(57)【要約】【課題】脱分化（カルス化）が誘導されるように改変された植物体の生産方法を提供する。【解決手段】ＤＳＴ依存ｍＲＮＡ分解経路で制御される転写因子であって、脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記転写因子を植物細胞内で生産させることにより脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の遺伝子が発現するように、該遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法：
（ａ）脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、
（ｃ）配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
（ｄ）配列番号２、４または６に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｅ）配列番号２、４または６に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有し、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の植物体の生産方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の生産方法により生産された、脱分化が誘導されるように改変された植物体。
【請求項４】
植物体内の内因性のオーキシンの濃度が、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、有意に増加していないことを特徴とする請求項３に記載の植物体。
【請求項５】
植物体には、成育した植物個体、植物組織、植物細胞、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項３または４に記載の植物体。
【請求項６】
上記植物体は、カルスであって、当該カルスは培養条件をコントロールすることにより表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖させることができるカルスであることを特徴とする請求項３ないし５のいずれか１項に記載の植物体。
【請求項７】
上記植物体は、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を、当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスであることを特徴とする請求項３ないし６のいずれか１項に記載の植物体。
【請求項８】
請求項１または２に記載の生産方法を行うためのキットであって、
上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物体の脱分化誘導キット。
【請求項９】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項８に記載の植物体の脱分化誘導キット。
【請求項１０】
請求項３ないし５のいずれか１項に記載の植物体を、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴とする有用物質の生産方法。
【請求項１１】
請求項６または７に記載の植物体を、上記選択マーカーの試薬である抗生物質および植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴とする有用物質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法及びこれを用いて得られる植物体、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物は分化全能性を持ち、高度に分化した体細胞からカルスを形成（脱分化）させることができ、また、カルスを一定条件下で培養すれば、不定胚や不定芽および不定根の分化を経て、植物個体を再生させることができる。カルス培養は、１）無限増殖能を有し、２）カルスの細胞塊から様々な組織や個体へ分化させることができる、３）植物体では得にくい増殖細胞を均一かつ多量に得られる、４）細胞の質や量に季節変動がなく実験材料として適している、５）培地に加えた物質の植物に対する影響を直接に見ることができる、６）植物によってはカルス化を経ることにより遺伝子の変異が誘発されやすく育種などに利用できる等の点で優れている。そのため、カルス培養は、有用物質の生産、新品種の開発、植物体への遺伝子導入および形質転換体の再生、人工種子の生産等に広く利用されている。
【０００３】
一般的に植物の分化・脱分化は、オーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモンの組成と培地への添加量によって制御することができる。一般的に、培地に与えたオーキシンの比率が高いと不定根の形成（分化）、サイトカイニンの比率が高いと不定芽の形成（分化）、両者の適当な存在比ではカルス（脱分化）が維持されることが知られている。
【０００４】
また、脱分化（カルス化）の誘導は、植物ホルモンによるほか、ウイルスや細菌の感染、傷害（UV、X線、物理的傷害などを含む）によっても低頻度であるが起こることが知られている。
【０００５】
細菌感染によるものとしては、例えば、Agrobacterium tumefaciensの感染によるクラウンゴールの生成が知られている。これは、Ｔｉプラスミド中のＴ−ＤＮＡ領域に含まれるオーキシン合成遺伝子およびサイトカイニン合成遺伝子の発現によって感染した植物の細胞中で両植物ホルモンが生産され植物組織に腫瘍細胞（カルス）が生じるためである。生じたカルスは外部からの植物ホルモンの添加なし（植物ホルモンフリー）で培養可能である。
【０００６】
また、脱分化はウィルスによっても起こることが知られている。２本鎖ＲＮＡを有する腫瘍ウィルス(Aureogenus magnivena)をクローバー類(Trifolium)やヒメスイバ（Rumex acetosella）の傷を付けた部分に接種すると葉の奇形や根の腫瘍を生じる。このウイルス腫瘍は動物のＲＮＡ腫瘍ウィルスとは異なり宿主に形質転換を起こさない。
【０００７】
また、親植物には見られないが特定の組み合わせの種間雑種だけにみられる遺伝的腫瘍が知られている。この遺伝的腫瘍は、Brassica（アブラナ）属、Datura（チョウセンアサガオ）属、Lilium（ユリ）属、Nicotiana（タバコ）属などで生じることが報告されている。生じる腫瘍細胞はオーキシンに対して自律的に増殖する。Nicotiana（タバコ）属の研究から、ゲノム間の不和合と特定の染色体の機能とが結びついて腫瘍の形成を引き起すことが示されている。遺伝的腫瘍の形成は、外的ストレス（傷害、X線、機械的刺激、化学物質など）とともに、内的ストレス（側根の形成、頂芽優勢の減少、葉の喪失、密植など）によっても誘発される。
【０００８】
さらに、遺伝子組み換え技術により植物細胞の脱分化が誘導および促進された例がいくつか報告されている。これらは主に植物ホルモン応答機構に関与する遺伝子の解析から偶発的に脱分化が誘導および促進された例であり、いずれも植物ホルモンへの応答経路が増幅されたことが原因となっていると考えられる。しかし、これらの報告では、生じた脱分化した細胞が継代可能であるかについては言及されていない。
【０００９】
シロイヌナズナｃＤＮＡのファンクショナルスクリーニングにより、ＥＳＲ１(Enhancer of Shoot Regeneration)遺伝子が単離されている（例えば、非特許文献１等参照）。ＥＳＲ１遺伝子は、アグロバクテリウムを用いて根片にｃＤＮＡライブラリを形質転換し、選択マーカーとなる抗生物質を含むサイトカイニンフリーの茎葉誘導培地（オーキシンは含まれる）でシュートまたは緑色カルスを形成するものから単離された。この遺伝子を根の外植片で発現させると、サイトカイニン非依存的にシュートを分化する。また、低いサイトカイニン濃度でもシュートの形成が促進される。ＥＳＲ１遺伝子を過剰発現させた植物体（35S:ESR1植物体）をＭＳ培地（植物ホルモンフリー）で培養すると、正常な発達が見られず、濃緑色のカルスが茎頂分裂組織周辺で形成される。
【００１０】
また、サイトカイニンに対する初発応答遺伝子の転写活性化を担う転写因子であるＡＲＲ１(Arabidopsis Response Regulator1)タンパク質についての報告がある（例えば、非特許文献２等参照。）。このＡＲＲ１タンパク質はシロイヌナズナのタイプＢレスポンスレギュレーターに属する。胚軸断片を用いた緑色カルスの誘導実験では、機能欠損型の突然変異体で、サイトカイニンに対する感受性の低下が起こり、逆に過剰発現体では感受性の増加が見られることが報告されている。ＡＲＲ１タンパク質のリン酸レシーバードメインを欠損させたタンパク質を過剰発現させた植物体は、子葉からの異所的なシュート形成や茎頂のカルス化などの著しい形態変化が見られる。
【００１１】
さらに、細胞周期におけるＧ１期からＳ期への移行を制御する転写因子であるＥ２Ｆａタンパク質について報告されている（例えば、非特許文献3等参照。）。Ｅ２Ｆａタンパク質は、Ｅ２Ｆａ−ＤＰａ複合体となることで、ＤＮＡへのより親和性の高い、配列特異的な結合が可能となる。シロイヌナズナのＥ２ＦａとＤＰａをタバコで過剰発現させると、細胞分裂が促進し、核内倍加が起こる。またカルス誘導培地で葉片から誘導したカルスは、植物ホルモン無添加の培地でもしばらくは増殖を続けることが報告されている。またシュートを分化させるための植物ホルモン組成培地でも、シュートへの分化は見られず、胚性カルス（embryonic callus）の状態が維持される。
【００１２】
また、ＲＡＰ２．４タンパク質は、ＲＡＰ２タンパク質ファミリーに属するタンパク質であることが知られている（例えば、非特許文献４等参照。）。このＲＡＰ２．４タンパク質は、他のＲＡＰ２ファミリータンパク質と同様、野生型（Ｌｅｒ）の花、葉、茎及び根で発現が見られていることが報告されている。また、本発明者らの基礎的な実験から、植物体に比べて複数のカルス株で発現が上昇している転写活性化因子の遺伝子であることが明らかになっている。しかし、このタンパク質の機能についてはほとんどわかっていない。
【非特許文献１】Banno H,Ikeda Y, Niu QW, Chua, NH(2001) Overexpression of Arabidopsis ESR1   induces initiation of shoot regeneration. Plant Cell.13:2609-2618
