(57)【要約】【課題】  酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用して、酢酸耐性が実用レベルで向上した酢酸菌を育種するための手段を提供すること、さらに該酢酸菌を用いて高濃度の酢酸を従来以上に効率良く製造する方法を提供すること。【解決手段】  細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めると同時に、上記タンパク質とは別の細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子、または酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めることを特徴とする酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法、前記育種方法により得られる酢酸耐性の向上した酢酸菌を用いる食酢の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めると同時に、上記タンパク質とは別の細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子、または酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めることを特徴とする酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項２】
細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによって、該遺伝子の発現量を高めることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項３】
酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによって、該遺伝子の発現量を高めることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項４】
細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質が、グルコシルセラミド合成酵素またはＡＢＣトランスポーターであることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項５】
酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質が、アルコール脱水素酵素またはクエン酸合成酵素であることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項６】
グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項４に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グルコシルセラミド合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項４に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を向上させる活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項５に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、アルコール脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
クエン酸合成酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする請求項５に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号２１４〜１５０９からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号２１４〜１５０９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、クエン酸合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
酢酸菌が、アセトバクター属、または、グルコンアセトバクター属に属することを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の育種方法により得られる酢酸耐性の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子や酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を同時に過剰発現させた酢酸菌、特に、アセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて食酢を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖能力や発酵能力が低下しない、酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられている。
【０００３】
これまでの酢酸菌の酢酸耐性遺伝子に関する知見としては、アセトバクター属の酢酸菌の酢酸耐性を変異させて酢酸感受性にした株を元の耐性に回復させることのできる相補遺伝子として、クラスターを形成する３つの遺伝子（ａａｒＡ、ａａｒＢ、ａａｒＣ）がクローニングされていた（例えば、非特許文献１参照）。
このうち、ａａｒＡ遺伝子はクエン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、また、ａａｒＣ遺伝子は酢酸の資化に関係する酵素をコードする遺伝子であると推定されたが、ａａｒＢ遺伝子については機能が不明であった（例えば、非特許文献２参照）。
これらの３つの酢酸耐性遺伝子を含む遺伝子断片をマルチコピープラスミドにクローニングし、アセトバクター・アセチ・サブスペシーズ・ザイリナム  ＩＦＯ３２８８（Acetobacter aceti subsp．xylinum IFO3288）株に形質転換して得られた形質転換株は、酢酸耐性の向上レベルが僅かでしかなく、また実際の酢酸発酵での能力の向上の有無については不明であった（例えば、特許文献３参照）。
【０００４】
一方、酢酸菌からクローニングされた膜結合型アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）をコードする遺伝子を酢酸菌に導入することによって、酢酸発酵において最終到達酢酸濃度の向上が認められた例が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかし、ＡＬＤＨはアセトアルデヒドを酸化する機能を有する酵素であって酢酸耐性に直接関係する酵素ではないことから、ＡＬＤＨをコードする遺伝子が真に酢酸耐性遺伝子であるとは断定できないものであった。
【０００５】
上記遺伝子以外の酢酸発酵能を向上させる遺伝子としては、アコニターゼ遺伝子（特許文献４参照）、アルコール脱水素酵素（特許文献５参照）、セリンパルミトイルトランスフェラーゼと相同性のある遺伝子（特許文献６参照）、グルコシルセラミド合成酵素（特許文献７参照）、ＡＢＣトランスポーター遺伝子（特許文献８参照）と相同性のある遺伝子などが知られている。これらの遺伝子を過剰発現させることにより、酢酸菌の酢酸耐性が向上することが見出されているが、いずれも不十分であった。
このような実情から、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な遺伝子を取得し、また取得した遺伝子を用いて、より高い発酵能を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６０−９４８８号公報
【特許文献２】特開平２−２３６４号公報
【特許文献３】特開平０３−２１９８７８号公報
【特許文献４】特開２００３−２８９８６７号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００４／０８１２１６号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ０３／０７８６３５号公報
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００４／０５３１２２号公報
【特許文献８】特開２００３−２８９８６８号公報
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）」、１７２巻、ｐ．２０９６−２１０４、１９９０年
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」、７６巻、ｐ．２７０−２７５、１９９３年
【非特許文献３】「平成１３年度日本生物工学会大会講演要旨集」、ｐ．３６４、２００１年
【非特許文献４】「トレンズ・イン・ジェネテェックス（Trends in Genetics）」、５巻、ｐ．１８５−１８９、１９８９年
【非特許文献５】「アプライド・オブ・エンバイロメント・アンド・マイクロバイオロジー（Applied of Environment and Microbiology）」、５５巻、ｐ．１７１−１７６、１９８９年
【非特許文献６】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）」、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９、１９８８年
【非特許文献７】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）」、４９巻、ｐ．２０９１−２０９７、１９８５年
【非特許文献８】「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience，Biotechnology and Biochemistry）」、５８巻、ｐ．９７４−９７５、１９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、酢酸耐性を遺伝子レベルで解明し、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は、従来報告されていない。
本発明は、酢酸耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用して、酢酸耐性が実用レベルで向上した酢酸菌を育種するための手段を提供すること、さらに該酢酸菌を用いて高濃度の酢酸を従来以上に効率良く製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、既に酢酸菌の酢酸発酵能を向上させる遺伝子を複数見出してきているが、酢酸菌の酢酸耐性機構に関しては、ほとんど知見がなく不明であった。このような状況下、本発明の目的を達成するためには、従来以上に酢酸耐性の高い酢酸菌を育種して、酢酸菌の酢酸発酵能を高めることが知られている遺伝子が、どのような機構で該酢酸菌の酢酸発酵能を向上させるのか、その機構を明らかにすることがまず必要と考えた。
従来より、高濃度の酢酸は細胞に対し毒性を示すことが知られている。毒性の作用メカニズム（作用機構）としては、酢酸が細胞膜のイオンバリアーを破壊して、細胞膜上で行われている生体の維持に必要なＡＴＰの生成にかかわる呼吸鎖を阻害すること、及び酢酸が細胞内へ流入し、細胞内ｐＨの低下や酢酸によるタンパク質変性が起こることによるものと推定されていた。
また、実際に、酢酸発酵と共に酢酸菌の細胞内ｐＨが低下することも観察されていた。
【０００９】
もし、上記のような作用機構で酢酸が細胞に損傷を与えているとすれば、酢酸菌の酢酸発酵能を向上させる遺伝子の中には、細胞外の酢酸濃度が高まった際に細胞内の酢酸濃度の上昇を抑制する、すなわち、細胞内酢酸濃度を低減することによって、酢酸耐性を向上させる機能を発揮する遺伝子が含まれると考えられた。
そこで、発明者らは、細胞外の酢酸濃度を上昇させた際の細胞内の酢酸濃度の推移を測定することにした。具体的には、酢酸発酵能を向上させることが明らかにされている特定の遺伝子を挿入したプラスミドを、形質転換により細胞内に導入し保有させた酢酸菌で、通常の酢酸発酵を行い、経時的に細胞内酢酸濃度を測定した。
その結果、同一の酢酸濃度の培地で発酵させたにもかかわらず、意外にも、酢酸発酵能を向上させるタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって、細胞内酢酸濃度に違いがあることが明らかになり、特定の遺伝子でのみ細胞内酢酸濃度が低下していること分かった。
さらに、酢酸菌の酢酸発酵能を向上させる遺伝子を複数組み合わせて導入すると共に、細胞内酢酸濃度の上昇の抑制が見られなかった遺伝子を併せて導入した細胞について、同様に細胞内酢酸濃度の推移を検討したところ、酢酸存在下での生育が顕著に促進されている導入株が存在することをも見出した。
【００１０】
これらの知見に基づき、高酸度領域での細胞内酢酸濃度の上昇を抑制することで、より酢酸耐性を高めることが可能ではないかと考えた。また、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有していることが明らかになったタンパク質をコードする遺伝子を複数組み合わせて、同時に発現量を高めた場合、さらに酢酸耐性を向上させることができるのでないかと考えた。
更に、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有していることが明らかにされているタンパク質をコードする遺伝子と、これらとは機能の違う酢酸存在下での生育を促進するタンパク質をコードする遺伝子の細胞内での発現量を同時に高めることによっても、酢酸菌の酢酸耐性を向上できるのではないかと考えた。
