(57)【要約】      （修正有）【課題】メタン発酵微生物系においてメタン生成に関連する主要な微生物の動態解析に好適な定量検出手段になるヌクレオチドプライマーおよびそれらを用いたメタン発酵微生物系の評価法、さらにはその安定運転のために微生物動態をモニタリングおよび制御するのに役立つ指標を提供する。【解決手段】メタン発酵微生物系における微生物処理活性を評価する方法であって、メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、特定のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCR法を行うことにより、該メタン発酵微生物系においてメタン生成に関与する菌群を検出すること含む評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン生成菌を属または科レベルでターゲットとする下記（ａ）〜（ｅ）に記載のいずれか１組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：
（ａ）Methanosarcina属の菌群を検出するための配列番号１の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）Methanosaetaceae科の菌群を検出するための配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｃ）Methanomicrobiaceae科のMethanoculleus属およびMethanogenium属の菌群を検出するための配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｄ）Methanomicrobiales目のMethanospirillaceae科の菌群を検出するための配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；および
（ｅ）Methanobacteriaceae科の菌群を検出するための配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
セルロース分解酸生成菌を種レベルでターゲットとする下記（ｆ）又は（ｇ）に記載のいずれか１組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：
（ｆ）Clostridium  sp. JC3株を検出するための配列番号１１の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；および
（ｇ）Clostridium  sp. JC94株を検出するための配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
メタン発酵微生物系における微生物処理活性を評価する方法であって、メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、請求項１又は２に記載の少なくとも１組のプライマーセットを使用してPCR法を行うことにより、該メタン発酵微生物系においてメタン生成に関与する菌群を検出することを含む評価方法。
【請求項４】
メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、請求項１に記載の少なくとも１組のプライマーセットを使用してPCR法を行い、該メタン発酵微生物系における所定のメタン生成菌群の優占状況を調べることにより、メタン生成能を評価することを含む、請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
請求項１に記載の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のメタン生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすることによりメタン生成効率を予測することを含む、請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料から、Clostridium sp. JC3株の16S rRNA（配列番号１５、１６または１７）および／またはその近縁株Clostridium  sp. JC94株の16S rRNA（配列番号１４）に対して少なくとも90％の相同性を持つ16S rRNA遺伝子を検出して該メタン発酵微生物系における前記セルロース分解酸生成菌群の優占状況を調べることにより、セルロース分解能を評価することを含む、請求項３に記載の評価方法。
【請求項７】
メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、請求項２に記載の少なくとも１組のプライマーセットを使用してPCR法を行い、所定のセルロース分解酸生成菌群の菌濃度および／または活性を測定することにより、セルロース分解能を評価することを含む、請求項６に記載の評価方法。
【請求項８】
請求項２に記載の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のセルロース分解酸生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすることにより、セルロース分解効率を予測することを含む、請求項６に記載の評価方法。
【請求項９】
メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、請求項１に記載の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のメタン生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすること；請求項２に記載の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のセルロース分解酸生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすること；および、前記２つのモニタリング結果に基づいて該メタン発酵微生物系におけるセルロース分解効率とメタン生成効率との間のバランスを評価することにより、該メタン発酵微生物系の安定性を予測することを含む、請求項３に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵微生物系における微生物処理活性、特にメタン生成能およびセルロース分解能等を評価する方法であって、一連のメタン生成反応に関与する一定の菌群をターゲットとするヌクレオチドプライマーを用いる評価方法に関する。より詳しくは、それら嫌気性処理系において所定のメタン生成菌および酸生成菌群集の動態をモニタリングする方法およびその制御に有用な管理指標に関する。
【背景技術】
【０００２】
高濃度の有機性廃棄物や廃水等を含有する排水や有機性汚泥の処理には、従来から嫌気性処理方式（メタン発酵）が多用されている。この方式は曝気動力が不要なのでエネルギー消費量が節約できること、余剰汚泥の発生量が少ないので処理費用が廉価であること、かつエネルギーとして有用なメタンガスを回収できることなどの利点がある。
【０００３】
メタン発酵は、大きく分けて3つのステップ：(1)高分子の有機物を可溶化する過程、(2)可溶化された有機物を酸発酵する過程、(3)メタン生成過程に様々な微生物が関与する複雑な生物反応系である。なお本願では、この生物反応系を「メタン発酵微生物系」と称するが、「メタン発酵系」、「嫌気性処理系」または単に「処理系」とも記す。
【０００４】
メタン発酵微生物系においてはメタン生成に関与する微生物（メタン生成菌、酸生成菌）の活性または菌濃度が最終的なメタン発生速度・量を決定する重要な因子である。例えば、有機物負荷が高くなると、メタン発酵汚泥中に有機酸の蓄積が生じ、バイオガス生成の安定性が失われる。
【０００５】
さらに、固体状有機性廃棄物のメタン発酵においては、セルロース等の高分子の有機物を可溶化する工程が律速になって、メタン発酵が十分に進まない場合が多く、高分子有機物の低分子化に関与する微生物（酸生成菌）の活性または菌濃度も、メタン生成に関与する微生物の活性と共に、最終的なメタン発生速度・量を決定する重要な因子である。従って、高効率且つ安定なメタン発酵プロセスを開発するためには、酸生成菌とメタン生成菌の菌数と活性のモニタリングおよび制御方法の導入が必要である。
【０００６】
メタン生成に関与する微生物の定量検出方法は、以下のようなものが知られている。
