(57)【要約】【課題】  検査効率に優れ、培養液や被検物の乾燥を防ぐことができ、被検物を個々のウエルに容易に入れることができるウエルプレートを開発する。【解決手段】  ガラス又は樹脂製の基板の表面に、径が１〜５００μｍ、深さが１〜３００μｍのウエルを複数個、１０〜３００μｍの間隔で設けることで検査効率のよいウエルプレートとすることができる。ウエルの集団の周囲に、ウエルが形成されている表面よりも高いカバープレート載置面を形成し、該載置面の上にウエルの集団を覆ってカバープレートを載置可能とすることで培養液や被検物の乾燥を防ぐことができる。ウエル内面に金被膜を形成し、その上にアルカンチオール被膜を形成すると、被検物を個々のウエルに容易に入れることができる。【選択図】      図１
2006266768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス又は樹脂製の基板の表面に、径が１〜５００μｍ、深さが１〜３００μｍのウエルを複数個、１０〜３００μｍの間隔で設けたことを特徴とするウエルプレート。
【請求項２】
請求項１のウエルプレートにおいて、前記ウエルの集団の周囲に、前記ウエルが形成されている表面よりも高いカバープレート載置面を形成し、該載置面の上に、前記ウエルの集団を覆ってカバープレートを載置可能としたことを特徴とするウエルプレート。
【請求項３】
請求項２のウエルプレートにおいて、前記載置面が前記ウエルの形成されている表面よりも０．１〜０．５ｍｍ高いことを特徴とするウエルプレート。
【請求項４】
請求項２又は３のウエルプレートにおいて、前記ガラス又は樹脂製の基板の表面に、穴を有するシリコーン製のシートを付着させて該シートの表面を前記載置面とし、前記穴の中に前記ウエルの集団が位置するようにしたことを特徴とするウエルプレート。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかのウエルプレートにおいて、前記ウエル内面の少なくとも底面に金被膜を形成したことを特徴とするウエルプレート。
【請求項６】
請求項５のウエルプレートにおいて、前記金被膜の上に更にアルカンチオール被膜を形成したことを特徴とするウエルプレート。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかのウエルプレートにおいて、前記ウエルの集団の周囲に溝を形成したことを特徴とするウエルプレート。
【請求項８】
請求項７のウエルプレートにおいて、前記溝の底のレベルと、前記ウエルの底のレベルが等しいことを特徴とするウエルプレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物（細菌、原生動物など）、細胞などの被検物の各種検査に用いて好適なウエルプレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
多数のウエル（穴）を有するウエルプレートの各ウエルに細胞などの被検物を入れ、さらに薬液などをウエル内に注入して被検物がどのような挙動を示すかを検査することが行われている。このような用途に供するウエルプレートとしては、例えば特開平１０−２２１２４３号（特許文献１）に開示されている。これは、１８ｃｍ×１２ｃｍ程度のプレートに、直径７．５ｍｍ程度のウエルを９６個程度設けたものである。このウエルには機械的操作で細胞などの被検物を入れ、さらに機械的操作で薬液などを注入する。
【特許文献１】特開平１０−２２１２４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
近年、一度にたくさんの被検物を検査したい、高価な薬液の使用をなるべく少なくしたいという要請が強まり、なるべく小さい径のウエルをなるべく多く形成したウエルプレートが求められている。本発明は、このような要請に応えるべく、ガラス又は樹脂製の基板の表面に微細なウエルを多数設けたウエルプレートを開発することを課題とする。
