(57)【要約】【課題】  より簡易な方法で血管や神経等の生体組織を再生可能にする人工生体部材の製造方法を提供する。【解決手段】  生体適合性を有する材料で形成されたポリマー基材の表面の所定領域に有機物質を付加することと、有機物質が付加されたポリマー基材の表面に超臨界流体を接触させて有機物質をポリマー基材に浸透させることと、有機物質が浸透したポリマー基材の表面に細胞を播種することと、上記細胞を培養することとを含む人工生体部材の製造方法を提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工生体部材の製造方法であって、
生体適合性を有する材料で形成されたポリマー基材を用意することと、
上記ポリマー基材の表面に所定のパターンで有機物質を付加することと、
上記有機物質が付加されたポリマー基材の表面に超臨界流体を接触させて上記有機物質を上記所定のパターンで上記ポリマー基材に浸透させることと、
上記有機物質が浸透した上記ポリマー基材の表面に細胞を播種することと、
上記細胞を培養することとを含む人工生体部材の製造方法。
【請求項２】
上記ポリマー基材の表面に所定のパターンで有機物質を付加する際に、スクリーン印刷法またはインクジェット法により上記有機物質を付加することを特徴とする請求項１に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項３】
人工生体部材の製造方法であって、
生体適合性を有する材料で形成されたポリマー基材を用意することと、
上記ポリマー基材の表面に有機物質を付加することと、
上記有機物質が付加されたポリマー基材の表面に所定のパターンで超臨界流体を接触させて上記有機物質を該所定のパターンで上記ポリマー基材に浸透させることと、
上記有機物質が浸透した上記ポリマー基材の表面に細胞を播種することと、
上記細胞を培養することとを含む人工生体部材の製造方法。
【請求項４】
上記有機物質が付加されたポリマー基材の表面に上記所定のパターンで超臨界流体を接触させて上記有機物質を上記ポリマー基材の表面に所定のパターンで浸透させることが、
上記所定のパターンに対応する凹凸パターンが表面に形成された金型を用意することと、該凹凸パターンが形成された上記金型の表面と上記ポリマー基材の有機物質が付加されている側の表面とを密着させることと、上記金型の凹部と上記ポリマー基材との間に画成された空間に上記超臨界流体を流入して上記金型の凹部に対向するポリマー基材の領域の有機物質をポリマー基材内に浸透させることと、上記ポリマー基材内に浸透していない上記ポリマー基材上の有機物質を溶媒を用いて洗浄することとを含むことを特徴とする請求項３に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項５】
上記ポリマー基材が多孔質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項６】
上記ポリマー基材が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリε−カプロラクトン及び乳酸／ε−カプロラクトン共重合体からなる群から選ばれる少なくとも一種の材料により形成されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項７】
上記超臨界流体が超臨界状態の二酸化炭素であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項８】
上記有機物質が上記超臨界流体に溶解することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項９】
上記有機物質がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項１０】
上記細胞が血管細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の人工生体部材の製造方法。
【請求項１１】
生体適合性を有するポリマー基材と、
上記ポリマー基材の表面の所定領域に形成された人工生体組織とを備えた人工生体部材。
【請求項１２】
上記ポリマー基材が多孔質であることを特徴とする請求項１１に記載の人工生体部材。
【請求項１３】
上記ポリマー基材が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリε−カプロラクトン及び乳酸／ε−カプロラクトン共重合体からなる群から選ばれる少なくとも一種の材料で形成されていることを特徴とする請求項１１または１２に記載の人工生体部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工生体部材の製造方法及び人工生体部材に関し、より詳細には、基板上で細胞を所定のパターンで培養する人工生体部材の製造方法及び人工生体部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、親水化などの機能性を有する膜を基材上にパターニングすることにより、種々の機能を持たせた機能性素子を作製する方法が知られている。この機能性素子の作製技術は再生医療分野でも応用されており、例えば、光触媒を用いて基板上に血管網パターンを形成する方法が提案されている（例えば、非特許文献１を参照）。以下に、非特許文献１で開示されている血管網パターンの形成方法について図６を用いて簡単に説明する。
【０００３】
