(57)【要約】【課題】触媒活性が高く、測定妨害物質に対する選択性にすぐれるとともに、実用性にすぐれたバイオセンサーとして好適に用いられるセンサーを提供する。【解決手段】基板上に形成された電極の少なくとも一方の電極上に部分的または全体的に枠体を設け、該枠体内にナノカーボンおよび粘性バインダーを混合したペーストが電極に接触するように充填されてなるセンサー。枠体が作用極および対極のいずれか一方の電極上に設置された場合には、その枠体内にペーストが充填され、また枠体が作用極および対極の両方の電極上に別々にあるいは跨って設置された場合には、少くとも一方の枠体内にペーストが充填される。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に形成された電極の少なくとも一方の電極上に部分的または全体的に枠体を設け、該枠体内にナノカーボンおよび粘性バインダーを混合したペーストを電極に接触するように充填してなるナノカーボンセンサー。
【請求項２】
作用極および対極のいずれか一方の電極上に枠体が設置され、枠体内にペーストを充填した請求項１記載のナノカーボンセンサー。
【請求項３】
作用極および対極の両方の電極上に枠体が設置され、少くとも一方の枠体内にペーストを充填した請求項１記載のナノカーボンセンサー。
【請求項４】
ナノカーボン混合割合が5〜90重量％であるペーストが用いられた請求項１記載のナノカーボンセンサー。
【請求項５】
粘性バインダーがミネラルオイル、ブロモホルム、ヌジョール、ポリテトラフルオロエチレン樹脂またはナフィオンである請求項１記載のナノカーボンセンサー。
【請求項６】
枠体がゴム製またはプラスチック製枠体である請求項１記載のナノカーボンセンサー。
【請求項７】
さらに導電性配合剤が50重量％以下混合されたペーストが用いられた請求項１記載のナノカーボンセンサー。
【請求項８】
導電性配合剤がグラファイト、ケッチェンブラック、アセチレンブラック、インジウム・スズ酸化物、酸化チタン、酸化亜鉛、ニッケル、銅、銀およびコバルトの少くとも一種である請求項７記載のナノカーボンセンサー。
【請求項９】
分子識別素子が、ペースト中に配合されまたはペースト上に配置された請求項１または５記載のナノカーボンセンサー。
【請求項１０】
分子識別素子が酵素、酵素のミュータント、抗体、核酸、プライマー、ペプチド核酸、核酸プローブ、アプタマー、微生物、オルガネラ、シャペロン、レセプター、細胞組織、クラウンエーテル、メデイエーター、挿入剤、補酵素、抗体標識物質、基質、界面活性剤、脂質、アルブミン、ナフィオン、チオール基導入試薬および共有結合試薬の少なくとも一種である請求項９記載のナノカーボンセンサー。
【請求項１１】
分子識別素子が混合されたペースト表面上またはペースト上に配置された分子識別素子上に、さらに有機物質層が形成された請求項９記載のナノカーボンセンサー。
【請求項１２】
測定システムとしてフローインジェクションアナリシス(FIA)法またはバッチ法に用いられる請求項１記載のナノカーボンセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサーに関する。さらに詳しくは、触媒活性が高く、測定妨害物質に対する選択性にすぐれたカーボンナノチューブを用いたセンサー、特にバイオセンサーとして好適に用いられるセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
カーボンナノチューブはそれの発見以来、その特異な構造により、それの応用が注目されている材料である。カーボンナノチューブは、電気化学的特性として、触媒活性が他の電極材料より高いことが挙げられ、これを電極として用いた場合、同一電位において、酸化電流、還元電流が大きく、感度向上につながることや、測定妨害物質に対する選択性があるといった特徴がある。
【非特許文献１】Nature, 354, 56 (1991)
【０００３】
このようなセンサーとしては、例えばミネラルオイルにカーボンナノチューブやグラファイトを配合し、得られたペーストを金属製電極端子の先端に付着させて、電極を製作する方法が提案されている。
【非特許文献２】Bioelectrochem. Bioenerg. 41, 121 (1996)
【非特許文献３】Electroanalysis 14, 1609 (2002)
【非特許文献４】J. Am. Chem. Soc. 125, 2408 (2003)
【非特許文献５】Ana. Chem. 75, 2075 (2003)
【非特許文献６】Electrochem. Commun. 5, 689 (2003)
【０００４】
