(57)【要約】      （修正有）【課題】子宮頸癌抑制の融合蛋白の提供。【解決手段】子宮頸癌抑制の融合蛋白は、ヒトパピロマウイルス１６型のＥ７蛋白ペプチド配列、トランスロケーションのペプチド配列、及びカルボキシル基終端部フラグメント内のペプチドを包含する。本発明は更にＥ７ペプチドと結合された抗体組成物を提示する。トランスロケーションペプチド配列は緑膿菌外毒素の一部由来であると共に、該Ｅ７ペプチドの特定配列を示す。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸癌抑制の融合蛋白において、
ヒトパピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
【請求項２】
請求項１記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、ヒトパピロマウイルス１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
【請求項３】
請求項１記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
【請求項４】
請求項１記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
【請求項５】
請求項４記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部がＫＤＥＬのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
【請求項６】
請求項５記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白。
【請求項７】
子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、そのうち、該子宮頸癌抑制融合蛋白が、
ヒトパピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項７記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
【請求項９】
請求項７記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、ヒトパピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
請求項７記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部がＫＤＥＬのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物。
【請求項１３】
Ｅ７ペプチドと結合された抗体組成物において、Ｅ７ペプチドのヌクレオチド配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１であることを特徴とする、Ｅ７ペプチドと結合された抗体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一種の融合蛋白に係り、特に子宮頸癌抑制の融合蛋白に関する。
【背景技術】
【０００２】
台湾では、子宮頸癌の発生率は成人女性の癌の首位を占める。一般に子宮頸上皮変異或いは早期子宮頸癌発生時にはほぼなんの症状もなく、早期に治療すれば結果は良好であるが、予防に勝る治療はなく、このため関係学者は子宮頸癌の有効な予防方法を探索している。
【０００３】
現在、ヒトパピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）と子宮頸癌の形成との密接な関係が実証されており、ＨＰＶは子宮頸癌の最も主要な発病因子である。ＨＰＶの亞型（例えば１６、１８型）のＤＮＡ配列は７５％から１００％の子宮頸癌病例の癌細胞中に発見されるが、その癌発生メカニズムについてはまだ完全には明らかにされていない。最近、ＨＰＶのハイリスクの亞型１６、１８及び３１の早期ウイルス遺伝子産物Ｅ６とＥ７蛋白が、極めて容易にＲｂとｐ５３遺伝子の産物と結合し並びにその細胞生長抑制機能を中和することが発見され、この現象はＨＰＶが癌発生時に単独で作用するのではなく、環境因子の協同が必要であることを説明するものである。
【０００４】
腫瘤免疫反応は細胞免疫をメインとし、体液免疫はサブである。細胞免疫に参加する反応細胞はＣＴＬ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、ＮＴ細胞、マクロファージを有する。ＣＴＬ細胞はＴ細胞増殖因子インターロイキンー２（ＩＬ−２）により活性化された後、Ｔ細胞により、抗原表出状態の腫瘤細胞上に位置する主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｏｌｅｘ；ＭＨＣ）第１型分子の出現が識別され、溶解酵素を釈放し、腫瘤細胞を殺滅し、並びに腫瘤細胞の増殖を抑制する。ＣＴＬの保護作用は例えばＨＰＶのもたらす腫瘤に対抗する時に特に明らかであり、これにより、もしＨＰＶ抗原とＭＨＣ  Ｉ型分子の複合体が腫瘤細胞の経路における出現を増してＨＰＶ抗原特異性を具備するＣＴＬ例えばＣＤ８+ Ｔ細胞の増殖を誘発できれば、直接腫瘤細胞を抑制して免疫予防或いは治療を行なうことが可能である。