非特許文献１で開示されている血管網パターンの形成方法では、まず、図６（ａ）に示すように、光触媒６３をコーティングしたフォトマスク６４と、疎水性材料層６２が表面に形成されたガラス基板６１とを用意する。次いで、光触媒６３をコーティングしたフォトマスク６４を、図６（ｂ）に示すように、ガラス基板６１上に形成された疎水性材料層６２の上に被せて、フォトマスク６４側から紫外線露光６５を行う。これにより疎水性材料層６２のマスクされていない領域（図６（ｂ）中の領域６６）の疎水性材料が光触媒により分解されて親水化する。その結果、ガラス基板６１上の疎水性材料層６２の表面には、図６（ｃ）に示すように、親水性部分６６と疎水性部分６７とからなるパターンが形成される。このように所定のパターンで表面改質された疎水性材料層６２上に血管内皮細胞６８を播くと、図６（ｄ）に示すように、親水性部分６６にのみ血管内皮細胞６８が粘着して、血管内皮細胞６８のパターンがガラス基板上に形成される。次いで、血管内皮細胞６８を播種したガラス基板６１を別途用意した細胞培地（不図示）上に転写して血管内皮細胞６８を培養すると、血管パターンの形状に培養され管腔化された血管（以下、人工血管ともいう）が細胞培地上に形成される。
【０００４】
また、従来、マイクロリソグラフィーの手法を利用して基板表面を親水性領域と疎水性領域とでパターン化し、親水性領域を細胞培養領域とする方法が提案されている（例えば、非特許文献２を参照）。非特許文献２では、ガラス基板の表面にパターンマスクを介して金を蒸着し、この金の蒸着膜をチオール基を有する化合物に浸漬して金表面を改質することより基板表面に親水性／撥水生パターンを形成する方法が提案されている。
【０００５】
【非特許文献１】「バイオ  インダストリイ」（ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ），２００４年，第２１巻，第１０号
【非特許文献２】藤井、他１名，「細胞診断のためのマイクロ・セルチップの開発」，第３１回医用高分子シンポジウム発表論文，２００２年，ｐ２０−２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のような非特許文献１で提案されている人工血管の形成技術では、人工血管のパターン形成がガラス基板であるので、基板を培地として細胞を培養し且つ基板上に人工血管が再生された状態で、人工血管を人体に戻すことはできない。そのため、再生された人工血管を一旦を細胞培地から引き剥がし、さらに、別途培養された皮膚などの組織に接着して一緒に体内に戻すプロセスが必要であった。すなわち、非特許文献１に記載の技術では、再生された人工血管を生体内に戻す際に複雑なプロセスが必要であった。
【０００７】
また、非特許文献２で提案されているパターニング技術では、ガラス基板上に親水性領域と疎水性領域とからなるパターンを形成する際に、蒸着工程またはプラズマエッチング工程が必要であり、このような工程では減圧雰囲気または真空雰囲気を形成することが必要となる。そのため、非特許文献２に記載のパターニング技術もまたプロセス数が多くなりプロセスが複雑になるという問題がある。
【０００８】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、本発明の目的は、より簡易な方法で基材表面に所定のパターンで血管、神経等の人工生体組織を再生することができ、また、再生された血管、神経等の人工生体組織を生体内に戻す際のプロセスをより簡易にすることができる人工生体部材の製造可能方法及び人工生体部材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様に従えば、人工生体部材の製造方法であって、生体適合性を有する材料で形成されたポリマー基材を用意することと、上記ポリマー基材の表面に所定のパターンで有機物質を付加することと、上記有機物質が付加されたポリマー基材の表面に超臨界流体を接触させて上記有機物質を上記所定のパターンで上記ポリマー基材に浸透させることと、上記有機物質が浸透した上記ポリマー基材の表面に細胞を播種することと、上記細胞を培養することとを含む人工生体部材の製造方法が提供される。
【００１０】
血管、神経等の生体組織および臓器の機能を人工的な材料を用いた成形物やそれを部品として用いた装置によって補助あるいは代行しようとするもの、いわゆる人工臓器と呼ばれるもの（以下では、人工生体部材ともいう）は生体内に埋入して用いられるので、それらに用いる材料は生体に害を与えることなく使用できる性質、つまり、生体適合性を持たなければならない。そこで、本発明の人工生体部材の基材には、生体適合性を有するポリマー基材を用いる。また、本発明の人工生体部材の製造方法で用いるポリマー基材は、血管などの生体組織細胞を生着させて細胞を体外で培養するための基材、すなわち、細胞培養基材としても用いる。特に、血管、神経等のように網目状の構造を有する繊維状の生体組織は、再生した培地から取り外した状態ではその取り扱いが困難となるが、本発明では生体適合性を有する基材上で細胞培養を行うため、再生した生体組織を基材に担持させた状態のまま生体に埋入することができる。それゆえ、本発明の人工生体部材の製造方法では、再生した生体組織の取り扱い及びプロセスが非常に容易になる。
【００１１】
