(57)【要約】【課題】本発明は、慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性に影響を及ぼすｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型の検出を容易せしめるための有用な手法を提供するものである。【解決手段】ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析する方法として、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を検出する場合、変異部分にプローブを作成し、該プローブと測定したい核酸配列を含む溶液とを混合しプローブと核酸配列のハイブリダイズの様子を解析することで判定できる。また、慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性に影響を及ぼすｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型を検出するためのプライマーを設計し、遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅産物が得られたか否かによって慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法であって、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を核酸レベルで解析することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記変異をプライマーもしくはプローブを用いて解析することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を引き起こすヌクレオチドに対応するようにプライマーが設計されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プライマーの３’末端のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
チロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法であって、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号３１５番のスレオニンから他のアミノ酸への変異を核酸レベルで検出するためのプライマーもしくはプローブを用いて解析することを特徴とする慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【請求項６】
プライマーの３’末端のヌクレオチドが、前記変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが、前記変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２４４、２４８、２５０、２５２、２５３、２５５、３１１、３１５、３１７、３４３、３５１、３５５、３５９、３７９、３８２、３８７、３９６からなる群より選択されるアミノ酸の変異をプライマーもしくはプローブを用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【請求項９】
ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２４４、２４８、２５０、２５２、２５３、２５５、３１１、３１５、３１７、３４３、３５１、３５５、３５９、３７９、３８２、３８７、３９６からなる群より選択されるアミノ酸の変異をプライマーの３’末端より２番目の塩基に対応している該プライマーを用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【請求項１０】
配列番号１−５に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つをプライマーもしくはプローブとして用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【請求項１１】
配列番号１に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つをｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の野生型および変異型の共通のプライマーとして用いることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号２及び４に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つを、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の野生型のプライマーもしくはプローブとして用いることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号３及び５に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つを、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型のプライマーもしくはプローブとして用いることを特徴とする請求項１０に記載の方法
【請求項１４】
プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライマーの３’末端のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの塩基に、相補的でないヌクレオチドが少なくとも１つ含まれることを特徴とする請求項３，７，９及び１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
プライマーが、予めビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団よりなる群から選ばれたいずれかにより標識されていることを特徴とする請求項２〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項２〜１７のいずれかに記載のプライマーを利用して遺伝子増幅法を行い、遺伝子増幅産物が得られたか否かによって慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定する方法。
【請求項１９】
