(57)【要約】【課題】  精製されたＵｓ３を大量に発現できる系、及び信頼性の高いＵｓ３プロテインキナーゼ活性の測定系の提供。【解決手段】  単純ヘルペスウイルス特異的プロテインキナーゼＵｓ３遺伝子とグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子とを有する組み換えベクターにより形質転換された細胞を培養し、当該形質転換細胞破砕液をグルタチオン固定化ビーズに吸着させ、還元グルタチオンを含有する溶液で溶出することを特徴とする組み換えＵｓ３の製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス特異的プロテインキナーゼＵｓ３遺伝子とグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子とを有する組み換えベクターにより形質転換された細胞を培養し、当該形質転換細胞破砕液をグルタチオン固定化ビーズに吸着させ、還元グルタチオンを含有する溶液で溶出することを特徴とする組み換えＵｓ３の製造法。
【請求項２】
組み換えベクターが組み換えバキュロウイルスであり、宿主細胞が昆虫細胞である請求項１記載の組み換えＵｓ３の製造法。
【請求項３】
請求項１又は２の製造法により得られる組み換えＵｓ３。
【請求項４】
請求項３記載の組み換えＵｓ３とプロテインキナーゼ基質とをＡＴＰの存在下に反応させ、リン酸化されたプロテインキナーゼ基質量を測定することを特徴とするＵｓ３のプロテインキナーゼ活性の測定法。
【請求項５】
陰性対照として、Ｕｓ３のアミノ酸配列中２２０番目のリジンをメチオニンに置換した変異ペプチドＵｓ３−Ｋ２２０Ｍを使用する請求項４記載の測定法。
【請求項６】
プロテインキナーゼ基質が、Ｕｓ３、ＵＬ３４、ＩＣＰ２２又はＵＬ３１である請求項４又は５記載の測定法。
【請求項７】
ＡＴＰが標識ＡＴＰである請求項４〜６のいずれか１項記載の測定法。
【請求項８】
被験物質の存在下、請求項３記載の組み換えＵｓ３とプロテインキナーゼ基質とをＡＴＰの存在下に反応させ、リン酸化されたプロテインキナーゼ基質量を測定することを特徴とする、Ｕｓ３プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング法。
【請求項９】
陰性対照として、Ｕｓ３のアミノ酸配列中２２０番目のリジンをメチオニンに置換した変異ペプチドＵｓ３−Ｋ２２０Ｍを使用する請求項８記載のスクリーニング法。
【請求項１０】
プロテインキナーゼ基質が、Ｕｓ３、ＵＬ３４、ＩＣＰ２２又はＵＬ３１である請求項８又は９記載のスクリーニング法。
【請求項１１】
ＡＴＰが標識ＡＴＰである請求項８〜１０のいずれか１項記載のスクリーニング法。
【請求項１２】
単純ヘルペスウイルスプロテインキナーゼＵｓ３のアミノ酸配列中２２０番目のリジンをメチオニンに置換してなる変異ポリペプチドＵｓ３−Ｋ２２０Ｍ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のプロテインキナーゼの一種であるＵｓ３の組み換え体の製造法、プロテインキナーゼ活性測定法及びＵｓ３プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＳＶには、主に、唇、口、顔等に感染するＩ型（ＨＳＶ−１）と、性器に感染するII型（ＨＳＶ−２）があり、ＨＳＶに感染すると、通常水泡を生じ、痛みを伴う。抗ＨＳＶ剤としては、アシクロビル等が知られているが、この抗ＨＳＶ剤は、ＨＳＶのチミジンキナーゼ（ＴＫ）を標的にしており、ＴＫ遺伝子領域に変異する薬剤耐性ウイルスの出現が問題になっており、新たな作用機序による抗ＨＳＶ剤の開発が求められている。
【０００３】
ＨＳＶゲノムは、１５２kbpの直鎖状ｄｓＤＮＡゲノムを有し、８４種類以上のウイルスタンパク質をコードしている。これらのウイルスタンパク質のうち、Ｕｓ３は、ＨＳＶ特異的なプロテインキナーゼであるとともに病原性に関与している。また、アポトーシスの制御、核膜からのウイルス粒子の放出にも関与している。従って、Ｕｓ３は抗ＨＳＶ剤のスクリーニングターゲットとして重要である。
【０００４】
Ｕｓ３の測定法としては、クロマトグラフィーで精製したＵｓ３を用いる方法（非特許文献１及び２）、Ｕｓ３欠損組み換えウイルスを用いる方法（非特許文献３）、及び免疫沈降法で精製したＵｓ３を用いる方法（非特許文献４）が知られている。
【非特許文献１】Biochim. Biophys. Acta 889：208-215(1986)
【非特許文献２】Virology 197：685-694(1993)
【非特許文献３】J. Virol. 65：5757-5764(1991)
