(57)【要約】【課題】  核酸増幅において、非特異的増幅を効果的に抑制して、特異的な増幅効率を向上することができる技術の提供、特には、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を最適に制御できる技術の提供。【解決手段】  耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化機能を制御する、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質を含有してなるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が付加されたポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸を増幅するための核酸増幅方法であって、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質の存在下で標的核酸を増幅する核酸増幅方法、並びに、核酸増幅用キット。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化機能を制御する、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質を含有してなるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物。
【請求項２】
前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のＲｅｃＡタンパク質である請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物。
【請求項３】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が、前記ＤＮＡポリメラーゼの化学的又は生物学的な修飾により付加されている請求項１又は２に記載のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物。
【請求項４】
前記修飾が、前記ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体による修飾である請求項３に記載のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物。
【請求項５】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が付加されたポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸を増幅するための核酸増幅方法であって、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質の存在下で標的核酸を増幅する核酸増幅方法。
【請求項６】
前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のＲｅｃＡタンパク質である請求項５に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が、前記ＤＮＡポリメラーゼの化学的又は生物学的な修飾により付加されている請求項５又は６に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
前記修飾が、前記ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体による修飾である請求項７に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
前記標的核酸が、阻止的または抑制的２次構造の区域を有する請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、マルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応である請求項５〜９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１１】
請求項５〜１０のいずれか一項に記載の核酸増幅方法による増幅産物をスクリーニングすることにより一塩基多型を検出する、一塩基多型の検出方法。
【請求項１２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと前記ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対して熱可逆性不活性化機能を付加する物質との組み合わせ、又は、熱可逆性不活性化機能が付加された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
アデニン、チミン、グアニン及びシトシンの夫々に対応する４種類のデオキシヌクレオチド５´−三リン酸と、
高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質と、を含む核酸を増幅するための核酸増幅用キット。
【請求項１３】
前記核酸の増幅が、マルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応に基づく請求項１２に記載の核酸増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物、及び核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と略する場合がある。）は、目標とする特定の核酸領域を短時間で１０万倍以上に増幅できる画期的な技術である。しかしながら、その反応を最適化することは難しい。つまり、プライマーが標的配列以外にアニールする、あるいはプライマー同士がアニールする等のミスプライミングに起因する非特異的な増幅が生じることが問題となっている。非特異的増幅の問題は、特に標的核酸が非常に低濃度で存在する場合に深刻である。そこで、標的核酸領域のみを特異的かつ効率的に増幅できる技術の確立が求められていた。そのためには、ＰＣＲサイクルの各段階でミスプライミングがおこらないようにＰＣＲをコントロールする必要がある。
【０００３】
そこで、非特異的増幅を起こりにくくするための方法として、いわゆるホットスタート（hot start）型ＰＣＲが知られている（例えば、特許文献１、２、３を参照）。かかる方法は、非特異的増幅が生じやすい初期反応において耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性を一時的に抑制すべく、高温、例えばアニーリング温度以上となるまで、ＤＮＡポリメラーゼが伸長反応を行わないようにするものである。ホットスタート型ＰＣＲとしては、種々の手法が報告されている。たとえば、低温条件、例えばアニーリング温度以下でのＤＮＡポリメラーゼの活性を、化学的修飾により熱可逆的に不活性化する方法、ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体を結合させる等の生物学的修飾により熱可逆的に不活性化する方法が報告されている。
【０００４】
