(57)【要約】【課題】  血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを高価で大型な装置を使うことなく、低コストでしかも短時間で簡単に、なおかつ高収率で製造することができるナットウキナーゼ製造方法を提案する。【解決手段】  ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離することによりナットウキナーゼを製造する方法。ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離した後、アルコール類を用いて当該抽出物からビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分を除去してナットウキナーゼを製造する方法。これらの製造方法によって製造したナットウキナーゼ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離することによりナットウキナーゼを製造する方法。
【請求項２】
ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離した後、アルコール類を用いて当該抽出物からビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分を除去してナットウキナーゼを製造する方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の製造方法によって製造したナットウキナーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は納豆菌の生産する血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを製造する方法に関する。特に、ナットウキナーゼを簡便、短時間で、しかも、高収率でありながら低コストで製造する方法及び、血液凝固成分であるビタミンＫと納豆特有の臭い成分とを除去してナットウキナーゼを製造する方法、これらによって製造したナットウキナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆菌培養液から納豆菌の生産する血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを抽出精製し血液凝固成分であるビタミンＫを除去する方法として、限外濾過機を用いて培養液からビタミンＫおよび臭い成分を除去してナットウキナーゼを濃縮する方法が提案されている（特開２００１−３５２９２９＝特許第３５３２５０３号）。また、納豆菌培養液にキトサンを加えてビタミンＫを凝集沈殿させて除き、その後逆浸透圧濃縮機を用いてナットウキナーゼを濃縮する方法が提案されている（特開２００１−２９９２７７）。
【０００３】
しかしながら両方法ともに高価で大型の装置を用いるため製造コストが高くなる。また抽出精製に時間がかかるためにナットウキナーゼが分解して回収率も低下する。
【特許文献１】特開２００１−２９９２７７
【特許文献２】特開２００１−３５２９２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを高価で大型な装置を使うことなく、低コストでしかも短時間で簡単に、なおかつ高収率で製造することができるナットウキナーゼ製造方法を提案することを目的としている。
【０００５】
また、このように、高価で大型な装置を使うことなく、低コストでしかも短時間で簡単に、なおかつ高収率でナットウキナーゼを製造すると共に、製造されたナットウキナーゼからは、血液凝固成分であるビタミンＫと納豆特有の臭い成分とが除去されているナットウキナーゼ製造方法を提案することを目的としている。
【０００６】
そして、これらの製造方法によって製造されたナットウキナーゼ、ビタミンＫと納豆特有の臭い成分とが除去されているナットウキナーゼを提供することを目的にしている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願の発明者は、酒類の醸造工程でおりと呼ばれているタンパク質を主成分とする不純物が、ポリフェノール類の一種であるタンニンにより沈殿除去されていることに着目し、本願発明を完成させたものである。
【０００８】
