(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料中の脂質混合物を効率よく質量分析により同定する手法を提供する。【解決手段】脂質混合試料について、条件付きのニュートラルロススキャンによりＭＳ２段階で脂質の極性基に由来するセレクションを行い、続いてＭＳ３段階で脂質の疎水部である脂肪族炭化水素鎖の分析を行う。また脂質混合試料について本発明の方法を網羅的に行うことが可能な質量分析システムを提供する。本発明により脂質の同定についてのエラーが低減し、解析速度が向上するので、ハイスループット解析が可能となり、脂質分析の研究において非常に有用な解析手法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析により脂質を同定する方法であって：
（１）ポジティブイオン測定モードまたはネガティブイオン測定モードから、測定したい脂質種に適した測定モードを選択し；
（２）脂質試料をイオン化し；
（３）脂質試料のイオン化により得られた脂質分子量関連イオンをＭＳ１段階で分離し検出した後、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーでフラグメント化し；
（４）該フラグメント化により、測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスを生じて生成したフラグメントイオンをＭＳ２段階で分離して選択し；
（５）得られた質量スペクトルから脂質を同定する；
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
質量分析により脂質を同定する方法であって：
（１）ポジティブイオン測定モードまたはネガティブイオン測定モードから、測定したい脂質種に適した測定モードを選択し；
（２）脂質試料をイオン化し；
（３）脂質試料のイオン化により得られた脂質分子量関連イオンをＭＳ１段階で分離し検出した後、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーでフラグメント化し；
（４）該フラグメント化により、測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスを生じて生成したフラグメントイオンの一つをＭＳ２段階で分離して選択し；
（５）当該フラグメントイオンを、前記と同じまたは異なる衝突エネルギーでさらにフラグメント化し；
（６）当該フラグメントイオンのプロダクトイオンスキャンをＭＳ３段階で行うことにより特定の脂質の構造に関する質量スペクトルを得て；そして、
（７）得られた質量スペクトルから脂質を同定する；
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
さらに、（５）および（６）の工程と同様のプロダクトイオンスキャンを繰り返して行い、ＭＳ４以上の分析を行うことを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
脂質がリン脂質である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
リン脂質が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
イオン化を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法により行う、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
エレクトロスプレーイオン化の際に脂質試料にギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムが加えられており；そして、
測定したい脂質種に適した測定モード、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギー、および、測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスの組み合わせが、以下：
測定したい脂質の種がホスファチジルコリン（ＰＣ）の時：測定モードはネガティブイオンモード；衝突エネルギーは２５−４５ｅＶ；ニュートラルロスは６０Ｄａまたは７４Ｄａ；
測定したい脂質の種がスフィンゴミエリン（ＳＭ）の時：測定モードはネガティブイオンモード；衝突エネルギーは５０−７０ｅＶ；ニュートラルロスは６０Ｄａまたは７４Ｄａ；
測定したい脂質の種がホスファチジルセリン（ＰＳ）の時：測定モードはネガティブイオンモード；衝突エネルギーは２５−４０ｅＶ；ニュートラルロスは８７Ｄａ；
測定したい脂質の種がホスファチジルセリン（ＰＳ）の時：測定モードはポジティブイオンモード；衝突エネルギーは３０−５０ｅＶ；ニュートラルロスは１８５Ｄａ；
測定したい脂質の種がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の時：測定モードはポジティブイオンモード；衝突エネルギーは３０−５０ｅＶ；ニュートラルロスは１４１Ｄａ； 
測定したい脂質の種がホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の時：測定モードはポジティブイオンモード；衝突エネルギーは２５−５０ｅＶ；ニュートラルロスは２７７Ｄａ；および／または
測定したい脂質の種がホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の時：測定モードはポジティブイオンモード；衝突エネルギーは２５−３５ｅＶ；ニュートラルロスは１８９Ｄａ；
である、請求項６項に記載の方法。
【請求項８】
脂質を同定するための質量分析システムであって、
（ａ）ＭＳ３以上の測定が可能な装置；および
（ｂ）該ＭＳ３以上の測定が可能な装置と電気接続する装置制御システムであって、該装置制御システムは、測定したい脂質種それぞれの分析に適した測定モード、該脂質種に特異的な衝突エネルギー、および、該衝突エネルギーによって生じる該脂質種に特徴的なニュートラルロスの組み合わせについて与えられた、１以上のパラメータの組み合わせのすべてについてスキャンするように該装置を制御する、前記装置制御システム；
を備える、前記質量分析システム。
【請求項９】
脂質を同定するための質量分析システムであって、
（ａ）ＭＳ３以上の測定が可能な装置；
（ｂ）該ＭＳ３以上の測定が可能な装置と電気接続する装置制御システムであって、該装置制御システムは、測定したい脂質種それぞれの分析に適した測定モード、該脂質種に特異的な衝突エネルギー、および、該衝突エネルギーによって生じる該脂質種に特徴的なニュートラルロスの組み合わせについて与えられた、１以上のパラメータの組み合わせのすべてについてスキャンするように該装置を制御する、前記装置制御システム；および、
（ｃ）該ＭＳ３以上の測定が可能な装置と電気接続するデータ解析システム；
を備える、前記質量分析システム。
【請求項１０】
ＭＳ３以上の測定が可能な装置が、イオン分離部として、四重極型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、飛行時間型質量分析計、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計からなる群から選択される１以上の質量分析計を備える、請求項８または９に記載の質量分析システム。
【請求項１１】
ＭＳ３以上の測定が可能な装置が、イオン分離部として少なくとも１つのイオントラップを備える、請求項８または９に記載の質量分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析により脂質を同定する方法に関する。また、本発明は、脂質を同定するための質量分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、リン脂質は細胞膜の構成成分として知られており、細胞の恒常性を保つために非常に重要な成分である。これに加え、近年のメタボローム研究によって、これらの脂質や脂質代謝物が微量生理活性分子の一群として、シグナル伝達のメディエーターや受容体のリガンドとしても重要な役割を担っていることがわかってきた。メタボロームとは、生体や細胞における代謝産物の総称で、ポストゲノムとして、プロテオームやトランスクリプトーム等に続いて注目されている研究分野である。しかし、リン脂質の構造は非常に多様であることから、研究がなかなか進んでいないのが現状である。
【０００３】
リン脂質は大きく分けて、グリセロリン脂質とスフィンゴリン脂質に分類される。グリセロリン脂質は、グリセロール骨格にリン酸を含む極性基および脂肪族基が一残基（リゾ体）ないし二残基（ｄｉｒａｄｙｌ体）結合している構造を有している。天然のグリセロリン脂質は、その極性基の違いによるホスファチジルコリン（ＰＣ）やホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などのクラス、そして、ｓｎ−１位の脂肪族基の結合様式の違いによるアシル型、アルキル型、アルケニル型などのサブクラス、脂肪族基の鎖長や不飽和度の違いによる分子種、の各段階に分類できる。また、スフィンゴミエリン（ＳＭ）などのスフィンゴリン脂質は、グリセロール骨格ではなくスフィンゴシン骨格を有し、そしてリン酸極性基および脂肪族基を有するが、脂肪族基はＯ−アシルではなくＮ−アシルの形で結合した構造をとっている。リン脂質は、このような非常に微細な構造類似物の混合物の形で生体内に存在しているので、タンパク質やペプチドに比べてその解析は困難であるといえる。
【０００４】
