(57)【要約】【課題】  βアミロイドによりアストログリア細胞で発現が誘導される新規な遺伝子を見出すことであり、さらに該遺伝子がコードするポリペプチドを同定し、該遺伝子および該ポリペプチド等をβアミロイドに関連した神経疾患の診断および治療を目的とする手段として使用すること。【解決手段】  βアミロイド刺激により発現が誘導される新規遺伝子をｃＤＮＡサブトラクション法により取得し、新規ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチドの製造法、上記のものを用いた該遺伝子および／または蛋白質の発現を調節する化合物の同定法、該方法で得られる化合物、ならびにこれらを用いたβアミロイドに関連した神経疾患のための医薬組成物、診断方法、診断用キット、治療方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれかのポリヌクレオチドまたはその相補鎖：
（１）配列表の配列番号１または３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（２）配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記の群より選ばれるポリヌクレオチドまたはその相補鎖：
（１）請求項１の（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドと少なくとも７０％の塩基配列上の相同性を有し、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（２）請求項１の（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（３）請求項１の（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加され、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
下記のいずれかのポリペプチド：
（１）請求項３に記載のポリペプチドと少なくとも７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチド；または
（２）請求項３に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加され、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項６】
プラスミド  ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５４号）。
【請求項７】
請求項５に記載の組換えベクターまたは請求項６に記載のプラスミドを用いて形質転換させた形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項３または４に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体。
【請求項１０】
以下の工程を含有する、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生を阻害する化合物および／または抑制する化合物の同定方法：
（１）細胞にβアミロイドおよび候補化合物を添加する工程；および
（２）該細胞においてＭｉｂの発現が阻害および／または抑制された場合に、該候補化合物をアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生を阻害する化合物および／または抑制する化合物として同定する工程。
【請求項１１】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３もしくは４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載のプラスミド、請求項７に記載の形質転換体、または請求項９に記載の抗体のうち少なくとも１つを用いることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の同定方法により同定された化合物。
【請求項１３】
脳組織由来の被検組織が、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患に罹患した患者由来の組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする、判定方法。
【請求項１４】
脳組織由来の被検組織が、アルツハイマー病患者由来の組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする、判定方法。
【請求項１５】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３もしくは４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載のプラスミド、請求項７に記載の形質転換体、請求項９に記載の抗体、または請求項１２に記載の化合物のうち少なくとも１つを用いることを特徴とする、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患の診断用キット。
【請求項１６】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３もしくは４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載のプラスミド、請求項７に記載の形質転換体、請求項９に記載の抗体、または請求項１２に記載の化合物のうち少なくとも１つを用いることを特徴とする、アルツハイマー病の診断用キット。
【請求項１７】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３もしくは４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載のプラスミド、請求項７に記載の形質転換体、請求項９に記載の抗体、または請求項１２に記載の化合物のうち少なくとも１つを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３もしくは４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載のプラスミド、請求項７に記載の形質転換体、請求項９に記載の抗体、または請求項１２に記載の化合物のうち少なくとも１つを含む、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患の改善および／または治療剤。
【請求項１９】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、請求項３もしくは４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載のプラスミド、請求項７に記載の形質転換体、請求項９に記載の抗体、または請求項１２に記載の化合物のうち少なくとも１つを含む、アルツハイマー病の改善および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の原因の１つと考えられるβアミロイド蛋白質により、発現が誘導される新規遺伝子Ｍｉｂ（ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ）に関する。本発明は、Ｍｉｂの塩基配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法、該ポリペプチドに対する抗体、これらを用いたＭｉｂの発現を阻害および／または抑制する化合物の同定方法、該同定方法により得られた化合物、上記のポリヌクレオチド等を用いることを特徴とするアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）等の診断方法、Ｍｉｂの発現を検出する工程を含むアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）等の診断用キット、ならびに上記のポリヌクレオチド等を含む医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
βアミロイドは、アルツハイマー病患者の脳で観察される老人斑の構成因子であり、アルツハイマー病の初期発症段階で重要な因子と考えられている。βアミロイドは、βアミロイド前駆体からある種のプロテアーゼでプロセシングされ、不溶性のβシート構造の凝集体を形成する。βアミロイドは神経細胞に直接的または間接的に作用し、アルツハイマー病の進行を促すと考えられている。βアミロイドの間接的作用の１つとして、アストログリア細胞の活性化が知られている。アストログリア細胞は、βアミロイドで活性化されると、その突起を老人斑に伸長させたり、炎症性因子を含むいくつかの機能因子を生産したりすることが知られている（例えば、非特許文献１〜３を参照のこと）。老人斑により損傷を受けた神経細胞の修復およびβアミロイドの排除という役割を果たすと考えられていたこのアストログリア細胞の活性化は、実際には、このアストログリア細胞が炎症性因子を分泌してしまうので神経細胞の損傷を悪化させてしまうことが知られている。また、βアミロイドの非存在下では神経突起の伸長を促進するアストログリア細胞は、βアミロイドの存在下ではβアミロイドによる神経細胞の破壊を助長することが報告されている（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
【０００３】
本発明者はβアミロイドにより発現が誘導される遺伝子としてプロスタグランジンＥ２合成酵素（特許文献１を参照のこと）、アグリカナーゼ−１（ＡＤＡＭＴＳ−４：ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｍｏｔｉｆｓ−４）（特許文献２を参照のこと）、およびＬｉｂ（特許文献３を参照のこと）をすでに見出している。しかしながら、βアミロイドがアストグリア細胞の活性化を介してアルツハイマー病を増悪化する機構およびβアミロイドによりアストログリア細胞において遺伝子および／または蛋白質の発現が誘導あるいは抑制される因子についての解析は未だ十分でない。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−２５８５７５号公報
【特許文献２】特開２００１−３５２９９１号公報
【特許文献３】特開２００３−１６４２９０号公報
【非特許文献１】Ｍａｒｋ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２６，ｐｐ８１６−８２３（１９９５）
【非特許文献２】ＭｃＧｅｅｒ，Ｐ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２１，ｐｐ１９５−２１８（１９９５）
【非特許文献３】Ｅｄｄｌｅｓｔｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５４，ｐｐ１５−３６（１９９３）
