(57)【要約】【課題】装置が大掛かりにならず、特別な試薬を用いることなく物質を容易に分離することができる物質の分離方法を提供することを目的としている。【解決手段】チューブをコイル状に巻回することによって形成されたコイル状流路内に複数物質を含む混合溶液を流し、この混合溶液が前記コイル状流路内を通過するに伴って混合溶液中の各物質を分離することを特徴としている。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チューブをコイル状に巻回することによって形成されたコイル状流路内に複数物質を含む混合溶液を流し、この混合溶液が前記コイル状流路内を通過するに伴って混合溶液中の各物質を分離することを特徴とする物質の分離方法。
【請求項２】
コイル状流路のコイル内径が３ｍｍ以下である請求項１に記載の物質の分離方法。
【請求項３】
混合溶液を層流状態を保持させながらコイル状流路内に通す請求項１または請求項２に記載の物質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中に含まれる複数の物質を個別に分離する物質の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中に含まれる複数の成分を個別に分離するために、従来よりクロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動が用いられている（たとえば、特許文献１参照）。
しかしながら、クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動を用いた分離方法は、微量成分の分離も可能であるが、それぞれつぎのような問題がある。
【０００３】
すなわち、クロマトグラフィーの場合、カラムに充填剤を充填する必要があり、充填剤の合成・調製、充填剤を詰めるなど特別な技術も必要である。また、特別な（高価な）試薬が必要であるとともに、装置も大掛かりなものになってしまう。
一方、キャピラリー電気泳動の場合、電極を装置内に設けなければならないとともに、電極間に高電圧をかける装置が必要であって、装置が大掛かりで高価なものになってしまう。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１７２６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みて、装置が大掛かりにならず、特別な試薬を用いることなく物質を容易に分離することができる物質の分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明にかかる物質の分離方法は、チューブをコイル状に巻回することによって形成されたコイル状流路内に複数物質を含む混合溶液を流し、この混合溶液が前記コイル状流路内を通過するに伴って混合溶液中の各物質を分離することを特徴としている。
【０００７】
本発明において、特に限定されないが、コイル内径が３ｍｍ以下であることが好ましい。
コイル状流路の長さは、分離する物質やチューブ内径、コイル内径によって適宜選択され、特に限定されないが、長い方が分離能が高い。
【０００８】
チューブの内径は、内部を通過する混合溶液の種類、粘度等によって適宜選択されるが、２００μｍ以下が好ましい。
チューブとしては、内部を通過する混合溶液中の分離しようとする物質を吸着したり、反応したりするなど、混合溶液中の物質に影響を及ぼさない材質で所定径のコイル状に形成することができるものであれば特に限定されないが、たとえば、フッ素樹脂等の合成樹脂チューブ、金属チューブ、シリカチューブ等が挙げられ、可撓性があり、コイル径を小径化しやすく、耐食性に優れたフッ素樹脂チューブが好適に用いられる。
【０００９】
コイル状流路内を通過する混合溶液の速度や圧力は、特に限定されないが、層流条件を保ちながら通過できる速度や圧力とすることが好ましい。
