(57)【要約】【課題】遺伝子治療又は蛋白質の利用により、種々の神経退行性疾患におけるプログラムされた細胞死の阻止を生じることを目的とする。【解決手段】ＨＳＶ−１遺伝子γ1３４．５又はその発現産物ＩＣＰ３４．５の利用による、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の治療方法に関する。この遺伝子及びその発現は、ＨＳＶ−１ニューロビルレンスを必要とすること、特に、ウイルスの複製を与えるニューロンのプログラムされた細胞死のインヒビターとして作用することが示された。本発明は又、修飾したヘルペスウイルスを含む遺伝子治療のための新規なベクター、γ1３４．５の発現又はＩＣＰ３４．５の活性を真似し、強化し又は阻止することの出来る物質の分析方法、癌を含む腫瘍形成性疾患、並びにヘルペス及び他のウイルス感染の、γ1３４．５発現又はＩＣＰ３４．５活性のインヒビターを用いた治療方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現可能なγ1３４．５遺伝子を欠く単純ヘルペスウイルスベクターを含む哺乳動物の腫瘍形成性疾患の治療剤。
【請求項２】
γ1３４．５遺伝子がリーディングフレーム中に停止コドンを含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
γ1３４．５遺伝子が欠失変異を含む、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
単純ヘルペスウイルスベクターがＨＳＶ−１である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
単純ヘルペスウイルスベクターがＨＳＶ−２である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項６】
前記の腫瘍形成性疾患の腫瘍に直接注射により投与する、請求項１に記載の治療剤。
【請求項７】
腫瘍形成性疾患が中枢神経系の腫瘍形成性疾患である、請求項１に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、プログラムされた細胞死をブロックし又は遅延させる方法、特定の細胞への遺伝子治療の送達の方法、並びに癌及び他の腫瘍形成性疾患の治療の方法、並びに腫瘍又はウイルス宿主細胞のプログラムされた細胞死を強化することによるウイルス感染の治療に向けられている。本発明は又、プログラムされた細胞死を阻止し又は増加させる候補物質についてのアッセイにも向けられている。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
ａ．プログラムされた細胞死（アポトーシス）
最近１０年間に、細胞が実際に内部でプログラムされてそれらのライフサイクルのある時点において死ぬという考えが科学界においてますます受け入れられるようになってきた。能動的細胞機構であるプログラムされた細胞死（又はアポトーシス）は、幾つかの重要な密接な関係を有する。第１に、かかる能動的プロセスは、細胞数並びに細胞の生物学的活性を制御する更なる手段を提供することが出来る。第２に、突然変異又はアポトーシスを強化する細胞事象は、未熟細胞死を生じ得る。第３に、特定の能動的細胞機構に依存するある型の細胞死は、少なくとも潜在的に、抑制することが出来る。最後に、予めプログラムされた細胞死の阻止は、異常型細胞の生存へと導くことが予想され、発癌に寄与することが予想され得る。
【０００３】
一般に、アポトーシスは、核濃縮及びＤＮＡのオリゴヌクレオソーム断片への分解を含む明確な形態学的変化を含む。ある種の環境において、アポトーシスが蛋白質合成の変化によって誘発され又は先行されることは明らかである。アポトーシスは、細胞破壊のための非常に巧みなプロセスを提供するように見えるが、そこでは、細胞は特異的認識及び食作用及びその後のバースティングによって処分される。この方法で、細胞は、周囲の細胞にダメージを与えることなく組織から除去され得る。こうして、プログラムされた細胞死は、形態発生、免疫系におけるクローン選択、他の組織及び器官系における正常細胞の成熟及び死を含む多くの生理学的プロセスにおいて重要であることを理解することが出来る。
【０００４】
細胞が環境の情報に応答してアポトーシスを受け得ることも示された。例としては、未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン等の刺激の出現、或は成熟リンパ球からのインターロイキン２の撤去又は造血前駆細胞からのコロニー刺激因子の除去等の刺激の消失がある（総説としては、Williams,Cell,85;1097-1098,June28,1991を参照されたい）。更に、神経成長因子の確立された神経細胞培養物からの除去の応答は標的除去に似ていることが最近示され且つこの応答に含まれる細胞機構が神経成長因子除去に続く自殺プログラム又はプログラムされた細胞死の引き金であることが仮定された（Johnson等、Neurobiol.of Aging,10:549-552,1989）。これらの著者は、「死カスケード」又は「死プログラム」を提案しており、栄養因子奪取が新規なｍＲＮＡの転写及びそれに続くｍＲＮＡの、最終的に「キラー蛋白質」を生成するシーケンスにおいて作用する死関連蛋白質への翻訳を開始させることを想像している。かかる細胞内機構は、上述のアポトーシスの特徴とよく適合するように見える（例えば、有害物質の放出及び組織の完全性の崩壊を伴わない特定の細胞の死）。更に、著者等は、巨大分子合成のインヒビターが神経成長因子の不在下でニューロンの死を阻止したことを示している。
【０００５】
研究は、腫瘍細胞が人為的に誘発したアポトーシスによって除去され得ることの可能性を探究することへと導かれた。ＡＰＯ−１モノクローナル抗体は、幾つかのトランスフォームしたヒトＢ及びＴ細胞系統においてアポトーシスを誘導することが出来る。この抗体は、表面蛋白質に結合して正の死誘導信号を真似るか又は生存に必要な因子の活性をブロックすることによるかの何れかによって作用することが出来よう。抗ＦＡＳ抗体も又同様の効果を有し、ＦＡＳ抗原の遺伝子の最近のクローニング及び配列決定は、それが６３キロダルトンの膜貫通レセプターであることを示した（Itoh等、Cell 66:233-243(1991)）。
【０００６】
しかしながら、ＡＰＯ−１もＦＡＳも、排他的に細胞死の引き金として機能することは出来ないということに注意することは重要である。両者は、別の環境下では全く異なる応答を活性化し得る細胞表面レセプターである。更に、これらの抗原は、腫瘍細胞に限られず、それらの正常細胞における効果は確かに重要な問題である（もはやこれらの抗原を示さない変異体の出現があり得る）。
【０００７】
ある範囲の細胞毒性剤（癌治療において用いられる幾つかを含む）により誘導された細胞死も又、アポトーシスの形成が見出された。事実、腫瘍細胞におけるアポトーシスの不足は、細胞数の生理学的制御の回避のみならず、自然防御及び臨床的治療の両者に対する抵抗への寄与において基本的に重要であり得よう。
【０００８】
ｂｃｌ−２遺伝子の発現はアポトーシスによる死を阻止することが出来ることも示された。ｂｃｌ−２遺伝子は、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫である最も普通のヒトリンパ腫の高い割合において染色体１４と１８との間の転座のブレークポイントから単離された。転座は、ｂｃｌ−２遺伝子と免疫グロブリン重鎖遺伝子座を一緒に運び、Ｂ細胞において、異常に増加したｂｃｌ−２発現を生じる。続いて、Henderson等（Cell,65:1107-1115,1991）は、エプスタイン−バールウイルスに感染した細胞における潜在的膜蛋白質１の発現は、感染Ｂ細胞を、ｂｃｌ−２遺伝子の発現を誘導することによりプログラムされた細胞死から保護することを示した。Sentman等（Cell,67:879-88,1991年11月29日）は、ｂｃｌ−２遺伝子の発現が、多発型のアポトーシスを阻止し得るが胸腺細胞におけるネガティブ選択を阻止し得ないことを示し、Strasser等（Cell,67:889-899,1991年11月29日）は、ｂｃｌ−２トランス遺伝子の発現は、Ｔ細胞死を阻止し且つ胸腺の自己検閲を混乱させ得るということを示した。Clem等（Science,245:1388-1390,1991年11月29日）は、バクロウイルス遺伝子産物を昆虫細胞におけるアポトーシスをブロックする原因として同定した。
【０００９】
ｂ．ヘルペスウイルス感染及びニューロビルレンス
ヘルペスウイルスのファミリーは、多くの病気の原因因子であるので臨床的に大いに興味のある動物ウイルスを含んでいる。エプスタイン−バールウイルスは、Ｂ細胞リンパ腫に関係し；サイトメガロウイルスは、ＡＩＤＳ患者に対して最大の感染脅威を与え；そして水痘−帯状疱疹ウイルスは、水痘及び帯状疱疹が深刻な健康上の問題である世界のある部分に大いに関係している。性的に伝染する単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染の発病率の世界的な増加が、新生児ヘルペスの増加を伴って、過去１０年間に起きた。活性な潰瘍性病変又は無症候性排泄患者に触れることは、感染因子の伝染を生じ得る。伝染は、粘膜表面及びすりむいた皮膚におけるウイルスへの露出により、ウイルスの浸入及び上皮及び真皮の細胞内でのウイルス複製の開始を与える。臨床的に明らかな病変に加えて、特に知覚神経細胞内の潜在的感染が持続し得る。種々の刺激がＨＳＶ感染の再活性化を引き起こし得る。従って、これは撲滅するのが困難な感染である。この災いは、治療様式の不足の故に、抑制されずに大いに広がった。
【００１０】
公知のヘルペスウイルスは、４つの重要な生物学的特性を共有しているらしい：
１．すべてのヘルペスウイルスは、核酸代謝に関与する酵素（例えば、チミジンキナーゼ、チミジレートシンテターゼ、ｄＵＴＰアーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ等）、ＤＮＡ合成に関与する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ、プライマーゼ）、及び、可能であれば、蛋白質のプロセッシングに関与する酵素（例えば、プロテインキナーゼ）の大きい配列を、酵素の正確な配列があるヘルペスウイルスと他のものとで幾分か変化し得るにもかかわらず、規定する。
２．ウイルスＤＮＡの合成とキャプシドのアセンブリーの両者が核内で起きる。ある種のヘルペスウイルスの場合には、ウイルスが細胞質を通過する際に脱エンベロープされ及び再エンベロープ形成し得ることが要求された。これらの結論の長所に関係なく、キャプシドのエンベロープ形成は、核膜を通過する際に必須である。
３．感染性の子孫ウイルスの生成は、常に、感染細胞の不可逆的破壊を伴っている。
４．現在まで調べられたすべてのヘルペスウイルスは、それらの天然の宿主内に潜在し続けることが出来る。潜在性ウイルスを有する細胞において、ウイルスゲノムは、閉環状分子の形態を取り、ウイルス遺伝子の少数のサブセットのみが発現している。
【００１１】
ヘルペスウイルスは又、それらの生物学的特性を大いに変化させる。幾つかは、広い宿主細胞範囲を有して多くの結果を引き起こし、感染したそれらの細胞を急速に破壊する（例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２等）。他（例えば、ＥＢＶ、ＨＨＶ６）は、狭い宿主細胞範囲を有する。幾つかのヘルペスウイルス（例えば、ＨＣＭＶ）の増殖は、ゆっくりしているようである。すべてのヘルペスウイルスは特定の細胞セットにおいて潜在し続けるが、それらが潜在し続ける正確な細胞はウイルスごとに異なる。例えば、潜在性ＨＳＶは、知覚神経から回収されるが、潜在性ＥＢＶは、Ｂリンパ球から回収される。ヘルペスウイルスは、それらが引き起こす病気の臨床的現れに関して異なっている。
【００１２】
単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）は、ヒトが出会う最も一般的な感染性因子のうちにある（Corey及びSpear,N.Eng.J.Med.,314:686-691,1986）。これらのウイルスは、穏やかで有害な感染（再発性単純ヘルペスラビアリス等）から重い生命を脅かす病気（年長の子供及び成人の単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）又は新生児の播種性感染等）に及ぶ広いスペクトルの病気を引き起こす。ヘルペス感染の臨床的結果は、初期の診断及び迅速な抗ウイルス治療の開始に依存している。しかしながら、幾つかの成功した治療にもかかわらず、真皮及び表皮の病変は再発し、新生児のＨＳＶ感染及び脳の感染は高い罹患率及び死亡率と結び付いている。現在可能なよりも一層早い診断は、治療の成功を改善するであろう。更に、改善された治療が、非常に必要とされている。
【００１３】
外来の援助が、特に化学薬品の形態で、感染した個人に与えられてきた。例えば、ヘルペスウイルス複製の化学的インヒビターは、種々のヌクレオシドアナログ例えばアシクロバー（acyclovir）、５−フルロデオキシウリジン（ＦＵＤＲ）、５−ヨードデオキシウリジン、チミンアラビノシド等によって達成された。
【００１４】
幾つかの保護が実験動物モデルにおいて、多特異的又は単一特異的抗ＨＳＶ抗体、ＨＳＶプライムドリンパ球及び特定のウイルス抗原に対するクローン化Ｔ細胞により提供された（Corey及びSpear,N.Eng.J.Med.,314:686-691,1986）。しかしながら、満足出来る治療は見出されていない。
【００１５】
単純ヘルペスウイルスのγ1３４．５遺伝子は、このウイルスのＬコンポーネントに隣接するゲノムの逆方向反復領域内にマップされる。この遺伝子の発見及び特性決定は、幾つかの論文に報告された（Chou及びRoizman,J.Virol.,57:629-635,1986,及びJ.Virol.,64:1014-1020,1990;Ackermann等、J.Virol.,58:843-850,1986）。鍵となる特徴は、(i)この遺伝子が、２６３アミノ酸の長さの蛋白質をコードしていること；(ii)その蛋白質が、コード配列の中央に１０回反復するＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ３量体を含んでいること；(iii)この蛋白質が、天然で塩基性であり、多数のＡｒｇ及びＰｒｏアミノ酸からなること；(iv)この遺伝子のプロモーターが、ウイルスの幾つかの必須のウイルス機能の働きもするゲノムのａ配列中にマップされること；(v)γ1３４．５遺伝子の発現に必須のシス作用性要素が、ａ配列特にＤＲ２（２２回反復する１２塩基対配列）及びＵb要素内に含まれることである。この型のプロモーター構造は、この遺伝子にユニークであり、他のウイルス遺伝子プロモーターと共通でない。
