-(4)で作製したFGF-23RQHタンパク質(20〜30μｇ/匹)をスクアレン、Tween80、Monophosphoryl lipid AおよびTrehalose dimycolateを含むRIBIアジュバント（米国、Corixa社）に懸濁しエマルジョンを調製した後、腹腔内注射により4回または5回追加免疫し、さらに以下に述べる脾臓細胞の取得４日前に実施例15-(4)で作製したFGF-23Hタンパク質(18μｇ/匹)を尾静脈内注射により免疫した。
【０１０９】
16-(2)  ヒトFGF-23を用いた免疫
BALB/cマウスに、実施例15-(4)で作製したFGF-23(22μｇ/匹)を上述のRIBIアジュバントに懸濁して腹腔内注射により初回免疫した。さらに、同タンパク質を腹腔内注射により１週間毎に１回、４週間にわたり追加免疫し、以下に述べる脾臓細胞の取得３日前にFGF-23(10μｇ/匹)を尾静脈内注射により免疫した。
【０１１０】
16-(3)  ハイブリドーマの作製と選別
上述のように免疫したマウスから脾臓を摘出し、それより回収した脾臓細胞をマウスミエローマSP2/0（ATCC：CRL1581）と５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール1500（日本、ロッシュダイアグノスティクス社）を用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、10%のウシ胎児血清（Fetal Calf Serum、FCS）とヒポキサンチン(H)、アミノプテリン(A)、チミジン(T)を含有するHAT含有DMEM培地（米国、Gibco BRL社）中で培養することにより行った。さらに、HT含有DMEM培地を用いて限界希釈法によりクローニングを実施した。単一細胞に由来するクローン化ハイブリドーマを取得した。
【０１１１】
16-(4)  抗FGF-23抗体を産生するクローン化したハイブリドーマの選別
ハイブリドーマが産生する抗体とFGF-23タンパク質との結合性を調べることで、FGF-23タンパク質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別した。上述の第一の方法で免疫して得たハイブリドーマの選別は以下のように実施した。50mM NaHCO3の溶液に1μg/mlの濃度に希釈したFGF-23Hタンパク質溶液を、ELISA用96穴マイクロプレート（Maxisorp（登録商標）、米国、Nunc社）の各ウェルに50μlずつ加え、37℃で30分または４℃で12時間インキュベートし、FGF-23Hタンパク質をマイクロプレートに吸着させた。次にこの溶液を除去し、各ウェルにブロッキング試薬（SuperBlock（登録商標） Blocking Buffer,米国、PIERCE社）を加え室温で30分間インキュベートしたのち、各ウェルを0.1%のTween20を含有するTris-buffered saline（500mM NaCl 含有TRIZMA pre-set crystals（登録商標）米国、Sigma社）（T-TBS）で２回洗浄した。このようにFGF-23Hタンパク質をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清を50μl加え、30分間反応させた後、各ウェルを、T-TBSで2回洗浄した。次いで、各ウェルに50μlずつ3000倍希釈した過酸化酵素標識ヤギ抗マウスIgG抗体（米国、Zymed laboratories社）を加え、室温下で30分間インキュベートした。これをT-TBSで３回洗浄後、テトラメチルベンジジン（デンマーク、DAKO社）を含む基質緩衝液を各ウェルに50μlずつ加え、室温下で15分間インキュベートした。次いで、0.5M硫酸を各ウェルに50μlずつ加え、反応を止めた。参照波長を570nmとして波長450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（MTP-300、日本、コロナ電気社）で測定した。ここで、明確な吸光度の上昇を示したハイブリドーマを選別し、さらに、FGF-23タンパク質を用いて同様の実験を実施してFGF-23との結合が再確認されたクローンを選別した。これより、FGF-23タンパク質を認識する抗体を産生するハイブリドーマとして９種のクローンを得た。この中には後に示す1C3H、1D6A、2A2B、2C3B、2C5Lが含まれていた。上述の第二の方法で免疫して得たハイブリドーマの選別は、以下のように実施した。50mM NaHCO3の溶液に1μg/mlの濃度に希釈したFGF-23タンパク質溶液を、ELISA用96穴マイクロプレート（Maxisorp（登録商標）、米国、Nunc社）の各ウェルに50μlずつ加え、４℃で10時間インキュベートしてFGF-23タンパク質をマイクロプレートに吸着させた。