近年、質量分析の分野では、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法などのソフトイオン化法が登場したことにより、試料中の成分を壊すことなくイオン化し検出することができるようになった。また、機械性能の著しい向上によりフェムトモルオーダーの極微量での検出が可能になった。これらの要因から、質量分析を用いた生体物質の同定に注目が集まり、脂質代謝学の研究においても、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）による脂質解析の手法が急速に発展してきている（例えば、Han, X. and Gross, R. W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10635-10639 (1994)；Taguchi, R., et al., J. Mass Spectrom., 35: 953-966 (2000)；Pulfer, M. and Murphy, R. C., Mass Spectrom. Rev., 22: 332-364 (2003)；Han, X. and Gross, R. W., J. Lipid Res., 44: 1071-1079 (2003)；および、Ekroos, K., et al., Anal. Chem., 74: 941-949 (2002) を参照）。
【０００５】
数十種類以上の脂質の混合物を分析するにあたっては、混合物の状態で直接質量分析にかけても、主要な成分のマスピークに微量成分のマスピークが重ることで微量成分を検出できない、または主要な成分の存在により微量成分についてイオンサプレッションが起こり、微量成分が十分にイオン化できないために検出できないなどの問題がある。微量成分についても漏らすことなく、いかにして網羅的に解析するのかが課題であった。現在のところ網羅的に解析するための手法として、（１）高い質量分解能および質量精度が得られる、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計（ＦＴＩＣＲＭＳ）による精密質量分析を用いる手法（例えば、Ishida, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 18: 2486-2494, (2004)を参照）、（２）ＭＳ／ＭＳを用いて、分子量関連イオンとそこから生じる特徴的なフラグメントの検出（プリカーサーイオンスキャン）や、特異的な質量数のロスとを組み合わせて検出（ニュートラルロススキャン）を行う手法（例えば、Lehmann, W. D., et al., Anal. Biochem., (1997), 246: 102；Domingues, P., et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., (1998), 9: 1189；および、Heller, D. N., et al., Anal. Chem., (1988), 60: 2787、を参照）、（３）液体クロマトグラフィー（ＬＣ）やキャピラリー電気泳動（ＣＥ）と質量分析計を組み合わせることにより、ＬＣやＣＥで予め微量成分を主要な成分と分離することにより、微量成分についての検出感度を向上させる手法（例えば、Taguchi, R., et al., J. Mass Spectrom., 35: 953-966 (2000)、を参照）、などがある。
【０００６】
このように質量分析を用いた脂質の同定法が数多く検討されているが、現在知られている手法では効率的に分離同定できない脂質も多い。例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）は、共に極性基としてコリンを含有しており、分子量も近い。質量分析による測定方法では、分子量が近いことから分子量関連イオンのピークも近く、また極性基の構造が同じであるため、フラグメントイオンが生じるパターンも類似しており（例えば、Pulfer, M. and Murphy, R. C., Mass Spectrom. Rev., 22: 332-364 (2003)を参照）、通常のプリカーサーイオンスキャンやニュートラルロススキャンでは分離同定は困難である。さらに、質量分析の前に液体クロマトグラフィーによる分離を行う、ＬＣ−ＭＳを用いた測定方法においても、液体クロマトグラフィーでの保持時間がＰＣとＳＭでほぼ同じであるため、これらの脂質の分離同定は決して効率のよいものとはいえなかった（例えば、Taguchi, R., et al., J. Mass Spectrom., 35: 953-966 (2000)を参照）。
【０００７】
このように、生体試料中の脂質混合物について、効率的に質量分析により脂質の同定を行う方法の開発に対するニーズはますます高まっており、例えば、ハイスループット分析に応用可能な、現在の手法よりさらに効率の良い手法が求められている。
【０００８】
以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【非特許文献１】Han, X. and Gross, R. W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10635-10639 (1994)
【非特許文献２】Taguchi, R., et al., J. Mass Spectrom., 35: 953-966 (2000)
【非特許文献３】Pulfer, M. and Murphy, R. C., Mass Spectrom. Rev., 22: 332-364 (2003)
【非特許文献４】Han, X. and Gross, R. W., J. Lipid Res., 44: 1071-1079 (2003)
【非特許文献５】Ekroos, K., et al., Anal. Chem., 74: 941-949 (2002)
【非特許文献６】Ishida, M., et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 18: 2486-2494, (2004)
【非特許文献７】Lehmann, W. D., et al., Anal. Biochem., 246: 102 (1997)
【非特許文献８】Domingues, P., et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 9: 1189 (1998)
【非特許文献９】Heller, D. N., et al., Anal. Chem., 60: 2787 (1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、生体試料中の脂質混合物を、効率よく質量分析により同定する手法を提供することを目的とする。また、本発明は、本発明の方法を実施することが可能な質量分析システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題の解決のために、鋭意研究に勤めた結果、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーによって脂質分子量関連イオンを衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりフラグメント化すると、該脂質種のみがある特徴的なニュートラルロスを生じることを見いだした。
【００１１】
例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）は、共に極性基としてコリンを含有しており、そして分子量も近いためにこれらの脂質についての現在までの分離同定方法は必ずしも効率のよいものとはいえなかった。一例を挙げると、脂質混合物の試料をイオン化する際の脂質混合物試料溶液にギ酸アンモニウムを加えておくと、ＰＣおよびＳＭの両方についてギ酸イオンが付加した［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンが分子量関連イオンとして生じる。この分子量関連イオンは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）により容易に［Ｍ−ＣＨ３］−イオンに解離するので、分子量関連イオンからの６０Ｄａ（ギ酸メチル成分（ＨＣＯＯ＋ＣＨ３）のロスに相当する）についてのニュートラルロススキャンによってＰＣおよびＳＭをそれ以外の脂質から分離することは可能であった。しかしながら、この場合はＰＣとＳＭを分離することはできない。
【００１２】
しかし、本発明者らは鋭意研究の結果、この分子量関連イオン［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−は、通常用いられるような３０−４０ｅＶの低い衝突エネルギーで衝突誘起解離（ＣＩＤ）を行った場合には、ＰＣおよびＳＭの両方で［Ｍ−ＣＨ３］−イオンを生じる一方、５５−７０ｅＶの高い衝突エネルギーでＣＩＤを行った場合には、ＳＭのみで［Ｍ−ＣＨ３］−イオンを生じることを見いだした。このことについては、ＰＣに由来する［Ｍ−ＣＨ３］−イオンはＳＭに由来する［Ｍ−ＣＨ３］−イオンに比べて不安定であり、それらはより高い衝突エネルギーの下ではより小さいフラグメントに完全に解離する結果、ＳＭに由来する［Ｍ−ＣＨ３］−イオンのみをニュートラルロススキャンで検出することができたと結論づけた。
【００１３】
このように、測定したい脂質種に応じた適切な衝突エネルギーとその衝突エネルギーでのＣＩＤによって生じるニュートラルロスを適切に指定する条件付きのニュートラルロススキャンを行うことにより、脂質混合物試料の中から、測定したい脂質種に関連するイオンを分離することができることを、本発明者らは見いだした。そして本発明者らは、さらに当該ニュートラルロスにより生じたフラグメントイオンについてのＭＳ／ＭＳ解析を行うことで、脂質の脂肪族炭化水素基の情報を得ることができ、よって脂質の同定が可能であることを明らかにした。これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１４】
