(57)【要約】【課題】  ＴＮＦ−α産生促進作用、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用、皮膚角化細胞増殖促進作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有するものを見出し、それを有効成分として含有する免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤及び皮膚化粧料を提供することを目的とする。【解決手段】  免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤又は皮膚化粧料にツベイモシドＩを有効成分として含有せしめる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】
ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項３】
ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生促進剤。
【請求項４】
ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項５】
前記ツベイモシドＩ（tubeimoside I）が、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用の群から選ばれた１種又は２種以上の作用を有することを特徴とする請求項４に記載の抗老化剤。
【請求項６】
ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有することを特徴とする抗肥満剤。
【請求項７】
ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有することを特徴とするサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤。
【請求項８】
ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を配合したことを特徴とする皮膚化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤及び皮膚化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、消費者の健康に対する意識はますます高まりを見せている。一方で、現代社会には、不規則な生活習慣、食事の偏り、精神的ストレス等、免疫機構にダメージを与える要因が氾濫している。このようにして免疫力が低下することにより、癌、感染症、アレルギー症状等の各種疾患を誘発することが知られており、逆に免疫力が賦活されると、発癌抑制、制癌作用、抗感染症、抗アレルギー作用、さらには体調リズムの回復・恒常性維持など様々な効果が期待できる。
【０００３】
免疫機構には、多くの種類の細胞が関与しているが、特に白血球の役割は大きく、なかでもマクロファージは全動物に普遍的に存在しており、免疫応答の特に初期段階での働きを含め、あらゆる段階に関与している重要な白血球の一種である。近年、白血球の働きが物質レベルで解明されてきており、白血球の機能や細胞間相互作用は、白血球が分泌する微量タンパク質（サイトカイン）によって担われていることが分かってきている。
【０００４】
サイトカインには多くの種類があり、なかでも腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やインターロイキン（ＩＬ）類が注目されている。それらのなかで、ＴＮＦ−αに代表される炎症性サイトカインは、主にマクロファージから放出され、最終的には抗腫瘍作用等を示すことが報告されている。したがって、ＴＮＦ−αの産生機能を亢進させることにより、悪性腫瘍の増殖を抑制できるものと考えられる。このような考えに基づき、ＴＮＦ−α産生促進作用を有するものとして、ユキノシタ科スグリ属に属する植物からの抽出物（特許文献１参照）等が提案されている。
【０００５】
加齢に伴う皮膚老化の一因は、女性ホルモンの一種であるエストロゲンの分泌が減退することにある。すなわち、エストロゲンは成人女性の健康維持に深く関わっており、その分泌不足は種々の内科的疾患を招くほか、肌の過敏症、弾力性の低下、潤いの減少等、好ましくない肌の変化の原因となることが知られている。
【０００６】
そこで、エストロゲンの分泌が衰える更年期以降の女性に対して、エストロゲンと同様の作用を有する物質を配合した薬剤を、経皮的又は経口的に投与することが行われている。このようなエストロゲン様作用を有するものとしては、例えば、五斂子の葉部からの抽出物（特許文献２参照）等が提案されている。
【０００７】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞、及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては線維芽細胞の増殖は活発であり、線維芽細胞、コラーゲン等の皮膚組織の相互作用により皮膚に水分が保持されるとともに、皮膚の柔軟性、弾力性等が確保され、皮膚は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００８】
ところが、紫外線、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると線維芽細胞の増殖が遅くなり皮膚の保湿機能や弾力性が低下する。そして、皮膚は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。そのため、線維芽細胞の増殖を促進することにより皮膚の老化を予防又は改善することができると考えられる。このような考えに基づき、線維芽細胞増殖作用を有するものとして、クスノハガシワ抽出物（特許文献３参照）等が提案されている。
【０００９】
表皮は、最下層である基底層から始まって、有棘層、顆粒層、角質層へと連なる４層構造からなるが、各層に存在する大部分の細胞は、基底層から分化した角化細胞である。通常、角化細胞は基底層で産生され、徐々に上層に分化しながら移動して角質細胞となって角質層を構成し、最終的に垢として角質層から脱落していく。
【００１０】
