(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫系の分析において検体を捕捉する一次抗体を診断用容器の内表面に対して、疎水性相互作用によって固相化される場合に、該内表面により多数の一次抗体を吸着・固相化し得るようにし、その感度水準を向上させる。【解決手段】固相化された一次抗体に抗原を捕捉させ、更に標識マーカーによって標識化された二次抗体を該抗原に捕捉させることで、該抗原を定量化する各種免疫測定法に使用される有機系材料からなる診断用容器において、前記有機系材料として、シクロオレフィン系樹脂を使用した。【選択図】図１
2006194796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相化された一次抗体(ab1)に抗原(ag)を捕捉させ、更に標識マーカー(M)によって標識化された二次抗体(ab2)を該抗原(ag)に捕捉させることで、該抗原(ag)を定量化する各種免疫測定法に使用される有機系材料からなる診断用容器(20)において、
前記有機系材料として、シクロオレフィン系樹脂を使用した
ことを特徴とする診断用容器。
【請求項２】
前記診断用容器(20)における容器内表面(22)の所要領域の水に対する接触角は、７０度以上である請求項１記載の診断用容器。
【請求項３】
前記シクロオレフィン系樹脂は、ＡＳＤＭ  Ｄ５７０に準拠して測定した水温２３℃の純水中に２４時間放置した後の吸水率が０.１％以下である請求項１または２記載の診断用容器。
【請求項４】
前記シクロオレフィン系樹脂は、磁界０.１Ｔ、試料(S)からＳＱＵＩＤセンサまでの距離(D)１.５ｍｍ以下の条件下で磁界を印加した際の残留磁気量が１５ｐＴ以下である請求項１〜３の何れかに記載の診断用容器。
【請求項５】
前記シクロオレフィン系樹脂は、磁性金属の含有量が３０ｐｐｂ以下である請求項４記載の診断用容器。
【請求項６】
前記診断用容器(20)において試料(S)が保持される容器底面(22a)の厚さは、０.１〜１.０ｍｍの範囲である請求項１〜５の何れかに記載の診断用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、抗原・抗体反応を利用して抗体または抗原(以下、検体と云う)を測定する免疫系の分析において使用される診断用容器に関し、詳細には、疎水性相互採用によって一次抗体を容器内表面に好適に吸着させ、更にはＳＱＵＩＤセンサによって、定量化が可能な磁気マーカーを用いた免疫診断をなす免疫反応測定法に殊に好適に使用し得る診断用容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原菌やガン細胞、ＤＮＡの遺伝子解析または環境有害物質等の測定、所謂バイオ計測の分野において、免疫反応を用いて測定すべきバイオ物質(例えば抗原)と、これと選択的に結合する検査試薬(例えば二次抗体)との結合を測定することで、該抗原等の種類と量との計測がなされている。公知の免疫系の検査法としては、下記の［非特許文献１］に記載されるように測定すべき抗原や当該抗原を捕捉する抗体、すなわち検体を直接または間接的に発光物質、ラジオアイソトープその他の標識化物質(以下、マーカーと云う)で標識化した検体(以下、標識化検体と云う)の発光量や放射線量を計測し、分析・診断する方法が一般的に採用されている。そして殊にマーカーとして酵素を用いると共に、固相化された抗原または抗体を用いる、所謂エンザイムノアッセイ(ＥＬＩＳＡ)法や、サンドイッチ法(二重抗原決定基法)と呼ばれる方法が、その高い精度故に多用されている。
【非特許文献１】シンプル免疫学  株式会社南江堂(２００１年２月１５日)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そしてバイオ物質である抗原等の測定に用いるマーカーとしては、以下の［特許文献１］〜［特許文献５］に記載されるように、厳密な管理を要求されるラジオアイソトープより、使い勝手の良い発光マーカー等が一般的に使用されている。発光マーカー等を用いる光学的手法は、発光マーカーが予め付加されたを検査試薬である二次抗体等を抗原に結合させて、そのマーカーからの光量を測定することで抗原量の算出を行なうものである。しかしこの光学的手法においては、数ｐｇ(ピコグラム)の抗原測定が限界であり、数ｐｇ以下の極微量しか抗原が存在しない局所または血中に対する検査において要求される感度水準には応えられない問題を内在していた。
【特許文献１】特許２５３２６７０号公報
【特許文献２】特開２０００−３０４７４９号公報
【特許文献３】特開平１１−５０８０３１号公報
【特許文献４】特開平９−２４３６４１号公報
【特許文献５】特開平９−１８４８４１号公報
【０００４】
一般に抗原の測定限界は、(１)測定に際して使用される容器(以下、診断用容器と云う)に対して一定量の抗原を投入した場合に、該容器が補足し得る抗原の量と、(２)マーカーの検出限界とによって決定される。(１)抗原の補足数は、診断用容器に対して固相化し得る一次抗体の数、すなわち診断用容器の単位面積当たりの一次抗体の量で略決定される。一般的な診断用容器の場合、１００ｎｍ２に１〜１００個程度の一次抗体が固相化されている疎らな状態であり、効率的な補足が可能な状態とは言い難い。すなわち診断用容器への一次抗体の固相化数は充分とは云えなかった。
【０００５】