【００１６】
中枢神経系（ＣＮＳ）において、ウイルスを複製させ、増殖させ及び広げる能力におけるγ1３４．５遺伝子の機能は、組換えウイルスのセットにより及びマウスの脳における致命的脳炎を引き起こすそれらの能力を試験することにより示された。この遺伝子を欠く突然変異ウイルスは、それ故、ＣＮＳ及び眼の中で増殖し広がる能力を喪失し、それ故、非病原性である（Chou等、Science,250:1212-1266,1990を参照されたい）。
【００１７】
【非特許文献１】Williams，Cell,85;1097-1098,June28,1991
【非特許文献２】Johnson等、Neurobiol.ofAging,10:549-552,1989
【非特許文献３】Itoh等、Cell 66:233-243,1991
【非特許文献４】Henderson等、Cell,65:1107-1115,1991
【非特許文献５】Sentman等、Cell,67:879-88,1991年11月29日
【非特許文献６】Strasser等、Cell,67:889-899,1991年11月29日
【非特許文献７】Clem等、Science,245:1388-1390,1991年11月29日
【非特許文献８】Corey及びSpear，N.Eng.J.Med.,314:686-691,1986
【非特許文献９】Chou及びRoizman，J.Virol.,57:629-635,1986
【非特許文献１０】Chou及びRoizman，J.Virol.,64:1014-1020,1990
【非特許文献１１】Ackermann等、J.Virol.,58:843-850,1986
【非特許文献１２】Chou等、Science,250:1212-1266,1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
γ1３４．５遺伝子は、神経細胞を、ニューロン細胞におけるプログラムされた細胞死（アポトーシス）の特徴的な方法における全蛋白質合成の停止から保護することによって機能する。このプロモーターは、ストレス応答要素を含むようであり、ＵＶ照射にさらされること及び成長因子奪取によりトランス活性化される。これらのデータは、γ1３４．５遺伝子が神経細胞中でストレス時にトランス活性化されてアポトーシスを予防することを示唆している。
【００１９】
それ故、これらの発見の重要性は、γ1３４．５が生存能力を拡大し又は神経細胞に保護を与え、その結果、この例では、ウイルスが複製して細胞から細胞へと広がること（ニューロビルレンスと定義する）が出来るという事実にある。この保護は、細胞が受ける他の毒性因子又は環境ストレスに対しても拡大し得るらしい。このニューロンの性質に関する重要な面は、ヒトの他の如何なる細胞とも違って、脳、眼又はＣＮＳにおけるニューロンは再生せず、そのことが多くの神経障害疾患の基礎を形成しているという事実である。細胞の生命を死又は退行から延命させる如何なる遺伝子又は薬剤も、神経退行の領域に重大な影響を有することが予想され得る。
【００２０】
γ1３４．５及び抗アポトーシス因子の感染細胞における役割は、解明の初期段階にある。最近の研究は、エプスタイン−バールウイルスが感染細胞の生存能力を、潜在的膜蛋白質１（ＬＭＰ１）誘導されたｂｃｌ−２の上方制御を通して増大させることを示唆した。その系においては、ＬＭＰ１誘導されたｂｃｌ−２上方制御がウイルス感染したＢ細胞に生理学的選択を回避して長生きの記憶Ｂ細胞プールへの直接的アクセスを獲得する潜在能力を与えるということが仮定される。しかしながら、ｂｃｌ−２発現は、ある種の状況例えばインターロイキン２又はインターロイキン６の撤去においてアポトーシスを抑制することが出来ない。更に、ｂｃｌ−２発現の作用の細胞内機構は未知のままである。
【００２１】
ｃ．プログラムされた細胞死及び病気治療
上述のことに照らして、ＣＮＳ細胞におけるγ1３４．５の発現が保護の格別な特質をウイルス感染並びに天然の及びストレスで誘導されたアポトーシスに対してニューロンに加えたことは明らかである。この保護の格別の特質の評価は、中枢神経系（ＣＮＳ）異常の制御及び治療のための新規且つ革新的な手段に利用することが出来る。特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルーゲーリッグ病等（これらの病因はアポトーシスの型に帰することが出来、これらの治療は現在非常に貧弱である）を含むＣＮＳ退行性疾患の治療は、γ1３４．５遺伝子を遺伝子治療で用いるか又はγ1３４．５によって発現された蛋白質を治療剤として用いることによって有意に改善され得るであろう。これは、記載したようにニューロン細胞は有糸分裂後に再生しないという事実のためにかかる細胞の死が関係している場合に特に重要である。限られたニューロン数しかないので、それらの保護及び維持のための利用し得る方法及び薬剤を有することは重要である。γ1３４．５は又、γ1３４．５の効果を真似し及び生物学的に誘導されたプログラムされた細胞死のストレスをブロックする物質のアッセイのために非常に有用な遺伝子である。
【００２２】
更に、ＨＳＶ−１ウイルス（適当に修飾して非病原性にしたもの）は、ニューロンへの遺伝子治療の送達のためのビヒクルとして働くことが出来る。ＨＳＶ−１ウイルスは、世界のヒト集団の９０％の知覚神経節のニューロン内に存在する。このウイルスは、逆向性軸索輸送を介してニューロン細胞体中にのぼる（感染部位から神経向性プロセスによって軸索に到達する）。一度ニューロン細胞体内に入れば、このウイルスは、何らかの形態のストレス（例えば、ＵＶ露出、第２のウイルスの感染、外科手術又は軸索切断）がウイルス複製を誘導するまで休止し続ける。記載したように、ＨＳＶ−１のベクターとしての利用は、安全な非病原性のベクターとして働くための欠失変異体の構築を必要とする。かかるウイルスは、ニューロンの遺伝子治療のための優れたベクターとして作用するであろうし又、その利用は、少数の遺伝子治療しか中枢神経系の血液脳関門を通過して遺伝子を送達する手段を提供しないので、特に重要な開発となろう。
【００２３】
更に、他のウイルス例えばＨＳＶ−２、ピコルナウイルス、コロナウイルス、エウニアウイルス、トガウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス又はワクシニアウイルスは、γ1３４．５遺伝子治療のためのベクターとして利用することが出来る。ＨＳＶ−１ウイルスの利用に関して論じたように、これらのベクターもそのような方法で変化させて非病原性にすることが出来よう。適当に変異させたウイルスの利用に加えて、トランスフェクトした多能性神経細胞系統の移植も、血液脳関門を回避するγ1３４．５遺伝子のＣＮＳへの送達のための手段を提供する。
【００２４】
更に、γ1３４．５遺伝子に特定の突然変異を有するＨＳＶ−１ウイルスの利用は、ＣＮＳ及び身体の他のすべての部分における腫瘍形成性疾患の治療方法を提供する。「γ1３４．５マイナス」ウイルスは、アポトーシスを誘導することが出来、それ故、宿主細胞死を引き起こすが、このウイルスは複製して広がることは出来ない。それ故、ＣＮＳ内の腫瘍を標的とする能力を与えたならば、γ1３４．５マイナスウイルスは、今まで治療不可能であった型のＣＮＳ癌に対する強力な治療剤であることが証明された。更に、標的腫瘍細胞内で抗アポトーシス効果を有する遺伝子の発現を阻止し又はブロックするウイルス以外の物質も又、腫瘍治療及びヘルペスウイルス感染の治療並びにニューロビルレンスが宿主細胞のプログラムされた細胞死機構との干渉に依存する他のウイルスの感染の治療における重要な開発として働き得る。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
発明の要約
この発明は、神経退行性疾患に関連した治療のためのニューロン細胞におけるプログラムされた細胞死即ちアポトーシスの予防又は治療のための方法、並びに癌及び他の腫瘍形成性疾患及びヘルペスウイルス感染の治療方法に関するものである。本発明は又、γ1３４．５遺伝子又はその蛋白質発現産物ＩＣＰ３４．５の効果を調節し得る物質（即ち、これらの効果を強め又は阻止することの出来る物質）の同定を可能にするアッセイ方法にも関係している。更に、本発明は又、γ1３４．５発現又はＩＣＰ３４．５の活性の何れかを真似ることの出来る候補物質を同定するためにデザインされたアッセイ方法にも関係する。本発明は又、遺伝子を遺伝子治療のために細胞に送達する方法にも関係している。
【００２６】
本発明の１つの説明のための具体例において、ニューロン細胞におけるプログラムされた細胞死を予防し又は治療する方法を説明するが、そこでは、γ1３４．５遺伝子を含む非病原性ベクターを調製する。このベクターを、次いで、プログラムされた細胞死を現在受けているか又は受けそうなニューロン細胞に導入する。当業者は、たとえ本発明がγ1３４．５遺伝子の送達に関して用いるために特にデザインされたあるユニーク且つ新規なベクターの利用を構想していても、幾つかのベクターがこの方法に用いるのに適していることを理解するであろう。
【００２７】
本発明により構想されたかかる１つのベクターは、修飾して非病原性にしたＨＳＶ−１ウイルス自体である。軸索の内部輸送系を利用してニューロンの末梢神経の終末からニューロン細胞体中まで移動するＨＳＶ−１ウイルスのユニークな能力の故に、本発明は、影響されるニューロンのシナプス末端の近くに注入した非病原性ＨＳＶ−１ウイルス、或は末梢の傷又は病変領域又は他の適当な周辺位置における該ウイルスの利用を提供する。γ1３４．５遺伝子を含むＨＳＶ−１ウイルスは、次いで、異なる標的特異的プロモーターの下で、逆向性軸索輸送によってニューロン細胞体内に輸送されるであろう。
【００２８】
本発明は、ＨＳＶ−１ウイルスを非細胞毒性にするために該ウイルス中に導入する特定のゲノムの修飾を構想している。これらの修飾は、ゲノムの欠失、特定のゲノム配列の再配列、又はその他の特定の突然変異を含むことが出来よう。かかる修飾の一例は、ＩＣＰ４蛋白質をコードするα４遺伝子の修飾又は欠失を含む。ＩＣＰ４を発現する遺伝子の欠失又は修飾は、ＨＳＶ−１ウイルスがウイルスＤＮＡ及び構造蛋白質合成に必要な遺伝子を発現することを出来なくする。しかしながら、適当なプロモーターの下に置かれたγ1３４．５遺伝子は発現し、それ故、ニューロンにおいて、ストレス誘導されたニューロビルレンスの潜在能力を伴わずに抗アポトーシス効果を誘導する。修飾可能であろう他の遺伝子はα０遺伝子を含む。本発明は又、例えば、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ−２、コロナウイルス、エウニアウイルス、トガウイルス又はラブドウイルスベクターを含む他のベクターの利用をも構想している。再び、かかるウイルスのベクターとしての利用は、それらのベクターが安全で非病原性であるように欠失変異体の構築を必要とする。
【００２９】
本発明がγ1３４．５遺伝子をプログラムされた細胞死を受けているか又は受けそうなニューロン細胞中に導入することを構想する他の方法は、多能性神経細胞系統の利用によるものである。かかる系統は、イン・ビトロで表現型を変えることが示され又、マウスの中枢神経系に統合され且つそれらを植え付けた部位に適した様式でニューロン又は節に分化することも示された（Snyder等、Cell,68:33-51,1992）。γ1３４．５遺伝子を導入した多能性神経細胞系統の、細胞がプログラムされた細胞死を受けているか又は受けそうな中枢神経系への移植又は植付けは、プログラムされた細胞死の逆転及び阻止へ導くことが予想される。
【００３０】
γ1３４．５のアポトーシスを阻止する能力は、ヒトの医学においてのみならず、基礎的な科学の研究においても恩恵となるであろうことが期待される。この関係において、本発明は又、細胞培養におけるニューロン細胞の生命を延長させることにおけるγ1３４．５遺伝子の利用をも構想する。非細胞毒性ベクターの培養ニューロン細胞への導入は、抗アポトーシス効果を有し、それ故、細胞培養の生命を延長させるであろう。これは、更に、実験が行なわれる時間を延長し、基礎研究を行なうコストを減らすことをも期待することが出来る。
【００３１】
γ1３４．５遺伝子を含むベクターを利用することに加えて、本発明は又、γ1３４．５遺伝子の発現の産物の利用を含む、ニューロン細胞におけるプログラムされた細胞死を予防し又は治療する方法をも開示する。γ1３４．５により発現される蛋白質は、ＩＣＰ３４．５と呼ばれる。Ackermann等（J.Virol.,58:843-850,1986）は、ＩＣＰ３４．５がＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で見かけ分子量４３，５００を有し、ＨＩＶ感染細胞の細胞質内に大いに蓄積するらしいことを報告し、多くのＨＳＶ−１蛋白質と対照的に、ＩＣＰ３４．５は生理的溶液に可溶性であることが示された。
【００３２】
この方法の実施又はγ1３４．５遺伝子を細胞内に導入する方法の実施においては、γ1３４．５遺伝子又はその生物学的機能等価物を遺伝子治療に用いることが出来、精製した形態のＩＣＰ３４．５又はＩＣＰ３４．５蛋白質の生物学的機能等価物を抗アポトーシス剤として利用することが出来ることを想定している。ここで用いる場合、機能等価物とは、ある種の構造変化が起きているが、それにもかかわらず、ＩＣＰ３４．５の効果と同じ効果を明示する蛋白質であるか又はそれらをコードする、蛋白質及びそれらのコード核酸配列をいうことを意図している。
【００３３】
規定の機能活性の測定し得る消失を伴わずに蛋白質中である種のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されるという事実に照らして、発明者は、測定可能な生物学的有用性又は活性の消失を伴わずに、ＩＣＰ３４．５蛋白質の配列（即ち、γ1３４．５遺伝子のアンダーラインを付けたＤＮＡ）中に種々の変化が起こり得るということを予想する。アミノ酸を、同様の水治療成績を有して、他のアミノ酸と互いに置換することが出来る（Kyte等、J.Mol.Biol.,157:105-132,1982を参照されたい。該文献を参考として本明細書中に援用する）（米国特許第４，５５４，１０１号（参考として本明細書中に援用する）に記載のように、類似の親水性値を有するアミノ酸であるので）。
