(57)【要約】【課題】  ケラチンの持つ優れた生体吸収性および生体適合性を有しつつ、多数の細胞の取込みを可能にし、取込んだ細胞に対して、細胞が増殖するのに十分な量の酸素、栄養分などを供給し、かつ３次元的な細胞増殖または組織構築に十分な場を提供し得る、多孔性材料を提供すること。【解決手段】  孔径５００〜２０００μｍの孔を有する、ケラチンにより構成される多孔性材料。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
孔径５００〜２０００μｍの孔を有する、ケラチンにより構成される多孔性材料。
【請求項２】
細胞培養に用いられる、請求項１に記載の多孔性材料。
【請求項３】
組織再生または細胞移植に用いられる、請求項１に記載の多孔性材料。
【請求項４】
細胞をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多孔性材料。
【請求項５】
ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体を形成した後、該複合体のアルギン酸カルシウムビーズ部分を溶解する工程を包含する、孔径５００〜２０００μｍの孔を有する、ケラチンにより構成される多孔性材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチンにより構成される多孔性材料（ケラチン多孔体）に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞から比較的大きな組織または臓器を生体内で再生あるいは生体外で再構築する際、皮膚や関節軟骨のように組織が薄くて二次元的な場合には、再生中の細胞に十分な量の酸素と栄養分を供給するのは容易であるが、多くの組織は三次元的な厚みもあるため、栄養分の供給には工夫を要する。再生組織のサイズが大きくなると、多数の細胞を足場全体に均一に分布させるのさえ容易ではない。例えば、足場材料の細胞分散液への濡れが低ければ、分散液を足場の内部にまで十分に浸透させる手段を考えなければならない。足場材料に細胞が接着し、かつ多くの細胞が入り込める事も必要である。このことから、現在、様々な方法で理想的な足場作製の研究がなされている。
【０００３】
吸収性合成材料の中で、足場材料として最もよく使用されているのは、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびそれらの共重合体である。これらが頻繁に使用される理由は、分解生成物であるグリコール酸と乳酸が、生体内の代謝産物として存在するために、安全性の面において問題がないこと、および、人工物であるので、強度や分解性を、分子量や組成を変えることによってコントロールできるためである。これらの材料は、実際に、吸収性縫合糸や吸収性骨接合材などの医療用具として長く利用されている。
【０００４】
天然高分子の中で、足場材料として広く用いられているのは、細胞との接着性のよいタンパク質であるコラーゲンである。コラーゲンには、約１５の型があるが、その中でも、最も容易に入手できる事からＩ型コラーゲンが頻繁に利用されている。通常、抗原性を低下させたアテロコラーゲンが用いられる。コラーゲンの生体内における吸収期間は、架橋の程度にもよるが、通常、１〜３週間である。またコラーゲンは、主にスポンジ状の形態で用いられる事が多い。
他のタンパク質としては、コラーゲンの変性体であるゼラチンや、フィブリノーゲンの重合体であるフィブリンなどが使用されている。また、甲殻類から抽出される多糖類であるキチン・キトサンも、足場として多く使用されている。さらに、哺乳類の結合組織に広く分布しているヒアルロン酸も、ゲル状の足場として用いられている。
このように、足場材料として用いるためには、毒性がなく、生体吸収性を有するのはもちろんの事であるが、それ以外に、手軽に入手でき、扱いやすいという事も重要な条件になっている。
【０００５】
ケラチンは、爪、体毛、羽毛、皮膚の角質層などの体の外皮を構成する繊維状タンパク質であり、システイン残基を豊富に含み、それ故、多くのジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を有することが知られている。ケラチンは、細胞増殖のための足場材料に不可欠な、生体吸収性および生体適合性に優れ、さらには、炎症惹起性も低いことが報告されている（非特許文献１）。また、ケラチンは、天然に豊富に存在するタンパク質であるため、その有効利用が求められている。