【非特許文献４】Ｍ．Ｒ．Ｄｏｍｅｎｉｃｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｉｓ  ９６，ｐｐ３１３−３１６（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、アストログリア細胞においてβアミロイドにより発現が誘導される遺伝子を見出し、見出された遺伝子をアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）等の診断および／または治療に用いることである。他の本発明の課題は、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）等の診断および／または治療に用いることができる、該遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチドがコードするポリペプチドおよび該ポリペプチドに対する抗体を提供することである。また、他の本発明の課題は、該ポリヌクレオチドおよび／または該ポリペプチドの発現を阻害および／または抑制する化合物の同定方法、ならびに該同定方法で同定される化合物を提供することである。さらに、他の本発明の課題は、これらを使用したアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）等の診断用キット、診断方法、医薬組成物、および治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
課題解決のため、本発明者は、βアミロイド処理および未処理のラット胎仔由来アストログリア細胞の発現遺伝子を用いてｃＤＮＡサブトラクション処理を実施した。βアミロイド処理で発現が誘導される遺伝子を同定し、その遺伝子の塩基配列がコードするアミノ酸配列を有する蛋白質を決定することにより、本発明を完成した。さらに、ヒトにおける該遺伝子のオーソログを見出し、配列を決定した。
【０００７】
さらに、本発明の遺伝子は、アルツハイマー病に罹患していないヒトの脳では神経細胞に発現し、アルツハイマー病に罹患しているヒトの脳では神経細胞で発現が低下し、アストログリア細胞で発現が亢進していた。このことは、本発明の遺伝子がアストログリア細胞と関連する疾患（例えばアルツハイマー病）に関連する遺伝子であることを示唆するものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下：
［１］下記のいずれかのポリヌクレオチドまたはその相補鎖：
（１）配列表の配列番号１または３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（２）配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［２］下記の群より選ばれるポリヌクレオチドまたはその相補鎖：
（１）［１］の（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドと少なくとも７０％の塩基配列上の相同性を有し、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（２）［１］の（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションし、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（３）［１］の（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加され、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［３］配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
［４］下記のいずれかのポリペプチド：
（１）［３］に記載のポリペプチドと少なくとも７０％のアミノ酸配列上の相同性を有し、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチド；または
（２）［３］に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加され、かつアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチド；
［５］［１］または［２］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター；
［６］プラスミド  ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５４号）；
［７］［５］に記載の組換えベクターまたは［６］に記載のプラスミドを用いて形質転換させた形質転換体；
［８］［７］に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ポリペプチドの製造方法；
［９］［３］または［４］に記載のポリペプチドを免疫学的に認識する抗体；
［１０］以下の工程を含有する、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生を阻害する化合物および／または抑制する化合物の同定方法：
（１）細胞にβアミロイドおよび候補化合物を添加する工程；および
（２）該細胞においてＭｉｂの発現が阻害および／または抑制された場合に、該候補化合物をアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生を阻害する化合物および／または抑制する化合物として同定する工程；
［１１］［１］もしくは［２］に記載のポリヌクレオチド、［３］もしくは［４］に記載のポリペプチド、［５］に記載の組換えベクター、［６］に記載のプラスミド、［７］に記載の形質転換体、または［９］に記載の抗体のうち少なくとも１つを用いることを特徴とする、［１０］に記載の方法；
［１２］［１０］または［１１］に記載の同定方法により同定された化合物；
［１３］脳組織由来の被検組織が、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患に罹患した患者由来の組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における［１］または［２］に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする、判定方法；
［１４］脳組織由来の被検組織が、アルツハイマー病患者由来の組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における［１］または［２］に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする、判定方法；
［１５］［１］もしくは［２］に記載のポリヌクレオチド、［３］もしくは［４］に記載のポリペプチド、［５］に記載の組換えベクター、［６］に記載のプラスミド、［７］に記載の形質転換体、［９］に記載の抗体、または［１２］に記載の化合物のうち少なくとも１つを用いることを特徴とする、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患の診断用キット；
［１６］［１］もしくは［２］に記載のポリヌクレオチド、［３］もしくは［４］に記載のポリペプチド、［５］に記載の組換えベクター、［６］に記載のプラスミド、［７］に記載の形質転換体、［９］に記載の抗体、または［１２］に記載の化合物のうち少なくとも１つを用いることを特徴とする、アルツハイマー病の診断用キット；
［１７］［１］もしくは［２］に記載のポリヌクレオチド、［３］もしくは［４］に記載のポリペプチド、［５］に記載の組換えベクター、［６］に記載のプラスミド、［７］に記載の形質転換体、［９］に記載の抗体、または［１２］に記載の化合物のうち少なくとも１つを含む、医薬組成物；
［１８］［１］もしくは［２］に記載のポリヌクレオチド、［３］もしくは［４］に記載のポリペプチド、［５］に記載の組換えベクター、［６］に記載のプラスミド、［７］に記載の形質転換体、［９］に記載の抗体、または［１２］に記載の化合物のうち少なくとも１つを含む、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患の改善および／または治療剤；
［１９］［１］もしくは［２］に記載のポリヌクレオチド、［３］もしくは［４］に記載のポリペプチド、［５］に記載の組換えベクター、［６］に記載のプラスミド、［７］に記載の形質転換体、［９］に記載の抗体、または［１２］に記載の化合物のうち少なくとも１つを含む、アルツハイマー病の改善および／または治療剤；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明はβアミロイド処理により発現が誘導される遺伝子を提供するものである。本発明の遺伝子の発現および／または機能を利用した医薬組成物および／または診断手段等の提供は、アルツハイマー病等のβアミロイドに関連した疾患の臨床および基礎の医療分野で利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（アストログリア細胞のβアミロイド処理）
アストログリア細胞は各種動物の脳から調製できる。用いる動物としては、例えば、脳組織を採取し易いラット、マウス、モルモット、ウサギ等のげっ歯類が挙げられ、好ましくは、ラットが挙げられる。用いる脳組織としては、好ましくは、胎仔由来の脳が用いられる。胎仔由来の脳からのアストログリア細胞の調製は自体公知の方法が用いられる。その方法は実験医学別冊神経生化学マニュアル（伊藤仁一ら  羊土社（１９８９））などに開示されている。
【００１１】
アストログリア細胞に作用させるβアミロイドは市販されており、Ａｎａｓｐｅｃ社などから入手できる。また、βアミロイドは、遺伝子工学的手法により作成することもできる。処理させる前にβアミロイドは遠心処理等により凝集させてもよい。βアミロイドの添加濃度および処理時間は生理活性を示す範囲で適宜選択される。濃度としては２５〜５０μＭ、処理時間としては１０〜２０時間が好ましい。また、培養容器にアストログリア細胞を播種し、βアミロイドの希釈に用いた緩衝液を等量添加することによりβアミロイド未処理アストログリア細胞を調製できる。
【００１２】
（発現遺伝子の調製）
βアミロイド処理および未処理のアストログリア細胞の発現遺伝子は通常用いられるＲＮＡ抽出法により採取できる。発現遺伝子は、ｍＲＮＡのままで用いてもｃＤＮＡ化して用いてもよい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は逆転写酵素等を用いた方法が適用できる。全ＲＮＡを得るには、例えば、ＡＧＰＣ法（酸性グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，ｐｐ１５６−１５９（１９８６））が適用でき、全ＲＮＡからのｍＲＮＡの抽出にはオリゴｄＴカラム等を用いたｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡの精製法によればよい。ＲＮＡサンプルは複数回の実験で得たものを混合して用いることもできる。各ロットの品質を解析するためには、アストログリア細胞での発現が知られているいくつかの遺伝子の発現をモニターするとよい。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ｐ７５などをモニター遺伝子として選び、これらの発現が同等であるサンプルを使用するとよい。
【００１３】
（サブトラクション処理）