【００３４】
それ故、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性例えばそれらの疎水性、親水性、チャージ、寸法等に基づいている。上記の種々の性質を考慮した典型的な置換は当業者に周知であり、アルギニンとリジン；グルタメートとアルパルテート；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；並びにバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。
【００３５】
本発明のこの具体例は、製薬組成物を形成するためにＩＣＰ３４．５又はその生物学的機能等価物を製薬上許容し得るキャリアーと結合させることを含む方法を説明する。（γ1３４．５又はＩＣＰ３４．５というときには、発明者は、γ1３４．５の効果を真似る任意の化学薬品を含む生物学的機能等価物を含むことを意図しているということは後述の検討において理解されよう）。かかる組成物を、次いで、プログラムされた細胞死を受けそうな又は受けているニューロンに投与する。かかる組成物を、静脈注射、髄腔注射を用いて動物に投与することが出来よう（ある状況では、経口、大脳内又は脳室内投与が適している）。更に、培養中のニューロン細胞も又、それらが成長している培地に直接ＩＣＰ３４．５を投与することにより、その投与の恩恵を受けることが出来よう。
【００３６】
ＩＣＰ３４．５を、ＩＣＰ３４．５をコードすることの出来る核酸断片（即ち、γ1３４．５遺伝子又は生物学的機能等価物）を用いて調製することが出来る。かかる断片は、例えば、γ1３４．５断片を宿主細胞にトランスファーし、その宿主細胞をその断片の発現に適した条件下で培養して発現を生じさせ、その後に、十分確立された蛋白質精製技術を用いてその蛋白質を単離精製することを含む技術を用いて発現され得よう。核酸断片を宿主細胞に、組換えベクターのトランスフェクション又はトランスフォーメーションによってトランスファーする。
【００３７】
本発明の特に重要な具体例は、γ1３４．５遺伝子の効果又はＩＣＰ３４．５の効果を真似ることの出来る候補物質のアッセイ、並びにγ1３４．５の機能を強化するか又はＩＣＰ３４．５の保護機能を強化することの出来る候補物質のアッセイに関するものである。更に、γ1３４．５発現又はＩＣＰ３４．５の活性を阻止することの出来る候補物質のアッセイ方法も又本発明の具体例である。
【００３８】
典型的具体例において、抗アポトーシス遺伝子の発現をブロックし又は抗アポトーシス蛋白質例えばＩＣＰ３４．５の活性を阻止する候補物質を試験するアッセイは、下記の流れに沿って進める。ａ配列プロモーター及びγ1３４．５のコード配列の部分を有する試験プラスミッド構築物を、ｌａｃＺレポーター遺伝子又は任意の他のアッセイ可能なレポーター遺伝子と融合する。この構築物を、次いで、適当な細胞系統例えば神経芽細胞腫又はＰＣ１２細胞系統に、Ｇ４１８選択により導入する。スクリーニング目的のためのクローン化連続細胞系統を、次いで、確立する。ＨＳＶ後期プロモーター（通常、細胞系統中では発現せず且つ通常アポトーシスを誘導するストレス因子によっては発現が誘導されない）を有する対照のプラスミッド構築物を同じ又は異なる指標遺伝子に融合する。この構築物も又、連続クローン化細胞系統に導入して試験細胞系統に対する対照として働くことが出来る。次いで、この抗アポトーシス薬剤を加える。典型的にａ配列プロモーター活性化の引き金を引きプログラムされた細胞死を引き起こす環境ストレス例えばＵＶ傷害、ウイルス感染又は神経成長因子の奪取等を、次いで、細胞に加える。対照用細胞において、ストレスは、それらの細胞に何らの効果をも有さず、アッセイにおいて何らの検出可能な反応を生じないであろう。試験細胞系統におけるストレスは、正の候補物質の不在下において、適当な反応、典型的には色彩反応を生じるであろう。候補物質の存在下での試験細胞系統へのストレスの導入は、候補物質がγ1３４．５遺伝子の発現と干渉するか又はＩＣＰ３４．５の抗アポトーシス活性と干渉する物質の能力と干渉することを示す逆の色彩反応を生じるであろう。
【００３９】
同様に、本発明は、ＩＣＰ３４．５の活性を真似し若しくは強化するか又はγ1３４．５の発現を真似する候補物質のアッセイを説明するが、かかるアッセイは、上記と類似の流れに沿って進める。ＩＣＰ３４．５及び蛍光標識した細胞性遺伝子又は細胞の生存能力を知らせる容易に検出されるマーカーを与える任意の他の標識を構成的に発現している試験細胞系統（例えば、神経芽細胞種細胞系統）を生成する。更に、適当な指標遺伝子例えばａ−ｌａｃＺ指標遺伝子及び試験細胞系統と同じ宿主指標遺伝子からなる対応ヌル細胞系統も又生成する。又、同じ指標遺伝子及び同一宿主指標遺伝子からなる第３の細胞系統（例えば、ｖｅｒｏ細胞系統）も又生成する。再び、プログラムされた細胞死を引き起こす環境ストレスを、γ1３４．５の不在下でこれらの細胞に加える。それらがγ1３４．５発現の抗アポトーシス効果又はＩＣＰ３４．５若しくはその生物学的機能等価物の抗アポトーシス活性を真似るか強化するかどうかを決定するために候補物質も又加える。
【００４０】
本発明は又、遺伝子治療のための遺伝子の送達方法を具体化する。典型的具体例において、この方法は、遺伝子治療に用いる遺伝子を上述のような突然変異したウイルス即ち非病原性を付与されたＨＳＶ−１ウイルスと結合させることを含む。この遺伝子及びウイルスを、次いで、製薬組成物を形成するために薬理学的に許容し得るキャリアーと結合させる。この製薬組成物を、次いで、治療のための遺伝子を含む突然変異したウイルス又はその遺伝子を含むＨＳＶ−１野生型ウイルスが適当な領域で細胞に取り込まれ得るような方法で投与する。例えば、ＨＳＶ−１ウイルスを用いるときには、この組成物を、ウイルスがシナプス末端に取り込まれて軸索まで逆向性様式で、軸索細胞体中へ逆向性軸索輸送により輸送されるようにシナプス末端が位置する領域に投与することが出来よう。明らかに、末梢又は中枢神経系が遺伝子治療の標的とされた場合には、かかる方法のみが適当なものである。
【００４１】
本発明は又、癌又は他の腫瘍形成性疾患並びにヘルペス感染又はビルレンスが抗アポトーシス効果に依存するウイルスに関する他の感染の治療のための方法及び組成物をも構想する。上述のアッセイ方法において同定されたＩＣＰ３４．５の発現又は活性に対する阻害効果を有するとして同定された候補物質を用いて、標的腫瘍細胞又はウイルス感染細胞における細胞死を誘導することが出来る。かかる物質を含む製薬組成物を、髄腔内注射、静脈注射又は直接の注射を用いて、腫瘍又は感染領域に適当に導入することが出来る。
【００４２】
図面の簡単な説明
図１は、ＨＳＶ−１Ｆ株（配列番号１〜５）、１７ｓｙｎ＋株（配列番号：６〜９）、ＭＧＨ−１０株（配列番号１０〜１５）、及びＣＶＧ−２株（配列番号１６〜２０）のＩＣＰ３４．５の遺伝子領域（左パネル）及びこれらの株におけるＩＣＰ３４．５（配列番号２５〜３４）の予測されるオープンフレーム（右パネル）のＤＮＡ配列を示している。図１Ａは、番号６６５までの塩基配列であり、図１Ｂは、番号６６６〜１３３５までの塩基配列であり、図１Ｃは、対応するアミノ酸１９９までの配列であり、図１Ｄは、対応するアミノ酸２００以降の配列である。新たな塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴの挿入）、新たなアミノ酸（３文字記号）、或は塩基又はアミノ酸の不在（−）により示されない限り、ＨＳＶ−１（１７）ｓｙｎ＋、ＨＳＶ−１（ＭＧＨ−１０）及びＨＳＶ−１（ＣＶＧ−２）株の配列は、ＨＳＶ−１（Ｆ）と同じであった。アスタリスクは、９ヌクレオチド又は３アミノ酸の反復配列の始まりを示している。直列反復１（ＤＲ１）は、ａ配列荷隣接する２０塩基対の反復配列を示している。直列反復１の上流の配列は、ａ配列内に含まれる。各行の末尾の数は、ヌクレオチド１（左パネル）又はアミノ酸１（右パネル）からの相対的位置を示す。ＨＳＶ−１（Ｆ）配列の開始コドン及び終止コドンにはアンダーラインを引いてある。
【００４３】
図２は、野生型株であるＨＳＶ−１Ｆ株［ＨＳＶ−１（Ｆ）］及びそれに由来する組換えウイルスのゲノムの配列配置を示す。最上部の行は、ＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５の配列配置である。方形は、逆方向反復ａｂ、ｂ’ａ’ｃ、及びｃａを同定する。ＨＳＶ−（Ｆ）ａ配列は、これらの２つのゲノム末端に順方向で存在し、ロング及びショートコンポーネント間の接合部に逆方向で存在する。これらのｂ及びｃ配列は、それぞれ、約９及び６ｋｂｐ長である。ＴＫと印した三角形は、ｔｋ遺伝子の位置及びＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５から欠失したＢａｍＨＩＱ断片のＢｇｌＩＩ〜ＳａｃＩ配列の位置を同定する。上から２及び３行目は、ｂ配列がＩＣＰ３４．５及びＩＣＰ０を特定する遺伝子を含むこと及びｂ配列が逆方向で反復しているのでこれらの遺伝子がゲノム当り２コピー存在することを示す。糖蛋白質Ｈ遺伝子の部分を含むａ２４−ｔｋ断片の構築は記載された。Chou及びRoizman、J.Virol.,57:(1986);Ackerman等、J.Virol.,58:843(1986);Chou及びRoizman、J.Virol.,64:1014(1990)。７行目は、すべての３つのリーディングフレームにおける終止コドンを含むオリゴヌクレオチドの挿入の略図を示す。Ｒ４００２及びＲ４００４の構築においてそれぞれ用いたプラスミッドｐＲＢ３６１５及びｐＲＢ２９７６は、ほかの場所に記載したものである（Chou及びRoizman,J.Virol.,57:629(1986)及びJ.Virol.,64:1014(1990)）。ｐＲＢ３６１６を生成するために、プラスミッドｐＲＢ１４３をＢｓｔＥＩＩ及びＳｔｕＩで消化してＴ４ポリメラーゼで平滑末端化し、そしてリガーゼで再結合させた。アスタリスクは、合成オリゴマー（配列番号２１〜２２）との粘着末端を形成するベクターのプラスミッドからのヌクレオチドを示す。α４エピトープのＩＣＰ３４．５の第１のアミノ酸中への挿入（９行目）は、記載されたものである（Chou及びRoizman,J.Virol.,64:1014(1990)）が、但し、この例においては、配列をγ1３４．５遺伝子の両コピー（配列番号２３、２４及び３４）に挿入した。ｔｋ遺伝子は、マウスで試験したすべての組換えウイルスにおいて復原された。ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒ（６行目）は、γ1３４．５及びｔｋ遺伝子において欠失した配列の復原によって、Ｒ３６１７から誘導した。Ｎ、Ｂｅ、Ｓ及びＳｔは、それぞれ、ＮｃｏＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＳａｃＩ及びＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs社製）の略語である。括弧内の数は、マウスで試験した各構築物のｔｋ+バージョンである。
【００４４】
図３は、電気泳動で分離したプラスミッド（野生型及び突然変異ウイルスＤＮＡ）の消化物（固体支持体にトランスファーしてγ1３４．５及びｔｋ遺伝子の存在に対する標識プローブとハイブリダイズさせたもの）のオートラジオグラフィー像を示す。示したプラスミッド又はウイルスＤＮＡをＢａｍＨＩで又は、レーン１０に示したＲ４００９の場合にはＢａｍＨＩとＳｐｅＩの両方で消化した。これらのハイブリダイゼーションプローブは、γ1３４．５のコード配列（左パネル）内に完全に含まれるＮｃｏＩ〜ＳｐｈＩ断片及びＨＳＶ−１（Ｆ）のＢａｍＨＩＱ断片（右パネル）であった。これらのプローブを、［α−32Ｐ］デオキシシチジン三リン酸及びキット（Du Pont Biotechnology System社製 ）中に与えられた試薬を用いて、全プラスミッドＤＮＡのニックトランスレーションにより標識した。ＢａｍＨＩ（全レーン）又はＢａｍＨＩとＳｐｅＩの両方（左パネル、レーン１０）で限定消化したＤＮＡを、０．８％アガロースゲル上で、９０ｍＭトリホスフェート緩衝液中で、４０Ｖで一晩、電気泳動により分離した。次いで、ＤＮＡを、ゲルをはさんだ２枚のニトロセルロースシートに、重力によりトランスファーし、各プローブと一晩ハイブリダイズさせた。γ1３４．５は、ＢａｍＨＩＳ及びＳＰ断片中にマップされ、特徴的なバンドの梯子を、５００ｂｐ増加にて形成する。これらの梯子は、ロング及びショートコンポーネント間の接合部のユニーク配列に隣接する反復中のａ配列の変化する数の結果であるが、ＢａｍＨＩＳは、ロングコンポーネントの末端のウイルスゲノムの末端断片であり、ＢａｍＨＩＳＰは、末端ＢａｍＨＩＳ断片とＢａｍＨＩＰ（ショートコンポーネントの末端ＢａｍＨＩ断片）との融合により形成された断片である。ＢａｍＨＩＳ、ＳＰ及びＱ及びそれらの欠失バージョンであるΔＢａｍＨＩＳ、ΔＢａｍＨＩＳＰ及びΔＢａｍＨＩＱ（ΔＱ）のバンドを、それぞれ、示してある。バンク１は、Ｒ４００２中のＢａｍＨＩＳＰ断片への１．７ｋｂｐのα２７−ｔｋ挿入物を表し、それ故、この断片は、両標識プローブと反応した（レーン４）。バンド２は、ＢａｍＨＩＳ断片への同じ挿入物を表す。
【００４５】
図４は、オートラジオグラフィー像（左パネル）及びＨＳＶ−１（Ｆ）及び組換えウイルスに疑似感染（Ｍ）又は感染した細胞の溶解物の写真（右パネル）を示す（変性ポリアクリルアミド（１０％）ゲル中で電気泳動により分離し、ニトロセルロースシートに電気泳動によりトランスファーしてほかの場所で述べたウサギポリクローナル抗体Ｒ４で標識したもの）。Ackerman等、J.Virol.,58:843(1986);Chou及びRoizman,J.Virol.,64:1014(1990)。Ｖｅｒｏ細胞の重複培養を、感染させ、感染の１２〜２４時間後に［35Ｓ］メチオニン（Du Pont Biotechnology Systems ）で標識し、等量の細胞溶解物を各スロットに載せた。この手順は、記載されたようにした（Ackerman等、Chou及びRoizman）、但し、結合した抗体を、Promega,Inc.により供給されたアルカリホスファターゼ基質システムを用いて可視化した。感染細胞の蛋白質を、Honess及びRoizman（J.Virol.,12:1346(1973)）に従って番号で示した。Ｒ４００３により特定されるキメラＩＣＰ３４．５は、エピトープの挿入により生じた増加した分子量の故に、他のウイルスにより生成された蛋白質よりゆっくりと移動した。
【００４６】
