(57)【要約】      （修正有）【課題】ＧＡＰタンパク質ＳＨ３ドメインと相互作用し得るペプチド、それをコードする核酸配列、そのペプチドに対する抗体およびそれらを含む医薬組成物の提供。【解決手段】ＳＨ３ドメインに直接結合することによりＧＡＰタンパク質に結合しうるタンパク質、すなわち分子量約６８ｋＤａからなるヒト由来のポリペプチドの存在を実証した。本ポリペプチドはＲａｓシグナルの形質導入に対するＳＨ３ドメインの寄与の解明に貢献する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＰタンパク質のＳＨ３ドメインと相互作用し得るポリペプチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号９の配列から選択されるペプチド配列、またはこれらの配列の誘導体、の全体または一部を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号４を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
約 68 kDa の分子量を有することを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ヒト起源のものであることを特徴とする請求項１または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号５もしくは配列番号９の配列、またはこれらの配列の誘導体、の全体または一部を含むことを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号９またはその誘導体の一つによって表されることを特徴とする請求項１、４または５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
そのチロシンモチーフが分裂細胞または増殖細胞ではリン酸化されていないことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体または抗体断片。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号９で表されるペプチド配列から選択される配列に対するものであることを特徴とする請求項８に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１０】
ＧＡＰタンパク質と、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドとの間の相互作用を阻害する能力を有することを特徴とする請求項８または９に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに従って定義されるようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項１２】
（ａ）配列番号６、配列番号１０の配列、またはそれらの相補鎖、の一部または全体；
（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、本発明に係るポリペプチドをコードする配列；および
（ｃ）遺伝暗号の縮重により配列（ａ）および（ｂ）から誘導される配列
を含むことを特徴とする請求項１１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号６の配列を含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】
配列番号１０によって表されることを特徴とする請求項１１、１２または１３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドの産生を少なくとも部分的に阻害することができるアンチセンス核酸。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドの発現を検出するための、または遺伝子異常（欠陥スプライシング、多型性、点突然変異など）を検出するための、請求項１１〜１４のいずれかに記載の配列の使用。
【請求項１７】
ＧＡＰタンパク質と相互作用し得る非ペプチド化合物または事実上ペプチドでない化合物を構築するための請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドの使用であって、その構築を、このポリペプチドの活性に重要な構造上の要素を決定し、これらの要素を非ペプチド構造または事実上ペプチドでない構造を使用して再生することにより行う、ポリペプチドの使用。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも一つのポリペプチドおよび／または請求項８〜１０のいずれかに記載の抗体もしくは抗体断片および／または請求項１５に記載のアンチセンス核酸および／または請求項１７の記載に従って製造された化合物を活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ｐ２１タンパク質の活性化を調節するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌を治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１０に記載の抗体もしくは抗体断片および／または請求項１１に記載のヌクレオチド配列の、生物学的サンプルにおける、増幅され、突然変異誘発され、または再配列された請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドの発現および／または過発現を検出するための使用。
【請求項２２】
請求項８〜１０のいずれかに記載の抗体もしくは抗体断片および／または請求項１１〜１３のいずれかに記載のヌクレオチド配列の、癌またはシグナル伝達欠陥と関連する病気を型分類するための使用。
