(57)【要約】【課題】  本発明により、除草性作用機構が速効的である除草活性化合物の施用において薬害をさらに軽減することが可能となる植物及びその利用を提供すること。【解決手段】  雑草防除剤の有効成分として含有される、少なくともひとつのプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物に対する耐性が付与されてなる植物であって、下記の両ＤＮＡを含有することを特徴とする植物（１）プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA（２）前記除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA及びその利用等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
雑草防除剤の有効成分として含有される、少なくともひとつのプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物に対する耐性が付与されてなる植物であって、下記の両ＤＮＡを含有することを特徴とする植物。
（１）プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
（２）前記除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
【請求項２】
前記チトクロムP450が、放線菌由来のチトクロムP450であることを特徴とする請求項１記載の植物。
【請求項３】
前記チトクロムP450が、下記のいずれかのチトクロムP450であることを特徴とする請求項１記載の植物。
（１）ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムP450
（２）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するチトクロムP450
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムP450
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムP450
【請求項４】
前記プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、植物由来のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載の植物。
【請求項５】
前記プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、
（１ａ）植物由来であって、かつ前記除草活性化合物によって阻害されるプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質、又は、
（１ｂ）植物由来であって、かつ前記除草活性化合物によって阻害されないプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質、
であることを特徴とする請求項１又は２記載の植物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの請求項記載の植物を増殖する工程を有することを特徴とする除草活性化合物耐性植物の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかの請求項記載の植物を栽培する領域に、前記植物が耐性を示す除草活性化合物を散布する工程を有することを特徴とする雑草防除方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかの請求項記載の植物を栽培する領域又は培養する領域に、前記植物が耐性を示す除草活性化合物を散布又は添加する工程、及び、前記除草活性化合物の雑草防除効果が発現した後に生き残った植物を選抜する工程を有することを特徴とする除草活性化合物耐性植物の選抜方法。
【請求項９】
雑草防除剤の有効成分として含有される、少なくともひとつのプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物に対する植物への耐性付与方法であって、下記の両ＤＮＡを植物に導入して発現させる工程を有することを特徴とする方法。
（１）プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
（２）前記除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草活性化合物耐性植物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
除草活性化合物耐性植物としては、従来から各種の人為的な植物が作成されてきている。その中で、雑草防除剤の有効成分として含有されるプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物に対する耐性が付与されてなる植物としては、例えば、（１）植物体中でプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼを過剰発現させてなる植物や、（２）植物体中で又は、プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼのアミノ酸配列に雑草防除剤に対する感受性が下がるように、当該除草活性化合物に対する感受性が低下するような変異が人為的に導入され、当該変異型プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼが発現されてなる植物（例えば、特許文献１等記載参照）や、（３）植物体中で当該除草活性化合物を代謝し不活性化するような、放線菌由来のチトクロムP450が発現させてなる植物（例えば、特許文献２等記載参照）等が知られている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開パンフレット第９７／３２０１１号
【特許文献２】国際公開パンフレット第０３／４０３７０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、一般的には、前記雑草防除剤に含有されるる除草活性化合物における除草性作用機構が速効的であるために、これらの除草活性化合物耐性植物では当該除草活性化合物による薬害を生じやすい。従って、当該除草活性化合物の施用において薬害をさらに軽減することが可能となる植物の開発等が求められてきた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意研究を行った結果、植物体中で機能が異なる２種類のタンパク質を組み合わせて利用することにより、前記除草活性化合物に対する期待される以上の高度な耐性が付与されてなる植物を得ることが可能となることを見出し、本発明に至った。即ち、本発明は、
１．雑草防除剤の有効成分として含有される、少なくともひとつのプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物に対する耐性が付与されてなる植物であって、下記の両ＤＮＡを含有することを特徴とする植物（以下、本発明植物と記すこともある。）
（１）プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
（２）前記除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA；
２．前記チトクロムP450が、放線菌由来のチトクロムP450であることを特徴とする請求項１記載の植物；
３．前記チトクロムP450が、下記のいずれかのチトクロムP450であることを特徴とする請求項１記載の植物
（１）ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムP450
（２）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と90%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するチトクロムP450
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムP450
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するチトクロムP450；
４．前記プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、植物由来のプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載の植物；
５．前記プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質が、
（１ａ）植物由来であって、かつ前記除草活性化合物によって阻害されるプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質、又は、
（１ｂ）植物由来であって、かつ前記除草活性化合物によって阻害されないプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質、
であることを特徴とする請求項１又は２記載の植物；
６．請求項１〜５のいずれかの請求項記載の植物を増殖する工程を有することを特徴とする除草活性化合物耐性植物の製造方法；
７．請求項１〜５のいずれかの請求項記載の植物を栽培する領域に、前記植物が耐性を示す除草活性化合物を散布する工程を有することを特徴とする雑草防除方法（以下、本発明雑草防除方法と記すこともある。）；
８．請求項１〜５のいずれかの請求項記載の植物を栽培する領域又は培養する領域に、前記植物が耐性を示す除草活性化合物を散布又は添加する工程、及び、前記除草活性化合物の雑草防除効果が発現した後に生き残った植物を選抜する工程を有することを特徴とする除草活性化合物耐性植物の選抜方法；
９．雑草防除剤の有効成分として含有される、少なくともひとつのプロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性阻害型除草活性化合物に対する植物への耐性付与方法であって、下記の両ＤＮＡを植物に導入して発現させる工程を有することを特徴とする方法。
（１）プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA
（２）該化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、除草性作用機構が速効的である除草活性化合物の施用において薬害をさらに軽減することが可能となる植物及びその利用を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明における雑草防除剤とは、除草活性化合物を有効成分として含有する雑草防除を目的とした組成物である。尚、これらの組成物は、必要に応じて殺虫活性化合物、殺菌活性化合物、植物生長調節活性化合物、肥料成分等を同時に含有するものであってもよい。このような雑草防除剤のひとつとして、例えば、ポルフィリン生合成を阻害する化合物を有効成分として含有する組成物等を挙げることができる。ここで、ポルフィリン生合成を阻害する化合物としては、例えば、プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ（protoporphyrinogen IX oxydase、EC 1.13.11.27、以下、PPOと記すこともある。）の活性を阻害する化合物（以下、本除草活性化合物と記す。）等を挙げることができる。具体的には例えば、本除草活性化合物としては、Duke, S.O., Rebeiz, C.A. ACS Symposium Series 559, Porphyric Pesticides, Chemistry, Toxicology, and Pharmaceutical Applications. American Chemical Society, Washington DC (1994)等に記載される化合物等が挙げられる。本除草活性化合物には、多くの異なる構造の分子種が含まれており（Duke et al., Weed Sci. 39: p465 (1991); Nandihalli et al.、Pesticide Biochem. Physiol. 43: p193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: p35(1989); Yanase, Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: p70 (1989) ）、例えば、ジフェニルエーテル（例えば、クロロメトキシニル、ビフェノックス、クロロニトロフェン(CNP)、アシフルオルフェン（5-[2-クロロ-4-(トリフルオロメチル)フェノキシ]-2-ニトロ安息香酸等）、アシフルオルフェンのエチルエステル、アシフルオルフェン-ソディウム、オキシフルオルフェン（2-クロロ-1-(3-エトキシ-4-ニトロフェノキシ)-4-トリフルオロメチルベンゼン）、オキサジアゾール（例えば、オキサジアゾン（3-[2,4-ジクロロ-5-(1-メチルエトキシ)フェニル]-5-(1,1-ジメチルエチル)-1,3,4-オキサジアゾール-2 (3H)-オン）等）、環状イミド（例えば、S-23142（N-(4-クロロ-2-フルオロ-5-プロパギルオキシフェニル)-3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド等）、クロロフタリム（N-(4-クロロフェニル)-3,4,5,6-テトラヒドロフタルイミド））、フェニルピラゾール（例えば、TNPP-エチル（エチル 2-[1-(2,3,4-トリクロロフェニル)-4-ニトロピラゾリル-5-オキシ]プロピオネート）等）、ピリジン誘導体（例えば、LS82-556（N3-(1-フェニルエチル)-2,6-ジメチル-5-プロピオニルニコチンアミド）等）、フェノピレート、フェノピレートの O-フェニルピロリジノカルバメート類似体、フェノピレートのピペリジノカルバメート類似体等を挙げることができる。