【００１１】
そこで細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有していることが明らかにされているタンパク質をコードする遺伝子とを複数種々組み合わせて、或いは該遺伝子と酢酸存在下での生育を促進するタンパク質をコードする遺伝子とを種々組み合わせて、プラスミドベクターに連結して酢酸菌を形質転換して、酢酸を含有する培地での生育を比較した。
その結果、ある特定の遺伝子を組み合わせて細胞内に導入し、該遺伝子のコピー数を増幅させた形質転換株において、意外にも高濃度の酢酸を含む培地での生育が改善されることを見出し、さらに該微生物を使用してアルコールを含有する培地で培養することにより、酢酸の生成速度や蓄積できる酢酸濃度が高まることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）から（１１）からなる。
（１）細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めると同時に、上記タンパク質とは別の細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子、または酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めることを特徴とする酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（２）細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによって、該遺伝子の発現量を高めることを特徴とする前記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【００１３】
（３）酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによって、該遺伝子の発現量を高めることを特徴とする前記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（４）細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質が、グルコシルセラミド合成酵素またはＡＢＣトランスポーターであることを特徴とする請求項１に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（５）酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質が、アルコール脱水素酵素またはクエン酸合成酵素であることを特徴とする前記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
【００１４】
（６）グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする前記（４）に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グルコシルセラミド合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１５】
（７）ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする前記（４）に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、酢酸耐性を向上させる活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１６】
（８）アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする前記（５）に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、アルコール脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
（９）クエン酸合成酵素をコードする遺伝子が、下記の（ａ）または（ｂ）に示すＤＮＡであることを特徴とする前記（５）に記載の酢酸発酵能の向上した酢酸菌の育種方法。
（ａ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号２１４〜１５０９からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号２１４〜１５０９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、クエン酸合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
（１０）酢酸菌が、アセトバクター属、または、グルコンアセトバクター属に属することを特徴とする前記（１）に記載の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法。
（１１）前記（１）に記載の育種方法により得られる酢酸耐性の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、酢酸耐性が遺伝子レベルで解明され、酢酸耐性が選択的に増強され、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌を育種するための手段が提供されると共に、該酢酸菌を用いて高濃度の酢酸を従来以上に効率良く製造するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の酢酸耐性の向上した酢酸菌の育種方法は、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めると同時に、上記タンパク質とは別の細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子、または酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高めることを特徴とする。
すなわち、（１）細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を２種類以上組み合わせて、これらの発現量を高める場合と、（２）細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子のほかに、酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子を組み合わせて、これらの発現量を高める場合とに分けることができる。
【００２１】
本発明においては、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用する。
ここで、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能とは、細胞外の酢酸濃度を高めていった場合に、細胞内の酢酸濃度が対照（元株：細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を形質転換させていない元の株）よりも低濃度に維持されることを意味している。具体的には、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させた形質転換株を、酢酸を含む培地で培養した場合に、該形質転換株の細胞内の酢酸濃度が元株よりも低濃度に維持されること、例えば、酢酸濃度が８〜１５％の培地で培養した場合に、元株の約６０〜７０％に維持されることを意味する。
細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質としては、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、グルコシルセラミド合成酵素やＡＢＣトランスポーターが挙げられ、このうち、グルコシルセラミド合成酵素やＡＢＣトランスポーターが好ましい。
【００２２】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼは、ＥＣ：２．３．１．５０として分類されている酵素を指す。セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、国際公開ＷＯ０３／０７８６３５号公報に塩基配列が公開されているグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子が挙げられる。
【００２３】
グルコシルセラミド合成酵素は、セラミドに糖残基を転移する反応を触媒する酵素を指す。
グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子としては、該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、国際公開ＷＯ２００４／０５３１２２号公報に塩基配列が公開されている配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子（配列表の配列番号１記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２参照）が挙げられる。特に、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなるＤＮＡが好ましい。
【００２４】
また、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子としては、コードされるタンパク質の本来の活性が損なわれない限り、上記した遺伝子そのものではなくとも、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。このような同一の酵素活性を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして、特に、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、グルコシルセラミド合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡが好ましい。
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
グルコシルセラミド合成酵素活性は、例えば、上記ＤＮＡで形質転換してなる形質転換株について、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal）、３４１巻、ｐ.３９５−４００、１９９９年）」に従って測定して確認することができる。
【００２５】
ＡＢＣトランスポーターは、ＡＢＣモチーフの配列を有し、細胞内から細胞外へ酢酸を排出する能力を有しているタンパク質を指す。
ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子としては、ＡＢＣモチーフの配列を有し、細胞内から細胞外へ酢酸を排出する能力を有しているタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、特開２００３−２８９８６８号公報に塩基配列が公開されている配列表の配列番号３に記載のアセトバクター・アセチ由来の遺伝子（配列表の配列番号３記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４参照）や、同じく特開２００３−２８９８６８号公報に塩基配列が公開されているグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子などが挙げられるが、特に、（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなるＤＮＡが好ましい。
【００２６】
また、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子としては、コードされるタンパク質の本来の活性が損なわれない限り、上記した遺伝子そのものではなくとも、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。このような同一の酵素活性を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして、特に、（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３０１〜２０７３からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、ＡＢＣトランスポーターによる酢酸耐性を向上させる活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡが好ましい。
ストリンジェントな条件については、上記グルコシルセラミド合成酵素に関して述べたのと同様である。
ＡＢＣトランスポーターによる酢酸耐性を向上させる活性については、例えば、上記ＤＮＡで形質転換してなる形質転換株について、特開２００３−２８９８６８号公報に従って測定して確認することができる。
【００２７】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、グルコシルセラミド合成酵素、およびＡＢＣトランスポーターのそれぞれをコードする遺伝子を、酢酸菌（グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８）細胞内に実際に導入して発現させた形質転換株を、酢酸を含む培地で培養した場合の細胞内酢酸濃度は、以下の通りである。細胞内への遺伝子の導入は、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、９７４頁、１９９４年参照）等によって行なうことができる。
