(57)【要約】【課題】複数個のポリヌクレオチドからなる群からプローブを選択する方法を提供する。【解決手段】特定の配列を有するポリヌクレオチドを選択してポリヌクレオチド群を形成するステップと、ポリヌクレオチド群のうちの各ポリヌクレオチドから特定の長さのポリヌクレオチド断片を生成し、ポリヌクレオチド断片の配列及び位置情報を得るステップと、得られたポリヌクレオチド断片の配列及び位置情報を利用し、それぞれのポリヌクレオチド断片に配列特異的な確認番号を付与するステップと、ポリヌクレオチド群の各ポリヌクレオチドから得られる各断片の確認番号を比較してプローブを選択するステップとを含む、複数個のポリヌクレオチドからなる群からプローブを選択する方法である。【選択図】図１
2006122051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の配列を有するポリヌクレオチドを選択してポリヌクレオチド群を形成するステップと、
前記ポリヌクレオチド群のうちの各ポリヌクレオチドから特定の長さのポリヌクレオチド断片を生成し、前記ポリヌクレオチド断片の配列情報及び位置情報を得るステップと、
得られたポリヌクレオチド断片の配列情報及び位置情報を利用し、前記ポリヌクレオチド断片それぞれに配列特異的な確認番号を付与するステップと、
前記ポリヌクレオチド群の各ポリヌクレオチドから得られる各ポリヌクレオチド断片の確認番号を比較してプローブを選択するステップと、
を含む、複数個のポリヌクレオチドからなる群からプローブを選択する方法。
【請求項２】
配列特異的な確認番号を付与する前記ステップは、
前記得られたポリヌクレオチド断片の５’末端ヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドに向かって１つのヌクレオチド単位で移動し、該当位置のヌクレオチドの塩基が、
Ａである場合に０、
Ｔである場合に４（Ｌ−ｉ）／４、
Ｇである場合に４（Ｌ−ｉ）／２、
Ｃである場合に４（Ｌ−ｉ）×（３／４）、
をそれぞれ付与してこれらを合計した後、
４１から４（Ｌ−１）までの値を合計して得られる値を更に合わせて得られる値を前記ポリヌクレオチド断片の確認番号として付与するステップであり、
前記Ｌは、各ポリヌクレオチド断片の長さ（ｂｐ）であり、
ｉは、０からＬ−１の整数であって、５’末端ヌクレオチドを０として、３’末端側に１ヌクレオチド進むごとに、１ずつ増加する整数であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブは、各ポリヌクレオチドに特異的な配列または各ポリヌクレオチドに共通した配列であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
各ポリヌクレオチドに対して特異的なプローブを選択する場合であり、ミスマッチされるヌクレオチドを含む特異的なプローブを選択しようとする場合において、
前記各ポリヌクレオチド断片に配列特異的な確認番号を付与するステップは、確認番号が付与された前記断片に含まれる一つ以上のヌクレオチドがミスマッチしているポリヌクレオチド断片を生成し、それらに配列特異的な確認番号を付与するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列特異的な確認番号を付与する前記ステップは、
前記得られたポリヌクレオチド断片の５’末端ヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドに向かって１つのヌクレオチド単位で移動し、該当位置のヌクレオチドの塩基が、
Ａである場合に０、
Ｔである場合に４（Ｌ−ｉ）／４、
Ｇである場合に４（Ｌ−ｉ）／２、
Ｃである場合に４（Ｌ−ｉ）×（３／４）、
をそれぞれ付与してこれらを合計した後、
４１から４（Ｌ−１）までの値を合計して得られる値を更に合わせて得られる値を前記ポリヌクレオチド断片の確認番号として付与するステップであり、
前記Ｌは、各ポリヌクレオチド断片の長さ（ｂｐ）であり、
ｉは、０からＬ−１の整数であって、５’末端ヌクレオチドを０として、３’末端側に１ヌクレオチド進むごとに、１ずつ増加する整数であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択された配列特異的プローブのうちミスマッチされるヌクレオチドを含む配列特異的プローブが含まれている場合、