また(２)は、マーカーの検出機構および検出方法におけるマーカーの最低測定感度(感度水準)に略依存している。そして感度水準を向上させる手段の１つとして、超伝導状態で出現する磁束の量子化(量子効果)を利用するＳＱＵＩＤ(Superconducting Quantum Interference Device)センサによって、定量化が可能な磁気マーカーを用いた免疫診断をなす免疫反応測定法(以下、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法と云う)が、以下の［特許文献６］、［特許文献７］、［非特許文献２］および［非特許文献３］に記載される如く、開発途上にある。このＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法は、具体的には粒子径が２０〜４０ｎｍの磁性微粒子を内包したポリマーからなる磁気マーカーを抗体に付加させて標識化された抗体(標識化検体)と、測定されるバイオ物質である抗原とを抗原抗体反応で結合させ、該磁気マーカーからの微弱な磁気的な信号をＳＱＵＩＤセンサにより測定することで、抗原量を算出するものである。また感度水準を更に増強させるために、ビオチンと呼ばれる補酵素を抗体に付加したビオチン化抗体と、このビオチンと特異的に反応するアビジンと呼ばれる糖蛋白質と磁気マーカーとを予め結合させたアビジン・磁気マーカーの結合物とを反応させ、ＳＱＵＩＤセンサによって検出・測定する手段も一般的に用いられている。
【特許文献６】特開２００４−１５７０７２号公報
【特許文献７】特開２００１−３３４５５号公報
【非特許文献２】円福敬二「ＳＱＵＩＤを用いた抗原−抗体反応計測」、応用物理、７０巻１号４８頁(２００１年)
【非特許文献３】円福敬二「ＳＱＵＩＤを用いたバイオ免疫診断」、低温工学、３８巻９号４６９〜４７６頁(２００３年)
【０００６】
そしてこのＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法は、従来の吸光度計および光学系マーカーを使用した測定法に比べて、１００倍以上の感度を有することが確認されており、この高い感度故に抗原等の、血液等の検体含有溶液中での存在量が光学系の測定方法の１／１００といった微量であっても検出できることが確認されている。また従来の測定方法においては、抗原と標識化された抗体とを反応させた後に、未結合の抗体を洗浄することが必要とされていたが、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法では、未結合の磁気マーカーは血清等の被検査溶液中でブラウン運動をなし、個々の磁気マーカーの磁気信号が相殺されてＳＱＵＩＤセンサに検知されなくなる。このためＳＱＵＩＤセンサは、抗原に結合した磁気マーカーのみからの磁気信号を検出することとなり、前述の洗浄を省略でき、測定に関する手間を少なくし得る観点からもその重要性が高まっている。
【０００７】
ところでＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法で抗原は、磁気マーカーの磁気信号を検出することで測定されるため、該磁気信号の強度(感度水準)は抗原に結合した磁気マーカーの量に比例する。従って微量の抗原を高感度かつ高速に検出・測定するためには、微弱な磁気信号の検出・測定をなし得る必要がある。すなわち従来比１００倍以上の感度水準を確保するためには、従来比１／１００以下となる磁気マーカー(が結合した標識化抗体)からの磁気信号(シグナル)を検出・測定可能とするだけでなく、診断用容器も含め外部から生ずる磁気異常信号(ノイズ)の量も１／１００以下にしなければならない問題もある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を克服し、所期の目的を達成するため、本発明に係る診断用容器は、固相化された一次抗体に抗原を捕捉させ、更に標識マーカーによって標識化された二次抗体を該抗原に捕捉させることで該抗原を定量化する各種免疫測定法に使用される有機系材料からなる診断用容器において、
前記有機系材料として、高い疎水性相互作用を発現するシクロオレフィン系樹脂を使用したことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る診断用容器によれば、高い疎水性相互採用を発現するシクロオレフィン系樹脂をその材質として採用することで、抗原等の検体を測定する免疫系の分析に使用される診断用容器に対して、疎水性相互採用によってより多くの一次抗体を好適に吸着させて、その感度水準を向上させ得る。またＳＱＵＩＤセンサによって、定量化が可能な磁気マーカーを用いた免疫診断をなす免疫反応測定法に対しても、シクロオレフィン系樹脂は該免疫反応測定法に多大な悪影響を及ぼす磁気的汚染の虞がなく、殊に好適に使用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
次に本発明に係る診断用容器につき、好適な実施例を挙げて、添付図面を参照しながら以下説明する。本願の発明者は、抗原等を特異的に捕捉する一次抗体(固定用抗体)を診断用容器の内表面(一次抗体が固相化される内表面)に対して、疎水性相互作用によって固相化される場合に、診断用容器の材質としてシクロオレフィン系樹脂を採用することで、診断用容器の内表面により多数の一次抗体が吸着・固相化され、抗原の感度水準が向上された診断用容器が得られることを知見したものである。またシクロオレフィン系樹脂の蒸留可能でかつ重合後に重合に使用した触媒が除去可能である特性により、その診断用容器を検出限界が大きく向上しているＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定に使用することで、一次抗体の増加による感度水準の向上だけでなく、診断用容器に由来する磁気ノイズを低減して、より精密な測定をなし得ることも併せて知見した。なお以下の実施例においては、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法に好適に採用し得る診断用容器について説明する。