【０００５】
すでに研究により、子宮頸癌はワクチンを打つことで予防できることが実証され、子宮頸癌形成と関係のあるＨＰＶウイルス構造中、Ｅ７蛋白は癌症組織或いは癌化前の損傷した組織に発見されることから、ワクチンを発展標的とする潜在力を有している。このほか、現在発展中のＤＮＡワクチンは効果が長い特性を有するが、その製造コストは高く、ハイリスクである（ウイルス自身が容易に突然変異を誘発されやすい）ことがその発展を制限する主要な原因となっている。しかし、Ｅ７蛋白を子宮頸癌の遺伝子治療に応用する時、ＨＰＶウイルスＥ７蛋白の弱抗原特性により、良好な免疫反応を誘発できず、このため予期される予防或いは治療効果を発生させられない。
【０００６】
一般に、腫瘤の特異性抗原は宿主体内で処理後にＭＨＣ−Ｉ型分子と結合しなければ、細胞表面に表出してＣＤ８+ Ｔリンパ細胞を活性化できない。研究により、子宮頸癌組織中にＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子が含有されることが示されているが、ただしＥ７遺伝子コード抗原特定のＭＨＣ−Ｉ型分子の特定複合体の抗原表出細胞表面における表出が十分でなく、このためＨＰＶ１６  Ｅ７蛋白が宿主体内で表出されずに宿主の免疫監視をすり抜ける。このほか、一般にワクチンとされる蛋白質は生体中に進入する時、多くは細胞に外来抗原と認識され、作用を発揮する前に分解され、蛋白質ワクチンの効果が低減されてしまう。このため蛋白質抗原を完全に細胞質内部に送達できる輸送システムを提供すると共に、生体の有効性細胞免疫反応の発生を誘発させられる方法を発展させることが必要である。
【０００７】
【特許文献１】台湾特許出願第０９２１２６６４４号明細書
【非特許文献１】Ｊ．Ｒ．Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｗ．Ｌｉａｏ，Ｓ，Ｊ．Ｔ．Ｍａｏ，ａｎｄ  Ｃ．Ｎ．Ｗｅｎｇ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８０（２００１）３４７−３５７
【非特許文献２】Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１３：５５３−５６８，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は特定癌症に対して細胞免疫効果を誘発できる融合蛋白を提示し、特にそれは免疫反応を誘発させにくい弱抗原ウイルスである。本発明は有効な輸送システム及び細胞免疫活性化の過程により癌化細胞増殖抑制の目的を達成し、癌化程度を減らし、更には癌症予防の効果を達成する。
【０００９】
本発明の融合蛋白は蛋白融合の生体細胞中に誘発されたＣＴＬ及び抗体の保護作用を受け入れ、これにより感染された細胞を抗原の表出により壊滅させる。本発明はまた子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物を提供して細胞に癌変が発生する前に癌化細胞増殖を抑制し、癌症発生を抑制する目的を達成する。
【００１０】
本発明の提示する子宮頸癌抑制の融合蛋白、Ｔ細胞ワクチン或いは該融合蛋白を含有する医薬組成物は、ＨＰＶ１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメント、トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、及びカルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントを具えている。
【００１１】
本発明の融合蛋白中、ＨＰＶ１６のＥ７蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２である。
【００１２】
本発明の融合蛋白アミノ酸配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３である。
【００１３】
本発明は更にＥ７ペプチドと結合した抗体組成物を提示し、Ｅ７ペプチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に示される。本発明の抗体組成物を利用し、生体内のＥ７ペプチドフラグメントの出現を検出でき、並びに抗原抗体方式でそれを結合させることができる。
【００１４】
