(57)【要約】      （修正有）【課題】体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断するのに作用するエンドヌクレアーゼの利用法を提供する。【解決手段】DNaseγまたはDNaseγの活性阻害剤を薬剤とし、細胞に存在させることにより、以下の手段・方法を提供する。二本鎖ＤＮＡを切断するための切断剤、体細胞超変異を起こさせるための変異剤、抗体の親和性成熟を促進させるための促進剤、及び二本鎖ＤＮＡの切断を阻害するための阻害剤、体細胞超変異を阻害するための阻害剤、抗体の親和性成熟を阻害するための阻害剤。並びに、二本鎖ＤＮＡを切断する方法、体細胞超変異を起こさせる方法、抗体の親和性成熟を促進する方法、及び二本鎖ＤＮＡの切断を阻害する方法、体細胞超変異を阻害する方法、及び抗体の親和性成熟を抑制する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるための切断剤であって、
DNaseγをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有することを特徴とする切断剤。
【請求項２】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせるための変異剤であって、
DNaseγをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有することを特徴とする変異剤。
【請求項３】
Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進させるための促進剤であって、
DNaseγをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有することを特徴とする促進剤。
【請求項４】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるための切断剤であって、
DNaseγを有効成分として含有することを特徴とする切断剤。
【請求項５】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせるための変異剤であって、
DNaseγを有効成分として含有することを特徴とする変異剤。
【請求項６】
Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進させるための促進剤であって、
DNaseγを有効成分として含有することを特徴とする促進剤。
【請求項７】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害するための阻害剤であって、
DNaseγの活性阻害物質を有効成分として含有することを特徴とする阻害剤。
【請求項８】
前記DNaseγの活性阻害物質は、DNaseγのDNA結合ポケットに結合し、DNAのDNaseγに対する結合に対し立体的な結合障害を生じさせることを特徴とする請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記DNaseγの活性阻害物質が、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であることを特徴とする請求項７に記載の阻害剤。
【化１】
2006122018.tif 000012
【請求項１０】
前記DNaseγの活性阻害物質が、下式(2)〜(4)からなるグループから選ばれるいずれかの化合物またはその薬理学的に許容される塩であることを特徴とする請求項７に記載の阻害剤。
【化２】
2006122018.tif 000013
【請求項１１】
前記DNaseγの活性阻害物質が、DNaseγのGlu13、Ser14、Asp42、Ser43、及びAsn44からなるS1ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基と、DNaseγのSer10、Phe11、Gly12、Glu39、Ile40、及びLys41からなるS2ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基とに結合することを特徴とする請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記DNaseγの活性阻害物質が、さらにDNaseγのArg72、Thr77、Tyr78、Lys79、Glu80、及びGln81からなるS3ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基に結合することを特徴とする請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１３】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害するための阻害剤であって、
DNaseγの活性阻害物質を有効成分として含有することを特徴とする阻害剤。
【請求項１４】
前記DNaseγの活性阻害物質は、DNaseγのDNA結合ポケットに結合し、DNAのDNaseγに対する結合に対し立体的な結合障害を生じさせることを特徴とする請求項１３に記載の阻害剤。
【請求項１５】
前記DNaseγの活性阻害物質が、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１３に記載の阻害剤。
【化３】
2006122018.tif 000014
【請求項１６】
前記DNaseγの活性阻害物質が、下式(2)〜(4)からなるグループから選ばれるいずれかの化合物またはその薬理学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１３に記載の阻害剤。
【化４】
2006122018.tif 000015
【請求項１７】
前記DNaseγの活性阻害物質が、DNaseγのGlu13、Ser14、Asp42、Ser43、及びAsn44からなるS1ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基と、DNaseγのSer10、Phe11、Gly12、Glu39、Ile40、及びLys41からなるS2ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基とに結合することを特徴とする請求項１４に記載の阻害剤。
【請求項１８】
前記DNaseγの活性阻害物質が、さらにDNaseγのArg72、Thr77、Tyr78、Lys79、Glu80、及びGln81からなるS3ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基に結合することを特徴とする請求項１７に記載の阻害剤。
【請求項１９】
Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を阻害するための阻害剤であって、
DNaseγの活性阻害物質を有効成分として含有することを特徴とする阻害剤。
【請求項２０】
前記DNaseγの活性阻害物質は、DNaseγのDNA結合ポケットに結合し、DNAのDNaseγに対する結合に対し立体的な結合障害を生じさせることを特徴とする請求項１９に記載の阻害剤。
【請求項２１】
前記DNaseγの活性阻害物質が、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１９に記載の阻害剤。
【化５】
2006122018.tif 000016
【請求項２２】
前記DNaseγの活性阻害物質が、下式(2)〜(4)からなるグループから選ばれるいずれかの化合物またはその薬理学的に許容される塩であることを特徴とする請求項１９に記載の阻害剤。
【化６】
2006122018.tif 000017
【請求項２３】
前記DNaseγの活性阻害物質が、DNaseγのGlu13、Ser14、Asp42、Ser43、及びAsn44からなるS1ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基と、DNaseγのSer10、Phe11、Gly12、Glu39、Ile40、及びLys41からなるS2ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基とに結合することを特徴とする請求項２０に記載の阻害剤。
