(57)【要約】【課題】 各種植物うち特に唐辛子やピーマンのキュウリモザイクウイルスに対する防除効果が非常に優れたキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを得るためのサテライトRNA、該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物および該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種するキュウリモザイクウイルスの防除法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を含むサテライトRNA、該サテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られる、キュウリモザイクウイルス抵抗性植物、該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種することを特徴とする、キュウリモザイクウイルスの防除法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA。
【請求項２】
３９１塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNA。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列を含むサテライトRNA。
【請求項４】
配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNA。
【請求項５】
３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス
【請求項６】
３９１塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス。
【請求項７】
配列番号１の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス
【請求項８】
配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス
【請求項９】
「３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA」または「３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNA」をキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１０】
配列番号１または配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を組織培養または栄養繁殖して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１２】
植物が唐辛子である請求項９または請求項１０に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１３】
唐辛子が唐辛子品種BPH ９００６０８または唐辛子品種BPH ９００６１３である請求項１２に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１４】
植物がピーマンである請求項９または請求項１０に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１５】
「３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA」または「３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNA」をキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項１６】
請求項１または請求項２記載の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項１７】
植物が唐辛子である請求項１５または請求項１６に記載のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項１８】
唐辛子が唐辛子品種BPH ９００６０８またはBPH ９００６１３である請求項１７に記載のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【請求項１９】
植物がピーマンである請求項１５または請求項１６に記載のキュウリモザイクウイルスの防除法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は各種植物うち特に唐辛子やピーマンのキュウリモザイクウイルスに対する防除効果が非常に優れたキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを得るためのサテライトRNA、該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物および該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種するキュウリモザイクウイルスの防除法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キュウリモザイクウイルス（以下CMVということがある）は、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ種Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ属の代表的な種であって、世界中の温帯、亜熱帯および熱帯の地域で多くの重要な農産物に感染し、経済的に多大な被害を及ぼしている。このウイルスは、ウイルスなかで最も多くの宿主をもち、８５属８００種を越える植物に感染する。今まで、中国、クロアチア、フランス、エジプト、ギリシア、イスラエル、イタリア、日本、ポーランド、ポルトガル、スウェーデン、そしてアメリカ合衆国などの多くの国々で、バナナ、カボチャ、セルリー、豆類、レタス、唐辛子、トマトおよびタバコなどの作物に感染し、モザイク、糸葉、黄化、矮化、壊疽などの病害を生じさせ、果実や葉の品質を低下させ、また収量を低下させることが問題となった。例えば、トマト消費量の多い地中海沿岸において、缶詰用トマト栽培品種がCMVの多大な被害を被ったことが問題となった。また１９７２年フランスのアルザス地方で、また１９８７年イタリアとスペインのトマト主要産地において、CMVが突然大発生し、着果したトマトの殆どの果実が壊死病による被害を受け、壊滅状態となったことが報告されている。また近年、インドネシアで栽培されている唐辛子品種BPH ９００６０８やBPH ９００６１３が、また韓国で栽培されているパプリカなどのカラーピーマンが、CMVにより多大な被害を受けたことが報告されている。
【０００３】
このように多くの地域で多種多様な作物に感染し、多大な経済的被害を及ぼすCMVの感染から作物を防除する一般的な方法として、媒介昆虫（アブラムシ）の飛来を寒冷紗によって防止する方法、シルバーポリフィルムのマルチングやシルバーテープによって忌避効果を利用する方法、および農薬散布による防除方法などが挙げられるが、CMVの感染から作物を完全には防除することができない大きな欠点を有する。
【０００４】
さて、一般に植物には既に感染しているウイルス病と同じウイルスまたは極めて近縁なウイルスには感染し難いという現象（これを干渉作用という）があるので、植物に容易に感染して、その組織内で盛んに増殖しても、植物そのものの生育にほとんど影響を及ぼさない程度の弱い病原性のウイルス（これを弱毒ウイルスという）を、無病の植物に予め感染させると、強毒CMVの感染や被害を防ぐこと（これをウイルスの防除という）が可能となる。
【０００５】
従来、この現象を利用したキュウリモザイクウイルスの防除法および関連技術として下記が知られている。
（１）サテライトRNAを含まないキュウリモザイクウイルスとトマトに壊疽症状を発揮しないCMVから得られた分子量０．５〜２．５×１０５ダルトンのサテライトRNAとを、野菜、花卉、タバコ、豆類に接種せしめ、しかる後、該野菜、花卉、タバコ、豆類の汁液からCMV弱毒ウイルスを作出する方法、およびそれより得られた新規な弱毒ウイルス、並びにそれを用いたCMVの防除方法（特公昭６２−３７９５６号公報参照）が知られている。
（２）またサテライトRNAのcDNAをT７プロモーターを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させ、感染性のあるサテライトRNAを得ること、５’末端に２４塩基の余分な配列が付加されているものは、感染性が低かったが、これを６−９塩基にすると感染性は１０倍に増大すること、ナチュラルなサテライトRNAの感染性は１００倍であること、５’末端の２４塩基の余分な配列は植物内で複製することにより除去できること（J．Biochem．、１９８８、Vol．１０４、No．５、p．８４１−８４６参照）が知られている。
（３）またタバコで４世代継代したY−CMVからはYnサテライトRNAが生じ、このサテライトRNAは、トマトに壊疽症状を生ずること、YサテライトRNAは壊疽症状を生じないこと（J．Gen．Virol．、１９８６、Vol．６７、No．１０、p２２４１−２２４６参照）が知られている。
（４）YサテライトRNAがタバコで黄色症状を出し、トマトに壊疽症状を出すこと、その原因領域を特定するためにYサテライトRNAのcDNAに挿入や欠失を導入したこと、YサテライトRNAと非壊疽性のT７３サテライトRNAとのキメラを実験した結果、YサテライトRNAの３２５番の塩基を１塩基置換するだけでトマトの壊疽症状はなくなり、モザイク症状に変わったこと、S１９サテライトRNAとの同様な実験をした結果、タバコに黄色症状を出すのは１００番から２００番の間の二次構造が関与していること（Plant Cell．、１９８９、Vol．１２、p．１１６５−１１７３参照）が知られている。
【０００６】
しかしながら、従来知られている弱毒ウイルスは、非常に少ない植物に対してのみ、その防除効果を奏するものであり、対象としない植物に対しては、反対にキュウリモザイクウイルス症による病害をもたらすという欠点を有する。
従って、圃場などにおいてCMVの弱毒ウイルスを適用する場合、該弱毒ウイルスが対象としない植物に感染してモザイク、糸葉、黄化、矮化、壊疽などの病害が出る影響を考慮し、隔離された状態での栽培を余儀なくされる欠点を有する。また、一般に弱毒ウイルスは、常に変異を起こす可能性があり、継代接種や圃場での利用の過程で、突然変異などによって強毒ウイルスに変化して、対象作物などに病害が生じる危険性を有する。
そのため作出した弱毒ウイルスは、継代接種してウイルス症状の変化を調べることが、非常に重要であるが、その操作に労力と時間を要する欠点を有する。
【０００７】
一方、唐辛子およびピーマンもCMVに感染すると、葉は明瞭なモザイク症状となり、株は萎縮し、果実は硬化し変形する。
一般に唐辛子およびピーマンは、CMVに対する防除が難しく、また、このウイルスに対する効果的な防除薬はなく、１度感染し発病すれば、回復はせず、品質が劣化し、収量が低下する。
ピーマンに発生するCMVを特に対象とした弱毒ウイルスについては、これまでのところ本出願人が開発し、先に出願したもの（特開平１１−２７６１７８）が僅かに１件知られているに過ぎず、一方唐辛子に発生するCMVを対象とした弱毒ウイルスについては、これまでのところ知られていない。
そのため、従来公知のナス科およびウリ科作物を対象にして作出された弱毒ウイルスを取り寄せ、唐辛子での適応性を検討し、利用しているに過ぎない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このようなことから、多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスに変異しない、そして唐辛子、ピーマンなどに接種した場合においても、ウイルス症状がきわめて弱い性質を有するサテライトRNAを保有するキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを用いるキュウリモザイクウイルスの防除法およびキュウリモザイクウイルス抵抗性植物の出現が強く望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するため、種々検討を重ねた結果、日本各地の多くの圃場からウイルスに感染していると思われるナス科（トマトを含む）、ウリ科、キク科、アブラナ科などの植物のウイルス症状の葉を採集し、これらの葉からCMVを分離し、サテライトRNAを有する株を選抜して、唐辛子に接種して圃場に植え、自然条件下で防除効果のある（即ちウイルス症状の軽微な）CMVの中から、選抜を重ねた結果、当該唐辛子品種に感染してもウイルス症状が極めて軽微であって、そのウイルスを当該唐辛子品種に接種、感染しておくことにより、一般栽培圃場において、多種多様の強毒CMVの病害に対して防除効果のあるCMVを選抜することに成功した。