本発明は細菌性毒素の特性を利用し、蛋白質を付帯する細菌毒素と標的細胞（抗原表出細胞）の細胞膜表面のレセプターを接合させて、蛋白質を細胞に進入させ、並びに細菌毒素の自然なトランスロケーション特性を発揮させ、更に蛋白質を細胞質に輸送させる。この時、細胞質に位置する外来蛋白質は小ペプチドを生成させられ、並びに続いて主要組織適合複合体ＩＩ或いはＩ型分子（ＭｈｃＩＩ  或いはＭｈｃＩ）と結合され、抗原表出細胞の外部に表出されて、ＭｈｃＩＩ  或いはＭｈｃＩと結合されたものは更にＣＤ４+ Ｔ或いはＣＤ８+ Ｔ細胞により認識され、一連の免疫反応を誘発し、これにより本発明の融合蛋白が免疫向上の効果を達成する。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、周知の技術で使用されている適合する副剤、即ち分散剤或いは保湿剤（例えばＴｗｅｅｎ８０）及び懸濁剤を使用して無菌注射剤、例えば無菌注射水溶液或いは含油性懸濁液に調製される。無菌注射製剤はまた無毒性注射に用いられる希釈剤或いは溶剤中の無菌注射液或いは懸濁液、例えば１，３−ブチレングリコール中の溶液に用いられ得る。使用可能な許容できる担体或いは溶剤として、マンニトール、水、リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。このほか、周知の滅菌、固定油類を溶剤或いは懸濁媒体とする（例えば合成した単酸或いは二酸グリセリド類）。脂肪酸（例えばオレイン酸とそのグリセリド誘導体）、及び天然の医薬上許容される油類（例えばオリーブオイル或いはえごま油、特にその多酸エチル基化の形態）を注射可能な製剤に使用できる。これら油溶液或いは懸濁液もまた長鎖アルコール希釈剤或いは分散剤、或いはカルボキシメチルセルロース或いは類似の分散剤を含有しうる。その他の一般に使用される界面活性剤例えばＴｗｅｅｎｓ或いはＳｐａｎｓ或いはその他の類似の乳化剤或いは生体使用率増強剤（一般に医薬上許容される固体、液体、或いはその他の剤量形式）もまた調製の目的に使用可能である。
【００１６】
内服投薬用の組成物は任意の内服上許容される剤量形式とされ、例えばこれに限定される訳ではないが、カプセル、タブレット、乳剤、及び水性懸濁液、分散剤、と溶液とされうる。内服用途のタブレットの例では、一般に使用される担体としては、乳糖及びコーンスターチがある。一般にはまた常に潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムが添加される。カプセル形式内服投薬に関しては、使用可能な希釈剤として乳糖及びコースターチがある。水性分散剤、或いは乳剤を内服投薬する時は、活性成分と乳化剤或いは懸濁剤の成分が油相中に懸濁或いは分散する。鼻腔噴霧剤或いは吸入剤組成物は医薬処方の技術中、周知の技術により製造され、及び、生理食塩水を製造可能で、ベンジルアルコール或いはその他の適合する防腐剤、生体使用率を増す吸収促進剤、フッ化炭素化合物及び又はその他の技術中で周知の溶解剤或いは分散剤を使用する。インドール含有化合物の組成物は直腸投薬の座薬形式で投薬される。
【００１７】
医薬組成物中の担体は必ず許容されるものでなければならず、それは処方中の活性成分と相容し（及び好ましくは処方を安定させる）及び治療を受ける患者に無害であるということを意味する。その他の担体の実施例は、ゲル態二酸化シリコン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ドデカン硫酸ナトリウム、及びＤ＆Ｃ黄色１０号を包含する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
請求項１の発明は、子宮頸癌抑制の融合蛋白において、
ヒトパピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項２の発明は、請求項１記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、ヒトパピロマウイルス１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項３の発明は、請求項１記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項４の発明は、請求項１記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項５の発明は、請求項４記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部がＫＤＥＬのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項６の発明は、請求項５記載の子宮頸癌抑制の融合蛋白において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２であることを特徴とする、子宮頸癌抑制の融合蛋白としている。
請求項７の発明は、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、そのうち、該子宮頸癌抑制融合蛋白が、
ヒトパピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメント、
トランスロケーション機能を有するペプチドフラグメント、
カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメント、
