(57)【要約】【課題】求核性化合物、特に毒性の化合物を高濃度で使用できる非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供すること【解決手段】Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にする酵素による生体内変換を用いて非タンパク質Ｌ−アミノ酸を製造する方法において、前記の方法をｐＨ５．０〜７．４の範囲内のｐＨ値で実施することを特徴とする、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にする酵素による生体内変換を用いて非タンパク質Ｌ−アミノ酸を製造する方法において、前記の方法をｐＨ５．０〜７．４の範囲内のｐＨ値で実施することを特徴とする、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
ｐＨ６．０〜７．１の範囲内のｐＨ値で実施する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｐＨ６．０〜６．９９の範囲内のｐＨ値で実施する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にする非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼとしてＣｙｓＭを使用することを特徴とする、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項５】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼがバッチ中で少なくとも２ユニット／ｍｌの体積活性ＡCysを有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にする非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法において、持続的にＯ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ及び求核性化合物を供給し、同時に非タンパク質Ｌ−アミノ酸を含有する溶液を取り出すことを特徴とする、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを精製された形で使用する、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを担体に固定化した後に使用する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にする非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとしてＯ−アセチル−Ｌ−セリン−含有発酵ブイヨンを使用することを特徴とする、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１０】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ活性を有する休止微生物細胞の形で使用する、請求項１から６までのいずれか１項又は請求項９記載の非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１１】
求核性化合物が、
【化１】
2006325607.tif 000009
のグループから選択される基を有する、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
求核性化合物が、チオ硫酸塩、一般式（１）
Ｈ−Ｓ−Ｒ1                    （１）
［式中、Ｒ1は置換又は非置換の一価の、１〜１５個のＣ原子を有するアルキル基、アルコキシ基、アリール基又はヘテロアリール基を表す］のチオール、セレニド、一般式（２）
Ｈ−Ｓｅ−Ｒ1                  （２）
［式中、Ｒ1は式（１）について挙げられた意味を表す］のセレノール、アジ化物、シアン化物、一般式（３）又は（４）
【化２】
2006325607.tif 000010
［式中、Ｘ及びＹは同じ又は異なり、ＣＲ4又はＮを表し、Ｒ4は−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2-、−ＳＨ、−ＳＯ3-、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、Ｃ1〜Ｃ5−アルキルカルボニル−並びにそのエステル、アミド又は塩又はＲ1を表し、Ｒ1は式（１）について挙げられた意味を表し、
Ｒ2及びＲ3は同じ又は異なり、Ｒ4を表すか、又は式（４）中のＣ1及びＣ2はＲ2又はＲ3の置換基の代わりに架橋［−ＣＲ5Ｒ6−］aによって環を形成するように結合しており、その際、ａは１、２、３又は４を表し、Ｒ5及びＲ6は同じ又は異なり、Ｒ4を表し、１個又は数個の隣接しない基［−ＣＲ5Ｒ6−］は酸素、硫黄又は場合によりＣ1〜Ｃ5アルキル置換されたイミノ基により置換されていてもよくかつ２個の隣接する基［−ＣＲ5Ｒ6−］は基［−ＣＲ5＝ＣＲ6−］又は基［−ＣＲ5＝Ｎ−］により置き換えられていてもよい］のアゾール、一般式（５）又は（６）
【化３】
2006325607.tif 000011
［式中、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はすでに記載した意味を表し、式（６）中のＣ1及びＣ2は置換基Ｒ2及びＲ3の代わりに式（４）について定義された架橋を用いて１つの環を形成するように結合していてもよい］のイソキサゾリンノンのグループから選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
求核性化合物が、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオ酢酸、メルカプトコハク酸、メルカプトピルビン酸、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、１−チオグリセリン、チオフェノール、４−フルオロチオフェノール、４−クロロチオフェノール、４−メルカプトフェノール、ｐ−チオクレゾール、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、２−メルカプトチアゾール、２−メルカプトチアゾリン、２−メルカプトイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール、２−チオフェンチオール、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリミジン、２−チオシトシン、２−メルカプトニコチン酸、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾオキサゾール、６−メルカプトプリン、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸アンモニウム、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウム、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン化アンモニウム、メチルセレノール、エチルセレノール、プロピルセレノール、フェニルセレノール、１，２−ピラゾール、３−メチルピラゾール、４−メチルピラゾール、３，５−ジメチルピラゾール、３−アミノピラゾール、４−アミノピラゾール、ピラゾール−４−カルボン酸、ピラゾール−３，５−ジカルボン酸、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、インダゾール、インダゾール−３−カルボン酸、インダゾール−５−カルボン酸、５−アミノインダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、５−アミノベンゾトリアゾール、アミノピラゾロピリミジン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、イソオキサゾリン−５−オン、３−メチルイソオキサゾリン−５−オン、４−メチルイソオキサゾリン−５−オン、４，５−ジメチルイソオキサゾリン−２−オン、１，２，４−オキサジアゾリジン−３，５−ジオンのグループから選択される、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
