(57)【要約】【課題】本発明は、白血病などの疾患に対する、より有効な治療法を提示するための診断技術を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、細胞の分化成熟段階を識別する方法であって、  Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；およびＢ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する工程；を包含する、方法を提供する。本発明はさらに、細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置する方法であって、ここで、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する工程；および  Ｃ）決定された分化成熟段階に適切な処置を該被検体に施す工程、を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の分化成熟段階を識別する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；および
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記細胞マーカーの発現レベルは、相対レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞マーカーの発現レベルは、絶対レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞マーカーとして、少なくとも２つの細胞マーカーが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞マーカーとして、少なくとも３つの細胞マーカーが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞マーカーとして、少なくとも４つの細胞マーカーが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞マーカーは、以下：
ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴｄＴ、ＦＭＣ７およびＨＬＡ−ＤＲからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、造血幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は、単球系細胞、骨髄球系細胞、Ｂリンパ球系細胞、Ｔリンパ球系細胞および骨髄球系細胞からなる群より選択される細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化成熟段階は、単球系について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２およびＳｔａｇｅ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記分化成熟段階は、骨髄球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４およびＳｔａｇｅ５を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記分化成熟段階は、Ｂリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分化成熟段階は、Ｔリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原ではない抗原の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞マーカーは、Ｂリンパ球系統について、ＣＤ１０とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１９と
ＣＤ２３とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ５とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞マーカーは、Ｔリンパ球系統について、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ８とＣＤ７とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ４とＣＤ８とＣＤ１０とＣＤ４５からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞マーカーは、骨髄球系統または単球系統について、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｂとＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１６とＣＤ１３とＣＤ３３とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１４とＣＤ３３とＣＤ１１ｂとＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ１０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１１ｂとＣＤ１３とＣＤ１６とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ１０とＣＤ４とＣＤ１４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
細胞の分化成熟段階を識別するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定するための手段と、
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する手段と、
を備える、システム。
【請求項２０】
前記測定手段は、細胞マーカーの発現レベルを相対レベルで測定する、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記測定手段は、細胞マーカーの発現レベルを絶対レベルで測定する、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２２】
前記測定手段は、細胞マーカーに特異的な因子を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２３】
前記細胞マーカーは、少なくとも２つの細胞マーカーを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記細胞マーカーは、少なくとも３つの細胞マーカーを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記細胞マーカーは、少なくとも４つの細胞マーカーを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
前記細胞マーカーは、以下：
ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴｄＴ、ＦＭＣ７およびＨＬＡ−ＤＲからなる群より選択される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２７】
前記細胞は、造血幹細胞を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２８】
前記細胞は、単球系細胞、Ｂリンパ球系細胞、Ｔリンパ球系細胞および骨髄球系細胞からなる群より選択される細胞を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２９】
前記分化成熟段階は、単球系について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２およびＳｔａｇｅ３
を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項３０】
前記分化成熟段階は、骨髄球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４およびＳｔａｇｅ５を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記分化成熟段階は、Ｂリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項３２】
前記分化成熟段階は、Ｔリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項３３】
前記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原である抗原の組み合わせを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原ではない抗原の組み合わせを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３５】
前記細胞マーカーは、Ｂリンパ球系統について、ＣＤ１０とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１９とＣＤ２３とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ５とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３６】
前記細胞マーカーは、Ｔリンパ球系統について、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ８とＣＤ７とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ４とＣＤ８とＣＤ１０とＣＤ４５からなる群より選択される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３７】
前記細胞マーカーは、骨髄球系統または単球系統について、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｂとＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１６とＣＤ１３とＣＤ３３とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１４とＣＤ３３とＣＤ１１ｂとＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ１０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１１ｂとＣＤ１３とＣＤ１６とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ１０とＣＤ４とＣＤ１４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項３８】
前記測定する手段は、フローサイトメーターを含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項３９】
細胞の分化成熟段階を決定する方法であって、
Ａ）該細胞の正常な分化成熟段階をとるものについて、少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおける測定パターン（「正常パターン」）を提供する工程；および
Ｂ）該細胞について、該細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、該正常パターンと比較して、該細胞の分化成熟段階を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項４０】
細胞の分化成熟段階を決定するシステムであって、
Ａ）該細胞の正常な分化成熟段階をとるものについて、少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおける測定パターン（「正常パターン」）を提供する手段；および
Ｂ）該細胞について、該細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパ
ターンと、該正常パターンと比較して、該細胞の分化成熟段階を決定する手段；
を備える、システム。
【請求項４１】
細胞の分化成熟段階が正常であるかどうか判定する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルをフローサイトメトリーで測定する工程；および
Ｂ）該発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、正常な分化成熟段階にある細胞が示すフローサイトメトリーにおける該細胞マーカーの発現レベルのパターンとを比較して、相違があれば、正常でない細胞が含まれると判定する工程；
を包含する、方法。
【請求項４２】
細胞の分化成熟段階が正常であるかどうか判定するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルをフローサイトメトリーで測定する手段；および
Ｂ）該発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、正常な分化成熟段階にある細胞が示すフローサイトメトリーにおける該細胞マーカーの発現レベルのパターンとを比較して、相違があれば、正常でない細胞が含まれると判定する手段、
を備える、システム。
【請求項４３】
細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する工程；および
Ｃ）決定された分化成熟段階に適切な処置を該被検体に施す工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
白血病の処置後に、細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する工程；および
Ｃ）決定された分化成熟段階と、該細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を該被検体に施す工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記適切な処置は、
ｉ）前記細胞の決定された分化成熟段階について、正常細胞が存在する、存在する細胞が正常未熟細胞であると判定される場合、現治療法の継続あるいは投薬等の治療を終了し経過観察のみに留めるという処置を含み、
ｉｉ）前記細胞の決定された分化成熟段階について、存在する細胞が異常細胞であると判定される場合、現治療法の強化または変更を行うという処置を含む、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞の決定された分化成熟段階について、存在する細胞が正常未熟細胞であると判定された場合においても、元幹細胞の枯渇、あるいは分化成熟の進行の停止等の異常が認められる場合は、幹細胞の追加移植等を行うという処置を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階に適切な処置を該被検体に施す手段、
を備える、システム。
【請求項４８】
細胞の分化成熟段階に応じた処置を被検体に提供するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階に適切な処置を該被検体に提供する手段、
を備える、システム。
【請求項４９】
白血病の処置後に、細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階と、該細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を該被検体に施す手段、
を備える、システム。
【請求項５０】
白血病の処置後に、細胞の分化成熟段階に応じた処置を被検体に提供するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）該発現レベルに基づき、該細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階と、該細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を該被検体に提供する手段、
を備える、システム。
【請求項５１】
請求項１に記載の方法によって作成された細胞の分化成熟段階のパターン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分類法に関する。より詳細には、本発明は、細胞の分化過程に応じて詳細に分類する方法およびそのための関連技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリー技術を用いて種々の細胞の解析が行われるようになっている。特に、血液細胞の分化の判定が、フローサイトメトリー技術により可能となっている。このような分化判定は、白血病細胞の分析にも応用され、診断にも応用されるようになってきている。
【０００３】
フローサイトメトリーの利点としては、例えば、芽球の占める割合を把握しやすいこと、特異性および感度が高いこと、再現性が高いこと、多数の細胞を解析することができること、所要時間が短いことなどが挙げられる。しかし、他方、ある白血病のみに特異的な抗原はほとんどないこと、ある系統のみに特異的な抗原はほとんどないこと、白血病細胞によって抗原の発現の仕方または密度が異なることなどの白血病細胞の特徴がデータ判定を困難にさせていることも事実であるとされている。
【０００４】
これまでの白血病細胞解析では、白血病細胞の系統（ｌｉｎｅａｇｅ）を明確にすることを念頭にパネルが作成されてきた。このパネル作成では、種々のＣＤ抗原が組み合わされて使用されている。これらのＣＤ抗原を組み合わせることによって、白血病を、前駆体Ｂ−ＡＬＬ、前駆体Ａ−ＡＬＬ、Ｂ−ＣＬＬ、ＡＭＬ、混合系統白血病（Ｍｉｘｅｄ  Ｌｉｅａｎｇｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、非ホジキンリンパ腫などに分類することが可能であるとされてきた。例えば、Ｂリンパ球抗原とＴリンパ球抗原と、リンホイド抗原と骨髄球抗原となどを組み合わせることが提唱されている。
【０００５】
しかし、これらのＣＤ抗原は、正常細胞にも発現されている。白血病細胞が大半を占める治療前の検体では、この方法でも診断は可能であるが、白血病細胞比率が少なくなった後の治療後の検体では、正常細胞と白血病細胞との判別が非常に困難であり、事実上不可能であった。
【０００６】
正常血液細胞においては、分化成熟に応じて種々の細胞があるとされている。しかし、これまでに、そのような分化成熟を正確に判定する技術は存在していなかった。
【０００７】
従来から造血幹細胞移植治療は行われていたが、天然の細胞を濃縮したものを使用していたことから、種々の副作用があった。例えば、大量抗癌剤または放射線照射を用いた移植前処置による副作用（ＲＲＴ）が存在していた。また、前処置による骨髄抑制中の細菌・真菌感染症、出血；他人からの移植の場合、ドナーの白血球が生着して増えてきた時に患者臓器を異物（他人）とみなして攻撃する反応（移植片対宿主病＝ＧＶＨＤ）；サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）肺炎を中心とする様々な肺合併症；血管内皮細胞（血管の内側を覆っている細胞）の障害による種々の内臓障害；生着後にも遷延する免疫抑制状態（少なくとも１〜２年）の間に罹患する様々な感染症；遷延し様々な症状を呈する慢性ＧＶＨＤ；二次性発癌、性腺機能障害、不妊などの晩期障害などの副作用があった。
【０００８】
以上のような合併症のために、移植を行ったがために、かえって一時的に全身状態が悪くなるということはしばしば起こる。また、合併症のために死亡する患者も、自家移植でも１０〜２０％、他人からの移植では２０〜４０％程度認められる。また、これらの合併
症を乗り越えても、もとの病気が再発する可能性があり、現在の移植治療の限界があった。
【０００９】
骨髄移植後の合併症による早期死亡を予防することを目的に幹細胞を分離・純化し、生体外で幹細胞から前駆細胞を大量に産生し、それを幹細胞とともに移植することによって行う治療法が登場し、すでに臨床試験が試みられようとしている。
【００１０】
ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）が１９８０年代に提唱されて以来、ＦＡＣＳを使用した方法が造血幹細胞の濃縮・純化に多用されている。多重染色した骨髄球からＣＤ３４−ＫＳＬ細胞を分離することによって純度の高い造血幹細胞が得られることが明らかになっている。このように分化したかどうかについては、種々のマーカーを用いられている。ただし、マーカーによる選択が１００％移植適合性または幹細胞の未分化性と相関しているとはいえないことから、治療効果が必ずしも充分ではないと言うことも指摘されている。
【００１１】
幹細胞の分化を調節する機構として種々のタンパク質が重要な役割を果たす。例えば、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒまたはｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦともいう）は、造血幹細胞では注目されている因子である。
【００１２】
ＳＣＦは、骨髄ストローマ細胞により生成され、多能性幹細胞、ＣＦＵ−ＧＭのＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｍｅｇなどの骨髄球系細胞、リンパ系幹細胞に作用し、これらの分化を支持する。すなわち造血幹細胞から分化細胞へのほぼすべての系統の分化段階の細胞に作用して、他のサイトカインによる最終分化段階への分化誘導する作用を助けるとされる（非特許文献１）。しかし、このような分化因子は、マーカーとはなりえない。
【００１３】
ＣＤ３４、Ｌｉｎ（ｌｉｎｅａｇｅマーカー）、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１といった細胞表面マーカーは、幹細胞を識別するために一般に用いられている。しかし、これらのマーカーは、特異性が弱く、しかも単独では移植適合性、幹細胞未分化性を判断するには不十分であるという点が欠点として挙げられている。また、これらのマーカーを組み合わせても、幹細胞を１００％近く分離することができるかどうかについては疑問がある。特に、移植適合性を考えるとき、これらのすべてのマーカーを使用したとしても、移植適合性を有する細胞とそうでない細胞とが混合したものしか識別することしかできない。骨髄移植がうまくいく人とそうでない人とがいるのは、こうした移植適合性のマーカーがないことによるところが大きい。特に、造血幹細胞の幹細胞性および移植適合性については、適切なマーカーは未だにないというのが現状であるといえる。
【００１４】
造血器腫瘍（白血病、リンパ腫、各種血液疾患）細胞の新しく有用な検査方法である骨髄モニタリング検査（Ｍｕｌｔｉ  Ｄｉｅｎｓｉｏａｌ  ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ：ＭＤＦ）により、近年の造血器腫瘍治療分野の進歩により、現在では大半の症例を寛解に導入することが可能となってきた。
【００１５】
しかし、再発による死亡率は依然として高く、治癒率はまだ低いままである。治療の各過程において患者の血液中の細胞を詳しくモニタリングすることができれば、臨床的に非常に有用である。現在、日本国内で行われているＦＣＭを用いた造血器腫瘍細胞の解析としては、１）治療前の症例分類、２）幹細胞移植術に必要な幹細胞数定量などが行われている。しかし、最も重要な３）患者体内の麟細胞のモニ列ングによる治療効果判定、再発の予知・予防に関する検査方法は確立されていない。ＭＤＦを用いることによって、幹細胞移植後の骨髄中において、１）移植された造血幹細胞が生着したか、２）骨髄の正常再構築が順調に進んでいるか、３）再発の前兆となる骨髄球の異常な動態が起こっていないかという点にフォーカスを当てた解析が可能になる。日本国内でもＦＣＭを用いた造血器
腫瘍解析は行われている。しかしそれらは、治療前の症例分類にフォーカスを当てた検査方法であり、モニタリングに用いても威力を発揮することが出来ない方法である。しかも、それらの検体のほとんどは、効率化および自動化のみを追求した大手検査センターによって臨床的に全く役に立たないデータを提供されているだけである。最も危惧すべきことは、多くの造血器腫瘍の患者が、その役に立たないデータのために命を落とし続けているということである。
【００１６】
現在、日本国内には、白血病３万人、リンパ腫５万人の患者がいるとされている。ＦＣＭを用いた治療前の症例分類を行われている症例はその内の一部であり、まして治療後のモニタリングを行われている症例は殆どいない。また、５万人いるとされる骨髄異形成症候群に関しては、治療前の症例分類さえ行われていない。
【００１７】
従来のＦＣＭ検査は役に立たないという認識があるからである。
【非特許文献１】北村聖（Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ）、サイトカインの最前線、羊土社、平野俊夫（Ｔ．Ｈｉｒａｎｏ）編、１７４頁〜１８７頁、２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記問題点を考慮し、本発明は、白血病などの疾患に対するより有効な治療法を提示するための診断技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、鋭意検討した結果、細胞マーカーの発現レベルの分析結果により幹細胞などの分化成熟段階をより詳細に識別でき、従来知られていなかった成熟段階があること、およびそのような成熟段階に応じて適切な処置法を見出すことができることが判明したことによって、上記課題を解決した。従って、本発明は、以下を提供する。
