(57)【要約】      （修正有）【課題】小脳に関する基礎医学研究及び小脳疾患の遺伝子治療に応用可能なウイルスベクターを用いた、効率的にプルキンエ細胞に遺伝子を発現させるための技術を提供する。【解決手段】Ｌ７プロモーター配列若しくはその誘導配列、又はカルビンディンプロモーター若しくはその誘導配列を含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来で、該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置された発現ベクター、該発現ベクターを有効成分として含有してなる、小脳表面のクモ膜下腔に注入するための、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療剤、該発現ベクターを非ヒト動物のクモ膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させる、非ヒト動物の小脳プルキンエ細胞への核酸導入方法、並びに該発現ベクターを非ヒト動物のクモ膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させる、トランスジェニク動物の作製方法からなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置されてなる、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクター。
【請求項２】
下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置され、レンチウイルスに由来するベクター骨格中の配列番号：３に示される塩基配列を含有しないものである、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを有効成分として含有してなる、小脳表面のクモ膜下腔に注入するための、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療剤。
【請求項４】
導入対象の核酸が、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ポリグルタミンの分解促進タンパク質及びP/Q型カルシウムチャネルからなる群より選ばれたポリペプチド、又は該ポリペプチドの変異体若しくは該ポリペプチドの機能阻害のためのドミナントネガティブ体
をコードする核酸である、請求項３記載の治療剤。
【請求項５】
小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患が、脊髄小脳変性症である、請求項３又は４記載の治療剤。
【請求項６】
発現ベクターが、下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結され、レンチウイルスに由来するベクター骨格中の配列番号：２に示される塩基配列を含有しないものである、請求項３〜５いずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを非ヒト動物のくも膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させることを特徴とする、非ヒト動物の小脳プルキンエ細胞への核酸導入方法。
【請求項８】
下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを非ヒト動物のくも膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させることを特徴とする、トランスジェニク動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小脳に関する基礎医学生物学研究及び小脳疾患の遺伝子治療に応用可能なウイルスベククーを用いた、効率的にプルキンエ細胞に遺伝子を発現させるための技術に関する。さらに詳しくは、本発明は、プルキンエ細胞における遺伝子発現用ベクター、小脳への核酸の導入方法、トランスジェニック動物の作製方法及び小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
小脳は、複数の筋肉が関与する協調運動（例えば、歩行等）を行なうときに、個々の筋肉の伸縮や該伸縮のタイミングを巧みに調節し、運動を正確かつ円滑に行なわせる働きがある。したがって、小脳に損傷があるとこの調節が失われ、歩行障害、言語障害等が見られる。
【０００３】
小脳皮質への入力は、大脳皮質からの入力と脊髄からの入力とがあり、当該小脳皮質への入力は、最終的には、小脳皮質からの唯一の出力神経細胞であるプルキンエ細胞に伝えられる。
【０００４】
従来、プルキンエ細胞への遺伝子導入技術として、極めて高い力価のアデノウイルスを用いた培養プルキンエ細胞への遺伝子導入（特許文献１及び非特許文献１を参照のこと）、ヘルペスウイルスを用いた遺伝子導入（非特許文献２を参照のこと）、アデノウイルス随伴ウイルスを用いた生体マウスの小脳におけるプルキンエ細胞への遺伝子導入（非特許文献３及び非特許文献４を参照のこと）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を用いた生体マウスの小脳におけるプルキンエ細胞への遺伝子導入等が検討されている（非特許文献５）。
【０００５】
しかしながら、アデノウイルスは、プルキンエ細胞に対して、極めて低い親和性を示すにすぎないため、前記特許文献１又は非特許文献１に記載の方法は、培養プルキンエ細胞への遺伝子導入効率が低いという欠点がある。また、前記アデノウイルスは、免疫原性があり、感染部位に炎症を引き起こす場合があるという欠点がある。一方、前記非特許文献２に記載の方法は、ヘルペスウイルスにより神経障害が引き起こされる場合があるという欠点がある。さらに、非特許文献３及び非特許文献４に記載のアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入並びに非特許文献５に記載のＦＩＶによる遺伝子導入によれば、プルキンエ細胞への遺伝子導入は可能となるが、プルキンエ細胞に限定した遺伝子発現ではなく、効率が低く、小脳の他の神経細胞やグリア細胞にもタンパク質発現が誘導されるという欠点がある。
【０００６】
【特許文献１】特開平９−２８３７８号公報
【非特許文献１】ミツヒロ  ハシモト（Ｍｉｔｓｕｈｉｒｏ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第７巻、第１４９−１５８頁、１９９６年１月２０日
【非特許文献２】マルタ  アグド（Ｍａｒｕｔａ  Ａｇｕｄｏ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１３巻、第６６５−６７４頁、２００２年３月２０日
