(57)【要約】【課題】  細胞内の核酸と蛋白質を同時に観測することができるような生体組織切片の前処理液、および上記前処理液を使用して、同一の生体組織切片の核酸と蛋白質を同時に観測する方法を提供すること。【解決手段】  クエン酸緩衝液、キレート剤、及び下記式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、ｐＨが６．５〜７．５である、固定された生体組織切片の前処理液、この前処理液を使用することを特徴とする生体組織切片中の核酸及び蛋白質の同時観測方法。2006266755.tif 000005式中Ｒは炭素原子数４〜１２の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎは６〜１２である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸緩衝液、キレート剤、及び下記式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、ｐＨが６．５〜７．５である、固定された生体組織切片の前処理液。
2006266755.tif 000004
式中Ｒは炭素原子数４〜１２の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎは６〜１２である。
【請求項２】
キレート剤がエチレンジアミン四酢酸塩である請求項１記載の前処理液。
【請求項３】
クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、及び式（Ｉ）においてＲが８〜１０の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、ｐＨが６．８〜７．０である、請求項１記載の前処理液。
【請求項４】
クエン酸ナトリウム濃度５〜２０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム濃度５〜２０ｍＭ、及び式（Ｉ）においてＲが８〜１０の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル濃度０．０１〜０．２質量％、請求項３記載の前処理液。
【請求項５】
式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のオクチル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルと式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のノニル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、クエン酸ナトリウム濃度１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム濃度１０ｍＭ、式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のオクチル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルと式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のノニル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの合計の濃度０．１０質量％、ｐＨ７．０である、請求項３記載の前処理液。
【請求項６】
式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルが、式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のオクチル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルと式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のノニル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの１：１混合物である、請求項１〜５のいずれか１項記載の前処理液。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の前処理液を使用することを特徴とする生体組織切片中の核酸及び蛋白質の同時観測方法。
【請求項８】
核酸がＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項７記載の方法。
【請求項９】
核酸がテロメアＤＮＡである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
蛋白質が抗原蛋白質である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
生体組織切片が凍結切片である請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織切片の前処理液及びこれを用いた生体組織中の核酸及び蛋白質の観測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織中の種々の物質、例えば、核酸や蛋白質の動態を観測するためには、生体組織をホルマリン等の固定液で固定し、エタノール等で脱水後、パラフィン包埋し、ミクロトームで組織を５μｍ程度の厚さに薄切りし、スライドグラスに載せ、脱パラフィン後、水洗し、目的に合わせて前処理し、変性処理を行い、標識プローブを用いたハイブリダイゼーションや標識抗体を用いた抗原抗体反応等を行い蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、目的の核酸や蛋白質の細胞内における位置情報を観測する。