【非特許文献４】Exp. Cell Res. 291：242-250(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これら従来の測定系は、いずれも測定結果がＵｓ３精製時に付随する他のキナーゼの混入によるものであることを否定できなかった。また、大量のＵｓ３の精製が困難であり、大量に使用するスクリーニング系への応用が難しかった。
【０００６】
従って、本発明の目的は、Ｕｓ３を大量に発現し、精製できる系、及び信頼性の高いＵｓ３プロテインキナーゼ活性の測定系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、新たな組み換えＵｓ３の発現、精製系を確立すべく種々検討したところ、Ｕｓ３とＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合ポリペプチドを発現する組み換えベクターを用いて形質転換された細胞を培養し、得られた細胞からグルタチオンセファロースを用いて組み換えＵｓ３を精製すれば、純度の高い組み換えＵｓ３が大量に製造できることを見出した。また、Ｕｓ３の２２０番目のリジンをメチオニンに置換した変異体Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍが、タンパク自身は野生体のＵｓ３と同様に発現・精製できるものの、キナーゼ活性が消失しており、Ｕｓ３のプロテインキナーゼ活性測定の系において有用な陰性コントロールとなりうることを見出した。つまり、Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを発現・精製すると、野生体のＵｓ３の場合と同様な他のキナーゼの混入が期待される。よって、野生体のＵｓ３プロテインキナーゼ活性が検出された際に、Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍによってプロテインキナーゼ活性が検出されなければ野生体Ｕｓ３によって検出されたプロテインキナーゼ活性がＵｓ３精製時に混入した他のキナーゼによるものであることを否定できる。かくして得られた組み換えＵｓ３及び変異体Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを用いれば、正確にＵｓ３プロテインキナーゼ活性が測定でき、Ｕｓ３プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングが可能になることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、単純ヘルペスウイルス特異的プロテインキナーゼＵｓ３遺伝子又はＵｓ３−Ｋ２２０Ｍ遺伝子とグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子とを有する組み換えベクターにより形質転換された細胞を培養し、当該形質転換細胞破砕液をグルタチオン固定化ビーズに吸着させ、還元グルタチオンを含有する溶液で溶出することを特徴とする組み換えＵｓ３及びその変異体Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍの製造法、並びにかくして得られる組み換えＵｓ３及びその変異体Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを提供するものである。
また本発明は、上記の如くして得られた組み換えＵｓ３とプロテインキナーゼ基質とをＡＴＰの存在下に反応させ、リン酸化されたプロテインキナーゼ基質量を測定することを特徴とするＵｓ３のプロテインキナーゼ活性の測定法を提供するものである。
さらに本発明は、被験物質の存在下、上記の如くして得られた組み換えＵｓ３とプロテインキナーゼ基質とをＡＴＰの存在下に反応させ、リン酸化されたプロテインキナーゼ基質量を測定することを特徴とする、Ｕｓ３プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニング法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、純度の高い組み換えＵｓ３が簡便かつ大量に生産可能である。この組み換えＵｓ３及びその変異体Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを用いれば、測定結果がＵｓ３精製時に混入する他のプロテインキナーゼによるものであることを否定することができ、正確にＵｓ３プロテインキナーゼ活性が測定でき、かつＵｓ３プロテインキナーゼの阻害剤、すなわち抗ＨＳＶ剤がスクリーニングできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の組み換えＵｓ３の製造法は、まずＵｓ３遺伝子とグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子とを有する組み換えベクターを調製する。