(57)【要約】      （修正有）【課題】単離されたＭＥＫＫ（マイトジェンＥＲＫキナーゼキナーゼ）タンパク質、かかるタンパク質をコードする配列を有する核酸分子、およびかかるタンパク質に対して生成する抗体に関する。【解決手段】（ａ）特定の配列のＤＮＡ分子；（ｂ）特定のアミノ酸配列のタンパク質をコードするＤＮＡ分子；および（ｃ）（ｂ）に記載のアミノ酸配列中の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、転置、もしくは付加によって（ｂ）のＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質に由来し、かつ、哺乳類のＭＥＫタンパク質をリン酸化するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる単離されたＤＮＡ分子：
（ａ）ヌクレオチド配列が表２に表されているＤＮＡ分子；
（ｂ）アミノ酸配列が表２に表されたタンパク質をコードするＤＮＡ分子；および
（ｃ）（ｂ）に記載のアミノ酸配列中の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、転置、もしくは付加によって（ｂ）のＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質に由来し、かつ、哺乳類のＭＥＫタンパク質をリン酸化するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項２】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる単離されたＤＮＡ分子：
（ａ）ヌクレオチド配列が表３に表されているＤＮＡ分子；
（ｂ）アミノ酸配列が表３に表されたタンパク質をコードするＤＮＡ分子；および
（ｃ）（ｂ）に記載のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換、転置もしくは付加によって（ｂ）のＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質に由来し、かつ、哺乳類のＭＥＫタンパク質をリン酸化するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項３】
（ａ）請求項１または２に記載の配列を有するＤＮＡによりコードされるＭＥＫＫタンパク質を含有する細胞を推定の調節化合物と接触させる工程、
（ｂ）該細胞を細胞表面上のレセプターに結合できるリガンドと接触させる工程、および
（ｃ）該ＭＥＫＫタンパク質の活性を測定することにより該細胞を細胞表面上のレセプターから発せられるシグナルの調節に対する該推定調節化合物の能力を評価する工程
を含んでなる細胞表面上のレセプターから発せられるシグナルを調節できる化合物の同定方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＤＮＡ分子を含有するベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＥＫＫタンパク質をコードしている単離された核酸分子、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）（細胞外シグナル調節キナーゼまたはＥＲＫｓとも呼称される）は、チロシンキナーゼ（上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体のような）である増殖因子受容体およびトロンビン受容体のような異種三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）に結合している受容体の両方によって結合しているリガンドに応答して、急速に活性化される。ＭＡＰＫは、種々の第二メッセンジャーによって伝達された多重細胞内シグナルを統合するようである。ＭＡＰＫはリン酸化して、酵素および、ＥＧＦ受容体、Ｒｓｋ９０、ホスホリパーゼＡ２、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−ＪｕｎおよびＥｌｋ−１／ＴＣＦを含む転写因子の活性を調節する。チロシンキナーゼである受容体によるＭＡＰＫｓの急速な活性化はＲａｓに依存性であるが、ＭＡＰＫのＧタンパク質媒介活性化はＲａｓ依存性および独立性(非依存性)である経路を経て起こるようである。
【０００３】
酵母中のフェロモン誘発シグナル経路の相補性分析によって、ＭＡＰＫのＳｐｋ１とＦｕｓ３−Ｋｓｓ１、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）同族体の活性を調節するプロテインキナーゼ系が規定された（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４参照)。Ｓ．セレビシエでは、プロテインキナーゼＳｔｅ７はＦｕｓ３−Ｋｓｓ１活性の上流調節体であり、プロテインキナーゼＳｔｅ１１はＳｔｅ７を調節する。Ｓ．ポンベ遺伝子産物Ｂｙｒ１とＢｙｒ２は夫々Ｓｔｅ７とＳｔｅ１１と相同である。ＭＥＫ（ＭＡＰＫキナーゼもしくはＥＲＫキナーゼ）またはＭＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）酵素は配列がＳｔｅ７Ｂとｙｒ１に類似である。ＭＥＫｓはＭＡＰＫｓをチロシンとスレオニン残基の両方の上でリン酸化し、これによってＭＡＰＫが活性化される。哺乳類のセリン−スレオニンプロテインキナーゼＲａｆはリン酸化して、ＭＥＫを活性化して、ＭＡＰＫが活性化される。Ｒａｆは、増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性に応答して活性化され、それ故Ｒａｆは、膜関連チロシンキナーゼの刺激に応答して、ＭＡＰＫを活性化することができる。Ｒａｆは配列がＳｔｅ１１とＢｙｒ２に関連性でない。従って、Ｒａｆは、哺乳類細胞中で、酵母中で規定されたフェロモン応答性プロテインキナーゼ系からの拡散を示すことができる。ＭＡＰＫの調節において細胞および受容体に特異的な相違があることから、哺乳類ＭＥＫの他のＲａｆ独立性調節体が存在することが示唆される。
【０００４】
増殖および分化のようなある種の生物学的機能は、細胞内のシグナル伝達経路によってしっかりと調節されている。シグナル伝達経路は、細胞の平衡定常状態機能を維持している。疾患状態は、細胞中のシグナル伝達が壊れ、細胞機能に通常存在するしっかりした制御が除去される場合に起こることができる。例えば、腫瘍は、細胞増殖の調節が崩壊し、細胞のクローンが無限に膨脹する場合に発生する。シグナル伝達ネットワークは、細胞の種類に依存する多数の細胞機能を調節するから、多種類の疾病がかかるネットワーク中の異常に由来することができる。癌のような荒廃性疾患、自己免疫疾患、アレルギー反応、炎症、神経障害、およびホルモン関連疾患は異常なシグナル伝達に由来することができる。種々の疾患状態に関与する細胞を調節する方法を理解し発見する必要性は長年感じられてきたが、シグナル伝達経路の複雑さによって、細胞中のシグナル導入経路を操作することによって細胞機能を調節する生成物と方法の開発が阻まれてきた。このように、細胞中のシグナル伝達の予想できる制御の実行を可能にし、従って異常な細胞機能によって生起する種々の疾患の治療を可能にする生成物と方法の必要性は残されている。
【非特許文献１】Ｂ．Ｒ．Ｃａｉｒｎｓ等，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，６，１３０５（１９９２）
【非特許文献２】Ｂ．Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，６，１２９３（１９９２）
【非特許文献３】Ｓ．Ａ．Ｎａｄｉｎ−Ｄａｖｉｓ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．，７，９８５（１９８８）
【非特許文献４】Ｙ．Ｗａｎｇ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，３５５４(１９９１)参照)。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、哺乳類のＭＥＫタンパク質をリン酸化することができる実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質に関し、該ＭＥＫＫタンパク質は触媒ドメインを含む。本発明は、細胞の表面上の増殖因子受容体から出発するシグナルを、ＭＡＰＫタンパク質の活性を調節することによって、調節することができる実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質を包含し、調節する能力はＲａｆタンパク質シグナル調節と異なる。特に、実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質は、配列番号４：、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０を含むアミノ酸配列をコードしている核酸分子と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸によって、コードされたアミノ酸配列の少なくとも一部を含んでなる。実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質はＭＡＰＫタンパク質の活性を調節することができ、前記タンパク質はＲａｆタンパク質と異なるアミノ酸配列を有する。  本発明はまた、配列番号：２、配列番号４：、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０を含むアミノ酸配列をコードしている核酸分子と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸配列によってコードされたアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１種の単離たれたタンパク質を含んでなる製剤を包含する。
【０００６】
特に、本発明により提供される特定の態様は以下のものである。
態様１：下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる単離されたＤＮＡ分子：
（ａ）ヌクレオチド配列が表２に表されているＤＮＡ分子；
（ｂ）アミノ酸配列が表２に表されたタンパク質をコードするＤＮＡ分子；および
（ｃ）（ｂ）に記載のアミノ酸配列中の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、転置、もしくは付加によって（ｂ）のＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質に由来し、かつ、哺乳類のＭＥＫタンパク質をリン酸化するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
態様２：下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれる単離されたＤＮＡ分子：
（ａ）ヌクレオチド配列が表３に表されているＤＮＡ分子；
（ｂ）アミノ酸配列が表３に表されたタンパク質をコードするＤＮＡ分子；および
（ｃ）（ｂ）に記載のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換、転置もしくは付加によって（ｂ）のＤＮＡ分子によりコードされたタンパク質に由来し、かつ、哺乳類のＭＥＫタンパク質をリン酸化するタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
態様３：（ａ）請求項１または２に記載の配列を有するＤＮＡによりコードされるＭＥＫＫタンパク質を含有する細胞を推定の調節化合物と接触させる工程、
（ｂ）該細胞を細胞表面上のレセプターに結合できるリガンドと接触させる工程、および
（ｃ）該ＭＥＫＫタンパク質の活性を測定することにより該細胞を細胞表面上のレセプターから発せられるシグナルの調節に対する該推定調節化合物の能力を評価する工程
を含んでなる細胞表面上のレセプターから発せられるシグナルを調節できる化合物の同定方法。
態様４：請求項１または２に記載のＤＮＡ分子を含有するベクター。
態様５：請求項１または２に記載のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞。
【０００７】
本発明のさらに他の態様は、発現ベクターに操作可能に結合している核酸分子を含んでなる、組換え分子で形質転換された組換え細胞であり、該核酸分子は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９（即ち、表１、表２、表３、表４および表５に示された核酸配列）からなる群から選ばれた核酸配列と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸配列を含んでなる。
【０００８】
本発明はまた、細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することを含む細胞の恒常性を調節する方法を包含する。特に、この方法は、細胞のアポト−シスを調節することを含んでなる。かかる方法は内科的疾病を治療するのに有用である。特に、この方法は腫瘍形成および自己免疫を抑制するのに有用である。
【０００９】
本発明によれば、疾患を治療する方法は、Ｒａｆ依存性経路の活性を低下させることができる分子、ＭＥＫＫ依存性経路の活性を増加させることができる分子およびそれらの組合せを含む、少なくとも１種の調節分子を含んでなる治療化合物の有効量を、患者に投与することを含んでなり、該有効量は、疾患に関与する有害細胞を除去するに至る量を含んでなる。
【００１０】
また、本発明には、（ａ）細胞を推定上の調節分子と接触させること；（ｂ）推定上の調節化合物が細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節する能力を、前記ＭＥＫＫ依存性経路の少なくとも１つの構成員の活性化を測定することによって、決定すること；を含んでなる方法によって同定された、細胞中のＭＥＫＫ依存性の活性を調節することができる治療用化合物が包含される。
【００１１】
本発明の１つの態様は、実質的に純粋なタンパク質を包含し、該タンパク質は、哺乳類ＭＥＫタンパク質をリン酸化することができ、そしてＲａｆタンパク質から独立性のＭＡＰＫタンパク質の活性を調節することができるＭＥＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を使用して単離され、該抗体は、（ａ）動物に、本発明の実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質の有効量を投与すること；（ｂ）ＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を回収すること；を含んでなる方法によって製造することができる。
【００１２】
本発明の他の実施例は、ＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる単離された抗体を包含し、該抗体は、動物に、本発明の実質的に純粋なタンパク質の有効量を投与し、そしてＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を回収することを含んでなる方法によって製造することができる。
＜発明の詳細な記述＞
本発明は、細胞中のシグナル伝達を調節することができる新規なマイトジェンＥＲＫキナーゼキナーゼタンパク質（ＭＥＫＫ）に関する。本発明は、疾患を、かかる疾患に関与する細胞の活性を調節することによって治療する新規な方法を包含する。本発明は、本発明の新規な生成物および方法が、アポト−シスをもたらすことができるシグナル伝達を調節することができる点で、特に有利である。
【００１３】
本発明の１つの態様は単離されたＭＥＫＫタンパク質である。本発明によれば、単離されたタンパク質はその天然環境から取出されたタンパク質である。例えば、単離されたＭＥＫＫタンパク質はその天然源から得られるか、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されるか、または化学的に合成されることができる。本明細書で使用されるように、単離されたＭＥＫＫタンパク質は、アミノ酸が欠失（例えば、ペプチドのような、タンパク質の短縮された変形物）、付加、転置（または逆転）、削除、置換および／または誘導体化（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パリミトイル化、アミド化および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの添加によって）されたＭＥＫＫタンパク質のような、全長のＭＥＫＫタンパク質またはかかるタンパク質のいずれかの相同体とすることができ、該改変タンパク質はマイトジェンＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）および／またはＪｕｎ  ＥＲＫキナーゼ(ＪＥＫ）をリン酸化することができる。ＭＥＫＫタンパク質の相同体は、この相同体をコードしている核酸配列が、天然ＭＥＫＫタンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸配列に(即ち、と共に)、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる程度に、天然ＭＥＫＫタンパク質のアミノ酸配列に類似しているアミノ酸配列を有するタンパク質である。本明細書で使用されているように、緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリッド形成条件とは、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子が類似の核酸分子を同定するのに使用される、標準ハイブリッド形成条件を言う。かかる標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，分子クローニング：実験操作法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年に開示されている。ＭＥＫＫタンパク質の相同体はまた、その相同体が、天然に存在するＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一つのエピトープに対する免疫反応を誘発する能力を有する程度に、交差反応性であるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。
【００１４】
本発明のタンパク質相同体の最小の大きさは、対応する天然タンパク質をコードしている核酸分子の相補的配列と安定なハイブリッドを形成することができる核酸分子によってコードされる程度の大きさである。このように、かかるタンパク質相同体をコードしている核酸分子の大きさは、核酸組成、核酸分子と相補的配列との間のパーセント相同性並びにハイブリッド形成条件それ自体（例えば、温度、塩濃度およびホルムアミド濃度）に依存性である。かかる核酸分子の最小の大きさは通常、核酸分子がＧＣに富む場合、少なくとも約１２〜約１５個のヌクレオチドの長さであり、そしてＡＴに富む場合、少なくとも約１５〜約１７個の塩基の長さである。このように、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体をコードするために使用された核酸分子の最小の大きさは、約１２〜約１８個のヌクレオチドの長さである。かかる核酸分子の最大の大きさについては、核酸分子が遺伝子の一部、全遺伝子、もしくは同義遺伝子、またはそれらの一部を含むことができるという実際的な制限以外に、全く制限はない。同様に、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体の最小の大きさは、約４〜約６個のアミノ酸の長さであり、好適な大きさは、全長で多価性のタンパク質（即ち、一つ以上のドメインを有し、各ドメインが機能を有する融合タンパク質）が望まれているか、またはかかるタンパク質の機能部分が望まれるかに依存している。
【００１５】
ＭＥＫＫタンパク質相同体は、ＭＥＫＫタンパク質をコードしている天然遺伝子の対立遺伝子変異の結果であることができる。天然遺伝子とは、天然中に最もしばしば見出される遺伝子の形態を言う。ＭＥＫＫタンパク質相同体は、これに限定されないが、タンパク質をコードしている遺伝子を、例えば、無作為または標的突然変異誘発を行う古典的または組換えＤＮＡ技術を使用して、直接改変することを含む、当業界で既知の技術を使用して製造することができる。ＭＥＫＫタンパク質相同体がＭＥＫＫおよび／またはＪＥＫタンパク質をリン酸化する能力は、当業者に既知の技術を使用して試験することができる。かかる技術として、実施例で詳細に記載されるリン酸化測定法が挙げられる。
【００１６】
