(57)【要約】【課題】  雑菌に汚染されることなく、高倍率の対物レンズを装着した顕微鏡で微小なコロニーを観察することのできる微生物検出用デバイス及びこれを用いた微生物の検出方法を提供すること。【解決手段】  微生物検出用デバイス１０は、光透過性を有する容器本体１と、光透過性を有する蓋体３と、微生物を培養する固形培地５とを備える。容器本体１内には固形培地５が収容されている。固形培地５の表面Ａから容器本体１の底部外表面Ｃ又は前記蓋体３の外表面Ｂまでの距離が３ｍｍ以下である。容器本体１の底部から蓋体３側へ透過する光Ｌの透過率が波長５６０ｎｍにおいて３０％以上である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光透過性を有する容器本体と、
該容器本体内に収容され、微生物を培養する固形培地と、
光透過性を有する蓋体と、
を備え、
前記固形培地の表面から前記容器本体の底部外表面又は前記蓋体の外表面までの距離が３ｍｍ以下であり、
前記容器本体の底部から前記蓋体側へ透過する光の透過率が波長５６０ｎｍにおいて３０％以上である、
微生物検出用デバイス。
【請求項２】
前記固形培地の表面から前記容器本体の底部外表面又は前記蓋体の外表面までの距離が０．２ｍｍ以下である、請求項１記載の微生物検出用デバイス。
【請求項３】
前記蓋体が基材と該基材の少なくとも片面に形成された粘着層とを有する粘着シートである、請求項１又は２に記載の微生物検出用デバイス。
【請求項４】
前記固形培地が天然多糖類を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物検出用デバイス。
【請求項５】
前記固形培地が寒天、カラギーナン及びアルギン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物検出用デバイス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物検出用デバイスに収容されている固形培地に検体を接種して培養し、形成されるコロニーを検出する、微生物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物検出用デバイス及び微生物の検出方法に関し、より詳細には微生物を培養し、形成された微小なコロニーを検出するためのデバイス及びこれを用いる微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物検出用デバイスとして、環境中の雑菌汚染から保護できる蓋付きシャーレ内に固形の平板培地を収容したデバイスが知られている。このデバイスを用いた微生物の検出方法としては、細菌等の微生物を寒天等で賦形した固形の平板培地で至適環境下に培養することにより、形成されたコロニーを肉眼又は顕微鏡で観察し計測する方法が一般的に利用されている。また、この培地の組成を工夫することにより、大腸菌等の特定菌を検出する培地も開発されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特許第２８７９６９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前述したデバイスの固形培地に検体由来の微生物を接種して形成された微小なコロニーを蓋越しに顕微鏡で観察すると、１０倍程度の対物レンズしか使用することができないため、微小なコロニーを判別し難く正確な観察ができないという問題が生ずる。他方、高倍率の対物レンズを装着した顕微鏡でコロニーを観察するには、シャーレの蓋を外して対物レンズを固形培地の表面に近づけて観察する必要があるため、固形培地が雑菌に汚染されやすいという問題が生ずる。
【０００４】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は雑菌に汚染されることなく、高倍率の対物レンズを装着した顕微鏡で微小なコロニーを観察することのできる微生物検出用デバイス及びこれを用いた微生物の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、以下のような知見を得た。すなわち、市販の微生物検出用デバイスとして寒天培地が充填された蓋付きシャーレがあるが、このデバイスの構造は、例えば、シャーレの厚みが１ｍｍ、高さが１５ｍｍ、固形培地の厚みが３〜４ｍｍであり、微生物が増殖する固形培地の表面から蓋の外表面までの距離が１０ｍｍ以上となる。また、高倍率の対物レンズを装着した顕微鏡でコロニーを観察するには、対物レンズの先端をコロニーに近接させる必要がある。そこで、本発明者らはこれらの知見に基づいて顕微鏡による観察条件を詳細に検討したところ、固形培地の表面から容器本体の底部外表面又は蓋体の外表面までの距離を所定値内になるように調整し、かつ顕微鏡で観察するのに十分な光透過性を有するデバイスとすることで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
