(57)【要約】【課題】  例外的な大量の病原性ウイルスとくにパルボウイルスが存在しない血漿生成物の製造方法を提供する。【解決手段】  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、１０6〜１０7ゲノム当量／ｍｌ以上の量でパルボウイルスＢ１９が検出された全てのドナー血液を排除し、当該ＰＣＲの感度は、ＤＮＡ含量が１０6〜１０7ゲノム当量／ｍｌ以上であるサンプルのみにパルボウイルスＢ１９ＤＮＡが検出されるように調整されていることを特徴とする血漿生成物の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、１０6〜１０7ゲノム当量／ml以上の量でパルボウイルスＢ１９が検出された全てのドナー血液を排除し、当該ＰＣＲの感度は、ＤＮＡ含量が１０6〜１０7ゲノム当量／ml以上であるサンプルのみにパルボウイルスＢ１９ＤＮＡが検出されるように調整されていることを特徴とする血漿生成物の製造方法。  
【請求項２】
ＤＮＡ単一鎖へのプライマーの付加（アニーリング）および増幅は約５２℃の温度で行なわれ、３０サイクル以下で実施される請求項１記載の方法。  
【請求項３】
ＰＣＲの感度が、高度に希釈したサンプルで操作することにより確立されている請求項１又は２記載の方法。  
【請求項４】
増幅されたパルボウイルスＤＮＡセクションを２種の蛍光染料を有する付加的プローブにより検出し、一方の染料（レポーター）の蛍光は、付加的プライマーがまだ無傷である限り、第二の染料（クエンチャー）の近接によって低下し、そして、付加的プライマーが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによって置換され、蛍光染料がそのエンドヌクレオチド分解活性によって放出されると直ちに、レポーターの蛍光が増大することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。  
【請求項５】
使用される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔaq  ＤＮＡポリメラーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例外的な大量の病原性ウイルス、特にパルボウイルスが存在しない血漿生成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血漿タンパク質溶液中に含有されるウイルス性夾雑物は、それらから調製される血漿生成物中に移行することが可能であって、このタイプの血漿生成物を投与される患者に感染を招くおそれがある。この危険を防止するには、安全のための様々な手段が開発されてきた。それらの中で特に、ドナーについてのある種のウイルス感染の検査ならびにそのドナー血液からの血漿生成物の製造前、製造中および製造後におけるウイルスの不活性化および排除には、著しい格別な重要性が与えられてきた。
【０００３】
ドナーの血液にはパルボウイルスＢ19が夾雑していることが多い。パルボウイルスは例外的な場合にのみ重篤な疾患を生じるが、安全性の理由から、高力価のパルボウイルスが夾雑するドナー血液は血漿生成物の製造に使用すべきでない。他方、低力価のパルボウイルスは、処理されるドナー血液の血漿中に残る少量のウイルスは血漿タンパク質の調製時に除去可能な物理的および化学的方法を利用できることから容認される。
【０００４】
したがって、例外的に高濃度のパルボウイルスを有するドナー血液を、適当な時点で同定し、それを血漿生成物への処理から排除することが望ましい。
【特許文献１】国際特許出願 WO 92／02638
【非特許文献１】Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J.(1991), Science 252, pp.1643-1651
【非特許文献２】PCR Protocols. Current methods and applications (1993), ed. by B.A.White, Humana Press, Totowa, New Jersey, ISBN 0-89603-244-2
【非特許文献３】Livak K.J., Flood S.J.A., Marmaro J., Giusti W., Deetz K., Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probesystem useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Method and Appli. 1995; 4: 357-362
【非特許文献４】Ishizawa M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma S.: Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucl. Acids Res. 1991, 19: 5792
