(57)【要約】【課題】  微細な気孔にも細胞を浸透し易くしながら、気孔内から流出し難くして、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させる。【解決手段】  少血小板血漿を多孔性材料に導入してなる生体組織補填材を提供する。また、少血小板血漿および細胞を含む液体を多孔性材料内に導入し、少血小板血漿をゲル化させてなる生体組織補填体を提供する。さらに、少血小板血漿、塩化カルシウムおよび細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し（Ｓ８）、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法を提供する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少血小板血漿を多孔性材料に導入してなる生体組織補填材。
【請求項２】
少血小板血漿および細胞を含む液体を多孔性材料内に導入し、少血小板血漿をゲル化させてなる生体組織補填体。
【請求項３】
少血小板血漿、塩化カルシウムおよび細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法。
【請求項４】
細胞と少血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加する請求項３に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項５】
塩化カルシウムとともにトロンビンを添加し、
生体組織補填材の形態に合わせて、添加するトロンビンの量を調節する請求項４に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項６】
前記細胞が、デキサメタゾン存在下で培養された細胞である請求項３から請求項５のいずれかに記載の生体組織補填体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織補填材、生体組織補填体およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄細胞等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）やハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。生体組織補填体は、移植時に、すでに骨補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、細胞を含まない生体材料を移植した後に体内で細胞を増殖させ組織を修復する方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
生体組織補填体を製造するには、一般に、まず、患者の骨髄細胞等から取り出した間葉系幹細胞を培養容器内で一次培養して必要細胞数まで増加させる。この過程において、成長した細胞は、少なくとも１回以上、培養容器から剥がされて、さらに大きな培養容器に移し替えられる。そして、最終的に必要細胞数まで増加したところで、再度、培養容器から剥離させられ、生体組織補填材に付着させられて、二次培養が行われる。これにより、生体組織補填体が製造される（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
この場合において、間葉系幹細胞は、生体組織補填材に付着して成長することにより、生体組織の形成が盛んに行われるように活性化させられるので、間葉系幹細胞を生体組織補填材に十分に付着させることが重要になる。従来、生体組織補填材に細胞を十分に付着させる方法として、生体組織補填材の材質を改善し、生物活性ガラス材料あるいは生物活性セラミック材料により構成し、  特有のイオンを含む水溶液により処理することが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【特許文献１】特表２０００−５０６７３８号公報（第１０頁２０〜２３行等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、例えば、β−ＴＣＰのような材質からなる生体組織補填材は、骨のように、再生後の強度を高く保つ必要がある生体組織を補填する場合には、気孔率を小さくしていく必要があるが、気孔率が小さくなればなるほど、播種された細胞は気孔内部に入り込み難くなるという問題がある。すなわち、気孔が小さくなると、細胞自体の粘性や接着性により気孔内に細胞が入って行き難くなる。したがって、例えば、所定の大きさの生体組織欠損部を補填するために、該欠損部に合致するような比較的大きなブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体からなる生体組織補填材においては、播種された細胞を生体組織補填材の内部まで浸透させることが困難であった。
【０００６】
