(57)【要約】【課題】  ＤＡＢ免疫染色された細胞群から特定の転写因子Ｏｃｔ４を発現する転写因子発現細胞の様子を数値評価する方法を提供する。【解決手段】  ＤＡＢ免疫染色された細胞群から特定の転写因子を発現する転写因子発現細胞の様子を評価する転写因子発現細胞の評価方法は（ａ）前記転写因子発現細胞を含む細胞群からＤＡＢ免疫染色した細胞を顕微鏡を介してコンピュータ可読画像データに変換し、（ｂ）得られた画像データをソフトウェアによりＣＭＹＫイメージ変換し、ＣＭＹＫ変換した画像から青色を減色し、（ｃ）全体の画像中から黒要素測定値であるＫ値の割合を求め、さらに、好ましくは（ｄ）前記Ｋ値を予め定めた複数の黒要素測定値範囲を設定し、各設定した黒要素測定値範囲の割合を求めて、転写因子発現細胞の濃度分布を評価する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＡＢ免疫染色された細胞群から特定の転写因子を発現する転写因子発現細胞の様子を評価する転写因子発現細胞の評価方法であって、
（ａ）前記転写因子発現細胞を含む細胞群からＤＡＢ免疫染色した細胞を顕微鏡を介してコンピュータ可読画像データに変換し、
（ｂ）得られた画像データをソフトウェアによりＣＭＹＫイメージ変換し、ＣＭＹＫ変換した画像から青色を減色し、
（ｃ）全体の画像中から黒要素測定値であるＫ値の割合を求める
ことを特徴とする転写因子発現細胞の評価方法。
【請求項２】
さらに、
（ｄ）前記Ｋ値を予め定めた複数の黒要素測定値範囲を設定し、各設定した黒要素測定値範囲の割合を求めて、転写因子発現細胞の濃度分布を評価する
ことを特徴とする請求項１に記載の転写因子発現細胞の評価方法。
【請求項３】
さらに、
（ｅ）同一の細胞群に対して２又はそれ以上の転写因子を用いてＤＡＢ染色し、前記各転写因子により免疫染色された細胞のＫ値又は黒要素測定値範囲の割合、又は両者を比較することを特徴とする請求項２に記載の転写因子発現細胞の評価方法。
【請求項４】
前記細胞が、ＥＳ又はＥＳ様細胞であって、前記転写因子がＯｃｔ４又はＰ７５ＮＴＲであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の転写因子発現細胞の評価方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法を実行するためのプログラムが格納されたコンピュータ可読媒体。
【請求項６】
請求項５に記載のコンピュータ可読媒体が格納されたコンピュータシステムから構成された転写因子発現細胞の評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、転写因子発現細胞の評価方法及び評価装置及び転写因子発現細胞の評価プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】  ＤＡＢ染色は、免疫染色に最も一般的に使用されている免疫染色法であり、転写因子発現細胞は、褐色に染色される。
そのため、ＤＡＢ染色された細胞（転写因子発現細胞）から、細胞を定量的に評価・特定することは困難である。【０００３】  Ｏｃｔ４は、最も一般的なＥＳ細胞を同定するためのマーカであるが、これを転写因子として用いてＤＡＢ染色した場合、その染色の度合いを数値で示す指標がなかった。例えば、非特許文献１〜３には、マウス初期胚（Ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）ではＯｃｔ４の発現程度が異なる細胞が存在することが示されており、そこから分離されるＥＳ細胞ではＯｃｔ４の発現程度が異なる細胞は異なった運命、即ち潜在的な多分化能力を保持しながら未分化状態で増殖し続けるか、多様な細胞に分化するかの特性の違いを示す分子生物学的解析結果が記載されている。
【非特許文献１】  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｃｔａｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ６０４６１−４７２，１９９０．
