(57)【要約】【課題】拒絶反応を生じることが無く、しかも、注入された繊維芽細胞の生長が良好となるような皮下注入用の充填材料の提供。【解決手段】生体（例えば患者）から切除した皮膚片から培養した繊維芽細胞（３１）と、繊維芽細胞生長のための立体的な構造（マトリックス：「足場」）を提供する基材（３４）とを組成物として包含する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から切除した皮膚片から培養した繊維芽細胞と、繊維芽細胞生長のための立体的な構造を提供する基材とを組成物として包含することを特徴とする充填材料。
【請求項２】
前記基材として、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、多血小板血漿、ＣＭＣの何れかから選択される請求項１の充填材料。
【請求項３】
前記繊維芽細胞は、ケーシングの内部に培地を充填し、係る培地には、培養しようとする皮膚細胞を有する生体から採取した血液が加えられている培養装置で培養された繊維芽細胞を用いる請求項１、２の何れかの充填材料。
【請求項４】
前記培養装置のケーシングの底部には、高分子材料製のシートが敷き詰められている請求項３の充填材料。
【請求項５】
前記繊維芽細胞と前記基材との比率が１：４〜４：１である請求項１〜４の何れか１項の充填材料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚に形成された凹部（例えば、傷、シワ、事故等により陥没した箇所）を充填材料を皮下注入することにより修復する技術に関する。より詳細には、係る技術で用いられる充填材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、生体の皮膚に何等かの理由で凹部（傷、シワ、事故による陥没等）が発生した場合に、当該凹部が形成される以前の状態に復元或いは修復することは、医療分野、特に美容を主目的とする施術（シワの線を取る、事故等で凹んだ箇所の修復）では、非常に意義がある。
【０００３】
その様な施術を行うために、人工皮膚（例えば、特許文献１）を用いて行うことが考えられる。
しかし、生体に人工皮膚の様な人造物を取り込むことは、拒絶反応を惹起する可能性があり、好ましくはない。
また、人工皮膚や皮膚移植等の手法は、熱傷等で広範囲に皮膚が損傷された場合にそれを補填するのが目的であり、皮膚が持つ外界からの防御隔離機能、細菌感染や水分の維持、局所免疫等が欠損した場合に対処するものである。従って、シワや事故等による凹部の様に、皮膚の下の弾性繊維に欠損が生じた場合に対処することを本来的にはターゲットとしてはいない。
【０００４】
これに対して、近年、皮膚の凹部の修復を目的とする生体（患者）の皮膚の細胞を培養し、培養された皮膚細胞を上述した様な凹部に充填して、当該凹部を周辺と同一のレベルまで盛り上げて修復する技術（いわゆる「再移植」）が行われている。
係る技術であれば、再移植後に拒絶反応の問題が発生せず、皮膚下方の弾性繊維の欠損に対処するのに好都合である。
【０００５】
ここで、皮膚の細胞、特に繊維芽細胞は、生長のために「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）を必要とする。換言すれば、係る立体的な構造を提供せずに、繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入しても、注入された繊維芽細胞は十分に生長しない。
【０００６】
しかし、従来の最移植技術では、係る「足場」については全く考慮されておらず、従って、皮膚の細胞（特に繊維芽細胞）を患者（生体）内に注入しても、十分に生長せず、上述した様な凹部の修復の効果が十分に得られない、という問題があった。
或いは、凹部が修復しても、注入された細胞が生長せずに死滅してしまう可能性も存在した。
【０００７】
この様な問題を生じない様な皮下注入用の充填材料が望まれているが、現状では、その様な充填材料は未だに提案されていない。
【０００８】
【特許文献】
特開２００１−１０４３４６号
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上述した従来技術の問題点に鑑みて提案されたものであり、拒絶反応を生じることが無く、しかも、注入された繊維芽細胞の生長が良好となるような皮下注入用の充填材料の提供を目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の皮下注入用の充填材料は、生体（例えば患者）から切除した皮膚片から培養した繊維芽細胞（３１）と、繊維芽細胞生長のための立体的な構造（マトリックス：「足場」）を提供する基材（３４）とを組成物として包含することを特徴としている（請求項１）。
ここで、前記繊維芽細胞と前記基材との比率が１：４〜４：１であるのが好ましい（請求項４）。
【００１１】
上述した様な構成を具備する本発明の充填材料によれば、組成物である繊維芽細胞は、生体（例えば患者）から切除した皮膚片から培養したものであるため、拒絶反応の心配が無い。
そして、組成物として包含されている基材が繊維芽細胞生長のための立体的な構造（マトリックス：「足場」）を提供するので、充填材料中の組成物である繊維芽細胞は、生体（患者）内に再移植された際に、順調に生長し、弾性繊維であるコラーゲンを産生する。
注入された繊維芽細胞自体が寿命が来たとしても、分裂して新しく別の繊維芽細胞を再生する。従って、再移植された修復箇所が変形すること無く、再移植箇所周辺のその他の部位と同一レベルの状態を維持することが出来る。
【００１２】