求核性化合物の濃度が、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンに対して等モル濃度で存在するように選択される、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
５℃〜７０℃の温度で実施する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
非天然のＬ−アミノ酸を、Ｌ−配置の形の一般式（７）
【化４】
2006325607.tif 000012
［式中、Ｚは、式（８）〜（１９）
【化５】
2006325607.tif 000013
又はそのエステル、エーテル又は塩による一価の基を表し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ及びＹは式（１）〜（６）について記載した意味を表す］のアミノ酸のグループから選択される、請求項１から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
非タンパク質Ｌ−アミノ酸をこの方法の完了後に公知の方法を用いて単離する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
単離を濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿又は晶出を用いて行う、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を用いた生体内変換による非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非タンパク質アミノ酸は、天然においてタンパク質生合成のための成分として使用されずかつ２０種のタンパク質アミノ酸とは明確に区別される。本発明の範囲内で、絶対にタンパク質中に現れる極めて希なアミノ酸のＬ−セレノシステインは、非タンパク質アミノ酸に分類される。
【０００３】
非タンパク質アミノ酸は、例えば薬理作用物質及び農薬作用物質の製造のための重要な化合物である。この非タンパク質アミノ酸は、分子の擬態の種類の作用物質として又は作用物質の一部として天然のアミノ酸の構造を模倣することができ、それにより例えばレセプター相互作用において天然の反応を調節することができる。さらに、この非タンパク質アミノ酸は全く一般的にキラル化合物としてキラルプール「chiral pool」の範囲内で合成成分として用いることができる。
【０００４】
エナンチオマー純粋の形のこの非タンパク質アミノ酸の今までの製造方法は、大抵は煩雑な合成に基づいており、この合成はさらに大抵は特定の化合物だけを得ることができるにすぎない。出発化合物の簡単な交換により多様な化合物を製造することができるのはわずかな方法だけである。たいていの場合には、それ自体大抵すでにキラル成分から出発する化学合成である。他の方法はラセミ体の化学合成を、頻繁に酵素を用いて実施するラセミ分割と組み合わせる。
【０００５】
その他に、プロキラル化合物から出発し、非タンパク質アミノ酸のステレオ選択合成を可能にする若干の酵素による方法も記載されている。
【０００６】
トランスアミナーゼを用いて、α−ケト酸から、アミノ−ドナーとしてＬ−グルタミン酸を用いて多様な非タンパク質アミノ酸を製造することができる（Taylor et al. 1998, TIBTECH 16: 412-418）。他の方法は、ロイシン−デヒドロゲナーゼを用いたＬ−ｔ−ロイシンの合成である（Drauz 1997, Chimia 51: 310-314）。
【０００７】
微生物を用いた直接発酵による非タンパク質アミノ酸の製造のための特に簡単な方法は、特許出願ＤＥ１００４６９３４（同一出願人の２０００年９月２１日出願）に記載されている。この場合、制限解除されたシステイン−物質代謝を示し、従って高レベルのＯ−アセチル−Ｌ−システインを提供する微生物が使用される。この化合物はシステイン−物質代謝においてＬ−システインの生合成前駆体として用いられる。Ｌ−システインはβ位のアセテート基をチオール基に置換することにより生じる。β置換といわれるこの反応は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ［ＥＣ  ４．２．９９．８］の種類の酵素により触媒される。発酵の間での特定の種類の化合物（チオール、アゾールもしくはイソオキサゾリノン）の求核性化合物の添加により、これらの化合物がβ置換に導入され、非タンパク質Ｌ−アミノ酸の産生に達する。製造されたアミノ酸のそれぞれの基の構造は、従って供給された求核性化合物によって決定される。
【０００８】
この方法の場合の問題は、供給される求核性化合物の供給量が高すぎてはならないことである、それというのもこの化合物自体により又は生じたタンパク質により、微生物の物質代謝に関して毒性の作用を引き起こしかねないためである。特に多くのチオール化合物に対してこのことが該当する、それというのも、このチオール化合物はレドックス活性物質として比較的高濃度で毒性を有するためである。さらに、発酵方法にチオール化合物を使用することは極めて問題である、それというのも発酵槽中への強力な通気の際に酸化する傾向があり、技術的予防対策なしに著しい臭気が生じるためである。求核性化合物の内でアジ化物又はシアン化物の供給も、これらの化合物をＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを用いたβ置換に導入することが公知であるが（Flint et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:16053-16067）、その高い毒性のために不可能である。
【特許文献１】ＤＥ１００４６９３４
【非特許文献１】Taylor et al. 1998, TIBTECH 16: 412-418
【非特許文献２】Drauz 1997, Chimia 51: 310-314
【非特許文献３】Flint et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:16053-16067
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、求核性化合物、特に毒性の化合物を高濃度で使用できる非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の課題は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合物と、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下に反応させて非タンパク質アミノ酸にする酵素による生体内変換法において、ｐＨ値をｐＨ５．０〜７．４の範囲内で実施することを特徴とする方法より解決される。
【００１１】
この方法により、多数の非タンパク質の、エナンチオマー純粋な、部分的に新規のＬ−アミノ酸を工業的規模で合成することが可能である。
【００１２】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは公知である。これは今まで多様な植物及び微生物から単離されている。ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の相応する細菌性酵素が最もよく調査されている。この生物中では２種のＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−酵素が発現し、これらはＯＡＳＳ−ＡもしくはＯＡＳＳ−Ｂと命名されている。この所属する遺伝子は同様に公知であり、ｃｙｓＫもしくはｃｙｓＭの名称を有する。両方の酵素は著しく類似の反応メカニズムを有するが、アミノ酸配列をベースとする同一性は４５％にすぎない。
【００１３】
ＯＡＳＳ−Ｂ（ＣｙｓＭ）は、ＯＡＳＳ−Ａ（ＣｙｓＫ）とは反対に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンをチオ硫酸塩と反応させてＳ−スルホシステインにする反応を触媒することができる。この反応は、唯一のイオウ源としてチオ硫酸塩を用いた細菌の成長の際に、重要な役割を有する。
【００１４】