【非特許文献２】Sakai H, Honma T, Aoyama T, Sato S, Kato T, Tabata S, Oka A(2001) ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to Cytokinins. Science. 294: 1519-1521
【非特許文献３】Kosugi S, Ohashi Y(2003) Constitutive E2F expression in tobacco plants exhibits altered cell cycle control and morphological change in a cell type-specific manner. Plant Physiol. 132: 2012-2022
【非特許文献４】Okamuro JK, Caster B, Villarroel R, Van Montagu M, Jofuku KD(2001) The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 94: 7076-7081
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、従来から種々の脱分化（カルス化）の方法が知られているが、従来の方法でカルスを誘導できない植物も多く、かかる脱分化しにくい植物についても、カルスを誘導できるように、従来法とは異なるカルス誘導方法の開発が望まれている。また、無限増殖能を有するカルスを用いて有用物質生産を行う研究がこれまで数多くなされているが、カルスの有用物質生産能の不安定さにより工業化した例はほんの数例しかなく、従来法とは異なる安定した有用物質生産能を有するカルスを用いた有用物質生産法の開発が望まれている。
【００１４】
本発明の目的は、脱分化しにくい植物でもカルスを誘導できるような、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産する方法を提供することにある。また、そのように脱分化が誘導されるように改変された植物体を用いて、安定した有用物質生産法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、植物体に比べ複数のカルス株で発現が促進していた転写因子であって、その機能が明らかにされていない転写因子をコードする遺伝子を植物体内で機能するプロモーターにつないで植物体に導入し発現させたところ、得られた植物体は、植物ホルモン非存在下でも、茎、葉、根などの器官の正常な分化が抑制されカルス状になることを見出した。なお、本明細書において、「植物ホルモン非存在下」とは、特に規定する場合を除き、「植物ホルモン無添加」と同じ意味である。また、得られたカルス細胞は植物ホルモン無添加の培地でも増殖し、脱分化状態を維持したまま継代培養が可能であることを見出した。そして、これらの知見から、かかる転写因子は脱分化に関与する転写因子であることを初めて見出し、これらの転写因子をコードする遺伝子を用いることにより、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法は、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の遺伝子が発現するように、該遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴としている。
（ａ）脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子、
（ｂ）配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、
（ｃ）配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、
（ｄ）配列番号２、４または６に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子、
（ｅ）配列番号２、４または６に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有し、且つ、脱分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１７】
また、本発明にかかる植物体の生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００１８】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、脱分化が誘導されるように改変されていることを特徴としている。
【００１９】
本発明にかかる植物体においては、植物体内の内因性のオーキシンの濃度が、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、有意に増加していないことが好ましい。
【００２０】
上記植物体には、成育した植物個体、植物組織、植物細胞、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００２１】
また、上記植物体は、カルスであって、当該カルス培養条件をコントロールすることにより表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖させることができるカルスであってもよい。さらに、上記植物体は、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を、当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスであってもよい。
【００２２】
また、本発明にかかる植物体の脱分化誘導キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。
【００２３】
また、上記植物体の脱分化誘導キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【００２４】
また、本発明にかかる有用物質の生産方法は、本発明にかかる植物体を、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させることを特徴としている。
【００２５】
また、本発明にかかる有用物質の生産方法は、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するカルス、または、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスを、上記選択マーカーの試薬である抗生物質および植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させる方法であってもよい。
【発明の効果】
【００２６】
すなわち、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法は、以上のように上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の遺伝子が発現するように、該遺伝子を含む組換え発現ベクターを植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴としている。これにより、得られる植物体は、植物ホルモン非存在下でも、茎、葉、根などの器官の正常な分化が抑制されカルス状になる。また、得られたカルス細胞は植物ホルモン無添加の培地でも増殖し、脱分化状態を維持したまま継代培養が可能である。また、特に、かかる方法により得られる植物体は、脱分化が誘導されるように改変されているという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明にかかる植物体の生産方法、植物体及びその利用について説明すると以下の通りである。
【００２８】
上述したように、本発明者らは、植物体に比べ複数のカルス株で発現が促進されていた転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを、該遺伝子が植物体内で発現するように植物体に導入することにより、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができることを見出した。また、この知見より、上記転写因子は、脱分化に関与し、脱分化を誘導する転写因子であることを初めて見出した。したがって、この脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを植物体に導入することによって、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができる。
【００２９】
すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法は、この脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入するものであればよい。これにより、この脱分化に関与する転写因子が植物体内で過剰に生産される。
【００３０】
かかる転写因子を植物体で過剰に生産させることによって得られる植物体では、上記転写因子の標的遺伝子の転写が促進されると考えられ、脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができる。その結果、得られる植物体を脱分化が誘導されるように改変させることができる。
【００３１】
本発明の生産方法で生産される脱分化が誘導されるように改変された植物体とは、分化が抑制されるように改変された植物体であるということもできる。また、改変されたとは形質転換前と比較して改変されたことをいう。
【００３２】
ここで、植物体が分化するとは、１つの単純な系又は細胞集団が２つ以上の互いに異質な系又は細胞集団に分かれることをいう。例えば、植物体の表皮細胞やカルスからの不定胚の分化が知られており、この不定胚から子葉、頂芽、幼根等が再生する。また、脱分化とは、分化した組織や器官の細胞が再びより未分化性の高い状態に戻ることをいい、分化とは逆のプロセスである。言い換えれば、器官、組織などの機能分化・形態分化している細胞が、分裂を開始して、カルス化する現象をいう。
【００３３】
