(57)【要約】【課題】肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤をスクリーニングする方法を提供する。また、これらの疾患に有効な治療剤または予防剤を提供する。【解決手段】ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を検出できる系に被検物質を存在させて測定することにより、該結合または該反応の阻害物質を選択する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング法、ならびに該スクリーニング法により選択されたこれらの疾患の治療または予防剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を検出できる系に被検物質を存在させて、該結合または該反応の有無もしくは程度を測定する工程を含む、該被検物質による該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度の測定法。
【請求項２】
被検物質非存在下での測定結果と比較する工程をさらに含む、請求項１記載の測定法。
【請求項３】
ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を測定するに際し、先にヒスタミンレセプターＨ４に被検物質を接触させてから該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度を測定する、請求項１または２記載の測定法。
【請求項４】
ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を測定するに際し、先にケモカインＣＣＬ１６に被検物質を接触させてから該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度を測定する、請求項１または２記載の測定法。
【請求項５】
ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無または程度を検出できる系を用いた請求項１から４のいずれかに記載の測定法。
【請求項６】
ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞が、哺乳類の好酸球である請求項５記載の測定法。
【請求項７】
前記哺乳類が、ヒトまたはマウスの好酸球である請求項６記載の測定法。
【請求項８】
ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞が、ヒスタミンレセプターＨ４の遺伝子が導入された組換え体細胞である請求項５記載の測定法。
【請求項９】
前記組換え体細胞が、ヒスタミンレセプターＨ４の遺伝子が導入されたマウスプレＢリンパ球系細胞株Ｌ１．２の組換え体細胞である請求項８記載の測定法。
【請求項１０】
ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応が、細胞遊走反応である請求項５から９のいずれかに記載の測定法。
【請求項１１】
ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応が、細胞内カルシウム濃度上昇反応である請求項５から９のいずれかに記載の測定法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の測定法により該結合または該反応の阻害物質を選択する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、および該試験動物における血中の好酸球増多の抑制を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、および該試験動物における骨髄中の好酸球減少の抑制を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を試験動物に導入してこれを発現させる工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、および該試験動物における血液中の好酸球増多の抑制を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を試験動物に導入してこれを発現させる工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、および該試験動物における骨髄中の好酸球減少の抑制を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物の臓器または組織にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、およびケモカインＣＣＬ１６を投与した該試験動物の臓器または組織における好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞のいずれかの集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を試験動物に導入してこれを発現させる工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、およびケモカインＣＣＬ１６を発現する該試験動物の臓器または組織における好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞のいずれかの集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
試験動物にヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組換え体細胞を投与する工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物の臓器または組織にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、およびケモカインＣＣＬ１６を投与した該試験動物の臓器または組織における該組換え体細胞の集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を試験動物に導入してこれを発現させる工程、試験動物にヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組換え体細胞を投与する工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、およびケモカインＣＣＬ１６を発現する該試験動物の臓器または組織における該組換え体細胞の集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２１】
試験動物がマウスである、請求項１３から２０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
スクリーニングする治療剤または予防剤の対象疾患が、薬剤性肝障害、肝臓移植における拒絶反応、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、および原発性好酸球増多症にともなう肝臓障害からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患である、請求項１２から２１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
スクリーニングする治療剤または予防剤の対象疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、花粉症、疱疹状皮膚炎、肺好酸球増加症、アレルギー性血管炎からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患である、請求項１２から２１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
スクリーニングする治療剤または予防剤の対象疾患が、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患である、請求項１２から２１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
スクリーニングする治療剤または予防剤の対象疾患が、二次免疫不全症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患である、請求項１２から２１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
スクリーニングする治療剤または予防剤の対象疾患が、慢性または急性の炎症を伴う炎症性疾患である、請求項１２から２１のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
ケモカインＣＣＬ１６またはケモカインＣＣＬ１６遺伝子が、ヒト由来のものである請求項１２から２６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項１２から２７のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られる、前記結合もしくは前記反応の阻害物質、試験動物における血中の好酸球増多の抑制物質もしくは骨髄中の好酸球減少の抑制物質、または試験動物の臓器もしくは組織における好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞もしくはヒスタミンレセプターＨ４発現組換え体細胞のいずれかの集積の抑制物質を有効成分として含有する、肝臓疾患、肝臓障害に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患の治療剤または予防剤。
【請求項２９】
ヒスタミンレセプターＨ４に結合性がある請求項２８に記載の治療剤または予防剤。
【請求項３０】
ケモカインＣＣＬ１６に結合性がある請求項２８に記載の治療剤または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカインＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターＨ４への結合もしくはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応を特異的に阻害する物質を選択する方法、および該選択方法による肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患に対する治療剤または予防剤の取得方法に関する。
【０００２】
また、本発明は上記選択方法により得られた物質を有効成分とする、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患の治療剤または予防剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
ケモカインは細胞遊走や活性化作用を有する活性ポリペプチドである。ケモカインは、その構造上の特徴から４つのサブファミリーに分類される。一部の例外を除き、いずれも塩基性のヘパリン結合性ポリペプチドで、分子内に非常によく保存されたシステイン残基をもっている。最初の２つのシステイン残基の配列の特徴から、ＣＣ、ＣＸＣ、Ｃ、ＣＸ３Ｃの４つのサブファミリーに分類される。また、ケモカイン遺伝子は染色体上でクラスターを形成しており、ヒトでは、一部の例外を除き、ＣＣケモカインは第１７染色体、ＣＸＣケモカイン遺伝子は第４染色体、Ｃケモカインは第１染色体、ＣＸ３Ｃケモカインは第１６染色体上に位置している。そのようなケモカインの主要なものは現在のところＣＣケモカインについては２８種（ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８）、ＣＸＣケモカインについては１６種（ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１６）Ｃケモカインについては２種（ＸＣＬ１、ＸＣＬ２）、ＣＸ３Ｃケモカインは1種類（ＣＸ３ＣＬ１）が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。これらのケモカインは７回膜貫通型レセプター類に属するケモカインレセプターに結合して遊走反応などの細胞反応を引き起こし、炎症反応や免疫調節に関与している。ケモカインレセプターも４つのサブファミリーに分類され、ＣＣケモカインレセプター（ＣＣＲ１〜ＣＣＲ１０）、ＣＸＣＲレセプター（ＣＸＣＲ１〜ＣＸＣＲ６）、Ｃケモカインレセプター（ＸＣＲ１）、ＣＸ３Ｃケモカインレセプター（ＣＸ３ＣＲ１）等が存在する。それぞれのケモカインは特定のケモカインレセプターに反応するが、１種類のケモカインが複数の種類のケモカインレセプターに反応する例や、１種類のケモカインレセプターが複数のケモカインと反応する例も認められる（非特許文献２、非特許文献３）。また白血球の細胞はその種類によって発現しているケモカインレセプターの種類が異なることが知られており、このようなケモカインの発現細胞とその分布および各白血球細胞のケモカインレセプター発現パターンの組み合わせによって、炎症や免疫調節が行なわれていると考えられている。
【０００４】
ケモカインはその構造上の特徴からバイオインフォーマティックスの手法を用いて多く種類が同定されたことや、ケモカインレセプターは７回膜貫通型レセプターの中でも構造上類似した一群を形成することが知られている。しかしながら各ケモカインとケモカインレセプターとの反応は構造上からの解析のみから同定することは困難であり、各ケモカインを実際に各ケモカインレセプター発現細胞に接触させて反応を調べることによってその反応性が検証されてきた。また、７回膜貫通型レセプターにおいては、構造上から類推された反応物質（リガンド）とは全く異種類のリガンドとの反応がみられた例もある。たとえばバクテリア由来のペプチドｆＭＬＰのレセプターであるＦＰＲ１に構造上強い相同性を示すFormyl peptide receptor-like １（ＦＭＲＬ１）はｆＭＬＰに対してごく弱い反応しか認められないが、脂質由来の生体活性成分であるLipoxin Ａ４や血清中のタンパク質であるアミロイドＡと強く反応することが示されている（非特許文献４、非特許文献５）。しかしながら、ケモカイン類のケモカインレセプター以外のレセプターに対する反応については報告された例はない。
【０００５】
ＣＣＬ１６（その他の名称としてはＬＥＣ、ＳＣＹＡ１６、ＮＣＣ−４、ＨＣＣ−４、ＬＭＣ、ＬＣＣ−１、ＣＫｂ１２、Ｍｔｎ−１とも呼ばれる）はＧｅｎｂａｎｋのＥＳＴデータベースを用いてバイオインフォーマティックスの手法で発見されたＣＣケモカインファミリーに属するケモカインで（非特許文献６、特許文献１）、肝臓での発現が認められる（非特許文献７）。ＣＣＬ１６はヒトでは遺伝子およびタンパク質共に発見されているが、マウスにおいての対応する遺伝子はｐｓｅｕｄｅ−ｇｅｎｅであるためマウスではＣＣＬ１６タンパク質が発現されないとされている（非特許文献８）。また、ＣＣＬ１６はヒト肝臓組織での免疫染色によって、肝臓実質細胞および胆管上皮細胞において細胞内に多量に貯蓄されていることが示され、またヒト血清中にも１０ｎＭ程度が存在することが知られている（非特許文献９）。さらに、ＩＬ−１０によって刺激された単球がＣＣＬ１６を発現することが知られている（非特許文献１０）。ＣＣＬ１６はケモカインレセプターＣＣＲ１およびＣＣＲ８（非特許文献１１）、またはＣＣＲ１、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５（非特許文献８）との弱い反応性が示されているが、生理的役割または病態での作用については不明であった。
【０００６】
ＣＣＬ１６は肝臓以外では、脾臓・胸腺などの免疫に関連する臓器においても発現が認められる（非特許文献１２）。ＣＣＬ１６はヒトの単球・リンパ球・樹状細胞（ＤＣ）などの免疫の中枢となる細胞に対して遊走を誘導する（非特許文献１０、非特許文献１３、非特許文献１４）。
【０００７】
ＣＣＬ１６は、リポポリサッカライドやインターフェロンγで刺激したヒトの活性化単球においても発現が誘導されることが示されており（非特許文献１０、非特許文献１２）、また最近の報告ではＣＣＬ１６は、マウス腹腔マクロファージの細胞障害活性の亢進やＣＣＬ２・ＩＬ−１２などの炎症性のケモカインやサイトカインを誘導すること、およびＣＣＬ１６で活性化されたマウス腹腔マクロファージは抗原提示能が亢進して細胞障害性Ｔリンパ球の分化を強く誘導することが示されている（非特許文献１５）。これらのことはＣＣＬ１６がいわゆるＴｈ１型の免疫反応に関与している可能性を示唆している。なお、Ｔｈ１型免疫反応の異常亢進は、自己免疫疾患や炎症性疾患などを引き起こすことが知られている。
【０００８】