ここで、前記基材として、Ｈｅｓｐａｎｄｅｒ（ヘスパンダー：商品名：杏林製薬株式会社の製品）／Ｄｅｘｔｒａｎ（デキストラン：商品名：大塚製薬株式会社の製品）、コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、フィブリン（Ｆｉｂｒｉｎ）、多血小板血漿（ＰＲＰ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ）、ＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：カルボキシ・メチル・セルロース）の何れかから選択されることが好ましい（請求項２）。
【００１３】
本発明の実施に際して、前記繊維芽細胞は、ケーシング（例えばガラスや合成樹脂製の市販のシャーレ：２０）の内部に培地（哺乳類細胞培養基本培地２４：例えばＤＭＥＭ）を充填し、係る培地には、培養しようとする皮膚細胞を有する生体から採取した血液（自己血２６）が加えられている（培地と、生体から採取した血液とが混合されている）培養装置で培養された繊維芽細胞を用いることが好ましい（請求項３）。
培地としては市販の哺乳類細胞培養基本培地が適用できる。
【００１４】
係る構成を採用すれば、従来の培地には添加することが不可能であった血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が、培養装置内に提供されるので、再生力が旺盛な繊維芽細胞は、極めて良く生長し、増殖する。
そして、培養しようとする皮膚細胞（繊維芽細胞）を有する生体から採取した血液（自己血）を培地に加えているので、他の生体の血液や他の動物（牛等）の血液経由で感染する可能性は、完全に排除される。
なお、培地（２４）に対する血液（自己血２６）の比率は、４％〜５０％であるのが好ましい。培地（２４）に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が少な過ぎると、血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が不足してしまう。一方、培地（２４）に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が多すぎる場合には、相対的に培地（２４）の量が少なくなり、培地中に含まれる皮膚細胞の培養に必要な幾つかの栄養素、例えばアミノ酸や糖質等の液体栄養素、が不足してしまう。
係る理由により、培地（２４）に対する血液（自己血２６）の上述した比率（４％〜５０％）が好ましい。
【００１５】
ここで、前記培養装置は、温度が約３７℃で且つ約５％の二酸化炭素を含有する雰囲気に載置されるのが好ましい。生体内の環境に近い雰囲気下で培養されるので、繊維芽細胞の増殖する条件が整うからである。
【００１６】
さらに、前記培養装置のケーシング（シャーレ２０）の底部には、高分子材料（例えば、フィブリン）製のシートが敷き詰められていることが好ましい（請求項４）。
繊維芽細胞が増殖して、培地の下方に伸長しても、高分子材料性のシート（例えばフィブリンシート）を貫通して、ケーシング（シャーレ２０）底部に付着することはないので、培養した細胞は、培養装置から極めて容易に回収されるからである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
上述した様に、皮膚に生じた凹部を充填する施術（美容目的の施術：例えば、シワの線を取る、事故等で凹んだ箇所の修復）を行うに際しては、拒絶反応等の不都合が生じないため、係る施術を行う患者自身の皮膚の細胞で当該凹部を充填することが望ましい。
係る見地より、当該施術を行う患者の皮膚の細胞を培養する必要がある。
【００１９】
皮膚の細胞を培養するに際して、図１で示す様に、当該施術を行う患者の耳Ｙの後ろの部分（耳Ｙと髪の毛の生え際Ｈとの間：図１では符号１２で示す）から３ｍｍ四方の皮膚片（図１では符号１０で示す）を採取或いは切除する。
当該皮膚片１０は、真皮層を含む様に採取（或いは切除）される。後述する様に、真皮層から培養により遊走する繊維芽細胞を単離するためである。
【００２０】
ここで、当該皮膚片１０を採取する箇所として「耳Ｙの後ろの部分」（１２）としたのは、通常、紫外線の影響を受けない箇所であるため、繊維芽細胞を含む皮膚の細胞の状態が良好に保たれている箇所だからである。それと同時に、皮膚片を採取した跡（傷）が目立たない部分だからである。
換言すれば、紫外線の影響を受けず、繊維芽細胞を含む皮膚の細胞の状態が良好に保たれている箇所であって、皮膚片を採取した跡（傷）が目立たない部分であれば、耳Ｙの後ろの部分以外の箇所から、３ｍｍ四方の皮膚片１０を採取しても良い。
【００２１】
ここで、余りに多量の皮膚を採取してしまうと、採取した跡が患者に残存してしまう可能性がある。また、上述した耳Ｙの後ろの部分からは、あまりに大きな皮膚片を採取することは不可能である。従って、採取する皮膚片１０の面積を必要以上に大きくすることは出来ない。
一方、皮膚片にある程度の大きさが無いと、後述する前処理を行って培養を行う際に、十分な量の繊維芽細胞が確保出来なくなる可能性がある。
以上の理由により、採取するべき皮膚片１０を「３ｍｍ四方」とした。しかしながら、上述の理由に基き、大き過ぎず且つ小さ過ぎない範囲であれば、採取するべき皮膚片のサイズは「３ｍｍ四方」に限定するものではない。
【００２２】
次に、採取（切除）した皮膚片１０を、図２で示す様な手順にて、前処理を行う。
先ず、採取された皮膚片１０を洗浄液（ＲＩＮＳＥ液）２０ｍｌ中で２回洗浄する（図２：ステップＳ１）。
皮膚片１０に付着した異物、特に外皮に付着した異物を洗浄して除去するためである。
このＲＩＮＳＥ液は、皮膚片が乾燥して細胞が死滅してしまうのを防止するために添加されている。但し、ＲＩＮＳＥ液の量が多過ぎると、処理するべき皮膚片がＲＩＮＳＥ液に沈んでしまい、処理が難しくなる。係る見地により、「６０ｍｍのディシュ」に対して「３ｍｌ」というＲＩＮＳＥ液の量を設定した。
なお、処理作業が短時間であれば、生理食塩水を代用することが可能であるが、長時間に亘る作業の際には、栄養素を包含するＲＩＮＳＥ液の使用が好適である。
