(57)【要約】【課題】糖燐酸化合物燐酸基分子内転移活性を有する耐熱性酵素を提供し、糖鎖合成の基質となる糖燐酸を安定的に製造する。【課題解決手段】超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイの全ゲノム遺伝子情報から糖燐酸化合物燐酸基分子内転移酵素の遺伝子を見出し、該遺伝子を用いて遺伝子工学的手段により、耐熱性の糖燐酸化合物燐酸基分子内転移酵素を得るともに、これを用いて糖燐酸を安定的に製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するか、あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有することを特徴とする蛋白質。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードするDNA。
【請求項３】
配列番号２に記載の塩基配列を有することを特徴とするDNA。
【請求項４】
配列番号２に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするDNA。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のDNAがベクターに組み込まれていることを特徴とする組み換え体DNA。
【請求項６】
請求項５に記載の組み換え体DNAが宿主細胞に導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物から、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質の製造法。
【請求項８】
糖六燐酸または糖一燐酸に、請求項１に記載の蛋白質を作用させ、それぞれ糖一燐酸または糖六燐酸に変換することを特徴とする、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移体の製造方法。
【請求項９】
糖六燐酸または糖一燐酸に、請求項６に記載の形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させ、それぞれ糖一燐酸または糖六燐酸に変換することを特徴とする、糖燐酸酸化合物における燐酸基分子内転移体の製造方法。
【請求項１０】
糖六燐酸または糖一燐酸に、請求項３又は４に記載のDNAにコードされる蛋白質を作用させ、それぞれ糖一燐酸または糖六燐酸に変換することを特徴とする、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する耐熱性蛋白質、該蛋白質をコードするDNA、該DNAを含有する組み換え体DNA、該組み換え体DNAを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた糖燐酸化合物燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋白質あるいは該形質転換体を用いた糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移体の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する酵素としては、シュードモナス菌（Pseudomonas aeruginosa）  （非特許文献１参照）、ビブリオ菌（Vibrio furnissii）  （非特許文献２参照）、スフィンゴモナス菌（Sphingomonas paucimobilis）  （非特許文献３参照）由来のリン酸化マンノース-リン酸基分子内転移酵素・リン酸化グルコース-リン酸基分子内転移酵素（PMM/PGM）の詳しい性質がすでに報告されている。PMM/PGMはマンノース六燐酸及びグルコース六燐酸から、マンノース一燐酸及びグルコース一燐酸を合成するのに必須な酵素であり、マンノース六燐酸及びグルコース六燐酸を基質としてマンノース一燐酸及びグルコース一燐酸を生産する。その他にも、ヒトやウサギ、病原菌から糖燐酸化合物燐酸基分子内転移を行う酵素が見出されているが、その多くが常温生物由来のため室温以上では極めて不安定で、活性は80℃程度の加熱処理により速やかに失活する。このため、使用時に反応系を滅菌する等の処理が必要であったり、低温での注意深い保存が必要であった。
【０００３】
【非特許文献１】Naught LE, Regni C, Beamer LJ, Tipton PA “Roles of active site residues in Pseudomonasaeruginosa phosphomannomutase/phosphoglucomutase” (2003) Biochemistry,42, 9946-9951.
【非特許文献２】Kim SH, Ahn SH, Lee JH, Lee EM, Kim NH,Park KJ, Kong IS “Geneticanalysis of phosphomannomutase/phosphoglucomutase from Vibrio furnissii andcharacterization of its role in virulence” (2003) Archives ofMicrobiology, 180, 240-250.
