(57)【要約】【課題】カルバミン酸エステル化合物を中性付近かつ室温付近の温和な条件で副反応なく特異的な加水分解を行うことのできる酵素を提供する。【解決手段】一般式（１）【化１】2006230294.tif 000013（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数２から１２のアルキル基、Ｒ２は置換されていてもよい炭素数１から１２のアルキル基、又は置換されていてもよい炭素数６から１４のアリール基を表す。）で表わされるカルバミン酸エステルを、ｐＨ５から９の範囲内かつ温度１０℃から８０℃の範囲内の条件において加水分解しうる酵素であって、かつ微生物由来であることを特徴とする、微生物由来カルバミン酸エステル加水分解酵素。【選択図】    図１
2006230294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2006230294.tif 000012
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数２から１２のアルキル基、Ｒ２は置換されていてもよい炭素数１から１２のアルキル基、又は置換されていてもよい炭素数６から１４のアリール基を表す。）で表わされるカルバミン酸エステルを、ｐＨ５から９の範囲内かつ温度１０℃から８０℃の範囲内の条件において加水分解しうる酵素であって、かつ微生物由来であることを特徴とする、微生物由来カルバミン酸エステル加水分解酵素。
【請求項２】
微生物がグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の微生物由来カルバミン酸エステル加水分解酵素。
【請求項３】
微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｎｏｃａｒｄｉａ属細菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属細菌、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属細菌、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１または２に記載の微生物由来カルバミン酸エステル加水分解酵素。
【請求項４】
微生物がＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｅｒｒａｅ  ＤＳＭ１３９５３であることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の微生物由来カルバミン酸エステル加水分解酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学的な手段によりカルバミン酸エステルを温和な条件において加水分解する新規な酵素を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
カルバミン酸エステル（カルバメートあるいはカーバメートとも呼ばれる）はカルボン酸のエステルとは異なり、通常生体に含まれない化合物群であるが、医薬や農薬の中にはしばしば見出される。例えば医薬としてはアルツハイマー症治療薬であるリバスティグミン｛（−）−Ｓ−Ｎ−ｅｔｈｙｌ−３−［１−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ｝がある。この化合物の作用機序は脳におけるアセチルコリンエステラーゼの特異的な阻害であることが知られている（例えば非特許文献１参照）。一方農薬としてはカルバリル｛１−ｎａｐｈｔｈｙｌ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ｝やカルボフラン｛２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−７−ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ｝などＮ−メチルカルバミン酸エステル構造を有する多くの殺虫剤が開発されており、世界中で大量に用いられている。これらの作用機序もアセチルコリンエステラーゼなどのエステラーゼ活性阻害であると考えられている（例えば非特許文献２参照）。さらにジエトフェンカルブ｛ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  Ｎ−３，４−ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｃａｒｂａｍａｔｅ｝などのＮ−アリールカルバミン酸エステル構造を有する殺菌剤があるが、これらの薬剤はカビ菌の細胞分裂阻害に働くと考えられている（例えば非特許文献３参照）。
【０００３】
一般にカルバミン酸エステルにはアセチルコリンエステラーゼをはじめとしてリパーゼやエポキシド加水分解酵素など種々の加水分解酵素を阻害する活性があることが知られており（例えば非特許文献４参照）、特に高等動物のアセチルコリンエステラーゼに対する阻害様式については人体に及ぼす影響が大きいことから詳しく研究されている（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながらカルバミン酸エステルの代謝、特に多くの場合に初発反応になると考えられる加水分解反応に関する知見は乏しい。殺虫剤として大量に使用されているカルバリルやカルボフランなどについては加水分解酵素の存在が知られているが、これは土壌残留性を調べる目的で資化細菌が分離されたことによる（例えば特許文献１及び非特許文献５、６参照）。これらの酵素は一般のエステラーゼやアミダーゼに類縁の酵素であると推測されるが、基質特異性が高く、Ｎ−メチルカルバミン酸エステルにのみ作用する。同様にＮ−アリールカルバミン酸エステル系殺菌剤を資化できる細菌から分離された加水分解酵素の報告もあるが（例えば非特許文献７）、これはＮ−メチルカルバミン酸エステルには作用しない。またウレタン化合物を資化する微生物についての報告もあるが（例えば特許文献２、３）、基質として用いている化合物はＮ−アリールカルバミン酸エステルであることから、Ｎ−アルキルカルバミン酸エステルに作用するかどうかは明らかでなく、その可能性は低い。また資化性のみを指標にしているため、加水分解反応についての知見は得られていない。