なお、本発明において、層流条件とは、レイノルズ数が２３００以下となる条件をいう。
【発明の効果】
【００１０】
本発明にかかる物質の分離方法は、チューブをコイル状に巻回することによって形成されたコイル状流路内に複数物質を含む混合溶液を流すようにしたので、この混合溶液が前記コイル状流路内を通過するに伴って混合溶液中の各物質が分離させることができる。
【００１１】
分離のメカニズムは、明確ではないが、以下のように考察される。すなわち、物質の慣性力は、その質量の増加に伴って増加する。したがって、混合溶液がコイル状流路内を流れる場合、混合溶液中の質量が大きいため慣性力が大きい物質は、質量が小さいため慣性力が小さい物質に比べてコイル流路中でコイルの外径側を流れる。よって、コイルの軸方向の速度を見ると、質量が大きい物質は、質量が小さい物質に比べて遅くなり、物質の質量差によって分離されると考えられる。
【００１２】
以上のように、本発明にかかわる物質の分離方法は、チューブをコイル状に巻回することによって形成されたコイル状流路内に複数物質を含む混合溶液を流すだけでよいので、作業性に優れ、分析装置に組み込むと、装置全体を小型化できるとともに低コスト化することができる。
【００１３】
また、コイルの内径を３ｍｍ以下にすれば、混合溶液を低速で流路内を通過させるようにしても、効率よく各物質を分離することができる。
さらに、混合溶液を層流状態を保持させながらコイル状流路内に通すようにすれば、流路内で、各物質が分子拡散以外の拡散を起こさないため、より分離能が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を、その実施の形態をあらわす図面を参照しつつ詳しく説明する。
図１は、本発明にかかる物質の分離方法に用いるコイル状流路の１つの実施の形態をあらわし、図２は、本発明にかかる物質の分離方法を用いた化学発光分析装置の１例をあらわしている。
【００１５】
図１に示すように、このコイル状流路１は、たとえば、内径２００μｍ以下、好ましくは１５０μｍ以下のフッ素樹脂製のチューブが直径３ｍｍ以下、好ましくは２ｍｍ以下の芯材２の周りに巻き数５０〜２００回でコイル状に巻回されることによって形成されている。
【００１６】
図２に示すように、化学発光分析装置３は、化学発光検出器４と、サンプル供給装置５と、キャリア供給装置６と、三方弁７と、図１に示すコイル状流路１とを備えている。
キャリア供給装置６は、キャリア供給路６１と、注射器型のキャリア供給ポンプ６２とを備え、キャリア供給路６１の一端がキャリア供給ポンプ６２の吐出口に接続され、キャリア供給路６１の他端が三方弁７の１つの接続口に接続されている。
【００１７】
サンプル供給装置５は、サンプル供給路５１と、注射器型のサンプル供給ポンプ５２とを備え、サンプル供給路５１の一端がサンプル供給ポンプ５２の吐出口に接続され、サンプル供給路５１の他端が三方弁７の１つの接続口に接続されている。
コイル状流路１は、その一端が三方弁７の残りの１つの接続口に接続され、他端が後述する化学発光検出器４の導入路４１に接続されている。
【００１８】
化学発光検出器４は、導入路４１と、ブラックボックスになった化学発光検出セル４２と、フォトセンサモジュール４３と、積分器４４とを備えている。
【００１９】
そして、この化学発光分析装置３においては、たとえば、つぎのようにして、混合溶液中の２つの物質を分離して個別に分析することができる。
まず、化学発光検出セル４２内には発光試薬あるいは発光試薬で標識化された物質と反応することによって発光させる物質（以下、「反応液」と記す）を充填しておく。
【００２０】
また、サンプル溶液として、発光試薬によって標識化された物質と、標識化に用いられなかった残余の発光試薬とが混合されたサンプル溶液を用意し、サンプル供給ポンプ５２に充填する。
そして、三方弁７を切り替えて、キャリア供給路６１とコイル状流路１とを連通状態にしてキャリア供給ポンプ６２によってキャリア液をキャリア供給路６１からコイル状流路１内に供給する。
