(57)【要約】    【課題】高精度で疾患（たとえば、アルツハイマー病）をもつか否かの判定ができる方法を提供すること。    【解決手段】血液に抗凝固剤を添加した後、この血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除いて、この有形体の含有量が０．７×１０5個／ｍＬ以下である血漿を得る工程（１）を有することを特徴とする血漿の製造方法を用いる。また、工程（１）と、血漿に含まれるアネキシンＶを免疫測定する工程（２）とを有することを特徴とするアネキシンＶの定量方法を用いる。また、工程（１）と、工程（１）で得た血漿を−２００〜１０℃で保存する工程（３）とを有することを特徴とする血漿の保存方法を用いる。    【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液に抗凝固剤を添加した後、この血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除いて、この有形体の含有量が０．７×１０5個／ｍＬ以下である血漿を得る工程（１）を有することを特徴とする血漿の製造方法。
【請求項２】
血液に抗凝固剤を添加した後、この血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除いて、この有形体の含有量が０．７×１０5個／ｍＬ以下である血漿を得る工程（１）と、血漿に含まれるアネキシンＶを免疫測定する工程（２）とを有することを特徴とするアネキシンＶの定量方法。
【請求項３】
血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除く方法が遠心分離法、吸着除去法及びろ過法からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載のアネキシンＶの定量方法。
【請求項４】
血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除く方法に遠心分離法を含み、遠心力が２０００〜６０００Ｇである請求項２又は３に記載のアネキシンＶの定量方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の定量方法を用いる疾患の判定方法。
【請求項６】
疾患がアルツハイマー病である請求項５に記載の疾患の判定方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の疾患の判定方法に用いる免疫測定用試薬キット。
【請求項８】
血液に抗凝固剤を添加した後、この血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除いて、この有形体の含有量が０．７×１０5個／ｍＬ以下である血漿を得る工程（１）と、工程（１）で得た血漿を−２００〜１０℃で保存する工程（３）とを有することを特徴とする血漿の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿の製造方法に関する。さらに詳しくは疾患に関連するアネキシンＶの定量に好適な血漿を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでアルツハイマー病の程度を示す唯一の尺度であった長谷川式簡易知能評価スケールとアネキシンＶとの関係が検討され、アルツハイマー患者全てにアネキシンＶが高濃度に検出されたことが報告されている（非特許文献１）。そして、体液（血液等）を検体とし、ウエスタンブロットによるＥＬＩＳＡ法を用いて、アネキシンＶを簡便に検査できる方法が知られている（特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】大川宏子他，老年精神医学雑誌，第１４巻，第２号，２２７−２３５頁，２００３年，日本老年精神医学会機関誌
【特許文献１】特開平２００４−２５１７９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の検査方法では、アルツハイマー患者であるか、非アルツハイマー患者（健常人）であるかの判定の精度が高くないという問題がある。特に、アルツハイマー病の初期治療に効果的な治療薬（たとえば、塩酸ドネペジル）を効果的に使用するために、アルツハイマー病の初期段階で高精度で患者かどうかの判定方法の開発が望まれていた。すなわち本発明の目的は、高精度で疾患（たとえば、アルツハイマー病）をもつか否かの判定ができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、測定試料の調製や測定試料の保存の際にアネキシンＶの測定値が変動することを発見し、この変動を防止することにより上記目的を達成することができることを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の血漿の製造方法の特徴は、血液に抗凝固剤を添加した後、この血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除いて、この有形体の含有量が０．７×１０5個／ｍＬ以下である血漿を得る工程（１）を有する点を要旨とする。
