(57)【要約】【課題】  本発明は、胞子（分生子）の生存性を低減せしめた、特にバイオハザード対策に好適な糸状菌を新規に作成する。【解決手段】  転写制御因子タンパク質をコードするａｔｆＢ遺伝子を欠失または変異させることにより、胞子の生存性を低減せしめればよく、例えば、ａｔｆＢ遺伝子を欠失または変異させてなる遺伝子破壊用プラスミドを構築し、このプラスミドを用いて糸状菌を形質転換すればよい。得られた形質転換体は、戸外等において紫外線に当ると短時間に死滅するため、たとえ遺伝子操作した糸状菌が管理区域内に飛散しても安全である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌が有する転写制御因子タンパク質をコードするａｔｆＢ遺伝子のＤＮＡを完全にまたは部分的に欠失させるか、あるいは変異させること、を特徴とする糸状菌の胞子の生存性を低滅させる方法。
【請求項２】
ａｔｆＢ遺伝子のＤＮＡが以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡであること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ遺伝子発現制御活性を有するタンパク質
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものであること、を特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
ａｔｆＢ遺伝子の少なくとも一部を欠失又は変異せしめたＤＮＡを含んでなるａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドを構築する工程、及び、得られたプラスミドで糸状菌を形質転換する工程を包含すること、を特徴とする分生子の生存性を低滅せしめた糸状菌の作成方法。
【請求項５】
ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドが、ａｔｆＢ５’領域、マーカー遺伝子、ａｔｆＢ３’領域のＤＮＡを包含してなること、を特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マーカー遺伝子がｓＣ遺伝子であること、を特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａｔｆＢ５’領域のＤＮＡが、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡを含むものであること、を特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項８】
ａｔｆＢ’領域のＤＮＡが、以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡを含むものであること、を特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
（ｅ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項９】
ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドが、直線状にした際にａｔｆＢ５’領域、ｓＣ遺伝子、ａｔｆＢ３’領域が順番に配置されているΔａｔｆＢのＤＮＡをベクターｐＵＳＣに導入してなるｐＵＳＣΔａｔｆＢであること、を特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ΔａｔｆＢのＤＮＡが、以下の（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡを含むものであること、を特徴とするａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミド作成用のＤＮＡ。
（ｇ）  配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）  配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胞子（分生子）の生存性を低減せしめた、特にバイオハザード対策に好適な糸状菌の作成に関するものであって、更に詳細には、本発明は、遺伝子工学的手法を用いて得られる生存性を低めた分生子を作る糸状菌、及び当該形質転換糸状菌の作出方法、並びに糸状菌分生子の生存性を低める方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌はタンパク質の分泌能力が高く、様々な物質を発酵生産する際に利用される。近年これら糸状菌を宿主とした形質転換体を作成してさらなる有用菌株の作成が行われており、一般的に形質転換体の安全性は確認されないままではあるが、定められた管理区域内で厳密に管理されている。
【０００３】