（１）細胞の分化成熟段階を識別する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；および
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する工程；
を包含する、方法。
（２）上記細胞マーカーの発現レベルは、相対レベルである、項目１に記載の方法。
（３）上記細胞マーカーの発現レベルは、絶対レベルである、項目１に記載の方法。
（４）上記細胞マーカーとして、少なくとも２つの細胞マーカーが使用される、項目１に記載の方法。
（５）上記細胞マーカーとして、少なくとも３つの細胞マーカーが使用される、項目１に記載の方法。
（６）上記細胞マーカーとして、少なくとも４つの細胞マーカーが使用される、項目１に記載の方法。
（７）上記細胞マーカーは、以下：
ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴｄＴ、ＦＭＣ７およびＨＬＡ−ＤＲからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（８）上記細胞は、造血幹細胞を含む、項目１に記載の方法。
（９）上記細胞は、単球系細胞、骨髄球系細胞、Ｂリンパ球系細胞、Ｔリンパ球系細胞および骨髄球系細胞からなる群より選択される細胞を含む、項目１に記載の方法。
（１０）上記分化成熟段階は、単球系について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２およびＳｔａｇｅ３を含む、項目１に記載の方法。
（１１）上記分化成熟段階は、骨髄球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４およびＳｔａｇｅ５を含む、項目１に記載の方法。
（１２）上記分化成熟段階は、Ｂリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、項目１に記載の方法。
（１３）上記分化成熟段階は、Ｔリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、項目１に記載の方法。
（１４）上記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原の組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（１５）上記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原ではない抗原の組み合わせを含む、項目１に記載の方法。
（１６）上記細胞マーカーは、Ｂリンパ球系統について、ＣＤ１０とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１９とＣＤ２３とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ５とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（１７）上記細胞マーカーは、Ｔリンパ球系統について、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ８とＣＤ７とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ４とＣＤ８とＣＤ１０とＣＤ４５からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（１８）上記細胞マーカーは、骨髄球系統または単球系統について、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｂとＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１６とＣＤ１３とＣＤ３３とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１４とＣＤ３３とＣＤ１１ｂとＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ１０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１１ｂとＣＤ１３とＣＤ１６とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ１０とＣＤ４とＣＤ１４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（１９）細胞の分化成熟段階を識別するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定するための手段と、
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する手段と、
を備える、システム。
（２０）上記測定手段は、細胞マーカーの発現レベルを相対レベルで測定する、項目１９に記載のシステム。
（２１）上記測定手段は、細胞マーカーの発現レベルを絶対レベルで測定する、項目１９に記載のシステム。
（２２）上記測定手段は、細胞マーカーに特異的な因子を含む、項目１９に記載のシステム。
（２３）上記細胞マーカーは、少なくとも２つの細胞マーカーを含む、項目２２に記載のシステム。
（２４）上記細胞マーカーは、少なくとも３つの細胞マーカーを含む、項目２２に記載のシステム。
（２５）上記細胞マーカーは、少なくとも４つの細胞マーカーを含む、項目２２に記載のシステム。
（２６）上記細胞マーカーは、以下：
ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴｄＴ、ＦＭＣ７およびＨＬＡ−ＤＲからなる群より選択される、項目２２に記載のシステム。
（２７）上記細胞は、造血幹細胞を含む、項目１９に記載のシステム。
（２８）上記細胞は、単球系細胞、Ｂリンパ球系細胞、Ｔリンパ球系細胞および骨髄球系細胞からなる群より選択される細胞を含む、項目１９に記載のシステム。
（２９）上記分化成熟段階は、単球系について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２およびＳｔａｇｅ３を含む、項目１９に記載のシステム。
（３０）上記分化成熟段階は、骨髄球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔ
ａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４およびＳｔａｇｅ５を含む、項目１９に記載のシステム。
（３１）上記分化成熟段階は、Ｂリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、項目１９に記載のシステム。
（３２）上記分化成熟段階は、Ｔリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む、項目１９に記載のシステム。
（３３）上記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原である抗原の組み合わせを含む、項目２２に記載のシステム。
（３４）上記細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原ではない抗原の組み合わせを含む、項目２２に記載のシステム。
（３５）上記細胞マーカーは、Ｂリンパ球系統について、ＣＤ１０とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１９とＣＤ２３とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ５とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、項目２２に記載のシステム。
（３６）上記細胞マーカーは、Ｔリンパ球系統について、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ８とＣＤ７とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ４とＣＤ８とＣＤ１０とＣＤ４５からなる群より選択される、項目２２に記載のシステム。
（３７）上記細胞マーカーは、骨髄球系統または単球系統について、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｂとＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１６とＣＤ１３とＣＤ３３とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１４とＣＤ３３とＣＤ１１ｂとＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ１０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１１ｂとＣＤ１３とＣＤ１６とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ１０とＣＤ４とＣＤ１４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択される、項目２２に記載のシステム。
（３８）上記測定する手段は、フローサイトメーターを含む、項目１９に記載のシステム。
（３９）細胞の分化成熟段階を決定する方法であって、
Ａ）上記細胞の正常な分化成熟段階をとるものについて、少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおける測定パターン（「正常パターン」）を提供する工程；および
Ｂ）上記細胞について、上記細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、上記正常パターンと比較して、上記細胞の分化成熟段階を決定する工程；を包含する、方法。
（４０）細胞の分化成熟段階を決定するシステムであって、
Ａ）上記細胞の正常な分化成熟段階をとるものについて、少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおける測定パターン（「正常パターン」）を提供する手段；および
Ｂ）上記細胞について、上記細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、上記正常パターンと比較して、上記細胞の分化成熟段階を決定する手段；を備える、システム。
（４１）細胞の分化成熟段階が正常であるかどうか判定する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルをフローサイトメトリーで測定する工程；および
Ｂ）上記発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、正常な分化成熟段階にある細胞が示すフローサイトメトリーにおける上記細胞マーカーの発現レベルのパターンとを比較して、相違があれば、正常でない細胞が含まれると判定する工程；
を包含する、方法。
（４２）細胞の分化成熟段階が正常であるかどうか判定するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルをフローサイトメトリーで測定する手段；および
Ｂ）上記発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、正常な分化成熟段階にある細胞が示すフローサイトメトリーにおける上記細胞マーカーの発現レベルのパターンとを比較して、相違があれば、正常でない細胞が含まれると判定する手段、
を備える、システム。
（４３）細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する工程；および
Ｃ）決定された分化成熟段階に適切な処置を上記被検体に施す工程、
を包含する、方法。
（４４）白血病の処置後に、細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置する方法であって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する工程；および
Ｃ）決定された分化成熟段階と、上記細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を上記被検体に施す工程、
を包含する、方法。
（４５）上記適切な処置は、
ｉ）上記細胞の決定された分化成熟段階について、正常細胞が存在する、存在する細胞が正常未熟細胞であると判定される場合、現治療法の継続あるいは投薬等の治療を終了し経過観察のみに留めるという処置を含み、
ｉｉ）上記細胞の決定された分化成熟段階について、存在する細胞が異常細胞であると判定される場合、現治療法の強化または変更を行うという処置を含む、
項目４４に記載の方法。
（４６）上記細胞の決定された分化成熟段階について、存在する細胞が正常未熟細胞であると判定された場合においても、元幹細胞の枯渇、あるいは分化成熟の進行の停止等の異常が認められる場合は、幹細胞の追加移植等を行うという処置を含む、項目４４に記載の方法。
（４７）細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階に適切な処置を上記被検体に施す手段、
を備える、システム。
（４８）細胞の分化成熟段階に応じた処置を被検体に提供するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階に適切な処置を上記被検体に提供する手段、
を備える、システム。
（４９）白血病の処置後に、細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階と、上記細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を上記被検体に施す手段、
を備える、システム。
（５０）白血病の処置後に、細胞の分化成熟段階に応じた処置を被検体に提供するシステムであって、
Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；
Ｂ）上記発現レベルに基づき、上記細胞の分化成熟段階を決定する手段；および
Ｃ）決定された分化成熟段階と、上記細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を上記被検体に提供する手段、
を備える、システム。
（５１）項目１に記載の方法によって作成された細胞の分化成熟段階のパターン。
【００２０】
本発明者らの提供するＭＤＦを用いていれば白血病の再発を予知することができる。本発明を用いれば、従来の役に立たないと考えられていたＦＣＭ検査はを用いて、白血病などの疾患を正確に把握することが可能である。従って、３万人、５万人の患者がいるとされている白血病、リンパ腫などについて、ＦＣＭを用いた治療前の正確な症例分類を行うことが可能であり、５万人いるとされる骨髄異形成症候群に関してについても、治療指針を与えるに十分な診断結果を提供することが可能である。
【００２１】
正常血液細胞の分化成熟パターンに基づいた解析パネル正常骨髄血中の血液細胞は正確に制御された分化過程を経て成熟している。特定のＣＤ抗原を組み合わせて骨髄血↓末梢血、リンパ節に存在する正常細胞の各種抗原量の定量と分布をＦＣＭで解析すると、それらの細胞表面抗原の発現と消失が一本の道として示される。この正常経路（Ｎｏｒｍａｌ
Ｐａｔｈｗａｙ）は全ての血液細胞に認められ、年齢や治療に影響を受けることなく、正常細胞であれば全ての人において同じパターンを示すことが本発明において判明した。
【００２２】
そのデータを基礎にして種々の白血病細胞の解析を行うと、白血病細胞は決して正常細胞と同じような抗原分布を示さないことが判った。つまり、各抗原の発現量を測定し、多次元空間にプロットすると、白血病細胞は必ず正常細胞とは異なる空間に位置するということである。これは白血病細胞が正常骨髄血中または正常末梢血中細胞には存在しないが白血病細胞には存在する抗原発現異常（抗原発現系統不全：ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ；抗原発現不整、Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｙ；抗原欠損：Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ａｂｓｅｎｃｅ、および抗原発現量異常：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）を持っていることに由来している。分化成熟段階にある正常未熟細胞と白血病細胞を、ＣＤ抗原が陽性か陰性かという解析では、判別は非常に困難である。しかし、本発明では、この正常経路に基づいた解析を行うことによって、種々の検出が可能となることが判明した。
【００２３】
正常経路（Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ）はそれぞれの細胞の系絃ごとに異なる。Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、骨髄球、単球、赤血球などは、それぞれ独自の正常経路および経路を有している。これらのすべてのＰａｔｈｗａｙには個人差はないとされている。
【００２４】
従来の方法では、正常経路を捕らえようとする試みがなされてはいるが、このような方法では解明できていない詳細なＰａｔｈｗａｙが存在する。本発明の方法では、このような詳細なＰａｔｈｗａｙを解明することができる。
【００２５】
従来の方法では、フローサイトメトリ（ＦＣＭ）から得られる細胞のデータは、細胞の大きさ（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）、細胞の内部構造（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒｌ；ＳＳＣ）、抗原の蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ＦＬ−１，ＦＬ−２、ＦＬ−３、ＦＬ−４）が存在する。従来法では、ＦＳＣ×ＳＳＣのパラメータから、目的となる細胞を探し出し、その細胞の各ＦＬが陽性であるかまたは陰性であるかを見ていた。このＦＬにおいて用いられていたモノクローナル抗体（ＣＤ）は、「Ｔリンパ球系またはＢリンパ球系」、「リンパ球系または骨髄球系」などを分けるための組み合わせであった。これらのＣＤには系統的な相関関係はないことから、データを展開して意味のあるパラメータは、せいぜい、ＦＳＣ×ＳＳＣ、ＦＬ×ＦＬといった程度しか得られない。もちろん、腫瘍細胞はそのような単純なものではないことから、分類自体が全く役に立っていなかった。これは、形態学的検査でも指摘されていたことであった。
【００２６】
ところが、本発明のＭＤＦでは、代表的には、ＣＤ抗体として各細胞の系統ごとに関連
のあるものを用いる。たとえば、骨髄球系細胞の分化成熟過程で発現の強度が異なるのはＣＤ１１ｂ。ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３３、ＨＬＡ−ＤＲなどである。これらのＣＤのすべてが同じ系統の細胞において発現していることから、すべてのデータが相関を持っている。従って、このような例示的な例では、展開できるパラメータとしては、５データ×４データ×測定ＣＤという数になる。これらのパラメータがあることによって、正常経路をより詳細に見ることができる。
【００２７】
本発明では、一つの特徴として、ＣＤとして、細胞の系統に関連を有するものを選択して使用することが特徴である。
【００２８】
また、パラメータの数を多くして、解析することによって、このような系統における分化段階をより詳細に分析することが可能である。
【００２９】
（ＭＤＦの技術的な説明）
血液細胞は、幹細胞から様々な細胞へと分化成熟する。分化成熟の過程を詳細に検索すると、必ず１本の分化成熟の道（正常経路＝Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ）というものが見えてくる。この正常経路には、年齢および性差などの個人差はもちろん、治療による影響さえ認められないことが本発明において判明した。つまり、もともと身体の中にあった幹細胞であろうと、他から移植された幹細胞であろうと、全く同じ道を適って分化していくことになる。この正常経路を見つけるための方法が本発明のＭＤＦの一つの形態であるといえる。その例を図１Ａ−Ｓに示す。
【００３０】
Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙという定義はＬｏｋｅｎらによって形作られてきた。彼らは血液細胞が未熟な段階から成熟名段階に分化成熟していく間の各種ＣＤマーカーの発現を調べた結果、それらのＣＤマーカーが規則正しく増減を行っていることを見出した。彼らは、各種細胞を３色のＣＤマーカーを用いて多次元解析し、Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを見出した。彼らは、異常な細胞（腫瘍細胞等）がＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ上とは異なる空間に出現することを見出し、特に治療後の微小残存病変の検出に応用してきた。
しかし彼らの見出したＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙは予測で成り立っている部分が多くあり、また同定できた分化成熟ｓｔａｇｅも大まかなものであった。原因は、やはり技術的な問題（３カラー染色による限界）と、それ詳細にｓｔａｇｅを同定するためのＣＤマーカーの組み合わせが出来なかったことによる。特に、彼らが最終的に目指したものは微小残存病変の検出という、言い換えれば従来より行われてきた腫瘍細胞の分類や検出法と同じ目的であったため、選別されたＣＤマーカーが腫瘍細胞を検出するには適しているが、詳細なＰａｔｈｗａｙを解析できるものではなかった。
【００３１】
本発明では、まず前述の技術的問題点を解決するために４色のＣＤマーカーを用いた多次元解析を行った。これによって、解析できるパラメーターが大幅に増え、より多次元な解析が可能となった。用いたＣＤマーカーは、詳細なＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを検出することを目的として選別し、適切な組み合わせを作成した。これによって、従来のＰａｔｈｗａｙ解析ではｓｔａｇｅを把握できなかった細胞集団を、詳細にｓｔａｇｅ分けすることが可能となった（例えば、単球系細胞におけるｓｔａｇｅ  ２とｓｔａｇｅ３、骨髄球系細胞におけるｓｔａｇｅ３、ｓｔａｇｅ４、およびｓｔａｇｅ５の同定）。
【００３２】
ＭＤＦの具体的手法としては、以下の通りである。
【００３３】
１）移植された幹細胞は、必ず幹細胞の位置に現れる。現われない場合は、移植自体が失敗の可能性がある。
【００３４】
２）正常の幹細胞の位置に現れた幹細胞から正常経路上に分化成熟する細胞が現れてきたら、骨髄再構築が始まったことを示す。
【００３５】
３）正常な骨髄再構築が進んだ場合、幹細胞から分化成熟過程にある様々な細胞、および成熟細胞の全てが揃う。
【００３６】
４）もし、分化成熟した細胞ばかりになり、幹細胞や分化成熟過程にある細胞が認められなくなってきた場合は、移植された幹細胞が生着せずに単純に分化成熟しただけである可能性がある。そのままでは、幹細胞が枯渇し、骨髄再構築は途絶える。
【００３７】
５）もし、分化成熟過程にある細胞がその先の成熟段階へと進まなかった場合、その時点での骨髄再構築異常が起こっていると考えられる。
【００３８】
６）残存している腫瘍細胞は、正常幹細胞と全く別の位置に現れる。治療後の未熟細胞が残存している腫瘍細胞なのか、あるいは正常幹細胞なのかを区別することは非常に困難であったが、本発明のＭＤＦではこの位置の違いを利用して判別ができる。
【００３９】
７）腫瘍細胞が微量残存していても、正常な骨髄再構築が起こっていれば、強力な追加治療をしなくても、免疫能等で治癒していく。しかし、腫瘍細胞が微量残存していて、正常な骨髄再構築が行われない場合、腫瘍細胞の増殖を止める要因は無くなり、再発の危険性が出てくる。
【００４０】
これまでＦＣＭで調べられてきたのは、腫瘍細胞の表面マーカーを探すことであった。しかし、腫瘍細胞に特異的なマーカーというものは一部の症例にのみ認められただけであった。腫瘍細胞に認められるＦＣＭマーカーは、正常細胞にも同じように認められる。陽性または陰性という従来の方法では、両方とも同じ結果になる。
【００４１】
例えば、骨髄異形性症候群ではＣＤ１３が認められることが多いのであるが、ＣＤ１３は正常幹細胞や正常未熟骨髄球にも認めらる。従来の方法では、この時点で「この細胞はＣＤ１３が陽性」という結果を報告していた。これでは、臨床医はこれが異常なのか正常なの判断できなかった。
【００４２】
本発明のＭＤＦを用いると、同じＣＤ１３陽性であっても、それが正常経路上の陽性なのか、あるいは外れているのかが判る。その結果、「これは正常」あるいは「これは異常」という報告が可能となった。
【００４３】
従来の方法が、なぜそのようなものであったかというと、ＦＣＭの歴史が関係しているといえる。もともと、ＦＣＭは基礎研究機器として開発された。しかしＡＩＤＳの流行およびＡＴＬの発見が引き金となり、臨床検査の分野に広がった。ＡＩＤＳの場合は、末梢血のリンパ球中にＣＤ８陽性細胞がどれだけ存在するかを請べるだけである程度の知見が得られた。またＡＴＬも同様に、末梢血のリンパ球中のＣＤ３やＣＤ４陽性細胞がどれだけ存在するかを調べるだけである程度の知見が得られた。この発想が、そのまま造血器腫瘍細胞の解析に持ち込まれたのが従来のＦＣＭ検査である。リンパ球サブセット検査と言われるこれらの検査は、単純に陰性コントロールと比較して陽性または陰性を判断するもので、非常に明確に解析を行えるのではあるが、結果的には治療方針を左右する程の情報を得られるものではなかった。
【００４４】
