(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｇタンパク質結合受容体のサブファミリーを形成する微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で、且つ選択的であるフィンガープリント配列を提供する。【解決手段】Ｇタンパク質結合受容体のサブファミリーを形成する微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で、且つ選択的であるフィンガープリント配列を提供する。また、本ファミリーのメンバーとして同定された新規のヒトのポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、並びに新規のファミリーメンバーを含むベクター及び宿主細胞も提供する。さらに、ＴＡＡＲを同定する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５を含む単離された又は組換えのポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドの薬剤標的としての使用。
【請求項３】
統合失調症の治療における薬剤標的としての請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４】
偏頭痛の治療における薬剤標的としての請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５】
うつ病の治療における薬剤標的としての請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項６】
摂食障害の治療における薬剤標的としての請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項７】
注意欠陥多動性障害の治療に有用な化合物を同定するための薬剤標的としての請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
配列番号４を含む単離された又は組換えのポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
Ｘがいずれかの天然アミノ酸である、配列ＮＳＸＸＮＰＸＸＹＸＸＸＹＸＷＦを含むフィンガープリントモチーフ。
【請求項１３】
ＴＡＡＲを同定するための、請求項１２に記載のフィンガープリントモチーフを含む配列の使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載のフィンガープリントモチーフを含み、且つ、配列番号３、１３、１５、１８、２０の配列とは異なる配列を含む、単離された又は組換えのポリペプチド。
【請求項１５】
薬剤標的としての請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
統合失調症の治療に有用な化合物を同定するための、薬剤標的としての請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
偏頭痛の治療に有用な化合物を同定するための、薬剤標的としての請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
うつ病の治療に有用な化合物を同定するための、薬剤標的としての請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
摂食障害の治療に有用な化合物を同定するための、薬剤標的としての請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
注意欠陥多動性障害の治療に有用な化合物を同定するための、薬剤標的としての請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ａ）請求項１又は１４に記載のポリペプチドを候補化合物に接触させること、及び
ｂ）化合物が前記ポリペプチドに結合するかどうかを決定すること
を含む、請求項１又は１４に記載のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法。
【請求項２２】
ａ）請求項１又は１４に記載のポリペプチドを候補化合物に接触させること、及び
ｂ）前記化合物が前記ポリペプチドの機能又は活性を調節したかどうかを決定すること
を含む、請求項１又は１４に記載のポリペプチドの生物活性に対する刺激性又は抑制性の効果を有する化合物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質結合受容体のサブファミリーを形成する微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で、且つ選択的であるフィンガープリント配列を提供する。本発明はまた、本ファミリーのメンバーとして同定されたヒトのポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、並びに新規のファミリーメンバーを含むベクター、宿主細胞、及び非ヒト動物も提供する。さらに、本発明は、ヒトのＴＡＡＲを同定する方法を提供する。
【０００２】
微量アミン類（ＴＡ）は、構造的には生体アミン類に関連する内因性の化合物であり、哺乳類の神経系において微量に見い出される。ＴＡは神経終末に保存され、古典的な生体アミンと共に放出される。今日まで、独占的な伝達物質としてＴＡを使用するシナプスの存在についての証拠はない。最近、微量アミンを特異的に結合する受容体がBorowskiら（微量アミン：哺乳類のＧタンパク質結合受容体のファミリーの同定、Proc. Natl. Acad. Sci. USA:98(16):8966-71, 2001）及びBunzowら（アンフェタミン、３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン、リセルグ酸ジエチルアミド、及びカテコールアミン神経伝達物質の代謝産物は、ラットの微量アミン受容体のアゴニストである、Mol. Pharmacol.,60(6):1181-8, 2001）により報告された。これらの受容体は明らかに新規のＧＰＣＲファミリーを表している。
【０００３】
微量アミンの調節障害は、うつ病（Sandler, M.ら、うつ病における遊離フェニル酢酸の脳脊髄液濃度の低下、Clin. Chim. Acta., 93(1):169-71, 1979; Davis BA 及びBoulton AA, うつ病における微量アミン及びその酸性代謝産物−概説、Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 18(1):17-45, 1994）、統合失調症（Potkin SGら、妄想型慢性統合失調症におけるフェニルエチルアミン、Science 206(4417):470-1, 1979; Sandler M.及びReynolds GP.、フェニルエチルアミンは統合失調症を起こすか？Lancet, 1(7950):70-1, 1976）、及び双極性障害（Boulton AA、基礎精神薬理学の幾つかの側面：微量アミン、Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 6(4-6):563-70, 1982; Sabelli HCら、ＫＭ／２９．０４．２００５における臨床試験、情動障害のフェニルエチルアミン仮説：尿及び血液のフェニル酢酸及びフェニルアラニンの食事補助剤、J. Clin. Psychiatry 47:(2):66-70, Feb, 1986）のような種々の精神医学的障害に関連していた。微量アミンの調節障害と、注意欠陥多動性障害との間（Baker et al., 注意欠陥障害におけるフェニルエチルアミン作動性のメカニズム。Biol. Psychiatry 29(1):15-22, 1991）、パーキンソン病との間（Heller B & Fischer E., パーキンソン病患者の尿におけるフェネチルアミンの低下。Arzneimittelforschung 23(6):884-6, 1973）、偏頭痛との間（D'Andrea G. et al., 定義しにくいアミンと原発性頭痛：歴史的背景及び予想。Neurol. Sci., Suppl., 2:S65-7, 2003; D'Andrea G. et al., 原発性頭痛における高レベルの循環微量アミン。Neurology 62(10):1701-1705, 2004）、及び摂食障害との間（Wolf ME &Mosnaim AD, 神経精神医学的障害におけるフェニルエチルアミン。Gen pharmacol., 14(4):385-90, 1983; Branchek TA & Blackburn TP, 新規治療法のための標的としての微量アミン受容体：伝説的神話及び戦術。Curr. Opin. Pharmacol., 3(1):90-97, 2003）、たとえば、すなわち、ＰＥＡと、今日までに知られている最強の摂食障害化合物とみなされるアンフェタミンとの間の極めて類似した構造により示唆されるような肥満及び拒食症との間（Samanin R & Garattini S: 摂食障害薬の作用の神経化学的メカニズム。Pharmacol. Toxicol., 73(2):63-8, 1993 Aug; Popplewell DA et al., フェニルエチルアミン誘発性拒食症及び活動亢進の行動的及び薬理学的検討−アンフェタミンとの比較。Pharmacol. Biochem. Behav., 25(4):711-6, 1986, Oct）もまた関連付けられている。
【０００４】
