(57)【要約】【課題】微細針状物質を用いた核酸物質の導入技術は、細胞に何ら特別な処理をしなくても核酸物質の導入ができるため、他の方法では核酸物質の導入が困難であった細胞などに対しても核酸物質の導入が可能である。しかしこれまでの微細針状物質を用いた核酸物質導入技術では、充分な導入効率を達成することが困難である。【解決手段】核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布して、その後に平板培養基材の表面を一定方向に一定した大きさの力を加えながら擦ることで充分な核酸物質導入効率を得ることが可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸物質と微細針状物質および細胞を混合し、平板培養基材の表面に塗布した後に、平板培養基材の表面を一定方向に擦って滑り摩擦を与えることにより、混合物中の当該微細針状物質を混合物中の当該細胞に浸入させ混合物中の当該核酸物質を混合物中の当該細胞内に導入する核酸物質導入装置において、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布および平板培養基材の表面を一定方向に擦る時に使用する塗布用の部品に一定の力を加えることを特徴とする核酸物質導入装置。
【請求項２】
核酸物質と微細針状物質および細胞を混合し、平板培養基材の表面に塗布した後に、平板培養基材の表面を一定方向に擦って滑り摩擦を与えることにより、混合物中の当該微細針状物質を混合物中の当該細胞に浸入させ混合物中の当該核酸物質を混合物中の当該細胞内に導入する核酸物質導入装置において、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布および平板培養基材の表面を一定方向に擦る時に使用する塗布用の部品に一定の力を加えることを特徴とする核酸物質導入装置において、塗布用の部品に一定の力を加える方法として垂直抗力を一定に保つ装置を用いることを特徴とする核酸物質導入装置。
【請求項３】
核酸物質と微細針状物質および細胞を混合し、平板培養基材の表面に塗布した後に、平板培養基材の表面を一定方向に擦って滑り摩擦を与えることにより、混合物中の当該微細針状物質を混合物中の当該細胞に浸入させ混合物中の当該核酸物質を混合物中の当該細胞内に導入する核酸物質導入装置において、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布および平板培養基材の表面を一定方向に擦る時に使用する塗布用の部品に一定の力を加えることを特徴とする核酸物質導入装置において、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布および平板培養基材の表面を一定方向に擦る方法として、平板培養基材を一定速度で一定方向に回転させることを特徴とする核酸物質導入装置。
【請求項４】
核酸物質と微細針状物質および細胞を混合し、平板培養基材の表面に塗布した後に、平板培養基材の表面を一定方向に擦って滑り摩擦を与えることにより、混合物中の当該微細針状物質を混合物中の当該細胞に浸入させ混合物中の当該核酸物質を混合物中の当該細胞内に導入する核酸物質導入装置において、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布および平板培養基材の表面を一定方向に擦る時に使用する塗布用の部品に一定の力を加えることを特徴とする核酸物質導入装置において、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布および平板培養基材の表面を一定方向に擦る方法として、平板培養基材を一定速度で一定方向に回転させることおよび塗布用の部品に一定の力を加える方法として垂直抗力を一定に保つ装置を用いることを特徴とする核酸物質導入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、核酸物質と微細針状物質および細胞を混合し、これに一定の力を加えて滑り摩擦を与えることにより、核酸物質を吸着した微細針状物質を細胞に浸入させ核酸物質を細胞内に導入することを実現するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】  任意の核酸物質を目的の細胞に導入することは、遺伝子操作の基本的な技術であり、これまでに多くの方法が提案され、実用化されている。核酸物質はデオキシリボ核酸とリボ核酸の総称であり、遺伝子操作においては主にデオキシリボ核酸、特に特定の塩基配列を有する環状のデオキシリボ核酸（プラスミド）が細胞内に導入される。【０００３】  目的細胞を一定の条件で培養して核酸物質を細胞内に取り込み易い状態にし、この細胞と核酸物質を混合させることにより、核酸物質の自然的な拡散により拡散物質を目的の細胞内に導入する方法は広く行われている。この核酸物質を取り込み易い状態の細胞はコンピテント細胞と呼ばれ、その調整方法は例えば非特許文献１などに記載されている。さらに遺伝子導入効率の高いコンピテント細胞の製法なども提案されている（例えば特許文献１参照。）。【０００４】  目的細胞を塩化カルシウムなどの化学物質で処理して核酸物質を細胞内に取り込み易い状態にし、この細胞と核酸物質を混合させることにより、核酸物質の自然的な拡散により拡散物質を目的の細胞内に導入する方法は広く行われている。