前記ミスマッチされるヌクレオチドを含む配列特異的プローブから特定の長さのポリヌクレオチド断片を生成して配列情報及び位置情報を得て、前記配列情報及び位置情報を利用して前記ポリヌクレオチド断片に配列特異的な確認番号を付与するステップと、
前記ミスマッチされるヌクレオチドを含む各配列特異的プローブから得られる前記ポリヌクレオチド断片の配列特異的な確認番号を比較し、前記配列特異的な確認番号の出現頻度が最も高い前記ミスマッチされるヌクレオチドを含む配列特異的プローブをプローブとして選択するステップと、
をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド断片の位置情報から、一定の領域内で標的ポリヌクレオチドに対して特異的なプローブの出現頻度が高い領域を選択し、前記領域内に存在するプローブを配列特異的プローブとして選択する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数個のポリヌクレオチドからなる群からプローブを選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プローブとは、標的物質に特異的に結合する物質をいう。核酸プローブを設計するにあたり、従来には研究者が共通プローブを設計するか、または特異的プローブを設計するかにより、一般的に二種のプローブ設計法が広く使われた。共通プローブを設計しようとする場合には、多様な種または多様な科の遺伝子のうちから共通配列、すなわちコンセンサス配列を発見しようとする。共通プローブを設計する第１ステップは、興味の対象となる遺伝子を探すことである。これは、公用データベース（例、ＧｅｎＢａｎｋまたはＭｅｄｌｉｎｅ）からキーワード検索または相同性検索を行うことによりなすこともでき、または興味の対象となる遺伝子のうち一つと前記データベースの全体配列との間の相同性分析を行うことによってもなされる。第２ステップは、興味の対象となる関連遺伝子全てを検索することである。第３ステップは、ＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｏｆ  Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ｃａｌｉｆ．、米国）のような商業的に利用可能なプログラムを利用して多重整列分析を行う。このステップで、要求のあった配列のうちから共通したポリヌクレオチドを確認する。次に、得られた共通領域の配列をプログラムに入力し、二次構造を解析し、決められたＴｍ（融解温度）で二次構造のない候補プローブを選択する。選択された候補プローブを最終的に公用データベース（例、Ｇｅｎｂａｎｋ）の全体配列と比較し、クロスハイブリダイズが起こる配列があるか否かを検査し、クロスハイブリダイズが起こらない配列を最終プローブとして選抜する。
【０００３】
特異的なプローブを設計しようとする場合には、多様な種、科及びデータベースの公開された配列のうちから、固有な配列を探す。特異的プローブは、１つの特定の遺伝子座にだけハイブリダイズするプローブをいう。それらプローブを選抜する第１ステップは、例えば、公用データベース（例、ＧｅｎＢａｎｋまたはＭｅｄｌｉｎｅ）に対してキーワード検索を行うことによって興味の対象となる遺伝子を探し、あらゆる関連する遺伝子の情報を得る。この段階でまず、多重整列分析を利用して、前記得られた遺伝子とデータベース（例、Ｇｅｎｂａｎｋ）の公開された配列との相同性検索を行い、共通領域と、固有な領域と、を探すこともできる。第２ステップは、研究者は得られた特異的な領域のプローブ（候補プローブ）をプログラムに入力し、二次構造が存在するか否かを検査し、決められたＴｍで二次構造のない配列をプローブとして選択する。最後に、得られた候補プローブをデータベース（例、ＧｅｎＢａｎｋ）に公開された配列と比較し、同じ配列があるか否かを確認し、同じ配列が検索されないものを特異的なプローブとして選抜する。
【０００４】
しかし、前記のような従来技術は、いずれも多重整列分析を使用している。同方法は、標的とする複数個のポリヌクレオチドを一定の条件により、ヌクレオチドを互いに対応するように整列させ、前記複数個のポリヌクレオチドのうちから完全にマッチする領域とそうではない領域とを相互比較してプローブを選抜する。しかし、この方法による場合、ポリヌクレオチドを互いに整列してその配列を比較するために時間が長くかかり、更に配列の整列は、整列の条件によって変わりうるという短所がある。例えば、ヌクレオチドを読み取る間隔をどの程度まで許容して整列させるかを決定するギャップ条件により、整列結果が変わることがある。また、プローブを反復的に設計せねばならない場合にも、反復してポリヌクレオチドの間を整列せねばならないという短所があった。
