(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚に潤いを与え、再生を促す化粧料の提供。【解決手段】凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを含有する化粧用組成物、及び（１）ケラチン細胞または繊維芽細胞を培養する段階と、（２）前記培養されたケラチン細胞または繊維芽細胞を凍結乾燥させる段階と、（３）前記凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを、化粧用として受け入れられる担体に添加する段階とを含む前記化粧用組成物の製造方法に関する。前記化粧用組成物を皮膚に適用すると、ケラチン細胞及び繊維芽細胞の既に発現されたサイトカインが放出されて皮膚再生を促進する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥したケラチン細胞及び繊維芽細胞の少なくとも一つを含む化粧用組成物。
【請求項２】
前記ケラチン細胞及び繊維芽細胞は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ケラチン細胞成長因子（ＫＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、顆粒球形成刺激因子（ＧＣＳＦ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍怪死因子（ＴＮＦ）及びインターロイキンからなる群より選択されたサイトカインを分泌することを特徴とする請求項１記載の化粧用組成物。
【請求項３】
前記ケラチン細胞は化粧用組成物の全体重量に対して０.０１〜２.０重量％含まれることを特徴とする請求項１記載の化粧用組成物。
【請求項４】
前記ケラチン細胞は、分化された皮膚、皮膚付属器官または胚芽幹細胞から由来することを特徴とする請求項１記載の化粧用組成物。
【請求項５】
前記皮膚は、包皮、腋、尻、乳房、頭皮、恥骨部または陰嚢からなる群より選択されることを特徴とする請求項４記載の化粧用組成物。
【請求項６】
前記皮膚付属器官は、毛嚢、汗腺、皮脂腺及び毛細血管からなる群より選択されることを特徴とする請求項４記載の化粧用組成物。
【請求項７】
前記繊維芽細胞は、化粧用組成物の全体重量に対して０.０１〜５.０重量％含まれることを特徴とする請求項１記載の化粧用組成物。
【請求項８】
前記繊維芽細胞は、分化された皮膚または胚芽幹細胞から由来することを特徴とする請求項１記載の化粧用組成物。
【請求項９】
前記化粧用組成物は化粧水、ローション、クリームまたはジェルに剤形化したことを特徴とする請求項１記載の化粧用組成物。
【請求項１０】
（１）ケラチン細胞または繊維芽細胞を培養する段階と、（２）前記培養されたケラチン細胞または繊維芽細胞を凍結乾燥させる段階と、（３）前記凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを、化粧用として受け入れられる担体に添加する段階とを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の化粧用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧用組成物及びその製造方法に関し、凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを含有する化粧用組成物、及び（１）ケラチン細胞または繊維芽細胞を培養する段階と、（２）前記培養されたケラチン細胞または繊維芽細胞を凍結乾燥させる段階と、（３）前記凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを、化粧用として受け入れられる担体に添加する段階とを含む前記化粧用組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は表皮と真皮からなり、表皮層の外層は死んだ角質細胞(corneocyte)、内層は生きているケラチン細胞(keratinocyte)からなっている。細分すると、基底層(basal layer)、有極層(spinous layer)、顆粒層(granular layer)及び角質層(cornified layer)の４層に分けられる。ケラチン細胞は表皮の９０％を占め、残りはメラニン細胞、Ｔリンパ球、特殊マクロファージ(macrophage)のランゲルハンス細胞(Langerhans cell)、神経伝達物質分泌細胞のメルケル細胞(Merkel cell)などが存在する。活発に増殖するケラチン細胞は、表皮と真皮間の基底層(basement membrane)に接した小さい細胞（すなわち、基底細胞）であって、分化が始まると、大きさが大きくなり、細胞質の形態が変わり、予定されたプログラムに従って表皮の上層に移動しながら死滅する。表皮層の下の真皮層は繊維芽細胞(fibroblast)とその副産物からなり、真皮層の主要細胞群である繊維芽細胞は細胞外基質(extracellular matrix)の役割をするコラーゲン(collagen)とエラスチン(elastin)を生成する。このような繊維芽細胞生成物は、表皮層のケラチン細胞の増殖に必須的である。皮膚には、前述した表皮と真皮の外にも、皮膚付属器官である毛嚢、汗腺、皮脂腺及び毛細血管が存在する。毛嚢にはケラチン細胞が存在するが、近接した繊維芽細胞との相互作用によってモルフォゲン(morphogen)の発現が誘導されて毛に分化する。
【０００３】
