(57)【要約】【課題】バイオポリマーの合成反応を安定化し、かつ合成に使用される試薬消費量を削減して生産性を向上させる。【解決手段】容積型ポンプ１４と、反応性を有する粒状固形物または粒状の固形触媒１３が収容された反応器８と、粒状固形物と反応しまたは固形触媒により反応する流動性の反応物を収容した容器２５ａ〜ｄと、をこの順で流体的に接続し、反応物を、容積型ポンプの吸入行程で反応器を通過させ且つ吐出行程で反応器を逆方向に通過させて粒状固形物と反応を行わせまたは固形触媒により反応を行わせる。【選択図】図２
2006043559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容積型ポンプと、
反応性を有する粒状固形物または粒状の固形触媒が収容された反応器と、
前記粒状固形物と反応しまたは前記固形触媒により反応する流動性の反応物を収容した容器と、をこの順で流体的に接続し、
前記反応物を、前記容積型ポンプの吸入行程で前記反応器を通過させ且つ吐出行程で前記反応器を逆方向に通過させて前記粒状固形物と反応を行わせまたは前記固形触媒により反応を行わせる、
ことを特徴とする反応方法。
【請求項２】
前記粒状固形物がバイオポリマーの末端となる分子を結合させた固形支持坦体であり
前記反応物が前記分子と反応する試薬である、
請求項１に記載の反応方法によるバイオポリマーを製造する方法。
【請求項３】
前記固形支持坦体を前記反応器に流動可能に収容し、フィルターにより前記固形支持坦体の反応器外への流出を防止し、前記反応器を通過する前記反応物により前記固形支持坦体を流動させる、
請求項２に記載のバイオポリマーを製造する方法。
【請求項４】
バイオポリマーを製造する装置であって、
前記バイオポリマーの末端となる分子を結合させた粒状の固形支持坦体が流動可能に収容された反応器と、
前記分子と反応させる試薬を収容する試薬容器と、
前記試薬を前記反応器に供給するための容積型ポンプと、を有し、
前記容積型ポンプは、前記反応器を経由して前記試薬を前記試薬容器から吸入し、且つ吸入した前記試薬を前記反応器を経由して系外に吐出するように、前記反応器を介して前記試薬容器に接続されてなる、
ことを特徴とするバイオポリマーを製造する装置。
【請求項５】
バイオポリマーを製造する装置であって、
前記バイオポリマーの末端となる分子を結合させた粒状の固形支持坦体が流動可能に収容された反応器と、
前記分子と反応させる試薬を収容する試薬容器と、
２以上の補助試薬を個別に収容する補助試薬容器と、
前記試薬または前記補助試薬を前記反応器に供給するための容積型ポンプと、
前記反応器に供給する前記補助試薬容器を選択するための補助セレクタ弁と、
前記反応器と前記試薬容器、前記補助セレクタ弁、または系外とを選択的に連通させるセレクタ弁と、を有し、
前記容積型ポンプは、前記試薬または前記補助試薬を前記反応器を経由して前記試薬容器または前記補助試薬容器から吸入し、且つ吸入した前記試薬を前記反応器を経由して系外に吐出するように、前記反応器を介して前記セレクタ弁に接続されてなる、
ことを特徴とするバイオポリマーを製造する装置。
【請求項６】
前記補助セレクタ弁と各前記補助試薬容器との間に設けられた２ポート弁と、
前記セレクタ弁の選択、前記補助セレクタ弁による前記補助試薬容器の選択、前記２ポート弁の開閉、および前記容積型ポンプの吸入吐出動作を制御する制御手段と、を有し
前記制御手段は、
前記セレクタ弁が前記補助セレクタ弁と連通するとき前記補助セレクタ弁が選択する前記補助試薬容器との間の前記２ポート弁を開とし、
前記セレクタ弁が前記試薬容器または前記補助セレクタ弁と連通するとき前記容積型ポンプに吸入動作を行わせ、
前記セレクタ弁が系外と連通するとき前記容積型ポンプに吐出動作を行わせるように制御する、
請求項５に記載のバイオポリマーを製造する装置。
【請求項７】
前記反応器が、
本体と、緩衝部材と、を有し、
前記本体には、反応室と、前記反応室に開口し前記本体の外部と前記反応室とを連通する断面円形の２つの接続穴と、が設けられ、
前記緩衝部材は、両端部が円柱状であってその外周に螺旋状の溝を有し、前記端部が前記接続穴のそれぞれに嵌入されて前記溝により前記試薬が前記反応室に旋回流となって供給されるように構成されてなる、
請求項４ないし請求項６に記載のバイオポリマーを製造する装置。
【請求項８】
流動性反応物を流入させてその内部で反応させる反応器であって、
本体と、緩衝部材と、を有し、
前記本体には、反応室および前記反応室に開口し前記本体の外部と前記反応室とを連通する断面円形の２つの接続穴が設けられ、
前記緩衝部材には、板状の案内部および前記案内部の両側にそれぞれ突出し前記接続穴のそれぞれに挿入されて前記接続穴の前記反応室への開口面積を減少させる制限部が設けられており、
前記本体および前記緩衝部材は、前記流動性反応物を流速を速めて前記反応室に流入させ、前記案内部により前記流動性反応物の流れ方向を変化させるように構成されてなる、
ことを特徴とする反応器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、反応物を粒状固形物と反応させまたは前記固形触媒により反応させる方法に関し、さらに、固形支持担体上でオリゴヌクレオチドなどのバイオポリマーを製造する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学や医療分野での基礎研究および応用研究において、遺伝子（ＤＮＡ）の占める役割は益々増大し、遺伝子組み換えや遺伝子治療などの分野では実用的な産業の段階に入っている。これら分野で、化学的反応によって合成された、構造が明らかなオリゴヌクレオチドなどバイオポリマーの需要は益々増加しており、種々の自動化合成機が使われている。