遺伝子増幅法を行うに先立って、標的となるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子を含む試料を予め制限酵素処理を行うことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれるということを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子増幅法がＰＣＲであり、該ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼがピロコッカス・エスピーＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム由来であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
電気泳動、ハイブリダイゼーション法、５’ヌクレオチダーゼ活性を利用した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法、インターカーレーターを用いた蛍光検出法からなる群より選ばれる方法をもちいて、遺伝子増幅産物が得られたか否かを分析することを特徴とする請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ハイブリダイゼーション法、５’ヌクレオチダーゼ活性を利用した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法、インターカーレーターを用いた蛍光検出法からなる群より選ばれる方法を用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を核酸レベルで解析することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１０倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１００倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１０００倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１００００倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
請求項２〜１７のいずれかに記載の１対のプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）と、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドとを含むことを特徴とする慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定するための試薬キット。
【請求項３０】
請求項２９記載のＤＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする試薬キット。
【請求項３１】
ＤＮＡポリメラーゼがピロコッカス・エスピーＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム由来であることを特徴とする請求項２９または３０に記載の試薬キット。
【請求項３２】
さらに制限酵素を含むことを特徴とする請求項２９〜３１のいずれかに記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞における薬剤感受性の検査に用いられるプライマーに関する。具体的には、慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性に影響を及ぼすｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型の存在を検出することによって、薬剤に対する感受性または耐性を高感度に検出する方法である。
【背景技術】
【０００２】
化学療法においては、標的となる細胞や組織の薬剤感受性の早期診断は、治療戦略上、有効な手段となる。薬剤感受性には、薬剤が効果的に作用する場合と、薬剤に対する耐性が強まる場合がある。薬剤感受性の早期診断が可能となれば、薬剤が効果的に作用する場合は、薬剤の副作用を勘案し、薬剤投与量の検討を行うことができる。また、薬剤に対する耐性が強まる場合、癌細胞の薬剤耐性が強まるのに反比例して、その薬剤の有効性は徐々に減少する傾向を示す。よって、薬剤耐性の初期検出は、別の治療戦略の開発、選択、および時期を決めるために非常に有益なものである。薬剤耐性の獲得は標的分子をコードする遺伝子に変異が生じることによって生じることが知られている。
【０００３】
この変異を分析する従来技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）がある。核酸配列決定法は核酸配列中に含まれる変異を検出、同定することができるが、鋳型核酸の調製、ＤＮＡポリメラーゼ反応、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核酸配列の解析等を行うため多大な労力と時間が必要である。また近年の自動シークエンサーを用いることで省力化は行うことができるが、高価な装置が必要であるという問題がある。
【０００４】
他に変異を検出する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの遺伝子増幅法を利用した遺伝子の変異の検出方法が知られている（例えば、特許文献１及び２参照）。この方法では、遺伝子増幅法に用いる一対のプライマーのうち、一方のプライマーとして、野生型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な野生型プライマーと、変異型遺伝子の増幅領域の端部領域に完全に相補的な変異型プライマーを用いる。変異型のプライマーは、その３’末端が予想される変異を起こしたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドになっている。このような野生型及び変異型プライマーをそれぞれ別個に用いて試料遺伝子を遺伝子増幅法に供する。
【０００５】
試料遺伝子が野生型であれば、野生型プライマーを用いた場合には核酸の増幅が起きるが、変異型プライマーを用いた場合には、プライマーの３’末端が試料遺伝子の対応ヌクレオチドと相補的ではない（ミスマッチ）ので伸長反応が起きず、核酸の増幅は起きない。一方、試料遺伝子が変異型であれば、逆に、野生型プライマーを用いた場合には増幅が起きず、変異型プライマーを用いた場合に増幅が起きる。従って、各プライマーを用いた場合に増幅が起きるか否かを調べることにより、試料遺伝子が野生型か変異型かを判別することができ、それによって試料遺伝子中の変異を検出することができる。また変異を含む核酸配列を予め増幅しておき、各プライマーにおいて増幅核酸を用いて伸長反応が起きるか否かでの判定を行ってもかまわない。