本発明の第１の態様に従う人工生体部材の製造方法を簡単に説明すると、まず、生体適合性を有するポリマー基材を用意する。次いで、ポリマー基材表面に所定パターン（例えば、血管パターン等）で親水化等の機能を発揮する有機物質を付加する。次いで、有機物質が付加されたポリマー基材表面に超臨界流体を接触させて有機物質をポリマー基材表面に所定のパターンで浸透させる。これにより、ポリマー基材上に形成される有機物質のパターン領域のみを表面改質して親水化等の機能を持たせることができる。なお、ポリマー基材内に浸透しきれず、ポリマー基材上に残存している有機物質はそれに適した溶媒などで洗浄して除去することが好ましい。
【００１２】
次いで、有機物質の所定パターンが形成されたポリマー基材上に、培養すべき細胞を播種する。この際、播種する細胞は水等の液体あるいは培養液に含ませた状態で播種することが好ましい。培養すべき細胞をポリマー基材上に播種すると、細胞がそれを含む水等の液体あるいは培養液と一緒に、ポリマー基材の表面改質された（親水化等された）パターン上にのみ付着する。次いで、例えば、播種された細胞を別途用意された培地上で培養することにより、人工血管等の人工生体組織をポリマー基材の表面改質されたパターン上に形成する。本発明では、このようにして人工生体部材を作製する。
【００１３】
本発明の人工生体部材の製造方法で、有機物質をポリマー基材の表面に所定パターンで付加する際には、有機物質を液状化して付加することが好適である。液状化した有機物質を所定のパターンで付加する方法としては、スクリーン印刷法やインクジェット法などの印刷方法を用いることが好ましい。このような印刷方法を用いると、より簡単に有機物質をポリマー基板上に任意のパターンで付加することができる。なお、本発明の人工生体部材の製造方法を用いて血管や神経系などの複雑で個体差のあるパターンを形成する場合には、特に、個別対応性の高いインクジェット法が好適である。それ以外の方法としては、所定のパターンに穿孔したマスクを作製し、これをポリマー基材上に設置した後、有機物質を含有した溶液をスプレー塗布する方法を採用することもできる。また、有機物質を液状にする方法としては、有機物質を加熱して軟化させる方法や、有機物質を所定の溶媒に溶解する方法などが挙げられるが、温度調整を行う必要のない点から溶媒に溶解する方法が好適である。
【００１４】
本発明の第２の態様に従えば、人工生体部材の製造方法であって、生体適合性を有する材料で形成されたポリマー基材を用意することと、上記ポリマー基材の表面に有機物質を付加することと、上記有機物質が付加されたポリマー基材の表面に所定のパターンで超臨界流体を接触させて上記有機物質を該所定のパターンで上記ポリマー基材に浸透させることと、上記有機物質が浸透した上記ポリマー基材の表面に細胞を播種することと、上記細胞を培養することとを含む人工生体部材の製造方法が提供される。
【００１５】
本発明の第２の態様に従う人工生体部材の製造方法では、有機物質をポリマー基材表面に所定のパターンで浸透させる方法として、ポリマー基材表面に有機物質を付加した（例えば、全面に付加した）後、ポリマー基材表面に所定のパターンで超臨界流体を接触させることにより、有機物質を該ポリマー基材表面に該所定のパターンで浸透させる。
【００１６】
本発明の第２の態様に従う人工生体部材の製造方法では、上記有機物質が付加されたポリマー基材の表面に上記所定のパターンで超臨界流体を接触させて上記有機物質を上記ポリマー基材の表面に所定のパターンで浸透させることが、上記所定のパターンに対応する凹凸パターンが表面に形成された金型を用意することと、該凹凸パターンが形成された上記金型の表面と上記ポリマー基材の有機物質が付加されている側の表面とを密着させることと、上記金型の凹部と上記ポリマー基材との間に画成された空間に上記超臨界流体を流入して上記金型の凹部に対向するポリマー基材の領域の有機物質をポリマー基材内に浸透させることと、上記ポリマー基材内に浸透していない上記ポリマー基材上の有機物質を所定の溶媒を用いて洗浄することとを含むことが好ましい。
【００１７】
本発明の第２の態様に従う人工生体部材の製造方法では、ポリマー基材表面に有機物質を所定のパターン（血管パターン等）で浸透させる方法として、形成すべきパターンに対応した凹凸パターンが表面に形成された金型を用いて有機物質を所定のパターンで浸透させても良い。現状では、金型の表面に形成される凹凸パターンの方が、スクリーン印刷法やインクジェット法で形成されるパターンに比べて、より微細なサイズ（例えば、５０μｍ以下）で形成することができる。それゆえ、この方法によりポリマー基材上に所定の有機物質のパターンを形成すると、スクリーン印刷法やインクジェット法でパターンを形成した場合に比べて、より微細なパターンをポリマー基材上に形成することができる。すなわち、金型を用いた本発明の人工生体部材の製造方法では、より微細なサイズの人工生体組織をポリマー基板上に形成することができる。
【００１８】
本発明の第１及び第２の態様に従う人工生体部材の製造方法では、上述のように、細胞を培養する基材に生体適合性を有するポリマー基材を用いているので、人工生体組織がポリマー基材上で再生培養された状態で、ポリマー基材と一緒に人工生体組織を生体内に戻すことができる。そのため、本発明の第１及び第２の態様に従う人工生体部材の製造方法では、上述した非特許文献１に記載の技術のように、人工生体組織を生体内に戻す際に、培地から人工生体組織を引き剥がす必要がなく、また、人工生体組織を接着するための皮膚などの組織を別途培養して用意する必要もないので、人工生体組織を生体内に戻す際のプロセスがより簡易になる。
【００１９】
