(57)【要約】【課題】 簡便に効率よくスフィンゴミエリンを測定できるスフィンゴミエリンの検出方法を提供すること。【解決手段】 被験試料を物理処理又は化学処理した後に固相に接触させて被験試料中の脂質を固相に固定化し、次いで、該固相にライセニンを接触させ、さらに該固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出することを含む、被験試料中のスフィンゴミエリンの検出方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料を物理処理又は化学処理した後に固相に接触させて被験試料中の脂質を固相に固定化し、次いで、該固相にライセニンを接触させ、さらに該固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出することを含む、被験試料中のスフィンゴミエリンの検出方法。
【請求項２】
ＥＬＩＳＡ法により固相に結合したライセニンを検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験試料を凍結融解処理した後に固相に接触させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
スフィンゴミエリンの定量を行う、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
少なくともライセニン及び抗ライセニン抗体を含む、請求項１から４の何れかに記載の検出方法を行うためのスフィンゴミエリン検出キット。
【請求項６】
スフィンゴミエリンを固定化した固相に、被験物質とスフィンゴミエリナーゼを接触させてインキュベーションする工程；
洗浄後、該固相にライセニンを接触させる工程；及び
該固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出する工程：
を含む、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＥＬＩＳＡ法により固相に結合したライセニンを検出する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の方法により得られる、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤。
【請求項９】
以下の何れかの構造を有する化合物を含む、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤。
【化１】
2006214731.tif 000008
【化２】
2006214731.tif 000009
【化３】
2006214731.tif 000010
【化４】
2006214731.tif 000011
【化５】
2006214731.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴミエリンの検出方法、及び上記検出方法を用いたスフィンゴミエリナーゼ阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症・動脈硬化は多くの現代人が悩まされている成人病の一つである。従来、動脈硬化の診断・治療・発症メカニズムの解明などは、専ら低比重リポ蛋白質ＬＤＬ中のコレステロールに着目して行われてきた。しかし、近年、ＬＤＬ中にはコレステロールの他にスフィンゴミエリンが多く含まれること、高脂血症患者の血漿中のスフィンゴミエリン量が有意に増加していること、またＬＤＬの変性にスフィンゴミエリン分解酵素が関与していることなどが報告され、動脈硬化とスフィンゴミエリンとの関係がにわかに注目され始めている。
【０００３】
これまでの血漿中スフィンゴミエリンの定量法としては、非特許文献１（Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. (2000) 20, pp2614-2618）において、Xian-cheng Jiangらは４段階の酵素反応によって血漿中スフィンゴミエリン量を測定している。まず、バクテリア由来スフィンゴミエリナーゼによりスフィンゴミエリンをホスホリルコリンとｎ−アシルスフィンゴシンに加水分解する。次に、アルカリホスファターゼによりホスホコリンからコリンを産生させる。さらにコリンオキシダーゼ処理により過酸化水素を生成させる。最後にペルオキシダーゼの作用により、過酸化水素・フェノール・４−アミノアンチピリンから赤色のキノン色素を生成させ、比色定量する。
【０００４】
また、生化学的手法によるスフィンゴミエリン定量法も考えられる。まず血漿から脂質抽出を行った後、薄層クロマトグラフィーにより脂質成分を分離する。そしてスフィンゴミエリンのスポットを回収して再び脂質抽出を行い、リン定量によりスフィンゴミエリン量を測定する。
【０００５】
しかしながら、上記したスフィンゴミエリン定量法は何れも操作が煩雑であり、多数の試料を用いる場合でもより簡便に効率よくスフィンゴミエリンを測定できる方法を開発することが望まれている。
【０００６】
一方、スフィンゴミエリナーゼは、膜脂質の一つであるスフィンゴミエリンを加水分解してセラミドを産生する。スフィンゴミエリンは細胞内情報伝達や物質輸送を制御し、またセラミドはアポトーシスシグナルとして働くなど、これらの脂質が様々な細胞機能に深く関わっていることが知られている。一方、ニーマンピック病タイプＡは産生スフィンゴミエリナーゼ活性が欠損した遺伝病で、重篤な中枢神経症状を示し乳児期に死亡する。しかしながら、本酵素の欠損によりなぜ発症するのかは今のところ全く不明であり、効果的な治療方法も確立されていない。また、動脈硬化では変性リポ蛋白質がキーファクターとして働くが、最近になってスフィンゴミエリナーゼがリポ蛋白質の変性に関与していることが報告された。スフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、本酵素の生理的機能を明らかにし、さらにこれらの疾患の発症機序の解明や治療薬の開発を行ううえで極めて有用なツールになると期待されるが、現在のところ実用的なスフィンゴミエリナーゼ阻害剤はない。
