(57)【要約】  【課題】  短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成ＤＮＡの固定化量が高く、基板表面との結合強度が高く、かつ熱安定性の高いマイクロアレイを使用し、複数個の遺伝子をＤＮＡ複製酵素ポリメラーゼで増幅した後で、ハイブリダイゼーション法により遺伝子検出する基板上ＰＣＲ法を提供すること。  【解決手段】ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板上において、（１）短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたプローブＤＮＡを基板上に固定化する工程、（２）核酸又はＤＮＡ断片を鋳型として、基板上で着目遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で複製・増幅する工程、及び（３）複製・増幅した着目遺伝子と基板上に固定化されている前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程、を含む遺伝子の検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板上において、（１）短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたプローブＤＮＡを基板上に固定化する工程、（２）核酸又はＤＮＡ断片を鋳型として、基板上で着目遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；ＰＣＲ）で複製・増幅する工程、及び（３）複製・増幅した着目遺伝子と基板上に固定化されている前記プローブＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせる工程、を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
【請求項２】
前記プローブＤＮＡが、所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えたＤＮＡ断片である請求項１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項３】
基板上に固定されるプローブＤＮＡが複数種あり、各プローブは所定数の塩基配列からなり、各々のプローブは各々の着目遺伝子の特徴塩基配列と完全に対応した配列を有するＤＮＡ断片である請求項１記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
前記プローブＤＮＡが、５〜５０個の塩基配列からなる請求項１〜３いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
前記プローブＤＮＡが、前記基板のカルボン酸誘導基と共有結合して、当該基板の表面に固定化されることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
鋳型ＤＮＡ断片が、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片又はゲノムＤＮＡである請求項１〜５いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項７】
基板上でポリメラーゼ連鎖反応を行う際、反応試料に含まれるヌクレオチドモノマーの少なくとも一種がラベルされたものであることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項８】
前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである請求項１〜７いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項９】
前記高分子物質が更に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むものである請求項１〜８いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
前記基板が、プラスチック材料から構成されるものである請求項１〜９いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
前記基板上の一定の区画内に複数のスポットが設けられており、各スポットにプローブＤＮＡが固定化されていることを特徴とする請求項１〜１０いずれか記載の遺伝子の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子(核酸)の検出方法を、基板表面上で標的となるＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて増幅を行う方法を用いて提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、細胞や生体組織試料に由来する多数の遺伝子産物であるｍＲＮＡの測定には、選択的な核酸のハイブリダイゼーション法と多数の核酸固定化技術を組み合わせたＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップと呼ばれる同時に多数の遺伝子発現量を測定する方法が使用される。多様な生物の全遺伝子機能や一遺伝子変異多型（ＳＮＰ）などを効率的に解析するためのＤＮＡマイクロアレイに関した技術開発が進んでおり、従来は、スライドガラスなどの基板表面に固定化した遺伝子の一部分と標的遺伝子断片の間でのハイブリダイゼーションによる検査・分析が利用されている。ＤＮＡチップとは、スライドガラス等の平板担体に多数のオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ分子を整列させたマイクロアレイである。マイクロアレイ基板を用いる遺伝子解析技術は、創薬研究、疾病の診断法やその予防法の開発、環境問題対策（水質汚染、微生物、環境ホルモン等）の研究開発に新しい手段を提供するものとして期待されている。
【０００３】
ＤＮＡチップ技術が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴヌクレオチドやＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションによって決定できるという発見に始まった。ＤＮＡチップ、マイクロアレイの作製技術が開発され、多数の遺伝子発現を対象としてその変異や多型などを短時間で効率よく調べることが可能となった。ＤＮＡチップは、種々の遺伝子に対応した多数のオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡの断片（プローブともいう）を、チップの固体表面に整列させて固定化し、固定した多数のプローブをマトリックスに形成した素子である。通常、1枚のＤＮＡチップ上には、数千から数万のオリゴヌクレオチド個体が固定化されていた。