１９７５年当時、米国ＭＩＴ大学のＨｏｗａｒｄ Ｇｒｅｅｎ博士の実験室で培養方法を開発することにより人体ケラチン細胞培養が始まり(非特許文献１)、この方法は、他の種類の上皮細胞にも適用された。また、１９７９年に少量の皮膚組織からケラチン細胞を分離し、約２週培養して、皮膚移植に適したシートの製造に成功することにより、ケラチン細胞を培養して人体移植用培養皮膚断片(Cultured Epidermal Graft,ＣＥＧ)を製造し始めた。１９８４年ＢｏｓｔｏｎのＳｈｒｉｎｅｒ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌで９５％ＢＳＡ(Burn Surface Area)の小児に成功的に移植された後、現在まで米国とヨーロッパで臨床に適用されてきた(非特許文献２)。ところが、自己由来の培養皮膚は、皮膚組織を採取した後、培養期間が３週以上かかるので、直ちに傷に適用することができないという欠点があった。これを補完するために、１９８０年代後半には、他人の皮膚組織から由来する（同種由来）培養皮膚を使用し始めた。初期には同種由来の培養皮膚も自己由来と同様に移植されて人体に存在し増殖するものと思われたが、後で同種由来の皮膚は患部に残っているケラチン細胞を刺激して増殖と移動を促進する傷治癒用ドレッシング材料と判明された。
【０００４】
正確な作用機序は解明されていないが、ケラチン細胞の卓越した傷治癒効果はいろいろの研究者によって確認された。このような効果は、ケラチン細胞から由来するサイトカインと細胞外基質（ＥＣＭ）の作用に起因することが明らかになった。ケラチン細胞から分泌されるサイトカインは、免疫及び炎症反応に関与し、細胞の増殖及び移動を調節する役割をする。ケラチン細胞が生成及び分泌し、傷治癒に影響を及ぼすサイトカイン及び細胞外基質としては、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＰＤＦＧ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦなどが含まれる(非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５)。
【０００５】
この他にも知られていない因子が複合的に分泌されて真皮の繊維芽細胞を刺激してコラーゲンの生成を促進し、傷の周辺と皮膚付属器官などから傷の再上皮化が起こりうる環境を作る役割をする(非特許文献６)。特に、ＩＬ−１ａの場合には、繊維芽細胞に作用してＫＧＦという成長因子の発現を促進させるが、ＫＧＦは、繊維芽細胞で発現してケラチン細胞の増殖を媒介する代表的なパラクリン因子(paracrine factor)として作用する(非特許文献７、非特許文献８)。
【０００６】
すなわち、ケラチン細胞から分泌されるサイトカインは、傷治癒に直接作用するうえ、他の種類の皮膚細胞から特定のサイトカインの分泌を誘導することにより、間接的にも傷治癒を促進する(非特許文献９)。また、ケラチン細胞から分泌されるＭＭＰのような酵素は、コラーゲンの合成と分解に関与して、傷治癒の初期段階ではコラーゲンの合成を促進し、時間が経過すると減少させる機序によってコラーゲンの過多合成による肥厚性瘢痕の生成を阻害する作用をする(非特許文献１０)。
【０００７】
以上のようにケラチン細胞と繊維芽細胞で発現及び分泌される蛋白質の卓越した傷治癒及び皮膚再生効果が知られることにより、これを用いる様々な薬剤学的組成物及び化粧用組成物が開発されてきた。
【０００８】
特許文献１は、動物細胞、好ましくは人の皮膚から或いは人の毛髪またはまつ毛の毛幹から抽出したケラチン細胞または繊維芽細胞を培養する間、ＵＶ、温度の変化、磁気場、化学薬品、必須栄養分の欠如といったストレス要因を提供し、これに反応して前記細胞が生産及び分泌する物質を収集し、化粧品として受け入れられるキャリアに含ませて製造した化粧用組成物を開示している。
【０００９】
特許文献２は、培養された皮膚細胞から生産された成長因子を含有している組成物に関するもので、ケラチン細胞及び繊維芽細胞のような皮膚細胞を生体外(in vitro)培養し、培養中に前記皮膚細胞で発現及び分泌されるサイトカインを収集して薬剤または化粧品に添加する方法を開示している。
【特許文献１】特開平３−６８５０６号公報
【特許文献２】国際公開特許ＷＯ０１／１４５２７号パンフレット
【非特許文献１】Rheinwald and Green, Cell, 1975, vol.6, pp.331-344
【非特許文献２】Gallico et al. New England Journal of Medicine, 1984, vol.311, pp.448-451
【非特許文献３】Nowinski et al. Journal of Investigative Dermatology, 2003, vol.122, pp.216-221
【非特許文献４】Uchi et al. Journal of  Dermatological Science, 2000, vol.24, pp.S29-S38
【非特許文献５】Hashimoto, Journal of Dermatological Science, 2003, vol.24, pp.S46-S50
【非特許文献６】Garner, Plastic and Reconstructive Surgery, 1998, vol.102, pp.135-139
【非特許文献７】Chedid et al. Journal of Biological Chemistry, 1994, vol.269, pp.10753-10757
【非特許文献８】Mass et al. Journal of Cell Science, 1995, vol.112, pp.1843-1853
【非特許文献９】Nowinski et al. Journal of Investigative Dermatology, 2002, vol.119, pp.449-455
【非特許文献１０】McCawley et al. Current Opinion in Cell Biology, 2001, vol.13, pp.534-540
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところが、ケラチン細胞または繊維芽細胞で発現及び分泌される蛋白質を用いる場合には、前記蛋白質を培地から分離する工程を経なければならない。また、分離された蛋白質それ自体は、保管し難いうえ、そのまま化粧用組成物または薬剤学的組成物に投入する場合に固有の生物学的活性を失うおそれがあるため、これを防止するための工程も経なければならない。