一方、細胞を気孔内に進入させ易くするために、細胞を含む液体の粘性を低くすることも考えられるが、粘性が低いと細胞が気孔内に留まり難くなり、細胞が生体組織補填材の気孔内壁に付着する前に生体組織補填材の外部に流れ出てしまうことにもなる。細胞が気孔内に入り込み易く、かつ、流出し難いように細胞を含む液体の粘性を調整することは極めて困難であった。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、微細な気孔にも細胞を浸透し易くしながら、気孔内から流出し難くして、生体組織補填材の内部からも細胞を成長させることができる生体組織補填体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、少血小板血漿を多孔性材料に導入してなる生体組織補填材を提供する。
本発明によれば、多孔性材料内に導入された少血小板血漿(ＰＰＰ：platelet poor plasma)が、クエン酸ナトリウム等のような塩化カルシウム等によってゲル化する材料を含んでいるので、細胞とともに塩化カルシウム等を導入することで、ＰＰＰをゲル化させて、細胞を多孔性材料の気孔内に保持することができる。
【０００９】
すなわち、細胞および塩化カルシウム等を含む液体を生体組織補填材の気孔内に浸透させるときに、比較的低い粘性に抑えることができる。したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。細胞は、気孔内に滞留させられることによって、ＰＰＰのゲル中に保持され、気孔内部に留まり、もしくは、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。その結果、本実施形態に係る生体組織補填材が比較的大きなブロック状であっても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。
また、ＰＰＰはＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ等の骨芽細胞の分化を抑制する血小板由来の成長因子をほとんど含まないので、ゲル内に留められた細胞を非常に高い効率で活性化させることが可能となる。
【００１０】
また、本発明は、ＰＰＰおよび細胞を含む液体を多孔性材料内に導入し、ＰＰＰをゲル化させてなる生体組織補填体を提供する。
本発明によれば、ＰＰＰ内に含まれるフィブリノーゲンから作られるフィブリンの３次元構造により細胞を活性化させ、かつ、ＰＰＰに細胞の分化を抑制する血小板由来の成長因子が含まれていないことによって、ゲル内に留められた細胞を非常に高い効率で活性化させることが可能となる。したがって、生体組織欠損部等に移植することにより、欠損部を早期に修復することができる。
【００１１】
また、本発明は、ＰＰＰ、塩化カルシウムおよび細胞を含む液体を、多孔性の生体組織補填材に導入し、導入後に前記液体をゲル化させる生体組織補填体の製造方法を提供する。
本発明によれば、ＰＰＰと塩化カルシウムとの作用により、細胞を含む液体が生体組織補填材に導入された後にゲル化させられるので、生体組織補填材への導入時、すなわち、細胞を含む液体が生体組織補填材の気孔内に浸透するときには、比較的低い粘性に抑えることができる。したがって、導入時には、比較的高い流動性により気孔内への浸透を促進し、一旦導入された後には、粘性の高いゲル状に変化させて、気孔内に細胞を留まらせることが可能となる。細胞は、気孔内に滞留させられることによって、付近の気孔内壁に付着し、活性化させられて、十分に生体組織へと分化することができる。その結果、比較的大きなブロック状の生体組織補填材においても、内部まで十分に成長した細胞を有する生体組織補填体を製造することができる。
【００１２】
上記発明においては、細胞と少血小板血漿とを含む液体に、該液体を生体組織補填材に導入する前に、塩化カルシウムを添加することが好ましい。このようにすることで、塩化カルシウムが添加されると、緩やかにゲル化を開始するＰＰＰを含む液体の性質を利用して、細胞が生体組織補填材の内部に浸透するまで流動性を保ち、気孔内に到達した適当な時期に流動性をなくして留まらせることが可能となる。
【００１３】
また、上記発明においては、塩化カルシウムとともにトロンビンを添加し、生体組織補填材の形態に合わせて、添加するトロンビンの量を調節することとしてもよい。これにより、例えば、気孔が細かい生体組織補填材に対しては、トロンビンの量を少なくして凝固反応を遅くすることにより、ゲル化速度を遅くすることができ、気孔が比較的大きな生体組織補填材に対しては、トロンビンの量を多くして凝固反応を促進し、ＰＰＰと塩化カルシウムとの反応によるゲル化を早めることができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記細胞が、デキサメタゾン存在下で培養された細胞であることが好ましい。
本発明によれば、細胞がデキサメタゾンの存在下で初期培養の段階から培養されることにより、骨芽細胞等の前駆細胞への分化能が維持される。そしてデキサメタゾン存在下で培養された細胞が、ＰＰＰを含む液体とともに生体組織補填材内に導入され、ＰＰＰをゲル化させて生体組織補填材の気孔内に留まらせることにより、気孔内において細胞を活性化させた状態に維持して、生体組織の形成を促進することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体組織補填材への細胞の浸透性を高めかつ生体組織補填材内部に細胞を滞留させることを可能として、細胞を生体組織補填材の内部においても活性化させて、十分に成長させた生体組織補填体を提供することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明に係る生体組織補填材、生体組織補填体およびその製造方法の一実施形態について説明する。