【００１０】
また、同様にして上記ウイルス症状の葉からCMVを分離し、サテライトRNAを有する株を選抜し、ピーマン作物に感染してもウイルス症状が極めて軽微なCMVの中から、そのウイルスをピーマン苗に接種・感染させておくことにより、「一般圃場において、多種多様の強毒ウイルスCMVの病害に対して防除効果を有するCMV」を探索することに成功した。
【００１１】
そして、これら２つの弱毒ウイルスは、唐辛子、ピーマン以外の多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスとして変異しないことを発見した。
【００１２】
また、これら配列番号１および配列番号２に示す塩基配列を含むサテライトRNAを含むキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスは、それぞれ本出願人が先に開発したキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−３（特開平１１−２７６１７８号：配列番号３参照）、およびキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−１（特許２９７５７３９号：配列番号４参照）と対比すると、いずれも多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスに変異しない性質は、ほとんど同じであるが、配列番号１の場合は、唐辛子に接種した場合において、弱毒ウイルスNDM−３よりも品質の非常によい唐辛子を高収率で得ることができ、また配列番号２の場合は、ピーマンに接種した場合において、同弱毒ウイルスNDM−３およびNDM−１よりも品質の非常によいピーマンを高収率で得られることを発見した。
【００１３】
本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
（１）即ち本発明は、３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNAを提供する。
（２）また本発明は、３９１塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNAを提供する。
（３）また本発明は配列番号１の塩基配列のサテライトRNAを提供する。
（４）また本発明は配列番号２の塩基配列のサテライトRNAを提供する。
（５）また本発明は「３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA」をキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する。
（６）また本発明は「３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNA」をキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する。
（７）また本発明は配列番号１の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する。
（８）また本発明は配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する。
（９）また本発明は「３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA」または「３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNA」をキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供する。
（１０）また本発明は、配列番号１または配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供する。
（１１）また本発明は上記キュウリモザイクウイルス抵抗性植物の植物の一部を組織培養または栄養繁殖して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供する
(１２)また本発明は「３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA」または「３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNA」をキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法を提供する。（１３）また本発明は配列番号１または配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の概略を説明し、ついで本発明をより具体的に説明する。
ＣＭＶの核酸成分は約３３００塩基より構成されているＲＮＡ１、約３１００塩基のＲＮＡ２、約２２００塩基のＲＮＡ３、および約１０００塩基のＲＮＡ４から成る。そして、ＣＭＶの系統によっては上記ＲＮＡの４成分の外に更に小さな塩基数のサテライトＲＮＡと呼ばれる成分を含む系統がある。
このサテライトＲＮＡの塩基数は約２００〜５００である。
本発明を実施するには、先ず植物、例えばトマト、ナス、ピーマン、ホウレンソウなどより分離されたＣＭＶであって、トマトにえそ症状を示さないサテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルスをトマトの子葉に接種して、１〜４週間程度、ウイルスを増殖させた後、感染葉を凍結粉砕し、更にワーリングブレンダー（ミキサー、または磨砕機）などで適当なクロロホルムを含有する緩衝液中で磨砕する。得られた磨砕液から適当な遠心分離を繰返すことによってサテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルスの粒子を精製する。すなわち、フェノール抽出と、エタノール沈殿によってＲＮＡ画分（文献T.Maniatis）を得る。更にこのＲＮＡ画分を１０〜４０％のショ糖密度勾配遠心分離法やポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離精製し、弱毒ウイルスのサテライトＲＮＡを得る。
上記で得られるサテライトＲＮＡを鋳型としてＡＭＶ（ライフサイエンス社製）などの逆転写酵素を使用し、常法に従いｃＤＮＡを合成する。すなわち、対応するＤＮＡを合成する。
得られたｃＤＮＡにＴ７、Ｔ３、ＳＰ６（文献J.d.Watsonら、In Molecular Biology of the Gene(1987)））などの適切なプロモーターを連結した後、pUC119(pUC118)などの（宝酒造社製）プラスミドに導入し、得られる組換えプラスミドで大腸菌JM101,JM109などの宿主微生物を形質転換してクローニングする。
このサテライトＲＮＡのｃＤＮＡを含む組換えプラスミドにＲＮＡポリメラーゼを作用させ、サテライトＲＮＡを生産せしめる。こうして得られたクローニングサテライトＲＮＡをサテライトＲＮＡを含まないか、あるいはそれを除去したＣＭＶのＲＮＡ（但し、少なくともＲＮＡ１〜ＲＮＡ３を含む）と共に植物の幼苗の葉、根、茎に接種する。このようにして本発明の弱毒ウイルスを製造することができる。
これらの弱毒ウイルスは植物に接種することにより当該植物のＣＭＶによるウイルス病を有効に防除することができる。
防除法としては、種々あるが、例えば弱毒ウイルスを４０ｍMリン酸緩衝液（ｐH約7.0）で１０〜５０μｇ／mlに希釈し、これにカーボランダム、セライト、ベントナイトなどを少量加え、植物に接種してもよい。
更に植物への接種部位は格別制限されないが、子葉期など若い植物ほど感染率が高いので好ましい。
以上概略を説明したが、以下により具体的に説明する。
（１）CMV弱毒ウイルスの採取と作出
関東から甲信越にかけての５３ヶ所の圃場より、ナス科、ウリ科、キク科、アブラナ科などの植物からウイルス症状の葉を採集し、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト品種苗（日本デルモンテ社製TMK１４３）に接種した。一週間後、各々のエライザー検定を行った結果、１５２系統についてCMVの感染を確認した。これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、１５２系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト品種苗（TMK１４３）１０株ずつに接種し、一週間後、リボ核酸（RNA）分析を行った。その結果、サテライトRNAを有するCMVが１４系統から検出された。そして、その１４系統についてウイルス症状調査を行い、ネクロシス、モザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除き、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっていたので、上記品種のトマト苗５００株にこのウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜した。更にサテライトRNAの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマトに接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行なった。その結果、サテライトRNAを安定して含む2種類の弱毒ウイルス（NDM−４とNMD−５）を作出した。
【００１５】
（２）サテライトRNAの単離
サテライトRNAを含む２種類の弱毒ウイルス（NDM−4とNDM−５）を別々のトマトの子葉にそれぞれ接種、感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取し超低温にて凍結した。これら２種類の感染葉をそれぞれ粉砕し、２倍量の ０．１％チオグリコール酸を含む ０．５Mクエン酸緩衝液（pH６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで破砕した。これら破砕液を９，５００Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加え溶解させた後、４０分間静置した。これら溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０） をそれぞれ加え懸濁均一化した。これら粗精製品を１２，０００Ｘｇで遠心分離した上清を２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、沈殿を回収した後、１０ｍMリン酸緩衝液（pH７．０）にそれぞれ懸濁した。これら溶液に最終濃度で１％になるように１０％SDSを加え、更に溶液と等量のフェノールをそれぞれ加えた後１２，０００Ｘｇ、１５分間遠心した。これら上層（水層）を回収し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返して2種類のRNAをそれぞれ単離、精製した。この方法で感染葉１００ｇより、それぞれ約１００μｇのRNAを得た。上記の方法で得られたRNAを水にそれぞれ溶解し、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離(１７５，０００Ｘｇ、１６時間)して得られたサテライトRNAのバンドを採取し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返して、２種類のサテライトRNAを単離精製した。また精製が不十分な場合は６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった後、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトRNAのバンドの部分をカミソリなどで切り取った。サテライトRNAのバンドを含むゲル断片を透析チューブに入れEDTAを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行なってサテライトRNAを回収した後、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返してサテライトRNAを単離精製した。この電気泳動によるサテライトRNAの溶出の詳細はT．Maniatisらの方法［Molecular Cloning（１９８２）］に従って行なった。
【００１６】
（３）サテライトRNAのクローニングとシークエンス