【０００４】
また、ウエル内に細胞などの被検物を入れて検査・培養などを行う場合、ウエル内の培養液や被検物が乾燥してしまうおそれがある。本発明は、検査・培養などに際して、容易に培養液や被検物の乾燥を防ぐことのできるウエルプレートを開発することをも課題とする。
【０００５】
さらに、比較的小さいウエル（ウエルの径が約５００μｍ以下）で、ウエルの個数が非常に多い場合（目安として１０００個以上）の場合になると、一つ一つのウエルに機械的な操作で細胞などの被検物や薬液を入れることは非常に困難となり、実用的ではなくなる。本発明は、ウエルの径をきわめて小さくし、ウエルの個数をきわめて多くしても、細胞などの被検物や薬液を個々のウエルに容易に入れることのできるウエルプレートを開発することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（構成１）
本発明は、ガラス又は樹脂製の基板の表面に、径が１〜５００μｍ、深さが１〜３００μｍのウエルを複数個、１０〜３００μｍの間隔で設けたことを特徴とするウエルプレートである。
【０００７】
本発明において、「径」とはウエルの平面形状の重心を通る全てのさしわたし線分のうちの最小のものの長さをいう。したがって、例えばウエルの平面形状が円形の場合は直径の長さ、楕円の場合は短直径の長さ、正方形の場合は一辺の長さ、長方形の場合は短辺の長さが「径」となる。本発明において、ウエルの数は１０００個以上とすることが望ましい。
【０００８】
ウエルの径は、１μｍ未満では安定したウエルの形成が困難となり、５００μｍを超える大きさは不必要であり、検査効率が悪くなる。ウエルの深さは、１μｍ未満ではウエル内に被検物を安定して残存させることができず、またこのようなきわめて浅いウエルを安定して形成することも困難である。３００μｍを超える深さは不必要であり、またレーザ光などでウエルを形成するのも困難となる。ウエルどうしの間隔は、レーザ加工の精度及び基板素材の強度を考慮すると１０μｍ以上が望ましく、３００μｍを超えると検査効率が悪くなる。
【０００９】
（構成２）
また本発明は、前記構成１のウエルプレートにおいて、前記ウエルの集団の周囲に、前記ウエルが形成されている表面よりも高いカバープレート載置面を形成し、該載置面の上に、前記ウエルの集団を覆ってカバープレートを載置可能としたことを特徴とするウエルプレートである。
【００１０】
（構成３）
また本発明は、前記構成２のウエルプレートにおいて、前記載置面が前記ウエルの形成されている表面よりも０．１〜０．５ｍｍ高いことを特徴とするウエルプレートである。
【００１１】
カバープレート載置面の高さは、０．１よりも低いとカバープレートが基板と接触してしまう可能性があり、０．５ｍｍを超える高さとすると顕微鏡観察に支障をきたす可能性がある。
【００１２】
（構成４）
また本発明は、前記構成２又は３のウエルプレートにおいて、前記ガラス又は樹脂製の基板の表面に、穴を有するシリコーン製のシートを付着させて該シートの表面を前記載置面とし、前記穴の中に前記ウエルの集団が位置するようにしたことを特徴とするウエルプレートである。
【００１３】
（構成５）
また本発明は、前記構成１〜４のいずれかのウエルプレートにおいて、前記ウエル内面の少なくとも底面に金被膜を形成したことを特徴とするウエルプレートである。
【００１４】
金被膜の厚みは、１０〜７０ｎｍが適当である。１０ｎｍ未満であれば、金属の被膜強度が弱く剥離するおそれがあり、７０ｎｍを超えると光の透過性が著しく悪くなり、顕微鏡観察に支障をきたす。金被膜は他の金属被膜（コンタクト・メタル：例えばクロム、ニッケル、チタンなど）を形成した後、その上に形成しても良い。その場合、金属被膜の厚さ（コンタクト・メタルの厚さ＋金被膜の厚さ）は１０〜７０ｎｍが適当である。コンタクト・メタルを用いることにより、金被膜が基板から剥離しにくくなる。
【００１５】
