(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の宿主においてＴヘルパー応答、細胞毒性リンパ球応答及び中和性抗体を誘発するペプチドの提供。【解決手段】ＨＩＶのエンベロープタンパクに由来する多重決定基Ｔヘルパーペプチド類を含んだペプチド構築物と、ＨＩＶ-IIIＢの主要中和性決定基に対応し、且つ優勢ＣＴＬエピトープを含むことが示されているＨＩＶ−１・ｇｐ１６０のＶ３ループ中のペプチド１８を具備するポリペプチドであって、それぞれの応答が、広範な移植抗原ハプロタイプを提示する哺乳類種の複数の個体において生じる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され精製されたポリペブチドであって、
（ａ）ヘルパーＴ細胞応答を誘発できるＨＩＶ ｇｐ１６０に由来するエピトープを有する第一のペプチドであって、広範な移植抗原ハプロタイプのＴ細胞を増殖することによって認識される、重なってはいるが異なるＴヘルパーエピトープを含むクラスターペプチドである前記第一のペプチドと；
（ｂ）ＨＩＶ ｇｐ１６０  ＩＩＩＢ株のＶ３ループに由来し、アミノ酸３０８−３２２と、他のそれに類似するＨＩＶ株を含有するエピトープであって、細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発できる該エピトープを有し、且つ、ＨＩＶ ｇｐ１６０  ＩＩＩＢ株のＶ３ループに由来し、他のＨＩＶ株類似体のアミノ酸３０８−３２２を含有するエピトープであって、前記抗原に対する高力価の中和性抗体応答を誘発できる該エピトープを有する第二のペプチドとを具備し、
夫々の応答が、広範な移植抗原ハプロタイプを提示する哺乳類種の複数の個体において生じ、更に、前記ペプチドの夫々が他の両方のペプチドに対して隣接して結合し、第二及び第三のペプチドが第一のペプチドに対してカルボキシル側で連結しているポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペブチドであって、前記ペプチドの夫々が、線形に直列に結合されているポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドであって、前記ペプチド類は、ペプチド結合により共有結合的に連結され、分枝構造を形成しているポリペプチド。
【請求項４】
第一のペプチドが、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６のペプチド、又は配列番号２６のアミノ酸残基７−３３からなるペプチドである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
中和性エピトープを含む前記ペプチドが、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ ｇｐ１６０（配列番号７）のアミノ酸残基３０８−３２２、または他のＨＩＶ株に由来するＰ１８領域に対して相同性であるｇｐ１６０エンベロープタンパクの領域からなる、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｐ１８領域がＨＩＶ−１  ＭＮ株（配列番号３４）に由来する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ヒトを除く哺乳類の対象において、細胞障害性Ｔ細胞応答および高力価の中和性抗体応答を含んだ、抗原に対する広い免疫応答を誘発するための方法であって、前記対象に対して、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の少なくとも一つのポリペプチドを投与することを具備した方法。
【請求項８】
ヒトを除く哺乳類の対象において、ＨＩＶに対する露出を診断し、または免疫機能を評価するための方法であって、 
ｉ）対象から得たサンプルを請求項１乃至６のいずれか１項のポリペプチドに接触させる工程と；
ｉｉ）前記ポリペプチドに対する免疫応答を測定する工程とを具備し、 
前記免疫応答は、ヘルパーＴ細胞応答、細胞障害性Ｔ細胞応答および中和性抗体力価からなる群から選択される方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記の測定工程ｉｉ）は、インターロイキン−２の産生、Ｔ細胞増殖および抗体結合活性からなる群から選択される応答を試験することによって行われる方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
〔関連出願〕
本件出願は、1992年３月６日に出願された同時継続のアメリカ合衆国出願第07/847,311号の一部継続出願であり、この親出願は、1988年１月26日に出願されたアメリカ合衆国出願第07/148,692号の一部継続出願である。また、本件出願は、1991年８月29日に出願された同時継続のアメリカ合衆国出願第07/751,998号の一部継続出願である。これら全ての出願は、全体として本件出願の一部をなすべく、参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔発明の背景〕
発明の分野
本発明は、共有結合的に結合したＴヘルパー（Ｔｈ）エピトープ、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、および感染性物質（特に寄生性またはウイルス性の病原）に対して中和性抗体応答（ＡｂＮ）を誘発するエピトープを含んだペプチド類に関する。本発明の適用において特に焦点が当てられる例は、ヒト・免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するものである。当該ペプチドは、広範な腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）タイプを有する宿主において、これら三つの全ての応答を誘発する特徴を有している。
【０００３】
本発明はまた、上記ペプチドを利用した、ＨＩＶに感染した個体における免疫機能の測定法方に向けられている。本発明は更に、上記ペプチドをワクチン組成物の一成分として、または単一の活性成分として用いた予防ワクチンまたは治療ワクチンに向けられている。
【０００４】
関連技術の説明
自然感染の際に誘起されるＨＩＶ抗原に対する免疫応答は、ウイルス感染を規制(regulate)する反応と、免疫機能の一体性(integrity)に対して拮抗する反応との均衡かもしれない（１−３）。この均衡に対して有利または不利に影響する決定因子は、未だ定かではない。宿主の初期免疫応答は、免疫機能不全の増大を伴う進行性の衰弱性疾患に至る持続的ＨＩＶ感染の経過に影響するように思える（４−７）。該ウイルスは、抑制エピトープ(suppressive epitopes)またはマスク糖鎖(masking carbohydrate)のような、免疫系を回避できる構造、クローン制限(clonal restriction)を含む構造（８−１０）、或いはウイルスの感染性を高める抗体（１１−１６）または免疫不全に寄与する自己抗体もしくはＴ細胞（１７−２０）のような構造をを含んでいるかもしれない。
【０００５】
ＨＩＶエンベロープの主要な中和性決定基（ＰＮＤ）は、第三超可変領域またはシステイン残基３０１および３３１の間のＶ３ループに位置する（２１−２３）。Ｖ３ループに対するより広範な中和性抗体も見出されているが（２７）、当初ペプチド結合ＥＬＩＳＡで調べたときには、この領域の抗体はその中和特性においてタイプ特異的であり、より交差反応性であることが示された（２３−２６）。合成ワクチの開発にとっては幸運なことに、このような抗体は、短いペプチドでの免疫感作によって発生させることができる（２１，２８，２９）。細胞フリーの同族ウイルスによる攻撃に対するＶ３特異的抗体の防御効率が、チンパンジーにおける抗原投与研究で示されている（１５，３０，３１）。また、極く最近においては、Ｖ３ループに特異的なマウス／ヒトＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体をチンパンジーに受動移入することによって、ウイルス攻撃に対する防御が達成された（３２）。この領域の内および外（しかし影響はある）におけるウイルスエンベロープタンパクの配列変化は、中和回避突然変異体および可能なＣＴＬ免疫回避突然変異体の両者において生じ、細胞の向性を変化させる（３３−３７）。
【０００６】
感染個体において、ＨＩＶ単離体における高度の遺伝子可変性がみられる（３８−４０）。所定の個体から単離されたＨＩＶは、疾患の経過に亘って変化するように思える。免疫の圧力下では、ウイルスは感染の過程において、細胞変性(cytopathicity)、複製速度、および細胞向性のような発現型特性における相違を示すように見える。ウイルスが、感染の間に低レベルで連続的に複製し、また「真の潜伏」の状態を獲得しないことは、ＨＩＶ−１が慢性の活性感染を達成し、また選択的な機構がウイルスの存続に重要な役割を果たすとの見解（３３）を支持する。当該エンベロープタンパクのＰＮＤをコードする多くの異なったＶ３領域が、抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＨＩＶ単離体中に検出されており、このことは、陽性選別によってイン・ビボにおけるＨＩＶ・ｅｎｖ遺伝子の著しい多様性が導かれることを示唆している（４０）。にもかかわらず、ＰＮＤは、配列の多様な単離体によって生成される中和性抗体の標的となる保存されたエピトープを含んでおり、またＰＮＤに由来する限定数のペプチド類が、たとえ力価が低く、おそらくは親和性が低くとも、多くの単離体を認識する中和性抗体を誘発できるとの証拠が存在する（２４，２５，４１）。
【０００７】
有効なワクチンのための基準は、安全であること、即ち、自己免疫またはウイルス増大反応を誘起しないことだけでなく、感染ポピュレーションにおいて優勢な全ての可能なＨＩＶ変種に対して、細胞性免疫応答および中和性抗体応答を誘発できることでなければならない。加えて、所定の個体のＭＨＣ分子は、全体としての種(species)によって認識される可能な抗原性決定基のサブセットのみと結合してこれを認識するであろうから、合成ペプチドワクチンはまた、殆どのＨＬＡタイプのＴ細胞による認識を誘発するために充分な抗原決定基を組み込んでいなければならない。
【０００８】
従って、我々は先の研究において、夫々がＨＩＶエンベロープの６つの多重決定基Ｔヘルパー領域に対応する、２０〜３３残基の６種類の合成ペプチドを構築した（４２）。クラスターペプチドと呼ばれるこれらのペプチドは、３または４のハプロタイプのマウスのＴ細胞を増殖することによって認識される、重なってはいるが異なるＴヘルパーエピトープに亘っている。これらのクラスターペプチドは、組換えｇｐ１６０（ｒｇｐ１６０）で免疫感作されたマウス、並びにＨＩＶに感染したヒトの抹消血液リンパ球において、Ｔ細胞応答を刺激する能力について試験された。マウスはまた、完全なｇｐ１６０に応答したイン・ビトロでのＴ細胞の誘導について試験するために、当該クラスターペプチドで免疫感作された。クラスターペプチド３、４および６（表Ｉの配列を参照のこと）は、ｒｇｐ１６０で免疫感作された、４つのＭＨＣハプロタイプの全てのマウスに由来するＴ細胞を刺激した；また、マウスを当該クラスターペプチドで免疫感作すると、イン・ビトロで全エンベロープタンパクを認識することができるＴ細胞応答が誘発された。クラスターペプチド１は今回の研究においても用いられ、一つのマウス株でのみ強力に増殖を刺激した。これに対して、他の三つのマウス株は、当該ペプチドが作成された起源である多重決定基領域の成分を認識した。従って、全体は、その部分の総和よりも低い活性を有していた（４２）。クラスターペプチド１、３、４および６は、ＨＩＶ陽性でインフルエンザ陽性の抹消血液リンパ球において、夫々試験症例の６４、７３、５２および５８％で、顕著なＩＬ−２応答を刺激した。多分、試験された患者は多数の異なったＨＩＶ副株に感染していたであろう事実にも拘わらず、このような高い応答が得られたことは注目に値する。クラスターペプチド１、３および４は、北アメリカおよびヨーロッパのＨＩＶ単離体の間で相対的に保存された配列を有しており、またクラスターペプチド６は、保存配列および可変配列の間の境界に亘って広がっていた（４３）。
【０００９】
成功するペプチドワクチンは、多くのＨＬＡタイプのワクチン被接種者において、中和性抗体応答と共に、Ｔヘルパー（Ｔｈ）および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発できなければならない。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ制限ＣＴＬ(MHC class I-restricted CTL)は、ウイルス感染からの回復において中心的な役割を果たすように思える（８１）。イン・ビトロでは、外因性リンホカイン類はＣＴＬ前駆体の成熟におけるＴ細胞の補助(T-cell help)を肩代わりできるけれども、Ｔｈ−Ｂ細胞の共働と比較すると、イン・ビボでのＣＴＬのプライミングにおけるＴｈの役割は未だ少ししか理解されていない。ＣＴＬ誘導におけるヘルパーの必要性については多くの証拠があるが（８２−９０）、補助(help)から独立したＣＴＬ誘導についての証拠も存在する（８５，９１−９５）。更に、今日までの研究では、Ｂ細胞に関する同族補助(cognate help)におけるハプテンへのキャリアの連結に類似した、ＣＴＬ決定基へのヘルパー抗原性決定基の共有結合的連結を要求する補助の必要性は示されていない。この証拠の欠如は、ＣＴＬの標的が全細胞であり、最近まで、免疫感作には全細胞（組織移植片）または生ウイルスが必要とされていたという事実に起因するのかもしれない。決定基連結の示唆に至り得る最も密接に関連した証拠は、拒絶反応を誘発するために、ヘルパー決定基およびＣＴＬ決定基は同じ皮膚移植片に存在しなければならないことを示すものであった。しかし、これを更に分子レベルにおいて発展させることはできなかった。今や、ＣＴＬ誘発のためのペプチド免疫感作の可能性が示されており（９６−１００）、ヘルパーおよびＣＴＬの両者の決定基を含むペプチドを用いて、この疑問の解明に取りかかるのが容易になっている。最近の証拠は、ヘルパー部位が有益であることを示しているが（９０，１０１，１０２）、ヘルパー部位およびＣＴＬ部位を結合する必要があるか否かは不明である。実際に、未結合のヘルパーおよびＣＴＬエピトープペプチドは、二つの研究においては有効であり（９０，１０２）、他の研究においては試験されていない（１０１）。しかし、前者の研究においては、ヘルパーおよびＣＴＬ決定基ペプチドの混合物が、これら二つのペプチドを同じ微小環境に隔離する不完全フロイントアジュバントエマルジョン中に含有させた形での投与され、或いは多重免疫感作のための高投与量で与えられた。
