(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物を利用した３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造方法及びそれに用いる微生物を提供する。【解決手段】エピハロヒドリンを３-ハロ-１,２-プロパンジオールに変換する能力を有するリゾビウム(Rhizobium)属又はレイフソニア（Leifsonia）属に属する微生物、微生物が受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５２で特定されるリゾビウム・ラジオバクター （Rhizobium radiobacter ＭＲＣ０１株）、及びレイフソニア（Leifsonia）属に属する微生物が受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５３で特定されるレイフソニア  エスピー（Leifsonia sp.  ＭＲＣ０３株）、並びに上記のいずれかに記載の微生物又はその処理物をエピハロヒドリンと接触させ、３-ハロ-１,２-プロパンジオールを回収する３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示される化合物を、下記一般式(２) で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールに変換する能力を有するリゾビウム(Rhizobium)属、若しくはレイフソニア（Leifsonia）属に属する微生物。
【化１】
2006325520.tif 000009
【化２】
2006325520.tif 000010
【請求項２】
微生物がリゾビウム・ラジオバクター （Rhizobium radiobacter ）ＭＲＣ０１株（ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５２）である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
微生物が、レイフソニア  エスピー （Leifsonia sp.）ＭＲＣ０３株（ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５３）である請求項１記載の微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の微生物又はその処理物を下記一般式（１）で示される化合物と接触させ、下記一般式(2) で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールを回収する３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造方法。
【化３】
2006325520.tif 000011
【化４】
2006325520.tif 000012
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬中間体の原料または中間体として有用な３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造方法及びそれに用いる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで下記一般式(１)
【化５】
2006325520.tif 000002
【０００３】
で示される化合物を脱ハロゲン化及び／又はエポキシドの開環をする酵素として、シュードモナス(Pseudomonas)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、オウレオバクテリウム(Aureobacterium)属又はアグロバクテリウム(Agrobacterium)属微生物由来のものが知られている。例えば、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、オウレオバクテリウム属、アグロバクテリウム属に属する微生物の脱ハロゲン化酵素の作用により、１,３-ジハロ-２-プロパノールから光学活性３-ハロ-１,２-プロパンジオールを製造する方法（特許文献１〜３）、エピハロヒドリンから光学活性３-ハロ-１,２-プロパンジオールを製造する方法（特許文献２、４、５）及びアグロバクテリウム由来脱ハロゲン化酵素遺伝子組換え微生物を使用した光学活性３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造法（特許文献６）が知られている。
また、この他にもシュードモナス属、アルカリゲネス属を利用し、３-ハロ-１,２-プロパンジオールから(Ｓ)体又は(Ｒ)体を資化させ、残留する(Ｒ)体又は(Ｓ)体を回収する方法(特許文献７)や(Ｒ)-１-アシロキシ-３-クロロ-２-プロパノールを加水分解することで(Ｓ)-３-クロロ-１,２-プロパンジオールを得る方法（特許文献８）が知られている。
しかし、上述の方法で使用されている酵素は、シュードモナス(Pseudomonas)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、オウレオバクテリウム(Aureobacterium)属又はアグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する微生物由来の酵素のみであった。
【特許文献１】特開平０２−２９１２８０号公報
【特許文献２】特開平０５−２１９９６５号公報
【特許文献３】特開平０４−９４６８９号公報
【特許文献４】特開平０２−２８３２９５号公報
【特許文献５】特開平０４−９４６９０号公報
【特許文献６】特開平１０−２１０９８１号公報
【特許文献７】特開２００４−４１０７６号公報