【０００４】
ＤＮＡチップを用いる方法では、逆転写酵素反応を用いて、生体試料としてのｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）のｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）を合成し、断片化した後に各断片に蛍光標識をつけて標識化ＤＮＡ断片とする。これらの標識化ＤＮＡ断片をＤＮＡチップに接触させ、固定化させてあるオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片にハイブリダイゼーションさせる。標識化ＤＮＡ断片は配列が相補的なオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片と二本鎖を形成・保持され、過剰量の標識化ＤＮＡ断片は、洗浄操作で除去される。その後、蛍光測定によって保持された標識化ＤＮＡ断片の量及び位置を検出し、対応するオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片の種類を調べる。この方法は配列既知の遺伝子の発現をモニターするのに適している。ｃＤＮＡの代わりに、ゲノムＤＮＡ断片のポリメラーゼ複製連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；ＰＣＲと略す）を用いて増幅・蛍光標識化して、同様にプローブとの遺伝子相同性を調べることもできる。
【０００５】
ＤＮＡ固定化マイクロアレイは、スライドガラス或いはシリコン基板表面等にポリ−L−リジン等の高分子を塗布し、その後にＤＮＡを固定する方法により製造されている。また、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成する製造方法も知られている。マイクロアレイの作製法は、既に種々のものが公知である（例えば、特許文献１、非特許文献１、非特許文献２を参照）。
【０００６】
一般的なＤＮＡチップ作成方法は、固定化するオリゴヌクレオチドを有機合成により事前に準備し、そのオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片をスライドガラスなどの基板表面に微量滴下し、その位置に共有結合等によって固定化する。例えば、基板表面にアミノ基と反応する官能基のイソチオシアネート基または活性エステル基を導入しておき、オリゴヌクレオチドの５'末端をアミノ基にしておけば、任意の位置にオリゴヌクレオチドを共有結合によって容易に固定化することができる。
【０００７】
しかし、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリ−L−リジン等の高分子を塗布して長鎖ＤＮＡを固定する方法並びにイソチオシアネート基または活性エステル基を導入しておき、５'末端アミノ化したオリゴヌクレオチドを固定化する方法では、核酸（長鎖ＤＮＡ又は短鎖オリゴヌクレオチド）の固定化状態が不安定であり、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーション工程中やその後の洗浄工程において、核酸が剥がれ落ちやすい。結果として検出感度が下がることがあり、又、再現性が得られない等の欠点がある。更に、この方法では、比較的長い核酸は固定できるが、５０ｍｅｒ以下の５’末端無修飾またはリン酸修飾した短いオリゴヌクレオチドになると、効率よく固定化できないという欠点がある。
一方、半導体技術を用いたＤＮＡ固定化マイクロアレイに於いては、固相合成できるオリゴヌクレオチドの塩基鎖長は２０数塩基であるという技術的課題に加えて、極めて特殊な機械と試薬を必要で製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
【０００８】
一方、ＤＮＡポリメラーゼによる定量的ＰＣＲ法は、液相中で１種の目的遺伝子を複製増幅するには、その遺伝子の塩基配列に相補的な１組の合成オリゴヌクレオチド（通常、プライマーと呼ぶ）より開始されるため、１反応容器中に１種類の遺伝子断片しか複製増幅並びに定量することができなかった。そのため、複数の遺伝子や複数の遺伝子領域を１反応容器内で複製増幅させたい場合、もしくはそのＰＣＲ反応の成否を判定したい場合は目的とする遺伝子数に対応した反応液と反応容器を個別に準備する必要があった。また、このＰＣＲ反応の原理とその増幅効率の良さを利用して、ＰＣＲ反応により細胞の遺伝子産物であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の微量濃度を比較・定量することが一般に行われている（定量的ＰＣＲ法）。この場合も多種類の遺伝子に由来するｍＲＮＡ濃度を測定するために、個々に対応する反応液と反応容器を必要とし、準備・調整が煩雑になり、高価な試薬を使うために実験費用も嵩む。
【０００９】
以上の問題に鑑み、短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドを容易に固定化できて、ＰＣＲ増幅反応条件下で安定にＤＮＡを保持するＤＮＡマイクロアレイ基板の出現が望まれている。
【特許文献１】国際公開WO95／11995号
【非特許文献１】Lockhart, D. J. et.al, Nat. Biotech. 14：1675-1680（1996）、
【非特許文献２】Schena M．et.al, Proc．Natl．Acad．Sci．93：10614-10619（1996）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドの固定化量が比較的に高く、それらＤＮＡ分子と基板表面間の結合強度が高く、熱安定性の高いマイクロアレイを使用し、複数個の遺伝子をＤＮＡ複製酵素ポリメラーゼで増幅した後で、ハイブリダイゼーション法により遺伝子検出することができる基板上ＰＣＲ法(PCR on a chip)の基本原理とその実施方法の技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、前記従来技術の問題点を克服するために鋭意研究した結果、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板と５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチド(ＤＮＡ)の塩基部位に存在するアミノ基の間で共有結合させ固定化する方法を見出した。即ちＤＮＡの塩基部分(アデニン、グアニン、シトシン)のアミノ基NH2と基板表面の電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基との間でアミド結合を作成させることによってＤＮＡを基板に固定化させた短鎖の５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅反応条件下で強固にＤＮＡを保持す能力を持ったＤＮＡマイクロアレイ基板であり、本基板上で、複数個の遺伝子をＤＮＡポリメラーゼで同時に増幅した後で、ハイブリダイゼーション法により遺伝子検出することができるＰＣＲ法の基本原理を見出した。