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、例外的に大量の病原性ウイルス、特にパルボウイルスの存在のみを指示するが、少量のパルボウイルスの存在は指示しない、高力価血漿タンパク質溶液の検出操作を開発すること、および当該検出操作を応用した血漿生成物の製造方法を提供することが本発明の目的であった。
【０００６】
よく知られているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、サンプル中の少量の既知の核酸配列を検出するために極めて有効な方法である（非特許文献１；非特許文献２参照)。ウイルスＤＮＡの配列が既に分かっていれば、互いに反対側に存在し所望のＤＮＡ配列に隣接する一本鎖上の領域に相補性の１対のプライマーを合成することができる。ついで、それ自体既知のＰＣＲ条件下に、インビトロにおいて、一般的に３０サイクル反応以上を継続することによって、大量の特異的なＤＮＡを増幅させることができる。サンプル中に所望のウイルスのＤＮＡが存在すれば、ＰＣＲサイクルにより２つのプライマーの長さとそれらの間に挟まれたウイルスＤＮＡの長さからなる特異的なサイズのＤＮＡフラ
グメントのみが増幅される。
【０００７】
ＰＣＲ技術はきわめて高い感度を示すので、それを用いれば、きわめて少量のＤＮＡでも高い信頼性で検出することができる。ＰＣＲの高い感度はまた、検出すべきウイルスＤＮＡが、結果としてサンプルから誘導される献血の血漿生成物の調製のための実際的な有用性に悪影響を与えないような少量しかサンプル中に存在しない場合でも陽性の結果を導くことになる。たとえば慣用の定性的ＰＣＲ技術は、パルボウイルスＢ19の高および低濃度の間の差を識別できず、パルボウイルスＢ19の力価が低い血漿サンプルでも高度にウイルスが夾雑しているように見えることから、パルボウイルスＢ19ＤＮＡの検出には適当ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
血漿および／または血清中の高濃度のウイルスのポリメラーゼ連鎖反応による検出の操作は、準至適（suboptimal）核酸抽出、増幅もしくは検出条件の使用により、ポリメラーゼ連鎖反応の感度を制限すれば、実際の使用に効果的に改良できることが、今回見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この方法は病原性ウイルスの高濃度の核酸の検出に適している。この方法の使用は、特にパルボウイルスの高濃度の核酸の検出に有利である。本発明によれば、パルボウイルスの核酸の検出のためのＰＣＲの感度は、サンプル中のパルボウイルスのＤＮＡ含量が１０6〜１０7ゲノム当量以上の場合にのみ検出できるように著しく制限される。パルボウイルスＤＮＡ含量が低いサンプルは最早陽性とは認識されず、血漿生成物を与える以後の操作に付されるが、なお存在する可能性のある少量のパルボウイルスは製造操作中に除去される。
【００１０】
ＰＣＲの感度を限定するためには、数種の操作が利用できる。すなわち、たとえば核酸抽出を少量の核酸しか単離されない条件下に行うことが可能であり、また少量の核酸しか含まない高度に希釈した溶液で操作することも可能である。準至適増幅条件は、たとえばＤＮＡ単一鎖に対するプライマーの付加（アニーリング）および異常に低い温度での増幅の実施、ならびにＰＣＲサイクルの数の制限またはプライマー濃度の至適範囲以下の再生による増幅の「遅延」によって確立することができる。最後に、特に高濃度のパルボウイルスＤＮＡのみが認識されるような検出条件を選択することも可能である。
【００１１】
よく知られているように、慣用のＰＣＲは検討すべきサンプルから抽出された核酸を、９０℃またはそれ以上の温度でたとえば２０秒〜１分間変性させることにより開始される。
【００１２】
これらは、この経過中に単一鎖に開裂し、これにプライマーが通常、４５〜６５℃の温度で添加される。増幅はついで７２℃で行われる。
【００１３】
これに反し、本発明によれば、アニーリングおよび／または増幅は約５２℃の温度で行われる。さらにＰＣＲサイクルの数は３０回に制限する。この方法により、ＰＣＲの反応速度はかなり制限され、形成されるパルボウイルスＤＮＡの量はサイクル数の減少によってかなり低下する。
【００１４】
使用されるプライマーは、たとえば以下のオリゴヌクレオチドである。
配列番号１：5′ATG GGC CGC CAA GTA CAG GAA A 3′
配列番号２：5′CAG GCA CAG CTA CAC TTC CAC GC 3′
【００１５】
増幅されたパルボウイルスＤＮＡセクションの検出を２種の蛍光染料を有するプローブによって行うのが、本発明の方法に特に有利であることが、今回証明された。上述の配列を特徴とする２種のプライマーの間のＤＮＡに付加するこの標識プローブは、したがって、たとえば以下の配列を有する。