１つの態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質はＭＥＫＫ依存性経路を調節することができる。本発明によれば、ＭＥＫＫ依存性経路とは一般的に、ＭＥＫＫタンパク質が、Ｒａｆから実質的に独立している経路を調節する経路、およびＭＥＫＫタンパク質の調節が、Ｒａｆタンパク質特にＭＥＫタンパク質を含む経路の共通の構成員に集中する経路を指す（図２を参照）。適切なＭＥＫＫ依存性経路として、ＭＥＫＫタンパク質とＪＥＫタンパク質を含むが、Ｒａｆタンパク質を含まない経路が挙げられる。当業者は、ＭＥＫＫタンパク質による経路の調節がＲａｆタンパク質から実質的に独立していることを、ＭＥＫＫタンパク質とＲａｆタンパク質がかかる経路の下流の構成員のリン酸化を調節する能力を、例えば、実施例１６に記載の一般的方法を使用して比較することによって、決定することができる。ＭＥＫＫタンパク質がＭＥＫＫより下流の経路の構成員（例えば、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎおよび／またはＡＴＦ−２を含むタンパク質）のリン酸化を、Ｒａｆタンパク質が利用される場合より有意的に大きい量だけ誘発する場合、ＭＥＫＫタンパク質はＲａｆタンパク質から実質的に独立している経路を調節する。例えば、ＪＮＫのリン酸化のＭＥＫＫ誘発は、Ｒａｆタンパク質を使用する場合に誘発されるリン酸化より、好適には少なくとも約１０倍、さらに好適には少なくとも約２０倍、さらにもっと好適には少なくとも約３０倍大きいＪＮＫタンパク質のリン酸化である。リン酸化のＭＥＫＫ誘発がリン酸化のＲａｆタンパク質誘発と同様である場合、当業者は、ＭＥＫＫタンパク質による経路の調節が、Ｒａｆタンパク質も含むことができたシグナル伝達経路の構成員を含むと結論することができる。例えば、ＭＡＰＫのリン酸化のＭＥＫＫ誘発は、Ｒａｆタンパク質によるリン酸化の誘発と同程度の大きさである。
【００１７】
「Ｒａｆ依存性経路」とは、Ｒａｆタンパク質がＭＥＫＫタンパク質から実施的に独立しているシグナル伝達経路を調節するシグナル伝達経路、およびＲａｆタンパク質調節がＭＥＫＫタンパク質を含む経路の共通の構成員に集中する経路を言うことができる。Ｒａｆタンパク質による経路の調節の、ＭＥＫＫタンパク質による経路の調節からの独立性は、ＭＥＫＫの独立性を決定するのに使用された方法と同様の方法を使用して決定することができる。
【００１８】
他の態様では、ＭＥＫＫタンパク質は、これに限定されないが、マイトジェンＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、転写制御因子（ＴＣＦ）、Ｅｔｓ様−１転写因子（Ｅｌｋ−１）、Ｊｕｎ  ＥＲＫキナーゼ（ＪＥＫ）、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＵＫ）、ストレス活性化ＭＡＰＫタンパク質、Ｊｕｎ、活性化転写因子−２（ＡＴＦ−２）および／またはＭｙｃタンパク質を含む、シグナル伝達タンパク質の活性を調節することができる。本明細書で使用されるように、タンパク質の「活性」は、タンパク質のリン酸化状態および／またはタンパク質が特定の機能を行う能力（例えば、他のタンパク質をリン酸化するまたは転写を調節する）に直接に関連することができる。本発明のＭＥＫＫタンパク質によって調節された好適なＭＥＫタンパク質として、ＭＥＫ−１および／またはＭＥＫー２が挙げられる。本発明のＭＥＫＫタンパク質によって調節された好適なＭＡＰＫタンパク質として、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ４２ＭＡＰＫおよび／またはｐ４４ＭＡＰＫが挙げられる。ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化することができる好適なＭＥＫＫタンパク質として、配列番号：５によって表される核酸配列によってコードされたタンパク質が挙げられ、配列番号：７によって表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はさらに好適である。本発明のＭＥＫＫタンパク質によって調節された好適なストレス活性化ＭＡＰＫタンパク質として、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮｋ）、ストレス活性化ＭＡＰＫ−αおよび／またはストレス活性化ＭＡＰＫ−βが挙げられる。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫタンパク質の活性をＭＥＫの基礎水準（即ち、刺激されないで天然で見出される水準）以上に増加させることができる。例えば、ＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例９に記載の条件下で測定した場合、基礎水準の少なくとも約２倍、さらに好適には少なくとも約３倍、さらにもっと好適には少なくとも約４倍まで、ＭＥＫタンパク質のリン酸化を増加させることができる。
【００１９】
本発明の好適なＭＥＫＫタンパク質はまた、ＭＡＰＫタンパク質の活性をＭＡＰＫの基礎水準（即ち、刺激されないで天然で見出される水準）以上に増加させることができる。例えば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例３に記載の条件下で測定した場合、基礎水準の活性の少なくとも約２倍、さらに好適には少なくとも約３倍、さらにもっと好適には少なくとも約４倍まで、ＭＡＰＫ活性を増加させることができる。
【００２０】
さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質はＪＮＫタンパク質の活性を増加させることができる。ＪＮＫは、Ｔ細胞、ニュートラル細胞または繊維芽細胞のような種々の細胞の種類の増殖および分化を調節することに関与している、転写因子ＪＵＮの活性を調節する。ＪＮＫはＭＡＰＫと構造的および調節的相同性を示す。例えば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例１６に記載の条件下で測定した場合、Ｒａｆより少なくとも約３０倍、さらに好適にはＲａｆより少なくとも約４０倍、さらにもっと好適にはＲａｆより少なくとも約５０倍まで、ＪＮＫタンパク質のリン酸化を誘発することができる。
【００２１】
本発明の好適なＭＥＫＫタンパク質は追加的に、ｃ−Ｍｙｃのリン酸化転写トランスアクチベーションドメインが遺伝子転写を調節することができるような方法で、ｃ−Ｍｙｃ転写トランスアクチベーションドメインタンパク質のリン酸化を誘発することができる。ＭＥＫタンパク質がｃ−Ｍｙｃ転写トランスアクチベーションドメインタンパク質のリン酸化を調節する能力は、Ｒａｆタンパク質または環状ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼがｃ−Ｍｙｃタンパク質を調節する能力を超える。例えば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例１７に記載の条件下で測定した場合、Ｒａｆより少なくとも約２５倍、さらに好適には少なくとも約３５倍、さらにもっと好適には少なくとも約４５倍まで、リン酸化ｃ−Ｍｙｃ転写トランスアクチベーションドメインタンパク質によるルシフェラーゼ遺伝子転写を誘発することができる。
【００２２】
本発明の他の態様は、ＭＥＫＫ活性が、これらに限定されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｃ５Ａ、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性プロテイン１（ＭＩＰ１α）、単球化学誘引プロテイン１（ＭＣＰ−１）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４Ｒ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＩｇＥ、主要組織適合性タンパク質（ＭＨＣ）、ペプチド、超抗原、抗原、バソプレシン、トロンビン、ブラジキニンおよびアセチルコリンを含む増殖因子によって刺激される能力に関する。さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質の活性は、ＴＰＡのようなホルボールエステルを含む化合物によって刺激されることができる。好適なＭＥＫＫタンパク質はまたＥＧＦ、ＮＧＦおよびＴＮＦ（特に、ＴＮＦα）によって刺激されることができる。
【００２３】
好適には、本発明のＭＥＫＫタンパク質の活性は、ＭＥＫＫタンパク質を産生する細胞が実施例３に記載の条件下でＥＧＦと接触する場合、基礎水準（即ち、刺激されないで天然で見出される水準）の少なくとも２倍、さらに好適には基礎水準の少なくとも約４倍、さらにもっと好適には基礎水準の少なくとも約６倍まで、刺激されることができる。
【００２４】
同様に、本発明のＭＥＫＫタンパク質の活性は、ＭＥＫＫタンパク質を産生する細胞が実施例９に記載の条件下でＮＧＦと接触する場合、基礎水準の少なくとも１倍、さらに好適には基礎水準の少なくとも約２倍、さらにもっと好適には基礎水準の少なくとも約３倍まで、ＮＧＦ刺激によって刺激されることができる。
【００２５】
好適には、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫタンパク質を産生する細胞が実施例９に記載の条件下でＴＰＡと接触する場合、基礎水準の少なくとも０．５倍、さらに好適には基礎水準の少なくとも約１倍、さらにもっと好適には基礎水準の少なくとも約２倍まで、ＴＰＡ刺激によって刺激されることができる。
【００２６】
ＴＰＦは、種々の細胞の種類において細胞死および他の機能を調節することができる。本発明は、ＴＮＦによるＭＥＫＫ刺激がＲａｆから独立していることを発見したものである。同様に、本発明は、ＭＥＫＫタンパク質が細胞の紫外線（ＵＶ）損傷によって直接に刺激されることができ、一方Ｒａｆ依存性経路は刺激されることができないことを認識した最初のものである。それ故、ＴＮＦとＵＶの両方は、Ｒａｆを実質的に活性化することなく、ＭＥＫＫ活性を刺激する。さらに、ＭＥＫＫのＵＶとＴＮＦ活性はＲａｓ依存性である。
【００２７】
本発明の他の態様は、本発明のＭＥＫＫタンパク質が細胞のアポト−シスを調節することができ、この能力はＲａｆタンパク質によって共有されないという認識である。本明細書で使用されるように、アポト−シスとは、細胞質小器官の完全性を保存しながらの細胞容量の進行性退縮；光学または電子顕微鏡によって観察される染色質の凝縮；および遠心沈降分析法によって決定されるＤＮＡ切断を含んでなる細胞死の形態を言う。細胞の膜完全性が失われそして細胞溶解が起こる場合、細胞死が起こる。アポト−シスは、細胞が膨脹しついに破裂する点において、壊死と異なる。
【００２８】
本発明の好適なＭＥＫＫタンパク質は、細胞が、図２４、２５、２６、２７および２８に示される細胞質退縮および／または核凝縮に実質的に類似する特徴を有するように、細胞のアポト−シスを誘発することができる。図２４〜図２８のアポト−シスは、ＭＥＫＫタンパク質をコードしている発現プラスミドを細胞に微量注入して得たものである。注入された細胞は、抗−β−Ｇａｌ抗体を使用して同定され、そして細胞のＤＮＡはヨウ化プロピジウムで染色された。細胞質組織は抗−チューブリン抗体を使用して監視した。次いで、示差蛍光画像顕微鏡検査法によって、当業界の技術標準を使用して、細胞を映像した。細胞は、細胞質退縮と核凝縮を有する形態を示すことによって、アポト−シスを示した。  ＭＥＫＫ依存性である細胞増殖調節シグナル伝達経路の略図を図２に示す。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＪＥＫタンパク質、ＪＮＫタンパク質、Ｊｕｎタンパク質および／またはＡＴＦ−２タンパク質およびＭｙｃタンパク質の活性を調節することができ、かかる調節はＲａｆタンパク質から実質的に（完全でなくとも）独立している。かかるＲａｆ独立性調節は、細胞のアポト−シスを含む、細胞の増殖特性を調節することができる。さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫタンパク質の活性を調節することができ、それはまたＲａｆタンパク質によって調節されることができる。このように、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＡＰＫタンパク質、およびＴＣＦタンパク質（Ｅｌｋ−１タンパク質とも呼称される）のような転写因子のＥｔｓファミリーの構成員の活性を調節することができる。
【００２９】
図２を参照すると、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｓタンパク質を活性化することができる多種類の増殖因子によって活性化されることができる。さらに、ＭＥＫＫタンパク質は、ＪＮＫタンパク質を活性化することができ、それはまたＲａｓタンパク質によって活性化されるが、Ｒａｆタンパク質によっては活性化されない。このように、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、種々の細胞表面受容体によって始られるシグナル伝達経路中の分岐点のプロテインキナーゼを含んでなる。ＭＥＫＫタンパク質はまた、Ｒａｆから独立性のＴＮＦタンパク質によって調節されることができ、このことは、ＭＥＫＫタンパク質がＲａｓタンパク質とＲａｆタンパク質から独立している新規なシグナル伝達経路に連合していることを示している。このようにして、ＭＥＫＫタンパク質は、一つまたはそれ以上のシグナル伝達経路中で、Ｒａｆタンパク質から独立性かまたはバイパス性の多数の独特の機能を実行することができる。ＭＥＫＫタンパク質はＭＥＫ活性および／またはＪＥＫ活性を調節することができる。このように、ＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｆ活性を実質的に含まないシグナル伝達経路の構成員の活性を調節することができる。かかる構成員として、これらに限定されないが、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦおよびＭｙｃタンパク質を挙げられる。さらに、ＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｆを含むシグナル伝達経路の構成員を調節することができ、かかる構成員として、これらに限定されないが、ＭＥＫ、ＭＡＰＫおよびＴＣＦが挙げられる。従って、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｆタンパク質による顕著な関与から独立している細胞のアポト−シスを調節することができる。
【００３０】
ＭＥＫＫタンパク質の多数の機能的特徴の外に、本発明のＭＥＫＫタンパク質は多数の独特な構造的特徴を含んでなる。例えば、一つの態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、特定の機能的特徴を有する２つの異なった構造ドメインの少なくとも１つを含む。かかる構造ドメインには、ＭＥＫタンパク質および／またはＪＥＫをリン酸化することができるＣＯＯＨ−末端プロテインキナーゼ触媒ドメインを含む第二構造ドメインを調節するように働く、ＮＨ２末端調節ドメインが含まれる。
【００３１】
本発明によれば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、全長のＭＥＫＫタンパク質、並びに上記の機能の少なくとも１つを実行することができるＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部が含む。句「ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部」とは、本発明の全長のＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸分子によってコードされたＭＥＫＫタンパク質の一部を言う。ＭＥＫＫタンパク質の好適な部分は細胞中のアポト−シスを調節するのに有用である。追加の好適な部分は、ＭＥＫＫキナーゼ活性を調節するのに有用な活性を有する。本発明のＭＥＫＫタンパク質の一部に適した大きさは、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体について記載した通りである。
【００３２】
他の態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、好適には８％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して決定しそして当業界の標準技術を使用して分解して、約７０ｋＤ〜約２５０ｋＤの範囲内の分子量を有するＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部を含む。好適なＭＥＫＫタンパク質は、約７５ｋＤ〜約２２５ｋＤ、さらに好適には約８０ｋＤ〜約２００ｋＤの範囲内の分子量を有する。
【００３３】
さらに他の態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、約３．５ｋＤ〜約１２．０ｋＤの範囲内、さらに好適には約４．０ｋＤ〜約１１．０ｋＤの範囲内、もっとさらに好適には約４．５ｋＤ〜約１０．０ｋＤの範囲内のｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）によってコードされたＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部を含んでなる。特に好適なＭＥＫＫタンパク質は、約４．５ｋＤ〜約５．０ｋＤの範囲内の大きさ、約６．０ｋＤ〜約６．５ｋＤの範囲内の大きさ、約７．０ｋの大きさ、または約８．０ｋＤ〜約１０．０ｋＤの範囲内の大きさを有するｍＲＮＡによってコードされたＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部を含んでなる。
【００３４】
他の態様では、本発明のＮＨ２末端調節ドメインは、少なくとも約１０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約４００個のアミノ酸、さらに好適には少なくとも約１５％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約４００個のアミノ酸、もっとさらに好適には少なくとも約２０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約４００個のアミノ酸を含んでなるＮＨ２末端を含む。
【００３５】
本発明の好適なＮＨ２末端調節ドメインは、少なくとも約１０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３６０個のアミノ酸、さらに好適には少なくとも約１５％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３６０個のアミノ酸、もっとさらに好適には少なくとも約２０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３６０個のアミノ酸を含んでなるＮＨ２末端を含む。
【００３６】
本発明の他の好適なＮＨ２末端調節ドメインは、少なくとも約１０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３７０個のアミノ酸、さらに好適には少なくとも約１５％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３７０個のアミノ酸、もっとさらに好適には少なくとも約２０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３７０個のアミノ酸を含んでなるＮＨ２末端を含む。
【００３７】
一つの態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質はＳＨ２とＳＨ３ドメインが欠けている。
【００３８】
他の態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、天然に存在するＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインと、好適には少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％のアミノ酸相同性（比較できる領域内での同一性）を有するＭＥＫＫタンパク質相同体の少なくとも一部を含む。本発明の他のＭＥＫＫタンパク質はまた、天然に存在するＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメインと、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％のアミノ酸相同性を有する本発明のＭＥＫＫ相同体の少なくとも一部を含む。
【００３９】
ＭＥＫＫタンパク質の触媒ドメインを含む配列はホスホトランスフェラーゼ活性に関与し、それ故、比較的に保存されたアミノ酸配列を示す。しかし、ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメインは実質的に拡散的であることができる。ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメイン間に顕著な相同性が欠けることは、かかるドメインの各々が種々の上流の調節タンパク質によって調節されることと関連している。例えば、ＭＥＫＫタンパク質はタンパク質Ｒａｓによって調節されることができ、一方他のものはＲａｓから独立して調節されることができる。さらに、幾つかのＭＥＫＫタンパク質は増殖因子ＴＮＦαによって調節されることができ、一方他のものはできない。このように、ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメインは上流のシグナル伝達調節に選択性を与え、一方触媒ドメインはＭＥＫＫ基質選択性機能を与える。
【００４０】
好適なＭＥＫＫ相同体は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列を有するＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインと、少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％のアミノ酸相同性を有する。他の好適なＭＥＫＫ相同体は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列を有するＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメインと、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％のアミノ酸相同性を有する。