【００１２】
この方法により、安価な無修飾合成オリヌクレオチドを使用した非常に経済的なＤＮＡマイクロアレイ作成と基板上ＰＣＲ法の応用が可能となり、遺伝子工学、分子生物学、生化学の諸分野や遺伝子診断の医療分野において効率的に遺伝子機能解明ができるＤＮＡマイクロアレイ基板が提供されることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１３】
前記短鎖の５'末端無修飾又はリン酸修飾されたプローブＤＮＡ（固定化プローブ）は、所定の目的遺伝子の特徴配列を含む塩基配列の一塩基を他の塩基に置き換えたＤＮＡ断片であってもよい。これにより、鋳型ＤＮＡ(例えば、ゲノムＤＮＡ)を1組のプライマーでＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する基板上ＰＣＲ法を利用して得られるＰＣＲ産物をターゲットＤＮＡとしてハイブリダイゼーションする、一塩基置換多型（ＳＮＰ：single nucleotide polymorphisms）解析に適用することができる。
【００１４】
前記固定化プローブは所定数の塩基配列からなり、各々のプローブは同属種の特徴的遺伝子配列を複数種の組合せのそれぞれの配列を有するＤＮＡ断片であってもよい。これにより、本発明の基板上ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡとハイブリダイゼーションするフィンガープリンティング法を適用し、生物種の分類に応用できるようになる。
【００１５】
前記鋳型ＤＮＡ断片は、所定のＲＮＡを逆転写酵素で処理して得られるｃＤＮＡ断片であってもよい。これにより、本発明の基板上ＰＣＲ法を、遺伝子発現プロファイル（gene expression profile）解析に適用して、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡからの逆転写産物ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用い簡便な操作で遺伝子解析行うことができるようになる。
【００１６】
また、本発明に係る基板上ＰＣＲ法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に、５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチド(ＤＮＡ)を固定化させ、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片を含む試料が導入された反応系を、基板上で鋳型ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、前記反応系で1組のプライマーを用いたＤＮＡ鎖の複製反応を行い、必要に応じてＤＮＡ鎖の熱変性処理、アニール処理、複製反応および熱変性処理を複数回繰り返すことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法によれば、ある鋳型ＤＮＡを用いて、複数種のＰＣＲ反応を１つの反応容器で実施することが可能となる。これを応用することで、極微量のゲノムＤＮＡや細胞由来ＲＮＡを鋳型に、多数の遺伝子断片を一挙に増幅する、その増幅可能性の判定する、もしくは、多数の遺伝子量を正確に定量することを可能とせしめる。
【００１８】
また、本発明によれば安価な無修飾合成オリヌクレオチドを使用した非常に経済的なＤＮＡマイクロアレイ作成と基板上ＰＣＲ法の応用が可能となり、遺伝子工学、分子生物学、生化学の諸分野や遺伝子診断の医療分野において効率的に遺伝子機能解明ができるＤＮＡマイクロアレイ基板が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
例えばゲノムＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲ反応によりある領域の核酸断片を増幅させる、もしくは特定の遺伝子の発現量（メッセンジャーＲＮＡ：ｍＲＮＡ）を定量するためには、まず、生物試料等を採取し、核酸を抽出後、更に、ＤＮＡもしくはＲＮＡに分離精製する。本明細書において、核酸とは、任意のヌクレオチド及び／又は酵素又は化学合成より修飾されたヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。修飾ヌクレオチドには、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００２１】
核酸中の特定の遺伝子断片、もしくは遺伝子領域をＰＣＲ法で分析、もしくは定量する場合、試料を採取した後、通常は、該試料から核酸を抽出する操作を行う。生体成分から核酸を抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈殿の他、任意の抽出方法を使用し得る。ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。
【００２２】
通常、プライマーとなるオリゴヌクレオチドの塩基配列は、ＰＣＲ反応でＤＮＡ増幅させたい遺伝子領域の３'端の各ＤＮＡストランドに対し相補的になるように５０ヌクレオチドまでの長さで設定しておく必要かある。つまり、増幅させる遺伝子領域１つに対し、通常２種もしくはそれ以上（１組）のプライマーを必要とするので、本発明を実施するためには、この１組のプライマーを液相に存在せしめ、そのＰＣＲ産物とハイブリダイゼーションする特異的な塩基配列を有する１種類以上のプローブが、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板に固定化されていることが必要である。
【００２３】
この基板上ＰＣＲ反応のためのプローブの固定化を行う方法は、プローブとなる各オリゴヌクレオチドを化学合成する時に、その５'末端側に無修飾（ＯＨ）またはリン酸基を有する分子を共有結合させておく方法である。
【００２４】
実際の基板上ＰＣＲの反応は、複数のプライマー組およびＤＮＡポリメラーゼと鋳型となる核酸、基質となるデオキシヌクレオチド３燐酸等をふくむ反応液（液相）を、あらかじめ最適化された各温度で、変性、アニーリング、複製の３段階を繰り返すことにより、液相内に複製されたＤＮＡ断片が蓄積する。ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する基板表面に固定されたプローブＤＮＡは複製ＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションさせ、一種の定量的ＰＣＲ法として、目的とするＰＣＲ反応の成否、収率を判定することができる。本発明での基板上ＰＣＲ法でも、通常のＰＣＲ法と同様、耐熱性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ等が使用しうる。
