(57)【要約】【課題】  天然物由来のカルシウムチャンネル阻害ないし抑制剤及び同含有物質を開発する。【解決手段】  天然ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒ（ＶＹ）又はそれを含有する物質を有効成分とするカルシウムチャンネル阻害ないし抑制剤。ＶＹ含有物質としては、イワシ等の魚肉の加水分解物（サーデンペプチド）等が挙げられ、ＶＹ又はＶＹ含有物質は、医薬のほか飲食品としても使用できる。本発明によって、血圧降下において、ＶＹがＡＣＥ阻害のほかにカルシウムチャンネル阻害の２つの作用を有することが明らかにされた。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒ又はジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒ含有物を有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
【請求項２】
ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒ含有物が魚肉由来ペプチドであること、を特徴とする請求項１に記載のカルシウムチャンネル阻害剤。
【請求項３】
魚肉由来ペプチドが下記（イ）〜（ニ）に示されるペプチドα−１０００、Ｙ−２、ＳＹ、ＳＹ−ＭＤの少なくともひとつであること、を特徴とする請求項２に記載のカルシウムチャンネル阻害剤。
（イ）魚肉を熱変性した後、中性ないしアルカリプロテアーゼ処理して加水分解し、酵素を失活せしめた後、分離処理して得たペプチドα−１０００。
（ロ）ペプチドα−１０００の水溶液をペプチド原液とし、これをペプチド吸着樹脂に吸着せしめた後、８〜１７Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液で溶出した画分からなるペプチドＹ−２。
（ハ）ペプチド原液をペプチド吸着樹脂に吸着せしめた後、水、エタノール水溶液、水の順に溶出し、各溶出画分の少なくとも一部を混合してなるペプチドＳＹ。
（ニ）前記（ロ）におけるエタノール水溶液溶出画分を処理して得たペプチドＳＹ−ＭＤ。
【請求項４】
魚肉を熱変性した後、中性ないしアルカリプロテアーゼ処理して加水分解し、酵素を失活せしめた後、分離処理して得たペプチドであって、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドα−１０００を有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
【請求項５】
下記の理化学的性質を有するα−１０００を有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
（ペプチドα−１０００の理化学的性質）
（Ａ）分子量：
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１１９℃で着色（分解点）
（Ｃ）比旋光度：
〔α〕D20＝−２２°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性：
水に易溶；エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別
中性
（Ｆ）外観、成分：
白色粉末：水分５．１４％（減圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分５．０％（直接灰化法）。
（Ｇ）特性：
魚肉由来であり、加熱によって自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解して得たペプチドである。ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、カルシウムチャンネル阻害ないし抑制作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図１
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図２
【請求項６】
請求項４又は５に記載のペプチドα−１０００の水溶液をペプチド原液とし、これをペプチド吸着樹脂に吸着せしめた後、８〜１７Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液で溶出した画分であって、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＹ−２を有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
【請求項７】
下記の理化学的性質を有するペプチドＹ−２を有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
（ペプチドＹ−２の理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１３８℃で着色、分解する。
（Ｃ）比旋光度〔α〕D20＝−４０°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別：中性  ｐＨ５．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）物質の外観：白色〜淡黄色粉末。
（Ｇ）成分：水分２．７２％（常圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．２５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分０．２０％（直接灰化法）
（Ｈ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、カルシウムチャンネル阻害ないし抑制作用を有する。
（Ｉ）赤外線吸収スペクトル：図４
（Ｊ）紫外線吸収スペクトル：図５
【請求項８】
請求項４又は５に記載のペプチドα−１０００の水溶液を原液とし、これをペプチド吸着樹脂に吸着せしめた後、これを溶出分画処理して得られるペプチド成分であって、該溶出分画処理が展開溶液として水、エタノール水溶液及び水の順に用い、図１１の溶出パターンにおいて、それぞれの展開溶液により得られる下記で規定される水溶出（１）の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分及び水溶出（２）画分を分取混合してなり、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＳＹを有効成分とすること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
（１）水溶出（１）の後画分：展開液として水を用い、溶出ペプチド画分全体（ペプチドＳＹ）におけるナトリウム（Ｎａ）の量が１〜３ｇ／１００ｇとなる時点から、ナトリウムの量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる水溶出（１）の後画分の最終分取点までの画分。
（２）エタノール溶出画分：次に、１１〜１８Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分。
（３）水溶出（２）画分：次に、展開液として水を用い、溶出分画処理が終点となるまでに得られる画分。
【請求項９】
下記の理化学的性質を有するペプチドＳＹを有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
（ペプチドＳＹの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
；蛋白質８４〜９４％Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
；脂質０．５％（ソックスレー抽出法）
；灰分４±２％（直接灰化法）
