(57)【要約】【課題】細胞を蛍光発光色素で染色し、蛍光発光色素の蛍光発光輝度値および色素浸透性を計測することを目的とする。【解決手段】細胞を蛍光発光色素で染色し、励起光を照射し蛍光発光させ、目的の波長以外の波長を遮断する受光波長フィルタを有する微生物計測装置で細胞を撮像する。撮像をした画像を輝度測定により蛍光発光点の輝度を測定し、基準の輝度値を境に２値化をして基準値以上の輝度値がある発光点を輝点化し、形状や面積を認識してその発光が細胞か否かを判断し、輝点を計量する。次に取得した画像を図３で示した輝度値解析手段１２により輝点を平坦化１３し、再度２値化１４することにより、肉眼では確認できない輝点を抽出１５する。その抽出１５した画像をヒストグラム１６で、１画面中の輝度値の数を頻度で表し、輝度値の最大ピークを明確にする。これにより細胞に対する蛍光発光色素の蛍光発光輝度値の計測１７が可能となる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を蛍光発光色素で染色し、その染色した細胞に励起光を照射し蛍光発光させることで蛍光発光輝度値と色素浸透性を画像解析手段で数値化し、細胞に対する蛍光発光色素の性能を評価することを特徴とした蛍光発光色素の性能評価方法。
【請求項２】
細胞を蛍光発光色素で染色し、その染色した細胞に励起光を照射し蛍光発光させることで蛍光発光輝度値と色素浸透性を画像解析手段で数値化し、細胞に対する蛍光発光色素の性能を評価し、装置蛍光発光色素が備える吸収波長及び蛍光発光波長の特性に合わせた励起光及び受光波長フィルタを備えることを特徴とした蛍光発光色素の性能評価装置。
【請求項３】
細胞を微多孔膜支持体にろ過し励起光を照射し撮像した後、形状と面積および蛍光発光輝度を、画像解析手段でその細胞を認識させることを特徴とした請求項１記載の蛍光発光色素の性能評価方法。
【請求項４】
励起波長３５０ｎｍ〜４００ｎｍの励起光と受光波長４３０ｎｍ〜５８０ｎｍの受光波長フィルタを備えた請求項２記載の蛍光発光色素の性能評価装置。
【請求項５】
励起波長４３０ｎｍ〜４８５ｎｍの励起光と受光波長５２０ｎｍ〜５６５ｎｍの受光波長フィルタを備えた請求項２または４記載の蛍光発光色素の性能評価装置。
【請求項６】
励起波長４７２ｎｍ〜５４５ｎｍの励起光と受光波長５９０ｎｍ〜６４６ｎｍの受光波長フィルタを備えた請求項２、４または５記載の蛍光発光色素の性能評価装置。
【請求項７】
励起波長５５０ｎｍ〜５７０ｎｍの励起光と受光波長５９０ｎｍ〜６４６ｎｍの受光波長フィルタを備えた請求項２、４、５または６記載の蛍光発光色素の性能評価装置。
【請求項８】
励起波長６３０ｎｍ〜６７０ｎｍの励起光と受光波長６９０ｎｍ以上の受光波長フィルタを備えた請求項２、４、５、６または７記載の蛍光発光色素の性能評価装置。
【請求項９】
請求項２、４、５、６、７または８記載の蛍光発光色素の性能評価装置で得られた蛍光発光輝度値ならびに色素膜浸透性値をヒストグラムで表したことを特徴とする請求項１、または３記載の蛍光発光色素の性能評価方法。
【請求項１０】
ヒストグラムの半値幅が比較的小さい現象を蛍光発光色素が細胞活性に影響しないと判定する請求項１、３または９記載の蛍光発光色素の性能評価方法。
【請求項１１】
性能の良い蛍光発光色素のスクリーニングをするために、測定条件を合わせる手段として励起光の照射時間を調整し、測定後に蛍光発光輝度値を換算する請求項１、３、９または１０記載の蛍光発光色素の性能評価方法。
【請求項１２】
細胞に負荷を与えることで蛍光発光色素の染色性変動が評価できる請求項１、３、９、１０または１１記載の蛍光発光色素の性能評価方法。
【請求項１３】
細胞の経時変化を測定する請求項１、３、９、１０、１１または１２記載の蛍光発光色素の性能評価方法。
【請求項１４】
蛍光発光色素の細胞に対する褪色能を測定する請求項１、３、９、１０、１１、１２または１３記載の蛍光発光色素の性能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を蛍光発光色素で染色し、その染色した細胞に励起光を照射し蛍光発光させることで細胞の部位や個数を認識する蛍光発光色素の性能を評価する方法および評価する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の評価方法で用いられる装置は蛍光分光光度計が主に使われており、蛍光発光色素で被検材料である細胞を染色し、光源として、例えばキセノンランプを用いて被検材料を励起して、蛍光発光色素で標識した細胞が放つ蛍光スペクトルならびに蛍光強度を測定、または細胞内のｐＨならびにカルシウム濃度の測定ができる（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平９−１５９６０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような従来の蛍光分光光度計による蛍光発光色素の測定では、蛍光発光色素についての蛍光発光強度は明確となるものの、細胞に対する蛍光発光色素の膜浸透性が測定できないという課題があり、蛍光発光色素の蛍光発光強度および膜浸透性まで測定できる蛍光発光色素の性能評価方法と蛍光発光測定装置が要求されている。
