(57)【要約】【課題】カリウムチャンネルが導入された新しい形質の細胞株を提供し、これを基にしたＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネル抑制剤の高効率検索方法を提供する。【解決手段】Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞にカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含むベクターが形質導入された細胞株を提供する。該細胞株を使用してＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法を提供する。本発明の細胞株は、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤候補群の高効率検索に有用に使用することができるので、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの発現異常によって発生する多くの疾患の治療剤開発を加速化させることができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞にカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含むベクターが形質導入された細胞株。
【請求項２】
Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞が、ＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする、請求項１記載の細胞株。
【請求項３】
カリウムチャンネルをコードする遺伝子が、配列番号１で記載されるヒトＫｉｒ２．１遺伝子であることを特徴とする、請求項１記載の細胞株。
【請求項４】
高い安定膜電圧を有し、塩化カリウムまたはバリウム処理時にＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルが活性化することを特徴とする、請求項１記載の細胞株。
【請求項５】
寄託番号ＫＣＴＣ１０７８０ＢＰが付与された、請求項１記載の細胞株ＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２。
【請求項６】
請求項１記載の細胞株を使用してＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法。
【請求項７】
ｉ）第１項の細胞に蛍光染料を負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）する工程；
ｉｉ）工程ｉ）の細胞に検索薬物を加える工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の細胞を脱分極させる工程；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の細胞の蛍光イメージ及び光の強さを記録する工程を含む、請求項６記載のＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法。
【請求項８】
工程ｉｉｉ）が、細胞に塩化カリウムまたはバリウムを処理して細胞を脱分極させることを特徴とする請求項７記載のＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法。
【請求項９】
処理する塩化カリウムの濃度が、５０ｍＭないし６０ｍＭであることを特徴とする、請求項８記載のＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法。
【請求項１０】
配列番号１のヒトカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含む組換えベクターｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カリウムチャンネル（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）が導入された細胞株に関するものである。より詳細には、脱分極によってＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネル（ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）の活性化が可能なカリウムチャンネルが導入された細胞株に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ−型チャンネルは、低い電圧で活性化する電圧依存的カルシウムチャンネル（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃａ２＋ｃｈａｎｎｅｌ）の一種で、現在までＴ−型チャンネルをコードする遺伝子としては三種類の亜型（α１Ｇ、α１Ｈ及びα１Ｉ）が知られている（非特許文献１〜３）。これらＴ−型チャンネル亜型は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅやＨＥＫ２９３細胞のような異種発現系（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）に発現された時、（ａ）−６０ｍＶ近くの低い電圧で活性化、（ｂ）チャンネルの早い活性及び非活性、（ｃ）顕著に遅い脱活性（ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）及び（ｄ）小さなコンダクタンスなどの生物理学的特性を現わす。
【０００３】
Ｔ−型α１Ｈチャンネルの生理的機能をよく見れば中枢神経系に存在する神経の興奮性（ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ）を調節する重要な役目をすることが報告されている（非特許文献４）。それだけではなく、Ｔ−型α１Ｈチャンネルは、心臓拍動（非特許文献５）、ホルモン分泌（非特許文献６〜７）、平滑筋の収縮（非特許文献８）、生殖（非特許文献９）または細胞の成長及び分化（非特許文献１０〜１２）等、多くの多様な機能を調節することが知られている。
【０００４】
このようなＴ−型α１Ｈチャンネルが、遺伝的にまたは他の原因によって組職で過度に発現される場合に、小児テンカン（ａｂｓｅｎｃｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）（非特許文献１３〜１５）、心臓病（例、心室肥大及び高血圧）（非特許文献１６〜１７）、神経性痛症（非特許文献１８）または前立腺癌（非特許文献１９）等、多くの疾患が誘発され得る。
【０００５】
したがって、現在Ｔ−型α１Ｈチャンネルは、世界的に新薬開発の主なターゲットになっていて、生理及び病態生理学的状況でＴ−型α１Ｈチャンネルのさまざまな特性（生物理的及び薬理的特性、遺伝子発現及び細胞膜運搬調節、信号伝達など）がどのようにして調節されるかに関するメカニズムの研究は、新しい新薬開発の新しいターゲットを見出すことができるので非常に重要である。
【０００６】