；Ｎａ  １〜３Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、カルシウムチャンネル阻害ないし抑制作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図７
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図８
【請求項１０】
請求項８の（２）におけるエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分のみを単離分取してなり、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＳＹ−ＭＤを有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
【請求項１１】
下記の理化学的性質を有するペプチドＳＹ−ＭＤを有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害剤。
（ペプチドＳＹ−ＭＤの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分  ２〜６Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
；蛋白質  ９０〜９８Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
；脂質  ０．５Ｗ／Ｗ％（ソックスレー抽出法）
；灰分  ３．０Ｗ／Ｗ％（直接灰化法）
；Ｎａ  ０．１〜０．２Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質；ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、カルシウムチャンネル阻害ないし抑制活性を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル；図９
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル；図１０
【請求項１２】
天然物由来で、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有する物質を有効成分とすること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害ないし抑制用食品。
【請求項１３】
請求項５に記載のペプチドα−１０００、請求項７に記載のペプチドＹ−２、請求項９に記載のペプチドＳＹ、請求項11に記載のペプチドＳＹ−ＭＤから選ばれる少なくともひとつのペプチド自体からなること、あるいはこれらのペプチドから選ばれる少なくともひとつのペプチドを含有してなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害ないし抑制用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウムチャンネル阻害剤に関するものであり、更に詳細には、特定の天然ジペプチド及び／又はその含有物を有効成分とする新規にして有用なカルシウムチャンネル阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
先に、本発明者らは、魚肉を熱変性処理し、自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解し、酵素を失活せしめた後、分離処理することによってＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ：アンジオテンシンＩ変換酵素）阻害活性を有する新規ペプチドα−１０００を開発するのに成功し、既に特許権を得ている（特許文献１参照）。
【０００３】
一方、本発明は、天然ペプチド、特に天然由来の特定のジペプチド（Ｖａｌ−Ｔｙｒ）がカルシウムチャンネル阻害作用を有することをはじめて見出し、この有用新知見に基づいてなされたものであるが、本ジペプチドがこのようなすぐれた生理作用を有することは従来全く知られていない。
【特許文献１】特許第３１１７７７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特に安全性の観点から、天然物由来の薬剤、機能性食品の開発を目的としてなされたものであって、先に本発明者らが開発するのに成功した魚肉由来ペプチドα−１０００のすぐれた生理作用に再度着目し、すぐれた生理作用を有する新規ペプチドを新たに開発する目的でなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するために各方面から検討を行い、魚肉由来ペプチドに着目してその生理活性機能について研究した結果、魚肉由来ペプチドがすぐれた血圧上昇抑制作用を有することを見出した。そしてこの作用は、主として、血管収縮作用を示すアンジオテンシンII（Ａｎｇ  II）のアンジオテンシン  Ｉ（Ａｎｇ  Ｉ）からの産生を触媒するアンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）に対する阻害によるものであることを確認したが、その研究の過程においてＡＣＥ阻害作用のみでは説明できない現象がｉｎ  ｖｉｖｏ試験で認められた。
【０００６】
そこで本発明者らは、ＡＣＥ阻害作用とは別の降圧機構が魚肉由来ペプチドには存在するのではないかという新規着想を得、各方面から検討の結果、魚肉由来ペプチドによるＡＣＥ阻害作用とは別の降圧機構として、カルシウムチャンネルの阻害ないし抑制作用にはじめて着目した。カルシウムは細胞の生育に必要ではあるが、カルシウムチャンネルを介してカルシウムが過度に血管細胞に取り込まれると血管の柔軟性が低下し、血圧が上昇するため、カルシウムチャンネルを適宜閉じてカルシウムの吸収を防止（阻害）する必要がある。
【０００７】
本発明者らは、魚肉由来ペプチドを分画し、得られた各種分画画分について、その生理活性の解明を目的として、正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を用いて検討した結果、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒ（バリル−チロシン（Ｖａｌｙｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、以下ＶＹということもある）がカルシウムチャンネルを阻害ないし抑制する作用を有することをはじめて見出した。
【０００８】
また、単離したＶＹだけでなく、ＶＹを含有する物質のスクリーニング、ＶＹ高含有成分の分離、取得法についても検討を行い、これらのＶＹ含有物もすぐれたカルシウムチャンネル阻害（ないし抑制）作用を有することもはじめて確認し、これらの有用新知見に基づいて各種研究の結果、遂に本発明の完成に至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、ジペプチドＶＹについてカルシウムチャンネル阻害（ないし抑制）作用という新しい生理作用（ＡＣＥ阻害作用とは別の新しい血圧降下作用）をはじめて発見したことに基づくものであって、ＶＹ及び／又はＶＹ含有物を有効成分とするカルシウムチャンネル阻害（ないし抑制）用のあるいは予防用の薬剤または同飲食品に関するものであり、これらの薬剤及び／又は飲食品は、例えば血圧を降下させたり、予防的に血圧の上昇を抑制したりするのに有用である。
【００１０】
本発明においては、有効成分としてジペプチドＶＹを使用するものであるが、ＶＹとしては、精製、単離したものが使用できるほか、ＶＹを含有する組成物、特に天然物由来物質も各種使用することができる。該物質としては、本発明者らの研究の結果、例えば魚肉処理物が好適であることが見出された。
【００１１】