【００４１】
好適な態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインをコードしている核酸分子と、少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％の相同性を有する核酸分子によってコードされる、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体の少なくとも一部を含む。他の好適なＭＥＫＫタンパク質相同体は、ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメインをコードしている核酸分子と、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％の相同性有する核酸分子によってコードされる。
【００４２】
さらに他の好適なＭＥＫＫ相同体は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９によって表される核酸配列によってコードされたＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインと、少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％の相同性有する核酸分子によってコードされる。ＭＥＫＫ相同体はまた、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９によって表される核酸配列によってコードされたＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメインと、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％の相同性有する核酸分子によってコードされたものを含む。
【００４３】
本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ１と呼称し、表１に示されそして配列番号：１と配列番号：２で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有する（即ち、含む）ＭＥＫＫタンパク質を包含する。
【００４４】
【表１】
2006051026.tif 000002
【００４５】
【表２】
2006051026.tif 000003
【００４６】
【表３】
2006051026.tif 000004
【００４７】
本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ２と呼称し、表２に示されそして配列番号：３と配列番号：４で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含する。
【００４８】
【表４】
2006051026.tif 000005
【００４９】
【表５】
2006051026.tif 000006
【００５０】
【表６】
2006051026.tif 000007
【００５１】
本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ３と呼称し、表３に示されそして配列番号：５と配列番号：６で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含する。
【００５２】
【表７】
2006051026.tif 000008
【００５３】
【表８】
2006051026.tif 000009
【００５４】
【表９】
2006051026.tif 000010
【００５５】
【表１０】
2006051026.tif 000011
【００５６】
本発明のＭＥＫＫタンパク質は、表４に示されそして配列番号：７と配列番号：８で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含することができ、ＭＥＫＫ４と呼称される。
【００５７】
【表１１】
2006051026.tif 000012
【００５８】
【表１２】
2006051026.tif 000013
【００５９】
【表１３】
2006051026.tif 000014
【００６０】
【表１４】
2006051026.tif 000015
【００６１】
【表１５】
2006051026.tif 000016
【００６２】
本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ５と呼称し、表５に示されそして配列番号：９と配列番号：１０で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含する。
【００６３】
【表１６】
2006051026.tif 000017
【００６４】
【表１７】
2006051026.tif 000018
【００６５】
【表１８】
2006051026.tif 000019
【００６６】
【表１９】
2006051026.tif 000020
【００６７】
【表２０】
2006051026.tif 000021
【００６８】
ＭＥＫＫ５はＭＥＫＫ４のスプライス変異体を表す。表５に示された配列の下線の部分はスプライス挿入を示す。
【００６９】
ＭＥＫＫ１のアミノ酸配列と比較して、ＭＥＫＫ２とＭＥＫＫ３のアミノ酸配列が表６に示される。
【００７０】
【表２１】
2006051026.tif 000022
【００７１】
ボールドのアミノ末端−調節ドメイン
下線の配列−調節ヒンジ配列
ボールドのイタリック体−触媒ドメイン
表７は、ＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ２およびＭＥＫＫ３のキナーゼドメインと比較して、ＭＥＫＫ４のキナーゼドメインのアミノ酸配列を示す。
【００７２】
【表２２】
2006051026.tif 000023
【００７３】
上記の配列番号は、実施例に記載の方法に従って推論された配列を表す。核酸およびアミノ酸の配列決定技術は完全には誤り発生なしではないから、上記の配列番号はせいぜい本発明のＭＥＫＫタンパク質の見掛けの核酸配列およびのアミノ酸配列を表すことを注目すべきである。
【００７４】
本発明によれば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、転写後修飾を受けたＭＥＫＫタンパク質を含むことができる。かかる修飾として、例えば、グリコシル化（例えば、Ｎ−結合および／またはＯ−結合オリゴ糖の付加）または転写後立体配座変化もしくは転写後欠失を挙げることができる。
【００７５】
本発明の他の態様は、本発明のＭＥＫＫタンパク質をコードしているＭＥＫＫタンパク質遺伝子と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる単離された核酸分子である。本発明によれば、単離された核酸分子は、天然環境から取出された（即ち、人間の操作を受けた）核酸分子である。このように、「単離された」は、核酸分子が精製された程度を反映しない。単離たれた核酸分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体を挙げることができる。
【００７６】
本発明の単離された核酸分子は、その天然源から、全（即ち、完全）遺伝子またはその遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができるそれらの一部として得ることができる。本明細書で使用されるように、句、実体「の少なくとも一部」とは、実体の機能側面を有するのに少なくとも十分である実体の量を言う。例えば、核酸配列の少なくとも一部は、本明細書で使用されるように、特定の所望遺伝子（例えば、ＭＥＫＫ遺伝子）と、緊縮ハイブリッド形成条件下で安定なハイブリッドを形成することができる核酸配列の量である。本発明の単離された核酸分子はまた、組換えＤＮＡ技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成法を使用して製造することができる。単離されたＭＥＫＫタンパク質核酸分子は、これらに限定されないが、天然の対立遺伝子変異体、およびかかる修飾が本発明のＭＥＫＫタンパク質をコードするかまたはＭＥＫＫの天然核酸分子単離体と緊縮条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸の能力を妨害しないような方式で、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および／または転位された修飾核酸分子を含む、天然の核酸分子とそれらの相同体を含む。
【００７７】
本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子に対する好適な改変として、例えば、調節ドメインをコードしているＭＥＫＫタンパク質核酸分子の少なくとも一部を削除して（表６に示された例）構成的に活性なＭＥＫＫタンパク質を作成すること；触媒ドメインをコードしているＭＥＫＫタンパク質核酸分子の少なくとも一部を削除して（表６に示された例）不活性なＭＥＫＫタンパク質を作成すること；によって、全長のＭＥＫＫタンパク質核酸分子を切断すること、およびＭＥＫＫタンパク質を修飾してタンパク質の所望の不活性化および／または刺激を達成すること、例えば、触媒ドメイン（即ち、ホスホトランスフェラーゼドメイン）中のリジン残基をコードしているコドンをメチオニン残基で置換して触媒ドメインを不活性化することが挙げられる。
【００７８】
切断された好適なＭＥＫＫ核酸分子は、触媒ドメインを含有するが、調節ドメインを欠いている、ＭＥＫＫタンパク質の形態をコードする。好適な触媒ドメイン切断ＭＥＫＫ核酸分子は、ＭＥＫＫ  １の約３５２〜約６７２、ＭＥＫＫ  ２の約３５２〜約６１９、ＭＥＫＫ  ３の約３５８〜約６２６、ＭＥＫＫ  ４の約８１１〜約１１９５、またはＭＥＫＫ  ５の約８６３〜約１２４７の残基をコードする。
【００７９】
他の切断された好適なＭＥＫＫ核酸分子は、ＮＨ２末端調節ドメインを含むが、触媒ドメインを欠いているＭＥＫＫタンパク質の形態をコードする。好適な調節ドメイン切断ＭＥＫＫ核酸分子は、ＭＥＫＫ  １の約１〜約３６９、ＭＥＫＫ  ２の約１〜約３３５、ＭＥＫＫ  ３の約１〜約３６０、ＭＥＫＫ  ４の約１〜約８２５、またはＭＥＫＫ  ５の約１〜約８７５の残基をコードして、調節ドメインを除去して、切断されたＭＥＫＫ分子を形成する。
【００８０】
本発明の単離された核酸分子は、本発明の少なくとも１種のＭＥＫＫタンパク質をコードする核酸配列を含み、かかるタンパク質の例は本明細書で開示されている。句「核酸分子」とは主として、物理的な核酸分子を表し、そして句「核酸配列」とは主として、核酸分子を含んでなるヌクレオチドの配列を表し、２つの句は互換可能に使用することができる。上記に開示されたように、本発明のＭＥＫＫタンパク質として、これらに限定されないが、全長のＭＥＫＫタンパク質コード領域を有するタンパク質、それらの一部、および他のＭＥＫＫタンパク質相同体が挙げられる。
【００８１】
本明細書に使用されるように、ＭＥＫＫタンパク質遺伝子は、その遺伝子（これらに限定されないが、転写、翻訳または転写後制御領域を含む）並びにコード領域それ自体によってコードされたＭＥＫＫタンパク質の産生を制御する調節領域のような天然ＭＥＫＫタンパク質遺伝子に関連するすべての核酸配列を含む。本発明の核酸分子は、単離された天然ＭＥＫＫタンパク質核酸分子またはそれらの相同体であることができる。本発明の核酸分子は、一つまたはそれ以上の調節領域、全長もしくは部分コード領域、またはそれらの組合せを含むことができる。本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子の最小の大きさは、対応する天然の遺伝子と緊縮ハイブリッド形成条件下で安定なハイブリッドを形成することができる最小の大きさである。
【００８２】
ＭＥＫＫタンパク質核酸分子相同体は、当業者に既知の多数の方法(例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上掲）を使用して製造することができる。例えば、核酸分子は、これらに限定されないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸配列の選択された領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および／または突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成と核酸分子の混合物を「構築」するための混合物群の連結、およびそれらの組合せのような、古典的な突然変異誘発技術と組換えＤＮＡ技術を含む多種類の技術を使用して改変することができる。核酸分子相同体は、改変核酸の混合物から、核酸によってコードされたタンパク質の機能（相同体がＭＥＫタンパク質またはＪＥＫタンパク質をリン酸化する能力）についてスクリーニングすることによって、および／または単離されたＭＥＫＫタンパク質核酸と緊縮条件下でハイブリッド形成させることによって、選択することができる。
【００８３】
本発明の一つの態様は、本明細書に記載のように、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードすることができるＭＥＫＫタンパク質核酸分子、またはその相同体である。本発明の好適な核酸分子は、これらに限定されないが、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部を有するタンパク質をコードする核酸分子、またはその相同体を含む。
【００８４】
本発明の好適な核酸分子は、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸、またはその相同体と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる。ＭＥＫＫタンパク質の触媒ドメインをコードしている核酸配列の対応領域と、少なくとも約５０％、好適には少なくとも約７５％、さらに好適には少なくとも約８５％の相同性を有する核酸配列含むＭＥＫＫタンパク質核酸分子、またはその相同体も好適である。ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ２末端調節ドメインをコードしている核酸配列の対応領域と、少なくとも約２０％、好適には少なくとも約３０％、さらに好適には少なくとも約４０％の相同性を有する核酸配列含むＭＥＫＫタンパク質核酸分子、またはそれらの相同体をも好適である。特に好適な核酸配列は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の触媒ドメインをコードしている核酸配列と、少なくとも約５０％、好適には少なくとも約７５％、さらに好適には少なくとも約８５％の相同性を有する核酸配列である。他の特に好適な核酸配列は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列のＮＨ２末端調節ドメインをコードしている核酸配列と、少なくとも約２０％、好適には少なくとも約３０％、さらに好適には少なくとも約４０％の相同性を有する核酸配列である。
【００８５】
かかる核酸分子は、全長のタンパク質、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、多価性タンパク質または切断フラグメントをコードしている全長の遺伝子および／または核酸分子であることができる。本発明のさらに好適な核酸分子は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９によって表される核酸配列を有する単離された核酸分子を含んでなる。
【００８６】
本発明のＭＥＫＫタンパク質の核酸分子を知ることによって、当業者は、その核酸分子のコピーを作成すること、並びにＭＥＫＫタンパク質コード遺伝子（例えば、翻訳出発部位および／または転写および／もしくは翻訳制御領域を含む核酸分子）および／またはＭＥＫＫタンパク質核酸分子相同体を得ることが可能になる。本発明のＭＥＫＫタンパク質のアミノ酸配列の一部を知ることによって、当業者は、かかるＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸配列をクローニングすることが可能になる。
【００８７】
本発明はまた、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする、本発明の他の（好適には長い）核酸分子の相補的領域と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドである核酸分子、またはそれらの相同体を包含する。好適なオリゴヌクレオチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードすることができる核酸分子、またはそれらの相同体と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる。さらに好適なオリゴヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９によって表される核酸配列を有する核酸分子、またはそれらの相補体とハイブリッド形成することができる。
【００８８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそのいずれかの誘導体であることができる。かかるオリゴヌクレオチドの最小の大きさは、ある種のオリゴヌクレオチドと、本発明の他の核酸分子上の相補的配列との間に安定なハイブリッドを形成するのに必要な大きさである。最小の大きさの特性は、本明細書に開示されている。オリゴヌクレオチドの大きさはまた、本発明に従ってオリゴヌクレオチドを使用するのに十分なものでなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、追加の核酸分子を同定するプローブとして、核酸分子を増幅または伸張させるプライマーとして、または例えば、細胞によるＭＥＫＫタンパク質の発現を阻害する治療的応用において、を含む多種類の応用で使用することができる。かかる治療的応用として、例えば、アンチセンス−、トリプレックス形成−、リボザイム−および／またはＲＮＡ薬物−に基づく技術で、かかるオリゴヌクレオチドを使用することを含む。それ故、本発明は、かかるオリゴヌクレオチドの使用およびＭＥＫＫタンパク質の産生を妨害する方法を含む。
【００８９】
一つの態様では、本発明の単離されたＭＥＫＫタンパク質は、このタンパク質を製造するのに有効な条件下でこのタンパク質を培養し、そのタンパク質を回収することによって、製造することができる。培養するのに好適な細胞は、ＭＥＫＫタンパク質を発現することができる組換え細胞であり、その組換え細胞は、本発明の一つまたはそれ以上の核酸分子で宿主細胞を形質転換することによって製造することができる。核酸分子の細胞中への形質転換は核酸分子を細胞中に挿入することができる方法によって行うことができる。形質転換技術として、これらに限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入法、リポフェクション、吸着法、およびプロトプラスト融合法が挙げられる。組換え細胞は、単細胞にとどまるかまたは組織、器官もしくは多細胞生物に増殖することができる。本発明の形質転換された核酸分子は染色体外にとどまるか、または形質転換された（即ち、組換え）細胞の染色体内の一つまたはそれ以上の部位中に、発現する能力が保持される方法で、統合することができる。
【００９０】
本発明は、宿主細胞中に核酸分子を送達することができるベクター中に挿入された、本発明の少なくとも１種のＭＥＫＫタンパク質核酸分子を含む組換えベクターを包含する。かかるベクターは、異種核酸配列、例えば、天然では本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子に隣接して見出されない核酸配列を含有する。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、および原核または真核のいずれかであり、そして通常はウイルスまたはプラスミドである。組換えベクターは、クローニング、配列決定、および／またはその他本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子の操作に使用することができる。組換えベクターの１つの型（本明細書では組換え分子と呼称し、そして以下に詳細に説明する）は本発明の核酸分子の発現に使用される。好適な組換えベクターは形質転換細胞中で複製することができる。
【００９１】
組換えベクター中に挿入される好適な核酸分子には、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。組換えベクター中に挿入されるさらに好適な核酸分子には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。組換えベクター中に挿入されるさらにもっと好適な核酸分子には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および／または配列番号：９によって表される核酸分子、またはそれらの相補体が含まれる。
【００９２】