Ｔ−型α１Ｈチャンネルを抑制することができる新薬開発のためには、基本的に有機化学者等による先導化合物（ｌｅａｄｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）の探索とまた関連物質のデザイン及び合成過程が重要である。また、新薬開発を成功的に実現するためには、合成した物質がＴ−型α１Ｈチャンネルを抑制するかどうかを早くかつ効果的にテストすることができる高効率検索（ＨＴＳ）システムの構築が先行しなければならない。
【０００７】
これらの物質が、Ｔ−型α１Ｈチャンネルの抑制剤なのかどうかは、既存の電気生理学的（すなわち、ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）方法でカルシウム電流を測定することによって簡便に知ることができる。しかし、この方法はイオンチャンネルに関する情報を最も正確に提供するという長所を持ってはいるが、単位時間に処理することができるデータポイント（テストすることができる化合物の数）が制限されるため、多数の物質を早い時間内に検索するには不向きな面がある。
【０００８】
最近高効率でＴ−型α１Ｈチャンネルの活性を電気的に測定できるパッチ−クランプ（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）ＨＴＳシステムが、アキソンインスツリューメント（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ：米国）で開発され、Ｔ−型α１Ｈチャンネルに係わる新薬を開発する研究者たちは、これを活用することが前記問題点を克服する一つの選択枝になる。しかし、パッチ−クランプ技術自体の精巧で複雑なシーケンスを機械が満足に処理することができるかどうかに対する検証問題は相変らず残っている。
【０００９】
電気生理学的ＨＴＳの代案として、蛍光を測定してＴ−型α１Ｈチャンネル抑制剤を検索する方案がある。これはカルシウムに結合するフラ（ｆｕｒａ）のような蛍光物質を使用してカルシウムチャンネルの活性度をカルシウム電流の大きさの代わりにＴ−型α１Ｈチャンネルを通じて細胞内に流入されるカルシウムに比例して増加する蛍光の光度を測定して間接的に評価するものである。しかし、この方法はＴ−型α１Ｈチャンネルの開閉をパッチ−クランプによる膜電圧固定方法と同様に人為的に調節することができないという短所を有している。
【００１０】
以上のことに鑑みて、本発明者等は、前述した既存の高効率検索方法の問題点を認識して、Ｔ−型α１Ｈチャンネルが安定的に発現されるＨＥＫ２９３細胞にカリウムチャンネルを取り入れて高い安定膜電圧を付与することにより電気的刺激がなくても細胞外部に高濃度の塩化カリウムを加えた時、Ｔ−型α１Ｈチャンネルが活性化する細胞株及びこれを基にした高効率検索方法を開発した。テストの結果、細胞外部に高濃度のＫＣｌを加えた時、細胞が脱分極されてＴ−型α１Ｈチャンネルが活性化した。これによって細胞内に流入するカルシウムイオンの変化を高い信号対雑音（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ）蛍光比で測定することができた。したがって、本発明の細胞株がＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネル抑制剤の高効率検索及び広範囲特性研究のための最適の細胞株であることを確認して本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８年、第３９１巻、Ｐ．８９６−９００
【非特許文献２】Ｃｒｉｂｂｓ等，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．，１９９８年、第８３巻、Ｐ．１０３−１０９
【非特許文献３】Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９９年、第１９巻、Ｐ．１９１２−１９２１
【非特許文献４】Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９６年、第５８巻、Ｐ．３２９−３３４
【非特許文献５】Ｈａｇｉｗａｒａ等，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，第３９５巻、Ｐ．２３３−２５３
【非特許文献６】Ｃｏｈｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８年、第８５巻、Ｐ．２４１２−２４１６
【非特許文献７】Ｅｎｙｅａｒｔ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９３年、第７巻、Ｐ．１０３１−１０４０
【非特許文献８】Ａｋａｉｋｅ等，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９８９年、第４１６巻、Ｐ．１４１−１６０
【非特許文献９】Ａｒｎｏｕｌｔ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６年、第９３巻、Ｐ．１３００４−１３００９
【非特許文献１０】Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９８年、第２１巻、Ｐ．１３−２６
【非特許文献１１】Ｇｕｏ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９８年、第３０巻、Ｐ．１０９５−１１０３
【非特許文献１２】Ｋｏｎｏ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９６年、第１３２巻、Ｐ．９１５−９２３
【非特許文献１３】Ｈｕｇｕｅｎａｒｄ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９４年、第１４巻、Ｐ．５４８５−５５０２
【非特許文献１４】Ｔｓａｋｉｒｉｄｏｕ等，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９５年、第１５巻、Ｐ．３１１０−３１１７
【非特許文献１５】Ｋｉｍ等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００１年、第３１巻、Ｐ．３５−４５
【非特許文献１６】Ｎｕｓｓ等，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．，１９９３年、第７３巻、Ｐ．７７７−７８２
【非特許文献１７】Ｍａｒｔｉｎｅｚ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，１９９９年、第３１巻、Ｐ．１６１７−１６２５
【非特許文献１８】Ｄｏｇｒｕｌ等，Ｐａｉｎ，２００３年、第１０５巻、Ｐ．１５９−１６８