また、脱分化が誘導されるように改変された植物体（すなわち分化が抑制されるように改変された植物体）とは、言い換えれば、脱分化しやすくなる（分化しにくくなる）ように改変された植物体をいう。かかる植物体は、例えばオーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモン非存在下で、通常は脱分化しない条件下でも、脱分化するか、分化のレベルが低くなるように改変された植物体であるということもできる。かかる植物体は、また、オーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモンに対する感受性が高くなるように改変された植物体であるともいえる。なお、ここで植物ホルモンとは、植物の脱分化を制御するために用いられうるものであれば、オーキシンやサイトカイニンに限定されるものではなく、ジベレリン、エチレン、アブシジン酸、ジャスモン酸、ブラシノステロイド等も含まれる。
【００３４】
通常、カルスの誘導および維持（継代培養）には培地に上記植物ホルモンのうち特にオーキシンを添加する必要がある。しかしながら、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、誘導および維持において外因性の植物ホルモンを必要としない。すなわち、本発明の植物体では植物ホルモン非存在下でカルスの誘導と維持が可能である。
【００３５】
なお、ここで、外因性の植物ホルモンとは培地に添加する植物ホルモンのことをいう。一方、植物体内部で作られる植物ホルモンを内因性の植物ホルモンという。
【００３６】
従来から誘導および維持に外因性の植物ホルモンを必要としないカルスとしては、クラウンゴールが知られている。また馴化したカルスにおいても維持に外因性の植物ホルモンを必要としなくなる。この原因として、内因性の植物ホルモンであるオーキシンの濃度が高くなっていることがこれまでに報告されている。
【００３７】
そこで、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体でも内因性のオーキシンの濃度が高くなっていることが予想された。このため、本発明者らは、オーキシン応答エレメントを配置したプロモーターにレポーター遺伝子としてβ―グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を結合させたキメラ遺伝子を導入した植物体を、本発明にかかる植物体の生産方法を用いて、脱分化が誘導されるように改変し、内因性の植物ホルモンが過剰に生産されているか否かを調べた。その結果、驚くべきことに、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、オーキシンが過剰に生産されていないことが見出された。また、ＧＣ−ＭＳを用いた、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の内因性のオーキシン（インドール酢酸）濃度の測定によっても、ベクターコントロール植物体と比べて内因性のオーキシン濃度が同程度か、むしろ低いことが見出された。
【００３８】
本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、このように、植物体内の内因性のオーキシンの濃度が、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、有意に増加していないことが好ましい。なお、ここで、「有意に増加していない」とは、オーキシンの作用による遺伝子の変異や染色体の欠損などにより植物体の形態や代謝に影響を与える程度にまで増加していないことをいう。かかる増加量としては、脱分化が誘導されるように改変される前のオーキシンの濃度に対して、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがより好ましく、２０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましい。また、言い換えれば、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体では、植物体内で内因性のオーキシンが過剰生産されていないことが好ましい。また、植物体内の内因性のオーキシンの濃度は、脱分化が誘導されるように改変される前と比較して、同じであるか、または、減少していることがより好ましい。
【００３９】
有用物質生産へのカルス培養の応用において、植物培養細胞であるカルスが有用物質生産能を失ってしまう大きな原因の一つとして、外因性のオーキシンの作用による遺伝子の変異や染色体の欠損などが関与していることがよく知られている。本発明にかかる植物体の生産方法により脱分化が誘導されるように改変された植物体で誘導されたカルスでは、かかる作用を有する外因性のオーキシンを添加する必要がないため、遺伝子の変異や染色体の欠損などが起こりにくいと考えられる。加えて、内因性のオーキシンが過剰に増加していないため、過剰な内因性のオーキシンによる同様の遺伝子の不活性化が起きにくいと考えられる。それゆえ、本発明にかかる植物体は、有用物質生産に好適に用いることができると考えられる。
【００４０】
以降の説明では本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法、これらの生産方法により得られる植物体とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。
【００４１】
（Ｉ）脱分化が誘導されるように改変された植物体の生産方法
上述したように、本発明にかかる植物体の生産方法は、脱分化に関与する転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを植物細胞に導入する。以下、（Ｉ−１）脱分化に関与する転写因子、（Ｉ−２）本発明にかかる植物体の生産方法の一例の順に説明する。
【００４２】
（Ｉ−１）脱分化に関与する転写因子
本発明で用いられる転写因子は、脱分化に関与する転写因子であれば特に限定されるものではない。かかる転写因子は、植物界で広く保存されている。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有する転写因子が含まれる。
【００４３】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、例えば、シロイヌナズナのＲＡＰ２．４タンパク質（ＭＩＰＳ（Munich Information Center for Protein Sequence） Ｎｏ：Ａｔ１ｇ７８０８０）及びこれらのホモログである、Ａｔ１ｇ２２１９０タンパク質、Ａｔ１ｇ３６０６０タンパク質等を挙げることができる。ＲＡＰ２．４タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。Ａｔ１ｇ２２１９０タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。Ａｔ１ｇ３６０６０タンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００４４】
また、本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１、３または５にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＲＡＰ２．４タンパク質、Ａｔ１ｇ２２１９０タンパク質、またはＡｔ１ｇ３６０６０タンパク質に限定されるものではなく、配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であって、且つ、脱分化に関与するタンパク質であってもよい。かかる変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、及び置換を含む変異体を挙げることができる。特に、タンパク質における「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのタンパク質の活性にほとんど影響しない。
【００４５】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４６】
当業者は、周知技術を使用してタンパク質のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。
【００４７】
上記変異体は特に限定されるものではないが、タンパク質の活性を変化させない変異であることが好ましい。具体的には、サイレント変異や保存性置換等が挙げられる。
【００４８】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。また、サイレント置換は、アミノ酸が置換、添加又は欠失してもタンパク質活性に影響の無い変異である。
【００４９】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Bowie,J.U.ら「Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions」,Science 247:1306-1310 (1990)（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００５０】
また、上記転写因子は、脱分化に関与するタンパク質であって、配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００５１】
なお、上記の「配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００５２】
また、上記転写因子には、配列番号１、３または５に示されるアミノ酸配列との相同性が７０％以上、好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列を有し、脱分化に関与するタンパク質も含まれる。このようなタンパク質におけるアミノ酸配列の相同性は、７０％以上であればよいが、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。
【００５３】