【非特許文献３】ウイリアム  エフ．ケメラー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｆ．  Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第２巻、第４４６頁−４５７頁、２０００年１１月
【非特許文献４】ジョセフ  エム．アリスキー（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍ．Ａｌｉｓｋｙ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第１１巻、第２６６９頁−第２６７３頁、２０００年８月
【非特許文献５】アリスキー（Ａｌｉｓｋｙ，ＪＭ）ら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、第１１巻、第２６６９−２６７３頁、２０００年８月２１日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの側面は、効率的に小脳プルキンエ細胞に選択的に遺伝子を発現させることで、これまで非常に困難であったプルキンエ細胞遺伝子導入を介した小脳の医学生物学的研究や小脳疾患の遺伝子治療を可能にする、発現ベクターを提供することにある。また、本発明の別の側面は、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患に対し、効率のよい治療効果を得ること等を可能にする、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療剤に関する。さらに、本発明の他の側面は、従来、作製が極めて困難であることから行なわれていなかったウイルスベクターを用いた小脳をターゲットとするトランスジェニック動物の作製、タンパク質の小脳プルキンエの選択的な発現を可能にする、非ヒト動物の小脳プルキンエ細胞への核酸導入方法に関する。本発明のさらに他の側面は、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の研究等に有用なトランスジェニック動物を、効率よく作製することが可能な、トランスジェニック動物の作製方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は、
〔１〕  下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置されてなる、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクター、
〔２〕  下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置され、レンチウイルスに由来するベクター骨格中の配列番号：３に示される塩基配列を含有しないものである、前記〔１〕記載の発現ベクター、
〔３〕  下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを有効成分として含有してなる、小脳表面のクモ膜下腔に注入するための、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療剤、
〔４〕  導入対象の核酸が、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ポリグルタミンの分解促進タンパク質及びP/Q型カルシウムチャネルからなる群より選ばれたポリペプチド、又は該ポリペプチドの変異体若しくは該ポリペプチドの機能阻害のためのドミナントネガティブ体
をコードする核酸である、前記〔３〕記載の治療剤、
〔５〕  小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患が、脊髄小脳変性症である、前記〔３〕又は〔４〕記載の治療剤、
〔６〕  発現ベクターが、下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結され、レンチウイルスに由来するベクター骨格中の配列番号：２に示される塩基配列を含有しないものである、前記〔３〕〜〔５〕いずれか１項に記載の治療剤、
〔７〕  下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを非ヒト動物のクモ膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させることを特徴とする、非ヒト動物の小脳プルキンエ細胞への核酸導入方法、並びに
〔８〕  下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを非ヒト動物のクモ膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させることを特徴とする、トランスジェニク動物の作製方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の発現ベクターによれば、導入対象の核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ等を、効率的に小脳プルキンエ細胞に導入して、発現させることができ、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患に対し、効率よくプルキンエ細胞に治療剤を供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の発現ベクターによれば、これまで困難であることからほとんど行なわれていなかったウイルスベクターによるプルキンエ細胞の遺伝子改変を容易にし、小脳の基礎医学生物学研究に有用である。
【００１０】
また、本発明の小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療剤によれば、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患に対し、効率のよい治療効果を得ることができるという優れた効果を奏する。
【００１１】
本発明の非ヒト動物の小脳プルキンエ細胞への核酸導入方法によれば、広範囲の小脳プルキンエ細胞に遺伝子発現が可能となり、ウイルスベクターを用いたトランスジェニック動物、例えば、小脳疾患モデル動物の作製が可能であるという優れた効果を奏する。
【００１２】