【非特許文献１】Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. (2000) 20, pp2614-2618
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
即ち、本発明は、簡便に効率よくスフィンゴミエリンを測定できるスフィンゴミエリンの検出方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、ある種の疾患の発症機序の解明や治療薬の開発に有用であるスフィンゴミエリナーゼ阻害剤のスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、被験試料を物理的処理又は化学処理した後に固相に固定化し、ライセニンと抗ライセニン抗体を用いて固相に結合したスフィンゴミエリンを検出することによって、被験試料中のスフィンゴミエリンを簡便かつ正確に検出することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、被験試料を物理処理又は化学処理した後に固相に接触させて被験試料中の脂質を固相に固定化し、次いで、該固相にライセニンを接触させ、さらに該固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出することを含む、被験試料中のスフィンゴミエリンの検出方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、ＥＬＩＳＡ法により固相に結合したライセニンを検出する。
好ましくは、被験試料を凍結融解処理した後に固相に接触させる。
好ましくは、スフィンゴミエリンの定量を行う。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、少なくともライセニン及び抗ライセニン抗体を含む、本発明のスフィンゴミエリンの検出方法を行うためのスフィンゴミエリン検出キットが提供される。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、スフィンゴミエリンを固定化した固相に、被験物質とスフィンゴミエリナーゼを接触させてインキュベーションする工程；
洗浄後、該固相にライセニンを接触させる工程；及び
該固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出する工程：
を含む、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤のスクリーニング方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、ＥＬＩＳＡ法により固相に結合したライセニンを検出する。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、上記のスクリーニング方法により得られる、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの構造を有する化合物を含む、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤が提供される。
【化１】
2006214731.tif 000002
【化２】
2006214731.tif 000003
【化３】
2006214731.tif 000004
【化４】
2006214731.tif 000005
【化５】
2006214731.tif 000006
【発明の効果】
【００１６】
本発明のスフィンゴミエリンの検出方法によれば、簡便に効率よくスフィンゴミエリンを測定できる。また、本発明のスフィンゴミエリナーゼ阻害剤のスクリーニング方法によれば、簡便にスフィンゴミエリナーゼ阻害剤をスクリーニングすることができ、得られるスフィンゴミエリナーゼ阻害剤は、ある種の疾患の発症機序の解明や治療薬の開発に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
ライセニンはシマミミズ体腔液から単離された蛋白質で、スフィンゴミエリンに極めて特異的に結合することが明らかになっている（J.Biol.Chem. (1998) 273, pp5300-5306,及びJ.Biol.Chem. (2003) 278, pp22762-22770）。そこで、本発明者らは、ライセニンを検出プローブとして用い、臨床検査の診断キットとして最も頻繁に利用されているＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbent assay）を行うことにより、簡便に血漿中のスフィンゴミエリン量を測定できる方法を開発した。先ず、被験者の血漿を９６穴プラスチックプレートに播き固相化する。次いで、ライセニンを加えてインキュベーションした後、血漿中のスフィンゴミエリンに結合したライセニンを抗ライセニン抗体で検出して、比色定量する。この方法により得られた結果は、生化学的手法により定量したスフィンゴミエリン量の結果とよく相関していた。
【００１８】
また、本発明者らは、ライセニンを検出プローブとして用いた上記のスフィンゴミエリン検出方法を応用することにより、多数の試験化合物からスフィンゴミエリナーゼ阻害剤を簡便にスクリーニングする方法を開発した。先ず、スフィンゴミエリンを９６穴プラスチックプレートに固相化する。次に、試験化合物とスフィンゴミエリナーゼの混合液を加えてインキュベーションする。洗浄後、プレート上に残存しているスフィンゴミエリンをライセニンにより検出する。酵素が効いていればスフィンゴミエリンは分解されるためライセニンは反応しないが、もし試験化合物が酵素活性を阻害していればスフィンゴミエリンは分解されずにプレート上に残るため、ライセニンで検出することができる。
【００１９】
（１）スフィンゴミエリンの検出方法
本発明のスフィンゴミエリンの検出方法では、先ず、被験試料を物理処理又は化学処理した後に固相に接触させる。ここで言う物理処理又は化学処理とは、被験試料中のスフィンゴミエリンを分散させることができる処理であり、例えば、凍結融解処理を１回以上行うこと、超音波処理すること、界面活性剤で処理すること、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、凍結融解処理であり、回数は１回以上の任意の回数行うことができ、例えば、１〜５回程度行うことができる。