【００１１】
このため、本発明は、簡単な工程で持続的な皮膚再生効果を発揮することが可能な化粧用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決するために、ケラチン細胞及び繊維芽細胞自体を凍結乾燥させ、化粧用として受け入れられる担体に混入させた結果、前述した効果を達成することができるという事実を確認し、本発明の完成に至った。
【００１３】
本発明は、一観点として、凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを含有する化粧用組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、他の観点として、（１）ケラチン細胞または繊維芽細胞を培養する段階と、（２）前記培養されたケラチン細胞または繊維芽細胞を凍結乾燥させる段階と、（３）前記凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを、化粧用として受け入れられる担体に添加する段階とを含む前記化粧用組成物の製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係る化粧用組成物は、皮膚再生を促進する作用をする。前記「皮膚再生」は、皮膚の弾力性増大、皺の改善、老化進行阻害などを意味するもので、本発明の化粧用組成物を皮膚に適用すると、ケラチン細胞または繊維芽細胞で既に発現されたサイトカインが放出され、新しいケラチン細胞または繊維芽細胞の増殖を開始し、既存細胞の死滅を減少させて皮膚の弾力性を増加させ、皺の生成を遅延及び防止して老化を遅延させることができる。
【００１６】
このようにケラチン細胞または繊維芽細胞で生産されて皮膚再生を促進するサイトカインには、塩基性繊維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor；ｂＦＧＦ)、上皮細胞成長因子（epidermal growth factor；ＥＧＦ）、ケラチン細胞成長因子（keratinocyte growth factor；ＫＧＦ）、形質転換成長因子α（transforming growth factor alpha；ＴＧＦα）、形質転換成長因子β（transforming growth factor beta-1；ＴＧＦβ）、顆粒球形成刺激因子（granulocyte colony stimulating factor；ＧＣＳＦ）、インシュリン類似成長因子（insulin-like growth factor；ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor；ＶＥＧＦ）、腫瘍怪死因子（tumor necrosis factor；ＴＮＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１を含んだ多数のインターロイキンなどが含まれるが、これに制限されるものではない。
【００１７】
本発明に係る化粧用組成物の一成分であるケラチン細胞は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトから由来するものを使用する。前記ケラチン細胞の起源組織としては、分化された皮膚、皮膚付属器官または胚芽幹細胞(embryonic stem cell)が適する。起源組織が皮膚の場合には、包皮(foreskin)、腋、尻、乳房、頭皮、恥骨部または陰嚢から由来するものを使用することが好ましい。起源組織が皮膚付属器官の場合には、毛嚢、汗腺、皮脂腺または毛細血管から由来するものを使用することが適する。毛嚢は、成熟期(anagen)の毛嚢から由来し、毛嚢のケラチン細胞が付いている毛髪を使用することが好ましい。
【００１８】
本発明の化粧用組成物に、前記ケラチン細胞は組成物の全体重量に対して０.０１％〜２.０重量％、好ましくは０.１％〜１.０重量％、さらに好ましくは０.１％〜０.２重量％含まれる。
【００１９】
本発明に係る化粧用組成物の他の成分である繊維芽細胞は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトから由来するものを使用する。前記繊維芽細胞は、分化された皮膚組織を分解(disaggregation)し或いは胚芽幹細胞(embryonic stem cell)を分化して収得することができる。分解は、当業界に公知になっている方法を用いることができるが、そのような方法には、物理的分解及び／または消化酵素及び／または隣り合った細胞との連結を弱くするキレート剤の処理などが含まれる。このような方法を用いて細胞を破壊することなく組織を単一細胞に分散させることができる。特に、酵素による分離は、まず組織を粉砕(mincing)した後、多数の消化酵素のいずれか一つを単独で或いは混合して処理することにより、容易に達成できる。好適な酵素の例には、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ及びディスパーゼなどが含まれるが、これに制限されるものではない。物理的な分解方法には、グラインダー(grinder)、ブレンダー(blender)、シーブ(sieve)、ホモジナイザー(homogenizer)またはソニケーター(sonicator)を用いる方法がある。
【００２０】
本発明の化粧用組成物に、前記繊維芽細胞は組成物の全体重量に対して０.０１％〜５.０重量％、好ましくは０.０５〜２.０重量％、より好ましくは０.１〜１.０重量％含まれる。
【００２１】
一方、本発明に係る化粧用組成物は、（１）ケラチン細胞または繊維芽細胞を培養し、（２）前記培養されたケラチン細胞または繊維芽細胞を凍結乾燥させ、（３）前記凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つを、化粧用として受け入れられる担体に添加して製造することができる。