本発明のトランスジェニク動物の作製方法によれば、トランスジェニック動物、例えば、小脳疾患モデル動物の作製が、効率よく、より短期間で行なうことができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、１つの側面は、Ｌ７プロモーター又はカルビンディンプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置されてなる、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクター、好ましくは、小脳表面のクモ膜下腔に注入して、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターに関する。具体的には、本発明は、１つの側面では、下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置されてなる、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターに関する。
【００１４】
本発明の発現ベクターは、レンチウイルス由来のベクター又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターの基本骨格を有するため、高い導入効率でプルキンエ細胞に導入対象の核酸を導入することができるという優れた効果を発揮する。なお、本発明の発現ベクターには、前記レンチウイルス由来のベクター又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターの基本骨格が用いられているため、ベクター導入による生体における免疫応答、神経障害性等が抑制される点で有利である。
【００１５】
また、本発明の発現ベクターは、Ｌ７プロモーター又はカルビディンプロモーターを含有しているため、プルキンエ細胞において、効率的に導入遺伝子の翻訳産物を発現させることができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
さらに、本発明の発現ベクターは、レンチウイルス由来のベクター又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターの基本骨格と、Ｌ７プロモーター又はカルビディンプロモーターとが組み合わされて用いられているため、プルキンエ細胞において、高い選択性で、効率よく導入対象の核酸の翻訳産物を発現させることができるという優れた効果を発揮する。
【００１７】
前記レンチウイルス由来のベクターとしては、例えば、ｐＣＬ２０ｃ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ提供）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ等が挙げられる。
【００１８】
前記アデノ随伴ウイルス由来のベクターとしては、例えば、ｐＡＡＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社製）等が挙げられる。
【００１９】
本明細書において、「基本骨格」とは、特定の細胞内において、維持、複製されるに十分な因子を含む構成単位を意味する。したがって、本発明においては、汎用のレンチウイルス由来のベクター又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターにおける不要な部分を除去して得られたものも用いられうる。ウイルスベクターの力価を向上させる観点から、例えば、レンチウイルス由来のベクターであるｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴの場合、配列番号：３で示される塩基配列を有する部分が除去されていることが好ましい。したがって、例えば、下記（１）若しくは（２）：
（１）配列番号：１に示される塩基配列、若しくは
（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するＬ７プロモーター、又は
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有するカルビンディンプロモーター、
のいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸を作動可能に連結できるように配置され、レンチウイルスに由来するベクター骨格中の配列番号：３に示される塩基配列を含有しないものである、発現ベクターも本発明に含まれる。
【００２０】
本明細書において、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するために認識し、特異的に結合するＤＮＡ領域をいい、本発明においては、プルキンエ細胞への選択性をより向上させる観点から、プルキンエ細胞特異的なプロモーターであることが望ましい。
【００２１】
また、本明細書において、「作動可能に結合（した）」又は「作動可能に連結（した）」とは、本来の機能を発揮するように配置された状態を意味し、例えば、プロモーターにより、制御できるように、導入対象の核酸が配置され、かつ該核酸によりコードされた産物が該プロモーターの制御下に発現されるように配置された状態を意味する。
【００２２】
本発明の発現ベクターに用いられるＬ７プロモーターとしては、（１）配列番号：１に示される塩基配列を有するプロモーターが挙げられる。なお、天然の遺伝子が自然発生的に変異を起こして生じたバリアントであっても、該遺伝子によりコードされる産物が、本来の機能を発揮する場合があるため、本発明に用いられるＬ７プロモーターは、同等の機能を発揮するバリアントであってもよい。なお、かかるバリアントは、人為的に、例えば、慣用の部位特異的変異導入方法等により作製されうる。かかるバリアントの塩基配列としては、（２）該配列番号：１とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列を有するプロモーター等が挙げられる。
【００２３】
また、本発明の発現ベクターに用いられるカルビンディンプロモーターとしては、（Ａ）配列番号：２に示される塩基配列を有するプロモーター、及びそのバリアントのプロモーター、例えば、（Ｂ）該配列番号：２とは核酸多型により、少なくとも１ヌクレオチド残基が異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列を有するプロモーター等が挙げられる。
【００２４】
なお、本発明においては、前記Ｌ７プロモーター又はカルビンディンプロモーターの代わりに、制御下の遺伝子を、プルキンエ細胞特異的に発現させうる他のプロモーターを用いてもよい。例えば、後述の本発明の核酸導入方法により、本発明の発現ベクターを用いる場合には、小脳分子層及びプルキンエ細胞層の細胞に選択的に感染指せることが可能であり、興奮性神経細胞特異的プロモーターの使用でプルキンエ細胞特異的な遺伝子発現が可能となる。かかる観点からは、プロモーターとして、ＮＳＥプロモーター（配列番号：４）、シナプシンＩプロモーター（配列番号：５）等が挙げられる。
【００２５】
前記（２）又は（Ｂ）の塩基配列としては、例えば、