従って、微量アミンの受容体に関する知識を増やすことに、特にさらなる微量アミンの受容体を同定することに幅広い関心がある。しかしながら、文献や公的データベースでの検討では、ＴＡ受容体の命名に矛盾が示され、たとえば、ヒト受容体ＧＰＲ１０２（Lee et al., １０個の新規のＧタンパク質結合受容体遺伝子の発見及びマッピング。Gene 275(1):83-91, 2001）は、ＴＡ５（Borowski et al., 微量アミン：哺乳類のＧタンパク質結合受容体のファミリーの同定。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(16):8966-71, 2001）とも呼ばれ、ヒト５−ＨＴ４Ψ（Liu et al., ヒトにおけるセロトニン−４受容体様偽遺伝子。Brain Res. Mol. Brain Res., 53(1-2):98-103, 1998）は、ＴＡ２Ψ（Borowski et al.,  微量アミン：哺乳類のＧタンパク質結合受容体のファミリーの同定。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(16):8966-71, 2001）とも呼ばれる。さらに、ＧＰＲ５７（Lee et al., Ｇタンパク質結合受容体ファミリーの追加メンバーのクローニング及び性状分析。Biochem Biophys Acta., 1490(3):311-23, 2000）、ＧＰＲ５８（Lee et al., Ｇタンパク質結合受容体ファミリーの追加メンバーのクローニング及び性状分析。Biochem Biophys Acta., 1490(3):311-23, 2000）、及びＰＮＲ（Zeng et al., 骨格筋及び脳に発現される推定上のヒト神経伝達物質受容体のクローニング。Biochem. Biophys. Res. Commun., 242(3):575-8, 1998）は、今のところ一般的にはＴＡ受容体として認識されていない。この不一致によって混乱と不確実性が生じる。従って、本受容体ファミリーの明瞭な定義に対する強いニーズがある。
【０００５】
現在の命名の曖昧さを解消するために、これらの受容体を微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）と呼ぶ、新規の統一した命名法を本発明とともに提案する。この新規の命名法は、少なくとも一部のＴＡＡＲがＴＡと全く応答しないという知見を反映して、用語「関連」を反映させる。それは、このＧＰＣＲファミリーの受容体すべてを網羅し、様々な種における様々な数の受容体遺伝子に適合する。新規の命名法は、ヒトの各染色体上における受容体遺伝子の順序（図１を参照のこと）と共に異なった種にまたがる受容体遺伝子の詳細な系統発生の解析（図３）に厳密に基づく。命名法は以下の規則を堅持する。
【０００６】
ａ）オルソログである、すなわち、種分化を通じて生じた任意の２つ（又は３つ）の遺伝子は、同一番号で標識されるべきである。逆もまた同様に、２つの遺伝子は、それらがオルソログでなければ同一番号を有してはならない。
【０００７】
ｂ）パラログである、すなわち、１つの種の系統内で遺伝子重複によって生じた遺伝子は接尾文字によって区別されるべきである。
【０００８】
ｃ）例：遺伝子ｈＴＡＡＲ５、ｒＴＡＡＲ５、及びｍＴＡＡＲ５はすべてオルソログである。マウスにおける遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、及びｃはパラログである。遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、及びｃは、ｈＴＡＡＲ８に対してすべてオルソログである。
【０００９】
本発明は、ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定された新規のポリペプチド、前記ポリペプチドの薬剤標的としての使用、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、並びに前記ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、及び非ヒト動物を提供する。さらに、本発明は、ＴＡＡＲファミリーに特異的で且つ選択的なフィンガープリントモチーフ及びその使用に関する。
【００１０】
本発明は、Ｘが天然のアミノ酸である配列、ＮＳＸＸＮＰＸＸＹＸＸＸＹＸＷＦ（配列番号１）を含むフィンガープリントモチーフを提供する。本明細書で使用されるとき、用語「フィンガープリント」「フィンガープリントモチーフ」又は「フィンガープリント配列」は、ヒトＧＰＣＲサブファミリーＴＡＡＲに特異的で且つ選択的であるアミノ酸配列に関する。好ましくは、フィンガープリントモチーフは機能的ＴＡＡＲに特異的である。このＴＡＡＲフィンガープリントモチーフは予測された膜貫通ドメイン７と広く重なり合う。
【００１１】
フィンガープリントモチーフに関してトリプトファン残基はＴＡＡＲに専ら見い出され、そのほかのいかなる既知のＧＰＣＲに見い出されず；むしろ、対応する配列の位置は、そのほかのＧＰＣＲではほとんど常に極性又は荷電したアミノ酸によって占有されている。ＴＡＡＲを同定するのに、好ましくは機能的ＴＡＡＲを同定するのにフィンガープリントモチーフを用いてもよい。
【００１２】
本発明はまた、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いてヒトのＴＡＡＲを同定する方法も提供する。ヒトのＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるには、ポリペプチドは１００％の同一性を有してもよい。
【００１３】
さらに、本発明は、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いて、他の種の、好ましくは哺乳類のＴＡＡＲを同定する方法に関する。ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるには、ポリペプチドはフィンガープリント配列との少なくとも７５％の同一性、好ましくは８７％を超える同一性、さらに好ましくは１００％の同一性を有してもよい。好ましくは、フィンガープリントモチーフはチロシンを変えるので、フィンガープリント配列はラットでは、ＮＳＸＸＮＰＸＸ［Ｙ，Ｈ］ＸＸＸＹＸＷＦであり、マウスでは、ＮＳＸＸＮＰＸＸ［Ｙ，Ｈ］ＸＸＸ［Ｙ，Ｆ］ＸＷＦである。
【００１４】
フィンガープリント配列は、配列データベースで検索を行う「クエリー配列」として、たとえば、ＴＡＡＲファミリーのメンバーを同定するために配列データベースで検索を行う「クエリー配列」として使用してもよい。そのような検索はたとえば、EMBOSSのfuzzpro（Rice et al., EMBOSS：欧州の分子生物学オープンソフトウエア一式。Trends in Genetics, 16(6):276-277, 2000）としてのパターン認識プログラムを用いて行うことができる。ヒトＴＡＡＲの検索は、fuzzpro、要求配列としてのＮＳＸＸＮＰＸＸＹＸＸＸＹＸＷＦ、ミスマッチの数＝０、データベース＝swissprot（リリース４３）によって実施してもよい。
【００１５】
ヒトのＴＡＡＲファミリーは９つのメンバー（ｈＴＡＡＲ１〜ｈＴＡＡＲ９）を含有し、そのうち３つは偽遺伝子：ｈＴＡＡＲ３Ψ、ｈＴＡＡＲ４Ψ、及びｈＴＡＡＲ７Ψである。ヒトのＴＡＡＲファミリーメンバーをコードする遺伝子はすべて第６染色体の同一領域（６ｑ２３）に位置している。２つのエクソンにコードされるｈＴＡＡＲ２を除いて、すべてのＴＡＡＲ遺伝子のコード配列は単一エクソンに位置する。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意の断片を言う。遺伝子は、特異的機能的産物をコードする、特定の染色体上の特定の位置にあるヌクレオチドの規則正しい配列である。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、用語「偽遺伝子」は、活性のある祖先遺伝子から突然変異によって進化してもよい不活性の遺伝子に関する。
【００１８】
本発明は、配列番号５の配列を含む単離された又は組換えのポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）として同定され、ｈＴＡＡＲ２と命名された。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド配列」（たとえば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなど）は、天然に存在するアミノ酸を含むアミノ酸の重合体に関する。
【００２０】
本発明はさらに、ポリペプチドｈＴＡＡＲ２をコードする配列番号４を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド配列」（たとえば、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇを含むヌクレオチドの重合体に関する。
【００２２】
用語「単離された」は、天然の状態から「ヒトの手によって」変えられたことを意味する。「単離された」組成物又は物質が天然に存在するのであれば、元々の環境から変えられる又は取り除かれる、或いはその双方である。たとえば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の状態の共存する物質から分離された同一のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、用語が本明細書で採用されるとおり「単離」されている。
【００２３】
例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関連して使用される場合、用語「組換え」は、典型的には、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドが異種（又は外来）の核酸を導入すること若しくは天然の核酸を変えることによって改変されていることを示すか、又はタンパク質若しくはポリペプチドが異種アミノ酸の導入によって改変されていることを示す。
【００２４】
本発明はまた、配列番号１６の配列を含むポリヌクレオチドも提供する。前記ポリヌクレオチドは、微量アミン関連受容体の遺伝子断片として同定され、ｈＴＡＡＲ７Ψｆと命名された。
【００２５】
ＴＡＡＲファミリーのそのほかのメンバー（ｈＴＡＡＲ１、ｈＴＡＡＲ３、ｈＴＡＡＲ４、ｈＴＡＡＲ５、ｈＴＡＡＲ６、ｈＴＡＡＲ８及びｈＴＡＡＲ９）は以前記載されている（Borowski et al., 微量アミン：哺乳類のＧタンパク質受容体のファミリーの同定。Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(16):8966-71, 2001）が、公表された配列は細かい間違いがある（表１を参照のこと）。本発明はまた、ｈＴＡＡＲ１（配列番号２）、ｈＴＡＡＲ３Ψ（配列番号６）、ｈＴＡＡＲ４Ψ（配列番号９）、及びｈＴＡＡＲ５（配列番号１２）の正確なポリヌクレオチド配列を提供する。本発明はさらにｈＴＡＡＲ１（配列番号３）及びｈＴＡＡＲ５（配列番号１３）の正確なアミノ酸配列に関する。
【００２６】
