(57)【要約】【課題】  TROYシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物を提供することが本発明の課題である。あるいは本発明は、血液脳関門の物質透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物とその用途の提供を課題とする。【解決手段】  可溶型TROYの発現によりTROYシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物が提供された。このトランスジェニック非ヒト動物は、血液脳関門の透過性が亢進している。したがって、血液脳関門の透過性の亢進を伴う疾患のモデルとして有用である。本発明によって、当該疾患の治療薬のスクリーニングが可能となる。また本発明は、血液脳関門の物質透過性が亢進したモデル動物による、物質の中枢神経に与える影響の検出方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＯＹシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
可溶型ＴＲＯＹ蛋白質の発現、および内在性のＴＲＯＹ蛋白質の発現の抑制の、いずれか、または両方によってＴＲＯＹシグナルが阻害された請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
げっ歯類がマウスである、請求項３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
可溶型ＴＲＯＹ蛋白質が、下記の（ａ）−（ｃ）からなる群から選択されたいずれかの蛋白質である請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト動物；
（ａ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメインを欠失したアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメイン〜Ｃ末端に至る領域を欠失したアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（ｃ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメイン〜Ｃ末端に至る領域を欠失したアミノ酸配列とＴＲＯＹ以外の蛋白質のアミノ酸配列を有する融合蛋白質。
【請求項６】
可溶型ＴＲＯＹ蛋白質の発現、および内在性のＴＲＯＹ蛋白質の発現の抑制の、いずれか、または両方によってＴＲＯＹシグナルを阻害する工程を含む、血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物の製造方法。
【請求項７】
ＴＲＯＹシグナルを阻害する工程が、可溶型ＴＲＯＹ蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程を含む、請求項６に記載の血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物の製造方法。
【請求項８】
次の工程（１）−（３）を含む、被験化合物が血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用の検出方法。
（１）ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物に被験化合物を投与する工程、
（２）前記トランスジェニック非ヒト動物に、被験化合物の投与の前、後、または被験化合物と同時に、脳組織への移行を観察すべきトレーサー化合物を投与する工程、および
（３）血液脳関門を透過して脳に移行したトレーサー化合物の量を測定し、対照と比較して、脳に移行したトレーサー化合物の量が低下したときに、被験化合物が血液脳関門透過性の亢進を抑制する作用が検出される工程。
【請求項９】
次の工程（ａ）および（ｂ）を含む、血液脳関門透過性の亢進を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法；
（ａ）請求項８に記載の方法によって、被験化合物の血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用が検出された被験化合物を選択する工程。
【請求項１０】
次の工程（ａ）および（ｂ）を含む、血液脳関門透過性が亢進した病態を改善するための薬剤のスクリーニング方法；
（ａ）請求項８に記載の方法によって、被験化合物の血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用が検出された被験化合物を選択する工程。
【請求項１１】
血液脳関門透過性が亢進した病態が、脳梗塞の急性期、偏頭痛、脳損傷、外傷性脳浮腫、インフルエンザ脳症、くも膜下出血、エイズ脳症、および多発性硬化症からなる群から選択されたいずれかの疾患である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、被験物質の中枢神経系に与える影響を評価する方法。
（ｉ）ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物に被験化合物を投与する工程、
（ｉｉ）前記トランスジェニック非ヒト動物の中枢神経系の変化を観察する工程、および
（ｉｉｉ）対照と比較して、中枢神経系における変化が観察されたときに、被験化合物の中枢神経系に与える影響が検出される工程。
【請求項１３】
ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物と、トレーサー化合物を含む、被験化合物が血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用の検出用キット。
【請求項１４】
ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物と、前記トランスジェニック非ヒト動物の中枢神経系の変化をモニタリングするための装置を含む、被験化合物が中枢神経に与える作用の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＯＹシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物とその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳において作用するサイトカインやその受容体は、脳に関連した新規な医薬品開発の上で重要な標的となる。たとえば脳において作用するサイトカインとして、次のような分子が同定されている。
栄養因子：nerve growth factorβ（P01138）
brain-derived neurotrophic factor (P23560)
neurotrophin-3 (P20783)
neurotrophin-4 (P34130)
neurotrophin-6α (P34132)
neurotrophin-6β (P34133)
neurotrophin-6γ (P34134)等
ホルモン様サイトカイン：leptin (P41160) 
【０００３】
本出願人も脳に発現が見られるTNF受容体様分子として、TROYを単離している(WO 00/49149)。TROYは、N末端にシグナル配列を持ち、中間部には膜貫通領域と予想される疎水性に富んだアミノ酸領域を含む。TROYの構造的特徴とアミノ酸配列は、TNF受容体スーパーファミリーに属する既知のタンパク質と相同性を有していた。したがってTROYは、TNF受容体スーパーファミリー（Beulter.B,and Huffel.C.V (1994) SCIENCE 264,667-668 Unraveling function in the TNF ligand and receptor families）に属するタンパク質であると考えられた。
【０００４】
更に、ノーザンブロット解析の結果、マウスTROYタンパク質をコードする遺伝子は脳や皮膚に強い発現が見出された。また、皮膚の毛包（hair follicle）や汗腺や歯の発達に関与すると考えられているEdar(Nature Genetics 1999 vol.22. 370-374, 366-369)と高い相同性を示した。従って、TROYタンパク質は、脳機能や皮膚の発達・恒常性の維持に関与していることが期待され、脳機能や皮膚の発達などに関連する因子の精製やクローニング、さらには神経関連疾患の治療薬候補化合物のスクリーニングなどのための有用なツールとなると考えられた。
【０００５】
さて、脳の毛細血管においては、内皮細胞間が密接に連結された構造のために、細胞間隙の物質透過性が厳密に制限されていることが知られている。内皮細胞間の密接な結合はタイトジャンクション(tight junction)と呼ばれている。タイトジャンクションを構成する分子として、occuldin、claudin、あるいはZO-1などの蛋白質が同定された。これらの蛋白質にはいくつかのサブタイプの存在も明らかにされている。そして、このタイトジャンクションによって形成された、血液から脳への物質透過性を制限している組織が、血液脳関門(Blood Brain Barrier;BBB)である。
【０００６】
血液脳関門は、血管と脳の間で、物質の透過性を厳しく制限する一方で、さまざまな物質を能動的に移送するシステムを有していることが明らかにされつつある。たとえば、血液脳関門には、脳の生存に必要なグルコースを血液から脳内に移送するとともに、脳から血液に老廃物である乳酸を移送するシステムが存在する。あるいは、エネルギー生成に必要なATPは、脳においてはクレアチニンとして保存されていると考えられている。血液脳関門には、クレアチニンを移送するためのクレアチニントランスポーター(CRT)の存在も明らかにされている。
【０００７】
血液脳関門が有するさまざまな物質の選択的な移送機構、ならびに物質の透過を制限する機能は、脳の保護と機能維持に必要な重要な機能の一つである。そのため、脳疾患には、血液脳関門の機能異常を伴うものも多い。たとえば脳梗塞（特に急性期）や偏頭痛は、しばしば血液脳関門の透過性の亢進を伴うことが知られている。その他にも、脳損傷、外傷性脳浮腫、インフルエンザ脳症、くも膜下出血、エイズ脳症、および多発性硬化症などの疾患においても、血液脳関門透過性が亢進した病態を伴うことが知られている。したがって、これらの疾患の病態形成には、血液脳関門の物質透過性の亢進が関与していると考えられる。
【０００８】