図５は、ＨＳＶ−１Ｆ株［ＨＳＶ０１（Ｆ）］及び関連変異体のゲノム構造及び配列配置の図式表示である。１行目：それぞれ、逆方向反復に隣接したユニークな配列からなる、ＨＳＶ−１ＤＮＡの２つの共有結合したコンポーネント、Ｌ及びＳ（７、３１）。ａｂ及びｂ’ａ’で示されるＬコンポーネントに隣接する反復配列は、それぞれ、９ｋｂの大きさであり、他方、Ｓコンポーネントに隣接する反復は、６．３ｋｂの大きさである（３１）。２行目：γ1３４．５及びα０遺伝子を含む逆方向反復配列ａｂ及びｂ’ａ’の部分の拡大。３行目：２行目に示した拡大部分の配列配置及び制限エンドヌクレアーゼ部位。開いたボックスは、ａ配列に隣接する２０ｂｐの直列反復配列（ＤＲ１）を表す（２６、２７）。制限部位表示は、Ｎ−ＮｃｏＩ；Ｂｅ−ＢｓｔＥＩＩ；Ｓ−ＳａｃＩ；Ｓｔ−ＳｔｕＩである。４行目：細線及び塗りつぶした方形は、γ1３４．５遺伝子の転写されるコード領域を表す（４０６）。垂直の線は、γ1３４．５及びα０遺伝子の転写開始部位の位置を示す。Ｒ３６１６ウイルス組換え体において、γ1３４．５の２８番目のアミノ酸にあるＢｓｔＥＩＩから示した遺伝子の３’末端のＳｔｕＩの間の１Ｋｂを欠失させた。ＨＳＶ−１（Ｆ）ＲＤＮＡにおいて、Ｒ３６１６中のγ1３４．５遺伝子から欠失した配列を復原し、それ故、このウイルスは、野生型の表現型を示すことが予想されよう。Ｒ４００９組換えウイルスＤＮＡは、ＢｓｔＥＩＩ部位にフレームの合った翻訳終止コドンを含む。上部の垂直の矢印は、終止コドン挿入の部位を示している。
【００４７】
図６は、規定の35Ｓ−メチオニンで９０分間標識した感染細胞の電気泳動で分離した溶解物のオートラジオグラフィー像を示す。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種及びＶｅｒｏ細胞系統を疑似感染（Ｍ）させ又は３７℃で野生型又は突然変異ウイルスの５ｐｆｕに６ウェルディッシュ（マサチューセッツ州、Cambridge在、Costar）中でさらした。露出後２時間で、これらの細胞を１％仔ウシ血清を補った混合物１９９に重ねた。細胞のウイルスへの露出後５．５及び１１．５時間にて、重複感染させた６ウェル培養を、未標識メチオニンを欠くが５０μＣｉの35Ｓ−メチオニン（イリノイ州、Downers Grove在、Amersham Co.製、比活性＞１，０００Ｃｉ／ミリモル）を補った１ｍｌの１９９ｖ培地に重ねた。標識培地中での９０分の後に、細胞を採集し、ドデシル硫酸ナトリウムを含む緩衝液中にて可溶化し、Ｎ，Ｎ’ジアリルタルタルジアミンで架橋した変性１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動にかけ、ニトロセルロースシートへ電気泳動によりトランスファーして前記のようにしてオートラジオグラフィーにかけた（１３）。感染細胞蛋白質（ＩＣＰ）を、Honess及びRoizman,J.Virol.,12:1347-1365(1973)に従って示した。
【００４８】
図７は、変性ゲル中にて電気泳動で分離した標識したポリペプチドのオートラジオグラフィー像及び抗体との反応性により可視化された蛋白質のバンドの写真を示す。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種及びＶｅｒｏ細胞を、図６の説明で記載したように、１細胞当り５ｐｆｕのＲ３６１６又は親ＨＳＶ−１（Ｆ）に、疑似感染（Ｍ）させるか又は感染させた。これらの培養を、細胞をウイルスにさらしてから１３時間後に採集する前に、１．５時間にわたって標識した。細胞抽出物の調製、ポリペプチドの電気泳動、分離したポリペプチドのニトロセルロースシートへの電気的トランスファー及びオートラジオグラフィーを、ほかの場所（Ackerman等、J.Virol.,52:108-118,1984）に記載されたようにして行なった。ニトロセルロースシートを、Promega,Inc.（ウィスコンシン州、Madison在）からのキットの補助を受けて、製造者の支持に従って各抗体と反応させた。α２７に対するモノクローナル抗体Ｈ１１４２及びＵL２６．５遺伝子の産物に対するＨ７２５は、San Franciscoのカリフォルニア大学のLenore Pereiraより寛大にも贈られた。ＵS１１蛋白質に対するＭ２８モノクローナル抗体及びウイルス性チミジンキナーゼ（βｔｋ）に対するウサギポリクローナル抗体Ｒ１６１を、この研究室の特定のペプチド（M.Sarmiento及びB.Roizman、未発表の研究）に対して作成した。ＩＣＰの表示は、前記の通りである。
【００４９】
図８は、ホスホノアセテート（ＰＡＡ）の存在又は不在下での、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種細胞系統への感染の間に発現されたウイルス蛋白質のオートラジオグラフィー像を示す。二重のＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種細胞培養を、ホスホノアセテート（３００μｇ／ｍｌ；ミズーリ州、St Louis在、Sigma Chemical Co.社製）で処理する（感染の１．５時間前に開始して、感染の終了まで続ける）か又は未処理のままで置いた。これらの培養を、５ｐｆｕのＨＳＶ−１（Ｆ）、Ｒ３６１６、Ｒ４００９及びＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒの何れかに疑似感染させるか又は５ｐｆｕ／細胞でさらした。ウイルスへの露出の１１．５時間後に、これらの細胞を、図６の説明に記載したようにして、５０μＣｉの35Ｓ−メチオニンを含む培地に重ねた。ポリペプチド抽出、Ｎ，Ｎ’ジアリタルタルジアミンで架橋した１２％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動、ニトロセルロースシートへの電気的トランスファー及びオートラジオグラフィーを、図６の説明に記載したようにして行なった。
【００５０】
図９は、ウイルス性ＤＮＡ及びＲＮＡの感染ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫及びＶｅｒｏ細胞培養内の蓄積を示している。左パネル：疑似感染細胞又はＨＳＶ−１（Ｆ）、Ｒ３６１６、Ｒ４００９又はＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒウイルスを感染させた細胞から抽出した全ＤＮＡの、電気泳動により分離したＢａｍＨＩ消化物を含むエチジウムブロミド染色したアガロースゲルの写真。右パネル：電気泳動により分離してニトロセルロースシートにトランスファーしたＲＮＡのハイブリダイゼーション（α４７、ＵS１０及びＵS１１オープンリーディングフレームに対してアンチセンスのＲＮＡ配列をプローブとして使用）。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種及びＶｅｒｏ細胞を、１細胞当り５ｐｆｕのＨＳＶ−１（Ｆ）又はＲ３６１６に疑似感染又は感染させた。全ＤＮＡを、感染後１７時間で、Katz等、J.Virol.,64:4288-4295により公開された手順により細胞から抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で４０Ｖで電気泳動してエチジウムブロミドで染色して可視化した。ＲＮＡ分析のために、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種及びＶｅｒｏ細胞を、前述のように、Ｒ３６１６及びＨＳＶ−１（Ｆ）に疑似感染又は感染させた。細胞をウイルスにさらしてから１３時間後に、Peppel及びBaglioni（Bio Techniques,9:711-712,1990）の手順によってＲＮＡを抽出した。次いで、それらのＲＮＡを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロースシートへ重力によりトランスファーし、Promega,Inc.からのキットを用いて、製造者の指示に従って、ｐＲＢ３９１０オフＴ７プロモーターのイン・ビトロ転写により作成したアンチセンスＲＮＡをプローブとして探った。α４７、ＵS１０及びＵS１１転写物は、配列が重複し、同じ３’コターミナル配列を共有している。McGeoch等、J.Gen.Virol.,64:1531-1574(1988)。ＵS１０転写物は、少量であり、このアッセイでは検出されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
好適具体例の詳細な説明
序論
本発明は、ＨＳＶ−１γ1３４．５遺伝子、その遺伝子により発現されるＩＣＰ３４．５蛋白質、及び（ニューロンの）プログラムされた細胞死に対する治療として類似の様式で機能するその蛋白質の誘導体の利用に関するものである。本発明は又、改変した、非病原性ＨＳＶ−１ウイルス（並びに、他のウイルス）の遺伝子治療用ベクターとしての利用にも関係する。本発明の他の面は、抗アポトーシス剤として作用し得る候補物質を検出するアッセイ、並びに、腫瘍細胞におけるプログラムされた細胞死を誘導し得る候補物質を検出するためのアッセイに関するものである。更に、本発明は又、癌及びその他の腫瘍形成性疾患の治療方法にも関係する。最後に、本発明は又、γ1３４．５遺伝子又はＩＣＰ３４．５を不活性化し、それによりＨＳＶ−１及びその他のウイルス感染を抑制し得る候補物質の利用にも関係する。
【００５２】
野生型ＨＳＶ−１ゲノム（１５０キロ塩基対）は、２つのコンポーネントＬ及びＳを有し、各々は、逆方向反復に隣接したユニーク配列を有している。Ｌコンポーネントのこれらの反復配列（ａｂ及びｂ’ａ’で示す）は、各９キロ塩基対であり、他方、Ｓコンポーネントの反復配列（ａ’ｃ’及びｃａで示す）は、各６．５キロ塩基対である。Wadsworth等、J.Virol.,15:1487-1497(1975)。共通のａ配列（ＨＳＶ−１Ｆ株［ＨＳＶ−１（Ｆ）］においては、５００塩基対長）は、Ｓコンポーネント末端に１コピー存在し、Ｌ及びＳコンポーネント間の接合部に同じ向きで１〜数コピー存在する。Ｌ及びＳコンポーネントは、ウイルス粒子又は感染細胞から抽出したＤＮＡが、Ｌ及びＳコンポーネントの向きが異なるだけの４つの異性体からなるように、互いに逆向きになっている。Hayward等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:4243-4247(1975)。ａ配列は、ゲノム内のほかの場所へのａ配列の挿入又は完全な内部の逆方向反復配列（ｂ’ａ’ｃ’）の欠失が、それぞれ、更なる逆転又はＬ及びＳコンポーネントの逆転する能力の喪失へと導くので、シス作用部位であるらしい。このａ配列は又、感染後のゲノムの環化、コンカテマーからのＨＳＶゲノムの開裂及びＤＮＡのキャプシド封入のためのシス作用部位をも含むことが示された。
【００５３】
ＨＳＶ−１ゲノムは、発現が調和して制御され、カスケード様式で順次的に指令される少なくとも７３遺伝子を含む。α遺伝子が、最初に発現され、β、γ1及びγ2遺伝子が続いて発現される。β、γ1及びγ2遺伝子間の区別は、作動時のウイルスＤＮＡ合成のインヒビターの効果に基づいている。ウイルスＤＮＡ合成のインヒビターによって、β遺伝子の発現は刺激され、γ1遺伝子の発現は僅かに減じるが、γ2遺伝子の発現は、ウイルスＤＮＡ合成に厳重に必要である。
【００５４】
ａ配列の機能の研究の過程で、Chou及びRoizman（Cell,41:803-811,1985）は、ＨＳＶ−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の５’非コード転写配列に融合させたａ配列からなるキメラ構造がトランスファーした細胞中で誘導可能であり、ウイルスゲノムに挿入したときにはγ1遺伝子として制御されるということに注目した。この観察は、逆方向反復のｂ配列に最も近いａ配列の末端が、構造配列がＬコンポーネントに隣接するｂ配列中に位置している遺伝子のプロモーター及び転写開始部位を含むことを示唆している。感染細胞から抽出して電気泳動で分離したＲＮＡに対する標識ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション及びＳ１ヌクレアーゼ分析を含む研究は、ａ配列から始まるＲＮＡ転写物の存在を確実にした。ヌクレオチド配列分析は、２６３アミノ酸長の蛋白質をコードすることの出来るオープンリーディングフレームの存在を示した。Chou及びRoizman,J.Virol.,64:1014-1020(1990)。
【００５５】
前の研究は、Ｓコンポーネントの各逆方向反復が、その全長中に、α４で表される遺伝子を含み、他方、Ｌコンポーネントのものは、その全長中に、α０で表される遺伝子を含むということを示した。例えば、Mackem及びRoizman,J.Virol.,44:934-947(1982)を参照されたい。ヌクレオチド配列及びＲＮＡの分析に基づいて同定された推定の遺伝子も又、ゲノム当り２コピー存在する。逆転、コンカテマーからのＤＮＡの開裂及びＤＮＡのパッキングのためのシス作用部位を含むａ領域を有するこの遺伝子の領域の重複の故に、遺伝子産物を同定し特性決定することは興味深いことであった。この目的のために、このヌクレオチド配列は、蛋白質中に、１０回反復するアミノ酸トリプレットＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏが存在することを予言するという観察が利用され、この配列に基づいて合成した合成ペプチドに対する抗体は、見かけ分子量４３，５００のＨＳＶ−１蛋白質と反応した。Ackerman等、J.Virol.,58:843-850,1986。
【００５６】
ＩＣＰ３４．５をコードするオープンリーディングフレームの変異性の程度を、ヒト宿主の外で限られた回数継代された３種類のＨＳＶ−１株のヌクレオチド配列の比較により確立した。Chou及びRoizman（J.Virol.,64:1014-1020,1990）は、ＩＣＰ３４．５を特定する遺伝子は、３種類の限られた継代の株すべてにおいて保存されているが、ＨＳＶ−１（１７）ｓｙｎ＋株の報告された配列中では保存されていない２６３コドンを含むことを報告した（図１）。予言された反復配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏに対する抗体が類似の反復配列を有する異質蛋白質ではなくてＩＣＰ３４．５と反応することを確かめるために、他のＨＳＶ−１遺伝子の特徴であるエピトープをコードする４５ヌクレオチドの短い配列をＩＣＰ３４．５コード領域の５’末端近くに挿入した。この組換えウイルスは、妥当な遅い電気泳動移動度を有し、挿入したエピトープに対するモノクローナル抗体及びＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ反復要素に対するウサギ抗血清の両方と反応する蛋白質を発現した。