しかし、ケラチンは、取扱いが難しいなどの理由から、現在のところ、細胞増殖のための足場材料として頻繁には利用されていない。例えば、ケラチンを圧縮成型することによってフィルムを作製する場合は、ケラチンのみで作製するとフィルムが脆くなるため、ケラチンに賦形剤などを混合して、フィルムに強度および柔軟性を付与しなければその利用は難しい。また、ケラチンのみを凍結乾燥することによりスポンジを作製した場合、スポンジ全体に孔径約１００μｍ以下の孔が形成されるが、このスポンジを３次元的な細胞培養に用いたときに、この孔径では、細胞懸濁液、酸素、栄養分などをスポンジの内部にまで十分に供給できないという問題がある。細胞が増殖するのに十分な量の酸素、栄養分などをスポンジ内部へ供給することは、ケラチンスポンジのみならず、スポンジ状の足場材料における課題の一つである。
【非特許文献１】Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，３１，４３９（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ケラチンの持つ優れた生体吸収性および生体適合性を有しつつ、多数の細胞の取込みを可能にし、取込んだ細胞に対して、細胞が増殖するのに十分な量の酸素、栄養分などを供給し、かつ３次元的な細胞増殖または組織構築に十分な場を提供し得る、多孔性材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、ケラチンスポンジの作製において、アルギン酸カルシウムビーズを用いることによって、ケラチンスポンジの孔の孔径を調節することを着想し、さらに検討を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］  孔径５００〜２０００μｍの孔を有する、ケラチンにより構成される多孔性材料。
［２］  細胞培養に用いられる、［１］に記載の多孔性材料。
［３］  組織再生または細胞移植に用いられる、［１］に記載の多孔性材料。
［４］  細胞をさらに含む、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の多孔性材料。
［５］  ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体を形成した後、該複合体のアルギン酸カルシウムビーズ部分を溶解する工程を包含する、孔径５００〜２０００μｍの孔を有する、ケラチンにより構成される多孔性材料の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、ケラチンの優れた生体吸収性および生体適合性を有しつつ、多数の細胞の取込みを可能にし、取込んだ細胞に対して、細胞が増殖するのに十分な量の酸素、栄養分などを供給し、かつ３次元的な細胞増殖または組織構築に十分な場を提供し得る、多孔性材料が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
本発明に用いられるケラチンとしては、例えば、天然物（例えば、体毛（例えば、羊毛）、羽毛、爪、皮膚の角質層などの体の外皮を構成する繊維状タンパク質など）に由来するケラチン、合成ケラチンなどが挙げられる。ケラチンが天然物由来である場合、当該分野で公知の方法を用いて、天然物からケラチンを抽出し、本発明に用いることができる。
【００１１】
本発明の多孔性材料は、スポンジ状であり、その全体にわたって均一に分布した孔を有する。本発明の多孔性材料の密度、空隙率、水分吸収率、孔の大きさなどは、３次元的な細胞培養および／または組織再生などにおいて、細胞増殖および／または組織構築に十分な数の細胞の取込みを可能にし、取込んだ細胞に対して、細胞が増殖するのに十分な量の酸素、栄養分などを供給し、かつ細胞が増殖するのに十分な空間を提供し得る値である限り制限はないが、例えば、密度としては、好ましくは、０．０５ｇ／ｃｍ３以下（例えば、０．０１〜０．０５ｇ／ｃｍ３）が挙げられ、空隙率としては、好ましくは、少なくとも９５％以上（例えば、９５〜９９．９％）が挙げられ、水分吸収率としては、好ましくは、少なくとも１０００％以上（例えば、１０００〜５０００％）が挙げられ、孔の孔径としては、好ましくは、少なくとも約５００μｍ以上（例えば、約５００μｍ〜約１０００μｍ、約５００μｍ〜約１５００μｍ、約５００μｍ〜約２０００μｍ）が挙げられる。
【００１２】
ここで、密度とは、スポンジの乾燥重量をスポンジの体積で除算することにより算出される見かけの密度のことをいう。
また、空隙率は、ケラチンを完全に密になるまで圧縮成型して空隙率を０としたケラチンプレートから以下の式：
空隙率（％）＝（ρ（プレート）−ρ（スポンジ））／ρ（プレート）×１００
ρ（プレート）：ケラチンプレートの見かけの密度
ρ（スポンジ）：空隙率を算出するスポンジの見かけの密度
により算出され、水分吸収率は、以下の式：
水分吸収率（％）＝（Ｗｗ−Ｗｄ）／Ｗｄ×１００
Ｗｄ：乾燥重量
Ｗｗ：湿重量
により算出される。
【００１３】
本発明の多孔性材料は、上記に例示した孔径範囲内で種々の大きさの孔を含んでいてもよく、その孔径分布は特に限定されない。
