(57)【要約】【課題】迅速で、測定感度が高く、一回に処理できる検体数が多い、カルシウム作用の評価方法を提供すること。【解決手段】上記課題は、被検物質の生体内におけるカルシウム作用のポテンシャルを評価する方法であって：（ａ）ECAC2を発現する細胞に、被検物質を暴露する工程、及び（ｂ）前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量を測定する工程、を含んでなる方法によって達成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の生体内におけるカルシウム作用のポテンシャルを評価する方法であって：
（ａ）ECAC2を発現する細胞に、被検物質を暴露する工程、及び
（ｂ）前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量を測定する工程、
を含んでなる方法。
【請求項２】
更に、ECAC2を発現する細胞に被検物質を暴露する工程において、培地を交換する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地の交換が１日当たり１〜６回である請求項２記載の方法。
【請求項４】
培地の交換が１日当たり２回である請求項３記載の方法。
【請求項５】
生体内におけるカルシウム作用が血中カルシウム作用である請求項１記載の方法。
【請求項６】
生体内におけるカルシウム作用が血中カルシウム上昇作用である請求項５記載の方法。
【請求項７】
生体内におけるカルシウム作用が尿中カルシウム作用である請求項１記載の方法。
【請求項８】
生体内におけるカルシウム作用が尿中カルシウム上昇作用である請求項７記載の方法。
【請求項９】
被検物質が低分子化合物である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
被検物質がビタミンＤ化合物である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
被検物質を暴露する期間が10分間以上である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
被検物質を暴露する期間が192時間以下である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
被検物質を暴露する期間が22時間乃至26時間である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ECAC2を発現する細胞が、Caco-2 細胞 (ATCC: HTB-37, CRL-2102)、MDCK（Madin-Darby canine kidney)細胞(ATCC: CCL-34)、fura-2、ヒトリンパ節前立腺癌細胞(ATCC: CRL-13007, CRL-1740, CRL-5813, HB-8206, HB-8307)、HEK293 (ATCC: CRL-1573)、BeWo細胞(ATCC: CCL-98, HB-187)、Jurkat細胞(ATCC: CRL-10915, CRL-1990, CRL-2063, CRL-2424, CRL-2570, CRL-2571, CRL-2572, CRL-2676, CRL-2677, CRL-2678, CRL-2679, CRL-8131, HB-11465, HB-11726, TIB-152, TIB-153)、TC7細胞、Bbe、ラット好塩基性白血病細胞(ATCC: CRL-1378, CRL-2256)、CHO細胞(CCL-61, CRL-10052, CRL-10154, CRL-10762, CRL-11397, CRL-11398, CRL-12444, CRL-12445, CRL-1735, CRL-1736, CRL-1737, CRL-1781, CRL-1860, CRL-1861, CRL-1862, CRL-1865, CRL-1866, CRL-1867, CRL-2092, CRL-2093, CRL-1736, CRL-1737, CRL-1781, CRL-1860, CRL-1861, CRL-1862, CRL-1865, CRL-1866, CRL-1867, CRL-2092, CRL-2093, CRL-2241, CRL-2242, CRL-2243, CRL-2244, CRL-2245, CRL-8200, CRL-9096, CRL-9606)から選択される一種の細胞である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ECAC2を発現する細胞が、Caco-2細胞、MDCK細胞、HEK293、TC7細胞、Bbe細胞から選択される一種の細胞である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ECAC2を発現する細胞がCaco-2細胞である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって、被検物質の生体内におけるカルシウム作用を評価し、生体内におけるカルシウム作用が弱い被検物質を選択する工程を含む、カルシウム作用が弱い化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって、被検物質の生体内におけるカルシウム作用を評価し、生体内におけるカルシウム作用が強い被検物質を選択する工程を含む、カルシウム作用が強い化合物のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１７記載のスクリーニング方法によって選択された、生体内におけるカルシウム作用の弱い化合物。
【請求項２０】
請求項１８記載のスクリーニング方法によって選択された、生体内におけるカルシウム作用の強い化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物のカルシウム作用のポテンシャルの評価方法に関し、より詳しくは、ECAC2 mRNAの発現量を測定することによって化合物のカルシウム作用のポテンシャルを評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物にビタミンＤ化合物を投与したとき、その濃度にしたがって血中カルシウム濃度が高くなることは既に知られている。Song Yらはマウスの血中1,25(OH)2D3濃度と血中Ca濃度は相関係数がr2=0.8と高く、1,25(OH)2D3と血中Ca濃度は相関することを報告している（Song Y, Fleet JC., J Nutr. 2004 Aug;134(8):1857-61；非特許文献１）。しかし、その文献の中で1.25(OH)2D3濃度および血中カルシウム濃度とECAC2 mRNA発現量との相関係数は約r2=0.5と非常に相関が低いことが報告され、マウスに1,25(OH)2D3を0〜25 nmol/100g BW）で投与したとき、ECAC2 mRNA発現量は5 nmol/100g BWで約6倍に増加したが、その後は投与量を上げてもほとんど変動しないことも報告されている。
【０００３】
また、NATALIE F. BARLEY,らは、血中1,25(OH)2D3濃度および1,25(OH)2D3とECAC2 mRNA発現量の相関係数がr2=0.20およびr2=0.14と相関しないこと報告している（Barley NF, Howard A, O'Callaghan D, Legon S, Walters JR., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001 Feb;280(2):G285-90；非特許文献２）。一方、Walters JRらは、VDRのプロモーター領域であるCDX2-siteをSNPでGG、AG、AAと層別化し、その中で血中1,25(OH)2D3とECAC2 ｍRNAの相関がGGでr2=0.33、AGでr2=0.08とGGで相関傾向が認められたと報告している（Walters JR, Barley NF, Khanji M, Rhodes-Kendler O., J Steroid Biochem Mol Biol. 2004 May;89-90(1-5):317-9；非特許文献３）。しかし、相関係数がわずか0.33では相関があったとは考えにくく、血中ビタミンＤ化合物の濃度とECAC2 mRNA発現変動の相関関係は明らかになっていない。
【非特許文献１】Song Y, Fleet JC., J Nutr. 2004 Aug;134(8):1857-61.
