(57)【要約】      （修正有）【課題】α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有する新規なタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。【解決手段】該タンパク質は、エンテロバクター・クロアッセイ由来の（ａ）特定な配列で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は（ｂ）特定な配列で表されるアミノ酸配列において１個若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質である。【効果】遺伝子組換の方法でクローン化されたアミダーゼ遺伝子を菌体内に多数存在させることが出来る為、従来の方法に比して飛躍的に触媒能力を増大させた微生物の提供ができ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドから効率的に光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を製造できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなるエンテロバクター・クロアッセイ由来の遺伝子。
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有する新規なタンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物あるいは微生物由来の酵素をα−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドの加水分解触媒として用いることにより、光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を製造できることが知られている。例えば、光学活性なα−アミノ酸については、特開昭６１−２９３３９４号公報、特開昭６２−５５０９７号公報（特許文献１及び２）、光学活性なα−ヒドロキシ酸については、特開平２−８４１９８号公報（特許文献３）等が挙げられる。
【０００３】
【特許文献１】特開昭６１−２９３３９４号公報
【特許文献２】特開昭６２−５５０９７号公報
【特許文献３】特開平２−８４１９８号公報
【発明の開示】
【０００４】
遺伝子組換えの方法でクローン化されたアミダーゼ遺伝子は、菌体内に多コピー存在させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させることができる。
【０００５】
本発明者らは、より高い触媒活性を有する微生物触媒を調製する目的で、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ遺伝子のクローニングを行い、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質
（２）（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなるエンテロバクター・クロアッセイ由来の遺伝子。
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００７】
本発明の組換えタンパク質は、α−アミノ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−アミノ酸を、また、α−ヒドロキシ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−ヒドロキシ酸を製造することができる。
【０００８】
本明細書は、本願において主張する優先権の基礎である日本国特許出願第11‐109328号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のタンパク質及び遺伝子
本発明のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であり、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有する。このようなアミダーゼ活性により、本発明のタンパク質は、α−アミノ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−アミノ酸を、また、α−ヒドロキシ酸アミドに作用させることにより対応する光学活性α−ヒドロキシ酸を製造することができる。前記α−アミノ酸アミドはいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくはｔｅｒｔ−ロイシンアミドである。前記α−アミノ酸アミドがｔｅｒｔ−ロイシンアミドである場合には、上記加水分解の結果として生じるのはＤ体又はＬ体のｔｅｒｔ−ロイシン、好ましくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンである。前記α−ヒドロキシ酸アミドはいずれのものであってもよく、特に限定されないが、好ましくは乳酸アミドである。前記α−ヒドロキシ酸アミドが乳酸アミドである場合には、上記加水分解の結果として生じるのはＤ体又はＬ体の乳酸、好ましくはＬ−乳酸である。従って、上記アミダーゼ活性は、好ましくはｔｅｒｔ−ロイシンアミド及び乳酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性であり、より好ましくはｔｅｒｔ−ロイシンアミド及び乳酸アミドを立体選択的に加水分解して、それぞれＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン及びＬ−乳酸を生成させるアミダーゼ活性である。
【００１０】
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１で表される配列に限定されるものではなく、上記アミダーゼ活性を有する限り、該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加等の変異が生じていてもよい。変異するアミノ酸の数は特に制限されないが、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜数個、最も好ましくは１〜３個である。
【００１１】
上記のような本発明のタンパク質は、ペプチド合成法として知られる公知の方法を用いて調製することができ、また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、遺伝子組換え技術により調製することもできる。この遺伝子組換え技術では、例えば、以下に詳述するように、本発明の遺伝子を含む組換えプラスミド（組換えベクター）で形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のタンパク質を調製することができる。
【００１２】
本発明の遺伝子は、上記の本発明のタンパク質をコードするものである。従って、その塩基配列は特定の配列に限定されるものではないが、好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、より好ましくは配列番号２で表される塩基配列である。本明細書中で用いられる「遺伝子」という用語は、遺伝情報をコードする核酸を意味する。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。
【００１３】