【００５７】
ニューロビルレンスと関連した遺伝子の同定の研究は、ＨＳＶ−１ＤＮＡのロングコンポーネントの末端又は末端近くに位置するＤＮＡ配列に関係していた。それ故、Centifanto-Fitzgerald等（J.Exp.Med.,155:475,1982）は、ＤＮＡ断片によって、ビルレンスマーカーをビルレント株からＨＳＶ−１のアンチビルレント株へトランスファーした。ＨＳＶ−１ＤＮＡのロングコンポーネントの一端に位置する遺伝子の欠失は、プロトタイプＨＳＶワクチン株により示されたビルレンスの欠如に寄与した。Meignier等、J.Infect.Dis.,158:602(1988)。他の研究において、Javier等（J.Virol.,65:1978,1987）及びThompson等（Virology,172:435,1989）は、大部分ＨＳＶ−１ＤＮＡからなるが、ロングコンポーネントの一端に位置するＨＳＶ−２配列を有するＨＳＶ−１×ＨＳＶ−２組換えウイルスは、ビルレントでなく、ビルレンスは、相同なＨＳＶ−１断片を用いるレスキューによって復原され得るということを示した。Taha等（J.Gen.Virol.,70:705,1989）は、ＨＳＶ−２株のロングコンポーネントの両端の１．５ｋｂｐが欠失している自発的欠失変異体を記載した。親ウイルス集団における不均一性の故に、マーカーレスキューにより得られた組換え体が欠失変異体より一層ビルレントであったにもかかわらず、ビルレンスの消失は、特定の欠失に明らかに関係しているとは言えなかった。何れの研究においても、特定の遺伝子又は遺伝子産物は突然変異遺伝子座に同定されなかったし、何れの遺伝子もビルレンス表現型に特異的に結び付けられなかった。
【００５８】
γ1３４．５遺伝子の役割
γ1３４．５遺伝子の産物（ＩＣＰ３４．５）の役割を試験するために、一連の４種類のウイルス（図２）をPost及びRoizmanの手順（Cell,25:227,1981、本明細書中に参考として援用する）によって、遺伝子工学処理した。
【００５９】
１）組換えウイルスＲ４００２（図４、レーン３）は、ＩＣＰ３４．５コード配列の両コピー中のα２７遺伝子（α２７−ｔｋ）のプロモーターによって駆動されるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の挿入を含んだ。それは、ウサギ皮膚細胞を、ｔｋ遺伝子の部分を特異的に欠失したウイルスＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５の完全なＤＮＡ及びＢａｍＨＩＳ断片に含まれるγ1３４．５遺伝子に挿入したα２７−ｔｋ遺伝子を含むプラスミッドｐＲＢ３６１５のＤＮＡでコトランスフェクトすることによって構築した。ｔｋ+である組換え体を、次いで、ヒトの１４３のチミジンキナーゼマイナス（ＴＫ-）細胞上で選択した。α２７−ｔｋ遺伝子を含む断片は、ｔｋ遺伝子から下流を含む：５’非転写プロモーター、非コード転写配列及び糖蛋白質Ｈ遺伝子の開始メチオニンコドン。α２７−ｔｋ断片が挿入されたＢｓｔＥＩＩ部位は、γ1３４．５オープンリーディングフレームのコドン２９の直上流にある。結果として、糖蛋白質Ｈの開始コドンは、フレームを合わせて融合され、γ1３４．５遺伝子の切り詰めたオープンリーディングフレームの開始コドンとなった（図２、３行目）。更なる研究のために選択した組換え体Ｒ４００２は、γ1３４．５遺伝子の両コピー中にα２７−ｔｋ遺伝子挿入物を含むことが示され（図３、レーン４）、キメラγ1３４．５遺伝子の予言された切り詰めた産物のみを特定した（図４、右パネル、レーン３）。これらの及び以前の研究において検出された天然ＩＣＰ３４．５蛋白質の量は、一般に、低かった。糖蛋白質Ｈの５’非コード転写領域及び開始コドンと切り詰めたγ1３４．５遺伝子との（フレームをあわせた）融合によって形成されたキメラ遺伝子は、天然遺伝子より遥かに有効に発現した。
【００６０】
２）γ1３４．５遺伝子の各コピー中の１ｋｂのＤＮＡを欠失している組換えウイルスＲ３６１７（図２、５行目）は、ウサギ皮膚細胞を完全なＲ４００２ＤＮＡ及びプラスミッドｐＲＢ３６１６のＤＮＡでコトランスフェクトすることによって生成した。このプラスミッドにおいて、γ1３４．５のコード領域の大部分を含む配列は、欠失している（図２、５行目）。このトランスフェクションのｔｋ-子孫を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を含む培地に重ねた１４３ＴＫ-細胞上にプレートした。この手順は、ｔｋ-ウイルスを選択し、ｔｋ遺伝子はγ1３４．５遺伝子の両コピー中に存在するので、このトランスフェクションの選択した子孫は、両コピー中の欠失を含むことが予想され得よう。Ｒ３６１７と表示する選択したｔｋ-ウイルスを、γ1３４．５遺伝子の両コピー中の欠失の存在について分析した。ニューロビルレンスのアッセイのために、Ｒ３６１７の天然のｔｋ-遺伝子中の欠失（その起源をＨＳＶ−１（Ｆ）Δ３０５に帰する）を修復しなければならなかった。これは、ウサギ皮膚細胞を完全なＲ３６１７ＤＮＡ及びｔｋ遺伝子を含むＢａｍＨＩ  Ｑ断片でコトランスフェクトすることによって行なった。１４３ＴＫ-細胞中でｔｋ+表現型について選択したウイルスをＲ３６１６と表示した。このウイルスは、野生型ＢａｍＨＩ  Ｑ断片（図３、右パネル、レーン６）を含み、ＩＣＰ３４．５を作らない（図４、右パネル）。
【００６１】
３）Ｒ３６１６の表現型が実際にγ1３４．５遺伝子における欠失を反映することを確かめるために、欠失した配列を、ウサギ皮膚細胞を、完全なＲ３６１７ＤＮＡ、完全なｔｋ遺伝子を含むＨＳＶ−１（Ｆ）ＢａｍＨＩ  ＱＤＮＡ断片及び完全なγ1３４．５遺伝子を含むＢａｍＨＩ  ＳＰＤＮＡ断片でコトランスフェクト（モル比、１：１：１０）することによって復原した。次いで、ｔｋ+であるウイルスを、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地に重ねた１４３ＴＫ-細胞にて選択した。ｔｋ+候補を、次いで、野生型ｔｋ及びγ1３４．５遺伝子の存在についてスクリーニングした。予想されるように、選択したＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒで表されるウイルス（図２、６行目）は、野生型末端ロングコンポーネント断片を含み（図３、左パネル、レーン２、７及び８を比較されたい）、ＩＣＰ３４．５を発現した（図４、右パネル、レーン６）。
【００６２】
４）Ｒ３６１６の表現型が隠れたオープンリーディングフレーム中の欠失を反映している可能性を排除するために、ＩＣＰ３４．５コード領域の始めのすべての３つのリーディングフレーム中に翻訳終止コドンを含むウイルス（Ｒ４０１０、図２、７行目）を構築した。翻訳終止コドン及びその完全な配列を含む２０塩基のオリゴヌクレオチド（図２）を、Applied Biosystems社製 380D ＤＮＡシンセサイザーにて作成し、等モル比で混合し、８０℃に加熱し、そしてゆっくりと室温に冷却した。アニールしたＤＮＡを、ＨＳＶ−１（Ｆ）ＢａｍＨＩＳ断片に、ＢｓｔＥＩＩ部位に挿入した。その結果のプラスミッドｐＲＢ４００９は、ＩＣＰ３４．５コード配列の始めに挿入された終止コドンを含んだ。この２０ヌクレオチドオリゴマーＤＮＡ挿入は又、この挿入物の存在の迅速な確認を可能にするＳｐｅＩ制限部位をも含んだ。組換えウイルスＲ４０１０を生成するために、ウサギ皮膚細胞を、Ｒ４００２の完全なＤＮＡ及びｐＲＢ４００９プラスミッドＤＮＡでコトランスフェクトした。ｔｋ-である組換え体を、ＢｒｄＵを含む培地中の１４３ＴＫ-細胞にて選択した。このウイルスのｔｋ+バージョン（Ｒ４００９と表示）を、完全なｔｋ-Ｒ４０１０ＤＮＡをＨＳＶ−１（Ｆ）ＢａｍＨＩ  ＱＤＮＡ断片と共に用いるコトランスフェクション及びｔｋ+子孫の選択により生成した。ニューロビルレンス研究のために選択したウイルス、Ｒ４００９は、ＢａｍＨＩＳ及びＳＰ断片の両方のＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含み（図３、左パネル、レーン９及び１０）、ＩＣＰ３４．５を発現しなかった（図４、右パネル、レーン７）。
【００６３】
５）Ｒ４００４（図２、最下行）は、１６アミノ酸をコードする配列の挿入により生成した組換えウイルスであった。この配列は、ＩＣＰ４と表示されるウイルス蛋白質と反応性のモノクローナル抗体Ｈ９４３のエピトープであることが示された。Hubenthal-Voss等、J.Virol.,62:454(1988)。このウイルスを、完全なＲ４００２ＤＮＡ及び挿入物を含むプラスミッドｐＲＢ３９７６のＤＮＡでコトランスフェクトすることにより生成し、選択したｔｋ-子孫を挿入物の存在について分析した。ニューロビルレンス研究のために、そのｔｋ遺伝子を上述のようにして復原した（組換えウイルスＲ４００３）。このＤＮＡ配列を、フレームを合わせて、γ1３４．５遺伝子の開始メチオニンコドンのＮｃｏＩ部位に挿入した。この挿入物は、開始メチオニンコドンを再生し、ＩＣＰ３４．５のエピトープと残りの部分との間のメチオニンコドンを生成した。追加のアミノ酸の故  に、この蛋白質は、変性ポリアクリルアミドゲル中で、一層ゆっくりと移動した（図４、右パネル、レーン４）。
【００６４】
すべての組換え体のプラークの形態及び寸法は、Ｖｅｒｏ、１４３ＴＫ-及びウサギ皮膚細胞系統にプレートした場合に、野生型親ＨＳＶ−１（Ｆ）のものに類似していた。ＨＳＶ−１（Ｆ）及びＲ４００３は、野生型ウイルスと同様に、Ｖｅｒｏ細胞複製培養において複製したが、Ｒ３６１６及びＲ４００９の収量は、野生型の量の１／３〜１／４に減じた。ＩＣＰ３４．５は、培養細胞におけるＨＳＶ−１の生育に必須ではなかったが、表１に示す研究の結果は、γ1３４．５の欠失又は翻訳の終止がウイルスのビルレンスに深い影響を有することを示している。それ故、最高濃度［１．２×１０6プラーク形成単位（ＰＦＵ）］のＲ３６１６を接種されたすべてのマウスは生き残った。Ｒ４００９の場合には、最高濃度（〜１０7ＰＦＵ）のウイルスの接種の結果、１０匹のマウスの内３匹のみが死亡した。他の欠失変異体と比較して、Ｒ３６１６及びＲ４００９は、今日まで報告された最も低病原性のウイルスにランクされる。γ1３４．５遺伝子が復原されたウイルスは、親ウイルスのビルレンスを示した。
【００６５】
【表１】
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【００６６】
マウスの大脳内接種の後に死を引き起こす野生型及び組換えウイルスの比較能力。ノースカロライナ州、Raleigh在、Charles River Breeding Laboratories社からの２１日齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウス（体重±１．８ｇ）で、ニューロビルレンス研究を行なった。ウイルスを、イーグルの塩類及び１０％ウシ胎児血清、ペニシリン及びゲンタマイシンを含む最小必須培地にて稀釈した。マウスに、２６ゲージ針を用いて、右大脳半球に、大脳内接種した。送達した容積は０．０３ｍｌであり、各稀釈のウイルスを１０匹のマウスの群にて試験した。これらの動物を、毎日、２１日間にわたって、死亡率をチェックした。ＬＤ50を、英国、ケンブリッジ在、Elsevier Biosoft社製の「投与量効果分析」コンピュータープログラムの助けを借りて計算した。
【００６７】
野生型ウイルス及びすべての組換え体は、大脳細胞に取り付いて浸入するために必要な同じ表面糖蛋白質を有する。大脳への１０6ＰＦＵの注射は、有意の数の大脳細胞の感染及び死を生じるはずである。大脳内接種後の死は、ウイルスの複製、細胞から細胞への拡大及び免疫系が作用する機会をもつ前の細胞破壊から生じる。イーグル塩類及び１０％ウシ胎児血清を含む最小必須培地に懸濁させた大脳組織の稀釈は、ＩＣＰ３４．５を作れないウイルスを接種されたこれらの動物の大脳が、非常に少量のウイルスを含むことを示した。それ故、Ｒ３６１６及びＲ４００９ウイルスについては、回収率は、それぞれ、大脳組織１ｇ当り１２０及び１００ＰＦＵであった。接種物中のウイルス量（試験した最高濃度）を与えても、回収された少量のウイルスが、接種物の生き残りを表すのか新たに複製されたウイルスを表すのかは、はっきりしない。対照的に、ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒ及びＲ４００３を接種したマウスから回収されたウイルスの量は、それぞれ、６×１０6であった。これらの結果は、これらの２種類の組換えウイルスが死を引き起こせないのは、突然変異ウイルスがＣＮＳにおいて複製することが出来ないことの結果としてのニューロン組織におけるウイルスの乏しい広がりに関連しているに違いなく、それらの宿主の範囲の減少を反映しているということを示している。
【００６８】
γ1３４．５遺伝子産物の機能を求めるためにデザインした研究の過程で、ニューロナルオリジンの細胞にγ1３４．５遺伝子を発現することができない突然変異体を感染させると細胞蛋白質合成を停止することになるのに対し、非ニューロナルオリジンの細胞に野生型或は突然変異ウイルスを感染させると蛋白質合成及び感染性後代の産生を持続することになることを見出した。
【実施例】
【００６９】
例１−γ1３４．５発現がプログラムされた（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）細胞死に与える影響物質及び方法
細胞    由来はＡＴＣＣから得たＶｅｒｏ細胞を、子牛血清５％を含有するＤＭＥ培地で増殖させた。ヒトＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫（ＮＢ）神経系統をＡＴＣＣ（ＨＴＢ１１）から得て牛胎児血清１０％を含有するダルベッコの改変イーグル培地で増殖させた。
【００７０】