【００１１】
実施例に係る診断用容器２０は、図１に示す如く、一般的に用いられる形状で、かつ処分容易性の高いプラスチック製の容器(図１(ａ)参照)であり、その材質としてシクロオレフィン系樹脂が使用されている。そしてその容器内表面２２には、抗原ａｇを補足する一次抗体ａｂ１が吸着されて固相化されている。そしてこの一次抗体ａｂ１に測定すべき抗原ａｇが補足され、更に予め磁気マーカー(標識マーカー)Ｍで標識化された二次抗体ａｂ２がこの抗原ａｇに対して補足された形態となっている(図１(ｂ)参照)。なお実際の抗原(検体)測定に使用される部分は、診断用容器２０に供給される、例えば血液等の検体含有物質(以下、試料Ｓと云う)の総容量に対応した部分、具体的には容器底面２２ａと容器側面２２ｂとからなる容器内表面２２の一部だけであり、説明上、本実施例においては当該部位を所要領域と呼称する。
【００１２】
本発明で云うシクロオレフィン系樹脂とは、シクロオレフィンポリマー(以下、ＣＯＰと云う)と、シクロオレフィンコポリマー(以下、ＣＯＣと云う)に分類される。そして、例えば下記の［非特許文献４］に記載の如くＣＯＰは、原料であるジシクロペンタジエン(ＤＣＰＤ)を、単量化して得たシクロペンタジエン(ＣＰＤ)が合成される、図２に示す構造を有するノルボルネン系モノマー(以下、ＮＢと云う)を、(１)開環メタセシス重合した後に残存二重結合を水素化する、(２)末端に極性基を付加重合させたＮＢを開環メタセシス重合した後に残存二重結合を水素化する、といった所謂開環重合法で合成されるホモポリマーである。ＣＯＣは、ＮＢとプロピレン等のアルケン化合物であって末端に二重結合を有するα−オレフィンとの付加共重合体(コポリマー)である。
【非特許文献４】透明ポリマーの屈折率制御(日本化学会編)学会出版センター(１９９８年)
【００１３】
シクロオレフィン系樹脂が本願発明に好適である理由を、以下説明する。基本的に抗原ａｇを補足する一次抗体ａｂ１を、診断用容器２０における容器内表面２２に吸着・固相化する駆動力である疎水性相互作用は、少なくとも一次抗体ａｂ１を吸着すべき部位が疎水性を示すものであれば働き、かつその疎水性の度合いが高ければ該作用の度合いも高いことが知られている。この点を考慮すると、(Ａ)その組成中に、例えばメチル基やメチレン基等の疎水性の高い官能基を備え、その疎水性が高い材質が好適であり、例えばポリスチレン樹脂(ＰＳ)や、ポリプロピレン樹脂(ＰＰ)等のオレフィン系樹脂や、ポリフッ化ビニリデン(ＰＶＤＦ)の如きフッ素系化合物含有樹脂が挙げられる。
【００１４】
また前述した如く、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法においては、(Ｂ)磁気ノイズ、すなわち診断用容器２０の磁気汚染が小さい方がよい。更に診断用容器２０には、透明性、剛性、耐薬品性、成形性および処分容易性といった、(Ｃ)一般的物性が求められることは云うまでもない。殊にＳＱＵＩＤセンサの使用に際しては、下記の［非特許文献５］および［非特許文献６］に記載されるように、磁気マーカー(標識マーカー)Ｍから発せられる磁気信号は空間的に大きく分布するため、該磁気信号に関連する感度水準および測定安定性は、例えば図３に示すような構造のＳＱＵＩＤ計測装置５０に使用される診断用容器２０とＳＱＵＩＤセンサとの距離Ｄおよび診断用容器２０の形状に夫々依存することが確認されている。具体的には、ＳＱＵＩＤセンサと診断用容器内２０に保持される試料Ｓとの距離Ｄを出来るだけ接近させると共に、その距離Ｄを測定中に常に一定とする必要がある。この条件は、(Ｃ−１)試料Ｓが保持される診断用容器２０における容器底面２２ａの板厚さを薄くし、更に(Ｃ−２)診断用容器２０全体の反り等の変形をなくすことで達成される。
【非特許文献５】平成１５年度地域新生コンソーシアム研究開発事業「磁気ナノマーカーを用いた超高感度免疫検査システムの開発」成果報告書(平成１６年３月)
【非特許文献６】Kenji ENPUKU 、Shigenori HAMAOKA  et al.「Magentic marker and high Tc superconducting quantum interference device for biological immunoassays」IEICE Trans.Electron.Vol.88-C(電子情報通信学会英文誌Ｃ)（２００５年１月)
【００１５】
(Ｂ)診断用容器２０の磁気ノイズには、診断用容器２０自体の残留磁気と、外部磁場および機械ノイズ等の環境要因とが考えられる。環境要因については磁気シールド等の対策によって解決が可能であるが、診断用容器２０に関しては環境要因の如き解決手法が適用できず、その材質、材料作製プロセスおよび成形法等を考慮する必要がある。なお本発明のＳＱＵＩＤ計測装置５０を使用した測定におけるＳＱＵＩＤセンサと、診断用容器２０内に捕捉され、磁気マーカーＭによって標識化された二次抗体ａｂ２、すなわち試料Ｓとの距離Ｄは、感度水準の維持のために２ｍｍ以下に、実際の測定においては更なる感度水準の達成のため１.５ｍｍ以下とされている
【００１６】
