(57)【要約】【課題】  細菌の二成分情報伝達系の機構に着目した遺伝子転写制御系を用いるスクリーニング方法を簡便化し、従来の抗生物質に対して耐性を示す細菌に対する抗菌剤として有用な、イミダゾール化合物を提供する。【解決手段】  ｉｃｌＲプロモーターと、ＩｃｌＲリプレッサーとを有する遺伝子転写制御系であって、該リプレッサーのホモダイマー形成ドメインをヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメインで置換し、該プロモーターの下流側にＧＦＰをコードする塩基配列を連結させた塩基配列を有するベクターで形質転換した大腸菌に、試料を添加し、培養後、蛍光強度を測定する細菌の二成分情報伝達系におけるヒスチジンキナーゼの二量体化を阻害する化合物の簡便スクリーニング方法および該方法で得られた抗菌剤である１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾール。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の二成分情報伝達系におけるヒスチジンキナーゼの二量体化を阻害する化合物である抗菌剤。
【請求項２】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対する抗菌剤である請求項１記載の抗菌剤。
【請求項３】
１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールである請求項１記載の抗菌剤。
【請求項４】
請求項１記載の抗菌剤を有効成分とする抗菌用医薬組成物。
【請求項５】
大腸菌（E. coli）のｉｃｌＲプロモーターと、ＩｃｌＲリプレッサーとを有する遺伝子転写制御系であって、該リプレッサーのホモダイマー形成ドメインをヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメインで置換し、該プロモーターの下流側にＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をコードする塩基配列を連結させた塩基配列を有するベクターで形質転換した大腸菌に、目的化合物の試料を添加し、培養後、蛍光強度を測定することを特徴とする細菌の二成分情報伝達系におけるヒスチジンキナーゼの二量体化を阻害する化合物の簡便スクリーニング方法。
【請求項６】
化合物が抗菌剤である請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＭＲＳＡまたはＶＲＥに対する抗菌剤である請求項６記載の方法。
【請求項８】
大腸菌（E. coli）のｉｃｌＲプロモーターと、ＩｃｌＲリプレッサーとを有する遺伝子転写制御系であって、該リプレッサーのホモダイマー形成ドメインをヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメインで置換し、該プロモーターの下流側にＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をコードする塩基配列を連結させた塩基配列を有するベクター。
【請求項９】
ヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメインが黄色ブドウ球菌のＹｙｃＧ−細胞質ドメインである請求項８記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来の抗生物質に対して耐性を示す細菌に対して有効な抗菌剤およびそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）やバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）等の、従来の抗生物質に対して耐性を示す細菌が出現しており、これらの細菌に対して有効な抗菌剤が切望されている。
一方、ＭＲＳＡやＶＲＥ等も含め、細菌の二成分情報伝達系は薬剤耐性や病因における重要な役割を演じている（非特許文献１および２参照）。細菌の二成分情報伝達系は、細胞膜表面にあるセンサータンパク質（ＹｙｃＧ）と、細胞内にあるレギュレータータンパク質（ＹｙｃＦ）から構成されている。センサータンパク質は外部から刺激を受けると、そのＨｉｓ部位にリン酸基を付加して自己リン酸化し、ヒスチジンキナーゼ（ＨＫ）活性を生じ、このリン酸基をレギュレータータンパク質に転移させ、これによりレギュレータータンパク質は標的遺伝子に結合して遺伝子発現の制御を行う。この二成分情報伝達系においては、センサータンパク質であるヒスチジンキナーゼ（以下、ＨＫと略記する）の二量体化が必須の過程であることが知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【非特許文献１】Matsushita, M. & Janda, D.K., Bioorg. Med. Chem., 10, 855-867 (2002)
【非特許文献２】Barrett, J.F. & Hoch, J.A., Antimicrob. Agents Chemother., 42, 1529-1536 (1998)