【０００８】
代表的な本除草活性化合物を化学一般式を用いて示すと、例えば、
2006000110.tif 000002
［式中、Gは以下のG−1〜9のいずれかで示される基を表す。
2006000110.tif 000003
ここで、X は酸素原子又は硫黄原子を表し、
Y は酸素原子又は硫黄原子を表し、
R1 は水素原子又はハロゲン原子を表し、
R2 は水素原子、C1-C8 アルキル基、C1-C8 ハロアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、-OR9 基、-SH 基、-S(O)pR9 基、-COR9 基、-CO2R9 基、-C(O)SR9 基、-C(O)NR11R12 基、-CONH2基、-CHO 基、-CR9=NOR18 基、-CH=CR19CO2R9 基、-CH2CHR19CO2R9 基、-CO2N=CR13R14 基、ニトロ基、シアノ基、-NHSO2R15 基、-NHSO2NHR15 基、-NR9R20 基、-NH2 基、又は、1つ以上の同種若しくは異種の C1-C4 アルキル基で置換されていてもよいフェニル基を表し、
p は 0、1 又は 2 を表し、
R3 は C1-C2 アルキル基、C1-C2 ハロアルキル基、-OCH3 基、-SCH3 基、-OCHF2 基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、又は  環上でハロゲン原子、C1-C3 アルキル基、C1-C3 ハロアルキル基、OR28基、NR11R28基、SR28基、シアノ基、CO2R28基  又は  ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基で置換されたC1-C3アルコキシ基を表し、
R4 は水素原子、C1-C3 アルキル基、又はC1-C3 ハロアルキル基を表し、
R5 は水素原子、C1-C3 アルキル基、C1-C3 ハロアルキル基、シクロプロピル基、ビニル基、C2 アルキニル基、シアノ基、-C(O)R20 基、-CO2R20 基、-C(O)NR20R21 基、-CR16R17CN 基、-CR16R17C(O)R20 基、-CR16R17CO2R20 基、-CR16R17C(O)NR20R21 基、-CHR16OH 基、-CHR16OC(O)R20 基、又は -OCHR16OC(O)NR20R21 基を表すか、あるいは、G が G-2 若しくは G-6 の場合に R4 とR5とはこれらが結合している炭素原子とで C=O 基を表していてもよく、
R6 は C1-C6 アルキル基、C1-C6 ハロアルキル基、C2-C6 アルコキシアルキル基、C3-C6 アルケニル基、又は C3-C6 アルキニル基を表し、
R7 は水素原子、C1-C6 アルキル基、C1-C6 ハロアルキル基、ハロゲン原子、-S(O)2(C1-C6アルキル)基、又は -C(=O)R22 基を表し、
R8 は水素原子、C1-C8 アルキル基、C3-C8 シクロアルキル基、C3-C8 アルケニル基、C3-C8 アルキニル基、C1-C8 ハロアルキル基、C2-C8 アルコキシアルキル基、C3-C8 アルコキシアルコキシアルキル基、C3-C8 ハロアルキニル基、C3-C8 ハロアルケニル基、C1-C8 アルキルスルホニル基、C1-C8 ハロアルキルスルホニル基、C3-C8 アルコキシカルボニルアルキル基、-S(O)2NH(C1-C8 アルキル)基、-C(O)R23 基、又はフェニル環上で R24 で置換されていてもよいベンジル基を表し、
R9 は C1-C8 アルキル基、C3-C8 シクロアルキル基、C3-C8 アルケニル基、C3-C8 アルキニル基、C1-C8 ハロアルキル基、C2-C8 アルコキシアルキル基、C2-C8 アルキルチオアルキル基、C2-C8 アルキルスルフィニルアルキル基、C2-C8 アルキルスルフォニルアルキル基、C4-C8 アルコキシアルコキシアルキル基、C4-C8 シクロアルキルアルキル基、C4-C8 シクロアルコキシアルキル基、C4-C8 アルケニルオキシアルキル基、C4-C8 アルキニルオキシアルキル基、C3-C8 ハロアルコキシアルキル基、C4-C8 ハロアルケニルオキシアルキル基、C4-C8 ハロアルキニルオキシアルキル基、C4-C8シクロアルキルチオアルキル基、C4-C8 アルケニルチオアルキル基、C4-C8 アルキニルチオアルキル基、
環上でハロゲン原子、C1-C3 アルキル基及び C1-C3 ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェノキシ基で置換された C1-C4 アルキル基、環上でハロゲン原子、C1-C3 アルキル基及び C1-C3 ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジルオキシ基で置換された C1-C4 アルキル基、
C4-C8トリアルキルシリルアルキル基、C2-C8シアノアルキル基、C3-C8 ハロシクロアルキル基、C3-C8 ハロアルケニル基、C5-C8 アルコキシアルケニル基、C5-C8 ハロアルコキシアルケニル基、C5-C8 アルキルチオアルケニル基、C3-C8 ハロアルキニル基、C5-C8 アルコキシアルキニル基、C5-C8 ハロアルコキシアルキニル基、C5-C8 アルキルチオアルキニル基、C2-C8 アルキルカルボニル基、
環上でハロゲン原子、C1-C3 アルキル基、C1-C3 ハロアルキル基、-OR28基、-NR11R28基、-SR28基、シアノ基、-CO2R28基  又は  ニトロ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいベンジル基、
-CR16R17COR10 基、-CR16R17CO2R20 基、-CR16R17P(O)(OR10)2 基、-CR16R17P(S)(OR10)2 基、-CR16R17C(O)NR11R12 基、-CR16R17C(O)NH2 基、-C(=CR26R27)COR10 基、-C(=CR26R27)CO2R20 基、-C(=CR26R27)P(O)(OR10)2 基、-C(=CR26R27)P(S)(OR10)2 基、-C(=CR26R27)C(O)NR11R12 基、-C(=CR26R27)C(O)NH2 基、
環上でハロゲン原子、C1-C6アルキル基、C1-C6ハロアルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6ハロアルケニル基、C2-C6アルキニル基、C3-C6ハロアルキニル基、C2-C8アルコキシアルキル基、-OR28基、-SR28基、-NR11R28基、C3-C8アルコキシカルボニルアルキル基、C2-C4カルボキシアルキル基、-CO2R28基  及びシアノ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよい下記のQ-1からQ-7までのいずれかの環を表し、
2006000110.tif 000004
R10 は C1-C6 アルキル基、C2-C6 アルケニル基、C3-C6 アルキニル基、又はテトラヒドロフラニル基を表し、
R11 及び R13 は独立して水素原子、又は C1-C4 アルキル基を表し、
R12 はC1-C6 アルキル基、C3-C6 シクロアルキル基、C3-C6 アルケニル基、C3-C6 アルキニル基、C2-C6 アルコキシアルキル基、C1-C6 ハロアルキル基、C3-C6 ハロアルケニル基、C3-C6 ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、C1-C4 アルキル基及び C1-C4 アルコキシ基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基  又は  -C R16R17CO2R25基を表し
あるいは、
R11と R12とで -(CH2)5-、-(CH2)4-、又は -CH2CH2OCH2CH2- を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、 C1-C3 アルキル基、フェニル基及びベンジル基からなるグループの中から選択される置換基で置換されていてもよく、
R14 はC1-C4 アルキル基、又は環上でハロゲン原子、C1-C3 アルキル基及び C1-C3 ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基を表し、あるいは、
R13と R14とはこれらが結合している炭素原子とで C3-C8 シクロアルキル基を表していてもよく、
R15 は C1-C4 アルキル基、C1-C4 ハロアルキル基、又は C3-C6 アルケニル基を表し、
R16 及び R17 は独立して水素原子又は C1-C4 アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C2-C4 アルケニル基、C2-C4ハロアルケニル基、C2-C4 アルキニル基、C3-C4 ハロアルキニル基を表し、
あるいは、
R16 と R17はこれらが結合している炭素原子とでC3-C6 シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、C1-C3 アルキル基及びC1-C3 ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
R18 は水素原子、C1-C6 アルキル基、C3-C6 アルケニル基、又は C3-C6 アルキニル基を表し、
R19 は水素原子、C1-C4 アルキル基、又はハロゲン原子を表し、
R20 は水素原子、C1-C6 アルキル基、C3-C6 シクロアルキル基、C3-C6 アルケニル基、C3-C6 アルキニル基、C2-C6 アルコキシアルキル基、C1-C6 ハロアルキル基、C3-C6 ハロアルケニル基、C3-C6 ハロアルキニル基、環上でハロゲン原子、C1-C4 アルキル基及びOR28基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよいフェニル基、又は  -C R16R17CO2R25基を表し、
R21 は水素原子、C1-C2 アルキル基、又は -CO2(C1-C4アルキル)基を表し、
R22 は水素原子、C1-C6 アルキル基、C1-C6 アルコキシ基、又は NH(C1-C6 アルキル)基を表し、
R23 は C1-C6 アルキル基、C1-C6 ハロアルキル基、C1-C6 アルコキシ基、NH(C1-C6 アルキル)基、R24 基で置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、又は C2-C8 ジアルキルアミノ基を表し、
R24 は C1-C6 アルキル基、1 ないし 2 個のハロゲン原子、C1-C6 アルコキシ基、又は CF3 基を表し、
R25は水素原子、C1-C6 アルキル基、C1-C6 ハロアルキル基、C3-C6 アルケニル基、C3-C6 ハロアルケニル基、C3-C6 アルキニル基、又はC3-C6 ハロアルキニル基を表し、
R26 及び R27 はそれぞれ独立して水素原子又は C1-C4 アルキル基、C1-C4ハロアルキル基、C2-C4 アルケニル基、C2-C4ハロアルケニル基、C2-C4 アルキニル基、C3-C4 ハロアルキニル基、-OR28基、-NHR28基、又はSR28基を表し、
