(57)【要約】  【課題】  リムルステスト試薬を促進または妨害するような物質が混在する試料においても、正確にかつ迅速にエンドトキシンの活性を測定する方法の提供する。  【解決手段】  リムルステストによるエンドトキシン活性の測定方法において、試料液中に界面活性剤を添加した後、界面活性剤を除去し、リムルステストにて測定することを特徴とするエンドトキシン活性の測定方法。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リムルステストによるエンドトキシン活性の測定方法において、試料液中に界面活性剤を添加した後、該界面活性剤を除去し、リムルステストにて測定することを特徴とするエンドトキシン活性の測定方法。
【請求項２】
リムルステストによるエンドトキシン活性の測定方法において、試料液中に界面活性剤を添加した後、超音波処理を行い、次いで該界面活性剤を除去し、リムルステストにて測定することを特徴とするエンドトキシン活性の測定方法。
【請求項３】
濾過により界面活性剤を除去することを特徴とする請求項１または２に記載のエンドトキシン活性の測定方法。
【請求項４】
界面活性剤を添加した後の試料液中の界面活性剤濃度が、０．１重量％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
【請求項５】
界面活性剤を添加し、除去した後の試料液中の界面活性剤濃度が、０．０１重量％未満であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
【請求項６】
界面活性剤が陰イオン系の界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
【請求項７】
界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
【請求項８】
比濁法によってエンドトキシン活性を測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌内毒素であるエンドトキシン活性の測定方法に関するものであり、詳しくは、エンドトキシンをカブトガニ血球抽出液由来成分をもって定量する方法であるリムルステストによるエンドトキシン活性の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンとは、グラム陰性菌の細胞外膜に存在するリポ多糖体であり、発熱や炎症さらにはショック死などの毒作用を引き起こす性質から、注射用薬剤などの医薬品類、医療用具や透析液においては、生菌数とともに重要な管理項目となっている。
【０００３】
エンドトキシン活性を測定する方法としては、ウサギ発熱性試験、鶏胚致死試験、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイおよびガスマススペクトル等があるが、最も鋭敏、簡便かつ迅速な方法として、カブトガニ血球抽出物由来成分（カブトガニの血球を凝集しないように集めて、水を加え、細胞内容物を抽出したもの。Limulus Amebocyte Lysate 、以下、ＬＡＬと略す。）を利用したリムルステストが挙げられる。リムルステストとは、ＬＡＬにエンドトキシンを加えると凝固反応が生じる性質を応用した試験法で、１９８８年には日本薬局方にエンドトキシン試験法として収載されている。
【０００４】
リムルステストには、ゲル化法（ゲル化転倒法）、比濁法（比濁時間分析法）および合成基質法（比色法）の３方式が現在広く実施されている。
【０００５】
ゲル化法は、ＬＡＬと試料を混合し、３７℃の温度で６０分間反応させた後、１８０°転倒させ、ゲル化を判定する半定量法である。比濁法は、ＬＡＬと試料を混合し、３７℃での温度反応中の透過光量変化を観測して割り出されるゲル化時間からエンドトキシンを定量する方法である。合成基質法は、ＬＡＬとエンドトキシンの反応によって活性化される酵素により分解して色素を遊離する合成基質を用い、遊離色素量からエンドトキシンを定量する方法である。
【０００６】
従来、上記のそれぞれの手法に対し、各種試薬（例えば、生化学工業製「エンドスペシー」や和光純薬製「リムルス−ＥＳ−Ｔｅｓｔ−Ｗａｋｏ」等）が既に市販され、広く一般に使用されている。
【０００７】
しかしながら、リムルステストは、エンドトキシンのミセル構造に影響を受けるし、ある種の金属塩はリムルス反応自体に影響を及ぼす。これらのリムルステストへの影響として、促進的に働く場合、すなわち、実際のエンドトキシン活性よりも、見かけ上、活性が多くなってしまう場合と、阻害的に働く場合、すなわち、実際のエンドトキシン活性よりも、見かけ上、活性が少なくなってしまう場合がある。例えば、リムルステストに阻害的に働く物質が試料に混入している場合には、エンドトキシンの毒性は保持されているにも関わらず、リムルステストではエンドトキシンが検出されないことがあり得るため、医薬品や医療用具などの安全性を保証することができない。したがって、このようにリムルステスト妨害物質が混入している場合には、それらの影響を排除してからリムルステストに供することが重要である。
