(57)【要約】【課題】  ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの個体レベルにおける生理的役割の解明、ならびにＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが関与する疾患の診断・予防・治療医薬の開発のために有用な、遺伝的背景の明確な動物を提供する。【解決手段】  ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物（ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物）を、ターゲティングベクターを用い作製する。さらに本非ヒト哺乳動物の機能解析を行い、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の個体レベルでの機能解析を行うとともに、被験物質を投与して、ＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが関与する疾患の予防・治療に有用な医薬をスクリーニングする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたことを特徴とするノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
遺伝子ターゲティング法により作製されたことを特徴とする請求項１に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の翻訳開始コドンを含む領域を相同組み換えにより他の塩基配列に置換する工程を含んで作製されたことを特徴とする請求項２に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
マウスであることを特徴とする請求項４に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の不妊モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨量減少症または骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
請求項６の不妊モデル非ヒト哺乳動物を用いた不妊の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項７の骨量減少症または骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物を用いた骨量減少症または骨粗鬆症の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
以下の（１）〜（６）の工程を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法。
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターを作製する工程、
（２）前記ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、相同組み換えＥＳ細胞を作製する工程、
（３）前記相同組み換えＥＳ細胞を妊娠した雌から得た胚に挿入し、キメラ胚を作製する工程、
（４）前記キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、キメラ動物を作製する工程、
（５）前記キメラ動物を同種動物と交配させ、Ｆ１ヘテロ接合体を作製する工程、および
（６）前記Ｆ１ヘテロ型産仔同士を交配させ、Ｆ２ホモ接合体を作製する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、「ＴＺＦ」という）／Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌ（以下、「ＴＺＦ−Ｌ」という）遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物、その作製方法、およびその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＺＦは、骨形成を司る骨芽細胞から単離されたタンパク質である。ＴＺＦは、９４２アミノ酸残基から構成され、この中に核酸との結合に関与するＣｙｓ2−Ｈｉｓ2型のｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ領域が１箇所存在し、核移行シグナルと考えられる塩基性アミノ酸に富む領域が４箇所存在する。さらにＴＺＦは、成体マウスの細精管、特に減数分裂前期のパキテン期の精細胞等で高頻度に発現している。これらのことから、ＴＺＦは、核内に存在し、精子形成期、特に減数分裂期における精子形成に関連する遺伝子の転写調節因子として作用することが示唆されている（非特許文献１）。なおＴＺＦｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにコード番号ＡＦ１５９４５５で登録されている。
【０００３】
またＴＺＦには、アイソフォームであるＴＺＦ−Ｌが存在する。ＴＺＦ−Ｌは、２,０２５アミノ酸残基から構成され、そのＮ末端側９０２アミノ酸残基まではＴＺＦと共通する。ＴＺＦ−Ｌには、Ｃｙｓ2−Ｈｉｓ2型のｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ領域が２箇所存在し、核移行シグナルと考えられる塩基性アミノ酸に富んだ領域が４箇所存在する。またＴＺＦ−Ｌも、成体マウスの細精管、特に減数分裂前期のパキテン期の精細胞等で高頻度に発現している。これらのことから、ＴＺＦ−ＬもＴＺＦと同様に、核内に存在し、精子形成期、特に減数分裂期における精子形成に関連する遺伝子の転写調節因子として作用することが示唆されている（非特許文献２）。なおＴＺＦ−ＬｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにコード番号ＡＦ２２７１９４で登録されている。
【０００４】
さらにＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子スクリーニングおよび遺伝子解析により、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌは、同一遺伝子からオルタナティブスプライシングにより形成されること、ＴＺＦ−Ｌ遺伝子は、ＴＺＦ遺伝子と同一翻訳開始点を持つことが明らかになっている（非特許文献２）。なおＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋにＺｆｐ３１８（ＮＭ２０７６７１、ＮＭ０２１３４６、ＮＭ０１４３４５）として登録されている。
【０００５】
このようにＴＺＦおよびＴＺＦ−ＬｃＤＮＡ、ならびにＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のクローニングによってＴＺＦまたはＴＺＦ−Ｌの分子レベルでの解析は可能となりつつあるが、個体レベルでの生理的機能の解析には至らない。ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された遺伝的に安定な変異動物が系統的に得られれば、該タンパク質の個体レベルでの生理的機能の研究のみならず、ＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが関与する疾患に対する予防・治療用医薬の開発に有用であると期待される。しかしながら、現在のところＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が欠損した遺伝的に安定な動物は知られていない。
