(57)【要約】【課題】  エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質と、その実施容易で高収率な合成方法とを提供する。【解決手段】  単糖のガラクトサミンであり、又はガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖である糖構造体の前記ガラクトサミンの４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成する反応用原料準備ステップと、上記の反応用原料準備ステップで得られた反応用原料に対してアゾジカルボン酸ジエチル及びトリフェニルホスフィンを反応させた後、トルエン溶媒中、還流下で攪拌と言う条件下で求核剤としての4-メチルウンベリフェロンを反応させる光延反応ステップとを含む、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法。【選択図】          図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖のガラクトサミンであり、又はガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖である糖構造体において、その糖構造体の前記ガラクトサミンに対してα-(1-7)グリコシド結合により4-メチルウンベリフェロンが結合していることを特徴とするエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質。
【請求項２】
前記糖構造体が、ガラクトシルβ(1-3)-N-アセチルガラクトサミンであることを特徴とする請求項１に記載のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質。
【請求項３】
前記糖構造体のガラクトサミンが、その４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成したシリルアセタール構造誘導体であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質
【請求項４】
少なくとも以下の（１）及び（２）のステップを含むことを特徴とするエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法。
（１）単糖のガラクトサミンであり、又はガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖である糖構造体において、その糖構造体の前記ガラクトサミンの４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成する反応用原料準備ステップ。
（２）上記の反応用原料準備ステップで得られた反応用原料に対してアゾジカルボン酸ジエチル（DEAD）及びトリフェニルホスフィン（Ph３P）を反応させた後、トルエン溶媒中、還流下で攪拌と言う条件下で求核剤としての4-メチルウンベリフェロンを反応させる光延反応ステップ。
【請求項５】
前記糖構造体が、エンド -α-N- アセチルガラクトサミンであることを特徴とする請求項４に記載のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法。
【請求項６】
前記光延反応ステップにおいて、光延反応がＳＮ  １型のグリコシル化経路を経由するものであることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法。
【請求項７】
前記反応用原料準備ステップで形成するシリルアセタール構造の保護基がジ-(t-ブチル) シリレン基（DTBS基）であることを特徴とする請求項４〜請求項６のいずれかに記載のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載のα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質を、任意の目的のために、エンド -α- ガラクトサミニダーゼの基質又はリガンドとして用いることを特徴とするエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の利用方法。
【請求項９】
前記α- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の使用が、未知の起源の新規エンド -α- ガラクトサミニダーゼの探索を目的とするものであることを特徴とする請求項８に記載のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法、及びエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドα- ガラクトサミニダーゼは、微生物界で乳酸菌、肺炎双球菌、クロストリジウム属細菌等の広範囲な起源を持つグリコシダーゼである。この酵素は、ムチン型糖タンパク質におけるβ -D-ガラクトース-(1-3)- α-N- アセチル-D-
ガラクトサミン等のＴ−抗原とセリン残基又はスレオニン残基との間のＯ−グリコシド型のα結合を加水分解する。
【０００３】
現在、エンドα- ガラクトサミニダーゼの糖転移反応等への応用が展開されているが、その精製等を有効に行うための高感度基質が提供されていない、と言う問題がある。従来は、そのような目的の基質として、一般的に、単糖のガラクトサミン又は二糖体等の還元末端を構成しているガラクトサミンをα -p-ニトロフェニル（PNP ）化した蛍光基質が使用されているが、加水分解された PNPの蛍光強度が弱いために、感度が不十分であった。
【０００４】
そこで、例えば未知の起源の新規なエンドα- ガラクトサミニダーゼ（とりわけ、エンド−α-N- アセチルガラクトサミニダーゼ）を発見・単離したり、それらを応用した糖転移反応の研究開発を発展させたりする目的のため、より高感度の基質が求められている。