【００２０】
本発明で用いる被験試料の種類は特に限定されないが、例えば、全血、血漿、血清、尿、便、精液又は唾液等の体液、あるいは生体材料（組織、器官など）の溶解物やホモジネートなどのような生体材料から調製された溶液などが挙げられる。
【００２１】
物理処理又は化学処理を施した被験試料を固相に接触させることにより、被験試料中の脂質は固相に固定化される。次に、該固相にライセニンを接触させることにより、ライセニンを固相上のスフィンゴミエリンに特異的に結合させる。
【００２２】
本発明で用いるライセニンは、スフィンゴミエリンに特異的に結合するものであれば特に限定されないが、好ましくは、ライセニン１またはライセニン３であり、特に好ましくはライセニン１である。ライセニン１と３の塩基配列とアミノ酸配列を本明細書中の配列表の配列番号１（ライセニン１の塩基配列とアミノ酸配列）、配列番号２（ライセニン３の塩基配列とアミノ酸配列）に記載する。
【００２３】
本発明で用いるライセニンの入手・製造方法は特に限定されず、シマミミズから得られたもの（Biomed. Res.  17.  pp.197-203 (1996)）でも、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。比較的容易な操作でかつ大量に製造できるという点では、組み換えタンパク質が好ましい。
【００２４】
ライセニンを組み換えタンパク質として産生するには、該タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡまたはその変異体または相同体を入手し、これを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を製造することができる。発現ベクターおよび形質転換体の作成およびそれを用いた組み換えタンパク質の産生については当業者に周知である。
【００２５】
次に、スフィンゴミエリンに特異的に結合することによって固相に結合したライセニンを、抗ライセニン抗体を用いて検出する。抗ライセニン抗体は、上記でスフィンゴミエリンに特異的に結合するために用いたライセニンを認識できる抗体であればよく、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。このような抗ライセニン抗体は、当業者に公知の方法により取得することができる。
【００２６】
固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出する方法は特に限定されず、適当な標識物質を有する二次抗体を用いて上記の抗ライセニン抗体を検出することができる。検出のための標識物質の種類は特に限定されないが、例えば、親和性物質（例えば、マルトース結合タンパク質（Maltose-binding protein）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなど）蛍光物質（Ｃｙ５、Ｃｙ３（以上アマシャム）、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、アクリジンオレンジなど）、化学発光物質（例えば、ルミノール、アクリジニウム−Ｉなど）、放射性物質などが挙げられる。
【００２７】
本発明では、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法により、固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出することができる。ＥＬＩＳＡ法の具体例を以下に説明する。
【００２８】
先ず、スフィンゴミエリンを含む被験試料を96穴プラスチックプレートにまいた後に、ウシ血清アルブミン溶液などでブロッキングする。プレートを洗浄後、ライセニンを加えて室温でインキュベーションする。洗浄後、適当な倍率に希釈した抗ライセニンウサギ抗血清を加えてインキュベーションする。洗浄後、適当な倍率に希釈したビオチン標識抗ウサギIgG抗体（二次抗体）を加えてインキュベーションする。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加えてインキュベーションする。o-フェニレンジアミンを基質として10分間発色させた後に、492nm（対照波長630nm）の吸光度を測定することにより、スフィンゴミエリンを検出することができる。本発明によれば、スフィンゴミエリンの定量を簡便に行うことができる。
【００２９】
さらに本発明によれば、少なくともライセニン及び抗ライセニン抗体を含む、上記した本発明によるスフィンゴミエリンの検出方法を行うためのスフィンゴミエリン検出キットが提供される。
【００３０】
本発明のキットの中には、ライセニン及び抗ライセニン抗体に加えて、抗ライセニン抗体を検出するための標識を有する二次抗体、該二次抗体を検出するための発色試薬などを適宜含めることができる。例えば、抗ライセニン抗体として、抗ライセニンウサギ抗血清を使用する場合には、二次抗体としてビオチン標識抗ウサギIgG抗体を使用することができる。また、該二次抗体を検出するための発色試薬としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン及びo-フェニレンジアミンを使用することができる。即ち、本発明のキットの一例としては、ライセニン、抗ライセニンウサギ抗血清、ビオチン標識抗ウサギIgG抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン及びo-フェニレンジアミンを含むキットを挙げることができる。本発明のキットには、上記の試薬に加えて、反応に必要な緩衝液、ブロッキング液、洗浄液などを含めることができる。当業者であればこのような試薬を適宜選択し、キットを構成することができる。
【００３１】
（２）スフィンゴミエリナーゼ阻害剤のスクリーニング方法
