(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスホジエステラーゼ中に毒素によって生じる活性化に基づいて魚介類のyessotoxins（ＹＴＸｓ）を検出するための方法の提供。【解決手段】yessotoxin（ＹＴＸ）及びその類似物（ＹＴＸｓ）の細胞標的はホスホジエステラーゼ（ＰＤＥｓ）により活性化され、ＰＤＥｓ−ＹＴＸ結合は測定可能なシグナルを生成する。ＰＤＥｓを用いた親和性バイオセンサー又は蛍光によって結合を定量することができるので、当該バイオセンサーは生体分子の相互作用を検出し、そのＰＤＥｓとの相互作用のためにＹＴＸの存在を検出することができる。【選択図】図２
2006325580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ホスホジエステラーゼ中に毒素によって生じる活性化に基づいて魚介類のyessotoxins（ＹＴＸｓ）を検出するための定量方法であって、さらに、yessotoxin（ＹＴＸ）及びその化学的な類似物（ＹＴＸｓ）の活性化作用の、ＹＴＸｓ又は同様の活性の化合物を検出するための定量方法でのホスホジエステラーゼ活性についての使用を特徴とする方法。
【請求項２】
ＰＤＥｓとのＹＴＸ活性化に基づいて請求項１に記載された魚介類のＹＴＸｓを検出するための方法であって、２０〜３７℃の温度範囲でエバネセンス効果によって定量可能な分子間相互作用を生成することができる平坦又はマトリクスの支持体表面に結合するリガンドとしてＰＤＥｓを用いる親和性バイオセンサーの使用であり、レセプターとして機能するＹＴＸｓが添加され、見かけのＹＴＸ−ＰＤＥ結合率（Ｒａｐ）が得られる擬似−一次速度式にこの結合を当てはめることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載された魚介類のＹＴＸｓを検出するための方法であって、既知の濃度のＹＴＸｓの見かけの結合率の決定、及び見かけの結合率が既知である魚介類抽出物のテストサンプルでＹＴＸ濃度を計算する較正線の準備であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載された魚介類のＹＴＸｓを検出するための方法であって、ＰＤＥ活性蛍光による検出であり、類似のｃＡＭＰ蛍光基質を用い、既知の濃度のＹＴＸで得られる前記蛍光基質の破壊率で準備された較正線から魚介類サンプルのＹＴＸ濃度を計算することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載された魚介類のＹＴＸｓを検出するための方法であって、前記検出が基質としてアントラニロイル−ｃＡＭＰを用いるＰＤＥ活性蛍光によることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載された魚介類のＹＴＸｓを検出するための方法であって、ＹＴＸがＰＤＥｓに結合するときに生じる偏光蛍光、その結果偏光ユニットの強度の変化を決定することを特徴とする方法。
【請求項７】
２、３又は６に記載された魚介類のＹＴＸｓを検出するための方法の、天然又は合成化学化合物でのＹＴＸに等価な活性（ＰＤＥ活性化）を検出するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、in vitroでのyessotoxinsの検出と定量について、これらの毒素の細胞標的の１つであるホスホジエステラーゼ酵素を活性化するための能力に関して開示する。
【背景技術】
【０００２】
海のphycotoxinsは深刻な公衆衛生問題を現す藻類によって生成される物質である。これらの毒素は、軟体動物と魚に蓄えられ、人間によって摂取されるときに食中毒をもたらす。phycotoxinの分類は、それらがもたらす中毒のタイプに関して、５つの大きなグループでなされる。麻痺毒素（ＰＳＰ）、下痢毒（ＤＳＰ）、神経毒（ＮＳＰ）、シガテラ毒（ＣＦＰ）及び健忘毒（ＡＳＰ）である（Van Dolah, F.M., 2000, Seafood and freshwater toxins: pharmacology, physiology and detection, 19-44）。