(57)【要約】【課題】ビタミンＫ２を簡便に回収する方法を提供すること。【解決手段】ビタミンＫ２を含有する試料をキトサン処理する工程、および該キトサンに吸着したビタミンＫ２を有機溶媒で抽出する工程を含むビタミンＫ２の回収方法が提供される。好ましくは、ビタミンＫ２を含有する試料が納豆菌培養液である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＫ２を含有する試料をキトサン処理する工程、および該キトサンに吸着したビタミンＫ２を有機溶媒で抽出する工程を含む、ビタミンＫ２の回収方法。
【請求項２】
前記ビタミンＫ２を含有する試料が納豆菌培養液である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、納豆菌培養液からビタミンＫ２を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆菌が血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを生産することは、須見らによって発見され（非特許文献１）、納豆の栄養価はもちろん、健康食品としての価値が見直されている。ナットウキナーゼは、それ自身が線溶酵素として作用することが知られており、食品として摂取されると、血栓を溶解する。このナットウキナーゼは、半減期が長く、長時間効果が持続するという、極めて優れた特徴を有している。そして、同じ血栓溶解作用を有するウロキナーゼでは明確でなかった切迫期網膜中心静脈閉塞症の治療効果が、ナットウキナーゼで明確に現れたことが報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
そこで、ナットウキナーゼを多量に含む食品、例えば、納豆菌培養エキスを粉末あるいはカプセル化した商品が健康食品として販売されている。
【０００４】
他方で、納豆菌は、培養によりビタミンＫ２を多く生産することが知られている。このビタミンＫ２は、血液凝固系の必須成分として知られている。ビタミンＫ２は、また、別の生理作用を有しており、その欠乏症としては、新生児の吸収障害、老人性骨粗鬆症を引き起こし、過剰症としては、溶血性貧血、脾腫、腎・肝などの障害を引き起こすといわれている。このように納豆菌培養エキスにはナットウキナーゼという血栓溶解系の作用因子とビタミンＫ２という血液凝固系の作用因子とが同時に含まれている。
【０００５】
ところで、一般に、ビタミンＫ２の一日の必要摂取量は成人で５５〜６５μｇであるといわれている。ビタミンＫ類は、海藻、ブロッコリーなどの食物に多く含まれており、さらに腸内細菌により生産される、あるいは納豆を摂取した際の納豆菌が腸内で生育し、ビタミンＫ２を生産する可能性があるため、ビタミンＫ２の必要摂取量は、通常の食事により満たされているといわれている。このようにビタミンＫ２は、一般的には別途摂取する必要がないほどである。
【０００６】
他方で、血栓予防のため、ビタミンＫ依存性凝固因子（例えば、プロトロンビンVII、IX、Ｘなど）の合成抑制剤を服用している患者が、血栓予防等を目的として血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを含む納豆あるいは納豆菌培養エキスを摂取すると、ビタミンＫ２も同時に摂取することになり、そのビタミンＫ依存性凝固因子合成抑制剤の効果が打ち消されるという問題が生じる。
【０００７】
そこで、血栓形成予防のため、ビタミンＫ２含量が低減された納豆菌培養エキス食品が望まれており、ビタミンＫ２を減少させる方法が試みられている。ビタミンＫ２を減少させる方法としては、ヘキサンなどの有機溶媒を用いて脂溶性のビタミンＫ２を抽出する方法がある。
【０００８】
しかし、この方法では、ビタミンＫ２以外の脂溶性の栄養分も抽出されて除かれるという栄養学上の問題、ヘキサンなどの有機溶媒の除去が必要となるため、製造コストアップにつながるなどの製造技術面での問題、さらに、食品に有機溶媒が残留する可能性、有機溶媒の使用に対する消費者の抵抗感などの問題がある。一方で、ビタミンＫ２は、骨粗鬆症などに有効であるとされており、その有効利用が望まれている。
【非特許文献１】須見ら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ４３巻、１１１０頁（１９８７）