ウイルス    単純疱疹ウイルス１菌種Ｆ［ＨＳＶ−１（Ｆ）］の単離は、Ｅｊｅｒｃｉｔｏ等（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２：３５７〜３６４（１９６８））（本明細書中に援用する）によって記載された。組み換えウイルスＲ３６１６、Ｒ４００９及びＨＳＶ−１（Ｆ）の構成は、Ｃｈｏｕ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５０：１２６２〜１２６６、１９９０年１１月３０日）（本明細書中に援用する）によって報告された。図５に例示する通りに、Ｒ３６１６はγ1３４．５遺伝子の両コピーにおいて１Ｋｂｐ欠失を含有する。組み換えＲ４００９では、停止コードンをγ1３４．５遺伝子の両コピーに装入した。組み換えＲ３６１６におけるγ1３４．５遺伝子を回復して組み換えＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒを生じた。
【００７１】
ウイルス感染    細胞を通常感染の多重度５においてウイルスに３７℃で２時間暴露し、次いで取り出し、子牛血清１％を含有する１９９ｖ培地に取り換えた。感染は３７℃で各々の実験について示す通りの時間の間続いた。次いで、細胞を新たな蛋白質合成或はウイルス性ＤＮＡ及びＲＮＡの合成のいずれかについて標識した。
【００７２】
35Ｓ−メチオニン標識化    感染した後の示す時間で、35Ｓ−メチオニン（比活性＞１，０００Ｃｉｍモル、イリノイ、ダウナーズグローブ在Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．社製）５０μＣｉを、６つのウエル皿中の細胞にメチオニンを欠く１９９ｖ培地１ｍｌに加えた。標識化を１．５時間続けて、細胞を収穫した。細胞エキストラクトの調製；Ｎ，Ｎ’ジアリルタルタルジアミド（カリホルニア、リッチモンド在Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で架橋したポリアクリルアミドゲルを変性させる際の電気泳動による蛋白質の分離；ポリペプチドのニトロセルロースシートへの転移；抗体によるオートラジオグラフィー及び免疫ブロットは、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２：１０８〜１１８（１９８４）（本明細書中に援用する）によって記載された。
【００７３】
結果
γ1３４．５遺伝子を欠くＨＳＶ−１（Ｆ）ウイルスは神経芽細胞腫細胞において蛋白質合成の停止を誘発する。    ＣＮＳ組織に由来するヒト細胞系統をスクリーンする過程で、ＳＫ−Ｎ  ＳＨ神経芽細胞腫細胞系統が産生する突然変異ウイルスは、完全に許容的なＶｅｒｏ細胞に比べて１００倍少ないことが明らかであった。また、図６に示す通りに、Ｒ３６１６、Ｒ４００９で感染されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞は、７時間で収穫した細胞において蛋白質合成の減少を示し（左パネル）かつ感染した後１３時間までに35Ｓ−メチオニンを取り込むのを止めた（右パネル）ことにも留意された。その現象は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞だけで観測され、欠失された配列の回復が感染した後１３時間でウイルス性蛋白質を発現するウイルス［ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒ］を生じ（図６、右パネル）かつ親の野生型表現型を示したのだから、γ1３４．５遺伝子における突然変異に特異的に帰し得た。
【００７４】
α遺伝子を発現した後に、蛋白質合成の停止が起きた。    ウイルス性遺伝子は３つの主要なグループであって、それらの発現は同調調節されかつ逐次カスケード様式で並べられるものを形成する。Ｒｏｉｚｍａｎ及びＳｅａｒｓ，Ｆｉｅｌｄｓ’  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ等、編集、１７９５〜１８４１（１９９０）参照。α遺伝子はそれらを発現するために新たに蛋白質合成を必要とせず、ウイルス性ＤＮＡを合成するために必要とするβ遺伝子は機能的α及びβ蛋白質の事前合成並びにウイルス性蛋白質合成の開始を必要とする。突然変異ウイルスで感染されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞においてウイルス性遺伝子機能の発現が終結された点を求めるために、ポリアクリルアミドゲルを変性させる際に電気泳動分離された感染された細胞リゼイトをニトロセルロースシートへ転移させ、α（α２７）、αβ（ウイルス性チミジンキナーゼ）及び２種のたくさんある蛋白質への抗体によって立証した。Ｒｏｌｌｅｒ及びＲｏｉｚｍａｎ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５：５８７３〜５８７９（１９９１））は、後者がＵL２６．５及びＵS１１遺伝子の産物であって、それらの最適レベルにおける発現がウイルス性ＤＮＡ合成を必要とするものであることを示した。図７に示す通りに、突然変異ウイルスで感染されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞は、α２７蛋白質を通常量（左パネル）、チミジンキナーゼ（β）蛋白質を減少した量（中央パネル）で産生したが、検出し得るγ蛋白質を産生しなかった（左及び右パネル）。対照して、野生型及び突然変異の両方のウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞においてそれらの蛋白質の合成を複製する或は指図するそれらの能力に関し、差異を認めることができなかった（図７）。
【００７５】
蛋白質合成を停止するためのシグナルをウイルス性ＤＮＡ合成に関連付ける。    これらの実験は、蛋白質合成の停止が、遺伝子であってその発現がウイルス性ＤＮＡ合成に依存するものに関連付けられるかどうかを求めるためにデザインした。キーの実験の結果を図８に示す。複製ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＶｅｒｏ細胞培養にＨＳＶ−１（Ｆ）及び組み換えウイルスを感染させ、ウイルス性ＤＮＡ合成をブロックする薬剤であるホスホノアセテートを抑制濃度で存在させ或は存在させないで保った。細胞を、感染させた後１３時間で、35Ｓ−メチオニンによってパルス標識した。結果の顕著な特徴は、Ｒ３６１６か或はＲ４００９のいずれかで感染されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞における蛋白質合成が、ホスホノアセテートの存在では少なくとも１３時間持続されたが、その不存在では持続されなかったことであった。これらの結果は、突然変異ウイルスで感染されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞における蛋白質合成の停止についてのシグナルが、ウイルス性ＤＮＡ合成或はそれを発現するためのウイルス性ＤＮＡ合成に依存するγ遺伝子と関連することを示した。
【００７６】
たとえ蛋白質合成の停止が後期（ｌａｔｅ）蛋白質の蓄積を排除したとしても、γ1３４．５突然変異体で感染されたヒト神経芽細胞腫細胞はウイルス性ＤＮＡ及び蓄積された後期ｍＲＮＡを合成した。    上に提示した証拠は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞において、ウイルス性ＤＮＡ合成に関連する事象が蛋白質合成の停止を誘発しかつ後期（γ）ウイルス性蛋白質が蓄積しないことを示した。従って、本発明者等は、ウイルス性ＤＮＡをほとんど蓄積しない或は全く蓄積しないこと及びウイルス性ＤＮＡ合成の不存在では、後期（γ）ウイルス性転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）であって、それらの合成がウイルス性ＤＮＡ合成に依存するものをほとんど蓄積しない或は全く蓄積しないことを予想した。本発明者等が驚いたことに、突然変異ウイルスで感染して１７時間した後にＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞から回収されたウイルス性ＤＮＡの量は、野生型の親の或は修復された［ＨＳＶ−１（Ｆ）Ｒ］ウイルスから得られる量に匹敵し得るものであった（図９、左パネル）。その上、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞は証明できる量のＵS１１蛋白質を合成しなかったが、突然変異及び野生型ウイルスで感染された細胞中に蓄積したＵS１１遺伝子転写物の量は同様の大きさであった（図９、右パネル）。
【００７７】
これらの結果の有意性は３つの観測から生じる。第一に、感染された細胞では、蛋白質合成は調節カスケードを反映し；α蛋白質合成はβでかつ後にγ蛋白質合成に替えられる。現在までに試験されたγ1３４．５突然変異体で感染されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞と異なるすべての細胞では、一群の蛋白質の合成におけるブロックは全蛋白質合成の停止に至らない。例えば、ＰＡＡのようなＤＮＡ合成の抑制剤で処理した細胞では、それらの合成がウイルス性ＤＮＡ合成に依存するサブクラスのγ蛋白質は産生されない。しかし、これらの細胞では、β蛋白質合成は、未処理の感染された細胞におけるそれらの合成時間を越えて続く。γ1３４．５ヌル突然変異体で感染されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に関する研究でなされた顕著な観測は、（ｉ）すべての蛋白質合成が完全に停止し、（ｉｉ）ウイルス性ＤＮＡが作成され、（ｉｉｉ）たとえ蛋白質合成が停止したとしても、ＵS１１ｍＲＮＡによって例証される後期γｍＲＮＡが作成されたことである。ウイルス性複製についてのこれらの表現は前に報告されておらず、この報告に記載されるものと異なる細胞（例えば、Ｖｅｒｏ、ＨＥｐ−２、ハムスター乳児肝臓、１４３ｔｋ−及びウサギスキン細胞系統及びヒト胎児肺細胞株）の野生型ウイルス或は任意の突然変異ウイルス感染により感染された細胞を特性表示するものではない。
【００７８】
第二に、突然変異の修復は野生型表現型を回復するので、γ1３４．５遺伝子の機能はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞での蛋白質合成におけるこのブロックに打ち勝つことである。
【００７９】
最後に、蛋白質合成の停止をウイルス性ＤＮＡ複製の開始に関連付けることは、感染した後に作成される産物が停止の原因となる可能性を排除しないが、データは、蛋白質合成の停止が細胞の蛋白質合成機と相互作用する既知のウイルス性遺伝子産物により特異的に引き起こされるという仮定を強く支持する。例えば、ｖｈｓと表示されるＨＳＶ−１遺伝子の産物が、感染した後に細胞蛋白質合成を停止することができるということは確立されている。ｖｈｓはウイルスの構造的蛋白質であり、感染する間に細胞の中に導入される。それは感染において初期にｍＲＮＡを不安定にし、それの作用は感染した後に作成されるウイルス性遺伝子産物に依存しない。上述した実験では、野生型及び突然変異ウイルスの蛋白質合成が、ホスホノアセテートで処理した細胞では、感染した後１３時間で識別することができなかった、故に、突然変異ウイルスの表現型はｖｈｓ遺伝子産物に帰することができない。この結論は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるウイルス性蛋白質合成が、野生型ウイルスによる感染の多重度を１００ｐｆｕ／細胞程に大きな値に増大させることによって影響されなかったという観測により強められる（データは示さない）。蛋白質合成を停止する遺伝情報についての一層ありそうな源は細胞それ自体である。
【００８０】
ニューロナルオリジンの細胞から成長因子を奪取すると、プログラムされた細胞死になり、これは、初め蛋白質合成を停止し、次いでＤＮＡを切断することによって表われることが報告された。リンパ球におけるアポトシスは、ＤＮＡの分解により表わされる。その他のヘルペスウイルスの場合、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスで感染されたＢリンパ球では、ウイルス性ＬＭＰ−１  遺伝子の産物がプログラムされたリンパ球死を排除する宿主遺伝子Ｂｃｌ−２を含むことが示された（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等、Ｃｅｌｌ  ６５：１１０７〜１９９１）。これより、ニューロナル細胞におけるウイルス性ＤＮＡ合成の開始が蛋白質合成の停止によってプログラムされた細胞死を誘発すること及びＨＳＶ−１  γ1３４．５遺伝子がこのリスポンスを排除することは明らかである。
【００８１】
ニューロナルストレスへのリスポンスを排除するＨＳＶ−１遺伝子の発生は驚くべきことではない。ニューロン、特に感覚ニューロンの感染は、ＨＳＶ−１を潜伏のままにしかつヒト固体群において生き残るのを可能にさせるウイルス性繁殖ライフスタイルの本質的な特徴である。本発明者等が提案する通りに、γ1３４．５遺伝子の機能が細胞死を排除することであるならば、ＨＳＶは通常神経細胞を感染させるので、遺伝子の標的はリンパ球よりもむしろニューロンになろう。
【００８２】
γ1３４．５遺伝子はいくつかの異常な特徴を有する。遺伝子は、よくＴＡＴＡＡ−転写性の一層小さいユニットに関連される慣用のＴＡＴＡＡボックス或はリスポンスエレメントを欠く。遺伝子の発現を可能にする配列は長さ１２ｂｐであるが、この実験室で使用する野生型株では３回程多く反復させる。どこか他で報告された種々のアッセイは、非ニューロナル誘導の細胞において産生される遺伝子産物の量がほとんどのウイルス性遺伝子により発現される量に比べて少なくかつウイルス性ＤＮＡ合成の不存在において作成される蛋白質の量がその存在において作成される蛋白質の量に比べて少なかったことを示す。遺伝子はアミノ酸２６３の蛋白質をコード化することが予想される。それはトリプレットＡｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを１０回反復させて含有し、細胞質において蓄積する。最近の記録は、γ1３４．５蛋白質のカルボキシル末端の近くの６３アミノ酸残基が、インターロイキン６によって区別を生じさせられる骨髄性白血病細胞系統において見出されるマウス蛋白質ＭｙＤ１１６とアイデンティティ８３％を共有することを示す（Ｌｏｒｄ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８：２８２３、１９９０）。ＭｙＤ１１６の機能は知られていない。上に提示した結果は、γ1３４．５遺伝子の産物である蛋白質ＩＣＰ３４．５が極めて明瞭にＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞において持続した蛋白質合成を可能にすることを立証し、かつ遺伝子の発現がアポトーシスを排除するのに十分であることは明らかである。