【０００５】
かかる従来技術以外に、共通プローブまたは特異的プローブを探す方法の例として、日立化成工業株式会社のオリゴプローブ指定法（特許文献１参照）を例に挙げられる。同方法は、２つの配列を比較する方法を記述しているが、これを複数個の配列に反復適用すれば、共通プローブまたは特異的プローブを探すことができる。
【０００６】
特許文献１に記載の方法のうち一つは、ミスマッチモデルを構成する基本的なプログラムであり「ｋ  ｄｉｆｆ」と名付けられている。ウォーターマン−ペブツナーアルゴリズム（ＷＰＡＬＧ）というコンピューターに基づくプローブ選択処理がｋ  ｄｉｆｆにおいて２つの配列間の１以上の長さ（長さはユーザが特定する）のマッチ（適正塩基対合）の位置およびｋ個以下のミスマッチ（ｋもユーザが特定する）を見付けるために用いられている。候補となるオリゴヌクレオチドプローブがこれとうまく整合しなければ、それは特異的なものであるとみなされる。例えば、ユーザがプローブ長（ｌ）に１８を選択し、２個以下のミスマッチ（ｋ）があると仮定する。２個のミスマッチと共に１個のマッチ（適正塩基対合）が存在すれば、６に等しい長さの完全にマッチする（適正塩基対合を形成する）サブ配列が必ずあるはずである。シードの長さが決まったら、ミスマッチモデルはそのシード長（この例ではシード長は６である）の全サブストリングを調べ、長さ６の完全にマッチするサブ配列を見付け、さらにこのサブ配列はユーザが選択したプローブ長（すなわちこの例では２０）と等しい長さの配列まで延びているかどうか調べる。この配列まで延びている場合、ユーザの基準を満たす候補プローブが見付かったことになる。
【０００７】
従って、従来技術によっても、共通プローブまたは特異的プローブを複数個のポリヌクレオチドから速くかつ正確に選抜できる方法は、相変らず要求されている。
【特許文献１】特表平８−５０３０９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、非常に長いポリヌクレオチドに適用した場合、効率が悪く時間がかかるおそれがある。
【０００９】
本発明の目的は、速くかつ正確にプローブを選抜できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、特定の配列を有するポリヌクレオチドを選択してポリヌクレオチド群を形成するステップと、前記ポリヌクレオチド群のうちの各ポリヌクレオチドから特定の長さのポリヌクレオチド断片を生成し、前記ポリヌクレオチド断片の配列情報及び位置情報を得るステップと、得られたポリヌクレオチド断片の配列情報及び位置情報を利用し、前記ポリヌクレオチド断片それぞれに配列特異的な確認番号を付与するステップと、前記ポリヌクレオチド群の各ポリヌクレオチドから得られる各ポリヌクレオチド断片の確認番号を比較してプローブを選択するステップとを含む、複数個のポリヌクレオチドからなる群からプローブを選択する方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法の一具現例で、配列特異的な確認番号を付与する前記ステップは、前記得られたポリヌクレオチド断片の５’末端ヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドに向かって１つのヌクレオチド単位で移動し、該当位置のヌクレオチドの塩基がＡである場合に０、Ｔである場合に４（Ｌ−ｉ）／４、Ｇである場合に４（Ｌ−ｉ）／２、及びＣである場合に４（Ｌ−ｉ）×（３／４）をそれぞれ付与してこれらを合計した後、４１から４（Ｌ−１）までの値を合計して得られる値を更に合わせて得られる値を前記ポリヌクレオチド断片の確認番号として付与するステップであることが好ましく、前記Ｌは、各ポリヌクレオチド断片の長さ（ｂｐ）であり、ｉは、０からＬ−１の整数であって、５’末端ヌクレオチドを０として３’末端側に１ヌクレオチド進むごとに１ずつ増加する整数である。
【００１２】
本発明において、「プローブ」とは、標的ポリヌクレオチドに対して特異的に結合する配列を含むポリヌクレオチドをいう。かかるプローブには、例えば、複数個のポリヌクレオチドに共通した配列を含んでおり、それらポリヌクレオチドいずれにも特異的に結合するプローブ及び複数個のポリヌクレオチドのうちから特定のポリヌクレオチドだけに特異的な配列を含んでおり、前記特定のポリヌクレオチドに特異的なプローブが含まれる。本発明において、前記プローブは、核酸増幅のためのプライマーとして使われうる。本発明で使われるプローブには、標的ポリヌクレオチドと完全に相補的な配列だけではなく、ミスマッチされるヌクレオチドを含んでいるが、反応条件によって標的ポリヌクレオチドと特異的に結合できる配列を含む。
