(57)【要約】    【課題】      微量の全血から血清あるいは血漿、血球、さらには白血球を短時間で取得する方法を提供する。    【解決手段】  上記課題は、孔径が０．５〜４０μｍで、孔径のバラツキが変動係数２０％以下の膜からなる血液濾過膜と、同一の平均孔径の膜あるいは異なる平均孔径の膜を２枚以上用いることによる血液濾過方法によって解決される。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハニカム様構造を有する膜の製造方法において、溶媒にベンゼンあるいはトルエンあるいはキシレンを用い、孔径が２〜１０μｍで、孔径のバラツキが変動係数２０％以下の膜を製造方法。
【請求項２】
製膜時の雰囲気を相対湿度８０％以上１００％以下にすることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
両親媒性ポリアクリルアミドを膜の基材とすることを特徴とする請求項１及び２記載の製造方法。
【請求項４】
請求項１から３に記載の膜を３層以上積層させて用いることによって血液中の赤血球を捕捉する血液濾過方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血から血球を除去するための濾過膜、およびその濾過膜を用いて全血から赤血球あるいは白血球を捕捉して回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中の構成成分例えば代謝産物、蛋白質、脂質、電解質、酵素、抗原、抗体などの種類や濃度の測定は、通常全血を遠心分離して得られる血清または血漿を検体として行われている。しかし、遠心分離には手間と時間を要し、特に少数の検体を急いで処理したいときあるいは現場検査などには、電気を動力として遠心分離機を必要とする遠心分離法は不向きである。そこで、濾過により全血から血清あるいは血漿を分離回収する方法が検討されてきた。
【０００３】
濾過によって全血から血清あるいは血漿を得る方法には、富士写真フイルム（株）製の「プラズマフィルターＰＦ」として市販され、特開平２０００−８１４３２号公報で知られているように、３〜６枚のガラス繊維濾紙をプラスチック製のホルダーに装填して、吸引により全血を濾過する方法がある。しかし、この濾過方法では、血漿を１５０μＬ程度濾過できるものの全血を３ｍＬ程度必要とし、微量の全血を濾過することができない。
【０００４】
濾過によって全血から血球を捕捉し、血清あるいは血漿を得る方法には、特開平１０−１８５９１０号公報に記載された３次元多孔質体を用る方法があり、ポリスルホン膜、酢酸セルロース膜などが知られている。しかし、この膜は孔径を均一に作成するのは難しい。
【０００５】
一方、全血から白血球を捕捉して採取し、これをもとに遺伝子を回収して遺伝子解析あるいは遺伝子診断に用いることが、近年盛んに行われるようになってきており、全血から白血球を回収する技術が必要となってきている。
【０００６】
全血から白血球のみを除去する方法には、テルモ（株）社製の「イムノガード（登録商標）III−ＲＣ」で実用化されているポリウレタン多孔質フィルター，日本ポール(株)社で販売している「ポール輸血フィルターＰＬ１Ｊ」で実用化されているポリエステルフィルターなどが知られている。しかし、このフィルターは輸血用の全血から白血球を除去するためのものであり、微量の全血から白血球を捕捉して白血球を回収することが難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
新生児など微量の全血しか採血できない場合など、微量の全血から血清あるいは血漿を急いで得る方法が求められている。また、濾過によって全血から血球を捕捉する方法において、遺伝子診断等に用いるために白血球のみを分画して採取する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
均一な孔径の薄い膜を用いることで、微量の全血から血球のみを捕捉して血清あるいは血漿を回収することができること、および均一な孔径の大きさによって全血の白血球のみを捕捉して回収できることを見出した。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、微量の全血から、血清あるいは血漿と血球を分離し、さらには白血球のみを捕捉して分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