【０００７】
菌数の測定には、昔から培養を基本とする最確数法（Most  Probably  Number,  MPN法）などが用いられるが、嫌気性微生物、特にメタン生成菌は生育が遅いため、計数までに１ヶ月を要する。しかも、寒天培地で生育可能な細菌の割合は、汚泥等環境試料の場合、存在している全菌の1％以下にすぎないと言われており、培養できない細菌については、存在していても検出することができない。このため、メタン発酵の微生物の共生システムにおける微生物の種類、役割、相互の影響、数量的関係、消長などの知見は極めて乏しい。
【０００８】
また、生物反応系環境試料中のメタン生成活性を定量するために、メタン生成菌が持つ自家蛍光を持つ補酵素F420の蛍光強度を測定することも試みられている。しかし、F420を持つメタン生成菌の種類が限られていて、必ずしも総括的なメタン生成活性を表すことができない、また夾雑物の影響を受けやすいなどの問題がある。
【０００９】
近年、分子生物学的手法を利用した微生物の検出法が発達してきた。例えば、目的の細菌遺伝子配列の特異的な部分に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを作製し、これに蛍光色素をつけたDNAプローブを細胞内でハイブリダイゼーションするFISH（fluorescent in situ hybridization）法（非特許文献１参照）や、RNaseHとDNAプローブを利用したSSU（small subunit）rRNA酵素切断法（非特許文献２）、微生物遺伝子に特異的なプライマーを使用した定量PCR（polymerase chain reaction）法（非特許文献３）等によれば、標的の細菌を培養せずに環境試料から定量検出することができる。
【００１０】
先ず、FISH法では、2〜3種類の蛍光色素を別々のDNAプローブにつけ、同一試料にハイブリダイズさせることにより、同一視野で色素別に標的細菌を検出することができる。しかし、試料の準備から測定完成までの操作が煩雑であり、定量には蛍光顕微鏡を用いて複数視野を計数して平均値を算出することが必要であるため、標的細菌の種類が増えると、労力と時間が非常にかかることが問題である。また、この方法は細胞内RNAをターゲットとしているため、プローブの細胞浸入効率により検出感度が影響され易い。
【００１１】
また、微生物活性の定量法として、最近RNaseHとDNAプローブを利用したSSU（small subunit）rRNA切断法も開発されている。この方法は短時間で簡単に試料中の全菌16S rRNAに対する特異菌群の割合が定量検出できる。しかし、この方法はPCRで増幅せずに直接試料中の16S rRNAを測定するため、検出感度が低く、少量しか存在しない菌群の定量には適用不能である。
【００１２】
一方、PCR法はDNA鎖の特定部位のみを繰返し複製する反応で、微量のDNAを106倍程度まで増幅できる。PCR法により少量しか存在しない菌群の定量検出も可能である。さらに、PCRの第1回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、16S rRNA, mRNA 等のRNAからのcDNA増幅も行える。すなわち、本法では同じプライマーセットで特定微生物の菌数および発現している遺伝子を定量することにより活性の定量が可能である。PCR法により微生物DNAまたはRNAの定量測定には、競合PCR法とリアルタイムPCR法が挙げられる。競合PCR法は、微生物DNA試料の特異的なPCR増幅産物と内部標準DNA試料の競合PCR増幅産物の量をアガロース電気泳動法によって比較して、目的の微生物DNA量を測定する方法であり、内部標準の作製など操作が煩雑で、時間も掛かる欠点がある。これに対して、リアルタイム定量PCR法は試料の準備から測定、データ解析まで操作が簡単で、短時間で多量検体の測定が可能であるため、応用範囲が広い。
【００１３】
メタン発酵プロセスの操作パラメータの変化が、酸生成菌群とメタン生成菌群のポピュレーションや有機物の酸発酵・メタン発酵効率に及ぼす影響を把握するため、優占酸生成菌群とメタン生成菌群のモニタリング技術の開発が必要になる。
【００１４】
メタン生成菌群集構造を網羅的に且つ総括的に把握するのに有用な検出法や、高温メタン発酵系におけるMethanobacterium属菌にターゲットしたプライマーセットも開発されている（特許文献１、特許文献３）。しかし、これらのPCR増幅産物サイズは900bp以上であり、定量PCR測定機器（適用範囲100〜700bp）に適用できない。
【００１５】
メタン生成菌群は古細菌に属する。現在分離されているメタン生成菌は5目10科25属74種あり、古細菌のなかで最も多様である。有機性廃棄物の嫌気性処理リアクタ中における主なメタン生成菌を基質利用性により大きく分けると、下記(1)および(2)の2種類が挙げられる。それら菌群を網羅的に定量評価することによる嫌気性リアクタのメタン生成効率の評価する方法が考えられる。
(1)水素またはギ酸を資化するMethanobacteriales目菌（Methanobacterium科、Methanobrevibacter科等）、Methanomicrobiales目菌（Methanomicrobiaceae科、Methanocorpusculaceae科、Methanospirillaceae科等）
(2)酢酸やメチル化合物等を資化するMethanosarcinales目菌（Methanosarcinaceae科、Methanosaetaceae科等）
しかしながら、水素、ギ酸資化性メタン生成菌のうち、Methanobacteriales目菌とMethanomicrobiales目菌では16S rRNAの塩基配列や細胞壁、細胞膜脂質構造が大きく違い、生育環境（抗生物質の抵抗性、プロテアーゼの耐性、浸透圧や機械的切断力の耐性、SDSに対する溶解性等）や生理学的な特徴と複合微生物系における動態も大きく異なる（非特許文献４）。このため、これらの生態関係の調査と制御方法を見出すため、個別に定量検出することが必要である。
【００１６】
また、酢酸資化性メタン生成菌に関しては、Methanosarcinaceae科、Methanosaetaceae科に属する菌群しか知られていない。Methanosaetaceae科の菌群は酢酸のみを基質として利用し、酢酸の親和性が高く、酢酸濃度が低いUASB型リアクタ中において酢酸からメタン生成に主要な役割を演じているが、生育速度が非常に遅いため、有機物負荷が高くなる場合または水滞留時間（HRT）が短い完全混合型嫌気性処理系に定着し難く、生育速度の速いMethanosarcinaceae属の菌群に移行することが知られている（非特許文献５）。従って、これらの菌群のポピュレーション変動を把握するためにも、個別に定量検出する方法の開発が必要である。
【００１７】
メタン生成菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列をターゲットにしたFISH法用DNAプローブが開発されている（非特許文献６）。これらのプローブを用いて、Methanobacteriaceae科菌、Methanomicrobiales目菌、Methanosarcinales目菌またはMethanosarcina属およびMethanosaeta属の検出ができる。ここで、これらのグループに特異的なプローブと全菌の網羅的なオリゴヌクレオチドのプライマーセットを利用した定量PCR法でMethanosarcinales目菌とMethanomicrobiaceae科菌のメタン発酵槽における群集変化を調べる方法も試みられている（非特許文献７）。しかし、塩基配列解析ソフト（MacVector）でプライマーセットをテストした結果、これらのプライマーセットがターゲット菌群の全体を網羅することはできず、一方でターゲット菌群以外の非特異的な増幅が起こることが分かった。
【００１８】
また、Methanosarcina属およびMethanosaeta属を含むMethanosarcinales目菌をターゲットとした定量PCRプライマーも開発されている（非特許文献３）が、このうちのMethanosaeta属菌を特異的に検出するため、さらにその特異的なプローブとの併用が必要になる。
【００１９】