【０００５】
そのような点からは、4-メチルウンベリフェロン（4MU ）が、蛍光強度が高く、非常に微量でも容易に蛍光測定できるので、極めて好適である。しかしながら、一般的に、4MU のようなアリール構造体をα−選択的にグリコシル化することは容易ではない。しかも、酵素がエンド -α-N- アセチルガラクトサミニダーゼである場合、その基質は、アリール N- アセチル- α-D- ガラクトサミニドのようなアリール 1,2- シス−グリコサミニドであるが、このような基質の合成は、N-アセチル基の干渉のために、非常に困難である。
【非特許文献１】Szweda, R., Spohr, U., Lemieux, R. U., SchindlerBishop, D. F., Desnick, R. J., "Synthesis of 4-methylumbelliferylglycosides for the detection of α- and β-D-galactopyranosaminidases"Can. J. Chem., 1989, 67, 1388-1391  上記の非特許文献１において Szweda らは、N-アセチルガラクトサミンを4-メチルウンベリフェリル化したものの合成例を報告している。彼らは、3,4,6-トリ-O- アセチル-2- アジド-2- デオキシ- β-D- ガラクトピラノシル- クロライドと、4MU とを、銀トリフラート-sym- コリジン複合体の存在下に縮合させる方法を行っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記のような隣接基関与を発現しない２アジド糖の準備は手間のかかるプロセスを必要とする。又、実施例で後述するように、本願発明者が Szweda
らの合成方法を追試したところ、目的物の収率は低く、しかも、目的物たる4MU
のα-N- アセチルガラクトシドと Rf 値が近似した副産物を多く生成し、目的物と副産物との分離が容易ではなかった。
【０００７】
更に、 Szweda らは単糖たるN-アセチルガラクトサミンを4MU 化したものであり、Ｔ−抗原等の生理活性物質として重要な２糖類のアリール化ではない。
【０００８】
本発明は、4MU のα- ガラクトサミニドであるエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質を提供すること、特に、ガラクトサミンが還元末端を構成しているオリゴ糖型の高感度基質や、アリール N- アセチル- α-D- ガラクトサミニドのようなアリール 1,2- シス−グリコサミニドである高感度基質を提供すること、及び、これらの高収率で実施が容易な製造方法とを提供することを、解決すべき技術的課題とする。
【０００９】
本願発明者らは、このような技術的課題を解決するために、本願発明者らが最近開発した、ジ−（ｔ−ブチル）−シリレン基〔DTBS基〕を利用する高度にα−選択的なグリコシル化方法（特願２００３−１４４６２２号参照）と、公知の光延反応（ Mitsunobu反応）とを組合わせて応用することを考えた。
【００１０】
その結果、 Szweda らの合成方法とは異なり、上記各種のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質を容易かつ高収率に合成することに成功し、しかもその合成プロセスが予測外の反応経路を伴うと言う新規な知見を得て、本願発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、単糖のガラクトサミンであり、又はガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖である糖構造体において、その糖構造体の前記ガラクトサミンに対してα-(1-7)グリコシド結合により4-メチルウンベリフェロンが結合している、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質である。
【００１２】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る糖構造体がガラクトシルβ(1-3)-N-アセチルガラクトサミンである、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質である。
【００１３】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る糖構造体のガラクトサミンが、その４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成したシリルアセタール構造誘導体である、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質である。
【００１４】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、少なくとも以下の（１）及び（２）のステップを含む、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法である。
【００１５】
（１）単糖のガラクトサミンであり、又はガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖である糖構造体において、その糖構造体の前記ガラクトサミンの４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成する反応用原料準備ステップ。
【００１６】
（２）上記の反応用原料準備ステップで得られた反応用原料に対してアゾジカルボン酸ジエチル（DEAD）及びトリフェニルホスフィン（Ph３P）を反応させた後、トルエン溶媒中、還流下で攪拌と言う条件下で求核剤としての4-メチルウンベリフェロンを反応させる光延反応ステップ。