膜の素材としては、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ−３−ヒドロキシブチレート、アガロース、ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート、ポリスルホンなどの非水溶性溶媒に溶解する高分子化合物を用いることができるが、ポリ−ε−カプロラクトンを用いることが好ましい。
【００１１】
これらの素材だけでもハニカム様の構造の膜を形成させることができるが、両親媒性の素材を添加することが好ましい。両親媒性の素材としては、例えば両親媒性ポリアクリルアミドがある。
【００１２】
膜の素材と両親媒性の素材の混合比率は、重量比０：１〜１：０の範囲で使用することが好ましい。より好ましくは、重量比５：１〜２０：１の範囲である。
【００１３】
キャストする溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサンなど膜の素材となる高分子化合物を溶解させることができる非水溶性の溶媒であればよい。キャストするときのポリマー濃度は、高分子膜を形成できる濃度であればよく、工業的に大量生産をするためには、０．１ｗｔ％以上のできる限り高い濃度で製膜することが望ましい。
【００１４】
非水溶性の膜の素材、例えばポリ−ε−カプロラクトンを、非水溶性の溶媒、例えばクロロホルムに溶解させているので、高湿度空気によって溶媒を蒸発させるときに気化熱により空気中の水分が結露し、それが溶媒の蒸発とともに徐々に成長して直径０．５〜４０μｍ程度のサイズの水滴になる。この水滴には非水溶性のポリ−ε−カプロラクトンは溶解できないから、この部分が孔（ポア）となった膜が得られる。例えばシャーレに２次元的にキャストしているので、成長した水滴は、球の２次元的最密充填構造様に規則正しく配列し、結果としてハニカム構造の膜が得られる。
【００１５】
孔径は、キャストする液の濃度及び液量を調節してシャーレ等の支持層に供給し、雰囲気あるいは吹き付ける空気の温度、湿度を制御することで、溶媒の蒸発スピード、結露スピードを制御することによって、制御することができる。更に、微量の界面活性剤を添加して水滴の融合を抑えて安定化させることによって、より規則正しいハニカム構造の膜を作成することができる。
【００１６】
膜に吹き付ける高湿度空気は、相対湿度３０％および８０％のものを主に用いたが、膜の表面に空気中の水分を結露させることができる湿度であればよく、温度によって２０〜１００％の相対湿度であればよいし、空気に限らず窒素、アルゴンなどの比較的不活性なガスを用いてもよい。
【００１７】
膜に吹き付ける高湿度空気の流量は、膜の表面に空気中の水分を結露させることができ、キャストに用いた溶媒を蒸発させることができる流量であればよい。
【００１８】
高湿度空気を吹き付けるときの雰囲気の温度は、キャストに用いた溶媒が蒸発することができる温度であればよく、実験室レベルでは１５〜３２℃、生産レベルでは５〜８０℃の温度であることが望ましい。
【００１９】
キャストする溶液の濃度、溶液の量、溶媒の種類、吹き付ける空気の相対湿度・温度・流量を変えることによって、結露、水滴の成長、溶媒の蒸発速度を制御し、様々な孔径の規則正しいハニカム様の構造の膜を得ることができ、血液中の成分である、直径約３μｍの血小板、直径約１５μｍの白血球、変形能が大きいが直径約７μｍの赤血球を、孔径のサイズを変えることにより各々を分離できるフィルターとして使用できる。
【００２０】
また、孔径のほぼ等しい膜を積層することによって、フィルターとして分離できる能力を高めることができる。更に、孔径の異なる複数の膜を積層することによって、幾つかの生体物質を同時に分離する或いは分画することができる。例えば、孔径５．５〜８．５μｍの膜と孔径３．５μｍ以下の膜を積層して孔径の大きい膜側から全血を供給することによって、孔径の大きい膜で白血球を捕捉し、孔径の小さい膜で赤血球を捕捉することが同時に達成できる。
【００２１】
更に、孔径をサブミクロンオーダーに設定することで、透析などの血液浄化に代表されるような標的生体物質の選択的分離回収技術としての期待ができる。
【００２２】
本発明においてハニカム様構造とは、孔径がほぼ一定の複数の孔が規則正しく配列し、このような孔が膜を貫通している構造をいう。孔の断面に特に限定は無く、円形、楕円形、六角形、長方形、正方形等の形状でよい。
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【実施例１】
【００２４】
実施例１  ハニカム様構造の膜の作成（１）
平均分子量７万〜１０万のポリ−ε−カプロラクトン（化合物１）と両親媒性ポリアクリルアミド（化合物２）を重量比で１０：１の割合で混合したクロロホルム溶液（ポリマー濃度として０．１〜２ｗｔ％）を、直径１０ｃｍのシャーレ上に５ｍＬキャストし、相対湿度３０〜８０％の高湿度空気を毎分１〜２０Ｌの流量で吹き付け、クロロホルム溶媒を蒸発させることによって、柔軟性、弾性を有し、力学強度の強いハニカム様構造の膜を得た。