ここに処理物とは、アミノ酸、ペプチド、蛋白質等天然物の分離、精製に常用される各種処理の１種又は２種以上によって得られたものをいい、処理としては下記の処理が例示される：透析、酵素加水分解、酸加水分解、脱脂、イオン交換樹脂、クロマトグラフィーその他。
【００１２】
本発明においては、有効成分として天然物由来のＶＹ含有物質も使用することができ、例えば該物質としては小麦胚芽処理物や魚肉処理物が挙げられ、小麦胚芽由来のペプチドや魚肉由来のペプチドα−１０００、Ｙ−２、ＳＹ、ＳＹ−ＭＤ等が有利に使用される。そして所望する場合にはクロマトグラフィー処理等の分離精製手段をくり返したり適宜組み合わせたりして、ＶＹ濃度を高めたり、ＶＹ画分を分画したりすることも可能である。
ＶＹ含有物質の１例としての魚肉処理物について以下に述べる。
【００１３】
本発明者らは、各方面から研究を続けた結果、先に本発明者らが開発した魚肉由来ペプチドα−１０００を疎水性吸着樹脂ＯＤＳカラムに供した後、１０％エタノール水溶液で溶出した画分にＶＹが高濃度に含まれていることをはじめて見出し、鋭意研究の結果、ＶＹ含量の高い魚肉処理物（ペプチドＹ−２）を開発するのに成功し、また、別の処理による魚肉処理物（ペプチドＳＹ、ＳＹ−ＭＤ等）にもＶＹが高濃度に含まれていることも確認し、魚肉由来ペプチドの面からの発明を完成するのにも成功した。
【００１４】
例えば、ペプチドＹ−２は次のようにして製造することができる。ペプチド原液つまりペプチドＹ−２の原料としては、魚肉由来ペプチドを用い、これを疎水性吸着樹脂に供した後、５〜２０、好ましくは８〜１７、更に好ましくは約１５Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液で溶出することにより、ペプチドＹ−２が得られる。また、エタノール水溶液で溶出する前に水で溶出し次にエタノール水溶液で溶出してもよい。このようにして得られた溶出画分にはＶＹが含まれており、この画分（ペプチドＹ−２）は、本発明における有効成分として有利に使用することができる。
【００１５】
ペプチドＹ−２のほかＳＹやＳＹ−ＭＤの原料ないし起源、つまりペプチド原液としては、例えばペプチドα−１０００の水溶液が使用できる。
ペプチドα−１０００は、魚肉を熱変性した後、中性ないしアルカリプロテアーゼ処理して加水分解し、次いで加熱等常法にしたがって酵素を失活せしめた後、分離処理して製造することができる。その詳細を以下に述べる。
【００１６】
ペプチドα−１０００は、魚介類を原料として製造するものであって、例えば特許第３１１７７７９号にしたがって製造することができ、先ず、魚介類を採肉機、デボーナー等によって処理して魚肉質を分離する。原料は出来る限り新鮮なものが好ましい。分離した魚肉は、１０ｋｇ程度のすり身に分割し、このまま次の処理に使用してもよいが、−２０〜−５０℃、例えば−３０℃程度の冷気を吹き付けて急速凍結し、−２０〜−２５℃に保存しておき、必要に応じてこれを適宜使用することにしてもよい。
【００１７】
魚介類としては、イワシ、アジ、マグロ、カツオ、サンマ、サバ等赤身魚；ヒラメ、タイ、キス、コノシロ、タラ、ニシン、ブリ等白身魚；サメ、エイ等軟骨魚肉；ワカサギ、コイ、イワナ、ヤマメ等淡水魚肉；アイザメ、アンコウ等深海魚肉のほか、エビ、カニ、タコ、アミ類等も適宜使用できる。
【００１８】
採肉した後、粉砕機等によって魚介類を粉砕し、原料重量に対して１／２量〜２０倍量、好ましくは等量〜１０倍量の加水を行った後、加熱処理し、もって、自己消化酵素を失活させ、且つ細菌を死滅させるとともに、タンパク質を熱変性させて後に行う酵素反応効率を上昇せしめる。加熱条件としては、このような作用が奏される条件であればすべての条件が利用できるが、例えば６５℃以上、２〜６０分、好ましくは８０℃以上、５〜３０分とするのがよい。
【００１９】
次いで、アンモニア水か、水酸化ナトリウム（カリウム）水溶液等アルカリ剤を加えて、使用する蛋白分解酵素の適値にｐＨを調整し、（例えばアルカリプロテアーゼの場合は、ｐＨ７．５以上、好ましくは８以上）、温度も酵素適温（使用酵素によって異なるが、２０〜６５℃、アルカリプロテアーゼの場合は３５〜６０℃、好ましくは４０〜５５℃）に加温し、蛋白分解酵素を加えて３０分〜３０時間（アルカリプロテアーゼの場合は３０分〜２５時間、好ましくは１〜１７時間）処理する。
【００２０】
蛋白分解酵素としては、中性又はアルカリ性条件下で蛋白質を分解し得る酵素であればすべての酵素が単独で又は混合して使用し得る。その起源は、動植物のほかに微生物にも求めることができ、ペプシン、レニン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメラインのほか、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、放線菌プロテアーゼ等も広く利用できる。これらの酵素は、通常、市販されているものが使用されるが、未精製の酵素、酵素を含有した培養液、麹といった固体又は液体の酵素含有物も、目的により必要に応じて使用することができる。酵素の添加量としては０．１％〜５．０％程度でもよい。
【００２１】
次いで必要あれば中和処理を行った後、７０℃（好適には８０℃）以上の温度に２〜６０分間（好適には５〜３０分間）保持し、酵素を失活させるとともに後に行う分離を良好ならしめる。加熱失活処理後、バイブスクリーン等によって粗分離し、必要によりジエクター処理した後、超遠心分離処理して、浮遊物、沈殿物を除去する。
【００２２】
次に、ケイソウ土等濾過助剤（例えばセライト）を用いて濾過し、濾液を活性炭処理（０．０５〜２０Ｗ／Ｖ％、好ましくは０．１〜１０Ｗ／Ｖ％使用、２０〜６５℃、好ましくは２５〜６０℃、１５分〜４時間、好ましくは３０分〜２時間）して、脱臭、脱色、精製する。
【００２３】
これを減圧濃縮（０〜５０℃）その他常法にしたがって濃縮（Ｂｘ３０程度にまで）した後、必要あれば再度（超）遠心分離又は濾過してペプチド原液を得る。このようにして得たペプチド原液は、殺菌（ＵＨＴＳＴその他常法による）した後、容器に充填した製品（α−１０００（液体））とする。また、希望するのであれば、更に濃縮したりあるいは逆に希釈したり、また、噴霧乾燥、凍結乾燥等の常法によって６０メッシュ程度に粉末化し、これを袋等の容器に充填して製品（α−１０００（粉末））とすることもできる。これらの製品は、液体は冷蔵ないし冷凍保管、粉末は乾燥冷暗所保管する。
【００２４】
このようにして得た、液状、ペースト状ないし粉末状のペプチドがα−１０００である。
【００２５】
ペプチドα−１０００（スプレードライ粉末）の物理化学的性質は、下記に示すとおりである。
【００２６】
ペプチドα−１０００（粉末）の物理化学的性質
（Ａ）分子量；
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点；１１９℃で着色（分解点）
（Ｃ）比旋光度
〔α〕D20＝−２２°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性；
水に易溶；エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別；
中性  ｐＨ６．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）外観、成分；
白色粉末；水分５．１４％（減圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分５．０％（直接灰化法）。
（Ｇ）特  性；
魚肉由来であり、加熱によって自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解して得たペプチドである。
ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、カルシウムチャンネル阻害（ないし抑制）作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図１
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図２
（Ｊ）アミノ酸組成；