本発明の人工生体部材の製造方法で用いるポリマー基材としては、生体適合性を有する材料で形成する必要がある。また、そのポリマー材料としては、疎水性を有する材料であることが好適である。さらには、ポリマー基材が多孔質であっても良い。ポリマー基材が多孔質である場合、基材に培養液を充分に保持させ且つ基材に細胞を定着させる効果がある。
【００２０】
本発明の人工生体部材の製造方法に用い得る上述のような性質を有するポリマー基材の材料としては、ポリ乳酸(ＰＬＡ膜)、ＰＬＡ誘電体、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＧＡ誘導体、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体等が挙げられ、これらの群から選ばれる少なくとも一種の材料により形成されることが好ましい。これらの材料は、人体など生体内に埋め込むと、人体組織と融合する、または、次第に分解吸収されるという特徴を有する。それゆえ、これらのポリマー基材上に形成された人工血管などの人工生体組織は培養後、ポリマー基材から引き剥がすことなく、そのまま生体組織の欠損部などに埋入して用いることができる。なお、非特許文献１で開示されている技術では、基板上に血管網パターンを形成する際に、紫外線照射を行い光触媒を活性化するので、基板にポリ乳酸などのポリマー基材を用いると、光触媒によりポリマー基材が分解され破壊されてしまうおそれがある。それゆえ、非特許文献１で開示されている人工生体部材の形成方法では、血管などの生体組織を培養する際に用いる基板としてポリ乳酸などの生体適合性を有するポリマー基材を用いることはできない。
【００２１】
本発明の人工生体部材の製造方法では、上記超臨界流体が超臨界状態の二酸化炭素であることが好ましい。
【００２２】
本発明の人工生体部材の製造方法で、有機物質をポリマー基材内に浸透させる際に用いる超臨界流体としては、種々の物質（例えば、空気、窒素、水、ブタン、ペンタン、メタノール等）を用いることが可能であるが、特に超臨界状態の二酸化炭素（以下、超臨界ニ酸化炭素ともいう）が好ましい。超臨界二酸化炭素は、熱可塑性樹脂材料に対する可塑剤として、射出成形や押し出し成形において実績があり最適である。また、超臨界流体としては、有機材料にある程度の溶解性を有する流体であれば任意のものを用い得る。なお、超臨界流体はパターン形成後、ポリマー基材に残留しないので生体への影響はない。さらに、有機物質の超臨界流体に対する溶解度を向上させるために、超臨界流体にエントレーナ、即ち、助剤として各種エントレーナを混合しても良いが、人体などの生体に対し比較的害の少ないエタノール等のアルコールを用いることが望ましい。
【００２３】
また、本発明の人工生体部材の製造方法において、有機物質が付加されたポリマー基材に超臨界流体を接触させる際には、ポリマー基材の表面に超臨界流体を接触させた状態で超臨界流体の圧力を制御して、ポリマー基材を超臨界流体の圧力でプレスすることが好ましい。超臨界流体の圧力でポリマー基材の表面をプレスすることにより、有機物質をポリマー基材内部に深く浸透させることが可能となる。
【００２４】
さらに、本発明の人工生体部材の製造方法では、有機物質が付加されたポリマー基材の表面に接触させる超臨界流体の温度及び圧力等の条件は任意であるが、例えば、超臨界流体として超臨界状態になる閾値が温度約３１℃、圧力約７ＭＰａ以上である二酸化炭素を用いた場合、温度は３５〜１５０℃の範囲、圧力は１０〜２５ＭＰａの範囲が好適である。温度や圧力が上記範囲外であると、有機物質の超臨界二酸化炭素に対する溶解性やポリマー基材への浸透性が劣化する。また、超臨界流体の温度はポリマー基材のガラス転移温度より低い温度であることが望ましく、例えばポリマー基材として、ポリ乳酸を用いた場合には、超臨界二酸化炭素の温度は３５〜６０℃が望ましい。
【００２５】
本発明の人工生体部材の製造方法では、上記有機物質が上記超臨界流体に溶解することが好ましい。有機物質として超臨界流体に溶解するものを用いた場合には、有機物質が超臨界流体に溶解した状態で超臨界流体と一緒にポリマー基材内に浸透するので、有機物質がポリマー基材内に浸透し易くなる。
【００２６】
本発明の人工生体部材の製造方法では、上記有機物質がポリエチレングリコールであることが好ましい。
【００２７】
本発明の人工生体部材の製造方法において、ポリマー基材に上述のような疎水性材料を用いた場合には、ポリマー基材上に付加する有機物質としてポリマー基材に親水性の機能を付加できる物質を用いることが好適である。そのような性質を有する有機物質の一つとして、ポリエチレングリコールが挙げられる。ポリエチレングリコールは、例えば超臨界二酸化炭素に対して溶解し、比較的ポリマー基材に浸透し易く、また親水基（ＯＨ）を有するため、表面が親水化されたポリマー基材を作製し易いので特に好ましい。さらに、ポリエチレングリコールは生体適合性にも優れている。また、ポリエチレングリコール以外で、ポリマー基材に親水性の機能を付加できる有機物質としてはポリプロピレングリコールを用いることができるが、生体適合性の観点からポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も好適である。
【００２８】
本発明の人工生体部材の製造方法では、上記細胞が血管内皮細胞や神経細胞であることが好ましい。本発明の人工生体部材の製造方法では、上述のように、ポリマー基材の表面の一部に選択的（部分的）に有機物質を浸透させて表面改質し、表面改質した領域のみに細胞を培養することができる。すなわち、ポリマー基材上に任意のパターンで細胞を培養することができる。それゆえ、本発明の人工生体部材の製造方法は、血管や神経系などの複雑なパターンを有する生体組織の再生に特に有効である。