本発明のスフィンゴミエリナーゼ阻害剤のスクリーニング方法は、（ａ）スフィンゴミエリンを固定化した固相に、被験物質とスフィンゴミエリナーゼを接触させてインキュベーションする工程；（ｂ）洗浄後、該固相にライセニンを接触させる工程；及び（ｃ）該固相に結合したライセニンを抗ライセニン抗体を用いて検出する工程を含むことを特徴とする。
【００３２】
上記工程（ａ）では、先ず、スフィンゴミエリンを固相に固定化する。例えば、スフィンゴミエリンとコレステロールの等モル混合液10μMのエタノール溶液を96穴プレートにまき、乾固することによってスフィンゴミエリンを固相に固定化することができる。
【００３３】
次に、この固相に被験物質とスフィンゴミエリナーゼを接触させてインキュベーションする。被験物質の種類は特に限定されず、任意の物質を使用することができる。被験物質は個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。また、スフィンゴミエリナーゼの種類も特に限定されないが、例えば、黄色ブドウ球菌より精製されたスフィンゴミエリナーゼなどを使用することができる。
【００３４】
上記工程（ｂ）と（ｃ）は、本明細書中上記したスフィンゴミエリンの検出方法の場合と同様に行うことができる。
【００３５】
上記したスクリーニング方法により得られる、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤も本発明の範囲内である。具体的には、図３に記載の構造を有する化合物（サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）を含むスフィンゴミエリナーゼ阻害剤などが挙げられる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：ELISA法によるスフィンゴミエリンの検出
＜試薬＞
スフィンゴミエリン（脳）；Avanti Polar Lipids, Inc. #860062
ウシ血清アルブミン（Fraction V）；Sigma #A8022
ライセニン、抗ライセニン抗血清；ペプチド研究所
ビオチン標識抗ウサギIgG抗体；Vector Laboratories #BA-1000
ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン；Zymed #43-4323
o-フェニレンジアミン；ナカライ #271-37
【００３７】
＜実験方法＞
スフィンゴミエリン1μMのエタノール溶液を作製し、96穴プラスチックプレートにエタノールで2倍希釈しながら50μl/wellでまく。室温で放置し、エタノールを乾固させる。3％ウシ血清アルブミン溶液200μl /wellで2時間ブロッキングする。トリス緩衝生理食塩水で洗浄する。ライセニン1μg/mlを50μl /wellで加えて室温にて1〜2時間インキュベーションする。洗浄後、1000倍希釈した抗ライセニンウサギ抗血清と1〜2時間インキュベーションする。洗浄後、1000倍希釈したビオチン標識抗ウサギIgG抗体と1〜1.5時間インキュベーションする。洗浄後、1000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと30分間インキュベーションする。o-フェニレンジアミンを基質として10分間発色させ、4規定硫酸で反応を停止させる。492nm（対照波長630nm）の吸光度を測定する。その結果、図１に示したようにスフィンゴミエリン濃度と吸光度の測定値はよく相関した。
【００３８】
実施例２：ELISA法による血漿中のスフィンゴミエリンの測定
冠状動脈疾患患者あるいは正常人から採血し、遠心分離により血漿画分を調製する。血漿を−80℃フリーザーに30分間置いた後、37℃の水浴にて融解するという凍結―融解操作を4回繰り返し、16000倍希釈して96穴プレートに50μl /wellでまき、一晩置いて脂質を固相化させる。
【００３９】
3％ウシ血清アルブミン溶液200μl /wellで2時間ブロッキングした後、ライセニンで1時間、抗ライセニンウサギ抗血清で1時間、ビオチン標識抗ウサギIgG抗体で1時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで30分間、順次インキュベーションする。o-フェニレンジアミンを基質として10分間発色させ、4規定硫酸で反応を停止させた後、492nm（対照波長630nm）の吸光度を測定する。
【００４０】
ELISA法による結果と比較するため、生化学的方法によりリン脂質分析を行った。
血漿画分からBligh & Dyer法により脂質を抽出した後、薄層クロマトグラフィーでリン脂質を分離し、シリカゲルからスフィンゴミエリンを回収して、無機リンを定量することにより血漿中のスフィンゴミエリン濃度を測定した。
２種類の方法（ELISA法と生化学的方法）で血漿中のスフィンゴミエリン量を測定したところ、その結果はよく相関した（図２の棒グラフ参照）。
【００４１】
実施例３：スフィンゴミエリン分解酵素の阻害剤のスクリーニング
ChemBridge社  PRIME Collectionの中から阻害剤の候補物質をスクリーニングした。
スフィンゴミエリン分解酵素は黄色ブドウ球菌より精製されたスフィンゴミエリナーゼ（Sigma ＃S-8633）を用いた。コレステロールはSigma #C-8667を使用した。
【００４２】
スフィンゴミエリンとコレステロールの等モル混合液10μMのエタノール溶液を96穴プレートにまき、乾固させる。別の96穴プレートを3％ウシ血清アルブミンで4℃、一晩ブロッキングしておく。ブロッキングしておいた96穴プレート中で、100倍ないし200倍希釈したスフィンゴミエリン分解酵素50μlと、ChemBridge社  PRIME Collection  5μlを混和する。混和した溶液を、脂質をまいて乾固させたプレートに50μl /wellで移し、37℃にて30分間インキュベーションする。洗浄後、3％ウシ血清アルブミン溶液200μl /wellで2時間ブロッキングし、さらにライセニンを用いたELISA法により、プレート上に残存しているスフィンゴミエリンを検出する。
【００４３】