【００１７】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第４発明に係る糖構造体がエンド -α-N- アセチルガラクトサミンである、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法である。
【００１８】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第４発明又は第５発明に係る光延反応ステップにおいて、光延反応がＳＮ  １型のグリコシル化経路を経由するものである、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法である。
【００１９】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第４発明〜第６発明のいずれかに係る反応用原料準備ステップで形成するシリルアセタール構造の保護基が、ジ-(t-ブチル) シリレン基（DTBS基）である、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法である。
【００２０】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、第１発明〜第３発明のいずれかに係るα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質を、任意の目的のために、エンド -α- ガラクトサミニダーゼの基質又はリガンドとして用いる、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の利用方法である。
【００２１】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第８発明に係るα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の使用が、未知の起源の新規エンド -α- ガラクトサミニダーゼの探索を目的とするものである、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の利用方法である。
【発明の効果】
【００２２】
（第１発明の効果）
本願発明者らは、独自の方法により、アリール化合物である4-メチルウンベリフェロン（4MU ）を、高度にα−選択的に、かつ高収率でガラクトシド化することに成功した。このエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質においては、エンドα- ガラクトサミニダーゼにより加水分解されて分離される4MU の蛍光強度が高く、非常に微量でも容易に蛍光測定できる。そのため、例えば未知の起源の新規なエンドα- ガラクトサミニダーゼの発見・単離、あるいはそれらを応用した糖転移反応の研究開発の発展等の目的に非常に好適に利用できる。
【００２３】
特に、ガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖のガラクトサミンを4MU 化した高感度基質は、前記の非特許文献１で報告された単糖ガラクトサミンの4MU 化ではなく、生理活性物質たるＴ−抗原（β -D-ガラクトース-(1-3)- α-N- アセチル-D- ガラクトサミン）等を包含するオリゴ糖の4MU 化である。従って、例えば癌の発見・診断法を開発すること等をテーマとする研究・開発において、重要な意義を有する。
【００２４】
（第２発明の効果）
第２発明に係る高感度基質は、その糖構造体がガラクトシルβ(1-3)-N-アセチルガラクトサミンであり、エンドα- ガラクトサミニダーゼの内でも特に重要なエンド -α-N- アセチルガラクトサミニダーゼの高感度基質として利用できるものである。しかもこの種の4MU 化高感度基質は、前記したように、従来はN-アセチル基の干渉のために合成が困難であるとされてきたものであり、第２発明に係る高感度基質が提供されたことの技術的意義は大きい。
【００２５】
（第３発明の効果）
第３発明に係る高感度基質は、本来的に、第４発明の合成方法において生成する4MU 化ガラクトサミニド誘導体であるが、その水溶性に難点があるとは言え、その点を例えば適切な界面活性剤との併用等の適宜な手段で解決することができれば、有効なエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質として利用できる可能性がある。そして、この高感度基質は、前記の Szweda らが合成したエンドα-
ガラクトサミニダーゼ用の 4MU化高感度基質からは、全く想定することができない化学構造を持つ基質である。
【００２６】
（第４発明の効果）
第４発明は、ジ−（ｔ−ブチル）−シリレン基〔DTBS基〕を利用する高度にα−選択的なグリコシル化方法と、いわゆる光延反応（ Mitsunobu反応）とを、エンドα- ガラクトサミニダーゼ用の 4MU化高感度基質の合成のために巧妙に組み合わせて応用したものである。DTBS基を利用するα−選択的グリコシル化方法は特願２００３−１４４６２２号を基礎出願とする国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００７１５５に開示され、光延反応については下記の「非特許文献２」に開示されているが、後述する「発明を実施するための最良の形態」欄においてもこれらの内容を具体的に述べる。
【非特許文献２】Oyo Mitsunobu,  "The Use of Diethyl Azodicarboxylateand Triphenylphosphine in Synthesis and Transformation of NaturalProducts", Synthesis, 1-28, 1981  第４発明によって、α- ガラクトサミニダーゼ高感度基質としてのα -4MU 化ガラクトサミニドの合成に関する従来の諸問題を、以下のａ）〜ｃ）に順次述べるように、解決した。
【００２７】
ａ）第４発明の（１）のステップに起因するメリットとして、アリール 1,2-
シス- グリコサミニドである 4MU-1,2- シス- ガラクトサミニドを、N-アセチル基の干渉を生じることなく合成できる。