【００１４】
本発明の多孔性材料は、初めに、ケラチン水溶液に非水溶性のアルギン酸カルシウムビーズを加え、凍結乾燥することによって、非水溶性のケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体を形成させ、次いで、この複合体をＥＤＴＡ溶液で処理することにより、複合体中のアルギン酸カルシウムビーズ部分のみを溶解することで製造できる。
【００１５】
ＥＤＴＡは、アルギン酸カルシウムビーズのカルシウムイオンを補足し、その結果、ビーズの溶出を促進する。他方、アルギン酸カルシウムビーズは、ＥＤＴＡ中に浸すと徐々に膨潤し、そして複合体自体も全体が大きく膨潤する。
【００１６】
従って、本発明の多孔性材料は、ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体の状態では、最終的に得られるスポンジ状の多孔性材料よりも緻密な構造をしている。このため、本発明の多孔性材料は、ＮａＣｌ粒子との複合体を形成することにより製造される従来のＰＬＧＡスポンジと比較すると、同じサイズのスポンジを作製する場合に、より小さなサイズの複合体が得られるので、凍結乾燥の際の効率がよいなどの利点がある。
【００１７】
本発明の多孔性材料の孔径は、使用するアルギン酸カルシウムビーズの粒径によって調節することができる。ここで、使用するアルギン酸カルシウムビーズの粒径は、ＥＤＴＡによる溶出の際に生じるビーズの膨潤を考慮して選択される。
例えば、孔径が約５００〜約１０００μｍの孔を有する多孔性材料を製造する場合、アルギン酸カルシウムビーズの粒径としては、約３００〜約６００μｍが選択される。孔径が約５００〜約１５００μｍの孔を有する多孔性材料を製造する場合、アルギン酸カルシウムビーズの粒径としては、約３００〜約７５０μｍが選択される。孔径が約５００〜約２０００μｍの孔を有する多孔性材料を製造する場合、アルギン酸カルシウムビーズの粒径としては、約３００〜約９００μｍが選択される。
【００１８】
アルギン酸カルシウムビーズは、通常、室温以上（例えば、５〜４０℃）で、アルギン酸ナトリウム溶液を、塩化カルシウム溶液中に滴下することで作製することができる。
【００１９】
アルギン酸カルシウムビーズの作製に用いられるアルギン酸ナトリウム溶液の濃度は、通常、０．１〜５ｗ/ｖ％、好ましくは、０．５〜２ｗ/ｖ％であり、濃度が５ｗ/ｖ％を超えると、粘性が高くなりすぎて操作が困難となる。
【００２０】
アルギン酸カルシウムビーズの作製に用いられる塩化カルシウム溶液の濃度は、通常、１〜１０ｗ/ｖ％、好ましくは、３〜７ｗ/ｖ％である。
【００２１】
別の実施形態では、このようにして得られたアルギン酸カルシウムビーズの表面を、さらに、塩化カルシウム溶液でコーティングしたビーズを用いてもよい。
【００２２】
このコーティングに用いられる塩化カルシウム溶液の濃度は、通常、１〜１０ｗ/ｖ％、好ましくは、３〜７ｗ/ｖ％であり、塩化カルシウム溶液の使用量は、通常、ビーズが浸る量であれば制限はないが、例えば、アルギン酸カルシウムビーズ１ｇに対して、１〜１０ｍｌである。
【００２３】
コーティング処理の温度および時間は、通常、５〜３０℃にて１〜５分間である。
【００２４】
ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体は、水性溶媒にケラチンを溶解または懸濁させ、非水溶性のアルギン酸カルシウムビーズを加えた後、凍結乾燥によって溶媒を除去することで形成することができる。
【００２５】
ケラチンを溶解または懸濁させる溶媒は、通常、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはカルシウム捕捉効果のない緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液など）などから選択される。
【００２６】
複合体の形成におけるアルギン酸カルシウムビーズの使用量は、使用するアルギン酸カルシウムビーズの大きさに従って、アルギン酸カルシウムビーズがケラチン溶液を満たすように適宜選択されるが、通常、ケラチン１ｇに対して、５〜１０ｇである。
【００２７】
アルギン酸カルシウムビーズをケラチン溶液に加える際の温度は、使用する溶媒に応じて、例えば、４〜５０℃（通常、室温）の範囲から適宜選択される。
【００２８】
アルギン酸カルシウムビーズを加えたケラチン溶液を、凍結（例えば、−８０℃）させた後、凍結乾燥することで、ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体が形成される。
【００２９】
次いで、得られたケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体は、アルギン酸カルシウムビーズ部分のみを溶解させるために、ＥＤＴＡ溶液で処理される。