を具えたことを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項８の発明は、請求項７記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、トランスロケーションペプチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項９の発明は、請求項７記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、ヒトパピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）１６型のＥ７蛋白ペプチドフラグメントのヌクレオチド配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項１０の発明は、請求項７記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部を具えたペクチドフラグメントが緑膿菌外毒素の一部分由来であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項１１の発明は、請求項１０記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部がＫＤＥＬのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項１２の発明は、請求項１１記載の子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物において、カルボキシル基終端部のアミノ酸配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２であることを特徴とする、子宮頸癌抑制融合蛋白を含有する医薬組成物としている。
請求項１３の発明は、Ｅ７ペプチドと結合された抗体組成物において、Ｅ７ペプチドのヌクレオチド配列がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１であることを特徴とする、Ｅ７ペプチドと結合された抗体組成物としている。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は子宮頸癌抑制の融合蛋白を提供し、それは、ヒトパピロマウイルス１６型のペプチド配列、トランスロケーション機能を有するペプチド配列、及びカルボキシル基終端部フラグメント内のペプチドを包含する。本発明は更にＥ７ペプチドと結合された抗体組成物を提示し、そのうち、該Ｅ７ペプチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１に示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
実施例１：Ｅ７ヌクレオチド及びＫＤＥＬ配列の合成
米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースよりＨＰＶ１６  Ｅ７蛋白配列（ＮＣ ００１５２６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）を探し出す。合計９８個のアミノ酸で構成されている。
前述の特許文献１に記載の方法で、ＨＰＶ１６Ｅ７蛋白を大腸桿菌システムにより大量に表現させる。改質の重点は野生ウイルス株のヌクレオチドフラグメントに対して、それがもともと表現するアミノ酸に影響を与えず、有効に大腸桿菌宿主システム中で表現できる情況下で、単一ヌクレオチドの改質を行なう。改質後のヌクレオチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１である。
本実施例で合成するヌクレオチドフラグメントは、合計８対のプライマーを利用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でヌクレオチドフラグメントの合成を行なう。全てのプライマー対野配列については表１を参照されたい。表中の下線を有する配列は特定のフラグメントとの相補の発生を表示する。
まず、ＤＮＡ鋳型無しの重合方式で、ただＦ１及びＲ１プライマーを利用してヌクレオチドフラグメンテーションを行なう。そのうち、この二つのプライマーの３’端部分にはそれぞれ１５個の塩基があり、これは相互に相補の結合を行なう設計とされ、更に重合酵素の読み書き及び補足により１本の二股のＤＮＡ型板重合産物とされる。第１次ＰＣＲ完成後に、１μｌの重合産物をとって第２次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとなし、同時にＦ１及びＲ２プライマーをそれぞれ４μｌと、必要なｄＮＴＰｓ、反応試薬及びＰｆｕポリメラーゼ等を加え、第２次ＰＣＲを開始する。続いて同じ方式で合計８次のＰＣＲを行ない、改質後のヌクレオチド配列を合成する（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）。
同様の方式で、一部が情報ペプチドとされるＫＤＥＬ配列を重合により形成する。そのプライマー配列は表１中のＫ３ＦとＫ３Ｒである。合成されたＫＤＥＬヌクレオチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２のようである。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
実施例２：担体構築