本発明の遺伝子は、化学的合成法、ＰＣＲ法又は当該塩基配列を有する遺伝子断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法によって得ることができる。このような化学的合成法、ＰＣＲ法及びハイブリダイゼーション法は、当業者に公知の方法によって行うことができる。ＰＣＲ法及びハイブリダイゼーション法では、本発明の遺伝子を有する微生物（本発明におけるＤＮＡ供与体微生物）から得られるＤＮＡライブラリーを用いることができる。該微生物は特定の属又は種に限定されるものではないが、例えば、前記特開昭６２−５５０９７号公報記載のエンテロバクター・クロアッセイ（Enterobacter cloacae）Ｎ−７９０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８７３；1985年8月16日付；工業技術院生命工学工業技術研究所，日本国茨城県つくば市東１−１−３）を挙げることができる。その菌学的性質は同公報に記載されている。上記ＰＣＲ法は、例えば、上記ＤＮＡライブラリーを鋳型とし、配列番号２を参照して設計した適切なプライマーを用いて行うことができる。ＰＣＲ法におけるその他の試薬、条件等は、当業者であれば適切に設定することができ、また、市販のキットを用いることもできる。上記ハイブリダイゼーション法は、例えば、上記ＤＮＡライブラリーに対し、配列番号２で表される塩基配列を有するプローブをハイブリダイズさせることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション法としては、当業者に公知の方法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法等が挙げられる。このときのハイブリダイズの条件は特に限定されないが、好ましくはストリンジェントな条件とする。このようなストリンジェントな条件は、例えば、コロニー又はプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0.5〜1MのNaCl存在下42〜68℃で（又は50％ホルムアミド存在下42℃で、又は水溶液中65〜68℃で）ハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(saline-sodium citrate)溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成：150mM 塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）を用いて室温〜68℃でフィルターを洗浄することにより達成することができる。ハイブリダイゼーション法におけるその他の試薬、条件等は、当業者であれば適切に設定することができ、また、市販のキットを用いることもできる。化学的合成法としては、核酸の合成法として知られる方法であれば、いずれの方法を用いてもよい。化学的合成法によれば、所望の塩基配列を有する遺伝子を得ることが可能である。
【００１４】
なお、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＬＡ２０５で形質転換したエシェリシア・コリ  ＪＭ１０９株（E. coli JM109/pLA205）は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３）に、１９９９年１月２６日付けで国際寄託されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３２）。従って、配列番号２で表される塩基配列を有する本発明の遺伝子（ＤＮＡ）は、この菌株に含まれるプラスミドｐＬＡ２０５から得ることができ、その他の本発明の遺伝子も、部位特異的変異誘発法(Nucleic Acids Res. 10, 6487‐6500, 1982)によって得ることができる。
【００１５】
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列又はそのフラグメントとハイブリダイズし、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも包含する。上記ハイブリダイズの条件は特に限定されないが、好ましくはストリンジェントな条件とする。ストリンジェントな条件は、例えば、0.5〜1MのNaCl存在下42〜68℃で（又は50％ホルムアミド存在下42℃で、又は水溶液中65〜68℃で）ハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(saline-sodium citrate)溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成：150mM 塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム）を用いて室温〜68℃でフィルターを洗浄することにより達成することができる。
【００１６】
さらに、本発明の遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の相同性を有し、且つ、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも包含する。上記の相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。
【００１７】
上記のような、配列番号１以外のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号２以外の塩基配列を有する遺伝子がコードするタンパク質が上記アミダーゼ活性を有するか否かは、例えば、対象となるタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有するエシェリシア・コリＪＭ１０９株を上記アミダーゼ活性について試験することにより確認することができる。形質転換体の作製については後に詳述する。また、形質転換された上記菌株は、培養した後に菌を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の５０mM KH2PO4−Na2HPO4緩衝液（ｐＨ8.0）で２回洗浄した後、５０ｍｌの前記緩衝液に懸濁して菌体懸濁液としておく。
【００１８】
上記のアミダーゼ活性についての試験は、２重量％α−アミノ酸アミド又は２重量％α−ヒドロキシ酸アミドを含む上記緩衝液0.5ｍｌ、上記緩衝液0.3ｍｌ及び上記菌体懸濁液0.2ｍｌからなる反応液を４０℃で１時間振とうし、その上清を光学分割カラムを備えたＨＰＬＣにより分析して、対応する光学活性α−アミノ酸又は光学活性α−ヒドロキシ酸が検出されるかどうかを調べることにより行うことができる。上記α−アミノ酸アミドとしては所望のものを用いることができるが、好ましくはラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを用い、その場合の上記光学活性α−アミノ酸はＤ体又はＬ体のｔｅｒｔ−ロイシン、好ましくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンとなる。上記α−ヒドロキシ酸アミドとしては所望のものを用いることができるが、好ましくはラセミ体乳酸アミドを用い、その場合の上記光学活性α−ヒドロキシ酸はＤ体又はＬ体の乳酸、好ましくはＬ−乳酸となる。
【００１９】
２．組換えベクター及び形質転換体
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子（ＤＮＡ）を連結（挿入）することにより作製することができる。
【００２０】
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡは、大腸菌、アグロバクテリウム等の微生物からアルカリ抽出法(Birnboim,H. C. and Doly, J. 1979. Nucleic Acid Res. 7: 1513)又はその変法により調製することができる。また、市販のプラスミドベクターとして、例えば、pBluescript II SK+ (Stratagene社)、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119（宝酒造社)、pGEX4T-1（Pharmacia社）等を用いてもよい。これらのプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が含まれていることが好ましい。ファージベクターとしては、例えば、λgt11、M13mp18、M13mp19等が挙げられる。
【００２１】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結することができる。このような操作は当技術分野において通常行われるものであり、当業者であれば、挿入すべきＤＮＡの具体的な塩基配列に従って適切に行うことができる。
【００２２】
また、本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるように、すなわち発現可能なようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター及び本発明の遺伝子のほか、ターミネーター、リボソーム結合配列等を組み込んでもよい。このような操作は当技術分野において通常行われるものであり、当業者であれば適切に行うことができる。