単離精製した２種類のサテライトRNAからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）cDNAを合成するために、サテライトRNA（約３μg）と３’末端塩基配列に相補的なDNAプライマー（８塩基、１μM）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングした。この−鎖cDNA合成反応はOmniscript Reverse Transcriptase（QIAGEN）を用いて、３７℃、６０分の条件で行なった。次に、得られたcDNAをPCR法によって増幅させた。すなわち、プラス鎖サテライトRNAの５’末端に相同的なDNAプライマーと３’末端塩基配列に相補的なDNAプライマーを用い、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってPCR反応を行なった。［PCR反応液；１０mM Tris−HCl、１．５mM MgCl2、５０mM KCl、２００μM dNTP、２．５units DNA polymerase（Takara）］
このｃDNAを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出し、DNA回収キットGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（Amersham）を用いて精製した。得られたcDNAをT−Aクローニング用ベクターpGEM T Easy（Promega）にクローニングした。このプラスミドを制限酵素EcoRIで切断することによって、NDM−４とNDM−５それぞれのサテライトRNA由来のcDNAの存在を確認した。
【００１７】
これらサテライトRNAの塩基配列をThermo Sequenase Cycle Sequencing Kit（Amersham社製）とDNAシーケンサDSQ−１０００L（島津製作所製）を用いて決定し、３３９塩基から成る塩基配列を配列番号１とし、３９１塩基からなる塩基配列を配列番号２とに示した。これら配列番号１と配列番号２に示すサテライトRNAの塩基配列に相同的な塩基配列を有するプラスミドをFERM BP−８０９６（pPV１M−９４）とFERM BP−８０９７（pPV２−４０）として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託した。
【００１８】
本発明のサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号１）を以下に示す。
配列表
配列番号：１
（１）配列の長さ：３３９
（２）配列の型：核酸
（３）鎖の数：一本鎖
（４）トポロジー：
（５）配列の種類：サテライトRNA
（６）起源
（ａ）生物名：キユウリモザイクウイルス
（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）
（ｂ）株名：CMV NDM−４株
（７）配列：
2006050902.tif 000002
【００１９】
本発明の別のサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号２）を以下に示す。
配列表
配列番号：２
（１）配列の長さ：３９１
（２）配列の型：核酸
（３）鎖の数：一本鎖
（４）トポロジー：
（５）配列の種類：サテライトRNA
（６）起源
（ａ）生物名：キユウリモザイクウイルス
（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）
（ｂ）株名：CMV NDM−５株
（７）配列：
2006050902.tif 000003
【００２０】
比較のため、本出願人が先に開発したキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−３（特開平１１−２７６１７８号）を構成するサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号３）を以下に示す。
配列表
配列番号：３
（１）配列の長さ：３３９
（２）配列の型：核酸
（３）鎖の数：一本鎖
（４）トポロジー：
（５）配列の種類：サテライトRNA
（６）起源
（ａ）生物名：キユウリモザイクウイルス
（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）
（ｂ）株名：CMV NDM−３株
（７）配列：
2006050902.tif 000004
【００２１】
比較のため、本出願人が先に開発したキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−１（特許２９７５７３９号）を構成するサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号４）を以下に示す。
配列表
配列番号：４
（１）配列の長さ：３９１
（２）配列の型：核酸
（３）鎖の数：一本鎖
（４）トポロジー：
（５）配列の種類：サテライトRNA
（６）起源
（ａ）生物名：キユウリモザイクウイルス
（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）
（ｂ）株名：CMV NDM−１株
（７）配列：
2006050902.tif 000005
【００２２】
（４）弱毒ウイルスの接種源作成
弱毒ウイルスが感染したトマト葉１ｇに、緩衝液（中性付近の０．１Mリン酸緩衝液）を加えて、１０mlに調整した磨砕液をトマト１００株の子葉または本葉に接種し、１〜２週間程度、弱毒ウイルスを増殖させた後、トマト感染葉１５０ｇを採取し、超低温−８０℃で凍結した。この感染葉を粉砕した後、０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００ｍｌと等量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで磨砕して、CMV粒子を含む磨砕液を得た。この磨砕液を２，０００ Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）１２０mlを回収して、これに１０重量％の粉末ポリエチレングリコール１２ｇを加えて溶解させた後、４０分静置して、析出させ、沈殿し易くした。この溶液を９，５００ Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿（CMV粒子）を回収して、これに２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Mクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を洗浄のため加え溶解した。これを１２，０００Ｘｇで遠心分離し、CMV粒子を含む上澄を分取して、２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁して、弱毒ウイルスのCMV粒子を約１０mg抽出し、接種源を得た。
【００２３】
本発明のCMV弱毒ウイルスを接種する方法としては、純化した弱毒ウイルスのNDM−4またはNDM−5の粒子を５０〜５００μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝液に懸濁し、公知の方法により接種すればよく、例えば、噴霧ローラー法（特開平４−３３０００５号参照）やブラシ当接法（特開２０００−２０１５３５号参照）で行なうことが好ましい。これらの方法は、少量の弱毒ウイルス液で、迅速、簡便、かつ高い感染率で接種することができる特徴を有する。
【００２４】
このようにして、植物（例えば唐辛子またはピーマン）に弱毒ウイルスを接種すると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物の苗が得られる。したがって、この植物苗を適当な大きさに切断した後、挿し木、接ぎ木などの栄養繁殖手段を採用して、通常の育苗管理をすると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物苗が得られる。
【００２５】
また、この弱毒ウイルスを接種した植物苗を適当な大きさに切断した後、これを穂木として、弱毒ウイルスの接種していない他の台木に接ぎ木したり、また逆に弱毒ウイルスを接種した他の植物を台木として、弱毒ウイルス接種していない植物を接木して、通常の育苗管理をしても、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物体が得られる。
【００２６】
また、弱毒ウイルス接種苗からその一部（例えば側芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い、植物（例えば唐辛子またはピーマン）の弱毒ウイルス保毒苗を大量に得ることができる。またその弱毒ウイルス接種苗から一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望の植物の弱毒ウイルス苗を大量に得ることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を示して、本発明を具体的に説明する。
実施例１
（弱毒ウイルスの安定性）
（１）弱毒ウイルスNDM−４の安定性
外界から隔離されてあるガラス温室において、弱毒ウイルスNDM−４のウイルス粒子を４００μｇ／ｍｌの接種濃度にし、トマト（品種TMK１４３）において、子葉または本葉に接種し、５世代以上にわたって継代接種して本葉６〜８枚期までウイルス症状が現れるか否か調べた結果、ウイルス症状はまったく発生せず、変異によって、壊疽やモザイク症状が発生しない、安定している弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２８】
（２）弱毒ウイルスNDM−５の安定性
実施例１において、弱毒ウイルスNDM−４の代わりに弱毒ウイルスNDM−５を用いる以外は全く同様にして安定性を調べた結果、ウイルス症状はまったく発生せず、変異によって、壊疽やモザイク症状が発生しない、安定している弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２９】
実施例２
（１）各種ＣＭＶ弱毒ウイルスの各種作物に対する防除効果試験
外界から隔離されてあるガラス温室において、ナス、マメ、ヒユ、ウリ、アカザ、アブラナ、キク科などの作物の種子を播種し、発芽して１０〜２０日後それぞれの作物の幼苗に、公知のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−１（特許２９７５７３９号）、同NDM−３（特開平１１−２７６１７８号）、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４、同NDM−５および外界から得た強毒キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ＩＣ−２の粒子を４００μｇ／ｍｌの接種濃度で５〜１０株ずつ接種し、同時に無接種株も５〜１０株ずつ設けて、それぞれの作物のウイルス症状を接種後一ケ月以上に亘って調査した。無接種には全くウイルス症状が現れなかったので調査結果を示さないが、ここでは、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４接種株、公知ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−３接種株および強毒CMV（ＩＣ−２）接種株について、ウイルス症状の結果を表１および表２に示した。
【００３０】
【表１】
2006050902.tif 000006
【００３１】
【表２】
2006050902.tif 000007
（注１）
病徴の欄：0無病徴、cs弱いクロロシス（退緑斑点）、CSクロロシス（〃）、m弱いモザイク、Mモザイク、y弱い黄化、Y黄化、stやや矮化、St矮化、R縮葉、N壊死、L局部斑点をそれぞれ意味する。
（注２）
戻し接種の欄：弱毒CMVまたは強毒CMVをそれぞれの植物に接種して１０日以上経過した後、その植物の葉を擦り潰して液汁を採取し、これをササゲ（品種：黒種３尺）の初生葉に接種して局部斑点の発生（すなわち感染）の有無を調べた。
＋は局部斑点有り（CMV検出）、−は無し（CMV不検出）を示す。
尚、ピーマンの戻し接種では、ササゲの局部斑点は発生しにくいことから、CMV不検出であった。そこで、全品種全株について、ウイルス全核酸分析を行なった。その結果、全株からCMVを検出した。＋は、その感染を示す。
【００３２】
表１および表２の結果から、対照区の強毒CMV（ＩＣ−２）は、多くの作物に対して、モザイク、矮化、縮葉、黄化および局部斑点などのウイルス症状が現れることが判る。