このような原理によれば、従来法により明確に塩基変異型の検出が行えるように思われるが、実際には、野生型プライマーと変異型プライマーとはわずか１塩基の相違があるのみであり、変異型プライマーを用いて野生型遺伝子を増幅した場合及び野生型プライマーを用いて変異型遺伝子を伸長もしくは増幅した場合にもある程度の反応が起きることが多く、明確な判定が困難となる場合が少なくない。このようなミスマッチな組み合わせにおいて伸長または増幅が起きるか否かは、用いる機器の種類やその他の微妙な条件によって左右され、再現性も低い場合がある。従って、ミスマッチな組み合わせで反応が完全に起こらないようにするためには、反応時の温度条件等を極めて厳密に制御する必要があり、かなり困難な作業になる。
【０００６】
また、正確な伸長反応が可能である３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲに用いた場合は、更に判定を困難にさせる場合がある。すなわち、ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性によって、野生型プライマーと変異型プライマーの唯一ことなる３’末端が消失し、差異がなくなるおそれがある。しかし、ハイブリダイゼーション等で検出する場合、ＤＮＡプローブでの検出を容易せしめるためには正確な伸長反応を行う必要がある。
【０００７】
Ｔａｑポリメラーゼのように３’エキソヌクレアーゼが欠損したＤＮＡポリメラーゼの場合、伸長反応においてミスがあってもそれを更正することができずに変異を含んだ伸長反応を行う場合がある。この変異を含んだ伸長産物をハイブリダイゼーション等で検出する場合、ＤＮＡプローブの選定を極めて厳密に行わなければならない。
【０００８】
薬剤耐性に関連した変異遺伝子の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）後、制限酵素を用いる方法も検討されている（例えば、非特許文献１参照）。変異遺伝子は、増幅された核酸断片を配列特異的に切断することのできる制限酵素を用いるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によって検出される。ところが変異遺伝子の存在量が野生型遺伝子に比して極めて少ない場合、ＰＣＲ増幅においてバイアスが生じ、変異遺伝子の増幅が妨げられ、結果として検出されない場合がある。この場合、薬物を投与し続けると薬物に対する耐性を有する変異遺伝子を有する細胞の生存比率が高くなる結果、薬剤の治療効果は失われる。また、この方法では、少なくとも１０６個の腫瘍細胞が必要であり、その中にごくわずかしか存在しない薬剤耐性遺伝子は遺伝子増幅段階において、圧倒的多数を示す感受性遺伝子の存在のため、増幅されず結果として検出することが困難である。
【特許文献１】特公平４−６７９５７号公報
【特許文献２】特公平４−６７９６０号公報
【非特許文献１】BLOOD  第１００巻、第１０１４〜１０１８頁（２００２年発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性に影響を及ぼすｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型の検出を容易せしめるための有用な手法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
本発明は以下のような構成からなる。
【００１２】
１．  チロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法であって、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を核酸レベルで解析することを特徴とする方法。
【００１３】
２．  前記変異をプライマーもしくはプローブを用いて解析することを特徴とする項１に記載の方法。
【００１４】
３．  プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を引き起こすヌクレオチドに対応するようにプライマーが設計されていることを特徴とする項２に記載の方法。
【００１５】
４．  プライマーの３’末端のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする項２に記載の方法。
【００１６】
５．  チロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法であって、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号３１５番のスレオニンから他のアミノ酸への変異を核酸レベルで検出するためのプライマーもしくはプローブを用いて解析することを特徴とする慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【００１７】
６．  プライマーの３’末端のヌクレオチドが、前記変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする項５に記載の方法。
【００１８】
７．  前記プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが、前記変異を引き起こすヌクレオチドに対応するように設計されていることを特徴とする項５に記載の方法。
【００１９】
８．  ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２４４、２４８、２５０、２５２、２５３、２５５、３１１、３１５、３１７、３４３、３５１、３５５、３５９、３７９、３８２、３８７、３９６からなる群より選択されるアミノ酸の変異をプライマーもしくはプローブを用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【００２０】
９．  ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２４４、２４８、２５０、２５２、２５３、２５５、３１１、３１５、３１７、３４３、３５１、３５５、３５９、３７９、３８２、３８７、３９６からなる群より選択されるアミノ酸の変異をプライマーの３’末端より２番目の塩基に対応している該プライマーを用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【００２１】
１０．  配列番号１−５に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つをプライマーもしくはプローブとして用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型を検出し、それに基づきチロシンキナーゼ阻害活性を有する慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法。
【００２２】
