(57)【要約】【課題】昆虫による動物または植物への体内侵入(infestation)の制御し、そして昆虫によって伝搬される動物または植物の感染の予防し、また、昆虫による体内侵入の結果生じる感染の改善にも適用可能である解決手段の提供。【解決手段】昆虫を制御するための組成物であって、薬学的、獣医学的、農学的または園芸学的に受容可能なキャリアとともに、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターを含有し、そしてさらに、本明細書中で規定されるような強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを含有する、組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫を制御するための組成物であって、薬学的、獣医学的、農学的または園芸学的に受容可能なキャリアとともに、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターを含有し、そしてさらに、本明細書中で規定されるような強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを含有する、組成物。
【請求項２】
前記アミノペプチダーゼインヒビター活性および強力にキレートしないインヒビター活性が、同じ物質によって提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターがアミノ基またはその誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが１個以上のアミノ酸部分またはその誘導体を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、ロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン、システイン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニンまたはアラニン部分またはそれらの誘導体を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターがロイシン部分またはその誘導体を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが該メタロペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼの活性部位の金属イオンと相互作用する、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターがキレート剤を含むかまたはキレート活性を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが二座配位キレート剤、三座配位キレート剤、四座配位キレート剤または六座配位キレート剤を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記キレート剤がアミノカルボン酸部分またはニトリロ三酢酸、あるいはキレート活性を有するそれらの塩または誘導体を含む、請求項８または請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸、またはキレート作用を有するその塩または誘導体を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、遷移金属イオンまたは該イオンの複合体または誘導体を含み、ここで、該イオンが銅、コバルト、亜鉛、マグネシウム、マンガン、バナジウムおよび鉄からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、ホウ素部分、ホスホリル部分またはホスホニル部分を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、アミノペプチダーゼまたはメタロペプチダーゼに不可逆的に結合する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、トリプシンまたはカルパインを阻害しない、請求項１から１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、セリンペプチダーゼまたはシステインペプチダーゼを阻害しない、請求項１から１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記インヒビターが、ロイシンアミノペプチダーゼ、Ａ型、Ｂ型、Ｎ型およびＭ型のアミノペプチダーゼ、アルギニンアミノペプチダーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、亜鉛アミノペプチダーゼ、Ｎ−ホルミルメチオニンアミノペプチダーゼ、ジペプチジル−アミノペプチダーゼ、Ａ型およびＢ型のカルボキシペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼおよびペプチジル−トリペプチダーゼからなる群から選択される酵素の活性を阻害する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記インヒビターがロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記インヒビターが昆虫ロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、セリンペプチダーゼインヒビター、システインペプチダーゼインヒビター、アスパルチルペプチダーゼインヒビター、メタロペプチダーゼインヒビター、またはアミノペプチダーゼインヒビターを含む、請求項１から１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、トリプシンインヒビターおよびキモトリプシンインヒビターからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、豆果、野菜、果実または穀物に由来するセリンペプチダーゼインヒビターまたはシステインペプチダーゼインヒビターからなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、シスタチンおよびE-64からなる群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、ジャガイモカルボキシペプチダーゼインヒビターを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターがエグリンＣ（Eglin C）を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターがぺファブロック（Pefabloc）を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
ＳＢＴＩおよびＥＤＴＡを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｌ−ロイシンチオールおよびＥＤＴＡを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２９】
ぺファブロック（Pefabloc）およびＥＤＴＡを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３０】
アクチノニンおよびＳＢＴＩを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３１】
Ｌ−ロイシンチオールおよびＳＢＴＩを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３２】
1,10-フェナントロリンおよびＳＢＴＩを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３３】
ベスタチンおよびＳＢＴＩを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３４】
アンチパインおよびＥＤＴＡを含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記アミノペプチダーゼインヒビターまたは強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、ペプチド部分、ポリペプチド部分またはタンパク質部分を含む、請求項１から３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
昆虫を制御する方法であって、該昆虫を、請求項１から３５のいずれか１項に記載の組成物に曝す工程を包含する、方法。
【請求項３７】
昆虫の卵または昆虫の幼虫を、請求項１から３４のいずれか１項に記載の組成物に曝す工程を包含し、これによって、昆虫の卵の孵化および/または昆虫の幼虫の発育が阻害される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記昆虫が、鱗翅目（Lepidoptera）、半翅目（Hemiptera）、網翅目（Dictyoptera）、直翅目（Orthoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、チャタテムシ目（Psocoptera）、等翅目（Isoptera）、総翅目（Thysanoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（Homoptera）、双翅目（Diptera）、シラミ目（Anoplura）、食毛目（Mallophaga）およびノミ目（Siphonaptera）からなる群から選択される目の昆虫である、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記昆虫が、蝿蛆症ハエ、ノミ、ゴキブリ、薄茶リンゴ蛾、コオロギ、青虫、穀粒の昆虫および貯蔵庫の昆虫からなる群から選択される、請求項３６から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が局所的手段、経口的手段、または非経口的手段によって投与される、請求項３６から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が局所的手段によって投与される、請求項３６から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物が、綿花、脂肪種子作物、観賞植物、花、果樹、穀物作物、匍匐作物、根菜作物、牧草植物および野菜からなる群から選択される植物に投与される、請求項３６から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターを発現する、非ヒトトランスジェニック生物の昆虫の制御における使用方法であって、該使用方法は、強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターにトランスジェニック生物を暴露する工程を包含し、該アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、１または複数のアミノ酸部分またはその誘導体を含み、そして各々のインヒビターは、酵素活性の少なくとも５０％を阻害する、使用方法。
【請求項４４】
強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを発現する、非ヒトトランスジェニック生物の昆虫の制御における使用方法であって、該使用方法は、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターにトランスジェニック生物を暴露する工程を包含し、該アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、１または複数のアミノ酸部分またはその誘導体を含み、そして各々のインヒビターは、酵素活性の少なくとも５０％を阻害する、使用方法。