次にこの溶液を除去し、各ウェルにブロッキング試薬（SuperBlock（登録商標） Blocking Buffer,  米国、PIERCE社）を加え室温で30分間インキュベートしたのち、各ウェルを0.1%のTween20を含有するTris-buffered saline（T-TBS）で２回洗浄した。このようにFGF-23タンパク質をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清を50μl加え、30分間反応させた後、各ウェルを、0.1%のTween20を含有するTris-buffered saline（T-TBS）で2回洗浄した。次いで、各ウェルに50μlずつ3000倍希釈した過酸化酵素標識ヤギ抗マウスIgG抗体（米国、Zymed laboratories社）を加え、室温下で30分間インキュベートした。これをT-TBSで３回洗浄後、テトラメチルベンジジン（デンマーク、DAKO社）を含む基質緩衝液を各ウェルに50μlずつ加え、室温下で15分間インキュベートした。次いで、0.5M硫酸を各ウェルに50μlずつ加え、反応を止めた。参照波長を570nmとして波長450 nmでの吸光度をマイクロプレートリ−ダ−（MTP-300、日本、コロナ電気社）で測定した。ここで、明確な吸光度の上昇を示したハイブリドーマを選別した。これより、FGF-23タンパク質を認識する抗体を産生するハイブリドーマとして新たに４種のクローンを得た。この中に3C1Eが含まれていた。
【０１１２】
このように取得したFGF-23タンパク質を特異的に認識する抗体のサブクラスをIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（米国、Roche社）を用いて同定した。結果は表1に示した。
【０１１３】
【表１】
2006240990.tif 000002
【０１１４】
上記ハイブリドーマクローンのうち、3つのハイブリドーマクローン2C3B、3C1E、1D6Aを、平成13年12月26日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。また、ハイブリドーマクローン2C5Lを、2003年1月6日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託した。受託番号は以下の通りである。
2C3B：FERM BP-7838
3C1E：FERM BP-7839
1D6A：FERM BP-7840
2C5L：FERM BP-8268
【０１１５】
〔実施例１７〕  モノクローナル抗体の調製
17-(1)  抗FGF-23抗体を含む培養上清の調製
抗FGF-23抗体産生ハイブリドーマを10μg/mlのウシインシュリン（米国、Sigma社）、5.5μg/mlのヒトトランスフェリン（米国、Sigma社）、0.01mMのエタノールアミン（米国、Sigma社）、5ng/mlの亜セレン酸ナトリウム（米国、Sigma社）を含有するeRDF培地（日本、極東製薬社）に馴化した。抗体を調製するためのハイブリドーマの培養はスピナ−フラスコで実施した。培養液を孔径が0.2μmのフィルター（米国、Pall Gelman Laboratory社）を通すことでハイブリドーマ等の雑排物を除去し、抗体を含む培養上清を回収した。
【０１１６】
17-(2)  プロテインGを用いたモノクローナル抗体の精製
抗FGF-23抗体を含む培養上清をプロテインG Sepharose４FFカラム（米国、Amersham Pharmacia Biotech社）に通して抗体をカラムに吸着させ、0.1M グリシン緩衝液（pH2.8）を用いて溶出させた。溶出画分は1 M Tris-HCl を添加してpH7.2に調整した。このように調製した抗体溶液を分画分子量10000カットの透析膜（米国、Spectrum Laboratories社）を用いてPBS(-)で透析置換し、孔径0.22μmのメンブランフィルターMILLEX-GV（米国、Millipore社）でろ過滅菌し、精製抗FGF-23抗体を得た。精製抗体の濃度は280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出した。
【０１１７】
17-(3) プロテインAを用いたモノクローナル抗体の精製
プロテインA担体カラム（日本、免疫生物研究所社）を用い、吸着緩衝液としてグリシン緩衝液(pH8.9)、溶出緩衝液としてクエン酸緩衝液（pH 4.0）を用いて抗FGF-23抗体を含む培養上清から抗体をアフィニティー精製した。この抗体を含む溶出画分に1M Tris-HClを添加してpH7.2付近に調整した。次に透析膜を用いてこの抗体を含む溶液をPBS(-)に置換し、さらに孔径0.22μmのメンブランフィルターでろ過滅菌し、精製抗FGF-23抗体を得た。精製抗体の濃度は280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出した。
【０１１８】
