(57)【要約】      （修正有）【課題】追跡可能な金属で標識した場合に炎症部位の診断用造影に有用であるペプチド−キレート化剤複合体を提供する。【解決手段】ペプチド成分は、天然テトラペプチドであるタフトシンのアンタゴニストであり、一方キレート化剤成分は、金属、特にテクネチウム−９９ｍなどの放射性核種金属のための標識部位として役立つ。例えば、Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｘはアミノ酸残基又はそのアナログ）が金属キレート化剤と結合しているペプチド−キレート化剤複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症部位を造影するのに有用なペプチド−キレート化剤複合体であって、配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ここで、Ｘは、Ｌｙｓ又はＧｌｙである）を有するペプチドと結合させた金属キレート化剤を含み、
金属キレート化剤が、一般式（II）：
【化１】
2006056895.tif 000008
（式中、Ｒ3は、Ｈ；アルキル；ならびにアミノ、アミノアシル、カルボキシル、グアニジニル、ヒドロキシル、チオール、フェニル、フェノールイル、インドリル及びイミダゾリルから選択される基で置換されているアルキルから選択され；
Ｒ4は、ヒドロキシル、アルコキシ及び結合基から選択され；そして
Ｔは、Ｈ又は硫黄保護基を示す）
又は一般式（III）：
【化２】
2006056895.tif 000009
（式中、Ｗは、場合によりＮ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個のヘテロ原子により中断され、場合によりハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも１個の基により置換されている直鎖又は分岐鎖状、飽和又は不飽和Ｃ1〜Ｃ4アルキル鎖であり；
Ｙは、Ｈ、又はＷにより定義された置換基であり；
Ｗ及びＹは、一緒になって、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも１個の基により場合により置換されている５〜８員飽和又は不飽和複素環を形成してもよく；
Ｒ1〜Ｒ4は、Ｈ；カルボキシル；Ｃ1〜Ｃ4アルキル；ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基で置換されているＣ1〜Ｃ4アルキル；プロリン以外のＤ又はＬアミノ酸のα炭素側鎖；ならびにＣ（Ｏ）Ｚから独立して選択され；
Ｒ5及びＲ6は、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ1〜Ｃ4アルキル；ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されているＣ1〜Ｃ4アルキル；及びＣ（Ｏ）Ｚから独立して選択され；
Ｒ7は、Ｈ及び硫黄保護基から選択され；そして
Ｚは、配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ここで、Ｘは、前記と同義である）を有する標的分子から選択される）
で示されるペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項２】
金属キレート化剤及びペプチドが、結合基により結合されている、請求項１記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項３】
結合基が、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基である、請求項２記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項４】
結合基が、−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−、−βＡｌａ−及び−βＡｌａ−βＡｌａ−から選択される、請求項２記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項５】
金属キレート化剤が、ペプチドのＮ末端と結合している、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項６】
金属キレート化剤が、ペプチドのＣ末端と結合している、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項７】
ペプチドが、結合基によりＲ4で金属キレート化剤と結合しているか、又はペプチドがＲ4で金属キレート化剤と結合している、請求項１記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項８】
結合基が、−Ｇｌｙ−及び−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−から選択される、請求項７記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項９】
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＫＰＰＲ；