【００２２】
ケラチン細胞または繊維芽細胞は、通常の動物細胞培養用培地で培養することにより増殖することができる。そのような培地は、当業界に公知になっている成分及び組成によって製造し或いは商業的に入手することができる。本発明で利用できる培地には、ＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium)、Ｍ１９９、ＲＰＭＩ１６４０、ＥＤＭＥＭ(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、ＭＣＤＢ、Ｈａｍ'ｓ  Ｆ−１２、Ｈａｍ'ｓ  Ｆ−１０、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ(Keratinocyte-Serum Free Medium)、ＫＧＭ(Keratinocyte Growth Medium)などが含まれるが、これに制限されるのではない。本発明において、ケラチン細胞の培養にはＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、Ｈａｍ'ｓ  Ｆ−１２またはこれらの混合物を、繊維芽細胞の培養にはＨａｍ’ｓ Ｆ−１２またはＤＭＥＭを用いることが好ましい。
【００２３】
前記培地は、牛胎児血清(fetal bovine serum)、牛血清(bovine serum)、トリヨードチロニン(triiodothyronine,Ｔ３)、インシュリン(insuline)、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、グルタミン(glutamine)、アデニン(adenin)、トランスフェリン(transferrin)、ゲンタマイシン(Gentamaycin)及びフェニシリン−ストレプトマイシン(penicillin-streptomycin)といった抗生剤などをさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。
本発明において、ケラチン細胞または繊維芽細胞は、室温における安定性を増加させ、高費用の低温保存の必要性を減らし、保存の寿命を延長するために凍結乾燥させることが好ましい。凍結乾燥工程は、凍結、１次乾燥及び２次乾燥の連続段階で行われる。組成物を凍結させた後の１次乾燥段階は、圧力を降下し、水蒸気の昇華のために加熱する。２次乾燥段階は１次乾燥物から吸収された残余水分を蒸発させる。
【００２４】
ケラチン細胞または繊維芽細胞は、商業的に入手することが可能な凍結乾燥機を用いて、当業界に公知になっている凍結乾燥方法によって凍結乾燥させることができる。このような方法は、例えばＪａｎｏｆｆ等の米国特許第４８８０８３５号明細書に開示されている。凍結乾燥に先立ち、細胞が溶解されている溶液に凍結乾燥保護剤を添加することができる。凍結乾燥保護剤は、細胞及び生物学的分子を保護し、その大きさ及び形態が乾燥及び解凍工程中に一定に維持されるようにする。利用可能な凍結乾燥保護剤は、デキストロース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロース、ラクトース及びトリオースを含んだ糖類である。これらは、前記細胞が溶解された溶液に５〜２０重量％、好ましくは約１０重量％添加されることが好ましい。また、凍結乾燥工程以前に、細胞が溶解されている溶液に賦形剤を添加することもできる。賦形剤としては、これらに制限されるものではないが、約０.９％のＮａＣｌ及び約１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０Ｍ）または約１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）の緩衝液が含まれる。
【００２５】
一様態として、本発明において、ケラチン細胞または繊維芽細胞の凍結乾燥方法は次の順序通りである。（１）適した容器に細胞を入れ、緩衝溶液で浮遊させた後、超低温冷凍庫に入れて−７０〜−８０℃で約１２時間以上冷凍させる。（２）凍結乾燥機のサンプルコンテナーに容器を入れ、サンプルコンテナーの圧力が約１×１０−３ｔｏｒｒとなるまで、徐々に圧力を降下させる。（３）凍結乾燥機のチャンバー温度は約−５０℃を維持し、サンプルコンテナーの圧力を約２×１０−４ｔｏｒｒに調節し、約１２時間以上前記温度と圧力を維持しながら乾燥を完了する。（４）凍結乾燥機から容器を取り出した後、栓で密封して２〜８℃に維持する。
【００２６】
このように凍結乾燥したケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つは、化粧用として受け入れられる担体に添加され、本発明に係る化粧用組成物として提供できる。前記化粧用組成物に、ケラチン細胞と繊維芽細胞の少なくとも一つは凍結乾燥したままで含まれるか、或いは当業界で通常用いられる技術によってマイクロカプセル、微粒子または脂質小胞体に加工されて含まれることもできる。また、化粧用として受け入れられる担体と混合する形態よりは物理的に分離された（すなわち、別途の容器に保管された）形態で提供し、任意の化粧用組成物を皮膚に塗布する前に混合して使用するように剤形化することもできる。
【００２７】
本発明に係る化粧用組成物は、当業界に公知になっている技術を用いて一般的な化粧用組成物の剤形（例えば、化粧水、ローション、クリーム、ジェルなど）に剤形化することができる。目的の剤形に応じて利用可能な担体の種類と濃度は様々であるが、当業者であれば容易に決定することができる。
【００２８】
