(57)【要約】【課題】  巨大骨欠損部や特定の骨折部等の場合においても、内部にまで栄養分や骨形成促進細胞を行き届かせて、早期に修復する。【解決手段】  セラミックス多孔体のような生体適合性材料からなる基材に、末梢血内の細胞、骨髄由来の造血幹細胞、血管内皮細胞または平滑筋細胞のような血管基底膜生成細胞を付着させてなる骨補填材を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラミックス多孔体のような生体適合性材料からなる基材に、末梢血内の単球細胞、骨髄由来の造血幹細胞、血管内皮細胞または平滑筋細胞のような血管基底膜生成細胞を付着させてなる骨補填材。
【請求項２】
前記基材に、サイトカインまたは多血小板血漿のような成長因子を付着させてなる請求項１に記載の骨補填材。
【請求項３】
前記基材に、ラミニン−４，ラミニン−５またはコラーゲンのような蛋白質を付着させてなる請求項１または請求項２に記載の骨補填材。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれかに記載の骨補填材に、骨髄液、骨髄由来幹細胞、海綿骨由来幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪由来の脂肪前駆細胞、ＰＬＡ細胞、脂肪由来幹細胞または胚性幹細胞のような骨形成細胞を付着させた骨補填体。
【請求項５】
請求項４に記載の骨補填体を所定期間にわたって培養してなる培養骨。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、骨欠損部を再生する際に使用する骨補填材、骨補填体および培養骨に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腫瘍摘出や外傷等により生じた骨欠損部に、骨補填材を補填することにより、生体組織を再生させて骨欠損部を修復することが可能になってきている。骨組織の再生には、細胞、成長因子、足場（担体）となる骨補填材が必要不可欠である。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部に補填すると、破骨細胞がβ−ＴＣＰを吸収し、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を骨補填材とともにin vitroで培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系幹細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、骨補填材のみを補填する方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、骨欠損部が大きい場合や特定の骨折部等の場合に、培養骨を移植しても早期の修復が得られない場合がある。巨大骨欠損部の場合には、培養骨の内部まで栄養分が行き届かなかったり、あるいは、骨形成を促進するためのマクロファージ細胞や破骨細胞が培養骨内部にまで到達し難かったりすることがその原因であると考えられる。また、特定の骨折部の場合には、同様の原因により、折れた骨組織と培養骨との良好な接着が得られずに偽関節が形成されてしまう不都合がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、巨大骨欠損部や特定の骨折部等の場合においても、内部にまで栄養分や骨形成促進細胞を行き届かせて、早期に修復することを可能とする骨補填材、骨補填体および培養骨を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、セラミックス多孔体のような生体適合性材料からなる基材に、末梢血内の単球細胞、骨髄由来の造血幹細胞、血管内皮細胞または平滑筋細胞のような血管基底膜生成細胞を付着させてなる骨補填材を提供する。
本発明によれば、骨補填材を骨欠損部に補填すると、時間とともに、基材に付着した血管基底膜生成細胞によって基材内部に血管が形成される。そして、形成された血管を介して、基材の内部にまで栄養分の補給やマクロファージ細胞あるいは骨芽細胞の供給が行われるので、骨欠損部が大きい場合であっても、基材の内部における骨形成が促進される。あるいは、本発明の骨補填材が特定の骨折部に補填された場合においても、骨補填材と既存の骨組織との間における骨形成が促進される。したがって、いずれの場合においても、骨欠損部の早期修復を図ることができる。
【０００７】
上記発明においては、前記基材に、サイトカインまたは多血小板血漿のような成長因子を付着させてなることが好ましい。
成長因子の作用により、血管形成および骨形成が促進されるので、さらに早期に骨欠損部を修復することが可能となる。
【０００８】
また、上記発明においては、前記基材に、ラミニン−４，ラミニン−５またはコラーゲンのような蛋白質を付着させてなることとしてもよい。
基材に付着した蛋白質の作用により細胞の基材への接着性が向上される。その結果、幹細胞のような接着性の細胞の増殖を促進することが可能となり、さらに早期に骨欠損部を修復することが可能となる。
【０００９】
また、本発明は、上記いずれかの骨補填材に、骨髄液、骨髄由来幹細胞、海綿骨由来幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪由来の脂肪前駆細胞、ＰＬＡ（Processed
Lipoaspirate Cells）細胞、脂肪由来幹細胞または胚性幹細胞のような骨形成細胞を付着させた骨補填体を提供する。