メタン生成菌の基質を提供する酸生成菌は主に真正菌群に属する菌群である。有機物の高温嫌気性処理系において優占化するセルロース分解酸生成菌Clostridium  sp. JC3株（16S rRNA遺伝子Accession  No.AB093546、セルラーゼ遺伝子cbhA  Accession No. AB093547）の同定と検出に成功した（非特許文献８）。最近、高温メタン発酵汚泥からセルロース分解細菌Clostridium sp. JC3株（以下「JC3株」とも記す）の16S rRNA遺伝子の塩基配列と94％の相同性を持つClostridium sp. EBA02E-0045（16S rRNA遺伝子Accession No. AB186359）菌株も報告されている。セルロース系廃棄物の嫌気性処理系におけるJC3株とその近縁株の優占度変化とセルロース分解およびメタン生成効率の相関性を把握、制御するため、これらの菌群を個別に定量検出することも望ましい。JC3株をPCR法により検出する方法が開発されている(特許文献２)。しかし、そのPCR増幅産物サイズが819bpまたは1022bpで、リアルタイム定量PCR測定機器（100〜700bp）に適用することができない。
【非特許文献１】R.I.Amman, L. Krumholz and D.A.Stahl: Fluorescent-oligonucleotide probong of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology, J.Bacteriol., 172, 762-770, 1990
【非特許文献２】上野ら、Sequence-Specific  Cleavage  of Small-Subunit(SSU) rRNA with Oligonucleotides and Rnase H: a Rapid and Simple Approach to SSU rRNA-Based Quantitative Detection of Microorganisms, 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70(6), 3650-3663
【非特許文献３】Sawayama et al, Effect of Ammonium Addition on Methanogenic Community in a Fluidized Bed Anaerobic Digestion, J. Bioscience and Bioengineering, 97(1), 65-70, 2004
【非特許文献４】古賀洋介ら、古細菌の生物学、東京大学出版会、1998、ｐ258〜265
【非特許文献５】Bhatti  et al, Treatment Performance and Microbial Structure of a Granular Consortium Handling Methanolic Waste, J. Ferment. Bioeng., 76(3), 218-223, 1993
【非特許文献６】Raskin  et al, Group-Specific 16S rRNA Hybridization Probes To Describe Natural Communities of Methanogens, Applied and Environmental Microbiology, Vol 60, No.4, 1232-1240
【非特許文献７】岩倉ら、メタン発酵槽における負荷変動とメタン生成菌群集の変化、第41回下水道研究発表会講演集、p200-202
【非特許文献８】長屋ら、高温メタン発酵系における優占セルロース分解細菌の同定と検出、、第37回日本水環境学会年会講演集、p282
【非特許文献９】David R. Boone  et al, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1, p269-273
【特許文献１】特開2004-261124号公報  宮  晶子ら、メタン生成菌を検出するためのプライマーおよびそれを用いた検出方法等
【特許文献２】特開2004-261125号公報、長屋ら、環境試料のセルロース分解能の評価方法およびその為のオリゴヌクレオチド
【特許文献３】特開2005−245287号公報  宮  晶子ら、メタン発酵微生物系の診断方法およびプライマー
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従来、複雑なメタン発酵微生物系の運転管理は、熟練したオペレーターの経験に頼っており、一旦、メタン生成が悪化すると原因の特定が難しく、回復するまでに長期間を要するという問題があった。高効率且つ安定なメタン発酵プロセスを開発するためには、酸生成菌とメタン生成菌の菌数と活性のモニタリングおよび制御方法の導入が必要であるが、そのためにはメタン生成に関与する微生物群を個別に定量検出し、さらにそれらの動態と実際の系状態との相関性等を検討しなければならない。
【００２１】
しかしながら、従来の検出方法は、上記の目的を達成するためには充分対応していない。微生物処理系のモニタリングや制御に必要な指標や方法論を確立するのには検討の余地が多々残されている。
【００２２】
本発明の目的は、メタン発酵微生物系においてメタン生成に関連する主要な微生物の動態解析に好適な定量検出手段になるヌクレオチドプライマー、およびそれらを用いたPCR法に基づくメタン発酵微生物系の評価法を提供すること、さらには、メタン発酵微生物系の安定運転のために微生物動態をモニタリングおよび制御するのに役立つ運転管理指標を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、有機性廃棄物・廃水のようなメタン発酵微生物系においてメタン生成に関連する主要な菌群を検出するためのプライマーを見出し、さらにそれらを用いたメタン発酵微生物系の評価方法および制御方法を知得し、本発明を完成させた。
【００２４】
すなわち、本発明は、メタン生成菌を属または科レベルでターゲットとする下記（ａ）〜（ｅ）に記載のいずれか１組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：
（ａ）Methanosarcina属の菌群を検出するための配列番号１の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）Methanosaetaceae科の菌群を検出するための配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｃ）Methanomicrobiaceae科のMethanoculleus属およびMethanogenium属の菌群を検出するための配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｄ）Methanomicrobiales目のMethanospirillaceae科の菌群を検出するための配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；および
（ｅ）Methanobacteriaceae科の菌群を検出するための配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１０の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
を提供する。
【００２５】
また本発明は、セルロース分解酸生成菌を種レベルでターゲットとする下記（ｆ）又は（ｇ）に記載のいずれか１組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：
（ｆ）Clostridium  sp. JC3株を検出するための配列番号１１の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；および
（ｇ）Clostridium  sp. JC94株を検出するための配列番号１３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
を提供する。
【００２６】
本発明は他の側面において、メタン発酵微生物系における微生物処理活性を評価する方法であって、メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、前記（ａ）〜（ｇ）の少なくとも１組のプライマーセットを使用してPCR法を行うことにより、該メタン発酵微生物系においてメタン生成に関与する菌群を検出することを含む評価方法を提供する。
【００２７】
本発明の評価方法の一態様は、メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、前記（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１組のプライマーセットを使用してPCR法を行い、該メタン発酵微生物系における所定のメタン生成菌群の優占状況を調べることにより、メタン生成能を評価することを含む。