【請求項２３】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドと相互作用し得るＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド配列の使用。
【請求項２４】
Ｒａｓ遺伝子の産物によって形質導入されるシグナルを妨害するための、請求項１〜７のいずれかで定義したようなポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチドおよびヌクレオチド配列ならびにそれらの薬剤としての使用に関する。特に、本発明は、ＧＡＰタンパク質のＳＨ３ドメインに結合可能なペプチド関する。
【０００２】
Ｒａｓ遺伝子の産物は一般にｐ２１タンパク質と命名され、研究された全ての真核生物における細胞分裂の制御において重要な役割を果たしている。これらのタンパク質のある特定の改変によりその正常な制御が失われ、発癌性になる。すなわち、多数のヒトの腫瘍は、改変したＲａｓ遺伝子の存在と関連する。同様に、これらのｐ２１タンパク質の過発現は、細胞増殖の制御を解除する可能性がある。全体的に見ると、ｐ２１タンパク質は、ヒトの癌の30％において関係がある。
【０００３】
従って、これらのｐ２１タンパク質の正確な役割を理解することは、腫瘍学の領域における研究目的の一つを構成するものである。
【０００４】
ｐ２１タンパク質の機能の説明に対して現在利用できるモデルは、Ｇ形質導入タンパク質と共有する類似体に基づく。細胞においては、ＧＴＰに結合する活性ｐ２１タンパク質とＧＤＰに結合している不活性形との間に平衡がある。ｐ２１タンパク質を必要としない静止細胞では、これらのタンパク質のほとんどがＧＤＰ形である。細胞が刺激されると、ヌクレオチド交換因子であるＧＥＦがより活性になり、ＧＤＰの脱離およびそのＧＴＰによる置換を促進する。タンパク質はそのとき、そのエフェクターであるＧＡＰタンパク質、すなわち、他のタンパク質と会合する確率が高い「ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質」を認識し、刺激することができる活性型コンホメーションをとる。次いで、ｐ２１−ＧＴＰ−ＧＡＰ複合体は、恐らく一つ以上の他のタンパク質と相互作用し、それにより、シグナルの伝達が生じて、細胞による生物学的反応が生じる。ｐ２１−ＧＴＰとＧＡＰとの会合は、同時に、ＧＴＰの加水分解およびｐ２１の不活性型への戻りを引き起こす。
【０００５】
発癌性ｐ２１タンパク質の場合は、その突然変異が、不活性状態への戻りを防いでいる。この後者の場合、平衡は、ｐ２１の活性型の方にかたよる。
【０００６】
ｐ２１の活性型と不活性型との間のこの複雑な平衡は、ｐ２１タンパク質の生化学的性質に固有な因子（ＧＤＰおよびＧＴＰに対する相対的親和性、ヌクレオチド交換速度など）およびｐ２１タンパク質の活性を調節する外部因子、特にＧＡＰタンパク質などによって一体となって同時に制御される。
【０００７】
ＧＡＰタンパク質は、全ての真核生物に存在し、従って、正常なｐ２１タンパク質に結合するＧＴＰの加水分解を強く促進する性質を有する細胞質タンパク質である（TraheyおよびMcCormick 1987）。それは、別々の機能に関与する二つのドメインを有する。そのカルボキシ末端は、ｐ２１タンパク質を捕らえて、そのＧＴＰアーゼ活性を増加させる触媒活性を有する。その他方の端のアミノ末端部分の下流には、他のタンパク質との相互作用に関与し得る並列のＳＨ２およびＳＨ３ドメインがある。
【０００８】
現在、ＧＡＰタンパク質と相互作用する二つのタンパク質が知られている。これらのタンパク質は、ｐ６２およびｐ１９０と命名され、分子量が各々、62 kDaおよび 190 kDaである。これら二つのタンパク質は、ＧＡＰの異なるエピトープに対する抗体によって免疫沈降するので、明らかにＧＡＰと特異的複合体を形成する。特に、ｐ６２タンパク質は、ＧＡＰタンパク質とＳＨ２領域において相互作用することが知られている。
【０００９】
ＳＨ３ドメインに関する限り、特に、Ｃγホスホリパーゼ（ＰＬＣ−γ）、３−ホスファチジルイノシトールキナーゼのｐ８５サブユニットおよびｇｒｂ−２タンパク質などの種々のタンパク質（それらは全て、Ｒａｓ  ｐ２１シグナルの形質導入に関与する）におけるその存在は、このドメインが、タンパク質／タンパク質相互作用を行うのに特に重要であり、従って、対応するタンパク質および／または細胞におけるその位置の機能に必須であることを示唆している。従って、ＧＡＰタンパク質の特別のケースでは、このＳＨ３ドメインは、Ｒａｓシグナルの形質導入にも関与し得る。このＳＨ３ドメインの正確な役割を理解することは、治療レベルにおいて特に有効であることが明らかである。
【００１０】
本発明の目的は、正確には、Ｒａｓシグナルの形質導入に対するＳＨ３ドメインの寄与の解明に貢献することである。
【００１１】
すなわち、本出願人は、そのＳＨ３ドメインに直接結合することによりＧＡＰタンパク質に結合し得るタンパク質の存在を実証した。
【００１２】
特に、本発明は、ＧＡＰタンパク質のＳＨ３と相互作用することができるタンパク質の同定、単離および特性決定の結果として生じる。また、対応するペプチド配列を同定することによるこれらのタンパク質の構造解析からも生じる。
【００１３】
特に、ＧＡＰタンパク質のＳＨ３ドメインと相互作用することができる本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号９から選択されるペプチド配列、もしくはこれらの配列の誘導体、の全体または一部を含む。
【００１４】
本発明の意図において、誘導体は、本発明に係るポリペプチドの遺伝子的および／または化学的改変によって得られ、望ましい活性を保持する分子を意味する。遺伝子的および／または化学的改変は、一つ以上の残基の突然変異、置換、欠失、付加および／または改変を意味すると理解される。そのような誘導体は、種々の目的、特にペプチドの相互作用部位に対する親和性の増加、産生レベルの向上、プロテアーゼに対する耐性の増加、治療効力の増加もしくはその副作用の減少、または新規な薬物動態学および／または生物学的特性の付与などのために生じさせることができる。