「化粧用として受け入れられる担体(cosmetically acceptable carrier)」は、精製水、オイル、ワックス、脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、界面活性剤、吸湿剤(humectant)、増粘剤(thickening agent)、抗酸化剤、粘度安定化剤(viscosity stabilizer)、キレート剤、緩衝剤、防腐剤、低級アルコールなどが含まれるが、これに制限されるものではない。必要に応じて美白剤、保湿剤、抗炎症剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤、ビタミン、紫外線遮断剤、抗生剤、ニキビ防止剤、香水、染料が含まれることもでき、これらは化粧品分野で通常用いられる量だけ本発明の化粧用組成物に含まれることができる。組成物の総重量に対して０.０１〜２０重量％が適する。
【００２９】
具体的に、前記オイルとしては水素化植物性油、ヒマシ油、綿実油、オリーブ油、椰子脂、ホホバ油、アボカド油が利用でき、ワックスとしては蜜蝋、鯨蝋、カルナウバ、カンデリラ、モンタン、セレシン、液体パラフィン、ラノリンが利用できる。脂肪酸としてはステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸が利用でき、脂肪酸アルコールとしてはセチルアルコール、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、パンテノール、ラノリンアルコール、ステアリルアルコール、ヘキサデカノールが利用でき、脂肪酸エステルとしてはミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチルが利用できるが、これに制限されるものではない。
【００３０】
界面活性剤の例には、ステアリン酸ナトリウム、硫酸セチルナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸塩、Ｎ−アシルグルタミン酸ナトリウムなどの陰イオン界面活性剤と、ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド及びステアリルトリメチルアンモニウムクロライドなどの陽イオン界面活性剤と、アルキルアミノエチルグリシンヒドロクロライド及びレシチンなどの陽性界面活性剤、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、スクロース脂肪酸エステル、モノステアリン酸プロピレングリコール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンココナッツ脂肪酸モノエタノールアルニド(monoethanolarnide)、ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤などが含まれる。
【００３１】
吸湿剤としてはグリセリン、１,３−ブチレングリコール、プロピレングリコールが利用でき、低級アルコールとしてはエタノール、イソプロパノールが利用できる。増粘剤の例にはアルギン酸ナトリウム、カゼイン酸ナトリウム、ゼラチン寒天、キサンタンゴム、澱粉、セルロースエーテル（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ポリビニールピロリドン、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコール及びカルボキシメチルセルロースナトリウムなどが含まれるが、これに制限されるものではない。抗酸化剤としてはブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、クエン酸、エトキシキン(ethoxyquin)が利用でき、キレート剤としてはエデト酸二ナトリウム、エタンヒドロキシ二リン酸が利用でき、緩衝剤としてはクエン酸、クエン酸ナトリウム、硼酸、ボラックス(borax)、リン酸水素二ナトリウムが利用でき、防腐剤としてはメチルパラヒドロキシベンアート、エチルパラヒドロキシベンゾアート、ジヒドロ酢酸、サリチル酸、ベンゾ酸が利用できるが、これに制限されるものではない。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例はただ本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨に基づいて本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者には明らかなことである。
【００３３】
〔実施例１〕
皮膚または毛嚢から由来するケラチン細胞／繊維芽細胞の培養
（ｉ）ケラチン細胞の培養
皮膚または毛嚢から由来するケラチン細胞は、ガンマ線照射された３Ｔ３フィーダー(feeder)と、ＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)とＨａｍ−Ｆ１２を３：１で混合して作った培地を用いて培養した。約１ｃｍ２サイズの皮膚組織をトリプシンで処理して単一細胞化した後、約百万個の皮膚細胞を収得して継代培養し、毛嚢の場合は２０余個の毛髪の外毛根鞘(Outer Root Sheath：ＯＲＳ)を組織培養して７日後に万個以上のケラチン細胞を収得した。この際、接種２日及び５日経過後にケラチン細胞の細胞成長形態を位相差倒立顕微鏡を用いて１００倍の倍率で観察した（図１（ａ）〜（ｄ））。
【００３４】
図１（ａ）〜（ｄ）に示すように、ケラチン細胞がコロニーを形成し成長する形態は、ケラチン細胞の由来組織と関係なく類似であった。
（ｉｉ）繊維芽細胞の培養
繊維芽細胞は、皮膚組織を単一細胞化した後、フィーダーなしでＨａｍ−Ｆ１２を基礎とする培養液を使用する方法であって、１６２ｃｍ２面積の培養容器に５×１０５個の密度で接種して３７℃、１０％ＣＯ２の条件で培養した。この条件を用いて、皮膚組織に存在する細胞中の繊維芽細胞を選択的に培養した。７日後に選択的に培養した繊維芽細胞をトリプシン：ＥＤＴＡで単一細胞化して継代培養した。前述した実施例１の（ｉ）と同様に、接種２日後及び５日後に位相差倒立顕微鏡を用いて１００倍の倍率で細胞成長形態を観察した（図２（ａ）及び図２（ｂ））。
【００３５】
図２に示すように、接種５日後、細胞は繊維芽細胞の放射状形態を維持しながら成長し、１００％のコンフルアンシに到達し、この時点で培養容器から４〜５×１０６個の繊維芽細胞を収得した。