【非特許文献３】Videira PA, Cortes LL, Fialho AM,Sa-Correia I “Identificationof the pgmG gene, encoding a bifunctional protein with phosphoglucomutase andphosphomannomutase activities, in the gellan gum-producing strain Sphingomonaspaucimobilis ATCC 31461” (2000) Applied andEnvironmental Mictobiology, 66(5), 2252-2258.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有し、且つ耐熱性を有する酵素は、極めて有用である。すなわち、このような酵素が発見されれば、糖鎖合成の基質で有る糖ヌクレオチドの元となる糖燐酸、特に糖一燐酸を安定的に生成させることが可能となる。また、糖鎖合成の際の基質として必要な糖ヌクレオチドを合成するために、糖を材料として耐熱性糖燐酸化酵素と組み合わせる事で、安価に糖燐酸化合物特に糖一燐酸を合成する事が可能となる。それらの反応を行う熱安定性を有する酵素は渇望されていた。
【０００５】
したがって、本発明の課題は、耐熱性を有し、かつ糖燐酸を基質として糖燐酸の燐酸基を分子内転移することが可能な、新規酵素を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以上のような課題を解決すべく、75−80℃で生育する超好熱古細菌Sulfolobus tokodaii に着目し、本酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を得た。さらに、大腸菌を用いてその遺伝子から該酵素を生産し、この酵素が高温（80℃）で安定に存在し、かつ糖燐酸化合物燐酸基分子内転移活性を示すことを確認し、さらに、本酵素を用いることにより糖燐酸化合物燐酸基分子内転移体を生産することも見出して、本発明を完成するに至ったものである。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１０）に係るものである。
（１）  配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するか、あるいは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有することを特徴とする蛋白質。
（２）  上記（１）記載の蛋白質をコードするDNA。
（３）  上記（２）に記載の塩基配列を有することを特徴とするDNA。
（４）  配列番号２に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質をコードすることを特徴とするDNA。
（５）  上記（２）〜（４）のいずれかに記載のDNAがベクターに組み込まれていることを特徴とする組み換え体DNA。
（６）  上記（５）に記載の組み換え体DNAが宿主細胞に導入されていることを特徴とする形質転換体。
（７）  上記（６）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物から、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質の製造法。
（８）  糖六燐酸または糖一燐酸に、上記（１）に記載の蛋白質を作用させ、それぞれ糖一燐酸または糖六燐酸に変換することを特徴とする、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移体の製造方法。
（９）  糖六燐酸または糖一燐酸に、上記（６）に記載の形質転換体の培養液あるいは培養物の処理物を作用させ、それぞれ糖一燐酸または糖六燐酸に変換することを特徴とする、糖燐酸酸化合物における燐酸基分子内転移体の製造方法。
（１０）  糖六燐酸または糖一燐酸に、上記（３）又は（４）に記載のDNAにコードされる蛋白質を作用させ、それぞれ糖一燐酸または糖六燐酸に変換することを特徴とする、糖燐酸化合物における燐酸基分子内転移体の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、試験管内で糖燐酸の燐酸基分子内転移を行うことが可能で、かつ熱等に安定な新規な糖燐酸の燐酸基分子内転移酵素が提供できた。その結果、新規な糖燐酸の燐酸基分子内転移が可能になった。一方、糖燐酸は糖蛋白質、糖脂質、多糖類の糖合成に糖提供体として機能する糖ヌクレオチド合成に必要な供与体として機能するものであり、これらの糖合成は、癌転移、器官発生あるいは細胞性免疫等に密接に関与するものとして近年注目されており、本発明はこれらの研究の発展において、その貢献度はきわめて大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本願発明を具体的に説明する。