本発明によれば、付着させた骨形成細胞によって、より骨形成を促進することが可能となる。
【００１０】
また、本発明は、上記骨補填体を所定期間にわたって培養してなる培養骨を提供する。
本発明によれば、培養骨内に血管基底膜生成細胞が付着しているので、骨欠損部に移植されると培養骨内部にまで血管が形成され、血管を介して栄養分の補給やマクロファージ細胞あるいは骨芽細胞の供給が行われ、迅速に骨欠損部を修復することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る骨補填材および培養骨によれば、骨欠損部に補填されると、骨補填材や培養骨を構成する基材の内部にまで血管を形成させ、また、骨膜血管、骨端血管および骨幹端血管を同様に形成させ、形成された血管を介して栄養分の補給や末梢血中のマクロファージ細胞あるいは骨芽細胞の誘導を円滑に行うことができる。その結果、巨大骨欠損部に補填された場合においても、大きな基材の内部にまで血流を生じさせて、骨形成作用を促進し、骨欠損部の早期修復を図ることができる。また、偽関節となり易いような血流の少ない骨折部に補填した場合においても、骨補填材あるいは培養骨と既存の骨組織との間にも血流を生じさせて、骨形成作用を促進し、偽関節の形成を防止して、健全な骨組織の修復を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態に係る骨補填材および骨補填体について、以下に説明する。
本実施形態に係る骨補填材は、セラミックス多孔体のような生体適合性材料からなる基材に、血管内皮細胞を付着させたものである。セラミックス多孔体は、例えば、ブロック状のβリン酸三カルシウム多孔体である。
【００１３】
このように構成された本実施形態に係る骨補填材を用いて巨大骨欠損部を修復する場合について以下に説明する。
本実施形態に係る骨補填材を巨大骨欠損部に補填すると、基材に付着した血管内皮細胞によって、時間の経過とともに基材内部に血管が形成されていくことになる。
【００１４】
血管が形成されると、その形成された血管を介して末梢血中の栄養分やマクロファージ細胞の供給が行われる。末梢血のマクロファージ細胞は骨芽細胞や破骨細胞の前駆体となるため、血管が形成された基材の内部にまで骨芽細胞や破骨細胞が到達することが可能となり、また栄養分が供給されることから、それらの細胞が活性化され、基材を足場とした骨組織の形成が積極的に行われることになる。すなわち、骨欠損部が比較的大きな巨大骨欠損部である場合においても、補填された比較的大きな基材の中心部分から骨組織の形成作用を生じさせ、十分な自家骨化を図ることができる。
【００１５】
また、本実施形態に係る骨補填材が血管の比較的少ないような骨折部に補填された場合においても、基材に血管内皮細胞が付着しているので、該血管内皮細胞によって血管が形成され、基材の内部および周囲に血流を生じさせることができる。したがって、骨補填材と既存の骨組織との間における骨形成作用が促進され、基材を足場として自家骨化された新たな骨組織と骨折部近傍に配されている既存の骨組織とを一体化させることができる。その結果、血管が比較的少ない骨折部においても偽関節が形成されてしまうことを防止して、骨折部を比較的早期に治癒することができる。
【００１６】
また、上記骨補填材にさらに骨髄由来の間葉系幹細胞を付着させた骨補填体を構成してもよい。このようにすることにより、骨形成が促進され、より早期に骨折部を治療することが可能となる。
骨髄由来の間葉系幹細胞に代えて、骨髄液そのもの、ストローマ細胞、海綿骨由来の幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪由来の脂肪前駆細胞、ＰＬＡ（Processed
Lipoaspirate Cells）細胞、脂肪由来幹細胞、末梢血由来の幹細胞、胚性幹細胞、骨髄由来の造血肝細胞、末梢血由来のマクロファージ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞等を付着させてもよい。
【００１７】
次に、本発明の一実施形態に係る培養骨について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養骨は、上記骨補填体を所定の培養条件下において所定期間培養することにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させたものである。
所定の培養条件は、例えば、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％であり、また、所定培養期間は、例えば７日間である。
【００１８】
このように構成された本実施形態に係る培養骨を巨大骨欠損部に移植する場合について、以下に説明する。
本実施形態に係る培養骨を巨大骨欠損部に移植すると、既に間葉系幹細胞から分化形成されている骨芽細胞が骨基質の形成を開始しており、移植後即座に骨欠損部の修復が開始されることになる。この場合において、本実施形態に係る培養骨には、血管内皮細胞が付着しているので、骨欠損部に培養骨が移植されると、血管内皮細胞に基づいて血管形成が開始され、時間とともに血流が生じるようになる。
【００１９】
培養骨内に血流が生じるようになると、血管を介して運ばれてきた栄養分によって、さらに骨芽細胞が活性化されるので、迅速な骨形成が促進されることになる。
すなわち、本実施形態に係る培養骨によれば、単に血管内皮細胞を付着させた基材からなる骨補填材を骨欠損部に補填する場合と比較して、さらに早期に骨形成作用を促進して、骨欠損部の修復を図ることができる。