【００１３】
本発明の方法の一具現例で、複数個のポリヌクレオチドのうちから各ポリヌクレオチドに対して特異的なプローブを選択する場合であり、ミスマッチされるヌクレオチドを含む特異的なプローブを選択しようとする場合、前記各ポリヌクレオチド断片に配列特異的な確認番号を付与するステップは、確認番号が付与された前記断片に含まれる一つ以上のヌクレオチドがミスマッチしているポリヌクレオチド断片を生成し、それらに配列特異的な確認番号を付与するステップをさらに含むことができる。この場合、配列特異的な確認番号を付与するステップは、前記得られたポリヌクレオチド断片の５’末端ヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドまで１つのヌクレオチド単位で移動し、該当位置のヌクレオチドの塩基がＡである場合に０、Ｔである場合に４（Ｌ−ｉ）／４、Ｇである場合に４（Ｌ−ｉ）／２、及びＣである場合に４（Ｌ−ｉ）×（３／４）をそれぞれ付与して前記値を加えた後、４１から４（Ｌ−１）の値をそれぞれ加えて得られる値を合わせて得られる値を前記ポリヌクレオチド断片の確認番号として付与するステップであることが好ましく、前記Ｌは、各ポリヌクレオチド断片の長さであり、ｉは、０からＬ−１の整数であって、５’末端ヌクレオチドを０として３’末端側に１ヌクレオチド進むごとに１ずつ増加する整数でありうる。
【００１４】
本発明の方法において、一次的に選択されるプローブのうちには、標的ポリヌクレオチドに完全相補的なプローブだけではなく、一定数のミスマッチされるヌクレオチドを含むプローブも含まれうる。このように、選択された配列特異的プローブのうちミスマッチされるヌクレオチドを含む配列特異的プローブが含まれている場合、それらプローブのうちから最適のプローブを選択する必要がある。
【００１５】
本発明の方法の一具現例は、ミスマッチされるヌクレオチドを含む配列特異的プローブから特定の長さのポリヌクレオチド断片を生成して配列情報及び位置情報を得て、前記配列情報及び位置情報を利用し、前記ポリヌクレオチド断片に配列特異的な確認番号を付与するステップと、前記ミスマッチされるヌクレオチドを含む各配列特異的プローブから得られる前記ポリヌクレオチド断片の配列特異的な確認番号を比較し、前記配列特異的な確認番号の出現頻度が最も高い前記ミスマッチされるヌクレオチドを含む配列特異的なプローブをプローブとして選択するステップとをさらに含みうる。
【００１６】
本発明の方法の一具現例は、前記ポリヌクレオチド断片の位置情報から、一定の領域内で標的ポリヌクレオチドに対して特異的なプローブの出現頻度が高い領域を選択し、前記領域内に存在するプローブを配列特異的プローブとして選択しうる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法によれば、確認番号を利用してプローブを選抜するために、ゲノムポリヌクレオチドのような非常に長いポリヌクレオチドに対しても、速くかつ効率的にプローブを設計できる。また、本発明の方法によれば、確認番号を利用してプローブを選抜するために、多重整列を行わずに、別途、ハイブリダイゼーションによる検定過程を経ずともプローブを設計できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、添付された図面を参照し、本発明の望ましい実施形態を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の方法の一具現例は、ポリヌクレオチド断片の位置情報から、一定の領域内で標的ポリヌクレオチドに対して特異的なプローブの出現頻度が高い領域を選択し、前記領域内に存在するプローブを配列特異的プローブとして選択することである。
【００２０】
図１は、本発明の方法を表すフローチャートである。まず、複数個のポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド群を選択する。それらポリヌクレオチド群には、プローブの標的または前記標的と互いに区別されねばならないポリヌクレオチドが含まれる。前記ポリヌクレオチドは、任意の個体の染色体ポリヌクレオチドだけではなく、それらから由来した断片でもよい。
【００２１】