【０００５】
カルバミン酸エステルはアルカリ条件下において、さらに加熱することによって化学的に加水分解することができる。ただしこうした条件においてはアルカリや熱に不安定な官能基に害を与える、及び／又はカルバミン酸エステル結合以外の共有結合を切断する可能性があることから、温和な条件で反応させる方法が望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特開平４−１０４７８４号公報
【特許文献２】特開平９−１９２６３３号公報
【特許文献３】特開２００４−２６１１０３号公報
【非特許文献１】Ｂａｒ−Ｏｎ  Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、４１、（３５５５−３５６４頁）
【非特許文献２】Ｂｕｌｌ  Ｄ．Ｌ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ、１９９１、８４（４）、（１１４５−１１５３頁）
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、２５、（４１８−４２２頁）
【非特許文献４】Ｌｉｎ  Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９、３８、（９９７１−９９８１頁）
【非特許文献５】Ｈａｙａｔｓｕ  Ｍ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３、５９（７）、（２１２１−２１２５頁）
【非特許文献６】Ｆｅｎｇ  Ｘ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７、６３（４）、（１３３２−１３３７頁）
【非特許文献７】Ｐｏｈｌｅｎｚ  Ｈ．−Ｄ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９２、１７４（２０）、（６６００−６６０７頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、カルバミン酸エステル化合物を中性付近かつ室温付近の温和な条件で副反応なく特異的な加水分解を行うことのできる酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、一般式（１）
【０００９】
【化１】
2006230294.tif 000003
（式中、Ｒ１は置換されていてもよい炭素数２から１２のアルキル基、Ｒ２は置換されていてもよい炭素数１から１２のアルキル基、又は置換されていてもよい炭素数６から１４のアリール基を表す。）で表わされるカルバミン酸エステルを、ｐＨ５から９の範囲内かつ温度１０℃から８０℃の範囲内の条件において加水分解しうる酵素であって、かつ微生物由来であることを特徴とする、微生物由来カルバミン酸エステル加水分解酵素である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１０】
一般式（１）において、Ｒ１で表される置換されていてもよい炭素数２から１２のアルキル基としては、直鎖状、分枝状、又は環状のいずれであってもよく、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等のアルキル基を例示することができる。
【００１１】
これらのアルキル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、ジフルオロメチル基、３−フルオロプロピル基、シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、２−メチルチオエチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基等を例示することができる。
【００１２】
またＲ１で表される環状アルキル基としては、置換していてもよい炭素数３から８のシクロアルキル基が好ましく、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基等のシクロアルキル基を例示することができる。また、これらのシクロアルキル基はハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基等で置換されていてもよく、さらに具体的には、１−メチルシクロプロピル基、２，２−ジメチルシクロプロピル基、２−クロロシクロプロピル基、２，２−ジクロロシクロプロピル基、２−メトキシカルボニルシクロプロピル基、２−メチルシクロペンチル基、２−フルオロシクロプロピル基、３−メチルシクロペンチル基等を例示することができる。
【００１３】
一般式（１）において、Ｒ２で表される置換されていてもよい炭素数１から１２のアルキル基としては、直鎖状、分枝状、又は環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等のアルキル基を例示することができる。
【００１４】