【００２８】
本発明の評価方法の他の態様は、前記（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のメタン生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすることによりメタン生成効率を予測することを含む。
【００２９】
本発明の評価方法のさらに他の態様は、メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料から、Clostridium sp. JC3株の16S rRNA（配列番号１５、１６または１７）および／またはその近縁株Clostridium  sp. JC94株の16S rRNA（配列番号１４）に対して少なくとも90％の相同性を持つ16S rRNA遺伝子を検出して該メタン発酵微生物系における前記セルロース分解酸生成菌群の優占状況を調べることにより、セルロース分解能を評価することを含む。
【００３０】
本発明の評価方法のさらに他の態様は、メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、前記（ｆ）または（ｇ）の少なくとも１組のプライマーセットを使用してPCR法を行い、所定のセルロース分解酸生成菌群の菌濃度および／または活性を測定することにより、セルロース分解能を評価することを含む。
【００３１】
本発明の評価方法のさらに他の態様は、前記（ｆ）または（ｇ）の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のセルロース分解酸生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすることにより、セルロース分解効率を予測することを含む。
【００３２】
本発明の評価方法のさらに他の態様は、メタン発酵微生物系からサンプリングされた核酸試料を対象にして、前記（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のメタン生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすること；前記（ｆ）または（ｇ）の少なくとも１組のプライマーセットを使用して定量PCR法を行い、所定のセルロース分解酸生成菌群の菌濃度および／または活性を経時的にモニタリングすること；および、前記２つのモニタリング結果に基づいて該メタン発酵微生物系におけるセルロース分解効率とメタン生成効率との間のバランスを評価することにより、該メタン発酵微生物系の安定性を予測することを含む。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、メタン発酵微生物系におけるメタン生成反応に関連する主要なメタン生成菌または酸生成菌群集を属、科ないし種レベルで選択的に検出することができるヌクレオチドプライマーを提供する。それら一連のプライマーを使用することにより、メタン生成変動に影響を与える主要な細菌の菌数動態を調べ、好ましくはそれらを定量検出して菌数動態を経時的に把握し、その結果からメタン発酵微生物系の状態を評価したり、系状態の変動を予測したりすることができる。
【００３４】
特に後述の実施例で実証されるように、所定のメタン生成菌および酸生成菌群の菌数動態をモニタリングすることにより、それらの経時的動態と処理系の微生物活性（例えば、メタン発酵微生物系からのガス発生量）の変化との間の一定の相関性を知ることができる。本発明は、メタン生成菌および酸生成菌群の菌数動態に基づいてメタン発酵微生物系の安定運転を管理・制御するための指標、すなわち、一定の処理系におけるメタン生成活性についての基礎的な能力評価あるいはその状態変動を予測可能にする指標として有用な典型的な菌数動態情報を提供する。また、本発明のプライマーを用いてＲＮＡからのｃＤＮＡ増幅を行って遺伝子の発現量（ＲＮＡ量またはｃＤＮＡ量）を定量検出することにより各菌群の活動レベルをモニタリングすることができる。これにより、系内の菌数（ＤＮＡ量）の変動の如何に関わらず微生物処理活性を評価することが可能となる。
【発明の好ましい実施の形態】
【００３５】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３６】
本発明の好ましい実施の形態は、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在するメタン生成に関連する細菌に由来する16S ｒRNA遺伝子を鋳型とするPCR法を行い、ここで所定のプライマーセットを使用することにより、種、属ないし科の範囲でターゲットとされる菌群を選択的に定量検出する工程を含む、メタン発酵微生物系の微生物処理活性の評価およびモニタリング方法である。
【００３７】
本願明細書に使用される「属または科レベルでターゲットとする」および「種レベルでターゲットとする」という表現は、所定の種、属ないし科に分類される菌群を特異的に検出することを意図する。ここで「特異的」という用語は、検出対象の範囲が、所定の種、属ないし科に分類される菌群のターゲットDNAまたはRNAに対して包括性を有し、他の種、属ないし科の対応DNAまたはRNAに対して充分な排他性を有することを意味する。ただし、それら包括性および排他性は、完全な包括性および排他性を意味するものではなく、本法の有用性を損なわない程度の実質的な包括性および排他性を意味する。
【００３８】
本願明細書に使用される「微生物処理活性」とは、メタン発酵微生物系においてメタン生成反応に関与する嫌気性菌群の活動レベルのことであり、メタン生成に直接関与するメタン生成菌のメタン生成能のみならず、メタン生成菌に基質を提供する酸生成菌のセルロース分解能も含む概念である。
【００３９】
本願明細書に使用される「菌数動態」とは、一定のメタン発酵微生物系から検出される関連菌群の菌数の経時的な変動またはその傾向を意味する。また「菌数」は、PCR法の検出結果を考察する場合には簡便に「菌群濃度」または「菌濃度」としても言及される。これらは一般に「菌数」と正の相関関係にあり、特にターゲットRNAのコピー数/菌体を考慮に入れることで同義に用いられる。
【００４０】
本法による第１の検出法は、メタン生成菌のうち、水素資化性メタン生成菌であるMethanobacteriaceae科、Methanoculleus属、Methanogenium属またはMethanospirillaceae科に分類される細菌、あるいは酢酸資化性メタン生成菌であるMethanosarcina属またはMethanosaetaceae科に分類される所定の菌群をターゲットとする。この目的でPCR法に使用されるプライマーセット（ａ）〜（ｅ）は、所定のPCR条件下で、所定の菌群に由来するいずれかの16S rRNA遺伝子にアニールできるが、それと同一の条件下では、真正細菌およびその他のメタン生成菌由来の16S rRNA遺伝子にはアニールしない塩基配列を有するように設計されており、それぞれ企図された特異性を有する。
【００４１】
本法による第２の検出法は、メタン発酵微生物系中で優占化しセルロースの分解に深く関与する真正細菌の種をターゲットとする。具体的には、前記菌種の代表株であるClostridium sp. JC3株の16S rRNA（配列番号１５、１６および／または１７）および／またはその近縁株Clostridium  sp. JC94株（以下「JC94株」とも記す）の16S rRNA（配列番号１４）に対して少なくとも90％の相同性を持つ16S rRNA遺伝子を検出することが企図される。この目的でPCR法に使用される2つのプライマーセット（ｆ）および（ｇ）は、所定のPCR条件下で、JC3株およびJC94株に由来する16S rRNA遺伝子にそれぞれアニールできるが、それと同一の条件下ではその他の真正細菌およびメタン生成菌由来の16S rDNA遺伝子にはアニールしない塩基配列を有するように設計されており、それぞれ企図された特異性を有する。
【００４２】
本検出法によれば、上記の菌群の16S rDNAを定量検出することにより、各菌群の優占度やバランス関係を把握でき、それら菌数動態に基づいてメタン生成活性およびセルロース分解活性をそれぞれ独立に評価できる。さらに第１の検出法において各メタン生成菌群の16S rRNAを逆転写PCR法（RT-PCR）を使用して定量検出することにより、各菌群のメタン生成活性をモニタリングできる。
【００４３】