（ａ）配列番号：１又は２において、少なくとも１ヌクレオチド残基の変異（置換、欠失、挿入、付加等）を有する塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
（ｂ）配列番号：１又は２の核酸とストリンジェント、好ましくは高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
（ｃ）配列番号：１又は２に示される塩基配列に対し、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアライメント（例えば、Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ５、Ｆｉｘｅｄ  Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  １０、ｗｉｎｄｏｗｓｓｉｚｅ  ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ  Ｇａｐ  １０)により、最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも８０％、好ましくは、８５％以上、より好ましくは、９０％以上である塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した核酸をプルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
等が例示される。なお、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列の長さは、プロモーターとしての機能を発揮する範囲であればよく、例えば、配列番号：１又は２の核酸と同等の長さを有することが望ましく、高力価のウイルスを得る観点から、３０００ヌクレオチド長以下、好ましくは、２０００ヌクレオチド長以下、より好ましくは、５００ヌクレオチド長以下であることが望ましい。
【００２６】
なお、本明細書において、前記「少なくとも１ヌクレオチド残基」とは、プルキンエ細胞に特異的に発現させる機能を発揮する範囲であればよく、例えば、１個又は数個のヌクレオチド残基を意味する。
【００２７】
また、本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％  ホルムアミドを含む溶液中、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸とともに５５℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件により達成されうる。
【００２８】
前記核酸多型は、具体的には、１）  ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するために認識し、特異的に結合するＤＮＡ領域としての機能、２）  発現対象の核酸をプルキンエ細胞において効率的に発現させる機能等を発揮するための構造を維持する範囲での多型であればよい。
【００２９】
前記（１）の機能は、例えば、プルキンエ細胞中に含まれるＲＮＡポリメラーゼと、試験対象の核酸との結合の有無を検出することにより評価されうる。結合の有無の検出は、ゲルシフトアッセイにおける移動度、表面プラズモン解析における光学的センサーグラム又は質量センサーグラム化、フットプリント法等により行われうる。
【００３０】
前記（２）の塩基配列を有する核酸のプロモーターとしての機能は、例えば、試験対象の核酸の下流にレポーター遺伝子を作動可能に連結させ、構築物を得、得られた構築物を、マウスあるいはラット小脳グリア細胞＋神経細胞の混合培養に感染、あるいは固体マウスの小脳表面クモ膜下腔に投与することにより評価されうる。前記評価により、レポーター遺伝子が、プルキンエ細胞特異的に発現した場合、当該核酸が、本発明の発現ベクターに適したプロモーターであることの指標となる。
【００３１】
本発明の発現ベクターによる導入対象の核酸としては、目的に応じ、特に限定されるものではなく、例えば、小脳の発達、生理機能を制御するタンパク質をコードする核酸、具体的には例えば、小脳プルキンエ細胞のシナプス形成や可塑性に関与するタンパク質をコードする核酸、治療用途に用いうるタンパク質やｓｉＲＮＡを発現させうる核酸、具体的には、細胞内で生じた凝集体を分解若しくは除去する酵素をコードする核酸、細胞内において、低下している機能を補いうるタンパク質等をコードする核酸、細胞内において、過剰な機能の発現を抑制しうるｓｉＲＮＡを発現させうる核酸等；その他物質生産に関連するタンパク質をコードする核酸、特定物質を分解するタンパク質をコードする核酸等が挙げられる。前記導入対象の核酸としては、より具体的には、例えば、小脳シナプス形成および可塑性制御分子としてδ2型グルタミン酸受容体、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体をコードする核酸、治療用として脳由来神経栄養因子あるいはグリア細胞由来神経栄養因子をコードする核酸、脊髄小脳変性症の原因となるポリグルタミンの生産を抑制するsiRNAあるいはポリグルタミンの分解促進タンパク質をコードする核酸、脊髄小脳変性症6型の病因遺伝子であるP/Q型カルシウムチャネル、さらに前記タンパク質の変異体、機能阻害のためのドミナントネガティブ体をコードする核酸等が挙げられる。
【００３２】
本発明の発現ベクターとしては、上記のような構造を有しているものであればよく、例えば、配列番号：６に示される塩基配列を有するベクターｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７（図５）、配列番号：７に示される塩基配列を有するベクターｐＣＬ２０ｃ  Ｃａｌｐ（図６）、配列番号：８に示される塩基配列を有するベクターｐＡＡＶ  Ｌ７（図７）等が挙げられる。なお、前記ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７においては、該ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７中のＢａｍＨＩ認識部位に導入対象の核酸が挿入されうる。ｐＣＬ２０ｃ  Ｃａｌｐにおいては、該ｐＣＬ２０ｃ  Ｃａｌｐ中のＣｌａＩ認識部位に導入対象の核酸が挿入されうる。前記ｐＡＡＶ  Ｌ７においては、該ｐＡＡＶ  Ｌ７中のＢａｍＨＩ認識部位に導入対象の核酸が挿入されうる。
【００３３】
本発明は、別の側面では、前記（１）又は（２）の塩基配列を有するＬ７プロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを有効成分として含有してなる、小脳表面のクモ膜下腔に注入するための、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療剤に関する。
【００３４】