【非特許文献１】Ａｔｓｕｔｏ  Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ.ａｌ，Ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｆｏｒ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｍｏｔｉｆ  Ｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅａｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００年，第２７３巻，ｐ.３９８−４０３
【非特許文献２】Ｍａｓａｍｉｃｈｉ  Ｉｓｈｉｚｕｋａ  ｅｔ．ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｈｏｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅａｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００３年，第３０１巻，ｐ.１０７９−１０８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
すなわち本発明は、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの個体レベルにおける生理的役割の解明、ならびにＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが関与する疾患の予防・治療用医薬の開発に有用な、遺伝的背景の明確な非ヒト哺乳動物を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、人為的にＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物モデルの作製を試みた。具体的には、実施例に詳しく示されるように、マウスＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のクローニングを行い、これを用いてターゲティングベクターを構築し、これをマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入して組み換えクローンを得て、それをマウス個体に戻すという手法により、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたマウスを得ることに成功した。そして、本マウスの機能解析を進めたところ、雄性マウスにおける不妊が認められるとともに、予想外にも雌性マウスにおける著しい海綿骨密度低下が認められた。本発明は、かかる知見をもとに完成されたものである。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたことを特徴とするノックアウト非ヒト哺乳動物。
（２）遺伝子ターゲティング法により作製されたことを特徴とする（１）に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（３）ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の翻訳開始コドンを含む領域を相同組み換えにより他の塩基配列に置換する工程を含んで作製されたことを特徴とする（２）に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（４）齧歯目動物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１つに記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（５）マウスであることを特徴とする（４）に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物。
（６）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の不妊モデル非ヒト哺乳動物。
（７）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能が染色体上で欠損したことを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の骨量減少症または骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物。
（８）（６）の不妊モデル非ヒト哺乳動物を用いた不妊の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
（９）（７）の骨量減少症または骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物を用いた骨量減少症または骨粗鬆症の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。
（１０）以下の（ｉ）〜（vi）の工程を含む（１）〜（７）のいずれか１つに記載のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法。
（ｉ）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターを作製する工程、
（ii）前記ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、相同組み換えＥＳ細胞等を作製する工程、
（iii）前記相同組み換えＥＳ細胞を妊娠した雌から得た胚に挿入し、キメラ胚を作製する工程、
（iv）前記キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、キメラ動物を作製する工程、
（ｖ）前記キメラ動物を同種動物と交配させ、Ｆ１ヘテロ接合体を作製する工程、および
（vi）前記Ｆ１ヘテロ型産仔同士を交配させ、Ｆ２ホモ接合体を作製する工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物が提供される。すなわち本発明により、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの生理的機能の個体レベルでの解析のためのツールを提供することができる。
【００１０】
生殖細胞（精子形成細胞）の精原細胞から精子までを再現した培養系でのモデルシステムは、開発されておらず、精子形成の研究は大きく立ち遅れている。したがって現在、雄性不妊予防・治療用医薬の開発は、非常に困難な状況におかれている。本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物は、雄性不妊を呈することから、雄性不妊の予防・治療用医薬のスクリーニングのモデル動物として有用である。すなわち、本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物が提供されることにより、今まで不可能であった雄性不妊の予防・治療用医薬の大規模、かつ迅速な開発が可能となる。