異なる徴候をもたらし、先のグループに含まれないphycotoxinsの他のグループがあり、それらは、pectenotoxins（ＰＴＸｓ）、azaspiracids及びyessotoxins（ＹＴＸｓ）である（Van Dolah, F.M., 2000, Seafood and freshwater toxins: pharmacology, physiology and detection, 19-44）。まず、ＰＹＸｓとＹＴＸｓは、通常中毒症状で共存する親油性毒素であるため、ＤＳＰｓでグループ分けされた。しかし、それらは下痢を誘発しないで、経口毒性が低く、分子が異なるため、ここ１０年で、異なるグループとして考えられてきた（Draisci, R., Lucentini, L. など, 2000, Seafood and freshwater toxins: pharmacology, physiology and detection, 289-324）。これらの最後のグループ内で、yessotoxins（以下、ＹＴＸｓ）は、最近の偏在した存在のため、またそれらを検出するための精密で特定の方法が存在しないため、深刻な経済問題を提供する。
【０００３】
ＹＴＸｓは日本、ヨーロッパ、ニュージーランド及びチリで検出されており、それらは渦鞭毛藻のProtoceratium reticulatumとLingulodinium polyedrum（Gonyaulax polyedra）によってもたらされる。これらの毒素は、海洋軟体動物内に蓄積され、熱に安定であり、したがって、それらは海産物の調理の間、破壊されない。それらの消化管からの吸収は低く、したがって、それらは経口時の毒性はない。ただし、ラットのＹＴＸｓの経口投与の後、組織病理学的な修飾が肝臓とすい蔵で検出された（Terao, K.,Ito, E. など, 1990, Toxicon, 28, 1095-1104）。しかし、腹腔内投与の後、これらの毒素は重要な心臓毒性の影響を引き起こして、高い致死力を示す（Draisci, R., Lucentini, L. など, 2000, Seafood and freshwater toxins: pharmacology, physiology and detection, 289-324）。すでに述べたように、ＹＴＸｓはＤＳＰ毒と共存し、また、バイオアッセイにおいて後者を検出するときにそれらは偽陽性を検出することにつながる干渉をもたらすかもしれないため、これらの腹膜内の影響は考慮されなければならない。この理由から、これらの毒素の存在をモニターするために魚介類の抽出物を準備するときに、ＹＴＸｓとＤＳＰ毒を分離する有機溶剤で付随的な抽出を実行する必要がある。ただし、これらの修飾は、偽陽性を引き起こすかもしれない大量の脂肪酸の抽出を示す（Yasumoto, T., Murata, M. など, 1984, ACP Symp. Series. No 262. Seafood toxins., 207-214）。
【０００４】
海産物の抽出物由来のサンプル内のphycotoxinsの検出方法は、分析評価方法と分析方法で分類される。分析評価方法では、サンプル内に存在する全ての毒素の活性を含む一つの生物学的又は生化学的な反応を測定することによって総毒素含有量の値を提供する。分析方法では、装置の反応に関してサンプル内の毒素の分離、識別及び個々の定量が実行される。最初のものには、ラット又はマウスのin vivoの分析評価、及びin vitroの分析評価が含まれ、それらの中では、酵素抑制分析評価、細胞分析評価、レセプター分析評価などを強調しなければならない。これらのケースでは、毒素の検出は各グループの代表的な毒素のうち１つで得られる容量反応曲線に関して実行される。比色分析、蛍光分析、発光、偏光蛍光方法によって、又はバイオセンサーでリアルタイムにリガンド−レセプターの相互作用を決定することによって、その他の間で反応の定量を実行する。第２のものはin vitroの分析評価であり、各毒素の既知の濃度の標準で装置の機器の事前の較正を必要とする。これらの分析評価に含まれる化学方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析又はキャピラリー電気泳動などである。一般的に、サンプル内に存在する毒素のそれぞれを特定及び定量することが必要なときには、装置的な化学方法が用いられる。しかし、モニタリング又は健康検査プログラムでは、より多くの関連性を潜在的な全体の毒素の知識に与え、したがって、機能的方法とも称される分析評価方法を用いる（Fernandez, M. L., Miguez, A. ほか, 2002, Floraciones algales nocivas en el cono sur americano）。