Ｉ．脂質の同定方法
したがって本発明は、質量分析により脂質を同定する方法であって：
（１）ポジティブイオン測定モードまたはネガティブイオン測定モードから、測定したい脂質種に適した測定モードを選択し；
（２）脂質試料をイオン化し；
（３）脂質試料のイオン化により得られた脂質分子量関連イオンをＭＳ１段階で分離し検出した後、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーでフラグメント化し；
（４）該フラグメント化により、測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスを生じて生成したフラグメントイオンをＭＳ２段階で分離して選択し；
（５）得られた質量スペクトルから脂質を同定する；
ことを含む方法を提供する。
【００１５】
別の態様において本発明は、質量分析により脂質を同定する方法であって：
（１）ポジティブイオン測定モードまたはネガティブイオン測定モードから、測定したい脂質種に適した測定モードを選択し；
（２）脂質試料をイオン化し；
（３）脂質試料のイオン化により得られた脂質分子量関連イオンをＭＳ１段階で分離して検出した後、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーでフラグメント化し；
（４）該フラグメント化により、測定したい脂質種に特異的なニュートラルロスを生じて生成したフラグメントイオンの一つをＭＳ２段階で分離して選択し；
（５）該フラグメントイオンを、前記と同じまたは異なる衝突エネルギーでさらにフラグメント化し；
（６）該フラグメントイオンのプロダクトイオンスキャンをＭＳ３段階で行うことにより特定の脂質の構造に関する質量スペクトルを得て；そして
（７）得られた質量スペクトルから脂質を同定する；
ことを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の方法において、脂質を質量分析にかけるために脂質試料をイオン化する、すなわち、試料分子をイオンとして気相に取り出すことが必要であるが、そのためには、当業者に公知のいずれかのイオン化法を用いてもよい。好ましくはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法を用いる。ＥＳＩ法およびＭＡＬＤＩ法は、試料分子の断片化を起こさずにイオン化できるという点で、生体分子の測定に適したソフトなイオン化法として当業者に周知である。当業者であれば、測定する試料の状態や使用する質量分析計の特性により適当なイオン化法を選択することができる。本発明の方法において、最も好ましくはＥＳＩ法を用いる。
【００１７】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法は、エレクトロスプレー現象を利用したイオン化法である。ＥＳＩ法においては、試料溶液を供給するキャピラリーと対向電極の間に高電圧を印加することで、エレクトロスプレー現象により高度に帯電した微細な液滴をキャピラリーの先端で生成させ、そしてこの液滴から加熱ガスによって溶媒を気化させる。溶媒の気化によって液滴のサイズが小さくなるとイオン間の静電的反発が強くなり、液滴が自発的に分裂してさらに小さな液滴となる。このような小さな液滴中では電荷を帯びた試料分子間の反発が大きくなり、その力が溶媒との親和性よりも大きくなると試料イオンが液滴から気相へと飛び出し、気相中に試料イオンを取り出すことができる。
【００１８】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法は、使用するレーザー光波長に吸収帯をもつマトリックス（液体や結晶性化合物、金属粉など）に試料を混合溶解させた後固化し、これにレーザー照射して試料を気化およびイオン化させる方法である。
【００１９】
本明細書において、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）とは、複数の原理が同じかあるいは異なるイオン分離部を有する質量分析計を２台以上直列に結合した装置を用いて、イオン化室で生成したイオン種のうちの一つを第一の質量分析計でプリカーサーイオンとして選択し、そのプリカーサーイオンを衝突活性化などの手法でフラグメント化させ、生成したプロダクトイオンを第二の質量分析計で分離検出する方法である。また、生成したプロダクトイオンの一つをさらに選択し、これをプリカーサーイオンとしてさらにフラグメント化させ、生じたイオンを第三の質量分析計で分離検出することも可能である。このように、イオンの選択、イオンのフラグメント化、そしてプロダクトイオン分離検出の一連の工程は、繰り返して行うことができる。この場合は、分離検出の段階に応じてＭＳｎ（ｎは２以上の整数）として表記する。また、これに加えて本明細書においては、ＭＳｎ（ｎは２以上の整数）における各質量分析計における分離検出の段階を、ＭＳｎ段階（ｎは１以上の整数）と記載する。
【００２０】
本明細書において、衝突活性化（ＣＡ）とは、プリカーサーイオンにアルゴン、窒素、ヘリウムなどの中性の不活性ガスを衝突させることにより、イオンの運動エネルギーの一部を内部エネルギーに変え、イオンのフラグメント化を起こすことをいう。また、衝突活性化によって起こるイオンのフラグメント化を衝突誘起解離（ＣＩＤ）という。また、衝突活性化の際に与えるエネルギーを衝突エネルギーという。
【００２１】
本明細書において、プリカーサーイオンとは、あるイオンから例えば衝突活性化によりイオンがフラグメント化して別のイオンが生成する場合の元のイオンを意味する。また、該フラグメント化により生成したイオンをプロダクトイオン、またはフラグメントイオンという。
【００２２】
本明細書において、分子量関連イオンとは、分子量情報の獲得に直接役立つイオン種をいう。このようなイオン種は、プロトンが脱離する場合を除いては分子内の結合が切れていないイオン種である。例えば、電子の付加または脱離によりイオン化したイオン種、プロトンの付加または脱離によりイオン化したイオン種、別のイオン種が付加してイオン化したイオン種がこれに含まれる。
【００２３】
本明細書において、ニュートラルロススキャンとは、ＭＳ／ＭＳにおいて、ある特定の質量をもつ中性分子が脱離することで生じる、プリカーサーイオンとフラグメントイオンの差として示される特徴的な質量のロスについてスキャンすることにより、特定の分子群を含むすべてのプリカーサーイオンを検出する方法である。脱離する中性分子の質量をニュートラルロスという。ニュートラルロススキャンによって得られるマススペクトルをニュートラルロススペクトルという。
【００２４】
本明細書において、プロダクトイオンスキャンとは、ＭＳ／ＭＳにおいて、ある特定のプリカーサーイオンから生成したすべてのプロダクトイオンを検出するスキャン法である。プロダクトイオンスキャンによって得られるマススペクトルをプロダクトイオンスペクトルという。
【００２５】
本明細書において、測定モードは、ポジティブイオンモードまたはネガティブイオンモードである。ポジティブイオンモードは、プラスに帯電したイオンを検出するモードであり、ネガティブイオンモードは、マイナスに帯電したイオンを検出するモードである。
【００２６】
脂質
本明細書において、脂質とは、分子内に極性基および疎水性の脂肪族炭化水素鎖を持つ物質である。脂質にはリン脂質や糖脂質が含まれていてよい。好ましい態様において、本発明の方法により同定される脂質はリン脂質である。リン脂質にはグリセロリン脂質およびスフィンゴリン脂質が含まれる。グリセロリン脂質に分類されるものには、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、カルジオリピン（ＣＬ）、およびホスファチジン酸など、ならびに、それらのリゾリン脂質が含まれるがこれらに限定されない。スフィンゴリン脂質に分類されるものには、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、セラミド−１−リン酸（ＣｅｒＰ）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ−１−Ｐ）などが含まれるがこれらに限定されない。
【００２７】
グリセロリン脂質は、グリセロール骨格にリン酸を含む極性基および脂肪族炭化水素鎖が一残基（リゾ体）ないし二残基（ｄｉｒａｄｙｌ体）結合している構造を有している。グリセロリン脂質は、その極性基の違いによりクラスに分類される。たとえば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）はそれぞれ極性基が異なるので、各々別のクラスのグリセロリン脂質である。さらに、天然のグリセロリン脂質は、グリセロールのｓｎ−１位の脂肪族炭化水素鎖の結合様式の違いによってサブクラスに分類される。脂肪族炭化水素鎖の結合様式には、グリセロールと脂肪酸がエステル結合により連結しているアシル型、グリセロールとアルキル基がエーテル結合により連結しているアルキル型、グリセロールとアルケニル基がエーテル結合により連結しているアルケニル型などがある。そして、脂肪族炭化水素鎖の鎖長や不飽和度の違いによって分子種に分類される。このようにグリセロリン脂質は、クラス−サブクラス−分子種、の各段階に分類できる（図１−ａ）。
【００２８】
スフィンゴミエリン（ＳＭ）などのスフィンゴリン脂質は、グリセロール骨格ではなくスフィンゴシン骨格を有し、そしてリン酸極性基および脂肪族基を有するが、脂肪族基はＯ−アシルではなくＮ−アシルの形で結合した構造をとっている。