【００２１】
コイル状流路１内にキャリア液が充満したら、キャリア液の供給を停止するとともに、三方弁７を切り替えてサンプル供給路５１とコイル状流路１とを連通状態にしたのち、サンプル供給ポンプ５２によってサンプル溶液を所定量だけコイル状流路１に充填し、コイル状流路１内に止める。
つぎに、三方弁７を切り替えて、再びキャリア供給路６１とコイル状流路１とを連通状態にしてキャリア液をキャリア供給ポンプ６２によってキャリア液をキャリア供給路６１からコイル状流路１内に供給し、コイル状流路１内に残っているサンプル溶液をキャリア液によって化学発光検出セル４２内に押し出すことによって、発光試薬によって標識化された物質と反応液とによって化学発光検出セル４２内で生じる発光と、標識化に用いられなかった残余の発光試薬と反応液とによって化学発光検出セル４２内で生じる発光とをフォトセンサモジュール４３によってそれぞれ検出する。
【００２２】
すなわち、サンプル溶液中の発光試薬によって標識化された物質は、発光試薬に比べてその質量が大きい。したがって、サンプル溶液がコイル状流路１内を通過していくことによって、質量の差によって生じる慣性力の差からコイルの内側を通る発光試薬がまず化学発光検出セル４２内に到達し、発光試薬によって標識化された物質が発光試薬より遅れて化学発光検出セル４２内に到達する。その結果、発光試薬による発光のピークと発光試薬によって標識化された物質による発光のピークとがはっきりと分かれて検出され、サンプル溶液中のそれぞれの物質の混合割合を算出することができる。
【００２３】
本発明は、上記の実施の形態に限定されない。たとえば、上記の実施の形態では、コイル状流路がロッドの周りにチューブを巻回することによって形成されていたが、流路をコイル状に保つことができるのであれば、ロッドなどの芯材はなくても構わない。
上記の実施の形態では、コイル状流路を化学発光分析装置に組み込んでいたが、コイル状流路のみで混合溶液中の成分を分離するようにしても構わない。
【実施例１】
【００２４】
以下に、本発明の具体的な実施例を詳しく説明する。
【００２５】
（実験１）
各部が以下のような寸法および材料となった図２に示すような化学発光分析装置３を用意した。
（コイル状流路１）
内径１００μｍ、外径２００μｍ、長さ１５０cmの４フッ化エチレン樹脂製キャピラリーチューブ（ヤサカ工業株式会社製）を外径２ｍｍのロッドに巻き数８０回で巻回したもの。
（キャリア供給路６１、サンプル供給路５１、導入路４１）
溶融シリカキャピラリーチューブ（内径７５μＭ、長さ１００ｍｍ、ＧＬ科学（株）製）
（三方弁７）
ポリオレフィン系樹脂（サイゴン株式会社の商標Ｔｙｇｏｎ）からなる三方弁（内径０．１９ｍｍ、外径２．２０ｍｍ）
（化学発光検出セル４２）
容量約８ｍＬの立方体形状をしていて、フォトセンサモジュール４３がセットされた立方体の１つの面が1mm厚の耐熱ガラス板で形成され、残りの面が４フッ化エチレン樹脂で形成されているとともに、導入路４１の出口と耐熱ガラス板面との距離を約０．３ｍｍとされている。
【００２６】
つぎに、以下のようなキャリア液をキャリア供給ポンプ６２に、サンプル溶液をサンプル供給ポンプ５２に、反応液を化学発光検出セル４２にそれぞれ充填し、１１０ｎＬのサンプル液をキャリア液が満たされたコイル状流路１の入口に充填したのち、キャリア供給ポンプ６２からキャリア液をコイル状流路１に１．６７μL／ｍｉｎの流速で注入し、サンプル溶液をキャリア液とともに、化学発光検出セル４２に送った。その結果、図３に示すような化学発光の検出結果が得られた。
なお、この系においてコイル状流路１のレイノズル数は、おおよそ０．４になる。したがって、コイル状流路１内を通過する溶液は、層流状態を維持すると考えられる。
【００２７】
（キャリア液Ａ）
４μＭのマイクロパーオキシダーセ（microperoxidase ナカライテスク株式会社から入手）を含む１０ｍＭの炭酸緩衝液
（サンプル溶液Ａ）