１１．  配列番号１に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つをｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の野生型および変異型の共通のプライマーとして用いることを特徴とする項１０に記載の方法。
【００２３】
１２．  配列番号２及び４に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つを、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の野生型のプライマーもしくはプローブとして用いることを特徴とする項１０に記載の方法。
【００２４】
１３．  配列番号３及び５に示される配列またはこれに相補的な配列のうち、連続した少なくとも１５塩基を含んだ少なくとも一つを、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型のプライマーもしくはプローブとして用いることを特徴とする項１０に記載の方法
１４．  プライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする項１２または１３に記載の方法。
【００２５】
１５．  プライマーの３’末端のヌクレオチドが、ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異部位に対応するように設計されていることを特徴とする項１２または１３に記載の方法。
【００２６】
１６．  プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの塩基に、相補的でないヌクレオチドが少なくとも１つ含まれることを特徴とする項３，７，９及び１４のいずれかに記載の方法。
【００２７】
１７．  プライマーが、予めビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団よりなる群から選ばれたいずれかにより標識されていることを特徴とする項２〜１６のいずれかに記載の方法。
【００２８】
１８．  項２〜１７のいずれかに記載のプライマーを利用して遺伝子増幅法を行い、遺伝子増幅産物が得られたか否かによって慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定する方法。
【００２９】
１９．  遺伝子増幅法を行うに先立って、標的となるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子を含む試料を予め制限酵素処理を行うことを特徴とする項１８に記載の方法。
【００３０】
２０．  前記遺伝子増幅法が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＲおよびＴＭＡよりなる群から選ばれるということを特徴とする項１８に記載の方法。
【００３１】
２１．  前記遺伝子増幅法がＰＣＲであり、該ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする項１８に記載の方法。
【００３２】
２２．  前記ＤＮＡポリメラーゼがピロコッカス・エスピーＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム由来であることを特徴とする項２１に記載の方法。
【００３３】
２３．  電気泳動、ハイブリダイゼーション法、５’ヌクレオチダーゼ活性を利用した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法、インターカーレーターを用いた蛍光検出法からなる群より選ばれる方法をもちいて、遺伝子増幅産物が得られたか否かを分析することを特徴とする項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
【００３４】
２４．  ハイブリダイゼーション法、５’ヌクレオチダーゼ活性を利用した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法、インターカーレーターを用いた蛍光検出法からなる群より選ばれる方法を用いてｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を核酸レベルで解析することを特徴とする項１に記載の方法。
【００３５】
２５．  対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１０倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００３６】
２６．  対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１００倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００３７】
２７．  対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１０００倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００３８】
２８．  対立遺伝子が測定対象の変異アミノ酸を有する遺伝子の少なくとも１００００倍存在する場合において、特異的に測定対象物を検出する項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００３９】
２９．  項２〜１７のいずれかに記載の１対のプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）と、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドとを含むことを特徴とする慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性を判定するための試薬キット。
【００４０】
３０．  項２９記載のＤＮＡポリメラーゼが二本鎖ＤＮＡの３’エキソヌクレアーゼ活性を有することを特徴とする試薬キット。
【００４１】
３１．  ＤＮＡポリメラーゼがピロコッカス・エスピーＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム由来であることを特徴とする項２９または３０に記載の試薬キット。
【００４２】
３２．  さらに制限酵素を含むことを特徴とする項２９〜３１のいずれかに記載の試薬キット。
【発明の効果】
【００４３】
本発明は、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析することで、慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を判定する方法を提供するものである。本発明により、特殊な技術を要することもなく、厳密な反応条件の制御を用いる必要もなく、慢性骨髄性白血病の治療薬に対する感受性を早期診断できるようになり、化学療法の治療戦略において有効な手段として期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