【非特許文献１９】Ｍａｒｉｏｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７７巻、 Ｐ．１０８２４−１０８３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞に高い安定膜電圧を付与することにより高濃度ＫＣｌによってＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルが活性化されカルシウム信号を出すことができる新しい形質の細胞株及び、これを基にしたＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネル抑制剤の高効率検索方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために本発明は、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞にカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含むベクターが形質導入された細胞株を提供する。
【００１３】
また、前記細胞株を使用してＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法を提供する。
【００１４】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞にカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含むベクターが形質導入された細胞株を提供する。
【００１５】
カルシウム蛍光信号を測定するＨＴＳシステムを構築するにおいて、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルが安定的に発現されるＨＥＫ２９３細胞が持つ安定膜電圧が非常に低く、大部分のＴ−型α１Ｈチャンネルの機能が完全に非活性化になっているため（非特許文献１〜３）高濃度のＫＣｌで細胞膜を脱分極させても所願するカルシウム信号を得にくいというのが、技術的限界である。
【００１６】
今までＴ−型α１Ｈチャンネルの特性研究は、ＨＥＫ２９３細胞のような異種発現系に一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）または安定的（ｓｔａｂｌｙ）に発現させて成された。しかし、高い安定膜電圧を有する興奮性組職でのＴ−型α１Ｈチャンネルの特性（例、生物理的及び薬理的特性、遺伝子発現及び細胞膜運搬調節、リン酸化程度、信号伝達など）がＨＥＫ２９３細胞でのそれと非常に違うことがあり得るという点で既存のＨＥＫ２９３細胞の使用は大きい限界を持っていることになる。したがって、本発明の目的は、既存の安定的にＴ−型α１Ｈチャンネルを発現するＨＥＫ２９３細胞に高い安定膜電圧を付与することにより高濃度塩化カリウムによってＴ−型α１Ｈチャンネルが活性化されカルシウム信号を出すことができる新しい形質の細胞株を提供することである。
【００１７】
本発明では安定膜電圧の形成に重要な役目をするヒトカリウムチャンネルＫｉｒ２．１をコードする配列番号１の遺伝子（ｈＫｉｒ２．１−Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＦ１５３８２０）をクローニングして、ヒトＴ−型カルシウムチャンネルα１Ｈ（ｈＣａｖ３．２−Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＦ０５１９４６）を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞（Ｄｒ．Ｅｄｗａｒｄ  Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ，Ｄｅｐｔｍｅｎｅｔ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）にトランスフェクションして形質転換されたコロニーを抗生剤を使用して選別した。選別された細胞株候補群クローンを対象にパッチ−クランプ及び細胞内カルシウム測定方法を施行して最適に形質転換された細胞株を確認して、前記過程を経て高い安定膜電圧を有し高濃度塩化カリウムまたはバリウムによってＴ−型α１Ｈチャンネルが活性化され高いカルシウム信号を出すことができる新しい形質の細胞株を最終的に確立して、ＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２．１と命名した。本発明のＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２．１細胞株は、２００５年２月２２日に韓国生命工学研究院生物資源センター遺伝子銀行に寄託した。寄託番号は、ＫＣＴＣ１０７８０ＢＰである。
【００１８】
本発明の細胞株を使用して実際に非電気生理学的な蛍光カルシウム測定方法で（１）高いカルシウム信号を得ることができるかどうか、（２）Ｔ−型α１Ｈチャンネル選択的抑制剤によってカルシウム信号が遮断されるかどうかを確認した。
【００１９】
パッチ−クランプ方法を使用する場合には、電気刺激を加えて人為的にＴ−型α１Ｈチャンネルを活性化させたが、非電気生理学的蛍光測定方法を使用する場合には、細胞が十分な安定膜電圧を有しているので細胞外部にバリウムを加えたり塩化カリウムを加えたりして脱分極させることが必要である。
【００２０】
Ｆｕｒａ−２／ＡＭを負荷したクローン（Ｔ−型α１ＨチャンネルとｈＫｉｒ２．１が安定的に発現された細胞）の単一細胞に６０ｍＭ塩化カリウムを加えて脱分極させると、Ｆ３４０／Ｆ３８０が１．１から１．５５に増加した。このようなＴ−型α１Ｈチャンネルを通じて流入した細胞内カルシウムの増加は、非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤であるミベフラジル（ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）の前処理（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって完全に遮断された（図５参照）。また、細胞で脱分極によるＦ３４０／Ｆ３８０の割合変化は、細胞外液内カルシウムの濃度が２ｍＭと１０ｍＭの時、それぞれ０．１８±０．０６（実験数＝６）と０．５９±０．０７（実験数＝６）で、細胞外液内カルシウムの濃度に比例して増加した。
【００２１】
単一細胞ではない様々な細胞からカルシウム信号の蛍光イメージを一度に測定することができる冷却ＣＣＤイメージシステムは、実際に薬物のＨＴＳに使われる蛍光イメージプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ＦＬＩＰＬＲ）に似た実験環境と原理を提供する。したがって、本イメージシステムを使用して実際に本発明の細胞株がＴ−型α１Ｈチャンネル抑制剤を高効率で検索するのに適合かどうかを最終的に検証した。蛍光カルシウムイメージを測定するために細胞内にｆｌｕｏ−３を負荷した。その結果、塩化カリウムを加えていない、すなわち脱分極されない安定状態でも細胞内カルシウムレベルが少し高くなっている（一部細胞が赤色を帯びている）、非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤であるミベフラジルによって顕著に減少したことを確認することができた（赤色を帯びた細胞数が顕著に減少した）。
【００２２】
また、細胞に６０ｍＭ塩化カリウムを加えて脱分極させた時非常に早く蛍光イメージの明るさが増加することが確認された（図６参照）。このような細胞内カルシウム信号の増加は非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤であるミベフラジルまたは１００ｍＭニッケル（Ｎｉ２＋）の前処理によって完全に抑制された（図７参照）。