【発明の開示】
【００１０】
〔発明の概要〕
本発明は、病原により発現される抗原に対して広範な免疫応答を与えるペプチドに向けられている。当該抗原は、典型的にはウイルス性または寄生性の病原に由来する抗原である。ペプチド設計のための我々の基本方針は、夫々のクラスターペプチドを、クラスＩ分子と共同してＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞により認識される免疫優勢部位であることが先に同定されており、またＨＩＶ−III ＢエンベロープタンパクのＶ３ループまたは主要中和性決定領域内に存在する短い合成ペプチド（ペプチド１８）に連結することである。
【００１１】
広範なＭＨＣタイプ（マウスのＨ−２遺伝子座、ヒトのＨＬＡ遺伝子座と等価）を有する宿主を、本発明のペプチドで免疫感作することによって、液性および細胞性の両方の成分を有する免疫応答がもたらされる。液性サイドでは、高力化の中和性抗体応答が観察される。細胞性免疫応答に関しては、細胞障害性Ｔリンパ球およびヘルパー細胞の両方が誘導される。
【００１２】
使用するエピトープを適切に選択することによって、多くの病原株に対して広い特異性を有する応答が誘発される。これは、例えばＨＩＶに見られるように、標的病原の株間で抗原構造に大きな多様性があるときに特に重要である。多くのＨＩＶ株に対して特異性の広い応答を生じるようにペプチドを設計する一つの方法は、同時継続のアメリカ合衆国特許出願07/760,530（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００１３】
従って、本発明の一つの目的は、広範囲のＭＨＣタイプを発現する複数の宿主において、Ｔヘルパー応答、細胞毒性リンパ球応答および高力化の中和性抗体の全てを誘発するペプチドを提供することである。
【００１４】
本発明のペプチドは、診断の目的においても有用である。例えば、実施例に開示した特定のペプチドは、ＨＩＶに感染した個体において、Ｔヘルパー細胞、細胞障害性Ｔリンパ球およびＢ細胞（Ｂ細胞前駆体および成熟血漿細胞の両方）の免疫機能を試験する種々の試験フォーマットで用いることができる。従って、ここに記載するペプチドを試薬に用いる診断方法および免疫機能試験を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１５】
本発明のペプチドで免疫感作された宿主において誘発される広範囲の免疫応答によって、予防的または治療的の何れであれ、寄生性またはウイルス性の感染、特にＨＩＶ−１感染に対するワクチンを提供することも、本発明の更なる目的である。
【００１６】
本発明の更なる目的は、寄生性またはウイルス性の病原、特にＨＩＶ−１ウイルスに対して広範な免疫応答を誘発するような、哺乳類宿主を免疫化する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のペプチド類は、例えばアメリカ合衆国特許出願第751,997号に記載されているような多重決定基Ｔヘルパーエピトープを有するペプチド、例えばアメリカ合衆国特許出願第07/874,311号または第07/148,692号に記載されているような細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ（好ましくは種々の標的ウイルス株と交差反応するＣＴＬを誘発するもの）を有するペプチド、および中和性交代を誘発する決定基（主要な中和性決定基（ＰＮＤ））を有するペプチドの共有結合性リンケージを含んでいる。夫々の場合におけるエピトープ類は、広範な主要組織適合性複合体抗原（ＭＨＣ）を有する宿主によって認識されることが示され得るエピトープ類である。このＭＨＣは、ヒトではＨＬＡとも称され、組織移植片が宿主によって受容されるかまたは拒絶されるかを部分的に決定する細胞表面タンパクである。ＭＨＣタンパクは、免疫応答の初期段階において、免疫系に対する抗原の提示に関与している。本発明のペプチド類が多くの異なったＭＨＣまたはＨＬＡタイプによって認識されるという事実から、それらのペプチド類は当該宿主ポピュレーションの大部分において有効であることが期待される。
【００１８】
更に、本発明のペプチド類は、当該抗原に対する高力価の中和性抗体であって、その配列が該抗原に由来している抗体を誘発するという性質を示す。本発明のペプチドを用いたウイルス感染個体の免疫機能を評価する方法は、個体から単離して当該ペプチドと共にインキュベートした細胞の応答を測定するイン・ビトロ試験である。例えば、患者から取り出した抹消血液細胞を本発明のペプチドと共にインキュベートし、これに特異的に応答したサイトカイン類の放出を測定することによって、活性を評価することができる。測定すべき好ましいサイトカインはインターロイキン−２（ＩＬ−２）である。測定方法は、当該技術において公知の何れの技術であってもよく、例えば、インキュベートされた抹消血液細胞の培養上清中において、インターロイキン−２依存性細胞ラインの増殖を測定することである。或いは、ＩＬ−２（または他のサイトカイン類）のＥＬＩＳＡ試験を行うことができる（本明細書の一部として組み込まれる合衆国特許出願第07/751,998を参照のこと）。本発明のペプチドを用いた免疫化方法は極めて単純であり、例えば一以上の本発明のペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリア溶液もしくはアジュバントを含む滅菌組成物を静脈注射すればよい。或いは、当該ペプチドは、同時継続のアメリカ合衆国特許出願第08/032,494号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載されているように、放射線照射された抗原提示細胞の表面に結合させて投与することができる。
【００１９】
〔発明の詳細な説明〕
中和性応対応答を増強するための補助を提供する研究において、我々は、クラスターペプチドをＰＮＤ内に含まれるペプチド１８（Ｐ１８）に直接連結した。Ｐ１８は、ＨＩＶ−１・III Ｂ・ｇｐ１６０のアミノ酸残基３０８−３２２からなっている［配列の番号付けは、Los Alamosデータベース（４３）に従った。これは、我々が以前に用いたRatner et al．（４２）の番号付けよりも７少ない］。Ｐ１８はまた、免疫優勢な細胞障害性のＴ細胞部位を含んでいる（４５，４６）。Ｐ１８領域に対して相同性であるｇｐ１６０エンベロープタンパクの領域（III Ｂ以外の他のＨＩＶ株に由来するもの）が、同様の方法で用いられ得ることを理解すべきである。例えば、実施例III は、免疫原ペプチドにおけるＣＴＬエピトープとして、ＭＮ株のＰ１８領域を用いたときに得られた結果を示している。ＨＩＶの種々の株に由来するＰ１８領域の代表的なペプチド類は、同時継続中のアメリカ合衆国特許出願第07/847,311号に記載されている。
【００２０】
ハプテンペプチドの免疫原性は、Ｔヘルパー決定基に対する線形重合または結合によって増大することが示されている（４７−４９）。当該クラスターペプチドは、多重ＭＨＣハプロタイプにおける補助を提供するにちがいない。これらペプチドの幾つかで１回追加免役した直後に、幾つかのＭＨＣタイプのマウスにおいて、著しく高い中和力価が得られた。我々は更に、ペプチド１８に対する中和性抗体の詳細な特異性および親和性を調べた。このアプローチは、ＨＩＶ感染の免疫予防および免疫治療に用いる合成ペプチドワクチンのためのペプチドの設計に用いることができる。
【００２１】
以下に記載する実施例において用いた材料および方法の幾つかは、２以上の実施例において用いられる。これらの材料および方法につ、一般的な材料および方法として説明する。
【００２２】
一般的な材料および方法
〈ペプチドの合成〉
クラスターペプチド／ペプチド−１８構築物およびＴヘルパー／ペプチド−１８構築物は、表Ｉに示した配列（配列番号１〜６）に従い、ｔ−ｂｏｃ化学を利用して、ペプチド自動合成機（No.430A ；アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー，ＣＡ）で合成した。ペプチドはＨＦを用いて樹脂から切り離され、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｐ４バイオゲル；バイオラッド・ラボラトリーズ社、マウンテンビュー、ＣＡ）によって初期精製された。μボンダパック(μbondapack)逆相Ｃ１８分析および調製用カラム（ウオーターズ・アソシエーツ社、ミッドフォード、ＭＡ）によって、単一ピークになるまで精製が行われた。ペプチド５５−１８は、環化してピログルタミン酸の形成をもたらすＮ末端のＧｌｎを回避するために、Ｎ末端のエキストラＡｌａを用いて合成された。
【表１】
2006056893.tif 000002
【００２３】
個々のエピトープまたは多重決定基のエピトープを含むペプチドは、上記のようにこれらを共線形ペプチド(colinear peptide)として合成することによって、一緒に結合することができる。或いは、側鎖カルボン酸基およびアミノ基は、ペプチド結合の形成のために用いられ得る。側鎖を介したペプチドの結合によって、分枝構造を有する免疫原が提供される。第三の態様においては、ペプチドは非ペプチド結合によって連結され得る。ペプチドを結合するための幾つかの方法は、当該技術において周知である。このような一つの方法は、アメリカ合衆国特許第4,886,782号に記載されている。
【００２４】
〈マウス〉
Ｂ１０バックグラウンドでのＨ−２類遺伝子マウス(H-2 congenic mice)をジャクソン・ラボラトリーズ社（バーハーバー、ＭＥ）から購入し、またはバイオコン・インク社（BioCon Inc.,ロックウイル、ＭＤ）の我々のコロニーで繁殖させた。この研究で用いたマウスは８〜２０週齢であった。
【００２５】
〈ＥＬＩＳＡ〉
丸底の可撓性ＰＶＣマイクロタイタープレート（＃3912 Falcon Labware、オックスフォード、ＭＥ）のウエルを、夫々１０μＭのペプチド１８、置換されたペプチド１８、クラスターペプチド３、クラスターペプチド６、0.2 μｇ／ｍｌの組換えｇｐ１２０（ＡＢＴ、アドバンスト・バイオテクノロジー社、ＭＡ）または pH 9.6 の 0.1Ｍ炭酸緩衝液中の２μＭ鯨精液ミオグロビンの各１００μｌを用いて、４℃で一晩コーティングした。組換えｇｐ１２０プレートを、0.2μｇ／ｍｌのアフィニティー精製されたｒｇｐ１２０（ＡＢＴ）を炭酸緩衝液中に含有させたもの１００μｌを用いてコーティングした。このプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ＢＳＡを用いて４℃で１〜１．５時間ブロック処理し、0.05％トウィーン２０およびＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴＢ）で洗浄した。次に、１００μｌの被検血清を二つのウエルに添加し、４℃で１〜１．５時間インキュベートした。この被検血清は、1;100〜1:10,000のＰＢＳＴＢ中に１０倍希釈した状態で試験された。次いで、自動プレート洗浄機（バイオラッド社、モデル1550）を用い、ウエルを２００μｌのＰＢＳＴＢで１０回洗浄し、1:7500でＰＢＳＴＢ中に希釈した１００μｌのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（プロメガ社、メジソン、ＷＩ）と共に４℃で１時間インキュベートした。１０回洗浄した後、基質として１００μｌの１ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルホスフェートを添加することによって結合抗体を検出した。４０５nmでの光学密度をＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。関連抗体でコートしたウエルでの４０５nmの光学密度から、無関係の鯨精液ミオグロビンでコートしたウエルでの４０５nmの光学密度を差し引いたものとして、特異的吸光度が測定された。ヤギ抗マウスμ鎖特異的抗体（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）に続いて、アルカリホスファターゼ結合抗ヤギを用いることにより、ペプチド１８に特異的なＩｇＭが検出された。ビオチン結合ラット抗マウスモノクローナル抗体として、ＬＯ−ＭＧ１−１３（ＩｇＧ１）およびＬＯ−ＭＧ２ａ−３（ＩｇＧ２ａ）（バイオソースインターナショナル社、ウエストレイク・ビレッジ、ＣＡ）を用いることにより、全ＩｇＧ、並びにアイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａが検出された。ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（シグマ・イムノケミカルズ社、セントルイス、ＭＯ）の添加に続いて、基質を添加し、プレートをＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。
【００２６】
以下に、実施例により本発明を詳細に例示する。これらの実施例は本発明の好ましい態様として例証として提示されるものであり、如何なる形でも本発明の限定を意味するものではない。