下記に示すとおり。
【００２７】
（表１）
ペプチドα−１０００（粉末）のアミノ酸組成
―――――――――――――――――
分析試験項目      結果（％）
―――――――――――――――――
全アミノ酸
アルギニン          ３．３４
リジン              ６．８６
ヒスチジン          ３．３４
フェニルアラニン    ２．３３
チロシン            ２．０１
ロイシン            ６．３５
イソロイシン        ３．２７
メチオニン          ２．２６
バリン              ４．１６
アラニン            ５．１７
グリシン            ３．５９
プロリン            ２．１５
グルタミン酸      １２．３５
セリン              ３．３０
スレオニン          ３．７０
アスパラギン酸      ８．３６
トリプトファン      ０．３２
シスチン            ０．４７
全量              ７３．３３
―――――――――――――――――
分析方法：アミノ酸自動分析法による（但し、シスチンは、過ギ酸酸化処理後、塩酸加水分解し測定した。トリプトファンは、高速液体クロマトグラフ法を用いた。）
【００２８】
このようにして調製したペプチドα−１０００は、本発明において有効成分として利用できるが、更に処理してもよく、例えば液状の場合はそのまま、粉末の場合は加水した後、これをＯＤＳ樹脂その他疎水性吸着性樹脂に通し、水で溶出した後、ひき続き、５〜２０％、好ましくは１１〜１９％、更に好ましくは１３〜１８％エタノール水溶液を加えてエタノール水溶液での溶出を行い、ペプチドＹ−２を得る。なお、樹脂としては、疎水性吸着性樹脂であればすべての樹脂が使用可能であり、既述した市販の樹脂も適宜使用可能である。
【００２９】
このようにして得た魚肉精製ペプチドのＹ−２画分（つまり、ペプチドＹ−２）には、ＶＹが多く含有されており、事実、イワシ魚肉を０．７％アルカラーゼで１７．５時間処理して得た水解物をＯＤＳカラムに供し、水溶出画分の後半部分と１５％エタノール溶出画分を合わせたＹ−２画分（すなわち、イワシ魚肉由来酵素分解精製物であるサーデンペプチドＹ−２）には、高速液体クロマトグラフィーによる解析の結果、ＶＹが約１５０ｍｇ／１００ｇ含有されていることが確認された。
【００３０】
本発明において有効成分として使用するペプチドＹ−２の理化学的性質は、次に示される。
（ペプチドＹ−２の理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）（図３）
（Ｂ）融点：１３８℃で着色、分解する。
（Ｃ）比旋光度〔α〕D20＝−４０°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別：中性  ｐＨ５．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）物質の外観：白色〜淡黄色粉末。
（Ｇ）成分：水分２．７２％（常圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．２５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分０．２０％（直接灰化法）
（Ｈ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、カルシウムチャンネル阻害ないし抑制作用を有する。
（Ｉ）赤外線吸収スペクトル：図４
（Ｊ）紫外線吸収スペクトル：図５
（Ｋ）アミノ酸組成：下記の表２に示すとおり。分析方法はアミノ酸自動分析法（島津ＬＣ−６Ａシステム）による。
【００３１】
（表２）
ペプチドＹ−２のアミノ酸組成
―――――――――――――――――
アミノ酸          分析値（％）
―――――――――――――――――
アスパラギン酸      １０．９７
スレオニン            ４．１０
セリン                ２．９０
グルタミン酸        １２．５２
グリシン              ４．９１
アラニン              ５．０６
バリン                ６．２０
メチオニン            ２．５５
イソロイシン          ５．５５
ロイシン              ９．４７
チロシン              ２．９６
フェニルアラニン      ４．７５
ヒスチジン            ２．８３
リジン              １０．０７
アルギニン            ７．５０
―――――――――――――――――
【００３２】
そして更に、本発明者らは、上記したペプチドＹ−２の有用性に改めて着目し、魚肉を蛋白分解酵素で処理して得たペプチド（例えば、ペプチドα−１０００）について研究を行い、この魚肉由来ペプチドを疎水性吸着樹脂（例えば、ＯＤＳ樹脂）処理し、水溶出、エタノール水溶出、水溶出の三段階溶出を行ったところ、最初の水溶出の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液溶出画分及び最後の水溶出画分に、魚肉ペプチド中のＶＹが多量に回収されているという有用新知見を得た。
このように、最初の水溶出の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液溶出画分及び最後の水溶出画分の混合物はＶＹ含量が高いだけでなく、苦味が少なく、呈味性にすぐれ、安定性にもすぐれており、全く新規な機能性ペプチドであることを確認し、これを新規ペプチドと同定して、ここに、ベプチドＳＹと命名した。
更に、本発明において、上記の１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液溶出画分のみを単離して調べたところ、Ｎａ含量が０．１〜０．２％程度（ペプチドＳＹでは、Ｎａは１〜３％程度）と極めてＮａ含量の少ない新たなペプチドが得られたので、この画分をペプチドＳＹ−ＭＤと命名した。
【００３３】
本発明においては、ペプチドα−１０００を原料として、できるだけ多くのＶａｌ−Ｔｙｒを含むペプチドを連続的に回収することを目的に研究を行った。
その結果、α−１０００をＯＤＳ樹脂に吸着せしめた後、水を加えて水で溶出する画分の一部（後の方の画分）を得た後、ひき続き、連続してエタノール水溶液を加えてエタノール水溶液で溶出する画分を得るのであるが、その際、水溶出（１）に使用した水が一部残っているために、エタノール濃度は１１〜１８Ｖ／Ｖ％、好ましくは１４〜１６Ｖ／Ｖ％程度が好適であることをつきとめた。
【００３４】
そして更に、ペプチドＳＹを取得するに当り、目的とする水溶出（１）の後画分を分取する際の分取開始点の設定、その終了点（即ち、エタノール溶出の開始点）、その終了点（水溶出（２）の開始点）、その終了点について、分画時間、塩分濃度、Ｂｘ、波長２８０ｎｍのＵＶ吸収の測定、モニタリングによってそれぞれ特定ないし判断して、一種の連続システムによるペプチドＳＹの製造法も確立し、これらの有用新知見に基づき、更に研究の結果、遂に本発明の完成に至ったものである。
【００３５】
すなわち本発明は、ジペプチドＶＹを含有してなるペプチドＳＹ又はＳＹ−ＭＤを有効成分としてなること、を特徴とするカルシウムチャンネル阻害ないし抑制剤に関するものであって、その理化学的性質は次のとおりである。
【００３６】
（ペプチドＳＹの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）；図６
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
；蛋白質８４〜９４Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
；脂質０．５Ｗ／Ｗ％以下（ソックスレー抽出法）
；灰分４±２Ｗ／Ｗ％（直接灰化法）