【００２５】
【化１】
2006194908.tif 000002
【００２６】
【化２】
2006194908.tif 000003
【００２７】
上記の様々な条件で作成した膜の構造を、光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡で観察したところ、０．５〜４０μｍの孔径のハニカム様の構造の膜であり、表面から裏面へ単一層の孔で貫通している構造であった。孔径はキャストした全面にわたってきれいな円形をしており、サイズもほぼ同一であった。撮影した写真から孔径を計測し、孔径の分布を求めると変動係数でＣＶ１０％以下であることがわかった。また、レーザーを用いた光散乱の評価でキャストした膜全面にわたって１０次以上の回折光が観測できたことから、規則性の極めて高いポーラスフィルムを作成することができたことがわかった。
【実施例２】
【００２８】
実施例２  ハニカム様構造の膜の作成（２）
膜となる物質として化合物２からなる両親媒性ポリアクリルアミドを用い、キャストする溶媒をクロロホルム、ベンゼン、トルエン、キシレンと変え、溶液濃度を１．０ｇ／Ｌ、キャスト量を３０μＬとし、キャストさせる基板にガラスを用い、高湿度空気の流量を０．０９Ｌ／分にし、相対湿度を８５％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜の溶媒依存を評価した。このときの形態観察結果を図１に示す。
図１において、孔径は、上から０．５μｍ〜１０μｍである。
【実施例３】
【００２９】
実施例３  ハニカム様構造の膜の作成（３）
膜となる物質として化合物１からなるポリ−ε−カプロラクトンと化合物２からなる両親媒性ポリアクリルアミドを重量比で１０：１の割合で用い、溶媒としてクロロホルムを用い、溶液濃度を１０．０ｇ／Ｌにし、キャストする量を５、１０、２０ｍＬと変え、キャストさせる基板にガラスを用い、高湿度空気の流量を２．０Ｌ／分にし、相対湿度を３０％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜のキャスト量依存を評価した。このときの形態観察結果を図２に示す。
図２において、孔径は、上から８μｍ〜３５μｍである。
【実施例４】
【００３０】
実施例４  ハニカム様構造の膜の作成（４）
膜となる物質として化合物１からなるポリ−ε−カプロラクトンと化合物２からなる両親媒性ポリアクリルアミドを重量比で１０：１の割合で用い、溶媒としてクロロホルムを用い、溶液濃度を１、５、１０、２０ｇ／Ｌと変え、キャスト量を１０ｍＬとし、キャストさせる基板にハイドロゲルを用い、高湿度空気の流量を２．０Ｌ／分にし、相対湿度を３０％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜の溶液濃度依存を評価した。このときの形態観察結果を図３に示す。
図３において、孔径は、最小１５μｍ、最大２５μｍである。
【実施例５】
【００３１】
実施例５  ハニカム様構造の膜の作成（５）
膜となる物質として化合物１からなるポリ−ε−カプロラクトンを用い、溶媒としてクロロホルムを用い、溶液濃度を１．０ｇ／Ｌとし、キャスト量を５ｍＬとし、キャストさせる基板をアガロースゲル、ガラス、マイカ、ＰＨＥＭＡと変え、高湿度空気の流量を２．０Ｌ／分にし、相対湿度を３０％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜のキャスト基板依存を評価した。このときの形態観察結果を図４に示す。
図４において、孔径は、最小７μｍ、最大１４μｍである。
【００３２】
なお、図１〜図４において、バーの長さはすべて２０μｍである。
【実施例６】
【００３３】
実施例６  濾過性能の評価（１）
作成したハニカム様の構造の膜の血液濾過性能を評価するに先立ち、粒径が既知のポリスチレン粒子の通過実験を行い、孔径を変えることによって通過する粒子の種類と通過率を調べた。結果を表１に示す。孔径５．５〜８．５μｍの膜を用いると、直径３μｍの粒子は通過するが直径１０μｍ以上の粒子は全く通過しないことを初めて明らかにすることができた。
【００３４】
【表１】
2006194908.tif 000004
【実施例７】
【００３５】
実施例７  濾過性能の評価（２）