本発明で使用した超好熱古細菌は、好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイ（JCM登録番号JCM10545）である。本超好熱古細菌の全ゲノム情報から本酵素活性を示すと推定した遺伝子領域を、PCR反応で増幅・抽出し、蛋白質発現プラスミドpET28aに挿入後、そのプラスミドにより形質転換した大腸菌を用いて本酵素の生産をおこなった。生産された酵素は加熱処理およびカラムクロマトグラムで単離精製した。精製された酵素は分子量が約50,000の蛋白質でマンノース一燐酸、グルコース一燐酸及びグルコース六燐酸の燐酸基分子内転移活性を有する酵素であることが判明した。
この酵素は50mM MOPS緩衝液（pH7.6）中で、80℃30分以上の加熱後も活性を有し、高い耐熱性を示した。
この好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイが有するPMM/PGM (STPMM/PGM) のアミノ酸配列およびその遺伝子DNA（ST0242）の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号１および２に示す。
【００１０】
本発明における酵素は、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するもののみに限定されず、該アミノ酸配列において、1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であっても、このアミノ酸配列を有する蛋白質が、糖燐酸化合物燐酸基分子内転移活性を示すものも含む。また、本発明のこれら酵素遺伝子DNAについても、上記同配列番号２に示す塩基配列を有するもののみに限定されず、上記アミノ酸配列をコードするものを包含する。さらに上記配列番号２に示されるDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ糖燐酸化合物燐酸基分子内転移活性を有する蛋白質をコードするDNAも包含する。このストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション溶液１リットル中に52.59g NaCl、26.46g クエン酸ナトリウム、1g フィコール（Type  400）、1g ポリビニルピロリドン、1g ウシ血清アルブミン、5g SDS、1g 断片化鮭精子DNA、500ml  ホルムアミドを含み、温度42℃で行う。その後の洗浄は、洗浄用溶液1リットル中に17.53g NaCl、8.82g クエン酸ナトリウム、5g SDSを含み、温度68℃で行う条件である。
【００１１】
本発明の酵素を得るには、通常の遺伝子工学的手法が適用でき、上記酵素遺伝子DNAを、例えばpET28a、pHY481等の蛋白質発現プラスミドベクター等に形質転換し、該形質転換体を培地で培養し、培養物、培養処理物あるいはこれら培養物から分離回収された形質転換体から、酵素を通常の蛋白質精製手段により精製し単離する。上記宿主細胞としては、大腸菌・枯草菌等が利用可能である。
【００１２】
本発明においては、さらにこの酵素を用いて、燐酸基分子内転移した糖燐酸化合物を合成するが、この合成においては、糖六燐酸を含有する溶液に該酵素を添加し、反応温度60〜95℃で反応させて糖一燐酸を得る。また、糖一燐酸を含有する溶液に該酵素を添加し、反応温度60〜95℃で反応させて糖六燐酸を得る。
糖六燐酸としては、例えば、グルコース六燐酸等が挙げられ、糖一燐酸としては、マンノース一燐酸、グルコース一燐酸等が挙げられる。
【００１３】
この反応式として、グルコース六燐酸からグルコース一燐酸を合成する場合について以下に示す。
【化１】
2006050993.tif 000002
【００１４】
また、この反応においては、上記精製した酵素のみならず、粗酵素であってもよい。例えば、宿主として枯草菌等分泌型の系を用いる場合には、培養液中に本酵素が生成蓄積され、大腸菌等の非分泌型の系を用いる場合には、菌体内に生成されるので、本酵素を含有する培養液あるいはその処理物、もしくは菌体破砕物等の培養処理物を用いて、糖燐酸を合成してもよい。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
[実施例１]
糖燐酸化合物燐酸基分子内転移酵素の製造
（１） 菌の培養
好酸性好気性超好熱性古細菌スルフォロバス、トーコーダイイJCM10545は次の方法で培養した。
