(57)【要約】【課題】リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパーゼA１の新たな供給源を提供すると共に、ＤＨＡ高含有リン脂質及びリゾリン脂質をより効率良く大量に製造しうる方法を提供する。【解決手段】シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属し、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を産生する新規微生物ＨＦＫＩ−００２０（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５４５）をホスホリパーゼA１活性を有する酵素の新たな供給源とする。この新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA１活性を有する酵素を有効量含有する脂質改質剤によりリゾリン脂質を効率良く大量に製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属し、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を産生することを特徴とする新規微生物。
【請求項２】
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する新規微生物であって、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を産生し、下記菌学的性質及び下記生理・生化学的性質を有することを特徴とする新規微生物。
Ａ．菌学的性質
（１）細胞形態：幅０．８〜１．０μｍ、長さ２．０〜３．０μｍの桿菌
（２）グラム染色性：陰性
（３）胞子の有無：陰性
（４）運動性：陽性
（５）コロニー形態（４８時間培養）
（イ）直径：２．０〜３．０ｍｍ
（ロ）色調：淡黄色
（ハ）形：円形
（ニ）隆起状態：レンズ状
（ホ）周縁：全縁
（ヘ）表面の形状など：スムーズ
（ト）透明度：不透明
（チ）粘稠度：バター様
（６）生育温度試験（℃）
（イ）３７℃：陽性
（ロ）４５℃：反応弱い
（７）カタラーゼ反応：陽性
（８）オキシダーゼ反応：陽性
（９）グルコースからの酸／ガス産生（酸産生／ガス産生）：陰性／陰性
（１０）Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）：陰性／陰性
Ｂ．生理・生化学的性質
（１）硝酸塩還元：陰性
（２）インドール産生：陰性
（３）ブドウ糖酸性化：陰性
（４）アルギニンジヒドロラーゼ：陽性
（５）ウレアーゼ：陰性
（６）エスクリン加水分解：陰性
（７）ゼラチン加水分解：陽性
（８）β−ガラクトシダーゼ：陰性
（９）ブドウ糖資化性：陽性
（１０）Ｌ−アラビノース資化性：陽性
（１１）Ｄ−マンノース資化性：陽性
（１２）Ｄ−マンニトール資化性：陽性
（１３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性：陽性
（１４）マルトース資化性：陰性
（１５）グルコン酸カリウム資化性：陽性
（１６）ｎ−カプリン酸資化性：陽性
（１７）アジピン酸資化性：陰性
（１８）ｄＩ−リンゴ酸資化性：陽性
（１９）クエン酸ナトリウム資化性：陽性
（２０）酢酸フェニル資化性：陰性
（２１）チトクロームオキシダーゼ：陽性
（２２）King's B寒天培地上での蛍光色素産生：陽性
【請求項３】
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物ＨＦＫＩ−００２０（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０５４５）である請求項１又は２に記載の新規微生物。
【請求項４】
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する新規微生物であって、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を産生し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が配列表の配列番号１に記載の配列であることを特徴とする新規微生物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA１活性を有する酵素を有効量含有することを特徴とする脂質改質剤。
【請求項６】
前記酵素が菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項５に記載の脂質改質剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA１活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解し、２−アシルリゾリン脂質を得ることを特徴とする２−アシルリゾリン脂質の製造方法。
【請求項８】
前記酵素が菌体及び／又は培養液に含まれている形で使用されていることを特徴とする請求項７に記載の２−アシルリゾリン脂質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属し、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を産生する新規微生物、この新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA１活性を有する酵素を有効量含有する脂質改質剤及びこの新規微生物によって産生されたホスホリパーゼA１活性を有する酵素を用いてリン脂質を加水分解し、２−アシルリゾリン脂質を得る２−アシルリゾリン脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リゾリン脂質は通常のリン脂質より高い界面活性を有し、食品の乳化安定性、食感、弾力性をリン脂質以上に改善できるとともに、他の乳化剤の使用量を節約することができ、食品への利用に際して極めて効果的な脂質形態であることが知られている。また、食品用途の他に化粧品用乳化剤としても利用価値がある。
【０００３】
現在、リゾリン脂質の工業的な調製方法としてはホスホリパーゼＡ２による方法が知られている。ただ、このホスホリパーゼＡ２は豚膵臓を起源とする酵素だけであり、２−アシルリゾリン脂質によるエマルジョンに比べて、１−アシルリゾリン脂質によるエマルジョンは油層分離率が著しく低い点（第３５回油化学討論会、講演番号Ｐ１０）で問題がある。
【０００４】
ホスホリパーゼはトリグリセリドを加水分解しないので、基質中にトリグリセリドが存在していても、ジグリセリドやモノグリセリドが生成せず、リン脂質の加水分解生成物であるリゾリン脂質の精製を阻害しない。
【０００５】
特開平６−６２８５０号公報、特開平７−３１４７２号公報、特開平７−２２２５９２号公報等に開示されているように、糸状菌等の真菌に由来するホスホリパーゼA１の調製法が開発されているが、培養に長時間を要し菌体を含む培地からの酵素の抽出操作は煩雑である。
【０００６】