【非特許文献２】Barley NF, Howard A, O'Callaghan D, Legon S, Walters JR.,                   Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001 Feb;280(2):G285-90.
【非特許文献３】Walters JR, Barley NF, Khanji M, Rhodes-Kendler O., J                       Steroid Biochem Mol Biol. 2004 May;89-90(1-5):317-9.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ビタミンＤ化合物は、例えば、抗クル病作用、カルシウム代謝調節作用等の薬理作用を有することから、クル病、骨粗しょう症等の治療に有効である。しかしながら、ビタミンＤ化合物は、適度に調整されるべき血中カルシウム濃度に影響を与えるので、その開発に際しては候補化合物のカルシウム作用を迅速かつ的確に評価する方法が必要である。しかしながら、現在知られているビタミンＤ化合物のカルシウム作用の評価系は、迅速さに欠ける、測定感度が高くない、一回に処理できる検体数が少ないなど幾つかの問題点を有している。そこで、このような問題を解決したカルシウム作用の評価方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、Caco-2細胞に発現しているCaチャンネルの中で、3つのCaチャンネル、すなわち、管腔側に発現しているECAC2（epithelial Ca2+ channel）、細胞内に発現しているCABP9K（Calcium binding protein 9K）、及び血管側に発現しているPMCA1（Plasma membrane Ca2+-ATPase）をターゲットとして着目し、種々の実験を重ねた結果、従来明確でなかった、血中ビタミンＤ化合物濃度、血中Ca濃度等とECAC2 mRNA発現量との相関関係を見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）被検物質の生体内におけるカルシウム作用のポテンシャルを評価する方法であって：
（ａ）ECAC2を発現する細胞に、被検物質を一定期間暴露する工程、及び
（ｂ）前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量を測定する工程、
を含んでなる方法；
（２）更に、ECAC2を発現する細胞に被検物質を一定期間暴露する工程において、培地を交換する工程を含む、上記（１）記載の方法；
（３）培地の交換が１日当たり１〜６回である上記（２）記載の方法；
（４）培地の交換が１日当たり２回である上記（３）記載の方法；
（５）生体内におけるカルシウム作用が血中カルシウム作用である上記（１）記載の方法；
（６）生体内におけるカルシウム作用が血中カルシウム上昇作用である上記（５）記載の方法；
（７）生体内におけるカルシウム作用が尿中カルシウム作用である上記（１）記載の方法；
（８）生体内におけるカルシウム作用が尿中カルシウム上昇作用である上記（７）記載の方法；
【０００７】
（９）被検物質が低分子化合物である上記（１）記載の方法；
（１０）被検物質がビタミンＤ化合物である上記（９）記載の方法；
（１１）被検物質を暴露する期間が10分間以上である上記（１）記載の方法；
（１２）被検物質を暴露する期間が192時間以下である上記（１１）記載の方法；
（１３）被検物質を暴露する期間が22時間乃至26時間である上記（１２）記載の方法；
（１４）ECAC2を発現する細胞が、Caco-2 細胞 (ATCC: HTB-37, CRL-2102)、MDCK（Madin-Darby canine kidney)細胞(ATCC: CCL-34)、fura-2、ヒトリンパ節前立腺癌細胞(ATCC: CRL-13007, CRL-1740, CRL-5813, HB-8206, HB-8307)、HEK293 (ATCC: CRL-1573)、BeWo細胞(ATCC: CCL-98, HB-187)、Jurkat細胞(ATCC: CRL-10915, CRL-1990, CRL-2063, CRL-2424, CRL-2570, CRL-2571, CRL-2572, CRL-2676, CRL-2677, CRL-2678, CRL-2679, CRL-8131, HB-11465, HB-11726, TIB-152, TIB-153)、TC7細胞、Bbe、ラット好塩基性白血病細胞(ATCC: CRL-1378, CRL-2256)、CHO細胞(CCL-61, CRL-10052, CRL-10154, CRL-10762, CRL-11397, CRL-11398, CRL-12444, CRL-12445, CRL-1735, CRL-1736, CRL-1737, CRL-1781, CRL-1860, CRL-1861, CRL-1862, CRL-1865, CRL-1866, CRL-1867, CRL-2092, CRL-2093, CRL-1736, CRL-1737, CRL-1781, CRL-1860, CRL-1861, CRL-1862, CRL-1865, CRL-1866, CRL-1867, CRL-2092, CRL-2093, CRL-2241, CRL-2242, CRL-2243, CRL-2244, CRL-2245, CRL-8200, CRL-9096, CRL-9606)から選択される一種の細胞である上記（１）記載の方法；
（１５）ECAC2を発現する細胞が、Caco-2細胞、MDCK細胞、HEK293、TC7細胞、Bbe細胞から選択される一種の細胞である上記（１４）記載の方法；
（１６）ECAC2を発現する細胞がCaco-2 cellsである上記（１５）記載の方法；
【０００８】
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法によって、被検物質の生体内におけるカルシウム作用を評価し、生体内におけるカルシウム作用が弱い被検物質を選択する工程を含む、カルシウム作用が弱い化合物のスクリーニング方法；