それに対して、マウスに移植した固形腫瘍（ガン）の中にＣＣＬ１６の遺伝子を導入して発現させると、Ｔリンパ球や樹状細胞およびマクロファージが集積されるが、これらの細胞は抗腫瘍効果を示さないという報告がなされ、それらの細胞を解析した結果、マクロファージはＴＮＦやＩＬ−１２を産生しないＭ２型であり、樹状細胞はＩＬ−１２を産生しないＤＣ２型または未熟型であったという結果が示されている（非特許文献１６）。このことはＣＣＬ１６によって集積した免疫担当細胞は、Ｔｈ２型の免疫反応または免疫抑制状態にあると考えられる。Ｔｈ２型の免疫反応または免疫抑制状態が関与する疾患としては、アレルギーや免疫不全症などが挙げられる。さらにこの報告ではマウスに移植した固形腫瘍（ガン）の中にＣＣＬ１６の遺伝子を導入して発現させ、その後にＣｐＧおよび抗ＩＬ−１０抗体というＴｈ１型の免疫を誘導する物質を投与すると、非常に強力な抗ガン作用が認められている。このことは、ＣＣＬ１６によって集積したＴｈ２型または免疫抑制型となっている免疫担当細胞が、強力なＴｈ１型への刺激が存在する場合には、Ｔｈ１型の免疫担当細胞に分化して強力な細胞・組織破壊や炎症を惹起するものと考えられる。
【０００９】
このように、ＣＣＬ１６は生体の免疫調節にかかわる重要な分子と考えられ、免疫異常による疾患、たとえばアレルギー、免疫不全症、悪性腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患などとの関連が推定されるが、現在のところその作用や調節の機構などは不明であり、治療などへの応用の方策は示されていない。
【００１０】
ヒスタミンはアミノ酸ヒスチジンよりヒスチジン脱炭酸酵素によって作られる生体内アミンで、アレルギーなどの反応に関与している。ヒスタミンの反応は細胞上のヒスタミンレセプターを介して行なわれる。ヒスタミンレセプターは現状４種類（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）が知られており、それらは総て７回膜貫通型レセプターに属している。ヒスタミンレセプターＨ４は最近発見された新規なレセプターであり、好酸球および肥満細胞で発現していることが知られている（非特許文献１７、非特許文献１８）。また、古くより知られていたヒスタミンによる好酸球での細胞内カルシウム濃度上昇反応および遊走反応（非特許文献１９、非特許文献２０）において、ヒスタミンレセプターＨ４が関与していることが示された（非特許文献２１）。また、アレルギー性の疾患にヒスタミンレセプターＨ４が関与していると考えられている（非特許文献２２）。しかしながら、ヒスタミンレセプターＨ４を介しての反応にはかなり高濃度のヒスタミンが作用する必要がある。このことはアレルギー反応を起こしている局所などで大量のヒスタミンが肥満細胞から放出されている状態ではヒスタミンレセプターＨ４を介した反応が起こるものと考えられるが、ヒスタミンは放出後にヒスタミンデアミネースなどの作用で速やかに活性を失うことを考えると、骨髄などから好酸球を誘導するなどの作用との関係については説明できない。またヒスチジン血症の患者において血中の好酸球量が増えるとの報告も無いことから、ヒスタミンによる骨髄からの好酸球の誘導や疾患臓器への遊走反応との関係については知られていない。
【００１１】
また、ヒスタミンレセプターＨ４は好酸球および肥満細胞以外にも好中球、好塩基球、樹状細胞、皮膚のランゲルハンス細胞、Ｔリンパ球などの免疫系の細胞に発現が認められ、アレルギー反応や炎症反応に関与していると考えられている（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）。
【００１２】
さらに、最近の報告として、ヒトの単球からＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦで分化させた樹状細胞においてはヒスタミンレセプターＨ４の発現が亢進すること、該樹状細胞をヒスタミン等のヒスタミンレセプターＨ４のアゴニスト存在下でＩＬ−１２を誘導する刺激を行ってもＩＬ−１２を産生が抑制されるが、ＩＬ−１０の産生は抑制されないことが示された（非特許文献２７）。このことはヒト樹状細胞の分化の過程においてヒスタミンレセプターＨ４を介した細胞のシグナルは、樹状細胞がＴｈ１型の免疫を誘導するＤＣ１型の樹状細胞に分化することを阻害し、Ｔｈ２型の免疫または免疫抑制状態を誘導するＤＣ２型または未熟型の樹状細胞の形質を維持させることを示している。Ｔｈ２型の免疫反応または免疫抑制状態が関与する疾患としては、アレルギーや免疫不全症などが挙げられる。しかし、この樹状細胞におけるＩＬ−１２の産生抑制抑制には２４時間程度高濃度のヒスタミン等で前処理を行い、さらに高濃度のヒスタミン等が存在した状態でＩＬ−１２産生誘導刺激を行った結果であり、血中での半減期が１〜２分程度といわれるヒスタミンが生体内で長時間・高濃度で維持されるかについては疑問がある。
【００１３】
多くの肝臓疾患においては古くより好酸球と好酸球顆粒より放出されるMajor Basic Protein（ＭＢＰ）やeosinophilcationic protein（ＥＣＰ）などによる組織障害が注目されている。例えば、薬剤性肝障害の診断においては血中の好酸球増加は重要な指標となっており、肝臓組織への浸潤も認められる（非特許文献２８、非特許文献２９）。また、肝臓移植患者での臓器拒絶においては、血中の好酸球増多、組織中の好酸球浸潤、組織中へのＭＢＰやＥＣＰの放出などが認められ、臓器拒絶の原因として重要と考えられている（非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２）。そのほか原発性胆汁性肝硬変（非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５）および原発性硬化性胆管炎（非特許文献３６、非特許文献３７）においても、好酸球増多や組織中の好酸球および顆粒タンパク質と病態との関係が示されている。また、好酸球増多症が認められた患者において肝臓障害が生じた例も報告がある（非特許文献３８、非特許文献３９）。
【００１４】
以上のことから肝臓疾患と好酸球増多および組織への好酸球浸潤は深く関係していることが分かる。好酸球増多に対する治療としては現状ステロイドの投与が行なわれているが、ステロイドは患者の免疫全体を抑制することから感染などの副作用が懸念される。そのため肝臓疾患および肝臓疾患に関連する好酸球増多を特異的に抑制する薬剤の開発が求められている。
【００１５】
さらにＢ型肝炎またはＣ型肝炎などのウイルス性肝炎においては、細胞障害性Ｔリンパ球や樹状細胞の機能とウイルス排除または組織破壊との関連が関心となっている。一般に、ＤＣ２型の樹状細胞や細胞障害性Ｔリンパ球の活性が低下している場合には、ウイルスを排除できずキャリアーとなり、ＤＣ１型の樹状細胞の増加や細胞障害性Ｔリンパ球の活性が極端に高まると急激な組織障害を起こして劇症化すると考えられている。このようなウイルス性肝炎などにおける免疫の調節においてもそのメカニズムは不明であり、その解明と治療への応用が望まれている。
【００１６】
また好酸球はアレルギー性疾患において中心的な役割を果たしているおり、血中の好酸球増多や組織中への好酸球浸潤による病態のメカニズムなどについて注目されている。特にＴｈ２リンパ球が産生するＩＬ−５やＩＬ−１０の関与などについても盛んに研究されている。アレルギー性疾患においても、好酸球の骨髄からの誘導や組織への浸潤を特異的に抑制する薬剤の開発が求められている。
【００１７】
アレルギーにおいては一般にＴｈ２型免疫が亢進していると考えられており、その制御においてはＤＣ２型または未熟型の樹状細胞の関与が示唆されている。ＤＣ２型の樹状細胞はＴｈ２型のＴリンパ球の画分を増大させ、そのようなＴｈ２型Ｔリンパ球から産生されたＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などのサイトカインやＴｈ２型リンパ球からの指令で産生されるＩｇＥ型抗体などはアレルギーの病態形成において重要な役割を演じている。
【００１８】
アレルギーにおいては、好酸球、Ｔｈ２リンパ球、樹状細胞、または産生されるサイトカインや抗体などの役目についての情報は集まりつつあるものの、そのような免疫の制御がどのように行われているのかは十分には解明されておらず、この点についても今後のアレルギー治療における課題として残されている。
【００１９】
【特許文献１】特表平１０−５１０４３０号公報
【非特許文献１】サイトカイン・ファミリー・データベース（Cytokine Family Database）http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/
【非特許文献２】ズロトニック＆義江  イミュニティ（Immunity）（USA）  2000年
【非特許文献３】烏山編  免疫学イラストマップ  2004年  羊土社
【非特許文献４】フィオーレ（Fiore）等  ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（The Journal of Experimental Medicine）（USA）1994年  180巻  ｐ253-260
【非特許文献５】ス（Su）等  ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（ The Journal of Experimental Medicine）（USA）189巻  ｐ395-402
【非特許文献６】Naruse等  ジェノミックス（Genomics）（USA）1996年  34巻  ｐ236-240
【非特許文献７】Shoudai等  バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica acta）（Netherlands）  1998年  1396巻  ｐ273-277
【非特許文献８】Fukuda等  ディーエヌエー・アンド・セル・バイオロジー（DNA and Cell Biology）（USA）  1999年  18巻  ｐ275-283
【非特許文献９】野見山等  インターナショナル・イミュノロジー（International Immunology）日本免疫学会発行  2001年  13巻  ｐ1021-1029
【非特許文献１０】ヘンドリック（Hendrick JA）等  ブラッド（Blood）（USA）  1998年  91巻  p4242
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【非特許文献１２】ヨーロピアン・バイオインフォーマティックス・インスティチュート（Europian Bioinformatics Institute）・ユニプロット（UniProt）Query：CCL16_Human  http://www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/uniProtView.do?proteinId=CCL16_HUMAN&pager.offset=null
【非特許文献１３】ヨン（Youn）等  バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）  （USA）1998年  247巻  ｐ214-222
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【非特許文献１５】ジャーナル・オブ・リューコサイト・バイオロジー（Journal of Leukocyte Biology）（USA）  2004年  75巻  ｐ135-142
【非特許文献１６】グイドゥッチ（Guiducci）等  キャンサー・リサーチ（Cancer Research）（USA）  2005年  65巻  ｐ3437-3446
【非特許文献１７】Oda等  ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）（USA）  2000年  275巻  ｐ36781-36786
【非特許文献１８】Liu等  モレキュラー・ファーマコロジー（Molecular Pharmacology）（USA）  2001年  59巻  ｐ420-426
【非特許文献１９】ライブル（Raible）等  ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Journal of Immunology）（USA）1992年  148巻  ｐ3536-3542
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明が解決しようとする課題は、従来のケモカインとケモカインレセプターとの反応という概念を超えて、ケモカインによる好酸球の誘導に関する新規の機構を解明することである。また、別の課題としては、従来不明であった肝臓疾患における好酸球増多および好酸球の組織浸潤の機構を解明して、その治療のための方策を提供することにある。さらに、本発明の課題は肝臓疾患およびそれに関する好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、ならびに炎症性疾患の予防剤または治療剤を取得する方法を提供することである。さらに、そのような予防剤または治療剤を提供することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、ケモカイン類のヒスタミンレセプターに対する反応性について解析を行っている過程で、ケモカインＣＣＬ１６が予想外にもヒスタミンレセプターＨ４と特異的に反応することを見出した。また、肝臓疾患やアレルギーの病態と深く関連のある好酸球においてはヒスタミンレセプターＨ４が発現することが見出された。さらに、ケモカインＣＣＬ１６は実際に好酸球での遊走反応を誘導すること、またケモカインＣＣＬ１６を投与した動物において骨髄より好酸球を誘導して該動物を好酸球増多の状態になし得ること見出した。
【００２２】
以前の研究において、本発明者らはケモカインＣＣＬ１６が肝臓の実質細胞および胆管上皮細胞内に多く蓄積され、このような細胞が一部でも破壊された場合には血中に大量のケモカインＣＣＬ１６が放出されるであろうことまでは予見していた。このことから、肝臓疾患において少なくとも一部の組織の障害によって肝臓よりケモカインＣＣＬ１６が放出されることによって、骨髄より好酸球が誘導されると考えられる。また、循環している好酸球が肝臓組織に浸潤して組織破壊が起こることが肝臓疾患の病態形成において重要な役割を担っていると考えられる。さらに本発明者らはヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組変え体細胞およびヒトまたはマウスの好酸球を用いた検討によって、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンは調べたすべてにおいて同様の反応を引き起こすことを示しており、ＣＣＬ１６はヒスタミンと同等のヒスタミンレセプターＨ４に対するアゴニストであることを見出した。ヒスタミンが血中での半減期が１〜２分程度とされるのに対して、ケモカインＣＣＬ１６は正常人においても血中に１０ｎＭ程度存在することが考えられていて、よりヒスタミンレセプターＨ４と接する機会の多いリガンドであるとも考えられる。また活性化マクロファージなどにおいてはＣＣＬ１６を発現することが知られており、局所的にケモカインＣＣＬ１６の濃度が上昇することによって、好酸球、好中球、肥満細胞、好塩基球、樹状細胞、Ｔリンパ球などの免疫系の細胞の集積に関与しているものと思われる。また、ヒトの単球からＩＬ−４存在下で分化させた樹状細胞においてヒスタミンレセプターＨ４の発現が誘導されることからは、ケモカインＣＣＬ１６の濃度による調節のみではなく、細胞のおいてもヒスタミンレセプターＨ４の発現調節によって、ケモカインＣＣＬ１６やヒスタミンによる免疫調節を行っている可能性も考えられる。さらに、ＩＬ−４存在下でヒト単球から分化したヒスタミンレセプターＨ４発現が誘導された樹状細胞は、長時間ヒスタミン存在下で培養することで、ＤＣ２型または未熟型と思われる樹上細胞の形質をとる。このことはケモカインＣＣＬ１６がより安定的なヒスタミンレセプターＨ４のリガンドであることを考えると、免疫の中枢と考えられている樹状細胞のＤＣ２型もしくは未熟型への分化および維持に関与していることが推察される。そして、そのような樹状細胞の形質は、生体における免疫をＴｈ２型もしくは免疫抑制型に調節するものと考えられ、そのような状態が異常に亢進した状態ではアレルギー疾患や免疫不全症などの疾患、ウイルス性肝炎のウイルスキャリア状態の維持、また悪性腫瘍への生体の抗がん作用の低下に結びつくことが類推される。また、ＣＣＬ１６の作用によって集積し、Ｔｈ２型もしくは免疫抑制型に維持されていた免疫担当細胞も、Ｔｈ１型の免疫を誘導する刺激が起こった場合にはＴｈ１型の免疫担当細胞に分化することが示されている。このような状況下では細胞障害性Ｔ細胞などによる細胞および組織の障害性が亢進し、生体の悪性腫瘍への攻撃性は亢進するものの、それ以外に細胞・組織障害性の疾患、たとえば自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス性肝炎における劇症化などに関与する可能性がある。以上のこのことからケモカインＣＣＬ１６は、生体内での安定性の高いヒスタミンレセプターＨ４のリガンドとして、樹状細胞・単球／マクロファージ・細胞障害性Ｔリンパ球・肥満細胞などの遊走・機能の調節に関与することで、ガン・アレルギー・免疫不全症・炎症などの病態に関与しているものと考えられる。これらの知見をもとに、本発明者らは以下の発明に到達した。