【００１１】
骨量減少症や骨粗鬆症の早期には海綿骨に異常が認められること、閉経後の女性に起きる骨量減少症や骨粗鬆症は、海綿骨の骨梁数減少に伴う骨密度の低下に起因することが知られている。本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物は、著しい海綿骨密度減少を呈することから、上記疾患に極めて近い様相を呈すると考えられる。したがって本発明により、骨量減少症や骨粗鬆症の予防・治療用医薬のスクリーニングに極めて有用なモデル動物を提供することができる。その結果、骨量減少症や骨粗鬆症等の予防・治療用医薬の大規模、かつ迅速な開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．用語の定義
本発明の「ノックアウト非ヒト哺乳動物」は、ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されていることを特徴とする。
【００１３】
（１）「ＴＺＦ遺伝子」、「ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」、および「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」
図１に示すようにＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌは、１１個のエクソン部分と各エクソン間に存在する１０個のイントロン部分からなる同一遺伝子から、オルタナティブスプライシングにより形成される。すなわちＴＺＦは第２〜第７および第１１エクソンから形成され、ＴＺＦ−Ｌは、第２〜第１０エクソンから形成される。したがって本発明における「ＴＺＦ遺伝子」、「ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」、および「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子」とは、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌをコードする遺伝子、すなわち図１に示した、第１エクソンを含む１１個のエクソン部分と各エクソン間に存在するイントロン部分からなる遺伝子全体をいう。
【００１４】
（２）「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された」
本発明における「ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された」とは、本発明のノックアウト非ヒト哺乳動物において、野生型ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの全長、ならびに断片化タンパク質が発現されないことを意味する。ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能解析、およびＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子機能異常に起因する疾患に対する予防・治療剤のスクリーニングのためには、上記タンパク質の一部断片（ポリペプチド）も発現されないことが好ましいが、そのポリペプチドが野生型タンパク質の機能を有しない限り、当該ポリペプチドを発
現するものであってもよい。
【００１５】
（３）「ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変すること」
本発明における「ゲノム中のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列の全部または一部を改変すること」における「全部」とは、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の第１エクソンの５’末端から第１１エクソンの３’末端までの領域をいう。また「一部」とは、この領域の一部であって、（ｉ）野生型ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの全長タンパク質の発現のみならずその一部断片（ポリペプチド）の発現をも阻害するために塩基配列を改変することが必要な領域（例えば、翻訳開始コドン等）、または（ii）野生型ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの機能を何ら有していないその一部断片（ポリペプチド）の発現のみ許容する程度に塩基配列の改変が必要な領域をいう。さらに「改変」とは、単一または複数のヌクレオチドを置換、欠失、挿入および／または転位させることにより、ゲノムＤＮＡ中の対象領域の塩基配列を他の塩基配列に改変することをいう。
【００１６】
（４）「非ヒト哺乳動物」
本発明における「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトを除く哺乳動物であれば特に限定されないが、飼育や交配の容易性の観点から、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等の齧歯目に属する動物が好ましく、その中でも近交系が多数作出されており、体外受精の技術が整っているマウスが、特に好ましい。
【００１７】
２．ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法
本発明者は、後述の実施例に示すように、遺伝子ターゲティング法を用いてＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の破壊されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製した。本発明のノックアウト非ヒト哺乳動物の作製方法は、以下の工程を含む。
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターを作製する工程。
（２）前記ターゲティングベクターをＥＳ細胞等に導入し、相同組み換えＥＳ細胞を作製する工程。
（３）前記相同組み換えＥＳ細胞を妊娠した雌から得た胚に挿入し、キメラ胚を作製する工程。
（４）前記キメラ胚を偽妊娠させた雌の子宮に移植し、キメラ動物を作製する工程。
（５）前記キメラ動物を同種動物と交配させ、Ｆ１ヘテロ接合体を作製する工程。
（６）前記Ｆ１ヘテロ型産仔同士を交配させ、Ｆ２ホモ接合体を作製する工程。
以下、この遺伝子ターゲティング法を用いたＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物の作製方法について詳しく説明する。
【００１８】
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターの作製