【非特許文献２】西村ら、眼科臨床医報  第８８巻、第９号  ５３〜５７頁（１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、納豆菌培養液から安全性を考慮したビタミンＫ２の回収方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ビタミンＫ２を含有する試料をキトサン処理する工程、および該キトサンに吸着したビタミンＫ２を有機溶媒で抽出する工程を含む、ビタミンＫ２の回収方法を提供する。
【００１１】
好ましい実施態様では、上記ビタミンＫ２を含有する試料が納豆菌培養液である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、納豆菌培養液中のビタミンＫ２をキトサンに吸着させ、これを回収するという簡便な手法で、効率的にビタミンＫ２が回収される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明で、納豆菌培養エキスには、ナットウキナーゼと、１μｇ／ｇ乾燥重量以下のビタミンＫ２とが含有されている。好ましくは、ビタミンＫ２は０．５μｇ／ｇ乾燥重量以下、さらに好ましくは０．１μｇ／ｇ乾燥重量以下含有される。
【００１４】
納豆菌培養エキスの形態には、納豆菌を培養し、培養液から菌体がすべて除去され、またビタミンＫ２のほとんど、またはすべてが除去された培養液自体を含む。納豆菌培養エキスの形態は、液体、粉末、固形であり得る。液体としては、培養液の濃縮液、あるいはペーストであり得る。粉末としては、濃縮液あるいはペーストをさらに乾燥した粉末あるいは顆粒であり得る。固体としては打錠等により得られる錠剤であり得る。錠剤は、糖衣錠など、種々の用途に応じて表面がコーティングされた錠剤であり得る。または、これらの濃縮液、ペースト、粉末、顆粒を含有するカプセルであり得る。また、ドリンクの状態でもあり得る。
【００１５】
本発明の納豆菌培養エキスには、ナットウキナーゼが含まれる。ナットウキナーゼの含有量は特に制限がないが、１ｇ当り、２０ＦＵ以上が好ましく、より好ましくは１０００ＦＵ以上、さらに好ましくは２５００ＦＵ以上である。これらは濃度により変動する。乾燥粉末の場合は、上記濃度に加え、５０００ＦＵ以上であり得、１００００ＦＵ以上であり得る。ナットウキナーゼ活性の有無は、例えば、非特許文献１に記載された方法などに従い、フィブリンプレート上で溶解斑を形成するか否かで検出できる。なお、本発明で、ナットウキナーゼは、納豆菌により生産され、フィブリンプレート上でクリアなプラークを形成する能力のある酵素を意味する。
【００１６】
本発明の納豆培養エキスに含まれるビタミンＫ２は、１μｇ／ｇ乾燥重量以下であり、検出限界（０．００１μｇ／ｇ乾燥重量）以下の含量であり得る。ビタミンＫ２の除去は、キトサンを用いて行う。除去方法は、後述する。このキトサン処理により、ビタミンＫ２は、培養液から９９％以上除去される。
【００１７】
以下、納豆菌培養エキスの製造方法について、いわゆる納豆菌（Bacillus subtilis nattoがその代表である）を例に挙げて説明する。なお、この説明において、ビタミンＫ２などの数値は、用いる納豆菌の種類、培養条件などで変化するものであり、本発明を限定するものではない。
【００１８】
納豆菌培養エキスの製造に用いられる微生物は、納豆菌に分類され、ナットウキナーゼを生産できる微生物であれば、いずれの微生物も使用できる。市販の納豆から分離した納豆菌を用いてもよい。
【００１９】
納豆菌の培養に用いる培地には特に制限はないが、濃縮液自体が食品になることを考慮して決定することが好ましい。澱粉（例えば、コーンスターチ）、グルコース、蔗糖などの炭素源、脱脂大豆、肉エキスなどの窒素源、炭酸カルシウム、塩化マグネシウムなどの無機塩、必要に応じて脂肪酸などを培地成分として用いて、納豆菌を培養する。これらの培地に使用される成分は、食品添加物グレードであることが好ましい。
【００２０】
納豆菌の培養方法には特に制限がないが、大量に培養するためには、通気攪拌培養が好ましい。培養温度は納豆菌が生育できる温度であれば特に制限はないが、３０〜４５℃が好ましく、３２〜４２℃がさらに好ましく、３７℃前後が最も好ましい。培養は、３〜４日が好ましい。