1.65mgの人血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」と記す、分子量：およそ６６０００、シグマ株式会社から入手したもの）と0.11mgのイソルミノールイソチオシアネート（以下、「ＩＬＩＴＣ」と記す、分子量：２１９．２２、東京化成工業株式会社から入手したもの）を遠心分離用チューブに秤取り、95％水／5％トリエチルアミン溶液を100μL加えた。これを超音波槽に1分間浸した後、ボルテックスミキサーで十分撹拌して暗所で20分間放置した。次に、この溶液から溶媒を減圧留去した。測定を行う際は、これを10mmol/L炭酸緩衝液(pH10.8)5mlで溶かして使用した。
（反応液）
４００ｍmol/Lの過酸化水素を含む１０ｍmol/Lの炭酸緩衝液（ｐＨ１０．８）
【００２８】
（実験２）
コイル状流路１として、内径１００μｍ、外径２００μｍ、長さ７０cmの４フッ化エチレン樹脂製キャピラリーチューブ（ヤサカ工業株式会社製）を外径２ｍｍのロッドに巻き数４０回で巻回したものを用いた以外は、上記実験１と同様にして化学発光検出を行ったところ、図４に示すような化学発光の検出結果が得られた。
【００２９】
（実験３）
コイル状流路１に代えて、直線状にした内径１００μｍ、外径２００μｍ、長さ７０cmの４フッ化エチレン樹脂製キャピラリーチューブ（ヤサカ工業株式会社製）を用いた以外は、上記実験１と同様にして化学発光検出を行ったところ、図５に示すような化学発光の検出結果が得られた。
【００３０】
上記実験１〜３から、コイル状流路１を用いなければ、ＩＬＩＴＣとＩＬＩＴＣで標識化されたＨＳＡとが分離されず、図５に示すように、ＩＬＩＴＣとＩＬＩＴＣで標識化されたＨＳＡとが同時に検出され、本発明のようにコイル状流路１を用いれば、図３および図４に示すように、μLオーダー以下のサンプル溶液を、キャリア溶液とともに、μL／分オーダーの流速でコイル状流路内に通すだけで、サンプル溶液中のＩＬＩＴＣとＩＬＩＴＣで標識化されたＨＳＡとが分離されて、ＩＬＩＴＣで標識化されたＨＳＡがＩＬＩＴＣより遅れて導入路４１の出口に達することが判る。また、図３および図４に示すように、コイル状流路１の長さが長い程、分離能がよくなり、ＩＬＩＴＣとＩＬＩＴＣで標識化されたＨＳＡとが完全に分離されて検出され、ＩＬＩＴＣで標識化されたＨＳＡのみの定量を容易に行えることがよく分かる。
【００３１】
（実験４）
各部が以下のような寸法および材料となっているとともに、化学発光検出セル４２にかえてＵＶ検出器４７を備えている以外は、図６に示すようなＵＶ分析装置３ａを用意した。
（コイル状流路１）
内径１００μｍ、外径２００μｍ、長さ２３０cm（検出部までの距離は２１０cm）の４フッ化エチレン樹脂製キャピラリーチューブ（ヤサカ工業株式会社製）を外径２ｍｍのロッドに巻き数105回で巻回したもの。
（キャリア供給路６１、サンプル供給路５１、導入路４１）
溶融シリカキャピラリーチューブ（内径７５μＭ、長さ１０ｃｍ、ＧＬ科学（株）製）
（三方弁７）
ポリオレフィン系樹脂（サイゴン株式会社の商標Ｔｙｇｏｎ）からなる三方弁（内径０．１９ｍｍ、外径２．２０ｍｍ）
（ＵＶ検出器４７）
株式会社島津製作所製の液体クロマトグラフィー用ＵＶ検出器（SPD-6A）の検出セル部分を改造して使用
【００３２】
つぎに、以下のようなキャリア液をキャリア供給ポンプ６２に、サンプル溶液をサンプル供給ポンプ５２にそれぞれ充填し、１μLのサンプル液をキャリア液が満たされたコイル状流路１の入口に充填したのち、キャリア供給ポンプ６２からキャリア液をコイル状流路１に２．０μL／ｍｉｎの流速で注入し、サンプル溶液をキャリア液とともに、ＵＶ検出器４７に送り、２９０ｎｍのＵＶの吸光分析を行った。その結果、図７に示すような吸光度曲線が得られた。
【００３３】
（キャリア液Ｂ）
水とアセトニトリルとを容量比で２：８の割合で混合したもの
（サンプル溶液Ｂ）
1-ナフトールを8.33×10-5 mol/L、2,6-ナフタレンジスルホン酸二ナトリウムを3.33×10-4 mol/Lそれぞれ含む混合溶液