【非特許文献３】Surette, M.G. et al, J. Biol. Chem., 271, 939-945 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特願２００３−４３２３１号には、細菌の二成分情報伝達系の機構に着目した遺伝子転写制御系を用いるスクリーニング方法が開示され、スクリーニングの指標として幾つか挙げられており、該指標にはＨＫやレギュレータータンパク質（Ｒ）の二量体化の阻害が含まれている。この二量体化の阻害は、ＭＲＳＡやＶＲＥ等の従来の抗生物質に対して耐性を示す細菌に対して有効な抗菌剤の新たな作用点となることが考えられる。したがって、上記スクリーニング方法は、従来の抗生物質に対して耐性を示す細菌に対して有効な抗菌剤を見出すためのスクリーニング方法として有用である。
しかし、スクリーニングされた多数の候補化合物の個々ついて、さらなる培養によって抗菌性の判断を要する場合も多々あり、スクリーニングが必ずしも簡便に行われるものではない。
本発明は、特願２００３−４３２３１号に開示されるスクリーニング方法を簡便化することを目的とする。さらに、本発明は、簡便化された本発明のスクリーニング方法で得られた、従来の抗生物質に対して耐性を示す細菌に対する抗菌剤として有用な、イミダゾール化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
特願２００３−４３２３１号には、プロモーターと、二量体を形成して該プロモーターに結合するリプレッサーとからなる遺伝子転写系を有する大腸菌（E. coli）を、リプレッサーのＤＮＡ結合領域にセンサータンパク質細胞質内領域を結合させた融合タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターにより形質転換した大腸菌変異株を用い、転写制御される遺伝子をマーカーとして抗菌剤をスクリーニングする方法が開示されている。抗菌剤候補化合物をこの方法に適用し、転写制御される遺伝子が発現すれば、候補化合物によって上記リプレッサーの二量体化が阻害されたことになり、抗菌剤として有用な化合物がスクリーニングできる。
本発明者らは、このスクリーニング方法についてさらに研究を重ねる間に、遺伝子転写系におけるプロモーターおよびリプレッサーとして大腸菌のaceBAKオペロンのリプレッサーとして知られるＩｃｌＲを利用し、かつ、転写制御される遺伝子として、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）を選択することにより、目的の抗菌剤が蛍光強度によって簡便に判定できることを見出し、本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は、
【０００５】
（１）細菌の二成分情報伝達系におけるヒスチジンキナーゼの二量体化を阻害する化合物である抗菌剤。
（２）メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対する抗菌剤である上記（１）記載の抗菌剤、
（３）１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールである上記（１）記載の抗菌剤、
（４）上記（１）記載の抗菌剤を有効成分とする抗菌用医薬組成物、
（５）  大腸菌のｉｃｌＲプロモーターと、ＩｃｌＲリプレッサーとを有する遺伝子転写制御系であって、該リプレッサーのホモダイマー形成ドメインをヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメインで置換し、該プロモーターの下流側にＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）をコードする塩基配列を連結させた塩基配列を有するベクターで形質転換した大腸菌に、目的化合物の試料を添加し、培養後、蛍光強度を測定することを特徴とする細菌の二成分情報伝達系におけるヒスチジンキナーゼの二量体化を阻害する化合物の簡便スクリーニング方法、
（６）化合物が抗菌剤である上記（５）記載の方法、
（７）ＭＲＳＡまたはＶＲＥに対する抗菌剤である上記（６）記載の方法、
（８）大腸菌のｉｃｌＲプロモーターと、ＩｃｌＲリプレッサーとを有する遺伝子転写制御系であって、該リプレッサーのホモダイマー形成ドメインをヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメインで置換し、該プロモーターの下流側にＧＦＰをコードする塩基配列を連結させた塩基配列を有するベクター、