【００２３】
前記で詳しく見たように、本発明で提供する細胞株は、細胞外部に高濃度の塩化カリウムを加えた時脱分極されてＴ−型α１Ｈチャンネルが活性化された。これによって細胞内に流入するカルシウムイオンの変化を高い信号対雑音（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ）蛍光比で測定することができるので、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤検索及び広範囲特性研究のための最適の細胞株であることを確認することができた。
【００２４】
また、本発明は前記細胞株を使用してＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法を提供する。
【００２５】
Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルが遺伝的にまたは他の原因によって組職で過度に発現した場合に、小児テンカン、心臓病（例、心室肥大及び高血圧）、神経性痛症または前立腺癌など多くの疾患が誘発され得る。したがって、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルは世界的に新薬開発の主なターゲットになっていて、これを抑制することができる物質は関連疾患の新しい新薬（候補）物質になる。
【００２６】
前記検索方法は、
ｉ）請求項１の細胞に蛍光染料を負荷する工程；
ｉｉ）工程ｉ）の細胞に検索薬物を加える工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の細胞を脱分極させる工程及び；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の細胞の蛍光光の強さを記録する工程を含むことが好ましい。
【００２７】
前記過程を経てｉｖ）の工程で細胞の蛍光変化がなかったり光の強さが弱い細胞を選別したりして、工程ｉｉ）で処理された薬物をＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤またはその候補物質として判定することができる。
【００２８】
前記方法のｉｉｉ）の工程は、細胞に塩化カリウムまたはバリウムを処理することによりなされ、処理する塩化カリウムの濃度は１０ｍＭないし１００ｍＭであることが好ましく、５０ｍＭないし６０ｍＭであることがさらに好ましい。
【００２９】
図８では本発明の細胞株を使用した高効率検索方法のプロトコールを示しているが、これは実施態様の一つに過ぎず、本発明がこれに限定されるものではない。
【００３０】
また、本発明は配列番号１のヒトカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含む組換えベクターｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を提供する。
【００３１】
本発明者等は、配列番号３及び配列番号４の塩基配列を持つプライマーをデザインして、脳ライブラリーから合成されたｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応で前記配列番号１のヒトカリウムチャンネルをコードするＤＮＡ（ｈＫｉｒ２．１  ｃＤＮＡ）をクローニングした。
【００３２】
クローニングされたｈＫｉｒ２．１ｃＤＮＡは、哺乳類細胞ＨＥＫ２９３で安定的に発現させるために哺乳類ＣＭＶプローモーターがあるｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（米国インビトロゼン製品）のＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限（酵素）サイトにサブクローニングしてｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを製造した。前記ベクターの開裂地図は図３に示す通りである。
【００３３】
本発明（１）は、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞にカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含むベクターが形質導入された細胞株である。
本発明（２）は、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞が、ＨＥＫ２９３細胞であることを特徴とする、本発明（１）の細胞株である。
本発明（３）は、カリウムチャンネルをコードする遺伝子が、配列番号１で記載されるヒトＫｉｒ２．１遺伝子であることを特徴とする、本発明（１）の細胞株である。
本発明（４）は、高い安定膜電圧を有し、塩化カリウムまたはバリウム処理時にＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルが活性化することを特徴とする、本発明（１）の細胞株である。
本発明（５）は、寄託番号ＫＣＴＣ１０７８０ＢＰが付与された、本発明（１）の細胞株ＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２である。
本発明（６）は、本発明（１）の細胞株を使用してＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法である。
本発明（７）は、
ｉ）第１項の細胞に蛍光染料を負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）する工程；
ｉｉ）工程ｉ）の細胞に検索薬物を加える工程；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の細胞を脱分極させる工程；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の細胞の蛍光イメージ及び光の強さを記録する工程を含む、本発明（６）のＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法である。
本発明（８）は、工程ｉｉｉ）が、細胞に塩化カリウムまたはバリウムを処理して細胞を脱分極させることを特徴とする本発明（７）のＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法である。
本発明（９）は、処理する塩化カリウムの濃度が、５０ｍＭないし６０ｍＭであることを特徴とする、本発明（８）のＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネルの抑制剤を検索する方法である。
本発明（１０）は、配列番号１のヒトカリウムチャンネルをコードする遺伝子を含む組換えベクターｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）である。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の組換えベクターは、Ｔ−型α１Ｈカルシウムチャンネルを発現する細胞に導入して細胞内安定膜電圧の形成に寄与することができる。
【００３５】