一方、化合物が生体（人間）に与える作用を予測するために、実験動物にその化合物を投与して、その影響を観察する実験が一般的に行われている。このような実験によって、化合物の中枢神経に及ぼす影響を観察するときに、血液脳関門の存在は、実験を困難にする原因となる。中枢神経、すなわち脳に対する化合物の影響を知るには、化合物が脳内に送り込まれる必要がある。ところが血液脳関門によって、多くの物質は容易には脳に到達できない。特に、経口的に、あるいは血中に投与された化合物は、血液脳関門の働きによって、その大部分が中枢神経に作用できないことになる。したがって、化合物の中枢神経に与える影響を知るために、血液脳関門の透過性が亢進した状態を人為的に作り出すことができれば有用である。
【特許文献１】WO 00/49149
【非特許文献１】SCIENCE 264,667-668,1994
【非特許文献２】Nature Genetics 1999 vol.22. 370-374
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、TROYシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物の提供を課題とする。更に本発明は、TROYシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物を利用して、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を検出するための方法の提供を課題とする。あるいは本発明は、血液脳関門の透過性の亢進を伴う疾患の治療薬のスクリーニング方法の提供を課題とする。また本発明は、これらスクリーニング方法、あるいは化合物の中枢神経に与える影響を評価するための、血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物とその用途の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、TROYタンパク質の機能を生体レベルにおいて明らかにするため、TROYシグナルが阻害された状態を人為的に作り出すことを試みた。TROYは膜貫通領域を備えた膜蛋白質である。またTROYの細胞内領域には、TNFR-associated factor (TRAF)2の結合配列であるTLQEが存在する。TRAF2は、TNF受容体II型のシグナル伝達分子である。さらに本発明者らは、実際にマウスのTROYによって、NF-kB活性化が誘導されることも確認している。したがって、TROYシグナルとは、TROYへのリガンドの結合と、その結果引き起こされる細胞内ドメインへのシグナルの伝達の過程を含む。本発明者は、可溶型TROYによる、細胞上の内在性のTROYに対する競合阻害の影響を解析した。その結果、TROYシグナルを阻害した動物において、血液脳関門の透過性が亢進していることを見出した。
【００１１】
上記のとおり、本発明者は、TROYシグナルの阻害が血液脳関門の物質透過性の亢進をもたらすことを明らかにした。更にこうして得られた血液脳関門の物質透過性が亢進した動物を利用して、物質透過性の亢進を調節する作用を評価し、当該作用を有する物質をスクリーニングできることを見出し本発明を完成した。更に、血液脳関門の物質透過性が亢進した動物を利用して、中枢神経に対する化合物の作用を評価できることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のトランスジェニック非ヒト動物とその用途に関する。
〔１〕ＴＲＯＹシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔２〕可溶型ＴＲＯＹ蛋白質の発現、および内在性のＴＲＯＹ蛋白質の発現の抑制の、いずれか、または両方によってＴＲＯＹシグナルが阻害された〔１〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔３〕非ヒト動物がげっ歯類である、〔１〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔４〕げっ歯類がマウスである、〔３〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔５〕可溶型ＴＲＯＹ蛋白質が、下記の（ａ）−（ｃ）からなる群から選択されたいずれかの蛋白質である〔２〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物；
（ａ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメインを欠失したアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメイン〜Ｃ末端に至る領域を欠失したアミノ酸配列からなる蛋白質、および
（ｃ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメイン〜Ｃ末端に至る領域を欠失したアミノ酸配列とＴＲＯＹ以外の蛋白質のアミノ酸配列を有する融合蛋白質。
〔６〕可溶型ＴＲＯＹ蛋白質の発現、および内在性のＴＲＯＹ蛋白質の発現の抑制の、いずれか、または両方によってＴＲＯＹシグナルを阻害する工程を含む、血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物の製造方法。
〔７〕ＴＲＯＹシグナルを阻害する工程が、可溶型ＴＲＯＹ蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程を含む、〔６〕に記載の血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物の製造方法。
〔８〕次の工程（１）−（３）を含む、被験化合物が血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用の検出方法。
（１）ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物に被験化合物を投与する工程、
（２）前記トランスジェニック非ヒト動物に、被験化合物の投与の前、後、または被験化合物と同時に、脳組織への移行を観察すべきトレーサー化合物を投与する工程、および
（３）血液脳関門を透過して脳に移行したトレーサー化合物の量を測定し、対照と比較して、脳に移行したトレーサー化合物の量が低下したときに、被験化合物が血液脳関門透過性の亢進を抑制する作用が検出される工程。
〔９〕次の工程（ａ）および（ｂ）を含む、血液脳関門透過性の亢進を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法；
（ａ）〔８〕に記載の方法によって、被験化合物の血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用が検出された被験化合物を選択する工程。
〔１０〕次の工程（ａ）および（ｂ）を含む、血液脳関門透過性が亢進した病態を改善するための薬剤のスクリーニング方法；
（ａ）〔８〕に記載の方法によって、被験化合物の血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用が検出された被験化合物を選択する工程。
〔１１〕血液脳関門透過性が亢進した病態が、脳梗塞の急性期、偏頭痛、脳損傷、外傷性脳浮腫、インフルエンザ脳症、くも膜下出血、エイズ脳症、および多発性硬化症からなる群から選択されたいずれかの疾患である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、被験物質の中枢神経系に与える影響を評価する方法。
（ｉ）ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物に被験化合物を投与する工程、
（ｉｉ）前記トランスジェニック非ヒト動物の中枢神経系の変化を観察する工程、および
（ｉｉｉ）対照と比較して、中枢神経系における変化が観察されたときに、被験化合物の中枢神経系に与える影響が検出される工程。
〔１３〕ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物と、トレーサー化合物を含む、被験化合物が血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用の検出用キット。
〔１４〕ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物と、前記トランスジェニック非ヒト動物の中枢神経系の変化をモニタリングするための装置を含む、被験化合物が中枢神経に与える作用の検出用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、TROYシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物が提供された。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、血液脳関門の物質透過性が亢進している。したがって本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、血液脳関門の物質透過性が亢進した病態のモデル動物として有用である。本発明に基づくモデル動物によって、血液脳関門の物質透過性の亢進を伴う疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
【００１３】
本発明によって提供された血液脳関門の物質透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物は、物質の中枢神経に与える影響の評価にも有用である。通常、生体に投与された物質は、血液脳関門の物質透過性の制御機能によって、容易には脳内に到達することはできない。そのため、脳内投与を除けば、正常な血液脳関門機能を維持した実験動物においては、末梢投与によって中枢神経系に与える影響を評価できる化合物の範囲は限られる。本発明のトランスジェニック動物は、血液脳関門の透過性が亢進している。したがって、化合物が、経口的に、あるいは血中に投与された場合でも、脳内に到達できる可能性が高まる。このことは、化合物の中枢神経に与える影響を、より高い感度で評価できることを意味している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、TROYシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明において、TROYシグナルとは、TROYを介したシグナル伝達を言う。より具体的には、たとえば次のようなメカニズムが、本発明におけるTROYシグナルに含まれる。
i) TROYの細胞外領域へのシグナル伝達分子の結合、