例えば、メタン生成菌の定量検出法を用いて、先ず有機物の嫌気性処理系において優占化しているメタン生成菌群に対する診断を行い、次いで、検出された菌群の特徴（それらの菌学的または生理学的特性や栄養因子の要求性等）を考慮した制御を行うことができ、これにより安定な嫌気性処理が可能となる。
【００４４】
また、所定菌群の菌数や活性の変動をモニタリングすることにより、連続処理系の限界負荷や、原水（高負荷の廃棄物を含み嫌気性処理される排水）由来の阻害因子の存在を予測できる。これによりバイオガス生成量やpH等の従来の管理パラメータを使用する場合よりも早くメタン発酵系の不安定性化を回避するための対処が可能となる。
【００４５】
本発明のプライマーがターゲットとする菌群の動態に基づく評価または制御法は、各菌群の下記のような生理学的または菌学的特徴と関連付けて利用される。
【００４６】
水素資化性メタン生成菌であるMethanomicrobiales目の細菌（Methanoculleus属、Methanogenium属、Methanospirillaceae科等）の細胞表層は単純蛋白質または糖蛋白質であるS-レイヤーで構成されている。これらの表層構造は細胞内外の浸透圧の差に対して細胞構造を守る力が弱く、浸透圧ショックで細胞が容易に破裂したり、機械的剪断力に弱かったり、SDSのような界面活性剤によって可溶化されるという特徴を持つ（非特許文献４参照）。この特徴に基づき、Methanomicrobiales目細菌の菌数の減少をメタン発酵系がダメージを受けていることを示す指標として利用できる。また、この目の細菌の生育には酢酸、酵母エキス、コエンザイムM、ペプトン、塩化ナトリウム等が必要であるため、メタン発酵系内で菌数の減少が始まった場合に栄養因子の補充が必要になると考えられる。
【００４７】
一方、Methanobacteriales目のメタン生成菌は、嫌気性処理系に幅広く存在している。この目の細菌の細胞壁を構成するシュードムレインは、糖鎖とペプチドの結合した化合物で、ペニシリン、D-シクロセリン、バンコマイシンなどの細胞壁抗生物質に抵抗性がある。また、リゾチームや通常のプロテアーゼによって加水分解されない。これらの細菌はエネルギー源である水素が欠乏すると急速に自己溶菌する（非特許文献４参照）。嫌気性処理系におけるMethanobacteriales目細菌の菌数の減少は、有機物の水素生成酸生成活性が減少したことを示す指標として利用できる。また、水素分圧が高い有機物嫌気性処理系では、Methanobacteriales目細菌の菌数が一定になるが、本発明のプライマーを利用してその16S rRNA量の変化から処理系の水素資化性メタン生成活性を評価できる。
【００４８】
メタン発酵微生物系の嫌気性消化槽で生成されるメタンの70％は、酢酸に由来すると言われる。酢酸資化性メタン生成菌としてはMethanosaetaceae科とMethanosarcina属細菌のみが知られている。Methanosaetaceae科細菌は酢酸だけを利用して、生育する。酢酸との親和性が高く、増殖速度が遅い特徴があり、酢酸濃度が低く（<1-3mM、60-180mg/L）、pHが高い(>7)、水滞留時間（HRT）が長い条件の処理系で生育する。有機物負荷が高く（HRTが短く）、酢酸濃度が高く、pH<7という条件下では、Methanosarcina属細菌が優占化することが知られている（非特許文献９参照）。この属細菌は小塊状の集合体を形成して増殖する。集合体の外壁は高塩濃度特に二価カチオン塩で溶解する。その結果、ばらばらになった菌体が系内から流出し易くなり、これが当該系においてメタン生成活性が低下する１つの理由となっている。また、Methanosarcina属細菌は酢酸以外にメチル化合物や水素/CO2等多様の基質を利用して生育できるため、水素と酢酸が混在する環境では水素を先に利用し、水素分圧が高い場合、酢酸の分解反応が抑制される。本発明のプライマーでの所定の菌群の検出により、嫌気性処理系において酢酸除去を担う細菌の移行過程および処理系内からの菌体の流出状況を把握することが可能になる。また、本発明のプライマーで菌群のRNAを定量することによって、その処理系における酢酸資化性メタン生成活性の評価も可能になる。
【００４９】
セルロース分解酸生成菌であるJC3株は、セルロース負荷が高い高温（55℃）有機性廃棄物の処理系では優占化していることが知られている（特許文献３および４参照）。さらに、最近の研究ではJC94株がJC3株と共存していることが分かった。これら細菌は両者ともセルロースの分解活性に関与するが、処理系における増殖状況、原水や生育環境の影響に対する耐性が違うことが本発明のプライマーを利用して調べた結果から明らかになった。JC94株およびJC3株の両者の嫌気性微生物系における菌数動態をモニタリングして、処理系全体のセルロース分解能の評価が可能になる。
【００５０】
次に、本発明の典型的な実施態様を示す。
【００５１】
第１の実施態様
本法の好ましい第１の実施態様では、上記のような所定のメタン生成菌群に特異的なプライマーを使用したPCR法によって、サンプリングした試料中の16S rDNA上のターゲット領域を増幅し、その増幅産物を解析することにより各種廃棄物の嫌気性処理微生物系におけるメタン生成菌群の優占状況を把握する。
【００５２】
この態様には下記のプライマーを使用でき、これらプライマーにより検出されるメタン生成菌の系統分布図を図１に示す。
（ａ）配列番号１（Msar276F 5' GAAACCGTGATAAGGGGACAC 3'）および配列番号２（Msar459R   5' CCGGAGGACTGACCAAA 3'）の各塩基配列からなる1組のオリゴヌクレオチドである。このプライマーセットによると、酢酸資化性メタン生成菌Methanosarcina属細菌16S rDNAの一部に対応する断片が選択的に増幅される。代表的なMethanosarcina mazei（Accession No.AY196685，16S rDNA全長塩基数約1262個）においては、5’末端側から数えた塩基位置で276番目〜459番目の領域に相当する184塩基数の断片が増幅される。
（ｂ）配列番号３（Msaeta377F 5' CGAGTGCCAGGTTACAAA 3'）および配列番号４（Msaeta 642R 5' GGATTACAAGATTTCACCCCTAC 3'）の各塩基配列からなる1組のオリゴヌクレオチドである。このプライマーセットによると、酢酸資化性メタン生成菌Methanosaetaceae科細菌16S rDNAの一部に対応する断片が選択的に増幅される。代表的なMethanosaeta concilii（Accession No.M59146，16S rDNA全長塩基数約1471個）においては、5’末端側から数えた塩基位置で377番目〜642番目の領域に相当する266塩基数の断片が増幅される。
（ｃ）配列番号５（Mcul 485F 5' GGGATACTGGCAATCTTGGAACC 3'）および配列番号６（Mcul 863R 5' CGGCAATCATTCTGCTGTCTTAT 3'）の各塩基配列からなる1組のオリゴヌクレオチドである。このプライマーセットによると、水素資化性メタン生成菌Methanoculleus属とMethanogenium属細菌16S rDNAの一部に対応する断片がそれぞれ選択的に増幅される。代表的なMethanoculleus bourgensis（Accession No.AY196674，16S rDNA全長塩基数約1255個）においては、5’末端側から数えた塩基位置で485番目〜863番目の領域に相当する379塩基数の断片が増幅される。
（ｄ）配列番号７（Msp203F 5' CGGAGATGGATTCTGAGACACG 3'）および配列番号８（Msp496R 5' ATACAGTTTCCCCTGAACGCCCRC 3'）の各塩基配列からなる1組のオリゴヌクレオチドである。このプライマーセットによると、水素資化性メタン生成菌Methanospirilliaceae科細菌16S rDNAの一部に対応する断片が選択的に増幅される。代表的なMethanospirillum hungetii（Accession No.AY196683，16S rDNA全長塩基数約1255個）においては、5’末端側から数えた塩基位置で203番目〜496番目の領域に相当する294塩基数の断片が増幅される。