【０００３】
バイオポリマーの合成方法は、今日では専門文献に広汎に記載されており、合成装置も種々市販されている。一般に市販されている自動合成装置のほぼ全ては固形支持担体上でバイオポリマーを合成する固相合成法であり、バイオポリマーの合成においては、いわゆるホスホルアミダイト法が採用されている。
【０００４】
固相合成に使用される固形支持担体は、調整された多孔性のガラスビーズ（ＣＰＧ：ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）からなっており、更に一般的には官能化した無機または有機ポリマーの粒子からなっている。これらの代表的な支持担体には、ＮＨ2および／またはＣＯＯＨ基を有する炭化水素基によって官能化されたシリカを基剤とするものや、３−アミノプロピルトリエトキシシラン基によって官能化されたシリカを基剤とする無機性のもの、ポリスチレン、ポリジメチルアクリルアミドのような有機ポリマーを挙げることができ、一般に市販されている。
【０００５】
特に、バイオポリマーの合成は、これら固形支持担体に一連の工程で新規なヌクレオチドを付加処理することにより実行される。新規なヌクレオチドを付加する工程は、担体に結合された、または１工程以降の各サイクルで付加されたヌクレオチドから５’−ブロッキング基の除去（デブロック工程）、活性化されたヌクレオチドをホスファイトエステルとして縮合（カップリング工程）、未反応ヌクレオチド５’−ヒドロキシル基の共有反応抑制（キャッピング工程）、カップリング工程で発生したホスファイトのホスヘートへの酸化（酸化工程）または硫化（Ｓ化工程）からなる。一連の合成工程は、所望な長さのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの合成に要するサイクル回数だけ行われる。
【０００６】
さらに、合成する配列がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）で始まるかどうかによって、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵを結合した、前記の官能化した無機または有機ポリマーからなる固形支持担体が使用される。これらのヌクレオチドの一つが予め結合している固形支持担体が市販されており、適当な担体が選択され、カップリング試薬を用いて最初のヌクレオチドの伸長が起こる。自動化合成装置による実際の合成では、各工程での反応に使用した試薬溶液が互いに干渉することをさけるため、試薬流路、反応室および固形支持担体をアセトニトリルなどの洗浄用溶媒で洗浄する。さらに、洗浄用溶媒による次工程での試薬の希釈をさけるため、試薬流路、反応室および固形支持担体に残留する洗浄用溶媒をアルゴンガスなど不活性ガスや高純度窒素ガスなどで排出させ、各工程の反応を行わせる。
【０００７】
これまでに開発された自動化合成装置の例として、特公昭６３−３１４８０号公報の「化学化合物の改良された合成装置」（特許文献１）がある。この合成装置では、圧力調整された不活性ガスで加圧付勢した容器内の試薬を、バルブユニットを介して予備反応室とシリカ支持担体を封入した主反応器に導入し、バルブ開閉時間および流体回路の選択を電気的に制御することによって合成工程を逐次実施する方法が示されている。
【０００８】
別の例として、特開平８−２３９３９７号公報の「固形支持体上でのポリヌクレオチドの製造法およびその製造装置」（特許文献２）があり、カラム状の合成装置（反応室）に固形支持体を充填した「クロマトグラフィカラム」型反応装置（反応室）に各試薬を貫流させることによって合成を行う方法が示されている。
【０００９】
図８は、一般に市販されている高能率型ＤＮＡ合成機において見受けられる円筒形カラム８２を有する反応器８０の概念図である。試薬を加圧、送液するために必要な試薬瓶や加圧部材、弁などは省略するが、送られてきた試薬は、ノズル８１からカラム８２へ滴下される。カラム８２には、下部フィルター８３ａおよび上部フィルター８３ｂによって挟まれた空間に固形支持担体８４が充填されている。滴下された試薬は、カラム８２の上部空間８５に溜められ、ガスチャンバー８６のガスの圧力によって、上部フィルター８３ａを通過し、固形支持担体８４との接触をへて下部フィルター８３ｂを通過し、下部の穴８７から排出される。滴下された試薬は、１度の貫流によってのみ固形支持担体８４と接触反応する。試薬の供給量は、図示しない調整弁の開閉時間によって制御される。
【特許文献１】特公昭６３−３１４８０号公報
【特許文献２】特開平８−２３９３９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１および２に開示される方法は、バイオポリマーを合成するために、いずれも固形支持担体を充填した反応室を使用し、試薬や固形支持担体洗浄用の溶媒の流れを反応室に対し１方向にのみ貫流させている。これらの技術は、「液体クロマトグラフィ」において発展した「固相充填カラム」による固相と液相との接触技術を基礎技術にしていると考えられる。
【００１１】