【０００４】
また、蛍光分光光度計で染色した被検材料である細胞を測定する際、細胞がセル内で固定されていないため、同じ被検材料を再現良く測定できないという課題があり、被検材料を固定して測定できる蛍光発光測定方法が要求されている。
【０００５】
また、蛍光分光光度計で使用されている光源は主にキセノンランプ、ハロゲンランプが採用されているが、非常に高価な光源であり、冷却装置も必要になることから装置の小型化が困難とされている。
【０００６】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、複数の蛍光発光色素を同じ種類の細胞で評価し計数計測することで蛍光発光強度と合わせて膜浸透性についても測定することができ、また、被検材料である細胞を再現性良く同じ検体を測定することができる。また、光源にＬＥＤを採用することにより非常に安価な光源となり、冷却装置も必要としないため、装置の小型化も容易な蛍光発光色素評価方法および装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の蛍光発光色素の評価方法および装置は上記目的を達成するために、細胞を蛍光発光色素で染色し、その染色した細胞に励起光を照射し蛍光発光させることで蛍光発光輝度値と色素浸透性を画像解析手段で数値化し、細胞に対する蛍光発光色素の性能を評価するものである。
【０００８】
これにより蛍光発光色素の細胞に対する蛍光発光輝度値と色素色素浸透性を測定する蛍光発光色素の評価方法が得られる。
【０００９】
また、本発明は、細胞を蛍光発光色素で染色し、その染色した細胞に励起光を照射し蛍光発光させることで蛍光発光輝度値と色素浸透性を画像解析手段で数値化し、細胞に対する蛍光発光色素の性能を評価し、蛍光発光色素が備える吸収波長および蛍光発光波長の特性に合わせた励起光および受光波長フィルタを備えるものである。
【００１０】
これにより、様々な蛍光発光色素に最適な蛍光条件を与えることができる。
【００１１】
また、本発明は細胞を微多孔膜支持体にろ過し励起光を照射し撮像した後、形状と面積および蛍光発光輝度を、画像解析手段でその細胞を認識させるものである。
【００１２】
これにより蛍光発光色素で染色した細胞を固定化することができ、再現性のよい測定が可能となり、また、形状と面積および蛍光発光輝度を認識することにより、染色された細胞と他に存在する夾雑物との差別化が可能となる。
【００１３】
また、本発明は励起波長３５０ｎｍ〜４００ｎｍの励起光と４３０ｎｍ〜５８０ｎｍの受光波長フィルタを備えたものである。
【００１４】
これにより前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる。
【００１５】
また、本発明は励起波長４３０ｎｍ〜４８５ｎｍの励起光と受光波長５２０ｎｍ〜５６５ｎｍの受光波長フィルタを備えたものである。
【００１６】
これにより前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる。
【００１７】
また、本発明は励起波長４７２ｎｍ〜５４５ｎｍの励起光と受光波長５９０ｎｍ〜６４６ｎｍの受光波長フィルタを備えたものである。
【００１８】
これにより前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる。
【００１９】
また、本発明は励起波長５５０ｎｍ〜５７０ｎｍの励起光と受光波長５９０ｎｍ〜６４６ｎｍの受光波長フィルタを備えたものである。
【００２０】
これにより前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる。
【００２１】
また、本発明は励起波長６３０ｎｍ〜６７０ｎｍの励起光と受光波長６９０ｎｍ以上の受光波長フィルタを備えたものである。
【００２２】