ii) シグナル伝達分子の結合に伴うTROYの細胞内領域の活性化、および
iii) TROYの細胞内領域から更に下流のメディエーターへのシグナル伝達
本発明において、TROYシグナルを阻害するメカニズムは制限されない。たとえばi)-iii)に示したTROYシグナルは、それぞれ次に示すようなメカニズムを利用して阻害することができる。これらのメカニズムは、単独で利用することもできるし複数を組み合わせることもできる。
【００１５】
i) TROYの細胞外領域へのシグナル伝達分子の結合
TROYはTNF受容体様分子である。したがって、シグナル伝達物質の細胞外領域への結合によって、細胞内にシグナルを伝達する。一連の過程は、TROY様分子や、シグナル伝達分子のアンタゴニストによって阻害することができる。本発明において、TROY様分子とは、TROYの細胞外領域に結合するシグナル伝達物質とは結合するが、細胞内へのシグナル伝達作用が無い（または低い）分子を言う。具体的には、シグナル伝達物質との結合能を保持した可溶型のTROYをTROY様分子として示すことができる。
【００１６】
その他、シグナル伝達物質に結合してTROYとの結合を阻害する物質も、TROY様分子に含まれる。あるいは、シグナル伝達物質に対して競合阻害作用を有するアンタゴニストを利用して、TROYの細胞外領域へのシグナル伝達の少なくとも一部を阻害できる可能性がある。アンタゴニストとは、TROYとの結合活性は有するが、TROYへのシグナル伝達作用が低い、あるいは持たない物質である。
TroyはNogo-66 receptor、LINGO-1と複合体を形成し、myelin inhibitor (myelin-associated glycoprotein, oligodendrocyte myelinglycoprotein)の受容体として機能することが報告されている(Neuron, 2005, vol.45, 345-351, Neuron, 2005, vol.45, 353-359)。したがって、両者の結合をアンタゴナイズしうる物質によって、TROYへのシグナル伝達を阻害することができる。
【００１７】
これらの阻害メカニズムに必要な物質を発現するトランスジェニック動物を作製すれば、本発明のTROYシグナルが阻害されたトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。本発明のトランスジェニック動物において、TROYシグナルの阻害に必要な物質を発現する遺伝子は、ホモであってもヘテロであっても良い。
【００１８】
ii) シグナル伝達分子の結合に伴うTROYの細胞内領域の活性化
TROYは細胞内へのシグナル伝達機能を有する。したがって、この過程を阻害することによって、TROYシグナルを阻害することもできる。たとえば、TROYの細胞内領域の改変や欠失によって、細胞内へのシグナル伝達を阻害することができる。具体的には、TROYのTRAF2結合配列の改変や欠失によって、細胞内へのシグナル伝達を効果的に阻害することができる。あるいは、TROYの細胞内領域を、他の蛋白質のアミノ酸配列に置換しても同様の阻害効果を期待できる。更に、TROYをはじめとするTNF受容体スーパーファミリーは、３量体を形成してシグナルを伝達する。したがって、細胞膜上における３量体の形成に必要な領域を改変したTROYも、シグナル伝達の阻害に有効である。更にTROYの機能を完全に欠失した改変体を発現させる、あるいはTROYの発現を抑制することで、そのシグナルを阻害することもできる。
【００１９】
これらの阻害メカニズムに基づく本発明のトランスジェニック動物は、内在性のTROYに代えて、改変型のTROYを発現するトランスジェニック動物を作製することによって得ることができる。こうして得られるトランスジェニック動物は、言い換えれば、シグナル伝達作用を抑制した改変TROYをノックインしたトランスジェニック動物である。あるいは、内在性のTROYの機能、あるいは発現そのものを抑制したノックアウト動物を作製し、本発明のトランスジェニック動物として利用することもできる。本発明のトランスジェニック動物において、TROYシグナルの阻害に必要な改変TROYを発現する遺伝子は、ホモであってもヘテロであっても良い。同様に、内在性TROY遺伝子のノックアウト動物においても、遺伝子の改変は、ホモであってもヘテロであっても良い。
【００２０】
iii) TROYの細胞内領域から更に下流のメディエーターへのシグナル伝達の阻害
活性化したTROYは、更に細胞内のメディエーターにシグナルを伝達する。したがって、この過程を阻害することによって、TROYシグナルを阻害することもできる。たとえば、TROYはTRAF2に結合すると考えられる。したがって、TRAF2のTROY結合ドメインを修飾することによって、TROYシグナルを阻害することもできる。これらの阻害メカニズムに基づく本発明のトランスジェニック動物は、内在性のTRAF2に代えて、改変型のTRAF2を発現するトランスジェニック動物を作製することによって得ることができる。こうして得られるトランスジェニック動物は、言い換えれば、シグナル伝達作用を抑制した変異型TRAF2をノックインしたトランスジェニック動物である。本発明のトランスジェニック動物において、TROYシグナルの阻害に必要な改変TROYを発現する遺伝子は、ホモであってもヘテロであっても良い。
【００２１】
上記のi)-iii)に例示したTROYシグナルの阻害メカニズムの中では、i)可溶型TROYの発現による阻害が好ましい。本発明において、可溶型のTROYとは、TROYの細胞外領域のシグナル伝達物質との結合活性を維持し、かつ細胞外に遊離するTROYの変異体を言う。より具体的には、細胞外に分泌するための分泌シグナルを含み、かつ細胞膜結合領域に変異あるいは欠失を有するTROYが、本発明における可溶型TROYに含まれる。本発明における可溶型TROYには、たとえば次のような改変TROYが含まれる。
（ａ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメインを欠失したアミノ酸配列を含む蛋白質、
（ｂ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメイン〜Ｃ末端に至る領域を欠失したアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）ＴＲＯＹ蛋白質の膜結合ドメイン〜Ｃ末端に至る領域を欠失したアミノ酸配列とＴＲＯＹ以外の蛋白質のアミノ酸配列を有する融合蛋白質
【００２２】
本発明におけるTROY蛋白質は、上記可溶型のTROYを発現させる動物において、内在性のTROYシグナルを阻害できる限り、その由来は限定されない。たとえば、ヒトTROYの細胞外領域の構造を有する可溶型TROYは、マウスにおいてTROYシグナルを効果的に抑制することが確認された。したがって、トランスジェニック動物としてマウスを利用する場合、好ましい可溶型TROYは、マウスあるいはヒト由来の細胞外構造を含むTROY変異体である。マウスとヒトのTROYのアミノ酸配列（およびそれをコードする塩基配列）は、それぞれ次のAccession No.で参照することができる。ヒトTROYの１６９−１９３位は膜結合ドメイン、細胞外領域は３０−１６８に相当する。
マウス GenBank Acession No. BAB03267 (AB040432)
ヒト   GenBank Acession No. AAQ89247 (AB040434)
【００２３】
更に、本発明における可溶型TROYは、TROYシグナルの阻害作用、すなわちTROYの細胞外領域に結合してシグナルを伝達する物質との結合能を維持している限り、細胞外領域に変異を含むことができる。本発明における変異体としては、たとえば次のようなものを示すことができる。
I. 天然型TROYのアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、天然型のタンパク質と機能的に同等なタンパク質
II.天然型のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによってコードされ、天然型のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質
【００２４】
なお本発明において機能的に同等な蛋白質とは、TROYにシグナルを伝達する物質との結合能を維持している蛋白質を言う。TROYに結合してシグナルを伝達する物質は、リガンドとも言う。ある蛋白質がリガンドとの結合能を維持していることは、実際にリガンドとの結合を確認することによって知ることができる。TROYはNF-kBを介して細胞内にシグナルを伝達する。したがって、NF-kB結合サイトを含むレポータープラスミドを利用して、シグナルの伝達を検出することができる。このようなレポータープラスミドとしては、kB-lucなどを示すことができる。レポータープラスミドkB-lucは、HTLV-1プロモーターの基本プロモーターdN55（癌,79号,800-804(1988)）の上流に5つのNF-kB結合サイトを、下流にルシフェラーゼ遺伝子を有する。TROYの変異体を発現する細胞において、リガンドの存在下でレポータープラスミドのシグナルが観察されれば、当該変異体がリガンドとの結合能を維持していることが確認できる。リガンドとの結合能を維持している変異体に由来する細胞外領域は、本発明における可溶型TROYに利用することができる。
【００２５】
このようなタンパク質を単離するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、天然型のTroyタンパク質のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、これらタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。アミノ酸配列に変異を導入するための、部位特異的変異誘発法として以下のような論文を参照することができる。
Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、
- Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、
- Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and  Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、
- Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、
-Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）
【００２６】