その次に目を付けられたのが、造血器腫瘍細胞の解析であった。それまでの、人が顕微鏡で見て判定していた場合より、短時間で大量の細胞を検査できるということが利点であった。しかし、解析方法は何も変わらなかったので、結果的には得られた情報は、従来の形態学的判定を行う場合、自信が無い症例に関してのみ補助的なデータとして用いられるという程度のものであった。造血器腫瘍細胞の解析には専用の方法が必要だという認識はかなり広まっている。その方法の検討もたくさん行われてきたが、腫瘍細胞に特異的なマーカーを探すという発想から抜け出ることは出来なかった。なかには、マニアックな方法で微量な腫瘍細胞を検出することを報告している研究者もいる。従来の方法より、臨床的な有用性はあるようにみえる。しかし、最大の問題は、腫瘍細胞のみに焦点を当てていることである。「腫瘍細胞が残っている」という報告を受けると、医者は治療を行うことになる。しかし、骨髄は様々な血液細胞の集合体である。その他の細胞の動態を考えずに、腫瘍細胞のみに焦点を当てて治療を行うと、せっかく正常に再構築してきた他の細胞を排除することになる。従って、本発明は、１つの実施形態では、再生してきた他の細胞を活かすことができる治療を提供することになる。
【００４５】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００４６】
従って、本発明は、白血病治療などにおいて、再生してきた他の細胞を活かすことができる治療を提供することになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００４８】
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００４９】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５０】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。
【００５１】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄球系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄球系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００５２】
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
【００５３】
細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、リンパ球、脾臓細胞または精巣由来の細胞が使用され得る。
【００５４】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
【００５５】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、樹立された幹細胞を使用することは、宿主から新たに幹細胞を採取するという工程を回避することができるので好ましい。
【００５６】
本明細書において「経路（ｐａｔｈｗａｙ）」とは、細胞の分化成熟において用いられ、分化成熟の際にともなって変動する細胞マーカーの発現レベルのプロファイルを言う。
【００５７】
本明細書において「正常経路（Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ）」とは、細胞の分化成熟において用いられ、正常な分化成熟を生じる場合に発現される細胞マーカーの発現レベルのプロファイルをいう。このようなプロファイルは、フローサイトメトリーを用いることによって表現することができる。
【００５８】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例え
ば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００５９】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【００６０】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形腫（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６１】
従って、本明細書において「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」とは、、交換可能に用いられ、初期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常胚性幹細胞は、全能性またはほぼ全能性を有するとされる。この胚性幹細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（胚性幹細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５，１９８４）。胚性幹細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロでこのような処理をした胚性幹細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８，１９８９）。胚性幹細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることができる。従って、胚性幹細胞の樹立が容易になれば、その効果は図り知れない。このような胚性幹細胞は、受精３．５日目のマウス胚盤胞の内部細胞塊の細胞をインビトロ培養に移し，細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより，多分化能を保持し，正常核型を維持したまま無制限に増殖しつづける幹細胞を樹立することに作製することができる。通常、胚性幹細胞の多分化能を維持するには、ＳＴＯ細胞株および／またはマウス胎仔から調製した初代培養繊維芽細胞などのフィーダー細胞層上で胚性幹細胞を培養することが好ましいとされる。
【００６２】
本明細書において「造血幹細胞」とは、造血組織および腸上皮組織などの細胞新生系において細胞生産のもとになる細胞をいう。この幹細胞は、自己を保存するとともに、すべての血液系細胞に分化することができる。そのような血液細胞としては、例えば、単球系幹細胞、Ｂリンパ球系幹細胞、Ｔリンパ球系幹細胞、骨髄球系幹細胞、Ｔリンパ系細胞、Ｂリンパ系細胞、血小板系細胞、赤血球系細胞、単球系細胞などを挙げることができることが理解される。
【００６３】
造血細胞は骨髄の中でつくられ、分化して、赤血球、血小板、白血球などになり末梢血液の中を流れる。骨髄球系細胞の分化を見ると、一番大元には多能性幹細胞があり、次に造血系細胞に特化した造血幹細胞があり、多能性前駆細胞へと分化し、さらに骨髄球系前駆細胞およびリンパ球系前駆細胞へと分化する。
骨髄球系では多能性幹細胞からＣＦＵ−ＧＥＭＭという細胞へ分化する。そのＣＦＵ−ＧＥＭという細胞からＣＦＵ−ＧＭという細胞へ、次いで骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球という形で分化する。これらは骨髄中に存在する細胞であり、これが分化すると好中球となって末梢血中を流れる。次のラインへいくと、ＣＦＵ−ＧＭという細胞から単球の方へ行き、単芽球、前単球、単球と分化する。この単球が末梢血へあらわれる。３番目のラインでは、ＣＦＵ−ＧＥＭＭという細胞からＢＦＵ−Ｅ細胞へと分化し、それから前赤芽球、赤芽球、赤血球へと分化する。また、巨核球系というものもあり、ＣＦＵ−Ｍｅｇ（メガカリオサイトの略）、巨核芽球、巨核球、血小板へと分化する。
【００６４】
このような分化の過程で白血病は、多能性幹細胞の異常に起因する。したがって、本発明は、このような異常を改善するという意味で白血病の治療にも応用され得る。
【００６５】
リンパ球系では、多能性幹細胞からリンパ系の幹細胞へと分化し、Ｂリンパ球系とＴリンパ球系とに分かれる。それと別個にＮＫ細胞の方へ分かれていくというラインが存在する。Ｂリンパ球系のラインとしては前駆Ｂリンパ球、前駆前駆Ｂリンパ球（ｐｒｅ−ｐｒｅ−Ｂ−ｃｅｌｌ）、初期Ｂリンパ球（ｅａｒｌｙ−Ｂ−ｃｅｌｌ）などへと分化し、中間Ｂリンパ球（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−  Ｂ−ｃｅｌｌ）  、成熟Ｂリンパ球（ｍａｔｕｒｅＢ−ｃｅｌｌ  ）、形質球様細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ−  Ｂ−ｃｅｌｌ）  、形質細胞（ｐｌａｓｍａ−ｃｅｌｌ）へと分化する。Ｔリンパ球系としては、胸腺前駆細胞、未成熟胸腺細胞、共通胸腺細胞（ｃｏｍｍｏｎ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ）、成熟胸腺細胞へと分化する。別のルートとしてヘルパー／インデューサーＴリンパ球へいく系統と、成熟胸腺細胞から抑制／細胞傷害性Ｔリンパ球へと分化する系統が存在する。したがって、これらのＴリンパ球および／またはＢリンパ球の異常の処置または予防についても本発明の因子または組成物は有効であり得る。このような分化に関する模式的スキームを図１Ａ−Ａに示す。図１Ａ−Ａでは、分化において有用なマーカーも記載されている。このような分化に関するより詳細な説明については、赤司浩一、最新医学  ５６（２）、１５−２３，２００１を参照のこと。この文献は、本明細書において参考として援用される。
【００６６】
（造血幹細胞の同定法）
以下に代表的な造血幹細胞の同定法を説明する。
【００６７】
ａ．脾コロニー形成法
致死量放射線照射したマウスに同系マウスの造血細胞を静注すると、８〜１４日目に脾臓表面に隆起（コロニー）が認められる。各々のコロニーが種々の血液細胞から成っているが、１個のコロニーは１個の幹細胞に由来しており、この脾コロニーを形成する母細胞はＣＦＵ−Ｓ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｉｎ  ｓｐｌｅｅｎ）と呼ばれる。８日目に形成される脾コロニー（Ｄａｙ  ８  ＣＦＵ−Ｓ）を形成する細胞は赤芽球が主体であるのに対し、１２日目形成される脾コロニー（Ｄａｙ  １２  ＣＦＵ−Ｓ）は、赤芽球のほかに顆粒球および巨核球、さらにはＢリンパ球まで含み増殖能も高く、多能性幹細胞に由来している。Ｄａｙ  １２  ＣＦＵ−Ｓは多能性幹細胞の指標として用いられている。また、抗癌剤である５−ｆｌｕｏｒｏ−ｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）投与後に残存する造血幹細胞は非常に高い増殖能を示すことより、ＣＦＵ−Ｓの母細胞にあたるｐｒｅ−ＣＦＵ−Ｓと呼ばれる。当初未分化な造血幹細胞の指標になると思われたＤａｙ  １２  ＣＦＵ−Ｓも実は不均一な細胞集団であり、必ずしも未分化な造血幹細胞の指標にはなりえない。
【００６８】
ｂ．長期骨髄再構築能
移植した細胞により致死量放射線照射されたマウスの造血系を再構築し、長期間維持する事ができるか否かを観察する方法である。現在、造血幹細胞の多分化能と自己複製能をみる上で最も信頼性が高い。マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子の発現、雄雌の性染色体、コンジェニックマウス等が用いられている。この方法では定量化が困難であったが、最近ではドナーの造血細胞とともにレシピエントの造血細胞を移植し、その再構築の割合を調べる競合再集団アッセイが用いられるようになった。また、ヒトにおいてはマウスのようにｉｎ  ｖｉｖｏの移植実験系を組むことは困難であるので、リンパ球が欠如するために拒絶反応を起こさない免疫不全マウス（ｓｃｉｄ  ｍｏｕｓｅ）にヒトの造血幹細胞を移植する  Ｓｃｉｄ−ｈｕマウスが用いられる。この系では、マウスの中で長期間ヒトの造血機構を維持することができる。
【００６９】
ｃ．インビトロコロニー法
造血細胞（骨髄球・脾細胞等）を各種サイトカイン存在下にメチルセルロース、軟寒天等の半固形培地中で培養し、形成された細胞集団（コロニー）から造血幹細胞の数および性質を推定する方法である。このコロニーを分析することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて種々の造血前駆細胞および造血幹細胞の分化・増殖過程の観察や測定が可能になっている。混合コロニー（ＣＦＵ−Ｍｉｘ，ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）および分化能の高いコロニー（ＨＰＰ−ＣＦＣ；ｈｉｇｈ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）は、単系統のコロニーを形成する細胞（ＣＦＵ−ＧＭ，  ＢＦＵ−Ｅ）等より未分化であり、芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ｂｌａｓｔ）は最も未分化であるとされている。この方法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて造血幹細胞や前駆細胞の増殖・分化過程をとらえることができる。さらに、近年では無血清培地を用いたり造血幹細胞の単細胞培養を行うことにより、造血に関与する種々のサイトカインの作用を推定することができる。
【００７０】
ｄ．間質細胞との共培養系
造血幹細胞の分化・増殖には造血微小環境が密接に関与している。１９７７年Ｄｅｘｔｅｒらは、骨髄間質（ストロマ）細胞上で造血幹細胞が数ヵ月以上の長期間にわたって培養可能であることを示した（Ｄｅｘｔｅｒ培養法）が、その後造血を維持する間質細胞株が次々に樹立され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  において造血微小環境の再現が可能になった。この培養系では、造血前駆細胞は早期にコロニー形成能を失うのに対して、未分化な造血幹細胞は長期間コロニー形成能や骨髄再構築能を維持できる。このため、未分化な造血幹細胞活性の測定にも用いられる。特にヒトにおいてはｉｎ  ｖｉｖｏの系が用いにくいため、間質細胞上で長期間コロニー形成能を維持できる細胞をＬＴＣ−ＩＣ（Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）として未分化な造血幹細胞の指標として用いられている。
【００７１】
このように、本発明の診断において、当該分野において公知の技法を用いて診断、検出の補助とすることができる。
【００７２】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。好ましい実施形態では、そのような発現されたポリペプチドは、糖鎖修飾されたＣＤ抗原であり得る。本発明では、発現は、転写および翻訳の両方を含むことが理解される。したがって、本発明のＣＤ抗原の遺伝子の発現を確認する場合、転写物の存在および翻訳物の存在の両方またはその一方を確認することが企図されることが理解されるべきである。
【００７３】
本明細書において「発現」は、直接標識抗体（例えば、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＦＩＴＣ標識ＣＤ抗体、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ標識ＣＤ抗体、ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰｅｒＣＰ標識ＣＤ抗体、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ：ＡＰＣ標識ＣＤ抗体）、一次抗体（例えば、ビオチン化抗ＣＤ抗体）および二次抗体（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ストレプトアビジン）を用いた際の蛍光強度（ＦＩ）で示すことができる。このような表示は、絶対レベルまたは相対レベルで表すことができる。
【００７４】
ｍＲＮＡレベルの発現強度は、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイを用いた発現分析を用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合は、相対的にデンシトメーターを用いて定量化することができ、より詳細に数値化する場合は、マイクロアレイにおいてハウスキーピング遺伝子であるＨＲＰＴに対してそれより少ない発現は陰性、同等を弱陽性およびそれより強い（統計学的に強い）レベルを強陽性であらわすことができる。
【００７５】
本明細書において「発現レベル」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現されるレベルをいう。そのような発現レベルとしては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現レベル、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現レベルが挙げられる。「発現レベルの変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。発現レベルは、絶対レベルまたは相対レベルで評価され得る。
【００７６】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。したがって、あるマーカーの存在を確認するために、そのマーカーに特異的な因子を使用する場合、その因子とマーカーとの相互作用を確認することによって、そのマーカーの存在を確認することができる。
【００７７】
本明細書中で使用される「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物のような物質または関連するタンパク質もしくは化合物のような物質の間、あるいはそれらの組み合わせ
の間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【００７８】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００７９】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。好ましくは、プローブは標識で標識され得る。
【００８０】
プローブとして通常用いられるタンパク質としては、例えば、抗体またはその誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。プローブとして、タンパク質が用いられる場合も、直接または間接的に標識で標識され得る。
【００８１】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅTMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ2−
アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【００８２】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中
の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。また、本発明で使用されるヒトＣＤ抗原では、対応するアミノ酸は、例えば、別の種の対応する抗原の同様の部位であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
【００８３】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスのＣＤ抗原などの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスのＣＤ抗原などの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。そのようなＣＤ抗原は、当業者が本明細書において記載されるような表をもとに、検索することが可能である。
【００８４】
本明細書において「細胞マーカー」とは、細胞を識別することができる任意のマーカーを言う。代表的には、タンパク質（例えば、ＣＤ抗原など）などを挙げることができる。
【００８５】
本明細書において「ＣＤ抗原」とは、ＣＤに対する任意の抗原をいう。ここで、ＣＤとは、分化クラスターの省略形であり、ヒトの白血球分化抗原に対するモノクローナル抗体を，特性によって分類した群をいう。
【００８６】
ＣＤ抗原は、国際ワークショップによって，主にそれが認識する抗原の生化学的特徴（とくに分子量）を基準として群別（ｃｌｕｓｔｅｒ）して分類する（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）ことが合意された．これがＣＤ分類（ＣＤ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とよばれるもので，これにより特定の白血球分化抗原を認識する多くの種類のモノクローナル抗体は，ＣＤに続けて番号すなわちＣＤ番号（ＣＤ  ｎｕｍｂｅｒ）をつけた形（例えばＣＤ１，ＣＤ２など）の統一的な名称がつけられている。本明細書において使用される代表例の説明を以下に示す。
【００８７】
ＣＤ１（４．３〜４．９）：β２ミクログロブリンと非共有結合するＭＨＣクラスＩ様分子（いわゆるＭＨＣクラスＩｂ抗原の一つ）。一部のＴリンパ球への抗原提示を有する。ＣＤ１ａ，ｂ，ｃ，ｄの４種類があり，各々特有の臓器分布を示す。
【００８８】
ＣＤ２（５）免疫グロブリンファミリーの膜貫通のタンパク質。ＬＦＡ−３受容体で，ヒツジ赤血球とのロゼット形成に関与．Ｔリンパ球とＮＫ細胞に発現する。
【００８９】
ＣＤ３（１．６〜２．６）：Ｔリンパ球抗原受容体に会合するシグナル伝達分子である。γ，δ，ε，ζ，ηの５種類分子種からなり，１分子のＴＣＲにつきγ，δ，ε２，ζ２（またはζ，η）の６分子が会合し，機能的な抗原受容体複合体を形成．もっぱらＴリンパ球に発現する。
【００９０】
ＣＤ４（６．２）抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しＴリンパ球抗原受容体複合体の共受容体として機能する。ＭＨＣクラスＩＩ拘束性のヘルパーＴリンパ球に発
現する。
【００９１】
ＣＤ５：Ｔリンパ球表面糖タンパク質 CD5 (リンパ球糖タンパク質 T1/Leu-1)である。
【００９２】
ＣＤ７：Ｔリンパ球抗原 CD7 (Gp40) (Ｔリンパ球白血病抗原) (Tp41) (Leu-9)である
。
【００９３】
ＣＤ８（６．４）：α鎖とβ鎖のＳ−Ｓ結合による二量体タンパク質である。抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に結合し，Ｔリンパ球抗原受容体複合体の共受容体として機能する。ＭＨＣクラスＩ拘束性のキラーＴリンパ球に発現する。
【００９４】
ＣＤ１０：ネプリリシン (EC 3.4.24.11) (中性エンドペプチダーゼ) (NEP) (エンケファリナーゼ) (共通急性リンパ性白血病抗原)(CALLA)である。
【００９５】
ＣＤ１１（１８）：白血球の接着因子β２インテグリン（α鎖とβ鎖からなる二量体）のα鎖である。ＩＣＡＭ−１、Ｃ３ｂｉ、フィブリノゲンなどの受容体として機能し、白血球の接着・遊走・貪食などに関与する。ａ（ＬＦＡ−１），ｂ（Ｍａｃ−１），ｃ（ｐ１５０／９０）の３種類が存在する。単球・顆粒球・リンパ球などに広く発現する。
【００９６】
ＣＤ１３：アミノペプチダーゼ N (EC 3.4.11.2) (ミクロソーム アミノペプチダーゼ)
(Gp150)である。
【００９７】
ＣＤ１４：単球分化抗原 CD14 (骨髄性細胞特異的 ロイシンリッチ糖タンパク質) (LPSレセプター)である。
【００９８】
ＣＤ１５：非タンパク質: Sialyl Lewis (sLE)である。
【００９９】
ＣＤ１６（５〜７）：ＩｇＧに対するＦｃ受容体タイプ＿．膜貫通型と脂質結合型が存在するが，前者はＮＫ細胞に発現され，抗体依存性細胞傷害活性を媒介する。
【０１００】
ＣＤ１９：B-リンパ球抗原CD19 (B-リンパ球表面抗原 B4) (Leu-12)である。
【０１０１】
ＣＤ２０：B-リンパ球抗原CD20 (B-リンパ球表面抗原 B1) (Leu-16) (Bp35)である。
【０１０２】
ＣＤ２２：B-細胞レセプターCD22 (Leu-14) (B-リンパ球細胞 接着分子) (BL-CAM)である。
【０１０３】
ＣＤ２３（４．５）：細胞外にレクチンドメインをもつ膜貫通タンパク質だが，一部は遊離型として血中にも存在し，ＩｇＥに結合．リンパ球・単球・血小板などに広く発現する。
【０１０４】
ＣＤ３３：骨髄性細胞表面抗原 CD33 (Gp67)である。
【０１０５】
ＣＤ３４（１０．５〜１２）  膜貫通性糖タンパク質であり、造血幹細胞に選択的に発現されることから，マーカーとしてその同定や分離に汎用されている。
【０１０６】
ＣＤ４５（１８〜２０）：大きな膜貫通タンパク質で細胞外には多くの糖鎖を，細胞内にはチロシン脱燐酸化活性ドメインをもつ。すべての白血球に発現される主要なタンパク質であり、各種の膜受容体からチロシンキナーゼを介するシグナル伝達の制御に関与する。少なくとも３種類（ＲＯ，ＲＡ，ＲＢ）のイソフォームがあり，各々異なった分布様式を示す。
【０１０７】
ＴｄＴ：末端デオキシヌクレオチド転移酵素（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇなどから入手可能）
ＦＭＣ７：１０５ｋＤａの膜糖タンパク質であり、Ｂリンパ球のサブセットにおいて発現される。正常な成体の５０％以上の末梢Ｂリンパ球がこのＦＭＣ７抗原を有する。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能。
【０１０８】
ＨＬＡ−ＤＲ：ヒト白血球抗原の一種。ＨＬＡ抗原は、クラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原の２群に大別される。クラスＩ抗原としては、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇなどが挙げられる。クラスＩ抗原は、ほとんどすべての有核細胞上に発現している。クラスＩ抗原は、細胞内で産生されるペプチドと複合体を形成し、その複合体を、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球の抗原特異的Ｔリンパ球受容体に提示する。クラスＩＩ抗原としては、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰなどが挙げられる。