【００１５】
また、それは、これらの断片の誘導体の上記配列の断片も示すことができる。そのような断片は、種々の方法で生じさせることができる。特に、当業者に公知のペプチド合成機を使用して、図１に示す配列に基づいて化学的に合成することができる。また、細胞宿主において望ましいペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することにより、遺伝子的に合成することもできる。この場合、ヌクレオチド配列は、本出願で示すペプチド配列および遺伝暗号に基づいて、オリゴヌクレオチド合成機を使用して化学的に合成することができる。ヌクレオチド配列はまた、本出願で示す配列を使用し、当業者に公知の技術に従って、酵素制限、連結、クローニングなどにより、または配列番号１に基づいて生じさせたプローブによりＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより合成することもできる。
【００１６】
本発明の一つの態様によれば、クレームしたペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号４を含む。
【００１７】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、分子量が約 68 kDa である。
【００１８】
本発明の一つの実施態様によれば、ポリペプチドは、配列番号５もしくは配列番号９、もしくは前記で定義したようなそれらの誘導体の一つ、の全体または一部を含むヒト起源のポリペプチドである。
【００１９】
ポリペプチドは、特に、配列番号５を含むポリペプチドである。
【００２０】
特に、ポリペプチドは、配列番号９またはその誘導体の一つによって表されるポリペプチドである。
【００２１】
予期しなかったことに、このタンパク質は、ＳｒｃのＳＨ３ドメインに結合するとしてすでに同定された別のｐ６８タンパク質と相同性を持たない。そのチロシンモチーフは、増殖している細胞または分裂状態にある細胞ではリン酸化されていない。
【００２２】
タンパク質配列番号９の分析は、ＧＡＰタンパク質のＳＲ＋Ｈ３ドメインに結合し、Ｇ３ＢＰと命名されるタンパク質がｈｎＲＮＰ（ヘテロ核リボ核タンパク質）ファミリーに属することを示す。特に、Ｇ３ＢＰは、見かけの分子量が68 kDaであり、ＲＮＡに結合するタンパク質に対して特徴的ないくつかのドメイン：
−  ＲＮＰ２およびＲＮＰ１ドメイン (アミノ酸 342〜347)；  −  ４ＲＧＧボックス（アミノ酸 435〜449 ）；
−  酸性副ドメイン（アミノ酸 144〜221 ）
を含む、466 アミノ酸のタンパク質である。
【００２３】
本発明はまた、Ｇ３ＢＰとＧＡＰのＳＨ３ドメインとの間の相互作用を拮抗することができるペプチドにも及ぶ。これらのペプチドの活性は、競合試験（実施例２〜３参照）またはＲａｓタンパク質によって形質導入されるシグナルの妨害を含む試験において実証することができる。
【００２４】
本発明はまた、上記で定義したポリペプチドに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体または抗体断片に関する。そのような抗体は、当業者に公知の方法によって生じさせることができる。特に、これらの抗体は、配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号９またはこれらの配列の断片もしくは誘導体から選択されるポリペプチドに対して動物を免疫感作し、血液を採取して抗体を単離することにより作製することができる。これらの抗体は、また、当業者に公知の技術に従ってハイブリドーマを調製することにより生成させることもできる。
【００２５】
本発明の抗体または抗体断片は、次いで、Ｒａｓ遺伝子の産物の活性化状態を調節するために使用することができる。
【００２６】
さらに、これらの抗体を使用すると、生物学的サンプルにおける本発明のペプチドの検出および／またはアッセイ、ならびに、その結果、Ｒａｓ遺伝子の産物の活性化状態に関する情報の付与を行うことかできる。
【００２７】
本発明はまた、アンタゴニスト、すなわち、本発明に係るポリペプチドとＧＡＰタンパク質のＳＨ３ドメインとの相互作用を阻止することができるペプチドにも及ぶ。そのようなペプチドは、競合試験（実施例２〜３参照）またはＲａｓ活性を阻害する試験において実証することができる。
【００２８】
従って、本発明は、上記配列に由来するポリペプチド、およびこれらのポリペプチドまたは薬剤的利用に関して興味深い生物学的性質を示す対応するタンパク質に対して特異的な抗体の生成も可能にする。
【００２９】
本発明はまた、薬剤的に使用可能な非ペプチド化合物または事実上ペプチドではない化合物を提供する。すなわち、本出願に記載する活性タンパク質モチーフに基づいて、ｐ２１タンパク質−依存シグナル経路を阻害し、事実上ペプチドではなく、薬剤的利用に適合する分子を構築することができる。この点に関して、本発明は、薬理学的に活性な非ペプチド分子または事実上ペプチドではない薬理学的に活性な分子の製造に対する上記したような本発明のポリペプチドの使用に関し、その製造は、このポリペプチドの活性に対して重要な構造的要素を決定し、これらの要素を非ペプチド構造または事実上ペプチドではない構造によって再生することにより行う。本発明はまた、このようにして製造した１種以上の分子を含む医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明はまた、ＧＡＰタンパク質のＳＨ３ドメインに結合可能なポリペプチドをコードする核酸配列に関する。より好ましくは、
（ａ）配列番号６もしくは配列番号１０の配列、またはそれらの相補鎖の一つ、の全体または一部、