本発明はまた、ｈＴＡＡＲ３Ψ（配列番号７）及びｈＴＡＡＲ４Ψ（配列番号１０）の修復されたヌクレオチド配列を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｈＴＡＡＲ３（配列番号８）及びｈＴＡＡＲ４（配列番号１１）によりコードされるポリヌクレオチド配列を提供する。本明細書で使用されるとき、用語「修復された遺伝子」又は「修理された遺伝子」は遺伝子が活性を持つように配列が変更された偽遺伝子に関する。ｈＴＡＡＲ３のポリヌクレオチド配列は早期終結コドンを生じる突然変異のために不活性である。１３３〜１３４位に２つのヌクレオチドを挿入することによって配列を修復した（図４を参照のこと）。
【００２７】
本発明はまた、フィンガープリント配列を含み且つ配列番号３、１３、１５、１８、２０の配列と異なるアミノ酸配列を含む、単離された又は組換えのポリペプチドも提供する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、薬剤標的としての本発明のポリペプチドの使用に関する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、うつ病の治療、統合失調症の治療、偏頭痛の治療、あるいは注意欠陥多動性障害の治療又は拒食症若しくは肥満のような摂食障害の治療に有用な化合物を同定するための薬剤標的として使用される。薬剤標的は、医薬的に活性のある化合物の設計、スクリーニング、及び開発に好適であり得る。
【００２９】
本発明の実施形態の１つは、薬剤標的としての配列番号５のポリペプチド配列を有するポリペプチドに関する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、うつ病の治療、統合失調症の治療、偏頭痛の治療、あるいは注意欠陥多動性障害の治療又は拒食症若しくは肥満のような摂食障害の治療に有用な化合物を同定するための薬剤標的として使用される。
【００３０】
本発明のもう１つの実施形態は、フィンガープリント配列を含み且つ配列番号３、１３、１５、１８、２０の配列とは異なるアミノ酸配列を薬剤標的として有する受容体に関する。好ましくは、これらの受容体は、うつ病の治療、統合失調症の治療、偏頭痛の治療、あるいは注意欠陥多動性障害の治療又は拒食症若しくは肥満のような摂食障害の治療に有用な化合物を同定するための薬剤標的である。
【００３１】
用語「本発明のポリペプチド」は、本発明で提供される新規のポリペプチド、すなわち、ｈＴＡＡＲ２に関する。
【００３２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターにより形質導入された宿主細胞、及び組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。好ましくは、ベクターは配列番号４を含むポリヌクレオチドを含み、好ましくは、宿主細胞は前記ベクターにより形質導入される。
【００３３】
宿主細胞は、遺伝学的に操作（すなわち、形質導入、形質転換又はトランスフェクト）されて本発明のポリヌクレオチドのための発現系又はその一部を組み入れることができる。ベクターの宿主細胞への導入は、たとえば、Davis et al., 分子生物学における基礎的な方法、(David JM ed., 1986)：基礎的細胞培養、第２版、オックスフォード大学出版、２００２年、ＩＳＢＮ：０１９９６３８５３５；R. Ian Freshney, 動物細胞の培養：基礎的技法のマニュアル、第４版、John Wiley  & Sons (Sd) 1999, ＩＳＢＮ：０４７１３３２８５２、及びSambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y., 1989などの多数の標準的な実験室マニュアルに記載されている方法、たとえば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、トランスベクチン（transvectin）、微量注入、カチオン性脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は感染によって達成することができる。
【００３４】
宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａのような哺乳類細胞；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＰＣ１２、ＨＮ−１０（Lee HJ, Hammond DN, Large TH, Roback JD, Sim JA, Brown DA, Otten UH, Wainer BH, 胎児マウス及び若齢成熟マウスの不死化海馬細胞の神経特性及び栄養活性。J. Neurosci., 10(6):1779-87, 1990、６月）、ＩＭＲ−３２、ＮＢ４１Ａ３、ニューロ−２ａ、ＴＥ６７１、ラット若しくはマウスのような哺乳類の一次神経細胞若しくはグリア細胞のような神経細胞株、神経内分泌細胞株、神経芽細胞腫細胞株、若しくはグリア細胞株；アフリカツメガエルの卵母細胞；ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトマイセス、及び枯草菌のような細菌細胞；サッカロマイセス・セレビシアエ及びアスペルギルス細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；並びに植物細胞であってもよい。
【００３５】
多種多様の発現系を使用することができる。そのような発現系として、とりわけ、染色体、エピソーム、及びウイルスに由来する系、すなわち、細菌プラスミドに、バクテリオファージに、トランスポゾンに、酵母エピソームに、酵母の染色体要素に、ウイルスに、たとえば、バキュロウイルス、パポバウイルス、たとえばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスに由来するベクター、並びにこれらの組み合わせに由来するベクター、たとえば、プラスミド及びバクテリオファージの遺伝要素に由来するもの、たとえば、コスミドやファージミドが挙げられる。発現系は、発現を生じるとともにそれを調節する制御領域を含有していてもよい。一般に、宿主中でポリペプチドを生産するためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、又は発現させるのに好適ないかなる系又はベクターを使用してもよい。たとえば、Sambrook et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y., 1989又はBowosky et al., 2001（上記）に述べられているもののような多数の周知で日常的な技法によって適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入してもよい。
【００３６】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非ヒト動物をさらに提供する。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、配列番号４を含むポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
トランスジェニック非ヒト動物は、当該技術で既知のいかなる非ヒト動物であってもよい。好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は哺乳類であり、さらに好ましくはトランスジェニック非ヒト動物はげっ歯類である。最も好ましくは、本発明のトランスジェニック動物はマウスである。
【００３８】
トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法は、当該技術で周知であり、たとえば、Hogan BC, Lacy E, マウスの胎児の操作：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor laboratory Press, ニューヨーク, 1986; Hogan B. et al., マウス胎児の操作：第２版、Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor、1994、及びJoyner A(ed)：遺伝子ターゲティング−実用的アプローチ、第２版、実用的アプローチシリーズ、オックスフォード大学出版、１９９９年で述べられているようなものである。
【００３９】
本発明のポリペプチドは、受容体に結合し、本発明の受容体ポリペプチドの活性を活性化する（アゴニスト）又は阻害する（アンタゴニスト）化合物の、或いは受容体の機能を、たとえば、受容体の輸送に作用することによって調節する化合物のスクリーニング方法に採用されてもよい。
【００４０】
本発明は、
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物に接触させること、及び
ｂ）化合物が本発明のポリペプチドに結合するかどうかを決定すること
を含む、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物に接触させること、及び
ｂ）前記化合物が本発明のポリペプチドの機能又は活性を調節したかどうかを決定すること
を含む、本発明のポリペプチドの生物活性又はその発現に刺激作用又は阻害作用を有する化合物を同定する方法も提供する。
【００４２】
一般に、上述のようなそのようなスクリーニング手段には、本発明の受容体ポリペプチドを表面に発現する適切な細胞を作製することが含まれるが、適切な細胞で発現される受容体は、細胞内に局在してもよい。そのような細胞には、哺乳類、アフリカツメガエル、酵母、ショウジョウバエ、又は大腸菌の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。各細胞種に対する培養条件は特有であり、当該技術に精通するものには既知である。次いで、受容体を発現している細胞（又は発現された受容体を含有する細胞膜）を試験化合物に接触させて、結合又は機能的反応の刺激若しくは阻害を測定する。
【００４３】
スクリーニング技法の１つは、受容体の活性化により生じる細胞外ｐＨ又は細胞内カルシウムの変化を測定する系における、本発明の受容体を発現する細胞（たとえば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３）の使用を含む。この技法では、本発明の受容体ポリペプチドを発現する細胞に化合物を接触させてもよい。次いで、二次メッセンジャー応答、たとえば、シグナル伝達、ｐＨの変化、ＰＩ加水分解、ＧＴＰ−γ［３５Ｓ］の放出、又はカルシウムレベルの変化を測定し、可能性のある化合物が受容体を活性化するのか阻害するのかを決定する。