；Ｎａ  １〜３Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図７
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図８
（Ｊ）比旋光度：〔α〕D20＝−４０°〜−５１°
【００３７】
（Ｋ）主要なアミノ酸組成：下記表３のとおり、分析方法はアミノ酸自動分析法（島津ＬＣ−６Ａシステム）による。
【００３８】
（表３）
ペプチドＳＹのアミノ酸組成
――――――――――――――――――――
アミノ酸          分析値（％）
――――――――――――――――――――
アスパラギン酸      ８．０〜９．２
グルタミン酸        ９．５〜１２．０
バリン              ４．５〜５．５
メチオニン          ２．５〜３．８
イソロイシン        ４．５〜５．２
ロイシン            ７．３〜８．５
チロシン            ３．４〜４．８
フェニルアラニン    ４．５〜５．５
ヒスチジン          ３．０〜３．８
リジン              ６．５〜７．８
アルギニン          ５．０〜６．０
――――――――――――――――――――
【００３９】
（ペプチドＳＹ−ＭＤの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分  ２〜６Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
；蛋白質  ９０〜９８Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
；脂質  ０．５Ｗ／Ｗ％（ソックスレー抽出法）
；灰分  ３．０Ｗ／Ｗ％以下（直接灰化法）
；Ｎａ  ０．１〜０．２Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制活性を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図９
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図１０
【００４０】
ペプチドＳＹは次のようにして製造することができる。すなわち、ペプチド原液、つまりペプチドＳＹの原料となる魚肉の酵素処理物（例えば、ペプチドα−１０００）を、液状の場合はそのまま、粉末の場合は加水した後、ＯＤＳ樹脂その他疎水性吸着性樹脂に通し、図１１の「原液負荷」を行い、製造プロセスを開始する。
【００４１】
即ち、ペプチド原液を疎水性吸着樹脂による溶出分画処理により得られるペプチド成分であって、該溶出分画処理が展開溶液として水、エタノール水溶液及び水の順に用い、図１１で例示する溶出パターンにおいて、それぞれの展開溶液により得られる下記で規定される水溶出（１）の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分（図１１では１５％エタノールでの溶出を示す）及び水溶出（２）画分を分取混合してペプチドＳＹは製造される。
（１）水溶出（１）の後画分：展開液として水を用い、水溶出（１）のペプチド（ペプチドＳＹ）におけるナトリウム（Ｎａ）の量が１〜３ｇ／１００ｇとなる時点から、ナトリウムの量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる水溶出（１）の後画分の最終分取点までの画分。
（２）１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分：次に、１１〜１８Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分。（この画分のみを単離したものをペプチドＳＹ−ＭＤとした。）
（３）水溶出（２）画分：次に、展開液として水を用い、溶出分画処理が終点となる迄に得られる画分。
【００４２】
そして上記したように、（２）において、エタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分のみを単離分取することにより、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＳＹ−ＭＤを得ることができ、また、上記（２）、又は、上記（２）及び（１）からペプチドＹ−２を得ることもできる。
【００４３】
これらのペプチドの製法を、図１１を参照しながら、以下に詳述する。すなわち、ペプチドＳＹは、上記した溶出画分から分取、製造することができる。各種溶出液の溶出パターンの１例を図１１に示す。
本発明に係るペプチドＳＹは、図１１に示す如く、疎水性吸着樹脂に、例えばα−１０００を加え（原液負荷）、次いで水で溶出し（水溶出（１））、その水溶出（１）の後画分、と、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶液で溶出する１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分、と、更に水で溶出する水溶出（２）画分を混合することにより製造することができる。ペプチドＳＹ画分の分取スタート時点の設定、溶出液の切り変え時期の設定等は、Ｂｘ、塩分、ＵＶ（２８０ｎｍ吸収）、Ｎａの少なくともひとつの測定値に基づき、あるいは分画時間に基づいて適宜決定すればよく、これらの項目をリアルタイム等適宜モニターして、コンピュータによって実施することも可能である。
【００４４】
例えば、図１１の溶出パターンにおいてペプチドＳＹの水溶出（２）の後画分の分画スタート時点は、塩分値を測定し、次のようにしてこれを決定することができる。
ｉ）水溶出開始後０分時点から取ると、Ｎａ含量が４ｇ／１００ｇ以上となってしまうので、高Ｎａ素材となり血圧を上昇させる場合があるため、好ましくない。
ii）分取開始時間が水溶出開始後２０分の時は、Ｎａ含量として１〜３ｇ／１００ｇで許容範囲である。
iii）これ以降の分取開始とすると、更にＮａ含量は少なくなるが、今度は塩分含量が少なすぎるため濃縮時にペプチドＳＹに含まれるグアニンが析出しやすくなりオリが発生することがあって好ましくない。
iv）したがって分取開始時間を水溶出開始後２０分とし、Ｎａ量を１〜３ｇ／１００ｇ付近とした。
また、水溶出（１）画分の最終分取点はＮａ量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる点とした。
【００４５】
次に、この点から水にかえて１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液が添加され、ペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するところでエタノール水溶液の添加を止め、ここに得られる画分を１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分とした。（この１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分のみを単離したものがＮａをほとんど含まないペプチドＳＹ−ＭＤとなる。）
【００４６】
１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液の添加を停止し、水の添加に切り換える時期は、水溶出（２）のスタート時点でもあるが、ペプチド量を示す波長２８０ｎｍのＵＶ吸収値が急激に低下しはじめ、ピークの半分程度になった時期とし、エンドポイントは、ＵＶ吸収値がゼロになって定常状態に入った時期とすればよい。ここに得られた画分を水溶出（２）画分とした。
【００４７】
ここに得られる（１）水溶出（１）の後画分、（２）１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分、（３）水溶出（２）画分を、各別に又は連続して分取混合したものが本発明のペプチドＳＹである。