これにより前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる。また微生物を計測する場合、生死菌および死菌を染め分ける手段があるが、前期励起波長により短波長励起と組み合わせることで、生死菌および死菌を染め分ける手段を備えたものである。
【００２３】
また、本発明は蛍光発光色素の性能評価装置で得られた蛍光発光輝度値および色素浸透性値をヒストグラムで表したものである。
【００２４】
これにより蛍光発光輝度値がどの波長でピークを示したのが一目で把握でき、円滑な測定が可能となる。
【００２５】
また、本発明はヒストグラムの半値幅が小さい現象を蛍光発光色素が細胞活性に影響しないと判定するものである。
【００２６】
これにより蛍光発光色素のスクリーニングを行なう際、蛍光発光輝度値および色素浸透性で差が出ない場合に半値幅で判断することが可能となる。
【００２７】
また、本発明では性能の良い蛍光発光色素のスクリーニングをするために、測定条件を合わせる手段として励起光の照射時間を調整し、測定後に蛍光発光輝度値を換算するものである。
【００２８】
これにより蛍光発光輝度値の差が大きい蛍光発光色素同士を同じレベルで比較することができ、また、装置の限界を超える性能を持つ蛍光発光色素の評価も可能となる。
【００２９】
また、本発明は細胞に負荷を与えることで蛍光発光色素の染色性変動が評価できるものである。
【００３０】
これにより実使用時を想定した蛍光発光色素の評価が可能となる。
【００３１】
また、本発明では細胞の経時変化を測定できるものである。
【００３２】
これにより経時変化時の細胞に対する蛍光発光色素の性能が把握できる。
【００３３】
また、本発明では蛍光発光色素の細胞に対する褪色能を測定できるものである。
【００３４】
これにより蛍光発光色素の褪色能を評価できる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば蛍光発光色素の蛍光発光輝度値および色素浸透性を評価できる蛍光発光色素の評価方法および装置を提供できる。
【００３６】
また、微多孔膜支持体に被検材料である細胞をろ過することで細胞を固定でき、再現性のよい測定ができる蛍光発光色素の評価方法および装置を提供できる。
【００３７】
また、光源にＬＥＤを採用することにより、光源の寿命を延ばし安価で小型ならびに容易に使用でき、評価に使用するトータルのエネルギーを削減できる蛍光発光色素の評価装置が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明の請求項１記載の発明は、細胞を蛍光発光色素で染色し、その染色した細胞に励起光を照射し蛍光発光させることで蛍光発光輝度値と色素浸透性を画像解析手段で数値化し、細胞に対する蛍光発光色素の性能を評価することとしたものであり、蛍光発光色素の細胞に対する蛍光発光輝度値と色素浸透性を簡単に測定する蛍光発光色素の評価方法が得られるという作用を有する。
【００３９】
また、本発明の請求項２記載の発明は、蛍光発光色素が備える吸収波長および蛍光発光波長の特性に合わせた励起光および受光波長フィルタを備えるというものであり、様々な蛍光発光色素に最適な蛍光条件を与えることにより、蛍光発光色素の特性を生かし自家蛍光物質と区別できる作用を有する。
【００４０】
また、本発明の請求項３記載の発明は細胞を微多孔膜支持体にろ過し励起光を照射し撮像した後、形状と面積および蛍光発光輝度を、画像解析手段でその細胞を認識させるというものであり、蛍光発光色素で染色した細胞を固定化することができ、再現性のよい測定が可能となり、また、形状と面積および蛍光発光輝度を認識することにより、染色された細胞と他に存在する夾雑物との差別化が可能となる作用を有する。
【００４１】
また、本発明の請求項４記載の発明は、励起波長３５０ｎｍ〜４００ｎｍの励起光と４３０ｎｍ〜５８０ｎｍの受光波長フィルタを備えたものであり、前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる作用を有する。
【００４２】
また、本発明の請求項５記載の発明は、励起波長４３０ｎｍ〜４８５ｎｍの励起光と受光波長５２０ｎｍ〜５６５ｎｍの受光波長フィルタを備えたものであり、前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる作用を有する。
【００４３】
また、本発明の請求項６記載の発明は、本発明は励起波長４７２ｎｍ〜５４５ｎｍの励起光と受光波長５９０ｎｍ〜６４６ｎｍの受光波長フィルタを備えたものであり、前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる作用を有する。
