(57)【要約】【課題】植物の生育や生長には影響を及ぼさない範囲内で複数のストレス耐性遺伝子の発現量を簡便に増加させ、種々のストレス耐性を付与する方法を提供することである。【解決手段】植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、外因性アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子および／またはスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子により該植物を形質転換し、少なくとも１種以上のストレス耐性遺伝子の発現量を非形質転換体と比較して増加させることを特徴とするストレス予防効果の付与方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、外因性アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子および／またはスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子により該植物を形質転換し、
少なくとも１種以上のストレス耐性遺伝子の発現量を非形質転換体と比較して増加させることを特徴とするストレス予防効果を植物へ付与する方法。
【請求項２】
植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、外因性アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子および／またはスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子により該植物を形質転換し、
少なくとも１種以上のストレス耐性遺伝子の発現量を非形質転換体と比較して増加させ、
ストレス耐性遺伝子の発現レベルが非形質転換植物（野性株）に比べて増加した形質転換植物を選抜することを特徴とするストレス予防効果を植物へ付与する方法。
【請求項３】
ストレス耐性遺伝子が、以下の(a)〜(t)からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のストレス予防効果の付与方法：
(a)CBF1 / DREB1B transcription factor；
(b)cold regulated protein / LEA protein；
(c)cold regulated protein / cor15；
(d)pathogen related PR-1 protein；
(e)early response dehydration protein / ERD15；
(f)salt stress induced tonoplast intrinsic protein / aquaporin；
(g)water channel protein / aquaporin；
(h)dehydration induced protein / RD22；
(i)stress responsive protein；
(j)drought induced protein；
(k)low temperature and salt responsive protein；
(l)stress responsive protein；
(m)zinc finger protein；
(n)disease resistance protein；
(o)disease resistance protein；
(p)disease resistance protein；
(q)disease resistance protein；
(r)disease resistance protein；
(s)peroxidase；
(t)senescence associated protein sen1。
【請求項４】
付与するストレス予防効果が、以下の(a)〜(l)からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のストレス予防効果の付与方法：
(a)低温ストレス；
(b)高温ストレス；
(c)塩ストレス；
(d)浸透圧ストレス；
(e)酸化ストレス；
(f)除草剤ストレス；
(g)凍結ストレス；
(h)乾燥ストレス；
(i)病原菌感染ストレス；
(j)害虫ストレス；
(k)傷害ストレス；
(l)老化ストレス。
【請求項５】
ストレス耐性遺伝子の発現を、非形質転換体と比較して、１．３〜１０倍量の範囲内に発現させることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のストレス予防効果の付与方法。
【請求項６】
ストレス耐性遺伝子の発現を、非形質転換体と比較して、１．４〜８倍量の範囲内に発現させることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のストレス予防効果の付与方法。
【請求項７】
ストレス耐性遺伝子の発現を、非形質転換体と比較して、１．５〜５倍量の範囲内に発現させることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のストレス予防効果の付与方法。
【請求項８】
外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子が、植物由来であることを特徴とする請求項１または２に記載のストレス予防効果の付与方法。
【請求項９】
外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１、２または８に記載のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号１（ＳＰＤＳ，１３２８）に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１０】
外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１、２または８に記載のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号３（ＳＰＤＳ，１５６０）に示される塩基配列中塩基番号１１８〜１２８１で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１１】
外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１または２に記載のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号５（ＳＡＭＤＣ，１８１４）に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１２】
外因性アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１または２に記載のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号７（ＡＤＣ，３０３７）に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項１３】
外因性スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するスペルミン合成酵素遺伝子であることを特徴とする請求項１または２に記載のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号９（ＳＰＭＳ，１０２０）に示される塩基配列中塩基番号１〜１０２０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のストレス耐性またはストレス抵抗性に関与する遺伝子の発現量を高める方法、及び該ストレス抵抗性に関与する遺伝子の発現量を高めることにより種々のストレス予防効果を付与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物はそれぞれの生息地の温度や塩などの様々な環境ストレスに適応して生活している。しかし、例えば温度ストレスにおいては、植物が生育適温の上限または下限を越えるような環境に遭遇すると高温ストレスや低温ストレスを受け、徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて障害をひきおこす。これまで、種々の温度環境に適応した野生の植物を食料作物や工芸作物などに利用するために、選抜や交雑育種など育種的手段によって作物の温度適応性の拡大に努めてきた。また、野菜や花卉、果樹等の園芸作物においては育種的手段に加えて、施設園芸で栽培可能な期間の拡大を図ってきた。しかし、特に日本は南北に長く、地域によっては気候が著しく異なるとともに、四季の変化が著しいので地域や季節によっては作物は生育に不適な温度環境にさらされる危険性が大きい。例えば、熱帯を起源とするイネは、明治以来の品種改良によって東北地方や北海道などの冷涼地でも栽培できるようになり、現在ではこれらの地域の基幹作物として栽培されているが、これらの地域では初夏に異常低温があると冷害を受け、著しい減収になることが現在でも問題になっている。近年、地球温暖化やエルニーニョ現象が原因と考えられる異常気象によって作物が重大な被害を受け、１９９３年のひどい冷害による米不足は記憶に新しい。また、野菜類についてみると、トマト、キュウリ、メロン、スイカなど果菜類の中には熱帯起源の作物が多い。これらの作物は需要が大きく農業経営上も重要性の大きい作物で早くから施設栽培に取り入れられてきた。しかし、昭和４９年のオイルショック以来、施設園芸における省資源や暖房コストの低減が問題となっている。施設園芸における省資源については温室の構造的なものから栽培技術まで各方面から検討されているが、最も基本的なことは作物の低温ストレス耐性を高めることである。
高温ストレスについては植物にとって重要なストレスで、特に夏場の高温によって作物の生育や収量は著しく左右される。
塩ストレスについては全陸地面積の約１０％が塩害地域といわれ、近年東南アジアやアフリカなどの乾燥地を中心に塩類土壌の拡大が農業上深刻な問題となっている。
乾燥ストレスは植物にとって重要なストレスで、温度が制限要因とならないときには降雨量とその分布によって大きな影響を受ける。特に、主要な作物栽培地域である半乾燥地帯などでは、作物の生育や収量は乾燥ストレスによって著しく左右される。
浸透圧ストレスや水ストレスは植物にとって重要なストレスで、温度が制限要因とならないときには降雨量とその分布によって大きな影響を受ける。特に、主要な作物栽培地域である半乾燥地帯などでは、作物の生育や収量は浸透圧ストレスや水ストレスによって著しく左右される。
【０００３】
種々のストレス耐性を高めるために交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行われている。
これまでに遺伝子工学技術を利用した、ストレス耐性植物の作出が行われている。低温ストレス耐性の改良に用いられた遺伝子としては、生体膜脂質の脂肪酸の不飽和化酵素遺伝子（ω−３デサチュラーゼ遺伝子、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、ステアロイル−ＡＣＰ−不飽和化酵素遺伝子）や光合成に関与するピルビン酸リン酸ジキナーゼ遺伝子、凍結保護・防止活性を持つタンパク質をコードする遺伝子（ＣＯＲ１５、ＣＯＲ８５、ｋｉｎ１）等が報告されている。
塩ストレスや乾燥・水ストレス耐性の改良に用いられた遺伝子としては、浸透圧調節物質のグリシンベタイン合成酵素遺伝子（コリンモノオキシゲナーゼ遺伝子、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）、プロリン合成酵素遺伝子（１−ピロリン−５−カルボン酸シンテターゼ）等が報告されている。
【０００４】
ストレス耐性またはストレス抵抗性に関与する遺伝子の発現量を高めてストレス耐性を改良する方法としては転写因子（ＤＲＥＢ遺伝子）をコードする遺伝子を利用する方法が報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。いずれの報告でも、恒常的にＤＲＥＢ遺伝子を植物で過剰発現させることによって、ｒｄ２９Ａ、ｋｉｎ１、Ｐ５ＣＳ等のストレス耐性遺伝子群の発現量が高まり乾燥ストレス、塩ストレスおよび凍結ストレス耐性が向上することが示されているが、成長阻害が強く見られ生育が停止して枯死する個体が観察など生育への悪影響が示されている。
【０００５】
ＤＲＥＢ遺伝子以外のストレス耐性またはストレス抵抗性に関与する遺伝子を植物に導入した事例もある。cold regulated protein / LEA proteinはlate embryogenesis abundant（LEA）proteinでストレスによって誘導されることが知られており、LEA protein遺伝子であるHV1をイネに導入することで乾燥や塩ストレス耐性が高まることが報告されている（非特許文献３）。pathogen related PR-1 proteinは病原菌感染によって誘導されるタンパク質でPR-1（pathogenesis-related protein 1）の一つであるCABPR1遺伝子をタバコに導入することで、重金属や病原菌感染ストレス耐性が高まることが報告されている（非特許文献４）。peroxidaseは植物の細胞壁酵素の一つ（EC 1.11.1.7）で傷害やストレスによって誘導されることが知られており、植物に導入することで酸化ストレスや害虫ストレス耐性が高まることが報告されている（非特許文献５, 非特許文献６）しかし、これらストレス耐性またはストレス抵抗性は、ストレス耐性またはストレス抵抗性に関与する遺伝子を植物に１種類導入することにより、多くとも２種類のストレス耐性が付与されるのみである。自然界においては複数のストレスが同時にかかるため、作物の生産性を向上させるためには、複数のストレスに対して抵抗性を向上させる必要がある。また、前述した遺伝子により形質転換した植物の多くは、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。
【０００６】
植物に導入していないが、ストレスとの関係が深く示唆されている遺伝子もある。cold regulated protein / cor15は低温ストレスによって誘導される遺伝子で凍結ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（非特許文献７,非特許文献８）。early response dehydration protein / ERD15は乾燥ストレスによって誘導される遺伝子で乾燥ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（非特許文献９）。salt stress induced tonoplast intrinsic protein / aquaporinと遺伝子番号７のwater channel protein / aquaporinはストレスによって誘導される水チャンネルタンパク質で塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（非特許文献１０,非特許文献１１）。dehydration induced protein / RD22は乾燥ストレスによって誘導されるタンパク質で乾燥ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（非特許文献１２）。senescence associated protein sen1は老化ストレス、塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレスによって誘導されるタンパク質で老化ストレス、塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレス耐性に深く関与することが報告されている（非特許文献１３）。そのほかにも、ストレス耐性またはストレス抵抗性への関与が示されている遺伝子がある。これらの、遺伝子を植物体に導入すれば、それぞれの遺伝子に対応するストレス抵抗性は向上するが、同時に複数のストレス抵抗性を向上させることは難しい。
【非特許文献１】Nature Biotechnology, 17, 287-291, 1999、
【非特許文献２】The Plant Cell, 10, 1391-1406, 1998
【非特許文献３】Plant Physiology, 110, 249-257, 1996
【非特許文献４】Plant Cell Rep.,Feb 18, 2005
【非特許文献５】Plant Physiology, 132, 1177-1185, 2003
【非特許文献６】J. Econ. Entomol., 95(1), 81-88, 2002
【非特許文献７】Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13404-13409, 1996
【非特許文献８】Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14570-14575, 1998
【非特許文献９】Plant Physiology, 106, 1707, 1994
【非特許文献１０】Mol. Cells., 9(1), 84-90, 1999
【非特許文献１１】Foods Food Ingredients J. Jpn., 176, 40-45
【非特許文献１２】Plant Cell., 15(1), 63-78, 2003
【非特許文献１３】Plant Physiology, 130, 2129-2141, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
環境問題や食糧問題から植物にストレス予防効果を付与することは極めて重要な課題であり、遺伝子組換え技術によってストレス耐性を改良する試みは幾つか行われているが、実際には産業上利用可能な程度に十分な効果は得られておらず、実用化に至っていないのが現状である。さらに、転写因子の一つであるＤＲＥＢをコードする遺伝子を植物で過剰発現させることでストレス耐性遺伝子群の発現レベルを高めて、ストレス耐性が改良されているが、生育や生長に対して強い阻害効果が見られ、種子が採取できない等の問題がある。従って、本発明の目的は、ストレス遭遇前に植物の生育や生長には影響を及ぼさない範囲内で複数のストレス耐性遺伝子の発現量を簡便に増加させ、種々のストレス予防効果を付与する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の目的を達成すべく鋭意努力した結果、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子を単離して、該遺伝子を植物に導入してプロモーター制御下で過剰発現することによって、ストレス遭遇前にポリアミン量を増加させることにより植物の生育や生長には影響を及ぼさない範囲内でストレス耐性に関与する複数の遺伝子の発現レベルを高め、且つ、種々のストレス耐性のパラメーターが改良されることを見出した。さらに、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子だけでなく、スペルミジン又はスペルミン含量をコントロールすることが可能なＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子でも同様にストレス耐性に関与する複数の遺伝子の発現レベルを高めてストレス予防効果を付与することで、種々のストレス耐性のパラメーターが改良されることを見出した。すなわち、本発明は、植物にストレス予防効果を付与することに関する。