【請求項２４】
前記DNaseγの活性阻害物質が、さらにDNaseγのArg72、Thr77、Tyr78、Lys79、Glu80、及びGln81からなるS3ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基に結合することを特徴とする請求項２３に記載の阻害剤。
【請求項２５】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断して５′あるいは３′突出末端を生じさせる方法であって、
DNaseγを前記免疫グロブリン遺伝子に作用させることを特徴とする方法。
【請求項２６】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせる方法であって、
DNaseγを前記免疫グロブリン遺伝子に作用させることを特徴とする方法。
【請求項２７】
Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進する方法であって、
DNaseγを前記免疫グロブリン遺伝子に作用させることを特徴とする方法。
【請求項２８】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害する方法であって、
DNaseγの活性を阻害することを特徴とする方法。
【請求項２９】
免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害する方法であって、
DNaseγの活性を阻害することを特徴とする方法。
【請求項３０】
Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を抑制する方法であって、
DNaseγの活性を阻害することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるための切断剤、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせるための変異剤、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進させるための促進剤、及び、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害するための阻害剤、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害するための阻害剤、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を阻害するための阻害剤、並びに、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断して５′あるいは３′突出末端を生じさせる方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせる方法、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進する方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害する方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害する方法、及びＢ細胞が産生する抗体の親和性成熟を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
未分化Ｂ細胞は、分化過程において、免疫グロブリン遺伝子の可変（Ｖ）領域が再構成され、多様な抗体を産生するようになる。こうして成熟したＢ細胞は、抗原やヘルパーＴ細胞と接触することにより活性化して増殖し、末梢リンパ器官において胚中心（germinal center）を形成して、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ：class-switch recombination）や体細胞超変異（ＳＨＭ：somatic hypermutation）を起こすことにより、さらに多種多様な免疫グロブリン遺伝子を産出するようになる。
【０００３】
近年、胚中心において増殖するＢ細胞に特異的に発現し、ＳＨＭやＣＳＲに関わる分子としてＡＩＤ（activation-induced cytidine deaminase）が同定された（例えば、非特許文献１参照）。その後、ヒトやマウスにおいて、ＡＩＤが、成熟Ｂ細胞が抗原と接した後に起きるこれらの抗体多様性の機構に関わっていることが明らかになった。
【０００４】
ＳＨＭは、免疫グロブリンの再構成されたＶ領域やそれらの周辺のフランキング配列に、10-3〜10-4/塩基/細胞周期の割合で一塩基置換や欠失又は挿入を導入する。Ｖ領域において導入される変異は、ホットスポットと呼ばれる、RGYW/WRCYモチーフ、短い繰り返し配列、又はパリンドローム配列に対し優先的に生じる。このようにして、ＳＨＭによって、免疫グロブリンが多様性を獲得し、より親和性の高い抗体を産生できるようになることを抗体の親和性成熟（affinity maturation）と呼ぶ。
【０００５】
ＳＨＭにおいては、免疫グロブリンのＶ領域における二本鎖ＤＮＡの切断（ＤＳＢ：double-stranded DNA break）が関与すると考えられている（例えば、非特許文献２参照）。ＳＨＭの誘導と共に、免疫グロブリンの再構成されたＶ領域で、５′あるいは３′突出末端を生成するように、特異的に二本鎖ＤＮＡが切断される（例えば、非特許文献３参照）。その修復過程で、ＳＨＭが起きると考えられる。しかしながら、この過程で５′あるいは３′突出末端が生じる二本鎖ＤＮＡの切断に関与するエンドヌクレアーゼは未だ知られていない。
【０００６】
一方、アポトーシスの下流で働くＤＮＡエンドヌクレアーゼとして、DNaseγ、CAD/DFF40、Endonuclease Gなどが知られている。これらのＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちDNaseγは、33kDaのCa2+/Mg2+依存性の中性エンドヌクレアーゼであり、脾臓、リンパ節、胸腺等のリンパ系器官において高レベルで検出される。また、DNaseγは、DNaseＩやその他のファミリーのメンバーとは異なり、２つの機能的な核局在シグナルを有し、実際、主に核に局在していることが知られている（非特許文献４参照）。DNaseγは、アポトーシスの特徴であるヌクレオソームのDNA断片化を触媒する機能を有するが、DNaseγのin vivoにおける生理学的役割は未だ十分に明らかにされていない。
【非特許文献１】Muramatsu et al., Cell 102, 553-563, 2000
【非特許文献２】Sale and Neuberger, Immunity 9, 859-869, 1998
【非特許文献３】Zan et al., Immunity 18, 727-738, 2003