1.3g の(NH4)2SO4、0.28gのKH2PO4、0.25gのMgSO4・7H2O、0.07gのCaCl2・2H2O、0.02gのFeCl3・6H2O、1.8mgのMnCl2・4H2O、4.5mgのNa2B4O7・10H2O、0.22mgのZnSO4・7H2O、0.05mgのCuCl2・2H2O、0.03mgのNa2MoO4・2H2O、0.03mgのVoSO4・xH2O、0.01mgのCoSO4・7H2O、1.0ｇの酵母エキスを1リッターの蒸留水に溶かし、この溶液のpHを3.5に10規定H2SO4溶液で調製した。加圧殺菌した後、JCM10545を植菌した。この培養液を80℃で1〜2日培養し、その後遠心分離し集菌した。
【００１６】
（２） 染色体DNAの調製
JCM10545の染色体DNAは以下の方法により調製した。
培養終了後5,000rpm、10分間の遠心分離により菌体を集菌する。菌体を10mM EDTA(pH  6.0)溶液で洗浄後、50mM Tris/HCl-50mM EDTA(pH8.5)溶液を加えて細胞を溶解させる。さらに、0.5% Na-lauroylsarcosinate、1mg/ml プロテアーゼKとなるように各々を加えた後、50℃で3時間保温する。フェノール処理を3回行った後、溶液を10mM EDTA (pH8.0)溶液に対して透析する。37℃で30分間のRNaseによるRNAの分解後、フェノールクロロフォルム溶液で処理した後、10mM Tris-1mM EDTA(pH8.0)で透析を行う。
【００１７】
（３） 染色体DNAを含むショットガンライブラリークローンの作製
上記（２）の工程で得られた染色体DNAを超音波処理することにより断片化した後、アガロースゲル電気泳動により1kb及び2kb長のDNA断片を回収した。この断片をプラスミドベクターpUC118のHincII制限酵素部位に挿入したショットガンライブラリーを作製した。各ショットガンクローンの末端塩基配列を、ABI社製自動塩基配列読み取り装置377を用いて解読していった。
【００１８】
（４） STPMM/PGM遺伝子の同定
上記手法で決定された好酸性好気性超好熱古細菌スルフォロバス、トーコーダイイのゲノム塩基配列の大型計算機による解析を行い、phosphomannomutase/phosphoglucomutase酵素の機能を含むであろう蛋白質をコードする遺伝子(ST0242)を同定した。この超好熱性古細菌スルフォロバス、トーコーダイイのST0242遺伝子の開始コドンはATGで、455アミノ酸残基の蛋白質をコードする遺伝子として同定された。
【００１９】
（５）発現プラスミドの構築
構造遺伝子領域の前後に制限酵素(NdeIとXhoI）サイトを構築する目的でDNAプライマーを合成し、PCRでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
【００２０】
Upper primer、
5’- TTAATTCCATATGGGTAAGCTTTTTGGTACTGAC -3’ （配列番号３）
（下線部はNdeIサイトを示す）
Lower primer、
5’- ATATACTCGAGTCATTTACCCTCTACAATC -3’ （配列番号４）
（下線部はXhoIサイトを示す）
【００２１】
Upper primerとLower primerを組み合わせたPCR反応後、制限酵素（NdeIとXhoI）で完全分解（37℃で2時間）した後、その構造遺伝子領域断片を精製した。
制限酵素NdeIとXhoIで切断後精製したpET28a（Novagen社製）と上記の構造遺伝子（ST0242）領域断片とT4リガーゼを用いて16℃、2時間反応させることによって連結した。連結したDNAの一部を大腸菌DH5αのコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN社製)で精製し、塩基配列を確認して発現プラスミド、pET28a/ST0242を得た。発現プラスミドpET28a/ST0242を用いるとSTPMM/PGMはN末端にヒスチジンタグが付加された融合蛋白質として生産される。
【００２２】
（６）組み換え遺伝子の発現
大腸菌 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL、(Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、ファルコンチューブに0.1ml移す。その中に上記の発現プラスミド10ng分に相当する溶液を加え氷中に30分間放置した後、42℃でヒートショックを30秒間おこない、そこにSOC培地0.9mlを加え、37℃で1時間振とう培養する。その後、カナマイシンを含むLB寒天プレート上に適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体大腸菌BL21-CodonPus(DE3)-RIL/pET28a/ST0242を得た。
【００２３】
