(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質が生きた細胞内で周期的なリズムで集合−拡散を繰り返すこと利用した生理活性物質の評価方法を提供する。【解決手段】タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子ＫＩＡＡ０２９０に蛍光タンパク質遺伝子を融合した後、該融合遺伝子を生細胞に導入し、該細胞を培養して、該タンパク質の集合−拡散の繰り返し時間もしくは該タンパク質の集合−拡散の繰り返し周期を消失した細胞の割合を計測することを利用して、生理活性物質を評価する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分裂サイクルにおける静止期に周期的に集合−拡散を繰り返す特徴を有するタンパク質を指標として、生理活性物質の評価を行う生理活性物質評価方法。
【請求項２】
細胞周期サイクルの静止期に周期的に集合−拡散を繰り返す特徴を有するタンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子を指標として、生理活性物質の評価を行う生理活性物質評価方法。
【請求項３】
該タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子がＫＩＡＡ０２９０であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の生理活性物質評価方法。
【請求項４】
該タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子を融合させた後、該融合遺伝子を生細胞に導入し、該細胞を培養して、該タンパク質の集合−拡散の繰り返し時間を観察することを利用して、生理活性物質の評価を行うことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の生理活性物質評価方法。
【請求項５】
該タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子を融合させた後、該融合遺伝子を生細胞に導入し、該細胞を培養して、該タンパク質の集合−拡散の繰り返し周期を消失した細胞の割合を計測することを利用して、生理活性物質の評価を行うことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の生理活性物質評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質の評価方法に関し、特に、生細胞を使用して薬剤等の生理活性物質の評価を行う方法に関する。本発明は、例えば、医薬品のスクリーニング、毒性評価、機能性食品の評価等に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
医学の発展が人類の寿命延長に大きく貢献していることは勿論のこと、とりわけ様々な医薬品開発が大きく貢献してきたことは誰も認めるところである。医学の進歩は新薬開発のターゲットをますますピンポイントなものにしており、それに対応する新規なスクリーニング方法の開発が望まれている。
【０００３】
しかし、現在のスクリーニング方法は、例えば試験管中で生理活性物質の反応の様子を追跡したり、あるいは生きた細胞を使用した場合でもその後細胞を固定しなければ観察ができず、生きた細胞内における生理活性物質による内部かく乱状態そのものの観察は不可能な状況にあった。
わずかに微生物などではその増殖状態を観察する事で生理活性物質の効果の有無を確かめることができただけである。
【０００４】
これに対し、本発明者等は、標的となる数種類のタンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子に、それぞれ別個の蛍光タンパク質遺伝子を融合させた遺伝子を導入した生細胞を用い、生きたままの状態で観察することによって、標的とするタンパク質の細胞内動態を経時的に観測する方法を提案している（特許文献１参照）
【特許文献１】特開２００４−１８７５３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、本発明者等が提案している上記方法を応用して、薬剤開発などの生理活性物質のスクリーニングにおいて、従来の方法では不可能であった生きた細胞内のかく乱状態の観察が可能な、全く新しい評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するためになされた本発明の生理活性物質評価方法は、指標となるタンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子を融合させた遺伝子を生きた細胞に導入し、該細胞を薬剤の存在、非存在下で培養し、細胞内の動態を可視化条件の下に観察することによって薬剤の評価を行うものである。
【０００７】
より具体的に説明すると、発明者等は、蛍光タンパク質の遺伝子を利用して、ＫＩＡＡ０２９０遺伝子によってアミノ酸配列が規定されているタンパク質が微小粒子を形成し、細胞分裂サイクルの静止期において、その微小粒子が集合−拡散を周期的に繰り返すことを見出した。更にこの周期的な繰り返し時間は薬剤の共存下によって、早くなったり遅くなったりし、場合によっては周期的な繰り返しを消滅してしまう現象を発見した。そこで、この遺伝子を指標にすることによる、新たな評価方法を提案するに至った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、スクリーニングに共された生理活性物質の効果を非常に感度良く評価する事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、生細胞を生きたままの状態で、且つ増殖過程における細胞内の構成タンパク質の変動を、該構成タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子に蛍光タンパク質の遺伝子を融合させることによって、蛍光顕微鏡下で観測する技術（特許文献１）を利用して完成させたものである。
【００１０】