細胞を形質転換するのに適した宿主細胞は、本発明の少なくとも１種の核酸分子で形質転換された後、本発明のＭＥＫＫ分子を産生することができるものであればいずれの細胞も含むことができる。宿主細胞は、未形質転換細胞、またはすでに少なくとも１種の核酸分子で形質転換されている細胞であることができる。本発明の適切な宿主細胞として、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物および植物細胞を挙げることができる。好適な宿主細胞として、細菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞が挙げられ、哺乳類細胞が特に好適である。
【００９３】
組換え細胞は好適には、宿主細胞を、その各々が一つまたはそれ以上の転写制御配列を含有する発現ベクターに作用結合している本発明の一つまたはそれ以上の核酸分子を含んでなる、一つまたはそれ以上の組換え分子で形質転換することによって製造される。句、作用結合したとは、ベクターが宿主細胞中に形質転換された場合に核酸分子が発現することができるような方式で、核酸分子を発現ベクター中に挿入することを言う。本明細書で使用されているように、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、そして特定の核酸分子の発現を行うことができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好適には、発現ベクターはまた、宿主細胞中で複製することができる。発現ベクターは、原核または真核のいずれかであり、そして通常はウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターには、細菌、真菌、昆虫、動物および／または植物細胞中を含む、本発明の組換え細胞中で作用する（即ち、直接遺伝子発現）ものであればいずれのベクターも含まれる。このように、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、停止配列、複製の起点、および組換え細胞と適合性でありそして本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列のような調節配列を含有する発現ベクターに作用結合することができる。本明細書で使用されるように、転写制御配列には、転写の開始、伸張および停止を制御することができる配列が含まれる。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列のような転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本発明の少なくとも一つの組換え細胞中で作用することができるものであればいずれの転写制御配列も含まれる。多種類のかかる転写制御配列は当業者に知られている。好適な転写制御配列として、これらに限定されないが、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージランダ（λ）（λＰＬとλＰＲかおよびかるプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ交配因子、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルスアクチン、レトロウイルス長末端反復、ラウスウイルス、熱ショック、ホスフェートおよびニトレート転写制御配列、並びに原核または真核細胞中の遺伝子発現を制御することができる他の配列のような、細菌、酵母、および哺乳類細胞中で作用するものが挙げられる。追加の適切な転写制御配列として、組織特異性プロモーターとエンハンサー並びにリンホカイン誘発プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘発されるプロモーター）が挙げられる。本発明の転写制御配列はまた、ＭＥＫＫタンパク質をコードしているＤＮＡ配列と天然で会合している天然に存在する転写制御配列を包含することができる。
【００９４】
発現ベクター中への挿入のために好適な核酸分子には、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。発現ベクター中への挿入のためにさらに好適な核酸分子には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。発現ベクター中への挿入のためにさらにもっと好適な核酸分子には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および／または配列番号：９によって表される核酸分子、またはそれらの相補体が含まれる。
【００９５】
本発明の発現ベクターはまた、本発明の挿入された核酸分子が融合タンパク質として発現する融合配列を含有する。本発明のＭＥＫＫ核酸分子の一部として融合配列が含まれると、核酸分子によってコードされたタンパク質の産生、貯蔵および／または使用の間の安定性が向上する。さらに、融合セグメントは、得られた融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができるように、ＭＥＫＫタンパク質の精製を単純化する道具として作用することができる。適切な融合セグメントは、所望の機能（例えば、向上した安定性および／または精製道具）を有するいずれの大きさのドメインであることができる。一つまたはそれ以上の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは、ＭＥＫＫタンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端に結合することができる。融合セグメントとＭＥＫＫタンパク質との間の結合は、ＭＥＫＫタンパク質の直送的（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｆｏｒｗａｒｄ）回収を可能にする切断に感受性をもつように、構築することができる。融合タンパク質は好適には、ＭＥＫＫタンパク質のカルボキシルおよび／またはアミノ末端に結合した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することによって製造することができる。
【００９６】
本発明の組換え細胞には、本発明のいずれか少なくとも一種の核酸分子で形質転換されたいずれの細胞も含まれる。好適な組換え細胞は、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする少なくとも一種の核酸分子、またはそれらの相同体で形質転換された細胞である。さらに好適な組換え細胞は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードすることができる核酸分子、またはそれらの相同体で形質転換される。さらにもっと好適な組換え細胞は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および／または配列番号：９によって表される少なくとも一種の核酸分子、またはその相補体で形質転換される。特に好適な組換え細胞には、下記の核酸分子の少なくとも一種で形質転換された、疾病に関与する哺乳類細胞が含まれる。組換えＤＮＡ技術を使用すると、形質転換された核酸分子の発現を、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、これらの核酸分子が転写される効率、得られた転写物を翻訳される効率、および転写後修飾の効率を操作することによって、改善することがきることは、当業者によって認識されることができる。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術として、これらに限定されないが、高コピー数プラスミドに作用結合した核酸分子、一つまたはそれ以上の宿主細胞染色体中への核酸分子の統合、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナルの置換または修飾（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）、転写制御シグナルの置換または修飾（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）、宿主細胞のコドン使用法に対応する本発明の核酸分子の修飾、転写を不安定にする配列の削除、および発酵の間に組換えタンパク質産生から組換え細胞増殖を一時的に分離する制御シグナルの使用が挙げられる。本発明の発現した組換えタンパク質の活性は、得られたタンパク質を断片化すること、修飾すること、または誘導体化することによって改善することができる。本明細書で使用されるように、細胞中の核酸配列のコピー数を増幅することは、細胞のゲノム中の核酸配列のコピー数を増加させることによってか、または形質転換によって核酸配列の追加のコピーを細胞中に導入することによって、達成することができる。コピー数の増幅は、さらに多量の酵素を産生させて、基質の生成物への変換を向上させるような方法で行われる。例えば、本発明の核酸を含有する組換え分子は、細胞中に形質転換されて、酵素合成を向上させることができる。形質転換は、核酸配列が細胞中に挿入されるいずれの方法を使用しても、達成することができる。形質転換前に、組換え分子上の核酸配列は、より高い特異的活性を有する酵素をコードするように操作することができる。
【００９７】
本発明によれば、組換え細胞は、かかるタンパク質を製造するのに有効な条件下でかかる細胞を培養し、そしてタンパク質を回収することによって、本発明のＭＥＫＫタンパク質を製造するのに使用することができる。タンパク質を製造するのに有効な条件として、これらに限定されないが、タンパク質製造を可能にする適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられる。適切または有効な培地とは、本発明の細胞を培養した場合、ＭＥＫＫタンパク質を産生することができるいずれの培地をも言う。かかる培地は通常、同化性の炭水化物、窒素とリン源、並びに適切な塩、ミネラル、金属およびビタミンのような他の栄養素を含んでなる水性培地である。培地は、複合栄養素を含んでなることができるか、または規定の最小培地であることができる。
【００９８】
本発明の細胞は、これらに限定されないが、バッチ、フィード・バッチ、細胞リサイクル、および連続発酵槽を含む慣用の発酵バイオリアクター中で培養することができる。培養はまた、振盪フラスコ、試験管、ミクロタイター皿、およびペトリ皿中で行うことができる。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含量で行われる。かかる培養条件は当業者の専門的技術の範囲内にある。
製造に使用されたベクターおよび宿主系に依存して、得られたＭＥＫＫタンパク質は、組換え細胞内に残存するか、または発酵培地中に分泌される。句「タンパク質を回収すること」とは、単にタンパク質を含有する全発酵培地を収集することを指し、そして分離または精製の追加の工程を含める必要はない。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、濾過法、電気泳動法、疎水性相互反応クロマトグラフィー法、ゲルクロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー法、等電点クロマトグラフィー法および示差可溶化法のような多種類の標準タンパク質精製技術を使用して精製することができる。
【００９９】
さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、動物から回収されたＭＥＫＫタンパク質を発現する細胞からＭＥＫＫタンパク質を単離することによって製造することができる。例えば、Ｔ細胞のような細胞型は、動物の胸腺から単離することができる。次いで、ＭＥＫＫタンパク質が、単離されたＴ細胞から本明細書に記載の標準技術を使用して単離することができる。
【０１００】
本発明はまた、細胞の表面上の受容体から始まるシグナルを調節することができる化合物を同定する方法を包含し、かかるシグナル調節はいくつかの点でＭＥＫＫタンパク質に関係する。かかる方法は、（ａ）ＭＥＫＫタンパク質を含有する細胞を推定される調節化合物と接触させること；（ｂ）細胞を細胞の表面上の受容体に結合することができるリガンドと接触させること；（ｃ）推定される調節化合物が細胞シグナルを調節することができる能力を、本発明のＭＥＫＫ依存性経路の構成員の活性化を決定することによって評価すること；の諸工程を含んでなる。工程（ｃ）を行う好適な方法は、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員のリン酸化を測定することを含んでなる。かかる測定は、ホスホチロシン、ホスホセリンおよび／またはホスホスレオニンに特異的な抗体を有する免疫測定法を使用して行うことができる。工程（ｃ）を行う他の好適な方法は、ＭＥＫＫタンパク質がＭＥＫタンパク質および／またはＪＥＫタンパク質をリン酸化する能力を本明細書で記載の方法を使用して測定することを含んでなる。
【０１０１】
他の態様では、細胞中のシグナル伝達を調節することができる化合物を同定する方法は、（ａ）推定される阻害化合物を、ＭＥＫＫタンパク質と接触させて反応混合物を生成すること；（ｂ）反応混合物をＭＥＫタンパク質と接触させること；（ｃ）推定される阻害化合物がＭＥＫタンパク質のリン酸化を阻害する能力を、ＭＥＫＫタンパク質によって評価すること；の諸工程を含んでなる。工程（ｃ）から得られる結果を、推定される阻害化合物が、ＭＥＫタンパク質をリン酸化するＲａｆタンパク質の能力を、阻害する能力と比較して、その化合物が、Ｒａｆタンパク質から独立性のＭＥＫＫタンパク質を含むシグナル伝達を選択的に調節することができるかどうかを決定することができる。上記の方法で使用されるＭＥＫＫ、ＭＥＫおよびＲａｆタンパク質は組換えタンパク質または天然で誘導されたタンパク質であることができる。
【０１０２】
さらに、特定のシグナル伝達経路中の阻害作用の部位がＲａｆとＭＥＫＫタンパク質の両方を含むかどうかを、上記の実験（即ち、ＭＥＫＫ依存性経路についての記載を参照）を行うことによって決定することができる。
【０１０３】
本発明の他の態様は、細胞の表面上の受容体から始まるシグナルを調節することができる化合物を同定するキットを包含し、シグナルはいくつかの点でＭＥＫＫタンパク質と関係する。かかるキットは、（ａ）ＭＥＫＫタンパク質を含有する少なくとも１種の細胞；（ｂ）その細胞の表面上の受容体に結合することができるリガンド；および（ｃ）推定される調節化合物がＭＥＫＫタンパク質のリン酸化を変える能力を評価する手段；を含んでなる。リン酸化を検出するかかる手段は、当業者に知られている方法および試薬を包含し、例えば、リン酸化は、チロシン、セリンおよびスレオニンのようなリン酸化アミノ酸残基に特異的な抗体を使用して検出することができる。かかるキットを使用して、特定の経路構成体のシグナル伝達経路中の位置、並びに調節部位またはその近辺の、かかる経路中に含まれる構成体の同一性を、かなり良好な特異性をもって決定することができる。
【０１０４】
他の態様では、本発明のキットは、（ａ）ＭＥＫＫタンパク質；（ｂ）ＭＥＫタンパク質；および（ｃ）推定される阻害化合物がＭＥＫタンパク質のリン酸化を阻害する能力をＭＥＫＫタンパク質によって評価する手段；を包含する。本発明のキットはさらに、Ｒａｆタンパク質および推定される阻害化合物が、ＭＥＫタンパク質をリン酸化するＲａｆタンパク質の能力を阻害する能力を検出する手段を含んでなることができる。本発明の他の態様は、疾患に関与する細胞中のシグナル伝達経路を操作することによって、調節または治療をうける内科的疾病を有する動物の治療に関する。かかる内科的疾病には、異常な細胞増殖および分泌される細胞生成物の異常な産生に由来する疾患が含まれる。特に、かかる内科的疾病として、これらに限定されないが、自己免疫疾患、炎症反応、アレルギー反応およびパーキンソン病とアルツハイマー病のような神経疾患が挙げられる。本発明の方法を使用する治療を受ける好適な癌として、これらに限定されないが、小細胞癌、過発現ＥＧＦ受容体をもつ非小細胞肺癌、過発現ＥＧＦまたはＮｅｕ受容体をもつ乳癌、樹立オ−トクリンループの過発現増殖因子受容体を有する腫瘍、および樹立パラクリンループの過発現増殖因子受容体を有する腫瘍が挙げられる。本発明によれば、用語、治療とは、内科的疾患の進行の調節または内科的疾患の完全な除去（例えば、治療）を言うことができる。内科的疾患の治療は、内科的疾患に関与する細胞が細胞外刺激（例えば、サイトカイニンの増殖因子）にもはや反応しないような方式で、細胞のシグナル伝達活性を調節すること、または内科的疾患に関与する細胞のアポト−シスによる死滅を含んでなることができる。
【０１０５】
本発明の１つの態様は、本発明のＭＥＫＫタンパク質が、細胞増殖、細胞死および細胞機能（細胞生成物の分泌）のような細胞活性を調節することによって、細胞の恒常性を調節することができるという認識を含む。かかる調節は、多くの場合、Ｒａｆから独立しているが、しかし、上記のように（図２に示されるように）ＭＥＫＫタンパク質によって調節することができる幾つかの経路は、Ｒａｆタンパク質による上流の調節を受けることができる。それ故、Ｒａｆタンパク質および／またはＭＥＫＫタンパク質の活性を刺激または阻害して、所望の結果を得ることは、本発明の範囲内にある。理論にとらわれないならば、Ｒａｓタンパク質（図２を参照）からの分岐点でのＲａｆタンパク質およびＭＥＫＫタンパク質活性の調節は、「２−ヒット」機構によって制御することができと考えられる。例えば、第一「ヒット」は、例えば、細胞を、Ｒａｓタンパク質が活性化されるような方式で、細胞表面受容体に結合することができる増殖因子と接触させることを含む、Ｒａｓタンパク質を刺激してＲａｓ依存性経路を刺激するいずれの手段をも含んでなることができる。Ｒａｓタンパク質の活性化に続いて、ＭＡＰＫ活性と比較して、ＪＮＫの活性を増加させ、またはその逆でもある、第二「ヒット」を導出することができる。第二「ヒット」として、これらに限定されないが、ＪＮＫまたはＭＡＰＫを、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、Ｒａｆおよび／またはＭＥＫの活性を刺激または阻害することができる化合物によって、調節することが挙げられる。例えば、プロテインキナーゼＣまたはホスホリパーゼＣキナーゼのような化合物は、ＪＮＫが優先的にＭＡＰＫ以上に活性化されるような方式で、拡散的Ｒａｓ依存性経路をＭＥＫＫ依存性経路の方に駆動するのに要する、第二「ヒット」を提供することができる。  本発明の１つの態様は、細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することを含んでなる細胞の恒常性を調節する方法を包含する。本明細書で使用されるように、用語「恒常性」とは、シグナル伝達経路のような細胞内システムを使用して、細胞が正常な状態を維持する傾向を言う。ＭＥＫＫ依存性経路の活性の調節には、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員、Ｒａｆ依存性経路の構成員、それらの組合せの活性を調節して、所定の経路中のリン酸化の所望の調節を達成することによって、Ｒａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を増加させることが含まれる。調節するＭＥＫＫ依存性経路またはＲａｆ依存性経路の好適な調節された構成員として、これらに限定されないが、ＭＥＫＫ、Ｒａｆ、ＪＥＫ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、ＴＣＦ、ＡＴＦ−２、ＪｕｎおよびＭｙｃ、並びにそれらの組合せが挙げられる。
【０１０６】
一つの態様では、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員、Ｒａｆ依存性経路の構成員、およびそれらの組合せの活性は、細胞中のかかる構成員の濃度を変えることによって調節される。一つの好適な調節スキームは、ＭＥＫＫ、Ｒａｆ、ＪＥＫ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、ＴＣＦ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃ、並びにそれらの組合せの濃度を変えることを含む。さらに好適な調節スキームは、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃ、並びにそれらの組合せを含むタンパク質の濃度を増加させることを含む。他のさらに好適な調節スキームは、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、および、ＴＣＦ、並びにそれらの組合せを含むタンパク質の濃度を減少させることを含む。２つまたはそれ以上の上記の調節スキーム中のタンパク質濃度の調節を組合せて、細胞中の最適のアポト−シス効果を達成することができることも本発明の範囲内にある。
【０１０７】
本発明の調節スキーム中でタンパク質の濃度を増加させる好適な方法として、これらに限定されないが、細胞内のかかるタンパク質をコードしている核酸配列のコピー数を増加させること、かかるタンパク質をコードしているかかる核酸配列が細胞内で転写される効率を改善すること、転写物がかかるタンパク質に翻訳される効率を改善すること、かかるタンパク質の転写後修飾の効率を改善すること、かかるタンパク質を産生することができる細胞をアンチ−センス核酸配列と接触させること、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１０８】