（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、本発明に係るポリペプチドをコードする配列、および
（ｃ）遺伝暗号の縮重によって配列（ａ）および（ｂ）から誘導される配列
を含む配列に関する。
【００３１】
好ましくは、配列番号６を含み、より好ましくは、配列番号１０によって表される。
【００３２】
本発明の種々のヌクレオチド配列は、起源が人工であってもなくてもよい。それらは、ゲノム、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列であり得る。これらの配列は、例えば、ＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー）を、上記した配列に基づいて設計したプローブを使用してスクリーニングすることにより得ることができる。そのようなライブラリーは、当業者に公知の通常の分子生物学的技術を使用して種々の起源の細胞から合成することができる。本発明のヌクレオチド配列はまた、特にホスホアミダイト法による化学的合成によって、または、ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる配列の化学的もしくは酵素的改変を含む混合法によって合成することもできる。
【００３３】
本発明に係るこれらのヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドの製造のために、または遺伝子治療で使用することができるアンチセンス配列を構成するために、またはハイブリダイゼーション実験によって生物学的サンプルにおけるＧＡＰタンパク質の活性を検出・診断するために、または他の細胞源から相同配列を単離するために、薬剤の領域で使用することができる。
【００３４】
本発明のポリペプチドを製造するためには、上記核酸配列を一般には、宿主細胞での発現を可能にするシグナルの制御下におく。これらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、分泌リーダー配列など）の選択は、使用する宿主細胞によって変わり得る。好ましくは、本発明のこれらのヌクレオチド配列は、自律的に複製し得るベクターまたは組み込まれるベクターの一部を形成する。特に、自律的に複製するベクターは、選択した宿主において自律的に複製する配列を使用して調製する。組み込みベクターは、例えば、宿主ゲノムのある領域に対して相同であり、相同組換えによってベクターを組み込むことができる配列を使用して調製することができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドの合成に対して使用できる宿主細胞は、真核細胞宿主または原核細胞宿主のいずれであってもよい。適する真核細胞宿主として挙げることができるのは、動物細胞、酵母または真菌類である。特に、酵母として挙げられるのは、サッカロミセス(Saccharomyces) 、 Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomycesまたは Hansenula属である。動物細胞として挙げられるのは、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７細胞などである。
【００３６】
特に挙げることができる真菌類は、 Aspergillus spp. またはTrichoderma spp.である。次の細菌は、原核細胞宿主として好ましく使用される。すなわち、大腸菌(E. coli) 、バチルス（Bacillus）またはストレプトミセス（Streptomyces）である。  本発明に係る核酸配列は、薬剤として使用することができるアンチセンス核酸の構築に使用することもできる。ある癌遺伝子の発現のアンチセンス核酸による阻害は、これらの癌遺伝子の役割を理解する上での有用な方法であり、抗癌治療を達成するための特に有望な方法であることが証明されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、所与の遺伝子のコード鎖に相補的であり、この理由のために、転写ｍＲＮＡと特にハイブリダイズして、タンパク質への翻訳を阻害することができる小さいオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、上記で定義した核酸配列の全体または一部によって構成することができる。一般に、それらは、本発明に係るペプチドをコードする配列に相補的である配列または配列の断片である。そのようなオリゴヌクレオチドは、上記した配列から、断片化などによって、または化学合成によって得ることができる。
【００３７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする上記で定義したヌクレオチド配列と、または対応するｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（合成であってもなくても）としてのヌクレオチドプローブに関する。そのようなプローブは、診断用ツールとしてin vitroで使用することができる。そのようなプローブは、前もって標識しなければならず、これを行うための種々の方法が当業者に公知である。これらのプローブを使用することができるハイブリダイゼーション条件は、通常のストリンジェンシィ条件である。これらのプローブはまた、他の細胞源を使用して、本発明のポリペプチドをコードする相同の核酸配列を検出し、単離するために使用することができる。これらのプローブの例示として、特に、配列番号７および配列番号８（これらは、下記実施例３で使用）によって表されるプローブを挙げることができる。
【００３８】
本発明はさらに、上記で定義した少なくとも一つのポリペプチドをその活性成分として含む医薬組成物に関する。
【００３９】
