(57)【要約】【課題】  ワルファリン等の抗血液凝固作用を実質的に阻害しないビタミンＫ低生産性新規納豆菌の選抜方法と、このビタミンＫ低生産性新規納豆菌で製造されたビタミンＫ低含有納豆を提供する。【解決手段】  抗生物質を添加した培地で変異誘導処理が施された納豆菌からビタミンＫ低生産性新規納豆菌が選抜され、このビタミンＫ低生産性新規納豆菌を使用してビタミンＫ低含有納豆を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質を添加した培地で変異誘導処理が施された納豆菌から選抜されたビタミンＫ低生産性新規納豆菌。
【請求項２】
請求項１記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌が接種されたビタミンＫ添加培地で選抜されたビタミンＫ低生産性新規納豆菌。
【請求項３】
培地に対する前記抗生物質の添加量が、１〜２００ｐｐｍであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌。
【請求項４】
培地に対するビタミンＫの添加量が、１〜１０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項２又は請求項３記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌。
【請求項５】
前記変異誘導処理が紫外線照射であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌。
【請求項６】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２６９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０２６８であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌を使用して製造された納豆。
【請求項８】
請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌を使用する納豆の製造方法。
【請求項９】
抗生物質添加培地に納豆菌を接種し、該納豆菌に変異誘導処理を施した後に選抜することを特徴とするビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法。
【請求項１０】
請求項９記載の製造方法により製造されたビタミンＫ低生産性新規納豆菌を、ビタミンＫ添加培地に接種した後に選抜することを特徴とするビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法。
【請求項１１】
変異誘導処理が紫外線照射であることを特徴とする請求項９又は請求項１０記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法。
【請求項１２】
納豆菌が生育可能な培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程を含む
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法。
【請求項１３】
納豆菌が生育可能な培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、
前工程から得られた納豆菌をビタミンＫ添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する工程と、を含む
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法。
【請求項１４】
納豆菌が生育可能な第１の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第１の培地に納豆菌を接種し、該第１の培地に接種された納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、
前工程で選抜された納豆菌が生育可能な第２の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第２の培地に納豆菌を接種し、該第２の培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、を含む
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法。
【請求項１５】
納豆菌が生育可能な第１の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第１の培地に納豆菌を接種し、該第１の培地に接種された納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、