（１）光透過性を有する容器本体と、該容器本体内に収容され、微生物を培養する固形培地と、光透過性を有する蓋体と、を備え、上記固形培地の表面から上記容器本体の底部外表面又は上記蓋体の外表面までの距離が３ｍｍ以下であり、上記容器本体の底部から上記蓋体側へ透過する光の透過率が波長５６０ｎｍにおいて３０％以上である、微生物検出用デバイス。
（２）上記固形培地の表面から上記容器本体の底部外表面又は上記蓋体の外表面までの距離が０．２ｍｍ以下である、上記（１）記載の微生物検出用デバイス。
（３）上記蓋体が基材と該基材の少なくとも片面に形成された粘着層とを有する粘着シートである、上記（１）又は（２）記載の微生物検出用デバイス。
（４）上記固形培地が天然多糖類を含む、上記（１）〜（３）のいずれか一に記載の微生物検出用デバイス。
（５）上記固形培地が寒天、カラギーナン及びアルギン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、上記（１）〜（４）のいずれか一に記載の微生物検出用デバイス。
（６）上記（１）〜（５）のいずれか一に記載の微生物検出用デバイスに収容されている固形培地に検体を接種して培養し、形成されるコロニーを検出する、微生物の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、微生物検出用デバイスの蓋を取り外して固形培地に対物レンズを近づけることなく、そのまま倍率２０倍以上、更には１００倍以上の対物レンズを装着した顕微鏡で微小なコロニーを観察することができる。したがって、固形培地及び対物レンズの双方とも雑菌に汚染されることなく、簡便かつ高精度でコロニーを検出することの可能な微生物検出用デバイス及び微生物の検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明に係る微生物検出用デバイスの好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、図示の便宜上、図面の寸法比率は説明のものと必ずしも一致しない。
【０００９】
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る微生物検出用デバイスの断面図である。本実施形態に係る微生物検出用デバイス１０は、光透過性を有する容器本体１と、光透過性を有する蓋体３と、微生物を培養する固形培地５とから構成されている。容器本体１内には、固形培地５が充填されている。蓋体３は、固形培地５の表面Ａに近接配置されている。
【００１０】
固形培地５の表面Ａから蓋体３の外表面Ｂまでの距離Ｈは３ｍｍ以下、好ましくは２ｍｍ以下である。また、微生物検出用デバイス１０は、容器本体１の底部から蓋体３側へ透過する光Ｌの透過率が波長５６０ｎｍにおいて３０％以上、好ましくは４０％以上である。このように距離Ｈを３ｍｍ以下、かつ光透過率を３０％以上とすることで、倍率２０倍以上の対物レンズを装着した顕微鏡でも微小コロニーを観察することが可能になる。なお、かかる距離Ｈは、容器本体１、蓋体３の厚みや固形培地５の高さｈで調整することができる。
【００１１】
容器本体１としては、市販されているシャーレや、耐水性があり内部の無菌環境を維持できる容器本体、例えば蓋を装着可能なトレイ等を用いることができる。容器本体１の材質としては光透過性を有するものであれば特に限定されるものではないが、波長５６０ｎｍにおける光透過率が少なくとも３０％以上のものが望ましく、具体的にはガラス、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート等の透明なものが好適である。また、容器本体１の厚みは２ｍｍ以下が好ましく、強度的に問題がなければ更に薄い方がより好ましい。なお、容器本体１の平面形状は特に限定されるものではないが、例えば、円形、略円形、方形、略方形等が挙げられる。また、その大きさも特に限定されないが、微生物を簡易に検出するためには長径が１〜１５ｃｍ程度のものが望ましい。
【００１２】
蓋体３は、環境中の雑菌汚染から固形培地５を保護する機能を有する。蓋体３の材質としては光透過性を有するものであれば特に限定されるものではないが、波長５６０ｎｍにおける光透過率が少なくとも３０％以上のものが望ましく、具体的にはガラス、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート等の透明なものが好適である。また、蓋体３の厚みは１ｍｍ以下が好ましく、強度的に問題がなければ更に薄い方がより好ましい。なお、蓋体３の平面形状は特に限定されるものではないが、容器本体１と同様の平面形状とすることが望ましい。また、蓋体３の大きさは、環境中の雑菌汚染から固形培地５を保護するために十分な大きさとすることが望ましい。