【００４４】
もう１つの方法は、受容体介在ｃＡＭＰ及び／又はアデニル酸シクラーゼの蓄積の阻害又は刺激を測定することにより受容体阻害剤をスクリーニングすることを含む。そのような方法には、本発明の受容体を真核細胞にトランスフェクトし、受容体を細胞表面に発現させることが含まれる。次いで、本発明の受容体の存在下、細胞を可能性のある拮抗剤にさらす。次いでｃＡＭＰの蓄積量を測定する。可能性のある拮抗剤が受容体を結合し、受容体の結合を阻害すれば、受容体介在ｃＡＭＰのレベル又はアデニル酸シクラーゼの活性は低下するか又は増加する。
【００４５】
本発明の受容体に対するアゴニスト又はアンタゴニストを検出する他の方法は、米国特許第５，４８２，８３５号に記載されているような技術に基づいた酵母である。
【００４６】
アッセイは単に候補化合物の結合を調べてもよく、その際、候補化合物に直接又は間接的に結合させた標識によって、或いは標識された競合物との競合を含むアッセイにおいて、受容体を持つ細胞への接着を検出する。さらに、これらのアッセイは、表面に受容体を持つ細胞に適した検出系を用いて、候補化合物が、受容体の活性化により生成されるシグナルを、結果的に生じるかどうかを調べてもよい。一般に、既知のアゴニストの存在下で活性化の阻害剤をアッセイし、アゴニストによる活性化に対する候補化合物の存在による影響を観察する。そのようなスクリーニング法を実施するための常法は当該技術でよく理解されている。
【００４７】
本発明のアンタゴニストの可能性のあるポリペプチドの例には、抗体、又は場合によっては、本発明のポリペプチドのリガンドに密接に関係するオリゴヌクレオチド若しくはタンパク質、たとえば、リガンドの断片、又は受容体に結合するが受容体の活性を阻害するような応答を引き出さない神経伝達物質若しくはアミノ酸の代謝産物などの低分子量分子が挙げられる。
【００４８】
今や本発明を一般的に記載してきたが、指示されない限り、説明のみを目的とし、限定することを目的としない具体的実施例を、以下の図面と併せて参照することにより、同様のことがさらによく理解されるであろう。
【００４９】
【表１】
2006051020.tif 000002
【００５０】
表１：微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）のための新しい命名法。
公表されている配列と本発明により提供された配列との間に矛盾が検出された遺伝子すべてに下線を引く。ジェンバンクの受入番号は、公表されている配列及び公表されている配列と本発明により提供された配列との間の矛盾を参照する。ヒトのゲノム又はｃＤＮＡ（全ヒト脳全ＲＮＡ由来、ストラタジーン）を用いて通常のプロトコールに従って、ＴＡＡＲ遺伝子のクローニング及び配列解析を行った（ｎｔ＝ヌクレオチド配列、ａａ＝アミノ酸配列）。
【実施例】
【００５１】
特に指示しない限り、実施例で言及する市販試薬は製造元の指示書に従って使用した。
【００５２】
実施例１：ＴＡＡＲファミリーメンバーの同定
ＢＬＡＳＴのような通常のアルゴリズムを用いて、ジェンバンクで（表１も参照のこと）利用可能なヒト、ラット、及びマウスのゲノム配列情報と、以前公表されたＴＡＡＲ受容体遺伝子とを比較することによってＴＡＡＲ遺伝子を同定した。
【００５３】
この配列情報に基づいて、各種のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＰＣＲによってＴＡＡＲ遺伝子を増幅した。さらに特定しなければ、すべての手順は基本的に、Sambrook J., Fritsch EF., & Maniatis T., 分子クローニング：実験室マニュアル（Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y., 1989）に記載されたように行った。試薬はすべて利用可能な最高の純度であり、溶液及び試薬は特に指示されない限り、使用前に滅菌した。
【００５４】
この目的で、ジェンバンクで利用可能なゲノム配列情報に由来するＴＡＡＲコード配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマー（表２）を設計した。アンプリコンがオープンリーディングフレーム全体を含有するようにプライマーを設計した。ベクターＮＴＩソフトウエア（ベクターＮＴＩバージョン９．０．０．、インフォーマックス）を用いて、ＰＣＲプライマーに対する標準ルール、主として：ａ）プライマーは１８〜２５ｎｔの長さを有するべきである；ｂ）約５０％のＧ／Ｃ含量；ｃ）３ｎｔより長い逆方向反復を含有すべきでない；ｄ）少なくとも５’末端にＧ又はＣを持つべきではない；ｅ）３を超えて同一ｎｔの単純な反復を有すべきでない；及びｆ）同一ＰＣＲ反応で使用されるプライマーのアニーリング温度(ＴＭ)はできるだけ差がないようにすべきである（詳細については、McPherson MJ., Hames BD., Taylor GR., (eds): ＰＣＲ２−実用的アプローチ。実用的アプローチシリーズ、オックスフォード大学出版、１９９５年、ＩＳＢＮ：０−１９−９６３４２４−６を参照のこと）に従ってプライマーを設計した。プライマーオリゴヌクレオチドのアニーリング温度は、Breslauer KJ., Frank R., Blocker H., Marky LA., 塩基配列からのＤＮＡ二本鎖の安定性の予測。Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(11):3746-50, 1986, June（これらのルールは、配列が対称ではなく、少なくとも１つのＧ又はＣを含有し、最低８ｎｔの長さを有することを前提とする）に記載されたルールに基づいて計算した。オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣ精製の品質でMicrosynth（Microsynth AG, Schutzenstrasse 15, 9436, Balgach, スイス）に注文した。
【００５５】
【表２】
2006051020.tif 000003
【００５６】
表２．ｈＴＡＡＲのクローニング用プライマー。
ｈＴＡＡＲ２：ｃＤＮＡからｈＴＡＡＲ２をクローニングする主な理由は、対応する遺伝子の転写産物が２つのエクソンを実際に含有しているかどうかを確認するためであった。これらの実験とは別に、２つのコードエクソンがゲノムＤＮＡから別々にクローニングされている（Ｔｍ：Breslauer KJ., Frank R., Blocker H., Marky LA., 塩基配列からのＤＮＡ二本鎖の安定性の予測。Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(11):3746-50, 1986, Juneに従って計算した℃における溶融温度；プライマー名における５は５’プライマーを指し、プライマー名における３は３’プライマーを指す。）。
【００５７】
実際のＰＣＲ反応は、全量５０μＬで以下の組成を有した：１００〜２００ｎｇの全ＲＮＡ（以下で特定する起源）と同等の５〜１００ｎｇのＤＮＡ又はｃＤＮＡに相当する鋳型、２００ｎＭのオリゴヌクレオチドプライマー、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（インビトロゲン），２００ｍＭの各ｄＮＴＰ（インビトロゲン）、１倍濃縮ＰＣＲ反応緩衝液（インビトロゲン）、及び５Ｕ／反応の組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロゲン）。ＰＣＲ反応は、無菌の作業ベンチ及びＵＶ照射器具のもとで行い、ａ）鋳型材料の調製、ｂ）ＰＣＲ反応の組立、ｃ）ＰＣＲ反応及びアガロースゲル電気泳動の実行、及びｄ）プラスミドの調製は、ＰＣＲで増幅した材料又はプラスミドＤＮＡと試薬とのコンタミネーションの可能性を回避するために、それぞれ、別の部屋で行った。ＰＣＲ反応はＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む２００μＬのＰＣＲ容器（エッペンドルフ）で室温にて組み立て、９５℃に予備加熱したサーモサイクラー（金のブロックを伴うGeneamp 9700, Applied Biosystems）に移した。温度プロフィールは以下のように調整した。
【００５８】
【表３】
2006051020.tif 000004
【００５９】
アニーリング温度：ＰＣＲ反応の低い方のＴｍ値（上で特定されたように計算した）を持つオリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ（溶融温度）−１℃をアニーリング温度として用いた。例：Ｔｍプライマー１＝５５℃、Ｔｍプライマー２＝５７℃の２つのプライマー⇒アニーリング温度５４℃。
【００６０】
アンプリコンの長さ（ｂｐ）ｘ１分により伸長時間を算出した。
【００６１】
サイクル数：各遺伝子について、２５〜４０の間のサイクル数で並行して幾つかのＰＣＲ反応を行った。続いてすべてのＰＣＲ反応をアガロースゲル電気泳動で分析し、正しいサイズの明瞭に見えるＰＣＲ産物を生じる最も少ないサイクル数のＰＣＲ反応をその後のクローニングに用いた。
【００６２】
ＴＡＥ緩衝液（インビトロゲン）で作製した１％ウルトラピュアアガロース（GibcoBRL) を用いたアガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分析した。標準のプロトコール（Sambrook et al., 1989）に従って、パーフェクトブルー水平ミニ電気泳動システム（Pequlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, ドイツ）でアガロースゲルを泳動させた。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶトランスイルミネータ（Syngene, 英国、ケンブリッジ）で視覚化し、１ｋｂのＤＮＡラダーの分子量標準（インビトロゲン）と比較して、ＰＣＲ産物のサイズを分析した。予想したサイズのＰＣＲ産物を、無菌の外科用メス（Bayaha, Tuttlingen, ドイツ）を用いてアガロースゲルから切り出し、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（QIAGEN AG, スイス、バーゼル）を用い製造元の指示書に従ってアガロースゲル断片から抽出した。
【００６３】