【００２１】
培養終了後の培養物上清中には、一般的には、ナットウキナーゼ活性が約３００〜６００ＦＵ／ｍｌ、ビタミンＫ２が約１０〜１００μｇ／ｇ乾燥重量含まれている。この培養物をキトサンと接触させて、ビタミンＫ２をキトサンに吸着させる。キトサンは溶液でもよく、固体でもよいが溶液状で加えるのが好ましい。
【００２２】
キトサン処理として、キトサン単独で培養液を処理する場合、０．１〜１重量％のキトサンを含むキトサン水溶液を用いることが好ましい。好ましいキトサン濃度は０．２〜０．８重量％であり、さらに好ましくは０．３〜０．６重量％である。キトサン単独では溶解しない場合、水溶液のｐＨを酸性側にすることにより、溶解することができる。食品用途とすることを考慮すると、酢酸を０．０５〜１重量％、好ましくは０．１〜０．３重量％添加したキトサン水溶液（キトサン−酢酸混合溶液）を用いることがより好ましい。
【００２３】
培養液に対して上記キトサン水溶液またはキトサン−酢酸混合溶液を１〜１０重量％、好ましくは５〜１０重量％、より好ましくは、６〜８重量％添加し、攪拌して十分に反応させる。その後、例えば、パーライト、珪藻土などの濾過助剤を用いて、加圧型濾過機で濾過して清澄な濾液を得る。また、キトサン溶液あるいはキトサン−酢酸水溶液を培養液に添加した後、パーライト、珪藻土などの濾過助剤を添加して、適切な時間、攪拌して、加圧型濾過機で濾過し、濾液を得ることができる。本明細書でキトサン処理とは、上記いくつかの方法に限定されることなく、キトサンと培養液とを接触させることをいう。
【００２４】
なお、キトサンは、水溶液中に溶解しているものの、培養液中の菌体などを吸着し、濾過助剤で除去され、濾液中にはほとんど含まれない。上記キトサン処理により、濾液中のビタミンＫ２は、９９％以上、場合によっては９９．９％以上除去される。
【００２５】
得られた濾液は、そのまま、あるいはさらに濾過助剤などを用いて精密濾過された後、濃縮機、例えば、逆浸透圧濃縮機を用いて濃縮される。この逆浸透圧濃縮機を用いることにより、分子量１００以下の物質は大部分が除去される。さらに、必要に応じて、メンブレンフィルター、例えば、０．５μｍおよび／または０．２μｍのメンブランフィルターを用いて濃縮液を無菌濾過することにより、納豆菌培養液の濃縮液が得られる。このときの、濃縮液中のビタミンＫ２の濃度は、１μｇ／ｇ乾燥重量以下となる。
【００２６】
得られた濃縮液は、さらに濃縮されてペースト状となる。また、得られた濃縮液に対し適切な量の食品添加物、例えば、水溶性食物繊維、乳糖、セルロースなどを加え、凍結乾燥して、粉末状、あるいは顆粒状の納豆菌培養エキスが製造される。また、上記得られた濃縮液、ペースト状、粉末状、顆粒状のエキスをカプセルに封入し、納豆菌培養エキスを含有するカプセルが製造される。また、錠剤も製造される。錠剤は、糖衣錠など、種々の用途に応じて表面がコーティングされた錠剤であり得る。
【００２７】
他方、キトサン処理した濾過残渣を有機溶媒、例えば、低級アルコール類、ヘキサン、エチルエーテル、アセトン、酢酸エチルまたはこれらの混合溶媒などで抽出し、濃縮することにより、ビタミンＫ２を含有する粗生成物が得られる。好ましい混合溶媒は、ヘキサン−イソプロピルアルコール（３：２重量比）である。この粗生成物からのビタミンＫ２の回収には、分子蒸留、水蒸気蒸留などの当業者が通常用いる方法が適用される。このようにして回収されたビタミンＫ２は、骨粗鬆症などの予防・治療に利用される。
【００２８】
なお、ナットウキナーゼの活性とビタミンＫ２の定量は以下の方法によった。
（Ａ：ナットウキナーゼの活性測定）
ナットウキナーゼをフィブリンに作用させ、フィブリンの分解に伴って増加する酸可溶性低分子分解産物の量を、紫外線（２７５ｎｍ）の吸光度を測定して求める方法で測定した。
【００２９】
（a-1：フィブリノーゲン水溶液の調製）
５０ｍＭホウ砂緩衝液（ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）１０ｍｌにフィブリノーゲン（シグマ社製、牛血漿由来フィブリノーゲンフラクションＩ、ＴＹＰＥＩ−Ｓ）７２ｍｇ相当分を溶解し、０．７２％フィブリノーゲン水溶液を調製した。
【００３０】
（a-2：トロンビン溶液の調製）