１．植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、外因性アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子および／またはスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子により該植物を形質転換し、少なくとも１種以上のストレス耐性遺伝子の発現量を非形質転換体と比較して増加させることを特徴とするストレス予防効果を植物へ付与する方法。
２．植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、外因性アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子および／またはスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子により該植物を形質転換し、少なくとも１種以上のストレス耐性遺伝子の発現量を非形質転換体と比較して増加させ、ストレス耐性遺伝子の発現レベルが非形質転換植物（野性株）に比べて増加した形質転換植物を選抜することを特徴とするストレス予防効果を植物へ付与する方法。
３．ストレス耐性遺伝子が、以下の(a)〜(t)からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする１または２のストレス予防効果の付与方法：
(a)CBF1 / DREB1B transcription factor；
(b)cold regulated protein / LEA protein；
(c)cold regulated protein / cor15；
(d)pathogen related PR-1 protein；
(e)early response dehydration protein / ERD15；
(f)salt stress induced tonoplast intrinsic protein / aquaporin；
(g)water channel protein / aquaporin；
(h)dehydration induced protein / RD22；
(i)stress responsive protein；
(j)drought induced protein；
(k)low temperature and salt responsive protein；
(l)stress responsive protein；
(m)zinc finger protein；
(n)disease resistance protein；
(o)disease resistance protein；
(p)disease resistance protein；
(q)disease resistance protein；
(r)disease resistance protein；
(s)peroxidase；
(t)senescence associated protein sen1。
４．付与するストレス予防効果が、以下の(a)〜(m)からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする１〜３のいずれかのストレス予防効果の付与方法：
(a)低温ストレス；
(b)高温ストレス；
(c)塩ストレス；
(d)浸透圧ストレス；
(e)酸化ストレス；
(f)除草剤ストレス；
(g)凍結ストレス；
(h)乾燥ストレス；
(j)病原菌感染ストレス；
(k)害虫ストレス；
(l)傷害ストレス；
(m)老化ストレス。
５．ストレス耐性遺伝子の発現を、非形質転換体と比較して、１．３〜１０倍量の範囲内に発現させることを特徴とする１〜４のいずれかのストレス予防効果の付与方法。
６．ストレス耐性遺伝子の発現を、非形質転換体と比較して、１．４〜８倍量の範囲内に発現させることを特徴とする１〜５のいずれかのストレス予防効果の付与方法。
７．ストレス耐性遺伝子の発現を、非形質転換体と比較して、１．５〜５倍量の範囲内に発現させることを特徴とする１〜６のいずれかのストレス予防効果の付与方法。
８．外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子が、植物由来であることを特徴とする１または２のストレス予防効果の付与方法。
９．外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子であることを特徴とする１、２または８のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号１（ＳＰＤＳ，１３２８）に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
１０．外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するスペルミジン合成酵素遺伝子であることを特徴とする１、２または８のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号３（ＳＰＤＳ，１５６０）に示される塩基配列中塩基番号１１８〜１２８１で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
１１．外因性Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子であることを特徴とする１または２のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号５（ＳＡＭＤＣ，１８１４）に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
１２．外因性アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するアルギニン脱炭酸酵素遺伝子であることを特徴とする１または２のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号７（ＡＤＣ，３０３７）に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルギニン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
１３．外因性スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）または（ｃ）の塩基配列を有する塩基配列を有するスペルミン合成酵素遺伝子であることを特徴とする１または２のストレス予防効果の付与方法。
（ａ）配列番号９（ＳＰＭＳ，１０２０）に示される塩基配列中塩基番号１〜１０２０で示される塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つスペルミジン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の塩基配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり、且つスペルミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、植物のストレス耐性を改良することができ、植物の生育および生長過程において遭遇する様々なストレスによる障害の回避や生長抑制を軽減することができ栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大、栽培期間の拡大などが期待できる。不毛地域や塩類集積土壌でも植物の栽培が可能となり地球温暖化や食糧問題に対して貢献が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において「ストレス」とは、環境からうけるあらゆるストレスで、例えば高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、塩、浸透圧、乾燥、水、冠水、カドミウム、銅、オゾン、大気汚染、紫外線、強光、弱光、病原体、病原菌、害虫、除草剤、老化などを指す。
本発明において「非形質転換体」または「非形質転換植物」、とは該外因性スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、およびスペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を導入する前のあらゆる植物を意味する。従って、いわゆる野生種のほか、通常の交配によって樹立された栽培品種、それらの自然または人工変異体、並びにスペルミジン合成酵素遺伝子以外の外因性遺伝子を導入されたトランスジェニック植物などをすべて包含する。
【００１１】
ポリアミン合成酵素遺伝子
本発明においては、ポリアミン合成酵素遺伝子を植物に導入することで、ストレス耐性またはストレス抵抗性に関与する複数の遺伝子の発現量を高めることを思いがけず見いだした。さらに、ストレス耐性またはストレス抵抗性に関与する複数の遺伝子の発現量が高まることでストレス予防効果を与えて、複数のストレス耐性またはストレス抵抗性が付与されることを見いだした。特に、ポリアミン合成酵素遺伝子のなかでも、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子のようなスペルミジン又はスペルミン含量を増加させることが可能なポリアミン合成酵素遺伝子により植物を形質転換させることで、植物の生育や生長には影響を及ぼさない範囲内で複数のストレス耐性遺伝子の発現量を増加させ、種々のストレス予防効を付与する方法を見いだした。本明細書では、ＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＯＤＣ遺伝子、およびＳＰＭＳ遺伝子を総称して、「ポリアミン合成酵素遺伝子」と呼ぶことがある。従って、「ポリアミン合成酵素遺伝子」には、ＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＯＤＣ遺伝子、およびＳＰＭＳ遺伝子が包含される。
【００１２】
本発明において「スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子」とは、スペルミジン又はスペルミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、スペルミジンの直前の律速酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：spermidine synthase EC2.5.1.16.）はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。「アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子」とは、スペルミジン又はスペルミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子である。アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ：arginine decarboxylase EC4.1.1.19.）はＬ−アルギニンからアグマチンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。「Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子」とは、スペルミジン又はスペルミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、スペルミジンの律速酵素である。Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ：S-adenosylmethionine decarboxylase EC4.1.1.50.）はＳ−アデノシルメチオニンからアデノシルメチルチオプロピルアミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。「オルニチン脱炭酸酵素遺伝子」とは、スペルミジン又はスペルミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子である。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ：ornithine decarboxylase EC4.1.1.17.）はＬ−オルニチンからプトレシンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素である。「スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子」とは、スペルミンの生合成に関与する酵素のアミノ酸をコードする遺伝子であり、スペルミンの直前の律速酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：spermidine synthase EC2.5.1.16.）はプトレシンとアデノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメチルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素である。本発明を実施するにあたって、最も好ましい「ポリアミン合成酵素遺伝子」はＳＰＤＳ遺伝子である。
【００１３】
これらの遺伝子は、ストレス耐性遺伝子の発現量を生育に対して悪影響を及ばさない範囲内で高めることができれば、いずれの由来であってもよく、植物、微生物、動物などが挙げられる。既に単離されている遺伝子を用いても良い。例えば、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子については植物から既に幾つか単離されている。シロイヌナズナやタバコ（Plant Cell Physiol., 39(1), 73-79, 1998）、トマト（Plant Physiol., 120, 935, 1999）、コーヒー（Plant Science., 140, 161-168, 1999）、エンドウ（Plant Molecular Biology, 39, 933-943, 1999）、リンゴ（Mol. Gen. Genomics, 268, 799-807, 2003）、クロダネカボチャ（WO02/23974, WO03/84314）等から単離されている。さらに、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子をモデル植物であるタバコへの導入が試みられており、ポリアミン含量の変化については調べられているが、ストレス耐性遺伝子の発現レベルや種々の環境ストレス耐性の改良については調べられていない（Joural of Plant Physiology, 161, 989-1001, 2004）。アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子はエンバク（Mol. Gen. Genet., 224, 431-436, 1990）、トマト（Plant Physiol., 103, 829-834, 1993）、シロイヌナズナ（Plant Physiol., 111, 1077-1083, 1996）、エンドウ（Plant Mol. Biol., 28, 997-1009, 1995）、クロダネカボチャ（WO02/23974, WO03/84314）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子はジャガイモ（Plant Mol. Biol., 26, 327-338, 1994）、ホウレンソウ（Plant Physiol., 107, 1461-1462, 1995）、クロダネカボチャ（WO02/23974, WO03/84314）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）（Biocem. J., 314, 241-248, 1996）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）はシロイヌナズナ（EMBO J., 19, 4248-4256, 2000）から単離されている。
【００１４】
本発明に従えば、微生物から単離したポリアミン合成酵素遺伝子がＤＲＥＢ、ＣＢＦ１、ＬＥＡ、ＣＯＲ等のストレス耐性遺伝子を非形質転換体と比較して１．１〜６倍量の範囲内で発現させることができる。好ましくは、微生物から単離したポリアミン合成酵素遺伝子がＤＲＥＢ、ＣＢＦ１、ＬＥＡ、ＣＯＲ等のストレス耐性遺伝子を非形質転換体と比較して１．５〜５倍量の範囲内で発現させることができる。より好ましくは、微生物から単離したポリアミン合成酵素遺伝子がＤＲＥＢ、ＣＢＦ１、ＬＥＡ、ＣＯＲ等のストレス耐性遺伝子を非形質転換体と比較して１．５〜４倍量の範囲内で発現させることができる。
【００１５】
さらに、ポリアミン合成酵素遺伝子を、種々の植物からも単離することもできる。具体的には、双子葉植物、例えばウリ科；ナス科；シロイヌナズナ等のアブラナ科；アルファルファ、カウピー（Vigna unguiculata）等のマメ科；アオイ科；キク科；アカザ科；ヒルガオ科からなる群から選ばれたもの、又は単子葉植物、例えばイネ、小麦、大麦、トウモロコシ等のイネ科などが含まれる。好ましくは、ウリ科植物、アブラナ科、イネ科、より好ましくはクロダネカボチャ、シロイヌナズナ、イネがよい。
【００１６】
本発明では、ポリアミン合成酵素遺伝子を取得するための最適な条件をも見いだしたので、併せて開示する。すなわち、本発明のポリアミン合成酵素遺伝子を単離する植物組織としては種子形態、または生育過程にあるものである。生育中の植物は全体、あるいは部分的な組織から単離することができる。単離することができる部位としては、特に限定はされないが、好ましくは植物の全樹、蕾、花、子房、果実、葉、茎、根などである。さらに好ましくは根、葉などである。
【００１７】
本発明において使用される好ましいポリアミン合成酵素遺伝子として、スペルミジン合成酵素遺伝子を挙げることができる。具体的には、
・配列番号１（クロダネカボチャ）に示される塩基配列中塩基番号７７〜１０６０で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号３（イネ）に示される塩基配列中塩基番号１１８〜１２８１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号５（クロダネカボチャ）に示される塩基配列中塩基番号４５６〜１５４７で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号７（クロダネカボチャ）に示される塩基配列中塩基番号５４１〜２６６１で示される塩基配列を有するＤＮＡ