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＱＰＰＲ；
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−βＡｌａ−ＴＫＰＰＲ；
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＴＫＰＰＲ
；及び
Ｂｚ−ＭＡ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＤＧ−ＴＫＰＰＲ
から選択される、請求項１記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項１０】
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＫＰＰＲ；
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＱＰＰＲ；
【化３】
2006056895.tif 000010
から選択される、請求項１記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項１１】
診断上有用な金属あるいはその酸化物又は窒化物と錯体を形成した形である、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項１２】
99mＴｃあるいはその酸化物又は窒化物と錯体を形成した形である、請求項１〜１０のいずれかに記載のペプチド−キレート化剤複合体。
【請求項１３】
請求項１１記載のペプチド−キレート化剤複合体を含有する、哺乳類における炎症部位の造影用組成物。
【請求項１４】
請求項１２記載のペプチド−キレート化剤複合体を含有する、哺乳類における炎症部位の造影用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は診断用造影の分野に属し、炎症部位を標的とするのに有用なペプチド標的剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断用造影の技術は、体内で部位選択的に結合又は局在して、診断上興味のある画像を解像するのに有用な標的剤を利用するものである。例えば、モノクローナル抗体は、特定のガン細胞に対して高い親和性及び特異性を有するように開発されたものであり、したがって腫瘍を造影するのに有用である。その高親和性及び特異性にもかかわらず、産業的規模で生産するには経費がかかり、しかも標識特性が不十分であるために、抗体は理想的な造影剤を提供するものではない。特に、金属標識は、抗体上の多数の低親和性結合部位で結合する傾向にあり、in vivo で放出され、その結果、非標的部位において標識の望ましくない蓄積がおこる。抗体に替わる別の標的剤は、受容体結合性小ペプチドである。ペプチドは、種々のキレート化分子と複合体を形成して、標識が促進され、効率のよい標識がなされるという利点を有する。ペプチドが有する、抗体を上回るその他の利点は、合成が容易である、迅速に組織に浸透する、及び身体から迅速に排泄されるという点である。
【０００３】
天然テトラペプチドであるタフトシンＴＫＰＲは、好中球及びマクロファージの外表面上に発現する受容体と結合することにより食作用を刺激することが発見された。食作用は、細菌感染に対する宿主の防御の主力部隊であり、したがって食作用の刺激物質として、タフトシンは感染性炎症の部位を造影するための良好なペプチドであると予測される。しかしながら、放射性核種金属で標識されたタフトシンは、非標的部位に望ましくなく蓄積することが試験により示されている。特に、標識タフトシンは、胃腸管中に蓄積するため、造影剤としてのその有用性が制限されてしまう。
【０００４】
抗体に関連する困難性からみて、炎症部位に局在することができる一方、非標的組織中には実質的に蓄積されないペプチド標的剤を提供することが望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
追跡可能な金属で標識された場合に、炎症部位の診断用造影に有用であるペプチド−キレート化剤複合体が提供されるものである。ペプチド成分は、天然テトラペプチドであるタフトシンのアンタゴニストであり、一方キレート化剤成分は、金属、特にテクネチウム−９９ｍのような放射性核種金属による標識部位として働く。本発明の一面によれば、Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ここで、Ｘは、アミノ酸残基又はそのアナログである）が金属キレート化剤と結合しているペプチド−キレート化剤複合体が提供される。
【０００６】
本発明の詳細な実施態様では、複合体の金属キレート化剤成分は、式（Ｉ）：
【化４】
2006056895.tif 000002
（式中、Ｒ1及びＲ2は、一緒になって、場合により５員又は６員環と縮合していてもよい、５員又は６員複素環を形成し（ここで、いずれかの環は、場合によりアルキル、アルコキシ、カルボキシル、ハロゲン、ヒドロキシル及び結合基から選択される基で置換されていてもよい）；
Ｒ3は、Ｈ；アルキル；ならびにアミノ、アミノアシル、カルボキシル、グアニジニル、ヒドロキシル、チオール、フェニル、フェノールイル、インドリル及びイミダゾリルから選択される基で置換されているアルキルから選択され；
