(57)【要約】【課題】現在の臨床的要請に応えるために、最終的な内胚葉、あるいは膵臓ホルモン産生細胞の個体群、あるいは消化管ホルモン産生細胞、あるいはβ細胞系列への分化能を維持しながら増殖できる羊水由来細胞およびその採取方法を提供する。【解決手段】この発明は、β細胞系列に分化可能な羊水由来細胞の増殖可能な個体群に関するものである。また、この発明は、上記羊水由来細胞を分離し、かつ増殖する方法、並びに糖尿病治療に上記羊水由来細胞を利用するための方法および上記羊水由来細胞を利用した組成物に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に精製された羊水由来細胞の個体群。
【請求項２】
請求項１記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、およびＴｒａ２−５４からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項３】
請求項２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−１β、ＧＡＴＡ−６およびＳｏｘ−１７からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項４】
請求項２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−３β、Ｈｅｓ−１、ＧＡＴＡ−４およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させるものでもある、羊水由来細胞の個体群。
【請求項５】
請求項２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ＡＸＬ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項６】
請求項２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項７】
請求項６記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項８】
請求項６記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項９】
請求項１記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１０】
請求項１記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−１７およびＴｒａ２−５４の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１１】
請求項１０記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１２】
請求項１０記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１３】
請求項１０記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１４】
請求項１記載の羊水由来膵臓細胞の個体群において、
試験管内で増殖可能である、羊水由来膵臓細胞の個体群。
【請求項１５】
請求項１記載の羊水由来細胞の個体群において、
低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１６】
請求項１記載の羊水由来細胞の個体群において、
β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１７】
請求項１記載の羊水由来細胞の個体群において、
消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。
【請求項１８】
羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
ａ．羊水を分離するステップと、
ｂ．前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
ｃ．培地中に前記細胞を配置するステップと、
ｄ．培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
ｅ．少なくとも５日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、およびＴｒａ２−５４からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−１β、ＧＡＴＡ−６およびＳｏｘ−１７からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
【請求項２１】
請求項１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−３β、Ｈｅｓ−１、ＧＡＴＡ−４およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
【請求項２２】
請求項１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ＡＸＬ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
【請求項２３】
請求項１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
【請求項２６】
請求項１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
【請求項２７】
請求項１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−１７およびＴｒａ２−５４の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項２９】
請求項２７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
【請求項３０】
請求項２７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
【請求項３１】
請求項１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
【請求項３２】
請求項１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
【請求項３３】
請求項１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
【請求項３４】
請求項１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
【請求項３５】
羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
ａ．羊水を分離するステップと、
ｂ．前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
ｃ．ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１からなる群より選択された少なくとも１つのマーカーを発現させる細胞を選択するステップと、
ｄ．培地中に前記細胞を配置するステップと、
ｅ．培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
ｆ．少なくとも５日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、およびＴｒａ２−５４からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項３７】
請求項３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−１β、ＧＡＴＡ−６およびＳｏｘ−１７からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
【請求項３８】
請求項３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−３β、Ｈｅｓ−１、ＧＡＴＡ−４およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
【請求項３９】
請求項３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ＡＸＬ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
【請求項４０】
請求項３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項４１】
請求項４０記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項４２】
請求項４０記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
【請求項４３】
請求項３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
【請求項４４】
請求項４０記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−１７およびＴｒａ２−５４の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項４５】
請求項４４記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
【請求項４６】
請求項４４記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
【請求項４７】
請求項４４記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
【請求項４８】
請求項３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
【請求項４９】
請求項３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
【請求項５０】
請求項３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
【請求項５１】
請求項３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
【請求項５２】
糖尿病患者あるいは糖尿病発症のリスクを負う者を治療するための方法において、
ａ．ドナーから採取した羊水由来細胞の個体群を分離するステップと、
ｂ．前記患者に前記羊水由来細胞を移すステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願〕
この出願は、米国出願データ：２００５年５月２７日付けの仮出願Ｎｏ６０／６８５，６０７号および２００６年３月２７日付けの仮出願Ｎｏ６０／７４３，８２１号に関連するものである。
【０００２】
〔発明の分野〕
この発明は、β細胞系列に分化することができ、個体群が増殖可能な羊水由来細胞に関するものである。また、この発明は、上記羊水由来細胞を分離し、かつ増殖させるための方法ばかりでなく、糖尿病治療において、上記羊水由来細胞を利用する方法および上記羊水由来細胞を利用した組成物を提供するものである。
【０００３】
〔発明の背景〕
器官機能の低下は、先天的な欠陥、外傷、あるいは疾患に起因することがある。器官機能の低下を引き起こす疾患の一例は、真性糖尿病、すなわち糖尿病である。ほとんどの糖尿病の場合は、２つの臨床型に分類される。１型は、若年型糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られており、２型は成人発症性糖尿病としても知られている。各型は、予後、治療および発症原因が異なっている。両型は、患者の血糖値の調節不能によって特徴付けられる。その結果、糖分が細胞に入ることができず、代謝要求量を満たすことができないので、血糖値は高い値に上昇する。血糖を適切に代謝することができないということは、最初に、例えば高血糖症、過度の空腹感、口渇感、多尿症および糖尿がみられ、その後に、ニューロパシー、巨大血管疾患および微小血管疾患へ段階的に拡大してゆく、初期症状および末期症状が複合化した一連の総体的症状を引き起こすことを示すものである。
【０００４】
１型糖尿病の一般的な治療方法には、典型的には、注射器あるいはポンプのいずれかで注入することによる外因性インスリン投与が含まれる。この方法は、血糖値を完全に正常化せず、しばしば低血糖症の発症リスク増加に関連している。低血糖症のリスクが増加する場合は、より有効な血糖調節を実現することができる。仮に膵臓の機能が臓器移植あるいは細胞（移植）治療によって回復あるいは活性化できる場合には、より有効な血糖調節を実現することができる。
【０００５】
現在、糖尿病を治療するために用いられる多くの臓器移植治療が存在する。このような治療方法の１つには、分離した膵島を糖尿病患者へ移植する方法がある。ヒト膵島移植を行う上で、越えるべき大きなハードルの１つは、多くの糖尿病患者を治療するのに十分な数の膵島がないことである。膵島の不足に対する１つの実現可能な解決策は、交代細胞源からの膵島の生成である。
【０００６】
成人体組織由来の前駆細胞が膵臓β細胞フェノタイプに分化することができるとの記録がある。例えば、国際出願ＷＯ２００４／０８７８８５Ａ２、ヘス（Ｈｅｓｓ）らによる文献（ネイチャーバイオテクノロジー２００３年、第２１巻第７６３頁〜第７７０頁）およびイアナス（Ｉａｎｕｓ）らによる文献（「臨床研究誌（J. Clin. Invest.）」２００３年、第１１１巻第８４３頁〜第８５０頁）を参照されたい。これらの文献は、試験管内で、膵臓β細胞の特性を有する細胞に分化するか、あるいは生体内で機能低下した膵臓を再生するのに役立つ栄養因子を分泌する成人骨髄細胞由来の細胞の能力を報告している。
【０００７】
膵臓細胞に分化できる他の前駆細胞源の中には、げっ歯類肝臓由来の楕円形幹細胞（国際出願ＷＯ０３／０３３６９７）および分娩後胎盤（米国出願公開２００４／０１６１４１９Ａ１）が含まれる。
【０００８】
β細胞を含む膵島の内分泌細胞は、アポトーシスおよび新しい膵島細胞（新生）の増殖の過程によって、常に入れ替わっている。そういうものであるから、膵臓は、膵臓ホルモン産生細胞に分化できる前駆細胞源であると考えられる。膵臓から分離され、かつ膵臓前駆細胞の潜在的な供給源として、形態学的に明瞭な３つの組織型である、膵島濃縮画分、脈管濃縮画分および腺房細胞濃縮画分が存在している。
【０００９】
膵臓組織粗抽出物からの前駆細胞あるいは部分的に分化した細胞の分離は、細胞表面マーカーに対して生成された抗体を用いて実現可能である。例えば、米国出願公開２００４／０２４１７６１は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｍｓｘ−２、ＰＤＸ−１を発現したマウス細胞およびインスリンの分離を開示している。
【００１０】
ゲルシェンゴーン（Ｇｅｒｓｈｅｎｇｏｒｎ）らによる文献（サイエンス２００４年、第３０６巻第２２６１頁〜第２２６４頁）は、膵島様の細胞凝集体を構成できた増殖細胞の生成方法を教示している。これらの増殖細胞は、分離されたヒト膵島の試験管内培養液から出現した粘着細胞の不均質な個体群に由来したものである。分離された膵島は、当初、組織培養プレート上に植えられ、１０％血清を含有する培地内で培養されている。線維芽細胞様の細胞については、培養された膵島から出て移動し、かつ単一膜を形成する点が観察された。これらの細胞は、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）、平滑筋アクチンおよびビメンチンを発現させるものである。
【００１１】
また、膵臓前駆細胞は、シーバーグ（Ｓｅａｂｅｒｇ）らによる文献（ネイチャーバイオテクノロジー２００４年、第２２巻第１１１５頁〜第１１２４頁）によって開示されているように、単一細胞に切り離された膵島および脈管組織の培養液から生成してもよい。シーバーグ（Ｓｅａｂｅｒｇ）らによって開示されたマウス前駆細胞は、増殖中にネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）を発現させるものである。
【００１２】
米国出願公開２００３／００８２１５５は、幹細胞の機能および分子特性を有するヒト膵臓の膵島由来の細胞個体群を分離し、かつ同定する方法を開示している。特に、これらの分離細胞は、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）染色陽性、ネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）形質発現性、ＧＬＰ−１Ｒ染色陽性、ＧＬＰ−１Ｒ形質発現性、ＡＢＣＧ２染色陽性、ＡＢＣＧ２形質発現性、Ｏｃｔ３／４染色陽性、Ｏｃｔ３／４形質発現性、ラトロフィリン（ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ）（２型）染色陽性、ラトロフィリン（ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ）（２型）形質発現性、Ｈｅｓ−１染色陽性、Ｈｅｓ−１形質発現性、インテグリンサブユニットα６およびβ１染色陽性、インテグリンサブユニットα６およびβ１形質発現性、ｃ−ｋｉｔ染色陽性、ｃ−ｋｉｔ形質発現性、ＭＤＲ−１染色陽性、ＭＤＲ−１形質発現性、ＳＳＴ−Ｒ，２，３，４染色陽性、ＳＳＴ−Ｒ，２，３，４形質発現性、ＳＵＲ−１染色陽性、ＳＵＲ−１形質発現性、Ｋｉｒ６．２染色陽性、Ｋｉｒ６．２形質発現性、ＣＤ３４染色陰性、ＣＤ４５染色陰性、ＣＤ１３３染色陰性、ＭＨＣクラスＩ染色陰性、ＭＨＣクラスＩＩ染色陰性、サイトケラチン−１９染色陰性、培養液中での長期増殖、培養液中での擬似膵島への分化能によって特徴付けされている。
【００１３】
米国特許第５，８３４，３０８号、米国特許第６，００１，６４７号および米国特許第６，７０３，０１７号に開示されているように、他の取り組みでは、ＮＯＤマウス由来の膵島培養液の粗サンプルは、１年以上にわたって、増殖培養液中で保持され、かつインスリンを分泌できる膵島様の個体群に分化する能力を実証するように見える上皮様の培養物を作り出すのに使用可能である。
【００１４】
膵島様の構造体は、ボナー・ワイア（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ）らによる文献（「自然科学アカデミー会報（Proc Nat Acad Sci）」２０００年、第９７巻第７９９９頁〜第８００４頁）および米国特許第６，８１５，２０３Ｂ１に開示されているように、脈管組織を濃縮したヒト膵臓消化物画分から生成されてもよい。これらの文献に開示された膵島様の塊は、サイトケラチン−１９染色が陽性となり、インスリンとの免疫活性を示している。
【００１５】
国際出願２００４／０１１６２１は、ヒト膵臓の脈管画分からインスリン陰性粘着細胞を生成する方法を開示している。
【００１６】
国際出願０３／１０２１３４は、ヒト膵臓消化物の腺房画分からサイトケラチン−１９陽性の上皮細胞を生成する方法を開示している。この生成された上皮細胞は、誘導培地の存在下で、限定的に増殖し、かつインスリン産生細胞に分化することができる。
【００１７】
米国出願公開２００４／０１５８０５Ａ１は、ヒト膵臓幹細胞サブセットが細胞表面マーカーＣＤ５６（ＮＣＡＭとしても知られている）へのリガンドを用いて分離可能であると報告している。これらの細胞は、インスリン産生細胞およびインスリン産生凝集体に分化することができる。
【００１８】
胎仔組織あるいは胚組織由来の前駆細胞が膵臓ホルモン産生細胞に分化する可能性があることが記録されている。例えば、ヒト胎仔あるいは胚由来の細胞がβ細胞系列に分化する可能性を報告する米国特許第６，４３６，７０４号、国際出願０３／０６２４０５、国際出願ＷＯ０２／０９２７５６および欧州特許出願０３６３１２５Ａ２を参照されたい。
