(57)【要約】【課題】  ホルモン様作用を示す内分泌撹乱物質を迅速且つ簡便にスクリーニングできる方法を提供する。【解決手段】  本発明に係る内分泌撹乱物質のスクリーニング方法は、スクリーニング対象となった候補物質を神経細胞に接触させる工程と、前記候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態を評価する工程と、前記評価結果に基づいて前記候補物質のホルモン様作用を評価する工程と、を含む方法とする。【選択図】      図１
2006325427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内分泌撹乱物質のスクリーニング方法であって、
スクリーニング対象となった候補物質を神経細胞に接触させる細胞刺激工程と、
前記候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態を評価するスパイン形態評価工程と、を含む
ことを特徴とする内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項２】
前記スパイン形態評価工程において、前記スパインの形態として、前記スパインの立体形状を評価する
ことを特徴とする請求項１に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項３】
前記スパイン形態評価工程において、前記スパインの形態として、前記スパインの頭部の形態とくびれ部の形態とを評価する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項４】
前記スパイン形態評価工程において、前記スパインの形態として、前記スパインの数を評価する
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項５】
前記細胞刺激工程において、前記候補物質を１〜１００ｎＭの濃度範囲で含む溶液中に前記神経細胞を保持することにより、前記候補物質を前記神経細胞に接触させる
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項６】
前記候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態と、前記候補物質を接触させない神経細胞に含まれるスパインの形態と、を比較する工程をさらに含む
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項７】
前記スパイン形態評価工程における評価結果と、スパインの形態に基づき予め決定された分類と、に基づいて、前記スパイン形態評価工程において評価されたスパインの形態を分類する工程をさらに含む
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項８】
前記神経細胞として、動物の脳組織切片に含まれる神経細胞を用いる
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【請求項９】
前記脳組織切片として、海馬領域の切片を用いる
ことを特徴とする請求項８に記載の内分泌撹乱物質スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内分泌撹乱物質をスクリーニングする方法に関し、特に、神経細胞樹状突起のスパインの形態観察に基づくホルモン様作用の評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の発生、成長、代謝等を調節するしくみの一つとして、生体を構成する細胞のうち特定の細胞が血液中に分泌するホルモン（成長ホルモンや性ホルモン等）による内分泌系が知られている。
【０００３】
この内分泌系としては、例えば、卵巣の濾胞細胞が分泌した女性ホルモン（エストロゲン）が血液中を循環し、他の細胞のエストロゲン受容体に結合することによって、当該他の細胞にエストロゲン特有の機能を発現させるしくみ等がある。
【０００４】
このような内分泌系について、ホルモン受容体に対する本来のアゴニストであるホルモンとは異なる物質であるにもかかわらず、当該ホルモン受容体に結合して当該ホルモンと同様の作用（ホルモン様作用）を引き起こす外因性物質が、いわゆる内分泌撹乱物質として問題となることがある。
【０００５】
例えば、いわゆる合成エストロゲンと呼ばれるジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）は、流産の防止の目的で多用された結果、胎児期に暴露された女性の生殖器に遅発性のがん等を発生させることが報告されており、内分泌撹乱物質の一つとして知られている。
【０００６】
このような内分泌撹乱物質としては、ＤＥＳのように既にその内分泌撹乱作用が確認されているものもあるが、未だその内分泌撹乱作用が確認されていない未知の物質も存在すると考えられる。
【０００７】
したがって、このような既知或いは未知の物質によるヒトの健康或いは自然界の生態系への悪影響を防止するために、ホルモン様作用を示す内分泌撹乱物質を特定する必要がある。
【０００８】
そこで、従来、内分泌撹乱物質を特定するために、例えば、動物個体の親世代に候補物質を作用させた場合に、当該候補物質がその子世代の発生過程に与える影響を評価する方法や、候補物質が培養細胞の増殖能力に与える影響を評価する方法等が試みられている（例えば、非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｎｅｗｂｏｌｄ，Ｒ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９，  １６５５−１６６３，  １９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、上記従来の評価方法は、ホルモンの作用経路として、細胞の核内に存在するホルモン受容体を介し、比較的長い時間を経た後に観察される長期的な作用を指標としたものであったため、その結果を得るために長時間を要し、多数の候補物質について評価する場合には、利便性の低いものであった。