また、本発明のアネキシンＶの定量方法の特徴は、血液に抗凝固剤を添加した後、この血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除いて、この有形体の含有量が０．７×１０5個／ｍＬ以下である血漿を得る工程（１）と、血漿に含まれるアネキシンＶを免疫測定する工程（２）とを有する点を要旨とする。
また、本発明の血漿の保存方法の特徴は、血液に抗凝固剤を添加した後、この血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除いて、この有形体の含有量が０．７×１０5個／ｍＬ以下である血漿を得る工程（１）と、工程（１）で得た血漿を−２００〜１０℃で保存する工程（３）とを有する点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の血漿の製造方法、アネキシンＶの定量方法又は血漿の保存方法を用いると、高精度で疾患を持つか否かの判定ができる。特に、アルツハイマー病の判定に効果が高い。また、アルツハイマー病の初期段階で高精度で患者かどうかの判定ができるので、アルツハイマー病の初期治療に効果的な治療薬を効果的に使用できる（重症になる前に、疾患の進行の遅延若しくは停止、又は完治させることができる）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
＜工程（１）について＞
本発明で使用する血液は採取部位及び採取方法等に制限がなく、従来の採取部位及び採取方法（例えば、採血用注射器を用いて、主に肘正中静脈より全血５ｍＬ程度を採血する方法）等が用いられる。なお、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ（金子ら，第２５１巻，６５−８０頁，１９９６年）によると、採血した血液の溶血はアネキシンＶ測定値に正の誤差を及ぼすことが示されているため、本発明に使用する血液として、溶血が認められない血液が好ましい。
【０００８】
血液に添加する抗凝固剤としては、通常の抗凝固剤が使用でき、たとえば、抗トロンビン作用を促進する抗凝固剤や、カルシウムイオンをキレートする事で血液凝固を阻害する抗凝固剤等が挙げられる。抗トロンビン作用を促進する抗凝固剤としては、ヘパリンナトリウム及びヘパリンリチウム等が挙げられる。また、カルシウムイオンをキレートする抗凝固剤としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（ＥＤＴＡ２Ｋ）、エチレンジアミン四酢酸三カリウム（ＥＤＴＡ３Ｋ）、フッ化ナトリウム及びクエン酸ナトリウム等が挙げられる。これらのうち、使用時の簡便さの観点等から、カルシウムイオンをキレートする抗凝固剤が好ましく、さらに好ましくはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（ＥＤＴＡ２Ｋ）及びエチレンジアミン四酢酸三カリウム（ＥＤＴＡ３Ｋ）、特に好ましくはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）である。
抗凝固剤の添加濃度（ミリモル／リットル：ｍＭ）としては、通常よく用いられる量でよく、たとえば、血液の容量に基づいて、１〜１０が好ましく、さらに好ましくは２〜７、特に好ましくは３〜５である。
【０００９】
０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体としては、血球成分及びフィブリン塊等が含まれる。
血球成分としては、赤血球、白血球（顆粒球、単球及びリンパ球等）及び血小板等が挙げられる。なお、血小板には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ２Ｎａ）、エチレンジアミン四酢酸二カリウム（ＥＤＴＡ２Ｋ）及びエチレンジアミン四酢酸三カリウム（ＥＤＴＡ３Ｋ）等の抗凝固剤を使用した際に形成される血小板塊状等も含まれる。
フィブリン塊としては、フィブリノゲンがトロンビンによる分解を受けて生成したフィブリンモノマーが重合して形成されたフィブリンからなる塊等挙げられる。
【００１０】
０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体の含有量（個／ｍＬ）は、０．７×１０5以下が好ましく、さらに好ましくは０．５×１０5以下、特に好ましくは０．３×１０5以下である。この範囲であると、さらに高精度で疾患を持つか否かの判定ができる。また、血漿の保存安定性がさらに良好となり、長時間保存後でも疾患に関与するアネキシンＶをさらに正確に定量できる。