また、本発明の治療剤は、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患の治療に適した導入対象の核酸が作動可能に連結された発現ベクターを有効成分として含有することに１つの大きな特徴がある。本発明の治療剤は、前記発現ベクターを含有しているため、導入対象の核酸を、効率的に小脳プルキンエ細胞に導入することができ、発現させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の治療剤によれば、小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患に対し、効率のよい治療効果を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００３５】
本明細書において、「小脳プルキンエ細胞における障害を病因とする疾患」としては、脊髄小脳変性症１型、２型、６型等が挙げられる。
【００３６】
前記治療剤の薬理評価は、治療対象となる疾患の種類により異なるが、脊髄小脳変性症の場合、治療剤を、小脳表面のクモ膜下腔に投与した後、細胞学的にはプルキンエ細胞（および小脳のその他の細胞）に見られるポリグルタミン凝集塊の減少によって、さらに臨床的（動物の場合は行動学的）には小脳失調の改善程度により行われうる。脊髄小脳変性症の病因はポリグルタミンの蓄積であり、このため小脳失調が出現すると考えられることから、細胞内のポリグルタミン凝集塊が減少し、小脳失調が改善した場合、治療剤が、薬理作用を示すことの指標となりうる。
【００３７】
本発明の治療剤においては、治療対象となる疾患の種類等に応じ、有効成分である発現ベクターに組み込む導入対象の核酸を適宜選択することができる。例えば、脊髄小脳変性症６型の場合、プルキンエ細胞に多く発現している電位依存性Ｃａチャネルα１Ａサブユニット遺伝子の変異による機能異常を相補又は抑制しうる因子又はエレメントをコードする核酸、例えば、変異した電位依存性Ｃａチャネルα１Ａサブユニット遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを発現させ得る核酸、細胞質封入体を分解するタンパク質をコードする核酸等が用いられうる。また、脊髄小脳変性症１型、２型の場合、核内及び細胞質封入体を分解するタンパク質をコードする核酸、脳由来又はグリア細胞由来神経栄養因子をコードする核酸等が挙げられる。
【００３８】
本発明の治療剤は、好ましくは、小脳表面のクモ膜下腔に注入することにより、投与されうる。本発明の治療剤を小脳表面のクモ膜下腔に注入することにより、注入部位周辺の少数のプルキンエ細胞のみに限局することなく、小胞分子層及びプルキンエ細胞層全体に高い親和性で、かつ広範囲に有効成分を送達することができる点で有利である。また、小脳表面のクモ膜下腔への本発明の治療剤の注入は、下オリーブ核や小脳核への注入に比べ、脳実質の損傷を抑制でき、臨床応用に優れる。したがって、本発明の治療剤によれば、治療効果をより向上させることができる。
【００３９】
また、本発明の治療剤の投与には、注入の際、脳圧を安定して維持させる観点から、好ましくは、一定した速度で注入可能な手段、例えば、ハミルトンシリンジとそれを取りつけることができるマイクロマニピュレーター及び注入のためのマイクルインジェクションポンプ等を用いることが望ましい。注入速度は、脳圧を安定して維持できる範囲であれば特に限定されるものではなく、個体の年齢、体重、疾患状態等に応じて、適宜設定され得る。例えば、１０ｎｌ／分〜８００ｎｌ／分、好ましくは、５０ｎｌ／分〜４００ｎｌ／分、より好ましくは、１００ｎｌ／分〜２００ｎｌ／分であることが望ましい。
【００４０】
本発明の治療剤の投与量は、治療効果を発揮させるに適した量であれば特に限定されるものではなく、個体の年齢、体重、疾患状態等に応じて、適宜設定され得る。例えば、また、本発明の治療剤の投与回数は、治療効果を発揮させるに十分な回数であればよい。レンチウイルスを基本骨格とする場合、遺伝子が染色体に組み込まれることから、１回の投与でもよく、組み込まれる遺伝子のコピー数を増加させ、より広範囲の細胞に導入させるために、小脳表面の場所を変更して（右、正中、左など）3回程度であってもよい。アデノ随伴ウイルスを基本骨格とする場合、長期にわたる発現が確認されていることから前記レンチウイルスの場合と同様に行い、小脳失調の状態によって追加投与を行なってもよい。
【００４１】
本発明は、他の側面では、前記Ｌ７プロモーター、又は前記カルビンディンプロモーターのいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを非ヒト動物のクモ膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させることを特徴とする、非ヒト動物の小脳プルキンエ細胞への核酸導入方法に関する。
【００４２】
なお、本発明の核酸導入方法は、ヒトへの応用も可能である。
【００４３】
本発明の核酸導入方法においては、前記治療剤と同様の手法により、導入対象の核酸を保持した本発明の発現ベクターをクモ膜下腔に注入することにより、広範な小脳プルキンエ細胞に特異的に該核酸を発現させることができ、トランスジェニック動物、例えば、小脳疾患モデル動物の作製が可能である。
【００４４】
したがって、本発明は、さらに他の側面では、前記Ｌ７プロモーター、又は前記カルビンディンプロモーターのいずれかのプロモーターを含有したレンチウイルス又はアデノ随伴ウイルス由来のベクターであり、かつ該プロモーターの下流に導入対象の核酸が作動可能に連結された、小脳プルキンエ細胞に導入対象の核酸を発現させるための発現ベクターを非ヒト動物のクモ膜下腔に導入し、プルキンエ細胞特異的に発現させることを特徴とする、トランスジェニク動物の作製方法に関する。
【００４５】
本発明のトランスジェニク動物の作製方法によれば、トランスジェニック動物、例えば、小脳疾患モデル動物の作製が、効率よく、より短期間で行なうことができる。
【００４６】
本発明のトランスジェニック動物の作製方法によれば、特に限定されないが、マウス、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル等に代表される非ヒト動物のトランスジェニック動物を作製することができる。
【００４７】
以下、実施例、比較例等により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例等により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
プルキンエ細胞における外来遺伝子産物発現用レンチウイルスベクターの作製
（１）ウイルスの産生
以下の操作を、Ｐ２実験室で行なった。
【００４９】