あるいは、
R26 と R27はこれらが結合している炭素原子とでC3-C6 シクロアルキル基を表していてもよく、このようにして形成されるそれぞれの環では、ハロゲン原子、C1-C3 アルキル基及びC1-C3 ハロアルキル基からなるグループの中から選択される少なくともひとつの置換基で置換されていてもよく、
R28  は水素原子、C1-C6 アルキル基、C1-C6 ハロアルキル基、C3-C6 アルケニル基、C3-C6 ハロアルケニル基、C3-C6 アルキニル基、C3-C6 ハロアルキニル基、C2-C4カルボキシアルキル基、C3-C8アルコシキカルボニルアルキル基、C3-C8ハロアルコキシカルボニルアルキル基、C5-C9アルケニルオキシカルボニルアルキル基、C5-C9ハロアルケニルオキシカルボニルアルキル基、C5-C9アルキニルオキシカルボニルアルキル基、C5-C9ハロアルキニルオキシカルボニルアルキル基、C5-C9シクロアルコキシカルボニルアルキル基  又は  C5-C9ハロシクロアルコキシカルボニルアルキル基を表す。]
で示される化合物を挙げることができる。またさらに、具体的には例えば、下記の化学式で示される化合物（以下、化合物（II）と記すこともある。）
2006000110.tif 000005
、ブタフェナシル、フルフェンピルエチル、メチル 2-[2-クロロ-5-[3,6-ジヒドロ-3-メチル-2,6-ジオキソ-4-(トリフルオロメチル)-1(2H)-ピリミジニル]-4-フルオロフェノキシ]フェノキシアセテート、エチル [3-[2-クロロ-5-[3,6-ジヒドロ-3-メチル-2,6-ジオキソ-4-(トリフルオロメチル)-1(2H)-ピリミジニル]-4-フルオロフェノキシ]-2-ピリダジニル]オキシアセテート、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン等が挙げられる。
【０００９】
ここで「ブタフェナシル」とはCAS登録番号134605-64-4の化合物であり、「フルフェンピルエチル」とはCAS登録番号188489-07-8の化合物であり、「カルフェントラゾンエチル」とはCAS登録番号128639-02-1の化合物であり、「スルフェントラゾン」とはCAS登録番号122836-35-5の化合物である。尚、以下、（メチル 2-[2-クロロ-5-[3,6-ジヒドロ-3-メチル-2,6-ジオキソ-4-(トリフルオロメチル)-1(2H)-ピリミジニル]-4-フルオロフェノキシ]フェノキシアセテート（CAS登録番号344419-98-3）を化合物 (III)と記し、エチル 3-[2-クロロ-5-[3,6-ジヒドロ-3-メチル-2,6-ジオキソ-4-(トリフルオロメチル)-1(2H)-ピリミジニル]-4-フルオロフェノキシ]-2-ピリダジニルオキシアセテート（CAS登録番号353292-31-6）を化合物 (IV) と記載することもある。
【００１０】
本発明において「配列相同性」とは、２つの塩基配列又は２つのアミノ酸配列間の相同性をいう。配列相同性は、比較対象の配列の全領域にわたって最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象の塩基配列又はアミノ酸配列が最適な状態にアラインメントされるためには、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。このような配列相同性は、例えば、FASTA（Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，4, 2444-2448 (1988)）、BLAST（Altschul et al., Journal of Molecular Biology, 215, 403-410 (1990)）、CLUSTAL W（Thompson, Higgins ＆ Gibson, Nucleic Acid Research, 22, 4673-4680 (1994a)）等のプログラムを用いて相同性解析を行いアラインメントを作成することによって算出することができる。上記のプログラムは、例えば、DNA Data Bank of Japan（国立遺伝学研究所 生命情報・ＤＤＢＪ研究センター (Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan; CIB/DDBJ)内で運営される国際DNAデータバンク）のWebページ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-e.html）等において、一般的に利用可能である。また、配列相同性は市販の配列解析ソフトウェアを用いて求めることもできる。具体的には、配列相同性はGENETYX-WIN Ver. 6（GENETYX Corporation製）を用いてLipman-Pearson法（Lipman, D. J. and Pearson, W.R., Science, 227, 1435-1441, (1985)）により相同性解析を行ってアラインメントを作成することにより算出することができる。例えば、当該方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列と配列番号２で示されるアミノ酸配列との相同性解析を行いアラインメントを作成した結果、90％の配列相同性が存在するという結果が算出される。
【００１１】
本発明において使用される遺伝子（DNA）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する「プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質」としては、例えば、野生型のPPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（例えば、USP5767373等記載参照）、本除草活性化合物によって阻害されないPPO活性を有する変異型PPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（例えば、USP5939602等記載参照）、本除草活性化合物によって阻害されないPPO活性を有するバクテリア由来のPPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（例えば、EP0770682、WO9833927等記載参照）等を挙げることができる。このような遺伝子は、いずれも「プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ活性を示すタンパク質」のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であって、当該遺伝子と後述する本除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450の遺伝子（DNA）とを組み合わせて利用するために、両遺伝子を植物に導入して発現させることにより、本除草活性化合物に対する耐性を付与することができるタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子である。かかる遺伝子としては、天然に存在するPPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であってもよく、天然に存在するPPOのアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加又は欠失等が導入されてなるPPO活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であってもよく、PPO活性を指標に選抜されたタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であってもよい。また、これらの遺伝子は、植物の天然のPPO活性を阻害する量の本除草活性化合物によって阻害されるPPO活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であってもよいし、本除草活性化合物によって阻害されないPPO活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子であってもよい。具体的には例えば、天然に存在するPPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子としては、大腸菌Esherichia coli (Genebank accession X68660)、枯草菌Bacillus subtilis (Genebank accession M97208)、Haemophilus influnzae (Genebank accession L42023)、マウス(Genebank accessionD45185)、ヒト(Genebank accession D38537)、シロイヌナズナ(Genebank accession D83139)又はタバコ(Genebank accession Y13465, Y13466)等由来の遺伝子を挙げることができる。また、本除草活性化合物によって阻害されないPPO活性を有する変異型PPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子としては、US5939602、WO9704089等に記載されている遺伝子が挙げられる。
【００１２】
本発明において使用されるチトクロムP450とは、還元状態で一酸化炭素を結合して450nm付近にソーレ吸収帯を示す分光学的な性質に由来する名称を持つ一群のプロトヘム含有タンパク質であり、多くの動物植物組織、糸状菌、酵母、細菌に認められるものである。当該チトクロムP450は、通常、NADPH又は稀にNADHに由来する２個の電子及び分子状酸素を用いて、本除草活性化合物等に一原子酸素添加反応や、それに引き続く官能基の脱離反応を引き起こす能力を有する。当該チトクロムP450としては、（１）フェレドキシン及びNADPH−フェレドキシンレダクターゼの両者と電子伝達して電子を供給されるタイプ、（２）直接NADPH−チトクロムP450レダクターゼから電子を供給されるタイプが存在するがいずれのタイプのものでもよい。好ましくは、前者のタイプを挙げることができる。尚、前者の場合におけるチトクロムP450は、宿主細胞内のいずれの細胞内小器官に存在するものでもよいし、また、細胞質に存在するものでもよい。一方、フェレドキシンは、宿主細胞に内在するフェレドキシンであってもよいし、また、宿主細胞に遺伝子を外部から導入することによって宿主細胞とは異種のフェレドキシンであってもよい。
宿主細胞に導入されたチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の存在場所は、細胞内のいずれの細胞内小器官又は核内の染色体であってもよい。また、かかるチトクロムP450の存在場所は、いずれの細胞内小器官、細胞質又は細胞外間隙であってもよいが、好ましくは、宿主細胞の細胞内小器官、より好ましくは色素体を挙げることができる。
【００１３】
尚、チトクロムP450が細胞内の細胞内小器官に移行されるようにするには、例えば、細胞内小器官への移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するDNAが、当該チトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAの上流にその読み枠を合わせて連結されてなるキメラDNAを宿主細胞に導入すればよい。ここで「読み枠を合わせて連結されて」とは、細胞内小器官への移行シグナル配列をコードする塩基配列の読み枠と、当該チトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列の読み枠とが接続されて一続きの読み枠が形成されるように連結されていることを意味する。宿主細胞においてタンパク質の細胞内小器官への移行及び局在化をもたらす移行シグナル配列としては、例えば、USP5717084等に記載される植物の葉緑体に局在するタンパク質の細胞質前駆体タンパク質由来の移行シグナル配列や、USRE36449等に記載される複数種の移行シグナル配列から構成されるキメラ配列等を挙げることができる。具体的には例えば、WO03040370に記載される方法によって取得可能なダイズのribulose-1,5-bisphosphate carboxylase（以下、RuBPCOと記すこともある。）小サブユニット由来の葉緑体移行シグナルペプチド等が挙げられる。
【００１４】
かかるチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（DNA）としては、天然に存在する塩基配列を有する遺伝子であってもよく、また、チトクロムP450をコードする遺伝子を宿主に最適なコドンに変換したチトクロムP450をコードする遺伝子であってもよい。天然に存在するチトクロムP450にアミノ酸の置換、付加、又は欠失等が導入されてチトクロムP450活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよく、チトクロムP450活性を指標に選抜されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。具体的には、チトクロムP450をコードする遺伝子としては、WO03040370に記載のチトクロムP450をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１５】
本発明において使用される好ましいチトクロムP450としては、放線菌由来のチトクロムP450を挙げることができる。ここで「放線菌」とは、放線菌目（Actinomycetales）に属する一群の原核生物のことであり、ストレプトミセス、アクチノマイセス、マイコバクリウム、フランギア、ノルカデア等の８属に分けられる一群のグラム陽性細菌である。より好ましいチトクロムP450としては、ストレプトミセス属に属する放線菌由来のチトクロムP450が挙げられ、具体的には例えば、Streptomyces phaeochromogenes、Streptomyces testaceus、Streptmyces achromogenes、Streptomyces griseofuscus、Streptomyces thermocoerulescens、Streptomyces nogalater、Streptomyces tsusimaensis、Streptomyces glomerochromogenes、Streptomyces olivochromogenes、Streptomyces ornatus、Streptomyces griseus、Streptomyces lanatus、Streptomyces misawanensis、Streptomyces pallidus、Streptomyces roseorubens、Streptomyces rutgersensis、Streptomyces steffisburgensis、Saccharopolyspora taberi等由来のチトクロムP450を挙げることができる。
【００１６】
上記に挙げたPPO活性を示すタンパク質及びチトクロムP450のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、付加若しくは置換を人為的に行う手法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAに対して部位特異的変異を導入する手法等を挙げることができる。具体的には例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。また、例えば、アミノ酸配列のいずれかをコードする塩基配列を有するDNAに対してランダムに変異を導入する手法等を挙げることができる。具体的には例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを鋳型とし、それぞれのDNAの全長を増幅できるようなプライマー対を用い、基質に用いるdATP、dTTP、dGTP、dCTPの各々の添加濃度を変化させた反応条件下又はポリメラーゼの反応を促進させるMg2+の濃度を増加させた反応条件下でPCRを行う方法等が挙げられる。このようなPCRの手法としては、例えば、Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112等に記載される通常の方法を挙げることができる。
【００１７】
上記のように変異が人為的に導入されたタンパク質のPPO活性を確認する方法としては、例えば、WO9732011等に記載されるように、変異が人為的に導入されたタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAをベクタープラスミドに挿入し、これをPPO欠損宿主内で発現させることにより、当該導入DNAがPPO欠損を相補しヘム非依存的に当該PPO欠損宿主が生育可能になることを確認すればよい。また、上記のように変異が導入されたタンパク質のチトクロムP450活性を確認する方法としては、例えば、変異が導入されたタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAをベクタープラスミドに挿入し、これをWO03040370等に記載されるように、宿主内で発現させることにより、変異が導入されたチトクロムP450を生産させた宿主の破砕液に、基質として本除草活性化合物、フェレドキシン及びNADPH−フェレドキシンレダクターゼを加えて反応させ、反応後の反応混合物中における当該基質の減少を測定することで確認すればよい。
【００１８】
本発明において用いられる導入遺伝子を植物に導入して発現させるには、一般的には、細胞内小器官への移行シグナル配列をコードする塩基配列を有するDNAが上記のように連結されてなるキメラDNA又は当該キメラDNAと宿主細胞で機能可能なプロモーターとが機能可能な形で接続されてなるDNA等を宿主細胞である植物で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞である植物に導入すればよい。尚、宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクタープラスミドを使用する場合には、ベクタープラスミド保有のプロモーターと当該キメラDNAとが機能可能な形で結合するように、当該プロモーターの下流に当該キメラDNAを挿入すればよい。
【００１９】
ここで、植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーターとは、植物細胞等の宿主細胞に導入するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（構造遺伝子）の塩基配列の上流5’−側に接合し、当該構造遺伝子を含む転写RNAを転写させる機能を持つ塩基配列のことである。植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子プロモーター等のT-DNA由来の構成型プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス由来の19Sプロモーター又は35Sプロモーター等の植物ウィルス由来のプロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ遺伝子プロモーター、Pathogenesis-related protein遺伝子プロモーター等の誘導型プロモーター、WO2000020613に記載される植物プロモーター等を挙げることができる。また、上記のような植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーターと、PPO活性を示すタンパク質又はチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAとが機能可能な形で接続されてなるDNAの下流に、植物細胞等の宿主細胞で機能可能なターミネーターを連結させてもよい。
【００２０】
植物細胞で機能可能なターミネーターとは、植物細胞等の宿主細胞に導入するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（構造遺伝子）の塩基配列の下流3’−側に接合し、当該構造遺伝子を含む転写RNAを転写安定化するためのポリアデニン配列を付加させる機能を持つ塩基配列のことである。植物細胞で機能可能なターミネーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）ターミネーター等のT-DNA由来の構成型ターミネーター、ニンニクウィルスGV1、GV2のターミネーター等の植物ウィルス由来のターミネーター、WO2000020613に記載される植物ターミネーター等を挙げることができる。
【００２１】
尚、宿主細胞である植物細胞としては、例えば、タバコ、ナス、バレイショ、トマトに代表されるナス科植物、ナタネ、カノーラ、レタス、テンサイ、シロイヌナズナに代表されるアブラナ科植物、ダイズ、エンドウ、アルファルファに代表されるマメ科植物、リンゴ、ナシ、アーモンドに代表されるバラ科植物、オレンジ、レモンに代表される柑橘類、ワタ、アマ、ヒマワリ、バナナ、ブドウ、アーモンド、ポプラ等の双子葉植物由来の植物細胞を挙げることができ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ソルガム等に代表されるイネ科植物等やバナナ等の単子葉植物由来の植物細胞を挙げることができる。
尚、宿主細胞である植物細胞としては、植物組織、植物個体、培養細胞、種子等の各種の植物細胞を用いることができる。
【００２２】
植物細胞等の宿主細胞で機能可能なプロモーター及びターミネーターが接続された前記構造遺伝子を有するDNAを、植物細胞等の宿主細胞に導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウム感染方法（特公平2-58917号公報及び特開昭60-70080号公報）、プロトプラストへのエレクトロポーレーション方法（特開昭60-251887号公報及び特開平5-68575号公報）、又はパーティクルガン方法（特表平5-508316号公報及び特開昭63-258525号公報）等の方法等を挙げることができる。
この際、例えば、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等から選ばれる選択マーカー遺伝子と、PPO活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA又は本除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAとを同時に植物細胞等の宿主細胞に導入すると、導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。当該選択マーカー遺伝子と、PPO活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA又は本除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAとを同一のベクター上に直列に組み込み、これを導入してもよいし、当該選択マーカー遺伝子を有するベクタープラスミドと、PPO活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA又は本除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAとを同時に導入してもよい。また、目的にする遺伝子を含むベクターが導入された植物細胞を、本除草活性化合物が添加された培地で培養し、増殖可能なクローンを単離することによっても、目的とする遺伝子が導入された形質転換体を選抜することができる。
【００２３】
PPO 活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAと本除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAとの両DNAを植物に導入する方法としては、（１）当該両DNAを混合して同時に同一植物細胞に導入する方法、（２）当該両DNAが直列に接続されてなるDNAを同一植物細胞に導入する方法、のいずれであってもよい。
尚、形質転換体が当該両DNAを保有していることは、当該形質転換体から調製されたDNAについて、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される遺伝子工学的分析方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、PCR等）を用いて解析を行うことにより確認すればよい。
【００２４】