【００８３】
γ1３４．５を発現させるために必須のプロモーター−調節エレメントは、ａ配列、すなわち直接反復ＤＲ２及びＤＲ４並びに特有のＵb配列の３つのエレメント内に含有される。ゲル遅延アッセイは、ウイルスの主要な調節蛋白質をコード化するα４遺伝子の産物を、γ1３４．５遺伝子の発現を調節するエレメントの内のいずれかに結合させることを示すことができなかった。一過性発現アッセイでは、α４或はα０遺伝子の産物  は、γ1３４．５遺伝子の５’非コード化配列に融合されたチミジン−キナーゼ遺伝子のコード化配列からなるキメラリポーター遺伝子をトランスアクチベートさせることができなかった。リポーター遺伝子は、α４及びα０の両方の遺伝子を含有するプラスミドによるコ−トランスフェクションによって誘発されたが、比較的低いレベルであった。α２７遺伝子をコード化するプラスミドは、単独でトランスフェクトされるキメラリポーター遺伝子の発現に影響を与えなかったが、それはα４及びα０遺伝子を含有するプラスミドによりキメラリポーター遺伝子の誘発を低減させた。
【００８４】
例２−プログラムされた細胞死（アポトーシス）の遺伝子治療による処置
本例では、アポトーシスの予防或は処置に向けるγ1３４．５遺伝子治療を記載する。本例のために、突然変異させたＨＳＶ−１ウイルスを、遺伝子をプログラムされた細胞死を受ける或は受けようとするニューロナル細胞に導入するためのベクターとして提案する。また、本発明のこの実施態様は、レトロウイルス性ベクター及びワクシニアウイルスであって、それらのゲノムをウイルスを非病原性にさせるように別の方法で処理したものを含む別のウイルス性或はファージベクターを使用して実施し得ることももくろむ。そのようなウイルス性突然変異を生じる方法は米国特許第４，７６９，３３１号に詳細に記載されており、同特許を本明細書中に援用する。その上、また、本発明のこの実施態様は、任意の遺伝子であって、その発現が遺伝子治療において有利なものを使用して実施し得、かつ非ＨＳＶウイルスの使用が非神経システムにおいて遺伝子治療を可能にすることももくろむ。
【００８５】
単純疱疹ウイルスはヒトＣＮＳ組織について天然の向性を有する。ウイルスは、野生型条件下で、神経システムにおいて複製及び繁殖することができかつニューロ毒性である。ウイルスは、また、ニューロンにおいて潜在感染を確立することができかつ時折再活性化されることができる。遺伝子をニューロンの中に送達するベクターを樹立するには、提案したＨＳＶベクターの構成体は下記の基準を満足しなければならない：１．そのようなベクターはＣＮＳ及び脳組織について天然の向性を有すべきである。２．そのようなベクターは非病原性、すなわち完全に無毒性であるべきでありかつ再活性化して感染を引き起こし得るべきでない。３．そのようなベクターは、ニューロ退化を受ける細胞における細胞死を防ぐために、γ1３４．５の構成発現からなるべきである。４．３においてそのように提案したそのようなベクターは、遺伝子治療のために更に外来の遺伝子を装入するのに適している。
【００８６】
物質及び方法
α４遺伝子において突然変異性病巣を有するＨＳＶベクターを構築する。提案したウイルスは、もはやＣＮＳにおける潜在感染から複製、繁殖及び再活性化することができない。ウイルスは、α４遺伝子の不存在において、ニューロンにおいて潜在感染を樹立することができる。このウイルスは、α４発現性細胞系統を含有するプラスミドによるウイルス性ＤＮＡのコ−トランスフェクションによって得ることができる。α４発現性細胞系統及びウイルスは前に報告された。ＤｅＬｕｃａ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５６：５５８〜５７０（１９８５）。
【００８７】
加えて、構成発現プロモーター下でγ1３４．５遺伝子を有するそのようなＨＳＶベクターもまたもくろむ。この構成発現プロモーターはＨＳＶ  ＬＡＴプロモーター、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター或は天然の遺伝子発現のために特異的な任意の他の外来のプロモーターにすることができる。適当に導入したそのようなウイルス性ベクターは、アポトーシスを受けるニューロナル細胞における細胞死を防ぐのに適している。
【００８８】
その上、ウイルス性ゲノム上の中性位に装入した外来の遺伝子を有するそのようなＨＳＶベクターは、外来の遺伝子を標的ニューロンに送達しかつＣＮＳ遺伝子治療するために適している。上記の組み換えウイルスを産生するための手順は、Ｐｏｓｔ及びＲｏｉｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ、２５：２２７、１９９１）（本明細書中に援用する）により発表されたものである。また、米国特許第４，７６９，３３１号（本明細書中に援用する）も参照。
【００８９】
突然変異させたＨＳＶ−１ウイルスを使用するのが適している場合では、ウイルスを緩衝生理食塩水のような製薬上許容し得るキャリヤーと組み合わせ、末梢神経末端であって、それらの軸索がアポトーシスを受ける或は受けようとする神経細胞体から始まるものの部位に注入することができる。医学分野の当業者ならば認める通りに、ウイルスの投与量は、取り分け、治療を必要とする細胞を標的にするベクターの能力（その程度に、遺伝子は標的細胞において発現される）及び発現された蛋白質の活性を含むいくつかの要因に応じて変わることになる。ホスフェート緩衝塩或はスキムミルク中にウイルスおよそ１０4〜１０5を含有する接種材料は、マウスにおいて好結果を生じた。そのように注入したウイルスは、末梢神経末端の中に吸収され、次いで逆向性軸索輸送によりニューロナル細胞体に輸送される。そのような末梢注入が有用でない或は適していない場合には、ウイルスの局在髄腔内或は心室内注入、もしくは直接微小注射を利用することができる。
【００９０】
適当に変えた非ＨＳＶウイルス、すなわちウイルスを非病原性にさせるような方法で処理したゲノムを有するウイルスを同様にして使用することができる。逆向性軸索輸送により細胞体に送達するための直接微小注射或は末梢注入はウイルス性送達についての任意選択になる。最後に、また、生物学的機能的等価遺伝子を、本例に記載する任意のベクターにおいて遺伝子治療用に利用し得ることにも留意すべきである。
【００９１】
例３−γ1３４．５遺伝子をＣＮＳに送達するための多能神経細胞系統の使用
ＣＮＳ及び脳組織へのウイルス性ベクター送達システムに加えて、最近生体外通過させた細胞系統を使用しかつこれらの細胞を動物に戻して植えつける別のベクターシステムが開発された。これらの手順は、胎児或は生後のＣＮＳオリジンの細胞を採取し、それらを生体外で不滅にしかつ変換しそして細胞をマウス脳の中に戻して移植することを伴う。これらの細胞は、植えつけた後に、通常の脳細胞発達の移動パターン及び環境キューに従い、非腫瘍形成性の、細胞構造的に適した方法で分化する。この研究は、顕著にはＳｎｙｄｅｒ等、Ｃｅｌｌ、６８：３３〜５１，１９９２及びＲａｎｆｒａｎｚ等、Ｃｅｌｌ、６６：７１３〜７２９，１９９１のいくつかの論文において例証された。適当に改正した技術を利用して、γ1３４．５遺伝子を単独で或は関心のあるその他の遺伝子と組み合わせて細胞の中に導入して植えつけることが可能である。このような手順は遺伝子をその天然の部位に送達するのを可能にする。これらのニューロンにおけるγ1３４．５遺伝子の適した発現は、神経退化における細胞死を防ぎかつ遺伝子治療に適した外来遺伝子を運ぶ細胞を保存することになる。
【００９２】
物質及び方法
小脳細胞系統の増殖    小脳細胞系統は、Ｒｙｄｅｒ等（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２１：３５６〜３７５、１９９０）により記載される通りにして産生する。系統を、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）（Ｓｉｇｍａ）（１０μｇｍｌ）被覆された組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上の牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）１０％、馬血清（Ｇｉｂ−ｃｏ）５％及びグルタミン２ｍＭを補ったダルベッコの改変イーグル培地で増殖させる。系統を標準の調湿した３７℃のＣＯ2５％−空気インキュベーター内に保ち、これらに集約的培養からの状態調節した培地半分及びフレッシュ培地半分を週１回供給するかもしくは週１回或は週２回分けて（１：１０〜１：２０）フレッシュ培地にするかのいずれかにする。
【００９３】
γ1３４．５遺伝子による小脳始原系統の形質導入    関心のある細胞系統の現世の１：１０スプリットを６０ｍｍ組織培養プレートにプレートする。プレートして２４〜４８時間した後に、細胞を、γ1３４．５遺伝子を単独で或は遺伝子治療に適したその他の遺伝子と組み合わせて導入するために、−ｍｙｃ遺伝子（１０6〜１０7コロニー形成性ユニット［ｃｆｕ］／ｍｌ）＋８μｇ／ｍｌポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を含有する複製−機能不全（ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）レトロウイルス性ＢＡＧ、並びにネオマイシンＧ４１８マーカーと共に１〜４時間インキュベートする。次いで、細胞をフレッシュ供給培地において、細胞が少なくとも２つの倍加を受けたように見えるまで、およそ３日間培養する。次いで、培養をトリプシン化し（ｔｒｙｐｓｉ−ｎｉｚｅｄ）、低い密度（１００ｍｍ組織培養皿上の細胞５０〜５０００）で播種する。およそ２週間した後に、プラスチッククローニングシリンダー内のトリプシンに短時間暴露することによって、良く分離されたコロニーが単離される。コロニーを２４−ウエルＰＬＬ被覆したＣｏＳｔａｒプレートにおいて平板培養する。これらの培養を、集密において、６０ｍｍ組織培養皿に通過させ、消費させる。各々のサブクローンからの代表的な皿を、Ｘ−ｇｅｌ組織化学を用いて組織培養皿において直接染色する（Ｐｒｉｃｅ等、１９６７；Ｃｅｐｋｏ、１９８９ａ、１９８９ｂ参照）。青色細胞のパーセンテージを顕微鏡下で求める。青色細胞を最も高いパーセンテージ（理想的には＞９０％；少なくとも＞５０％）で有するサブクローンを保ち、特性表示し、移植するために使用する。
【００９４】
ウイルス感染についてのテスト    ヘルパーウイルスの存在を、Ｇｏｆｆ等（１９８１）によって記載される通りにして細胞系統の上澄み中の逆転写酵素活性を測定することによりかつＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を感染させてＸ−ｇａｌ+コロニーのＧ４１８耐性コロニーを産生する能力をテストする（Ｃｅｐｋｏ、１９８９ａ、１９８９ｂに詳述されている）ことによって、アッセイする。移植用に用いる小脳細胞系統はすべて、これらの方法によって判断される通りに、ヘルパーウイルスが存在しない。
【００９５】
神経細胞系統の一次小脳組織との共培養（ｃｏｃｕ−ｌｔｕｒｅ）    新生マウス小脳の一次の解離された培養をＲｙｄｅｒ等（１９９０）の通りにして調製し、ＰＬＬ被覆した８チャンバーＬａｂ  Ｔｅｋガラス或はプラスチックスライド（Ｍｉｌｅｓ）当り細胞２×１０6〜４×１０6の密度で播種する。細胞が沈降した後（通常２４時間）、関心のある神経細胞系統のほぼ融合性の１０ｃｍ皿１０％を、トリプシン化した後に、スライドに播種する。共培養を、８或は１４日の共培養まで、ＣＯ2５０％−空気の調湿したインキュベーターにおいて、隔日に再供給して増殖させる。
【００９６】
移植用細胞系統の調製    ドナー細胞のほぼ融合性であるが、依然活性に増殖する皿からの細胞をホスフェート緩衝塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシン化し、血清含有培地において広い孔径のピペットで穏やかに研和し（トリプシンを不活性にするため）、穏やかにペレット化し（円筒形遠心機において１時間１１００ｒｐ）、かつＰＢＳ５ｍｌ中に再懸濁させる。フレッシュＰＢＳをペレット化しかつ再懸濁させることによる洗浄を２回反復し、細胞を最終的に容積の減少したＰＢＳ中に再懸濁させて高い細胞濃度（細胞少なくとも１×１０6／１μｌ）を生じる。トリパンブルー（０．０５％  ｗ／ｖ）を加えて接種材料を局限する。懸濁体を、穏やかではあるが、良く研和させ続け、氷上に保った後に移植して凝集を最少にする。
【００９７】
生後の小脳への注入    新生児のＣＤ−１或はＣＦ−１マウスを冷凍麻酔し、頭を徹照することによって局限する。細胞を、斜角を付けた３３ゲージ針を有するＨａｍｉｌｔｏｎ社製１０μｌ注射器か或はＦｌａ−ｍｉｎｇ  Ｂｒｏｗｎ  Ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ    Ｐｕｌｌｅｒ（商標）によりボロシリレート毛管チュービング（メイン、ブランズウイック在ＦＨＣ）から下記のパラメータ：熱７５０、引張力０、速度６０、時間０を用いて生成された内直径０．７５ｍｍ及び外直径１．０ｍｍを有する引板ガラスマイクロピペット（Ｍｏｄｅｌ  ｐ−８７、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）のいずれかによって投与する。最良の結果はガラスマイクロピペットにより達成される。チップを皮膚及び頭蓋骨を通して小脳の各々の半球及び虫部の中に装入し、そこで細胞懸濁液を注入した（通常１〜２μｌ／注入）。典型的には、下記の状態が存在すべきである：細胞１×１０7／懸濁液１ｍｌ；細胞×１０6〜２×１０6／注入；各々の小脳半球において及び虫部において１注入。重要なことに、凝集を少なくしかつ細胞を懸濁させ続けるために、細胞懸濁液を氷上にずっと保ち、各々の注入の前に穏やかに研和する。
【００９８】
ＢＡＧウイルスの注入を細胞懸濁液について記載した通りにして行なった。ＢＡＧウイルス株（８×１０7Ｇ４１８耐性ｃｆｕ／ｍｌ）は、トリパンブルーに加えて、ポリブレンを８μｇ／ｍｌ含有していた。
【００９９】
例４−プログラムされた細胞死（アポトーシス）のＩＣＰ３４．５による処置
例２及び３において例示するために記載した遺伝子治療法の代替として、プログラムされた細胞死を受ける或は受けようとするニューロナル細胞を、また、γ1３４．５遺伝子、すなわちＩＣＰ３４．５によって発現した蛋白質を用いて治療することもできる。別法として、生物学的機能的等価蛋白質をかかる治療において使用することができる。