しかるに、このような電極の場合、ペーストが電極端子表面から剥離しやすく、実用に耐え得ないという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、触媒活性が高く、測定妨害物質に対する選択性にすぐれるとともに、実用性にすぐれたバイオセンサーとして好適に用いられるセンサーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる本発明の目的は、基板上に形成された電極の少なくとも一方の電極上に部分的または全体的に枠体を設け、該枠体内にナノカーボンおよび粘性バインダーを混合したペーストを電極に接触するように充填したセンサーによって達成される。枠体が作用極および対極のいずれか一方の電極上に設置された場合には、その枠体内にペーストが充填され、また枠体が作用極および対極の両方の電極上に別々にあるいは跨って設置された場合には、少くとも一方の枠体内にペーストが充填される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明にかかるセンサーは、電極上に配置されるナノカーボンが、粘性バインダーとともに固定枠体内に充填された状態で配されているので、電極上から剥離するといった問題がみられず、特に測定システムとしてFIA(Flow Injection Analysis)法を採用し、送液溶液が流れる際や、バッチ法を採用して、撹拌状態となった場合においても、ナノカーボンの特性である高い触媒活性および測定妨害物質に対する優れた選択性を損なうことがないといった効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のセンサーの一例を図６に示す。基板２上には、作用極および対極の２極よりなる電極３が形成されており、さらに基板上には一方の電極を部分的に囲う状態で枠体４が設けられ、この枠体内には、電極と接触するようにペースト５が充填されている。また、図７に示された態様は、作用極および対極の両方の電極上に跨った状態で枠体４が設置され、その一方の枠体内にのみペースト５が充填されている。以下、かかるセンサーについて詳細に説明する。
【０００９】
基板としては、好ましくは平面状のものが用いられる。その材質としては、絶縁性のもの、例えばポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック、ポリ乳酸などの生分解性材料、紙、セラミック、ガラスなどが用いられる。
【００１０】
基板上には、電極が形成される。電極材料としては、白金、パラジウム、銀、銅などの単体またはこれらを樹脂などに分散されたものが用いられ、蒸着、スパッタリング、スクリーン印刷、箔貼り付けなどの方法で基板上に形成される。電極は、作用極および対極を設置した２電極またはこれに参照極を加えた３電極のものが用いられ、センサーを小型化する観点からは２電極のものが、測定精度の信頼性を高める観点からは、銀塩化銀などの参照極を加えた３電極のものが用いられる。
【００１１】
電極が形成された基板上には、枠体が設けられる。枠体の形状は任意であるが、少なくとも一方の電極の一部分を囲うように、高さが約100〜2000μm、好ましくは約500〜1500μmとなるように設けられる。枠体の成形材料としては、シリコーンゴムなどのゴムまたはポリテトラフルオロエチレン樹脂などのプラスチックが用いられ、好ましくはシリコーンゴムが用いられる。このような材料は、例えば測定システムとしてFIA法を用い、キャリヤー(送液溶液)が流れた際に、シール機能(漏れ防止、粘弾性機能)を発揮する。かかる枠体は、例えば測定システムがFIA法で送液溶液が流れた際や、バッチ法で撹拌状態の場合に、ペーストが電極から剥がれるといった不具合を防止することができる。ここで、枠体はセラミック平面基板上に静置されれば足り、作製されたセンサーは、測定システムがFIA法の場合には一般のセンサー測定用セルに格納される。これにより上部、下部の２体に分かれるセルの下部にセンサーが設置され、その上から上部をねじ止めすることで、その圧力によりセンサーとシリコーンゴム枠が固定され、同時にシール機能も付与されることとなる。
【００１２】
ペーストの主成分として用いられる中空型、カーボンナノホーン、コクーンなどのカーボンナノチューブ、カーボンナノコイル、フラーレンおよびこれらの誘導体などのいわゆるナノカーボンは、グラファイトやダイヤモンドなどと同様に炭素の同素体である。この内、カーボンナノチューブはアーク放電法、気相成長法またはレーザー蒸発法などにより製造されたものが用いられ、構造的には多層または単層のいずれのものも用いられる。
【００１３】