実際の細胞内酢酸濃度の測定は、枯草菌の方法（例えば、「アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）」、１５巻、ｐ．２２３３〜２２３９、２００２年参照）に準じて抽出した細胞内内容物をカルボン酸分析計で分析して、細胞内酢酸量を算出したものである。
酢酸を含む培地中の酢酸濃度と、各細胞についての細胞内酢酸濃度の測定値を、表１に示す。
【００２８】
【表１】
2006230329.tif 000002
【００２９】
表１から明らかなように、セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子やＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子をプラスミドベクターに連結して導入した形質転換株は、培地の酢酸濃度が６％の時点で、遺伝子を導入していない対照（元株）と比較して、酢酸濃度が顕著に低下していた。そして、酢酸濃度が１１％の時点では、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子やＡＢＣトランスポーター遺伝子をプラスミドベクターに連結して導入した株だけでなく、グルコシルセラミド合成酵素遺伝子プラスミドベクターに連結して導入した株でも、酢酸濃度の低下が見られた。
これらのことから、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、グルコシルセラミド合成酵素、及びＡＢＣトランスポーターは、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質であることが実際に証明された。
【００３０】
本発明においては、酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用する。
本発明で指す酢酸存在下で生育を促進する機能とは、酢酸が存在する培地での生育が通常の発現量の酢酸菌（元株：酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を形質転換させていない元の株）よりも改善されたことを意味しており、具体的には、酢酸を含有するＹＰＧ培地で生育させた場合に、対照株（元株）よりも短時間で生育を開始することができることを指す。
酢酸存在下で生育を促進する機能を有するタンパク質としては、アルコール脱水素酵素、クエン酸合成酵素、アコニターゼ、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、フマレートヒドラターゼ、マレートキノンオキシドレダクターゼ、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素、ＮＡＤＨ脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、エノラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、６−ホスホグルコネート脱水素酵素、ホスホグルコネートデヒドラターゼなどが挙げられる。このうち、特にアルコール脱水素酵素及びクエン酸合成酵素が特に好ましい。
【００３１】
アルコール脱水素酵素は、ＮＡＤ依存性のアルコール脱水素酵素であり、ＥＣ：１．１．１．１として分類されている酵素を指す。
アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子としては、該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、配列表の配列番号５記載の国際公開ＷＯ２００４／０８１２１６号公報に塩基配列が開示されているグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子（配列表の配列番号５記載の塩基配列からなる遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６参照）が挙げられる。特に、（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなるＤＮＡが好ましい。
【００３２】
また、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子としては、コードされるタンパク質の本来の活性が損なわれない限り、上記した遺伝子そのものではなくとも、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。このような同一の酵素活性を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして、特に、または（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、アルコール脱水素酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡが好ましい。
ストリンジェントな条件については、上記グルコシルセラミド合成酵素に関して述べたのと同様である。
アルコール脱水素酵素活性については、例えば、上記ＤＮＡで形質転換してなる形質転換株について、Ｔｓｉｇｏｓらの方法（例えば、「ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European Journal of Biochemistry）」、２５４巻、ｐ.３５６−３６２、１９９８年参照）に従って測定して確認することができる。
【００３３】
クエン酸合成酵素は、ＥＣ：２．３．３．１として分類されている酵素を指す。
クエン酸合成酵素をコードする遺伝子としては、該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）」、１７２巻、ｐ．２０９６−２１０４、１９９０年に記載のアセトバクター・アセチ由来の遺伝子や配列表の配列番号７に記載のグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子（配列表の配列番号７の遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８）が挙げられる。特に、（ａ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号２１４〜１５０９からなるＤＮＡが好ましい。
【００３４】
また、クエン酸合成酵素をコードする遺伝子としては、コードされるタンパク質の本来の活性が損なわれない限り、上記した遺伝子そのものではなくとも、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。このような同一の酵素活性を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして、特に、（ｂ）配列表の配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号２１４〜１５０９からなる塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ、クエン酸合成酵素活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡが最も好ましい。
ストリンジェントな条件については、上記グルコシルセラミド合成酵素に関して述べたのと同様である。
クエン酸合成酵素活性については、例えば、上記ＤＮＡで形質転換してなる形質転換株について、Ｓｒｅｒｅらの方法（「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、１３巻、ｐ.３−１１、１９６９年参照）に従って測定して確認することができる。
【００３５】
アコニターゼは、ＥＣ：４．２．１．３として分類されている酵素を指す。
アコニターゼをコードする遺伝子としては、該酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、特開２００３−２８９８６７号公報に塩基配列が公開されている遺伝子などが挙げられる。
アコニターゼの酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、１３巻、ｐ．２６−３１、１９６９年の方法に従って測定して確認することができる。
【００３６】
ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．４１として分類されている酵素を指す。
ＮＡＤ依存性イソクエン脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ＮＡＤ依存性イソクエン脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）のＳ０１５３８遺伝子（ＮＣＢIデータベースにＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  ２４３４７３００として遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
ＮＡＤ依存性イソクエン脱水素酵素の酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、１３巻、ｐ．３４−４２、１９６９年の方法に従って測定して確認することができる。
【００３７】
スクシニルＣｏＡ合成酵素は、ＥＣ：６．２．１．５として分類されている酵素を指す。
スクシニルＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子としては、スクシニルＣｏＡ合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｓｕｃＣｓｕｃＤオペロン（ｓｕｃＣ遺伝子は、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２８７０３として、  またｓｕｃＤ遺伝子は、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２８７０４としてＮＣＢＩデータベースに遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
スクシニルＣｏＡ合成酵素の活性は、ＧＴＰをＡＴＰに変更し、ＮＡＤＨ溶液の濃度を１．６ｍＭに変更する以外は「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、１３巻、ｐ．６２−６９、１９６９年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００３８】
フマレートヒドラターゼは、ＥＣ：４．２．１．２として分類されている酵素を指す。
フマレートヒドラターゼをコードする遺伝子としては、フマレートヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｆｕｍＡ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースにＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９５７０として遺伝子の塩基配列及びコードする蛋白質のアミノ酸配列が開示されている）や大腸菌のｆｕｍＣ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースにＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９５６９として遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
フマレートヒドラターゼの酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、１３巻、ｐ．９１−９９、１９６９年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００３９】
マレートキノンオキシドレダクターゼは、ＥＣ：１．１．９９．１６として分類されている酵素を指す。
マレートキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子としては、マレートキノンオキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｙｏｊＨ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３０１４７として遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
マレートキノンオキシドレダクターゼの酵素活性は、「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur．J．Biochem．）」、２５４巻、ｐ．３９５−４０３、１９９８年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４０】
ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）は、ＥＣ：１．１．１．３８として分類されている酵素を指す。
ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）をコードする遺伝子としては、ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｓｆｃＡ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９４３８として遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