ターゲティングベクターの作製のため、対象となる動物のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子（標的遺伝子）を単離する。例えば、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物を作製する場合は、対象となる動物の遺伝子ライブラリーから、プローブとしてＴＺＦもしくはＴＺＦ−ＬのｃＤＮＡ、またはＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の全部または一部の配列を用いて、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子をスクリーニングする。スクリーニングの条件、方法は特に限定されず、スクリーニングに用いるプローブについても、他の動物由来のｃＤＮＡから調製してもよい。後述の実施例においては、マウスＴＺＦのｃＤＮＡから調製したプローブを用いてマウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたが、他の動物のｃＤＮＡからプローブを調製してもよい。このようにスクリーニングされたＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子を、市販のプラスミドベクターなどを用いてサブクローニングし、ＤＮＡシーケンシングにより特定し、このクローンのＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の翻訳開始コドンを含むフラグメントを調製する。
【００１９】
上記スクリーニングにより得られたＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡを用いて、相同組み換えのためのターゲティングベクターを構築する。ターゲティングベクターは、公知の方法により作製することができる。すなわち標的動物のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能を欠損させるために、部位指定突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などの手段により、上記ＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡから、その一部の核酸を欠失した核酸配列を調製してもよく、また制限酵素等を用いて、ＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡに他の遺伝子を挿入した核酸配列を調製してもよい。
【００２０】
ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子に挿入される他の遺伝子としては、相同組み換えが起こった細胞の選別を容易にするために、ポジティブ選別を行うためのマーカーとして機能する遺伝子や、目的の相同組み換えが起こらなかった場合に発現して選別を行うことのできるネガティブ選別を行うためのマーカーとして機能する遺伝子が好ましい。ポジティブ選択マーカー遺伝子としてはネオマイシン耐性遺伝子（例えば、ＧＦＰ−ｎｅｏカセット、ジェネティシン耐性により選択）等の薬剤耐性遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子等のレポータ遺伝子等が挙げられる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子としては単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）やジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子などが挙げられる。さらに、このようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用してもよい。
【００２１】
これら遺伝子のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子における挿入場所は、標的におけるＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌの機能を有するタンパク質の発現を抑制しうる位置であれば特に限定されないが、通常エクソンに欠損が生じるように挿入する。ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌ遺伝子は、同一の翻訳開始点を有することから、翻訳開始コドン（ＡＧＴ）を含む領域が破壊されるように遺伝子を挿入して、ターゲティングベクターを構築するのが好ましい。このとき、目的とする制限酵素切断部位が、適切な位置に配されるようにターゲティングベクターを設計するとよい。またターゲティング効率は、相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長い方が好ましい。さらにターゲティングベクターは、環状より直鎖状の方が、ターゲティング効率の観点から望ましいので、直鎖状化のため相同領域以外の部分に一箇所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。
【００２２】
（２）相同組み換え胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の作製
作製したターゲティングベクターを、制限酵素で切断して直鎖状ＤＮＡとし、例えばフェノール・クロロフォルム抽出、アガロース電気泳動、超遠心等により精製して、ＥＳ細胞へ導入する。調製したターゲッティングベクターをＥＳ細胞にエレクトロポレーション法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等の公知の方法により導入する（導入遺伝子の相同遺伝子組み換え効率を勘案した場合、ＥＳ細胞へのエレクトロポレーション法が好ましい）。ターゲティングベクターのＥＳ細胞等への導入により、一部の細胞内において細胞中の野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子とターゲティングベクターの対応する領域との間で相同組み換えが生じ、ターゲティングベクター中に構築されていた遺伝子と野生型の遺伝子とが置き換わる。このようにして変異型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子を持つＥＳ細胞、すなわち相同組み換えＥＳ細胞を得ることができる。
【００２３】
なおＥＳ細胞は、作製すべきノックアウト動物と通常同一種の細胞を用いる。したがって、例えばノックアウトマウスを作製する場合には、マウスＥＳ細胞を使用する。
【００２４】
ターゲティングベクターに上記ポジティブ選択マーカー遺伝子が挿入されている場合には、所望の相同組み換えが行なわれた細胞では、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されるとともに、マーカー遺伝子が存在しているので、このマーカー遺伝子の特性を利用し選別することができる。すなわちマーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、タ
ーゲティングベクター導入後のＥＳ細胞を、致死濃度の薬剤の存在下で培養することにより、所望の相同組み換えが行なわれたＥＳ細胞を選別することができる。またマーカー遺伝子として酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）をコードするレポータ遺伝子を用いた場合には、適当な酵素基質を添加することにより、相同組み換えが行われたことを確認することができる。
【００２５】