【００１０】
さらに、従来、環境省によって内分泌撹乱物質の候補として挙げられていた６７種類の物質について、哺乳類における明確な内分泌撹乱作用が確認されなかったことが報告され、２００４年には、毒性が疑われる約千種類の化学物質の中から新たに内分泌撹乱物質を特定し直すことが発表された。
【００１１】
このため、内分泌撹乱物質の新たなスクリーニング方法の開発が求められている。
【００１２】
本発明は、上記問題に鑑みて為されたものであって、ホルモン様作用を示す内分泌撹乱物質を迅速且つ簡便にスクリーニングできる方法を提供することをその目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記従来の課題を解決するため、本発明の一実施形態に係る内分泌撹乱物質スクリーニング方法は、内分泌撹乱物質のスクリーニング方法であって、スクリーニング対象となった候補物質を神経細胞に接触させる細胞刺激工程と、前記候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態を評価するスパイン形態評価工程と、を含むことを特徴とする。
【００１４】
また、前記スパイン形態評価工程において、前記スパインの形態として、前記スパインの立体形状を評価することとしてもよい。
【００１５】
また、前記スパイン形態評価工程において、前記スパインの形態として、前記スパインの頭部の形態とくびれ部の形態とを評価することとしてもよい。
【００１６】
また、前記スパイン形態評価工程において、前記スパインの形態として、前記スパインの数を評価することとしてもよい。
【００１７】
また、前記細胞刺激工程において、前記候補物質を１〜１００ｎＭの濃度範囲で含む溶液中に前記神経細胞を保持することにより、前記候補物質を前記神経細胞に接触させることとしてもよい。
【００１８】
また、前記候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態と、前記候補物質を接触させない神経細胞に含まれるスパインの形態と、を比較する工程をさらに含むこととしてもよい。
【００１９】
前記スパイン形態評価工程における評価結果と、スパインの形態に基づき予め決定された分類と、に基づいて、前記スパイン形態評価工程において評価されたスパインの形態を分類する工程をさらに含むこととしてもよい。
【００２０】
また、前記神経細胞として、動物の脳組織切片に含まれる神経細胞を用いることとしてもよい。
【００２１】
また、前記脳組織切片として、海馬領域の切片を用いることとしてもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、スクリーニングの対象となった候補物質について、ホルモン様作用を示す内分泌撹乱物質か否か、又はどのようなホルモン様作用を示す内分泌撹乱物質であるか、を迅速且つ簡便に特定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に、本発明の一実施の形態に係る内分泌撹乱物質のスクリーニング方法について、図面を参照しつつ説明する。なお、本発明に係る内分泌撹乱物質スクリーニング方法は、以下に示す例に限られるものではない。
【００２４】
まず、本実施形態に係る内分泌撹乱物質スクリーニング方法（以下、本スクリーニング方法）の概要について説明する。
【００２５】
本スクリーニング方法は、本発明者らによって独自に得られた知見に基づいて為されたものである。すなわち、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、内分泌撹乱物質が、神経細胞の樹状突起に形成されるスパインの形態に変化を生じさせることを新たに見出した。本スクリーニング方法は、この新たな知見に基づき、神経細胞の樹状突起に形成されるスパインの形態の評価に基づいて、内分泌撹乱物質をスクリーニングするものである。
【００２６】
本スクリーニング方法において特長的なことの１つは、内分泌撹乱物質であることが疑われる候補物質を神経細胞に接触させた場合と、接触させない場合と、において、当該神経細胞のスパインの形態にどのような差異が生じるかを評価することによって、当該候補物質が内分泌撹乱物質であるか否か等を評価できることである。
【００２７】
すなわち、本スクリーニング方法によれば、容易に且つ大量に調製できる神経細胞を用い、短時間内でのスパインの形態を評価することにより、無数に存在する候補物質を対象として、内分泌撹乱物質のスクリーニングを迅速且つ簡便に行うことができる。
【００２８】
次に、本スクリーニング方法について具体的に説明する。本スクリーニング方法は、評価対象とする神経細胞を準備する工程と、スクリーニング対象となった候補物質を神経細胞に接触させる細胞刺激工程と、前記候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態を評価するスパイン形態評価工程と、前記スパイン形態評価工程における評価結果に基づいて前記候補物質のホルモン様作用を評価するホルモン様作用評価工程と、を含む。
【００２９】
細胞準備工程においては、本スクリーニング方法に用いる神経細胞として、例えば、所定の組成で調製された溶液中に保持された、生存状態の神経細胞を準備する。この神経細胞としては、ホルモンや内分泌撹乱物質等と接触することによって、その樹状突起のスパインの形態を変化させる神経細胞であれば特に制限されず用いることができ、例えば、ステロイドホルモン（男性ホルモン、女性ホルモン、ストレスホルモン等）や、合成ステロイドホルモン（ＤＥＳ等）等と接触することによって、そのスパインの数や形状を変化させる神経細胞（例えば、ステロイドホルモンに対する受容体を有する神経細胞等）を用いることができる。