抽出したＰＣＲ産物を冷却エタノール／酢酸ナトリウム沈殿によって沈殿させ（Sambrook et al., 1989）、ＤＮＡペレットを１０μＬ容量の１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解させた。続いて、製造元の指示書に従って、配列決定のためのＴＯＰＯクローニングキット（インビトロゲン；ベクター、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ及びｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを含有するキットを用いた）を用いて、この溶液のＰＣＲ産物をクローニングした。製造元の指示書に従って、化学的コンピテント細菌ＴＯＰ１０（配列決定のためのＴＯＰＯクローニングキットに含まれる）に連結物を転換した後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Sigma, Division of FLUKA, Chemie GmbH, Buchs, スイス）を含有するＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃にて一晩インキュベートした。「ミニプレップＰＣＲ」と呼ばれる方法により細菌コロニーを分析した。すなわち、無菌の播種用白金耳（Copan Diagnostic S.P.A. Brescia, イタリア）でコロニーをつみとり、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する新しいＬＢ寒天プレートに移した。白金耳に残った細菌を溶液に移すために、続いて同じ播種用白金耳を１．５ｍＬのエッペンドルフ容器（エッペンドルフ）中の５０μＬの１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）に個々に移した。その後、この細菌溶液を順次９５℃にて５分間加熱し、５０μＬのＰＣＲ反応当たり１μＬの得られた細菌溶解物を、プラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｔ７及びＭ１３逆、配列：プライマー「Ｔ７」：５’−ｃｇｇｇａｔａｔｃａｃｔｃａｇｃａｔａａｔ−３’、プライマー「Ｍ１３逆」：５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃ−３’）のマルチクローニング部位に隣接したプライマーによるＰＣＲ反応の鋳型として用いた。上述のようにＰＣＲ反応を組み立て、以下の温度プロフィールで実行した。
【００６４】
【表４】
2006051020.tif 000005
【００６５】
上述のようにアガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を解析した。上で概説した方法により、予想されたサイズのクローニングされたＤＮＡ断片が検出された細菌コロニーを次のプラスミドの調製に用いた。
【００６６】
プラスミドの調製については、「ミニプレップＰＣＲ」により予想されたサイズの挿入物を持つことが同定された細菌コロニーを用いて１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地の細菌液体培地に播種し、水平振盪器上で３７℃にて一晩インキュベートした（Sambrook et al., 1989）。ハイスピードプラスミドマキシキット（QIAGEN AG, スイス、バーゼル）を用い、製造元の指示書に従って細菌液体培地からプラスミドを単離した。ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計ultropec 3300 Pro （Amersham Biosciences Europe GmbH, Otelfingen, スイス）を用い、２６０ｎｍにてＯＤを測定することによりプラスミドの濃度を決定した。制限酵素、すなわち、ＥｃｏＲＩ（New England Biolabs, スイス、AllschwilのBioconceptによりスイスに流通している製品）を用いる制限消化によって、単離されたプラスミドにおける挿入物のサイズを解析した；ＥｃｏＲＩ制限部位は、ＰＣＲ４−ＴＯＰＯ及びｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯの両ベクターにおけるマルチクローニング部位に隣接しているので、ＥｃｏＲＩの制限消化によってクローニングされた挿入物をプラスミドから遊離することができる。製造元の推奨に従って、各プラスミド０．５μｇを総容量２０μＬにおいてＥｃｏＲＩで消化した。制限消化物を上述のようにアガロースゲル電気泳動により分析した。切断解析により示されたような予想されたサイズの挿入物を持つことが判明したプラスミドを、外部の会社（Microsynth AG, Schutzenstrasse 15. 9436, Balgach, スイス）で行われるＤＮＡ配列解析の対象とした。
【００６７】
クローニングしたＴＡＡＲ遺伝子のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列解析によって示すように、以前公表された配列と、及び／又はゲノム配列情報から取り出したＴＡＡＲ遺伝子の配列と、比較した。ＴＡＡＲ遺伝子当たり個々のＰＣＲ反応からそれぞれクローニングした２〜３個のＤＮＡプラスミドの配列を比較することにより、ＰＣＲ反応で導入された可能性があるＤＮＡ配列情報における潜在的誤りを排除した。独立したＰＣＲ反応でまさに同一位置で同一のＰＣＲ誤差が生じる可能性は基本的にゼロなので、各遺伝子について独立した配列のアラインメントは極めて正確なＤＮＡ配列を示した。
【００６８】
鋳型材料：我々は、適用可能であれば、ジェンバンクで利用可能なゲノム配列情報が由来する同一の近交系に由来する標準化された鋳型材料を使用することに特に注意を払った。近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はこのマウス系統に由来するゲノムＤＮＡはジャクソン研究所（米国メイン州０４６０９、バーハーバー、メイン通り６００番地）から購入し、近交系Ｃｒｌ：Ｗｉラットはフランスチャールズリバー研究所（フランス、Les Oncins；米国マサチューセッツ州０１８８７−１０００、ウィルミントン、バラードベール通り２５１番地、チャールズリバー研究所に属する）から購入した。成熟Ｃｒｌ：Ｗｉラットの尾生検によるゲノムＤＮＡは、基本的に、Laird PW., Zijderveld A., Linders K., Rudnicki MA., Jaenisch R., Berns A., 簡略化した哺乳類のＤＮＡ単離法。Nucleic Acids Res., 19(15):4293, 1991 Aug 11に従って調製した。上述のように２６０ｎｍにてＯＤを測定することによりＤＮＡ濃度を決定し、ＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／μＬに調整した。ＤＮＡをアリコートで４℃に保存した。ヒトのゲノムＤＮＡはストラタジーンより購入した。
【００６９】
ｃＤＮＡは、市販品（ヒト：ヒト脳、小脳のMarathon-Ready cDNA, BD Biosciences Clonotech）又は全ＲＮＡから作製した。ＲＮＡは、市販品（ヒト：ヒト成人全脳、男、全ＲＮＡ、ストラタジーン、オランダ、アムステルダム私書箱１２０８５−１１００、欧州ストラタジーン）であるか、又は生後３日のＣ５７ＢＬ／６マウス又はＣｒｌ：Ｗｉラットの仔から以下で説明するように抽出した。
【００７０】
ＲＮＡの単離
ＲＮＡは基本的に、Chomcznski P. & Sacchi N:酸性グアニジニウムチオイソシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離の一段階法（Chomcznski P. & Sacchi N：酸性グアニジニウムチオイソシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離の一段階法。Analytical Biochemistry 162:156-159, 1987）に従って組織試料から単離した。ＲＮＡを処理する基本的なルール及び原理はSambrook et al., 1989に詳細に記載されている。
【００７１】
断頭によりラット又はマウスの仔を殺した。脳全体を取り出し、計量し、５ｍＬのガラス製ダウンスに移し、１０倍容量のトリゾール試薬（インビトロゲン）中でホモジネートした。製造元の指示書に従ってこのホモジネートから全ＲＮＡを抽出した。各脳半分に由来するＲＮＡペレットをｐＨ７．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２００μＬに溶解させた。ＤＮＡ分解酵素Ｉの消化［１００μＬのＭｇＣｌ２を１０μＬ、ＲＮＡ分解酵素の入っていないＤＮＡ分解酵素Ｉを５μＬ（１０３Ｕ／μＬ、ロシュ）添加し、３７℃にて１時間のインキュベートした］によって微量のゲノムＤＮＡを除いた。Sambrook et al(1989)に従ってフェノール／クロロホルム抽出（Ｈ２Ｏで飽和したフェノール、ｐＨ７．０、シグマ）により溶液からＤＮＡ分解酵素Ｉを除いた。冷却エタノール／酢酸ナトリウム沈殿によりＲＮＡを沈殿させ（Sambrook et al, 1989）、ｐＨ７．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌに溶解させ、上述のように２６０ｎｍにてＯＤを測定することによりＲＮＡの濃度を決定した。このＲＮＡ調製物をｃＤＮＡの合成に用いた。
【００７２】
ｃＤＮＡの合成：１．５ｍＬのエッペンドルフ容器にて、全容量１１μＬの２μｇの全ＲＮＡ、０．５μｇ／μＬのオリゴｄＴ１２〜１８（インビトロゲン）１μＬを混合した。混合物を７０℃にて１０分間加熱し、氷上に置き、以下の試薬を加えた。
【００７３】
５倍の反応緩衝液（酵素と共に供給された）４μＬ、ＤＴＴ（酵素と共に供給された）２μＬ、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ、アマシャム）１μＬ、ＲＮＡ分解酵素阻害剤ＲＮエースアウト（インビトロゲン）０．５μＬ、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン）０．８μＬ。反応物を手短にボルテックスし、４２℃にて１時間インキュベートし、７０℃にて１０分間インキュベートすることにより酵素を不活化し、反応物をｐＨ７．０の１０ｍＭトリス／ＨＣｌにより最終容量１００μＬに調整した。使用するまで、ｃＤＮＡをアリコートで−８０℃にて保存した。