βアミロイド処理により発現が誘導される遺伝子を獲得する方法としては、例えば、サブトラクション処理またはディファレンシャルディスプレイ法が挙げられる。サブトラクション処理では差し引かれる側の遺伝子群（テスター）と差し引く側の遺伝子群（ドライバー）の二組の遺伝子群を用いる。例えば、βアミロイドにより発現が誘導される遺伝子を獲得するためには、テスターとしてβアミロイド処理細胞から得られた遺伝子（βアミロイド処理遺伝子）、ドライバーとして未処理細胞から得られた遺伝子（未処理遺伝子）を用いたサブトラクションを行うとよい。サブトラクション処理の方法としては、既知の各種手段を利用可能である（特開平３−１１７４８８号）。好ましくはｃＤＮＡサブトラクション法が挙げられ、ｃＤＮＡサブトラクション法としては、ＲＤＡ法（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＰＣＲ−選択（ＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔ）ｃＤＮＡ法などが特に好ましい。
【００１４】
サブトラクション処理では、サブトラクションの陽性対照として、テスター側に適当なＤＮＡフラグメントを加え、その濃縮を確認することにより、サブトラクション処理の効率を確認できる。また、βアミロイド処理により発現が誘導されることが知られている遺伝子をプローブとして、サブトラクション前およびサブトラクション後のＰＣＲ産物についてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを行うと、同様にサブトラクション処理の成否を確認することができる。βアミロイド処理により発現が誘導されることが知られている遺伝子としては、ＮＧＦ、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）等が挙げられる。
【００１５】
サブトラクション処理後のＰＣＲ産物を適当なベクターへ挿入し、プラスミドライブラリーなどを作成する。ベクター挿入部分をＰＣＲにより増幅し、それらの遺伝子をメンブレンにドットブロットしたものを２セット作製する。このドットブロットしたメンブレンに対して、テスターとしてβアミロイド処理遺伝子、ドライバーとして未処理遺伝子を用いたサブトラクション処理後のＰＣＲ産物〔以下、サブトラクション処理を（テスター）−（ドライバー）の式で表す。〕と（未処理遺伝子）−（βアミロイド処理遺伝子）のサブトラクション後のＰＣＲ産物プローブでそれぞれハイブリダイゼーションを実施する。（未処理遺伝子）−（βアミロイド処理遺伝子）のサブトラクション後のＰＣＲ産物と比較して、（βアミロイド処理遺伝子）−（未処理遺伝子）のサブトラクション後のＰＣＲ産物において特異的に濃縮が認められるクローンを、βアミロイド処理によって発現が誘導される遺伝子とすればよい。ベクター挿入部分はＤＮＡシークエンス法によりその配列を決定することができる。
【００１６】
（ラット遺伝子の取得）
本発明において提供される遺伝子は、ラット胎仔由来アストログリア細胞を用いたｃＤＮＡサブトラクション処理により、新規な蛋白質をコードする遺伝子としてそのｃＤＮＡの一部が取得されたものである。βアミロイド添加により発現誘導される遺伝子としてラット胎仔のアストログリア細胞よりｃＤＮＡサブトラクション法を用いてクローニングしたこのｃＤＮＡフラグメントは、データベース上のいかなる遺伝子とも相同性を示さず、新規遺伝子であることを確認した。作製したβアミロイド処理ラット胎仔アストログリア細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを用いて、該ｃＤＮＡフラグメントをプローブとしてスクリーニングしたところ約７キロ塩基対（ｂｐ）のｃＤＮＡを得た。蛍光色素（Ｃｙ５；ファルマシア社製）標識Ｍ１３ユニバーサルプライマー、リバースプライマー、および内部配列プライマーを用いてシークエンス反応を行い、ＡＬＦ  Ｅｘｐｒｅｓｓ蛍光シークエンサー（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡの配列を決定した。この配列解析により、本ラット遺伝子は、塩基配列（配列番号１）が６，９９６ｂｐであり、アミノ酸配列（配列番号２）が２，１０６アミノ酸の蛋白質をコードすることを明らかにした。また、本ラット遺伝子のＯＲＦ領域（ヌクレオチド３７１〜ヌクレオチド６６８１）を、ＤＤＢＪにアクセッションナンバーＡＢ１６１２２９で登録（未公開）した。
【００１７】
予測プログラムＰＳＯＲＴにて本ラット蛋白質を解析すると、シグナル配列（アミノ酸１〜２７）に続き、２３回の膜貫通領域（アミノ酸３３〜４９、アミノ酸８２〜９８、アミノ酸１４３〜１５９、アミノ酸１６５〜１８１、アミノ酸１９６〜２１２、アミノ酸２４８〜２６４、アミノ酸３６１〜３７７、アミノ酸３８７〜４０３、アミノ酸４０９〜４２５、アミノ酸４８６〜５０２、アミノ酸５４８〜５６４、アミノ酸５６８〜５８４、アミノ酸５９９〜６１５、アミノ酸７１７〜７３３、アミノ酸７３９〜７５５、アミノ酸７６９〜７８５、アミノ酸１２４７〜１２６３、アミノ酸１２６４〜１２８０、アミノ酸１５３８〜１５５４、アミノ酸１５７６〜１５９２、アミノ酸１６１０〜１６２６、アミノ酸１７５３〜１７６９、アミノ酸２０２０〜２０３６）を有していた。膜貫通領域を多数有していることから、ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ（Ｍｉｂ）と名付け、本ラット遺伝子をラットＭｉｂ（以下、ｒＭｉｂとも称する）とした。本発明のラットＭｉｂの組織分布を調べると、肺と腎臓で約９ｋｂｐの転写産物の発現を認めた。
【００１８】
本明細書において、「Ｍｉｂ」とは、ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄであり、特に記載がない限り、Ｍｉｂ遺伝子またはＭｉｂ蛋白質またはそれら両方を指す場合に使用する。
【００１９】
（ヒトオーソログの取得）
ラットＭｉｂのヒトオーソログ（以下、ヒトＭｉｂまたはｈＭｉｂとも称する）を見出すため、ＮＣＢＩヒトゲノムデータベースを検索した。ヒトの対応配列の一部がＮＣＢＩゲノムデータベース上に見つかった。この対応配列の一部からプライマー等を設計し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりヒト小腸由来ポリＡ（＋）ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）からクローニングした。蛍光色素（Ｂｉｇｄｙｅ；ＡＢＩ社製）標識ターミネーター、ならびに、Ｍ１３ユニバーサルプライマー、リバースプライマー、および内部配列プライマーを用いてシークエンス反応を行い、蛍光キャピラリーシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００（ＡＢＩ社製）を用いて配列を決定した。このヒト遺伝子は、塩基配列（配列番号３）が６，７９５ｂｐであり、アミノ酸配列（配列番号４）が２０９０アミノ酸の蛋白質をコードした。このヒトＭｉｂ遺伝子のＯＲＦ領域（ヌクレオチド２６５〜ヌクレオチド６５３４）を、ＤＤＢＪにアクセッションナンバーＡＢ１６１２３０で登録（未公開）した。予測プログラムＰＳＯＲＴにて本ヒト蛋白質を解析すると、シグナル配列（アミノ酸１〜２７）に続き、２４回の膜貫通領域（アミノ酸３３〜４９、アミノ酸８３〜９９、アミノ酸１４８〜１６４、アミノ酸１６６〜１８２、アミノ酸１９７〜２１３、アミノ酸２４９〜２６５、アミノ酸３７８〜３９４、アミノ酸３９９〜４１５、アミノ酸４２１〜４３７、アミノ酸４９８〜５１４、アミノ酸５６０〜５７６、アミノ酸５８０〜５９６、アミノ酸６１１〜６２７、アミノ酸７２９〜７４５、アミノ酸７５１〜７６７、アミノ酸７８１〜７９７、アミノ酸１２５８〜１２７４、アミノ酸１２７５〜１２９１、アミノ酸１３００〜１３１６、アミノ酸１５３２〜１５４８、アミノ酸１５６９〜１５８５、アミノ酸１６０４〜１６２０、アミノ酸１７４７〜１７６３、アミノ酸２００４〜２０２０）を有していた。ヒトＭｉｂはラットＭｉｂとアミノ酸レベルで８３％、ヌクレオチドレベルで６９％の相同性を示した（図２〜４）。ヒトＭｉｂの組織分布を調べたところ、心臓、胎盤、肺、肝臓、腎臓、膵臓で約１１．６ｋｂｐおよび約９．０ｋｂｐの転写産物の強い発現を認めた。
【００２０】
本発明者は、Ｍｉｂ遺伝子を、ｃＤＮＡサブトラクション法によりβアミロイド処理で発現が誘導される遺伝子として同定した。βアミロイドはアルツハイマー病の進行を促すと考えられている因子である。Ｍｉｂ遺伝子は、βアミロイド刺激のない状態では、ラット脳でほとんど発現せず、ヒト脳においても他の臓器より発現が低かった。本発明者は、これらの発現動態からＭｉｂ遺伝子はβアミロイド刺激によって脳内で発現し、それによってその機能を発揮すると考えている。
【００２１】
Ｍｉｂ遺伝子の発現および／または機能を抑制することによるアルツハイマー病の抑制効果が期待される。例えば、脳内にβアミロイドの沈着が存在する状態であってもＭｉｂ遺伝子の発現を抑制することによって、Ｍｉｂ遺伝子の発現を抑制することによってアルツハイマー病の抑制、遅延、改善、および／または治療が可能になると考えている。
【００２２】
（Ｍｉｂの機能）
一般に、細胞は、成体の定常状態の脳内では移動しないが、脳疾患などにより神経細胞が損傷を受けると、この損傷を修復および／または保護するためにグリア細胞が損傷部位へ移動することが知られている。アルツハイマー病のβアミロイドが凝集した老人斑周辺では、神経原繊維変化を伴う神経細胞の損傷と神経細胞の脱落が知られている。このときアストログリア細胞は、生体内で異物となった不溶性蛋白質凝集体（すなわち、老人斑）の影響をそれ以上に広げないために、老人斑を取り囲むように損傷部位に移動し、プラークのコアへ向け突起を伸長させることが知られている。アストログリア細胞の病変損傷部位への集積および突起の伸長は、本来、老人斑により損傷を受けた神経細胞の修復と異物の排除を目的とした生体防御機構であるはずだが、実際には、このアストログリア細胞が炎症性因子を分泌し、脆弱化している神経細胞の損傷をさらに悪化させることが知られている。また、βアミロイドの非存在下では神経突起の伸長を促進するアストログリア細胞は、βアミロイドの存在下ではβアミロイドによる神経細胞の損傷を助長することも知られている。
【００２３】
一方、本発明者は、ラットにおいてβアミロイド処理によって脳内で発現が誘導されるラットＭｉｂ遺伝子を見出した。この遺伝子は、その構造から細胞膜に局在することが推定された。また、ヒトＭｉｂ遺伝子はアルツハイマー病に罹患していないヒトの脳では神経細胞に発現するが、アルツハイマー病に罹患しているヒトの脳の老人斑周辺では神経細胞で発現が低下し、アストログリア細胞で発現が亢進するということを見出した。
【００２４】
上記のようなβアミロイドが凝集したときのアストログリア細胞の特性と、Ｍｉｂの発現がβアミロイドにより誘導されること、Ｍｉｂの発現がアルツハイマー病患者の老人斑に隣接するアストログリア細胞に特異的な発現を示すこと、Ｍｉｂは細胞膜に局在することが推定されていることから判断すると、Ｍｉｂはβアミロイド刺激によってアストログリア細胞の細胞膜に発現し、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連することが推測され、結果としてアルツハイマー病の進行に関わると本発明者は考えている。その場合、Ｍｉｂは、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と直接関連するか、または細胞膜に発現したＭｉｂにリガンド等が結合し、その下流にシグナルを伝達してアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞からの炎症性因子の生産および／または分泌と関連すると考えている。
【００２５】