【実施例】
【００２７】
例Ｉ：ＨＩＶ−１に対する高力価中和抗体を産生させるためのマウスの免疫感作
本発明のペプチドは、該ペプチドで哺乳類宿主の免疫感作をすることにより、標的抗原に対して高力価のＡｂＮを産生させるために用いることができる。この例においては、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０の配列に由来するペプチドを用いて、マウス中で高力価のＡｂＮを誘発させる。
【００２８】
免疫感作
マウスを、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）中に１：１でエマルジョン化した２０ナノモルのそれぞれのペプチドの腹腔投与によって免疫感作した。２１日目および３１日目の時点で、免疫感作後の血液を眼窩後方からの採血(retroorbital bleed)により採取し、凝血させ、血清を除き、−２０℃で冷凍した。１次免疫感作の２１日後から３１日後の間にも、抗体レベルはいまだに上昇し続けることが分かったので、３１日目の血清での結果を報告する。１次免疫感作の３６−５２週後に、腹腔内へのＣＦＡ中の１０ナノモルのペプチドにより選択されたグループの動物を追加免疫し、一般的に２次応答が最適になると知られている、１０−１１日後に採血された。
【００２９】
ＨＩＶ−１の中和アッセイ
ＣＥＭ−ＳＳ細胞を用いての、伝染性の定量的マイクロアッセイを、すでに記載されている（５２）ように行った。要約すれば、Ｈ９細胞の対数増殖期の培養によって得られた、最適に増殖した２００シンシチウム形成単位（ＳＦＵ）のＨＩＶ−１−ＩＩＩＢ株またはＨＩＶ−１ＭＮ株を含有し、かつ予め低温保存して力価測定された５０μｌの培養上清に対して、熱不活性化（５６℃，３０分）試験血清５０μｌの連続２倍希釈系列を混合し、この混合物を室温で３０分間インキュベートした。その混合物を５×１０4細胞のＤＥＡＥ−デキストラン処理されたＣＥＭ−ＳＳ細胞を含んでいる二重ウエル(duplicate wells)に加えて、３７℃で１時間おいた後、ウイルスと抗体との混合物を除き、培地を取り換えて、完全培地のみで５日間（ＨＩＶ−１−ＩＩＩＢについて）、または４日間（ＨＩＶ−１ＭＮについて，それぞれのウイルス株にとって最適であることが確定している）、細胞を５％ＣＯ2の下に３７℃で培養した。感染ウイルスの単位を、倒立顕微鏡の下での被感染細胞の、続いて起こるシンシチウム形成から定量した。逆数幾何（相乗）平均中和力価は、ＨＩＶ−１の指摘された株に感染した対照ＣＥＭ−ＳＳ／ＨＩＶ−１感染細胞の９０％超よりも多く（すなわちＶｎ／Ｖｏ＜０．１）においてＨＩＶ−１フォーカスの阻害が可能である血清希釈として表現された。このアッセイは、最初のインキュベーションにおいて細胞から遊離しているウイルスの中和を測定するものであって、感染ウイルスの計数についての読取りにすぎないような、シンシチウム形成の阻害を測定するものではない。ＣＥＭ−ＳＳ細胞に対する、血清単独での細胞増殖抑制性または毒性は、試験された最高濃度においても観察されなかった。５６℃での３０分間の熱不活性化により、マウス血清の非特異的中和作用が除かれることもまた示されている（５３）。
【００３０】
蛍光による直接結合の定量
天然のｇｐ１２０に対するペプチドに誘導された抗体の結合を評価するために、選択された中和血清および非中和血清の連続１０倍希釈系列が、生存細胞免疫蛍光定量法（ＩＦＡ）において、ＨＩＶ−１−ＩＩＩＢが豊富に感染した細胞の表面上に発現したウイルスｇｐ１２０について試験された（５２）。
【００３１】
拮抗ＥＬＩＳＡ結合曲線
結合性試験は、無菌のポリプロピレン試験管内で、１２５μｌの、１％卵アルブミンおよび０．０５％トゥイーン２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に含まれる異なる希釈度のｐ１８（０−２０μＭ）またはｒｇｐ１２０（０−１６０μＭ）と、１２５μｌの、上記と同じバッファーに含まれる、抗体希釈度に対して吸光が直線領域にあることが確認されている一定希釈度の抗血清とを混合することにより実施された。穏やかに振盪しながら４０℃で一夜インキュベーションをした後、１００μｌの量を拮抗抗原ｐ１８またはｇｐ１２０のそれぞれでコートしたマイクロタイター・プレートの二重ウエル(duplicate wells)に加え、４０℃で２０分間インキュベートし、標準ＥＬＩＳＡアッセイを行った。市販のソフトウエア・プログラム（バイオメタリックス社(Biometalics Ink.)製、プリンストン、ニュージャージー州）を用いて、吸光度に対する血清希釈度の対数の、パラメーターが４つのロジスティック関数を用いた結合曲線を作り、個々の血清の解離定数（Ｋd値）を算出し、決定した。
【００３２】
Ｐ１８置換ペプチドへの結合
中和血清および非中和血清の特異性を、プラスチック・マイクロタイター・ウエルにコートした１５種類の置換されたｐ１８ペプチド（３７）への結合についての標準ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。
【００３３】
合成された多決定基ペプチド（表Ｉ）は、「クラスターペプチド」と称し（特定構築物の名称としてＰＣＬＵＳと略称する）、それぞれは、すでになされた研究（４２，５４，５５）において同定された、一部重複しながらも異なっている、短くなったＴヘルパー決定基の団塊を構成している。この研究で用いられた３種類のクラスターペプチド、ＰＣＬＵＳ３、４、および６を選んだのは、これらがＩ−Ａ分子およびＩ−Ｅ分子の両方、並びに多様性(multiple)ＨＬＡタイプのヒトにおけるのとも異なって（４２，５６，５７）、マウスの４種の独立のＭＨＣハプロタイプにおいて増幅反応(proliferative responses)を誘発する基準を充足したためである。ＰＣＬＵＳ１はマウスのＢ１０．ＢＲ株のみに強く認識され、さらに３６個体のＨＩＶ血清陽性・インフルエンザ陽性ドナーのうちの２３個体においてＩＬ−２産生を刺激した。ＨＰ５３ペプチド（ロス・アラモス(Los Alamos)のデータベース（４３）のナンバリングでは８２７−８４１残基であり、これはラトナー(Ratner)（４４）が以前に用いたもの（４２，５４，５５）よりも７小さい）並びにＨＰ５５ペプチド（８３４−８４８残基）は以前に、それぞれＡkＥkおよびＡbＥbハプロタイプ並びにＡkＥk、ＡbＥb、ＡdＥdおよびＡsＥsハプロタイプのマウスにおけるＨＩＶ ＩＩＩＢエンベロープ配列のＴヘルパーエピトープとして同定されており、より長いＰＣＬＵＳペプチドの中に含まれる。（ＥbおよびＥsは、ここではそれぞれ、発現されたＥβbＥα分子およびＥβsＥα分子を指摘するために用いる。非多形性(nonpolymorphic)Ｅαは、純粋なＨ−２bおよびＨ−２ｓハプロタイプでは発現されないけれども、我々はＥαを発現する組換え株を用いた。）ＨＰ５３ペプチド（ｅｎｖ ＴＨ４．１とも称する）もまた以前に、無症候性ＨＩＶ−血清陽性ヒト患者の末梢血リンパ球におけるＩＬ−２産生を誘発することが示された（５７）。ペプチド１８（３０８−３２２残基）は、主要中和決定基（ＰＮＤ）として知られているＨＩＶ−１−ＩＩＩＢエンベロープの超可変Ｖ３ループ領域の範囲内に位置するＢ細胞エピトープであり、ヒトＣＴＬにより認識されるのと同様（４６）、マウスにおける主要免疫優性細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである（４５）。
【００３４】
クラスターペプチドのカルボキシ末端でペプチド１８を合成することにより、合成ペプチドワクチン構築物が調製された。ペプチド１８のみで免疫感作されたマウスにおいてはペプチド１８に特異的な抗体が検出されなかったのに対し、２０ナノモルの上記の構築物によるマウスの免疫感作により、ペプチド１８への特異性が高められた抗体が産生された（表ＩＩ）。クラスターペプチド３−１８は試験された４株すべてにおいて抗体反応を誘発したが、逆の極性の構築物、即ち、ヘルパー部位がＰ１８に対しＣ末端側であったＰ１８−クラスターペプチド３は、ペプチド１８への抗体反応を有意に低いレベルで、しかもＢ１０．ＨＴＴ−株のみにおいてしか誘発しなかったので、Ｔヘルパー細胞およびＢ細胞のエピトープの向き(orientation)が、構築物の免疫原性にとって必須であることが立証された。
【表２】
2006056893.tif 000003
【００３５】
ほとんどの事例において我々の作成した構築物のＴヘルパーペプチド成分は、以前の研究（５４，５８）でこれらＴ細胞エピトープが増幅反応を誘発した株において、ペプチド１８特異的抗体産生を助ける働きをした。ペプチド５３−１８およびペプチド５５−１８の例では、ＡbＥbおよびＡkＥkハプロタイプがペプチド５３−１８に反応し、ＡsＥs、ＡdＥdおよびＡbＥbハプロタイプがペプチド５５−１８に反応した（表ＩＩ）。加えて、ＡsＥsマウスはペプチド５３−１８に反応したが、ＡkＥkマウスは、Ｐ５５への反応において増幅することが以前に示されていた（５４）にもかかわらず、ペプチド５５−１８に対する抗Ｐ１８抗体作ることができなかった。ＰＣＬＵＳ１−１８は、この研究で用いられた全４株のマウスにより認識されるＴヘルパー細胞エピトープを包含し、Ｂ１０．ＢＲ−株のみにおいて強力な抗体応答を誘発し、かつ他の二株、Ｂ１０．Ｄ２およびＢ１０．ＨＴＴにおいてわずかな抗体応答を誘発する。この事は驚くべきことではない、なぜなら、以前の我々の研究において（４２）、クラスターペプチド１は単にその部分の総和ではなく、むしろ該クラスターペプチドよりも小さいその構成要素が増幅を誘発したいくつかの株において、増幅を誘発できなかったことが示されているからである。。大型のペプチドは、それ自体に折り重なってＭＨＣもしくはＴ細胞レセプターとの相互作用を妨げるのかもしれないし、または構成要素のエピトープを破壊するような異なるプロセシングを受けるのかもしれない。ＰＣＬＵＳ３−１８、４−１８、および６−１８は、ＥＬＩＳＡにより定量したときに、少なくとも１つの実験において試験されたマウス全株において強いペプチド１８抗体応答を誘発した。これらの結果は、Ｂ細胞エピトープを免疫優性Ｔ細胞エピトープのクラスターのカルボキシ末端に連結することにより、ほとんどの場合において、個々のエピトープのプロセシングが利用され、且つ、誘発されたＴ細胞は特異的抗体の産生についてＢ細胞を助ける働きを為し得ることを示す。これらのクラスターペプチド−ペプチド−１８構築物による単独免疫感作により高いレベルのＰ１８特異的抗体が誘発され得るので、我々は、ウイルスの攻撃の代りとなるであろう追加免疫により、増強されたペプチド１８特異的抗体を生じる特徴的な２次免疫反応を生起させ得るか否かを調べることを試みた（図１）。応答が２次免疫感作よりも遅い１次免疫感作の後の２１日目および３１日目に血清を得たが、抗体レベルは３１日目においてもまだ上昇し続けた。それゆえ、我々は、パネルＡにおいて、２０ナノモルのＰＣＬＵＳ６−１８で免疫感作され、免疫感作の３１日後に採血された動物についての個体平均ペプチド１８特異的吸光度を示し、これをパネルＢの結果、即ち１０ナノモルのＰＣＬＵＳ６−１８で１次免疫感作の３７週後および４９週後に追加免疫されて、２次応答が通常はピークに達する１１日後に採血された動物についての個体吸光度と比較した。追加免疫後に観察される抗体応答の増加は、２．５倍から１２倍の間であった。
【００３６】
ワクチンにおけるこれらの合成ペプチド構築物の有用性を評価するために、これらの構築物による単独免疫感作の後にペプチド１８に対して誘発された抗体が、イン・ビトロでウイルスを中和することが可能かどうかを測定することが必要であった。対照ＣＥＭ−ＳＳ／ＨＩＶ ＩＩＩＢ感染細胞に比較して９０％超も多くＨＩＶ ＩＩＩＢの細胞遊離感染ユニットを阻害することが可能な逆数幾何（相乗）平均力価として現された中和活性が、特異的抗体による応答のあった株においてペプチド５３−１８、５５−１８およびＰＣＬＵＳ１−１８で誘発された。しかしながら、抗体は、５３−１８で免疫された動物５個体の中の１個体のみ、並びに５５−１８で免疫された動物およびＰＣＬＵＳ１−１８で免疫された動物の５個体の中の２個体のみにおいて中和作用があった（表ＩＩ）。同群の中のほかの動物におけるＥＬＩＳＡでの定量によって、ペプチド１８特異的抗体が同レベルまたはより高いレベルであるにもかかわらず、このことが起きた。ペプチド１８特異的抗体レベルの総和が中和とは相関性を有さないことの発見は、ＰＣＬＵＳ４−１８で免疫された動物における株間比較にまで及んだ。前採血された(prebleed)対照に比較すれば、ＥＬＩＳＡではすべての株が有意なレベルでペプチド１８に対する抗体の応答を示すが、試験された最低希釈度で中和抗体を産生したのはＢＡＬＢ／ｃ株の動物４個体の中の１個体のみであった（表ＩＩ）。特異的なペプチド１８抗体の応答と中和活性との間の相関性の欠如は、ＰＣＬＵＳ３−１８で免疫された動物において特に明白である。ＥＬＩＳＡで定量したところによれば、有意なレベルのペプチド１８特異的抗体が、ＰＣＬＵＳ３−１８で免疫されたマウスのすべての株で誘発され、ＡsＥsハプロタイプの動物が、この構築物への最強の抗体応答を示した。にもかかわらず、ＥＬＩＳＡによれば抗体は低いレベルでありながら、Ｈ−２dハプロタイプの動物においてのみ、抗体は、イン・ビトロでウイルスを中和することが可能であった（動物１０個体のうち９個体）。この発見から、Ｂ細胞エピトープ（ペプチド１８）抗原による中和抗体のイン・ビボ誘発は、ヘルパーＴ細胞、または他のＭＨＣ結合調節因子の特異性のような補助のレベルに加えて、別の要因にも依存することが示唆される。
【００３７】
ＰＣＬＵＳ６−１８は、ＥＬＩＳＡ定量によれば有意な抗体応答を誘発した全被験株において再現性をもって中和抗体を誘発した（表ＩＩおよび表ＩＩＩ）。ＢＡＬＢ／ｃ（４２．２）およびＢ１０．ＢＲ（３２．０）において達した幾何（相乗）平均中和力価は、相同の(homologous)生ウイルスの攻撃からチンパンジーを防衛する上で十分であることが知られている、Ｖ３ループを作用対象とする中和活性のレベル（３０）に相当する。ＰＣＬＵＳ６−１８での単独免疫感作の後の、各動物群についての２つの別の実験からの中和滴定のプロフィールを図２に示す。