また、比較例区（弱毒ウイルスNDM−３）は、反対に多くの作物に対して、ウイルス症状は出ないが、ナス科植物のうち唐辛子およびピーマンに対して、軽微な（弱い）ウイルス症状（モザイク症状）が現れ、副作用を有することが判る。これに対して本発明区（NDM−４）は、多くの作物に対してばかかりでなく、唐辛子およびピーマンに対してもウイルス症状がでないことが判る。
即ち、本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、鷹の爪、三鷹、八房などの唐辛子品種；光栄、京ゆたか、土佐かつらなどの緑ピーマン；およびワンダーベル、コールデンサマーなどのカラーピーマンに対してウイルス症状を示さず、したがって、多くの作物、特に唐辛子やピーマンに対しても副作用がなく、汎用性を有することが判る。
【００３３】
（２）ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５の作物に対する防除効果試験
次に、ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５の作物に対する防除効果について調べた。
結果を表３および表４に示す。
なお、比較のためＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−１および同NDM−３についても同様に調べた。結果を表３および表４にまとめて示した。
【００３４】
【表３】
2006050902.tif 000008
【００３５】
【表４】
2006050902.tif 000009
表中の記号の意味は、表２の欄下参照。比較例区2（弱毒ウイルスNDM−３）は、表１、表２の比較例区に掲載したものを再掲載した。
【００３６】
表３および表４の結果から、比較例区１（NDM−１）および比較例区２（NDM−３）は、いずれも唐辛子、ピーマンに使用した場合、該植物に弱いモザイク症状が観察されることが判る。
これに対し、本発明区（NDM−５）は、唐辛子、ピーマンに使用した場合、該植物にウイルスによる病徴は観察されず、したがって本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５は、唐辛子、ピーマンに対して優れたＣＭＶの防除効果を有する弱毒ウイルスであることが判る。
また、比較例区１（NDM−１）は、ナス科植物（トマト、タバコ、ナス、唐辛子、緑ピーマン、カラーピーマン）、ウリ科植物（メロン、カボチャ）に使用した場合、弱いウイルス症状が観察されるが、本発明区（NDM−５）は、ウリ科植物（キュウリ＝つや太郎およびメロン＝アムス、プリンス）に使用した場合に弱いウイルス症状が観察されるだけで、使用した作物３６品種のうち３３品種についてウイルス症状が観察されないことが判る。したがって、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５は、多くの作物に対してＣＭＶの防除効果を奏し、圃場において特定の作物に本発明の弱毒ウイルスを使用した場合に、隣接する他の作物に対して当該弱毒ウイルスの病害をもたらす恐れ（副作用）がないことが判る。
【００３７】
実施例３
（ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４の外界強毒ウイルスに対する防除試験その１）
インドネシアより入手した唐辛子品種BPH ９００６０８およびBPH ９００６１３の種子を培養土に播種し、約1ヶ月間温室内で育成した。本葉１〜２枚期の当該２品種の唐辛子の幼苗に、本発明で調製したの弱毒ウイルスNDM−４（本発明区）と従来公知の弱毒ウイルスNDM−３（特開平１１−２７６１７８号：比較例区１）とを４００μｇ／ｍｌの接種濃度でそれぞれ２０株ずつ接種した。そして２０日後、国内の圃場から単離精製した強毒CMVであるＩＣ−２を、本葉６〜７枚期の該２品種の唐辛子にそれぞれ２０株ずつ接種した（比較例区２）。そして、該強毒ウイルス接種後３０日目の該品種唐辛子苗の病徴を、弱毒ウイルスNDM−４（本発明区）と強毒ウイルスＩＣ−２を接種しない該２品種唐辛子（対照区）、並びに強毒ウイルスＩＣ−２のみを接種した該２品種唐辛子（比較例区２）のウイルス症状を比較、観察した（表５）。
【００３８】
実施例４
（ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４の外界強毒CMVに対する防除効果試験その２）
上記実施例１の試験において、強毒ウイルスＩＣ−２の代わりに強毒ウイルスIＣ−６を用いる以外は全く同様にして、BPH ９００６０８およびBPH ９００６１３品種唐辛子のウイルス症状を比較、観察した（表５）。
【００３９】
【表５】
2006050902.tif 000010
病徴；H＝無病徴、ｍ＝弱いモザイク、M＝モザイク
【００４０】
表５の結果より、外界から分離した強毒CMVのIC−２またはIC−６を接種したBPH９００６０８およびBPH ９００６１３品種唐辛子は、試供した全株にモザイク症状が現れた。しかし、本発明の弱毒ウイルスNDM−４を当該２品種の唐辛子に予め接種することで、NDM−４は、外界強毒CMVのIC−２およびIC−６の該２品種の唐辛子への病害に対して、高い防除効果を示した。
また、従来公知の弱毒ウイルスNDM−３は、当該２品種の唐辛子に使用した場合、弱いモザイク症状が観察されたが、本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、病徴が観察されないことが判る。このことから、本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、従来公知の弱毒ウイルスNDM−３に比べて、唐辛子に対するウイルス防除効果が優れていることが判る。
【００４１】
実施例５
（弱毒ウイルスNDM−５のピーマンに対する影響）
ピーマンの種子（品種；「土佐かつら」南国種苗社製）を播種し、発芽して１０〜２０日後の幼苗に本発明の弱毒ウイルスNDM−５と、従来公知の弱毒ウイルスNDM−１（特許2975739号）、NDM−３（特開平11−276178号）のCMV粒子とを４００μg／mlの接種濃度でそれぞれ２０株ずつ接種した。そして、１９９８年５月１５日に群馬県利根郡白沢村に在する圃場に、これら弱毒ウイルス接種ピーマン各２０株を定植し、生育中のピーマン株のウイルス症状およびピーマン果実の収穫量について、それぞれ調査した。
【００４２】
（１）弱毒ウイルスを接種したピーマン株のウイルス症状
本発明の弱毒ウイルス（NDM−５）および公知の弱毒ウイルス（NDM−1、NDM−３）を接種したピーマンのウイルス症状について、時期別に調査した結果を表６に示す。
【００４３】
【表６】
2006050902.tif 000011
単位：株
ウイルス症状；H 健全なピーマン、c 弱いクロロシス、st 弱い矮化、ｍ 弱いモザイク、cs 弱いクロロシスと弱い矮化、cｍ 弱いクロロシスと弱い矮化
【００４４】
表６の結果から本発明の弱毒ウイルスNDM−５も、比較例の弱毒ウイルスNDM−１、NDM−３もピーマンに接種した場合、当初（2週間後）、約４０日後、および１００日後において、それぞれ各種の弱いウイルス症状が観察されることが判る。しかし、本発明の弱毒ウイルスは、後述するように、比較例のそれらに比べて、ピーマン果実の品質および収穫量に及ぼす悪影響は非常に少ないことが判明した(表７参照)。
【００４５】
（２）弱毒ウイルスがピーマン果実の品質および収穫量に及ぼす影響
表６記載の弱毒ウイルス接種ピーマン各２０株における、２０ｇ以上のピーマン果実の健全果実総数と健全果実総重量について、時期別に比較した結果を表７に示す。
【００４６】
【表７】
2006050902.tif 000012
【００４７】
表７の結果から、ピーマンの健全果実の総数において本発明区は、４６５６個であって、比較例１の３４２３個および比較例２の４３２１個と対比すると、それぞれ約３６％および約８％多く、またピーマンの健全果実の総重量において、本発明は１１０．７７ｋｇであって、比較例１の８０．７９ｋｇおよび比較例２の９９．６９ｋｇと対比すると、それぞれ約３７％および約１１％多いことが判る。
【００４８】
そしてまた表６および表７の結果より、本発明の自然界から分離した、配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAを含む弱毒ウイルスNDM−５並びに、従来公知の弱毒ウイルスNDM−１、NDM−３は、ピーマンに対するウイルス症状は大変に軽微なものであるが、ピーマン果実の収穫量に関しては、本発明の弱毒ウイルスは、従来公知のそれらに比べて優れた効果を有する弱毒ウイルスであることが判る。
【００４９】
実施例６
（本発明の弱毒ウイルスNDM−５の外界強毒CMVに対する防除効果試験）
１９９９年５月中旬に、ピーマン苗１６株ずつ４区分用意し、第１区分には本発明の弱毒ウイルス（NDM−５）を、第２区分には公知の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−１）を、第３区分には公知の弱毒ウイルス（NDM−３）を接種した。そして第４区分には弱毒ウイルスを接種することなく対照とした。これら弱毒ウイルス接種ピーマン苗と無接種ピーマン苗１６株ずつを群馬県利根郡白沢村の圃場に定植した。そして、外界のウイルス発生を促すため、定植以来殺虫剤や殺菌剤などの薬剤散布は、全く行なわなかった。その結果、５月下旬よりアブラムシが多数飛来し、６月下旬より外界ウイルスによるウイルス症状が、無接種株に発生し始め、８月下旬に至っては、弱毒ウイルス無接種ピーマンにウイルス症状が激しく現れた。このときの当該弱毒ウイルス接種ピーマンと弱毒ウイルス無接種ピーマンのウイルス症状およびピーマン果実の収量を調査した。
【００５０】
（１）９月２０日に、それぞれ上記４種類のピーマン１６株ずつのウイルス症状を調査した。その結果を表８に示す。尚、表中のウイルス症状で「CS」はクロロシス、「Cm」はクロロシスと弱いモザイク、「m」は弱いモザイク、「mM」は弱いモザイクと強いモザイクの中間、「M」は強いモザイク、「MS」は強いモザイクと矮化、「MY」は強いモザイクと黄変葉、および「ｃｓ」は弱いクロロシスをそれぞれ示す。
【００５１】
【表８】
2006050902.tif 000013
単位：株数
【００５２】
表８の結果より、対照区（弱毒ウイルス無接種ピーマン）は、クロロシス、モザイク、矮化などの激しいウイルス症状が全株に大発生し、健全な生育株は、見られなかった。しかし、本発明区（弱毒ウイルスNDM−５接種ピーマン）は、ウイルス症状としては弱いクロロシスを示したものが１５株、またクロロシスと弱いモザイクの複合症状を示したものが１株であったが、品質と収量に影響を与えるものではないことが判明した。
【００５３】
（２）９月２０日に、それぞれ該４種類のピーマン全１６株ずつから２０〜２２ｇの果実を収穫し、収穫した果実および１株当りの収量を調査した。そして健全果実総重量と、果実の種類を分類したものを表９に、１株当りの収量を表１０に示す。
【００５４】
【表９】
2006050902.tif 000014
【００５５】
表９の結果から、対照区（弱毒ウイルス無接種ピーマン）は、CMVの被害により、健全奇形果実、小果熟果実、壊疽果実、腐敗果（これらをウイルス果という）の個数が全体個数の１5．4％にも及んで、健全果実の比率が８３．３％と低いことが判る。
また、比較例区１（NDM−１接種株）は、ウイルス果が８．６%、比較例区２（NDM−３接種株）は、ウイルス果が３．８％であることが判る。
これに対し本発明区（NDM−５接種株）は、ウイルス果が２．５％と非常に少なく、反対に健全果実が９７．２％と非常に高いことが判る。
また、収穫したピーマンの個数においては、比較例区１および比較例区２においてはそれぞれ２２４４個、２３７７個であったが、本発明区は２６３２個とそれぞれ１７％、１０％も高い値を示すことが判る。
【００５６】
【表１０】
2006050902.tif 000015
【００５７】
表１０の結果から、本発明区の弱毒ウイルスを接種したピーマンは、他の弱毒ウイルスを接種した比較例区１および比較例区２のピーマンに比べて、１株当りの健全果実の個数が多く、また果実収量が非常に多いことが判る。
【００５８】
以上の結果より、本発明の新規である塩基配列を含むサテライトRNAを含む弱毒ウイルスNDM−５接種ピーマン苗は、強毒CMVが激しく発生する圃場においては、従来公知の弱毒ウイルスNDM−１またはNDM−３接種苗以上に健全果実の収穫個数と収穫総重量が向上し、よって、本発明の弱毒ウイルスNDM−５は、外界の強毒CMVに対しては、弱毒ウイルスNDM−１およびNDM−３以上に有効な防除効果を有していることが判る。
【００５９】
【発明の効果】
▲１▼本発明のＣＭＶの弱毒ウイルスは、農作物に対して５世代以上にわたって継代接種しても、該作物のウイルス症状は殆ど観察されないか、または全く観察されず、安定している。