【００２９】
本発明の第３の態様に従えば、生体適合性を有するポリマー基材と、上記ポリマー基材の表面の所定領域に形成された人工生体組織とを備えた人工生体部材が提供される。
【００３０】
本発明の人工生体部材では、上記ポリマー基材が多孔質であることが好ましい。また、本発明の人工生体部材では、上記ポリマー基材が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリε−カプロラクトン及び乳酸／ε−カプロラクトン共重合体からなる群から選ばれる少なくとも一種の材料で形成されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の人工生体部材の製造方法及び人工生体部材によれば、細胞を再生培養する基材に生体適合性を有するポリマー基材を用いているので、ポリマー基材に人工生体組織（人工血管等）が形成された状態で、人工生体組織を生体内に戻すことができる。従って、本発明の人工生体部材の製造方法では、上述した非特許文献１に記載の技術のように、人工生体組織を生体内に戻す際に、培地から人工生体組織を引き剥がす必要が無くなり、また、人工生体組織を接着するための皮膚などの組織を別途培養して用意する必要も無くなる。それゆえ、本発明の人工生体部材の製造方法によれば、人工生体組織を生体内に戻す際のプロセスをより簡易にすることができる。また、人工生体組織を生体内に戻す際の取り扱いも容易になる。
【００３２】
さらに、本発明の人工生体部材の製造方法によれば、生体適合性を有するポリマー基材上に任意のパターンで細胞を培養することができる。それゆえ、本発明の人工生体部材の製造方法は個別対応性に優れた人工生体部材の製造方法であり、血管や神経系などの複雑なパターンを有する生体組織であってもより簡単に再生することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下に、本発明の人工生体部材及びその製造方法の実施例について、図面を参照しながら具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３４】
［人工血管部材の構造］
実施例１では、ポリマー基板上に人工血管を形成した（以下、この形成部材を人工血管部材という）。実施例１で作製した人工血管部材の概略構成を図１に示した。
【００３５】
この例で作製した人工血管部材１０は、図１に示すように、ポリマー基板１（ポリマー基材）と、ポリマー基板１上に所定のパターンで形成された人工血管２（人工生体組織）とから構成される。この例では、ポリマー基板１として、ポリ乳酸製基板を用いた。ポリ乳酸は疎水性材料である。なお、ポリマー基板１の形状は任意であるが、本実施例では表面が平坦な板状基板を用いた。また、本実施例では、ポリマー基板１の寸法を幅１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、及び厚さ０．７ｍｍとした。なお、ポリマー基板１の厚さは０．０５ｍｍ〜２ｍｍが好適である。厚さが０．０５ｍｍ未満のポリマー基板１では、強度が弱く、再生された人工生体組織を安定に保持し難くなり、取り扱いが困難になる。一方、ポリマー基板１の厚さが２０ｍｍを越えると、生体内で分解吸収されるのに長い時間が必要となる。また、この例では、人工血管２の直径が約１００μｍとなるように再生培養した。
【００３６】
［ポリマー基板の表面改質に用いる高圧装置］
まず、この例の人工血管部材１０の作製方法について説明する前に、超臨界流体をポリマー基板１表面に接触させて、ポリマー基板１上に付加された有機物質をポリマー基板１内に浸透させて表面改質する際に用いた高圧装置について説明する。なお、この例では、超臨界流体として超臨界二酸化炭素を用い、有機物質としては平均分子量約１０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた。
【００３７】
実施例１の人工血管部材１０のポリマー基板１の表面改質に用いた高圧装置の概略構成を図４に示した。高圧装置１００は、図４に示すように、主に、高圧容器１１と、ＣＯ２ボンベ１２と、超臨界流体調整装置１３と、それらの構成要素を繋ぐ配管１６ａ及び１６ｂとで構成されている。
【００３８】
高圧容器１１は、図４に示すように、表面に凹部３１が形成された容器本体３３と、蓋３４とを含み、容器本体３３の凹部３１の外壁上面にはＯ−リング３２が設けられている。そして、図４に示すように、蓋３４を容器本体３３の凹部側の上面に載置してボルト締めすることにより、容器本体３３の凹部３１が密閉される。なお、高圧容器１１の密閉状態を維持するための手段として任意のものを用い得るが、回転式の蓋シール機構等を用いても良いし、プレス装置を用いて圧力をかけて合わせ面をシールする方法等を採用しても良い。
【００３９】
また、高圧容器１１には、図４に示すように、容器本体３３の凹部３１と流通した流路３６及び導入口３５が形成されている。また、流路３６は、図４に示すように、導入口３５を介して外部の超臨界流体を流す配管１６ｂと流通しており、高圧容器１１の外部で生成された超臨界流体は、配管１６ｂから導入口３５及び流路３６を通って密閉された容器本体３３の凹部３１に効率良く導入される。この際、容器本体３３の凹部３１はＯ−リング３２を介して蓋３４により密閉されているので、導入口３５及び流路３６を介して凹部３１に導入された超臨界流体が高圧容器１１の外部に漏れ出すことはない。