【００３０】
具体的に、例えば、動物の脳組織その他の神経組織に含まれる神経細胞、当該神経組織から単離された初代培養神経細胞、樹立された株化神経細胞、又はこれらの神経細胞に遺伝子組み換え操作等の人為的処理を施した神経細胞等を用いることができ、特に、ラットやマウス等の小動物の脳組織に含まれる神経細胞を好適に用いることができる。
【００３１】
脳組織を用いる場合には、神経細胞として、例えば、ビブラトーム等の切片作成装置を用いて脳組織の海馬領域を薄く切り出した海馬切片を好適に用いることができ、特に、脳海馬領域の海馬アンモン角（Ｃｏｒｎｕ  Ａｍｍｏｎｉｓ；ＣＡ）に含まれる錐体細胞や海馬歯状回に含まれる顆粒細胞等を好適に用いることができる。
【００３２】
この脳組織切片の厚さは、顕微鏡等を用いた所定の方法により、当該脳組織切片に含まれる神経細胞のスパインの形態を観察することができれば特に限られないが、例えば、共焦点レーザー顕微鏡や２光子レーザー顕微鏡等を用いた観察によってスパイン形態を評価する場合には、１５０〜４００μｍ程度の範囲の厚さで切り出された脳組織切片を好ましく用いることができ、特に３００μｍ程度のものを好適に用いることができる。これは、脳組織切片の厚さが１５０μｍ程度より小さい場合には、当該脳組織切片に含まれる神経細胞のほとんどが、切片の作製時にその細胞体や樹状突起に大きな損傷を受けたものとなるため、健常組織として用いることが困難となり、また、脳組織切片の厚さが４００μｍ程度より大きい場合には、当該脳組織切片の外部の溶液中から、当該脳組織切片の内部の神経細胞への酸素供給が不十分となり、やはり健常組織として用いることが困難となるためである。
【００３３】
また、単離された神経細胞を用いる場合には、例えば、所定の組成の培養液中、市販のプラスチックディッシュ等の所定の培養基材上で所定期間培養された神経細胞を準備する。
【００３４】
細胞刺激工程においては、細胞準備工程において準備した神経細胞に、スクリーニング対象となった候補物質を所定時間接触させる。具体的に、例えば、この細胞刺激工程においては、細胞準備工程において作製した脳組織切片を、所定濃度の候補物質を含む溶液中に所定時間浸漬することにより、当該脳組織切片に含まれる神経細胞に当該候補物質を接触させる。この場合、脳組織切片を長時間浸漬すると当該脳組織切片に含まれる神経細胞が死滅し始めることがあるため、脳組織切片を浸漬する時間は数時間（例えば、５時間）以内とすることが望ましい。また、この細胞刺激工程においては、例えば、細胞準備工程において培養した神経細胞を所定濃度の候補物質を含む溶液中で所定時間保持することにより、当該神経細胞に当該候補物質を接触させる。この場合、神経細胞を候補物質に接触させる時間は任意に選択することができるが、例えば、候補物質を含む溶液中で神経細胞を数日間培養することができる。
【００３５】
また、例えば、ガラスピペット等を用いて、脳組織切片に含まれる神経細胞や、単離神経細胞の近傍に（すなわち、局所的に）候補物質を含む溶液を噴射することによっても、当該神経細胞に当該候補物質を接触させることができる。
【００３６】
また、この細胞刺激工程においては、動物個体に対して候補物質を投与することにより、当該候補物質を当該動物に含まれる神経細胞に接触させることとしてもよい。この場合、例えば、所定濃度の候補物質を含む溶液をラットやマウス等の小動物の脳室内や腹腔内等に直接注入する。なお、このように神経細胞の採取前に予め動物に候補物質を投与する場合には、上述の細胞準備工程において、例えば、当該投与した候補物質が当該動物の脳に到達した後、当該脳の組織切片等を採取することにより、後述のスパイン形態を観察する対象とする神経細胞を準備する。
【００３７】
候補物質としては、ホルモン様作用を示すか否か、すなわち、内分泌撹乱作用を示すか否かを評価するため、スクリーニングの対象となった物質であれば、特に制限されず用いることができる。すなわち、この候補物質としては、例えば、既に何らかのホルモン様作用を示すことが報告されている物質、化学構造が未知でホルモン様作用を示すことが疑われる物質、化学構造や性質（生体又は神経細胞その他の細胞への作用等）が未知の物質、又はこれらの物質の誘導体等、天然の物質か人工的に合成されたものかを問わず、任意の化合物を用いることができる。
【００３８】
また、この候補物質を含む溶液中において当該候補物質を神経細胞に接触させる場合に、当該候補物質を溶解する溶媒としては、神経細胞の生存状態を維持できるものであれば特に制限されず用いることができ、例えば、適切な浸透圧を示すよう塩類（ナトリウムやカリウム等）の組成や濃度等を調製し、又は神経細胞の代謝に必要な栄養成分（グルコースやアミノ酸類等）の組成や濃度等を調製した水溶液を好適に用いることができる。また、この場合、溶液中に添加する候補物質の濃度としては、生体内においてホルモンが脳内に運ばれる際の血液中の濃度の範囲や、生体内において内分泌撹乱物質がホルモン様作用を示す場合に当該内分泌撹乱物質が脳内に運ばれる際の血液中の濃度の範囲等を用いることができるが、例えば、１００ｎＭ程度以下、特に、１〜１００ｎＭの範囲を好適に用いることができる。なお、内分泌撹乱物質を比較的高い（例えば、１００ｎＭ以上の）濃度で用いた場合には、当該内分泌撹乱物質がホルモン様作用以外の薬物作用を示す場合がある。
【００３９】
また、この細胞刺激工程においては、細胞準備工程において準備した神経細胞のうち、一部の神経細胞に対しては候補物質を接触させる刺激処理を施すとともに、他の一部の神経細胞に対しては当該候補物質を接触させない所定の処理を施すこととしてもよい。