また、最近になって、本発明者らは、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質（以下、「高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質」と略する場合がある。）が、鋳型やプライマーと相互作用して特定の標的核酸配列にのみプライマーの結合を促進でき、それにより、ミスプライミングを抑制できることを報告した（例えば、特許文献４を参照のこと。）。高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は各ＰＣＲサイクルにおける、ミスプライミングを抑制し、特異的なＰＣＲ産物の増幅を可能とした（以下、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下でＰＣＲを行う本発明者らの技術を、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲと称する場合がある。）
【特許文献１】米国特許第５,５６５,３３９号明細書
【特許文献２】米国特許第６,６１０,４７９号明細書
【特許文献３】米国特許第６,４０３,３４１号明細書
【特許文献４】国際公開第０４／０２７０６０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述のホットスタート型ＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応の制御が難しく、所望の増幅産物の効率的かつ特異的な取得の観点から十分に満足できる技術ではなかった。詳細には、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応に対する制御が強い場合には、その後のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応効率に影響し、効率的に所望の増幅産物を得ることができなかった。また、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応に対する制御が弱い場合には、十分なホットスタート効果を得られず、非特異的増幅を有効に抑制できなかった。
【０００６】
一方、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質であっても、ＰＣＲは高温下での熱変性を繰り返し、また、アニーリング温度が高いため、耐熱性が充分ではない。そのため、本発明者らの以前報告した特許文献４に開示の高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲ技術において、ＰＣＲの初期で高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の有する生物学的機能が低下し、サイクルを経る毎に徐々に非特異的増幅が生じることが判明した。また同時に、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質はＰＣＲ反応液によっても、その生物学的機能が低下することが判明した。その結果、特に、ＰＣＲサイクルの後期段階でミスプライミングが起こり非特異的な増幅が生じていた。
【０００７】
したがって、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を標的核酸領域の特異的かつ効率的な増幅のため最適に制御でき、引いては、ＰＣＲの各段階において更に最適にＰＣＲを制御できる技術の確立が依然として求められていた。
【０００８】
そこで、本発明は以上の実情を鑑みて、核酸増幅において、非特異的増幅を効果的に抑制して、特異的な増幅効率を向上することができる技術の確立を目的とする。特には、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を最適に制御できる技術の確立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究した結果、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化機能が付加されたポリメラーゼ連鎖反応の好適例である、いわゆる、ホットスタート型ＰＣＲにおいて、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を添加して反応を行った。これにより、非特異的結合を効果的に抑制でき、所望の標的核酸領域のみを特異的に増幅できるとの知見を得た。更に鋭意研究を行ったところ、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質が、ホットスタート型ＰＣＲにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応を適切に制御でき、それによりホットスタート機能を向上できるとの知見を得た。これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、上記目的を達成するため本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化機能を制御する、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質を含有してなるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物を提供する。好ましくは、前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のＲｅｃＡタンパク質である。
【００１１】
また、好ましくは、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が、前記ＤＮＡポリメラーゼの化学的又は生物学的な修飾により付加されており、更に、前記修飾が、記ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体による修飾であることが好ましい。
【００１２】
そして、また、上記目的を達成するため本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が付加されたポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸を増幅するための核酸増幅方法であって、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質の存在下で標的核酸を増幅する核酸増幅方法である。
【００１３】
好ましくは、前記高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質がサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のＲｅｃＡタンパク質である。
【００１４】
また、好ましくは、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が、前記ＤＮＡポリメラーゼの化学的又は生物学的な修飾により付加されており、更に、前記修飾が、前記ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体による修飾であることが好ましい。
【００１５】
特に、前記標的核酸が阻止的または抑制的２次構造の区域を有する場合に、好ましく、前記ポリメラーゼ連鎖反応がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応である場合にも好ましく利用できる。
【００１６】
そして、更に、上記目的を達成するため本発明は、本発明の核酸増幅方法による増幅産物をスクリーニングすることにより一塩基多型を検出する、一塩基多型の検出方法をも提供する。
【００１７】