前処理は細胞内の標的物質を露出させ、外部から供給する反応物質との反応を促進するための処理である。従来このような前処理液としては、緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が用いられ、あるいは水を用いてオートクレーブ中で加熱加圧処理する方法等が用いられている。このような前処理液として、例えば、特許文献１には、２−メチルマレイン酸無水物（Citraconic anhydride)(CCA)を含有する抗原賦活剤が開示されている。
【０００３】
蛋白質を観測する際の前処理液としては、クエン酸緩衝液やこれに界面活性剤を添加したものが使用されている。クエン酸緩衝液は熱処理の際に蛋白質が損傷を受けるのを防止する機能がある。また界面活性剤は細胞内の標的蛋白質を露出させ、外部から供給する反応物質との接触の機会を向上させる機能がある。しかし、オートクレーブの使用は危険を伴い、スライドグラスが割れたり、時間がかかるという問題の他、熱をかけすぎると細胞内の蛋白質の位置が乱れ、画像情報が壊れてしまうという問題がある。
また、核酸を観測する際の前処理液としては、蛋白質分解酵素（プロテアーゼＫやトリプシン等）を含むものが用いられている。この処理液は、蛋白質分解酵素で蛋白質を分解して、核酸を露出させ、プローブとのハイブリダイゼーション反応の機会を向上させる機能がある。しかしながら、蛋白質が分解されてしまうため、抗原の観測を行うことは不可能である。
このように従来使用されている前処理液を使用すると、細胞内の核酸と蛋白質を同時に観測することはできなかった。
また、ＤＮＡは酸に弱く、ＲＮＡはアルカリに弱いため、従来の前処理液ではＤＮＡとＲＮＡを同時に観測することは一般に極めて困難であった。
【０００４】
一方、染色体末端構造のひとつであるテロメアは、生体内における細胞分裂寿命を決定する重要な因子のひとつと考えられている。またテロメアは、精子や卵子を作る生殖細胞
以外の体細胞では細胞分裂のたびに短くなり、このテロメアの短縮が生体内における細胞分裂停止・細胞機能低下等の細胞老化を引き起こすと考えられている。同時に、細胞核内におけるテロメアの配置が細胞の分化・機能維持・機能低下に深く関与していることが示されている。従来の手法では細胞レベルでテロメアを観測することは可能であった（例えば、非特許文献１）。しかし、テロメアはＴＴＡＧＧＧの６塩基配列の繰り返し単位を有するため、ハイブリダイゼーションが難しく、このため、生体組織切片中のテロメアを蛍光in situハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）等の手法により観測し、生体組織切片の形態学的な情報とテロメアの動態を同時に得ることは不可能であった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３５０４３０
【非特許文献１】Molenaar, C. et al. Visualizing telomere dynamics in living mammalian cells using PNA probe, EMBO J. 22, 6631-6641 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、細胞内の核酸と蛋白質を同時に観測することができるような生体組織切片の前処理液を提供することである。
本発明の他の目的は、細胞内のＤＮＡとＲＮＡと蛋白質を同時に観測することができるような生体組織切片の前処理液を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、テロメアＤＮＡとＲＮＡと蛋白質を同時に観測することができるような生体組織切片の前処理液を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記前処理液を使用して、同一の生体組織切片の、核酸と蛋白質、ＤＮＡとＲＮＡと蛋白質、あるいはテロメアＤＮＡとＲＮＡと蛋白質の位置を同時に観測する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記前処理液を使用して、同一の生体組織切片の形態学的な情報とテロメアの動態を同時に観測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の生体組織切片の前処理液及びこれを用いた生体組織切片中の核酸及び蛋白質の位置を観測する方法を提供するものである。
１．クエン酸緩衝液、キレート剤、及び下記式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、ｐＨが６．５〜７．５である、固定された生体組織切片の前処理液。
2006266755.tif 000002
式中Ｒは炭素原子数４〜１２の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎは６〜１２である。アルキル基の結合位置は、ｏ−，ｍ−，ｐ−位のいずれでも良いが、好ましくはｐ−位である。