（９）ヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメインが黄色ブドウ球菌のＹｙｃＧ−細胞質ドメインである上記（８）記載のベクター等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、耐性菌の出現極めて低い、細菌の情報伝達阻害剤である新規な抗菌剤を簡便なスクリーニング方法で見出すことができる。該抗菌剤は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＹｙｃＧ（ＨＫ）の二量体結合ドメインに作用し、ＹｙｃＧの二量体化を阻害する。そのため、ＹｙｃＧのＨＫ活性が阻害され、ＹｙｃＦへのリン酸基移転が阻害され、ＹｙｃＦが標的とする増殖に必要な遺伝子発現が阻害され、黄色ブドウ球菌は致死する。このような作用を有する抗菌剤はこれまで知られていない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のスクリーニング方法は、大腸菌のＩｃｌＲリプレッサーの活性に基づいている。図１に示すように、ホモ二量体を形成して、レポーター遺伝子としてのＧＦＰをコードする塩基配列（ＥＧＦＰ）を有するｉｃｌＲプロモーターと結合して、リプレッサーとして作用し、ＥＧＦＰの転写が抑制される。抗菌剤の候補化合物によってホモ二量体の形成が阻害されると、プロモーターとの結合が調節されて、ＥＧＦＰの転写抑制が解除され、ＥＧＦＰが発現して蛍光を生じる。この蛍光強度により候補化合物をスクリーニングする。
本発明のスクリーニング方法の有効性を確認するため、以下の検討を行った。
【０００８】
ＩｃｌＲはＤＮＡ結合性のＮ末端ドメインと、ホモ二量体形成能（二量体化能）を有するＣ末端ドメイン（ＨＤ）からなり、２つのドメインはαへリックス領域で連結していることが知られている（J. Biol. Chem., 277, 19183-19190）。ＩｃｌＲのホモ二量体化を調節する領域の位置を決定するために、本発明者らは、図２に示すごとく、全長ＩｃｌＲおよびそのアミノ酸鎖長を種々に変えた配列を有するｐＦＩ０００１、ｐＦＩ００２、ｐＦＩ００３およびｐＦＩ００４の４種のプラスミドを構築した。
図３に示すごとく、ｉｃｌＲの全長（２７４アミノ酸）をクローンしたプラスミドｐＦＩ００１を含む大腸菌ＪＭ１０９株中では、ＥＧＦＰの発現が抑制された（図３、レーン１）。プラスミドｐＦＩ００４およびｐＦＩ００３を含む大腸菌の蛍光強度（各々、レーン２および３）はプラスミドｐＦＩ００１を含むものの約５倍、プラスミドｐＦＩ００２を含む大腸菌の蛍光強度（レーン４）はプラスミドｐＦＩ００１を含むものの約２倍であった。このことは、ＩｃｌＲのリプレッサー活性を調節する領域がＩｃｌＲのＮ末端アミノ酸から１１７アミノ酸残基と１００アミノ酸残基の間に存在していることを示している。
【０００９】
ＩｃｌＲのＣ末端ドメインの役割を確認するため、プラスミドｐＦＩ００３におけるＩｃｌＲのＮ末端１００アミノ酸部位にロイシンジッパー（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5752-5756 (1998)）が融合したキメラリプレッサー（プラスミドｐＦＩ００６）を構築し、大腸菌ＪＭ１０９株中でＥＧＦＰを発現させた。このキメラリプレッサー（Ｎ１００−ｚｉｐ）はＥＧＦＰの発現を抑制するが（図３、レーン６）、該Ｎ末端１００アミノ酸部位にλｃＩリプレッサー（Nat. Biotechnol., 18, 847-851 (2000)）のＤＮＡ結合ドメイン（ＮｃＩ：２−１３２残基）を融合させたｐＦＩ００７を含む大腸菌ＪＭ１０９株では抑制が観察されなかった（図３、レーン５）。さらに、化学的架橋およびゲルシフト実験から、Ｎ１００−ｚｉｐは二量体を形成し、ｉｃｌＲボックスを含むプロモーター領域と結合し、ＥＧＦＰの発現を抑制すると結論された。
さらに、ホモ二量体化ドメインを含む大腸菌のＦａｄＲ（J. Biol. Chem., 272, 30645-30650 (1997)）のＣ末端ドメイン（ＣＦａｄ：８３−２３９残基）のホモ二量体化能を調べた。その結果、得られたキメラリプレッサーはＮ１００−ｚｉｐと同様に抑制機能を有していた（図３、レーン７）。これらの結果から、ＩｃｌＲのＣ末端ドメインがある種のホモ二量体化ドメインで置換でき、図１に示すような活性リプレッサーとして機能することが示された。
【００１０】
一方、黄色ブドウ球菌のＹｙｃＧとしてのＨＫと同じファミリーに属するＨＫの細胞質型または切形（truncated）型が二量体化することが知られている。そこで、黄色ブドウ球菌からのＹｙｃＧのホモ二量体化ドメインの機能を解明するために上記の系を使用した。
Ｎ１００を黄色ブドウ球菌のＹｙｃＧ−細胞質ドメイン（ＣＹｙｃＧ）（Mol. Microbiol., 35, 566-576 (2000))に融合させてプラスミドｐＦＩ０２８を構築した。ｐＦＩ０２８を含む大腸菌ＪＭ１０９株中で、蛍光強度はＮ−１００の５倍も減少した（図３、レーン３および８）。この結果から、ＹｙｃＧの細胞質領域もホモ二量体化に関与し、ＥＧＦＰ遺伝子の発現を抑制することが示された。
かくして、上記の系がＹｙｃＧ抑制剤のハイスループットスクリーニング用の系として使用できることが確認された。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法で使用されるベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドが挙げられ、自体公知の方法に従って、大腸菌のｉｃｌＲプロモーターと、ＩｃｌＲリプレッサーとからなる遺伝子転写制御系の、該リプレッサーのホモ二量体形成ドメインをヒスチジンキナーゼのホモ二量体形成ドメイン、特に、黄色ブドウ球菌のＣＹｙｃＧで置換し、該プロモーターの下流側にＧＦＰをコードする塩基配列を結合させた塩基配列を有するプラスミドを構築する。