トロンビン（シグマ社製、牛血漿由来）を５０ｍＭホウ砂緩衝液に溶解し、１０００Ｕ／ｍｌの濃度に調製し、使用時に同じホウ砂緩衝液を用いて５０倍に希釈（すなわち、２０Ｕ／ｍｌ）する。
【００３１】
（a-3：活性測定）
試験管に５０ｍＭホウ砂緩衝液１．４ｍｌおよびフィブリノーゲン水溶液を０．４ｍｌ量り取り、３７℃±０．３℃の恒温水槽で５分間加温した後、トロンビン溶液０．１ｍｌを加え、攪拌する。混合液を１０分間この恒温水槽に放置した後、試料溶液０．１ｍｌを混合液に加え、５秒間攪拌して恒温水槽で放置する。試料溶液を添加してから２０分後、および４０分後にそれぞれ５秒間攪拌し、６０分後に０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍｌを加えて攪拌し、さらに２０分放置する。この反応液を１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清の２７５ｎｍにおける吸光度（Ａｒ）を測定する。
【００３２】
他方で、５０ｍＭホウ砂緩衝液１．４ｍｌおよびフィブリノーゲン水溶液を０．４ｍｌ量り取り、３７℃±０．３℃の恒温水槽で５分間加温した後、トロンビン溶液０．１ｍｌを加え、攪拌する。混合液を１０分間この恒温水槽に放置した後、０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍｌを混合液に加えて攪拌する。次に、試料溶液を０．１ｍｌ加えて攪拌し、２０分放置する。この反応液を１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清の２７５ｎｍにおける吸光度（Ａｃ）を測定し、コントロールとする。
【００３３】
ナットウキナーゼの活性は以下の式により求められる。
Ａ（ＦＵ／ｍｌ）＝｛（Ａｒ−Ａｃ）／（０．０１×６０×０．１）｝×Ｄ
（Ｄは希釈倍率）
【００３４】
（Ｂ：ビタミンＫ２の定量）
また、ビタミンＫ２は、以下の方法でＨＰＬＣ用サンプルを調製し、ＨＰＬＣで測定した。
（b-1：ＨＰＬＣ用試料の調製）
測定試料０．５ｍｌ、水０．５ｍｌ、イソプロパノール１．５ｍｌを混和し、その後ヘキサン５ｍｌを加えて攪拌する。遠心分離（１７００×ｇ、１０分、２０℃）を行い、上清（有機層）４ｍｌを濃縮乾固し、１００μｌのエタノールに溶解して、サンプル溶液とする。
【００３５】
（b-2：ＨＰＬＣの条件）
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：Ｓｉｍａｚｕ  ＳＴＲ  ＯＤＳ−２  ４．６×２５０ｍｍ
溶出液：９７％エタノール
流速：  ０．７ｍｌ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
この条件におけるビタミンＫ２の保持時間は１６分の後半である。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
（試験例１〜２、試験比較例１〜２）
ポリペプトン１重量％、グルコース１重量％、肉エキス０．５重量％、ＮａＣｌ０．２重量％、ｐＨ７．０の培地を含む丸底フラスコにＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｎａｔｔｏを接種後、３７℃で１８時間培養した。得られた培養液を、同じ組成の培地を含むシード培養槽に接種し、２２時間培養してシード培養液を得た。
【００３７】
他方で、コーンスターチ６．２５重量％、脱脂大豆  ３．０９重量％、食品添加物グレードの炭酸カルシウム０．１５重量％、大豆油１．５重量％、シリコン０．００８重量％を含む、ｐＨ７．３の本培養培地を準備し、これに上記シード培養液を添加して、通気量０．５ＶＶＭ、温度３７℃で、６９時間培養した。得られた培養液中には、４７０ＦＵ／ｍｌのナットウキナーゼと５５μｇ／ｇ培養液のビタミンＫ２が含まれていた。
【００３８】