これらのアルキル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルコキシ基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２−クロロエチル基、３−クロロプロピル基、ジフルオロメチル基、３−フルオロプロピル基、シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、２−メチルチオエチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基等を例示することができ、中でも炭素数２から６の低級アルキル基が高活性を与える点で好ましい。
【００１５】
またＲ２で表される環状アルキル基としては置換していてもよい炭素数３から８のシクロアルキル基が好ましく、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロオクチル基等のシクロアルキル基を例示することができる。また、これらのシクロアルキル基はハロゲン原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数１から４のアルコキシカルボニル基等で置換されていてもよく、さらに具体的には、１−メチルシクロプロピル基、２，２−ジメチルシクロプロピル基、２−クロロシクロプロピル基、２，２−ジクロロシクロプロピル基、２−メトキシカルボニルシクロプロピル基、２−メチルシクロペンチル基、２−フルオロシクロプロピル基、３−メチルシクロペンチル基等を例示することができる。
【００１６】
Ｒ２で表される置換されていてもよい炭素数６〜１４のアリール基としては置換または無置換のフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アンスリル基、２−アンスリル基、９−アンスリル基などをあげることができる。これらの芳香環上の置換基としては、炭素数１から６までの直鎖あるいは分枝状アルキル基、フェニル基、ビフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、１−アンスリル基、２−アンスリル基、９−アンスリル基などのようなアリール基、ビニル基、プロペニル基、ブテニル基のようなアルケニル基、メトキシ基、エトキシ基、ブトキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基のようなアルコキシル基、アセトキシル基、ブトキシル基のようなアシルオキシル基、メトキシメチルオキシ基、メトキシエトキシメチルオキシ基のようなアルコキシメチルオキシル基、フェニルオキシル基、ナフトキシル基のようなアリールオキシル基、２−オキサ−３−ヒドロキシメチル−４，５，６−トリヒドロキシシクロヘキシルオキシ基のような糖骨格を有する基、ハロゲン原子などをあげることができ、また、これらの、芳香環に置換する置換基上にはさらにアルキル基、アリール基、アルケニル基、ニトロ基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アルコキシル基、ヒドロキシル基、ハロゲン、スルホニル基、エポキシドのような環状エ−テル構造や糖骨格を有する基などが置換していてもよい。
【００１７】
Ｒ２で表される置換していてもよいフェニル基としては、ベンゼン環上の置換基として、ハロゲン原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のハロアルキル基、炭素数１から６のアシル基、炭素数１から４のアルコキシイミノ基で置換された炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、シアノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、アリールオキシ基、炭素数１から６のハロアルキルオキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、炭素数１から６のハロアルキルチオ基、炭素数１から６のハロアルキルスルフィニル基、炭素数１から６のハロアルキルスルホニル基、ニトロ基等を有する、置換していてもよいフェニル基を例示することができる。
【００１８】
さらに具体的には、２−フルオロフェニル基、２−クロロフェニル基、２−ブロモフェニル基、３−フルオロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−フルオロフェニル基、４−クロロフェニル基、４−ブロモフェニル基、２，４−ジフルオロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基、３，５−ジフルオロフェニル基、３，５−ジクロロフェニル基、３−クロロ−２，４−ジフルオロフェニル基、２，４，５−トリクロロフェニル基、２，４−ジクロロ−３−メチルフェニル基、２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル基、２，４−ジクロロ−５−イソプロピルオキシフェニル基、２−フルオロ−４−クロロ−５−メトキシフェニル基、２−フルオロ−４−クロロ−５−イソプロピルオキシフェニル基、２−フルオロ−４−クロロ−５−シクロペンチルオキシフェニル基、２−フルオロ−４−クロロ−５−プロパルギルオキシフェニル基、２−フルオロ−４−クロロ−５−（１−ブチン−３−イルオキシ）フェニル基等を例示することができる。
【００１９】