【特許文献８】特開平１１−１０３８７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、微生物を利用した３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造方法及びそれに用いる微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
下記一般式（１）で示される化合物を、下記一般式(２) で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールに変換する能力を有するリゾビウム(Rhizobium)属、若しくはレイフソニア（Leifsonia）属に属する微生物。
【０００６】
【化６】
2006325520.tif 000003
【０００７】
【化７】
2006325520.tif 000004
【０００８】
リゾビウム・ラジオバクター （Rhizobium radiobacter ）ＭＲＣ０１株（ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５２）である上記微生物、レイフソニア  エスピー （Leifsonia sp.）ＭＲＣ０３株（ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５３）である上記微生物、並びに、上記のいずれかに記載の微生物又はその処理物を下記一般式（１）で示される化合物と接触させ、下記一般式(２) で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールを回収する３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造方法。
【０００９】
【化８】
2006325520.tif 000005
【００１０】
【化９】
2006325520.tif 000006
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微生物を利用した３-ハロ-１,２-プロパンジオールの製造方法及びそれに用いる微生物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に係る微生物としては、上記一般式（１）で示される化合物を上記一般式（２）で示される化合物（３-ハロ-１,２-プロパンジオール）に変換する能力を有するリゾビウム(Rhizobium)属に属する微生物又はレイフソニア(Leifsonia)属に属する微生物が挙げられ、好ましくはリゾビウム・ラジオバクター （Rhizobium radiobacter ）ＭＲＣ０１株（以下、「ＭＲＣ０１株」という。）及びレイフソニア  エスピー(Leifsonia  sp.)ＭＲＣ０３株（以下、「ＭＲＣ０３株」という。）が挙げられる。
以下にＭＲＣ０１株及びＭＲＣ０３株の分類学的性質を説明する。
【００１３】
〔分類学的性質〕
ＭＲＣ０１株及びＭＲＣ０３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に平成１７年３月９日付で寄託されており、その受領番号はＭＲＣ０１株がＦＥＲＭ ＡＰ-２０４５２及びＭＲＣ０３株がＦＥＲＭ ＡＰ-２０４５３である。
【００１４】
ＭＲＣ０１株及びＭＲＣ０３株について、株式会社エヌシーアイエムビー・ジャパン(ＮＣＩＭＢ Ｊａｐａｎ Ｃｏ., ＬＴＤ)に委託して、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（ＭＲＣ０１株が４６９ｂｐ、ＭＲＣ０３株が５０６ｂｐ）を決定（MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA)を使用）し、さらに16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹を作製し、系統分析を行った。決定されたＭＲＣ０１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。また、MＲＣ０３株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。
得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率上位１０株を決定した。更に検索された上位１０株とMＲＣ０３株の１６Ｓ  ｒＲＮＡを用いて近接結合法により分子系統樹を作製し、ＭＲＣ０１株及びＭＲＣ０３株の近縁種及び帰属分類の検討を行った。相同性検索及び系統樹の作製にはMicroSeq Microbial Identification System Software1.4.1を使用した。
【００１５】
相同性解析の結果、ＭＲＣ０１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ部分塩基配列は、相同率100%でリゾビウム・ラジオバクター （Rhizobium radiobacter）の１６Ｓ  ｒＲＮＡと一致した。また、リゾビウム  エスピー（Rhizobium sp.）ＧＨ-2001株等の１６Ｓ  ｒＲＮＡと一致した。ＭＲＣ０３株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ部分塩基配列は相同率９８．４％でレイフソニア  ポアエ（Leifsonia poae）の１６Ｓ  ｒＲＮＡに対し最も高い相同性を示した。その他にもレイフソニア（Leifsonia）由来の１６Ｓ ＲＤＮＡが検出された。１６Ｓ ｒＤＮＡを用いた解析において基準株に対して相同率が９７％以上の場合、同種である可能性があるが、二つの塩基配列は完全に一致しなかった。よって、レイフソニア  ポアエ（Leifsonia poae）に近縁であるが系統的に異なる菌株であると判断した。
以上の事から、ＭＲＣ０１株は、リゾビウム・ラジオバクター （Rhizobium radiobacter）に属する菌株であると判断した。また、ＭＲＣ０３株は、レイフソニア(Leifsonia)属に属する菌株であると判断した。