【００３８】
それぞれの動物は腹腔内に、０．１ｍｌ量で、ＣＦＡ中にエマルジョン化（１：１）された２０ナノモルの合成ペプチドを投与された。中和活性は、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ ＨＸ３株を用いて、マイクロカルチャー・シンシチウム形成アッセイにより定量され、Ｖｎ／Ｖｏで表現される（ここでＶｎは二重テストウエル(duplicate test wells)におけるシンシチウム形成単位（ＳＦＵ）の平均値であり、Ｖｏは試験血清なしでインキュベートされた対照ウエルにおけるＳＦＵ値である）。それぞれの曲線は、一つの被験群のすべての動物の血清を含む前採血プール(prebleed pool)を除いて、個々のマウスの血清の連続２倍希釈系列を表す。２つの欄は、２つの別個の実験を表すものである。
【００３９】
第１のパネルに示されるＢＡＬＢ／ｃマウス５個体の中の３個体が、試験された最大の希釈度であった６４を超えて、９０％中和力価を有したことは注目に値する。加えて、パネル３および４に示されるＢ１０．ＢＲマウス５個体の中の３個体が、６４を超えて、中和力価を現した。クラスターペプチド６−１８により免疫感作された全動物の半分より多く（２２／４０）において、１：６４の希釈度での生ウイルスの５０％中和が例証され、１例を除くすべてが、試験された希釈度の１つにおいてウイルスの５０％を中和した。このＢ１０．ＨＴＴ株の動物番号６２６９の１個体は、ほとんど免疫感作されていないように思える群において、免疫応答が無視し得るものであった。１次免疫感作に反応したマウスに対して、最初の免疫感作の３７週または４９週後に、ＣＦＡ中の同じ構築物で単回の追加免疫が為された。この単回追加免疫により、多くの動物では１：２０４８−１：４０９６まで、幾つかにおいては１：１６，３８４まで９０％中和が起こるという、中和抗体の注目すべき高力価が得られた（図３及び表ＩＶ）。単に２回の免疫感作(just two immunizations)の後の相同の(homologous)ウイルス株に対するこれらの中和力価は、我々がこれまで観察してきたいかなる免疫感作により誘導されたポリクローナル血清の最高力価（８，５９）よりも、少なくとも４倍から８倍高い。さらに、時期の選択(the timing)から、１次免疫感作からの記憶が少なくとも１１か月持続することが示される。さらに加えて、ＰＣＬＵＳ６−１８ ＩＩＩＢ（配列番号３６）により追加免疫された４株の中の３株において、その血清は、とても低い力価であったが、ＨＩＶ−１ ＭＮ株をもまた中和することができた（表ＩＶ）。Ｈ−２dハプロタイプのマウスで、単回の追加免疫後にＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに対する最高の中和力価が得られることもある（例えば１：１６，３８４）が、これらの血清には、ＭＮ株に対する交差性中和活性を示したものはなかった。ある種の血清が高い中和活性を有し、同じ短配列に対して同様のＥＬＩＳＡ力価を持つ他の血清がそうでないのはなぜかを説明することを試みるために、我々は、それぞれのクラスターペプチド−ペプチド−１８での免疫感作により産生された中和抗体および非中和抗体の親和性、アイソタイプ、精密な特異性および他の特性を比較した（表ＩＩＩにおいて要約されている）。全被験血清は、１種類の動物（Ｂ１０．ＢＲ＃９７７０）のものを除いて、９０％阻害の基準によれば非中和的なものであっても、対照血清と比較しての５０％阻害で評価することにより、希釈度によってはウイルスを中和し得ることになるということは重要であり、注意すべきである。このように、９０％阻害では非中和的である血清であっても、中和血清の区別が分かり難くなるような低いレベルの中和抗体を有しているかもしれないので、特異性の差異を識別することはより困難になるであろう。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表４】
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【００４０】
４欄の結果は、免疫蛍光によるＨＩＶ ＩＩＩＢ株感染細胞への直接結合を示す。中和力価とＩＦＡ力価との間には相関性はなかったが、クラスターペプチド６−１８により免疫感作された動物由来の、シンシチウム形成アッセイにおいて９０％までウイルスを中和することが可能である５血清のうちの３血清が、ウイルス感染細胞への結合を示した。ＰＣＬＵＳ３−１８，＃６２４５で、およびＰＣＬＵＳ６−１８，＃６２４９で免疫感作されたマウスからの２つの中和血清は、ＩＦＡによれば感染細胞に結合できなかった。加えて、２つの非中和血清の１つである、ＰＣＬＵＳ６−１８で免疫感作されたマウス＃９７７０からの血清は、シンシチウム形成アッセイにおける５０％阻害のレベルではいかなる中和活性も存在しないにもかかわらず、ウイルス感染細胞への結合を示した。この小さな試料においては、我々は、ＩＦＡにより中和血清と非中和血清との間の差異を検出できなかった。
【００４１】
クラスターペプチドにより免疫感作された動物からの血清を、ＥＬＩＳＡアッセイでｒｇｐ１２０への結合について試験した。表ＩＩＩにおけるＥＬＩＳＡアッセイから吸光度を比較するのは、同じ縦軸の中の値の間でのみ妥当であって、異なる縦軸の間では妥当でないことに注意しなくてはならない。というのは、それぞれのタイプのＥＬＩＳＡに対して異なる試薬とアッセイ条件が用いられるからである。前採血された対照血清は結合しなかったが、試験された免疫血清はすべてｒｇｐ１２０に結合し、中和血清と非中和血清との間に見られた有意なレベルの差は存在しなかった。加えて、Ｐ１８またはｒｇｐ１２０に結合したＩｇＭのレベルにおいても血清の間に差異は見られなかった。小さな試料において、Ｐ１８に対して誘発された抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ1であると決定された。被験血清に、アイソタイプＩｇＧ2aのいずれかの抗体を示すものはなかった。アイソタイプと中和活性との間には相関性は見られなかった。
【００４２】
Ｔヘルパー部位に対して誘発された抗体は、引き続くウイルス感染においてもある役割を果たすかも知れないので、クラスターペプチド−ペプチド−１８構築物により免疫感作された動物からの血清が、クラスターペプチドそれ自体への抗体を含むかどうかを確定することが重要である。さらに、もしもヘルパー部位に対する抗体が中和作用を有するならば、このことからペプチド１８への結合と中和との間の相関性の欠如についての理由を説明できるであろう。我々は、クラスターペプチド３単独またはクラスターペプチド６によりコートされたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡによってこの可能性を試験した。被験動物血清には、ＰＣＬＵＳ３への結合を示したものはなかった。それに対し、対照動物には抗クラスターペプチド６抗体を産生するものはなかったが、ＰＣＬＵＳ６−１８により免疫感作された動物はすべて、Ｔヘルパー部位に対して反応性を有する抗体を産生し、産生された抗体のレベルは、それらのペプチド１８への反応に比例した。しかしながら、さらに後に考察されるように、ｇｐ４１の細胞質内の尾部(intracytoplasmic tail)における位置およびＭＮ株についての交差性中和作用の欠如（表ＩＩＩ）からも、これらの血清の中和活性がクラスターペプチド６に対する抗体によるものであったということはありそうもない。このことから、この中和活性は、主として構築物のＰ１８部分に対して向けられるのに違いない。
【００４３】
中和能力における相違が、抗体の親和性における相違に起因するものである可能性が残されている。この可能性について試験するために、定量的感染性シンシチウムプラーク形成アッセイにおけるウイルス中和能力に基づいて選択された血清を、様々な濃度のペプチド１８またはｒｇｐ１２０と混合し、溶液相平衡に達するようにした。拮抗剤(competitor)の希釈物を、それぞれの抗血清の１０-3希釈物と溶液相平衡に達するように４℃で１夜インキュベーションを行った。次いで、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、競合するペプチド１８またはｒｇｐ１２０のそれぞれをコートしたプレート上で短時間のインキュベーションを行うことにより、遊離の抗体を定量した。５０％最大競合(maximal competition)に必要な濃度（ＩＣ50）は、Ｋdの概算値として、結合曲線からそれぞれの被験血清について決定された。それぞれの実験を３回から４回反復し、代表的な結果を図４に示す。全被験血清の結合親和性(Binding avidities)（Ｋdの逆数）は、ｒｇｐ１２０で試験した場合、ペプチド１８で試験した場合よりも対数で２以上大きかった（すなわち、対数で２小さいＩＣ50）（表ＩＩＩ）。ペプチド１８に対する中和血清および非中和血清の結合親和性は同等であり、ｒｇｐ１２０に対する親和性における差異は決定的ではない。ひとつの事例においては、クラスターペプチド６−１８により免疫感作された動物のＢ１０．ＢＲ株マウスナンバー９７７２からの中和血清は、対応する非中和血清のＢＡＬＢ／ｃ株ナンバー６２５１よりも、ｒｇｐ１２０について５倍低い結合親和性を示した。それに対して、この同じ群のもう一つの中和血清であるＢ１０．Ａ（５Ｒ）マウスナンバー９７７７は、対応する非中和血清６２５１よりも１．４倍低い結合親和性しか示さなかった。結合曲線が予測されたほど急勾配でなかったという事実から、ペプチド１８またはｒｇｐ１２０のいずれかに結合する抗体の集合体(the population)として、これらの血清は均質またはモノクローナルでなかったこと、並びに不均質性がこれらの結果に影響を及ぼしたかもしれないことが明らかになった。しかしながら、中和血清がしばしば非中和血清よりも低い親和性を有していたという事実から、中和作用は、ペプチドまたは組換えｇｐ１２０に対する高い平均親和性とは相関性がないことが示唆される。
【００４４】
特異性の精密な差異(fine specificity differences)が、ペプチド結合作用が同等の血清の中和作用における差異を説明し得ることの可能性を検討するために、我々は、ＨＩＶ−１−ＲＦ配列から１残基がＨＩＶ−１−ＩＩＩＢ配列における残基に置き換った、アミノ酸１つが置換したペプチド（表Ｖ参照、配列番号８−２３）を用いて、ＰＣＬＵＳ３−１８、およびＰＣＬＵＳ６−１８により免疫感作された動物からの中和血清および非中和血清の結合におけるそれぞれの残基の効果を調べた（図５）。
【表５】
2006056893.tif 000007
【００４５】
ペプチド１８のアミノ末端の置換もカルボキシ末端の置換も、ＰＣＬＵＳ３−１８またはＰＣＬＵＳ６−１８により免疫感作された動物からの、中和血清（ベタ塗りの棒グラフにより表される）または非中和血清（白抜きの棒グラフにより表される）のいずれかによる結合には影響を及ぼさないらしい。実際のところ、位置番号１１でバリンをチロシンに置換したときに、対照のペプチド１８よりも結合が増強され、位置番号１２、１３、１４、および１５での置換でも同様に増強することが明らかとなった。ペプチド１８配列ＰＧＲＡＦの、中央ループ領域において置換が為されたときは、両群の血清の結合は減衰した。この事は驚くべきことではない。なぜなら、配列ＧＰＧＲが中和抗体に対する結合部位であり、極めて明瞭な形状のβ屈曲(β-turn)コンホメーションを保持することが示されているからである（６０）。残基３１２においてグリシンをアラニンに置換（ペプチド１８−５）しても結合に影響しないことは驚くべきことであった。残基３１３のプロリンをアラニンに置換（ペプチド１８−６）しても、推定上の逆回転コンホメーションを破壊する点での効果にもかかわらず、結合性をさらに完全には無力化しなかったこともまた驚くべきことであった。最も興味深い置換は、置換位置番号８、アミノ酸残基３１５においてであった。中和血清は、非置換ペプチド１８に対する結合よりも有意に劣るとしても、この残基においてアルギニンをアラニンに置換したペプチドに対する結合を保持したのに対し、非中和血清は、この置換ペプチドに対して結合しなくなった。我々は、追加の血清を用いて、さらに該中央ループ領域を試験した。実験の結果を図６に示す。クラスターペプチド３−１８により免疫感作された動物からの中和血清および非中和血清はともに（図６Ａ）、６、７、８および９の位置で為された置換については結合の減衰を示した。しかしながら、非中和血清は結合しなかったのに対し、中和血清は、位置番号８で置換されたペプチドに対して、わずかな程度の結合を保持した。同様に、下側のパネルにおいては、ＰＣＬＵＳ６−１８により免疫感作された動物からの中和血清および非中和血清も、６、７、８および９の位置で置換が為されたペプチドに対する結合において劇的な減衰を示した。しかしながらやはり、中和血清は、位置番号８でアルギニンに対してアラニンが置換されたペプチドに対して、より高いレベルの結合を保持した。もう一つの実験においては、同じ程度に多くの置換について試験されたのではなかったとはいえ、中和血清と非中和血清との間の、８の位置の効果における差異はさらに顕著であった。３１５残基でのアルギニンのアラニンへの置換は、それが中程度の結合を保持するのが中和血清であることから、置換による影響は不明瞭である。しかしながらこの結果を、位置６および位置７での置換の結合に対する効果は非中和血清よりも中和血清の方が僅かながら大きいことと結び付けることにより、中和血清はループの頂部により強く集中され、非中和血清は中央ループに隣接するカルボキシ側により強く集中されるのであろうことが示唆される。この様に、細部の特異性における微妙な違いから、同程度にペプチドおよびｇｐ１２０への結合作用を有する血清の間���中和活性における差異が説明されるかもしれない。
【００４６】