このようにして得られた各精製モノクローナル抗体を、産生するハイブリドーマの名前を用いて示すことにする。例えばハイブリドーマ1D6Aが産生する抗体に関しては1D6A抗体と記載することにする。
【０１１９】
〔実施例１８〕  EGR１プロモータ・ルシフェラーゼを用いたklothoタンパク質発現PEAK細胞でのアッセイ系での抗FGF-23抗体の影響
抗FGF-23抗体の中和活性能が実施例９のアッセイ系で測定できるかどうかを調べる為に、実施例１５で作製した抗FGF-23抗体（2C3B）を用いて検討した。方法は実施例９に従って行ない、FGF-23添加直前に2C3B抗体を最終濃度２．５μｇ/mlになるように添加した。その結果、2C3B抗体はFGF-23によるルシフェラーゼの上昇を有意に抑制した（図１１）。このことから、EGR１プロモータ・ルシフェラーゼを用いたklothoタンパク質発現細胞でのアッセイ系はFGF-23とklothoタンパク質のシグナル伝達を抑制するような物質の探索に有効であることが示された。
【０１２０】
〔実施例１９〕  FGF-23と可溶化型klothoタンパク質によるCHOras clone1細胞のERKリン酸化亢進のアッセイ系への抗FGF-23抗体の影響
抗FGF-23抗体の中和活性能が実施例8のアッセイ系で測定できるかどうかを調べる為に、実施例１５で作製した抗FGF-23抗体（2C3B）を用いて検討した。
【０１２１】
方法は実施例８にしたがって行ない、FGF-23と２C３B抗体をあらかじめ混合した状態で細胞へ添加した。その結果、図１２に示すように2C3B抗体濃度依存的にFGF-23と可溶化型klothoタンパク質によるERKリン酸化亢進を抑制した。このことから、FGF-23とklothoタンパク質を用いたERKリン酸化亢進検出のアッセイ系はFGF-23とklothoタンパク質シグナル伝達を抑制するような物質の探索に有効であることが示された。
【０１２２】
〔実施例２０〕  抗FGF-23抗体"2C3B抗体"のマウス投与における効果
抗ヒトFGF-23モノクローナル抗体の正常マウスへの影響を検討するため、以下の実験を実施した。正常マウス（BALB/c、雄、12週齢）を4匹ずつからなる５つの群に無作為に分別し、図１３に示すように、第1群には媒体としてPBSを、第2には0.67mg/mlの抗ヒトFGF-23モノクローナル抗体（2C3B）を、また第３群には対照として0.67mg/mlの抗TPOモノクローナル抗体を、それぞれ0.15mlずつ尾静脈内に単回投与した。投与から24時間後に、エーテル麻酔下、心採血を実施し、マイクロテイナ(米国  ベクトンディッキンソン社)を用いて血清を分離した。得られた血清中のリン酸濃度をリン-テストワコー(日本国 和光純薬社)、血清1,25D濃度を1,25(OH)2D RIAキットTFB(米国  テイエフビー社)をそれぞれ用いて添付の文書に従い測定した。投与から採血までの間、各群毎にプラスチックケージで飼育し、リンおよびカルシウムを1%ずつ含む固形食CE-2(日本国 日本クレア社)および水道水を自由摂取させた。
【０１２３】
得られた結果を図１３に示す。測定値は各群における平均値+/-標準偏差で表されている。＊を付与した群は、student-tにより有意差検定を実施した結果、媒体（PBS）投与群および抗TPO抗体投与群の双方に対し、p<0.01を示した群を表す。
【０１２４】
【発明の効果】
実施例に示すように、klothoタンパク質の投与により血中の1,25ジヒドロキシビタミンD濃度および血清リン濃度が低下する。また、抗kolothoタンパク質抗体の投与により血中の1,25ジヒドロキシビタミンD濃度および血清リン濃度が上昇する。これらの実施例は、klothoタンパク質および抗kolothoタンパク質抗体が血中の1,25ジヒドロキシビタミンD濃度および血清リン濃度を変動させ、リンおよび／またはビタミンＤが関与する疾患の治療および／または予防に使用し得ることを示している。
【０１２５】
【配列表】
2006240990.tif 000003
2006240990.tif 000004
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2006240990.tif 000040
2006240990.tif 000041
【０１２６】
【配列表フリーテキスト】
配列番号４〜２２、２８〜３０、３２〜３５：合成DNA
配列番号２４〜２７、３１：合成ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトFGF23組換え体を単回投与してから１時間後、８時間後でのマウス腎臓におけるEGR1遺伝子の発現変化をRT-PCR法で解析した結果を示す図である。
【図２】  ヒトFGF23組換え体を単回投与してから５分後、１０分後でのマウス腎臓におけるERKタンパク質のリン酸化変化をウェスタンブロッティング法で解析した結果を示す図である。