【００４０】
具体的に、例えば、脳組織切片を用いる場合には、細胞準備工程において１のマウス個体の脳組織から切り出した複数の海馬切片のうち、一部の海馬切片については、候補物質を含む溶液（以下、刺激溶液）中に一定時間浸漬する一方で、他の海馬切片については、当該刺激溶液から候補物質のみを除いた（すなわち、候補物質を含まない溶媒のみからなる）溶液（以下、対照溶液）中に一定時間浸漬する。
【００４１】
また、例えば、単離神経細胞を用いる場合には、例えば、動物や組織の由来等に基づく性質や、継代数、培養期間等の培養条件等が同一となるよう調製された培養神経細胞のうち、一部の神経細胞については刺激溶液中で一定時間培養する一方で、他の一部の神経細胞については対照溶液中で一定時間培養する。
【００４２】
なお、この細胞刺激工程において神経細胞を浸漬する溶液は、例えば、所定のポンプ装置等を用いて、当該神経細胞を含む所定の容器内を循環（灌流）させてもよいし、循環させることなく、当該所定容器内にバッチ方式で保持してもよい。
【００４３】
スパイン形態評価工程においては、細胞刺激工程において候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態を評価する。具体的に、このスパイン形態評価工程においては、例えば、所定の観察方法により、神経細胞が有する樹状突起に形成されたスパインの形態として、当該スパインの数や、各スパインの二次元断面形状及び三次元立体形状等を観察し、当該スパインの形態を表すパラメータを評価する。
【００４４】
スパインの評価方法としては、評価対象となった神経細胞に含まれるスパインの形態を特定し、評価できる方法であれば特に限られず用いることができ、例えば、顕微鏡装置を用いた観察方法、特に、共焦点レーザー顕微鏡や２光子レーザー顕微鏡等、各スパインの二次元的又は三次元的な形態を観察することのできる顕微鏡装置を用いた観察方法を好適に用いることができる。
【００４５】
すなわち、共焦点レーザー顕微鏡を用いる場合には、例えば、当該顕微鏡において所定範囲の視野内で観察される神経細胞のスパインを撮影し、その顕微鏡画像を、所定の解析用ソフトウェア等を用いてコンピュータ上で解析することにより、当該顕微鏡画像に撮影されているスパインの形態を定性的及び定量的に評価することができる。
【００４６】
図１に、このスパイン形態評価工程において、顕微鏡下で、神経細胞が有する１つの樹状突起の一部を撮影して取得される顕微鏡画像の一例を示す。図１Ａに示すように、このスパイン形態評価工程においては、例えば、所定範囲の顕微鏡視野内に観察される樹状突起Ｄ（ハッチング部分）と、当該樹状突起から様々な形状で伸び出す複数のスパインＳ１〜Ｓ５と、を撮影した顕微鏡画像を取得し、当該顕微鏡画像内に撮影されているスパインの数を測定する（図１Ａに示す例においては５つとなる）。
【００４７】
また、このスパイン形態評価工程においては、例えば、観察対象となった１以上のスパインのうち少なくとも一部について、各スパインの形状を評価する。図１Ｂに、図１Ａに示す複数のスパインＳ１〜Ｓ５のうち、一点鎖線で示す矩形領域Ｃ内に観察された１つのスパインＳ１に注目した場合の、当該注目スパインＳ１の形状を評価する場合の一例を示す。
【００４８】
図１Ｂに示すように、このスパイン形態評価工程においては、例えば、注目スパインＳ１の先端に比較的大きく膨らんだ頭部Ｐと、当該頭部Ｐと樹状突起Ｄとを連結するように当該樹状突起Ｄから伸び出す細長いくびれ部Ｑと、の各々について、その形状を表すパラメータを評価する。
【００４９】
具体的に、例えば、注目スパインＳ１の頭部Ｐの形状を一点鎖線で示す１つの楕円形状Ｅで近似し、当該頭部Ｐの形状を表す頭部パラメータとして、当該楕円形状Ｅの長径ｔと短径ｗとを測定する。この場合、例えば、頭部パラメータとして、この長径ｔと短径ｗとに基づいて、楕円形状Ｅの面積を、注目スパインＳ１の頭部Ｐの面積として算出することもできる。
【００５０】
また、例えば、注目スパインＳ１のくびれ部Ｑの形状を、一点鎖線で示す２つの長方形Ｒ１，Ｒ２で近似し、当該くびれ部Ｑの形状を表すくびれ部パラメータの一部として、当該各長方形Ｒ１，Ｒ２の長さｈ１，ｈ２や太さｕ１，ｕ２を測定する。この場合、例えば、くびれ部パラメータとして、くびれ部Ｑの樹状突起Ｄ側の部分を近似した長方形Ｒ１と当該樹状突起Ｄとのなす角度θを求めることもできる。
【００５１】
また、他のパラメータとして、例えば、頭部Ｐの長径ｔと、各長方形Ｒ１，Ｒ２の長さｈ１，ｈ２と、を合算した長さＬを、注目スパインＳ１の全長として算出することもできる。なお、これら注目スパインＳ１の全体又は頭部Ｐやくびれ部Ｑ等の各部分の形状を近似するための図形の形状や数は任意に設定することができる。
【００５２】
また、このスパイン形態評価工程においては、例えば、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、図１Ｂに示す注目スパインＳ１の厚さ方向について、所定間隔で、図１Ｂに示すような二次元断層画像を複数取得した場合には、当該複数の二次元断層画像に基づいて、当該注目スパインＳ１の立体形状に係るパラメータを評価することもできる。
【００５３】
すなわち、この場合、例えば、コンピュータ上において、所定のソフトウェアを用い、複数の二次元断層画像を再構成した三次元立体画像を作成し、当該三次元立体画像に基づいて、注目スパインＳ１の全体又は頭部Ｐやくびれ部Ｑの厚さや体積等を表す三次元形状パラメータを評価することができる。
【００５４】
また、このスパイン形態評価工程においては、細胞刺激工程において候補物質を接触させられていない神経細胞についても、そのスパインの形態を評価することとしてもよい。すなわち、この場合、例えば、細胞刺激工程において対照溶液中に浸漬された、すなわち対照処理を施された神経細胞について、スパインの形態を評価する。