【００２８】
ｂ）第４発明の合成方法は前記 Szweda らの方法のように２アジド糖のような準備に手間のかかる化合物を利用しないし、実施例で後述するように Szweda らの方法に比較して目的物の収率が著しく高く、しかも目的物との分離が困難な多量の副産物を生成しない。
【００２９】
ｃ） Szweda らとは異なり、単糖たるガラクトース又はN-アセチルガラクトースを4MU 化したものも、オリゴ糖の還元末端たるガラクトース又はN-アセチルガラクトースを4MU 化したものも合成している。
【００３０】
本願発明者は、上記国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００７１５５に開示したDTBS基を利用するα−選択的グリコシル化方法に加え、本願発明の目的が、アリール化合物を水酸基に導入するものであると言う面、及びアリール化合物をアクセプターとしたグリコシル化方法であると言う面を考慮して、第４発明の合成方法を開発したものである。
【００３１】
（第５発明の効果）
前記したように、第４発明に係るエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法においては、アリール 1,2- シス−グリコサミニドを、N-アセチル基の干渉を特段に生じることなく合成できる。従ってこの合成方法は、第５発明のように糖構造体がエンド -α-N- アセチルガラクトサミンである場合に特に好ましく適用することができる。
【００３２】
（第６発明の効果）
前記第４発明に係る光延反応ステップにおいては、光延反応がＳＮ  １型のグリコシル化経路を経由するものであることが判明した。一般的に、光延反応は立体構造（α／β）の転換を伴うと考えられている。しかし本発明の合成方法においては、第４発明の（１）のステップにおけるシリルアセタール構造の保護基形成が契機となって、原料系のα型糖構造体がα型を維持して 4MU化される、と言うユニークな知見が得られた。
【００３３】
（第７発明の効果）
前記第４発明に係る反応用原料準備ステップで形成する保護基は、シリルアセタール構造の保護基である限りにおいて限定されないが、ジ-(t-ブチル) シリレン基（DTBS基）が特に好ましい。
【００３４】
（第８発明の効果）
第１発明〜第３発明に係るα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質は任意の目的及び用途に利用することができるが、例えば、エンド -α-N- アセチルガラクトサミニダーゼを含む各種のエンド -α- ガラクトサミニダーゼの基質又はリガンドとして用いることが好ましい。
【００３５】
（第９発明の効果）
上記第８発明のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の利用方法において、その重要な利用形態の一つとして、第９発明のように、未知の起源の新規エンド -α- ガラクトサミニダーゼの探索を目的とするものが例示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
次に、本願の第１発明〜第９発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において、単に「本発明」と言う時は、関連する各発明を一括して指している。
【００３７】
〔エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質〕
本発明のエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質は、所定の糖構造体のガラクトサミンに対して、α-(1-7)グリコシド結合により下記の「化１」に構造式を示す蛍光物質4-メチルウンベリフェロン（ 4MU）が結合したものである。これらの高感度基質は、エンドα- ガラクトサミニダーゼの作用により加水分解されたとき、 4MUが分離されて強い蛍光強度を示すので、エンドα- ガラクトサミニダーゼの探索や精製のために極めて好適である。
【００３８】
【化１】
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上記の「所定の糖構造体」とは、単糖のガラクトサミン、又はガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖を言う。エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質には、その高感度基質としての機能を阻害しない限りにおいて、上記の糖構造体又は 4MUの任意の位置に任意の置換基、及び／又は、修飾基が導入されたものも含まれる。
【００３９】
エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の代表的な例として、糖構造体がガラクトースの二糖体である、ガラクトシルβ(1-3)-ガラクトサミンが挙げられる。又、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質における糖構造体が単糖のN-アセチルガラクトサミンであり、又はN-アセチルガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖である場合も代表的に例示される。
【００４０】
とりわけ、前記第２発明に示すように、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の糖構造体が二糖体であって、その還元末端がN-アセチルガラクトサミンであるようなガラクトシルβ(1-3)-N-アセチルガラクトサミンである場合（下記の「化２」にその構造式を示す）が、代表的に例示される。このエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質は、いわゆるＴ−抗原をα- 4MU 化したもので、エンド−α-N- アセチルガラクトサミニダーゼの基質となるものであって、非常に有用性が高い。