本発明はまた、上記で定義した少なくとも一つの抗体および／または抗体断片をその活性成分として含む医薬組成物ならびに上記で定義した少なくとも一つのアンチセンスオリゴヌクレオチドをその活性成分として含む医薬組成物に関する。
【００４０】
さらに、本発明は、上記で定義したポリペプチド、抗体およびオリゴヌクレオチドが互いに結合し、または他の活性成分に結合した医薬組成物にも関する。
【００４１】
本発明に係る医薬組成物を使用すると、ｐ２１タンパク質の活性化を調節し、その結果、ある細胞型の増殖を調節することができる。特に、これらの医薬組成物は、癌を治療するためのものである。すなわち、多くの癌が、発癌性Ｒａｓタンパク質の存在と関連している。突然変異のあるＲａｓ遺伝子を最も頻繁に含むそれらの癌の中で、特に挙げることができるのは、その 90 % がＫｉ−Ｒａｓ癌遺伝子（12番目のコドンに突然変異がある）を含む膵臓腺癌(Almogueraら、 Cell 53(1988) 549) 、結腸腺癌および甲状腺癌（50％）、または肺癌および骨髄性白血病（30％、 Bos, J.L., Cancer Res. 49 (1989) 4682）である。
【００４２】
本発明はまた、ｐ２１タンパク質の活性を調節する、すなわち阻害する上記した分子の使用に関する。特に、本発明は、Ｒａｓ遺伝子の産物によって形質導入されるシグナルを妨害するためのＧ３ＢＰの全体または断片の使用に関する。ｈｎＲＮＰと相同であるタンパク質断片は、Ｇ３ＢＰのその標的ＲＮＡへの結合の阻害に対して有利に使用される。これらの標的ＲＮＡと同一または相補的である配列も、Ｇ３ＢＰタンパク質によって形質導入されるシグナルの妨害に使用することができる。
【００４３】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＧ３ＢＰの発現および／または過発現の検出法を提供する。そのような方法は、例えば、該サンプルを本発明に係る抗体または抗体断片と接触させ、抗原／抗体複合体を検出し、得られた結果を標準サンプルと比較することを含む。そのような方法では、抗体は、懸濁させるか、前もって支持体に固定させることができる。この方法はまた、サンプルを本発明に係るヌクレオチドプローブと接触させ、得られるハイブリッドを検出し、標準サンプルの場合に得られたものと比較することを含むことができる。
【００４４】
本発明のポリペプチド、抗体およびヌクレオチド配列は、  Ｒａｓ遺伝子の活性を調節することができ、それによって、癌の発生過程への介入が可能となるので、本発明は、治療の領域において多くの方法で使用することができる。横紋骨格筋細胞で強く発現するという事実により、これらのペプチドは恐らく、例えば糖尿病などのシグナル伝達欠陥に関係する病理学にも介入する。本発明の別の態様は、クレームしたポリペプチドと相互作用できるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列の使用から成る。これらの配列は、国際出願 WO 91/19813に記載の方法を使用して合成できる。
【００４５】
本発明はまた、癌の診断および型分類と関連して使用することができる。
【００４６】
本発明の他の利点は、下記実施例および図面により明らかにされるが、以下の実施例および図面は、説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００４７】
図面
図１：ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞におけるＧ３ＢＰ過発現のＣＡＴ活性に対する影響。
【００４８】
図２：ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞におけるＧ３ＢＰ過発現の、ＳｒｃおよびＲａｓ癌遺伝子によって誘発される病巣形成に対する影響。
【００４９】
材料および方法
一般的クローン化法
分子生物学で使用される通常の方法、例えば、プラスミドＤＮＡの分離抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配における遠心分離、アガロースまたはアクリルアミドゲルによる電気泳動、ＤＮＡ断片の電気溶離による精製、タンパク質のフェノールまたはフェノール／クロロホルムによる抽出、生理的食塩水媒体におけるＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、大腸菌（Escherichia coli）への形質転換などは、当業者には周知であり、文献に十分記載されている［Maniatis T. ら、“Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,1982;Ausubel F.M. ら編、“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, 1987]。
【００５０】
制限酵素は、New England Biolabs (Biolabs) 、 Bethesda Research Laboratories (BRL) または Amersham によって提供され、提供者の忠告に従って使用する。
【００５１】
プラスミド pGEX 2Tは、市販されている。
【００５２】
ＰＣＲ法［ポリメラーゼ触媒による連鎖反応、Saiki R.K.ら、Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350 ］によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、ＤＮＡ熱サイクラー（Perkin Elmer Cetus）を使用し、製造者の取扱説明書に従って行う。
【００５３】
ヌクレオチド配列は、Sangerら［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467 ］によって開発された方法により、Amersham製のキットを使用して確定する。
【００５４】
