(57)【要約】      （修正有） 【課題】補体レセプターｓＣＲ１の立体構造解析に利用でき、また、補体活性抑制剤として極めて有用な補体レセプターｓＣＲ１の結晶を製造しうる、高純度補体レセプターｓＣＲ１の製造方法を提供する。 【解決手段】補体レセプターｓＣＲ１を産生する動物細胞を、血清培地及び無血清培地を使用する二段階培養法で培養し、得られた培養液あるいは培養処理液をアフィニティクロマト及びサイズ排除クロマトを使用する二段階精製法で精製する。 【選択図】図２
2006230411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａおよびｂ工程からなることを特徴とする、高純度可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）の製造方法。 
ａ：可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）遺伝子を導入した動物細胞を血清培地で増殖させた後、無血清培地で培養して可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を産生させる工程、 
ｂ：産生された可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を含む培養液又はその培養処理液を、アフィニティクロマトグラフィーカラム及びサイズ排除クロマトグラフィーカラムを順次使用して精製する工程。
【請求項２】
可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）遺伝子が、膜貫通ドメインのコード領域において変異または欠失を生じたものである、請求項１に記載の製造方法。 
【請求項３】
可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）遺伝子が導入された動物細胞が、可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を細胞外に分泌するものである請求項１又は２に記載の製造方法。 
【請求項４】
培養工程が、ツニカマイシン処理で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。 
【請求項５】
可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を含む動物細胞の培養上清液を直接アフィニティクロマトグラフィーカラムにかけることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。   
【請求項６】
アフィニティクロマトグラフィーカラム及び／またはサイズ排除クロマトグラフィーカラム使用による精製において、可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）が界面活性剤により分散している状態で行うことを特徴とする、請求項１〜５に記載の製造方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補体活性化抑制機能を有する、高純度可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）の製造方法に関する。 
【背景技術】
【０００２】
膜糖蛋白質である補体レセプター１（ＣＲ１）は、赤血球、単球／マクロファージ、顆粒球、Ｂ細胞、いくつかのＴ細胞、脾濾胞性樹状細胞、および糸球体有足細胞の細胞膜上に存在する。ＣＲ１は、C3bおよびC4bを結合し、C3b／C4bレセプターと称され、その主なアミノ酸配列は決定されている(サイエンス(Science) 249：146.151 (1990))。 
またｓＣＲ１は補体系の活性化を抑制する物質と知られており、補体系の古典経路及び第二経路を阻害する。この経路を阻害する背景として、補体経路は補体成分C1-C9 が限定分解を繰り返すことが知られている。そしてｓＣＲ１は補体系の中間産物である活性型C3b及びC4bを結合し、補体因子であるfactor I との共活性(コファクター活性)によりこれらの補体成分を不活化したものに分解することで、最終的に細胞死(ネクローシス)を阻害する（図１）。 
更にｓＣＲ１は、好中球酸化バースト、補体媒介溶血反応および補体成分であるC3aおよびC5a産生などをin vitro(生体外)で 阻害することが知られている。また逆受身アルツス反応(アレルギー反応に類似した反応)、抑制した虚血後心筋炎症および壊死においてin vitro 活性を示すことも報告されている。よってｓＣＲ１は補体系の重要な調節蛋白質であり、これらは補体活性化による宿主組織の自己溶解的破壊を防止するために機能する。
【０００３】
従来の細胞上清回収法及び補体レセプターｓＣＲ１の精製法については以下の文献が上げられる(J. immunol., vol. 146, No.1, 250-256(1991),  Eur. J. immunol., vol. 26, No.8, 1729-1735 (1996), J. of biol. chem., vol. 274, No.16, 11237-11244(1999))。これらは、いずれもATCC CRL-10052番のCHO細胞を用い細胞培養液上清からｓＣＲ１の精製を行なったものである。しかしこれらの手法は多くの高価な細胞増殖装置や精製用カラムシステムを使うことと煩雑なステップを包含するため、精製の効率が低下しｓＣＲ１の大半が変性してしまう。また全細胞上清回収物には他に多種類の夾雑物が含まれているため、そのため精製度が低いと考えられる。蛋白質の濃縮は一見成功したかに見えるが、つまり濃縮後のサンプルの蛋白質濃度は高いが、その中に含まれるｓＣＲ１の割合が低いため、濃縮率が高いとは考えられない。
【０００４】
しかも、このような精製度が低いｓＣＲ１では、その結晶化は当然困難であり、分子量200kDa以上の可溶化補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)の結晶化、及びこれに基づく立体構造解明は望まれているが未だに実現する方法は見出されていない。現在様々な蛋白質の結晶化方法は見出されているが、200kDa以上の膜蛋白質、特に様々な網内系細胞膜に存在する補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)は、細胞培養及び精製条件によって蛋白質がインタクトな状態を保持し難いため蛋白質の結晶を得るには至っていない。 
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような従来技術の問題点を踏まえ、補体レセプターｓＣＲ１の結晶を得るための手段を開発し、該補体レセプターの立体構造解析に利用でき、また、補体活性抑制剤として極めて有用な、高純度な補体レセプターｓＣＲ１の製造方法を提供することにある。 
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明では上記課題を解決するために鋭意実験を重ねた結果、血清を含む栄養培地を使った細胞増殖培養と、細胞がｓＣＲ１の産生を向上させる無血清培地からなる二段階細胞培養法、続いて、アフィニティカラムクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーの2種類のカラムクロマトグラフィーから構成される迅速な二段階カラム精製法を新たに開発した。そして、これら手段を用いれば、インタクトな状態で、しかも結晶化が可能な、極めて高純度なｓＣＲ１を産生することが可能となることを見いだし、補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)の結晶化に初めて成功したものである。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に係るものである。
（１）  以下のａおよびｂ工程からなることを特徴とする、高純度可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）の製造方法。 
ａ：可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）遺伝子を導入した動物細胞を血清培地で増殖させた後、無血清培地で培養して可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を産生させる工程、 
ｂ：産生された可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を含む培養液又はその培養処理液を、アフィニティクロマトグラフィーカラム及びサイズ排除クロマトグラフィーカラムを順次使用して精製する工程。