次に、選択されたポリヌクレオチド群から各ポリヌクレオチドに対してプローブ候補として使用可能な特定の長さを有する断片を生成する。生成された断片について、配列及び位置情報を得る。前記位置情報は、染色体上の特定の基準点（例、複製開始点）から定められる位置、または選択されたポリヌクレオチドに対して５’末端から定められる位置でもよいが、これらの例に限定されるものではない。本発明において、各ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド断片を生成する方法は、特別に限定されず、プローブを選択する具体的な条件によって変わりうる。前記断片を生成する方法は、例えば、特定の長さを有するあらゆる断片を生成するものが含まれる。図２は、長さｎが２２（ｂｐ）のポリヌクレオチドから長さＬが６（ｂｐ）であるポリヌクレオチド断片を生成する例を表す図面である。図２に示すように、ポリヌクレオチド断片長Ｌが６（ｂｐ）であるポリヌクレオチド断片を、１つのヌクレオチドの間隔で５’末端から３’末端側に移動しつつ生成した。この結果、１７個のポリヌクレオチド断片が生成する。
【００２２】
次に、生成された断片について配列特異的な確認番号を付与する。前記確認番号は、前記断片の配列に特異的に付与されるものであるならば、任意の方法によって付与可能である。例えば、下記のように、５’末端ヌクレオチドからの位置と塩基の種類とにより、異なる数を付与した後、それらの値を合算することによって前記確認番号が付与される。具体的に、断片の５’末端ヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドまで１つのヌクレオチド単位で移動し、該当位置のヌクレオチドの塩基がＡである場合に０、Ｔである場合に４（Ｌ−ｉ）／４、Ｇである場合に４（Ｌ−ｉ）／２、及びＣである場合に４（Ｌ−ｉ）×（３／４）とした後、各ヌクレオチドに振られた値を合計したものと、４１から４（Ｌ−１）の値を合計して得られる値と、を合わせて得られる値を前記ポリヌクレオチド断片の確認番号として付与できる。ここで、Ｌは、各ポリヌクレオチド断片の長さであり、ｉは、０からＬ−１の整数であって、５’末端ヌクレオチドを０として、３’末端側に１ヌクレオチド進むごとに、１ずつ増加する整数である。
【００２３】
かような方法により、長さ８ｂｐであるポリヌクレオチド断片について付与された配列特異的な確認番号の例は、下記表１の通りである。
【００２４】
【表１】
2006122051.tif 000003
【００２５】
断片配列ａｇｔｃｔａｇａに対して前記確認番号は、Ｌ＝８、５’末端のａの位置をｉ＝０として、１つのヌクレオチド間隔で３’末端に向かって移動しつつ各塩基に対して付与された値を計算し、ここに４１から４７の値をそれぞれ加えて得られる値を合算して得られた。すなわち、｛０＋４７／２＋４６／４＋４５×３／４＋４４／４＋０＋４２／２｝＋｛４＋４２＋４３＋４４＋４５＋４６＋４７｝＝３１９００であった。同様にして、断片配列ｃｔａｇｇｔａｇからは７５７５０という確認番号が得られ、断片配列ｔａｇｇｃｇｃｃからは４１０２７という確認番号が得られる。
【００２６】
次に、得られた前記断片に対する確認番号を利用し、各ポリヌクレオチドから得られた断片の集合の中での特定の確認番号の出現頻度と、他のポリヌクレオチドから得られた断片の集合の中での前記特定の確認番号の出現頻度とを比較することにより、前記断片のうちからプローブを選択する。本発明において、「各断片の確認番号」を比較するということは、前記確認番号と関連する情報（位置、配列、頻度）をそれぞれ比較するという意味であり、特定のポリヌクレオチドから得られる断片の確認番号の出現頻度及びその位置などを比較することが含まれるが、それらの例に限定されるものではない。
【００２７】
比較結果、所定の要件を満足する断片をプローブとして選択できる。例えば、Ａ、Ｂ及びＣポリヌクレオチドから各断片を生成し、前記各断片に確認番号を付与し、それらを比較し、Ａポリヌクレオチドから由来し、ＢとＣポリヌクレオチドからは由来しない断片確認番号を有する配列部位を、Ａポリヌクレオチドに対する特異的プローブとして選択できる。
【００２８】
本発明の特異的あるいは共通的プローブ生成は、一度の配列比較を介して生成されたインデックスを再使用して使用するので、特異的あるいは共通的プローブ生成のために多重配列分析をする従来の方法や、ｋ＿ｔｕｐｌｅの種配列を生成して１つのｂｐずつ拡張して配列を比較する特許文献１の方法に比べて比較演算の回数が少ない。共通的、特異的配列の長さ、許容される不一致の個数、共通的、特異的配列を抽出しようとする対象によって所要時間が変わりうるが、一般的な式で表した本発明の比較演算回数と特許文献１の方法の比較演算回数は、次の通りである。