上述した、ライセニンを用いたELISA法を応用したスクリーニング方法で、80％以上の阻害がみられたサンプルについてスフィンゴミエリン分解酵素阻害剤の候補物質として、下記の方法で2次スクリーニングを行った。
【００４４】
スフィンゴミエリンとコレステロールを500μMずつ含むリポソーム（小さな一重の人工膜）を作製する。
候補物質溶液5μlと、200倍希釈したスフィンゴミエリン分解酵素液5μlを混和し、リポソーム溶液40μlに加え、37℃にて30分間インキュベーションする。
【００４５】
その後Bligh & Dyer法により脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーを行う。展開溶媒はクロロホルム：メタノール：酢酸：蟻酸(50:30:4.5:6.5、容積比）を用い、スフィンゴミエリンの検出にはディットマー試薬を用いる。
【００４６】
候補物質を加えない場合をスフィンゴミエリン分解酵素活性100％とし、スフィンゴミエリン分解酵素の無い場合を活性0％として、スフィンゴミエリンのスポットの強さにより、定性的に酵素活性の阻害の程度を++, +, - の3段階で判断する。
【００４７】
2次スクリーニングによりポジティブと判断された候補物質について、さらに10倍低い濃度で同様のスクリーニングを行い、3次スクリーニングとした。
スクリーニングの結果を以下の表１に示す。
【００４８】
【表１】
2006214731.tif 000007
【００４９】
なお、サンプルＡ〜Ｅの化学構造式と名称（PRIME CollectionにおけるIDナンバー）を図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ELISA法によりスフィンゴミエリンを検出した結果を示す。
【図２】図２は、本発明によるELISA法と従来の生化学的方法により血漿中のスフィンゴミエリン量を測定した結果を示す。
【図３】図３は、実施例でのスクリーニングの結果、ポジティブであった化合物の構造を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５１】
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> A method of detection of sphingomyelin
<130> A51029A
<160> 2
<210> 1
<211> 894
<212> DNA
<213> Eisenia foetida
<400> 1
atg tcg gct aaa gca gca gag gga tat gaa cag ata gaa gta gat gtg   48
Met Ser Ala Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Glu Gln Ile Glu Val Asp Val 
1               5                  10                  15
gtg gca gta tgg Aaa gaa ggc tat gta tac gaa aat cgc gga agc acc   96
Val Ala Val Trp Lys Glu Gly Tyr Val Tyr Glu Asn Arg Gly Ser Thr
20                  25                  30
agt gtg gat cag aag atc aca ata aca aaa ggc atg aaa aat gtg aat  144
Ser Val Asp Gln Lys Ile Thr Ile Thr Lys Gly Met Lys Asn Val Asn
35                  40                  45
tca gaa aca agg aca gtg act gct acg cat agt att ggt tct act att  192
Ser Glu Thr Arg Thr Val Thr Ala Thr His Ser Ile Gly Ser Thr Ile
50                  55                  60
agc act gga gat gca ttc gaa att gga agc gtg gag gtt agc tac agc  240
Ser Thr Gly Asp Ala Phe Glu Ile Gly Ser Val Glu Val Ser Tyr Ser
65                  70                  75                  80
cat tca cat gaa gaa tcc caa gtt agc atg acg gaa act gaa gtt tat  288
His Ser His Glu Glu Ser Gln Val Ser Met Thr Glu Thr Glu Val Tyr
85                  90                  95
gaa tca aag gtg atc gaa cac act ata acg att cca cct act tca aaa  336
Glu Ser Lys Val Ile Glu His Thr Ile Thr Ile Pro Pro Thr Ser Lys
100                 105                 110
ttc aca aga tgg caa ctg aat gct gac gtt ggt gga gcg gat att gaa  384
Phe Thr Arg Trp Gln Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Ala Asp Ile Glu
115                 120                 125
tac atg tat ttg att gat gaa gtc aca ccc ata gga ggg act cag agt  432
Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Pro Ile Gly Gly Thr Gln Ser