本研究は、多様性(multiple)ＨＬＡタイプにおいて免疫原性が増強された合成ペプチドワクチンを構築することを目的とした、中和性Ｂ細胞エピトープと免疫優性Ｔヘルパー部位のクラスターとを組み合わせることの有用性を証明する。本研究のために選ばれたＴヘルパー部位は、ＨＬＡタイプの広範な系列(a broad array)を示すＨＩＶ感染患者からのヒトＴ細胞と同様に多様性(multiple)Ｈ−２タイプのマウスにより認識されることが以前に示されている、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０の多決定基領域を含む。我々の基本方針(strategy)は、それぞれのクラスターペプチドを、クラスＩ分子と共働してＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞により認識される免疫優性部位であることが以前に同定され、且つＶ３ループ、すなわちＨＩＶ−ＩＩＩＢエンベロープタンパク質の主要中和決定基領域の中に発見された、短い合成ペプチド（ペプチド１８）に連結しようとするものであった。これら構築物、ＰＣＬＵＳ３−１８、ＰＣＬＵＳ４−１８、およびＰＣＬＵＳ６−１８（表Ｉ）はすべて、１回の免疫感作後に、ｒｇｐ１２０への結合が可能なペプチド１８特異的な抗体を誘発した。これらの構築物の一つであるＰＣＬＵＳ６−１８により免疫感作された、４つの異なるＭＨＣハプロタイプを表すマウスからの抗体は、ウイルスを中和することが可能であった。ＰＣＬＵＳ６−１８により免疫感作された全株の動物の総和である３５個体中の２４個体（６９％）において、１回の免疫感作後に誘発された抗体は、９０％よりも高い比率で、相同性(homologous)ウイルスの感染性を阻害した。試験された株の中の３つにおいて、ＰＣＬＵＳ６−１８は、ＥＬＩＳＡによればペプチド−１８特異的反応を示す動物の８０−９０％で中和抗体を誘発した。興味深く、注意すべきことは、ある実験において２つのハプロタイプのマウスで達した逆数幾何（相乗）平均中和力価（Ｈ−２dにおいて４２．２およびＨ−２kにおいて３２．０）は、チンパンジーにおいて静脈投与でのウイルスの攻撃に対して防御することが知られているレベル（３０）に近いレベルであった。この平均値は低い概算値である、というのは、それぞれの群の多くの動物は、試験された最高希釈度であった６４よりも大きな中和力価を有していたからである。さらに、１回の追加免疫の結果、我々の経験においてほかのいかなる免疫感作のプロトコールで（８，５９）見られたよりもはるかに高い、１：１０００から１：１６，０００の９０％中和力価が得られた。ＰＣＬＵＳ３−１８は、被験株すべてにおいてペプチド特異的抗体を誘発したが、しかしＨ−２dハプロタイプの動物においてのみ、これらの抗体は一貫して中和性であった（マウス１０個体の９個体）。
【００４７】
ＥＬＩＳＡによるペプチド１８またはｒｇｐ１２０のいずれかへの抗体の結合活性のレベルは、クラスターペプチド−ペプチド１８構築物により誘発された抗体が中和性であるか否かを予見させるものではなかった。このことは、抗体応答の規模(magnitude)を増強するＴ細胞の補助のレベルに加えて、他の要因が該構築体への質的な反応に影響を及ぼすことが示唆される。ＥＬＩＳＡによれば同等のペプチド１８結合活性の血清の間で、中和活性に著しい差異が結果として現れる機構を調べるために、我々は、特異性、親和性および抗体のアイソタイプを比較した。興味深いことに、動物はペプチドで免疫感作されているにもかかわらず、ペプチド１８特異的抗体を含む血清はすべて、エンベロープタンパク質ｒｇｐ１２０に結合する抗体をもまた高いレベルで含有した。この発見から、ペプチド１８の短い合成配列の好ましいコンホメーションは、ある程度まで、それより大きなエンベロープタンパク質における対応領域のコンホメーションによく似ていることが示唆される。ＰＣＬＵＳ６−ペプチド１８により免疫感作された動物からの５つの被験血清のうちの３つは、IＦＡアッセイにおいて天然のｇｐ１２０を発現するウイルス感染細胞に結合したが、中和力価とＩＦＡによる結合との間にはいかなる相関性も発見されなかった。さらに加えて、予想に反して、中和血清は、非中和血清よりもｒｇｐ１２０に対してわずかに低い結合親和性を示した。明らかに、ｇｐ１２０のＶ３ループへの結合の規模および親和性に加えて、他の要因が中和作用に影響を及ぼす。
【００４８】
このことを研究するために、我々はアイソタイプおよび精密な特異性(fine specificity)における差異を調べた。アイソタイプの差異は無かった。中和血清および非中和血清はともに、ペプチド１８の中央ループ領域（ＰＧＲＡＦ）での置換物に対する結合の減衰を示したが、とは言えその結果は、ジャバヘリアン(Javaherian)ら（６１）の経験に一致して、中和血清は該ループの頂部により強く集中し、非中和血清は該中央ループに隣接するカルボキシ側により強く集中することを示唆するものであった。
【００４９】
この研究での結果は、Ｔヘルパー部位（即ちＴ１ペプチド残基４２１−４３６）を、ＳＰ１０と称する長いペプチド（即ち、Ｖ３ループの範囲内に位置する残基２９６−３１４）に結合することにより合成ワクチンを作成した以前の研究結果と両立する（６２，６３）。この構築物により免疫感作された動物では、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質への増幅反応も、異なる免疫感作の処方計画を用いた一連の免疫感作後の中和抗体もともに発現した。Ｔ１はＰＣＬＵＳ３の範囲内に含まれているが、多決定基領域を表さず、またＳＰ１０はペプチド１８と一部重複するが、中央ループのカルボキシ末端に向かう８残基を欠いている。Ｖ３ループは、中和抗体を誘発するウイルスエンベロープ上の唯一の部位ではないが（６４−６７）、直鎖状(linear)ペプチド配列により定義されることができ、且つそれの細胞レセプターであるＣＤ４分子に結合した後にそれに対する抗体がウイルスを中和し得る主要部位であるように思われる（２４，６１，６８，６９）。
【００５０】
この領域の超可変性から、この配列のどの程度の数の変異体がワクチンに含まれなければならないかについての疑問が浮上する。北アメリカおよびヨーロッパの分離株からのウイルスのＰＣＲでの研究から、比較的良く保存され、ＭＮまたはＳＣ分離株に極めてよく似たコンセンサス配列が存在することが示唆される（２４）。北アメリカおよびヨーロッパにおける被感染患者についての別の独立した研究において、被験者の大多数は、Ｖ３ループのＭＮ様変異体に反応する抗体を有することが示された（７０，７１）。該ループの比較的よく保存された部分のＧＰＧＲＡＦは、被験ＨＩＶの７分離株の４株を中和する抗体を誘発することが示されている（６１）。分離株に特異的な中和は、一般にみられる。被感染患者における中和回避突然変異体の存在は、コンホメーション変化を導くループ外での配列変異と同様、Ｖ３ループ自体の内部での配列変異と関係があるかもしれない（３３，７２）。合成ペプチドワクチンが、多くの感染分離株に対して適切な立体構造上の特異性を有する中和抗体を産生させる、分岐した(divergent)Ｖ３ループペプチドを含む多様な(multiple)構築物を含んでいなくてはならないということは、ありそうなことである。
【００５１】
本研究において、我々は、ワクチン接種の４９週後までに停止されたＰＣＬＵＳ６−１８での追加免疫による免疫感作が、ＥＬＩＳＡによれば、最初の応答の２．５−１０倍の大きさの応答を導くこともまた示した。抗体レベルにおけるこの上昇は、中和力価において、９０％中和については１：１０００から１：１６，０００に至るさらに高い上昇と相関し、また５０％中和についてもさらに高い上昇と著しく相関する（図３および表ＩＶ）。ＭＮ分離株において低い力価滴定値の交差反応性もまた観察された。追加免疫後５か月の時点で、ＥＬＩＳＡにより測定されたＰ１８に対する抗体の力価は、高いプラトーの状態に止まっていた。
【００５２】
重要な問題は、ＰＣＬＵＳ３−１８またはＰＣＬＵＳ６−１８による免疫感作が、Ｔヘルパー部位それ自体を対象とした抗体を誘発するかどうかを測定することであった。タンパク質全体に対しての抗体は、分子の取り込みおよびＴ細胞への提示を昂進することがこれまで示されてきたことから、Ｔヘルパー部位に対しての抗体が、Ｔ細胞レセプターが抗原提示細胞により提示される部位を認識することを遮断することはありそうもない。また、例外が報告されては来たが（７７，７８）、Ｔ細胞エピトープに対する抗ペプチド抗体によるＴヘルパー細胞への抗原の提示を遮断することは、通常は可能ではなかった（７３−７６）。我々は、クラスターペプチド６−１８のＴヘルパー領域に対して誘発される抗体があることを例証してはいたが、ワクチン接種３６−５２週後の１回の追加免疫に続いてこの構築物により免疫感作された動物において、反応の減衰を観察しなかった。もう一つの潜在的な関心事は、Ｆｃレセプターおよび補体レセプターを媒介とした（１６，７９）、ウイルスの感染性についての抗体媒介性の抗体増強である。ｇｐ４１のＮ末端部分に結合することが分かったものもあるが（１１，７９）、自然感染の間に、どの部位に対して昂進性抗体が誘発されるのか、現在は不明である。ＰＣＬＵＳ３に含まれる領域に対する抗体は、感染性を増強しないように見えた。クラスターペプチド６はウイルスエンベロープタンパク質の細胞質内ｇｐ４１領域の範囲内に位置しており、このことから、昂進性または中和性のいずれかではとてもありそうにない。結局、２つの理由から、中和活性の多くがヘルパークラスターペプチドに対して向けられていることはないであろうと我々は考える。第１に、ＰＣＬＵＳ３−１８構築物により免疫感作された動物からの中和血清において、我々は、ＥＬＩＳＡによってはＰＣＬＵＳ３に対する抗体を検出できなかった。ＰＣＬＵＳ６−１８により免疫感作された動物において、ＰＣＬＵＳ６に対する抗体がいくつか検出されたが、これらは、ウイルス粒子上には発現されないと考えられているｇｐ４１の細胞質内の尾部に対するものなので、ウイルスを中和できるとは考えにくい。第２に、ＰＣＬＵＳ３またはＰＣＬＵＳ６のいずれかに対する抗体は、もし中和作用があれば、ＨＩＶ−１のＭＮ株にも交差中和作用を有すると考えられる。というのは、これらの領域は、中和抗体が一般的にタイプ特異的となるＰ１８領域と比較すれば、相対的に良く保存されているからである。このように、交差中和作用の欠如（表ＩＩＩ）から、中和作用は主にＰ１８を対象とするものであり、ヘルパー部位を対象とするものではない。
【００５３】
加えて、別の研究において、ＰＣＬＵＳ３ペプチドの主要部分を表現するＴ１ペプチドに対する抗体は中和作用と関係がないことが分かった（８０）。
【００５４】
例II：ＨＩＶ−１に対するＣＴＬを誘発せしめるためのマウスの免疫
ＨＩＶは細胞から細胞への伝染によって広がり得るので、合成ペプチドワクチンを免疫療法の効果的な実施形態とするためには、ウイルス特異的なＣＴＬ応答を誘発せしめる能力が重要である。
【００５５】
例Ｉに記述されるペプチドは、ＴｈエピトープおよびＰＮＤに加えてＣＴＬエピトープを含む。このため、このペプチドを、マウスにおけるＣＴＬ活性の誘発についても試験した。
【００５６】
ここで、我々は、我々が限定条件下においてヘルパーとＣＴＬエピトープとの間の共有結合的結合の必要性を試験することを可能にする、エマルジョンを必要としないサポニンアジュバント、ＱＳ２１（１０３）、を用いる単一の免疫で問題を処理する。また、我々は、クラスIIＭＨＣにおいては異なるがＣＴＬ決定基を表わすＨ−２ＤdクラスＩ分子を共有する類遺伝子マウス系を用いることによって、ヘルパー活性のＭＨＣ結合を扱った。
【００５７】
我々は、既に、ＨＩＶエンベロープタンパクｇｐ１６０（４２）由来の、多重決定領域に及ぶ免疫優性Ｔｈペプチドを取り巻く合成ペプチドの構築（５４）を記述している。各々重複する決定基のクラスターからなる、これらの所謂クラスターペプチドが、多重ＭＨＣ型のマウスおよびヒトにおいて、それぞれイン・ビトロＴ細胞増殖およびサイトカイン生成を誘発することが見出された（４２）。この研究においては、３種類のクラスターペプチドを用いた：ＰＣＬＵＳ３（４２１−４４４残基、ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲ、配列番号２４）、ＰＣＬＵＳ４（４７６−４９９残基、ＲＤＮＷＲＳＥＬＹＫＹＫＶＶＫＩＥＰＬＧＶＡＰＴ、配列番号２５）、およびＰＣＬＵＳ６（８２１−８５３残基、ＡＶＡＥＧＴＤＲＶＩＥＶＶＱＧＡＹＲＡＩＲＨＩＰＲＲＩＲＱＧＬＥＲ、配列番号２６）である。ここで、ＨＩＶ−１ IIIＢナンバリングは、ロスアラモスデータベース（４３）に従った（以前の刊行物（４２）において用いたＲatnerら（４４）のものよりも７少ない）。
【００５８】
多重ＭＨＣ型において免疫原性であるペプチドワクチンを設計し、イン・ビボにおけるＣＴＬプライミング(priming)の機構を調べるために、各々のクラスターペプチドを免疫優性ＣＴＬ決定基、Ｐ１８（４５）（３０８−３２２残基、ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ、配列番号７）のＮ−末端で共に線状(co-linearly)に合成した。この決定基は、ＨＬＡ型の広い列を発現するＨＩＶ−感染患者由来のヒトＴ細胞（４６）に加えて、４種類の異なるＭＨＣ型のネズミＣＤ８+ＣＴＬ（１０４）によって認識されることが既に確認されている。Ｐ１８ペプチドはｇｐ１６０Ｖ３ループの一部およびｇｐ１６０の主要中和決定（ＰＮＤ）領域に相当し（２１−２３）、また、クラスII ＭＨＣ分子（Ｉ−Ａd）によって、適当なＭＨＣ型のマウスにおいてヘルパーＴ細胞にも渡されている（１０５）。
【００５９】