【００１３】
培地５としては、液体の場合には微小なコロニーを形成することが難しいので、天然多糖類を添加して固化させた固形培地とする必要がある。天然多糖類としてはゲル状の培地を形成可能なものであれば特に制限なく使用できるが、例えば寒天、カラギーナン、アルギル酸、ザンサンガム、ローカストビーンガムが挙げられる。なかでも、天然多糖類としては、寒天、カラギーナン及びアルギン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。固形培地５の形成方法としては、天然多糖類の種類に応じて、それぞれに公知の方法を用いることができる。例えば、寒天を使用する場合には、所定濃度の寒天を含有する溶液を加熱後、放冷することにより固形培地を得ることができる。また、アルギン酸を使用する場合には、所定濃度のアルギン酸を含有する溶液をカルシウム塩、鉄塩、アルミニウム塩等の２価又は３価の金属塩溶液に接触させることにより固形培地を得ることができる。固形培地５中の天然多糖類の濃度は、ゲル形成可能な最低濃度以上であれば任意に選択することができ、使用する天然多糖類の種類に応じて適切な濃度を選択すればよい。なお、固形培地５としては、波長５６０ｎｍにおける光透過率が少なくとも３０％以上であれば、微生物培養用の固形培地も使用することができ、また検出する微生物に応じて培地を適宜選択することもできる。
【００１４】
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態に係る微生物検出用デバイスについて説明する。図２は、本実施形態に係る微生物検出用デバイス２０の断面図である。微生物検出用デバイス２０は、光透過性を有する容器本体１と、光透過性を有する蓋体３と、微生物を培養する固形培地５とから構成されている。蓋体３は、基材２と、該基材２の片面に形成された粘着層４とからなる粘着シートで構成されている。固形培地５は容器本体１の側壁上端まで充填されており、固形培地５の表面Ａは蓋体３の粘着層４と密着している。なお、微生物検出用デバイス２０の容器本体１、蓋体３及び固形培地５の構成は、第１実施形態において説明した通りである。
【００１５】
蓋体３としては、例えば、ポリエステル、ポリカーボネート、トリアセチルセルロース、ポリプロピレン等のプラスチックフィルムの片面にアクリル系、ゴム系、シリコーン系等の粘着剤を積層した粘着シートを挙げることができる。蓋体３として粘着シートを使用することで、粘着層４で環境表面に存在する微生物を容易に採取することができる。なお、基材２の厚みは通常１０〜２００μｍ、好ましくは２０〜１００μｍである。また、粘着層４の厚みは通常５〜１００μｍ、好ましくは１０〜６０μｍである。特に、蓋体３を０．２ｍｍ以下の厚みのシートとし、かつ蓋体３の内表面と固形培地５の表面Ａとが接するように固形培地５の高さｈを調整すると、１００倍以上の倍率の対物レンズを装着した光学顕微鏡で微小なコロニーを観察することが可能になる。
【００１６】
上記実施形態においては、固形培地５の表面Ａから蓋体３の外表面Ｂまでの距離が３ｍｍ以下である微生物検出用デバイスについて説明したが、固形培地５の表面Ａから容器本体１の底部外表面Ｃまでの距離が３ｍｍ以下である微生物検出用デバイスとしてもよい。
【００１７】
次に、本発明の微生物検出用デバイスの製造方法について説明する。本発明の微生物検出用デバイス１０は、エチレンオキサイドガス（ＥＯＧ）、電子線又はγ線で予め滅菌した容器本体１に、オートクレーブで滅菌し固化前の培地を無菌環境で充填し固化させた後、容器本体１と同様の方法で滅菌した蓋体３で容器本体１を密閉することにより作製することができる。容器本体１の耐熱性が高ければ固化前の培地を充填した容器本体１ごとオートクレーブで滅菌した後、蓋体３で密閉してもよい。また、培地の種類によっては、特許第２６７２０５３号公報に記載されるように、固形培地５を充填し蓋体３で密閉した後、微生物検出用デバイス１０全体を電離放射線で滅菌することも可能である。なお、粘着シートは、例えば粘着層４を形成するための高分子化合物を含有する溶液を、基材２であるフィルムに直接塗布し乾燥させた後、所定の形状に打抜きくことで製造できる。
【００１８】