【００２３】
ここで洗浄液（ＲＩＮＳＥ液）は、皮膚片の洗浄のために調整された液体であり、浸透圧とミネラル組成が、採取された皮膚片の細胞と合致する様に調整されている。
当該ＲＩＮＳＥ液をケース・バイ・ケースで調整することが出来るが、市販品を用いることも可能である。
【００２４】
ステップＳ１において、ＲＩＮＳＥ液の量「２０ｍｌ」は、採取された皮膚片１０に付着した異物を洗浄除去するのに必要且つ十分な量として例示された量である。余り少な過ぎると皮膚片１０を十分に洗浄することが出来なくなる。但し、余りに使用量を増加すると、洗浄の対象である皮膚片１０が３ｍｍ四方という微小なサイズであるため、不経済である。
但し、皮膚片１０を十分に洗浄して付着物を除去することが出来て、しかも、不経済とならない程度の量であれば、ＲＩＮＳＥ液の量は２０ｍｌに限定されるものではない。
【００２５】
洗浄後、ＲＩＮＳＥ液３ｍｌの入った内径６０ｍｍのディシュに、洗浄により付着物が除去された皮膚片１０を移動する（ステップＳ２）。
【００２６】
そして、手術用のメス等を用いて、洗浄された皮膚片１０を、直径１ｍｍ程度の細片に切断する（ステップＳ３）。
皮膚片を細切後、ＲＩＮＳＥ液と共に細切された皮膚片を他の容器（例えば、容量５０ｍｌのｓｅｒｕｍ  ｔｕｂｅ）に移し、１０ｍｌピペットでピペッティングする（ステップＳ４）。
【００２７】
そして、遠心分離機（図示せず）で、１０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行う（ステップＳ５）。当該遠心分離が終了したならば、上清を捨てて、新しいＲＩＮＳＥ液１０ｍｌを入れて（ステップＳ６）、再度、遠心分離機にかけて、１０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行う（ステップＳ７）。
【００２８】
ステップＳ５〜Ｓ７で示す工程は、ステップＳ３で手術用メスにより細断された皮膚片を回収するために行われる。
細断された皮膚片は、ＲＩＮＳＥ液中に点在しているので、そのままでは回収が困難である。しかし、テップＳ５〜Ｓ７で示す工程で遠心分離を行えば、細断された皮膚片はＲＩＮＳＥ液その他から分離され、極めて容易に回収される。
【００２９】
ここで、３ｍｍ四方の皮膚片１０を洗浄後、直ちに培地で培養せずに、直径１ｍｍ程度の細片に細断して回収するのは、３ｍｍ四方の皮膚片１０を培地上に設置して培養する場合に比較して、直径１ｍｍ程度の皮膚細片を（後述する様に）培地上に分散させる方が真皮層の細胞における自由度が大きく、繊維芽細胞が遊走する可能性が高くなるからである。
【００３０】
ステップＳ７の遠心分離が終了したならば、ＲＩＮＳＥ液３ｍｌを細胞を含むペレットに添加し（ステップＳ８）、細胞培養用のシャーレに細胞を含むペレットとＲＩＮＳＥ液の全量を移す（ステップＳ９）。細胞培養用のシャーレについては、詳細に後述する。
これで、前処理が完了する。
【００３１】
ステップＳ９が行われて前処理が完了したならば、温度３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で２日以上静置し、その後、２週間以上、シャーレ内の細胞を無菌培養する（ステップＳ１０）。ここで、ステップＳ１０は既に細胞を培養する段階であり、前処理とは言い得ない。その意味で、図２において、ステップＳ１０には括弧を付するのみで、四角い枠で囲まれているステップＳ１〜Ｓ９とは明確に異なって表現されている。
【００３２】
ここで、回収された皮膚細片が移された細胞培養用のシャーレ（培養装置）について、図３を参照して説明する。
断面図として表現されている図３において、全体を符号２０で示すシャーレ２０の底部には、高分子材料（例えばフィブリン、コラーゲン、多血小板血漿、ＣＭＣ等）２２から成る層が形成されており、高分子材料２２の層上に皮膚細片３０が載置されている。
そして、細胞培養用の培地（哺乳類細胞培養基本培地：以下、本明細書では、単に、「培地」と記載する）２４と、図１で示す工程で皮膚片１０を採取した患者自身の血液（自己血）２６とが分離不能に混合された混合物２５が、皮膚細片３０が載置されている高分子材料２２の層から上方の領域に充填されている。自己血２６はヘパリン採血した血清成分だけなので、凝固することは無い。
ここで、培地２４と自己血２６とを混合するに際して、培地２４に対する自己血２６の比率は、４％〜５０％である。
なお、図３において、符号２７は、遊走している繊維芽細胞を示す。
【００３３】
そして、温度が３７℃、５％ＣＯ２という雰囲気（図２のステップＳ１０に関連して説明）下で２日以上静置し、その後、２週間以上、シャーレ内の細胞を無菌培養する。その結果、皮膚細片３０の真皮層から繊維芽細胞が遊走する。
２日以上静置するのは、繊維芽細胞が遊離して足場を固めて落ち着くようにするためであり、「２週間」という期間は、繊維芽細胞の培養に最低限必要である。係る培養期間の最中は、最低でも１週間に２回、好ましくは毎日、上記混合物２５を新鮮なものに交換する。
ここで、増殖するのは繊維芽細胞のみである。表皮細胞や真皮成分が仮に混入していても、この条件下で生存し且つ増殖するだけの活性は持たない。従って、繊維芽細胞のみが培養、増殖する。
【００３４】
繊維芽細胞は増殖能力が高く、各臓器の実質細胞の間に介在する間質組織を構成し、紡錘型をしており、間葉系由来の（将来的に間質細胞となる）細胞であり、主にコラーゲンたんぱく質を産出する。
【００３５】
繊維芽細胞は分化して繊維細胞になるが、通常、繊維芽細胞及び繊維細胞は混在しており、何れもコラーゲン繊維を作り、分泌する。
繊維芽細胞の生体内での機能としては、間質組織の修復や維持であり、そして、傷や炎症の修復過程では旺盛に増殖し、コラーゲンやプロテオグリカン等の弾性繊維を作り出して、修復や生態の防衛反応に応答する。