上記角質層は皮膚の最外殻に存在しており、外界からの刺激に対する物理的なバリアーとしての役割を果たしている。皮膚ではこのバリアー機能を持たせるため、角化細胞が基底層で産生されてから垢となって剥がれ落ちるまでのサイクル（角化）を通常４週間の周期で繰り返し、表皮の新陳代謝を行っている。しかしながら、この角質層も加齢によって新陳代謝機能が衰え、こじわ、くすみ、色素沈着、肌荒れ等の皮膚のトラブルを発生することになる。そのため、角化細胞の増殖を促進し、肌の新陳代謝機能を回復させることにより、こじわ、くすみ、色素沈着等の皮膚の老化を改善できるものと考えられる。このような考えに基づき、表皮角化細胞増殖作用を有するものとして、ハス胚芽抽出物（特許文献４参照）等が提案されている。
【００１１】
近年、飽食や運動不足等の生活習慣が原因となって体脂肪が増加し、肥満が増えている。このような肥満の増加は、人間ばかりでなく、ペットや家畜においても見られる。肥満は、高脂血症や動脈硬化等の成人病の原因になるため、美容の面で問題となるばかりでなく、健康の面でも大きな問題となる。
【００１２】
生体内の脂肪を分解するためには、サイクリックＡＭＰの役割が重要となる。サイクリックＡＭＰは生体内に存在するリパーゼを活性化し、活性化されたリパーゼによって脂肪が脂肪酸とグリセロールとに分解される。しかし、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼが活性化されるとサイクリックＡＭＰの分解が誘発され、リパーゼの活性化が阻害される。そのため、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼの活性を阻害することにより細胞内におけるサイクリックＡＭＰが増量し、脂肪の分解を促進することができるものと考えられる。このような考えに基づき、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有するものとして、ピーナッツ渋皮抽出物（特許文献５参照）等が提案されている。
【特許文献１】特開２００４−１０７６６０号公報
【特許文献２】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献３】特開２００３−１４６８３７号公報
【特許文献４】特開２００２−６８９９３号公報
【特許文献５】特開２００４−２６７１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ＴＮＦ−α産生促進作用、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有するものを見出し、それを有効成分として含有する免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤及び皮膚化粧料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有することを特徴とし、本発明の皮膚化粧料は、ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を配合したことを特徴とする。
【００１５】
本発明の抗老化剤においては、前記ツベイモシドＩが、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用の群から選ばれた１種又は２種以上の作用を有していることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ツベイモシドＩが有するＴＮＦ−α産生促進作用に基づく免疫賦活効果；エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用に基づく抗老化効果；又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用に基づく抗肥満効果に優れる免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤又は皮膚化粧料を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について説明する。
〔免疫賦活剤、抗腫瘍剤，ＴＮＦ−α産生促進剤，抗老化剤，抗肥満剤，サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤〕
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、ツベイモシドＩ（tubeimoside I）を有効成分として含有するものである。
【００１８】
上記ツベイモシドＩは、土貝母（学名：Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）からの抽出物から単離・精製することにより製造することもできるし、合成により製造することもできる。なお、合成により製造する場合、その合成方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により合成することができる。本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤に含有される有効成分としてのツベイモシドＩは、土貝母からの抽出物から得られた単離・精製物であってもよいし、合成物であってもよい。
【００１９】
上記土貝母からの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって得ることができる。
ここで、抽出原料である土貝母（学名：Bolbostemma paniculata（Maxim.）Franq.）は、ウリ科の多年生の植物であり、その鱗茎は数個から十数個の鱗片からなる。土貝母は、中国の遼寧省、河北省、河南省、山東省、山西省等に分布しており、これらの地域から容易に入手することができる。
【００２０】
抽出原料として使用し得る土貝母の構成部位としては、全草を用いることができ、例えば、葉部、花部、茎部、種子、鱗茎（鱗片）、根部又はこれらの混合物を用いることができる。これらのうち、鱗茎（鱗片）を抽出原料として用いるのが好ましい。
【００２１】
土貝母からの抽出物は、抽出原料を乾燥した後、そのまま、又は粉砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。この際、抽出原料の乾燥は天日で行ってもよいし、通常用いられる乾燥機を使用して行ってもよい。また、土貝母は、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、土貝母の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００２２】