得られた培養液の一部をとり、培養液２００Ｌに対して、キトサン（株式会社共和テクノス製）０．４重量％、酢酸０．１８重量％を含むキトサン水溶液を１５ｋｇ加え、さらにパーライトを５ｋｇ添加し、攪拌した（試験例１）。別の培養液２００Ｌにはこのキトサン水溶液を１５ｋｇのみを添加し、攪拌した（試験例２）。さらに別の培養液２００Ｌにはパーライト（商品名：トプコパーライト；日本酵研株式会社製）５ｋｇのみを添加する（試験比較例１）か、珪藻土（商品名：セライト＃５０５、Celite  Corporation製：Lompoc  CA、93438-0519、米国）５ｋｇのみを添加した（試験比較例２）。それぞれの培養液を１時間攪拌後、加圧型濾過機で濾過して濾液を得た。なお、試験例２では、珪藻土を濾過助剤として濾過した。それぞれの濾液についてビタミンＫ２量を測定した結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
2006325597.tif 000002
【００４０】
表１から明らかなように、キトサン溶液を用いて処理した試験例１および２では、ビタミンＫ２がほとんど除去されていた。すなわち、キトサンとパーライトとを組合せた場合、ビタミンＫ２が９９．９９％除去された。キトサンのみでもビタミンＫ２が９９．７２％除去された。これに対して、パーライトのみを用いた場合（試験比較例１）および珪藻土のみを用いた場合（試験比較例２）、ビタミンＫ２はほとんど除去されなかった。
【００４１】
（試験例３）
試験例１で得られた濾液（キトサン−パーライト処理）１８０Ｌに、さらに珪藻土を５ｋｇ加えて加圧型濾過機を用いて精密濾過し、逆浸透膜を用いて３５Ｌまで濃縮した。この濃縮液を、０．２μｍのメンブランフィルターを通過させ、納豆菌培養エキスを得た。この納豆菌培養エキス５Ｌに対して０．２ｋｇの水溶性食物繊維を加え、凍結乾燥した後粉砕して、納豆菌培養エキスの粉末約８００ｇが得られた。得られた納豆菌培養エキスおよびその粉末中のナットウキナーゼおよびビタミンＫ２の含量を表２に示す。なお、対照として市販の納豆を２２種類購入し、その約５０ｇ中のナットウキナーゼおよびビタミンＫ２の含量を併せて表２に示す。
【００４２】
【表２】
2006325597.tif 000003
【００４３】
表２の結果が示すように、本発明により、高いナットウキナーゼ活性と０．１μｇ／ｇ乾燥重量以下の濃度のビタミンＫ２を含有する納豆菌培養エキスおよび納豆菌培養エキス粉末が得られた。特に、市販の納豆との比較により本発明の有用性が明らかになる。市販の納豆１パック（約５０ｇ）には、１０００〜２０００ＦＵのナットウキナーゼ、および３００〜６００μｇのビタミンＫ２が含まれている。すなわち、市販の納豆には１ｇ当り、２０〜４０ＦＵのナットウキナーゼが含まれているにすぎないが、本発明の納豆菌培養エキスおよびその粉末には、それぞれ、１ｇ当り、２５００ＦＵおよび１３，０００ＦＵ含まれている。本発明の納豆菌培養エキスおよびその粉末には、ぞれぞれ、市販の納豆の約６０〜１２０倍、および約３００〜６００倍のナットウキナーゼが含まれていることがわかる。
【００４４】
さらに、市販の納豆が１ｇ当り、６〜１２μｇのビタミンＫ２を含むのに対して、本発明の納豆菌培養エキスおよびその粉末には、それぞれ、０．０１μｇ、０．０５μｇのビタミンＫ２が含まれるに過ぎない。すなわち、本発明の納豆菌培養エキスおよびその粉末には、それぞれ、市販の納豆の約１／５００〜１／１０００のビタミンＫ２が含まれているにすぎないことがわかる。
【００４５】
なお、必要に応じて、得られた納豆菌培養エキス（濃縮液、ペースト状、粉末状、顆粒状）に、ビタミンＫ２を添加し、ビタミンＫ２を富化した納豆菌培養エキスとすることもできる。例えば、得られた納豆菌培養エキスとビタミンＫ２とを適切な割合、例えば、市販納豆の１パック分（約５０ｇ）のナットウキナーゼ活性値１０００〜２０００ＦＵを含み、かつ、ビタミンＫ２を成人の１日に必要な摂取量である５５〜６５μｇ含むように混合して含有するカプセル、錠剤、ドリンクなどとすることもできる。
【００４６】
（実施例１）
試験例１の製造プロセス（キトサン−パーライト処理）で生じた残渣を回収した。回収した残渣５００ｇにへキサン７５０ｇとイソプロピルアルコール５００ｇを加えてよく攪拌し、有機層をデカンテーションして集めた。有機層には、１２０μｇ／ｇのビタミンＫ２が含まれていた。この有機層を濃縮蒸発乾固（６０℃）により、精製されたビタミンＫ２を１５０ｍｇ回収した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、納豆菌培養液から簡便にビタミンＫ２を回収できるので、ナットウキナーゼやビタミンＫ２を利用する健康食品分野で特に有用である。