【０１０９】
上記抗原は、具体的には、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＵＳＡ；www.bdbiosciences.com）、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）などから購入することができる。
【０１１０】
あるＣＤ抗原がある細胞系統に特有かどうかは、その発現パターンを見て増減があるかないかをみることによって判別することができる。その方法は、以下の通りである。細胞は、その大きさと内部構造によって、リンパ球、単球、顆粒球、血小板、赤血球の系統に大別できる。任意のCD抗体を用いて、それぞれの細胞系統ごとに任意のCD抗体が反応して蛍光を発しているかどうかを検出する。本発明によれば、例示されるＣＤ抗原の組み合わせ以外にも、このようなＣＤ抗原から、ある細胞系（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、血小板、赤血球、単球など）に特有なＣＤ抗原を同定することによって、種々の分析を行うことが可能であることが理解される。
【０１１１】
各種ＣＤ抗原の遺伝子配列などの特徴を示す説明は以下のとおりである。
【０１１２】
【表１−１】
2006194901.tif 000002
【０１１３】
【表１−２】
2006194901.tif 000003
【０１１４】
【表１−３】
2006194901.tif 000004
【０１１５】
【表１−４】
2006194901.tif 000005
【０１１６】
【表１−５】
2006194901.tif 000006
【０１１７】
【表１−６】
2006194901.tif 000007
【０１１８】
【表１−７】
2006194901.tif 000008
【０１１９】
【表１−８】
2006194901.tif 000009
【０１２０】
【表１−９】
2006194901.tif 000010
【０１２１】
【表１−１０】
2006194901.tif 000011
【０１２２】
【表１−１１】
2006194901.tif 000012
【０１２３】
【表１−１２】
2006194901.tif 000013
【０１２４】
【表１−１３】
2006194901.tif 000014
【０１２５】
【表１−１４】
2006194901.tif 000015
本明細書において「分化成熟段階」とは、ある細胞系統について言及するとき、その系統が、幹細胞から、分化細胞へと分化していく段階（レベル）をいう。従来は、このような分化レベルは、測定されていなかったが、本発明では、このような分化成熟段階を同定
することができるようになり、正常な分化経路をたどっているかどうかを判定することが可能となったことから、テイラーメイドの治療を提供することができる。
【０１２６】
（Ｓｔａｇｅの分類）
以下のマーカーに従って、本発明では、各種Ｓｔａｇｅに分類することができる。ここで、より多くのマーカーを使用すれば、Ｓｔａｇｅの分類はより正確に行うことができることが理解される。従って、好ましくは、すべてのＣＤマーカーを使用することができるが、それには限定されない。
【０１２７】
本明細書では、単球系は、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２およびＳｔａｇｅ３に分けることができる。
【０１２８】
単球系Ｓｔａｇｅ１は、ＨＬＡ−ＤＲが陽性、ＣＤ１１ｂが陰性、ＣＤ４５が弱陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ１６が陰性、ＣＤ１３が弱陽性、ＣＤ１４が陰性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ中等度、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１６陰性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性領域ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性領域ＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性領域ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性領域ＣＤ１６陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性領域ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性領域ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ陽性陽性ＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＣＤ１６陰性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ１６陰性領域、かつ、ＣＤ１６陰性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１６陰性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｂを参照）。
【０１２９】
単球系Ｓｔａｇｅ２は、ＨＬＡ−ＤＲが陽性、ＣＤ１１ｂが陽性、ＣＤ４５が陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ１６が陰性、ＣＤ１３が陽性、ＣＤ１４が弱陽性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ中等度、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ４５陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１６陰性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１４弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１６陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１４弱陽性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＣＤ１６陰性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１６陰性領域、かつ、ＣＤ１６陰性ＣＤ１４弱陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１４弱陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１６陰性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｃを参照）。
【０１３０】
単球系Ｓｔａｇｅ３は、ＨＬＡ−ＤＲが陽性、ＣＤ１１ｂが陽性、ＣＤ４５が陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ１６が陰性から弱陽性、ＣＤ１３が陽性、ＣＤ１４が陽性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ中等度、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ４５陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＳＳＣ中等度ＣＤ１４陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１４陽性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＨＬＡ−ＤＲ陽性領域、かつ、ＣＤ１６陰性から弱陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ１６陰性から弱陽性ＣＤ１４陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１４陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１６陰性から弱陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｄを参照）。
【０１３１】
骨髄球系Ｓｔａｇｅ１は、ＨＬＡ−ＤＲが弱陽性から陽性、ＣＤ１１ｂが陰性、ＣＤ４５が弱陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ１６が陰性から弱陽性、ＣＤ１３が弱陽性、ＣＤ１４が陰性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ高レベル、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ弱陽性から陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＨＬＡ−ＤＲ弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ弱陽性から陽性ＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１１ｂ陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＨＬＡ−ＤＲ弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ１６陰性から弱陽性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陰性ＣＤ１６陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ１６陰性から弱陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１６陰性から弱陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｅを参照）。
【０１３２】
骨髄球系Ｓｔａｇｅ２は、ＨＬＡ−ＤＲが陰性から弱陽性、ＣＤ１１ｂが弱陽性、ＣＤ４５が弱陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ１６が弱陽性、ＣＤ１３が弱陽性、ＣＤ１４が陰性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ高レベル、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１６弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１１ｂ弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１６弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性ＣＤ１１ｂ弱陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１１ｂ弱陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ１６弱陽性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ弱陽性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ弱陽性ＣＤ１６弱陽性領域、かつ、ＣＤ１６弱陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１６弱陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｆを参照）。
【０１３３】
骨髄球系Ｓｔａｇｅ３は、ＨＬＡ−ＤＲが陰性から弱陽性、ＣＤ１１ｂが陽性、ＣＤ４５が弱陽性から陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ１６が弱陽性、ＣＤ１３が弱陽性、ＣＤ１４が陰性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ高レベル、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性から陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１６弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１６弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ１６陰性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１３弱陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１６陰性領域、かつ、ＣＤ１６陰性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陰性ＣＤ１６陰性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｇを参照）。
【０１３４】
骨髄球系Ｓｔａｇｅ４は、ＨＬＡ−ＤＲが陰性から弱陽性、ＣＤ１１ｂが陽性、ＣＤ４５が弱陽性から陽性、ＣＤ１０が弱陽性、ＣＤ１６が陽性、ＣＤ１３が陽性、ＣＤ１４が陰性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ高レベル、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性から陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ４５弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１６陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１３陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１６陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０弱陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０弱陽性ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ１６陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１６陽性領域、かつ、ＣＤ１６陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０弱陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０弱陽性ＣＤ１６陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｈを参照）。
【０１３５】
骨髄球系Ｓｔａｇｅ５は、ＨＬＡ−ＤＲが陰性から弱陽性、ＣＤ１１ｂが陽性、ＣＤ４
５が陽性、ＣＤ１０が陽性、ＣＤ１６が陽性、ＣＤ１３が陽性、ＣＤ１４が陰性という特徴を有し、ＦＳＣ高レベルＳＳＣ高レベル、かつ、ＦＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１０陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１６陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１３陽性領域、かつ、ＦＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１０陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１６陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１３陽性領域、かつ、ＳＳＣ高レベルＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１０陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１６陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性領域ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陽性ＣＤ１１ｂ陽性領域、かつ、ＣＤ１０陽性ＨＬＡ−ＤＲ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ１６陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１３陽性領域、かつ、ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ１６陽性領域、かつ、ＣＤ１６陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陽性ＣＤ１４陰性領域、かつ、ＣＤ１０陽性ＣＤ１６陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｉを参照）。
【０１３６】
Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ１は、ＣＤ２０が陰性、ＣＤ１０が陽性、ＣＤ４５が弱陽性、ＣＤ３４が陽性、ＣＤ５が陰性、ＣＤ１９が弱陽性から陽性という特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ２０陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ５陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ２０陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ５陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ２０陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１０陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ３４陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ５陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ２０陰性ＣＤ１０陽性領域、かつ、ＣＤ３４陽性ＣＤ１０陽性領域、かつ、ＣＤ３４陽性ＣＤ２０陰性領域、かつ、ＣＤ５陰性ＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ３４陽性ＣＤ１９弱陽性から陽性領域、ＣＤ３４陽性ＣＤ５陰性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｊを参照）。
【０１３７】
Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ２は、ＣＤ２０が弱陽性、ＣＤ１０が陽性、ＣＤ４５が弱陽性から陽性、ＣＤ３４が陰性、ＣＤ５が陰性、ＣＤ１９が弱陽性から陽性という特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ２０弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性から陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ５陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ２０弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ５陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ２０弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１０陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ５陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性から陽性ＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ２０弱陽性ＣＤ１０陽性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ１０陽性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ２０弱陽性領域、かつ、ＣＤ５陰性ＣＤ１９弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ１９弱陽性から陽性領域、ＣＤ３４陰性ＣＤ５陰性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｋを参照）。
【０１３８】
Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ３は、ＣＤ２０が陽性、ＣＤ１０が陰性から弱陽性、ＣＤ４５
が陽性、ＣＤ３４が陰性、ＣＤ５が弱陽性、ＣＤ１９が陽性という特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ２０陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ５弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１９陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ２０陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ５弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１９陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ２０陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１０陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ５弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１９陽性領域、かつ、ＣＤ２０陽性ＣＤ１０陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ１０陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ２０陽性領域、かつ、ＣＤ５弱陽性ＣＤ１９陽性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ１９陽性領域、ＣＤ３４陰性ＣＤ５弱陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｌを参照）。
【０１３９】
Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ４は、ＣＤ２０が陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ４５が陽性、ＣＤ３４が陰性、ＣＤ５が陰性、ＣＤ１９が陽性という特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ２０陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ５陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１９陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ２０陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ５陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１９陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ２０陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ５陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１９陽性領域、かつ、ＣＤ２０陽性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ２０陽性領域、かつ、ＣＤ５陰性ＣＤ１９陽性領域、かつ、ＣＤ３４陰性ＣＤ１９陽性領域、ＣＤ３４陰性ＣＤ５陰性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｍを参照）。
【０１４０】
Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ１は、ＣＤ１ａが陰性から弱陽性、ＣＤ３４が陰性から弱陽性、ＣＤ４５が弱陽性、ＣＤ３が陰性、ＣＤ８が陰性、ＣＤ１０が陽性、ＣＤ４が陰性という特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１ａ陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陰性から弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ８陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０強陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１ａ陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陰性から弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ８陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０強陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１ａ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ３４陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ３陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ８陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１０強陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ４陰性領域、かつ、ＣＤ１ａ陰性から弱陽性ＣＤ３４陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ３陰性ＣＤ３４陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ３陰性ＣＤ１ａ陰性から弱陽性領域、かつ、ＣＤ８陰性ＣＤ１０強陽性領域、かつ、ＣＤ４陰性ＣＤ１０強陽性領域、かつ、ＣＤ４陰性ＣＤ８陰性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｎを参照）。
【０１４１】
Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ２は、ＣＤ１ａが陽性、ＣＤ３４が陰性、ＣＤ４５が弱陽性、ＣＤ３が陰性、ＣＤ８が弱陽性から陽性、ＣＤ１０が弱陽性から陽性、ＣＤ４が弱陽性から陽性という特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１
ａ陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ８弱陽性から陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０弱陽性から陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１ａ陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ８弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０弱陽性から陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１ａ陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ３陰性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ８弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ１０弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４５弱陽性ＣＤ４弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ１ａ陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ３陰性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ３陰性ＣＤ１ａ陽性領域、かつ、ＣＤ８弱陽性から陽性ＣＤ１０弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４弱陽性から陽性ＣＤ１０弱陽性から陽性領域、かつ、ＣＤ４弱陽性から陽性ＣＤ８弱陽性から陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｏを参照）。
【０１４２】
Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ３は、ＣＤ１ａが弱陽性、ＣＤ３４が陰性、ＣＤ４５が陽性、ＣＤ３が弱陽性、ＣＤ８が陽性、ＣＤ１０が弱陽性、ＣＤ４が陽性という特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１ａ弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ８陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１ａ弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ８陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４陽性性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１ａ弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ３弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ８陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ４陽性領域、かつ、ＣＤ１ａ弱陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ３弱陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ３弱陽性ＣＤ１ａ弱陽性領域、かつ、ＣＤ８陽性ＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＣＤ４陽性ＣＤ１０弱陽性領域、かつ、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｐを参照）。
【０１４３】
Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ４は、ＣＤ１ａが陰性、ＣＤ３４が陰性、ＣＤ４５が陽性、ＣＤ３が陽性、ＣＤ１０が陰性、ＣＤ４とＣＤ８は陽性であるが両陽性細胞は認められなくなるという特徴を有し、ＦＳＣ低レベルＳＳＣ低レベル、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１ａ陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ３陽性領域、かつ、ＦＳＣ低レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１ａ陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３４陰性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ４５陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ３陽性領域、かつ、ＳＳＣ低レベルＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１ａ陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ３陽性領域、かつ、ＣＤ４５陽性ＣＤ１０陰性領域、かつ、ＣＤ１ａ陰性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ３陽性ＣＤ３４陰性領域、かつ、ＣＤ３陽性ＣＤ１ａ陰性領域、かつ、ＣＤ４とＣＤ８がそれぞれ陽性領域という形態で同定される（図１Ａ−Ｑを参照）。
【０１４４】
本発明において使用され得るマーカーとしては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴｄＴ、ＦＭＣ７およびＨＬＡ−ＤＲなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１４５】
本発明において使用され得る細胞マーカーは、Ｂリンパ球系統について、ＣＤ１０とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１９とＣＤ２３とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ５とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択され得るがそれらに限定されない。
【０１４６】
本発明において使用され得る細胞マーカーは、Ｔリンパ球系統について、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ８とＣＤ７とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ４とＣＤ８とＣＤ１０とＣＤ４５からなる群より選択され得るがそれらに限定されない。
【０１４７】
本発明において使用され得る細胞マーカーは、骨髄球系統または単球系統について、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｂとＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１６とＣＤ１３とＣＤ３３とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１４とＣＤ３３とＣＤ１１ｂとＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ１０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１１ｂとＣＤ１３とＣＤ１６とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ１０とＣＤ４とＣＤ１４とＣＤ４５との組み合わせからなる群より選択され得るがそれらに限定されない。
【０１４８】
このような細胞マーカーは、その発現レベルを測定することによって、Ｓｔａｇｅを同定することができることが理解される。このようなレベルは、絶対レベルまたは相対レベルで評価され得る。
【０１４９】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の方法またはシステムを使用することができる。
【０１５０】
本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、本発明の抗体または単鎖抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の遺伝子の転写産物・翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
【０１５１】
（フローサイトメトリを用いたヒト末梢血白血球の分離と、フローサイトメトリ法によるリンパ球サブセットの計測例）
本明細書において「フローサイトメトリ」とは、液体中に懸濁する細胞，個体およびその他の生物粒子の粒子数，個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。この技術を用いた装置は、「フローサイトメーター」という。フローサイトメーターは、細胞の均一な浮遊液より、浮遊物（細胞）の光学特性を測定する機器である。細胞は液流に乗ってレーザー光の焦点を通過するが、その通過時に毎秒  ５００−４，０００個の細胞より前方散乱光、側方散乱光、及び３つの異なる波長の蛍光の計５種類の光学特性を、個々の細胞について同時に測定し、それら細胞のの大きさ、内部構造、及び細胞膜・細胞
質・核内に存在する種々の抗原あるいは核酸量等の、生物学的特性を迅速、かつ正確に測定することができる。
【０１５２】
散乱光とは、レーザーが細胞に当たって周囲に散乱した光である。前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）はレーザー光軸に対して前方で検出し、散乱光強度は細胞の表面積に比例する。すなわち、相対的にＦＳＣの値が大きければ細胞も大きく、ＦＳＣの値が小さければ細胞も小さいと考えられる。側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）はレーザー光軸に対して９０度（直角）の位置で検出し、細胞の顆粒や細胞内構造の状態に散乱光強度が比例する。すなわち、相対的にＳＳＣの値が大きければ細胞の内部構造は複雑であり、ＳＳＣの値が小さければ細胞の内部構造は単純であると考えられる。
【０１５３】
フローサイトメトリの結果は、代表的には、ＦＳＣをＸ軸に、ＳＳＣをＹ軸にとったドットプロットとして表現され得る。各細胞は図の中の一つのドット（点）で示されており、それらの位置は、ＦＳＣとＳＳＣとの相対値によって決められる。比較的サイズが小さく内部構造が単純なリンパ球は左下部に、サイズが大きく内部に顆粒を持つ顆粒球は右上部に、またサイズは大きいが内部構造が単純な単球はリンパ球と顆粒球の間に、それぞれお互いに分離した集団を作って表示される。
【０１５４】
蛍光とは、細胞に標識されている蛍光色素が照射されたレーザー光によって励起され、エネルギーを放出する際生じた光をいう。フローサイトメーター（例えば、製品名：Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）は、代表的には、４８８ｎｍの単一波長レーザー光と６３５ｎｍの単一波長レーザー光とを照射する。細胞はそれ自体も弱い蛍光を発する性質を有しているが（自家蛍光）、実際に細胞の持つ分子を蛍光を用いて特異的に検出しようとする場合は、あらかじめ何らかの形で細胞あるいはその持つ分子に蛍光色素  を結合させる必要がある。例えば、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）は、４８８ｎｍの励起光を吸収し、主に５３０ｎｍの蛍光（緑色）を発する。抗体にあらかじめＦＩＴＣを標識しておけば、細胞の表面に存在する抗原量に応じて結合する抗体量に差が生じ、その結果ＦＩＴＣの蛍光強度が異なってくるため、その細胞の表面に存在する抗原量を推定することができる。例示的に使用され得るＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒは、異なる蛍光波長域を検出できる４本の蛍光検出器を搭載しており、異なった波長の光を発する複数の蛍光色素を用意しておけば、最大４つの異なる抗原を同時に検出することが可能である。４８８ｎｍの単一波長レーザー光によって励起されるＦＩＴＣ以外の蛍光色素として、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）は主に５８５ｎｍの蛍光を発し、ＰｅｒＣＰ（ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＰＥ−Ｃｙ５（ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎ−５）は主に６７０ｎｍの蛍光を発する。６３５ｎｍの単一波長レーザー光によって励起される蛍光色素であるＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）は、主に６７０ｎｍの蛍光を発する。これらの蛍光色素が種々の抗体と組み合わされ、細胞の二重染色や三重染色に用いられる。Ｂリンパ球表面に発現しているＣＤ１９分子など、およびＴリンパ球の表面に発現しているＣＤ４およびＣＤ８分子などを、これらと特異的に反応するモノクローナル抗体で検出することができる。
【０１５５】
厳密にいうと、フローサイトメトリは、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）が発展したものである。「ＦＡＣＳ」とは、レーザー光線を使ってリンパ球などの遊離細胞の表面抗原の解析をしたり表面抗原の有無などによって細胞を分離および解析する方法およびこの方法において用いられる装置をいう。
【０１５６】
フローサイトメトリの結果は、ヒストグラム、ドットプロットなどで表すことができる
。
【０１５７】
本明細書において「ヒストグラム」とは、フローサイトメーターを用いた蛍光測定において、各パラメーターの光信号の強度をＸ軸に、細胞数をＹ軸にとったグラフをいう。このような形態により、総計で１万個以上の細胞を計数することが可能である。
【０１５８】
本明細書において「ドットプロット」とは、二種類の蛍光色素の蛍光強度をＸ軸とＹ軸にとったプロットという。二重染色および三重染色をした場合には、それぞれの蛍光強度をＸあるいはＹ軸におき、個々の細胞が二次元グラフ上の一つ一つの点に対応するような表示方法を用いて解析することができる。
【０１５９】
例えば、末梢血もしくは骨髄液を採取後、溶血法か比重遠心法にて赤血球を除いた後に蛍光標識抗体（目的とする抗原に対する抗体とそのコントロール抗体）と反応させ、十分に洗浄してからフローサイトメトリを用いて観察することができいる。検出された散乱光や蛍光は電気信号に変換されコンピューターにより解析される。その結果は、ＦＳＣの強さは細胞の大きさを表しＳＳＣの強さは細胞内構造を表すことによりリンパ球、単球、顆粒球を区別することが可能である。その後、必要に応じて目的とする細胞集団をゲートしそれらの細胞における抗原発現様式を検討する。
【０１６０】
代表的な例として、ヒト末梢血単核白血球（単核球）の分離と生細胞数の算出は、フローサイトメトリーを用いて、例えば以下のようなプロトコルをもとに行うことができる。
【０１６１】
採血：採血者は供血者の静脈穿刺部位より５ｃｍ以上近位に駆血帯をかけ、静脈を怒張させ固定させる。このとき、供血者に拳を握らせる。静脈穿刺部位を酒精綿でやや強くこするように消毒してから採血を行う。注射器に６ｍｌの採血が終了したら駆血帯を外し、すばやく針を抜き、ただちに穿刺部位を酒精綿で圧する。出血がある程度止まったら、救急絆創膏を貼る。注射針を適切に処理し、採取した血液とヘパリン（または他の抗凝固剤）とを混和させるために注射器を数回転倒させる。
【０１６２】
血液希釈：採血した血液を注射器から１５ｍｌ遠心分離管に移す。６ｍｌのＰＢＢＳ（０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水；組成：  ＮａＣｌ７．２０ｇ、ＫＣｌ  ０．３２０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２０ｇ、ＣａＣｌ２  ０．１４０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．２０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２０ｇ、グルコース  １．００ｇ、フェノールレッド  ０．０１０ｇ。精製水で総量を  １リットルとする。）を加えて血液を２倍量に希釈する（採血量が６ｍｌ以下の場合は、添加するＰＢＢＳを増やすことにより、希釈後の液量を１２ｍｌに調整する）。希釈血液はピペッティングにより、泡が立たないように攪拌する。
【０１６３】
比重遠心法による単核細胞の分離：予めリンパ球分離液（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；３ｍｌ）が入った遠心分離管を２本調製しておく。上記のように調製した希釈血液の６ｍｌを、各遠心分離管のリンパ球分離液の上に、パスツールピペットを用いて静かに、分離液と希釈血液との界面を乱さないように重層する。分離液に希釈血液を重層させた遠心分離管を遠心分離器により１５００ｒｐｍにて３０分間遠心分離する。
【０１６４】
単核細胞の回収：リンパ球および単球を含む末梢血単核細胞は、血漿（黄色味を帯びる）と分離液（透明）との中間に、白い帯状の層として観察される。一方、赤血球および顆粒球は、遠心分離管の底に沈む。白い帯状の単核細胞層をパスツールピペットで吸い上げるように回収し、それを新しい１５ｍｌ遠心分離管（細胞洗浄用）に入れる。２本の遠心分離管から回収した単核細胞浮遊液を同一の洗浄用遠心管にまとめ、それら細胞浮遊液に適宜ＰＢＢＳを加えて、全液量を１２ｍｌにする。ピペッティングにより泡立てないように攪拌した後、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することで細胞をペレット化する。遠心分離後、流しのアスピレーターで上清を吸引除去する。細胞ペレットにＰＢＢＳを１０ｍｌ加えて、駒込ピペットで細胞を丁寧に再浮遊させ、再び１５００ｒｐｍ、１０分間遠心した後、上清を吸引することにより、細胞からリンパ球分離液を完全に洗浄除去する。
【０１６５】
必要に応じて生細胞数の算定する。上清を吸引除去した細胞ペレットに、ショートピペットでＰＢＢＳを３ｍｌ加え、パスツールピペットを用いて細胞を再浮遊させる（細胞の固まりがなくなるまで十分攪拌する）。
【０１６６】
先端にチップを着けたマイクロピペットで遠心管の細胞浮遊液５０μｌを取り（浮遊液中の細胞が重力で下に沈まないよう、素早く操作する）、エッペンドルフチューブに移し、このチューブにあらかじめ入れてある０．１％トリパンブルー溶液（５０μｌ）と細胞浮遊液を、ピペッティングにより丁寧に攪拌する。
【０１６７】
これは、例えば、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ血球計算盤にカバーガラスを載せ、計算盤とカバーガラスの隙間に、マイクロピペットでトリパンブルー液と混ぜた細胞浮遊液を入れる（毛細管現象で吸い込まれる）。計算盤とカバーガラスの隙間に入れる液量として、およそ７ｌが適量であるが、カバーガラスの着け方（計算盤との位置関係）によっては、その液量を必要に応じて微調整する。液量が適当であれば、計算盤とカバーガラスの密着面にニュートンリングが確認できる。
【０１６８】
Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ計算盤を顕微鏡に載せ、コンデンサーの絞りを絞って目盛が見えるようにする。このタイプの血球計算盤には、右の図のように一辺１ｍｍの正方形が９つある。細かく区画された中央の正方形は赤血球を数えるのに使う。今回は白血球を数えるので、四隅にある区画の大きい正方形のどれか一つを使う。外側を区画する三重線の一番外までが１ｍｍの辺であることに注意する。
【０１６９】
１ｍｍ四方の正方形の中に含まれる細胞数を数えるが、青く染まっているのは死細胞、丸く透明に見えるのが生細胞である。１ｍｍ四方中の生細胞数と死細胞数の両方を数えよ。
【０１７０】
計算盤の目盛面とカバーガラスの間の隙間は０．１ｍｍになるように作られている。従って、ここで数えた細胞の数は、底面が一辺１ｍｍの正方形で、高さが０．１ｍｍの直方体に相当する体積の浮遊液中にある細胞数となる。
【０１７１】
必要に応じて細胞浮遊液の濃度調整する。上で計算した細胞密度を基に、最終的な細胞濃度が１．０×１０６個／ｍｌになるように、細胞浮遊液にＰＢＳを加えて調整する。細胞浮遊液は冷蔵庫に保存する。
【０１７２】
上記のように調製したヒト末梢血単核細胞浮遊液（１×１０６／ｍｌに調整済み）を用いて、以下の分析を行う。
【０１７３】
ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ抗体（例えば、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体）（１０μｇ／ｍｌに調整済み）：２０μｌ
ＰＥ標識抗ＣＤ抗体（例えば、ＰＥ標識ＣＤ８抗体）（１０μｇ／ｍｌに調整済み）：２０μｌ  ０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）入りリン酸緩衝平衡塩類溶液（ＰＢＳ）
マイクロピペッター、マイクロピペッター用チップ、エッペンドルフチューブ、ショートピペット、パスツールピペット、駒込ピペットなど
水流式アスピレーター
エッペンドルフチューブ用マイクロ遠心分離機。
【０１７４】
（操作手順）
Ａ）エッペンドルフチューブを２本用意し、蓋にＡ、Ｂと記入し、上記のごとく作製した末梢血単核細胞の浮遊液をそれぞれのチューブに１ｍｌずつ入れる（１チューブあたり１×１０６個の細胞が入ることになる）。マイクロ遠心分離機にて３，０００ｒｐｍで３分間遠心して、細胞ペレットを残して上清のみを吸引除去する。
【０１７５】
Ｂ）Ａと記入したチューブに、先端にチップを着けたマイクロピペッターで抗ＣＤ４抗体液を５０μｌ添加し、その同じチップのままでピペッティングにより、泡を立てずに、細胞を再浮遊させる。次に、マイクロピペッターのチップを新しいものに交換し、同じチューブに適切な、例えば、抗ヒトＣＤ８抗体液を５０μｌ添加し、同様にして抗体液と細胞浮遊液を撹拌混合する。その後、チューブは氷上に置いて抗体を細胞に結合させる。
【０１７６】
Ｃ）Ｂと記入したチューブにマイクロピペットで、例えば、抗ヒトＣＤ１９抗体液を１００μｌ添加し、同様にして抗体液と細胞浮遊液を撹拌した後、チューブを氷上に置く。
【０１７７】
Ｄ）チューブを氷上においてから３０分が経過したら、それぞれのチューブに駒込ピペットでＰＢＢＳを１ｍｌずつ加え、マイクロ遠心分離機にて３，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離して、上清を吸引除去する。