ＮＡＤ依存性リンゴ酸脱水素酵素（脱炭酸）の酵素活性は、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochemical Journal）」、９７巻、ｐ．２８４−ｐ．２９７、１９６５年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４１】
ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．２８として分類されている酵素を指す。
ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｄｌｄ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３００７１として遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
ＦＡＤ依存性乳酸脱水素酵素の酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Biosci．Biotechnol．Biochem．）」、６８巻、ｐ．５１６−ｐ．５２２、２００４年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４２】
ＮＡＤＨ脱水素酵素は、ＥＣ：１．６．５．３として分類されている酵素を指す。
ＮＡＤＨ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、ＮＡＤＨ脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、また、ＮＡＤＨ脱水素酵素複合体の場合、該複合体をコードする全ての遺伝子を用いてもよいが、サブユニットの１つ又は２つ以上の遺伝子を用いることもできる。尚、ＮＡＤＨ脱水素酵素複合体の具体例としては、大腸菌のｎｕｏオペロン中のｎｕｏＭ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３０２１２として遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
ＮＡＤＨ脱水素酵素の酵素活性は、「バイオケミストリー（Biochemistry）」、２６巻、ｐ．７７３２−７７３７、１９８７年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４３】
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．２．１．１２として分類されている酵素を指す。
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｇａｐＡ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９７３３として遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が開示されている）などが挙げられる。
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、４１巻、ｐ．２６４−２７３、１９７５年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４４】
エノラーゼは、ＥＣ：４．２．１．１１として分類されている酵素を指す。
エノラーゼをコードする遺伝子としては、エノラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｅｎｏ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１３０６８６として遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が開示されている）などが挙げられる。
エノラーゼの酵素活性は、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、９巻、ｐ．６７０−６７９、１９６６年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４５】
グルコース−６−リン酸脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．４９として分類されている酵素を指す。
グルコース−６−リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子としては、グルコース−６−リン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｚｗｆ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９８０５として遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が開示されている）などが挙げられる。
グルコース−６−リン酸脱水素酵素の酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience，Biotechnology and Biochemistry）」、６７巻、１２号、ｐ．２６４８−２６５１、２００３年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４６】
６−ホスホグルコノラクトナーゼは、ＥＣ：３．１．１．３１として分類されている酵素を指す。
６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子としては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、メソリゾビウム・ロチ（Mesorhizobium loti）のｍｌ１６５１４遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １３４７５４４４としての遺伝子塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
６−ホスホグルコノラクトナーゼの酵素活性は、「プロシーディングス・ナチュラル・アカデミー・サイエンス  ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA）」、８２巻、１１号、ｐ．３８７６−３８７８、１９８５年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４７】
６−ホスホグルコネート脱水素酵素は、ＥＣ：１．１．１．４４として分類されている酵素を指す。
６−ホスホグルコネート脱水素酵素をコードする遺伝子としては、６−ホスホグルコネート脱水素酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｇｎｄ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９９７０としての遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
６−ホスホグルコネート脱水素酵素の酵素活性は、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience，Biotechnology and Biochemistry）」、６７巻、１２号、ｐ．２６４８−２６５１、２００３年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４８】
ホスホグルコネートデヒドラターゼは、ＥＣ：４．２．１．１２として分類されている酵素を指す。
ホスホグルコネートデヒドラターゼをコードする遺伝子としては、ホスホグルネートデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定はなく、大腸菌のｅｄｄ遺伝子（ＮＣＢＩデータベースに、ＧＩ  ｎｕｍｂｅｒ  １６１２９８０４として遺伝子の塩基配列及びコードするタンパク質のアミノ酸配列が公開されている）などが挙げられる。
ホスホグルコネートデヒドラターゼの酵素活性は、エントナー・ドードルフ経路全体の活性として「ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Journal of Biotechnology）」、１０５巻、ｐ．１１−３１、２００３年に記載の方法に従って測定して確認することができる。
【００４９】
本発明の育種方法においては、上記したような細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現量を高めると同時に、上記タンパク質とは別の細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子、または酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子の発現量を高める。
ここで、上記各遺伝子の発現量を高めるための手段としては、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子や、酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して発現させることによることができる。
【００５０】
すなわち、本発明の育種方法において、前記した（１）細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を２種類以上組み合わせて、これらの発現量を高める場合においては、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の２種類以上を細胞内に導入して発現させることにより、上記遺伝子の発現量を高めることができる。このような細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の組み合わせとしては、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子の組み合わせを挙げることができる。
また、本発明の育種方法においては、前記した（２）細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子のほかに、酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子を組み合わせて、これらの発現量を高める場合には、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする１種類または２種類以上の遺伝子を細胞内に導入して発現させることにより、上記遺伝子の発現量を高めることができる。このような細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と酢酸存在下での生育を促進する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の組み合わせとしては、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とクエン酸合成酵素をコードする遺伝子の組み合わせ、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子とＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子の組み合わせ、またはアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子とグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子の組み合わせを挙げることができる。
【００５１】
各遺伝子の発現量を高めるための手段の一例を挙げると、細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質や細胞内酢酸濃度の上昇を抑制する機能を有するタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合は、対応する酵素のアナログ耐性変異株を取得し、該変異株の酵素活性を測定して元株よりも向上した株を取得することによって可能である。
また、他の例としては、該遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて酢酸菌を形質転換して、酢酸耐性が増強されたことを確認する方法が挙げられる。
【００５２】
遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、対象とする遺伝子を保持するマルチコピーベクターを酢酸菌、好ましくは、アセトバクター属、またはグルコンアセトバクター属に属する細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をグルコンアセトバクター属やアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００５３】