・配列番号９（シロイヌナズナ）に示される塩基配列中塩基番号１〜１０２０で示される塩基配列を有するＤＮＡ
が挙げられる。さらに、
・該上記いずれかの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等のスペルミジン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。更に、
・該上記いずれかの配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等のスペルミジン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１８】
なお、「ポリアミン合成酵素遺伝子」は、公知の遺伝子並びに該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ該配列と同等のポリアミン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。更に、上記いずれかの配列において、１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなり且つ該配列と同等のポリアミン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを包含する。
【００１９】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、特定ポリアミン合成酵素遺伝子（例えばスペルミジン合成酵素遺伝子）配列にコードされるポリアミン合成酵素（例えばスペルミジン合成酵素）と同等の酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列が該特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の活性を有しないポリペプチドをコードする塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応および洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液および洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましくは５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．１×ＳＳＣにより洗浄する条件が挙げられる
【００２０】
ここでいう「１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列」とは、一般的に生理活性を有するタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が置換、削除、挿入または付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されている。本発明にはこのような修飾が加えられ、かつポリアミン合成酵素（例えばスペルミジン合成酵素）をコードする遺伝子も本発明で使用することができる。例えば、polyＡテールや５’、３’末端の非翻訳領域が「欠失」されてもよいし、アミノ酸を欠失するような範囲で塩基が「欠失」されてもよい。また、フレームシフトが起こらない範囲で塩基が「置換」されてもよい。また、アミノ酸が付加されるような範囲で塩基が「付加」されてもよい。但し、そのような修飾があっても、ポリアミン合成酵素（例えばスペルミジン合成酵素）活性を有することが必要である。好ましくは、「１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された遺伝子」がよい。
【００２１】
このような改変されたＤＮＡは例えば、部位特異的変異法（Nucleic Acid Research, Vol.10, No. 20, 6487-6500, 1982）等によって、特定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって得られる。
【００２２】
ポリアミン
ポリアミンは第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見いだされている。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用としては(1)核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化(2)種々の核酸合成系への促進作用(3)タンパク質合成系の活性化(4)細胞膜の安定化や物質の膜透過性の強化などが知られている。植物におけるポリアミンの役割としては細胞増殖や分裂時に核酸、タンパク質生合成の促進効果や細胞保護が報告されている。本発明で言うところの「スペルミジン」は代表的なポリアミンの一つで生物体内に普遍的に存在する一般的な天然物であり、第一級アミノ基を３つもつ脂肪族炭化水素化合物である。
【００２３】
近年、ポリアミンの種々の環境ストレスに対する関わりが報告されている。低温ストレス（J. JapanSoc. Hortic. Sci., 68, 780-787, 1999、J. JapanSoc. Hortic. Sci., 68, 967-973, 1999、Plant Physiol. 124, 431-439, 2000）、塩ストレス（Plant Physiol., 91, 500-504, 1984）、酸ストレス（Plant Cell Physiol., 38(10), 156-1166, 1997）、浸透ストレス（Plant Physiol. 75, 102-109, 1984）、病原菌感染ストレス（New Phytol., 135, 467-473, 1997）、除草剤ストレス（Plant Cell Physiol., 39(9), 987-992, 1998）などとの関わりが報告されているが、いずれの報告も生長発育反応やストレス抵抗性とポリアミン濃度の変化の関連性からポリアミンの関与を推定したものであり、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子と環境ストレス耐性との遺伝子レベルでの関与については十分に調べられていなかった。
【００２４】
他に、ポリアミン合成酵素遺伝子を植物に導入した事例はあるが、ストレス耐性遺伝子の発現量調節については検討がなされていない。例えば、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子により植物を形質転換した報告はタバコで示されている（非特許文献１６：Joural of Plant Physiology, 161, 989-1001, 2004）。シロバナヨウシュチョウセンアサガオ由来のＳＰＤＳ遺伝子をタバコに恒常的に過剰発現させて、ポリアミン含量の変化を調べられている。しかし、ストレス耐性遺伝子の発現量の変化やストレス耐性については全く示されていない。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子により植物を形質転換させることで、ストレス耐性遺伝子群の発現量を高めることによりストレス耐性を付与する方法はこれまでに報告されていない。また、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子により植物を形質転換させることで、ストレス耐性遺伝子群の発現量を高めてストレス耐性を付与する方法も、これまでに報告されていない。加えて、植物への導入が試みられており、ポリアミン含量の変化については調べられているが、ストレス耐性遺伝子の発現レベルと種々の環境ストレス耐性の改良については調べられていない。
本発明においてはじめて、ポリアミン合成酵素遺伝子とストレス耐性遺伝子の発現レベルと種々の環境ストレス耐性の改良の関係が開示された。
【００２５】
本発明者らは植物のストレス耐性を改良するために鋭意検討した結果、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子により植物を形質転換することによって、ストレス遭遇前にスペルミジン又はスペルミン含量が増加し、増加したスペルミジン又はスペルミンの作用によりストレス耐性遺伝子の発現レベルを高めてストレス予防効果を付与することが種々のストレス耐性の付与又は改良にとって極めて重要であることを見出した。理論により拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、(1)ＳＰＤＳ遺伝子による植物の形質転換によって増加したスペルミジン又はスペルミンはセカンドメッセンジャー（シグナル伝達物質）として作用し、シグナル伝達に関与するプロテインキナーゼを活性化することでストレス耐性遺伝子の発現を誘導する、(2)ＳＰＤＳ遺伝子による植物の形質転換によって増加したスペルミジン又はスペルミンがポリアミン酸化酵素（ＰＡＯ）の反応により生じた過酸化水素（ＲＯＳ）がシグナル伝達を活性化することでストレス耐性遺伝子の発現を誘導すると考えている。ストレス耐性遺伝子の発現レベルの誘導や増加にはスペルミジン又はスペルミン含量の増加とその作用が重要であることから、スペルミジン又はスペルミン含量を増加させることができるＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子、アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）遺伝子、スペルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子でも、同様にストレス耐性遺伝子の発現レベルを高める効果が得られる。ストレス耐性遺伝子の発現レベルを高める時期は恒常的、非ストレス条件下、ストレス条件下のいずれでもよいが、特に恒常的または非ストレス条件下において植物の生育や生長に対して影響を及ぼさない範囲内でストレス耐性遺伝子の発現量を高めて、植物にストレス遭遇前にあらかじめ（事前に）ストレス予防効果を付与させること（防御効果またはワクチン様効果）が重要で、そのことによってストレス遭遇時に種々のストレスに対してより優れた耐性や抵抗性を示すことを本発明者は見出した。さらに、ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＳＰＭＳ等の遺伝子を植物に導入してプロモーター制御下で過剰発現させることで、生育や生長に対して影響を及ぼさない範囲内で、ＤＲＥＢ、ＣＢＦ１、ＣＯＲ等のストレス耐性遺伝子の発現レベルを高めることでストレス予防効果を与えて、それにより種々のストレス耐性のパラメーターが改良され、生産性（例えば収量）や形質が向上することを見出して本発明を完成するに至った。なお、本明細書で引用された文献は、その全体が参考として援用される。
【００２６】
ストレス耐性遺伝子
本発明において「ストレス耐性遺伝子」とは、植物がストレスに遭遇した時に発現誘導又は発現量が増加する遺伝子であり、ストレス耐性に関与若しくは関係している遺伝子である。例えば以下の表の遺伝子が挙げられる。
【００２７】
【表１】
2006325554.tif 000002
【００２８】
遺伝子番号１のCBF1 / DREB1B transcription factorはストレスによって誘導される転写因子の一つで、植物に導入することで乾燥、塩、凍結、低温などの種々の環境ストレス耐性が高まることが報告されている（The Plant Cell, 10, 1391-1406, 1998, Nature Biotechnology, 17, 287-291, 1999, Plant Physiology, 124, 1854-1865, 2000, Plant Physiology, 130, 639-648, 2002, Plant Physiology, 130, 618-626, 2002）。
【００２９】
遺伝子番号２のcold regulated protein / LEA proteinはlate embryogenesis abundant（LEA）proteinでストレスによって誘導されることが知られており、LEA protein遺伝子であるHV1をイネに導入することで乾燥や塩ストレス耐性が高まることが報告されている（Plant Physiology, 110, 249-257, 1996）。
【００３０】
遺伝子番号３のcold regulated protein / cor15は低温ストレスによって誘導される遺伝子で凍結ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13404-13409, 1996, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14570-14575, 1998）。
遺伝子番号４のpathogen related PR-1 proteinは病原菌感染によって誘導されるタンパク質でPR-1（pathogenesis-related protein 1）の一つであるCABPR1遺伝子をタバコに導入することで、重金属や病原菌感染ストレス耐性が高まることが報告されている（Plant Cell Rep.,Feb 18, 2005）。
【００３１】
遺伝子番号５のearly response dehydration protein / ERD15は乾燥ストレスによって誘導される遺伝子で乾燥ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Plant Physiology, 106, 1707, 1994）。
【００３２】
遺伝子番号６のsalt stress induced tonoplast intrinsic protein / aquaporinと遺伝子番号７のwater channel protein / aquaporinはストレスによって誘導される水チャンネルタンパク質で塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Mol. Cells., 9(1), 84-90, 1999, Foods Food Ingredients J. Jpn., 176, 40-45）。
【００３３】
遺伝子番号８のdehydration induced protein / RD22は乾燥ストレスによって誘導されるタンパク質で乾燥ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Plant Cell., 15(1), 63-78, 2003）。
【００３４】
遺伝子番号１〜８の遺伝子は、本発明において発現量が高められる重要なストレス耐性遺伝子である。
【００３５】
遺伝子番号の９、１０、１１、１２、１３はストレスによって誘導されるタンパク質でストレス耐性への関与が示唆されている。
【００３６】
遺伝子番号の１４、１５、１６、１７、１８は傷害ストレスによって誘導されるタンパク質で傷害ストレス耐性への関与が示唆されている。
【００３７】
遺伝子番号の１９のperoxidaseは植物の細胞壁酵素の一つ（EC 1.11.1.7）で傷害やストレスによって誘導されることが知られており、植物に導入することで酸化ストレスや害虫ストレス耐性が高まることが報告されている（Plant Physiology, 132, 1177-1185, 2003, J. Econ. Entomol., 95(1), 81-88, 2002）
【００３８】
遺伝子番号２０のsenescence associated protein sen1は老化ストレス、塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレスによって誘導されるタンパク質で老化ストレス、塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレス耐性に深く関与することが報告されている（Plant Physiology, 130, 2129-2141, 2002）。
【００３９】
遺伝子番号１９，２０の遺伝子はまた、本発明において発現量が高められる重要なストレス耐性遺伝子である。
【００４０】
ストレス予防効果の付与
本発明において、「ストレス」としては、上述のごとく、高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、塩、浸透圧、乾燥、水、冠水、カドミウム、銅、オゾン、大気汚染、紫外線、強光、弱光、病原体、病原菌、害虫、除草剤、老化などの環境から受けるストレスが例示される。この中で「高温ストレス」とは、植物の生育適温度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、高温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「低温ストレス」とは、植物の生育適温度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、低温ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「塩ストレス」とは、植物の生育適塩濃度の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、塩ストレスを受けた植物は過剰な塩が細胞内に流入して徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「浸透圧ストレス」とは、植物の生育適浸透圧の上限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、浸透圧ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「乾燥ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、乾燥ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「水ストレス」とは、植物の生育適水分濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、水ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「弱光ストレス」とは、植物の生育適光強度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、弱光ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「除草剤ストレス」とは、植物の生育適除草剤濃度の下限を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物が受けるストレスであり、除草剤ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「病原菌ストレス」とは、植物の生育不適な病原菌に感染又は罹病することによって植物が受けるストレスであり、病原菌ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。「害虫ストレス」とは、植物不適な害虫に遭遇あるいは食害あるいは感染することによって植物が受けるストレスであり、害虫ストレスを受けた植物は徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて傷害が引き起こされる。
