(57)【要約】  【課題】  酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する新規タンパク質、及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供し、かつ、該新規タンパク質をコードする遺伝子を用いて酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種する方法を提供すること、及び、該酢酸菌を用いて食酢や高濃度の酢酸を効率よく製造する方法を提供すること。  【解決手段】  培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴とする酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法、酢酸菌由来のセンサーキナーゼタンパク質、酢酸菌由来のセンサーキナーゼタンパク質遺伝子、及び上記育種方法により得られる酢酸菌を用いた食酢の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴とする酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項２】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによって発現量を高めることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項３】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項８】
下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項９】
酢酸菌がアセトバクター属、または、グルコンアセトバクター属に属することを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項１０】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸耐性が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法に関し、詳しくは、酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する新規タンパク質、及び該新規タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を用いて培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることによって酢酸耐性の向上した酢酸菌、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの酢酸菌を用いて食酢を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しない、酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００３】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
この内、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、又、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、ＡＬＤＨはアセトアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
上記以外に酢酸発酵能を向上させる遺伝子として、アコニターゼ遺伝子（例えば、特許文献３参照）、アルコール脱水素酵素（例えば、特許文献４参照）、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと相同性のある遺伝子（例えば、特許文献５参照）、グルコシルセラミド合成酵素（例えば、特許文献６参照）、ＡＢＣトランスポーター遺伝子と相同性のある遺伝子（例えば、特許文献７参照）などが知られており、これらの遺伝子を過剰発現させることにより、酢酸菌の酢酸耐性が向上することを見出されているが、いずれも不十分であった。
このような実情から、より高い酢酸耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開平２−２３６４号公報
【特許文献２】特開平０３−２１９８７８号公報
【特許文献３】特開２００３−２８９８６７号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００４／０８１２１６号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ０３／０７８６３５号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００４／０５３１２２号公報
【特許文献７】特開２００３−２８９８６８号公報
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）」、１７２巻、ｐ．２０９６−２１０４、１９９０年
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」、７６巻、ｐ．２７０−２７５、１９９３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、酢酸菌の酢酸耐性を増強する機能を有する新規タンパク質、及び該新規タンパク質をコードする遺伝子を提供し、かつ、該新規タンパク質をコードする遺伝子を用いて酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種する方法を提供することを目的とするものである。
また本発明は、該酢酸菌を用いて食酢や高濃度の酢酸を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成すべく、従来とは別の観点で、酢酸菌の酢酸耐性を向上させる手段を検討することとした。その過程で、本発明者は、これまで検討されていなかった酢酸菌のセンサーキナーゼタンパク質を利用することに着目した。
一般に遺伝子の発現に係わる転写制御は、その遺伝子の転写開始点における制御とは別に、温度やｐＨなどの各種の培養ストレスに応答するセンサーキナーゼタンパク質とそれによってリン酸化され活性化されるレスポンスレギュレータータンパク質によって構成される２成分系と呼ばれる転写制御系が知られており、この系によって複数の遺伝子の転写が同時に制御されることが大腸菌等で明らかにされている。
しかし、酢酸菌では２成分系と呼ばれる転写制御系の存在は知られていなかった。
【０００８】
そこで、本発明者は、酢酸菌の２成分系、特に、酢酸発酵に特徴的な酢酸ストレスに応答してそれ自体の転写量が変動する２成分系タンパク質の中に、酢酸耐性を向上させる複数の遺伝子の転写を制御する機能を有するものが存在し、その２成分系自体の発現量を制御することにより、酢酸ストレスに応答して酢酸耐性を向上させる複数の遺伝子の転写制御を同時に行うことができ、その結果、従来以上に酢酸菌の酢酸耐性を向上させることができるのではないかと考えた。
さらに、２成分系を構成するセンサーキナーゼタンパク質とレスポンスレギュレータータンパク質のうち、酢酸ストレスを最初に感知する役割を担うセンサーキナーゼタンパク質がより重要と考えた。
【０００９】
一般にセンサーキナーゼタンパク質は、そのアミノ酸配列の中に、機能ドメインとしてリン酸化される部位とＡＴＰを結合する部位を有することが知られている。
そこで、本発明者は、上記の特徴的なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を鋭意探索し、培地に酢酸を添加した場合にそれ自体の転写量が増大する遺伝子を見出した。
さらに、見出した培地の酢酸に応答して転写量が増大した遺伝子をプラスミドベクターと連結し、酢酸菌に導入し、形質転換された酢酸菌の酢酸を含む培地での生育の有無を比較することで酢酸耐性を調べたところ、酢酸耐性の向上が認められた。
さらに該微生物を使用してアルコールを含有する培地で培養することにより、酢酸の生成速度や蓄積できる酢酸濃度が高まり、酢酸発酵能が向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）から（１０）からなる。
（１）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴とする酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（２）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによって発現量を高めることを特徴とする上記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【００１１】
（３）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
（４）培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする上記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１３】
（５）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
（６）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１５】