多様な生物からのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の配列比較は、さらに２種の系統発生的グループが存在することを示している（Kitabatake et al., 2000, J. Bacteriol. 182:143-145）。ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び大腸菌（Escherichia coli）のＣｙｓＫは他のユーバクテリウ、メタン生成古細菌及び植物からのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼと一緒に大きなグループを形成する。それに対して、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及び大腸菌（Escherichia coli）のＣｙｓＭは、超好熱性古細菌（例えば、Pyrococcus, Sulfolobus, Thermoplasma）からのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼと一緒に極めて小さな類縁グループにある。
【００１５】
本発明の範囲内でＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ（O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase）は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとスルフィドとからのＬ−システインの合成を触媒することができることを特徴とする。ＣｙｓＭ−類縁の並びにＣｙｓＫ−類縁の酵素は従って本発明の範囲内でＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼである。
【００１６】
ＣｙｓＫ−グループのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼが比較的広い基質スペクトルを有していることが個々の文献（Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemistry 35: 1089-1104; Flint et al., 1996,J. Biol. Chem. 271:16053-16067）に示されているにもかかわらず、今までに、非タンパク質アミノ酸の産生のための工業的使用の可能性は考慮されていなかった。
【００１７】
非タンパク質アミノ酸の酵素による製造の工業的実現を今まで妨げていた決定的理由は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの活性範囲に該当するｐＨ−範囲内でのＯ−アセチル−Ｌ−セリンの不安定性にある。
【００１８】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンはｐＨに依存してＮ−アセチル−Ｌ−セリンに異性化する。この反応は、不可逆的で、例えば７．６のｐＨ値では１％×ｍｉｎ-1の速度で極端に急速である。この反応速度はｐＨ値の低下と共に低下するため、この化合物は例えばｐＨ４．０で安定である。この反応のメカニズムは、アシル基のカルボニル−炭素での脱プロトンしたアミノ基の分子内の求核攻撃に基づく（Tai et al. 1995, Biochemistry 34: 12311-12322）。
【００１９】
それに対して、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの最適ｐＨ値は、ｐＨ８．０の範囲内にあり（Ikegami & Murakoshi, 1994, Phytochemistry 35: 1089-1104; Tai et al.1995, Biochemistry 34:12311-12322）、従って、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンに関する異性化の範囲内で極めて不利である。
【００２０】
この理由から、Ikegami & MurakoshiはＯ−アセチル−Ｌ−セリン、求核試薬、ピリドオキサルホスフェート及び金属イオン（有利にＧａ2+）を用いる非タンパク質アミノ酸のバイオミメティック合成を提案した。この反応は３．５〜５．５のｐＨ範囲内で可能であり、従ってＯ−アセチル−Ｌ−セリンの安定性を保障する。＜４５％の最大収率によりこの方法は有効であるが、しかしながら極めて高くはない。酵素合成と比較した著しい欠点は、エナンチオ選択性の欠如である。
【００２１】
従って、本発明により解決されるもう一つの課題は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−安定性と酵素活性スペクトルとの非相容性にもかかわらず、わずかな異性化で効果的な酵素転化率（＞＞４５％）を保障する、エナンチオマー純粋の非タンパク質アミノ酸の酵素を用いた製造方法を提供することである。
【００２２】
前記の課題は、本発明による方法により解決される、それというのも、
この反応はＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの最適ｐＨ値を下回って実施され、かつ
この酵素は十分に高い量で使用されるためである。
【００２３】
本発明の範囲内で、非タンパク質アミノ酸の製造のための有利なｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜７．４のｐＨ範囲である。
【００２４】
このｐＨ範囲はｐＨ６．０〜７．１の間にあるのが特に有利である。
【００２５】
このｐＨ範囲はｐＨ６．０〜６．９９の間にあるのがさらに特に有利である。
【００２６】
このｐＨ値は酢酸の化学量論的形成にも対抗するため、能動的ｐＨコントロールにより一定に保持するのが有利である。能動的ｐＨコントロールは有利に測定ユニット及び制御ユニットにより達成することができ、前記のユニットはｐＨ値が規準値から逸れた場合にアルカリ液又は酸を供給することにより所望のｐＨ値に調整する。
【００２７】
今まで、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを用いた非タンパク質アミノ酸の合成のための文献に記載された反応は、本発明による方法とは反対に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの最適ｐＨ値の範囲内で、能動的ｐＨコントロールなしで単に分析的規模で実施された。さらに、例外なくＣｙｓＫ−酵素の系統分類グループの酵素を使用していた。
【００２８】
従って、本発明は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを求核性化合物とＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下で反応させて非タンパク質Ｌ−アミノ酸にする非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造方法において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼとしてＣｙｓＭを使用する方法にも関する。
【００２９】
この酵素の十分に高い用量は、酵素反応の最適ｐＨ値の範囲外でも十分な転化反応が行われることを保障する。このような酵素濃度は本発明にとって、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの体積活性ＡCysがバッチ中で少なくとも２ユニット／ｍｌである場合に特に有利である。２〜２００ユニット／ｍｌの活性が特に有利である。この活性測定は例３に記載された試験によって行った。
【００３０】
本発明による方法の展開において、ＣｙｓＭ−酵素の系統的グループからのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼも、非タンパク質アミノ酸の製造のための優れた酵素であることが観察される。基質として適した求核試薬のスペクトルはＣｙｓＫ−酵素のスペクトルよりもさらに広いことが意想外であった。
【００３１】