本発明の好適な態様では、細胞の恒常性は、細胞のアポト−シスを調節することによって制御される。細胞のアポト−シスを調節する適切な方法は、ＭＥＫＫタンパク質がＲａｆから実質的に独立している経路を調節するＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することである。細胞のアポト−シスを調節する特に好適な方法は、細胞を、未調節キナーゼ活性を有するＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子と接触させることによって、ＭＥＫＫタンパク質の濃度を増加させることを含んでなる。細胞を接触させる好適な核酸分子として、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０、によって表されるＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子、およびそれらの組合せが挙げられる。細胞を接触させるさらに好適な核酸分子として、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメイン（即ち、調節ドメインでない）のみを有する切断されたＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子が挙げられる。細胞を接触させるさらにもっと好適な核酸分子として、ＭＥＫＫ  １３５２−６７２、ＭＥＫＫ  ２３５２−６１９、ＭＥＫＫ  ３３５８−６２６、ＭＥＫＫ  ４８１１−１１９５、ＭＥＫＫ  ５８６３−１２４７を含む核酸分子、およびそれらの組合せが挙げられる。再び、本明細書に記載のＭＥＫＫタンパク質の適切な変形は、緊縮条件下で上記の配列のいずれかとハイブリッド形成することができる核酸分子によってコードされたタンパク質を含んでなる。
【０１０９】
上記の方法が、細胞を、ＭＥＫＫ活性を阻害することができる化合物と接触させることによって、細胞中のＭＥＫＫタンパク質の活性を低下させる工程をさらに含んでなることは、本発明の範囲内にある。かかる化合物としては、ＭＥＫタンパク質によるＭＡＰＫのリン酸化が阻害されるような方式で、ＭＥＫＫのキナーゼドメインに結合することができるペプチド；および／またはＭＡＰＫタンパク質のリン酸化が阻害されるような方式で、ＭＡＰＫタンパク質の一部に結合することができるペプチドを挙げることができる。
【０１１０】
他の態様では、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員、Ｒａｆ依存性経路の構成員、およびそれらの組合せの活性は、細胞中のかかる構成員の活性を直接に変えることによって調節することができる。ＭＥＫＫ依存性経路の構成員の活性を変える好適な方法としては、これらに限定されないが、細胞を、タンパク質が活性化されるような方式で、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃを含むタンパク質、およびそれらの組合せと直接に相互作用することができる化合物と接触させること；および／または細胞を、タンパク質の活性が阻害されるような方式で、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、ＴＣＦタンパク質を含むタンパク質、およびそれらの組合せと直接に相互作用することができる化合物と接触させることが挙げられる。ＭＥＫＫ依存性経路の構成員を調節することができる、細胞を接触させるのに好適な化合物として、ペプチドが、かかるタンパク質のキナーゼドメインの活性を調節する調節ドメインの能力を阻害する、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃを含むタンパク質の調節ドメインに結合することができるペプチドが挙げられる。細胞を接触させるのに好適な他の化合物として、ＴＮＦα、チロシンキナーゼを調節する増殖因子、Ｇタンパク質結合受容体を調節するホルモンおよびＦＡＳリガンドが挙げられる。
【０１１１】
Ｒａｆ依存性経路の構成員を調節することができる、細胞を接触させるのに好適な化合物として、ペプチドが、タンパク質がリン酸化されるかまたは基質をリン酸化する能力を阻害する、Ｒａｆ、ＭＥＫ−１、ＭＥＫ−２、ＭＡＰＫ、およびＴＣＦからなる群から選ばれたタンパク質のキナーゼ触媒ドメインに結合することができるペプチドが挙げられる。本発明の１つの態様は、ＭＥＫＫタンパク質がＭＡＰＫを活性化することができるという認識に関する。ＭＡＰＫは、哺乳類系中の種々の細胞経路に関与していることは知られている。ＭＡＰＫは、細胞分裂誘発、ＤＮＡ合成、細胞分裂および分化に関与していることは知られている。ＭＡＰＫはまた、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｍｙｃのような癌遺伝子の活性化に関与していると認められる。理論にとらわれないならば、本発明者は、ＭＡＰＫはまた遺伝子源を有する種々の異常症に密接に関与していると考える。ＭＡＰＫは核膜を横断することが知られていて、種々の遺伝子の発現を調節することの少なくとも部分的に原因であると考えられる。このように、ＭＡＰＫは、癌、神経疾患、自己免疫疾患、アレルギー反応、創傷治癒および炎症反応の刺激と進行に顕著な役割を果たすと考えられる。本発明者は、ＭＥＫＫをコードしている核酸配列を最初に同定することによって、ＭＥＫＫの発現を調節し、そのようにしてＭＡＰＫの活性化を調節することが可能になることを認めた。
【０１１２】
本発明はまた、被験者の身体の区域に、有効量の裸のプラスミドＤＮＡ化合物を注入することを含んでなる、細胞の恒常性を調節する方法を包含する。裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、本発明のＭＥＫＫタンパク質をコードしていて、身体の区域中に位置する受容細胞中に取込まれそして発現することができる裸のプラスミドＤＮＡベクターに操作可能に結合している核酸分子を含んでなる。本発明の好適な裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、脱調節されたキナーゼ活性を有する切断されたＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子を含んでなる。本発明の好適な裸のプラスミドＤＮＡベクターは当業界で知られているものを包含する。本発明の裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、被験者に投与された場合、被験者内の細胞を形質転換し、細胞のアポト−シスを調節することができるＭＥＫＫタンパク質またはＲＮＡ核酸分子の少なくとも一部の産生を指示する。
【０１１３】
本発明の裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、癌、自己免疫疾患、炎症反応、アレルギー反応およびＰａｒｋｉｎｓｏｎ病とＡｌｚｈｅｉｍｅｒ病のような神経障害を含む内科的疾病に罹っている被験者を治療することができる。例えば、裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、抗腫瘍療法として、プラスミドが腫瘍細胞によって取込まれ、発現して、腫瘍細胞を死滅させるように、プラスミドの有効量を直接に腫瘍中に注射することによって、投与することができる。本明細書で使用されるように、被験者に投与する裸のプラスミドＤＮＡの有効量は、裸のプラスミドＤＮＡが治療することが意図されている内科的疾病を調節または治療するのに要する量を含んでなり、かかる投与の方法、投与の回数および投与の頻度は、不適当な実験に頼ることのない当業者によって決定されることができる。
【０１１４】
本発明の治療方法で使用される治療用化合物は、適切な賦形剤をさらに含んでなる。本発明の治療方法で使用される治療用化合物は、治療される被験者が許容できる賦形剤中に製剤することができる。かかる賦形剤として、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、ハンクス液、および他の生理学的に平衡された塩水溶液が挙げられる。固定（ｆｉｘｅｄ）油、ごま油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような非水媒体を使用することができる。他の有用な賦形剤として、ナトリウムカルボキシメチルセルローズ、ソルビトール、またはデキストランのような粘度増強剤を含有する懸濁剤が挙げられる。賦形剤はまた、等張性および化学的安定性を向上する物質のような、少量の添加剤を含有することができる。緩衝液として、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液およびトリス緩衝液が挙げられ、一方保存剤の例として、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。標準製剤は注射用液剤または注射用懸濁剤もしくは液剤として適切な液体中に取込まれることができる固形剤であることができる。従って、非液状製剤では、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、投与前に無菌水または食塩水に添加することができる保存剤等を含んでなることができる。
【０１１５】
他の態様では、本発明の治療方法で使用される治療用化合物はまた、担体を含んでなることができる。担体は通常、治療される動物中で治療用化合物の半減期を増加させる化合物である。適切な担体として、これらに限定されないが、リポゾーム、ミセル、細胞、高分子制御放出製剤、生物分解性移植片、細菌、ウイルス、油、エステルおよびグルコールが挙げられる。好適な担体はリポソームとミセルを含む。
【０１１６】
本発明の治療方法で使用される治療用化合物は、本明細書に記載の内科的疾病を有するいずれの被験者にも投与することができる。本発明の治療用化合物を有効な方法で投与する許容されるプロトコールは、１回の服用量、服用の回数、服用投与の頻度および投与の方法によって変えることができる。かかるプロトコールの決定は、不適当な実験に頼ることのない当業者によって行われることができる。有効な服用量とは、本明細書に記載の内科的疾病について被験者を治療することができる服用量を言う。有効な服用量は、例えば、使用された治療用化合物、治療される内科的疾病、および受容動物の大きさと種類に依存して変わることができる。被験者を治療する有効服用量は、内科的疾病に関与する細胞の活性（増殖を含めて）を調節することができる、経時的に投与される服用量を含む。例えば、本発明の裸のプラスミドＤＮＡ化合物の第一回の服用量は、腫瘍を有する被験者に投与された場合、腫瘍の大きさを７日間で約１０％減少させる量を含んでなる。第二回の服用量は、第一回の服用と少なくとも同一の治療用化合物を含んでなる。
【０１１７】
本発明の他の態様は、本明細書に記載の内科的疾病を有する被験者のための治療法を処方する方法を包含する。治療法を処方する好適な方法は、（ａ）内科的疾病に関与する細胞中のＭＥＫＫタンパク質活性を測定して、細胞が本発明の方法を使用する治療法に感受性があるかどうかを決定すること；および（ｂ）細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節して、細胞のアポト−シスを誘発することを含む治療法を処方すること；を含んでなる。ＭＥＫＫタンパク質活性を測定する工程は、（１）被験者から細胞の試料を取出すこと；（２）細胞をＴＮＦαで刺激すること；および（３）ホスホスレオニンおよび／またはホスホセリンに特異的である抗体を使用する免疫測定法を使用して、ＪＥＫタンパク質のリン酸化の状態を検出すること；を含んでなることができる。
【０１１８】
本発明はまた、本発明のＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を包含する。かかる抗体は本明細書では抗ＭＥＫＫ抗体と呼称される。抗ＭＥＫＫ抗体の多クローン性集団はＭＥＫＫ抗血清中に含有されることができる。ＭＥＫＫ抗血清とは、アフィニティー精製された多クローン性抗体、硫酸アンモニウムカット抗血清または全血清を言うことができる。本明細書で使用されるように、用語「に選択的に結合した」とは、かかる抗体がＭＥＫＫタンパク質に優先的に結合する能力を言う。結合は、免疫ブロット測定法、免疫沈降測定法、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）、放射標識免疫測定法、免疫蛍光抗体測定法および免疫電子顕微鏡法、［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、分子クローニング  実験手引き書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照］を含む、当業者に既知の多種類の方法を使用して測定することができる。
【０１１９】
本発明の抗体は多クローン性または単クローン性抗体であることができ、そして当業界で標準の技術を使用して製造することができる。本発明の抗体は、抗体を得るために使用されたタンパク質のエピトープの少なくとも１つに選択的に結合することができる、一本鎖抗体を含む、抗体断片および遺伝子工学の抗体のような機能的均等物を包含する。好適には、抗体は、ＭＥＫＫ核酸分子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質に応答して、生成する。さらに好適には、抗体は、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部に応答して生成し、さらに好適には、抗体は、ＭＥＫＫタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に応答して生成する。好適には、本発明の抗体は、本発明のＭＥＫＫタンパク質に対して、約１０３Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の単一部位結合親和力を有する。
【０１２０】
本発明の抗体を製造する好適な法は、動物に、ＭＥＫＫタンパク質の有効量を投与して抗体を産生させ、そして抗体を回収することを包含する。本発明の抗体は、本発明の範囲内にある多種類の潜在的な使用を有する。例えば、かかる抗体は、独特のＭＥＫＫタンパク質を同定し、そしてＭＥＫＫタンパク質を回収するのに使用することができる。
【０１２１】
本発明の他の態様は、（ａ）細胞を推定される調節分子と接触させること；および（ｂ）推定される調節化合物が細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節する能力を、前記ＭＥＫＫ依存性経路の少なくとも１つの構成員の活性化を測定することによって、決定すること；によって同定された、細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することができる治療用化合物を含んでなる。ＭＥＫＫ依存性経路の構成員の活性化を測定する好適な方法は、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の転写調節活性を測定すること、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｍｙｃからなる群から選ばれたタンパク質のリン酸化を測定すること、およびそれらの組合せを包含する。
【０１２２】
以下の実施例は、本発明の説明のために提供されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
＜実施例１＞
本実施例はＭＥＫＫ１タンパク質の構造的特性決定について記載する。Ａ．  ＭＥＫＫ１ヌクレオチド配列
ＭＥＫＫ１タンパク質を以下の方法によってクローン化した。独自の変性イノシンオリゴデオキシヌクレオチドを、酵母Ｓｔｅ１１とＢｙｒ２遺伝子の間の配列同一性の領域に対応するように設計した。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞からのポリアデニル化ＲＮＡから誘導されたプライマーと
ｃＤＮＡ鋳型を用いて、３２０塩基対（ｂｐ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅生成物を単離した。この３２０ｂｐ  ｃＤＮＡをプローブとして使用して、マウス脳ｃＤＮＡライブラリーから、当業界の標準方法を使用して、３２６０ｂｐのＭＥＫＫ１ｃＤＮＡを同定した。ＭＥＫＫ１ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡのジデオキシヌクレオチド配列決定法によって、当業界の標準方法を使用して決定した。
【０１２３】
表６を参照すると、開始コドンのためのＫｏｚａｋ共通配列に基づいて、出発メチオンはヌクレオチド４８４に存在すると予想することができる。このメチオニンを出発点として、ｃＤＮＡは、７３ｋＤの分子サイズに相当する、６７２個のアミノ酸のタンパク質をコードする。位置４４１に、Ｋｏｚａｋ規則に従わないが、６８７個のアミノ酸残基のタンパク質（７４．６ｋＤ）を与える、他のインフレーム・メチオニンがある。また表６を参照すると、ＮＨ２末端の４００個のアミノ酸の２０％はセリンとスレオニンであり、チロシンは２個だけある。プロテインキナーゼＣによるリン酸化の数個の潜在的部位は、ＮＨ２末端領域中にある。キナーゼ触媒ドメインはＭＥＫＫ１のＣＯＯＨ末端半分の中に位置する。
Ｂ．  ＭＥＫＫ１転写のサザンブロット分析
同量（２０μｇ）の全ＲＮＡを、臭化エチジウム染色によって示されるように、ゲル中に入れた。ブロットを、ＭＥＫＫキナーゼドメインの一部をコードしている３２０−ｂｐのｃＤＮＡ断片またはＭＥＫＫのＮＨ２末端領域の一部をコードしている８５８−ｂｐの断片のいずれかで、当業界の標準方法を使用してプローブした。図３Ａを参照すると、７．８ｋＤのｍＲＮＡが、数種の細胞株とマウス組織中でＭＥＫＫ  ｃＤＮＡの５′末端と３′末端から誘導されたプローブで同定された。ＭＥＫＫ  ｍＤＮＡは、マウスの心臓と脾臓中で高度に発現し、肝臓中では発現は低い量であった。
Ｃ．  サザンブロット分析
マウスのゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、当業界の標準方法を使用して、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏ  ＲＩのいずれかで消化し、ゲルに塗布した。ブロットを、ＭＥＫＫ遺伝子の３２０−ｂｐの断片でプローブした。図３Ｂには、Ｂａｍ  ＨＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化物中に１つのバンドの出現を示し、それはＭＥＫＫが１つの遺伝子によってコードされていることを示す。Ｅｃｏ  ＲＩ消化物中に２つのバンドが出現することは、プローブによってスパンされたイントロン配列内にＥｃｏ  ＲＩ部位が存在するらしいことを示す。
Ｄ．  抗ＭＥＫＫ抗体を使用するイムノブロット
３種の異なった抗原を使用して、３種の多クローン性抗血清を製造した。第一の多クローン性抗血清は、ＭＥＫＫのＣＯＯＨ末端から誘導された１５個のアミノ酸のペプチドＤＲＰＰＳＲＥＬＬＫＨＰＶＥＲを含む抗原を使用して製造した。ＮＺＷウサギをペプチドで免疫処置して、当業界の標準方法を使用して抗血清を回収した。この第一の多クローン性抗血清を本明細書ではＤＲＰＰ抗血清と呼称する。
【０１２４】
第二の多クローン性抗血清は、ＥｃｏＲ１とＰｓｔＩで消化されたＭＥＫＫ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡクローンを使用し、ＭＥＫＫのアミノ末端をコードする１２７０ｂｐの断片を生成させて、製造した。この断片をｐＲＳＥＴＣ中でクローン化して、ＭＥＫＫ１のアミノ酸残基１〜３６９を含む組換え分子ｐＭＥＫＫ１〜３６９を生成させた。ｐＭＥＫＫ１〜３６９組換え分子をＥ．コリ中で発現させて、組換え分子によってコードされたタンパク質を回収し、当業界の標準方法を使用して精製した。ＮＺＷウサギを精製組換えＭＥＫＫ１〜３６９分子で免疫処置し、当業界の標準方法を使用して回収した。この第二の多クローン性抗血清を本明細書ではＭＥＫＫ１〜３６９抗血清と呼称する。
【０１２５】
第三の多クローン性抗血清は、Ｐｓｔ  ＩとＫｐｎ  １で消化されたＭＥＫＫ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡクローンを使用し、ＭＥＫＫの触媒ドメインをコードする１６７０ｂｐの断片を生成させて、製造した。この断片をｐＲＳＥＴＣ中でクローン化して、ＭＥＫＫ１のアミノ酸残基３７０−７３８を含む組換え分子ｐＭＥＫＫ３７０−７３８（塩基対１５９２−３２６０によってコードされた）を生成させた。ｐＭＥＫＫ１３７０−７３８組換え分子を、Ｅ．コリ中で発現させて、組換え分子によってコードされたタンパク質を回収し、当業界の標準方法を使用して精製した。ＮＺＷウサギを精製組換えＭＥＫＫ３７０−７３８タンパク質で免疫処置し、当業界の標準方法を使用して回収した。この第三の多クローン性抗血清を本明細書ではＭＥＫＫ１３７０−７３８抗血清と呼称する。
【０１２６】
ＤＲＰＰ抗血清を使用して、数種の噛歯動物の細胞株から誘導された可溶性細胞タンパク質のウエスタンブロットをプローブした。可溶性細胞タンパク質（１００μｇ）または組換えＭＥＫＫ  ＣＯＯＨ末端融合タンパク質（３０ｎｇ）を、１０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に入れ、タンパク質を当業界の標準方法を使用してナイロンフィルターに移した。ナイロンフィルターをアフィニティー精製ＤＲＰＰ抗血清でイムノブロットした（１：３００希釈）。図３Ｃを参照すると、７８ｋＤの免疫活性タンパク質が、フェノクロモサイトーマ（ＰＣ１２）、Ｒａｔ  １ａおよびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞からのタンパク質を含む試料中に同定された。顕著な５０ｋＤの免疫活性バンドも通常存在するが、強度が標本によって変わり、このことはバンドがタンパク質分解断片であることを示す。イムノブロット上の７８ｋＤと５０ｋＤの免疫活性バンドの両方の視覚化は、１５個のアミノ酸ペプチド抗原のアフィニティー精製ＤＲＰＰ抗血清との予備インキュベーションによって抑制された。イムノブロットによって検出されたＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ  ｃＤＮＡの転写解読枠から推定された分子サイズと類似である。