反応室への１回の試薬貫流のみを行う特許文献１および２で開示される反応方法では、反応室内の固形支持担体に結合されたヌクレオチドやこれに塩基配列が付加されたポリヌクレオチドを、供給された試薬と有効に反応するために、必要化学当量に対して過剰な試薬量が必要とされ、未反応試薬は無駄に廃棄されることになる。さらに、試薬と固形支持担体とを好ましく接触させ、反応効率を上げる物理的な撹拌混合などの手段が示されていない。
【００１２】
また、図８に示す反応器８０による反応は、試薬の供給量が調整弁の開閉時間によってのみ制御されるため、周囲温度の変化による試薬の粘度変化やガスの圧力変動による圧送差圧の変化の影響を受け、正確な液量の制御ができない。また、固形支持担体８４が試薬と接触する時間は、上部フィルター８３ａ、下部フィルター８３ｂの空隙率等、および固形支持担体８４の充填密度によって変化する流路抵抗の影響を受けて変動するため、正確な時間の制御ができず、安定した反応を行うことが容易ではない。
【００１３】
本発明は、上述の問題に鑑みてなされたもので、バイオポリマーの合成反応を安定化し、かつ合成に使用される試薬消費量を削減して生産性を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
請求項１の発明に係る反応方法は、容積型ポンプと、反応性を有する粒状固形物または粒状の固形触媒が収容された反応器と、前記粒状固形物と反応しまたは前記固形触媒により反応する流動性の反応物を収容した容器と、をこの順で流体的に接続し、前記反応物を、前記容積型ポンプの吸入行程で前記反応器を通過させ且つ吐出行程で前記反応器を逆方向に通過させて前記粒状固形物と反応を行わせまたは前記固形触媒により反応を行わせる。
【００１５】
請求項２の発明に係るバイオポリマーを製造する方法は、前記粒状固形物がバイオポリマーの末端となる分子を結合させた固形支持坦体であり前記反応物が前記分子と反応する試薬である。
【００１６】
前記バイオポリマーを製造する方法において、好ましくは、前記固形支持坦体を前記反応器に流動可能に収容し、フィルターにより前記固形支持坦体の反応器外への流出を防止し、前記反応器を通過する前記反応物により前記固形支持坦体を流動させる。
【００１７】
請求項４の発明に係る装置は、バイオポリマーを製造する装置であって、前記バイオポリマーの末端となる分子を結合させた粒状の固形支持坦体が流動可能に収容された反応器と、前記分子と反応させる試薬を収容する試薬容器と、前記試薬を前記反応器に供給するための容積型ポンプと、を有し、前記容積型ポンプは、前記反応器を経由して前記試薬を前記試薬容器から吸入し、且つ吸入した前記試薬を前記反応器を経由して系外に吐出するように、前記反応器を介して前記試薬容器に接続されてなる。
【００１８】
請求項５の発明に係る装置は、バイオポリマーを製造する装置であって、前記バイオポリマーの末端となる分子を結合させた粒状の固形支持坦体が流動可能に収容された反応器と、前記分子と反応させる試薬を収容する試薬容器と、２以上の補助試薬を個別に収容する補助試薬容器と、前記試薬または前記補助試薬を前記反応器に供給するための容積型ポンプと、前記反応器に供給する前記補助試薬容器を選択するための補助セレクタ弁と、前記反応器と前記試薬容器、前記補助セレクタ弁、または系外とを選択的に連通させるセレクタ弁と、を有し、前記容積型ポンプは、前記試薬または前記補助試薬を前記反応器を経由して前記試薬容器または前記補助試薬容器から吸入し、且つ吸入した前記試薬を前記反応器を経由して系外に吐出するように、前記反応器を介して前記セレクタ弁に接続されてなる。
【００１９】
好ましくは、前記補助セレクタ弁と各前記補助試薬容器との間に設けられた２ポート弁と、前記セレクタ弁の選択、前記補助セレクタ弁による前記補助試薬容器の選択、前記２ポート弁の開閉、および前記容積型ポンプの吸入吐出動作を制御する制御手段と、を有し前記制御手段は、前記セレクタ弁が前記補助セレクタ弁と連通するとき前記補助セレクタ弁が選択する前記補助試薬容器との間の前記２ポート弁を開とし、前記セレクタ弁が前記試薬容器または前記補助セレクタ弁と連通するとき前記容積型ポンプに吸入動作を行わせ、前記セレクタ弁が系外と連通するとき前記容積型ポンプに吐出動作を行わせるように制御する。
【００２０】
さらに好ましくは、前記反応器が、本体と、緩衝部材と、を有し、前記本体には、反応室と、前記反応室に開口し前記本体の外部と前記反応室とを連通する断面円形の２つの接続穴と、が設けられ、前記緩衝部材は、両端部が円柱状であってその外周に螺旋状の溝を有し、前記端部が前記接続穴のそれぞれに嵌入されて前記溝により前記試薬が前記反応室に旋回流となって供給されるように構成されてなる。
【００２１】
請求項８の発明に係る反応器は、流動性反応物を流入させてその内部で反応させる反応器であって、本体と、緩衝部材と、を有し、前記本体には、反応室および前記反応室に開口し前記本体の外部と前記反応室とを連通する断面円形の２つの接続穴が設けられ、前記緩衝部材には、板状の案内部および前記案内部の両側にそれぞれ突出し前記接続穴のそれぞれに挿入されて前記接続穴の前記反応室への開口面積を減少させる制限部が設けられており、前記本体および前記緩衝部材は、前記流動性反応物を流速を速めて前記反応室に流入させ、前記案内部により前記流動性反応物の流れ方向を変化させるように構成されてなる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、バイオポリマーの合成反応を安定化し、かつ合成に使用される試薬消費量を削減して生産性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