そしてこの磁界０.１Ｔ、試料ＳからＳＱＵＩＤセンサまでの距離(Ｄ)１.５ｍｍ以下の条件下で、例えば抗原ａｇとしてヒトＩＬ８を使用した場合の、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法が目的とする数ｐｇ以下の検出限界(感度水準)を達成する磁気信号(Ｂ)の強度は、下記の［実験１］から約２０ピコテスラ(ｐＴ：２０×１０−１２Ｔ)であることが確認された。ここから、磁気信号測定時に許容される診断用容器２０を含めた外部から生ずる磁気ノイズは２０ｐＴ以下であるため、診断用容器２０から生ずる磁気ノイズが１５ｐＴ程度以下であることが要求される。なお磁気ノイズとは、残留磁気量、すなわち磁気汚染を指すものである。
【００１７】
一般に診断用容器２０の材質としては、ガラス系材料と高分子系材料とが挙げられ、前述の磁気ノイズの点ではガラス系材料の採用が好適であるが、本願発明においては高分子系材料を採用している。高分子系材料の場合、(Ｂ)診断用容器２０の磁気ノイズは、(Ｂ−１)殆どの重合工程において触媒や配合材料として使用される金属化合物の存在、(Ｂ−２)所要の診断用容器２０形状への成形に際して、金属との接触に由来する金属成分の混入によって発生している。従って選択され得る材質としては、下記の［実験２］から明らかな通り、シクロオレフィン系樹脂、アクリル樹脂(ＰＭＭＡ(ポリメチルメタクリレート))および高圧法ポリエチレンが挙げられる。これらはモノマー時における蒸留による金属不純物の除去および重合完了後の触媒(金属成分)の除去が可能であったり、その製造方法上、金属触媒が不要となるためである。
【００１８】
外部磁場や機械ノイズ等の環境要因を完全に排除できた場合において  診断用容器２０に求められる１５ｐＴ以下の磁気ノイズを達成する金属の量は、下記の［実験３］から３０ｐｐｂ以下であることが確認された。またこの［実験３］は、殊に強い残留磁気特性を示すことが知られている、鉄(Ｆｅ)、コバルト(Ｃｏ)およびニッケル(Ｎｉ)等の周期律表における第４周期第８族元素の酸化物について実施されている。
【００１９】
そして診断用容器２０には、(Ｃ)一般的物性、すなわち透明性、剛性、耐薬品性、成形性および処分容易性、殊に容器底面２２ａの薄い板厚および反りのない状態を達成するため、一定以上の剛性および成形性が要求され、この点からポリスチレン樹脂(ＰＳ)、ポリプロピレン樹脂(ＰＰ)等のオレフィン系樹脂、フッ素系化合物含有樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリアミド樹脂またはアクリル樹脂が好適である。また一方で対象物が抗原ａｇ(バイオ物質)であるため、安全確実な処分を考慮し、診断用容器２０は焼却等による高温減容処分が可能であることが求められる。しかしこの点で、(Ａ)疎水性相互作用の点で優れているフッ素系化合物含有樹脂は、高温処理時に有害なフッ素化ガスの発生が避けられない上に、流動性が低いため成形性が悪いという問題がある。また(Ｂ)磁気ノイズの点で優れているガラス系材料は、高温による減容が困難なため、夫々好適な材質とはなり得ない。すなわちこれら(Ｂ)および(Ｃ)の観点を考慮すると、シクロオレフィン系樹脂またはアクリル樹脂が、本発明に係る診断用容器２０の好適な材質として使用できる。
【００２０】
しかしアクリル樹脂は構造および官能基種類の点から若干の極性を持つため、親水性が発現している。この親水性の発現は、例えば血液等の水系溶液であることが多い試料Ｓを好適に保持する観点から望ましい一方で、疎水性相互作用は強いとは云えず、下記の［実験４］に記載の如く、これを利用した一次抗体ａｂ１の容器内表面２２への吸着・固相化性が弱く、免疫反応の感度水準の向上には必ずしも満足のいく特性を有しているとは云えなかった。またこの他、アクリル樹脂は、シクロオレフィン系樹脂に比較して、機械的強度やアルコール等の有機溶媒に対する耐性が低い。
【００２１】
これに対し、本発明で知見が得られたシクロオレフィン系樹脂は、所謂アルカン系物質であるため高い疎水性を備えており、このため高い疎水性相互作用が発現することになる。このため疎水性相互作用による、一次抗体ａｂ１の吸着・固相化は、これまで診断用容器２０として一般的に使用されてきた材質に比較して、より多量になされる結果となる。これは診断用容器２０の単位面積当たりに、より多数の抗原ａｇ、ひいては多数の標識化検体(二次抗体ａｂ２、磁気マーカーＭ)の補足が可能であることを意味しており、その結果、抗原ａｇの感度水準を高めることが可能となる。
【００２２】
そしてこのシクロオレフィン系樹脂を採用することで、診断用容器２０における容器内表面２２の所要領域の水に対する接触角は、７０度以上となる。これは前述した［非特許文献５］で記載されている。ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法の診断用容器２０の材質として好適な結果を得たアクリル樹脂を基準とした数値である。すなわち水に対する接触角が７０度以上であれば、アクリル樹脂からなる診断用容器２０が発現する疎水性相互作用以上の一次抗体ａｂ１の吸着・固相化が期待できる(［実験４］および［実験５］参照)。
【００２３】
また有機系材料としては、ＡＳＤＭ  Ｄ５７０に準拠して測定した水温２３℃の純水中に２４時間放置した後の吸水率(以下、単に吸水率と云う)が０.１％以下であるものが好適であることが確認されている。これは吸水率が０.１％を超えると、診断用容器２０の容器内表面２２における親水性が高まって疎水性が低下し、その結果、疎水性相互作用による一次抗体ａｂ１の吸着・固相化性が弱くなってしまうためである。本発明に係るシクロオレフィン系樹脂における親水性は、基本的に図２に示されているＲ１、Ｒ２の種類によって略決定され、ここに親水性の官能基、すなわち極性を持った官能基が結合するとその吸水率が０.１％を超えてしまうことがある。またこの吸水率は、時間の経過と共に大きくなるものであるため、該吸水率が０.１％を超えてしまうものは経時的変化により疎水性相互作用が劣化してしまう。一例として、その吸水率が０.３％程度と高いアクリル樹脂を、診断用容器２０の材質として採用する場合、経時的変化により疎水性相互作用が大きく劣化してしまうことが知られている。