▲２▼本発明の弱毒ウイルスは、鷹の爪、三鷹、八房などの唐辛子品種；光栄、京ゆたか、土佐かつらなどの緑ピーマン；およびワンダーベル、コールデンサマーなどのカラーピーマンに接種した場合、該ピーマンに対してウイルス症状が観察されず、また唐辛子に対してウイルス症状を観察されない。しかも、多くの作物に対して副作用がなく、汎用性を有する。
▲３▼また本発明の配列番号１の塩基配列を有するサテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルスの場合（NDM─４）は、唐辛子に接種した場合において、公知の弱毒ウイルスNDM−３よりも品質の非常によい唐辛子を高収率で得ることができ、また配列番号２の場合（NDM─５）は、ピーマンに接種した場合において、同弱毒ウイルスNDM−３およびNDM−１よりも品質の非常によいピーマンを高収率で得られる。
▲４▼本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、インドネシアで試験栽培されている唐辛子品種のBPH ９００６０８およびBPH ９００６１３に対するキュウリモザイクウイルスに対する防除効果が非常に優れている特徴を有し、ウイルス病徴を有する果肉の割合が非常に少なく、高品質の唐辛子を高収量で得る効果を奏する。
▲５▼カラーピーマンは、風味、歯応えが良好で、赤色、黄色などの色が鮮やかで、艶があり、形がよく、大きいことから、近年需要が伸びているが、本発明によれば、品質のよいカラーピーマンが収率よく得ることが可能となる。更に、これら弱毒ウイルスを上記品種唐辛子またはピーマン作物に用いることにより、ウイルスを媒介するアブラムシを防除する農薬や、寒冷紗やシルバーポリフィルムなどのアブラムシ忌避資材などを必要とせず、加えて環境汚染の問題もなく、栽培経費を削減できる効果も奏する。
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月17日(2003.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA。
【請求項２】
３９１塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNA。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列を含むサテライトRNA。
【請求項４】
配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNA。
【請求項５】
３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス。
【請求項６】
３９１塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス
【請求項７】
配列番号１の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス
【請求項８】
配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス
【請求項９】
３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNA、または３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１０】
配列番号１または配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物の一部を組織培養または栄養繁殖して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１２】
植物が唐辛子である請求項９または請求項１０に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物。
【請求項１３】
唐辛子が唐辛子品種ＢＰＨ９００６０８または唐辛子品種ＢＰＨ９００６１３である請求項１２に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物
【請求項１４】
植物がピーマンである請求項９または請求項１０に記載のキュウリモザイクウイルス抵抗性植物
【請求項１５】
３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNAまたは３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法
【請求項１６】
請求項１または請求項２記載の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法
【請求項１７】
植物が唐辛子である請求項１５または請求項１６に記載のキュウリモザイクウイルスの防除法
【請求項１８】
唐辛子が唐辛子品種BPH９００６０８またはBPH９００６１３である請求項１７に記載のキュウリモザイクウイルスの防除法
【請求項１９】
植物がピーマンである請求項１５または請求項１６に記載のキュウリモザイクウイルスの防除法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は各種植物うち特に唐辛子やピーマンのキュウリモザイクウイルスに対する防除効果が非常に優れたキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを得るためのサテライトRNA、該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物および該弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種するキュウリモザイクウイルスの防除法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キュウリモザイクウイルス（以下CMVということがある）は、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ種Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ属の代表的な種であって、世界中の温帯、亜熱帯および熱帯の地域で多くの重要な農産物に感染し、経済的に多大な被害を及ぼしている。このウイルスは、ウイルスなかで最も多くの宿主をもち、８５属８００種を越える植物に感染する。今まで、中国、クロアチア、フランス、エジプト、ギリシア、イスラエル、イタリア、日本、ポーランド、ポルトガル、スウェーデン、そしてアメリカ合衆国などの多くの国々で、バナナ、カボチャ、セルリー、豆類、レタス、唐辛子、トマトおよびタバコなどの作物に感染し、モザイク、糸葉、黄化、矮化、壊疽などの病害を生じさせ、果実や葉の品質を低下させ、また収量を低下させることが問題となった。例えば、トマト消費量の多い地中海沿岸において、缶詰用トマト栽培品種がCMVの多大な被害を被ったことが問題となった。また１９７２年フランスのアルザス地方で、また１９８７年イタリアとスペインのトマト主要産地において、CMVが突然大発生し、着果したトマトの殆どの果実が壊死病による被害を受け、壊滅状態となったことが報告されている。また近年、インドネシアで栽培されている唐辛子品種BPH ９００６０８やBPH ９００６１３が、また韓国で栽培されているパプリカなどのカラーピーマンが、CMVにより多大な被害を受けたことが報告されている。
【０００３】
このように多くの地域で多種多様な作物に感染し、多大な経済的被害を及ぼすCMVの感染から作物を防除する一般的な方法として、媒介昆虫（アブラムシ）の飛来を寒冷紗によって防止する方法、シルバーポリフィルムのマルチングやシルバーテープによって忌避効果を利用する方法、および農薬散布による防除方法などが挙げられるが、CMVの感染から作物を完全には防除することができない大きな欠点を有する。
【０００４】
さて、一般に植物には既に感染しているウイルス病と同じウイルスまたは極めて近縁なウイルスには感染し難いという現象（これを干渉作用という）があるので、植物に容易に感染して、その組織内で盛んに増殖しても、植物そのものの生育にほとんど影響を及ぼさない程度の弱い病原性のウイルス（これを弱毒ウイルスという）を、無病の植物に予め感染させると、強毒CMVの感染や被害を防ぐこと（これをウイルスの防除という）が可能となる。
【０００５】
従来、この現象を利用したキュウリモザイクウイルスの防除法および関連技術として下記が知られている。
（１）サテライトRNAを含まないキュウリモザイクウイルスとトマトに壊疽症状を発揮しないCMVから得られた分子量０．５〜２．５×１０５ダルトンのサテライトRNAとを、野菜、花卉、タバコ、豆類に接種せしめ、しかる後、該野菜、花卉、タバコ、豆類の汁液からCMV弱毒ウイルスを作出する方法、およびそれより得られた新規な弱毒ウイルス、並びにそれを用いたCMVの防除方法（特公昭６２−３７９５６号公報参照）が知られている。
（２）またサテライトRNAのcDNAをT７プロモーターを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させ、感染性のあるサテライトRNAを得ること、５’末端に２４塩基の余分な配列が付加されているものは、感染性が低かったが、これを６−９塩基にすると感染性は１０倍に増大すること、ナチュラルなサテライトRNAの感染性は１００倍であること、５’末端の２４塩基の余分な配列は植物内で複製することにより除去できること（J．Biochem．、１９８８、Vol．１０４、No．５、p．８４１−８４６参照）が知られている。
（３）またタバコで４世代継代したY−CMVからはYnサテライトRNAが生じ、このサテライトRNAは、トマトに壊疽症状を生ずること、YサテライトRNAは壊疽症状を生じないこと（J．Gen．Virol．、１９８６、Vol．６７、No．１０、p２２４１−２２４６参照）が知られている。
（４）YサテライトRNAがタバコで黄色症状を出し、トマトに壊疽症状を出すこと、その原因領域を特定するためにYサテライトRNAのcDNAに挿入や欠失を導入したこと、YサテライトRNAと非壊疽性のT７３サテライトRNAとのキメラを実験した結果、YサテライトRNAの３２５番の塩基を１塩基置換するだけでトマトの壊疽症状はなくなり、モザイク症状に変わったこと、S１９サテライトRNAとの同様な実験をした結果、タバコに黄色症状を出すのは１００番から２００番の間の二次構造が関与していること（Plant Cell．、１９８９、Vol．１２、p．１１６５−１１７３参照）が知られている。
【０００６】
しかしながら、従来知られている弱毒ウイルスは、非常に少ない植物に対してのみ、その防除効果を奏するものであり、対象としない植物に対しては、反対にキュウリモザイクウイルス症による病害をもたらすという欠点を有する。
従って、圃場などにおいてCMVの弱毒ウイルスを適用する場合、該弱毒ウイルスが対象としない植物に感染してモザイク、糸葉、黄化、矮化、壊疽などの病害が出る影響を考慮し、隔離された状態での栽培を余儀なくされる欠点を有する。
また、一般に弱毒ウイルスは、常に変異を起こす可能性があり、継代接種や圃場での利用の過程で、突然変異などによって強毒ウイルスに変化して、対象作物などに病害が生じる危険性を有する。
そのため作出した弱毒ウイルスは、継代接種してウイルス症状の変化を調べることが、非常に重要であるが、その操作に労力と時間を要する欠点を有する。
【０００７】
一方、唐辛子およびピーマンもCMVに感染すると、葉は明瞭なモザイク症状となり、株は萎縮し、果実は硬化し変形する。
一般に唐辛子およびピーマンは、CMVに対する防除が難しく、また、このウイルスに対する効果的な防除薬はなく、１度感染し発病すれば、回復はせず、品質が劣化し、収量が低下する。
ピーマンに発生するCMVを特に対象とした弱毒ウイルスについては、これまでのところ本出願人が開発し、先に出願したもの（特開平１１−２７６１７８）が僅かに１件知られているに過ぎず、一方唐辛子に発生するCMVを対象とした弱毒ウイルスについては、これまでのところ知られていない。
そのため、従来公知のナス科およびウリ科作物を対象にして作出された弱毒ウイルスを取り寄せ、唐辛子での適応性を検討し、利用しているに過ぎない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このようなことから、多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスに変異しない、そして唐辛子、ピーマンなどに接種した場合においても、ウイルス症状がきわめて弱い性質を有するサテライトRNAを保有するキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルス、該弱毒ウイルスを用いるキュウリモザイクウイルスの防除法およびキュウリモザイクウイルス抵抗性植物の出現が強く望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このような課題を解決するため、種々検討を重ねた結果、日本各地の多くの圃場からウイルスに感染していると思われるナス科（トマトを含む）、ウリ科、キク科、アブラナ科などの植物のウイルス症状の葉を採集し、これらの葉からCMVを分離し、サテライトRNAを有する株を選抜して、唐辛子に接種して圃場に植え、自然条件下で防除効果のある（即ちウイルス症状の軽微な）CMVの中から、選抜を重ねた結果、当該唐辛子品種に感染してもウイルス症状が極めて軽微であって、そのウイルスを当該唐辛子品種に接種、感染しておくことにより、一般栽培圃場において、多種多様の強毒CMVの病害に対して防除効果のあるCMVを選抜することに成功した。