【０１７８】
Ｅ）細胞ペレットのみを残して上清を吸引した各チューブに、先端が細胞に触れないように注意しながら駒込ピペットでＰＢＢＳを１ｍｌずつ加え、パスツールピペットを使って  Ａのチューブの細胞に液を吹きかけるようにして丁寧に浮遊させる。次にパスツールピペットを新しいものに換えて、Ｂのチューブの細胞を浮遊させる。マイクロ遠心機にて３，０００ｒｐｍ、３分間遠心し、上清を吸引除去する。
【０１７９】
Ｆ）細胞ペレットのみを残して上清を吸引した各チューブに、先端が細胞に触れないように注意しながら駒込ピペットでＰＢＢＳを０．５ｍｌずつ加える。チューブを氷上に置く。
【０１８０】
Ｇ）細胞の浮遊液を目の粗いフィルターに通過させ、細胞の凝集塊などの大きなかたまりを除くと同時に、細胞浮遊液をフローサイトメーター解析用チューブに移し、蓋をする。再び細胞浮遊液の入ったチューブを氷上に置く。
【０１８１】
Ｈ）フローサイトメーターによって１０，０００個の単核細胞を解析し、データ解析ソフトウェア（例えば、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標））を用いて染色データを可視化する。チューブＡはＦＩＴＣとＰＥとの２重染色なのでドットプロットで解析し、ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合を調べる。チューブＢは単染色なのでヒストグラムで解析し、細胞表面ＣＤ１９陽性細胞の割合を調べる。
【０１８２】
（診断）
本明細書において「診断」とは、被検体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の細胞の分化段階を調べることができ、そのような情報を用いて、被検体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。
【０１８３】
本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができることから、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である
。
【０１８４】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。
【０１８５】
本明細書において「被検体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被検体は好ましくは、ヒトであり得る。
【０１８６】
本発明が対象とする「疾患」は、細胞の分化段階が関連するかまたは処置時にその分化段階が関連する、任意の疾患であり得る。そのような疾患としては、貧血、がん（例えば、癌、白血病、リンパ腫など）、免疫疾患などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１８７】
本発明が対象とする「障害」は、分化段階が関連する任意の障害であり得る。
【０１８８】
そのような疾患、障害または状態の具体例としては、例えば、循環器系疾患（貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、がん性貧血など）、がんまたは腫瘍（例えば、白血病、多発性骨髄腫）など）；免疫系疾患（Ｔリンパ球欠損症、白血病など）；呼吸器系疾患（肺がん、気管支がんなど）；消化器系疾患（原発性肝がんなど）；泌尿器系疾患（膀胱がんなど）；生殖器系疾患（男性生殖器疾患（前立腺がん、精巣がんなど）、女性生殖器疾患（子宮がん、卵巣がんなど）など）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１８９】
本明細書において「がん」または「癌」は、互換可能に用いられ、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壊性に浸潤し得あるいは転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、がんは固形がんおよび造血器腫瘍を含むがそれらに限定されない。
【０１９０】
本明細書において「白血病」または「造血器腫瘍」とは、交換可能に用いられ、未熟な造血細胞の腫瘍性増殖を伴う疾患を総称して言う。増殖する白血球細胞が骨髄球系かリンパ系かにより，骨髄性白血病とリンパ性白血病とに大別される。
【０１９１】
本明細書において「骨髄性白血病(myelogenous leukemia)」とは、臨床的に急性と慢性に分類される．未熟な白血球の腫瘍性増殖と蓄積を伴うだけでなく，正常の骨髄球の増殖や分化過程も抑制することが知られる。慢性骨髄性白血病は骨髄幹細胞の腫瘍化によると考えられ，腫瘍細胞は多分化能をもち，さまざまな分化段階の腫瘍細胞が認められる。
【０１９２】
本明細書において「慢性骨髄性白血病」は骨髄幹細胞の腫瘍化によるものが多いと考えられる。腫瘍細胞は多分化能をもち，さまざまな分化段階の腫瘍細胞が認められるている。従って、分化段階を種々に判定することは、テイラーメイド治療には必要である。
【０１９３】
本明細書において「急性骨髄性白血病」は白血球の各成熟段階の未熟骨髄球の腫瘍性増殖からなり，その特殊なものとして，急性前骨髄球性白血病や急性単球性白血病などがある。慢性骨髄性白血病と同様，骨髄・肝臓・脾臓などを侵し，一般に予後不良．急性骨髄性白血病は家族集積性も報告されており，さまざまな染色体異常を伴うことが知られている。従って、分化段階を種々に判定することは、テイラーメイド治療には必要である。特に、多くの場合、赤血球、白血球、血小板の3系統のうち1〜3系統の細胞数が減少するこ
とが知られており、貧血や感染症にかかりやすくなったり、出血が止まらなくなるという症状が起こることも頻繁に生じることから、系統に応じた治療を行うことが重要である。
【０１９４】
本明細書において「リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）」とは、若年者にみられることが多く，その大部分は急性リンパ性白血病である．腫瘍細胞はＢリンパ球（Ｂリンパ球）またはＴリンパ球（Ｔリンパ球）の形質を示すものと，それをもたないものに大別される．日本の九州地方やカリブ海沿岸諸国にみられる成人Ｔリンパ球白血病（ａｄｕｌｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，  ＡＴＬ）は５０歳前後の成人にみられる慢性リンパ性白血病である。ＨＴＬＶ−ＩがＣＤ４リンパ球に感染して発生する．主な感染経路は母子感染で，現在日本には約１００万人の感染者が存在し，約１００人に１人の割合で成人Ｔリンパ球白血病が発生すると考えられている。療法としては，代謝拮抗剤・アルキル化剤・一部の抗生物質・植物アルカロイド・副腎皮質ホルモンなどの投与が行われる。
【０１９５】
造血器腫瘍、特に白血病の分類はＦＡＢ（Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｏｎ）による形態学的・細胞化学的分類によってなされていたが、近年では白血病の病因・病態をより反映しうる特徴的な染色体異常によって層別化されている（ＷＨＯ分類）。しかし、白血病は非常に多様な疾患が混在しており、これらの分類だけではその白血病細胞の特性を正確に理解することは困難である。したがって、表面抗原、免疫遺伝子解析、特異的遺伝子変異の検索、などは白血病細胞の特性のみならず、治療戦略を考える上でも重要であり、本発明を利用した分析およびその結果を利用することは重要であると考えられる。フローサイトメトリを用いた腫瘍細胞の表面抗原発現様式の検討は、細胞のクロナリティ、細胞起源、診断、治療法、予後予測のためには不可欠な検査となっているが、その検査法における長所と短所を十分理解している必要がある。
【０１９６】
長所としては多数の細胞を短時間で検索できるのみならず、多重染色をすることにより１個の細胞に発現している複数の抗原を同時に検索することが可能である。この制限を少しでも緩和する目的で導入されたのが、ＣＤ４５ｂｌａｓｔ  ｇａｔｉｎｇ法（宮崎年恭，ほか！フローサイトメトリ一法による急性白血病表面マーカー解析におけるＣＤ４５抗体を用いたｇａｔｉｎｇ法．臨床血液３７：２１４〜２２０，１９９６）である。ＣＤ４５抗原は白血球共通抗原であり、全ての系統の白血球に発現しているが、各系統の種類によって発現量に差が認められる。また、その発現量は未熟な分化成熟段階にある白血球では少なく、分化成熟が進むにつれ増大する。
【０１９７】
このような細胞表面のＣＤ４５抗原の発現量を利用して、骨髄血中の細胞は各系統別に、また分化成熟段階別に分類され、細胞表面抗原の発現パターンが詳細に調べることが可能となる。しかし、ほとんど増殖していないような腫瘍細胞ではＣＤ４５の発現が高値であること、ウイルス感染時の活性化Ｔリンパ球や、化学療法後の骨髄回復期ではＣＤ４５弱発現正常細胞の出現が見られることを留意する必要がある。急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  １ｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ））においては、ＣＤ４５  Ｂｌａｓｔ  Ｇａｔｉｎｇ法によるデータ表示とＦＡＢ分類の間に相関が見られる。他方、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）では、ＣＤ４５抗原の発現強度に一定のパターンは認められないばかりでなく、ではＣＤ４５陰性の症例も認められることが報告されている。
【０１９８】
白血病細胞の検索は、骨髄液もしくは末梢血より溶血法を用いて白血球分離後または比重遠心分離法を用いて、単核球細胞を分離後にフローサイトメトリにより表面抗原発現様式により行うことができる。診断のためには細胞の系統（ｌｉｎｅａｇｅ）、分化段階（ｓｔａｇｅ）に関与するＣＤ抗原などに対するモノクローナル抗体を用いる。特にＦＣＭを用いた白血病細胞の解析は、どのようなＣＤ抗原を、どのように組み合わせるかということが重要であり、白血病細胞の特徴を考えて解析パネル（抗体の組み合わせ〕を作成することが重要である。
【０１９９】
代表的な抗原は幹細胞抗原としてはＣＤ３４、ＣＤ１１７、骨髄球系としてはＣＤ３３、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｌｌｂ、単球系細胞としては、ＣＤ１４、Ｂリンパ球系としては、ＣＤＩ９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、Ｔリンパ球系としてはＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤｌａ、ＮＫ細胞系としては、ＣＤ５６がありこれらの抗原発現様式にて白血病細胞のｌｉｎａｇｅを決定することができる。これに加え、本発明において同定されるような他の抗原を用いることが可能である。
【０２００】
さらに細胞質内ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｏ（ＭＰＯ）、ＣＤ３、ＣＤ２２およびＣＤ７９の発現、ならびに免疫グロブリン遺伝子やＴリンパ球受容体遺伝子のクローナルな再構成、染色体分析などの結果とあわせることによって、より的確な診断が可能となる。ＡＭＬまたはＡＬＬを対象とする場合は、白血病細胞の系統（ｌｉｎｅａｇｅ）を明確にすることを念頭にパネルを作成することによって、病型をさらに詳細に分類することも可能である。
【０２０１】
時に白血病細胞では２種類以上の系統にわたる表面抗原を発現する場合が存在する（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ、１ｉｎｅａｇｅ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）。個々の白血病細胞に特異的なＣＤ抗原を用いて解析パネルを作成することにより微小残存病変（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＭＲＤ）の検出も可能となる。
【０２０２】
その代表的な白血病である抗原発現異常白血病（ａｂｅｒｒａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）を、その細胞学的・臨床病態的特性を簡潔に説明する。
【０２０３】
ＣＤ７＋急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ））：ＣＤ７は汎Ｔリンパ球抗原であり、その発現はＴリンパ球性白血病に見られるが、ＡＭＬの一部にも発現している。したがって、ＭＰＯと細胞質内ＣＤ３の双方が陰性の場合はＡＭＬ（ＭＯ）とＴ-ＡＬＬの鑑別が必要であり注意を要す。ＡＭＬにおけるＣＤ７の発現は約４０％に見られ、その発現は予後不良因子である可能性が報告されているが、別の検討では予後に差異は見られなかったとされている。おそらく、ＣＤ７＋ＡＭＬは多彩な白血病の集団であり、その発現はdenovoＡＭＬのみならずＭＤＳより移行したＡＭＬにおいて高頻度で見られ、これらのＭＤＳ／ＡＭＬは難治性であることがＣＤ７＋ＡＭＬの病態に影響を及ぼしている可能性が推測される。また、慢性骨髄性白血病からの骨髄性急性転化例では高頻度にＣＤ３４、ＣＤ７の発現が認められることが報告されている。これらのことは幹細胞レベルの細胞が腫瘍化した場合にＣＤ７が出現することを意味するようである。
【０２０４】
ＣＤ１９＋ＡＭＬ：ＣＤ１９は汎Ｂリンパ球抗原であるが、ＣＤ７と同様にＡＭＬにもその発現を見る場合がある。ＣＤ７＋ＡＭＬが多彩な白血病細胞の集団であるのと異なり、ＣＤ１９＋ＡＭＬのほとんどが染色体異常であるｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を持ち、多くはＦＡＢ分類上Ｍ２に分類される。ＣＤ１９  ＡＭＬは、成人によく見られ、白血病細胞は分化傾向を持ち、好酸球増加、予後良好などの特徴を持つ、またＷＨＯ分類では予後良好な単一疾患とされている。しかし、一部には予後不良群も存在しており、不良因子としてＣＤ５６の発現、付加的染色体異常、髄外腫瘤の存在などが示唆されている。
【０２０５】
ＣＤ５６＋ＡＭＬ：ＣＤ５６はＮＫ細胞に見られる抗原であるぷＡＭＬ細胞に発現していることがある。上記のようにｔ（８；２１）ＡＭＬにおけるＣＤ５６の発現は予後不良因子である可能性が示唆されているが、ＡＭＬＭ３に対する全トランスレチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を用いた治療においても予後不良因子
であるようである。
【０２０６】
ＣＤ１５＋ＣＤ１１７＋ＡＭＬ：ＣＤ１５は頼粒球や単球に発現する一方、ＣＤ１１７は幹細胞抗原であり未分化細胞に発現する。双方の発現は正常細胞で同一細胞に見られることはないが、一部のＡＭＬではそれらの発現が見られることがあり、これらの白血病は予後良好であるようである。
【０２０７】
ＣＤ３３／ＣＤ１３＋急性リンパ性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＬＬ））：ＣＤ３３、ＣＤ１３はともに骨髄球系抗原であるが、ＡＬＬにそれらの発現が見られる症例があり、これらは骨髄球系抗原（ｍｙｅｌｏｉｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）＋ＡＬＬと呼ばれている。発現機序は不明であるものの臨床病態に差異はないとされている。また、Ｔリンパ球抗原であるＣＤ２がＢ−ＡＬＬに見られることがあるが、このＢ−ＡＬＬは小児では予後良好であるとされている。
【０２０８】
ＣＤ４＋白血病：ＣＤ４はＴリンパ球抗原のひとつであり、白血病細胞ではＴリンパ球性腫瘍に見られる。しかし、ＭＰＯ陽性白血病（ＣＤ４＋ＡＭＬ〕にも見られることがある。これらの白血病の多くはＭＯ、Ｍ１、Ｍ４、Ｍ５（ＦＡＢ分類）であり、未分化単球系細胞の腫瘍化である可能性が示唆されている。しかし、ＣＤ４＋ＡＭＬが疾患特異的な病態を示すかどうかは明らかではなく今後の解析が必要である。他方、ＭＰＯ陰性であり、ＣＤ３、ＣＤ１１７、ＣＤ３３、ＣＤ１３抗原が全て陰性であるＣＤ４＋ＣＤ５６＋Ｌｅｕｋｅｍｉａが報告されている。この表現型よりｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ（メラニン形成細胞）の白血化が推測されている。この種の白血病は髄外（リンパ節、皮膚）に再発をきたしやすいとされている。
【０２０９】
ＣＤ５６＋ＣＤ３３＋ＣＤ７＋白血病：ＭＰＯ陰性であり、ＣＤ５６＋ＣＤ３３＋ＣＤ７＋ＣＤ３−の表現型を示す一群の白血病（骨髄球／ＮＫ細胞急性白血病＝ｍｙｅｌｏｉｄ／ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）が存在することが報告されている。これらの白血病はリンパ節などの髄外腫瘤を高頻度に認め予後不良な疾患群である可能性が推測されている。
【０２１０】
抗原発現系統不全に基づいたＡＭＬおよびＡＬＬ細胞のフローサイトメトリを用いたＭＲＤ解析が可能である。そのような解析は、正常骨髄血中または正常末梢血中細胞には存在しないが白血病細胞には存在する抗原発現異常（ａｂｅｒｒａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）として前述した抗原発現不整、抗原欠損、抗原発現量異常、抗原発現系統不全（ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）がある。これの抗原発現系統不全が認められる症例においては、その抗原発現系統不全をマーカーとして用いることによって、ＭＲＤの検出が行える。一方、ＡＭＬでは８５％の症例において骨髄球系（ｍｙｅｌｏｉｄ）抗原〔ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ）とリンパ球系（ｌｙｍｐｈｏｉｄ）抗原またはＮＫ細胞抗原（ＣＤ２，ＣＤ５，ＣＤ７，ＣＤＩＯ，ＣＤ１９，ＣＤ２５，ＣＤ５６）が同時発現しており、ＡＬＬでは１１３の症例においてｍｙｅｌｏｉｄ抗原が発現している。また特異的なマーカーとしては、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｐｈ１）染色体陽性ＡＬＬにおいて、正常骨髄血中には存在しないＣＤ１９＋／ＫＯＲ−ＳＡ３５４４＋細胞がほぼ全症例において見られる。このような抗原発現系統不全は白血病細胞の特異的マーカーと考えることができ、それらをマーカーとして高精度かつ高感度なＭＲＤの検出が容易に行える（図２を参照）。
【０２１１】
抗原発現不整、抗原欠損、抗原発現藍異常に基づいたＦＣＭを用いた骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＭＤＳ））細胞の解析は、代表的に以下のように行うことができる。ＭＤＳを対象とする場合は、白血病細胞の抗原発現不整（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｙ）、抗原欠損（Ａｎｔｉｇｅｎ
ｉｃ  Ａｂｓｅｎｃｅ）、および抗原発現量異常（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）を明確にすることを念頭にパネルを作成する。正常骨髄血中の血液細胞は正確に制御された分化過程を経て成熟している（図３を参照）。特定のＣＤ抗原を組み合わせて骨髄血、末梢血、リンパ節に存在する正常細胞の各種抗原量の定量と分布をＦＣＭで解析すると、それらの細胞表面抗原の発現と消失が一本の道（Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ）として示される。この正常経路は全ての血液細胞に認められ、年齢や治療に影響を受けることなく、正常細胞であれば全ての人において同じパターンを示す。そのデータを基礎にして種々の白血病細胞の解析を行うと、白血病細胞は決して正常細胞と同じような抗原分布を示さないことが判る。つまり、各抗原の発現量を測定し、多次元空間にプロットすると、白血病細胞は必ず正常細胞とは異なる空間に位置するということである。これは前述したように、白血病細胞が抗原発現異常を持っていることに由来している。ＭＤＳは、ＣＤ抗原が陽性か陰性かという解析では、正常細胞との判別は非常に困難であるが、このＮｏｍｌａｌ  Ｐａｔｈｗａｙに基づいた解析を行うことによって、検出が可能となる（図４を参照）。これらを捉えるためのパネルを以下の表に記載する。
【０２１２】
（表２）
Ｂリンパ球成熟
ＣＤ２０×ＣＤ１０×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ５×ＣＤ１９×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ１０×ＣＤ１９×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ１０×ＣＤ２０×ＣＤ５×ＣＤ４５
ＣＤ１９×ＣＤ２３×ＣＤ５×ＣＤ４５
Ｔリンパ球成熟
ＣＤ１ａ×ＣＤ３×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ１ａ×ＣＤ３×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ４×ＣＤ８×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ４×ＣＤ８×ＣＤ７×ＣＤ４５
骨髄球／単球成熟
ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１１ｂ×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ１６×ＣＤ１３×ＣＤ３３×ＣＤ４５
ＣＤ１６×ＣＤ１３×ＣＤ１１ｂ×ＣＤ４５
ＣＤ１６×ＣＤ１４×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ１４×ＣＤ３３×ＣＤ１１ｂ×ＣＤ４５
ＣＤ４×ＣＤ１０×ＣＤ３４×ＣＤ４５。
【０２１３】
それぞれのＣＤ抗原の組み合わせによって、各血液細胞の分化成熟段階を反映したＰａｔｈｗａｙの検出が可能となる（図７）。このパネルはＡＭＬおよびＡＬＬを解析する場合にも有用である。本発明のフローサイトメトリーを用いた表面抗原発現様式の検索は白血病細胞の特性を理解する上で非常に有用である。
【０２１４】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、抗体、標識など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体などを記載した指示書などが含まれる。
【０２１５】
本明細書において「指示書」は、本発明の試薬の使用方法、反応方法、測定方法などを使用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の酵素反応などの手順を指示
する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。本発明のキットは、フローサイトメトリの反応のための試薬をさらに含む。
【０２１６】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０２１７】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｒｌｔｏｎ  Ｃ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊａｎｅｔ  Ｋ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，２０００．などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０２１８】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０２１９】
１つの局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階を識別する方法を提供する。この方法は、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；およびＢ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する工程；を包含する。このような発現レベルは、フローサイトメトリーなどの免疫学的な方法を用いて測定することができる。使用される細胞マーカーは、対象となる幹細胞の分化成熟段階に関連するマーカーであることが好ましい。そのような関連するマーカーは、本明細書における開示をもとに同定することができることが理解される。そのような同定方法としては、例えば、ある幹細胞およびある細胞マーカーについてフローサイトメトリーを行い、予め分化段階を示すことがわかっている他の指標（例えば、本明細書に記載されるＣＤ抗原）を参酌してその分化段階とその細胞マーカーとを関連付けることによって同定することができる。そのような段階は、さらに細分化されてもよい。分化段階に関係がなかったＣＤ抗原は、その細胞については用いられないことが好ましい。調べられる発現レベルは、相対レベルまたは絶対レベルで表現され得る。
【０２２０】
使用される細胞マーカーは、好ましくは、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つの、さらにより好ましくは少なくとも５つの細胞マーカーが使用される。そのように多量の細胞マーカーを用いることにより、より詳細な分化成熟段階を調査することができることが理解される。
【０２２１】
そのような細胞マーカーの例としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴｄＴ、ＦＭＣ７およびＨＬＡ−ＤＲなどを挙げることができるがそれらに限定されない。このような細胞マーカーは、分析対象となる細胞（例えば、造血幹細胞）の種類、系統に応じて当業者が適切に選択できることが理解される。
【０２２２】
１つの実施形態では、本発明が対象とする幹細胞は、造血幹細胞を含む。そのような代表的な幹細胞としては、例えば、単球系幹細胞、Ｂリンパ球系幹細胞、Ｔリンパ球系幹細胞および骨髄球系幹細胞などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０２２３】