すなわち、前記課題を解決するため、この発明が提案するナットウキナーゼ製造方法は、ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離することを特徴とするものである。また、他のナットウキナーゼ製造方法は、ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離した後、アルコール類を用いて当該抽出物からビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分を除去してナットウキナーゼを製造する方法である。
【０００９】
そして、本願発明は、前記本願発明の製造方法によって製造されたナットウキナーゼ、ビタミンＫが除去されているナットウキナーゼ、納豆特有の臭い成分とが除去されているナットウキナーゼ、ビタミンＫと納豆特有の臭い成分が除去されているナットウキナーゼを提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば納豆菌の生産する血栓溶解酵素であるナットウキナーゼを簡便、短時間、高収率、低コストで製造することができる。例えば、納豆菌培養液から、ナットウキナーゼを簡便、短時間、高収率、低コストで抽出して、ナットウキナーゼを製造できる。
【００１１】
また、前記のように製造したナットウキナーゼから簡単に、血液凝固成分であるビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分を除去し、これらが除去されたナットウキナーゼを抽出精製して、簡便、短時間、高収率、低コストでナットウキナーゼを製造することができる。
【００１２】
このように、本発明によれば、例えば、納豆菌培養液から濃縮することにより、高収率でナットウキナーゼを抽出精製して、ナットウキナーゼを製造することができる。
【００１３】
こうして、心筋梗塞などの心臓病治療薬ワーファリンの効果を阻害するビタミンＫをほぼ完全に除去し、臭い成分を除去できることで、納豆嫌いの人でも困難なく摂取可能なナットウキナーゼを製造できる。
【００１４】
本発明の製造方法において、ポリフェノール類としてカテキンを使用し、納豆菌培養液からナットウキナーゼとカテキンとを結合させ、沈殿させることにより抽出してナットウキナーゼを製造することにすると、このようにして製造された本発明のナットウキナーゼにはカテキンが結合している。カテキンには、近年、抗アレルギー作用、抗腫瘍作用などの生理作用が見いだされており、アレルギー等の症状の人に対して有効な効果を発揮できるものになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明が提案するナットウキナーゼ製造方法は、ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離することを特徴とするものである。
【００１６】
ここで、ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離する形態としては、例えば、納豆菌培養液にポリフェノール類、例えば、タンニンの一種であるカテキンを加え、カテキンとナットウキナーゼとを結合させて沈殿させることにより抽出する方法を採用できる。例えば、納豆菌培養液にカテキンを加え、カテキンとナットウキナーゼとを結合させ、遠心分離によりナットウキナーゼを沈殿物として抽出することができる。
【００１７】
この沈殿物を凍結乾燥などすることによって、本発明のナットウキナーゼ（ナットウキナーゼとカテキンの結合物である）の粉末を得ることが出来る。
【００１８】
次に、本発明が提案する他のナットウキナーゼ製造方法は、ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて分離した後、アルコール類を用いて当該抽出物からビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分を除去してナットウキナーゼを製造するものである。
【００１９】
すなわち前記のようにして製造したナットウキナーゼ、例えば、前記のように、納豆菌培養液にカテキンを加え、カテキンとナットウキナーゼとを結合させ、遠心分離により抽出したナットウキナーゼの沈殿物に、アルコール類、例えば、エチルアルコールを加えてよく混合し、ビタミンＫ、又は、納豆特有の臭い成分、又はこれらの双方を除去してナットウキナーゼを製造するものである。
【００２０】