【００１０】
また、同様にして上記ウイルス症状の葉からCMVを分離し、サテライトRNAを有する株を選抜し、ピーマン作物に感染してもウイルス症状が極めて軽微なCMVの中から、そのウイルスをピーマン苗に接種・感染させておくことにより、一般圃場において、多種多様の強毒ウイルスCMVの病害に対して防除効果を有するCMVを探索することに成功した。
【００１１】
そして、これら２つの弱毒ウイルスは、唐辛子、ピーマン以外の多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスとして変異しないことを発見した。
【００１２】
また、これら配列番号１および配列番号２に示す塩基配列を含むサテライトRNAを含むキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスは、それぞれ本出願人が先に開発したキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−３（特開平１１−２７６１７８号：配列番号３参照）、およびキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−１（特許２９７５７３９号：配列番号４参照）と対比すると、いずれも多くの作物に接種してもその防除効果を奏し、また継代接種しても強毒ウイルスに変異しない性質は、ほとんど同じであるが、配列番号１の場合は、唐辛子に接種した場合において、弱毒ウイルスNDM−３よりも品質の非常によい唐辛子を高収率で得ることができ、また配列番号２の場合は、ピーマンに接種した場合において、同弱毒ウイルスNDM−３およびNDM−１よりも品質の非常によいピーマンを高収率で得られることを発見した。
【００１３】
本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
（１）即ち本発明は、３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNAを提供する。
（２）また本発明は、３９１塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNAを提供する。
（３）また本発明は配列番号１の塩基配列のサテライトRNAを提供する。
（４）また本発明は配列番号２の塩基配列のサテライトRNAを提供する。
（５）また本発明は３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する
（６）また本発明は３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトＲＮＡをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する
（７）また本発明は配列番号１の塩基配列を含むサテライトＲＮＡをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する
（８）また本発明は配列番号２の塩基配列を含むサテライトＲＮＡをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを提供する
（９）また本発明は３３９塩基を有するサテライトＲＮＡであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトＲＮＡまたは３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトＲＮＡをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供する
（１０）また本発明は、配列番号１または配列番号２の塩基配列を含むサテライトＲＮＡをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供する
（１１）また本発明は上記キュウリモザイクウイルス抵抗性植物の植物の一部を組織培養または栄養繁殖して得られるキュウリモザイクウイルス抵抗性植物を提供する
(１２)また本発明は３３９塩基を有するサテライトRNAであって、５’末端側の配列が配列番号１に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が塩基配列１に示す塩基配列のうち第３２１番目から第３３９番目の配列を含むサテライトRNAまたは３９１塩基を有する塩基配列であって、５’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第１番目から第５０番目の配列を含み、かつ３’末端側の配列が配列番号２に示す塩基配列のうち第３７１番目から第３９１番目の配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルス弱毒ウイルスを予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法を提供する
（１３）また本発明は配列番号１または配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAをキュウリモザイクウイルスに組み込んでなるキュウリモザイクウイルスの弱毒ウイルスを、予め植物の苗に接種することを特徴とするキュウリモザイクウイルスの防除法を提供する
【００１４】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の概略を説明し、ついで本発明をより具体的に説明する。
ＣＭＶの核酸成分は約３３００塩基より構成されているＲＮＡ１、約３１００塩基のＲＮＡ２、約２２００塩基のＲＮＡ３、および約１０００塩基のＲＮＡ４から成る。そして、ＣＭＶの系統によっては上記ＲＮＡの４成分の外に更に小さな塩基数のサテライトＲＮＡと呼ばれる成分を含む系統がある。
このサテライトＲＮＡの塩基数は約２００〜５００である。
本発明を実施するには、先ず植物、例えばトマト、ナス、ピーマン、ホウレンソウなどより分離されたＣＭＶであって、トマトにえそ症状を示さないサテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルスをトマトの子葉に接種して、１〜４週間程度、ウイルスを増殖させた後、感染葉を凍結粉砕し、更にワーリングブレンダー（ミキサー、または磨砕機）などで適当なクロロホルムを含有する緩衝液中で磨砕する。得られた磨砕液から適当な遠心分離を繰返すことによってサテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルスの粒子を精製する。すなわち、フェノール抽出と、エタノール沈殿によってＲＮＡ画分（文献T.Maniatis）を得る。更にこのＲＮＡ画分を１０〜４０％のショ糖密度勾配遠心分離法やポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離精製し、弱毒ウイルスのサテライトＲＮＡを得る。
上記で得られるサテライトＲＮＡを鋳型としてＡＭＶ（ライフサイエンス社製）などの逆転写酵素を使用し、常法に従いｃＤＮＡを合成する。すなわち、対応するＤＮＡを合成する。
得られたｃＤＮＡにＴ７、Ｔ３、ＳＰ６（文献J.d.Watsonら、In Molecular Biology of the Gene(1987)））などの適切なプロモーターを連結した後、pUC119(pUC118)などの（宝酒造社製）プラスミドに導入し、得られる組換えプラスミドで大腸菌JM101,JM109などの宿主微生物を形質転換してクローニングする。
このサテライトＲＮＡのｃＤＮＡを含む組換えプラスミドにＲＮＡポリメラーゼを作用させ、サテライトＲＮＡを生産せしめる。こうして得られたクローニングサテライトＲＮＡをサテライトＲＮＡを含まないか、あるいはそれを除去したＣＭＶのＲＮＡ（但し、少なくともＲＮＡ１〜ＲＮＡ３を含む）と共に植物の幼苗の葉、根、茎に接種する。このようにして本発明の弱毒ウイルスを製造することができる。
これらの弱毒ウイルスは植物に接種することにより当該植物のＣＭＶによるウイルス病を有効に防除することができる。
防除法としては、種々あるが、例えば弱毒ウイルスを４０ｍMリン酸緩衝液（ｐH約7.0）で１０〜５０μｇ／mlに希釈し、これにカーボランダム、セライト、ベントナイトなどを少量加え、植物に接種してもよい。
更に植物への接種部位は格別制限されないが、子葉期など若い植物ほど感染率が高いので好ましい。
以上概略を説明したが、以下により具体的に説明する。
（１）CMV弱毒ウイルスの採取と作出
関東から甲信越にかけての５３ヶ所の圃場より、ナス科、ウリ科、キク科、アブラナ科などの植物からウイルス症状の葉を採集し、これらの葉に１０倍量のリン酸緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）を加えて磨砕し、その液をトマト品種苗（日本デルモンテ社製TMK１４３）に接種した。一週間後、各々のエライザー検定を行った結果、１５２系統についてCMVの感染を確認した。これらの中から弱毒ウイルスを選抜すべく、１５２系統のトマトの感染葉をそれぞれトマト品種苗（TMK１４３）１０株ずつに接種し、一週間後、リボ核酸（RNA）分析を行った。その結果、サテライトRNAを有するCMVが１４系統から検出された。そして、その１４系統についてウイルス症状調査を行い、ネクロシス、モザイクが発病した系統や感染力を有しない系統を取り除き、ウイルス症状が軽微でウイルス増殖量の多い弱毒ウイルスを選抜した。この選抜した弱毒ウイルスは遺伝的に均一ではなく、ウイルス症状が異なっていたので、上記品種のトマト苗５００株にこのウイルスを接種し、弱いウイルス症状が揃っている株だけを選抜した。更にサテライトRNAの存在が継続されている株だけを採集して、ウイルス接種液の調製を行い、再度トマトに接種し、同じ選抜操作をしてウイルス接種液の調製する作業を５回繰り返し、トマトで継代接種を行なった。その結果、サテライトRNAを安定して含む2種類の弱毒ウイルス（NDM−４とNMD−５）を作出した。
【００１５】
（２）サテライトRNAの単離
サテライトRNAを含む２種類の弱毒ウイルス（NDM−4とNDM−５）を別々のトマトの子葉にそれぞれ接種、感染させ、１〜４週間程度ウイルスを増殖させた後、トマト子葉を採取し超低温にて凍結した。これら２種類の感染葉をそれぞれ粉砕し、２倍量の ０．１％チオグリコール酸を含む ０．５Mクエン酸緩衝液（pH６．５）と同量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで破砕した。これら破砕液を９，５００Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）の１０％に当たる重量のポリエチレングリコールを加え溶解させた後、４０分間静置した。これら溶液を９，５００Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿に２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０） をそれぞれ加え懸濁均一化した。これら粗精製品を１２，０００Ｘｇで遠心分離した上清を２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、沈殿を回収した後、１０ｍMリン酸緩衝液（pH７．０）にそれぞれ懸濁した。これら溶液に最終濃度で１％になるように１０％SDSを加え、更に溶液と等量のフェノールをそれぞれ加えた後１２，０００Ｘｇ、１５分間遠心した。これら上層（水層）を回収し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返して2種類のRNAをそれぞれ単離、精製した。この方法で感染葉１００ｇより、それぞれ約１００μｇのRNAを得た。上記の方法で得られたRNAを水にそれぞれ溶解し、１０〜４０％ショ糖密度勾配により超遠心分離(１７５，０００Ｘｇ、１６時間)して得られたサテライトRNAのバンドを採取し、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返して、２種類のサテライトRNAを単離精製した。また精製が不十分な場合は６Ｍ尿素を含む９％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった後、臭化エチジウムの溶液で染色し、サテライトRNAのバンドの部分をカミソリなどで切り取った。サテライトRNAのバンドを含むゲル断片を透析チューブに入れEDTAを含むトリス−酢酸緩衝液中で電気泳動による溶出を行なってサテライトRNAを回収した後、常法に従ってエタノール沈殿を繰り返してサテライトRNAを単離精製した。この電気泳動によるサテライトRNAの溶出の詳細はT．Maniatisらの方法［Molecular Cloning（１９８２）］に従って行なった。