相同組み換え体の確認は、さらにサザンブロット解析やＰＣＲ等で行うことができる。サザンブロット解析は、ＤＮＡを細胞から抽出し、該ＤＮＡを特定の制限酵素でダイジェストし、相同組み換えが起こったＤＮＡと相同組み換えが行われていないＤＮＡとが区別できるように設計されたプローブを用いて行う。別法としては、ターゲティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲティングベクターに使用したＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。また、ターゲティングベクターがランダムに挿入されていないことは、ターゲティングベクター内のＤＮＡをプローブとしてサザンブロット解析することにより確認できる。これらの方法を組み合わせることにより、相同組み換えを起こしたＥＳ細胞を取得することができる。
【００２６】
（３）キメラ胚の作製
上記のように調製したＥＳ細胞を、胚形成の初期の適当な時期、例えば、８細胞期の動物胚または胚盤胞（ブラストシスト）に注入することによりキメラ胚を作製することができる。注入に用いる動物胚または胚盤胞は、妊娠した雌の子宮を取り出し、灌流することによって得ることができる。
【００２７】
ＥＳ細胞の胚盤胞等への注入は、好ましくはマイクロインジェクションによって行うことができる。マイクロインジェクションでは、約１０〜３０個のＥＳ細胞をマイクロピペットに収集し、胚盤胞等に注入する。マイクロインジェクションは、例えば倒立顕微鏡下で、マイクロマニピュレーター、マイクロインジェクター、インジェクションピペット及びホールディングピペットを用いて行うことができる。
【００２８】
胚に注入したＥＳ細胞が発生分化中の胚に取り込まれたか否かを個体作製後に確認できるようにするために、作製された個体の外部的特徴（例えば、毛色）が、注入したＥＳ細胞に由来する部分と胚盤胞に由来する部分とで異なるように、胚盤胞を選択することが好ましい。
【００２９】
（４）キメラ動物の作製
上記で得られたキメラ胚を偽妊娠させた哺乳動物の子宮角に移植する。作出された動物は正常なＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
【００３０】
（５）Ｆ１ヘテロ接合体の作製
このキメラ動物を、野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子をホモでもつ、適当な系統の同種動物と交配させることによって、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。娩出される産仔はキメラマウスの生殖細胞が相同組み換えＥＳ細胞に由来していれば、該ＥＳ細胞が由来するマウスと同じ野生色を呈し、胚盤胞に由来していれば、該胚盤胞が由来するマウスと同じ色を呈する。
【００３１】
（６）Ｆ２ホモ接合体の作製
上記で得られたＦ１ヘテロ接合体同士を交配させて、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたホモ接合体、すなわち本発明のＴ
ＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロット解析、ノーザンブロット解析、またはＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。なお第２世代として、ＴＺＦ／ＴＺＦ遺伝子ノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ）を得ることができるが、この野生型動物は対照実験に好適に用いることができる。
【００３２】
３．本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物の利用
本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたものであるから、第一義的には、個体レベルにおけるＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能解析に用いられるものではあるが、これに止まらず、以下の様々な用途に使用することができる。
【００３３】
（１）医薬のスクリーニング
（ｉ）雄性不妊治療薬のスクリーニング
本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、後述する実施例に示すように雄性動物における不妊（雄性不妊）という興味ある挙動を示す。さらにＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌは、精子形成期、特に減数分裂期における転写調節因子として作用することが示唆されていることから、雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、雄性不妊のモデル動物と考えることができる。
【００３４】
したがって本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、以下の態様で医薬のスクリーニングに使用することができる。例えば、本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物に被験物質を投与し、該ノックアウト動物と交配させた雌性動物の妊娠率を指標として、被験物質の中から雄性不妊の予防・治療用医薬の候補物質をスクリーニングすることができる。
【００３５】
（ii）骨量減少症および骨粗鬆症治療薬のスクリーニング
さらに本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、後述する実施例に示すように雌性動物における著しい海綿骨密度低下という興味ある挙動を示す。骨量減少症および骨粗鬆症の早期には海綿骨に異常が観察されることが多く、さらに女性の閉経後に起こる骨量減少症および骨粗鬆症は、海綿骨の骨梁数低下に起因することから、本発明の雌性ノックアウト動物は、前記疾患のモデル動物と考えることができる。
【００３６】
したがって本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、以下の態様で医薬のスクリーニングに使用することができる。例えば、本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物に被験物質を投与し、該ノックアウト動物の海綿骨密度を指標として、被験物質の中から骨量減少症および骨粗鬆症の予防・治療用医薬の候補物質をスクリーニングすることができる。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など)；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【００３８】
（２）精子形成機構の研究
本発明の雄性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、精子形成機構の研究に用いることができる。具体的には、精子形成の各分化段階における細胞（精原細胞、精母細胞等）の形態や機能等を、野生型動物とＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物とで比較検討することにより、ＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが精子形成に及ぼす影響を、組織・細胞レベルで検討することができる。