【００１９】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）は、受精卵の胚発達初期において胚盤胞の内細胞塊に由来するものである。胚盤胞は、胚が子宮壁内に着床する前の段階、胚の着床前期である。トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）およびその同僚によって記述された条件（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）らによる文献（「自然科学アカデミー会報」１９９５年、第９２巻第７８４４頁〜第７８４８頁）；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）らによる文献（「サイエンス」１９９８年、第２８２巻第１１４５頁〜第１１４７頁）；マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）らによる文献（「分子生物学体系（Methods Mol. Biol.）」２００１年、第１５８巻第１１頁〜第１８頁））に従って、不活性化された支持細胞層上で培養された場合には、胚盤胞の細胞内層は、試験管内で、未分化状態で無限に増殖可能である。正常に増殖したヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）は、多能性すなわち三胚葉である外胚葉（Ｅｃ）、中胚葉（Ｍｅ）および内胚葉（Ｅｎ）に分化する能力を維持しながら、倍加する無限の可能性を有している。多能性のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）として増殖した場合には、その細胞は倍数性の核型を維持し、老化現象に陥らない。
【００２０】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）は、特異的な転写因子ＯＣＴ−４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ−２、ＦＧＦ−４およびＲＥＸ−１を発現させることに加えて、細胞表面抗原の別の群であるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−２−５４（アルカリ性脱リン酸酵素）、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を呈するものである（ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）らによる文献（幹細胞（Stem Cells）２００２年、第２０巻第３２９頁〜第３３７頁）、ドレーパー（Ｄｒａｐｅｒ）らによる文献（「解剖学会誌（J. Anat.）」２００２年、第２００巻第２４９頁〜第２５８頁）、ミツイ（Ｍｉｔｓｕｉ）らによる文献（「細胞（Cell）」２００３年、第１１３巻第６３１頁〜第６４２頁）、チェンバース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ）らによる文献（「細胞」２００３年、第１１３巻第６４３頁〜第６５５頁））。
【００２１】
しかしながら、上記文献から、ヒト胚細胞が、多能性を拡大し維持するための支持細胞層、あるいは、例えばマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ：登録商標）等の複合細胞外基質に調整培地を加えた組み合わせを、しばしば必要とする点について留意することは重要である。しかし、これらの条件は、細胞数を容易に拡大すること、および糖尿病を治療するための決定的な細胞（移植）治療を可能にするものではない。
【００２２】
研究者は、非胚性の幹細胞（“成人幹細胞”）が、胚性幹細胞のように多くの異なる組織型に分化することができないことから、胚性幹細胞がまだ成人幹細胞の使用に比べて優位に立っていることを見出している。しかしながら、細胞が“胚盤胞”期における胚に由来していることは、胚性幹細胞の分離を妨げる壁の１つである。ヒト胚性幹細胞の研究は、感情的に告発された政治的および倫理的な議論によって妨げられており、成果を上げるのに、おそらく何年もかかりそうである。
【００２３】
さらに、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）は、免疫疾患を有する動物、すなわち分娩後の状況で、組織中に注入された場合には、腫瘍化するのに対して、成人幹細胞では腫瘍化しないことが見出された。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）の腫瘍化の性状については、頻繁に取り扱われることはないが、この組織は、将来、細胞置換治療に使用される重責を担う可能性がある。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）およびこれらの腫瘍化特性を巡る政治的、道徳的および倫理的な論争ばかりでなく、遺伝的に正常なゲノムを維持しながら、培養液中で未分化の成人幹細胞を増殖させる場合に認識された困難性は、ヒト細胞置換治療の開発にとって大きな障壁である。
【００２４】
多能性すなわち組織幹細胞は、絨毛膜絨毛および羊水から分離されている。多くの羊膜細胞および胎盤細胞は、共通の起源、すなわち胚自体、卵黄嚢、絨毛膜絨毛の間葉細胞核、絨毛膜および羊膜の元となる柔実胚の内細胞塊を共有している（クレン（Ｃｒａｎｅ）およびチュン（Ｃｈｅｕｎｇ）による文献（「分娩前診断（Prenatal Diagnosis）」１９８８年、第８巻第１１９頁〜第１２９頁））。三胚葉のすべてに由来する胚細胞および胎児細胞は、長期間、羊水中で確認されている（ミルンスキー（Ｍｉｌｕｎｓｋｙ）による文献（米国ニューヨーク州のプレナム出版社（Plenum Press）１９７９年発行、第７５頁〜第８４頁の「胎仔の遺伝的疾患(Genetic Disorder of the Fetus)」）、ホーン（Ｈｏｅｈｎ）およびサルク（Ｓａｌｋ）による文献（「細胞生物学（Methods in Cell Biology）」１９８２年、第２６巻第１１頁〜第３４頁）、ゴスデン（Ｇｏｓｄｅｎ）による文献（「英国医学報告（British Medical Bulletin）」１９８３年、第３９巻第３４８頁〜第３５４頁）、プルサ（Ｐｒｕｓａ）らによる文献（「ヒト再生（Human Reproduction）」２００３年、第１８巻第１４８９頁〜第１４９３頁））。したがって、羊水は、胚性様および胎仔様の幹細胞に、最小限侵襲的に到達する機会を与えるものである。
【００２５】
羊水由来細胞は、胎仔の染色体疾患を検出するのに日常的に用いられている。羊水は、典型的には、第２妊娠３半期（妊娠期間の１６週目〜２２週目）中にサンプルが採取される。先行技術では、特異的な形態学的細胞：“線維芽細胞性（Ｆ）”細胞、“羊水（ＡＦ）”由来細胞および“上皮性（Ｅ）”細胞を有する３つの部分個体群の存在を明らかに実証している。“線維芽細胞性（Ｆ）”細胞および“羊水（ＡＦ）”由来細胞は急速に増殖するのに対して、“上皮性（Ｅ）”細胞は非常に遅い増殖曲線を示し、低いクローン効率を有している。
【００２６】
例えば、特許協力条約（ＰＣＴ）による国際出願ＷＯ２００３／０４２４０５は、絨毛膜絨毛、羊水および胎盤からのｃ−Ｋｉｔ染色陽性幹細胞の分離を開示している（細胞１、表１参照）。
【００２７】
他の例では、米国出願公開２００５／００５４０９３は、羊水からの幹細胞の分離を開示している。これらの幹細胞は、発生段階特異性胚抗原―３（ＳＳＥＡ−３）、発生段階特異性胚抗原―４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＴＲＡ  ２−５４、Ｏｃｔ−４、ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂおよびＣＤ１０５（細胞２、表１参照）を発現させるものである。
【００２８】
他の例では、胎仔細胞は、羊水から分離されている（アンカー（Ａｎｋｅｒ）らによる文献（「血液（Blood）」２００３年、第１０２巻第１５４８頁〜第１５４９頁））。この文献に開示された細胞は、次のマーカー：ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ＆Ｃの形質発現性に関して陽性である。これらの細胞は、次のマーカー：ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＤ１１、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−Ｄの形質発現性に関して陰性である（細胞３、表１参照）。
【００２９】
また、羊水から分離された間葉幹細胞の個体群は、ツアイ（Ｔｓａｉ）らによる文献（「ヒト再生（Human Reproduction）」２００４年、第１９巻第１４５０頁〜第１４５６頁）に報告されている。この文献に開示された細胞は、次のマーカー：ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＨＬＡ−Ａ，Ｂ＆Ｃの形質発現性に関して陽性である。また、これらの細胞は、胚性転写因子ＯＣＴ−４の形質発現性に関して陽性である。上記細胞は、次のマーカー：ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＤ３４およびＨＬＡ−Ｄの形質発現性に関して陰性である（細胞４、表１参照）。
【００３０】
近年の刊行物および特許文献は、線維芽細胞性の羊水あるいは上皮部分個体群内に、ヒト胚細胞のいくつかの特性として、表面マーカーＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の形質発現性、転写因子ＯＣＴ−４の形質発現性、高い増殖能、および多数の細胞型への分化能などを呈する細胞個体群が存在することを示唆しているが、ＥＳマーカーＳＳＥＡ−４の形質発現性を維持しながら、初期段階の内胚葉性マーカーの重要な形質発現性として、ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７およびＧＡＴＡ−６などを呈する細胞の部分個体群の存在を示す先行文献はない。
【００３１】
ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β（ＦＯＸａ２としても知られている）、ＳＯＸ−１７およびＧＡＴＡ−６に共通する形質発現性は、原腸形成中に、内胚葉の決定的な形成方法を規定する重要なステップとしてみなされている。したがって、上記マーカーの形質発現性は、羊水由来細胞から、膵臓β細胞の個体群、あるいは膵臓ホルモン産生細胞の個体群、あるいは消化管ホルモン産生細胞を生成する上で、重要となる可能性がある。
【００３２】
したがって、現在の臨床的要請に応えるために、最終的な内胚葉、あるいは膵臓ホルモン産生細胞の個体群、あるいは消化管ホルモン産生細胞、あるいはβ細胞系列への分化能を維持しながら増殖できる羊水由来細胞系列を樹立するための培養条件を開発するという重要な要請が解決されなければならない。
【００３３】
〔発明の概要〕
１つの実施の形態では、この発明は、哺乳類の羊水由来細胞を分離する方法を提供するものである。この発明によれば、羊水由来細胞は、妊娠期間の約１４週目〜約２３週目までの羊水サンプルから採取される。これに代えて、羊水由来細胞は、妊娠期間の約２３週目〜約４０週目までの羊水サンプルから採取される。
【００３４】
１つの実施の形態では、培養液は、低酸素条件（酸素濃度：３％）下で、少なくとも５日間〜１０日間、静かに放置される。これに代えて、培養液は、正常酸素条件（酸素濃度：約２０％）下で、少なくとも５日間〜１０日間、静かに放置される。
【００３５】
他の実施の形態では、羊水由来細胞は、妊娠期間の第２妊娠３半期中の羊水サンプルから採取される。これに代えて、羊水由来細胞は、妊娠期間の第３妊娠３半期中の羊水サンプルから採取される。
【００３６】
１つの実施の形態では、培養された羊水由来細胞は、単一細胞として分離され、クローン増殖される。
【００３７】
この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞は、例えば、羊水由来細胞によって発現する蛋白質マーカーを特異的に認識し、羊水由来細胞を同定し、かつ選択し、これにより実質的に精製された羊水由来細胞の個体群を得ることができる試薬（抗体等）と接触させてもよい。ここで、認識された蛋白質マーカーは少なくとも５０％の細胞個体群中で発現する。
【００３８】
１つの実施の形態では、結果として得られた羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７あるいはＧＡＴＡ−６のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陽性である。羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陰性である。この羊水由来細胞の個体群は、ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７あるいはＧＡＴＡ−６を発現させる能力を喪失することなく、５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができる。
【００３９】
１つの実施の形態では、羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＳＥＡ−４およびＣＤ４４に関して実質的に陽性である。この羊水由来細胞の個体群は、ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７あるいはＧＡＴＡ−６を発現させる能力を喪失することなく、５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができる。
【００４０】
１つの実施の形態では、この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＯＸ−１７、ＣＤ１１７、ＯＣＴ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陰性である。羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＳＥＡ−４およびＣＤ４４に関して実質的に陽性である。この羊水由来細胞の個体群は、５０回を超える回数の自己複製を繰り返して増殖することができる。
【００４１】
１つの実施の形態では、この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞の個体群は、サイトケラチンと、次のマーカー：ＳＯＸ−１７、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーとに関して実質的に陰性である。羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＳＥＡ−４およびＣＤ４４に関して実質的に陽性である。この羊水由来細胞の個体群は、５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができる。
【００４２】
１つの実施の形態では、この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞の個体群は、ＳＯＸ−１７に関して実質的に陰性である。羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＳＥＡ−４およびＣＤ４４に関して実質的に陽性である。この羊水由来細胞の個体群は、５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができる。
【００４３】
１つの実施の形態では、この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：サイトケラチンと、ＳＯＸ−１７とに関して実質的に陰性である。羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＳＥＡ−４およびＣＤ４４に関して実質的に陽性である。この羊水由来細胞の個体群は、５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができる。
【００４４】
１つの実施の形態では、この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞の個体群は、ＳＯＸ−１７に関して実質的に陰性である。さらに、羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陰性である。羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＳＥＡ−４およびＣＤ４４に関して実質的に陽性である。この羊水由来細胞の個体群は、５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができる。
【００４５】
１つの実施の形態では、この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：サイトケラチンおよびＳＯＸ−１７に関して実質的に陰性である。さらに、羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陰性である。羊水由来細胞の個体群は、次のマーカー：ＳＳＥＡ−４およびＣＤ４４に関して実質的に陽性である。この羊水由来細胞の個体群は、５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができる。
【００４６】
他の実施の形態では、この発明は、次のマーカー：ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陰性である、分離精製された羊水由来細胞の個体群を提供するものである。
【００４７】
他の実施の形態では、この発明は、次のマーカー：ＳＯＸ−１７、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陰性である、分離精製された羊水由来細胞の個体群を提供するものである。
【００４８】
他の実施の形態では、この発明は、ＳＯＸ−１７に関して実質的に陰性である、分離精製された羊水由来細胞の個体群を提供するものである。
【００４９】
他の実施の形態では、この発明は、ＳＯＸ−１７に関して実質的に陰性であり、かつ次のマーカー：ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーに関して実質的に陰性である、分離精製された羊水由来細胞の個体群を提供するものである。
【００５０】
１つの実施の形態では、この発明による方法に従って分離された羊水由来細胞は、Ｍｕｓａｓｈｉ−１およびＨｅｓ−１のうち、少なくとも１つを発現させてもよい。
【００５１】
この発明によって分離され、かつ増殖された羊水由来細胞を、適切な試験管内あるいは生体内で、誘導してβ細胞系列の細胞に分化することができる。したがって、この発明によって選択され、かつ増殖された羊水由来細胞並びに羊水由来細胞に由来する分化細胞は、１型および２型の糖尿病を治療するのに有用である。
【００５２】
この発明によって分離され、かつ増殖された羊水由来細胞を、適切な試験管内あるいは生体内で、消化管ホルモン産生細胞に誘導することができる。１つの実施の形態では、この発明によって分離され、かつ増殖された羊水由来細胞は、適切な試験管内あるいは生体内で、消化管ホルモン産生細胞に誘導することができると共に、糖反応法でインスリンを発現させてもよい。
【００５３】
〔発明の詳細な説明〕
開示内容を明確にするため、およびこの発明を限定しないものとして、この発明の詳細な記述は、この発明の一定の特徴、実施の形態あるいは用途を記述するか、あるいは図示する次のサブセクションに分けられている。
【００５４】
この発明は、高い増殖能を有し、かつ胚様の特性を呈する羊水由来細胞の個体群を分離するための方法に関するものである。同様の細胞は、絨毛膜絨毛内にも存在する可能性がある。この明細書に開示された発明の実施の形態の一部では、羊水由来細胞の、形態学的に明瞭な３つの個体群： “線維芽細胞性（Ｆ）”細胞、“上皮性（Ｅ）”細胞および“羊水（ＡＦ）”由来細胞を記述している。