（２）  可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）遺伝子が、膜貫通ドメインのコード領域において変異または欠失を生じたものである、上記（１）に記載の製造方法。 
（３）  可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）遺伝子が導入された動物細胞が、可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を細胞外に分泌するものである上記（１）又は（２）に記載の製造方法。 
（４）  培養工程が、ツニカマイシン処理で行うことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。 
（５）  可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）を含む動物細胞の培養上清液を直接アフィニティクロマトグラフィーカラムにかけることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。 
（６）  アフィニティクロマトグラフィーカラム及び／またはサイズ排除クロマトグラフィーカラム使用による精製において、可溶化補体レセプタータイプ１（ｓＣＲ１）が界面活性剤により分散している状態で行うことを特徴とする、上記（１）〜（５）に記載の製造方法。 
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、純度の極めて高い、可溶化補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)を得るための手段を開発したものであり、これにより、初めて可溶化補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)結晶化に成功したものである。したがって、本発明によれば、純粋で副作用の軽減された補体活性抑制剤としての利用が可能となり、また、得られた結晶によりＸ線結晶構造解析法による立体構造解明を可能とする。また、類似した可溶化膜蛋白質の結晶化及び立体構造解析に向けた研究に対しても教示するところが大である。しかも、本発明で目標とした構造解析を前提とした結晶化を可能とする高純度、高効率のｓＣＲ１生産手法は、生理活性を高い状態で保持し、高品質のｓＣＲ１の安定供給を可能とし，広く医療分野、創薬の分野に貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明をさらに詳細に説明する。 
本発明は、血清を含む栄養培地による細胞増殖培養および細胞がｓＣＲ１蛋白質の産生を向上させる無血清培地による二段階細胞培養法、並びにアフィニティカラム精製法およびサイズ排除クロマトグラフィー支持体から構成されるカラム精製法による二段階蛋白質カラム精製法を開発し、これら手段によればインタクトな(完全な構造を維持できるような)状態で、高純度可溶化補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１) を産生でき、これにより容易に、可溶化補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)の結晶を製造できることを見いだしたものである。本発明における可溶化補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)の結晶の製造工程の概要を図２に示す。
本発明の可溶化補体レセプタータイプ1 (ｓＣＲ１)の結晶の製造手段は、高分子量蛋白質であり立体構造解析は未だ行なわれていないｓＣＲ１の結晶作製を可能とし、本法を用いた結晶化によってｓＣＲ１の立体構造情報および機能情報が得られることはもちろん、極めて純粋で、安全性の高い補体活性抑制剤を提供できる。
【００１０】
本発明における可溶化補体レセプタータイプ1 (ｓＣＲ１)の結晶化の成功は、二段階細胞培養法および二段階カラム精製法により蛋白質が効率良く高純度かつ高濃度で得られることに起因するものである。
本発明で用いるｓＣＲ１は、ＣＲ１の膜貫通部位を遺伝子レベルで変異あるいは欠失等の改変を行ったものであり、分子量約220kDaの水溶性の部分からなる。この可溶性ＣＲ１フラグメントは、補体系の中間産物である活性型C3b及び／又はC4bを結合することができることから生理活性を有する。
【００１１】
一方、上記したように、ｓＣＲ１は補体系の活性化を抑制する物質と知られており、補体系の古典経路及び第二経路を阻害する。この経路を阻害する背景として、補体経路は補体成分C1-C9 が限定分解を繰り返すことが知られている。そしてｓＣＲ１は補体系の中間産物である活性型C3b及びC4bを結合し、補体因子であるfactor
I との共活性(コファクター活性)によりこれらの補体成分を不活化したものに分解することで、最終的に細胞死(ネクローシス)を阻害する。 
更にｓＣＲ１は、好中球酸化バースト、補体媒介溶血反応および補体成分であるC3aおよびC5a産生などをin vitro(生体外)で 阻害することが知られている。また逆受身アルツス反応(アレルギー反応に類似した反応)、抑制した虚血後心筋炎症および壊死においてin
vitro 活性を示すことも報告されている。よってｓＣＲ１は補体系の重要な調節蛋白質であり、これらは補体活性化による宿主組織の自己溶解的破壊を防止するために機能する。
【００１２】
本発明に関わるｓＣＲ１は、ヒト扁桃腺由来ｓＣＲ１遺伝子をCHO細胞に導入し、発現させたものである。具体的にはATCCに寄託されており、受託番号CRL10052を有するプラスミド(pBSCR1c/pTCSgpt)を担持するチャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞により発現させたものである。前述したとおり、実質的に膜貫通ドメインを含有しないＣＲ１分子は細胞外に分泌することができるため、細胞培養上清から回収することが可能である。
【００１３】
本発明における補体レセプターｓＣＲ１の結晶化にあたっては、従来の細胞上清回収法及び補体レセプターｓＣＲ１の精製法(J. immunol., vol. 146, No.1, 250-256(1991),  Eur. J. immunol., vol. 26, No.8, 1729-1735 (1996), J. of biol. chem., vol. 274, No.16, 11237-11244(1999))における問題点を、細胞の培養段階から徹底的に見直して根本的な改善を行い、二段階培養法及び二段階カラム精製法を新たに開発し、これにより、迅速、高効率かつ高純度なｓＣＲ１蛋白質の精製が可能となったものである。
上記の細胞は本発明の二段階培養法によってｓＣＲ１を効率よく分泌する。基本的に動物細胞はFBS (fetal bovine serum)などの血清及び様々なアミノ酸の添加より増殖速度が促進する。それゆえ第１段階の細胞増殖培養は血清含有培地中で行なった。しかし血清の存在によって夾雑物量が増大するため、蛋白質の精製手順が煩雑となる。それゆえ第２段階では無血清培地を用い、含まれる夾雑物の種類と量を激減させ、ｓＣＲ１蛋白質の精製を行なう。この精製段階では高価なカラムは必要なく、簡便かつ低コストな精製法である。
【００１４】
培養後の二段階カラム精製法においては、煩雑な精製ステップを一気に省き、二段階だけのカラムクロマトグラフィーでｓＣＲ１を高純度、高濃度で精製できる。第１段階としてｓＣＲ１と親和性の高いアフィニティクロマトグラフィーカラムを採用し、ｓＣＲ１のより高純度な精製を達成する。第２段階は分子サイズの違いにより、ｓＣＲ１は他の蛋白質から速やかに分取できる。 
精製されたｓＣＲ１は、SDS- PAGE及びウエスタンブロッティング等を用いることで、溶出される画分及びインタクトなｓＣＲ１の構造を確認した後、蒸気拡散法により結晶化条件の検討を行なった。また精製されたｓＣＲ１の共活性(コファクター活性)、及びin vitro(生体外),in vivo(生体内)での活性の有無を確認した。 
【００１５】
〔ｓＣＲ１結晶化方法〕 
以下に本発明の結晶化方法についてさらに具体的に説明する。 
（１）二段階細胞培養工程 
ｉ） 本発明においては、例えば、ヒト扁桃腺由来のｓＣＲ１遺伝子を導入したATCC CRL10052 チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）細胞を用いて、血清含有培地による細胞増殖培養(ステップ1)、細胞増殖後にｓＣＲ１のみを産出する無血清培地による無血清培養(ステップ2)することによりｓＣＲ１を得る。