【００５５】
また、例えば、細胞刺激工程において刺激処理又は対照処理のいずれの処理も施されていない（すなわち無処理の）神経細胞について、スパイン形態の評価を行ってもよい。なお、このスパイン形態評価工程においては、対照処理を施された神経細胞と、無処理の神経細胞と、の両方についてスパインの形態評価を行ってもよいし、いずれか一方のみについてスパインの形態評価を行ってもよい。
【００５６】
また、このスパイン形態評価工程においては、例えば、特定の神経細胞について、まず候補物質を接触させない状態でスパインの形態を評価し、その後、当該神経細胞に対して候補物質を接触させ、さらに、当該候補物質を接触させた後の当該神経細胞について、再度スパインの形態を評価することとしてもよい。
【００５７】
すなわち、この場合、このスパイン形態評価工程においては、例えば、１つの海馬切片について、まず、無処理の状態で、又は対照溶液に浸漬した後に、スパインの形態を評価する。そして、この評価後の海馬切片を刺激溶液中に浸漬し、当該浸漬後に、当該海馬切片について、スパインの形態を評価することにより、候補物質に接触させる前後に亘ってスパインの形態を評価することとなる。
【００５８】
また、このスパイン形態評価工程においては、スパインの形態評価に先立って、評価の対象とする神経細胞を、所定の染色方法により、染色しておいてもよい。この場合、例えば、カレントインジェクション（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）法やマイクロインジェクション法等、細胞内に蛍光色素を直接注入する方法を用いて、予め神経細胞の樹状突起やスパインを染色する。
【００５９】
また、例えば、神経細胞を、所定の蛍光色素を所定の濃度で含む溶液中に浸漬することにより、当該神経細胞の細胞質内、樹状突起内、及びスパイン内に当該蛍光色素を蓄積させ、又は当該神経細胞の樹状突起やスパインの細胞膜に当該蛍光色素を物理的又は化学的に結合させることにより、当該樹状突起やスパインを染色することとしてもよい。
【００６０】
なお、この染色は、生きた神経細胞に対して行ってもよいし、所定の保存処理を施された神経細胞に対して行ってもよい。保存処理を行う場合には、例えば、ホルムアルデヒド溶液やエタノール溶液等の所定の保存処理溶液中に神経細胞を一定時間浸漬することにより、当該神経細胞を固定する。ただし、後にさらに刺激処理等を施す場合等、生きた神経細胞を用いる必要がある場合には、このような保存処理を経ていない神経細胞を染色する。
【００６１】
ホルモン様作用評価工程においては、スパイン形態評価工程におけるスパイン形態の評価結果に基づいて、細胞刺激工程で用いられた候補物質のホルモン様作用を評価する。すなわち、このホルモン様作用評価工程においては、スパイン形態評価工程において取得されたスパインの数や形状等を表すパラメータに基づいて、当該神経細胞に接触させた候補物質がホルモン様作用を示すか否か、又は当該候補物質がどのようなホルモン様作用を示す物質であるかを評価する。
【００６２】
具体的に、このホルモン様作用評価工程においては、例えば、スパイン形態評価工程において取得したスパイン形態を表すパラメータ値が所定の条件を満たすか否かを判断し、当該判断結果に基づいて、候補物質のホルモン様作用を評価する。
【００６３】
この場合、例えば、スパイン形態評価工程において測定したスパインの数を、所定数の神経細胞あたり、所定数の樹状突起あたり等の所定単位あたり（この所定単位は任意に設定することができる）に換算したスパイン密度を算出する。
【００６４】
また、この場合、例えば、算出されたスパイン密度が、予め定められたスパイン密度閾値の範囲内か否かを判断し、当該スパイン密度が当該スパイン密度閾値の範囲外であれば、当該スパイン密度に係る神経細胞に接触させた候補物質はホルモン様作用を示す、すなわち内分泌撹乱物質であると判断する。
【００６５】
また、このホルモン様作用評価工程においては、例えば、スパイン形態評価工程において取得された各スパインの二次元形状又は三次元形状を表すパラメータの値（例えば、図１Ｂに示す例における頭部Ｐの長径ｔ、くびれ部Ｑの長さｈ１，ｈ２や注目スパインＳ１の全長Ｌ等）が予め定められた閾値範囲内か否かを判断し、当該判断結果に基づいて、当該各スパインに係る神経細胞に接触させた候補物質がホルモン様作用を示すか否かを評価する。
【００６６】
また、このホルモン様作用評価工程においては、例えば、予めスパインの形態に基づき決定された分類と、スパイン形態評価工程における評価結果と、に基づいて、候補物質のホルモン様作用を評価することとしてもよい。
【００６７】
この場合、例えば、スパイン形態評価工程において評価された各スパインが、予めスパインの形状を表すパラメータの値に基づいて定められているスパインの分類において、いずれのタイプに属するかを判断し、当該判断結果に基づいて、当該各スパインを含む神経細胞に接触させた候補物質がホルモン様作用を示すか否か、又は当該候補物質がどのようなホルモン様作用を示すものであるか、等を判断することができる。
【００６８】
このスパインの分類は、例えば、各スパインの頭部Ｐの形状を表すパラメータと、くびれ部Ｑの形状を特定するパラメータと、がそれぞれ所定の条件を満足するか否かに基づいて行うことができる。
【００６９】
具体的に、このスパイン形態評価工程においては、例えば、図２に示すように、スパインの頭部Ｐの面積ａが所定の面積閾値Ｍ以上か否か、くびれ部Ｑの長さｈが所定の長さ閾値Ｎ以上か否か、に基づいて、スパインを複数のタイプ１〜４に区別した分類を用いることができる。
【００７０】