図１は本発明に係る４連のシリンジポンプユニットを実装した反応装置１の外観図、図２は本発明に係る反応装置１の流体回路図、図３は反応装置１における反応器８の正面断面図、図４は反応器８を構成する緩衝部材１１の斜視図、図５は反応器８内の試薬等の流れを示す図、図６は他の実施形態による緩衝部材１１の斜視図、図７はポリヌクレオチド合成のフロー図である。
【００２４】
反応装置１を説明する前に、バイオポリマーであるポリヌクレオチドのホスホルアミダイト法による合成について、図７を参照しながら以下に説明する。ホスホルアミダイト法では、例えば、ヌクレオチドが有機分子とのエステルの形で表面に結合された多孔性の粉末状のガラスビーズ（ＣＰＧ）である固形支持担体を反応室に収納する。そして、順次、所定の試薬を反応室に供給して、固形支持担体に結合するヌクレオチドと反応させ、ポリヌクレオチドを合成する。なお、ポリヌクレオチドのホスホルアミダイト法による合成自体は公知である。
【００２５】
ホスホルアミダイト法によってポリヌクレオチドを合成する工程は、
（１）デブロック工程＃１１：固形支持担体に結合したヌクレオチドのジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基を、トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（以下、「デブロック試薬」という。）で処理して除去する。トリチル基除去の段階で鮮やかな橙色の発色が観察される。この発色は青色ＬＥＤの４７０ｎｍ波長光を吸収するので、透過光量の測定によって合成可能なポリマー量を計量することができる。
（２）洗浄工程＃１２：十分に水分を除去したアセトニトリルによって、試薬の供給流路、反応室および固形支持担体を洗浄し、デブロック試薬を除去する。
（３）ガスフラッシュ工程＃１３：試薬の供給流路、反応室および固形支持担体の洗浄に使用したアセトニトリルを不活性ガスによって排出し、次工程における反応試薬の希釈を防止する。
（４）カップリング工程＃１４：３価のリン酸誘導体であるホスホルアミダイトモノマー（以下、「アミダイト試薬」という。）とテトラゾールのアセトニトリル溶液（以下、「アクチベータ試薬」という。）とによって、デブロック工程＃１１で脱保護された５’端末ヒドロキシル基を縮合反応させポリヌクレオチド間の結合を行う。目的とする塩基配列を実現するために必要とされるＡ，Ｃ，Ｇ，ＴまたはＵ、あるいはそれらの混合されたアミダイト試薬を選択して反応室に供給する。
（５）洗浄工程＃１５：デブロック工程＃１１後の洗浄工程＃１２と同様に、十分に水分を除去したアセトニトリルによって、アミダイト試薬およびアクチベータ試薬を除去する。
（６）ガスフラッシュ工程＃１６：洗浄工程＃１５において使用したアセトニトリルを不活性ガスによって排出する。
（７）キャッピング工程＃１７：無水酢酸のテロラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（以下、「Ｃａｐ−Ａ試薬」という。）と１−メチルイミダゾールのＴＨＦ溶液（以下、「Ｃａｐ−Ｂ試薬」という。）とを反応室に供給して、カップリング工程＃１４で未反応のまま残った５’端末ヒドロキシル基をアセチル化し、以降の合成サイクルでアミダイト試薬と反応することを防止する。
（８）洗浄工程＃１８：上に説明した洗浄工程＃１２，＃１５と同様である。
（９）ガスフラッシュ工程＃１９：上に説明したガスフラッシュ工程＃１３，＃１６と同様である。
（１０）酸化工程＃２０：カップリング工程＃１４の縮合反応で生じた、ポリヌクレオチド間結合である亜リン酸トリエステル結合を、ヨウ素、水およびピリジン含有ＴＨＦ溶液（以下、「酸化試薬」という。）で処理し、安定なリン酸エステル結合に変化させる。
（１１）洗浄工程＃２１：上に説明した洗浄工程＃１２，＃１５，＃１８と同様である。
（１２）ガスフラッシュ工程＃２２：上に説明したガスフラッシュ工程＃１３，＃１６，＃１９と同様である。
【００２６】
以上の（１）〜（１２）の工程を、必要とする鎖長のポリヌクレオチドになるまで繰り返す。
【００２７】
通常は市販されている固形支持担体に予めＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔのどれかが結合しているため、鎖長が３０塩基のポリヌクレオチドを得る場合には、２９回上記工程のサイクルを繰り返すことになる。
【００２８】
このような、バイオポリマーの合成を行うことができる反応装置１について、以下に説明する。
【００２９】
図１および図２において、反応装置１は、補助試薬瓶取付部２２、補助試薬セレクタ弁２７、アミダイト試薬瓶取付部２５、合成ユニット３０、および操作部３２からなっている。
【００３０】
反応装置１において、補助試薬瓶取付部２２は、１つの面に２段に設けられており、補助試薬瓶取付部２２には、デブロック試薬瓶２２ａ、酸化試薬瓶２２ｂ、Ｃａｐ−Ａ試薬瓶２２ｃ、Ｃａｐ−Ｂ試薬瓶２２ｄ、アクチベータ試薬瓶２２ｅ、およびアセトニトリル試薬瓶２２ｆが取り付けられる。補助試薬瓶取付部２２には、試薬瓶２２ａ〜ｆを取り付けた状態で試薬瓶２２ａ〜ｆから各補助試薬を取り出すための挿入管が設けられている。また、補助試薬瓶取付部２２には、各試薬瓶２２ａ〜ｆの空間部を加圧して各挿入管に補助試薬を圧入するためのガス導入管が、それぞれの試薬瓶２２ａ〜ｆの取付部分に設けられている。各ガス導入管には、高純度窒素ガス（以下、「窒素ガス」ということがある。）の供給源１８から、ストップ弁１９、および調圧弁２０を介して圧力調整された窒素ガスが供給される。窒素ガスは、調圧弁２０により好ましくは０．０２〜０．０３ＭＰａに調圧される。高純度窒素ガスに代えてアルゴンなどの不活性ガスを用いてもよい。