前記のナットウキナーゼの沈殿物（ナットウキナーゼとカテキンの結合物である）に、アルコール類を加えて混合し、アルコール類の中にビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分を溶解させてこれらを除去するのは、例えば、遠心分離によりビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分が除去されたナットウキナーゼ（ナットウキナーゼとカテキンの結合物である）を沈殿物として回収することができる。
【００２１】
納豆特有の臭い成分には、例えば、ジメチルピラジン、トリメチルピラジン、テトラメチルピラジン、２−メチル酪酸、イソ吉草酸、アンモニアなどがあるが、本発明においては、これらの中の少なくとも一種以上を除去するものである。
【００２２】
前記のポリフェノール類は、最終製品が食品として流通することを考慮した上で、ナットウキナーゼと結合することにより、ナットウキナーゼとポリフェノール類との結合物を分離できるようになるもの、例えば、納豆菌培養液中に添加することにより、ナットウキナーゼと結合し、沈殿する等して、抽出可能になるものであれば、いかなるものも使用できる。
【００２３】
前記のアルコール類は、ナットウキナーゼとポリフェノール類との結合物を溶解せず、その一方、ビタミンＫ及び前記に例示される納豆特有の臭い成分を溶解するものであれば使用可能である。食品であることを考慮して、例えば、エチルアルコールを使用することができる。
【００２４】
なお、前記のようにして、ビタミンＫ及び／又は納豆特有の臭い成分が除去されたナットウキナーゼ（ナットウキナーゼとカテキンの結合物である）を沈殿物として回収した後、この沈殿物に水を加えて混合して、アルコール類を水に置換した後、遠心分離で沈殿物を回収し、この沈殿物を凍結乾燥などすることによって、ビタミンＫ及び納豆特有の臭い成分が除去されている本発明のナットウキナーゼ（ナットウキナーゼとカテキンの結合物である）の粉末を得ることが出来る。
【００２５】
以下、納豆菌培養液にポリフェノール類を加えることによって、ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて抽出することにより、ナットウキナーゼとポリフェノール類との結合物を分離し、本発明のナットウキナーゼを製造する場合の一実施形態について説明する。
【００２６】
（納豆菌培養液の製造）
培地成分は最終製品が食品として流通することから食品および食品添加物であることが好ましく、澱粉や糖類などの炭素源、調味液や肉エキスなどの窒素源、炭酸カルシウムや硫酸マグネシウムなどの無機塩類などを組み合わせて調製する。
【００２７】
培地をジャーファメンターに投入し滅菌した後に納豆菌を接種し、温度３０〜４５℃、撹拌数３００〜５００rpm、通気量０．３〜２vvmで３から４日間通気撹拌培養してナットウキナーゼを大量に含む納豆菌培養液を得る。
【００２８】
なお、納豆菌培養液を製造する方法は、これに限られず、最終製品が食品として流通することを考慮した上で、ナットウキナーゼを大量に含む納豆菌培養液を製造できるものであれば、従来公知の種々の方法で製造した納豆菌培養液を使用できる。
【００２９】
なお、これ以降の工程はナットウキナーゼの分解を避けるために出来るだけ低温下で行うことが好ましい。
【００３０】
（ナットウキナーゼの抽出）
前記のようにして得た納豆菌培養液から遠心分離により納豆菌や不溶性不純物を沈殿として除き培養上清液を得る。
【００３１】
この培養上清液にカテキンを重量割合で０．５〜２％加えてよく混合し１時間ほど緩やかに撹拌する。次に本液を遠心分離し沈殿物を得る。
【００３２】
この沈殿物を凍結乾燥して、本発明のナットウキナーゼ（ナットウキナーゼとカテキンの結合物である）の粉末を得る。
【００３３】
（ビタミンＫと臭い成分の除去）
前記の沈殿物重量の１０倍量のエチルアルコールを沈殿物に加えてよく混合し３０分ほど緩やかに撹拌した後、遠心分離により沈殿物を得る。
【００３４】
再度この沈殿物に１０倍量のエチルアルコールを加えてよく混合し３０分ほど緩やかに撹拌し遠心分離により沈殿物を得る。
【００３５】
ビタミンＫと納豆特有の臭い成分はエチルアルコールに溶解するので、この工程によりビタミンＫと納豆特有の臭い成分は９９％以上が除去される。
【００３６】
（精製）
前記のようにして得た沈殿物重量の１０倍量の水を沈殿物に加えてよく混合し、エチルアルコールから水への置換を行う。その後、速やかに遠心分離により沈殿物を得てこれを予備凍結後に凍結乾燥する。
【００３７】
これによって、ビタミンＫ及び納豆特有の臭い成分が除去されている本発明のナットウキナーゼ（ナットウキナーゼとカテキンの結合物である）の粉末を得ることが出来る。