【請求項４５】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターおよび強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを発現する、非ヒトトランスジェニック生物の昆虫の制御における使用方法であって、該使用方法は、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組成物に該トランスジェニック生物を暴露する工程を包含する、使用方法。
【請求項４６】
前記トランスジェニック生物が、前記昆虫による攻撃に対して脆弱な動物または植物の中または上に定住する、請求項４３から４５のいずれかに記載の使用方法。
【請求項４７】
前記トランスジェニック生物が、前記動物または植物と共生するかまたは片利共生する、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項４８】
Bacillus、PseudomonasおよびMycobacterium種から選択される、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は昆虫を制御する方法およびその組成物に関する。
【０００２】
具体的には、本発明は昆虫による動物または植物への体内侵入(infestation)の制御に関し、そして昆虫によって伝搬される動物または植物の感染の予防に関する。本発明はまた、昆虫による体内侵入の結果生じる感染の改善にも適用可能である。
【０００３】
さらに具体的には、本発明はペプチダーゼインヒビターを含有する昆虫制御用の組成物の使用に関し、そしてペプチダーゼインヒビターを発現する、耐昆虫性のトランスジェニック生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
昆虫は、世界中で様々な種類の動物および植物に重大な害虫問題を引き起こしており、現存の制御策にもかかわらず、毎年、作物生産の13％が失われていると推定されている。Lepidoptera、Hemiptera、Orthoptera、Coleoptera、Psocoptera、Isoptera、ThysanopteraおよびHomoptera目の種の昆虫は、多くの園芸作物およびブロードエーカー(broadacre)作物、ならびに保存および製造された穀粒製品に対して大量の損失を引き起こす。Diptera、Anaplura、MalophagaおよびSiphonapteraは、動物およびヒトに寄生感染を引き起こす。他の目(Hymenoptera、Dictyoptera、Isoptera)には、重要な家庭害虫および産業害虫が含まれる。
【０００５】
公知の昆虫制御策の多くは、例えば、塩素化炭化水素(DDT、エンドスルファンなど)、有機リン酸塩(クロルピリホス、ダイアジノン、マラチオン、パラチオン)、有機カルバミン酸塩(カルバリル、メトミル、プロキシプル(proxypur))および合成ピレスロイド(シペルメトリン、デルタメトリン)などの化学殺虫剤の使用に依存している。
【０００６】
化学殺虫剤の使用に伴う問題には、標的昆虫による耐性の発達(有機リン酸塩、合成ピレスロイド)、環境内ならびに植物および動物組織内における化学物質の持続性、および非標的生物への有害な影響(有機塩素系殺虫剤、昆虫成長調整剤)などがある。
【０００７】
ホウ素化合物(ホウ砂、ポリボール(polybor))もまた殺虫剤の用途に用いられてきた。ホウ素化合物は安定であり、実際の用量では昆虫を比較的徐々に殺傷し(MullensおよびRodriguez、1992)、そしてヒトによる大量摂取は致命的であり得る(Anon、1991)。
【０００８】
他のカテゴリーの殺虫剤には、昆虫成長調整剤(IGR)および殺虫性細菌性毒素(例えば、Bacillus  thuringiensis  (Bt)毒素)が含まれる。IGRは、ある方法でキチン合成を妨げる化合物である。それらには、幼若ホルモンアナログ(メトプレン)、キチン合成インヒビター(フェノキシカルボ(fenoxycarb)、ジフルベンズロン、フルラズロン(flurazuron))およびトリアジン誘導体(シロマジン)が含まれる。多くのクラスのIGRについては、耐性が指摘されている。特定の鱗翅類(lepidoterans)においては、Bt毒素に対する耐性も発達している。IGRおよびBt毒素の両方を用いて、昆虫の生活環内の適切な段階で十分な殺虫を確実に行うのは技術的に困難である。いくつかのIGRは、安定であり、そして環境危機の問題を引き起こし得る。
【０００９】
最も有用な群の殺虫剤は、高い殺虫活性および環境における低い持続性を有するものである(有機リン酸塩、合成ピレスロイド)。しかし、これらに伴う最大の問題は、標的昆虫による耐性の発達である。殺虫剤の使用の90％は依然として古典的な神経毒殺虫剤に基づいていると考えられる。従って、現存の殺虫剤に対する昆虫の耐性に効果的な、低残留性の代替殺虫剤の探求は特に緊急を要する。
【００１０】
共力剤（synergist）と呼ばれる薬剤を使用して、特定の殺虫剤の効果を最大化し得る。共力剤には、それ自体に殺虫作用が有るもの、または無いものがある。BloodおよびStuddert(1988)は、共力剤を、他と共に作用する、あるいは他の作用を増強する薬剤として定義している。例えば、ピペロニルブトキシドが、合成ピレスロイドの共力剤であることを留意し得る。特定の殺虫剤と組合せて効果的である共力剤でも、他の殺虫剤と組合せた時には効果がない場合がある。共力剤を用いて昆虫の耐性の問題を解消することが可能であるが、共力剤に対しても昆虫の耐性は生じ得る。殺虫剤の処方における共力剤の役割は、商品化可能な結果を達成するため、および殺虫剤の耐性管理のために重要であり得る。効果的な共力剤の組合せの探求は、効果的な殺虫剤自体の探求と同様に緊急を要する(Forresterら、1993)。
【００１１】
その阻害が昆虫制御の実施可能な手段を提供し得る、昆虫ペプチダーゼが、近年注目を集めている。ペプチダーゼは、タンパク質およびペプチドを破壊する遍在性酵素であり、従って腸内および細胞内の両方において消化を助ける。ペプチダーゼは、昆虫の胚の発達、脱皮および蛹化の間の組織の再編成に関係する。ぺプチダーゼはまた、侵入生物に対する防御およびタンパク質調整にも関係する。
【００１２】
ペプチダーゼは、広く変異性を有する酵素の群である。これらは現在、以下によって分類されている。
【００１３】
(1)触媒する反応
(2)触媒部位の化学的性質、および
(3)構造によって解明される進化の関係(Barrett、1994)
The  International  Union  of  Biochemistry  and  Molecular  Biology  (IUBMC)、Enzyme  Nomenclature(1992)では、ペプチダーゼを酵素クラス(EC)カテゴリーによって分類している。これらのカテゴリーは、エキソペプチダーゼ(ペプチド鎖の末端付近でのみ作用する酵素)についてのEC  3.4.11から3.4.19、および優先的にペプチドの内部領域で作用する酵素についてのEC  3.4.21から3.4.99である。EC  3.4.99の群は、その触媒メカニズムが未確認あるいは特徴づけられていないペプチダーゼの群である。
【００１４】
ペプチダーゼのクラスおよびそれらの昆虫生化学との関係の概要を以下に説明する。
【００１５】
1. セリンペプチダーゼ
このグループは、セリン型のカルボキシペプチダーゼ、EC  3.4.16、およびセリンエンドペプチダーゼ、EC  3.4.21を含む。
【００１６】
セリンペプチダーゼは、典型的には、その活性部位に触媒活性セリンアミノ酸を有すること、および酵素インヒビター、3,4-ジクロロイソクマリン(3,4-DCI)に対するそれらの感受性により認識される。哺乳類セリンペプチダーゼの活性の好ましいpH範囲は２から８である。しかし、昆虫セリンペプチダーゼは、通常アルカリ条件下に適応する(鱗翅目の幼虫によっては、pHは９から11)。
【００１７】
昆虫内のセリンペプチダーゼの活性はまた、合成基質と酵素との反応によって通常定義される。昆虫セリンペプチダーゼの３つの一般的なカテゴリー(トリプシン様、キモトリプシン様およびエラスチン様)は、以下のように同定できる。トリプシン様セリンペプチダーゼは、合成基質P-トシル-L-アルギニンメチルエステル(TAME)、α-N-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル(BAEE)、α-N-ベンゾイル-DL-アルギニン-p-ニトロアニリド(BAPNA)、およびベンゾイル-DL-アルギニンナフチルアミン(BANA)と反応する。
【００１８】
キモトリプシン様ペプチダーゼは、以下とのそれらの反応によって同定され得る。
【００１９】
N-アセチル-L-フェニルアラニンエステル(APNE)
N-アセチル-L-チロシンエチルエステル(ATEE)
N-ベンゾイル-L-チロシンエチルエステル(BTEE)
N-ベンゾイル-L-チロシン-p-ニトロアニリド(BTPNA)
L-グルタリル-L-フェニルアラニン-p-ニトロアニリド(GPPNA)
N-スクシニル-L-フェニルアラニン-p-ニトロアニリド(SPAPNA)
L-グルタリル-L-フェニルアラニンナフチルアニド(GPNA)
エラスターゼ様セリンペプチダーゼインヒビターは、N-スクシニル-ala-ala-pro-leu  p-ニトロアニリド(SAAPLpNA)等の合成基質とのそれらの反応によって同定され得る。
【００２０】
セリンペプチダーゼの活性はまた、酵素インヒビターとのそれらの反応によっても記載され得る。セリングループペプチダーゼは、通常ジ-イソプロピル-フルオロ-ホスフェート(DipF/DFP)、およびパラフェニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)によって阻害される。トリプシン様ペプチダーゼは、トシル-L-リジンクロロメチルケトン(TLCK)によって阻害される。キモトリプシン様ペプチダーゼは、トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン(TPCK)によって阻害される。エラスターゼ様ペプチダーゼは、Eglin-Cによって阻害される。
【００２１】
多数の天然に存在するタンパク質が、セリンペプチダーゼを阻害し得ることがわかった。これらには、Kunitzの結晶性大豆トリプシンインヒビター(SBTI)およびBowman-Birkの大豆トリプシンインヒビター(BBTI)が含まれる。その他の様々なマメ科植物のタネは、総タンパク質の1-4%のペプチダーゼインヒビターを含有し、例えば、ヒヨコマメトリプシン/キモトリプシンインヒビター(CI)、ライマメトリプシンインヒビター(LBTI)およびカウピートリプシンインヒビター(CPTI)がある(MacIntoshら、1990)。動物由来セリンペプチダーゼ阻害剤は、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI、アプロチニン)、タマゴ由来オボムコイドおよび血液由来のα-1-アンチトリプシンを含む。
【００２２】