アストログリア細胞の移動を測定する方法としては、例えば、再構成した細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を塗布した孔のあるメンブレンを用いた方法が挙げられる。具体的には、本発明のＭｉｂ遺伝子を発現させたアストログリア細胞等またはｓｉＲＮＡ法によってＭｉｂ遺伝子の発現量を低下させたアストログリア細胞等を調製し、該細胞を該メンブレン上に播種する。静置した後、移動せずに上部チャンバー表面に残った細胞を綿棒で除去し、チャンバー裏部へ移動した細胞を固定する。この細胞を染色し、顕微鏡等で計数することによってアストログリア細胞の移動を測定することができる。本実験には、Ｍｉｂ遺伝子を発現させていないアストログリア細胞等またはｓｉＲＮＡ法に供していないアストログリア細胞等をコントロール細胞として用いることができる。再構成したＥＣＭを塗布した孔のあるメンブレンとしては、例えば、ＢｉｏＣｏａｔ  ｍａｔｒｉｇｅｌ  ２４  ｗｅｌｌチャンバー（ＢＤファルコン社製）が挙げられる。
【００２６】
アストログリア細胞の突起の伸長を測定する方法としては、例えば、遺伝子導入によって本発明のＭｉｂ遺伝子を発現させたアストログリア細胞等またはｓｉＲＮＡ法によってＭｉｂ遺伝子の発現量を低下させたアストログリア細胞等の突起伸長を誘発させ、突起の長さまたは突起の数を顕微鏡で直接測定する方法が挙げられる。本実験には、Ｍｉｂ遺伝子を発現させていないアストログリア細胞等またはｓｉＲＮＡ法に供していないアストログリア細胞等をコントロール細胞として用いることができる。
【００２７】
アストログリア細胞の炎症性因子の生産および／または分泌を測定する方法としては、例えば、本発明のＭｉｂ遺伝子を発現させたアストログリア細胞等において、ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲによって炎症性因子をコードするｍＲＮＡの発現量を測定する方法、またはＥＬＩＳＡによって炎症性因子の蛋白質量を測定する方法が挙げられる。あるいは、ｓｉＲＮＡ法によってＭｉｂ遺伝子の発現量を低下させたアストログリア細胞等を作製し、該細胞における炎症性因子の発現量または蛋白質量をノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＥＬＩＳＡを用いて測定する方法が挙げられる。これらの方法には、Ｍｉｂ遺伝子を発現させていないアストログリア細胞等またはｓｉＲＮＡ法に供してないアストログリア細胞等をコントロール細胞として用いることができる。本発明のＭｉｂ遺伝子とその生成量および／または分泌量が関連すると考えている炎症性因子としては、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）、Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、Ｓ１００β等が挙げられる。
【００２８】
（ポリヌクレオチドおよびその相補鎖）
本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖としては、配列表の配列番号１または３に記載の塩基配列またはその部分塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列表の配列番号１または３に記載の塩基配列またはその部分塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはその相補鎖、配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、あるいは配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしては、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリヌクレオチドが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドとしては、翻訳される蛋白質が細胞膜局在性を有するポリヌクレオチドが好ましい。
【００２９】
部分塩基配列としては、Ｍｉｂの特徴的な構造部分のアミノ酸断片をコードする塩基配列が挙げられる。このような部分塩基配列としては、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のシグナル配列部分または膜貫通領域、すなわち、アミノ酸１〜２７、またはアミノ酸３３〜４９、アミノ酸８２〜９８、アミノ酸１４３〜１５９、アミノ酸１６５〜１８１、アミノ酸１９６〜２１２、アミノ酸２４８〜２６４、アミノ酸３６１〜３７７、アミノ酸３８７〜４０３、アミノ酸４０９〜４２５、アミノ酸４８６〜５０２、アミノ酸５４８〜５６４、アミノ酸５６８〜５８４、アミノ酸５９９〜６１５、アミノ酸７１７〜７３３、アミノ酸７３９〜７５５、アミノ酸７６９〜７８５、アミノ酸１２４７〜１２６３、アミノ酸１２６４〜１２８０、アミノ酸１５３８〜１５５４、アミノ酸１５７６〜１５９２、アミノ酸１６１０〜１６２６、アミノ酸１７５３〜１７６９、もしくはアミノ酸２０２０〜２０３６のいずれかのアミノ酸断片をコードする塩基配列が挙げられる。あるいは、このような部分塩基配列としては、例えば、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のシグナル配列または膜貫通領域、すなわち、アミノ酸１〜２７、またはアミノ酸３３〜４９、アミノ酸８３〜９９、アミノ酸１４８〜１６４、アミノ酸１６６〜１８２、アミノ酸１９７〜２１３、アミノ酸２４９〜２６５、アミノ酸３７８〜３９４、アミノ酸３９９〜４１５、アミノ酸４２１〜４３７、アミノ酸４９８〜５１４、アミノ酸５６０〜５７６、アミノ酸５８０〜５９６、アミノ酸６１１〜６２７、アミノ酸７２９〜７４５、アミノ酸７５１〜７６７、アミノ酸７８１〜７９７、アミノ酸１２５８〜１２７４、アミノ酸１２７５〜１２９１、アミノ酸１３００〜１３１６、アミノ酸１５３２〜１５４８、アミノ酸１５６９〜１５８５、アミノ酸１６０４〜１６２０、アミノ酸１７４７〜１７６３、アミノ酸２００４〜２０２０のいずれかのアミノ酸断片をコードする塩基配列が挙げられる。
【００３０】
また、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖としては、上記のポリヌクレオチドと少なくとも約７０％の塩基配列上の相同性を有するポリヌクレオチドもしくはその相補鎖であって、かつ全長のＭｉｂと実質的に同質の機能を有するものが挙げられる。Ｍｉｂの機能としては、好ましくは、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしては、翻訳される蛋白質が細胞膜局在性を有するポリヌクレオチドが好ましい。その選択されるポリヌクレオチドは、好ましくは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上、より好ましくは約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上、さらに好ましくは約９０％、約９５％、または約９９％以上の塩基配列上の相同性を有する。塩基配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えば塩基配列を直接決定する方法を使用することができる。
【００３１】
また、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖としては、上記のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドもしくはその相補鎖であって、かつ全長のＭｉｂと実質的に同質の機能を有するものが挙げられる。Ｍｉｂの機能としては、好ましくは、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしては、翻訳される蛋白質が細胞膜局在性を有するポリヌクレオチドが好ましい。「ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド」は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９））に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳおよび５０％  ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも判別可能な陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察されることを表す。
【００３２】
また、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖としては、上記のポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加されたポリヌクレオチドもしくはその相補鎖であって、かつ全長のＭｉｂと実質的に同質の機能を有するものが挙げられる。Ｍｉｂの機能としては、好ましくは、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしては、翻訳される蛋白質が細胞膜局在性を有するポリヌクレオチドが好ましい。ヌクレオチドの欠失、置換、または付加の手段は自体公知であり、エキソヌクレアーゼを用いた欠失変異体の作製法、または部位特異的突然変異誘発法などが挙げられる。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、いずれも本発明のポリペプチドの製造に有用な遺伝子を提供するものである。また、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ検出のためのプローブもしくはプライマーとして、あるいは遺伝子発現を調節するアンチセンスオリゴマーとして使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをアンチセンスとして使用する場合、本発明のポリヌクレオチドの発現が特異的に阻害される。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、核酸に関する試薬としても利用できる。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００３４】
（ポリペプチド）
本発明のポリペプチドとしては、配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、本発明のポリペプチドとしては、配列表の配列番号２または４に記載のアミノ酸配列またはその部分アミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。本発明のポリペプチドとしては、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能を有するポリペプチドが好ましい。また、本発明のポリペプチドとしては、翻訳される蛋白質が細胞膜局在性を有するポリペプチドが好ましい。
【００３５】