組換えＤＮＡを得る場合における目的遺伝子の取得は、上述したように、該遺伝子の塩基配列が明らかであることから、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、酢酸菌、例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）やグルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）や大腸菌Ｋ−１２株、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）  ＭＲ−１株（ＡＴＣＣ７００５５０）、メソリゾビウム・ロチ  ＭＡＦＦ３０３０９９（Mesorhizobium loti MAFF303099）（独立行政法人  農業生物資源研究所から分譲可能）のゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）（例えば、「トレンズ・オブ・ジェネティックス（Trends Genet．）」、５巻、１８５頁、１９８９年参照）によることができる。
また、上記塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡライブラリーを用いるハイブリダイゼーションによっても、目的の遺伝子を得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ９７００などを用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用して、定法に従って行なうことができる。
【００５４】
また、前記したように、各遺伝子として特定の酵素活性を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡを用いることもできるが、このようなＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換又は付加されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。このように改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもグルコンアセトバクター属やアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
具体的には、グルコンアセトバクター属やアセトバクター属に属する酢酸菌、又は変異処理したグルコンアセトバクター属やアセトバクター属に属する酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号３５９〜１３９０からなる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００５５】
使用するマルチコピーベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、「セルロース（Cellulose）、ｐ．１５３−１５８（１９８９年）参照」、ｐＭＶ２４（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl．Environ．Microbiol．）」、５５巻、ｐ．１７１−１７６（１９８９年）参照）、ｐＧＩ１８（例えば、本願明細書参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９（１９８８年）参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
増幅させるＤＮＡは、目的とする酵素活性を有する蛋白をコードする遺伝子であれば、特に起源は問わないが、酢酸菌由来の遺伝子の方が酢酸菌での発現が容易であり、特に好ましい。
【００５６】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem．）」、４９巻、p.２０９１、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）等によって行なうことができる。
【００５７】
ベクターに酵素遺伝子をコードするＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の酵素遺伝子をコードするＤＮＡは、そのＤＮＡがコードする遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５８】
また、染色体ＤＮＡ上の、酵素遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えるには、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。このようにして微生物における内因性の酵素遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該酵素遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
【００５９】
アセトバクター属（Acetobacter）の細菌として、具体的にはアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Acetobacter aceti IFO3283）株などを用いることができる。
【００６０】
グルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）の細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス（Gluconacetobacter europaeus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、具体的には、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株、グルコンアセトバクター・ヨーロパエウス  ＤＳＭ６１６０（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）株、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス  ＡＴＣＣ４９０３７（Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC49037）株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）としてはアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）を用いることができる。
【００６１】
本発明者らは、後述の実施例に示すように、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）由来のＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来のクエン酸合成酵素をコードする遺伝子の組み合わせ、上記ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来のグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子の組み合わせ、アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来のアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子と上記ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子の組み合わせ、及び上記アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子と上記グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子の組み合わせのそれぞれを、酢酸菌であるアセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）及びグルコンアセトバクター・キシリナス（ＩＦＯ３２８８）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ−ＣＳ、Ｎｏ．１０２３／ｐＡＢＣ−ＧＣＳ、Ｎｏ．１０２３／ｐＡＤＨ−ＡＢＣ、及びＮｏ．１０２３／ｐＡＤＨ−ＧＣＳ、並びにグルコンアセトバクター・キシリナスＩＦＯ３２８８／ｐＡＢＣ−ＣＳ、ＩＦＯ３２８８／ｐＡＢＣ−ＧＣＳ、ＩＦＯ３２８８／ｐＡＤＨ−ＡＢＣ、及びＩＦＯ３２８８／ｐＡＤＨ−ＧＣＳを得た。これらの酢酸菌８種類は、いずれも独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その受託番号は、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ−ＣＳ、Ｎｏ．１０２３／ｐＡＢＣ−ＧＣＳ、Ｎｏ．１０２３／ｐＡＤＨ−ＡＢＣ、及びＮｏ．１０２３／ｐＡＤＨ−ＧＣＳがそれぞれＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３５、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３６、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３７、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３８、グルコンアセトバクター・キシリナスＩＦＯ３２８８／ｐＡＢＣ−ＣＳ、ＩＦＯ３２８８／ｐＡＢＣ−ＧＣＳ、ＩＦＯ３２８８／ｐＡＤＨ−ＡＢＣ、及びＩＦＯ３２８８／ｐＡＤＨ−ＧＣＳがそれぞれＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３９、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２４０、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２４１、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２４２である。
【００６２】
本発明の育種方法により、上記のようにして、酢酸耐性の向上した酢酸菌を得ることができる。
得られる酢酸菌は、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、食酢を効率よく製造することができ、本発明はこのような食酢の製造方法をも提供するものである。
【００６３】
本発明の食酢の製造方法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。
酢酸菌については、特に、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌であって、アルコール酸化能を有するものであることが好ましい。
酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養は、静置培養法、振盪培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。
【実施例】
【００６４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（製造例１）大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の作成
酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８は、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の約３．１ｋｂのプラスミドｐＧＩ１とｐＵＣ１８とから作製した。
すなわち、アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の培養液より、菌体を集菌し、水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
得られたプラスミドは、ＨｉｎｃＩＩで３ヶ所、また、ＳｆｉＩで１ヶ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１００塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位は有していなかった。
このプラスミドをｐＧＩ１と命名し、ベクターｐＧＩ１８の作製に用いた。
【００６５】
上記で得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、ＡａｔＩＩで切断した。この断片をｐＵＣ１８の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＧＩ１８を作製した（図１）。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。即ち、鋳型としてプラスミドｐＧＩ１を用い、プライマーとして制限酵素ＡａｔＩＩ認識部位を有するプライマーＡ（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）及びプライマーＢ（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）を用い、下記のＰＣＲ条件にて、ＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００６６】
図１に示すように、得られたプラスミドｐＧＩ１８はｐＵＣ１８及びｐＧＩ１のいずれも含有していて、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。
このプラスミドｐＧＩ１８の塩基配列を、配列表の配列番号１１に示した。
【００６７】
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０〜３３６時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。
【００６８】