Ｕｓ３遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列を有する。当該Ｕｓ３遺伝子は、例えば、ＨＳＶ感染細胞から抽出したウイルスゲノムＤＮＡからＰＣＲ反応により増幅させることにより得られる。このＰＣＲに用いられるプライマーとしては、5'-tggcctgtcgtaagtaagttttg-3'（配列番号２）及び5'-tcatttctgttgaaacagcg-3'（配列番号３）を用いることができる。ＰＣＲ反応は、例えば９４℃５分−９４℃１分、５４℃１分、７２℃２分×３０サイクル−７２℃１０分行うのが好ましい。
【００１１】
得られたＵｓ３遺伝子と、ＧＳＴ遺伝子とを有する組み換えベクターの調製は、ＧＳＴ遺伝子を有するベクターにＵｓ３遺伝子を導入すればよい。ＧＳＴ遺伝子を有するベクターとしては、バキュロウイルスベクター、大腸菌用発現ベクター等が挙げられるが、バキュロウイルスベクターが好ましい。
【００１２】
より詳細には、Ｕｓ３遺伝子をまず、クローニング用ベクター（例えばストラタジーン社のpBluescript IIＫＳ＋等）にクローニングし、さらに得られたプラスミドをＧＳＴ遺伝子を有するプラスミド（例えばファーミンジン社のpAcGHL-B等）にクローニングし、得られたプラスミドをバキュロウイルス遺伝子とともに昆虫細胞に導入し、組み換えバキュロウイルスとして得られる。
得られた組み換えベクターを宿主細胞に形質導入させて形質転換細胞を得る。宿主細胞としては、昆虫細胞、酵母、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等が挙げられるが、昆虫細胞が好ましい。昆虫細胞としては、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ５等が挙げられる。
【００１３】
形質転換細胞の培養法は、細胞の種類より異なるが、例えば２７℃で１〜３日間培養するのが好ましい。培養した細胞を破砕し、その上清をグルタチオン固定化ビーズに吸着させる。ここで細胞の破砕は、超音波処理をするのが好ましい。グルタチオン固定化ビーズとしては、グルタチオンセファロース、グルタチオンアガロース等を用いることができる。
【００１４】
グルタチオン固定化ビーズに吸着したＧＳＴ−Ｕｓ３融合ポリペプチドは、還元グルタチオンで溶出することにより回収される。得られたＧＳＴ−Ｕｓ３融合ポリペプチドは、例えばプロテアーゼであるトロンビンによる消化等（例えばGuan, K., and J. E. Dixon. 1991, Anal. Biochem. 192：262-267）の手段によりＧＳＴを脱離させることができる。このようにして組み換えＵｓ３が得られる。なお、ＧＳＴ−Ｕｓ３融合ポリペプチドをそのまま、Ｕｓ３プロテインキナーゼ活性測定、Ｕｓ３プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングに用いることもできる。
【００１５】
本発明者は、Ｕｓ３のプロテインキナーゼ活性測定系における陰性コントロールの作製を目的として、Ｕｓ３の変異ペプチドの作製を試みた。すなわち、Ｕｓ３遺伝子の代わりに、Ｕｓ３のアミノ酸配列中２２０番目のリジンをメチオニンに置換した変異ペプチドＵｓ３−Ｋ２２０Ｍを作製した。
このＵｓ３−Ｋ２２０Ｍは、前記組み換えＵｓ３の製造法において、Ｕｓ３遺伝子の代わりに、Ｋ２２０Ｍ変異を有する遺伝子を用いることにより得られる。ここで、Ｋ２２０Ｍ変異遺伝子としては、例えば配列番号１の６５９番目のＡをＴに置換した遺伝子が挙げられる。このような変異は、例えばストラタジーン社のQuick-Changeキットを用いて行うことができる。
【００１６】
得られたＵｓ３−Ｋ２２０Ｍは、プロテインキナーゼ活性を示さないので、Ｕｓ３精製時のコントロールとして、またプロテインキナーゼ活性測定及びプロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングのコントロールとして有用である。すなわち、Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを発現・精製すると、野生体のＵｓ３の場合と同様な他のキナーゼの混入が期待される。よって、野生体のＵｓ３プロテインキナーゼ活性が検出された際に、Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍをコントロールとして用い、Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍによってプロテインキナーゼ活性が検出されなければ、野生体のＵｓ３によって検出されたプロテインキナーゼ活性がＵｓ３精製時に混入した他のキナーゼによるものでなく、Ｕｓ３プロテインキナーゼ特異的なものであることがいえる。