ＭＲＣ０１株又はＭＲＣ０３株を含む本発明に係る微生物の培養方法は、当該微生物が生育できる方法であればいずれの方法でもよい。
【００１６】
培養に使用する培地は、本発明に係る微生物が生育することができれば、天然培地又は合成培地のいずれでもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、マルトースやフルクトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、またはエタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、硫酸、塩酸、燐酸やホウ酸等の無機酸あるいはその塩、用いられる微生物が利用可能なナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウム等を含む無機塩、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケル微量金属塩、微生物育成促進剤としてビタミンＢ１、Ｂ２、Ｃ、Ｋ等のビタミン等が必要に応じて適宜添加される。さらに、誘導剤を培地に添加することで、一般式（１）で示される化合物を一般式（２）で示される化合物（３-ハロ-１,２-プロパンジオール）に変換する能力を有する酵素の酵素量を高めることができる。誘導剤としては、一般式（１）に示す化合物が挙げられる。例えば、１,３-ジクロロ-２-プロパノール、１,３-ジブロモ-２-プロパノール、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、３-クロロ-１,２-プロパンジオール、３-ブロモ-１,２-プロパンジオール等である。
本発明に係る微生物の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下、１０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃で行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、ｐＨ２〜１１、好ましくはｐＨ５〜９、特に好ましくはｐＨ７〜８に設定すれば良い。培養時間は、好ましくは1〜９６時間、特に好ましくは８〜７２時間である。
【００１７】
本発明に係る微生物は、培養により得られた微生物が触媒として使用される。微生物は、一般式（１）から一般式（２）の変換を触媒する。
その使用形態は、該触媒活性を示す限り特に制限されず、培養液そのまま又は該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる微生物菌体、培養上清、菌体処理物又は常法により固定化した菌体等の形で、利用することができる。処理物としては、例えば、アセトン、トルエン等で処理した菌体、菌体の破砕物、無細胞抽出物、粗酵素、精製酵素、遺伝子操作微生物等が挙げられ、菌体の破砕物、無細胞抽出物、粗酵素、精製酵素又は遺伝子操作微生物が好ましい。  
ここで、遺伝子操作微生物とは、酵素を発現し得るように宿主細胞中に該酵素をコードする遺伝子が組み込まれた微生物のことである。遺伝子操作微生物の使用形態も上記と同様に特に制限されない。また、一般に、菌体処理物、粗酵素、精製酵素又は遺伝子操作微生物等の形態では微生物菌体、菌体培養液等に比べて酵素活性が上昇することがある。
本発明において一般的に使用される基質は一般式(１)で示される。
【００１８】
【化１０】
2006325520.tif 000007
【００１９】
ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には、１,３-ジフルオロ-２-プロパノール, １,３-ジクロロ-２-プロパノール、１,３-ジブロモ-２-プロパノール、１,３-ジヨード-２-プロパノール、エピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンエピヨードヒドリン等が挙げられる。１,３-ジクロロ-２-プロパノール、１,３-ジブロモ-２-プロパノール、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンが好ましい。
【００２０】
上記一般式（１）で表される化合物は、上記微生物又はその処理物と接触させることにより下記一般式（２）で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールが生成する。
【００２１】
【化１１】
2006325520.tif 000008
【００２２】
例えば、３-フルオロ-１,２-プロパンジオール、３-クロロ-１,２-プロパンジオール、３-ブロモ-１,２-プロパンジオール、３-ヨード-１,２-プロパンジオール等である。光学活性３-クロロ-１,２-プロパンジオール、光学活性３-ブロモ-１,２-プロパンジオール等の光学活性体が特に好ましい。
【００２３】
「接触」とは、培養物又はその処理物中の酵素触媒が酵素として機能し、当該酵素触媒と基質とが酵素反応する状態であればよい。酵素として機能する条件は、例えば、ｐＨ４〜１０、好ましくはｐＨ６〜９、温度は５〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃であることに起因して、本条件下で、本発明に係る微生物又はその処理物と基質とを接触させることが好ましい。
【００２４】
微生物又はその処理物を一般式（１）で示される化合物に接触させて一般式(２) で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールを得る反応について、以下に示す。
反応液中の一般式(１)で表される基質の濃度は、 ０．０１〜１５(Ｗ/Ｖ) ％とすることが好ましい。この範囲内であると酵素安定性の観点から好ましい。基質濃度を１０％以下とすることが特に好ましい。