本実施形態に係る生体組織補填材は、多孔性材料にＰＰＰを導入することにより構成されている。多孔性材料は、例えば、ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体である。ＰＰＰは、血液を遠心分離し、可及的に血球成分および血小板を除去したものを使用する。
【００１７】
このように構成された本実施形態に係る生体組織補填材によれば、該生体組織補填材に細胞を播種する際に、細胞浮遊液内に塩化カルシウムを添加しておくことにより、生体組織補填材の気孔内において、ＰＰＰに含有されているキレート剤であるクエン酸ナトリウムを塩化カルシウムで中和反応することによりゲル化させることができる。したがって、ゲル化した細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の本実施形態に係る生体組織補填体を製造することが可能となる。
【００１８】
また、ＰＰＰ内においては、フィブリノーゲンから作られるフィブリンの３次元構造により、細胞が活性化させられる。さらに、ＰＰＰ内に、細胞の分化を抑制するような血小板由来の成長因子が含まれていないために、気孔内壁に付着し、あるいはゲル中に保持された細胞の分化が促進され、細胞が高い活性を維持したまま成長させられることになる。したがって、生体組織の欠損部に移植された後、早期に欠損部を修復可能な生体組織補填体を製造することができる。
【００１９】
次に、本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
この製造方法は、図１に示されるように、まず、例えば、骨髄細胞から取り出した間葉系幹細胞を、培養容器内に所定の培養液とともに投入し、一定の培養条件に維持することにより培養する（ステップＳ１）。
【００２０】
培養液は、例えば、ＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle's
Medium)および抗生剤を任意の配合比率で混合したものである。また、培養条件は、例えば、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％である。
【００２１】
この培養の過程（ステップＳ１）においては、定期的にあるいは必要に応じて培養液を交換し（ステップＳ２，Ｓ３）、細胞の成長に合わせて、培養容器も大きいものへと変更していく（ステップＳ４，Ｓ５）。
【００２２】
また、少なくとも１回の培養容器の変更を行いつつ培養された細胞が、必要な細胞数まで増殖させられると（ステップＳ６）、再度、培養容器から剥離されるとともに、細胞どうしの結合も切り離されてバラバラに分離される（ステップＳ７）。その後、バラバラに分離された細胞は、所定の溶液と混合された後に、β―ＴＣＰ多孔体ブロックからなる生体組織補填材に播種される（ステップＳ８）。
【００２３】
図中、符号Ｓ９は分化ステップであり、ある程度増殖した間葉系幹細胞に、デキサメタゾンのような分化誘導因子を添加する。これにより、間葉系幹細胞が、所望の生体組織、例えば、骨芽細胞に分化され、生体組織補填体が製造される。分化ステップＳ９は、図１のように細胞の生体組織補填材への播種の前に、培養中に行うことにより、ある程度、生体組織へ分化誘導された細胞を生体組織補填材に播種することが好ましい。また、符号Ｓ１０は、製造された生体組織補填体に含まれている細胞の状態を評価する評価ステップである。
【００２４】
上記播種ステップＳ８においては、図２に示されるように、バラバラに分離された細胞が、まず、培養液と混合される（ステップＳ８１）ことにより、所定濃度の細胞浮遊液が構成される。培養液は、上述した培養に使用される培養液と同様でよい。細胞浮遊液は、その後に添加されるＰＰＰ等の他のゲル化可能材料の量を考慮して、細胞を多く含む高い濃度に設定されている。次いで、この細胞浮遊液に、ＰＰＰを添加する（ステップＳ８２）。ＰＰＰの添加量は、フィブリノーゲンの濃度がおおよそ２〜４５ｍｇ／ｍｌとなる程度の量でよい。
【００２５】
次に、細胞の播種に先立って、細胞を播種する生体組織補填材を準備しておく。生体組織補填材は、例えば、ブロック状のβ−ＴＣＰ多孔体である。そして、上記のようにして構成されたＰＰＰを含む細胞浮遊液に、塩化カルシウム溶液を添加する（ステップＳ８３）。添加する塩化カルシウム溶液は、ＰＰＰに対しておおよそ０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｏｌ／ｌの濃度となるように塩化カルシウムを溶解させたものである。
【００２６】
ＰＰＰにはクエン酸ナトリウムが含まれているので、添加された塩化カルシウムとクエン酸ナトリウムとが反応してゲル化が開始される。ゲル化の反応は一般に緩やかであり、粘性が高まるまでに数分程度かかるので、塩化カルシウムを添加した後には、即座に、ピペッティングにより生体組織補填材に播種する（ステップＳ８４）。
【００２７】
塩化カルシウム添加直後であれば、ゲル化は進行しておらず、細胞浮遊液の粘性は低い状態に維持されている。したがって、細胞は、比較的容易に生体組織補填材の気孔内に浸透していくことが可能となる。そして、細胞が生体組織補填材の中心まで浸透する頃には、クエン酸ナトリウムと塩化カルシウムとのゲル化反応が進行し、細胞浮遊液はゲル化させられて粘性が急激に上昇する。