更には、上記目的を達成するため本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと前記ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応に対して熱可逆性不活性化機能を付加する物質との組み合わせ、又は、熱可逆性不活性化機能が付加された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンの夫々に対応する４種類のデオキシヌクレオチド５´−三リン酸と、高度好熱菌由来のＲｅｃＡタンパク質と、を含む核酸を増幅するための核酸増幅用キットを提供し、特には、前記核酸の増幅がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応に基づく場合が好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の作用により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する不活性化機能を最適に制御することができる。そして、このような機能が付加されたＰＣＲ、特に好適には、いわゆるホットスタート型ＰＣＲ、におけるホットスタート機能を向上させることができ、ミスプライミングをより効果的に抑制することができる。それにより、効率的かつ特異的な核酸増幅が実現され増幅精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、具体的な本発明の実施の形態について説明するが、これはあくまでも本発明を例示するに留まり、本発明を限定するものではない。
【００２０】
本発明の一の実施形態は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化機能を制御することができるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物である。そして、かかる組成物は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を含むことを特徴とする。
【００２１】
ここで、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質とは、単鎖核酸に協同的に結合し、該単鎖核酸と二本鎖核酸との間で相同領域を検索し、核酸の相同組換えを行うタンパク質である。本発明において用いられるＲｅｃＡタンパク質は、高度好熱菌由来のタンパク質である。本発明の使用に適した高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質としては、サーマス（Thermus）属、サーモコッカス（Thermococcus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）属、サーモトーガ（Thermotoga）属等由来のＲｅｃＡタンパク質が例示される。具体的には、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermusaquaticus）由来のＲｅｃＡタンパク質が例示される。特に、好ましくは、サーマス・サーモフィラス由来である。
【００２２】
これらの高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は、天然由来の高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の他、化学合成的もしくは遺伝子工学的に人工的に合成された高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質も包含する。具体的には、常法に従って、高度好熱菌から抽出したものを利用することができる。更に、既知の大腸菌等の宿主・発現ベクター系を利用して、容易に精製することができる。例えば、当該ＲｅｃＡタンパク質をコードする遺伝子を公知の方法により導入した発現ベクターにより宿主である大腸菌を形質転換して培養し、当該ＲｅｃＡタンパク質を発現させる。そして、宿主の大腸菌を破砕して熱処理を行うことにより、当該ＲｅｃＡタンパク質以外の大腸菌由来タンパク質は熱変性して熱凝集するため、遠心分離等により分離除去できる。これにより熱変性しない当該ＲｅｃＡタンパク質を可溶画分として大腸菌由来タンパク質と分離し、親和性クロマトグラフィー等を用いて精製できる。
【００２３】
このとき、当該ＲｅｃＡタンパク質は高度好熱菌由来であるため室温で構造が安定しており、さらに有機溶剤に対しても高い安定性を有している。そのため、上記精製工程は室温で行うことが可能である。
【００２４】
また、宿主細胞としては、大腸菌に限定されず、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を好適に利用することが可能である。
【００２５】
発現ベクターとしては、プロモーター配列、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質をコードする遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素サイトを有するマルチクローニングサイト等の配列を含み、かつ、上記宿主細胞で発現できるものであれば、何れの発現ベクターを用いることができる。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７ｌａｃプロモーターを利用するのが好ましい。
【００２６】
さらに、この発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。他の公知の塩基配列としては特に限定されない。例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、及びネオマイシン耐性遺伝子・カナマイシン耐性遺伝子・クロラムフェニコール耐性遺伝子・アンピシリン耐性遺伝子・ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。このような発現ベクターは、市販の大腸菌用発現ベクター（例えばｐＥＴタンパク質発現システム：ノバジェン社製）を用いることが可能である。さらに、適宜所望の配列を組み込んだ発現ベクターを作製して使用することが可能である。
【００２７】
更に、上記したような高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質と類似の構造を有し、かつ、機能的に同等なタンパク質をも含む。したがって、自然界に存在する高度好熱菌ＲｅｃＡ類似タンパク質の他、人為的な変異誘発または遺伝子組換えにより改変されたタンパク質をも含むことが意図される。例えば、上記した天然由来の高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記した高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質と生物学的機能が同等である改変体が包含し得る。なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の生物学的機能が維持される限り制限されない。
【００２８】
ここで、アミノ酸配列に対する改変は、改変しようとするアミノ酸配列に部位特異的変異導入法（例えば、Nucleic Acid Res. 10、pp6487、1982年を参照）等の公知の変異操作手段を用いて人工的に行うことができる。更には、自然界におけるアミノ酸の変異によって生じた改変体をも含む。
【００２９】