上記増殖培養法(ステップ1)に用いられる培地は、例えば、α-MEM(Gibco BRL, F-12(Sigma), DMEM/F-12(Sigma), F-10(Sigma), RPMI (Sigma)などであり、血清(FBS (牛胎児血清) Sigma  必須)および 500nM メトトキセート(methotrexate: MTX (Sigma)) 添加、培養時間 0-36時間の条件下で行なわれる。 
また、無血清培養法(ステップ2)に用いられるserum free培地は、例えば、トランスフェリンやインスリン含有培地(例としてASF104(味の素)、α-MEM(GibcoBRL), F-12 (Sigma), DMEM/F-12 (Sigma), F-10 (Sigma))などであり、500nM メトトキセート(methotrexate:MTX:(Sigma))添加、培養時間 0-36時間の条件下で行なわれる。細胞培養は、常に37℃、5%CO2 の条件下で行なうことを特徴とする。
ｉｉ）  上記で得られた無血清培養上清中のｓＣＲ１は、次工程の二段階カラム精製法の手順により精製し得る。この手順により、単位リットルあたり90％以上の純度および、数十mgの蛋白質が得られる。本発明ではスケールアップも可能であり、スケールの大きさは限定されない。 
本発明においては、細胞培養系にてツニカマイシン(tunicamycin: Wako)を用いた糖鎖除去を行ってもよい。一般に蛋白質に糖鎖が二割以上付加する場合、そのフレキシビリティー(flexibility)のために三次元的に整然と並んだ配列を作り難いため良い結晶が得られないといわれている。それゆえ、ツニカマイシンによる糖鎖除去は、結晶のコア形成に影響する。ｓＣＲ１は糖鎖を含有する蛋白質であり、糖鎖の影響を考慮することが望ましい。しかし、本発明においては糖鎖を除去しないｓＣＲ１であっても結晶化することができる。
【００１６】
この糖鎖除去は、細胞培養中にツニカマイシンを添加するツニカマイシン浸潤期を置くことで、ｓＣＲ１からN-link糖鎖の除去産物(Aglyco-sCR1)が得られる。ツニカマイシン浸潤期は、細胞増殖培養方法の細胞増殖後にツニカマイシンの濃度が2-10μg/ ml となるように添加し、12-48時間の浸潤期間を意味する 。この時の培養条件は増殖培養法に用いられる血清含有培地を用い、MTXも添加する。浸潤後、物質産生培養法で用いる無血清培地に交換し、12-60時間 Aglyco-sCR1産生を行ない、除糖したｓＣＲ１のみを得ることが可能となる。 
【００１７】
（２）二段階カラム精製工程   
ｉ）  分泌されたｓＣＲ１を含有する細胞培養上清から、二段階カラム精製方法によってｓＣＲ１を精製し得る。この精製法では、第１段階としてアフィニティクロマトグラフィー、第２段階としてサイズ排除クロマトグラフィー支持体から構成されるカラムを使用する。 
本発明の二段階カラム精製方法では以下に列挙する従来の問題点を克服した。すなわちpH変化による変性蛋白質の溶出や、イオン交換カラムなどに用いられる煩雑な緩衝液の交換、硫安沈殿法から生ずる蛋白質変性、ｓＣＲ１のインタクトな状態が維持できない操作条件などである。そのため第１段階のアフィニティカラムによる溶出はNaCl(Wako)などの塩の濃度勾配を利用し、第２段階では、サイズ排除クロマトグラフィーによる蛋白質の分子サイズによって分離し、インタクトな蛋白質を溶出させる。 
ｉｉ）  第１段階のアフィニティクロマトグラフィーにおいては、例えばヘパリンを用いるアフィニティクロマトグラフィーを行う。ヘパリン担体としては、例えば、Pharmacia Biotech の Heparin- Sepharose CL-6B (Code No. 17-0467-01)を用いることができる。ヘパリンはD-グルクロン酸、或いはL-イズロン酸のいずれかを含むウロン酸残基と、D-グルコサミンとの二糖体の繰り返し構造を骨格にもつグルコサミノグリカンであり、分子量も3千〜10万と不均一なものである。ヘパリンは、ヘパリン結合性増殖因子(HBGF) であるチロシンキナーゼ型膜受容体や止血時に有効な作用を持つフォンブルブラント因子(vWF)、多種のサイトカインとも結合することが報告されている。またヘパリンとｓＣＲ１は、強いアフィニティを持つことが報告されている(免疫と生体防御(第十巻) 長澤 滋治著)。 
【００１８】
アフィニティクロマトグラフィーの溶出条件は、ミセル形成率の低い界面活性剤を含んだ緩衝液により溶出させる。また蛋白質を溶出させるために、溶出緩衝液は0.1- 2MのNaClを含む。この時界面活性剤の濃度は全体の緩衝液の容量に対し、0.01%- 0.5%の範囲に収まるように調製する。同時にpHはやや酸性付近からアルカリ性側(pH6.0-10.0)の範囲に収まるように調製し、緩衝液はこの範囲に収まるような緩衝液を選択するのがよく、また第２段階のサイズ排除クロマトグラフィーにおいては、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーを使用する。これによれば分子の大きさに基づく分離が行なわれ、実質的には分子ふるいの形態である。マトリックスおよび溶質の間の相互作用が起こらないのが望ましいため、全体的に不活性なマトリックス物質が好ましい。マトリックスは、堅くかつ非常に多孔性であるのが望ましい。ゲルは比較的に軟らかいが、増加した堅さを有するゲルが開発されており、本発明では高流速でさえ分離が維持されるHPLCゲル濾過カラムクロマトグラフィー(東ソーの分析用カラム TSKgel G3000SWXL)を使用するのが好ましい。またこの第２段階のサイズ排除クロマトグラフィーにおいては第１段階よりも更にミセル形成率の低い界面活性剤を用い、この第２段階の溶出緩衝液には塩は含まない。それぞれ溶出時の流速は、第１段階の精製では2-5ml/min、第２段階では0.5-1ml/min で溶出させる。 
【００１９】
使用する界面活性剤としては、第１段階においては、例えばCHAPS等が挙げられ、第２段階においては、例えばDDM(n-Dodecyl-β-D-maltoside)、DM(n-Decyl-β-D-Maltopyranoside)等が挙げられる。 
ｉｉｉ）  第１段階及び第２段階精製後において、加圧濃縮器(amicon)や限外濾過膜(amicon)等による常法の濃縮操作を繰り返し行なう。この時標準的には上述した濃縮器を用いるが、これらに限定はされない。加圧式濃縮器の圧力は2-3kPaを基準とし、限外濾過膜の濃縮器による遠心は2000-3000xgで行なう。 
【００２０】
（３）二段階細胞培養法及び二段階カラム精製法におけるｓＣＲ１の確認 
ｉ）  上記二段階カラム精製法適用後において、ｓＣＲ１の産生量及び夾雑物の量、溶出された画分及び精製度の確認をするためには、0.1%SDSを含む7.5% ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動を行なう。SDS-PAGEの条件はすべてDDT(dithiothreitol(Sigma))による還元条件(蛋白質のシステイン残基同士を切断した状態)で電気泳動を行なう。泳動後、蛋白質をCBB染色(Bio-Rad)及びCBB染色よりも検出感度の高い銀染色(第一化学)によってバンドを検出する。
ｉｉ）  精製によって得られた蛋白質がｓＣＲ１であるかどうか、そして構造は維持されているかの確認を行なうため、ウエスタンブロッティングにより確認を行なう。ウエスタンブロッティングでは0.1%SDSを含む7.5%ポリアクリルアミドゲル上で非還元条件で電気泳動を行なったものを、ニトロセルロースメンブレン(0.45μm: Amersham pharmaciabiotech)に転写し、転写後、5%スキムミルク(雪印乳業)にてブロッキングを行ない、mouse anti-sCR1 mAb を一次抗体として、Sheep anti-mouse horseradish peroxidase (HRP) linked IgG mAb(Amersham  life science)を二次抗体としてそれぞれ用いる。3回の洗浄作業の後に、ECL試薬(Western blotting detection reagent: Amersham life science)を添加して、二次抗体の検出を行なう。 
【００２１】
（４）ｓＣＲ１の結晶化工程 