【００７４】
一般に、ＰＣＲ反応によって、及び鋳型材料によって導入される多型による配列の誤りを除外するのに特定の測定法が取られる：ａ）サイクル数：各ＴＡＡＲ遺伝子について、異なったサイクル数で数回ＰＣＲ反応を行い、クローニングするのに十分な量の特異的産物が得られる最もサイクル数が少ないＰＣＲ反応を用いた。ｂ）遺伝子当たり複数の別個のクローン：各ＴＡＡＲ遺伝子を別個のＰＣＲ産物から２又は３回クローニングし、別個に生じたこれらプラスミドの配列のアラインメントから正確な配列を演繹した。数回の独立したＰＣＲ反応においてまさに同一位置でＰＣＲ誤差が生じる可能性は基本的にはゼロなので、これらプラスミドの配列のアラインメントは、遺伝子の極めて正確な配列を生じる。ｃ）標準化された鋳型材料：近交系間の差異は配列情報に有意な矛盾を導入しうるので、我々はＴＡＡＲ遺伝子のクローニングに採用する鋳型材料の選択に特別の注意を払った。すなわち、マウスのゲノムＤＮＡは、ジャクソン研究所（米国メイン州０４６０９、バーハーバー、メイン通り６００番地）から購入し、近交系Ｃ５７ＢＬ／６がジェンバンクでのマウスのゲノム配列のデータベースに採用されているので、この系統のゲノムＤＮＡを用いた。ヒトゲノムＤＮＡはストラタジーンから購入し、ラットのゲノムＤＮＡは、フランスチャールズリバー研究所（フランス、Les Oncins；米国マサチューセッツ州０１８８７−１０００、ウィルミントン、バラードベール通り２５１番地、チャールズリバー研究所に属する）から購入した近交系Ｃｒｌ：Ｗｉのラットから単離し、ラット系統Ｃｒｌ：Ｗｉがジェンバンクでのラットのゲノム配列のデータベースに採用されているので、この系統を選択した。ｃＤＮＡの合成については、トリゾール試薬を用い製造元の指示書に従って、Ｃｒｌ：Ｗｉラット又はＣ５７ＢＬ／６マウスの生後３日の仔からラット及びマウスの全脳の全ＲＮＡを単離した。ヒトの全脳ＲＮＡはストラタジーンから購入した。インビトロゲンのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素及びアマシャムのｄＮＴＰを用い、製造元の指示書に従って、ｃＤＮＡを合成した。
【００７５】
実施例２：細胞培養及び安定した細胞株の生成
ａ）サブクローニング：哺乳類細胞においてＴＡＡＲ受容体を発現させるために、ＴＡＡＲのオープンリーディングフレーム全体を持つＤＮＡ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ又はｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン）からｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２（Rees S. et al., 組換えタンパク質を発現させるために抗生物質耐性のすべての細胞に感染しやすくする、安定な哺乳類細胞株を創出するためのバイシストロン性ベクター。Biotechniques 20(1):102-4, 106, 108-10, 1996 Jan）にサブクローニングした。
【００７６】
この目的で、ＴＡＡＲのオープンリーディングフレーム全体を持つＤＮＡ断片を、制限消化、すなわちＥｃｏＲＩによってそれぞれのＴＯＰＯベクターから取り出し、次いで上記のようにアガロースゲル電気泳動し、ゲルから抽出することにより約１ｋｂの断片を精製した。並行して、ＥｃｏＲＩによりｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターを直鎖化し、エビのアルカリホスファターゼ（ロシュ）により、製造元の指示書に従って脱リン酸化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を用いて、直鎖化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクター３０ｎｇ、各ＴＡＡＲコード配列を持つＤＮＡ断片１００〜３００ｎｇ、１倍の連結緩衝液（最終濃度：１０倍濃度として酵素に提供される）、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１μＬを総容量２０μＬ中にて混合することにより、ＴＡＡＲのオープンリーディングフレーム全体を持つＤＮＡ断片を直鎖化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターに連結した。室温にて２〜３時間反応を進め、ＴＯＰＯ連結について記載されているように、連結物で化学的コンピテント細胞ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換した細菌をプレートに播き、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡからＴＡＡＲ遺伝子をクローニングするＰＣＲのために前に記載したように細菌クローンのつみ取りを行った。つみ取った細菌クローンを用いて、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢの液体培地５ｍＬに播種した。ＱＩＡプレップミニプレップキット（QIAGEN）を用いて製造元の指示書に従って、ミニプラスミドの調製にこれらの液体培地を用いた。ＥｃｏＲＩ及びアガロースゲル電気泳動を用いた制限解析によって予想されるサイズの挿入物の存在について、精製したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２由来プラスミド構築物を解析した。挿入物の正しい方向性及び配列を確認するために、予想されるサイズの挿入物を持つことが同定されたプラスミドをMicrosynthによって実施されるＤＮＡ配列解析の対象とした。正しい方向で正しい挿入物を持つプラスミドを、哺乳類細胞株における各ＴＡＡＲの発現に用いた。
【００７７】
ｂ）細胞培養：使用した基本的な細胞培養の取り扱い及び技法は、Davis JM (ed), 基本的細胞培養、第２版、オックスフォード大学出版、２００２年、ＩＳＢＮ：０１９９６３８５３５に記載されている。ＨＥＫ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３；Graham FL., Smiley J., Russell WC., & Nairn R, ヒトアデノウイルス５型のＤＮＡで形質転換されたヒト細胞株の性状分析。J. General Virology, 36:59-74, 1977に記載）中にＴＡＡＲを発現させた。培養培地は、グルタマックスＩ、ピルビン酸ナトリウム、ピリドキシン、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース（インビトロゲン、カタログ番号３１９６６−０２１）、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％の熱非働化ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭから成った。トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロゲン、カタログ番号２５３００−０６２）を用い、１：１０〜１：３０の比率で細胞を継代した。
【００７８】
ｃ）安定した細胞株：安定したトランスフェクトされた細胞株を生成するために、リポフェクトアミン２０００トランスフェクション試薬及びグルタマックス（インビトロゲン、カタログ番号５１９８５−０２６）とともにオプチメンＩ血清使用量低減培地を用いて、リポフェクトアミン２０００データシートに提供された勧告に従って、各ＴＡＡＲのｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２発現ベクターをＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をトリプシン処理し、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を補給した培養培地で１：１０〜１：３００に希釈して９０ｍｍの組織培養用ディッシュ（ヌンク）に移し、培地を毎日交換した。トランスフェクション後７〜１０日で、よく分離したクローンが観察され、直径が約３ｍｍに達したらクローンをつみ取った。ギルソンの１ｍＬピペットを用いて培養ディッシュからクローン全体をはがすことによってクローンのつみ取りを行い、トリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロゲン、カタログ番号２５３００−０６２）を用いて１．５ｍＬのエッペンドルフ容器中でクローンをトリプシン処理し、４８穴ディッシュにそれらを蒔き、そこから、培養表面積を増やした（４８穴−１２穴−６０ｍｍなど）ものに移すことによって細胞を続けて増やした。細胞を新しいプレートに移すときはいつも、細胞を慎重にトリプシン処理した。単一クローンを選択してすぐに、培養培地中のＧ４１８の濃度を５００μｇ／ｍＬに減らした。
【００７９】
個々のクローンが十分に増殖した後、それらを微量アミン［ｐ−チラミン、β−フェニルエチルアミン（β−ＰＥＡ）、トリプタミン、オクトパミン］又は化合物の選択（５−ＨＴセロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン及びヒスタミン）のいずれかを用いて、アマシャムのｃＡＭＰバイオトラック酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）システムによる機能アッセイにおいて調べた。安定してトランスフェクトされた細胞株を生成する成功率は、調べたクローン３つのうち約１つであった。この高い成功率は、ｐＩＲＥＳベクターの使用により可能になったが、そのベクターから同一ｍＲＮＡ分子においてＴＡＡＲのＣＤＳとＮＥＯＲのＣＤＳを持つバイシストロン性の転写にてＴＡＡＲが発現される。
【００８０】
【表５】
2006051020.tif 000006
【００８１】