クラスターペプチド−ペプチド−１８構築体は、ｔ−ｂｏｃ化学を利用する自動ペプチド合成機（モデル４３０Ａ；Ａpplied Ｂiosystems、Ｆoster Ｃity、ＣＡ）で合成した（５１）。このペプチドを、ＨＦで樹脂から切り出し、最初にサイズ排除クロマトグラフィで精製した。μボンダパック（μbondapack）逆相Ｃ１８カラム(Ｗaters Ａssociates,Ｍilford,ＭＡ)上での逆相ＨＰＬＣによって単一ピークまでの精製を達成した。８−２０週齢のマウスを、ＱＳ２１（１５μｇ）と混合した各ペプチド２０ナノモルを用いて、尾幹皮下で免疫した。このＱＳ２１は、シャボンの木Ｑuillaja saponaria由来の高度に精製したサポニン画分であり、もっとも高いアジュバント活性を保持するが非毒性である（１０３）。単一免疫の２週間後、Ｂ１０．Ｓ（９Ｒ）（Ｈ−２d）（図７Ａ）、Ｂ１０．Ａ（５Ｒ）（Ｈ−２i5）（図７Ｂ）、またはＢ１０．Ｓ（９Ｒ）（Ｈ−２t4）（図７Ｃ）マウス由来の免疫脾臓（２４ウェル培養プレートにおいて、完全Ｔ細胞培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５ｘ１０-5Ｍ２−ＭＥを含有する、ＲＰＭＩ１６４０およびＥＨＡＡ培地の１：１混合物）中、５ｘ１０6／ｍｌ）を、０．１μＭのＰ１８および１０％ＣｏｎＡ上清含有培地（Ｒat Ｔ stim；Ｃollaborative Ｒesearch,Ｉnc.,Ｂedford,ＭＡ）を用いてイン・ビトロで６日間再度剌激した。51Ｃｒ標識された標的を用いる６時間アッセイで、イン・ビトロ２次ＣＴＬの細胞溶解活性を以前記述した通りに測定した（１０４）。この線維芽細胞標的は、全ｇｐ１６０タンパクを内在的に発現するＢＡＬＢ／ｃ．３Ｔ３形質導入体（Ｈ−２d、クラスＩ ＭＨＣ+、クラスII ＭＨＣ-）（細胞株１５−１２（参考文献（４５））であった。同様の結果が、ネオマイシン耐性遺伝子（１８ｎｅｏ細胞）のみを形質導入し、１μＭ Ｐ１８でパルス(puls)した対照ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３細胞を用いて得られた（データは示さず）。ｇｐ１６０形質導入体およびペプチド−パルス１８ｎｅｏ細胞の両者の対照として、特定のペプチドがない状態における非パルス１８ｎｅｏ標的細胞を用いるバックグランド溶解は８％未満であった。イフェクターをペプチド−パルス標的と、示されたＥ：Ｔ比で共培養した。特異的51Ｃｒ放出の割合を、１００ｘ（（実験による放出−自発的な放出）／（最大放出−自発的な放出））として算出した。最大放出は、５％トリトンＸ−１００を添加することによって溶解した細胞の上清から決定した。自発的な放出は、イフェクター細胞を添加することなくインキュベートした標的細胞から決定した。このアッセイを、ウェル当り５０００標的細胞を用いて、３回繰り返して行なった。
【００６０】
このように、クラスII において異なるが、クラスＩＤ4分子を共有する３種類のハプロタイプのマウス、Ｂ１０．Ｄ２（Ｈ−２d；ＡdＥd）、Ｂ１０．Ａ（５Ｒ）（Ｈ−２i5；ＡbＥb／k）、およびＢ１０．Ｓ（９Ｒ）（Ｈ−２t4；ＡsＥS／d）を、化合物ペプチド、ＰＣＬＵＳ３−１８，ＰＣＬＵＳ４−１８、もしくはＰＣＬＵＳ６−１８を含有する精製サポニン、またはＰ１８のみを用いて、尾幹皮下で一度免疫した。それらの免疫脾臓を、ＩＬ２の存在下において、イン・ビトロでＰ１８を用いて再度剌激した際に、全ｇｐ１６０タンパクを内在的に発現する形質導入ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３線維芽細胞標的（１５−１２と呼ばれる；参考文献（４５））（図７）の両者は殺すことができるが、対照ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３線維芽細胞標的（１８ｎｅｏと呼ばれ、ネオマイシン耐性遺伝子のみが形質導入されている）は殺さないＣＴＬが得られた。それらはまた、ペプチドＰ１８でパルスされたｇｐ１６０−陰性１８ｎｅｏ細胞（図８参照）をも殺すことができ、これはこの殺害がＰ１８残基に特異的であることを証明している。イン・ビボで化合物ペプチドによって感作したマウスは、７：１という低いイフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、Ｐ１８パルス標的の他に１５−１２に対する強いＣＴＬ活性を生じ、６０：１のＥ：Ｔ比で４５−７５％のレベルの特異的溶解に達した（図７Ａ、Ｂ、Ｃ）。反対に、Ｐ１８のみで免疫されたマウスは、６０：１の最大Ｅ：Ｔ比でさえも最低限のＣＴＬ活性を示すのみであった。１５−１２標的殺害のＥ：Ｔ比曲線におけるシフトは、化合物ペプチドで感作したマウスにおける、イン・ビボにおいてＰ１８のみで感作したマウスと比較して１０倍を越える数のＣＴＬ溶解単位を示している。非免疫マウスまたはアジュバントもしくはペプチドのみで免疫したマウスもまた、ＣＴＬに到達せしめることができなかった。また、Ｐ１８成分を持たないクラスターペプチドも特異的ＣＴＬを引き起こすことができなかった。ＱＳ２１と混合したＰ１８のみで免疫したマウスにおいてＰ１８に対するＣＤ８+ＣＴＬ応答が著しく減少するか、もしくは存在しないという発見は、イン・ビボにおけるＰ１８特異的ＣＴＬの誘発にＣＤ４クラスIIに制限される助力が必要であり、この助力がクラスターＴｈ決定基を有する化合物ペプチドを用いた免疫によって与えられる可能性を提示した。
【００６１】
ＣＴＬ決定基へのヘルパー決定基の共有結合的な結合がイン・ビボにおいてマウスにＣＴＬ応答を誘発せしめるために必要であるのか、あるいは、共有結合的に結合はしていないペプチドの混合物で十分であるのかどうかを試験するために、Ｂ１０．Ｄ２またはＢ１０．Ａ（５Ｒ）マウスを化合物ペプチドＰＣＬＵＳ３−１８もしくはＰＣＬＵＳ４−１８の各々で、または遊離ペプチドＰＣＬＵＳ３もしくはＰＣＬＵＳ４およびＰ１８の混合物で、またはＰ１８単独で、ＱＳ２１アジュバントに加えて免疫した（図８Ａ−８Ｄ）。マウスを、ＰＣＬＵＳ３−１８もしくはＰＣＬＵＳ４−１８の各々で、またはＰＣＬＵＳ３もしくはＰＣＬＵＳ４およびＰ１８の混合物で、またはＰ１８のみで、ＱＳ２１アジュバントに加えて免疫した。免疫したマウスに由来する脾臓細胞を、０．１μＭ Ｐ１８およびｒＩＬ１２（１０単位／ｍｌ、Ｇenzyme、Ｃambridge、ＭＡ）で６日間再度剌激した。ｇｐ１６０形質導入株１５−１２（図８Ａ、８Ｂ）または、Ｐ１８でパルスされた（１μＭ 一晩）、ｎｅｏのみが形質導入されている３Ｔ３線維芽細胞（図８Ｃ、８Ｄ）についてイフェクターの試験を行なった。ペプチドの非存在下における対照１８ｎｅｏ線維芽細胞に対するバックグランド溶解は８％未満であった。３回繰り返したウェルのＳＥＭでは、平均の７．２％未満であった。
【００６２】
このように、イン・ビボにおいてこの発明によるペプチドで免疫された脾臓細胞をＰ１８およびＩＬ−２で再度剌激した。これは、（培養物中にＴｈ細胞が存在しないので）イン・ビトロでのＴ細胞の助力における不足を補う。内在的にｇｐ１６０を発現する形質導入された１５−１２線維芽細胞株、およびＰ１８でパルスされた、もしくはペプチドでパルスされていない対照１８ｎｅｏ線維芽細胞の両者について、細胞溶解活性を測定した。ペプチドが存在しない条件下では、対照標的に溶解は観察されなかった。驚いたことに、混合物もしくはＰ１８のみで免疫されたマウスに由来する免疫脾臓細胞のＣＤ８+ＣＴＬ活性は、化合物ペプチドでの免疫が両株において強いＣＴＬ応答を引き出したのに対して、無視できるものであった（図８Ａ−８Ｄ）。Ｐ１８のみでパルスされた標的の溶解は、ＰＣＬＵＳ３もしくはＰＣＬＵＳ４でパルスされた標的に対するＣＴＬ活性の欠如と共に、結合要求がＰ１８決定基に特異的なＣＴＬ活性の誘導に適合することを示しており、そのため、化合物ペプチドによって誘発され、ｇｐ１６０−発現標的について観察されるいくかの他の活性によるものではない。これらの結果は、イン・ビボにおけるＣＴＬの誘発に、化合物ペプチドＰＣＬＵＳ３−１８およびおＣＬＵＳ４−１８中のＣＴＬ部位へのヘルパー部位としてのクラスターペプチドの共有結合的な結合が必要であることを示している。この発見は、３つの独立した実験において、一貫して再現可能であった。
【００６３】
化合物ペプチドでの免疫がＣＤ４+ＣＴＬを誘発するはずであるので、このペプチドによって誘発される特異的なＣＴＬの表現型を決定した。図９Ａは、１５μｇ ＱＳ２１中２０ナノモルの化合物ペプチドで免疫されたＢ１０．Ｄ２およびＢ１０．Ａ（５Ｒ）マウス由来のＣＴＬを、抗−ＣＤ８モノタローナル抗体（３．１５５；ラットＩｇＭ）（１１４）および補足物（黒塗りの棒）または抗−ＣＤ４モノタローナル抗体（ＲＬ．１７４；ラットＩｇＭ）（１１３）および補足物（白抜きの棒）、または補足物のみ（図示せず）のいずれかで以前記述した通り（２８）に処理し、標的として１８ｎｅｏでパルスされたＰ１８に対して試験した場合の結果を示す。
【００６４】
図９Ａに示されるように、このＣＴＬは通常のＣＤ８+ＣＤ４-ＣＴＬである。また、標的がクラスIIではなくクラスＩ ＭＨＣ分子のみを発現するので、このＣＴＬはクラスＩＭＨＣ分子によって制限されなければならない。この制限は、各Ｈ−２dクラスＩ分子で形質導入されたＬ−細胞を用いてＤd分子にマップされた。
【００６５】
反対に、ＰＣＬＵＳ−１８構築物によって誘発されるヘルパー細胞は、少なくとも免疫脾臓細胞のイン・ビトロ剌激における測定ではＣＤ４+であった。例えば、Ｂ１０．Ａ（５Ｒ）マウスを２０ナノモルのＰＣＬＵＳ４−１８で免疫し、それらの脾臓細胞を、組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２、１０Ｕ／ｍｌ）の存在下もしくは非存在下においてＰＣＬＵＳ４−１８もしくはＰ１８単独で６日間再度剌激する前に、抗−ＣＤ４（ＲＬ１７４、参考文献１１３）および補足物で、もしくはこれらなしで処理した。得られたイフェクター細胞を、標的としてのｇｐ１６０−発現１５−１２ＢＡＬＢ／ｃ線維芽細胞株またはｎｅｏのみ形質導入した線維芽細胞（図示せず）について試験した（図９Ｂ）。ｎｅｏのみ形質導入した対照標的については溶解は観察されなかった（４．２％未満）。３回繰り返したウェルのＳＥＭは平均の７．３％未満であった。対照としての、ＩＬ−２の存在下における（Ｐ１８に結合していない）ＰＣＬＵＳ４単独は、いかなるＣＴＬ活性も誘発しなかった。Ｐ１８単独ではないＰＣＬＵＳ４−１８は、ｒＩＬ−２の非存在下において、ＣＴＬ活性の誘発を剌激して助力を置き換えた（図９Ｂ）。この結果は、ＰＣＬＵＳ４−１８ペプチドが、再剌激培養においてＴ細胞の助力を引き出すこと示唆した。これは、外部ＩＬ−２を不必要にする。ＣＤ４+細胞を排除することにより、ＩＬ−２の非存在下におけるＣＴＬ活性の誘発は妨げられるが、ＩＬ−２の存在下ではそのようなことはない（図９Ｂ）。このように、ＰＣＬＵＳ４−１８に対して免疫された細胞の培養物中に誘導され、ＰＣＬＵＳ４−１８で再度刺激されたヘルパー細胞は、ＣＤ４陽性であった。ｒＩＬ−２の存在下、抗−ＣＤ４−処理細胞培養物中でのＣＴＬ活性の誘導は、この抗体および補足物での処理がＣＴＬ前駆体それ自体には影響を及ぼさないことを示している。したがって、ＣＴＬ前駆体は、ＣＴＬイフェクター細胞（図９Ａ）と同様に、ＣＤ４陰性である。
【００６６】
このように、我々は、ＣＴＬを誘発するためには、イン・ビボにおけるヘルパー−ＣＴＬ決定基結合が必要であることを示した。これは、ＣＴＬについては未だかつて示されたことはなく、イン・ビボにおける同系助力が永年広く認められているＴｈ−Ｂ−細胞協力とは対照的である。この結果は、共有結合的な結合が強制されていない、ヘルパーとＣＴＬ抗原性ペプチドとの混合物を用いる最近の２つの研究（９０、１０２）とは対照的であるように思われる。我々は、前者の研究（９０）においては、アジュバントエマルジョン中のペプチドの隔離がそれらを一緒に微小油滴中に物理的に保護することを、そして後者の研究（１０２）においては、用いられるペプチドの多重高投与量が非結合混合物の本質的な不都合を解消し得ることを示唆することによって、これらの発見を一致させることができる。この説明は、イン・ビボにおいて拒絶応答を誘導するために同じ皮膚移植片上に存在するヘルパーおよびＣＴＬ決定基に対する要求（８９）によって示される、同じ提示細胞上での近接もしくは提示に対する要求と一致する。この説明はまた、培養ウェルの境界において、クラスターペプチドとＰ１８との混合物が、共有結合構築体にほぼ十分なＩＬ−２を加えることなくＣＴＬ応答を引き出すに十分であるというイン・ビトロでの我々の発見に一致する。アジュバントエマルジョンを伴わない低い用量は、自然感染の事例をより密接に模倣し得る。最も強いＣＴＬ応答を誘発するペプチドは株の間で異なるので（図７Ａ−７Ｃ）、化合物ペプチドによるＣＴＬ応答の増強は、イン・ビボにおける酵素的な分解に対するこのペプチドの耐性または感受性に及ぼすヘルパー部位の効果によっては簡単に説明することはできない。実際、クラスIIでは異なるが同じＨ−２ＤdクラスＩ分子を共有する類遺伝子性組換えマウス系の間の異なるペプチド構築体に対する反応性の再現性のある差異は、ヘルパーＴ細胞がクラスII ＭＨＣに制限され、クラスターペプチドが全てのクラスII分子によって均等に与えられるものではないことを意味する。さもなければ、クラスターペプチドを用いることにより、異なるＭＨＣ型のマウスの間で単一のヘルパー決定基によって引き出されるであろうものよりも広いヘルパー認識が可能となる（４２）。
【００６７】
化合物ペプチドによるイン・ビボにおけるＣＴＬの誘発機構は、より長いペプチドが、ＣＴＬ誘発に関連付けられる特化したクラスII−発現抗原提示細胞（ＡＰＣ）（１００、１０６、１０７）によって、恐らくは注入部位もしくは排液リンパ節において、血清もしくは細胞外流体中でプロテアーゼによってペプチドが分解する前に取り込まれ、前記細胞がクラスＩおよびクラスII ＭＨＣによってＣＴＬおよびＴｈエピトープの両者をそれぞれ提示するのであろう。この提示は、２種類のエピトープが異なるＡＰＣによって独立に提示される他のものよりも効率的である。同じＡＰＣによるより効率の高い提示は、それがヘルパーＴ細胞とＣＴＬ前駆体とを一緒に有し、少量の不安定なリンホカイン類をより効率的に送達するためであるか、あるいは、Ｇill およびＬafferty（１０８）によって示唆されるように、ＡＰＣがヘルパー細胞によって活性化し、その後順番に、ＣＴＬに対する提示抗原でより効力が高まるためであろう。前者の場合には、両細胞ヘの提示事象が時間的に近接するであろう。これに対して、後者の場合に時間的に離れてもよい。いずれの場合においても、同じＡＰＣは２つの分離したＡＰＣよりも効率的であり、したがって、結合した決定基は、一度イン・ビボに注入されると離散し得るものよりも効率的である。これは、特化したＡＰＣ発現クラスII ＭＨＣが、それぞれＣＴＬおよびＴｈへのクラスＩおよびクラスII ＭＨＣ両経路によって細胞外抗原を同時に提示するという最近の観察（１０７）、および前に引用した皮膚移植片実験（８９）と一致する。ＱＳ２１は、細胞膜を浸透し、細胞質に抗原を誘導する能力があってもよい。それは、この細胞質からＭＨＣクラスＩ提示経路に入ることができる（１０３）。上記機構のいずれが保持されていても、同じＡＰＣによる両細胞の刺激は助力の送達を容易にする。