また、２−フルオロ−４−トリフルオロメチルフェニル基、２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェニル基、２−クロロ−５−トリフルオロメチルフェニル基、４−フルオロ−３−フェノキシフェニル基、２−フルオロ−５−ニトロフェニル基、２，４−ジフルオロ−５−ニトロフェニル基、２−メチルフェニル基、３−メチルフェニル基、４−メチルフェニル基、２，４−ジメチルフェニル基、４−エチルフェニル基、４−イソプロピルフェニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、２，４−ビス（トリフルオロメチル）フェニル基、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル基、２−アセチルフェニル基、４−アセチルフェニル基、４−イソバレリルフェニル基、２−メトキシカルボニルフェニル基、２−エトキシカルボニルフェニル基等を例示することができる。
【００２０】
また、３−メトキシカルボニルフェニル基、４−メトキシカルボニルフェニル基、２−カルボキシフェニル基、４−カルボキシフェニル基、２−シアノフェニル基、４−シアノフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、４−イソプロピルオキシフェニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルオキシフェニル基、３−トリフルオロメトキシフェニル基、４−トリフルオロメトキシフェニル基、３−フェノキシフェニル基、４−フェノキシフェニル基、２−メチルチオフェニル基、４−メチルチオフェニル基、２−メチルスルフィニルフェニル基、４−メチルスルフィニルフェニル基、２−メチルスルホニルフェニル基、４−メチルスルホニルフェニル基、４−トリフルオロメチルチオフェニル基、４−トリフルオロメチルスルフィニルフェニル基、４−トリフルオロメチルスルホニルフェニル基、２−ニトロフェニル基、４−ニトロフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等を例示することができる。
【００２１】
本発明の酵素は微生物由来のものであるが、微生物としてはグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌が好ましい。本発明で示される微生物は、本目的を達成するために好適であれば良く特に限定されないが、操作上また培養の容易さなどからＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｎｏｃａｒｄｉａ属細菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属細菌、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属細菌、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ属が好ましい。特にＪａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｅｒｒａｅ  ＤＳＭ１３９５３が好ましい。
【００２２】
また多くの種類の酵素あるいは微生物試料に含まれる加水分解活性を容易に検出するため、式（２）および式（３）で示されるような、加水分解生成物が可視領域に吸収帯を有する化合物（式（２）で表される化合物を以下、化合物（２）とする：Ｎ−ｓｅｃ−ブチルカルバミン酸４−ニトロフェニル。式（３）で表される化合物を以下、化合物（３）とする：Ｎ−（２−メチルシクロヘキシル）カルバミン酸４−ニトロフェニル。）を用いることができる。
【００２３】
【化２】
2006230294.tif 000004
【００２４】
【化３】
2006230294.tif 000005
これらの化合物を用いて、反応温度及びｐＨを本発明の範囲内に設定し、加水分解活性の有無を調べることにより、本発明の酵素を容易に検出することができる。
【００２５】
またカルバミン酸エステルを資化する微生物を獲得するために、上記化合物（２）、（３）に加えて、式（４）で示される化合物（以下、化合物（４）とする。Ｎ−ｓｅｃ−ブチルカルバミン酸エチル）を用いることもできる。化合物（４）は４−ニトロフェニル基に比べて脱離しにくいエチル基を有しており、数日間から数週間におよぶ微生物スクリーニングの期間中において自然加水分解の進行を抑えるのに好適である。
【００２６】
【化４】
2006230294.tif 000006
なお、本発明の酵素は微生物に由来するものであるが、それを加水分解に使用する際にはその酵素を含有する微生物自体をそのままもしくは適宜破砕して用いてもよく、又は微生物から酵素を抽出して用いてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の酵素によって、通常酵素的な加水分解が困難であると考えられているカルバミン酸エステルが、中性付近かつ室温付近の温和な反応条件で加水分解することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２９】
実施例１  各種微生物培養物を用いた加水分解反応
微生物保存機関より入手可能な微生物菌株として表１に示すものを用いた。
【００３０】
【表１】
2006230294.tif 000007