【００２８】
これにより、ゲル化された細胞浮遊液内に含まれている細胞は、生体組織補填材の気孔内に滞留させられる。その結果、細胞は、生体組織補填材外に流出することなく気孔内に留まり、近接する気孔の内壁に付着して成長する。これにより、生体組織補填材の内部にも細胞が付着した状態の生体組織補填体が製造されることになる。
【００２９】
このように、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材の気孔内に細胞を浸透させる浸透段階においては、細胞浮遊液の流動性を高く維持することにより気孔内に円滑に浸透させ、細胞が気孔内部まで到達したときに細胞浮遊液をゲル化させることにより流動性を失わせるので、簡易に、細胞を生体組織補填材の内部にも付着させることができる。
【００３０】
この場合において、本実施形態に係る製造方法によれば、ゲル化可能材料としてＰＰＰを採用しているので、ＰＰＰに含まれているフィブリノーゲンにより形成されるフィブリンの３次元的な足場の作用により、生体組織補填材に付着した細胞の活性化を促進することができる。したがって、簡易に気孔の内部に付着させて、内部から細胞を３次元的に成長させることができるとともに、細胞の活性化を促進して、組織再生を効率的に行うことができる生体組織補填体を製造することができる。また、ＰＰＰには、血小板塊その他の細胞の活性化を阻害する物質が含まれていないので、ゲル内に留まる細胞を非常に高い活性に維持することができる。
【００３１】
また、本実施形態に係る製造方法によれば、気孔内に浸透させられた細胞が、ゲル化した細胞浮遊液によって気孔内に保持されるので、従来必要であった、細胞を生体組織補填材に付着させるための培養工程を省略することができるという効果もある。すなわち、導入直後の細胞は生体組織補填材の気孔内壁に付着するまでに時間がかかるため、培養容器内に静置して、所定時間培養する必要があった。しかし、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、ゲル化した細胞浮遊液によって細胞が気孔内から流出することが禁止されるので、静置する必要がない。したがって、細胞を生体組織補填材に付着させるための静置培養工程を不要とし、あるいは短縮することができるので、製造効率を高め、製造時間を短縮することができる。
【００３２】
さらに、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填体は、細胞が気孔内に保持され続けるので、生体組織欠損部への補填前および補填後においても、細胞が生体組織補填材の外部に流出せず、効率よく組織再生を行うことができる。
【００３３】
なお、本実施形態においては、細胞浮遊液にＰＰＰを添加した溶液に、塩化カルシウム溶液を添加することによりゲル化させる方法を採用した。添加するトロンビン、塩化カルシウムの量を適宜調節することにより、ゲル化の程度、すなわち、ゲル化した後の粘性の大小、ゲル化する速度の大小を調節することができる。また、ＰＰＰに適度に含まれるフィブリノーゲンによって形成されるフィブリンにより細胞浮遊液内の血液成分が凝固され、細胞浮遊液の粘性はさらに高められることになる。
【００３４】
添加する塩化カルシウム量や適度なトロンビンの量は、細胞を播種すべき生体組織補填材の形態に応じて設定することにしてもよい。すなわち、気孔が大きく細胞が流出しやすい生体組織補填材に対しては、比較的早期にゲル化が開始され、かつ、より高い粘性のゲル状になるように塩化カルシウムを増やすことが考えられる。また、気孔が細密で粘性が高いと細胞浮遊液が浸透して行きにくい生体組織補填材に対しては、比較的ゆっくりしたゲル化速度でよく、最終的なゲルの粘性も低く設定してよい。したがって、このような場合には、ＰＰＰ自体に含まれるトロンビン量のままで、塩化カルシウムの添加量は少なくてよい。
【００３５】
また、ＰＰＰ自体は患者から採取するものであるため、ゲル化速度にも個人差がある。したがって、採取されたＰＰＰの成分分析により、添加する塩化カルシウム等の量を決定してもよい。
【００３６】
また、播種する細胞として、骨髄細胞から集めた間葉系幹細胞を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞等の他の体細胞を採用することにしてもよい。また、間葉系幹細胞を骨髄から採取することとしたが、これに代えて、抹消血や臍帯血から採取することにしてもよい。
【００３７】
また、細胞を播種する生体組織補填材としては、β―ＴＣＰ多孔体に代えて、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせを用いてもよい。また、チタンのような金属であってもよい。また、形態もブロック状、顆粒状、ゲル状等任意の形態を採用してよい。
【実施例】
【００３８】
［実施例１］
次に、上記実施形態に係る生体組織補填体およびその製造方法の実施例について図３を参照して以下に説明する。
まず、ＰＰＰの採取方法について説明する。