（７）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１６】
（８）下記の（ａ）または（ｂ）に示す、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【００１７】
（９）酢酸菌がアセトバクター属、または、グルコンアセトバクター属に属することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（１０）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、酢酸菌に対して、酢酸耐性を増強する機能を有する新規なセンサーキナーゼタンパク質、及び、該タンパク質をコードする遺伝子が提供される。
また、該センサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴する酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法が提供される。
本発明によれば、酢酸菌に対して、酢酸存在下での生育能を高めることができる。そして、酢酸に対する耐性が顕著に向上する。その結果、培地中での酢酸発酵速度の向上や高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法は、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めることを特徴とする。
ここで、センサーキナーゼタンパク質とは、センサーキナーゼタンパク質、すなわち、一般にヒスチジンキナーゼと呼ばれるタンパク質を指す。このセンサーキナーゼタンパク質は、該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列中に、センサーキナーゼタンパク質の機能ドメインであるリン酸化部位とＡＴＰ結合部位とが存在していることが特徴である。
また、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するとは、酢酸菌を、酢酸の存在しない培地を用いた培養中において、該培地中に酢酸を添加して更に培養を継続した場合に、あるタンパク質をコードする遺伝子の転写量が、酢酸添加前と比較して増大することを意味する。このような転写量の増大は、ノザン解析や定量的ＰＣＲ法などの一般的な方法によって検出することができる。
【００２０】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質の具体例としては、下記の２種類を挙げることができる。
第一の例としては、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列のうち、２５７番目から３２４番目のアミノ酸の部位には、上述したようにセンサーキナーゼタンパク質に特有のリン酸化部位が存在し、３６４番目から４６５番目のアミノ酸の部位には、ＡＴＰ結合部位が存在する。
第二の例としては、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するタンパク質のうち、２５３番目から３２０番目のアミノ酸の部位には、上述したようなセンサーキナーゼタンパク質に特有のリン酸化部位が存在し、３５９番目から４６０番目のアミノ酸の部位には、ＡＴＰ結合部位が存在する。
【００２１】
また、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質としては、該タンパク質を構成するアミノ酸配列そのものを有するものでなくとも、タンパク質の本来の活性が損なわれない限り、該配列のうち１または複数の位置で１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
すなわち、上記第一の例に関して言えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質も、実質的に同一のタンパク質と言うことができる。
また、上記第二の例に関して言えば、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質も、上記のタンパク質と実質的に同一のタンパク質と言うことができる。
【００２２】
本発明の育種方法においては、上記のような培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を利用する。
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子としては、該タンパク質を構成するアミノ酸配列に対応する塩基配列そのものをコーディング領域として含むＤＮＡの他、該塩基配列を有するものでなくとも、タンパク質の本来の活性が損なわれない限り、からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても良い。
【００２３】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子としては、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質の具体例として既に示した、２種類のタンパク質それぞれをコードする遺伝子を挙げることができる。
すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質として示される、培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第一のセンサーキナーゼタンパク質と、（ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または（ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質として示される、培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第二のセンサーキナーゼタンパク質のそれぞれをコードする遺伝子である。
【００２４】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第一のセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡである。配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７部分は、コーディング領域であり、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の領域に対応するものである。
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡのうち、塩基番号１１３〜１５０７部分がコードするタンパク質（すなわち、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）について、アミノ酸レベルでの相同性検索を行った結果、大腸菌の浸透圧センサータンパク質ｅｎｖＺとの間で僅か２８％の相同性を示すに過ぎなかった。また、上記ｅｎｖＺタンパク質について、酢酸の存在により転写量が変化するとの知見はない。このことから、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ｅｎｖＺ遺伝子とは別の遺伝子を構成するものと考えられる。
【００２５】
また、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、上記のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡと言うことができる。
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００２６】
配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡで構成されるセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）や、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）などの酢酸菌から、一般的な方法で容易に調製することができる。また、人工的に合成することも可能である。
【００２７】
培地中の酢酸に応答して転写量が増大する第二のセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、より具体的には、（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６部分は、コーディング領域であり、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列の領域に対応するものである。
配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡのうち、塩基番号１０７〜１４８６部分がコードするタンパク質（すなわち、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）について、アミノ酸レベルでの相同性検索を行った結果、大腸菌の浸透圧センサータンパク質ｅｎｖＺとの間で僅か３７％の相同性を示すに過ぎなかった。また、上記ｅｎｖＺタンパク質について、酢酸の存在により転写量が変化するとの知見はない。このことから、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ｅｎｖＺ遺伝子とは別の遺伝子を構成するものと考えられる。
【００２８】
また、（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、上記のＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡと言うことができる。