【００４１】
本発明において、「ストレス予防効果の付与方法」とは、植物に外因性ポリアミン合成酵素遺伝子を導入することによって、導入前に比してストレス予防効果を付与させる方法をいう。具体的には、「低温ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、生育過程において遭遇する低温ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「高温ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、生育過程において遭遇する高温ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「塩ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する塩ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「浸透圧ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、生育過程において遭遇する浸透圧ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「酸化ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する酸化ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「除草剤ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する除草剤ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「凍結ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する凍結ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「乾燥ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する乾燥ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「病原菌ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する病原菌ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「害虫ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する害虫ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「傷害ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する傷害ストレスによる生長抑制、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。「老化ストレス予防効果の付与方法」とは、植物にストレス予防効果を付与することで、植物の生育過程において遭遇する老化ストレスによる生長抑制、傷害、生産性低下を回避若しくは低減することができる方法である。ストレス耐性遺伝子の発現量を指標としてまたはコントロールすることにより、栽培の安定化、生産性、収量の向上、栽培・環境・期間・地域・面積の有効利用などが期待できる。さらに、植物の生産性や収量が高まることによって、植物から得られる種々の有用物質（澱粉、タンパク質等）の生産性の向上も期待することができる。また、ストレス耐性遺伝子の発現量を指標として栽培有効作物の選定・診断方法にも利用できる。
【００４２】
本発明の付与方法は、該外因性ポリアミン合成酵素遺伝子を有していない植物に、遺伝子工学的手法により外因性ポリアミン合成酵素遺伝子が導入され、且つ安定に保持されたものである。ここで「安定に保持される」とは、少なくともポリアミン合成酵素遺伝子が導入された当代の植物体で該ポリアミン合成酵素遺伝子が発現し、それによってストレス耐性が改良するのに十分な期間、該植物細胞内に保持されることをいう。従って、現実的には、該ポリアミン合成酵素遺伝子は宿主植物の染色体上に組み込まれるのが好ましい。該ポリアミン合成酵素遺伝子は次世代に安定に遺伝することがより好ましい。
【００４３】
また、ここで「外因性」とは、植物が生来有しておらず、外部より導入されたものを意味する。従って、本発明の「外因性ポリアミン合成酵素遺伝子」は、遺伝子操作により外部より導入される、宿主植物と同種の（すなわち、該宿主植物由来の）ポリアミン合成酵素遺伝子であってもよい。コドン使用（codon usage）の同一性を考慮すれば、宿主由来のポリアミン合成酵素遺伝子の使用もまた好ましい。
【００４４】
外因性ポリアミン合成酵素遺伝子はいかなる遺伝子工学的手法によって植物に導入されてもよく、例えば、ポリアミン合成酵素遺伝子を有する異種植物細胞とのプロトプラスト融合、ポリアミン合成酵素遺伝子を発現するように遺伝子操作されたウイルスゲノムを有する植物ウイルスによる感染、あるいはポリアミン合成酵素遺伝子を含有する発現ベクターによる宿主植物細胞の形質転換が挙げられる。
【００４５】
好ましくは、本発明のストレス耐性が付与された植物は、植物中で機能し得るプロモーターの制御下にある外因性ポリアミン合成酵素遺伝子を含む発現ベクターで、該外因性ポリアミン合成酵素遺伝子を有していない植物の細胞を形質転換することにより得られる、トランスジェニック植物である。
【００４６】
植物中で機能し得るプロモーターとしては、例えば、植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーター、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子プロモーター、ペルオキシダーゼ遺伝子プロモーター等を挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知の植物プロモーターも挙げられる。
【００４７】
恒常性タイプのプロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、アクチンプロモーター（Plant Cell, 2, 163-171, 1990）、ユビキチンプロモーター（Plant Mol. Biol., 18, 675-689, 1992）、イネサイクロフィリンプロモーター（Plant Mol. Biol., 25, 837-843, 1994）のような器官全体に恒常的または構成的に発現させるプロモーターだけでなく、器官または組織特異的プロモーターを用いれば、特定の器官、又は組織だけに目的遺伝子を発現させることができ、特定の器官又は組織だけストレス予防効果を付与することができる。葉組織特異的プロモーターとしては、aldPプロモーター（Mol. Gen. Genet., 248, 668-674, 1995）、rbcsプロモーター（Plant Cell Physiol., 35, 773-778, 1994）、花組織特異的プロモーターとしては、chsAカルコンシンターゼプロモーター（Plant Mol. Biol., 15, 95-109, 1990）、LAT52プロモーター（Mol. Gen. Genet., 217, 240-245, 1989）、根・塊根・塊茎組織特異的プロモーターとしては、SbPRP1プロモーター（Plant Mol. Biol., 21, 109-119, 1993）、スポラミンプロモーター（Mol. Gen. Genet., 225, 369, 1991）などが利用できる。例えばポリアミン合成酵素遺伝子と塊根に特異的に働くスポラミンプロモーターを用いることによって、塊根のみでストレス予防効果を付与することができる。
【００４８】
誘導性タイプのプロモーターとしては、ストレス誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、時期誘導性プロモーター、病原体誘導性プロモーター、傷害誘導性プロモーター等を用いることができる。例えば、ポリアミン合成酵素遺伝子と植物が低温に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、BN115プロモーター：Plant physiol.,106, 917-928, 1999）を用いることによって、低温時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し低温ストレス予防効果を付与することができる。ポリアミン合成酵素遺伝子と植物が乾燥に遭遇した時だけ転写を起こさせ得るプロモーター（例えば、Atmyb2プロモーター：The Plant Cell, 5, 1529-1539, 1993）を用いることによって、乾燥時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し乾燥ストレス予防効果を付与することができる。種々のストレスで誘導されるペルオキシダーゼプロモーター（特許第3571639号、特許第3259178号）を用いることによって、種々のストレス時に植物体のポリアミン代謝を制御し種々のストレス予防効果を付与することができる。さらにポリアミン合成酵素遺伝子と栄養生長期に働くプロモーターを用いることによって、栄養生長期のみでストレス予防効果を付与することができる。
【００４９】
好ましくはストレス遭遇前に植物の生育や生長に対して影響を及ぼさない範囲内でストレス耐性遺伝子の発現量を高めて、植物にあらかじめ（事前に）ストレス予防効果を付与させること（防御効果またはワクチン様効果）がストレス耐性付与に特に重要との考えから、恒常的、構成的プロモーター、器官または組織特異的プロモーター、生長や生育に応じた時期特異的なプロモーターである。特に好ましくは、恒常的、構成的プロモーターである。
【００５０】
本発明の発現ベクターにおいて、外因性ポリアミン合成酵素遺伝子は、植物中で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該ポリアミン合成酵素遺伝子の下流には、植物で機能し得る転写終結シグナル（ターミネーター領域）がさらに付加されていることが好ましい。例えば、ターミネーターＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子等が挙げられる。
【００５１】
本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでもよい。また、該発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子マーカーなどの形質転換体選抜のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（ＮＰＴII）遺伝子、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含んでもよい。選択圧をかけない条件では、組み込まれた遺伝子が脱落する現象が起こる場合があるので、除草剤耐性遺伝子をベクター上で共存させておけば、栽培中該除草剤を使用することにより、常に選択圧がかかった条件を実現できるという利点もある。
【００５２】
さらに、大量調製および精製を容易にするために、該発現ベクターは、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点および大腸菌での選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現ベクターは、簡便には、ｐＵＣ系またはｐＢＲ系の大腸菌ベクターのクローニング部位に上記ポリアミン合成酵素遺伝子の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を挿入することにより構築することができる。
【００５３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）やアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）による感染を利用して外因性ポリアミン合成酵素遺伝子を導入する場合には、該細菌が保持するＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（植物染色体に転移する領域）内に該ポリアミン合成酵素遺伝子発現カセットを挿入して用いることができる。現在、アグロバクテリウム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な機能は、Ｔ−ＤＮＡ自身とＴｉ（またはＲｉ）プラスミドの両者から独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリープラスミドはＴ−ＤＮＡの切り出しと組込みに必要な両端の２５ｂｐボーダー配列を有し、クラウンゴール（または毛状根）を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の挿入余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えばｐＢＩ１０１やｐＢＩ１２１（Clontech社製）などが市販されている。なお、Ｔ−ＤＮＡの組込みに作用するＶｉｒ領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別のＴｉ（またはＲｉ）プラスミド上にあってトランスに作用する。
【００５４】
植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ポリアミン合成酵素遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイトーシス様の過程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（ＰＥＧ法）、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストをＰＥＧ存在下に融合させる方法（リポソーム法）、ミニセルを用いて同様の過程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクトロポレーション法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタクトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクターＤＮＡを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、およびＤＮＡをコーティングした微小金粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、アグロバクテリウムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。従って、操作の簡便性を考慮すれば、アグロバクテリウム法および、パーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点さらに有用である。また、アグロバクテリウム法において、バイナリーベクターに植物ウイルス、例えばトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）等のジェミニウイルスのゲノムＤＮＡをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意の部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウイルス感染が拡がり、同時に目的遺伝子も植物体全体に導入される。これらの方法は、当該分野に置いて周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当該者により適宜選択され得る。
具体的方法の例示
【００５５】
以下に、ポリアミン合成酵素遺伝子の具体例として、ＳＰＤＳ遺伝子の取得方法とアグロバクテリウムによる目的核酸配列の導入および形質転換植物の作出方法を例示するが、これにより、本発明が限定されるものではない。ＳＰＤＳ遺伝子以外のポリアミン合成酵素遺伝子も同様に取得することができる。
【００５６】
１．ＳＰＤＳ遺伝子の取得
（１）ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの作製
低温処理を行ったクロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）の根組織やイネ（Oryza sativa）の幼苗から常法に従い、ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを抽出する。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡから市販のＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）等を用いてＰＣＲ用に使用するｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。単離したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、３’末端に２つのｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎを持つ修飾ｌｏｃｋ−ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用いてｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化したｃＤＮＡを得る。該２本鎖ｃＤＮＡをＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼにより末端を平滑化し、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡアダプターをライゲーション反応により結合させ、アダプター結合二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【００５７】
（２）ＰＣＲプライマーの設計
ポリアミン合成酵素遺伝子としてＳＰＤＳ遺伝子を単離することができる。ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナ、エンドウ、トマト等から単離されており、既に塩基配列が決定している。従って、決定している既知の塩基配列を比較し、非常に保存されている領域を選抜し、ＤＮＡオリゴマーを合成しＰＣＲ用プライマーを設計することができる。
【００５８】
（３）ＰＣＲによるＳＰＤＳ遺伝子断片の取得