【００６８】
ＨＩＶ−１感染のＡＩＤＳへの進行は、ＨＩＶ−１特異サイトカイン応答におけるＴｈ１からＴｈ２優性へのシフトに相関するようである（１０９、１１０）。我々の研究所の以前の研究において、併発している吸血住虫感染によるＰ１８に対するＣＴＬ応答の減少が、ＩＬ２を産生するＴｈ１からＴｈ２優性へとシフトすることに相関することが明らかであった（１１１）。Ｔｈ１細胞は、Ｔｈ２細胞がＣＴＬ産生を阻害するサイトカイン類を分泌するのに対して、ＣＤ４+クラスIIに制限される、ＣＴＬ誘発の助力を提供するものと考えられている。したがって、ＨＩＶ−１キャリアを免疫療法のために免疫することは、これらの化合物構築物が意図するように、Ｔｈ１ ＣＤ４+細胞およびＣＴＬの両者を追加免疫するのであれば、最も効率的である。
【００６９】
Ｐ１８−特異的中和抗体を誘発するための助力もまた、４種類の異なる表現型のマウスをクラスターペプチドを含むこれらの化合物構築体（例Ｉ）で単一免疫した後に観察された。ここに提示される免疫実験は実験動物において行なわれたものであるが、同じエピトープが１以上の組織適合性複合体（ＨＬＡ）クラスIIもしくはクラスＩ分子を有するヒトヘルパーＴ細胞およびＣＴＬによっても認識されるという事実は、同じアプローチをヒトの免疫に適用することが可能であることを示唆している。クラスター３および４は北米および欧州のＨＩＶ−１個体の間で比較的保存されている配列を有しており、クラスター６は保存された配列と可変配列の間の境界をまたいでいる（４３）。
【００７０】
クラスII ＭＨＣ分子において相違する組換えマウスを用いる我々の現在の結果は、Ｔ−Ｔ協働およびＣＤ４+クラスIIで制限されるイン・ビボにおけるＣＴＬ応答誘発の助力を容易にするために、Ｔｈ決定基は単一ペプチド上のＣＴＬ決定基と共有結合的に結合すべきであることを示唆している。また、高力価のＨＩＶ−中和抗体を誘発することが既に示されている（上記例Ｉ）これらのクラスターペプチド−Ｐ１８構築体は、多重ＭＨＣ型の個人において、ＨＩＶに対する中和抗体の他にＣＴＬを誘発する有用な免疫構築体である。
【００７１】
例III：ＨＩＶ−１変異体ＭＮのＰ１８ペプチドに結合したクラスターペプチドによって誘発された広い免疫応答
ＨＩＶ−１ウイルスのＶ３ループの超可変性は、この領域内の特定のアミノ酸配列を指向するワクチンは個人が晒されうる広範囲の種類の株に対する防御を与えはしないという問題を提示する。株の変異の問題を解消するためのアプローチの１つは、各々異なる株の標的病原を指向する幾つかのペプチドの混合物を含む調製品で個人を免疫することである。ＨＩＶ−１のさらなる株に対するこの発明のペプチドの効率を評価するために、ＨＩＶ−１のＭＮ株のＶ３ループに由来するＰ１８ペプチドに結合した、一連のクラスターペプチドを調製した。
【００７２】
これらのペプチドは、上記 Ｇeneral Ｍethods に記述される通りに調製した。ＰＣＬＵＳ−１８ＭＮペプチドは表 VIに提示されている（配列番号２７−３３）。
【表６】
2006056893.tif 000008
【００７３】
４種類の異なる表現型を表わす４種類の系統のマウス（例Ｉ参照、表II）を、例Ｉに記述される通りに完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化したＰ１８ＭＮ、ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮもしくはＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮペプチド２０ナノモルを腹腔内投与して免疫した。７ないし８週間後、これらのマウスを第２の免疫、２０ナノモルを再度腹腔内投与することで追加免疫し、ＨＩＶ−１ ＭＮ株に対するＡｂＮ力価を決定した。この実験の結果を図１０に示す。
【００７４】
ペプチドＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮおよびＰＣＬＵＳ６．１−１８ＭＮを比較する類似の実験において、これらのペプチドを用いる他は上述の通りにマウスを免疫した。この実験の結果を図１１Ａ−１１Ｈに示す。
【００７５】
これら２つの実験から、ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮ、ＰＣＬＵＳ６−１８およびＰＣＬＵＳ６．１−１８ＭＮは、ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮがＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては免疫応答を誘発しないことを除いて、試験した全ての系統のマウスにおいて、１：６４を越える力価を有するＡｂＮのレベルを誘発することが結論付けられる。このように、Ｈ−２d表現型はＰＣＬＵＳ−１８ＭＮペプチドには応答しない。
【００７６】
ＰＣＬＵＳ−１８ＭＮペプチドに対するＣＴＬ応答を、Ｐ１８ＭＮおよびＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮペプチドを用いて調べた。以下のアジュバントの１種と１：１で乳化したペプチド２０ナノモルを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループの第１の免疫を行なった：ミョウバン、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＱＳ２１（上記）、ＤＯＴＡＰ（ＢoehringerＭannheim Ｂiochimica，カタログ番号１２０２ ３７５；ＤＯＴＡＰは原形質膜を通して細胞内に巨大分子を導入するためのリポフェクション（lipofection）試薬である）およびＣ２５９／７６３（Ｃ２５９／７６３は、Ｌederle研究所のＦredrick Ｄurr博士によって提供された権利品である）。
【００７７】
２ないし３週間後にこれらのマウスを１０ナノモルのペプチドで追加免疫し、さらに２ないし３週間後に、１グループ当り２匹のマウスから脾臓を取り出し、上記例IIに記載される通りに、イン・ビトロで剌激した。６日後、これらの細胞を回収し、同じく例IIに記載されている通りに、通常の細胞毒性Ｔ細胞アッセイにおいて試験した。結果を図１２Ａ−１２Ｂに示す。
【００７８】
ＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮペプチドのＣＴＬ応答を誘発する能力を評価するためにさらなる実験を行なった。ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮに対するＣＴＬを誘発させるために上で用いた免疫と類似の免疫を用いた。この第２の事例では、Ｐ１８ＭＮおよびＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮおよびＰＣＬＵＳ６．１−１８ＭＮに対する応答を比較した。しかしながら、２０ナノモルのペプチドを用いて追加免疫を行ない、ペプチドＰ１８およびＩＬ−２（後者は非特異的な助力を得るためのものである）を用いるイン・ビトロ剌激の後、ＣＴＬの量について脾臓細胞のアッセイを行なった。この実験の結果を図１３Ａ−１３Ｂに示す。
【００７９】
ＣＴＬ実験によって明瞭に示されるように、ＣＴＬ応答の誘発において、ＰＣＬＵＳ−１８ＭＮペプチドはＰ１８ＭＮペプチドよりも効率的である。ＣＴＬ応答は、広い範囲の異なるＭＨＣ表現型を有するマウスにおいて生じる。さらに、ＣＴＬ応答の生成におけるＰＣＬＵＳ−１８ＭＮペプチドのより優れた効率は、種々のアジュバント中において示し得る。
【００８０】
Ｖ３ループの超可変性がこの領域に特異的な中和抗体およびＣＴＬを誘発することを目的とするワクチンを設計する上での問題を引き起こすとしても、欧州および北米において最も一般的な株の代表である（２４、７１）ＨＩＶ−１ ＭＮ単離体に由来するＰ１８領域と同じ構成もまた、イン・ビボにおけるＭＮ変異体に対するＣＴＬ応答を誘発し、中和抗体応答を引き出すことが見出されたことは励みになる。また、最近我々は、IIIＢ−ｇｐ１６０誘発ネズミ脾臓を１つの位置に脂肪族置換があるＭＮ型ペプチド（１１２）で再剌激することにより、ウイルス株に関して広い特異性を有するＣＴＬポピュレーションが生成しうることを見出した。
【００８１】
上記の例によって示されるように、広い範囲のＭＨＣ表現型を示すホストにおける中和抗体およびＣＴＬの両者の誘発のための十分な結合した助力を引き出すこの発明によるペプチドは、ＡＩＤＳの予防または免疫治療のためのワクチン候補として考慮されるべきである。ここに提示されたアプローチ、すなわち、中和抗体に対するＴｈエピトープ、ＣＴＬエピトープおよびＰＮＤを構成するエピトープを共有結合的に結合させ、広い範囲のＭＨＣ型を有する複数のホストにおいてこれら全ての免疫応答の生起に効果的な単一の免疫原性ポリペプチドとすることは、他の病原に適用することが可能である。特に、このアプローチが他のウイルス性病原、例えば、これらに限定されるものではないが、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉ、ラビーウイルス等に対するワクチンの開発に適用可能であることが期待される。さらに、非ヒトホストを持つウイルス、例えば、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス等に対するワクチンもまた、この発明のアプローチを用いて生成することが可能である。
【００８２】
例IV：マラリアサーカムスポロゾイト抗原に対する広い免疫応答の誘発
米国特許５，０２８，４２５には、熱帯熱マラリア原虫（Ｐlasmodium falciparum）のサーカムスポロゾイト（circumsporozoite；ＣＳ）タンパクを指向する合成ワクチンが開示されている。このワタチンは、ＣＳ抗原由来のＣＴＬエピトープを含むペプチド免疫原からなる。米国特許４，８８６，７８２には、ＡｂＮに結合するＴｈエピトープからなるＣＳタンパクに対する第２の合成ワタチンが開示されている。これらの特許は、各々、参照することによって全体がここに組み込まれる。
【００８３】
広い範囲のＭＨＣ型によって認識され、Ｔｈ応答、ＣＴＬ応答および高力価ＡｂＮ応答を引き出すペプチドワクチンを作製するために、配列ＰＳＤＫＫＩＥＱＹＬＫＫＩＫＮＳＩＳＣＮＰ（ＮＡＮＰ）5ＮＡＫＰＫＤＥＬＤＹＥＮＤＩＥＫＫＩＣＫＭＥＫＣＳ（配列番号３５）を有するペプチドを上述の通りに合成する。このペプチドを、異なるＭＨＣ表現型（Ｂ１０．Ｄ２，Ｂ１０Ａ（５Ｒ）およびＢ１０．Ｓ（９Ｒ）系）のマウスに、例IIに記載される通りに投与する。ＡｂＮおよびＣＴＬ応答を、例ＩおよびIIにそれぞれ記載される通りに評価する。
【００８４】
例Ｖ：ヒト患者における臨床試験
この発明によるペプチドは、予防もしくは治療ワクチンとしてヒト患者に投与することができる。最初に、安全性および最大耐量を評価するために、既にＨＩＶに感染しているヒト患者において臨床試験を行なう。したがって、この例は、治療様式におけるワクチン形成の効率の予備的な証拠を提示する実験を記述する。
【００８５】
この発明によるペプチドは、当該分野において周知の材料および方法を用いて、医薬組成物に処方することができる。例えば、このペプチドは、無菌の薬学的に許容し得る担体溶液、例えば、生理食塩水、および注入可能な調製品を調製するためのシリンジボトルに封入されたものと混合することができる。
【００８６】
投与されるペプチドの投与量もまた、薬学分野において周知の方法によって決定することができる。投与される実際の投与量は、半減時間、種々の組織による隔離、投与経路等を含む様々な薬物動力学特性によって変化する。典型的には、ペプチド医薬は０．１ないし５０μｇ／患者体重ｋｇの範囲をとる量で投与される。
【００８７】
ここで記述される臨床試験において、実験群は、年齢１８−７５の、ＣＤ４+細胞カウントが＞６００細胞／ｍｌであるＨＩＶ感染患者からなる。試験に入る患者は、再生抗原（recall antigen）、例えば、参考文献５７に記述されている、ＩＬ−２産生アッセイにおけるインフルエンザウイルス、に対する応答によって測定される、本来のＴ細胞免疫機能の証拠を提示すべきであるという要求が考慮される。患者は、試験の最初の４ヶ月間は、抗レトロウイルス治療から離れるべきである。試験に突入して３ヶ月目に入って、ＣＤ４+細胞カウントが５００細胞／ｍｌ未満であり、それが１ヶ月間維持されるならば、標準抗レトロウイルス治療が患者に施される。
【００８８】
Ｓeppic Ｉnc.（Ｆairfield,ＮJ）によるＧＭＰ標準で調製された処方で、モンタナイド（Ｍontanide）ＩＳＡ−５１アジュバント中に含まれるペプチドＰＣＬＵＳ３−１８およびＰＣＬＵＳ６．１−１８を患者に皮下投与する。第０日にワクチンを投与し、第１、３、６、９および１２ヶ月目に追加免疫する。以下の免疫群を作製する：
１．80μｇＰＣＬＵＳ3-18
２．80μｇＰＣＬＵＳ6.1-18
３．160μｇＰＣＬＵＳ3-18
４．160μｇＰＣＬＵＳ6.1-18
５．80μｇＰＣＬＵＳ3-18＋80μｇＰＣＬＵＳ6.1-18
６．160μｇＰＣＬＵＳ3-18＋160μｇＰＣＬＵＳ6.1-18