【００１６】
（３）サテライトRNAのクローニングとシークエンス
単離精製した２種類のサテライトRNAからマイナス鎖（以下−鎖と表記する）cDNAを合成するために、サテライトRNA（約３μg）と３’末端塩基配列に相補的なDNAプライマー（８塩基、１μM）を９５℃で熱処理した後、徐冷してアニーリングした。この−鎖cDNA合成反応はOmniscript Reverse Transcriptase（QIAGEN）を用いて、３７℃、６０分の条件で行なった。次に、得られたcDNAをPCR法によって増幅させた。すなわち、プラス鎖サテライトRNAの５’末端に相同的なDNAプライマーと３’末端塩基配列に相補的なDNAプライマーを用い、９４℃１分間、３７℃１分間、７２℃２分間の反応を４５回繰り返すことによってPCR反応を行なった。［PCR反応液；１０mM Tris−HCl、１．５mM MgCl2、５０mM KCl、２００μM dNTP、２．５units DNA polymerase（Takara）］
このｃDNAを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離させた後、ゲルより切り出し、DNA回収キットGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（Amersham）を用いて精製した。得られたcDNAをT−Aクローニング用ベクターpGEM T Easy（Promega）にクローニングした。このプラスミドを制限酵素EcoRIで切断することによって、NDM−４とNDM−５それぞれのサテライトRNA由来のcDNAの存在を確認した。
【００１７】
これらサテライトRNAの塩基配列をThermo Sequenase Cycle Sequencing Kit（Amersham社製）とDNAシーケンサDSQ−１０００L（島津製作所製）を用いて決定し、３３９塩基から成る塩基配列を配列番号１とし、３９１塩基からなる塩基配列を配列番号２とに示した。これら配列番号１と配列番号２に示すサテライトRNAの塩基配列に相同的な塩基配列を有するプラスミドをFERM BP−８０９６（pPV１M−９４）とFERM BP−８０９７（pPV２−４０）として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託した。
【００１８】
本発明のサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号１）を後記配列表に示す。
【００１９】
本発明の別のサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号２）を後記配列表に示す。
【００２０】
比較のため、本出願人が先に開発したキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−３（特開平１１−２７６１７８号）を構成するサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号３）を後記配列表に示す。
【００２１】
比較のため、本出願人が先に開発したキュウリモザイク弱毒ウイルスNDM−１（特許２９７５７３９号）を構成するサテライトＲＮＡの塩基配列（配列番号４）を後記配列表に示す。
【００２２】
（４）弱毒ウイルスの接種源作成
弱毒ウイルスが感染したトマト葉１ｇに、緩衝液（中性付近の０．１Mリン酸緩衝液）を加えて、１０mlに調整した磨砕液をトマト１００株の子葉または本葉に接種し、１〜２週間程度、弱毒ウイルスを増殖させた後、トマト感染葉１５０ｇを採取し、超低温−８０℃で凍結した。この感染葉を粉砕した後、０．１％チオグリコール酸を含む０．５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００ｍｌと等量のクロロホルムを加え、ワーリングブレンダーで磨砕して、CMV粒子を含む磨砕液を得た。この磨砕液を２，０００ Ｘｇ、１０分間遠心し、上層（水層）１２０mlを回収して、これに１０重量％の粉末ポリエチレングリコール１２ｇを加えて溶解させた後、４０分静置して、析出させ、沈殿し易くした。この溶液を９，５００ Ｘｇ、２０分間遠心し、得られた沈殿（CMV粒子）を回収して、これに２％トライトンＸ−１００を含む０．０５Mクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を洗浄のため加え溶解した。これを１２，０００Ｘｇで遠心分離し、CMV粒子を含む上澄を分取して、２４０，０００Ｘｇ、４５分間遠心し、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁して、弱毒ウイルスのCMV粒子を約１０mg抽出し、接種源を得た。
【００２３】
本発明のCMV弱毒ウイルスを接種する方法としては、純化した弱毒ウイルスのNDM−4またはNDM−5の粒子を５０〜５００μｇ／ｍｌになるようにリン酸緩衝液に懸濁し、公知の方法により接種すればよく、例えば、噴霧ローラー法（特開平４−３３０００５号参照）やブラシ当接法（特開２０００−２０１５３５号参照）で行なうことが好ましい。これらの方法は、少量の弱毒ウイルス液で、迅速、簡便、かつ高い感染率で接種することができる特徴を有する。
【００２４】
このようにして、植物（例えば唐辛子またはピーマン）に弱毒ウイルスを接種すると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物の苗が得られる。したがって、この植物苗を適当な大きさに切断した後、挿し木、接ぎ木などの栄養繁殖手段を採用して、通常の育苗管理をすると、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物苗が得られる。
【００２５】
また、この弱毒ウイルスを接種した植物苗を適当な大きさに切断した後、これを穂木として、弱毒ウイルスの接種していない他の台木に接ぎ木したり、また逆に弱毒ウイルスを接種した他の植物を台木として、弱毒ウイルス接種していない植物を接木して、通常の育苗管理をしても、容易に弱毒ウイルスが全身に感染した植物体が得られる。
【００２６】
また、弱毒ウイルス接種苗からその一部（例えば側芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い、植物（例えば唐辛子またはピーマン）の弱毒ウイルス保毒苗を大量に得ることができる。またその弱毒ウイルス接種苗から一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望の植物の弱毒ウイルス苗を大量に得ることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例を示して、本発明を具体的に説明する。
実施例１
（弱毒ウイルスの安定性）
（１）弱毒ウイルスNDM−４の安定性
外界から隔離されてあるガラス温室において、弱毒ウイルスNDM−４のウイルス粒子を４００μｇ／ｍｌの接種濃度にし、トマト（品種TMK１４３）において、子葉または本葉に接種し、５世代以上にわたって継代接種して本葉６〜８枚期までウイルス症状が現れるか否か調べた結果、ウイルス症状はまったく発生せず、変異によって、壊疽やモザイク症状が発生しない、安定している弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２８】
（２）弱毒ウイルスNDM−５の安定性
実施例１において、弱毒ウイルスNDM−４の代わりに弱毒ウイルスNDM−５を用いる以外は全く同様にして安定性を調べた結果、ウイルス症状はまったく発生せず、変異によって、壊疽やモザイク症状が発生しない、安定している弱毒ウイルスであることが分かった。
【００２９】
実施例２
（１）各種ＣＭＶ弱毒ウイルスの各種作物に対する防除効果試験
外界から隔離されてあるガラス温室において、ナス、マメ、ヒユ、ウリ、アカザ、アブラナ、キク科などの作物の種子を播種し、発芽して１０〜２０日後それぞれの作物の幼苗に、公知のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−１（特許２９７５７３９号）、同NDM−３（特開平１１−２７６１７８号）、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４、同NDM−５および外界から得た強毒キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ＩＣ−２の粒子を４００μｇ／ｍｌの接種濃度で５〜１０株ずつ接種し、同時に無接種株も５〜１０株ずつ設けて、それぞれの作物のウイルス症状を接種後一ケ月以上に亘って調査した。無接種には全くウイルス症状が現れなかったので調査結果を示さないが、ここでは、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４接種株、公知ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−３接種株および強毒CMV（ＩＣ−２）接種株について、ウイルス症状の結果を表１および表２に示した。
【００３０】
【表１】
2006050902.tif 000016
【００３１】
【表２】
2006050902.tif 000017
（注１）
病徴の欄：0無病徴、cs弱いクロロシス（退緑斑点）、CSクロロシス（〃）、m弱いモザイク、Mモザイク、y弱い黄化、Y黄化、stやや矮化、St矮化、R縮葉、N壊死、L局部斑点をそれぞれ意味する。
（注２）
戻し接種の欄：弱毒CMVまたは強毒CMVをそれぞれの植物に接種して１０日以上経過した後、その植物の葉を擦り潰して液汁を採取し、これをササゲ（品種：黒種３尺）の初生葉に接種して局部斑点の発生（すなわち感染）の有無を調べた。
＋は局部斑点有り（CMV検出）、−は無し（CMV不検出）を示す。
尚、ピーマンの戻し接種では、ササゲの局部斑点は発生しにくいことから、CMV不検出であった。そこで、全品種全株について、ウイルス全核酸分析を行なった。その結果、全株からCMVを検出した。＋は、その感染を示す。
【００３２】
表１および表２の結果から、対照区の強毒CMV（ＩＣ−２）は、多くの作物に対して、モザイク、矮化、縮葉、黄化および局部斑点などのウイルス症状が現れることが判る。
また、比較例区（弱毒ウイルスNDM−３）は、反対に多くの作物に対して、ウイルス症状は出ないが、ナス科植物のうち唐辛子およびピーマンに対して、軽微な（弱い）ウイルス症状（モザイク症状）が現れ、副作用を有することが判る。
これに対して本発明区（NDM−４）は、多くの作物に対してばかかりでなく、唐辛子およびピーマンに対してもウイルス症状がでないことが判る。
即ち、本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、鷹の爪、三鷹、八房などの唐辛子品種；光栄、京ゆたか、土佐かつらなどの緑ピーマン；およびワンダーベル、コールデンサマーなどのカラーピーマンに対してウイルス症状を示さず、したがって、多くの作物、特に唐辛子やピーマンに対しても副作用がなく、汎用性を有することが判る。
【００３３】
（２）ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５の作物に対する防除効果試験
次に、ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５の作物に対する防除効果について調べた。
結果を表３および表４に示す。
なお、比較のためＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−１および同NDM−３についても同様に調べた。結果を表３および表４にまとめて示した。
【００３４】
【表３】
2006050902.tif 000018
【００３５】
【表４】
2006050902.tif 000019
表中の記号の意味は、表２の欄下参照。比較例区2（弱毒ウイルスNDM−３）は、表１、表２の比較例区に掲載したものを再掲載した。
【００３６】