【非特許文献４】アポトーシスがわかる  わかる実験医学シリーズ−基本＆トピックス（編集：田沼靖一，出版社：羊土社，ISBN：4897069882）６９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるのに必要なエンドヌクレアーゼを明らかにし、それによって、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるための切断剤、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせるための変異剤、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進させるための促進剤、及び、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害するための阻害剤、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害するための阻害剤、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を阻害するための阻害剤、並びに、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断して５′あるいは３′突出末端を生じさせる方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせる方法、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進する方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害する方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害する方法、及びＢ細胞が産生する抗体の親和性成熟を抑制する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、DNaseγの発現が、CD40による刺激とともに成熟Ｂ細胞に誘導されることや、AIDの発現と同様に胚中心Ｂ細胞においてDNaseγの発現が高いことを見出した。そこで、本発明者らは、ＳＨＭ能を有するヒトBurkitt B-lymphomaであるRamos細胞株において、DNaseγを強制発現したところ、細胞の細胞周期が止まったり、アポトーシスを起こしたりすることはなく、細胞内に多量の突出末端を有するＤＮＡ断片が特異的に生じた。また、再構成した免疫グロブリン遺伝子可変領域のＳＨＭの頻度が有意に上昇した。
【０００９】
また、本発明者らは、Ramos細胞株において、DNaseγの活性阻害物質である、下式(1)の化合物を投与し、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際に生じる５′あるいは３′突出末端の生成量を調べたところ、上記化合物は、５′あるいは３′突出末端を有するＤＮＡ断片の生成を抑制することが明らかになった。
【化１】
2006122018.tif 000002
【００１０】
これらのことから、DNaseγは、ＳＨＭの過程に必要なエンドヌクレアーゼとして機能することが明らかとなり、本発明者らは、このDNaseγの機能を利用した薬剤及び方法を考案し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、
（１）本発明に係る免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるための切断剤は、DNaseγまたはDNaseγをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する。
【００１２】
本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせるための変異剤は、DNaseγまたはDNaseγをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する。
【００１３】
本発明にかかるＢ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進させるための促進剤は、DNaseγまたはDNaseγをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する。
【００１４】
本発明にかかる、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるための切断剤は、DNaseγまたはDNaseγをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する。
【００１５】
（２）本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害するための阻害剤は、DNaseγの活性阻害物質を有効成分として含有する。
【００１６】
本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害するための阻害剤は、DNaseγの活性阻害物質を有効成分として含有する。
【００１７】
本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害するための阻害剤は、DNaseγの活性阻害物質を有効成分として含有する。
【００１８】
本発明にかかる、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を阻害するための阻害剤は、DNaseγの活性阻害物質を有効成分として含有する。
【００１９】
上記いずれの活性阻害物質も、DNaseγのDNA結合ポケットに結合し、DNAのDNaseγに対する結合に対し立体的な結合障害を生じさせてもよい。
【００２０】
また、上記いずれの活性阻害物質も、下式(1)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であってもよい。  
【化２】
2006122018.tif 000003
【００２１】
また、上記いずれの活性阻害物質も、下式(2)〜(4)からなるグループから選ばれるいずれかの化合物またはその薬理学的に許容される塩であってもよい。  
【化３】
2006122018.tif 000004
【００２２】
また、上記いずれの活性阻害物質も、DNaseγのGlu13、Ser14、Asp42、Ser43、及びAsn44からなるS1ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基と、DNaseγのSer10、Phe11、Gly12、Glu39、Ile40、及びLys41からなるS2ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基とに結合してもよい。この活性阻害物質が、さらにDNaseγのArg72、Thr77、Tyr78、Lys79、Glu80、及びGln81からなるS3ドメインの１又は２以上のアミノ酸残基に結合してもよい。
【００２３】
（３）本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断して５′あるいは３′突出末端を生じさせる方法は、DNaseγを作用させることを特徴とする。
【００２４】
本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせる方法は、DNaseγを作用させることを特徴とする。
【００２５】
本発明にかかるＢ細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進する方法は、DNaseγを作用させることを特徴とする。
【００２６】
（４）本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害する方法は、DNaseγを阻害することを特徴とする。
【００２７】
本発明にかかる免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害する方法は、DNaseγを阻害することを特徴とする。
【００２８】