上記微生物をＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｏｎ、０．５％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）中３０℃で好気的に振とう培養し、初期静止期まで培養を行った。培養終了後菌体を遠心分離によって回収し、蒸留水で洗浄する操作を２回行った後、培養時の２８倍濃度になるように菌体を蒸留水に懸濁した。反応液組成として０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１８％ＮａＣｌ、２０％上記菌懸濁液、０．５ｍＭ化合物（２）あるいは（３）とし、総量０．９ｍｌとなるように調製し、キャップ付き試験管を用いて３０℃において化合物（２）を用いた場合には３０分間、化合物（３）を用いた場合には６０分間反応させた。反応後にメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７）の混合溶媒を３ｍｌ加え、激しく攪拌した後、試験管を遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分間、室温）にかけて相分離を行い、分取した上層（有機相）の４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）を測定した。反応時間ゼロ分間のＡ４００との値の変化（ΔＡ４００）を加水分解に伴うＡ４００変化とした。また自然加水分解にともなう変化を菌懸濁液の代わりに蒸留水を用いたもので同様に測定し、３０分間反応での自然加水分解に相当する吸光度変化を上記ΔＡ４００から減じた値を酵素反応によるものとして算出した（ΔΔＡ４００）。
【００３１】
【表２】
2006230294.tif 000008
表２に示すように用いた菌株のいずれからも活性が検出され、化合物（２）と（３）に対する反応性は異なっていた。
【００３２】
また反応生成物をＨＰＬＣ（カラムＯＤＳ−８０ＴＭ、東ソー製）により分析して標準標品と保持時間を比較することにより、４−ニトロフェノールの生成が確かめられた。
【００３３】
実施例２  Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｅｒｒａｅ  ＤＳＭ１３９５３菌体抽出物の調製
Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｅｒｒａｅ  ＤＳＭ１３９５３をＬＢ培地１Ｌ中３０℃で３６時間培養し、６００ｎｍにおける濁度が１２．２である培養物を得た。この培養物から７０００ｒｐｍ、２０分間の遠心により菌体を集め、これを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡの組成を有する緩衝液（以下緩衝液Ａと表記）１２０ｍｌに懸濁した。同様の操作を２回繰り返し、２００ｍｌの緩衝液Ａに懸濁した。この懸濁液に卵白リゾチームを１００ｍｇ含む緩衝液Ａ２０ｍｌを添加し、３０℃で９０分間ゆっくり攪拌させて溶菌を行った。次に最終濃度１０ｍＭになるように２Ｍ  ＭｇＣｌ溶液を１ｍｌ添加した後、デオキシリボヌクレアーゼＩを２ｍｇ含む緩衝液Ａ１ｍｌを添加し、３０℃で９０分間ゆっくり攪拌させて菌体抽出物の粘性を低下させた。この抽出物を９ｋｒｐｍ、３０分間の遠心にかけ、上清を回収し、粗抽出物標品とした。
【００３４】
この粗抽出物標品を緩衝液Ａで１０倍希釈し、実施例１に記載した方法と同様の操作により化合物（３）を反応基質とした加水分解反応を行った。その結果反応３０分間でのΔΔＡ４００は０．０４１、６０分間でのΔΔＡ４００は０．０６０であった。
【００３５】
実施例３  Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｔｅｒｒａｅ  ＤＳＭ１３９５３菌体抽出物からの加水分解酵素の部分精製
実施例２に記載したように調製した粗抽出物標品に対して６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で３０分間静置した後、９０００ｒｐｍ、１５分間の遠心により沈殿物を集めた。これに実施例２に記載した緩衝液Ａ２０ｍｌを加えて溶解し、緩衝液Ａに対して透析して標品中の硫酸アンモニウムを除去した。これに飽和硫酸アンモニウム水溶液を１／４容添加し、生じた沈殿を９ｋｒｐｍ、１５分間の遠心操作で除去した後、６０％飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ樹脂（東ソー製）を充填したカラムを用いて疎水クロマトグラフィーを行った。６０％飽和硫安を含む緩衝液Ａでカラムの洗浄を行った後、硫酸アンモニウムを含まない緩衝液Ａを用いて溶出を行った。溶出した各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定し、またいくつかのフラクションについては化合物（３）を反応基質とした加水分解活性を測定した。図１に各フラクションのＡ２８０を表わす。フラクション番号１から１６は素通り画分、フラクション番号２３から４０は洗浄操作によって溶出された画分を表わす。フラクション番号４３以降は硫酸アンモニウムを含まない上記緩衝液によって溶出された部分を表わす。活性測定の結果は表３のようになり、フラクション番号４５付近に加水分解活性が濃縮された。
【００３６】
【表３】
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実施例４  新規微生物の単離と簡易同定
１００ｍｌ容の三角フラスコに１０ｇの農地土壌と化合物（３）あるいは（４）を２ｍｇ添加して２５〜３０℃の室温に静置し、湿度を保ちながら２ｍｇの化合物（３）あるいは（４）を１週間おきに添加する操作を６回繰り返した。このような処理を施した土壌０．５ｇを１００ｍｌのＭＭ２培地（表４に組成を示す）に加えて３０℃で３日間振とうさせた後、懸濁液を希釈してから化合物（３）あるいは（４）を含むＭＭ２寒天培地に展開した。数日後に生じた微生物コロニーをＭＭ２培地で懸濁し、上記寒天培地を用い定法に従って微生物の単離を行い、実施例１に記載したＬＢ培地を用いて増殖させ、保存した。化合物（３）を用いた操作により９種の菌株（３−１、３−２、３−４、３−５、３−６、３−７、３−１３、３−１５、３−１８）、化合物（４）を用いた操作により５種の菌株（４−１、４−４、４−１２、４−１８、４−１９）を取得した。このうち３−５は化合物（３）を含むＭＭ２寒天培地上で黄緑色の呈色を示した。
【００３７】
【表４】