【００４１】
【化２】
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他にも、例えば下記の「化３」に示すように、糖構造体のガラクトサミンが、その４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成したシリルアセタール構造誘導体であるようなエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質も例示される。「Ac」はアセチル基を示し、、「TrocHN」は 2,2,2-
トリクロロエトキシカルボニル基（Troc基）で保護されたアミノ基を示す。但し、「 AcO」は水酸基であっても良いし「TrocHN」はアミノ基であっても良い。
【００４２】
【化３】
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〔エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法〕
本発明に係るエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の合成方法は、少なくとも以下に述べる反応用原料準備ステップと光延反応ステップとを含む。
【００４３】
反応用原料準備ステップは、単糖のガラクトサミンであり、又はガラクトサミンが還元末端を構成している二糖体以上のオリゴ糖である糖構造体において、その糖構造体の前記ガラクトサミンの４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成するステップである。なお、このステップでは、後述するように、４位と６位の水酸基以外の一定の反応性官能基を予め保護基修飾したり、α- グリコシル結合の形成に備えてガラクトサミンの１位の炭素を活性基で修飾する（例えば、１位の炭素を塩素化する）ことも好ましい。
【００４４】
このステップで用いる糖構造体は、上記の規定に該当する限りにおいて限定されないが、例えば、ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、ガラクトシルβ(1-3)-ガラクトサミン、ガラクトシルβ(1-3)-N-アセチルガラクトサミン等が上げられる。一方、環状に形成するシリルアセタール構造の保護基の種類は限定されないが、ジ-(t-ブチル) シリレン基（DTBS基）が特に好ましい。
【００４５】
光延反応ステップは、反応用原料準備ステップで得られた反応用原料に対し、アゾジカルボン酸ジエチル（DEAD）及びトリフェニルホスフィン（Ph３P）を反応させた後、トルエン溶媒中、還流下で攪拌と言う条件下で求核剤としての4-メチルウンベリフェロン（ 4MU）を反応させるステップである。後述のように、求核剤として 4MUを用いるこの反応では、前記反応用原料準備ステップにおけるシリルアセタール構造の保護基形成（例えばDTBS基による保護）が契機となって、光延反応がＳＮ  １型のグリコシル化経路を経由し、α−グリコシドである反応用原料が、α型を維持したままで、 4MU化される。
【００４６】
〔本発明におけるα−選択的グリコシル化方法〕
国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００７１５５に開示したように、上記の反応用原料準備ステップにおいて糖構造体のガラクトサミンの４位と６位の水酸基にわたってシリルアセタール構造の保護基を環状に形成すると、ドナーとしての糖構造体とアクセプター化合物としての 4MUとの間で、選択的なα-(1-7)グリコシド結合を形成させることができる。
【００４７】
例えば、このα−選択的グリコシル化反応方法は、糖構造体におけるN-アセチルアミノ基のグリコシル化反応への干渉を受けない。そして、同じ観点から提案されてきた従来技術、例えば２−アジド誘導体を利用する方法に比較して極めて簡便な方法である。
【００４８】
糖構造体にシリルアセタール構造の保護基を形成するに当たり、４位と６位の水酸基以外の一定の反応性官能基を予め保護基修飾することが好ましい。予め保護基修飾すべき反応性官能基の種類及び糖構造体における位置は限定されず、必要に応じて適宜に保護基修飾を行えば良いが、糖構造体の２位のアミノ基又は水酸基、３位の水酸基に対する保護基修飾を代表的に例示することができる。
【００４９】
２位のアミノ基に対する保護基としては、例えばアセチル基、トリハロアセチル基、レブリノイル基、フタロイル基、Troc基（2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基）等のアシル系保護基全般を挙げることができる。２位の水酸基に対する保護基としては、アセチル基、モノハロアセチル基、ジハロアセチル基、レブリノイル基、ベンゾイル基、ピバロイル基等のアシル系保護基全般を挙げることができる。３位の水酸基に対する保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基等のアシル系保護基の他、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリール基等のエーテル系保護基を挙げることができる。
【００５０】
上記の各種保護基の内、２位のアミノ基又は水酸基に対する保護基の多くは、通常のグリコシル化反応においては強い隣接基関与を示し、α−選択的なグリコシル化反応に対しては重大な障害になるものであるが、このα−選択的グリコシル化反応方法においては、そのような懸念がない。
【００５１】
〔本発明における光延反応〕
前記の非特許文献２に示された光延反応（ Mitsunobu反応）と呼ばれるものは、一般的に、下記の「化４」に簡単に示すように、光学活性第二級アルコールにアゾジカルボン酸ジエチル（DEAD）及びトリフェニルホスフィン（Ph３P）を反応させた後に安息香酸を反応させると、立体反転を伴って、対応するベンゾイルオキシ誘導体が生成し、これをアルカリ加水分解することにより対応する立体反転したアルコールを得る方法である。