【００３１】
補助試薬セレクタ弁２７は、補助試薬瓶取付部２２に取り付けられた各補助試薬の中から、反応器８に供給する補助試薬を選択するためのものである。補助試薬セレクタ弁２７の選択位置の切り替えは、図示しないステップモータにより行われる。補助試薬セレクタ弁２７により選択された補助試薬は、後に説明する試薬給排セレクタ弁２８を経由して反応器８に供給される。補助試薬セレクタ弁２７は、それぞれ別個の電磁ソレノイド駆動により開閉される２ポート弁２３ａ〜ｆを介して、各試薬瓶２２ａ〜ｆに挿入される挿入管に接続されている。そして、例えば、補助試薬セレクタ弁２７が位置２７ｃに選択された場合には２ポート弁２３ｃのみが開となる、というように、補助試薬セレクタ弁２７と２ポート弁２３ａ〜ｆとは連動して動作するように構成されている。また、補助試薬セレクタ弁２７は、２ポート弁２３ｊを介して調圧弁２０の２次側で分岐した窒素ガスに接続されている。上に説明したガスフラッシュ工程＃１３，＃１６，＃１９，＃２２では、補助試薬セレクタ弁２７は位置２７ｆとなり、２ポート弁２３ｊは開となる。そして、補助試薬セレクタ弁２７を通じて流路に送り込まれた窒素ガスは、反応器８内などの洗浄に使用したアセトニトリルを系外に排出する。
【００３２】
アミダイト試薬瓶取付部２５には、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴのアミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄが取り付けられる。アミダイト試薬瓶取付部２５は、先に説明した補助試薬瓶取付部２２と同様に、アミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄから各アミダイト試薬を取り出すための挿入管がそれぞれの取付部分に設けられる。また、挿入管にアミダイト試薬を圧入できるように、各アミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄの空間部を加圧するためのガス導入管が設けられている。このガス導入管は、調圧弁２０の２次側に接続されている。アミダイト試薬瓶取付部２５には、アミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄに加え、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴのうちのいずれか２種類または３種類が混合されたアミダイト試薬瓶２５ｅ、Ｕのアミダイト試薬瓶２５ｆ等を取り付けてもよい。
【００３３】
反応装置１において、合成ユニット３０は４基設けられている。各合成ユニット３０は、いずれも試薬給排セレクタ弁２８、反応器８、およびポンプ装置２９からなる。４基の合成ユニット３０は全て同じ構成であり、全ての合成ユニット３０では同時に図７における同一の工程の処理が行われる。ただし、１基の合成ユニット３０でＡのアミダイト試薬瓶２５ａからのアミダイト試薬を用いてカップリング工程＃１４を行い、同時に他の合成ユニット３０でＣのアミダイト試薬を用いてカップリング工程＃１４を行うことが可能である。
【００３４】
以下、図２を参照しながら、合成ユニット３０について説明する。
【００３５】
試薬給排セレクタ弁２８は、アミダイト試薬瓶取付部２５に取り付けられた各アミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄの中から、反応器８に接続するアミダイト試薬を収容するアミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄを選択するためのものである。試薬給排セレクタ弁２８の選択位置の切り替えは、図示しないステップモータにより行われる。選択されたアミダイト試薬は反応器８に供給される。試薬給排セレクタ弁２８は、それぞれ電磁ソレノイド駆動により開閉される別個の２ポート弁２４ａ〜ｄを経由して各アミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄに挿入される挿入管に接続されている。試薬給排セレクタ弁２８と２ポート弁２４ａ〜ｄとは、アミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄのうち、いずれか１つが反応器８と連通するように連動して動作する。
【００３６】
補助試薬セレクタ弁２７および試薬給排セレクタ弁２８の位置の切り替え、２ポート弁２３ａ〜ｆ，ｊおよび２ポート弁２４ａ〜ｄの開閉は、図示しない制御装置により自動で行われる。
【００３７】
２ポート弁２４ａ〜ｄを各合成ユニット３０に個別に設けるのではなく、各合成ユニットに共通する２ポート弁２４ａ〜ｄとしてもよい。その場合、全ての合成ユニットにおいて、カップリング工程＃１４で同一のアミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄからのアミダイト試薬が反応器８に供給される。