Ｒ4は、ヒドロキシル、アルコキシ及び結合基から選択され；そして
Ｔは、Ｈ又は硫黄保護基を示す）
で示される。
【０００７】
本発明の特定の実施態様では、複合体の金属キレート化剤成分は、式（II）：
【化５】
2006056895.tif 000003
（式中、Ｒ3は、Ｈ；アルキル；ならびにアミノ、アミノアシル、カルボキシル、グアニジニル、ヒドロキシル、チオール、フェニル、フェノールイル、インドリル及びイミダゾリルから選択される基で置換されているアルキルから選択され；
Ｒ4は、ヒドロキシル、アルコキシ及び結合基から選択され；そして
Ｔは、Ｈ又は硫黄保護基を示す）
で示される。
【０００８】
本発明の一面によれば、ペプチド−キレート化剤複合体は、診断上有用な金属あるいはその酸化物又は窒化物と錯体を形成した形で提供される。
【０００９】
本発明の別の一面によると、式：Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのペプチドが、診断上有用な金属あるいはその酸化物又は窒化物と錯体を形成した金属キレート化剤と結合しているペプチド−キレート化剤複合体を含有する組成物の診断的有効量を投与する工程を有する、哺乳類における炎症部位の造影法が提供される。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、診断上有用な金属と錯体を形成し、炎症部位の造影に有用なペプチド−キレート化剤複合体を提供するものである。「複合体」とも呼ばれるペプチド−キレート化剤複合体は、ペプチド成分として、金属キレート化剤と結合しているタフトシンのアンタゴニストを組み入れたものであり、このペプチド成分は、アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＴＸＰＰＲ）（ここで、Ｘは、天然又は非天然アミノ酸残基である）を有する。詳細な実施態様では、Ｘは、生理学的条件下で電荷されるか又は極性であるα炭素側鎖を有するアミノ酸残基である。好ましくは、Ｘは、アミノ酸残基、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びトレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）からなる群から選択される。更に好ましくは、Ｘは、リシン、グルタミン、アルギニン及びアスパラギンから選択される。最も好ましくは、Ｘは、リシン及びグルタミンから選択される。
【００１１】
非天然性であるアミノ酸残基もＸに包含される。適当な非天然残基は、複合体の生体分布特性に影響することなくリシン又はグルタミンと置き換わりえるものである。それは、リシンのグルタミンによる置換は、造影のために十分耐容され、Ｘは、側鎖構造においては様々に変化され得るという事実から理解される。特に、非天然アミノ酸残基としては、その側鎖の長さにおいて天然残基と異なるリシン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン及びトレオニンが挙げられる。非天然残基の側鎖は、１個又は２個のＣ1〜Ｃ2アルキル基を分岐鎖として有するＣ1〜Ｃ8アルキレン鎖を組み入れたものである。好ましくは、アルキレン鎖は、１〜８個のメチレン基を有し、１個又は２個のメチレン基により対応する天然残基と異なる。好ましくは、非天然残基としては、その側鎖に１個又は数個のメチレン基を有するリシン及びグルタミンが挙げられる。適当な非天然残基は、市販されているか又は確立された化学的技術にしたがって合成することができる。
【００１２】
キレート化剤は、ペプチドＴｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ＡｒｇのＮ−又はＣ−末端のいずれかと結合していると理解される。Ｎ末端にキレート化剤を結合させた場合、ペプチドＴｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、好ましくは１〜３個のアミノ酸残基によりそのＣ末端で延長されてもよいし、又はＣ末端で修飾されてもよく、例えばアミド化されるか、そうでなければ誘導化されることによって、エキソペプチダーゼによる消化を阻止する。許容可能な延長又は修飾とは、本明細書に記載された評価モデルにより決定されているように、複合体の炎症造影能を明らかに低下させないものである。
【００１３】
診断用造影のためには、キレート化剤は、放射性核種金属と結合して、生理学的条件下で安定であり、更に標的分子との複合のための反応性官能基をも有する錯体を形成する化合物である。放射性核種金属99mＴｃのキレート化剤は、代表的には、４個の窒素及び硫黄の金属配位性原子の組合せを組み入れたもので、Ｎ4、Ｎ3Ｓ、Ｎ2Ｓ2等と示される。しかしながら、キレート化剤は、酸素、リン及びセレンのようなその他の金属配位性原子を組み入れていてもよい。本発明の複合体の有利な合成のためには、キレート化剤は、理想的にはペプチドに基づくものであり、したがって複合体は、固相ペプチド合成技術を用いてin toto で合成することができる。
【００１４】