（ｉｉｉ）ケラチン細胞及び繊維芽細胞の凍結乾燥
実施例１の(ｉ)及び（ｉｉ）から収得した細胞を培養し、９０％のコンフルアンシ(confluency)に到達したとき、トリプシン：ＥＤＴＡを用いて単一細胞化してケラチン細胞及び繊維芽細胞を得た。
【００３６】
このように得られた細胞を５０ｍＬのチューブに入れ、約５ｍＬのリン酸緩衝溶液で分散させ、前記チューブを超低温冷凍庫に入れ、−７５℃で約１２時間以上完全冷凍させた。予め稼動された凍結乾燥機のサンプルコンテナーにチューブを入れ、サンプルコンテナーの圧力が１×１０−３ｔｏｒｒになるまで徐々に圧力を降下した。凍結乾燥機のチャンバー温度は約−５０℃に維持し、サンプルコンテナーの圧力は２×１０−４ｔｏｒｒに調節した。このような温度と圧力を１２時間以上維持して乾燥を完成した。凍結乾燥機からチューブを取り出した後、栓で密封して２〜８℃に保存した。
【００３７】
凍結乾燥した細胞は、ＰＢＳまたは化粧用組成物に含ませて下記実施例による細胞増殖程度の分析、ＥＬＩＳＡ分析、蛋白質パターン及び含有量の分析などに使用した。
【００３８】
〔実施例２〕
ケラチン細胞の分化能力の比較
実施例１の（ｉｉ）から得た繊維芽細胞を含んだコラーゲン層上に、実施例１の（ｉ）から得たケラチン細胞を接種し、実施例１と同一の培地を用いて３７℃、１０％ＣＯ２、湿度８０〜１００％の条件で５日間培養した後、空気中に露出させる方法であり、皮膚組織由来のケラチン細胞及び毛嚢由来のケラチン細胞の分化を誘導した。すなわち、培養液に浸漬された状態でコラーゲン層上で１００％のコンフルアンシに到達したケラチン細胞を空気中に浮遊させるために、高吸収力の綿パッド(cotton pad)をコラーゲン層の下に敷き、培地の水位が紙と一致するようにした。このような状態で３週間培養及び分化された皮膚モデルを１０％のホルマリンで固定し、パラフィン組織を作った後、薄切してＨ＆Ｅ(Hematoxylin & Eosin)染色を行った（図３（ａ）及び図３（ｂ））。
【００３９】
図３（ａ）及び図３（ｂ）に示すように、実施例１から得たケラチン細胞が由来組織と関係なく基底層、有極層、顆粒層、角質層を形成し、正常的に分化することを確認した。
【００４０】
〔実施例３〕
ケラチン細胞の培養期間による蛋白質発現パターンの比較
ケラチン細胞０.２×１０６個をフィーダー上に接種して８日、９日、１０日間培養し、１０日間培養した細胞の一部を凍結乾燥させた。細胞はトリプシン：ＥＤＴＡを用いて単一細胞化し、このような単一細胞浮遊液を溶解用緩衝溶液(lysis buffer)で処理して蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質はＳＤＳ(Sodium Dodecyl Sulphate)を含んだサンプル緩衝溶液(sample buffer)に浮遊させて沸かした後、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて大きさによって分離した後、コマシブルー(Coommassie blue)染色をして肉眼で評価した（図４）。
【００４１】
図４に示すように、ケラチン細胞の蛋白質発現パターンと総発現量は、培養期間に関係なく一定であり、凍結乾燥前、後（レイン３及び４）を比較したときにも差異がなかった。これより、凍結乾燥は細胞の蛋白質発現及び分泌に影響を及ぼさないことが分かる。
【００４２】
〔実施例４〕
繊維芽細胞の培養期間による蛋白質発現パターンの比較
皮膚由来の繊維芽細胞を培養して、前記繊維芽細胞のコンフルアンシが５０％、７０％、９０％、１００％に到達したとき、前記実施例３と同様に細胞を分離した後、蛋白質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて蛋白質発現パターンを分析した（図５のレイン６〜９）。また前記繊維芽細胞のコンフルアンシが５０％、７０％、９０％、１００％に到達したとき、培養培地の一部を収集してＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて蛋白質発現パターンを分析した（図５のレイン２〜５）。
【００４３】
図５に示すように、抽出された蛋白質のパターンは、時間に関係なく一定であったが、分泌された蛋白質のパターンを分析するための培養培地の蛋白質パターンとは異なった。また、２つの場合、両方ともケラチン細胞から分泌される蛋白質とは異なるパターンを示さなかった。培養培地の蛋白質パターンは、１０％の血清のみを分析した結果（図５のレイン１）と類似のパターンを示すことから分かるように、蛋白質パターンの変化を測定することが難しかったが、コンフルアンシが増加するにつれて、分子量１２０〜２００ｋＤの間でバンド（２列）が太くなることを見ることができた。これはコラーゲンの蛋白質質量と類似なので、コラーゲンと推測される。反面、培地に含まれた血清が排除された抽出蛋白質のパターンは、コンフルアンシが増加するにつれて、コラーゲンを含んだ全ての蛋白質の量が増加することが分かった。
【００４４】
〔実施例５〕
ケラチン細胞と繊維芽細胞から分泌されるサイトカイン量の比較
凍結乾燥前、後のケラチン細胞と繊維芽細胞から分泌されるサイトカインの量をＥＬＩＳＡ方法で分析した。具体的に、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて、細胞から分泌されるＩＬ−１α、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦの量を測定した（図６）。
【００４５】
図６に示すように、凍結乾燥は、サイトカインの分泌に影響を及ぼさないため、凍結乾燥前の生きている細胞と比較したとき、凍結乾燥で死滅した細胞も類似量のサイトカインを分泌することが分かった。
【００４６】
〔実施例６〕
ケラチン細胞のコロニー形成能力の比較