上記（１）の方法で作製したＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、上記（２）の方法で設計したプライマーを使用して、それぞれＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で分離し、グラスミルク法などで精製する。精製したＰＣＲ産物はＴＡベクターなどのクローニングベクターに連結させる。
クローン化されたｃＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいはダイデオキシ法等により決定できる。いずれの方法も市販されているキットを用いて行うことができ、配列決定を自動的に行うオートシーケンサーを使用してもよい。
【００５９】
（４）完全長遺伝子の単離
完全長の遺伝子を得るためには、常法に従って、プラークハイブリダイゼーション、ＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）法やＭａｒａｔｈｏｎ  ＲＡＣＥ法等により完全長の遺伝子を得ることができる。
このようにして取得した遺伝子は、スペルミジン又はスペルミン生合成に関与する遺伝子であり、この遺伝子を利用して巧妙に、即ち、遺伝子発現を分子生物学的に制御することにより、スペルミジン又はスペルミンレベルやストレス耐性遺伝子の発現レベルの制御が可能となり、種々の環境ストレス抵抗性が改良された植物の作出も可能になる。
【００６０】
２．シロイヌナズナにおけるアグロバクテリウムによる目的核酸配列の導入、および形質転換植物の作出
上記１．で取得した遺伝子から得られた核酸配列を植物宿主に導入することにより、ストレス耐性遺伝子の発現レベルを高めて、種々の環境ストレス抵抗性が改良された特性を有するトランスジェニック植物を作出することができる。
【００６１】
（１）発現コンストラクトの作製および、アグロバクテリウムの形質転換
発現コンストラクトの作製は前記１．で得られたポリアミン合成酵素遺伝子の核酸配列をオープンリーディングフレームをすべて含むような適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適当なリンカーを連結し、植物形質転換用ベクターに挿入して作製することができる。植物形質転換用ベクターとしては、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１などを用いることができる。
作製した発現コンストラクトを大腸菌中で増幅後、発現コンストラクトをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１等に、三者接合法（Nucleic Acid Research, 12, 8711, 1984）、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により形質転換することができる。例えば、三者接合法は目的核酸配列を含んだ発現コンストラクトを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、およびアグロバクテリウムを混合培養して、抗生物質（例えばリファピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン等）を含んだ培地上で培養することによって形質転換アグロバクテリウムを得ることができる。
【００６２】
（２）トランスジェニック植物の作出
本発明において、遺伝子導入を行う植物としては、植物体全体、植物器官（例えば葉、茎、根、花器、生長点、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞などを挙げることができる。
【００６３】
（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えばカルス再生法（Plant Cell Reports, 12, 7-11, 1992）で植物に感染させて目的核酸配列を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って、ＭＳＯプレート（ムラシゲ・スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミンストック液１ｍｌ／リットル、ｐＨ６．２）に播種し、無菌的に栽培する。発根した根の切片を用いてＣＩＭプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度０．５μｇ／ｍｌ、カイネチンを０．０５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上でカルス培養を行う。プロモーターに目的核酸配列を接続し、カナマイシン及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、希釈したものをチューブに分注し、カルス化した根の切片を浸し、数日間ＣＩＭプレート上で共存培養する。菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行い、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、N6-[2-イソペンテニル] アデニンを終濃度５μｇ／ｍｌ、インドール酢酸（ＩＡＡ）を終濃度０．１５μｇ／ｍｌ、クラフォランを終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）上で数日間培養を行う。これらの切片を最終的にＳＩＭＣＳプレート（カナマイシンおよびハイグロマイシンＢを含有するプレート）上で培養し、１週間ごとに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した切片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択しているため、非形質転換切片は褐変する。形質転換体が５ｍｍ程度の大きさになり、ロゼット葉を形成するまで培養する。完全なロゼットの形状を示すようになったら、形質転換体の根元をカルス部分を含まないようにメスで切り取り、ＲＩＭプレート（ＭＳＯプレートにＩＡＡを終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）に移植する。大きなカルスが付いていると、発根してもカルスを介して根が出ていて、ロゼットとは維管束がつながっていないことが多い。約８〜１０日後、無機塩類培地〔５ｍＭ  ＫＮＯ3 、２．５ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4 、２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ3 ）2 、５０μＭ  Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量要素（７０ｍＭ  Ｈ3 ＢＯ3 、１４ｍＭ  ＭｎＣｌ2 、０．５ｍＭ  ＣｕＳＯ4 、１ｍＭ  ＺｎＳＯ4 、０．２ｍＭ  ＮａＭｏＯ4 、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ  ＣｏＣｌ2 ）１ｍｌ／リットル〕に浸したロックウール上に定植する。開花し、さやを形成した植物体は無機塩類培地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この種子を滅菌処理し、ＭＳＨ（ＭＳＯプレートのハイグロマイシンＢを終濃度５Ｕ／ｍｌとなるように加えたもの）に播種して発芽させることにより形質転換体を得ることができる。
【００６４】
さらに、（１）で作製した形質転換アグロバクテリウムを例えば減圧浸潤法（The Plant Journal, 19(3), 249-257, 1999）で植物に感染させて目的核酸配列を導入することができる。すなわち、シロイヌナズナの種子を常法に従って培養土（例えばメトロミックス等）に播種して、２２℃、長日条件下（例えば１６時間日長・８時間暗黒等）で栽培する。約３〜４週間後に伸長した主軸（花茎）を切除して、側枝の誘導を開始させる。摘心約１週間をに培養した形質転換アグロバクテリウム懸濁液にシロイヌナズナを浸し、これをデシケーターに入れてバキュームポンプで約−０．０５３Ｍｐａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、１０分間、室温放置する。感染後の鉢を深底トレイに移して、横倒しに置き、トレイの底に少量の水を滴下して透明な覆いを被せ多湿条件下で約１日放置する。感染後の鉢を起こして、２２℃・長日条件下で栽培を開始して、種子の収穫を行う。
約２〜４週間の間、種子の収穫を行い、収穫した種子は茶こしなどで莢やゴミを取り除き、デシケーター内で乾燥保存する。
【００６５】
トランスジェニック植物体の選択は、収穫した種子を常法に従って殺菌処理して、約９ｍｌの０．１％寒天水溶液に懸濁して、選択培地（例えば、１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、０．８％  寒天、１００ｍｇ／ｌ  カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ  カナマイシン、４０ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシンなど）に広げ、２２℃で無菌栽培する。抗生物質に対して抵抗性を示すトランスジェニック植物体は順調に生長して、約１〜２週間で同定することができる。本葉が約４〜６枚展開したトランスジェニック植物体を培養土を含んだ鉢に移植して２２℃で長日栽培を開始する。
【００６６】
得られたトランスジェニック植物より、常法に従ってＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ポリアミン合成酵素遺伝子をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、遺伝子導入の有無を確認することができる。
【００６７】
また、トランスジェニック植物や、非トランスジェニック植物より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、ポリアミン合成酵素遺伝子を有するプローブを作製し、これらのプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行い、目的核酸配列の発現の状態を調べることができる。
【００６８】
減圧浸潤法で得られたトランスジェニック植物（Ｔ１）の、自家受粉により得られるＴ２種子の形質転換出現比率は、通常メンデルの法則に従う。例えば、該ＳＰＤＳ遺伝子が一遺伝子座にヘテロ（heterozygous）に組み込まれた場合、Ｔ２種子では形質転換体は３：１の割合で分離する。Ｔ２種子を栽培して、自家受粉させて得られるＴ３種子において、形質転換体がすべての種子で出現すれば、該Ｔ２形質転換植物はホモ接合体（homozygote）であり、該形質転換植物が３：１に分離すれば、該Ｔ２形質転換植物は導入されたＳＰＤＳ遺伝子についてヘテロ（heterozygote）であると決定できる。
【００６９】
このようにして選抜された、導入されたＳＰＤＳ遺伝子についてホモ接合体である植物は、改良された環境ストレス抵抗性が固定された系統として、種子産業の分野において極めて有用である。上記と同様にして得られた他のポリアミン合成酵素遺伝子についてホモ接合体である植物は、改良された環境ストレス抵抗性が固定された系統として、種子産業の分野において極めて有用である。
【００７０】
上記に示した方法で作製された形質転換植物は、サザン解析やノーザン解析でポリアミン合成酵素遺伝子の遺伝子発現解析、ポリアミン量の分析、ストレス耐性遺伝子の発現評価、ストレス耐性の評価を行うことができる。
【００７１】
例えば、ポリアミンの定量は、０．０５〜１０ｇの試料をサンプリングして、５％過塩素酸水溶液を加えて、ポリアミンを抽出する。抽出したポリアミンの定量はダンシル化またはベンゾイル化等で標識した後、蛍光又はＵＶ検出器を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて内部標準法で分析することができる。
【００７２】
例えば、ポリアミン分析の結果から外因性ポリアミン合成酵素遺伝子により形質転換された形質転換体の系統（セルライン）の中から、外因性ポリアミン合成酵素遺伝子により形質転換されていない非形質転換植物（野性株）に比べてスペルミジン含量又はスペルミン含量が１．１〜３倍量高まっている系統（セルライン）を選抜又はスクリーニングする。
【００７３】
例えば、外因性ポリアミン合成酵素遺伝子により形質転換された形質転換体の系統（セルライン）の中から、外因性ポリアミン合成酵素遺伝子により形質転換されていない非形質転換植物（野性株）に比べてストレス耐性遺伝子の発現レベルが１．３〜１０倍量、好ましくは１．４〜８倍量、更に好ましくは１．５〜５倍量の範囲内の系統（セルライン）を選抜又はスクリーニングする。ストレス耐性遺伝子の発現レベルの解析はノーザンハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ解析法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等で調べることができる。
【００７４】
例えば、低温ストレス耐性は、０〜２０℃に１〜１０日間低温処理後、２５〜３０℃で生育させて生育状況や低温傷害等を調べることにより評価することができる。１０℃〜１８℃でトウモロコシを全期間生育させて生育状況や生体重（収量）を調べることにより低温ストレス耐性を評価することができる。高温ストレス耐性は、３５〜５０℃に１〜１０日間低温処理後、２５〜３０℃で生育させて生育状況や高温傷害等を調べることにより評価することができる。３５℃〜４５℃でトウモロコシを全期間生育させて生育状況や生体重（収量）を調べることにより高温ストレス耐性を評価することができる。塩ストレス耐性は、１０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌを含んだ培地中で、２５〜３０℃で生育させて生育状況や塩ストレス障害等を調べることにより評価できる。１０〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含んだ培養土でトウモロコシを全期間生育させて生育状況や生体重（収量）調べることにより塩ストレス耐性を評価できる。乾燥・水ストレス耐性は、水の供給を停止させて停止後の生育状況や障害程度を調べることにより評価することができる。潅水制限した培養土でトウモロコシを全期間生育させて生育状況や生体重（収量）調べることにより乾燥・水ストレスを評価できる。
【００７５】
本発明の形質転換される植物は、特に限定されるものではないが、双子葉植物、単子葉植物、草本性植物、木本性植物などが挙げられる。例えば、サツマイモ、トマト、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ、タバコ、シロイヌナズナ、ピーマン、ナス、マメ、サトイモ、ホウレンソウ、ニンジン、イチゴ、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、ダイズ、ナタネ、ソルガム、ユーカリ、ポプラ、ケナフ、杜仲、サトウキビ、シュガービート、キャッサバ、サゴヤシ、アカザ、ユリ、ラン、カーネーション、バラ、キク、ペチュニア、トレニア、キンギョソウ、シクラメン、カスミソウ、ゼラニウム、ヒマワリ、シバ、ワタ、マツタケ、シイタケ、キノコ、チョウセンニンジン、柑橘類、バナナ、キウイ等が挙げられる。好ましくは、サツマイモ、トマト、キュウリ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ペチュニア、トレニア、ユーカリ、ワタ、ナタネである。
【００７６】
本発明により、ポリアミン合成酵素遺伝子を植物体に導入することで、ストレス遭遇前にポリアミン量を増加させ、ストレス耐性またはストレス抵抗性に関与する複数の遺伝子発現量を高めることで、複数のストレス予防効果を付与することが可能となった。
【実施例】
【００７７】
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００７８】
（ポリアミン解析方法）
野生株（非組換え植物）と形質転換体（遺伝子組換え植物）を同時に栽培して、葉、茎、根、種子、果実などの組織中に含まれるポリアミン含量を調べることができる。ポリアミン含量は生育状況によってその含量が変化することから同じ条件下で栽培し、生育期間や栽培期間が揃った組織（例えば葉の場合は同じ葉齢）を調べることが重要である。ポリアミンは遊離型ポリアミン、化合型ポリアミン、結合型ポリアミンがあり抽出方法は異なるがいずれも解析することができる（Plant Cell Physiol., 43(2), 196-206, 2002）。具体例として葉の遊離型ポリアミンの分析方法について詳細に示す。約０．１〜１．０ｇの葉（同じ葉齢の若葉など）をサンプリングして凍結保存する。サンプリングした試料に希釈内部標準液（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、内部標準量＝７．５又１２ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり５〜２０ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出する。磨砕液を、４℃・３５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とする。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに４００μｌの遊離型ポリアミン溶液、２００μｌの飽和炭酸ナトリウム水溶液、２００μｌのダンシルクロライド／アセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて軽く混和する。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で覆い、６０℃のウォーターバスで１時間加温してダンシル化を行う。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて混和する。アルミ箔で覆ってウォーターバスで３０分間再加温する。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、６００μｌのトルエンを加えて激しく混和する。チューブを静置して２相に分かれた後に、上層のトルエン層を３００μｌマイクロチューブに分取する。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去する。チューブに２００μｌのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させる。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器（励起波長：365nm・発光波長：510nm）を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析する。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用する。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出する。