【０００５】
汚染された軟体動物でＹＴＸｓを検出するために、いくつかの液体クロマトグラフィー質量分析（Draisci, R., Palleschi, L. ほか, 1999, J Chromatogr A, 847, 213-221、 Goto, H., Igarashi, T. ほか, 2001, J Chromatogr A, 907, 181-189）と蛍光ＨＰＬＣ（Ramstad, H., Larsen, S. ほか, 2001, Toxicon, 39, 1393-1397、 Yasumoto, T. と Takizawa, A., 1997, Biosci Biotechnol Biochem, 61, 1775-1777）分析方法がある。これらの毒素を検出するためにin vitroの機能的な分析評価の範囲内で最近２つのものがあり、Ｅ−カドヘリン検出分析評価（Pierotti, S., Malaguti, C. ほか, 2003, Anal Biochem, 312, 208-216; Rossini, G.P., 2002, International Application published under the patent cooperation treaty.）とカスパーゼ活性分析評価（Malaguti, C., Ciminello, P. ほか, 2002, Toxicol in Vitro, 16, 357-363）である。しかしながら、２００２年３月１５日の委員会決定2002/225/EECによれば、唯一の公式に認められた方法はマウス生物検定である。この決定によれば、軟体動物サンプルのＹＴＸｓの最大値は、軟体動物の生鮮食品のＫｇあたり１ｍｇのＹＴＸｓである。生物検定は、２４時間、３匹のマウスを観察することからなる。この３匹のマウスには、通常ＹＴＸｓが蓄積する５グラムの軟体動物の消化線に、又は２５グラムの軟体動物全体に、抽出物等価物が腹腔内に接種されている。許容されるＹＴＸの最大量が６時間以内に腹腔内投与によって死亡を誘発することがあるため、この分析評価は観察時間を短くして、その方法で追加的な抽出を取り込むことで修正された（Yasumoto, T., Murata, M. ほか, 1984, ACS Symp. Series. No 262. Seafood toxins, 207-214）。これらの抽出物によってＤＳＰ、ＰＴＸ及びazaspiracid toxinsをＹＴＸｓから切り離すが、それらは大量の脂肪酸を抽出することを意味する。３匹の予防接種されたマウスのうち２匹が死亡するならば、抽出物中にＹＴＸがあると考えられる。この技術は動物を犠牲にすることを意味して、毒素濃度の正確な値を提供しなくて、ほとんど再生可能でなくて、偽陽性を引き起こして、他の毒素の存在を識別するために付加的な抽出プロセスを必要とする。ＹＴＸｓを検出するために述べられている他の生物学的方法は、結果が２４〜４８時間未満で得られない遅い方法であり、それらは毒素抽出の慎重なプロセスを必要とする。さらに、他のＤＳＰｓがこれらの毒素に加えて検出されるため、それらはＹＴＸｓの特定でユニークな特徴に基づいていない。
【０００６】
細胞標的と、したがってＹＴＸｓの動作のメカニズムを決定するために、いくつかの研究がなされた。ＹＴＸは、エーテル基を有する１１の環からなる新油性分子を、不飽和側鎖に、そして、２つのスルホ基のエステル類に結合させる。図１は、側鎖置換で区別されるＹＴＸのいくつかの自然類似物を示すが、最近、５０以上の自然な誘導体が説明されているが、その構造はまだ特定されていない。