【非特許文献２】  Ｐｅｓｃｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｃｔ−４  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．７１：８９−９８，１９９８．
【非特許文献３】  Ｎｉｗａ  Ｈ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ−Ｉ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＧ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｃｔ−３／４  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４：３７２−３７６，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  したがって、本発明の課題は、細胞組織の状態を評価するするために最も日常的で頻繁に実施されている免疫染色法によるＤＡＢ免疫染色された細胞群から特定の転写因子Ｏｃｔ４を発現する転写因子発現細胞の様子を数値評価する方法を提供することであるが、本発明はＯｃｔ４に限定されるものではなくその他の免疫染色や、さらに特定の物質の存在量を画像評価することにまで拡張される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  上記課題を解決する本発明は、下記事項に関する。
（１）  ＤＡＢ免疫染色された細胞群から特定の転写因子を発現する転写因子発現細胞の様子を評価する転写因子発現細胞の評価方法であって、
（ａ）前記転写因子発現細胞を含む細胞群からＤＡＢ免疫染色した細胞を顕微鏡を介してコンピュータ可読画像データに変換し、
（ｂ）得られた画像データをソフトウェアによりＣＭＹＫイメージ変換し、ＣＭＹＫ変換した画像から青色を減色し、
（ｃ）全体の画像中から黒要素測定値であるＫ値の割合を求める
ことを特徴とする転写因子発現細胞の評価方法。
（２）  さらに、
（ｄ）前記Ｋ値を予め定めた複数の黒要素測定値範囲を設定し、各設定した黒要素測定値範囲の割合を求めて、転写因子発現細胞の濃度分布を評価する
ことを特徴とする（１）に記載の転写因子発現細胞の評価方法。
（３）  さらに、
（ｅ）同一の細胞群に対して２又はそれ以上の転写因子を用いてＤＡＢ染色し、前記各転写因子により免疫染色された細胞のＫ値又は黒要素測定値範囲の割合、又は両者を比較することを特徴とする（２）に記載の転写因子発現細胞の評価方法。
（４）  前記細胞が、ＥＳ又はＥＳ様細胞であって、前記転写因子がＯｃｔ４又はＰ７５ＮＴＲであることを特徴とする（１）から（３）のいずれか１項に記載の転写因子発現細胞の評価方法。
（５）  （１）か（４）のいずれか１項に記載の方法を実行するためのプログラムが格納されたコンピュータ可読媒体。
（６）  （５）に記載のコンピュータ可読媒体が格納されたコンピュータシステムから構成された転写因子発現細胞の評価装置。
【発明の効果】
【０００６】  このように構成することによってＤＡＢ免疫染色された細胞群から特定の転写因子Ｏｃｔ４を発現する転写因子発現細胞の様子を数値評価することが可能となる。この評価方法はＯｃｔ４に限定されるものではなくその他の免疫染色や、さらに特定の物質の存在量を画像評価することも可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】  本発明は、ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｎｚｉｄｉｎｅ）反応よって免疫染色された細胞群から特定の転写因子を発現する転写因子発現細胞の様子を評価する転写因子発現細胞の評価方法に関する。
以下の実施形態においては、転写因子としてＯｃｔ４を用いた例を例示して説明するが、本発明は、このような特定の実施形態に限定されるものではなく、幅広く適用されるものである。【０００８】  まず、所定の細胞群のうち、Ｏｃｔ４発現細胞を含むか否かを、特定するのに当たって、まず当該技術分野に公知の方法により取得した細胞を免疫染色し、染色した細胞を顕微鏡を介してコンピュータ可読画像データ（ＲＧＢデータ）に変換する。