１次培養したケラチン細胞ＴＧ００４を３Ｔ３フィーダー上に約１００個接種して１２日間培養した。前記ケラチン細胞の培養液に、凍結乾燥したケラチン細胞または繊維芽細胞を０.５×１０６／ｍＬの濃度で浮遊させて培養培地として使用した。培養が終わった後、１０％のホルマリン溶液を添加して固定し、ローダミンブルー(Rhodamine blue)溶液で染色した。コロニー形成能力(Colony Forming Efficiency：ＣＦＥ)は接種した細胞数対比コロニー形成数の割合で定義した。
【００４７】
コロニー形成能力（ＣＦＥ）％＝コロニー形成数／接種した細胞数×１００
図７に示すように、凍結乾燥した細胞が排除された培養液を使用した場合（対照群）、細胞のコロニー形成能力は３５％であり、ケラチン細胞または繊維芽細胞を含有する培養液を使用した場合はそれぞれ４６％及び４４％とコロニー形成能力を示した。特に、コロニーのサイズは直径３.２ｍｍからそれぞれ８.３ｍｍと７.９ｍｍに増加した。これより、ケラチン細胞または繊維芽細胞を含有する培養液は、ケラチン細胞の増殖と移動に必要なサイトカインを分泌してコロニーの数と大きさの増加を誘導することが分かった。
【００４８】
〔実施例７〕
繊維芽細胞の増殖能力の比較
２４ウェルプレートに０.５×１０５個の繊維芽細胞を１０％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭを用いて培養した。２４時間後、５％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭで取り替えながら、培養液に、０.５×１０５／ｍＬの濃度で凍結乾燥したケラチン細胞または繊維芽細胞を浮遊させた。次に、２４時間培養した後、繊維芽細胞の増殖率はＭＴＴ(tetrazolium salt 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)方法で測定した。具体的に、細胞が成長しているプレートにＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ＰＢＳ）を添加して３７℃の加湿条件で４時間反応させた。培養液を除去した後、１０％のＳＤＳとｐＨ４.７の４５％のdimethyl foramideから構成された溶解用(lysis)溶液を添加した後、１２〜２４時間反応させた。脱水素作用によって黄色の水溶性基質であるＭＴＴテトラゾリウム(tetrazolioum)を、青紫色を呈する非水溶性のＭＴＴFormazon(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)に還元させるミトコンドリアの能力、すなわち細胞の増殖率を５９０ｎｍで吸光度を測定して判断した（図８）。
【００４９】
図８に示すように、ケラチン細胞または繊維芽細胞を含有する培養液を用いて繊維芽細胞を培養した場合、増殖率が２１〜３０％であった。したがって、ケラチン細胞または繊維芽細胞が実施例６と同様にケラチン細胞の増殖だけでなく、繊維芽細胞の増殖も促進させることが分かる。
【００５０】
〔実施例８〕
繊維芽細胞のコラーゲン生成能力の比較
化粧用組成物に含有されたケラチン細胞または繊維芽細胞が、指示細胞の繊維芽細胞が発現する細胞外基質中の一つであるコラーゲンを測定することにより、皮膚再生を促進させることができるか否かを評価した。前述した実施例７と同一の条件で培養し、培養中に収集したならし培地(conditioned medium)５００μｌと１ｍＬのシリウスレッド(Sirius Red)染色試薬を混合した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した（図９）。
【００５１】
図９に示すように、ケラチン細胞または繊維芽細胞が含有されていない培養液（対照群）を用いて培養した場合と比較して、ケラチン細胞または繊維芽細胞を含有する培養液を使用したとき、それぞれ３５.４％と２５.６％のコラーゲン生成増加を示した。
【００５２】
〔実施例９〕
ケラチン細胞及び繊維芽細胞を含有する組成物の安定性
ケラチン細胞から分泌される因子中の一つであるＩＬ−１αの量を実施例５と同様に測定することにより、時間経過に伴って組成物内のケラチン細胞が安定的に蛋白質を分泌して皮膚再生効能を示すことができるか否かを評価した。これは細胞が含有された組成物の効能が維持される期間を判断することが可能な基準を提供することができる（図１０）。
【００５３】
図１０に示すように、ケラチン細胞が含有された組成物において、ＩＬ−１αの分泌量は、８週が経過した時点でも、製造時の分泌量の７０％以上を示し、安定的に維持された。
【００５４】
〔実施例１０〕
ケラチン細胞及び繊維芽細胞を含有する化粧用組成物の製造
本発明に係る化粧用組成物をヒトの皮膚に直接適用し、剤形内に含まれた細胞から分泌されるサイトカインの活性及び安定性を確認するために、先立って得た、凍結乾燥したケラチン細胞及び繊維芽細胞を含有するエセンスに剤形化した。
【００５５】
【表１】
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容器に表１の成分の中でも、Ａグループの成分を投入し、ミキサで混合して水溶液相を作った後、Ｂグループの成分を前記水溶液相に徐々に投入して十分攪拌させて均質にした。Ｃグループの成分は別途の容器でやや加温（５０℃）して均質化させた後、前記Ａ及びＢグループ成分の混合液に徐々に投入しながら攪拌してミセルを形成した。その次の成分Ｄを加えて中和させ、粘度を与える。組成物（Ｂ）の場合にはＥ成分を添加して粘液状のエセンス化粧品を製造した。
【００５６】
〔実施例１１〕
ケラチン細胞と繊維芽細胞を含有する化粧品組成物の皮膚再生実験
アトピー皮膚炎をもっている自願者を対象として、前記実施例１０で製造された組成物（Ａ）または組成物（Ｂ）を４週間塗布して、皮膚がいくら速く再生されるかを角質層の水分保有量及び経皮皮膚水分量を測定することにより確認した。
【００５７】
