(57)【要約】      （修正有）【課題】チロクロームＰ４５０  ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の一塩基多型領域を、同時に増幅するためのプライマーセットを提供する。【解決手段】以下の（Ａ）〜（Ｃ）うち、特定の２対以上のプライマーを含むプライマーセットを同時に用いて増幅反応を行う。（Ａ）記載した特定の塩基配列のうち、第１の連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、及び第２の連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー（Ｂ）記載した特定の塩基配列のうち、第３の連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、及び第４の連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー（Ｃ）記載した特定の塩基配列のうち、第５の連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、及び第６の連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）うちの２対以上のプライマーを含むプライマーセット（Ａ）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（Ｂ）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（Ｃ）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【請求項２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）に含まれる全てのプライマーが１０塩基から３５塩基の長さのプライマーである、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記（Ａ）〜（Ｃ）に含まれる全てのプライマーが１５塩基から３０塩基の長さのプライマーである、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項４】
ヒトチトクロームＰ４５０ ２Ｄ６遺伝子を増幅する方法であって、請求項１に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の一塩基多型を含む領域を複数同時に増幅するためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、個別化医療に関する研究として、ゲノム中の塩基の変異とそれによって生じる表現型の違いはよく研究され、薬剤の副作用、体質などの蓄積がなされている。なかでもチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）分子種は薬物代謝に関与する酵素として近年研究が進められている。特にＣＹＰ２Ｄ６はヒト肝臓での発現量が総Ｐ４５０含量の約５％と少ないものの、抗うつ薬、抗ヒスタミン薬等臨床上重要な多くの薬を特異的に代謝する酵素として知られている。
ＣＹＰ２Ｄ６は遺伝子多型と代謝活性の相関が研究されており、その遺伝子多型を調べることは研究上、臨床上大変意味がある。
【０００３】
これらの遺伝子を調べることは個別化医療のためには必要なことであるが、その遺伝子を調べる方法としては変異箇所に特異的なプライマーを設計してＰＣＲ等による増幅の有無を調べる方法、変異箇所を含む領域をＰＣＲ等によって増幅を行い、制限酵素による切断の有無で変異を確認する方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）、ＴａｑＭａｎやＤＮＡマイクロアレイなどハイブリダイゼーションによって多型を検出する方法が挙げられる。
【０００４】
上記の方法では、多型ごとに増幅用のプライマーを設計する必要があり、複数の変異を検出するためにはその数だけ増幅を行わなければならないため、鋳型として必要となるゲノム量が多くなる。このため、複数の多型箇所を同時に増幅する方法が求められている。しかしながら、ＰＣＲ等で用いるプライマーセットは非特許文献１〜３に示されるように単一の領域を増幅することは可能であるが、複数領域を同時に増幅させるためには各領域を同程度に増幅させる必要があるため、検出に使用する多型領域のセットごとにプライマーの配列、組み合わせを検討しなければならない。さらにＣＹＰ２Ｄ６＊１０、ＣＹＰ２Ｄ６＊１８、ＣＹＰ２Ｄ６＊２１が有する多型領域を同時に増幅することの可能なプライマーセットは報告がない。
【非特許文献１】臨床検査  ２００４  Ｖｏｌ．４８  ｐ１６３−１６９
【非特許文献２】Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９６  Ｖｏｌ．６  ｐ３９５−４０１
【非特許文献３】Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  Ｖｏｌ．９  ｐ２８７−２９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の一塩基多型を含む領域を同時に増幅するためのプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、以下の（Ａ）〜（Ｃ）うちの２対以上のプライマーを含むプライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の一塩基多型を含む領域を複数同時に増幅できることを見出し、発明を完成するに至った。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー
及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（Ｂ）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（Ｃ）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
すなわち、本発明は上記プライマーセットを提供する。本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの長さは１０〜３５塩基が好ましく、１５〜３０塩基がより好ましい。
本発明はまた、上記プライマーセットを用いてＣＹＰ２Ｄ６遺伝子を増幅する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のプライマーセットを用いることによりＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の一塩基多型を含む複数のフラグメントを同時に増幅することができ、一塩基多型の検出を簡便に行うことができる。また、使用するゲノムの量を減らすことや増幅に使用する試薬の量を減らすことができるため、検査にかかるコストを低減することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のプライマーセットは以下の（Ａ）〜（Ｃ）うちの２対以上のプライマーを含むプライマーセットである。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号２記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（Ｂ）配列番号３記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号４記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー、（Ｃ）配列番号５記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー及び配列番号６記載の塩基配列のうち連続した１０塩基以上の配列を有するプライマー。
【０００９】
配列番号１〜６の配列はヒトCYP2D6遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１３；GenBank Accession No. M33388）の部分配列またはその相補配列である。配列番号１はCYP2D6遺伝子の1591〜1630番目の塩基配列、配列番号２はCYP2D6遺伝子の1761〜1800番目の塩基配列の相補配列、配列番号３はCYP2D6遺伝子の5643〜5682番目の塩基配列、配列番号４はCYP2D6遺伝子の5763〜5802番目の塩基配列の相補配列、配列番号５はCYP2D6遺伝子の4051〜4090番目の塩基配列、配列番号６はCYP2D6遺伝子の4211〜4250番目の塩基配列の相補配列である。
なお、ヒトCYP2D6遺伝子は本発明のプライマーセットによって特異的に増幅されるものである限り特に制限されず、その配列は人種の違いなどにより変化することもあるため、例えば、配列番号１３の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション反応を行った後に６５℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件が挙げられる。
【００１０】
本発明のプライマーセットは上記（Ａ）及び（Ｂ）、（Ｂ）及び（Ｃ）、もしくは（Ａ）及び（Ｃ）の2対、または（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の3対のプライマーを含むプライマーセットである。なお、この組み合わせに他の多型領域を増幅するプライマーセットを加えてもかまわない。
各プライマーの鎖長は増幅方法や増幅条件によって異なるため、各領域が単一で増幅される範囲において特に制限されないが、１０塩基から３５塩基が好ましく、１５塩基から３０塩基がより好ましい。
【００１１】
本発明のプライマーを構成するオリゴヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸等が挙げられるが増幅が行える範囲であれば特に制限されない。また、合成方法は通
常のオリゴヌクレオチドと同様にして例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって行うことができる。
またプライマーは標識されたものであってもよい。プライマーを標識する物質は、通常のハイブリダイゼーション法に用いられる標識物質を使用することができる。このような標識物質として蛍光物質やハプテンなどが挙げられる。具体的にはフルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリン、テキサスレッド、シアニン系蛍光色素が、ハプテンとしてはビオチン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルなどが挙げられる。
【００１２】
上記プライマーセットを用いることにより、CYP2D6遺伝子のC100T（配列番号１３の１７１９番目の塩基におけるＣ／Ｔ多型）、C2850T（配列番号１３の４４６９番目の塩基におけるＣ／Ｔ多型）、及びG4180C（配列番号１３の５７９９番目の塩基におけるＧ／Ｃ多型）のいずれかの一塩基多型を含むフラグメントを、2種以上同時に増幅することができる。すなわち、上記（Ａ）のプライマーによりC100T（ＣＹＰ２Ｄ６＊１０）の多型部位を含む領域が増幅され、上記（Ｂ）のプライマーによりG4180C（ＣＹＰ２Ｄ６＊１８）の多型部位を含む領域が増幅され、上記（Ｃ）のプライマーによりC2850T（ＣＹＰ２Ｄ６＊２１）の多型部位を含む領域が増幅されるため、これらを２対以上用いることにより2又は3種類の領域を同時に増幅することができる。ここで、同時とは、単一の反応系において、単一の増幅反応（増幅サイクル）で反応を行うことを意味する。