この方法は主に大腸菌で使われており、その調整方法は例えば非特許文献１などに記載されている。さらに化学物質での処理を行う簡便な装置なども提案されている（例えば特許文献２参照。）。【０００５】  細胞壁の厚い酵母やグラム陽性細菌では、細胞壁を除去したプロトプラストの状態にして遺伝子の導入操作が行われている。この操作においてはポリエチレングリコールが主に用いられており、その調整方法は例えば非特許文献２などに記載されている。さらにポリエチレングリコールでの処理を行う簡便な装置なども提案されている（例えば特許文献３参照。）。【０００６】  細胞と核酸物質の混合物に一定強度の一定方向の電圧を掛けると、細胞膜に小孔が生じて核酸物質が細胞内に導入される。この方法は電気穿孔（エレクトロポレーション）法と呼ばれ、その操作方法とその調整方法は例えば非特許文献１などに記載されている。またこの方法を実現する装置は例えばネッパジーン株式会社の「ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ」（非特許文献２）や日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社の「Ｅ．ｃｏｌｉパルサー」や「ジーンパルサーＩＩシステム」などが広く市販されている。【０００７】  金の微粒子に核酸物質を吸着させ、これを圧縮ガスや爆発などによる駆動力で高速で細胞内に打ち込んで核酸物質を細胞内に導入する方法はパーティクルガン法と呼ばれ、日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社の「Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎシステム」や「ＰＤＳ−１０００／Ｈｅシステム」などが広く市販されている。しかしパーティクルガン法は細胞壁の硬い植物細胞を主に対象として開発された方法であり、微生物細胞には適応することができない。【０００８】  アスベストを用いた核酸物質の導入については、１９８８年にＡｐｐｅｌらによって報告がある（非特許文献３）。しかしこれは哺乳類細胞を用いた実験報告であり、微生物への応用は記されていない。また操作方法も具体性に欠け、核酸物質の導入装置は提案もなされていない。
【特許文献１】特表２００２−５０２２３２号  公報
【特許文献２】特開２００３−１４４１５８号  公報
【特許文献３】特開平５−１９２１６９号  公報
【非特許文献１】「新版  微生物学実験法」、講談社サイエンティフィク、１９９９年、ｐ１６８−１７１
【非特許文献２】「ネッパジーン株式会社Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」、２０００年、ｐ２−８
【非特許文献３】Ａｐｐｅｌ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、１９８８年、ｐ７６７０−７６７４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  アスベストなどの微細針状物質を用いた核酸物質の導入技術は、核酸物質を微細針状物質に吸着させて物理的に細胞に導入するため、細胞に何ら特別な処理をしなくても核酸物質の導入ができるという利点を有する。従って他の方法では核酸物質の導入が困難であったコンピテンス細胞を作り難い細胞や細胞壁の硬い細胞などに対しても核酸物質の導入が可能である。しかし非特許文献３に示されたようなこれまでの微細針状物質を用いた核酸物質の導入技術では、一定以上の核酸物質の導入効率を得ることや再現性ある導入効率を達成することが困難である。【００１０】  核酸物質の導入効率が低い場合には実験回数を増加することにより、目的の核酸物質の導入細胞を得ることができるが、実際には実験回数が数１０から数１０００倍となり、現実的には困難である。さらに導入効率に再現性がない場合には、実験計画が立て難いなどの問題点が生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明はアスベストなどの微細針状物質を用いた核酸物質の導入技術において、各種の条件検討を行い、多くの実験因子を検討した結果、一定の大きさの力で微細針状物質を細胞に接触および侵入させることで一定以上の安定した核酸物質の導入効率を得ることに成功した。【００１２】  一定の力で微細針状物質を細胞に接触および侵入させるためには、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布して、その後に平板培養基材の表面を一定方向に一定した大きさの力を加えながら擦って滑り摩擦を与えることが必要となる。この塗布および平板培養基材の表面を一定方向に擦る時に例えば平板培養基材を一定速度で一定方向に回転させ、さらに使用する塗布用の部品に機械的に調節された一定の大きさの力を加えることで、微細針状物質と細胞の間に一定方向でかつ一定の大きさの力を加えることが可能となる。平板培養基材を回転させずに水平の一定方向の移動を行っても同様な効果が得られるが、装置の設置面積が大きくなるなどの問題が生じる。【００１３】  使用する塗布用の部品に一定の大きさの力を加える１つの方法として、塗布用の部品に機械的に制御された垂直抗力を加える方法がある。微細針状物質と細胞の間に加わる力は、使用する塗布用の部品に加えられた垂直抗力と平板培養基材の回転速度および平板培養基材表面の硬さの関係で決定される。