フィッシャーラットから採血すると同時に血液保存液（ＣＰＤ液）と混合することにより凝血を防ぐ。全血とＣＰＤ液との割合は１０：１である。全血を遠沈管に入れて、３１２Ｇで１０分間遠心分離し、バフィーコートおよびそれより上層の部分を別の遠沈管に移した。これをさらに１２４８Ｇで１０分間遠心分離し、上清（９／１０の量）を採取した。これがＰＰＰである。残り１／１０が多血小板血漿（ＰＲＰ：Platelet Rich Plasma）である。
【００３９】
次に、使用した細胞について説明する。
フィッシャーラットの大腿骨骨髄より採取した間葉系幹細胞を、ＤＭＥＭおよび抗生剤を任意の配合比率で混合した培養液内で、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で１０日間培養した後、デキサメタゾン、β−グリセロフォスフェートおよびアスコルビン酸リン酸を添加し４日間分化誘導した。
【００４０】
次に、生体組織補填体について説明する。
上述したＰＰＰおよびＰＲＰに、培養した細胞を浮遊させ、２％塩化カルシウム溶液（ＰＰＰおよびＰＲＰに対し１／７の量）を加え、直ちに、１辺が５ｍｍの立方体からなるβ−ＴＣＰ多孔体に導入することにより生体組織補填体を製造した。細胞濃度は２．６×１０６／ｍｌである。製造された生体組織補填体をフィッシャーラットの皮下に移植した。
【００４１】
次に、移植結果について説明する。
ＰＰＰ細胞浮遊液およびＰＲＰ細胞浮遊液をβ−ＴＣＰ多孔体に導入した生体組織補填体を、それぞれフィッシャーラットの皮下に移植した後、３週間および６週間経過後に採取し、図３（ａ）に示すように２７分割した。分割されたＡ〜Ｄの部分について新生骨の面積率を分析した結果を図３（ｂ）および図３（ｃ）に示す。これらによれば、ＰＲＰの場合と比較してＰＰＰの場合の方が、新生骨が多く存在し、細胞の活性が高いことがわかる。
【００４２】
［実施例２］
次に、ＰＰＰとデキサメタゾンとを合わせて用いた場合の効果について説明する。
ニホンザルの大腿骨から穿刺により骨髄液を採取し、ＤＭＥＭおよびＦＢＳ１０％の培地で培養した。このとき、デキサメタゾン１０ｎＭを加えたものと加えないものとで培養した。継代を行いながら培養し、得られた骨髄細胞をβ−ＴＣＰ多孔体に播種した。
【００４３】
サンプルとしては、デキサメタゾンを加えずに培養し、移植直前（移植４日前）よりデキサメタゾン、βグリセロフォスフェート、アスコルビン酸リン酸を加えて得た骨髄細胞の細胞浮遊液を陰圧でβ−ＴＣＰ多孔体に導入したもの（ＤＥＸ−）、培養開始時からデキサメタゾンを加えて培養し、移植直前（移植４日前）よりデキサメタゾン、βグリセロフォスフェート、アスコルビン酸リン酸を加えて得た骨髄細胞の細胞浮遊液を、陰圧でβ−ＴＣＰ多孔体に導入したもの（ＤＥＸ＋ＰＰＰ−）、培養開始時からデキサメタゾンを加えて培養した骨髄細胞のＰＰＰ細胞浮遊液をβ−ＴＣＰ多孔体に導入してゲル化させたもの（ＤＥＸ＋ＰＰＰ＋）を用意した。これらのサンプルをニホンザルの背部皮下に移植し、移植後５週間経過後に回収して顕微鏡で観察した。
【００４４】
その結果を図４〜図６に示す。これらの図４〜図６において、（ａ）は１．２５倍拡大写真、（ｂ）は１０倍拡大写真をそれぞれ示している、
これらの図４〜図６によれば、（ＤＥＸ−）、（ＤＥＸ＋ＰＰＰ−）、（ＤＥＸ＋ＰＰＰ＋）の順に、β−ＴＣＰ多孔体の全域に骨組織Ｘが広がっていることがわかる。このことから、デキサメタゾンを培養開始時より添加し、およびＰＰＰを導入した生体組織補填体が骨形成に有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法における細胞の播種ステップを説明するフローチャートである。
【図３】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の実施例１を示し、（ａ）はサンプルの位置を示す模式図、（ｂ）は３週間経過後のサンプル毎の新生骨面積率をＰＲＰを含有する生体組織補填体との対比において示すグラフ、（ｃ）は６週間経過後のサンプル毎の新生骨面積率をＰＲＰを含有する生体組織補填体との対比において示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の比較例として、デキサメタゾンを添加せずに培養した細胞を用いた（ＰＰＰを用いない）場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。
【図５】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の比較例として、デキサメタゾン存在下で培養した細胞を用いた場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。
【図６】本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の実施例２を示し、デキサメタゾン存在下で培養した細胞をＰＰＰとともに用いた場合の骨組織の形成状態を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００４６】
Ｓ８  播種ステップ
Ｓ８２  ＰＰＰ添加ステップ
Ｓ８３  塩化カルシウム添加ステップ
Ｓ８４  細胞播種ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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