（１８）上記（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法によって、被検物質の生体内におけるカルシウム作用を評価し、生体内におけるカルシウム作用が強い被検物質を選択する工程を含む、カルシウム作用が強い化合物のスクリーニング方法；
（１９）上記（１７）記載のスクリーニング方法によって選択された、生体内におけるカルシウム作用の弱い化合物；
（２０）上記（１８）記載のスクリーニング方法によって選択された、生体内におけるカルシウム作用の強い化合物；
などを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の好ましい態様に係る評価方法は、例えば、次のような利点を有する。
（１）短期間（例えば、1週間）で迅速に評価を行うことができる。
（２）極めて感度の高い評価を実施することができる。
（３）1回のスクリーニングで多くの検体を処理することができる。
したがって、これらの利点を有する本発明の評価方法は、特にビタミンＤ誘導体のカルシウム作用のポテンシャルの評価方法として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．本発明のカルシウム作用のポテンシャルの評価方法
まず、本発明は、被検物質の生体内におけるカルシウム作用のポテンシャルを評価する方法であって、（ａ）ECAC2を発現する細胞に被検物質を一定期間暴露する工程、及び、（ｂ）前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量を測定する工程を含んでなる方法を提供する。ここで、「生体内におけるカルシウム作用のポテンシャル」とは、具体的には生体内における血中カルシウム作用のポテンシャル又は生体内における尿中カルシウム作用のポテンシャルをいい、好ましくは生体内における血中カルシウム上昇作用のポテンシャル又は生体内における尿中カルシウム上昇作用のポテンシャルをいい、特に好ましくは生体内における血中カルシウム上昇作用のポテンシャルをいう。ここで「ポテンシャル」とは、被検物質の生体内における血中濃度が250 pg/mLになったときに予想される血中カルシウム上昇作用をいう。Ca作用ポテンシャルは以下のようにして評価することができる。
【００１１】
（Ca作用ポテンシャル評価）
まず，血漿中Caレベルあるいは尿中Ca排泄量が、ビタミンＤ化合物（VD誘導体ともいう）の定常状態血漿中濃度(Css)に比例して上昇すると仮定し，VD誘導体を2種類の投与量で静脈内持続投与したときの定常状態血漿中濃度Csslow, Csshigh(pg/mL)，血漿中Caレベルまたは尿中Ca排泄量（総称してCa作用と呼ぶ）Calow, Cahigh (mg/dLまたはmg/day)を用いて，任意のCss(=X)に対するCa作用を，以下の関数で定義することができる。
【数１】
2006230323.tif 000002
ここで，X=250を代入した値を，Ca作用ポテンシャルとする。
【００１２】
なお、Ca作用のポテンシャル決定の際に、250 pg/mLと設定した理由は、次の通りである。ラットの内因性1,25(OH)2VD3濃度が60 pg/mL(Biochem. Biophys. Res. Commun. 144: 1055-1058 (1987))、ヒトの内因性1,25(OH)2VD3濃度が32〜60 pg/mL(「ビタミンDのすべて」、尾形悦郎、須田立雄ら、サイエンティフィック  P37)である。250 pg/mLはこれらの内因性1,25(OH)2VD3濃度より十分に高い濃度あり、十分にビタミンＤ化合物を投与したときの、投与したビタミンＤ化合物のポテンシャルを評価できる濃度として設定することができる。
【００１３】
１．１  被検物質のECAC2を発現する細胞への暴露工程（ａ）
本発明においては、まず、工程（ａ）において、ECAC2を発現する細胞に被検物質を暴露する。
本発明において用いられる「ECAC2を発現する細胞」は、特に限定されないが、例えばCaco-2細胞 (ATCC: HTB-37, CRL-2102)、MDCK（Madin-Darby canine kidney)細胞(ATCC: CCL-34)、fura-2 (J Biol Chem. 2004 Aug 27;279(35):36546-52. Epub 2004 Jun 07)、ヒトリンパ節前立腺癌細胞(ATCC: CRL-13007, CRL-1740, CRL-5813, HB-8206, HB-8307)、HEK293 (ATCC: CRL-1573)、BeWo cells (ATCC: CCL-98, HB-187)、Jurkat cells (ATCC: CRL-10915, CRL-1990, CRL-2063, CRL-2424, CRL-2570, CRL-2571, CRL-2572, CRL-2676, CRL-2677, CRL-2678, CRL-2679, CRL-8131, HB-11465, HB-11726, TIB-152, TIB-153)、TC7細胞、Bbe (Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002 Sep;283(3):G618-25)、ラット好塩基性白血病細胞(ATCC: CRL-1378, CRL-2256)、CHO（Chinese hamster ovary)細胞(CCL-61, CRL-10052, CRL-10154, CRL-10762, CRL-11397, CRL-11398, CRL-12444, CRL-12445, CRL-1735, CRL-1736, CRL-1737, CRL-1781, CRL-1860, CRL-1861, CRL-1862, CRL-1865, CRL-1866, CRL-1867, CRL-2092, CRL-2093, CRL-1736, CRL-1737, CRL-1781, CRL-1860, CRL-1861, CRL-1862, CRL-1865, CRL-1866, CRL-1867, CRL-2092, CRL-2093, CRL-2241, CRL-2242, CRL-2243, CRL-2244, CRL-2245, CRL-8200, CRL-9096, CRL-9606)等を挙げることができる。好ましくは、Caco-2細胞、MDCK細胞、HEK293、TC7細胞、Bbe細胞から選択される一種の細胞であり、特に好ましくはCaco-2細胞である。