【００２５】
定量方法として、放射性物質、例えば３２Ｐでラベルされたヌクレオチド３燐酸を用いて増幅産物を内部標識する方法を使用し得る。標識された増幅産物は、基板を洗浄することで遊離の放射性ヌクレオチドを分離することができる。次に、オートラジオグラィー、バイオイメージングアナライザー等の操作によって、基板上にある複数のプローブとハイブリダイゼーションしたターゲットの放射活性として定量することができる。放射性物質の代わりに、蛍光物質や発光物質を標識基質としてＰＣＲ反応で使用し、フルオロイメージングアナライザー、ＣＣＤカメラを用いて増幅産物を定量してもよい。また、望ましくは現在、多用されつつあるＰＣＲ反応随時定量装置（Real Time ＰＣＲ装置）等を用いて、固相のプライマー組が結合させてあった各部位ごとに、ＰＣＲ反応のサイクル経過を追って反応産物量を経時的にモニターすることで、より信頼性の高い核酸の定量ができる。
【００２６】
ここで使用される基板に表面には、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
【００２７】
このホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を特異的に固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプローブを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プローブは、前記このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。
【００２８】
第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００２９】
また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基板表面における鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
【００３０】
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
【００３１】
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。
【００３２】
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。
【００３３】
【化１】
2006230335.tif 000002
（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００３４】
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００３５】
【化２】
2006230335.tif 000003
【００３６】
（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ1はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ2はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００３７】
上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。
【００３８】
上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【化３】
2006230335.tif 000004
【００３９】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００４０】
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
【００４１】
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００４２】
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
【００４３】
表面にプローブが固定化される基板の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００４４】
また、本実施形態の基板のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の基板表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００４５】
具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。
【００４６】
【化４】
2006230335.tif 000005
【００４７】
ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００４８】
上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＤＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プローブを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた基板上への鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プローブをさらに確実に共有結合により固定化して基板上に導入することができる。
【００４９】
なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００５０】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００５１】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。
【００５２】
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００５３】
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
【００５４】
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
【００５５】
このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。
【００５６】
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
【００５７】
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００５８】