ＹＴＸのin vitroの研究においてそれがアポトーシスをもたらす可能性があると観察されてきたが、その有効性はオカダ酸（通常、ＹＴＸに関連して起こるＤＳＰ毒素（Leira, F., Alvarez, C. ほか, 2001, Toxicology in vitro, 15, 277-283））のものより少なく、オカダ酸で起こることと対照的に、ＹＴＸは細胞ホスファターゼを抑制しない（Draisci, R., Lucentini, L. ほか, 2000, Seafood and freshwater toxins: pharmacology, physiology and detection, 289-324）。ＹＴＸは、リンパ球の細胞質のカルシウム値を修正して（De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Biochem. Pharmacol., 61, 827-833）、これらの細胞のマイトトキシンによって誘導されるカルシウムフローを増加させることもまた説明されてきた（De la Rosa, L.A., Alfonso, A. ほか, 2001, Cell Signal, 13, 711-716）。ＹＴＸが細胞ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥｓ）の活性化を通して環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の二次メッセンジャーの細胞内レベルを低下させることが最近観察されてきた。ＰＤＥｓはｃＡＭＰを破壊する酵素であり、これらの酵素はＹＴＸｓの細胞標識の中の１つであると推測されている（Alfonso, A., de la Rosa, L.A. ほか, 2003, Biochem Pharmacol, 65, 193-208）。
【０００７】
哺乳類細胞では、異なるイソフォームを持つ約１１ファミリーのＰＤＥがある（Houslay, M.D. と Adams, D.R., 2003, Biochem J., 370, 1-18）。これらの酵素は、ｃＡＭＰと環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の値を一定に調整して維持する。後者は、多数の不可欠な機能に関連する細胞機能に必要な二次メッセンジャーである（Soderling, S.H. とBeavo, J.A., 2000, Curr. Opin. Cell. Biol., 12）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
作用についてＹＴＸのメカニズムの最近の説明を利用して、本発明では、魚介類からの抽出物中でこれらの毒素を検出するための方法を開発する。これは、細胞ＰＤＥｓへのそれらの特定の親和性に基づく。これらの機能的な分析評価では、他の毒素の存在があり、その作用のメカニズムは異なり干渉しない。すなわち、それらはＰＤＥｓについて作用しないが、毒性の症状のＹＴＸと共存する。さらに、偽陽性と動物の犠牲を防止し、毒素の正確な濃度に関する結果を１〜２時間で得ることができるため、その生成物の汚染モニタープロセスを促進する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
前述した発明は、ＹＴＸがＰＤＥ活性剤であるという発見に基づいて２つの設備を開示し、この活性を測定可能な信号に変換することに関する。
【００１０】
使用１：親和性センサーを用いてＰＤＥ−ＹＴＸ生体分子結合を決定するための方法。
【００１１】
バイオセンサーを用いてリアルタイムに分子間相互作用を決定することは、新しい技術であり、その使用は異なる研究分野に広がってる（Hide, M., Tsutsui, T. ほか, 2002, Anal Biochem, 302, 28-37、 Lee, T.H., Mozsolits, H. ほか, 2001, J Pept Res, 58, 464-476、 Mariotti, E., Minunni, M. ほか, 2002, Anal Chim Acta, 453, 165-172、 Tsoi, P.Y. と Yang, M.S., 2002, Biochem J, 361, 317-325）。用いられるバイオセンサーは、リガンドと称される生物学的に活性な分子と、レセプターと称されるそれが結合するもう一方の分子との間の分子反応を検出する機器である。リガンドは、一般的にキュベット又はプレートである機器の支持体表面に結合される。