基質は反応液に一括して加えるかあるいは分割添加することができる。分割添加により基質濃度を一定とすることが３-ハロ-１,２-プロパンジオールの蓄積性の観点から好ましい。
【００２５】
反応液の溶媒としては、水又は緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、o-フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液あるいはグッド緩衝液等が挙げられる。この溶媒であると酵素活性の最適ｐＨ４〜１０の付近であることから好ましい。溶媒は、水とすることが特に好ましい。
【００２６】
反応時間は基質濃度、微生物又はその処理物の酵素量あるいはその他の反応条件等によって適時選択する。反応時間は、０.１〜１２０ 時間で終了するように条件を設定することが好ましい。反応時間は、０．１〜４８時間とすることが特に好ましい。この範囲内であると生産性の観点から好ましい。  
また、反応系内に微生物又はその処理物及び基質を添加する順序は問わない。例えば、培養液あるいは遠心分離等により得られた微生物又はその処理物に基質を添加する方法や微生物の培養時に基質を培養液に添加して培養と同時に反応を行う方法等が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る一般式（２）で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールの回収は、以下の方法で行うことができる。培養物又はその処理物と生成化合物との混合物が菌体又は細胞を含む場合には、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、次いで、濾過、濃縮、各種クロマトグラフィー、抽出、活性炭処理及び蒸留等の通常の方法に単独で又は適宜組み合わせて適用する。あるいは、混合物を、濾過、濃縮、各種クロマトグラフィー、抽出、活性炭処理及び蒸留等の通常の方法に単独で又は適宜組み合わせて直接適用してもよい。
例えば、反応液から遠心分離により菌体を除いた後、有機溶媒で抽出を行い、その有機相から減圧下に溶媒を除去することにより３-ハロ-１,２-プロパンジオールのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。
以上のように、本発明に係る一般式（２）で示される3-ハロ-1,2-プロパンジオールの製造方法によれば、一般式（１）の化合物から一般式（２）で示される３-ハロ-１,２-プロパンジオールを効率よく製造することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
なお、３-ハロ-１,２-プロパンジオールの定量及び光学純度は、下記の分析条件でガスクロマトグラフィーを用いて決定した。
【００２９】
＜３-ハロ-１,２-プロパンジオールの定量＞
試料調製方法：      試料を等量の酢酸エチルに溶解
装置：              カラムオーブン        島津製作所社製    ＧＣ-１７Ａ
インテグレータ        島津製作所社製    Ｃ-Ｒ５Ａ 
カラム：            ＤＢ−５             Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
キャリヤー：        Ｈｅ 純度            ９９．９９５％以上
メイクアップガス：  Ｈｅ 純度            ９９．９９５％以上
検出器ガス：        水素 純度            ９９．９９５%以上
カラム温度：        ５０℃から１０℃ずつ昇温して、２５０℃で５分保持
インジェクション温度：  ２５０℃
デテクタ温度：      ２５０℃
線速度 ：            ３５ ｃｍ／ｓ
リテンションタイム：１０ｍｉｎ
【００３０】
＜３-ハロ-１,２-プロパンジオールの光学純度＞
試料調製方法：反応液から等量の塩化メチレンで抽出を行い、p-toluenesulfonateを用いて誘導体化した後、減圧下で溶媒を除去してシロップを得、シロップ中の３-クロロ１,２-プロパンジオールを２００μｌのキャリアに溶解して、高速液体クロマトグラフィ−による光学異性体の分析を行う。
装置：        カラムオーブン              島津製作所社製  ＣＴＯ―６ＡＵＶ
ポンプ                      ジャスコ社製   ＰＵ―１５８０
インテグレーター            sic社製     Chromatocoder   ２１Ｊ
ＵＶ                        ジャスコ社製  ＵＶ １５７５
カラム：      ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＣ    ダイセル化学工業社製
キャリヤー：  ヘキサン/２-プロパノール=９８．５/１．５（容積比）
カラム温度：  ４０ ℃
流速：        ２．５ｍＬ／ｍｉｎ
波長：        ２３５ｎｍ
リテンションタイム：Ｓ体  ２０ｍｉｎ
Ｒ体  ２６ｍｉｎ
光学純度（エナンチオマー過剰率；％e.e.）は、 (Ｓ)- ３-ハロ-１,２-プロパンジオール及び(Ｒ)- ３-ハロ-１,２-プロパンジオールのＨＰＬＣによる各ピーク面積から、以下の式によって算出することができる。
Ｒ＞Ｓの場合：Ｒ体の光学純度（％e.e.）＝（Ｒ−Ｓ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ＞Ｒの場合：Ｓ体の光学純度（％e.e.）＝（Ｓ−Ｒ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ：(Ｓ)- ３-ハロ-１,２-プロパンジオールのピーク面積
Ｒ：(Ｒ)- ３-ハロ-１,２-プロパンジオールのピーク面積
【００３１】
[調製例１]