本発明の特に有利な実施態様においてこの酵素反応は連続的方法として運転される。この場合、反応の間に持続的にＯ−アセチル−Ｌ−セリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ及び求核試薬を供給し、同時にバッチから非タンパク質Ｌ−アミノ酸を含む溶液（生成物溶液）を取り出す。この取り出しは有利に反応バッチ中の体積は変化しないように行うのが有利である。この方法の特別な利点は、流量の平衡が調整されるため、バッチ中にはＯ−アセチル−Ｌ−セリンの持続的に低い濃度が存在し、従って異性化は回避される。バッチ中で＜１．０ｇ／ｌのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−濃度を調整するのが有利である。この値は、溶液の反応バッチ中での平均滞留時間のバリエーションによって制御することができる。連続的反応のためのＯ−アセチル−Ｌ−セリンの貯蔵は、十分な安定性を保障するために酸性のｐＨ値下に、有利にｐＨ４〜５に保持される。
【００３２】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンは今までＬ−セリンのアセチル化による化学合成から得られており、高いＬ−セリン価格によって高価であった。２００１年２月１５日出願の同一出願人の出願明細書ＤＥ１０１０７００２は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの発酵による製造方法を記載している。従って、コストの低い製造システムは使用可能であるが、発酵ブイヨンから生成物の単離はＯ−アセチル−Ｌ−セリンの不安定性に基づき問題であった。
【００３３】
本発明の利点は、例えばＤＥ１０１０７００２により実施された発酵から得られたＯ−アセチル−Ｌ−セリン含有発酵ブイヨンを、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−供給源として直接本発明による方法に使用することができることである。この方法は特に経済的であり、不安定な化合物の単離を回避できる。
【００３４】
非タンパク質アミノ酸の合成のためのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの製造は、有利に、当業者に周知であるような通常の組換えＤＮＡ技術を用いて行われる。
【００３５】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼをコードする遺伝子は、このため適当なベクター中にクローニングされ、引き続き適当な宿主を形質転換する。宿主として、組換えＤＮＡ技術に用いられる各微生物及び組換えタンパク質の発酵による製造のために適した各微生物が適している。
【００３６】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの製造のために有利な微生物は大腸菌（Escherichia coli）である。
【００３７】
原則として、組換えＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ遺伝子の染色体挿入並びに自己複製性のプラスミドベクターに関する使用も可能である。
【００３８】
クローニングの際に、すでに、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の制御された著しく誘導可能な発現を可能にする遺伝的要素（例えば調節可能なプロモータ、ターミネータ）を有するベクターを使用するのが有利である。高いコピー数を有するプラスミド−ベクター、例えばEschericia coliベクターｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４及びこれらの誘導体が特に有利である。著しく誘導可能なプロモータとして、例えばｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ−、ｌａｍｂｄａ  ＰL、ａｒａ−又はｔｅｔ−プロモータが適している。
【００３９】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの産生は例えば組換え微生物株の培養により発酵によって行う。この場合、当業者に公知の培養方法が適用され、この際、このプロセスパラメータはそれぞれの微生物株に適合させなければならない。培養基として、完全培地並びに最少培地を使用することができる。バッチプロセス並びにフィードバッチプロセス（fed-batch-Prozess）を適用することができる。誘導可能なプロモータ系を使用する場合、適当な時点でＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−遺伝子の発現が、相応するインダクタの添加によりスイッチオンされる。十分な産生期間の後に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ含有細胞は公知の方法（遠心分離）によって収穫される。
【００４０】
この方法により製造されたＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−酵素はタンパク質精製の通常の方法によって単離することができる。この場合、典型的な方法（例えば、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動）も使用可能であり並びに「アフィニティタグ（Affinitaetstags）」の使用下での近代的なアフィニティークロマトグラフィーも使用可能である。このアフィニティ付加物をコードする配列は、遺伝子のクローニングの際にコードされる領域と融合されていてもよく、その結果、相応するアフィニティ付加物を有する誘導タンパク質が得られる。これは次いで１工程精製（Ein-Schritt-Reinigung）において単離される。アフィニティ付加物とアフィニティ精製との適当な組合せの例は、ＳｔｒｅｐＴａｇとストレプトアビジン−アフィニティクロマトグラフィーとの組合せであり、IBA, Goettingen, Dにより市販されている。
【００４１】
本発明による方法において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは精製された形で使用することができる。溶液中での反応の他に、酵素を担体へ固定することも可能である。相応する方法は先行技術である。
【００４２】
しかしながら、非タンパク質アミノ酸の製造のためのＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの単離は必須ではない。同様に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性を有する微生物細胞を本発明による方法に直接使用することも可能である。このような微生物株の例は、大腸菌（Escherichia coli）株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５及びＢＬＲ２１（ＤＥ３）／ｐＬＥ４である。これらは実施例１及び２に記載されており、ブラウンシュバイクのドイツ微生物及び細胞培養のための寄託機関ＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ in Braunschweig）に寄託番号ＤＳＭ１４０８８及び１４０８９のもとで寄託されている。
【００４３】
本発明による方法のこの変法において、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの非タンパク質Ｌ−アミノ酸への生体内変換は休止細胞を用いて行う。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン及び求核性化合物の細胞への侵入は、この場合、反応生成物の非タンパク質Ｌ−アミノ酸の放出と同様に細胞を通して行われる。
【００４４】
所望の場合には、細胞の易透化を引き起こす物質で細胞を処理することにより、細胞内部と反応媒体との間の物質代謝を高めることができる。このような物質は、例えばクロロホルム又はトルエンであり、この使用は当業者に公知である。
【００４５】
この方法の有利な実施態様において、非タンパク質アミノ酸を、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの触媒作用下でＯ−アセチル−Ｌ−セリンと求核性化合物との反応により生成し、その際、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは微生物の細胞内に存在する。
【００４６】