アルカリ側に最適pHを有するセリンペプチダーゼは、昆虫の消化液中に可溶な酵素としてその主な重要性が認められている。例えば、sphingidae(Millerら、1974)、noctuidae(Ahmedら、1976、1980;  Ishaayaら、1971;  Prichetら、1981;  Teoら、1990;  BroadwayおよびDuffy、1986)、bombycidae(SasakiおよびSuzuki、1982;  EuguchiおよびIwanito、1976;  EuguchiおよびKuriyama、1985)、pieridae(LecadetおよびDedonder、1966;  Broadwayら、1989)、pyralidae(LarocqueおよびHouseman、1990;  Housemanら、1989;  MohammedおよびAltias、1987)、およびdiptera(Bowlesら、1990)が含まれる。Christellerら(1992)には、セリンペプチダーゼが、12のphytophagous  lepidopteransの(カゼイン)消化活性に含まれていたことが示された。この文献において、Christellerらは、他のタイプのペプチダーゼに消化活性がある有意な証拠を見いだせなかった。セリンペプチダーゼはまた、ケラチン-消化鱗翅類(lepidopterans)(Christellerら、1994;  ProwningおよびIrzykiewicz、1962;  Ward,1975、a、b)において優れた役割を示すことがわかった。さらに、これらは、いくつかの鞘翅類(coleopterans)(McGhieら、1995;  Dymock  ら、1992)、いくつかの直翅類(orthopterans)(Sakalら、1989;  Christellerら、1990)、いくつかの曲翅類(heteropterans)(Cohen、1993)、およびいくつかの双翅類(dipterans)(Bowlesら、1990)における消化活性に重要な役割を示すことがわかった。
【００２３】
消化性のセリンペプチダーゼは、種内および種間で、数および触媒特性の両方が相当に変化する(Applebaum、1985)。例えば、昆虫食物内のセリンペプチダーゼのインヒビターは、消化阻害とともに栄養補給抑止を起こすことが認められている(Dymockら、1992)。
【００２４】
トリプシン様セリンペプチダーゼが、脱皮の重要な成長調節領域に関与していることが認められた。これらは、発達制御、キチン原線維のキチナーゼ酵素への露出、およびクチクラ(cuticular)物質のリサイクルを含むいくつかの役割を示す(SamuelsおよびPaterson、1991)。
【００２５】
セリンペプチダーゼは、その優性な代謝的役割、一般に天然に生じること、および植物および動物内に多数の天然インヒビターが存在するために、昆虫制御用薬剤として最も注目を集めてきた。昆虫制御におけるセリンペプチダーゼの使用の面がトランスジェニック植物のほぼ全体の領域にわたっていることに注目するのは重要である。
【００２６】
２. システイン（チオール）ペプチダーゼ
このグループは、システイン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３.４.１８）およびシステインエンドペプチダーゼ（ＥＣ３.４.２２）を含む。
【００２７】
これらの酵素は、その活性部位に触媒的に活性なシステイン残基を有すること、および特定のインヒビターへの感受性を特徴とする。システインペプチダーゼは、還元条件（添加されたシステイン、ジチオスレイトールまたは他の還元剤）のもとで特徴的に活性化される。システインペプチダーゼは、一般に、昆虫の中腸内容物に見出される可溶性の酵素である。哺乳類のシステインペプチダーゼは、通常、低いｐＨ条件で作用するが、昆虫においては、中性に近いかまたはやや酸性のｐＨ値が好まれる（Wolfson  および  Murdock,1987)。
【００２８】
システインペプチダーゼの活性は、合成基質ｎ−α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）またはベンゾイルオキシ−カルボニル−phe−arg−７−（４−メチル）クマリルアミド（ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）との反応によって典型的に示される。システインペプチダーゼの活性は、また、ヨード酢酸アミド、ヨード酢酸塩、重金属、ｐ−クロル水銀安息香酸塩、システインシアン化物、Ｎ−エチルマレイミドおよび特徴的にＥー６４などの酵素インヒビターとの反応に関して記載され得る。Ｅ−６４は、Aspergillus  japonicusの菌株から得られる小さなペプチド（Ｌ−トランス−エポキシ−スクシニル−ロイシルアミド−（４−グアニジノ−ブタン）である。天然のシステペプチダーゼインヒビターは、微生物（Ｅ−６４）、植物（米穀からのオリザシスタチンＩおよびＩＩならびにジャガイモの塊茎からのジャガイモのマルチシスタチン（ＰＭＣ））および動物（鶏卵のシスタチン、ＨＥＣ）で同定されている。アンチパインが、別の周知のシステインペプチダーゼインヒビターである。
【００２９】
システインペプチダーゼは、ある昆虫、特に、鞘翅類(coleopterans)の腸の可溶性消化酵素として主要な役割を果す（Orrら、1994:  Thie  および  Houseman、1990;  Liangら、1991)。昆虫の制御のためのシステインペプチダーゼインヒビターの使用は、遺伝子導入植物に関連して大いに探究されてきた（Orrら、1994;  Wolfson  および  Murdock、1987)。
【００３０】
３. アスパラギン酸ペプチダーゼ（ＥＣ３.４.２３）
典型的には、これらの酵素は、活性部位に２つのアスパラギン酸（aspartyl)残基を有すると認められている。多くのアスパラギン酸ペプチダーゼは、低いｐＨ値で最も活性である。これらの酵素のための合成基質は、Ｎ−カルボベンゾキシグルタミル−Ｌ−チロシンおよびＮ−アセチル−Ｌ−フェナニルジヨードチロシンを含む。アスパラギン酸ペプチダーゼの特徴的なインヒビターは、ペプスタチンおよびジフェニルジアゾメタンを含む（McDonald、1985）。ペプスタチンは、微生物源からの天然インヒビターである。
【００３１】
Applebaum(1985)は、アスパラギン酸ペプチダーゼの双翅類(dipteran)への重要性を示唆した。Wolfson  および  Murdock(1987)は、ペプスタチンによる鞘翅類（コロラドジャガイモハムシの幼虫）の成長阻害をいくらか示した。しかし、成長のさらに大きな阻害は、システインペプチダーゼを標的にすることによって得られた。
【００３２】
ペプチダーゼに関する文献の広範囲な検索により、昆虫アスパルチルペプチダーゼを遺伝子導入して植物を改変するか、または昆虫アスパルチルペプチダーゼを局所的に適用するかのいずれかによって、昆虫を制御するための研究は、ほんのわずかしか行われていないことが示された。Christellerら（1992)は、アスパラギン酸ペプチダーゼ活性は、植食性鱗翅類の腸材料に存在しないようであることを見出した。
【００３３】
４. メタロペプチダーゼ
典型的には、これらの酵素は、活性部位に触媒的に活性な金属イオン（一般的に亜鉛）およびキレート試薬への感受性を有すると認められている。メタロペプチダーゼのカテゴリーは、ある種のエンドペプチダーゼ（ペプチド鎖内で切断する酵素）およびエキソペプチダーゼ（ペプチドの末端からアミノ酸を切断する酵素）を含む。エキソペプチダーゼは、さらに、カルボキシペプチダーゼ（Ｃ末端からアミノ酸を切断する）またはアミノペプチダーゼ（Ｎ末端からアミノ酸を切断する）として分類され得る。
【００３４】
メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ  ３.４.２２）
これらの酵素は、ケラチン食性鱗翅類によるウールの消化という役割の可能性を除いて、昆虫の生化学に関わっていないようである（Prowning  および  Irykiewicz、1962;  Ward、1975  a  および  b;  Christellerら、1990、1994)。
【００３５】
メタロカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３.４.１７）
メタロカルボキシペプチダーゼは、活性のために二価のカチオン（通常Ｚｎ２＋）を必要とする。それらは、遊離形態および膜結合形態の両形態で存在し、高いｐＨ（８〜１０）で活性である。カルボキシペプチダーゼのための合成基質は、カルボキシペプチダーゼのタイプＡおよびタイプＢに対して、それぞれ、ヒプリル−ＤＬ−フェニル−乳酸およびヒプリル−Ｌ−アルギニンを含む。カルボキシペプチダーゼＡ様の酵素は、昆虫に一般的であるようであり、直翅類、鞘翅類、双翅類および鱗翅類に見出された。
【００３６】
メタロカルボキシペプチダーゼに対する合成インヒビターは、１,１０−フェナントロリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、β−ヒドロキシキノリン、およびホスホルアミドン（phosphoramidon)を含む。メタロカルボキシペプチダーゼの天然のインヒビターは、ジャガイモ由来のカルボキシペプチダーゼインヒビター（ＰＣＰＩ）である。
【００３７】
遊離形態および膜結合形態のカルボキシペプチダーゼ酵素は、いずれも鱗翅類の幼虫からの中腸材料に認められた（Ferreiraら、1994;  Christeller、1990)。Christellerら（1992）は、タンパク質消化系の予期される成分としてこれらの酵素を記載した。この出願の優先日以前に、これらの酵素は、局所的制御剤の成分としてはもちろんのこと、植物の遺伝子導入修飾の標的として、明らかに認められていなかった。
【００３８】
アミノペプチダーゼ（ＥＣ３.４.１１−３.４.１３）
アミノペプチダーゼは、ペプチド鎖のＮ−末端からアミノ酸を加水分解し、一般的に、それらの金属イオン（Ｚｎ２＋またはＭｇ２＋）への依存性に従って分類される。最もよく研究されたアミノペプチダーゼは、膜結合形態および可溶形態の両方の形態で哺乳類の消化系に見出される。アミノペプチダーゼは、通常、ｐＨ最適値、酸性（Ａ）塩基性（Ｂ）または中性（Ｎ）を指定する接尾文字によって、あるいは膜結合（Ｍ）状態またはペプチド基質から切断されたアミノ酸の数および型によって命名される。これらの名称は、排他的ではない。従って、ロイシンアミノペプチダーゼＭまたはＮは、ペプチドから、優先的にロイシンを取り除くが、ロイシンだけを取り除くわけではない酵素であり、膜結合であり、その活性は、中性ｐＨで最適である。アミノペプチダーゼは、ロイシル、アルギニル、メチオニル、アスパルチル、アラニル、グルタミル、プロリル、バリルおよびシステイニル残基の優先的な加水分解を示す。しかし、基質特異性は、通常広範であり、かつペプチド鎖の他の残基に依存する（Taylor、1993  a  および  b)。いくつかのバクテリアの酵素は、その活性に金属イオンを必要としないことが知られている(Taylor,1993aおよびb)  が、ほとんどのアミノペプチダーゼは、メタロペプチダーゼである。アミノペプチダーゼの天然のインヒビターは存在しないようである。
【００３９】
昆虫のアミノペプチダーゼは、通常、アルカリ側に最適ｐＨを有し、一般的に、ベスタチン（Taylor、1993)およびフェナントロリン（Barrett、1994)によって阻害される。
【００４０】
基質特異性は、上記のように、広範であるが、代表的な基質は、ｌｅｕ−ｐＮＡ、ａｒｇ−ｐＮＡ、ｍｅｔ−ｐＮＡおよびｐｒｏ−ｐＮＡを含む。
【００４１】
メタロアミノペプチダーゼは、キレート試薬（ＥＤＴＡのような）によって阻害され、キレート試薬は、ペプチダーゼから金属イオンを取り除くか、または酵素と不活性な錯体を形成し得る（Terra  &  Ferriera、1994)。特定のキレート化剤のアクションは、アミノペプチダーゼの型およびキレート化剤自体の構造によって変化する。
【００４２】
アミノペプチダーゼは、また、昆虫の消化ペプチダーゼの補足物の一部として認められており、タンパク質消化の最終段階に関与していると考えられている（Terra  &  Ferriera、1994)。Christellerら（1990、1992)は、エキソペプチダーゼ（アミノペプチダーゼを含む）は、セリンおよびシステインペプチダーゼに比べて、食物タンパク質の消化におけるこれらの酵素の役割が小さいために、昆虫制御にあまり有用ではないと主張した。