【００４４】
また、本発明の請求項７記載の発明は、励起波長５５０ｎｍ〜５７０ｎｍの励起光と受光波長５９０ｎｍ〜６４６ｎｍの受光波長フィルタを備えたものであり、前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能となる作用を有する。
【００４５】
また、本発明の請求項８記載の発明は、励起波長６３０ｎｍ〜６７０ｎｍの励起光と受光波長６９０ｎｍ以上の受光波長フィルタを備えたものであり、前記励起波長以上ならびに前記受光波長以下に属する波長を持つ蛍光発光色素を測定することが可能であり、また微生物を計測する場合、生死菌および死菌を染め分ける手段があるが、前期励起波長により短波長励起と組み合わせることで、生死菌および死菌を染め分ける作用を有する。
【００４６】
また、本発明の請求項９記載の発明は、蛍光発光色素の性能評価装置で得られた蛍光発光輝度値および色素浸透性値をヒストグラムで表したものであり、蛍光発光輝度値がどの波長でピークを示したのが一目で把握でき、円滑な測定が可能となる作用を有する。
【００４７】
また、本発明の請求項１０記載の発明は、ヒストグラムの半値幅が小さい現象を蛍光発光色素が細胞活性に影響しないと判定するものであり、蛍光発光色素のスクリーニングを行なう際、蛍光発光輝度値および色素浸透性で差が出ない場合に半値幅で判断することが可能となる作用を有する。
【００４８】
また、本発明の請求項１１記載の発明は、性能の良い蛍光発光色素のスクリーニングをするために、測定条件を合わせる手段として励起光の照射時間を調整し、測定後に蛍光発光輝度値を換算するものであり、蛍光発光輝度値の差が大きい蛍光発光色素同士を同じレベルで比較することが可能となる作用を有する。
【００４９】
また、本発明の請求項１２記載の発明は、細胞に負荷を与えることで蛍光発光色素の染色性変動が評価できるものであり、実使用時を想定した蛍光発光色素の評価が可能となる作用を有する。
【００５０】
また、本発明の請求項１３記載の発明は、細胞の経時変化を測定できるものであり、経時変化時の細胞に対する蛍光発光色素の性能が把握できる作用を有する。
【００５１】
また、本発明の請求項１４記載の発明は、蛍光発光色素の細胞に対する褪色能を測定できるものであり、蛍光発光色素の褪色能を評価できる作用を有する。
【００５２】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００５３】
（実施の形態）
細胞を蛍光発光色素（例えばＳＹＴＯ１１〜ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２０〜ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０〜ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ５９〜ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０〜ＳＹＴＯ８５、ＤＡＰＩ、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ３、ＳＹＴＯＸＢｌｕｅ、ＳＹＴＯＸＯｒｅｎｇｅ、ＳＹＴＯ９）で染色しその染色した細胞を図１に示した微多孔膜１と押さえリング２とベース３からなる微多孔膜支持体４に被検材料をろ過し、励起光であるＬＥＤ（例えば３５０ｎｍ〜４００ｎｍ、４３０ｎｍ〜４８５ｎｍ、４７２ｎｍ〜５４５ｎｍ、５５０ｎｍ〜５７０ｎｍ、６３０ｎｍ〜６７０ｎｍのものであり、細胞を蛍光発光させる蛍光発光色素に適しているもの）を照射し蛍光発光させ、目的の波長以外の波長を遮断する受光波長フィルタ（例えば４３０ｎｍ〜５８０ｎｍ、５２０ｎｍ〜５６５ｎｍ、５９０ｎｍ〜６４６ｎｍ、５９０ｎｍ〜６４６ｎｍ、６９０ｎｍ以上のものであり、細胞が蛍光発光する波長に適しているもの）を有する微生物計測装置（図示せず）で細胞を撮像する。そして図２に示すように画像解析手段５として、撮像６をした画像を輝度測定７により蛍光発光点の輝度を測定し、基準の輝度値を境に２値化８をして基準値以上の輝度値がある発光点を輝点化し、形状判断９で輝点化された形状の面積を認識してその発光が細胞か否かを判断し、細胞と判断した輝点をカウント１０し計量１１する。これにより画像解析手段５を使用して細胞以外の被検材料中の夾雑物を誤って計測しないようになり、微多孔膜１に捕集された細胞を計量し、細胞に対する蛍光発光色素の色素浸透性を計測することが可能となる。次に取得した画像を図３で示した輝度値解析手段１２により輝点を平坦化１３し再度２値化１４することにより、肉眼では確認できない輝点を抽出１５する。その抽出１５した画像をヒストグラム１６を用いて、１画面中の輝度値の数を頻度で表し、輝度値の最大ピークを明確にする。これにより細胞に対する蛍光発光色素の蛍光発光輝度値の計測１７が可能となる。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