発酵により得られる精製されていないＯ−アセチル−Ｌ−セリンを、求核性化合物と、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼによる触媒作用下で反応させることによる非タンパク質Ｌ−アミノ酸の製造は特に有利であり、その際、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼは微生物の細胞内に存在する。
【００４７】
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼにより触媒されるβ−置換のための求核性化合物として、本発明による方法において、次のグループ：
【化１】
2006325607.tif 000002
から選択される基を有する有利な化合物が使用される。
【００４８】
反応バッチに、次の化合物
−  チオ硫酸塩
−  一般式（１）
Ｈ−Ｓ−Ｒ1      （１）
［式中、Ｒ1は、１〜１５個のＣ原子を有する一価の置換又は非置換のアルキル基、アルコキシ基、アリール基又はヘテロアリール基を表す］のチオール
−  セレニド
−  一般式（２）
Ｈ−Ｓｅ−Ｒ1      （２）
［式中、Ｒ1は式（１）に記載した意味を表す］のセレノール
−  アジ化物
−  シアン化物
−  一般式（３）又は（４）
【化２】
2006325607.tif 000003
［式中、Ｘ及びＹは同じ又は異なり、ＣＲ4又はＮを表し、Ｒ4は−Ｈ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＳＯ3-、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、Ｃ1〜Ｃ5−アルキルカルボニル−並びにそのエステル、アミド又は塩又はＲ1を表し、Ｒ1は式（１）について挙げられた意味を表し、
Ｒ2及びＲ3は同じ又は異なり、Ｒ4を表すか、又は式（４）中のＣ1及びＣ2はＲ2又はＲ3の置換基の代わりに架橋［−ＣＲ5Ｒ6−］aによって環を形成するように結合しており、その際、ａは１、２、３又は４を表し、Ｒ5及びＲ6は同じ又は異なり、Ｒ4を表し、１個又は数個の隣接しない基［−ＣＲ5Ｒ6−］は酸素、硫黄又は場合によりＣ1〜Ｃ5アルキル置換されたイミノ基により置換されていてもよくかつ２個の隣接する基［−ＣＲ5Ｒ6−］は基［−ＣＲ5＝ＣＲ6−］又は基［−ＣＲ5＝Ｎ−］により置き換えられていてもよい］のアゾール
−  一般式（５）又は（６）
【化３】
2006325607.tif 000004
［式中、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はすでに記載した意味を表し、式（６）中のＣ1及びＣ2は置換基Ｒ2及びＲ3の代わりに式（４）について定義された架橋を用いて１つの環を形成するように結合していてもよい］のイソキサゾリンノンのグループから選択される求核性化合物を添加するのが特に有利である。
【００４９】
チオ硫酸塩の例は、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム又はチオ硫酸アンモニウムである。
【００５０】
チオールの例は、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト−１−プロパンスルホン酸、メルカプトエタンスルホン酸、２−メルカプトエチルアミン、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオ酢酸、メルカプトコハク酸、メルカプトピルビン酸、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、１−チオグリセリン、チオフェノール、４−フルオロチオフェノール、４−クロロチオフェノール、４−メルカプトフェノール、ｐ−チオクレゾール、５−チオ−２−ニトロ安息香酸、２−メルカプトチアゾール、２−メルカプトチアゾリン、２−メルカプトイミダゾール、３−メルカプト−１，２，４−チアゾール、２−チオフェンチオール、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリミジン、２−チオシトシン、２−メルカプトニコチン酸、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、２−メルカプトベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾオキサゾール、６−メルカプトプリンのグループから選択される化合物である。
【００５１】
セレノールの例は、メチルセレノール、エチルセレノール、プロピルセレノール、フェニルセレノールのグループから選択される化合物である。
【００５２】
アジ化物の例は、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム又はアジ化アンモニウムである。
【００５３】
シアン化物の例は、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム又はシアン化アンモニウムである。
【００５４】
アゾールの例は、１，２−ピラゾール、３−メチルピラゾール、４−メチルピラゾール、３，５−ジメチルピラゾール、３−アミノピラゾール、４−アミノピラゾール、ピラゾール−４−カルボン酸、ピラゾール−３，５−ジカルボン酸、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、インダゾール、インダゾール−３−カルボン酸、インダゾール−５−カルボン酸、５−アミノインダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール−５−カルボン酸、５−アミノベンゾトリアゾール、アミノピラゾロピリミジン、８−アザグアニジン、８−アザアデニンのグループから選択される化合物である。
【００５５】
イソオキサゾリノンの例は、イソオキサゾリン−５−オン、３−メチルイソオキサゾリン−５−オン、４−メチルイソオキサゾリン−５−オン、４，５−ジメチルイソオキサゾリン−２−オン、１，２，４−オキサジアゾリジン−３，５−ジオンのグループから選択される化合物である。
【００５６】
求核性化合物の濃度はバッチ中で有利に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンと等モル濃度で存在するように選択される。
【００５７】
反応温度は有利に５℃〜７０℃に選択される。特に有利な温度範囲は２０℃〜４０℃である。
【００５８】
反応のための溶剤として有利に水が使用される。
【００５９】
反応生成物として、有利にＬ配置の一般式（７）
【化４】
2006325607.tif 000005
［式中、Ｚは次の式（８）〜（１９）
【化５】
2006325607.tif 000006
並びにそのエステル、エーテル又は塩から選択される一価の基を表し、及び
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ及びＹはすでに式（１）〜（６）に挙げられた意味を表す］のＬ−アミノ酸が生成される。
【００６０】
可溶性の非タンパク質Ｌ−アミノ酸は本発明による方法の完了後及び有利に水溶液の分離後にバイオマス及び培養上澄液中で公知の方法を用いて培養上澄液から単離される。このようなアミノ酸の単離のための方法は同様に当業者に公知である。この方法は例えば濾過、遠心分離、抽出、吸着、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、晶出である。難溶性の非タンパク質アミノ酸が存在する場合に、有利に、当業者に公知のような慣用の遠心分離が実施され、その際、バイオマスはできる限り遠心分離上澄液中に残留する。分離された生成物は有利に慣用の方法により溶解及び再沈殿させる。
【実施例】
【００６１】
次の実施例は、本発明をさらに詳説するために用いられる。
【００６２】
例１：ＳｔｒｅｐＴａｇ−配列を有する融合遺伝子としての大腸菌からのｃｙｓＫ−遺伝子もしくはｃｙｓＭ−遺伝子のクローニング
大腸菌からのｃｙｓＫ−遺伝子もしくはｃｙｓＭ−遺伝子のクローニングのために、まずＰｗｏ−ＤＮＡ−ポリメラーゼを用いて次のホスホロチオエート保護したオリゴヌクレオチド−プライマー−ペアのポリメラーゼ連鎖反応を実施した。
【００６３】
【表１】
2006325607.tif 000007
【００６４】