ｂｃｒ−ａｂｌポリペプチド配列及びＤＮＡ配列の番号付けは、GenBank accession no. M14752に登録された配列の番号付けに基づくものである。例えば２５５位と３１５位のアミノ酸変異の非制限的な例を、以下に示す。
【００４５】
塩基１１２７番目のＧ→Ａ（アミノ酸２５５番目のＥ→Ｋ）
塩基１３０８番目のＣ→Ｔ（アミノ酸３１５番目のＴ→Ｉ）
ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析する方法として、プローブを用いる方法、核酸配列を複製または増幅する方法が利用できる。あるいは、これらの方法を組み合わせた方法も利用できる。
【００４６】
ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析する方法として、プローブを用いる方法が利用できる。例えば、本発明のｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を検出する場合、変異部分にプローブを作成し、該プローブと測定したい核酸配列を含む溶液とを混合しプローブと核酸配列のハイブリダイズの様子を解析することで判定できる。例えば、ＴａｑＭａｎプローブ法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  第６巻、第９８６頁（１９９６））などを用いて解析を実施してもよいがこれに限定されるものではない。
【００４７】
ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析する方法として、核酸配列を複製または増幅する方法も利用できる。核酸配列を複製する場合、一本鎖に変性した標的核酸にプライマー、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型としてプライマー伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される。このとき試料核酸に野生型プライマーと、変異型プライマーをそれぞれ別個に用いて伸長反応を行うことにより変異型を検出する方法である。
【００４８】
またこのとき標的核酸が検出するのに十分な量が含まれていない場合、予め前記変異配列を含む核酸断片を増幅しておくことも可能である。この場合の核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁(１９９１)）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２０巻、第１６９１頁（１９９２））、ＲＣＲ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第３１巻、第３２７０頁（１９９３））などが挙げられる。
【００４９】
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２n倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
【００５０】
上記のような核酸増幅法を利用した方法では、野生型核酸を増幅できる野生型プライマーと、変異型核酸を増幅できる多型プライマーをそれぞれ別個に用いて遺伝子増幅法を行う。ここで、変異型核酸とは、野生型核酸のうちの１つのヌクレオチドのみが点変異して他のヌクレオチドに置換されているものや野生核酸配列の一部に挿入、欠失配列等を含む核酸配列のことである。
【００５１】
野生型プライマーを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が野生型であれば反応が起きるが、変異型では反応が起きない。逆に、変異型プライマーを用いて試料核酸を伸長または増幅反応を行った場合、試料核酸が変異型であれば反応が起きるが、野生型であれば反応は起こらない。従って、一つの試料を二つに分け、一方は野生型プライマーを用いて反応を行い、他方は変異型プライマーを用いて反応を行い、反応が起ったか否かを調べることにより、試料核酸が野生型であるか変異型であるかを明確に知ることができる。
【００５２】
これまで説明したことは従来法とも共通するものであるが、上述のように、従来法では、野生型プライマー／変異型核酸及び変異型プライマー／野生型核酸の組合せにおいて、プライマーの３’末端のみが鋳型核酸と非相補的（ミスマッチ）になっている（すなわち、プライマーの３’末端が試料核酸の予想される多型部位に対応する）ので、これらの組合せにおいても反応が起こる場合がある。このような場合には、試料核酸が野生型か変異型かを判別することが困難になる。
【００５３】
これは増幅反応によく用いられるサーマス・アクエティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ等は３’エキソヌクレアーゼ活性を持たないため、増幅反応を行った場合、正確に鋳型配列の相補鎖を合成できなかった時もそのまま増幅反応を続けるため、増幅核酸断片に変異を含有する事がある。つまり３’末端にミスマッチがあっても反応が進んでしまう事になり、このような問題が起こると考えられている。
【００５４】
一方、伸長反応の正確性が優れているピロコッカス・エスピー（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＫＯＤ１株もしくはハイパーサーモフィリック・アーカエバクテリウム（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のＤＮＡポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するため３’末端にミスマッチがあった場合、そのヌクレアーゼ活性によりミスマッチ部分を切除した後伸長反応を続けるためこのような問題が起こると考えられる。
【００５５】
このような問題を解決するためには、上記組合せにおいてプライマーの３’末端から２番目のヌクレオチドが変異型配列のヌクレオチドと対応するように設計してもよい。このように設計した場合野生型プライマー／野生核酸及び変異型プライマー／変異型核酸の組合せにおいて、プライマーは完全に一致する為反応は起こるが、野生型プライマー／変異型核酸及び変異型プライマー／野生型核酸の組合せにおいてはプライマーの３’末端より２番目の塩基がミスマッチしているため、特に３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼはミスマッチを認識するが、３’末端は相補的な為、エキソヌクレアーゼも働かず、またＤＮＡポリメラーゼ反応も起こらない事が確認された。
【００５６】