なお、本明細書における上記「相同性」とは、BLAST（Basic local alignment search tool；Altschul, S. F. et al，J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990）検索により得られた値を意味するものであり、アミノ酸配列の相同性は、BLAST検索アルゴリズムにより決定することができる。具体的には、BLASTパッケージ（sgi32bit版、ver. 2.0.12；ＮＣＢＩより入手）のbl2seqプログラム（Tatiana A. Tatusova及びThomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174, 247-250, 1999）を用い、デフォルトパラメーターにしたがって算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「blastp」を用い、Gap挿入Cost値を「０」とし、Gap伸長Cost値を「０」とし、Query配列のフィルターとして「SEG」を、Matrixとして「BLOSUM62」をそれぞれ用いる。
【００５４】
また、本発明で用いられる、脱分化に関与する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。そのため、脱分化を誘導させたい個々の植物体において、脱分化に関与する転写因子やその遺伝子を必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナ由来の上記転写因子を、他の植物で発現させることで、さまざまな種の植物において簡便に脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産できることが予想される。
【００５５】
本発明で用いられる転写因子を生産する際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００５６】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＲＡＰ２．４タンパク質を用いる場合には、このＲＡＰ２．４タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＲＡＰ２．４遺伝子と称する）を、転写因子としてＡｔ１ｇ２２１９０タンパク質を用いる場合には、このＡｔ１ｇ２２１９０タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、Ａｔ１ｇ２２１９０遺伝子と称する）を、転写因子としてＡｔ１ｇ３６０６０タンパク質を用いる場合には、このＡｔ１ｇ３６０６０タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、Ａｔ１ｇ３６０６０遺伝子と称する）を挙げることができる。ＲＡＰ２．４タンパク質、Ａｔ１ｇ２２１９０タンパク質、またはＡｔ１ｇ３６０６０タンパク質の具体的な一例としてはそれぞれ、例えば、配列番号２、４または６に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５７】
もちろん、本発明で用いられる転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号２、４または６に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号２、４または６に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。
【００５８】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしにくくなる）。
【００５９】
また、本発明で用いられる転写因子をコードする遺伝子としては、上記転写因子をコードする遺伝子の変異体であってもよい。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。かかる変異体は特に限定されるものではないが、コードするタンパク質の活性を変化させない変異であることが好ましい。
【００６０】
このような変異体としては、上記転写因子をコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換、又は付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、又はその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、又は付加を生成し得る。
【００６１】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子をコードする遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００６２】
本発明では、上記転写因子をコードする遺伝子を用いれば、上記転写因子を植物体で過剰に生産することができる。具体的には、上記転写因子をコードする遺伝子を、当該遺伝子が発現するように植物体に導入する。これにより、上記転写因子を過剰に生産することができる。なお、過剰に生産するとは、上記転写因子をコードする外因性の遺伝子を導入し発現させることによって、外因性の遺伝子を導入しない場合と比較して、上記転写因子の発現量が多くなっていればよい。
【００６３】
（Ｉ−２）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子を植物体で過剰に生産させる過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００６４】
（Ｉ−２−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００６５】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００６６】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００６７】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００６８】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーター及び上記転写因子をコードする遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選択マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００６９】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることができる。
【００７０】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００７１】
上記選択マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００７２】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記転写因子をコードする遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００７３】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター及び転写因子をコードする遺伝子、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【００７４】
発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記転写因子をコードする遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【００７５】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００７６】
（Ｉ−２−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（Ｉ−２−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子を生産させるようになっていればよい。
【００７７】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。
【００７８】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００７９】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【００８０】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−２−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【００８１】
（Ｉ−２−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【００８２】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、オーキシンやサイトカイニン等の植物ホルモン非存在下で通常脱分化が起こらないような条件下で、脱分化が起こる植物体から選抜してもよい。
【００８３】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記転写因子をコードする遺伝子を植物体に導入することにより、該植物体から、有性生殖又は無性生殖により単に、脱分化が誘導されるように改変された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【００８４】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物組織、植物細胞、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【００８５】
また、本発明者らは、本発明にかかる植物体を、上記形質転換工程で用いられた選択マーカーの試薬であるハイグロマイシンを添加せずに培養したところ、カルス表面が分化し、この状態のまま植物ホルモン無添加の培地でも活発に増殖をすることを見出した。そして、この状態で、シロイヌナズナで計測可能なモデル二次代謝産物として用いられるアントシアニンを誘導培地培養することにより、シロイヌナズナにおいて従来法で誘導されたカルスではほとんど生産されないアントシアニンを高濃度に生産する現象を見出した。