前工程から得られた納豆菌をビタミンＫ添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する工程と、
前工程で選抜された納豆菌が生育可能な第２の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第２の培地に納豆菌を接種し、該第２の培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、を含む
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法。
【請求項１６】
請求項１２乃至請求項１５のいずれか一項に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法で得られたビタミンＫ低生産性新規納豆菌。
【請求項１７】
請求項１６記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌を使用して製造された納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワルファリン等の抗血液凝固作用を阻害しないビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法並びにビタミンＫ低生産性新規納豆菌と、このビタミンＫ低生産性新規納豆菌で製造されたビタミンＫ低含有納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は原料として大豆を使用し、稲ワラや枯れ草等に多く生息する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の一種である納豆菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｎａｔｔｏ）を繁殖させて作った発酵食品であって、その粘性から糸引き納豆ともいわれている。そして、納豆は良質なたんぱく質やイソフラボン等の有効成分を豊富に含み、その性質と食品としての機能性が多く報告されてきた。例えば、特許文献１には、血栓溶解酵素活性が高く、かつ粘質物生産量が高い納豆とその製造方法、及びこれを製造するための納豆菌が示されている。
【特許文献１】特開２００１−２３８６６７号公報
【特許文献２】特開平３−２９７３５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上述のような有効成分を含有し、高い血栓溶解酵素活性を示す納豆は、血液凝固因子等の生成に必要なビタミンＫ（主にビタミンＫ２（メナキノン））を生産することが知られている。このビタミンＫは、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬と拮抗し、医薬の抗血液凝固作用を低下させる等の悪影響を及ぼすおそれがある。また、ビタミンＫを生産する納豆菌は、人が摂取した後も腸内でビタミンＫを高生産してしまうという問題点があった。従って、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬を服用する血栓塞栓症患者等は、有効成分を豊富に含み、かつ高い血栓溶解酵素活性を示すナットウキナーゼ等を含む納豆を食したい場合であっても、納豆中に含まれるビタミンＫのために納豆の厳格な食餌制限がなされているという問題を抱えている。
【０００４】
一方、特許文献２に記載のビタミンＫ低含有量の納豆の製造方法では、抗生物質及び変異原性物質で納豆菌を変異させるものであるが、ビタミンＫ低産化の効果は十分なものではなかった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、ワルファリン等の抗血液凝固作用を実質的に阻害しないビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法と、このビタミンＫ低生産性新規納豆菌で製造されたビタミンＫ低含有納豆を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、請求項１の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌は、抗生物質を添加した培地で変異誘導処理が施された納豆菌から選抜された。
【０００７】
請求項２の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌は、請求項１記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌が接種されたビタミンＫ添加培地で選抜された。
【０００８】
請求項３の発明は、請求項１又は請求項２に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌において、培地に対する抗生物質の添加量が、１〜２００ｐｐｍである