【００３８】
図３ないし図５を参照して、反応器８は、下部ハウジング部材８ａ、上部蓋部材８ｂ、および緩衝部材１１により構成される。
【００３９】
下部ハウジング部材８ａと上部蓋部材８ｂとは分割自在に一体化され、内部に円筒形空隙である反応室１２が形成される。反応室１２には、固形支持坦体１３が収容される。固形支持坦体１３は、ポリヌクレオチドの合成ごとに新しい固形支持坦体１３に交換される。固形支持坦体１３は、好ましくは反応室１２の空隙容積の２／３〜１／３封入される。反応室１２は、Ｏリング１７により気密が保持される。下部ハウジング部材８ａおよび上部蓋部材８ｂには、対向する位置関係で反応室１２に開口し、それぞれを貫通する断面円形の接続穴９ａ，ｂが設けられている。接続穴９ａ，ｂは、いずれも反応室１２側に径大部１８ａ，ｂを有している。径大部１８ａ，ｂは同一の内径および長さを有し、それぞれの径大部１８ａ，ｂの深部にはフィルター１０ａ，ｂが設けられている。各フィルター１０ａ，ｂは、固形支持坦体１３が反応室１２外に流出するのを防止する。また、接続穴９ａ，ｂにはＯリング１６ａ、１６ｂが設けられ、試薬給排セレクタ弁２８およびシリンジポンプ１４に接続するための接続部材との気密を保つ。
【００４０】
緩衝部材１１は、図４によく示されるように、円盤状の案内部１１１と、案内部１１１を挟んで設けられ案内部１１１と軸心を共通とする断面が略円形の棒状部１１２ａ，ｂとからなっている。棒状部１１２ａ，ｂの外径は、下部ハウジング部材８ａおよび上部蓋部材８ｂの径大部１８ａ，ｂの内径と略等しい。棒状部１１２ａ，ｂの外周には螺旋状の溝１１３ａ，ｂが設けられている。緩衝部材１１は、棒状部１１２ａ，ｂが径大部１８ａ，ｂに滑動的に挿入されて、反応器８に組み込まれる。接続穴９ａ，ｂの反応室１２への開口面積は、実質的に溝１１３ａ，ｂによる分のみに制限される。アミダイト試薬および補助試薬などの試薬は、フィルター１０ａ，ｂを通過した後、径大部１８ａ，ｂと螺旋状の溝１１３ａ，ｂとによって構成された螺旋通路を通過することによって流速が速められるとともに物理的な旋回を与えられ、反応室１２内で固形支持担体１３と良好に撹拌混合される。反応室１２に旋回しながら流入した試薬は、案内部１１１により軸方向の流れから半径方向外方への流れに変化する。試薬は、接続穴９ａ，ｂ間をショートパスせずに案内部１１１の外周を迂回し、流れの停滞部分を生じることなく反応室１２全体を循環する。反応器８では反応室１２内全体が流入した流体により良好に撹拌混合され、固形支持担体１３は流動して表面の境界層が頻繁に更新され、各試薬による反応や洗浄が促進される。
【００４１】
螺旋状の溝１１３ａ，ｂの傾斜角度は、上に説明した効果を得られる任意の角度とすることができる。また、図３において、溝１１３ａ，ｂは、流体が反応室１２から流出するときには流入するときと逆方向に旋回するように構成されているが、流出するときの流体の旋回方向を流入するときと同一方向にしてもよい。
【００４２】
図６には、他の実施形態に係る緩衝部材１１Ｂを示す。
【００４３】
緩衝部材１１Ｂは、円盤状の案内部１１１Ｂ、案内部１１１Ｂの両側に設けられた第１の円筒状壁２０Ｂｂ、および、同じく案内部１１１Ｂの両側のそれぞれの第１の円筒状壁２０Ｂｂの外側に設けられた第２の円筒状壁２１Ｂａ，ｂからなる。
【００４４】
第１の円筒状壁２０Ｂｂは複数の切り欠きが設けられ、その端部は、下部ハウジング部材８ａおよび上部蓋部材８ｂの径大部１８ａ，ｂに嵌入される。第２の円筒状壁２１Ｂａ，ｂは、第１の円筒状壁２０Ｂｂに設けた切り欠きと１／２位相をずらせた位置に切り欠きを持ち、第２の円筒状壁２１Ｂａ，ｂの両端間の距離は、反応室１２の軸方向長さに略等しく形成される。試薬などの流体は、フィルター１０ａ，ｂを通過した後、接続穴９ａ，ｂの一方から第１の円筒状壁２０Ｂａ，ｂの切り欠き部を通過して反応室１２に流入する。試薬などの流体は、第１の円筒状壁２０Ｂａ，ｂの切り欠き部により流路を制限されて流速が速められ、案内部１１１Ｂにより軸方向の流れから半径方向の流れに変化する。
【００４５】
流体は、その後、第２の円筒状壁２１Ｂａ，ｂの切り欠き部によって流れ方向を変えられ、渦流れによる撹拌混合を発生しながら第２の円筒状壁２１Ｂａ，ｂの外部へ流出する。流体は、反応室１２から流出するときにも、流出側の第２の円筒状壁２１Ｂａ，ｂの切り欠き部通過時に渦流れにより撹拌混合され、流出側の第１の円筒状壁２０Ｂｂを通過して、接続穴９ａ，ｂから流出する。緩衝部材１１Ｂを有する反応器においても、反応器に流入する試薬などの流体は、接続穴９ａ，ｂ間をショートパスすることなく反応室１２全体を循環し、固形支持担体１３は流動して表面の境界層が頻繁に更新され、各試薬による反応や洗浄が促進される。
【００４６】
図６に示される緩衝部材１１Ｂでは、それぞれ４カ所の切り欠きを持つ第１の円筒状壁２０Ｂｂおよび第２の円筒状壁２１Ｂａ，ｂの２重の円筒状壁を有しているが、切り欠き数と壁の数はこれに拘らない。
【００４７】
反応室は、円筒形空隙である反応室１２のような断面形状が円形のものに限られず、断面形状を種々の多角形にすることができる。その場合、案内部も円盤状ではなく、反応室の断面形状に合わせて種々の形状の板状とすることができる。棒状部１１２ａ，ｂまたは第１の円筒状壁２０Ｂａ，ｂは、反応時に流体により回転等することのないように径大部１８ａ，ｂに嵌入される。
【００４８】