【００２３】
すなわち、本発明は、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を検出できる系に被検物質を存在させて、該結合または該反応の有無もしくは程度を測定する工程を含む、該被検物質による該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度の測定法に関する。
【００２４】
前記測定法は、被検物質非存在下での測定結果と比較する工程をさらに含むことが好ましい。
前記測定法は、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を測定するに際し、先にヒスタミンレセプターＨ４に被検物質を接触させてから該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度を測定してもよい。
【００２５】
または、前記測定方法は、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を測定するに際し、先にケモカインＣＣＬ１６に被検物質を接触させてから該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度を測定してもよい。
前記測定法は、ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無または程度を検出できる系を用いることが好ましい。
【００２６】
前記測定法において、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞は、哺乳類の好酸球であることが好ましい。中でも、ヒトまたはマウスの好酸球がより好ましい。
前記測定法において、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞はヒスタミンレセプターＨ４の遺伝子が導入された組換え体細胞であることが好ましい。中でも、ヒスタミンレセプターＨ４の遺伝子が導入されたマウスプレＢリンパ球系細胞株Ｌ１．２の組換え体細胞がより好ましい。
前記測定法において、ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応は、細胞遊走反応、または細胞内カルシウム濃度上昇反応であることが好ましい。
【００２７】
さらに、本発明は、前記測定法により前記結合または前記反応の阻害物質を選択する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法にも関する。
【００２８】
また、本発明は、試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、および該試験動物における血中の好酸球増多の抑制または骨髄中の好酸球減少の抑制を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。
【００２９】
また、本発明は、ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を試験動物に導入してこれを発現させる工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、および該試験動物における血液中の好酸球増多の抑制または骨髄中の好酸球減少の抑制を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。
【００３０】
また、本発明は、試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物の臓器または組織にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、およびＣＣＬ１６を投与した該試験動物の臓器または組織における好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞のいずれかの集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。
【００３１】
また、本発明は、ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を試験動物に導入してこれを発現させる工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、およびケモカインＣＣＬ１６を発現する該試験動物の臓器または組織における好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞のいずれかの集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。
【００３２】
また、本発明は、試験動物にヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組換え体細胞を投与する工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物の臓器または組織にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、およびケモカインＣＣＬ１６を投与した該試験動物の臓器または組織における該組換え体細胞の集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。
【００３３】
また、本発明は、ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を試験動物に導入してこれを発現させる工程、試験動物にヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組換え体細胞を投与する工程、該試験動物に被検物質を投与する工程、および該試験動物の臓器または組織における該組換え体細胞の集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。
【００３４】
前記スクリーニング方法において、試験動物はマウスであることが好ましい。
詳細には、前記スクリーニング方法は、薬剤性肝障害、肝臓移植における拒絶反応、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、および原発性好酸球増多症にともなう肝臓障害からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患の治療剤または予防剤のスクリーニングに適する。
【００３５】
前記スクリーニング方法は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、花粉症、疱疹状皮膚炎、肺好酸球増加症、アレルギー性血管炎からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患の治療剤または予防剤のスクリーニングにも適する。
【００３６】
前記スクリーニング方法は、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患の治療剤または予防剤のスクリーニングにも適する。
【００３７】
前記スクリーニング方法は、二次免疫不全症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患の治療剤または予防剤のスクリーニングにも適する。
【００３８】
前記スクリーニング方法は、慢性または急性の炎症を伴う炎症性疾患の治療剤または予防剤のスクリーニングにも適する。
前記スクリーニング方法において、ケモカインＣＣＬ１６またはケモカインＣＣＬ１６遺伝子は、ヒト由来のものであることが好ましい。
【００３９】
さらに本発明は、前記スクリーニング方法により得られる、前記結合もしくは前記反応の阻害物質、試験動物における血中の好酸球増多の抑制物質もしくは骨髄中の好酸球減少の抑制物質、または試験動物の臓器もしくは組織における好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞もしくはヒスタミンレセプターＨ４発現組換え体細胞のいずれかの集積の抑制物質を有効成分として含有する、肝臓疾患、肝臓障害に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患の治療剤または予防剤に関する。
前記治療剤または予防剤は、ヒスタミンレセプターＨ４またはケモカインＣＣＬ１６に結合性があるものが好ましい。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、肝臓疾患、肝臓障害に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患の治療剤または予防剤の有効成分として用いることのできる物質を選択することができる。また、本発明によれば、これらの疾患の治療剤または予防剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を検出できる系に被検物質を存在させて、該結合または該反応の有無もしくは程度を測定する工程を含む、該被検物質による該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度の測定法に関する。該測定法は、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度を検出できる系、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を検出できる系を利用するものである。このような系の具体例については後に詳しく説明する。
【００４２】
本発明の測定法では、被検物質非存在下での測定も同時に、または別個に行い、その結果と前記被験物質存在下での結果を比較することが好ましい。ここでいう被検物質非存在下での測定条件としては、被検物質が存在しないこと以外は被検物質存在下と実質的に同一条件であることが好ましい。例えば被検物質の溶液の代わりに緩衝液のみを用いたり、不活性であることが明らかな物質を対照として用いたりすることが挙げられる。
【００４３】
本発明の測定法は、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の有無もしくは程度、またはケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無もしくは程度を測定するに際し、先にヒスタミンレセプターＨ４に被検物質を接触させてから該結合または該反応の阻害の有無もしくは程度を測定してもよいし、先にケモカインＣＣＬ１６に被検物質を接触させてから測定してもよい。
【００４４】
本発明の測定法は、ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の有無または程度を検出できる系を用いることができる。その場合には、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞として、例えば哺乳類の好酸球を用いることができる。なかでもヒトまたはマウスの好酸球を用いることが好ましい。別の例としてはヒトもしくは他の哺乳動物の活性化マクロファージ、単球より分化させた樹状細胞、その他Ｔリンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞なども挙げられる。また、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞として、ヒスタミンレセプターＨ４の遺伝子が導入された組換え体細胞を用いてもよい。例えば、ヒスタミンレセプターＨ４の遺伝子が導入されたマウスプレＢリンパ球系細胞株Ｌ１．２の組換え体細胞が挙げられる。
【００４５】
また、本発明の測定法において測定されるケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応としては、例えば、細胞遊走反応、または細胞内カルシウム濃度上昇反応が挙げられる。これらの反応の測定方法については後に詳説する。
【００４６】
さらに、本発明は、前記測定法により前記結合または前記該反応の阻害物質を選択する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法にも関する。
【００４７】
本発明スクリーニング方法の別の態様としては、試験動物を用いる方法が挙げられる。そのような方法としては、例えば、試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、および該試験動物における血中の好酸球増多の抑制を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法が挙げられる。試験動物にケモカインＣＣＬ１６を投与する代わりに、ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を導入してこれを発現させた試験動物を用いてもよい。また、血中の好酸球増多の抑制を検出する代わりに、骨髄中の好酸球減少の抑制を検出してもよい。
【００４８】
また別の試験動物を用いる方法の例としては、試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物の臓器または組織にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、および該試験動物におけるケモカインＣＣＬ１６を投与した臓器または組織に好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞のいずれかの集積を検出する工程を含む、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患に有効な治療剤または予防剤のスクリーニング方法である。試験動物にケモカインＣＣＬ１６を投与する代わりに、ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を導入してこれを発現させた試験動物を用いてもよい。
【００４９】
また、試験動物にヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組換え体細胞を投与する工程、試験動物に被検物質を投与する工程、該試験動物の臓器または組織にケモカインＣＣＬ１６を投与する工程、ケモカインＣＣＬ１６を投与した臓器または組織に導入した組換え体細胞の集積を検出する工程という形で、該スクリーニング方法を実施することも可能である。試験動物にケモカインＣＣＬ１６を投与する代わりに、ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を導入してこれを発現させた試験動物を用いてもよい。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法に使用する試験動物としては、マウスが好ましい。そのほか、好酸球においてヒスタミンレセプターＨ４が発現している動物、特にヒトヒスタミンレセプターＨ４と高い類似性を示すヒスタミンレセプターを保有するブタ、ラット、モルモットなどを用いてもよい。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法における検出に利用される臓器および組織は、特に限定されるものではなく、ケモカインＣＣＬ１６が投与された臓器もしくは組織、またはケモカインＣＣＬ１６を発現する臓器もしくは組織であれば、どのような部位のものでもよい。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法は、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患からなる群から選ばれた一つまたは複数の疾患の治療剤または予防剤のスクリーニングに適する。肝臓疾患としては、例えば薬剤性肝障害、肝臓移植における拒絶反応、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、および原発性好酸球増多症に伴う肝臓障害が挙げられる。また、アレルギー性疾患としては、例えばアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、花粉症、疱疹状皮膚炎、肺好酸球増加症、アレルギー性血管炎が挙げられる。また、悪性腫瘍の例としては、上皮性細胞由来の悪性腫瘍として、例えば肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌が挙げられ、造血器由来の悪性腫瘍として、例えば白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫が挙げられ、非上皮性細胞由来（肉腫）として、例えば骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫などが挙げられる。また免疫不全症としては、特に二次免疫不全症が挙げられ、例えば遺伝および代謝疾患（尿毒症、糖尿病、栄養不良、蛋白喪失性腸症、またはネフローゼ症候群）によるもの、免疫抑制因子（放射線照射、免疫抑制薬、またはコルチコステロイド）によるもの、感染症（先天性風疹、ウイルス性発疹、ＨＩＶ感染、サイトメガロウイルス感染、伝染性単核球症、急性細菌性疾患、重症のマイコバクテリア性もしくは真菌性疾患、組織球増加、またはサルコイドーシス）によるもの、浸潤性および血液学的疾患（ホジキン病、リンパ腫、白血病、骨髄腫、顆粒球減少、再生不良性貧血、または熱傷）によるもの、その他の原因（ＳＬＥ、慢性活動性肝炎、アルコール性肝硬変、加齢、抗けいれん薬、または移植片対宿主病）によるものが挙げられる。また、自己免疫疾患としては、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、全身性硬化症、多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、および自己免疫溶血性貧血が挙げられる。さらに炎症性疾患は、種々臓器および組織における慢性および急性の炎症を伴う疾患一般が含まれる。該慢性または急性の炎症とを伴う疾患としては、気管支炎、肺炎、かぜ症候群、心筋炎、心膜炎、動脈硬化症、動脈炎、静脈炎、リンパ管炎、口内炎、食道炎、胃炎、腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎炎、髄膜炎、脳炎、筋炎、腱炎、甲状腺炎、膵炎、乾癬、関節炎、歯周炎、副鼻腔炎、および蕁麻疹が挙げられる。