本発明にかかるＢ細胞が産生する抗体の親和性成熟を抑制する方法は、DNaseγを阻害することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるのに必要なエンドヌクレアーゼを解明し、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせるための切断剤、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせるための変異剤、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異によるＢ細胞の成熟を促進させるための促進剤、及び、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害するための阻害剤、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害するための阻害剤、Ｂ細胞が産生する抗体の親和性成熟を阻害するための阻害剤、並びに、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際、二本鎖ＤＮＡを切断して５′あるいは３′突出末端を生じさせる方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こさせる方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を起こすことによりＢ細胞の成熟を促進する方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害する方法、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害する方法、及び免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異によるＢ細胞の成熟を抑制する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００３１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００３２】
＝＝＝DNaseγの作用効果について＝＝＝
上述したように、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際に、DNaseγが作用することで、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせることが明らかになった。
【００３３】
このことから、再構成した免疫グロブリン遺伝子及び抗体の親和性成熟に必要な因子を有する細胞にDNaseγを同時に存在させることで、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際に、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせ、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を効率よく起こさせることができる。そして結果的に、多様化した抗体を産生させることができ、上記細胞が産生する抗体の親和性成熟を促進させることができる。
【００３４】
このように、DNaseγを含む薬剤は、二本鎖ＤＮＡを切断する切断剤、体細胞超変異を起こさせるための変異剤、抗体の親和性成熟を促進させるための促進剤として用いることができ、多様化した抗体の生産に有用であると考えられる。
【００３５】
ここで用いられる細胞は、抗体を産生する本来の細胞であるＢ細胞に限らず、再構成した免疫グロブリン遺伝子及び抗体の親和性成熟に必要な因子を有していれば何でもよく、本来その細胞が免疫グロブリン遺伝子や因子を有していなければ、外因性の遺伝子を導入することにより、外から供給してもよい。その場合、再構成した免疫グロブリン遺伝子を導入しても、再構成前の免疫グロブリン遺伝子を導入して、細胞内で再構成させた後で、DNaseγを存在させてもよい。
【００３６】
DNaseγを細胞内に存在させるには、DNaseγをコードするポリヌクレオチド、例えばDNaseγ遺伝子を組み込んだプラスミドやファージなどの発現ベクター、あるいはDNaseγ遺伝子を含むＤＮＡをin vitroで転写させて作製したmRNA、DNaseγをコードするポリヌクレオチドをもつウイルス又は細菌、DNaseγあるいはDNaseγ遺伝子を封入したリポソーム、DNaseγあるいはDNaseγ遺伝子を内包した高分子ミセル、DNaseγをHIVのTATタンパク質の膜貫通領域と融合させたタンパク質などを用い、DNaseγあるいはDNaseγ遺伝子をそれぞれに適した方法で細胞内に導入すればよい。
【００３７】
また、DNaseγをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドと、高分子キャリアとの複合体も薬剤として有用である。これにより、生体内の標的組織にプラスミドを運び、そこでDNaseγをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを遊離することが可能になる。前記高分子キャリアは、前記ポリヌクレオチドを細胞内に導入することが可能な物質であり、例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポロタミン、キトサン、合成ペプチド、又はデンドリマーなどである。
【００３８】
なお、上記薬剤においては、使用する目的に応じて、薬理学的に許容された適切な賦形剤又は基剤を含ませることとしてもよく、剤型は問わない。
【００３９】
前記発現ベクターとしては、適切なエンハンサー／プロモーターを有するものであればどのようなものでもよく、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクター等のウイルスベクターや、トランスポゾン又はプラスミドベクターなどがある。
【００４０】
また、前記ウイルスとしては、抗体産生細胞にDNaseγをコードするポリヌクレオチドを導入できるものであればどのようなものでもよく、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、ファージ等のウイルスなどがある。前記細菌としては、抗体産生細胞にDNaseγをコードするポリヌクレオチドを導入できるものであればどのようなものでもよく、例えばアグロバクテリウムなどがある。なお、動物（例えば、ヒトや、ヒト以外のラット、マウスなどの脊椎動物）や植物などの生体内にこれらのウイルスや細菌を投与する場合には、毒性や副作用が生じないようにするために、細菌やウイルスを無害化しておくことが好ましい。例えば、感染はするが、複製しないように改変されたレトロウイルスやアデノウイルスにDNaseγを発現することができる組換えベクターを組み込んでもよい。
【００４１】
なお、上記DNaseγをコードするポリヌクレオチドを挿入した組換えベクター、又はDNaseγをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドなどを抗体産生細胞に導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法などを用いることができる。
【００４２】
＝＝DNaseγの活性阻害物質の薬理作用について＝＝
本発明者らは、DNaseγのDNase活性を阻害する物質をスクリーニングするために、まずDNase I共結晶構造に基づいてDNaseγの立体構造を予測した。DNase Iの立体構造においては、DNase Iが２本鎖DNA を解離しながらDNAを切断する際に切断する側のDNA鎖が結合するDNase Iの酵素活性中心と、もう一方のDNA鎖が結合するDNA結合ポケットが存在することが知られている。そこで、本発明者らは、DNaseγの立体構造において、このDNase IのDNA結合ポケットに対応するドメインを同定した。なお、本明細書では、実際にDNAに結合するかどうかに関わらず、DNase IのDNA結合ポケットに対応するDNaseγのドメインを、DNaseγのDNA結合ポケットと呼ぶこととする。
【００４３】
上述のDNaseγのDNA結合ポケットは、DNaseIと同様、DNA切断の際のDNA結合部位であることが予想される。従って、DNA結合ポケットに結合する物質は、DNaseγに対するDNAの安定な結合に対し、立体的な結合障害を生じさせることにより、DNaseγのDNase活性に対する阻害効果を有すると考えられる。
【００４４】
続いて、DNaseγのDNA結合ポケットと結合親和性の高い物質を化合物ライブラリーから選択し、その後、選択した化合物がDNaseγのDNase活性を阻害することができるか否かを実験的に調べることにより、DNaseγのDNase活性を阻害する物質（下式(1)〜(4)で表される化合物；以下、それぞれを化合物(1)〜(4)と称する。）を見出した。
【化４】
2006122018.tif 000005
【００４５】