結合が発生する支持体表面に生成されるエバネセント場と称される電磁界は、質量の変化に非常に敏感である。バイオセンサーは、リガンド−レセプタ結合のため支持体表面に発生する質量の変化を電気信号へ変換する。本方法で用いることができる商業的なバイオセンサーモデルは、Biocore又はThermo Labsystems社によって市販されているものである。本発明では、リガンドとしてのＰＤＥｓ機能と、レセプターとして機能するＹＴＸを持ったサンプルをそこへ加える。バイオセンサーでのシグナルは、ＰＤＥｓに付着する毒素の量、したがってサンプル中のＹＴＸの存在に応じて、より大きいか又はより小さいかである。
【００１２】
リガンドとして機能する細胞ＰＤＥｓは支持体表面に結合する。続けて、レセプターとして作用する既知の濃度のＹＴＸをこの表面に添加する。この技術は平坦表面又はマトリクスによって形成される表面を用いてよく機能する。ＰＤＥ−ＹＴＸ結合は速度式に従う。この速度式は、擬似−一次オーダーの式に当てはまり、これから得られる定数は見かけの結合率（Ｒａｐ）と呼ばれ、毒素の各濃度で異なる。較正線はＲａｐと毒素濃度のデータで引かれる。テストサンプル（魚介類の抽出物）を表面に添加する。そのＲａｐを計算し、この値を較正線に置くことでテストサンプルでのＹＴＸ濃度を得ることができる。
【００１３】
（実施の形態）
本方法は２２〜３７℃の温度で実行される。
【００１４】
ａ．ｐＨ７．７で０．１〜０．２４ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＤＥｓの溶液を活性化した二重の区画表面に添加する。これらの酵素は分離できない共有結合によって支持体表面に結合する。ＰＤＥｓが結合しない活性基を異なるブロック溶液（ＢＳＡ、エタノールアミン、トリス−ＨＣｌ…）でブロックする。
【００１５】
ｂ．既知の濃度でＹＴＸの溶液を一方の区画に添加する。他方の区画をブランクとして使用し、毒素溶媒をそこに添加する。ＰＤＥｓとＹＴＸ間の関連性のある速度式を１５分間記録する。
【００１６】
ｃ．そして、ｐＨ７．７でバッファ溶液で長方の区画を洗浄することでリガンド−レセプター分離を実行する。このように、ＰＤＥｓからＹＴＸを分離する。
【００１７】
ｄ．ＹＴＸを完全に取り除くために、区分を酸又は塩基性溶液で再生する。したがって、ＰＤＥｓはＹＴＸの新たな付加のために利用可能になる。
【００１８】
ｅ．ＹＴＸの５つの異なる濃度でステップｂ、ｃ及びｄを繰り返す。
【００１９】
ｆ．見かけの結合率（Ｒａｐ）を毒素の各濃度で関連性のある速度式から得る。ＹＴＸ濃度に対するＲａｐ値のプロットは、０．９より大きい回帰係数で線形フィットに従う。このように、得られた線とともに、サンプル中のＹＴＸの濃度をそのＲａｐが既知ならば得ることができる。
【００２０】
ｇ．研究対象の魚介類の肉の抽出を実行する。最大値を決定するための２００２年３月１５日の決定2002/225/EEC又はその他の公式方法（D.O.G.A., 1986, Decree 328/1986 of 30 October. Diario oficial de Galicia, 224）、及び異なる魚介類中に存在する特定の魚介毒素のための分析方法に従って、この抽出を実行する。抽出物（テストサンプル）のアリコートを採取し、表面に結合したＰＤＥに添加する。得られる関連する速度式からそのＲａｐを計算する。このテストＲａｐ値を得られた回帰直線に置くことによって、サンプルに存在するＹＴＸ濃度を決定することができる。
【００２１】
図２は、この方法で取られるステップの分析結果のグラフを示し、表面活性化からテストサンプルを添加するまでである。図３に示す回帰直線は既知の濃度のＹＴＸに対してＲａｐ値をとる。
【００２２】
使用２：蛍光分子を用いてＹＴＸによるＰＤＥ活性化を決定するための方法。
【００２３】