当該形質転換体をカナマイシン含有LB培地(2リットル)中で一晩37℃において振とう培養した後、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalacopyranoside）を1mMになるように加え、さらに30℃で5時間振とう培養した。培養後、遠心分離（6000rpm、20分間）により集菌をおこなった。
【００２４】
（７）STPMM/PGM酵素の精製
2リットル培養液から集菌した菌体に2倍量の20mM燐酸ナトリウム塩緩衝液（pH7.4）、菌体1g あたり2mgのLysozyme（Wako社製）、0.1μgのDNase I（Takara社製）を加え懸濁液を得た。氷上で1時間放置後、超音波破砕し、遠心分離（20,000 x g、30分間）により上清液を得た。得られた上清液を80℃で30分間加熱した後、遠心分離（20,000 x g、30分間）により上清液を得た。この上清液を20mM燐酸ナトリウム塩緩衝液（pH7.4）0.5M  NaClで平衡化したHiTrap phenyl sepharose(ファルマシア社製)カラムに吸着させ、同緩衝液中のイミダゾール濃度を0.0Mから0.5Mに増加させることにより目的蛋白質の溶出を行った。さらに、Amicon(R) Ultra（Millipore社製）で濃縮し、50mM  MOPS緩衝液（pH7.6）に緩衝液の交換を行い、精製サンプルとした。
【００２５】
[実施例２]  グルコース一燐酸の燐酸基分子内転移
（１） 糖燐酸化合物燐酸基分子内転移反応
50mM MOPS緩衝液(pH7.6)、2mM MgSO4、10μM  グルコース 1,6-ビス燐酸、1mM  NADP（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸酸化型）、1unit  グルコース六燐酸脱水素酵素、0.4mMグルコース一燐酸、からなる酵素反応溶液2,000μl中に実施例１で得られた精製酵素3.5μgを加えた。この酵素反応液を65℃で保温することにより、反応させた。この反応により、グルコース一燐酸の燐酸基が分子内転移しグルコース六燐酸が生成する。
【００２６】
（２） 糖燐酸化合物燐酸基分子内転移反応の測定
本酵素を用いた反応の反応生成物であるグルコース六燐酸をグルコース六燐酸脱水素酵素により六燐酸グルコノラクトンに変換する際に、副反応としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸（NADP）が酸化型から還元型へ変化する。その変化量を340nmにおける吸光度の変化として紫外・可視分光光度計を用いて測定した。（非特許文献４参照）NADPの酸化型と還元型では波長に依存した吸光度プロファイルが全く異なる。特に340nmの吸光度が全く異なる事から、この波長の吸光度を利用して生成された還元型NADPの量を定量する。
そこで、（１）で反応させたサンプルに関しても、紫外・可視分光光度計による340nmの吸光度を用いて（１）の反応の解析を行った。
【００２７】
【非特許文献４】Klingenberg M “Methods of Enzymatic Analysis” (1974)  Weinheim-Academic Press, New York, vol. 4,pp. 2045.
【００２８】
[実施例３]  マンノース一燐酸の燐酸基分子内転移
（1）糖燐酸化合物燐酸基分子内転移反応
50mM MOPS緩衝液(pH7.6)、2mM MgSO4、10μM グルコース 1,6-ビス燐酸、1mM  NADP、1unit  グルコース六燐酸脱水素酵素、１unit マンノース六燐酸異性化酵素、１unit  グルコース六燐酸異性化酵素、0.4mMマンノース一燐酸、からなる酵素反応溶液2,000μl中に実施例１で得られた精製酵素7.0μgを加えた。この酵素反応液を65℃で保温することにより、反応させた。この反応により、マンノース一燐酸の燐酸基が分子内転移しマンノース六燐酸が生成する。
【００２９】
（２）糖燐酸化合物燐酸基分子内転移反応の測定
本酵素を用いた反応の反応生成物であるマンノース六燐酸をマンノース六燐酸異性化酵素によりフルクトース六燐酸に変換し、フルクトース六燐酸をグルコース６燐酸異性化酵素によりグルコース六燐酸に変換し、グルコース六燐酸脱水素酵素により六燐酸グルコノラクトンに変換する際に、副反応としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸（NADP）が酸化型から還元型へ変化する。その変化量を340nmにおける吸光度の変化として紫外・可視分光光度計を用いて測定した。（非特許文献４参照）NADPの酸化型と還元型では波長に依存した吸光度プロファイルが全く異なる。特に340nmの吸光度が全く異なる事から、この波長の吸光度を利用して生成された還元型NADPの量を定量する。