【０１００】
例えば、ＩＣＰ３４．５を蛋白質を発現する細胞から単離し、Ａｃｋｅｒｍａｎ等（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５８：８４３〜８５０、１９８６、本明細書中に援用する）によって記載される慣用のクロマトグラフィー精製及びイムノアフィニティー精製法を用いて精製する。次に、精製した蛋白質を、緩衝生理食塩水或は精製蒸留水のような製薬上適したキャリヤーと組み合わせる。製薬組成物は、投与するために、適する通りに下記のいくつかの方法の内の一つで注入することができる：（ｉ）髄腔内注入；（ｉｉ）心室内注入；（ｉｉｉ）プログラムされた細胞死を受ける或は受けようとするニューロンを含有する領域への直接注入或は当業者により理解されるその他の任意の適した投与方法。そのような治療は切断された抹消神経を外科修復する際に特に適しており、蛋白質を治療剤として使用することは、本明細書に鑑みて、医学分野における現行の技術レベルの十分範囲内である。
【０１０１】
例５−プログラムされた細胞死（アポトーシス）を防ぐための候補物質のアッセイ
単純疱疹ウイルスのγ1３４．５遺伝子はウイルスを中枢神経システム及び脳において複製し、繁殖し及び広がるのを可能にし、それでウイルスは宿主に対してニューロ毒性になる。その遺伝子を欠いた組み換えウイルスは、宿主のＣＮＳを浸透させるこの能力を失って、完全に無毒性になる。培養においてこの無毒性表現型の性質を調べる際に、その遺伝子を欠いた突然変異ウイルスはプログラムされた細胞死を特性表示する全トランスレーション停止表現型を示した。宿主細胞によって与えられるプログラムされた細胞死のこの機構は、ウイルスが繁殖しかつ広がる能力を大きく低減させた。従って、ウイルスにおけるγ1３４．５の機能は、細胞のプログラムされた死を不活性化し（抗アポトーシス）、従ってトランスレーションを回復しかつウイルスを宿主において完全なポテンシャルに複製させるのを可能にすることである。
【０１０２】
γ1３４．５のこの抗アポトーシス作用を更に調べ、神経細胞をアポトーシスに至る他の環境ストレスから保護するそれの能力を見出した。これらの環境ストレスはＵＶ、神経成長因子奪取及びニューロナル細胞分化を含む。本例は、γ1３４．５遺伝子及びγ1３４．５の生体内機能に良く似た製薬剤及び薬剤についてスクリーンするそれの保護機能を用いてニューロ退化を予防することを記載する。このようなスクリーニング手順  は、γ1３４．５を発現する細胞系統及び遺伝子を持たないヌル細胞系統の構築並びにリポーター遺伝子を誘発することによりストレス処理した後の細胞の生存度の測定を構成する。これは蛍光インジケーターを付けた宿主遺伝子プロモーター或は生存度を信号で知らせるその他の任意の容易にアッセイし得るマーカーにすることができる。
【０１０３】
物質及び方法
γ1３４．５を構成発現しかつ蛍光を付けた（例えば、ｌａｃＺに融合されたａ配列プロモーター）細胞性遺伝子、或は生存度を信号で知らせる容易にアッセイし得るマーカーになる任意の標識を含有するテスト神経芽細胞腫細胞系統を樹立する。また、ａ−ｌａｃＺインジケーター遺伝子及び同じ宿主インジケーター遺伝子からなる神経芽細胞腫ヌル細胞系統を、ａ−ｌａｃＺインジケーター遺伝子及び同じ宿主インジケーター遺伝子からなるＶｅｒｏ細胞系統と共に樹立する。次いで、通常、（１）ａ配列プロモーター活性化を誘発し；（２）ストレス処理した後に生存度が信号で知らされる通りにγ1３４．５によって与えられる保護を誘発し；及び  （３）γ1３４．５の不存在において細胞プログラムされた死を誘発することになる環境ストレスをかける。ポジティブ候補を評価するためのアッセイの提案スキームを表２に概略形態で示す。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
例６−癌或は腫瘍形成性疾患を治療する及びＨＳＶ感染をおさえるためにプログラムされた細胞死（アポトーシス）を活性化するの候補物質のアッセイ
腫瘍細胞において細胞死を誘発させるために、抗アポトーシス遺伝子の発現或は遺伝子によって発現された蛋白質の活性をブロックするのが望ましい。それ故に、腫瘍細胞において細胞死を誘発させる候補物質についてスクリーニングを可能にすることになる手順を開発するのが望ましい。加えて、ＨＳＶ−１のγ1３４．５遺伝子の発現はニューロナル細胞においてアポトーシスを防ぐのが示され、それでウイルスはＣＮＳにおいて複製、繁殖し及び広がることができる（すなわち、それでウイルスはニューロ毒性になることができる）ので、γ1３４．５発現をブロックする或はＩＣＰ３４．５の作用を抑制することができる物質は、アポトーシスを感染されたニューロンにおいて生じさせることによって、ＨＳＶニューロ毒性（或は同様の機構によるその他のウイルスの毒性）を抑制するものと予期することができる。
【０１０６】
γ1３４．５によって与えられる保護はその他の細胞を環境ストレスから保護するのに拡張することができることが見出され、実際、遺伝子は一般化された抗アポトーシス作用を有する。遺伝子γ1３４．５についてのプロモーターはＨＳＶのａ配列中にあり、ストレスの時に、プロモーターは活性化される。ａ配列プロモーターはアポトーシスリスポンシブエレメントを含有し、抗アポトーシス遺伝子の発現を伝達する細胞性因子（特に、転写因子）は性質がアポプトチックであると仮定することができる。従って、これらの細胞性因子は、抗アポトーシス遺伝子を誘発するそれらの能力を不活性にする薬剤或は剤についてスクリーンするための本アッセイの目標物になる。アッセイはａ配列プロモーター並びにアポトーシスを、抗アポトーシス遺伝子の発現をブロックすることができ、従って細胞をプログラムされた細胞死で死なせることができる治療剤及び薬剤についてスクリーンするインジケーターアッセイとして誘発させる条件によるその誘発性を使用することを伴う。
【０１０７】
ａ配列及びγ1３４．５の２８番目のアミノ酸までのコード化配列を持つテストプラスミド構造をｌａｃＺリポーター遺伝子或はその他の任意の容易にアッセイし得るリポーター遺伝子に融合させる。その構造をＧ４１８選択により神経芽細胞腫或はＰＣ１２細胞系統の中に導入し、スクリーンするためのクローンかつ連続した細胞系統を樹立する。通常細胞系統において発現されず、更にアポトーシス誘発性ストレスによって発現するように誘発されないプロモーターであるＨＳＶ後期プロモーターを持つ対照プラスミド構造を同じインジケーター遺伝子に融合させる。この構造をまた連続したクローン細胞系統の中にも導入してテスト細胞系統についての対照として働らかせる。次いで、ａ配列プロモーター活性化を誘発しかつプログラムされた細胞死を引き起こす環境ストレスを規定する。これらの状態は、取り分け、ＵＶ障害、ウイルス感染、神経成長因子奪取及び抗体の細胞表面レセプターに与える影響を含む。次いで、候補物質或は製薬上適した薬剤及び剤を、ストレスの時にａ配列プロモーター活性化をブロックするそれらの能力についてアッセイでテストする。
【０１０８】
本発明のアッセイは、抗アポトーシス遺伝子の発現を誘発する種々の細胞性因子に目標を定めた製薬上適した薬剤及び剤をスクリーンしかつ同定するのを可能にする。これらの剤は、本質的な細胞性因子を不活性にすることにより、細胞プログラムされた死を起きさせることができるべきである。このようなポジティブ候補を、次いで、腫瘍細胞において、ヘルペスウイルスで感染されたニューロンにおいて、或はウイルスであって、それの毒性が抗アポトーシス作用に依存するもので感染された細胞においてプログラムされた細胞死を誘発するために、適当に投与する（静脈内、くも膜下、或は直接注入により、もしくは経口投与により）。蛋白質及びその他の化学療法物質を抗腫瘍治療において用いることは当分野において良く知られており、従って、腫瘍形成性疾患（例えば、癌）或はヘルペス感染を治療するための候補物質の使用及び投与量は、本明細書に鑑みて、医学分野の現在の状態の技術の十分範囲内である。米国特許第４，４５７，９１６号；同第４，５２９，５９４号；同第４，４４７，３５５号；及び同第４，４７７，２４５号（これらはすべて本明細書中に援用する）参照。これらのポジティブ候補は、また、細胞プログラムされた死に至る経路において中間体の身元を確認するのにも用いることができる。
【０１０９】
物質及び方法
コラーゲンを被覆した９６ウエル培養皿においてＷ５細胞系統を樹立する。プロモーター融合エレメントを含有する対照細胞系統もまたかかる９６ウエル皿において樹立する。テスト候補物質を、９６ウエル皿において生じさせたテスト及び対照の両方の細胞系統を収容する個々のウエルにおける媒体に加える。次いで、細胞をＵＶ或はその他のストレスに短時間曝す。ストレス誘発して８時間した後に、細胞をＰＢＳ−Ａで２回洗浄し、ＰＢＳ中にホルムアルデヒド２％（ｖ／ｖ）及びグルタルアルデヒド０．２％を含有する０．５ｍｌを用いて室温で５分間固定させる。細胞を再びＰＢＳですすぎ、次いでＰＢＳ中２ｍｌの５ｍＭフェロシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（ジメチルスルホキシド中の４０ｍｇ／ｍｌ株溶液から希釈した）で染色する。３７℃で２〜３日間インキュベートした後に、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞が青色に染色された。
【０１１０】
結果
ｌａｃＺリポーター遺伝子に関して上記した構造をＰＣ１２細胞系統に導入した。新しい細胞系統Ｗ５をＧ４１８選択によってクローン樹立した。次いで、Ｗ５細胞系統を上記３に挙げた最適以下の（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）条件下でａ配列プロモーターの活性化についてテストした。結果は下記の通りである：（ａ）上記の細胞は、ＵＶに２分間簡潔に暴露した場合、ＵＶ暴露して６〜１０時間後に固定された細胞をＸ−ｇａｌで染色する際に、青色に変わる。（ｂ）上記の細胞は、ＨＳＶ−１（Ｆ）ウイルスに感染の多重度５で暴露した場合、感染して８時間後に染色する際に、また青色に変わる。（ｃ）上記の細胞は、神経成長因子（ラット、７ｓ）を媒体に導入して分化プロセスを可能にする場合に、明るい青色に変わる。（ｄ）分化が完了した後に、神経成長因子を媒体から取り出すと、細胞は一層暗い青色に変わり、細胞は生存について神経成長因子に依存するようになった。（ｅ）血清（牛胎児血清０％）が不足した細胞及び牛胎児血清１０％において充分に供給したものでは、発色の差はほとんど或は全く見られない。（ｆ）上記の実験を、毒性誘発される細胞死よりもむしろ抗アポトーシス遺伝子発現を真に抑制するために調節する対照プロモーター融合エレメントに関して、反復する。従って、この手順により、細胞において細胞死を誘発することができるポジティブ候補は下記の表現型を与えることになる：（ｉ）この物質の不存在においてストレスをテスト細胞系統に導入すると青色の細胞を生じることになる。（ｉｉ）同じ物質の存在においてストレスをテスト細胞系統に導入すると白色細胞を生じることになる。（ｉｉｉ）ストレスをこの推定物質を有する或は有しない対照細胞系統に導入しても細胞の色に影響を及ぼさない。
【０１１１】
本発明を、発明者等が発明を実施するための最良モードと考える特定の実施態様に関して開示した。しかし、種々の分野の当業者は、本明細書中に挙げる開示に鑑みて、発明の意図する範囲から逸脱しないで変更をなすことができることを認めるものと思う。本明細書中に記載する例示の実施態様並びにその他の変更及び実施態様は、本発明及び添付の請求の範囲の範囲及び精神の内に入ることを意図する。
【０１１２】
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【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１Ａ】ＨＳＶ−１Ｆ株（配列番号１〜５）、１７ｓｙｎ＋株（配列番号：６〜９）、ＭＧＨ−１０株（配列番号１０〜１５）、及びＣＶＧ−２株（配列番号１６〜２０）のＩＣＰ３４．５の遺伝子領域（左パネル）及びこれらの株におけるＩＣＰ３４．５（配列番号２５〜３４）の予測されるオープンフレーム（右パネル）のＤＮＡ配列であり、番号６６５までの塩基配列を示す。
【図１Ｂ】図１ＡのＤＮＡ配列の、番号６６６〜１３３５までの塩基配列を示す。図１Ｃは、対応するアミノ酸１９９までの配列であり、図１Ｄは、対応するアミノ酸２００以降の配列である。
【図１Ｃ】図１ＡのＤＮＡ配列の、対応するアミノ酸１９９までの配列を示す。
【図１Ｄ】図１ＡのＤＮＡ配列の、対応するアミノ酸２００以降の配列を示す。
【図２】野生型株であるＨＳＶ−１Ｆ株［ＨＳＶ−１（Ｆ）］及びそれに由来する組換えウイルスのゲノムの配列配置を示す。
【図３】電気泳動で分離したプラスミッド（野生型及び突然変異ウイルスＤＮＡ）の消化物（固体支持体にトランスファーしてγ1３４．５及びｔｋ遺伝子の存在に対する標識プローブとハイブリダイズさせたもの）のオートラジオグラフィー像を示す。
【図４】オートラジオグラフィー像（左パネル）及びＨＳＶ−１（Ｆ）及び組換えウイルスに疑似感染（Ｍ）又は感染した細胞の溶解物の写真（右パネル）を示す。
【図５】ＨＳＶ−１Ｆ株［ＨＳＶ０１（Ｆ）］及び関連変異体のゲノム構造及び配列配置を図示する。
【図６Ａ】規定の35Ｓ−メチオニンで９０分間標識した、７時間感染の感染細胞の電気泳動で分離した溶解物のオートラジオグラフィー像を示す。
【図６Ｂ】規定の35Ｓ−メチオニンで９０分間標識した、１３時間感染の感染細胞の電気泳動で分離した溶解物のオートラジオグラフィー像を示す。
【図７】変性ゲル中にて電気泳動で分離した標識したポリペプチドのオートラジオグラフィー像及び抗体との反応性により可視化された蛋白質のバンドの写真を示す。
【図８】ホスホノアセテート（ＰＡＡ）の存在又は不在下での、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞種細胞系統への感染の間に発現されたウイルス蛋白質のオートラジオグラフィー像を示す。
【図９】ウイルス性ＤＮＡ及びＲＮＡの感染ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫及びＶｅｒｏ細胞培養内の蓄積を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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