【００５５】
〔定義〕
“β細胞系列”とは、転写因子ＰＤＸ−１と、次の転写因子：ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ニューロＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４およびＰａｘ６のうち、少なくとも１つの転写因子とに対する形質発現が陽性である細胞を意味する。この技術分野における当業者にとっては、上記β細胞系列の細胞特性は、周知であり、上記β細胞系列の他の特性の確認を続行する。上記転写因子は、内分泌細胞の同定に関する従来技術において十分に確立されている（「ネイチャー遺伝学概要（Nature Reviews Genetics）」２００２年、第３巻第５２４頁〜第６３２頁）。
【００５６】
“膵島様の構造体”とは、この発明の方法を実施することによって導き出され、膵島の外観を有する細胞の三次元塊を意味する。膵島様の構造体内の細胞は、少なくとも上記ＰＤＸ−１遺伝子と、グルカゴン、ソマトスタチンあるいはインスリンから選択された１つのホルモンとを発現させるものである。
【００５７】
用語“低酸素性”とは、２０％を下回る酸素濃度を意味し、好ましくは１０％を下回る酸素濃度を意味し、より好ましくは５％を下回るが、１％を上回る酸素濃度を意味する。
【００５８】
用語“正常酸素性”とは、約２０％の大気酸素濃度を意味する。
【００５９】
用語“実質的に陽性”とは、ある特定のマーカー（膜受容体、細胞質蛋白質または核蛋白質あるいは転写因子等）の形質発現性に関して細胞の個体群に関連して使用された場合に、上記マーカーが、細胞個体群の総数の少なくとも約５０％、あるいは少なくとも約６０％、あるいは少なくとも約７０％に存在する、あるいは発現することを意味する。
【００６０】
用語“実質的に陰性”とは、ある特定のマーカー（膜受容体、細胞質蛋白質または核蛋白質あるいは転写因子等）の形質発現性に関して細胞の個体群に関連して使用された場合に、上記マーカーが、細胞個体群の総数の少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％、あるいは少なくとも約９０％に存在しない、あるいは発現しないことを意味する。
【００６１】
この明細書で用いられている“幹細胞”とは、生体内あるいは生体外のいずれにおいても高度に増殖することができ、かつ他の細胞型に分化することができる未分化細胞を意味する。
【００６２】
“前駆細胞”とは、分化によって幹細胞から導き出され、かつより成熟細胞型にさらに分化することができる細胞を意味する。前駆細胞は、典型的には、幹細胞と比較して、より制限的な増殖能を有している。
【００６３】
“増殖可能な個体群”とは、細胞培養系内で少なくとも５０回またはそれ以上の細胞分裂を経て、増殖される分離細胞の個体群の能力を意味する。
【００６４】
“未分化細胞”とは、羊水から分離された細胞に関連して使用された場合に、ＰＤＸ−１またはインスリンの形質発現性に関して実質的に陰性である羊水由来細胞の個体群を意味する。
【００６５】
“分化細胞”とは、羊水から分離された細胞に関連して使用された場合に、ＰＤＸ−１またはインスリンの形質発現性に関して実質的に陽性である羊水由来細胞の個体群を意味する。
【００６６】
この明細書で用いられている“マーカー”は、対象細胞内で分化的に発現する核酸あるいはポリペプチド分子である。この文脈において、分化的な発現とは、陽性マーカーに関してはマーカー濃度の増加を意味し、陰性マーカーに関してはマーカー濃度の低下を意味する。マーカーとしての核酸あるいはポリペプチドの検出可能レベルは、対象外の細胞と比較して、対象細胞内で、十分に高いか、あるいは低いものであり、これにより、この技術分野において公知である種々の方法のすべてを用いて、対象細胞が同定され、かつ他の細胞との間で、識別可能である。
【００６７】
“ｃ−Ｋｉｔ”および“ＣＤ１１７”とは、共に、遺伝子保存機関（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号Ｘ０６１８２に開示された配列を有するか、あるいは自然に出現する変異型配列を有する細胞表面受容体としてのチロシンキナーゼを意味する。
【００６８】
また、“ＣＤ９”とは、“運動性関連蛋白質−１（ＭＲＰ−１）”を意味し、細胞接着、運動性、増殖能および分化能に関係した膜貫通糖蛋白質である。
【００６９】
また、“ＣＤ１０”とは、“急性リンパ性白血病の共通抗原（ＣＡＬＬＡ）”を意味する。ＣＤ１０は、中性の金属結合型蛋白質分解酵素活性（metalloendopeptidase）を有する細胞表面酵素であり、リンパ芽球性リンパ腫、バーキット型リンパ腫、および小胞性胚中心リンパ腫内で、および慢性骨髄性白血病患者内で発現する。また、ＣＤ１０は、平均的な初期リンパ様前駆細胞、成人骨髄内の未成熟Ｂ細胞およびリンパ系組織内の胚中心Ｂ細胞表面上で発現する。また、ＣＤ１０は、胸部筋上皮細胞、毛細胆管、線維芽細胞、腎臓の刷子縁および消化管上皮細胞上に存在している。
【００７０】
また、“ＣＤ４４”とは、“ヘルメス抗原”を意味し、ヒアルロナン用の主要な細胞表面受容体である。このＣＤ４４は、主に、肝細胞、上皮細胞の一部および心筋等の組織／細胞を除き、ほとんどの細胞型で発現する。
【００７１】
また、“ＣＤ４９ｆ”とは、“ａ６インテグリン”および“ＶＬＡ−６”を意味し、ラミニンを結合するインテグリンサブユニットβ１に関係している。ＣＤ４９ｆは、主に、上皮細胞、栄養芽細胞、血小板および単核白血球上で、発現する。
【００７２】
また、“ＣＤ７３”とは、“外側−５´−ヌクレオチダーゼ”を意味し、ＣＤ７３は、主に、Ｂ細胞およびＴ細胞のサブセット、骨髄間質細胞、種々の上皮細胞、線維芽細胞および内皮細胞上で、発現する。
【００７３】
また、“ＣＤ９０”とは、“Ｔｈｙ−１”を意味し、ＣＤ９０は、主に、造血幹細胞、結合組織細胞および種々の線維芽細胞および間質細胞上で、発現する。
【００７４】
“ＳＳＥＡ−１”（発生段階特異性胚抗原―１）は、マウス奇形幹細胞（ＥＣ）、マウスおよびヒトの胚芽細胞（ＥＧ）およびマウス胚性幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００７５】
“ＳＳＥＡ−３”（発生段階特異性胚抗原―３）は、ヒト奇形幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚芽細胞（ＥＧ）およびヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００７６】
“ＳＳＥＡ−４”（発生段階特異性胚抗原―４）は、ヒト奇形幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚芽細胞（ＥＧ）およびヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００７７】
“ＴＲＡ１−６０”は、ヒト奇形幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚芽細胞（ＥＧ）およびヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の表面上で発現するケラチン硫酸塩関連抗原である。
【００７８】
“ＴＲＡ１−８１”は、ヒト奇形幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚芽細胞（ＥＧ）およびヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の表面上で発現するケラチン硫酸塩関連抗原である。
【００７９】
“ＴＲＡ２−４９”は、ヒト奇形幹細胞（ＥＣ）およびヒト胚性幹細胞（ＥＳ）の表面上で発現するアルカリ性脱リン酸酵素のアイソザイムである。
【００８０】
“Ｏｃｔ−４”は、ＰＯＵドメイン転写因子の要素であり、多能性の幹細胞の証しとして広く見なされている。ＯＣＴ−４と多能性の幹細胞との関係は、未分化状態の多能性の幹細胞への厳しく制限された形質発現によって示されている。体細胞系列への分化時に、ＯＣＴ−４の形質発現は、急速に消滅する。
【００８１】
また、“ＥＰＣＡＭ”とは、上皮起源細胞および上皮由来腫瘍細胞上で広く発現する“上皮細胞粘着分子”を意味する。
【００８２】
“Ｒｅｘ−１”は、発達段階で調節された酸性ジンクフィンガー遺伝子（Ｚｆｐ−４２）である。Ｒｅｘ−１のメッセージレベルは、胚性幹細胞内で高く、分化への誘導時に低下する。幹細胞に特異的なメッセージについて予想されるように、Ｒｅｘ−１  ｍＲＮＡ（伝令リボ核酸）は、胞胚の内細胞塊（ＩＣＭ）、胞胚の栄養芽細胞の極内に存在し、後に、卵筒（栄養芽細胞由来組織）の栄養膜錐状体および胚体外外胚葉内に存在するが、その発生量は、上記内細胞塊（ＩＣＭ）からの直接的な系統である胚の外胚葉内で非常に減少する。
【００８３】
“ＨＮＦ−１α”、“ＨＮＦ−１β”および“ＨＮＦ−３β”は、転写因子の肝核因子ファミリーに属しており、上記ファミリーは、高度に保護されたＤＮＡ（デオキシリボ核酸）結合ドメインおよび２つの短いカルボキシル末端ドメインによって特徴付けされる。
【００８４】
“ＧＡＴＡ−４”および“ＧＡＴＡ−６”は、ＧＡＴＡ転写因子ファミリーの要素である。この転写因子ファミリーは、ＴＧＦβシグナルによって誘導されるものであり、初期段階の内胚葉マーカー、Ｓｏｘ１７αおよびＨＮＦ−１βと、初期段階以降のマーカーＨＮＦ−３βの維持に寄与するものである。
【００８５】
“ＳＯＸ−１７”は、胚形成中における内胚葉の形成に関係する転写因子である。
【００８６】
“細胞培養用基本合成培地”とは、細胞培養のための無血清合成培地あるいは血清を化学的に含有させた合成培地を意味する。このような培地には、ダルベッコ調製イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）（ＤＭＥＭ）、α調製最小必須培地（αＭＭＥＭ）、基本必須培地（ＢＭＥ）、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｍ１９９培地、ハムＦ１０栄養培地（Ham's F10 nutrient medium）、ノックアウト（ＫＮＯＣＫＯＵＴ：商標）ダルベッコ調製イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ改良型調製イーグル培地、ＭＣＤＢ−１５１、ＭＣＤＢ−１５３、ＭＣＤＢ−２０１およびＭＣＤＢ−３０２（米国ミズーリ州のシグマ社製）等のＭＣＤＢ系培地、およびダルベッコ調製イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地が含まれるが、これらに限定されるものではない。上記培地および上記以外の有用な培地は、例えば、米国ニューヨーク州グランドアイランドのギブコ社（ＧＩＢＣＯ）から入手可能である。多くの培地は、アカデミック出版社により発行され、ウイリアム・ビー・ジャコビー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂ．Ｊａｋｏｂｙ）およびアイラ・エイチ・パスタン（Ｉｒａ  Ｈ．Ｐａｓｔａｎ）共編の “細胞培養（Cell Culture）”第ＬＶＩＩ巻第６２頁〜第７２頁の「酵素学の方法編（Methods in Enzymology）」において評価されている。
【００８７】
“ヘアリー／エンハンサ分割因子−１（hairy/enhancer of split-1）”としても知られている“Ｈｅｓ−１”は、細胞死の決定に影響を及ぼす可能性がある転写因子である。
【００８８】
“Ｍｕｓａｓｈｉ−１”は、種を越えて高度に保護されたリボ核酸（ＲＮＡ）結合蛋白質のサブファミリーの要素である。Ｍｕｓａｓｈｉ−１の形質発現は、発達している中央神経系内の増殖性細胞中に高濃度に濃縮されており、腸管細胞内の幹細胞マーカーとされてもよい。
【００８９】
“薬剤担体”とは、哺乳類の細胞移植用の担体としての役割を果たすことができる、生分解性あるいは非生分解性にして、多孔性あるいは非多孔性の基質を意味する。
【００９０】
この明細書で用いられているように“移植”には、人間の患者等の哺乳類内に細胞あるいは細胞の個体群あるいは組織を導入するステップが含まれる。また、“移植”には、薬剤担体に細胞あるいは組織を組み入れるステップと、人間の患者等の哺乳類内に上記担体を移植するステップを含めてもよい。
【００９１】
〔羊水由来細胞の分離〕
この発明の１つの態様では、羊水由来細胞は、複数段階の方法によって分離され、その方法は、
−羊水を分離するステップ、
−上記羊水を遠心分離した後に、上清を除去するステップ、
−増殖培地中に細胞沈殿物を再懸濁させるステップ、
−低酸素環境下で、上記組織および細胞を培養するステップ、
−培地を変更することなく、上記培養物を約５日間〜１０日間、静かに放置するステップ、
−クローニングリングを用いて、形態学的に明瞭なコロニーを分離するステップ、
−分離されたコロニーを増殖培地中で培養するステップ、
−連続希釈してクローン化し、増殖コロニーの元となる単一細胞を同定するステップ、および
−上記クローンを増殖培地中で培養するステップを本質的に含むものである。
【００９２】
他の実施の形態では、羊水由来細胞は、複数段階の方法によって分離され、その方法は、
−羊水を分離するステップ、
−上記羊水を遠心分離した後に、上清を除去するステップ、
−増殖培地中に細胞沈殿物を再懸濁させるステップ、
−正常酸素環境下で、上記組織および細胞を培養するステップ、
−培地を変更することなく、上記培養物を約５日間〜１０日間、静かに放置するステップ、
−クローニングリングを用いて、形態学的に明瞭なコロニーを分離するステップ、
−分離されたコロニーを増殖培地中で培養するステップ、
−連続希釈してクローン化し、増殖コロニーの元となる単一細胞を同定するステップ、および
−上記クローンを増殖培地中で培養するステップを本質的に含むものである。
【００９３】
培養プレートは、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、トロンボスポンジン、胎盤抽出物、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ：登録商標）、テネイシン、ヒト血清あるいはこれらの組み合わせ等の試薬で、予め被覆されてもよい。
【００９４】
所望ならば、羊水を、例えば、羊水細胞で発現した蛋白質マーカーを特異的に認識し、羊水由来細胞を同定しかつ選択し、これにより実質的に精製された羊水由来細胞の個体群を得ることができる、試薬（抗体等）へさらしてもよい。
【００９５】
羊水由来細胞は、アムニオマックス（ＡＭＮＩＯＭＡＸ：商品名）完全培地（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）中で培養されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、チャン（Ｃｈａｎｇ）Ｂ／Ｃ培地（アーバインサイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製）中で培養されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、インスリン・トランスフェリン・セレニウム−Ｘ（ＩＴＳ−Ｘ、米国カリフォルニア州のインビトロゲン社製）、２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）＋２５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補給した低糖ＤＭＥＭ培地中で、培養されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、２０％のノックアウト（ＫＮＯＣＫＯＵＴ：商標）血清置換体（米国カリフォルニア州のインビトロゲン社製）、１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補給したディー・エム・ノックアウト（ＤＭ−ＫＮＯＣＫＯＵＴ：商標）培地（米国カリフォルニア州のインビトロゲン社製）中で、培養されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、２％に規定されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、ＩＴＳ（インスリン・トランスフェリン・セレニウム）、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）、４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および４ｎｇ／ｍＬのデキサメタソンを補給したウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）培地Ｅ中で、培養されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、配合比率１：１のＤＭＥＭ−ＬＧ／ＭＣＤＢ２０１培地に、２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＩＴＳ−Ｘ（インスリン・トランスフェリン・セレニウム−Ｘ）、５５μＭのβｍｅ（メルカプトエタノール）、１００μＭのアスコルビン酸２−リン酸塩、４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）および４ｎｇ／ｍＬのデキサメタゾンを補給した培地中で、培養されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、２０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補給した低糖ＤＭＥＭ培地中で、培養されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補給した低糖ＤＭＥＭ培地中で、培養されてもよい。上記羊水由来細胞は、２％に規定されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＩＴＳ−Ｘ（インスリン・トランスフェリン・セレニウム−Ｘ）、１ｎＭのデキサメタソン、１００ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸塩、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ―ｂｂおよび１００ｍＭの２−メルカプトエタノールを補給した、配合比率１：１の低糖ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１培地中で、培養されてもよい。上記培地には、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、約５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で補給されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、１ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸および０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールを補給した２０％のノックアウト（ＫＮＯＣＫＯＵＴ：商標）血清置換体＋８０％のノックアウト（ＫＮＯＣＫＯＵＴ：商標）ＤＭＥＭ中で、培養されてもよ��。上記培地は、４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を補給したヒトあるいはマウスの胚性線維芽細胞、ヒト骨髄由来間質細胞、あるいはヒト胎盤由来細胞上で、一晩中、調整されてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、２０％に規定されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールを補給した高糖ＤＭＥＭ中で、培養されてもよい。表２は、この発明の羊水由来細胞を培養するのに使用される種々の培地組成を示している。