この場合、プライマー配列を介して制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩ（下線のヌクレオチド）のための切断箇所を導入した。鋳型として、E. coli W3110（ATTC 27325）の染色体ＤＮＡを用いた。得られた増幅物を制限酵素ＢｓａＩを用いて消化し、引き続きＥｃｏ３１Ｉ−処理したベクターｐＡＳＫ−ＩＢＡ３（institut fuer Bioanalytik, Goettingen, D）中にクローニングした。このベクターは、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩの名称のアフィニティペプチド（WSHPQFEK 配列番号５）をコードする配列を３′末端に遺伝子融合物としてクローニングすることができる。ｔｅｔ−プロモータを用いたこの遺伝子融合物の発現はＣ末端ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ−付属遺伝子を有するタンパク質を生じる。後者はタンパク質の単離のために利用することができる、それというのもＳｔｒｅｐＴａｇＩＩはストレプトアビジン−カラムへの結合を媒介するためである。
【００６５】
例２：ＣｙｓＫタンパク質もしくはＣｙｓＭタンパク質の精製
ｃｙｓＭ−ＳｔｒｅｐＴａｇ−構築物（ｐＦＬ１４５）を用いてE. coli株ＤＨ５α（Clonetech, Heidelberg, D）中で著しく良好な遺伝子発現を行うことができた。この場合、培養及び発現はInstitut fuer Bioanalytik社, Goettingen, Dの指示に従って実施した。株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５はドイツ微生物及び細胞培養の寄託機関（ＤＳＭＺ）にブタペスト条約に従い、寄託番号ＤＳＭＺ１４０８８で寄託されている。ｃｙｓＫ−ＳｔｒｅｐＴａｇ−構築物（ｐＬＥ１）の場合にはそれに対してこの発現は著しく弱い。ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントとしての遺伝子融合物をＴ７−プロモータ（ｐＲＳＥＴ５ａ）（Stratagene, Heidelberg, D）を有するベクター中へ再クローニングし、株ＢＬＲ２１（ＤＥ３）（Novagen, Darmstadt, D）中での発現により、この場合（ｐＬＥ４）に遺伝子産物の良好な形成が達成された。株ＢＬＲ２１（ＤＥ３）／ｐＬＥ４はドイツ微生物及び細胞培養の寄託機関（ＤＳＭＺ）にブタペスト条約に従い、寄託番号ＤＳＭＺ１４０８９で寄託されている。ＣｙｓＫタンパク質もしくはＣｙｓＭタンパク質の単離は、ストレプトアビジンカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより行い、その際、原則としてInstitut fuer Bioanalytik社, Goettingen, Dの製造元の指示に従って方法を実施した。収量は培養２５０ｍｌを使用した場合、精製されたＣｙｓＫタンパク質３ｍｇもしくは精製されたＣｙｓＭタンパク質４．５ｍｇであった。両方のタンパク質はピリドオキサルホスフェート−コファクターに基づき、明らかに黄色の呈色を生じ、４２０ｎｍでの最大吸光を示した。
【００６６】
例３：酵素活性の測定
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの活性の測定は、「天然の」反応生成物Ｌ−システイン（Ｃｙｓ）の検出により行うか又はＣｙｓＭの場合には他にＳ−スルホ−Ｌ−システイン（Ｓ−Ｃｙｓ）として行った。両方の生成物は、著しく特異的にかつ著しく敏感にGaitonde（1967, Biochem. J. 104: 627-633）による試験を用いて測定される。両方の化合物に対して、別々の検量線を記録した、それというのもスルホシステインを用いた着色複合体は僅かな強度を有するためである。
【００６７】
一般的な試験バッチは、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン（ナトリウム−スクシネート−緩衝液５００ｍＭ中の株溶液２００ｍＭからの添加物、ｐＨ５．５）１０ｍＭ、硫化ナトリウム又はチオ硫酸ナトリウム１０ｍＭ、カリウム−ホスフェート−緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＭ、精製された酵素５μｇ／ｍｌを含有し、これを３７℃でインキュベートした。特異的活性Ａをユニット／ｍｇタンパク質で表示し、つまりμｍｏｌ産物×ｍｉｎ-1×ｍｇ-1タンパク質で表示した。ＡCysはスルフィドを用いたシステイン形成の特異的活性を意味する。ＡS-Cysはチオ硫酸塩を用いたＳ−スルホ−システイン形成の特異的活性を意味する。例２中で単離されたタンパク質を用いるこの特異的活性は次のようであった：
ＣｙｓＫ：ＡCys    １４０ユニット／ｍｇ
ＣｙｓＭ：ＡCys    １９９ユニット／ｍｇ
ＣｙｓＭ：ＡS-Cys  １４５ユニット／ｍｇ
休止細胞中のＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの活性を測定する場合、まず、２０．０の光学密度（６００ｎｍで測定）を有する細胞懸濁液を調整した。引き続き、この細胞をクロロホルムの添加により１０体積％まで浸透させ、室温で５分間インキュベートした。次いで酵素の対して１．０の光学密度を調整し、細胞を用いて上記したようにＯ−アセチル−Ｌ−セリン及びスルフィドもしくはチオ硫酸塩との反応を実施した。この細胞の特異的活性Ａはこの場合μｍｏｌ×ｍｉｎ-1（６００ｎｍで１．０の光学密度を有する細胞懸濁液ｍｌ）；短縮形：ユニット／ｍｌ  ＯＤで示した。
【００６８】
例４：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼＣｙｓＫもしくはＣｙｓＭの触媒作用能力の試験
Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼを用いて非タンパク質アミノ酸を製造するために、他の求核性化合物をスルフィド又はチオ硫酸塩の代わりに反応中で使用した。この検出のために、アミノ酸に対する予備カラム誘導化（Vorsaeulenderivatisierung）を、オルト−フタルジアルデヒドを用いて実施した。この方法を用いて、精製された求核性基質の広範囲なスクリーニングを実施できた。
【００６９】
このバッチはＯ−アセチル−Ｌ−セリン（Ｎａスクシネート−緩衝液５００ｍＭ中の株溶液２００ｍＭからの添加物、ｐＨ５．５）４ｍＭ、求核試薬２０ｍＭ、Ｋ−ホスフェート−緩衝液１００ｍＭ、ｐＨ７．０、精製された酵素、５μｇ／ｍｌを含有した。この反応を酢酸（９６％ｖ／ｖ）１／１００体積を用いて停止し、HP Aminoquantカラム（２００ｍｍ×２．１ｍｍ）を用いるＨＰＬＣによりHewlett Packard, Waldbronn, D,の製造元の指示に従って分析した。
【００７０】
生成された生成物を特性決定するために、ＨＰＬＣ−ＭＳを用いて分子量を検出した。このために、移動層としてギ酸（０．１％ｖ／ｖ）を用いるLuna-C18-カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, D）を用いた。イオン化を正のエレクトロスプレー法で実施した。
【００７１】
次の表は多様な求核試薬に対する２つの酵素ＣｙｓＫもしくはＣｙｓＭの反応性及びＨＰＬＣ−ＭＳ−分析（ＭＨ+）での測定量を示した。
【００７２】
【表２】
2006325607.tif 000008
＊  ＋＋＋  ３０分後に７０％を越える転化率、  ＋＋  ３０分後に４０％を越える転化率、  ＋  ３０分後に１０％を越える転化率、  −  ３０分後に５％未満の転化率。
【００７３】
例５：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼＣｙｓＭの発酵による製造