ストリンジェントな条件については、上記第一のセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子に関して述べたのと同様である。
【００２９】
配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡで構成されるセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）などの酢酸菌から、一般的な方法で容易に調製することができる。また、人工的に合成することも可能である。
【００３０】
本発明の育種方法において、上記のような培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高める手段としては、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることができる。
【００３１】
細胞内、すなわち酢酸菌（元株）に導入される対象である培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子については、既に例示した２種類の遺伝子、すなわち、（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡ、または（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、もしくは、（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡ、または（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を挙げることができる。
【００３２】
本発明の育種方法において、上記のような、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めるためには、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子を、細胞内に導入して発現させることができる。例えば、上記遺伝子の変異株の取得、該遺伝子の細胞内コピー数の増幅、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いた酢酸菌の形質転換によることができる。
上記遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、上記遺伝子を保持するマルチコピーベクターを酢酸菌、例えばアセトバクター属またはグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、上記遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をグルコンアセトバクター属やアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００３３】
組換えＤＮＡを用いる場合の遺伝子の取得は、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子として、前記した２種類のいずれかを用いる場合には、その塩基配列が明らかであるので、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、酢酸菌、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（「トレンズ・オブ・ジェネティックス（Trends Genet．）」、５巻、１８５頁、１９８９年）によることができる。ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ２４００などを用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用して、定法に従って行なうことができる。
また、上記塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡライブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。
【００３４】
本発明においては、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子として、前記したように、実際のタンパク質のアミノ酸配列とは相違するが実質的に同一の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、配列表の配列番号２または４記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いることもできるが、このようなＤＮＡは、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位でアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加または逆位が生ずるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００３５】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１１３〜１５０７からなるＤＮＡまたは配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち塩基番号１０７〜１４８６からなるＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもグルコンアセトバクター属やアセトバクター属に属する酢酸菌の種、株、変異処理してなるまたは自然変異処理してなる変異体、変種から得ることが可能である。
【００３６】
上述の遺伝子を保持させるために使用するマルチコピーベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Cellulose）」、ｐ．１５３−１５８、１９８９年参照）、ｐＭＶ２４（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl．Environ．Microbiol．）」、５５巻、ｐ．１７１−１７６、１９８９年参照）、ｐＧＩ１８（例えば、本願明細書製造例１参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられる。また、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９、１９８８年参照）も用いることができる。また、トランスポゾン、例えばＭｕやＩＳ１４５２などを用いることもできる。
細胞内コピー数の増幅対象であるＤＮＡは、上記したような培地中の酢酸に応答して転写量が増大するセンサーキナーゼタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡであれば、特に起源は問わないが、酢酸菌での発現が容易である点で、酢酸菌由来の遺伝子が特に好ましい。
【００３７】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、４９巻、ｐ．２０９１、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（例えば、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）等によって行なうことができる。
【００３８】
ベクターにＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の酵素遺伝子をコードするＤＮＡは、そのＤＮＡがコードする遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３９】
また、染色体ＤＮＡ上の、酵素遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えるには、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。
【００４０】
相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。このようにして微生物における内因性の酵素遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該酵素遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
アセトバクター属（Acetobacter）の細菌として、具体的にはアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株などを用いることができる。
【００４１】
グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）の細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス  ＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス  ＡＴＣＣ４９０３７（Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037）株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）としてはアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）を用いることができる。
