(57)【要約】【課題】  解析対象である生体内高分子の比較データ数が少なく、且つそれら比較データ内に試料間でバラツキが大きい生体内高分子が数多く存在する生体内高分子の比較データを正確、且つ再現性高く規格化する方法を提供する。【解決手段】  異なる２種類の試料間に存在する生体内高分子の存在量を指標とした比較解析において、当該試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の複数の生体内高分子を選んで、その存在量を表す信号強度の補正値を算出し、前記補正値を用いて２試料間の比較データを規格化する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる２種類の試料間に存在する生体内高分子の存在量を指標とした比較解析において、当該試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の複数の生体内高分子を選び、その存在量を表す信号強度の補正値を算出し、前記補正値を用いて２試料間の比較データを規格化することを特徴とする生体内高分子の比較解析方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１記載の比較解析方法：
１）異なる２試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の複数の生体内高分子を選び、その存在量を表す信号強度について、第１の試料における信号強度の総和、平均値又は中間値と第２の試料における信号強度の総和、平均値又は中間値が等しくなるような補正値を求める；
２）上記補正値を用いてすべての生体内高分子の信号強度を補正し、２試料間の比較データを規格化する。
【請求項３】
異なる２試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の生体内高分子についての補正値が、少なくとも２０種類以上の生体内高分子について算出されることを特徴とする、請求項１又は２記載の比較解析方法。
【請求項４】
異なる２試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の生体内高分子についての補正値が、少なくとも１００種類以上の生体内高分子について算出されることを特徴とする、請求項３記載の比較解析方法。
【請求項５】
異なる２試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の生体内高分子についての補正値が、１０００種類以下の生体内高分子について算出されることを特徴とする、請求項３又は４記載の比較解析方法。
【請求項６】
生体内高分子が遺伝子又はタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる２種類の試料間に存在する生体内高分子の存在量を指標とした比較解析における比較データの規格化方法に関する。詳細には、異なる２種類の試料間の遺伝子比較発現解析における比較データの規格化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学における実験手法の進歩により１つの試料内に存在する膨大な種類の生体内高分子、例えば遺伝子や蛋白質の量を簡便に測定することが可能となった。例えば、マイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析では、数千から数万といった遺伝子についてその発現量を一度に解析することができる。マイクロアレイでは、ガラスやシリコン基板上に配置された遺伝子配列に由来する多数のプローブと測定試料に由来する標識産物をハイブリダイズさせた後、プローブにハイブリダイズした標識産物の量を測定する。各遺伝子の発現量は、得られた測定値とどの位置にどの遺伝子由来のプローブが配置されているのかという“位置情報”を用いて一度に解析される。２種類の試料間の発現量を比較する場合は、別の試料について同様の解析を行い、得られた結果を一方の結果と比較すればよい。蛍光標識を用いる場合、こうした解析は比較する２種類の試料をそれぞれ異なる色素で標識した後マイクロアレイ上で競合ハイブリダイゼーションすることにより一度で行うことができる。
【０００３】
２種類の異なる試料の比較においては、通常２つの試料間に存在する測定値の偏り、より詳細には、２つの試料の調製に起因する偏り、測定環境の変化に起因する偏り、ラベル試薬の感度や品質に起因する偏り等が存在するため、各試料間で規格化を行う必要がある。
【０００４】
規格化の方法としては、外在性や内在性のコントロール物質を用いる方法がある。具体的には、外在性のコントロール物質を用いる方法では、両試料にそれぞれ外在性のコントロール物質を所定量混合して解析を行い、得られたコントロール物質の測定結果の補正値を用いて全体を規格化する。一方、内在性のコントロール物質を用いる方法では、試料間に等量存在するようなことが既知の内在性物質を用いて補正することで規格化を行う。例えば、遺伝子発現解析を行う場合の内在性のコントロール物質としては、ハウスキーピング遺伝子として知られる、アクチン（Actin）遺伝子やグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；GAPDH）遺伝子が挙げられる。
【０００５】