【０１２７】
第二のイムノブロット実験では、ＥＧＦで刺激されたまたは刺激されなかったＰＣ１２細胞を溶解し、上記のように、１０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分別した。細胞溶解物中に含有されたＭＥＫＫタンパク質は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ１−３６９抗血清（１：３００）を使用するイムノブロットによって、当業界の標準方法を使用して、同定された。
【０１２８】
図４を参照すると、ＭＥＫＫ１、およびＭＥＫＫ活性、ＭＥＫＫαとＭＥＫＫβを有する２種の高分子量タンパク質は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ１−３６９抗血清を使用して、同定された。ＭＥＫＫ１は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ１−３６９抗血清を使用して同定され、ＭＥＫＫαとＭＥＫＫβは同定されなかった。
【０１２９】
上記と同一の方法を使用して、ＰＣ１２、Ｒａｔｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＳｗｉｓｓ細胞溶解物中に存在する、約９８ｋＤと８２ｋＤの２種のＭＥＫＫ免疫活性種が、図５に示されるように、アフィニティー精製ＭＥＫＫ１−３６９抗血清によって認められた。本明細書に記載の９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質は元来、関連ＰＣＴ出願（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０４１７８）の９５ｋＤのＭＥＫＫタンパク質と同定されたことを注目すべきである。その後のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって、分子量の改変が決定された。これらのタンパク質の両方の視覚化は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ１−３６９抗血清を、精製組換えＭＥＫＫ１−３６９融合タンパク質抗原とインキュベートすることによって抑制された。一本鎖の９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ免疫沈降物中に存在するが、プレイムノ血清を使用する免疫沈降物中には存在しなかった。９８ｋＤのＭＥＫＫは、繊維芽細胞株に比してＰＣ１２細胞中で多く発現した。Ｒａｆ−１またはＲａｆ−Ｂを特異的に認識する抗体を用いるイムノブロットによって、これらの酵素のいずれもが、ＭＥＫＫ免疫沈降物の混入物として存在したものでないことが示された。ＭＥＫＫ免疫沈降物中の９８ｋＤのＭＥＫＫは、ＰＣ１２細胞溶解物中のＲａｆ−１またはＲａｆ−Ｂとコミグレート（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）せず、そしてＭＥＫＫとＲａｆ抗体との間の交差反応性は観察されなかった。
＜実施例２＞
この実施例はＭＥＫＫ２、ＭＥＫＫ３およびＭＥＫＫ４タンパク質をコードしている核酸配列の単離について記載する。
【０１３０】
ＰＣＲプライマーは、ＭＥＫＫ１のヌクレオチド配列に基づいて設計した。ＰＣ１２とＨＬ６０細胞から単離されたＲＮＡのリバーストランスクリプターゼ反応から単離されたＤＮＡからの断片のＰＣＲ増幅は、標準技術を使用して行った。得られたＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＸクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中で、標準方法を使用してクローン化し、標準技術を使用するＤＮＡ配列分析に供した。
＜実施例３＞
この実施例は、ＣＯＳ−１細胞中でＭＥＫＫ１タンパク質を発現させて、ＭＡＰＫを含むシグナリング系を調節する機能を規定することについて記載する。
【０１３１】
１００ｍｍ培養皿中のＣＯＳ細胞を、ｐＣＶＭＶ５発現ベクター単独（１μｇ：対照）またはｐＣＶＭＶ５  ＭＥＫＫ構築物（１μｇ：ＭＥＫＫ）のいずれかで、トランスフェクトした。４８時間後、細胞を、ウシ血清アルブミン（０．１％）を含有する無血清培地中に１６〜１８時間入れて、休止を誘導した。次いで、細胞を、ヒトＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）（＋ＥＧＦ）または緩衝液（対照）で１０分間処理し、冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして５０ｍＭ  β−グリセロホスフェート（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．５％)、ロイペプチン（２μｇ／ｍｌ)、アプロチニン（２μｇ／ｍｌ)、および１ｍＭジチオスレイトール（６００μｌ）を含有する細胞溶解緩衝液中で溶解させた。マイクロフュージ中で最高速度で１０分間遠心分離した後、０．５〜１ｍｇの可溶性タンパク質を含有するＣＯＳ細胞溶解物を、ＭＯＮＯ  Ｑカラム上のＦＰＬＣで処理して、溶出フラクションを、Ｈｅａｓｌｅｙ等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ，第３巻，第５４５頁，１９９２年に記載の方法にしたがって、ＭＡＰＫ活性について測定した。
【０１３２】
図６Ａを参照すると、ＭＥＫＫ１がＣＯＳ１細胞中で過発現した場合、ＭＡＰＫ活性は、ＭＥＫＫ  １ｃＤＮＡ挿入物を欠くプラスミドでトランスフェクトされた対照細胞中よりも４〜５倍大きかった。ＭＡＰＫの活性化は、血清から遮断されたＣＯＳ細胞中、および添加された増殖因子の不在下で、起こる。ＭＡＰＫの活性は、対照細胞のＥＧＦによる刺激の後に、観察された活性と同様であった。ＭＥＫＫを一時的に過発現するＣＯＳ細胞をＥＧＦで刺激すると、ＭＡＰＫ活性が、ＭＥＫＫ発現単独の場合に観察された活性と比較して、少しだけ増加した。
【０１３３】
ＭＥＫＫタンパク質が、ＭＡＰＫ活性について試験した試料中に存在することを確認するために、トランスフェクトされたＣＯＳ１細胞の細胞溶解物からのタンパク質を、ＭＥＫＫ特異性抗血清とイムノブロットした。ＣＯＳ細胞からの可溶性タンパク質溶解物の同量（１００μｇ）を、実施例１に記載の方法を使用するイムノブロットのためのゲル上に置いた。フィルターを、アフィニティー精製ＤＲＰＰ抗血清（１：３００）とアフィニティー精製ＭＥＫＫ１−３６９抗血清（１：３００）を使用してイムノブロットした。図６Ｂを参照すると、結果は、ＥＧＦで処理されたまたはＥＧＦ無しで処理されたＭＥＫＫをコードしているベクターでトランスフェクトされた細胞中でＭＥＫＫが発現することを示す。５０ｋＤのＭＥＫＫ免疫活性断片のみが、対照ＣＯＳ細胞からの溶解物中に、ＤＲＰＰ抗血清を使用して検出された。ＣＯＳ細胞中でのＭＥＫＫの一過性の発現は、ＰＣ１２、Ｒａｔ  １ａ、またはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中で観察されたものより少し大きい顕著な８２ｋＤのバンドを与えた。イムノブロット中に、１５個のアミノ酸ＤＲＰＰペプチド抗原を抗血清に添加すると、免疫反応性バンドのすべての検出が防止された。これらのバンドは対照ＣＯＳ細胞の抽出物中に検出されなかた。このことは、それらが発現ＭＥＫＫタンパク質から誘導されたことを示している。
＜実施例４＞
この実施例は、ＣＯＳ細胞中でＭＥＫＫ１を発現させて、ＭＥＫタンパク質を活性化するＭＥＫＫタンパク質の能力を試験することについて記載する。
【０１３４】
組換えＭＡＰＫを使用して、ＭＯＮＯ  Ｓカラム上の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって分画されたＣＯＳ細胞溶解物中のＭＥＫ活性を測定した。クセノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）からのｐ４２  ＭＡＰＫをコードしているｃＤＮＡを、ｐＲＳＥＴＢ発現ベクター中でクローン化した。この構築物を、ＮＨ２末端にポリヒスチジンを含有するｐ４２  ＭＡＰＫ融合タンパク質の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）のＬｙｓＳ株中での発現のために使用した。発現プラスミドを含有する培養物を、６００ｎＭで０．７〜０．９の光学濃度まで、３７℃で増殖させた。融合タンパク質合成を誘導するために、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（０．５ｍＭ）を添加し、培養物を３時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、凍結、解凍、および音波処理によって溶解した。溶解物を、１０，０００ｇで４℃にて１５分間遠心分離した。次いで、上澄液をＮｉ２＋充填セファロース樹脂に通し、可溶性組換えＭＡＰＫをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶出させた。精製組換えＭＡＰＫは８０％以上の純度であった。精製組換えＭＡＰＫは、ＭＥＫのための基質として働き、ＥＧＦ受容体の残基６６２〜６８１からなるペプチド（ＥＧＦＲ６６２〜６８１）のリン酸化を触媒した。
【０１３５】
一時的にＭＥＫＫでトランスフェクトされた、ｍｏｃｋトランスフェクトされた（対照）、またはｍｏｃｋトランスフェクトされそしてＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）（＋ＥＧＦ）で処理された、ＣＯＳ細胞からの可溶性細胞溶解物を、Ｍｏｎｏ  Ｓカラム上のＦＰＬＣによって分画し、内因性ＭＥＫ活性を測定した。内因性ＭＡＰＫはフラクション２〜４中に溶出し、一方ＭＥＫはフラクション９〜１３中に含有された。内因性ＭＥＫ活性を測定するために、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍＭ  β−グルセロホスフェート、１０ｍＭ  ２−Ｎ−モルホリンエタン−スルホン酸（ｐＨ６．０）、１００μＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．５％）、ロイペプチン（５μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２μｇ／ｍｌ）、および１ｍＭジチオスレイトールを含有する６５０μｌの溶液中で溶解した。マイクロフュージ中で最高速度で１０分間遠心分離した後、可溶性細胞溶解物（１〜２ｍｇのタンパク質）を、溶出緩衝液（５０ｍＭ  β−グイセロホスフェート、１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１００μＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１ｍＭジチオスレイトール）中で平衡化されたＭｏｎｏ  Ｓカラムに導入した。カラムを緩衝液（２ｍｌ）で洗浄し、結合したタンパク質を、溶出緩衝液中の線状勾配０−３５０ｍＭのＮａＣｌの３０ｍｌで溶出させた。各フラクションの一部（３０μｌ）を、４０μｌの最終容量中で、の緩衝液（２５ｍＭ  βーグルセロホスフェート、４０ｍＭ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタノールスクホン酸）（ｐＨ７．２）、５０ｍＭバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（３０００〜４０００  ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、阻害剤、プロテイン−２０（ＩＰ−２０；ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ；２５μｇ／ｍｌ）、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、組換えＭＡＰキナーゼ（７．５μｇ／ｍｌ）、および２００μＭ  ＥＧＦＲ６６２−６８１）と混合して、ＭＥＫ活性について測定した。３０℃で２０分間インキュベートした後、γ−３２Ｐ−ＡＴＰのＥＧＦＲ６６２−６８１中への取込みを測定した。この測定では、添加された組換えＭＡＰＫを活性化する各カラムフラクションの能力を、ＭＡＰＫ基質、ＥＧＦ受容体から誘導されたペプチド（ＥＧＦＲ）、中へのγ−３２Ｐ−ＡＴＰの取込みによって測定した。
【０１３６】
図７を参照すると、溶出した活性の第一のピークは内因性活性化ＭＡＰＫを表し、それはＥＧＦＲペプチド基質を直接にリン酸化する。活性の第二のピークはＣＯＳ細胞中の内因性ＭＥＫを表す。
【０１３７】
内因性ＭＥＫの活性は、Ｍｏｎｏ  Ｓ  ＦＰＬＣの分画によって特性決定した。ＣＯＳ細胞溶解物をＭｏｎｏ  Ｑカラム上のＦＰＬＣによって分画し、発現ＭＥＫＫを部分的に精製した。次いで、精製組換えＭＥＫ−１を、ＭＥＫＫのための基質として、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で使用して、ＭＥＫＫがＭＥＫ−１を直接にリン酸化するかどうかを決定した。
【０１３８】
ＭＥＫ−１をコードしているｃＤＮＡは、マウスＢ細胞のｃＤＮＡ鋳型から、ポリメラーゼ連鎖反応およびＭＥＫ−１の５′コード領域と
３′非翻訳領域の部分に対応するオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて、得た。触媒的不活性なＭＥＫ−１は、Ｌｙｓ３４３からＭｅｔの部位特異的突然変異誘発によって生成させた。野生型ＭＥＫ−１と触媒的不活性なＭＥＫ−１タンパク質は、それらのＮＨ２末端でポリヒスチジン配列を含有する組換え融合タンパク質として、ｐＲＳＥＴＡ中で発現させた。
【０１３９】
ＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞またはｍｏｃｋトランスフェクトされたＣＯＳ細胞（対照）からの溶解物は、上記のＭｏｎｏ  Ｑカラム上のＦＰＬＣの処理を行った。ＭＥＫＫを含有するフラクションの一部（２０μｌ）を、４０μｌの反応容量中に、５０ｍＭ  βーグルセロホスフェート（ｐＨ７．２）、１００μＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０μＭ  ＡＴＰ、ＩＰ−２０（５０μｇ／ｍｌ）、および１０μｌ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰを含有する緩衝液と混合し、組換え触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）
（キナーゼ−ＭＥＫ−１）の存在下（＋）または不在下（−）で、４０分間インキュベートした。反応は、５×ＳＤＳ試料緩衝液（１０μｌ）を添加して停止させた。１×ＳＤＳ緩衝液は２％ＳＤＳ、５％グリセロール、６２．５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％  βーメルカプトエタノール、および０．００１％ブロモフェノールブルーを含有する。試料を３分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィー処理を行った。
【０１４０】
図８Ａを参照すると、自己リン酸化された組換え野生型ＭＥＫ−１
（ＷＴ  ＭＥＫ−１）は、リン酸化された触媒的不活性なＭＥＫ−１とコミグレートした。従って、ＭＥＫＫはＭＥＫ−１をリン酸化することができる。しかし、対照細胞からの溶解物の対応フラクションはＭＥＫ−１をリン酸化することができなかった。
＜実施例５＞
この実施例は、実施例４のリン酸化測定法で使用されたＭＥＫＫ−１の改変形態が、野生型ＭＥＫ−１のようには、自己リン酸化しなかったことを示す研究について記載する。
【０１４１】
触媒的不活性なＭＥＫ−１のＭＥＫＫによるリン酸化は時間依存性であった（図８Ｂ）；ＭＥＫＫもリン酸化された。Ｍｏｎｏ  Ｑカラム上のＦＰＬＣからのフラクション２２（２０μｌ）を、組換え触媒的不活性なＭＥＫ−１（０．１５μｇ）とまたはなしで、記載の時間の間インキュベートした。図８Ｂを参照すると、キナーゼＭＥＫ−１およびＭＥＫＫのリン酸化は、５分後に可視的になり、２０分後に最高になった。ＭＥＫＫリン酸化の時間依存的増加は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のＭＥＫＫタンパク質の高い易動度と相互に関連していた。図８Ｃを参照すると、イムノブロットは、ＭＥＫＫタンパク質が、ＭＥＫをリン酸化する活性のピーク（フラクション２２）と（ｍｏｎｏ  Ｑカラム上のＦＰＬＣの後に）共溶出することを示した。ＭＥＫＫのゆっくりと移動する種も、イムノブロットによって検出された。従って、ＭＥＫＫの発煙は、ＭＥＫを活性化して、ＭＡＰＫを活性化するようである。
＜実施例６＞
この実施例は、過発現したＭＥＫＫによってＭＥＫをリン酸化すると、ＭＥＫ、組換え野生型ＭＥＫ−１、および触媒的不活性であるＭＡＰＫの改変形態が活性化されることを記載する。
【０１４２】
ＣＯＳ細胞溶解物をＭｏｎｏ  Ｑ−ＦＰＬＣによって分別して、ＭＥＫＫを含有するフラクションを、それが触媒的不活性な組換えＭＡＰＫをγ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でリン酸化するように、添加された野生型ＭＥＫ−１を活性化するそれらの能力について測定した。ＭＥＫＫでトランスフェクトされたまたはｍｏｃｋトランスフェクトされたＣＯＳ細胞（対照）からの溶解物を、Ｍｏｎｏ  Ｑカラム上のＦＰＬＣによって分画して、ＭＥＫＫを含有するフラクションの一部（２０μｌ）を緩衝液と混合した。各フラクションを、精製組換え野生型ＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）の存在下（＋）または不在下（−）で、ならびに精製組換え触媒的不活性な（キナーゼ）ＭＡＰＫ（３００ｎｇ）の存在下で、インキュベートした。図９Ａを参照すると、ＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の溶解物からのフラクション２０−２４はＭＥＫ−１を活性化した。従って、ＭＥＫＫがＭＥＫ−１をリン酸化し、活性化して、ＭＡＰＫがリン酸化された。
＜実施例７＞
この実施例は、ＭＥＫＫが直接にＭＥＫを活性化し、カラムフラクション中に含有された一つまたはそれ以上の他のキナーゼの活性化によってではないことを示す研究について記載する。
【０１４３】
過発現されたＭＥＫＫを、ＣＯＳ細胞溶解物から、アフィニティー精製ＭＥＫＫ１−３６９抗血清によって免疫沈降させた。免疫沈降したＭＥＫＫを、１５μｌのＰＡＮ（１０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ））中に再懸濁させ、そして２０μｌの最終容量中で、２０ｍＭ  ｐｉｐｅｓ（ｐＨ７．０）中の触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と２５μＣｉのγ−３２Ｐ−ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）と共に（＋）、または無しで（−）、３０℃で１５分間インキュベートした。反応を、５×ＳＤＳ緩衝液（５μｌ）を添加して停止させた。試料を３分間煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー処理を行った。
【０１４４】
図９Ｂを参照すると、ＭＥＫＫは触媒的不活性ＭＥＫ−１をリン酸化し、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で野生型ＭＥＫ−１とコミグレートした。免疫沈降物中に、過発現ＭＥＫＫの数個のリン酸化されたバンドが検出された。これらのバンドは多分、ＭＥＫＫの自己リン酸化に由来し、そしてＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの溶解物のイムノブロットによって同定されたＭＥＫＫの形態に対応した。プレイムノ血清で得た免疫沈降物はＭＥＫＫを含有せず、またＭＥＫ−１をリン酸化しなかった。従って、ＭＥＫＫはＭＥＫを直接的にリン酸化するようである。
【０１４５】
一緒にして考えると、実施例４〜実施例７からの結果は、ＭＥＫＫはＭＥＫをリン酸化し活性化して、それが順にＭＡＰＫをリン酸化し活性化することを示している。
＜実施例８＞
この実施例は、ＲａｆもＭＥＫをリン酸化し活性化することができることを示す。
【０１４６】