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用することが好ましく、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが特に好ましい。
【００２３】
抽出溶媒として使用し得る水は、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、濾過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００２４】
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００２５】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましい。
【００２６】
抽出処理は、土貝母に含有される可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定されるものではなく、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
【００２７】
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々撹拌しながら、通常３０分〜４時間静止して可溶性成分を溶出した後、濾過又は遠心分離により固形物を除去し、抽出液を得る。抽出溶媒量は、通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度であり、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。
【００２８】
得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すれば、固形の抽出物が得られる。ただし、土貝母からの抽出物は、固形の抽出物にしたものである必要はなく、上記抽出液又はその濃縮液の状態であっても構わない。本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤及びサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤の有効成分であるツベイモシドＩは、これら土貝母からの抽出物から、以下のようにして単離・精製することにより得ることができる。
【００２９】
上記ツベイモシドＩを土貝母からの抽出物から単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、土貝母からの抽出物を、多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付して、水、アルコール（メタノール等）、アセトンの順で溶出させ、アルコール（メタノール等）で溶出される分画として得ることができる。さらに、当該分画物を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィーや再結晶等により精製してもよい。
【００３０】
以上のようにして得られるツベイモシドＩは、ＴＮＦ−α産生促進作用、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有しているため、それらの作用を利用して免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤として用いることができるとともに、エストロゲン様作用剤、線維芽細胞増殖促進剤又は表皮角化細胞増殖促進剤としても用いることができる。
【００３１】
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、上記ツベイモシドＩのみからなるものでもよいし、上記ツベイモシドＩを製剤化したものでもよい。
【００３２】
上記ツベイモシドＩは、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、液状等の任意の剤形に製剤化して提供することができ、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。
【００３３】
なお、本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、必要に応じて、ＴＮＦ−α産生促進作用、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。
【００３４】
本発明の免疫賦活剤は、有効成分であるツベイモシドＩが有するＴＮＦ−α産生促進作用を通じて、免疫機能を賦活させ、免疫機能の低下等に伴う各種疾病を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明の免疫賦活剤は、これらの用途以外にも、ＴＮＦ−α産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３５】
本発明の抗腫瘍剤は、有効成分であるツベイモシドＩが有するＴＮＦ−α産生促進作用を通じて、悪性腫瘍の増殖を抑制することができる。ただし、本発明の抗腫瘍剤は、これらの用途以外にも、ＴＮＦ−α産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３６】
本発明のＴＮＦ−α産生促進剤は、有効成分であるツベイモシドＩが有するＴＮＦ−α産生促進作用を通じて、ＴＮＦ−αの産生を促進し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。ただし、本発明のＴＮＦ−α産生促進剤は、これらの用途以外にも、ＴＮＦ−α産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３７】
本発明の抗老化剤は、有効成分であるツベイモシドＩが有するエストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用及び表皮角化細胞増殖促進作用の群から選ばれる１種又は２種以上の作用を通じて、エストロゲンの分泌の減退、線維芽細胞の増殖能の低下又は表皮角化細胞の増殖能の低下に伴う皮膚の老化症状等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明の抗老化剤は、これらの用途以外にもエストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用又は表皮角化細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３８】