【００４０】
超臨界流体調整装置１３は、図４に示すように、主に、ブースターポンプ２１と、バッファータンク１７とから構成されている。ＣＯ２ボンベ１２と超臨界流体調整装置１３とは配管１６ａによって接続されており、ＣＯ２ボンベ１２から配管１６ａを介して超臨界流体調整装置１３に導入されたＣＯ２ガスは、ブースターポンプ２１により、バッファータンク１７内に導入される。そして、導入されたＣＯ２ガスは、バッファータンク１７内で所定の圧力に昇圧され、バッファータンク１７に設けられたヒーター１４ａにより所定の温度に調整された超臨界状態のＣＯ２ガス（超臨界二酸化炭素）となる。バッファータンク１７内で発生した超臨界二酸化炭素は、温調装置１４ｂで所定の温度に温調された配管１６ｂを通過して、高圧容器１１の導入口３５から流路３６を介して密閉された凹部３１内に導入される。
【００４１】
［人工血管部材の作製方法］
次に、この例の人工血管部材１０の作製方法を、図２を用いて説明する。まず、図１に示すような再生すべき人工血管２の血管パターンを患者等の生体から抽出する。具体的には、例えば、まず、レントゲンや顕微鏡観察等で得られた観測結果を画像データとしてパソコン等に取り込み、次いで、再生すべき領域の血管パターンの画像データをソフト的に処理して人工血管２の血管パターンの原画を作製する。
【００４２】
次いで、上記血管パターンの抽出で得られた原画に基いて、スクリーン印刷法により、ポリ乳酸製のポリマー基板１上に６０℃に加熱したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付加した。その結果、図２（ａ）に示すように、抽出した血管パターン部にＰＥＧ３が付加されたポリマー基板１が得られる。図２（ａ）の状態におけるＰＥＧ３のパターン幅は約８０μｍであった。なお、この例では、ポリマー基板１の表面の血管パターン上にＰＥＧ３を付加するためにスクリーン印刷法を用いたが、本発明はこれに限定されず、インクジェット法を用いても良い。特に、血管パターンの原画をデジタル画像として取り込んだ場合には、コンピュータを通じて直接出力制御可能な点で、インクジェット法が好適である。また、ポリマー基板１の表面の血管パターン上にＰＥＧ３を付加する方法としては、ポリマー基板１上に選択的（部分的）にＰＥＧ３を付加できれば良いので、任意の印刷・塗布技術を適用することができる。
【００４３】
次いで、ＰＥＧ３が付加されたポリマー基板１の表面に超臨界二酸化炭素６を接触させ、ＰＥＧ３をポリマー基板１内に浸透させる（図２（ｂ）の状態）。これにより、ポリマー基板１の血管パターン部のみを親水化させることができる。ここで、図２（ａ）〜図２（ｂ）のプロセスについて図３及び４を用いてより詳細に説明する。
【００４４】
まず、上述したようにスクリーン印刷法により、図３（ａ）に示すように、血管パターン状にＰＥＧ３が付加されたポリマー基板１を作製する（図２（ａ）の状態）。次いで、ポリマー基板１を図４に示した高圧装置１００の高圧容器１１内に設置して高圧容器１１内部を密閉した。次いで、図３（ｂ）に示すように、高圧容器１１内部に、圧力Ｐ＝１５ＭＰａ、温度５０℃の超臨界二酸化炭素６を導入し滞留させた。この際、超臨界二酸化炭素６の圧力が安定した後、その状態を３０分間保持した。この結果、ポリマー基板１の表面に塗布されたＰＥＧ３が超臨界二酸化炭素６に溶解して、ＰＥＧ３が超臨界二酸化炭素６と一緒にポリ乳酸製のポリマー基板１内部に浸透する（図２（ｂ）及び図３（ｃ）中のＰＥＧ３’）。なお、高圧容器１１の温度は適宜任意に設定可能であるが、超臨界流体６をポリマー基板１に接触させて、ポリマー基板１表面に塗布されたＰＥＧ３をポリマー基板１内に浸透させる際には、ポリマー基板１のガラス転移温度より５〜５０℃程度低い温度に高圧容器１１の温度を制御することが望ましい。
【００４５】
次いで、図４に示した高圧装置１００の開放弁２４を開放することにより、高圧容器１１内の空間を大気開放して、高圧容器１１からポリマー基板１を取り出した。上述のようにして、図３（ｃ）に示すようなポリマー基板１の血管パターン部にのみＰＥＧ３’が浸透したポリマー基板１が得られる（図２（ｂ）の状態）。すなわち、図２（ｂ）及び図３（ｃ）の段階では、ポリマー基板１の血管パターン部のみが表面改質（親水化）されたポリマー基板１が得られる。なお、図３（ｃ）では、ＰＥＧ３’の一部がポリマー基板１に浸透した例を示しているが、本発明はこれに限定されず、例えば、付加したＰＥＧ３’を全てポリマー基板１内に浸透させても良い。ＰＥＧ３’の浸透量は接触させる超臨界流体６の温度、圧力、接触時間等の条件を変化させることにより任意に制御することができ、用途等に応じて適宜ＰＥＧ３’の浸透量を調整することが好ましい。なお、ポリマー基板１を高圧容器１１から取り出した後、ポリマー基板１上に残存しているＰＥＧ３を水、アルコール等で洗浄して除去してもよい。
【００４６】
次に、上述のようにして得られた血管パターン部のみが親水化したポリ乳酸製ポリマー基板１をエチレンオキシドガスで滅菌した後、クリーンベンチ（不図示）内に設置した。次いで、図２（ｃ）に示すように、ポリマー基板１の血管パターンが形成された表面に患者の血管内皮細胞４を播種した。この際、播種した血管内皮細胞４は約１．２×１０４個であり、血管内皮細胞４は生理的食塩水などの保存液に含ませた状態で播種した。その結果、血管内皮細胞４を含んだ保存液がポリマー基板１の親水化された血管パターン上にのみ付着し、それにより、図２（ｄ）に示すように、血管内皮細胞４が血管パターン上に付着した。基材（ポリマー基板１）に多孔質のポリマー基板を用いると、細胞播種の際に、細胞を効果的に基材に付着させることができ、細胞の培養時に培養液により細胞が流出あるいは拡散することを防ぐことができる。なお、上記細胞播種の段階において、細胞の保存液に培養液を混合しておき、初期培養を開始させることも好適である。