本発明の実施態様では、ペプチドは、そのＮ末端で、上記の式（Ｉ）のＮ3Ｓ型金属キレート化剤と結合している。この製造及び用途は、同時係属中の米国特許出願（Pollak et al．1993年12月22日出願、出願番号08/171,737号）に開示されている。別の実施態様では、ペプチドは、Ｎ末端で、式（II）のＮ2Ｓ2型金属キレート化剤と結合している。上記の式（Ｉ）及び（II）中で用いたように、可変基Ｒ1〜Ｒ4及びＴを定義する用語は以下の意味を有する：
「アルキル」は、直鎖又は分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ8アルキルを示し、低級Ｃ1〜Ｃ4アルキルが挙げられる；
「アルコキシ」は、直鎖又は分岐鎖状Ｃ1〜Ｃ8アルコキシを示し、低級Ｃ1〜Ｃ4アルコキシが挙げられる；
「チオール」は、アルキル基で置換されてチオエーテルを形成してもよいスルフヒドリル基を示す；
「硫黄保護基」は、硫黄原子と結合し、硫黄の酸化を阻止し、金属とのキレート形成により開裂される基を含む化学基を示す。適当な硫黄保護基としては、公知のアルキル、アリール、アシル、アルカノイル、アリールオイル、メルカプトアシル及びオルガノチオ基が挙げられる。
【００１５】
「結合基」は、ペプチドとキレート化剤を結合させるのに役立つ一方、ペプチドの標的機能又はキレート化剤の金属結合機能に悪影響を及ぼさない化学基を示す。適当な結合基としては、ペプチド又はキレート化剤との結合のための反応基で官能化されているアルキル鎖及びアミノ酸鎖が挙げられる。
【００１６】
「金属キレート化剤」は、金属がin vivo で複合体と結合したままの生理学的条件下で追跡可能である金属原子と安定な錯体を形成する分子を示す。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様では、キレート化剤は、上記の式（Ｉ）又は式（II）（式中、Ｒ1及びＲ2は、一緒になって、６員複素環を形成し；Ｒ3は、Ｈ、ならびにメチル及びエチルから選択されるヒドロキシ置換アルキル基から選択され、最も好ましくはヒドロキシメチルであり；Ｒ4は、１〜３個のアミノ酸残基の結合基であり；そしてＴは、硫黄保護基アセトアミドメチル（Ａｃｍ）又はベンゾイル（Ｂｚ）である）に合致する。
【００１８】
本発明の更に好ましい実施態様では、キレート化剤は、上記の式（Ｉ）（式中、Ｒ1及びＲ2は、一緒になって、ピリジン環を形成し；Ｒ3は、ヒドロキシメチルであり；Ｔは、Ａｃｍであり、そしてＲ4は、−Ｇｌｙ−及び−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−から選択される結合基である）に合致する。ペプチドと結合した形のこれらのキレート化剤は、以下の配列で示される：
Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ；
Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−ＴＱＰＰＲ；及び
Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ （Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ
（ここで、Ｐｉｃは、アミノ酸誘導体ピコリン酸を示す）。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様では、キレート化剤は、上記の式（II）（式中、Ｒ3は、ヒドロキシメチルであり；Ｔは、Ａｃｍ又はＢｚであり、そしてＲ4は、結合基−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−である）と合致する。Ｒ4の結合基でペプチドと結合したこのキレート化剤は、以下の式で示される：
Ｂｚ−ＭＡ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＴＫＰＰＲ
（式中、Ｂｚ−ＭＡは、ベンゾイルメルカプト酢酸基を示す）。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様では、キレート化剤は、上記の式（II）に合致する。
【００２１】
本発明の更に別の実施態様では、ペプチドは、同時係属中の米国特許出願（Pollak et al．1994年7月22日出願、出願番号08/279,155号）に開示の金属キレート化剤と結合し、これが式（III）：
【化６】
2006056895.tif 000004
（式中、Ｗは、場合によりＮ、Ｏ及びＳから選択される１個又は２個のヘテロ原子により中断され、場合によりハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも１個の基により置換されている直鎖又は分岐鎖状、飽和又は不飽和Ｃ1〜Ｃ4アルキル鎖であり；
Ｙは、Ｈ、又はＷにより定義された置換基であり；
Ｗ及びＹは、一緒になって、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アリール及びＣ（Ｏ）Ｚから選択される少なくとも１個の基により場合により置換されている５〜８員飽和又は不飽和複素環を形成してもよく；
Ｒ1〜Ｒ4は、Ｈ；カルボキシル；Ｃ1〜Ｃ4アルキル；ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ハロゲン、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル及びアミノカルボニルから選択される基で置換されているＣ1〜Ｃ4アルキル；プロリン以外のＤ又はＬアミノ酸のα炭素側鎖；ならびにＣ（Ｏ）Ｚから独立して選択され；