しかしながら、外在性のコントロール物質を用いる方法では、加えるコントロール物質の混合量のわずかな誤差によりその結果が大きく変化してしまうという問題がある。また、内在性コントロール物質を用いる場合でも、比較したい試料の組み合わせによっては、試料内に存在する内在性コントロール物質の存在量が必ずしも試料間で等しくないため、正確な規格化を行うことができない場合がある。
【０００６】
一方、コントロール物質を用いずに規格化する方法として、測定で得られた全ての遺伝子の発現量を用いるグローバルノーマリゼーション法がある。詳細には、比較する試料間で測定された全ての発現量の総和が等しくなるように規格化する方法や、信号強度比の中間値を用いて規格化する方法等がある。しかしながら、グローバルノーマリゼーション法では計測対象である大多数の遺伝子において、その発現量の変化が少ないといった前提が必要となる。従って、計測対象の遺伝子数が少なく、且つこれらの中の多くの遺伝子の発現量が試料間で大きく変動しているような場合には正確な規格化を行うことができない。
【０００７】
現在のマイクロアレイの主な解析目的は、複数の患者から取得した試料を測定して試料間で共通に変動する疾患関連遺伝子マーカーを探索することにある。例えば、特開平2004-208547号公報ではマイクロアレイを用いて約80種類のうつ病関連遺伝子マーカーを抽出している（特許文献１）。搭載遺伝子数が少ないマイクロアレイはコスト的に有利なため、今後、こうした疾患関連遺伝子マーカーに絞って搭載したマイクロアレイを用いた解析の需要が高まることが予想される。
【０００８】
【特許文献１】特開平2004-208547号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
疾患関連遺伝子マーカーに絞って搭載したマイクロアレイはコスト面で有利な反面、搭載遺伝子数が少なく、且つ疾患関連遺伝子マーカー自体、罹患の有無に応じてその発現量が大きく変動するため、サンプル間の規格化が困難であるという問題がある。そこで、本発明は、解析対象の遺伝子数が少なく、且つ試料間でのバラツキが大きい遺伝子が数多く存在する場合においても、正確且つ再現性高く比較発現データを規格化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、異なる２種類の試料間に存在する生体内高分子の存在量を指標とした比較解析において、当該試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の複数の生体内高分子を選んで、その存在量を表す信号強度の補正値を算出した後、前記補正値を用いて他の生体内高分子の比較データを規格化する。本発明の方法では、試料間での比較的発現量が一定している（バラツキが少ない）生体内高分子を用いて規格化を行うため、測定時に生じるバラツキをより正確に補正することができ、且つ再現性高く規格化することができる。
【００１１】
選択された複数の生体内高分子についての信号強度の補正値は、線形あるいは非線形デ−タを補正する公知の規格化方法、例えば、比較する試料間で対象となるデータの総和、平均値又は中間値を等しくするような規格化方法を用いて算出することができる。
【００１２】
前記方法において、異なる２試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の生体内高分子についての信号強度の補正値は、少なくとも２０種類以上の生体内高分子について算出されることが望ましい。より好ましくは、前記補正値は、少なくとも１００種類以上の生体内高分子について算出されるとよい。このように、数多くのバラツキが少ないことが既知の生体内高分子の補正値を用いて規格化を行うことにより、本発明では生体内高分子の存在量の比較データをより再現性高く規格化することができる。
【００１３】
なお、規格化する際のデータの取り扱い易さを考慮すると、前記補正値は１０００種類以下の生体内高分子について算出することが好ましい。
【００１４】
本発明の方法は、すべての生体内高分子の存在量を指標とした比較解析に適用でき、例えば、遺伝子やタンパク質の比較発現解析に好適に利用することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、解析対象の遺伝子数が少なく、且つそれら解析対象遺伝子内には試料間でのバラツキが大きい遺伝子が数多く存在する場合においても、正確且つ再現性高く比較発現データを規格化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明では、異なる２種類の試料間に存在する生体内高分子の存在量を指標とした比較解析において、当該試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の複数の生体内高分子を選んで、その存在量を表す信号強度の補正値を算出した後、前記補正値を用いて他の生体内高分子の比較データを規格化する。
【００１８】
対象とする比較データは特に制限されず、例えば、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析データ、プロテインアレイを用いた蛋白質発現解析データ等を挙げることができる。前記比較データは、比較する２つの試料を用いた個別の発現解析データを比較したデータであっても、２蛍光染色法のように２つの試料を異なる色素で標識した後マイクロアレイ上で競合ハイブリダイゼーションして得られた比較データであってもよい。存在量を表す信号強度は生体内高分子の存在量の指標となるシグナル値であれば特に限定されず、例えば、蛍光強度、ＲＩカウントを挙げることができる。