また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、天然型のTroyタンパク質のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、これらタンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは、15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内である。
【００２７】
本発明において、変異するアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば以下に示すような構造的な特徴を共有するアミノ酸残基は、一般に、互いに類似の性質を保持していると予測することができる。したがって、相互にアミノ酸残基を置換しても、蛋白質の機能が維持される可能性が高い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれる。
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
【００２８】
また、機能的に同等なタンパク質を単離する方法として、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）を利用した方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、天然型のタンパク質をコードするDNAもしくはその一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAからこれらタンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することも通常行いうることである。このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されたDNAがコードするタンパク質は、本発明における機能的に同等なタンパク質に含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、哺乳動物のホモログが挙げられる。
【００２９】
機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションは、例えば、ストリンジェンシーが、10％ホルムアミド、5xSSPE、1xデンハルト溶液、1xサケ精子DNAの条件で行うことができる。より好ましい条件（よりストリンジェントな条件）としては、25％ホルムアミド、5xSSPE、1xデンハルト溶液、1xサケ精子DNAの条件であり、さらに好ましい条件（さらにストリンジェントな条件）としては、50％ホルムアミド、5xSSPE、1xデンハルト溶液、1xサケ精子DNAの条件である。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては上記ホルムアミド濃度以外にも複数考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、ハイブリダイゼーションにかえて、天然型のタンパク質をコードするDNAの一部をプライマーに用いる遺伝子増幅法を利用して単離することもできる。遺伝子増幅法としてはPCRを利用できる。
【００３０】
これらハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術により単離されるDNAがコードするタンパク質は、通常、天然型のタンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、70％以上の相同性、好ましくは 85％以上の相同性、さらに好ましくは 95％以上の相同性である。蛋白質の相同性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
【００３１】
本発明における好ましいトランスジェニック非ヒト動物は、例えば、可溶型TROY蛋白質をコードするDNAの導入により、血液能関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物である。TROYは、脳をはじめとする神経細胞におけるシグナル伝達に関与する分子であることが明らかにされている。しかしそのシグナル伝達を阻害することによって、血液能関門の透過性が亢進することは、本発明によって明らかにされた新規な知見である。特に、可溶型のTROYの作用によって、血液脳関門の透過性が亢進した動物を作製できることは、知られていない。
【００３２】
すなわち本発明は、可溶型ＴＲＯＹ蛋白質の発現、および内在性のＴＲＯＹ蛋白質の発現の抑制の、いずれか、または両方によってＴＲＯＹシグナルを阻害する工程を含む、血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物の製造方法に関する。あるいは本発明は、可溶型ＴＲＯＹ蛋白質の発現、および内在性のＴＲＯＹ蛋白質の発現の抑制の、いずれか、または両方によってＴＲＯＹシグナルを阻害された非ヒト動物の、血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物としての使用に関する。本発明において、ＴＲＯＹシグナルを阻害する工程としては、具体的には、可溶型ＴＲＯＹ蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製する工程を示すことができる。可溶型ＴＲＯＹ蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト動物は、(1)可溶型TROYを発現可能に保持したベクターを胚に導入し、(2)当該胚から発生した個体を選択することによって製造することができる。トランスジェニック非ヒト動物の具体的な作製方法は以下に述べるとおりである。
【００３３】
本発明において、血液脳関門の透過性の亢進とは、正常な状態と比較して、物質の透過性が亢進している状態を言う。正常な血液脳関門は、原則的に、限られた物質の透過のみを許容する。人為的に投与された化合物の多くは、通常、血液脳関門を透過することはない。したがって、正常な動物において、透過性が確認できない物質が、トランスジェニック非ヒト動物の血液脳関門で透過するとき、透過性が亢進していることが確認できる。あるいは、正常な動物における透過性と比較して、T細胞系列の分化または発生が抑制されている状態のトランスジェニック非ヒト動物を意味する。また、トランスジェニック非ヒト動物の血液脳関門における透過性が上昇しているときも、透過性が亢進していることを確認できる。血液脳関門の透過性を評価する方法は公知である。
【００３４】
たとえば、追跡可能な化合物を血中に投与し、脳組織への移行を追跡することによって、血液脳関門の透過性を評価することができる。血中に投与される追跡可能な化合物は、「プローブ」と呼ばれる。血液脳関門の透過性を評価するためのプローブには、色素や蛋白質を利用することができる。より具体的には、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(horseradish peroxidase; HRP)、あるいは内在性のアルブミンやイムノグロブリンなどの血液蛋白質をプローブとして利用することができる。色素としては、エバンスブルー(Evans blue; Azovan blue)などがプローブとして公知である。エバンスブルーは、アルブミンとのコンプレックスとして用いられることもある。脳組織に移行したプローブは、組織の顕微鏡観察によって検出することができる。あるいは、脳のホモジェネートに含まれるプローブを検出して、移行レベルを決定することもできる。
【００３５】
本発明における「非ヒト動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いて遺伝子の発現を人為的に改変するのに適した非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）であり、最も好ましくはマウスである。
【００３６】
トランスジェニック動物の作製方法は公知である。例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980)に記載の方法により、トランスジェニック動物を得ることができる。具体的には、たとえば可溶型TROYをコードするDNAを動物の全能細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させる。得られた個体のうち、体細胞および生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって、目的とするトランスジェニックマウスを作製することができる。遺伝子を導入する全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するES細胞のような培養細胞などが挙げられる。より詳細には、後述の実施例に記載の方法により、トランスジェニック動物を作製することができる。当業者においては、上記の方法を適宜改変して、所望の遺伝子の発現が改変されたトランスジェニック動物を作製することができる。
【００３７】
上記の「可溶型TROYをコードするDNA」は、該DNAを導入すべき動物の細胞において発現可能なプロモーターに連結した組み換え遺伝子コンストラクト（発現ベクター）とするのが一般的である。本発明の組み換え遺伝子コンストラクトは、適当な宿主を利用してクローニング可能なベクターに、前記可溶型TROYをコードするDNAと、その上流にプロモーターとを挿入し、クローニングすることによって構築することができる。
【００３８】
本発明に利用することができるプロモーターは、動物細胞で発現可能なプロモーターであれば特に制限されない。本発明においては、可溶型TROYは、血中に分泌されればよい。したがってプロモーターは、全身性の発現を誘導するプロモーターのみならず、部位特異的なプロモーターを用いることもできる。更には、誘導性(inducible)のプロモーターを利用することもできる。具体的には、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40）等のウィルスプロモーターを用いることができる。例えば、SV40のプロモーターを使用する場合は、Mulliganらの方法（Nature (1990) 277, 108）に従って、上記コンストラクトを作製することができる。コンストラクトには、エンハンサーやターミネーターなどの付加的な発現制御領域を付加することもできる。
【００３９】