このようにして、水溶出（１）画分の途中からの後画分から、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分を経て、水溶出（２）画分までの画分を、本発明に係るペプチドＳＹとして得ることができる（図１１においては、サーデンペプチドＳＹと表示）。
また、図１１において「１５％エタノール溶出」としたところが、「ペプチドＳＹ−ＭＤ」に相当する。
【００４８】
ペプチドＳＹ、ＳＹ−ＭＤ、Ｙ−２、α−１０００は、本発明者らによってカルシウムチャンネル阻害ないし抑制ペプチドの本体のひとつとしてはじめて確認されたジペプチド（バリル−チロシン：Ｖａｌ−Ｔｙｒ又はＶＹ）を高濃度に含有しており、特にペプチドＳＹ−ＭＤは、水溶出（１）の後画分を含まないので少し苦みは残るが呈味性が大幅に改良されているだけでなく、Ｎａをほとんど含まないので、Ｎａ摂取不可の人にとっては非常に有用である。
【００４９】
すなわち、「原液負荷」部分は呈味性は強いが、原料由来の魚臭も幾分含まれており、Ｎａ含量も多い。これに対して、水溶出（１）の後画分は原料由来の魚臭が少なく、味も非常に良好である。
従って水溶出（１）の後画分を組み入れることによって、ペプチドＳＹ−ＭＤより、ＶＹを多量に回収でき、かつ呈味性と安定性に優れたペプチド素材「ペプチドＳＹ」が得られることになるのである。
【００５０】
本発明に係るペプチドα−１０００、Ｙ−２、ＳＹ、ＳＹ−ＭＤは、いずれもジペプチドＶＹを含有する天然物由来物質であって、すぐれたカルシウムチャンネル阻害ないし抑制作用を示し、しかも安全性についても問題はないので、カルシウムチャンネル阻害ないし抑制剤ないし該抑制を目的として特定保健用食品向けペプチドとしても使用することができる。したがって本ペプチドは、調味料、栄養強化用食品といった食品ないしは動物飼料添加剤として使用されるほか、上記した独特の生理活性の故に、血管性疾病の予防、ある場合には治療のために、医薬として、または輸液、健康食品、臨床栄養食品等としても巾広く使用することができる。
【００５１】
なお本発明において、カルシウムチャンネル阻害とは、カルシウムチャンネルを完全に阻害する場合だけでなく、一部阻害、すなわち抑制する場合も広く包含するものであるが、これらを含めて、以降、カルシウムチャンネル阻害ということにする。
【００５２】
食品として使用する場合には、ペプチドをそのまま添加したり、他の食品ないしは食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。また、医薬として使用する場合には、経口又は非経口投与することができる。経口投与の場合には、例えば常法にしたがい、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤、ドリンク剤とすることができ、又、非経口投与の揚合には、例えば注射薬製剤、点滴剤、坐剤等として使用することができる。もちろん、精製したジペプチドＶＹについても上記と同様に、医薬、食品（本発明においては飲料も包含する）とすることができることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００５３】
本発明によってはじめてＶＹが正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）においてそのカルシウムチャンネルを阻害することが確認され、ＶＹを有効成分とするカルシウムチャンネル阻害剤が開発された。更にまた、ＶＹを含有する物質（例えば、魚肉由来のペプチド、サーデンペプチド、ペプチドα−１０００、Ｙ−２、ＳＹ、ＳＹ−ＭＤ等）も有効であることも確認され、これらのペプチドを有効成分とするカルシウムチャンネル阻害剤もはじめて開発された。
【００５４】
本発明は、ＶＹにＡＣＥ阻害作用とは全く別のカルシウムチャンネル阻害作用という全く新規な作用を見出したものであって、いわゆる第２薬効の新規開発に成功したものである。また、本発明は、ＶＹによる血圧降下機構において、ＡＣＥ阻害のほかにカルシウムチャンネル阻害の２つの作用があることをはじめて確認したものであって、まさに画期的な新発見であり、カルシウムチャンネル阻害ルートによる降圧剤の開発等、新しい展開も期待できるものである。
【００５５】
ＶＹ、及びそれを含有する物質（例えば上記した各種ペプチド）は、いずれも安全性には問題がなく（現に、ラットに対して５００ｍｇ／日を強制的に経口投与したけれども、１０日間経過後において急性毒性は認められなかった。）、薬効はもとより呈味性にもすぐれているので、同阻害剤のほか、同阻害を目的とした特定保健用食品向けペプチド等食品としても使用することができる。
【００５６】
また、ＶＹ、それを含有する物質は、すぐれたカルシウムチャンネル阻害作用を有するので、脳梗塞性疾患、偏頭痛疾患、てんかん性疾患、精神病疾患、疼痛性疾患、高血圧症、狭心症、不整脈、心筋症、脳虚血、心不全、虚血性冠動脈心疾患等の予防及び／又は治療用の薬剤や飲食品としての利用が可能であり、また、腹痛抑制、シワ・コジワの低減、動脈硬化予防等にも有効性が充分に期待される。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５８】
（実施例１：ペプチドα−１０００の製造）
新鮮イワシをデボーナーで処理して採肉した。採肉した魚肉質を１０ｋｇのすり身に分割し、これを−３０℃以下で急速凍結した後、粉砕機で粉砕した後等量の水を加え、これをタンクに送り、１００℃で１０分間加熱して自己消化酵素を失活させ、熱変性させた。次いでアンモニア水を加えてｐＨを９．５に調整した。
これに市販のアルカリプロテアーゼ製品の０．１％液を加え、５０℃に１７．５時間保持して酵素分解を行った。次いで１５分間煮沸して酵素を失活せしめた。
これをバイブスクリーン（１５０メッシュ）に通し５０００ｒｐｍでジェクター処理した後、シャープレス遠心分離機で処理し（１５０００ｒｐｍ）、ケイソウ土を濾過助剤として用い、濾過処理したものをペプチド原液とした。
【００５９】
上記で得たペプチド原液に活性炭を１％Ｗ／Ｖ加え、３０℃で６０分間攪拌した後濾過して濾液を得た。これを常法にしたがって減圧濃縮（２０℃）した後、常法にしたがってＵＨＴＳＴ殺菌を行って、α−１０００（液体）製品を得、これを更に常法にしたがって噴霧乾燥して粒径６０メッシュのα−１０００（粉末）製品を得、それぞれこれらの製品は冷凍保管した。
【００６０】
（実施例２：ペプチドＹ−２の製造１）
イワシ肉を０．７％アルカラーゼで１７．５時間分解処理し、得られた水解物をＯＤＳカラムに供し、水溶出画分の後半部分と次に行った１５％エタノール溶出画分とを合し、この画分をペプチドＹ−２とした。ペプチドＹ−２にはＶＹが１５０ｍｇ／１００ｇ含有されていた。
【００６１】
（実施例３：ペプチドＹ−２の製造２）
実施例１で製造したイワシペプチドα−１０００（液体）８００ｍｌ（Ｂｒｉｘ４５、たんぱく質含量２９．６％）に２６．２Ｌの脱イオン水を加え、これをＯＤＳ樹脂（ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱ１２０−Ｓ５０）カラム（１．５×５０ｃｍ）に流してペプチドを吸着させ、脱イオン水で洗滌し、次に、０％、１０％、２５％、５０％、９９．５％のエタノール水溶液２７Ｌを用いて順次溶出してそれぞれＹ−１、Ｙ−２、Ｙ−３、Ｙ−４、Ｙ−５の画分を得た。このうちＹ−２画分を、４０℃で濃縮してエタノールを除去し、凍結乾燥してイワシ精製ペプチド（Ｙ−２）を得た。このＹ−２画分にはＶＹがα−１０００の約２〜３倍含有されていた。
【００６２】
（実施例４：ペプチドＳＹの製造）
実施例１で製造したイワシペプチドα−１０００（粉末）５ｇを５００ｍｌの脱イオン水で溶解して原液とし、疎水性吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７（三菱化学（株）製）カラム（３．５×１３ｃｍ）に流してカラムをα−１０００溶液で満たし（原液負荷）、次に、図１１の溶出パターンにしたがい、水、１５％エタノール水溶液、次いで水、各５００ｍｌを加えて、図１１におけるサーデンペプチドＳＹの全画分、即ち、水溶出（１）の後画分、１５％エタノール溶出画分、水溶出（２）画分を分取混合し、凍結乾燥し、ペプチドＳＹ（粉末）２．１ｇを得た。ペプチドＳＹのＮａ含量は１．４５Ｗ／Ｗ％であった。（原子吸光光度法による）