【００１９】
本発明の規格化方法では、まず最初にバラツキが少ないことが既知の複数の生体内高分子について、存在量を表す信号強度の補正値を算出する。ここで、「バラツキが少ない」とは、２つの試料間で比較的発現量が一定していることを意味する。具体的には、２つの試料間で発現量比が２倍程度までの生体内高分子を用いることが好ましい。補正に用いられる規格化方法は特に制限されず、線形あるいは非線形デ−タを補正する公知の規格化方法を用いることができる。
【００２０】
線形デ−タを補正する方法としては、比較する試料間で対象となるデータの総和、平均値又は中間値を等しくするような規格化方法を挙げることができる。すなわち本発明の場合では、補正対象となる信号強度の数値そのものについて、その総和、平均値又は中間値を等しくするように補正値を算出すればよい。
【００２１】
非線形データを補正する方法としては、小さく限局化された信号強度の範囲ごとに規格化を行い補正値を算出する方法（J Cell Biochem. 2000 Oct 20;80(2):192-202.  参照）や区分線形変動メジアンを用いる方法（Genome Biol. 2001;2(8):RESEARCH0032. Epub 2001 Aug 03.  参照）等を挙げることができる。
【００２２】
上記の補正値の算出で用いられる、異なる２試料間で存在量のバラツキが小さいことが既知の生体内高分子数は、少なくとも２０種類以上、より好ましくは１００種類以上であることが望ましい。２０種類以下であると規格化して得られる補正値のバラツキが大きくなり、結果的に比較データの再現性が低くなるからである。
【００２３】
また、補正値算出の対象とする生体内高分子数は１０００種類以下とすることが好ましい。補正値算出の対象とする前記生体内高分子数が多すぎると規格化する際のデータの取り扱いが難しくなるからである。
【実施例】
【００２４】
以下、具体例を示して本発明をより詳細に説明する。
【００２５】
実施例１：
１．変動遺伝子群、及び変動が少ない遺伝子群の抽出
20匹のWistar系ラットを屠殺して各個体のそれぞれから肝臓と脳を摘出した後、Trizol試薬（インビトロジェン社）を用いてそれぞれの組織からトータルRNAを抽出した。次に、各個体のそれぞれについて、マイクロアレイ（HITACHI chip；日立製作所社製）を用いて肝臓由来のトータルRNAと脳由来のトータルRNA間の遺伝子比較発現解析を行った。マイクロアレイを用いた遺伝子比較発現解析の詳細は下記の通りである。
【００２６】
(1) 蛍光標識cRNAの調製
各組織より抽出したトータルRNA 5マイクログラムのそれぞれに対して、T7プロモータ配列を付加したオリゴ(dT)24プライマーをアニールさせてFirst strand DNAを合成した。次に、得られたFirst strand DNAを鋳型にT7プロモータ配列を有するSecond strand DNAを合成した。最後に、Second strand DNAを鋳型にaminoallyl-UTP存在下でin vitro増幅反応を行いaminoallyl基が導入されたcRNAを作製した。次に得られたcRNAとN-ヒドロキシスクシイミドエステルで修飾されたCy-dyeとのカップリング反応を行い蛍光標識されたcRNAを作製した。なお、肝臓由来の産物をCy-5に、また脳由来の産物をCy-3にそれぞれ蛍光標識した。
【００２７】
(2) マイクロアレイを用いた比較発現解析
同じ個体由来のCy-5標識産物とCy-3標識産物をそれぞれ等量混合した後、約1900種類のオリゴDNAプローブを搭載したマイクロアレイ（HITACHI chip；日立製作所社製）上で競合ハイブリダイゼーションを行った。その後、スキャナー（GSI-Lumonics社製ScanArray 5000）を用いて各スポットの蛍光強度を測定した。
【００２８】
得られた結果より、肝臓と脳の間で発現量が有意に変動している遺伝子を変動が大きい順に上位30個づつ有意差検定より抽出し変動遺伝子群として表１に示した。また、肝臓と脳の間で発現量の変動が小さい遺伝子群を上位20個抽出して結果を表２に示した。
【００２９】
【表１】
2006194611.tif 000002
【００３０】
【表２】
2006194611.tif 000003
【００３１】
２．マイクロアレイの作製
前項で抽出した60種類の変動遺伝子群、及び20種類の変動が少ない遺伝子群、及びハウスキーピング遺伝子（GAPDH遺伝子）を、支持体上に一本鎖核酸プローブが共有結合したオリゴマイクロアレイとして作製した（特開2002-204693参照）。なお、マイクロアレイに搭載したオリゴDNAプローブの配列は、再現性、測定感度が高くなるよう、特開2003-52385に示される方法に従って決定した。
【００３２】
３．標識産物の調製、及び発現解析
１に示した方法に従い、新たにWistar系ラット6匹の肝臓、及び脳由来の蛍光標識産物を調製した後、前項で作製したマイクロアレイを用いて肝臓由来産物と脳由来産物間の遺伝子比較発現解析を6個体それぞれについて行った。
【００３３】
４．規格化
前項で得られた各個体の比較発現解析結果に対して、以下の規格化を行った。