２．キレート剤がエチレンジアミン四酢酸塩である上記１記載の前処理液。
３．クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、及び式（Ｉ）においてＲが８〜１０の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、ｐＨが６．８〜７．０である、上記１記載の前処理液。
４．クエン酸ナトリウム濃度５〜２０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム濃度５〜２０ｍＭ、及び式（Ｉ）においてＲが８〜１０の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル濃度０．０１〜０．２質量％、上記３記載の前処理液。
５．式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のオクチル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルと式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のノニル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、クエン酸ナトリウム濃度１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム濃度１０ｍＭ、式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のオクチル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルと式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のノニル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの合計の濃度０．１０質量％、ｐＨ７．０である、上記３記載の前処理液。
６．式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルが、式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のオクチル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルと式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のノニル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの１：１混合物である、上記１〜５のいずれか１項記載の前処理液。
７．上記１〜６のいずれか１項記載の前処理液を使用することを特徴とする生体組織切片中の核酸及び蛋白質の同時観測方法。
８．核酸がＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれる少なくとも１種である上記７記載の方法。
９．核酸がテロメアＤＮＡである上記８記載の方法。
１０．蛋白質が抗原蛋白質である上記８記載の方法。
１１．生体組織切片が凍結切片である上記７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の前処理液を使用すると、生体組織切片中の核酸及び蛋白質、ＤＮＡ及びＲＮＡ及び蛋白質の位置情報を同一の試料を用いて同時に観測することができる。また本発明の前処理液は、凍結された生体組織切片に対しても同様に適用することができる。
また本発明によれば従来観測が極めて困難であった生体組織切片での種々の分化過程にある細胞における核内のテロメアの動態を容易に観測することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の前処理液は、生体組織を固定液で固定し、パラフィン包埋後に生体組織切片を作成した後、これを前処理して、生体組織切片中の標的物質を観測する際の当該前処理に使用される処理液である。
固定液としては、一般的に使用されるホルマリン系固定液、アルコール系固定液が使用できるが、標識済みプローブ等の組織切片への浸透性の点で、アルコール系固定液の方が好ましい。
本発明の前処理液は、クエン酸緩衝液とキレート剤、及び下記式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルを含み、ｐＨが６．５〜７．５である、固定された生体組織切片の前処理液である。
2006266755.tif 000003
式中Ｒは炭素原子数４〜１２の直鎖及び／又は分岐鎖のアルキル基であり、ｎは６〜１２である。
クエン酸緩衝液は熱処理時の蛋白質の損傷を防止し、蛋白質の細胞内の位置関係を維持する機能がある。クエン酸緩衝液としては、クエン酸ナトリウム緩衝液が一般的である。クエン酸緩衝液の濃度は１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、さらに好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭである。クエン酸緩衝液濃度が１ｍＭ未満では蛋白質の損傷を防止する効果が不充分となり、１００ｍＭを超えて使用する必要はない。
【００１０】
キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩、プロピレンジアミン四酢酸等のナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、エチレンジアミン四酢酸塩ナトリウムが最も一般的である。キレート剤は、核酸分解酵素阻害剤として機能し、ＤＮＡやＲＮＡの分解を防止する。キレート剤の濃度は、試験環境中に存在する核酸の量によっても異なるが、通常は１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、さらに好ましくは８〜１２ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭである。キレート剤の濃度が１ｍＭより低いと核酸分解酵素阻害機能が不充分であり、１００ｍＭを超えて使用する必要はない。
【００１１】
本発明の前処理液は上記式（Ｉ）で表される特定のノニオン系界面活性剤を含有することを特徴とする。特に好ましい前処理液は、上記式（Ｉ）で表される特定のノニオン系界面活性剤を２種以上含むものである。好ましくは式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のオクチル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルと式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のノニル基であり、ｎが８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの２：１〜１：２（質量比），好ましくは１：１混合物である。
式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のｐ−オクチル基であり、ｎが約８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの具体例としては、トリトンＸ−１００（ナカライテスク株式会社製商品名）が挙げられる。
他方のノニオン系界面活性剤である、式（Ｉ）においてＲが直鎖及び／又は分岐鎖のｐ−ノニル基であり、ｎが約８〜１０であるポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの具体例としては、ＣＡＳ  Ｎｏ．１２７０８７−８７−０（ＭＳＤＳ  Ｎｏ．３２８２２）として登録され、タージトールＮＰ−４０（ナカライテスク株式会社製商品名）として市販されているものが挙げられる。
【００１２】
２種のノニオン系界面活性剤の濃度は、それぞれ好ましくは０．０１〜０．１質量％、さらに好ましくは０．０３〜０．０７質量％、最も好ましくは０．０５質量％である。
ノニオン系界面活性剤の濃度が０．１質量％より高いと、脆い臓器では溶解するおそれがあり、好ましくない。また、理由は不明であるが、２種の界面活性剤の一方が存在しないと核酸や蛋白質の形態及び位置関係が崩れてしまう場合があり、２種の界面活性剤を併用することが望ましい。
【００１３】
本発明の前処理液のｐＨは６．５〜７．５、好ましくは６．７〜７．２、さらに好ましくは、６．８〜７．０、最も好ましくは７．０である。ｐＨが６．５より低いと酸に弱いＤＮＡの観測が困難になり、ｐＨが７．５より高いとアルカリに弱いＲＮＡの観測が困難になる。
【００１４】
本発明はさらに、上記前処理液を使用することを特徴とする生体組織切片中の核酸及び蛋白質の同時観測方法を提供するものである。
まず、生体組織を採取し、これを固定液により固定する。固定液としては、ホルマリン固定液や、メタカン固定液（メタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１）等が使用できるが、後者の方が標識済みプローブ等の組織切片への浸透性の点で好ましい。
次に固定した組織をエタノール等で脱水後、常法に従いパラフィン包埋処理し、目的に応じた厚さ例えば、３〜１０μｍ程度の生体組織薄切切片を作成する。上記操作はいずれもＤＮａｓｅフリーのものを使用する。
【００１５】
脱パラフィン後、水洗し、本発明の前処理液中で所定時間、例えば、２０〜６０分間煮沸湯煎した後、水洗し、前処理液を除去する。
次に、切片に変性液、例えば、７０％ホルムアミド・２Ｘ ＳＳＣをのせ、加熱する。加熱温度、加熱時間、加熱手段は特に制限されないが、例えば、１００℃のヒートブロック上で５分間程度の加熱で充分である。
変性液を除去し、急冷脱水する。急冷脱水は例えば、ドライアイス入りのエタノールにより行うことができる。
【００１６】
次いで常法により、標的物質と反応する物質を反応させるか、あるいは標的物質を着色可能な物質で着色する。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選ばれる少なくとも１種であり、核酸の観測は、蛍光物質等で標識した核酸プローブをその場でハイブリダイズさせる（fluorescence in situ hybridization: FISH)。ハイブリダイゼーションは、例えば、蛍光標識した特異プローブを用いて、４５℃〜６０℃で１２〜２４時間、例えば、４５℃で一晩程度ハイブリダイズさせればよい。
次にクエン酸緩衝液例えば、０．１Ｘ ＳＳＣにより、４５℃で洗浄し、さらにリン酸緩衝液例えば、０．０１Ｍ−ＰＢＳで洗浄する。
次いで、常法により免疫組織化学・核染色を行う。