作成したハニカム様の構造の膜を用いて、ヒト全血中の白血球の捕捉実験を行った。孔径５．２μｍ、９．８μｍの膜を用い、ヘパリン採血管で採血した人全血を濾過させ、血球計算板に血液をキャストして白血球の数を計測したところ、濾過前では４８００個／μＬあった白血球数が、濾過後は０個／μＬになっていることがわかった（表２）。また、濾過した濾液を３０００回転で１０分遠心分離して得られた上清の色を目視で確認したところ、溶血は確認されなかった。
【００３６】
【表２】
2006194908.tif 000005
【実施例８】
【００３７】
実施例８  濾過性能の評価（３）
作成したハニカム様の構造の膜を用いて、ヒト全血中の赤血球の捕捉実験を行った。孔径３．５〜５．５μｍの膜を用い、各々直径５ｍｍに３枚打ち抜いて積層してニトロセルロース膜の上に静置した。ヘパリン採血管で採血したヘマトクリット値４０％のヒト全血を、同一全血を遠心分離して得られた血漿で希釈してヘマトクリット値２．５％に調製した全血にしたものを、積層した膜の上に５μＬ点着して１０秒間放置し、その後に積層した膜を持ち上げ、濾過されてニトロセルロース膜に転写した血漿に赤血球の赤い色が残存しているかどうかの評価を行ったところ、孔径が３．５μｍの膜で赤い色が見とめられず、赤血球を捕捉できていることが確認できた（表３）。
【００３８】
【表３】
2006194908.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ハニカム様の膜を作成するときの孔径の溶媒依存を示したものである。
【図２】ハニカム様の膜を作成するときの孔径のキャスト量依存を示したものである。
【図３】ハニカム様の膜を作成するときの孔径の濃度依存を示したものである。
【図４】ハニカム様の膜を作成するときの孔径のキャストする基板依存を示したものである。
【図１】
2006194908.tif 000007
【図２】
2006194908.tif 000008
【図３】
2006194908.tif 000009
【図４】
2006194908.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月24日(2006.4.24)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、全血から血球を除去するための濾過膜の製造方法、およびその濾過膜を用いて全血から赤血球あるいは白血球を捕捉して回収する方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
キャストする溶媒としては、ベンゼン、トルエンあるいはキシレンを用いる。キャストするときのポリマー濃度は、高分子膜を形成できる濃度であればよく、工業的に大量生産をするためには、０．１ｗｔ％以上のできる限り高い濃度で製膜することが望ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
非水溶性の膜の素材、例えばポリ−ε−カプロラクトンを、非水溶性の溶媒であるベンゼン、トルエンあるいはキシレンに溶解させているので、高湿度空気によって溶媒を蒸発させるときに気化熱により空気中の水分が結露し、それが溶媒の蒸発とともに徐々に成長して直径０．５〜４０μｍ程度のサイズの水滴になる。この水滴には非水溶性のポリ−ε−カプロラクトンは溶解できないから、この部分が孔（ポア）となった膜が得られる。例えばシャーレに２次元的にキャストしているので、成長した水滴は、球の２次元的最密充填構造様に規則正しく配列し、結果としてハニカム構造の膜が得られる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
膜に吹き付ける高湿度空気は、膜の表面に空気中の水分を結露させることができる湿度であればよいが、温度によって８０〜１００％の相対湿度が好ましい。空気に限らず窒素、アルゴンなどの比較的不活性なガスを用いてもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
参考例１  ハニカム様構造の膜の作成（１）
平均分子量７万〜１０万のポリ−ε−カプロラクトン（化合物１）と両親媒性ポリアクリルアミド（化合物２）を重量比で１０：１の割合で混合したクロロホルム溶液（ポリマー濃度として０．１〜２ｗｔ％）を、直径１０ｃｍのシャーレ上に５ｍＬキャストし、相対湿度３０〜８０％の高湿度空気を毎分１〜２０Ｌの流量で吹き付け、クロロホルム溶媒を蒸発させることによって、柔軟性、弾性を有し、力学強度の強いハニカム様構造の膜を得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
実施例１  ハニカム様構造の膜の作成（２）