次に、本発明の微生物の検出方法について説明する。本発明の微生物の検出方法は、例えば、本発明の微生物検出用デバイスを用いて以下のようにして行う。すなわち、先ず微生物検出用デバイス１０の蓋体３を開けて検体液を固形培地５に塗抹し蓋体３を閉めた後、検出すべき微生物の最適な環境下で培養する。また、蓋体３が粘着シートの場合には、粘着シートで検体表面から微生物を粘着シートの粘着面に転写した後、固形培地５に積層するように粘着シートの蓋体３を閉めることによって微生物を接種し、検出すべき微生物の最適な環境下で培養する。そして、培養終了後又は培養途中に、微生物検出用デバイス１０の蓋体３越しに、あるいは容器本体１の底部Ｃから顕微鏡を用いて位相差等の透過光で観察し、微生物の微小コロニーの観察や測定を行う。なお、微生物には、細菌や放線菌等の原核生物、酵母等の真核生物が包含される。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２０】
（実施例１）
１）微生物検出用デバイスの作製
ＳＣＤ寒天培地顆粒（ペプトン１５ｇ、ダイズペプトン５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ）４０ｇを１Ｌの蒸留水に溶かした後、オートクレーブ滅菌した培地を、予め滅菌処理したポリスチレン製シャーレ（直径９０ｍｍ）に寒天培地の表面からシャーレの蓋外表面までの距離が３ｍｍとなるように注ぎ、固化させた。また、トリアセチルセルロースフィルムの片面にアクリル系粘着剤を積層し、γ線により滅菌処理を施した粘着シート（総厚０．０６ｍｍ）を作製した。そして、粘着シートでシャーレを密閉し、微生物検出用デバイスを作製した。作製した微生物検出用デバイスの特性を表１に示す。なお、微生物検出用デバイスのシャーレの底部から粘着シートを透過する、波長５６０ｎｍの光の透過率については、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−１６０Ａ）を用いて測定した。
【００２１】
（実施例２）
寒天培地の表面からシャーレの蓋外表面までの距離が１．５ｍｍとなるように培地をシャーレに注いだこと以外は、実施例１と同様の方法により微生物検出用デバイスを作製した。作製した微生物検出用デバイスの特性を表１に示す。
【００２２】
（実施例３）
０．５ｍｍ厚のＡ−ＰＥＴを真空成型し加工後、平面形状が５０ｍｍ×５０ｍｍ、深さが３ｍｍの窪みを有し、γ線により滅菌処理した透明トレイに、窪みが埋まるように寒天培地を注ぎ、固化させた。そして、実施例１と同様の方法で作製した粘着シートでトレイを密閉し、微生物検出用デバイスを作製した。作製した微生物検出用デバイスの特性を表１に示す。
【００２３】
（比較例１）
寒天培地の表面からシャーレの蓋外表面までの距離が１０ｍｍとなるように培地をシャーレに注いだこと以外は、実施例１と同様の方法により微生物検出用デバイスを作製した。作製した微生物検出用デバイスの特性を表１に示す。
【００２４】
（比較例２）
寒天培地の表面からシャーレの蓋外表面までの距離が８ｍｍとなるように培地をシャーレに注いだこと以外は、実施例１と同様の方法により微生物検出用デバイスを作製した。作製した微生物検出用デバイスの特性を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2006230304.tif 000003
【００２６】
２）コロニーの計測
ブドウ球菌の培養液を無菌の生理食塩水で希釈した液を、実施例１〜３及び比較例１〜２の微生物検出用デバイスの寒天培地に塗抹後、３７℃で培養し、５〜８時間後、微生物検出用デバイスの蓋を外さずにそのまま位相差顕微鏡（オリンパス株式会社製、ＢＸ５１）の倍率を変えて微小コロニーを観察した。倍率１００倍の対物レンズを用いた観察は油浸して行った。観察結果を表２に示す。なお、表２中、○は微小コロニーを観察できたことを意味し、×は微小コロニーを観察できなかったことを意味する。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
実施例１〜３の微生物検出用デバイスは、倍率２０倍以上の対物レンズでも蓋を外さずにそのままコロニーの観察が可能であった。これにより、環境中の雑菌に汚染されることなく、微生物の検出が可能であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の微生物検出用デバイスの一実施形態を示す断面図である。
【図２】本発明の微生物検出用デバイスの他の実施形態を示す断面図である。
【符号の説明】
【００３０】
１…容器本体、３…蓋体、５…固形培地、１０…微生物検出用デバイス
Ａ…固定培地表面、Ｂ…蓋体外表面、Ｃ…容器本体の底部外表面
Ｌ…透過光
【図１】
2006230304.tif 000005
【図２】
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