しかし糸状菌の分生子は空気中に飛散しやすく、これらを閉鎖環境中にとどめておくためには多大な労力が必要である。万が一環境中へ出た場合、糸状菌の形質転換体は容易に増殖可能であり、これらの形質転換糸状菌はさらなる胞子を形成することで、繁殖範囲を広げていくと考えられており、バイオハザード対策は、当業界における緊急の課題となっている（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、ｐ．８２２−８２３（１９８６年１０月９日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、バイオハザードをできる限り低減、防止する技術を開発するためになされたものであって、各方面から鋭意検討の結果、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅させればよいとの観点にたち、そのためには形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させる必要がある点に着目した。
【０００５】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、形質転換の宿主となる糸状菌の胞子のストレス抵抗性を低減させることで、管理区域外に飛散した糸状菌胞子を死滅しやすくさせることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであって、転写制御因子遺伝子（Ａｔｆ遺伝子群）の解析の過程において、麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のａｔｆＢ遺伝子を欠失させたところ、胞子の生存性が低下することをはじめて見出し、そして更に、このａｔｆＢ遺伝子欠失株は紫外線等のストレスを与えると容易に死滅することもはじめて確認し、これらの有用新知見を基礎に更に研究の結果、ついに完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、糸状菌においてａｔｆＢ遺伝子を欠失または変異させることで、胞子の生存性を低める技術を開発することにはじめて成功したものであって、形質転換糸状菌が紫外線等のストレスが豊富な野外等において容易に死滅する方法を提供するものである。
【０００８】
本発明者らは、転写制御因子遺伝子について広く研究、解析を行っているが、転写制御因子タンパク質をコードしているａｔｆＢ遺伝子は、相同遺伝子が麹菌以外の糸状菌にも存在しているものの、その機能は分かっていない。本発明者らはマイクロアレイ等を用いた精力的な解析の結果、このａｔｆＢ遺伝子産物がＣａｔａｌａｓｅＡ遺伝子（ｃａｔＡ）やトレハロース合成酵素様遺伝子など一連のストレス耐性遺伝子群の転写を、分生子内において正に制御していることを突き止めた。しかしながら、ａｔｆＢ遺伝子が胞子の生存性に関与していることまでは解明に至らず、ましてやａｔｆＢ遺伝子の欠失株が紫外線等によって容易に死滅することは全く解明されておらず、本発明が最先である。
【０００９】
本発明は、このような有用新知見に基づいてなされたものであって、その実施態様としては以下の態様が例示される。
【００１０】
（態様１）
糸状菌が有する転写制御因子タンパク質をコードするａｔｆＢ遺伝子のＤＮＡを完全にまたは部分的に欠失させるか、あるいは変異させること、を特徴とする糸状菌の胞子の生存性を低減させる方法。
（態様２）
ａｔｆＢ遺伝子のＤＮＡが以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡであること、を特徴とする態様１に記載の方法。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ遺伝子発現制御活性を有するタンパク質
（態様３）
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含むものであること、を特徴とする態様２に記載の遺伝子。
（ａ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ遺伝子発現制御活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１１】
（態様４）
ａｔｆＢ遺伝子の少なくとも一部を欠失又は変異せしめたＤＮＡを含んでなるａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドを構築する工程、及び、得られたプラスミドで糸状菌を形質転換する工程を包含すること、を特徴とする分生子の生存性を低滅せしめた糸状菌の作成方法。
（態様５）
ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドが、ａｔｆＢ５’領域、マーカー遺伝子、ａｔｆＢ３’領域のＤＮＡを包含してなること、を特徴とする態様４に記載の方法。
（態様６）
マーカー遺伝子がｓＣ遺伝子であること、を特徴とする態様５に記載の方法。
（態様７）
ａｔｆＢ５’領域のＤＮＡが、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡあるいはそれを含むものであること、を特徴とする態様４〜６のいずれか１項に記載の方法。
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（態様８）