一般に、ハイブリダイゼーション実験に対する通常のストリンジェンシィ条件は次の通りである。すなわち、 5×デンハルト液の存在下、65℃で 3×SCC ；洗浄：65℃で 0.5×SCC 。
【実施例１】
【００５５】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＳＨ３融合タンパク質の調製
ＧＡＰ（残基 275〜350 ）およびｃ−Ｓｒｃ（残基84〜148 ）タンパク質のＳＨ３ドメインをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ法により増幅し、 BamHIおよび EcoRI制限部位の間で発現ベクターpGEX2Tにクローン化する。こうして形質転換した細菌を培養し、ＩＰＴＧ（１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で誘発し、音波処理により溶菌する。ＧＳＴ  ＳＨ３融合タンパク質を、グルタチオンアガロースビーズ（Pharmacia LKB biotech ）によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、10 mM の還元グルタチオンで溶離する。
【実施例２】
【００５６】
１）細胞溶解産物の調製
ＥＲ２２細胞（ヒトＥＧＦ受容体を過発現するハムスター繊維芽細胞）またはＣ−Ｓｒｃ  ｐｐ６０（Ｆ−５２７）を発現するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、抗生物質Ｇ４１８（200 μg/ml）および2 mM/lのグルタミン（5GIBCO-BRL）を含む10％ウシ胎児血清に富むＤＭＥＭ培地（ダルベツコの改良イーグル培地）上で、37℃、 5％ＣＯ２下で培養する。
【００５７】
各アッセイにおいて、ＥＲ２２細胞を、集密的になるまで100mm の皿で培養し、次いで、血清なしで18時間インキュベートする。オルトバナジン酸ナトリウムを最終濃度 100μM となるように添加し、インキュベートを30分間続ける。次いで、ＥＧＦを、37℃で10分かけて培地に直接添加し、最終濃度を 80 nMとする。
【００５８】
ある種のアッセイに対しては、分裂細胞を、0.4 μg のノコダゾール (SIGMA)／mlで18時間処理することにより回収する。それをリン酸塩をベースとする塩水緩衝液で迅速に洗浄し、氷中で再冷却した後、ホスファターゼ阻害剤（1 mMのＮａ３ＶＯ４、10 mM のＮａ４Ｐ２Ｏ７および10 mM のＮａＦ）およびプロテアーゼ阻害剤（1 μg/mlのロイペプチン、1 μg/mlのトリプシン阻害剤、1 μg/mlのペプスタチンＡ、2 μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのベンズアミジン、1 mMのフッ化フェニルメタンスルホニル、 1μg/mlのアンチパインおよび 1μg/mlのキモスタチン）の存在下、1 mlの溶解緩衝液ＨＮＴＧ（50 mM の Hepes、pH 7.5、150 mMのＮａＣｌ、 1％のTritonｘ100 、10％のグリセロール、1 mMのＭｇＣｌ２、1 mMのＥＧＴＡ）中、４℃で30分かけて可溶化する。
【００５９】
溶解産物は、15,000 rpmで10分間遠心分離することにより清澄化する。次いで、タンパク質の濃度を測定する（Bioradミクロ試験）。
【００６０】
２）直接結合についての試験
細胞溶解産物（200 μg ）および免疫沈殿タンパク質の全体を、 7.5％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した後、二フッ化ポリビニリデン膜（ＰＶＤＦ、Millipore Corp.）上に移した。0.05％のTween 20を含むＰＢＳ中の 2 %脱脂粉乳により、室温で２時間、フィルターへの非特異的結合をブロックする。フィルターを、４℃で12時間、ブロッキング緩衝液中のＧＳＴタンパク質およびＧＳＴ−ＳＨ３タンパク質とともにインキュベートする。ＰＢＳ−0.05％ Tween 20 により洗浄した後、結合タンパク質を、抗−ＧＳＴモノクローナル抗体(0.25 μg/ml) (Hybridolab Pasteur Inst.)、アルカリホスファターゼに結合した抗−マウス抗体および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートトルイジニウムニトロブルーテトラゾリウム塩(PROMEGA) とともに順次インキュベートすることにより検出する。
【００６１】
３）競合試験
ＧＡＰ  ＳＨ３の配列(275〜305)、(299〜326)、(317〜326)および(320〜350)、またはＳＨ３ドメインに結合するダイナミン(RRAPAVPPARPGS) の推定上の配列に対応する合成ペプチドを、ＦＭＯＣ化学を使用して、Applied Biosystems 431 A装置により合成する。
【００６２】
精製したｐ６８タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することにより単離し、電気泳動によってＰＶＤＦ膜上に移す。膜を増加する量のペプチドとともにインキュベートする。対照反応では、ペプチドポリ−Ｌ−プロリン（SIGMA ）を 500μM で使用する。１時間インキュベートした後、タンパク質ＧＳＴ−ＧＡＰ−ＳＨ３（2 μg/ml） を各反応培地に添加する。濾液を、前述したように、抗−ＧＳＴモノクローナル抗体をプローブとして調べる。
【００６３】
４）免疫沈殿およびイムノトランスファー
可溶性細胞溶解産物（3 mg）を、４℃で２時間、50μl のタンパク質ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia Biotech ）により清澄化する。清澄化した細胞溶解産物を抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体（モノクローナル抗体4G10−Upstate Biotechnology Incorporated）とともに４℃で４時間、インキュベートする。次いで、50μl のプロテインＡセファロースを複合体に添加し、インキュベーションを４℃で一夜続ける。免疫沈殿物をＨＮＴＧ緩衝液で３回洗浄し、ＳＤＳ緩衝液（100 μl)のサンプルに可溶化する。次いで、複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、電気泳動によってＰＶＤＦ膜に移す。