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上記１４菌株のうち９株（３−２、３−５、３−６、３−７、３−１５、３−１８、４−１、４−１２、４−１８）について微生物の簡易同定法である１６ＳリボゾームＤＮＡの約５００塩基部分にわたる配列分析（例えばＨａｌｌ  Ｌ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３、４１（４）、（１４４７−１４５３頁）参照）を行った。３−２、３−６、３−１５は同一の配列を有することが明らかになり、データベース上最も高い相同性を示したものはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  Ｓ４．９であることから（一致率９９．８％）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌と推定された。以下同様に３−５についてはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４であり（一致率９８．５％）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌と推定された。３−６についてはＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ  Ａ１Ｙ１５であり（一致率９８．４％）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌と推定された。３−７についてはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４であり（一致率９８．５％）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌と推定された。３−１８についてはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌａｔｈｅｉ  ＡＴＣＣ２９１９５であり（一致率９８．４％）、Ｂｕｒｋｏｌｄｅｒｉａ属細菌と推定された。４−１についてはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４であり（一致率９９．８％）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌もしくはＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌と推定された。４−１２と４−１８は同一の配列を有し、これらと最も高い相同性を示したものはＦｒａｔｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  ＩＦＯ３２４７であり（一致率９７．０％）、Ｆｒａｔｅｕｒｉａ属を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の細菌と推定された。
【００３８】
実施例５  新たに単離した微生物を用いた反応
実施例４に記載した微生物のうち６株（３−２、３−５、３−６、３−１５、３−１８、４−１９）について実施例１に記載したのと同様の方法を用いて化合物（３）を基質とした加水分解反応を行った。その結果を表５に示す。
【００３９】
【表５】
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これらのうち最も高い活性を示した３−５は実施例２において黄緑色の呈色を示したものであり、菌株単離の過程で活性の有無を推測することができた。
【００４０】
参考例１  Ｎ−ｓｅｃ−ブチルカルバミン酸４−ニトロフェニル（化合物（２））の合成
ｓｅｃ−ブチルアミン（２．０２ｍｌ，２０．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２０ｍｌ）溶液に氷冷下で水酸化ナトリウム（８８０ｍｇ，２２．０ｍｍｏｌ）の水（８ｍｌ）溶液とクロロギ酸４−ニトロフェニル（４．４３ｇ，２２．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２０ｍｌ）溶液を順次滴下し、室温で４時間攪拌した。反応終了後、有機相を分離し、水相をクロロホルム（８０ｍｌ×３回）で抽出した。有機相を合わせ、１Ｎ塩酸（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）、ならびに飽和食塩水（５０ｍｌ）で順次洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をクロロホルムから再結晶することにより、Ｎ−ｓｅｃ−ブチルカルバミン酸４−ニトロフェニルの無色固体（２．４４ｇ、収率５１％）を得た。
【００４１】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．８９（ｂｒｓ，１Ｈ），３．６９−３．７６（ｍ，１Ｈ），１．５４−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５６．１３，１５２．４９，１４４．６３，１２５．０８（２Ｃ），１２１．９２（２Ｃ），４９．１５，２９．６８，２０．４６，１０．２８。
【００４２】
参考例２  Ｎ−（２−メチルシクロヘキシル）カルバミン酸４−ニトロフェニル（化合物（３））の合成