血清から遮断されたＣＯＳ細胞をＥＧＦで刺激し、そしてＲａｆを、Ｒａｆ−１のＣＯＯＨ末端に対する抗体で免疫沈降させた。ＣＯＳ細胞を、ベクター単独（対照）またはＰＣＶ／Ｍ５−ＭＥＫＫ構築物（ＭＥＫＫ）で一時的にトランスフェクトした。休止性の対照細胞を、ヒトＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で、またはなしで、１０分間処理して、Ｒａｆを、細胞溶解物から、ＲａｆからのＣＯＯＨ末端ペプチドに対する抗体で、免疫沈降させた。免疫沈降したＲａｆを、触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と２５μｌのγ−３２Ｐ−ＡＴＰとインキュベートした。免疫沈降したＲａｆは、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ＭＥＫ−１をリン酸化した（図１０Ａ）。ＭＥＫＫを過発現するＣＯＳ細胞からのＲａｆの免疫沈降物中では、ＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化は少ししかまたは全く観察されなかった。ＭＥＫＫを過発現するＣＯＳ細胞をＥＧＦで処理すると、免疫沈降したＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化が同程度に起こった（図１０Ｂ）。ＭＥＫＫでトランスフェクトされそして血清から遮断された細胞を、ＥＧＦで処理し、そしてＲａｆを免疫沈降させて、触媒的不活性なＭＥＫ−１とインキュベートした。Ｒａｆに対する抗体とのイムノブロットによって示されたように、同量のＲａｆが各試料中に免疫沈降した。最も緩慢に移動するバンドは、ＲａｆまたはＭＥＫ−１に無関連である免疫沈降したリンタンパク質を表す。対照細胞およびＭＥＫＫでトランスフェクトされた細胞からの免疫沈降物中のＲａｆの量は、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲａｆに対する抗体とのイムノブロットによって示されるように、同様であった。従って、ＭＥＫＫとＲａｆは独立してＭＥＫを活性化することができる。
＜実施例９＞
この実施例は、ＭＥＫＫタンパク質を含有する細胞の増殖因子による刺激に応答して、ＰＣ１２細胞から単離された９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質が活性化することについて記載する。
【０１４７】
ＰＣ１２細胞を、飢餓培地（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ）中で１８〜２０時間インキュウベートすることによって、血清から遮断し、そしてＭＥＫＫを、未処理の対照またはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理された細胞の同量を含有する溶解物から、ＭＥＫＫのＮＨ２末端部分に特異的な上記の抗ＭＥＫＫ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降したＭＥＫＫを８μｌのＰＡＮ（１０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ））中に再懸濁させ、触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と４０μＣｉの（γ−３２Ｐ）ＡＴＰと、万能キナーゼ緩衝液（２０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＭｎＣｌ２、およびアピロチニン（２０μｇ／ｍｌ））中で、２０μｌの最終容量中で、３０℃で２５分間インキュベートした。２Ｘ  ＳＤＳ試料緩衝液（２０μｌ）を添加して、反応を停止した。試料を３分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＥとオートラジオグラフィー処理を行った。Ｒａｆ−Ｂを、Ｒａｆ−ＢのＣＯＯＨ末端ペプチドに対する抗血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で、上記のように、同一の未処理および処理されたＰＣ１２細胞溶解物から免疫沈降させ、同様に測定した。Ｒａｆ−１を、Ｒａｆ−１のＣＯＯＨ末端アミノ酸に対する抗血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で免疫沈降させた。血清飢餓にされたＰＣ１２細胞を表皮増殖因子（ＥＧＦ）処理すると、ＭＥＫＫ活性が増加した。
【０１４８】
図１１を参照すると、結果は、ＭＥＫＫの免疫沈降物によって精製ＭＥＫ−１（キナーゼ不活性型）のリン酸化を、試験管内キナーゼ測定で、測定することによって得たものである。ＮＧＦは、未処理細胞からの対照免疫沈降物と比較して、ＭＥＫＫ活性のわずかな増加を刺激した。Ｒａｆ−Ｂは高い基礎活性を示したが、ＮＧＦとＥＧＦによるＭＥＫＫ活性の刺激は、これらの試薬によるＲａｆ−Ｂ活性化と同様であった。ＮＧＦとＥＧＦによるｃ−Ｒａｆ−１の活性化は、ＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂのそれと比較して殆ど無視してよい程度であった。
【０１４９】
ＥＧＦによるＭＥＫＫ刺激の経時変化は、０、１、３、５、１０、または２０分間ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＰＣ１２細胞の溶解物からのＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂタンパク質を免疫沈降させ、そのタンパク質を、上記のように、触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と（γ−３２Ｐ）ＡＴＰとインキュベートすることによって行った。データは、典型的実験からの、放射性ゲルのホスホルイメージャー分析によって定量された、各時点での応答の相対的大きさを表す。ＥＧＦ処理の経時変化は、ＭＥＫＫ活性化が５分後に最高水準に達し、少なくとも３０分間持続することを示した（図１２）。Ｒａｆ−Ｂは同様の経時変化を示した；ピークの活性はＥＧＦ処理後３−５分以内に生じ、２０分までの間持続した。
【０１５０】
ＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫ活性をＲａｆ−Ｂのそれからさらに分離するために、ＭＥＫＫ免疫沈降の前に、Ｒａｆ−Ｂを細胞溶解物から免疫清掃した。Ｒａｆ−Ｂを、ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理されたまたは処理されなかった血清飢餓ＰＣ１２細胞の溶解物から予備清掃した。Ｒａｆ−Ｂを、Ｒａｆ−Ｂに対する抗血清を使用して、または対照として免疫前ＩｇＧ抗血清を使用して、２回予備清掃した。次いで、予備清掃された上澄液を、ＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂ抗血清で免疫沈降させ、詳細に上記したように、触媒的不活性なＭＥＫ−１と（γ−３２Ｐ）ＡＴＰとインキュベートした。ＥＧＦ刺激された、および刺激されなかったＰＣ１２細胞溶解物を、ＩｇＧまたはＲａｆ−Ｂ抗血清で予備清掃し、次いでＭＥＫＫ抗血清またはＲａｆ−Ｂ抗体で免疫沈降処理を行った。図１３に示された結果は、試験管内キナーゼ測定中に、Ｒａｆ−Ｂのホスホルイメージャー分析によって測定して、Ｒａｆ−Ｂ活性が６０％低下したことを示した。ＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫ活性はＲａｆ−Ｂ除去によって影響されなかったが、これはＲａｆ−ＢがＭＥＫＫ免疫沈降物の成分ではないことを示唆する。Ｒａｆ−Ｂ活性の少なくとも４０％は、Ｒａｆ−Ｂ抗体による予備清掃に対して抵抗性である。ＣＯＳ細胞中で過発現した組換え野生型ＭＥＫＫは、セリンとスレオニン残基上で容易に自己リン酸化し、ＭＥＫＫのアミノ末端は非常にセリンとスレオニンに富む。ＰＣ１２細胞の免疫沈降物中に含有されたＭＥＫＫを、精製組換えＭＥＫＫアミノ末端融合タンパク質の選択的リン酸化について、試験管内キナーゼ測定法で試験した。
【０１５１】
血清飢餓のＰＣ１２細胞を、ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理し、同一の細胞溶解物からの同量のタンパク質を、ＭＥＫＫ、Ｒａｆ−Ｂ、または対照として免疫前抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物を、精製組換えＭＥＫＫ  ＮＨ２末端融合タンパク質（４００ｎｇ）および（γ−３２Ｐ）ＡＴＰと、上記のようにインキュベートした。図１４に示された結果は、ＥＧＦ刺激されたおよびＥＧＦ刺激されなかったＰＣ１２細胞の溶解物から免疫沈降したＭＥＫＫは不活性な５０ｋＤのＭＥＫＫＮＨ２融合タンパク質を強くリン酸化し、一方Ｒａｆ−Ｂ、またはＥＧＦ刺激されたまたはＥＧＦ刺激されなかったＰＣ１２細胞からの免疫前免疫沈降物は、基質としてＭＥＫＫ  ＮＨ２融合タンパク質を使用しなかったことを示している。従って、ＭＥＫＫ免疫沈降物中に含有されたＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫ活性は、混入Ｒａｆキナーゼによるものではない。
＜実施例１０＞
この実施例は、ＰＣ１２細胞溶解物のＦＰＬＣ  Ｍｏｎｏ  Ｑイオン交換カラムフラクション中のＭＥＫＫ活性について記載する。
【０１５２】
細胞溶解物は、ＥＧＦ刺激されたＰＣ１２細胞から製造した。１ｍｌのカラムフラクション（１−５２５ｍＭ  ＮａＣｌ勾配）の一部（９００μｌ）をトリクロロ酢酸による沈殿によって濃縮し、上記のようにゲル上に置いた。ゲルをブロットし、次いでＭＥＫＫ特異性抗体でイムノブロットした。図１５Ａに示された結果は、９８ｋＤのＭＥＫＫの免疫反応性がフラクション１０−１２に溶出したことを示している。Ｒａｆ−Ｂ免疫反応性のピークはフラクション１４中に溶出し、一方Ｒａｆ−１はカラムからの溶出液中に検出されなかった。未刺激の対照細胞またはＥＧＦ処理された細胞のＰＣ１２溶解物からの各フラクションの一部（３０μｌ）を、基質として精製組換えＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）を含有する緩衝液中で、上記のように測定した。図１５Ｂに示された結果は、ＥＧＦ刺激されたＰＣ１２細胞からのフラクション１０−１２中に溶出したＭＥＫＫ活性のピークはＭＥＫをリン酸化し、一方未刺激の細胞からのフラクション中にはＭＥＫリン酸化があまり起らなかったことを示している。
＜実施例１１＞
この実施例は、ＭＥＫ−１とＭＥＫＫ  ＮＨ２末端融合タンパク質のリン酸化は９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの活性によるものであることを示す研究について記載する。
【０１５３】
ＥＧＦ刺激されたおよび未刺激の細胞から製造された細胞溶解物を、Ｍｏｎｏ−Ｑカラム上のＦＰＬＣによって分画して、内因性ＭＥＫＫを部分的に精製した。未刺激対照ＰＣ１２細胞またはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理された細胞からの溶解物を、０−５２５ｍＭ  ＮａＣｌの線状勾配を使用するＭｏｎｏ  Ｑカラム上のＦＰＬＣによって分画した。各偶数番号のフラクションの一部（３０μｌ）を、４０μｌの最終容量中に基質として精製組換えＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）を含有する緩衝液（２０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、アプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）、５０ｍＭ  β−スルセロホスフェート（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ＩＰ−２０（５０μｇ／ｍｌ）、５０ｍＭ  ＮａＦ、および３０μＣｉ（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ）と混合し、３０℃で２５分間インキュベートした。反応を、２×ＳＤＳ試料緩衝液（４０μｌ）を添加して停止させ、煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィー処理を行った。ＭＥＫＫ活性のピークはフラクション１０−１２に溶出した。ＥＧＦ処理されたＰＣ１２細胞の溶解物からの各偶数番号のフラクションの一部（３０μｌ）を、ＭＥＫ−１の代わりに基質として精製組換えＭＥＫＫ  ＮＨ２末端融合タンパク質（４００ｎｇ）を含有すること以外は上記の通りの緩衝液と混合した。次いで、精製組換えキナーゼ不活性なＭＥＫ−１またはＭＥＫＫ  ＮＨ２末端融合タンパク質を、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ）の存在下で、基質として使用し、９８ｋＤのＭＥＫＫがいずれかの基質を直接にリン酸化するかどうかを決定した。ＥＧＦで処理されたＰＣ１２細胞からの溶解物のフラクション１０−１４がＭＥＫ−１をリン酸化し、一方未処理の対照のフラクション中ではＭＥＫ−１リン酸化は僅かしか起らなかった。活性のピークが少し幅広であったが（フラクション８−１６）、ＭＥＫＫ  ＮＨ２末端融合タンパク質も、ＭＥＫ−１と同一のフラクション中でリン酸化された。
【０１５４】
図１６を参照すると、カラムフラクションのイムノブロットから、９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質が、外因的に添加されたキナーゼ不活性なＭＥＫ−１または５０ｋＤのＭＥＫＫ  ＮＨ２末端融合タンパク質をリン酸化した活性のピークと共に共溶出したことを示した。偶数番号のカラムフラクションの一部（９００μｌ）をトリクロロ酢酸による沈殿によって濃縮し、ＭＥＫＫ抗体でイムノブロットした。免疫反応性のピークはフラクション１０−１２に溶出した。
＜実施例１２＞
この実施例は、９８ｋＤのＭＥＫＫによるＭＥＫの活性化について記載する。
【０１５５】
９８ｋＤのＭＥＫＫを、未処理（−）またはＥＧＦ処理（＋）ＰＣ１２細胞溶解物からの、実施例１に記載のＭＥＫＫ１−３６９抗血清を使用して免疫沈降させた。免疫沈降物を、精製組換え野生型ＭＥＫ（１５０ｎｇ）の存在下で（＋）または不在下で（−）、および精製組換え触媒不活性なＭＡＰＫ（３００ｎｇ）および（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ）の存在下でインキュウベートした。図１７Ａに示された結果は、ＥＧＦ刺激された細胞から免疫沈降されたＭＥＫＫが、ＭＥＫをリン酸化し活性化して、ＭＡＰＫをリン酸化したことを示している。添加された組換えＭＥＫの不在下では、ＭＡＰＫのリン酸化は起らなかった。イムノブロットからは、ＥＧＦ刺激されたＰＣ１２細胞からのＭＥＫＫ免疫沈降物中には、混入ＭＡＰＫ（図１７Ｂ）または混入ＭＥＫ（図１７Ｃ）は全く無いことが示された。従って、ＭＥＫのリン酸化と活性化は、免疫沈降物中に測定されたＭＥＫＫ活性のＥＧＦ刺激によるものである。
＜実施例１３＞
この実施例は、９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫとＲａｆが、増殖因子媒介シグナリングのための機能的Ｒａｓタンパク質を必要とするかどうかについて記載する。
【０１５６】
優性の負のＨａ−ｒａｓ（Ａｓｎ−１７）（Ｎ１７Ｒａｓ）をＰＣ１２細胞中で発現させ、そしてＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂ活性化を、免疫沈降物中で、基質としてキナーゼ不活性なＭＥＫ−１を使用して測定した。デキサメタソン誘発Ｎ１７Ｒａｓを安定して発現するＰＣ１２細胞を、１μＭデキサメタソンを持つまたは持たない０．１％ＢＳＡを含有する培地中で、１８−２０時間、血清飢餓にさせ、次いで未処理またはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理した。細胞溶解物からの可溶性タンパク質の同量を、ＭＥＫＫ抗血清またはＲａｆ−Ｂ抗血清で免疫沈降して、上記のように、精製組換え触媒的不活性ＭＥＫ−１および（γ−３２Ｐ）ＡＴＰとインキュウベートした。Ｎ１７Ｒａｓの発現が、Ｎ１７Ｒａｓ遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＰＣ１２クローン中で、飢餓培地にデキサメタソンを添加することによって、誘発された。Ｎ１７Ｒａｓの発現は、キナーゼ不活性なＭＥＫをリン酸化するその能力によって測定して、ＥＧＦによるＭＥＫＫの活性化を抑制した。Ｒａｆ−ＢのＥＧＦ媒介活性化はまた、Ｎ１７Ｒａｓ発現するＰＣ１２細胞中で、非誘発のＮ１７Ｒａｓトランスフェクタントに比較して、大きく低下した。野生型ＰＣ１２細胞へのデキサメタソンの添加は、ＥＧＦによって誘導されたＭＥＫＫ活性化またはＲａｆ−Ｂ活性化の大きさに効果を有しなかった。Ｎ１７Ｒａｓ遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＰＣ１２細胞クローンは、野生型ＰＣ１２細胞よりも、ＭＥＫＫ活性のＥＧＦ媒介活性化に対する応答性が低い。これらの結果から、機能性Ｒａｓが、ＰＣ１２細胞中のＲａｆ−ＢとＭＥＫＫの増殖因子刺激された活性化に必要であることが示され、このことはＲａｓが、ＲａｆとＭＥＫＫ系統群からの多重プロテインキナーゼエフェクターの活性化によって、細胞増殖と分化に対するその効果を媒介することを示唆する。従って、ＥＧＦは、５分間以内に活性のピークを刺激し、それは処理後少なくとも３０分間持続し、Ｒａｆ−Ｂ活性化の経時変化と同様であった。神経増殖因子（ＮＧＦ）とホルボールエステルＴＰＡも、ＥＧＦより低い程度であるが、ＭＥＫＫを活性化した。免疫沈降物またはカラムフラクション中のＭＥＫＫ活性は、ＥＧＦ刺激されたｃ−Ｒａｆ−１とＲａｆ−Ｂ活性から分離され得る。ホスコリン前処理は、ＥＧＦ、ＮＧＦ、およびＴＰＡによるＭＥＫＫおよびＲａｆ−Ｂ活性化を廃止した（図１８）。ＥＧＦに対応するＭＥＫＫおよびＲａｆ−Ｂ活性化は、優性の負のＮ１７Ｒａｓの安定な発現によって抑制された。これらの知見は、増殖因子によるＲａｓ依存性ＭＥＫＫ調節の第一の証明を表し、そしてＲａｓが、ＲａｆとＭＥＫＫ系統群の構成員との間を交互に結合することができる、複合細胞内キナーゼネットワークの出現を示唆する。
【０１５７】
９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの増殖因子媒介活性化がＰＫＡによって抑制されるかどうかを決定するために、ホルスコリンを使用して、細胞内ｃＡＭＰを上昇させ、ＰＫＡを活性化した。血清飢餓されたＰＣ１２細胞を、ホルスコリン（５０μＭ）で３分間前処理するかまたはホルコリン無しで前処理して、プロテインキナーゼＡを活性化し、次いでＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＴＰＡ（２００ｎＭ）で５分間処理して、ＭＥＫＫを、細胞溶解物からの可溶性タンパク質の同量から免疫沈降させ、上記のように、精製組換え触媒的不活性なＭＥＫ−１および（γ−３２Ｐ）ＡＴＰとインキュウベートした。同一細胞溶解物から、Ｒａｆ−Ｂ活性を、その調節がＭＥＫＫのそれと異なるかどうかを試験するために、測定した。Ｒａｆ−Ｂを、上記の同一の細胞溶解物から免疫沈降させ、上記のように、ＭＥＫ−１をリン酸化するその能力について測定した。ホルスコリン前処理は、キナーゼ不活性なＭＥＫ−１をリン酸化するそれらの能力によって測定して、ＥＧＦ、ＮＧＦ、およびＴＰＡによるＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂの活性化を廃止した（図１８）。ホルスカリン処理単独では、いずれのキナーゼにも顕著な効果を有しなかった。これらの結果は、Ｒａｆ−１とＲａｆ−Ｂの外に、ＰＫＡ活性化が、９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの増殖因子刺激を抑制することを示し、このことは、Ｒａｓの間または下流およびこれらの３つのキナーゼの各々の上流または水準に在るＰＫＡ作用のための共通の調節制御点の存在を示唆する。
＜実施例１４＞
この実施例は、類似のＭＥＫ活性または相違するＭＥＫ活性が、Ｇｉタンパク質結合された受容体によるＭＡＰＫの活性化に関与するかどうかを、トロンビン刺激されたＲａｔ  １ａ細胞からの細胞溶解物中のＭＥＫＫ活性を測定することによって、決定することについて記載する。トロンビン刺激された細胞は、ＥＧＦ刺激された細胞中に検出された主要ＭＥＫピークと共に共分画されたＭＥＫ活性を示した。トロンビン攻撃誘発された（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｅ）細胞からのＭＥＫ活性の大きさは一般的に、ＥＧＦ刺激の場合に観察されたものより２〜３倍低く、それは、本発明者がトロンビン攻撃誘発された細胞中に観察したより小さいＭＡＰＫ応答と関連している。
【０１５８】
ｇｉｐ２、ｖ−ｓｒｃ、ｖ−ｒａｓ、またはｖ−ｒａｆを発現するＲａｔ  １ａとＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中のＭＥＫの微分調節によって、本発明者は、ＭＥＫ−１の推定される調節体であるプロテインキナーゼを研究するようになった。最近、Ｒａｆ−１がＭＥＫをリン酸化し活性化することができることが示された。Ｒａｆ活性化は以下の方法で測定した。細胞を血清飢餓にして、上記のように、適切な増殖因子の存在または不在下で攻撃誘発させた。血清飢餓のＲａｔ  １ａ細胞を緩衝液単独でまたはＥＧＦで攻撃誘発させ、Ｒａｆを、ＲａｆのＣ末端を認識する抗体を使用して免疫沈降させた。細胞を、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１０ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭグルセロリン酸ナトリウム、２ｍＭバナジン酸ナトリウム、２．１μｇ／ｍｌアプロチニン）中で擦過することによって溶解し、１０分間マイクロフュージして、核を除去した。上澄液をタンパク質含量について正常化し、プロテインＡセファロースで４℃で２−３時間予備清澄化した後、Ｒａｆ−１のＣ末端に対するウサギ抗血清とプロテインＡセファロースで免疫沈降させた。ビーズを氷冷ＲＩＰＡで２回、ＰＡＮ（１０ｍＭＰｉｐｅｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２１μｇ／ｍｌアプロチニン）で２回洗浄した。免疫沈降物の一部をＳＤＳ試料緩衝液で希釈し、イムノブロット分析に使用した。残部をキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１５０ｎｇキナーゼ不活性な、ＭＥＫ−１、３０μＣｉ  γ−３２Ｐ−ＡＴＰおよび２０μｇ／ｍｌアプロチニン）中に、５０μｌの最終容量中、３０℃で３０分間再懸濁させた。野生型組換えＭＥＫ−１をマーカーとして平行して自己リン酸化させた。反応を１２．５μｌのＳＤＳ試料緩衝液の添加によって停止させ、５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィー処理を行った。