蛍光発光色素のスクリーニングを行なう場合、まず蛍光発光色素の濃度の調整から行なう。蛍光発光色素は有機化合物であるため、希釈溶媒にジメチルスルホキシドを選択した。なお、有機化合物ということですべての蛍光発光色素をジメチルスルホキシドで希釈するわけではない。希釈濃度はメーカー推奨濃度を用い、希釈濃度もメーカー推奨濃度を用いた。次に細胞の数の調整を行なうが、被検材料として微生物を用いた。微生物の数を調整するため希釈溶媒として、被検材料のｐＨの変性により細胞膜に影響を与えないため、ｐＨ７．２りん酸緩衝液を用いた。染色方法はマイクロチューブ内で１０分間染色した。
【００５５】
染色が完了した後、微多孔膜支持体４にろ過し、画像解析手段５ならびに輝度値解析手段１２を踏まえて、図４に蛍光発光色素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇを評価した結果を示す。蛍光発光色素毎の蛍光発光輝度値ならびに色素浸透性を計測ならびに比較し、蛍光発光色素をスクリーニングすることにより、各蛍光発光色素の特徴を把握することが可能である。
【００５６】
（実施例２）
蛍光発光色素の染色性を確認する際、細胞に負荷を与えることで染色性の影響を把握するため、例えば、微生物を計測する場合、専用の容器に希釈溶媒（好ましくは生理食塩水、リン酸緩衝液または蒸留水）で菌数を調整した細胞を７００時間まで放置する手段をとり、０時間〜７００時間の間で微生物をスポット測定し、図５で示すように、時間を経過し様々な状態の細胞膜を有する微生物に対する蛍光発光色素の蛍光発光輝度値ならびに色素浸透性を確認できた。
【００５７】
（実施例３）
被検材料である微生物の細胞膜が損傷した状態を死菌状態と定義しているため有機溶剤（好ましくはエタノール）によって微生物の細胞膜を溶解させた。溶解させた後、前記画像解析手段５および輝度値解析手段１２を用いることで、死菌状態の微生物に対する蛍光発光色素の蛍光発光輝度値および色素浸透性の定量的な計測１７が可能となる。
【００５８】
（実施例４）
また、図６で示すように、蛍光発光色素で染色した細胞を乾燥する条件および環境に放置することで、蛍光発光色素の細胞に対する褪色能の計測が可能となる。なお、蛍光発光色素に与える負荷工程として、蛍光発光色素で染色した細胞を励起光照射下に放置することで、蛍光発光色素の細胞に対する褪色能を計測１７することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
細胞を蛍光発光色素で染色し、画像解析手段と輝度値解析手段を用いて蛍光発光輝度値と色素浸透性を計測しスクリーニングできることにより、製薬分野、研究所分野における蛍光染色法を用いた実験において、細胞を染色できる蛍光発光色素のスクリーニングの用途で適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施の形態１の微多孔膜支持体を示す全体断面図
【図２】本発明の実施の形態１の撮像から計量までの模式図
【図３】本発明の実施の形態１の平坦化から計測までの模式図
【図４】本発明の実施例１の蛍光発光色素スクリーニング結果の図
【図５】本発明の実施例２の細胞に対する蛍光発光色素の経時変化評価図
【図６】本発明の実施例４の細胞に対する蛍光発光色素の褪色経過図
【符号の説明】
【００６１】
１    微多孔膜
２    押さえリング
３    ベース
４    微多孔膜支持体
５    画像解析手段
６    撮像
７    輝度測定
８    ２値化
９    形状判断
１０  カウント
１１  計量
１２  輝度値解析手段
１３  平坦化
１４  ２値化
１５  抽出
１６  ヒストグラム
１７  計測
【図１】
2006194711.tif 000003
【図２】
2006194711.tif 000004
【図３】
2006194711.tif 000005
【図４】
2006194711.tif 000006
【図５】
2006194711.tif 000007
【図６】
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