【００３４】
（実験５）
キャリア液の注入流速を１．０μL／ｍｉｎとした以外は、上記実験４と同様にして吸光分析を行ったところ、図８に示すような吸光度曲線が得られた。
【００３５】
（実験６）
サンプル溶液Ｂに代えて以下に示すサンプル溶液Ｃを用いた以外は、上記実験４と同様にして吸光分析を行ったところ、図９に示すような吸光度曲線が得られた。
（サンプル溶液Ｃ）
1-ナフトールを8.33×10-4 mol/L、2,6-ナフタレンジスルホン酸二ナトリウムを3.33×10-4 mol/Lそれぞれ含む混合溶液
【００３６】
（実験７）
コイル状流路１に代えて直線状にした内径１００μｍ、外径２００μｍ、長さ２３０cm（検出部までの距離は２１０cm）の４フッ化エチレン樹脂製キャピラリーチューブ（ヤサカ工業株式会社製）を用いた以外は、上記実験４と同様にして吸光分析を行ったところ、図１０に示すような吸光度曲線が得られた。
【００３７】
図７〜９から、実験４〜６のように、コイル状流路１を用いれば、まず、1-ナフトールが検出され、続いて2,6-ナフタレンジスルホン酸二ナトリウムが検出されるのに対し、実験７のように直線のチューブを用いた場合、図１０に示すように、1-ナフトールと2,6-ナフタレンジスルホン酸二ナトリウムとが分離されず１つのピークとして検出されることがわかる。
【００３８】
また、図７と図８とを対比させると、図８の方がピークがうまく分かれて検出されている。したがって、実験５のように流速を遅くすれば、より分離がうまく行えると思われる。
さらに、図７と図９とを対比させると、1-ナフトールの濃度が高い図９の方が1-ナフトールのピークが高くなっている。したがって、定性だけでなく定量も可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明にかかる物質の分離方法は、コイル状流路の中で、移動距離に差が生じる物性のものであれば分離が可能になる。実施例で示した標識剤と標識化合物が分離できれば、標識反応について反応速度、結合定数、結合比などを求めることができる。同じように、高分子材料とその添加剤との分離、高分子反応におけるモノマーと重合分子の分離、基質と酵素の分離、抗原と抗原-抗体複合体の分離、高分子化合物（多糖、核酸、タンパク質などの生体高分子も含む）の分解反応における各種分解生成物の分離などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明にかかる物質の分離方法に用いるコイル状流路の１例をあらわす斜視図である。
【図２】本発明にかかる物質の分離方法を用いた化学発光分析装置の１例をあらわす概略図である。
【図３】実験１で求められた検出結果をあらわすグラフである。
【図４】実験２で求められた検出結果をあらわすグラフである。
【図５】実験３で求められた検出結果をあらわすグラフである。
【図６】本発明にかかる物質の分離方法を用いたＵＶ吸光分析装置の１例をあらわす概略図である。
【図７】実験４で求められた検出結果をあらわすグラフである。
【図８】実験５で求められた検出結果をあらわすグラフである。
【図９】実験６で求められた検出結果をあらわすグラフである。
【図１０】実験７で求められた検出結果をあらわすグラフである。
【符号の説明】
【００４１】
１  コイル状流路
【図１】
2006266773.tif 000003
【図２】
2006266773.tif 000004
【図３】
2006266773.tif 000005
【図４】
2006266773.tif 000006
【図５】
2006266773.tif 000007
【図６】
2006266773.tif 000008
【図７】
2006266773.tif 000009
【図８】
2006266773.tif 000010
【図９】
2006266773.tif 000011
【図１０】
2006266773.tif 000012