【００２９】
本明細書において、脂質種または脂質の種というときには、疎水性の脂肪族炭化水素鎖は多様であってもよいが極性基と骨格が同一の脂質の群を意味する。例えば、グリセロリン脂質の場合は、同じ脂質の種に属することは同じクラスのグリセロリン脂質の群に属することを意味する。したがって、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）および、スフィンゴミエリン（ＳＭ）はそれぞれ互いに異なる脂質種に属する。
【００３０】
ＭＳ２段階でのニュートラルロススキャン
本発明者らは、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーによって脂質分子量関連イオンを衝突活性化によりフラグメント化すると、該脂質種のみがある特徴的なニュートラルロスを生じることを見いだした。このことから、測定したい脂質種ごとに、ポジティブまたはネガティブイオンモードの測定モード、衝突エネルギー、検出するニュートラルロス、の組み合わせを指定した条件でニュートラルロススキャンを行うことにより、脂質混合物試料のイオンから、当該測定したい脂質種に関連するイオンをＭＳ２段階において選択的に分離することが可能であることを見いだした。
【００３１】
本発明の方法において、測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは、脂質の極性基の一部または全部のロスに起因するものである。このことにより、脂質混合物の試料についてニュートラルロススキャンを行うことにより、ＭＳ２段階において特定の脂質の種ごとに分離することができる。すなわち、ＭＳ２段階において脂質種ごとのセレクションが可能になる。
【００３２】
本発明の方法において、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは、当該衝突エネルギーを脂質の分子量関連イオンにかけた場合に、測定したい脂質種にのみ、測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスを生じるような強度の衝突エネルギーである。
【００３３】
本発明の方法において、測定したい脂質種に適した測定モードは、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーをかけた場合に測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスを生じる分子量関連イオンが、ポジティブイオンである場合はポジティブイオンモードを選択し、ネガティブイオンである場合はネガティブイオンモードを選択する。
【００３４】
したがって、脂質混合物試料の測定にあたっては、脂質種ごとに特徴的なニュートラルロスを選択し；そのようなニュートラルロスを生じるための衝突エネルギー、すなわち測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギー、を選択し；そして、そのようなニュートラルロスを生じるイオンがポジティブイオンであるかまたはネガティブイオンであるかによって測定したい脂質種に適した測定モードを選択する。このように、測定したい脂質種ごとの測定モード、衝突エネルギーおよび検出するニュートラルロスの組み合わせは相互に密接に関連しており、測定したい脂質種に応じて選択される。
【００３５】
本発明の方法の一態様において、測定したい脂質種がホスファチジルコリン（ＰＣ）であり、そして、脂質試料のイオン化法がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法であって脂質混合物の試料をイオン化する際の脂質混合物試料溶液にギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを加えた場合、測定したい脂質種に適した測定モードはネガティブイオンモードであり、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは２５−４５ｅＶ、好ましくは３０−４５ｅＶ、さらに好ましくは３０−４０ｅＶであり、そして測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは６０Ｄａ（試料溶液にギ酸アンモニウムを含む場合）または７４Ｄａ（試料溶液に酢酸アンモニウムを含む場合）である。この場合、ＰＣの分子量関連イオンは［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンまたは［Ｍ＋ＣＨ３ＣＯＯ］−イオン（試料溶液にそれぞれ、ギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを含む場合。また、Ｍはそれぞれの分子全体を意味する、以下同じ）であり、ＰＣに特徴的なニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンは［Ｍ−ＣＨ３］−イオンである。
【００３６】
本発明の方法の別の態様において、測定したい脂質種がスフィンゴミエリン（ＳＭ）であり、そして、脂質試料のイオン化法がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法であって脂質混合物の試料をイオン化する際の脂質混合物試料溶液にギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを加えた場合、測定したい脂質種に適した測定モードはネガティブイオンモードであり、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは５０−７０ｅＶ、好ましくは５０−６５ｅＶ、より好ましくは５５−７０ｅＶ、さらに好ましくは５５−６５ｅＶであり、そして測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは６０Ｄａ（試料溶液にギ酸アンモニウムを含む場合）または７４Ｄａ（試料溶液に酢酸アンモニウムを含む場合）である。この場合、ＳＭの分子量関連イオンは［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンまたは［Ｍ＋ＣＨ３ＣＯＯ］−イオン（試料溶液にそれぞれ、ギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを含む場合）であり、ＳＭに特徴的なニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンは［Ｍ−ＣＨ３］−イオンである。
【００３７】
本発明の方法のさらなる態様において、測定したい脂質種がホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、そして、脂質試料のイオン化法がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法であって脂質混合物の試料をイオン化する際の脂質混合物試料溶液にギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを加えた場合、測定したい脂質種に適した測定モードがネガティブイオンモードのとき、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは２５−４０ｅＶ、好ましくは３０−４０ｅＶ、より好ましくは２５−３５ｅＶ、さらに好ましくは３０−３５ｅＶであり、そして測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは８７Ｄａである。この場合、ＰＳの分子量関連イオンは［Ｍ−Ｈ］−イオンであり、ＰＳに特徴的なニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンは［Ｍ−Ｈ−Ｓｅｒ］−、すなわち、［ＰＡ−Ｈ］−（ＰＡは、ホスファチジン酸を意味する）イオンである。また、測定したい脂質種に適した測定モードがポジティブイオンモードのとき、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは３０−５０ｅＶであり、そして測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは１８５Ｄａである。この場合、ＰＳの分子量関連イオンは［Ｍ＋Ｈ］＋イオンであり、ＰＳに特徴的なニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンは［Ｍ−Ｓｅｒ−Ｐｉ］＋（Ｓｅｒはセリン、Ｐｉはリン酸）すなわち、［Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンである。
【００３８】
本発明の方法のさらに別の態様において、測定したい脂質種がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、そして、脂質試料のイオン化法がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法であって脂質混合物の試料をイオン化する際の脂質混合物試料溶液にギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを加えた場合、測定したい脂質種に適した測定モードはポジティブイオンモードであり、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは３０−５０ｅＶ、好ましくは３０−４０ｅＶであり、そして測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは１４１Ｄａである。この場合、ＰＥの分子量関連イオンは［Ｍ＋Ｈ］＋イオンであり、ＰＥに特徴的なニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンは［Ｍ−Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｐｉ］＋（Ｐｉはリン酸）すなわち、［Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンである。