本発明の細胞株は、カルシウム蛍光の測定を通じたＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネル抑制剤候補群の高効率検索に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
ヒトＫｉｒ２．１カリウムチャンネルのクローニング及びサブクローニング
本発明者等は、連鎖重合反応（ＰＣＲ）によってｈＫｉｒ２．１遺伝子を特異的に増幅するためにＰＣＲプライマーを下記のようにデザインして製作した。
【００３８】
フォワードプライマー：５‘ＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＡ３’（配列番号３）；
リバースプライマー：５‘ＡＧＡＣＣＧＴＧＴＴＧＴＡＡＡＧＴＡＡＣＴ３’（配列番号４）
【００３９】
ＰＣＲの鋳型に使用する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＡＭＶ逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（日本タカラ製品）を使用してヒト脳ＲＮＡライブラリ（米国インビトロゼン製品）０．５ｍｇから逆転写反応によって合成した。Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用して遂行したＰＣＲ反応条件を、下記に示す。まず、１分間９４℃で非活性化させた後、３０回の温度変化サイクル（９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分２０秒）を遂行した。前記ＰＣＲ結果増幅されたｃＤＮＡは、１％アガロースゲルから分離した後、精製して、ＴＯＰＯ  ＴＡベクター（米国インビトロゼン製品）にクローニングした。形質転換を通じて再び獲得されたＰＣＲ産物は塩基配列決定でヒトカリウムチャンネルＫｉｒ２．１のｃＤＮＡであることを確認した。この塩基配列（配列番号１）と翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２）は図１及び図２に示す。
【００４０】
クローニングされたｈＫｉｒ２．１ｃＤＮＡは、哺乳類細胞であるＨＥＫ２９３細胞で安定的に発現させるために哺乳類ＣＭＶプローモーターがあるｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（米国インビトロゼン製品）のＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限酵素サイトにサブクローニング（ｓｕｂ−ｃｌｏｎｉｎｇ）して、ｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを製造した。前記ベクターの開裂地図は図３に示す通りである。
【実施例２】
【００４１】
ＨＥＫ２９３細胞株の培養及びヒトカリウムチャンネルＫｉｒ２．１遺伝子を含むｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのトランスフェクション発明に使われた細胞株として発明者中の一人であるペレズ−レース博士（米国バージニア大学）によって樹立されたヒトＴ−型α１Ｈチャンネル（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＦ０５１９４６）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞株を使用した。この細胞株の培養に使用した培地は、ダルベッコの変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ，米国シグマ社）で、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ，米国ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、２．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、１００，０００ｕｎｉｔ／Ｌ  ペニシリン、１００ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン（米国ライフテクノロジー製品）を添加して使用した。ＨＥＫ２９３細胞株は、３７℃加湿ＣＯ２インキュベーター（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ＣＯ２ｉｎｃｕｂａｔｏｒ；９５％空気−５％二酸化炭素）で７日の周期で継代培養した。この時、培地にゼネティシン選別抗生剤（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）であるＧ−４１８（米国ライフテクノロジー製品）をさらに添加し、培地を３日に一度ずつ入れ換えてＴ−型α１Ｈチャンネルを安定的に発現する細胞株を維持した。
【００４２】
本発明では、ヒトＴ−型α１Ｈチャンネルを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞株に実施例１で製作したｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを取り入れるためにリン酸カルシウムトランスフェクションキット（米国インビトロゼン製品）を使用した。具体的に、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）を使用して前記ベクターをトランスフェクションする２４時間前、３５ｍｍ培養皿（米国コーニング製品）に総２×１０５個の細胞を接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）して培養し、トランスフェクションの３〜４時間前に新しい培地（培地の組成は上と同一）に交換した。トランスフェクションのための準備として一つのＥ−（エペンドルプ）チューブに７．５μｌの２Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）と１μｇのｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを入れた後、総６０μｌ容積に合わせた後、ゆっくりと撹拌した。６０μｌ  ２Ｘハンク緩衝食塩水（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＨＢＳ）が入っている他のチューブに１〜２分間徐々にベクターが入っている溶液を滴下しながら気泡を生成（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）させて撹拌した。ベクター沈殿物が形成されると室温で３０分間放置しておいて、細胞が接種されている３５ｍｍ培養皿にゆっくり滴下した。ベクター沈殿物がよく混合するようにゆっくりと培養お皿を振らした後、ＣＯ２培養器で２４時間培養した後、新しい培地に交換した。
【実施例３】
【００４３】
形質転換されたコロニーの選別及び細胞クローンの培養