【００４３】
特異的なロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）インヒビターに曝した後では昆虫の幼虫の成長が遅延することが報告されている。Christellerら(1990)は、野生のコオロギの腸の抽出物を用いて、エキソペプチダーゼレベル、特にＬＡＰがこの昆虫において重要であるが、エキソペプチダーゼはタンパク質消化の１６〜２０％しか寄与しないことを示した。Christellerらの研究において、２つの効果的なセリンペプチダーゼインヒビターの存在下で、タンパク質消化へのエキソペプチダーゼの寄与が大きく減少することがさらにわかった。これは、エキソペプチターゼの基質として作用するオリゴペプチド鎖末端の欠如のためであった。これは、さらに昆虫制御におけるアミノペプチダーゼの役割が小さいことを示した。
【００４４】
上記の発見は、エキソペプチダーゼインヒビター（主にアミノペプチダーゼインヒビター）の昆虫制御剤としての使用を教示しておらず、セリンペプチダーゼインヒビターおよびアミノペプチダーゼを組み合わせて昆虫制御剤として使用することを教示していない。
【００４５】
消化の役割の他に、アミノペプチダーゼ活性は、鱗翅類  Manduca  sexta  の脱皮分泌液に示された（Jungries、1979)。しかし、アミノペプチダーゼの役割は、ここでも、セリン（トリプシン様）ペプチダーゼの役割に対して副次的であるようである。昆虫の発達において重要なアミノペプチダーゼまたはメタロペプチダーゼの天然インヒビターのいずれも、脱皮の遅延に効果的であると報告されていない。いずれも昆虫耐性の遺伝子導入植物を提供するために用いていない。
【００４６】
理論的には、化学的殺虫剤に耐性である昆虫を制御するために、ペプチダーゼインヒビターを用いる可能性が高いと思われる。第１に、ペプチダーゼ阻害の作用メカニズムは、有機リン酸塩類および合成ピレスロイドの作用メカニズムとは異なる。第２に、ペプチダーゼ酵素の活性部位のアミノ酸配列は、高度に保存されているようである（Taylor、1993）ので、活性を結果的に失うことなく、変異する可能性が低いことを示している。最後に、ある特定のペプチダーゼインヒビターに対する昆虫の耐性が生じる場合には、この耐性は、その他のペプチダーゼ仲介代謝事象にまで持ち越すべきではない。
【００４７】
しかしながら、昆虫の制御のためのペプチダーゼインヒビターの使用に関わる重大な問題がいくつかある。高い使用率が要求され得るので、費用効率的ではない産物につながる。さらには、ペプチダーゼインヒビターは幼虫の成長を制限し得るが、使用率を高くした場合でも、用量応答曲線においてプラトーに到達する可能性がある。ペプチドベースの、またはタンパク質ベースのペプチダーゼインヒビターは、環境中に残存しないと推定されるが、延長された期間貯蔵することが困難であり得、そして硬水で送達されると効力を失い得る。特定の酵素インヒビターの供給源に関連する微妙な問題について対処する必要があり得る。例えば、ダイズ、ポテト、およびササゲ（cowpea）トリプシンインヒビターによるCostelytra  zealandicaの成長阻害、およびライマメ（lima  bean）トリプシンインヒビターによる成長刺激を含む異常な応答が注記されている（Dymockら、1992）。
【００４８】
かなりの研究が、昆虫組織、腸抽出物、半精製、あるいは精製された酵素をインビトロで用いて、昆虫タンパク質代謝、主として消化代謝の生化学的調査に集中していた。
【００４９】
これらの研究の多くは、消化酵素と、タンパク質またはペプチドベースのインヒビターとの関係を調査することによって、植物のトランスジェニックな改変のための酵素インヒビターを選択することに向けられた（Applebaum、1985;  Christellerら、1989、1990、1992;  Lenzら、1991;  Teoら、1990;  Pritchettら、1981;  SantosおよびTerra、1984;  Dow、1986;  Sakalら、1984、1989）。
【００５０】
比較的少数の研究が、昆虫の成長および／または生殖に対するペプチダーゼインヒビターの直接的な悪影響を実証している。セリンおよびシステインペプチダーゼインヒビターは、Callosobruchus  maculatus、Leptinotarsa  decemlineata、Heliothis  spp、Spodoptera  exiqua、Costelytra  zealandica、Teleogryllus  commodus、Diabrotica  sp、Manduca  sexta、red  flour  beetleおよびbean  weevilを含む種々の昆虫の幼虫の成長および／または生存を低減することが示されている（GatehouseおよびBoulter、1983;  ShuckleおよびMurdock、1983;  Shadeら、1986;  WolfsonおよびMurdock、1987;  BroadwayおよびDuffey、1986;  Hilderら、1987;  Dymockら、1992;  Orrら、1994;  Burgessら、1994;  Hinesら、1990）。
【００５１】
一般に、昆虫の成長阻害は、腸の主要な消化酵素のインヒビターを用いて達成されてきた。また、これらの酵素に基づく適切な殺虫インヒビターを選択するための方法は、Christellerら（1992）によって記載されている。
【００５２】
上記研究のうち、タンパク質代謝に対する妨害による局所的な昆虫制御剤の製造を直接の目的とするものはないようである。Czaplaによる国際特許出願第W094/16565号には、しかしながら、European  corn  borer  (ECB)およびSouthern  corn  rootworm  (SCR)の制御のために、アプロチニンに対して90％の相同性を有するアプロチニンあるいはその他のセリンペプチダーゼインヒビターの局所的使用を記載するマイナークレームがある。アプロチニンは、単独で、あるいは殺虫レクチンと組み合わせて用いられ得ることがクレームされた。Czaplaは、20mg/mlの食餌でのアプロチニンの取り込みが、実験室アッセイにおいて100％の新生ECB幼虫を殺すこと、および60％の新生SCRを殺すことを見出した。このように高い摂取率は、局所適用では達成することが困難であろうし、また、処置費用は、化学的殺虫剤と競合しそうもないであろう。Czaplaは、セリンペプチダーゼインヒビターSBTI（KunitzおよびBowman-Birk）およびシステインペプチダーゼインヒビターシスタチンが、アプロチニンほど有効ではないことを見出した。
【００５３】
SBTIを吸血昆虫に対して直接に与えることが、DeloachおよびSpates（1980）によって調べられた。DeloachおよびSpatesは、SBTIをウシの赤血球内にカプセル化し、horn-flyの餌として用いたところ、死亡率が上昇し、卵の孵化が阻害されたことを見出した。血液中では、種々の天然ペプチダーゼインヒビター（主としてセリンペプチダーゼの）が知られている。しかしながら、それらのインヒビターは、動物を昆虫の攻撃から保護する点については、限られた効力しか有していない（Sandemanら、1990）。
【００５４】
WolfsonおよびMurdock（1987）は、植物内のペプチダーゼインヒビターの存在および分布については広範な証拠資料があり、また、これらのインヒビターは昆虫消化ペプチダーゼを標的すると推定されているものの、それらのインヒビターが、昆虫の成長および発育の阻害において有効な作用をすることを裏付ける直接の証拠が乏しいことを観察した。これらの著者は、E-64（システインペプチダーゼインヒビター）を閾値レベル50μg/mlでポテトの葉に対して与えることによって、Colorado  potato  beetleにおける幼虫の成長が低減したことを実証した。しかしながら、はるかに高い適用レベル（1000μg/ml）では、死亡率74〜85％でプラトーが見出された。これでは、実用化するには不十分である。SBTI（KunitzおよびBowman-Birk）は、成長遅延剤としては有効ではなかった。また、ペプスタチンに対してわずかな応答しかなかった。
【００５５】
Dymockら（1992）による研究論文は、ペプチダーゼインヒビターによるコウチュウ目幼虫（ニュージーランド生息の牧草幼虫）の成長阻害について述べている。この研究は、根について幼虫の食餌として重要な牧草種の遺伝的形質転換を焦点としていた。バイオアッセイは、セリンペプチダーゼインヒビターを用いて成長阻害を示した。特定のインヒビターに対するいくつかの異常な応答が注目された（SBTI、POT  I、POT  II、CpTIによる阻害、LBTIによる刺激）。Christellerら（1989）は、通常は、コウチュウ目の腸のペプチダーゼがシステインの範疇が優勢であるという事実にも関わらず、上記幼虫ではトリプシンを主要な腸ペプチダーゼとして先に同定していた。一般に、死亡率を達成するために要求されるペプチダーゼインヒビターの使用率は、高すぎて局所使用には費用効率的ではなかった。
【００５６】
メタロペプチダーゼ（アミノペプチダーゼまたはLAPを含む）の阻害によって機能する組成物は、昆虫の制御用には商業的に開発されてはいない。事実、先行技術は、ペプチドベースのアミノペプチダーゼインヒビターあるいはメタロペプチダーゼインヒビターの昆虫制御のための使用を教示していない。なぜなら、
（ａ）植物の遺伝的形質変換に適した上記範疇の有効なインヒビターが同定されておらず、
（ｂ）これらの酵素の見かけの役割は、昆虫の腸における優勢なシステインおよび／またはセリンペプチダーゼの活性に対しては小さいからである。
【００５７】
Shenvi（1993）は、哺乳類のアミノペプチダーゼの有効なインヒビターとしてα−アミノホウ酸誘導体を用いることを述べている。Shenviは、α−アミノホウ酸誘導体の合成時における特定の中間体が、殺虫特性を有していることを述べている。しかしながら、これらの中間体は、アミノ基を有していなかったので、アミノペプチダーゼインヒビターあるいは何らかの種類のペプチダーゼインヒビターとして作用するとは示唆されていない。
【００５８】
ヘキサデンテートメタルキレート剤EDTAは、SamuelsおよびPaterson（1995）ならびにFerreiraおよびTerra（1986）によって、脱皮流体および消化膜に由来するアミノペプチダーゼのインヒビターであると認識された。EDTAの殺虫効果については、何も認識されていない。しかしながら、メタルキレート剤の殺虫作用についての包括的クレームが、TomaliaおよびWilson（1985、1986）によってなされている。裏付けとなるとなる証拠は、全く呈示されなかった。昆虫の制御にメタルキレート剤を用いると、噴霧用に硬水を使用することによって、あるいは、処理されるべき材料が鉱物または土壌によって汚染されている場合に、悪影響を及ぼされると予想され得る。
【００５９】
驚くべきことに、アミノペプチダーゼインヒビターあるいはメタロペプチダーゼインヒビターを含み、かつ、強力なキレート剤ではないペプチダーゼインヒビターをさらに含む組成物が、昆虫の卵の孵化および／または昆虫幼虫の発育を防止し得ることが、今や見出された。当業者は、アミノペプチダーゼインヒビターの大半が、この用語が本願において定義されるように、事実強力なキレート剤でないことを認識するであろう。
【００６０】
本発明が様々なメカニズムを介して昆虫の制御に利用可能であることは、明らかに理解されるであろう。本発明の方法により、例えば、昆虫を実際に殺すこと、または、成熟を遅くしたり防止したりするように昆虫の成長および発育を中断することを結果として可能にし得る。昆虫の卵の孵化を防止することが特に望ましい。なぜなら、それらの幼虫の侵食活動の結果、多くの経済的に重要な昆虫が損害をもたらすからである。
【００６１】