【００５３】
前記スクリーニング方法において用いられるケモカインＣＣＬ１６またはケモカインＣＣＬ１６遺伝子は、ヒト由来のものであることが好ましい。
【００５４】
さらに本発明は、前記スクリーニング方法により得られる、前記結合もしくは前記反応の阻害物質、試験動物における血中の好酸球増多の抑制物質もしくは骨髄中の好酸球減少の抑制物質、または試験動物の臓器もしくは組織における好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞のいずれかの集積の抑制物質を有効成分として含有する、肝臓疾患、肝臓障害に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患の治療剤または予防剤に関する。そのほか、該治療剤または予防剤は、ケモカインＣＣＬ１６の投与を受けた試験動物において、血中の好酸球増多もしくは骨髄中の好酸球減少を抑制する物質、またはケモカインＣＣＬ１６の投与を受けた試験動物の臓器または組織において、好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞のいずれかの集積を抑制する物質、あるいは試験動物にヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組換え体細胞を投与した試験動物において、該組換え体細胞の集積を抑制する物質を有効成分として用いることもできる。また、ケモカインＣＣＬ１６の投与を受けた試験動物の代わりに、ケモカインＣＣＬ１６遺伝子を導入してこれを発現させた試験動物を用いてもよい。これらの試験動物としては、マウスが好ましいが、そのほか好酸球においてヒスタミンレセプターＨ４が発現している動物、特にヒトヒスタミンレセプターＨ４と高い類似性を示すヒスタミンレセプターを保有するブタ、ラット、モルモットなどを用いてもよい。
【００５５】
また、このような治療剤または予防剤は、ヒスタミンレセプターＨ４に結合性があるものや、ケモカインＣＣＬ１６に結合性があるものが好ましい。
【００５６】
本発明の治療剤または予防剤の対象疾患は、本発明のスクリーニング方法について記載した疾患の通りである。本発明の治療剤または予防剤に関して、スクリーニングに使用されるケモカインＣＣＬ１６またはその遺伝子は、ヒト由来のものが好ましい。
【００５７】
なお、本発明の治療剤または予防剤の対象疾患がアレルギー性疾患である場合において、ある物質がヒスタミンによるヒスタミンレセプターＨ４への作用をも阻害する場合には、該阻害物質は本発明で用いる有効成分の範囲からは除かれる。
【００５８】
以下に本発明を実施するために必要とされる要素について説明する。
＜ケモカインＣＣＬ１６＞
本発明で用いるケモカインＣＣＬ１６は、上述のようにアミノ酸配列既知のケモカインであり、市販のヒトケモカインＣＣＬ１６（ヒトＣＣＬ１６）、たとえばＲ＆Ｄ社の製品（Ｃａｔ Ｎｏ． ８０２−ＨＣ）を用いることができる。また、他の方法としてはヒトＣＣＬ１６のｃＤＮＡ（Entrez Acc． No. NM004590）をコーディングする部分を含む形で発現ベクターに組み込んで、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などに導入して発現させるなど、当業者が自分で調製することもできる。この技術は当業者の技術常識に属するものにすぎないが、たとえばハービン（Harbin）著クローニング・ジーン・イクスプレッション・アンド・ピューリフィケイション・エクスペリメンタル・プロシデゥアー・アンド・プロセス・ラショナル（Cloning, Gene Expression and Protein Purification: Experimental Procedures and Process Rationale）オックスフォード大学出版（Oxford University Press）2001年記載の方法が用いられる。もしくは、ｃＤＮＡをＴ７、Ｔ３、ＳＰ６などのＲＮＡ転写プロモーターを含むベクター中に組み込んで、転写によってヒトＣＣＬ１６のｍＲＮＡを作製し、無細胞蛋白質合成系で発現させる方法、たとえばシュワルツとジェームズ（Swartz,＆James）著  無細胞タンパク質発現（Cell-Free Protein Expression）  スプリンジャー出版（Springer Publication）  2003年に記載の方法で発現させることで取得できる。また、ヒトＣＣＬ１６のアミノ酸配列を基にペプチド合成法（泉谷等  ペプチド合成の基礎と実験  丸善株式会社  1975年発行、矢島等−日本生化学会編  生化学実験講座１  タンパク質の化学ＩＶ  東京化学同人株式会社  1977年発行）や部分的な配列をペプチド合成してそのペプチドを縮合する反応（日本生化学会編  新生化学実験講座  タンパク質IV  合成および発現  東京化学同人株式会社  1991年）によっても作製することが可能である。
【００５９】
＜ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞＞
本発明で用いるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞としては、例えば遺伝子組換えによって作製された細胞、動物より取得した細胞、または培養細胞株などが挙げられる。
遺伝子組換えによって作製されたヒスタミンレセプターＨ４発現細胞は、例えば、ヒスタミンレセプターＨ４遺伝子を用いて、実施例１に示した方法によってヒスタミンレセプターＨ４を発現する組換え体細胞を取得することができる。ここで、例えば、ヒトのヒスタミンレセプターＨ４遺伝子は、後述する実施例１に示した方法、またはGenBank accession no. NM 021624に記載のＤＮＡ塩基配列を基にＰＣＲ法（チェンとジェームズ（Chen & James）著  ＰＣＲクローニングプロトコル第２版（PCR Cloning Protocols, 2nd ed.）  ヒューマナ出版（HUMANA press）2002年）やｃＤＮＡクローニング法（サンブロック、フリッチ、マニアティス著（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.）モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル  第２版（Molecular Cloning:a laboratory Manual,2nd Edn.）（USA）Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989年）を用いることで取得することが可能である。
【００６０】
また実施例１に記載の方法以外でも、当業者が用いる一般的な方法（横田および新井編集  バイオマニュアルシリーズ４  遺伝子導入と発現解析  羊土社発行  1994年、およびハービン（Harbin）著クローニング・ジーン・イクスプレッション・アンド・ピューリフィケイション・エクスペリメンタル・プロシデゥアー・アンド・プロセス・ラショナル（Cloning, Gene Expression and Protein Purification: Experimental Procedures and Process Rationale）オックスフォード大学出版（Oxford University Press）2001年）を用いて酵母、動物細胞、昆虫細胞等で発現させることが可能である。
【００６１】
本発明においてヒスタミンレセプターＨ４発現細胞として使用し得る遺伝子組換え体細胞としては、実施例１に示した方法のほかに、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＷＩＨＩ−３細胞などの哺乳類細胞やＳｆ９、Ｓｆ２１細胞などの昆虫細胞に、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、アデノウイルス法、レトロウイルス法、バキュロウイルス法など一般的な方法で遺伝子を導入することにより得られる細胞が挙げられる（横田および新井編集  バイオマニュアルシリーズ４  遺伝子導入と発現解析  羊土社発行  1994年、およびハービン（Harbin）著クローニング・ジーン・イクスプレッション・アンド・ピューリフィケイション・エクスペリメンタル・プロシデゥアー・アンド・プロセス・ラショナル（Cloning, Gene Expression and Protein Purification: Experimental Procedures and Process Rationale）オックスフォード大学出版（Oxford University Press）2001年）。組換え体細胞における発現は、一過性発現および安定性発現のどちらでも使用できる。
【００６２】
動物より取得したヒスタミンレセプターＨ４発現細胞としては、好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、または肥満細胞が挙げられる。例えば、後述する実施例６にはヒトおよびマウスの好酸球の取得方法が記載されているが、ヒスタミンレセプターＨ４の発現が確認されている樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞を用いることも可能である。これらの細胞はヒトまたはマウスのものを使うことが望ましいが、他の種の細胞を用いることも可能である。特にブタ、ラット、モルモットにおいては、ヒトに対するマウスのヒスタミンレセプターＨ４におけるアミノ酸配列のホモロジー（類似性）と比較して同等以上のホモロジーのあるヒスタミンレセプターＨ４分子をもつことが報告されていることから（ヒトヒスタミンレセプターＨ４のアミノ酸配列を用いたＦＡＳＴＡ解析結果、各ヒスタミンレセプターのEMBL Acc. No.はヒトＨ４：Ｑ９Ｈ３Ｎ８、マウスＨ４：Ｑ９１ＺＹ２、ブタＨ４：Ｑ８ＷＮＶ９、ラット：Ｑ９１ＺＹ１、モルモット：Ｑ９１ＺＹ３）、これらの種の好酸球を用いることも可能である。
【００６３】
ヒスタミンレセプターＨ４を発現している培養細胞株としては、ヒト白血病細胞株であるＨＬ−６０などを用いることが可能である。ＨＬ−６０細胞にヒスタミンレセプターＨ４が発現していることは遺伝子的および機能的に確認されており、その発現はＩＬ−５刺激によって増強されることも示されている（リュウ（Liu）等  モレキュラー・ファーマコロジー（Molecular Pharmacology）（USA）  2001年  59巻  ｐ420-426およびリン（Ling）等  ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（British Journal of Pharmacology）（UK）  2004年  142巻  p161-171）。
【００６４】
＜ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合阻害物質の評価方法＞
ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合阻害の評価は、例えば後述する実施例５に記載のように１２５Iで標識したヒトＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４発現細胞への結合を定量する系において被検物質を共存させることにより、ヒトケモカインＣＣＬ１６の結合量を低下させる効果をみることによって実施できる。ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞としては、前述の、遺伝子組換えによって作製された細胞、または動物より取得した好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球もしくは肥満細胞、または培養細胞株などを用いることができる。
【００６５】
また、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合阻害の評価は、ヒスタミンレセプターを発現した細胞を細胞の状態で用いるほか、該細胞をホモジェナイズによって破壊してレセプターが発現している細胞膜を回収して用いることによって行なうことも可能である。標識化ケモカインＣＣＬ１６として、１２５Iの他に３Ｈで標識化されたケモカインＣＣＬ１６も用いることができ、該３Ｈ標識化ケモカインＣＣＬ１６は、３Ｈ標識化されたアミノ酸を用いて上記の方法で細胞系もしくは無細胞系で発現させることによって、またはペプチド合成法によって得ることができる。これらのラジオアイソトープされたケモカインＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターへの結合量は、例えばガンマカウンターやシンチレーションカウンターを用いることで測定できる。
【００６６】
また、ケモカインＣＣＬ１６を蛍光物質または発光物質で標識してヒスタミンレセプターＨ４への結合量を測定することも可能である。ＣＣＬ１６の蛍光物質または発光物質の標識は、ハーマンソン（Hermanson）著  バイオコンジュゲート・テクニックス（BIOCONJUGATE Techniques）  アカデミック・プレス（Academic Press）発行  1996年などに記載の方法で行うことができる。蛍光物質で標識されたケモカインＣＣＬ１６の結合量は、例えば蛍光分光光度計による測定やフローサイトメトリーなどの方法が用いられる。また、発光物質で標識されたケモカインＣＣＬ１６の結合量は、例えば発光光度計やシンチレーションカウンターでの測定法などが用いられる。さらに、別のケモカインＣＣＬ１６の標識法としては、アルカリフォスファターゼやパーオキシダーゼなどの酵素を結合させることであり、それらの酵素活性を測定するための基質を反応させて各基質の性状によって発色、蛍光、発光などを測定することで結合したケモカインＣＣＬ１６量を測定できる。酵素のケモカインＣＣＬ１６への結合は、ハーマンソン（Hermanson）著  バイオコンジュゲート・テクニックス（BIOCONJUGATE Techniques）  アカデミック・プレス（Academic Press）発行  1996年などの方法を用いることができる。また、遺伝子工学的にＣＣＬ１６をコードするＤＮＡ分子とアルカリフォスファターゼなどの酵素をコードするＤＮＡ分子を使って融合タンパク質として発現させることも可能である（稗島（Hieshima）等  ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Journal of Immunology）（USA）1997年  159巻  ｐ1140-1149）。また、ケモカインＣＣＬ１６をビオチンやその類縁物質で標識して、酵素や蛍光物質や発光物質などが結合したアビジンまたはその類縁タンパク質を反応させることによって、結合量を測定することも可能である。さらに、標識されていないケモカインＣＣＬ１６を用いてヒスタミンレセプターＨ４との結合を検出することも可能である。その一つの方法は、BIACORE(R)等の表面プラズモン共鳴法による測定で、センサーに固定化されたヒスタミンレセプターＨ４発現細胞または該細胞の細胞膜に対してのケモカインＣＣＬ１６の結合を、BIACORE(R)システム（BIACORE社）などを用いて測定することができる（永田・半田編  生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法  シュプリンガー・フェアラーク東京発行  1998年）。また別の方法としては、ＢＲＥＴ法によるケモカインＣＣＬ１６の結合を検出することも可能である。この方法はヒスタミンレセプターＨ４をコードするＤＮＡとルシフェラーゼをコードするＤＮＡを、これらが融合タンパク質として発現するように遺伝子を構築して細胞に遺伝子導入し、レセプターが活性化した際に結合が認められるアレスチンにオワンクラゲの蛍光タンパク質を融合したタンパク質を発現するように作られた遺伝子を同時に細胞に導入してルシフェラーゼの発光性基質と反応させると、レセプターにケモカインＣＣＬ１６が結合したときにのみ発光基質からの光エネルギーがオワンクラゲ蛍光タンパク質に転移することで波長のシフトが起こることを測定することにより、ケモカインＣＣＬ１６の結合量を測定することが可能となる（パッカード・バイオサイエンス社  アプリケーション・ノート＃BLT-001）。