反応室１２を構成する下部ハウジング部材８ａおよび上部蓋部材８ｂは、耐試薬および耐溶剤性能を持つ材質で構成され、好ましくはステンレス鋼を使用する。フィルター１０ａ，ｂは、多孔性高密度ポリエチレンや多孔性ステンレス鋼焼結体が使用される。
【００４９】
ポンプ装置２９は、ステップモータＳＭ、およびボールねじ１４１でシリンジピストン１５が駆動されるシリンジポンプ１４からなる。シリンジポンプ１４の吸い込み容量、吸い込み速度および吐出速度は、アミダイト試薬および補助試薬ごとに予めプログラムされた制御装置によって決められている。シリンジピストン１５は、プログラムされた吸入行程の設定位置に達し、設定時間停止した後、吐出動作に入る。それぞれの試薬は、制御された容積型のシリンジポンプ１４によって設定された正確な吐出時間および吐出量に制御される。各試薬は、それぞれ該当する工程において、シリンジポンプ１４の吸入行程および吐出行程の２度、流速が速められた旋回流による混合によって固形支持担体と接触するので、高い反応効率および洗浄効果が得られる。
【００５０】
シリンジポンプ１４に代えて、吸入側と吐出側とを切り替えることができる、例えば、軟質チューブをローラーでしごいて送液するペリスタルティックポンプのような、容積型ポンプを使用してもよい。
【００５１】
図１によく示されるように、操作部３２は反応装置１の外面に設けられている。操作部３２は、スタートスイッチ１０１、非常停止スイッチ１０２、表示盤１０３、調圧弁２０の調圧ハンドル１０４、および圧力計１０５からなっている。スタートスイッチ１０１は、ポリヌクレオチドの合成を開始するためのものであり、オンされると、図７のデブロック工程＃１１が開始される。
【００５２】
非常停止スイッチ１０２は、ポリヌクレオチドの合成を途中で停止するためのものであり、例えば、デブロック工程＃１１において脱保護反応が不十分な場合に、非常停止スイッチ１０２をオンして合成作業を停止する。
【００５３】
表示盤１０３は液晶で形成されており、例えば、デブロック工程＃１１ないしガスフラッシュ工程＃２２のうち、実際に行われている合成の工程名を表示する。
【００５４】
調圧弁２０の調圧ハンドル１０４および圧力計１０５は、補助試薬瓶取付部２２に取り付けられた各試薬瓶２２ａ〜ｆの空間部およびアミダイト試薬瓶取付部２５に取り付けられたアミダイト試薬瓶２５ａ〜ｄの空間部を加圧し、また、ガスフラッシュ工程＃１３，＃１６，＃１９，＃２２に使用される窒素ガスの圧力を調整するためのものである。
【００５５】
次に、図２および図５を参照しながら、反応装置１の動作について説明する。
【００５６】
例えば、デブロック工程＃１１が実行される場合には、補助試薬セレクタ弁２７は位置２７ａに切り替わり、同時に試薬給排セレクタ弁２８は位置２８ｈに切り替わる。補助試薬セレクタ弁２７および試薬給排セレクタ弁２８は、それぞれ図示しないステップモータなどで切り替え位置を制御される。それぞれのセレクタ弁２７，２８の位置決め完了によって、デブロック試薬瓶２２ａに接続された２ポート弁２３ａを開く。同時に、ステップモータＳＭとボールねじ１４１などで駆動されるシリンジピストン１５が、設定された速度で設定された位置まで上昇し、反応室１２内にデブロック試薬を吸入する。デブロック試薬は、螺旋状の溝１１３ａを通過するとき流速が速められた旋回流となって反応室１２に流入し、固形支持担体１３を攪拌流動させ、固形支持担体１３に結合したヌクレオチドの脱保護反応を促進させる。また、一部のデブロック試薬は、反応室１２を通過してシリンジポンプ１４内に流入する。
【００５７】
予めプログラムで設定された時間を経過した後、２ポート弁２３ａを閉じ、試薬給排セレクタ弁２８を排出位置２８ｅに切り替え、シリンジピストン１５を決められた運転パターンで下降させる。デブロック試薬は、シリンジポンプ１４内から吐出されて再び反応室１２内に流入し、溝１１３ｂにより流速が増した旋回流となって固形支持担体１３を攪拌流動させる。つまり、デブロック試薬は、シリンジポンプ１４の吸入および吐出のいずれにおいても、反応器８内において固形支持担体１３に接触してヌクレオチドの脱保護反応を行うことになり、デブロック試薬は、脱保護反応に有効に利用される。
【００５８】
反応室１２から流出するデブロック試薬は、試薬給排セレクタ弁２８を通過し、廃液瓶２６に排出される。デブロック工程＃１１では、デブロック試薬中に含まれる脱保護反応で発生した離脱トリチル基による発色を反応モニター３１で監視し、予め設定したレベルの吸光が見られなければ警報を発して以降の工程やサイクルを停止する。
【００５９】
カップリング工程＃１４およびキャッピング工程＃１７では、それぞれ所定の試薬を混合して固形支持担体１３に結合したヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドと反応させる必要がある。Ａ塩基を合成するカップリング工程＃１４を例にして操作順序を以下に説明する。
【００６０】
カップリング工程＃１４では、アミダイト試薬とアクチベータ試薬とを混合し、活性化して固形支持担体１３に結合したヌクレオチドの脱保護した５’端末ヒドロキシル基と反応させる。各セレクト弁２７，２８および各２ポート弁２３ａ〜ｆ，２４ａ〜ｄは、補助試薬セレクタ弁２７が位置２７ｅに切り替わり、同時に試薬給排セレクト弁２８が位置２８ｈに切り替わる。それぞれのセレクタ弁２７，２８の位置決め完了によって、アクチベータ試薬瓶２２ｅに接続された２ポート弁２３ｅを開く。次いで、シリンジピストン１５が設定された速度で上昇し、反応室１２にアクチベータ試薬を導入する。アクチベータ試薬の一部は、反応室１２を通過してシリンジポンプ１４内に流入する。