【００８６】
このように、形質転換体の選択マーカーの試薬である抗生物質を培地から除くと、本発明の植物体であるカルスは、カルスの表面が一部分化し、この状態のまま植物ホルモン無添加で増殖することができる。かかるカルスは、特に、特定の分化した組織で生合成が行われる二次代謝産物の生産に好適に用いることができる。それゆえ、本発明にかかる植物体には、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するカルスも含まれる。また、本発明にかかる植物体は、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を、当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養したカルスでありうる。
【００８７】
ここで、上記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性遺伝子であり、より具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。中でも、上記選択マーカーは、ハイグロマイシンに対する薬剤耐性遺伝子であることが好ましい。また、上記選択マーカーの試薬である抗生物質としては、例えばハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等を挙げることができ、中でもハイグロマイシンをより好適に用いることができる。
【００８８】
（ＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記転写因子を植物体で過剰に生産させることによる。これにより、当該転写因子が標的とする標的遺伝子の転写が促進されると考えられる。その結果、得られる植物体の脱分化が誘導されるように改変された植物体を生産することができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる植物体も含まれる。
【００８９】
（ＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
ここで、本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、かかる脱分化の誘導によりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよいが、双子葉植物であることがより好ましい。双子葉植物としては、離弁花亜綱であってもよいし、合弁花亜綱であってもよい。合弁花亜綱としては、例えば、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツムシソウ目、キク目を挙げることができる。また、離弁花亜綱としては、例えば、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、サガリバナ目、ウツボカズラ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目等を挙げることができる。
【００９０】
本発明にかかる脱分化が誘導されるように改変された植物体の具体例をさらに挙げると、ナタネ、ジャガイモ、ホウレンソウ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワー、さやいんげん、かぶ、大根、ブロッコリー、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウなどの各種の食用植物、あるいはバラ、キク、あじさい、カーネーションなどの観葉植物またあるいは、ニチニチソウ、イチイ、オウレン、ハナビシソウ、キハダ、オタネニンジン、ケシ、イカリソウ、ベラドンナ、チョウセンアサガオ、Cephaelis ipecacuanhaなどの薬用植物を挙げることができる。
【００９１】
（ＩＩ−２）本発明の有用性
本発明では、植物体を脱分化が誘導されるように改変することができるが、本発明の有用性は特に限定されるものではなく、そのような脱分化の誘導により効果がある分野であればよい。かかる分野としては、例えば、脱分化が誘導されるように改変されることによるカルス化が困難な植物のカルス化、カルスを用いた有用物質生産、カルスからの再分化系を利用した育種分野等を挙げることができる。
【００９２】
まず、カルス化が困難な植物のカルス化への応用例について説明すると、例えば、カルス化には用いる植物ホルモンの種類や濃度の検討が必要であり、例えばユーカリ、スギ等の木本類、ゴム、コムギ等のようにカルス化が困難な植物もある。このような、カルス化が困難な植物に、本発明に係る植物体の生産方法を用いて、脱分化を誘導することにより、カルス化を促進することができると考えられ、応用価値が高い。
【００９３】
また、有用物質生産への応用について説明すると、カルス培養において、植物培養細胞であるカルスが有用物質生産能を失ってしまう大きな原因の一つとして、過剰濃度のオーキシンの作用による遺伝子のメチル化などのエピジェネティックな変異（Lambe et al., In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant . 33 .155-162(1997)）や染色体の欠損などが関与していることがよく知られている。有用物質生産においては、増殖能を有しつつ有用物質も安定して生産する（二次代謝も安定に発現させる）植物培養細胞が必要である。しかし、オーキシンは、形態を脱分化させ、細胞の増殖を促進するが、同時に二次代謝を抑制することが多い。
【００９４】
本発明にかかる植物体の生産方法により脱分化が誘導されるように改変された植物体で誘導されたカルスでは、外因性のオーキシンを必要としないことに加え、アグロバクテリウムによって生ずる腫瘍細胞（クラウンゴール）等とは異なり、内因性のオーキシン（インドール酢酸）量が過剰に増加していないことが、実験的に明らかになっている。すなわち、培地に添加する外因性のオーキシンや、過剰な内因性のオーキシンによる遺伝子の不活性化が起きにくいと考えられる。それゆえ、本発明にかかる植物体は、有用物質の生産に好適に用いることができる。
【００９５】
また、本発明の植物体を選択マーカーの試薬であるハイグロマイシンを添加せずに培養すると、カルス表面が分化し、この状態のまま植物ホルモン無添加の培地でも活発に増殖をする。この状態で、シロイヌナズナで計測可能なモデル二次代謝産物として用いられるアントシアニンを誘導培地培養することにより、シロイヌナズナにおいて従来法で誘導されたカルスではほとんど生産されない二次代謝産物（アントシアニン）を高濃度に生産する現象が見られている。このことから、本発明によって得られるカルスはホルモンの作用による二次代謝の不活性化が起こりにくいばかりか、部分的に再分化させることで二次代謝産物をより積極的に生産させることが可能であると考えられる。この機能を有用で付加価値の高い物質（アルカロイドなど）をつくる薬用植物で応用できることが示されれば、これまでにない新しいタイプの細胞による新規な有用物質生産システムの構築が提案できる。さらに転写誘導系を利用（グルココルチコイド、estradiol、ガラクトース等）することで、培養環境因子と１対１の遺伝子発現制御が可能となり、脱分化状態（誘導系ON）で細胞量を増やし、再分化状態（誘導系OFF）で二次代謝産物を生産させることができ、より効率的な有用物質生産が可能になると考えられる。
【００９６】
また、育種分野への応用についても同様に、得られたカルスは選択マーカーであるハイグロマイシンを添加せずに培養すると組織化、特にシュートへの分化が起こりやすく、固体培養では発根し親植物体に戻る現象もみられることから、これらの再分化のメカニズムや分化誘導条件を研究および利用して行くことで、カルスの状態で細胞を増殖させ、その後再分化させることで大量の苗が生産可能であると考えられる。
【００９７】
なお、上述したように、上記転写因子をコードする遺伝子のアンチセンス鎖を含むベクターやRNAiベクターを植物細胞に導入することによって、導入された植物体または細胞において脱分化を抑制することも可能と考えられる。かかる方法により、脱分化が抑制されるように改変されることによる除草剤耐性植物の作製等への応用が可能となる。すなわち、脱分化が抑制されるように改変された植物体は、オーキシン等の植物ホルモン感受性が低い。それゆえ、オーキシン等の存在下でも生育可能な植物、つまりオーキシン等を利用した除草剤に対する除草剤耐性植物の作製に寄与できる。
【００９８】
（ＩＩ−３）本発明の利用
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、上述したように、本発明にかかる植物体の生産方法により脱分化が誘導されるように改変された植物体は、有用物質の生産に好適に用いることができる。それゆえ、本発明には、本発明の植物体を、植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させる有用物質の生産方法も含まれる。
【００９９】
本発明にかかる有用物質の生産方法は、本発明の植物体を培養し二次代謝産物を生産させる方法であれば、特に限定されるものではなく、従来公知のあらゆる方法を用いることができる。
【０１００】
また、本発明にかかる有用物質の生産方法には、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するカルス、または、上記形質転換工程で選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いて得られた植物体を当該選択マーカーの試薬である抗生物質を添加せずに培養して得られたカルスを、上記選択マーカーの試薬である抗生物質および植物ホルモンの添加なしで培養し、二次代謝産物を生産させる方法も含まれる。
【０１０１】
また、本発明の利用分野、利用方法の他の一例としては、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち脱分化誘導キットを挙げることができる。
【０１０２】
この脱分化誘導キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいるものを挙げることができる。また、本発明にかかる脱分化誘導キットは、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【実施例】
【０１０３】