また、基板として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００５９】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
【００６０】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００６１】
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００６２】
なお、基板の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性のプラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。
【００６３】
次に、基板の表面へのプローブＤＮＡの固定化方法について説明する。
【００６４】
例えば、（ｉ）基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプローブＤＮＡとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でプローブを固定化し、続いて（ｉｉ）プローブＤＮＡを固定化した以外の基板表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プローブＤＮＡを基板の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００６５】
このプローブＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００６６】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプローブＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
【００６７】
また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプローブＤＮＡを固定化した以外のプラスチック基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
【００６８】
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
【００６９】
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００７０】
本発明に使用するプローブＤＮＡとしては、ハイブリダイゼーションが可能なＤＮＡであれば特に制限されず、例えば、天然又は合成のＤＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）が挙げられる。また、上記ＤＮＡは１本鎖であっても、２本鎖であっても構わない。プローブＤＮＡの鎖長は、ハイブリダイゼーションが可能な長さであれば特に制限されないが、通常５〜５００００塩基、好ましくは５〜１００塩基、更に好ましくは５〜５０塩基である。又、基板上ＰＣＲ法を応用するためには、プローブ自身がポリメラーゼと鋳型ＤＮＡの存在で伸長反応が制限される ５’末端無修飾またはリン酸修飾された合成オリゴヌクレオチドが好ましい。
【００７１】
プローブＤＮＡを溶解する溶媒も特に制限されず、蒸留水、又は通常核酸溶液の調製に用いられる緩衝液、例えばTE緩衝液（10mM Tris塩酸, pH8.0／1mM EDTA）等のTris緩衝液、食塩を含む水溶液、カルボン酸塩を含む水溶液（クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム等）、スルホン酸塩を含む水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸アンモニウム等）、ホスホン酸塩を含む水溶液（リン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム等）を挙げることができる。また、一般に市販されている溶媒、Spotting Solution等も挙げることができる。また、プローブＤＮＡ溶液の濃度も特に制限されないが、通常１ｍＭ〜１ｐＭ、好ましくは10mＭ〜1ｎＭの濃度である。
【００７２】
プローブＤＮＡ溶液をマイクロアレイ基板上にスポットする方法としては、ピペットでプローブＤＮＡ溶液を担体上に滴下する方法、又は市販のスポッター(アレイヤー)を用いる方法等が挙げられる。スポットの形状及びスポット量としては、プローブＤＮＡ溶液をスポットした位置を把握することができる程度であれば、特に制限されないが、形状としては点状又は円状が好ましい。また、好ましいスポット量は10nl〜10mlである。プローブＤＮＡ溶液は、マイクロアレイ基板上に１箇所又は複数箇所にスポットされる。スポットされるプローブＤＮＡ溶液は、１種類でも２種類又はそれ以上であってもよい。尚、担体にプローブＤＮＡが固定されたことを示す陽性コントロールとして、標識した核酸を固定化しておいてもよい。
【００７３】
本発明の好ましい形態においては、プローブＤＮＡ溶液をマイクロアレイ基板上にスポットした後に、２８０nmの波長を含む紫外線を照射することで固定化率を上げることも出来る。また、前記プローブＤＮＡ溶液をスポット後紫外線照射前に乾燥させることができる。前記プローブＤＮＡ溶液の乾燥方法としては、自然に乾燥させてもよく、加熱して乾燥させてもよい。加熱する場合の温度は、通常３０〜１００℃、好ましくは７０〜１００℃である。
【００７４】
次に、マイクロアレイ基板、少なくとも基板のプローブＤＮＡを固定した部位に、波長280nmの成分を含む紫外線を照射する。具体的には、波長280nmを含むブロードな波形を有する紫外線であっても良い。照射量は、累積照射量として通常100mJ/cm2以上、好ましくは200mJ/cm2以上である。
【００７５】
上記のようにして、プローブＤＮＡをマイクロアレイ基板上に固定化することにより、ＤＮＡ固定化マイクロアレイが製造される。本発明の方法により得られるＤＮＡ固定化マイクロアレイは、例えば、ハイブリダイゼーションによる核酸の分析に用いることができる。本発明の方法によりマイクロアレイ基板に固定化されたプローブＤＮＡは、通常のハイブリダイゼーションの条件下で担体から脱離しにくいため、紫外線照射を行わない場合に比べて検出感度が良好で、再現性も良い。ハイブリダイゼーション及びその検出は、通常の固相化核酸(プローブ)を用いたハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。
【００７６】
本発明では、プローブＤＮＡを固定化するのに用いるマイクロアレイ基板として、安価な熱可塑性合成樹脂のプラスチックを用いているため、低コスト化が可能である。また、プラスチック素材は軽量で形成が容易なため、様々な形態のＤＮＡマイクロアレイの作製が容易となる。また、長期保存が可能であり、保存安定性に優れている。
【００７７】
以下に、本発明の遺伝子の検出方法の実施形態の適用例について説明する。
【００７８】
（ＳＮＰ解析）