（ｅ）配列番号９（Mtb674F 5' GATGTGGACTTGGTGTTGGGAT 3'）および配列番号１０（Mtb 944R 5' AGGGTTCCGCTGGTAACTAAGG 3'）の各塩基配列からなる1組のオリゴヌクレオチドである。このプライマーセットによると、水素資化性メタン生成菌Methanobacteriaceae科細菌16S rDNAの一部に対応する断片が選択的に増幅される。代表的なMethanothermobacter  thermoautotrophicus（Accession No.AY196661，16S rDNA全長塩基数約1265個）においては、5’末端側から数えた塩基位置で674番目〜944番目の領域に相当する321塩基数の断片が増幅される。
【００５３】
第２の実施態様
本法の好ましい第２の実施態様では、所定のセルロース分解菌（JC3株およびJC94株）にそれぞれ特異的なプライマーを使用したPCR法によって、サンプリングされた試料中の16S rDNA上のターゲット領域を増幅し、その増幅産物を解析することにより、各種廃棄物の嫌気性処理系におけるJC3株とJC94株の優占状況を把握できる。
【００５４】
この態様には、下記のプライマーを使用できる。
（ｆ）配列番号１１(JC3-76F 5’CGTTGGAGATGTAACCAGC 3’)および配列番号１２(JC3-687R 5’ACATCTGACTTGCTTCCC 3’)の各塩基配列からなる1組のオリゴヌクレオチドである。このプライマーセットによると、セルロース分解酸生成菌Clostridium  sp. JC3 株の16S rDNA（Accession No.AB093546，16S rDNA全長塩基数約1623個）においては、5’末端側から数えた塩基位置で76番目〜687番目の領域に相当する612塩基数の断片が増幅される。
（ｇ）配列番号１３(JC94-304F 5’CATAACGAGGTGGCATCACTTTG 3’)および配列番号１２(JC3-687R 5’ACATCTGACTTGCTTCCC 3’)の各塩基配列からなる1組のオリゴヌクレオチドである。このプライマーセットによると、セルロース分解酸生成菌Clostridium sp. JC94 cloneの16S rDNA（Accession No.AB231801、16S rDNA全長塩基数約1628個）においては、5’末端側から数
えた塩基位置で304番目〜705番目の領域に相当する402塩基数の断片が増幅される。
【００５５】
上記（ｆ）および（ｇ）のプライマーセットを用い、各種セルロース系廃棄物の高温メタン発酵汚泥におけるJC3株とJC94株の優占度を調べることができる。後述の実施例で示すように多くの高温（55℃）メタン発酵汚泥中ではJC3株の菌体濃度がJC94株より高いことが分かった。しかし、セルロースパウダーの集積培養体や古新聞の高温メタン発酵回分実験の汚泥では、JC94株が優占化する場合もあった。JC3株とJC94株のそれぞれの優占時期に汚泥のセルロース分解活性、酸生成活性またはメタン生成活性を調査することによって、セルロース分解活性に対するJC3株とJC94株の寄与度、およびそれらの複合微生物共生系における生育環境による影響を把握できる。
【００５６】
第３の実施態様
本発明のプライマーを用いて、有機性廃棄物の高温メタン発酵連続処理系や回分実験系におけるメタン生成菌等の動態解析を行うことができる。具体的には、その動態解析において、所定菌群の菌数動態と、メタン生成活性もしくは酸生成活性またはセルロース分解率などの発酵特性との間の相関性に関する知見を獲得する。後述の実施例で示すように菌群の濃度変化は、汚泥の種類（集積培養体、連続処理または回分処理）、原水の種類（廃棄物の種類、セルロース源の種類）などに依存して異なる動態をとる。本態様によれば、処理系の種類や条件に応じて適正な評価および運転管理を判断するための典型的な菌数動態の指標が提供される。
【００５７】
各処理系において菌群濃度の変化がメタン生成活性に有意に相関している菌群が制御すべき菌群として挙げられ、その菌群に関する生理学的または菌学的情報に基づきその処理系の安定運転の制御方法を見出すことができる。また、連続処理または回分実験の条件変動に依存するメタン生成菌および酸生成菌（セルロース分解酸生成菌等）の典型的な菌数変動に照らし合わせて、その処理系のメタン生成効率を評価することができる。
【００５８】
例えば、環境の変動を受けて菌体濃度変動が早いかまたは激しい菌群のRNAを定量検出し、その動態をモニタリングすることにより、メタン発酵効率が低減する前に処理活性の低下を予測することができる。一方、菌群濃度変動が小さいまたは激しくない菌群の動態をモニタリングすることによって、その処理系が持つ基礎的なメタン発酵効率を評価することができる。また、同じ機能を持つ2種類の菌群：JC94株およびJC3株が共存している微生物系において、それぞれの菌群濃度変動とメタン生成や酸生成活性の変動との相関性から、それら菌群のその処理系におけるメタン生成や酸生成能に対する寄与度を推測できる。
【００５９】
本発明のプライマーは競合PCR法またはリアルタイム定量PCR法に利用できる。後者の方は、操作が簡単であり、迅速的に多量な検体の定量検出ができるため、菌群濃度または活性のモニタリングに好適である。
【００６０】
また、定量PCR法によって得られた菌群濃度値は、ターゲット菌群の単位試料当たり外部標準検量用微生物16S rRNA遺伝子PCR増幅産物のコピー数で表される。原核生物の1菌体当たりの16S rRNA遺伝子コピー数については菌種によって異なり、1コピーを持つ菌種もあるし、15コピーまで持つ菌種もある。既知の微生物が持つ16S rRNA遺伝子のコピー数は当業者に知られており、例えば、The Ribosomal RNA Operon Copy Number Database (http://rrnd.cme.msu.edu)で検索できる。既知の原核生物の濃度は16S rRNA遺伝子コピー数を用いて補正できる。未知の原核生物に関する補正値は不明であっても、16S rRNA遺伝子コピー数の変動が菌濃度の変動と一定な相関関係があると考えられ、その平均的16S rRNA遺伝子コピー数は真正細菌で4コピー/細胞、メタン生成菌で2.5コピー/細胞であることも報告されている（非特許文献３参照）。
【００６１】
メタン発酵微生物系からの核酸試料のサンプリングは、公知の核酸抽出方法に従う。微生物DNAは安定性が高く、取り扱い易いため、冷凍保存した試料からの抽出も容易である。DNAの抽出方法としては一般的なフェノール/クロロホルム−エタノール沈殿法を利用でき、市販のDNA抽出用キットやDNA抽出装置を使用してもよい。微生物RNAは分解され易いため、新鮮試料採取後（24時間以内）からの抽出が望ましいが、市販のRNA安定剤を添加して、冷凍保存した試料からの抽出も可能である。また、逆転写PCR（Reverse transcription PCR; RT-PCR）法によりRNAをｃDNAに転写すると、DNA液として-８０℃で保存し、繰り返し溶解、凍結しても安定的にターゲット菌群の検出が可能になる。
【実施例１】
【００６２】
有機性廃棄物嫌気性処理系におけるメタン生成菌群の定量検出
各菌群のリアルタイムPCR法による定量検出には、Light Cycler-Faststart DNA  Master SYBR Green I(Roche No.2239264）DNA増幅キットとLight Cycler System  (Roche Diagnostics)を用い、使用するプライマーにそれぞれ最適化されたアニーリング温度、伸長反応時間とマグネシウム濃度条件下で行った。
【００６３】
各種の有機性廃棄物として、(1)生ごみとトイレットペーパー混合液（COD除去率57％、セルロース分解率95％、HRT30日）、(2)コーヒー粕粉砕物（COD除去率43％、セルロース分解率83％、HRT60日）または(3)古新聞と生ごみ混合液（COD除去率44％、セルロース分解率53％、HRT35日）の高温メタン発酵処理汚泥を用意した。サンプリングした汚泥(1)〜(3)から抽出した核酸試料を鋳型として、本発明のプライマーセット（ａ）〜（ｅ）を用いた定量PCRを行い、各プライマーセットによる増幅産物を電気泳動により同定した（図２）。
【００６４】
定量PCRの結果、検出されたメタン生成菌群の種類が多い順は(1)＞(2)＞(3)であった。プライマーセット（ａ）および（ｂ）での結果を対比すると、酢酸資化性メタン生成菌は、汚泥(1)と汚泥(3)ではMethanosarcina属菌しか検出できなかったが、HRTが長い汚泥(2)ではMethanosaetaceae科の菌も検出できた。プライマーセット（ｃ）〜（ｅ）の結果では、水素資化性メタン生成菌は、COD除去率、セルロース分解率とも高い汚泥(1)において多種類存在しているのに対し、汚泥(2)と汚泥(3)ではMethanomicrobiales目菌がほとんど存在しないことがわかった。この結果から、メタン生成菌の多様性の減少傾向と、汚泥の有機物除去活性、特にセルロース除去活性の低下傾向との間の相関性が示唆された。