【０００８】
リムルステスト妨害物質として、例えば、最近では医療用具等の滅菌方法として放射線照射を用いることが多く、この放射線滅菌により医薬品や医療用具の容器や構成基材の分解物が試料中に溶出することがあり、そのような分解溶出物がリムルステスト妨害物質になることがある。
【０００９】
このようなリムルステストを妨害する物質については、その解決策がいくつか提示されている。具体的に、リムルステストを妨害する物質が混入している試料を、阻害作用が失われる濃度にまで必要に応じて加熱しながら希釈して測定する方法が提案されている（特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、試料中のエンドトキシンも希釈されるため、試料中のエンドトキシン量が少ないとリムルステストの感度以下になって検出不能になること、希釈を繰り返すと希釈に使用した容器にエンドトキシンが吸着して、正確な値が得られなくなる危険性がある。
【００１０】
また、他の方法としては、既に市販のエンドトキシン吸着体を用い、エンドトキシンを吸着させ洗浄した後に脱離させる方法があるが、この方法では、試料の吸着時には酸性・低イオン強度の条件下に、脱離時にはアルカリ条件下に調整する必要があり、コンタミネーションの問題や作業効率が良くないという問題があった。
【００１１】
さらに、従来のこのような解決方法は、リムルス反応を妨害する物質についてのみしか適用できない。すなわち、エンドトキシンのミセル構造を変化させるような物質については、適用が不可能であった。例えば、リムルス反応は、エンドトキシンミセルの大きさによってその反応の活性が異なってくる。エンドトキシンミセル内に入り込んで、その大きさを変えるような化合物の場合、エンドトキシンのミセル構造自体が変わっているため、前記の希釈法によっても解決することができない。また、前記のエンドトキシン吸着体を用いても、妨害物質がエンドトキシンミセル内に入り込んでいる場合は、これを取り除くことができないので、解決することができない。
【００１２】
すなわち、リムルステストを妨害するような物質に対しての満足できるような解決策は、これまで提示されていなかった。
【特許文献１】特開平０２−１４３１６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで本発明の目的は、前述した従来技術の問題点を直視し、リムルステストを促進または阻害するような物質が混入する試料においても、正確にエンドトキシンの活性を測定することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下に記す簡単な前処理を施すことにより、正確にエンドトキシンの活性を測定できるところに特徴を有するものである。
（１）リムルステストによるエンドトキシン活性の測定方法において、試料液中に界面活性剤を添加した後、該界面活性剤を除去し、リムルステストにて測定することを特徴とするエンドトキシン活性の測定方法。
（２）リムルステストによるエンドトキシン活性の測定方法において、試料液中に界面活性剤を添加した後、超音波処理を行い、次いで該界面活性剤を除去し、リムルステストにて測定することを特徴とするエンドトキシン活性の測定方法。
（３）濾過により界面活性剤を除去することを特徴とする上記（１）または（２）に記載のエンドトキシン活性の測定方法。
（４）界面活性剤を添加した後の試料液中の界面活性剤濃度が、０．１重量％以上であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
（５）界面活性剤を添加し、除去した後の試料液中の界面活性剤濃度が、０．０１重量％未満であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
（６）界面活性剤が陰イオン系の界面活性剤であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
（７）界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムであることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。