得られた菌体から、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。すなわち、該菌体をＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥＳ緩衝液を加えて菌体を懸濁し、リゾチーム液を加えて静置し、ＥＤＴＡ液を加えて３７℃で２０分間反応させた。
反応後、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、３７℃で２０分間静置したのち、食塩水を加え、０℃で一夜静置した。次いで、遠心分離を行ない上清を得た。この上清にポリエチレングリコール６０００を加え、４℃で一夜静置した後遠心分離を行ない、ＤＮＡを含む沈殿物を得た。
【００６９】
上記のようにして得られたアセトバクター・アルトアセトゲネス  ＭＨ−２４株の染色体を鋳型として、プライマー１（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）およびプライマー２（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００７０】
（実施例２）アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）由来のＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）株を、１％酢酸と２％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４〜３６時間振盪培養を行なった。
培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。
【００７１】
得られた菌体から、実施例１と同様な方法でアセトバクター・アセチの染色体ＤＮＡを調製した。
調製したアセトバクター・アセチの染色体を鋳型として、プライマー３（配列表の配列番号１４記載の塩基配列参照）およびプライマー４（配列表の配列番号１５記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００７２】
（実施例３）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
実施例１と同様に調製された、グルコンアセトバクター・エンタニイの１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体を鋳型として、プライマー５（配列表の配列番号１６記載の塩基配列参照）およびプライマー６（配列表の配列番号１７記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００７３】
（実施例４）グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のクエン酸合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
実施例１と同様に調製された、グルコンアセトバクター・エンタニイの１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体を鋳型として、プライマー７（配列表の配列番号１８記載の塩基配列参照）およびプライマー８（配列表の配列番号１９記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、クエン酸合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００７４】
（実施例５）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子及びアルコール脱水素酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例１で調製されたグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
また、実施例３で調製されたグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【００７５】
このようにして調製された各ＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＧＣＳ及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨを得た。
【００７６】
更に、ｐＧＣＳを鋳型として、プライマー９（配列表の配列番号２０記載の塩基配列参照）及びプライマー１０（配列表の配列番号２１記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、上記のようにして作製されたプラスミドｐＡＤＨの制限酵素ＸｂａＩ部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製されたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地（１０ｇポリペプトン、５ｇ酵母エキス、１０ｇ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨ−ＧＣＳを得た。
【００７７】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得られたｐＧＣＳ、ｐＡＤＨおよびｐＡＤＨ−ＧＣＳのそれぞれを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ対応するプラスミドを保有していることを確認した。
【００７８】
このようにして得られた形質転換株のうち、グルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８／ｐＡＤＨ−ＧＣＳ（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pADH-GCS）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２４２である。
【００７９】
（３）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＣＳ、ｐＡＤＨまたはｐＡＤＨ−ＧＣＳを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸２．５％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養７日目の結果を、表２に示す。
【００８０】
【表２】
2006230329.tif 000003
【００８１】
表２から明らかなように、２．５％酢酸を添加した培地において、元株はほとんど増殖しなかったのに対し、各形質転換株は旺盛に増殖した。
次に、酢酸３％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、各形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養８日目、および培養１１日目の結果を、表３に示す。
【００８２】
【表３】
2006230329.tif 000004
【００８３】
表３から明らかなように、３％の酢酸を添加した培地において、元株、ｐＧＣＳ形質転換株及びｐＡＤＨ形質転換株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＤＨ−ＧＣＳ形質転換株のみが増殖した。
これらのことから、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子とグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を酢酸菌（グルコンアセトバクター・キシリヌス）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【００８４】
（実施例６）ＡＢＣトランスポーター遺伝子及びアルコール脱水素酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例２で調製されたアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）由来のＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
また、実施例３で調製されたグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【００８５】
このようにして調製された各ＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３及び配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ及びアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨを得た。
【００８６】
更に、ｐＡＢＣを鋳型にして、プライマー９（配列表の配列番号２０記載の塩基配列参照）及びプライマー１０（配列表の配列番号２１記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、上記のようにして作製されたプラスミドｐＡＤＨの制限酵素ＸｂａＩ部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製されたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法により形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３及び配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨ−ＡＢＣを得た。
【００８７】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得られたｐＡＢＣ、ｐＡＤＨおよびｐＡＤＨ−ＡＢＣのそれぞれを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ対応するプラスミドを保有していることを確認した。
【００８８】
このようにして得られた形質転換株のうち、グルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８／ｐＡＤＨ−ＡＢＣ（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pADH-ABC）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２４１である。
【００８９】
（３）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ、ｐＡＤＨまたはｐＡＤＨ−ＡＢＣを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸２．５％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養７日目の結果を、表４に示す。
【００９０】
【表４】
2006230329.tif 000005
【００９１】
表４から明らかなように、２．５％酢酸を添加した培地において、元株はほとんど増殖しなかったのに対し、各形質転換株は旺盛に増殖した。
次に、酢酸３％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、各形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養８日目、および培養１１日目の結果を、表５に示す。
【００９２】
【表５】
2006230329.tif 000006
【００９３】
表５から明らかなように、３％の酢酸を添加した培地において、元株、ｐＡＢＣ及びｐＡＤＨの形質転換株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＤＨ−ＡＢＣ形質転換株のみが増殖した。
これらのことから、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子とＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を酢酸菌（グルコンアセトバクター・キシリヌス）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【００９４】
（実施例７）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子及びＡＢＣトランスポーター遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例１で調製されたグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
また、実施例２で調製されたアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）由来のＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【００９５】
このようにして調製されたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＧＣＳ及びＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣを得た。
【００９６】