【００１４】
本発明において、「被験物質（または被験成分）」は、生体内におけるカルシウム作用のポテンシャルを評価することが必要な物質である。本発明における好ましい被験物質としては、例えば、ビタミンＤ化合物、ビタミンＤ作用あるいはビタミンＤに対するアンタゴニスト作用を有するその他の化合物等が挙げられる。ここで、「ビタミンＤ化合物」とは、生体内ビタミンＤレセプターに結合し、ビタミンＤ作用あるいはビタミンＤに対するアンタゴニスト作用を引き起こす低分子化合物を意味する。従って「ビタミンＤ化合物」は、セココレステロイド骨格を有する化合物に限定されず、セココレステロイド以外の骨格を有する化合物（例えば、ビタミンＤレセプターモジュレーターであることが知られているビスフェニル骨格を有する化合物、フェニル−チオフェン骨格を有する化合物など）をも包含する。
【００１５】
「ビタミンＤ作用」とは、生体内ビタミンＤレセプターに結合し、遺伝子群(例えば副甲状腺ホルモン、ビタミンＤ−１α位の水酸化酵素、オステオカルシン等)の発現を調節することで引き起こされる作用をいう。具体的には、抗クル病作用、カルシウム代謝調節作用、骨形成作用、細胞分化誘導作用、細胞増殖調節作用等を意味する。ビタミンＤ作用の確認方法としてHL-60分化誘導作用の確認、レポータージーンアッセイ等がある。
「ビタミンＤに対するアンタゴニスト作用」とは、生体内ビタミンＤレセプターに結合し、他の生体内ビタミンＤが引き起こす上記の作用発現を阻害する作用を意味する。ビタミンＤに対するアンタゴニスト作用の確認方法としてHL-60分化誘導作用の確認、レポータージーンアッセイ等がある。
【００１６】
本発明において、「細胞に被験物質を暴露する」とは、被験物質と細胞を接触させることをいい、例えば、被験物質と細胞を培地又は培養液中で接触させることをいう。より具体的には、ECAC2を発現する前記細胞を48ウエルプレート等の適切な容器内で培養し、これに被検物質を添加した細胞培養液（例えば、0.1 ％エタノールまたはDMSO）を添加することによって、被検物質を前記細胞に接触させる。このような接触は、通常、静置下、所定の期間行われる。本発明において、前記細胞に被検物質を暴露する期間は、被検物質が前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量に影響を与えることができる期間であれば特に限定されない。この暴露期間は、適切な評価を行うこと、迅速性を担保することなどを考慮して、10分間以上であることが好ましく、192時間以下であることがより好ましく、22時間乃至26時間であることが特に好ましい。
尚、被検物質としてビタミンＤ化合物を用いる場合は、前記細胞においてビタミンＤ化合物が代謝されることの影響を最小限にするために、添加培地を、１日当り、１〜６回、好ましくは２〜３回、より好ましくは２回交換する。
【００１７】
１．２  ECAC2 mRNAの発現量を測定する工程（ｂ）
次いで、本発明の方法では、前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量を測定する。
本発明において、前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量を測定する方法としては、特に限定されることなく、公知の各種の方法を用いることができる。例えば、PCR法（RT-PCR法、リアルタイム RT-PCR法、半定量的 RT-PCR法など）又はそれに類似した方法を用いることにより、前記細胞におけるECAC2 mRNAの発現量を測定することができる。上記の方法のなかでも、RT-PCR法と近年確立されたリアルタイム定量検出法を組合わせたリアルタイムRT-PCR法が、本発明において好ましく用いられる。
【００１８】
リアルタイムRT-PCR法は、特定の蛍光標識プローブ(TaqMan probe)を用いて核酸を測定する方法である。即ち、例えば5'末端にリポーター色素および3'末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブを、ターゲットDNAにアニールさせた状態で、通常のPCR 反応（またはRT-PCR反応）を行わせると、伸長反応の進行に伴って、DNAポリメラーゼの有する5'-3'エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが5'末端から加水分解される。その結果、5'末端のリポーター色素が3'末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるFRET（FluoresenceResonance Energy Transfer, 両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。この蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイム に選択的に定量および検出できる方法である。
【００１９】
リアルタイム定量検出法においては、プローブとして、前記特定配列を有するオリゴヌクレオチドの一端、例えば5'-末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば3'-末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを利用する。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャー色素は、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合にレポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものである。レポーター色素の例としては、例えば6-カルボキシ-フルオレッセイン(FAM)、テトラクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(TET)、2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレッセイン(JOE)、ヘキソクロロ-6 -カルボキシフルオレッセイン(HEX)などが挙げられ、本発明ではFAMが好ましく用いられる。クエンチャー色素の例としては、例えば6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン (TAMRA)などが挙げられ、好ましく用いられる。