膜となる物質として化合物２からなる両親媒性ポリアクリルアミドを用い、キャストする溶媒をクロロホルム、ベンゼン、トルエン、キシレンと変え、溶液濃度を１．０ｇ／Ｌ、キャスト量を３０μＬとし、キャストさせる基板にガラスを用い、高湿度空気の流量を０．０９Ｌ／分にし、相対湿度を８５％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜の溶媒依存を評価した。このときの形態観察結果を図１に示す。
図１において、孔径は、上から０．５μｍ〜１０μｍである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
参考例２  ハニカム様構造の膜の作成（３）
膜となる物質として化合物１からなるポリ−ε−カプロラクトンと化合物２からなる両親媒性ポリアクリルアミドを重量比で１０：１の割合で用い、溶媒としてクロロホルムを用い、溶液濃度を１０．０ｇ／Ｌにし、キャストする量を５、１０、２０ｍＬと変え、キャストさせる基板にガラスを用い、高湿度空気の流量を２．０Ｌ／分にし、相対湿度を３０％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜のキャスト量依存を評価した。このときの形態観察結果を図２に示す。
図２において、孔径は、上から８μｍ〜３５μｍである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
参考例３  ハニカム様構造の膜の作成（４）
膜となる物質として化合物１からなるポリ−ε−カプロラクトンと化合物２からなる両親媒性ポリアクリルアミドを重量比で１０：１の割合で用い、溶媒としてクロロホルムを用い、溶液濃度を１、５、１０、２０ｇ／Ｌと変え、キャスト量を１０ｍＬとし、キャストさせる基板にハイドロゲルを用い、高湿度空気の流量を２．０Ｌ／分にし、相対湿度を３０％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜の溶液濃度依存を評価した。このときの形態観察結果を図３に示す。
図３において、孔径は、最小１５μｍ、最大２５μｍである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
参考例４  ハニカム様構造の膜の作成（５）
膜となる物質として化合物１からなるポリ−ε−カプロラクトンを用い、溶媒としてクロロホルムを用い、溶液濃度を１．０ｇ／Ｌとし、キャスト量を５ｍＬとし、キャストさせる基板をアガロースゲル、ガラス、マイカ、ＰＨＥＭＡと変え、高湿度空気の流量を２．０Ｌ／分にし、相対湿度を３０％にし、温度を２０℃にしたときに作成できる膜のキャスト基板依存を評価した。このときの形態観察結果を図４に示す。
図４において、孔径は、最小７μｍ、最大１４μｍである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
参考例５  濾過性能の評価（１）
作成したハニカム様の構造の膜の血液濾過性能を評価するに先立ち、粒径が既知のポリスチレン粒子の通過実験を行い、孔径を変えることによって通過する粒子の種類と通過率を調べた。結果を表１に示す。孔径５．５〜８．５μｍの膜を用いると、直径３μｍの粒子は通過するが直径１０μｍ以上の粒子は全く通過しないことを初めて明らかにすることができた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
参考例６  濾過性能の評価（２）
作成したハニカム様の構造の膜を用いて、ヒト全血中の白血球の捕捉実験を行った。孔径５．２μｍ、９．８μｍの膜を用い、ヘパリン採血管で採血した人全血を濾過させ、血球計算板に血液をキャストして白血球の数を計測したところ、濾過前では４８００個／μＬあった白血球数が、濾過後は０個／μＬになっていることがわかった（表２）。また、濾過した濾液を３０００回転で１０分遠心分離して得られた上清の色を目視で確認したところ、溶血は確認されなかった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
参考例７  濾過性能の評価（３）
作成したハニカム様の構造の膜を用いて、ヒト全血中の赤血球の捕捉実験を行った。孔径３．５〜５．５μｍの膜を用い、各々直径５ｍｍに３枚打ち抜いて積層してニトロセルロース膜の上に静置した。ヘパリン採血管で採血したヘマトクリット値４０％のヒト全血を、同一全血を遠心分離して得られた血漿で希釈してヘマトクリット値２．５％に調製した全血にしたものを、積層した膜の上に５μＬ点着して１０秒間放置し、その後に積層した膜を持ち上げ、濾過されてニトロセルロース膜に転写した血漿に赤血球の赤い色が残存しているかどうかの評価を行ったところ、孔径が３．５μｍの膜で赤い色が見とめられず、赤血球を捕捉できていることが確認できた（表３）。