部分アミノ酸配列としては、Ｍｉｂの特徴的な構造部分のアミノ酸断片が挙げられる。このような部分アミノ酸配列としては、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のシグナル配列部分または膜貫通領域、すなわち、アミノ酸１〜２７、またはアミノ酸３３〜４９、アミノ酸８２〜９８、アミノ酸１４３〜１５９、アミノ酸１６５〜１８１、アミノ酸１９６〜２１２、アミノ酸２４８〜２６４、アミノ酸３６１〜３７７、アミノ酸３８７〜４０３、アミノ酸４０９〜４２５、アミノ酸４８６〜５０２、アミノ酸５４８〜５６４、アミノ酸５６８〜５８４、アミノ酸５９９〜６１５、アミノ酸７１７〜７３３、アミノ酸７３９〜７５５、アミノ酸７６９〜７８５、アミノ酸１２４７〜１２６３、アミノ酸１２６４〜１２８０、アミノ酸１５３８〜１５５４、アミノ酸１５７６〜１５９２、アミノ酸１６１０〜１６２６、アミノ酸１７５３〜１７６９、もしくはアミノ酸２０２０〜２０３６）のいずれかのアミノ酸断片が挙げられる。あるいは、このような部分アミノ酸配列としては、例えば、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のシグナル配列または膜貫通領域、すなわち、アミノ酸１〜２７、またはアミノ酸３３〜４９、アミノ酸８３〜９９、アミノ酸１４８〜１６４、アミノ酸１６６〜１８２、アミノ酸１９７〜２１３、アミノ酸２４９〜２６５、アミノ酸３７８〜３９４、アミノ酸３９９〜４１５、アミノ酸４２１〜４３７、アミノ酸４９８〜５１４、アミノ酸５６０〜５７６、アミノ酸５８０〜５９６、アミノ酸６１１〜６２７、アミノ酸７２９〜７４５、アミノ酸７５１〜７６７、アミノ酸７８１〜７９７、アミノ酸１２５８〜１２７４、アミノ酸１２７５〜１２９１、アミノ酸１３００〜１３１６、アミノ酸１５３２〜１５４８、アミノ酸１５６９〜１５８５、アミノ酸１６０４〜１６２０、アミノ酸１７４７〜１７６３、アミノ酸２００４〜２０２０のいずれかのアミノ酸断片が挙げられる。
【００３６】
また、本発明のポリペプチドとしては、上記のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチドであって、かつＭｉｂと実質的に同質の機能を有するポリペプチドが挙げられる。Ｍｉｂの機能としては、好ましくは、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能が挙げられる。本発明のポリペプチドとしては、細胞膜局在性を有するポリペプチドが好ましい。その選択されるポリペプチドは、好ましくは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上、より好ましくは約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上、さらに好ましくは約９０％、約９５％、または約９９％以上のアミノ酸配列上の相同性を有する。
【００３７】
また、本発明のポリペプチドとしては、上記のポリペプチドのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたポリペプチドであって、かつＭｉｂと実質的に同質の機能を有するポリペプチドである。Ｍｉｂの機能としては、好ましくは、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する機能が挙げられる。本発明のポリペプチドとしては、細胞膜局在性を有するポリペプチドが好ましい。
【００３８】
本発明のポリペプチドは、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。本発明のポリペプチドは、天然のポリペプチド、組換えポリペプチド、または合成ポリペプチドであり、好ましくは組換えポリペプチドである。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、それら自体で生体内での機能を調節するための医薬組成物に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、それらの機能を調節し得る化合物、例えば、阻害剤、拮抗剤、賦活剤等を得るためのスクリーニングや、それらに対する抗体の取得に用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドは、試薬としても使用可能である。
【００４０】
（組換えベクター）
本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターへ組み込むことにより、組換えベクターを得ることができる。ベクターとしては、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外のポリヌクレオチドの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、Ｃｏｌ  Ｅ１から派生するベクター、ラムダファージから派生するベクターがある。前記ベクターに本発明のポリヌクレオチドを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択し、ポリヌクレオチドを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。後述の実施例中に示すｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂ（図５）では、ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いたが、むろんこれに限定されない。プラスミド  ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂは、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５４号として平成１６年３月５日付けで寄託し、平成１６年４月１９日付けで生存に関する証明書の通知を受けた。
【００４１】
（形質転換体）
上記のような無細胞蛋白質発現系以外にも、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を用いた遺伝子組換え技術によって、本発明のポリペプチドおよびその由来物を提供可能である。
【００４２】
形質転換は、自体公知の手段を応用することができ、例えば、レプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を用いて宿主の形質転換を行う。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を用いた自律複製系を利用する。ベクターは、宿主の種類により選択され、発現目的遺伝子配列とその複製および制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。構成要素は宿主が原核細胞か真核細胞かによって選択し、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組み合わせて使用する。
【００４３】
（ポリペプチドの製造方法）
形質転換体は、自体公知である各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養することにより、本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。培養は、発現産生されるポリペプチドの生理活性を指標に行ってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチによって行ってもよい。
【００４４】
本発明のポリペプチドを製造するための形質転換体は、例えば、本発明の遺伝子を組み込んだベクター（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂ）でコンピテントセル  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換することによって得ることができる。本発明のポリペプチドは、これらの形質転換体を用いて本発明の遺伝子を組み込んだベクター（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂ）の増幅を行うことによって得ることができる。培地からのポリペプチドおよびその由来物からなるポリペプチドの精製および／または回収方法としては、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの組み合わせ、または溶解度差に基づく硫安、アルコールなどの分画が挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、ポリペプチドの回収方法としては、アミノ酸配列の情報に基づき該アミノ酸配列に対する抗体を作製し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体によって特異的に吸着回収する方法が挙げられるが、これに限定されない。
【００４５】
（抗体）
抗体は、本発明のポリペプチドおよびその由来物からなるポリペプチドの抗原決定基を選別し、作製する。抗原決定基は、少なくとも５〜１５個、好ましくは少なくとも７〜１２個、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列または配列番号１もしくは配列番号３の塩基配列がコードするポリペプチドと相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位であればよい。露出部位が不連続部位であれば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有効である。抗体は、本発明の蛋白質および／またはポリペプチドおよびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する限り特に限定されない。この認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定することができる。
【００４６】
抗体を産生するためには、本発明のポリペプチドおよびその由来物からなるポリペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行う。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を起こさなければ特に限定されず、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、馬等が好適に用いられるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得する。好ましい手段としては、例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００４７】
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行うことができる。
【００４８】
このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本発明の蛋白質および／またはポリペプチドと直接結合し、その機能および／または活性を制御することができる。このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本発明の蛋白質および／またはポリペプチドの機能および／または活性が関与する疾患の診断、予防、抑制、遅延、改善および／または治療などに有用である。
【００４９】
（上記ポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体の用途）