そして、繊維芽細胞は、それが生存すれば、その場に留まってコラーゲンの供給源となるものである。
係る性質は、上述した施術、すなわち皮膚に生じた凹部を充填する施術（美容目的の施術：例えば、シワの線を取る、事故等で凹んだ箇所の修復）に好都合である。
【００３６】
ここで、培地２４は、皮膚細胞の培養に必要な幾つかの栄養素を含んでいる。具体的には、アミノ酸や糖質等の液体栄養素を包含する。
しかし、従来の培地２４には、血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）は、包含されていない。
そのため、自己血２６が充填されているのである。
換言すれば、培地２４、自己血２６の何れか一方のみでは、皮膚細胞（繊維芽細胞）の培養に必要な条件は充足しない。
【００３７】
培地２４としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：インビトロジェン株式会社発売：市販品）を使用した。
ここで、表１に、使用可能な培地ＤＭＥＭの組成を示す。
表１
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【００３８】
但し、グルコースの量、アミノ酸（特にグルタミン酸）の量、ビタミン、ミネラル等、培地の組成が繊維芽細胞の条件に合致していれば、ＤＭＥＭ以外の培地、例えばＭＥＭ（インビトロジェン株式会社発売：市販品）、ＲＰＭ１１６４０（インビトロジェン株式会社発売：市販品）、ＨＡＮＫＳ（インビトロジェン株式会社発売：市販品）等を使用することも可能である。
【００３９】
発明者は、図示の実施形態に加えて、培地（ＤＭＥＭ）のみで培養した場合と、自己血のみで培養した場合についても、実験した。
係る実験の結果と、図３で示す様に培地２４に自己血２６を加えて繊維芽細胞を培養した場合とを比較して、以下の表１で示す。
表２
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【００４０】
表２から明らかな様に、培地２４に自己血２６を加えた（図３参照）場合における繊維芽細胞の培養結果が極めて良好であるのに対して、培地２４のみ、或いは自己血２６のみでは、繊維芽細胞の培養は失敗している。
【００４１】
自己血２６を用いることにより、培養される皮膚細細片を構成する細胞が、拒絶反応等を起こすという不都合を防止することが出来る。また、増殖した繊維芽細胞が、血液を媒介とする各種感染症等の各種病気（或いは、その病原体）に感染してしまうことも防止できる。
さらに、自己血２６を用いる結果として、従来の牛の血清を用いて培養する手法とは異なり、いわゆる「狂牛病」（ＢＳＥ）感染の恐れが皆無となる。
【００４２】
自己血２６の量は、１０ｍｌで十分であることが、発明者の過去における実験結果より分かっている。自己血２６の量は、１０ｍｌ以下でも良い場合があるが、繊維芽細胞の培養中に、たんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が不足する事態を未然に防止するため、１０ｍｌの自己血２６を用いる。
【００４３】
図２のステップＳ１０を参照して上述した様に、図３で示す様なシャーレ２０は、温度３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下（人間の生体内の環境と類似した雰囲気）で２日以上静置し、その後、約２週間、無菌培養される。
無菌培養されている間に、皮膚細片３０の繊維芽細胞が分裂し増殖して、真皮層から遊走する。
【００４４】
ここで、繊維芽細胞が分裂、増殖すると、下方に延びて（いわゆる「脚を伸ばした」状態）、シャーレ２０の底部まで到達する。そして、さらに分裂、増殖すると、培養された繊維芽細胞をシャーレ２０から回収する際に、当該培養された繊維芽細胞が、シャーレ２０の底部に付着して、そこから外れなくなってしまう。そして、係る事態が生じて培養した繊維芽細胞が回収できなくなった場合や、シャーレ２０の底部に付着した繊維芽細胞を無理に外した際に繊維芽細胞を破壊してしまった場合には、長時間をかけて培養した繊維芽細胞を有効利用することが出来なくなってしまう。
そのため、従来は係る事態になった場合は、酵素（トリプシン、リガーゼ）を用いて、培養された繊維芽細胞をシャーレの底部から剥がしていた。しかし、前記酵素を用いた処理を行うために、多大な労力を費やさなければならなかった。
【００４５】
これに対して、図示の実施形態では、図３で示す様に、シャーレ２０の底部には高分子材料（例えばフィブリンシート）２２から成る層が形成されている。増殖した繊維芽細胞が下方に生長して、高分子材料（例えばフィブリンシート）２２から成る層の上に付着する。下方に生長した繊維芽細胞が高分子材料２２の層を貫通することは殆ど無い。
従って、図３で示す容器において、増殖して下方へ生長した繊維芽細胞がシャーレ２０の底部に付着することによる不都合は防止される。
【００４６】
その結果、増殖した繊維芽細胞はシャーレ２０から容易に剥離して、回収することが出来る。
表３に、シャーレ２０の底部にフィブリンシート２２を敷き詰めた場合における（増殖した）繊維芽細胞の回収結果と、シャーレ２０に直接培地２４を充填し、フィブリンシート２２を敷き詰めなかった場合における回収結果とを、比較して示す。
【００４７】
表３において、「回収率」は、繊維芽細胞を培養したシャーレを、フィブリンシートを敷き詰めたものとフィブリンシートを有していないものとを、それぞれ２０個用意して、肉眼で判別できる範囲で培養した繊維芽細胞を回収できたシャーレの個数を、全シャーレ数（２０個）に対する百分率で表現したものである。
同様に、「潰れた細胞の比率」は、繊維芽細胞が底壁や側壁に付着して剥離、回収できなかったシャーレの個数を、全シャーレ数（２０個）に対する百分率で表現している。
表３
2006230418.tif 000005