以下、実施例及び図１ないし図６に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
〔実施例１〕
以下の実施例１においては、シロイヌナズナ由来のＲＡＰ２．４遺伝子（Ａｔ１ｇ７８０８０）をカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）の下流につないで組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換し、ＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。
【０１０５】
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
【０１０６】
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号７）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号８）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号９）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１０）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
【０１０７】
（２）クローンテック社製（Clontech社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、ＣａＭＶ３５Ｓとノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
【０１０８】
（３）以下の配列番号１１、１２の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１１、１２の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
5'-ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc-3'（配列番号１１）
5'-cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct-3'（配列番号１２）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
【０１０９】
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図２に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
【０１１０】
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Becker, D. Nucleic Acids Res. 18:203,1990)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
【０１１１】
（２）インビトロジェン社から購入したGateway(登録商標）ベクターコンバージョンシステムのFragmentＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、FragmentＡ断片を回収した。
【０１１２】
（３）回収したFragmentＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
【０１１３】
＜構築用ベクターへのＲＡＰ２．４遺伝子の組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＲＡＰ２．４タンパク質をコードする遺伝子を以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込み、ｐ３５ＳＲＡＰ２．４Ｇを得た。
【０１１４】
（１）シロイヌナズナ葉から調整したｍＲＮＡを用いて作成したｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマーを用いて、シロイヌナズナＲＡＰ２．４遺伝子の終止コドンを含むコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１（ＲＡＰ２．４−Ｆ）5'-ATGGCAGCTGCTATGAATTTGTAC-3'（配列番号１３）
プライマー２（ＲＡＰ２．４−Ｒ）5'-CTAAGCTAGAATCGAATCCCAATC-3'（配列番号１４）
ＲＡＰ２．４遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び１に示す。
【０１１５】
（２）得られたＲＡＰ２．４コード領域のＤＮＡ断片を、図３に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
【０１１６】
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離した。
【０１１７】
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＲＡＰ２．４遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway（登録商標）ＬＲ clonase（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
【０１１８】
（１）まず、ＲＡＰ２．４コード領域のＤＮＡ断片が順方向に挿入されたｐ３５ＳＲＡＰ２．４Ｇ 1.5μＬ（約150ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ4.0μＬ（約400ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ buffer 4.0μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ TrisCl pH7.0、１ｍＭ EDTA）5.5μＬを加えた。
【０１１９】
（２）この溶液にＬＲ clonase4.0μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、proteinaseＫ4.0μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１２０】
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
【０１２１】
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記ＲＡＰ２．４遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＲＡＰ２．４（３５Ｓ：：ＲＡＰ２．４）で、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
【０１２２】
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＲＡＰ２．４を、土壌細菌（（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Sahell  １９８６)）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含む１リットルのＬＢ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、下表１）に懸濁した。
【０１２３】
【表１】
2006325588.tif 000002
【０１２４】
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを２分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ（有効次亜塩素酸濃度１．５％）、０．０２％Triton Ｘ-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表２）に蒔種した。
【０１２５】
【表２】
2006325588.tif 000003
【０１２６】
（３）蒔種した約２０００粒の種子から平均して２０ないし３０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＡＰ２．４遺伝子が導入されていることを確認した。得られた形質転換植物体は著しく分化が抑制され、次第に茎頂、胚軸および根がカルス化した。
【０１２７】
＜植物ホルモン非存在下でのカルス化＞
得られた形質転換植物体の芽生えを、植物ホルモン（オーキシン及びサイトカイニン）非存在のハイグロマイシンを含むＣＩＭ培地で生育させた。下表３にＣＩＭ培地の組成を、下表４にＢ５培地の組成を示す。なお、本実施例において用いた植物ホルモン非存在のＣＩＭ培地は、表３中、オーキシン（「２，４−Ｄ」と表示。）とサイトカイニンの一種であるカイネチンとを加えていない培地である。また、ＣＩＭ培地に加えたハイグロマイシンの量は、ＣＩＭ培地１ｌに対し30 ｍｇであった。
【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
３５Ｓ−ＲＡＰ２．４を用いてＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を上記植物ホルモン非存在のＣＩＭ培地で生育させた結果を図４に示す。通常植物体をカルス化させるには、植物ホルモンが存在する培地で生育させなければならないが、図４に示すように、３５Ｓ−ＲＡＰ２．４（３５Ｓ：：ＲＡＰ２．４）で形質転換されたシロイヌナズナの幼植物は、植物ホルモン非存在下でも、茎、葉、根などの器官分化が抑制されカルス状の植物体となった。なお、図４(ａ)中スケールバーは３ｍｍを、図４（ｂ）中スケールバーは５ｍｍを示す。このように、３５Ｓ−ＲＡＰ２．４でＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換体では、オーキシン及びカイネチン不存在下でも、これらが存在するのと同様に脱分化が誘導された。このことから、ＲＡＰ２．４遺伝子でコードされる転写因子は、脱分化に関与する転写因子であることが確認された。
【０１３１】
〔実施例２〕