また、宿主たる大腸菌は特に限定するものではなく、上記ベクターでの大腸菌の形質転換も常法により行うことができる。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法を実施するには、例えば、マイクロタイタープレートのウエルに形質転換した大腸菌と適宜の培地、例えば、ＬＢ（Luria-Bertani）ブロス、またはこれにアンピシリンを補足した培地を入れ、これに候補化合物の適宜な希釈液を加え、大腸菌の増殖に適した培養条件下で培養後、各ウエルの蛍光強度を測定することにより、さらなる抗菌性の検査なしに簡便に候補化合物を選択できる。
例えば、種々のイミダゾール化合物の試料溶液を、プラスミドｐＦＩ０２８で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株およびプラスミドｐＦＩ００１で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株とＬＢブロスを入れた９６−ウエルのマイルトタイタープレートのウエルに加え、一夜３７℃で培養し、ついで各ウエルの蛍光強度を測定した。その結果、図４
に示すごとく、式：
【化１】
2006056787.tif 000002
で示される１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールの存在下で、プラスミドｐＦＩ０２８を含む大腸菌ＪＭ１０９株における蛍光強度は不存在下の２倍に増加し、一方、プラスミドｐＦＩ００１を含む大腸菌ＪＭ１０９株における蛍光強度は当該化合物の存在、不存在にかかわらず、蛍光強度は増加しなかった。この結果は、１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールは、黄色ブドウ球菌のＣＹｙｃＧを特異的に阻害し、ＥＧＦＰを発現させることを示している。事実、実施例に示すごとく、該化合物は、ＣＹｙｃＧの自己リン酸化を７６．５μＭのＩｃ５０で阻害し、ＭＲＳＡおよびＶＲＥの増殖を２５および５０μｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害した。
したがって、１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールは、黄色ブドウ球菌のＹｙｃＧの自己リン酸化を抑制し、抗菌剤として、特にＭＲＳＡおよびＶＲＥに対する抗菌剤として有用なこと明らかとなった。また、プラスミドｐＦＩ０２８を含む系がこのような抗菌剤のスクリーニングに有用な系であることが明らかとなった。
１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールは公知であり、また、参考例に示す方法で合成できる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法により選択された化合物は、ＭＲＳＡまたはＶＲＥに対する抗菌剤として有用であり、自体公知の方法により、他の抗菌剤と同様にして抗菌用医薬組成物とすることができる。
以下、実施例および参考例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明する。実施例中、大腸菌ＪＭ１０９株およびＢＬ２１（ＤＥ３）株はＬＢブロス中で培養し、必要に応じて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した。
【実施例１】
【００１４】
プラスミドの構築
図５に示すプラスミドｐＧＭＩｉｃｌＲをつぎのようにして構築した。
クローニングに適した、各々、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉ部位を有する配列番号１および２で示されるプライマーを用いてＰＣＲにより、９９ｂｐのｉｃｌＲプロモーター（ＡＥ０００４７５、４２２６８８０−４２２６９７８）を増幅した。ＰＣＲ生成物を制限酵素で消化し、ｐＧＭＩ３０１（Mol. Microbiol., 43, 269-279 (2002))のＥｃｏＴ２２ＩおよびＢｇｌＩＩ部位に連結した。ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（１２６０ｂｐ）をｐＴｒｃ９９ＡのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローンしてプラスミドｐＦ００１を得た。配列番号３および４で示されるプライマーおよびＷ３１１０からのゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより、ｉｃｌＲ(８２５ｂｐ、ＡＥ０００４７５、４２２６８８２−４２２６０５８）を増幅した。増幅したＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＦ００１の対応する部位に連結してプラスミドｐＦＩ００１を得た。
Ｎ末端から１１７、１００および６６アミノ酸残基を含む切形ＩｃｌＲを構築するため（図２）、Quick Change部位特異的キット（Stratagene）および以下のプライマーを用いて、ＫｐｎＩ部位を、プラスミドｐＦＩ００１のｉｃｌＲの対応する部位に導入した。