本発明においては、上記限外濾過などの常法の濃縮操作によって、十分な蛋白質濃度が得られる。次いで、この濃縮されたｓＣＲ１溶液を用いて、ｓＣＲ１の結晶化を行う。結晶化の手法としては、蛋白質溶液に過飽和の状態になるまで沈殿剤を加え、そのまま放置させる方法としてバッチ法、細い試験管やキャピラリーに沈殿剤を半分注入し、その上に静かに蛋白質界面を形成させ、この界面を通して溶媒や沈殿剤が移動した事を利用する液体-液体拡散法(自由界面拡散法)、キャピラリーやボタンと呼ばれる透析器具を用いてその外側を透析膜で覆い、それを沈殿剤溶液に浸して徐々に溶解度を下げる透析法、及び気相を通じて拡散により揮発性の溶媒や沈殿剤が移動する仕組みを利用した蒸気拡散法などがある。この中は、結晶成長が観察でき、様々な沈殿剤による検討を容易に行なうことができる蒸気拡散法が好ましい。
【００２２】
蒸気拡散法とは気相を通じて、液滴（蛋白質溶液と少量の沈殿剤の混合液）から沈殿剤溶液への蒸気拡散、あるいはその逆の過程で平衡に達する仕組みを利用した方法であり、蛋白質溶液が沈殿剤溶液とのあいだで蒸気拡散することにより、蛋白質濃度と沈殿剤濃度が共に高まって過飽和の領域で結晶化が起こる現象を利用するのが特徴である。また、蒸気拡散法の中でも、マウントする形状から、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法があげられるが、シッティングドロップ法が好ましい。この理由は、膜蛋白質を遺伝子的に改変したｓＣＲ１は、水-緩衝溶液には容易には溶け難い理由から精製系で界面活性剤を用いているため、蛋白質精製を行なったサンプルには界面活性剤が存在し、表面張力が弱いためハンギングドロップ法ではカバーグラス上に広がってしまう可能性があるためである。図１４にシッティングドロップ法を用いた結晶作成方法に関する模式図を示す。
また、蒸気拡散法による結晶化に用いる沈殿剤(緩衝液、界面活性剤、有機溶媒)と得られた蛋白質溶液を１：１で混合し、結晶を得ることができる。 
また、この時ｓＣＲ１の結晶を得る条件(緩衝液、界面活性剤、有機溶媒などの種類及びpH、温度)及び結晶化法(蒸気拡散法、バッチ法、自由界面拡散法など)は、特に限定されない。 
【００２３】
（５）ｓＣＲ１の電子顕微鏡法による観察 
本発明においては、得られたｓＣＲ１の結晶をＸ線や放射光を使った回折データの収集、即ち結晶構造解析だけでなく、電子顕微鏡法からも立体構造解析を行ない得る。電子顕微鏡法は、大きい結晶の作製が困難な場合や、結晶化のための大まかな情報を取得するために用いられてきた。しかしながら、最近では電子顕微鏡法による観察技術及び周辺ツールが目覚ましく発展したため、二次元結晶から三次元モデルを構築することが可能となった。そこで本発明では、まず、得られたｓＣＲ１蛋白質の一分子観察を、高分機能の解析が可能な氷包埋による電子顕微鏡法の適用を検討し、現在までに、本発明では結晶化による最適化条件の検討及びｓＣＲ１の全体像を得るため、重金属を使ったネガティブ染色法による透過型電子顕微鏡法を用いた観察及び解析を行なった。 
【００２４】
（６）ｓＣＲ１の機能確認の手法 
in vitro(生体外)活性の確認 
(1)本発明で得られるｓＣＲ１の機能面での特徴は、補体因子Ｉ（Ｉ因子）のコファクターとしても、また崩壊促進因子としても機能する能力を持つことにある。in vitro でのアッセイを実行して、これらの生理学的活性を測定し得る。 
本発明によって得られるｓＣＲ１が補体調節機能を有することは、精製されたC3およびＩ因子を使用するコファクター活性について、およびIgM感作ヒツジ赤血球(CH50) 、ならびにウサギの赤血球(ACH50)を使用する崩壊促進活性についての実験を行うことにより確認されている。コファクター活性または崩壊促進活性測定実験の結果から、C3/C5転換酵素の不活化、C3b/C4bを限定分解することができ、ｓＣＲ１が機能的な特徴を保持していることが確認されている。 
【００２５】
(2)CH50の上清を用いたELISA法によるin vitroアッセイは、ｓＣＲ１が古典経路および第二経路による補体系活性化の抑制量を定量的に測定することが可能である。
【００２６】
(3)本発明で得られたｓＣＲ１が補体系を抑制できるかどうか、非動化処理をしていないヒト血清(補体活性が失われていないヒト血清)を用いた細胞障害性実験により、動物細胞を用いて確認を行なった。前述したように血清中には補体成分が含まれており、補体系の活性化により細胞には細胞死(ネクローシス)が起こる。そこでin vitro において細胞障害性実験を行なうことで、補体系がどのくらい抑制したかを顕微鏡下で観察することが可能である。 
【００２７】
(4)前述したようにｓＣＲ１の活性を確認するためのコファクター活性は、Factor IとのC3bの限定分解を用いた反応である。C3bは不安定な物質であることから、安定化したC3ma(C3をメチルアミンと反応させたもの(methylamine-treated human C3))を代用品として用いた。コファクター活性の基質としてC3ma 、Factor I 、ｓＣＲ１の各成分を混和し、37℃で8時間反応させた。反応後のサンプルは7.5% Gel,SDS-PAGE (還元条件)にて行ない、CBB(Bio Rad)染色によってバンドの検出を行なった。 
【００２８】
(5)CH50及びACH50は96穴プレート(Iwaki)を用いたマイクロプレート法により行なった。マイクロプレート法とはプレート上で検体を希釈変量し、赤血球を加えて反応させマイクロプレートのまま遠心及び吸光度測定する方法である。このCH50及びACH50測定法は補体成分であるC3, B, D, P及びC5-C9が全てそろってはじめて検出され、測定は50%溶血法であり、単位はCH50/ml 及びACH50/mlで表される。用いた緩衝液として、CH50ではGVB(gelatin veronal buffer), ACH50ではGGVB(glucose gelatin veronal buffer)及びEGTA-Mg2+-GGVB(GGVB containing 0.1M EGTA & 0.02M Mg solution)を用いた。また反応条件は赤血球及びNHS、緩衝液をマイクロプレート中でマイクロプレート用マルチチャンネルピペッターを用いて混合した後、37℃で60min,インキュベートした後、プレートを室温で1600- 2000xg,10min 遠心し、その後415/630nm の波長に合わせたマイクロプレートリーダーを使って吸光度を測定した。
Excelを用いて吸光度から実測値を求め、グラフ化した。
【００２９】
(6)ELISA法はQuidelのkitを用い、メーカーのプロトコールに従い測定を行なった。このkitには抗補体成分抗体の結合した96穴マイクロプレート及びHRP(西洋ワサビ過酸化酵素の結合した)-抗補体成分抗体、発光基質が入っており、サンドイッチ法(目的の蛋白質を二つの抗体によって挟み込むことで、実測値がより正確な値として検出される方法)によって測定した。反応はすべて室温で行ない、波長405nmでの吸光度を読みとり、(予め蛋白質の濃度が分かっているものから作製した)検量線から蛋白質濃度を求め、グラフ化した。
【００３０】
(7) ｓＣＲ１のin vitro 活性を顕微鏡下にて観察を行なう細胞障害性実験では、動物細胞としてマウスの頭蓋骨由来のストローマ細胞株(PA-6)を用いた。また血清はヒトの非動化未処理の血清(NHS)を用いた。マウスの細胞(PA-6)は、予め実験を行なう1-2日前に24穴プレートに播種しコンフルエントになるまで培養した。コンフルエント後、培地を入れ、非動化したNHS(Heated inactivated pooled NHS: 56℃,40min) 及びNHS、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)にて調製したｓＣＲ１を添加し、 60min、37℃、5%CO2 の条件下でインキュベートし、 その後形態を観察した。 
【００３１】
ｓＣＲ１のin vivo(生体内)活性の確認 
ｓＣＲ１のin vivo(生体内) における治療活性を検討するために、 急性致死ショック反応(アレルギー反応と類似した反応で、アナフィラキシーショックと知られている)は、組織中の抗原の循環性抗体との相互作用により引き起こされる急性炎症応答である。これは、局在化したインビボ炎症応答の古典例として使用され、そして免疫複合体の形成、補体活性化、炎症細胞漸増(recruitment)、浮腫および組織損傷により特徴づけられる
(P.BaileyおよびA.Sturm、1983，Biochem. Pharm．32:475)。実験的には、逆受身アルサス反応を動物モデルにおいて、抗原の静脈内注射および引き続く抗体の投与によって確立し得る形式が一般的であるが、今回は細胞膜上に存在する補体調節蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体(mAb against rat Crry,512)を投与したヌードモデルラット(免疫系が働いていないようなラットで、リポ多糖(LPS)を投与することで補体反応を引き起こす事ができるモデル動物：LPS感作512ショックモデル)を使用して、本発明のｓＣＲ１のin vivo(生体内)での治療効力を評価した。 