【００６７】
ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との特異的な結合を阻害する化合物の種類には大別して２種類考えられ、ひとつはケモカインＣＣＬ１６側に結合する化合物であり、もうひとつはヒスタミンレセプターＨ４に結合する化合物である。ケモカインＣＣＬ１６に結合する化合物は、先にケモカインＣＣＬ１６と化合物を接触させた後、得られた混合物を化合物による非特異的な結合の影響がないように希釈してヒスタミンレセプターＨ４との結合を調べるか、限外ろ過法などで過剰な化合物の濃度を下げた後にケモカインレセプターＨ４との結合を調べることによって確認できる。また別の方法としては、ＢＩＯＣＯＲＥなどの表面プラズモン共鳴法などによってもケモカインＣＣＬ１６と化合物の結合を解析することが可能である。ヒスタミンレセプターＨ４と結合する化合物については、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞または該細胞の細胞膜と化合物を接触させた後に、該細胞または細胞膜を洗浄し、ケモカインＣＣＬ１６との結合を調べることなどで確認できる。
【００６８】
＜ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応を阻害する物質の評価＞
前述のケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合を阻害する化合物として得られた化合物は、必ずしもヒスタミンレセプターＨ４を介しての細胞への作用を阻害するとは限らず、ある場合においては化合物が単独でヒスタミンレセプターＨ４の活性化を及ぼす可能性、すなわちアゴニスト作用をもつ可能性がある。したがって、以下に述べるようなケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の細胞反応についても評価することが望ましい。ここで、ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応とは、ケモカインＣＣＬ１６がヒスタミンレセプターＨ４と結合してレセプターを活性化し、その活性化のシグナルが細胞内の種々のシグナルを介して細胞内の物質の変動や変化、または細胞自体の形態や動きの変化を起こすことをいう。このようなケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応を抑制し得る化合物を取得することで、目的の化合物を選択することができる。７回膜貫通型レセプターのうちでＧαｑやＧαｉという種類のＧ蛋白質と共役するものは、レセプターが活性化することによって一過性に細胞内のカルシウム濃度が上昇することが知られている。そのような反応は、細胞内カルシウム濃度上昇反応と呼ばれており一般的には後述する実施例２、３、８に示したようにＦｕｒａ２−ＡＭ試薬を用いて蛍光波長のシフトによる細胞内カルシウム濃度変化を見る方法が用いられるが、Ｆｕｒａ２−ＡＭの代わりにＦｕｒａ３などの試薬が使われることもある。
【００６９】
また、細胞内カルシウム濃度上昇反応は、カルシウム結合発光蛋白質エオクリンをヒスタミンレセプターＨ４発現細胞に注入または発現させることによって、発光によって検出することも可能である（レ・ポウル（Le Poul）等  ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・スクリーニング・ザ・オフィシャル・ジャーナル・オブ・ザ・ソサエティ・フォー・バイオモレキュラー・スクリーニング（Journal of biomolecular screening : the official journal of the Society for Biomolecular Screening.）  2002年  7巻  ｐ57-65）。
【００７０】
また、評価に使用できる細胞反応として、ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の細胞遊走反応が挙げられる。細胞遊走反応は通常は実施例４に記載の方法のように、トランスウェルなど遊走を惹起する因子がない場合には通過できない程度の小孔のあいたメンブレンを通過した細胞の数を指標とする。遊走した細胞数の算定については、実施例４のように細胞のＤＮＡを蛍光染色などで染色する方法や、フローサイトメトリー法を用いたり血球算定盤を用いて顕微鏡下で計数する方法も用いられる。
【００７１】
その他の細胞の反応を評価する方法としては、ヒスタミンレセプターＨ４はＧαｉ型のＧタンパク質と共役しているものと考えられることから、Ｇタンパク質と共役しているアデニルサイクレースの阻害による細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）上昇の抑制反応の検出する方法を用いることができる。この方法の概要は、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞をForskolinなどの細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させる薬剤の存在下でケモカインＣＣＬ１６を細胞に反応させることによってｃＡＭＰ濃度上昇が抑えられることを検出する（リュウ（Liu）等  モレキュラー・ファーマコロジー（Molecular Pharmacology）（USA）  2001年  59巻  ｐ420-426）。ケモカインＣＣＬ１６と共に該ケモカインとヒスタミンレセプターＨ４との反応を阻害する化合物が存在すれば、該ケモカインによるｃＡＭＰ上昇抑制効果が濃度依存的に解除されることを調べることによって、化合物のケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプター発現細胞に対する反応の阻害効果を評価できる。ｃＡＭＰ濃度の測定は市販のＥＬＩＳＡキット（Cayman社  Cat＃581101  等）やパーキンネルマー社cAMP AlphaScreen camp assay kit（CatNo.6760600）などを用いることで測定できる。
【００７２】
また、別の細胞反応の評価方法としては、レセプター活性化からカルシウム流入のシグナル系の間にあるＩＰ３の濃度を測定することが挙げられる。ケモカインＣＣＬ１６がヒスタミンレセプターＨ４細胞へ作用することで細胞内のＩＰ３濃度の上昇が引き起こされるが、その作用を低下させる効果を試験することで目的の化合物を得ることができる。細胞内のＩＰ３測定については既知の方法で実施可能であるが、たとえばパーキンエルマー社のAlpha Screen IP3 assay supplement（Cat No.6760621）とGST detection kit（Cat No. 6760603）の組み合わせなどを用いることもできる。
【００７３】
また、好酸球ではヒスタミンレセプターＨ４の作用として細胞形態の変化を起こすことが知られており（リン（Ling）等  ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（British Journal of Pharmacology）（UK）  2004年  142巻  p161-171）、このような反応を用いてケモカインＣＣＬ１６の作用およびその作用を阻害する化合物を評価することも可能である。ヒスタミンレセプターＨ４が活性化された好酸球においてはフローサイトメトリーにおける前方散乱光がより高い方にシフトすることが観察されるため、ケモカインＣＣＬ１６と化合物によるこのような作用について評価できる。また、その他の７回膜貫通型レセプターの機能を解析するための細胞反応系についても、適宜ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の反応の解析に応用することができる。
【００７４】
ここで用いるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞は、特に断りの無い限りは、前述の、遺伝子組換えによって作製された細胞、または動物より取得した好酸球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球もしくは肥満細胞、または培養細胞株などを用いることができる。
【００７５】
ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞における細胞反応を阻害する化合物の種類は大別して３種類考えられる。ひとつはケモカインＣＣＬ１６側に結合する化合物であり、もうひとつはヒスタミンレセプターＨ４に結合する化合物であり、さらにもう一つは細胞内でヒスタミンレセプターＨ４のシグナル伝達系を阻害する化合物である。ケモカインＣＣＬ１６に結合する化合物は、先にケモカインＣＣＬ１６と化合物を接触させた後、得られた混合物を化合物による非特異的な結合の影響がないように希釈してヒスタミンレセプターＨ４との結合を調べるか、限外ろ過法などで過剰な化合物の濃度を下げた後にケモカインレセプターＨ４との結合を調べることによって確認できる。また、ケモカインＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４の反応に対して阻害効果の得られた化合物については、BIOCOREなどの表面プラズモン共鳴法などによってもＣＣＬ１６と化合物との結合を解析できる。ヒスタミンレセプターＨ４と結合する化合物もしくは該レセプターのシグナル伝達系を阻害する化合物については、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞もしくは該細胞の細胞膜と化合物を接触させた後に、該細胞もしくは細胞膜を洗浄し、ケモカインＣＣＬ１６の反応性を検証できる。ヒスタミンレセプターＨ４に結合する化合物と細胞内で該レセプターのシグナル伝達系を阻害する化合物の弁別するためには、上に示したケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合の阻害について調べるか、ヒスタミンレセプターＨ４発現細胞もしくは該細胞の膜画分を用いてBIOACORE(R)などによって化合物のヒスタミンレセプターＨ４への結合を確認することによって行うことができる。
【００７６】
＜試験動物を用いてのケモカインＣＣＬ１６による好酸球誘導に対する化合物の試験方法＞
ヒトにおいてケモカインＣＣＬ１６は肝臓に特異的な発現をすることが示されているものの、マウスにおいてはケモカインＣＣＬ１６の機能的な遺伝子や発現については証明されていない。しかしながら、実施例７においてマウスの好酸球がヒトＣＣＬ１６と反応して遊走反応を起こすこと、および実施例９に示したようにマウスにヒトＣＣＬ１６を投与することによって、好酸球の骨髄からの誘導と血中の好酸球増多状態を惹起することができることを証明した。そのため、試験動物において血中または肝臓組織中にケモカインＣＣＬ１６を高濃度存在させることによって、ケモカインＣＣＬ１６による好酸球増多および好酸球の肝臓組織浸潤による組織障害に対する、予防剤または治療剤候補化合物の試験を行うことができる。その一つの様式としては実施例９に示したように試験動物としてマウスを用いてケモカインＣＣＬ１６を注射することで血中のケモカインＣＣＬ１６濃度を上げる方法が挙げられる。この方法においては血中のケモカインＣＣＬ１６の濃度が１〜１０，０００ｎＭ程度、好ましくは１０〜１０００ｎＭ程度になるようにケモカインＣＣＬ１６を投与する。試験に供される化合物は経口的または非経口的に投与され、ケモカインＣＣＬ１６が投与された直後から２時間の間、好ましくはケモカインＣＣＬ１６投与後３０分から１時間３０分の間の血中、骨髄中の好酸球量を測定して投与した化合物の効果を判定できる。
【００７７】
化合物の投与は、ケモカインＣＣＬ１６を投与する前に行うことによって該化合物の予防効果を、ケモカインＣＣＬ１６を投与して血中での好酸球量の上昇か骨髄での好酸球減少が認められるタイミングで投与することによって該化合物の治療効果を検証できる。また別の形態としては、マウスにヒトＣＣＬ１６をコードした遺伝子を導入して発現させることによっても血中もしくは肝臓組織中のケモカインＣＣＬ１６量を上げることができる。その方法の例としては、ケモカインＣＣＬ１６の遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスが挙げられる。この方法では適当なプロモーター配列（場合によってはエンハンサー配列を組み合わせる）に制御される形でケモカインＣＣＬ１６をコードする遺伝子を含むベクターをマウス受精卵にマイクロインジェクション法などで導入し、偽妊娠させたマウスの子宮内に移植して生まれてきた仔を得る。この仔の尾もしくは部分切除した肝臓についてケモカインＣＣＬ１６遺伝子が組み込まれていることＰＣＲ法等で確認し、血中もしくは組織中でケモカインＣＣＬ１６の発現を抗体（R＆D System社  MAB328およびBAF802等）によるＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロティング、免疫組織化学的手法によって確認できる。またケモカインＣＣＬ１６を制御するプロモーターやエンハンサーの種類として、アルブミン（albumin）プロモーターとエンハンサーの組み合わせやアルファ１アンチトリプシン（α1-antitrypsin）プロモーターなどを用いることによって、該トランスジェニックマウスの成体肝臓中に特異的にケモカインＣＣＬ１６を発現させることが可能である（ピンカート（Pinkert）等  ジーンズ・アンド・デベロップメント（Genes and development）（USA）  1987年  １巻  p268-276、ガイ（Gay）等  エンドクリノロジー（Endocrinology）（USA）  1997年  138巻  p2937-2947）。また、ＣＹＰ１Ａ１プロモーターを用いたベクターを導入したマウスにダイオキシンや３−メチルコラントレンを投与したり、C-reactive proteinのプロモーターを用いたベクターを導入したマウスにリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を投与することなどによって、これらのプロモーターの下流に組み込んだケモカインＣＣＬ１６遺伝子の肝臓における発現を誘導することも可能である（キャンベル（Campbell）等  ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Journal of Cell Science）（England）  1996年  109巻  p2619-2925、キッフ（Cuif）等  オンコジーン（Oncogene）（England）1993年  8巻  p87-93）。
【００７８】
また、試験動物においてケモカインＣＣＬ１６をハイドロダイナミックーベースド・トランスフェクション法（ロスマニス（Rossmanith）等  ディーエヌエー・アンド・セル・バイオロジー（DNA and cell biology）（USA）2002年  21巻  p847-853）によって適当なプロモーター（場合によってエンハンサー配列も含む）の制御されたケモカインＣＣＬ１６のｃＤＮＡを含むベクターを注入することによって行うことができる。この方法においては注入したベクターが肝臓に選択的に取り込まれるため、肝臓においてケモカインＣＣＬ１６が選択的に発現されるが、より選択的に肝臓で定常的もしくは誘導的にケモカインＣＣＬ１６を発現させるために前述のように肝臓特異的発現のためのプロモーターやエンハンサーを用いることも可能である。
【００７９】
さらに、試験動物に遺伝子を導入する方法としてはアデノウイルスベクターなどウイルスベクターや（オウリッチオ（Auricchio）等  ジーン・セラピー（Gene therapy）（England）  2002年  9巻  p963-971）、リポソームによる遺伝子導入法（イイムロ（Iimuro）等  ジャーナル・オブ・ヘパト・ビリアリー・パンクレアティック・サージェリー  （Journal of hepato-biliary-pancreatic surgery）（Japan）  2003年  10巻  p45-47、ハシダ（Hashida）等  アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Advanced drug delivery reviews）（Netherlands）  2001年   52巻  p187-196）なども用いることができる。