【００６１】
シリンジピストン１５は、設定された位置まで上昇すると停止し、２ポート弁２３ｅが閉じられる。続いて、試薬給排セレクト弁２８を位置２８ａに切り替え、アミダイト試薬瓶２５ａに接続された２ポート弁２４ａを開く。シリンジピストン１５を設定された速度で上昇させて反応室１２にアミダイト試薬を導入し、設定された位置でシリンジピストン１５を停止する。アミダイト試薬は、上に説明したデブロック工程＃１１におけるデブロック試薬と同様に、溝１１３ａにより流速を増した旋回流となって反応室１２に流入し、良好な攪拌状態の下で、反応室１２内のアクチベータ試薬と混合して固形支持担体１３に結合したヌクレオチドと縮合する。また、アミダイト試薬の一部も、反応室１２を通過してシリンジポンプ１４内に流入する。
【００６２】
さらに、２ポート弁２３ｅを開き、同時に試薬給排セレクト弁を位置２８ｈに切り替える。再度、シリンジピストン１５を設定された速度で上昇させ、反応室１２にアクチベータ試薬を導入して、アミダイト試薬と混合する。このとき、反応室１２内が溝１１３ａによって良好な攪拌状態となり効率よく反応が行われるのは、上に説明した通りである。
【００６３】
シリンジピストン１５が設定された位置まで上昇したら２ポート弁２３ｅを閉じる。この状態で予めプログラムで設定された時間を経過した後、試薬給排セレクト弁２８を排出位置２８ｅに切り替える。シリンジピストン１５を決められた運転パターンで下降させ、反応室１２および試薬給排セレクト弁２８を経由して反応後の試薬を廃液瓶２６に排出する。このシリンジピストン１５の下降時に、シリンジポンプ１４内のアクチベータ試薬およびアミダイト試薬が、溝１１３ｂにより流速が速められた旋回流となって再び反応室１２内に流入し、固形支持担体１３を攪拌流動させて、活性化したアミダイト試薬が固形支持担体１３に結合したヌクレオチドと縮合する。
【００６４】
酸化工程＃２０においても、上に述べたデブロック工程＃１１およびカップリング工程＃１４と同様に、反応室１２内の良好な攪拌により反応が効率的に行われる。また、洗浄工程＃１２，＃１５，＃１８，＃２１においても、流入する洗浄用溶媒により反応器１２内が攪拌され、洗浄用溶媒は固形支持担体１３に効率よく接触するので、洗浄が良好に行われる。
【００６５】
このように、アミダイト試薬および補助試薬は、シリンジポンプ１４により反応器８内に液送されるときに、反応室１２内に旋回流などを生じさせて固形支持担体１３と十分に撹拌接触する。旋回流は、反応を促進させるために必要な複数の試薬を、確実に混合して固形支持担体１３と撹拌接触させ、それぞれの工程において反応効率を高めることは明らかである。容積型のシリンジポンプ１４の採用によって、反応に必要とされる正確な容積の試薬量が設定できるため、高価な試薬の無駄な消費を防ぎ、生産性の高い合成が可能になることも明らかである。
【００６６】
上述の実施形態において、反応器の構造を本発明の趣旨に沿って適宜変更することができる。例えば、緩衝部材１１における螺旋状の溝１１３ａ，ｂに代えて軸方向に複数の溝を設けてもよい。ポンプ装置を、ステップモータＳＭおよびボールねじ１４１で駆動するシリンジポンプ１４ではなく、他の駆動方式または他の容積型ポンプとすることもできる。
【００６７】
その他、補助試薬瓶取付部２２、補助試薬セレクタ弁２７、アミダイト試薬瓶取付部２５、試薬給排セレクタ弁２８、反応器８、ポンプ装置２９、および合成ユニット３０などの全体または各部の構成、材質、形状および寸法などは、本発明の趣旨に沿って適宜変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明に係る４連のシリンジポンプユニットを実装した反応装置の外観図である。
【図２】本本発明に係る反応装置の流体回路図である。
【図３】反応器の正面断面図である。
【図４】緩衝部材の斜視図である。
【図５】反応器内の試薬等の流れを示す図である。
【図６】他の実施形態による緩衝部材の斜視図である。
【図７】ポリヌクレオチド合成のフロー図である。
【図８】従来の反応器の概念図である。
【符号の説明】
【００６９】
１  反応装置（バイオポリマーを製造する装置）
８  反応器
８ａ  下部ハウジング部材（本体）
８ｂ  上部蓋部材（本体）
９ａ，ｂ  接続穴
１１，１１Ｂ  緩衝部材
１１１，１１１Ｂ  案内部
１１２ａ，ｂ  棒状部（端部、制限部）
１１３ａ，ｂ  溝
１２  反応室
１３  固形支持坦体（粒状固形物、固形触媒）
１４  シリンジポンプ（容積型ポンプ）
２２ａ  デブロック試薬瓶（補助試薬容器）
２２ｂ  酸化試薬瓶（補助試薬容器）
２２ｃ  Ｃａｐ−Ａ試薬瓶（補助試薬容器）
２２ｄ  Ｃａｐ−Ｂ試薬瓶（補助試薬容器）
２２ｅ  アクチベータ試薬瓶（補助試薬容器）
２２ｆ  アセトニトリル試薬瓶（補助試薬容器）
２３ａ〜ｆ  ２ポート弁
２５ａ〜ｄ  アミダイト試薬瓶（試薬容器）
２７  補助試薬セレクタ弁（補助セレクタ弁）
２８  試薬給排セレクタ弁（セレクタ弁）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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