また、Insecta綱（class）の構成員の間では個々の生化学的能力は多種多様であるので、特定のインヒビターおよび／またはインヒビターの組み合わせに対する応答は、種と種の間で変動することも理解されるであろう。したがって、本発明の範囲内のいくつかの組成物が、ある種の昆虫に対しては有効性に乏しかったり、有効ではなかったりさえするのに、他の昆虫に対しては非常に有効である可能性がある。応答における変動は、亜種レベルでも、特定の昆虫の生活環の異なる段階においても、あるいは昆虫の食餌においてさえ観察され得る。当業者は、通常の試行錯誤の実験室およびフィールド実験を適用することによって、関連するインヒビターを昆虫標的に一致させることができるであろう。
【００６２】
また当業者には、本発明が、以下を含むがこれらに限られない様々な様式で利用され得ることが明らかである：
(a)このような体内侵入を受けやすい植物または動物への直接の適用による昆虫の体内侵入の制御；
(b)昆虫の生息地または繁殖部位に対する、本発明の薬剤の適用による昆虫数の減少；
(c)予防あるいは重篤度の低減のいずれかによる、昆虫によって伝搬される植物または動物への感染の制御；および
(d)  予防あるいは重篤度の低減のいずれかによる、昆虫の体内侵入の結果生じる植物または動物への感染の制御。
【００６３】
本明細書において、用語「ペプチダーゼインヒビター」は、いずれかのペプチダーゼを阻害できるあらゆる化合物であると理解される。
【００６４】
実際、ペプチダーゼインヒビターは、以下の工程により同定され得る。
【００６５】
１．精製され得る、あるいは組成物中に活性酵素を有し得る、代表的活性ペプチダーゼを選択する。
【００６６】
２．好都合な時間内に適切な定量化可能な終点を生じるように、上記酵素に適した基質および反応条件を選択することにより、代表的ペプチダーゼの各々に対する酵素活性アッセイを選択する。
【００６７】
３．上記酵素活性アッセイのいずれかにおいて50%以上の反応阻害が見られる場合、テスト化合物をペプチダーゼインヒビターと考える。
【００６８】
特に、メタロペプチダーゼインヒビターまたはアミノペプチダーゼインヒビターがこのようにして同定され得る。
【００６９】
用語「強力にキレートしないペプチダーゼインヒビター」は、競合的結合評価においてEDTAよりも強くないZn2+イオンをキレートするペプチダーゼインヒビターを意味すると理解されるべきである。EDTAとインヒビターとは両方とも、反応混合物中において同一の濃度であるべきであり、その濃度は好都合には0.1  mMである。当業者であれば、Zn2+分布を決定する適切な反応条件および方法（例えば、多核性核磁気共鳴(NMR)、UV分光法、ボルタンメトリー法およびソフトイオン化質量分光法を用いること）を選択することができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００７０】
本発明によって以下が提供される：
（１）昆虫を制御するための組成物であって、薬学的、獣医学的、農学的または園芸学的に受容可能なキャリアとともに、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターを含有し、そしてさらに、強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを含有する、組成物。
（２）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターがアミノ基またはその誘導体を含む、項目１に記載の組成物。
（３）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが１個またはそれ以上のアミノ酸部分またはその誘導体を含む、項目１または項目２に記載の組成物。
（４）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、ロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン、システイン、アスパラギン酸、プロリン、アルギニンまたはアラニン部分またはそれらの誘導体を含む、項目１から３のいずれかに記載の組成物。
（５）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターがロイシン部分またはその誘導体を含む、項目１から４のいずれかに記載の組成物。
（６）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターがメタロペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼの活性部位の金属イオンと相互作用する、項目１から５のいずれかに記載の組成物。
（７）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターがキレート剤を含むかまたはキレート活性を有する、項目１から６のいずれかに記載の組成物。
（８）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが二座配位キレート剤、三座配位キレート剤、四座配位キレート剤または六座配位キレート剤を含む、項目７に記載の組成物。
（９）前記キレート剤がアミノカルボン酸部分またはニトリロ三酢酸、あるいはキレート活性を有するそれらの塩または誘導体を含む、項目７または項目８に記載の組成物。
（１０）前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸、またはキレート作用を有するその塩または誘導体を含む、項目９に記載の組成物。
（１１）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、遷移金属イオンまたは該イオンの複合体または誘導体を含み、ここで、該イオンが銅、コバルト、亜鉛、マグネシウム、マンガン、バナジウムおよび鉄からなる群から選択される、項目１に記載の組成物。
（１２）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、ホウ素部分、ホスホリル部分またはホスホニル部分を含む、項目１から９のいずれかに記載の組成物。
（１３）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、アミノペプチダーゼまたはメタロペプチダーゼに不可逆的に結合する、項目１から１２のいずれかに記載の組成物。
（１４）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、トリプシンまたはカルパインを阻害しない、項目１から１３のいずれかに記載の組成物。
（１５）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターが、セリンペプチダーゼまたはシステインペプチダーゼを阻害しない、項目１から１３のいずれかに記載の組成物。
（１６）前記インヒビターが、ロイシンアミノペプチダーゼ、Ａ型、Ｂ型、Ｎ型およびＭ型のアミノペプチダーゼ、アルギニンアミノペプチダーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、亜鉛アミノペプチダーゼ、Ｎ−ホルミルメチオニンアミノペプチダーゼ、ジペプチジル−アミノペプチダーゼ、Ａ型およびＢ型のカルボキシペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼおよびペプチジル−トリペプチダーゼからなる群から選択される酵素の活性を阻害する、項目１から１５のいずれかに記載の組成物。
（１７）前記インヒビターがロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害する、項目１６に記載の組成物。
（１８）前記インヒビターが昆虫ロイシンアミノペプチダーゼの活性を阻害する、項目１７に記載の組成物。
（１９）前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、セリンペプチダーゼインヒビター、システインペプチダーゼインヒビター、アスパルチルペプチダーゼインヒビター、メタロペプチダーゼインヒビター、またはアミノペプチダーゼインヒビターを含む、項目１から１８のいずれかに記載の組成物。
（２０）前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、トリプシンインヒビターおよびキモトリプシンインヒビターからなる群から選択される、項目１９に記載の組成物。
（２１）前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、豆果、野菜、果実または穀物に由来するセリンペプチダーゼインヒビターまたはシステインペプチダーゼインヒビターからなる群から選択される、項目１９に記載の組成物。
（２２）前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、シスタチンおよびE-64からなる群から選択される、項目１９に記載の組成物。
（２３）前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、ジャガイモカルボキシペプチダーゼインヒビターを含む、項目１９に記載の組成物。
（２４）前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターがEglin  Cを含む、項目１９に記載の組成物。
（２５）前記強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターがPefablocを含む、項目１９に記載の組成物。
（２６）ＳＢＴＩおよびＥＤＴＡを含有する、項目１９に記載の組成物。
（２７）Ｌ−ロイシンチオールおよびＥＤＴＡを含有する、項目１９に記載の組成物。
（２８）PefablocおよびＥＤＴＡを含有する、項目１９に記載の組成物。
（２９）アクチノニンおよびＳＢＴＩを含有する、項目１９に記載の組成物。
（３０）Ｌ−ロイシンチオールおよびＳＢＴＩを含有する、項目１９に記載の組成物。
（３１）1,10-フェナントロリンおよびＳＢＴＩを含有する、項目１９に記載の組成物。
（３２）ベスタチンおよびＳＢＴＩを含有する、項目１９に記載の組成物。
（３３）アンチパインおよびＥＤＴＡを含有する、項目１９に記載の組成物。
（３４）前記アミノペプチダーゼインヒビターまたは強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターが、ペプチド部分、ポリペプチド部分またはタンパク質部分を含む、項目１から３３のいずれかに記載の組成物。
（３５）昆虫を制御する方法であって、該昆虫を、項目１から３４のいずれかに記載の組成物に曝す工程を包含する、方法。
（３６）昆虫の卵または昆虫の幼虫を、項目１から３４のいずれかに記載の組成物に曝す工程を包含し、これによって、昆虫の卵の孵化および/または昆虫の幼虫の発育が阻害される、項目３５に記載の方法。
（３７）前記昆虫が、Lepidoptera、Hemiptera、Dictyoptera、Orthoptera、Coleoptera、Psocoptera、Isoptera、Thysanoptera、Hymenoptera、Homoptera、Diptera、Anoplura、MalophagaおよびSiphonapteraからなる群から選択される目の昆虫である、項目３５または項目３６に記載の方法。
（３８）前記昆虫が、蝿蛆症ハエ、ノミ、ゴキブリ、薄茶リンゴ蛾、コオロギ、青虫、穀粒の昆虫および貯蔵庫の昆虫からなる群から選択される、項目３５から３７のいずれかに記載の方法。
（３９）前記組成物が局所的手段、経口的手段、または非経口的手段によって投与される、項目３５から３８のいずれかに記載の方法。
（４０）前記組成物が局所的手段によって投与される、項目３５から３８のいずれかに記載の方法。