【００２０】
２．本発明のスクリーニング方法及びその方法によって得られる化合物
本発明はまた、上記の方法によって被検物質の生体内におけるカルシウム作用を評価し、生体内におけるカルシウム作用が弱い被検物質をあるいはその作用が強い被検物質を選択する工程を含む、所望の強さのカルシウム作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。ここでいう「被験物質」も、特に限定されず、生体内におけるカルシウム作用を評価するための如何なる物質をも含む。そのような被験物質として、特に限定されず、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられる。
【００２１】
さらに本発明は、該スクリーニング方法によって選択された、生体内におけるカルシウム作用の弱い被検物質または生体内におけるカルシウム作用の強い被検物質を提供する。ここで、生体内におけるカルシウム作用の弱い物質は、例えば、骨粗鬆症、二次性副甲状腺機能亢進症、乾癬、癌、前立腺肥大症等の治療剤の活性成分として有用である。また、生体内におけるカルシウム作用の強い物質は、例えば、低カルシウム血症（例えば、二次性副甲状腺機能亢進症患者の透析直後、低アルブミン血症、ネフローゼ症候群、突発性副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症、又は急性膵炎に伴う低カルシウム血症）等の治療剤の活性成分として有用である。したがって、本発明は、そのような治療剤にも関する。
【００２２】
上記治療剤の投与形態は、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、水性および非水性の経口用溶液および懸濁液、および個々の投与量に小分けするのに適応した容器に充填した非経口用溶液を包含する。投与単位形態は、また、皮下移植のような調節された放出処方物を包含する種々の投与方法に適応させることもできる。投与方法は、経口的、直腸的、非経口的（静脈内的、筋肉内的、皮下的）、槽内的、膣内的、腹腔内的、膀胱内的、局所的（点滴、散剤、軟膏、ゲルまたはクリーム）投与および吸入（口腔内または鼻スプレー）を包含する。
【００２３】
非経口的処方物は、医薬的に許容し得る水性または非水性溶液、分散液、懸濁液、乳濁液およびこれらを製造するための滅菌粉末を包含する。このような担体の例は、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、植物油および注射できる有機エステル、例えばオレイン酸エチルを包含する。流動性は、レシチン、界面活性剤のようなコーティングの使用によって維持することができる。固体の投与形態に対する担体は、（a）充填剤または増量剤、（b）結合剤、（c）保湿剤、（d）崩壊剤、（e）溶液遅延剤、（f）吸収促進剤、（g）吸着剤、（h）滑沢剤、（I）緩衝剤および（j）噴射剤を包含する。組成物は、また、補助剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸；等張剤、例えば糖または塩化ナトリウム；吸収―延長剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン；および吸収−増強剤を含有することもできる。
上記有効成分を含有する治療剤の投与量、投与回数は対象の疾患患者の年齢、体重、病状および他の投薬の存在といった因子を考慮して、適宜決定できる。一般に、そのような治療剤は、通常成人1人あたり、有効成分の投与量として1〜10000 mg好ましくは10〜200 mg投与し得る。また、投与は時間差を持って行ってもよく、例えば１日１回から３回、必要に応じて繰り返してもよい。
【００２４】
実施例
以下に実験例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
実験例１：ラットにおける血中VD誘導体及び血中Ｃａ濃度の評価
１．実験動物
Slc:SD系統のラット（雄性；入荷時７週齢、投与時約9週齢；日本エスエルシー社）を、約1週間馴化後に静脈内持続投与モデル作製のための処置を施し、さらに約1週間馴化した。モデル作製のための手術は、投与開始の約1週間前（入荷後１週間，8週齢）に全例について行った。動物にミダゾラム（8 mg/kg，ドルミカム，山之内製薬社製）、ドロペリドール（4 mg/kg，ドロレプタン，三共社製）およびペンタゾシン（60 mg/kg，ソセゴン，山之内製薬社製）を腹腔内投与し全身麻酔した。大腿部内側の皮膚を切開し、大腿静脈を剥離した。カテーテル（3 Fr，ポリウレタン製）を大腿静脈から挿入し、後大静脈に位置するよう固定した。カテーテルの他端は、皮下を通して尾部より体外へ導出し、テールカフおよびテサーを装着後、シーベル、フィルターおよびシリンジポンプ（テルモ社製）を介してシリンジに接続した。カテーテル内の凝血予防のため、被験物質の投与開始まで、生理食塩液（テルモ社製）を4 mL/kg/hrの速度で持続投与した。
【００２６】
２．飼育環境
実験動物の飼育環境として、温度を    24±2 ℃に、湿度を55±10％に、換気回数を14〜16回／時、照明時間を14時間（午前5時〜午後7時点灯）に設定した。なお、ケージとして、手術前は、金網製吊りケージ（大きさ：幅660 mm，奥行310 mm，高さ200 mm；材質：ステンレス製；飼育密度：5匹／ケージ）を用いた。手術後は、ケージとして、ラットinfusion用個別ケージ（大きさ：幅220 mm，奥行380 mm，高さ180 mm；材質：ポリカーボネート製（本体），ステンレス製（蓋））を用い、飼育密度は1匹／ケージとした。飼料としては、固型飼料CE-2（日本クレア（株)）を、ステンレススチール製給餌器を用いて不断給