Ｒ5及びＲ6は、Ｈ；カルボキシル；アミノ；Ｃ1〜Ｃ4アルキル；ヒドロキシル、カルボキシル又はアミノにより置換されているＣ1〜Ｃ4アルキル；及びＣ（Ｏ）Ｚから独立して選択され；
Ｒ7は、Ｈ及び硫黄保護基から選択され；そして
Ｚは、配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ここで、Ｘは、前記と同義である）を有する標的分子から選択される）
と合致する。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様では、上記式（III）のＲ1〜Ｒ7、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは、キレート化剤ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）（ここで、ＤＭＧは、アミノ酸残基アナログであるＮ’，Ｎ−ジメチルグリシンを示す）となるよう選択される。このキレート化剤を組み入れているペプチドＴｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの複合体としては：
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＫＰＰＲ；
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＱＰＰＲ；
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−βＡｌａ−ＴＫＰＰＲ；及び
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＴＫＰＰＲが挙げられる。
【００２３】
別の詳細な実施態様では、ペプチドＴｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの複合体は、ペプチドのＣ末端に結合させたキレート化剤を有する。この型の複合体としては：
【化７】
2006056895.tif 000005
が挙げられる。
【００２４】
本発明の複合体は、選択されるキレート化剤によって種々の方法で調製することができる。複合体のペプチド部分は、ペプチド合成技術で一般的に確立されている固相法などの技術により好都合に調製される。固相合成は、ポリスチレンなどの不溶性支持体又はマトリックスに結合させた伸長させるペプチド鎖へアミノ酸残基を段階的に付加させることからなる。ペプチドは、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（ｔＢｏｃ）又はフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基などのＮ保護剤によりそのアミノ基を保護しながら、先ずペプチドのＣ末端残基を市販の支持体に固定させる。アミノ保護基を、ｔＢＯＣの場合にはＴＦＡ、ＦＭＯＣの場合にはピペリジンなどの適当な脱保護化剤により除去し、次のアミノ酸残基（Ｎの保護された形で）を、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカップリング剤を用いて付加する。ペプチド結合形成時に、試薬を支持体から洗い落とす。最終残基の付加後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はフッ化水素（ＨＦ）などの適当な試薬を用いて、ペプチドを支持体からはずす。
【００２５】
ペプチドのＴｈｒ残基の遊離アミノ基と、キレート化剤のカルボキシル基又は活性化エステルなどの適当な官能基とを反応させることによりペプチド及びキレート化剤成分を結合させて、複合体を生成する。例えば、複合体は、エチレン鎖上のカルボキシル置換基により官能化させる場合、配位化学の技術でよく知られているキレート化剤エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を組み入れてもよい。この種のＥＤＴＡ誘導体の合成は、Arya et al．（Bioconjugate Chemistry 1991，2:323）に報告されており、ここでは、４個の配位カルボキシル基が、各々ｔ−ブチル基によりブロックされている一方、エチレン鎖のカルボキシル置換基は、遊離しており、ペプチドのアミノ基と反応し、それにより複合体を生成する。
【００２６】
複合体は、ペプチド性で、固相ペプチド合成に適合している金属キレート化剤成分を組み入れていてもよい。この場合、キレート化剤は、上記のＥＤＴＡと同様の方法でペプチドと結合していてもよいし、あるいはキレート化剤及びペプチドを、ペプチドのＣ末端残基から出発してキレート化剤のＮ末端残基で終わるようin toto 合成するのもより好都合である。
【００２７】