４１）前記組成物が、綿花、脂肪種子作物、観賞植物、花、果樹、穀物作物、匍匐作物、根菜作物、牧草植物および野菜からなる群から選択される植物に投与される、項目３５から４０のいずれかに記載の方法。
（４２）アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターおよび/または強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを発現する、非ヒトトランスジェニック生物。
（４３）アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターと強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターとの両方を発現する、項目４２に記載の生物。
（４４）アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターを発現する、項目４２に記載の生物。
（４５）強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを発現する、項目４２に記載の生物。
（４６）前記生物が、前記昆虫による攻撃に対して脆弱な動物または植物に定住する、項目４２から４５のいずれかに記載の生物。
（４７）前記生物が、前記動物または植物と共生するかまたは片利共生する、項目４６に記載の生物。
（４８）Bacillus、PseudomonasおよびMycobacterium種から選択される、項目４６または項目４７に記載の生物。
（４９）昆虫を制御する方法であって、項目４４に記載のトランスジェニック生物を強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターに曝す工程を包含する、方法。
（５０）昆虫を制御する方法であって、項目４５に記載の生物を、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターに曝す工程を包含する、方法。
（５１）昆虫を制御する方法であって、項目４２から４９のいずれかに記載のトランスジェニック生物を、項目１から３４のいずれかに記載の組成物に曝す工程を包含する、方法。
(発明の要旨)
本発明は、一局面において、昆虫を制御するための組成物を包含し、この組成物は、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターを含み、さらに強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターを含む。
【００７１】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、アミノ基またはその誘導体、あるいは１以上のアミノ酸部分またはその誘導体を含み得る。好適には、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、ロイシン、アルギニン、メチオニン、アスパラギン酸(aspartic)、アラニン、グルタミル、プロリル、バリル、システイン部分、またはその誘導体を含む。より好適には、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、ロイシン部分またはその誘導体を含む。
【００７２】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、メタロペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼの活性部位において、１つまたは複数の金属イオンと相互作用し得る。
【００７３】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、キレート剤を含み得、このキレート剤は好適には二座配位、三座配位、四座配位、または六座配位のキレート剤を含み得る。キレート剤は好適には、キレート作用を有するアミノカルボン酸部分またはその塩であり、そしてより好適にはエチレンジアミン四酢酸であり、あるいはニトリロ三酢酸またはキレート作用を有するその塩またはその誘導体である。  
【００７４】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、銅、コバルト、亜鉛、バナジウム、マグネシウム、マンガンおよび鉄からなる群より選択される水溶性遷移金属イオンまたはその複合体またはその誘導体を含み得る。
【００７５】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、ホウ素部分、ホスホリル部分またはホスホニル部分を含み得る。
【００７６】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、不可逆的にアミノペプチダーゼまたはメタロペプチダーゼに結合し得る。
【００７７】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、トリプシンまたはカルパインを阻害せず、且つ好適には他のセリンペプチダーゼまたはシステインペプチダーゼを阻害しない選択的インヒビターを含み得る。
【００７８】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、ロイシンアミノペプチダーゼ、Ａ型、Ｂ型、Ｎ型、およびＭ型アミノペプチダーゼ、アルギニンアミノペプチダーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、Ｄ−アミノ酸アミノペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、亜鉛アミノペプチダーゼ、Ｎ−ホルミルメチオニンアミノペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、Ａ型およびＢ型カルボキシペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、およびペプチジルトリペプチダーゼからなる群より選択される酵素を阻害し得る。
【００７９】
好適には、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターは、ロイシンアミノペプチダーゼを阻害することができ、そしてより好適には昆虫ロイシンアミノペプチダーゼを阻害する。
【００８０】
強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターは、セリンペプチダーゼインヒビター、システインペプチダーゼインヒビター、アスパルチルペプチダーゼインヒビター、またはアミノペプチダーゼインヒビターを含み得る。本発明における使用に適したインヒビターは、以下を含むがこれらに限られない。
【００８１】
・pefabloc  のようなトリプシンインヒビターおよびキモトリプシンインヒビター；
・豆果、野菜、果物または穀物由来のセリンペプチダーゼインヒビターまたはシステインペプチダーゼインヒビター；
・シスタチンおよびＥ−６４；
・ジャガイモまたは他の供給源からのカルボキシペプチダーゼインヒビター；
・Eglin  Ｃ；
・Ｌ−ロイシンチオール。
【００８２】
トリプシンおよびキモトリプシンインヒビターは、Kunitzトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）、Bowman−Birkトリプシンおよびキモトリプシンインヒビター、大豆トリプシンインヒビター、ウシ膵臓トリプシンインヒビター、ニワトリオボムコイドトリプシンインヒビター、Cucurbit  maximaトリプシンインヒビター、POT-IおよびPOT-IIトリプシンインヒビター、α−ｌ−アンチトリプシン、クワイ(arrowhead)トリプシンインヒビター、エリトリントリプシンインヒビター、およびヒトのインター−αトリプシンインヒビターを含むがこれに限定されない。
【００８３】
豆果、野菜、果物または穀物由来のセリンまたはシステインペプチダーゼインヒビターは、アズキ(red  bean)、カウピー(cowpea)、干しエンドウ(split  pea)、ウィングビーン(wing  bean)、ヤエナリ(mung  bean)、からし、カボチャ(squash)、ヒメウイキョウ(caraway)、ケージャンピー(cajun  pea)、綿花、トウモロコシ、小麦、モロコシ(sorghum)、菜種、キビ(millet)、大麦、およびペポカボチャ(pumpkin)由来のペプチダーゼインヒビターを含むが、これに限定されない。
【００８４】
シスタチンは、イネ由来のオリザシスタチン(oryzacystatin)  I  およびII、ジャガイモマルチシスタチン、およびそのトリプシン消化されたサブユニット、ならびに鶏卵シスタチンを含むが、これに限定されない。
【００８５】
本明細書においてペプチダーゼインヒビターを一般名で呼称するときは、アナログまたはこれらのインヒビター、すなわち、同様な構造および／または一般認識されている１つまたは複数の物質に対する阻害特性（１つまたは複数の標的酵素活性部位との相互作用）を有するインヒビターを含むことを、意図している。
【００８６】
適切なアナログは、上記インヒビターの部分、その結合体、または、上記物質と少なくとも70％の相同性、好ましくは少なくとも80％の相同性、そしてより好ましくは少なくとも90％の相同性を有する物質であり得る。
【００８７】
本発明の組成物はまた、必要に応じて、薬学的、獣医学的、農学的、または園芸学的使用に受容可能な１種類以上の添加物、例えば分散剤、粘度調整剤、凍結防止剤、湿潤剤、共溶剤、ＵＶ吸収剤、染料、およびキャリアなどを含有してもよい。
【００８８】
１つの実施態様において、本発明の組成物は、L-ロイシンチオール、アクチノニン、ベスタチン、1,10-フェナントロリンおよびＥＤＴＡからなる群より選択されるアミノペプチダーゼインヒビターを、ＳＢＴＩ、pefablocおよびアンチパインからなる群より選択される強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターとともに含有する。
【００８９】
アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターまたは強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターは、好ましくは、ペプチド、ポリプチドおよび／またはタンパク質を含有する。
【００９０】
第２の局面において、本発明は、昆虫を本発明の組成物に曝す工程を包含する、昆虫を制御する方法を提供する。
【００９１】
好ましくは、昆虫の卵または幼虫を本発明の組成物に曝し、昆虫の卵の孵化および／または昆虫の幼虫の発育を阻害することによって、昆虫は制御される。
【００９２】
好ましくは、昆虫は、鱗翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、噛虫目(Psocoptera)、膜翅類(Hymenoptera)、網翅目(Dictyoptera)、等翅目(Isoptera)、総翅目(Thysanoptera)、同翅目(Homoptera)、双翅目(Diptera)、正脱翅目(Anaplura)、Malophagaおよび隠翅目(Siphonaptera)からなる群より選択される目の一種である。より好ましくは、昆虫は、蝿蛆症ハエ、青虫、蚤、野コオロギ(field  cricket)、ゴキブリ、薄茶リンゴ蛾、および穀粒および小麦粉貯蔵庫の昆虫からなる群より選択される。
【００９３】
本発明の方法によれば、標的昆虫は、任意の適切な手段によって酵素インヒビターに曝露され得る。インヒビターを植物に適用するか動物に適用するかに応じて、ならびに標的昆虫の性質および植物または動物の性質に応じて、これらの手段は幅広く変化し得ることが、当業者には理解される。昆虫により攻撃される植物または動物に酵素インヒビターを直接適用するために適切な手段は、昆虫の生息地または繁殖地に酵素インヒビターを適用するのに適切な手段とはかなり異なり得る。