【００７９】
（マイクロアレイを用いたストレス耐性遺伝子の解析方法）
形質転換体の中から、スペルミジン又はスペルミン含量が野性株に比べて１．１〜３．０倍量の範囲内で高まっているＴ３ホモラインを選抜する。野生株（ＷＴ）とＴ３ホモライン（ＴＳＰ−１６，ＯＳＰ−２）の種子を培養土（ハイポネックスジャパン社製：メトロミックス２５０）を含んだプラスチック鉢に播種する。土壌に十分に水を与えてサランラップで覆い、２日間の低温処理（同調化）を行う。低温処理後の鉢を栽培室に移して、長日条件下（２２℃・１６時間日長・５０μmol m-2 sec-1 PPFD）で約１週間の順化を行う。１週間後にサランラップを外して前記の長日条件下で栽培を開始する。栽培開始から５０日目（抽だい直前）に地上部と根に分けてサンプリングする。新鮮重（ＦＷ）を測定した後、直ちに液体窒素で凍結させて−８０℃に保存する。Total RNAの抽出はTRIZOL reagent（GIBCO-BRL社製）を用いてプロトコールに従って行う。さらに、Total RNAの精製をRNeasy column（キアゲン社製）を用いてプロトコールに従って行う。約４０μｇの３種類のTotal RNA（ＷＴ，ＴＳＰ−１６，ＯＳＰ−２）からプローブを調製する。プローブの調製はCyanine 3-dUTPとCyanine 5-dUTPによるLabelStar Arrayラベリングキット（キアゲン社製）を用いてプロトコールに従って行う。アレイ解析に用いたチップはｃＤＮＡアレイチップ（奈良先端科学技術大学院大学、河内孝之博士より提供）及び／又はＤＮＡアレイチップ（Arabidopsis、Agilent Technologies社製）を用いる。ハイブリダイゼーションはアレイチップをプレハイブリダイゼーションバッファー（４×ＳＳＣ、１％ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ）で、３７℃、１時間以上プレハイブリダイゼーションを行う。高純度なＭｉｌｌｉＱ水でアレイチップを洗浄する。この操作を２回繰り返す。水分を、プレート遠心機（１５００ｒｐｍ、５分間）を用いて除去する。６５℃に設定したインキュベーターで１時間以上乾燥させる。LabelStar Arrayラベリングキットで作製したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。３５μｌのプローブを含んだハイブリダイゼーションバッファー（４×ＳＳＣ、１０×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、１％ＢＳＡ、０．２％ＳＤＳ、１μｇ／μｌ  ｐｏｌｙＡ、０．０３μｇ／μｌ  ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ）とアレイチップを６０℃〜６５℃で１７時間ハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、アレイチップを１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを含む洗浄液で６５℃からスタートし、最終的には０．２×ＳＳＣで室温まで洗浄する。スキャンニングとデータ解析は、Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ５０００とＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウエア（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）またはＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００ＸＬ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行う。バックグランドにはネガティブコントロールの蛍光値を用い、各スポットの蛍光値から差し引く。ノーマリゼーションはメジアンノーマリゼーション法またはグローバルノーマリゼーション法のいずれかを用いる。マイクロアレイ解析は信頼性を高めるためにそれぞれのアレイチップで数回繰り返す。
【００８０】
実施例１：植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子のクローニング
クロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子は、ＷＯ０２／２３９７４の実施例２の記載に従って取得した（ＦＳＰＤ１；配列番号１，２）。イネ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＯＳＰＤ２；配列番号３，４）の取得方法について以下に示した。ＷＯ０２／２３９７４の実施例２の記載に従い、クロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１；配列番号１，２）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子（ＦＳＡＭ２４；配列番号５，６）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子を（ＦＡＤＣ７６；配列番号７，８）を得た。シロイヌナズナ由来のスペルミン合成酵素遺伝子（ＦＳＰＭ５；配列番号９，１０）は特開２００２−３５１７５０号の実施例１の記載に従って得た。イネ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＯＳＰＤ２；配列番号３，４）の取得方法について以下に示した。
【００８１】
（１）ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製
イネ品種（‘ユキヒカリ’）の完熟種子から籾を取り除いた後、７０％エタノールで５分浸漬の後、同様に滅菌したビーカーに入れた滅菌液（５％次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に２０分浸漬して滅菌を行った。滅菌した種子は、滅菌ビーカーに入れた滅菌水で３回洗浄を行った。洗浄後、生育培地（ＭＳ無機塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／ｌ シュクロース、８ｇ／ｌ Ｐｈｙｔａｇａｒ、ｐＨ５．８）上に置床し、植物インキュベーター（サンヨー社製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中で２６℃、明所（４５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１、１６時間明期／８時間暗期、以下この光条件を明所とする）条件下にて培養した。約１０日目に、インキュベーター内の温度を昼夜１２℃まで下げて低温処理を開始した。低温処理３日後にサンプリングした。ＲＮＡ抽出までは−８０℃のフリーザーに保存した。
【００８２】
約３gのイネの幼苗を直ちに液体窒素中で凍結し、液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕した。Total RNAの抽出はTRIZOL reagent（GIBCO-BRL社製）を用いてプロトコールに従った。Total RNA溶液を65℃で5分間インキュベートした後、氷上で急冷した。これに2×結合緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、1M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）を等量になるようにTotal RNA溶液に加え、平衡化緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、0.5M NaCl、0.5% SDS、pH7.5）で予め平衡化したオリゴdTセルロースカラム（Clontech社製）に重層した。次いで、カラムを約10倍量の前述の平衡化緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（10mM Tris-HCl、5mM EDTA・2Na、pH7.5）でpoly(A)＋RNAを溶出した。得られた溶出液に1/10倍量の前述の3M酢酸ナトリウム水溶液と、2.5倍量のエタノールを加え混合し、−80℃で静置した。その後、10,000×gで遠心分離を行い、得られた沈殿を70%エタノールで洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度500μμｌのTE緩衝液に溶解し、オリゴdTセルロースカラム精製を繰り返し行った。得られた低温処理したイネの幼苗由来のpoly(A)＋RNAをcDNAライブラリーの作製に用いた。
【００８３】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
cDNAライブラリーの作製はMarathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を使用し、プロトコールに従った。poly(A)＋RNAを鋳型として3’末端に2つのdegenerate nucleotide position を持つ修飾lock-docking オリゴdTプライマーと逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。合成したcDNAの両末端にMarathon cDNAアダプター（T4 DNA ligaseによりds cDNAの両末端へ結合しやすくなるように5’末端をリン酸化したもの）を連結した。得られたアダプター結合のcDNAをライブラリーとした。
【００８４】
（３）ＰＣＲ用プライマーの設計
既に植物や哺乳類から単離されているスペルミジン合成酵素遺伝子の決定されている塩基配列を比較した。そして、非常に相同性が高く保存されている領域を選び出し、ＤＮＡオリゴマーを合成した（配列プライマーＩ・II）。
ＳＰＤＳプライマーＩ（配列番号１１）：５’−ＧＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＡＴＴＣＡ−３’
ＳＰＤＳプライマーII（配列番号１２）：５’−ＧＴＧＡＡＴＣＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＡ−３’
【００８５】
（４）ＰＣＲによる増幅
（２）で得られたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、（３）で設計した配列プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲのステップは最初、９４℃、３０秒、４５℃、１分間、７２℃、２分間で５サイクル、続いて９４℃、３０秒、５５℃、１分間、７２℃、２分間で３０サイクル行った。
【００８６】
（５）アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロース電気泳動で分離し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で増幅バンドを検出した。
【００８７】
（６）ＰＣＲ産物の確認と回収
検出された増幅バンドを確認し、カミソリの刃を用いてアガロースゲルから切り出した。切り出したゲルを１．５ｍｌのマイクロチューブに移し、ＱＩＡＥＸII  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いてゲルからＤＮＡ断片の単離精製を行った。回収したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴクローニングベクター（Promega社製）にサブクローニングし、大腸菌に形質転換後、常法に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
【００８８】
（７）塩基配列決定
得られたプラスミドの挿入配列の塩基配列決定をダイデオキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により行った。
【００８９】
（８）ホモロジー検索
これらの遺伝子の塩基配列を既知遺伝子塩基配列のデータベースとホモロジーサーチを行うと、取得した遺伝子は既知の植物由来のスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子と７０〜１００％の相同性を示した。
【００９０】
（９）完全長遺伝子の単離
完全長遺伝子の単離はMarathon cDNA Amplification Kit（Clontech社製）を使用した5’-RACE（rapid amplification of cDNA ends）及び3’-RACEを一体化した方法（Chenchik et al., 1995）で行った。5’-RACEはcDNAライブラリーをテンプレートとして、AP1プライマー（5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’）と遺伝子特異的プライマー（5’-TCCCTCGCGTAGCTGTCGGGTTTGA-3’）を用いてPCRを行った。PCRのステップは最初、94℃、30秒、60℃、45秒、72℃、2分で35サイクル行い、続いて72℃、7分間で1サイクル行った。3’-RACEはcDNAライブラリーをテンプレートとして、AP1プライマー（5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’）と遺伝子特異的プライマー（5’-ACACAACGCCTCCTGGTCGAAGAGC-3’）を用いてPCRを行った。PCRのステップは最初、94℃、30秒、60℃、45秒、72℃、2分で35サイクル行い、続いて72℃、7分間で1サイクル行った。5’-RACEと3’-RACEで得られた遺伝子断片をそれぞれpGEM-Tクローニングベクター（Promega社製）にサブクローニングした。さらに前述した方法に従って全塩基配列を決定し、DINASIS-Mac version 3.6 software package（日立ソフトウエアエンジニアリング社製）で解析した。
【００９１】
完全長のクロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子をＦＳＰＤ１（配列番号１，２）、イネ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子をＯＳＰＤ２（配列番号３，４）、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＳＡＭ２４（配列番号５，６）、アルギニン脱炭酸酵素遺伝子をＦＡＤＣ７６（配列番号７，８）、シロイヌナズナ由来のスペルミン合成酵素遺伝子をＦＳＰＭ５（配列番号９，１０）と命名した。
【００９２】
得られたＦＳＰＤ１とＯＳＰＤ２を既知の植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子とアミノ酸レベルで比較したところ、ＦＳＰＤ１は他の植物由来のスペルミジン合成酵素遺伝子と約８０％の相同性が認められた。ＯＳＰＤ２はイネ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子であるＯｓＳＰＤＳ２（Journal of Plant Physiology, 161, 883-886, 2004）と１００％の相同性が認められた。ＦＳＡＭ２４を既知の植物由来のＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子（ＳＡＭＤＣ遺伝子）とアミノ酸レベルで比較したところ、ＦＳＡＭ２４は６３〜６６％の相同性が認められた。ＦＡＤＣ７６を既知の植物由来のアルギニン脱炭酸酵素遺伝子（ＡＤＣ遺伝子）とアミノ酸レベルで比較したところ、ＦＡＤＣ７６は７１〜７７％の相同性が認められた。ＦＳＰＭ５をシロイヌナズナ由来のスペルミン合成酵素遺伝子（ＡＣＬ５：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＡＦ１８４０９３）とアミノ酸レベルで比較したところ、アミノ酸の完全一致が認められた。
【００９３】
実施例２：トランスジェニックシロイヌナズナの作製と解析
（１）発現コンストラクトの作製
配列番号１に示したポリアミン合成酵素遺伝子ＦＳＰＤ１の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断し、グラスミルク法で精製した。次にｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＸｈｏＩ切断して、ＦＳＰＤ１断片をセンスとアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。ｐＧＥＭ−７Ｚｆのマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで再度ＦＳＰＤ１断片を切り出して、３５Ｓプロモーター又はストレス・傷害誘導性タイプのプロモーターである西洋ワサビペルオキシダーゼＣ２プロモーター（特許第3259178号）が連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にそれぞれサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＤ１＋／−と命名した。
【００９４】
配列番号３に示したポリアミン合成酵素遺伝子ＯＳＰＤ２の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏＩで切断し、グラスミルク法で精製した。次にｐＧＥＭ−７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＸｈｏＩ切断して、ＦＳＰＤ１断片をセンスとアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。ｐＧＥＭ−７Ｚｆのマルチクローニングサイトの制限酵素ＸｂａＩとＫｐｎＩで再度ＦＳＰＤ１断片を切り出して、３５Ｓプロモーター又はストレス・傷害誘導性タイプのプロモーターである西洋ワサビペルオキシダーゼＣ２プロモーター（特許第3259178号）が連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にそれぞれサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＯＳＰＤ２＋／−、ｐＢＩＣ２−ＯＳＰＤ２＋／−と命名した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＯＳＰＤ２＋／−、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩＣ２−ＯＳＰＤ２＋／−と命名した。
【００９５】