複合体には、ペプチドをキレート化剤と結合させるのに役立つが、ペプチドの標的機能又はキレート化剤の金属結合機能に悪影響を及ぼさない結合基成分を更に組み入れていてもよい。適切な結合基成分としては、ペプチドとキレート化剤の両方と結合するための反応基で官能化されたアミノ酸鎖及びアルキル鎖が挙げられる。キレート化剤がペプチド性であって、複合体が、固相法によりin toto 合成することができる場合、アミノ酸鎖が好ましい結合基である。詳細な実施態様では、結合基は、１〜５個の残基、より詳細には１〜３個の残基を有するアミノ酸鎖である。好ましい結合基としては、−Ｇｌｙ−及び−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−、ならびに合成アミノ酸残基鎖、−βＡｌａ−及び−βＡｌａ−βＡｌａ−が挙げられる。
【００２８】
ペプチドのＴｈｒ残基のアミノ基を、アルキル鎖上のカルボキシル基又は活性化エステルなどの第一の官能基と反応させることにより、アルキル鎖結合基を複合体に組み入れてもよい。その後、アルキル鎖上の第二の官能基をキレート化剤上の適当な基と反応させることにより、キレート化剤をアルキル鎖と連結させて、複合体の生成を完了させる。アルキル鎖上の第二の官能基は、キレート化剤上の官能基と反応性であり、好ましくはペプチドのＴｈｒ残基とは反応しない置換基から選択される。例えば、キレート化剤がカルボキシル基又は活性化エステルなどの官能基を組み入れている場合には、アルキル鎖結合基の第二の官能基は、アミノ基であることができる。望ましくない物質の生成を避けるためには、複合体の生成において、存在する官能基の保護及び脱保護が必要であると思われる。
保護及び脱保護は、有機合成技術でよく用いられる保護基、試薬及び方法を用いて達成される。特に、上記の固相ペプチド合成に用いられる保護及び脱保護技術を使用することができる。
【００２９】
アルキル鎖に替わる別の化学結合基は、複合体中への組み入れに関して上記のアルキル鎖と同様の方法で官能化されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。別法として、結合基を先ずキレート化剤に、次いでペプチドに結合させてもよいと考えられる。
【００３０】
本発明の一面によれば、ペプチド−キレート化剤複合体には、錯体を形成させることのできる診断上有用な金属を組み入れる。適当な金属としては、テクネチウム及びレニウムなどの放射性核種を、99mＴｃＯ3+、99mＴｃＯ2+、ＲｅＯ3+及びＲｅＯ2+などの種々の形態で挙げることができる。複合体内への金属の組み入れは、配位化学技術でよく用いられる種々の方法により行なうことができる。金属が、テクネチウム−９９ｍである場合、以下の一般的手順を用いてテクネチウム錯体を生成することができる。エタノールなどの水性アルコールに複合体を溶解することによって、ペプチド−キレート化剤複合体溶液を先ず生成する。次に、溶液を脱気して酸素を除去した後、チオール保護基を適当な試薬で、例えば水酸化ナトリウムで除去し、酢酸などの有機酸で中和する（pH６．０〜６．５）。標識の工程では、モリブデン発生器から得られた過テクネチウム酸ナトリウムを、テクネチウムを還元するのに十分な量の塩化第一スズなどの還元剤とともに複合体溶液に加えて、加熱する。標識複合体を、クロマトグラフィー処理により、例えばＣ−１８ Ｓｅｐ Ｐａｋカートリッジを用いて、夾雑物99mＴｃＯ4-及びコロイド99mＴｃＯ2から分離してもよい。
【００３１】
別の方法では、トランスキレート化反応により標識を行なうことができる。テクネチウム供給源は、選択されたキレート化剤との配位子交換を促す置換活性配位子と錯体を形成したテクネチウムの溶液である。トランスキレート化に適した配位子としては、酒石酸、クエン酸及びヘプタグルコン酸が挙げられる。この場合、好ましい還元試薬は、亜ジチオン酸ナトリウムである。上記の方法を用いて複合体を標識するか、あるいはキレート化剤それ自体を標識した後、ペプチドと結合させて複合体を生成することができる。この方法は「予備標識化配位子」法と呼ばれる。
【００３２】
本発明の複合体を標識するための別の方法としては、同時係属中の米国特許出願第08/152,680号（1993年11月16日出願）に記載の方法が挙げられる。要約すると、金属キレート形成時に開裂される結合により、固相支持体上にペプチド−キレート化剤複合体を固定する。これは、キレート化剤が錯体形成原子の１つにより支持体の官能基と結合する場合に行なう。好ましくは、錯体形成硫黄原子を、マレイミドなどの硫黄保護基で官能化されている支持体に結合させる。
【００３３】
診断上有用な金属で標識されている場合、本発明のペプチド−キレート化剤複合体を用いて、診断用造影技術で確立されている方法により、炎症部位を検出することができる。テクネチウム−９９ｍなどの放射性核種金属で標識された複合体を、等張生理食塩水などの薬学的に許容しうる溶液に溶解し、静注により哺乳類に投与することができる。投与に適した標識複合体の量は、迅速に排泄される複合体は、それほど迅速に排泄されないものよりは高用量で投与するという観点から選択された複合体の分布特性に応じて決定する。炎症の造影に許容しうる単位用量は、体重７０kgの個体について約５〜４０mCiの範囲である。In vivo における分布及び局在化は、投与後の適切な時点、典型的には非標的組織でのクリアランス速度に対する標的部位での蓄積速度に応じて３０分〜１８０分で、標準的シンチグラフィー法により追跡する。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例で更に本発明の実施態様を説明する。
【００３５】
実施例１  複合体の調製：
Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＫＰＰＲ
Ｐｉｃ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＧＤＧ−ＴＫＰＰＲ
Ｂｚ−ＭＡ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−ＧＤＧ−ＴＫＰＰＲ
Applied Biosystems 433Aペプチドシンセサイザー（Foster City,CA）を用いて、保護Ｃ末端を有する残基を予めつけた２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Sasrin樹脂、Bachem Biosciences Inc.，Philadelphia PA）上で、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学を用いて、ペプチド−キレート化剤複合体をin toto 合成した。合成の最終残基としてそれぞれピコリン酸及びベンゾイルメルカプト酢酸を用いることにより、Ｎ末端残基Ｐｉｃ及びＢｚ−ＭＡを組み入れた。
【００３６】
複合体を結合させた樹脂を１２時間真空乾燥した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９５％及び水５％の冷却溶液（ペプチド−樹脂１００mg当り１ml）を複合体−樹脂と室温で１．５〜２時間混合して、樹脂から複合体をはずした。濾過により樹脂を除去し、５０mlの円錐形ポリプロピレン遠心分離管中、ｔ−ブチルメチルエーテル３０mlにより３回洗浄して、白色沈澱を得た。アセトニトリルを加えて、沈澱物を水に溶解した。沈澱物をアセトン−ドライアイス中で凍結させ、１２時間凍結乾燥させた。生じた白色粉末を水に溶解し、０．４５μmシリンジフィルター（GelmanAcrodisc LC PVDF）で濾過し、緩衝液Ａとして水に溶解した０．１％ＴＦＡ及び緩衝液Ｂとしてアセトニトリルに溶解した０．１％ＴＦＡを用いて、Ｃ18カラム（Waters RCM 25 x 10）を用いた逆相ＨＰＬＣ（Beckman System Gold）により精製した。カラムを１００：０の緩衝液Ａ：緩衝液Ｂで平衡化させ、１ml／分で２５分間かけて、５０％緩衝液Ｂまで線状勾配で溶離した。分画をＨＰＬＣ上で再分析し、適合プロフィールにしたがってプールした。必要な場合には、同一条件を用いて、プールした分画を再精製した。純粋な分画を、アセトン−ドライアイス中で凍結させ、１０時間凍結乾燥して、白色粉末を得た。
【００３７】
同様の方法で、複合体ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＫＰＰＲ；
ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇ−ＴＱＰＰＲ；ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−βＡｌａ−ＴＫＰＰＲ；及びＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−βＡｌａ−βＡｌａ−ＴＫＰＰＲを、市販の残基Ｎ’，Ｎ−ジメチル−グリシン（ＤＭＧ）を合成の最終残基として用いて合成した。
複合体の調製：
【化８】
2006056895.tif 000006
ペプチドＴｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、以下の手順で、リシン残基を含むキレート化剤又はそれに結合した結合基に、リシン残基のεアミノ基を介して、そのＣ末端で結合させることができる。標記の複合体に関しては、Applied Biosystems 433A ペプチドシンセサイザーを用い、ＦＭＯＣ−グリシンを予めつけた２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリジン）−エチル（Ｄｄｅ）オルトゴナル保護リシンを用いて、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）化学により、ペプチド及び結合基の一部（ＴＫＰＰＲ−βＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＴＫＰＰＲ−βＡｌａ−βＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ）をまず合成した。ペプチド−樹脂をシンセサイザーから取り出し、２時間真空乾燥した。
【００３８】
ペプチド−樹脂（５０mg／２ml）を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）溶液中、２％ヒドラジン水和物とともに３分間２回撹拌した後、濾過し、ＤＣＭで洗浄し、４時間真空乾燥して、ε−アミノリシン保護基（Ｄｄｅ）を除去した。
【００３９】