（８）比濁法によってエンドトキシン活性を測定することを特徴とする上記（１）〜（７）記載のエンドトキシン活性の測定方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明を用いることにより、リムルステストを促進または阻害するような物質が混入する試料においても、正確にエンドトキシンの活性を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のエンドトキシン活性の測定方法は、リムルステストによるエンドトキシン活性の測定方法において、試料液中に界面活性剤を添加した後、該界面活性剤を除去し、リムルステストにて測定することを特徴とするものである。
【００１７】
本発明でいう試料液とは、エンドトキシン活性測定の対象となる液であれば、特に限定されるものではなく、医薬品などを溶解させた溶液や分散液、医療用具からの抽出液や人工腎臓などに含まれている充填液などが挙げられる。
【００１８】
試料は、無菌的かつパイロジェンフリー（エンドトキシンフリー）下で採取する。ポリプロピレン製容器や軟質ガラス製容器はエンドトキシンを吸着するといわれており、試料と長期にわたって接触させることは避けた方がよく、２５０℃以上の温度で乾熱処理したパイレックス（登録商標）等の硬質ガラスからなる容器を用いることが好ましい。また、パイロジェンフリーのポリスチレン容器も好適に使用することができる。
【００１９】
採取した試料液をリムルステスト試薬に所定量分注するが、試料液をリムルステスト試薬に添加する前に、本発明の前処理を実施し、リムルステスト阻害物質を除去することでエンドトキシン活性測定を正確に実施することができる。
【００２０】
ここで、次の式１に従って算出される回収率が５０％〜２００％の範囲に収まる場合、エンドトキシン活性測定が成立すると日本薬局方に記載されており、本発明でいうところの、正確も、上記範囲に収まる場合を指す。
回収率(％)＝ (試料液中に添加したエンドトキシン活性)／(水中に添加したエンドトキシン活性)×１００  ・・・・・（式１）
本発明でいうところのリムルステスト妨害物質とは、リムルステストに対して促進的に働く物質でも、阻害的に働く物質でも良く、リムルス反応自体に影響を与える物質でも良いし、エンドトキシンのミセル構造に影響を与えるものでも良い。
【００２１】
本発明のエンドトキシン活性の測定方法では、これらのいずれにおいても、エンドトキシン活性測定を正確に実施することができるが、エンドトキシンのミセル構造に影響を与える妨害物質の場合に、特に好適に用いることができる。エンドトキシン水溶液のリムルステストによるエンドトキシン活性が経時的に低下していく場合、リムルス反応を阻害する物質であれば、経時的な活性の低下は観測されないため、エンドトキシンのミセル構造に影響を与える物質が混在している可能性が高い。
【００２２】
本発明のエンドトキシン活性の測定方法は、エンドトキシンのミセルを壊し、単量体にすることで、エンドトキシンのミセル構造に影響を与えていた妨害物質、例えば、ミセル内部などに入り込んでミセル構造を変化させると考えられるような妨害物質を効率的に除去することができる。その後、単量体を再びミセルに戻すことにより、エンドトキシン活性を正確に測定することができると考えられる。
【００２３】
具体的な方法としては、界面活性剤を試料液中に添加することにより、試料液中のエンドトキシンのエンドトキシンミセル構造を壊す。先ず、パイロジェンフリーであることが確認された注射用水に界面活性剤を溶解した界面活性剤溶液を作製し、その界面活性剤溶液を測定対象の試料液中にクリーンベンチ下で添加する。
【００２４】
本発明で用いられる界面活性剤とは、界面活性作用を有する物質であれば良く、陰イオン性の界面活性剤、陽イオン性の界面活性剤、両性イオンの界面活性剤やノニオン性界面活性剤が挙げられる。エンドトキシンをミセルから単量体にする効率性の良さから、陰イオン性の界面活性剤を使用することが好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムのようなアルキル硫酸や
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、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の芳香族系硫酸塩、コール酸塩やデオキシコール酸塩の様な胆汁酸塩や、それ以外にもラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウロイルサルコシンナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ノニルフェノキシカルボン酸、高級脂肪酸などが挙げられる。この中でも入手の容易さなどの点からコール酸ナトリウムやデオキシコール酸ナトリウムを使用することができる。また、界面活性剤は異なる２種類以上のものを併用添加してもかまわない。