請求項４の発明は、請求項２又は請求項３に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌において、培地に対するビタミンＫの添加量が、１〜１０μｇ／ｍｌである。
【０００９】
請求項５の発明は、請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌において、変異誘導処理が紫外線照射である。
【００１０】
請求項６の発明は、請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌において、新規納豆菌がＦＥＲＭ  Ｐ−２０２６９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０２６８である。
【００１１】
請求項７の発明は、請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の納豆菌を使用して製造された納豆である。
【００１２】
請求項８の発明は、請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の納豆菌を使用する納豆の製造方法である。
【００１３】
請求項９の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法は、抗生物質添加培地に納豆菌を接種し、該納豆菌に変異誘導処理を施した後に選抜する。
【００１４】
請求項１０の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法は、請求項９記載の製造方法により製造されたビタミンＫ低生産性新規納豆菌を、ビタミンＫ添加培地に接種した後に選抜する。
【００１５】
請求項１１の発明は、請求項９又は請求項１０に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法において、変異誘導処理が紫外線照射である。
【００１６】
請求項１２の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法は、納豆菌が生育可能な培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程を含む。
【００１７】
請求項１３の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法は、納豆菌が生育可能な培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、前工程から得られた納豆菌をビタミンＫ添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する工程と、を含む。
【００１８】
請求項１４の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法は、納豆菌が生育可能な第１の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第１の培地に納豆菌を接種し、該第１の培地に接種された納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、前工程で選抜された納豆菌が生育可能な第２の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第２の培地に納豆菌を接種し、該第２の培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、を含む。
【００１９】
請求項１５の発明に係るビタミンＫ低生産性新規納豆菌の製造方法は、納豆菌が生育可能な第１の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第１の培地に納豆菌を接種し、該第１の培地に接種された納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、前工程から得られた納豆菌をビタミンＫ添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する工程と、前工程で選抜された納豆菌が生育可能な第２の培地に、納豆菌の生育を阻害する限界濃度の上限以下の濃度範囲の抗生物質を添加し、該抗生物質が添加された該第２の培地に納豆菌を接種し、該第２の培地に接種された納豆菌に紫外線を照射し、該紫外線を照射した該納豆菌から生育可能な納豆菌を選抜する工程と、を含む。
【００２０】
請求項１６の発明は、請求項１２乃至請求項１５のいずれかに記載の納豆菌を使用して製造された納豆である。
【００２１】
請求項１７の発明は、請求項１６に記載のビタミンＫ低生産性新規納豆菌を使用して製造された納豆である。