【００１７】
本発明によるＵｓ３のプロテインキナーゼ活性の測定法は、前記組み換えＵｓ３及びその変異体とプロテインキナーゼ基質とをＡＴＰの存在下に反応させ、リン酸化されたプロテインキナーゼ量を測定することにより行われる。ここで、プロテインキナーゼ基質としては、Ｕｓ３の標的ポリペプチド又はタンパクであれば制限されない。そのようなタンパクとしては、Ｕｓ３、ＵＬ３４、ＩＣＰ２２、ＵＬ３１等が挙げられる。ここで、ＵＬ３１がＵｓ３の標的タンパクであることは、全く知られておらず、本発明により初めて見出されたことである。
【００１８】
リン酸化されたプロテインキナーゼ基質量の測定には、標識ＡＴＰを用い、リン酸化プロテインキナーゼ基質の標識量を測定するのが好ましい。標識体としては、［γ−32Ｐ］ＡＴＰを用いるのが好ましい。
【００１９】
より詳細には、組み換えＵｓ３とビーズ固層化された基質を標識ＡＴＰを含むバッファー中で反応させ、ビーズからリン酸化基質を溶出し、次いで電気泳動後、タンパク染色し、オートラジオグラフにより標識量を測定する。
【００２０】
Ｕｓ３プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングは、被験物質の存在下に、前記のＵｓ３プロテインキナーゼ活性を測定し、被験物質非存在下のＵｓ３プロテインキナーゼ活性と対比することにより、当該被験物質のＵｓ３プロテインキナーゼ阻害作用を評価することにより行われる。組み換えＵｓ３とプロテインキナーゼ基質との反応を被験物質の存在下で行う以外は、前記と同様にして行われる。
【００２１】
Ｕｓ３は、ＨＳＶ特異的なプロテインキナーゼであり、かつ病原性に関与しており、さらにアポトーシスの制御や核膜からのウイルス粒子の放出にも関しているから、Ｕｓ３プロテインキナーゼ阻害剤は、抗ＨＳＶ剤として有用である。従って、本発明のＵｓ３プロテインキナーゼが阻害剤のスクリーニングによれば、抗ＨＳＶ剤がスクリーニングできる。
【００２２】
また本発明のＵｓ３プロテインキナーゼ活性測定法及びスクリーニング法においては、Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを陰性対照とすることにより、より正確な判断が可能となる。
【実施例】
【００２３】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２４】
実施例１（組み換えバキュロウイルスの作製）
ＨＳＶ−１（Ｆ）感染細胞より調製したウイルスＤＮＡより、ＰＣＲ法により開始点ＡＴＧのＡを欠損したＵｓ３を作製し、pBluescriptII（ストラタジーン社）にクローニングし、ｐＢＳ−Ｕｓ３を作製した。Quick Changeキット（ストラタジーン社）を用いて、Ｕｓ３の６５９番目のＡをＴに置換したｐＢＳ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを作製した。ｐＡｃ−ＧＨＬＴ−ｂ（ファーミンジェン社）のＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１部位にｐＢＳ−Ｕｓ３のＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１  フラグメントをクローニングし、トランスファーベクターｐＡｃ−ＧＨＬＴ−Ｕｓ３を作製した。ｐＢＳ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍからも同様にｐＡｃ−ＧＨＬＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを作製した。各々のトランスファーベクターとBaculo Gold TM Linearized Baculovirus ＤＮＡ（ファーミンジェン社）をそれぞれＳｆ９細胞へリポフェクチン（Gibco-BRL社）を用いてトランスフェクトした。その後、相同性組み換えによって、ＧＳＴ−Ｕｓ３及びＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを発現する組み換えバキュロウイルスを得た。
【００２５】
実施例２（Ｕｓ３及びＵｓ３−Ｋ２２０Ｍの発現と精製）