Ｔ−型α１ＨチャンネルｈＣａｖ３．２とカリウムチャンネルｈＫｉｒ２．１が安定的に発現して形質が転換された細胞株群をトランスフェクション後、４週間Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）とハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）（０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加した培地で培養して選別した。二つの種類の抗生剤に生き残ったコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）をクローニングシリンダー（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｃｙｌｉｎｄｅｒ）を使用して分離した後、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を処理して単一細胞を収得した。これら単一細胞を２４ウェルプレートに分けて接種して培養した後、２５個の他の細胞クローンを得た。
【実施例４】
【００４４】
電気生理学的方法による最適に形質転換された細胞株の確認
本発明者等は、電気生理学的な方法（電流及び電圧固定法）を使用して、実施例３で選別された２５個クローンのｈＫｉｒ２．１の発現程度、Ｔ−型α１Ｈチャンネルの電流密度、安定膜電圧、細胞の同質性などを測定することにより蛍光カルシウム測定を使用したＨＴＳシステムに最も適合するクローン＃３０を得ることができた。これを２００５年２月２２日に韓国生命工学研究院生物資源センター遺伝子銀行に寄託した。寄託番号はＫＣＴＣ１０７８０ＢＰである。
【００４５】
詳細な実験方法と条件を下記に示す。選別された様々な細胞クローンの中で最適にヒトＴ−型α１ＨチャンネルとヒトカリウムチャンネルＫｉｒ２．１を発現するＨＥＫ２９３クローンを確認するために、Ｔ−型カルシウム電流と内向性整流（ｉｎｗａｒｄｌｙ  ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ）カリウム電流（以下「ＩＲＫ電流」）を電圧固定法中の一つである全細胞破裂パッチクランプ（Ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｒｕｐｔｕｒｅｄ  ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）方法（Ｈａｍｉｌ等、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．，１９８１年、第３９１巻、Ｐ．８５−１００；Ｊｅｏｎｇ及びＩｋｅｄａ，Ｎｅｕｒｏｎ、１９９８年、第２１巻、Ｐ．１２０１−１２１２）で記録した。一方、カルシウム及びカリウム電流の測定によって確認された細胞クローンを対象に安定膜電圧をグラミシジン穿孔電流固定法（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ−ｐｅｒｆｏｒａｔｅｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ−ｃｌａｍｐ）（Ａｋａｉｋｅ、Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７年、第６５巻、 Ｐ．２５１−２６４）で測定した。
【００４６】
測定に使用したパッチ電極（ｐａｔｃｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）は、Ｐ−９７フラミングブラウン（Ｆｌａｍｉｎｇ  Ｂｒｏｗｎ）マイクロピペットフラー（米国Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製品）を使用してボロシリカ（ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ）ガラス管（米国コーニング製品）で製作した。電極は、内部溶液（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を満たした時、１〜３ＭΩの抵抗を示した。細胞のキャパシタンスとシリーズ抵抗は、Ａｘｏｐａｔｃｈ−１Ｄ（米国Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製品）または、ＥＰＣ−１０増幅器（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）（ドイツＨＥＫＡ、製品）を使用して８０％以上補正した。電圧刺激プロトコ−ルの生成とデータ収集のためにＩＴＣ１８（米国Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ製品）を使用したＳ４（米国Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｒ．Ｉｋｅｄａ博士製作）やＰｕｌｓｅ（ドイツＨＥＫＡ製品）を使用した。イオン電流は、４−ｐｏｌｅ  Ｂｅｓｓｅｌフィルターを使用して、５ＫＨｚで高域フィルターリング（ｈｉｇｈ−ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）し、２ＫＨｚでデジタル化してコンピューターに保管した。データ分析は、ＩＧＯＲプログラム（米国Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ製品）を使用した。グラミシジン穿孔電流固定法に使用したグラミシジン（米国シグマ製品）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に５０ｍｇ／ｍｌで溶融してストック（ｓｔｏｃｋ）溶液として製造し、電圧測定前に内部電極溶液に５０μｇ／ｍｌに希釈して使用した。
【００４７】
電流及び電圧測定に使用した外部及び内部溶液の組成を下記に示す。
（１）カルシウム電流測定用：
内部電極溶液（ｉｎ  ｍＭ）−
１２０  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン−メタンスルホン酸（ＮＭＧ−ＭＳ）、２０  テトラエチル−アンモニウム（ＴＥＡ）−ＭＳ、２０  ＨＣｌ、１１  ＥＧＴＡ、１  ＣａＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳ、４  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．３  Ｎａ−ＧＴＰ、１４  リン酸クレアチン（ｐＨ７．４）
外部溶液（ｉｎ  ｍＭ）−
１５５  トリス−ＡＭＥＭ、２０  ＨＥＰＥＳ、１０  ＣａＣｌ２、１０  グルコース、０．０００３  テトロドトキンｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ（ＴＴＸ）（ｐＨ７．４）
【００４８】
（２）カリウム電流測定用：
内部電極溶液（ｉｎ  ｍＭ）−
１４０  Ｋ＋グルコネート、５  ＮａＣｌ、１  ＥＧＴＡ、２  ＭｇＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳ、２  Ｎａ−ＡＴＰ、０．１  Ｎａ−ＧＴＰ（ｐＨ７．３）
外部溶液（ｉｎ  ｍＭ）−
１３５  ＮａＣｌ、５．４  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、１．８  ＣａＣｌ２、５  ＨＥＰＥＳ、１０  グルコース（ｐＨ７．４）
【００４９】
（３）安定膜電圧測定用：