【発明の効果】
【００２２】
以上説明したように本発明によれば、ビタミンＫ生産性の低い新規納豆菌を製造し、ビタミンＫ含有量の低い納豆を選抜することができる。従って、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬を服用する血栓塞栓症患者等でも安心して本発明の納豆を食し、納豆に含まれる豊富な蛋白質、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、レシチン等の栄養素やナットウキナーゼ、プロテアーゼ、イソフラボン等の生理活性物質を摂取することができる。また、本発明のビタミンＫ低生産性新規納豆菌は、腸内においてもビタミンＫの生産は低いまま保たれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、（１）抗生物質添加培地中で納豆菌試料を培養後選抜する工程、（２）ビタミンＫ添加培地中で生育し、コロニーが増大した納豆菌のみを選抜する工程、（３）納豆を製造し、粘性試験により粘性を示した納豆菌のみを選抜する工程、（４）納豆菌を抗生物質添加培地中に接種し、この納豆菌に紫外線を照射して変異処理し、抗生物質添加培地中で培養後選抜する工程、をそれぞれ組み合わせた選抜工程によりビタミンＫ低生産性新規納豆菌を製造する。
【００２４】
また、本発明は、上記（１）乃至（４）を組み合わせた工程で製造されたビタミンＫ低生産性新規納豆菌によってビタミンＫ低含有納豆を製造する。このビタミンＫ低含有納豆は、まず、大豆を水に浸漬して水切りした後に蒸煮し、そして、得られた大豆にビタミンＫ低生産性新規納豆菌を接種した後、発酵及び熟成させて得られる。
【００２５】
本発明に用いる納豆菌は、市販されている納豆菌、市販されている納豆から分離して得られる納豆菌、その他所定の研究施設に保存していた納豆菌、または、例えば自然界、具体的には土壌、落ち葉、枯れ草花、及び稲ワラ等より分離されて得られる納豆菌を用いてもよい。また、本発明における納豆菌は、通常の納豆菌と同様にナットウキナーゼの生産が認められる。これにより、ビタミンＫ低生産性とともに血栓溶解性も示すので、血栓予防にも効果を示す。
【００２６】
本発明に用いる抗生物質は、納豆菌に作用するものであれば良く、特に制限されない。例えば、アミノグルコシド系抗生物質としては、ストレプトマイシン、シソマイシン、アルベカマイシン、ゲンタマイシン、アストロマイシン、ベカナマイシン、リボスタマイシン、カナマイシン等の抗生物質が挙げられる。
【００２７】
また、ニューキノロン系抗生物質として、ノルフロキサシン、エノキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン等の抗生物質が挙げられる。
【００２８】
また、ペニシリン系抗生物質として、メチシリン、ピペラシリン等の抗生物質が挙げられる。
【００２９】
また、セフェム系抗生物質として、セフピロム、セファゾリン、セフォチアム、セファレキシン等の抗生物質が挙げられる。
【００３０】
また、グリコペプチド系抗生物質として、バンコマイシン、アボバルジン、テイコプラニン等の抗生物質が挙げられる。
【００３１】
さらに、マクロライド系抗生物質として、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、ミデカマイシン、キタサマイシン等の抗生物質が挙げられる。
【００３２】
さらにその上、テトラサイクリン系抗生物質として、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン等の抗生物質が挙げられる。
【００３３】
他にも、ホスホマイシン、クロラムフェニコール、チアンフェニコール等の抗生物質が挙げられる。
【００３４】
上記に挙げた抗生物質の中で、より好ましくは、メチシリン、ドキシサイクリン、シプロフロキサシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等である。
【００３５】
また、本発明に用いる抗生物質の濃度は、１ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの範囲が好ましく、より好ましくは５ｐｐｍ〜８０ｐｐｍの範囲であり、さらに好ましくは１０ｐｐｍ〜６０ｐｐｍの範囲である。さらに、本発明に用いる抗生物質は、１種又は２種以上を混合したものを用いることができる。
【００３６】
本発明における培地は、ビオチンを含む細菌用寒天培地であることが好ましい。また、本発明におけるビタミンＫ添加培地は、ビタミンＫ３（メナジオン）添加ＴＢＡＢ（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  ｂｌｏｏｄ  ａｇａｒ  ｂａｓｅ）培地であることが好ましい。尚、本実施形態では、ビタミンＫ３（メナジオン）を培地に添加したがこれに限られず、フィロキノン、メナキノンを添加しても良い。