【００５２】
【化４】
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しかし本発明においては、光延反応ステップは、反応用原料準備ステップで得られた反応用原料に対し、アゾジカルボン酸ジエチル（DEAD）及びトリフェニルホスフィン（Ph３P）を反応させた後、トルエン溶媒中、還流下で攪拌と言う条件下で求核剤としての 4MUを反応させることにより、光延反応がＳＮ  １型のグリコシル化経路を経由し、α−グリコシドである反応用原料が、α型を維持したままで 4MU化される。その反応のメカニズムは、実施例において詳しく述べる。
【００５３】
〔エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の利用方法〕
本発明に係るエンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質は、強い蛍光強度を示す 4MUをα−グリコシド結合しているので、エンド -α- ガラクトサミニダーゼの基質又はリガンドとして任意の目的のために使用できる。例えば、未知の起源の新規エンド -α- ガラクトサミニダーゼの探索のために使用できるし、その精製等を有効に行うためにも使用できる。従って、エンドα- ガラクトサミニダーゼの糖転移反応等への応用を展開する上で、非常に有用である。
【００５４】
又、この高感度基質における糖構造体部分がβ -D-ガラクトース-(1-3)- α-N- アセチル-D- ガラクトサミン等のＴ−抗原である場合、その生理作用等の研究にも極めて有用である。
【実施例】
【００５５】
次に、本発明の一実施例を図面に基づいて説明する。本発明の技術的範囲が、この実施例によって限定されないことは言うまでもない。
【００５６】
〔実施例の概要〕
本願発明者らは、 DTBS 効果を利用して、本発明に係るエンド -α- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の、高収率かつ実施容易な合成方法の開発に成功した。ここに、「 DTBS 効果」とは、「ジ-(t-ブチル)-シリレン基（ DTBS 基）効果」の意味であって、糖構造体のガラクトサミンの４位と６位の水酸基にわたって、ジ-(t-ブチル)-シリレン基のようなシリルアセタール構造の保護基を環状に形成することにより、ドナーとしての糖構造体と、アクセプター化合物としての 4MUとの間で選択的にα -グリコシド結合を形成させることができる効果を言う。
【００５７】
得られたエンド -α- ガラクトサミニダーゼ高感度基質は、酵素研究、即ち未知のエンド -α-N- アセチルガラクトサミニダーゼ探索の有用な手段となる。又、このような合成方法を開発する過程で、光延反応条件下において、糖構造体の 4MU化がトリクロロエトキシオキサゾール中間体を経由すると言う興味深い反応経路を取ることを見出した。このことは、ＳＮ  ２型ではなくＳＮ  １型のグリコシル化を経由することを意味すると考えられる。
【００５８】
周知のように、「ＳＮ  １型のグリコシル化」とは、「脱離基が脱離した後に生じるオキソカルベニウムイオンに求核剤としてアクセプターが攻撃すると言う経路を通って進行し、一次の反応速度を示すグリコシル化」を意味している。又、「ＳＮ  ２型のグリコシル化」とは、「脱離基が脱離すると同時に求核剤であるアクセプターが攻撃することによって立体反転を伴って進行し、二次の反応速度を示すグリコシル化」を意味している。
【００５９】
〔実施例１：シリルアセタール構造を持つガラクトース２糖体の調製〕
図１に示すようにして、化合物（７）を調製した。即ち、2-アミノ-2- デオキシ-D- ガラクトサミン（２）から始まる４段階のステップにより、２位のアミノ基をTroc基で保護したチオグリコシド（３）を予め調製した。
【００６０】
上記の「４段階のステップ」は、簡単に述べると以下の各ステップである。
【００６１】
（イ）炭酸水素ナトリウム水溶液中で 2, 2, 2- トリクロロエトキシカルボニルクロライドを作用させることによりアミノ基をTroc基で保護するステップ。
【００６２】
（ロ）無水酢酸、ピリジンを用いて１，３，４，６位の水酸基をアセチル基で保護するステップ。
【００６３】
（ハ）チオフェノール、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を用いて１位のアセチル基をチオフェニルグリコシドに変換するステップ。
【００６４】
（ニ）メタノール中でナトリウムメチラートを作用させることによって３，４，６位のアセチル基を脱保護するステップ。
【００６５】
次に、上記の化合物（３）を、ピリジン中、 DTBS(OTf)２  〔ジ-(t-ブチル)-シリル  ビストリフレート〕で処理することにより、４位と６位の水酸基にわたって酸素を介してジ-(t-ブチル)-シリレン基の環状構造が形成された糖アクセプター（４）を、良好な収率で得た。
【００６６】
続いて、この糖アクセプター（４）をトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホン酸の存在下に、 1,2,3,4,6- ペンタ-O- アセチル- β-D- ガラクトピラノシド（５）とのグリコシル化反応に供し、６４％の収率で２糖体（６）を得た。そして、この２糖体（６）を (CH３)２CO ／ H２O（5/1, v/v）中で NBS（Ｎ−ブロモスクシンイミド）でヘミアセタール化し、 DTBS 効果によって立体選択的にαアノマーたるヘミアセタール（７）を得た。このヘミアセタール（７）に対してVilsmeier 試薬を用い、還元末端のガラクトサミン構造体におけるα−水酸基を塩素化して、対応するクロライド（８）に変換した。
【００６７】
〔比較例１： Szweda らの方法による目的物の合成〕