本発明の特徴のうちの１つは、脳におけるＭｉｂの発現を検出することによるアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患、例えば、アルツハイマー病の診断に関する。すなわち、脳サンプル中のＭｉｂの発現を検出し、Ｍｉｂの発現が高い場合に、該サンプルをアルツハイマー病に罹患した被験体由来の脳サンプルと判断することができる。Ｍｉｂの発現の検出は、Ｍｉｂ遺伝子を検出するものであっても、Ｍｉｂ蛋白質を検出するものであってもよい。Ｍｉｂの発現の検出には、上記のポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体を使用することができる。具体的には、Ｍｉｂ遺伝子の発現の検出方法としては、上記のポリヌクレオチドからプローブを設計し、そのプローブを用いたノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。Ｍｉｂ蛋白質の発現の検出方法としては、上記の抗体を用いたウエスタンブロット法などが挙げられる。
【００５０】
別の本発明の特徴のうちの１つは、βアミロイドによるＭｉｂの発現を抑制および／または阻害することによるアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患、例えば、アルツハイマー病の発症および／または進行を抑制、遅延、改善、および／または治療する方法に関する。すなわち、βアミロイドにより、Ｍｉｂの発現が誘導されることを初めて見出し、それが脳との関係、特にアルツハイマー病の発症および／または進行に関連することを見出した。この新規な知見に基くと、βアミロイドが存在しても、そのＭｉｂの発現誘導を抑制および／または阻害しさえすれば、アルツハイマー病の発症および／または進行を抑制、遅延、改善、および／または治療することができると考えられる。
【００５１】
Ｍｉｂの発現を抑制および／または阻害するには、例えば、Ｍｉｂをコードする構造遺伝子のｍＲＮＡ発現を阻害することが挙げられる。このような阻害剤は、例えばβアミロイドを用い、Ｍｉｂをコードする構造遺伝子のｍＲＮＡ発現系を用いて候補化合物スクリーニングすることにより獲得できる。このようなスクリーニングにより得られるβアミロイドによるＭｉｂのｍＲＮＡ発現を抑制および／または阻害することのできる化合物は、アルツハイマー病の予防／治療剤として提供することができる。
【００５２】
（化合物の同定）
かくして調製されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体および抗体は、単独または複数手段を組み合わせることによって、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生を阻害する化合物および／または抑制する化合物の同定に有効な手段を提供する。
【００５３】
このような同定方法としては、βアミロイドおよび候補化合物を添加した細胞におけるＭｉｂの発現変化が比較できる方法であれば特に限定されない。具体的には、例えば、（１）一方の細胞にβアミロイドを添加し、他方の細胞にβアミロイドおよび候補化合物を添加し、（２）βアミロイドを添加した細胞におけるＭｉｂの発現と、βアミロイドおよび候補化合物を添加した細胞におけるＭｉｂの発現を比較し、（３）βアミロイドを添加した細胞におけるＭｉｂの発現と比較して、βアミロイドおよび候補化合物を添加した細胞におけるＭｉｂの発現が低下した場合に、該候補化合物をアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生を阻害する化合物および／または抑制する化合物として同定することができる。候補化合物の添加は、βアミロイド添加の前であっても、βアミロイド添加と同時であっても、βアミロイド添加の後であってもよい。比較するＭｉｂの発現は、発現量を比較できれば、ｍＲＮＡ発現であっても蛋白質発現であってもよい。Ｍｉｂ  ｍＲＮＡ量は、例えば、配列表の配列番号１または３で表される塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いたノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法等によって検出可能である。Ｍｉｂ蛋白質量は、例えば、配列表の配列番号２もしくは４で表されるアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドに対する抗体を用いて、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ法等によって検出可能である。配列表の配列番号１もしくは３で表される塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドを組換えベクターに組み込み、この組換えベクターを用いて例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換することによって形質転換体を作製し、この形質転換体を用いてポリペプチドを産生させるか、配列表の配列番号２もしくは４で表されるアミノ酸配列からポリペプチドを合成する。このようなポリペプチドを用いてＭｉｂ蛋白質に対する抗体を作製する。具体的な抗体の作製方法は、上記に詳述されている。また、βアミロイドを添加した細胞におけるＭｉｂの発現と比較して、βアミロイドおよび候補化合物を添加した細胞におけるＭｉｂの発現が少なくとも２０％低下した場合、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％低下した場合に、該候補化合物をアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生を阻害する化合物および／または抑制する化合物として同定することができる。
【００５４】
また、例えば、ポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質発現系を用いた遺伝子レベルでの発現調節剤の選別、抗体を用いた抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリーニングシステムにおいて利用可能である。
【００５５】
本同定方法により得られた化合物は後述する医薬組成物、疾患の治療剤として有用である。
【００５６】
（化合物、医薬組成物、診断手段）
上記の同定方法で得られた化合物は、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）を治療するための候補化合物として用いることができる。候補化合物としては、蛋白質、ポリペプチド、抗原性を有さないポリペプチド、低分子化合物が挙げられるがこれらに限定されず、好ましくは低分子化合物である。
【００５７】
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性および毒性等を考慮して選別することによって、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）の治療に用いる医薬組成物として調製可能である。また、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、本発明のポリペプチド、上記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含む組換えベクター、これら組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体、および上記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それら自体が、本発明の遺伝子および／または蛋白質の発現に対する阻害、拮抗、賦活等の機能を有し、本発明の遺伝子および／または蛋白質の発現および／または機能が関与する疾患の治療および／または防止に用いる医薬手段として使用できる。
【００５８】
アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患としては、例えば、アルツハイマー病等の神経疾患が挙げられる。本発明のＭｉｂは、βアミロイド処理で発現が誘導され、βアミロイド刺激のない状態では発現が低く抑えられている。Ｍｉｂはβアミロイド刺激によって脳内で発現し、それによってその機能を発揮すると考えられるので、Ｍｉｂの発現および／または機能の抑制によるアルツハイマー病の抑制効果が期待される。また、高い確率で細胞膜局在が予測されていることから、Ｍｉｂが疾患メカニズムまたは創薬ターゲットに関連する可能性は高いと考えられる。従って、本発明者は、Ｍｉｂの発現阻害および／または機能阻害は、疾患、特にアルツハイマー病の治療に用いることができると考えている。
【００５９】
上記の候補化合物、あるいは本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、本発明のポリペプチド、上記ポリヌクレオチドもしくはその相補鎖を含む組換えベクター、これら組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体、または上記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、適当な医薬担体と組み合わせて処方してアストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）の防止および／または治療剤として用いることができる。かかる処方は、治療有効量の上記の候補化合物、あるいは本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、本発明のポリペプチド、上記ポリヌクレオチドもしくはその相補鎖を含む組換えベクター、これら組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体、または上記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体と、医薬上許容される担体および／または賦形剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与経路に適したものを選択すればよい。
【００６０】
投与経路は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば、静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内、または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様として、腸溶処方またはカプセル処方等の経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフジシン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を用いることもできる。局所的な投与のときは、膏薬、パスタ、ゲルなどの形態を利用できる。
【００６１】
必要な用量範囲は、上記の候補化合物、あるいは本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、これらがコードするポリペプチド、上記ポリヌクレオチドもしくはその相補鎖を含む組換えベクター、これら組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体、または上記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状および担当医師の判断によるが、適当な用量は、例えば、対象の体重１ｋｇあたり０．０１〜１０００μｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり０．０５〜５００μｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり０．１〜１００μｇの範囲である。