(1) 変動が少ない遺伝子群を用いた補正値の算出
表２に示した20種類の変動が少ない遺伝子群の発現解析結果に対して、肝臓由来の産物より得られた信号強度の総和と脳由来の産物の信号強度の総和が等しくなるような補正値を算出した。
【００３４】
(2) 変動遺伝子の規格化
(1)で得られた補正値を用いて表１に示した変動遺伝子の発現量を補正した。補正後の発現量を用いて肝臓由来の産物より得られたCy5信号強度とCy3信号強度の比を算出した。
最後に、6個体それぞれで実施した解析結果から得られた信号強度比の平均値、肝臓で発現量が多い遺伝子のメディアン値、脳で発現量が多い遺伝子群のメディアン値、及び信号強度比の相対標準偏差の平均値（C.V.値）を表３に示した。
【００３５】
【表３】
2006194611.tif 000004
【００３６】
実施例２：
実施例１の「１．変動遺伝子群、及び変動が少ない遺伝子群の抽出」に準じて、肝臓と脳の間で発現量の変動が少ない遺伝子群を100個抽出した（表４）。次いで、実施例１で抽出した60種類の変動遺伝子群（表１）、及び表４に示した100種類の変動が少ない遺伝子群、及びハウスキーピング遺伝子（GAPDH遺伝子）を搭載したオリゴマイクロアレイを作製した。このマイクロアレイを用いて肝臓由来産物と脳由来産物間の遺伝子比較発現解析を行い、規格化を行った。なお、規格化は、表４に示した100種類の変動が少ない遺伝子群の発現解析結果に対して、肝臓由来の産物より得られた信号強度の総和と脳由来の産物の信号強度の総和が等しくなるような補正値を算出して行った。明示した以外、実験は実施例１の方法に準じて実施した。結果を表３に示す。
【００３７】
【表４】
2006194611.tif 000005
2006194611.tif 000006
【００３８】
実施例３：
実施例２において、肝臓由来の産物、及び脳由来の産物をともにCy5で蛍光標識した後、それぞれ異なるマイクロアレイにハイブリダイゼーションして遺伝子発現解析を行った後、変動比（肝臓／脳）を計算し、規格化を行った。それ以外は、実施例２の方法に準じた。結果を表３に示す。
【００３９】
比較例１：
実施例１の「２．マイクロアレイの作製」において、抽出した60種類の変動遺伝子群、及びハウスキーピング遺伝子（GAPDH遺伝子）を搭載したオリゴマイクロアレイを作製した。このマイクロアレイを用いて肝臓由来産物と脳由来産物間の遺伝子比較発現解析を行い、規格化を行った。なお、規格化は、60種類の変動遺伝子群の発現解析結果に対して、肝臓由来の産物より得られた信号強度の総和と脳由来の産物の信号強度の総和が等しくなるような補正値を算出して行った。明示した以外、実験は実施例１の方法に準じて実施した。結果を表３に示す。
【００４０】
比較例２：
比較例１の規格化工程において、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子の発現量が等しくなるように規格化を行った。それ以外は、比較例１の方法に準じた。結果を表３に示す。
【００４１】
比較例３：
実施例１に記載の約1900種類のオリゴDNAプローブを搭載したマイクロアレイ（HITACHI chip;日立製作所製）を用いて、肝臓由来産物と脳由来産物間の遺伝子比較発現解析解析を行った。発現解析結果は、上記マイクロアレイ上に搭載されている全ての遺伝子（約1900種類）の発現量の総和が等しくなるようなグローバルノーマリゼーション法を用いて規格化を行った。結果を表３に示す。
【００４２】
表３に示した通り、実施例１の肝臓で発現量が多い遺伝子群のメディアン値、及び脳で発現量が多い遺伝子群のメディアン値と比較例３のそれぞれのメディアン値はほぼ一致しており、一般に広く用いられている方法で得られた解析結果と本発明の規格化方法の間で高い相関があることが確認された。また、再現性の指標であるC.V.値が低いことから、再現性が高い規格化方法であることが証明された。
【００４３】
実施例２では実施例１よりもさらに多くの遺伝子群を用いて規格化されているため、実施例１よりもさらにC.V.値が低く、再現性が高いことが確認された。
【００４４】
実施例３では実施例1及び２とは異なり競合ハイブリダイゼーションを用いずに得られた発現データに対して本発明の規格化方法を実施した結果を示した。その結果、実施例３でも、実施例１及び２と同様に高い再現性、及び既存の規格化方法との高い相関が確認された。
【００４５】
比較例１では変動遺伝子を搭載したマイクロアレイとグローバルノーマリゼーション法の組み合わせで解析、規格化した結果を示した。実施例１〜３、及び比較例３で得られたメディアン値と比較例１のメディアン値は大きく異なり、相関が低いことが確認された。これは、表１に示した変動遺伝子群に関して、肝臓での発現量の総和と脳での発現量の総和が元々等しくないにもかかわらず、グローバルノーマリゼーション法を用いて規格化したため、正確な規格化ができなかったことに起因すると考えられる。
【００４６】
比較例２ではコントロール遺伝子であるGAPDH遺伝子の発現量を用いて規格化した結果を示したが、1種類の遺伝子のみを用いて規格化しているため、バラツキが大きくC.V.値が高くなっていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、遺伝子やタンパク質等の生体内高分子の比較発現解析における規格化方法として有用である。