本発明者らは、機能がまだ判っていない遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子を導入したプラスミドを作製し、該プラスミドを導入した形質転換細胞株を種々作製し、細胞内における機能がまだ判っていないタンパク質の挙動を観察してきた結果、ＫＩＡＡ０２９０遺伝子によってアミノ酸配列が規定されているタンパク質が微小粒子を形成し、細胞分裂サイクルの静止期において、周期的な蛍光強度の増減、即ち該微小粒子が周期的な集合−拡散を行っている現象を発見した(試験例に示す。)。
【００１１】
（試験例）ＫＩＡＡ０２９０遺伝子によってアミノ酸配列が規定されているタンパク質が、細胞分裂サイクルの静止期において周期的な蛍光強度の増減を繰り返す現象の確認試験
【００１２】
プラスミドＤＮＡの作製と可視化ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の安定発現細胞株の取得は次のように行ったが、この方法に限定されるものではない。
ＫＩＡＡ０２９０タンパク質を可視化するために用いる発現ベクターは、緑色蛍光タンパク質の遺伝子を含むベクターである哺乳動物細胞用発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃｌ(ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製) を改変した。ＫＩＡＡ０２９０によってアミノ酸配列が規定されているタンパク質を可視化でき、且つ安定に発現する細胞の作製は以下のように行った。上記ベクターにヒトＫＩＡＡ０２９０のｃＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００６６２８，９０６アミノ酸配列を規定している）の２−９０６アミノ酸配列を規定している領域を挿入することにより、ヒトＫＩＡＡ０２９０緑色蛍光タンパク質融合タンパク質を発現させるためのプラスミド ＤＮＡ(ｐＥＧＦＰ−ＫＩＡＡ０２９０) を作製した。該プラスミドＤＮＡをヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に導入することにより、目的とする細胞を得た。その作製方法を以下に示す。
【００１３】
上記で得られた細胞を１０％ＦＣＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地（日水製薬製）にて、３７℃、 ５％炭酸ガス空気下で培養した。エレクトロポレーション法により、予め作製したプラスミドＤＮＡ (ｐＥＧＦＰ−ＫＩＡＡ０２９０) をＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内に導入し、選択用薬剤を加えた培地で培養し、ＫＩＡＡ０２９０緑色蛍光タンパク質融合タンパク質を安定に発現する形質転換細胞株を得た。
【００１４】
この形質転換細胞株を３５ｍｍシャーレ（カバーガラスが底に張り付けられたもの；旭テク（硝子社製）で４日間培養し、リアルタイム観察を行う直前に３５ｍｍシャーレをサーモスタット及び炭酸ガス導入制御タイマー（Ｋｏｋｅｎｓｈａ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製）により、炭酸ガス濃度及び温度をコントロールできる湿潤器を備えた倒立蛍光顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００（ニコン社製）に移入した。
【００１５】
可視化したＫＩＡＡ０２９０タンパク質の動態観測は、コンピュータソフトウェア（Ｌｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｖ．１．５５；三谷商事社製）で統合的に制御された高感度ＣＣＤカメラＯＲＣＡ−ＥＲ（浜松フォトニクス社製）、 ＣＦＰ／ＹＦＰ／ＲＦＰ用フィルターセット（Ｎｏ．８６００６，Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．製）を備えた励起・吸収フィルターホイール, Ｚ軸モーターとその制御機であるコントローラーＢｉｏｐｏｉｎｔ  ＭＣＡ５０００（Ｌｕｄｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．製）のシステムのもと、対物レンズＰｌａｎ  Ａｐｏ  ６０ｘを用いて８〜１０秒間隔で観察した。それぞれの時間における観察では緑色蛍光タンパク質の蛍光を励起する波長の光を照射し、１μｍの間隔でステージの高さ（Ｚ軸）を変化させ、計３〜５枚の画像を取得した。この観察を１０〜１５分間続け、計３００〜６００枚程度の画像を取得し、上記ソフトウェアを用いて画像のタイムラプス解析を行った。
【００１６】
その結果、ＫＩＡＡ０２９０によってアミノ酸配列が規定されているタンパク質は細胞内で微小粒子を形成し、細胞分裂サイクルの静止期において、その微小粒子が集合−拡散を周期的に行うことが判明した。
【００１７】
この細胞内の周期的な蛍光強度の増減を指標にして、生理活性を有する薬剤の評価方法が構築できないかと考え、細胞培養液に薬剤を添加したところ、薬剤の生理活性の種類、量によって蛍光強度の増減の周期時間並びに蛍光強度の増減を消失した細胞数に影響することが判明した。
【００１８】
ポリアミン合成阻害剤であるα−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（ＤＦＭＯ）は細胞成長の制御に関わるポリアミンの合成酵素オルニチンデカルボキシラーゼの阻害剤であり、オルニチンデカルボキシラーゼ活性は乳癌細胞で高くなっていることが知られている。ＤＦＭＯを培養液に最終濃度０．１５ｍＭ になるように添加した培養液を用いて可視化ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の安定発現細胞株を培養すると、ＫＩＡＡ０２９０タンパク質由来の蛍光強度の増減の周期時間はDFMO無添加に比べて短くなる。換言すれば、本発明を実施することによって、ポリアミン合成阻害作用を有する物質を評価、選択できることを示している。
【００１９】
同様にして、可視化ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の安定発現細胞株を微小管の集合阻害剤であるコルセミドを培養液に添加すると、細胞との接触時間を長くすればするほど、培養液中のコルセミド濃度を高くすればするほど、蛍光強度の増減を繰り返す細胞数は減少する。この知見を利用すれば、微小管の重合阻害剤のスクリーニングが可能である。微小管の重合阻害剤は抗癌剤に利用されており、本発明は抗癌剤の評価系にも利用可能である。