【００６２】
製剤化にあたっては、化合物、ポリペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体等、各対照に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば、散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脱脂乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法を利用できる。
【００６３】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、シドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００６４】
懸濁剤は、水、またはスクロース、ソルビトールおよびフルクトースなどの糖類、ポリエチレングリコールなどのグルコール類、油類等を使用して製造できる。
【００６５】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体等を用いて調製可能である。
【００６６】
リポソーム化は、例えば、リン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、浸とう、超音波処理および遠心分離した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
【００６７】
脂肪乳化剤は、例えば、当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油など）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー）を用いて、乳化および／または均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えば、グリセリン、糖類（例えば、ブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
【００６８】
シクロデキストリン包接化は、例えば、当該物質を溶媒（エタノール）に溶解した溶液に、シクロデキストリンンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径のことなるシクロデキストリン（α型、β型、γ型）を適宜選択すればよい。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖、本発明のポリペプチド、上記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含む組換えベクター、これら組換えベクターを用いて形質転換した形質転換体、および上記ポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、アストログリア細胞の移動、アストログリア細胞の突起の伸長、および／またはアストログリア細胞の炎症性因子の産生と関連する疾患（例えば、アルツハイマー病）の診断手段として有用である。特に、アルツハイマー病の診断マーカーおよび／または試薬等の診断手段として有用である。本明細書において手段とは、目的達成のために使用する方法および／または媒体を意味する。すなわち、例えば、診断手段には、診断するための方法、診断に用いる試薬、キットなどが含まれる。
【００７０】
診断は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの試料中での存在量を決定することによって行う。試料としては血液、ずい液、脳生検サンプル等が好適であり、特に脳脊ずい液が好ましい。診断に用いる測定法は、自体公知の抗原抗体反応、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用することができる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００７２】
（グリア細胞の培養）
アストログリア細胞はラット大脳皮質から得た。Ｗｉｓｔｅｒ系ラット胎仔（チャールスリバー、１７日齢）の大脳を採取し、トリプシン処理により細胞を分散させた。得られた細胞を２０％の牛胎仔血清（ＦＣＳ）、抗生物質液を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１週間培養後、１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でさらに二次培養した。９０％以上の細胞がグリア線維酸性蛋白陽性であることを、蛍光抗体法により確認した。
【００７３】
（βアミロイドの調製およびアストログリア細胞のβアミロイド処理）
βアミロイド（Ａｎａｓｐｅｃ社製、βアミロイド１−４０）を滅菌水に溶解し−７０℃で保存し用時融解して用いた。βアミロイドの凝集は、１ｍＭのβアミロイドをイーグル緩衝液に溶解し、ＣＯ２インキュベーターで１週間保持後、１００００×ｇで１０分間遠心処理することにより行った。ペレットをＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を含むＤＭＥＭ中に再懸濁し、適宜の濃度に調製して用いた。二次培養後のアストログリア細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｂ２７サプリメントを含む無血清培地に変換し、２日間培養後、２５μＭの凝集βアミロイドを添加してさらに１５時間培養した。
【００７４】
（ｃＤＮＡサブトラクションおよびライブラリースクリーニング）
βアミロイド処理および未処理のアストログリア細胞（６ｃｍプラスチックディッシュ、各２０枚）よりＡＧＰＣ法にて９回にわたり全ＲＮＡを抽出した。ｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡはオリゴｄＴ−ラテックス（ロシュ社製）を用いて調製した。
【００７５】
βアミロイド処理および未処理のアストログリア細胞由来のｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡ各２μｇを出発原料として（βアミロイド処理遺伝子）−（未処理遺伝子）および（未処理遺伝子）−（βアミロイド処理遺伝子）のｃＤＮＡサブトラクション処理を、Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ９３，ｐｐ６０２５−６０３０（１９９６））に準じて、ＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて行った。サブトラクション処理のポジティブコントロールとして、Ｒｓａ  Ｉ消化後のテスターにφΧ１７４／Ｈａｅ  ＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントをテスター中の重量比で約２．５×１０−５になるように加えた。
【００７６】
実施したサブトラクション処理の効率を検証するため、陽性対照であるφΧ１７４／Ｈａｅ  ＩＩＩ消化ＤＮＡフラグメントをプローブとして、サブトラクション後のＰＣＲ産物およびサブトラクション前のＰＣＲ産物についてサザンブロット・ハイブリダイゼーションを実施した。
【００７７】
（βアミロイド処理遺伝子）−（未処理遺伝子）のＰＣＲ産物のベクター〔ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）〕へのライゲーションを行い、プラスミドライブラリーを作製し、ＤＨ５αコンピテントセル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）のトランスフォーメーションを行った。
【００７８】
プラスミドライブラリーの９６０クローンのベクター挿入部分をＰＣＲ法により増幅し、それらの遺伝子を６０〜１００ｎｇずつメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）にドットブロットしたものを２セット作製した。このドットブロットメンブレンに対して、（βアミロイド処理遺伝子）−（未処理遺伝子）および（未処理遺伝子）−（βアミロイド処理遺伝子）のサブトラクション後のＰＣＲ産物のプローブで、０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．８）、１０μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡを含む７％  ＳＤＳ液中、６８℃、１６時間のハイブリダイゼーションをそれぞれ実施した。０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣを用いてメンブレンを６８℃で３０分間洗浄した。（未処理遺伝子）−（βアミロイド処理遺伝子）のサブトラクション後のＰＣＲ産物と比較して（βアミロイド処理遺伝子）−（未処理遺伝子）のサブトラクション後のＰＣＲ産物において特異的に濃縮が認められるクローンを選択した。
【００７９】
（ノーザンブロットハイブリダイゼーションによる解析）
選択したクローン群のそれぞれのベクター挿入部分を３２Ｐで標識後プローブとし、βアミロイド処理および未処理アストログリア細胞由来ｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡを用いたノーザンブロット・ハイブリダイゼーションを実施した。上記方法により、βアミロイド処理および未処理のアストログリア細胞から、それぞれのｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡサンプルを調製した。常発現性遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）ｃＤＮＡ、βアクチンｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を内部標準プローブとして用いた。検出はＢＡＳ２０００（富士フィルム社製）を用いて行った。Ｇ３ＰＤＨ遺伝子、βアクチン遺伝子は、βアミロイド処理時および未処理時において発現量に差が認められないのに対し、本発明の遺伝子は、βアミロイド未処理時では低レベルで維持されていた発現量が、βアミロイド処理により約７．０倍増加した（図１）。
【００８０】
（塩基配列解析および相同性検索）
本発明の遺伝子は、高次構造をとりやすく通常のシークエンス反応条件では配列の同定が困難であった。本発明者は、シークエンス反応の変性温度、変性時間およびアニーリング温度を詳細に検討し、本遺伝子の配列解析を可能にした。具体的なシークエンス反応の条件は、増幅反応中の変性温度を９６℃に高め、さらに変性時間も２０〜３０秒に延長した。また、アニーリング温度に関しては、低温でのテンプレートＤＮＡの２次構造の再形成を回避するために、それぞれのプライマーについて可能な限り高い温度に設定した。βアミロイドにより発現が誘導されるこのクローンは、蛍光色素（Ｃｙ５；ファルマシア）標識Ｍ１３ユニバーサルプライマー、リバースプライマー、および内部配列プライマーを用いてシークエンス反応を行い、ＡＬＦ  Ｅｘｐｒｅｓｓ蛍光シークエンサー（ファルマシア社製）を用いてベクター挿入部分の塩基配列を解析した。得られた配列について、ＮＣＢＩデータベースで相同性検索を実施した。得られた全長ｃＤＮＡのうちの１クローンは相同性を示す遺伝子はなく、新規と考えられた。βアミロイド添加ラットアストログリア細胞由来ファージライブラリーのスクリーニングで得られたｃＤＮＡ全長は、６，９９６ｂｐ（配列番号１）で２，１０６アミノ酸（配列番号２）をコードする新規遺伝子であった。予測プログラムＰＳＯＲＴにて本蛋白質を解析すると、シグナル配列（アミノ酸１〜２７）に続き、２３回の膜貫通領域（アミノ酸３３〜４９、アミノ酸８２〜９８、アミノ酸１４３〜１５９、アミノ酸１６５〜１８１、アミノ酸１９６〜２１２、アミノ酸２４８〜２６４、アミノ酸３６１〜３７７、アミノ酸３８７〜４０３、アミノ酸４０９〜４２５、アミノ酸４８６〜５０２、アミノ酸５４８〜５６４、アミノ酸５６８〜５８４、アミノ酸５９９〜６１５、アミノ酸７１７〜７３３、アミノ酸７３９〜７５５、アミノ酸７６９〜７８５、アミノ酸１２４７〜１２６３、アミノ酸１２６４〜１２８０、アミノ酸１５３８〜１５５４、アミノ酸１５７６〜１５９２、アミノ酸１６１０〜１６２６、アミノ酸１７５３〜１７６９、アミノ酸２０２０〜２０３６）を有していた。膜貫通領域を多数有していることから、この遺伝子をＭｉｂ（Ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ）と名付けた。ラットＭｉｂは新規配列であり、ｍＲＮＡとして転写されていることを今回初めて示した。