【００３２】
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明は特にこれらにより限定されるものではない。 
実施例1. 二段階細胞培養法（図３） 
（１）細胞増殖培養法（第１段階） 
ｓＣＲ１を発現するCHO細胞(ATCC CRL-10052)の培養は、ATCCが推奨するプロトコールに従い実施した。細胞は10% ウシ胎児血清(FBS;Gibco BRL)、必須アミノ酸、L-グルタミン、プロリン、ペニシリン(100U/ml)-ストレプトマイシン(100μg/ml)、および500nM メトトキセート(methotrexate)を添加した Alpha 改変 Eagle培地(α-MEM, Gibco BRL)で、150mm dish(25ml 容量)を用いて培養および増殖させた。この時、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3: Wako) は不含有であるため、1Lに対して2.2g入れpHの調製を行なった。また培地はCHO細胞に合わせてデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドが不含有な培地を選択しなければならない。次に約70.80%の集密度(confluency) を与えるような細胞密度となったら、新しい150mm dish 中に継代培養した。継代培養は、25ml 容器をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS:ニッスイ)で2-3回程度洗浄し、トリプシン(0.25% Trypsin-1mM EDTA-4Na、Gibco BRL)処理によりプレートから脱着させ、 そして25mlの容器に約2.0×106 cells/ml で播種した。使用した培地は 10%ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン-ストレプトマイシンを添加したα-MEM培地(増殖培地)であった。この作業を約50枚程度になるまで繰り返し、細胞は常に5% CO2 インキュベーター中、37℃で培養を行なった。
【００３３】
（２）物質生産培養法(無血清培養法)（第２段階） 
次にCHO細胞が増殖培地によって約 80.90%の集密度(confluency)を与えるような細胞密度となった後、物質生産用の培地(無血清培地)に交換を行なった。培地は無血清培地(味の素:ASF104: アルブミン不含有)を用いた。ASF104培地は、各種のハイブリドーマ細胞について高い抗体産生能が得られているという報告がある。この培地の主剤、緩衝剤、添加剤を混合し、培地を調製する。培地調整後、増殖培地で用いたメトトキセート(methotrexate)を添加し、これをASF(+：メトトキセート含有)とした。この培地を添加する前に細胞が密集した150mm dish をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)により、2-3 回程度洗浄し、調製したASF(+)培地を添加した。その後、5% CO2 インキュベーターを使い、37℃で36時間培養を行なった。36 時間後、ｓＣＲ１含有培地を回収し、更に培地を交換しASF(+)培地を添加し、再び5% CO2 インキュベーター中、37℃で36時間培養(合計72時間培養)を行なった。回収したｓＣＲ１含有培地はスイングローター(Tomy)を用いて800-1000xg、5分間、遠心して夾雑物を取り除き、デカンテーションによってその上清のみを集めた。その後、回収した上清は0.45μm pore size フィルター(Millipore)を用いて濾過を行ない、これをｓＣＲ１精製用調製溶液とした。(ｓＣＲ１の産生物量と不純物量の確認のため、溶出した各画分を7.5%ポリアクリルアミドSDSゲル上で還元下にて電気泳動を行なった結果を図４に示す。実施例で示した二段階細胞培養法においては、ｓＣＲ１以外の夾雑成分が少ないことが明らかである。
【００３４】
（３）ツニカマイシン(Tunnicamycin)による糖鎖を除去したｓＣＲ１(Aglyco-sCR1)の培養方法（図５及び６） 
ツニカマイシン(Wako)による浸潤培養は、増殖培養法後に行なった。まずツニカマイシンをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS:ニッスイ)にて200μg/mlとなるように調製を行なった。この時、ツニカマイシンは溶液に融解しないため、非プロトン性極性溶媒であるジメチルスルホキシド(DMSO:Wako)やイソプロパノ.ル(2-Propanol:Wako) などの有機溶媒を全量に対し0.2-0.4%となるように調製した。次にCHO細胞が増殖培地によって約 80.90%の集密度(confluency)を与えるような細胞密度となった150mm dish(Greiner) を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)により、2-3 回程度洗浄作業を行なった。そこに増殖培養時に用いた培地(α-MEM(Gibco BRL)、10% FBS含有培地)を加え、そこに前もって調製したツニカマイシンをdish全量に対して6-8μg/ml となるように添加した。添加した後、5%CO2 インキュベーター中、37℃で24-36 時間(細胞が崩壊してしまうため最適時間は24時間)ツニカマイシンによる浸潤培養を行なった。浸潤培養後、dishを再び2-3 回程度洗浄し、無血清培地(ASF(+))を添加した。この時も同様にdish全量に対して6-8μg /ml(最適濃度は6μg/ml) となるようにツニカマイシンを添加し、再度5%CO2 インキュベーター中、37℃で36 時間ツニカマイシンによるAglyco-sCR1の物質産生培養を行なった。36時間後、培地を回収し、先述したような方法で培地を調製し、これをAglyco-sCR1精製用調製溶液とした。
【００３５】
実施例2. 培養上清からのｓＣＲ１の精製方法 
（１）アフィニティ担体によるｓＣＲ１の精製方法 
ｓＣＲ１の実験室スケール精製を、ヘパリンを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより達成した。ヘパリン担体は、Pharmacia Biotech の Heparin- Sepharose CL-6B (Code No. 17-0467-01)を用いた。ヘパリンは製造者が推奨するプロトコールに従って、カラムの準備を行なった。1gの担体に対し200ml の超純水で15分間膨潤させ、その後 直径1.5X15cm のカラムにゆっくりとゲルを流し込んだ。(1gから得られる膨潤した担体は約4ml であり、用いた膨潤担体は約10-15ml であった。) その後、カラムに流し込んだ膨潤した担体を10倍以上のvolumeの超純水で洗浄し、更に0.05%のCHAPS(ICN)の入った 20mMTris-Cl (pH7.4)緩衝液を担体volumeの5倍量流し込み、カラムを平衡化させた(それぞれ流速は5ml/min)。次にｓＣＲ１含有培地(約1L)を直接カラムに流し込み、上清中のｓＣＲ１を担体にトラップさせた(流速は5ml/min)。この際カラムを通り抜けてくる画分を全て回収した。その後、0.15M、0.45M、0.75M、1M NaCl (Wako)含有の緩衝液を順に60mlずつ流し込み、10mlずつ画分を溶出させた(流速は3ml/min)。溶出後、0.5%MNaCl 含有 0.1M Tris-Cl(pH8.5)緩衝液と0.5%MNaCl含有 0.1M sodiumacetate(pH5.0) 緩衝液を交互に3回ずつ、カラムvolumeの3倍以上流し、次いで平衡化緩衝液をカラムvolumeの5倍以上流し、カラム内の夾雑物の除去と再生を行なった(それぞれ流速は5ml/min)。カラムは次回より、平衡化緩衝液を流すところからはじめ、再度同じ作業を繰り返した。
【００３６】
その後、ｓＣＲ１がどの画分に含まれているか、また産生物量と不純物量の確認のため、溶出した各画分を7.5% ポリアクリルアミドSDSゲル上で還元下にて電気泳動を行なった。泳動後、クマシーブリリアントブルー(CBB:Bio Rad)によって染色した結果、約200kDaより上の部位(約220kDa)に単一の蛋白質種を検出された(ｓＣＲ１の場合において)。これは、その推定されるアミノ酸配列から予想されるｓＣＲ１の蛋白質のサイズである。また糖鎖の付加されてないｓＣＲ１(Aglyco-sCR1)の場合、約200kDaより下の部位(約190kDa)に単一の蛋白質種が検出された。これは糖鎖の付加が無いため、分子量が減少したと推察される。これらの結果を図７及び図９に示す。 