ａｔｆＢ３’領域のＤＮＡが、以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡあるいはそれを含むものであること、を特徴とする態様４〜７のいずれか１項に記載の方法。
（ｅ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（態様９）
ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドが、直線状にした際に、ａｔｆＢ５’領域、ｓＣ遺伝子、ａｔｆＢ３’領域が順番に配置されてなるΔａｔｆＢのＤＮＡをベクターｐＵＳＣに導入してなるｐＵＳＣΔａｔｆＢであること、を特徴とする態様６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【００１２】
（態様１０）
ΔａｔｆＢのＤＮＡが、以下の（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡを含むものであること、を特徴とするａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミド作成用のＤＮＡ。
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（態様１１）
配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡによって示されるａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドｐＵＳＣΔａｔｆＢ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生存性の低い胞子を作る糸状菌を作成することができ、作出された糸状菌は紫外線等に当たると容易に死滅するという特性を有する。したがって、糸状菌を宿主とした各種形質転換体がたとえ管理区域外に飛散したとしても、本発明に係るこれらの形質転換体は短時間に死滅するため、バイオハザードが未然に防止されるという著効が奏される。
【００１４】
そのため、糸状菌を対象とする遺伝子操作技術を各種広範に適用することができ、その際、バイオハザードを過度に心配することなく、研究、製造が可能である。通常、微生物の生存の増進が効果として評価されるのであるが、本発明は、これとは逆の効果、つまり負の効果が著効として評価される点できわめて特徴的であり、本発明は、遺伝子操作技術の分野において、特異的な独特な効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明を実施するには、糸状菌からａｔｆＢ遺伝子を欠失又は変異させればよい。ａｔｆＢ遺伝子の欠失は、全体を完全に欠失させてもよいし、一部を欠失させてもよく、また、ａｔｆＢ遺伝子を包含する領域を広く欠失させてもよい。ａｔｆＢ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号２（図９）に示し、対応するアミノ酸配列は配列番号１（図８）に示す。本遺伝子は、麹菌に含まれており、例えばアスペルギルス・オリゼＮＳ４株（後記）にも含まれているので、それから切り出すことによっても入手することができる。
【００１６】
また、本発明を実施するには、ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドを構築し、これで糸状菌を形質転換してもよい。ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドは、ａｔｆＢ５’領域及びａｔｆＢ３’領域をベクター（例えば、染色体組込型ベクターｐＵＳＣ）導入することによって構築することができる。通常、上記２つの領域のほか、ｓＣ遺伝子その他マーカー遺伝子を導入するのが好ましい。
【００１７】
ａｔｆＢ５’領域は、その塩基配列は配列番号３（図１０）で示され、プロモーター領域と概略対応し、また、ａｔｆＢ３’領域は、その塩基配列は配列番号４（図１１）で示され、ターミネーター領域と概略対応するものである。これらの領域は、塩基配列が明らかにされているので、麹菌の遺伝子から切り出してもよいし、麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型にしてプロモーターを用いてＰＣＲを行って合成してもよく、その入手に格別の困難はない。
【００１８】
ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドの作成は、プロモーター領域及びターミネーター領域をベクターに導入することにより行えばよく（図１）、例えば、ａｔｆＢ５’領域、ａｔｆＢ３’領域をベクターｐＵＳＣに導入することにより、マーカー遺伝子とｓＣ遺伝子を含有した、ａｔｆＢ遺伝子を欠失したａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドｐＵＳＣΔａｔｆＢを構築することができる。（ａｔｆＢ５’領域）−（ｓＣ遺伝子）−（ａｔｆＢ３’領域）の配列は、ΔａｔｆＢ配列と命名され、その塩基配列は配列番号５（図１２〜１６）に示され、遺伝子破壊の概略は図３に示される。なお、配列番号５の塩基配列において、塩基番号１〜８はＮｏｔＩ制限酵素サイト、９〜２０４９はａｔｆＢ５’配列、４２４９〜７５０１はＳＣ配列、７５２５〜９５２４はａｔｆＢ３’配列をそれぞれ示す。