なお、多型の塩基番号は配列番号１３の１番目の塩基から数えた番号で示しているが、これらの番号はCYP2D6遺伝子における塩基の付加や欠失によって変動することがあり、その場合、配列番号１３の１７１９、４４６９、５７９９番目の塩基に相当する塩基の番号となる。
CYP2D6遺伝子上における上記3種類の一塩基多型は臨床検査２００４  Ｖｏｌ．４８  ｐ１６３−１６９に開示されており、これらの多型と配列番号１〜６の配列との位置関係は図１に示される。
なお、本発明のプライマーセットは、さらに、臨床検査２００４  Ｖｏｌ．４８  ｐ１６３−１６９に開示されているような他の多型領域を増幅するプライマーセットを含むものであってもよい。
【００１３】
増幅方法は上記のプライマーを用いることができる方法であれば特に制限されないが、PCR、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などが挙げられる。この中ではPCR法が特に好ましい。反応条件は通常の条件を採用することができ、試料中の標的核酸の濃度などに応じて適宜変更することができる。
【００１４】
増幅に用いる鋳型は人由来のゲノム、プラスミド、RNAなど特に制限されない。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられている方法を採用することができる。例えばＡｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｊ．７１（８）：２２２−２３４，２０００で紹介されている方法が挙げられる。
【００１５】
本発明のプライマーを用いた増幅反応により得られた増幅産物を用いることにより、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の多型を検出することができる。多型を検出する方法は特に制限されないが、例えば、各多型に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用意し、各プローブと増幅産物のハイブリダイゼーションの有無を測定することにより検出する方法が挙げられる。このようなハイブリダイゼーションによる検出方法としては、マイクロアレイを用いた方法がより好ましい。この場合、各塩基におけるそれぞれの多型に対応したプローブ（100C、100T、2850C、2850T、4180G、4180C）を同時に用いることにより、２または３箇所の塩基における多型を同時に検出することが特に好ましい。
なお、多型の検出方法は上記の方法に限定されず、TaqManプローブを用いたやシークエンスによる方法であってもよい。
【実施例】
【００１６】
［実施例］
（１）プライマーの設計
ＣＹＰ２Ｄ６＊１０が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー１（配列番号１の１１〜３３番目：ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＡＴ  ＧＧ）、リバースプライマー２（配列番号２の９〜３２番目：ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ）、ＣＹＰ２Ｄ６＊１８が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー２（配列番号３の１１〜２７番目：ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＣＧ
ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＡＴ）、リバースプライマー２（配列番号４の１７〜３８番目：ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  Ｇ）、ＣＹＰ２Ｄ６＊２１が有する多型領域の増幅用としてフォワードプライマー３（配列番号５の４〜２５番目：ＧＴＧ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  Ｃ）、リバースプライマー３（配列番号６の１１〜３１番目：ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＣＡ）を設計した。ＣＹＰ２Ｄ６＊１０の多型検出用プライマー、ＣＹＰ２Ｄ６＊１８の多型検出用プライマー、ＣＹＰ２Ｄ６＊２１の多型検出用プライマーそれぞれのＰＣＲ反応後の予想される鎖長は野生型であれば１９２ｂｐ、８４ｂｐ、１８７ｂｐである。
【００１７】
（２）プライマーの合成
（１）で設計したフォワードプライマー１〜３とリバースプライマー１〜３をそれぞれ市販のＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００１８】
（３）鋳型ＤＮＡの抽出
ヒト血液より市販のＤＮＡ抽出キットを用いて常法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００１９】
（４）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５μLと１０μＭフォワードプライマー１〜３：各１μＬ、１０μＭリバースプライマー１〜３：各１μＬ、蒸留水：１９μＬをそれぞれ加え、総量５０μＬとした。
ＰＣＲ反応はＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃、３０秒で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。