その後、得られた溶出物 (高純度なもの)は一つにまとめて、加圧濃縮器(分画分子量 100kDa amicon)を用いて10-15倍濃縮を行なった。約10mlの濃縮後のｓＣＲ１を更に濃縮するため、限外濾過膜(Centri-plus分画分子量100kDa、Millipore社)による濃縮を再度行ない、volumeが半分くらいになるまで濃縮を行なった。 
【００３７】
（２）サイズ排除クロマトグラフィーによる精製方法 
本発明では高流速でさえ分離が維持されるHPLCゲル濾過カラムクロマトグラフィー(東ソーの分析用カラム TSKgel G3000SWXL)を使用した。まず当初ヘパリンでの溶出緩衝液としては、0.05%のCHAPS(ICN)の入った 20mM Tris-Cl (pH7.4)緩衝液を用いていたが、可溶化膜蛋白質由来ｓＣＲ１の結晶化には界面活性剤であるCHAPSはあまり適さないため、糖の付加したDDM(n-Decyl-beta-D-maltopyranoside:ICN)を全量に対して0.05% になるように調製して用いた。カラムに前述したｓＣＲ１濃縮溶液を500μlインジェクション後、約6-7ml溶出したところで一本の溶出ピークが得られるので（図８）、これを1-2ml程度回収した。この作業を何回か繰り返し10ml程度回収した。 
【００３８】
その後不純物量の有無を確認するため、溶出した各画分を7.5% ポリアクリルアミドSDSゲル上で還元下にて電気泳動を行ない、CBB染色でバンドを検出した（図８）。この結果、得られた溶出物が高純度なものであることが確認された(ｓＣＲ１及び除糖されたAglyco-sCR1の両方において確認された（図８及び１０）)。また実際に得られた蛋白質が実際にｓＣＲ１であるかどうか、精製方法により蛋白質の構造が損なわれていないかを確認するため、4種類(anti-sCR1mAb であるE11(Pharmingen), J3D3(Beckman coulter), To5(Dako), KuN241(Neo makers))の一次抗体とanti- mouse Ig mAb (Amersham life science)の二次抗体を用いて非還元下にてウエスタンブロッティングを行なった。なお、図１１に４種類のanti-sCR1mAbのｓＣＲ１に対する結合部位を表す模式図を示す。それぞれ本研究で用いた抗体はE11の場合、ｓＣＲ１のLHR C及びD、KuN241はLHR A及びB、J3D3とTo5においてはLHR A, B, C の各部位へ特異的に結合すると報告されている(Clin Exp Immunol 1998; 112: 27-33)。この結果より、全てにおいて特異性を示したことから得られた蛋白質はｓＣＲ１であり、その構造は保持されていることが確認された（図１２）。しかしながらAglyco-sCR1では薄くE11のみしか標識されなかったため（図１３）、抗体は糖鎖も認識していることが推察される。逆説的に考えれば、ツニカマイシンによる糖鎖除去が完全になされたのではないかと考えられる。
【００３９】
この後、ゲル濾過クロマトグラフィー精製後のサンプルを結晶化用サンプルとして更に濃縮するため、限外濾過膜(amicon)を用いて濃縮を行なった。また in vitro(生体外)及びin vivo(生体内) の生化学的なassayで用いるサンプルについては透析膜(Spectra/Por
排除分子量12-14000)による透析を行なった。 
最終的に本発明方法、二段階細胞培養方法から二段階精製方法によって得られたｓＣＲ１は、ｓＣＲ１では回収した培地1Lあたり10-20mg/L 、Aglyco-sCR1では回収した培地1Lあたり2-3mg/L 回収可能であることが確認された。 
【００４０】
実施例 3. ｓＣＲ１の結晶化方法 
十分な濃度が得られたｓＣＲ１の結晶化実験は、シッティングドロップ蒸気拡散方法によって行なった。実験方法は、まず24穴dish(Iwaki) を用意してエアースプレーにより穴（ウェル）の中の細かい埃を除去した。その後ウェルにシッティングドロップ用の台（ブリッジ）を入れ、グリースをウェルの口の部分に塗布した。その後、蒸気拡散させる母液(沈殿剤含有)を500μl、ブリッジの下に流し入れた。Hampton Research社 のクリスタルスクリーニング kit によるスクリーニングによって第１段階の条件サーチを行なった。母液を添加後、精製したサンプルを2μlずつブリッジの窪みに滴下し、順にウェルより分取した母液を2μl添加し、よくピペッティングした。その後ガラス製のカバーガラスをウェルの口に載せ、ピンセットで上から良く押さえて密閉状態を作り出した。24 穴全てに対して同様な処理を行なった後、25℃で2-8週間静置することで、結晶を得ることができた（図１５）。この際の結晶化の最適条件は、母液の組成が、(1)28%PEG-400、0.1MNaHepes pH7.5、0.2MCalcium Chlorideのもの、及び(2)30%PEG-400、0.1MNaHepes pH7.5、0.2MMgnecium Chlorideのものがよく、この中でも前者（1）の組成のものが良好な結晶を与えた。この後、上記最適な結晶化条件に基づき、25-35%PEG-400、0.1MNaHepes pH7.5、0.2MCaCl2 CMgCl2の組成の母液で再度結晶化を行い再現性を確認したところ、いずれも、同様な結晶を得ることができた。
【００４１】
実施例 4. ｓＣＲ１の電子顕微鏡法による観察 
実施例２（２）のHPLCゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得られた精製ｓＣＲ１について電子顕微鏡による観察を行った。電子顕微鏡観察では、親水的な支持膜上に蛋白質(ｓＣＲ１)を乗せて負染色する方法によって行なった。実験手順は、カーボンの蒸着膜を張ったグリッドを用意し、これを真空中でグロー放電等を利用して炭素を励起化し、親水化した。次に5μlのｓＣＲ１試料(200-400μg/ml)をのせ、20-30秒間待った。その後試料をあらかじめ湿らせた濾紙で吸い取り、染色剤(１％酢酸ウラニル)をのせ、吸着するのに適当な時間(20-30秒)の後、これを再び濾紙で吸い取った。試料の乗ったグリッドはグリッドホルダーに乗せて電子顕微鏡鏡筒内部に挿入し、焦点を合わせるなどして観察を行なった。その結果、ｓＣＲ１に関しては単分子状に分散している像が得られた（図１６）。またAglyco-sCR1に関しては、オリゴマーを形成している像が得られた（図１７）。
【００４２】
実施例 5. ｓＣＲ１のin vitro(生体外)活性の確認 
実施例２（２）のHPLCゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得られた精製ｓＣＲ１及びAglyco-sCR1について以下の実験を行った。 
（１）コファクター活性の確認 
Factor IとのC3bの限定分解を用いたコファクター活性によりｓＣＲ１の活性の確認を行なった。 
C3bは不安定な物質であることから代用品として、C3ma (C3をメチルアミンと反応させたもの(methylamine-treated human C3))を用いた。コファクター活性の基質としてC3ma を20μl (20μg)、Factor I を40μl (0.5μg)、ｓＣＲ１を40μl(6μg)の分量で各成分を混和し、37℃で8時間反応させた。反応後のサンプルを20μl ずつ7.5%SDS- PAGE (還元)にて電気泳動し、CBB染色によってバンドの検出をした。本発明によって得られたｓＣＲ１はFactor I とのコファクター活性により、C3maのα鎖を限定分解した（図１８）。この結果により精製したｓＣＲ１は、活性を保持している事が示唆された。また、Aglyco-sCR1についても同様な結果が得られた（図１９）。
【００４３】
（２）崩壊促進活性の測定 