【００３７】
ビタミンＫ低生産性とは、当該納豆菌を使用して製造した納豆中において、ワーファリン等の医薬の作用を実質的に阻害しない程度のビタミンＫしか生産しないことを意味する。納豆中のビタミンＫ生産量は、５００μｇ／１００ｇ納豆以下であり、好ましくは３００μｇ／１００ｇ納豆以下、さらに好ましくは１００μｇ／１００ｇ納豆以下である。
【００３８】
当該納豆菌を使用して製造した納豆は、粘性を有していても良いし、粘性が無くても良い。粘性を有するビタミンＫ低含有納豆の場合は、特有の糸引きが見られ、市販されている納豆と何ら変わりない。また、粘性の無いビタミンＫ低含有納豆の場合は、納豆の粘性が苦手な人にとっても食べ易い上に、加工食品への応用が容易になる等の利点をもつ。また、粘性の有無に関係なく、当該納豆菌を使用して製造した納豆は、ワルファリン等の抗血液凝固作用を阻害せず、薬効の低減を抑制することができる。
【００３９】
本発明における生理学同定試験は、メチルレッド試験、グラム染色、カタラーゼ試験、デンプンの分解、レシチナーゼ試験、硝酸塩の還元、ヒスチジンの資化、ビオチン要求性、及びヒートショック試験からなる。これらの試験からなる生理学同定試験によって、自然界から得られた菌株の属種が明確になる。
【００４０】
さらに、本発明における分子生物学的同定試験は、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を解析するものであり、その相同性から菌種を同定することができる。
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。この実施例のメナキノンの数値は納豆菌の種類等によって変動するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
まず、東京都内２カ所（採取場所Ａ、Ｂ）、愛知県１カ所（採取場所Ｃ）の土壌、落ち葉、枯れ草花または稲ワラから採取した納豆菌分離源から０．１ｇを秤量し蒸留水にて１０倍希釈後、加熱温度８０℃〜１２０℃、加熱時間３分間の条件下で納豆菌分離源を加熱処理した。その後、予備培養でコロニーの形状から納豆菌と考えられるものを選抜した。後述のスクリーニングに供給する試料数を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2006230253.tif 000002
【００４４】
以下、採取場所Ａより得られた納豆菌試料を納豆菌試料Ａ、採取場所Ｂより得られた納豆菌試料を納豆菌試料Ｂ、採取場所Ｃより得られた納豆菌試料を納豆菌試料Ｃとする。
【００４５】
また、本実施例は、上記した自然界から分離した納豆菌試料Ａ〜Ｃの他に、市販されている納豆菌Ｄ（１５株）と、その他所定の研究施設に保存していた納豆菌Ｅ（６株）を用いて実験をおこなった。
【００４６】
第１スクリーニング工程を説明する。すなわち、まず、上述した各納豆菌試料Ａ〜Ｃを１００倍希釈した。また、上述した各納豆菌（コロニー）Ｄ、Ｅを前培養として１２時間〜１４時間振とう培養（回転数１２５ｒｐｍ、培養温度３７℃）を行った。これら各納豆菌試料Ａ〜Ｃ及び納豆菌Ｄ、Ｅの各懸濁液を培養温度３７℃、培養時間２４時間の条件下で、乾燥ブイヨン１．５％、ビオチン１００μｇ、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールを等量ずつ混合した抗生物質２０ｐｐｍ、寒天１．５％を含む抗生物質添加ブイヨン培地（第１の培地）にて培養し、生育できた納豆菌試料及び納豆菌（いずれもコロニー）のみを選抜した。第１スクリーニング工程後の各納豆菌試料及び納豆菌のコロニー数は、表２に示す。
【００４７】
【表２】
2006230253.tif 000003
【００４８】
続いて、第２スクリーニング工程を説明する。すなわち、第１スクリーニング工程で選抜された各納豆菌試料（コロニー）Ａ〜Ｃ及び納豆菌株（コロニー）Ｄ、Ｅを、５μｇ／ｍｌのビタミンＫ３（第一化学薬品株式会社製）を添加したＴＢＡＢ培地及び無添加ＴＢＡＢ培地にそれぞれ接種した。そして、各培地のコロニーの生育差を比較して、ビタミンＫ３添加ＴＢＡＢ培地にて０．２ｍｍ以上の生育増大を示したコロニーを選抜した。また、第２スクリーニング工程後のビタミン要求性の納豆菌試料及び納豆菌のコロニー数は、表２に示すとおりである。
【００４９】
ここで、自然界から採取し、第１スクリーニング工程及び第２スクリーニング工程で選抜した納豆菌試料Ａ〜Ｃから、食品微生物に適した納豆菌を選抜するために第３スクリーニング工程乃至第６スクリーニング工程を行った。なお、納豆菌Ｄ、Ｅに関しては、事前に納豆菌としての特性を有することが確認されているので、第３スクリーニング工程乃至第６スクリーニング工程は行わなかった。
【００５０】