実施例１で重合反応完成後に獲得されたＥ７産物を、５％ポリアクリルアミド寒天ゲルを利用し分離し、並びに産物分子量を根拠とし標的産物を純化抽出する。ｐＥＴ或いはｐＰＥ（△ＩＩＩ）担体を取り（非特許文献１）、制限酵素を利用して二つの担体及び純化後のＥ７フラグメントを同時に処理し、更に同様に５％ポリアクリルアミド寒天ゲルを利用し分離純化を行ない、０．３ｋｂのＥ７配列を含有するフラグメントを取り、Ｔ４リガーゼを利用し、Ｅ７フラグメントと担体でフラグメント長さ７．８４ｋｂで、緑膿桿菌外毒素Ａを含有し酵素毒性を有さない部分のＰＥ（△ＩＩＩ）遺伝子、及びＥ７遺伝子を含有する融合蛋白ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７のペプチドｐＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７、及びフラグメント長さが３．８３ｋｂで、Ｅ７とｐＥＴ２３ａを含有するｐＥ７ペプチドを構築する。
Ｋ３−Ｆ  Ｋ３−Ｒプライマーにより製造されたＰＣＲ  ＤＮＡを制限酵素を利用して切断及び純化した後、ｐＥＴ２３ａのＳａｌｌ−Ｘｈｏｌ位置に接合してフラグメント長さが３．７８ｋｂでｎ’−ＫＤＥＬＲＤＥＬＫＤＥＬ  多型ポリペプチド遺伝子を含有するｐＫＤＥＬ３ペプチドを得る。
同様の方式で、制限酵素Ｓａｌｌ及びＰｓｔ１でｐＫＤＥＬ３ペプチド中でフラグメント長さ１．４７ｋｂでＫＤＥＬ含有配列を切断後に制限酵素Ｘｈｏ１１及びＰｓｔ１で切断した６．５ｋｂのＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７ペプチドＤＮＡに接合し、８．０ｋｂサイズの融合蛋白ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３遺伝子を含有するペプチドｐＰＥ（ＤＩＩＩ）−Ｅ７−Ｋ３を完成する。上述のペプチド構築フローについては図１を参照されたい。
上述の構築完成したペプチドを大腸桿菌ＪＭ１０８菌株中にトランスフォームして保存する。
【００２３】
実施例３：蛋白質純化
上述の構築完成したペプチドをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ菌株中にトランスフォームし、続いて大腸桿菌を２００μｇ／ｍｌの抗生物質アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含有する２００ｍｌの培養液中で培養し、菌液濃度ＯＤ５５０に０．３を達成させる。続いて１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトサイド，Ｐｒｏｍｅｇｅ，ＵＳＡ）を加え、続けて２時間培養し、生長した細胞を遠心分離で収集する。冷凍解凍反復操作の方式で目標蛋白質を付帯する細胞の細胞膜構造をばらばらにし、この時、溶解液１０ｍｌ（０．３ｍｇ／ｍｌ溶菌酵素、１ｍＭのＰＭＳＦ及び０．０６ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを含有する）を加え、室温下で２０分置き、続いて１ｍｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、室温下で１０分置き、その後、１２０００ｘｇで１０分間遠心分離して蛋白質を収集する。さらに１Ｍと２Ｍの尿素で洗浄する。最後に収集した蛋白質封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を８ｍｌの８Ｍ尿素中に溶かす。
続いて市販のｐＥＴ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ純化システム（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）で、実験説明書に照らして以下の実験を行なう。８Ｍ尿素に溶かした蛋白質封入体を先に４ｍｌ  ＮＴＡ−Ｎｉ２+ で取り付け完成した寒天樹脂カラム中に注入する。更に、カラム中に接着した蛋白質を異なるｐＨ（８．０、７．０、６．５、５．４、及び３．５）のバッファ液（６Ｍ  尿素、０．３ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸塩バッファ液及び２０ｍＭ  り−を含有）を注いで収集する。最後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質純度を分析並びに定量する。この蛋白質のアミノ酸配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４である。
【００２４】
実施例４：腫瘤細胞株（ＴＣ−１）の製造
ＨＰＶ１６−Ｅ６、Ｅ７及びｒａｓ癌発生遺伝子を、Ｃ５７ＢＬ／６品系のマウスの主要肺部上皮細胞の癌化に用いる。この癌化細胞株は即ちＴＣ−１であり、周知の方式を利用してＴＣ−１細胞株を維持と生産する。この細胞株をＲＰＭＩ  １６４０中で培養し、同時に１０％（ｖ／ｖ）胎牛血清、５０単位／ｍｌのペニシリン或いはストレプトマイシン、Ｌ−ｇｕｒｕｔａｍｉｎｎ  ２ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、２ｍＭの非必須アミノ酸、及び０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を加え、培養条件として、摂氏３７度、培養箱中を５％のＣＯ2 に維持する。