目的とする化合物は、前記「化３」に示す化合物であり、それは Szweda らの従来技術でも得ることができると思われるので、下記の「化５」に示すように、銀トリフラート -γ- コリジン複合体の存在下でのα- クロライド（８）と市販の 4-MU との反応により、目的とするα -グリコシド（１０）を得た。
【００６８】
【化５】
2006335644.tif 000007
しかし、この反応ではα -グリコシド（１０）の収率は２４％で、かなり低かった。又、加水分解の結果物としてのヘミアセタール（７）が主な副産物として生成し、目的物たるα -グリコシド（１０）と副産物たるヘミアセタール（７）とのシリカゲルクロマトグラフィーによる分離は、両者の Rf 値が近似しているため、かなり困難であった。更に、対応する 4-MU のβ−グリコシドは単離されなかった。この結果は、α -グリコシド（１０）の合成反応が DTBS 効果によってα−選択的に進行したこと、しかしＳＮ  １型反応経路を通らなかったことを示している。
【００６９】
〔実施例３： DTBS 効果を利用した光延反応〕
従来より、アリールグリコシル化に光延反応を適用する試みが多くなされており、本願発明者らも、より有効な 4MU化の手段を見出すため、光延反応を試みた。即ち、下記の表１に示すように、前記クロライド（８）を種々の条件下で光延反応に供した。
【００７０】
【表１】
2006335644.tif 000008
表１において、TPP はトリフェニルホスフィンを、DEADはアゾジカルボン酸ジエチルをそれぞれ示し、「 TPP/DEAD[eq.]」の欄は使用したTPP とDEADの当量比を示す。又「 4-MU[eq.]」の欄は使用した4-MUの当量比を示す。「Solvent 」の欄は使用した溶媒の種類を示し、右端の「Yield 」の欄には、得られた 4-MU-グリコシドのαアノマー：βアノマーの収量比を百分比で示す。なお、Entry １〜３は、いずれも還流下で光延反応を行った。
【００７１】
表１において、例えば、Entry １で溶剤として THF（テトラヒドロフラン）を用いた場合、目的とするα−グリコシド（１０）が４７％の収率で得られたが、この結果は本願発明者らにとっても予測外のことであった。即ち、光延反応は、種々の求核剤のアルコールによって、立体構造（α／β）の転換を伴うアルキル化を行う、応用範囲の広い方法であることが知られている。それにも関わらず、α−グリコシルアルコールの誘導体であるクロライド（８）から立体構造が転換していないα -グリコシド（１０）が優勢に得られた。立体構造の転換によって生成されるβ−グリコシドは、Entry １において、僅かに５％得られただけであった。立体構造に関する根拠は  １Ｈ−ＮＭＲデータに基づいているが、その詳細なデータの提示は省略する。
【００７２】
一方、表１のEntry ２のように、トルエンを溶剤とすることにより、α−グリコシド（１０）の収率を７４％に向上させることができた。更に、Entry ３のように、 4MUの使用量を多くすることによって、α−グリコシド（１０）の収率を８０％まで向上させることができた。これらの結果は、トリクロロエトキシオキサゾールの開環には高い反応温度と多量のプロトンが必要であることを示唆している。
【００７３】
因みに、光延反応における反応温度の設定は使用する基質によって様々であるが、この実施例の反応においては、Entry １では溶剤として THFを使用したので反応温度は６６°Ｃとし、Entry ２、３では、１１１°Ｃとした。下記のように、反応温度がより低温であるEntry １においては反応中間体であるトリクロロエトキシオキサゾールが残存し、反応温度がより高温であるEntry ２、３ではトリクロロエトキシオキサゾールの残存が確認されなかったことから、高い反応温度の必要性が示唆された。
【００７４】
〔実施例４：反応メカニズムの推定〕
Entry １等ではトリクロロエトキシオキサゾール誘導体が単離されるが、これと 4MUとの反応は、「トリクロロエトキシオキサゾールが、グリコシル化反応の中間生成物である」とのストーリーで説明できると考えられる。即ち、図２に示すように、トリクロロエトキシオキサゾール誘導体（図２の化合物９）と 4MUとの混合物は、トルエン中、還流下でアクチベーターなしにカップリング反応し、目的とするα−グリコシド（１０）が高いα選択性を以て得られると共に、βーアイソマーの収率は非常に低い。この結果は、このグリコシル化反応がトリクロロエトキシオキサゾールを中間生成物として進行すること、及び、 4MUがオキサゾール環の開裂のためのプロトン給源であることを証明している。
【００７５】
上記のように、光延反応条件で、主な副産物としてトリクロロエトキシオキサゾール誘導体（９）が得られる。反応過程を薄層クロマトグラフィーでモニタリングすると、この副産物が減少するにつれて、代わりにグリコシドが増加する。このことは、この副産物がグリコシル化反応の中間生成物であり、反応が光延反応の典型的なＳＮ  ２型反応経路を経由せずに進行することを示唆している。
以上の点を考慮すると、図３に示す反応メカニズムが推定される。即ち、まず第１に光延反応によりトリフェニルホスフィンオキサイド（Ｐｈ３  Ｐ＝Ｏ）が排除されて、トリクロロエトキシオキサゾール誘導体（９）が生成する。第２に、高い反応温度と 4MUからのプロトン供給により、トリクロロエトキシオキサゾール誘導体（９）のオキサゾール環が開裂し、遊離のオキソカルベニウムイオンが生成する（図３中、「the oxocarbenium ion stage」と表記する段階）。次に、４位の炭素におけるアキシャル配向の陰性置換基から、オキソカルベニウムイオンへの強い空間透過的な電子供与（ "through-space" electron donation）が、オキソカルベニウム種を安定化させる。
【００７６】
Milijkovic ら（Journal of Organic Chemistry, 1997）によれば、電子リッチなアキシャル配向基は、電子が不足するカチオンに電子を供給することができる。更に Milijkovic らは、アキシャル酸素原子と、対応するオキソカルベニウムイオンとの原子間距離は、アキシャル置換基が電子供与基である場合には小さくなると報告している。