表３から明らかな様に、フィブリンシートを有している方が、細胞を潰さずに回収することが出来る。
【００４８】
次に、高分子材料２２から成る層を、いわゆる「フィブリンシート」で形成する態様について、説明する。
図３において、シャーレ２０の底部にフィブリンシート２２（高分子材料）の層を作成するには、自己血から採取したフィブリンをシャーレ２０の底へ膜状に敷き詰め、フィブリンシートとして作成するのである。
【００４９】
具体的には、１０ｍｌの自己血を凝固させ、凝固した自己血を遠心分離によって回収する。ここで、「１０ｍｌ」という数値は、必要且つ十分と思われる数値として例示したものであり、限定的な意味は有さない。
回収された（凝固した）自己血を注射器の中に入れ、注射針から押し出すことにより物理的に破砕する。
その状態で、シャーレの底に敷き詰めれば、シャーレの底部にフィブリンシート２２の層が形成される。
【００５０】
この様な手法でフィブリンシート２２を形成する場合、フィブリンシート作成のために凝固させる自己血の量は、実験的に、１０ｍｌで十分なことが判明している。すなわち、皮膚片を採取した患者の自己血は、前述した培養用に必要な１０ｍｌと合わせて、合計で２０ｍｌが採血される。
なお、培地２４と共に培養に用いられる自己血２６（図３）については、凝固させない様に「ヘパリン採血」を行う。
【００５１】
次に、フィブリンシート作成の他の形態を説明する。
皮膚片を採取した患者の血液を採決し、採血後２〜３時間経過して凝固が始まった段階で、遠心分離にかける。採血された血液の凝固した塊（凝固塊）が下方に沈降したならば、上方にある凝固していない成分を培地（例えば、一般的なアミノ酸等の栄養培地）上に撒く。
【００５２】
前記「凝固していない成分」は、大部分が血清であり、血漿、その他少量の白血球、血小板、赤血球をふくんでおり、血清中には未だに凝固していない成分（フィブリンを含む）が、必要且つ十分な量だけ残存している。
従って、前記「凝固していない成分」を培地上に撒けば、前記「凝固していない成分」に包含されているフィブリンの残存量が培地上で徐々に凝固して、薄い膜、すなわちフィブリンシートが形成されるのである。
そして、この様に形成されたフィブリンシートを、図３で示す様に、シャーレ２０の底部に敷き詰めれば良いのである。
【００５３】
（皮膚細片３０の）繊維芽細胞の培養は、細胞数が１０００万個程度から１億個程度に増殖するまで行われる。しかし、増殖した細胞数は、培養期間を決定するための厳密な条件ではない。細胞数のオーダーが一桁違っても、容量的には殆ど変化がないからである。
なお、培養当初は、繊維芽細胞は数１００個程度であり、この数１００個の繊維芽細胞が遊離して、上述した細胞数になるまで十分に増殖してから、生体（皮膚片を採取した患者）に戻される。
【００５４】
すなわち、培養或いは増殖された繊維芽細胞は、図３で示す様なシャーレ２０から、患者の傷やシワ、事故等で凹んだ箇所の皮下に注入される。注入された繊維芽細胞は、注入された箇所で生長し、コラーゲンを産生して、患者の傷やシワ、その他の凹んだ箇所を修復する。
【００５５】
ここで、繊維芽細胞が生長するためには、患者（生体）内に注入された後においても、「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）を必要とする。換言すれば、係る立体的な構造を提供せずに、繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入しても、注入された繊維芽細胞は十分に生長せず、コラーゲン産生量も少なくなってしまう。
【００５６】
そのため、培養された繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入する以前に、繊維芽細胞生育のための立体的な構造（マトリックス）を提供するための基材と混合する。
使用する基材は次の通りである。
（１）  Ｈｅｓｐａｎｄｅｒ（商品名：杏林製薬株式会社の製品）／Ｄｅｘｔｒａｎ（商品名：大塚製薬株式会社の製品）
（２）  コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）或いはヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）
（３）  フィブリン（Ｆｉｂｒｉｎ）
（４）  ＰＲＰ（多血小板血漿：Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ）
（５）  ＣＭＣ（Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）
【００５７】
上記（１）の「Ｈｅｓｐａｎｄｅｒ／Ｄｅｘｔｒａｎ」は、浸透圧が血液と同等以上に設定されているもので、代用血漿として市販されている。使用の際には、繊維芽細胞生育のための栄養素として市販のアミノ酸製剤、例えばモリプロン（ｍｏｒｉｐｒｏｎ：商品名：味の素フォルマ株式会社の製品）、ハイプレアミン（Ｈｙ―ｐｌｅａｍｉｎ：商品名：扶桑薬品工業株式会社の製品）等を混合して使用することが好ましい。
【００５８】
上記（２）のコラーゲン或いはヒアルロン酸は、シワへの注入に用いられている一般的な注入剤である。繊維芽細胞が増殖しなくても、一次的に抗シワ効果が得られるという利点を有する。
従来技術で用いられているものは動物由来であるため、感染症、その他の病原体による汚染を防止する十分な処理が必須であった。これに対して、本発明においても繊維芽細胞がコラーゲンを産生するが、患者自身の繊維芽細胞を患者自身の血液（自己血）で培養しており、そのようにして増殖した繊維芽細胞が産生したコラーゲンであるため、「感染症、その他の病原体による汚染」の恐れが無い。
【００５９】
上記（３）のフィブリン、特に患者の自己血から生成したフィブリンは、基材として最適である。
【００６０】