（構成６）
また本発明は、前記構成５のウエルプレートにおいて、前記金被膜の上に更にアルカンチオール被膜を形成したことを特徴とするウエルプレートである。
【００１６】
アルカンチオールとは、末端にSH基をもち、間にＣＨ２基が続き、他方の末端にＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＣＯＯＨなどの様々な官能基をもつ化合物のことであり、一般式、ＨＳ−（ＣＨ２)ｎ−Ｘで示されるものである（Ｘは官能基）。アルカンチオールをエタノールに溶解したものを金被膜に塗布し、又はウエルプレートを浸漬するだけで、金被膜表面にアルカンチオールが自己組織化し、アルカンチオール被膜が形成される。アルカンチオールのSH基が金被膜に結合し、官能基が被検体（細胞）と結合するので、被検体（細胞）がアルカンチオール被膜を介して金被膜に付着する。
【００１７】
（構成７）
また本発明は、前記構成１〜６のいずれかのウエルプレートにおいて、前記ウエルの集団の周囲に溝を形成したことを特徴とするウエルプレートである。
【００１８】
ウエルの集団の周囲に溝を設けると、ウエル内に被検体を入れるときに溝の中にも被検体を入れ、溝の中で補助的に被検体を培養することができる。したがって、ウエル内の被検体に不都合が生じた場合、これを溝内の好ましい被検体と交換し、検査効率を高めることができる。
【００１９】
（構成８）
また本発明は、前記構成７のウエルプレートにおいて、前記溝の底のレベルと、前記ウエルの底のレベルが等しいことを特徴とするウエルプレートである。
【００２０】
溝の底のレベルとウエルの底のレベルとを等しくすると、ウエルと溝を観察する場合の顕微鏡の焦点が等しくなり、作業がしやすくなる。なお、溝の底のレベルとウエルの底のレベルとを完全に等しくするのは技術的に困難であり、１μｍまでの誤差は、実用上問題ないので、本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のウエルプレートは、きわめて微小なウエルを高密度で設けたので、各ウエルに１個ないし２個程度のきわめて少数の被検物（細胞など）を入れ、能率良く検査、培養などの作業を行うことができる。使用する薬液などはきわめて少量でよいので、経済的でもある。
【００２２】
ウエルの集団の周囲にカバープレート載置面を設け、その上にカバープレート（透明な薄いカバーガラスなど）を載せ、蓋をすることで、被検物や薬液の乾燥を防ぐことができる。
【００２３】
ウエルの少なくとも底面に金被膜を形成し、金被膜の上にアルカンチオール被膜を形成すると、微小なウエル内に細胞などの被検物を効率よく入れることができる。
【００２４】
ウエルの集団の周囲に溝を設けると、ウエル内の被検体に不都合が生じた場合、これを溝内の好ましい被検体と交換し、検査効率を高めることができる。その際、溝の底のレベルとウエルの底のレベルとを等しくしておくと、顕微鏡の焦点が等しくなり、作業がしやすくなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
ウエルプレートの基板は、一般の顕微鏡検査に用いるスライドガラスのような薄いガラス又は樹脂のプレートとするのが実用的である。ウエルプレートを直接顕微鏡で見て検査することができるからである。ガラスとする場合、ガラス組成は不純物の少ない無色透明ガラスが適している。樹脂とする場合、樹脂の種類は、透明性、加工性、安全性などを考慮して自由に選択することができるが、例えばポリカーボネート樹脂などとすることができる。
【００２６】