得られた画像データ（ＲＧＢデータ）をソフトウェア例えばＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標名）によりＣＭＹＫイメージ変換する。ＤＡＢ免疫染色法により染色した箇所（本実施形態ではＯｃｔ４を免疫染色した箇所、すなわち、Ｏｃｔ４発現細胞は）、通常褐色で表されているので、この画像から青色を減色すると、画像中Ｏｃｔ４発現細胞だけが黒色要素（Ｋ）を含んでいることとなる。【０００９】  このようにして変換した画像は、免疫染色された箇所が黒色要素（Ｋ）として数値評価することが可能となる。例えば、全体の細胞群における免疫染色された箇所が面積比として数値評価可能となる。【００１０】  本発明の好ましい実施形態において、このようにしてＫ値で示された染色細胞（Ｏｃｔ４発現細胞）の染色の程度を、Ｋ値の分布として示すことが可能となる。図示しないが、Ｋ値（すなわち、染色濃度）の濃度分布を分布曲線として示すことも可能であるが、例えばＯｃｔ４発現の強度を、Ｋ値の所定の区画、無し（ｎ）「１０００未満」、弱（ｍ）「１０００以上、５０００未満」、中（ｍ）「５０００以上９０００未満」、強（ｓ）「９０００以上」の四段階評価で示すことができる。本実施形態におけるＫ値の所定の区画、無し（ｎ）「１０００未満」、弱（ｍ）「１０００以上、５０００未満」、中（ｍ）「５０００以上９０００未満」、強（ｓ）「９０００以上」はあくまでも恣意的に決定したものであるので任意に変更することも可能であり、また３段階評価、５段階評価等の区画数も任意である。【００１１】  このように構成することによって従来数値評価することが不可能であり、特に発現程度とその分布を調べることが困難であったＯｃｔ４発現細胞を評価することが可能となる。【００１２】  また、本発明の別の実施形態によると、異なる転写因子を用いた同一検体をＤＡＢ染色することによって、比較評価を行う。例えば、ＥＳ、ＥＳ様細胞のマーカ（転写因子）には前記のＯｃｔ４以外にもＤＡＢ転写因子として種々の転写因子が知られている。【００１３】  そして、これらの転写因子は、細胞の状態により発現の様子が異なることも本発明者等の予備実験にて確認されている。
例えば、皮膚癌について本発明者等が調査した所、Ｏｃｔ４では異常なし（±）、初期（±）、末期（＋＋）であり、Ｐ７５ＮＴＲでは異常なし（±）、初期（＋）、末期（＋＋）と、初期癌段階では異なる挙動を示す。また、食道癌、子宮頸癌も同様な挙動を示す。
したがって、両者を比較することによって皮膚癌・食道癌、子宮頸癌等癌の診断を行うことも可能であると考えられる。さらに、癌幹細胞のスクリーニングを行うことも可能となると考えられる。すなわち、同一の細胞群（癌幹細胞を含む細胞群）を異なるマーカ（転写因子）を用いて免疫染色して、本発明の評価方法により評価することによって、癌幹細胞のスクリーニングを行うことが可能となる。【００１４】  次に、具体的には手順を図１に基づいて説明する。
ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｎｚｉｄｉｎｅ）反応よって得られたＯｃｔ４蛋白の褐色の画像ファイルを画像処理ソフト、例えばＰｈｏｔｐｓｈｏｐによって開き、“イメージ”メニューから“モード”の“ＣＭＹＫカラー”を選択する。ＣＭＹＫはシアン（Ｃ）、マジェンタ（Ｍ）、黄色（Ｙ）．黒色（Ｋ）の色成分で表現される。【００１５】  次いで、画像処理ソフトのスポイトツールを選択してＤＡＢ陽性褐色部分（この場合は細胞核内で機能する遺伝子転写因子Ｏｃｔ４であるため、褐色の染色を示す細胞核）を選択する。
次に、描画色のパレットをクリックしカラーピッカーのウインドウを開きＣＭＹＫのＫ値（黒色％値）を確認し、さらにＤＡＢ陰性細胞核（細胞質及び細胞膜に存在するＤＡＢの非特異的発色含む青色が優勢な部分）を選択しカラーピッカーで同様にＫ値を測定する。