【００３９】
（３）骨代謝機構の研究
本発明の雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、骨代謝機構の研究に用いることができる。具体的には、野生型動物とＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物との骨代謝速度等を比較検討することにより、ＴＺＦおよび／またはＴＺＦ−Ｌが骨代謝に及ぼす影響を、組織・細胞レベルで検討することができる。
【００４０】
（４）診断薬等への応用
本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子治療法の開発や雄性不妊、骨量減少症、および骨粗鬆症の新たな診断法、診断用医薬の開発に利用することができる。
【００４１】
（５）ダブルノックアウト動物の作製
さらに本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物、および該動物から得られた細胞（特に精子、卵細胞、ＥＳ細胞、体性幹細胞）は、他の遺伝子を破壊したダブルノックアウト動物の作製に有用である。
【００４２】
以下、本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物として、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスを作製した実施例について説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
１．ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの作製
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ターゲティングベクターの作製
マウスＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬゲノムＤＮＡを単離するために、プローブとしてマウスＴＺＦｃＤＮＡの５’末端〜ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド＃１０９８）ｃＤＮＡフラグメントを用いて、プラークハイブリダイゼーション法により、マウス１２９ｓｖｊゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。得られた陽性クローン（Ｃｌｏｎｅ １）をサブクローニングし、シーケンスを行った。ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の５’末端測約１５kbpが含まれていることを確認した（図２）。
【００４４】
得られたマウスＴＺＦ／ＴＺＦ−ＬのゲノムＤＮＡのうちエクソン２（翻訳開始コドンを含む）を含む、約４kbのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をＧＦＰ−ｎｅｏカセットによって置換した。さらに上流の相同領域の５’末端にネガティブセレクション用のマーカーとしてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子のカセットを保持させた（図２）。なお制限酵素切断部位は、図中それぞれ次の略号で表記している。ＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＨｉｎｄIII（Ｈ）、ＰＩ（Ｐ）。
【００４５】
このベクターは以下のような特徴を持つ。
（ｉ）エクソン２（翻訳開始コドンを含む）を含む、約４kbのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片が、ネオマイシン耐性遺伝子（ＧＦＰ−ｎｅｏカセット）により置換されている。
（ii）ネガティブ選択用マーカー遺伝子としてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を持つ。
（iii）野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子との相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が約１.５kb、ネオマイシン耐性遺伝子下流が約７kbである。
【００４６】
（２）相同組み換えによるＪ１ＥＳ細胞でのＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子変異
Ｊ１ＥＳ細胞に直鎖状化したターゲティングベクターをエレクトロポレーション法により導入、培養し、目的とする相同組み換えが起こった細胞をジェネティシンで選別した。
【００４７】
ジェネティシン耐性コロニーについては、変異アレイ中に存在するＧＦＰ部分（詳細についてはクロンテック社カタログ参照）をプローブとしてサザンブロット解析により相同組み換え体の確認を行った。ジェネティシン耐性のＥＳクローンの中から実際に相同組み換えによりＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された１１個のクローンが得られた。
【００４８】
（３）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子変異ＥＳ細胞によるキメラマウスの作製
得られたクローンの中から３つのクローンを選択しＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスから採取した胚盤胞にマイクロインジェクション法により注入した。その後、胚盤胞を偽妊娠雌性マウスに移植し、生殖系列のキメラマウスを得た。このキメラマウス（雄）とＣ５７ＢＬ／Ｂ６雌性マウスとを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたヘテロ接合体マウスを得た。
【００４９】
（４）ホモ接合体マウスの作製
さらに、これらへテロ接合体マウス同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊されたホモ接合体マウス、すなわち本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスを作製した。ヘテロ接合体マウス同士の交配により生まれたＦ２はメンデルの法則に従い、野生型（＋/＋）、ヘテロ接合体（＋/−）、ホモ接合体（−/−）のは１：２：１の比率で娩出された。
【００５０】
（５）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの遺伝型の判定
（ｉ）ゲノムＤＮＡによるサザンブロッティング解析
５.５週齢の野生型マウス、ヘテロ接合体マウス、およびホモ接合体マウスの尾を、それぞれ約１cm採取し、ＤＮＡ抽出ｂｕｆｆｅｒ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８.０、１００mM ＮａＣｌ、２０mM ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）１００μL、２０mg／mL ｐｒｏｔｅｎａｓｅ Ｋ（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８.０、１００mM ＮａＣｌ、 ２０mM ＥＤＴＡ）１μL中で、５５℃で一晩処理し、組織を溶解した。その後、ＤＮＡ抽出キット（ＴＯＹＯＢＯ、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−Ｃｏｄｅ：ＮＰＫ−１０２）を用いて組織中に含まれるＤＮＡを精製した。ＤＮＡの精製過程はキットに付属するマニュアルに従った。精製したＤＮＡは滅菌水に溶解した。