Ｓｆ９細胞をフラスティックフラスコに捲く。約３時間後、ＧＳＴ−Ｕｓ３又はＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを発現する組み換えバキュロウイルスを感染させる。２〜３日間２７℃で培養後、細胞を回収する。細胞をバッファーＣ（50mM Tris-HCl［pH7.5］,100mM NaCl, 5mM MgCl2, 0.1％ Nonidet P-40, 10％ glycerol, 1mM PMSF）に懸濁後、超音波破砕装置に供した後、遠心分離し、上清をグルタチオンセファロース４Ｂ（Amersham Biosciences社）ビーズと反応させる。２時間から一昼夜の反応後、ビーズをバッファーＣで洗浄後、１０mMの還元型グルタチオンを含むキナーゼバッファー（50mM Tris-HCl pH9.0, 20mM MgCl2, 0.1％ NP40, 1mM DTT）を用いてＧＳＴ−Ｕｓ３及びＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを溶出させ、精製ＧＳＴ−Ｕｓ３又はＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを得る（図１）。
【００２６】
実施例３（Ｕｓ３プロテインキナーゼ活性の測定）
一般にプロテインキナーゼは自己リン酸化能を有している。Ｕｓ３の自己リン酸化能を指標に、Ｕｓ３のプロテインキナーゼ活性を測定できる。精製ＧＳＴ−Ｕｓ３又はＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを１０μＭ  ＡＴＰ及び１０μCi［γ−32Ｐ］ＡＴＰを含むキナーゼバッファー内で３０℃３０分間インキュベートする。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色し、ゲルを乾燥させる。32Ｐで標識されたバンドをオートラジオグラフィーにて検出する（図２）。
【００２７】
実施例４（Ｕｓ３基質の確認と同定）
（ｉ）大腸菌発現系によるＵｓ３基質の調製
検討対象タンパク質をコードする遺伝子（例えばＵＬ３４、ＩＣＰ２２、ＵＬ３１）をｐＭＡＬ−ｃ（New England BioLab社）のマルトース結合タンパク（ＭＢＰ）の翻訳枠に合わせてクローニングし、大腸菌に形質転換する。得られた大腸菌を用いてＩＰＴＧ誘導により目的タンパク質を過剰発現させる。大腸菌を回収後、ＰＢＳに懸濁させ、超音波破砕を行う。遠心分離後、上清にアミロースレジン（New England BioLab社）を反応させる。反応後、ビーズをＰＢＳ及びキナーゼバッファーで洗浄し、ビーズに固層化された精製ＭＢＰ融合目的タンパク質（例えば、ＭＢＰ−ＵＬ３４、ＭＢＰ−ＩＣＰ２２、ＭＢＰ−ＵＬ３１等）を得る。
（ii）精製基質及びＧＳＴ−Ｕｓ３又はＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍを１０μＭ  ＡＴＰ及び１０μCi［γ−32Ｐ］ＡＴＰを含むキナーゼバッファー内で３０℃３０分間インキュベートする。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色し、ゲルを乾燥させる。32Ｐで標識されたバンドをオートラジオグラフィーにて検出する。ＧＳＴ−Ｕｓ３存在下で基質が［γ−32Ｐ］ＡＴＰで標識され、ＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍ存在下で基質が［γ−32Ｐ］ＡＴＰで標識されない、又は、ＧＳＴ−Ｕｓ３存在下での基質の標識がＧＳＴ−Ｕｓ３−Ｋ２２０Ｍ存在下での基質の標識より著しく多い際に、Ｕｓ３が特異的に基質をリン酸化すると判定する。
（iii）その結果、図３〜図６の如く、ＵＬ３４（図３）、ＩＰＣ２２（図４）及びＵＬ３１（図６）がＵｓ３の基質であり、ＵＬ３４のリン酸化サイトがＴｈｒ−１９５及びＳｅｒ−１９８であることがわかる（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｕｓ３及びＵｓ３−Ｋ２２０Ｍの発現を示す図である。
【図２】Ｕｓ３及びＵｓ３−Ｋ２２０Ｍの酵素活性を示す図である。
【図３】ＵＬ３４がＵｓ３の基質であることを示す図である。
【図４】ＩＣＰ２２がＵｓ３の基質であることを示す図である。
【図５】Ｕｓ３によるＵＬ３４のリン酸化サイトの同定結果を示す図である。
【図６】ＵＬ３１がＵｓ３の基質であることを示す図である。
【図１】
2006000037.tif 000002
【図２】
2006000037.tif 000003
【図３】
2006000037.tif 000004
【図４】
2006000037.tif 000005
【図５】
2006000037.tif 000006
【図６】
2006000037.tif 000007
【配列表】
2006000037000001.app