本発明の抗肥満剤は、有効成分であるツベイモシドＩが有するサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を通じて、サイクリックＡＭＰの産生を促進し、脂肪細胞の分解をすることができる。ただし、本発明の抗肥満剤は、これらの用途以外にも、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３９】
本発明のサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、有効成分であるツベイモシドＩが有するサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を通じて、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼの活性を阻害し、サイクリックＡＭＰによる脂肪細胞の分解を促進することができる。ただし、本発明のサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、これらの用途以外にも、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４０】
〔皮膚化粧料〕
上記ツベイモシドＩは、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚化粧料に配合するのに好適である。この場合、ツベイモシドＩをそのまま配合してもよいし、当該ツベイモシドＩから製剤化した免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤を配合してもよい。上記ツベイモシドＩを皮膚化粧料に配合することによって、皮膚化粧料にＴＮＦ−α産生促進作用、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を付すことができる。
【００４１】
上記ツベイモシドＩを配合し得る皮膚化粧料としては、特に限定されるものではなく、例えば、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、リップ、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディーシャンプー等が挙げられる。
【００４２】
上記ツベイモシドＩを皮膚化粧料に配合する場合、その配合量は、皮膚化粧料の種類等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は、約０．０００１〜１０質量％である。
【００４３】
本発明の皮膚化粧料は、ツベイモシドＩが有するＴＮＦ−α産生促進作用、エストロゲン様作用、線維芽細胞増殖促進作用、表皮角化細胞増殖促進作用又はサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を妨げない限り、通常の皮膚化粧料の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することにより、より一般性のある製品となり、また、それにより、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。
【００４４】
なお、本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤、ＴＮＦ−α産生促進剤、抗老化剤、抗肥満剤、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤及び皮膚化粧料は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００４５】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４６】
〔製造例１〕ツベイモシドＩ（tubeimoside I）の製造
細切りにした土貝母の鱗片２００ｇに５０質量％エタノール２０００Ｌを加え、還流抽出器で８０℃の温度条件下にて２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて、減圧下に濃縮し、乾燥して土貝母抽出物８７ｇを得た。
【００４７】
上記のようにして得られた土貝母抽出物８７ｇを多孔性吸着樹脂（ダイヤイオンＨＰ−２０，三菱化学社製）に付し、水８Ｌ、メタノール８Ｌ、アセトン８Ｌの順で溶出させ、メタノールによる分画物５．９ｇを得た。
【００４８】
メタノールによる分画物４ｇを水／メタノール＝１：１（容量比）の混合溶液に溶解させ、逆相カラム（商品名：クロマトレックスＯＤＳ，富士シリアル化学社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより、水／メタノール＝１：１（容量比）の混合溶液で展開溶出させ、その溶出液を集めた。
【００４９】
当該溶出液から脱溶媒した後、得られた濃縮物をメタノール３ｍＬに溶解し、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーを用いて分離・精製を行い、ツベイモシドＩ３８０ｍｇを得た。
【００５０】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：リサイクル分取高速液体クロマトグラフィー（日本分析工業社製）
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：５００ｍｍ（長さ２５０ｍｍのカラムを２本連結）
移動相：メタノール
移動相流速：５ｍＬ／分
検出器：ＲＩ
【００５１】
上記のようにして単離したツベイモシドＩについて、１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。以下に、１３Ｃ−ＮＭＲによる分析結果を示す。
【００５２】
［１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフト：δ（ｐｐｍ），溶媒：ピリジン−ｄ５］