まず、第３スクリーニング工程を説明する。すなわち、第２スクリーニング工程で選抜された各納豆菌試料Ａ〜Ｃを用いて、生理学的同定試験を行った。この生理学的同定試験により、ヒスチジンの資化のみが陰性を示し、且つヒスチジンの資化以外の試験では陽性を示す納豆菌試料（コロニー）のみを選抜した。この選抜した納豆菌試料を用いて、加熱温度８０℃、加熱時間３０分間の条件下でヒートショック試験を行った。その後、吸光度計を用いて波長６６０ｎｍにおける細菌試料の濁度を測定した。その結果、ヒートショック試験前後の生菌濁度の差が０．５以上の納豆菌試料のみを選抜した。第３スクリーニング工程後の各納豆菌試料の株数は、表２に示すとおりである。
【００５１】
次に、第３スクリーニング工程で選抜した各納豆菌試料Ａ〜Ｃを用いて納豆を製造した。まず、大豆１ｋｇを約４℃の水に１２時間浸漬して水切りした後、１時間蒸煮する。ここで、浸漬する際の水は大豆の３倍量を用いた。蒸煮した大豆に第３スクリーニング工程で選抜した納豆菌試料の懸濁液を５ｍｌ接種して、発酵温度３７℃、発酵時間２４時間の条件下で発酵させた。そして、発酵後の各納豆の熟成条件は、４℃、２４時間にて熟成させた。
【００５２】
そして、第４スクリーニング工程を説明する。すなわち、第３スクリーニング工程で選抜した各納豆菌試料Ａ〜Ｃを用いて製造した納豆を試料とする粘性試験を行い、糸引きを示した納豆の製造に使われた各納豆菌試料のみを選抜した。この第４スクリーニング工程により、第１スクリーニング工程乃至第３スクリーニング工程を経た自然界より得られた納豆菌試料から、粘性（糸引き）を有する納豆を製造することができる納豆菌株を選抜することが可能である。第４スクリーニング工程後の各納豆菌試料の株数は、表２に示すとおりである。
【００５３】
また、第５スクリーニング工程を説明する。すなわち、第４スクリーニング工程で選抜した各納豆菌試料Ａ〜Ｃを用いて、分子生物学的同定試験を行った後、メナキノン生産量の測定と粘性の確認を行う。まず、第４スクリーニング工程で選抜した各納豆菌試料Ａ〜Ｃの１６ＳｒＲＮＡ法にて塩基配列を解析して、枯草菌の塩基配列と実質的に相同性を示す納豆菌試料を選抜した。続いて、これらの菌株を使用して納豆を製造し、納豆中のメナキノンを定量し、メナキノン生産性が低く、且つ粘性を有する納豆菌試料を選抜した。第５スクリーニング工程後の各納豆菌試料の株数は、表２に示すとおりである。
【００５４】
さらに、第６スクリーニング工程を説明する。すなわち、第５スクリーニング工程で選抜した各納豆菌試料Ａ〜Ｃの中から、納豆菌標準株と同等のプロテアーゼ生成能とナットウキナーゼ生成能を有する納豆菌試料を選抜した。第６スクリーニング工程後の各納豆菌試料の株数は、表２に示すとおりである。
【００５５】
上記、第１乃至第６スクリーニング工程を行うことによって、納豆菌３株を選抜し、それぞれ、Ｎ−５６、Ｂ−１４、Ｂ−１７とした。
【００５６】
また、表２に示すように、上記第１及び第２スクリーニング工程によって納豆菌Ｄから２１株を分離した。この２１株の中から、前述した方法でメナキノン生産量の測定を行い、メナキノン含有量の特に低かった２株を選抜し、一方の納豆菌ＤをＭ１−１２、他方の納豆菌ＤをＭ１３−２１とした。さらに、表２に示すように、上記第１及び第２スクリーニング工程によって納豆菌Ｅから１２株を分離した。この１２株の中から、前述した方法でメナキノン生産量の測定を行い、メナキノン含有量の特に低かった１株を選抜し、この納豆菌ＥをＳ６８−２とした。
【００５７】
その後、第７スクリーニング（選抜）工程を行った。すなわち、上記第１乃至第６スクリーニング工程によって分離した各納豆菌を親株として、培養温度３７℃、培養時間５時間、振とう数１２５ｒｐｍの条件下でビオチン添加液体ブイヨン培地にて各納豆菌の振とう培養を行う。この振とう培養を行った培養液１００μｌを、乾燥ブイヨン１．５％、ビオチン１００μｇ、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールを等量ずつ混合した抗生物質４０ｐｐｍ、寒天１．５％を含む抗生物質添加ブイヨン培地（第２の培地）に塗沫接種した。そして、抗生物質添加ブイヨン培地に塗沫接種した納豆菌試料に、照射距離３ｃｍ、照射時間３分間の条件下、ＧＬ１５形の殺菌ランプにより紫外線を照射して納豆菌変異株を作出した。そして、紫外線照射後の納豆菌変異株を、上記と同様に抗生物質４０ｐｐｍを添加したブイヨン培地中で培養温度３７℃、培養時間４８時間の条件下にて培養し、生育できた納豆菌変異株のみを選抜した。また、第７スクリーニング工程後の各納豆菌変異株の株数は、表３に示す。
【００５８】
【表３】
2006230253.tif 000004
【００５９】
続いて、第８スクリーニング工程を説明する。すなわち、第７スクリーニング工程で選抜した納豆菌変異株を、５μｇ／ｍｌのビタミンＫ３（第一化学薬品株式会社製）を添加したＴＢＡＢ培地及び無添加ＴＢＡＢ培地にそれぞれ接種する。そして、培養温度３７℃、培養時間４８時間の条件下にて培養し、各培地のコロニーの生育差を比較して、ビタミンＫ３添加ＴＢＡＢ培地にて０．２ｍｍ以上の生育増大を示した納豆菌変異株を選抜した。第８スクリーニング工程後の各ビタミンＫ要求性納豆菌変異株の株数は、表３に示すとおりである。