配列番号５に示したポリアミン合成酵素遺伝子ＦＳＡＭ２４の塩基配列より５‘非翻訳領域（uORF配列）とオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーター又はストレス・傷害誘導性タイプのプロモーターである西洋ワサビペルオキシダーゼＣ２プロモーター（特許第3259178号）が連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、ｐＢＩＣ２−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩＣ２−ＦＳＡＭ２４＋／−と命名した。
【００９６】
配列番号７に示したポリアミン合成酵素遺伝子ＦＡＤＣ７６の塩基配列より５‘非翻訳領域（uORF配列）とオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＮｏｔＩで切断し、それぞれ平滑末端化した。これらの断片を平滑末端化した３５Ｓプロモーター又はストレス・傷害誘導性タイプのプロモーターである西洋ワサビペルオキシダーゼＣ２プロモーター（特許第3259178号）が連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−、ｐＢＩＣ２−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩＣ２−ＦＡＤＣ７６＋／−と命名した。
【００９７】
配列番号９に示したポリアミン合成酵素遺伝子ＦＳＰＭ５の塩基配列よりオープンリーディングフレームをすべて含むように、ＸｈｏIで切断した。これらの断片をＸｈｏI処理した３５Ｓプロモーター又はストレス・傷害誘導性タイプのプロモーターである西洋ワサビペルオキシダーゼＣ２プロモーター（特許第3259178号）が連結しているバイナリーベクターｐＢＩ１０１−Ｈｍ２にセンス方向とアンチセンス方向にそれぞれサブクローニングした。これらのプラスミドをｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５＋／−、ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＭ５＋／−と命名した。なお、形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５＋／−、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＭ５＋／−と命名した。
【００９８】
（２）プラスミドのアグロバクテリウムへの導入
（１）で得られた大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、大腸菌ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＤ１＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、大腸菌ｐＢＩＣ２−ＦＳＡＭ２４＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−、大腸菌ｐＢＩＣ２−ＦＡＤＣ７６＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＯＳＰＤ２＋／−、大腸菌ｐＢＩＣ２−ＯＳＰＤ２＋／−、大腸菌ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５＋／−、大腸菌ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＭ５＋／−、とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＣ５８株を５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブに取り集菌したのち、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、２８℃で培養してプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達（三者接合法）させた。１から２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２５ｍｇ／ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。得られた形質転換体をＣ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＤ１＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＤ１＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＡＭ２４＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩＣ２−ＦＳＡＭ２４＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＡＤＣ７６＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩＣ２−ＦＡＤＣ７６＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＯＳＰＤ２＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩＣ２−ＯＳＰＤ２＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩ３５Ｓ−ＦＳＰＭ５＋／−、Ｃ５８／ｐＢＩＣ２−ＦＳＰＭ５＋／−、と命名した。トランスジェニックシロイヌナズナの作製は減圧浸潤法〔以下（３）〜（６）〕で行った。
【００９９】
（３）シロイヌナズナの栽培
培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）をプラスチック鉢に入れ、表面を網戸用のメッシュで覆い、メッシュの間にシロイヌナズナコロンビア株（以下「コロンビア株」又は「野生株」という）の種子（奈良先端科学技術大学院大学、河内孝之博士より提供）を２〜５粒播種した。２日間・４℃の低温室に移して発芽処理後、２２℃・長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）に移して栽培を行った。約４〜６週間後に主軸花茎が５〜１０ｃｍ伸長した植物体について、摘心して側枝の誘導を行った。摘心約１〜２週間後にアグロバクテリウム感染処理を行った。
【０１００】
（４）アグロバクテリウム懸濁液の調製
前記（２）で作製したアグロバクテリウムを感染２日前に、抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ  カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン）を含んだ１０ｍｌＬＢ培地に植菌して２８℃で２４時間振とう培養した。さらに、この培養液を分取して抗生物質（５０ｕｇ／ｍｌ  カナマイシン、２０ｕｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン）を含んだ１０００ｍｌ  ＬＢ培地に移して、さらに、２８℃、約２４時間振とう培養した（ＯＤ600が１．２〜１．５になるまで）。培養液を室温下で集菌して、ＯＤ600が０．８〜１になるように浸潤用懸濁培地（０．５×ＭＳ塩、０．５×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、０．４４μＭ  ベンジルアミノプリン、０．０２％  Ｓｉｌｗｅｔ−７７）に再懸濁した。
【０１０１】
（５）アグロバクテリウムの感染
前記（３）で作製したシロイヌナズナの鉢に前記（４）で調製したアグロバクテリウム懸濁液が培養土中に吸収されるのを抑えるために、鉢の培養土中に水を与えた。１０００ｍｌのビーカーに約２００〜３００ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を分取し、シロイヌナズナの鉢を逆さにして、植物体を懸濁液に浸けた。鉢を入れたビーカーをデシケーター内に入れ、バキュームポンプで約−０．０５３ＭＰａ（４００ｍｍＨｇ）になるまで吸引後、約１０分間放置した。徐々に陰圧を解除した後、植物をアグロバクテリウム懸濁液から取り出して、キムタオルで余分なアグロバクテリウム懸濁液を取り除き、深底トレイに横倒しした。少量の水を入れて、サランラップを被せた。この状態で約１日放置した。サランラップを外して、鉢を起こして約１週間給水を停止した。その後、徐々に培養土に水を与え、約３〜５週間の間、成熟したさやから種子の収穫を行った。収穫した種子は、茶こしを用いて、さややゴミを取り除きデシケーター内に入れ十分に乾燥させた。
【０１０２】
（６）形質転換植物の取得
前記（５）で取得した種子１００μｌ（約２０００粒）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移して、７０％エタノール中で２分間、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液中に１５分間それぞれ浸して、最後に滅菌水で５回洗浄して種子の殺菌を行った。殺菌後の種子を１５ｍｌのファルコンチューブに移して、約９ｍｌの０．１％無菌寒天溶液を加えて、激しく混合した。種子との０．１％寒天混合液をファージをプレートする要領で選択培地（１×ＭＳ塩、１×ＧａｍｂｏｒｇＢ５ビタミン、１％  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、０．８％  寒天、１００ｍｇ／ｌ  カルベニシリン、５０ｍｇ／ｌ  カナマイシン、４０ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシン、８ｇ／ｌ  Ｐｈｙｔａｇａｒ、ｐＨ５．７）に均一になるように広げた。クリーンベンチ内で約３０分乾燥後、４℃、２日間の低温処理後、２２℃のグロースチャンバーに移して、抗生物質に対して抵抗性を示す形質転換体を選抜した。本葉が３〜５枚した植物体を再度新しい選択培地に移して本葉が４〜６枚になるまで栽培した。抗生物質に対して抵抗性を示した形質転換植物（Ｔ１）を培養土を含んだ鉢に定植して、約５〜７日間多湿条件下で順化させた。順化後、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培させた。得られた形質転換植物（Ｔ１）、および該形質転換植物から得られた種子（Ｔ２）から生育させたＴ２植物体についてＰＣＲまたはサザンハイブリダイゼーションによる導入遺伝子の解析とノーザンハイブリダイゼーションによる発現レベルの解析を行い、目的のスペルミジン合成酵素遺伝子が安定に組み込まれ、且つ発現している形質転換体を確認して選抜した。さらに、Ｔ２植物体からＴ３種子を収穫し、抗生物質に対する抵抗性試験（分離比検定）を行って形質転換出現比率からホモ接合体（Ｔ２）を取得した。Ｔ２種子とホモ接合体から取得したＴ３種子（Ｔ３ホモセルライン）を以下の実験に用いた。
【０１０３】
（７）ノーザンブロット解析
（６）で得られたＴ２形質転換体で、ＦＳＰＤ１とＯＳＰＤ２の発現レベルを確認するためにノーザンブロッティングを行った。形質転換を行っていない野生株（ＷＴ）とＴ２形質転換体（ＦＳＰＤ１を導入したセルライン：ＴＳＰ−１４，１５，１６，１７，１９、ＯＳＰＤ２を導入したセルライン：ＯＳＰ−１，２）のロゼット葉から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は定法に従って行った。得られた全RNA10μgを1.5%ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ハイボンドNナイロンメンブランに一晩ブロッティングした。UVクロスリンカーでRNAを固定した後、プレハイブリダイゼーションバッファー（50% Formamide、5X SSPE、5X Denhardt's、 0.1% SDS、80μg/ml Salmon sperm DNA、pH7.0）で、42℃、2時間プレハイブリダイゼーションを行った。実施例１の（６）で得られたイネＳＰＤＳ遺伝子断片とクロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子断片のcDNAを32P-dCTPとランダムラベルキット（アマシャム社製）を用いて、プローブを作製した。このプローブをプレハイブリダイゼーションに加え、42℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブランを2×SSC、0.1% SDSを含む洗浄液からスタートし、0.5× SSC、0.1% SDSを含む洗浄液で50℃、30分、最終的には0.1× SSC、0.1% SDSを含む洗浄液で55℃、30分2回まで洗浄した。メンブランをX線フィルム（Kodak社製）を用いて、オートラジオグラフィーを行った。ノーザンブロッティングの結果の一部を図１に示した。図１の結果から、野生株（ＷＴ）では外因性のクロダネカボチャＳＰＤＳ遺伝子（ＦＳＰＤ１）またはイネＳＰＤＳ遺伝子（ＯＳＰＤ２）は検出されなかったが、形質転換体では全てのセルラインで高いレベルでシグナルが検出され、ＦＳＰＤ１、ＯＳＰＤ２が発現していることが確認された。
【０１０４】
（８）ポリアミン解析
ＰＣＲ（またはサザン解析）、ノーザン解析、ウエスタン解析の結果からセルラインの選抜を行った。確実にポリアミン代謝関連酵素遺伝子が導入され、且つ該遺伝子を安定的に発現している系統についてポリアミン分析を行った。ＦＳＰＤ１が導入されているセルライン、ＴＳＰ−１４、ＴＳＰ−１５、ＴＳＰ−１６、ＴＳＰ−１７、ＴＳＰ−１９、ＴＳＰ−１０１を選抜した。ＯＳＰＤ２が導入されているセルライン、ＯＳＰ−１、ＯＳＰ−２、ＯＳＰ−５、ＯＳＰ−７を選抜した。野生株（ＷＴ）と形質転換体（ＴＳＰ、ＯＳＰ）から約０．１〜０．５ｇのロゼット葉をサンプリングして凍結保存した。サンプリングした試料に希釈内部標準液（１，６−ｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ、内部標準量＝７．５又１２ｎｍｏｌ）と５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ当たり５〜２０ｍｌ）を加え、オムニミキサーを用いて室温下で十分に磨砕抽出した。磨砕液を、４℃・３５，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清液を採取し本液を遊離型ポリアミン溶液とした。スクリューキャップ付きのマイクロチューブに４００μｌの遊離型ポリアミン溶液、２００μｌの飽和炭酸ナトリウム水溶液、２００μｌのダンシルクロライド／アセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて軽く混和した。チューブの栓をしっかりと閉めたのちアルミ箔で覆い、６０℃のウォーターバスで１時間加温してダンシル化を行った。チューブを放冷した後、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２００μｌ加えて混和した。アルミ箔で覆ってウォーターバスで３０分間再加温した。放冷後、窒素ガスを吹き付けてアセトンを除いた後に、６００μｌのトルエンを加えて激しく混和した。チューブを静置して２相に分かれた後に、上層のトルエン層を３００μｌマイクロチューブに分取した。分取したトルエンに窒素ガスを吹き付けてトルエンを完全除去した。チューブに２００μｌのメタノールを加えてダンシル化遊離型ポリアミンを溶解させた。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの遊離型ポリアミン量の定量は蛍光検出器（励起波長：365nm・発光波長：510nm）を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて内部標準法で分析した。ＨＰＬＣカラムはμＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製：０２７３２４、３．９×３００ｍｍ、粒子径１０μｍ）を使用した。試料中のポリアミン含量は標準液と試料のＨＰＬＣチャートから、それぞれ各ポリアミンと内部標準のピーク面積を求めて算出した。その結果を表２に示した。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
表２より明らかなように、スペルミジン合成酵素遺伝子であるＦＳＰＤ１またはＯＳＰＤ２を導入したセルラインは、プトレシン含量、スペルミジン含量、スペルミン含量が野生株（ＷＴ）より有意に増加し、総ポリアミン含量も野生株（ＷＴ）より有意に増大していることが明らかとなった。特にスペルミジンとスペルミン含量の増加が顕著であった。ＦＳＰＤ１またはＯＳＰＤ２を植物に導入することによって、野性株（非形質転換体）に比べてスペルミジン又はスペルミン含量が１．１〜３．０倍量の範囲内で増加することが示された。スペルミジン又はスペルミン含量が野性株に比べて１．１〜３．０倍量の範囲内で増加した形質転換体（セルライン）では生育阻害や稔性低下等の悪影響は観察されなかった。
【０１０７】
実施例３：トランスジェニックシロイヌナズナのマイクロアレイ解析
Ｔ３形質転換体の中から、スペルミジン又はスペルミン含量が野性株に比べて１．１〜３．０倍量の範囲内で高まっているＴ３ホモラインを選抜した。野生株（ＷＴ）とＴ３ホモライン（ＴＳＰ−１６，ＯＳＰ−２）の種子を培養土（ハイポネックスジャパン社製：メトロミックス２５０）を含んだプラスチック鉢に播種した。土壌に十分に水を与えてサランラップで覆い、２日間の低温処理（同調化）を行った。低温処理後の鉢を栽培室に移して、長日条件下（２２℃・１６時間日長・５０μmol m-2 sec-1 PPFD）で約１週間の順化を行った。１週間後にサランラップを外して前記の長日条件下で栽培を開始した。栽培開始から５０日目（抽だい直前）に地上部と根に分けてサンプリングした。新鮮重（ＦＷ）を測定した後、直ちに液体窒素で凍結させて−８０℃に保存した。Total RNAの抽出はTRIZOL reagent（GIBCO-BRL社製）を用いてプロトコールに従った。さらに、Total RNAの精製をRNeasy column（キアゲン社製）を用いてプロトコールに従った。約４０μｇの３種類のTotal RNA（ＷＴ，ＴＳＰ−１６，ＯＳＰ−２）からプローブを調製した。プローブの調製はCyanine 3-dUTPとCyanine 5-dUTPによるLabelStar Arrayラベリングキット（キアゲン社製）を用いてプロトコールに従った。アレイ解析に用いたチップはｃＤＮＡアレイチップ（奈良先端科学技術大学院大学、河内孝之博士より提供）とＤＮＡアレイチップ（Arabidopsis、Agilent Technologies社製）である。ハイブリダイゼーションはアレイチップをプレハイブリダイゼーションバッファー（４×ＳＳＣ、１％ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ）で、３７℃、１時間以上プレハイブリダイゼーションを行った。高純度なＭｉｌｌｉＱ水でアレイチップを洗浄した。この操作を２回繰り返した。水分をプレート遠心機（１５００ｒｐｍ、５分間）を用いて除去した。６５℃に設定したインキュベーターで１時間以上乾燥させた。LabelStar Arrayラベリングキットで作製したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。３５μｌのプローブを含んだハイブリダイゼーションバッファー（４×ＳＳＣ、１０×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、１％ＢＳＡ、０．２％ＳＤＳ、１μｇ／μｌ  ｐｏｌｙＡ、０．０３μｇ／μｌ  ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ）とアレイチップを６０℃〜６５℃で１７時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、アレイチップを１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを含む洗浄液で６５℃からスタートし、最終的には０．２×ＳＳＣで室温まで洗浄した。スキャンニングとデータ解析は、Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ５０００とＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウエア（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社製）またはＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００ＸＬ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。バックグランドにはネガティブコントロールの蛍光値を用い、各スポットの蛍光値から差し引いた。ノーマリゼーションはメジアンノーマリゼーション法またはグローバルノーマリゼーション法のいずれかを用いた。マイクロアレイ解析は信頼性を高めるためにそれぞれのアレイチップで数回繰り返した。野生株（ＷＴ）に比べて形質転換体（ＴＳＰ−１６，ＯＳＰ−２）で発現量が増加した（発現量比が１．５〜５．０倍の範囲内）ストレス耐性遺伝子を表３に示した。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