上記（４）のＰＲＰは、自己血中に含まれる血小板及び血小板由来の成長因子を多量に含む血漿である。
血小板が産生する増殖因子により、繊維芽細胞の分裂、増殖が助長されるので、ＰＲＰを基材とすれば、注入材自体が繊維芽細胞の増殖に良好な環境を提供することが出来る、という利点を有している。
【００６１】
なお、上記項目（５）のＣＭＣは、例えば豊胸術で用いられる素材である。生体との馴染みが良いというメリットを有する。
【００６２】
次に、上述した様に培養された繊維芽細胞と、上述の基材とを用いて、生体に再移植する場合について、図４〜図９を参照して説明する。
上述した基材を培養された繊維芽細胞と混合するに際して、図４で示す様に、シャーレ２０内で培養された繊維芽細胞３１を、ピペットや注射器等の器具４０で吸引する。その際に、図３で示す様に、シャーレ２０の底部にはフィブリンシートが敷き詰められているので、繊維芽細胞３０はシャーレの底部に付着すること無く、シャーレ２０から容易に剥離して、器具４０内に吸引される。
【００６３】
器具４０に吸引された繊維芽細胞は、図５で示す様に、試験管等の振とう用容器４２内に移される。容器４２には、さらに、上述した基材３４が、ピペットや注射器等の器具４４により、投入される。
繊維芽細胞と基材との比率は、１：４〜４：１程度まで可能であり、例えば１：１で混合することが出来る。但し、これは基材の種類やその他の条件により変動する。例えば、ヒアルロン酸の様に粘調な基材の混合量は、少なくて済む。
【００６４】
ここで、図４で示す段階において、培養された繊維芽細胞３０と共に、シャーレ３０底部に敷き詰められたフィブリンシート（図３の符号２２：図４では図示せず）も器具４０で吸引される場合には、基材３４を容器４４へ新たに投入する必要はない。
フィブリンシートを構成するフィブリン自体が、（上述した様に）基材として極めて有効に作用するため、器具４０で吸引されたフィブリンシートを繊維芽細胞３０と共に容器４４へ投入すれば足りるからである。
【００６５】
繊維芽細胞３０及び基材３４（フィブリンシートの場合を含む）が投入された後、容器４２は、図６で示す様に、人手ＨＨにより振とうされる。
ここで、振とう機等の機械を使用しないのは、機械による振とうでは、繊維芽細胞が潰れてしまうおそれが存在するためである。勿論、細胞が潰れない程度の低速の振とうが可能であり、衛生面での配慮が十分に為され、且つ、人手ＨＨで行うよりも労力が低減できるのであれば、機械による振とうを行っても良い。
【００６６】
図６で示す工程により振とうされた基材（或いはマトリックス）及び繊維芽細胞、換言すれば繊維芽細胞と基材との混合物は、充填材料５０として、注射器４６に吸入される（図７）。
そして図８で示す様に、繊維芽細胞と基材との混合物である充填材料５０は、生体の皮膚Ｓ上に生じた凹部５５（例えば、傷、シワ、事故による欠損部等）の下方の領域（皮下部分）へ注入される。
【００６７】
充填材料５０を皮下注入した結果、皮膚Ｓ上の凹部（図９において、点線で示す凹部５５Ｂ）は、図９において符号５５Ａで示す様に、皮膚Ｓ上のその他の部位と同一レベルまで盛り上がり、修復される。
充填材料５０の組成物として皮下に注入された繊維芽細胞は、基材が存在するため、注入された箇所でも順調に成長し、弾性繊維であるコラーゲンを産生する。そのため、注入された繊維芽細胞自体が寿命を迎えたとしても、分裂して別の繊維芽細胞を再生し、コラーゲンの産生が継続される。そして、修復箇所５５Ａは皮膚Ｓ上のその他の部位と同一レベルの状態を維持する。
【００６８】
ここで、図７〜図９で示す生体への再移植は、培養された繊維芽細胞をシャーレ２０から取り出して（或いは回収して：図４の工程）から所定の時間内（６時間以内）に、好ましくは混合した直後に、注射器４６により、生体の所定箇所（きず、シワ、凹部、その他）の皮下へ注入され、充填される（図８）。
シャーレ２０（の培地２４）から回収された状態の繊維芽細胞は、（自己血を加えた培地２４上とは異なり）必要な栄養素が供給されている状態でなくなるため、培地２４から回収すると細胞活性が衰えてしまう。したがって、生体内に戻された繊維芽細胞が十分に成育して機能するためには、培地２４から回収された後、生体内に戻されるまでの時間が短ければ短い程、好都合である。
【００６９】
発明者等の実験によれば、自己血２６を加えた培地２４で培養された繊維芽細胞は、培地から回収された後、６時間以上経過すると、生体内に戻された後に成長するのに必要な細胞活性が失われた。
【００７０】
但し、基材としてフィブリンやＰＲＰを使用する場合には、係る基材は細胞が増殖するための好条件を提供することが出来るため、細胞活性の劣化を減衰して、培地から繊維芽細胞を回収した後、生体内に戻すまでの臨界時間を長くすることが可能である。
係る臨界時間に関する実験結果を表４で示す。
【００７１】
表４は、繊維芽細胞が培地から回収後、必要な活性を失うまでの時間を比較して示している。
表４
2006230418.tif 000006
【００７２】
表４で示す実験結果から明らかな様に、基材としてコラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン或いはＰＲＰを用いれば、繊維芽細胞を培地から回収後、必要な活性を失うまでの時間を長期化することが出来る。
従って、培地から回収された繊維芽細胞の保存も容易となる。
【００７３】
培地から回収された繊維芽細胞と基材との混合物は、冷凍保存することが可能である。すなわち、培養された繊維芽細胞、自己血から得られた細胞保存用の血清、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド：Ｄｉｍｅｔｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、フィブリンシート（基材）とを混合し、液体窒素により急速冷凍すれば、その状態で冷凍保存が可能となる。
【００７４】