【００３０】
このＥＤＴＡ溶液は、通常、ＥＤＴＡを水に加え、ＮａＯＨによりｐＨ７．０〜９．０に調整することにより調製される。
【００３１】
この溶液中のＥＤＴＡの濃度は、アルギン酸カルシウムビーズ部分を溶出できれば特に制限はないが、通常、０．１〜１Ｍ、好ましくは、０．３〜０．７Ｍである。
【００３２】
このＥＤＴＡ溶液の使用量は、アルギン酸カルシウムビーズ部分を溶出できれば特に制限はないが、通常、複合体１ｇに対して約５０〜５００ｍｌである。
【００３３】
アルギン酸カルシウムビーズの溶出処理の温度は、通常、約１０〜８０℃の範囲から選択される。
【００３４】
アルギン酸カルシウムビーズの溶出処理の時間は、通常、１２〜４８時間の範囲から選択される。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明の多孔性材料の製造において、アルギン酸カルシウムビーズの代わりに、有機溶媒可溶性ポリマービーズのような、ケラチンとは異なる溶解特性を有する粒状物質が用いられ得る。このような粒状物質を用いる場合、粒径、溶出条件などは、使用する粒状物質の性質に応じて適宜選択され得る。
【００３６】
本発明の多孔性材料は、３次元的な細胞培養において細胞が増殖するための足場として利用できる。
【００３７】
本発明の多孔性材料を用いて培養を行う細胞の種類は、特に制限はなく、所望の任意の細胞が選択される。例えば、このような細胞としては、皮膚細胞、神経細胞、血管細胞、血液細胞、内臓細胞（例えば、膵島細胞、肝細胞など）、腺細胞、筋細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、生殖細胞、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、体性幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞など）、免疫細胞など、またはこれらの前駆細胞、あるいはこれらの細胞を遺伝子工学的手法により改変した遺伝子改変細胞などが挙げられる。また、これらの細胞は、初代培養細胞であっても、株化細胞であってもよい。
【００３８】
本発明の多孔性材料を用いて３次元的な細胞培養行う場合の培養条件としては、通常の細胞培養に用いられる条件を用いることができる。
【００３９】
例えば、培養培地としては、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地などから、用いる細胞の種類に応じて任意の培地が適宜選択され得る。
【００４０】
培地のｐＨは、用いる細胞の種類に応じて適宜選択されるが、好ましくは約６〜８である。必要に応じて、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））、栄養素、成長因子、酵素、抗生物質などが培地に加えられ得る。
【００４１】
培養は、通常、約２５℃〜４０℃（動物細胞の場合は、通常、３７℃）で、２４時間以上（通常、２４時間〜８週間）行なわれる。
【００４２】
播種する細胞の量は、培養する細胞の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、本発明の多孔性材料１ｃｍ３あたり、約１０×１０４〜約２００×１０４cellsである。
【００４３】
本発明の多孔性材料はまた、ヒトまたは非ヒト哺乳動物などの動物における組織再生または細胞移植おいて、細胞が増殖するための足場としても利用できる。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、非ヒト哺乳動物とは、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ハムスターなどのことを意味する。
【００４５】
本発明の多孔性材料を用いて組織再生を行う場合、対象となる組織としては、例えば、皮膚、血管、骨、軟骨、筋肉、歯、内臓（例えば、肝臓、膵臓など）などが挙げられる。
【００４６】
これらの組織を再生するために、本発明の多孔性材料に、対象となる組織に由来する細胞またはその前駆細胞が播種される。このような細胞としては、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物由来の、皮膚細胞、神経細胞、血管細胞、血液細胞、内臓細胞（例えば、膵島細胞、肝細胞など）、腺細胞、筋細胞、線維芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、生殖細胞、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、体性幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞など）、免疫細胞など、またはこれらの前駆細胞、あるいはこれらの細胞を遺伝子工学的手法により改変した遺伝子改変細胞などが挙げられる。