０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体の含有量の計数には、位相差機能を有した培養顕微鏡による計数法が適用できる。測定試料は、希釈等の前処理無しに使用することが好ましく、また、加熱処理等の特別な処理を行う必要もない。また、計数時における培養顕微鏡の倍率は８００倍で行い、計数にあたっては、Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ計算板やＮｅｕｂａｕｅｒ計算板を用いて計数する。
計数対象となる０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体の形状は、球状や塊状等であり、その最長径又は最長長さが０．１μｍ以上のものを計数する。
【００１１】
血液から０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体を取り除くには、遠心分離法、吸着除去法及びろ過法等が適用できる。これらのうち、簡便性（操作が速やかで簡単に行える）の観点等から、遠心分離法が好ましい。
遠心分離法で用いる遠心分離器及び遠心分離用容器は通常のもの（血液分離用に使用されるもの等）が用いられ、冷却機能付き遠心分離器や採血時に使用する真空採血管等を使用することが好ましい。
遠心時における温度（℃）は、０〜４０が好ましく、さらに好ましくは０〜３７、特に好ましくは０〜２５、最も好ましくは２〜１０である。
遠心時の遠心力（Ｇ）は、２０００〜６０００が好ましく、さらに好ましくは２５００〜５５００、特に好ましくは３０００〜５０００Ｇである。この範囲であると、さらに高精度で疾患を持つか否かの判定ができる。また、血漿の保存安定性がさらに良好となり、長時間保存後でも疾患に関与するアネキシンＶをさらに正確に定量できる。すなわち、遠心力が１８００Ｇ未満であると、被験者の血球成分濃度に応じた測定値変動が生じやすくなり、疾患に関与するアネキシンＶを正確に定量する事が困難になる傾向がある。通常の血漿を得る際の遠心力は８００〜１８００Ｇであるため、従来の遠心力で調製した血漿ではアネキシンＶを正確に定量できない、さらに、この範囲の遠心力で得た血漿は保存によりアネキシンＶの測定値が著しく上昇するという問題が存在する。一方、遠心力が６０００Ｇを超える場合、血液中の血球成分等が破壊されやすくなり、これに伴い疾患に関与しないアネキシンＶが検出されるようになり、疾患に関与するアネキシンＶを正確に定量する事が困難となる傾向がある。
遠心力（Ｇ）が印可される時間（分）は、５〜３０が好ましく、さらに好ましくは６〜２５、特に好ましくは８〜２０、最も好ましくは１０〜１５である。
【００１２】
吸着除去法は、吸着剤を充填したカラムに血液を通過させて吸着剤に有形体を吸着させることにより有形体を除去できる。
吸着剤としては広く知られているものが使用でき、ポリオレフィン繊維、ニトロセルロース繊維、セルロース繊維及びポリエチレンテレフタレート繊維等が挙げられる。これらのうち、吸着能の観点等から、ポリエチレンテレフタレート繊維が好ましい。血液を通過させる際の液量（ｍＬ）は、吸着剤０．１ｇに対して０．５〜２が好ましく、さらに好ましくは１〜１．５である。
なお、カラムに血液を通過させる際、赤血球等の血球成分の破壊を防止するために、加圧せず、自然落下させることが好ましい。
【００１３】
ろ過法は、ろ材（透析膜や限外ろ過膜等）を用いてろ過することにより有形体を除去できる。ろ材としては通常用いられるものが使用でき、セルロース膜、ニトロセルロース膜及びガラスフィルター等が挙げられる。ろ材の平均孔径（μｍ）としては、０．０１〜２が好ましく、さらに好ましくは０．０２〜１．６、特に好ましくは０．０５〜０．８である。
【００１４】
本発明の血漿の製造方法は、工程（１）を有すれば他の通常の工程｛血漿を調製するのに適用される公知の工程等｝を含むことができる。
本発明の血漿の製造方法には工程（１）以外に、タンパク質分解酵素阻害剤（プロテアーゼインヒビター）を共存させる工程等を含んでもよい。なお、タンパク質分解酵素阻害剤は、血漿中のタンパク質の分解を防止するために添加される。タンパク質分解酵素阻害剤としては、例えば、特開２００３−２７０２３８号公報に記載されている阻害剤等が挙げられる。
【００１５】
＜工程（２）について＞
以上のようにして得られた血漿は、アネキシンＶを免疫測定（免疫学的測定法）する工程（２）に付すことにより、疾患に関与するアネキシンＶを精度良く定量できる。
免疫学的測定法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）及びラテックス凝集法等が適用できる。これらのうち、定量感度の観点等から、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）が好ましい。