プライマーｐＩＦ００４：配列番号５および６
プライマーｐＩＦ００３：配列番号７および８
プライマーｐＩＦ００２：配列番号９および１０
これらをＫｐｎＩで消化し、それら同志を連結してプラスミドｐＦＩ００４、ｐＦＩ００３およびｐＦＩ００２を構築した（図６）。
【００１５】
以下のプライマーおよびテンプレートを用いるＰＣＲにより、λｃＩのＤＮＡ結合ドメイン（Ｎ末端から２−１３２アミノ酸残基）を含むフラグメント、ロイシンジッパー（３３アミノ酸残基）を含むフラグメント、大腸菌のｆａｄＲの二量体化ドメイン（Ｎ末端から８３−２３９アミノ酸残基）を含むフラグメントおよび黄色ブドウ球菌のＹｙｃＧドメインの細胞質ドメインを調製した。
λｃＩのＤＮＡ結合ドメイン：配列番号１１および１２ならびにｐＫＷＹ２４２８
ロイシンジッパー：配列番号１３および１４ならびにｐＴ１８−ｚｉｐ
ｆａｄＲの二量体化ドメイン：配列番号１５および１６ならびにＷ３１１０からのゲノムＤＮＡ
ＹｙｃＧの細胞質ドメイン：配列番号１７および１８ならびにｐＹｙｃＧＳａ
λｃＩのＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパー、ｆａｄＲの二量体化ドメインおよびＹｙｃＧの細胞質ドメインをＫｐｎＩで消化した後、ｐＦＩ００３のＫｐｎＩ部位に融合させて、各々、プラスミドｐＦＩ００６、ｐＦＩ００７、ｐＦＩ００９およびｐＦＩ０２８を構築した。ＩｃｌＲのＣ末端が欠失したキメラＩｃｌＲリプレッサーを調製するため、以下のプライマーおよびテンプレートを用いるＰＣＲによりＮ１００またはＮ１００−ｚｉｐ領域を増幅した。
Ｎ１００：配列番号１９および２０ならびにｐＦＩ００３
Ｎ１００−ｚｉｐ：配列番号２１および２２ならびにｐＦＩ００６
Ｎ１００およびＮ１００−ｚｉｐフラクションをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した後、これらをｐＥＴ２１（ａ）＋（Novagen）の対応する部位に連結して、各々、プラスミドｐＥＴＮ１００およびｐＥＴ１００−ｚｉｐを得た。
【実施例２】
【００１６】
蛍光強度
プラスミドｐＦＩ００１、ｐＦＩ００２、ｐＦＩ００３、ｐＦＩ００４、ｐＦＩ００６、ｐＦＩ００７、ｐＦＩ００９またはｐＦＩ０２８を含む大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ補足ＬＢ（ＬＰ−ａｍｐ）ブロス中、３７℃で培養した。供試化合物の存在下または不存在下、ＬＢ−ａｍｐブロスを入れたマイクロタイタープレートのウエルに上記の培養液を１μｌづつ添加し、３７℃で２０時間培養した。培養後、各々、Wallac 1420 ARVOsx (PerkinElmer Life Science）およびModel 3550 Microplate Reader (Biolad）で、励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍおよび光学密度（ＯＤ）６００ｎｍにて蛍光を測定した。蛍光を測定した。各試料の蛍光強度をＯＤ６００値で除して正規化した。
【実施例３】
【００１７】
ＣＹｙｃＧの自己リン酸化
ＣＹｙｃＧ５ｐｍｏｌを１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールと混合し、２．５μＭのＡＴＰを含有する反応緩衝液Ａ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２〕１０μｌ中、室温で５分間［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで自己リン酸化した。ついで、反応を停止させ、２ｘ試料緩衝液〔１２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール、０．１％ＢＰＢ〕を加えた。
１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールはＣＹｙｃＧの自己リン酸化を７６．５μＭのＩｃ５０で阻害した。
【実施例４】
【００１８】
抗菌性の評価
液体希釈法により、生育最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定して抗菌性を評価した。ＭＲＳＡおよびＶＲＥをＬＢブロス中で、一昼夜培養した。一方、１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールの順次２倍希釈系列を調製し、それらに各細菌を１０６細菌／ｍｌとなるように植菌し、３７℃で一昼夜培養後、完全に増殖の阻止される最小濃度をＭＩＣとした。１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールはＭＲＳＡおよびＶＲＥの増殖を、各々、２５および５０μｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害した。
【参考例１】
【００１９】
１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールの合成