【００６３】
（実施例５：ペプチドＳＹ−ＭＤの製造）
実施例１で得られたペプチドα−１０００（粉末）５ｇを５００ｍｌの脱イオン水で溶解して原液とし、疎水性吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７（三菱化学（株）製）カラム（３．５×１３ｃｍ）に流してカラムをα−１０００溶液で満たし（原液負荷）、図１１の溶出パターンに示されたサーデンペプチドＳＹの全画分のうち、１５％エタノール溶出画分のみを単離分取し、これを凍結乾燥し、ペプチドＳＹ−ＭＤ（粉末）１．７ｇを得た。ペプチドＳＹ−ＭＤのＮａ含量は０．１２４Ｗ／Ｗ％であった。（原子吸光光度法による）
【００６４】
（実施例６：ドリンクの製造）
―――――――――――――――――――――――
１００ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖        ４．５ｇ
糖アルコール            １ｇ
酸味料                  ０．２ｇ
香料                    ０．１３ｇ
甘味料（ステビア）      ０．０３ｇ
カラメル色素            ０．０２ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）    ０．５ｇ
（実施例４で得た）
精製水              全量を１００ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
５０ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖      １０ｇ
香料                    ０．３ｇ
酸味料                  ０．１６ｇ
甘味料（ステビア）      ０．０１５ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）    ０．５ｇ
（実施例４で得た）
精製水              全量を５０ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
３０ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖        ５ｇ
香料                    ０．２５ｇ
酸味料                  ０．１ｇ
甘味料（ステビア）      ０．０１５ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）    ０．５ｇ
（実施例４で得た）
精製水              全量を３０ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
【００６５】
上記配合を６０℃で混合溶解した後、１２８℃、１０秒のプレート殺菌をした。次いでこれを充分に洗浄した１００ｍｌ、５０ｍｌ、３０ｍｌの各容量褐色ビンに９０℃で充填し、室温で放冷後、流水水槽中で急冷し、ドリンクを製造した。
【００６６】
（実施例７：錠剤の製造）
次の配合により錠剤を製造した。
実施例４で得たペプチドＳＹ（粉末）５００ｇ、還元麦芽糖水飴３５６ｇ、結晶セルロース１００ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４０ｇ、甘味料（ステビア）４ｇを混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して素錠（２５０ｍｇ×４０００個）を作製した。この素錠に、１錠当たり７．５ｍｇのセラック溶液をコーティングし、４錠当たりペプチドＳＹ（粉末）を５００ｍｇ含有する錠剤４０００個を製造した。
【００６７】
上記と同様にして、実施例１で得たペプチドα−１０００、実施例２、３で得たペプチドＹ−２、実施例５で得たペプチドＳＹ−ＭＤを用い、ドリンク及び錠剤を製造した。
【００６８】
（実施例８：カルシウムチャンネル阻害試験）
細胞としては、正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ、Ｃｒｙｏ  ＡＯＳＭＣ：三光純薬（株））を用い、ＶＹとしては化学合成したバリル−チロシンを用いて、ＶＹによるカルシウムチャンネル阻害作用を確認した。
【００６９】
ｉ）ＶＳＭＣに対するＶＹの影響
１×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＶＳＭＣを無血清培地で２４時間前培養し、５％ＦＢＳ、１％ｈＥＧＦ、１％ｈＥＧＦ−βを含む培地に移してＶＹを０、５０、１００μＭ濃度となるように添加し、ＣＯ2インキュベータ内、３７℃で５日間培養した。これをＴｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅで染色して血球計測盤にて生細胞を数えた。結果をグラフ化したものが図１２（５％ＦＢＳ存在下におけるＶＹの添加効果）である。その結果、添加するＶＹ濃度に比例して細胞増殖が抑制されることがわかった。
【００７０】
そこで、ＶＹの毒性をチェックするために、ＶＳＭＣを無血清培地で２４時間９６ｗｅｌｌプレートで前培養し、そこにＶＹを０ｍＭ、１ｍＭ添加し４８時間培養した。そこに１０μＭ  ＷＳＴ−８（２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）を含む溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、同人化学（株））を加えてＣＯ2インキュベータ内、３７℃で３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量を４５０ｎｍの吸光度で測定して、ＤＮＡ合成量から細胞増殖を測定した。結果をグラフ化したものが図１３（ＶＹ毒性試験）である。その結果、それぞれの細胞増殖に差はなく、ＶＹには毒性がないことが示された。
【００７１】
ii）Ａｎｇ  II刺激に対するＶＹの影響
ＶＳＭＣはその培養液にＡｎｇ  IIを添加することにより、細胞増殖が促進される。これは、Ａｎｇ  IIがＶＳＭＣ表面に存在するＡＴ１レセプターに結合し、その結合シグナルが細胞内を流れ、結果的にカルシウムチャンネルが開きカルシウムイオンが細胞内に流入するためであることが知られている。この仕組みを利用し以下の試験を実施した。
【００７２】
ＶＳＭＣを無血清培地で２４時間９６ｗｅｌｌプレートで前培養し、コントロールとして添加無し、Ａｎｇ  IIのみを１μＭ濃度に添加（Ａｎｇ  II（＋））、Ａｎｇ  II  １μＭとＶＹ  １ｍＭ（Ａｎｇ  II（＋）ＶＹ（＋））濃度に添加した３種を４８時間培養した。そこに１０μＭ  ＷＳＴ−８を加えてＣＯ2インキュベータ内、３７℃で３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量を４５０ｎｍの吸光度で測定して、ＤＮＡ合成量から細胞増殖を測定した。結果をグラフ化したものが図１４（Ａｎｇ  II刺激に対するＶＹの効果）である。その結果、Ａｎｇ  II（＋）で増殖が強く促進され、Ａｎｇ  II（＋）ＶＹ（＋）では細胞増殖が促進されず、ＶＹがＡｎｇ  II刺激によるＶＳＭＣ増殖に対する抑制効果を有することが示された。
【００７３】