【００２９】
本発明の比較演算回数は、プローブ断片長さ（Ｐｒｏｂｅ  Ｌｅｎｇｔｈ）：ｐｒｏｂｅＬ、許容するミスマッチ個数：ｎ、検索する配列の数：ｄｂＳｉｚｅであるときの比較回数Ｏ（ｎ）は、ｐｒｏｂｅＬＣｎ＜Ｏ（ｎ）＜ｐｒｏｂｅＬＣｎ＊ｄｂＳｉｚｅの領域間の値として決定される。
【００３０】
特許文献１の発明の比較演算回数は、プローブ断片長さ：ｐｒｏｂｅＬ、ｋ＿タプル長さ：ｋ＿ｔｕｐｌｅＬ（ｋ＿タプル長さは、プローブの長さとミスマッチ数とが決まっているときに存在する最小の連続した配列の長さである；例えば、１８ｂｐのプローブ長さの配列で、２ｂｐのミスマッチを許容するならば、少なくとも６ｂｐの連続された配列が存在する）、許容するミスマッチ個数：ｎ、検索する配列の数：ｄｂＳｉｚｅ、検索する配列の平均長さ：ｌであるとき、ｄｂＳｉｚｅ（（ｌ−ｋ＿ｔｕｐｌｅＬ＋１＋ｎ））＜Ｏ（ｎ）＜ｄｂＳｉｚｅ（ｌ−ｋ＿ｔｕｐｌｅＬ＋１＋ｐｒｏｂｅＬ−ｋ＿ｔｕｐｌｅＬ＋１）の領域間の値として決定される。
【００３１】
かかる演算の比較は、単位だけで比較すれば、本発明の方が比較の回数がさらに多い。しかし、特許文献１の方法は、共通的あるいは特異的プローブ配列の導出という問題で、配列のメモリへのローディング、分析する配列の特定部分の接近のための前処理などの時間がかかる一方、本発明の方法は、すでに生成されたインデックスだけを使用するので、データ獲得時間以外に付加的な時間は必要ではない。配列情報の処理のための時間が必要ではなく、実際的なプローブの長さが２０ｂｐから３０ｂｐほどであることを勘案すれば、本発明の比較演算回数は、実用的な時間内に計算可能である。
【００３２】
本発明の方法はまた、前記の方法によって得られた候補プローブからミスマッチされるヌクレオチドを含む候補プローブを決定し、それらからミスマッチされるヌクレオチドを含むプローブを選択するのに使われうる。例えば、確認番号１４１２３１であるａｃｇｔａｔに対して１つのミスマッチするヌクレオチドを含むプローブを選択しようとする場合、前記ａｃｇｔａｔに対して１つのヌクレオチドがミスマッチされるポリヌクレオチドｔｃｇｔａｔ、ｇｃｇｔａｔ、ｃｃｇｔａｔ、ａａｇｔａｔ、ａｔｇｔａｔ、ａｇｇｔａｔ…（３×ｎ個：ｎはヌクレオチドの個数）を得て、それらに前記のような方法で確認番号を付与し、それらを比較することによってプローブを選択できる。
【００３３】
本発明の方法はまた、標的ポリヌクレオチドとミスマッチされるヌクレオチドを含むプローブのうちから、最も適したプローブを選抜するのに使われうる。例えば、複数個のミスマッチされるヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに対して特定の長さを有する断片を生成し、前記断片に前記のような配列特異的な確認番号を付与し、それらを比較して標的ポリヌクレオチドに対して完全相補的な断片の出現頻度が最も高い断片をプローブとして選抜できる。
【００３４】
本発明の方法はまた、一定の領域内で出現頻度が高いプローブをプローブとして選択できる。かかるプローブの選択は、ポリヌクレオチド断片の確認番号と共に位置情報を利用し、一定の領域の範囲を限定した後、その範囲内で存在し、特定の標的ポリヌクレオチドに対して特異的なプローブとして確認された断片の確認番号の出現頻度を比較することによってなされうる。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００３６】
本実施例では、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７及びＫ−１２：ＭＧ１６５５の染色体配列から大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７だけに特異的な８ｂｐ長さのプローブを選抜した。また、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対して特異的な前記８ｂｐ長さのプローブが最も密集している領域を選抜し、その領域内に含まれるプローブを選抜した。
【００３７】