【００１９】
本プラスミドの特徴は、次のとおりである。
（１）「直鎖状」にした際に、
（２）「プロモーター領域」、「ｓＣ遺伝子」、「ターミネーター領域」が順番に並んでおり、
（３）「プロモーター領域」と「ターミネーター領域」が方向性をもって配置されている。さらに、
（４）ｓＣの方向性は任意でよい。また、
（５）「プロモーター領域」、「ｓＣ遺伝子」、「ターミネーター領域」以外の配列はあってもなくてもかまわない。
（６）「プロモーター領域」や「ターミネーター領域」がこれより長くなってもなまわないし、短くなってもかまわない。但し、短い場合には、遺伝子組換えの効率が低下することがある。
【００２０】
（７）なお、ｓＣ遺伝子は、導入する菌株に合わせて変更してもかまわないし、他の栄養要求性を相補する遺伝子であってもかまわない。薬剤耐性遺伝子でもかまわないし、他のマーカー遺伝子でもかまわないと言う点でｓＣ遺伝子は必須ではなく、他のマーカー遺伝子も適宜使用可能である。
【００２１】
本プラスミドにおいて、ｓＣ領域はいわゆるマーカー遺伝子として働き、形質転換体を効率的に取得する目的で入っている。ｓＣ遺伝子は硫酸（硫黄源）資化に関与する遺伝子で、これを硫酸資化欠損株である麹菌ＮＳ４株に導入すると、変異が相補されることで栄養要求性培地上での形質転換体単離が容易にできる。どちらかというと、Ａｍｐ（アンピシリン耐性遺伝子）は麹菌の形質転換体中には必要性が低く、Ａｍｐは大腸菌中でプラスミドを増幅させる場合に有用である。
【００２２】
（８）これらの遺伝子のＤＮＡは、ｐＵＳＣその他適宜なベクターに導入して、ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミド（図１）を構築する。ｐＵＳＣは、下記の文献に記載されており、また、（独）酒類総合研究所においても頒布されているものであって、入手に困難性はない。Ｏ．Ｙａｍａｄａ，Ｂ．Ｒ．Ｌｅｅ，Ｋ．Ｇｏｍｉ：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｎｉａＤ  ａｎｄ  ｓＣ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６１（８），１３６７−１３６９，１９９７
【００２３】
（９）プロモーター領域としてａｔｆＢ５’領域（配列番号３：図１０）を用い、ターミネーター領域としてａｔｆＢ３’領域（配列番号４：図１１）を用い、ベクターとしてｐＵＳＣを用いた場合のａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミド（ｐＵＳＣΔａｔｆＢ：その全塩基配列を配列番号５に示す）の構築を図２に示す。なお、（ａｔｆＢ５’領域）−（ｓＣ遺伝子）−（ａｔｆＢ３’領域）は、ΔａｔｆＢ配列と命名され、その塩基配列は配列番号５（図１２〜１６）内に示される。
【００２４】
（１０）本プラスミドは、麹菌（黄麹菌：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒなど）、白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉなど）といったアルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌のほか、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属菌、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属菌といった各種糸状菌のほか、一般的に様々な生物で使用することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施例について記載するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１：麹菌（アルペルギルス・オリゼ）に存在するａｔｆＢ遺伝子を欠失させることで、紫外線等のストレスに抵抗性が低い分生子を形成する麹菌の作成）
ａｔｆＢ遺伝子破壊株の単離と確認を次のようにして行った。
【００２７】
（１）ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドの作成
ａｔｆＢ遺伝子の５’側約２ｋｂｐと３’側約２ｋｂｐを染色体組込型ベクターｐＵＳＣに導入してａｔｆＢ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図２）。このベクターを用いて麹菌ＮＳ４株を形質転換（図３）することでａｔｆＢ遺伝子破壊株を得た。
【００２８】
すなわち、下記するように、ａｔｆＢ５’領域（配列番号３：図１０）及びａｔｆＢ３’領域（配列番号４：図１１）をそれぞれ作成し、ベクターｐＵＳＣにこれらの領域を導入して、ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドｐＵＳＣΔａｔｆＢ（その構築を図２に示し、全塩基配列を配列番号５（図１２〜１６）に示す）を作成した。