【００４７】
播種する細胞の量は、再生する組織、使用する細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、本発明の多孔性材料１ｃｍ３あたり、約１０×１０４〜約２００×１０４cellsである。
【００４８】
本発明の多孔性材料を用いて組織再生を行う場合、処置する動物の生体内で目的の組織の構築を行ってもよいし、目的の組織を生体外で一部または完全に構築した後、処置する動物へ移植してもよい。
【００４９】
本発明の多孔性材料を細胞移植に用いる場合、移植する細胞の種類、およびその播種する量としては、例えば、組織再生において例示したものが挙げられる。
【００５０】
本発明の多孔性材料を細胞移植に用いる場合、多孔性材料に播種した細胞を、生体外で、上記のような培養条件で任意の期間培養した後、処置する動物へと移植してもよい。
【００５１】
本発明の多孔性材料は、用途に応じて、栄養素、成長因子、酵素、抗生物質などを加えてもよい。
【００５２】
本発明の多孔性材料の大きさは、特に制限はなく、用途に適した任意の大きさが選択される。
【００５３】
本発明の多孔性材料は、柔軟性のあるスポンジ状であるため、用途に応じて、例えば、フィルム状、矩形、円筒状、円盤状などの形態に、さらに成形して用いることができる。
【００５４】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
（アルギン酸カルシウムビーズを用いるケラチンスポンジの作製）
【００５６】
（ケラチン溶液の調製）
羊毛（９ｇ）を細かく切り、５００ｍｌフラスコに入れた。フラスコに、２−メルカプトエタノール（１３．０ｇ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（７．５ｇ）、８Ｍ  尿素（１２８ｇ）を加え、温浴（５０℃）にて５時間振盪した。この反応溶液を濾過し、透析チューブに移し、２−メルカプトエタノール（６ｍｌ）を含む蒸留水３Ｌに対して透析した。透析後、限外濾過器（ADVANTEC UHP-62K；TOYO）により濃縮し、Ｌｏｗｌｙ法により、得られたケラチン溶液のタンパク質濃度を測定した（ケラチン濃度：約９０ｍｇ／ｍｌ）。
【００５７】
（アルギン酸カルシウムビーズの作製）
１ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液、および５ｗ/ｖ％の塩化カルシウム溶液を別々の容器に調製した。１ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム溶液（１０００ｍｌ）を、５ｗ/ｖ％の塩化カルシウム溶液（１５００ｍｌ）に室温で滴下し、アルギン酸カルシウムビーズを作製した。このビーズを蒸留水で洗浄し、室温で乾燥して、粒径約５００μｍのアルギン酸カルシウムビーズ（以下、アルギン酸カルシウムビーズＡという）を得た。
【００５８】
（カルシウムコーティングしたアルギン酸カルシウムビーズの作製）
２０ｇのアルギン酸カルシウムビーズＡを、５ｗ/ｖ％の塩化カルシウム溶液（１００〜２００ｍｌ）に室温で１分間浸した後、乾燥することによって、ビーズ表面がカルシウムでコーティングされたアルギン酸カルシウムビーズ（以下、アルギン酸カルシウムビーズＢという）を作製した。
【００５９】
（ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズの複合体の作製）
９０ｍｇ／ｍｌのケラチン溶液（０．５ｍｌ；ケラチン量約４５ｍｇ）を含むサンプルチューブに、０．３５ｇのアルギン酸カルシウムビーズＡを加えた。サンプルチューブを、−８０℃にて２時間凍結した後、一晩凍結乾燥することで、ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズＡの複合体（ケラチン／アルギン酸カルシウムビーズ複合体Ａ）０．４ｇを得た。
同様に、アルギン酸カルシウムビーズＢから、ケラチンとアルギン酸カルシウムビーズＢの複合体Ｂ（ケラチン／アルギン酸カルシウムビーズ複合体Ｂ）０．４ｇを得た。
【００６０】
得られたケラチン／アルギン酸カルシウムビーズ複合体ＡおよびＢを肉眼で観察すると、いずれの複合体も、その表面にアルギン酸カルシウムビーズが均一に存在していることが確認できた。また、ケラチン／アルギン酸カルシウムビーズ複合体ＡおよびＢを電子顕微鏡で観察すると、いずれの複合体も、直径約５００〜約６００μｍのアルギン酸カルシウムビーズが、ケラチン構造内に存在していることが確認された。また、ケラチン構造自体にも、孔径約３０〜４０μｍの孔が確認された。
【００６１】