【００２４】
この他、前述のＳＱＵＩＤセンサと試料Ｓとの距離Ｄを達成するため、診断用容器２０において試料Ｓが保持される容器底面２２ａの厚さを０.１〜１.０ｍｍの範囲とすることが好適である。この厚さが０.１ｍｍ未満であると、診断用容器２０の剛性の確保が困難となって選択した材質に関係なく、診断用容器２０全体の反り等の変形を抑制し得なくなり、一方、１.０ｍｍを超えると、電動スライダによって常に移動状態にある診断用容器２０とＳＱＵＩＤセンサとの間の間隔が小さくなり、測定安全性に問題が生じる。そしてその厚さが０.１〜１.０ｍｍの範囲であれば、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法において正確なデータ採取が可能なことも確認されている。
【００２５】
(製造方法)
次に本実施例に係る診断用容器の製造方法の一例を説明する。具体的には、診断用容器２０を成形する原料であるシクロオレフィン系樹脂を準備し、これを、例えば図１に示すような好適に試料Ｓを保持し得る所要形状の診断用容器２０に成形すればよい。従来の光学系マーカーを使用したマーカー測定法においては一般的な成形方法での製造が可能である。しかしより検出限界の高いＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法での使用を考える場合、前述の金属の混入と、容器底面２２ａの厚さおよび診断用容器２０全体の変形を考慮することが必要となる。
【００２６】
すなわち原料の準備と成形との何れも、シクロオレフィン系樹脂と各種金属とが直接接触しないように、例えば各種部材をセラミック等の非金属物質でコーティングしたり、加熱手段としてセラミックヒーターを使用する必要がある。また成形方法については、単一工程で診断用容器２０が成形できるが、成形機内が高温(１８０〜２８０℃)、高圧(１６００〜２２００ｋｇ／ｃｍ２)状態にあり、原料とスクリュー、シリンダーおよび金型等とが接触・摩擦する射出成形は不向きである。一方、加熱重合に相当の時間を要し、工業的大量生産が困難であるが、原料を直接、シリコーンまたはガラス製の型中に注型して成形を行なうキャスト成形(鋳込み重合法)や、これを連続的に行なう連続キャスト成形法は、原料と金属との接触を防止し得るため、下記の［実験６］から明らかなように、採用可能である。また原料がスクリュー、シリンダー、スクリーンおよびダイス等の鋼材と接触する押出成形法は、その接触による汚染水準は射出成形と比べて成形品に掛かる圧力が極めて低いため、金属の混入は殆どなく採用し得ることが確認されている。
【００２７】
またシクロオレフィン系樹脂から、成形が容易なシート状物を押出成形法によって成形し、その後、真空圧空成形法により診断用容器２０を得るようにしてもよい。この際、真空圧空成形法に使用される成形用金型の材質や、押出成形法に使用されるダイスおよびスクリューの材質として非磁性金属であるアルミニウムを採用し、更にその表面をアルマイト、セラミックまたはフッ素系物質でコーティング加工等するとより好適である。また真空圧空成形の際には、水分、金属分および油分をより完全に除去するとより好適である。
【００２８】
このように製造された診断用容器２０は、その容器内表面２２に一次抗体ａｂ１、抗原ａｇおよび標識マーカーＭで標識化された二次抗体ａｂ２が供給され、最終的には抗原ａｇに捕捉された磁気マーカーＭで標識化された二次抗体ａｂ２の量を測定することで、免疫系の測定がなされる。
【００２９】
(実験例)
以下に本発明に係る診断用容器の各種物性、例えば疎水性、磁気ノイズおよび一次抗体の捕捉量(度合い)、すなわち標識化された二次抗体の捕捉量等についての実験例を示す。なお本発明に係る診断用容器は、この実験例に限定されるものではない。また以下の各実験において診断用容器の材質は、［非特許文献５］で評価対象となっているアクリル樹脂を基本的に採用している。
【００３０】
(実験１)  ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法による測定限界について
図１(ａ)に示す形状の診断用容器(セル)を、アクリル樹脂を材質としてキャスト成形法および真空圧空成形法によって準備し、この容器内表面に以下説明する一般的な方法によって、ヒトＩＬ８(抗原)を補足させ、これを磁気マーカーによって標識化してＳＱＵＩＤ測定に供し、その際のヒトＩＬ８の重さと、磁気信号との関係を観察した。
【００３１】
(ヒトＩＬ８(抗原)の診断用容器への補足、二次抗体および磁気マーカーの付与方法)
(１)ｐＨ７.４のリン酸緩衝溶液(以下、ＰＳＢと云う)に界面活性剤(商品名 Ｔｗｅｅｎ２０：ａｔｌａｓ ｐｏｗｄｅｒｓ製)を０.０５％混合した溶液(以下、ｔＰＢＳと云う)を調製する。
(２)ＩＬ８モノクロナール抗体(商品名 ＭＡＢ２０８：Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ製)の１００μｇ／ｍＬ濃度の溶液１００μＬをセル内に入れ、温度４℃、時間１２時間の条件で放置する。
(３)セル内から未反応抗体溶液を捨てる。
(４)ブロッキング材(商品名 ブロックエース：大日本製薬製)の０.１％ｔＰＢＳ溶液を作製し、セル内に２００μＬ加えて、室温、時間１時間の条件で放置する。