【００４２】
本発明者らは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片をグルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）に導入して発現させてなる形質転換株グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pHIK1）株を得て、該形質転換株の酢酸耐性が飛躍的に向上していることを確認した。このグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pHIK1）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２２７である。
また、本発明者らは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片をアセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に導入して発現させてなる形質転換株アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023/pHIK2）株を得て、該形質転換株の酢酸耐性が飛躍的に向上していることを確認した。このアセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023/pHIK2）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２２８である。
【００４３】
本発明の育種方法により、酢酸耐性が選択的に増強された酢酸菌を得ることができ、該酢酸菌、特にアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であって、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができる。本発明は、このような食酢の製造方法をも提供するものである。
【００４４】
本発明の製造方法において、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生産蓄積せしめるには、酢酸発酵を行えば良く、その条件は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様とすることができる。
アルコールを含有する培地としては、酢酸発酵に使用する培地を利用することができ、例えば、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００４５】
また、培養は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は２５〜３７℃の範囲で、通常２７〜３２℃で行う。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
【実施例】
【００４６】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（製造例１）大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の作製
酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８は、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の約３．１ｋｂのプラスミドｐＧＩ１とｐＵＣ１８とから作製した。
すなわち、アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の培養液より、菌体を集菌し、水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
【００４７】
得られたプラスミドは、ＨｉｎｃＩＩで３ヶ所、また、ＳｆｉＩで１ヶ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１００塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位は有していなかった。
このプラスミドをｐＧＩ１と命名し、ベクターｐＧＩ１８の作製に用いた。
上記で得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、ＡａｔＩＩで切断した。この断片をｐＵＣ１８の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＧＩ１８を作製した（図１）。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。即ち、鋳型としてプラスミドｐＧＩ１を用い、プライマーとして制限酵素ＡａｔＩＩ認識部位を有するプライマーＡ（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）及びプライマーＢ（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）を用い、下記のＰＣＲ条件にて、ＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００４８】
図１に示すように、得られたプラスミドｐＧＩ１８はｐＵＣ１８及びｐＧＩ１のいずれも含有していて、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。
このプラスミドｐＧＩ１８の塩基配列を配列表の配列番号７に示した。
【００４９】
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）からの配列表の配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の調製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の一種であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。
【００５０】
得られた菌体から、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離を行ないＤＮＡを含む沈殿物を得た。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）およびプライマー２（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法によって配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００５１】
（実施例２）アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）からの配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片の調製
アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）を、ＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて３６時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。
【００５２】
得られた菌体から、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後、遠心分離を行ないＤＮＡを含む沈殿物を得た。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー３（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）およびプライマー４（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００５３】
（実施例３）実施例１で得られたＤＮＡ断片の、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）における酢酸添加時の転写量解析
（１）ＲＮＡの調製
アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、２．５Ｌの原料培地（酢酸７％、エタノール３％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）にて、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行った。菌体の明らかな増殖が認められ、残留エタノール濃度が２％になった段階で、エタノール含有液（酢酸１％、エタノール５０％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）を流加し、発酵液のエタノール濃度が２％になるように制御した培養を行ない、培養液中の酢酸濃度が６％になった時点で、最終濃度が１２％となるように酢酸を添加し、添加直前、添加後７．５分、添加後１５分の培養液からそれぞれ全ＲＮＡを抽出した。
全ＲＮＡの調製は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、付属のマニュアルに従って行った。
【００５４】
（２）プローブの調製