前者が後者よりＫ値（％）が十分高い％値であることを確認しカラーピッカーのウインドウを閉じる。この時の前者と後者のＫ値（％）が大きくない場合は非特異的ＤＡＢ発色の占める割合が高いと判定されるため、より信頼できるＫ値を得るためには非特異的染色が少ない良質の免疫染色標本を再度得ることが好ましい。【００１６】  例えば本標本のＫ値は前者が５８〜６０％、後者が２２〜２４％となる。“ウインドウ”メニューから「ブラック」のチャンネルを選択クリックし画面を白黒で表現する。“選択範囲”メニューから画像全てを選択し“編集”から“コピー”機能によってクリップボードにコピーする。【００１７】  “ファイル”メニューから「新規」を選択し、モードをグレースケールとする（図１、図面１「これを図１−▲１▼とする」、図１−▲１▼の下に挿入、例えば図１−▲２▼左上図４０ｗ  Ａｍ−４０週羊膜基部羊膜上皮層．同様に左下図４０ｗＰｒｉ−培養した４０収容幕細胞）。ＯＫをクリックする。“編集”メニューから“ペースト”機能によって新規ファイルにＤＡＢ発色の画像を移す。“ウインドウ”メニューから“レイヤー”を表示し、背景レイヤーとペースト画像の二つが確認されたら、プルダウンメニューから“画像の統合”選択し画像を統合する。【００１８】  “ファイル”メニューから保存を選択し、ファイルタイプを、例えばＴＩＦＦ（拡張子．ｔｉｆ）とし保存する。例えば、画像解析ソフトＣｌｏｎｔｅｃｈＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＴＭ）でのＯｃｔ４染色値を測定する場合，「色調補正」から「階調の反転」を選択し白黒画像を反転しておく。本解析で例示されるＣｌｏｎｔｅｃｈＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＴＭ）で与えられた個々の細胞核の黒色濃度の測定値はほぼ３００〜２００００までの任意の値を記録した。この実際の測定値（Ｖａｌｕｅ）は異なった標本（組織、培養細胞）におけＯｃｔ４のＤＡＢ発色による免疫染色標本ごとでほぼ一定の域値を得ることが出来ることから、再現性が認められる。【００１９】  本発明者等は、さらに、このようにして黒色要素Ｋの強度により、Ｏｃｔ４発現細胞として表されたＯｃｔ４発現細胞を詳細に調査した所、そのＫ値により、Ｏｃｔ４発現細胞の挙動が異なることを見出した。すなわち、本発明においては、黒色要素測定値が、無し（ｎ）「１０００未満」、弱（ｍ）「１０００以上、５０００未満」、中（ｍ）「５０００以上９０００未満」、強（ｓ）「９０００以上」の四段階評価で示した場合、無し（ｎ）又は弱（ｗ）の場合、ＥＳ細胞又はＥＳ様細胞としての挙動をまったくあるいはほとんど示さず、逆に強（ｓ）の場合には上皮表層に分布し羊水中へ脱落する傾向にあり、ＥＳ細胞又はＥＳ様細胞として、未分化ではなくむしろ分化傾向または終末期であった。これに対して中（ｍ）の場合には上皮基底層側に位置する傾向にあり長期生存に有利であるＥＳ細胞又はＥＳ様細胞として、未分化状態の維持という優れた挙動を保証する。したがって、単にＯｃｔ４陽性細胞の存在のみならず、Ｏｃｔ４の発現程度に幅があるＯｃｔ４陽性細胞集団がＥＳ又はＥＳ様細胞の存在を保証する。
本発明の細胞群には、このようなＥＳ細胞又はＥＳ様細胞として優れた挙動を示す中程度の強度を有するＯｃｔ４発現細胞が有意に含まれることが実験的及び解析的に判った。【００２０】  このように本発明の評価方法は、取得した画像をコンピュータにより一連の処理を行うことが可能である。
このようにして解析した結果、例えば、前記のＯｃｔ４発現細胞を含む細胞群の場合には、細胞全体における染色された細胞の割合、無し（ｎ）、弱（ｗ）、中（ｍ）、強（ｓ）の各々の割合をプリントアウトして、サンプリングした細胞群を保存する容器に貼ることによってその細胞の様子を後段の研究、適用に用いることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】  本発明の評価方法を示す図面である。
【図１】
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