与した。飲料水は、自動給水あるいはポリサルホン製給水瓶を用いて不断給与した。
群構成として、1検体あたり低用量（目標Css 50 または100 pg/mL）、高用量（目標Css 250 pg/mL）の2群を設定した。試験は3回に分けて実施し（Step 1, Step 2-1, Step 2-2）、各回ごとにvehicle投与群を設置した。
【００２７】
３．被験物質及び投与液の調製
投与液は、投与溶媒として2% Tween 20含有生理食塩液 /エタノール=1980/20（V/V）を用い、下記被験物質（保存条件：冷凍（-20℃）；中外製薬社製）の原液をエタノール溶液として投与液の100倍濃度に調製後、2% Tween 20含有生理食塩液で希釈して調製した。投与液は用時調製した。
（１）1,25(OH)2D3,；
（２）化合物１（(1R,3S,5Z)-4-メチレン-5-[(2E)-[(1S,3aS,7aS)-オクタヒドロ-1-[(1S)-1-[(2S)-2-ヒドロキシ-3-メチルブトキシ]エチル]-7a-メチル-4H-インデン-4-イリデン]エチリデン]-1,3-シクロヘサンジオール：(1R,3S,5Z)-4-methylene-5-[(2E)-[(1S,3aS,7aS)-octahydro-1-[(1S)-1-[(2S)-2-hydroxy-3-methylbutoxy]ethyl]-7a-methyl-4H-inden-4-ylidene]ethylidene]-1,3-cyclohexanediol）；
（３）化合物２（(1R,3S,5Z)- 5-[(2E)-[(3aS,7aS)-3,3a,5,6,7,7a-ヘキサヒドロ-1-[(1R)-1-[[(2R)-2-ヒドロキシ-3-メチルブチル]チオ]エチル]-7a-メチル-4H-インデン-4-イリデン]エチリデン]-4-メチレン-1,3-シクロヘキサンジオール：(1R,3S,5Z)- 5-[(2E)-[(3aS,7aS)-3,3a,5,6,7,7a-hexahydro-1-[(1R)-1-[[(2R)-2-hydroxy-3-methylbutyl]thio]ethyl]-7a-methyl-4H-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylene-1,3-Cyclohexanediol）；
（４）化合物３（(1R,3S,5Z)- 5-[(2E)-[(3aS,7aS)-1-[(1S)-6-エチル-6-ヒドロキシ-1-メチル-4-オクチニル]-3,3a,5,6,7,7a-ヘキサヒドロ-7a-メチル-4H-インデン-4-イリデン]エチリデン]-4-メチレン-1,3-シクロヘキサンジオール：(1R,3S,5Z)- 5-[(2E)-[(3aS,7aS)-1-[(1S)-6-ethyl-6-hydroxy-1-methyl-4-octynyl]-3,3a,5,6,7,7a-hexahydro-7a-methyl-4H-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylene-1,3-cyclohexanediol）；
（５）化合物４（[(1S)-1-[(3aS,7E,7aS)-7-[(2Z)-[(3S,5R)-3,5-ジヒドロキシ-2-メチレンシクロヘキシリデン]エチリデン]-3a,4,5,6,7,7a-ヘキサヒドロ-3a-メチル-1H-インデン-3-イル]エトキシ]-酢酸 1,1-ジメチルエチルエステル；[(1S)-1-[(3aS,7E,7aS)-7-[(2Z)-[(3S,5R)-3,5-dihydroxy-2-methylenecyclohexylidene]ethylidene]-3a,4,5,6,7,7a-hexahydro-3a-methyl-1H-inden-3-yl]ethoxy]-acetic acid 1,1-dimethylethyl ester）
【００２８】
４．被験物質の投与
上記のようにして調製した投与液を、上記のようにして準備した実験動物に、下記5被験物質（検体）を、24時間毎に投与液を交換し、96時間静脈内持続投与した。なお、投与容量は、4 mL/h/kgとした。
【００２９】
５．試料の採取および処理
実験動物からは、所定の時期に、Ca測定のみの場合約1 mL，Caおよび検体濃度測定の場合約2 mLの血液を、（１）Ca測定用としては、オペ前，投与前，投与開始後72時間及び 96時間経過後に、（２）Caおよび検体濃度測定用としては、投与開始後24時間及び48時間経過後に、頸静脈より採血して採取した。採取した試料は、1870G，4℃で10分遠心分離し，血漿を採取した。なお、試料は必要に応じて-20℃にて凍結保存した。
【００３０】
６．血漿中VD誘導体（未変化体）濃度の測定
血清試料0.3 mLをBond Elute（登録商標） C18とBond Elute（登録商標） NH2 (Varian)により固相抽出し、測定用試料を調製し、血漿中VD誘導体（未変化体）濃度を下記のような条件で測定した。
測定方法：          LC-MS/MS法
イオン化法；        ESI(+)
検出法；  multiple reaction monitoring法
移動相；メタノール −10 mM 酢酸アンモニウム (9:1, v/v)
流速；    0.2 mL/min
カラム；  CAPCELL PAK C18 UG120 粒径5μm
内径2.0mm，長さ250mm  （（株）資生堂）
precursor > product ion m/z；
1,25(OH)2D3  434 > 381
化合物１     436 > 297
化合物２     450 > 313
化合物３     470 > 435
化合物４     462 > 313
測定機器：          HPLC装置            HP1100 （Agilent Technologies）
MS/MS装置           API300 （Applied Biosystems/MDS Sciex）
【００３１】
７．血漿中Ca濃度の測定