そこで、（１）で反応させたサンプルに関しても、紫外・可視分光光度計による340nmの吸光度を用いて（１）の反応の解析を行った。
【００３０】
[実施例４]  グルコース六燐酸の燐酸基分子内転移
（１） 糖燐酸化合物燐酸基分子内転移反応
50mM MOPS緩衝液(pH7.6)、2mM MgSO４、10μl グルコース1,6ビス燐酸、0.4mM TTP、2.5μg スルフォロバス・トーコーダイイ由来のRmlA（glucose-1-phosphate thymidylyltransferase ）、1mMグルコース六燐酸からなる酵素反応溶液2,000μl中に、実施例１で得られた精製酵素2.5μgを加えた。この酵素反応液を80℃で30分間保温することにより反応させた。反応後、100μlの500mM  燐酸二水素カリウム溶液を加えることにより反応を停止させた。この反応により、グルコース六燐酸の燐酸基が分子内転移しグルコース一燐酸が生成する。
【００３１】
（２）糖燐酸化合物燐酸基分子内転移反応の測定
HPLCを用いて、反応性生物であるグルコース一燐酸をRmlAによりTDP-グルコースに変換し、TDP-グルコースの量をヌクレオチド部分の紫外線の吸収を目安に測定した。図１に示すように、標準物質であるTTPおよびTDP-グルコースは、HPLCにおいて溶出位置がまったく異なる。そこで、上記（１）で反応させたサンプルに関しても、HPLCで同様の解析をおこなった。その結果、図２に示すように、確かにTDP-グルコースが見出されたことから、該酵素は、グルコース六燐酸の分子内燐酸基を転移させたグルコース一燐酸を確かに生成している事が確認された。
【００３２】
[実施例５]  酵素の性質
（１） 蛋白質化学的性質
当該酵素は上記の精製プロセスで完全に精製され、SDS-PAGEで分子量約50KDaの単一バンドを示した（図３）。当該酵素は455アミノ酸残基より構成され（配列番号１）、そのアミノ酸配列から予測された分子量は50,102 Daであった。また、シュードモナスPMM/PGMとの相同性は低いが、活性中心、金属イオン結合、糖認識に関与するモチーフが保存されていた（図４）。
【００３３】
（２）STPGM/PMMの糖燐酸の燐酸基分子内転移活性
実施例１により精製された該酵素を用いて、グルコース一燐酸及びマルトース一燐酸が有する燐酸基の分子内転移活性を実施例３，４に従って測定した。その結果、図５に有るように、基質であるグルコース一燐酸の濃度に依存した活性が65℃で検出された。また、図６に有るように、同様の活性がマンノース一燐酸を基質としたときにも検出されたことから、該酵素は耐熱性PGM/PMM活性を有する事が確認された。また、グルコース六燐酸を基質とした場合にも、実施例４の手法により、確かに分子内燐酸基が一位に転移している事が確認された。
【００３４】
（２） 金属イオン依存性
50mM MOPS緩衝液、10μM グルコース1,6ビス燐酸、1mM NADP酸化型、１unit グルコース六燐酸脱水素酵素、0.4mM グルコース一燐酸からなる酵素反応溶液2,000μl中の2mMの金属イオンを、マグネシウム、コバルト、マンガン、ニッケル、カルシウムに変化させた酵素反応溶液中に、実施例１で得られた精製酵素3.5μgを加えた。この酵素反応溶液を65℃で10分間反応させて340nmの吸光度の計時変化を実施例の２にあるように紫外・可視分光光度計で測定した。表１に示すように、本酵素の活性はマグネシウムが存在する条件において最も高い活性を示した。
【００３５】
【表１】
2006050993.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】TTP及びTDP-グルコースのHPLCでの分離・溶出パターンを示す図である。
【図２】TDP-グルコース生成の経時変化を示す図である。
【図３】精製した該酵素のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す図である。
【図４】保存されている活性中心等のモチーフ配列
【図５】グルコース一燐酸を基質とした場合の波長340nmにおける吸光度の経時変化を示す図である。
【図６】マンノース一燐酸を基質とした場合の波長340nmにおける吸光度の経時変化を示す図である。
【図１】
2006050993.tif 000004
【図２】
2006050993.tif 000005
【図３】
2006050993.tif 000006
【図４】
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【図５】
2006050993.tif 000008
【図６】
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【配列表】
2006050993000001.app