さらに、ダブルミスマッチを利用した野生型プライマー及び変異型プライマーを設計してもよい。すなわち３’末端から２番目の塩基は変異型が予想されるヌクレオチドに対応する塩基配列であり、また３番目から５’末端までの塩基に相補的でないヌクレオチドを含むプライマーを用いることも可能である。これは３番目にミスマッチを用いた場合ミスマッチの認識が更に強くなり、また他の部分に用いた場合はプライマーの結合を妨げる効果が考えられる。
【００５７】
また、上記のプライマーが予め標識されているものであってもよい。該標識としては、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、放射線物質、発光団などが挙げられる。
【００５８】
以下に、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のアミノ酸の変異を核酸レベルで解析するためのプライマー設定箇所を説明する。
【００５９】
慢性骨髄性白血病患者のほとんど（９０〜９５％）には、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ染色体）と呼ばれる異常な染色体が認められている。このフィラデルフィア染色体は、２２番染色体が途中から切れて、９番染色体の断片と結合している。つまり、９番と２２番の染色体がそれぞれある部分で２つに切断され、互いに入れ替わって結合しているキメラ遺伝子が存在する。９番染色体の切断された部分にはａｂｌという名の遺伝子が、２２番染色体の切断部分にはｂｃｒという遺伝子があり、９番と２２番の染色体断片が結合することによってこの２つの遺伝子が融合し、新たにｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が作られる。このｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子から作り出されるｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質は、白血病細胞の異常増殖を引き起こし、同時に血液細胞のアポトーシス（細胞死）を起こしにくくし、その結果、慢性骨髄性白血病を発症させている。
【００６０】
この慢性骨髄性白血病に対して、チロシンキナーゼ活性阻害作用を有する薬剤が有効に作用することが知られている。ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のキナーゼ領域は、ａｂｌに含まれるキナーゼ領域に存在する。
【００６１】
本発明は、Ｐｈ染色体を有する慢性骨髄性白血病患者に適用されるものである。
【００６２】
特にｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のキナーゼ領域のアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異が、慢性骨髄性白血病の治療薬に対し薬物抵抗性になることが、Ann. Hematol. (2003) 284-289に記載されている。
【００６３】
この変異は、アミノ酸番号２５５番のグルタミン酸からリジンへの変異が多いが、これに限定されるものではない。また、アミノ酸番号３１５番のスレオニンから他のアミノ酸への変異によって薬剤の感受性が異なることが制限酵素を用いた方法で確認されている（例えば、非特許文献１参照）。この変異は、アミノ酸番号３１５番のスレオニンからイソロイシンへの変異が多いが、これに限定されるものではない。
【００６４】
このように、チロシンキナーゼ活性阻害作用を有する薬剤の感受性を判定するには、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のキナーゼ領域を判定することが有効であることがわかる。そのほかにも、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質のキナーゼ領域にはアミノ酸番号２４４、２４８、２５０、２５２、２５３、３１１、３１７、３４３、３５１、３５５、３５９、３７９、３８２、３８７、３９６より選ばれる位置にも変異があることも知られている(Soverini et al. “Denaturing-HPLC-Based Assay for Detection of ABL Mutations in Chronic Myeloid Leukemia Patients Resistant to Imatinib” Clinical Chemistry 50, No.7, 2004)。
【００６５】
薬剤治療時において、薬剤に対する感受性を遺伝子レベルで調べることは、治療方針選択において極めて重要な臨床データが提供されることに繋がる。特に、チロシンキナーゼ活性阻害作用を有する薬剤を使用する場合、その投与量には厳密な注意がはらわれているので、このｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質に含まれるキナーゼ領域の変異の有無を早期に診断することは重要である。少ないコピー数を検出すること及び対立遺伝子／対象遺伝子の比率が大きい試料において標的遺伝子を検出することは、薬剤に対する抵抗性を有する遺伝子の高感度検出を行うことであり、より早く治療方針、治療計画の変更を行うことが可能となる。
【００６６】
本発明は、対立遺伝子が測定対象遺伝子の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、特に好ましくは少なくとも１００００倍存在するサンプルにおいても、測定対象遺伝子を検出することが可能である。
【００６７】
しかし、前述のように制限酵素を用いる方法（例えば、非特許文献１参照）では、変異遺伝子の存在量が野生型遺伝子に比して極めて少ない場合、検出することが困難となりやすい。
【００６８】
従来の制限酵素を用いる方法の問題点を解決するため、本発明の方法に従って野生型プライマーと変異型プライマーを設定することにより、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質に含まれるキナーゼ領域の変異を、従来法より高感度に検出でき、早期に薬剤耐性の評価を行なうことが可能となる。より好ましくは、配列番号１〜５の配列に従ったプライマーを作製し、薬剤耐性の評価を行なうのがよいが、これに限定されるものではない。
【００６９】
プライマーは１５〜３０塩基が好ましく、より好ましくは１７〜２６塩基である。
【００７０】
好ましいプライマーは、配列番号１〜５のプライマーであり、配列番号１については、１５塩基以上の連続する塩基配列を有するプライマーが好ましく、配列番号２〜５については、3’末端から15塩基以上の連続する塩基配列を有するプライマーが好ましい。
【００７１】
また、本発明の方法に従ってプローブを設定することにより、ｂｃｒ−ａｂｌ融合蛋白質に含まれるキナーゼ領域の変異を、従来法より高感度に検出でき、早期に薬剤耐性の評価を行なうことが可能となる。より好ましくは、配列番号２，３、４，５の配列またはこれに相補的な配列に従ったプローブを作製し、薬剤耐性の評価を行うのがよいが、これに限定されるものではない。