対数増殖期のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン供給）をＰＢＳ（−）に分散させ、ついで、１０ｃｍディッシュ（ファルコン社製）あたり５×１０5細胞となるように播種した。播種後の１０ｃｍディッシュに、１０重量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ  １０ｍｌを添加し、その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で培養した。２４時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（１０重量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ）  １０ｍｌと交換した。その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で０．５時間培養した。
【００５０】
一方、ｐＣＡＧ−ＫＧＰ１Ｒ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）  ３μｇ、ｐＣＡＧ−ＲＴＲ２（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）  １μｇ、ｐＣＡＧＧＳ−ＶＳＶＧ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）  １μｇ、ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−ＧＦＰ（図２）  ５μｇそれぞれを４５０μｌ  滅菌水に溶解させ、プラスミド溶液を得た。なお、前記ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−ＧＦＰは、図１に示されるｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ；配列番号：９）のＭＳＣＶプロモーター部分を、配列番号：1に示される塩基配列を有するＬ７プロモーターに置き換えたものである。
【００５１】
得られたプラスミド溶液に２．５Ｍ  ＣａＣｌ2  ５０μｌを添加し、撹拌した。得られた混合物を、５分間静置させた後、前記混合物に、２ｘＢＢＳ〔組成：５０ｍＭ  Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．９５）〕  ５００μｌを添加し、すばやく撹拌した。その後、得られた混合物を、室温で３０分間静置させた。
【００５２】
前記ディッシュにプラスミド溶液を均等に滴下し、穏やかにディッシュ内の培地と混合した。その後、細胞を、３体積％  ＣＯ2、３５℃で培養した。以下、バイオハザード対策用安全キャビネットの中で操作を行なった。
【００５３】
２４時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（１０重量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ）  １０ｍｌと交換した。その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で４８時間培養した。
【００５４】
（２）濃縮
前記（１）で得られたディッシュから、培地を回収して、５０ｍｌ  遠沈管に移し、１０００ｒｐｍ（１２０×ｇ）、４分間遠心分離して、上清を得た。得られた上清を、フィルター（ミリポア社製、０．２２μｍ径）に通した。得られた濾液を、ベックマン社製ローターＳＷ２８．１を用いた超遠心分離（２５，０００ｒｐｍ、２時間、４℃）に供して、ウイルス粒子を沈殿させ、上清を除去した。
【００５５】
得られたウイルス粒子沈殿物をリン酸緩衝化生理食塩水（Ｍｇ2+とＣａ2+とを含有しない）〔以下、ＰＢＳ（−）〕に懸濁し、最終量を２００μｌとし、プルキンエ細胞感染用ウイルス液を得た。なお、すぐに使用しないウイルス液を、２０μｌずつ分注し、−８０℃で保存した。
【００５６】
（３）ウイルス力価の測定
対数増殖期のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＰＢＳ（−）に分散させ、ついで、６ウェルディッシュ（イワキ硝子社製）に１ウェルあたり１０4細胞となるように播種した。播種後の６ウェルディッシュに、１０重量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ  １０ｍｌを、２ml／ウェルとなるように添加し、その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で２４時間培養した。
【００５７】
ウイルス液を１０3〜１０8倍となるように培地で希釈し、前記ウェル内の培地に添加した。また、同時に、ポリブレン（ＳＩＧＭＡ社製、商品名：Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）を６μｇ／ｍｌとなるように各ウェルに添加した。その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で９６時間培養した。
【００５８】
ウェルの中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現細胞を蛍光顕微鏡（オリンパス社製、商品名：ＣＫＸ４１）下でセルカウンター（アズワン社製、商品名：数取器）を用いて計測し、ウイルスの力価を算出した。１０n希釈ウイルス液を添加した中、Ｙ個の細胞のＧＦＰ発現細胞が見出された場合、ウイルス力価は、Ｙ×１０nＴＵ／ｍｌ  （ＴＵ：  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）として算出される。ＨＥＫ２９３ＦＴ等の細胞系は、増殖速度が速いため、これらの細胞においては、Ｌ７プロモーター等の細胞特異的プロモーターも細胞特異性を示すことなく活性を有する。
【００５９】
（４）プルキンエ細胞における外来遺伝子産物発現用改良レンチウイルスベクター
インビトロジェン社製のレンチウイルスベクター（商品名：ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ）の場合、そのまま使用すると超遠心分離による濃縮を行った場合であっても１０6 ＴＵ／ｍｌの力価しか得られないが、該ベクターからＳＶ４０プロモーターとＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅ耐性遺伝子を除去することで、１０8 ＴＵ／ｍｌの力価を得ることができた。
【実施例２】
【００６０】
プルキンエ細胞における外来遺伝子産物発現用アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製
（１）ウイルスの産生
以下の操作を、Ｐ１実験室で行なった。
【００６１】