ウエルの平面形状は円形、正方形など自由である。基板がガラスの場合、ウエルは、いわゆるエッチングの手法で形成することができる。また、基板が樹脂の場合はエキシマレーザを用いるのが好ましい。エキシマレーザはＸｅ、Ｋｒ、Ａｒ、Ｎｅなどの希ガスとＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどのハロゲンの組み合わせを励起状態とし、非常に高い発振効率と大出力のレーザ発振を得るもので、熱硬化性樹脂層にエキシマレーザ光を照射すると、樹脂が瞬時に蒸発しシャープで所望の形状のウエルが形成される。ウエルの形成に用いるレーザ照射装置は、レーザ光が複数の透過孔を有するマスク、集光レンズを順次通過するように構成されたものが好ましい。マスクを通過したレーザ光を集光レンズで絞り込むので、非常に小さな径のウエルを高精度に形成することができる。
【００２７】
ウエルの集団の周囲に形成するカバープレート載置面は、穴を有するシリコーン製のシートを基板表面に付着して形成するのが便利である。シリコーンのシートは細胞に対して毒性がなく、また、基板の上に重ねるだけで、通常の作業では容易に離脱しない程度に付着する。カバープレートも上に載せるだけで通常の作業では容易に離脱しない程度に付着する。また、カバープレートやシートの取り外しも簡単で便利である。カバープレートは、顕微鏡検査に用いるいわゆるカバーガラスのような、２０ｍｍ×２０ｍｍ×０．１ｍｍ程度の透明なプレートとすると、カバープレートをしたまま顕微鏡検査を行えるので便利である。
【実施例】
【００２８】
図１は実施例のウエルプレートの平面図である。このウエルプレートは、７６ｍｍ×２６ｍｍ、厚さ１ｍｍの無色透明ポリカーボネート製基板１の表面中央部に、直径１５μｍ、深さ８μｍの円筒形ウエル２を３０μｍ間隔で縦横に１００個×１００個、合計１００００個設け、ウエルの集団３を形成している。図２は、そのウエルの集団３の平面図で、縦（Ｙ方向）横（Ｘ方向）共に中央部分を省略して表している。ウエルの集団３の下辺にはＸ方向の番地１、１０、２０、…８０、９０、１００を、左辺にはＹ方向の番地１、１０、２０、…８０、９０、１００を刻印している。このようにすることで、各ウエルに入れた被検体を個別に管理しやすくなる。図３はＡ部分、すなわちＸ＝１、Ｙ＝８０付近の拡大図、図４はＢ部分、すなわちＸ＝２０、Ｙ＝１付近の拡大図である。このウエルプレートは、顕微鏡観察にごく普通に使用される、いわゆるスライドガラスと同じ大きさであるので、このまま顕微鏡観察を行うのに便利である。
【００２９】
ウエルの形成はレーザ照射装置によって行われる。図５に示すように、レーザ照射装置はエキシマレーザ発振器４、マスク６、集光レンズ７、加工台８を有する。エキシマレーザ発振器４のレーザ光照射部より照射されたレーザ光５はマスク６、集光レンズ７を経てワーク（基板１）に照射される。エキシマレーザ発振器４としては、例えばフッ化クリプトン（ＫｒＦ）レーザ（主波長２４８ｎｍ）、フッ化アルゴン（ＡｒＦ）レーザ（主波長１９３ｎｍ）を用いることができる。マスク６としては、例えば厚さ約５０μｍのステンレス板、厚さ数ｍｍの石英ガラスにクロムを数百ｎｍの厚さに成膜したものを用いることができる。マスクにはレーザ光が透過できる個所とできない個所がある。すなわち、ステンレスのマスクでは所定の透過孔（貫通孔）が所定間隔で開けられ、石英ガラスのマスクではクロム膜に所定の透過孔（貫通孔）が所定間隔で開けられている。これらの透過孔の大きさと集光レンズの倍率により、形成されるウエルの径が定まり、透過孔の形状によりウエルの形状が定まる。直径１５μｍのウエルを形成する場合、マスクの透過孔の直径は６０〜１５０μｍ程度とするのがよい。
【００３０】
基板１を加工台８の上にセットする。加工台８は、ワークを所定量Ｘ及びＹ方向に移動させることができる。直径１５μｍのウエルを３０μｍ間隔で１００×１００個、合計１００００個形成する場合、例えば、直径７５μｍの透過孔を１５０μｍ間隔で２０×２０個、合計４００個設けたマスクを用い、集光レンズの倍率を５倍とし、エキシマレーザ光を例えば１秒間照射して４００個のウエルを形成する。ワーク（基板１）を９００μｍＸ方向又はＹ方向に移動し、エキシマレーザ光を照射して更に４００個のウエルを形成する。このような動作を合計２５回繰り返して１００個×１００個、合計１００００個のウエルを形成することができる。番地の刻印も、このようなレーザ照射装置により行うことができる。