カーボンナノチューブなどのナノカーボンは、ミネラルオイル、ブロモホルム、ヌジョール、ポリテトラフルオロエチレン樹脂またはナフィオンなどの粘性バインダーと混合されてペースト状とされる。ここで粘性バインダーとは、ナノカーボンに対して分散、保持、加工性に優れるという性状を示すものをいう。ナノカーボンは、ペースト中5〜90重量％、好ましくは10〜60重量％の割合で用いられる。ナノカーボンがこれより少ない割合で用いられると、ナノカーボンに起因する特性が発現しないことがあり、一方これより多い割合で用いられると、ペースト製作の段階でもろくなり、ペースト作製が困難となる。
【００１４】
以上の必須成分に加えて導電性のさらなる改善を目的として、導電性配合剤を添加することもできる。導電性配合剤としては、グラファイトやケッチェンブラック、アセチレンブラックなどの粉体、ITO（インジウム・スズ酸化物）、酸化チタン、酸化亜鉛、ニッケル、銅、銀、コバルトなどの金属粉が用いられる。これらの配合は導電性を改善し、また金属粉、例えばニッケル、銅、銀、コバルトなどはタンパク質、アミノ酸、アルコールなどに対して反応するので、これらの添加により、タンパク質、アミノ酸、アルコールセンサーへの応用が可能となる。
【００１５】
このような導電性配合剤は、ペースト中50重量％以下、好ましくは1〜20重量％の割合で用いられる。導電性配合剤がこれより多い割合で用いられると、電極がもろくなり好ましくない。
【００１６】
以上述べたセンサーをバイオセンサーとして用いる場合には、分子識別素子をペースト中に混合してまたはペースト上に配置して用いることができる。分子識別素子の配置する方法としては、例えば分子識別素子を水溶液として、ペーストの表面にピペットなどにより滴下して配置し、好ましくはその後に乾燥処理をするという方法が挙げられる。
【００１７】
分子識別素子としては、酵素、酵素のミュータント、抗体、核酸、プライマー、ペプチド核酸、核酸プローブ、アプタマー、微生物、オルガネラ、シャペロン、レセプター、細胞組織、クラウンエーテル、フェリシアン化カリウムなどのメデイエーター、挿入剤、補酵素、抗体標識物質、基質、界面活性剤、脂質、アルブミン、ナフィオン、チオール基導入試薬および共有結合試薬の少なくとも一種が用いられ、これらは、吸着法、共有結合法などを用いてペーストへ結合される。
【００１８】
上記酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼおよびこれらのミュータントなどが挙げられる。
【００１９】
以上の各成分よりなるペーストは、各成分を任意の配合順序により乳鉢やボールミルなどを用いて粉砕、混合することにより作製される。得られたペーストは、基板上に設けられた枠内に電極と接触するように充填される。
【００２０】
このように、ナノカーボンが粘性バインダー中に分散しているペーストは、ナノカーボンの導電性などの諸特性を発現する。ナノカーボンの特性の発現は、ナノカーボン同志の接触、導電性配合剤同士の接触、異種配合成分同士の接触、トンネル効果などにより得られる。
【００２１】
また、分子識別素子が混合されたペースト表面上またはペースト上に配置された分子識別素子上には、さらに分子識別素子の保護などを目的として有機物質層を形成することができる。有機物質層としては、例えばアルブミンまたはアルブミンのグルタルアルデヒド架橋膜、ナフィオン膜、ナイロンなど一般材料の網状体または布状体などを挙げることができる。
【００２２】
有機物質層は、有機物質を水溶液として、分子識別素子が混合されたペースト表面上またはペースト上に配置された分子識別素子上にピペットなどにより滴下することにより形成され、好ましくはその後乾燥処理が行われる。
【００２３】
本発明のセンサーを用いての測定法としては、酸化電流もしくは還元電流を測定するポテンシャルステップクロノアンペロメトリーまたはクーロメトリー、サイクリックボルタンメトリー法などが用いられ、例えば電極間電圧を特定電圧に設定することにより、測定妨害物質の影響を避け、目的物質を選択的に測定することを可能とする。また、測定システムとしては、FIA法またはバッチ法などが用いられる。
【００２４】
ここで、電極のみから構成されるセンサーを用いた場合には、過酸化水素、NADH、尿酸、ドーパミン、モノアミン、アルコール、金属イオン、遺伝子損傷マーカーである8-ヒドロキシデオキシグアノシンなどの核酸(特許文献１参照）、たんぱく質(特許文献２参照）、脂質、炭水化物またはそれらの誘導体などの検出が可能である。
【特許文献１】特開２００１−２５８５９７号公報
【特許文献２】ＵＳ  ５６５３８６４
【００２５】
例えば、過酸化水素は、次式の電極反応に従って酸化または還元された電流を測定することにより、その濃度が電気化学的に測定される。
電極による酸化の場合：H2O2 → O2 + 2H+ + 2e-
電極による還元の場合：H2O2 + 2H+ + 2e- → 2H2O
【００２６】