可溶型TROYは、先に述べたように、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。そのためには、適当なスプライシングドナー配列とイントロン配列を介して、他の蛋白質をコードする遺伝子を配置する。あるいは、TROYの遺伝子に他の蛋白質をコードする遺伝子を融合させてコンストラクトを構築することもできる。TROYと融合させるTROY以外の蛋白質には、任意の蛋白質を用いることができる。血中で滞留性を向上させる蛋白質と融合させることによって、可溶型TROYの滞留性の向上が期待できる。たとえば、イムノグロブリンの定常領域やアルブミンを含む蛋白質は、血中滞留性の向上に貢献すると考えられている。したがって、TROYの細胞外領域と、イムノグロブリンのFcドメインやアルブミンとの融合蛋白質は、本発明における可溶型TROYとして好ましい。
【００４０】
コンストラクトを動物に導入するためのベクターとしては、導入遺伝子を動物の生体内で発現誘導でき得るものであれば特に限定されない。当業者において周知の発現ベクターを利用することができる。具体的には、pCAGGSベクター(Gene 108(1991) p193-200)などを用いることができる。
【００４１】
組み換え遺伝子コンストラクトを保持したベクターは、十分に精製されトランスジェニック動物の作製に用いられる。通常、トランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに、前記コンストラクトを導入することによって作製される。コンストラクトを導入する細胞としては、通常、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階、より具体的には単細胞あるいは受精卵細胞の段階で、通常8細胞期以前のものが利用される。上記コンストラクトの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法等が公知である。さらに、こうして得られた形質転換細胞を上述の胚芽細胞と融合させることによりトランスジェニック動物を作製することも可能である。
【００４２】
トランスジェニック動物の作製が可能なあらゆる非ヒト動物に由来する細胞に、上記コンストラクトを導入することができる。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、あるいはネコ等の細胞を利用することができる。マウスの場合、例えば、排卵誘発剤を投与したメスのマウスに正常なオスのマウスを交配させるて、コンストラクトを導入するための受精卵を回収することができる。回収されたマウス受精卵には、一般に雄性前核へのマイクロインジェクションによりコンストラクトが導入される。コンストラクトを導入した細胞は、体外での培養の後、導入に成功したと思われる細胞が代理母の卵管に移植され、トランスジェニック動物が誕生する。代理母には、通常、精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
【００４３】
生まれたトランスジェニック動物は、導入すべきDNAが組み込まれていることを確認した上で、F1動物の誕生のために正常な動物と交配させる。一般にコンストラクトとして導入した外来DNAは、ゲノムの同一の部分に複数コピーが直列に組み込まれる。通常はこの組み込みコピー数が多いほど、多量の遺伝子発現につながり、より明瞭な表現型が期待できるためである。体細胞ゲノムにおいて、導入すべきDNAが正しい方向で組み込まれていることは、コンストラクトに特異的なプライマーを用いたPCRや特異的なプローブを用いたサザンブロット法によって確認することができる。
【００４４】
この交配の結果誕生するF1動物の中で、体細胞に外来遺伝子（可溶型TROYをコードするDNA）を有するもの（ヘテロザイゴート）は、生殖細胞に外来遺伝子（可溶型TROYをコードするDNA）を伝えることができるトランスジェニック動物である。F1動物の中から体細胞に外来遺伝子（可溶型TROYをコードするDNA）を保持するものを選び、これらを両親とすることによって、F2動物であるホモザイゴートを得ることができる。
【００４５】
本発明のトランスジェニック動物は、可溶型TROYを発現するものであれば、上記のトランスジェニック動物のいずれの世代の動物であってもよい。例えば、可溶型TROYの外来DNAをヘテロで保持するトランスジェニック動物であっても、可溶型TROYが発現しているものであれば、本発明のトランスジェニック動物として利用することができる。あるいは生殖細胞に外来性の遺伝子を持たないトランスジェニックキメラ動物であっても、可溶型TROYを発現する限り、本発明におけるTROYシグナルが阻害されたトランスジェニック動物に含まれる。その他、アンタゴニストなどの作用によってTROYシグナルの阻害を実現する場合には、可溶型TROYに代えて、当該アンタゴニストをコードするDNAを用いて、目的とするトランスジェニック動物を得ることができる
【００４６】
あるいは、内在性(endogenous)のTROYの機能や発現を阻害することによって、本発明における、TROYシグナルが阻害されたトランスジェニック動物を作製することもできる。内在性遺伝子の機能を阻害する方法は公知である。
本発明において、内在性(endogenous)のTROYの機能や発現の阻害の対象となる動物は、特に限定されない。好ましくはマウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類である。特に、動物モデルとして用いることを考慮する場合には、マウスが好ましい。また、TROY遺伝子の改変の対象となるES細胞も特に限定されない。具体的には、げっ歯類、中でもマウスに由来するものが好ましい。ES細胞は、周知の方法により取得し、維持することができる(Doetschman et al. (1985) J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45参照)。
【００４７】
ここで、「TROY遺伝子の発現が抑制された」とは、TROY遺伝子対の両方の発現が抑制された完全な抑制(ヌル対立遺伝子)の他、遺伝子対の一方の発現のみが抑制された不完全に抑制された状態を含む。本発明においては、TROY遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、TROY遺伝子を欠損させる方法、およびTROY遺伝子の発現制御領域を欠損させる方法を挙げることができる。内在性遺伝子、および発現制御領域の欠損方法としては、遺伝子ターゲティングを示すことができる。中でも、TROY遺伝子対の一方または両方に外来遺伝子を挿入して遺伝子を不活性化する方法（ノックアウト、あるいはノックイン）は好ましい。その他、RNA干渉(RNA interference;RNAi)効果、ドミナントネガティブ効果、あるいはアンチセンス効果などによる遺伝子の機能阻害を、TROY遺伝子の発現抑制に利用することもできる。RNAiによる遺伝子の発現制御効果は公知である(Nature Biothechnol.2003,21,559-561)。
【００４８】
TROY遺伝子の発現制御領域は、例えば、TROYの塩基配列を利用してゲノムDNAから公知の方法により得ることができる。たとえば、S1マッピングなどの方法 (細胞工学 別冊8 新細胞工学プロトコール、東京大学医科学研究所制癌研究部編(1993)362〜374頁、秀潤社) によって、転写開始点を特定することができる。一般に遺伝子の発現制御領域は、転写物の5’末端の塩基配列をプローブとしてゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることで探知される。プローブには、15〜100bp、好ましくは30〜50bpの長さの塩基配列が利用される。次いで、ゲノムDNAライブラリーから得られたポリヌクレオチドを短縮化または断片化し、レポーター遺伝子を利用してその発現能を調べることにより、その転写活性を確認することができる。
【００４９】
これらの実験的な手法以外に、以下のような発現制御領域を予測するためのプログラムも開発されている。これらのプログラムによって予測された発現制御領域についても、実験的な手法と同様に、断片化した塩基配列について、レポーター遺伝子を使って、実際に転写活性を確認することができる。
遺伝子の発現制御領域を予測するためのプログラム：
Neural Network (http://www.fruitfly.org./seq_tools/promoter.html); Reese et al. (1996) Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, Hunter and Klein ed., World Scientific Publishing Co.)等の
発現制御領域の活性最小単位を予測するプログラム：
http://biosci.cbs.umn.edu./software/proscan/promoterscan.htm
【００５０】
本発明における遺伝子改変マウスは、例えば、以下のようにして作製することができる。まず、マウスからTROY遺伝子のエクソン部分を含むDNAを単離し、このDNA断片に適当な遺伝子を挿入し、ターゲティングベクターを構築する。DNA断片に挿入する遺伝子としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子(ネオマイシン耐性遺伝子等)のマーカー遺伝子を用いることができる。マーカー遺伝子として抗生物質耐性遺伝子を用いた場合には、細胞を抗生物質を含む培地中で培養することにより、細胞に該ベクターが導入されたことを確認することができる。
【００５１】
ターゲティングベクターは、細胞中に挿入されることにより天然のTROY遺伝子の転写を妨げるか、または、阻止するようにゲノムDNAへと相同組換えにより組込まれる。ベクターは、エレクトポーレション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法等によりES細胞株に導入され、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。さらに効率的な組換え細胞の選抜を行うために、ターゲティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子等を結合させておくことにより、非相同組換えを起こした細胞株を排除することもできる。また、ターゲティングベクターにジフテリアトキシンAフラグメント(DT-A)遺伝子等を結合させ、非相同組換えを起こした細胞株を排除する方法も知られている。これらの技術は。いずれも本発明における変異細胞または動物に利用することができる。また、PCR及びサザンブロットにより相同組換え検定を行い、TROY遺伝子の遺伝子対の少なくとも一方が不活性化された細胞株を効率的に得ることもできる。