【００８０】
ケモカインＣＣＬ１６の投与もしくはケモカインＣＣＬ１６遺伝子を導入した試験動物においては、肝臓疾患モデルの手法、例えば四塩化炭素投与肝硬変誘導モデル（イナガキ（Inagaki）等  ヘパトロジー（Hepatology）（USA）  2003年  38巻  p890-899）やマウス肝炎ウイルス感染モデル（フチザキ（Fuchizaki）等  ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Jouralof Medical Virology）（USA）2003年  69巻  p188-194）との組み合わせによって肝臓疾患における化合物の効果を検討することも可能である。
【００８１】
また、ケモカインＣＣＬ１６の投与もしくはケモカインＣＣＬ１６遺伝子を導入した試験動物においては、アレルギー性疾患モデルの手法、例えば喘息モデル（田中ら  薬学雑誌  （日本薬学会発行）  2002年  122巻  ｐ637-642）や、アレルギー性皮膚炎モデル（マツモト（Matsumoto）等  スキン・リサーチ・アンド・テクノロジー（Skin research and technology）（Denmark） 2004年   10巻  p122-129）、もしくはアレルギー性鼻炎モデル（マックカスター（McCusker）等  カレント・オピニオン・イン・アラジー・アンド・クリニカル・イミュノロジー（Current opinion in allergy and clinical immunology）（USA）2004年 4巻  p11-16）などとの組み合わせによってアレルギー性疾患における化合物の効果を検討することも可能である。
【００８２】
以上の検討に用いる試験動物としてはマウスのほかに、好酸球においてヒスタミンレセプターＨ４が発現している動物、特にヒトヒスタミンレセプターＨ４と高い類似性を示すヒスタミンレセプターを保有するブタ、ラット、モルモットなどを用いることが可能である。
【００８３】
＜試験動物を用いての、ケモカインＣＣＬ１６による樹状細胞、マクロファージ、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞またはヒスタミンレセプターＨ４発現組換え体細胞誘導に対する化合物の試験方法＞
好酸球以外を指標にして、例えば試験動物における樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩基球、肥満細胞の集積を指標として、該試験動物における化合物の試験を行うことができる。グイドゥッチ（Guiducci）等  （キャンサー・リサーチ（Cancer Research）（USA）  2005年  65巻  ｐ3437-3446）の中に、マウスに固形腫瘍を形成させて、遺伝子導入によってその腫瘍の中でケモカインＣＣＬ１６を発現させた場合、樹状細胞、マクロファージ、リンパ球が集積することが報告されている。同様にケモカインＣＣＬ１６またはケモカインＣＣＬ１６の遺伝子を動物の臓器または組織に導入することによって、樹状細胞、マクロファージ、リンパ球の該臓器または組織への集積を検出することができる。このような方法において、試験動物に試験物質を投与する工程を組合わせることで、該試験物質のケモカインＣＣＬ１６の樹状細胞、マクロファージ、リンパ球などの集積に対する抑制の効果を試験することが可能である。また集積を検出する対象の細胞としては、ヒスタミンレセプターＨ４の発現が知られている好中球、好塩基球、肥満細胞などを用いることができる。さらに、試験動物にヒスタミンレセプターＨ４を発現させた組換え体細胞を導入し、試験動物においてケモカインＣＣＬ１６を投与した、またはケモカインＣＣＬ１６の遺伝子を導入して発現させた臓器または組織への該組換え体細胞の集積を検出することで、試験を行うことも可能である。これらの試験方法で特定した化合物は、前述のケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４を発現した細胞を用いた試験方法と組合わせることで、該物質のケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との反応に対する特異性を検証することも可能である。用いる動物としてはマウスが好ましいが、ヒスタミンレセプターＨ４が発現している動物、特にヒトヒスタミンレセプターＨ４と高い類似性を示すヒスタミンレセプターを保有するブタ、ラット、モルモットなどを用いることも可能である。
【００８４】
＜本発明の予防または治療薬の選択方法に供する被検物質＞
以上述べてきたケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４または該レセプターを発現する細胞との関係に着目した肝臓疾患、肝臓疾患に関連する好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患の予防剤または治療剤の選択方法に供される被検物質について説明する。ここで被検物質は、無機化合物、有機化合物、有機ポリマー、ペプチド、タンパク質、糖、脂質およびそれらの複合体を含む。このような化合物は適当な溶媒、好ましくは水系溶液もしくは水系分散溶液の形で試験に供することができる。
【００８５】
ケモカインＣＣＬ１６と、ヒスタミンレセプターＨ４または該レセプター発現細胞との結合や反応を阻害する化合物の一つの形態としては、ヒスタミンレセプターＨ４に結合して該レセプターのシグナルを遮断する化合物が挙げられる。このような化合物の一例としてはヒスタミン作用におけるヒスタミンレセプターＨ４のアンタゴニストが挙げられる。現在まで、ヒスタミンレセプターのアンタゴニストの肝臓疾患や肝臓疾患に関連する好酸球増多症に対する作用については報告がないが、実施例３〜５および７〜９においてヒスタミンレセプターＨ３、Ｈ４アンタゴニストであるthioperamideは、求める活性をもつことが示されている。
【００８６】
このほかのヒスタミンレセプターＨ３やＨ４に対してのアンタゴニストとしてはClobenpropitやIodophenpropitなど（オライリー（O‘Reilly）等  ジャーナル・オブ・レセプターズ・アンド・シグナル・トランスダクション（Journal of Receptors and Signal Transduction）（USA）  2002年  22巻  ｐ431-448）、ヒスタミンレセプターＨ１、Ｈ４アンタゴニストとしてはDexepinやCinnarizineおよびPromethazineなどが知られている（ギュエン（Nguyen）等モレキュラー・ファーマコロジー（Molecular Pharmacology）（USA）  2001年  59巻  ｐ427-433）。また、ヒスタミンレセプターＨ４に対する特異的なアンタゴニストとしてJNJ7777120（サーモンド（Thurmond）等  ザ・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・セラピューティックス（The Journal of pharmacology and experimental therapeutics）（USA）  2004年  309巻  p404-413）も報告されている。
【００８７】
また、別のケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４または該レセプター発現細胞との結合または反応を阻害する化合物の形態としては、ケモカインＣＣＬ１６に結合して、ケモカインＣＣＬ１６とヒスタミンレセプターＨ４との結合もしくは反応を阻害する化合物がある。このような化合物の一例としてはケモカインＣＣＬ１６の中和抗体が挙げられる。このような抗体としてはＲ＆Ｄ社のＣＣＬ１６中和抗体（ＭＡＢ３２８）などがあるが、当業者は市販のヒトＣＣＬ１６などをマウスや他の動物に免疫してケモカインＣＣＬ１６の中和活性のあるポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を取得することができる。これらの抗体については、抗体結合能を保持した形での抗体断片とすることができる。またモノクローナル抗体をコードする遺伝子の塩基配列を解析することによってｓｃＦｖやキメラ抗体、ヒト型化抗体などの組換え型抗体の作製も公知の技術で可能である。これらのケモカインＣＣＬ１６に結合する化合物も、本発明の評価に供される化合物として挙げられる。
【００８８】
このように本発明のスクリーニング方法により評価され、所望の活性を有する化合物は、肝臓疾患、肝臓障害に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍（ガン）、免疫不全症、自己免疫疾患、または炎症性疾患の治療剤または予防剤として用いることができる。
【００８９】
本発明のスクリーニング方法により選択される化合物は、製剤化して経口または非経口的に、ヒトまたは動物に対して安全な薬剤として投与することができる。
非経口投与には、例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与、経肺投与、経鼻投与、経腸投与、口腔内投与、経粘膜投与等が挙げられる。例えば注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収テープなどである。
【００９０】
経口投与製剤としては、例えば錠剤（糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コーティングされたものを含む）、丸剤、トローチ剤、液剤、またはこれらの製剤学的に許容されうる徐放化製剤等が挙げられる。経口投与用液剤には懸濁剤、乳剤、シロップ剤（ドライシロップを含む）、エリキシル剤などが挙げられる。
これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等とともに医薬組成物として投与される。
【００９１】
これらの製剤に用いる担体や腑形剤としては、例えば乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末などを、結合剤としては例えばデンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどを、崩壊剤としては例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどを、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴールなどを、着色剤としては医薬品に添加することが許容されているものを、それぞれ用いることができる。
【００９２】
錠剤、顆粒剤は必要に応じ白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体などで被膜してもよい。さらにエチルセルロースやゼラチンのような物質のカプセルでもよい。また、注射剤を調製する場合は、必要に応じ、主薬にｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加してもよい。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００９４】
［実施例１］ヒスタミンレセプターＨ１、Ｈ２、Ｈ４を発現する組換え体細胞の調製
種々のケモカインがヒスタミンレセプターＨ１、Ｈ２、Ｈ４に対する反応性の有無を調べるため、それぞれのヒスタミンレセプターを発現する組換え体細胞を調製し、細胞内カルシウム濃度上昇反応を指標にした実験を行なった。ヒスタミンレセプターＨ１、Ｈ２、Ｈ４をコードするＤＮＡ核酸分子は、フィトヘムアグルチニンで刺激したヒト末梢血単核球細胞よりｃＤＮＡ合成システム（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社：現Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリー、および各々のヒスタミンレセプターのコード領域を増幅しうるプライマーセットを用いてＰＣＲ法によって増幅し、その産物を精製することにより取得した。ＰＣＲ法による増幅に用いたプライマーセットの配列は以下の通りである。
Ｈ１：  Forward  ＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣＣＣＡＡＴＴＣＣ
Reverse  ＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＧＡＧＣＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧ
Ｈ２：  Forward  ＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＣ
Reverse  ＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣ
Ｈ４：  Forward  ＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＣ
Reverse  ＣＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＡＣＣＧ
【００９５】
得られたそれぞれのヒスタミンレセプターをコードするＤＮＡ核酸分子を、レトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰ（吉田等  FEBSレターズ（FEBS letters）（Netherlands）  1999年  458巻  ｐ37-40）のＳａｌ Ｉ− Ｎｏｔ Ｉサイトに挿入し、クローニングした。得られた各ヒスタミンレセプターをコードするＤＮＡ核酸分子がクローニングされたｐＭＸ−ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰベクター各１μｇを、ＢＯＳＣ２３細胞（ATCC CRL-11270 、ピアー（Pear）等  プロシーディング・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）（USA）1993年90巻  ｐ8392-8396）にトランスフェクトし、その培養上清を回収することで各ヒスタミンレセプターをコードしている核酸分子がパッケージされたウイルス含有培養液を得た。そのウイルス含有培養液を、マウスのプレＢリンフォーマ細胞株Ｌ１．２細胞（キャンベル（Campbell）等  ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（The Journal of Cell Biology）（USA）1996年  134巻  ｐ255-266）の培養液中に添加して培養した。各ヒスタミンレセプターをコードする核酸分子を含有しているレトロウイルスが感染して各ヒスタミンレセプターが発現したＬ１．２ 細胞を取得するために、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰにおいて各レセプターをコードするＤＮＡ核酸分子の下流に存在して各ヒスタミンレセプターが発現したときのみに発現されるＥＧＦＰ（オワンクラゲ蛍光タンパク質）の発現した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン社)によってＦＬ１の蛍光強度が高い細胞を取得して培養により増殖させるステップを３回繰り返した。
【００９６】
その結果、各ヒスタミンレセプターを発現した細胞は、全細胞数の９５％以上がＥＧＦＰ陽性という形で得ることができた。これらの細胞についてヒスタミンレセプターＨ１をコードするＤＮＡ核酸分子を導入して発現させたものをＬ１．２−Ｈ１、ヒスタミンレセプターＨ２をコードするＤＮＡ核酸分子を導入して発現させたものをＬ１．２−Ｈ２、ヒスタミンレセプターＨ４をコードするＤＮＡ核酸分子を導入して発現させたものをＬ１．２−Ｈ４とそれぞれ名づけた。
【００９７】
［実施例２］各種ケモカイン分子のヒスタミンレセプターＨ１、Ｈ２、Ｈ４レセプター発現細胞に対する反応性の検討
３２種類のケモカイン分子（ＣＣケモカイン：ＣＣＬ１、２、３、４、５、７、８、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２４、２５、２６、２７、２８；ＣＸＣケモカイン：ＣＸＣＬ４、８、９、１０、１２、１３、１６；その他：ＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１  総てのリコンビナントケモカインはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製を使用）について、ヒスタミンレセプターＨ１、Ｈ２、Ｈ４との反応性を細胞内カルシウム濃度上昇反応を用いて解析した。その方法は、Ｌ１．２−Ｈ１、Ｌ１．２−Ｈ２、Ｌ１．２−Ｈ４の各細胞１０６個を、１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、そこに３μＭになるようにｆｕｒａ２−ＡＭ fluorescence dye（Molecular Probes社）を添加して４５分間静置した。そののち、該細胞を１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、Ｆ２０００型分光蛍光光度計（日立製作所）のキュベット中に移した後、各ケモカインを最終濃度１００ｎＭになるように添加して蛍光強度を測定した。蛍光測定によるカルシウムイオン流入の強度は、５１０ｎＭの波長の励起光を用いて３４０ｎＭと３８０ｎＭの蛍光強度を測定し、３４０ｎＭの蛍光強度／３８０ｎＭの蛍光強度の比が上昇することを指標にしてモニタリングした。