130                 135                 140
att cca cag gtc atc aca agt cgg gct aaa att ata gtt ggc cga cag  480
Ile Pro Gln Val Ile Thr Ser Arg Ala Lys Ile Ile Val Gly Arg Gln
145                 150                 155                 160
ata atc ctt gga aaa aca gaa att cga att aag cat gca gaa agg aag  528
Ile Ile Leu Gly Lys Thr Glu Ile Arg Ile Lys His Ala Glu Arg Lys
165                 170                 175
gag tac atg aca gtc gtt tca aga aaa agt tgg cca gct gca act ctt  576
Glu Tyr Met Thr Val Val Ser Arg Lys Ser Trp Pro Ala Ala Thr Leu
180                 185                 190
gga cat agc aaa ctt ttc aag ttt gtg ctc tat gaa gat tgg ggg gga  624
Gly His Ser Lys Leu Phe Lys Phe Val Leu Tyr Glu Asp Trp Gly Gly
195                 200                 205
ttt cga att aaa acg ctg aac acc atg tat tcg ggc tat gag tat gcc  672
Phe Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Met Tyr Ser Gly Tyr Glu Tyr Ala
210                 215                 220 
tat tcc tct gat caa gga gga atc tac ttt gat cag ggt act gat aat  720
Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Gln Gly Thr Asp Asn
225                 230                 235                 240
ccg aaa cag cgc tgg gca atc aat aag tca ttg cct ctt cgt cat ggt  768
Pro Lys Gln Arg Trp Ala Ile Asn Lys Ser Leu Pro Leu Arg His Gly
245                 250                 255
gac gta gtc acc ttc atg aat aag tac ttc act cgc agt ggg ctg tgc  816
Asp Val Val Thr Phe Met Asn Lys Tyr Phe Thr Arg Ser Gly Leu Cys
260                 265                 270
tac gat gat gga ccg gca aca aac gtg tac tgt ctg gac aaa cgt gaa  864
Tyr Asp Asp Gly Pro Ala Thr Asn Val Tyr Cys Leu Asp Lys Arg Glu
275                 280                 285
gac aag tgg att ttg gaa gtg gtt ggt taa                          894
Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Gly 
290                 295
<210> 2
<211> 903
<212> DNA
<213> Eisenia foetida
<400> 2
atg tcg tct aga gca gga atc gca gag gga tat gaa cag ata gaa gta   48
Met Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ala Glu Gly Tyr Glu Gln Ile Glu Val
1               5                  10                  15
gat gtg gtg gca gta tgg aaa gaa ggc tac gtt tac gaa aat cgg gga   96
Asp Val Val Ala Val Trp Lys Glu Gly Tyr Val Tyr Glu Asn Arg Gly
20                  25                  30
agc acc agt gtg gag cag aag atc aaa ata aca aaa ggc atg aga aat  144
Ser Thr Ser Val Glu Gln Lys Ile Lys Ile Thr Lys Gly Met Arg Asn
35                  40                  45
ttg aat tca gaa aca aag aca ttg acg gct tcg cat agt att ggt tct  192
Leu Asn Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Ala Ser His Ser Ile Gly Ser
50                  55                  60
act att agc act gga gat cta ttt gaa ata gca acc gtg gat gtt agc  240