【００１６】
免疫測定するのに用いられる抗アネキシンＶ抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の何れも用いることができる。また、免疫測定に際しては、抗アネキシンＶ抗体を固相に固定化した固相抗体と、標識化合物で標識した標識抗体を用いたサンドイッチ測定法が好ましい。
抗アネキシンＶ抗体を固相に固定化する方法としては、通常の方法（化学結合法及び物理吸着法）等で行うことができる。
化学結合法としては、固相表面に導入された官能基（アミノ基及びスルホ基等）と、抗アネキシンＶ抗体の官能基（アミノ基及びスルホ基等）とを結合剤（グルタルアルデヒド、サクシンアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロサクシンイミドエステル及びｏ−フェニレンビスマレイミド等）で架橋する方法（米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書等）等が挙げられる。
物理吸着法としては、固相がポリスチレンの場合、抗アネキシンＶ抗体を０．００１〜０．０４％（Ｗ／Ｖ）含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）にポリスチレン固相を適当時間浸漬する方法（バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７頁、１９７１年）等が挙げられる。この方法は、固相がポリスチレン以外の物質、例えばポリプロピレン、シリコン、ガラス及びセルロース等にも適用できる。
【００１７】
抗アネキシン抗体を標識する際の標識化合物としては、通常のものが使用でき、ラジオアイソトープした原子（125Ｉ等）、蛍光物質（ユーロピニウム錯体等）、発光物質（Ｎ−メチルアクリジウムエステル等）及び酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ等）等が用いられる。これらのうち、酵素が好ましく、さらに好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼである。標識方法としては通常の方法等が適用できる｛たとえば、「続生化学実験講座５  免疫生化学実験法」（日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年発行、１０２〜１１２頁｝。
【００１８】
本発明のアネキシンＶの定量方法を用いれば、疾患をより正確に判定できる。
疾患としては、血液中に含まれるアネキシンＶと関連するもの等が含まれ、たとえば、心疾患及びアルツハイマー病が挙げられる。
【００１９】
本発明の判定方法には、抗アネキシンＶ抗体を固定化した固相と、ペルオキシダーゼを標識酵素として用いたペルオキシダーゼ結合抗アネキシンＶ抗体とを構成物として含む免疫測定用試薬キットが用いられる。免疫測定試薬キットの構成には制限がないが、免疫反応用緩衝液、Ｂ／Ｆ分離用緩衝液及びコントロール試料（検量線作成用の標準物質）等を含むことが好ましい。免疫反応用緩衝液及びＢ／Ｆ分離用緩衝液等としては、特開２００４−２６４２９４号公報に記載された緩衝液等が使用できる。
試薬キットに含まれる各試薬の剤型等に制限はない。
【００２０】
＜工程（３）について＞
工程（３）は、工程（１）で得た血漿を−２００〜１０℃で保存する工程である。
工程（１）で得られた血漿は、通常の保存用機器（冷凍庫や冷蔵庫等）を用いて保存を行うことができ、保存時の容器に関しても、通常用いる保存容器を使用することができる。
保存における温度（℃）は、−２００〜１０が好ましく、さらに好ましくは−１００〜４、特に好ましくは−８５〜−２０である。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
（アルツハイマー患者等の選定）
長谷川式簡易知能評価スケールにて知能得点を調べ、アルツハイマー病と認められた１０名（男性５名、女性５名）と、アルツハイマー病と認められない健常人１０名（男性５名、女性５名）とを選定した。
【００２２】
（血漿検体の調製）
５．４ｍｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む真空採血管（商品名「ベノジェクトＩＩ」、テルモ社製）を用いて、アルツハイマー病患者１０名（男性５名、女性５名）及び健常人１０名（男性５名、女性５名）から、血液５ｍＬを採取した後、均一混合して抗凝固剤入り血液を得た。その後、ＫＯＫＵＳＡＮ社製遠心分離器Ｈ−３ＦＲ型（４℃、３５００Ｇ、１５分）を用いて、抗凝固剤入り血液の遠心分離をそれぞれ行い、上層下層に分離した血液の上層部分のみを取り出し、血漿｛アルツハイマー患者に由来する血漿（患者１〜１０）、健常人に由来する血漿（健常人１〜１０）｝を得た。