配列番号３：5′ FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA 3′
【００１６】
この配列は、商品名ＴaqＭan（登録商標）での市販品を入手可能であり、５′−ヌクレアーゼアッセイ、ＴaqＭanアッセイにおける使用が意図されている。この方法は 非特許文献３に詳細に記載されている。この記載は引用により本明細書に加入される。
【００１７】
このプローブの特定の性質はプローブの５′末端に付着した染料（ＦＡＭ)、レポーターの蛍光が、プライマーの３′末端に配置されたクエンチャー、第２の蛍光染料（ＴＡＭＲＡ）の接近によって減弱することである。
【００１８】
増幅の過程において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＴaqＤＮＡポリメラーゼの作用下に、新しいＤＮＡ鎖が形成される。この経過中、ＤＮＡポリメラーゼは、プローブを一本鎖から置換するのみでなく、そのエンドヌクレオチド分解活性によって開裂させ、同時に２つの蛍光染料を遊離させる。レポーター染料の蛍光は、クエンチャー染料によって最早抑制されることはなく、増大する。レポーターの波長ならびにクエンチャーの波長における蛍光（ＦＡＭについては５１８nm、ＴＡＭＲＡについては５８２nm）を蛍光スペクトロメーターを用いて測定するとレポーターおよびクエンチャーの値の商（ＲＱ）を得ることができる。それから数種の陰性対照からの商の平均値（ＲＱ-）を差引き、計算値をΔＲＱとする。２種の蛍光染料でラベルされたプライマーの使用によるＰＣＲにおけるＤＮＡの形成の認識方法は特許文献１に記載されている。この記載は引用により本明細書に加入する。
【００１９】
パルボウイルスＢ19ＤＮＡの検出のこの方法を本発明により感度が制限されたＰＣＲ操作に採用すると、０.７以上のΔＲＱ値を有するサンプルが陽性として検出され、分離される。低ΔＲＱ値を有するサンプルは少量のパルボウイルスＢ19ＤＮＡ（＜106〜107ゲノム当量／ml）を含有する。
【実施例】
【００２０】
本発明を以下の実施例によって例示する。
Ａ. 核酸の抽出
核酸の抽出は Ishizawaらにより記載された方法（非特許文献４参照）の改良された変法を用いて実施される。この目的では、100μlの血漿または血清を 300μl の抽出緩衝液（６Ｍヨウ化ナトリウム、13mM EDTA、0.5％ザルコシル、26mM tris HCl、pH 8.0、33μg／mlのグリコーゲン、77μg／mlの酵母ｔＲＮＡ）と混合し、６０±２℃で１５分間インキュベートする。４００μlのイソプロパノールを加えて核酸を室温で２０分間沈殿させる。続いて核酸をペレット化するために、ベンチトップ遠心分離器により13,000〜14,000rpmで１０分間遠心分離を行う。上清を捨て、ペレット（沈殿）を１mlの４０％イソプロパノールで洗浄し、乾燥し、２０μlのＨ2Ｏに再懸濁する。
【００２１】
Ｂ. 増幅
ＮＳ１遺伝子中のＢ19ＤＮＡの増幅は、ＤＮＡ含量が１０6〜１０7ゲノム当量／mlのサンプルのみ陽性になるように準至適アニーリングおよび伸長温度により調整する。４０μlのMaster Mix〔５μlの10×ＰＣＲ緩衝液（Perkin-Elmerカタログ 1995／96 PCR Systems, Reagents and Consumables)、３μlの２５mM MgCl2、４μlの２.５mMデオキシヌクレオシドトリホスフェート、各４μlの配列番号：１および配列番号：２のオリゴヌクレオチド（いずれも10pmol／μl)、0.3μlの配列番号：３のオリゴヌクレオチド（10pmol／μl)、0.25μlのTaq DNAポリメラーゼ（1.25単位；Perkin-Elmerカタログ 1995／96 PCR Systems, Reagentsand Consumables)、11.45μlのＨ2Ｏ〕をピペットで、１０μlの抽出ＤＮＡ中に加え、混合して以下の熱サイクルに付す。
１. ９０℃、１分間の初期変性
２. ９４℃、２８秒間の変性ならびに５２℃で各１分間のアニーリングおよび伸長を３０サイクル
３. 評価まで４℃に冷却
【００２２】
Ｃ. 評価
ＰＣＲ反応は蛍光スペクトロメーターで評価する。この目的では、レポーターの波長およびクエンチャーの波長（ＦＡＭについては５１８nm、ＴＡＭＲＡについては５８２nm）における蛍光を測定し、レポーター値およびクエンチャー値の商（ＲＱ）をそれぞれ求める。３種の陰性対照からの商の平均値（ＲＱ-）を差し引き、計算値をΔＲＱとする。０.７以上のΔＲＱ値を有するサンプルを陽性、０.７未満のサンプルを陰性と評価する。この方法により、ＤＮＡ含量が１０6〜１０7ゲノム当量／mlより大きいサンプルのみが陽性と評価される。
【配列表】
2006335764000001.app