【００５１】
このようにして調製した野生型マウス、ヘテロ接合体マウス、およびホモ接合体マウスゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIでダイジェストし、配列番号１のプローブＡ（２５０ｂｐ、エクソン１とエクソン２の間にあるイントロン部分：野生型および変異型アレイの最も５’末端側にあるＨｉｎｄIIIサイトのすぐ下流、図２参照）を用い、サザンブロッティング法により解析した。
【００５２】
サザンブロッティング解析用プローブ：
５’−ＣＴＴＴＡＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴＣＣＧＡＣＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＴＡＧＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＡＧＧＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＧＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＡＡＧＴＡＧＣＴＴＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１）
【００５３】
結果を図３に示す。野生型マウスにおいては野生型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の存在を示す５.６kbpにバンドが認められ、変異ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の存在を示す３.３kbpにバンドが認められなかったのに対し、ホモ接合体マウスでは全く逆の結果が得られた。なおヘテロ接合体マウスでは、５.６kbpと３.３kbpの両方にバンドが認められた。
【００５４】
（ii）マウス精巣より抽出したＲＮＡを用いたノーザンブロッティング解析
マウス精巣を摘出し、その半分をＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）溶液１mL中でホモゲナイズした。懸濁液の遠心操作により、ＲＮＡと不純物を分離した。ＲＮＡの精製過程はキットに付属するマニュアルに従った。精製したＲＮＡは滅菌水に溶解した。このようにして調製したｍＲＮＡを、ＴＺＦとＴＺＦ−Ｌとの共通領域に当たる配列番号２のプローブ（１１８ｂｐ、ＴＺＦのＣ末端に対応）を用い、ノーザンブロッティング法により解析した。
【００５５】
ノーザンブロッティング用プローブ：
５’−ＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＧＡＡＡＣＣＡＣＡＧＡＧＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号２）
【００５６】
結果を図４に示す。野生型マウスおよびヘテロ接合体マウスにおいてはＴＺＦおよびＴＺＦ−ＬｍＲＮＡの存在を示すバンドが認められたのに対し、ホモ接合体マウスでは全く認められなかった。
【００５７】
（iii）ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ解析
上記（ｉ）に記載した方法により調製したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ解析によってホモ接合体マウス遺伝子型を確定した。ＰＣＲは上記精製ＤＮＡ １μＬをテンプレートとし、反応系を２０μＬとして６０℃ ３０秒、７２℃ １分４５秒、９４℃ ３０秒を３５サイクル行った。この際に用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
【００５８】
（ア）遺伝型解析用プライマー：
ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ（野生型ＤＮＡの検出）；
「センス（ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ ｍｕｔａｎｔと共通）」
５’−ＣＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＡＡ−３’（配列番号３）
「アンチセンス」
５’−ＴＴＣＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＡＣＴ−３’（配列番号４）
（イ）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ ｍｕｔａｎｔ（変異の入ったＤＮＡの検出）；
「センス（ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌと共通）」
５’−ＣＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＡＡ−３’（配列番号３）
「アンチセンス」
５’−ＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴ−３’（配列番号５）
【００５９】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにより電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。ＤＮＡマーカーIII（ＴＯＹＯＢＯ）をサイズマーカーとして用いた。
【００６０】
結果を図５に示す。野生型マウスではＷＴ（野生型）−ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のバンド（１,５００ｂｐ）のみが観察されるのに対し、ホモ接合体マウスでは変異型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子のバンド（１，５００ｂｐ）のみが観察された。ヘテロ接合体マウスでは、ＷＴ−ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子と変異型ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の２本のバン
ドが観察された。
以上（ｉ）〜（iii）で得られた結果から、本発明の方法により得られたマウスは、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子が破壊された、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスであることが確認された。
【実施例２】
【００６１】
２．ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の機能解析
（１）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの妊娠率