更に、ｐＧＣＳを鋳型にしてプライマー９（配列表の配列番号２０記載の塩基配列参照）及びプライマー１０（配列表の配列番号２１記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、上記のようにして作製されたプラスミドｐＡＢＣの制限酵素ＸｂａＩ部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製されたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法により形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ−ＧＣＳを得た。
【００９７】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得られたｐＧＣＳ、ｐＡＢＣおよびｐＡＢＣ−ＧＣＳのそれぞれを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦ３２８８（Gluconacetobacter  xylinus IF3288）株をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ対応するプラスミドを保有していることを確認した。
【００９８】
このようにして得られた形質転換株のうち、グルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８／ｐＡＢＣ−ＧＣＳ（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pABC-GCS）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２４０である。
【００９９】
（３）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＣＳ、ｐＡＢＣまたはｐＡＢＣ−ＧＣＳを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸２．５％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養７日目の結果を、表６に示す。
【０１００】
【表６】
2006230329.tif 000007
【０１０１】
表６から明らかなように、２．５％酢酸を添加した培地において、元株はほとんど増殖しなかったのに対し、各形質転換株は旺盛に増殖した。
次に、酢酸３％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、各形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養８日目、および培養１１日目の結果を、表７に示す。
【０１０２】
【表７】
2006230329.tif 000008
【０１０３】
表７から明らかなように、３％の酢酸を添加した培地において、元株、ｐＡＢＣ及びｐＧＣＳの形質転換株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＢＣ−ＧＣＳ形質転換株のみが増殖した。
これらのことから、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子とＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を酢酸菌（グルコンアセトバクター・キシリヌス）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【０１０４】
（実施例８）ＡＢＣトランスポーター遺伝子及びクエン酸合成酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸耐性の向上
（１）プラスミドの調製
実施例２で調製されたアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）由来のＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
また、実施例４で調製されたグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）由来のクエン酸合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩ−ＸｂａＩで切断し、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳａｃＩ−ＸｂａＩ切断部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
【０１０５】
このようにして調製したＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Biosci．Biotech．Biochem．）」、５８巻、ｐ．９７４、１９９４年参照）によって形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ寒天培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３及び配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ及びクエン酸合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＳを得た。
【０１０６】
更に、ｐＣＳを鋳型にして、プライマー９（配列表の配列番号２０記載の塩基配列参照）及びプライマー１０（配列表の配列番号２１記載の塩基配列参照）を用いて、ＰＣＲ法により、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、上記で作製したプラスミドｐＡＢＣの制限酵素ＸｂａＩ部位にライゲーションにより挿入したＤＮＡを調製した。
このようにして調製されたＤＮＡを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（Escherichia coli JM109）株を、エレクトロポレーション法により形質転換した。
形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、配列表の配列番号３及び配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを保持していることを確認した。得られた形質転換株から、定法により、プラスミドＤＮＡを調製して、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とクエン酸合成酵素をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ−ＣＳを得た。
【０１０７】
（２）酢酸菌形質転換株の取得
このようにして得られたｐＡＢＣ、ｐＣＳおよびｐＡＢＣ−ＣＳのそれぞれを用いて、グルコンアセトバクター・キシリヌス  ＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。
上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ対応するプラスミドを保有していることを確認した。
【０１０８】
このようにして得られた形質転換株のうち、グルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８／ｐＡＢＣ−ＣＳ（Gluconacetobacter xylinus IFO3288/pABC-CS）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３９である。
【０１０９】
（３）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ、ｐＣＳまたはｐＡＢＣ−ＣＳを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸２．５％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養７日目の結果を、表８に示す。
【０１１０】
【表８】
2006230329.tif 000009
【０１１１】
表８から明らかなように、２．５％酢酸を添加した培地において、元株はほとんど増殖しなかったのに対し、形質転換株は旺盛に増殖した。
次に、酢酸３％、エタノール４％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、各形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養８日目、および培養１１日目の結果を、表９に示す。
【０１１２】
【表９】
2006230329.tif 000010
【０１１３】
表９から明らかなように、３％の酢酸を添加した培地において、元株、ｐＡＢＣ及びｐＣＳの形質転換株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＢＣ−ＣＳ形質転換株のみが増殖した。
これらのことから、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とクエン酸合成酵素をコードする遺伝子を酢酸菌（グルコンアセトバクター・キシリヌス）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【０１１４】
（実施例９）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子及びアルコール脱水素酵素遺伝子で形質転換したアセトバクター・アセチの酢酸耐性の向上
（１）酢酸菌形質転換株の取得
実施例５で調製されたグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＧＣＳ、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨ、及びグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とアルコール脱水素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨ−ＧＣＳの３種類を用いて、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）を、エレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
【０１１５】
このようにして得られた形質転換株のうち、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３／ｐＡＤＨ−ＧＣＳ（Acetobacter aceti No．1023/pADH-GCS）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３８である。
【０１１６】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＣＳ、ｐＡＤＨまたはｐＡＤＨ−ＧＣＳを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸３％、エタノール３％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養５日目の結果を、表１０に示す。
【０１１７】
【表１０】
2006230329.tif 000011
【０１１８】
表１０から明らかなように、３％酢酸を添加した培地において、元株やｐＧＣＳ形質転換株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＤＨ−ＧＣＳ形質転換株では、急速かつ旺盛な増殖を示した。ｐＡＤＨ形質転換株も増殖したものの、増殖の速度や程度の点ではｐＡＤＨ−ＧＣＳ形質転換株に劣っていた。
これらのことから、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を酢酸菌（アセトバクター・アセチ）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【０１１９】
（実施例１０）ＡＢＣトランスポーター遺伝子及びアルコール脱水素酵素遺伝子で形質転換したアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）の酢酸耐性の向上
（１）酢酸菌形質転換株の取得
実施例６で調製されたＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ、アルコール脱水素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨ、及びＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片とアルコール脱水素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＤＨ−ＡＢＣの３種類を用いて、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
【０１２０】
このようにして得られた形質転換株のうち、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３／ｐＡＤＨ−ＡＢＣ（Acetobacter aceti No．1023/pADH-ABC）株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３７である。
【０１２１】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＤＨ、ｐＡＢＣまたはｐＡＤＨ−ＡＢＣを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸３％、エタノール３％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養５日目の結果を、表１１に示す。