クロロホルム１０ｍＬ中、２−イソプロピルイミダゾール１．４４ｇ（１３．１ｍｍｏｌ)を７０℃で攪拌し、ついで、この溶液にドデシルブロマイド１．１７ｇ（４．６９ｍｍｏｌ）を滴下し、同温度で１日攪拌した。減圧下で溶液を蒸発させてクロロホルムを除去し、残渣を、メタノール−クロロホルム（１：１５ｖ／ｖ）を用いてシリカゲル上でカラムクロマトグラフィーに付し、１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾール１．３０ｇを得た（収率９７．６％）。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明によれば、より簡便な方法で、従来の抗生物質に対して耐性を示す細菌に対して有効な抗菌剤がスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＭＲＳＡに対する抗菌剤をスクリーニングするためのホモ二量体化（ＨＤ）系の機序を説明する図面。
【図２】ＩｃｌＲ誘導体およびリプレッサーの構成を説明する図面。
【図３】ＩｃｌＲおよびキメラリプレッサーの蛍光強度を比較したグラフ。
【図４】１−ドデシル−２−イソプロピルイミダゾールの抑制解除効果を示すグラフ。
【図５】実施例におけるプラスミドｐＦ００１の構築過程を示す図面。
【図６】実施例におけるプラスミドｐＦ００１からの各種プラスミドの構築過程を示す図面。
【配列表フリーテキスト】
【００２２】
配列番号１：ｉｃｌＲプロモーターを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２：ｉｃｌＲプロモーターを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号３：ｉｃｌＲを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号４：ｉｃｌＲを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号５：プライマーｐＦＩ００４構築のために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号６：プライマーｐＦＩ００４構築のために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号７：プライマーｐＦＩ００３構築のために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号８：プライマーｐＦＩ００３構築のために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号９：プライマーｐＦＩ００２構築のために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１０：プライマーｐＦＩ００２構築のために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１１：λｃＩのＤＮＡ結合ドメインを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１２：λｃＩのＤＮＡ結合ドメインを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１３：ロイシンジッパーを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１４：ロイシンジッパーを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１５：ｆａｄＲの二量体化ドメインを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１６：ｆａｄＲの二量体化ドメインを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１７：ＹｙｃＧの細胞質ドメインを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１８：ＹｙｃＧの細胞質ドメインを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１９：Ｎ１００を得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２０：Ｎ１００を得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２１：Ｎ１００−ｚｉｐを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号２１：Ｎ１００−ｚｉｐを得るために設計したオリゴヌクレオチドプライマー。
【図１】
2006056787.tif 000003
【図２】
2006056787.tif 000004
【図３】
2006056787.tif 000005
【図４】
2006056787.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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