以上の処理を行った後、標識または着色された切片を蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡で観測することにより核酸及び蛋白質の位置を容易に観測することができる。
【００１７】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質（例えば、抗原）を同時に観測できることを特徴とするものであるが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質（例えば、抗原）の１種の観測に適用できることはいうまでもない。
前処理液中の２種のノニオン系界面活性剤のうち一方のみを使用すると、生体組織切片中の核酸や蛋白質の形態（位置）が維持されなくなり、立体的な位置関係の情報が得られなくなることが多い。例えば、トリトンＸ−１００を含むがタージトールＮＰ−４０を含まない前処理液を使用すると、核酸に対するアクセス度が低下し、核酸の画像が消滅してしまう傾向がみられる。
【００１８】
本発明は特定の緩衝液、キレート剤、特定の界面活性剤、好ましくは特に２種の特定の界面活性剤を組み合わせることにより、細胞内における核酸と蛋白質の立体的な位置情報を維持し、両者を同一の試料を用いて同一の視野内で観測することを可能としたものである。
本発明の方法は、生体、特に哺乳類の臓器を含む全ての組織の切片の観測に適用が可能である。また、凍結した切片を試料として用いることも可能である。
従来、核酸と蛋白質を同時に検出する手法は全く知られておらず、従って、本発明は核酸及び蛋白質の生体細胞内における画期的な動態観測手段を提案するものである。
【００１９】
本発明の方法を適用して生体組織切片中のＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白質（抗原等）を観測する方法においてその観測順序は特に制限されない。しかし、ＲＮＡが最も分解し易いのでＲＮＡを最初に観察することが通常は望ましい。次いで、蛋白質、ＤＮＡ、あるいはＤＮＡ、蛋白質の順に観測を行えば良い。
【００２０】
実施例１
前処理液の調製
１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５質量％タージトールＮＰ４０（ナカライテスク）及び０．０５質量％トリトンＸ−１００（ナカライテスク）を含む、ｐＨ７．０の前処理液を調製した。
【００２１】
試験例１
マウス精巣を摘出し、メタカン固定液（メタノール：クロロホルム：酢酸＝６：３：１）により固定した。使用した器具はＤＮａｓｅフリーのものを使用した。
固定した組織をエタノール脱水後、常法に従いパラフィン包埋した。使用した器具はＤＮａｓｅフリーのものを使用した。
ミクロトームを用いて厚さ５μｍの生体組織切片を作成した。使用した器具はＤＮａｓｅフリーのものを使用した。
脱パラフィン後、水洗し、実施例１で調製した前処理液中で４０分間煮沸湯煎した。
水洗し、前処理液を除去した。
切片に変性液（７０％ホルムアミド・２Ｘ ＳＳＣ）をのせ、１００℃のヒートブロック上で５分間加熱した。
変性液を除去し、ドライアイス入りのエタノールで急冷脱水した。
０．２μｇ／ｍｌローダミンで蛍光標識したテロメア特異プローブ（ＴＴＡＧＧＧ）3を用いて、５０℃１２時間ハイブリダイズした。
０．０１Ｘ ＳＳＣ、４５℃で洗浄した。
０．０１Ｍ−ＰＢＳで洗浄した。
【００２２】
次に上記試料をサイトグリーン（Molecular Probes, USA）により核染色（緑色）を行い、さらに抗ＰＣＮＡモノクローナル抗体（Oncogene Research Products, USA)及びAlexa Flour（登録商標）６３３で標識した第２抗体（Molecular Probes, USA）と反応させ免疫組織染色（青色）を行った。
蛍光顕微鏡を用いてマウス精巣におけるテロメア動態を観察し、ＦＩＳＨ画像（赤色）を得た。
また、ＬＳＭ−５１０共焦点顕微鏡（Carl Zeiss, Germany)により、核染色した画像（緑色）及び免疫組織染色した画像（青色）を得た。
３種の画像（免疫組織染色画像（青色）／ＦＩＳＨ画像（赤色）／核染色画像（緑色））を合成した画像を作成したところ、３色の画像に加え、赤色と緑色が合成されて黄色となった部分、緑色と青色が合成されて水色となった部分、青色と赤色が合成されて赤紫色となった部分、これらの中間色の部分が観測された。この試験では全く同一の試料を用いており、これにより、生体組織切片中のテロメアＤＮＡと特定の抗原及び核の位置関係を明瞭に確認することができた。
【００２３】
試験例２（比較）
試験例１において、実施例１の前処理液の代わりに、１質量％トリトン含有ＰＢＳを使用したもの、および前処理液を使用しなかったものでは、テロメアのＦＩＳＨ画像は極めて不明瞭であり、テロメアと、特定の抗原及び核の位置関係を明瞭に確認することはできなかった。
【００２４】
試験例１において、マウスの精巣の代わりにマウス胎子脳を使用し、Ｐａｘ６のｍＲＮＡとその遺伝子産物の同定を同時に行った。Ｐａｘ６・ｍＲＮＡの存在を示すシグナルはディゴキシゲニン標識した特異プローブを用いたin situ ハイブリダイゼーションによって試行し（疑似カラー・緑色で表示）、Ｐａｘ６・遺伝子産物（この場合は蛋白質）の存在はＰａｘ６に対する特異抗体を用いた免疫組織化学にて試行した（疑似カラー・赤色で表示）。なお、対比核染色としてはＤＮＡ染色剤を用いた（疑似カラー・青色で表示）。