所定の着目遺伝子の特徴配列を含む塩基配列と相補的な配列を完全マッチ配列とするとき、プローブをこの完全マッチ配列の一塩基を他の塩基に置き換えることで、ＳＮＰ解析を行うことが可能になる。なお、プローブは２５塩基以内の長さを有するものを用いることが好ましい。
【００７９】
すなわち、ある着目遺伝子の特異的配列と一塩基だけミスマッチとなるＤＮＡ断片をプローブとして基板の表面に固定化する。このとき、例えば３８４穴（各穴２５６スポット）、９６穴（各穴１０２４スポット）のマイクロアレイを用いて、各スポットに固定化されたプローブの配列を把握しておくようにする。この特異的配列を含むＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、基板上で鋳型ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、前記反応系で1組のプライマーを用いたＤＮＡ鎖の複製反応を行い、必要に応じてＤＮＡ鎖の熱変性処理、アニール処理、複製反応および熱変性処理を複数回繰り返し、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片の増幅を行う。
【００８０】
また、前述したように反応系内に導入されるサンプル中に放射線または非放射線ラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、液相中の１組のプライマーからＰＣＲ反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、そのラベル化ＤＮＡ断片と基板表面に固定化されたプローブＤＮＡの間でハイブリダイゼーション反応を起こし、洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプローブの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプローブの配列を知ることができる。これにより、ハイブリダイゼーションが起こったプローブの塩基配列がわかり、前記着目遺伝子の特異的配列を含む鋳型ＤＮＡ断片に対する一塩基多型を解析することが可能になる。
【００８１】
（ＳＢＨ解析）
所定数、例えば６〜１０ｍｅｒ、好ましくは８ｍｅｒの塩基配列を有するプローブを、全組合せ、例えば８ｍｅｒのプローブを用いた場合には、全組合せである４8＝６５５３６種類のプローブを用意して、各々のプローブがマイクロアレイのひとつのスポットに固定化させることにより、塩基配列決定（ＳＢＨ）解析を行うことが可能になる。
【００８２】
すなわち、各プローブをマイクロアレイの各スポットにそれぞれ固定化する。このとき、各スポットに固定化されたプローブの配列を把握しておくようにする。未知の塩基配列のＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡ断片として用いて、別のＰＣＲ反応容器内で鋳型ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、前記反応系で1組の５’末端を蛍光ラベル化(例えば、Ｃｙ５)したプライマーを用いたＤＮＡ鎖の複製反応を行い、必要に応じてＤＮＡ鎖の熱変性処理、アニール処理、複製反応および熱変性処理を複数回繰り返し、所望する配列を有する蛍光ラベル化されたＤＮＡ断片の増幅を行う。
【００８３】
また、前述した蛍光ラベル化されたＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を適宜精製・濃縮した後、プローブが固定化されたマイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応を行う。洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、各アレイに固定化されたプローブの配列が把握されていることから、検出されたスポットに固定化されたプローブの配列を知ることができる。これにより、ＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションしたプローブの塩基配列がわかる。
【００８４】
ここで、図１に示したように、基板上で配列未知のＤＮＡ断片４３とハイブリダイゼーションしたスポットを検出した後、検出されたスポットに固定化されているプローブのランダム配列群４５の各配列を取り出し、配列の前後で一塩基ずらしてオーバーラップするように順番付けして順番付け配列群４７が得られる。この順番付け配列群４７に示された順番にしたがって、各プローブの先頭の塩基を読んで行き、最後のプローブについては全塩基配列を読んで得られる塩基配列に基づいて、未知の塩基配列４３を有する鋳型ＤＮＡ断片の塩基配列４９を決定することができる。
【００８５】
なお、プローブが６塩基長の場合は４０９６種類のプライマーを用意する必要があり、プローブが７塩基長の場合は１６３８４種類のプライマーを用意する必要がある。これらのプローブは、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡおよびマイクロ（ｍｉ）ＲＮＡなどの２０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒの比較的小分子の探索、遺伝子配列解析に用いることができる。
【００８６】
また、プローブが８塩基長の場合は６５５３６種類のプローブを用意する必要があり、プローブが９塩基長の場合および１０塩基長の場合は、それぞれ２６２１４４および１０４８５７６種類のプローブを用意する必要がある。これらのプローブは、通常の遺伝子配列解析に用いることができる。
【００８７】
（フィンガープリンティング解析）
このＳＢＨ解析を応用した例として、ある生物種の特徴的な遺伝子配列を抽出したプローブセットを作成し、マイクロアレイ上に固定化する。一方、遺伝子配列未知なる生物種の特定領域、例えば、リボゾームＲＮＡまたはミドコンドリアＤＮＡを前記ＰＣＲ増幅と同様の方法で調整し、蛍光ラベル化されたＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を適宜精製・濃縮した後、プローブが固定化されたマイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応を行う。洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、検出されたスポットに固定化されたプローブの配列を知ることができる。これにより、ＤＮＡ断片とハイブリダイゼーションしたプローブの部分的塩基配列がわかり、そのプローブの組み合わせより、ある生物種の属レベルでの分類に応用できる。
【００８８】
（遺伝子発現プロファイル解析）
図２は、遺伝子発現プロファイル用サンプルとして、ラベルを導入したサンプルを調整および発現プロファイル解析するための従来の方法を示す。
【００８９】