また、電極と共に酵素などの分子識別素子をセンサーの構成要素とした場合は、バイオセンサーとして用いることができ、グルコース、エタノール、アミノ酸またはこれらの誘導体などが検出される。
【００２７】
特許文献４〜６に示される如く、酵素センサーでは、検体の測定対象によって分子識別素子としての酵素の種類を変えることが必要である。例えば、測定対象がグルコースの場合にはグルコースオキシターゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼが、エタノールの場合にはアルコールオキシターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼが、乳酸の場合には乳酸オキシターゼが、総コレステロールなどの場合にはコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼの混合物などが用いられる。
【特許文献４】ＵＳ  ６０７１３９１
【特許文献５】ＵＳ  ６１５６１７３
【特許文献６】ＵＳ  ６５０３３８１
【００２８】
例えば、下記式に示す如く、グルコースオキシダーゼ(GOD)が触媒する反応を用いてグルコースを測定する場合には、発生した過酸化水素を、電極のみから構成されるセンサーを用いた場合と同様に酸化または還元された電流を測定することにより、その濃度が電気化学的に測定可能となり、これにより間接的にグルコース濃度を測定することができる。
グルコース ＋ 酸素 → グルコノラクトン ＋ Ｈ2Ｏ2
【００２９】
このようなセンサーにおいて、反応が溶存酸素濃度に律速され、低濃度の試料しか測定できない場合、検出範囲の拡大を目的として酵素とともに電子伝達体(メディエーター)が使用される。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体などが用いられる。例えばグルコースを測定する場合、グルコースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼなどの酵素のいずれかと、フェリシアン化カリウムが用いられる。フェリシアンイオンは酵素により還元されてフェロシアンイオンとなり以下の式のように更に電極によりフェリシアンイオンに酸化され、このときの電流値を測定することにより、間接的にグルコースが測定される。
2[Fe(CN)6]4-  →    2[Fe(CN)6]3-  +  2e-
【実施例】
【００３０】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００３１】
実施例１
グラファイトパウダー(フィシャー社製品グレード♯38)30mgをめのう乳鉢に入れ、乳棒を用いて20分間粉砕処理を行った後、多層カーボンナノチューブ(ナノラボ社製品、直径15〜45nm、長さ1〜5μm)30mgを添加して、乳棒を用いてさらに20分間粉砕処理を行い、グラファイトパウダーと混合した。これにミネラルオイル(アルドリッチ社製品、比重0.94)42.6μl(40mg)を添加し、乳棒を用いて20分間混合を行い、ペーストを得た。得られたペーストをセラミック平面基板(15×20mm)にスクリーン印刷法により形成された白金電極(作用極および対極)(2×16mm)の一部分上に設けられたシリコーンゴム枠(15×12×1mm)の中に充填し、図７に示されるようにセンサーを作製した。ここで、シリコーンゴム枠はセラミック平面基板上に静置され、センサーは、測定用セルに格納され、上部、下部の２体に分かれたFIAシステム用のセルの下部に設置され、その上から上部をねじ止めすることで、固定された。
【００３２】
FIAシステムは、キャリア(送液溶液)溜のビン、送液チューブ、送液ポンプ、サンプル打ち込み用インジェクター、センサー測定用セル、電気化学検出器、廃液溜のビンから構成されており、かかる測定装置のセルにセンサーが格納された。
【００３３】
サンプルとしては、pH6.86リン酸緩衝液を用いて所定濃度とした過酸化水素が用いられ、サンプル注入にはインジェクターが用いられた。インジェクターとセンサー間距離は21cm、チューブ径は内径：0.75mm、外径：1.60mmであり、サンプル注入量は137μl、キャリヤとしては、50mMKCl、8.2mM安息香酸を含むpH5.0緩衝液が用いられ、キャリア流速を0.92ml/分としたところ、１サンプル測定に要した時間は95秒であった。
【００３４】
測定は、室温下において、電極の印加電圧を400mV(酸化電流測定)、-50mV（還元電流測定）の条件下で行われた。測定の間、平面基板からのペーストの剥離はみられなかった。
【００３５】
比較例１
実施例１において、カーボンナノチューブが用いられず、グラファイトパウダー量が60mgに変更されて用いられた。
【００３６】