【００２０】
（５）電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物溶液２μＬを５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をしたところ、８５ｂｐ付近と１９０ｂｐ付近に計二本のバンドが確認された。８５ｂｐ付近はＣＹＰ２Ｄ６＊１８の増幅産物の鎖長と一致するのでＣＹＰ２Ｄ６＊１８が有する多型領域の増幅が確認された。
【００２１】
（６）増幅産物のクローニングおよびクローンの増幅
一方、１９０ｂｐ付近のバンドはＣＹＰ２Ｄ６＊１０とＣＹＰ２Ｄ６＊１０の２種類の増幅産物であると考えられたので、クローン化、シーケンス解析を試みた。
電気泳動によって得られた１９０ｂｐ付近のＰＣＲ産物を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。その後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製産物をｐＧＥＭにライゲーションした。作製したライゲーション反応液を大腸菌へトランスフォーメーションし、その後、ＬＢ寒天培地上で一晩３７℃にて培養を行った。形成したコロニーのうち２０個を選びそれぞれＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてクローンの抽出を行った。
【００２２】
（７）シーケンス解析
（６）で抽出したクローンをＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を使用し、それぞれシーケンス解析を行った。得られた配列をＢｌａｓｔによって配列の相同性を調べ、遺伝子を特定した。以下にその結果を示す。シーケンス解析を行った２０クローンのうち１０クローンがＣＹＰ２Ｄ６＊１０が有する多型領域の配列で、１０クローンがＣＹＰ２Ｄ６＊２１が有する多型領域の配列となった。以上のことより本発明のプライマーを用いることにより３領域を同時に増幅することが確認された。
【００２３】
【表１】
2006325407.tif 000003
【００２４】
［比較例］
（１）プライマーの設計
実施例１で設計したプライマーセットとの比較として、ＣＹＰ２Ｄ６＊１０およびＣＹＰ２Ｄ６＊１８については臨床検査（２００４  Ｖｏｌ．４８  ｐ１６３−１６９）記載のプライマー、具体的にはＣＹＰ２Ｄ６＊１０が有する多型領域の増幅については配列番号７、および配列番号８記載のプライマーを、ＣＹＰ２Ｄ６＊１８が有する多型領域の増幅については配列番号９、および配列番号１０記載のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応後の予想される鎖長はそれぞれ２９５ｂｐ、９７ｂｐである。
また、ＣＹＰ２Ｄ６＊２１が有する多型領域の増幅についてはＰｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９  Ｖｏｌ．９  ｐ２８７−２９３）記載のプライマー、具体的には配列番号１１、および配列番号１２記載のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応後の予想される鎖長は５８７ｂｐである。
【００２５】
（２）プライマーの合成
（１）で設計したプライマーをそれぞれ市販のＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００２６】
（３）鋳型ＤＮＡの抽出
ヒト血液より市販のＤＮＡ抽出キットを用いて常法によりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００２７】
（４）ＰＣＲ反応
実施例と同様の条件によりＰＣＲ反応を行った。具体的にはＰＣＲ反応液はＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）：２５μLと１０μＭ配列番号７〜１２記載のプライマー各１μＬ、蒸留水：１９μＬをそれぞれ加え、総量５０μＬとした。
ＰＣＲ反応はＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅを用い、先ず９５℃で１５分間加熱した後、９５℃、１分で熱変性、５０℃、３０秒でアニーリング、７２℃、３０秒で伸長のサイクルを３５サイクル行い、最後に７２℃で３分間を行った。
【００２８】
（５）電気泳動
ＰＣＲ反応によって得られたＰＣＲ産物溶液２μＬを５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をしたところ、合計5本のバンドが確認された。5本のバンドはそれぞれ１００ｂｐ付近、２６０ｂｐ付近、３００ｂｐ付近、３４０ｂｐ付近そして５９０ｂｐ付近であった
。１００ｂｐ付近はＣＹＰ２Ｄ６＊１８が有する多型領域を含む配列であることが、３００ｂｐ付近はＣＹＰ２Ｄ６＊１０が有する多型領域を含む配列であることが、５９０ｂｐ付近はＣＹＰ２Ｄ６＊２１が有する多型領域を含む配列であることがそれぞれ推測されるが、２６０ｂｐ付近、３４０ｂｐ付近のバンドについてはミスアニールにより増幅が起こったものと考えられる。
一方実施例に示したとおり本発明のプライマーセットを用いることで特異的な増幅が確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】CYP2D6遺伝子上の一塩基多型と配列番号１〜６の配列との位置関係を示す図。
【図１】
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【配列表】
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