次に、化合物(1)とDNaseγのDNA結合ポケットとの結合様式を調べたところ、図１に示すように、化合物(1)は、DNaseγのS1（Glu13、Ser14、Asp42、Ser43、及びAsn44からなる。）、S2（Ser10、Phe11、Gly12、Glu39、Ile40、及びLys41からなる。）、S3（Arg72、Thr77、Tyr78、Lys79、Glu80、及びGln81からなる。）などのドメインにおけるアミノ酸残基と水素結合することが明らかになった。
【００４６】
また、化合物(2)とDNaseγのDNA結合ポケットとの結合様式を調べたところ、図２に示すように、化合物(2)は、DNaseγのS1、S2などのドメインにおけるアミノ酸残基と結合することが明らかになった。
【００４７】
以上のことから、DNaseγのDNA結合ポケットのS1（Glu13、Ser14、Asp42、Ser43、及びAsn44からなる。）、S2（Ser10、Phe11、Gly12、Glu39、Ile40、及びLys41からなる。）、S3（Arg72、Thr77、Tyr78、Lys79、Glu80、及びGln81からなる。）などのドメインにおけるアミノ酸残基と水素結合する化合物は、安定にDNA結合ポケットに結合して、立体的な結合障害を生じさせることができることが示唆された。
【００４８】
そこで、本発明者らは、DNaseγのDNase活性を阻害する物質は、DNaseγの作用、すなわち、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害することができるのではないかと考え、化合物(1)を用いて５′あるいは３′突出末端の生成量の変化を調べた。その結果、DNaseγのDNase活性を阻害する物質は、５′あるいは３′突出末端の生成量を抑制することが明らかになった。このことから、DNaseγのDNase活性を阻害する物質は、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害し、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異を阻害し、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異によるＢ細胞の親和性成熟を抑制することができることが示唆された。
【００４９】
また、以上のことから、立体的な結合障害を生じさせるためにDNaseγのDNA結合ポケットに物質を結合させれば、DNaseγの活性を阻害することができることから、上記化合物以外に、水素結合でDNA結合ポケットに結合する化合物、DNA結合ポケット周辺をエピトープとする抗体、DNA結合ポケットに強固に結合する修飾１本鎖DNA等のようなDNaseγと結合する物質は、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断、及び免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異などを阻害し、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における体細胞超変異によるＢ細胞の親和性成熟を抑制することができると考えられる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。
【００５１】
［実施例１］
免疫グロブリン遺伝子の可変領域における５′あるいは３′末端突出二本鎖ＤＮＡ切断が、免疫グロブリン遺伝子の体細胞超変異が起こる胚中心Ｂ細胞において特異的に検出されることが報告されている。発明者らは、このような胚中心Ｂ細胞においてDNaseγの発現が高いことを以下のように明らかにした。
【００５２】
ＳＰＦ下で飼育した10ヶ月齢のBalb/cマウス（Sankyo Labo Service）の小腸から、パイエル板（Peyer’s Patches；PPs）を単離した。パイエル板由来の細胞浮遊液をナイロンメッシュで濾過して解離させた細胞に、フィコエリスリンを結合させた抗-B220抗体（RA3-6B2；Pharmingen, BD Biosciences、希釈率：1000倍）及びFITCを結合させたピーナッツ凝集素（PNA；Sigma-Aldrich、希釈率：1000倍）を結合させた。その後、FACSVantage SE（BD Biosciences）を用いてB220+ PNA+及びB220+ PNA-細胞を分離し（図３参照）、B220+ PNA+細胞を胚中心Ｂ細胞とし、B220+ PNA-細胞を胚中心以外のＢ細胞として用いた。
【００５３】
次に、TRI reagent（Sigma-Aldrich）を用いて、胚中心（GC）Ｂ細胞、胚中心以外のＢ細胞、全脾臓細胞（ポジティブコントロール）、及び成体脳細胞（ネガティブコントロール）からそれぞれ全RNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを合成し、得られたcDNAの等量を3倍ずつ連続的に希釈し、PCR法によりDNaseγ、AID、及びHPRTの各cDNAを増幅し、アガロースゲル電気泳動した。その結果を図４に示す。
【００５４】
上記RT-PCR法において、cDNAの合成には、SuperScript III Reverse Transcriptase（Invitrogen）を用い、反応は、200μM 各dNTP（Toyobo）及び表１に示すプライマー（各400 nM）を含むPCRバッファー（10 mM Tris-HCl [pH 8.3]/50 mM KCl/1.5 mM MgCl2/0.1% Triton X-100）を用いて行った。PCRの反応は、予め95℃で3分間熱処理し、それから、85℃で3分間保温する間に1.5 units Taqポリメラーゼを加えて、その後、表２に示す遺伝子ごとのサイクル条件でそれぞれを処理し、最後に72℃で10分間伸長させることにより行った。
【表１】
2006122018.tif 000006
【表２】
2006122018.tif 000007
【００５５】
図４に示されるように、胚中心Ｂ細胞においては、胚中心以外のＢ細胞よりDNaseγが強く発現していることが明らかになった。
【００５６】
［実施例２］
ヒト末梢血Ｂ細胞を抗CD40抗体によって、in vitroでCD40を介した刺激を加えると、AIDが発現するとともに、再構成されたＶ領域のDNAにおいて、５′あるいは３′突出末端を有する二本鎖DNA切断が誘導される。また、それと同時に抗IgM抗体やIL-4によって細胞を刺激すると、５′あるいは３′突出末端の生成及びAIDの発現が増加する（Zan et al., Immunity 18, 727-738, 2003）。そこで、本実施例では、マウス脾臓Ｂ細胞を抗CD40モノクローナル抗体、及び、抗IgM抗体又はIL-4で刺激し、上記反応が起きる際、DNaseγの発現が増加するかどうかを調べた。
【００５７】
MACS B-cell Isolation Kit（Miltenyi Biotec.）を用いて9週齢のC57BL/6マウスから調製した脾臓Ｂ細胞（1.5×106個；98％の純度）を、1μg/ml 抗CD40モノクローナル抗体（1C10；Southern Biotechnology）、及び、10μg/ml ヤギ抗マウスIgM F(ab’)2 フラグメント（The Jackson Laboratory）又は100 units/ml 組換えマウスIL-4（Peprotech）、並びに10％不活性化ウシ胎仔血清（FBS）を含むRPMI-1640培地 1 ml中で24、48、又は72時間，37℃，5％CO2存在下で培養した。その後、DNaseγの検出に対しては35サイクル、HPRTの検出に対しては30サイクルPCRを行う他は実施例１に記載の方法と同様にRT-PCRを行った。その結果を図５に示す。
【００５８】
図５に示すように、マウスの脾臓Ｂ細胞を、抗IgM抗体又はIL-4及び抗CD40抗体で刺激すると、AIDと同様にDNaseγの発現の顕著な増加がみられた。この結果から、Ｂ細胞の活性化において、AIDの発現が誘導されるだけでなく、DNaseγの発現も誘導されることが示され、DNaseγがSHMに関与している可能性が示唆された。
【００５９】
［実施例３］
本実施例では、免疫グロブリン遺伝子の可変領域における平滑末端又は突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡ切断がDNaseγを必要とするかどうか調べた。