C-1:44.3，C-2:69.2，C-3:83.2，C-4:43.2，C-5:48.7，C-6:18.8，C-7:33.2，C-8:40.3，C-9:47.6，C-10:37.4，C-11:24.1，C-12:122.7，C-13:144.3，C-14:42.1，C-15:29.4，C-16:22.9，C-17:47.2，C-18:41.5，C-19:46.2，C-20:30.9，C-21:34.1，C-22:32.4，C-23:64.9，C-24:15.7，C-25:17.9，C-26:17.8，C-27:26.2，C-28:176.0，C-29:33.4，C-30:23.8，C-1’:171.1，C-2’:46.5，C-3’:70.4，C-4’:47.9，C-5’:171.3，C-6’:26.6，Glu-1:102.9，Glu-2:80.2，Glu-3:79.0，Glu-4:71.5，Glu-5:78.7，Glu-6:62.6，Ara-1:104.6，Ara-2:73.7，Ara-3:72.5，Ara-4:72.4，Ara-5:64.4，Ara-1:94.2，Ara-2:74.8，Ara-3:71.4，Ara-4:67.8，Ara-5:64.4，Rha-1:100.7，Rha-2:72.6，Rha-3:78.0，Rha-4:73.3，Rha-5:68.0，Rha-6:18.4，Xyl-1:106.6，Xyl-2:74.8，Xyl-3:78.3，Xyl-4:71.4，Xyl-5:67.0
【００５３】
以上の結果から、高速液体クロマトグラフィーにより単離されたものが、ツベイモシドＩであることが確認された。
【００５４】
〔試験例１〕ＴＮＦ−α産生促進試験
製造例１で得られたツベイモシドＩについて、以下のようにしてＴＮＦ−α産生促進作用を試験した。
【００５５】
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、４時間培養した。
【００５６】
培養終了後、培地を抜き、終濃度１％のＤＭＳＯを含む１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで試料を溶解した試料溶液（試料濃度：５０μｇ／ｍＬ）を各ウェルに２００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、各ウェルの培養上清中のＴＮＦ−α量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。同様に、試料溶液を添加せずに培養した培養上清中のＴＮＦ−α量についても測定した。得られた結果から、以下の式により、試料溶液添加時のＴＮＦ−α産生促進率（％）を算出した。
【００５７】
ＴＮＦ−α産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料溶液添加時のＴＮＦ−α量」を、Ｂは「試料溶液無添加時のＴＮＦ−α量」を示す。
【００５８】
上記試験の結果、ツベイモシドＩのＴＮＦ−α産生促進率は、３１０５．６±１５１．０％であり、ツベイモシドＩは、優れたＴＮＦ−α産生促進作用を有することが確認された。
【００５９】
〔試験例２〕エストロゲン様作用試験
製造例１で得られたツベイモシドＩについて、以下のようにしてエストロゲン様作用を試験した。
【００６０】
ヒト乳癌由来細胞（ＭＣＦ−７）を１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭ培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を、活性炭処理した１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有しフェノールレッドを含有しないＭＥＭ培地（Ｔ−ＭＥＭ培地）を用いて、３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に調整した後、４８ウェルプレートに１ウェルあたり４５０μＬずつ播種し、細胞を定着させるため培養した。６時間後（０日目）にＴ−ＭＥＭ培地で終濃度の１０倍に調整した試料溶液（試料濃度：３．１２５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに５０μＬずつ添加し培養を続けた。３日目に培地を抜き、Ｔ−ＭＥＭ培地で終濃度に調整した試料溶液を各ウェルに０．５ｍＬずつ添加し、さらに培養を続けた。
【００６１】
エストロゲン様作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、１％ＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭ培地に終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで溶解したＭＴＴを各ウェルに２００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。ポジティブコントロールとして、１×１０−９Ｍのエストラジオールを使用した。得られた結果から、下記の式により、試料溶液添加時のエストロゲン様作用率（％）を算出した。
【００６２】
エストロゲン様作用率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、上記式において、Ａは「試料溶液添加時の吸光度」を、Ｂは「試料溶液無添加時の吸光度」を示す。
【００６３】
上記試験の結果、ツベイモシドＩのエストロゲン様作用率は、１３２．２±３．０％であり、ツベイモシドＩは、優れたエストロゲン様作用を有することが確認された。
【００６４】
〔試験例３〕線維芽細胞増殖作用試験
製造例１で得られたツベイモシドＩについて、以下のようにして線維芽細胞増殖作用を試験した。
【００６５】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように、５％ＦＢＳ含有α―ＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで試料を溶解した試料溶液（試料濃度：１２．５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬ添加し、３日間培養した。
【００６６】