【００６４】
膜をＴＢＳ（10 mM のトリス、ｐＨ 7.4、150 mMのＮａＣｌ、3 ％のウシ血清アルブミン）中のホスホチロシンモノクローナル抗体とともにインキュベートし、また、アルカリホスファターゼに結合した第二抗体ともインキュベートする。次いで、アルカリホスファターゼに対する基質を添加して、適切に発色させる。
【００６５】
５）配列の精製および分析
約 5×10９個のＥＲ２２細胞を、200 mlのＨＮＴＧ緩衝液に溶解する。溶解産物を 15,000gで15分間遠心分離し、ＨＮＧ緩衝液（50 mM の Hepes、ｐＨ 7.5、150 mMのＮａＣｌ、10％のグリセロール、1 mMのＥＧＴＡ、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤）で５倍に希釈する。溶解産物を、同じ緩衝液で平衡化した6 mlのFast Flow Ｓ−Sepharose とともに一夜インキュベートする。複合体をカラム（ＩＢＦ− 2.5×1.3 cm）に移す。カラムをその10倍の体積の緩衝液で洗浄した後、結合タンパク質を60 ml/h の溶離速度で、同じ緩衝液における 0〜1 M の直線勾配の60 ml のＮａＣｌで溶離する。実施例２．２の条件（0.15〜0.37M ＮａＣｌ）下で測定される結合活性を有する画分を集め、ＨＮＧ緩衝液で10倍に希釈し、24 ml/h の溶離速度で、同じ緩衝液で予め平衡化させたヘパリン- セファロースＣ１−６Ｂ (3 ml) (Pharmacia LKB) 上に載せる。ＨＮＧ緩衝液で洗浄した後、カラムを 0〜1MのＮａＣｌ勾配 24 mlで溶離する。ＳFastクロマトグラフィーからの活性画分を集め、ＭＥＳ緩衝液（100 mMのＭＥＳ、ｐＨ 6.8、1 mMのＭｇＳＯ４、1 mMのＥＧＴＡ）で４倍に希釈し、50 mM のＮａＣｌを含むＭＥＳ緩衝液で予め平衡化させてあるアガロースＡＴＰカラム (3 ml) (Sigma No. A9264) に6 ml/hの溶離速度で移動させる。次いで、カラムを、50 mM のＮａＣｌを含む20 ml のＭＥＳ緩衝液で洗浄し、ＭＥＳ緩衝液中の50mM〜2Mの直線ＮａＣｌ勾配により、30ml/hで溶離する。ｐ６８タンパク質は、 0.3 Mと0.4 M のＮａＣｌの間で溶離する。活性画分を集め、20 mM のＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ 8.3に対し透析し、濃縮する。乾燥した後、タンパク質をＳＤＳ緩衝液に再懸濁し、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離する。ゲルをクーマシーブルーで染色し、ＳＨ３結合活性に対応する68 kDAの分子量のバンドを回収する。それを次の溶液で１時間洗浄する。すなわち、水、水／メタノール(90/10) 、水／ＣＨ３ＣＮ(80/20) および水／ＣＨ３ＣＮ(50/50) である。
【００６６】
次いで、精製したｐ６８タンパク質を含むゲルのバンドを小さい画分に分けてSPEED/VAC (SAVANT)下で乾燥する。25 mM のトリス、ｐＨ 8.5、1 mMのＥＤＴＡ、0.05％のＳＤＳおよび 5μg の Lys-cエンドプロテイナーゼ(Boehringer Mannheim) を含む 400μl の溶液を添加し、全体を37℃で一夜インキュベートする。加水分解産物を逆相ＨＰＬＣカラム (Vydac C18: 2.1×250 mm) 上に注入する。カラムを 0.2 ml/分で、 0〜35％の直線勾配のＢ（Ａ：Ｈ２０＋0.07％のＴＦＡおよびＢ：ＣＨ３ ＣＮ＋0.07％のＴＦＡ）により 150分で溶離し、113.7 、117.7 および 133.7分の保持時間で確認された溶離ピークを集め、Applied Biosystems 477A マイクロシークエンサーを使用して直接配列分析を行う。こうして得られた対応するペプチド配列を、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４に示す。これらの配列は、タンパク質データベース（PIR 33．Swiss-Prot 33 (intelligenetics) ）中のタンパク質との相同性は何も示さなかった。
【００６７】
ｐ６８タンパク質が分裂細胞または非同調細胞(non-synchronous cells) においてチロシン−リン酸化されているかどうかを調べるために、10％ウシ胎児血清で培養したＥＲ２２細胞またはノコダゾールで処理した細胞に由来する溶解産物中のタンパク質を抗−ホスホチロシン抗体により免疫沈殿させて膜に移動させ、抗−ホスホチロシン抗体により免疫検出するか、実施例２．２および２．４に記載の条件下でＧＳＴ−ＧＡＰ−ＳＨ３もしくはＧＳＴ−Ｓｒｃ−ＳＨ３のいずれかとともにインキュベートする。対照として、ｃ−Ｓｒｃ（ｃ−Ｓｒｃ  Ｙ５２７Ｆ）の活性化対立遺伝子で形質転換したＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のタンパク質をＥＲ２２タンパク質に対して記載したものと同じ条件下で試験する。得られた結果は、タンパク質が、特に60〜70 kDaの領域においてチロシン−リン酸化されていることを示す。リン酸化ｐ６８タンパク質に対する結合は、ＧＳＴ−ＧＡＰ−ＳＨ３またはＧＳＴ−Ｓｒｃ−ＳＨ３プローブを使用したＥＲ２２細胞では検出されない。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ｃ−Ｓｒｃ−Ｙ５２７Ｆ）では、ＧＳＴ−Ｓｒｃ−ＳＨ３プローブは68 kDaの分子量のチロシン−リン酸化タンパク質に結合し、ＧＳＴ−ＧＡＰ−ＳＨ３プローブは、どのタンパク質とも相互作用しない。