【００２５】
ここで、添加する界面活性剤の量は、試料液中の界面活性剤濃度が０．１重量％以上となるように選択される。これは、界面活性剤濃度が０．１重量％程度であれば、エンドトキシンは完全に単量体にならならないが、ミセル構造は乱されるため、ミセル内部に入り込んだ物質などは、ある程度、取り除けるものと考えられる。界面活性剤濃度を上げることで、ミセル構造から単量体にすることができ、単量体にすることで妨害物質を完全に取り除くことができる。ミセル構造から単量体にする界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類によって異なるが、１重量％以上であることが好ましい。また、単量体になると、それ以上の界面活性剤を添加しても効果はなく、むしろ界面活性剤の除去に時間がかかるなど、作業効率が低下するため、添加濃度は１０重量％以下が好ましい。
【００２６】
また、このとき、ミセル構造を効率的に壊すために、界面活性剤を添加した後、超音波を照射することは、有効な手段である。ここでいう超音波とは、一般的に“可聴周波以上の周波数音波”、すなわち“１６ｋＨｚ以上の音波“と定義されているものである。
【００２７】
本発明で用いられる超音波処理は、特に制限されるものではないが、水槽内に超音波発信器を備えた市販の超音波処理器を使用することができる。例えば、試料溶液の入った容器を水槽中にいれ、超音波処理を行うことによって達成することができる。
【００２８】
超音波処理時間は、短すぎるとエンドトキシンのミセル構造の破壊が不十分となるため、超音波処理の効果が十分に発現できない。また、処理時間が長すぎると試料溶液の温度が上昇するため、エンドトキシンの活性が低下する可能性がある。好適な処理時間は超音波発生装置の出力により変動するが、一般実験向けの卓上超音波発生装置であれば１０分から２時間程度が好ましい。
【００２９】
また、試料溶液を入れる容器については、この超音波処理の振動を試料に与えるために極端に厚みのある容器ではなく１〜３ｍｍ厚さの容器で硬質ガラスかポリスチレン製等の容器が好適に使用できる。
【００３０】
試料液中に添加された界面活性剤は、次いで、好ましくは膜等の濾過材を用い濾過することよって除去することができる。濾過材としては、妨害物質の分子量がエンドトキシン単量体よりも小さい場合、エンドトキシン単量体と妨害物質および界面活性剤を分けることのできる孔径の濾過材を選択すればよい。このとき、界面活性剤と妨害物質は同時に除去される。なお、エンドトキシン単量体の分子量は、５０００〜２万と考えられており、界面活性剤で単量体にした場合には、これに界面活性剤と結合した分子量となる。したがってこの場合、濾過材の分画分子量は２万以下が好ましい。分画分子量とは、分画曲線から阻止率が９０％の分子量をいう。
【００３１】
界面活性剤を取り除くことで、エンドトキシンは自己集合し、ミセル構造が再構築される。
【００３２】
妨害物質がエンドトキシン単量体よりも大きい場合、エンドトキシン単量体と妨害物質を分けることができる孔径の濾過材を選択し、妨害物質を取り除いた後、エンドトキシン単量体と界面活性剤をわけることができる孔径の濾過材によって、界面活性剤を除去すればよい。濾過材の分画分子量は４万以上が好ましい。
【００３３】
また、ここでいう濾過は、全濾過でなくとも良く、透析も含む。
【００３４】
なお、界面活性剤の種類にもよるが、一般的には界面活性剤の濃度はは０．０１重量％未満になれば、リムルス反応を阻害することもなく、エンドトキシンもミセル構造を再構築することができる。
濾過材としては、エンドトキシンを吸着するような素材は好ましくない。例えば、疎水性基材だけで構成された濾過材は、エンドトキシンと疎水性相互作用による吸着の危険性がある。
【００３５】
本発明において、上記の処理を施した試料液について、次にリムルステストでエンドトキシン活性を測定する。
【００３６】
リムルステストの方法としては、ゲル化転倒法、比濁法および比色法等、現在実施されている方式のいずれも使用可能であり、既知の方法で測定でき特に限定されない。リムルステスト試薬は、和光純薬製「リムルス−ＥＳ−Ｔｅｓｔ−Ｗａｋｏ」や生化学工業製「エンドスペシー」など市販のものを使うことができる。測定試料を所定量分注しリムルステスト試薬に添加した後、試薬と試料をよく攪拌し速やかに測定を開始するが、攪拌後の放置が長いと試料とリムルス試薬との反応が進み正確な測定ができなくなるので、数十秒内で開始することが望ましい。当然のことながら、これらの処理はクリーンベンチなど、無菌かつパイロジェンフリー下で実施する。
【実施例】
【００３７】
１．リムルステスト妨害物質の混入したエンドトキシンの調製