発酵のため予備培養として、付加的にアンピシリン１００ｍｌ／ｌを含有するＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ）２０ｍｌに、株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（上記参照）を接種し、３０℃で１５０ｒｐｍで振盪器中で一晩中インキュベートした。引き続き全体のバッチを、グルコース５ｇ／ｌ、ビタミンＢ1  ０．５ｍｇ／ｌ及びアンピシリン１００ｍｇ／ｌを補充したＳＭ１培地（Ｋ2ＨＰＯ4  １２ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4  ３ｇ／ｌ；（ＮＨ4）2ＳＯ4  ５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  ０．３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ  ０．０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  ０．００２ｇ／ｌ；Ｎａ3シトレート×２Ｈ2Ｏ  １ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ０．１ｇ／ｌ；Ｎａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ  ０．１５ｇ／ｌ；Ｎａ3ＢＯ3  ２．５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ  ０．７ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ  ０．２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ2×４Ｈ2Ｏ  １．６ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  ０．３ｇ／ｌからなる微量元素溶液１ｍｌ／ｌ）１００ｍｌに移した。この予備培養をさらに３０℃で８時間１５０ｒｐｍでインキュベーションした。
【００７４】
発酵槽として、２リットルの最大培養容量を有するBraun Biotech (Melsungen, D)社のBiostat M-装置を用いた。記載した予備培養（６００ｎｍでの約２の光学密度）を用いて、発酵培地（グルコース１５ｇ／ｌ；トリプトン１０ｇ／ｌ；酵母抽出物５ｇ／ｌ；（ＮＨ4）2ＳＯ4  ５ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4  １．５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  ０．３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ  ０．０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ  ０．０７５ｇ／ｌ；Ｎａ3シトレート×２Ｈ2Ｏ  １ｇ／ｌ及び前記のような微量元素溶液１ｍｌ／ｌ、ビタミンＢ１  ５ｍｇ／ｌ及びアンピシリン１００ｍｇ／ｌ、２５％アンモニアを用いてｐＨ７．０に調整）９００ｍｌを有する発酵槽に接種した。発酵の間に３２℃の温度を調整し、ｐＨ値をアンモニア２５％ｖ／ｖの添加により７．０の値に一定に保持した。この培養に除塵した圧縮空気を１．５ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｍｉｎで通気し、２００ｒｐｍの撹拌機回転数で撹拌した。酸素飽和が５０％の値に低下した後、回転数を制御装置を介して１２００ｒｐｍの値にまで高め、酸素飽和５０％を維持した（ｐＯ2センサを用いて測定、９００ｒｐｍで１００％飽和に校正）。発酵槽中のグルコース含有量が最初１５ｇ／ｌから約５〜１０ｇ／ｌに低下するまで、グルコース溶液５６％ｗ／ｖの添加を行った。この培養を３〜６ｍｌ／ｈの流動速度で行い、その際、発酵槽中のグルコース濃度を０．５〜１０ｇ／ｌの間に維持した。グルコース測定をＹＳＩ社（Yellow Springs, Ohio, USA）のグルコース分析機を用いて実施した。光学密度３０に到達した際に酵素生産をテトラサイクリン３ｍｇ／ｌの添加により誘導した。誘導時間は７時間であった。この時間の後に、試料を取り出し、細胞を培地の遠心分離により分離し、洗浄した。生じた細胞懸濁液を例３に記載したように分析した。チオ硫酸塩を用いて測定したＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性ＡS-Cysは１２ユニット／ｍｌ  ＯＤであった。
【００７５】
この細胞を遠心分離により精製し、液体窒素中で衝撃冷凍し、−２０℃で貯蔵した。
【００７６】
例６：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼＣｙｓＫの発酵による製造
ＣｙｓＫ−酵素の製造のために原則として例５に記載したと同様に行った。もちろんこの場合に株ＢＬＲ２１（ＤＥ３）／ｐＬＥ４を使用した。装入されたグルコース１５ｇ／ｌの消費後に、６０％（ｖ／ｖ）グリセリン溶液を用いた培養を行った。流動速度は９．５ｍｌ／ｈであった。同時に酵素産生をイソプロパノール−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）０．４ｍＭの添加により誘導した。２１時間の誘導時間の後に試料を取り出し、培養基の遠心分離により細胞を分離し、洗浄した。得られた細胞懸濁液を例３に記載されたと同様に分析した。スルフィドＡCysを用いて測定した特異的Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性は２ユニット／ｍｌ  ＯＤであった。
【００７７】
細胞を遠心分離により分離し、液体窒素中に衝撃冷凍し、−２０℃で貯蔵した。
【００７８】
例７：休止細胞を用いたＳ−フェニル−Ｌ−システインの酵素による製造
ｐＨセンサ及びｐＨ制御装置を備えた温度調節可能な容器中に、まずＯ−アセチル−Ｌ−セリン−ヒドロクロリド（Sigma, Deisenhofen, D）を水１００ｍｌに溶かし、その結果、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン２００ｍＭ（２９．４ｇ／ｌ）の最終濃度が生じた。その後、撹拌しながらチオフェノール２００ｍＭを添加した。引き続きこのバッチを５Ｍ  ＮａＯＨの滴定により素早く６．７のｐＨ値にもたらし、すぐにＣｙｓＭ産生株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５の細胞懸濁液を混入した。この細胞懸濁液は１２ユニット／ｍｌ  ＯＤの特異的活性ＡS-Cysを有していた。バッチ中の細胞の光学密度（６００ｎｍで測定）は２．０であり、従ってＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼ−活性は２４ユニット／ｍｌのＡS-Cysの値であった。反応の間にｐＨ値を５Ｍ  ＮａＯＨの供給によりｐＨ制御システムを用いて一定に保持した。
【００７９】
反応の間に白色沈殿物の形成が確認された。３０分後に試料を取り出し、１％（ｖ／ｖ）酢酸を添加した。沈殿物を遠心分離により分離し、同じ体積の２１％（ｖ／ｖ）リン酸中に溶かし、ＨＰＬＣにより分析した。遠心分離の上澄液を同様にクロマトグラフィーにかけた。この分析はＬＵＮＡ  ５μ  Ｃ１８（２）−カラム（Phenomenex, Aschaffenburg, D）の逆相ＨＰＬＣを用いて実施した。溶離剤として、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流動速度で希釈したリン酸（０．１ｍｌ濃リン酸／ｌ）を用いた。
【００８０】
Ｓ−フェニル−Ｌ−システインの含有量は上澄液中で１．６ｇ／ｌ、沈殿物中で２４．８ｇ／ｌであった。これはＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対して６７％の全反応収率に相当した。このバッチをＯ−アセチル−Ｌ−セリン−スルフヒドリラーゼの使用を１２もしくは２ユニット／ｍｌに減少させながらも実施した。しかしながら、これは延長された酵素反応を生じ、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの異性化に基づき５２％もしくは１５％の収率に低下した。
【００８１】
例８：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−フェニル−Ｌ−システインの酵素を用いた製造