細胞ＰＤＥ活性を検出する通常の方法では、ｃＡＭＰを破壊するそれらの能力を観察する。ｃＡＭＰの蛍光誘導体、アントラニロイル−ｃＡＭＰ（励起波長：３５０ｎｍ、放射波長：４４５ｎｍ）があり、その蛍光はそれが分解されるため減少する。蛍光の減少は経時的にｃＡＭＰの破壊率として表される。ＰＤＥｓの存在で、破壊率が増加し、これらの酵素が活性化すると、分解率がさらにより大きくなる。本発明では、ＰＤＥｓの存在で蛍光指示薬のアントラニロイル−ｃＡＭＰの分解率を決定し、ＹＴＸを持つサンプルを添加するときにその種類を研究する。マイクロ滴定プレートのために準備される蛍光計で蛍光を読み取る。いくつかの既知の濃度のＹＴＸの存在下で破壊率を決定する。毒素濃度に対する破壊率の表現は、０．９より大きい回帰係数である直線フィットに従う。このように、得られる回帰直線では、魚介類からのサンプル（テストサンプル）で得られる破壊率の値をＹＴＸ濃度に変換することができる。
【００２４】
（実施の形態）
２２〜３７℃の温度範囲でマイクロ滴定プレートで本方法を実行し、３６０ナノメーターの励起波長と４６０ナノメーターの放射波長で蛍光を測定する。
【００２５】
４つのタイプのウェルがあり、それらのそれぞれを複製して実行する。
【００２６】
ウェルＡ：ｃＡＭＰ濃度を計算するためのウェル。それらには２〜１０μＭの５つの濃度でアントラニロイル−ｃＡＭＰを添加する。
【００２７】
ウェルＢ：８μＭの蛍光指示薬と酵素による制御ウェル。
【００２８】
ウェルＣ：８μＭの蛍光指示薬、酵素及び既知の濃度のＹＴＸによる較正ウェル。
【００２９】
ウェルＤ：８μＭの蛍光指示薬、酵素及び任意の魚介類の抽出物からのサンプルによるテストサンプルウェル。
【００３０】
ａ．１００μＬの最終的なインキュベーション量のために全てのウェルにテストバッファ（１０ｍＭのトリスＨＣｌ＋１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）を添加し、対応する量はアントラニロイル−ｃＡＭＰのウェルのタイプに従う。最初の読み取りを２分間実行する。
【００３１】
ｂ．  ２〜５μｇのＰＤＥｓをウェルＢ、Ｃ及びＤに添加し、新しい読み取りを２分間実行する。
【００３２】
ｃ．既知の濃度のＹＴＸ又は魚介類からのサンプルをウェルＣ及びＤに添加する。０．１〜１０μＭの濃度でＹＴＸを添加する。最大値を決定するための２００２年３月１５日の決定2002/225/EEC又はその他の公式方法（D.O.G.A., 1986, Decree 328/1986 of 30 October. Diario oficial de Galicia, 224）、及び異なる魚介類に存在する特定の魚介毒素の分析方法に従って、抽出物からのサンプルを得る。
【００３３】
ｄ．これらの添加の後、プレートを振動させ、続けて蛍光測定を１５分間実行し、毎分データを取得する。
【００３４】
ｅ．各ウェルの指示薬の濃度に対しウェルＡで得られた蛍光データをプロットすることで、０．９９９より大きい回帰係数の直線を得る。
【００３５】
ｆ．アントラニロイル−ｃＡＭＰ濃度での前述の直線を用いて、ウェルの残りの蛍光データを変換する。時間ゼロで毒素添加時のｃＡＭＰ濃度と、１０分後の濃度から、時間の単位ごとに破壊される指示薬の量、すなわちＡＭＰｃの破壊率を得る。
【００３６】
ｇ．ウェルＢで得られた破壊率を制御破壊率とする。
【００３７】
ｈ．ＹＴＸ濃度に対してウェルＣの破壊率データをプロットすることで、ＹＴＸ濃度の標準線を得る。ウェルＤで得られた破壊率をこの直線で置換することで、そのサンプルのＹＴＸを決定する。
【００３８】
図４は、アントラニロイル−ｃＡＭＰの濃度に対する蛍光単位の較正線を示す。図５は、標準分析評価のＹＴＸ濃度に対するｃＡＭＰの破壊率の標準線を示す。
【００３９】
（文献）
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【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は側鎖置換で区別されるＹＴＸのいくつかの自然類似物である。
【図２】図２はこの方法で取られるステップの分析結果のグラフを示す。
【図３】図３は既知の濃度のＹＴＸに対してＲａｐ値をとる回帰直線を示す。
【図４】図４はアントラニロイル−ｃＡＭＰの濃度に対する蛍光単位の較正線を示す。
【図５】図５は標準分析評価のＹＴＸ濃度に対するｃＡＭＰの破壊率の標準線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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