【００９６】
増殖培地での培養中に、上記羊水由来細胞は、低酸素条件あるいは正常酸素条件下で、培養されてもよい。低酸素条件下では、酸素濃度は、２０％を下回るか、あるいは１０％を下回るか、あるいは５％を下回るが、１％を上回る。
【００９７】
好ましくは、上記培養は、培地を変更することなく、約５日間〜１４日間、静かに増殖培地中で維持されるべきであり、この時点で、上記羊水由来細胞は典型的には、使用されている培養基質に粘着している。この点で、細胞は継代培養されてもよい。
【００９８】
継代培養は、この技術分野における当業者にとって周知のいかなる酵素溶液で実現可能である。この発明の使用に適した酵素溶液の一例は、トリプルエクスプレス（ＴｒｙｐＬＥ−ＥＸＰＲＥＳＳ：商標）（米国カリフォルニア州のインビトロゲン社製）である。
【００９９】
さらに、羊水由来細胞は、この発明の細胞の増殖を刺激する１つまたはそれ以上の試薬を含有する合成の増殖培地中で培養することによって増殖させてもよい。上記因子としては、例えば、ニコチン酸アミド、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３）、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子ＡＡおよび血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板多血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１）、グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）およびグルカゴン様ペプチドＩＩ（ＧＬＰ−ＩＩ）、ＧＬＰ−Ｉ擬似体（mimetobody）、ＧＬＰ−ＩＩ擬似体、エキセンジン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、テストステロン、エストロゲン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩおよびガストリンＩＩ、トリエチレンペンタミン等の銅キレート剤、ＴＧＦ−α、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、酪酸ナトリウム塩、アクチビン、ベータセルリン、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、神経増殖因子、結節（ｎｏｄａｌ）、インスリン・トランスフェリン・セレニウム（ＩＴＳ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ウシ脳下垂体抽出物、小島新生関連蛋白質（ＩＮＧＡＰ）、プロテアゾーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＧＳＫ−３β阻害剤、あるいはこれらの組み合わせを含めてもよい。これに代えて、上記羊水由来細胞は、調整培地中で培養することによって増殖させてもよい。“調整培地”とは、細胞の個体群が細胞培養用基本合成培地中で増殖し、上記培地に可溶性因子を付与するものである。このような用途の一例では、上記細胞が生成する可溶性因子を残したまま、上記細胞が上記培地から除去される。この培地は、その後、異なる細胞の個体群を育成するのに使用される。
【０１００】
ある特定の実施の形態では、上記羊水由来細胞は、標準組織培養プレート上で培養される。これに代えて、培養プレートは、例えば、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ：登録商標）、増殖因子を減少させたマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ：登録商標）、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、テネイシン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、胎盤抽出物、ヒト血清等の細胞外基質蛋白質あるいはこれらの組み合わせで、被覆されてもよい。
【０１０１】
〔分離された羊水由来細胞の特性〕
培養され、あるいは分離された細胞中で蛋白質マーカーおよび核酸マーカーの形質発現を読み取る方法は、この技術分野において通例である。この方法には、逆転写酵素・重合酵素の計量的連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、切片上ハイブリッド形成法（例えば、「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（オスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らにより編集された補遺２００１年）参照）、および材料切片の免疫組織化学的検定法のような免疫検定法、ウェスタンブロット法、無傷細胞中に到達しやすいマーカーを用いた流動細胞計測分析法（ＦＡＣＳ）（例えば、米国ニューヨーク州のコールドスプリングハーバー研究所出版社から１９９８年に発行された研究便覧：ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）による“抗体の使用（Using Antibodies）”参照）が含まれる。
【０１０２】
表３〜５には、ある特定の蛋白質マーカーを検出するのに有用な抗体の例が示されている。表３〜５に示された抗体によって認識される同一のマーカーに向けて誘導される他の抗体も利用可能であるか、あるいは容易に開発できる点が留意されるべきである。上記のような他の抗体も、この発明に従って分離された細胞中のマーカーの形質発現を読み取るために使用可能である。
【０１０３】
この技術分野における当業者にとっては、β細胞系列の細胞特性は周知であり、上記β細胞系列の他の特性の確認を続行する。これらの特性は、この発明に従って分離された羊水由来細胞が分化して上記β細胞系列の細胞特性を獲得したことを確認するのに使用可能である。β細胞系列の特異的な特性は、例えば、ＰＤＸ−１（膵臓および十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、ＮＧＮ−３（ニューロゲニン−３）、Ｈｌｘｂ９、Ｎｋｘ６、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、ニューロ（Ｎｅｕｒｏ）Ｄ、Ｈｎｆｌａ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ３β、Ｍａｆａ、およびその他等、１つまたはそれ以上の転写因子の形質発現を含むものである。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定に関する技術分野において十分に確立されている。例えば、エドルンド（Ｅｄｌｕｎｄ）による文献（「ネイチャー遺伝学概要（Nature Reviews Genetics）」２００２年、第３巻第５２４頁〜第６３２頁）を参照されたい。
【０１０４】
この技術分野における当業者にとっては、腸管細胞系列の細胞特性は周知であり、この系列の他の特性の確認を続行する。これらの特性は、この発明に従って分離された分化羊水由来細胞あるいは未分化羊水由来細胞が腸管細胞系列の特徴的特性の一部を有することを確認するのに使用可能である。腸管細胞系列の特性は、例えば、ＨＥＳ−１（ヘアリー／エンハンサ分割因子−１）、ＮＧＮ−３（ニューロゲニン−３）、Ｐａｘ６、ニューロ（Ｎｅｕｒｏ）Ｄ、Ｍａｔｈ−１、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、およびその他等、１つまたはそれ以上の転写因子の形質発現を含むものである。さらに、消化管細胞は、セクレチン、コレシストキニン、ＧＬＰ−１、ニューロテンシン、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、およびその他等のような、ホルモン類を発現させるものである。これらの転写因子および消化管ホルモンは、腸管細胞の同定に関する従来技術において十分に確立されている。例えば、ショーノフ（Ｓｃｈｏｎｈｏｆｆ）による文献（「内分泌学（Endocrinology）」２００４年、第１４５巻第２６３９頁〜第２６４４頁）。
【０１０５】
この発明の発明者らは、高度の増殖性を有し、胚細胞様の特性を呈し、次のマーカー：ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７あるいはＧＡＴＡ−６のうち、少なくとも１つのマーカーを発現させる羊水由来細胞の個体群を同定し、かつ分離している。特に、この発明に従って分離された羊水由来細胞は、次の蛋白質マーカー：ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーを実質的に欠くことによって、とりわけ特徴付けられる。上記特性を有する羊水由来細胞の個体群とは、この明細書においてＡＦ−Ｉ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託番号ＰＴＡ−６９７５）を意味する。
【０１０６】
上述した増殖条件下では、この発明に従って分離された羊水由来細胞は、次のマーカー：ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７あるいはＧＡＴＡ−６のうち、少なくとも１つのマーカーを発現させる能力を維持しながら、５０回を超える回数の細胞集団倍加数を繰り返して増殖することができる。
【０１０７】
また、この発明の発明者らは、高度の増殖性を有し、胚細胞様の特性を呈するが、次のマーカー：ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーを発現させない羊水由来細胞の個体群を同定し、かつ分離している。特に、この発明に従って分離された羊水由来細胞は、次の蛋白質マーカー：ＣＤ１１７、ＯＣＴ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーを実質的に欠くことによって、とりわけ特徴付けられる。上記特性を有する羊水由来細胞の個体群とは、この明細書においてＡＦ−ＩＩを意味する。
【０１０８】
また、この発明の発明者らは、高度の増殖性を有し、胚細胞様の特性を呈するが、次のすべてのマーカー：ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、あるいはＴｒａ２−５４を発現させない羊水由来細胞の個体群を同定し、かつ分離している。特に、この発明に従って分離された羊水由来細胞は、次の蛋白質マーカー：ＣＤ１１７、ＯＣＴ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーを実質的に欠くことによって、とりわけ特徴付けられる。上記特性を有する羊水由来細胞の個体群とは、この明細書においてＡＦ−ＩＩを意味する。
【０１０９】
また、この発明の発明者らは、高度の増殖性を有し、胚細胞様の特性を呈するが、サイトケラチンと、次のマーカー：ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＣＤ１１７、ＯＣＴ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーとを発現させない羊水由来細胞の個体群を同定し、かつ分離している。特に、この発明に従って分離された羊水由来細胞は、次の蛋白質マーカー：ＣＤ１１７、ＯＣＴ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーを実質的に欠くことによって、とりわけ特徴付けられる。上記特性を有する羊水由来細胞の個体群とは、この明細書においてＡＦ−ＩＩＩを意味する。
【０１１０】
また、この発明の発明者らは、高度の増殖性を有し、胚細胞様の特性を呈するが、次のすべてのマーカー：サイトケラチン、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＣＤ１１７、ＯＣＴ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４を発現させない羊水由来細胞の個体群を同定し、かつ分離している。特に、この発明に従って分離された羊水由来細胞は、次の蛋白質マーカー：ＣＤ１１７、ＯＣＴ−４、あるいはＴＲＡ−２−５４のうち、少なくとも１つのマーカーを実質的に欠くことによって、とりわけ特徴付けられる。上記特性を有する羊水由来細胞の個体群とは、この明細書においてＡＦ−ＩＩＩを意味する。
【０１１１】
図９には、ＡＦ−Ｉ細胞、ＡＦ−ＩＩ細胞およびＡＦ−ＩＩＩ細胞の形質発現プロファイルの概要が示されている。
【０１１２】
この発明の羊水由来細胞は、最終的な内胚葉あるいは膵臓β細胞系列の特性を有する細胞への分化能、あるいは消化管ホルモン産生細胞への分化能を維持しながら、５０回を超える回数の細胞集団倍加数を繰り返して増殖することができる。
【０１１３】
〔羊水由来細胞の分化〕
１つの態様では、この発明は、この発明の増殖された羊水由来細胞を、β細胞系列の特性を有するマーカーを支持する細胞へ分化させることができる組成物を提供するものである。
【０１１４】
他の態様では、この発明は、この発明の増殖された羊水由来細胞を、最終的な内胚葉の特性を有するマーカーを支持する細胞へ分化させることができる組成物を提供するものである。
【０１１５】
他の態様では、この発明は、この発明の増殖された羊水由来細胞を、消化管ホルモン産生細胞の特性を有するマーカーを支持する細胞へ分化させることができる組成物を提供するものである。
【０１１６】
羊水由来細胞の増殖を支持する１つまたはそれ以上の成分が補給された場合における基本合成培地とは、１つまたはそれ以上の増殖因子が分化誘導量で補給された“誘導培地”を意味する。この発明によれば、誘導培地は２０％以下の血清を含有している。１つの実施の形態では、ウシ胎児血清が使用されてもよい。これに代えて、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、すべの哺乳類由来の血清、あるいはアルブミン、ウシアルブミンあるいは、β細胞系列への羊水由来細胞の分化を許容するか、あるいは分化能を高める他の物質と差し替えてもよい。これに代えて、誘導培地は、調整培地であってもよい。
【０１１７】
上記誘導培地に使用されるのに適切な因子としては、例えば、ニコチン酸アミド、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３を含むＴＧＦβファミリーのメンバー、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３）、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子−ＡＡおよび血小板由来増殖因子−ＢＢ、血小板多血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１）、グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）およびグルカゴン様ペプチドＩＩ（ＧＬＰ−ＩＩ）、ＧＬＰ−１擬似体、ＧＬＰ−２擬似体、エキセンジン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩおよびガストリンＩＩ、トリエチレンペンタミン等の銅キレート剤、ＴＧＦ−α、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、酪酸ナトリウム塩、アクチビン、ベータセルリン、インスリン・トランスフェリン・セレニウム（ＩＴＳ）、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、神経突起増殖因子、結節（ｎｏｄａｌ）、バルプロ酸（ｖａｌｐｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、トリコスタチン（ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ）Ａ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−０７ａおよびＷｎｔ−８等のＷｎｔ蛋白質、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ディコフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）蛋白質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、小島新生関連蛋白質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、プロテアゾーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、あるいはこれらの組み合わせを含めてもよい。
【０１１８】
この発明の１つの態様では、増殖因子と、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、ＦＧＦ−５、Ｎ２およびＢ２７（米国カリフォルニア州のギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）、例えば、ソニックヘッジホッグシグナルを阻害するシクロパミン（ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ；米国カリフォルニア州のイー・エムー・ディー（ＥＭＤ）社製）等のステロイドアルカロイド、および例えばＭＧ−１３２（米国カリフォルニア州のイー・エムー・ディー（ＥＭＤ）社製）等のプロテアゾーム阻害剤を含む化学物質との組み合わせは、β細胞系列への羊水由来細胞の分化を支持するために、基本合成培地に補給される。１つの態様では、上記羊水由来細胞は、１０μＭのＭＧ−１３２を含有するＤＭＥＭ（低糖、５．５ｍＭ）から構成された誘導培地中で、１日〜２日間、培養され、その後に、１ＸＢ２７（米国カリフォルニア州のギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）および１ＸＮ２（米国カリフォルニア州のギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）を補給した誘導培地中で、さらに３日〜７日間、培養され、その後に、シクロパミン（１０μＭ；米国カリフォルニア州のイー・エムー・ディー（ＥＭＤ）社製）、塩基性線維芽細胞増殖因子（２０ｎｇ／ｍＬ；ｂＦＧＦ；米国ミネソタ州のアール・エンド・ディー（Ｒ＆Ｄ）システム製）、アクチビンＡ（２０ｎＭ；米国ミネソタ州のアール・エンド・ディー（Ｒ＆Ｄ）システム製）あるいはＦＧＦ−５（２０ｎｇ／ｍＬ；米国ミネソタ州のアール・エンド・ディー（Ｒ＆Ｄ）システム製）を補給した誘導培地中で、さらに５日間、培養される。
【０１１９】
この発明の他の態様では、この発明の羊水由来細胞は、胎仔の原発性発育不全の腸管および膵臓の培養物から分離された調整培地で、それぞれ腸管細胞系列あるいは膵臓細胞系列への更なる分化能を誘導するために、処理可能である。また、上記羊水由来細胞は、ＰＡＮＣ−１、ＣＡＰＡＮ−１、ＢｘＰＣ−３、ＨＰＡＦ−ＩＩ等の膵臓細胞系列、ＨｅｐＧ２等の肝臓細胞系列、および例えばＦＨｓ７４およびＨＳ７３８等の腸管細胞系列由来の調整培地で分化するように誘導されてもよい。これに代えて、この発明の羊水由来細胞は、内胚葉系列への分化を誘導されたヒトあるいはマウスの胚性幹細胞から分離された調整培地で、処理可能である。これらの細胞系列は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション；米国バージニア州）から入手可能である。
【０１２０】
増殖因子の組み合わせおよび濃度、培養期間および他の培養条件は、この技術分野における当業者によって例えば、β細胞系列の細胞特性へ分化した細胞の割合をモニターすることによって、効率的な分化を達成するように最適化可能である。１つまたはそれ以上の増殖因子は、約１週間〜約４週間の期間中にわたって、この発明の羊水由来細胞がβ細胞系列のマーカーを支持する細胞に分化するのを誘導するのに十分な量で添加されてもよい。