【００６８】
Ｒａｓシグナル伝達経路におけるこのタンパク質の機能的関与を確認するための競合実験を、実施例２．３に記載した条件下で行った。得られた結果は、ＧＡＰ由来のペプチドが、アフリカツメガエルの卵核胞（ＧＶＢＤ）のＲａｓ−誘発破壊を阻止することができ、ＧＡＰ  ＳＨ３ペプチド(299〜326)および(317〜326)もＧ３ＢＰタンパク質とＧＡＰとの間の相互作用を阻止することができることを示す。
【００６９】
これらの結果から、本発明に係るタンパク質の活性を阻止し、または妨害する能力が、癌の治療における特に望ましい新規方法を構成することがはっきり確認された。
【実施例３】
【００７０】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからのヒトの配列番号６の配列の単離
配列番号１および配列番号３のペプチド配列に基づく配列番号７および配列番号８の配列をプローブとして使用する。Clonetech HL1008B ライブラリーのＤＮＡを調製し、ＰＣＲ反応で使用した。次の条件下で30サイクルの増幅を行った。すなわち、94℃で１分の変性、35〜40℃で１分のアニーリング、および72℃で１分の伸長である。この反応により、1.3 kBのＤＮＡ断片が得られ、その配列の一部は配列番号６で示される。ノーザンブロット分析は、対応するＲＮＡ（3.3 kb）が遍在し、成人の骨格筋において非常に強く発現されることを示した。
【実施例４】
【００７１】
ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからのヒトｐ６８をコードする配列番号１０の配列の単離
２つのオリゴヌクレオチド（配列番号７）および（配列番号８）をプライマーとして使用し、ヒト胎盤ライブラリーにおけるｃＤＮＡの増幅を行う。ＰＣＲは、Perkin Elmer Amplitaq を使用し、35℃のアニーリング温度で、続いて、10 %のホルムアミドの存在下、72℃で１分の伸長を行うことにより行った。1164 bp のｃＤＮＡ断片を増幅した。順方向および逆方向の20塩基の配列を含むpMOSblueベクター（Amersham）で直接クローニングした後、断片を蛍光プローブを使用して配列分析した。このＰＣＲ断片は次いで、ヒト胎盤λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリー(Clonetech) から10６個のファージをスクリーニングするためのプローブとして使用した。プローブは、Amersham Rediprimeシステムによって合成し、フィルターを、プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（ 6×SSC 、 5×デンハルト液、100 μg/mlのサケの精子、0.25％の SDS）中、45℃で16時間、インキュベートした。フィルターは次いで、室温で１時間、およびハイブリダイゼーション温度で20分間、 2×SSC 、0.05％ SDSで洗浄した。８個の陽性クローンが確認された。それらのうちの２つを精製し、それらのｃＤＮＡを EcoRIで消化して挿入物を切り出した。それらを配列分析のために M13mp18/EcoRI 中にサブクローン化した。配列分析は、エキソヌクレアーゼ III（Nested Deletion キット、 Pharmacia Biotech）によるｃＤＮＡの段階的欠失によって得られる断片に対して行った。断片の大きさの相違は、M13 ベクターの順方向および逆方向の20塩基プライマーの間でのＰＣＲ増幅により分析し、種々の大きさの集団を選択して配列分析を行った。得られた異なる配列を組み立てることにより、ｐ６８のオープンリーディングフレーム全体を再構成することができた。
【実施例５】
【００７２】
ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞でのＧ３ＢＰの過発現
ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのレポーター遺伝子を、ポリオーマウイルスエンハンサーに由来するＲａｓ反応要素の制御下においてトランスフェクションする。これらの要素は、細胞がＳｒｃおよびＲａｓ癌遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターでトランスフェクションされると、15〜30倍刺激される。これらの刺激は、そのタンパク質のオープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡを含む発現ベクターとともに同時トランスフェクションした後、Ｇ３ＢＰタンパク質を発現すると、改変される。Ｇ３ＢＰは、Ｓｒｃによって、およびＲａｓの発癌型によって刺激されるＣＡＴ活性を、用量依存的に阻害する。この観察結果を図１に示す。
【００７３】
同様に、Ｇ３ＢＰタンパク質の発現は、ＳｒｃおよびＲａｓ癌遺伝子によって誘発される病巣形成に対抗する。図２は、この観察結果を説明するものである。
【００７４】
これらの実験から、正常または発癌性Ｒａｓタンパク質によって形質導入されるシグナルの増殖作用に対抗するＧ３ＢＰの能力がはっきり示される。
【００７５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞におけるＧ３ＢＰ過発現のＣＡＴ活性に対する影響。
【図２】ＮＩＨ  ３Ｔ３繊維芽細胞におけるＧ３ＢＰ過発現の、ＳｒｃおよびＲａｓ癌遺伝子によって誘発される病巣形成に対する影響。
【図１】
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【図２】
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