自己血から得られた細胞保存用の血清は、血清に「非働化」という操作を加えることにより得られる。「非働化」という操作は、血清を例えば５５℃で３０分加熱する操作であり、係る操作により、細胞増殖を抑制する因子（例えばＴＧＦ−ｂｅｔａ等）を不活性化して、血清中の成分を栄養素としての利用効率を高めることが出来る。
冷凍保存に際しては、保存用の血清１０％、培地、ＤＭＳＯ１０％の保存液中に増殖した繊維芽細胞を入れて、１分間に１℃ずつ冷やして、最終的には液体窒素中に保存するのである。
【００７５】
なお、ＤＭＳＯに代えて、グリセリン（ｇｒｙｃｅｒｉｎ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ）や、ＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｅｔｈｙｌ  Ｓｔａｒｃｈ）を使用することも可能である。
【００７６】
足場となる基材と混合されて生体内の所定箇所に注入された後、繊維芽細胞は順調に生育して、増殖すると共に、コラーゲンを産生して、傷やシワ、怪我で生じた凹部等の内部空間を充填し、係る傷、シワ、凹部が出来る以前の（生体の）状態に修復するのである。
【００７７】
図３の符号２２で示す高分子シート（例えばフィブリンシート）を使用しない場合には、遊走してきた繊維芽細胞は、培地と自己血との混合物中に沈み込んで、シャーレ２０の底部に張り付き、足場を固めながら生育する。
所定の培養期間が経過したならば、シャーレ２０から培地と自己血との混合物中を吸引して廃棄し、繊維芽細胞が乾燥しないうちに直ちにＲＩＮＳＥ液で洗浄して、酵素トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ：商品名「トリプシンレコンビナント」としてＲｏｃｈｅ社が製造、販売）を、直径が１０ｃｍのシャーレ２０であれば２５ｍｇ程度添加し、１０℃〜３７℃で１０〜２０分保温すれば、当該酵素の作用により、繊維芽細胞はシャーレ２０の底部から剥離する。
なお、トリプシンは長時間作用させると細胞毒性が出てくるので、必要最小限に使用する。例えば、シャーレの底部から繊維芽細胞を剥がすタイミングについては、温度や時間をパラメータとせずに、顕微鏡で観察しながら、繊維芽細胞が丸くなったならば、シャーレの底部から剥離する。
【００７８】
剥離した繊維芽細胞をピペットでトリプシンごと吸引して回収し、遠心分離機で８００ｒｐｍで５分間回転する。遠心分離機にかければ、繊維芽細胞は沈降するので、トリプシンとは分離される。沈降した繊維芽細胞を回収して、新たな培地に溶いで均等に拡散させる（混濁：約５〜１０ｍｌ）。新たに培地で混濁された繊維芽細胞は、例えば１０枚の別のシャーレへ撒くことによって、相対的な濃度を調整し、増殖した細胞を回収すれば、１０倍に増殖させることが出来る。
以下、回収、遠心分離、混濁、複数の別のシャーレで培養、という上記手順を繰り返して、所定数の繊維芽細胞を得る。
【００７９】
図４〜図９を参照して上述した実施形態において、高分子シート２２上で培養された細胞が、回収する際に注射器の針を通らず、回収が困難となってしまう場合が存在する。上述した様に、トリプシンを用いれば回収することは可能であるが、出来る限りトリプシンは使用したくないという要請が存在する。
係る場合に対処するには、例えば、高分子シート２２を、低温感受性ポリマーにすれば良い。以下、図１０〜図１２を参照して、低温感受性ポリマーを高分子シート２２にした場合について、説明する。
【００８０】
図３で示す様な状態で培養した結果、図１０で示す様に高分子シート２２の表面全域に亘って繊維芽細胞２７が増殖したのであれば、シャーレ２０が配置されている雰囲気温度を３７℃から３２℃まで降温する。
雰囲気温度を３２℃まで降温すると、低温感受性ポリマーの特性に基いて、図１１で示す様に、繊維芽細胞２７のシート２２に対する付着状態が解除され、培養された繊維芽細胞は、培地と自己血の混合物２５（液相）中を浮上する。
図１１では、シート２２から剥離して浮上した繊維芽細胞は符号２７Ａで示されている。
【００８１】
そして、図１２で示す様に、増殖した繊維芽細胞の全量が低温感受性ポリマーのシート２２から剥離して浮上したならば（符号「２７Ａ」で示す繊維芽細胞）、ピペットのような大径の器具６４により、浮上した繊維芽細胞２７Ａを回収すればよい。
【００８２】
培養された繊維芽細胞のみを患者（生体）内に注入する以前に、繊維芽細胞生育のための立体的な構造（マトリックス）を提供するための基材と混合するが、繊維芽細胞と上述した基材との比率は、１：４〜４：１程度まで可能である旨を上述したが、係る比率は、表５で示す結果から得られた。
表５では、繊維芽細胞と上述した基材との比率を、繊維芽細胞と基材との混合物に対する繊維芽細胞の百分率で示し、係る百分率を５％毎に、１０％（繊維芽細胞と上述した基材との比率が１：９）から９０％（繊維芽細胞と上述した基材との比率が９：１）の範囲で実験を行った。そして、３５％〜６５％の結果については、何れも「良好」であるため、表５では省略してある。
なお、移植後に再生箇所が他の領域と同一のレベルを維持することが出来た場合が「良好」、肉眼で判別できる程度の凹みが発生した場合を「不良」と判定している。
表５
2006230418.tif 000007
【００８３】
このように、繊維芽細胞と基材との比率が１：４（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が２０％）〜４：１（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が８０％）程度であるのは、次の理由によるものと推測される。