【００７７】
その結果として、 DTBS 基の２つの t- ブチル基がアノマー炭素原子に接近し、 DTBS 基からオキソカルベニウム種へ直接の電子供与が行われることもあるかも知れない。オキソカルベニウム種の強い安定化がＳＮ  １型のグリコシル化経路に導くと考えられる。そして、アノマー位置に接近した嵩高い t- ブチル基が、求核剤としての 4MNのβ側からの攻撃を障害し、α側からの求核攻撃を優勢にするのである。
【００７８】
〔実施例５：エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の取得〕
前記クロライド（８）（40mg, 48.4μmol ）、4MU （68mg, 387 μmol ）、トリフェニルホスフィン（16mg, 63.0μmol ）及びジエチルアゾカルボキシレート（28.0μL, 63.0 μmol ）の無水トルエン（4.3mL ）溶液を、環流下で１０時間加熱した。次に反応液を冷却し、減圧下で濃縮した。残渣をトリクロロメタンで希釈し、続いて NaHCO３  で洗浄し、brine （飽和塩化ナトリウム水溶液）し、乾燥して濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（1:1 EtOAc-Hexane）で精製し、α−グリコシド（１０）を得た（38mg, 80％）。同時に、α−グリコシド（１０）に対応する非晶質のβアノマーが 4mg（9 ％）得られた。
【００７９】
最後に、図４に示すように、前記のα−グリコシド（１０）から図示のａ〜ｃの３ステップを経由してシリルアセタール構造の環状保護基やその他の保護基を外し、α -(1-7) グリコシド結合で4MU 化されたガラクトシルβ(1-3)-N-アセチルガラクトサミン（以下、「 4MU-T-antigen」と言う）を得た。
【００８０】
即ち、図の下半部に「ａ→ｂ」として示すように、 Zn の作用による Troc 保護基の脱保護と、これに続くアセトアミド化で、化合物（１１）が８９％の収率で生成された。次に、図の下半部に「ｂ→ｃ」として示すように TBAHF試薬により 4,6-O-DTBS 基が除去され、全ての水酸基がアセチル化された 4MU-T-antigen（１２）が９５％の収率で得られた。この完全保護体の 4MU-T-antigen（１２）を常法に従い脱アセチル化して、遊離の 4MU-T-antigen（１）を得た。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によって、エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質と、その実施容易で高収率な合成方法とが提供される。本発明は、未知の起源の各種エンドα-
ガラクトサミニダーゼの発見・単離や、それらを応用した糖転移反応の研究開発の発展等に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例における反応プロセスを示す図である。
【００８３】
【図２】実施例における反応プロセスを示す図である。
【００８４】
【図３】実施例における反応メカニズムの推定を示す図である。
【００８５】
【図４】実施例における反応プロセスを示す図である。
【図１】
2006335644.tif 000009
【図２】
2006335644.tif 000010
【図３】
2006335644.tif 000011
【図４】
2006335644.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月4日(2006.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
〔実施例３： DTBS 効果を利用した光延反応〕
従来より、アリールグリコシル化に光延反応を適用する試みが多くなされており、本願発明者らも、より有効な 4MU化の手段を見出すため、光延反応を試みた。即ち、下記の表１に示すように、前記ヘミアセタール（７）を種々の条件下で光延反応に供した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
表１において、例えば、Entry １で溶剤として THF（テトラヒドロフラン）を用いた場合、目的とするα−グリコシド（１０）が４７％の収率で得られたが、この結果は本願発明者らにとっても予測外のことであった。即ち、光延反応は、種々の求核剤のアルコールによって、立体構造（α／β）の転換を伴うアルキル化を行う、応用範囲の広い方法であることが知られている。それにも関わらず、α−グリコシルアルコールの誘導体であるヘミアセタール（７）から立体構造が転換していないα -グリコシド（１０）が優勢に得られた。立体構造の転換によって生成されるβ−グリコシドは、Entry １において、僅かに５％得られただけであった。立体構造に関する根拠は  １Ｈ−ＮＭＲデータに基づいているが、その詳細なデータの提示は省略する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
〔実施例５：エンドα- ガラクトサミニダーゼ高感度基質の取得〕
前記ヘミアセタール（７）（40mg, 48.4μmol ）、4MU （68mg, 387 μmol ）、トリフェニルホスフィン（16mg, 63.0μmol ）及びジエチルアゾカルボキシレート（28.0μL, 63.0 μmol ）の無水トルエン（4.3mL ）溶液を、環流下で１０時間加熱した。次に反応液を冷却し、減圧下で濃縮した。残渣をトリクロロメタンで希釈し、続いて NaHCO３  で洗浄し、brine （飽和塩化ナトリウム水溶液）し、乾燥して濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（1:1 EtOAc-Hexane）で精製し、α−グリコシド（１０）を得た（38mg, 80％）。同時に、α−グリコシド（１０）に対応する非晶質のβアノマーが 4mg（9 ％）得られた。