目的に応じた生体組織から全ＲＮＡ（totalＲＮＡ）を抽出する。さらに全ＲＮＡからは逆転写反応によって、ｃＤＮＡを合成する（第一鎖合成）。逆転写反応の際にはｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰを一定の割合で混合したものを加えて、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだｃＤＮＡを合成する。
【００９０】
なお、組織から得た全RNA量が少ない場合は、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、2本鎖のｃＤＮＡ（転写鋳型ＤＮＡ断片）を合成し（第二鎖合成）、それを鋳型としてアンチセンス鎖のＲＮＡ（ａＲＮＡ）を増幅する。このＲＮＡ増幅の際にｄＮＴＰとアミノアリルｄＵＴＰとを一定の割合で混合したものを加えることで、アミノアリルｄＵＴＰを取り込んだａＲＮＡを合成することができる。
【００９１】
続いて、上記のｃＤＮＡまたはアンチセンスアミノアリルＲＮＡ（ａＲＮＡ）をエタノール沈殿した後、０．２Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（NaHCO3-Na2CO3（pH9．0））に溶解する。ＤＭＳＯに溶解しておいた蛍光色素（Ｃｙ３またはＣｙ５）を加えて、常法に従い、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡに取り込ませておいたアミノアリルｄＵＴＰとカップリング反応させ、ｃＤＮＡまたはａＲＮＡを蛍光標識する。遊離の蛍光色素をゲルろ過カラムまたはフィルターなどを用い常法の精製により除去した後、ａＲＮＡについてはさらにフラグメンテーションバッファー（終濃度０．０４Ｍ酢酸トリアミノメタン（ｐＨ８．１）、０．１Ｍ酢酸カリウム、０．０３Ｍ酢酸マグネシウム）を加えて９５℃で１５分間反応後、クラッシュアイスで急冷してａＲＮＡを断片化する。ゲル電気泳動などの方法によりフラグメント化を確認した後、ゲルろ過フィルターで精製・濃縮する。
【００９２】
次に、調製したｃＤＮＡまたはａＲＮＡとマイクロアレイのプライマーとのハイブリダイゼーションを行う。ｃＤＮＡまたはａＲＮＡにハイブリダイゼーションバッファー（最終濃度５×ＳＳＣ、０．５（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ、４×Denhardt's solution）及びホルムアミド（Formamide）を適宜混合し、ＤＮＡマイクロアレイと４５℃〜６０℃で一晩ハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ-０．１（ｖ／ｖ）％ＳＤＳ溶液、２×ＳＳＣ溶液、１×ＳＳＣ溶液で５分間ずつ洗浄したのち、蛍光読取装置(例えば、CRBIO（登録商標） IIe；日立ソフトウエアーエンジニアリング製)を用いて画像をスキャンし、解析ソフト（例えば、DNASISRArray；日立ソフトウエアーエンジニアリング製）を用いてシグナル強度を定量化する。
なお、図２においては、ａＲＮＡの合成を示しているが、途中の工程で得られるｃＤＮＡが解析に十分な量であれば、このｃＤＮＡを直接解析してもよい。
【００９３】
この方法では、複雑な前処理工程を行うため、それぞれの試料で条件選定など設定条件が多くなる上に、全工程で少なくとも５日〜一週間はかかってしまうのが迅速な遺伝子検査の上で問題であった。
【００９４】
本発明においては、解析対象となる遺伝子の特徴配列に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとして基板の表面に固定化する。このとき、例えば３８４穴（各穴２５６スポット）、９６穴（各穴１０２４スポット）のマイクロアレイを用いて、各スポットに固定化されたプローブの配列を把握しておくようにする。この特徴配列を含むＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡ断片として用いてサンプル導入を行い、基板上で鋳型ＤＮＡ鎖を熱変性する温度まで引き上げ、前記反応系の温度をアニール処理する温度まで下げ、前記反応系で1組のプライマーを用いたＤＮＡ鎖の複製反応を行い、必要に応じてＤＮＡ鎖の熱変性処理、アニール処理、複製反応および熱変性処理を複数回繰り返し、所望する配列を有する鋳型ＤＮＡ断片の増幅を行う。
【００９５】
また、前述した反応系内に導入されるサンプル中に放射線または非放射線ラベルされたヌクレオチドモノマーを含めておくことで、液相中の１組のプライマーからＰＣＲ反応により得られるＤＮＡ断片がラベルされ、そのラベル化ＤＮＡ断片と基板表面に固定化されたプローブＤＮＡの間でハイブリダイゼーション反応を起こし、洗浄後の基板に残った蛍光ＤＮＡ断片を含むスポットの検出を行い、発現遺伝子を特定および発現量を定量することが可能になる。すなわち、既知の遺伝子が有する特徴配列と相補的な塩基配列を有するプローブが、特定の細胞由来の全ＲＮＡから得られる鋳型ＤＮＡ断片中に存在するか否かまたどの程度発現しているかが分かる。
【００９６】
この方法によれば、特定の着目遺伝子の発現プロファイル(gene expression profile）解析を、通常の解析において手間と時間がかかるサンプル調製をほとんど行うことなく、ゲノムＤＮＡ又は全ＲＮＡからの逆転写産物ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡ断片として用い簡便な操作で行うことができるようになる。
【００９７】
以上の用途のほかには、
マイクロサテライト解析、染色体異常解析(ＣＧＨ：Comparative Genomic Hybridization)、機能未知（ｎｃ）ＲＮＡ探索などの遺伝子解析用基本ツールへの適用；
これらツールを使用した臓器・疾患別遺伝子発現解析チップ、変異原性試験キット（環境ホルモン）、遺伝子組換え食品検査キット、ミトコンドリア遺伝子配列解析キット、親子鑑定・犯罪捜査のための解析キット、先天性疾患解析キット、染色体・遺伝子異常解析キット、遺伝子診断（着床前・出生前）キット、薬物反応関連遺伝子多型解析キット、脂質代謝関連遺伝子多型解析キット、耳鼻科・眼科領域遺伝子多型解析キットなどの用途別カスタムチップへの適用；
ガン予後予測チップ、医薬品開発（臨床・創薬）用チップ、健康食品開発用チップなどの診断・臨床用カスタムチップへの適用；
微生物限度試験や食品飲料水中の微生物検査などの薬品・食品製造工程、およびう蝕・歯周病関連菌の検出、日和見感染菌の検出などの歯科領域の臨床検査、および食品工場・厨房施設環境検査、飲料・公衆浴場、井戸水などの水質検査における環境検査、および感染症・食中毒の予防、会社従業員の衛生管理などの保健衛生、および耐性菌を含む一般細菌同定、肝炎ウイルス、ヘリコバクターピロリ、肝炎クラミジア菌、エイズウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ウエストナイルウイルス、ノロウイルス（生カキ由来の食中毒）、インフルエンザウイルス、真菌・カビなどの臨床検査などの微生物同定検査キットへの適用