【００３１】
なお、プラスチック製のウエルプレートの場合、基板及びウエルを射出成形により同時に成形することも可能である。
【００３２】
図６〜８はウエルの集団３を形成した基板１の表面にシリコーン製の厚さ０．１〜０．５ｍｍのシート１２を付着してカバープレート載置面１５を形成し、該載置面にカバープレート１４（大きさ２ｃｍ×２ｃｍ、厚さ０．１ｍｍの透明な、いわゆるカバーガラス）を付着した場合に関し、図６は平面図、図７は分解斜視図、図８は幅方向断面図である。シート１２は、ウエルの集団３に対応する位置に、ウエルの集団３よりも若干大きな穴１３を有する。シート１２を付着することにより、ウエルが形成されている表面よりもシート１２の厚み分だけ高いカバープレート載置面１５が形成される。このようにすることで被検体及び検査液などの乾燥を防ぐことができ、このままの状態で顕微鏡観察することもでき、便利である。実例として、酵母表面の蛍光確認も可能であり、バイオ試料にも適用できる。
【００３３】
この場合、カバープレート載置面を形成するためのシートは基板１と同じ大きさ・形状であるが、その大きさ・形状は自由であり、例えば、ウエルの集団３よりもやや大きなドーナツリング状とすることもできる。また、カバープレート載置面は、基板を成形するときに基板に一体に成形しておくこともできる。図１０、１１のウエルプレートは、ポリカーボネート樹脂製の基板１を成形する際に載置面１５を基板と一体に設けている。図１０においては、基板１のウエルの集団３の付近を除く部分を全て高い面で形成しており、図１１においては、基板１のウエルの集団３の周囲にドーナツリング状のカバープレート載置面１５を形成している。なお、図１０、１１において左側は平面図、右側は中央縦断面図を表している。
【００３４】
被検体をウエル内に入れるには、例えば図９に示すようにすることができる。すなわち、被検体を純水などの液体で希釈した被検体希釈液１１を、スポイトなどでウエルの集団３の上に滴下し、その後、スクレープ手段１６を基板１に押し付けながら矢印方向に移動し、余剰の被検体希釈液１１を拭うようにすることで、被検体がウエル内に入り込む。被検体希釈液の希釈具合は、希釈度Ａ６００で０．０５〜０．０７程度が適当である。希釈度Ａ６００とは、被検体として酵母を用いるとき、１ｍｌの菌体懸濁液に何個の酵母が存在するかを吸光度計で検出する波長が６００ｎｍであることを示し、希釈度Ａ６００で１の場合、酵母は約３×１０７個存在する。スクレープ手段は、底面が平滑な面となっているものであれば何でも良いが、例えばカバーガラスが大きさ及び厚さが手軽なため、好適である。直径２０μｍ、深さ７．５μｍのウエルを１００個×１００個で一万個形成したウエルプレートに、被検体（酵母細胞）を純水に分散させて希釈度Ａ６００＝０．０５とした被検体希釈液１１を図９に示すように基板１のウエル集団３の上に滴下し、スクレープ手段１６（カバーガラス）を指で基板に押し付けながら矢印方向に移動し、余剰の被検体希釈液を拭い取った結果、約７０％の数のウエル内に１個又は２個の被検体を入れることができた。
【００３５】
前記のようにウエルを形成した基板１をマスク９で覆い（図１２）、スパッタリングマシンで金を蒸着した。マスク９はステンレスの薄板（厚さ約５０μｍ程度）で、ウエルの集団３と同じパターンで直径１５μｍの円形の孔１０が３０μｍ間隔で１００００個開けられている。顕微鏡下で各孔１０が各ウエル２の位置になるように位置合わせを行った。金は孔１０の部分にあるウエル内面のみに蒸着され、ウエル２の内面に金被膜１７が形成された（図１３）。金被膜は、必ずしもウエルの内面全体に形成する必要はなく、少なくとも底面に形成することで、十分な効果を得ることができる。
【００３６】