キレート化剤部分ＤＭＧ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｇｌｙ−ＯＨを、４３３Ａペプチドシンセサイザー上でペプチドのε−アミノリシンに付加した。キレート化剤−ペプチド−樹脂を２時間真空乾燥した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１０mlフェノール０．７５ｇ、１，２−エタンジオール０．２５ml、チオアニソール０．５ml及び水０．５mlの冷却溶液を、キレート化剤−ペプチド−樹脂と室温で２．５〜３時間混合して、樹脂及び保護基から、キレート化剤−ペプチドをはずした。濾過して樹脂を除去し、ＴＦＡ１〜３mlで洗浄して、透明な黄色の液体６〜８mlを得た。この液体を、５０mlの円錐形ポリプロピレン遠心分離管中、０℃で、tert−ブチルメチルエーテル３０〜３５ml中に徐々に滴下して、白色沈澱を得た。沈澱物を７０００rpmで０℃で１０分間遠心分離（Sorvall RT6000，Dupont）し、デカントし、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回以上洗浄した。真空下で乾燥後、沈澱物を水に溶解させた。沈澱物をアセトン−ドライアイス中で凍結させ、１０時間凍結乾燥した。得られた白色粉末を、ジメチルスルホキシド（２０μl）及び５０：５０アセトニトリル：水溶液（９８０μl）に溶解し、０．４５μmシリンジフィルター（Gelman Acrodisc LC PVDF）により濾過し、緩衝液Ａとして水に溶解した０．１％ＴＦＡ及び緩衝液Ｂとしてアセトニトリルに溶解した０．１％ＴＦＡを用いて、Ｃ18カラム（Waters RCM 25 x 10）を用いた逆相ＨＰＬＣ（Beckman System Gold）により精製した。カラムを５０：５０緩衝液Ａ：緩衝液Ｂで平衡化させ、１ml／分で２５分間かけて、１００％緩衝液Ｂまで線状勾配で溶離した。分画をＨＰＬＣ上で再分析し、適合プロフィールにしたがってプールした。純粋な分画をアセトン−ドライアイス中で凍結させ、１２時間凍結乾燥して、白色粉末を得た。
【００４０】
実施例２  複合体の標識及び造影
以下のようにラット炎症モデルで、造影試験を行なった。雄性ウィスター系ラット（Charles River、１５０〜２００ｇ）に、酵母細胞壁懸濁液であるザイモサン（２５mg）をその左後脚に筋注し、２４時間後に造影を行なった。脚の病巣炎症は１日後に可視的に検出可能となった。
【００４１】
各複合体（５０μl、生理食塩水中２mg/ml）を、生理食塩水１００μl、過テクネチウム酸塩１００μl（１０mCi）及びグルコン酸第一スズ（塩化第一スズ５０μg及びグルコン酸ナトリウム１mg）１００μlと共に１．５ml試験管に入れた。試験管に栓をし、沸騰水浴中に１０分間入れた後、Watman PVDF シリンジにより濾過して、標識複合体溶液を収集し、これを更に生理食塩水で希釈して、約１００μCi（３．７MBq）の活性を有する注射液（２００μl）を調製した。ラットを、ソムノトール(somnotol)（４０〜５０mg/kg）で麻酔し、Ｔｃ−９９ｍ標識複合体溶液（２００μl）を尾静脈に静注した。ガンマ線カメラにより、投与３０分後に、連続全身シンチグラムを得た。次いでラットを麻酔して屠殺し、器官、尿、血液、炎症筋（左脚）、及び非炎症筋（右脚）の標本の重量を測定し、ウェル形ガンマ計数器又はガンマ線量測定器のいずれかで計数した。（１）ラットの体重は２００ｇであり、（２）血液容積は体重の８％であるという仮定に基づいて、血中線量算定を行なった。下表に示す結果は、多数の試験の平均であり、尾中残留線量について補正される。
【００４２】
【表１】
2006056895.tif 000007
【００４３】
理論に拘束されることを望むものではないが、高い標的対バックグラウンド比で示されるような、標的組織で薬剤が選択的に蓄積される場合に良好な画像が得られると考えられる。造影剤の有用性を示す他の因子は、その生体分布及び排泄速度である。例えば、腎臓を経て尿中に迅速に排泄されるものとは対照的に、胃腸管に蓄積される薬剤は、標的部位がその近くにある場合には画像を不鮮明にする。
【００４４】
表に略記した結果は、そのＮ末端でキレート化剤と結合しているＴＫＰＰＲ又はＴＱＰＰＲペプチドを含む複合体が、試験した他のタフトシン関連ペプチドに比して有意に高い炎症筋対非炎症筋比（標的対バックグラウンド）、ならびに優れた分布特性を有することを示している。このため、これらの複合体は、炎症筋組織を最も明確に区別した画像を示した。ペプチドをＮ2Ｓ2及びＮ3Ｓ種のキレート化剤と結合させると、いずれも、高い標的対バックグラウンド比及び尿中への迅速な排泄を示した。アミノ酸長１〜４の３種の異なる結合基を用いて、ペプチドをキレート化剤と結合させたところ、それぞれが良好な画像を示した。
【００４５】
本来のタフトシンペプチド及び他のアンタゴニストをＮ3Ｓキレート化剤と結合させて試験を行なったが、いずれも、ＴＫＰＰＲ及びＴＱＰＰＲ複合体より低い標的対バックグラウンド比ならびに胃腸管中での高い蓄積性（１例を除く）を示した。ＴＫＫＰＲ複合体は、胃腸管及び血液中では低蓄積性であったが、尿中の量は特に低く、このことは複合体が他の場所に蓄積されたことを示し、これは造影には望ましくない。そのＣ末端でキレート化剤と結合させると、ＴＫＰＰＲペプチドは、相対的に低い標的対バックグラウンド比及び胃腸管での高蓄積性を示し、その結果画像の解像度が低くなった。
【００４６】
これらの結果により、そのＮ末端でキレート化剤と結合させたペプチドＴＫＰＰＲ又はＴＱＰＰＲを組み入れた複合体が、炎症の造影に有用であることが示され、このことは、複合体中に組み入れられたキレート化剤又は結合基の種類とは無関係である。