などが挙げられる。
【実施例】
【００９８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００９９】
下記の実験にて、５’末端無修飾あるいは比較対象としてアミノ基修飾されたオリゴＤＮＡプローブを、ホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板の表面に固定化して、熱安定性、再利用性、ハイブリダイゼーション効果について比較検討した。
（実験例１）
【０１００】
（基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板（寸法：76ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）を得た。基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。
（プローブＤＮＡの固定）
５’末端が無修飾またはアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡ（１５〜５０塩基鎖）をＳＳＣバッファー中に溶解させ、１０μＭのオリゴＤＮＡ溶液を調製した。この溶液はマイクロピペットを用い、前記のホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板の表面上に、それぞれ0.2μlスポットした。スポット径は直径約0.5mmであった。この平板を乾燥機に入れ、８０℃で1時間加熱乾燥して、オリゴＤＮＡ（プローブ）を固定化させた。その後、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液中に５分間浸とうさせ活性エステル基を不活化することによりブロッキングを行った後、前記平板を沸騰水中に1分間浸とうして洗浄後、乾燥した。各スポットのオリゴＤＮＡ固定化量は、定法のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）とＣｙ３標識dUTPヌクレオチドを併用してプローブの３‘末端にＣｙ３標識を導入して検定した。結果を表１に示す。
【０１０１】
【表１】
2006230335.tif 000006
【０１０２】
オリゴＤＮＡプローブ塩基鎖長に依存した固定化率が観察される。無修飾オリゴの15mer並びに20merはアミノ基修飾オリゴに比べ、固定化率は低いが、25mer以上の塩基鎖長のオリゴプローブでは固定化率はほぼ同等である。
又、ホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板をブロッキング溶液で不活性化した後では、オリゴＤＮＡは基板表面に全く固定化できなかった。
【０１０３】
（実験例２）
(ハイブリダイゼーション)
実験例１の５’末端が無修飾またはアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡプローブ（１５〜５０塩基鎖）を固定化したホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板をハイブリダイゼーションチャンバーに着装し、5’末端がＣｙ5蛍光ラベル化された５０塩基鎖プローブと相補的な塩基配列を有するターゲット溶液(５００ｐＭ、２０ml)をチャンバー内に注入し、1000rpm振動下、45℃で２時間過熱した。結果を表２に示す。
【０１０４】
【表２】
2006230335.tif 000007
【０１０５】
完全に相補的なターゲットがハイブリダイゼーションした量はプラスチック基板表面に固定されているオリゴＤＮＡプローブの固定化量に依存しており、５’末端が無修飾またはアミノ基修飾オリゴ間の基板表面との結合様式の違いがあるにも係らず、ハイブリダイゼーション効果に差異は見出されない。
【０１０６】
（実験例３）
（ＰＣＲ条件化でプローブ固定量）
実験例１の５’末端が無修飾またはアミノ基で修飾されたオリゴＤＮＡプローブ（１５〜５０塩基鎖）を固定化したホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板をハイブリダイゼーションチャンバーに着装し、ＰＣＲバッファー２０mlをチャンバー内に注入し、９５℃１分−４０℃３分の２ステップのＰＣＲ条件化で３０サイクル後、固定化プローブＤＮＡの蛍光強度を測定した。その結果は表３に示す。
【０１０７】
【表３】
2006230335.tif 000008
【０１０８】
本試験結果から、５’末端が無修飾のオリゴＤＮＡプローブを固定化したホスホリルコリン基を含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板はＰＣＲ条件化で安定であり、基板上ＰＣＲ法による着目遺伝子の増幅が行え、高感度で迅速な遺伝子解析の結果を得ることができる。
【０１０９】
（実験例４）
プローブをホスホリルコリン基の含有した高分子物質により表面コーティング済みのプラスチック基板の表面に固定化して、このプローブをプライマーとして各基板上でＤＮＡ鎖伸長反応を行って、プライマーのＤＮＡ鎖伸長反応(ＭＰＥＣ法：Multiple Primer Extension on a Chip)を検出した。
（ＤＮＡ鎖伸長反応）
図３のステップＳ２０で導入する鋳型ＤＮＡ断片として、所定の５０ｍｅｒの、予め５’末端をＣｙ５にて標識したＤＮＡ断片を用いて、鋳型ＤＮＡ断片の濃度が１００ｐＭとなるような反応系とした。
【０１１０】
続いて、図３のステップＳ３０の熱変性処理、ステップＳ４０のアニール処理、ステップＳ５０の伸長反応をそれぞれ９５℃５分（変性）−９５℃１分（変性）−４０℃３分（アニール）−９５℃１分（変性）とした。
【０１１１】
以下、サンプル中にＣｙ３−ｄＵＴＰを含めておいて各基板において行ったＤＮＡ鎖伸長反応検出におけるＣｙ３−ｄＵＴＰ由来の蛍光強度を測定した結果を以下に示す。
【０１１２】
【表４】
2006230335.tif 000009
【０１１３】
所定の高分子物質で表面処理したプラスチック基板に固定された無修飾のオリゴＤＮＡは、アミノ基オリゴＤＮＡに比べ、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖伸長・増幅の酵素反応速度が低く、基板上の液層でのＰＣＲ反応が優先して起こっている。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ＳＢＨ結果から未知遺伝子塩基配列解析する基本概念を説明する図である。
【図２】従来の遺伝子発現プロファイル用サンプルを調製する例を示す図である。
【図３】ＤＮＡ鎖伸長方法（ＭＰＥＣ法）の基本原理を示すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年9月29日(2005.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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