(57)【要約】【課題】  対象遺伝子の二次構造などの高次構造を考慮に入れることにより、二本鎖形成の確実性、配列特異性を高めたオリゴヌクレオチドを設計するための方法とそのオリゴヌクレオチドをプローブとして搭載したＤＮＡマイクロアレイ。ＤＮＡマイクロアレイの感度、再現性、対象遺伝子の識別能力を向上させる。【解決手段】  対象遺伝子配列の二次構造などの高次構造から、自己相補性による二本鎖を形成するステム領域と一本鎖のループ領域を予測し、ループ領域近辺の配列類似性と実験条件を評価し、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼージョンに適した領域を絞り込み、プローブを設計する。図２に示すようなループ領域の配列はｍＲＮＡのファミリー配列で異なっていることがしばしばあり、識別可能となる。更に一本鎖であるため、相補配列となるプローブとのハイブリダイズ能力がステム領域よりも高く、感度、再現性の向上が見込める。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の核酸塩基配列の中からターゲット核酸塩基配列を特異的に検出するためのプローブ核酸塩基配列を決定する方法において、ターゲット核酸塩基配列の高次構造を求め、自己相補性によるステム構造をとらず、かつ他のターゲット核酸塩基配列に対し、１次元的連続領域として配列特異性を有する領域を選出し、少なくともこの部分を含んだ核酸塩基配列に対し、相補性を有する１つまたは複数の核酸塩基配列をプローブ核酸塩基配列とする決定方法。
【請求項２】
請求項１で示される方式で決定されるプローブ核酸塩基配列に対し、高次構造を求め、ターゲット核酸塩基配列と１塩基ごとのハイブリダイゼーションについて、ステムとステム、ステムとループ、ループとループで異なるスコア値を与え、その総和をターゲットとプローブのハイブリダイゼーション強度とする優先付けを特長とするプローブ核酸塩基配列の決定方法。
【請求項３】
複数の核酸塩基配列の中からターゲット核酸塩基配列を特異的に検出するためのプローブ核酸塩基配列を決定する方法において、ターゲット核酸塩基配列の高次構造を求め、自己相補性によるステム構造をとらず、かつ他のターゲット核酸塩基配列に対し、幾何学的連続領域として配列特異性を有する領域を選出し、少なくともこの部分を含んだ核酸塩基配列に対し、相補性を有する１つまたは複数の核酸塩基配列をプローブ核酸塩基配列とする決定方法。
【請求項４】
請求項３で示される方式で決定されるプローブ核酸塩基配列に対し、高次構造を求め、ターゲット核酸塩基配列と１塩基ごとのハイブリダイゼーションについて、ステムとステム、ステムとループ、ループとループで異なるスコア値を与え、その総和をターゲットとプローブのハイブリダイゼーション強度とする優先付けを特長とするプローブ核酸塩基配列の決定方法。
【請求項５】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５で示される決定方法を組み合わせることによるプローブ核酸塩基配列の決定方法
【請求項６】
前期請求項１から５で示される決定方法に基づくプローブ核酸塩基配列を搭載したＤＮＡマイクロアレイ
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、複数の核酸塩基配列の中から、ターゲット核酸塩基配列に対し特異的に二本鎖を形成するプローブ核酸塩基配列の決定方法に関し、ターゲット核酸塩基配列の高次構造に基づく、１つまたは複数のプローブ核酸塩基配列の決定方法及びそれを搭載したＤＮＡマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】  遺伝子の発現解析などでは、多数のＤＮＡ断片をガラスなどの基板上に配列させたＤＮＡマイクロアレイが利用される。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス、シリコン、プラスチックなどの基板上に多数の異なったプローブを高密度に配列化してスポットしたものである。プローブとしては、通常ｃＤＮＡや２０〜１００ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドなどが用いられる。ＤＮＡマイクロアレイの原理は、ＤＮＡを構成する４つの塩基Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）において、ＡとＴ、ＧとＣが互いに水素結合するハイブリダイゼーションに基づいている。このＤＮＡマイクロアレイ上に蛍光物質などで標識したＤＮＡやＲＮＡなどのターゲットを注ぎ、プローブとハイブリダイゼーションさせることにより、ターゲットを捕獲する。捕獲されたＤＮＡやＲＮＡなどのターゲットは各プローブスポットからの蛍光シグナルとして検出され、これをコンピューター解析することにより、ターゲット中の数千から数万のＤＮＡやＲＮＡの状況を一挙に観測することが可能になる。【０００３】  ＤＮＡマイクロアレイに搭載する核酸塩基配列を決めるにあたり、従来はターゲット核酸塩基配列の１次元的配列特異性にのみ着目し、これの相補配列の内、自己相補性が低く、Ｔｍ値、ＧＣ含量が指定条件を満たすものをプローブ核酸塩基配列とし、ＤＮＡマイクロアレイに搭載していた。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  従来のＤＮＡマイクロアレイのプローブ設計法は、ターゲットとプローブを１対１に対応づけるものであるが、実験結果は必ずしも満足のいくものではなく、１次元的配列特異性を保証しているにも関わらず、ターゲット−プローブ間のハイブリダイゼーションが検出できない場合があったり、特にｍＲＮＡのスプライシングバリアントでは、ファミリー配列間では１次元的配列特異性が保証したプローブ配列を設計できず、従って単独のｍＲＮＡの発現を識別できないという問題があった。