【００６０】
ヒトBurkitt B-lymphoma細胞株Ramosは、免疫グロブリンの重鎖遺伝子を再構成しており、低頻度ではあるが免疫グロブリン遺伝子の可変領域に変異を起こすことが知られている。そこで、Ramos細胞にDNaseγ遺伝子を導入し、DNaseγを発現する安定形質導入細胞株を樹立した。
【００６１】
（ベクターの構築）
GENE PULSER II (BIORAD)及びCAPACITANCE EXTENDER II (BIORAD)を用いて、1 mF・260Vの条件で、10％不活性化ウシ胎仔血清（FBS）を含むRPMI-1640培地 0.5 ml中でRamos Ｂ細胞（1×107個）にリニアライズしたphDNaseγ-Myc-His (Shiokawa & Tanuma, Biochemistry 40, 143-152, 2001) 33μgを導入した。10％ FBS及び55μM 2-ME (2-メルカプトエタノール)を含むRPMI培地（Sigma-Aldrich）を用い、5％ CO2の条件下，37℃で培養し、24時間後からG418（6 mg/ml）を添加して、耐性細胞を選択した。その結果、DNaseγを高レベルで発現し、DNaseγの酵素活性を有し、同レベルで細胞表面にIgMを発現する３つの安定形質導入クローン（Ramos 12、25、21細胞株；以下「γ/Ramos細胞株」と称する。）を得た。
【００６２】
従来、免疫グロブリン遺伝子の可変領域において生じる、平滑な二本鎖ＤＮＡの切断片又は５′あるいは３′末端が突出した二本鎖ＤＮＡの切断片を確認する方法として、T4 DNA polymeraseを用いたLM-PCR法が知られている（図６に概略図を示す。）。平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡの切断片は、T4 DNA polymeraseの処理なしでリンカーと結合することができるため、リンカー部分をプライマーにしてPCRを行うことにより増幅する。一方、５′あるいは３′突出末端を有する二本鎖ＤＮＡの切断片はT4 DNA polymeraseの処理なしではリンカーと結合できないため、リンカー部分をプライマーにしてPCRを行っても増幅しないが、T4 DNA polymeraseを行えば末端が平滑になり、リンカー部分をプライマーにしてPCRを行うことにより増幅できるようになる。
【００６３】
そこで、Genomic Tips (Qiagen)を用いて、３つのγ/Ramos細胞株及びRamos 2-2細胞株（それぞれ2×106個）からゲノムDNAを調製し、各ゲノムDNA（1μg）を200μM 各dNTPの存在下でT4 DNA polymerase（Toyobo）の有無の両方の条件で37℃，20分間処理した。
【００６４】
反応後、溶液中の酵素を熱で不活性化して、DNAをエタノールで沈殿させた後、混合液（ligation buffer (Takara Bio)、20 pmol BWリンカー、2 mM ATP、及び2.8 Weiss units T4 DNA Ligase (Takara Bio)） 20μlに溶解し、16℃で一晩インキュベーションすることによりBWリンカーをライゲートした。その後、30μlのPCR-Lバッファー（10mM Tris-HCl [pH 8.8]/50 mM KCl/0.25% Tween-20/0.25% ノニデットP-40）を添加し、95℃で10分間熱処理した。その後、BWリンカーで処理したDNAを、2.5倍ずつ連続的に希釈した。なお、上述のBWリンカーは、2 nmolのオリゴヌクレオチドBW-1（5’-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC-3’；配列番号9）及びBW-2（5’-GAATTCAGATC-3’；配列番号10）をアニーリングすることにより調製した。
【００６５】
次に、連続的に希釈した溶液を用いて、LM-PCRを2ラウンド行った。最初のラウンドでは表３に示すプライマーをそれぞれ用いて、試料を予め95℃で2分間熱処理し、それから、85℃で10分間処理する間にTaq polymeraseを加え、その後、94℃で1分間、50℃で2分間という処理を12サイクル行った。
【表３】
2006122018.tif 000008
【００６６】
続いて、最初のラウンドで得られたPCR産物 1μlに対し、表４に示すプライマーをそれぞれ用いて第２ラウンドのPCRを行った。なお、PCRは、試料を予め95℃で2分間熱処理し、それから、85℃で10分間処理する間にTaq polymeraseを加え、その後、94で1分間、60℃で2分間という処理を25サイクル行った。
【表４】
2006122018.tif 000009
【００６７】
その後、増幅したDNAを3％又は2％のアガロースゲルで電気泳動し、Biodyne-B membrane（Pall）にDNAをブロットし、γ-32P-ATPでラベルした遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（ＶＨプローブ；5’-CGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAG-3’（配列番号15）、Ｃμプローブ；5’-CACGTGGTGTGCAAAGTCCAGCACC-3’（配列番号16））でハイブリダイズした。なお、コントロールとして、Ｃμ領域遺伝子（Ｃμ遺伝子）を用いるために、プライマー（5’-CAAGACACAGCCATCCGGGTCTTCG-3’（SP6：配列番号17）、及び5’-TCAGTAGCAGGTGCCAGCTGTGTCG-3’（AP6：配列番号18））を用いて、PCRを30サイクル行い、増幅した。その結果を図７に示す。
【００６８】
図７に示すように、γ/Ramos細胞株から調製したDNAは、T4 DNA polymeraseで処理した場合、T4 DNA polymeraseで処理しない場合に比べて、免疫グロブリン遺伝子のＶ領域の検出できる切断片が顕著に増加することがわかった。よって、これらの細胞株では二本鎖DNAが切断されてできた５′あるいは３′突出末端が平滑末端より著しく多いことがわかった。一方、Ramos 2-2細胞株では５′あるいは３′突出末端は若干しか含まれていなかった。また、γ/Ramos細胞株から調製したDNAは、T4 DNA polymeraseで処理しても処理しなくても免疫グロブリン遺伝子のＣμ領域の切断片は確認できなかった。
【００６９】
［実施例４］
次に、実施例３に記載の方法の信頼性を確かめるため、Ramos2-2のゲノムDNAを制限酵素で消化したDNAを用いて同様の実験を行った。
【００７０】
まず、ゲノムDNA中に平滑末端又は突出末端を生成するために、Ramos2-2細胞のゲノムDNAを、平滑末端を生じるMsl I（New England Biolab）又は突出末端を生じるBstE II（Toyobo）で処理し、その後、実施例３に記載の方法と同様な処理を行い、Ｃμ領域の遺伝子の二本鎖DNA切断を検出した。なお、リンカーで処理されたDNA（16ng）の増幅は、RaCm5’-608、RaCm5’-644、及びBW-1プライマーを用いて行った。その結果を図８に示す。
【００７１】
図８に示すように、Msl Iを用いた場合、Ｃμ領域における平滑末端を有する二本鎖DNA切断をLM-PCRにより検出したところ、DNA断片の検出量はT4 DNA polymeraseの処理の有無に影響しないことが確認できた。一方、BstE IIを用いた場合、Ｃμ領域における５′あるいは３′突出末端を有する二本鎖DNA切断は、T4 DNA polymeraseの処理なしで検出されず、T4 DNA polymerase処理によって検出されるようになった。これらの結果から、実施例３に記載の方法が信頼できる方法であることが明らかとなった。
【００７２】
以上のことから、DNaseγは、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際に、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせる作用を有することが示唆された。
【００７３】
［実施例５］