実施例１にてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）から調製した配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とし、また、プライマー５（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）及びプライマー６（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）をプライマーとし、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて、ＰＣＲを、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  ３分を1サイクルとして、３０サイクルの条件で実施した。
得られたＰＣＲ産物とＤＩＧ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い、添付のマニュアルに従ってプローブを調製した。
【００５５】
（３）転写解析
（１）で調製された全ＲＮＡの電気泳動、及びナイロンメンブレンへのトランスファーは、バイオ実験イラストレイテッド（２）遺伝子解析の基礎（中山広樹・西方敬人著、１９９５年、秀潤社）に従って行った。また、ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティック社製）を用い、添付のマニュアルに従って行った。
遺伝子の転写量の検出には、ＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（富士写真フイルム株式会社製）を使用し、得られた画像から該遺伝子の転写量をＩｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ（富士写真フイルム社製）を用いて数値化し、酢酸添加直前の転写量に対する酢酸添加後（７．５分及び１５分）の転写量の比を計算した。
酢酸添加前後における転写量の変動を、表１に示す。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
表１に示すように、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片の転写量は、培地への酢酸添加後７．５分において添加前の７．０倍に、添加後１５分において添加前の２．４倍に増大することが確認できた。
このことから、配列表の配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡ断片は、培地中の酢酸に応答して転写量が増大するタンパク質をコードする遺伝子であることが明らかとなった。
【００５８】
（実施例４）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来の配列表の配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡで形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例１にてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）から調製した、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製したＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
【００５９】
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。
得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＨＩＫ１を得た。
【００６０】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＨＩＫ１を用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）参照）によって形質転換した。
【００６１】
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株であるグルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８／ｐＨＩＫ１（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pHIK1）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２２７である。
【００６２】
上記のようにして得られたプラスミドｐＨＩＫ１を保有するアンピシリン耐性の形質転換株（以下、ｐＨＩＫ１形質転換株と称する。）について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株（グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株）と比較した。
具体的には、酢酸２％、及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。培養開始時、培養３６時間目、及び培養６０時間目の結果を、表２に示す。
【００６３】
【表２】
2006230260.tif 000003
【００６４】
その結果、表２に示すように、２％酢酸を添加した培地でｐＨＩＫ１形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。このことから、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡを細胞内に導入して発現させることによって、酢酸菌の酢酸培地での生育を促進し、酢酸耐性を向上させることができることが確認できた。
【００６５】
（実施例５）アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）から調製した配列表の配列番号３記載の塩基配列を有する遺伝子で形質転換したアセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例２でアセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）から調製した配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製したＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地中で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。
得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＨＩＫ２を得た。
【００６６】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得たｐＨＩＫ２を用いてアセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）を、エレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４（１９９０年）参照」）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株のうち、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３／ｐＨＩＫ２（Acetobacter aceti No.1023/pHIK2）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月９日付で寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２２８である。
【００６７】
上記のようにして得られたプラスミドｐＨＩＫ２を保有するアンピシリン耐性の形質転換株（以下、ｐＨＩＫ２形質転換株と称する。）について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株（アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株）と比較した。
具体的には、酢酸１．５％、及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。培養開始時、培養４８時間目、及び培養６９時間目の結果を、表３に示す。
【００６８】
【表３】
2006230260.tif 000004
【００６９】
その結果、表３に示すように、１．５％酢酸を添加した培地でｐＨＩＫ２形質転換株は旺盛に増殖したのに対して、元株はほとんど増殖しなかった。このことから、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡを細胞内に導入して発現させることによって、酢酸菌の酢酸培地での生育を促進し、酢酸耐性を向上させることができることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ｐＧＩ１８の構築図及び制限酵素地図を示した図である。
【符号の説明】
【００７１】
図１中、「Ａａｔ  ＩＩ」及び「Ｓｆｉ  Ｉ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」、「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」はプラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｌｂｐ」及び「５．８ｌｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
【図１】
2006230260.tif 000005
【配列表】
2006230260000001.app