【０００５】  本発明の目的は上記の問題点を解決するために、ターゲット核酸塩基配列およびプローブ核酸塩基配列が実験時にとりうる高次構造に着目し、ハイブリダイゼーションの効率を上げ、核酸塩基配列の一次構造からは見出せない配列特異性を見出し、この部分に相補なプローブ核酸塩基配列を設計すること、それを搭載することにより、感度、再現性、識別能力の高いＤＮＡマイクロアレイを作成することである。
【発明を解決するための手段】
【０００６】  本発明では、ターゲットとなる核酸塩基配列の高次構造を求め、自己相補によるステム部以外の１次元的連続領域（図１参照）、または幾何学的連続領域（図２参照）において配列特異性の高い部分配列を求め、これの相補配列をプローブ核酸塩基配列としたＤＮＡマイクロアレイを作成することで、従来の問題点を解決する。本発明の方式で設計されたプローブ核酸塩基配列は、従来のものに比べ、ターゲット核酸塩基配列の高次構造上の１本鎖部分と相補となるため、ハイブリダイゼーションの反応効率が高い。また１次元的連続領域では特異性が保証できないｍＲＮＡのスプライシングバリアントの各ファミリー配列においても、幾何学的連続領域において配列特異性を保証できれば、個々のターゲット核酸塩基配列との特異的なハイブリダイゼーションが可能である。このため、本発明によるプローブ核酸塩基配列を搭載したＤＮＡマイクロアレイは、感度、再現性、ターゲット核酸塩基配列の識別能力の各点で、従来のものに比べ高い性能を有するものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】  以下に本発明を実施する場合の一形態を図面を用い、具体的に説明する。図３はプローブ核酸塩基配列を設計するシステムのブロック図である。本システムは、ターゲット核酸塩基配列データの入出力、高次構造解析等を行う中央処理装置３００、中央処理装置３００での処理に必要なプログラムを格納するプログラムメモリ３０４、キャラクタ及びグラフィック画面を表示する表示装置３０１、本システムへの値の入力を行うためのキーボード３０２、マウス３０３、ターゲット核酸塩基配列データ３１２、ターゲット核酸塩基配列の高次構造より求まる幾何学的連続配列データ３１３、最終出力であるプローブ核酸塩基配列設計データ３１４を備える。【０００８】  プログラムメモリ９１０は、ターゲット核酸塩基配列データ３１２より設計対象となるものを抽出するターゲット配列データ処理部３０５、ターゲット配列の高次構造を求めるターゲット高次構造解析部３０６、高次構造を元に自己相補によるステムを構築しない部位の前後で指定された長さの配列領域を選出する設計対象領域決定部３０７、設計対象領域に対して、Ｔｍ値、ＧＣ含量等の実験条件に従うプローブ核酸塩基配列を設計するプローブ核酸塩基配列設計部３０８、設計したプローブ核酸塩基配列の配列特異性を計算する配列特異性計算部３０９、プローブ高次構造解析部３１０、ターゲットとプローブ間のハイブリダイゼーション強度を計算するハイブリダイゼーション強度計算部３１１とからなる。【０００９】  図４は、本発明の概略処理フローを示した図である。まずターゲット核酸塩基配列データ３１２を読込み、設計対象のターゲット核酸塩基配列を抽出する（ステップ４００）。次に設計対象のターゲット核酸塩基配列の高次構造を求める（ステップ４０１）。この高次構造を元に
自己相補によるステムを構成しない部分を探し、プローブ長の条件を満たすようにその前後を含んだ領域をプローブ設計対象領域とする。このときに発見された幾何学的連続領域の核酸塩基配列を幾何学的連続配列データ３１３に出力する（ステップ４０２）。このプローブ設計対象領域に対し、Ｔｍ値、ＧＣ含量などの指定条件に従うプローブ核酸塩基配列を設計する（ステップ４０３）。設計したプローブ核酸塩基配列とターゲット核酸塩基配列データ３１２、及び幾何学的連続配列データ３１３との間で配列の相同性検索を行い、配列特異性が指定条件を満たすものを選出する（ステップ４０４）。選出されたプローブ核酸塩基配列の高次構造を求める（ステップ４０５）。ターゲットとプローブのハイブリダイゼーション強度を計算する。この計算は１塩基ごとにステム−ステム、ステム−ループ、ループ−ループの組み合わせにより異なるスコア値を与え、そのスコア値の総和をハイブリダイゼーション強度とすることで行う（ステップ４０６）。
【発明の効果】
【００１０】  本発明により、よりハイブリダイゼーション効率が高く、ハイブリダイゼーション強度が均一なプローブ核酸塩基配列の設計が可能になる。加えて従来では設計不可能であったｍＲＮＡのスプライシングバリアントについても、幾何学的連続な配列の配列特異性を確保することにより、設計可能となる場合が多くなると予想される。このようなプローブ核酸塩基配列を搭載することによりＤＮＡマイクロアレイは、従来より感度、再現性、識別能力が高くなり、その応用範囲が広がるとともに、実験時間の短縮、実験回数の削減でも大いに役立つものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】  １次元的連続配列の説明
【図２】  幾何学的的連続配列の説明
【図３】  本発明実施時のブロック図
【図４】  本発明実施時の概略処理フロー
【符号の説明】
【００１２】３００  中央処理装置
３０１  表示装置
３０２  キーボード
３０３  マウス
３０４  プログラムメモリ
３０５  ターゲット配列データ入力部
３０６  ターゲット高次構造解析部
３０７  設計対象領域決定部
３０８  プローブ核酸塩基配列設計部
３０９  配列特異性計算部
３１０  プローブ高次構造解析部
３１１  ハイブリダイゼーション強度計算部
３１２  ターゲット核酸塩基配列データ
３１３  幾何学的連続配列データ
３１４  プローブ核酸塩基配列設計データ
４００〜４０６  本発明の概略処理フロー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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