Thr Ile Ser Thr Gly Asp Leu Phe Glu Ile Ala Thr Val Asp Val Ser
65                  70                  75                  80
tac agc tac tca cat gaa gaa tcc caa gtt agt atg acg gaa act gaa  288
Tyr Ser Tyr Ser His Glu Glu Ser Gln Val Ser Met Thr Glu Thr Glu
85                  90                  95
gtt tat gaa tca aag gaa atc gaa cac act ata acg att cca cct act  336
Val Tyr Glu Ser Lys Glu Ile Glu His Thr Ile Thr Ile Pro Pro Thr
100                 105                 110
tca aaa ttc aca aga tgg caa ctg aat gct gac gtt ggt gga gcg gat  384
Ser Lys Phe Thr Arg Trp Gln Leu Asn Ala Asp Val Gly Gly Ala Asp
115                 120                 125
att gaa tac atg tat ttg att gat gaa gtc aca ccc ata gga ggg act  432
Ile Glu Tyr Met Tyr Leu Ile Asp Glu Val Thr Pro Ile Gly Gly Thr
130                 135                 140
ctg agt att cca cag gtc atc aaa agt cgg gct aaa att cta gtt ggc  480
Leu Ser Ile Pro Gln Val Ile Lys Ser Arg Ala Lys Ile Leu Val Gly
145                 150                 155                 160
cga gaa ata tac ctt gga gaa aca gaa att cga ata aag cat gcg gac  528
Arg Glu Ile Tyr Leu Gly Glu Thr Glu Ile Arg Ile Lys His Ala Asp
165                 170                 175
agg aaa gag tat atg aca gtc gtt tca aga aaa agc tgg cca gct gca  576
Arg Lys Glu Tyr Met Thr Val Val Ser Arg Lys Ser Trp Pro Ala Ala
180                 185                 190
act ctt gga cat agc aaa ctt tac aag ttt gtg ctc tat gaa gat atg  624
Thr Leu Gly His Ser Lys Leu Tyr Lys Phe Val Leu Tyr Glu Asp Met
195                 200                 205
tat gga ttt cga att aaa acg ctg aac acc atg tat Tcg ggc tat gag  672
Tyr Gly Phe Arg Ile Lys Thr Leu Asn Thr Mer Tyr Ser Gly Tyr Glu
210                 215                 220
tat gcc tat tcc tct gat caa gga gga atc tac ttt gat cag ggt agt  720
Tyr Ala Tyr Ser Ser Asp Gln Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Gln Gly Ser
225                 230                 235                 240
gat aat ccg aaa cag cgc tgg gca atc aat aag tca ttg cct ctt cgt  768
Asp Asn Pro Lys Gln Arg Trp Ala Ile Asn Lys Ser Leu Pro Leu Arg
245                 250                 255
cat ggt gac gta gtc acc ttc atg aat aag tac ttc act cgc agt ggt  816
His Gly Asp Val Val Thr Phe Mer Asn Lys Tyr Phe Thr Arg Ser Gly
260                 265                 270
ctg tgc tac tat gat gga ccg gca aca gac gtg tac tgt ttg gac aaa  864
Leu Cys Tyr Tyr Asp Gly Pro Ala Thr Asp Val Tyr Cys Leu Asp Lys
275                 280                 285
cgt gaa gac aag tgg att tta gaa gtg gtt aaa ccc taa              903
Arg Glu Asp Lys Trp Ile Leu Glu Val Val Lys Pro 
290                 295                 300
【図１】
2006214731.tif 000013
【図２】
2006214731.tif 000014
【図３】
2006214731.tif 000015