【００７２】
アッセイのための腫瘍細胞は、患者の組織または腹水から採取し、鋳型として用いるＤＮＡあるいはＲＮＡは既知の方法により抽出すればよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ 第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行う方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．  ＵＳＡ 第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。
【００７３】
得られたＲＮＡあるいはＤＮＡを本発明の処方に従い作製された野生型プライマーと変異型プライマーを用い特異的増幅反応を行えば、ＰＣＲ増幅反応によるバイアスを回避し、高感度に薬剤感受性遺伝子変異を検出することができる。また、得られた核酸試料は制限酵素処理を行った上で増幅反応に供することも可能である。特異的増幅反応により得られた核酸断片は電気泳動や、相補的なプローブとのハイブリダイゼーションによって検出可能であるが、これに限定されるものではない。また、ＴａｑＭａｎプローブ法のような５´ヌクレアーゼ活性を利用した蛍光標識プローブアッセイへの適用も可能である。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
（プライマーの設計）
本発明の処方に従い、慢性骨髄性白血病の原因遺伝子として知られているｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子のａｂｌ領域にあたるアミノ酸番号３１５番のスレオニンから他のアミノ酸への変異と、アミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異の検出を行うプライマーを配列番号１〜５に従い設計し、薬剤耐性を判定する例とした。選択されたプライマーセットの配列の詳細を表１に示す。表１中「Ｆｏｒｗａｒｄ」とはフォワードプライマー、「Ｒｅｖｅｒｓｅ」とはリバースプライマー、を意味する。
【００７５】
【表１】
2006325446.tif 000003
【００７６】
（ＲＮＡの調製）
白血病 細胞株から抽出したトータルＲＮＡをカラム（ＱＩＡａｍｐＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ; ＱＩＡＧＥＮ社製）に吸着させ、カラムを洗浄後、吸着したＲＮＡをＤＥＰＣ水（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）で溶出した。ＲＮＡの濃度と純度は、吸光度Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍの比で確認した。
（ｃＤＮＡの調製）
上記で得られたトータルＲＮＡ２μｇを、５００ｎｇのランダムプライマー、２００ユニットの逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ; ＧＩＢＣＯ社製）、４０ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤（ＧＩＢＣＯ社）及び１ｍＭ ｄＮＴＰを含む４５μｌの反応液中で逆転写して調製した。
【００７７】
上記で調製したｃＤＮＡ２μｌに、フォワードプライマー(gagcagcagaagaagtgtttcaga)とリバースプライマー(ctctagcagctcatacacctggg)を各５pmole、10×PCR buffer、0.2mM dNTPs、1.5mM MgSO4、KOD-plusDNApolymeraseを添加し、全量を２５μｌとした。
【００７８】
ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６５℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計３５サイクル行うことにより実施し、二本鎖DNAを得た。得られた反応溶液をminiprepを用いて精製することによって、核酸断片を得た。
【００７９】
得られた核酸断片を制限酵素Hinc IIで切断されたpUC18にライゲーションし、competent cell DH5αへ導入することによって形質転換体を得た。得られた形質転換体をクローニングし、目的の断片が挿入されたクローンを得た。得られたクローンを試験管で培養後、プラスミドを抽出し、以後の実験に使用した。
（ＰＣＲの実施）
上記で調製したプラスミドを１０倍希釈し、１〜１０６コピーを有する試料溶液を調製した。調製された各プラスミド溶液２.２５μｌ、フォワードプライマーとリバースプライマー各 ５ｐmoles、および１０×ＰＣＲｍｉｘ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇSO4、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ミリＱ水に加えて全量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で２分、次いで９４℃−１５秒のデナチュレーション工程、及び６５℃−３０秒のアニーリング及び６８℃−３０秒のＤＮＡ伸長反応工程を１サイクルとして、これを計４０サイクル行うことにより実施した。
（判別）
ＰＣＲ増幅後、反応液を電気泳動することによって判別を行った。
【００８０】
なお、上記本発明によって白血病キメラ遺伝子の検出並びに白血病 の診断において所望の測定系が提供できることが確認できた（図１、図２）。本発明によれば、従来１０６Ｃｏｐｙ存在しなければ検出されなかった変異遺伝子が１０３Ｃｏｐｙ存在すれば検出可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、特殊な技術を要することもなく、厳密な反応条件の制御を用いる必要もなく、慢性骨髄性白血病の治療薬の感受性に影響を及ぼすｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子の変異型の早期診断方法を提供するものであり、化学療法の治療戦略において、有効な手段として期待され、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例１におけるアミノ酸番号２５５番のグルタミン酸から他のアミノ酸への変異を判定した結果を示す図である。
【図２】実施例１におけるアミノ酸番号３１５番のスレオニンから他のアミノ酸への変異を判定した結果を示す図である。
【図１】
2006325446.tif 000004
【図２】
2006325446.tif 000005
【配列表】
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