具体的には例えば、モデル植物の実験プロトコール イネ・シロイヌナズナ編（島本功、岡田清孝監修、秀潤社1996年）、第4章に記載される方法に準じて、当該両DNAが導入されたイネやシロイヌナズナを得ることができる。また、特開平3-291501に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いてダイズ不定胚に導入して、当該両DNAが導入されたダイズを得ることができる。同様に、Fromm, M. E., et al., Bio/Technology, 8; p838 (1990) に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いてトウモロコシ不定胚に導入し、当該両DNAが導入されたトウモロコシを得ることができる。同様に、宅見ら著、育種学会雑誌、1995年、第44巻、別冊1号、57頁に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したコムギ未熟胚盤に導入し、当該両DNAが導入されたコムギを得ることができる。同様に、萩尾ら著、育種学会雑誌、1995年、第44巻、別冊1号、67頁に記載されている方法に準じて、パーティクルガンを用いて無菌培養したオオムギ未熟胚盤に導入し、当該両DNAが導入されたオオムギを得ることができる。
【００２５】
このようにして作製された形質転換体から、例えば、「植物細胞組織培養  実際・応用・展望」（原田、駒嶺編集、理工学社1979年）、65-118頁等に記載される植物細胞培養法に準じて植物体を再生させることによって、当該両DNAが導入された形質転換植物を得ることができる。
【００２６】
さらに、当該両DNAが導入され、発現する形質転換植物と目的とする品種の植物とを交配させることにより、目的品種の植物の染色体に当該両DNAを導入し、当該両DNAが導入された目的品種の植物を取得することもできる。
またPPO 活性を示すタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAと、本除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAとを別個に異なる植物細胞に導入して、これを選抜及び個体再生させた後、再生された形質転換体の後代の系統を交配することによって、本発明植物を作製することもできる。
【００２７】
具体的には例えば、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えダイズ系統と、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えダイズ系統とを作出するために、前記の両DNA断片をそれぞれ独立して、特開平3-291501号公報に記載される方法に準じて、パーティクルガンを用いてダイズ不定胚に導入する。次いで、作出された組換えダイズ系統を交配することにより交配系統を得る。尚、当該交配系統における本除草活性化合物に対する耐性を調べるために、後述の実施例９等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物の散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
【００２８】
また、具体的には例えば、トウモロコシ由来の変異型PPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えトウモロコシ系統と、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えトウモロコシ系統とを作出するために、前記の両DNA断片をそれぞれ独立して、Fromm, M. E., et al., Bio/Technology, 8; p838 (1990) に記載される方法に準じて、パーティクルガンを用いてトウモロコシ不定胚に導入する。次いで、作出された組換えトウモロコシ系統を交配することにより交配系統を得る。尚、当該交配系統における本除草活性化合物に対する耐性を調べるために、後述の実施例９等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物の散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
【００２９】
また、具体的には例えば、ワタ由来の変異型PPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えワタ系統と、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えワタ系統とを作出するために、前記の両DNA断片をそれぞれ独立して、アグロバクテリウム法を用いてワタに導入する。次いで、作出された組換えワタ系統を交配することにより交配系統を得る。尚、当該交配系統における本除草活性化合物に対する耐性を調べるために、後述の実施例９等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物の散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
【００３０】
また、具体的には例えば、ナタネ由来の変異型PPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えナタネ系統と、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えナタネ系統とを作出するために、前記の両DNA断片をそれぞれ独立して、アグロバクテリウム法を用いてナタネに導入する。次いで、作出された組換えナタネ系統を交配することにより交配系統を得る。尚、当該交配系統における本除草活性化合物に対する耐性を調べるために、後述の実施例９等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物の散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
【００３１】
また、具体的には例えば、コムギ由来の変異型PPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えコムギ系統と、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えコムギ系統とを作出するために、前記の両DNA断片をそれぞれ独立して、宅見ら著、育種学会雑誌、1995年、第44巻、別冊1号、57頁に記載される方法に準じて、パーティクルガンを用いてコムギ未熟胚盤に導入する。次いで、作出された組換えコムギ系統を交配することにより交配系統を得る。尚、当該交配系統における本除草活性化合物に対する耐性を調べるために、後述の実施例９等に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）に準じて本除草活性化合物の散布試験における感受性に係るスコアリング評価を行えばよい。
【００３２】
本発明雑草防除方法においては、本発明植物を栽培する領域に、本除草活性化合物を施用する。尚、本除草活性化合物の施用量は、施用時期、雑草の種類、本除草活性化合物の種類等に応じて適宜決定すればよい。
本発明植物は、PPO活性を示すタンパク質と本除草活性化合物を代謝する活性を示すチトクロムP450との両タンパク質を各々１種類のみを同時に発現していてもよいし、一方のタンパク質については１種類、他方のタンパク質については複数種を同時に発現していてもよいし、両タンパク質とも複数種を同時に発現していてもよい。本発明植物においては、その体内で、本除草活性化合物が除草活性のより低い化合物へと速効的に代謝され、その結果として本除草活性化合物の施用において薬害をさらに軽減されることが可能となる。従って、本発明植物を栽培する領域又は培養する領域に本除草活性化合物を散布又は添加する場合にも本発明植物は良好に生育することができる。本発明植物を栽培してその栽培領域に本発明活性化合物を有効成分として含有する雑草防除剤を施用することにより、本発明植物以外の雑草等の植物を効率よく取り除くことができ、本発明植物の収量の向上、高品質化、使用する雑草防除剤の量の軽減、省力化等が可能となる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  （配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコの作出）
プラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soy（図１参照）又はプラスミドpBI-NdG6-rSt-1584（図２参照）は、CR16G6 プロモーター（例えば、WO00020613等記載参照）支配下に、ダイズ（cv. Jack）のRuBPCO小サブユニットの葉緑体移行シグナルペプチド配列と、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列とからなるキメラタンパク質を発現する、WO0304370に記載されるバイナリーベクタープラスミドである。
これらのプラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soyとプラスミドpBI-NdG6-rSt-1584soyとをそれぞれAgrobacterium tumefaciens LBA4404 株（クロンテック 社製）に導入し、300 mg/L ストレプトマイシン、100 mg/L リファンピシン及び25 mg/L カナマイシンを含むLB寒天培地（0.5% Yeast extract、1.0% Bacto tryptone、0.5% NaCl）で培養して薬剤耐性コロニーを選抜することによって、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soy及びプラスミドpBI-NdG6- rSt-1584soyを有する組換えアグロバクテリウム株をそれぞれ単離した。
次いで、植物遺伝子操作マニュアル（内宮博文著、講談社サイエンティフィック、1992年）に記載されている方法に準じて、タバコへの遺伝子導入を行った。上記のプラスミドを有する組換えアグロバクテリウム株を、300 mg/L ストレプトマイシン、100 mg/L リファンピシン及び25 mg/L カナマイシンを含む LB 液体培地中で28℃にて終夜培養し得られた培養液に、無菌培養したタバコ（Nicotiana tabacum strain SR-1）より採取された葉片を浸漬した。当該タバコ葉片を、0.1 mg/L ナフタレン酢酸及び 1.0 mg/L ベンジルアミノプリンが添加された MS 寒天培地（MS 無機塩類、MS ビタミン類、3% ショ糖、0.8% 寒天;  Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant. (1962) 15, p473）に植え込み、明所・室温で 2日間培養した。次に、当該タバコ葉片を滅菌水で洗浄した後、0.1mg/L ナフタレン酢酸、1.0 mg/L ベンジルアミノプリン及び500 mg/L セフォタキシムが添加された MS 寒天培地上で 7日間培養した。次いで、当該タバコ葉片を 0.1 mg/L ナフタレン酢酸、1.0 mg/L ベンジルアミノプリン、500 mg/L セフォタキシム及び100 mg/L カナマイシンが添加された MS 寒天培地に移植し培養した。当該培養は、前記タバコ葉片を２週間毎に同一組成の新鮮な培地に移植しながら継続的に２ヶ月間実施した。この間に、当該タバコの葉片から出現した不定芽を、100 mg/L カナマイシンが添加されたMS寒天培地に移植して発根させ、再生個体を得た。その後、得られた再生個体を培養ポット（住友ベークライト社製）に分注された100 mg/L カナマイシンが添加された MS 寒天培地に移植して培養することにより、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soy及びプラスミドpBI-NdG6-rSt-1584soyのT-DNA領域が組み込まれた組換えタバコ個体をそれぞれ取得した。取得された個体を、培養ポットからクレハ培土（クレハ化学製）が入れられた栽培ポットに移植し、人工気象機内で外部環境に馴化した後、温室で栽培した。他の個体との交雑を避けるため開花時に花に袋かけを行い、種子の採取を行った。
【００３５】
実施例２  （配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が蓄積される組換えタバコ個体の選抜）