患者を、最初に群１および２に、次いで群３および４に、その後群５に、最後に群６に入れる。ペプチドのヒトへの投与に関して経験を得ることができるので、個々のペプチドの１種もしくは他のものの６ヶ月のレジメの後には、群１−４の患者は、ＰＣＬＵＳ３−１８とＰＣＬＵＳ６．１−１８との組み合わせを受けられたほうがよい。
【００８９】
個々の患者において、下記を含む種々の免疫系パラメータが監視される：
通常の化学的および血液学的パラメータ；
毒性学および日和見感染の試験；
リンパ球サブセット；
血清ＨＩＶ ｐ２４抗原レベル；
ウイルス負荷の測定のために血清、血漿および細胞が定期的に凍結される；測定は、ＰＣＲをベースとするアッセイを含む、この技術分野の現状をなすアッセイによる；
ペプチドおよびＨＩＶ上の他の決定基に特異的な抗体の測定；
ＨＩＶ中和抗体力価の決定；
マイトジェン、アロ抗原、通常の抗原（例えばインフルエンザ）およびＨＩＶ抗原に対する応答における、インターロイキン−２産生を含むサイトカイン産生；
ＨＩＶ抗原に対するＣＴＬ活性の測定；
サイトカイン応答の試験に用いられるもの以外の抗原に対する免疫応答のための皮膚試験。
【００９０】
これらのアッセイの各々の技術は、当該技術分野においては日常的なものである。
【００９１】
例VI：診断アッセイにおけるこの発明のペプチドの使用
広範な免疫応答を引き出す免疫原としての有用性に加えて、この発明によるペプチドが診断様式で患者の抗体およびＣＴＬ機能のアッセイにも利用可能であることは、当該分野の熟練者にはもちろん明らかである。
【００９２】
抗体アッセイ、とりわけＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等の固相アッセイ、の基礎フォーマットは当該分野においては周知である。そのような固相アッセイにおいては、不溶性基板にこの発明によるペプチドを結合させ、このペプチドが結合している基板を、サンプル中に特異的な抗ペプチド抗体が存在する場合にはそれらがペプチドに結合し得るような条件下で、試験しようとするサンプルと接触させる。その後、当該分野において周知の種々の手段によって結合抗体を検出する。そのような検出方法の１つでは、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に特異的な放射標識もしくは酵素標識二次抗体が用いられる。
【００９３】
同様に、ＣＴＬ応答の測定も周知である。ＣＴＬ応答を測定する一方法は例IIに記載されている。したがって、患者由来の末梢血細胞をこの発明によるペプチド、およびＭＨＣ分子を発現する線維芽細胞系（それらの表面にはこの発明によるペプチドが提示される）を含む標的細胞ポピュレーションと共にインキュベートすることができる。標的細胞のペプチド特異的な溶解が、患者におけるＣＴＬ機能の尺度である。
【００９４】
ここに記述された発明は、この発明の作製および実施に用いられる材料および方法の種々の変形を用い得ることは、当該分野の熟練者には明らかであろう。そのような変形は、以下に請求される発明の範囲に包含されるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂ：クラスターペプチド６〜１８での免疫感作に続く、４つの異なったＭＨＣハプロタイプのマウスのＰ１８特異的な抗体応答。（ａ）２０ナノモルのペプチドで免疫感作した３１日後の一次抗体応答（２１日でのレベルは低かった；結果の項を参照のこと）。（ｂ）一次免疫の３７日および４９日後における、１０ナノモルのペプチドの追加免疫に対する二次免疫応答。予出血プール(prebleed pool)を示す＋を除き、記号は個体マウスに対応する。
【図２−１】図２Ａ及び図２Ｂ：ペプチドＰＣＬＵＳ６−１８での単一の免疫感作の３１日後における、４つのマウス株のＨＩＶ−１・III Ｂ中和特性。
【図２−２】図２Ｃ及び図２Ｄ：ペプチドＰＣＬＵＳ６−１８での単一の免疫感作の３１日後における、４つのマウス株のＨＩＶ−１・III Ｂ中和特性。
【図２−３】図２Ｅ及び図２Ｆ：ペプチドＰＣＬＵＳ６−１８での単一の免疫感作の３１日後における、４つのマウス株のＨＩＶ−１・III Ｂ中和特性。
【図２−４】図２Ｇ及び図２Ｈ：ペプチドＰＣＬＵＳ６−１８での単一の免疫感作の３１日後における、４つのマウス株のＨＩＶ−１・III Ｂ中和特性。
【図３−１】図３Ａ及び図３Ｂ：一次免疫から３９〜４２週後に１０ナノモルのＰＣＬＵＳ６−１８を用いて単一の追加免疫を行った１０日後の、４つのマウス株のＨＩＶ−１・III Ｂ中和特性。図２に夫々番号を付した血清について、Ｖｎ／Ｖｏが希釈逆数に対してプロットされている。動物番号および記号は、一次反応に関して図２で用いたものと対応するように表されている。なお、マウス株ＢＡＬＢ／ｃに関する縦軸は他の株とは異なっており、他の株での終点は1:4096であるのに対して、ＢＡＬＢ／ｃについての終点は1:32,768である。
【図３−２】図３Ｃ及び図３Ｄ：一次免疫から３９〜４２週後に１０ナノモルのＰＣＬＵＳ６−１８を用いて単一の追加免疫を行った１０日後の、４つのマウス株のＨＩＶ−１・III Ｂ中和特性。図２に夫々番号を付した血清について、Ｖｎ／Ｖｏが希釈逆数に対してプロットされている。動物番号および記号は、一次反応に関して図２で用いたものと対応するように表されている。なお、マウス株ＢＡＬＢ／ｃに関する縦軸は他の株とは異なっており、他の株での終点は1:4096であるのに対して、ＢＡＬＢ／ｃについての終点は1:32,768である。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂ：ペプチドおよび全タンパクに対する抗体の親和性を試験するために、ｐ１８およびｒｇｐ１２０を拮抗剤に用いた拮抗結合曲線。黒塗りの記号は、試験された一つの希釈において＞９０％の中和活性を有する血清を表し、また白抜きの記号は試験した最低希釈において＜９０％の中和活性を有する血清を表す。データは、３〜４の実験の代表値である。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂ：ＰＣＬＵＳ３−１８（図５Ａ）及びＰＣＬＵＳ６−１８（図５Ｂ）で免疫感作されたマウスにおける、中和性血清 VS 非中和性血清の詳細な特異性。中和性血清（黒塗り棒）及び非中和性血清（白抜き棒）が、Ｐ１８置換ペプチドでコーティングされたウエルでのＥＬＩＳＡ試験を用いて試験された。ＨＩＶ−１・III Ｂ配列（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ；配列番号７）の一つのアミノ酸を、ＨＩＶ−１・ＲＦ（＊＊ＴＫＧＰＧＲＶＩＹＡＴＧＱ；配列番号８）の対応アミノ酸で置換した１５のペプチドが、ウエルのコーティングに用いられた。二つの配列が同一であるときはＡｌａで置換された。これらのペプチドは、１８−１から１８−１５と称され、二番目の番号が配列中における置換位置を示している。夫々の図における数字の下の文字は、Ｐ１８／III Ｂ配列の対応位置において置換された、ＲＦ配列由来のアミノ酸（またはＡｌａ）を示す。星印は欠失を示す。血清は、希釈率1:1000で比較された。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂ：中央のＶ３ループ内で置換されたＰ１８変種に対する結合。位置３−１０で置換されたペプチド１８変種（表Ｖに示すもの）が、マイクロタイターウエルのコーティングに用いられ、ＥＬＩＳＡ試験で血清の結合が試験された。夫々の図における数字の下の文字は、Ｐ１８／III Ｂ配列の対応位置で置換された、ＲＦ配列由来のアミノ酸（またはＡｌａ）を示す。黒塗りの棒は中和性抗体を表し、白抜きの棒は非中和性血清を表す。縦軸（カラム）は置換されたペプチド vs Ｐ１８に対する結合の、４０５ｎｍでの平均吸光度の比率を表しており、このデータは、ＰＣＬＵＳ３−１８（図６Ａ）またはＰＣＬＵＳ６−１８（図６Ｂ）で免疫感作された動物から採取した個体血清（数字で指定した）について２回測定して得たものである。
【図７】図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃ：ＱＳ２１アジュバント中の合成ペプチド(compoud peptides)を用いた免疫感作による、ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１６０特異的ＣＴＬ活性の誘導。各実験において、１５−１２のトランスフェクトされた標的細胞が用いられた。即ち、図７Ａは、Ｂ１０．Ｄ２マウス由来のＣＴＬ；図７Ｂは、Ｂ１０．Ａ（５Ｒ）マウス；図７Ｃは、Ｂ１０．Ｓ（９Ｒ）由来のＣＴＬである。三つのウエルにおける平均の標準誤差（ＳＥＭ）は、一貫して平均の８％未満であるから、明瞭さを重視して誤差を示すバーは省略してある。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ及び図８Ｄ：ＣＴＬのプライミングのための、ヘルパーとＣＴＬ決定基との間の結合に関する要件。Ｂ１０．Ｄ２マウス（図８Ａおよび８Ｃ）またはＢ１０．Ａ（５Ｒ）マウス（図８Ｂおよび８Ｄ）に由来するＣＴＬを、標的としての１５−１２のトランスフェクト細胞と共にインキュベートし、Ｐ１８＋インターロイキン２を用いてイン・ビトロで再刺激し（図８Ａおよび８Ｂ）、または標的としてのＰ１８パルスされたＢＡＬＢ／ｃ・３Ｔ３繊維芽細胞と共にインキュベートした（図８Ｃおよび８Ｄ）。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂ：合成ペプチド構築物での免疫感作によって誘導された、ＣＴＬエフェクター（図９Ａ）およびヘルパーＴ細胞（図９Ｂ）の発現型。図９Ｂにおいて、免疫感作はＰＣＬＵＳ４−１８を用いて行われた。
【図１０−１】図１０Ａ及び図１０Ｂ：ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮで追加免役された血清（図１０Ａ−１０Ｄ）およびＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１０Ｅ−１０Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１０−２】図１０Ｃ及び図１０Ｄ：ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮで追加免役された血清（図１０Ａ−１０Ｄ）およびＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１０Ｅ−１０Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１０−３】図１０Ｅ及び図１０Ｆ：ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮで追加免役された血清（図１０Ａ−１０Ｄ）およびＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１０Ｅ−１０Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１０−４】図１０Ｇ及び図１０Ｈ：ＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮで追加免役された血清（図１０Ａ−１０Ｄ）およびＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１０Ｅ−１０Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１１−１】図１１Ａ及び図１１Ｂ：ＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免役された血清（図１１Ａ−１１Ｈ）およびＰＣＬＵＳ６．１−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１１Ｅ−１１Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１１−２】図１１Ｃ及び図１１Ｄ：ＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免役された血清（図１１Ａ−１１Ｈ）およびＰＣＬＵＳ６．１−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１１Ｅ−１１Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１１−３】図１１Ｅ及び図１１Ｆ：ＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免役された血清（図１１Ａ−１１Ｈ）およびＰＣＬＵＳ６．１−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１１Ｅ−１１Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１１−４】図１１Ｇ及び図１１Ｈ：ＰＣＬＵＳ６−１８ＭＮで追加免役された血清（図１１Ａ−１１Ｈ）およびＰＣＬＵＳ６．１−１８ＭＮで追加免疫された血清（図１１Ｅ−１１Ｈ）の、ＨＩＶ中和活性を示している。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂ：種々のアジュバント中に含有されたＰ１８−ＭＮおよびＰＣＬＵＳ３−１８ＭＮでの免疫感作によって誘導されたＣＴＬ応答を示している。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂ：種々のアジュバント中に含有されたＰ１８およびＰＣＬＵＳ６．１ＭＮの２回の免疫感作に続く、ＣＴＬ応答を示している。
【参考資料】
【００９６】
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2006056893.tif 000021
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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