この場合、例えば、図１Ａに示すような１つの顕微鏡画像内に含まれる複数のスパインＳ１〜Ｓ５の各々について、その頭部面積ａとくびれ部長さｈとが、図２に示す各タイプに関連付けられているいずれの条件を満たすかを判断し、当該各スパインを、図２に示す複数のタイプ１〜４のうち、当該各スパインが満たす条件に関連付けられているタイプに分類する。
【００７１】
すなわち、例えば、注目したスパインについて、その頭部面積ａが面積閾値Ｍ以上であり、且つくびれ部長さｈが長さ閾値Ｎ以上であるという条件を満たす場合には、当該注目スパインは、図２に示すタイプ１〜４のうち、当該条件に関連付けられているタイプ１に属すると判断される。
【００７２】
そして、このホルモン様作用評価工程においては、例えば、所定のタイプに分類されたスパインの数や密度が予め定められた条件を満たすか否か（例えば、予め定められた閾値以上であるか否か等）を判断し、当該判断結果に基づいて、候補物質のホルモン様作用を評価することとしてもよい。この場合、このホルモン様作用評価工程においては、神経細胞に含まれる様々な形状のスパインのうち、特定の形状のスパインについて評価することができ、例えば、当該特定の形状のスパインの数や密度を選択的に変化させる作用を示す内分泌撹乱物質を特定することができる。
【００７３】
また、このホルモン様作用評価工程においては、例えば、候補物質を接触させた神経細胞に含まれるスパインの形態と、候補物質を接触させない神経細胞に含まれるスパインの形態と、を比較し、当該比較結果に基づいて、当該候補物質のホルモン様作用を評価することしてもよい。
【００７４】
すなわち、このホルモン様作用評価工程においては、例えば、候補物質を含む刺激溶液中に一定時間浸漬された刺激処理後の神経細胞について取得されたスパインの形態を表すパラメータと、当該刺激溶液から候補物質のみを除いた対照溶液中に一定時間浸漬された対照処理後の神経細胞について取得されたスパインの形態を表すパラメータと、の差異を評価し、当該差異に基づいて、当該候補物質がホルモン様作用を示すか否か又は当該候補物質がどのようなホルモン様作用を示すか等を評価する。
【００７５】
具体的に、この場合、ホルモン様作用評価工程においては、例えば、１のマウス個体の脳組織から切り出した複数の海馬切片のうち、刺激処理を施された一部の海馬切片に含まれるスパインの数又は密度と、対照処理を施された他の一部の海馬切片に含まれるスパインの数又は密度と、の差分や比率等（すなわち、スパイン数の増減数又は増減率等）を評価し、当該差分や比率等が予め定められた閾値範囲外である場合には、当該刺激処理に用いた候補物質はホルモン様作用を示すと判断する。
【００７６】
また、例えば、図２に示すような分類が予め定められている場合には、刺激処理を施された海馬切片と、対照処理を施された海馬切片と、の間で、当該分類に含まれる各タイプのスパインの数や密度の差分や比率等を評価し、特定のタイプに属するスパインについての当該差分や比率等が所定の閾値以上である場合には、当該刺激処理に用いた候補物質はホルモン様作用を示すと判断する。
【００７７】
なお、このホルモン様作用評価工程において参照されるスパインの分類は、図２に示すものに限られず、例えば、スパインの頭部Ｐの径（例えば、長径ｔ若しくは短径ｗのいずれか、又は長径ｔと短径ｗとの算術平均値等）や面積ａと、くびれ部Ｑの長さ（図１Ｂにおける長さｈ１と長さｈ２との合計長さ）と、の比率を算出し、当該比率が所定の比率閾値以上であるか否かに基づいて規定される分類等を用いることもできる。
【００７８】
また、図２に示すスパインの形態の分類や、パラメータの評価に用いる所定の閾値等は、例えば、本スクリーニング方法又は本スクリーニング方法と同様の方法を用いて、ステロイドホルモン等の既知のホルモンや、ＤＥＳ等のホルモン様作用を示す内分泌撹乱物質を接触させた神経細胞において生ずるスパインの形態の変化を評価することにより、予め定めることができる。
【００７９】
このように、本スクリーニング方法によれば、スクリーニングの対象となった候補物質が、ホルモン様作用を示すか否かのみならず、例えば、神経細胞のどのようなホルモン受容体に作用するのか、神経細胞にどのような生理学的変化をもたらすのか等、当該候補物質が示すホルモン様作用の詳細な特徴を特定することもできる。
【００８０】
次に、本スクリーニング方法を用いて内分泌撹乱物質のホルモン様作用を評価した一例について説明する。本実施例に係る細胞準備工程においては、ビブラトーム（ＤＳＫ  ＺＥＲＯ１、堂阪イーエム株式会社製）を用いて、成獣ラットの脳海馬を、その長軸に対して垂直に切断し、厚さ３００μｍの長軸横断切片を複数作製した。
【００８１】
本実施例においては、得られた複数の海馬切片のうち、一部の海馬切片を、候補物質と接触させる刺激処理グループとして、他の一部の海馬切片を、候補物質を接触させない対照処理グループとして、それぞれ準備した。
【００８２】
これらの海馬切片は、酸素・二酸化炭素混合ガス（９５％酸素ガス、５％二酸化炭素ガス）で十分に飽和させた人工脳脊髄液中に浸漬し、室温で１時間以上静置した後に、後述の工程に用いた。
【００８３】
なお、この人工脳脊髄液としては、１２４ｍＭのＮａＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２２ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのＧｌｕｔａｍｉｎを含む水溶液を用いた。
【００８４】
細胞刺激工程においては、細胞準備工程で作製した海馬切片のうち、刺激処理グループとした海馬切片を、ジメチルスルフォオキシド（ＤｉＭｅｔｈｙｌ  ＳｕｌｆＯｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）に溶解した候補物質を含む刺激処理用の人工脳脊髄溶液中に２時間浸漬するとともに、対照処理グループとした海馬切片を、ＤＭＳＯのみを含み当該候補物質を含まない対照処理用の人工脳脊髄溶液中に２時間浸漬した。
【００８５】