表３．ｈＴＡＡＲの薬理学。ｃＡＭＰバイオトラックＥＩＡシステム（アマシャム）を用いて、列記された化合物それぞれによる刺激に応答して、示された受容体を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞によって産生されるｃＡＭＰの量を測定した。ＥＣ５０値をμＭで示す（少なくとも３回の独立した実験の平均値；ＥＣ５０値は、３０μＭ〜０．１ｎＭの範囲で均一に分布するそれぞれ１２の濃度で２回繰り返した実験から算出する）。最大応答をｐ−ＴＹＰにより誘導される最大のｃＡＭＰのレベルのパーセントとして表す。本試験で用いられたヒトＴＡＡＲ１は、インフルエンザ血球凝集素Ｎ末端ウイルスリーダー配列を付加し、ラットのＴＡＡＲ１配列（すなわち、Ｎ及びＣ末端並びに第３細胞内ループ）に相当する選択された領域を置換することによって構築されたキメラである。このキメラはポートランド大学のDavid K. Grandy (Bunzow JR., Sonders MS., Arttamangkul S., Suchland KS., Amara SG., Scanlan TS., Grandy DK., 微量アミン受容体の薬理学及び生理学、プログラムＮｏ．５１５．４、アブストラクトビューアー／スケジュールプランナー、ワシントンＤＣ、神経科学会２００２年、オンライン)によって得られた。ドーパミンの実験では、ＥＣ５０値は、ｐ−チラミンによって達するレベルに比べて５０％の最大ｃＡＭＰのレベルを基にして算出した。
【００８２】
ｈＴＡＡＲ１以外の全ｈＴＡＡＲについては、最低１０個の別個のクローンを調べた。微量アミン又は選択した上の化合物のどちらにも応答しなかった場合は、定義された試験条件下では、各ＴＡＡＲはその化合物に全く反応性ではないと結論付けた。
【００８３】
ｃＡＭＰのアッセイ：製品マニュアルに記載されているような、いわゆる非アセチル化ＥＩＡ法に従って、アマシャムのｃＡＭＰバイオトラック酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）システムを用いてｃＡＭＰを測定した。一般的な方法はまた、Notley-McRobbら（外部グルコース濃度と大腸菌内部中のｃＡＭＰレベルとの関係：アデニル酸シクラーゼのホスホトランスフェラーゼ介在調節のモデルの意味。Microbiology, 143(Pt6):1909-18, 1997 June）及びAlfonso A., de la Rosa Lら（エソ毒素、新規のフィコ毒素はホスホジエステラーゼ活性を活性化する。ヒトリンパ球におけるｃＡＭＰレベルに対するエソ毒素の影響。Biochem. Pharmacol., 65(2):193-208, 2003, Jan. 15）にも記載されている。
【００８４】
プロトコールでは以下の細かな改変を導入した：９６穴プレートにおけるＨＥＫ細胞を刺激した後、予備冷却した（−２０℃）等量のエタノールを加えることにより反応を止めた。細胞の溶解はキットで供給された溶解緩衝液を適用して達成するのではなく、９６穴プレートを最低６時間（最大数日間）−８０℃に移すことにより達成した。その後、９６穴プレートの内容物を５０℃にて一晩乾燥し、９６穴プレートに残っている物質をアッセイ緩衝液（キットの全試薬を再懸濁するために使用する緩衝液）２００μＬに再懸濁した。アッセイ緩衝液で連続希釈して再懸濁液をアッセイした。
【００８５】
系統発生的解析
全ＴＡＡＲ遺伝子を同定するため、特にＴＡＡＲファミリーのこれまで未知の潜在的メンバーの存在のために、手持ちのゲノム配列解析手段を用いて、ヒト、マウス、及びラットのゲノム配列（ヒト：ＮＣＢＩ参考ドラフト３４、２００３年７月；マウス：ＮＣＢＩドラフト３２、２００３年１０月；ラット：ラットゲノム配列決定コンソーシアムドラフト３、２００３年６月）をスクリーニングした。このスクリーニングにより、ヒト、マウス及びラットにわたる４４個のＴＡＡＲ遺伝子が同定され、そのうち、２２個の新規遺伝子（２つの偽遺伝子及びヒトＴＡＡＲ７遺伝子断片を含む）及び以前公表された配列と矛盾する１１個の遺伝子が同定された。単純なＤＮＡ配列とタンパク質配列との比較、並びにリガンドポケットベクトルのＧＰＣＲファーマコフォアの関係及びＴＡＡＲ遺伝子のゲノム配列との系統発生的関係のようなさらに複雑なパラメータの比較は、図３に列記するＴＡＡＲ受容体がヒト、マウス、及びラットにおける完全なＴＡＡＲ受容体ファミリーを表すという結論を強く支持する。ゲノム配列情報に基づいたＴＡＡＲ遺伝子の同定は、ＴＡＡＲ２を除くＴＡＡＲがすべて単一エクソンにコードされるという事実によって大きく促進された。
【００８６】
この背景において、ヒト、マウス、及びラットのゲノムにおけるＴＡＡＲ遺伝子のアラインメントを解析した（ヒトの場合、図１を参照のこと）。遺伝子は、合計がヒトで約１０９ｋｂ（染色体６ｑ２３．１）、マウスで１９２ｋｂ（染色体１０Ａ４）、及びラットで２１６ｋｂ（染色体１ｐ１２；すべてLocusLinkで指定された染色体領域）に及ぶ非常に小さな領域にマップされ、同一染色体領域にほかに注釈された又は予想された遺伝子はなかった。２つのエクソンにコードされるＴＡＡＲ２を除いて、すべてのＴＡＡＲ遺伝子のコード配列は単一エクソンに位置し、全３種を通して約１ｋｂの長さで極めて類似している（範囲：９９９〜１０８９ｂｐ）。ヒト第６染色体上の６ｑ２３．１領域が、統合失調症感受性遺伝子座（Levinson et al., 染色体５ｑ、６ｑ、１０ｐ及び１３ｑにおける統合失調症候補領域の多施設連鎖試験：統合失調症連鎖共同研究グループＩＩＩ。Am. J. Hum. Genet., 67(3):652-63, 2000, Sep., Epub 2000 Aug 02; Martines et al., 染色体６ｑにおける統合失調症の感受性遺伝子座に関する追跡試験。Am. J. Med. Genet., 88(4):337-43, 1999 Aug 20）として知られることに注目するのは興味深く、それは精神医学的障害のための薬剤標的としてのＴＡＡＲの可能性を強調する。
【００８７】
ヒトでは、ＴＡＡＲ１〜５ならびにＴＡＡＲ６、８及び９が逆方向のオープンリーディングフレームを有する遺伝子の２個のブロックに配列していることが判明した。ヒトとげっ歯類との間の最も顕著な差異はヒトゲノムでの機能的ＴＡＡＲ７パラログの完全な欠如であり、それはラットにおける全ＴＡＡＲファミリーの約半分を表し、そのため、我々はヒトではｒＴＡＡＲ７ｈに最も近い類似性を持つ変性した遺伝子断片しか検出しなかった。さらに、ＴＡＡＲ３及び４は、げっ歯類では機能的受容体であるが、ヒトでは偽遺伝子である。ｈＴＡＡＲ３Ψ及び４Ψ遺伝子は、非機能的にさせるコード配列中の２及び３ｂｐの変化を有するのみで、全体として非常によく保存されているので、これら遺伝子の偽物化は最近の出来事であると思われる。ラットにおける９つのＴＡＡＲ７パラログ（２つの偽遺伝子、ｒＴＡＡＲ７ｆΨ及びｒＴＡＡＲ７ｉΨを含む）及びマウスにおける６つのＴＡＡＲ７パラログ（１つの偽遺伝子、ｍＴＡＡＲ７ｃΨを含む）の総数の差異はかくも密接に関係した遺伝子のファミリー内における顕著なげっ歯類内の差異を表し、それは、リガンドポケットベクトル解析（下を参照のこと）のＧＰＣＲファーマコフォアの関係により決定されるマウスとラットの個々のＴＡＡＲ間における予想されたリガンド結合の強い差異に反映されている。全体として極めて高い類似性のタンパク質配列を持つ受容体の予想されたリガンド結合ポケットで検出された強い差異は、そのファーマコフォア特性に関してマウスとラットのＴＡＡＲの類似性の程度を予想するのに全体としてアミノ酸配列の同一性は好適な指標ではないこと、行動動物モデルを開発するのに周到な注意が必要であるという事実を示す。
【００８８】
ヒト及びげっ歯類におけるＴＡＡＲ遺伝子の染色体上の集約的アラインメント及び各種内での多数の非常に類似した遺伝子に端を発して、ＴＡＡＲ遺伝子の系統発生的関係を３つの種すべてについて分析した。系統発生的分析は、ＴＡＡＲ遺伝子が推定上共通の祖先を起源に持ち、それから合計８回の遺伝子重複を介して進化して、霊長類とげっ歯類の系列が分岐する前に９個の遺伝子セットに至ったことを示している（図２；共通祖先からの遺伝子重複、ヒト及び霊長類系列への種分化、及びげっ歯類系列内での遺伝子重複をそれぞれ番号１、２及び３でまとめて示す）。７つの場合で、ヒト、マウス、及びラットに至る２回の種分化によってこれらの遺伝子はさらに重複し、３つのオルソロガスなセットになった。げっ歯類のＴＡＡＲ７及び８は、ラット及びマウス系列の範囲内でさらに独立した重複により進化した。これらの出来事が上で概説した順番でのみ生じうることに注目することが重要である。
【００８９】
系統樹の全体的構造は直ちに我々にＴＡＡＲファミリーの３つの亜群（図３において灰色の囲みで示す）への区別を示唆した。以下で詳細に議論するように、亜群の概念は、単に全体的なＤＮＡ配列よって推測される任意の区別ではなく、それが有意な機能的差異を反映することが判明した。
【００９０】
ヒト、ラット及びマウスにおいて合計５つの偽遺伝子がある。小さな変更を導入することによって偽遺伝子はすべて機能的タンパク質に変換することができた。偽物化を起こす可能性があった最も明らかな且つ最も可能性の高い突然変異の記載に続いて：ｈＴＡＡＲ３Ψは、早期終結を生じる１３５位での２個のｂｐ（ＣＡ）の欠失で偽遺伝子になった可能性が最も高い。Ｃｙｓを終結コドンに変える点突然変異（Ａ４１１Ｔ）及び２箇所の挿入（Ｇ６０５、Ａ７５０）がｈＴＡＡＲ４Ψの偽物化を生じた可能性がある。ｒＴＡＡＲ７ｆΨは、そのほかのＴＡＡＲ７との２つの明瞭な相違点、おそらく挿入で生じた７２６位での１２個の付加のｂｐ及びＴｒｐを終結コドンに変える点突然変異（Ａ５１５Ｇ）を有する。ラットの第２の偽遺伝子、ｒＴＡＡＲ７ｉΨは、９０位において１０ｂｐを失損し、早期終結を生じ、またｍＴＡＡＲ７ｃΨは、８９５位にて１５ｂｐ（細胞内ループ）を欠損し、５１３位にて７ｂｐを欠損して早期終結を生じる。要約すると、ＴＡＡＲファミリーでは、偽物化は、点突然変異、欠失、及び挿入のようなすべて可能性のある突然変異で生じたと思われる。全体として高度に保存された配列なので、イベントはかなり最近生じたと思われる。そのような修復された偽遺伝子の薬理学は、進化の間の適応過程の背景でＴＡＡＲの重要性に見識を与える可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ヒトにおけるＴＡＡＲ遺伝子の染色体局在を示す。各遺伝子の単一コーディングエクソンを表すボックスは染色体上のＴＡＡＲ遺伝子の相対的位置を示す。２つのエクソンにコードされるｈＴＡＡＲ２については、ボックスは、オープンリーディングフレームの９５％を超える部分を含む第２のコードエクソンの位置を示す。各コード配列の長さに関してボックスの幅は比例せず、色彩は本文で議論する受容体の亜群における区別を示す。ボックス上の矢印は、ＴＡＡＲ遺伝子の方向性を示す［→：フォワードストランド（forward strand）方向のＯＲＦ、←：リバースストランド（reverse strand）方向のＯＲＦ］。（ｆ＝断片、Ψ＝偽遺伝子）