【００２３】
（０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体数の計測）
得られた血漿について、ＯＬＹＭＰＵＳ社製培養顕微鏡ＣＫＸ４１型及びＢｕｒＫｅｒ−Ｔｕｒｋ型計数板を用いて、０．１μｍ以上の大きさを持つ有形体の計測を行った。なお、計測に供した血漿は前処理を行わず使用した。また、顕微鏡の倍率は８００倍とし、計測は各血漿についてそれぞれ３回づつ行った（３回の平均値を計測結果とした）。
【００２４】
（血漿検体の保存）
血漿は、直ちにアネキシンＶを測定するための１ｍＬを分取し、残りの血漿を凍結保存（ＳＡＮＹＯ社製超低温フリーザー、−８０℃にて４日間）した。
【００２５】
（免疫測定試薬の調製）
・抗アネキシンＶ抗体の取得
アネキシンＶを免疫源として得られた２種類のマウスモノクローナル抗体（抗体Ａ及びＢ）を単クローン抗体実験マニュアル記載の方法（富山ら，講談社サイエンティフィック，１９８７年）により調製した。
【００２６】
・抗アネキシンＶ抗体結合ポリスチレンビーズ
抗体Ａを、ｐＨ９．０、０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍＬの濃度になるように均一混合して混合液を得た。次にこの混合液５０ｍＬに直径３．２ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル社製）２０００個を加えて４℃で４８時間静置させた後、混合液をアスピレーターで吸引除去して抗アネキシンＶ抗体結合ポリスチレンビーズの２０００個を得た。
そして、直ちにこの抗アネキシンＶ抗体結合ポリスチレンビーズの２０００個を５０ｍＬの０．１％重量ＢＳＡ含有リン酸緩衝液に浸漬して、浸漬状態で冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００２７】
・ペルオキシダーゼ標識抗アネキシンＶ抗体
抗体Ｂを、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗アネキシンＶモノクローナル抗体溶液を調製した。
次に、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でペルオキシダーゼ標識抗アネキシンＶモノクローナル抗体溶液を抗体濃度として１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、標識抗体液を調製した｛測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した｝。
【００２８】
・化学発光試薬（第１液及び第２液）
ルミノールナトリウム（和光純薬工業社製）２．８０ｇと、４−（シアノメチルチオ）フェノール０．５６ｇとをｐＨ８．０のリン酸緩衝液１Ｌに溶解して、化学発光試薬（第１液）を得た｛測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した｝。
また、２００μＬの３５重量％過酸化水素水を脱イオン水１Ｌに溶解して化学発光試薬（第２液）を得た｛測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した｝。
【００２９】
・アネキシンＶ標準液の調製
ヒトアネキシンＶ抗原（ＡＬＥＸＩＳ社製）約１００μｇを、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液１００μＬで溶解してアネキシンＶ溶液を得た後、この溶液中のアネキシンＶ濃度をＢＣＡ法で決定した。ついで、このアネキシンＶ溶液を、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で段階希釈し、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、７．５ｎｇ／ｍＬ、５．０ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、１．０ｎｇ／ｍＬの各溶液を作製し、これらをアネキシンＶ標準溶液（２０、１０、７．５、５．０、２．５、１．０）とした｛測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した｝。
【００３０】
（サンプル中のアネキシンＶ濃度測定）
調製直後の血漿及び４日間、−８０℃凍結保存した血漿（１０℃×３０分で融解した）について、アネキシンＶの免疫測定を以下の通り行った。