金被膜の上にアルカンチオール被膜を形成するには、アルカンチオール溶液（アルカンチオールをエタノールに溶解したもの）を金被膜に塗布し、又は基板をアルカンチオール溶液に浸漬し、その後乾燥させて（自然乾燥、強制乾燥を問わない）アルカンチオールを金被膜の上に自己組織化させる。その後、アルコールなどで洗浄すると、金被膜以外の部分に付着しているアルカンチオールは洗い落とされ、金被膜の上にアルカンチオール被膜が残る。
【００３７】
図１４〜１６の基板１は、７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍのガラス製の板で、中央部にウエルの集団３が形成されている。ウエル２は直径０．５ｍｍ、深さ０．３ｍｍの円筒形状で、０．３ｍｍ間隔で縦横２０個×２０個で合計４００個形成されている。ウエルが形成されている面は、基板１の表面よりも０．４ｍｍ、ウエルが形成されている面よりも０．３mm低いレベルとなっている。ウエルの集団３の周囲には、基板１の表面よりも０．７ｍｍ掘り下げられた溝１８が形成されている。溝１８の幅は２．６５ｍｍである。溝底面１８ａとウエル底面２ａのレベル（高さ）は同じで、当該部分のガラス厚は共に０．３ｍｍである。ウエル内に被検体を入れるときに溝の中にも被検体を入れ、溝の中で補助的に被検体を培養することができる。したがって、ウエル内の被検体に不都合が生じた場合、これを溝内の好ましい被検体と交換し、検査効率を高めることができる。その際、溝の底のレベルとウエルの底のレベルとが等しいので、顕微鏡の焦点が等しくなり、作業がしやすい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ウエルプレートの平面図である。
【図２】ウエルの集団３の略平面図である。
【図３】図２におけるＡ部拡大図である。
【図４】図２におけるＢ部拡大図である。
【図５】ウエル形成方法を模式的に示す説明図である。
【図６】カバープレートを載置したウエルプレートの平面図である。
【図７】カバープレートを載置したウエルプレートの分解斜視図である。
【図８】カバープレートを載置したウエルプレートの幅方向断面図である。
【図９】被検体をウエル内に入れる方法の説明図である。
【図１０】ウエルプレートの平面図及び中央縦断面図である。
【図１１】ウエルプレートの平面図及び中央縦断面図である。
【図１２】基板をマスクで覆った状態を示す断面図である。
【図１３】金被膜を形成したウエルの断面図である。
【図１４】ウエルプレートの平面図である。
【図１５】図１４におけるＡ部拡大図である。
【図１６】図１５におけるＢＢ線端面図である。
【符号の説明】
【００３９】
１  基板
２  ウエル
３  ウエルの集団
４  エキシマレーザ発振器
５  レーザ光
６  マスク
７  集光レンズ
８  加工台
９  マスク
１０  孔
１１  被検体希釈液
１２  シート
１３  穴
１４  カバープレート
１５  カバープレート載置面
１６  スクレープ手段
１７  金被膜
１８  溝
【図１】
2006266768.tif 000003
【図２】
2006266768.tif 000004
【図３】
2006266768.tif 000005
【図４】
2006266768.tif 000006
【図５】
2006266768.tif 000007
【図６】
2006266768.tif 000008
【図７】
2006266768.tif 000009
【図８】
2006266768.tif 000010
【図９】
2006266768.tif 000011
【図１０】
2006266768.tif 000012
【図１１】
2006266768.tif 000013
【図１２】
2006266768.tif 000014
【図１３】
2006266768.tif 000015
【図１４】
2006266768.tif 000016
【図１５】
2006266768.tif 000017
【図１６】
2006266768.tif 000018