【００２３】
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００２４】
宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、細菌、酵母等が挙げられる。細菌としては、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリシア属に属する細菌、及びバチルス・ズブチリス（Bachillussubtilis）等のバチルス属に属する細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。上記エッシェリシア・コリとしては、特に、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＩＦＯ３３０１株等が好ましい。
【００２５】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合には、本発明の組換えベクターは、該宿主中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよく、例えば、Trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌又はファージに由来するプロモーターを用いることができる。本発明の組換えベクターはさらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。
【００２６】
細菌への本発明の組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69: 2110-2114, 1972）等が挙げられる。
【００２７】
酵母を宿主として用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、YEp13、YEp24、YCp50等が用いられる。この場合に使用するプロモーターとしては、酵母中で発現できるものであればよく、特に限定されないが、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター等が挙げられる。
【００２８】
酵母への本発明の組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であればよく、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション（Methods. Enzymol., 194:182-187, 1990）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1929-1933, 1978）、酢酸リチウム法（J. bacteriol., 153: 163-168, 1983）等が挙げられる。
【００２９】
なお、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＬＡ２０５で形質転換したエシェリシア・コリ  ＪＭ１０９株（E. coli JM109/pLA205）は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３）に、１９９９年１月２６日付けで国際寄託されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３２）。
【００３０】
３．本発明のタンパク質（アミダーゼ）の生産
本発明のタンパク質（アミダーゼ）は、上述のようにして作製した形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取することができる。
【００３１】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法によって行われる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３２】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類、及び又はエタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
【００３３】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
【００３４】
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３５】
微生物を宿主として得られた形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約２８℃で４８〜６０時間行う。培養期間中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に加えてもよい。
【００３６】
プロモーターとして誘導性プロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデユーサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシルピラノシド(IPTG)等を、Trpプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００３７】
培養後、本発明のタンパク質を培養物から採取する。該タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕等することにより、該タンパク質を採取することができる。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用して、又は遠心分離等により菌体若しくは細胞を除去した後に、該酵素を採取することができる。該酵素の採取は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を、単独で又は適宜組合せて用いることにより行うことができる。
【００３８】
以上のようにして得られたタンパク質が上記アミダーゼ活性を有することの確認は、一般的な酵素化学反応、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気泳動法、抗原抗体反応等の免疫学的方法などにより行うことができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例として、エンテロバクター・クロアッセイ  Ｎ−７９０１株のアミダーゼ遺伝子のエシェリシア・コリＪＭ１０９株へのクローニングについて示す。
【００４０】
実施例１
（１）エンテロバクター・クロアッセイＮ−７９０１染色体ＤＮＡの調製とＤＮＡライブラリーの作製：
Saito and Miura（Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)参照）の方法によりエンテロバクター・クロアッセイ  Ｎ−７９０１株の染色体ＤＮＡを分離し、これを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解後、常法によって遺伝子断片を分取し、ベクタープラスミドｐＵＣ１１８にライゲーションして、組換え体ＤＮＡのライブラリーを作製した。
（２）形質転換体の作製及び組換え体ＤＮＡの選別：
（１）で調製した組換え体ライブラリーによる形質転換体を宿主微生物としてエシェリシア・コリ  ＪＭ１０９株を用いて塩化カルシウム法（J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)）により作製し、その中からアミダーゼ活性を示すようになったものを選別した。選別は以下のようにして行った。
【００４１】
アンピシリンナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で形質転換体を培養した後、培養液をグリセロールを炭素源とし、ロイシンアミドあるいは乳酸アミドを窒素源とする寒天培地に塗布した。３７℃で１〜３日間培養して生じたコロニーを単離し、アンピシリンナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を含むＬＢ培地で３７℃にて１夜培養した。培養液から遠心分離で菌体を集めた後、菌体を５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（pH 8.0）で洗浄し、同緩衝液に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を１％乳酸アミドを含む５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（pH 8.0）に懸濁し、３０℃にてインキュベートした。一定時間後、生成するＬ−乳酸を高速液体クロマトグラフィー（カラム：スミキラルOA-5000、住友化学社製；溶離液：１mM硫酸銅水溶液；流速：1.0 ml/分；検出：UV 254nm）にて定量した。Ｌ−乳酸を生成する形質転換体からプラスミドｐＬＡ００２を得た（図１）。
【００４２】
（３）制限酵素地図の作製とアミダーゼ遺伝子の位置の決定：
（２）で得られたプラスミドについて、常法に従い、制限酵素地図を作製した。その後、より小さなＤＮＡ断片をもつプラスミドを作製した。これらのプラスミドによって（２）と同様にして形質転換した株のアミダーゼ活性の有無によって目的遺伝子の含まれていることを確認した。プラスミド作製の経過を図２に示す。
【００４３】
すなわち、ｐＬＡ００２のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片（３．４ｋｂ）をｐＵＣ１１９にライゲーションしてｐＬＡ２０１を作製し、さらに、このプラスミドからのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片（２．６ｋｂ）をｐＵＣ１１８にライゲーションしてｐＬＡ２０２を作製した。ｐＬＡ２０２のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を削除（０．７ｋｂ）することにより、ｐＬＡ２０５を得た。ｐＬＡ２０５からさらに様々な断片を削除したプラスミドを作製して、これらによって形質転換した株のアミダーゼ活性の有無を調べて、目的遺伝子の含まれている箇所を推定した（図２）。
【００４４】
（４）塩基配列の決定：
（３）で得られたｐＬＡ２０５のＢａｍＨＩ−ＮａｅＩ部分（１．４ｋｂ）のＤＮＡの塩基配列をファルマシアＤＮＡシーケンサーＡＬＦIIを用いて決定した。その結果、配列番号３に示される塩基配列が得られ、配列番号１に示されるアミノ酸配列をもつオープンリーディングフレーム（配列番号２）が見出された。プラスミドｐＬＡ２０５の制限酵素地図及びアミダーゼの存在位置を図３に示した。
【００４５】
アミノ酸配列データーベースSWISS PROTとの比較により、本遺伝子は、既知のアミダーゼ、具体的には、マイコバクテリウム属細菌由来のアセトアミダーゼ（J. Gen. Microbiol., 139, 575 (1993)）、メチロフィラス属細菌由来のホルムアミダーゼ（Eur. J. Biochem., 240, 314 (1996)）とアミノ酸配列レベルで２８〜３０％の低いホモロジーを有しており、酵素の基質特異性が全く異なる。また、アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する既知の酵素とのホモロジーはほとんどなく、従って、本酵素は新規なアミダーゼであると考えられた。
【００４６】
なお、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドｐＬＡ２０５で形質転換したエシェリシア・コリ  ＪＭ１０９株（E. coli JM109/pLA205）は、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３）に、１９９９年１月２６日付けで国際寄託されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１３２）。
【００４７】
実施例２
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５株の培養
１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２％ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ、０．００２％ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００２％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる培地（ｐＨ  ７．２）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌した後、アンピシリンナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）を添加し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５を植菌して、３７℃にて１９時間振盪培養した。
【００４８】
（２）エンテロバクター・クロアッセイＮ−７９０１株の培養
比較のため当該株の培養を行った。
１％シュークロース、０．５％肉エキス、０．５％プロピオンアミド、０．０１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００１％ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ、０．００１％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００１％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０００１％ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、からなる培地（ｐＨ  ６．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌した後、エンテロバクター・クロアッセイ  Ｎ−７９０１株を植菌して、３０℃にて２日間振盪培養した。
【００４９】
（３）アミダーゼの産生及び該活性の確認
培養後、それぞれの菌体を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（pH 8.0）で２回洗浄した後、５０ｍｌの同緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液とした。２％ラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシンアミド０．５ｍｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（pH 8.0）０．３ｍｌ、菌体懸濁液０．２ｍｌからなる反応液を４０℃で１時間振盪した。反応液から遠心分離によって、菌体を除いた後、ＨＰＬＣ（カラム：スミキラルOA-5000、住友化学社製；溶離液：２mM硫酸銅水溶液／MeOH (85:15)；流速：1.0 ml/分；検出：UV 254nm）にて分析した。それぞれの菌体の酵素活性を比較した（表１）。
【００５０】
【表１】
2006051034.tif 000002
【００５１】
なお、表１中、Ｕは、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの生成する速度（μモル／分）であり、アミダーゼ活性は、反応液中に含まれる乾燥菌体重量あたりの数値として表した。
【００５２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、遺伝子組換の方法でクローン化されたアミダーゼ遺伝子を菌体内に多数存在させることができるため、従来の方法に比して飛躍的に触媒能力を増大させた微生物の提供ができ、これにより、α−アミノ酸アミド及びα−ヒドロキシ酸アミドから効率的に光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ｐＬＡ００２の制限酵素地図を示す。
【図２】図２は、ｐＬＡ００２からｐＬＡ２０５に至るプラスミド作製過程を示す。
【図３】図３は、ｐＬＡ２０５の制限酵素地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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