【００３９】
本発明の方法のまた別の態様において、測定したい脂質種がホスファチジルイノシトール（ＰＩ）であり、そして、脂質試料のイオン化法がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法であって脂質混合物の試料をイオン化する際の脂質混合物試料溶液にギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを加えた場合、測定したい脂質種に適した測定モードはポジティブイオンモードであり、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは２５−５０ｅＶ、好ましくは３０−５０ｅＶ、より好ましくは２５−３５ｅＶ、さらに好ましくは３０−３５ｅＶであり、そして測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは２７７Ｄａである。この場合、ＰＩの分子量関連イオンは［Ｍ＋ＮＨ４］＋イオンであり、ＰＩに特徴的なニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンは［Ｍ−Ｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｐｉ］＋（Ｐｉはリン酸）、すなわち、［Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンである。
【００４０】
本発明の方法のさらにまた別の態様において、測定したい脂質種がホスファチジルグリセロール（ＰＧ）であり、そして、脂質試料のイオン化法がエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法であって脂質混合物の試料をイオン化する際の脂質混合物試料溶液にギ酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを加えた場合、測定したい脂質種に適した測定モードはポジティブイオンモードであり、測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーは２５−３５ｅＶであり、そして測定したい脂質種に特徴的なニュートラルロスは１８９Ｄａである。この場合、ＰＧの分子量関連イオンは［Ｍ＋ＮＨ４］＋イオンであり、ＰＧに特徴的なニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンは［Ｍ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−Ｐｉ］＋（Ｐｉはリン酸）、すなわち、［Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンである。
【００４１】
ここで、衝突エネルギーは、使用する機器の衝突室の特性により、衝突エネルギーがイオンの内部エネルギーに変換される効率が変化することがあるため、すべての機器において上記の衝突エネルギーの設定で目的のフラグメント化が起こるわけではない。上記の衝突エネルギーは、アプライドバイオシステム社のＡＰＩシリーズ、およびＷａｔｅｒｓ社のＱｕａｔｔｒｏシリーズで用いられている衝突室の設定の値を例示したものである。目的のフラグメント化を生じさせる衝突エネルギーの設定の値は、機器によって上記の範囲とは多少異なってもよい。しかしながら、脂質種ごとの特異的な衝突エネルギーの大小関係は機器が異なっても変わらない。当業者は、測定に用いる機器の特性に応じて衝突エネルギーの設定を適宜調整することができる。
【００４２】
ＭＳ３段階での分析
脂質の分子量関連イオンからニュートラルロスを生じて生成したフラグメントイオンは、ＭＳ２段階で分離・検出される。本発明の方法においては、当該フラグメントイオンをプリカーサーイオンとして選択し、衝突活性化によりフラグメント化して、ＭＳ３段階でプロダクトイオンスキャンを行うことによりさらに脂質の構造の情報を得てもよい。
【００４３】
プリカーサーイオンとして選択された該フラグメントイオンは、任意の衝突エネルギーによりフラグメント化してよい。すなわち、この段階での衝突エネルギーは、上述の測定したい脂質種に特異的な衝突エネルギーと同じであっても異なっていてもよい。
【００４４】
本発明の方法において、ＭＳ３段階でのプロダクトイオンスキャンにより得られる脂質の構造の情報とは、脂質の構造を特定できる任意のプロダクトイオンの質量の情報を意味する。好ましくは、ＭＳ３段階で得られる脂質の構造の情報は、脂質の脂肪族炭化水素鎖に関する情報である。脂質の脂肪族炭化水素鎖に関する情報を与えるプロダクトイオンには、例えば、脂質の脂肪族炭化水素鎖部分のイオン、脂質の脂肪族炭化水素鎖部分がニュートラルロスとして失われた結果生じたイオンが含まれる。
【００４５】
本発明の方法において、ホスファチジルコリン以外のグリセロリン脂質についてのネガティブイオンモードの測定においては、ＭＳ２段階で［ＰＡ−Ｈ］−イオン（ホスファチジン酸イオン）を生じる。測定するグリセロリン脂質の脂肪族炭化水素鎖部分がジアシル型、すなわちサブクラスがアシル型である場合、この［ＰＡ−Ｈ］−イオンからは、ＭＳ３段階のフラグメントイオンとして脂肪酸に対応する［ＲＣＯＯ］−イオン、脂肪酸がケテン（ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）のニュートラルロスとして失われた結果生じるホスファチジン酸のリゾ体である［ＰＡ−Ｈ−ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ］−イオン、および、脂肪酸が失われることによって生じる［ＰＡ−Ｈ−ＲＣＯＯＨ］−イオンを生じる。［ＲＣＯＯ］−イオンの質量、ならびに、［ＰＡ−Ｈ−ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ］−イオンおよび［ＰＡ−Ｈ−ＲＣＯＯＨ］−イオンからはそのプリカーサーイオンとの質量の差から、脂肪族炭化水素鎖の質量を決定することでその構造を同定することができる。そして、ホスファチジルコリンについてのネガティブイオンモードの測定においては、ＭＳ２段階で［Ｍ−ＣＨ３］−イオンを生じる。このイオンからは、ＭＳ３段階のフラグメントイオンとして脂肪酸に対応する［ＲＣＯＯ］−イオンが生じる。これに加えて、脂肪族炭化水素鎖がケテン（ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）のニュートラルロスとして失われた結果生じる［Ｍ−ＣＨ３−ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ］−イオン、および、脂肪酸のニュートラルロスとして失われた結果生じる［Ｍ−ＣＨ３−ＲＣＯＯＨ］−イオンも生じる。［ＲＣＯＯ］−イオンの質量、ならびに、［Ｍ−ＣＨ３−ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ］−イオンおよび［Ｍ−ＣＨ３−ＲＣＯＯＨ］−イオンからはそのプリカーサーイオンとの質量の差から、脂肪族炭化水素鎖の質量を決定することでその構造を同定することができる。脂肪族炭化水素鎖部分がケテンまたは脂肪酸のニュートラルロスとして失われた結果生じるフラグメントイオンは、ケテンのニュートラルロスにより生じるイオンの方が、生じる頻度が高い。また、グリセロールのｓｎ−２位のアシル基の方がｓｎ−１位のアシル基よりもニュートラルロスを生じやすいので、フラグメントイオンのイオン強度から脂肪族炭化水素鎖の位置決定を行うこともできる。よってこれらのフラグメントイオンを脂質の脂肪族炭化水素鎖部分の構造の同定に用いることができる。
【００４６】
また、本発明の方法において、グリセロリン脂質についてのポジティブイオンモードの測定においては、ＭＳ２段階で［Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンを生じる。測定するグリセロリン脂質の脂肪族炭化水素鎖部分がジアシル型、すなわちサブクラスがアシル型である場合、このイオンからは、ＭＳ３段階のフラグメントイオンとして脂肪族炭化水素部分のＯ−アシル鎖に対応する［ＲＣＯ］＋イオンが主として生じる。そして、ケテンのニュートラルロスとして失われることによって生じる［ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンを生じる。［ＲＣＯ］＋イオンからはその質量から、ならびに、［ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンからはそのプリカーサーイオンとの質量の差から、脂肪族炭化水素鎖の質量を決定することでその構造を同定することができる。
【００４７】
サブクラスがアルキル型またはアルケニル型のグリセロリン脂質、すなわち、脂肪族炭化水素鎖部分についてｓｎ−１位がエーテル結合で連結したアルキルまたはアルケニルであり、ｓｎ−２位がＯ−アシルであるグリセロリン脂質をネガティブイオンモードで本発明の方法により分析した場合、ＭＳ３段階で得られる脂質の構造の情報を与えるプロダクトイオンは、ｓｎ−２位のＯ−アシル鎖についてはアシル型の脂質と同様に、Ｏ−アシル鎖に対応する［ＲＣＯＯ］−イオン、ならびに、ｓｎ−２位のＯ−アシル鎖が脂肪酸および／またはケテンのニュートラルロスとして失われた結果生じるイオンである。ｓｎ−１位のエーテル結合で連結したアルキルまたはアルケニル部分はフラグメント化しないが、この部分がフラグメント化しないことはアルキル型またはアルケニル型であることを示す。ｓｎ−１位のエーテル結合で連結したアルキルまたはアルケニル部分の構造は、プリカーサーイオンとそのプロダクトイオンのＭＳの差から同定することができる。