【０１２１】
〔この発明の羊水由来細胞の治療用途〕
１つの態様では、この発明は、１型糖尿病患者あるいは同型糖尿病を発症するリスクを負う者を治療する方法を提供するものである。この方法は、羊水由来細胞を分離し培養するステップと、分離された細胞の個体群を増殖するステップと、上記培養細胞を試験管内でβ細胞系列に分化させるステップと、上記分化細胞を直接あるいは薬剤担体内に含めた形態で、患者内に移植するステップを含むものである。適切な場合には、患者は、移植細胞の生存および機能に役立つ薬剤すなわち生理活性因子で、さらに治療可能である。上記薬剤としては、例えば、インスリン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を含むＴＧＦβファミリーのメンバー、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３）、線維芽細胞増殖因子−１および線維芽細胞増殖因子−２、血小板由来増殖因子ＡＡおよび血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板多血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、エンドセリン、およびその他を含めてもよい。他の薬剤配合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）、グルカゴン様ペプチドＩＩ（ＧＬＰ−ＩＩ）、ＧＬＰ−Ｉ擬似体、ＧＬＰ−ＩＩ擬似体、エキセンジン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国出願公開２００４／０２０９９０１および米国出願公開２００４／０１３２７２９に開示された化合物等のＭＡＰＫ阻害剤を含めることができる。
【０１２２】
さらに他の態様では、この発明は、２型糖尿病患者あるいは同型糖尿病を発症するリスクを負う者を治療する方法を提供するものである。この方法は、この発明による羊水由来細胞を分離し培養するステップと、分離された細胞の個体群を増殖するステップと、上記培養細胞を試験管内でβ細胞系列に分化させるステップと、上記分化細胞を直接あるいは薬剤担体内に含めた形態で、患者内に移植するステップを含むものである。
【０１２３】
さらに他の実施の形態では、この発明の羊水由来細胞は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはグリセロールを含有する市販の培地を用いて、凍結保存されてもよい。凍結保存された細胞は、必要とされるまで、液体窒素保存容器の気相中に保存されてもよい。
【０１２４】
さらに他の実施の形態では、この発明の羊水由来細胞は、この羊水由来細胞の生存力を高めるか、あるいは上記羊水由来細胞の膵臓β細胞系列への分化を誘導するために、同種あるいは異種の動物の成熟膵島を移植されてもよい。
【０１２５】
治療中の患者に対して供給される細胞の供給源であって、当該細胞が分離される羊水は、自己由来であってもよい。これに代えて、供給源は、同種由来あるいは異種由来であってもよい。また、患者に投与されるべき細胞は、増殖能および／または分化能を高めるか、あるいは免疫的拒絶反応のリスクを防止するか、あるいは低減するように、遺伝子的に変性されてもよい。これに代えて、この発明に従って得られた羊水由来細胞は、この発明に従って調製された分化細胞を移植する前に、被移植者の免疫反応を調節するのに使用可能である。例えば、米国特許第６，３２８，９６０号および米国特許第６，２８１，０１２号を参照されたい。
【０１２６】
この発明の羊水由来細胞は、被移植者への移植前に、インスリン産生細胞に分化されてもよい。特定の実施の形態では、この発明の羊水由来細胞は、被移植者への移植前に、β細胞に完全に分化される。これに代えて、この発明の羊水由来細胞は、未分化状態あるいは部分的分化状態で、被移植者へ移植されてもよい。更なる分化は、被移植者の体内で生じる可能性がある。
【０１２７】
この発明の羊水由来細胞は、遺伝子的に変性されてもよい。例えば、上記羊水由来細胞は、例えばＰＤＸ−１あるいはインスリン等のβ細胞系列の細胞特性を有するマーカーを過剰に発現させるように改良されてもよい。上記羊水由来細胞は、いかなる適切な対象遺伝子を過剰に発現させるように改良されてもよい。さらに、上記羊水由来細胞は、ＭＡＴＨ−１等の腸管細胞の特性を有するマーカーを過剰に発現させるように改良されてもよい。これに代えて、この発明の羊水由来細胞は、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）発現細胞の個体群に分化し、さらに、この個体群が糖感受性のインスリン産生細胞の個体群となるように、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）プロモータの支配下でインスリン遺伝子で変性してもよい。この発明の羊水由来細胞を遺伝的に変性するのに有用な技術は、例えば、細胞生物学の標準的な教科書および検討書中で検索可能である。分子遺伝学および遺伝子工学における方法は、例えば、「分子クローニング」：研究マニュアル第２版（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らによる。１９８９年）；「オリゴヌクレオチド合成」（エム・ジェイ・ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編。１９８４年）；「動物細胞培養」（アール・アイ・フレッシュネイ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編。１９８７年）；「酵素学の方法シリーズ」（アカデミック出版社）；「哺乳類細胞の遺伝子転写ベクター」（アイ・エム・ミラー（Ｉ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ）およびエム・ピー・カロス（Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ）編。１９８７年）；「分子生物学の最新プロトコルおよび分子生物学の簡略プロトコル」第３版（エフ・エム・オスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集。１９８７年および１９９５年）；および「ＤＮＡ組換え方法ＩＩ」（アール・ウー（Ｒ．Ｗｕ）編。アカデミック出版社。１９９５年）に記述されている。
【０１２８】
対象遺伝子をコード化する核酸分子は、宿主の羊水由来細胞のゲノム中に安定に組み込まれてもよく、あるいは上記核酸分子は、ベクターあるいはプラスミド等の染色体外分子として存在してもよい。このような染色体外分子は、自己複製されてもよい。この明細書で用いられている用語“形質移入”とは、宿主の羊水由来細胞中に異種の核酸を導入するプロセスを意味する。
【０１２９】
未分化状態あるいは他の状態の細胞は、分散された細胞として、あるいは肝門脈中に注入可能な塊となった細胞として使用されてもよい。これに代えて、上記細胞は、生体適合性で生分解性の重合支持体、多孔性で非生分解性の装置、あるいは宿主の免疫反応から保護するようにカプセル内に配されてもよい。上記細胞は、被移植者の体内の適切な部位に移植されてもよい。移植部位としては、例えば、肝臓、生来の膵臓、腎臓被膜下腔、網（腹膜の襞）、腹膜、漿膜下腔、腸管、胃あるいは皮下嚢を含むものである。
【０１３０】
移植細胞の更なる分化能、生存力あるいは活性を高めるためには、増殖因子、抗酸化剤あるいは抗炎症剤等の付加的な因子は、細胞の注入前に、注入と同時に、あるいは注入後に、投与可能である。ある特定の実施の形態では、増殖因子は、生体体に注入された細胞を分化させるのに用いられる。上記因子を、内在性の細胞によって分泌可能であり、元の位置に注入された羊水由来細胞にさらすことができる。移植された羊水由来細胞を、この技術分野において公知の増殖因子であって、内在性の増殖因子と、注入された外来性の増殖因子とのいかなる組み合わせによって分化するように誘導可能である。
【０１３１】
移植に使用される細胞の投与量は、患者の容態および上記治療に対する感受性を含む多くのファクターに依存しており、この技術分野における当業者によって決定可能である。
【０１３２】
１つの態様では、この発明は、糖尿病患者あるいは糖尿病を発症するリスクを負う者を治療する方法を提供するものである。この方法は、この発明による羊水由来細胞を分離し培養するステップと、分離された細胞の個体群を増殖するステップと、上記培養羊水由来細胞を試験管内でβ細胞系列に分化させるステップと、上記分化細胞を三次元支持体に組み入れるステップを含むものである。この分化細胞は、患者への移植前に、試験管内の上記支持体上で維持可能である。これに代えて、上記分化細胞を含有する上記支持体は、試験管内で、付加的な培養をすることなく、直接、患者の体内に移植可能である。この支持体は、任意に、移植細胞の生存および機能に役立つ少なくとも１つの薬剤に組み入れることができる。
【０１３３】
この発明の目的に適した使用に供される支持体材料としては、組織修復に有用な組織テンプレート、導管、バリアおよびレザバーを含むものである。特に、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織布構造の形態を有する材料であって、生物学的組織を再構築あるいは再生するばかりでなく、組織の成長を誘導する走化性因子を送出するのに試験管内および生体内で使用されてきた合成材料および天然材料は、この発明の方法の実施に使用するのに適している。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、米国特許第６，０２２，７４３号、米国特許第５，５６７，６１２号、米国特許第５，７５９，８３０号、米国特許第６，６２６，９５０号、米国特許第６，５３４，０８４号、米国特許第６，３０６，４２４号、米国特許第６，３６５，１４９号、米国特許第６，５９９，３２３号、米国特許第６，６５６，４８８号および国特許第６，３３３，０２９号に開示された材料を参照されたい。この発明において使用に適したポリマー材料の例は、米国出願公開２００４／００６２７５３および米国特許第４，５５７，２６４号に開示されている。
【０１３４】
薬剤を組み入れた支持体を形成するために、薬剤は、上記支持体を形成する前に、ポリマー溶液と混合可能である。これに代えて、薬剤は、好ましくは薬剤担体の存在下で、形成された支持体上に被覆されてもよい。薬剤は、液体、微細に分割された固体、あるいは他のいかなる適切な物理的形態を呈してもよい。これに代えて、支持体には、薬剤の放出速度を変更する賦形剤が添加されてもよい。他の実施の形態では、支持体には、例えば、米国特許第６，５０９，３６９号に開示された物質等の抗炎症剤である、少なくとも１種の薬剤配合物が組み入れられている。
【０１３５】
１つの実施の形態では、支持体には、例えば、米国特許第６，７９３，９４５号に開示された物質等の抗アポトーシス剤である、少なくとも１種の薬剤配合物が組み入れられている。
【０１３６】
他の実施の形態では、支持体には、例えば、米国特許第６，３３１，２９８号に開示された物質等の線維形成阻害剤である、少なくとも１種の薬剤配合物が組み入れられている。
【０１３７】
他の実施の形態では、支持体には、例えば、米国出願公開２００４／０２２０３９３および米国出願公開２００４／０２０９９０１に開示された物質等、血管形成能を高めることができる、少なくとも１種の薬剤配合物が組み入れられている。
【０１３８】
さらに他の実施の形態では、支持体には、例えば、米国出願公開２００４／０１７１６２３に開示された物質等の免疫抑制剤である、少なくとも１種の薬剤配合物が組み入れられている。
【０１３９】
他の実施の形態では、支持体には、例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を含むＴＧＦβファミリーのメンバー、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３）、線維芽細胞増殖因子−１および線維芽細胞増殖因子−２、血小板由来増殖因子ＡＡおよび血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板多血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、エンドセリン、およびその他の物質等の増殖因子である、少なくとも１種の薬剤配合物が組み入れられている。他の薬剤配合物には、例えば、ニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチドＩ（ＧＬＰ−Ｉ）、グルカゴン様ペプチドＩＩ（ＧＬＰ−ＩＩ）、ＧＬＰ−Ｉ擬似体、ＧＬＰ−ＩＩ擬似体、エキセンジン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４、結節（ｎｏｄａｌ）、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロビン由来ペプチド、カテリチジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）、ディフェンシン、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチン等、粘着性細胞外基質蛋白質の細胞結合ドメインおよびヘパリン結合ドメインを含む生物学的ペプチド、例えば米国出願公開２００４／０２０９９０１および米国出願公開２００４／０１３２７２９に開示された化合物等のＭＡＰＫ阻害剤を含めることができる。
【０１４０】
この発明の羊水由来細胞の骨格への組み入れは、骨格上に細胞を単純に付着させることによって、実現可能である。細胞は、単純な拡散によって骨格内に導入可能である（ジェイ・ペディアール（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ）による「外科学」１９８８年、第２３（１、パート２）巻第３頁〜第９頁）。細胞播種の効率を高める他のいくつかの取り組みが開発されている。例えば、ポリグリコール酸骨格上に軟骨細胞を播種するのに、撹拌フラスコが使用されている（最新バイオテクノロジー１９９８年、第１４（２）巻第１９３頁〜第２０２頁）。細胞を播種するための他の取り組みとしては、播種細胞への負荷を最小にし、かつ播種効率を高める効果を与える遠心分離の利用がある。例えば、ヤン（Ｙａｎｇ）らは、遠心分離的細胞固定化方法（ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種法を開発した（生医学材料研究誌（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．）２００１年、第５５（３）巻第３７９頁〜第３８６頁）。
【０１４１】
さらに、この発明は、次の実施例によって示されるが、これら実施例によって限定されるものではない。
【０１４２】
〔実施例１：ヒト羊水由来細胞系列の樹立〕
この発明の羊水由来細胞を分離するのに使用される羊水を、通常、妊娠期間の１６週〜２２週で実行される、胎仔の核型分析用の羊水穿刺法により得られたサンプルから採取した。図１には、上記羊水由来細胞を分離するのに使用される、複数の段階を踏む方法が概略的に示されている。上記羊水を７分間、重力の４００倍の遠心力で遠心分離し、上清を除去した。この結果として得られた細胞沈殿物を、この発明に使用される上記羊水サンプル用の表３〜５に表示された増殖培地中に再懸濁させた。上記細胞を、コラーゲンＩＶ型（１００ｍｍプレート当たりの１ｍｇ）、あるいはコラーゲンＩ型（１ｃｍ2当たりの１μｇ）、ビトロネクチン（１ｍＬ当たりの１０μｇ）あるいはフィブロネクチン（１ｍＬ当たりの１０μｇ）のいずれかを被覆したプレート上で培養した。羊水サンプルから得られた細胞は、大きなバラツキ（１サンプル当たりの細胞数：８，０００〜３００，０００個）を有しており、一部のサンプルには、かなりの数の血球が混入していた。上記培養物を、低酸素条件（酸素濃度：３％）下で、少なくとも５日間〜１０日間、静かに放置した。平行して、培養物を正常酸素条件下で、上記同様の条件で培養した。次に、上記培養物を上記増殖培地と同一の培地に添加し、７０％〜８０％の培養飽和密度（confluency）に達するまで培養した。この段階の細胞を“Ｐ０”と呼ぶものとする。培養物の一部では、細胞コロニーをクローニングリングで分離し、異なる培養プレートで継代培養した。形態学的に明瞭なコロニーは、線維芽細胞（Ｆ）、羊水細胞（ＡＦ）および上皮細胞（Ｅ）の特性を有する形態で存在していた（図２）。“トリプルエクスプレスＴｒｙｐＬＥ−ＥＸＰＲＥＳＳ（商標）”（インビトロゲン社製）を用いて、上記Ｐ０から細胞を放出させ、この細胞を、種々の濃度（１ｃｍ2当たりの細胞数：５０〜１０，０００個）で、フィブロネクチン、ビトロネクチンあるいはコラーゲンＩＶ型を被覆したフラスコ／皿／プレートに播種した。連続希釈クローン化処理に、上記Ｐ０細胞の一部を使用した。最速で増殖する細胞の細胞集団倍加時間は、継代初期で、約２４時間であった。種々の培地条件（表２）下で培養された増殖細胞を、細胞表面マーカー（表３〜５）で分析した。細胞は、典型的には培養飽和密度７０％まで分裂し、１ｃｍ2当たりの細胞数１００〜１０，０００個で、再度、播種した。細胞増殖の種々の段階で、リボ核酸（ＲＮＡ）を採集し、胚性および胚葉マーカー（表９）で分析した。
【０１４３】
この発明の羊水由来細胞は、種々の妊娠期間で存在していた。表１０は、妊娠期間の１７週〜４１週で採取した羊水サンプル中に、羊水細胞（ＡＦ）、線維芽細胞（Ｆ）および上皮細胞（Ｅ）の形態の存否を示している。
【０１４４】
また、この発明の羊水由来細胞を、満期分娩時（妊娠期間の約４０週）に得られた羊水から採取した。羊水サンプルを３８週〜４０週の分娩時に採取し、上記プロトコルに従って培養した。結果として得られた粘着細胞の固体群は、妊娠期間の１６週〜２２週で分離された細胞の特性に非常に類似する特性を呈した。
【０１４５】
〔実施例２：この発明の羊水由来細胞のクローン増殖〕
実施例１で記述された方法で、羊水細胞（ＡＦ）様の形態を有する細胞を、クローニングリングを用いてＰ０培養物から得た。表面受容体、細胞骨格蛋白質および転写因子について異なる発現性を示す３つの明瞭な細胞固体群を同定した。簡略化のために、上記固体群を、ＡＦ−Ｉ細胞、ＡＦ−ＩＩ細胞およびＡＦ−ＩＩＩ細胞と呼ぶ。次の実施例では、ＡＦ−Ｉ細胞、ＡＦ−ＩＩ細胞およびＡＦ−ＩＩＩ細胞の各個体群の差異を明確にする。
【０１４６】
〔実施例３：蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による分析〕
トリプルエクスプレス（ＴＲＹＰＬＥ（商標）−ｅｘｐｒｅｓｓ）発現溶液（米国カリフォルニア州のギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）で５分間、培養することによって培養プレートから接着細胞を取り出した。この取り出された細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ダルベッコ調製イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に再度、懸濁させ、かつ遠心分離後に、洗浄および、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％のアジ化ナトリウム（米国ミズーリ州のシグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を含有させた染色緩衝液中への再度の懸濁によって、上記細胞を回収した。適切な場合には、０．１％のγ―グロブリン（米国ミズーリ州のシグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）溶液を１５分間用いて、上記細胞のＦｃ（免疫グロブリン結晶化可能断片）受容体を阻害した。アリコート（細胞数：約１０5個）を、表３に示されているように、フィコエリトリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｒｉｎ）（ＰＥ）あるいはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）のいずれかを接合したモノクローナール抗体（細胞数１０6個当たりの抗体量５μＬ）あるいは未接合型の一次抗体と共に培養した。対照区には、アイソタイプが適切に適合した抗体、非染色細胞、および接合型の二次抗体のみが染色された細胞を含めた。すべての抗体との細胞培養を、４℃、３０分間、実行したのち、上記細胞を染色緩衝液で洗浄した。未接合型の一次抗体で染色した細胞サンプルについては、接合型のフィコエリスリン（ＰＥ）あるいはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識二次抗体と共に、さらに４℃、３０分間、培養した。使用した二次抗体の記載に関しては表４を参照されたい。洗浄された細胞を顆粒化し、染色緩衝液中に再度、懸濁させ、蛍光標示式細胞分取器アレイ（ＦＡＣＳＡｒｒａｙ：ビー・ディー・バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製）で、少なくとも１０，０００件の事象を収集することによって、細胞表面分子を同定した。