内部電極溶液（ｉｎ  ｍＭ）−
１４０  ＫＣｌ、５  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳ、０．５  ＣａＣｌ２、５  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．２）
外部溶液（ｉｎ  ｍＭ）−
１３５  ＮａＣｌ、５．４  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、１．８  ＣａＣｌ２、５  ＨＥＰＥＳ、１０  グルコース（ｐＨ７．４）
【００５０】
以上の実験方法で実施して得た結果を下記に示す。
【００５１】
図４のＡに示したようにクローン＃３０細胞を−８０ｍＶに固定して−１４０ｍＶから＋５０ｍＶに変わるランプ電圧（ｒａｍｐ  ｖｏｌｔａｇｅ）を加えた時、−１４０ｍＶで最大に活性化するｈＫｉｒ２．１によってコードされるＩＲＫ電流と−５０ｍＶで活性化され−３０ｍＶで最大値を示すＴ−型α１Ｈチャンネル電流を記録することができた。ＩＲＫとＴ−型α１Ｈチャンネルの平均電流密度（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ）は、それぞれ２４．９±５．７ｐＡ／ｐＦと５０±１４．８ｐＡ／ｐＦ（実験数＝３〜６）と現われた。ＩＲＫ電流は、選択的遮断剤である１００ｍＭバリウム（Ｂａ２＋）によって抑制された（図４のＢ）。このようなバリウムに敏感なＩＲＫ電流は、−１４０ｍＶから＋１０ｍＶずつ増加する電圧刺激（ｔｅｓｔ  ｐｕｌｓｅ）によって活性化された。ｈＫｉｒ２．１をＨＥＫ２９３細胞に安定的に発現させた時、高い安定膜電圧が生成されるかどうかを電流固定法で確認したところ、この時細胞内のイオンの組成が変わらないようにして正確な膜電圧を測定するためにグラミシジン−穿孔パッチ−クランプ方法を使用した。図４のＣに示した測定結果のように−７２ｍＶの高い安定膜電圧が生成されたことを確認することができた。平均的にｈＫｉｒ２．１が発現されない対照群ＨＥＫ２９３細胞（Ｔ−型α１Ｈチャンネルは発現された）では安定膜電圧が−２６．７±３．９ｍＶで測定され、ｈＫｉｒ２．１が安定的に発現されることにより安定膜電圧が−６６．２±４．２ｍＶで統計的に有意義に高くなった（Ｐ＜０．００１）。また、ｈＫｉｒ２．１を一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ）に発現させた時に得た安定膜電圧−５７．６±４．８ｍＶよりｈＫｉｒ２．１を安定的（ｓｔａｂｌｙ）に発現させた時が統計的にさらに高く現われた（ｐ＜０．０５）。一方、他のクローンのテスト結果においてＨＥＫ２９３細胞で測定されたＩＲＫ電流密度の大きさが大きくなっても生成された安定膜電圧の大きさは比例して大きく増加しなかった。むしろｈＫｉｒ２．１の過発現は、Ｔ−型α１Ｈチャンネル電流密度を大きく減少させた。図４のＤにみられるように電流固定法でクローン＃３０の細胞膜電圧を測定しながらＩＲＫの抑制剤であるバリウム（１００μＭ）を加えた時、細胞膜電圧の脱分極（ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）と一緒にカルシウムスパイクまたは活動電圧（Ｃａ２＋  ｓｐｉｋｅまたはａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ）が誘導された。このような結果はナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ）チャンネルがないＨＥＫ２９３細胞で脱分極によって充分に多数のＴ−型α１Ｈチャンネルが活性化され、このチャンネルを通るカルシウムの流入がそうとうに多いということを意味する。これは、ｈＫｉｒ２．１の安定的発現により形成された高い安定膜電圧が脱分極時に活性化させることができるＴ−型α１Ｈチャンネルの数を大きく増加させたからである。したがって、電気生理学的測定結果を総合して見る時、安定膜電圧が高く生成されながら、Ｔ−型α１Ｈチャンネル電流の密度も高く維持されなければならない必要条件を満足させるクローン＃３０がＨＴＳシステム構築に最も適合した細胞であることが分かった。
【実施例５】
【００５２】
蛍光測定方法を使用した細胞株（＃３０）の適合性検証
電気生理学的方法で検証された細胞株（クローン＃３０）を使用して実際に非電気生理学的な蛍光カルシウム測定方法で（１）高いカルシウム信号（ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌ）を得ることができるのかどうか、（２）非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤によってカルシウム信号が遮断されるかどうかを確認した。
【００５３】
細胞内カルシウム濃度の測定は、蛍光顕微鏡（ニコンＴＥ２０００、日本）に装着されたｒａｔｉｏ蛍光システム（Ｒａｔｉｏｍａｓｔｅｒ、フォトンテクノロジーインタ−ナショナル、米国）及びＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＣＣＤイメージングシステム（ロパーサイエンティフィック、米国）をそれぞれ使用して施行した。先にカバースリップ（ｃｏｖｅｒ  ｓｌｉｐ）の上で培養された細胞にＦｕｒａ−２／ＡＭまたはＦｌｕｏ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国）を５μＭになるように加えて、常温で光が遮断された状態で３０−６０分間負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）させた。負荷した後、細胞外還流液で２回洗浄した後、細胞が付いているカバースリップを顕微鏡上還流チェンバーに張着した。Ｆｕｒａ−２／ＡＭを使用した場合細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化は、３４０ｎｍと３８０ｎｍの光で交替して励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）させた時、５１０ｎｍで放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）される蛍光の比（Ｆ３４０／Ｆ３８０  ｒａｔｉｏ）をフォトンマルチプライヤーチューブ（ｐｈｏｔｏｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ、ＰＭＴ）を通じて測定した。Ｆｌｕｏ−３を使用した場合は、蛍光比を測定しないで５２５ｎｍで放出される蛍光イメージを冷却ＣＣＤにキャプチャーして記録し、メタイメージ６．１プログラム（Ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）で分析した。
【００５４】