【００４８】
また、サブクラスがアルキル型またはアルケニル型のグリセロリン脂質をポジティブイオンモードで本発明の方法により分析した場合、ＭＳ３段階で得られる脂質の構造の情報を与えるプロダクトイオンは、ｓｎ−２位のＯ−アシル鎖についてはアシル型の脂質と同様に、Ｏ−アシル鎖に対応する［ＲＣＯ］＋イオンの他、ｓｎ−２位のＯ−アシル鎖を脂肪酸（ＲＣＯＯＨ）またはケテン（ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）をニュートラルロスとして失った結果生じるイオンである。ｓｎ−１位のエーテル結合で連結したアルキルまたはアルケニル部分の構造は、プリカーサーイオンと［ＲＣＯ］＋イオンの質量の差から同定することができる。ｓｎ−２位のＯ−アシル鎖の構造は、［ＲＣＯ］＋イオンの質量から直接同定することができる。
【００４９】
具体的には、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルセリンをネガティブイオンモードで本発明の方法により分析した場合、ＭＳ３段階で得られる脂質の構造の情報を与えるプロダクトイオンは、Ｏ−アシル鎖に対応する［Ｒ１ＣＯＯ］−イオンおよび［Ｒ２ＣＯＯ］−イオン（Ｒ１およびＲ２は、それぞれｓｎ−１およびｓｎ−２の位置の脂肪族炭化水素鎖）である。この場合は、これらのプロダクトイオンの質量から直接、脂肪族炭化水素鎖の質量を得ることができるので、脂肪族炭化水素鎖の構造を同定することができる。また、Ｏ−アシル鎖がケテンまたは脂肪酸のニュートラルロスとして失われた結果生じるイオンも脂質の構造の情報を与える。
【００５０】
また、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルイノシトール、およびジアシルホスファチジルグリセロールをポジティブイオンモードで本発明の方法により分析した場合、ＭＳ３段階で得られる脂質の構造の情報を与えるプロダクトイオンは、Ｏ−アシル鎖に対応する［ＲＣＯ］＋イオンである。［ＲＣＯ］＋イオンの質量から脂肪族炭化水素鎖の構造を同定することができる。また、［Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンから、ケテン（ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）がニュートラルロスとして失われた、［ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンも脂質の構造の情報を与えるプロダクトイオンである。［Ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンのＭＳ値と、そのプロダクトイオンとしての［ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ＯＨ］＋イオンのＭＳ値との差から、ケテンのニュートラルロスを算出することによって、脂肪族炭化水素鎖の構造を同定することができる。
【００５１】
スフィンゴリン脂質をネガティブイオンモードで本発明の方法により分析した場合、ＭＳ３段階で得られる脂質の構造の情報を与えるプロダクトイオンは、Ｎ−アシル型の脂肪族炭化水素鎖がケテン（ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）のニュートラルロスとして失われた結果生じるイオンである。スフィンゴシン部分の質量は該プロダクトイオンから得ることができ、Ｎ−アシル脂肪族炭化水素鎖の質量は、プリカーサーイオンとプロダクトイオンの質量の差から得ることができる。そして、それによってスフィンゴリン脂質の脂肪族炭化水素鎖の構造を同定することができる。
【００５２】
具体的には、スフィンゴミエリンをネガティブイオンモードで本発明の方法により分析した場合、ＭＳ３段階ではＮ−アシル鎖部分は電気的に中性のケテンとしてプリカーサーイオンから脱離するため、Ｎ−アシル鎖に対応するプロダクトイオンは検出されない。しかし、ＭＳ２段階で選択したプリカーサーイオン［Ｍ−ＣＨ３］−から、Ｎ−アシル鎖部分がケテンとして脱離して生じたプロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３−ＲＣＨ＝Ｃ＝Ｏ］−イオン（Ｒは脂肪族炭化水素鎖）から脂質の構造の情報を得ることができる。すなわち、スフィンゴミエリン中のＮ−アシル鎖の構造は、前記プリカーサーイオンと前記プロダクトイオンの質量の差、すなわちＮ−アシル鎖に対応するニュートラルロスの値から、脂肪族炭化水素鎖の構造を同定することができる。
【００５３】
ＭＳ４以上の分析との組み合わせ
本発明の一態様において本発明の方法では、ＭＳ３段階で検出したイオンを選択し、衝突活性化によりフラグメント化し、プロダクトイオンスキャンを行う工程を、場合により繰り返して行ってもよい。すなわち、本発明の方法においてはＭＳ４以上の分析を行うことを含んでいてもよい。ＭＳ４以上の分析を行うことによって、脂質の構造に関するさらに詳細な情報を得ることができる。
【００５４】
液体クロマトグラフィーとの組み合わせ
本発明の一態様において、本発明の方法を行う前に、脂質試料を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）等で分離してもよい。質量分析の前にＬＣまたはＣＥ等で脂質混合物の試料を予め分離しておくことで、主要な成分の存在により微量成分のイオン化の効率が低減するイオンサプレッションを抑制することができるため、微量成分であっても十分にイオン化することができ、本発明の方法による脂質の同定の効率をさらに向上させることができる。
【００５５】
液体クロマトグラフィーを組み合わせる場合は、いずれのカラムを用いてもよいが、好ましくは、順相カラムまたは逆相カラムを用いる。順相カラムを用いた場合は、親水性の高い物質ほど保持時間が長くなる性質があり、例えばリン脂質の場合、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）の順に溶出される。逆相カラムを用いた場合は、疎水性の低いものから順に溶出される性質がある。逆相カラムを用いた場合の脂質の溶出時間は、脂質の極性基よりもむしろ脂肪族炭化水素鎖の長さおよび不飽和度の違いの影響を受ける。具体的には、鎖長の長い分子ほど、そして飽和度が高い分子ほどその保持時間が長くなる。
【００５６】
ＩＩ．質量分析システム
上述した本発明の脂質同定方法は、脂質混合物の試料について条件付きのニュートラルロススキャンを行うことにより極性基に由来するセレクションをＭＳ２段階で行い、さらに脂肪族炭化水素鎖の分析をＭＳ３段階で行う、といったように段階を追って脂質の同定を行うことができるため、脂質同定のエラーが飛躍的に減少し、脂質の同定を非常に効率よく行うことができる。本発明の脂質同定方法を利用することにより、脂質の同定についての解析速度の向上が見込めるので、ハイスループット解析が可能である。したがって、本発明は、以下のような本発明の方法を実施することができる質量分析システムを提供する。
【００５７】
本発明は、脂質を同定するための質量分析システムであって、
（ａ）ＭＳ３以上の測定が可能な装置；および
（ｂ）該ＭＳ３以上の測定が可能な装置と電気接続する装置制御システムであって、該装置制御システムは、測定したい脂質種それぞれの分析に適した測定モード、該脂質種に特異的な衝突エネルギー、および、該衝突エネルギーによって生じる該脂質種に特徴的なニュートラルロスの組み合わせについて与えられた、１以上のパラメータの組み合わせのすべてについてスキャンするように該装置を制御する、前記装置制御システム；
を備える質量分析システムを提供する。
【００５８】
別の態様において本発明は、脂質を同定するための質量分析システムであって、
（ａ）ＭＳ３以上の測定が可能な装置；
（ｂ）該ＭＳ３以上の測定が可能な装置と電気接続する装置制御システムであって、該装置制御システムは、測定したい脂質種それぞれの分析に適した測定モード、該脂質種に特異的な衝突エネルギー、および、該衝突エネルギーによって生じる該脂質種に特徴的なニュートラルロスの組み合わせについて与えられた、１以上のパラメータの組み合わせのすべてについてスキャンするように該装置を制御する、前記装置制御システム；および、
（ｃ）該ＭＳ３以上の測定が可能な装置と電気接続するデータ解析システム；
を備える質量分析システム、を提供する。
【００５９】
本発明の質量分析システムにおいて、ＭＳ３以上の測定が可能な装置は、１の試料導入部、１のイオン化室、１以上の質量分析計、１以上の衝突室、および１のコンピュータを備える。試料導入部は、外部から試料を装置内部へと導入するためのものである。イオン化室は、ＥＳＩ法やＭＡＬＤＩ法などによって試料をイオン化する部分である。質量分析計は、主としてイオン分離部および検出器で構成され、イオンを分離して検出する部分である。衝突室は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を行う部分であり、基本的には質量分析計の間に設置する。コンピュータは、試料導入ポート、イオン化室、質量分析計および衝突セルと電気接続されており、試料の装置への導入から質量分析の一連の測定の制御、および、得られたデータの解析を行う部分である。
【００６０】