まず、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチド（全長配列受託番号ＡＥ００５１７４：５，４９８，４５０ｂｐ）及びＫ−１２：ＭＧ１６５５のゲノムポリヌクレオチド（全長配列受託番号Ｕ０００９６：４，６３９，２２１ｂｐ）をそれぞれ選択し、前記各ポリヌクレオチドから８ｂｐの断片を生成し、配列及び位置情報を得て保存した（Ｏｒａｃｌｅ  ９ｉ  ｄａｔａｂａｓｅ使用）。得られた各断片についての確認番号情報を利用し、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチド及びＫ−１２：ＭＧ１６５５のゲノムポリヌクレオチドでの出現頻度を比較し、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチドにのみ存在する確認番号をもとに大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチドに特異的に存在する断片をプローブとして選抜した。
【００３８】
その結果、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチドに特異的な１３１種の８ｂｐプローブを選抜し、それらプローブの位置は３２０個の部位に存在した。それらプローブのうち大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチドで最も出現頻度が高いのは、ｇｔｇｇｇｃｃｃであって１２回出現した。前記１３１種の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチドに特異的なプローブの一部例を下記表２に表した。
【００３９】
【表２】
2006122051.tif 000004
【００４０】
次に、上記の通りに選択された１３１種の８ｂｐプローブのうちから最適のプローブを選抜した。最適プローブの選抜は、前記１３１種のプローブそれぞれに対して１ｂｐが異なった断片を生成し、それら１ｂｐのミスマッチヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列が大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のゲノムポリヌクレオチド及びＫ−１２：ＭＧ１６５５のゲノムポリヌクレオチドに出現する頻度と、出現した種類の個数とを確認し、相互比較することによってなされた。かような比較結果の一部は、下記表３に表した。
【００４１】
【表３】
2006122051.tif 000005
【００４２】
その結果、ｃｃｔｃｔａｇｇ配列（確認番号８５１５０）と、その１ｂｐが異なったプローブの集合とが最適プローブ群として選抜された。
【００４３】
本実施例では、かように選抜された複数個のプローブから一定の領域に密集しているプローブを優先的に選抜し、最終的に一定領域に密集している最適のプローブを選抜した。プローブが一定領域に密集している場合には、それらプローブは、その領域を増幅するためにＰＣＲプライマーとして使用されるか、または特定配列の存在を検証するハイブリダイゼーション方法でプローブとして使用されうる。さらに、ＰＣＲのような増幅反応によって得られる標的ポリヌクレオチドを多様なプローブを使用して分析することができるという長所がある。
【００４４】
一定領域にプローブが密集している場合には、位置情報を利用して領域の区間を定め、その区間内に含まれる前記一次的に選抜されたプローブの個数を決定することによってプローブを決定することができる。
【００４５】
以上のような実施例の結果から、本発明の方法によって標的ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド断片を得て、それらに配列特異的な確認番号を付与し、それを利用してプローブを設計できることが分かった。また、標的ポリヌクレオチドから得られたポリヌクレオチド断片に対して付与された確認番号は、反復して使用できるために、従来のように毎度配列を整列せずとも速かにプローブを設計できる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の複数個のポリヌクレオチドからなる群からプローブを選択する方法は、例えばプローブ設計関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の方法を表すフローチャートである。
【図２】２２ｂｐのポリヌクレオチドから長さ６ｂｐであるポリヌクレオチド断片を生成する例を表す図面である。
【図１】
2006122051.tif 000006
【図２】
2006122051.tif 000007
【配列表】
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