８週齢雄性マウス（野生型７匹、ヘテロ接合体８匹、ホモ接合体１３匹）に１匹あたり３〜４匹の８週齢雌性マウス（ｄｄｙマウス）を２週間交配させた。その後、妊娠した雌性マウスの数を集計し、雌性マウスの妊娠率を算出した。結果を図６に示す。ヘテロ接合体マウスでは妊娠率の低下は全く認められなかったのに対し、ホモ接合体マウスでは有意な妊娠率の低下が認められた（ｐ＜０.０００１）。なお、雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスでは不妊は確認されなかった（データ示さず）。
【００６２】
以上の結果から、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子は雄性マウスの生殖機能に深く関与していることが示された。また本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、雄性不妊のモデル動物として、雄性不妊の予防・治療用医薬のスクリーニングに有用であることが示された。
【実施例３】
【００６３】
（２）ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの骨量の変化
（ｉ）骨組織の摘出
生後７０日齢、１４０日齢に達した野生型マウス、ヘテロ接合型マウス、ホモ接合型マウスを、ＳＰＦ環境から取り出し頚椎脱臼法により致死させた。その後解剖し、後足の股関節を脱臼させてから後足を摘出した。骨密度測定のため、筋肉等の骨以外の組織を取り除き、１０ｍＬの７０％エタノール中で、４℃で固定した。
【００６４】
（ii）ｐＱＣＴ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）法による骨密度の測定
ｐＱＣＴ法によるマウス大腿骨の骨密度の骨密度測定には、Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製骨密度測定装置であるＸＣＴ ＲＥＳｅａｒｃｈ ＳＡを用いた。この装置はマウス組織の横断画像を得る位置を指定でき、さらに海綿骨と皮質骨を識別して骨密度を測定することができる装置である。骨密度の測定は付属のマニュアルに従って行った。また、コリメータをマウス、ラットの摘出骨及び生体を測定できるＲＥＳｅａｒｃｈ Ｍモード（ＣＵＲ＿Ｍ、緑色）に設定した。骨密度の測定部位の決定は、マウス大腿骨遠位部に存在する成長板をＸ線の吸収値によって特定し、次に成長板から海綿骨、皮質骨それぞれ１.５mm、５.５mmの部位の断層映像を取得し、野生型マウス、ヘテロ接合型マウス、ホモ接合型マウスの骨密度を測定した。算出された海綿骨密度と皮質骨密度について、測定した日齢（７０日齢、１４０日齢）、性別ごとに分けて統計解析（一元分散分析、有意差が認められた場合には、さらに個別の２群を比較するｔ検定）を行った。
【００６５】
（iii）雌性ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウトマウスの骨量減少
７０日齢、および１４０日齢の雄性野生型マウス、ヘテロ接合体マウス、およびホモ接合体マウスの皮質骨、および海綿骨密度を比較したが、３群間の骨密度に有意差は認められなかった（図７、Ａ、Ｂ）。
【００６６】
７０日齢の雌ホモ接合体マウスの皮質骨において有意な骨密度減少が認められたものの、大きな変化ではなかった（図８、Ａ）。しかし、海綿骨においては、７０日齢、１４０
日齢の両方においてヘテロ接合体マウス、ホモ接合体マウスの順に骨密度が大きく減少した（図８、Ｂ）。
【００６７】
以上の結果から、ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子は雌性マウスの海綿骨形成に深く関与していることが示された。また骨量減少症および骨粗鬆症の早期には海綿骨に異常が観察されることが多く、さらに女性の閉経後に起こる骨量減少症および骨粗鬆症は、海綿骨の骨梁数減少による骨密度低下に起因することから、本発明のＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子ノックアウト動物は、前記疾患のモデル動物として、骨量減少症または骨粗鬆症の予防・治療用医薬のスクリーニングに有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＴＺＦ遺伝子、ＴＺＦ−Ｌ遺伝子、およびＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子の模式図を示す。図中、四角形はエクソンを示す。黒色、灰色、斜線模様の四角形は、それぞれ、ＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌに共通するエクソン、ＴＺＦ−Ｌに特異的なエクソン、ＴＺＦに特異的なエクソンを示す。なお白塗りの四角形は、非翻訳配列を示す。
【図２】ＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ野生型アレル、ターゲティングベクター、変異型アレルの制限酵素地図を示す。
【図３】野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）マウスにおけるＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子型を、サザンブロッティングで解析した結果を示す。
【図４】野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）マウスにおけるＴＺＦおよびＴＺＦ−Ｌ  ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロッティングで解析した結果を示す。
【図５】Ａは、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）マウスにおけるＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子型を、配列番号３および４のプライマーを用いて、ＰＣＲで解析した結果を示し、Ｂは、Ａ．野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）マウスにおけるＴＺＦ／ＴＺＦ−Ｌ遺伝子型を、配列番号３および５のプライマーを用いて、ＰＣＲで解析した結果を示す。
【図６】野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）雄性マウスに雌性マウスを交配させた場合の、雌性マウスの妊娠率を示す。
【図７】Ａは野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）雄性マウスの皮質骨密度を示し、Ｂは野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）雄性マウスの海綿骨密度を示す。
【図８】Ａは、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）雌性マウスの皮質骨密度を示し、Ｂは、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）、およびホモ接合体（−／−）雌性マウスの海綿骨密度を示す。
【図１】
2006325452.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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