ＭＳ３以上の測定が可能な装置における質量分析計は、四重極型質量分析計（ＱＭＳ）、イオントラップ型質量分析計（ＩＴＭＳ）、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計（ＦＴＩＣＲＭＳ）からなる群から選択される。
【００６１】
四重極質量分析計（ＱＭＳ）は、平行な４本の円柱状の電極に、直流と高周波を重ね合わせた電圧を印加して四重極電場をつくりだし、その電場を通過するイオンをｍ／ｚに応じて分離する質量分析計である。四重極中を通過するイオンは、高周波電場中を振動しながら進むが、ある特定の周波数に対応したイオンだけが振幅が大きくならず、四重極を通過することができる。
【００６２】
イオントラップ型質量分析計（ＩＴＭＳ）は、高周波電場や静電場と静磁場とを組み合わせて作ったポテンシャルの井戸にイオンを長時間閉じこめる手法を利用した質量分析計である。閉じこめられたイオンの質量分析は、高周波電圧やその周波数の走査によりイオンをｍ／ｚ別にイオントラップから追い出すことにより行う。ここで、ＩＴＭＳは、エンドキャップ型、リニアイオントラップ型の両方を含む。イオントラップ型質量分析計の場合は、イオントラップ内に閉じこめたイオンについて衝突誘起解離（ＣＩＤ）を行うことができるため、イオントラップ質量分析計自体が衝突セルとしての役割を担ってもよい。
【００６３】
飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）は、イオンを真空の管中で飛行させ、検出器まで到達する時間の違いによってイオンをｍ／ｚ値に応じて分離する方式の質量分析計である。ここでＴＯＦＭＳは、リニア型、リフレクトロン型の両方を含む。
【００６４】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計（ＦＴＩＣＲＭＳ）は、一様な磁場とこれに直交する高周波電場の中で、イオンがサイクロトロン共鳴することを利用し、イオンのサイクロトロン周波数を検出してｍ／ｚ値の異なるイオンを検出する質量分析計である。高い質量分解能および質量精度が得られるので、精密質量分析が可能である。
【００６５】
ＭＳ３以上の測定が可能な装置における質量分析計は、当業者が適宜選択することができる。一態様において、ＭＳ３以上の測定が可能な装置における質量分析計は、少なくとも１つのイオントラップ質量分析計を含む。別の一態様において、ＭＳ３以上の測定が可能な装置における質量分析計は、少なくとも１つの四重極質量分析計と少なくとも１つのイオントラップ質量分析計を含む。
【００６６】
本発明の質量分析システムにおける装置制御システムは、ＭＳ３以上の測定が可能な装置が、本発明の方法を実行可能なように制御するシステムである。該装置制御システムは、ＭＳ３以上の測定が可能な装置のコンピュータに搭載されていてよい。該装置制御システムは、特定の脂質種の分析に適した測定モード、特定の脂質種に特異的な衝突エネルギー、および該衝突エネルギーによって生じる脂質種に特徴的なニュートラルロス、の組み合わせについて与えられたパラメータにしたがって、質量分析のスキャニングを実行可能なように該装置を制御する。特定の脂質種の分析に適した測定モード、特定の脂質種に特異的な衝突エネルギー、および該衝突エネルギーによって生じる脂質種に特徴的なニュートラルロス、の組み合わせについては、本発明の脂質同定方法についての記載において上述したものと同じである。該制御システムには、複数の脂質種についての当該組み合わせについてのパラメータが登録されており、該制御システムはその組み合わせのパラメータすべてについてスキャンするように該装置を制御する。このようなシステムを備えることで、本発明の質量分析システムは、脂質混合物試料について、一度の測定で該試料に含まれるすべての脂質の解析を行うことができる。
【００６７】
本発明の質量分析システムにおけるデータ解析システムは、本発明の方法により得られる測定データを含むデータベースを含み、そして測定結果を自動的に該データベースと比較して検索することにより脂質の試料の同定を行う。該データ解析システムは、ＭＳ３以上の測定が可能な装置のコンピュータに搭載されていてよい。質量分析システムに脂質のデータ解析システムを備えることは、ハイスループット解析の実現に貢献する。
【００６８】
本発明の一態様において、本発明の質量分析システムは、さらに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）またはキャピラリー電気泳動（ＣＥ）等の分離手段を備えていてもよい。当該分離手段の試料出口は、質量分析システムにおける試料導入部に連結していてもよい。分離手段が液体クロマトグラフィーである場合には、いずれのカラムを用いてもよいが、好ましくは、順相カラムまたは逆相カラムを用いる。
【発明の効果】
【００６９】
本発明の脂質同定方法は、脂質混合物の試料について条件付きのニュートラルロススキャンを行うことにより極性基に由来するセレクションをＭＳ２段階で行い、さらに脂肪族炭化水素鎖の分析をＭＳ３段階で行う、といったように段階を追って脂質の同定を行うことができるため、脂質同定のエラーが飛躍的に飛躍的に減少し、脂質の同定を非常に効率よく行うことができる。本発明の脂質同定方法を利用することにより、脂質の同定についての解析速度の向上が見込めるので、ハイスループット解析が可能である。本発明の方法により、脂質分析の研究において非常に有用な解析手法を提供できる。
【００７０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００７１】
材料および装置
材料
すべての溶媒は、ＨＰＬＣグレードであり、そして和光純薬（日本、大阪）より購入した。脱イオン水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｗａｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（ミリポア；米国、マサチューセッツ州ミルフォード）より得た。
【００７２】
ブタ脳由来のスフィンゴミエリン（ＳＭ）混合物、およびラウロイルジヒドロスフィンゴミエリンは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（米国、アラバマ州アラバスター）から購入した。
【００７３】
また、リン脂質は以下のようにして得た。生体の雌のＷｉｓｔｅｒラットの脳（１ｇ）を、クロロホルム／メタノール（１：２）でホモジェナイズし、そしてリン脂質をＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの方法（Bligh, E. G. and Dyer, W. J., J. Med. Sci., 37: 911 (1959)）を用いて抽出した。全脂質抽出物を穏やかな窒素流の下で乾燥させ、そして４０００μＬのクロロホルム／メタノール（１：１）中に溶解した。
【００７４】
質量分析計
質量分析は、ＳＩＬ−１０ＡＤ  ＶＰオートサンプラーを備えたＬＣ−１０ＡＤ  ＶＰμ  ＨＰＬＣシステム（島津製作所）組み合わせた４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（登録商標）四重極−リニアイオントラップ  ハイブリッド質量分析計（Applied Biosystems/MDS Scies）を用いて行った。
【００７５】
質量分析に用いた条件は以下の通りである。抽出したリン脂質は、液体クロマトグラフィーによる分離を行わずに、フロー注入により直接、ＥＳＩ−ＭＳ分析にかけた。典型的には、２μＬの試料を適用した。移動相組成は、アセトニトリル／メタノール／水  ６：７：２（０．１％ギ酸アンモニウム含有）で、流速が４μＬ／分であった。質量分析計のスキャン範囲をｍ／ｚ  ４００−９５０に、スキャンスピードを１０００Ｄａ／ｓにセットした。トラップ充填時間は、ポジティブイオンモードで３ｍｓ、ネガティブイオンモードで５ｍｓにセットした。イオンスプレーのボルト数は、ポジティブイオンモードで５５００Ｖ、ネガティブイオンモードで−４５００Ｖにセットした。窒素を、カーテンガス（自由裁量のユニットで１０のセッティング）として、および衝突ガス（“ｈｉｇｈ”にセットした）として用いた。デクラスタリング電位を２０Ｖにセットして、インソース（in-source）フラグメント化を最小限にした。Ｑ１およびＱ３の両方の分解能を単位質量にセットした。分子量関連イオンにかける衝突エネルギーは、以下に示すそれぞれの実験によって変化させた。
【００７６】
実施例１：ニュートラルロススキャンによるコリン含有リン脂質の特異的検出
コリン含有リン脂質は、リン脂質の中でも細胞中に非常に多く含まれる分子であり、ホスファチジルコリン（ＰＣ）やスフィンゴミエリン（ＳＭ）等がこれに相当する。
【００７７】
ラット脳から抽出されたリン脂質混合物中のＰＣおよびＳＭの質量分析による分析を、ネガティブイオンモードでニュートラルロススキャンによって行った。この実験条件におけるＰＣおよびＳＭの分子量関連イオンはいずれも［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンである。これは、移動相のギ酸アンモニウムのギ酸が付加したものである。衝突誘起解離（ＣＩＤ）により、脂質の種類に特徴的なニュートラルロスが生じるが、ＰＣおよびＳＭは［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンからの（ＨＣＯ２＋ＣＨ３）のロスに対応する６０Ｄａについてのニュートラルロススキャンにより他の脂質から分離して検出された。これらのリン脂質の種は、ＨＰＬＣによる事前の分離なしに、脂質混合物から高い特異性をもって検出されたことに注目されたい。
【００７８】