【００９８】
３２種類のケモカイン分子と３種類のヒスタミンレセプターの反応を細胞内カルシウム濃度上昇反応で解析した結果、ＣＣＬ１６をＬ１．２−Ｈ４細胞と反応させた場合にのみ顕著な細胞内カルシウム濃度上昇反応が認められた。
【００９９】
［実施例３］ＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターＨ４との反応の検証
実施例２で認められたＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターＨ４との反応性について、細胞内カルシウム濃度上昇反応を指標にして検証した。細胞内カルシウム濃度上昇反応の検出は、実施例２に記載の方法と同様に行なった。反応するレセプターの特異性を調べるため、Ｌ１．２−Ｈ１、Ｌ１．２−Ｈ２、およびＬ１．２−Ｈ４細胞に、種々の濃度のＣＣＬ１６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を添加してカルシウム流入の強度を測定した。コントロールとしては最終濃度１００ｎＭのヒスタミン（Sigma社）を用いた。またＣＣＬ１６の反応がヒスタミンレセプターＨ４を介していることを検証するため、デセンシタイゼイション反応による検証を行なった。デセンシタイゼイション反応とは、ケモカインレセプターをはじめとした七回膜貫通型レセプターにおいて、一度その特異的リガンドによって活性化された後に、該レセプターを再度そのリガンドで刺激しても反応が抑制される現象をいう（ミューラー（Mueller）等  ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（The Journal of Biochemistry）(USA) 1997年  272巻  ｐ8207-8214）。その方法は、Ｌ１．２−Ｈ４細胞にＣＣＬ１６またはヒスタミンを反応させて細胞内カルシウム濃度上昇反応を検出し、その反応がほぼベースライン程度まで低下した時点でヒスタミンまたはＣＣＬ１６のうち最初に加えたものとは異なる試薬を加えた時の細胞内カルシウム濃度上昇反応を観察する。このとき最初に加えた試薬によって後から加えた試薬の細胞内カルシウム濃度上昇反応が抑制されている場合には、両者は同じレセプターを介して反応していると解釈される。また、ヒスタミンレセプターＨ３およびＨ４のアンタゴニストであるthioperamide（Sigma社）を添加した後に、ＣＣＬ１６またはヒスタミンに対する細胞内カルシウム濃度上昇反応の抑制効果を観察することで、ヒスタミンレセプターＨ４との反応性について検証した。なお、ここで行なっている細胞内カルシウム濃度上昇反応の観察は実施例２に記載の方法で行なった。
【０１００】
Ｌ１．２−Ｈ１、Ｌ１．２−Ｈ２、およびＬ１．２−Ｈ４細胞におけるＣＣＬ１６およびヒスタミンによる細胞内カルシウム濃度上昇反応の結果を図１Ａに示す。最終濃度１００ｎＭのヒスタミンによれば、Ｌ１．２−Ｈ１、Ｌ１．２−Ｈ２、およびＬ１．２−Ｈ４細胞に顕著な細胞内カルシウム濃度上昇反応が検出された。それに対してＣＣＬ１６では、Ｌ１．２−Ｈ１およびＬ１．２−Ｈ２細胞においては最終濃度１００ｎＭでは細胞内カルシウム濃度上昇反応は認められず、Ｌ１．２−Ｈ４細胞においてのみ最終濃度１０ｎＭおよび１００ｎＭで細胞内カルシウム濃度上昇反応が認められ、ＣＣＬ１６はヒスタミンレセプターＨ４と特異的に反応することが示された。また、Ｌ１．２−Ｈ４細胞を用いたＣＣＬ１６およびヒスタミンの相互によるヒスタミンレセプターＨ４におけるデセンシタイゼイションの結果、ならびにヒスタミンレセプターＨ４におけるthioperamideによるＣＣＬ１６またはヒスタミンとの反応性の結果を図１Ｂに示す。Ｌ１．２−Ｈ４細胞に最初に最終濃度５０ｎＭから４００ｎＭのＣＣＬ１６を添加し細胞内カルシウム濃度上昇反応を起こした後、最終濃度１００ｎＭのヒスタミンを加えて細胞内カルシウム濃度上昇反応を調べた結果では、ＣＣＬ１６の濃度に依存して後から加えたヒスタミンによる細胞内カルシウム濃度上昇反応が抑制される現象が観察された。またＬ１．２−Ｈ４細胞に最初に最終濃度１００ｎＭのヒスタミンを添加して、その後に最終濃度１００ｎＭのＣＣＬ１６を添加した場合には、ヒスタミン添加によるカルシウムイオン流入に続くＣＣＬ１６の反応は強く抑制されることが観察された。また最終濃度５０μＭのthioperamideを最初に添加しておいて、その後に最終濃度１００ｎＭのＣＣＬ１６またはヒスタミンを添加しても細胞内カルシウム濃度上昇反応は認められなかった。以上の結果より、ＣＣＬ１６はヒスタミンレセプターＨ４と特異的に反応して、細胞反応を引き起こすことが示された。
【０１０１】
［実施例４］ＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４発現細胞の遊走反応
ケモカイン分子の特徴であるレセプター反応を介しての細胞遊走反応について、Ｌ１．２−Ｈ４細胞を用いて検証した。細胞遊走反応の検出方法は５μｍ ポアのポリカーボネート膜のトランスウェルプレート（Costar社）を用いて以下の方法で行なった（野見山等  インターナショナル・イミュノロジー（International Immunology）日本免疫学会発行  2001年  13巻8号  ｐ1021-1029）。ヒスタミンレセプター発現細胞を２ｘ１０６細胞／ｍｌになるように０．５％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を含み、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０倍地（Invitrogen社）よりなる遊走反応用培地に懸濁させ、その細胞懸濁液１００μｌをトランスウェルプレートの上槽（upper well）に注入した。下槽（lower well）にはＣＣＬ１６またはヒスタミンを所定の濃度含むように遊走反応用培地に溶解したものを６００μｌ注入し、５％ＣＯ２で３７℃の細胞培養インキュベーター中に４時間静置した。遊走反応により上槽から下槽へ膜を通過して移動した細胞は、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で溶解してPicoGreen(R) double-stranded ＤＮＡ quantitation reagent (Molecular Probes社)を用いてＤＮＡ量を定量した。測定したＤＮＡ量を基に、上槽に入れた細胞数に対して下槽に移動した細胞の割合（％）を算定して、遊走反応の強度の指標とした。ＣＣＬ１６のヒスタミンレセプター発現細胞の種類による違いを検証するためにＬ１．２−Ｈ１、Ｌ１．２−Ｈ２、およびＬ１．２−Ｈ４細胞をそれぞれ上槽に入れ、下槽に０．１から１０００ｎＭのＣＣＬ１６またはヒスタミンを添加したときの遊走反応実験を行なった。次にＬ１．２−Ｈ４細胞を用いてヒスタミンレセプターＨ３およびＨ４のアンタゴニストであるthioperamideを０．０１から１００μＭ添加して、下槽に１００ｎＭのＣＣＬ１６を入れた時の遊走反応反応実験を行なった。またＣＣＬ１６のＬ１．２−Ｈ４の遊走反応におけるヒスタミンの作用を調べるため、下槽に１、１０、１００ｎＭのＣＣＬ１６とヒスタミンを１０ｎＭ共存させたとき、または共存させなかったときの遊走反応実験を行なった。またさらに、ＣＣＬ１６のＬ１．２−Ｈ４への作用がケモカインの特徴である細胞を呼び寄せる作用（Chemotaxis）であることを検証するため、上槽、下槽に対してＣＣＬ１６（１００ｎＭ）を両方に入れない（−／−）、上槽のみに入れる（＋／−）、下槽のみに入れる（−／＋）および両方に入れる（＋／＋）のパターンで遊走反応実験を行なった。ケモカインレセプターなどの細胞内でのシグナル伝達による遊走反応は、レセプターに共役するＧαｉ型のＧタンパク質の作用を介するといわれている。そのためＬ１．２−Ｈ４細胞にＧαｉの阻害剤である百日咳毒素：ＰＴＸ（Invitrogen社）を５００ｎｇ／ｍｌで加えた場合と加えなかった場合について、１００ｎＭのＣＣＬ１６による細胞遊走反応実験を行なった。
【０１０２】
Ｌ１．２−Ｈ１、Ｌ１．２−Ｈ２およびＬ１．２−Ｈ４細胞を用いてヒスタミンおよびＣＣＬ１６での細胞遊走反応実験の結果を図２Ａに示す。ヒスタミンおよびＣＣＬ１６の両者においてＬ１．２−Ｈ１およびＬ１．２−Ｈ２細胞での遊走反応は認められなかったが、Ｌ１．２−Ｈ４細胞においてはいずれも１００ｎＭの濃度をピークとする遊走反応が認められた。ＣＣＬ１６のピークでの遊走の程度（% Input cell）は、ヒスタミンの場合のピークと比べて同等かやや高い傾向にあった。次にＬ１．２−Ｈ４細胞のＣＣＬ１６に対する遊走反応におけるthioperamideの作用を調べた結果を図２Ｂに示す。１００ｎＭのＣＣＬ１６によるＬ１．２−Ｈ４細胞の遊走反応はthioperamideによって濃度依存的に抑制されたことからＣＣＬ１６の細胞遊走作用はヒスタミンレセプターＨ４を介していることが示された。またその際のＩＣ５０値は約５０μＭであった。またＣＣＬ１６のＬ１．２−Ｈ４の遊走反応においてヒスタミンをＣＣＬ１６に加えた場合の細胞遊走反応実験の結果を図２Ｃに示す。１、１０、１００ｎＭのＣＣＬ１６に１０ｎＭのヒスタミンを加えた場合にはＣＣＬ１６単独よりも高い遊走反応（% Input cell）が認められ、ヒスタミンがＣＣＬ１６と相加的にＬ１．２−Ｈ２細胞の遊走反応に作用することが示された。ＣＣＬ１６のＬ１．２−Ｈ４への作用が細胞を呼び寄せる作用（Chemotaxis）であることを検証するため、上槽、下槽に対してＣＣＬ１６（１００ｎＭ）を両方に入れない（−／−）、上槽のみに入れる（＋／−）、下槽のみに入れる（−／＋）および両方に入れる（＋／＋）のパターンで遊走反応実験を行なった結果を図４Ｄに示す。この結果では下槽（lower well）のみにＣＣＬ１６を入れた場合（−／＋）にのみＬ１．２−Ｈ４の強い遊走反応が観察されたことから、ＣＣＬ１６の細胞遊走への作用は細胞をChemotaxisであることが証明された。またＣＣＬ１６によるＬ１．２−Ｈ４の遊走反応に対するＰＴＸの作用を検討した実験結果を図２Ｅに示す。この結果、ＰＴＸの作用によってＣＣＬ１６によるＬ１．２−Ｈ４細胞の遊走は完全に抑制されるため、ＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターＨ４を介した反応もケモカインレセプター等と同じＧαｉ型のＧタンパク質による細胞内シグナルによることが示された。
【０１０３】
[実施例５]ＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターＨ４への結合
ＣＣＬ１６がヒスタミンレセプターＨ４に直接結合することおよびその親和性について調べるため、１２５Ｉで標識したＣＣＬ１６のＬ１．２−Ｈ４細胞での結合実験を行なった。リコンビナントＣＣＬ１６（R&D sysytem社）を125I-labeled Bolton and Hunter reagent（Amersham Biosciences社）を用いて業者添付のプロトコールに準じて標識化を行なった。得られた１２５Ｉ−ＣＣＬ１６の比活性は１．２ｘ１０７ｃｐｕ／μｇであった。飽和結合実験は、１ｘ１０６細胞のＬ１．２−Ｈ４に対して種々の濃度の１２５Ｉ−ＣＣＬ１６を含む２００μｌの結合実験用培地（０．１％ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を含むＲＰＭＩ１６４０）を１５℃で１時間反応させることによって行なった。その後細胞を５回結合実験用培地で洗浄して、結合した１２５Ｉ量をガンマカウンターで計測した。この際のバックグランド値としては１２５Ｉ−ＣＣＬ１６に対して１００倍のモル比の標識していないＣＣＬ１６を加えて反応させたときのカウントを計測して、各測定値より差し引いた。また１２５Ｉ−ＣＣＬ１６のＬ１．２−Ｈ４への結合に対するＣＣＬ１６、ヒスタミン、thioperamideの結合競合実験においては１０ｎＭの１２５Ｉ−ＣＣＬ１６と種々の濃度のＣＣＬ１６、ヒスタミン、thioperamideそれぞれを含む２００μｌの結合実験培地を１ｘ１０６細胞のＬ１．２−Ｈ４と反応させて同様な方法で結合１２５Ｉの量を測定した。結合実験の結果の解析はGraphPad PRISM(R)ソフトウエア（GraphPadSoftware社）を用いて行なった。
【０１０４】
飽和結合実験の１２５Ｉ−ＣＣＬ１６結合量のグラフを図３Ａに、その結果から算定したスキャッチャードプロットのデータを図３Ｂに示した。この結果より１２５Ｉ−ＣＣＬ１６はヒスタミンレセプターＨ４に対してＫｄ＝１７ｎＭの親和性を示し、Ｌ１．２−Ｈ４上の１２５Ｉ−ＣＣＬ１６結合サイトは４１，０００ｓｉｔｅｓ／ｃｅｌｌであることが分かった。また結合競合実験の結果を図３Ｃに示す。この結果から１２５Ｉ−ＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターＨ４に対する結合へのＣＣＬ１６、ヒスタミン、thioperamideの結合阻害活性はそれぞれＩＣ５０＝８．８ｎＭ、４．１ｎＭ、５７ｎＭ であり、ＣＣＬ１６とヒスタミンは、ヒスタミンレセプターＨ４に対してほぼ同程度の親和性を持つことが示された。
【０１０５】
[実施例６]ヒトおよびマウス好酸球におけるヒスタミンレセプターＨ３およびＨ４の発現の解析
ヒトおよびマウスの好酸球のヒスタミンレセプターＨ３およびＨ４の発現を確認するため、ＲＴ−ＰＣＲ法による解析を行なった。ヒト好酸球の取得はハンセル（Hansel）等  ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ（Journal of Immunological Methods）(Netherlands) 1991年  145巻  ｐ105-110に記載の方法に従って行なった。その概要はアレルギー罹患歴の無い健常人（4名）より静脈採血した血液をデキストランＴ５００存在下で遠心分離してバフィーコートを取得した。得られた細胞は比重１．０８８ｇ／ｍｌのPercoll（Pharmacia Biotech社）による比重遠心法で好酸球画分を取得した。さらに好酸球の純度を上げるため、anti-CD16-bound micromagnetic beadsおよびmagnetic-activated cell sorter column（以上Miltenyi BioTech社）を用いて混在する好中球を除去し、そのカラムの素通り画分を取得した。得られた好酸球の純度は９９％以上であった。マウスの好酸球の取得はTokui等  バイオケミカル・アンド・バイオフィジッカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and biophysical research communications）（USA）1997年  233巻  ｐ527-531に記載の方法に従って行なった。その概要は以下の通りである。８週齢で購入したBalb/cマウス（日本クレア社）を少なくとも１週間ＳＰＦ飼育環境で馴化した。そのマウスの両側ヒラメ筋に５０μｌの０．２５％ bupivacaine（Sigma社）を注射し、その３日および１０日後に同じ部位に５０μｌのＰＢＳに溶解した７５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ−５プラスミドを注射した。その２から３週間後にマウスの血中白血球のうち好酸球が＞５０％になったことを確認してマウスを屠殺して脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製した。脾臓細胞は比重が１．０６、１．０７、１．０９ｇ／ｍｌのPercoll（Pharmacia Biotech社）による不連続密度勾配遠心法で２５０ｘｇで２０分間遠心して比重１．０７ｇ／ｍｌと１．０９ｇ／ｍｌの間の層に存在する細胞を回収した。さらに好酸球はPercoll遠心法で得られた細胞をanti-CD90(Thy1.2), anti-CD45R (B220), anti-CD8α-bound micromagnetic beadsとImagnet（以上BD Bioscience社）を用いて素通りする細胞群を回収する操作を２回繰り返すことによって精製した。得られたマウス好酸球の純度は９０％以上であった。好酸球からの全ＲＮＡの抽出は、TRIzol(R) reagent（Invitrogen社）を用いて業者添付のプロトコールに従って行なった。またヒトおよびマウスの脳および骨髄の全ＲＮＡはBD Biosciences社より購入した。全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、各全ＲＮＡ１μｇ、Oligo(dT)18プライマー、およびSuperScript(R) First-Strand Synthesis System for ＲＴ−ＰＣＲ（Invitrogen社）を用いて業者添付のプロトコールの方法で行なった。得られたｃＤＮＡ（元の全ＲＮＡ 20ng相当量）は、ヒト、マウスのヒスタミンレセプターＨ３およびＨ４に対する特的プライマー各１０ｐｍｏｌを含んだ全量２０μｌの系で、１ＵのＥｘ−Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase（宝酒造社）を用い、９４℃で５分間の反応の後、９４℃３０秒＋６０℃３０秒＋７２℃３０秒の温度サイクルを３７回行なった後に７２℃５分間の反応で増幅した。また内部標準としては、ヒト、マウスのグルコース３リン酸脱水素酵素遺伝子（GAPDH）のプライマーを用いて、同様の系で温度サイクル２７回による増幅反応を行なった。得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物は、各１０μｌをエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲルでの���気泳動を行い、写真撮影を行って各遺伝子についての発現を確認した。なおＲＴ−ＰＣＲ反応に用いたプライマーセットは以下の通りである。