対数増殖期のＡＡＶ２９３細胞（ストラタジーン供給）をＰＢＳ（−）に分散させ、ついで、１０ｃｍディッシュ（ファルコン社製）あたり５×１０5細胞となるように播種した。播種後の１０ｃｍディッシュに、１０重量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ  １０ｍｌを添加し、その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で培養した。２４時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（１０重量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ）  １０ｍｌと交換した。その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で０．５時間培養した。
【００６２】
一方、ｐＡＡＶ−ＲＣ  ３．３μｇ、ｐＨｅｌｐｅｒ  ３．３μｇ又はｐＡＡＶ  Ｌ７-ＧＦＰ  ３．３μｇを４５０μｌ  滅菌水に溶解させ、プラスミド溶液を得た。なお、ｐＡＡＶ  Ｌ７-ＧＦＰは、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（図３）のＣＭＶプロモーターをＬ７プロモーターに置き換えたものである。
【００６３】
得られたプラスミド溶液に２．５Ｍ  ＣａＣｌ2  ５０μｌを添加し、撹拌した。得られた混合物を、５分間静置させた後、前記混合物に、２ｘＢＢＳ  ５００μｌを添加し、すばやく撹拌した。その後、得られた混合物を、室温で３０分間静置させた。
【００６４】
前記ディッシュにプラスミド溶液を均等に滴下し、穏やかにディッシュ内の培地と混合した。その後、細胞を、３体積％  ＣＯ2、３５℃で培養した。以下、バイオハザード対策用安全キャビネットの中で操作を行なった。
【００６５】
２４時間後、前記ディッシュ中の培地を、新しい培地（１０重量％  ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ）  １０ｍｌと交換した。その後、細胞を、５体積％  ＣＯ2、３７℃で４８時間培養した。
【００６６】
（２）濃縮
前記（１）で得られたディッシュから、古い培地を除去し、該ディッシュにＰＢＳ（−）  ２ｍｌを添加して洗浄した。洗浄後のディッシュにＰＢＳ（−）  １０ｍｌを添加し、３７℃で５分間静置させた。
【００６７】
前記ディッシュから細胞を剥がし、該細胞を遠沈管に回収した。１０００ｒｐｍ（１２０×ｇ）で４分間の遠心分離により、上清を除去した。得られた沈澱を、細胞と等量のＰＢＳ（−）に懸濁した。得られた懸濁液について、ドライアイス入りエタノールと３７℃に設定したウォーターバスとを用い、凍結と融解とを３回繰り返した。
【００６８】
得られた産物を、１３０００ｒｐｍ（８０００×ｇ）で１０分間遠心分離し、上清を回収した。
【００６９】
ベックマン社製ローターＳＷ２８．１用のチューブに、底から順に、ＣｓＣｌ−ＨＮＥ１．５０〔４Ｍ  ＣｓＣｌ−ＨＮＥ（組成：ＣｓＣｌ  ６７．３ｇ、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ５ｍｌ、５Ｎ  ＮａＣｌ  ３ｍｌ）〕  ４ｍｌ、ＣｓＣｌ−ＨＮＥ１．２５〔２．２Ｍ  ＣｓＣｌ−ＨＮＥ（組成：ＣｓＣｌ  ３３．７ｇ、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ５ｍｌ、５Ｎ  ＮａＣｌ  ３ｍｌ）〕  ４ｍｌ、上清  約１０ｍｌを重層し、得られたチューブを超遠心分離〔２５０００ｒｐｍ（８５４７０×ｇ）、３時間、４℃〕に供し、ウイルスを含む溶液の層を回収した。
【００７０】
回収したウイルスを含む溶液を、商品名：Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ〔ＰＩＥＲＣＥ社製〕を用いて、ウイルスを含む溶液の１００倍の容量のＨＮ緩衝液〔組成：１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）〕に対し、２４時間透析した。なお、透析中、前記ＨＮ緩衝液を３回交換した。得られた透析物を、商品名：Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、最終量２００μｌまで濃縮し、ウイルス液を得た。
【００７１】
（３）ウイルス力価の測定
前記実施例２の（２）と同様に行なった。
【実施例３】
【００７２】
マウス小脳クモ膜下腔へのベクターの接種
以下の操作は、Ｐ２実験室にて行い、また、ウイルスベクター接種後のマウスはＨＥＰＡフィルター付の感染動物用ラック（トキワ科学器械株式会社製、商品名：バイオクリーンカプセルユニットＴ−ＢＣＣ−Ｍ４）内で飼育した。
【００７３】
マウス（ＳＬＣ供給、４〜１０週齡）に、ペントバルビタール（商品名：ネンブタール）を、体重３０ｇあたり２００μｌ、腹腔内投与にて麻酔した。
【００７４】
なお、以下の操作は、バイオハザード対策用安全キャビネットの中で行なった。
【００７５】
麻酔後、マウスを、小動物固定装置〔ナリシゲ社製、商品名：ＳＧ−４〕を用いて固定した。また、体温コントローラー〔Ｆ・Ｓ・Ｔ、商品名：体温コントロールシステム（マウス用）  ＦＳＴ−ＨＰＳＭ〕にて、マウス体温を３７℃となるように維持した。マウスの頭部の毛を刈った後、Ｂｒｅｇｍａより数ミリ吻側から小脳直上にかけて皮膚を切開した。ついで、実体顕微鏡（ニコン社製、商品名：ＳＭＺ６４５）下で、Ｂｒｅｇｍａより５．５〜７．５ｍｍ尾側の正中部の頭蓋骨に、マイクロドリル〔浦和工業社製、商品名：パワーコントローラーＵＣ１００＋ＨＢ１（ドリル）〕を用いて、内径２〜３ｍｍの穴を開けた。また、注射針を用いて、骨の下の硬膜及びクモ膜に穴を開けた。
【００７６】
前記実施例１で得られた外来遺伝子産物発現用レンチウイルスベクターを、商品名：レックスフィルマイクロシリンジ（ＷＰＩ社製、１０μｌ容量）に充填し、該フレックスフィルマイクロシリンジをマイクロマニピュレーターに取りつけたウルトラマイクロポンプ２（ＷＰＩ社製）にセットした。
【００７７】
マイクロシリンジの針先を、Ｎｏ．５の穴より約０．５ｍｍ刺入し、クモ膜下腔に留置後、外来遺伝子産物発現用レンチウイルスベクターを、ウルトラマイクロポンプ２専用デジタルコントローラーＭｉｃｒｏ４（商品名、ＷＰＩ社製)を用いて、１００ｎｌ／分の速度で４０分間、計４μｌ注入した。
【００７８】
注入後、切開したマウスの皮膚を、縫合糸付き眼科用微小針（夏目製作所社製、商品名：眼科用弱弯針Ｃ６７−０）で縫合した。その後、固定装置からマウスをはずし、ヒーティングパッド（昭和精機工業社製、商品名：ゴムマットヒーターＳＧ−１５）上に置いたケージ(安全キャビネット内)で観察した。マウスが、麻酔から覚醒した後、マウスケージを感染動物用ラックに戻し、７〜１４日間維持した。