培地（培地組成；グルコース１％、ペプトン０．５％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．３％）をｐＨ７．０に調整し５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌずつ分注し、１２１℃で１５分滅菌した。培地を常温に戻してから、メンブレンフィルターで除菌した２５(ｗ/ｖ)％の３-クロロ-１,２-プロパンジオール水溶液を０．８ｍｌ添加した。
[調製例２]
３-クロロ-１,２-プロパンジオール水溶液に代えてエピクロロヒドリンを０．１ｍｌ添加した以外は、調製例１と同様の方法で培地を作成した。
【００３２】
[実施例１]
調製例１で作製された培地に、レイフソニア  エスピー（Leifsonia sp.）ＭＲＣ０３株（ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５３）をピペットマンで１００μｌ接種し３０℃で48時間振とう培養を行った。この培養液を各々遠心分離（１５０００ｘｇ）して菌体を集菌した。これに１００ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液１００ｍｌを加えた。その後、遠心分離（１５０００ｘｇ）して菌体の洗浄を行った。その後、７８０ｍＭの１,３-ジクロロ−２-プロパノール溶液（１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０）１００ｍｌに菌体を懸濁し、反応を３０℃で２３時間振とうして行った。
反応後、反応液を遠心分離（１５０００ｘｇ）し、菌体を除去した。上清中の生成3-クロロ１,２-プロパンジオールをガスクロマトグラフィーで定量し、基質からの収率を求めた。結果、６００ｍＭの３-クロロ-１,２-プロパンジオールが生成していた。また、この上清に５０ｍｌの塩化メチレンを加えて抽出を行い、p-toluenesulfonateを用いて誘導体化した後、減圧下で溶媒を除去してシロップを得、シロップ中の３-クロロ１,２-プロパンジオールを２００μｌのキャリヤーに溶解して、高速液体クロマトグラフィ−による光学異性体の分析を行った。３-クロロ-１,２-プロパンジオールの光学純度はＲ体８３%ｅｅであった。
【００３３】
[実施例２]
終濃度１１０ｍＭとなるようエピクロロヒドリンを１ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．０)３５ｍｌに添加した後、菌体を懸濁した以外は実施例１と同様の方法で行った。
結果、８６ｍＭの３-クロロ-１,２-プロパンジオールが生成していた。３-クロロ-１,２-プロパンジオールの光学純度は、Ｒ体３２％ｅｅであった。
【００３４】
[実施例３]
調製例２で作製された培地に、リゾビウム・ラジオバクター（Rhizobium radiobacter ）ＭＲＣ０１株（ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５２）を接種し３０℃で４８時間振とう培養を行った。この培養液を各々遠心分離（１５０００ｘｇ）して菌体を集菌した。これに１００ｍＭ 燐酸緩衝液(ｐＨ７．０)１００ｍｌを加え、遠心分離（１５０００ｘｇ）して菌体の洗浄を行った。同緩衝液５０ｍｌに、菌を懸濁し菌液とした。その後、１５６ｍＭの１,３-ジクロロ-２-プロパノール溶液（１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．０）１００ｍｌに上記菌液５０ｍｌを混合し、反応を２０℃で３０分間振とうして行った。反応後、反応液を遠心分離（１５０００ｘｇ）し、菌体を除去した。実施例１と同様の方法で分析した結果、１５６ｍＭの３-クロロ-１,２-プロパンジオールが生成していた。３-クロロ-１,２-プロパンジオールの光学純度は、Ｓ体９５％ｅｅであった。
【００３５】
[実施例４]
菌体の洗浄を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液１００ｍｌで行った以外は実施例３と同様の方法で行った。同緩衝液５０ｍｌに、菌を懸濁し菌液とした。終濃度１１０ｍＭとなるようエピクロロヒドリンを１ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．０)３５ｍｌに添加し、上記菌液５０ｍｌを混合し、反応を３０℃で２３時間振とうして行った以外は実施例３と同様の方法で行った。その結果、７０ｍＭの３-クロロ-１,２-プロパンジオールが生成していた。シロップの比旋光度は、Ｓ体の光学純度５％ｅｅであった。
【００３６】
[実施例５]
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８．０)緩衝液１４０ｍｌで３回洗浄した以外は実施例１と同様の方法で行った。同緩衝液５０ｍｌに、培養して得られた菌を遠心分離（１５０００ｘｇ）して得たものを懸濁し、超音波で菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離して上清を回収した。この上清を粗酵素液とした。粗酵素液に1,3-ジクロロ−２−プロパノールを終濃度５０ｍＭになるよう添加し、反応を２０℃で５０分間振とうして行った。分析した結果、３６ｍＭの３-クロロ-１,２-プロパンジオールが生成していた。光学純度が８７％ｅｅで(Ｒ)-３-クロロ-１,２-プロパンジオールあった。
【００３７】
[実施例６]
実施例３と同様の方法でリゾビウム・ラジオバクター （Rhizobium radiobacter ）ＭＲＣ０１株（ＦＥＲＭ  ＡＰ-２０４５２）の菌体を得た。実施例５と同様の方法で粗酵素液を得た。得られた粗酵素液に１,３-ジクロロ−２−プロパノールを終濃度５０ｍＭになるよう添加し、反応を２０℃で３０分間振とうして行った。分析した結果、４６ｍＭの３-クロロ-１,２-プロパンジオールが生成していた。光学純度が９６％ｅｅの(Ｓ)-３-クロロ-１,２-プロパンジオールであった。
【配列表】
2006325520000001.app