(５)セル内から未反応ブロッキング剤(溶液)を捨て、ｔＰＢＳ溶液で３回洗い流す。
(６)所定量のヒトＩＬ８(商品名 ０９１−０４３３１：ＷＡＫＯ製)を、ｐＨ７.４のＰＢＳ溶液に所定量溶解し、セル内に１００μＬ分注し、プレートシール(密封)して室温、時間１時間の条件で放置して抗体(ＩＬ８モノクロナール抗体)と反応させる。
(７)セルのシールを剥がし、αＩＬ８ポリクロナール抗体(商品名 ＡＦ２０８：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製)と磁気マーカーとを予め結合させた標識化抗体５０μＬ(濃度０.１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ、ＰＨ７.４)を加え、プレートシール後、３０分放置し、抗原(ヒトＩＬ８)と磁気マーカーが付与された抗体(αＩＬ８ポリクロナール抗体)を反応させる。なお磁気マーカーの作製方法については下に記す。
(８)診断用容器に０.１Ｔの磁場をかけ、磁気マーカー内のフェライト粒子を磁化する。
(９)ＳＱＵＩＤ計測装置(図３参照)により、診断用容器の残留磁気を測定し、検量線を用いて抗原量を算出する。
なお上記工程(７)に記載したαＩＬ８ポリクロナール抗体(商品名 ＡＦ２０８：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製)と磁気マーカーとを予め結合させた標識化抗体は［特許文献７］の記載の内容に準拠して調整した。
【００３２】
(磁気マーカーの作製方法)
メタノール１０ｍＬに、マイクロモノマーとしてのポリビニルピロリドン(０.００４〜０.０４ｍｇ範囲内の一定量)にフェライト(Ｆｅ２Ｏ３)微粒子０.０５ｇを加え、超音波照射し、更に攪拌を実施した後に遠心分離を行なうことによってポリビニルピロリドンを吸着したフェライト微粒子を作製し、次いでテトラヒドロフラン(ＴＨＦ)５ｍＬに、Ｎ−アクロイル−Ｌ−グルタミン酸０.２０ｇ(フェライト微粒子に吸着したポリビニルピロリドンのビニル基量の１００倍量)と、０〜１００倍量の架橋剤トリ(アクロイルオキシ)アミン塩酸塩とを溶解させて準備溶液とし、これに粒子１ｇ当たりに０.２ｇのポリビニルピロリドンを吸着したフェライト微粒子０.０１８ｇと、２,２'−アゾビス(イソブチロニトリル)(ＡＩＢＮ)０.０１ｇとを加え、温度３５℃、時間１０時間の条件で攪拌し、更に遠心分離(５回繰り返し)を実施して磁気マーカーを得た。
【００３３】
(実験１の結果)
ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法による測定限界についての結果を図４に示す。この図４から、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法が目的とする数ｐｇ以下の検出限界(感度水準)を達成する磁気信号(Ｂ)の強度は２０ｐＴ程度であることが確認された。
【００３４】
(実験２)  磁気ノイズと材質とについて
下記の測定例１〜１０および参考測定例の各材質を、該材質に好適な加工法によって厚さ１.０ｍｍの板状物とし、これを超純水中で超音波洗浄してその表面に付着している磁気汚染物質を取り除き、乾燥後、板状物とＳＱＵＩＤセンサとの距離を１.５ｍｍに保つ条件で移動させ、磁気信号の最大値と最小値との差をもって磁気ノイズ値とするＳＱＵＩＤ測定を実施した。なお磁気信号の計測にあたっては、予め板状物に０.１Ｔの磁界をかけて磁化している。この結果を下記の表１に示す。
【表１】
2006194796.tif 000003
【００３５】
(使用した材質)
測定例１：アクリル樹脂(商品名  コモグラス：クラレ製)
測定例２：ポリカーボネート樹脂(商品名  タフロンＡ１９００：出光石化製)
測定例３：ポリアミド樹脂(商品名  ＵＢＥナイロン１２  ３０１４Ｂ：宇部興産製)
測定例４：ポリプロピレン樹脂(商品名  グランドポリプロＪ２２７ＴＰＰ：グランドポリマー製)
測定例５：ポリスチレン樹脂(商品名  ＧＰＰＳ  ＨＦ５５：ＰＳジャパン製)
測定例６：ポリフッ化ビニリデン(商品名  ＫＦポリマー：呉羽化学工業製)
測定例７：ＣＯＰ(商品名  ＺＥＯＮＥＸ  ４８０Ｒ：日本ゼオン製)
測定例８：ＣＯＰ(商品名  ＺＥＯＮＥＸ  １０６０Ｒ：日本ゼオン製)
測定例９：ＣＯＣ(商品名  ＴＯＰＡＳ  ６０１３Ｓ：ポリプラスチックス製)
測定例１０：ＣＯＣ(商品名  ＴＯＰＡＳ  ６０１５Ｓ：ポリプラスチックス製)
参考測定例：ガラス(ソーダ石灰ガラス)
【００３６】
(実験２の結果)
表１に記載された結果から、シクロオレフィン系樹脂およびアクリル樹脂が、素材として磁気ノイズが少なく、(Ｂ)磁気ノイズの観点からは本発明に採用し得ることが確認された。なお測定例１〜３および７〜１０と、参考測定例とについては、その磁気信号のパターンを図５〜図１２に示す。
【００３７】
(実験３)  磁気ノイズと(磁性)金属の含有量とについて
材質として、上市されている複数の樹脂製品から選択されたシクロオレフィン系樹脂２種およびアクリル樹脂１種についての測定例Ａ〜Ｅに係る下記の試料を、図１に示す診断用容器の形状とし、図３に示す装置５０によりＳＱＵＩＤ測定(診断用容器に磁界０.１Ｔをかけた場合の残留磁気量(磁気信号Ｂ(ｐＴ：センサと診断用容器との距離：１.５ｍｍ))を行なった。そして各測定例に係る診断用容器について元素分析を行ない、鉄、コバルトおよびニッケルの含有量(ｐｐｂ)を調べた。この結果を下記の表２に示す。なお測定例ＤおよびＥについては同一の材質を用い、ここに鉄製のカッターによる切り傷を意図的に形成することで、該カッターとの接触に由来する金属を付着させた。