血漿２０μＬと、１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液３００μＬと、抗アネキシンＶモノクローナル抗体結合ポリスチレンビーズ１個とを試験管内に入れ、３７℃で、１時間反応させた後、反応液をアスピレータで除去して、反応ビーズを得た。引き続き、反応ビーズに生理食塩水５ｍＬを加て反応ビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して、反応洗浄ビーズを得た。
次に、ペルオキシダーゼ標識抗アネキシンＶモノクローナル抗体液３００μＬを、反応洗浄ビーズに加え３７℃、１時間反応させた後、反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水５ｍＬを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去して測定用ビーズを得た。
測定用ビーズが入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、化学発光試薬（第１液）２００μＬ及び化学発光試薬（第２液）２００μＬを加えてから４０秒後に化学発光量の積算計測を開始し１０秒間の化学発光量（積算量）を得た。
そして、アネキシンＶ標準液についても同様な方法で化学発光量を測定し、得られたアネキシンＶ標準液の発光量に基づいて検量線を作成し、この検量線から血漿に含まれるアネキシンＶ濃度を算出した。
【００３１】
＜実施例２＞
遠心分離の条件（４℃、３５００Ｇ、１５分）を、（４℃、２５００Ｇ、１５分）に変更した以外実施例１と同様にして血漿を調製し、有形体数を計数した後、アネキシンＶの濃度を算出した。
【００３２】
＜実施例３＞
遠心分離の条件（４℃、３５００Ｇ、１５分）を、（４℃、５５００Ｇ、１５分）に変更した以外実施例１と同様にして血漿を調製し、有形体数を計数した後、アネキシンＶの濃度を算出した。
【００３３】
＜比較例１＞
遠心分離の条件（４℃、３５００Ｇ、１５分）を、（４℃、１０００Ｇ、１５分）に変更した以外実施例１と同様にして血漿を調製し、有形体数を計数した後、アネキシンＶの免疫測定を行った。
【００３４】
＜比較例２＞
遠心分離の条件（４℃、３５００Ｇ、１５分）を、（４℃、７０００Ｇ、１５分）に変更した以外実施例１と同様にして血漿を調製し、有形体数を計数した後、アネキシンＶの濃度を算出した。
【００３５】
実施例１〜３及び比較例１〜２のアネキシンＶの免疫測定結果及び長谷川式簡易知能評価スケールでの知能得点を表１（実施例測定結果）、表２（比較例測定結果）及び図１〜５に示した。
【００３６】
【表１】
2006266913.tif 000003
【表２】
2006266913.tif 000004
【００３７】
実施例１〜３の結果について、アネキシンＶ測定値と長谷川式簡易知能評価スケールとの関係を図１〜３に示した。
一方、比較例１〜２の結果についてアネキシンＶ測定値と長谷川式簡易知能評価スケールとの関係を図４〜５に示した。
【００３８】
これらの結果より、実施例１〜３の方法が、比較例１〜２の方法に比較して、長谷川式簡易知能評価スケールとの相関が著しく高いことが明白である。特に、アルツハイマー疾患の初期段階における長谷川式簡易知能評価スケールの２０点付近においては、実施例１〜３の方法が、比較例１〜２の方法に対して精度が著しく優れていた。
また、実施例１〜３の方法が、血漿調製直後の測定値と−８０℃にて４日間保存した時の測定値変動が極めて少なく、血漿を極めて著しく安定に保存できた。
このことより、有形体に含まれるアネキシンＶは疾患（アルツハイマー病等）に由来せず、有形体に含まれないアネキシンＶだけが疾患（アルツハイマー病）に由来すると推定される。遠心力が弱い場合、保存により有形体が少しずつ破壊され、アネキシンＶ測定値が少しずつ変化するものと考えられる（特に、冷凍保存後の融解処理の際に有形体の破壊が顕著に生じ、アネキシンＶ測定値が保存前の値に比べて大きく変動したと考えられる。）。一方、遠心力を強くすると、遠心時における有形体成分の破壊がより進行し、血漿調製直後のアネキシンＶ測定値を変動させる原因になったものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１におけるアネキシンＶ測定値と長谷川式簡易知能評価スケールとの関係を表したグラフである。
【図２】実施例２におけるアネキシンＶ測定値と長谷川式簡易知能評価スケールとの関係を表したグラフである。
【図３】実施例３におけるアネキシンＶ測定値と長谷川式簡易知能評価スケールとの関係を表したグラフである。
【図４】比較例１におけるアネキシンＶ測定値と長谷川式簡易知能評価スケールとの関係を表したグラフである。
【図５】比較例２におけるアネキシンＶ測定値と長谷川式簡易知能評価スケールとの関係を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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