【０１０６】
ヒトのヒスタミンレセプターＨ３遺伝子増幅用プライマーセット
5’-CCACTGTATGTACCCTACGTGCTG-3’と5’-AGCTATGACCGATTCCTGTCAGTC-3’
マウスのヒスタミンレセプターＨ３遺伝子増幅用プライマーセット
5’-AGCTATGACCGATTCCTGTCAGTC-3’と5’-CCTCTGGATGTTCAGGTAGATGCT-3’
ヒトのヒスタミンレセプターＨ４遺伝子増幅用プライマーセット
5’-ATGCCAGATACTAATAGC-3’と5’-TTAAGAAGATACTGACCG-3’
マウスのヒスタミンレセプターＨ４遺伝子増幅用プライマーセット
5’-TGTGGTGGACAGAAACCTRTAGACA-3’と5’-AAGAATCTGAAGCCAGAATCATCG-3’
ヒトおよびマウスのGAPDH遺伝子増幅用プライマーセット
5’-GCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGG-3’と5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’
【０１０７】
ヒトおよびマウスにおける好酸球、脳、および骨髄のｃＤＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を図４Ａに示す。この結果からヒトでは脳においてはヒスタミンレセプターＨ３の増幅バンドが認められ、発現が示されたが、ヒスタミンレセプターＨ４の発現は認められなかった。それに対して骨髄および4人の健常人からそれぞれ採取した好酸球（eosinophils）においては、ヒスタミンレセプターＨ４の発現は認められたが、Ｈ３の発現は認められなかった。内部コントロールのＧＡＰＤＨの増幅産物量はほぼ同じ程度であり全ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は同じ効率で行なわれた事を示している。また、マウスの場合も同じ結果が得られ、脳においてはヒスタミンレセプターＨ３のみの、骨髄および好酸球においてはヒスタミンレセプターＨ４のみの発現が認められた。このことからヒトおよびマウス好酸球においては、ヒスタミンレセプターＨ３とＨ４のうちＨ４のみが選択的に発現されていることが示された。
【０１０８】
[実施例７]ヒトおよびマウス好酸球のＣＣＬ１６による遊走反応
ヒスタミンレセプターＨ４を発現していることが示されたヒトおよびマウスの好酸球におけるＣＣＬ１６による細胞遊走反応について検証した。好酸球の調整は実施例６に示した方法を用いた。また、細胞遊走反応については実施例４に示した方法を用いて行なった。また好酸球に対して強い細胞遊走反応をもつことが知られているＣＣＬ１１（eotaxin）１０ｎＭでの遊走反応をコントロールとした。また、ＣＣＬ１６のヒトおよびマウス好酸球の遊走反応に対する、ヒスタミンレセプターＨ３、Ｈ４に対するアンタゴニストであるthioperamideの阻害作用についても実施例４に記載の方法と同様に検証した。
【０１０９】
ヒト好酸球（eosinophil）に対するＣＣＬ１６の遊走反応の結果を図４Ｂの左側に、マウス好酸球に対するＣＣＬ１６の遊走反応を図４Ｂ右側に示す。ヒト好酸球における遊走反応はＣＣＬ１６が１０ｎＭ以上の濃度で認められ、１０００ｎＭ以上まで濃度をあげるにしたがって遊走の程度は増大した。また遊走の程度は１０ｎＭのＣＣＬ１１（eotaxin）の遊走反応の程度と比較して、ＣＣＬ１６が１０ｎＭでの反応性はほぼ同じ程度であった（ＣＣＬ１１の場合にはほぼ最高の遊走を示す濃度）のに対して、ＣＣＬ１６では濃度を上昇させるにしたがって遊走の程度はさらに増大し、１０００ｎＭで約５０％程度と非常に強い遊走反応を示すことが判明した。マウス好酸球についてもヒトＣＣＬ１６により遊走反応が誘導されることが示され、その遊走の程度は１０００ｎＭで約３０％程度とヒト好酸球よりも若干低いものの、全体の傾向としてはヒト好酸球と同じパターンが得られた。ＣＣＬ１６によるヒト好酸球の遊走反応のthioperamideによる反応阻害の結果を図４Ｃ左側に、マウス好酸球に対する作用を同図右側に示した。その結果、ヒトおよびマウスの好酸球のＣＣＬ１６による遊走反応は、thioperamideによって濃度依存的に阻害されることが示された。実施例６の結果より、ヒトおよびマウス好酸球においてはヒスタミンレセプターＨ３は発現しておらず、Ｈ４のみの発現がみられたことから、このＣＣＬ１６のヒトおよびマウス好酸球への遊走反応は、ヒスタミンレセプターＨ４を介した反応と考えられる。
【０１１０】
[実施例８]マウス好酸球に対するＣＣＬ１６の細胞内カルシウム濃度上昇反応
マウス好酸球を用いて、ＣＣＬ１６のヒスタミンレセプターＨ４を介しての細胞内カルシウム濃度上昇反応について検証した。方法としては実施例３のデセンシタイゼイション実験と同様の方法で行った。概要としてはマウス好酸球にｆｕｒａ２−ＡＭ fluorescence dyeを取り込ませて、１００ｎＭのＣＣＬ１６で刺激した後に１００ｎＭのヒスタミンで刺激した場合の細胞内カルシウム濃度上昇反応の検出、および逆に同濃度のヒスタミンで刺激した後のＣＣＬ１６の反応を調べた。またヒスタミンレセプターＨ３、Ｈ４のアンタゴニストであるthioperamideを反応させた後に１００ｎＭのＣＣＬ１６の細胞遊走反応についても検証した。
【０１１１】
マウス好酸球に対するＣＣＬ１６およびヒスタミンの細胞内カルシウム濃度上昇反応の実験結果を図４Ｄに示す。図４Ｄ上に示したように、ＣＣＬ１６はマウス好酸球に対して細胞内カルシウム濃度上昇反応を引き起こし、その後のヒスタミンの反応をデセンシタイゼイションすることが示された。また図４Ｄ中に示したように、ヒスタミンによって細胞内カルシウム濃度上昇反応が引き起こされた後にＣＣＬ１６を反応させた場合にもデセンシタイゼイションされることから、ＣＣＬ１６とヒスタミンは同一のレセプターを介してマウス好酸球に細胞内カルシウム濃度上昇反応を引き起こすことが証明された。また図４Ｄに示したように、thioperamideはＣＣＬ１６の細胞内カルシウム濃度上昇反応を阻害することから、ＣＣＬ１６によるマウス好酸球の細胞内カルシウム濃度上昇反応はヒスタミンレセプターＨ４を介した反応と考えられる。
【０１１２】
[実施例９]ＣＣＬ１６投与動物における血中および骨髄中においての好酸球動態
動物における血中ＣＣＬ１６濃度の上昇に対しての好酸球の動態を調べる実験を行った。メスの６週齢ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（日本クレア社）を購入し、１週間以上馴化を行った。そのマウスに対して、０．５ｎｍｏｌのヒトＣＣＬ１６を含む１００μｌのＰＢＳを尾静脈より投与した。コントロールは１００μｌのＰＢＳのみを投与した。またヒスタミンレセプターＨ３、Ｈ４のアンタゴニストであるthioperamideの効果を調べる実験においては、thioperamide  ２５０ｎｍｏｌをヒトＣＣＬ１６またはＰＢＳと同時に投与した。経時的にマウスをジエチルエーテルで麻酔して血液を採取し、その後頚椎脱臼法でマウスを屠殺して大腿骨を解剖的に取得した。得られた大腿骨は骨頭を切り離して注射筒に入れた１ｍｌのＰＢＳで骨髄細胞を押し流して回収し、骨髄細胞懸濁液を得た。得られた血液および骨髄細胞懸濁液をスライドグラス上に塗沫した標本を作製し、メイ・グリュンワルド−ギムザ染色法で染色を行った。得られた染色塗沫標本について1枚の標本につき最低５００細胞を観察して白血球の種類を同定した。その観察を基に血中および骨髄細胞懸濁液中の好酸球（eosinophil）、リンパ球（lymphocyte）および好中球（neutorphil）の量を算定した。
【０１１３】
ＣＣＬ１６を投与した場合または投与しなかった場合のマウスにおける血中の好酸球（eosinophil）、リンパ球（lymphocyte）および好中球（neutorphil）を図５Ａ左側に、骨髄細胞懸濁液の各細胞量を図５Ａ右側に示した。その結果、ＣＣＬ１６を投与したマウス（図中●）においては投与後６０分をピークに血中の好酸球量の顕著な増大がみられ、骨髄中においては逆に好酸球の減少がみられた。それに対してＰＢＳのみを投与した群（図中○）においては血中および骨髄細胞懸濁液中の好酸球において細胞数の変動は認められなかった。また、リンパ球および好中球においては、ＣＣＬ１６またはＰＢＳのみの投与において細胞数の変動は認められなかった。この実験における投与後６０分での好酸球、リンパ球、好中球の血中での細胞数変化を図５Ｂ上の段に、骨髄細胞懸濁液における各細胞の変動を図５Ｂ下の段に示す。この結果によるとＣＣＬ１６を０．５ｎｍｏｌ投与したことによって血中の好酸球量は約５倍に増加するのに対して、骨髄中の好酸球量は半分程度に減少していた。それに対してリンパ球および好中球はほとんど変動は認められなかった。thioperamideが投与された群においては、ＣＣＬ１６の投与によって認められた血中の好酸球量の増多および骨髄の好酸球減少がコントロールレベルまで抑制された。このＣＣＬ１６投与による血中の好酸球増加および骨髄中の好酸球減少は、骨髄よりＣＣＬ１６によるヒスタミンレセプターＨ４を介した作用によって好酸球が血中に誘導されたことが原因と考えられる。
【０１１４】
[実施例１０]ケモカインレセプターとヒスタミンレセプターの相同性の解析
ケモカインは通常ケモカインレセプターファミリーのレセプターと反応すると考えられており、ＣＣＬ１６はすでにケモカインレセプターファミリーのＣＣＲ１、２、５、８と弱い反応を示すことが知られている。それに対して本発明において、ケモカインＣＣＬ１６はヒスタミンレセプターＨ４と結合して細胞反応を引き起こすことが示された。このことからケモカインレセプター・ヒスタミンレセプターを含むヒトの７回膜貫通型レセプター類のアミノ酸配列類似性についての検討を行った。ケモカインレセプターはCCR1：EMBL Acc No. P32246・CCR2：EMBL Acc No. P41597・CCR5：EMBL Acc No. P51681・CCR8：EMBL Acc No. P51685、ヒスタミン（Histamine）レセプターはH1R：EMBL Acc No. P35367・H2R：EMBL Acc No. P25021・H3R：EMBL Acc No. Q9Y5N1・H4R：EMBL Acc No. Q9H3N8、その他ブラジキニン（Bradykinin）レセプターRB１：EMBL Acc No. P46663・RB2：EMBL Acc No. P30411、アンジオテンシン（Angiotensin）レセプターR1：EMBL Acc No. P30556・R2：EMBL Acc No. P50052、オピオイド（Opioid）レセプターRD：EMBL Acc No. P41143・RM：EMBL Acc No. P35372・RK：EMBL Acc No. P41145・RX：EMBL Acc No. P41146、ソマトスタチン（Somatostatin）レセプターR１：EMBL Acc No. P30872・R2：EMBL Acc No. P30874・R3：EMBL Acc No. P32745・R4：EMBL Acc No. P31391、セロトニン（Serotonin）レセプター１AR：EMBL Acc No. P08908・１BR：EMBL Acc No. P28222・１DR：EMBL Acc No. P28221・１ER：EMBL Acc No. P28566、ドーパミン（Dopamine）レセプターRD２：EMBL Acc No. P14416・RD３：EMBL Acc No. P35462・RD４：EMBL Acc No. P21917およびムスカリン（Muscarinic）レセプターR1：EMBL Acc No. P11229・R2：EMBL Acc No. P08172・R3：EMBL Acc No. P20309・R4：EMBL Acc No. P08173のアミノ酸配列について、PRRPプログラム（後藤（Gotoh）等 (1999) アドバンスズ・イン・バイオフィジックス（Advances in biophysics）（Japan） 1999年  36巻  p159-206）を用いて分子系統樹解析を行った。
【０１１５】
分子系統樹解析の結果を図６に示す。この結果ではケモカインレセプターはブラジキニン、アンジオテンシン、ソマトスタチンなどのペプチド性のリガンドに対するレセプター群に属するのに対して、ヒスタミンレセプターはセロトニン、ドーパミンなどの生体アミン類のレセプター群に属する形となり、ケモカインレセプターとヒスタミンレセプターは構造上まったく異なるグループに属してかなり類似性の低い関係にあることが示された。このことから、レセプターのアミノ酸配列からケモカインＣＣＬ１６がヒスタミンレセプターＨ４のリガンドであることをバイオインフォーマティックの観点から予測することは困難であったことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明のスクリーニング方法によって選択された物質は、肝臓疾患、肝臓疾患に伴う好酸球増多症、アレルギー性疾患、悪性腫瘍、免疫不全症、自己免疫疾患、もしくは炎症性疾患の治療剤または予防剤の製造のための有効成分として用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１Ａは、ヒスタミンレセプターＨ４発現組換え体細胞におけるケモカインＣＣＬ１６による細胞内細胞内カルシウム濃度上昇反応を示す。図１Ｂは、該反応についての、デセンシタイゼイション反応およびヒスタミンレセプターＨ４のアンタゴニストによる効果を示す。
【図２】図２Ａは、ヒスタミンレセプターＨ４発現組換え体細胞におけるケモカインＣＣＬ１６による細胞遊走反応を示す。図２Ｂは、該反応に対するヒスタミンレセプターＨ４のアンタゴニストによる効果を示す。図２Ｃは、ヒスタミンレセプターＨ４発現組換え体細胞におけるＣＣＬ１６とヒスタミンの併用使用による細胞遊走反応を示す。図２Ｄは、ＣＣＬ１６によるChemotaxis効果を示す。図２Ｅは、ＣＣＬ１６による細胞遊走反応のＰＴＸによる阻害反応を示す。
【図３】図３Ａは、ヒスタミンレセプターＨ４に対するケモカインＣＣＬ１６の結合を示す。図３Ｂは、図３Ａに示すヒスタミンレセプターとＣＣＬ１６との結合量の結果から算定したスキャッチャードプロットデータを示す。図３Ｃは、ヒスタミンレセプターＨ４のアンタゴニスト等の化合物による結合の阻害を示す。
【図４】図４Ａは、ヒトおよびマウスの好酸球におけるヒスタミンレセプターの発現の確認結果を示す。図４Ｂは、各好酸球に対するケモカインＣＣＬ１６の細胞遊走反応および細胞内細胞内カルシウム濃度上昇反応の反応性を示す。図４Ｃは、該反応に対するヒスタミンレセプターＨ４のアンタゴニストの効果を示す。図４Ｄは、マウス好酸球におけるＣＣＬ１６およびヒスタミンによる細胞内カルシウム濃度上昇反応についての、デセンシタイゼイション反応およびヒスタミンレセプターＨ４のアンタゴニストによる効果を示す。
【図５】図５Ａは、ケモカインＣＣＬ１６を投与されたマウスにおける血中および骨髄中の好酸球、リンパ球、および好中球数の変動を示す。図５Ｂは、ＰＢＳ、ＣＣＬ１６またはＣＣＬ１６＋ヒスタミンレセプターＨ４のアンタゴニスト投与６０分後の、血中の好酸球、リンパ球および好中球の細胞数を示す。
【図６】ヒスタミンレセプター、ケモカインレセプターを含む７回膜貫通型レセプターの中でのヒスタミンレセプターＨ４と他のレセプターとの類似性の解析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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