【００６０】
その後、第１スクリーニング工程乃至第８スクリーニング工程により製造されたビタミンＫ要求性納豆菌変異株よりなるビタミンＫ低生産性新規納豆菌を用いて納豆を製造した。まず、大豆１ｋｇを約４℃の水に１２時間浸漬して水切りした後、１時間蒸煮する。この大豆に第１スクリーニング工程乃至第８スクリーニング工程で選抜したビタミンＫ低生産性新規納豆菌懸濁液を５ｍｌ接種して、３７℃、２４時間の条件下で発酵させた。次に、発酵後の納豆を、４℃、２４時間の条件下で熟成させて、納豆を製造した。
【００６１】
さらに、第９スクリーニング工程を説明する。すなわち、第１スクリーニング工程乃至第８スクリーニング工程で選抜したビタミンＫ低生産性新規納豆菌を用いて製造した納豆を試料とする粘性試験を行い、糸引きを示した納豆の製造に使われたビタミンＫ低生産性新規納豆菌のみを選抜した。第９スクリーニング工程後の各ビタミンＫ低生産性新規納豆菌の株数は、表３に示すとおりである。
【００６２】
最後に、第１スクリーニング工程乃至第９スクリーニング工程により得られたビタミンＫ低生産性新規納豆菌で製造された各納豆を用いて、納豆中のメナキノン含有量の測定を行った。
【００６３】
納豆中のメナキノン含有量の測定方法について説明する。熟成後に得られた納豆５ｇに蒸留水２０ｍｌを添加後、温度１００℃、時間１０分間から１５分間の条件下熱水抽出を行った。さらに、得られた各抽出液を、遠心分離（回転数３０００ｒｐｍ、回転時間２０分間）を行った。その後、遠心分離により得られた各沈殿物にアセトン５ｍｌ及びポリエチレングリコール１ｍｌを添加した後、その上澄み液をメタノールで適宜希釈した。最後に、紫外部吸収スペクトル（波長２４０ｎｍ〜２７０ｎｍ）によって、各納豆中のメナキノン含有量を測定した。
【００６４】
その結果を図１に示す。図１に示すように、第１スクリーニング工程乃至第９スクリーニング工程により得られたビタミンＫ低生産性新規納豆菌のメナキノン含有量は、全てのビタミンＫ低生産性新規納豆菌において親株のメナキノン含有量よりも低下していた。特に、納豆菌標準株（ＩＦＯ３００９）で製造された納豆は１０３４μｇ／１００ｇものメナキノン含有量を示したが、本実施例におけるビタミンＫ低生産性新規納豆菌の株Ｎ−５６、Ｂ−１７から製造された納豆は、それぞれ６８、６５μｇ／１００ｇのメナキノンを含有していた。
【００６５】
本実施例によれば、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬を服用する血栓塞栓症患者等でも安心して、本実施例におけるビタミンＫ低生産性新規納豆菌から製造されたビタミンＫ低含有納豆を摂取することができる。
【００６６】
本実施例のビタミンＫ低生産性新規納豆菌のうち、Ｂ−１７の中で低メナキノン含有量を示したＢＵ１７−４９は、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２６９として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００６７】
尚、本実施例は、第２スクリーニング工程と第８スクリーニング工程の２工程においてビタミンＫ３添加ＴＢＡＢ培地によりビタミン要求性納豆菌変異株を選抜した。しかしながら、ビタミン要求性納豆菌変異株を選抜することができるのであれば、ビタミンＫ３添加ＴＢＡＢ培地によるスクリーニング工程は複数回ではなく１回行うだけでも良い。これにより、作業時間の効率化を図ることができる。
【実施例２】
【００６８】
本実施例では、第１スクリーニング工程乃至第９スクリーニング工程の後に第１０スクリーニング工程及び第１１スクリーニング工程をおこなった。すなわち、第１スクリーニング工程乃至第９スクリーニング工程により製造した各ビタミンＫ低生産性新規納豆菌から４株を選抜し、これを親株として、更に抗生物質を添加した培地に接種し、紫外線を照射した。
【００６９】
第１スクリーニング工程乃至第９スクリーニング工程に関しては、上記実施例１と同様であるので省略する。また、各ビタミンＫ低生産性新規納豆菌から選抜した４株とは、実施例１において、Ｎ−５６の中から低メナキノン含有量を示した２株（ＮＵ５６−６、ＮＵ５６−２９）、Ｂ−１７の中から低メナキノン含有量を示した１株（ＢＵ１７−４９）、及び、Ｓ６８−２の中から低メナキノン含有量を示した１株（ＳＵ６８２−１２）のことである。
【００７０】