【表２】
2006194796.tif 000004
【００３８】
(使用した材質)
測定例Ａ：ＣＯＰ(商品名  ＺＥＯＮＥＸ  ４８０Ｒ：日本ゼオン製)
測定例Ｂ：ＣＯＣ(商品名  ＴＯＰＡＳ  ６０１５Ｓ：ポリプラスチックス製)
測定例Ｃ〜Ｅ：アクリル樹脂(商品名 コモグラス：クラレ製)
【００３９】
(実験３の結果)
上記の表２に記載された結果から、１５ｐＴ以下の磁気ノイズを達成する金属の量(含有量)は、３０ｐｐｂ以下であることが確認された。
【００４０】
(実験４)  疎水性(接触角)と材質とについて
実験２における測定例１(アクリル樹脂)、７(ＣＯＰ)および９(ＣＯＣ)の各材質を、該材質に好適な加工法によって厚さ１.０ｍｍの板状物とし、接触角計(商品名 Ｆａｃｅ接触角計Ｍｏｄｅｌ ＣＡ−ＤＴ：協和界面科学製)を用いて、室温下での水に対する接触角を測定して、これにより疎水性を評価した。
【００４１】
(実験４の結果)
下記の表３に示した結果から、シクロオレフィン系樹脂は、アクリル樹脂より２０度以上接触角が大きい、すなわち疎水性が高いことが確認された。
【表３】
2006194796.tif 000005
【００４２】
(実験５)  抗原(バイオ物質)の疎水性相互作用による吸着性について
実験２における測定例１(アクリル樹脂)および７(ＣＯＰ)の各材質を、押出成形法によって厚さ１.０ｍｍの板状部材６２とし、この上に光学法で多用されるポリスチレン樹脂からなる円筒部材６４を載置して、図１３に示す形状の試験容器６０を夫々作製し、以下の手順に従って抗原(バイオ物質)の板状部材６２への吸着性を測定した(ブロッキング剤の有無あり)。その結果を下記の表４に記す。
【００４３】
(抗原の吸着性の測定方法)
(１)１０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(以下、ＷＳＣと云う)を、ＰＢＳ、ＰＨ５.８(以下、ＰＢＳ５.８と云う)１０ｍＬに溶解させて調製する。
(２)(１)で調整したＷＳＣ溶液１００μＬをセル内(円筒部材６４内に画成される空間)に入れ、温度３７℃、時間２時間の条件で放置する。
(３)未反応のＷＳＣを３００μＬのＰＢＳ５.８で３回洗浄する。
(４)５μｇ／ｍＬのビオチンヒドラジドをＰＢＳ５.８に溶解して調製する。
(５)セル内にビオチンヒドラジド溶液を１００μＬ分注し、プレートシールして温度３７℃、時間２時間の条件で放置して反応を進行させ、未反応分を捨てる。
(６)セル内を３００μＬのＰＢＳ(ｐＨ７.４)に界面活性剤(商品名 Ｔｗｅｅｎ２０：ａｔｌａｓ ｐｏｗｄｅｒｓ製)を０.０５％混合した溶液(以下、ｔＰＢＳと云う)で３回洗浄する。
(７)ＰＢＳ７.４で４倍に希釈したブロックエース(大日本製薬(株)製)に、Ｔｗｅｅｎ２０を０.０５％混合した溶液３００μＬをセル内に入れ、温度３７℃、時間１時間の条件で放置する。
(８)３００μＬのｔＰＢＳで３回洗浄する。
(９)ｔＰＢＳで５０００倍に希釈した  西洋わさびペルオキシナーゼ結合ストレプトアビジン(以下、ＨＲＰと云う(商品名 Ｐ０３９７：ＤＡＫＯ製))を２００μＬ入れ、温度３７℃、時間１時間の条件で放置する。
(１０)３００μＬのｔＰＢＳで３回洗浄する。
(１１)発色基質液ＡＢＴＳのＡ溶液とＢ溶液とを等量混合し、室温下に放置して液温を室温としておく。
(１２)セル内に発色基質液ＡＢＴＳ等量混合溶液を１００μＬ入れて混合する。
(１３)温度３７℃、時間１時間の条件で放置し、反応停止液を１００μＬ加える。
(１４)３０分以内に、４０５ｎｍの吸光度を、以下の機器で計測して反応性を評価する。
なお工程(７)および(８)は、蛋白質の吸着を制御するブロッキング剤を用いた場合の工程であり、本実験においては、測定例１(アクリル樹脂)および７(ＣＯＰ)の各材質についてブロッキング剤なしの実験を実施した。またここで測定した吸光度４０５ｎｍは、ＨＲＰと結合した発色基質液ＡＢＴＳを測定するものである。
(使用した機器)
・吸光度計：マイクロプレートリーダー(商品名 Ｓｏｆｔ  ＭＡＸ  Ｐｒｏ：日本モレキュラーデバイス製)
【表４】
2006194796.tif 000006
【００４４】
(実験５の結果)
上記の表４から、測定例７に係るシクロオレフィン系樹脂(ＣＯＰ４８０Ｒ)は、測定例１に係るアクリル樹脂に比べて２倍以上の疎水性相互作用による吸着作用があると考えられる。またブロッキング剤を用いた場合、ビオチン固相化面へのアビジンの吸着が、樹脂差に関わらず５０％程度抑制された。これはシクロオレフィン系樹脂を固相に用いた場合、高密度に抗原(バイオ物質)を吸着させてアクリル樹脂よりも感度水準を上げることが出来るだけでなく、ブロッキング剤の作用もアクリル樹脂と同等に機能することを示しており、同一の試料であればより少ない量で同等の感度水準を達成し、言い換えれば診断用容器を小型化できることを示唆している。
【００４５】
(実験６)  キャスト成形法、押出成形法および射出成形法で得られたシート状物の磁気ノイズ等の物性について
図１(ａ)に示す形状をなす厚さ０.４ｍｍの診断用容器を、実験２の測定例２に係るアクリル樹脂を材質としてキャスト成形法(と真空圧空成形法)、押出成形法(と真空圧空成形法)および射出成形法によって作製し、磁気ノイズおよび厚み精度の２点を、◎：良好、○：使用に耐える、×：使用不可、で評価し、その結果を下記の表５に示す。なお磁気ノイズは、実験２と同様の方法で測定して１０ｐＴ以下を◎、１０〜１５ｐＴを○、１５ｐＴを超えた場合を×とし、厚さ精度については、汎用のマイクロメータにより厚さを測定して、そのばらつき(３σ)が０.０５未満を◎、０.０５〜０.１０を○、０.１０を超える場合を×として評価し、更に磁気ノイズおよび厚さ精度から総合的な評価を◎：良好、○：使用に耐える、△：場合(磁気ノイズ)によって使用可で評価した。またキャスト成形法および押出成形法は、シート状物を成形する方法であり、シート状物とされたアクリル樹脂は、最終的には真空圧空成形法によって診断用容器形状に成形されている。