表３の結果より、クロダネカボチャ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１）、イネ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＯＳＰＤ２）により植物を形質転換させることで、非形質転換体である野性株（ＷＴ）に比べてストレス耐性遺伝子群（遺伝子番号１〜２０）の発現レベルが１．５倍〜５．０倍量増加することが明らかとなった。
【０１１０】
遺伝子番号１のCBF1 / DREB1B transcription factorはストレスによって誘導される転写因子の一つで、植物に導入することで乾燥、塩、凍結、低温などの種々の環境ストレス耐性が高まることが報告されている（The Plant Cell, 10, 1391-1406, 1998, Nature Biotechnology, 17, 287-291, 1999, Plant Physiology, 124, 1854-1865, 2000, Plant Physiology, 130, 639-648, 2002, Plant Physiology, 130, 618-626, 2002）。
【０１１１】
遺伝子番号２のcold regulated protein / LEA proteinはlate embryogenesis abundant（LEA）proteinでストレスによって誘導されることが知られており、LEA protein遺伝子であるHV1をイネに導入することで乾燥や塩ストレス耐性が高まることが報告されている（Plant Physiology, 110, 249-257, 1996）。
【０１１２】
遺伝子番号３のcold regulated protein / cor15は低温ストレスによって誘導される遺伝子で凍結ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13404-13409, 1996, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14570-14575, 1998）。
【０１１３】
遺伝子番号４のpathogen related PR-1 proteinは病原菌感染によって誘導されるタンパク質でPR-1（pathogenesis-related protein 1）の一つであるCABPR1遺伝子をタバコに導入することで、重金属や病原菌感染ストレス耐性が高まることが報告されている（Plant Cell Rep.,Feb 18, 2005）。
【０１１４】
遺伝子番号５のearly response dehydration protein / ERD15は乾燥ストレスによって誘導される遺伝子で乾燥ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Plant Physiology, 106, 1707, 1994）。
【０１１５】
遺伝子番号６のsalt stress induced tonoplast intrinsic protein / aquaporinと遺伝子番号７のwater channel protein / aquaporinはストレスによって誘導される水チャンネルタンパク質で塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Mol. Cells., 9(1), 84-90, 1999, Foods Food Ingredients J. Jpn., 176, 40-45）。
【０１１６】
遺伝子番号８のdehydration induced protein / RD22は乾燥ストレスによって誘導されるタンパク質で乾燥ストレス耐性に深く関与していることが報告されている（Plant Cell., 15(1), 63-78, 2003）。
【０１１７】
遺伝子番号の９、１０、１１、１２、１３はストレスによって誘導されるタンパク質でストレス耐性への関与が示唆されているが、その機能は十分には明らかになっていない。
遺伝子番号の１４、１５、１６、１７、１８は傷害ストレスによって誘導されるタンパク質で傷害ストレス耐性への関与が示唆されているが、その機能は十分には明らかになっていない。
【０１１８】
遺伝子番号の１９のperoxidaseは植物の細胞壁酵素の一つ（EC 1.11.1.7）で傷害やストレスによって誘導されることが知られており、植物に導入することで酸化ストレスや害虫ストレス耐性が高まることが報告されている（Plant Physiology, 132, 1177-1185, 2003, J. Econ. Entomol., 95(1), 81-88, 2002）
【０１１９】
遺伝子番号２０のsenescence associated protein sen1は老化ストレス、塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレスによって誘導されるタンパク質で老化ストレス、塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレス耐性に深く関与することが報告されている（Plant Physiology, 130, 2129-2141, 2002）。
【０１２０】
以上の結果から、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子により植物を形質転換することによって、ストレス耐性に関与するストレス耐性遺伝子の発現量を野性株に比べて高める（誘導又は増加）ことが明らかとなった。
【０１２１】
実施例４：環境ストレス耐性の評価
（１）浸透圧ストレス耐性の評価
実施例２で得られた形質転換体（ＴＳＰ−１５、１６、１７）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例２の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を１００ｍＭと２００ｍＭのソルビトールを含んだ発芽生育培地（１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％  ＭＥＳ、８ｇ／ｌ  Ｐｈｙｔａｇａｒ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、生育程度の観察を開始して、特に６週間目と１０週間目に発芽生育培地上の植物体の生育程度を観察し、その結果を図２に示した。
【０１２２】
播種数日後から１００ｍＭ、２００ｍＭのソルビトールを含んだ生育培地ではＴＳＰ−１５、１６、１７は野生株（ＷＴ）より発芽勢が高く、優れた生育が見られた。播種６週間目では、１００ｍＭ、２００ｍＭのソルビトールを含んだ培地でＴＳＰ−１５、１６、１７の植物体はＷＴより大きく、生育阻害の程度が有意に小さかった。特にＴＳＰ−１７の結果を図１０に示した。播種７週間目を越えると、特に２００ｍＭのソルビトールを含んだ培地では、ＴＳＰ−１５、１６、１７の植物体は特に根の発達が明らかにＷＴと比べて優れ。播種１０週間目では地上部、根ともに顕著な差が観察された。特にＴＳＰ−１６の結果を図２に示した。また、ＷＴでは生育阻害による黄化した枯死個体が一部観察された。
以上の結果から、スペルミジン合成酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１、ＯＳＰＤ２）を導入することによって、植物の浸透圧ストレス予防効果が付与できることが明らかとなった。
【０１２３】
（２）乾燥ストレス耐性の評価
形質転換体（ＴＳＰ−１５、ＴＳＰ−１６）から、選抜した形質転換体（Ｔ３ホモセルライン）を用いた。得られた形質転換体と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、約３週間目までロゼット葉が完全展開するまで育成した。ロゼット葉が完全展開した時点で、生育が揃った個体を選抜後、土壌水分量を揃えるためにバット内に水を補給し、プラスチック鉢の中位まで水で満たした。５日後、土壌水分量が一定であることを確認して、乾燥ストレス処理を開始（水の補給停止）した。開始直後から生育状況の観察を行った。
【０１２４】
乾燥処理開始１３日目に野生株（ＷＴ）では乾燥ストレス障害である萎えが観察された。乾燥処理１４日目にはＷＴは５０％の植物体が枯死した。一方、形質転換体では２０％の植物体が枯死して、ＷＴより高い生存率を示した。処理開始１５日目にはＷＴは１００％全て枯死したのに対して、形質転換体では３０〜４０％が生存していた。その結果を図３に示した。図３の結果から明らかに野性株：ＷＴ（左）は枯死して、形質転換体：Ｔ３ホモセルライン（中と右）は生存していることが確認された。
【０１２５】
形質転換体（ＯＳＰ−２）から、選抜した２つの形質転換体（Ｔ３ホモセルライン）を用いた。得られた２つの形質転換体と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、約４週間目までロゼット葉が完全展開するまで育成した。ロゼット葉が完全展開した時点で、生育が揃った個体を選抜後、土壌水分量を揃えるためにバット内に水を補給し、プラスチック鉢の中位まで水で満たした。５日後、土壌水分量が一定であることを確認して、乾燥ストレス処理を開始（水の補給停止）した。開始直後から生育状況の観察を行った。
【０１２６】
乾燥処理開始１４日目に野生株（ＷＴ）では乾燥ストレス障害である萎えが観察された。乾燥処理１５日目にはＷＴは５０％の植物体が枯死した。一方、２つの形質転換体では２０％の植物体が枯死して、ＷＴより高い生存率を示した。処理開始１８日目にはＷＴは１００％全て枯死したのに対して、形質転換体では５０％が生存していた。その結果を図４に示した。図４の結果から明らかに野性株：ＷＴ（左）は枯死して、形質転換体：Ｔ３ホモセルライン（中と右）は生存していることが確認された。
【０１２７】
以上の結果から、スペルミジン合成酵素遺伝子（ＦＳＰＤ１、ＯＳＰＤ２）を導入することによって、植物の乾燥ストレス予防効果が付与できることが明らかとなった。
【０１２８】
（３）低温ストレス耐性（凍結ストレス耐性）の評価
形質転換体（ＴＳＰ−１５、ＴＳＰ−１６）から、選抜した形質転換体（Ｔ３ホモセルライン）を用いた。得られた形質転換体と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を培養土メトロミックス（ハイポネックスジャパン社製）を含んだプラスチック鉢に播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、鉢をプラスチックバットに入れ、２３℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、約４週間目までロゼット葉が完全展開するまで育成した。ロゼット葉が完全展開した時点で、生育が揃った個体を選抜後、−５℃のグロースチャンバーに移して凍結ストレス処理を開始した。凍結ストレス処理は暗期で４０時間行った。処理後に２３℃、長日条件下の常温に戻して生育状況の観察を行った。
【０１２９】
常温復帰直後から野生株（ＷＴ）では凍結ストレス障害である水浸状や萎れが観察された。常温復帰５日目にはＷＴは全ての植物体が枯死した。一方、形質転換体では３０〜４０％の植物体が生存していた。その結果を図５に示した。図５の結果から明らかに野性株：ＷＴ（左）は枯死して、形質転換体：Ｔ３ホモセルライン（中と右）は生存していることが確認された。イネ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＯＳＰＤ２）を導入したセルライン（ＯＳＰ−２）でも同様な結果を得た。
【０１３０】
以上の結果から、植物にスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子を導入することによって、植物の低温ストレス（凍結ストレス）予防効果が付与できることが明らかとなった。
【０１３１】
（４）塩ストレス耐性の評価
実施例２で得られた形質転換体（ＴＳＰ−１６）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例２の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を７５ｍＭのＮａＣｌを含んだ発芽生育培地（７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％  ＭＥＳ、５ｇ／ｌ  Ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒づつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、６週間目に発芽生育培地上の植物体の生育程度を観察した。その結果を図６に示す。
【０１３２】
図６の結果からコントロールであるＷＴは７５ｍＭ  ＮａＣｌを含んだ培地上では著しく生育阻害が観察され、植物体全体が白色又は黄化して生長が停止し枯死した。一方、スペルミジン合成酵素遺伝子を導入した形質転換体では生育抑制は受けるが、本葉の展開がみられて遅いながらもそのまま生育を続けた。イネ由来のスペルミジン合成酵素遺伝子（ＯＳＰＤ２）を導入したセルライン（ＯＳＰ−２）でも同様な結果を得た。
【０１３３】
以上の結果から、植物にスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子を導入することによって、植物の塩ストレス予防効果が付与できることが明らかとなった。
【０１３４】
（５）除草剤ストレス耐性の評価
形質転換体（セルライン：ｐＢＩ１２１（３５Ｓ−ＧＵＳ）、ＴＳＰ−１５、ＴＳＰ−１６）と野生株（ＷＴ：コロンビア株）種子を実施例２の（６）と同じ方法で表面殺菌した。殺菌処理した種子を２ｕＭのパラコート（ＰＱ）を含んだ発芽生育培地（２ｕＭ  ＰＱ、１×ＭＳ塩、１０ｇ／ｌ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．１ｇ／ｌ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ、５％  ＭＥＳ、５ｇ／ｌ  Ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍ、ｐＨ５．７）に一粒ずつ播種した。播種後、約２日間、４℃で低温処理後、２２℃、長日条件下（１６時間日長・８時間暗黒）で栽培を開始した。播種後、１０日目に発芽個体数（発芽率）、さらに２０日目に生存個体数（生存率）を観察した。その結果を表４に示す。
【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
表４の結果から野生株とベクターコントロールのライン（ｐＢＩ１２１）は、明らかにパラコートによる毒性効果で発芽率と生存率が著しく低下しているのに対して、ポリアミン代謝関連酵素遺伝子を導入したセルラインＴＳＰ−１５と１６の発芽率、生存率は高い値で維持された。
以上の結果から、植物にスペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）遺伝子を導入することによって、植物の除草剤ストレス予防効果が付与できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明により、植物のストレス予防効果が付与できることで、植物の生育および生長過程において遭遇する様々なストレスによる障害の回避や生長抑制を軽減することができ栽培の安定化、生産性の向上、栽培地域の拡大、栽培期間の拡大などが期待でき、産業界に大きく寄与することが期待される。また、不毛地域や塩類集積土壌でも植物の栽培が可能となり地球温暖化や食糧問題に対して貢献が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ポリアミン合成酵素遺伝子を導入した形質転換体（ＴＳＰ・ＯＳＰ）と野性株（ＷＴ）とのノーザンブロッティングの結果
【図２】ポリアミン合成酵素遺伝子を導入した形質転換体（ＴＳＰ）と野性株（ＷＴ）との浸透圧ストレス耐性の比較
【図３】ポリアミン合成酵素遺伝子を導入した形質転換体（ＴＳＰ）と野性株（ＷＴ）との乾燥ストレス耐性の比較
【図４】ポリアミン合成酵素遺伝子を導入した形質転換体（ＯＳＰ）と野性株（ＷＴ）との乾燥ストレス耐性の比較
【図５】ポリアミン合成酵素遺伝子を導入した形質転換体（ＴＳＰ）と野性株（ＷＴ）との低温ストレス耐性の比較
【図６】ポリアミン合成酵素遺伝子を導入した形質転換体（ＴＳＰ）と野性株（ＷＴ）との塩ストレス耐性の比較
【図１】
2006325554.tif 000006
【図２】
2006325554.tif 000007
【図３】
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【図４】
2006325554.tif 000009
【図５】
2006325554.tif 000010
【図６】
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【配列表】
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