【００２９】
（導入方法）
（イ）  プライマー１及びプライマー２を用いて、麹菌ゲノムＤＮＡからプロモーター領域をＰＣＲにより増幅し、得られた断片を制限酵素ＰｓｔＩ及びＡａｔIIで切断した。
（ロ）  ｐＵＳＣを制限酵素ＰｓｔＩ及びＡａｔIIで切断し、切断箇所に（イ）で得られた断片を導入した。
（ハ）  プライマー３及びプライマー４を用いて、麹菌ゲノムＤＮＡからターミネーター領域をＰＣＲにより増幅し、得られた断片を制限酵素ＮｏｔＩで切断した。
（ニ）  （ロ）で得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断し、平滑化処理した後にＮｏｔＩで切断した。この断片と（ハ）で作成した断片を結合させることでｐＵＳＣΔａｔｆＢを作成した。
【００３０】
プライマー１は、その塩基配列を配列番号６（図１７）に示し、プライマー２は、その塩基配列を配列番号７（図１８）に示し、プライマー３は、その塩基配列を配列番号８（図１９）に示し、プライマー４は、その塩基配列を配列番号９（図２０）に示した。
【００３１】
宿主としてはＮＳ４株を使用する。ＮＳ４株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＳ４）は、先に示した文献により既知であるうえ、当研究所においても頒布しており、入手に困難性はない。
【００３２】
（２）ゲノムサザンによる破壊株の確認
ａｔｆＢＯＲＦの３’側領域をプローブとして用い、ゲノムサザンを行った結果（図４）、遺伝子破壊株において予想通りの３．５ｋｂｐのバンドが観察された。ＯＲＦ部分をプローブにしたゲノムサザンにおいてはバンドが検出されなかったことから、ａｔｆＢ遺伝子破壊株であることが確認できた。すなわち、ゲノムＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、電気泳動に供した。その結果、ＯＲＦ部分をプローブに用いた場合、ＮＳ４株では８ｋｂｐのバンドが検出されるが、破壊株ではＯＲＦが存在しないため、シグナルは検出されないことが確認され（図面左側）、ａｔｆＢ３’領域をプローブとすると、ＮＳ４は８．３ｋｂｐ、破壊株は３．５ｋｂｐのバンドが検出された（図面右側）。図５はゲノムサザンの説明図である。
【００３３】
（２）ノーザン解析による確認
分析子形成期（ふすま培養３７時間目）の麹菌から回収したＲＮＡを用い、ａｔｆＢのｃＤＮＡをプローブとしてノーザン解析を行った（図６）。ｎｉａＤ３００で見られるシグナルは破壊株で確認されなかったことから、この時間にａｔｆＢが発現していること及びａｔｆＢ遺伝子破壊が成功していることが確認できた。この結果から明らかなように、ａｔｆＢ破壊株ではａｔｆＢ遺伝子が存在しないため、分生子形成期におけるａｔｆＢ遺伝子が検出されない（図面右側）。なお図中、ＥｔＢｒはエチジウムブロマイドを示し、ｎｉａＤはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの硝酸資化能欠損株であって、当研究所において頒布されている。
【００３４】
（４）各種ストレス耐性の測定（図７）
耐熱性      蒸留水に懸濁した分生子を５０℃で所定の時間インキュベートし、寒天培地に塗布して生存数を確認した。
耐酸化性    ５０ｍＭか酸化水素水溶液に懸濁した分生子を３０℃で所定の時間インキュベートし、寒天培地に塗布して生存数を確認した。
耐紫外線性  紫外線照射器により寒天培地に塗布した分生子に紫外線を照射して生存数を確認した。
【００３５】
以上の結果から、ａｔｆＢ遺伝子破壊株では各種ストレスによる生存率が野生株よりも有意に低いことから、日光のあたる野外等で死滅しやすくなっていることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ａｔｆＢ遺伝子破壊用プラスミドを示す。
【図２】ｐＵＳＣΔａｔｆＢプラスミドを示す。
【図３】遺伝子破壊概略図である。
【図４】破壊株のゲノムサザンの結果を示す電気泳動図である。（図面代用写真）。
【図５】ゲノムサザンの説明図である。
【図６】破壊株のノーザン解析の結果を示す電気泳動図である（図面代用写真）。
【図７】各種ストレスに対する麹菌分生子の耐性を示す。
【図８】配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を示す。
【図９】配列表の配列番号２で示される塩基配列を示す。
【図１０】配列番号３で示される塩基配列を示す。
【図１１】配列番号４で示される塩基配列を示す。
【図１２】配列番号５で示される塩基配列を示す。
【図１３】同上続きを示す。
【図１４】同上続きを示す。
【図１５】同上続きを示す。
【図１６】同上続きを示す。
【図１７】プライマー１を示す。
【図１８】プライマー２を示す。
【図１９】プライマー３を示す。
【図２０】プライマー４を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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