【００８１】
（ヒトオーソログの取得）
ヒトオーソログを見出すため、ＮＣＢＩヒトゲノムデータベースを検索したところ、ヒトの対応遺伝子の断片がＮＣＢＩゲノムデータベース上に見つかった。本情報をもとに、ヒト小腸由来ポリＡ  （＋）ＲＮＡ（１μｇ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）よりＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  （ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、プライマーをオリゴｄＴ（１２−１８）とするＲＴ−ＰＣＲ法にて全長配列のクローニングと同定を実施した。ラットＭｉｂと同様に、ヒトＭｉｂも高次構造をとりやすく、通常のシークエンス反応条件では配列の同定が困難であり、シークエンス反応の条件を詳細に検討した。具体的なシークエンス反応の条件は、増幅反応中の変性温度を９６℃に高め、さらに変性時間も２０〜３０秒に延長した。また、アニーリング温度に関しては、低温でのテンプレートＤＮＡの２次構造の再形成を回避するために、それぞれのプライマーについて可能な限り高い温度に設定した。ベクター挿入部分の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ標識ターミネーター（ＡＢＩ社製）、Ｍ１３ユニバーサルプライマー、リバースプライマー、および内部配列プライマーを用いてシークエンス反応を行い、蛍光キャピラリーシークエンサー  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００（ＡＢＩ社製）を用いて解析した。ｃＤＮＡ全長が長い本遺伝子のＰＣＲエラーによる配列決定ミスを避けるため、独立した５つのクローンの配列を決定し、それらを総合判断して本遺伝子の配列を決定した。さらにｃＤＮＡの５’端、３’端を完全に同定するため、５’−ｒａｃｅ法、３’−ｒａｃｅ法（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ｋｉｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をそれぞれ実施した。ＰＣＲにはＫＯＤ  ｐｌｕｓ  （ＴＯＹＯＢＯ社製）をＤＮＡポリメレースとして用い、ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込み、シークエンスを行った。
【００８２】
本ヒトｃＤＮＡは、全長６，７９５ｂｐ（配列番号３）で２，０９０アミノ酸（配列番号４）をコードする遺伝子であり、シグナル配列（アミノ酸１〜２７）に続き、２４回の膜貫通領域（アミノ酸３３〜４９、アミノ酸８３〜９９、アミノ酸１４８〜１６４、アミノ酸１６６〜１８２、アミノ酸１９７〜２１３、アミノ酸２４９〜２６５、アミノ酸３７８〜３９４、アミノ酸３９９〜４１５、アミノ酸４２１〜４３７、アミノ酸４９８〜５１４、アミノ酸５６０〜５７６、アミノ酸５８０〜５９６、アミノ酸６１１〜６２７、アミノ酸７２９〜７４５、アミノ酸７５１〜７６７、アミノ酸７８１〜７９７、アミノ酸１２５８〜１２７４、アミノ酸１２７５〜１２９１、アミノ酸１３００〜１３１６、アミノ酸１５３２〜１５４８、アミノ酸１５６９〜１５８５、アミノ酸１６０４〜１６２０、アミノ酸１７４７〜１７６３、アミノ酸２００４〜２０２０）を有していた。ヒトＭｉｂは新規遺伝子であり、ｍＲＮＡとして転写されていることを今回初めて示した。ヒトＭｉｂは、ラットＭｉｂと比較して、アミノ酸レベルで８３％の相同性を示し、ヌクレオチドレベルで６９％の相同性を示した。ｒＭｉｂとｈＭｉｂのアミノ酸配列の比較を図２〜４に示す。
【００８３】
（ラットＭｉｂおよびヒトＭｉｂの組織発現分布）
ラットおよびヒトの各組織から抽出した、ｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡを用いたノーザンブロット解析方法は、特開２００１−２５８５７５、特開２００１−３５２９９１、または特開２００３−１６４２９０に記載の方法と同様に実施した。具体的には、ラットＭｉｂについてはプローブとして配列番号１のヌクレオチド６６４５〜６９３９の２９５ｂｐの遺伝子フラグメントを用い、ヒトＭｉｂについてはプローブとして配列番号３のヌクレオチド３６１６〜３９７５の３６０ｂｐの遺伝子フラグメントを用いた。ラットまたはヒトの各組織から抽出したｐｏｌｙ  Ａ（＋）ＲＮＡのノーザンブロット（共に、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に、ラットＭｉｂまたはヒトＭｉｂのｃＤＮＡを３２Ｐ標識後、ハイブリダイゼーションさせた。本発明者は、ラットＭｉｂが肺と腎臓において約９ｋｂｐの転写産物として発現すること、ならびに、ヒトＭｉｂが心臓、胎盤、肺、肝臓、腎臓、および膵臓において約１１．６ｋｂｐまたは約９．０ｋｂｐの転写産物として発現することを確認した。
【００８４】
（ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５４号）の作製）
ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂは、ラットＭｉｂ  ｃＤＮＡ全長（約７．０ｋｂｐ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＰｓｔＩサイト−ＸｈｏＩサイト間に組み込まれた形で得た。具体的には、βアミロイド添加ラットアストログリア細胞由来ファージライブラリーのスクリーニングで得られた当該ファージを、ヘルパーファージを用いたインビボエクサイジョン法により得た。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、本発明の遺伝子がβアミロイド処理により誘導されることを確認したノーザンブロッティングの結果の図である。図中、レーンＮは無処理のラットアストログリア細胞由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを示し、レーンＡは２５μＭのβアミロイドで１５時間処理した後のラットアストログリア細胞由来ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルをそれぞれ示す。（Ａ）はＭｉｂ遺伝子、（Ｂ）は内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子をプローブとして用いた結果を示す。内部標準であるＧ３ＰＤＨ遺伝子は、βアミロイド処理時および未処理時において発現量に差が認められないのに対し、本発明の遺伝子は、βアミロイド未処理時では低レベルで維持されていた発現量がβアミロイド処理により約７．０倍増加した。
【図２】図２は、ヒトＭｉｂ（上段）とラットＭｉｂ（下段）のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、「＊」はアミノ酸が同一であることを示し、「．」は性質の類似したアミノ酸であることを示す。
【図３】図３は、図２の続きである。ヒトＭｉｂ（上段）とラットＭｉｂ（下段）のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、「＊」はアミノ酸が同一であることを示し、「．」は性質の類似したアミノ酸であることを示す。
【図４】図４は、図３の続きである。ヒトＭｉｂ（上段）とラットＭｉｂ（下段）のアミノ酸配列の比較を示す図である。図中、「＊」はアミノ酸が同一であることを示し、「．」は性質の類似したアミノ酸であることを示す。
【図５】図５は、ｐＢＳ  ＳＫ（−）−ｒＭｉｂ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５４号）の構築を示す図である。図中、ｒＭｉｂ（約７．０ｋｂｐ）は、ラットＭｉｂ遺伝子の挿入部分を示す。ｒＭｉｂは、ベクターのマルチクローニングサイトのＰｓｔ  Ｉ制限酵素部位とＸｈｏ  Ｉ制限酵素部位との間に挿入されている。ｆ１（−）ｏｒｉはファージミド複製開始配列、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子部位、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉはプラスミド複製開始配列を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列表の配列番号１：ラットＭｉｂ遺伝子の塩基配列。
【００８７】
配列表の配列番号２：ラットＭｉｂ蛋白質のアミノ酸配列。アミノ酸１〜２７にシグナル配列が存在する。以下の部分に２３回の膜貫通領域が存在する：アミノ酸３３〜４９、アミノ酸８２〜９８、アミノ酸１４３〜１５９、アミノ酸１６５〜１８１、アミノ酸１９６〜２１２、アミノ酸２４８〜２６４、アミノ酸３６１〜３７７、アミノ酸３８７〜４０３、アミノ酸４０９〜４２５、アミノ酸４８６〜５０２、アミノ酸５４８〜５６４、アミノ酸５６８〜５８４、アミノ酸５９９〜６１５、アミノ酸７１７〜７３３、アミノ酸７３９〜７５５、アミノ酸７６９〜７８５、アミノ酸１２４７〜１２６３、アミノ酸１２６４〜１２８０、アミノ酸１５３８〜１５５４、アミノ酸１５７６〜１５９２、アミノ酸１６１０〜１６２６、アミノ酸１７５３〜１７６９、アミノ酸２０２０〜２０３６。
【００８８】
配列表の配列番号３：ヒトＭｉｂ遺伝子の塩基配列。
【００８９】
配列表の配列番号４：ヒトＭｉｂ蛋白質のアミノ酸配列。アミノ酸１〜２７にシグナル配列が存在する。以下の部分に２４回の膜貫通領域が存在する：アミノ酸３３〜４９、アミノ酸８３〜９９、アミノ酸１４８〜１６４、アミノ酸１６６〜１８２、アミノ酸１９７〜２１３、アミノ酸２４９〜２６５、アミノ酸３７８〜３９４、アミノ酸３９９〜４１５、アミノ酸４２１〜４３７、アミノ酸４９８〜５１４、アミノ酸５６０〜５７６、アミノ酸５８０〜５９６、アミノ酸６１１〜６２７、アミノ酸７２９〜７４５、アミノ酸７５１〜７６７、アミノ酸７８１〜７９７、アミノ酸１２５８〜１２７４、アミノ酸１２７５〜１２９１、アミノ酸１３００〜１３１６、アミノ酸１５３２〜１５４８、アミノ酸１５６９〜１５８５、アミノ酸１６０４〜１６２０、アミノ酸１７４７〜１７６３、アミノ酸２００４〜２０２０。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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