具体的には、まず、第１スクリーニング工程乃至第９スクリーニング工程によって製造したビタミンＫ低生産性新規納豆菌４株を、培養条件３７℃、５時間、振とう数１２５ｒｐｍにてビオチン添加液体ブイヨン培地で各納豆菌の振とう培養を行う。ここで、この振とう培養を行い、第１０スクリーニング工程前の培養液１００μｌ中に含まれる各ビタミンＫ低生産性新規納豆菌の株数を表４に示す。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
この振とう培養を行った培養液１００μｌを、乾燥ブイヨン１．５％、ビオチン１００μｇ、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールを混合した抗生物質４０ｐｐｍ、寒天１．５％を含む抗生物質添加ブイヨン培地に塗沫接種した。そして、抗生物質添加ブイヨン培地に塗沫接種した納豆菌試料に、照射距離３ｃｍ、照射時間３分間の条件下、ＧＬ１５形の殺菌ランプにより紫外線を照射して第２納豆菌変異株とした。
【００７３】
この第２納豆菌変異株を、そのまま抗生物質添加ブイヨン培地中で培養条件３７℃、４８時間にて培養し、生育できた納豆菌のみを選抜した。また、第１０スクリーニング工程後の各第２納豆菌変異株の株数は、表４に示すとおりである。
【００７４】
さらに、第１１スクリーニング工程を説明する。すなわち、第１０スクリーニング工程で選抜した第２納豆菌変異株を、５μｇ／ｍｌのビタミンＫ３（第一化学薬品株式会社製）を添加したＴＢＡＢ培地及び無添加ＴＢＡＢ培地にそれぞれ接種する。そして、培養条件３７℃、４８時間にて培養し、各培地のコロニーの生育差を比較して、ビタミンＫ３添加ＴＢＡＢ培地にて０．２ｍｍ以上の生育増大を示したコロニーを選抜した。第１１スクリーニング工程後の各第２ビタミンＫ要求性納豆菌株の株数は、表４に示すとおりである。
【００７５】
以上、第１スクリーニング工程乃至第１１スクリーニング工程により、第２ビタミンＫ低生産性納豆菌変異株よりなるビタミンＫ低生産性新規納豆菌が得られた。
【００７６】
その後、第１スクリーニング工程乃至第１１スクリーニング工程により得られたビタミンＫ低生産性新規納豆菌を用いて納豆を製造した。まず、大豆１ｋｇを約４℃の水に１２時間浸漬して水切りした後、１時間蒸煮する。この大豆に第１スクリーニング工程乃至第１１スクリーニング工程で選抜したビタミンＫ低生産性新規納豆菌懸濁液を５ｍｌ接種して、発酵条件３７℃、２４時間にて発酵させた。次に、発酵後の納豆を、熟成条件４℃、２４時間の条件下で熟成させて、納豆を製造した。
【００７７】
最後に、第１スクリーニング工程乃至第１１スクリーニング工程により得られたビタミンＫ低生産性新規納豆菌で製造された納豆を用いて、各納豆中のメナキノン含有量の測定を行った。まず、熟成後に得られた納豆５ｇに蒸留水２０ｍｌを添加後、温度１００℃、時間１０分間から１５分間の条件下熱水抽出を行った。さらに、得られた各抽出液を、遠心分離（回転数３０００ｒｐｍ、回転時間２０分間）を行った。その後、遠心分離により得られた各沈殿物にアセトン５ｍｌ及びポリエチレングリコール１ｍｌを添加した後、その上澄み液をメタノールで適宜希釈した。最後に、紫外部吸収スペクトル（波長２４０ｎｍ〜２７０ｎｍ）によって、各納豆中のメナキノン含有量を測定した。
【００７８】
その結果を図２に示す。図２に示すように、第１スクリーニング工程乃至第１１スクリーニング工程により得られたビタミンＫ低生産性新規納豆菌のメナキノン含有量は、全てのビタミンＫ低生産性新規納豆菌において親株のメナキノン含有量よりも低下していた。特に、納豆菌標準株（ＩＦＯ３００９）で製造された納豆は１０３４μｇ／１００ｇものメナキノン含有量を示したが、本実施例におけるビタミンＫ低生産性新規納豆菌の株ＢＵ１７−４９から製造された納豆は１１μｇ／１００ｇのメナキノンを含有していた。
【００７９】
本実施例のビタミンＫ低生産性新規納豆菌のうち、ＢＵ１７−４９の中で低メナキノン含有量を示したＢＵ１７−４９Ａは、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２６８として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００８０】
尚、実施例２は、第２スクリーニング工程、第８スクリーニング工程、及び第１１スクリーニング工程の３工程においてビタミンＫ３添加ＴＢＡＢ培地によりビタミン要求性納豆菌変異株を選抜した。しかしながら、ビタミン要求性納豆菌変異株を選抜することができるのであれば、ビタミンＫ３添加ＴＢＡＢ培地によるスクリーニング工程の回数を削減しても良い。これにより、作業時間の効率化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の実施例１に係る各納豆菌株のメナキノン含有量を示すグラフ
【図２】本発明の実施例２に係る各納豆菌株のメナキノン含有量を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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