別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、単球系について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２およびＳｔａｇｅ３を含む。
【０２２４】
別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、骨髄球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４およびＳｔａｇｅ５を含む。
【０２２５】
別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、Ｂリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む。
【０２２６】
別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、Ｔリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む。
【０２２７】
好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原の組み合わせを含むがこれに限定されず、系統別ＣＤ抗原ではない抗原の組み合わせを含んでいてもよい。そのような系統別のＣＤ抗原は、以下の表に表すことができる。
【０２２８】
（表３）
Ｔリンパ球：ＣＤ１ａ・ｂ・ｃ、ＣＤ２、ＣＤ２Ｒ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤｗ６０、ＣＤ９８、ＣＤ９９、Ｃ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４
Ｂリンパ球：ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ・ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤｗ１５０
骨髄球・単球：ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ・ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ１０１、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１６３、
血小板：ＣＤ９、ＣＤｗ１７、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ・ｂ・ｃ・ｄ、ＣＤ６３、ＣＤ１０７ａ・ｂ、ＣＤ１５１
ＮＫ：ＣＤ１６ａ・ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ１６１
活性化抗原：ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ９６、ＣＤ９７
内皮細胞：ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤｗ１０９、ＣＤ１４０ａ・ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７
細胞接着分子：ＣＤ１１ａ・ｂ・ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ４６ａ・ｂ・ｃ・ｄ・ｅ・ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤｗ１０８、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６
サイトカインレセプター：ＣＤ２５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ・ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤｗ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７
ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｇｅ：ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９
図１Ｂ〜１Ｄには、それぞれ、成熟とＣＤ抗原の発現の変化の関係、リンパ球の分化に伴う表面抗原の変化、骨髄系細胞の分化と表面マーカーとの関係を示す。
【０２２９】
特定の実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、Ｂリンパ球系統について、ＣＤ１０とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１９とＣＤ２３とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ５とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせなどを挙げることができる。
【０２３０】
特定の実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、Ｔリンパ球系統について、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ８とＣＤ７とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ４とＣＤ８とＣＤ１０とＣＤ４５などを挙げることができる。
【０２３１】
特定の実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、好中球系統または単球系統について、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｂとＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１６とＣＤ１３とＣＤ３３とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１４とＣＤ３３とＣＤ１１ｂとＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ１０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１１ｂとＣＤ１３とＣＤ１６とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ１０とＣＤ１６とＣＤ１４とＣＤ４５との組み合わせなどを挙げることができる。
【０２３２】
別の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階を識別するシステムを提供する。このシステムは、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定するための手段と、Ｂ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する手段と、を備える。測定手段としては、例えば、フローサイトメーターを挙げることができる。分化段階の決定は、発現レベルに基づいて、ＣＰＵなどに搭載されたプログラムによって実行することができる。
【０２３３】
本発明において使用される測定手段は、細胞マーカーの発現レベルを相対レベルまたは絶対レベルで測定することができる。
【０２３４】
別の実施形態では、測定手段は、細胞マーカーに特異的な因子を含む。そのような因子としては、例えば、抗体を挙げることができるがそれらに限定されない。
【０２３５】
本発明において使用される細胞マーカーは、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも４つの、さらに好ましくは少なくとも５つの細胞マーカーを含む。４つの細胞マーカーを用いることによって、従来は実現できなかった細分類が可能になった。
【０２３６】
本発明のシステムにおいて使用される前記細胞マーカーとしては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＴｄＴ、ＦＭＣ７およびＨＬＡ−ＤＲなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０２３７】
本発明のシステムの１つの実施形態では、本発明が対象とする幹細胞は、造血幹細胞を含む。そのような代表的な幹細胞としては、例えば、単球系幹細胞、Ｂリンパ球系幹細胞、Ｔリンパ球系幹細胞および骨髄球系幹細胞などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０２３８】
本発明のシステムの別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、単球系について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２およびＳｔａｇｅ３を含む。
【０２３９】
本発明のシステムの別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、骨髄球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３、Ｓｔａｇｅ４およびＳｔａｇｅ５を含む。
【０２４０】
本発明のシステムの別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、Ｂリンパ
球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む。
【０２４１】
本発明のシステムの別の実施形態では、本発明が分析し得る分化成熟段階は、Ｔリンパ球系統について、Ｓｔａｇｅ１、Ｓｔａｇｅ２、Ｓｔａｇｅ３およびＳｔａｇｅ４を含む。
【０２４２】
本発明のシステムの好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、系統別ＣＤ抗原の組み合わせを含むがこれに限定されず、系統別ＣＤ抗原ではない抗原の組み合わせを含んでいてもよい。
【０２４３】
本発明のシステムの特定の実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、Ｂリンパ球系統について、ＣＤ１０とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１９とＣＤ２３とＣＤ５とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１０とＣＤ２０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ５とＣＤ１９とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせなどを挙げることができる。
【０２４４】
本発明のシステムの特定の実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、Ｔリンパ球系統について、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ８とＣＤ７とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１ａとＣＤ３とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ４とＣＤ８とＣＤ１０とＣＤ４５などを挙げることができる。
【０２４５】
本発明のシステムの特定の実施形態では、本発明において使用される細胞マーカーは、好中球系統または単球系統について、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ１１ｂとＣＤ１０とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１６とＣＤ１３とＣＤ３３とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１４とＣＤ３３とＣＤ１１ｂとＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ４とＣＤ１０とＣＤ３４とＣＤ４５との組み合わせ、ＣＤ１１ｂとＣＤ１３とＣＤ１６とＣＤ４５との組み合わせ、およびＣＤ１０とＣＤ１６とＣＤ１４とＣＤ４５との組み合わせなどを挙げることができる。
【０２４６】
別の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階を決定する方法を提供する。この方法は、Ａ）該幹細胞の正常な分化成熟段階をとるものについて、少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおける測定パターン（「正常パターン」）を提供する工程；およびＢ）該幹細胞について、該細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、該正常パターンと比較して、該幹細胞の分化成熟段階を決定する工程；を包含する。この方法において使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。正常パターンの例示としては、例えば、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇに示される正常パターンがあり、図１Ｈおよび図１Ｉには、Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの例を示す。各細胞の特徴および同定の方法は、本明細書において（Ｓｔａｇｅの分類）に記載されるように実施することができる。図１Ａ−Ｓには、骨髄球Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙにおいて、従来のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙと本発明のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙとを比較したものを示す。
【０２４７】
別の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階を決定するシステムを提供する。
【０２４８】
このシステムは、Ａ）該幹細胞の正常な分化成熟段階をとるものについて、少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおける測定パターン（「正常パターン」）を提供する手段；およびＢ）該幹細胞について、該細胞マーカーの発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、該正常パターンと比較して、該幹細胞の分化成熟段階を決定する手段；を備える。この方法において使用される技法は、本明細書
において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２４９】
他の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階が正常であるかどうか判定する方法を提供する。この方法は、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルをフローサイトメトリーで測定する工程；およびＢ）該発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、正常な分化成熟段階にある細胞が示すフローサイトメトリーにおける該細胞マーカーの発現レベルのパターンとを比較して、相違があれば、正常でない細胞が含まれると判定する工程；を包含する。この方法において使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５０】
別の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階が正常であるかどうか判定するシステムでを提供する。このシステムは、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルをフローサイトメトリーで測定する手段；およびＢ）該発現レベルのフローサイトメトリーにおけるパターンと、正常な分化成熟段階にある細胞が示すフローサイトメトリーにおける該細胞マーカーの発現レベルのパターンとを比較して、相違があれば、正常でない細胞が含まれると判定する手段、を備える。このシステムにおいて使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５１】
別の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置する方法を提供する。この方法は、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；
Ｂ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する工程；およびＣ）決定された分化成熟段階に適切な処置を該被検体に施す工程、を包含する。この方法において使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５２】
別の局面において、本発明は、白血病の処置後に、幹細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置する方法を提供する。この方法は、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する工程；Ｂ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する工程；およびＣ）決定された分化成熟段階と、該幹細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を該被検体に施す工程、を包含する。この方法において使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５３】
好ましい実施形態では、この適切な処置は、ｉ）前記幹細胞の決定された分化成熟段階について、正常細胞が存在する、存在する細胞が正常未熟細胞であると判定される場合、現治療法の継続あるいは投薬等の治療を終了し経過観察のみに留めるという処置を含み、ｉｉ）前記幹細胞の決定された分化成熟段階について、存在する細胞が異常細胞であると判定される場合、現治療法の強化または変更を行うという処置を含む。
【０２５４】
別の実施形態では、上記幹細胞の決定された分化成熟段階について、存在する細胞が正常未熟細胞であると判定された場合においても、元幹細胞の枯渇、あるいは分化成熟の進行の停止等の異常が認められる場合は、幹細胞の追加移植等を行うという処置を含む。
【０２５５】
別の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置するシステムを提供する。このシステムは、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；Ｂ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する手段；およびＣ）決定された分化成熟段階に適切な処置を該被検体に施す手段、を備える。このシステムにおいて使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５６】
別の局面において、本発明は、幹細胞の分化成熟段階に応じた処置を被検体に提供するシステムを提供する。このシステムは、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；  Ｂ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する手段；およびＣ）決定された分化成熟段階に適切な処置を該被検体に提供する手段、を備える。このシステムにおいて使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５７】
別の局面において、本発明は、白血病の処置後に、幹細胞の分化成熟段階に応じて被検体を処置するシステムを提供する。このシステムは、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；Ｂ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する手段；およびＣ）決定された分化成熟段階と、該幹細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を該被検体に施す手段、を備える。このシステムにおいて使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５８】
他の局面において、本発明は、白血病の処置後に、幹細胞の分化成熟段階に応じた処置を被検体に提供するシステムを提供する。このシステムは、Ａ）少なくとも１つの細胞マーカーの発現レベルを測定する手段；Ｂ）該発現レベルに基づき、該幹細胞の分化成熟段階を決定する手段；およびＣ）決定された分化成熟段階と、該幹細胞が正常な場合にとる分化成熟段階とを比較した結果に基づいて適切な処置を該被検体に提供する手段、を備える。このシステムにおいて使用される技法は、本明細書において上述されるように任意の技法を用いることができる。
【０２５９】
他の局面において、本発明は、本発明の方法によって作成された幹細胞の分化成熟段階のパターン、およびそのパターンが記録された記録媒体、伝送媒体などを提供する。
【０２６０】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０２６１】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０２６２】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、などから市販されるものを用いた。動物の取り扱いは、厚生労働省などにおいて規定される規準を遵守して行った。
【０２６３】
（実施例１：正常骨髄血中の未熟細胞表面抗原の解析）
（方法）
1. 対象
正常骨髄血中の未熟細胞表面抗原の解析には、インフォームド・コンセントを行った後の患者より採取された骨髄血を用いた。骨髄血はヘパリン採取後、１０％牛血清（ＦＣＳ）加培養液（ＲＰＭＩ−１６４０）に浮遊させ、４℃にて保存し、４８時間以内に細胞表面抗原の解析を行った。
【０２６４】
２．  モノクローナル抗体
以下のＣＤ抗体については、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＩＳ：Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）社から入手したフルオレセインイソシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ＝ＦＩＴＣ）標識を用いた：ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ−ＤＲ抗体。
【０２６５】
以下のＣＤ抗体ついては、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＩＳ：Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）社から入手したフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ＝ＰＥ）標識を用いた：マウスＩｇＧ２ａ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３，ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４抗体。
【０２６６】
以下のＣＤ抗体ついては、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＩＳ：Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）社から入手したペリジニンクロロフィルタンパク質（ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ＝ＰｅｒＣＰ）標識を用いた：ＣＤ４５抗体。
【０２６７】
以下のＣＤ抗体ついては、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＤＩＳ：Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）社から入手したアロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ＝ＡＰＣ）標識を用いた：マウスＩｇＧ２ａ、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ３３抗体。
【０２６８】
以下のＣＤ抗体ついては、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ−Ｐｅｒｍｉｎｇｅｎ（ＰｅｒＭｉｎｇｅｎ：  ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）社から入手したＦＩＴＣ標識を用いた：マウスＩｇＧ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ１６、ＣＤ３４抗体
以下のＣＤ抗体ついては、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ−Ｐｅｒｍｉｎｇｅｎ（ＰｅｒＭｉｎｇｅｎ：  ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）社から入手したＡＰＣ標識を用いた：ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４抗体。