【図２Ａ−１】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ヒトの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。予測されるＴＭの位置：
【表６】
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【図２Ａ−２】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ヒトの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。予測されるＴＭの位置：
【表７】
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【図２Ａ−３】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ヒトの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。予測されるＴＭの位置：
【表８】
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【図２Ｂ−１】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  マウスの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｂ−２】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  マウスの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｂ−３】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  マウスの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｂ−４】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  マウスの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｂ−５】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  マウスの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｃ−１】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ラットの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｃ−２】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ラットの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｃ−３】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ラットの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｃ−４】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ラットの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図２Ｃ−５】機能的ＴＡＡＲすべてのアラインメントを示す。ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲすべてにおいて保存されているアミノ酸残基を黒い網掛けで強調する。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントはＴＭ ＶＩＩに局在する。  ラットの機能的ＴＡＡＲのアラインメント。
【図３】ヒト、ラット、及びマウスにおけるＴＡＡＲ遺伝子のそのＤＮＡ配列に基づいた系統発生的関係を示す。  その後の遺伝子重複のイベントを分岐点での数字により示す（１：推定上の共通の祖先からの遺伝子重複；２：霊長類とげっ歯類の系列の分離に至る種分化；３：マウス及びラットの種に至る遺伝子重複）。ヒトの５−ＨＴ４受容体との配列の比較に基づいて外集団を置いた。別個のサブファミリーへのＴＡＡＲ遺伝子の概要を、灰色の陰影の囲みによって示す。Ψ：偽遺伝子；＊：げっ歯類ＴＡＡＲ７パラログの残物に類似するヒトゲノムにおけるラットＴＡＡＲ７ｈに最も類似性が近い遺伝子断片。スケール：ＪＴＴタンパク質距離。
【図４】偽遺伝子ｈＴＡＡＲ３（旧名ＧＰＲ５７Ψ）の「修復」を示す。修理されたＯＲＦの１３３〜１３４位に２つの塩基対ＣＣを付加し、他の早期終結コドンＴＣＡを修復した。
【図５Ａ】リガンドポケットベクトル（計算モデルにより決定される、残基がおそらくリガンド結合に関与するアミノ酸）の特性に基づくＴＡＡＲの関係を示す。  Kratochwil et al. (2004)により予測されたような、ヒト、ラット、及びマウスのＴＡＡＲタンパク質におけるリガンドポケットベクトル（ＬＰＶ）。最もよく似たリガンド結合ポケットを持つタンパク質を互いに隣同士に配置するように個々のＴＡＡＲを並べる。色彩のある陰影により、アミノ酸残基の物理化学的特性を示す（青色：疎水性／芳香族残基、緑色：脂肪族極性残基、赤色／濃紫色：正又は負に荷電した残基；橙色／黄色：グリシン／プロリン残基、ＴＭドメインにおけるキンク（kink）を誘導する可能性がある；ピンク色：ヒスチジン、明るい青色：チロシン）。膜貫通ドメイン（ＴＭ１〜７）ならびに細胞外ループＩＩ（ＥＣＩＩ）における各アミノ酸の位置を図の下方におけるボックスで示す。予想されるＴＭ領域の正確な位置については、図２の説明を参照のこと。
【図５Ｂ】リガンドポケットベクトル（計算モデルにより決定される、残基がおそらくリガンド結合に関与するアミノ酸）の特性に基づくＴＡＡＲの関係を示す。  ＴＡＡＲタンパク質のリガンド結合ポケットのファーマコフォア類似性を示す階層樹。以下のタンパク質を「修復された偽遺伝子」として解析に含めた。カッコ内は修飾：ｈＴＡＡＲ３Ψ（挿入：Ｃ１３５〜、Ａ１３６〜）、ｈＴＡＡＲ４Ψ（点突然変異：Ｔ４１１Ａ、欠失：〜６０５Ｇ、〜７５０Ａ）、ｍＴＡＡＲ７ｃΨ（挿入：Ｃ５１３〜）、ｒＴＡＡＲ７ｆΨ（点突然変異：Ｇ５１５Ａ）、ｒＴＡＡＲ７ｉΨ（挿入：Ａ９０〜）。スケールバー：ファーマコフォア多様性単位。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図２Ｂ−４】
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【図２Ｂ−５】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｃ−４】
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【図２Ｃ−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
1. Title of Invention
Human Trace Amine Associated Receptors
2. Detailed Description of Invention
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3. Brief Description of Drawings
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2006051020.tif 000054
1.Claims
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1. Abstract
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2. Representative Drawing
None
Fig. 1
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Fig. 2A-1
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Fig. 2A-2
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Fig. 2A-3
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Fig. 2B-1
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Fig. 2B-2
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Fig. 2B-3
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Fig. 2B-4
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Fig. 2B-5
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Fig. 2C-1
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Fig. 2C-2
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Fig. 2C-3
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Fig. 2C-4
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Fig. 2C-5
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Fig. 3
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Fig. 4
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Fig. 5
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【配列表】
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