【００７９】
なお、対照として、Ｌ７プロモーターの代わりにＣＭＶプロモーターを保持するレンチウイルスベクターを用いて、同様に、マウスに接種した。
【００８０】
接種後７〜１４日目におけるマウスについて、４％  ホルムアルデヒド−ＰＢで灌流固定後、脳を摘出した。蛍光実体顕微鏡を用いて脳全体の蛍光写真を撮影後、３０％  シュークロースで２４時間処理後、凍結切片を作製した。作製された脳切片を、一次抗体（Ｒａｔ  Ａｎｔｉ-ＧＦＰＡｂ；ナカライ社製）と共に２４時間室温でインキュベーションし、ついで、二次抗体（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ-Ｒａｔ  ＩｇＧＡｂ；モレキュラープローブ社製）で２時間、室温でインキュベーションし、顕微鏡用標本を得た。その後、蛍光顕微鏡で標本の観察を行なうことによりベクターの局在を調べた。
【００８１】
その結果、図８（Ｌ７プロモーターを保持するレンチウイルスベクターを用いた場合）および図１０（ＭＳＣＶプロモーターを保持するレンチウイルスベクターを用いた場合）に示されるように小脳直上クモ膜下腔へのウイルス投与により、小脳に限局したＧＦＰの発現が見られた。凍結切片では、Ｌ７プロモーターを保持するレンチウイルスベクター（本発明）を用いた場合、プルキンエ細胞に限局して遺伝子の発現が見られた（図９）が、ＭＳＣＶプロモーターを保持するレンチウイルスベクターを用いた場合、小脳プルキンエ細胞に加えて、星状細胞やバーグマングリアへの発現も認められる（図１１）。実体顕微鏡写真において、Ｌ７プロモーターを保持するレンチウイルスベクターを接種した小脳のＧＦＰ蛍光強度が弱い一つの理由として、遺伝子発現がプルキンエ細胞に限局していることが挙げられる。
【００８２】
また、かかる方法により、広範囲の小脳プルキンエ細胞に遺伝子発現が見られることより、トランスジェニック動物が作製できることがわかる。
【実施例４】
【００８３】
前記実施例１〜３において、Ｌ７プロモーターの代わりに、カルビンディンプロモーターを用いて、同様の操作を行なう。レンチウイルスの基本骨格を有するベクターの一例を図６に示す。かかるベクターによれば、Ｌ７プロモーターを用いた場合と同様に、プルキンエ細胞に限局して遺伝子の発現が見られる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明により、効率的なプルキンエ細胞へのタンパク質供給が可能になり、脊髄小脳変性症等に代表される疾患の治療への応用が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、ｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰの概略図である。
【００８６】
【図２】図２は、ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−ＧＦＰの概略図である。
【００８７】
【図３】図３は、ｐＡＡＶ  ＣＭＶ−ＧＦＰの概略図である。
【００８８】
【図４】図４は、ｐＡＡＶ  Ｌ７−ＧＦＰの概略図である。
【００８９】
【図５】図５は、本発明の発現ベクターの一例であるｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７（配列番号：６）の概略図である。
【００９０】
【図６】図６は、本発明の発現ベクターの一例であるｐＣＬ２０ｃ  Ｃａｌｐ（配列番号：７）の概略図である。
【００９１】
【図７】図７は、本発明の発現ベクターの一例であるｐＡＡＶ  Ｌ７（配列番号：８）の概略図である。
【図８】図８は、小脳プルキンエ細胞特異的なＧＦＰ遺伝子の発現例を示す図である。かかる図は、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスの小脳直上クモ膜下腔に、Ｌ７プロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子を発現するレンチウイルス〔ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７−ＧＦＰ；１．０×１０9ＴＵ／ｍｌの力価〕を用い、マイクロインジェクションポンプを用いて１００ｎｌ／分の速度で４０分かけて４μｌ投与し、７日後に４％  パラフォルムアルデヒド＋リン酸緩衝液にて環流固定し、得られた脳を蛍光実体顕微鏡で観察した結果である。スケールバーは、５０μｍである。
【００９２】
【図９】図９は、小脳分子層、プルキンエ細胞層への非特異的なＧＦＰ遺伝子の発現例を示す図である。図８の小脳から凍結切片を作製した。スケールバーは、５０μｍを示す。
【００９３】
【図１０】図１０は、かかる図は、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスの小脳直上クモ膜下腔に、ＭＳＣＶプロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子を発現するレンチウイルス〔ｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ−ＧＦＰ２．５×１０9ＴＵ／ｍｌの力価〕を、マイクロインジェクションポンプを用いて１００ｎｌ／分の速度で４０分かけて４μｌ投与し、７日後に４％  パラフォルムアルデヒド＋リン酸緩衝液にて環流固定し、得られた脳を蛍光実体顕微鏡で観察した結果である。
【００９４】
【図１１】図１１は、小脳分子層、プルキンエ細胞層への非特異的なＧＦＰ遺伝子の発現例を示す図である。図１０の小脳から凍結切片を作製した。スケールバーは、５０μｍである。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号：１は、Ｌ７プロモーターの配列である。
【００９６】
配列番号：２は、カルビンディンプロモーターの配列である。
【００９７】
配列番号：３は、レンチウイルスベクター（インビトロジェン社製、商品名：ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ）から除去した部分の配列を示す。
【００９８】
配列番号：４は、ＮＳＥプロモーターの配列である。
【００９９】
配列番号：５は、シナプシンＩプロモーターの配列である。
【０１００】
配列番号：６は、ｐＣＬ２０ｃ  Ｌ７の配列である。
【０１０１】
配列番号：７は、ｐＣＬ２０ｃ  Ｃａｌｐの配列である。
【０１０２】
配列番号：８は、ｐＡＡＶ  Ｌ７の配列である。
【０１０３】
配列番号：９は、ｐＣＬ２０ｃ  ＭＳＣＶ-ＧＦＰの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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