ｉ）CH50(complement hemolysis 50)とは50%の溶血単位に由来し、本来は単位の名称であるが、補体価と同義語としてしばしば用いられている。測定は一定数のEA(赤血球に抗体を感作(付着)させたもの（E=Erythrocyte,A=Antibody）と変量した検体を混合して37℃で一時間反応させた後遠心し、上清中のヘモグロビン濃度を分光光度計で測定することによって溶血率を求めた。加えたEAの50%を溶血させるのに必要な補体量を1CH50単位とし、もとの検体単位体積あたりの補体量をCH50単位で表す。即ち単位はCH50/mlである。今回は96穴プレートを用いたマイクロプレート法を用いた。マイクロプレート法とはプレート上で検体を希釈変量し、EAを加えて反応させマイクロプレートのまま遠心及び吸光度測定する方法である。CH50で準備するものとして、EA(感作(ウサギの抗体の付いた)ヒツジの赤血球)及びGVB (gelatin veronal buffer)、NHS (nomal human serum)及び希釈系列を前もって用意した。実験方法は、マイクロプレート法のプロトコールに従って行なった(免疫と生体防御Ｉ,平成9年出版,  長沢滋治著)。まず5VB(stock veronal buffer; Na- barbital 5.095g, NaVl 41.5g, 1N HCl 18.5ml, 蒸留水 全量1000 ml)を作り、次にGVB (gelatin1.0g, 5VB  200ml, 0.15M Ca & 1M Mg solution 1ml , 全量1000ml)及び0.9%NaCl, sCR1, NHSを用意する。次に1.5x108 cells/ml のEA及び1-120μg/ml -NHS(ml)(sCR1の希釈系列を作り、それをNHSで10倍希釈したもの)を用意する。96穴のプレートにはGVB及び蒸留水を上段以外にアプライし、同様にして希釈系列を作ったsCR1-NHS溶液を更にGVBで10倍希釈したものを空いている上段に75μlづつアプライする。ダイリューターで上段から一番下の段に向かって50μlづつ次の穴へ移動を繰り返し、各25μlの連続3/2倍希釈系列を作る。各穴に50μl づつGVBを加え、完全溶血する穴と溶血しない穴(コントロール)を2-3個用意し、それぞれGVBと蒸留水を75μlずつ加える。その後調製したEAを全ての穴に25μlづつ加え、37℃、60分間 反応させ、反応後1600-2000xgで十分間遠心させた。遠心後、マイクロプレート用の分光光度計を用いて、上清のODを波長415/630nmで読んだ。その後、補体価を算出し、グラフを作製した。その結果を図２０に示す。この結果からｓＣＲ１による古典経路における補体抑制効果、即ちC3b及びC4bの限定分解がなされることで、ｓＣＲ１が膜侵襲型複合体(MAC)の形成を阻害していることが確認された。また約20μg/ml-NHSの時には、CH50において約50%以上の補体抑制効果を持つ。 
【００４４】
ｉｉ)  ACH50とはAlternative Complement Hemolysis 50の略称であり、補体第二経路(alternative pathway) を介する補体活性を一括して測定するものである。(別名AP-CH50、AH50とも呼ばれる。) 補体系の第二経路はC3, B 因子, D因子及びPを介してC3,C5, C6, C7, C8, C9 と活性化され、この経路には古典経路に関わる抗体, C1, C4及びC2 は関与しない。活性化物質として、ウサギの赤血球などが知られている。ACH50は通常ウサギ赤血球(Er:モルモットの赤血球も使用されるので Er=Erythrocyte)を標的とする膜侵襲型複合体形成能を指標に測定される。即ち、検体中の補体第二経路の因子群はErによって活性化され、Er膜上にC5b-9複合体を形成し、Erは溶血する。第二経路が活性化されるにはMg2+が(B因子の活性化の段階で)必要であるがCa2+は要らない。一方、ヒト血清とErを反応させると、ヒト血清の中にはErに対する自然抗体が存在するため、古典経路を介した溶血も起こる。そこで古典経路を介さず、第二経路だけを介した溶血を起こさせるため、Mg2+は存在するがCa2+は存在しない反応液が必要である。そのためCa2+に特異的なキレート剤であるEGTAを用いる。このACH50の測定法はCH50と同様にC3, B, D, P及びC5-C9が全てそろってはじめて検出され、測定は50%溶血法であり、単位はACH50/mlで表される。実験方法は、マイクロプレート法のプロトコールに従って行なった(免疫と生体防御Ｉ,平成9年出版,  長沢滋治著)。まず5VBを作り、次にGGVB(gelatin1.0g, 5VB  100ml, dextrose(無水)1g, 0.15M Ca & 1M Mg solution 1ml , 全量1000ml)及びEGTA・Mg・stock.1M EGTA & 0.02M Mg solution)を作った。その後   EGTA・GGVB(Mg2+)(gelatin1.0g, 5VB 80ml, dextrose(無水)25g, EGTA・Mg・stock  100ml , 全量1000ml))及び0.9%NaCl, sCR1,NHSを用意する。次に5.0x107 cells/ml のEr及び1-120μg/ml -NHS(ml)(sCR1の希釈系列を作り、それをNHSで10倍希釈したもの)を用意する。96穴のプレートにはEGTA・GGVB(Mg2+)及び蒸留水を上段以外に添加し、同様にして希釈系列を作ったsCR1-NHS溶液を更にGVBで10倍希釈したものを空いている上段に75μlづつアプライする。ダイリューターで上段から一番下の段に向かって50μl ずつ次の穴へ移動を繰り返し、各25μlの連続3/2倍希釈系列を作る。 
その後調製したErを全ての穴に25μlづつ加え、37℃、60分間 反応させ、60分後、各穴に50μl づつEGTA・GGVB(Mg2+)を加え、反応後1600-2000xgで十分間遠心させた。遠心後、マイクロプレート用の分光光度計を用いて、上清のODを波長415/630nmで読んだ。その後、補体価を算出し、グラフ化した。結果を図２１に示す。この結果からｓＣＲ１による第二経路における補体抑制効果、即ちC3bの限定分解がなされることで、ｓＣＲ１が膜侵襲型複合体(MAC)の形成を阻害していることが確認された。また約20μg/ml-NHSの時には、ACH50において約50%以上の補体抑制効果をもつ。 
【００４５】
ｉｉｉ）ELISA法による補体成分iC3b及びSC5b-9の定量的な測定 
CH50の付随実験として、ELISAによる補体の検出を行なった。検出キット(QUIDEL)は抗iC3b, SC5b-9 抗体を用いたサンドイッチ法であり、これによりMACの形成量とiC3bの形成量が定量的に測定することができる。またサンプルとしてはCH50で反応させた後の上清を二種類(一番上の列と三番目の列)用い、実際ｓＣＲ１を添加することでNHS中に存在するこれらの補体成分が、どう変化しているかを確認した。実験方法としては、まずｓＣＲ１のサンプルを調製した。(それぞれ希釈率は元のNHSよりX200, X315の物を調製した。)次にキットから一次抗体がコートされた96穴plateを取り出し、希釈した洗浄液を各穴に300μl ずつ加え、一分間放置した。穴に添加したwash solution (以下w.s.と略す)を吸引し、この作業を合計3回行なった。所定の位置にサンプル等を100μlずつ添加し(この時NHSはX200、SC5b-9のcontrol H,LはX25 希釈して用いた。)、添加後、iC3b plateでは30min,SC5b-9 plateでは60分間 室温でインキュベートを行なった。インキュベート後、各wellを吸引しw.s.を約300μl加え、一分間放置し、その後w.s.を吸引した。この作業を合計5回繰り返した。(この作業の間にsecond AbであるHRP-conjugateを用意)iC3b,SC5b-9conjugate Abを各穴に50μlずつ添加し、iC3b plateでは30分間, SC5b-9 plateでは60分間 室温でインキュベートを行なった。インキュベート後、各wellの溶液を吸引し、w.s.を300μl添加して一分間放置し、その後w.s.を吸引し、この作業を合計5回繰り返した。(この作業の間にSubstrateをX21希釈した。550μl Sub.:11ml S.Diluent) 希釈したSubstrateを各wellに100μlずつ添加し、アルミホイルに包んで(遮光して)室温でインキュベートし、発色の頃合いをみて、Stop solution を添加し反応を止めた。波長405nmに調節したマイクロプレートリーダーを用いて、吸光度を測定し 検量線作製溶液から読みとった数値より、検量線を作製した。その後、検量線から各サンプルのiC3b及びSC5b-9濃度を算出し、グラフを作製した（図２２、図２３）。なお、検量線の式として以下の数式を用いた。
iC3bタンパク濃度=(得られたO.D.値-219.42)X希釈率/349.45 
SC5b-9タンパク濃度=(得られたO.D.値-198.93)X希釈率/2260.2 
【００４６】