（ケラチン／アルギン酸カルシウムビーズ複合体からのケラチンスポンジの作製）
ＥＤＴＡ・２Ｎａを水に加え、ＮａＯＨでｐＨを調整して、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を調製した。０．４ｇのケラチン／アルギン酸カルシウムビーズ複合体Ａを、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（４０ｍｌ）を含むサンプルチューブに入れ、振盪機（Rotary Shaker NR-20（TAITEC））（８０〜９０ｒｐｍ）で、半日振盪した。ＥＤＴＡ溶液を交換し、再度振盪を繰り返した。得られた複合体（２０〜３０個）を、蒸留水で簡単に洗浄した後、３Ｌの蒸留水を含むプラスティックビーカーに入れ、振盪機（１００〜１１０ｒｐｍ）で半日洗浄した。−８０℃で３時間凍結した後、２晩凍結乾燥して、ケラチンスポンジ（以下、ＡＬＫスポンジＡという）（１個あたり約２０ｍｇ）を得た。
同様に、ケラチン／アルギン酸カルシウムビーズ複合体Ｂから、ケラチンスポンジ（以下、ＡＬＫスポンジＢ）（１個あたり約２０ｍｇ）を得た。
【００６２】
（実施例２）
（アルギン酸カルシウムビーズを用いて作製したケラチンスポンジの性状）
【００６３】
（電子顕微鏡による観察）
実施例１で作製したＡＬＫスポンジＡおよびＡＬＫスポンジＢを、肉眼および電子顕微鏡で観察した。比較対象として、ケラチンのみを凍結乾燥して作製したスポンジ（以下、凍結乾燥スポンジという）を用いた。
凍結乾燥スポンジは、肉眼では孔が確認できなかった。ＡＬＫスポンジＡおよびＢは、いずれも、肉眼で確認できる孔がその全体にわたって観察された。また、ＡＬＫスポンジＢは、ＡＬＫスポンジＡよりも体積が大きく、スポンジ全体が繊維状（綿状）であった。
電子顕微鏡による観察では、凍結乾燥スポンジは、表面から内部に至るまで、孔径約３０〜４０μｍの孔が多数存在した。これに対して、ＡＬＫスポンジＡおよびＢでは、いずれも、アルギン酸カルシウムビーズが溶出することにより形成されたと考えられる孔径約５００〜約１０００μｍの多数の孔が存在した。ＡＬＫスポンジＢは、アルギン酸カルシウムビーズの溶出により形成された孔のほかに、ケラチン自体に存在していた小さな孔が膨潤して形成された孔も観察された（図１〜図３）。
【００６４】
（赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）の測定）
凍結乾燥スポンジ、ＡＬＫスポンジＡ、およびＡＬＫスポンジＢのそれぞれについて、ＫＢｒ法によりＩＲの測定を行った。
凍結乾燥スポンジの赤外線吸収スペクトルとの比較から、ＡＬＫスポンジＡおよびＢにアルギン酸カルシウムビーズが残存していないことが確認された。
【００６５】
（密度、空隙率、水分吸収率の測定）
ケラチン粉末を完全に密になるように圧縮成型したプレート（以下、ケラチンプレートという）、凍結乾燥スポンジ、ＡＬＫスポンジＡ、およびＡＬＫスポンジＢについて、密度、空隙率、水分吸収率を測定した。
【００６６】
（密度の測定）
ケラチンプレート、凍結乾燥スポンジ、ＡＬＫスポンジＡ、およびＡＬＫスポンジＢのそれぞれの乾燥重量を測り、直径および高さから体積を求め、これらの値から見かけの密度を算出した。
【００６７】
（空隙率の測定）
各々の見かけの密度から、以下の式により空隙率を算出した。
空隙率（％）＝（ρ（プレート）−ρ（スポンジ））／ρ（プレート）×１００
ρ（プレート）：ケラチンプレートの見かけの密度
ρ（スポンジ）：凍結乾燥スポンジ、ＡＬＫスポンジＡ、またはＡＬＫスポンジＢの見かけの密度
【００６８】
（水分吸収率の測定）
ケラチンプレート、凍結乾燥スポンジ、ＡＬＫスポンジＡ、およびＡＬＫスポンジＢのそれぞれについて、乾燥重量と、蒸留水に１時間浸漬した後の重量（湿重量）を測定し、以下の式により水分吸収率を算出した。
水分吸収率（％）＝（Ｗｗ−Ｗｄ）／Ｗｄ×１００
Ｗｄ：乾燥重量
Ｗｗ：湿重量
【００６９】
測定結果を以下の表に示す。
【００７０】
【表１】
2006239093.tif 000002
【００７１】
ケラチンプレートは、空隙率が０％になるまで圧縮されているため、その見かけの密度は、非常に高い値（１．３ｇ／ｃｍ３）を示した。他方、水分吸収率は、他と比較して、かなり低い値（約８７％）を示した。
凍結乾燥スポンジは、ケラチンプレートに対して、見かけの密度が、約１／１０に低下し、その結果、空隙率は約９０％となった。この空隙率は、電子顕微鏡で観察された約３０〜４０μｍの孔径の孔に起因すると考えられる。凍結乾燥スポンジは、ケラチンプレートと比較して、水分吸収率も増加したが、ＡＬＫスポンジＡおよびＢほどの増加率ではなかった。これは、凍結乾燥スポンジの孔の孔径が、ＡＬＫスポンジＡおよびＢの孔の孔径よりも小さいので、ＡＬＫスポンジＡおよびＢと比べて、水分がスポンジの内部に浸透するのに時間がかかるためと考えられる。