候補物質としては、エストラジオール（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ；Ｅ２）、ビスフェノールＡ（ＢｉｓＰｈｅｎｏｌ  Ａ；ＢＰＡ）、又はＤＥＳを用い、刺激処理用及び対照処理用の人工脳脊髄溶液としては、予め上記酸素・二酸化炭素混合ガスで十分に飽和させたものを用いた。刺激処理用人工脳脊髄溶液中に含まれる候補物質の濃度は、Ｅ２については１ｎＭ、ＢＰＡについては１０ｎＭ、ＤＥＳについては１ｎＭとした。
【００８６】
スパイン形態評価工程においては、まず、細胞刺激工程において刺激処理を施された刺激処理グループに係る海馬切片と、対象処理を施された対照処理グループに係る海馬切片と、をそれぞれの処理後速やかに４％（ｖ／ｖ）パラフォルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ（−））に浸漬し、４℃で２〜４時間保存することにより固定した。
【００８７】
そして、この固定した海馬切片を、４０倍水浸レンズ(開口数（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ；ＮＡ）０．８、Ｎｉｋｏｎ)を備えた正立顕微鏡（Ｅ６００ＦＮ、Ｎｉｋｏｎ）、赤外線カメラ(Ｃ２４００−７９Ｈ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）、水圧式カレントインジェクション用マニピュレータ（三次元水圧式マニピュレータＭＨＷ−３、ナリシゲ社製）、パッチクランプ装置（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ、Ａｘｏｎ  ＩＮｓｔｒｕｍｅｎｔ）等を含むカレントインジェクション装置を用いたカレントインジェクション法により蛍光染色した。
【００８８】
すなわち、まず、マニピュレータに固定されたガラス電極の内部に、脱イオン蒸留水（Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ；ＤＤＷ）に５％（ｗ／ｖ）Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗを添加した染色溶液を充填した。なお、このガラス電極は、マイクロピペット・プラー（Ｐ−８７、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、その先端径が約１μｍとなるよう作製したものを用いた。
【００８９】
そして、染色対象とする海馬切片を正立顕微鏡の試料台に設置し、当該海馬切片を赤外線カメラで観察しながら、当該海馬切片に含まれる神経細胞のうちから標的とする神経細胞を特定し、マニピュレータを操作して、当該標的神経細胞にガラス電極の先端を刺し込んだ。
【００９０】
それから、パッチクランプ装置を動作させて、標的神経細胞に刺し込んだガラス電極に、−１０ｎＡの直流電流を１５分間流して、負に帯電したＬｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ蛍光色素をガラス電極から当該標的神経細胞内へ移行させることにより、当該標的神経細胞を染色した。
【００９１】
なお、この染色処理においては、海馬切片の表面（ビブラトームにより形成された断面）から１００〜２００μｍの深さに存在する神経細胞のうち、１つの海馬切片あたり約５個の神経細胞を特定し、当該各標的細胞に蛍光色素を注入した。
【００９２】
また、このように蛍光色素により標識した標的神経細胞を含む海馬切片を、４％パラフォルムアルデヒドＰＢＳ（−）溶液に浸漬して４℃で一晩保存し、さらにＰＢＳ（−）で洗浄した後、スパイン形態の評価に用いるまで４℃でＰＢＳ（−）中に浸漬した状態で保存した。
【００９３】
次に、共焦点レーザー顕微鏡（ＭＲＣ−１０２４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と解析用ソフトウェア（Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ、ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ）とを用いて、上述の前処理工程において蛍光染色された標的神経細胞に含まれるスパインの形態を評価した。
【００９４】
すなわち、標的神経細胞に注入した蛍光色素Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗの観察に適した励起用フィルター（４８８ｎｍ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）及びバンドパスフィルター（５１５ｎｍ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）と、６０倍油浸レンズ（ＮＡ１．４、Ｎｉｋｏｎ）と、を備えた共焦点レーザー顕微鏡の試料台に標的神経細胞を含む海馬切片を設置し、当該海馬切片の厚さ方向（すなわち、試料台表面（ｘｙ平面）に対して垂直なｚ軸方向であって、当該海馬切片の表面に対して略垂直な方向）に、０．５μｍの間隔でずらした各焦点位置でデジタル断層撮影を行い、各海馬切片について複数の二次元画像切片を取得した。
【００９５】
なお、本実施例においては、ｘｙ平面の分解能が約０．１８μｍの共焦点レーザー顕微鏡において２倍ズームを使用したため、１μｍあたり１２．０ピクセル（ｐｉｘｅｌ）となる二次元断層画像を取得した。また、ｚ軸方向の分解能は０．３４μｍであり、断層撮影は上述のように０．５μｍ間隔で行ったため，海馬切片に含まれるスパインの形態（密度や形状等）を十分に観察することができた。
【００９６】