【００９４】
酵素インヒビターを動物に適用するための適切な手段は、浸漬(dipping)またはスプレーによるような直接局所的塗布および、経口水薬(oral  drenching)、移植物、遅延放出ボーラス処方物、または瘤胃(rumen)中で維持するのに適したデバイス、または昆虫餌および錠剤によるような内服を含むがこれに限定されない。本発明の薬剤をヒトに適用する場合は、局所適用に適した処方物は、スプレー、エアゾール、クリームおよびローションを含むがこれに限定されない。そして、内服に適した処方物は、錠剤、カプセル剤または液剤を含むがこれに限定されない。状況によっては、注射による非経口投与が、ヒトまたは動物の処置の最も適切な手段であり得る。
【００９５】
酵素インヒビターを植物に適用する場合、適切な手段は、スプレー、粉剤(dust)、ペレット、またはエアゾールを含むがこれに限定されない。本発明の方法はまた、２種類以上のメタロペプチダーゼインヒビターの同時または連続使用、あるいは、１種類以上のメタロペプチダーゼインヒビターまたはアミノペプチダーゼインヒビターを、１種類以上の他タイプの酵素インヒビター、他の昆虫生理学的プロセスの１種類以上のインヒビター、もしくは他の１種類以上の殺虫剤と共に同時または連続して使用することを、包含する。これら他のインヒビターを局所的に送達するか、内服的に送達するか、トランスジェニック改変(transgenic  modification)的に送達するかに依存しない。
【００９６】
本発明の目的に有用なインヒビターのいくつかは、自然のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。この場合には、アミノペプチダーゼインヒビターまたはメタロペプチダーゼインヒビターと強力にキレートしないペプチダーゼインヒビターとの一方もしくは両方を、標的植物または非ヒト動物においてあるいは関連のトランスジェニック発現によって供給してもよい。これらのインヒビターのうち１つのみがトランスジェニック的に発現される場合、他のインヒビターを局所適用によって供給してもよい。
【００９７】
トランスジェニック生物は、好ましくは昆虫による攻撃に対して脆弱な植物または非ヒト動物であるが、そのような攻撃に対して脆弱な動物または植物内または上に在留する生物でもよい。後者の場合、生物は植物または動物と好ましくは共生または片利共生の関係にある。適切な在留生物は、Bacillus種またはPseudomonas種、あるいはMycobacterium種を含むがこれに限定されない。好適な実施態様においては、上記生物は、Bacillus  thuringiensisまたはMycobacterium  phleiである。トランスジェニック生物を製造する方法は当該技術分野において周知であり、Bacillus  thuringiensis結晶タンパク質を発現する植物は、昆虫による攻撃に対していくぶんかの耐性を示す。
【００９８】
本発明の好適かつ非限定的な実施態様において：
（ａ）本発明の方法によって処置される動物は、ヒト、ヒツジ、畜牛(cattle)、ウマ、ブタ、家禽、イヌおよびネコからなる群より選択される。
【００９９】
（ｂ）本発明の方法によって処置される植物は、綿花、脂肪種子作物、観賞植物、花、果樹、穀物作物、葡萄作物、根菜作物、牧草植物および野菜からなる群より選択される。
【０１００】
（ｃ）本発明の園芸およびブロードエーカー適用の場合に制御される昆虫は、鱗翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、等翅目(Isoptera)、総翅目(Thysanoptera)または同翅目(Homoptera)であり、動物の昆虫感染の場合は、双翅目(Diptera)、正脱翅目(Anaplura)、Malophagaまたは隠翅目(Siphonaptera)であり、家庭害虫または産業害虫の場合は、等翅目(Isoptera)、網翅目(Dictyoptera)および膜翅類(Hymenoptera)である。
【０１０１】
（ｄ）トランスジェニック植物は、綿花、脂肪種子作物、観賞植物、花、果樹、穀物作物、葡萄作物、根菜作物、牧草植物および野菜からなる群より選択され、そして
（ｅ）動物または植物内または上に在留するトランスジェニック生物は、Bacillus種またはPseudomonas種またはMycobacteria種である。
【０１０２】
トランスジェニック植物または生物は、当業者に公知の技術を用いて調製し得る。例えば、非ヒト動物または植物あるいは生物は、以下の工程によって改変すされ得る。
【０１０３】
・アミノペプチダーゼまたは「強力にキレートしない」ペプチダーゼを阻害するペプチド剤をコードするヌクレオチド配列およびプロモーターを含む適切なベクターを調製する工程。上記ヌクレオチド配列は、上記ベクターを含む宿主により発現され得る。
【０１０４】
・ベクターを宿主中に導入する工程；および
・ベクターを含む宿主を、ヌクレオチド配列を上記ペプチド剤中に転写および翻訳するために適切な条件下に維持する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０５】
発明の詳細な説明
本発明を、以下の例を参照して詳細に記載するがこれに限定されない。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明の使用により得られる昆虫成長阻害または殺虫剤活性を示す。しかし、他の方法および適用もまた用いられ得ることが理解される。セリンペプチダーゼおよびシステインペプチダーゼ単独（本発明の分野内ではない）の阻害剤の効果には、種間のインヒビターに対する変動性を例示すること、あるいは本発明の使用を介して連続して得られる付加的または相乗的な利益を例示することが包含される。
【０１０７】
実施例１  ヒツジキンバエ（Lucilia  cuprina；Diptera）の幼虫の成長および生存に対する個々のインヒビターの影響
方法
幼虫を、0.5％次亜塩素酸ナトリウムで表面を滅菌した卵から孵化させ、27℃で一晩インキュベートした。第１齢幼虫を採集し、そして示したように、１つまたは複数のインヒビターを添加してまたは添加せずにオートクレーブした１mlの培養培地に入れた。培地は滅菌バイアルまたはボトル中に、滅菌水中２％寒天、10％カゼイン、２％酵母、および0.5％グルコースを含んでいた。培養の意図された期間に応じて、５〜50匹の幼虫を各ボトル中にいれ、次いで、細かいプラスチックメッシュの挿入面を有するふたを用いてキャップした。このキャップはボトル中への空気を自由に交換することができた。
【０１０８】
次いで、このボトルを外部環境との接触を防ぐために密封された大きな滅菌容器内に入れた。この容器は、滅菌し、加温、加湿された空気の供給源および真空ポンプにそれぞれ接続された入口チューブおよび出口チューブを含んでいた。培養ボトルを含んでいるこの装置は、24〜72時間35℃に保たれた。これにより、必要な発育段階への幼虫の成長が可能となった。
【０１０９】
培養物を、滅菌空気流フード中に設置し、そして幼虫の成長を援助または妨害し得、それにより結果を無効にする細菌の混入の可能性を最小にするような滅菌環境中でインキュベートした。意図された培養期間の後、ボトルを取り出し、そして幼虫を凍結によって殺した。次いで、それらを乾燥し、ひとまとめにまたは個別にのいずれかで秤量した。
【０１１０】
次いで、コントロール培養物中の昆虫の幼虫（インヒビターの非存在という点を除いて、同一の環境条件および食餌下で、同時に成長させた幼虫）の重量と、インヒビターを含む幼虫の重量を比較し、阻害パーセント(I)を以下の式に従って算出した：
Ｉ＝(ｃ−ａ)/ｃ×100
ここで、
ａ＝インヒビターの存在下での幼虫の重量、および
ｃ＝コントロール幼虫の重量。
【０１１１】
多数のインヒビターをこの培養系でテストし、そしてこれらの選択を表1.1に挙げる。第１齢幼虫の成長および生存に対するインヒビターの効果を、表1.2に示す。
【０１１２】
【表１−１】
2006335765.tif 000002
【０１１３】
＊  他に記載がなければ、酵素インヒビターは滅菌リン酸緩衝化生理食塩水または水に可溶性である。DMSO/H20またはMeOH/H20にのみ可溶性である酵素インヒビターは、同量のDMSOまたはMeOHを含むコントロール処理と比較した。
【０１１４】
【表１−２】
2006335765.tif 000003
【０１１５】
この結果は、トリプシン様酵素に影響を与えるインヒビターが幼虫の成長を遅らせること、またはTLCKの場合にテストした最高濃度で幼虫を殺すことに有効であることを示した。システインペプチダーゼインヒビターであるE64は有効ではなかった；しかし、成長に対するカルパインインヒビターの効果ならびにロイペプチンおよびAPMS（システイン特異的インヒビターではない）による中間阻害は、システインペプチダーゼに対するいくつかの本質的な役割があり得ることを示唆する。
【０１１６】
ペプスタチンによる１つまたは複数のアスパルチルペプチダーゼの阻害が有効ではなかったことは先行文献と一致する。
【０１１７】
この実験の驚くべき結果は、幼虫の成長に対するいくつかのアミノペプチダーゼインヒビターの顕著な影響であった。これらの結果は、幼虫の１つまたは複数のアミノペプチダーゼの阻害が有効であることを示した。L-ロイシンチオール、EDTA、1,10-フェナントロリン、ベスタチン、アマスタチン、ロイヒスチン、およびアクチノニンは、有効な成長インヒビターであった。ジペプチジルアミノペプチダーゼのインヒビターであるジプロチンＡ（Diprotin  A）およびメチオニンアミノペプチダーゼのインヒビターであるエバラクトン（Ebalactone）は有効ではなかった。
【０１１８】
実施例２ ヒツジキンバエ（L.  cuprina；双翅目(Diptera)）の幼虫の成長および生存に対する組み合わせたペプチダーゼインヒビターの影響
(a)  組み合わせたセリンおよびセリン：アミノペプチダーゼインヒビターの組み合わせの使用。
【０１１９】
実施例１に概説したテストからのデータは、トリプシン様酵素および／またはアミノペプチダーゼ酵素に影響を与えるインヒビターの組み合わせが付加的または相乗的な効果を有し得ることを示唆した。さらなる実験を、既述の方法を用いてこの可能性を試験するために行った。結果を表2.1に示す。
【０１２０】
【表２−１】
2006335765.tif 000004
【０１２１】
SBTIとロイペプチンまたはPefablocとの組み合わせがほとんど効果がないことは明らかであった。SBTIとEDTAで中程度の効果が得られた。SBTIをTLCKまたはL-ロイシンチオールとテストした場合、より大きな阻害を生じた。結果は、トリプシン様ペプチダーゼおよびアミノペプチダーゼの複数の阻害が幼虫に対する有用な阻害効果を有することを示唆した。
【０１２２】
(b)  L.cuprinaの幼虫の成長阻害に対する、セリンペプチダーゼインヒビター（SBTI）とアミノペプチダーゼインヒビター（L-ロイシンチオール）との組み合わせの効果の研究
SBTIとL-ロイシンチオールインヒビターとの組み合わせの幼虫の成長に対する効果を、相乗的阻害が生じる可能性を研究するためにある範囲の濃度にわたって検討した。この実験は有意な致死率が生じる前に終了した。結果を表2.2に示す。
【０１２３】
【表２−２】
2006335765.tif 000005
【０１２４】
(c)  L.cuprinaの幼虫の成長に対する、２つのアミノペプチダーゼインヒビター（EDTAおよびL-ロイシンチオール）の組み合わせの効果の検討
これらの実験の結果を表2.3に示す。
【０１２５】
【表２−３】
2006335765.tif 000006
【０１２６】
実施例３ ヒツジクロバエ(L.  cuprina；双翅目(Diptera))およびHeliothis  punctigensの幼虫の孵化に対するペプチダーゼインヒビターの影響