実施例１(○)および比較例１(●)で得られた結果は、図１(測定電圧400mV)および２(測定電圧-50mV)に示される。カーボンナノチューブが用いられた実施例１の出力(感度)は、比較例１のそれよりも高いことが確認された。
【００３７】
比較例２
実施例１において、シリコーンゴム枠が設けられなかったところ、キャリアの送液により、ペーストは電極端子から剥がれてしまい、測定には至らなかった。
【００３８】
実施例２
実施例１において、ペーストとしてさらにグルコースオキシダーゼ(シグマ社製品G7016、タイプ VII−S、166500U/g)39.6mg(66000ユニット)を混合したものが用いられ、サンプルとして過酸化水素の代わりにリン酸緩衝液(pH6.86)を用いて所定濃度としたグルコースが用いられた。なお、測定の間、平面基板からのペーストの剥離はみられなかった。
【００３９】
比較例３
比較例１において、ペーストとしてさらにグルコースオキシダーゼ(シグマ社製品G7016、タイプ VII−S、166500U/g)39.6mg(66000ユニット)を混合したものが用いられ、サンプルとして過酸化水素の代わりにリン酸緩衝液(pH6.86)を用いて所定濃度としたグルコースが用いられた。なお、測定の間、平面基板からのペーストの剥離はみられなかった。
【００４０】
実施例２(○)および比較例３(●)で得られた結果は、図３(測定電圧400mV)および４(測定電圧-50mV)に示される。カーボンナノチューブが用いられた実施例２の出力(感度)は、比較例３のそれよりも高いことが確認された。
【００４１】
比較例４
実施例２において、シリコーンゴム枠が設けられなかったところ、キャリアの送液により、ペーストは電極端子から剥がれてしまい、測定には至らなかった。
【００４２】
実施例３
実施例２において、サンプルとしてリン酸緩衝液(pH6.86)緩衝液を用いて0.2mMとしたアスコルビン酸および100mg/dlグルコースが用いられ、所定の測定電圧における出力を測定した。
【００４３】
比較例５
比較例３において、サンプルとしてリン酸緩衝液(pH6.86)を用いて0.2mMとしたアスコルビン酸および100mg/dlグルコースが用いられ、所定の測定電圧における出力を測定した。
【００４４】
実施例３および比較例５で得られた測定結果より、選択比＝(100mg/dlグルコースの出力）/(0.2mMアスコルビン酸の出力）を算出し、グルコース測定の妨害物質となるアスコルビン酸のセンサー応答に対する影響を検討した。実施例３(○)および比較例５(●)における算出値は、図５に示される。還元側（マイナス側電圧）および酸化側（プラス側電圧）のいずれにおいても、特に還元側では明らかにカーボンナノチューブ配合電極の方が選択性に優れていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明に係るバイオセンサーは、各種測定システム、殊にFIAシステムに用いられた場合にあっても、優れた選択性を発揮するものであり、各種溶液中の成分濃度を電気化学的に測定するセンサー、例えば酵素などを利用して目的物質を電気化学的に測定する、家庭内自己診断用の血糖センサー、尿糖センサー、タンパク質や核酸の機能、構造解明に用いるプロテインチップ、DNAチップ、環境管理のための水質検査などに用いられるセンサーなどとして有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例１(○)および比較例１(●)の測定電圧400mV(酸化電流測定)における過酸化水素に対する出力値を示すグラフである。
【図２】実施例１(○)および比較例１(●)の測定電圧-50mV(還元電流測定)における過酸化水素に対する出力値を示すグラフである。
【図３】実施例２(○)および比較例３(●)の測定電圧400mV(酸化電流測定)におけるグルコースに対する出力値を示すグラフである。
【図４】実施例２(○)および比較例３(●)の測定電圧-50mV(還元電流測定)におけるグルコースに対する出力値を示すグラフである。
【図５】実施例３(○)および比較例５(●)のグルコースのアスコルビン酸に対する選択比の電圧依存性を示すグラフである。
【図６】本発明に係るバイオセンサーの一実施態様である。
【図７】本発明に係るバイオセンサーの他の実施態様である。
【符号の説明】
【００４７】
１  センサー本体
２  基板
３  電極
４  枠
５  ペースト
【図１】
2006308463.tif 000003
【図２】
2006308463.tif 000004
【図３】
2006308463.tif 000005
【図４】
2006308463.tif 000006
【図５】
2006308463.tif 000007
【図６】
2006308463.tif 000008
【図７】
2006308463.tif 000009