【００４７】
次に、親水化された血管パターン上にのみ血管内皮細胞４が付着したポリマー基板１を、図２（ｅ）に示すように、別途用意したガラス製フラットシャレー７内に設置し、ポリマー基板１上に液体培地８を滴下した。この際、液体培地８（培養液）は親水化された領域、すなわち、血管内皮細胞が播種された血管パターン部にのみ付着し、その他の疎水領域には滞留しない。なお、培養液を滴下する際には、播種した細胞が滴下された培養液により流出、拡散しないように留意する必要がある。
【００４８】
次いで、フラットシャレー７を温度が３７℃に調節された５％二酸化炭素ガス雰囲気のインキュベータ内に設置して血管内皮細胞４を培養した。この状態でまず、播種した細胞をポリマー基板１上に定着させるために初期培養を行う。初期培養が進み、ポリマー基板１上に細胞が定着した後、図２（ｅ）に示すように、該ポリマー基板１を培養液で静かに満たし本培養を行う。本培養に際しては、ゲル状の培地を用い、その上に、該ポリマー基板１の細胞を播種した面を下向きにして（培地側に向けて）該ポリマー基板１をふせて設置することも好適である。なお、この例では、培地８として、ダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ製）９０ｃｍ２に牛胎児血清１０ｃｍ３、内皮細胞増殖因子２．０ｍｇ及びヘパリン９．０ｍｇを混合し、全量１００ｃｍ３を濾過滅菌したものを用いた。そして、初期培養４時間、本培養４８時間行った後、インキュベータよりポリマー基板１を取り出して（図２（ｆ）の状態）顕微鏡で観察したところ、直径約１００μｍの管状の人工血管２が、親水化した血管パターン上に形成されていることが認められた。なお、親水化処理されていないポリマー基材の領域には血管内皮細胞４は存在しなかった。こうして、この例の人工血管部材１０を作製した。
【００４９】
そして、上述の方法で作製された人工血管部材１０をもとの患者の体内に戻し、血管端部を接合することにより、人工血管部材１０を移植することができる。
【００５０】
上述のように、この例の人工血管部材の製造方法を用いると、生体適合性を有するポリマー基板上に任意の親水化した血管パターンを形成することができる。それゆえ、親水化した血管パターン領域にのみ新たに血管を形成することができ、血管細胞を血管パターン状に配列された状態で再生することができる。
【００５１】
また、この例の人工血管部材の製造方法及び人工血管部材では、血管細胞の培養基板に生体適合性を有するポリマー基板を用いているので、ポリマー基板上に人工血管が形成された状態で人工血管を体内に戻して移植することができる。
【実施例２】
【００５２】
実施例２では、実施例１と同様の構造の人工血管部材を作製した。すなわち、この例では、図１に示した構造の人工血管部材１０を作製した。ただし、この例では、実施例１の人工血管部材より微細なサイズの血管パターンを有する人工血管部材１０を作製した。具体的には、この例では、人工血管２の直径が約５０μｍとなるように再生培養した。また、ポリマー基板１としては、ポリ乳酸製基板を用いた。なお、ポリマー基板１の形状は任意であるが、この例では実施例１と同様に表面が平坦な板状基板（幅１０ｍｍ、長さ２０ｍｍ、厚さ０．７ｍｍ）を用いた。
【００５３】
また、この例では、実施例１の人工血管部材より微細な血管パターンを形成するために、金型を用いて有機物質（この例ではＰＥＧ）を所定の血管パターンでポリマー基板１上に形成した。現状では、金型の表面に形成される凹凸パターンの方が、スクリーン印刷法やインクジェット法で形成されるパターンに比べて、より微細なサイズで形成することができる。それゆえ、この例では、ポリマー基材上に有機物質のパターンを形成する際に金型を用いた。
【００５４】
すなわち、この例では、図２中の図２（ａ）〜（ｂ）のプロセスを実施例１とは違う方法で行った。図２（ａ）〜（ｂ）のプロセスを変えたこと以外は、実施例１と同様にして人工血管部材１０を作製した。
【００５５】
なお、この例でポリマー基板１上にＰＥＧのパターンで形成する際に用いた高圧装置では、図４に示した高圧装置１００内の高圧容器１１の代わりに、ポリマー基板１上に形成される血管パターンに対応した凹凸パターンが表面に形成された金型を装備したプレス成形装置（不図示）を用いた。高圧容器１１の代わりにプレス成形装置を用いたこと以外は、実施例１で用いた高圧装置１００と同じ構成とした。
【００５６】
次に、この例でポリマー基板１上にＰＥＧを所定の血管パターンで形成する際の手法について、図５を用いて説明する。
【００５７】
まず、実施例１と同様にして図１に示すような再生すべき人工血管２の血管パターンを患者等の生体から抽出する（血管パターンの原画を作製する）。次いで、得られた血管パターンの原画に基いて、図５（ａ）に示すように金型５５の表面に機械加工により血管パターンに対応する凹凸パターンを形成した。この際、金型５５の凹部５７が血管パターン部となるように凹凸パターンを形成し、この例では凹部５７の幅を約４０μｍとした。また、この例では、図５（ａ）に示すように、金型５５の凹部５７の底部には後述する超臨界二酸化炭素５６を凹部５７に導入するための導入口５８が形成されている。なお、金型の凹凸パターンの加工に際しては、機械加工の他にレーザ加工や放電加工などの任意の方法を用いることができる。また、フォトリソグラフィー法により原盤を作製してメッキ法によりスタンパを作製して金型として用いることも可能である。