【表５】
2006194796.tif 000007
【００４６】
(実験６の結果)
上記の表５から、キャスト成形法(と真空圧空成形法)および押出成形法(と真空圧空成形法)で診断用容器を作製した場合、磁気ノイズおよび厚み精度の双方とも良好であり、本発明に係る診断用容器の製造に好適であることが確認された。
【００４７】
(実験７)  本発明に係るシクロオレフィン系樹脂からなる診断用容器を使用した場合の、抗原(量(ｐｇ))と、(正味)磁気信号(量(Ｂ)))との関係について
下記の表６に示す所定量としたヒトＩＬ８(抗原)を、シクロオレフィン系樹脂から作製した本発明に係る診断用容器を使用して、実施例１〜３に係る診断用容器を準備し、これに実験１と同様の処理を実施して、ＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法により抗原量を算出した。なお磁気信号測定条件は、以下の通りである。
・診断用容器の容器底部の厚さ０.４ｍｍ
・診断用容器の回転ブレ０.１ｍｍ
・ＳＱＵＩＤセンサと容器底面との距離Ｄは１.５ｍｍ
・ＳＱＵＩＤ計測装置本体からの磁気ノイズは１０ｐＴ
【表６】
2006194796.tif 000008
【００４８】
(実験７の結果)
結果を上の表６に記し、更に夫々のその磁気信号のパターンを図１４〜図１６に示す。この結果から、実際の抗原等の測定に対して高い感度水準を発現し、実用性があることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の好適な実施例に係る表面改質された診断用容器を示す(ａ)斜視図と、(ｂ)標識化された二次抗体を結合させた診断用容器の断面図である。
【図２】本発明の診断用容器に好適に使用される材質であるシクロオレフィン系樹脂の原料であるノルボルネン系モノマーの化学構造を示す図である。
【図３】本発明の診断用容器によって抗原を好適に測定するＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法に使用されるＳＱＵＩＤ測定装置の一例を示す概略図である。
【図４】実験１に係るＳＱＵＩＤ・磁気マーカー測定法によるヒトＩＬ８の重さと磁気信号との関係で、その測定限界の一例を示グラフである。
【図５】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す測定例１に係る磁気信号のパターン図である。
【図６】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す測定例２に係る磁気信号のパターン図である。
【図７】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す測定例３に係る磁気信号のパターン図である。
【図８】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す測定例７に係る磁気信号のパターン図である。
【図９】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す測定例８に係る磁気信号のパターン図である。
【図１０】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す測定例９に係る磁気信号のパターン図である。
【図１１】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す測定例１０に係る磁気信号のパターン図である。
【図１２】実験２の磁気ノイズと材質との関係を示す参考測定例に係る磁気信号のパターン図である。
【図１３】実験５において抗原の疎水性相互作用による吸着性を評価する試験容器を示す概略図である。
【図１４】実験７の抗原量と磁気信号との関係を示す実施例１に係る磁気信号のパターン図である。
【図１５】実験７の抗原量と磁気信号との関係を示す実施例２に係る磁気信号のパターン図である。
【図１６】実験７の抗原量と磁気信号との関係を示す実施例３に係る磁気信号のパターン図である。
【符号の説明】
【００５０】
２０  診断用容器
２２  容器内表面
２２ａ  容器底面
ａｂ１  一次抗体
ａｂ２  二次抗体
ａｇ  抗原
Ｄ  距離
Ｓ  試料
【図１】
2006194796.tif 000009
【図２】
2006194796.tif 000010
【図３】
2006194796.tif 000011
【図４】
2006194796.tif 000012
【図５】
2006194796.tif 000013
【図６】
2006194796.tif 000014
【図７】
2006194796.tif 000015
【図８】
2006194796.tif 000016
【図９】
2006194796.tif 000017
【図１０】
2006194796.tif 000018
【図１１】
2006194796.tif 000019
【図１２】
2006194796.tif 000020
【図１３】
2006194796.tif 000021
【図１４】
2006194796.tif 000022
【図１５】
2006194796.tif 000023
【図１６】
2006194796.tif 000024