シロイヌナズナ由来のＲＡＰ２．４遺伝子（Ａｔ１ｇ７８０８０）の代わりにシロイヌナズナ由来の遺伝子（Ａｔ１ｇ２２１９０）を用いた以外は実施例１と同様にして、シロイヌナズナを形質転換し、Ａｔ１ｇ２２１９０遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。
【０１３２】
なお、Ａｔ１ｇ２２１９０遺伝子の終止コドンを含むコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅するにあたり以下のプライマーを用いた。
プライマー１（Ａｔ１ｇ２２１９０−Ｆ）5'-ATGACAACTTCTATGGATTTTTACAG-3'（配列番号１５）
プライマー２（Ａｔ１ｇ２２１９０−Ｒ）5'-CTAATTTACAAGACTCGAACACTG-3'（配列番号１６）
また、Ａｔ１ｇ２２１９０遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び３に示す。
【０１３３】
得られた形質転換植物体の芽生えの一部を切り取り、実施例１と同様にして植物ホルモン非存在下のＣＩＭ培地で生育させた結果を図５に示す。図５中ＡおよびＢは、個別の２ラインの形質転換体の結果を示す。図５に示すように、３５Ｓ：：Ａｔ１ｇ２２１９０で形質転換されたシロイヌナズナの幼植物は、植物ホルモン非存在下でも、正常な植物体にならず脱分化（カルス化）した。なお、図５中スケールバーは３ｍｍを示す。
【０１３４】
〔実施例３〕
シロイヌナズナ由来のＲＡＰ２．４遺伝子（Ａｔ１ｇ７８０８０）の代わりにシロイヌナズナ由来の遺伝子（Ａｔ１ｇ３６０６０）を用いた以外は実施例１と同様にして、シロイヌナズナを形質転換し、Ａｔ１ｇ３６０６０遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体を生産した。
【０１３５】
なお、Ａｔ１ｇ３６０６０遺伝子の終止コドンを含むコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅するにあたり以下のプライマーを用いた。
プライマー１（Ａｔ１ｇ３６０６０−Ｆ）5'-ATGGCGGATCTCTTCGGTGG-3'（配列番号１７）
プライマー２（Ａｔ１ｇ３６０６０−Ｒ）5'-TCACGATAAAATTGAAGCCCAATC-3'（配列番号１８）
また、Ａｔ１ｇ３６０６０遺伝子の塩基配列及びコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び５に示す。
【０１３６】
得られた形質転換植物体の芽生えの一部を切り取り、実施例１と同様にして植物ホルモン非存在のＣＩＭ培地で生育させた結果を図６に示す。図６中ＡおよびＢは、個別の２ラインの形質転換体の結果を示す。図６に示すように、３５Ｓ：：Ａｔ１ｇ３６０６０で形質転換されたシロイヌナズナの幼植物は、植物ホルモン非存在下でも、正常な植物体
にならず脱分化（カルス化）した。なお、図６中スケールバーは３ｍｍを示す。
【０１３７】
〔実施例４〕
以下の実施例４においては、本発明の植物体のカルス化が内因性のオーキシンの過剰生産に起因するものであるのか否かを、ＤＲ５::ＧＵＳ植物体でＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させることにより調べた。
【０１３８】
ＤＲ５::ＧＵＳはオーキシン応答エレメント(TGTCTC)を７個タンデムに配置したプロモーターにレポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を融合させたものである(Ulmasov, T. et al., Plant Cell, 9, 1963-1971,1997)。このプロモーターレポーターを導入したシロイヌナズナでは、ＧＵＳ活性を検出することにより、内因性のオーキシンの生合成部位や外因性のオーキシンに応答している部位を特定することができる（Aloni,R. et al., Planta 216,841-853, 2003）。このため、このプロモーターレポーターを導入した植物体であるＤＲ５::ＧＵＳ植物体はオーキシンの生合成やオーキシンと形態形成の関連における研究によく用いられている。
【０１３９】
このＤＲ５::ＧＵＳ植物体でＲＡＰ２．４を過剰発現させる（３５ＳＲＡＰ２．４ＮＯＳ／ＤＲ５::ＧＵＳ）ことにより、ＤＲ５::ＧＵＳ植物体を脱分化が誘導されるように改変することができる。こうして誘導されるカルス（以下、ＲＡＰ２．４カルスと略称することがある。）のカルス化が、内因性のオーキシンの過剰生産に起因するのであれば、このＲＡＰ２．４カルスで高いＧＵＳ活性が見られるはずである。
【０１４０】
そこで、図７の右側の流れのように、ＤＲ５::ＧＵＳ植物体に、実施例１で構築したＲＡＰ２．４を過剰発現させる組換え発現ベクター（３５ＳＲＡＰ２．４ＮＯＳ）を、実施例１と同様にして、アグロバクテリウムを用いて形質転換した。得られた形質転換第一世代（Ｔ１）の種子を、上述したハイグロマイシン選択培地に播種し、形質転換体を選抜した後、上述した植物ホルモン非存在のＣＩＭ培地（ハイグロマイシン（Ｈｍ）を含む)に移植し、ＲＡＰ２．４カルスを得た。実験の対照（コントロール）として図７の左側の流れのように、ＤＲ５::ＧＵＳ植物体にＲＡＰ２．４を含まないベクター（ベクターコントロール；３５ＳＮＯＳ）を形質転換し、得られる形質転換第一世代（Ｔ１）の芽生えからオーキシン（２，４−Ｄ）を含む培地（上記ＣＩＭ培地）でカルスを誘導した。なお、ＤＲ５::ＧＵＳ植物体は、Dr. T. Guilfoyle (Department of Biochemistry,. University of Missouri, Columbia)よりDR5::GUSを含む形質転換用ベクターを分譲してもらい、このベクターを予めシロイヌナズナに形質転換して用いた。
【０１４１】
得られた２種類のカルスをＧＵＳ染色した。ＧＵＳ染色の方法は下表５に示す試薬を混合して調製したＧＵＳ染色用バッファを用いて以下のように行った。
【０１４２】
【表５】
2006325588.tif 000006
【０１４３】
上記ＧＵＳ染色用バッファ0.5-1.5 ｍＬにサンプリングした試料を全体が浸るように入れた。３０℃で６０分脱気処理を行い、その後３７℃、オーバーナイトで（１８時間）インキュベートした。次に７０％エタノールでバッファと置き換える処理を数回行って脱色した。その後、蒸留水で置換し、実体顕微鏡または顕微鏡で観察を行った。
【０１４４】
この結果、図８に示すベクターコンロールのカルス（図８中、「Vector Control/DR5::GUS callus(+auxin)」と表示。）はＧＵＳ染色後（図中Ｂ）は青く染まりＧＵＳ活性が見られた。これは、培地中に添加してある外因性のオーキシン(２，４−Ｄ)にＤＲ５::ＧＵＳが応答したためである。
【０１４５】
一方、ＲＡＰ２．４カルスでは、外因性のオーキシンがなくても（図８中、「RAP2.4/DR5::GUS callus(auxin free)」と表示。）、図中Ｃのようにカルスの形態を保っているが、ＧＵＳ染色後（図中Ｄ）ではＧＵＳ活性が見られなかった。この結果は、ＤＲ５::ＧＵＳ遺伝子のエピジェネティクなサイレンシンング(メチル化など)に起因していることも考えられたため、ＲＡＰ２．４カルスを、オーキシン(２，４−Ｄ)を含む培地で４８時間培養した後にＧＵＳ染色したところ（図８中、「RAP2.4/DR5::GUS callus(+auxin after 48 hours)」と表示。）、ＧＵＳ染色後（図中Ｆ）は青く染まり、ベクターコントロールのカルス同様にＧＵＳ活性が見られた。この結果は、ＲＡＰ２．４カルスが有するＤＲ５::ＧＵＳ遺伝子がオーキシンによって正常に機能していることを示している。
【０１４６】
これらの結果から、ＲＡＰ２．４カルスでは、内因性のオーキシンの過剰生産が起こっているのではないことが示された。また図８中Ｃで見られるようなＲＡＰ２．４カルスの形態が、外因性のオーキシンに起因するものでないことを示している（実際に植物ホルモン非存在下の培地でカルス化していることを示している）。
【０１４７】
〔実施例５〕
次にＲＡＰ２．４カルスの内因性オーキシン（ＩＡＡ）濃度の測定を試みた。方法はGas Chromatography-Mass Spectrometry(ＧＣ−ＭＳ)を用いたNakamuraらの方法 (Nakamura, A. et al. Plant Physiology, 133, 1843-1853, 2003) に基づいた。方法の手順を以下に示す。
【０１４８】
１−１０ｍｇの組織を１．５ｍＬのマイクロチューブに採り、液体窒素中でホモジナイズした。このマイクロチューブに５００μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ７, ０．０２％（ｗ／ｖ）ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムを含む)を加えて組織を良く懸濁し、２００ｐｇの１３Ｃ６ＩＡＡとを加えた。４℃で１時間振とうしながら抽出を行い、１Ｍ  ＨＣｌ２５μＬでｐＨを２．６に調整した。５０ｍｇのＸＡＤ７−ＨＰを加え３０分間マイルドシェーカーで懸濁および平衡化し、バッファを除去した後、ＸＡＤ７−ＨＰを５００μＬの１％酢酸で２回洗浄し、５００μＬのジクロロメタンで３０分間抽出した（２回）。ジクロロメタンフラクションを合わせて、スピードバックで乾燥し、試料を誘導化してＧＣ−ＭＳ分析に供した。
【０１４９】
ＲＡＰ２．４カルスをサンプルに用いた際には、内部標準（１３Ｃ６ＩＡＡ）と重なるピークが存在し、定量が不可能であった。そこで、播種後７日目のＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体の芽生えをサンプルとして用いた。コントロールとして、ベクターコントロール植物体の芽生えを用いた。芽生えを用いた場合、カルスで見られた内部標準と重なるピークは存在せず定量が可能であった。また、播種後７日目においては、ＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体とベクターコントロール植物体とにおいて形態の差は明瞭であり、導入した遺伝子の影響が出ている。
【０１５０】
図９に、内因性オーキシン（ＩＡＡ）濃度（図中「IAA concentration」と表示。単位はｐｇ／ｍｇF.W.（F.W.：fresh weight ; 組織の生重量））の測定結果を示す。結果として、ＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させた形質転換植物体の芽生え（図中、「RAP2.4 seedling」と表示。）では内因性のオーキシン濃度が、ベクターコントロール植物体の芽生え（図中、「Vector control seedling」と表示。）と比べて同程度か、むしろ低いことが明らかとなった。