【０１４７】
細胞内染色については、まず、４％のパラホルムアルデヒドで、１０分間、細胞を固定した後、染色緩衝液で２回洗浄し、細胞を遠心分離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に０．５％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を含有させた透過処理用緩衝液中に、室温（ＲＴ）で、５分間、上記細胞を再度、懸濁させた。浸透化させた細胞を、水洗用緩衝液で２回洗浄し、遠心分離し、上記染色緩衝液中に再度、懸濁させ、適切な接合型の抗体（細胞数１０6個当たりの抗体量５μＬ）と共に、４℃、３０分間、培養した。未接合型の一次抗体で染色した細胞サンプルについては、接合型のフィコエリスリン（ＰＥ）あるいはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識二次抗体（表４）と共に、さらに４℃、３０分間、培養した。洗浄された細胞を顆粒化し、染色緩衝液中に再度、懸濁させ、蛍光標示式細胞分取器アレイ（ＦＡＣＳＡｒｒａｙ：ビー・ディー・バイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製）で、少なくとも１０，０００件の事象を収集することによって、内部蛋白質を同定した。表６および表７には、検査した細胞表面マーカーおよび細胞内部マーカーの発現レベルが記載されている。蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による分析では、羊水細胞（ＡＦ−Ｉ、ＡＦ−ＩＩおよびＡＦ−ＩＩＩ）、線維芽細胞（Ｆ）および上皮細胞（Ｅ）を識別する特性を有するマーカーを同定することができた（図３〜図５）。表８には、満期分娩時（３８週〜４０週）の羊水から分離したＡＦ−Ｉ細胞の細胞表面発現プロファイルが示されている。細胞表面受容体の発現レベルは、１６週〜２２週の羊水から分離したＡＦ−Ｉ細胞に非常に類似している。
【０１４８】
〔実施例４：未分化細胞の免疫染色〕
実施例１によって培養した細胞（１ｃｍ2当たりの細胞数：１０，０００個）を、ガラス製の底部を有する３５ｍｍ径マイクロウェル皿（米国マサチューセッツ州のマテック（Ｍａｔｅｋ）社製）の種々の増殖培地上に播種した。培養３日後に、４％のパラホルムアルデヒドで、１０分間、上記細胞を固定した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、さらに、０．５％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を含有させた透過処理用緩衝液を５分間、室温（ＲＴ）で添加し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で、さらに３回洗浄した。固定され、透過処理された細胞を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）あるいは二次抗体が生成される種（ヤギ、ロバあるいはウサギ）から得られた４％の血清のいずれかで、阻害した。対照区サンプルには、一次抗体を省いた反応生成物、あるいは一次抗体をこの一次抗体に対応する免疫グロブリンに、上記一次抗体と同一の濃度で、置き換えた反応生成物を含めた。染色されたサンプルを、染色された核を計数するためにジアミジノ−２−フェニルインドール、ニ塩化水素化物（ＤＡＰＩ）を含有するプロロング（ＰＲＯＬＯＮＧ：登録商標）抗退色性試薬（米国カリフォルニア州のインビトロゲン社製）で洗浄した。ニコン共焦エクリプスＣ−１型反転顕微鏡（日本国のニコン社製）および１０倍〜６０倍の対物レンズで、細胞画像を得た（図６〜図８）。
【０１４９】
〔実施例５：未分化細胞の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）分析〕
増殖培地中で培養した細胞からリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出した。ヒト膵臓、肝臓、脳、消化管（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製）、ＮＴＥＲＡ細胞（ヒト胚性癌腫細胞系列；ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション））、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）、およびヒト気道上皮細胞（ケンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社製）由来の全リボ核酸（ＲＮＡ）を、陽性対照区として用いた。骨髄由来間葉細胞（米国メリーランド州のケンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社製）を、膵臓発達過程に含まれる鍵遺伝子の発現性に関して陰性となる対照区として用いた。
【０１５０】
［リボ核酸（ＲＮＡ）の抽出、精製、および相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）の合成］
リボ核酸（ＲＮＡ）サンプルを、エタノール含有高塩緩衝液の存在下で、シリカゲル膜（米国カリフォルニア州のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製のルナシー（Ｒｎｅａｓｙ）ミニキット）との結合によって精製すると同時に、異物を洗浄除去した。カラムに結合した状態のリボ核酸（ＲＮＡ）サンプルを、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）で１５分間、処理することによって、さらに精製した。その後に、高純度のリボ核酸（ＲＮＡ）を水中に溶出させた。収量および純度を、分光光度計のＡ２６０（２６０ｎｍ吸収セル）およびＡ２８０（２８０ｎｍ吸収セル）の測定値によって推定した。相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）の複製を、エイ・ビー・アイ（米国カリフォルニア州のエイ・ビー・アイ（ＡＢＩ）社製）高容量相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）アーカイブキット（ABI high capacity cDNA archive kit）で、精製リボ核酸（ＲＮＡ）から作製した。
【０１５１】
〔リアルタイムの重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅および定量分析〕
他に述べない限り、すべての試薬をアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社から入手した。エイ・ビー・アイ・プリズム（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ：登録商標）品番７０００配列検出システムで、リアルタイムの重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を実行した。全反応液量を２０μＬとして２０ｎｇの逆転写型リボ核酸（ＲＮＡ）と共に、タクマン（ＴＡＱＭＡＮ：登録商標）ユニバーサル・ピー・シー・アール・マスター・ミックス（ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ：登録商標）（米国カリフォルニア州のエイ・ビー・アイ（ＡＢＩ）社製）を用いた。ピペット操作ミスを訂正するために、各相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）サンプルについて控えをとって実行した。反応開始剤およびタクマン（ＴＡＱＭＡＮ：登録商標）のＦＡＭ標識プローブを２００ｎＭの濃度で使用した。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の予備培養型１８Ｓリボソームリボ核酸（ＲＮＡ）あるいはヒト・グリセルアルデヒド−３−リン酸・デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照キットで、各標的遺伝子の発現レベルを標準化した。反応開始剤およびプローブについては、エイ・ビー・アイ・プリズム・プライマー・エクスプレス（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ：商品名）ソフトウエアで設計するか、あるいはエイ・ビー・アイ（ＡＢＩ）社製の予備培養型遺伝子分析キットを用いた。各遺伝子に関して、エクソンと境界部分との距離（spanning)となるように、反応開始剤あるいはプローブのいずれか一方を設計した。この設計は、反応開始剤／プローブが、存在するいかなるゲノム・デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に結合する可能性を無くした。反応開始剤とプローブとのセットとしては、次の組み合わせ：Ｎｋｘ２．２（Ｈｓ００１５９６１６）、Ｐｄｘ−１（Ｈｓ００４２６２１６）、Ｎｋｘ６．１（Ｈｓ００２３２３５５）、Ｎｇｎ３（Ｈｓ００３６０７００）、Ｐａｘ４（Ｈｓ００１７３０１４）、Ｐａｘ６（Ｈｓ００２４０８７１）、インスリン（Ｈｓ００３５５７７３）、Ｇｌｕ２（Ｈｓ００１６５７７５）、グルカゴン（Ｈｓ００１７４９６７）、Ｉｓｌ−１（Ｈｓ００１５８１２６）、ソマトスタチン（Ｈｓ００１７４９４９）、ＦｏｘＡ２（ＨＮＦ３β）（Ｈｓ００２３２７６４）、ＨｌｘＢ９（Ｈｓ００２３２１２８）、ＧＡＴＡ−４（Ｈｓ００１７１４０３）、ＨＮＦ１β（Ｈｓ００１７２１２３）、Ｍｕｓａｓｈｉ同族体−１（Ｍｓｉ−１）（Ｈｓ００１５９２９１）、Ｈｅｓ−１（Ｈｓ００１７２８７８）、ニューロテンシン（ＮＴＳ）（Ｈｓ００１７５０４８）、コレシストキニン（Ｈｓ００１７４９３７）、ＡＦＰ（Ｈｓ００１７３４９０）、セクレチン（Ｈｓ００３６０８１４）、ＧＩＰ（Ｈｓ００１７５０３０）、ＧＦＡＰ（Ｈｓ００１５７６７４）、ＭＡＰ２（Ｈｓ００１５９０４１）、Ｏｌｉｇ２（Ｈｓ００３７７８２）、Ｏｃｔ−４（ＣＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＧ（配列識別番号１））およびＯｃｔ−４（ＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＡ  ＴＴＣＣＴＡ（配列識別番号２））；Ｒｅｘ−１（ＣＡＧＡＴＣＣＴＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＣＡＧＡＡＴ（配列識別番号３））およびＲｅｘ−１（���ＣＧＴＡＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＣＴＣＣＡＧＡ（配列識別番号４））；Ｓｏｘ−１７（ＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡ（配列識別番号５））、Ｓｏｘ−１７（ＡＧＣＧＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＧ（配列識別番号６））、Ｓｏｘ−１７（ＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＧＧＣＧ（配列識別番号７））、ＡＢＣＧ−２（ＧＴＴＴＡＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧ（配列識別番号８））およびＡＢＣＧ−２（ＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧ（配列識別番号９））、Ｓｏｘ２（ＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＴＧＡ（配列識別番号１０））およびＳｏｘ２（ＣＴＴＴＴＧＣＡＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＴＴ（配列識別番号１１））として記載されている。残りの反応開始剤を、ＰＲＩＭＥＲＳプログラムソフトウエア（米国カリフォルニア州のエイ・ビー・アイ（ＡＢＩ）社製）で設計し、表９中に記載した。上記サンプルについて、当初５０℃で２分間、９５℃で１０分間処理した後に、９５℃で１５秒間の変性ステップと、６０℃で１分間の焼鈍／伸張ステップを４０回、繰り返した。ジーンアンプ（ＧＥＮＥＡＭＰ：登録商標）品番７０００配列検出システムソフトウエアで、データ分析を実行した。各反応開始剤／プローブセットに関して、蛍光強度が指数増幅領域の中間にある特異値に到達した周期数として、Ｃt値を求めた。形質発現の相対レベルを、比較Ｃt法で算出した。簡単に言えば、各相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）サンプルについては、内在性対照区のＣt値を、対象遺伝子のＣt値から差し引いて、ΔＣt値（ΔＣt）を得た。１００％の効率で増幅すると仮定して、対象遺伝子の標準量を２-ΔCtとして算出した。最終データを較正サンプルの相対値として示した。上記比較Ｃt法は、仮に対象区および内在性対照区の増幅効率が略等しい場合にのみ、有効とされている。したがって、反応開始剤／プローブのセット毎に、連続的に希釈した相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）サンプルを増幅し、上記ΔＣt値を確認することによって、予備実証実験を実行した。上記ΔＣt値は、仮に増幅効率が等しい場合には、希釈範囲を超えて一定となるはずである（表９）。
【０１５２】
〔実施例６：細胞集団倍加時間〕
実施例１により分離し、かつ増殖した継代数６の羊水細胞（ＡＦ−Ｉ型）を、２４ウェル組織培養プレート（米国マサチューセッツ州のコーニング社製）における培地番号１１の増殖培地に１ウェル当たり細胞数１０，０００個で播種した。トリプルエクスプレス（ＴＲＹＰＬＥ（商標）−ＥＸＰＲＥＳＳ）発現溶液（米国カリフォルニア州のインビトロゲン（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）社製）で、上記プレートの３つのウェルから細胞を除去し、グアバ（Ｇｕａｖａ）ＰＣＡ−９６細胞分析システムおよびビアカウント（ＶＩＡＣＯＵＮＴ：登録商標）試薬（米国カリフォルニア州のグアバ（Ｇｕａｖａ）社製）で、細胞を計数した。図１０は、低酸素条件（酸素濃度：３％）下で、培養した継代数６の細胞の増殖曲線を示している。対数グラフの直線部分で、上記細胞の細胞集団倍加時間を推定した。継代数６の細胞の細胞集団倍加時間は３１時間であった。
【０１５３】
上記３つの細胞個体群（線維芽細胞、羊水細胞および上皮細胞形態）の増殖能を、長期間培養で比較した。図１１は、５番培地中で培養したＡＦ−Ｉ細胞、ＡＦ−ＩＩ細胞、ＡＦ−ＩＩＩ細胞、Ｆ細胞およびＥ細胞の増殖能を示している。Ｆ（“線維芽細胞性”羊水由来）細胞および羊水（ＡＦ）細胞が５０回を超える回数の細胞集団倍加を繰り返して増殖することができ、かつ細胞（移植）治療用の供給源であることを示していることは明らかである。
【０１５４】
［実施例７：ＡＦ−Ｉ細胞のテロメア長］
末端ＴＡＧＧＧテロメア長検定法（米国インディアナ州のロッシュ社製）を用い、その製造者の指示に従って、限定された回数で行う連続希釈処理によって、単一細胞から分離したＡＦ−Ｉ細胞系列のテロメア長を継代数１２（１継代当たり細胞集団倍加：約５０回）で分析した。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ−ＬＧ培地で培養した細胞およびアムニオマックス（Ａｍｎｉｏｍａｘ（商標）；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製）培地で培養した細胞について、テロメア長を分析した（図１２参照）。胚性癌腫細胞系列（ＮＴＥＲＡ細胞）由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を陽性の対照区とした。
【０１５５】
〔実施例８：核型分析〕
複数のドナーから分離した継代数８〜１０（１継代当たり細胞集団倍加：約３０回）のＡＦ細胞の核型を、Ｇバンド染色検定法によって確認した。５つの核型が調製し、細胞遺伝学的分析では、上記細胞が常染色体を有し、形式上、染色体数４６を有していることが示された。また、分析された全細胞は、胎仔起源を裏付けるＸ染色体およびＹ染色体を含有していた。図１３は、妊娠期間の１６週〜２２週のドナーから採取した羊水から分離された羊水由来細胞（ＡＦ−Ｉ細胞、ＡＦ−ＩＩ細胞およびＡＦ−ＩＩＩ細胞）の核型を示している。
【０１５６】
〔実施例９：満期分娩時の羊水由来のＡＦ細胞の増殖能〕
図１４は、満期分娩時（約３８週まで）の羊水由来であって５番培地で培養したＡＦ−Ｉ細胞形態の増殖能を示している。この増殖能は、１６週〜２２週で採取した羊水から分離したＡＦ−Ｉ細胞の増殖能に非常に類似している。
【０１５７】
〔実施例１０：線維芽細胞、上皮細胞および羊水細胞の形態に関するマイクロアレイ分析〕
ルナシー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製）で、継代数９〜１１の線維芽細胞性羊水由来細胞（Ｆ細胞）、上皮性羊水由来細胞（Ｅ細胞）、羊水由来羊水細胞（ＡＦ−Ｉ細胞系列、ＡＦ−ＩＩ細胞系列およびＡＦ−ＩＩＩ細胞系列）および満期分娩時の羊水（ＡＦ  ｔｅｒｍ）から全リボ核酸（ＲＮＡ）を分離した。コードリンク（Ｃｏｄｅｌｉｎｋ（商標））システム（米国ニュージャージー州のアメルシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社ジー・イー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）部門製）に従って、サンプル調製、ハイブリダイゼーションおよび画像分析を実行した。コードリンク（Ｃｏｄｅｌｉｎｋ（商標））ヒト・ホール・ゲノム・アレイ（Codelink Human Whole Genome arrays）を用いた。このアレイは、標的遺伝子の転写部分の端から端までのエクソンを保存するように設計された約５５０００３０の部分プローブから構成されている。チップは４５０００までの非反復単一遺伝子識別番号（unique Unigene IDs）を含むものである。標準化および対数変換に続けて、オムニビズ（ＯｍｎｉＶｉｚ：登録商標）ソフトウエア（米国マサチューセッツ州のマテック（Ｍａｔｅｋ）社製）およびジーンシフター（ＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ：米国ワシントン州のビズエックスラボズ（ＶｉｚＸＬａｂｓ）社製）で、データ分析を実行した。標準化サンプルの歪みに伴う変換の分散安定化を対数変換型アレイデータセットに適用した。ピアソン相関係数で、各細胞系列内および異種細胞系列間での変動を比較した。分析されたすべてのサンプルに関しては、細胞系列内の相関係数は、細胞系列間の相関係数と比較して高くなった。図１５には、細胞系列間の相関係数に伴う異種細胞型間の遺伝子発現プロファイルの変動が示されている。変動分析およびＰ値を０．０５以下に調整（ベンジャミニ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ）およびホックベルグ（Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）補正）したＦ検定で、遺伝子発現における細胞型間の顕著な差異を求めた。表１１〜表１７は、種々の細胞型間で、少なくとも５倍の分化的な発現性を呈する遺伝子を示している。