純粋物質としてのＯ−アセチル−Ｌ−セリンの代わりに、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン中でこの試験を実施した。このブイヨンはＤＥ１０１０７００２特許出願明細書に記載されたと同様に発酵により得られた。発酵の完了時に、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの安定化は２１％（ｖ／ｖ）リン酸を用いてｐＨ値４．０が調整された。この細胞を遠心分離により分離し、発酵ブイヨンを蒸発によりＯ−アセチル−Ｌ−セリンの濃度を３０ｇ／ｌにした。引き続きブイヨン１００ｍｌにチオフェノール２００ｍＭを添加し、ｐＨ６．７に滴定した後、ＣｙｓＭ−産生株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５を混入した。この活性ＡS-Cysは２４ユニット／ｍｌであった。その後、例７によるように実施した。Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンに対する収率は６５％であった。
【００８２】
ＣｙｓＫ−産生株ＢＬＲ２１（ＤＥ３）／ｐＬＥ４の細胞を有する同様のバッチを供給し、ＡCys  ３８ユニット／ｍｌの使用で７２％の収率が得られた。
【００８３】
例９：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を有するＳ−フェニル−Ｌ−システインの連続的な酵素による製造
反応実施の目標は、高価でかつ不安定な原料のＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対してできる限り高い収率を達成することである。これを保障するために、連続的方法が行われる。この場合、まず例８に記載されたと同様に実施し、単にＣｙｓＭ活性ＡS-Cysに関する使用が４８ユニット／ｍｌに高められた。２０分の反応時間の後に供給ユニットを介してＯ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン（３０ｇ／ｌ）、チオフェノール及びＣｙｓＭ産生株ＤＨ５α／ｐＦＬ１４５（６００ｎｍで２４０ＯＤ、リン酸カリウム緩衝液中でｐＨ７．０）の細胞懸濁液を添加した。流動速度は１５０、２．５もしくは３ｍｌ／ｈであった。同時に、連続的に生成物溶液を反応容器から１５５．５ｍｌ／ｈの流速で取り出すことで開始した。この流速は、反応器中の反応体積が一定に保持され、反応器中の平均滞留時間が３０分であるように選択される。この方法を用いて、バッチ中で一定のＯ−アセチル−Ｌ−セリン−濃度で１．０ｇ／ｌの流動速度が生じた。この低い濃度に基づき（この酵素はそのなお低いＫＭ値に基づきなお極めて良好な活性を有する）Ｎ−アセチル−Ｌ−セリンへの異性化が効果的に最小化することができる。このＯ−アセチル−Ｌ−セリンに対する反応収率は８５％である。
【００８４】
例１０：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたアジ化−Ｌ−アラニンの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、アジ化ナトリウム２００ｍＭを使用した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に４５％の転化率が測定された。
【００８５】
例１１：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたシアノ−Ｌ−アラニンの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、シアン化カリウム２００ｍＭを使用した。シアン化物の添加をまず行い、バッチを６．７のｐＨ値に調整した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性の細胞を用いた３０分の反応時間の後に６５％の転化率が測定された。
【００８６】
例１２：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−スルホ−Ｌ−システインの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、チオ硫酸ナトリウム２００ｍＭを使用した。バッチ中で１６ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に９１％の転化率が測定された。
【００８７】
例１３：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−チアゾール−２−イル−Ｌ−システインの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、２−メルカプトチアゾール２００ｍＭを使用した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に６２％の転化率が測定された。
【００８８】
例１４：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたＳ−１，２，４−チアゾール−３−イル−Ｌ−システインの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、３−メルカプト−１，２，４−チアゾール２００ｍＭを使用した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に７４％の転化率が測定された。
【００８９】
例１５：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたセレノ−Ｌ−システインの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、セレン化ナトリウム２００ｍＭを使用した。セレン化ナトリウムはホウ水素化ナトリウムを用いる亜セレン酸ナトリウムの還元により製造した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に７５％の転化率が測定された。
【００９０】
例１６：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いたフェニル−セレノ−Ｌ−システインの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様にＣｙｓＭ−含有細胞を用いて実施した。チオフェノールに代わり、フェニルセレノール２００ｍＭを使用した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に６２％の転化率が測定された。
【００９１】
例１７：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた１，２，４−チアゾール−１−イル−Ｌ−アラニンの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様に実施した。チオフェノールに代わり、１，２，４−チアゾール２００ｍＭを使用した。この反応のために細胞を１０％（ｖ／ｖ）クロロホルムを用いた処理により易透化した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に４８％の転化率が測定された。
【００９２】
例１８：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−２−イル−Ｌ−アラニンの酵素による製造
この例において、原則として例８と同様に実施した。チオフェノールに代わり、１，２，４−オキサジアゾリジン−２，５−ジオン２００ｍＭを使用した。この反応のために細胞を１０％のクロロホルムを用いた処理により易透化した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に１１％の転化率が測定された。
【００９３】
例１９：Ｏ−アセチル−Ｌ−セリン−含有の発酵ブイヨン及び休止細胞を用いた１，２，４−オキサジアゾリジン−３，５−ジオニル−Ｌ−アラニン（キスカル酸）の酵素による製造
この例において、原則として例８と同様に実施した。チオフェノールに代わり、５−カルボキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール２００ｍＭを使用した。この反応のために細胞を１０％のクロロホルムを用いた処理により易透化した。バッチ中で７２ユニット／ｍｌの活性に相当する細胞を用いた３０分の反応時間の後に５４％の転化率が測定された。
【配列表】
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