しかしながら、ＰＣ種およびＳＭ種は、通常の実験条件下（衝突エネルギーが３０−４０ｅＶ）では互いに分離することはできなかった。ＳＭのみを検出可能な条件をネガティブイオンモードにおけるニュートラルロススキャン測定について探した。その結果、低い衝突エネルギー（３５−４５ｅＶ）を用いた場合、ＳＭはＰＣと共に検出される（図２（ｂ））が、高い衝突エネルギー（５５−７０ｅＶ）を用いた場合は、ＳＭ種のみが観察された（図２（ｃ））。このような結果になった理由は、ＰＣ種の［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンについて６０Ｄａのニュートラルロスにより生じるフラグメントイオンである［Ｍ−ＣＨ３］−イオンは、ＳＭ種についての対応する［Ｍ−ＣＨ３］−イオンよりも壊れやすいことによる。すなわち、高い衝突エネルギーではＰＣ種の［Ｍ−ＣＨ３］−イオンはより小さいフラグメントへと完全に解離するが、ＳＭ種の［Ｍ−ＣＨ３］−イオンは解離しないため、この条件ではＳＭ種の［Ｍ−ＣＨ３］−イオンのみが検出されるのである。
【００７９】
このように、測定したい脂質種に応じて適切な衝突エネルギーを選択してニュートラルロススキャンを行うことにより、測定したい脂質種に関連するイオンのみを分離することができる。
【００８０】
実施例２：ＭＳ３を用いるホスファチジルコリン（ＰＣ）種の同定方法
脂質混合物を、液体クロマトグラフィーによって事前に分離することなく質量分析にかけた場合には、ニュートラルロススキャンで検出されるイオンはＰＣ種の複数の異なるサブクラスおよび／または分子種のイオンを含む。リン脂質混合物中のＰＣ種のサブクラスおよび／または分子種の同定を、ＭＳ３ネガティブイオンモードで行った。ＰＣ種の分子量関連イオン（［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−）からの６０Ｄａのニュートラルロスにより生じる［Ｍ−ＣＨ３］−イオンについて、さらに衝突誘起解離（ＣＩＤ）を行うと、カルボキシレートイオン（［ＲＣＯＯ］−）を生じ（得られるスペクトルはＭＳ３スペクトルである）、脂肪族Ｏ−アシル鎖の情報を提供する。たとえば、ｍ／ｚ  ８７８の分子量関連イオン（［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−）からの６０Ｄａのニュートラルロスにより生じるｍ／ｚ  ８１８の［Ｍ−ＣＨ３］−イオンについてのＭＳ３スペクトルは、ｍ／ｚ  ２８３および３２７のカルボキシレートイオンを示し、これによりｍ／ｚ  ８７８のイオンは、ジアシル１８：０−２２：６  ＰＣであると同定できた（図３（ａ））。他のピークについても同様に、ｍ／ｚ  ８２６はジアシル１６：０−２０：４  ＰＣであり、そしてｍ／ｚ  ８０２はジアシル１６：０−１８：２  ＰＣであることを同定できた（図３（ｂ）および（ｃ））。また、ピーク強度としてはカルボキシレートイオンよりも小さいが、脱メチル化ＬＰＣ（リゾＰＣ）に対応するイオン、例えば、ｍ／ｚ  ４８０（１６：０アシル）、ｍ／ｚ  ５０８（１８：０アシル）、ｍ／ｚ  ５２８（２２：４アシル）、およびｍ／ｚ  ５５９（２２：６アシル）、も検出した（図３（ａ）−（ｃ）の点線枠内）。
【００８１】
実施例３：ＭＳ３を用いるスフィンゴミエリン（ＳＭ）種の同定方法
ブタ脳から抽出したスフィンゴミエリン（ＳＭ）混合物をＭＳ３で分析したところ、Ｎ−アシル鎖に対応するフラグメントイオンピークは検出されなかった。しかしながら、Ｎ−アシル鎖に対応するニュートラルロスにより生じたフラグメントイオンがスフィンゴシルホスホコリンイオン（［Ｍ−ＣＨ３−Ｒ１ＣＯ］−）として検出された。ＳＭ中のＮ−アシル鎖の情報は、ＭＳ３段階におけるプリカーサーイオンである［Ｍ−ＣＨ３］−イオンとそのフラグメントイオンの［Ｍ−ＣＨ３−Ｒ１ＣＯ］−イオンのｍ／ｚ値の違い、すなわちニュートラルロスの値、から導き出すことができる。例えば、ｍ／ｚ  ６８７のプリカーサーイオンとｍ／ｚ  ４４９のフラグメントイオンの間の質量の違いは２３８Ｄａ（１６：０ケテンのロス）であるのでＮ−アシル鎖は１６：０である。このことからｍ／ｚ  ７４７のＳＭをｄ１８：１−Ｃ１６：０  ＳＭとして同定した（図４（ａ））。他の種（ｍ／ｚ  ７７５および８５７のＳＭ）も同様に、２６６Ｄａ（１８：０ケテンのロス）および３４８Ｄａ（２４：１ケテンのロス）として観察された質量の違いから、ｄ１８：１−Ｃ１８：０  ＳＭおよびｄ１８：１−Ｃ２４：１  ＳＭとして同定した（図４（ｂ）および（ｃ））。
【００８２】
ＳＭの［Ｍ−ＣＨ３］−イオンに由来するセラミド関連イオン［Ｍ−Ｃｈ］−および［Ｍ−Ｃｈ−Ｈ２Ｏ］−もまた、例えば、ｍ／ｚ  ６１６および５９８（図４（ａ））、ｍ／ｚ  ６４４および６２６（図４（ｂ））、ならびに、ｍ／ｚ  ７２６および７０８（図４（ｃ））のように、同時に観察された。
【００８３】
これらの結論は、標準試料としてラウロイルジヒドロスフィンゴミエリン（ｄ１８：０−Ｃ１２：０  ＳＭ、図４（ｄ））を分析することにより確認した。ＳＭ（ｄ１８：１）の場合とは異なり、ＳＭ（ｄ１８：０）の［Ｍ−ＣＨ３］−イオンのプロダクトイオンスペクトル中にスフィンガニルホスホコリンイオンをｍ／ｚ  ４５１（ケテンとしてＣ１２：０部分の喪失）で検出した。ｍ／ｚ  ６３３のプリカーサーイオン（［Ｍ−ＣＨ３］−）およびｍ／ｚ  ４５１のフラグメントイオン（［Ｍ−ＣＨ３−Ｒ１ＣＯ］−）の間の質量の違いから、プリカーサーイオンがラウリル酸を含有することを確認した。また、ＮＨ（ＣＨ３）２の喪失により生じるイオン（［Ｍ−ＣＨ３−ＮＨ（ＣＨ３）２］−）、およびセラミド関連イオン（［Ｍ−Ｃｈ］−（ｍ／ｚ  ５６２）および［Ｍ−Ｃｈ−Ｈ２Ｏ］−（ｍ／ｚ  ５４４））も検出した（図４（ｄ））。このことは、フィトスフィンゴシンおよびスフィンガニン誘導体についても、この方法によりそれらのフラグメントイオンから効果的に同定することができることを意味している。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１−ａ】図１−ａは、グリセロリン脂質の分類を示した模式図である。
【図１−ｂ】図１−ｂは、各種のアシル型のグリセロリン脂質の構造式である。
【図１−ｃ】図１−ｃは、スフィンゴミエリンの構造式である。
【図２】図２は、ネガティブイオンモードにおけるニュートラルロススキャンによるホスファチジルコリン（ＰＣ）とスフィンゴミエリン（ＳＭ）の特異的検出を示すスペクトルである。（ａ）ラット脳由来の全リン脂質のマススペクトル。（ｂ）低い衝突エネルギー（３０−４５ｅＶ）における６０Ｄａのニュートラルロススペクトル。ＰＣとＳＭが共に検出された。（ｃ）高い衝突エネルギー（５５−７０ｅＶ）における６０Ｄａのニュートラルロススペクトル。ＳＭのみが特異的に検出された。
【図３】図３（ａ）−（ｃ）は、ネガティブイオンモードにおけるＰＣ種のＭＳ３段階でのプロダクトイオンスペクトルである。ＭＳ２段階において［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンは６０Ｄａのニュートラルロスにより［Ｍ−ＣＨ３］−イオンを生じた。そしてＭＳ３段階においては［Ｍ−ＣＨ３］−イオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ）により脂肪酸カルボキシレートアニオンおよび脱メチル化ＬＰＣ関連イオンを生じた。これらのスペクトルによりもとの分子量関連イオン［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンは：（ａ）ジアシル１８：０−２２：６  ＰＣ（ｍ／ｚ８７８）、（ｂ）ジアシル１６：０−２０：４  ＰＣ（ｍ／ｚ  ８２６）、（ｃ）ジアシル１６：０−１８：２  ＰＣ（ｍ／ｚ  ８０２）であると同定した。図３（ｄ）は、ＰＣのネガティブイオンモードでのフラグメンテーションパターンを示す模式図である。
【図４】図４（ａ）−（ｃ）は、ネガティブイオンモードにおけるＳＭ種のＭＳ３段階でのプロダクトイオンスペクトルである。ＭＳ２段階において［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンは６０Ｄａのニュートラルロスにより［Ｍ−ＣＨ３］−イオンを生じた。そしてＭＳ３段階においては［Ｍ−ＣＨ３］−イオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ）によるＮ−アシル脂肪族鎖のロスにより、スフィンゴシルホスホコリン（１８：１、ｍ／ｚ  ４４９）イオンを生じた。これらのスペクトルによりもとの分子量関連イオン［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−イオンは：（ａ）ｄ１８：１−Ｃ１６：０  ＳＭ（ｍ／ｚ  ７４７）、（ｂ）ｄ１８：１−Ｃ１８：０  ＳＭ（ｍ／ｚ  ７７５）、（ｃ）ｄ１８：０−Ｃ２４：１  ＳＭ（ｍ／ｚ  ８５７）であると同定した。図４（ｄ）は、標準試料のラウロイルジヒドロスフィンゴミエリン（ｄ１８：０−Ｃ１２：０  ＳＭ、［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−のｍ／ｚは６９３）のＭＳ３段階でのプロダクトイオンスペクトルである。Ｎ−アシル脂肪族鎖の脱離により、スフィンガニルホスホコリンイオン（１８：０、ｍ／ｚ  ４５１）を生じた。図４（ｅ）は、ＳＭのネガティブイオンモードでのフラグメンテーションパターンを示す模式図である。
【図１−ａ】
2006226730.tif 000002
【図１−ｂ】
2006226730.tif 000003
【図１−ｃ】
2006226730.tif 000004
【図２】
2006226730.tif 000005
【図３】
2006226730.tif 000006
【図４】
2006226730.tif 000007