腫瘤細胞株を使用する当日、トリプシンで培養した細胞を処理並びに収集し、１Ｘ  ＨＢＳＳバッファ液で細胞を２回洗浄し、最後に１Ｘ  ＨＢＳＳバッファ液で細胞を使用したい濃度に希釈する。
【００２５】
実施例５：マウス癌化モデルの生体腫瘤試験
試験を行なう蛋白質サンプル：Ｅ７、ＰＥ（△ＩＩＩ）、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３を１：１０の比例でリン酸塩バッファ液中に希釈し、濃度を０．１ｍｇ／ｍｌとし、まず摂氏３７度で２時間培養し、使用前に更に１０％  ＩＳＡ２０６補助剤（Ｓｅｐｅｃ，Ｆｒａｎｃｅ）と振動方式で混合し、四種類の異なるワクチンを形成する。それぞれ含有抗原量０．１ｍｇの上述のワクチンを取り、同時にマウスのワクチン接種を進行し、並びに２週間後に一度のワクチン接種を追加して行ない、最後の接種の一週間後に、５×１０4 ＴＣ−１腫瘤細胞を免疫マウスの右腿皮下位置に注射して腫瘤生長を誘発し、同時に一組のワクチン未接種のマウスにも注射し、腫瘤の自然生長の情況を観察する。腫瘤生長誘発実験を行なって６０日後、毎週或いは隔週で腫瘤生長の目測と触診を行なう。
結果は図２に示されるようであり、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３融合蛋白（■）免疫を受けた後のマウスは腫瘤生長誘発試験期間にあって、この試験グループに参加したマウスはいずれも腫瘤発生が１００％なく、且つ６０日観察を続けてもいずれも同様の現象を呈した。反対に、Ｅ７、ＰＥ（△ＩＩＩ）、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７等の融合蛋白を受け、融合蛋白注射を受けなかったマウスグループは、腫瘤生長誘発試験期間の後、腫瘤発生無しの記録は最長でただ２０日であった。結果から分かるように、ＰＥ（△ＩＩＩ）及びＫＤＥＬ３配列とＥ７抗原フラグメントの融合蛋白は、ＴＣ−１細胞株マウス癌化誘発試験モデル中で有効に腫瘤生長抑制の免疫効果を発揮した。
【００２６】
実施例６：細胞免疫実験
上述のワクチンで免疫したマウスを一週間後に犠牲試験に使用した後、その脾臓マクロファージ細胞を取り、異なるワクチン処理に属するマクロファージ細胞約３．５×１０5 を含む細胞液と、ＭＨＣ  クラスＩ抗原決定位置を含有するＥ７ペプチド（第４６−５７個のアミノ酸位置）１μｇ／ｍｌを、一緒に１６時間培養し、更にＣＤ８+ 細胞表面標識と細胞内サイトカインＩＦＮ−γの結合染色反応及びフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ）を使用した試験方法については、非特許文献２を参照されたい。
本実施例中、最初にＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３融合蛋白のＥ７特定免疫の誘発に対する影響力を確認する。図３に示されるように、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３融合蛋白を注射したグループにあって、ＩＦＮ−γで製造したＥ７特定性を具えたＣＤ８+ Ｔ細胞前躯物質は、どのグループよりも高いことが分かった（ブランクグループ１０．１±１．４、Ｅ７グループ１４．０±２．１、ＰＥ（△ＩＩＩ）グループ１２．０±２．１、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７グループ３６．０±２．８、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３グループ５６４．０±２８．０，ｐ＜０．０１，ＡＶＯＮＡ）。結果からＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３グループはＥ７グループに較べ、４０倍のＥ７特定性を具えたＣＤ８+ Ｔ細胞前躯物質を誘発しうることが分かる。
【００２７】
実施例７：Ｅ７特定性抗体の測定
実施例５の動物免疫方法のように、０．１ｍｇのＥ７、ＰＥ（△ＩＩＩ）、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３融合蛋白でマウスに免疫し、並びに一週間後と二週間後に一度ワクチンを追加補強する。最後の免疫から７日後にマウス血清を収集する。
９６孔トレイの各孔中を１００μｌのＨＰＶ１６−Ｅ７（０．５μｇ／ｍｌ）融合蛋白で多い、摂氏４度下で培養隔液し、更に２０％胎牛血清を含有するＰＢＳで培養孔中を覆う。マウス血清をＰＢＳで連続希釈し、続いて培養孔中に加え、摂氏３７度で２時間培養する。更に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳで培養孔を洗浄した後、１：２０００のペロキシダーゼ結合ラビットアンチマウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を培養孔内に加え、更に室温下で１時間培養する。その後、培養トレイを洗浄し、並びに１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加えて色を展開させ、最後に１ＭのＨ2 ＳＯ4 で反応を終了する。ＥＬＩＳＡ判読機を利用し、４５０ｎｍの吸収スペクトル下で結果の判読を行なう。