パッチクランプ方法を使用する時には、電圧刺激を加えて人為的にＴ−型α１Ｈチャンネルを活性化させたが、非電気生理学的蛍光測定方法を使用する場合には、細胞が十分な安定膜電圧を持っているので細胞外部にバリウムを加えたり塩化カリウムを加えたりして脱分極させることが必要である。図５に示されたようにＦｕｒａ−２／ＡＭを負荷したクローン＃３０（Ｔ−型α１ＨチャンネルとｈＫｉｒ２．１が安定的に発現された細胞）の単一細胞を６０ｍＭ塩化カリウムを加えて脱分極させた時、Ｆ３４０／Ｆ３８０が１．１から１．５５に増加した。このようなＴ−型α１Ｈチャンネルを通じて流入した細胞内カルシウムの増加は、非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤であるミベフラジル（ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）（３μＭ）の前処理によって完全に遮断された。図６に要約したとおりクローン＃３０細胞で脱分極によるＦ３４０／Ｆ３８０の割合変化は、細胞外液内のカルシウムの濃度が２ｍＭと１０ｍＭである時、それぞれ０．１８±０．０６（実験数＝６）と０．５９±０．０７（実験数＝６）で、細胞外液内のカルシウムの濃度に比例して増加した。
【００５５】
単一細胞ではない様々な細胞からカルシウム信号の蛍光イメージを一度に測定することができる冷却ＣＣＤイメージシステムは、実際に薬物のＨＴＳに使われる蛍光イメージプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ＦＬＩＰ±ＬＲ）に似た実験環境と原理を提供する。したがって、本イメージシステムを使用して実際に本発明がＴ−型α１Ｈチャンネル抑制剤をＨＴＳで検索するのに適合するかどうかを最終的に検証した。蛍光カルシウムイメージを測定するためにクローン＃３０細胞内にｆｌｕｏ−３を負荷した。本カルシウムイメージ測定実験でＦｌｕｏ−３をＦｕｒａ−２／ＡＭの代わりに使用した理由は、Ｆｌｕｏ−３が薬物開発のための細胞基盤（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ）ＨＴＳに非常に多く使われる蛍光染料（Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９年、第２９４巻、Ｐ．２０−４７）として知られているからである。図７は、細胞内カルシウム信号の蛍光イメージを示した（Ｆｌｕｏ−３が結合するカルシウムの濃度に比例して赤色が増加するように現われる）。塩化カリウムを加えていない、すなわち脱分極されない安定状態でも細胞内カルシウムレベルが少し高くなっているが（一部細胞が赤色を帯びている）非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤であるミベフラジル（３μＭ）によって顕著に減少した（赤色を帯びた細胞数が顕著に減少）。このことから、安定膜電圧でＴ−型α１Ｈチャンネルの一部が活性化して刺激を加えなくても少しのカルシウムがＴ−型α１Ｈチャンネルを通じて細胞内に入ったことが分かる（これを「ウィンドウ電流」という）。しかし、このようなウィンドウ電流を使用して薬物をテストすることは、信号対雑音比（Ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−Ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）が非常に低いため好ましくない。クローン＃３０細胞を６０ｍＭ塩化カリウムを加えて脱分極させた時、非常に早く蛍光イメージの明るさが増加した（図７のＡ）。このような細胞内カルシウム信号の増加は、非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤であるミベフラジル（３μＭ）（図７のＢ）または１００μＭニッケル（Ｎｉ２＋）の前処理によって完全に抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
前記で詳しく見たように、本発明の細胞株は、カルシウム蛍光の測定を通じたＴ−型α１Ｈカルシウムチャンネル抑制剤候補群の高効率検索に使用できる。このことにより、Ｔ−型チャンネルの発現異常により発生する多くの疾患の治療剤開発を促進させることが期待される。また、今まで安定膜電圧がほとんど形成されない異種発現系で遂行されていたＴ−型α１Ｈチャンネルの生物理学的及び薬理的特性、遺伝子発現及び細胞膜運搬調節、リン酸化程度及び信号伝達などの広範囲特性に関する研究を高い安定膜電圧を持ち神経細胞と類似になった興奮性細胞株で遂行することにより、Ｔ−型α１Ｈチャンネルの特性とそれによる生体現象の解明に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ヒトカリウムチャンネルＫｉｒ２．１の塩基配列を示した図である。
【図２】ヒトカリウムチャンネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列を示した図である。
【図３】ヒトカリウムチャンネルＫｉｒ２．１がサブクローニングされたｈＫｉｒ２．１−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターの開裂地図である。
【図４】本発明のＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２．１細胞株の電気生理学的適合性テスト結果を示したグラフである。  図４のＡは、本発明のＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２．１細胞株でランプ刺激によって活性化になったＴ−型電流及び内向性整流ＩＲＫカリウム電流を記録したグラフである。  図４のＢは、テスト刺激によって記録されたバリウムに敏感なＩＲＫ電流を示したグラフである。  図４のＣは、同じ細胞で安定膜電圧形成を確認した結果を示すグラフである。  図４のＤは、安定膜電圧が記録された細胞にＫｉｒ２．１抑制剤であるバリウムを加えて脱分極させた時に現われるカルシウム活動電圧を記録したグラフである。
【図５】本発明のＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２．１細胞株でカルシウム信号を蛍光測定した結果を示したもので、細胞に蛍光染料ｆｕｒａ−２／ＡＭを負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）した後、高濃度の塩化カリウムを加えて脱分極させた時、細胞内に流入するカルシウムによるＦ３４０／Ｆ３８０比の変化をポトンマルチプライヤーチューブ（ＰＭＴ）で増幅した後、測定したグラフである。
【図６】本発明のＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２．１細胞株で細胞外液のカルシウム濃度に比例してＦ３４０／Ｆ３８０比が変化する、すなわち、カルシウム信号が増加することを示したグラフである。
【図７】蛍光カルシウムイメージング方法を使用して本発明のＨＥＫ２９３−ＴＣｈＨ−ＩＲＫ２．１細胞株をテストした結果を示した図で、細胞にＦｌｕｏ−３を負荷して冷却ＣＣＤカメラでキャプチャーされた多くの細胞でのカルシウム信号の変化をデジタル蛍光イメージに転換したものである（非特異的Ｔ−型チャンネル抑制剤であるミベフラジル（ｍｉｂｅｆｒａｄｉｌ）は高濃度の塩化カリウムによって現われる蛍光カルシウムイメージを完全に遮断した）。
【図８】本発明の細胞株を使用した高効率薬物検索プロトコールを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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