線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、各ウェルから１００μＬずつ培地を抜き、終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに２０μＬずつ添加した。４．５時間培養した後に、１０％ＳＤＳを溶解した０．０１ｍｏｌ／ｍＬの塩酸溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、一晩培養した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同様にして波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両吸光度の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。補正後の各吸光度から、下記の式により線維芽細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００６７】
線維芽細胞増殖促進率(％)＝(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)×１００
ただし、上記式において、Ｓｔは「試料溶液添加・細胞添加時の吸光度」を示し、Ｓｂは「試料溶液添加・細胞無添加時の吸光度」を示し、Ｃｔは「試料溶液無添加・細胞添加時の吸光度」を示し、Ｃｂは「試料溶液無添加・細胞無添加時の吸光度」を示す。
【００６８】
上記試験の結果、ツベイモシドＩの線維芽細胞増殖促進率は、１２７．３±２．３％であり、ツベイモシドＩは、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００６９】
〔試験例４〕表皮角化細胞増殖作用試験
製造例１で得られたツベイモシドＩについて、以下のようにして表皮角化細胞増殖作用を試験した。
【００７０】
正常ヒト皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、正常ヒト表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭで試料を溶解した試料溶液（試料濃度：３．１２５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに２００μＬ添加し、３日間培養した。
【００７１】
表皮角化細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（−）に溶解したＭＴＴを各ウェルに２００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。測定された各吸光度から、下記の式により表皮角化細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７２】
表皮角化細胞増殖促進率(％)＝Ｓｔ／Ｃｔ×１００
ただし、上記式において、Ｓｔは「試料溶液添加時の吸光度」を、Ｃｔは「試料溶液無添加時の吸光度」を示す。
【００７３】
上記試験の結果、ツベイモシドＩの表皮角化細胞増殖促進率は、１３９．４±１．３％であり、ツベイモシドＩは、優れた表皮角化細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００７４】
〔試験例５〕サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用試験
製造例１で得られたツベイモシドＩについて、以下のようにしてサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を試験した。
【００７５】
５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．２ｍＬに、２．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液０．１ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬのホスホジエステラーゼ溶液０．１ｍＬ及び試料溶液０．０５ｍＬを加え、３７℃の温度条件下で５分間予備反応させた。この反応溶液に、０．５ｍｇ／ｍＬのサイクリックＡＭＰ溶液０．０５ｍＬを加え、３７℃の温度条件下で３０分間反応させた。３分間沸騰水浴上で煮沸することにより反応を停止させ、これを遠心（２２６０×ｇ，１０分，４℃）し、上清を試料反応溶液として、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーを用いて分析した。また、試料溶液を添加せずに同様の方法で空試験を行った。
【００７６】
＜高速液体クロマトグラフィー条件＞
製品名：TOSOH UV-8011（東ソー社製）
固定相：Wakosil-II 5C18-ODS（和光純薬工業社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相：1mM TBAP in 25mM KH2PO4:CH3CN＝90:10
移動相流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ，２６０ｎｍ
【００７７】
上記液体クロマトグラフィーによる分析結果のサイクリックＡＭＰのピーク面積から、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率（％）を下記の式により算出した。
サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率(％)＝(１−Ａ／Ｂ)×１００
ただし、上記式において、Ａは「試料溶液添加時のサイクリックＡＭＰのピーク面積」を、Ｂは「コントロールのサイクリックＡＭＰのピーク面積」を示す。
【００７８】
試料溶液の濃度を段階的に減少させて、上記サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率を算出し、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ；ｐｐｍ）の値を内挿法により算出した。
【００７９】
上記試験の結果、ツベイモシドＩのサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０は、１７８．９μｇ／ｍＬであり、ツベイモシドＩは、優れたサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の免疫賦活剤、抗腫瘍剤及びＴＮＦ−α産生促進剤は、悪性腫瘍細胞の増殖の抑制に、本発明の抗老化剤は、皮膚の老化症状等の予防、治療又は改善に、本発明の抗肥満剤及びサイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼ活性阻害剤は、脂肪細胞の分解に有用である。