本実施例中、更に実験でＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３が向上できるアンチＥ７抗体の力価を求める。図４に示されるように、免疫後のマウスが生産するアンチＥ７抗体の、血清中で測定されうる数値を、１：１００希釈倍数でみると、ブランクグループは０．６２９±０．０９３、Ｅ７グループは０．８８２±０．８８６、ＰＥ（△ＩＩＩ）グループは０．６９±０．０６、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７グループは０．９３±０．０６、そしてＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３グループは３．５９３±０．５４（ｐ＜０．０１，ＡＶＯＮＡ）であり、明らかに、ＰＥ（△ＩＩＩ）ＫＤＥＬ／Ｅ７融合蛋白で免疫したマウスは、他のグループより高いアンチＥ７抗体を発生することが分かる。
我々の実験結果は、ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３融合蛋白の有するＥ７特定性の免疫反応を十分に表示し、それはＥ７特定性ＣＤ８+ Ｔリンパ細胞及びＥ７特定性抗体の増加を包含する。
得られたデータはいずれも平均値及び標準誤差値（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表示される。実験グループの間の比較データは、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ
Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＰＳＳ  ９．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を利用してＡＮＯＶＡ変異数分析を行なったもので、誤差率が０．０５より低ければ、そのデータが顕著な差異性を有することを表示する。
【００２８】
以上の実施例は本発明を説明するために提示されたものであり、本発明の権利請求範囲は特許請求の範囲の記載に準じ、上述の実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の実施例２のペプチド構築のフローチャートである。
【図２】本発明の実施例２の腫瘤生長試験結果図である。
【図３】本発明の実施例６のＥ７特定性ＣＤ８+ Ｔ細胞前躯物質の誘発結果図である。
【図４】本発明の実施例７のＥ７特定性抗体の測定結果図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月16日(2004.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
実施例１：Ｅ７ヌクレオチド及びＫＤＥＬ配列の合成
米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースよりＨＰＶ１６  Ｅ７蛋白配列（ＮＣ ００１５２６，ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）を探し出す。合計９８個のアミノ酸で構成されている。
前述の特許文献１に記載の方法で、ＨＰＶ１６Ｅ７蛋白を大腸桿菌システムにより大量に表現させる。改質の重点は野生ウイルス株のヌクレオチドフラグメントに対して、それがもともと表現するアミノ酸に影響を与えず、有効に大腸桿菌宿主システム中で表現できる情況下で、単一ヌクレオチドの改質を行なう。改質後のヌクレオチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１である。
本実施例で合成するヌクレオチドフラグメントは、合計８対のプライマーを利用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でヌクレオチドフラグメントの合成を行なう。全てのプライマー対の配列については表１を参照されたい。表中の下線を有する配列は特定のフラグメントとの相補の発生を表示する。
まず、ＤＮＡ鋳型無しの重合方式で、ただＦ１及びＲ１プライマーを利用してヌクレオチドフラグメンテーションを行なう。そのうち、この二つのプライマーの３’端部分にはそれぞれ１５個の塩基があり、これは相互に相補の結合を行なう設計とされ、更に重合酵素の読み書き及び補足により１本の二股のＤＮＡ型板重合産物とされる。第１次ＰＣＲ完成後に、１μｌの重合産物をとって第２次ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとなし、同時にＦ１及びＲ２プライマーをそれぞれ４μｌと、必要なｄＮＴＰｓ、反応試薬及びＰｆｕポリメラーゼ等を加え、第２次ＰＣＲを開始する。続いて同じ方式で合計８次のＰＣＲを行ない、改質後のヌクレオチド配列を合成する（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．１）。
同様の方式で、一部が情報ペプチドとされるＫＤＥＬ配列を重合により形成する。そのプライマー配列は表１中のＫ３ＦとＫ３Ｒである。合成されたＫＤＥＬヌクレオチド配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２のようである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