ホスホリパーゼA１は動物の膵臓や肝臓、微生物に存在し、ホスホリパーゼＡ２と共にリン脂質の代謝回転に寄与している。また、リン脂質の脂肪酸分子内分布の解析や脂質生化学研究において有用な酵素であるが、現在のところ精製品も含めて市販品はない。
【特許文献１】特開平６−６２８５０号公報
【特許文献２】特開平７−３１４７２号公報
【特許文献３】特開平７−２２２５９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパーゼA１の新たな供給源を提供すると共に、ＤＨＡ高含有リン脂質及びリゾリン脂質をより効率良く大量に調製しうる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上述の課題を解決するために鋭意研究した結果、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物（ＨＦＫＩ−００２０）の培養液中にホスホリパーゼA１活性を検出した。
【０００９】
すなわち本発明は、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属し、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を分泌する微生物（ＨＦＫＩ−００２０）、この酵素を含む培養液を有効成分とする脂質改質剤及びこの脂質改質剤を用いてリン脂質を加水分解する２−アシルリゾリン脂質の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパーゼA１活性を有する酵素の新たな供給源を提供することができるという利点がある。
【００１１】
また、本発明の微生物によれば、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を菌体外の培養液中に分泌するので、酵素が菌体の内部に留まっている菌の場合と比べ、酵素を大量に生産することができるという利点がある。
【００１２】
また、本発明の微生物によれば、ホスホリパーゼA１活性を有する酵素を菌体外の培養液中に分泌するので、酵素を菌体内に産生する菌から酵素を回収する場合より分画が容易で、酵素を培養液から容易に回収することができるという利点がある。
【００１３】
また、本発明の脂質改質剤（培養液）によれば、１０℃という低温状況下においても２−アシルリゾリン脂質を効率良く製造することができるという利点がある。また、２−アシル基がＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）であるものを用いると、ＤＨＡ高含有リン脂質及びリゾリン脂質を製造しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明において、培養液とは、Pseudomonas sp. ＨＦＫＩ−００２０を培養して得られる培養産物をすべて包含するものであり、菌体を含んでいても、含んでいなくてもよい。本発明の培養液は、これらの菌株を、例えば常法に従ってペプトンと酵母エキスを含む培地で培養した後、慣用の方法で単離、精製することにより得られる。本発明の調製法及び製造法においては、遠心によって菌体を除去した培地（培養上清）を用いることが好ましい。基質としては大豆、菜種などの植物、イクラ、イカ、卵黄などの陸産及び海産動物、バクテリア、酵母などの微生物由来の天然に存在するリン脂質、及び化学的、酵素的に調製されたリン脂質など、sn-1位エステル結合を有するリン脂質であれば用いることができる。
【００１５】
微生物（ＨＦＫＩ−００２０）の同定を実施した結果、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属であると同定された。以下に、形態観察、生理・生化学性状試験及び16S rDNA (16S rRNA遺伝子)塩基配列解析の方法並びに微生物試験、解析結果を示す。
【００１６】
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物（ＨＦＫＩ−００２０）の培養方法は、Ｋ２８培地を用いる。表１にＫ２８培地組成を示す。培養温度は１０℃で好気条件にて5日間培養を行なった。
【００１７】
【表１】
2006325485.tif 000002
【００１８】
菌学的性状試験として、光学顕微鏡ＢＸ５０Ｆ４ （オリンパス，日本）により、細胞形態、グラム染色性、胞子の有無、鞭毛による運動性の有無を観察した。また、Ｋ２８培地平板上でのコロニー形態を観察した。また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）について試験を行なった。菌学的性状試験の結果は表２に示す通りであった。
【００１９】
【表２】
2006325485.tif 000003
【００２０】
また、生理・生化学性状試験を行なったところ、結果は表３に示す通りであった。
【００２１】
【表３】
2006325485.tif 000004
【００２２】
また、追加試験として、Ｋｉｎｇ’ｓ Ｂ寒天培地上で蛍光色素産生試験を行なったところ、結果は表４に示す通りであった。
【００２３】
【表４】
2006325485.tif 000005
【００２４】
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析として、ゲノムＤＮＡの抽出にはInstaGene Matrix （BIO RAD, CA, U.S.A.)を使用し、操作はBIO RAD社のプロトコールに従った。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより16S ribosomal ＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡ）の全塩基配列１５００〜１６００ ｂｐの領域を増幅した。その後、増幅された１６Ｓ ｒＤＮＡをシーケンシングし、検体の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を得た。ＰＣＲにはReady-To-Go PCR Beads(Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA), とプライマー９Ｆ及び１５１０Ｒを使用した。サイクルシークエンスにはABI Prism BigDye Terminator v3.1  Kit  (Applied Biosystems, CA, USA)とシークエンスプライマー８種を使用した。サーマルサイクラーにはGeneAmp PCR System 9600(Applied Biosystems, CA, USA)、ＤＮＡシーケンサーにはABI PRISM 3100 DNA Sequencer(Applied Biosystems, CA, USA)を使用し、得られた塩基配列断片の結合にはAutoAssembler2.1(Applied Biosystems, CA, USA)を使用した。なお、ＰＣＲからサイクルシークエンスまでの基本的操作は各キットのプロトコールに従った。
【００２５】
シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物（ＨＦＫＩ−００２０）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。