【実施例１】
【００３８】
納豆菌培養液にポリフェノール類を加えることによって、ナットウキナーゼをポリフェノール類と結合させて抽出し、本発明のナットウキナーゼを製造する場合の前述した実施形態に基づき、納豆菌培養液の上清液７５０ｇにカテキンを重量割合で１％加え、前述した工程を経て、精製工程後の凍結乾燥粉末を１．４g得た。
【００３９】
納豆菌培養液の上清液と凍結乾燥粉末のナットウキナーゼ活性（NKase）、ビタミンＫ含量（VK）は以下のようになった。
【００４０】
NKase    NKase回収率    ＶＫ      ＶＫ除去率
培養上清液    93000FU  −              3200μg    −
凍結乾燥粉末  82000FU  88%            0.21μg    99.99%
前記の通り、ナットウキナーゼは８８％と高収率で回収され、ビタミンＫは９９．９９％が除去された。
【００４１】
また、凍結乾燥粉末から納豆特有の臭いはまったくしなかった。
【００４２】
なお、ナットウキナーゼの活性測定とビタミンＫ含量の測定は、Experientia４３巻、１１１０ページ（１９８７年）（須見ら）に記載されている以下の方法によった。
【００４３】
（ナットウキナーゼの活性測定）
ナットウキナーゼをフィブリンに作用させ、フィブリンの分解に伴って増加する酸可溶性低分子分解産物の量を、紫外線（２７５ｎｍ）の吸光度を測定して求める方法で測定した。
【００４４】
（フィブリノーゲン水溶液の調製）
５０ｍＭホウ砂緩衝液（ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む）１０ｍｌにフィブリノーゲン（シグマ社製、牛血漿由来フィブリノーゲンフラクションＩ、ＴＹＰＥＩ−Ｓ）７２ｍｇ相当分を溶解し、０．７２％フィブリノーゲン水溶液を調製した。
【００４５】
（トロンビン溶液の調製）
トロンビン（シグマ社製、牛血漿由来）を５０ｍＭホウ砂緩衝液に溶解し、１０００Ｕ／ｍｌの濃度に調製し、使用時に同じホウ砂緩衝液を用いて５０倍に希釈（すなわち、２０Ｕ／ｍｌ）する。
【００４６】
（活性測定）
試験管に５０ｍＭホウ砂緩衝液１．４ｍｌおよびフィブリノーゲン水溶液を０．４ｍｌ量り取り、３７℃±０．３℃の恒温水槽で５分間加温した後、トロンビン溶液０．１ｍｌを加え、攪拌する。混合液を１０分間この恒温水槽に放置した後、試料溶液０．１ｍｌを混合液に加え、５秒間攪拌して恒温水槽で放置する。試料溶液を添加してから２０分後、および４０分後にそれぞれ５秒間攪拌し、６０分後に０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍｌを加えて攪拌し、さらに２０分放置する。この反応液を１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清の２７５ｎｍにおける吸光度（Ａｒ）を測定する。
【００４７】
他方で、５０ｍＭホウ砂緩衝液１．４ｍｌおよびフィブリノーゲン水溶液を０．４ｍｌ量り取り、３７℃±０．３℃の恒温水槽で５分間加温した後、トロンビン溶液０．１ｍｌを加え、攪拌する。混合液を１０分間この恒温水槽に放置した後、０．２Ｍトリクロロ酢酸溶液２ｍｌを混合液に加えて攪拌する。次に、試料溶液を０．１ｍｌ加えて攪拌し、２０分放置する。この反応液を１５，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清の２７５ｎｍにおける吸光度（Ａｃ）を測定し、コントロールとする。
【００４８】
ナットウキナーゼの活性Ａ（ＦＵ／ｍｌ）は以下の式により求められる
Ａ（ＦＵ／ｍｌ）＝｛（Ａｒ−Ａｃ）／（０．０１×６０×０．１）｝×Ｄ（Ｄは希釈倍率）。
【００４９】
（ビタミンＫの定量）
ビタミンＫは、以下の方法でＨＰＬＣ用サンプルを調製し、ＨＰＬＣで測定した。
【００５０】
（ＨＰＬＣ用試料の調製）
測定試料０．５ｍｌ、水０．５ｍｌ、イソプロパノール１．５ｍｌを混和し、その後ヘキサン５ｍｌを加えて攪拌する。遠心分離（１７００×ｇ、１０分、２０℃）を行い、上清（有機層）４ｍｌを濃縮乾固し、１００μｌのエタノールに溶解して、サンプル溶液とする。
【００５１】
（ＨＰＬＣの条件）
ＨＰＬＣの条件は以下の通り
カラム：Ｓｉｍａｚｕ ＳＴＲ ＯＤＳ−２４．６×２５０ｍｍ溶出液：９７％エタノール流速： ０．７ｍｌ／分検出：ＵＶ２５４ｎｍこの条件におけるビタミンＫの保持時間は１６分の後半である。