【００５８】
次に、表面に所定の血管パターンに対応する凹凸パターンが形成された金型５５を装備するプレス成形装置に、ＰＥＧ５３を全面に塗布したポリ乳酸製のポリマー基板１を装着した（図５（ａ）の状態）。その際、図５（ａ）に示すように、ポリマー基板１の全面に塗布されたＰＥＧ５３と金型５５の凹部５７が対向するように設置した。なお、この例では、平均分子量約１０００のＰＥＧ５３をポリマー基板１上に塗布した。
【００５９】
次いで、図５（ｂ）に示すように、金型５５の表面がＰＥＧ５３に接するように金型５５をポリマー基板１に押圧し、金型５５の凹部５７とポリマー基板１上に塗布されたＰＥＧ５３との間に画成された空間に導入口５８を介して超臨界二酸化炭素５６を導入した。その結果、図５（ｂ）に示すように、超臨界二酸化炭素５６と接触した領域のＰＥＧ５３のみが超臨界二酸化炭素５６に溶解して、超臨界二酸化炭素５６と一緒にポリマー基板１内に浸透する。次いで、ポリマー基板１をプレス成形装置から取り出した（図５（ｃ）の状態）。
【００６０】
次いで、ポリマー基板１上のＰＥＧ５３が浸透していない領域のＰＥＧを溶媒（例えば、水、アルコール等）を用いて洗い流した。その結果、図５（ｄ）に示すように、ポリマー基板１上の血管パターン部にのみＰＥＧ５３が浸透した、すなわち、ポリマー基板１上の血管パターン部のみが親水化されたポリマー基板１（図２（ｂ）の状態のポリマー基板）が得られた。
【００６１】
上述のようにして血管パターン部のみが親水化されたポリマー基板１を作製した後、実施例１と同様にして（図２（ｃ）〜（ｆ）の工程）、図１に示すような人工血管部材１０を作製した。その結果、この例では、直径が約５０μｍの管状の人工血管２をポリマー基板１上に形成することができた。
【００６２】
この例のように金型を用いてポリマー基板上に血管パターンを形成すると、実施例１で用いたスクリーン印刷法に比べて、より微細な血管パターンを形成することができる。それゆえ、この例の人工生体部材の製造方法の方が、実施例１より微細な寸法の人工血管を形成することができる。実際、この例では直径約５０μｍの人工血管を形成することができ、実施例１で形成した人工血管（直径約１００μｍ）の約１／２の直径を有する血管をポリマー基板上に形成することができた。一方、実施例１で用いた印刷法はコストも低く、また、短い期間で人工血管を作製することができる。
【００６３】
上記実施例１及び２では、人工の血管部材を作製する方法について説明したが、本発明はこれに限定されない。上記実施例１及び２で説明した人工生体部材の製造方法は、例えば、神経細胞のような複雑なパターンの生体組織の再生にも同様に適用することができ、同様の効果が得られる。
【００６４】
上記実施例２では、ポリマー基材表面の全面に有機物資を付加する例を説明したが、本発明はこれに限定されず、所望のパターン領域を含む一部の領域に有機物質が付加されていても良く、その場合にも実施例２と同様の人工生体部材の製造方法を適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の人工生体部材の製造方法によれば、生体適合性を有するポリマー基材上に任意のパターンで細胞を培養することができる。それゆえ、本発明の人工生体部材の製造方法は、個別対応性に優れた人工生体部材の製造方法であり、血管や神経系などの複雑なパターンを有する生体組織の再生に好適である。
【００６６】
また、本発明の人工生体部材の製造方法は、閉塞性動脈硬化症などの心臓疾患、あるいは皮膚、骨などの創傷への血管移植治療に応用可能なほか、角膜、網膜、口腔粘膜、ハイブリッド型人工血管、心筋、肝臓、軟骨、大型血管などを形成する組織移植分野、あるいは神経医療にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、実施例１で作製した人工血管部材の斜視図である。
【図２】図２（ａ）〜（ｆ）は、実施例１の人工血管部材の作製手順を説明するための図である。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、実施例１でポリマー基板上にＰＥＧを浸透させる際の手順を説明するための図である。
【図４】図４は、実施例１でポリマー基板上にＰＥＧを浸透させる際に用いた高圧装置の概略構成図である。
【図５】図５（ａ）〜（ｄ）は、実施例２でポリマー基板上にＰＥＧを浸透させるとともに血管パターンを形成する際の手順を説明するための図である。
【図６】図６（ａ）〜（ｄ）は、従来の血管網パターンの形成方法の手順を説明するための図である。
【符号の説明】
【００６８】
１  ポリマー基板
２  人工血管
３  有機物質（ＰＥＧ）
６  超臨界流体
１０  人工血管部材
【図１】
2006325791.tif 000003
【図２】
2006325791.tif 000004
【図３】
2006325791.tif 000005
【図４】
2006325791.tif 000006
【図５】
2006325791.tif 000007
【図６】
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