【００２６】
上記の塩基配列を、2種類の塩基配列データベースに対し相同性検索を実施した。
【００２７】
まず、解析ソフトウェアとしてMicroSeq Microbial Identification System Software V.1.4.1(Applied Biosystems, CA, USA)を使用し塩基配列を解析した。相同性検索を行なう際の対象データベースにはMicroSeq Bacterial Full Gene Library v.0001(Applied Biosystems, CA, USA)を使用した。具体的には、ＢＬＡＳＴ を用いて上記データベースに対し相同性検索を実施し、相同率が上位１０位までの配列を取得した。相同性検索結果を表５に示す。
【００２８】
【表５】
2006325485.tif 000006
【００２９】
次に、より多くの情報を得るため国際塩基配列データベース(Genbank/DDBJ/EMBL)に対し相同性検索を実施しました。具体的には、米国ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih, gov/)が提供するオンラインサービスより、ＢＬＡＳＴをもちいて国際塩基配列データベースに対して相同性検索を行い、得られた１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列からシュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物（ＨＦＫＩ−００２０）と近縁と考えられる種の相同検索を実施した。相同性検索結果を表６に示す。
【００３０】
【表６】
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【００３１】
形態および生理学的性状学的試験の結果、シュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する微生物（ＨＦＫＩ−００２０）はグラム染色陰性、桿菌、運動性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陽性、蛍光色素産生能などの性状を示し、これらのことから蛍光色素産生Pseudomonasであることが示唆された。また、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析でもP. fluorescens biotype GやP. agariciなど蛍光色素を産生するPseudomonasの１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示した。これらのことから蛍光色素産生Pseudomonasであると考えられる。
【００３２】
種については、P. fluorescens biotype Gは本種基準株ではなく、P. fluorescensの基準株であるＡＴＣＣ １３５２５株はＭｉｃｒｏＳｅｑによる相同性検索６位に検索され、このP. fluorescens基準株に対しては高い相度率を示さない。ＡＴＣＣ １７５１８株に代表される本種 ｂｉｏｔｙｐｅ ＧなどP. fluorescensには１６Ｓ ｒＤＮＡに基づく解析で系統的に異なる幾つかのｂｉｏｔｙｐｅが存在することが知られ、これらのｂｉｏｔｙｐｅは分類学的には依然P. fluorescensとして扱われる。P. fluorescensについては分類学的に未整理な部分である。従って、現時点では本願微生物（ＨＦＫＩ−００２０）はシュードモナス(Pseudomonas sp.)属に属する新規微生物.とすることが妥当と考えられる。
【実施例１】
【００３３】
以下、参考例と実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
シュードモナス(Pseudomonas sp.) ＨＦＫＩ−００２０株をＫ２８培地（ペプトン  0.5%、酵母エキス0.1%、人工海水 50%）に植菌して10℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質として1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン(16:0/18:1(n-9)-PC)、又は1-オレオイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(18:1(n-9)/16:0-PC) 5mg、培養上清１ｍｌにジエチルエーテル１ｍｌを加え、全量を２ｍｌにした。１０℃で２４時間撹拌した後、フォルチ法で脂質を抽出した後、シリカゲルＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）でリゾホスファチジルコリン(LPC)を分画した。塩酸メタノール法でＬＰＣの構成脂肪酸を塩酸メタノール法でメチルエステルとして得た後、ガスクロマトグラフィで定量分析した。原料とＬＰＣの脂肪酸組成を表７に示す。
【００３５】
【表７】
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【００３６】
表７はシュードモナス(Pseudomonas sp.)ＨＦＫＩ−００２０株の培養上清を用いた合成ＰＣの加水分解反応で生成したＬＰＣの脂肪酸組成(mol％)を示す。両基質ともＬＰＣにはｓｎ−１位とｓｎ−２位の脂肪酸が検出されたが、ｓｎ−２位の脂肪酸が多く残っており、ｓｎ−１位のアシル基が選択的に加水分解された。即ち、酵素溶液として用いた培養上清中には、主要な加水分解活性としてホスホリパーゼA１活性が存在することが確認された。
【００３７】
シュードモナス(Pseudomonas sp.）ＨＦＫＩ−００２０株をＫ２８培地（ペプトン  0.5%、酵母エキス0.1%、人工海水 50%）に植菌して１０℃で約７２時間振盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基質としての大豆油１０μgに培養上清０．５ｍｌにジエチルエーテル０．５ｍｌを加え、１０℃で２４時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルＴＬＣに展開した結果、遊離酸の生成は検出されず、加水分解は確認されなかった。従って、この培養上清はリパーゼ活性を有しないことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
培養液中に含まれるホスホリパーゼA１活性を有する酵素を分離・精製することにより食品や化粧品を工業的に大量に乳化する用途に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】リン脂質のホスホリパーゼによる加水分解の状況を示す説明図である。
【図１】
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【配列表】
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