表３および表４の結果から、比較例区１（NDM−１）および比較例区２（NDM−３）は、いずれも唐辛子、ピーマンに使用した場合、該植物に弱いモザイク症状が観察されることが判る。
これに対し、本発明区（NDM−５）は、唐辛子、ピーマンに使用した場合、該植物にウイルスによる病徴は観察されず、したがって本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５は、唐辛子、ピーマンに対して優れたＣＭＶの防除効果を有する弱毒ウイルスであることが判る。
また、比較例区１（NDM−１）は、ナス科植物（トマト、タバコ、ナス、唐辛子、緑ピーマン、カラーピーマン）、ウリ科植物（メロン、カボチャ）に使用した場合、弱いウイルス症状が観察されるが、本発明区（NDM−５）は、ウリ科植物（キュウリ＝つや太郎およびメロン＝アムス、プリンス）に使用した場合に弱いウイルス症状が観察されるだけで、使用した作物３６品種のうち３３品種についてウイルス症状が観察されないことが判る。したがって、本発明のＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−５は、多くの作物に対してＣＭＶの防除効果を奏し、圃場において特定の作物に本発明の弱毒ウイルスを使用した場合に、隣接する他の作物に対して当該弱毒ウイルスの病害をもたらす恐れ（副作用）がないことが判る。
【００３７】
実施例３
（ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４の外界強毒ウイルスに対する防除試験その１）
インドネシアより入手した唐辛子品種BPH ９００６０８およびBPH ９００６１３の種子を培養土に播種し、約1ヶ月間温室内で育成した。本葉１〜２枚期の当該２品種の唐辛子の幼苗に、本発明で調製したの弱毒ウイルスNDM−４（本発明区）と従来公知の弱毒ウイルスNDM−３（特開平１１−２７６１７８号：比較例区１）とを４００μｇ／ｍｌの接種濃度でそれぞれ２０株ずつ接種した。そして２０日後、国内の圃場から単離精製した強毒CMVであるＩＣ−２を、本葉６〜７枚期の該２品種の唐辛子にそれぞれ２０株ずつ接種した（比較例区２）。そして、該強毒ウイルス接種後３０日目の該品種唐辛子苗の病徴を、弱毒ウイルスNDM−４（本発明区）と強毒ウイルスＩＣ−２を接種しない該２品種唐辛子（対照区）、並びに強毒ウイルスＩＣ−２のみを接種した該２品種唐辛子（比較例区２）のウイルス症状を比較、観察した（表５）。
【００３８】
実施例４
（ＣＭＶ弱毒ウイルスNDM−４の外界強毒CMVに対する防除効果試験その２）
上記実施例１の試験において、強毒ウイルスＩＣ−２の代わりに強毒ウイルスIＣ−６を用いる以外は全く同様にして、BPH ９００６０８およびBPH ９００６１３品種唐辛子のウイルス症状を比較、観察した（表５）。
【００３９】
【表５】
2006050902.tif 000020
【００４０】
表５の結果より、外界から分離した強毒CMVのIC−２またはIC−６を接種したBPH ９００６０８およびBPH ９００６１３品種唐辛子は、試供した全株にモザイク症状が現れた。しかし、本発明の弱毒ウイルスNDM−４を当該２品種の唐辛子に予め接種することで、NDM−４は、外界強毒CMVのIC−２およびIC−６の該２品種の唐辛子への病害に対して、高い防除効果を示した。
また、従来公知の弱毒ウイルスNDM−３は、当該２品種の唐辛子に使用した場合、弱いモザイク症状が観察されたが、本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、病徴が観察されないことが判る。このことから、本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、従来公知の弱毒ウイルスNDM−３に比べて、唐辛子に対するウイルス防除効果が優れていることが判る。
【００４１】
実施例５
（弱毒ウイルスNDM−５のピーマンに対する影響）
ピーマンの種子（品種；「土佐かつら」南国種苗社製）を播種し、発芽して１０〜２０日後の幼苗に本発明の弱毒ウイルスNDM−５と、従来公知の弱毒ウイルスNDM−１（特許2975739号）、NDM−３（特開平11−276178号）のCMV粒子とを４００μg／mlの接種濃度でそれぞれ２０株ずつ接種した。そして、１９９８年５月１５日に群馬県利根郡白沢村に在する圃場に、これら弱毒ウイルス接種ピーマン各２０株を定植し、生育中のピーマン株のウイルス症状およびピーマン果実の収穫量について、それぞれ調査した。
【００４２】
（１）弱毒ウイルスを接種したピーマン株のウイルス症状
本発明の弱毒ウイルス（NDM−５）および公知の弱毒ウイルス（NDM−1、NDM−３）を接種したピーマンのウイルス症状について、時期別に調査した結果を表６に示す。
【００４３】
【表６】
2006050902.tif 000021
ウイルス症状；H 健全なピーマン、c 弱いクロロシス、st 弱い矮化、ｍ 弱いモザイク、cs 弱いクロロシスと弱い矮化、cｍ 弱いクロロシスと弱い矮化
【００４４】
表６の結果から本発明の弱毒ウイルスNDM−５も、比較例の弱毒ウイルスNDM−１、NDM−３もピーマンに接種した場合、当初（2週間後）、約４０日後、および１００日後において、それぞれ各種の弱いウイルス症状が観察されることが判る。しかし、本発明の弱毒ウイルスは、後述するように、比較例のそれらに比べて、ピーマン果実の品質および収穫量に及ぼす悪影響は非常に少ないことが判明した(表７参照)。
【００４５】
（２）弱毒ウイルスがピーマン果実の品質および収穫量に及ぼす影響
表６記載の弱毒ウイルス接種ピーマン各２０株における、２０ｇ以上のピーマン果実の健全果実総数と健全果実総重量について、時期別に比較した結果を表７に示す。
【００４６】
【表７】
2006050902.tif 000022
【００４７】
表７の結果から、ピーマンの健全果実の総数において本発明区は、４６５６個であって、比較例１の３４２３個および比較例２の４３２１個と対比すると、それぞれ約３６％および約８％多く、またピーマンの健全果実の総重量において、本発明は１１０．７７ｋｇであって、比較例１の８０．７９ｋｇおよび比較例２の９９．６９ｋｇと対比すると、それぞれ約３７％および約１１％多いことが判る。
【００４８】
そしてまた表６および表７の結果より、本発明の自然界から分離した、配列番号２の塩基配列を含むサテライトRNAを含む弱毒ウイルスNDM−５並びに、従来公知の弱毒ウイルスNDM−１、NDM−３は、ピーマンに対するウイルス症状は大変に軽微なものであるが、ピーマン果実の収穫量に関しては、本発明の弱毒ウイルスは、従来公知のそれらに比べて優れた効果を有する弱毒ウイルスであることが判る。
【００４９】
実施例６
（本発明の弱毒ウイルスNDM−５の外界強毒CMVに対する防除効果試験）
１９９９年５月中旬に、ピーマン苗１６株ずつ４区分用意し、第１区分には本発明の弱毒ウイルス（NDM−５）を、第２区分には公知の弱毒ウイルス（ＮＤＭ−１）を、第３区分には公知の弱毒ウイルス（NDM−３）を接種した。そして第４区分には弱毒ウイルスを接種することなく対照とした。これら弱毒ウイルス接種ピーマン苗と無接種ピーマン苗１６株ずつを群馬県利根郡白沢村の圃場に定植した。そして、外界のウイルス発生を促すため、定植以来殺虫剤や殺菌剤などの薬剤散布は、全く行なわなかった。その結果、５月下旬よりアブラムシが多数飛来し、６月下旬より外界ウイルスによるウイルス症状が、無接種株に発生し始め、８月下旬に至っては、弱毒ウイルス無接種ピーマンにウイルス症状が激しく現れた。このときの当該弱毒ウイルス接種ピーマンと弱毒ウイルス無接種ピーマンのウイルス症状およびピーマン果実の収量を調査した。
【００５０】
（１）９月２０日に、それぞれ上記４種類のピーマン１６株ずつのウイルス症状を調査した。その結果を表８に示す。尚、表中のウイルス症状で「CS」はクロロシス、「Cm」はクロロシスと弱いモザイク、「m」は弱いモザイク、「mM」は弱いモザイクと強いモザイクの中間、「M」は強いモザイク、「MS」は強いモザイクと矮化、「MY」は強いモザイクと黄変葉、および「ｃｓ」は弱いクロロシスをそれぞれ示す。
【００５１】
【表８】
2006050902.tif 000023
【００５２】
表８の結果より、対照区（弱毒ウイルス無接種ピーマン）は、クロロシス、モザイク、矮化などの激しいウイルス症状が全株に大発生し、健全な生育株は、見られなかった。しかし、本発明区（弱毒ウイルスNDM−５接種ピーマン）は、ウイルス症状としては弱いクロロシスを示したものが１５株、またクロロシスと弱いモザイクの複合症状を示したものが１株であったが、品質と収量に影響を与えるものではないことが判明した。
【００５３】
（２）９月２０日に、それぞれ該４種類のピーマン全１６株ずつから２０〜２２ｇの果実を収穫し、収穫した果実および１株当りの収量を調査した。そして健全果実総重量と、果実の種類を分類したものを表９に、１株当りの収量を表１０に示す。
【００５４】
【表９】
2006050902.tif 000024
【００５５】
表９の結果から、対照区（弱毒ウイルス無接種ピーマン）は、CMVの被害により、健全奇形果実、小果熟果実、壊疽果実、腐敗果（これらをウイルス果という）の個数が全体個数の１5．4％にも及んで、健全果実の比率が８３．３％と低いことが判る。
また、比較例区１（NDM−１接種株）は、ウイルス果が８．６%、比較例区２（NDM−３接種株）は、ウイルス果が３．８％であることが判る。
これに対し本発明区（NDM−５接種株）は、ウイルス果が２．５％と非常に少なく、反対に健全果実が９７．２％と非常に高いことが判る。
また、収穫したピーマンの個数においては、比較例区１および比較例区２においてはそれぞれ２２４４個、２３７７個であったが、本発明区は２６３２個とそれぞれ１７％、１０％も高い値を示すことが判る。
【００５６】
【表１０】
2006050902.tif 000025
【００５７】
表１０の結果から、本発明区の弱毒ウイルスを接種したピーマンは、他の弱毒ウイルスを接種した比較例区１および比較例区２のピーマンに比べて、１株当りの健全果実の個数が多く、また果実収量が非常に多いことが判る。
【００５８】
以上の結果より、本発明の新規である塩基配列を含むサテライトRNAを含む弱毒ウイルスNDM−５接種ピーマン苗は、強毒CMVが激しく発生する圃場においては、従来公知の弱毒ウイルスNDM−１またはNDM−３接種苗以上に健全果実の収穫個数と収穫総重量が向上し、よって、本発明の弱毒ウイルスNDM−５は、外界の強毒CMVに対しては、弱毒ウイルスNDM−１およびNDM−３以上に有効な防除効果を有していることが判る。
【００５９】
【発明の効果】
本発明のＣＭＶの弱毒ウイルスは、農作物に対して５世代以上にわたって継代接種しても、該作物のウイルス症状は殆ど観察されないか、または全く観察されず、安定している。
本発明の弱毒ウイルスは、鷹の爪、三鷹、八房などの唐辛子品種；光栄、京ゆたか、土佐かつらなどの緑ピーマン；およびワンダーベル、コールデンサマーなどのカラーピーマンに接種した場合、該ピーマンに対してウイルス症状が観察されず、また唐辛子に対してウイルス症状を観察されない。しかも、多くの作物に対して副作用がなく、汎用性を有する。
また本発明の配列番号１の塩基配列を有するサテライトＲＮＡを含む弱毒ウイルスの場合（NDM─４）は、唐辛子に接種した場合において、公知の弱毒ウイルスNDM−３よりも品質の非常によい唐辛子を高収率で得ることができ、また配列番号２の場合（NDM─５）は、ピーマンに接種した場合において、同弱毒ウイルスNDM−３およびNDM−１よりも品質の非常によいピーマンを高収率で得られる。
本発明の弱毒ウイルスNDM−４は、インドネシアで試験栽培されている唐辛子品種のBPH ９００６０８およびBPH ９００６１３に対するキュウリモザイクウイルスに対する防除効果が非常に優れている特徴を有し、ウイルス病徴を有する果肉の割合が非常に少なく、高品質の唐辛子を高収量で得る効果を奏する。
カラーピーマンは、風味、歯応えが良好で、赤色、黄色などの色が鮮やかで、艶があり、形がよく、大きいことから、近年需要が伸びているが、本発明によれば、品質のよいカラーピーマンが収率よく得ることが可能となる。更に、これら弱毒ウイルスを上記品種唐辛子またはピーマン作物に用いることにより、ウイルスを媒介するアブラムシを防除する農薬や、寒冷紗やシルバーポリフィルムなどのアブラムシ忌避資材などを必要とせず、加えて環境汚染の問題もなく、栽培経費を削減できる効果も奏する。
【００６０】
【配列表】
2006050902.tif 000026
2006050902.tif 000027
2006050902.tif 000028
【００６１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１は、キユウリモザイクウイルス  ＮＤＭ−４株から得たものである。
配列番号２は、同ＮＤＭ−５株から得たものである。
配列番号３は、同ＮＤＭ−３株から得たものである。
そして配列番号４は、同ＮＤＭ−１株から得たものである。