ＡＬＫスポンジＡは、ケラチンプレートと比較して、見かけの密度が、かなり小さい値（０．０２８ｇ／ｃｍ３）を示し、空隙率は、約９８％であった。ＡＬＫスポンジＡは、凍結乾燥スポンジと比べて、体積的な差異はなかったが、空隙率が著しく増加していた。これは、アルギン酸カルシウムビーズにより形成された約５００〜約１０００μｍの孔径の孔に起因すると考えられる。さらに、凍結乾燥スポンジの孔の孔径よりも大きな孔の孔径により、ＡＬＫスポンジＡは、凍結乾燥スポンジよりも、水分がスポンジの内部へと浸透しやすくなり、約２４００％の水分吸収率を示したと考えられる。
ＡＬＫスポンジＢは、ケラチンプレートと比較して、見かけの密度の減少、ならびに空隙率および水分吸収率の増加が、ＡＬＫスポンジＡよりもさらに顕著であった。ＡＬＫスポンジＢは、ＡＬＫスポンジＡと比較して見かけの密度で１／２、空隙率は１％の増加を示し、水分吸収率は、約３９００％もの高い数値を示した。この結果は、ＡＬＫスポンジＢが、ＡＬＫスポンジＡよりも体積が増加していること、また繊維状（綿状）の形態をしていることに起因すると考えられた。
【００７２】
（実施例３）
（アルギン酸カルシウムビーズを用いて作製したケラチンスポンジのトリプシンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解試験）
エタノール処理ケラチンスポンジ（直径１．１ｃｍ、高さ０．３ｃｍを４分割したもの；孔径約３０〜４０μｍ）、圧縮成型ケラチンスポンジ（縦および横０．４ｃｍ、高さ０．２ｃｍ；孔径約３００〜５００μｍ）、およびＡＬＫスポンジＢについて、トリプシン分解試験を行った。
ＮａＣｌ  ８．０ｇ（１３７ｍｍｏｌ）、ＫＣｌ  ２００ｍｇ（２．６８ｍｍｏｌ）、ＮａＨ２ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２．９ｇ（８．１０ｍｍｏｌ）、ＫＨ２ＰＯ４  ２００ｍｇ（１．４７ｍｍｏｌ）を、１Ｌの純水に溶解してＰＢＳ（−）溶液を調製した。ＰＢＳ（−）溶液にトリプシンを加えて、０．５％トリプシン溶液を調製した。各サンプルを、低圧で十分に乾燥し、サンプルの重量を測定した。１２ウェルプレートに、それぞれ、０．５％トリプシン溶液を５ｍｌずつ加え、３７℃にて一定時間（１、３、６、１２、２４、４８、９６、１６８、および３３６時間）反応後、サンプルを取り出し、蒸留水で３０分×２回洗浄した。洗浄後、サンプルを低圧で十分に乾燥し、トリプシン分解後の重量を測定した。トリプシン溶液は、２日毎に交換した。
【００７３】
トリプシン溶液と１時間反応させた時点で、ＡＬＫスポンジＢは、重量が半分になるまで分解した。他方、この時点でのエタノール処理ケラチンスポンジの分解は重量の約３０％、圧縮成型ケラチンスポンジの分解は重量の約５％であった。ＡＬＫスポンジＢの分解が顕著であったのは、ＡＬＫスポンジＢをトリプシン溶液に浸した際、直ちに、スポンジの内部までトリプシン溶液が浸透すること、またケラチンが繊維状（綿状）であることに起因すると考えられる。
対照的に、圧縮成型ケラチンスポンジは、圧縮によって、孔以外の部分のケラチンが密になった構造を有しており、その結果、分解し難いと考えられる。
エタノール処理ケラチンスポンジは、凍結乾燥スポンジに近い構造を有し、孔がＡＬＫスポンジＢよりも小さいため、スポンジ内部へのトリプシン溶液の浸透性がＡＬＫスポンジＢよりも悪く、トリプシン溶液と接触している外表面から分解したと考えられる。
トリプシン溶液と２４時間反応させた時点で、ＡＬＫスポンジＢは、重量の約８０％まで分解した。この時点で、エタノール処理ケラチンスポンジも、重量の約８０％まで分解し、そして圧縮成型ケラチンスポンジは、重量の約６０％まで分解した。
２週間後には、全てのスポンジが、重量の約２０〜２７％まで分解した。
以上の結果から、ＡＬＫスポンジは、生体吸収性を有することが示された。
【００７４】
（実施例４）
（アルギン酸カルシウムビーズを用いて作製したケラチンスポンジによる線維芽細胞の培養）
【００７５】
（培養溶液の調製）
（ＰＢＳ（−）溶液）
ＰＢＳ粉末（Wako）を、超純水１Ｌに溶解し、１２０℃にて２０分間オートクレーブ滅菌後、４℃で保存した。
（トリプシン−ＥＤＴＡ溶液）
ＰＢＳ（−）溶液に、２．５％トリプシン溶液、および２％ＥＤＴＡ溶液を加え、０．０５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液を調製し、ガンマ線滅菌されたフィルターで滅菌濾過した後、無菌条件下、４℃で保存した。
【００７６】
（培地溶液の調製）
ＤＭＥＭ（SIGMA-ALDRICH）５００ｍｌに、ペニシリン・グルタミン・ストレプトマイシン溶液（GIBCO）を５ｍｌ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５０ｍｌ加えて培地溶液とし、４℃で保存した。