中空糸型人工腎臓である東レ株式会社製「トレスルホンＢＳ−１．６ＵＬ」（登録商標）の血液側充填液を抜き出し、これにエンドトキシン標準品（日本薬局方標準品１００００ＥＵ／バイアル）を、注射用水（日本薬局方注射用水：大塚製薬、以下同じ）に溶解したものを順次パイロジェンフリーの注射用水で希釈し、０．１２ＥＵ／ｍｌの濃度に調整した溶液と１：１（容量比）でポリスチレン製テストチューブ２０５４（ファルコン社製）にて混合して、エンドトキシンの活性が０．０６ＥＵ／ｍｌである試料液を調製した。
【００３８】
上記試料液を調整後、速やかにリムルステスト用チューブ（透析液用リムルス試薬０．２ｍｌ用：和光純薬）に０．２ｍｌ添加し、卓上ラボミキサーにて５秒間撹拌して試薬を溶解後、速やか（１０秒以内）にトキシノメーター（ＥＴ―３０１：和光純薬）にセットし、比濁法にてエンドトキシン活性の測定を行った。リムルステストによるエンドトキシンの活性は、０．０６ＥＵ／ｍｌであった。コントロールとして、エンドトキシン標準品を、パイロジェンフリーの注射用水に溶解したものを順次パイロジェンフリーの注射用水で希釈し、エンドトキシンの活性が０．０６ＥＵ／ｍｌである試料液を調製した。リムルステストによるエンドトキシン活性は、０．０６ＥＵ／ｍｌであった。
【００３９】
上記の試料液およびコントロールの試料液を調製後５日間室温にて放置し、同様にトキシノメーターでエンドトキシン活性を測定した。その結果、試料液は、リムルステストによるエンドトキシンの活性は０．００６ＥＵ／ｍｌであったが、コントロールの試料液は０．０６ＥＵ／ｍｌであった。調製直後にエンドトキシン添加量と測定値が一致するが、時間をおくことで、リムルステストによるエンドトキシン活性が低下することから、リムルス反応に影響を及ぼした結果ではなく、エンドトキシンのミセル構造が変わり、見かけ上、エンドトキシン活性が低下したものと考えられる。
【００４０】
［実施例１］
上記１．で作成したエンドトキシンの試料液０．８ｍｌ対し、陰イオン系の界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（１級試薬：和光純薬、以下ＳＤＳと略す）のパイロジェンフリーな１０重量％水溶液を０．２ｍｌ添加した。その後、“ウルトラザルト”Ｄ２０（ザルトリウス社）に該溶液を入れ、約０．１ｍｌまで濾過濃縮した。その後、パイロジェンフリーの注射用水１０ｍｌを添加し、同様に約０．１ｍｌまで濾過濃縮した。注射用水の添加をさらに２回、同様に添加し、濾過濃縮を繰り返した。この後、総液量を０．８ｍｌになるように、注射用水を添加した。
【００４１】
上記試料を速やかに、上記１．記載の方法と同様にして、エンドトキシン活性の測定を行った。その結果、エンドトキシンの活性は０．０５ＥＵ／ｍｌまで活性を回復することができた。一方、コントロールの試料液について同様の操作を行った結果、エンドトキシンの活性は０．０６ＥＵ／ｍｌと変わらなかった。
【００４２】
［実施例２］
実施例１と同様に、上記１．で作成した試料液０．８ｍｌ対し、パイロジェンフリーな１０重量％ＳＤＳ水溶液を０．２ｍｌ添加した。ＳＤＳ溶液を添加した試料液を卓上ラボミキサー（ＮＳ−８：井内盛栄堂）で５秒間攪拌した後、超音波処理器（Ｂ２２１０Ｊ−ＭＴＨ：ＢＲＡＮＳＯＮ、出力９０Ｗ）でテストチューブごと９０分間超音波処理を行った。
【００４３】
超音波処理後、実施例１と同様にウルトラザルト“Ｄ２０”による処理を行った後、エンドトキシン活性の測定を行った。その結果、エンドトキシンの活性は０．０６ＥＵ／ｍｌまで活性を回復することができた。この試料液をさらに５日間室温放置しても、エンドトキシンの活性は０．０６ＥＵ／ｍｌで低下することはなかった。一方、コントロールの試料液について同様の操作を行った結果、エンドトキシンの活性は０．０６ＥＵ／ｍｌと変わらなかった。
【００４４】
［比較例１］
実施例２と同様に、上記１．で作成した試料液に０．８ｍｌ対し、パイロジェンフリーな１０重量％ＳＤＳ水溶液を０．２ｍｌ添加し、超音波処理を９０分間行った。ウルトラザルト“Ｄ２０”による処理を行わずに、エンドトキシン活性の測定を行った。その結果、添加直後にリムルス試薬がゲル化し、測定不能となった。これはＳＤＳがリムルス反応に影響を与えたためであると考えられる。
【００４５】
［比較例２］
上記１．で作成した試料液に１ｍｌにＳＤＳを添加せずに、実施例１と同様に、ウルトラザルト“Ｄ２０”による処理を行った後、エンドトキシン活性の測定を行った。その結果、エンドトキシンの活性は０．００７ＥＵ／ｍｌと活性の回復はほとんど見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
リムルステストを促進または阻害するような物質が混入する試料においても、正確にエンドトキシンの活性を測定することができる。