【００５２】
得られたES細胞株をマウス胚盤胞にインジェクションしてキメラマウスを得ることができる。相同組換えを生じた細胞株の選抜においては、相同組換えの箇所以外における遺伝子挿入による遺伝子破壊の恐れもある。したがって、複数のクローンを用いてキメラの作製を行うことが好ましい。このキメラマウスを交配させることで、TROY遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、TROY遺伝子対の両方を不活性化したマウスを得うることができる。ES細胞が樹立されているマウス以外の動物においても、同様の手法により、TROY遺伝子改変細胞及び動物を得ることができる。
【００５３】
また、TROY遺伝子の遺伝子対の両方が不活性化されたES細胞株は、以下の方法によっても取得することができる。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化したES細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対の両方に抗生物質耐性マーカーを導入された細胞株を選択することができる。つまり、TROY遺伝子の遺伝子対の両方が不活性化されたES細胞株を得ることができる。
あるいは、遺伝子対の一方を不活性化したES細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株の選択することによっても、TROY遺伝子の遺伝子対の両方が不活性化されたES細胞株を得ることができる。再度の相同組換えを行う場合には、ターゲティングベクターに挿入するマーカー遺伝子を、一回目の相同組換え用と二回目の相同組換え用とで異なるものを使用することが好ましい。このようにして作製されたTROY遺伝子の発現を抑制されたトランスジェニック動物は、TROYシグナルが抑制されたトランスジェニック動物として利用することができる。
【００５４】
本発明によって、血液脳関門の透過性が亢進したモデル動物が提供された。したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用の検出に有用である。すなわち本発明は、次の工程（１）−（３）を含む、被験化合物の、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用の検出方法を提供する。
（１）ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物に被験化合物を投与する工程、
（２）前記トランスジェニック非ヒト動物に、被験化合物の投与の前、後、または被験化合物と同時に、脳組織への移行を観察すべきトレーサー化合物を投与する工程、および
（３）血液脳関門を透過して脳に移行したトレーサー化合物の量を測定し、対照と比較して、脳に移行したトレーサー化合物の量が低下したときに、被験化合物が血液脳関門透過性の亢進を抑制する作用が検出される工程。
【００５５】
本発明の方法によって血液脳関門透過性の亢進を抑制する作用が検出された被験化合物を選択すれば、当該作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。すなわち本発明は、次の工程（ａ）および（ｂ）を含む、血液脳関門透過性の亢進を抑制する作用を有する化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）前記工程（１）−（３）を含む本発明の方法によって、被験化合物の血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用が検出された被験化合物を選択する工程。
【００５６】
血液脳関門の透過性の亢進は、脳梗塞急性期や偏頭痛などの疾患の重要な病態の一つである。したがって、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を有する化合物は、血液脳関門の透過性の亢進を伴う疾患の治療剤としての用途が期待できる。すなわち本発明は、次の工程（ａ）および（ｂ）を含む、血液脳関門透過性が亢進した病態を改善するための薬剤のスクリーニング方法に関する。
（ａ）前記工程（１）−（３）を含む本発明の方法によって、被験化合物の血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用を検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において、血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用が検出された被験化合物を選択する工程。
【００５７】
本発明においては、被験化合物とともに、トレーサー化合物が投与される。一般に、被験化合物とトレーサーは、末梢血中に投与することができる。被験化合物が、血中以外の投与が可能な場合には、適宜、投与方法を選択することができる。具体的には、経口的、経皮的、あるいは経気道的投与などを選択することもできる。トレーサー化合物も同様に、投与される化合物の性状に応じた投与方法を選択することができる。
【００５８】
本発明における被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。被験化合物がタンパク質であれば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に該遺伝子を導入することも可能である。
【００５９】
一方、本発明において、トレーサー化合物とは、生体への投与の後に、血液脳関門を介した脳組織への移行を追跡しうる任意の化合物を言う。血液脳関門の透過性を評価するためのトレーサー化合物には、先にプローブとして例示した色素や蛋白質などを利用することができる。すなわち、正常な状態では、血液脳関門を介する脳組織への移行が制限されている化合物は、本発明におけるトレーサー化合物として利用される。中でも検出が容易な化合物は、トレーサー化合物として好ましい。本発明において、トレーサー化合物と被験化合物の投与のタイミングは任意である。すなわち、前記トランスジェニック非ヒト動物に、被験化合物の投与の前、後、または被験化合物と同時に、脳組織への移行を観察すべきトレーサー化合物を投与することができる。
【００６０】
より具体的には、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(horseradish peroxidase; HRP)、あるいは内在性のアルブミンやイムノグロブリンなどの血液蛋白質をトレーサー化合物として利用することができる。色素としては、エバンスブルー(Evans blue; Azovan blue)などを用いることができる。エバンスブルーは、アルブミンとのコンプレックスとして用いられることもある。脳組織に移行したトレーサー化合物は、組織の顕微鏡観察によって検出することができる。あるいは、脳のホモジェネートに含まれるトレーサー化合物を検出して、移行レベルを決定することもできる。トレーサー化合物として、アルブミンなどの内在性の物質を利用する場合には、外来性のトレーサー化合物を投与する必要は無い。内在性の物質をトレーサー化合物とする場合には、トランスジェニック非ヒト動物は、予めトレーサー化合物を投与された状態にあるとみなすことができる。
【００６１】
本発明において、血液脳関門の物質の透過性を調節する作用は、対照との比較によって評価することができる。たとえば、被験化合物を投与していないトランスジェニック動物における、トレーサー化合物の脳への移行レベルを対照とすることができる。被験化合物が生理食塩水などの溶媒とともに投与されるときには、溶媒のみを投与した場合の移行レベルを対照とすることもできる。あるいは、予め、血液脳関門の物質の透過性を調節する作用を有することが明らかな物質を投与した場合の、トレーサー化合物の脳への移行レベルを対照とすることもできる。この場合、一定の調節作用と比較して、より調節作用の大きい物質を見出すことができる。
【００６２】
本発明の、血液脳関門の物質の透過性を調節する作用を検出する方法、あるいはこの方法に基づく当該作用を有する化合物のスクリーニング方法に必要な要素は、予め組み合わせてキットとすることができる。すなわち本発明は、ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物と、トレーサー化合物を含む、被験化合物が血液脳関門の透過性の亢進を調節する作用の検出用キットを提供する。本発明のキットは、当該作用を有する化合物のスクリーニング方法を実施するためのキットとして利用することができる。本発明のキットには、目的とする作用を有しないことが明らかな化合物からなる陰性対照、あるいは目的とする作用を有することを予め確認した化合物からなる陽性対照を、付加的に組み合わせることができる。更に、検出方法、ならびにスクリーニング方法を実施するためのプロトコルを解説した手順書を組み合わせることができる。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物は、血液脳関門の物質透過性の亢進の調節に有用である。血液脳関門の物質透過性の亢進の調節を通じて、血液脳関門の物質透過性の亢進を伴う疾患の治療を可能とする。このような疾患には、脳梗塞急性期や偏頭痛が含まれる。すなわち本発明は、前記スクリーニングによって選択された化合物を有効成分として含有する、血液脳関門の物質透過性の亢進を調節するための薬剤を提供する。
【００６４】
血液脳関門の物質透過性の亢進や、あるいは血液脳関門の透過制御機能の破綻は、以下のような疾患を構成する重要な病態であることが示されている。したがって、本発明によって提供された血液脳関門の物質透過性が亢進した病態のモデル動物は、以下のような疾患のモデル動物として有用である。更に、当該モデル動物を利用したスクリーニング方法を通じて選択された薬剤は、以下に示す疾患の治療薬として有用である。
脳梗塞急性期:Neuropatol Pol. 1990;28(1-2):1-17.
偏頭痛:Pathol Biol (Paris). 1992 Apr;40(4):313-7.
脳損傷（外傷性脳浮腫）:Anesteziol Reanimatol. 2002 Nov-Dec;(6):17-9
インフルエンザ脳症:J Med Invest. 2003 Feb;50(1-2):1-8.
くも膜下出血:Acta Neurochir (Wien). 1985;77(3-4):110-32.
エイズ脳症:Ann Neurol. 1992 Nov;32(5):658-66.
多発性硬化症（Multiple sclerosis;MS）:Mult Scler. 2003 Dec;9(6):540-9.