また、同じ方法で添加するＶＹの濃度を、０μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭとしたときの細胞増殖を測定した。すなわちＶＳＭＣを無血清培地で２４時間９６ｗｅｌｌプレートで前培養し、コントロールとして添加無し、Ａｎｇ  IIを１μＭ濃度に添加し、さらにＶＹを０μｍ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ濃度に添加した計６種を４８時間培養した。そこに１０μＭ  ＷＳＴ−８を加えてＣＯ2インキュベータ内、３７℃で３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量を４５０ｎｍの吸光度で測定して、ＤＮＡ合成量から細胞増殖を測定した。結果をグラフ化したものが図１５（Ａｎｇ  II刺激によるＶＳＭＣ増殖に対するＶＹ濃度依存性）である。その結果、ＶＹは濃度依存的にＡｎｇ  II刺激によるＶＳＭＣ増殖に対する抑制効果を有することが示された。
【００７４】
ＶＳＭＣを無血清培地で２４時間９６ｗｅｌｌプレートで前培養し、そこにＡＣＥ阻害薬であるｃａｐｔｏｐｒｉｌを１μＭ添加し４８時間培養した。そこに１０μＭ  ＷＳＴ−８を加えて３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量を４５０ｎｍの吸光度で測定して、ＤＮＡ合成量から細胞増殖を測定した。結果をグラフ化したものが図１６（Ａｎｇ  II刺激に対するＡＣＥ阻害薬の影響）である。その結果、ＣａｐｔｏｐｒｉｌはＡｎｇ  II刺激抑制効果を示さなかった。
【００７５】
これらの結果から、ＶＹが示すＡｎｇ  II刺激抑制効果はＡＣＥ阻害活性によるものではないことが明らかとなった。
【００７６】
iii）Ａｎｇ  IIレセプターに対するＶＹの影響
ＶＳＭＣの表面に存在するＡｎｇ  IIレセプターＡＴ１に対するＶＹの影響を検討した。すなわち、ＶＳＭＣを無血清培地で２４時間９６ｗｅｌｌプレートで前培養し、Ａｎｇ  IIを１μＭ濃度に添加、またはＡｎｇ  IIアンタゴニストであるｓａｒａｌａｓｉｎを１０μＭ濃度に添加、またはＡｎｇ  IIとｓａｒａｌａｓｉｎをそれぞれ１μＭ濃度に添加、またはＡｎｇ  IIとｓａｒａｌａｓｉｎをそれぞれ１μＭとＶＹを１ｍＭ濃度に添加し、４８時間培養した。そこに１０μＭ  ＷＳＴ−８を加えてＣＯ2インキュベータ内、３７℃で３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量を４５０ｎｍの吸光度で測定して、ＤＮＡ合成量から細胞増殖を測定した。結果をグラフ化したものが図１７   （Ａｎｇ  II刺激に対するＶＹ及びｓａｒａｌａｓｉｎ（Ａｎｇ  IIアンタゴニスト）の影響）である。その結果、ｓａｒａｌａｓｉｎを添加した場合でも、Ａｎｇ  IIほどではないが細胞増殖を促進し、Ａｎｇ  IIとｓａｒａｌａｓｉｎ両方を添加した場合はｓａｒａｌａｓｉｎが競合阻害作用を示してｓａｒａｌａｓｉｎ単独の場合より増殖促進効果が弱まっていた。そしてＡｎｇ  II及びｓａｒａｌａｓｉｎ及びＶＹを培養液に添加すると増殖促進効果は見られず、ＶＹの示すＡｎｇ  II刺激抑制効果はＡｎｇ  IIのレセプターに対する阻害でないこともわかった。
【００７７】
iv）カルシウムチャンネルアゴニスト刺激に対するＶＹの影響
細胞増殖促進効果を示すＡｎｇ  II刺激の下流になるカルシウムイオンの流入について検討した。すなわち、ＶＳＭＣを無血清培地で２４時間９６ｗｅｌｌプレートで前培養し、カルシウムチャンネルアゴニストであるＢａｙ  Ｋ  ８６４４を１μＭ濃度に添加、またはＢａｙ  Ｋ  ８６４４とカルシウムチャンネル阻害剤であるＶｅｒａｐａｍｉｌそれぞれを１μＭ濃度に添加、またはＢａｙ  Ｋ  ８６４４を１μＭとＶＹを１ｍＭ濃度に添加し、４８時間培養した。そこに１０μＭ  ＷＳＴ−８を加えてＣＯ2インキュベータ内、３７℃で３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量を４５０ｎｍの吸光度で測定して、ＤＮＡ合成量から細胞増殖を測定した。結果をグラフ化したものが図１８（Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｃａ++チャンネルアゴニスト）刺激に対するＶＹの影響）である。その結果、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４により細胞増殖は促進され、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４とＶｅｒａｐａｍｉｌをそれぞれ添加すると細胞増殖促進活性が抑制され、そしてＢａｙ  Ｋ  ８６４４とＶＹを添加するとＶｅｒａｐａｍｉｌ添加時と同様に細胞増殖促進活性が抑制されることが示された。
【００７８】
また、同じ方法でＢａｙ  Ｋ  ８６４４を１μＭと同時に添加するＶＹの濃度０、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭとしたときの細胞増殖を測定した。すなわち、ＶＳＭＣを無血清培地で２４時間９６ｗｅｌｌプレートで前培養し、コントロールとして添加無し、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を１μＭと同時にＶＹを０、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ濃度になるように添加し、４８時間培養した。そこに１０μＭ  ＷＳＴ−８を加えてＣＯ2インキュベータ内、３７℃で３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量を４５０ｎｍの吸光度で測定して、ＤＮＡ合成量から細胞増殖を測定した。結果をグラフ化したものが図１９（Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４刺激に対するＶＹの濃度依存性）である。その結果、ＶＹは濃度依存的にＢａｙ  Ｋ  ８６４４刺激によるＶＳＭＣ増殖に対する抑制効果を持つカルシウムチャンネル阻害剤であることが示された。
【００７９】
v）結論
よって、ＶＹが示すＡｎｇ  II刺激によるＶＳＭＣ増殖に対する抑制効果はカルシウムチャンネル阻害によるものであることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ペプチドα−１０００の赤外線吸収スペクトルを示す。
【図２】ペプチドα−１０００の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図３】ペプチドＹ−２のゲル濾過による分子量分布を示す。
【図４】ペプチドＹ−２の赤外線吸収スペクトルを示す。
【図５】ペプチドＹ−２の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図６】ペプチドＳＹの分子量を示す。
【図７】ペプチドＳＹの赤外線吸収スペクトルを示す。
【図８】ペプチドＳＹの紫外線吸収スペクトルを示す。
【図９】ペプチドＳＹ−ＭＤの赤外線吸収スペクトルを示す。
【図１０】ペプチドＳＹ−ＭＤの紫外線吸収スペクトルを示す。
【図１１】ペプチドＳＹ、ＳＹ−ＭＤの溶出パターンのグラフである。
【図１２】５％ＦＢＳ存在下におけるＶＹの添加効果を示す。
【図１３】ＶＹ毒性試験の結果を示す。
【図１４】Ａｎｇ  II刺激に対するＶＹの効果を示す。
【図１５】Ａｎｇ  II刺激に対するＶＳＭＣ増殖に対するＶＹ濃度依存性を示す。
【図１６】Ａｎｇ  II刺激に対するＡＣＥ阻害薬の影響を示す。
【図１７】Ａｎｇ  II刺激に対するＶＹ及びｓａｒａｌａｓｉｎ（Ａｎｇ  IIアンタゴニスト）の影響を示す。
【図１８】Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｃａ++チャンネルアゴニスト）刺激に対するＶＹの影響を示す。
【図１９】Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４刺激に対するＶＹの濃度依存性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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