実施例１で作出された組換えタバコ個体からウエスタンブロッティング法を用いて、配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が葉片の中に蓄積されている組換えタバコ個体を選抜した。まず、検定する組換えタバコの葉片を1 cm角程度サンプリングし、2 mLのサンプリングチューブに入れた後、これに5 mmφのジルコニアビーズ（YTZボール、ニッカトー社製）を１個入れ蓋をした後、液体窒素で急速冷凍した。これを、試料破砕装置MM300（キアゲン社製）を用いて、15秒間、30回／秒の速度で２回振とうすることにより、試料を破砕した。これに、サンプル緩衝液（1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド含有PBS緩衝液（137 mM 塩化ナトリウム、8.1 mM リン酸水素２ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1.47 mM リン酸２水素カリウム））を0.1 mL 加えて振とうすることにより、タンパク質を抽出した。この溶液の一部をサンプリングし、当該溶液中のタンパク質濃度をバイオラッドプロテインアッセイキット（バイオ・ラッド社製）を用いて、キット添付のプロトコールに従い595nmの吸光度を測定することにより、牛血清アルブンミンをスタンダードとして測定した。このようにして、組換えタバコ個体から調製されたタンパク質溶液に、等量の2xSDSサンプルバッファー（ナカライテスク社製）を混合し、100℃で3分間加熱した後、当該混合物を氷冷した。これを１ウエル当り10 μgになるように、SDS-PAGEゲル（PAGミニ「第一」（第一化学薬品社製））のウエルに添加した。SDS-PAGE電気泳動緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン15 g、グリシン72 g、SDS 5g/L）中でゲル１枚当り40 mAで1時間電気泳動した。このゲルから電気泳動後のタンパク質を、セミドライブロッティング装置であるトランスブロットSDセル（バイオ・ラッド社製）を使用して、装置添付の取扱説明書の方法に従い、BjerrumとSchafer-Nielsenの転写バッファー（48 mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、39 mMグリシン、20％メタノール）を用いてPVDFメンブレン（ミリポア社製イモビロンP）に30分間、10ボルトで転写した。このメンブレンをイミュンブロットキット（バイオ・ラッド社製）を用いて抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ標識抗体を用いてNBT/BCIP発色系で組換えタバコ個体（の葉片）から調製されたタンパク質のバンドを検出した。まず3％ゼラチン含有TBS緩衝液（20 mMTris-HCl（pH7.5）、0.5 M塩化ナトリウム）中、30分間、室温でゆるやかに振とうしブロッキングを行った。その後、メンブレンをTBS緩衝液で5分間洗浄した後、一次抗体反応用抗血清を0.05％Tween20を含有するTBS緩衝液で3,000倍希釈した溶液中で、1時間時間、室温でゆるやかに振とうすることにより、一次抗体反応を行った。ウエスタンブロッティングに用いた一次抗体反応用の抗血清は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原としてウサギに免疫して作製された、WO03040370に記載されたウサギ抗血清を使用した。次に、0.05％Tween20を含有するTBS緩衝液でメンブレンを5分間、２回洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体（バイオ・ラッド社製）を0.05％Tween20を含有するTBS緩衝液で3,000倍希釈した溶液中で、1時間、室温でゆるやかに振とうすることにより、二次抗体反応を行った。その後、メンブレンを0.05％Tween20含有TBS緩衝液で5分間、2回洗浄した後、AP発色キット（バイオ・ラッド社製）を用いて発色反応を行った。発色後のメンブレンは乾燥後に保管された。上記のウエスタンブロッティング法により、組換えタバコの個体の葉片の中に配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを有するDNA断片がが導入された組換えタバコ個体を検定した。
その結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片を含有するプラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soyが導入された組換えタバコ個体40株のうち、26株で相対的に高い量の分子量44 kDaのタンパク質が検出された。一方、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片を含有するプラスミドpBI-NdG6-rSt-1584soyが導入された組換えタバコ個体20株のうち、６株で相対的に高い量の分子量44 kDaのタンパク質が検出された。
次いで、これらの組換えタバコ個体から種子を採取し、次の導入遺伝子のコピー数の検定に供試した。
【００３６】
実施例３  （配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAが導入された組換えタバコ個体のうち、遺伝子１コピー導入系統の選抜）
アグロバクテリウムによるバイナリーベクターを用いた植物への遺伝子導入ではカナマイシン耐性遺伝子にタンデムに接続された遺伝子が連鎖すると考えられる原理を用いて、実施例２で選抜された組換えタバコ個体から導入遺伝子が相同染色体の一方に1コピー存在する系統を選抜した。
実施例２で選抜されたT0世代の組換えタバコ個体から種子を採取し、5倍希釈された次亜塩素酸ナトリウム溶液（ナカライテスク社製）に15分間浸漬して殺菌した。殺菌処理された約50粒の種子を、100 mg/L カナマイシンが添加された MS 寒天培地に無菌播種した後、明所で25℃で培養して無菌的に発芽させた。その約２週間後に生じた芽を観察し、χ２乗検定により 5% の有意水準で 3:1 の分離比を示すと判断される系統を選抜した。
その結果、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soyが導入された組換えタバコ個体の中で、実施例２で選抜された26系統のうち、9系統は導入遺伝子が相同染色体の一方に1コピー存在する系統であると判定された。一方、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1584soyが導入された組換えタバコ個体の中で実施例２で選抜された6系統のうち、2系統は導入遺伝子が相同染色体の一方に1コピー存在する系統であると判定された。
次いで、これらの系統のT1世代の個体を、クレハ培土（クレハ化学製）が入れられた栽培ポットに移植し、人工気象機内で外部環境に馴化した後、温室で栽培した。そして他の個体との交雑を避けるため開花時に花に袋かけを行い、種子の採取を行った。
【００３７】
実施例４  （配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統のホモ接合体の選抜）
実施例３において選抜された配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAが導入された組換えタバコ系統であるプラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soy導入組換えタバコ系統のうち、実施例３において選抜されかつ正常に生育する系統である#17系統、#19系統、#22系統、#23系統、#25系統、#29系統、#30系統、#34系統、#40系統の9系統と、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1584soy導入組換えタバコ系統のうち、実施例３において選抜された#5系統及び#16系統の2系統との全11系統の種子を採取した。プラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soy導入組換えタバコ系統の#17系統及び#25系統の2系統と、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1584soy導入組換えタバコ系統の#16系統の1系統との全３系統それぞれ4個体の種子を、実施例３に記載された同様な方法によって、100 mg/Lカナマイシン添加 MS 寒天培地に無菌播種し、全てがカナマイシン耐性を示すものをホモ接合体として選抜した。
【００３８】
実施例５  （ダイズ変異型プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統の作出）
ダイズ（Glycine max cv. Williams82）由来のPPO遺伝子の塩基配列の677番目のシトシンがチミンに変換されることにより、226番目アミノ酸残基であるアラニンがバリンに変換されてなる、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するダイズ由来の変異型PPO遺伝子のDNA断片を植物細胞で機能するプロモーター及びターミネーターと連結して植物内で当該DNA断片が発現する発現プラスミドを構築した。
特開平11-18775号公報に記載されたプラスミドを、制限酵素Sac I 切断部位とSal I切断部位とで消化することにより、ダイズ由来のPPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有しかつ制限酵素Sac I切断部位とSal I切断部位との間のDNA断片を切り出した。得られたDNA断片をプラスミドpKF18k-2（タカラバイオ社製）のマルチクローニングサイトの制限酵素Sac I 切断部位とSal I切断部位との間にライゲーションして挿入することにより、ダイズ由来のPPOのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片をサブクローニングした。
このようにしてサブクローニングされたプラスミド中の当該DNA断片を、Mutan-Express Km Kit（タカラバイオ社製）を使用し、キット付属のプロトコールに従ってOligonucleotide-directed Dual Amber法により、ダイズ由来のPPO遺伝子の塩基配列の677番目のシトシンがチミンに変換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列である、配列番号４で示される塩基配列を有するDNA断片をマルチクローニングサイトの制限酵素Sac I 切断部位とSal I切断部位との間に含むプラスミドpKFGMP03を構築した（図３参照）。
WO03040370（実施例１６）に記載されたプラスミドpNdG6-ΔTを制限酵素BglIIとSacIとで消化した後、Bgl II切断部位とSac I切断部位との間に、制限酵素Sac I切断部位とSal I切断部位とを含む合成オリゴヌクレオチドのアダプターを挿入することにより、CR16G6プロモーター下流に制限酵素Sac I切断部位とSal I切断部位とを含み、当該部位に挿入されたDNA断片を植物で発現させる発現ユニットを構築できるプラスミドpNdG6-#89を構築した。プラスミドpNdG6-#89が挿入された合成オリゴヌクレオチドのアダプターは、5’− GATCTGAGCTCCATGGATCCGTCGACAGCT −3’と5’− GTCGACGGATCCATGGAGCTCA −3’との塩基配列を有する2種類の合成オリゴヌクレオチドの100μM/Lの溶液を等量混合し、65℃、10分加熱後に室温で放冷して作製した。次に、前記のプラスミドpKFGMP03を制限酵素Sac I 切断部位とSal Iとで消化することにより、ダイズ由来の226番目のアラニンがバリンに変換されたダイズ由来のPPO（以下、sPPOavと記すこともある。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有しかつ制限酵素Sac I切断部位とSal I切断部位との間に存在する配列番号４で示された塩基配列を有するDNA断片を切り出した。次いで、当該DNA断片を前記のプラスミドpNdG6-#89の制限酵素Sac I切断部位とSal I切断部位との間にライゲーションして挿入することにより、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片をCR16G6プロモーター下流に接続した。このようにして、当該DNA断片を発現する発現ユニットを含むプラスミドpSUM-NdG6-sPPOavを構築した（図４参照）。
まず、バイナリーベクタープラスミドpBI121（CLONTECH社製）を制限酵素Not Iで消化した後、TaKaRa BKL Kit（タカラバイオ社製）を用いてキット付属のプロトコールに従って制限酵素切断部位の１本鎖DNAの部分の相補鎖に塩基を付加することにより、DNA末端を平滑化した。その後、これを自己環化させた。