【０１５１】
実施例４、実施例５の実験結果より、RAP２．４遺伝子の過剰発現によるカルス化は、内因性のオーキシンの過剰生産によって引き起こされるのではないことが明らかとなった。
【０１５２】
〔実施例６〕
以下の実施例６においては、ＲＡＰ２．４カルスの培養において、形質転換体の選択マーカーの試薬であるハイグロマイシン（Ｈｍ）を培地から除き、カルスの変化を観察した。
【０１５３】
実施例１＜植物ホルモン非存在下でのカルス化＞と同様に植物ホルモンを含まないＣＩＭ培地にハイグロマイシンを加えたもの（Ｈｍ（＋））と、植物ホルモンを含まないＣＩＭ培地にハイグロマイシンを加えないもの（Ｈｍ（−））とを準備した。
【０１５４】
それぞれの培地に、ＲＡＰ２．４カルスの一部を植え継ぎ、光照射条件下で培養した。植え継ぎ後、４０日目のＲＡＰ２．４カルスの観察結果を図１０に示す。なお、図１０中、スケールバーは５ｍｍを示す。図１０中Ａに示すようにＨｍ（＋）では脱分化した形態を維持したのに対し、Ｂに示すようにＨｍ（−）ではカルスの表面に葉が分化しているのが観察された。
【０１５５】
また、それぞれの培地に、ＲＡＰ２．４カルスの一部を植え継ぎ、光を照射しないで培養した。植え継ぎ後、４０日目のＲＡＰ２．４カルスの観察結果を図１０に示す。図１０中Ｃに示すようにＨｍ（＋）では脱分化した形態を維持したのに対し、Ｄに示すようにＨｍ（−）ではカルスの表面に葉および根が分化しているのが観察された。
【０１５６】
さらに、ＲＡＰ２．４カルスは、図１１中Ｅに示すように、Ｈｍ（−）の植物ホルモンを含まない液体のＣＩＭ培地において、カルスの表面を一部分化させたままで継代培養が可能であることが確認された。
【０１５７】
なお、カルスの表面を一部分化させた状態で、再び植物ホルモンを含まないＣＩＭ培地をＨｍ（＋）にしたところ、図１１中Ｆに示すように、カルスの表面の一部分化していた組織は白化し枯死した。これは、ハイグロマイシンによる作用であることが判る。すなわち、カルス表面の一部分化してきた細胞組織は、ハイグロマイシン感受性になっており、これはＲＡＰ２．４カルスに導入されているハイグロマイシン耐性遺伝子が何らかの影響で作用しなくなっていることに起因していると考えられる。ハイグロマイシン耐性遺伝子は、ＲＡＰ２．４遺伝子とともにＲＡＰ２．４カルスに導入されているために、この実験系においてハイグロマイシン耐性遺伝子と同様に、ＲＡＰ２．４遺伝子の発現も何らかの理由で抑制されていることが考えられる。言い換えると、何らかの影響でＲＡＰ２．４遺伝子の発現が抑制された細胞が分化してきたことが予想される。
【０１５８】
〔実施例７〕
以下の実施例７においては、実施例６で得られた、表面が一部分化し、表面が一部分化した状態のまま増殖するＲＡＰ２．４カルスを用いて、本発明にかかる植物体が有用物質を安定して生産する（二次代謝を安定に発現させる）ことを検証した。なお、二次代謝産物としては、シロイヌナズナで計測可能なモデル二次代謝産物とてアントシアニンを選び、シロイヌナズナの植物体、培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するＲＡＰ２．４カルスにおける二次代謝産物生産能の比較を行った。
【０１５９】
シロイヌナズナの植物体としては、野生株（Ｃｏｌ−０）を植物ホルモンを含まないＣＩＭ培地に播種し、芽生えから１４日間培養した植物体全体（根を含む）を用いた。シロイヌナズナの培養細胞としては、新規に誘導したＬＩ株（葉由来）およびＲＩ株（根由来）および理化学研究所バイオリソースセンターから分譲されたＴ８７培養細胞を用いた。この３種類の培養細胞を、植物ホルモンを含むＣＩＭ培地で予め１４日間培養したものを実験に用いた。ＲＡＰ２．４カルスは、Ｈｍ（−）の植物ホルモンを含まないＣＩＭ培地で予め１４日間培養したものを実験に用いた。
【０１６０】
シロイヌナズナは、高濃度のスクロース培地で光照射を行うことによりアントシアニン誘導することが知られている。そこでアントシアニン誘導培地として６％のスクロースを含む液体のＣＩＭ培地（植物ホルモンを含まない）を用いた。
【０１６１】
アントシアニン誘導培地における誘導前後の各細胞を凍結乾燥し、単位乾燥重量あたりのアントシアニン含有量を５３０ｎｍでの吸光度で比較した。アントシアニンの抽出は以下の手順で行った。５％（ｖ／ｖ）酢酸を含む４５％（ｖ／ｖ）メタノール溶液中で細胞をホモジナイザーで破砕後、１２０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心した。上清をさらに１２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心しその上清をアントシアニン抽出液とした。アントシアニン含有量はLaby らの方法(Laby RJ et al. The Arabidopsis sugar-insensitive mutants sis4 and sis5 are defective in abscisic acid synthesis and response. Plant Jounal 23:587-596(2000))を参考に以下の式によって算出した。
アントシアニン含有量(Abs５３０ ／ g D.C.W) 
= [Abs５３０−(0.25×Abs６５７)]×extraction volume(mL) ／ dry cell weight
なお、上記式中、「D.C.W」は「dry cell weight 」すなわち細胞乾燥重量を表す。
【０１６２】
図１２に結果を示す。アントシアニン誘導培地による培養前後の比較において植物体、３つの培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するＲＡＰ２．４カルスのアントシアニン合成能に明瞭な差が現れた。植物体と培養細胞を比べると、アントシアニンの誘導前には植物体と培養細胞にアントシアニン蓄積に関してほとんど差はなかった。しかし、誘導後には植物体では誘導前の約８倍にアントシアニン含有量が増加しているのに対し、３つの培養細胞では誘導前と変化はなかった。一方、今回用いた培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するＲＡＰ２．４カルスでは、他の細胞（植物体および３つの培養細胞）に比べ誘導前からアントシアニンの蓄積が見られた上に、誘導後にはさらにアントシアニンが蓄積された。このことから、今回用いた培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するＲＡＰ２．４カルスは３つの培養細胞にはみられないアントシアニン合成能を有していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
このように、本発明では、脱分化に関与する転写因子を過剰に発現させることによって、脱分化が誘導されるように改変された植物体を得ることができる。このように改変された植物体および誘導されたカルスは、有用物質の生産、新品種の開発、植物体への遺伝子導入後の形質転換体の再生、人工種子等に広く利用が可能である。それゆえ、本発明は、植物由来の化合物を原料とする製薬業、品種改良を必要とする園芸業、林業、各種農業およびアグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】実施例において用いる組換え発現ベクターを構築するための構築用ベクターの構築方法を示す工程図である。
【図２】形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨの構築方法を示す工程図である。
【図３】実施例において用いる構築用ベクターｐ３５ＳＧに、ＲＡＰ２．４遺伝子を組み込む工程図である。
【図４】カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターでＡｔ１ｇ２２１９０遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換植物体を植物ホルモン非存在下で生育させた結果を示す図である。
【図５】カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターでＡｔ１ｇ３６０６０遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換植物体を植物ホルモン非存在下で生育させた結果を示す図である。
【図６】カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターでＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換植物体を植物ホルモン非存在下で生育させた結果を示す図である。
【図７】実施例４において、ＤＲ５::ＧＵＳ植物体でＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させることにより本発明の植物体のカルス化が内因性のオーキシンの過剰生産に起因するものであるか否かを調べた手順を示す図である。
【図８】実施例４において、ＤＲ５::ＧＵＳ植物体でＲＡＰ２．４遺伝子を過剰発現させることにより本発明の植物体のカルス化が内因性のオーキシンの過剰生産に起因するものであるか否かを調べた結果を示す図である。
【図９】実施例５において、ＲＡＰ２．４カルスの内因性オーキシン（ＩＡＡ）濃度を測定した結果を示す図である。
【図１０】形質転換体の選択マーカーの試薬であるハイグロマイシンを加えた培地（Ｈｍ（＋））と、ハイグロマイシンを加えない培地（Ｈｍ（−））とでＲＡＰ２．４カルスを培養した結果を示す図である。
【図１１】カルスの表面を一部分化させたままでＲＡＰ２．４カルスを継代培養した結果を示す図である。
【図１２】アントシアニンをモデル二次代謝産物として、シロイヌナズナの植物体、培養細胞および表面が一部分化した状態のまま増殖するＲＡＰ２．４カルスにおける二次代謝産物生産能の比較を行った結果を示すグラフである。
【図１】
2006325588.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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