次に、DNaseγの過剰発現がRamos細胞における免疫グロブリンの自然突然変異率に影響を与えるかどうかを調べた。本実施例では、γ/Ramos細胞株からサブクローンを樹立し、各RamosサブクローンにおけるＶＨ領域の突然変異率を調べ、原細胞株であるRamos2-2における突然変異率と比較した。
【００７４】
96ウェルプレートにγ/Ramos及びRamos2-2細胞（1 cell/well）を播種し、増殖してきたシングルコロニーを細胞密度が過剰にならないように継代しつつ培養した。１ヶ月後、各サブクローンのゲノムDNAをそれぞれ調製し、KOD plus polymerase（Toyobo）及びプライマー（RVHFOR及びJOL48；Sale and Neuberger, Immunity 9, 859-869, 1998参照）を用い、再構成されたＶＨＤＪＨ配列（プライマー配列を除く341bp）をPCRで増幅し、各PCR産物を、Zero Blunt TOPO PCR cloning kit（Invitrogen）を用いてプラスミドベクターpCR-Blunt II-TOPOにクローニングした。DNA配列の解析のための鋳型を、TempliPhi Amplification kit（Amersham Biosciences）を用いてローリングサークル型複製により調製し、T7 primer（Takara Bio.）を用いてPCR産物の塩基配列を決定した。
【００７５】
その結果を表５に示す。なお、表中の「ｂ」は1 bpの欠失を、「ｃ」は1 bpの挿入を、「ｄ」は総変異数を総塩基数で割ることにより算出した変異率を、「ｅ」はスチューデントｔ−テストによって算出したp値を、「ｆ」はＧ−Ｃ塩基対における変異率を、挿入を含む総変異数で割った変異率を、「ｇ」はＧからＡ、又はＣからＴへの塩基置換数をＧＣ変異数で割った変異率を、それぞれ示す。
【表５】
2006122018.tif 000010
【００７６】
Ramos細胞の変異率は、１世代あたりおよそ2.4×10-5 /bpであると報告されている。これに対し、Ramos2-2のサブクローンの変異率は、平均で1.7×10-4/bp（１世代あたりおよそ4.7×10-6/bp；ただし、１世代に20時間要すると仮定。）であり、以前に報告されたものに比べておよそ５倍低かった。３つのγ/Ramos細胞株のサブクローンの変異率は、平均で3.2×10-4/bpであり、Ramos2-2細胞株のものより有意に高いことがわかった。このことから、DNaseγの過剰発現が、ゲノムDNAのＶＨ領域における変異率を上昇させていることが示唆された。
【００７７】
３つのγ/Ramosのサブクローンにおいては、変異の95％はG/Cの塩基対で生じており、この変異にAIDのDNAデアミナーゼ活性が関与していると思われた。G/Cの変異のうち44％は、GからA又はCからTの塩基の変換であり、以前Ramos細胞において報告された頻度（50％；Sale JE & Neuberger MS, Immunity 9, 859-869, 1998）と同様であった。このことから、UNG（uracil-nucleotide glycosylase）及び／又は変異性ミスマッチ修復系がγ/Ramosにおいても同程度に寄与していることが示唆された。以上のことから、DNaseγは、生理的にSHMの機構に関与しており、５′あるいは３′突出末端を有する二本鎖DNA切断を促進してＶＨ領域に変異を生じさせる機能を有することが示唆された。
【００７８】
［実施例６］DNaseγの立体構造の予測
（1）DNase I結晶構造(PDB code：2DNJ)を基に、ホモロジーモデリング法により、DNaseγの初期構造を構築した（図９参照）。なお、ホモロジーモデリング法のソフトウェアとしてModeller（http://salilab.org/modeller/modeller.html）を用いた。  
（2）鋳型として用いたDNase Iの立体構造はDNAとの共結晶であることから、その複合体構造を基にDNaseγ/DNA複合体構造を構築した。  
（3）分子動力学ソフトウェアであるAmberを用いてDNaseγ/DNA複合体構造の構造を最適化し、最終的な立体構造とした。  
（4）予測したDNaseγ/DNA複合体の立体構造の妥当性を、Verify3Dを用いて評価した。
【００７９】
Verify3Dを用いた評価の結果、スコアが121.41であり、立体構造の妥当性目安値（S=exp(-0.83+1.008ln(L))；Lは残基数で(L=256)）が116.7以上であったことから、予測したDNaseγ/DNA複合体の立体構造は妥当であると判断した。また、予測したDNaseγ/DNA複合体の立体構造から、DNase IのDNA結合ポケットに対応するDNaseγのドメイン（S1, S2, S3）を予測した（図１及び図２参照）。これらのドメインに含まれるアミノ酸は、S1(Glu13、Ser14、Asp42、Ser43、Asn44)、S2(Ser10、Phe11、Gly12、Glu39、Ile40、Lys41)、S3(Arg72、Thr77、Tyr78、Lys79、Glu80、Gln81)であった。
【００８０】
［実施例７］Docking ProgramによるDNaseγ阻害剤の１次スクリーニング
次に、実施例６で予測したDNaseγの構造を用いて、Dockingプログラム（Autodock 3.0）により、化合物ライブラリーに含まれる化合物とDNaseγのDNA結合ポケットとをドッキングさせ、その結合親和性スコアを計算することでDNaseγの阻害剤となりうる物質（上述の化合物(1)〜(4)）を選択した。なお、化合物ライブラリーとしてはChemACXを用い、パラメータとしては全てデフォルトで行った。
【００８１】
［実施例８］DNaseγのDNase活性に対する阻害効果（２次スクリーニング）
実施例７により選択された化合物(1)〜(4)がDNaseγのDNase活性を阻害することができるかどうかを確認するため、化合物(1)及び(2)をSigma社から、化合物(3)をFluka社から、化合物(4)をMolecular Probes社からそれぞれ購入し、in vitroで、DNaseγによるDNA切断活性の阻害効果を調べた。
【００８２】
（1）各濃度の化合物（化合物(1)〜(4)のいずれか）とDNaseγ（final 8×10-4 Kunitz units/μl)とを反応液（50 mM Mops-NaOH (pH 7.2)、3 mM MgCl2、3 mM CaCl2、0.1 mg/ml BSA(bovine serum albumin)） 45μl中に懸濁し、37℃にて30分間インキュベートした。  
（2）サケ精子DNA（0.5mg/ml） 5μlを加え、37℃にて20分間反応した(total 50μl)。  
（3）10% PCAを50μl加えることにより反応を停止した。  
（4）氷上20分間放置した。  
（5）3000 rpm、4℃で15分間遠心した。  
（6）上清を蒸留水で希釈し、DNaseγにより分解された酸可溶性DNA産物を吸光度A260を測定し、DNaseγの活性を算出し、IC50を求めた。
【００８３】
結果を表６に示す。
【表６】
2006122018.tif 000011
【００８４】
表６に示すように、化合物(1)〜(4)はいずれもDNaseγのDNase活性を阻害することが明らかとなった。特に化合物(1)及び化合物(2)は優れた阻害効果を示した。
【００８５】
［実施例９］アポトーシスにおけるDNA断片化阻害効果の確認（２次スクリーニング）
次に、実施例７により選出された化合物が、培養細胞のアポトーシスにおいてゲノムDNA断片化を抑制することができるかどうかを調べた。
【００８６】
（1）内因性のDNaseγの発現がほとんど検出されず、様々なアポトーシス刺激に対してDNAの断片化が生じないHeLa S3細胞を培地（10% FCSを含むダルベッコ改変イーグル培地）の入った3.5 cm dish に1×105個播種した。  
（2）一晩培養し、培地を交換した後、DNaseγ依存性アポトーシス活性を細胞に与えるため、Human DNaseγのcDNAをベクターpcDNA3.1/Myc-His (Invitrogen社)のNot I SiteへサブクローニングしたhDNaseγの発現ベクターをHeLa S3細胞に導入した（サンプル３〜６）。なお、遺伝子導入はFuGene6（Roche社製）を用いて行った。  