実施例２：担体構築
実施例１で重合反応完成後に獲得されたＥ７産物を、５％ポリアクリルアミド寒天ゲルを利用し分離し、並びに産物分子量を根拠とし標的産物を純化抽出する。ｐＥＴ或いはｐＰＥ（△ＩＩＩ）担体を取り（非特許文献１）、制限酵素を利用して二つの担体及び純化後のＥ７フラグメントを同時に処理し、更に同様に５％ポリアクリルアミド寒天ゲルを利用し分離純化を行ない、０．３ｋｂのＥ７配列を含有するフラグメントを取り、Ｔ４リガーゼを利用し、Ｅ７フラグメントと担体でフラグメント長さ７．８４ｋｂで、緑膿桿菌外毒素Ａを含有し酵素毒性を有さない部分のＰＥ（△ＩＩＩ）遺伝子、及びＥ７遺伝子を含有する融合蛋白ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７のプラスミドｐＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７、及びフラグメント長さが３．８３ｋｂで、Ｅ７とｐＥＴ２３ａを含有するｐＥ７プラスミドを構築する。
Ｋ３−Ｆ  Ｋ３−Ｒプライマーにより製造されたＰＣＲ  ＤＮＡを制限酵素を利用して切断及び純化した後、ｐＥＴ２３ａのＳａｌｌ−Ｘｈｏｌ位置に接合してフラグメント長さが３．７８ｋｂでｎ’−ＫＤＥＬＲＤＥＬＫＤＥＬ  多型ポリペプチド遺伝子を含有するｐＫＤＥＬ３プラスミドを得る。
同様の方式で、制限酵素Ｓａｌｌ及びＰｓｔ１でｐＫＤＥＬ３プラスミド中でフラグメント長さ１．４７ｋｂでＫＤＥＬ含有配列を切断後に制限酵素Ｘｈｏ１１及びＰｓｔ１で切断した６．５ｋｂのＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７プラスミドＤＮＡに接合し、８．０ｋｂサイズの融合蛋白ＰＥ（△ＩＩＩ）−Ｅ７−ＫＤＥＬ３遺伝子を含有するプラスミドｐＰＥ（ＤＩＩＩ）−Ｅ７−Ｋ３を完成する。上述のプラスミド構築フローについては図１を参照されたい。
上述の構築完成したプラスミドを大腸桿菌ＪＭ１０８菌株中にトランスフォームして保存する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
実施例３：蛋白質純化
上述の構築完成したプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ菌株中にトランスフォームし、続いて大腸桿菌を２００μｇ／ｍｌの抗生物質アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含有する２００ｍｌの培養液中で培養し、菌液濃度ＯＤ５５０に０．３を達成させる。続いて１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトサイド，Ｐｒｏｍｅｇｅ，ＵＳＡ）を加え、続けて２時間培養し、生長した細胞を遠心分離で収集する。冷凍解凍反復操作の方式で目標蛋白質を付帯する細胞の細胞膜構造をばらばらにし、この時、溶解液１０ｍｌ（０．３ｍｇ／ｍｌ溶菌酵素、１ｍＭのＰＭＳＦ及び０．０６ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを含有する）を加え、室温下で２０分置き、続いて１ｍｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、室温下で１０分置き、その後、１２０００ｘｇで１０分間遠心分離して蛋白質を収集する。さらに１Ｍと２Ｍの尿素で洗浄する。最後に収集した蛋白質封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を８ｍｌの８Ｍ尿素中に溶かす。
続いて市販のｐＥＴ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ純化システム（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）で、実験説明書に照らして以下の実験を行なう。８Ｍ尿素に溶かした蛋白質封入体を先に４ｍｌ  ＮＴＡ−Ｎｉ２+ で取り付け完成した寒天樹脂カラム中に注入する。更に、カラム中に接着した蛋白質を異なるｐＨ（８．０、７．０、６．５、５．４、及び３．５）のバッファ液（６Ｍ  尿素、０．３ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸塩バッファ液及び２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌを含有）を注いで収集する。最後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質純度を分析並びに定量する。この蛋白質のアミノ酸配列はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
【図１】本発明の実施例２のプラスミド構築のフローチャートである。
【図２】本発明の実施例２の腫瘤生長試験結果図である。
【図３】本発明の実施例６のＥ７特定性ＣＤ８+ Ｔ細胞前躯物質の誘発結果図である。
【図４】本発明の実施例７のＥ７特定性抗体の測定結果図である。