上記のようにして調製した試料について、自動分析装置7170（日立製作所製）を用い、OCPC法に基づいて血漿中Ca濃度の測定した。
【００３２】
実施例１：ECAC2発現細胞を用いたECAC2 mRNAの測定
１．Caco-2細胞の培養
液体窒素タンク中に保存してある継代数29〜30のCaco-2細胞（ATCCより入手し、継代したもの）を37℃ですばやく解凍し、約4 x 105Cells/mLとなるように細胞培養液(終濃度として2mM L-glutamine、1mM non-essential amino acids及び10％FBSを加えたDulbecco's Modified Eagle Medium) 6mLに希釈し、小フラスコ(底面積25cm2)に蒔いた。その後、約4日間37℃、5％CO2の条件で培養し、細胞が70〜90％程度にコンフルエントとなった時点でトリプシン処理し、48ウエル・セルカルチャークラスター（cell culture cluster：底面積0.8cm2  costar 3548）に7.8 x 104 Cells/cm2の細胞密度で播種した。
【００３３】
２．被験物質の Caco-2細胞への暴露
播種後、4日間経過したCaco-2細胞に1、10または100nMとなるように各被験物質（Calcitriol、化合物１、化合物２、化合物３又は化合物４）を添加した細胞培養液（0.1％エタノールまたはDMSO）1.5mLを添加後、37℃、5％CO2の条件で6〜96時間静置した。コントロール群はVD誘導体の代わりにDMSOまたはエタノールのみを添加した細胞培養液を添加した。なお、VD誘導体添加培地の交換は、Caco-2細胞におけるVD誘導体の代謝の影響を最小限にするために1日2回行った。
【００３４】
３．TotalRNA採取方法
Vitamin D誘導体の所定暴露期間が終了したCaco-2細胞はVitamin D誘導体添加培地を取り除いた後、低温のPBS 1mLで2回洗浄し、RNeasy mini kitを用いてTotalRNAを採取した。以下にRNeasy mini kitのプロトコールを示す。
PBSで洗浄した細胞にβ-Mercaptoethanol添加(10μL/mL)Buffer RLTを0.35mL添加し、数回ピペッティングした。さらに70％エタノール0.35mL添加し、数回ピペッティングした。全量0.7mLをRNeasy mini columnにapplyし、8000gで15秒間(25℃)遠心分離した。その後、Buffer RW1 0.7mLをカラムに添加後8000gで15秒間(25℃)遠心分離し、次にBuffer RPE 0.5mLをカラムに添加後10000gで2分間(25℃)遠心分離し、さらに10000gで1分間(25℃)遠心分離した。最後にRNase free water 30〜60μLをカラムに加えて8000gで1分間(25℃)遠心分離し、溶出液をTotalRNA試料とした。
測定までTotalRNAは-80℃に設定された冷凍庫に保存した。
【００３５】
４．DNase I処理
TotalRNA約1μg、DNase I 1μL、10 x DNase reaction buffer 1μLにDEPC処理水を加え10μLとし、室温15分間反応させた。反応終了後25mM EDTA 1μL加え、65℃で10分間インキュベートすることによりDNase Iを失活させた。
また、TotalRNA採取時にDNase I処理するためにRNase-Free DNase Set を用いた。Cell Lysateを含む全量0.7mLをRNeasy mini columnにapplyし、8000gで15秒間(25℃)Centrifugeした。Buffer RW1 0.35mL添加後8000gで15秒間(25℃)Centrifugeし、その後DNase I（10μL stock solutionと70μL Buffer RDD混合したもの）80μLをカラムにアプライし15分間放置した。放置後、Buffer RW1 0.35mL添加後8000gで15秒間(25℃)Centrifugeした。その後はRNeasy mini kitのプロトールに従った。
【００３６】
５．リアルタイム RT-PCR反応
コントロールのGAPDHは、DNase I処理したTotalRNA 0.5〜1μg、10 x Taqman buffer A 2.5μL、25mM Magnesium Chloride 5.5μL、10mM dATP, dCTP, dGTP and 20mM dUTP  各0.75μL、primer 0.5μL、Taqman Probe 0.5μL、AmpliTaq Gold DNA polymerase 0.125μL、MultiScribe Reverse Transcriptase 0.125μL、RNase Inhibitor 0.5μL、DEPC処理水を加えて全量25μLとした。
ECAC2はDNase I処理したTotalRNA 0.5〜1または1〜2μg、10 x Taqman buffer A 2.5または1.25μL、25mM Magnesium Chloride 5.5または2.75μL、10mM dATP, dCTP, dGTP and 20mM dUTP  各0.75または0.38μL、primer 0.5μL、Taqman Probe 0.5または0.25μL、AmpliTaq Gold DNA polymerase 0.125または0.06μL、MultiScribe Reverse Transcriptase 0.125または0.06μL、RNase Inhibitor 0.5または0.25μL、DEPC処理水を加えて全量25μLとした。
【００３７】
上記の反応溶液を調製後、PRISM7700を使って測定した。反応条件を以下に示す。
1-1  48℃  30min
2-1  95℃  10min
3-1  95℃  15second
3-2  60℃  1min
ステップ3を40〜55回繰り返した。
なお、ECAC2遺伝子増幅用のプライマーおよびプローブとして以下の配列を用いた。
Forward: 5'-GATTTTTGGCGACCTGATGC-3'(175-195)（配列番号：１）
Reverse: 5'-GGCTGAAGCAAGCCCAG-3'(224-242)（配列番号：２）