（3）さらに一晩培養し、培地を交換した後、0.5μM スタウロスポリン（STS；アポトーシス誘導剤）（サンプル２〜６）及び各濃度で化合物(1)（サンプル３〜６）を添加して24時間インキュベートした。  
（4）細胞を回収し、プロティナーゼＫ（タンパク質分解酵素）及びRNase A（RNA分解酵素）で処理して、細胞から抽出物を得た後、その抽出物を1.8% アガロースゲルを用いて電気泳動した。結果を図１０に示す。
【００８７】
以下、各サンプルに対する処理のまとめである。  
（サンプル１）DNAのみ
（サンプル２）ネガティブ・コントロール（STS(＋)  DNaseγ(−)）
（サンプル３）ポジティブ・コントロール（STS(＋)  DNaseγ(＋)）
（サンプル４）（STS(＋)  DNaseγ(＋)  化合物(1)（10 μM））
（サンプル５）（STS(＋)  DNaseγ(＋)  化合物(1)（30 μM））
（サンプル６）（STS(＋)  DNaseγ(＋)  化合物(1)（100 μM））
【００８８】
図１０に示すように、化合物(1)が、DNaseγによるゲノムDNA断片化を濃度依存的に抑制し、100μMではほぼ完全に抑制することが明らかになった。
【００８９】
さらに、化合物(1)がアポトーシスの他の過程、即ちゲノムDNA断片化以外の過程に影響を及ぼさないことを確認するため、アポトーシスの指標であるPARP（poly(ADP-ribose) polymerase-1）の切断に対する化合物(1)の効果を調べた。上述のようにhDNaseγの発現ベクターを導入したHeLa S3細胞を0.5μM スタウロスポリン（STS；アポトーシス誘導剤）及び100μMの化合物(1)で処理した後（サンプル４）、細胞をホモゲナイズして得られた抽出物を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。コントロールとして、処理をしない細胞（サンプル１）、化合物(1)のみで処理した細胞（サンプル２）、STSのみで処理した細胞（サンプル３）、についても同様に実験を行った。１次抗体は、抗PARPモノクローナル抗体（和光No. 016-16831、1:500で使用）、２次抗体は、抗マウスIgG抗体（Promega社、1:1000で使用）を用い、Western-Blue（Promega社）を用いてシグナルを検出した。
【００９０】
図１１（サンプル４）に示すように、化合物(1)の存在下においてもPARPの切断が検出されたことから、化合物(1)はアポトーシスの開始や進行にはほとんど影響を及ぼさず、DNaseγによるゲノムDNA断片化を特異的に阻害することが明らかになった。
【００９１】
［実施例１０］
次に、Ramos 2-2細胞の増殖に対する、化合物(1)の影響を評価した。  
まず、最初にRamos 2-2細胞株（2×106個）に100μM 化合物(1)が添加された上述の培地、又は上述の培地のみで48時間培養し、細胞数の経時変化を調べることにより、化合物(1)がRamos 2-2細胞の増殖に与える影響を評価した。その結果を図１２に示す。
【００９２】
化合物(1)を添加した培地と、化合物(1)を添加していない培地を用いた場合に、Ramos 2-2細胞の増殖に何ら変化が見られなかったことから、化合物(1)は、Ramos 2-2細胞の増殖に対して毒性を示さないことがわかった。
【００９３】
そこで、化合物(1)を用いて、DNaseγの、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際に、二本鎖ＤＮＡを切断し５′あるいは３′突出末端を生じさせる作用を阻害することができるかどうかを調べた。
【００９４】
Ramos 2-2細胞株（2×106個）に100μM 化合物(1)が添加された上述の培地、又は上述の培地のみで24時間培養し、実施例３に記載の方法と同様に、培養した細胞株（2×106個）からゲノムDNAを調製し、T4 DNA polymeraseを用いたLM-PCR法を行い、５′あるいは３′突出末端した二本鎖ＤＮＡの切断片の生成量の変化を測定した。その結果を図１３に示す。
【００９５】
Ramos2-2細胞株から調製したDNAをT4 DNA polymeraseで処理しない場合には、DNaseγの活性阻害物質を添加しても免疫グロブリン遺伝子のＶ領域の切断片の生成量の変化はなかった。よって、平滑末端をもつ二本鎖DNA切断にはDNaseγは関与しないと考えられる。
【００９６】
一方、Ramos2-2細胞株から調製したDNAをT4 DNA polymeraseで処理した場合には、免疫グロブリン遺伝子のＶ領域の検出できる切断片は増加したが、DNaseγの活性阻害物質の添加により、その増加は抑制された。
【００９７】
以上のことから、DNaseγの活性阻害物質は、DNaseγの作用を阻害して、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断を阻害することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明の一実施形態において、化合物(1)とDNaseγとの結合様式を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、化合物(2)とDNaseγとの結合様式を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、B220+ PNA+（GC Ｂ細胞）及びB220+ PNA-（GC以外のＢ細胞）を分画するためのFACSの結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、胚中心Ｂ細胞、胚中心以外のＢ細胞、全脾臓細胞、及び成体脳の細胞の全RNAを用いて、DNaseγ、AID、及びHPRTの発現を調べた結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、脾臓Ｂ細胞におけるCD40、及び、BCR又はIL-4Rを刺激した場合のDNaseγの発現の変化を調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、Ramosの免疫グロブリン遺伝子のＶＨ領域において、二本鎖ＤＮＡが切断する際に生じる５′あるいは３′突出末端を検出するためのLM-PCR分析の概略図を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、Ramos細胞に対するDNaseγの過剰発現の影響を調べた結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、実施例３に記載の方法の信頼性を調べるために、Ramos2-2のゲノムDNAのゲノムDNAをMsl I又はBstE IIで消化し、Ｃμ領域における切断片をLM-PCR法により検出して確認した結果を示す図である。
【図９】本発明の一実施例において、DNaseγの立体構造を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例において、化合物(1)がDNaseγによるDNA断片化を阻害する効果を示す図である。
【図１１】本発明の一実施例において、アポトーシスの指標であるPARP（poly(ADP-ribose) polymerase-1）の切断に対する化合物(1)の影響を調べた結果を示す図である。
【図１２】本発明の一実施例において、Ramos2-2細胞株に対する化合物(1)の影響を調べた結果を示す図である。
【図１３】本発明の一実施例において、免疫グロブリン遺伝子の可変領域に体細胞超変異が起きる際の、５′あるいは３′突出末端を生じる二本鎖ＤＮＡの切断に対する化合物(1)の効果を調べた結果を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図１２】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月4日(2004.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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