【０２６９】
以下のＣＤ抗体ついては、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（ＤａＫｏ：ＤＫ−２６００、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）社から入手したＦＩＴＣ標識を用いたＣＤ２３抗体およびＰＥ標識を用いたＣＤ１０抗体を使用した。
【０２７０】
３．  染色および測定
検体中の白血球濃度を測定し、２〜５×１０６細胞／ｍｌになるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．１％ＢＳＡ，０．１％アジ化ナトリウム）を用いて調製を行った。それぞれのチューブに必要な抗体を添加した後、濃度調製した検体を１００μｌずつサンプリングし、よく混和させ、室温、遮光にて２０分間インキュベーションを行った。その後、溶血剤（８．２６ｇ  ＮＨ４Ｃｌ，１．００ｇ  ＫＨＣＯ３，ＥＤＴＡ−４Ｎａ  ０．０３７ｇ／Ｌ  蒸留水）を添加し、室温にて５分間インキュベーションを行い、混入赤血球の溶血操作を行った。さらにＰＢＳにて洗浄を行い、１％パラホルムアルデヒド（ＣｅｌｌＦＩＸ：ＢＤＩＳ）を用いて固定した。
【０２７１】
４．  測定方法
測定はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ−４Ａ（ＢＤＩＳ）を用いて行った。機器の設定はＣａｌｉＢＲＩＴＥ  ｂｅａｄｓ（ＢＤＩＳ）を用いて、ＦＡＣＳＣｏｍｐ  ｓｏｆｔｗａｒｅのＬｙｓｅ−Ｗａｓｈ  ｍｏｄｅにて行った。機器の安定性の確認は、ＳＰＨＥＲＯＴＭ  Ｒａｉｎｂｏｗ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＲＣＰ：  ＰｅｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて行った。細胞の取り込みはＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒ
ｅを用いて行い、１万細胞を測定しＬｉｓｔ  Ｍｏｄｅ  Ｄａｔａとして保存した。
【０２７２】
５．  正常骨髄血中の細胞表面抗原発現強度の解析
保存したＬｉｓｔ  Ｍｏｄｅ  ＤａｔａはＷｉｎＬｉｓｔ（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ，  Ｉｎｃ．）  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０を用いて、任意のパラメータを設定し、Ｄｏｔ−Ｐｌｏｔに展開して、各ステージ細胞毎にポジションの同定を行った。詳細なパラメータおよびゲート設定を以下に示す：
用いるパラメーターは、細胞の大きさを反映するｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）、細胞の構造を反映するｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳＣ）、ＦＩＴＣ標識抗体の反応を反映するＦＬ−１、ＰＥ標識抗体の反応を反映するＦＬ−２、ＰｅｒＣＰ標識抗体の反応を反映するＦＬ−３、ＡＰＣ標識抗体の反応を反映するＦＬ−４である。
【０２７３】
各パラメーターの組み合わせは、ＦＳＣ−ＦＬ−１、ＦＳＣ−ＦＬ−２、ＦＳＣ−ＦＬ−３、ＦＳＣ−ＦＬ−４、ＳＳＣ−ＦＬ−１、ＳＳＣ  −ＦＬ−２、ＳＳＣ  −ＦＬ−３、ＳＳＣ  −ＦＬ−４、ＦＬ−３−ＦＬ−１、ＦＬ−３−ＦＬ−２、ＦＬ−３−ＦＬ−４、ＦＬ−１−ＦＬ−２、ＦＬ−４−ＦＬ２、ＦＬ４−ＦＬ−１、およびＦＳＣ−ＳＳＣである。ゲートの設定は、Ｐａｇｅ３４の各細胞の同定の方法に従った位置に設定し、全てのゲート条件を満たす細胞を抽出した。
【０２７４】
（結果）
Ｂリンパ球系、Ｔリンパ球系、好中球系および単球系の各幹細胞について、各Ｓｔａｇｅにおける各ＣＤ抗原の発現レベルの推移を示すグラフを図２に示す。
【０２７５】
図２に示されるように、以下のＣＤ抗原が少なくとも各系統の造血幹細胞およびその子孫細胞についての分化成熟段階の分類に使用され得ることが理解される。
【０２７６】
Ｂリンパ球系：
ＴｄＴ、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５、ＦＭＣ７、ＣＤ５、ＣＤ２３。
【０２７７】
Ｔリンパ球系：
ＣＤ３４、ＣＤ１ａ、ＣＤ５、ＣＤ４５、ＣＤ１０、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２。
【０２７８】
骨髄球系：
ＣＤ３４、ＣＤ１５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＣＤ１６、ＣＤ４５。
【０２７９】
単球系：
ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４５、ＣＤ１４。
【０２８０】
図２からも明らかであるが、例えば、Ｂリンパ球系について、ＣＤ１０などの抗原の発現レベルを観察する場合、その１種類のみの観察で、すべてのＳｔａｇｅに分類可能であることが分かる。逆に、単球系細胞におけるＣＤ１５およびＨＬＡ−ＤＲのように、Ｓｔａｇｅ２とＳｔａｇｅ３では同じ挙動を採るようなＣＤ抗原であれば、２種類では足りず、ＣＤ１４などのＳｔａｇｅ２とＳｔａｇｅ３とを見分けることができるＣＤ抗原を観察することが必要であることがわかる。
【０２８１】
これらをまとめると、図１Ａ−Ｒに示されるような分化成熟段階があることが分かる。
【０２８２】
（実施例２）
次に、正常な骨髄球系細胞および骨髄異形成症候群の骨髄球系細胞について、ＣＤ１３（ＰＥ標識）およびＣＤ１６（ＦＩＴＣ標識）を用いて実施例１に示したように観察を行った後、ドットプロットを行って、Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを描いた。
【０２８３】
その結果を、図３に示す。図３には、正常骨髄球（左）および骨髄異形成症候群（右）についての、Ｐａｔｈｗａｙを示す。正常骨髄球を用いた場合は、左に示すように、常に、一定のＰａｔｈｗａｙが示された。他方、骨髄異形成症候群患者の骨髄球系細胞を用いた場合は、Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙとは全く異なるＰａｔｈｗａｙが観察された。このように骨髄異形成症候群の患者が有する骨髄球系細胞では、異常な細胞ばかりが含まれていることが分かる。
【０２８４】
（実施例３）
次に、同様の実験を行い、Ｂリンパ球系、Ｔリンパ球系、骨髄球系および単球系の細胞の成熟段階におけるＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを同定した。
【０２８５】
実施例１に記載されるような方法に基づき、Ｂリンパ球系細胞については、ＣＤ１０（ＰＥ標識）およびＣＤ２０（ＦＩＴＣ標識）を用い、Ｔリンパ球系細胞については、ＣＤ４（ＰＥ標識）およびＣＤ８（ＦＩＴＣ標識）を用い、骨髄球系および単球系の細胞については、双方ともＣＤ１３（ＰＥ標識）およびＣＤ１６（ＦＩＴＣ標識）を用いた。
【０２８６】
結果を図４に示す。解析した結果、図中の矢印で示されるようなＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙが同定された。
【０２８７】
このような実験を繰り返したところ、以下のような代表的なＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ解析パネルが見出された。
【０２８８】
Ｂリンパ球成熟
ＣＤ２０×ＣＤ１０×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ５×ＣＤ１９×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ１０×ＣＤ１９×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ１０×ＣＤ２０×ＣＤ５×ＣＤ４５
ＣＤ１９×ＣＤ２３×ＣＤ５×ＣＤ４５
Ｔリンパ球成熟
ＣＤ１ａ×ＣＤ３×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ１ａ×ＣＤ３×ＣＤ３４×ＣＤ４５
ＣＤ４×ＣＤ８×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ４×ＣＤ８×ＣＤ７×ＣＤ４５
好中球／単球成熟
ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１１ｂ×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ１６×ＣＤ１３×ＣＤ３３×ＣＤ４５
ＣＤ１６×ＣＤ１３×ＣＤ１１ｂ×ＣＤ４５
ＣＤ１６×ＣＤ１４×ＣＤ１０×ＣＤ４５
ＣＤ１４×ＣＤ３３×ＣＤ１１ｂ×ＣＤ４５
ＣＤ４×ＣＤ１０×ＣＤ３４×ＣＤ４５。
【０２８９】
（実施例５）
実施例１に記載の方法に基づき、患者を診断し、適宜治療に供した。
【０２９０】
患者名：Ｙ．Ｓ．急性白血病
２００３／１２／０２  Ｊａ−００２８（再発時検査）：１．２％リンパ球，０．０％単球，２．６％骨髄形態，および９４．４％異常リンパ芽球。急性白血病細胞が全白血球中に９４．４％認められた。
【０２９１】
２００３／１２／１７  Ｊａ−００３４（寛解導入療法２回終了時）：７３．９％リンパ球，１．１％単球，７．４％骨髄形態，および８．６％異常リンパ芽球。急性白血病細胞が全白血球中に８．６％認められた。
【０２９２】
２００４／０１／０５  Ｊａ−００４１（寛解導入後）：２．８％リンパ球，１．６％単球，９２．７％骨髄形態，０．１％リンパ芽球および０．４％骨髄芽球。急性白血病細胞は認められなかった。骨髄芽球は正常な分化成熟パターンを示していた。成熟骨髄性細胞が多く認められたが、それに比較して未熟骨髄性細胞の数が少量であった。急速な骨髄再構築が起こっている。
【０２９３】
２００４／０２／０３  Ｊａ−００５２（末梢血幹細胞移植  １週間後）：０．６％リンパ球，３．１％単球，９５．２％骨髄形態，０．１％リンパ芽球および０．５％骨髄芽球。急性白血病細胞は認められなかった。骨髄芽球は正常な分化成熟パターンを示していた。
【０２９４】
２００４／０３／０８  Ｊａ−００６９（末梢血幹細胞移後  経過観察）：６．０％リンパ球、５．９％単球、６１．９％骨髄形態、１４．６％リンパ芽球および３．１％骨髄芽球。非常に微量のため詳細な確認はできないが、急性白血病細胞らしき２〜３個／１０，０００個のドットプロットを確認した。Ｌｙｍｐｈ芽球と骨髄芽球に異常は認められなかったが、骨髄性細胞のＰａｔｈｗａｙに若干乱れが認められた。再発の予兆と考えられる。
【０２９５】
２００４／０４／１９  Ｊａ−００９５（経過観察）：２．５％リンパ球，５．５％単球，６６．６％骨髄形態，１３．６％リンパ芽球，および２．９％骨髄芽球。急性白血病細胞が０．７％認められた。再発の前兆。寛解維持強化療法が必要。
【０２９６】
２００４／０５／２４  Ｊａ−０１１１（第二回目  同種骨髄移植の前処置開始）：１０．０％リンパ球，５．９％単球，６２．０％骨髄形態，８．６％リンパ芽球，および１．６％骨髄芽球。急性白血病細胞が０．０６％認められた。
【０２９７】
代表例として、Ｊａ−００９５の段階のＳｔａｇｅ−２  Ｍｏｎｏ（ＣＤ３４×ＣＤ４×ＣＤ４５×ＣＤ１０）（図５）、Ｓｔａｇｅ−２  Ｍｏｎｏ（ＣＤ１４×ＣＤ３３×ＣＤ４５×ＣＤ１１ｂ）（図６）、Ｊａ−００９６の段階のＳｔａｇｅ−１およびＳｔａｇｅ−２  Ｂ−Ｌｙｍｐｈ（ＣＤ１９×ＣＤ１０×ＣＤ４５×ＣＤ３４）（図７）、Ｓｔａｇｅ−２  Ｍｙｅｌｏ（ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１０×ＣＤ１１ｂ）（図８）およびＳｔａｇｅ−４  Ｍｙｅｌｏ（ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１０×ＣＤ４５×ＣＤ１１ｂ）（図９）、ならびにＪａ−００９９の段階のＳｔａｇｅ−１およびＳｔａｇｅ−２  Ｂ−Ｌｙｍｐｈ（ＣＤ１９×ＣＤ１０×ＣＤ４５×ＣＤ３４）（図１０）およびＳｔａｇｅ−２  Ｍｙｅｌｏ（ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１０×ＣＤ１１ｂ）（図１１）を示す。
【０２９８】
示されるように、Ｊａ−００９５において急性白血病細胞が０．７％認められることが明らかに分かる。Ｊａ−０１０４以降の患者状態。
【０２９９】
Ｊａ−００９５以降の患者状態については、２００４／０５／２４（Ｊａ−０１１１）、急性白血病細胞が０．０６％残存しているが、その他の骨髄血細胞が正常に再構築し始
める。２００４／０７／０１（Ｊａ−０１３１）、急性白血病細胞は検出されず、未熟な骨髄血細胞が認められる。これらの細胞は全てＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ上に存在しており、急速な骨髄再構築が始まっていると考えられる。２００４／０７／２８現在、当患者は無症状にて存命中である。
【０３００】
このように、詳細な診断を行うことにより、適切な治療を行うことが可能となる。
【０３０１】
（実施例６）
別の患者において、同様の診断および治療を行った。この患者は、急性白血病に罹患している。
【０３０２】
２００４／０１／２０  Ｊａ−００４８（寛解療法中）：２．１％リンパ球、２．３％単球、５１．９％骨髄形態、３１．６％リンパ芽球および４．２％骨髄芽球。急性白血病細胞は認められなかった。多くのリンパ芽球が認められた。形態学的検査では、骨髄中の芽球が５％以下の状態を寛解と定義しており、今回のデータ（芽球  ３１．６％）は再発疑いとなり、追加治療を受けることになりかねない。ＭＤＦを用いた抗原発現パターンの解析より、これらの芽球は正常未熟細胞であるＳｔａｇｅ−１  Ｂリンパ芽球、Ｓｔａｇｅ−２  Ｂ  リンパ芽球と判定できた。骨髄の急速な再構築が起こっている。強力な追加治療は不要で（命を奪いかねない）、現行の治療を継続すべき。
【０３０３】
２００４／０３／１６  Ｊａ−００７３（経過観察中）３４．８％リンパ球、８．９％単球、２２．１％骨髄形態、１０．８％リンパ芽球および１２．１％骨髄芽球。急性白血病細胞は認められなかった。前回検査時と同じく多くのリンパ芽球が認められたが、抗原発現パターンより正常未熟細胞であるＳｔａｇｅ−１  Ｂリンパ芽球と判定できた。同様に多くの骨髄芽球が認められた。成熟骨髄性細胞は少なく、まだ前骨髄球の分化成熟段階にある。骨髄の急速な再構築が始まったところである。今後、これらのＳｔａｇｅ−１  Ｂ  リンパ芽球がＳｔａｇｅ−２  Ｂリンパ芽球へ、骨髄芽球および前骨髄球が成熟骨髄球へ分化成熟していくことを確認する必要がある。
【０３０４】
２００４／０５／１２  Ｊａ−０１０４（寛解維持療法開始前）：５．４％リンパ球、５．２％単球、４８．４％骨髄形態、２３．１％リンパ芽球，および５．５％骨髄芽球。大半の芽球は正常パターンを示していた。しかし、急性白血病細胞の可能性がある細胞が０．３％認められた。寛解維持療法の早急な開始が必要である。未検査だが、２００４／０７／２８現在、当患者は無症状にて存命中。
【０３０５】
このように、詳細な診断を行うことにより、適切な治療を行うことが可能となる。
【０３０６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３０７】
本発明は、白血病などの疾患に関して、より適切な診断を行うための情報を提供することができ、従って、医薬および医療に関連する種々の産業において有用性が認められるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１Ａ−Ａ】図１Ａ−Ａは、造血幹細胞の分化の代表的スキームである。
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ−Ｂは、単球系Ｓｔａｇｅ１の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｃ】図１Ａ−Ｃは、単球系Ｓｔａｇｅ２の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｄ】図１Ａ−Ｄは、単球系Ｓｔａｇｅ３の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｅ】図１Ａ−Ｅは、骨髄球系Ｓｔａｇｅ１の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｆ】図１Ａ−Ｆは、骨髄球系Ｓｔａｇｅ２の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｇ】図１Ａ−Ｇは、骨髄球系Ｓｔａｇｅ３の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｈ】図１Ａ−Ｈは、骨髄球系Ｓｔａｇｅ４の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｉ】図１Ａ−Ｉは、骨髄球系Ｓｔａｇｅ５の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｊ】図１Ａ−Ｊは、Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ１の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｋ】図１Ａ−Ｋは、Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ２の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｌ】図１Ａ−Ｌは、Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ３の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｍ】図１Ａ−Ｍは、Ｂリンパ球系Ｓｔａｇｅ４の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｎ】図１Ａ−Ｎは、Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ１の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｏ】図１Ａ−Ｏは、Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ２の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｐ】図１Ａ−Ｐは、Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ３の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｑ】図１Ａ−Ｑは、Ｔリンパ球系Ｓｔａｇｅ４の同定のための図を示す。
【図１Ａ−Ｒ】図１Ａ−Ｒは、本発明によって同定された、造血幹細胞から各種細胞へ分化する際の分化成熟段階の模式図を示す。
【図１Ａ−Ｓ】図１Ａ−Ｓは、骨髄球のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを示す。骨髄球Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙにおいて、従来のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙと本発明のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙとを比較したものを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、成熟段階と分化マーカーとの関係を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、リンパ球の分化に伴う表面抗原の変化を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、骨髄系細胞の分化と表面マーカーとの関係を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、骨髄球系Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、単球系Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、Ｂリンパ球系Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、本発明による造血幹細胞移植後の骨髄再構築のモニタリング例を示す。
【図１Ｉ１】図１Ｉ１は、骨髄球のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの１例を示す。
【図１Ｉ２】図１Ｉ２は、骨髄球のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの別の例を示す。
【図１Ｉ３】図１Ｉ３は、単球のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの１例を示す。
【図１Ｉ４】図１Ｉ４は、単球のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの別の例を示す。
【図１Ｉ５】図１Ｉ５は、Ｔリンパ球のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの１例を示す。
【図１Ｉ６】図１Ｉ６は、Ｂリンパ球のＮｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙの１例を示す。
【図２】図２は、各種細胞における分化成熟段階の各種ＣＤ抗原の発現レベルを示す。
【図３】図３は、Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙを用いたＭＤＳ細胞の解析を示す。
【図４】図４は、Ｎｏｒｍａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ用パネルを用いた骨髄血中細胞の解析を示す。
【図５】図５は、Ｊａ−００９５の段階のＳｔａｇｅ−２  Ｍｏｎｏ（ＣＤ３４×ＣＤ４×ＣＤ４５×ＣＤ１０）を示す。
【図６】図６は、Ｊａ−００９５の段階のＳｔａｇｅ−２  Ｍｏｎｏ（ＣＤ１４×ＣＤ３３×ＣＤ４５×ＣＤ１１ｂ）を示す。
【図７】図７は、Ｊａ−００９６の段階のＳｔａｇｅ−１およびＳｔａｇｅ−２  Ｂ−Ｌｙｍｐｈ（ＣＤ１９×ＣＤ１０×ＣＤ４５×ＣＤ３４）を示す。
【図８】図８は、Ｊａ−００９６の段階のＳｔａｇｅ−２  Ｍｙｅｌｏ（ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１０×ＣＤ１１ｂ）を示す。
【図９】図９は、Ｊａ−００９６の段階のＳｔａｇｅ−４  Ｍｙｅｌｏ（ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１０×ＣＤ４５×ＣＤ１１ｂ）を示す。
【図１０】図１０は、Ｊａ−００９９の段階のＳｔａｇｅ−１およびＳｔａｇｅ−２  Ｂ−Ｌｙｍｐｈ（ＣＤ１９×ＣＤ１０×ＣＤ４５×ＣＤ３４）を示す。
【図１１】図１１は、Ｊａ−００９９の段階のＳｔａｇｅ−２  Ｍｙｅｌｏ（ＨＬＡ−ＤＲ×ＣＤ１０×ＣＤ１１ｂ）を示す。
【図１Ａ−Ｒ】
2006194901.tif 000016
【図１Ａ−Ａ】
2006194901.tif 000017
【図１Ａ−Ｂ】
2006194901.tif 000018
【図１Ａ−Ｃ】
2006194901.tif 000019
【図１Ａ−Ｄ】
2006194901.tif 000020
【図１Ａ−Ｅ】
2006194901.tif 000021
【図１Ａ−Ｆ】
2006194901.tif 000022
【図１Ａ−Ｇ】
2006194901.tif 000023
【図１Ａ−Ｈ】
2006194901.tif 000024
【図１Ａ−Ｉ】
2006194901.tif 000025
【図１Ａ−Ｊ】
2006194901.tif 000026
【図１Ａ−Ｋ】
2006194901.tif 000027
【図１Ａ−Ｌ】
2006194901.tif 000028
【図１Ａ−Ｍ】
2006194901.tif 000029
【図１Ａ−Ｎ】
2006194901.tif 000030
【図１Ａ−Ｏ】
2006194901.tif 000031
【図１Ａ−Ｐ】
2006194901.tif 000032
【図１Ａ−Ｑ】
2006194901.tif 000033
【図１Ａ−Ｓ】
2006194901.tif 000034
【図１Ｂ】
2006194901.tif 000035
【図１Ｃ】
2006194901.tif 000036
【図１Ｄ】
2006194901.tif 000037
【図１Ｅ】
2006194901.tif 000038
【図１Ｆ】
2006194901.tif 000039
【図１Ｇ】
2006194901.tif 000040
【図１Ｈ】
2006194901.tif 000041
【図１Ｉ１】
2006194901.tif 000042
【図１Ｉ２】
2006194901.tif 000043
【図１Ｉ３】
2006194901.tif 000044
【図１Ｉ４】
2006194901.tif 000045
【図１Ｉ５】
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【図１Ｉ６】
2006194901.tif 000047
【図２】
2006194901.tif 000048
【図３】
2006194901.tif 000049
【図４】
2006194901.tif 000050
【図５】
2006194901.tif 000051
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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