また、このスパイン形態評価工程においては、各海馬切片に含まれる標的神経細胞のうち、１細胞あたり１００個以上のスパインを有する２〜３個の標的神経細胞を評価対象として特定した。そして、各海馬切片において、評価対象として特定した標的神経細胞のスパインが１つの顕微鏡視野あたり（すなわち、１断層画像あたり）５０個以上観察される領域（すなわち、５０個以上のスパインが形成されている樹状突起が観察される海馬領域）を解析対象として特定し、各標的神経細胞について、その厚さ方向に少なくとも３つ以上の断層画像を取得した。
【００９７】
さらに、このスパイン形態評価工程においては、このように取得された各蛍光画像に含まれるスパインの形態を、コンピュータ上で解析用ソフトウェアを用いて評価した。すなわち、各海馬切片の海馬アンモン角ＣＡ１領域に含まれる標的神経細胞の放線状層（放射状層）（Ｓｔｒａｔｕｍ  Ｒａｄｉａｔｕｍ、細胞体から１００〜２００μｍ程度離れた領域）に注目し、当該放線状層に存在する樹状突起に形成されたスパインの数や形状を評価した。
【００９８】
具体的に、例えば、評価対象とした樹状突起において１回分岐した長さ３０〜１００μｍの枝部分（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｅ）に形成されているスパインの数を測定し、当該枝部分のながさ１μｍあたりのスパイン密度を算出した。
【００９９】
また、スパインの数に加えて、各樹状突起について複数取得された二次原画像から再構成した三次元再構築画像に基づいて、当該各樹状突起やその枝部分において各スパインが形成されている位置、各スパインの全体又は一部の形状を表すパラメータ（例えば、図１Ｂに示す頭部Ｐやくびれ部Ｑの長さや太さ等）を評価した。
【０１００】
ホルモン様作用評価工程においては、スパイン形態評価工程において評価したスパイン密度に基づいて、細胞刺激工程において用いた各候補物質のホルモン様作用を評価した。図３に、細胞刺激工程において、Ｅ２、ＢＰＡ又はＤＥＳのいずれか１つを候補物質として神経細胞に接触させた刺激処理グループと、当該候補物質を神経細胞に接触させなかった対照処理グループと、について、スパイン形態評価工程において取得された、樹状突起の１μｍあたりのスパイン密度（図３の縦軸）を示す。
【０１０１】
図３に示すように、対照処理グループのスパイン密度（すなわち、候補物質の溶媒であるＤＭＳＯのみを添加し、混合ガスで十分に飽和させた人工脳脊髄液中に２時間静置した後の神経細胞のスパイン密度）は、０．８５個と算出された。
【０１０２】
これに対し、刺激処理グループのスパイン密度（すなわち、候補物質を溶解したＤＭＳＯを添加し、混合ガスで十分に飽和させた人工脳脊髄液中に２時間静置した後の神経細胞についての樹状突起１μｍあたりのスパイン密度）は、候補物質としてＥ２を接触させた神経細胞について１．３１個、ＢＰＡを接触させた神経細胞について１．５５個、ＤＥＳを接触させた神経細胞について１．３８個、とそれぞれ算出された。
【０１０３】
すなわち、このホルモン様作用評価工程において、候補物質としてＥ２、ＢＰＡ、ＤＥＳを接触させた神経細胞のスパイン密度は、候補物質を接触させない神経細胞のスパイン密度に対して、それぞれ１．５倍、１．８倍、１．６倍と増加していることが確認された。
【０１０４】
また、このホルモン様作用評価工程においては、スパイン形態評価工程において評価したスパイン形状のパラメータに基づいて、スパインの分類を行った。すなわち、このホルモン様作用評価工程においては、図４に示すように、（１）タイプI（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｔｙｐｅ）：大きな頭部Ｐとくびれ部Ｑとをもつスパイン（その頭部Ｐの直径ｄが０．６μｍ以上で、そのスパインの全長Ｌは当該頭部Ｐの直径ｄの２倍未満、すなわち、ｄ＞０．６μｍ且つＬ＜２ｄの条件を満たす形状のスパイン）、（２）タイプII（Ｔｈｉｎ  ｔｙｐｅ）：くびれ部Ｑをもつが、頭部Ｐは比較的小さいスパイン（すなわち、ｄ＜０．６μｍ且つＬ＞２ｄの条件を満たす形状のスパインであって、くびれ部Ｑをもつが、Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｔｙｐｅ以外のスパイン）、（３）タイプIII（Ｆｉｌｏｐｏｄｉｕｍ  ｔｙｐｅ）：長い糸状突起でくびれ部Ｑをもたず、全長Ｌはスパインの頭部Ｐの直径ｄに比べて極めて大きいスパイン）、（４）タイプIV（Ｓｔｕｂｂｙ  ｔｙｐｅ）：くびれ部Ｑをもたず、頭部Ｐの直径ｄと全長Ｌとが同じくらいのスパイン）、の４つのタイプにスパインを分類した。なお、この頭部Ｐの直径ｄとしては、くびれ部Ｑの長軸方向中心線の頭部Ｐへの延長線に直交する当該頭部Ｐの径（図１Ｂに示す頭部Ｐの短径ｗに相当）を用いた。
【０１０５】
このスパイン分類に基づいた評価の結果、Ｅ２、ＤＥＳ又はＢＰＡを接触させたいずれの刺激処理グループについても、図４に示す４つのタイプのうち、特にタイプIIに分類される形態のスパインの数が、対照処理グループに比較して顕著に増加していた。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の一実施形態に係るスクリーニング方法におけるスパイン形態の評価の一例を示す説明図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るスクリーニング方法におけるスパインの分類の一例を示す説明図である。
【図３】本発明の一実施形態に係るスクリーニング方法において撮影されたスパインの画像の一例を示す。
【図４】本発明の一実施形態に係るスクリーニング方法におけるスパインの形態の評価結果の一例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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