【実施例２】
【００６５】
セルロース系廃棄物嫌気性処理系におけるセルロース分解菌の定量検出
JC3株とJC94株がそれぞれ優占化した汚泥試料を用意した。本発明のプライマーセット（ｆ）および（ｇ）を用いた定量PCRによりJC3株とJC94株が各汚泥試料から各菌を特異的に検出し、同定した結果を図３に示す。
【００６６】
さらに、各種セルロース系廃棄物の高温メタン発酵汚泥を対象として、プライマーセット（ｆ）および（ｇ）を用いて同様に定量PCRを行い、各汚泥におけるJC3株とJC94株の優占度を調べた（表１）。
【００６７】
【表１】
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この結果から、多くの汚泥中ではJC3株の菌体濃度がJC94株より高いことが分かった。しかし、セルロースパウダーの集積培養体や古新聞の高温メタン発酵回分実験の汚泥には、JC94株が優占化するものもあった。
【実施例３】
【００６８】
コーヒー粕の高温メタン発酵連続処理系におけるセルロース分解細菌およびメタン生成菌の動態解析
コーヒー粕高温メタン発酵連続処理実験は有効容積24Lの処理槽を用いて、55℃で4ヶ月間でHRT120日から40日への負荷上昇実験を行った。この負荷上昇実験の間、1回/週の頻度で汚泥をサンプリングし、本発明のプライマーを用いて、コーヒー粕の高温メタン発酵連続処理系におけるセルロース分解細菌およびメタン生成菌の動態解析を定量PCR法で行った。図４に、本発明のプライマーセット（ａ）、（ｃ）および（ｆ）を使用して検出したMethanosarcina属菌、Methanoculleus属菌およびJC3株の菌濃度変動のモニタリング結果を示す。
【００６９】
360〜420日目にかけてコーヒー粕原水の1日当りの投入量を200 mL、400 mL、600 mLと上げることによって、HRTはそれぞれ120日、60日、40日となった。この負荷の上昇につれてメタンガス発生量は徐々に増加したが、600 mL原水投入の開始からおよそ1週間後を境にガス発生量は低下した。有機物負荷の上昇につれて各菌濃度も上昇した。JC3株は、ガス発生量がピークに達する時点から起算してその10日後まで増加し、当初の1012コピー/Lから約1014コピー/Lに増加した。その後、ガス発生量の低下に伴い、JC3株の菌濃度も減少した。メタン生成菌の濃度変動とガス発生量の変動を比較してみると、ガス発生量が減少した1週間前からMethanoculleus属菌DNA濃度の減少が認められた。その後、ガス発生量の低下につれてMethanosarcina属菌の減少も観察された。この結果から、水素資化性メタン生成菌の減少はJC3株の生育に影響があることが示唆された。
【実施例４】
【００７０】
生ごみとトイレットペーパーの高温メタン発酵連続処理系におけるセルロース分解細菌およびメタン生成菌の動態解析
生ごみとトイレットペーパー混合液の高温メタン発酵処理実験は有効容積3.5L発酵槽を用い、55℃で行った。1日原水投入量100mLの負荷条件では（有機物負荷2.3ｇCODCr/L・日、HRT＝35日）半年以上にわたり安定な連続処理運転ができた。しかし、原水投入量が150mL/日の負荷条件になると（有機物負荷3.4ｇCODCr/L・日、HRT=23日）、有機酸の蓄積により汚泥のpHが下がり、メタン生成活性が不安定になる傾向が現れた。このメタン生成量の低減は、原水投入停止した後しばらくすると回復した。さらに、原水投入量250mL/日（有機物負荷5.6ｇCODCr/L・日、HRT＝14日）の高負荷条件で連続処理を行った場合、実験開始2週間後からバイオガス生成量が低減し始めた。このまま連続処理を続けた結果、汚泥中に有機酸が蓄積することにより汚泥のpHも下がり、バイオガス生成が完全に止まった。その後、原水投入を停止しても、バイオガスの生成は回復しなかった。
【００７１】
本発明のプライマーセット（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）を用いて、上記の不安定なメタン発酵系（原水投入量150mL/日）におけるMethanosarcina属菌（Msar）、Metahnoculleus属菌（Mcul）、Methanospirilliaceae科菌（Msp）、Methanobacteriaceae科菌（Mtb）、JC3株およびJC94株の菌群濃度をモニタリングした（図５）。
【００７２】
実験開始から2週間のメタン発酵期（I）には、ガス生成量が4300mL〜6000mL/日であり、各メタン生成菌群の菌濃度が安定または増加した。汚泥pHの低下と共に、バイオガスの生成量が減少したが、原水投入を停止することによって、回復した。しかし、回復後約1ヶ月間の連続処理期間中（IV）にメタン生成量が約4000mL〜3000mL/日に徐々に低減した。このとき原水投入停止期間（III）中に汚泥中に少量存在していたメタン生成菌群（Methanospirilliaceae科菌）が消えた。また、回復後発酵期（IV）においてもMethanosarcina属菌とMetahnoculleus属菌も徐々に減少する傾向が見られた。この結果は、このままこのような状態で連続処理を続ける場合にはバイオガスの生成が停止する傾向があることが予想されることを示す。
【００７３】
また、セルロース分解菌の動態を解析した結果からは、汚泥中でのJC3株の優占化が認められた。JC94株の菌体濃度は不安定であり、pHの低下（汚泥中における有機酸濃度の上昇）と同時に、JC94株の菌体濃度の増加が見られた。汚泥の酸生成活性とメタン生成活性のバランスが崩れたことが汚泥中に有機酸が蓄積した原因だと考えられ、JC94株の増加による過剰な酸生成も有機酸蓄積の１つの因子として考えられる。
【００７４】
さらに、高負荷なメタン発酵系（原水投入量250mL/日）における微生物の菌体濃度をモニタリングした（図６）。この高負荷処理系では、バイオガス生成が6000mLから8000mL/日の速度で2週間運転できたが、汚泥中のメタン生成菌群は実験開始から菌数の減少を起こすことが認められた。菌数の減少する速度は、Methanoculleus属菌＞Methanospirilliaceae科菌＝Methanosarcina属菌＞Methanobacteriales目菌の順であった。これら菌数の減少は、バイオガス生成能の低下を予期させる指標となる。従来の知見によると、汚泥のpHの低下がメタン生成活性低下の指標とされているが、本実施例のような菌数のモニタリングによってバイオガス生成能の低下を2〜3週間前に予測することができる。
【００７５】
また、セルロース分解菌JC94株の菌濃度はバイオガス生成量の低減と共に減少したが、JC3株の菌濃度はバイオガス生成量が低下する時期より1週間早く低下することが観察された。このように2種類のセルロース分解菌群を個別にモニタリングすることにより汚泥のセルロース分解能の低下をいち早く予測することが可能となった。
【実施例５】
【００７６】
古新聞の高温メタン発酵回分実験系におけるセルロース分解細菌濃度と酸生成特性の相関性調査
古新聞を2g/Lの最終濃度で125mLバイアル瓶に添加し、セルロースパウダーによる集積培養体を4.5mL植菌して、高温メタン発酵回分実験を約3週間行った。ガス組成はTCDガスクロマトグラフ（ジーエルサイエンス株式会社  GC-323）で分析した。
【００７７】
ガスクロマトグラフの操作条件は、ガスボンベ2次圧5kg・f /cm2、アルゴンガスCarrier圧力1.2 kg・f /cm2、カラム（Unibeads 60/80）温度150℃、極性マイナス、検出器（TCD）電流値50mAとした。揮発性有機酸（Volatile Fatty acids; VFA）測定は、サンプルを10000rpmで10分間遠心分離した後、上澄みを孔径0.8μmメンブレンフィルターで濾過したものを用いた。VFA濃度は高速液体クロマトグラフ（HPLC）で測定した。HPLCの操作条件は、溶離液0.1%リン酸溶液、溶離液流速0.7mL/分、カラムオーブン(Shodex OVENA0-30)温度60℃、検出器は高感度示差屈折計（SCI製ERC-7515A）とした。
【００７８】