２−メチルシクロヘキシルアミン（８．００ｍｌ、８０．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（８０ｍｌ）溶液に氷冷下で水酸化ナトリウム（３．５ｇ、８８．０ｍｍｏｌ）の水（１１２ｍｌ）溶液を滴下した後、クロロギ酸４−ニトロフェニル（１７．７ｇ、８８．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（８０ｍｌ）溶液を滴下し、室温で４時間攪拌した。反応終了後、有機相を分離し、水相をクロロホルム（２００ｍｌ×３回）で抽出した。有機相を合わせ、１Ｎ塩酸（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）、ならびに飽和食塩水（１００ｍｌ）で順次洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をクロロホルムから再結晶することにより、Ｎ−（２−メチルシクロヘキシル）カルバミン酸４−ニトロフェニルの無色固体（５．６０ｇ、収率２９％）を得た。
【００４３】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２３−８．２７（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．３４（ｍ，２Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２０−３．２７（ｍ，１Ｈ），２．０５−２．０８（ｍ，１Ｈ），１．０６−１．８１（ｍ，８Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５６．１８，１５２．７１，１４４．６１，１２５．０８（２Ｃ），１２１．８８（２Ｃ），５６．７１，３８．５３，３４．２５，３３．７１，２５．５８，２５．４１，１９．０８。
【００４４】
参考例３  Ｎ−ｓｅｃ−ブチルカルバミン酸エチル（化合物（４））の合成
ｓｅｃ−ブチルアミン（４．０４ｍｌ、４０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（４０ｍｌ）溶液に氷冷下で水酸化ナトリウム（１．７６ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）の水（６ｍｌ）溶液を滴下した後、クロロギ酸エチル（４．２ｍｌ、４４．０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（４０ｍｌ）溶液を滴下し、室温で４時間攪拌した。反応終了後、有機相を分離し、水相をクロロホルム（１００ｍｌ×３回）で抽出した。有機相を合わせ、１Ｎ塩酸（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）、ならびに飽和食塩水（５０ｍｌ）で順次洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、乾燥剤をろ過し、溶媒を減圧下で留去することにより、Ｎ−ｓｅｃ−ブチルカルバミン酸エチルの無色液体（６．０８ｇ、収率＞９８％）を得た。
【００４５】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．４２（ｂｒｓ，１Ｈ），４．１０（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６１−３．６４（ｍ，１Ｈ），１．４５（ｑｎ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．１２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５６．１６，６０．４７，４８．２９，２９．９４，２０，７４，１４．６７，１０．３０。
【００４６】
参考例４  ブタ肝臓エステラーゼを用いた加水分解反応
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．９％ＮａＣｌ、０．５ｍＭ化合物（２）あるいは（３）、０．５ｍｇ／ｍｌブタ肝臓エステラーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、２０ｕｎｉｔ／ｍｇ）の反応液組成で総量０．９ｍｌとなるように調製し、キャップ付き試験管を用いて３０℃において６０分間反応させた。反応後にメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７）の混合溶媒を３ｍｌ加え、激しく攪拌した後、試験管を遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分間、室温）にかけて相分離を行い、分取した上層（有機相）の４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）を測定した。反応時間ゼロ分間のＡ４００との値の変化（ΔＡ４００）を加水分解に伴うＡ４００変化とした。また自然加水分解にともなう変化を酵素水溶液の代わりに蒸留水を用いたもので同様に測定し、３０分間の反応での自然加水分解に相当する吸光度変化を上記ΔＡ４００から減じた値を酵素反応によるものとして算出した（ΔΔＡ４００）。これにより化合物（２）に対してΔΔＡ４００＝０．０９１、化合物（３）に対してΔΔＡ４００＝０．１７１の値が得られた。それぞれの値はｐＨ６．０におけるモル吸光係数を３．２×１０３Ｍ−１ｃｍ−１とすると２８μＭ、５３μＭであり、酵素の比活性としては０．００３ｕｎｉｔ／ｍｇ、０．００５ｕｎｉｔ／ｍｇと算出された。この結果からブタ肝臓エステラーゼは通常のエステル化合物と比較してカルバミン酸エステル化合物を加水分解する活性がきわめて低いことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】実施例３で行ったカラムクロマトグラフィーの結果を示した図である。
【図１】
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