【実施例】
【００２０】
以上のように、本発明はＫＩＡＡ０２９０遺伝子またはそれによりアミノ酸配列が規定されているタンパク質を用いることにより、ポリアミン合成阻害剤、抗癌剤を始めとした様々な生理活性物質を評価できるものである。
以下に、実施例にて本発明について更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）α−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（ＤＦＭＯ）の作用
使用した可視化ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の安定発現細胞株の作成方法及び実験方法は、以下に記載する培養方法を除いては試験例と同様にして行い、生細胞内におけるＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光の増減周期時間を測定した。
【００２２】
培養方法；作製した可視化細胞株を２日間培養した後、ＤＦＭＯを最終濃度０．１５ｍＭになるように培養液に添加し、更に２日間培養を継続した。
その結果を表1に示した。表１は、ＤＦＭＯ添加の有無による、可視化ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光量増減周期の速さの変化を比較した表である。
ＤＦＭＯ無添加区におけるＫＩＡＡ０２９０タンパク質の周期間隔は１０５．２±９．７秒であったのに対し、ＤＦＭＯ添加区におけるそれは９５．０±１１．９秒と短くなっていた。即ち、この方法を用いることにより、ポリアミン合成阻害剤を評価できる。
【００２３】
【表１】
2006325448.tif 000002
【００２４】
（実施例２）コルセミドの作用
実施例１と同様、培養方法以外は試験例と同様に行った。
培養方法；実施例の培養方法に準じて行い、リアルタイム観察を開始する５時間前にコルセミドを０．０１５〜０．１５ｍＭになるように培養液に添加し、ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光の増減周期時間及び蛍光の増減周期をなくした細胞数を測定した。
【００２５】
その結果を図１及び図２に示した。微小管の重合阻害剤であるコルセミドはＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光増減周期時間には影響を及ぼさなかった。一方、ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光量増減の周期的変化を示さない細胞の割合は、コルセミド無添加区で１５％であったのが、コルセミド０．０５μｇ／ｍｌ添加区では３０％弱、かつ接触時間の延長によって６０％弱と増加し、接触時間にレスポンスすることが判った。更に培養液中のコルセミド濃度が高くなるほど、ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光増減周期を消失する細胞が増加し、０．１０μｇ／ｍｌ添加区で７５％、０．１５μｇ／ｍｌ添加区では１００％となり、ドーズレスポンスの傾向が認められることが判った。
【００２６】
微小管の重合阻害剤は抗癌剤に利用されているので、この方法は抗癌剤の評価に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の生理活性物質評価方法は、新たな医薬品の開発、薬剤の毒性評価及び機能性食品の機能評価に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】可視化ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光量増減の周期的変化を示さない細胞の割合を表したグラフ（平均値および標準偏差）である。左側はコルセミドを添加していないコントロールの細胞群であり、右側は０．０５μｇ／ｍｌコルセミドを添加した細胞群のものである。グラフ下横軸の０−１は０時間から１時間の間を、２−３は２時間から３時間の間を、２−は２時間以上を示している。
【図２】高濃度のコルセミドを投与して３−４時間経過後の、可視化ＫＩＡＡ０２９０タンパク質の蛍光量増減の周期的変化を示さない細胞の割合を表したグラフである。
【図１】
2006325448.tif 000003
【図２】
2006325448.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月27日(2005.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分裂サイクルにおける静止期に周期的に集合−拡散を繰り返す特徴を有するタンパク質を指標として、生理活性物質の評価を行う生理活性物質評価方法。
【請求項２】
細胞分裂サイクルにおける静止期に周期的に集合−拡散を繰り返す特徴を有するタンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子を指標として、生理活性物質の評価を行う生理活性物質評価方法。
【請求項３】
該タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子がＫＩＡＡ０２９０であることを特徴とする請求項２に記載の生理活性物質評価方法。
【請求項４】
該タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子を融合させた後、該融合遺伝子を生細胞に導入し、該細胞を培養して、該タンパク質の集合−拡散の繰り返し時間を観察することを利用して、生理活性物質の評価を行うことを特徴とする請求項２または請求項３のいずれかに記載の生理活性物質評価方法。
【請求項５】
該タンパク質のアミノ酸配列を規定している遺伝子に蛍光タンパク質遺伝子を融合させた後、該融合遺伝子を生細胞に導入し、該細胞を培養して、該タンパク質の集合−拡散の繰り返し周期を消失した細胞の割合を計測することを利用して、生理活性物質の評価を行うことを特徴とする請求項２または請求項３のいずれかに記載の生理活性物質評価方法。