【００６５】
すなわち本発明は、前記スクリーニングによって選択された化合物を有効成分として含有する、血液脳関門の物質透過性が亢進した病態を伴う疾患の治療剤を提供する。あるいは本発明は、前記スクリーニングによって選択された化合物を投与する工程を含む、血液脳関門の物質透過性が亢進した病態を伴う疾患の治療方法に関する。更に本発明は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物の、血液脳関門の物質透過性が亢進した病態を伴う疾患の治療剤の製造における使用に関する。また本発明は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物の、血液脳関門の物質透過性が亢進した病態を伴う疾患の治療における使用に関する。
【００６６】
本発明によって選択された化合物をヒトや他の動物のための薬剤として使用する場合には、本発明の化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与することもできる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に投与することができる。あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用することもできる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することできる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６７】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００６８】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
【００６９】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
【００７０】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することができる。
【００７１】
化合物の投与量は、経口投与の場合、一般的に成人（体重60kgとして）においては、1日あたり約0.1から100mg、好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約1.0から20mgである。一般に化合物の投与量は、症状により、適宜調節することができる。また化合物が継続して投与される場合には、治療効果に応じて、投与量を調節することもできる。
【００７２】
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は、例えば注射剤の形では通常成人（体重60kgとして）においては、通常、1日当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射により投与することができる。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法に応じて、適宜調節することができる。
【００７３】
本発明によって、TROYシグナルの阻害が、血液脳関門の透過性を亢進させることが明らかにされた。血液脳関門の透過性が亢進した状態にあるトランスジェニック非ヒト動物は、血液脳関門の機能が正常な状態と比較して、末梢に投与された化合物が、より容易に脳に到達する。このような動物は、化合物の、中枢神経に与える影響の評価に有用である。すなわち本発明は、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む、被験物質の中枢神経系に与える影響を評価する方法を提供する。
（ｉ）ＴＲＯＹシグナルの阻害によって血液脳関門の透過性が亢進したトランスジェニック非ヒト動物に被験化合物を投与する工程、
（ｉｉ）前記トランスジェニック非ヒト動物の中枢神経系の変化を観察する工程、および
（ｉｉｉ）対照と比較して、中枢神経系における変化が観察されたときに、被験化合物の中枢神経系に与える影響が検出される工程。
【００７４】
本発明において、被験化合物とは、中枢神経系に対する影響を評価すべきあらゆる物質を利用することができる。たとえば、医薬品開発においては、中枢神経系に与える影響の評価は必須である。本発明によれば、被験化合物が容易に脳組織に到達することから、被験化合物の中枢神経系に与える影響を、鋭敏に、かつ迅速に評価することができる。本発明によって、化合物が中枢神経に与えるさまざまな影響を知ることができる。たとえば、医薬品開発においては、化合物の中枢毒性、あるいは神経毒性などと呼ばれる影響が重要である。これらの毒性は、神経中枢に加え、呼吸中枢や消化中枢のような生存に必要な機能中枢、あるいは運動中枢のような随意運動のための中枢に対する障害作用を言う。本発明は、化合物の中枢毒性あるいは神経毒性の検出に有用である。
正常な血液脳関門機能を備えた実験動物においては、被験化合物が脳に達しない可能性が常に伴う。つまり、血液脳関門を通過しない化合物については、の中枢神経に与える作用の評価はできないことを意味する。あるいは被験化合物が血液脳関門を通過したとしても、通過に時間を要したり、通過する化合物のレベルが不十分な場合には、中枢神経に与える影響を鋭敏に観察することは難しい。本発明の方法によれば、このような化合物であっても、迅速にかつ鋭敏に、その中枢神経系に与える影響を評価することができる。
【００７５】
被験化合物を投与されたトランスジェニック非ヒト動物は、投与の後、中枢神経系の変化が観察される。中枢神経系の変化を知ることができる任意の方法を本発明に利用することができる。一般に中枢神経系に及ぼす評価は、動物の行動の変化の観察によって評価される。たとえば、中枢神経毒性を評価する方法として、ラットやマウスを対象としてIrwinの変法(Samuel Irwin, Psychopharmacologia (Berl.), 13, p222-257(1968))や機能観察総合評価法 (Functional observational battery : FOB)という方法が広く利用されている。これらの方法は、動物の行動や生体反応の変化を総合的に評価するための手法である。
【００７６】
本発明によって、ＴＲＯＹシグナルの阻害によって、血液脳関門の透過性の亢進がもたらされることが明らかになった。この知見に基づいて、脳への薬剤の投与方法を実現することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む、脳組織への薬剤送達方法を提供する。
（１）ＴＲＯＹシグナルを阻害する工程、および
（２）脳組織に送達すべき薬剤を投与する工程
本発明において、ＴＲＯＹシグナルを阻害する工程としては、たとえば可溶型ＴＲＯＹを投与する工程を示すことができる。つまり、可溶型ＴＲＯＹと脳組織に送達すべき薬剤とを投与することによって、脳組織に当該薬剤を送達することができる。あるいは本発明は、以下の成分を配合した、脳に薬剤を送達するための医薬組成物を提供する。
（ａ）ＴＲＯＹシグナルの阻害剤、および
（ｂ）脳組織に送達すべき薬剤
【００７７】
本発明の医薬組成物において、ＴＲＯＹシグナルの阻害剤とは、具体的には可溶型ＴＲＯＹを示すことができる。本発明の脳組織への薬剤送達方法、あるいは脳に薬剤を送達するための医薬組成物において、脳組織に送達すべき薬剤とは、脳関連疾患の治療および／または予防に利用することができる任意の薬剤を用いることができる。本発明においては、ＴＲＯＹシグナルの阻害によって、血液脳関門の透過性が亢進する。その結果、薬剤単独での投与では、脳組織への移行性が期待できない薬剤であっても、迅速に、脳組織に送達することができる。本発明は、脳への薬剤送達(Drug Derivery)のための新たなアプローチを実現した。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。
【実施例】
【００７８】
〔実施例１〕可溶型のTROYを組み込んだトランスジェニックマウスの作製
TROYの中枢神経系における役割を検討するため、可溶型のTROYをCAGGプロモーター下に組み込んだトランスジェニックマウスを作製した。可溶型のTROYを持続的に発現させることにより、TROYのリガンドの作用を抑制することを目的としたトランスジェニックマウスである。
【００７９】
１）  プラスミドの構築
可溶型のTROYとヒトIgG1のFcとの融合タンパクをコードする遺伝子を作製するために、168番目のThrの直後にスプライス・ドナー配列を付加した遺伝子を構築した（図１）。当該遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。
BamHIサイト(波下線部)を利用して、ヒトIgG1のFc遺伝子のヒンジをコードするエクソンの直前のイントロンに挿入することによって可溶型のTROYとFcを融合させた遺伝子を構築した。以下、構築された融合遺伝子をTROY-Fcと記載する。この遺伝子にコードされる融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）は図２のようになる（下線部分が可溶型のTROY）。
これを動物細胞用発現ベクターpCAGGS(Gene 108(1991) p193-200)のEcoRIサイトに挿入し、pCAGGS-TROYFcを作製した（図３）。本プラスミドをトランスジェニックマウスの作製に供した。
【００８０】
２）  遺伝子の導入
インジェクション用DNAフラグメントは、次のようにして調製した。まずTROY-Fcを挿入したpCAGGSベクター(pCAG-TROYFc；図３)を、SalIおよびPstIで処理した後、TROY遺伝子を含む断片(約4kb)を切り出した。この断片を、Gel Extraction Kit (QIAGEN)により回収し、３ng/μlになるようにPBS-で希釈してインジェクション用DNAフラグメントとした。
【００８１】
DNAフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずC57BL/6J雌マウス(日本クレア)に5 i.uのPMSGを腹腔内投与、さらに48時間後5 i.uのhCGを腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。
【００８２】
インジェクション用DNAフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）、190-207, 2000）。DNAフラグメントを335個のC57BL/6J胚へ注入し、翌日、2細胞期に発生していた胚281個を、偽妊娠1日目の受容雌の卵管に片側当たり10個前後（1匹あたり20個前後）を移植した。
分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し里親に哺育させた。その結果、65例の産仔が得られ、そのうちの3例がTROY-Fc遺伝子を導入されたトランスジェニックマウスであった。