【００２０】
なお、本実施形態においては、間葉系幹細胞を培養し、骨芽細胞に分化させた状態の培養骨について説明したが、これに限定されるものではなく、骨芽細胞に分化させる前の間葉系幹細胞を十分な細胞数となるまで培養した状態の培養骨を補填することにしても、単に骨補填材を補填する場合と比較して早期に骨欠損部を修復することができる。
【００２１】
また、本実施形態においては、骨髄由来の間葉系幹細胞を培養して培養骨を製造することとしたが、これに代えて、骨髄液そのもの、ストローマ細胞、海綿骨由来の幹細胞、筋肉幹細胞、脂肪由来の脂肪前駆細胞、ＰＬＡ（Processed
Lipoaspirate Cells）細胞、脂肪由来幹細胞、末梢血由来の幹細胞、胚性幹細胞、骨髄由来の造血肝細胞、末梢血由来のマクロファージ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞等を培養して培養骨を製造することにしてもよい。
【００２２】
また、血管を形成するための血管基底膜細胞としては、血管内皮細胞に代えて平滑筋細胞を採用してもよい。
さらに、基材に、血管基底膜細胞や骨形成細胞の増殖を促進する増殖因子や成長因子を付着させてもよい。成長因子としては、モノカイン、サイトカイン、ＢＭＰ、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質からなるものが挙げられ、増殖因子としては、血管内皮細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、アンジオポエチン様増殖因子や多血小板血漿が挙げられる。
【００２３】
また、細胞の基材への接着性を向上するために、ラミニン−４，ラミニン−５またはコラーゲンのような蛋白質を付着させたり、基材表面に親水性処理を施したり、あるいは、荷電粒子により帯電させることにしてもよい。
また、本実施形態においては、基材としてβリン酸三カルシウム多孔体等のセラミックス多孔体のような生体適合性材料からなるものを例示したが、これに代えて、他のセラミックス田抗体や、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリラクトン、ポリカプロラクトンもしくはそれらの共重合体、コラーゲン、キチン、キトサンなどを採用してもよい。
【００２４】
以下に、本実施形態に係る培養骨の移植例について、図１および図２を参照して説明する。
本実施例の培養骨は、次のようにして調製した。
１．乾燥したβ−ＴＣＰ多孔体ブロックからなる骨補填材をＤＭＥＭ液に浸漬し、保湿の環境を作った後に脱気および水分除去し、細胞を浸入させ易くする。
具体的には、以下の処理を行った。
(1)  ５０ｍＬ遠心チューブに１ｃｍ角の骨補填材を１本当り１０個入れ、ＤＭＥＭ培地を１０mｌ入れた。
(2)  遠心分離機に全ての遠心チューブを入れ、遠心分離を行った（１３００ｒｐｍ，３分間）。
(3)  遠心分離後、培地を吸引除去した。
(4)  骨補填材をピンセットでシャーレ１枚につき１０個ずつ移した。
(5)  チップをつけたピペットで、骨補填材の培地を完全に吸い取った。
２．セレクチン（あるいは、セレクチンとヒアルロン酸との混合物）を１．の骨補填材表面に載せる。これにより、水溶性の化学物質による細胞分子間の架橋が行われる。セレクチンはアデノシンの細胞外への遊離促進作用等の間接的な作用も有している。セレクチンはＰＡＤＧＥＭ（Platelet Activation
Dependent Granule External Membrane）を刺激することによって、細胞表層にＰＡＤＧＥＭを移行（トランスロケーション）させる作用がある。ＰＡＤＧＥＭは、血管内皮細胞と活性化血小板に発現し、白血球上の糖鎖リガンドと結合する。
３．血管基底膜細胞の懸濁液（Medium DMEM 10%FBS）４０μＬを１００μＬフィンピペットで２．の骨補填材に注入した。このとき、成長因子を含む約１０μＬ以下の液体も注入し、１５分間室温に保つ。
これにより、本実施例の培養骨が調製された。
【００２５】
次に、上記により調製された培養骨を骨欠損部に移植する場合について説明する。
１．まず、エタノールと氷を混合して低温環境（１〜１０℃）を作る。
２．次いで、上記により調製された培養骨を上記低温環境内に配置し、１〜３分間細胞を冷却処理した。これにより、細胞外基質への分化誘導が行われる。
３．図１に示されるように骨皮質部、髄質部の内外部分、創傷の欠損部、体内創傷の相応部位に移植した。図１は移植後２週間経過後の状態を示し、（ａ）は２５倍拡大写真、（ｂ）は１００倍拡大写真をそれぞれ示している。この図によれば、矢印Ａで示される箇所等に骨基質が形成され、矢印Ｂで示される箇所等に血管が再生されていることがわかる。
４．図２に比較例として、β−ＴＣＰからなる骨補填材のみを移植した場合の移植後２週間経過後の状態を示している。（ａ）は４０倍拡大写真、（ｂ）は１００倍拡大写真をそれぞれ示している。この図によれば、矢印Ｃで示されるように骨補填材がそのまま残り、骨基質および血管の再生は行われていないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施形態に係る骨補填材および培養骨を移植した後の骨基質形成の状態を示す顕微鏡写真である。
【図２】図１の比較例として、β−ＴＣＰからなる骨補填材のみを移植した場合を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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