すなわち、繊維芽細胞の比率が８０％よりも多いと、相対的に基材の量が少なすぎて、繊維芽細胞が生長するために必要な「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）が不十分となり、生体内に注入された繊維芽細胞は十分に生長せず、コラーゲン産生量も少なくなってしまう。一方、繊維芽細胞の比率が２０％未満であると、そもそも繊維芽細胞の絶対量が少ない為、コラーゲン産生量も少なくなってしまう。
そのため、上述した繊維芽細胞と基材との比率が１：４（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が２０％）〜４：１（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が８０％）が好ましいのである。
なお、表５では示されていないが、繊維芽細胞と基材との割合が１：１（繊維芽細胞と基材との混合物における繊維芽細胞の比率が５０％）の場合は、特に良好な結果を示した。
【００８４】
図３に関する上述した説明において、培養装置１０に収容される細胞培養用の培地２４と自己血２６との混合物は、培地２４に対する自己血２６の比率は、４％〜５０％である旨を述べたが、係る比率は、表５で示す実験結果から求められた。
表６で示す実験では、培地２４に対する自己血２６の比率を１％毎に、２％から５２％の範囲で実験を行った。そして、７％〜４８％の結果については、何れも「良好」であるため、表５では省略してある。
なお、移植に必要な量だけ培養が出来た場合が「良好」、必要量が得られなかった場合を「不良」と判定している。
表６
2006230418.tif 000008
【００８５】
表６から明らかな様に、培地２４に対する自己血２６の比率が４％未満であるか、或いは５０％より大きいと、繊維芽細胞の培養は上手くいかなかった。その理由は、以下の様に推察される。
すなわち、培地２４に対する自己血２６の比率が４％未満であると、培地２４に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が少な過ぎて、血液中に含まれるたんぱく質や、血液や培養液の浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が不足してしまう。一方、培地２４に対する自己血２６の比率が５０％より大きいと、培地２４に対する生体から採取した血液（自己血２６）の量が多すぎて、相対的に培地２４の量が少なくなり、培地中に含まれる皮膚細胞の培養に必要な幾つかの栄養素、例えばアミノ酸や糖質等の液体栄養素、が不足してしまう。
そのため、培地２４に対する自己血２６の比率は、４％〜５０％が好適なのである。
【００８６】
図示の実施形態はあくまでも例示であり、本発明の技術的範囲を限定する趣旨の記述ではない。
【００８７】
【発明の効果】
上述した本発明の作用効果を以下に列挙する。
（１）  「足場」となるような立体的な構造（マトリックス）を組成分として包含しているので、他の組成分である繊維芽細胞は、培養容器から剥離して生体内に戻されても順調に生長し、コラーゲンを産生する。
（２）  培養しようとする繊維芽細胞を有する生体の血液（自己血）を市販の培地に加えて充填材料の組成物である繊維芽細胞を培養すれば、必要な栄養素やアミノ酸、浸透圧を維持するのに必要な成分（アルブミン）が存在する環境下で、繊維芽細胞を順調に培養することが出来る。それと共に、自己血を用いるため、例えば他の生体の血液を媒介とする各種感染症や病原体が、充填材料を介して伝播してしまうことが、確実に防止出来る。
（３）  繊維芽細胞を培養しようとする培養容器の底部に高分子（フィブリン）のシートを敷き詰めておけば、培養された繊維芽細胞が培養容器の底部に付着して、剥離しなくなることが防止され、培養された繊維芽細胞の歩留まりが向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】皮膚片採取の態様を説明する図。
【図２】培養前の処理手順を説明する工程図。
【図３】培養装置の要部を説明する断面図。
【図４】培養装置から繊維芽細胞を回収する態様を示す斜視図。
【図５】繊維芽細胞と基材とを混合する工程を示す図。
【図６】繊維芽細胞と基材とを混合する工程であって、図５に後続する工程を示す図。
【図７】充填材料を注射に吸引する状態を示す図。
【図８】充填材料を皮下注入する状態を示す図。
【図９】皮下注入された後の充填材料を示す図。
【図１０】増殖した繊維芽細胞を回収する態様を示す図。
【図１１】図１０で示す繊維芽細胞を回収する態様であって、図１０とは別の段階を示す図。
【図１２】図１０、図１１で示す繊維芽細胞を回収する態様であって、図１０、図１１とは別の段階を示す図。
【符号の説明】
１０・・・培養装置
２０・・・シャーレ
２２・・・高分子材料（フィブリンシート）
２４・・・培地
２５・・・培地と自己血との混合物
２６・・・自己血
３０・・・皮膚細片
３１・・・繊維芽細胞
４０，４４・・・器具（ピペット）
４２・・・振とう用容器
４６・・・注射器
ＨＨ・・・人手
５０・・・充填材料
Ｓ・・・皮膚
５５，５５Ｂ・・・凹部
５５Ａ・・・修復箇所
【図１】
2006230418.tif 000009
【図２】
2006230418.tif 000010
【図３】
2006230418.tif 000011
【図４】
2006230418.tif 000012
【図５】
2006230418.tif 000013
【図６】
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【図７】
2006230418.tif 000015
【図８】
2006230418.tif 000016
【図９】
2006230418.tif 000017
【図１０】
2006230418.tif 000018
【図１１】
2006230418.tif 000019
【図１２】
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