【０１５８】
［実施例１１：腸管様細胞への細胞分化］
ＡＦ−Ｉ細胞系列で継代数１４のＡＦＣＡ００７クローンＡを、１ｃｍ2当たりの細胞数１０，０００個で、アムニオマックス（ＡＭＮＩＯＭＡＸ（商標））完全培地中で培養した。培養飽和密度時に、上記細胞を、アムニオマックス（ＡＭＮＩＯＭＡＸ：商品名）完全培地中に１日当たり１０μＭのレチノイン酸（ＲＡ）を投与して、２週間、さらに処理した。リボ核酸（ＲＮＡ）を１４日目に採集し、消化管ホルモン（セクレチン、ニューロテンシン、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、コレシストキニン、ソマトスタチンおよびガストリン）の形質発現を、実施例４に説明されているようなリアルタイムの重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で推定した。ΔΔＣ1法で相対的な発現レベルを推定するのに腸管リボ核酸（ＲＮＡ）（Ambion）を用いた。表１８は、処理済みサンプルおよび未処理サンプルにおける消化管ホルモンのＣ1値および相対的発現レベルを示している。表１８に示されているように、レチノイン酸（ＲＡ）の添加は消化管ホルモンの発現を高めた。
【０１５９】
〔実施例１２：複数の内分泌細胞系列への細胞分化〕
継代数８のＡＦＣＡ００７クローンＡ（ＡＦ−Ｉ細胞系列）由来の細胞を、１％増殖因子低減型マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ：登録商標）基質（米国カリフォルニア州のベクトン・ディキンソン社製）を含むコラーゲン型Ｉ（ベクトン・ディキンソン社製）中に包理し、６ウェル・トランスウェル・インサート中に１ウェル当たり細胞数５×１０5個で播種した。継代数６のヒト大動脈内皮細胞（米国メリーランド州のケンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社製）をウェル底部に播種した。細胞を、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と、シクロパミン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）−４〜７、アクチビンＡ、エキセンジン−４、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−４、全トランス型レチノイン酸およびγ−セクレターゼ阻害剤を含む増殖因子を補給したＤＭＥＭ地で１４日間、培養した。培養物を１日おきに、供給した。全トランス型レチノイン酸によって処理した細胞は、α−胎仔性蛋白質（ＡＦＰ）の反応性の向上を示した。アクチビンＡ、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）−４あるいはγ−セクレターゼ阻害剤Ｌ−６８５，４５８で処理した細胞は、ＨＮＦ−３β発現反応性を向上させた。５０ｎｇ／ｍＬという高濃度の骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）で処理した細胞は、転写因子ＧＡＴＡ−４発現反応性を向上させた。５０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−４で処理した細胞は、転写因子ＰＤＸ−１発現反応性を向上させた（表１９）。
【０１６０】
継代数６のＡＦＣＡ００４（Ｅ細胞形態）の細胞系列由来の細胞を、６ウェル培養プレートの各ウェルに５×１０5個で播種し、集密的ＰＡＮＣ−１細胞（ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション；米国バージニア州））を他の増殖因子と組み合わせて調整した培地で処理した。基本的な線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と上皮増殖因子（ＥＧＦ）との組み合わせは、未処理細胞に対するＨＮＦ−３βの発現を１００倍まで高めた。基本的な線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）および骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）も、１４日間の処理後に、ソマトスタチンの発現を活性化した（図１６のパネルａおよびパネルｂ）。
【０１６１】
同時に得られた知見として、上記結果は、ＡＦ細胞を複数の異なる増殖因子で処理することによって、ＡＦ細胞が膵臓細胞系列、肝臓細胞系列あるいは消化管細胞系列に分化することができることを示唆している。
【０１６２】
〔実施例１３：ノッチ経路阻害による内胚葉マーカーの発現調節〕
継代数８のＡＦＣＡ００７（ＡＦ−Ｉ細胞系列）由来の細胞を、ある濃度範囲のノッチ経路阻害剤Ｌ−６８５，４５８（米国ミズーリ州のシグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）で、３日間〜５日間、処理した。Ｌ−６８５，４５８の細胞毒性を、ＭＴＳ検定法（米国ウィスコンシン州のプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）で細胞の生存力を測定することによって確認した。上記処理後に、Ｈｅｓ−１形質発現性を分析するために、リアルタイムの重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）検定法を実行した。我々発明者らは、Ｌ−６８５，４５８がＨｅｓ−１形質発現性に対する投与量依存型の阻害効果を示したことを確認した（図１７のパネルａ）。なお、Ｈｅｓ−１は、ノッチ経路の下流側の直接的な標的である。ＭＴＳ検定法で確認されたように、細胞の生存力に対する効果は、５日間、１０μＭまでのＬ−６８５，４５８の次の処理では、観察されなかった（図１７のパネルｂ）。
【０１６３】
〔実施例１４：ＡＦ−Ｉ細胞およびＡＦ−ＩＩ細胞のサイトカイン抗体アレイ分析〕
継代数１０のＡＦＣＡ００７Ａ（ＡＦ−Ｉ細胞系列）およびＡＦＣＡ０１５Ｃ（ＡＦ−ＩＩ細胞系列）を、集密度約７０％まで増殖させた後、哺乳類細胞溶解キット（米国ミズーリ州のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社製）で、細胞溶解物を収集した。米国ジョージア州のレイバイオテック（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）社（http://www/raybiotech.com/）から提供されたサイトカイン・アレイ・パネルで、サイトカイン・アレイ分析を完了した。表２０は、バックグラウンドを差し引いたデータの標準化後のサイトカイン、サイトカインおよび増殖因子の発現性を示している。各パネルについては、陽性および陰性の対照区も含まれている。上記パネルは、１つの細胞型当たり２つの異なるサンプルについて実施したものである。
【０１６４】
この明細書全体で引用された文献は、この明細書において参照することによって、その文献全体がこの明細書に組み込まれる。この発明の種々の態様が実施例および好適な実施の形態を参照して示されているが、この発明の範囲が、特許法の精神の下に適切に議論される特許請求の範囲によって規定されるが、先の記述によっては限定されないものと正当に評価されるはずである。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
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【表１１−９】
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【表１１−１０】
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【表１１−１１】
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【表１１−１２】
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【表１１−１３】
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【表１１−１４】
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【表１１−１５】
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【表１１−１６】
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【表１１−１７】
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【表１１−１８】
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【表１１−１９】
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【表１１−２０】
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【表１１−２１】
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【表１１−２２】
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【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【表１２−１０】
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【表１２−１１】
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【表１２−１２】
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【表１２−１３】
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【表１２−１４】
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【表１２−１５】
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【表１２−１６】
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【表１２−１７】
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【表１２−１８】
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【表１２−１９】
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【表１２−２０】
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【表１２−２１】
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【表１２−２２】
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【表１２−２３】
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【表１２−２４】
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【表１２−２５】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【表１５−１２】
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【表１５−１３】
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【表１５−１４】
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【表１５−１５】
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【表１５−１６】
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【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１６−７】
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【表１６−８】
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【表１６−９】
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【表１６−１０】
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【表１６−１１】
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【表１６−１３】
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【表１６−１４】
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【表１６−１５】
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【表１６−１６】
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【表１６−１７】
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【表１６−１８】
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【表１６−１９】
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【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【表１７−５】
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【表１７−６】
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【表１７−７】
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【表１７−８】
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【表１７−９】
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【表１７−１０】
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【表１７−１１】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０−１】
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【表２０−２】
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【表２０−３】
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【表２０−４】
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【表２１−１】
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【表２１−２】
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【表２１−３】
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【表２１−４】
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【表２１−５】
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【０１６５】
〔実施の態様〕
以下、この発明の実施の態様を説明する。
（１）実質的に精製された羊水由来細胞の個体群。
（２）実施態様１記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、およびＴｒａ２−５４からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
（３）実施態様２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−１β、ＧＡＴＡ−６およびＳｏｘ−１７からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、羊水由来細胞の個体群。
（４）実施態様２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−３β、Ｈｅｓ−１、ＧＡＴＡ−４およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させるものでもある、羊水由来細胞の個体群。
（５）実施態様２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ＡＸＬ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
（６）実施態様２記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
（７）実施態様６記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
（８）実施態様６記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
（９）実施態様１記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。
（１０）実施態様１記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−１７およびＴｒａ２−５４の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
（１１）実施態様１０記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、羊水由来細胞の個体群。
（１２）実施態様１０記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、羊水由来細胞の個体群。
（１３）実施態様１０記載の羊水由来細胞の個体群において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、羊水由来細胞の個体群。
（１４）実施態様１記載の羊水由来膵臓細胞の個体群において、
試験管内で増殖可能である、羊水由来膵臓細胞の個体群。
（１５）実施態様１記載の羊水由来細胞の個体群において、