次いで、これを制限酵素Hind IIIと制限酵素Eco RIとで消化して得られた消化物の制限酵素Hind III切断部位と制限酵素Eco RI切断部位とに、WO03040370（実施例１６）に記載されるプラスミドpNdG6-ΔTを制限酵素Hind IIIと制限酵素Eco RIとで消化することにより制限酵素Hind III切断部位と制限酵素Eco RI切断部位とで切り出されたDNA断片を挿入することにより、プラスミドpBI-NdG6を構築した。
構築されたプラスミドpBI-NdG6のNot I切断部位に、前記のプラスミドpSUM-NdG6-sPPOavが制限酵素Not Iで消化されたDNA断片をライゲーションして挿入することにより、プラスミドpBI-NdG6-sPPOav（図５参照）を構築した。
プラスミドpBI-NdG6-sPPOavが有する塩基配列を確認した結果、配列番号５に示される塩基配列を当該プラスミドの制限酵素HindIII切断部位とEcoRI切断部位との間に含んでいることを確認した。
【００３９】
次に、カリフラワー・モザイク・ウイルス由来の35Sプロモーター制御下で導入遺伝子が植物細胞中で発現する発現ユニットを含むプラスミドpBI121（クロンテック社製）を制限酵素Bgl IIと制限酵素Sac Iとで消化した。当該消化物のBgl II切断部位とSacI切断部位との間に、制限酵素Sac I 切断部位とSal I切断部位とを含む合成オリゴヌクレオチドのアダプターを挿入することにより、35Sプロモーター下流に制限酵素Sac I 切断部位とSal I切断部位とを含みかつ当該部位に挿入されたDNA断片が植物で発現する発現ユニットを構築できるプラスミドpBI121#89を構築した。プラスミドpBI121に挿入された上記合成オリゴヌクレオチドのアダプターは、5’− GATCTGAGCTCCATGGATCCGTCGACAGCT −3’と5’− GTCGACGGATCCATGGAGCTCA −3’との塩基配列を有する2種類の合成オリゴヌクレオチドの100μモル/Lの溶液を等量混合し、65℃、10分間加熱後に室温で放冷して作製した。
次に、前記のプラスミドpKFGMP03を制限酵素Sac I切断部位とSal Iとで消化することにより、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有しかつ制限酵素Sac I切断部位とSal I切断部位との間のDNA断片を切り出した。当該DNA断片を前記のプラスミドpBI121#89の制限酵素Sac I切断部位とSal I切断部位との間にライゲーションして挿入することにより、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片を35Sプロモーター下流に接続し、当該DNA断片を発現する発現ユニットを含むプラスミドpBI-35S-sPPOavを構築した（図６参照）。
プラスミドpBI-35S-sPPOavが有する塩基配列を確認した結果、配列番号６に示される塩基配列を当該プラスミドの制限酵素HindIII切断部位とEcoRI切断部位との間に含んでいることを確認した。
このようにして構築されたプラスミドpBI-NdG6-sPPOav及びプラスミドpBI-35S-sPPOavを、それぞれ独立して、実施例１に記載された方法により、Agrobacterium tumefaciens LBA4404 株（クロンテック 社製）に導入することにより、組換えタバコ個体を作出した。次いで、作出された組換えタバコ個体から種子の採取を行った。
【００４０】
実施例６  （ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ個体のうち、遺伝子１コピー導入系統の選抜）
実施例５で作出された組換えタバコ個体に由来する系統から、実施例３に記載された帆法と同様な操作により、導入遺伝子が相同染色体の一方に1コピー存在する系統を選抜した。その結果、プラスミドpBI-NdG6-sPPOavが導入された組換えタバコ個体の中で、27系統のうち17系統は導入遺伝子が相同染色体の一方に1コピー存在する系統であると判定された。一方、プラスミドpBI-35S-sPPOavが導入された組換えタバコ個体の中で、実施例５で作出された4系統のうち3系統は導入遺伝子が相同染色体の一方に1コピー存在する系統であると判定された。
次いで、これらの系統のT1世代の個体をクレハ培土（クレハ化学製）が入れられた栽培ポットに移植し、人工気象機内で外部環境に馴化した後、温室で栽培した。そして他の個体との交雑を避けるため開花時に花に袋かけを行った。このようにして、実施例４に記載された方法と同様な操作により、ホモ接合体を選抜した。
【００４１】
実施例７  （ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコの解析）
実施例６で選抜されたホモ接合体のうち、プラスミドpBI-NdG6-sPPOav導入組換えタバコ系統のP023系統及びプラスミドpBI-35S-sPPOav導入組換えタバコ系統の35S-2系統について、ウエスタンブロッティング法を用いて実施例２に記載された方法と同様な操作により、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）の検定を行った。尚、ウエスタンブロッティングに用いられた一次抗体反応用の抗血清としては、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）の部分ペプチドをマウス由来のデヒロドロ葉酸還元酵素遺伝子（キアゲン社製プラスミドpQE-40）の下流に融合して作製したタンパク質を抗原としてラットに免疫して作製されたラット抗ダイズPPO抗血清（旭テクノグラス社製）を使用した。
当該ウエスタンブロッティング法により、プラスミドpBI-NdG6-sPPOav導入組換えタバコ系統のP023系統及びプラスミドpBI-35S-sPPOav導入組換えタバコ系統の35S-2系統の組換えタバコの葉片の中に、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）の分子量に相当するバンドが検出されることを確認した。
【００４２】
実施例８  （ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコと、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統との交配）
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統のうち、実施例４で選抜されたホモ接合体の系統である1609soy#25系統と、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統のうち、実施例６で選抜されたホモ接合体の系統であるプラスミドpBI-NdG6-sPPOav導入組換えタバコ系統であるP023系統又はプラスミドpBI-35S-sPPOav導入組換えタバコ系統である35S-2系統との交配を行った。併せて、1609soy#25系統、P023系統又は35S-2系統と、野生型タバコSR-1株との交配を行い、それぞれの導入遺伝子をヘテロに有する個体の作出を行った。
T1世代の組み換えタバコから採取された種子を、100 mg/L カナマイシンが添加された MS 寒天培地に、一方、野生型タバコの種子を、カナマイシン無添加の MS 寒天培地にそれぞれ独立して無菌播種した。次いで、発芽した個体をクレハ培土（クレハ化学製）が入れられた栽培ポットに移植し、人工気象機内で外部環境に馴化した後、人工気象機内で23℃で日長23時間で栽培した。
雌株として使用する系統のタバコの蕾の花弁を切除し開裂前の葯を取り除いて除雄を行い、この柱頭に雄株として使用する系統の開裂した葯を接触させた。各系統につき、雄株系統と雌株系統とを入れ替えた正逆交雑を行った。受粉後の花には袋かけを行い他の系統の花粉の受粉を防止した。交配後、約2ヶ月間人工気象機内で23℃で日長23時間で栽培し種子を採取した。同一の母株由来の同一の鞘から採取された種子を1系統として次世代の検討に用いた。作出された交配系統名、その雄株系統名及び雌株系統名を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2006000110.tif 000006
【００４４】
実施例９  （ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコと、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統との交配系統における本除草活性化合物の散布試験）
実施例８で交配して作出された組換えタバコ種子を系統毎に、100 mg/L カナマイシンが添加された MS 寒天培地に無菌播種した。その約２週間後に生じた芽を観察した。雌株として野生型SR-1系統を用いた交配タバコも全てカナマイシン耐性となり正常に生長した。
発芽した個体をクレハ培土（クレハ化学製）が入れられた栽培ポットに移植し、人工気象機内で外部環境に馴化させた後、約２週間人工気象機内で23℃で日長23時間で栽培した。このようにして得られた本発明植物を本除草活性化合物の散布試験に供試した。
本除草活性化合物である化合物 (II) を、Solvesso 200（Valent社製）とSorpol 3816（住友化学工業社製）とが87.5対10の割合で混合されてなるソルベッソカクテルに、当該ソルベッソカクテル0.5 mL中に本除草活性化合物である化合物 (II) がそれぞれ独立して0.22 mg、0.45 mg、0.89 mg、1.78 mg含まれるように溶解した。本除草活性化合物の散布液は、化合物 (II) が溶解されたソルベッソカクテルを2.5％、アジバンドとしてAgri dex（Valent社製）が１％の濃度で含まれる水溶液として調製した。
上記の本発明植物への当該散布液の散布は、走行型薬剤自動散布機（難波設計社製）を用いて、散布液20 mLを0.9平方メートルの散布範囲に置かれた組換えタバコ苗に均一に噴霧して行った。約2週間後に、供試された組換えタバコにおける本除草活性化合物である化合物 (II) に対する感受性を、野生型タバコであるSR-1系統における本除草活性化合物である化合物 (II) に対する感受性と比較した。尚、上記の散布試験には、本除草活性化合物である化合物 (II) の施用量毎に4個体の組換えタバコを用いた。当該組換えタバコの本除草活性化合物である化合物 (II) に対する感受性は、下記の指数に基づきスコアリングし、組換えタバコ１系統・施用量毎に4個体のスコアの平均値を算出することにより求めた。尚、陰性対照として野生型SR-1系統における同様な散布試験を行った。
その結果を表２に示す。
【００４５】
＜薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数＞
「０」：個体が枯死した場合
「１」：葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害が発生し、当該薬害が生育に対して大きな障害を与えているが、枯死していないもの
「２」：葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害は発生しているが、当該薬害が生育に対して大きな障害を与えておらず、枯死していないもの
「３」：葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害は軽微であるか、又は、殆ど見られないもの
【００４６】
【表２】
2006000110.tif 000007
【００４７】
さらにまた、野生型SR-1系統、比較例（6-S-1系統、S-P-1系統）及び本発明植物（6-P-1系統）の組換えタバコにおける本除草活性化合物である化合物 (II) （施用量1.78 mg/20 mL  散布液）の散布後に温室内で14日間栽培した各組換えタバコの写真を図７に示した。
【００４８】
実施例１０  （ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコと、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統との交配系統の発現解析）
本除草活性化合物である化合物 (II) の散布前に、6-S-1系統、S-6-1系統、P-S-1系統、S-P-1系統、P-6-1系統、6-P-1系統、3-P-1系統、P-3-1系統、3-S-1系統、S-3-1系統の組換えタバコについて、実施例２に記載される方法と同様な操作により、ウエスタンブロッティング法を用いて、チトクロムP450の発現（各組換えタバコの葉片からタンパク質を抽出し、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の蓄積有無を調べる）を検定した。
その結果を図８に示した。
【００４９】