【０１５９】
免疫沈降したＲａｆは、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ＭＥＫ−１をリン酸化することができた。この測定で使用された組換えＭＥＫ−１は、野生型ＭＥＫ−１で観察されるように、それが自己リン酸化しなかったことを確認する程キナーゼ不活性であった。対照細胞からの免疫沈降物中には、ＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化は少しかまたは全く観察されなかった。ＥＧＦの攻撃誘発は明らかに、ＭＥＫ−１のＲａｆ触媒されたリン酸化を刺激した；反対に、Ｒａｔ  １ａ細胞のトロンビン攻撃誘発は、内因性ＭＥＫが明らかに活性化された場合でも、測定できる程にはＲａｆを活性化しなかった。ＥＧＦは、組換えＭＥＫ−１のＲａｆリン酸化を、基礎の約２．６倍に刺激した。Ｇｉｐ２またはｖ−ｓｒｃ発現するＲａｔ  １ａ細胞からのＲａｆ免疫沈降物中には、ＲａｆによるＭＥＫのリン酸化が少ししか観察さなかった。ＥＧＦ刺激は、これらの細胞株中でＭＥＫ−１のＲａｆ触媒されたリン酸化を、夫々１．８倍と１．４倍に活性化することができた。Ｇｉｐ２とｖ−ｓｒｃ発現する細胞中のＥＦＧ応答のブランティングは、ＭＡＰＫの構成性活性化に対するＥＦＧ受容体の脱感受性の結果のようである。免疫沈降物中のＲａｆ量は、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲａｆ抗体を使用するイムノブロットによって、同様であることが示された。ＭＥＫのトロンビン刺激が基礎の２〜３倍であるから、Ｒａｆがこの増殖因子によるＭＥＫ活性化に顕著に貢献した場合、ＭＥＫリン酸化の少なくとも１．５倍の刺激が期待される。活性化のこの水準は、ＥＧＦ刺激されたＧｉｐ２とｖ−ｓｒｃ発現する細胞株中に検出可能であった。従って、Ｒａｆのトロンビン活性化を検出できなかたことは、多分測定法の感度によるものである。ＭＡＰＫのトロンビン刺激は３分で最高になる。トロンビンで１分または５分間Ｒａｔ  １ａ細胞を刺激しても、Ｒａｆ活性は増加しなかった。
【０１６０】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞では、Ｒａｔ  １ａ細胞中のように、ＥＧＦはＲａｆを約２．７倍に活性化し、他方トロンビンは活性化しない。Ｖ−Ｒａｆ発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞はＭＥＫ−１リン酸化の増加を示さなかった。この結果は、ＭＥＫがｖ−Ｒａｆ発現するＮＩＨ２Ｔ３細胞中で明らかに活性化されたから、意外であった。ｃ−Ｒａｆ−１の外に、ｐ９０とｐ７５ｇａｇ−ｒａｆ融合タンパク質の両方は、ｖ−Ｒａｆ  ＮＩＨ３Ｔ３細胞から、抗血清によって免疫沈降した。ｐ７５ｇａｇ−ｒａｆはプロテインキナーゼ活性を示すことが示されたが、ＮＨ２末端ｇａｇ融合タンパク質は、試験管内測定系中で、組換えＭＥＫ−１のＲａｆリン酸化を立体化学的に妨害することが可能である。ｖ−Ｒａｆキナーゼ活性を測定する研究がさらに行われることが必要である。結果は、ＭＥＫの活性化が専らＲａｆの活性化によっては説明できないことを示している。トロンビン刺激された、Ｇｉタンパク質結合経路中およびｇｉｐ２とｖ−ｓｒｃトランスフェクトされた細胞中のＭＥＫ活性化に貢献する、ＭＥＫのための追加の調節キナーゼが存在しなければならない。
＜実施例１５＞
この実施例は、全長のＭＥＫＫタンパク質および負の制御タンパク質と比較して、ＭＥＫＫタンパク質のｐｐｐｓｓ−ｔｒｕｎｃおよびＮｃｏｌ−ｔｒｕｎｃがＭＡＰ活性を活性化する能力を示す。
【０１６１】
図１９に示された結果は、切断されたＭＥＫＫ分子が全長のＭＥＫＫより活性であったことを示している。事実、切断されたＭＥＫＫ分子は、全長のＭＥＫＫタンパク質より少なくとも約１．５倍活性であった。従って、ＭＥＫＫの調節ドメインが除去されると、触媒ドメインの活性が脱調節され、酵素活性が改善する。
＜実施例１６＞
この実施例は、Ｒａｆに比較して、ＭＥＫによるＪＮＫの優先的活性化について記載する。
【０１６２】
ヒーラー細胞を、切断されたＭＥＫＫ３７０−７３８で、誘発性乳房腫瘍ウイルスプロモーターの制御下で、エピトープ標識されたＪＮＫ１と一緒に、一時的にトランスフェクトした（Ｄｅｒｉｊａｒｄ等，Ｃｅｌｌ，第７６巻，第１０２８頁，１９９４年に詳細に記載）。他のヒーラー細胞も、切断されたＢＸＢ−Ｒａｆで、誘発性乳房腫瘍ウイルスプロモーターの制御下で、エピトープ標識されたＪＮＫ１と一緒に、一時的にトランスフェクトした（Ｄｅｒｉｊａｒｄ等、上掲）。次の日、ＭＥＫＫ３７０−７３８発現およびＢＸＢ−Ｒａｆ発現が、デキサメトソン（１０μＭ）の投与によって、１７時間誘発された。次いで、細胞抽出物を製造し、免疫複合キナーゼ測定法を使用してＪＮＫ活性について測定した（Ｄｅｒｉｊａｒｄ等，上掲、に詳細に記載）。図２０に示された結果は、ＭＥＫＫは、未不刺激の細胞（基礎）の約３０倍〜約５０倍にＪＮＫ活性を刺激し、Ｒａｆ刺激された細胞の約１５倍〜約２５倍にＪＮＫ活性を刺激したことを示している。
＜実施例１７＞
この実施例は、ＭＥＫＫ発現に応答する、ｃ−Ｍｙｃトランスアクチベーションドメインのリン酸化がＭＹＣ−ＧＡＬ４転写活性を活性化することを記載する。
【０１６３】
２つの別々の発現プラスミドを以下のように構築した。発現プラスミドｐＬＮＣＸを、ＧＡＬ４（１−１４７）に連結されたｃ−ｍｙｃ（１−１０３）を含むｃＤＮＡクローンに連結して（Ｓｅｔｈ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６６巻，第２３５２１−２３５２４頁，１９９３年）、組換え分子ｐＭＹＣ−ＧＡＬ４を生成させた。発現プラスミドＵＡＳＧ−ＴＫルシフェラーゼ（Ｓａｄｏｗｓｋｉ等，Ｎａｔｕｒｅ，第３３５巻，第５６３−５６４頁，１９８８年）を、ｐＭＹＣ−ＧＡＬ４またはｐＬＵ−ＧＡＬで、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞中に、当業界の標準方法を使用してトランスフェクトし、組換え細胞（本明細書ではＬＵ／ＧＡＬ細胞と呼称する）を生成させた。組換え対照細胞も、ＧＡＬ４（１−１４７）単独を含有するｐＧＡＬ４−対照プラスミド中で、ｃ−ｍｙｃ（１−１０３）の不在下で、トランスフェクトすることによって製造した。
【０１６４】
ＬＵ／Ｇａｌ細胞を、ｐＭＥＫＫ３７０−７３８、ｐＭＥＫＫ（全長のＭＥＫＫ１−７３８をコードしている）、ＢＸＢ−Ｒａｆ、ｐＭｙｃ−Ｇａｌ４、ｐＣＲＥＢ−Ｇａｌ４（Ｇａｌ４１−１４７に融合されたＣＲＥＢ１−２６１をコードしている；Ｈｏｅｆｆｌｅｒ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，第３巻，第８６８−８８０頁，１９８９年）、ｐＧａｌ４またはＣＲＥＢ融合タンパク質（ＧＡＬ４と呼称）のいずれかでトランスフェクトした。
【０１６５】
トランスフェクトされた細胞を一夜インキュベートし、次いで当業界の標準方法を使用して溶解した。各細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。図２１に示された結果は、ＭＥＫＫが、ｃ−Ｍｙｃトランスアクチベーションドメインのリン酸化を、ｃ−Ｍｙｃドメインが活性化されそしてトランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘発するような方式で、選択的に刺激することができることを示している。さらに、結果は、ＭＥＫＫがＣＲＥＢ活性化を刺激しないことを示している。また、活性化されたＲａｆはＭｙｃ活性化を刺激することができない。ＭＥＫＫによるｃ−Ｍｙｃタンパク質の活性化機構の略図を図２３に示す。
＜実施例１８＞
この実施例は、ＭＥＫＫ３タンパク質によってｐ３８ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化することおよびＭＥＫＫ１タンパク質ではリン酸化しないことについて記載する。
【０１６６】
ＣＯＳ細胞を、ＭＥＫＫ１もしくはＭＥＫＫ３タンパク質をコードしているｃＤＮＡクローンに連結された発現プラスミドｐＣＶＭ５、またはＭＥＫＫ  ｃＤＮＡ挿入物を欠いている対照ｐＣＶＭ５プラスミドで、トランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後、ＣＯＳ細胞は溶解し、溶解物をＭｏｎｏ  Ｑ  ＦＰＬＣカラム上で実施例４に記載の条件を使用して分画した。フラクションを、ＭＡＰキナーゼ様酵素のチロシンリン酸化について、実施例４に記載のキナーゼ測定法を使用して、分析した。図２３を参照すると、ＭＥＫＫ３の発現は、ｐ３８  ＭＡＰＫおよびｐ４２とｐ４４型のＭＡＰＫのチロシンリン酸化を誘発する。しかし、ＭＥＫＫはｐ３８  ＭＡＰＫの弱いリン酸化を誘発するのみであるが、ｐ４２とＰ４４  ＭＡＰＫのリン酸化を誘発する。
＜実施例１９＞
この実施例はＭＥＫＫ誘発性アポト−シスについて記載する。
【０１６７】
アポト−シスの研究のために、細胞を以下のように製造した。Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞を、注入された細胞の検出のために、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）をコードしている発現プラスミドでトランスフェクトした。次いで、β−Ｇａｌトランスフェクトされた細胞の１セットに、ＭＥＫＫ３７０−７３８タンパク質をコードしている発現ベクターを微量注入した。次いで、β−Ｇａｌトランスフェクトされた細胞の他のセットに、切断されたＢＸＢ−Ｒａｆタンパク質をコードしている発現ベクターを微量注入した。
【０１６８】
Ａ．  ビュ−ベリシン誘発性アポト−シス
トランスフェクトされたＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞の第一群を、５０μＭビューベリシンで、３７℃で６時間処理した。ビューベリシンは哺乳類細胞中でアポト−シスを誘発することが知られている化合物である。細胞の第二群を、ビューベリシンを欠く対照緩衝液で処理した。次いで、処理された細胞をパラホルムアルデヒド中に固定し、当業界の標準プロトコールを使用してサポニンで浸透性化した。次いで浸透性化された細胞を、細胞を、細胞質収縮を検出するためには、フルオレセイン標識された抗チューブリン抗体（１：５００；ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手）と、またはＤＮＡを染色して核凝結を検出するためには、１０μＭヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手）とインキュベートすることによって標識した。次いで、標識された細胞を、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を使用して、微分蛍光画像化法によって観察した。図２４は、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞の２つの視野を示し、第一の視野は対照緩衝液で処理された細胞を表し、第二の視野はビューベリジンで処理された細胞を表す。ビューベリジンで処理された細胞は、アポト−シスに特徴的である細胞収縮（抗チューブリン抗体によって監視された）と核凝結（ヨウ化プロピジウムによって監視された）を示した。
【０１６９】
Ｂ．  ＭＥＫＫ誘発性アポト−シス
β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド、およびＭＥＫＫコードプラスミドもしくはＢＸＢ−Ｒａｆコードプラスミドを微量注入されたＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞を、上記のＡ節に記載の方法を使用して、処理し、観察した。抗β−Ｇａｌ抗体（１：５００；ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手）を使用して、注入された細胞を検出した。図２５を参照すると、ＲＥＦ５２細胞の顕微鏡分析は、ＭＥＫＫタンパク質を発現する細胞は細胞質収縮と核凝結を受け、アポト−シス的細胞死したことを示した。反対に、ＢＸＢ−Ｒａｆタンパク質を発現する細胞は正常な形態を示し、アポト−シスを受けなかった。同様に、図２６を参照すると、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞の顕微鏡分析は、ＭＥＫＫタンパク質を発現する細胞は細胞質収縮と核凝結を受け、アポト−シス的細胞死することを示した。反対に、ＢＸＢ−Ｒａｆタンパク質を発現する細胞は正常な形態を示し、アポト−シスを受けなかった。図２７は、実質的な細胞質収縮と核凝結を受けた、ＭＥＫＫタンパク質を発現するＲＦＥ５２細胞の３つの代表的な視野を、ＭＥＫＫを発現しない対照細胞と比較して示す。同様に、図２８は、実質的な細胞質収縮と核凝結を受けた、ＭＥＫＫタンパク質を発現するＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞の３つの代表的な視野を、ＭＥＫＫを発現しない対照細胞と比較して示す。このように、ＭＥＫＫタンパク質はアポト−シス的プログラム細胞死を誘発することができ、Ｒａｆタンパク質はできない。
＜実施例２０＞
この実施例は、ＭＥＫＫとＲａｆタンパク質によるＭＡＰＫ活性の調節について記載する。
【０１７０】
ＣＯＳ細胞を、実施例３に記載の方法を使用して製造した。さらに、ＣＯＳ細胞を、ｐＣＶＭＶ５  Ｒａｆ構築物（１μｇ：Ｒａｆ）でトランスフェクトした。ＦＰＬＣ  Ｍｏｎｏ  Ｑイオン交換カラムフラクションを実施例３に記載の通り製造し、ＭＡＰＫ活性についてＨｅａｓｌｅｙ等，上掲に記載の方法に従って測定した。
【０１７１】
図２９を参照すると、ＣＯＳ１細胞中でＭＥＫＫとＲａｆが過発現すると、ＭＡＰＫ活性が基礎水準以上の同様な水準まで刺激された。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は脊椎動物と酵母のシグナル経路の略図である。
【図２】図２はＲａｓタンパク質経路と異なるＭＥＫＫとＲａｆの二相経路の略図である。
【図３Ａ】図３Ａは数種の細胞株とマウス組織中の一本鎖の７．８ｋｂ  ＭＥＫＫ  ｍＲＮＡのノーザン（ＲＮＡ）ブロットを示す。
【図３Ｂ】図３ＢはＭＥＫＫ遺伝子のサザン（ＤＮＡ）ブロットを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは齧歯類の細胞株中の７８ｋｄと５０ｋｄのＭＥＫＫの発現を示すイムノブロットを示す。
【図４】図４はＭＥＫＫ抗血清を使用するＭＥＫＫタンパク質の免疫沈降物を示す。
【図５】図５は免疫沈降物と細胞溶解物中のＭＥＫＫタンパク質のイムノブロットを示す。
【図６Ａ】図６ＡはＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中のＭＡＰＫの活性化を示す。
【図６Ｂ】図６ＢはＥＧＦで処理されたか、または処理されなかった細胞中のＭＥＫＫの発現を示すイムノブロットである。
【図７】図７はＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中のＭＥＫの活性化とリン酸化を示す。
【図８Ａ】図８ＡはＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。
【図８Ｂ】図８ＢはＣＯＳ細胞中で発現したＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化の経時変化を示す。
【図８Ｃ】図８ＣはＣＯＳ細胞中で過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）したＭＥＫＫのイムノブロットである。
【図９Ａ】図９Ａは活性化ＭＥＫ−１によるＭＡＰＫのリン酸化を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは免疫沈降したＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは活性化ＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＭＥＫＫを過発現していて、そしてＥＧＦで処理されたＣＯＳ細胞から単離されたＲａｆのリン酸化状態を示す。
【図１１】図１１は、免疫沈降したＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂが、キナーゼ不活性なＭＥＫ−１をリン酸化する相対的能力を示す。
【図１２】図１２はＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂ活性の経時変化を示す。
【図１３】図１３は、ＭＥＫＫ免疫沈降物からのＲａｆ−Ｂの免疫低下がＭＥＫＫ活性に影響しないことを示す。
【図１４】図１４は、ＭＥＫＫ免疫沈降物からのＲａｆ−Ｂの免疫低下がＲａｆ−Ｂ活性を低下させることを示す。
【図１５】図１５はＰＣ１２細胞溶解物のＦＰＬＣモノＱイオン交換カラムフラクション中のＭＥＫＫ活性を示す。
【図１６】図１６は優性の陰性Ｎ１７ＲＡＳ発現によるＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂ活性の阻害を示す。
【図１７】図１７は９８ｋＤ  ＭＥＫＫによるＭＥＫタンパク質の活性化を示す。
【図１８】図１８はフォルスコリンによるＭＥＫＫのＥＧＦ活性化の阻害を示す。
【図１９】図１９は切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）トランケートＭＥＫＫ分子による改良されたＭＥＫＫ活性を示す。
【図２０】図２０はＭＥＫＫタンパク質によるＪＮＫ活性化を示す。
【図２１】図２１は、ＭＥＫＫタンパク質による、ｃ−Ｍｙｃ制御転写およびＣＲＥＢ制御転写の調節を示す。
【図２２】図２２はｃ−Ｍｙｃ制御転写のＭＥＫＫ調節の略図である。
【図２３】図２３はＭＥＫＫ３によるｐ３８ＭＡＰＫリン酸化の誘発を示す。
【図２４】図２４はビュ−ベリシン（ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ）によるＳｗｉｓｓ３Ｔ３とＲＥＦ５２細胞中のアポト−シスの誘発を示す。
【図２５】図２５はＭＥＫＫによるＲＥＦ５２細胞中のアポト−シスの誘発を示す。
【図２６】図２６はＭＥＫＫによるＳｗｉｓｓ３Ｔ３とＲＥＦ５２細胞中のアポト−シスの誘発を示す。
【図２７】図２７はＭＥＫＫタンパク質を発現しているアポト−シス的なＲＥＦ５２細胞の３枚の代表的な顕微鏡図を示す。
【図２８】図２８はＭＥＫＫタンパク質を発現しているアポト−シス的なＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の３枚の代表的な顕微鏡図を示す。
【図２９】図２９はＭＥＫＫタンパク質とＲａｆタンパク質によるＭＡＰＫ活性の類似な刺激を示す。
【図１】
2006051026.tif 000024
【図２】
2006051026.tif 000025
【図３Ａ】
2006051026.tif 000026
【図３Ｂ】
2006051026.tif 000027
【図３Ｃ】
2006051026.tif 000028
【図４】
2006051026.tif 000029
【図５】
2006051026.tif 000030
【図６Ａ】
2006051026.tif 000031
【図６Ｂ】
2006051026.tif 000032
【図７】
2006051026.tif 000033
【図８Ａ】
2006051026.tif 000034
【図８Ｂ】
2006051026.tif 000035
【図８Ｃ】
2006051026.tif 000036
【図９Ａ】
2006051026.tif 000037
【図９Ｂ】
2006051026.tif 000038
【図１０Ａ】
2006051026.tif 000039
【図１０Ｂ】
2006051026.tif 000040
【図１１】
2006051026.tif 000041
【図１２】
2006051026.tif 000042
【図１３】
2006051026.tif 000043
【図１４】
2006051026.tif 000044
【図１５】
2006051026.tif 000045
【図１６】
2006051026.tif 000046
【図１７】
2006051026.tif 000047
【図１８】
2006051026.tif 000048
【図１９】
2006051026.tif 000049
【図２０】
2006051026.tif 000050
【図２１】
2006051026.tif 000051
【図２２】
2006051026.tif 000052
【図２３】
2006051026.tif 000053
【図２４】
2006051026.tif 000054
【図２５】
2006051026.tif 000055
【図２６】
2006051026.tif 000056
【図２７】
2006051026.tif 000057
【図２８】
2006051026.tif 000058
【図２９】
2006051026.tif 000059