Taqman probe: 5'-TTCTGCTGGCTGATGGCTGTGGTC-3'(198-221)（配列番号：３）
プローブは5'をFluorescent：FAMで、3'をQuencher：TAMRAでそれぞれ標識した。コントロールとして増幅するGAPDH遺伝子用試薬として、TaqMan GAPDH control reagents（Applied Biosystems）を使用した。
【００３８】
なお、上記実験においては、ABI PRISM7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)及び微量高速冷却遠心機MX-160（トミー精工）を用い、試薬としては次のものを用いた。
ダルベッコ改良イーグル培地 (GIBCO)；10mM 非必須アミノ酸 (GIBCO)；FBS (INTERGEN)：トリプシン (DIFCO)；Taqman Gold RT-PCR Kit(Applied Biosystems：10 x Taqman buffer A、25mM 塩化マグネシウム、10mM dATP, dCTP, dGTP and 20mM dUTP、5 units/μL AmpliTaq Gold DNA polymerase、50 units/μL MultiScribe Reverse Transcriptase、0.4 units/μL RNase Inhibitor）；Forward and Reverse primers (ECAC2, 50μM, hGAPDH 10μM)；Probes (ECAC2 10μM, hGAPDH 5μM)；TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents Kit(Applied Biosystems：2 x AmpliTaq Gold DNA polymerase, dNTPs with dUTP、40 x MultiScribe Reverse Transcriptase RNase Inhibitor）；RNeasy mini Kit (Qiagen：RNeasy mini spin columns、Buffer RLT、Buffer RW1、Buffer RPE）；RNase-Free DNase Set（Qiagen：DNase I, RNase-Free、Buffer RDD）；DNase I(GIBCO)；10 x DNase reaction buffer(GIBCO)；25mM EDTA(GIBCO)
なお、その他の試薬は記載しない限り、特級およびそれと同様のグレードの試薬を使用した。
【００３９】
データ解析
１．三点濃度暴露試験
各ビタミンＤ誘導体暴露群における1細胞当たりの各CaチャンネルのmRNA発現量は、その細胞のGAPDH mRNA発現量に対する比を算出することで補正した。
さらにその補正値を使ってコントロール群に対する差を算出し、その差をEmaxモデルに当てはめ、EC50を算出しその各EC50をCalcitriol群と比較してCalcitriol比を算出した。
Emaxモデル
【００４０】
【数２】
2006230323.tif 000003
Ei：各Vitamin D誘導体暴露群のECAC2 mRNA発現量のGAPDH mRNA発現量に対する比
E0：コントロール群のECAC2 mRNA発現量のGAPDH mRNA発現量に対する比
Ci：Vitamin D誘導体の暴露濃度
【００４１】
２．三点濃度暴露試験
4日間培養したCaco-2細胞にCalcitriol、化合物１、化合物２、化合物３又は化合物４を1、10および100nMで24時間暴露し、Caco-2細胞におけるECAC2 mRNA発現量のEC50の結果を表１に示し、Vitamin D誘導体の血中Ca作用を評価したデータを表２に示した。ECAC2 mRNA発現変動とVitamin D誘導体の血中Ca作用の相関を検討した結果、相関係数がR2で0.9315と非常に高いことが明らかとなった。
【００４２】
【表１】
2006230323.tif 000004
【００４３】
【表２】
2006230323.tif 000005
【００４４】
上記の分析結果から次のことが判明した。
（１）本発明の価方法はデータアップまでの日数が極めて短く（例えば、1週間）、迅速な評価方法である。
（２）本発明の好ましい評価方法では、各検体間の最大差が300倍にも達し、極めて高感度である。
（３）本発明の評価方法によれば、1回のスクリーニングで多くの検体（例えば、約75検体）を処理できる。例えば、三点濃度で暴露した場合には、1回のスクリーニングで処理できる検体数は最大25である。しかし、試験期間が短期間で完了するため、1週間に2サイクルのスクリーニングを行うことができる。したがって、1週間に、一点濃度暴露方法で150検体、三点濃度暴露方法で約50検体のスクリーニングが可能であり、本発明の評価方法の処理能力は高いことが示された。
（４）本発明の評価方法は短期間かつ高感度でスクリーニングを行えるため、検体を三点濃度暴露する事が可能である。三点濃度でスクリーニングを行い、そのEC50を指標にすることによって不適切な評価（Over/Under Estimate）を回避することができ、in vivoにおけるラット持続投与時の血漿中Ca濃度と良好な相関を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の好ましい態様に係る評価方法は、例えば、（１）短期間で迅速に評価を行うことができる、（２）感度の高い評価を実施できる、（３）1回のスクリーニングで多くの検体を処理することができるなどの利点を有する。したがって、これらの利点を有する本発明の評価方法は、特にビタミンＤ誘導体のカルシウム作用のポテンシャルの評価方法として極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号：１は、ECAC2増幅のためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：２は、ECAC2増幅のためのプライマーの塩基配列である。
配列番号：３は、Real time RT-PCR反応に用いるプローブの塩基配列である。
【配列表】
2006230323000001.app