実施例１１  （ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコと、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統との交配及び当該交配系統における本除草活性化合物の散布試験）
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統のうち、実施例４で選抜されたホモ接合体である1584soy#16系統と、ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統のうち、実施例６で選抜されたホモ接合体であるプラスミドpBI-NdG6-sPPOav導入組換えタバコ系統のP023系統又はプラスミドpBI-35S-sPPOav導入組換えタバコ系統の35S-2系統との交配を、実施例８に記載された方法と同様な操作により行った。
【００５０】
【表３】
2006000110.tif 000008
【００５１】
次いで、SR-1系統、5-S-1系統、S-P-1系統、5-P-1系統について、さらに実施例９に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）と同様な操作により、本除草活性化合物である化合物 (II) に対する感受性を調べた。
その結果、交配系統である5-P-1系統において、5-S-1系統又はS-P-1系統と比較して明らかな耐性の向上が認められた。
【００５２】
実施例１２  （ダイズ由来の変異型PPO（sPPOav）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコと、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA断片が導入された組換えタバコ系統との交配系統における本除草活性化合物の散布試験（その２））
実施例８で交配して作出されたSR-1系統、6-S-1系統、S-P-1系統、6-P-1系統の組換えタバコの種子を、実施例９に記載された方法と同様な操作により、ブタフェナシル、フルフェンピルエチル、化合物 (III)及びカルフェントラゾンエチルの散布試験に供試した。尚、各本除草活性化合物については、
（１）フルフェンピルエチル及び化合物 (III)の場合；
各本除草活性化合物がソルベッソカクテルに、それぞれ独立して、ソルベッソカクテル0.5 mL中に0.89 mg、1.78 mg含まれるように溶解し散布液を調製した。
（２）ブタフェナシルの場合；
当該本除草活性化合物がソルベッソカクテルに、ソルベッソカクテル0.5 mL中に8.9 mg、17.8 mg含まれるように溶解し散布液を調製した。
（３）カルフェントラゾンエチルの場合；
AIM TM水和剤（40%(w/w)含有FMC社製）の製剤品を、有効成分が0.89 mg、1.78 mg含まれるように、Agri dex（Valent社製）1%水溶液に溶解し散布液を調製した。
次いで、SR-1系統、6-S-1系統、S-P-1系統、6-P-1系統について、さらに実施例９に記載される方法（薬液散布によって生じた個体の枯死や、葉又は茎に褐変・白化の生じる薬害の程度に基づくスコアリング指数による評価）と同様な操作により、本除草活性化合物であるブタフェナシル、フルフェンピルエチル、化合物 (III)及びカルフェントラゾンエチルに対する感受性を調べた。
その結果、交配系統である6-P-1系統において、全ての本除草活性化合物に対して、6-S-1系統又はS-P-1系統と比較して明らかな耐性の向上が認められた。
【００５３】
実施例１３  （交配組換えタバコ系統染色体への遺伝子導入の確認）
以下に記載されるＰＣＲによる方法で、交配された組換え体系統の染色体に配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、及び、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ若しくは配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡが導入されていることを確認した。
野生型SR-1系統、組換えタバコ6-S-1系統、S-P-1系統、6-P-1系統、5-S-1系統および5-P-1系統の種子をカナマイシン無添加のMS寒天培地にそれぞれ無菌播種した。播種後11日目の芽生えをサンプリングした後、これに40マイクロリットルのPrepMan Ultra Reagent（Applied Biosystems社製）を加えた。得られた混合物を100℃で10分間加熱した後、放冷した。放冷された混合物を15,000 rpmで1分間遠心分離することにより上清を取得した。得られた上清をPCR反応の鋳型となる染色体ＤＮＡ溶液として以下の実験で用いた。当該染色体ＤＮＡ溶液1マイクロリットルを鋳型として使用しかつＤＮＡポリメラーゼEx-Taq-HS（タカラバイオ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全量20マイクロリットルの反応液を調製した。調製された反応液を94℃で2分間保温した後、94℃で30秒間、次いで58℃で30秒間、次いで72℃で1分間保温する一連の工程を1サイクルとして、これを30回繰り返し実施し、最後に72℃で2分間保温した。尚、プライマーとしては、下記の（１）から（３）の２種類の合成オリゴヌクレオチドを使用した。反応後の反応液10マイクロリットルを、1.5%アガロースを含むＴＢＥ緩衝液アガロースゲル中で電気泳動した後、当該アガロースゲルゲルをエチジウムブロミドで染色することにより、反応により増幅されて生じる下記のＤＮＡ断片を254 nmの紫外線照射下で検出した（図９参照）。その結果、図９からも明らかなように、ゲノムＤＮＡ中の導入遺伝子が確認された。
【００５４】
（１）配列番号1の場合：
配列番号７で示される塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドと、配列番号８で示される塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドとをプライマーとして使用した。反応により増幅されて生じる503 bpのＤＮＡ断片を検出することにより、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡが導入されていることを確認した。
【００５５】
（２）配列番号２の場合：
配列番号９で示される塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドと、配列番号１０で示される塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドとをプライマーとして使用した。反応により増幅されて生じる656 bpのＤＮＡ断片を検出することにより配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡが導入されていることを確認した。
【００５６】
（３）配列番号３の場合：
配列番号１１で示される塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドと、配列番号１２で示される塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドとをプライマーとして使用した。反応により増幅されて生じる686 bpのＤＮＡ断片を検出することにより配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡが導入されていることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、除草性作用機構が速効的である除草活性化合物の施用において薬害をさらに軽減することが可能となる植物及びその利用を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1609soyの制限酵素地図を示す図である。
【図２】図２は、プラスミドpBI-NdG6-rSt-1584soyの制限酵素地図を示す図である。
【図３】図３は、プラスミドpKFGMP03の制限酵素地図を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドpSUM-NdG6-sPPOavの制限酵素地図を示す図である。
【図５】図５は、プラスミドpBI-NdG6-sPPOavの制限酵素地図を示す図である。
【図６】図６は、プラスミドpBI-35S-sPPOavの制限酵素地図を示す図である。
【図７】図７は、野生型SR-1系統、比較例（6-S-1系統、S-P-1系統）及び本発明植物（6-P-1系統）の組換えタバコにおける本除草活性化合物である化合物 (II) （施用量1.78 mg/20 mL  散布液）の散布後に温室内で14日間栽培した各組換えタバコの写真を示す図である。
【図８】図８は、本除草活性化合物である化合物 (II) の散布前に、6-S-1系統、S-6-1系統、P-S-1系統、S-P-1系統、P-6-1系統、6-P-1系統、3-P-1系統、P-3-1系統、3-S-1系統、S-3-1系統の組換えタバコについて、実施例２に記載される方法と同様な操作により、ウエスタンブロッティング法を用いて、チトクロムP450の発現（各組換えタバコの葉片からタンパク質を抽出し、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の蓄積有無を調べる）を検定した結果を示す図である。図中のレーン下方の文字は、組換えタバコの系統を表す。また「Positive」は、上記のウエスタンブロッティング法において用いられた抗体の抗原であって、大腸菌内で発現させ作製されたタンパク質（配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）10 ngを電気泳動してウエスタンブロッティングされた結果を示している。
【図９】図９は、野生型SR-1系統と組換えタバコ6-S-1系統、S-P-1系統、6-P-1系統、5-S-1系統、および、5-P-1系統について、実施例１３に記載される方法と同様な操作により、ＰＣＲ法を用いて染色体ＤＮＡ溶液から導入遺伝子ＤＮＡ断片を増幅した反応液10マイクロリットルを1.5%アガロースを含むＴＢＥ緩衝液アガロースゲル中で電気泳動後に、該アガロースゲルをエチジウムブロミドで染色し、254 nmの紫外線照射下で写真撮影しＤＮＡ断片を検出した結果を示す図である。「Marker」は、λ/HindIIIマーカー（タカラバイオ社製）を0.5マイクログラム電気泳動したものである。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列番号１
放線菌チトクロムP450のアミノ酸配列
配列番号２
放線菌チトクロムP450のアミノ酸配列
配列番号３
ダイズ変異型プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼのアミノ酸配列
配列番号４
プラスミドpKFGMP03の塩基配列
配列番号５
プラスミドpBI-NdG6-sPPOavの塩基配列
配列番号６
プラスミドpBI-35S-sPPOavの塩基配列
配列番号７
配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを増幅するためのプライマーとしての合成オリゴヌクレオチド
配列番号８
配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを増幅するためのプライマーとしての合成オリゴヌクレオチド
配列番号９
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを増幅するためのプライマーとしての合成オリゴヌクレオチド
配列番号１０
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを増幅するためのプライマーとしての合成オリゴヌクレオチド
配列番号１１
配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを増幅するためのプライマーとしての合成オリゴヌクレオチド
配列番号１２
配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡを増幅するためのプライマーとしての合成オリゴヌクレオチド
【図１】
2006000110.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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