低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、羊水由来細胞の個体群。
（１６）実施態様１記載の羊水由来細胞の個体群において、
β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。
（１７）実施態様１記載の羊水由来細胞の個体群において、
消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、羊水由来細胞の個体群。
（１８）羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
ａ．羊水を分離するステップと、
ｂ．前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
ｃ．培地中に前記細胞を配置するステップと、
ｄ．培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
ｅ．少なくとも５日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。
（１９）実施態様１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、およびＴｒａ２−５４からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
（２０）実施態様１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−１β、ＧＡＴＡ−６およびＳｏｘ−１７からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
（２１）実施態様１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−３β、Ｈｅｓ−１、ＧＡＴＡ−４およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
（２２）実施態様１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ＡＸＬ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（２３）実施態様１９記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（２４）実施態様２３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（２５）実施態様２３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（２６）実施態様１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
（２７）実施態様１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−１７およびＴｒａ２−５４の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（２８）実施態様２７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（２９）実施態様２７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（３０）実施態様２７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
（３１）実施態様１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
（３２）実施態様１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
（３３）実施態様１８記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
（３４）実施態様１８記載の方法において、前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
（３５）羊水から細胞の個体群を採取する方法において、
ａ．羊水を分離するステップと、
ｂ．前記羊水から前記細胞を分離するステップと、
ｃ．ＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−３、ＴＲＡ１−６０およびＴＲＡ１−８１からなる群より選択された少なくとも１つのマーカーを発現させる細胞を選択するステップと、
ｄ．培地中に前記細胞を配置するステップと、
ｅ．培養容器中に前記細胞を播種するステップと、
ｆ．少なくとも５日間、前記培地中で前記細胞を増殖させ、これにより羊水由来細胞の個体群を採取するステップと、
を含む、方法。
（３６）実施態様３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、およびＴｒａ２−５４からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
（３７）実施態様３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−１β、ＧＡＴＡ−６およびＳｏｘ−１７からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
（３８）実施態様３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−３β、Ｈｅｓ−１、ＧＡＴＡ−４およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
（３９）実施態様３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ＡＸＬ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（４０）実施態様３６記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（４１）実施態様４０記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（４２）実施態様４０記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（４３）実施態様３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
（４４）実施態様４０記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−１７およびＴｒａ２−５４の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（４５）実施態様４４記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（４６）実施態様４４記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（４７）実施態様４４記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
（４８）実施態様３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
（４９）実施態様３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
（５０）実施態様３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
（５１）実施態様３５記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
（５２）糖尿病患者あるいは糖尿病発症のリスクを負う者を治療するための方法において、
ａ．ドナーから採取した羊水由来細胞の個体群を分離するステップと、
ｂ．前記患者に前記羊水由来細胞を移すステップを含む、方法。
（５３）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、およびＴｒａ２−５４からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陰性である、方法。
（５４）実施態様５３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−１β、ＧＡＴＡ−６およびＳｏｘ−１７からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して実質的に陽性である、方法。
（５５）実施態様５３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＨＮＦ−３β、Ｈｅｓ−１、ＧＡＴＡ−４およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させるものでもある、方法。
（５６）実施態様５３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ＡＸＬ、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（５７）実施態様５３記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（５８）実施態様５７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（５９）実施態様５７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（６０）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
（６１）実施態様５７記載の方法において、
前記個体群の細胞は、ＣＤ１１７、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−１７およびＴｒａ２−５４の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（６２）実施態様６１記載の方法において、
前記個体群の細胞は、サイトケラチン蛋白質の発現に対して実質的に陰性である、方法。
（６３）実施態様６１記載の方法において、
前記個体群の細胞は、肝臓活性化蛋白質、ＰＤＧＦ受容体β、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＧＲＯ、ＧＲＯ−α、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＭＩＦ、オステオプロテゲリン、ＴＩＭＰ−２およびＴＲＡＩＬ  Ｒ３からなる群より選択された少なくとも１つの蛋白質マーカーの発現に対して陽性である、方法。
（６４）実施態様６１記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記蛋白質マーカーＳｏｘ−１７の発現に対して実質的に陰性であり、かつＨｅｓ−１およびＭｕｓａｓｈｉ−１からなる群より選択された少なくとも１つの遺伝子を発現させる、方法。
（６５）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記患者に移すステップの前に、膵臓ホルモン産生細胞に分化される、方法。
（６６）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、前記患者に移すステップの後に、膵臓ホルモン産生細胞に分化される、方法。
（６７）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、試験管内で増殖可能である、方法。
（６８）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、低酸素条件下の試験管内で増殖可能である、方法。
（６９）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、β細胞系列の特性を示す細胞に分化可能である、方法。
（７０）実施態様５２記載の方法において、
前記個体群の細胞は、消化管ホルモン産生細胞に分化可能である、方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】この発明の羊水由来細胞を分離するのに用いられる分離ステップおよび培養ステップを示している。
【図２】継代数ゼロの羊水サンプルから分離された細胞の３つの特徴的な形態を示すもので、ａ）は羊水細胞の形態、ｂ）は上皮細胞の形態、およびｃ）は線維芽細胞の形態である。
【図３】羊水由来のＡＦ−Ｉ細胞上の細胞表面マーカーの発現を示している。これらのマーカーはパネルａ〜ｎ上に示されている。
【図４】羊水由来のＦ細胞上の細胞表面マーカーの発現を示している。これらのマーカーはパネルａ〜ｌ上に示されている。
【図５】羊水由来のＥ細胞上の細胞表面マーカーの発現を示している。これらのマーカーはパネルａ〜ｍ上に示されている。
【図６】羊水サンプル由来のＦ細胞の免疫蛍光像を示している。Ｆ細胞は、ａ）ビメンチン、ｂ）発生段階特異性胚抗原（ＳＳＥＡ）−４、およびｃ）βＩＩＩチューブリンに関して染色陽性を示した。
【図７】羊水サンプル由来のＥ細胞の免疫蛍光像を示している。Ｅ細胞は、ａ）ビメンチンおよびネスチン、ｂ）発生段階特異性胚抗原（ＳＳＥＡ）−４、ｃ）βＩＩＩチューブリン、ｇ）全サイトケラチン、ｈ）平滑筋アクチン、およびｉ）サイトケラチン−１９に関して染色陽性を示した。
【図８】羊水サンプル由来のＡＦ−Ｉ細胞の免疫蛍光像を示している。ＡＦ−Ｉ細胞は、ａ）ビメンチンおよびネスチン、ｂ）βＩＩＩチューブリン、ｃ）サイトケラチン−１９およびＨｅｓ−１、ｄ）全サイトケラチン、ｅ）発生段階特異性胚抗原（ＳＳＥＡ）−４、ｆ）ＳＯＸ−１７およびＺＯ−１、ｇ）ＧＡＴＡ−６、ｈ）ＨＮＦ−１β、およびｉ）平滑筋アクチンおよびＨＥＳ−２に関して染色陽性を示した。
【図９】この発明のＡＦ−Ｉ細胞、ＡＦ−ＩＩ細胞およびＡＦ−ＩＩＩ細胞の発現プロファイルを示している。
【図１０】初期継代のＡＦ−Ｉ培養細胞の個体群の増殖曲線を示している。
【図１１】異なるドナー由来のＡＦ細胞、Ｆ細胞あるいはＥ細胞の増殖能を示している。図中記号◆は、妊娠期間の１４週〜２３週の第１ドナーの羊水から採取した、ＡＦ−Ｉ細胞形態を有する羊水由来細胞の細胞数を示している。５番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。図中記号▲は、妊娠期間の１４週〜２３週の第２ドナーの羊水から採取した、ＡＦ−Ｉ細胞形態を有する羊水由来細胞の細胞数を示している。５番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。図中記号■は、妊娠期間の１４週〜２３週の第３ドナーの羊水から採取した、Ｆ細胞形態を有する羊水由来細胞の細胞数を示している。１５番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。図中記号＊は、妊娠期間の１４週〜２３週の第４ドナーの羊水から採取した、Ｆ細胞形態を有する羊水由来細胞の細胞数を示している。１６番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。図中記号●は、妊娠期間の１４週〜２３週のドナーの羊水から採取した、Ｅ細胞形態を有する羊水由来細胞の細胞数を示している。５番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。図中記号＋は、妊娠期間の１４週〜２３週の第２ドナーの羊水から採取した、ＡＦ−ＩＩ細胞形態を有する羊水由来細胞の細胞数を示している。５番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。図中記号△は、妊娠期間の１４週〜２３週の第２ドナーの羊水から採取した、ＡＦ−ＩＩＩ細胞形態を有する羊水由来細胞の細胞数を示している。５番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。
【図１２】アムニオマックス（ＡＭＮＩＯＭＡＸ：商品名）完全培地あるいは１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ＤＭ−ＬＧ培地のいずれかにおいて、中程度の継代数（１継代当たり細胞集団倍加数：約４０回）で培養されたＡＦ−Ｉ細胞系列のテロメア長を示している。区分１は分子量の階段状分布であり、区分２は、テロメア長が高い位置にある対照区であり、区分３は、テロメア長が低い位置にある対照区であり、区分４は、ドナーから採取された羊水由来細胞であって、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭ−ＬＧ培地において、継代数１２で培養された羊水由来細胞であり、区分５は、区分４と同一のドナーから採取された羊水由来細胞であって、５番培地において、継代数１２で培養された羊水由来細胞であり、区分６は、陽性の対照区としての胚性癌腫細胞系列（ＮＴＥＲＡ細胞）である。
【図１３】継代数７回〜９回（１継代当たり細胞集団倍加数：約３０〜３５回）で培養されたａ）ＡＦ−Ｉ細胞、ｂ）ＡＦ−ＩＩ細胞およびｃ）ＡＦ−ＩＩＩ細胞の核型を示している。
【図１４】満期分娩時（約３８週）における１つのドナーからの単一の羊水由来細胞の増殖能を示している。５番培地（表ＩＩ）で、細胞を培養した。
【図１５】異種の羊水由来細胞型間の形質発現プロファイルを分散プロットで示している。各プロットのピアソン相関係数も示されている。
【図１６】羊水由来細胞内での形質発現における増殖因子の効果を示している。羊水由来細胞を単一のドナーから採取し、ＰＡＮＣ−１細胞の培養液から採取した調整培地で１２日間、培養した。表示された増殖因子を調整培地に補給した。リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、ＨＮＦ−３βおよびソマトスタチンの発現レベルを確認した。較正物質としてヒト膵臓由来の全リボ核酸（ＲＮＡ）を含めた。パネルａは、ＨＮＦ−３β発現の変化を示している。パネルｂは、ソマトスタチン発現の変化を示している。
【図１７】羊水（ＡＦ）細胞の形態を有する羊水由来培養細胞上でのＬ−６８５，４５８の効果を示している。パネルａは、表示された濃度のＬ−６８５，４５８で処理された羊水（ＡＦ）培養細胞内で、ヒトＨｅｓ−１のＲＮＡ形質発現の相対的な差異を示している。パネルｂは、Ｌ−６８５，４５８処理後に、上記培養細胞の生存力に対するＬ−６８５，４５８の効果を示している。細胞を、表示濃度で３日間、処理した。細胞毒性に対応する生存力の変化を、細胞の生存力の低下が４９０ｎｍの波長での吸光度の減少に対応するＭＴＳ検定法で検出した。
【図１】
2006325594.tif 000128
【図２】
2006325594.tif 000129
【図３】
2006325594.tif 000130
【図４】
2006325594.tif 000131
【図５】
2006325594.tif 000132
【図６】
2006325594.tif 000133
【図７】
2006325594.tif 000134
【図８】
2006325594.tif 000135
【図９】
2006325594.tif 000136
【図１０】
2006325594.tif 000137
【図１１】
2006325594.tif 000138
【図１２】
2006325594.tif 000139
【図１３】
2006325594.tif 000140
【図１４】
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【図１５】
2006325594.tif 000142
【図１６】
2006325594.tif 000143
【図１７】
2006325594.tif 000144
【配列表】
2006325594000001.app
【外国語明細書】
2006325594000001.pdf