【００７７】
（細胞の継代）
細胞：マウス由来線維芽細胞  Ｌ９２９株
細胞培養には、２５ｃｍ２のTissue Culture Flask(TPP)を用いた。細胞が８０％のコンフルエントになった時点で継代を行った。使用する溶液は、予め３７℃で保温した。３〜４日の培養後、８０％のコンフルエント（約５．０×１０７  ｃｅｌｌｓ）になったことを確認して、培地を取り除き、ＰＢＳ（−）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液１．３ｍｌを加え、ＣＯ２インキュベーター（SANYO CO2 INCUBATOR）内で、３７℃で５分間インキュベートすることで、トリプシン処理を行った。細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、培養溶液を１０ｍｌ加えてトリプシンを阻害した後、ピペッティングによりフラスコから細胞を取り出し、細胞浮遊液を得た。この細胞浮遊液をサンプルチューブに移し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離に供することで、細胞を沈降させた。上清を捨て、新しい培地溶液を加えて、ピペッティングにより細胞を再懸濁し、血球計算板で細胞濃度を計測し、培養培地（２０ｍｌ）を含む細胞培養フラスコに３０×１０４  ｃｅｌｌｓとなるように播種して、インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。
【００７８】
（線維芽細胞の培養）
ＡＬＫスポンジＢを０．８ｃｍ角に切り、６ウェルプレートに入れ、７０％エタノールに２時間浸漬して滅菌した。ＡＬＫスポンジＢをクリーンベンチ内に移し、ＰＢＳ（−）に１時間浸漬してエタノールを取り除いた後、培地溶液に３０分間浸漬し、培地溶液を交換してさらに１時間浸漬して、ＰＢＳ（−）を培地溶液に交換した。
継代している細胞の上清を捨て、トリプシン処理後、細胞濃度を５００×１０４  ｃｅｌｌｓに調製して、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液４０μｌ（２０×１０４  ｃｅｌｌｓ）をＡＬＫスポンジＢに播種し、さらに培地溶液を加えた後、インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ２にて、３日間および１０日間培養した。１０日間の培養において、培地溶液は３日毎に交換した。
【００７９】
ＡＬＫスポンジＢにおける線維芽細胞の増殖状態を電子顕微鏡で観察した。
培養３日目の電子顕微鏡像では、スポンジの表面（培養時の上面）および裏面（培養時の底面）の両方で、細胞がまばらに存在した（図４および５）。
培養１０日目の電子顕微鏡像では、スポンジの表面および裏面の両方で、コンフルエントには達していないものの、かなり多くの数の細胞が観察された（図６および７）。
【００８０】
以上の結果から、ＡＬＫスポンジは、細胞毒性が低く、細胞親和性を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、凍結乾燥スポンジの電子顕微鏡像である。（ａ）および（ｂ）は、凍結乾燥スポンジの表面（凍結乾燥時の上面）の像であり、（ｃ）は、凍結乾燥スポンジの裏面（凍結乾燥時の底面）の像であり、（ｄ）は、凍結乾燥スポンジの断面の像である。数値は拡大率を表す。
【図２】図２は、ＡＬＫスポンジＡの電子顕微鏡像ある。（ａ）および（ｂ）は、凍結乾燥スポンジの表面（凍結乾燥時の上面）の像であり、（ｃ）は、凍結乾燥スポンジの裏面（凍結乾燥時の底面）の像であり、（ｄ）は、凍結乾燥スポンジの断面の像である。数値は拡大率を表す。
【図３】図３は、ＡＬＫスポンジＢの電子顕微鏡像である。（ａ）、（ｂ）および（ｅ）は、凍結乾燥スポンジの表面（凍結乾燥時の上面）の像であり、（ｃ）は、凍結乾燥スポンジの裏面（凍結乾燥時の底面）の像であり、（ｄ）は、凍結乾燥スポンジの断面の像である。数値は拡大率を表す。
【図４】図４は、細胞培養３日目の、ＡＬＫスポンジＢ表面（培養時の上面）の電子顕微鏡像である。数値は拡大率を表す。
【図５】図５は、細胞培養３日目の、ＡＬＫスポンジＢ裏面（培養時の底面）の電子顕微鏡像である。数値は拡大率を表す。
【図６】図６は、細胞培養１０日目の、ＡＬＫスポンジＢ表面（培養時の上面）の電子顕微鏡像である。数値は拡大率を表す。
【図７】図７は、細胞培養１０日目の、ＡＬＫスポンジＢ裏面（培養時の底面）の電子顕微鏡像である。数値は拡大率を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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