軽症以上の（すなわち、激しいアトピーではなく軽微なアトピーが皮膚全体にわたって均一に広がっている）アトピー患者と診断された支援者（以下、被験者という）３０名を選定した。本発明に係る化粧品用組成物を塗布するに先立ち、被験者の皮膚を写真撮影し、角質水分量(Skin hydration)及び皮膚水分損失量（ＴＥＷＬ）を測定し、皮膚の外見上の症状を記録した。このような結果より、各被験者から水分損失量及び皮膚水分量が誤差範囲内で類似の値を有する２部位（以下、測定部位という）を選定した。その後、被験者が直接１日２回（朝及び夜）組成物（Ａ）または組成物（Ｂ）を測定部位に適用した。
【００５８】
角質層の水分保有量及び経皮水分蒸発量は、６週間（塗布前、１週、２週、４週、６週（総５回測定））週１回ずつ測定した。測定する前に、測定部位を刺激することなく洗浄(cleansing)し、その後恒温恒湿室（２０℃、湿度５０％）で３０分以上適応させた後測定した。
【００５９】
（ｉ）角質層の水分保有量の測定
測定部位の角質層内の水分含有量は水分測定器(corneometer、Ｃ＆Ｋ)を用いて測定（単位：corneometer units）し、測定値は表２及び図１１に示した。
【００６０】
【表２】
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組成物間の角質層の水分含有量を考察すると、組成物（Ａ）より組成物（Ｂ）を適用した測定部位の水分含有量が高いことを確認することができる。それぞれを考察すると、水分含有量は時間経過に伴って増加することが分かった。反復測定分析した結果、組成物（Ａ）と組成物（Ｂ）との間には角質層の水分含有量に有意的な差があったが（ｐ値＝０.０１１）、各組成物内の時点間には有意的な差がなかった（ｐ値＝０.０９６６４）。統計的に有意的ではないが、水分含有量は０週に比べて時間経過に伴って高くなり、６週の水分含有量は０週に比べて約２３.５％程度増加した。
【００６１】
（ｉｉ）経皮水分蒸発量の測定
測定部位の経皮水分蒸発量は水分蒸発量測定器(tewameter)を用いて測定（単位：ｇ／ｍ２／ｈ）し、測定値は表３及び図１２に示した。
【００６２】
【表３】
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組成物間の経皮水分蒸発量を考察すると、組成物（Ａ）が組成物（Ｂ）より高い水分蒸発量を示すことを確認することができた。組成物（Ｂ）の場合、０週には８.１４であったが、１週には高くなった後、２週からはやや低くなることが分かる。組成物（Ａ）の場合、水分蒸発量は０週には２１.１６であったが、１週には２５.０９に増加し、以後からは段々水分蒸発量が低くなることが分かる。
【００６３】
反復測定分析結果、組成物（Ａ）と組成物（Ｂ）との間には有意的な経皮水分蒸発量に差異があったが（ｐ値＝０.００５５）、各組成物内の時点間には有意的な差異がなかった（ｐ値＝０.４３７３）。統計的に有意的ではないが、０週の水分蒸発量に比べて６週の水分蒸発量は約１３.４％程度減少した。
【００６４】
これらの実施例によって、凍結乾燥したケラチン細胞及び繊維芽細胞は、化粧品用担体に含まれた形態でも迅速な皮膚再生を誘導することができることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、凍結乾燥したケラチン細胞のいずれか一つを含有する化粧用組成物は、長時間にわたって、既に発現されたサイトカインを分泌することにより、皮膚への適用時に持続的な皮膚再生効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】（ａ）および（ｂ）は皮膚組織に由来するケラチン細胞の形態を、それぞれ接種２日及び５日後に位相差倒立顕微鏡を用いて観察した結果を示す図であり、（ｃ）及び（ｄ）は毛嚢に由来するケラチン細胞の形態を、それぞれ接種２日及び５日後に位相差倒立顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は皮膚組織から由来する繊維芽細胞の形態を、それぞれ接種２日及び５日後に位相差倒立顕微鏡を用いて観察した結果を示す図である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ皮膚組織および毛嚢から由来するケラチン細胞の分化有無を三次元培養皮膚モデルにより確認した結果を示す図である。
【図４】培養期間に伴う、ケラチン細胞で発現される蛋白質のパターンを示す図である（レイン１：培養８日目、レイン２：９日目、レイン３：１０日目、レイン４：１０日後に凍結乾燥）。
【図５】培養期間に伴う、繊維芽細胞で発現される蛋白質のパターンを示す図である（レイン１：血清、レイン２〜５：培養培地の蛋白質パターンであって、それぞれ５０、７０、９０、１００％のコンフルアンシ、レイン６〜９：抽出蛋白質の蛋白質パターンであって、それぞれ５０、７０、９０、１００％のコンフルアンシ、レイン１０：マーカ）。
【図６】ケラチン細胞及び繊維芽細胞が凍結乾燥前、後に分泌されるサイトカインの量を比較したグラフである。
【図７】図７はケラチン細胞（ａ）または繊維芽細胞（ｂ）がケラチン細胞の増殖に及ぼす影響をコロニー形成試験によって示す図である。
【図８】図８はケラチン細胞または繊維芽細胞が繊維芽細胞の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
【図９】図９はケラチン細胞または繊維芽細胞が繊維芽細胞のコラーゲン生成に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１０】図１０はケラチン細胞を含有する組成物から分泌されるケラチン細胞のサイトカインの安定性を示すグラフである。
【図１１】図１１はケラチン細胞及び繊維芽細胞を含有する化粧用組成物が角質水分含有量に及ぼす影響を示す図である。
【図１２】図１２はケラチン細胞及び繊維芽細胞を含有する化粧用組成物が経皮水分蒸発量に及ぼす影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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