以下の実験を、本発明の組成物が孵化の阻害により、殺虫の役割を満足し得るかどうかを評価するために行った。
【０１２７】
L.cuprinaの卵を肝臓片(0.9g)上に置き、それを次いで24ウェル組織培養プレートの個々のウェル中に置いた。設定された濃度でインヒビターを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、0.1ml)を、30の新たに生みつけられそして無菌のL.cuprinaの卵とともに各ウェルに添加した。次いで培養プレートを、無菌環境に35℃で24時間維持し、その後、孵化の百分率を評価した。
【０１２８】
Heliothisの卵は、24ウェルの組織培養プレート中の規定培地(カゼイン３g、コムギ麦芽３g、スクロース５g、寒天2.25g、複合ビタミンB錠剤５mg、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む80mlのPBS中に溶解)上で培養した(２つの卵/ウェル)。卵の孵化は、27℃で３日間のインキュベーション後評価した。結果を表3.1に示す。
【０１２９】
【表３−１】
2006335765.tif 000007
【０１３０】
最初のインビトロ試行では、10個のHeliothis卵が、0.17mM  SBTIと５mMアクチノニンとの混合物中で孵化しなかったが、10個のコントロール卵はすべて孵化した。
【０１３１】
実施例４ 人工餌を与えたCotton  Budworm(Heliothis  punctigens、鱗翅目)幼虫の成長および生存に対する本発明の影響
人工餌は以下のように調製した：
隠元豆                    468グラム(g)
小麦麦芽                      100g
酵母                          70g
アスコルビン酸                70g
パラベン                      44g
ソルビン酸                    2.2g
寒天                          28g
H2O                          800ml
*  リン酸およびプロピオン酸    ４ml
*  リン酸およびプロピオン酸のストック溶液は以下を含んでいた：
29ml    プロピオン酸
21ml    オルトリン酸
270ml  dH2O
全量  500ml
１．  隠元豆は、マイクロ波で40分間料理した。
２．  寒天は熱水に添加し、そしてほぼ沸騰するまでホットブレート上で撹拌した。
３．  隠元豆、寒天混合物、酵母および小麦麦芽を３分間電気ミキサー中でブレンドした。
４．  温度が60℃まで低下したとき、酸を添加しそして培地と混合した。
５．  インヒビター溶液、または等量の水を、所定の濃度で無菌ガラス管中に置いた。人工培地を、無菌の10mlのシリンジを用いて各管に添加した(1.5ml)。第一齢(孵化から最初の脱皮まで)のHeliothis  punctigens幼虫(管あたり１匹の幼虫)をガラス管に加え、そして管にキャップをした。この管を25℃で10日間インキュベートした。このガラス管を、-70℃で24時間置くことにより幼虫を殺し、次いで個々に秤量した。阻害パーセントは、コントロール幼虫に対する比較により計算した。
【０１３２】
結果を表4.1に示す。
【０１３３】
【表４−１】
2006335765.tif 000008
【０１３４】
実施例５ ネコノミ(Ctenocephalides  felis；隠翅目(Siphonaptera))の成長および生存に対するペプチダーゼインヒビターの影響
18ケ月外部寄生生物薬剤で処理されなかった５歳のメリノ種ヒツジの頚動脈から血液を採取した。血液を、0.8mlのヘパリンを含む100mlのプラスチックボトルに集め、そして４℃で維持した。インヒビターを予め無菌の５mlのプラスチックバイアル中に秤量し、そして4.5mlの血液を添加した。試料を混合し、-70℃で24時間置き、次いで凍結乾燥した。凍結乾燥した試料を、ステンレス鋼63ミクロンふるいを通してふるい、そして無菌の５mlのプラスチックバイアル中に入れた(0.15g/管あたり)。４つのノミの卵を、各バイアルに入れ、そして１枚のティッシュペーパーを弾性バンドで固定して各バイアルの上部に装着した。このバイアルを、25℃および70-80%  R  Hで６日間インキュベートした。次いで、バーミキュライトを各バイアルに添加してノミがさなぎになるための支持媒体を与え、そして管を、25℃および70-80%  R  Hでさらに10日間インキュベートした。10個のコントロールバイアルおよび各処置の３つのバイアルを試験した。
【０１３５】
バイアルのインキュベーション期間の終わりに、バイアルを-20℃に24時間置き、ノミを殺した。孵化した卵の数およびライフサイクルのステージを記録した。結果を表5.1に示す。
【０１３６】
【表５−１】
2006335765.tif 000009
【０１３７】
実施例６ 天然餌を与えた黒コオロギ(Teleogryllus  commodus、直翅目(Orthoptera))の幼虫の生存に対するペプチダーゼインヒビターの影響
(i)  インヒビターおよびコントロール溶液のストック溶液を、表6.1で概略を述べたように水性溶液または懸濁液として調製した。
(ii)  死亡率は、第一齢さなぎを用いて実験を開始することにより評価した。
(iii)  キャベツの葉のディスク(５×８mm直径ディスク/処置)に、100μlのインヒビターまたはコントロールストック溶液を塗り付けそして乾燥させた。ディスクは、一つ一つ40mmのペトリ皿に、水分供給源としての湿ったコットンウールパッド、およびシェルター用の縦溝のついた一枚のプラスチックとともに置いた。
(iv)  10匹のさなぎを各ディスク上に置き、そして皿を25℃でインキュベートした。
(v)  死亡率を毎日評価し、そして死んだ個体をすべて取り出した。結果を表6.1に示す。
【０１３８】
【表６−１】
2006335765.tif 000010
【０１３９】
実施例７ ヒツジシラミ(Bovicola  ovis；Anoplura)の成長および生存に対するペプチダーゼインヒビターの影響
ヒツジシラミは、オーストラリアおよび他の多くの国における主要な農業的昆虫害虫である。この昆虫のいくつかの系統は、有機リン酸系殺虫剤および合成ピレスロイドに対する高レベルの耐性を発達させている。この試みは、以下の目的のために行われた：
(i)本発明において有用なインヒビターの成長阻害活性または殺虫活性の評価を広げること；および
(ii)既知の高レベルの殺虫剤耐性を有する昆虫の系統に対して本発明の成長阻害活性または殺虫活性を評価すること。
【０１４０】
選択されたシラミの系統は、Hartleyとして公知の参照系統であった。これは、合成ピレスロイドに対して高度に耐性である（表7.1、Levot,G.W.,Aust.Vet.J.,1992  69  120)。
【０１４１】
(i)シラミを、重篤に感染したヒツジから小領域の羊毛を刈り込み、そして刈り取られた領域を１分間木綿布で覆うことにより採集した。シラミを布から容器の中に払い落とした。
【０１４２】
(ii)インヒビターのストック水溶液または懸濁液を、皮膚に最も近い40mmの羊毛から得た羊毛の房(tufts  of  wool)に塗布した。ドナーのヒツジは、２年間殺虫剤で処置されていないことが分かっており、そしてその羊毛は、刈り込み時に100mmの毛脚を有していた。
【０１４３】
(iii)交差汚染を避けるように注意し、４連(quadruplicate)の羊毛サンプルをインヒビターの水溶液または懸濁液に浸漬することにより処理し、水を切り、そして24時間乾燥させた。
【０１４４】
(iv)羊毛サンプルを、ラベルしたキャップ付きプラスチックチューブに加えた。
【０１４５】
(v)シラミを、（生存能試験として）紙を横切って光源から離れて這わせた。成虫、第３齢、第２齢、および第１齢のそれぞれから10匹のシラミを、羊毛の各チューブに加えた。
【０１４６】
(vi)チューブを35℃および60〜80％RHにてインキュベートし、そして毎日検査した。
【０１４７】
(vii)触った場合に動けないシラミを死んでいるとみなして生存能の評価を行った。
結果を表7.1に示す。
【０１４８】
【表７】
2006335765.tif 000011
【０１４９】
本発明の組成物は、殺虫剤耐性のヒツジシラミに非常に有効であった。
【０１５０】
実施例８ ブルキド(Bruchid)(Tribolium  castaneum；Coleoptera)の成長および生存に対するペプチダーゼインヒビターの影響
昆虫を、有機栽培小麦から作製した清潔にし挽いて篩にかけた全粒小麦粉で育てた。予め重量を測定した原料のボトルからのインヒビターを小麦粉と乾燥したまま混合し、そして残りのインヒビターを少量の水でボトルからすすぎ落とした。すすぎ水を小麦粉に添加し、そしてこの混合物を再び挽いた。含浸した小麦粉を20mLのバイアルに移し、そして振盪および倒置することにより完全に混合した。
【０１５１】
T.castaneumの成虫に、小麦粉の上で産卵させ、卵を小麦粉から篩い、そして少量の小麦粉を含むマイクロウェルチューブに１本の毛を用いて１つ１つ移した。それぞれのレベルの処理を、32ウェル／１連を用いて３連で行った。アッセイを３連で行った。培養物は、30℃および55％RHにてインキュベートした。
【０１５２】
６日後、各連の32ウェルを合わせて、幼虫を数え、そして数をコントロール（インヒビターなし）処理における数と比較した。幼虫を、参照幼虫よりもはっきりと小さな場合、「小」として、正常でない行動または正常でない形態（例えば、ねじれている(twisting)またはねじれた(twisted)幼虫）が観察された場合、異常として分類した。
【０１５３】
試験インヒビターおよび用量率は、実施例４で用いたものと同一であった。
【０１５４】
結果
（６日目）−卵の孵化は、６日目では一貫して影響されなかった
−幼虫は、アクチノニン(actinonin)およびEDTAの全ての用量レベルで「小」と分類されたが、しかし1,10-フェナントロリン(1,10-phenanthroline)および他の処理では正常であった
実施例９ 穀粒貯蔵害虫（Oryzaephylus  surinamensis；Coleoptera)の成長および生存に対するペプチダーゼインヒビターの影響
この昆虫に対するバイオアッセイは、インキュベーションを32.5℃および70％RHにて行ったことを除いてT.castaneumに対して概説した通りであった。８日後、昆虫を小麦粉から篩い、そして重量を測った。
【０１５５】
これらの結果を表9.1に示す。
【０１５６】
【表９】
2006335765.tif 000012
【０１５７】
個々のアミノペプチダーゼインヒビターに対する応答は、変わりやすかった。1,10-フェナントロリンは、非常に効果的な成長インヒビターであり、EDTAは、中程度に効果的であり、そしてベスタチンは、効果がなかった。
【０１５８】
本発明は明確さおよび理解のためにある程度詳細に記載したが、本明細書中に記載の実施態様および方法に対する種々の改変および変更が、本明細書に開示した発明の概念の範囲から逸脱せずになされ得ることは当業者には明らかである。
【０１５９】
本明細書に引用した参考文献が、以下の頁に列挙され、そして参考として本明細書中に援用される。
【０１６０】
【数１−１】
2006335765.tif 000013
【０１６１】
【数１−２】
2006335765.tif 000014
【０１６２】
【数１−３】
2006335765.tif 000015
【０１６３】
【数１−４】
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【０１６４】
【数１−５】
2006335765.tif 000017
【０１６５】
【数１−６】
2006335765.tif 000018
【０１６６】
【数１−７】
2006335765.tif 000019