【図３】  全長klothoタンパク質発現PEAK細胞にヒトFGF23組換え体を添加して１０分後のERKタンパク質のリン酸化変化をウェスタンブロッティング法で解析した結果を示す図である。
【図４】  EGR1プロモータの下流にルシフェラーゼを結合したレポーター遺伝子をklotho発現プラスミド共にトランスフェクションしたPEAK細胞でのヒトFGF23刺激時のルシフェラーゼ活性変化を調べた図である。
【図５】  PEAK細胞に可溶化マウスklothoタンパク質を安定発現するCHOras clone1細胞の培養上清とヒトFGF23を添加したときのPEAK細胞でのERKのリン酸化亢進を調べた図である。
【図６】  可溶化マウスklothoタンパク質一過性発現PEAK rapid細胞上清サンプルおよびその対照としてPEAK rapid細胞の培養上清サンプルをmklotho-97抗体、mklotho-118抗体、mklotho-299抗体およびmklotho-941抗体を用いてウエスタンブロット法により解析した結果である。
【図７】  可溶化マウスklothoタンパク質一過性発現PEAK rapid細胞上清サンプル、その対照としてPEAK rapid細胞の培養上清サンプル、およびそれらをFGF-23固定化レジンに供した時のFGF-23結合物サンプルを、mklotho-118抗体またはmklotho-941抗体を用いてウエスタンブロット法により解析した結果である。一方、図YY2Bは同様なサンプルを、銀染色法により染色した結果である。
【図８Ａ】  細胞移植後14日目における可溶化型klothoタンパク質発現細胞移植群（klotho, n=5）および対照CHO細胞移植群（control, n=5）の1,25ジヒドロキシビタミンD(1,25D)濃度を示したグラフである。結果は平均値±標準誤差として表されており、対照群との有意差検定をStudent's tにより実施した。
【図８Ｂ】  細胞移植後27日目における可溶化型klothoタンパク質発現細胞移植群（klotho, n=6）および対照CHO細胞移植群（control, n = 6）の血清リン濃度ならびに血清カルシウム濃度を示したグラフである。結果は平均値±標準誤差として表されており、対照群との有意差検定をStudent's tにより実施した。
【図９】  抗klothoタンパク質抗体（p118）群および媒体投与群の投与２４時間後の血清リン濃度、9時間後の血清活性型ビタミンD濃度を示した図である。結果は平均値±標準誤差として表されており、対照群との有意差検定をStudent's tにより実施した。
【図１０Ａ】  CHO-FGF23H細胞培養上清をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、抗FGF-23ポリクローナル抗体でウエスタンブロッティングにより組換え体FGF-23タンパク質およびその代謝物を検出した図である。培養上清中には全長のFGF-23Hタンパク質と配列番号３５のアミノ酸配列の配列番号179番目と180番目の間で切断されたて生じたN末側断片とC末側断片が存在する。hFGF23-48抗体および hFGF23-148抗体で、全長のFGF-23Hタンパク質とN末側断片ペプチドが認識された。Ｎ末側断片は小断片化されたペプチドの存在が認められる。抗His6-tag抗体では、全長タンパク質とC末側断片が検出された。
【図１０Ｂ】  CHO-FGF23細胞培養上清から精製したFGF-23全長タンパク質とN末側断片およびC末側断片をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、CBB染色して検出した図である。
【図１１】  EGR1プロモータの下流にルシフェラーゼを結合したレポーター遺伝子をklotho発現プラスミド共にトランスフェクションしたPEAK細胞でのヒトFGF-23刺激時に、抗FGF-23抗体（２C3B）を添加した時のルシフェラーゼ活性変化を調べた図である。FGF-23刺激により上昇するルシフェラーゼ活性が２C3B同時添加により抑制されることが示された。
【図１２】  CHOras clone1細胞に可溶化klothoタンパク質発現CHOras clone1細胞の培養上清とFGF23を添加したときに引き起こされるERKのリン酸化亢進を、抗FGF23抗体（2C3B）が抑制するかどうかを調べた図である。FGF23と可溶化klothoタンパク質発現CHOras clone1細胞培養上清を同時添加したときのERKリン酸化亢進は、2C3B抗体濃度依存的に抑制されることが示された。
【図１３】  2C3B抗体、抗TPO抗体、および媒体を投与後、24時間目における血清中リン酸、血清中1,25-ジヒドロキシビタミンD濃度を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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