本発明のプライマーセット（ｆ）および（ｇ）を用いて、古新聞の高温メタン発酵回分実験系におけるセルロース分解菌群の菌濃度と酸生成特性との間の相関性を解析した（図７）。図７において、汚泥の酸生成量は汚泥中における有機酸濃度とその日に生成した水素およびメタン量の合計とし、セルロース分解菌群濃度はJC3株とJC94株の菌濃度の合計として表している。酸生成量が多かったのはセルロース分解菌群、特にJC3株の菌数が最も高くなる時期であった。しかし、酸生成が止まった日（13日目）から、JC3株の菌濃度が著しく速い速度で減少したが、JC94株の菌濃度の減少幅は非常に小さかった。この結果から、JC3株を特異的にモニタリングすることにより汚泥の酸生成活性の評価ができることが示唆された。
【実施例６】
【００７９】
高負荷原水投入による生ごみとトイレットペーパー混合液の高温メタン発酵連続処理系におけるセルロース分解細菌およびメタン生成細菌の挙動および活性変動解析
生ごみとトイレットペーパー混合液の高温メタン発酵処理実験は有効容積3.5L発酵槽を用い、55℃で行った。一日原水投入量100mlの負荷条件（有機物負荷2.3ｇCODCr/L・日、HRT＝35日）で三日間運転した汚泥に250mlの原水を投入し、2時間間隔で発酵槽のガス生成量、ガス組成を測定し、槽内の汚泥をサンプリングし、揮発性有機酸組成分析および各種菌群のDNAとRNAの定量測定を行った。
【００８０】
ガス組成はTCDガスクロマトグラフ（ジーエルサイエンス株式会社  GC-323）で分析した。ガスクロマトグラフの操作条件は、ガスボンベ2次圧5kg・f /cm2、アルゴンガスCarrier圧力1.2 kg・f /cm2、カラム（ジーエルサイエンス株式会社Unibeads 60/80）温度150℃、極性マイナス、検出器（TCD）電流値50mAとした。
【００８１】
揮発性有機酸（Volatile Fatty acids; VFA）測定は、サンプルを10000rpmで10分間遠心分離した後、上澄みを0.8μmメンブレンフィルターで濾過したものを用いた。VFA濃度は高速液体クロマトグラフ（HPLC）で測定した。HPLCの操作条件は、溶離液0.1%リン酸溶液、溶離液流速0.7mL/分、カラムオーブン(ジーエルサイエンス株式会社、Shodex OVENA0-30)温度60℃、検出器は高感度示差屈折計（SCI製ERC-7515A）とした。
【００８２】
発酵槽汚泥のDNAをフェノール/クロロホルム法により抽出した。  RNAprotect Bacteria Reagent（Qiagen  No. 76506）による前処理した汚泥試料からRNeasy Mini Kit (Qiagen No.74106)を用いてRNAの抽出を行った。そのRNA抽出液をテンプレートとして用い、Transcriptor  First  Strand  cDNA  Synthesis  Kit（Roche  4379012）による汚泥試料のcDNAを逆転写した。これらの汚泥のDNAおよびcDNA液に対して、LightCycler-Faststart  DNA  Master  SYBR  Green  I（Roche  No.2239264）DNA増幅キットとLight Cycler System  (Roche Diagnostics)を用い、それぞれ最適化されたアニーリング温度、伸長反応時間とマグネシウム濃度条件下で、本発明のプライマーセット（ａ）（ｃ）(e)（ｆ）および（ｇ）を用いてリアルタイムPCR法による定量測定を行い、Methanosarcina属菌（Msar）、Metahnoculleus属菌（Mcul）、Methanobacteriaceae科菌（Mtb）、JC3株およびJC94株のＤＮＡおよびｃＤＮＡ量をモニタリングした（図８）。
【００８３】
250ml生ごみとトイレットペーパー原水を投入して12.2時間後にガス生成量が最も多く、その後徐徐に減少した。ガス中のメタン生成量も12.2時間後が最も多かった。汚泥のpHは12.2時間で7.0まで下がり、その後徐徐に7.5まで回復した。汚泥中の有機酸濃度は、10.2〜16.2時間の間に酢酸が1200〜1300mg/L、プロピオン酸が1900mg/Lであった。その後、酢酸濃度がガス生成と共に減少したが、プロピオン酸濃度が高いままであった。
【００８４】
原水投入後2時間間隔でサンプリングした汚泥試料の各微生物菌群の菌濃度（DNA濃度）を測定した結果、ガス生成量の増減変化との相関関係は認められなかった。しかし、各微生物菌群のRNA発現量（cDNA濃度）を測定した結果、セルロース分解菌JC94株、水素資化性メタン生成菌Methanobacteriaceaと酢酸資化性メタン生成菌Methanosarcinaがガス生成量の最も多い12.2時間にRNA発現量のピークが認められた。これらの結果から、RNAの定量検出は微生物菌体濃度（DNA濃度）の変動が小さく安定な汚泥のメタン生成活性に寄与する微生物群種の同定に有効な手段として利用できることが示唆された。
【実施例７】
【００８５】
コーヒー粕の高温メタン発酵連続処理系におけるセルロース分解細菌およびメタン生成細菌の挙動および活性変動解析
食品工場現地のコーヒー粕を原水として用い、二槽式連続処理装置（有効容積5Lの酸発酵槽と10Lのメタン発酵槽を含む）1系列で、高温メタン発酵連続処理実験を55℃、HRT67日〜50日の条件下に約4ヶ月間行った。毎日にメタン発酵槽のガス生成量を測定し、菌相解析用汚泥試料をサンプリングした。また、1回/週の頻度で発酵槽のガス組成および汚泥の揮発性有機酸濃度を測定した。本発明のプライマーセット（ａ）（ｃ）（ｄ）および（ｅ）を用いて、コーヒー粕の高温メタン発酵連続処理系におけるセルロース分解細菌およびメタン生成細菌のDNAおよびRNA（cDNA）濃度変化をリアルタイムPCR法によって調べた（図９）。
【００８６】
連続運転の全期間中に、メタン生成量とpHが安定であったが、水素分圧が一時的に高くなったことが観察された。また、汚泥中の揮発性有機酸特にプロピオン酸の増減と酢酸の蓄積が認められた。
【００８７】
HRT67日の運転期間中に、酢酸資化性メタン生成菌Methanosarcina（Msar）の菌濃度（DNA濃度）が10倍増えたことに対して、RNA濃度（cDNA濃度）は15倍の増加が認められた。HRT50日の期間中に、Msarの菌濃度がほぼ一定であったが、汚泥中のプロピオン酸の蓄積と同時にMsarのRNA濃度の増加が見られた、その後汚泥中の酢酸の蓄積時期と同じ時期にMsarのRNA濃度が減少したことも認められた。水素資化性メタン生成菌Methanoculleus(Mcul)、Methanobacteriaceae(Mtb)とMethanospirilliaceae（Msp）がそれぞれ一定な菌濃度で汚泥中に保持されたが、RNA濃度変化幅はMsp、Mcul、Mtbの順で大きかった。
【００８８】
これらの結果から、汚泥中のプロピオン酸の蓄積はMsarの活性に影響を与え、さらに、Msarの活性の低減が汚泥中の酢酸の蓄積に相関していることが示唆された。本発明の方法を用いて、メタン生成量と菌濃度が安定したメタン発酵系でも菌の活性をモニタリングすることが可能になり、メタン発酵系の安定性の喪失を引き起こす潜在的な危険因子（例えば有機酸の蓄積）を予測することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のプライマーセット（ａ）〜（ｅ）により検出されるメタン生成菌を含む系統分布図である。
【図２】各種廃棄物の嫌気性処理系におけるメタン生成菌の検出結果を示す電気泳動写真である。（実施例１）
【図３】セルロース分解酸生成細菌の特異的な検出結果を示す電気泳動写真である。（実施例２）
【図４】コーヒー粕高温メタン発酵連続処理系の負荷上昇実験におけるMethanosarcina属菌、Methanoculleus属菌およびJC3株の菌濃度とガス発生量のモニタリング結果を示すグラフである。（実施例３）
【図５】生ごみとトイレットペーパー混合液の高温メタン発酵連続処理実験における菌濃度とガス発生量のモニタリング結果を示すグラフである。（実施例４）
【図６】より高負荷な高温メタン発酵連続処理実験における菌濃度とガス発生量のモニタリング結果を示すグラフである。（実施例４）
【図７】古新聞の高温メタン発酵回分実験系におけるセルロース分解菌群の菌濃度と酸生成量のモニタリング結果を示すグラフである。（実施例５）
【図８】高負荷生ごみとトイレットペーパー混合原水投入後のガスおよびＶＦＡ組成と嫌気性微生物群のＤＮＡおよびｃＤＮＡのモニタリング結果を示すグラフである。（実施例６）
【図９】コーヒー粕高温メタン汚泥のガスおよびＶＦＡ組成とメタン生成菌群のＤＮＡおよびｃＤＮＡのモニタリング結果を示すグラフである。（実施例７）
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【配列表】
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