使用する塗布用部品の平板培養基材表面に接触する部分の硬さも微細針状物質と細胞の間に加わる力に影響するが、平板培養基材に比べて充分な硬さを有するプラスチックやガラスあるいは金属などを用いた場合には、ほとんど影響を無視することができる。【００１４】  また微細針状物質と細胞の間に加える力の最適値を実験的に求めることにより、異なる塗布用の部品や平板培養基材を用いても一定以上の安定した核酸物質の導入効率を得ることができる。あるいは異なる核酸物質や細胞を用いた場合にも、微細針状物質と細胞の間に加える力の最適値を実験的に求めることにより、最適な核酸物質の導入のための条件を求めることができる。【００１５】  微細針状物質と細胞の間に加える力が大きいほど微細針状物質が細胞内に侵入しやすくなるので、核酸物質の導入効率も大きくなる。しかしあまり強すぎる力を加えると、平板培養基材を破壊してしまい、核酸物質の導入はできなくなる。平板培養基材の表面に細胞の培養に必要な栄養源を透過するメンブランフィルターなどを置いて、平板培養基材表面の硬さを補強することも可能である。あるいは充分な硬さを有する別の物質の表面で微細針状物質と細胞に一定方向でかつ一定の大きさの力を加えて核酸物質を導入することもできるが、最終的には核酸物質を導入した細胞を培養する必要があり、平板培養基材表面で核酸物質導入操作を行う方が効率的である。【００１６】本発明で用いることのできる微細針状物質には、核酸物質を吸着しかつ細胞に侵入できるための充分な硬さを有している物質であることが要求される。核酸物質の吸着はイオン的な力（静電力）、ファンデルワールス力などで起こる。微細針状物質の具体的な例としてアスベスト、リン酸カルシウム、イモゴライト、カーボンナノチューブなどを挙げることができる。またアス��ストは蛇紋石群のクリソタイル、かくせん石群のクロシドライト、アモサイト、トレモライト、アンソフィライトなどの総称である。
【発明の効果】
【００１７】  以上の様にアスベストなどの微細針状物質を用いた核酸物質の導入技術において、核酸物質と微細針状物質および細胞の混合物を平板培養基材の表面に塗布して、その後に平板培養基材の表面を一定方向に一定した大きさの力を加えながら擦ることで一定以上の安定した核酸物質の導入効率を得ることが可能となる。さらに微細針状物質と細胞の間に加える力を調節することで、細胞に何ら特別な処理をしなくても、核酸物質を細胞に導入でき、従来の方法では核酸物質の導入が困難であった細胞に対しても核酸物質の導入が可能となる。
【実施例】
【００１８】  以下に本発明の実施例を示す。以下の内容は本発明の効果を具体的に示した例であり、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】  ２％アガーと抗生物質アンピシリンを含む平板培地（直径９ｃｍの円形）の上に大腸菌ＪＭ１０９株（終濃度２００，０００，０００細胞／ｍｌ）とアスベスト（終濃度５０μｇ／ｍｌ）およびプラスミドｐＵＣ１８（終濃度０．００１μｇ／ｍｌ）の混合液を５０μｌ添加し、平板培地を回転させながら、核酸物質の導入を行った。核酸物質の導入効率は抗生物質アンピシリンに対する耐性細胞数を計測して算出した。大腸菌ＪＭ１０９株は抗生物質アンピシリンに感受性があり、抗生物質アンピシリンを含む平板培地では生育できない。プラスミドｐＵＣ１８には抗生物質アンピシリンに対する耐性遺伝子が存在するため、プラスミドｐＵＣ１８が導入された大腸菌ＪＭ１０９株は抗生物質アンピシリンに対する耐性を獲得して、抗生物質アンピシリンを加えた平板培地上で成育することができる。【００１９】  平板培地を９０ｒｐｍで回転させながら、プラスチック製のストリークバーに掛かる垂直抗力を変化させて核酸物質の導入効率を測定した。図１はその実験結果を示している。ストリークバーに掛かる垂直抗力を２０ｇから４０ｇに増加させることで、核酸物質の導入効率は約２倍に向上した。またストリークバーに掛かる垂直抗力を４０ｇ以上に増加させても核酸物質の導入効率は、ほぼ一定であった。
【実施例２】  実施例１と同様な実験条件で、プラスチック製のストリークバーに掛かる垂直抗力を４０ｇとし、平板培地の回転数を変化させて核酸物質の導入効率を測定した。図２はその実験結果を示している。平板培地の回転数を１０ｒｐｍから３４ｒｐｍに増加させることで、核酸物質の導入効率は約７．７倍に向上した。また平板培地の回転数を３４ｒｐｍ以上に増加させても核酸物質の導入効率は、ほぼ一定であった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】プラスチック製のストリークバーに掛かる垂直抗力と核酸物質の導入効率の関係を示す図。垂直の棒グラフは各垂直抗力に対する核酸物質の導入効率を示している。核酸物質の導入効率は、アンピシリン耐性を獲得したＪＭ１０９株の数をプラスミド１μｇ当りに換算した数値で表している。
【図２】平板培地の回転数と核酸物質の導入効率の関係を示す図。垂直の棒グラフは各回転数に対する核酸物質の導入効率を示している。核酸物質の導入効率は、アンピシリン耐性を獲得したＪＭ１０９株の数をプラスミド１μｇ当りに換算した数値で表している。
【図１】
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【図２】
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