【００８３】
３）  導入遺伝子の確認
3週齢になった時点でマウスの尾からDNAを、核酸自動分離装置（KURABO）を用い抽出し、サザンブロット法およびPCR法によって導入遺伝子を確認した。サザンブロット法による導入遺伝子の確認方法は次のとおりである。すなわち、15μgのgenome DNAをEcoRI処理、泳動後、ナイロンメンブレンへトランスファーした。TROY-Fcを含む約2kbの断片をプローブに用い、トランスファーしたDNAとハイブリダイズさせた。1.7kbと0.2kbのトランスジェニックマウスに特異的なバンドの有無に基づいて導入遺伝子を確認した（図４）。
【００８４】
４）  TROY-FcトランスジェニックマウスにおけるTROY-Fcの発現確認
血中TROYを酵素免疫測定法(ELISA)で測定し、可溶型TROYの発現を確認した。可溶型TROYの発現が確認できたラインCAG2のマウスにおいて、ヒトIgG Fcに対するELISA法によって、検出された可溶型TROYがヒトFcを有する融合蛋白質であることを確認した。Goat affinity purified antibody to human IgG Fc（Cappel）をPBSにて5000倍に希釈し、OPAQUE plate, (Costar, 3922)に固相化した。2％BSAを含むPBSにてブロッキング処理した後、このBufferを用いて適当に希釈したマウス血清を添加した。また、受容体濃度算出のためのスタンダードとして、希釈したヒトIgG1を同様に添加した。3回洗浄したのち、Biotin-SP-conjugated Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc g Fragment Specific, (Jackson Laboratory)を反応させ、3回洗浄したのち、Streptavidin-AP conjugate, (Roche) を反応させ、3回洗浄したのち、CDP-Star, (TROPIX)を基質として発色させ、MicroLumat, LB96P, (EG&G Berthod)で測定した（図５）。表現型の解析には、このラインCAG2を使用した。
【００８５】
５）  トランスジェニックマウスのタイピング
サザンブロット(図６ａ)及びPCR解析(図６ｂ)によりトランスジェニックマウスのタイピングを行った。トランスジェニックマウスの産生はメンデルの法則に従っており、肉眼的に異常は認められなかった。光学顕微鏡による観察で、脳の大きさや構造に野生型とトランスジェニックマウスの間に差は認められなかった。
【００８６】
〔実施例２〕トランスジェニックマウスにおける血管周囲のグリア細胞の変化
TROYは生後から成体の中枢神経系（線条体、大脳皮質、海馬など）において、脳室下帯の前駆細胞に加え、アストロサイトに発現が認められる。更に成体の中枢神経系においては、海馬(図７Ａ−Ｃ)や大脳皮質(図７Ｅ−Ｇ)の、GFAP陽性の血管周囲のアストロサイトの終足にも発現が認められた。従って、トランスジェニックマウスのアストロサイトに関して形態学的に検討した。アストロサイトのマーカーであるGFAPに対する抗体を用いて免疫染色法を行ったところ、トランスジェニックマウスにおいて実質内及びアストロサイトの終足に明らかな異常は認められなかった (図７Ｄ、Ｈ)。更に大脳皮質や海馬におけるGFAPの発現レベルをウエスタンブロット解析にて検討したが、野生型とトランスジェニックマウスの間に差は認められなかった。
【００８７】
ところが、電子顕微鏡にて観察した結果、トランスジェニックマウスにおいて、血管周囲のアストロサイトの終足に形態の異常を認めた。野生型のマウスでは、グリアの終足が血管壁を完全に被覆していたのに対し、トランスジェニックマウスのグリアの終足は腫脹し、空胞(vacuoles)や電子密度の高い残骸(debris)を含んでいた（図８Ａ、Ｂ）。図８Ｃに示している様に、異常なグリアの終足を含む血管の割合を検討した結果、トランスジェニックマウスと野生型マウスにおいて、空胞(vacuoles)を含むグリアの終足を認めた血管と、電子密度の高い残骸(debris)を含むグリアの終足を認めた血管の割合はそれぞれ次のとおりだった。アクチンフィラメントなどの細胞内骨格の再構成を伴う細胞変性が考えられた。
トランスジェニックマウス    野生型マウス
空胞            57.8±8.3%              3.0±1.3%
高電子密度        62.9±7.7%              4.5±2.2%
【００８８】
〔実施例３〕トランスジェニックマウスにおける血液脳関門(blood-brain barrier; BBB)の透過性の亢進
脳血管周囲のアストロサイトは、血管内皮細胞の構造や機能に関与しているという報告が多数ある。これらの報告からアストロサイトがBBBの発達や維持に重要な役割を担っていることが示唆されている。トランスジェニックマウスにおける血管周囲のグリア細胞の変化による内皮細胞への影響を検討するため、horseradish peroxidase (HRP)をトレーサーとして用いてBBBの透過性を検討した。
【００８９】
HRP投与5分後に、トランスジェニックマウスの海馬(図９Ｂ)や大脳皮質において、著明なHRPの血管外への漏出が、光学顕微鏡にて観察された。一方野生型ではHRPの漏出は認められなかった(図９Ａ)。超微構造レベルにおいても、トランスジェニックマウスの海馬において、著明なHRPの血管外への漏出が観察された(図９Ｄ、矢印)。野生型マウスでは、内皮細胞にHRP反応産物が含液小胞(pinocytotic vesicles)として認められたが(図９Ｃ、 矢印)、内皮下や実質への漏出は認められなかった。
【００９０】
内皮細胞の密着結合帯(tight junction)は細胞間透過性(paracellular permeability)の制御に中心的な役割を担っていることが知られている。従ってトランスジェニックマウスにおけるtight junction 蛋白、ZO-1及びOccludinの発現を検討した。ウエスタンブロット解析及び免疫染色法を行った結果、野生型とトランスジェニックマウスの間に発現レベルの差は認められなかった。これらの結果より、トランスジェニックマウスにおける血管周囲のグリア細胞の変化はBBBの透過性の亢進を伴っていたが、tight junction 蛋白であるZO-1及びOccludinの減少は伴っていなかったことが示された。
【００９１】
〔実施例４〕トランスジェニックマウスにおける血管周囲のグリアの終足のSSeCKSの発現の低下
更にトランスジェニックマウスにおける、血管周囲のグリアの終足の変化の分子メカニズムを検索するために、グリアの終足に発現しており、BBBの分化や維持に関与すると考えられているAQP4やSSeCKSに関して検討した。
以前の報告に一致して、SSeCKSとGFAPの蛍光二重染色において、SSeCKSがGFAP陽性の血管周囲のアストロサイトの終足に発現していることが示された(図１０)。従ってトランスジェニックマウスにおけるSSeCKSの発現を、ウエスタンブロット解析にて検討した。図１１に示すように、海馬におけるSSeCKSの発現がトランスジェニックマウスにおいて有意に低下していた。一方、AQP4の発現には、野生型とトランスジェニックマウスの間に差は認められなかった。これらの結果よりトランスジェニックマウスにおける血管周囲のグリアの終足の変化が血管周囲のグリアの終足のSSeCKSの発現の低下に関与している可能性が示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によって提供されるトランスジェニック非ヒト動物は、血液脳関門の物質透過性の亢進を調節する作用の検出と、当該作用を有する物質のスクリーニングに有用である。このような作用を有する化合物は、血液脳関門の物質透過性の亢進を伴う疾患の治療に有用である。このような疾患には、脳梗塞の急性期、偏頭痛、脳損傷、外傷性脳浮腫、インフルエンザ脳症、くも膜下出血、エイズ脳症、および多発性硬化症などが含まれる。
【００９３】
また本発明は、血液脳関門の物質透過性が亢進したモデル動物を提供した。本発明のモデル動物は、化合物が中枢神経に与える影響を評価するための被験動物として有用である。実験動物を利用した、化合物の中枢神経系に与える影響の評価は、医薬品開発などにおいては必須である。本発明のモデル動物を利用すれば、正常な血液脳関門では透過できない（透過しにくい）物質であっても、鋭敏に、かつ迅速に、中枢神経系に与ええる影響を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】可溶型のTROY遺伝子にスプライス・ドナー配列を付加した遺伝子を示す図である。168番目のThrの直後にスプライス・ドナー配列を付加した（下線部）。波下線部はBamHIサイトを示す。
【図２】可溶型のTROYとFcを融合させた遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。下線部分は可溶型のTROYを示す。
【図３】可溶型のTROYとFcを融合させた遺伝子を挿入したプラスミドpCAGGS-TROYFcを示す図である。
【図４】サザンブロット法による導入遺伝子確認の結果を示す写真である。
【図５】ELISAによるトランスジェニックマウスの血中TROYFc濃度の測定結果を示す図である。
【図６】トランスジェニックマウスのタイピングの結果を示す写真である。Ａはサザンブロット、ＢはPCR解析による結果を示す。
【図７】正常マウスの脳におけるTROYの発現分布を示す、免疫染色の結果である。図７Ａ−Ｃは海馬の、図７Ｅ−Ｇは大脳皮質の染色結果を示す顕微鏡写真である。
【図８】トランスジェニックマウスにおける、血管周囲のグリア細胞の変化を示す写真および図である。Ａ、Ｂはそれぞれ野生型マウス、トランスジェニックマウスの血管周囲における電子顕微鏡写真を示す。Ｃは野生型とトランスジェニックマウスにおける、異常なグリアの終足を含む血管の割合を示す。スケールバーは１μmである。
【図９】トランスジェニックマウスにおけるHRPをトレーサーとしたBBBの観察結果を示す写真である。Ａ、Ｂはそれぞれ野生型マウスとトランスジェニックマウスにおけるBBBの光学顕微鏡による観察結果を示す。また、Ｃ、Ｄはそれぞれ野生型マウスとトランスジェニックマウスにおけるBBBの超微構造を示す。図中のスケールバーは、それぞれ、図９−Ｂ：１４０μm、図９−Ｄ：１μm（拡大図中では３００nm相当）である。
【図１０】トランスジェニックマウスにおける、血管周囲のSSeCKSとGFAPの蛍光二重染色の結果を示す写真である。
【図１１】トランスジェニックマウスの、血管周囲におけるSSeCKSのウェスタンブロッティングによる発現量の解析を示す写真および図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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