【０１２２】
【表１１】
2006230329.tif 000012
【０１２３】
表１１から明らかなように、３％酢酸を添加した培地において、元株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＤＨ−ＡＢＣ形質転換株では急速かつ旺盛な増殖を示した。ｐＡＢＣ形質転換株およびｐＡＤＨ形質転換株も増殖したものの、増殖の速度や程度の点ではｐＡＤＨ−ＧＣＳ形質転換株に劣っていた。
これらのことから、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を酢酸菌（アセトバクター・アセチ）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【０１２４】
（実施例１１）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子及びＡＢＣトランスポーター遺伝子で形質転換したアセトバクター・アセチの酢酸耐性の向上
（１）酢酸菌形質転換株の取得
実施例７で調製されたグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＧＣＳ、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ、及びグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片及びＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ−ＧＣＳの３種類を用いて、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
【０１２５】
このようにして得られた形質転換株のうち、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ−ＧＣＳ（Acetobacter aceti No．1023/pABC-GCS）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３６である。
【０１２６】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＣＳ、ｐＡＢＣまたはｐＡＢＣ−ＧＣＳを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸３％、エタノール３％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養５日目の結果を、表１２に示す。
【０１２７】
【表１２】
2006230329.tif 000013
【０１２８】
表１２から明らかなように、３％酢酸を添加した培地において、元株およびｐＧＣＳ形質転換株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＢＣ−ＧＣＳ形質転換株では急速かつ旺盛な増殖を示した。ｐＡＢＣ形質転換株も増殖したものの、増殖の速度や程度の点ではｐＡＢＣ−ＧＣＳ形質転換株に劣っていた。
これらのことから、グルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子とＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を酢酸菌（アセトバクター・アセチ）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【０１２９】
（実施例１２）ＡＢＣトランスポーター遺伝子及びクエン酸合成酵素遺伝子で形質転換したアセトバクター・アセチの酢酸耐性の向上
（１）酢酸菌形質転換株の取得
実施例８で調製されたＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ、クエン酸合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＳ、及びＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片及びクエン酸合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＡＢＣ−ＣＳの３種類を用いて、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）をエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．）」、８７巻、ｐ．８１３０−８１３４、１９９０年参照）によって形質転換した。
形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ培地で選択した。上記選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、それぞれ当該プラスミドを保有していることを確認した。
【０１３０】
このようにして得られた形質転換株のうち、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３／ｐＡＢＣ−ＣＳ（Acetobacter aceti No．1023/pABC-CS）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に２００５年２月１４日付で寄託されており、その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０２３５である。
【０１３１】
（２）形質転換株の酢酸耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＢＣ、ｐＣＳまたはｐＡＢＣ−ＣＳを保有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
具体的には、酢酸３％、エタノール３％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
元株および各形質転換株の培養開始時、培養４日目、および培養５日目の結果を、表１３に示す。
【０１３２】
【表１３】
2006230329.tif 000014
【０１３３】
表１３から明らかなように、３％酢酸を添加した培地において、元株ではほとんど増殖しなかったのに対し、ｐＡＢＣ−ＣＳ形質転換株では急速かつ旺盛な増殖を示した。ｐＡＢＣ形質転換株およびｐＣＳ形質転換株も増殖したものの、増殖の速度や程度の点ではｐＡＤＨ−ＧＣＳ形質転換株に劣っていた。
これらのことから、ＡＢＣトランスポーターをコードする遺伝子とクエン酸合成酵素をコードする遺伝子を酢酸菌（アセトバクター・アセチ）に導入して発現させることにより、酢酸耐性の向上した酢酸菌を育種することができることが明らかとなった。
【０１３４】
（実施例１３）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子及びアルコール脱水素酵素遺伝子で形質転換したグルコンアセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）の酢酸発酵試験
実施例５で得られたプラスミドｐＡＤＨ−ＧＣＳを保有するアンピシリン耐性を有するグルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株の形質転換株の酢酸発酵能を、製造例１で得られたプラスミドベクターｐＧＩ１８のみを有するグルコンアセトバクター・キシリヌスＩＦＯ３２８８（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）株（元株）との間で比較した。
具体的には、米糖化液を１７．９％、発酵諸味を３．２％、醸造用アルコールを９．８％、水を７１．１％の割合で混合して作成した原料培地（アルコール濃度９．８％、酢酸濃度０．２６％）を用いて、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）において、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度７.３％での連続発酵を行なった。その後、酢酸濃度を徐々に上げていき、安定に連続醗酵ができる酢酸濃度、及びその酢酸濃度の連続発酵での原料培地の添加速度を比較した。更に、培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
結果を表１４に示した。
【０１３５】
【表１４】
2006230329.tif 000015
【０１３６】
表１４の結果から、形質転換株の方が、連続酢酸発酵において、生産性（原料培地添加速度）と生産酢酸濃度において元株よりも顕著に優れていることが確認できた。
このことから、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子とグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を導入して発現させてなる酢酸耐性の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地での培養に供することにより、該培地中に、より高酸度の食酢を効率良く発酵製造することが可能であることが証明された。
【０１３７】
（実施例１４）グルコシルセラミド合成酵素遺伝子及びアルコール脱水素酵素遺伝子で形質転換したアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）の酢酸発酵試験
実施例９で得られたプラスミドｐＡＤＨ−ＧＣＳを保有するアンピシリン耐性を有するアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）の形質転換株について、製造例１で得られたプラスミドベクターｐＧＩ１８のみを有するアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No．1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）（元株）と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地を用いて、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）において、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。その後、７００ｍＬの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った７００ｍｌに対して酢酸、エタノール、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹＰＧ培地を添加して、酢酸３％、エタノール４％の濃度に調整し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が１％を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続した。最終到達酢酸濃度、比増殖速度、及び平均生産速度を算出して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。更に、培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度（最高値）を測定することで比較した。
結果を表１５にまとめた。
【０１３８】
【表１５】
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【０１３９】
表１５の結果から、以下のことが明らかである。
まず、ＯＤ６６０ｎｍの測定値（最高値）を見ると、形質転換株は元株よりも増殖速度が２．３８倍早いことが明らかである。
また、平均生産速度は、形質転換株は元株と比較して約１２％早いことから、発酵時間の短縮が可能であることが分かる。
更に、最終到達酢酸酸度は、元株の１０．２％に対して、形質転換株では１１．９％と上昇していた。
これらの結果から、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子とグルコシルセラミド合成酵素をコードする遺伝子を導入して発現させてなる酢酸耐性の向上した酢酸菌を、アルコールを含有する培地での培養に供することにより、該培地中に、より高酸度の食酢を効率良く発酵製造することが可能であることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明により、酢酸耐性が遺伝子レベルで解明され、酢酸耐性が選択的に増強され、高い酢酸耐性を有する実用酢酸菌を育種するための手段が提供されると共に、該酢酸菌を用いて高濃度の酢酸を従来以上に効率良く製造するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ｐＧＩ１８の構築図及び制限酵素地図を示した図である。
【符号の説明】
【０１４２】
図１中、「Ａａｔ  ＩＩ」及び「Ｓｆｉ  Ｉ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」、「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」はプラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｋｂｐ」及び「５．８ｋｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
【図１】
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【配列表】
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