その結果、iC3bに関して言えばｓＣＲ１の濃度が上がるにつれて、その濃度が下がっていることがグラフから読みとれる（図２２）。つまりC3bの総量が減少し、補体の活性化が抑制されている。第二経路はC3から限定分解が始まり、自己触媒(自己触媒としてはC3bBb等がある)をしながらC3→C3bに分解する。しかしながらその大元であるC3bはｓＣＲ１によって分解されてiC3b となってしまうので、C3→C3b の限定分解は触媒となるC3bBbがないためC3bの総量は減少し、血清中に含まれるiC3bの分解量は減少する。(すなわちC3の大半は分解されずに残っているということ。)
よって今回のような結果が得られた。また血清中に含まれる元来のiC3bの濃度が400-500μg/ml だと考えると、今回の結果からｓＣＲ１の濃度が120μg/ml-NHSの時、ほぼ半分以上のiC3bが減少することが確認された。 
SC5b-9(可溶性のC5b-9)についてのグラフから読みとれることは、ｓＣＲ１の濃度を上げることでSC5b-9の形成量が減少していることが分かる（図２３）。また今回の結果からｓＣＲ１の濃度を20μg/ml以上とした場合、SC5b-9の形成が殆ど見られない。このことはCH50及びACH50のデータと類似性があり、用いたｓＣＲ１の活性は約20μg/ml-NHSの濃度で、補体の活性化を殆ど抑制できると考えられる。
【００４７】
ｉｖ）  Aglyco-sCR1のCH50及びACH50の測定 
ｓＣＲ１同様にAglyco-sCR1についてもCH50およびACH50のそれぞれについて、補体活性の抑制効果を定量した。CH50、ACH50と同様にサンプルの調製は以下のように行なった。(得られた試料を以下の割合で調製した)〔1〕A-sCR1: NHS= 200 (μl ): 200 (μl )=1:1 
〔2〕0.9% 生理食塩水: NHS= 200 (μl ): 200 (μl )=1:1 
〔3〕NHSのみ 
CH50の場合
〔1〕液:GVB=100 (μl ): 400 (μl )=1: 4 (5倍希釈) 
〔2〕液:GVB=100 (μl ): 400 (μl )=1: 4 (5倍希釈) 
〔3〕液:GVB=100 (μl ): 400 (μl )=1: 4 (5倍希釈) 
ACH50の場合
〔1〕液:EGTA-Mg2+-GGVB=200 (μl ): 200 (μl )=1: 1 (2倍希釈) 
〔2〕液:EGTA-Mg2+-GGVB=200 (μl ): 200 (μl )=1: 1 (2倍希釈) 
〔3〕液:EGTA-Mg2+-GGVB=200 (μl ): 200 (μl )=1: 1 (2倍希釈) 
実験方法は前述した方法と同様に、CH50及びACH50の活性を測定した。その結果、同じ濃度のnativeなｓＣＲ１と比べ劣るものの、CH50及びACH50ともに今回Aglyco-sCR1のCH50及びACH50において補体の活性化を抑制することが確認できた。
【００４８】
ｖ）  ｓＣＲ１を用いた細胞障害性実験の観察 
よりin vivoに近い(細胞は細胞間同士のシグナル伝達が起こるため、補体が発動すると細胞同士が助け合い細胞回復が生じる。)実験として、実際に付着細胞を扱うことで補体の活性化によるネクローシスをどの位抑制できるかどうかを確認した。
ここで用いた細胞はマウスの頭蓋骨由来のストローマ細胞株(PA-6)であり、非動化したNHS及びNHS、濃度調製を行なったｓＣＲ１を用いてその様子を観察した。まず実験方法としては、マウスの頭蓋骨由来のストローマ細胞株(PA-6)を、予め24穴プレートに播種しコンフルエントになるまで待った。コンフルエント後、PBSにて2回洗浄作業を行ない、α-MEM培地を添加した。次に非動化したNHS(Heated inactivated pooled NHS: 56℃,40min) 及びNHS、PBSにて調製したｓＣＲ１をそれぞれ混合(sCR1:NHS  or  H-NHS =1:9 ; sCR1をNHSで10希釈した)したものを100μlずつ添加し、1時間後、その様子を観察した。結果を図２４に示す。この結果によれば、NHSのみの場合補体が活性化され、細胞がdishから剥離している様子が確認された。また非動化したサンプルにおいては、完全に補体が失活した事が確認された。ｓＣＲ１を添加したサンプルにおいては、20μg/ml-NHSの濃度より補体の抑制効果が現れていることが確認された。上記実施例５、（２）、ｉ）および２）で明らかにしたように、細胞の回復を考慮するとCH50及びACH50と比べｓＣＲ１の投与量はかなり少なくても補体の抑制効果を確認することができた。
【００４９】
実施例 6. ｓＣＲ１のin vivo(生体内)活性の確認 
なお。使用したｓＣＲ１は実施例２（２）のHPLCゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得られた精製ｓＣＲ１及びAglyco-sCR1である。 
モデルラット用いたｓＣＲ１の活性の確認 
この実験ではモデルラットを用いることで、in vivoにおけるｓＣＲ１の効果を確認した。実験手法の模式図を図２５に示す。実験手法としては、まず細胞膜状の膜レセプター(ＣＲ１等)を阻害する抗Crry抗体をラットに投与し、補体調節蛋白質が働かないような状態(免疫系が働かないようなヌードラット)を作り出した。次にｓＣＲ１を20mg/kgとなるようにラットに投与し、ｓＣＲ１投与後、補体を活性化させる物質であるリポ多糖(LPS)を投与した。その後生存しているラットに関してC3の沈着が行われているかどうか、各臓器を免疫染色したところ、肺、肝臓、腎臓においてC3の沈着はなく、補体が抑制されていることが確認された。また同様にAglyco-sCR1にも補体抑制能力はインタクトなｓＣＲ１に比べて活性は低いながらも、補体を抑制している結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】補体系とｓＣＲ１の作用を示す模式図である。
【図２】本発明の可溶化補体レセプタータイプ1(ｓＣＲ１)の結晶化工程を示す模式図である。
【図３】二段階細胞培養法における各培地中の細胞の状態を撮影した顕微鏡写真である。
【図４】従来の培養法と新規二段階細胞培養法によりそれぞれ回収した培地の電気泳動図である。
【図５】ｓＣＲ１の糖鎖除去を行なう場合の二段階細胞培養法の模式図である。
【図６】Tunicamycin を用いた二段階細胞培養法における各培地中の細胞の状態を撮影した顕微鏡写真である。
【図７】ヘパリンカラムによるｓＣＲ１の精製において溶出される画分の電気泳動図である。
【図８】ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによるｓＣＲ１の精製において溶出される画分の電気泳動図である。
【図９】ヘパリンカラムによるAglyco-sCR1の精製において溶出される画分の電気泳動図である。
【図１０】ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによるAglyco-sCR1の精製において溶出される画分の電気泳動図である。
【図１１】anti-sCR1抗体のｓＣＲ１に対する抗体結合部位を示す模式図である。
【図１２】ｓＣＲ１に対し４種の抗体が特異性を有することを示すウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図１３】Aglyco-sCR1に対し４種の抗体が特異性を有することを示すウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図１４】シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶作製方法を示す模式図である。
【図１５】ｓＣＲ１の結晶を撮影した実体顕微鏡写真である。
【図１６】ｓＣＲ１の電子顕微鏡による観察結果を示す写真である。
【図１７】Aglyco-sCR1の電子顕微鏡による観察結果を示す写真である。
【図１８】ｓＣＲ１とFactor1とによるC3b の限定分解を示す模式図及びその実験結果を示す電気泳動図である。
【図１９】Aglyco-sCR1とfactor IとによるC3b の限定分解を示す模式図及びその実験結果を示す電気泳動図である。
【図２０】ｓＣＲ１の濃度とCH50との関係を示すグラフである。
【図２１】ｓＣＲ１の濃度とACH50との関係を示すグラフである。
【図２２】ｓＣＲ１の添加量とiC3b濃度との関係を示すグラフである。
【図２３】ｓＣＲ１の添加量とSC5b-9濃度との関係を示すグラフである。
【図２４】マウスの頭蓋骨由来ストローマ細胞を用いた細胞障害実験の結果を示す写真である。
【図２５】LPS感作512ショックモデルラットを用いた動物の手法を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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