また、本明細書において、「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化」とは、不活性化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応が、昇温により再活性化されることを意味する。そして、「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化機能」とは、特に好適には、いわゆるホットスタート型ＰＣＲにおける、ホットスタート機能を意味する。また、「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活化機能を制御する」とは、特に好適には、ホットスタート型ＰＣＲにおける、ホットスタート機能を目的とする状態に保つために働くことを意味する。したがって、ＰＣＲに対するホットスタート機能の最適化が、特に好適に例示される。以下、このような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の熱可逆性不活性化が好適に利用されるホットスタート型ＰＣＲにおける場合を詳細に説明する。
【００３０】
ホットスタート型ＰＣＲとは、高温になるまで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが伸長反応を行わないように、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を熱可逆的に不活性化するホットスタート機能が付加されたＰＣＲである。したがって、ホットスタート型ＰＣＲは、ホットスタート機能が付加された状態において、一般的なＰＣＲを行うものである。これにより、非特異的産物の増幅を最小限に抑制して所望の増幅産物を効率的かつ特異的に取得することができる。非特異的増幅は、低温条件下においては、標的核酸の一本鎖部分の様々な部位にプライマーがアニーリングし、また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも低いながらも活性を有することが要因となって生じる。更に、低温条件下においては、プライマー同士がアニーリングしてプライマーダイマー及びプライマーオリゴマーを形成しやすいことに起因しても生じる。つまり、このような非特異的増幅は、反応液を混合してから最初の変性条件に温度を上げていくまでの過程で起こりやすいため、高温になってから、はじめてポリメラーゼの伸長反応を発揮させることにより、非特異的増幅を防止するものである。
【００３１】
ここで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを再活性化する温度は、ホットスタート機能に依存するものである。通常、プライマーが鋳型とする核酸上の非特異的部分、例えば、増幅標的領域以外の部位、へのアニーリング、並びに、プライマー同士のアニーリングが生じない程度に、十分に高温である必要がある。つまり、プライマーが、標的核酸の特定配列以外に対して相補的にアニーリングすることができない程度に十分に高温である必要がある。したがって、プライマーが安定して標的核酸領域とアニーリングすることができる限界温度である融解温度（以下、「Ｔｍ」と略する場合がある）以上であることが必要である。そして、典型的には、７０℃〜９５℃であり、特には、８７℃である。また、本明細書において高温とは少なくともＴｍ以上であることを意味するものとし、低温とは、少なくともＴｍ以下であることを意味する。
【００３２】
そして、ホットスタート型ＰＣＲとして、種々の手法が開発されている。本発明の、ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物は、公知のいずれのホットスタート型ＰＣＲにおいて、そのホットスタート機能をＰＣＲに対して最適に制御することができる。それによりホットスタート機能を向上させることができる。具体的には、ホットスタート型ＰＣＲには、以下のような化学的、生物学的、物理学的手法によりＰＣＲにホットスタート機能を付加したものを例示することができる。ただし、これらに限定されるものではない。
【００３３】
１）化学的手法
１）−Ａ．化学的修飾により、低温条件下での耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する方法
化学的修飾により熱可逆的に不活性化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、低温条件下での伸長活性を阻害する方法である。
このような方法として、非核酸ポリアニオンで温度（熱）依存的にＤＮＡポリメラーゼの伸長活性を可逆的に阻害する方法（例えば、米国特許第６，６６７,１６５号明細書参照）等を例示することができる。また、glyoxalを用いる方法（例えば、国際公開第０１／７５１３９号パンフレット参照）をも例示することができる。
【００３４】
１）−Ｂ．化学的修飾により、低温条件下での、核酸と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの結合を阻害する方法
このような方法として、核酸に対して親和性を有するカチオン性分子（ポリカチオン性分子をも含む）の添加により、核酸−カチオン性分子の結合を形成することで、低温でのＤＮＡポリメラーゼの作用を阻害する方法（国際公開第０２／１９８２２号パンフレット参照）等を例示できる。
【００３５】
２）生化学的手法
２）−Ａ．耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ抗体により、低温条件下での耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する方法
かかる方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体を添加することにより、ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害し、温度の上昇により抗体が変性してＤＮＡポリメラーゼから遊離するまでＤＮＡポリメラーゼ伸長活性が抑制される。これにより、高温条件下においてＤＮＡポリメラーゼの伸長反応が開始されるものである。（例えば、国際公開第９６／００３０１号パンフレット、国際公開第９６／３５７７９号パンフレット、米国特許第６,０２０，１２８号明細書、米国特許第５，９８５，６１９号明細書参照）
【００３６】
２）−Ｂ．低温感受性ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、低温条件下でのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する方法
かかる方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを「低温感受性」表現型に変異させた低温感受性ＤＮＡポリメラーゼを使用するものである。低温感受性ＤＮＡポリメラーゼは、変異のないＤＮＡポリメラーゼと比べて、室温での実質的に減少した活性を示し、また、最適な反応温度（高温）でほぼ正常な活性を示すことができる。つまり、高温条件下におくことにより伸長反応活性を発現するように改変されている。（例えば、米国特許第６，２１４，５５７号明細書、米国特許第６,３１６，２０２号明細書、米国特許第６，３３３，１５９号明細書、国際公開第０１／９４５６２号パンフレット、参照）
【００３７】
２）−Ｃ．ポリメラーゼ活性を保持しない熱感受性ＤＮＡポリペプチドによる、低温条件下での耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性の競合阻害
ポリメラーゼ活性を保持しない熱感受性ＤＮＡポリペプチド（いわゆる、阻害性ポリペプチド）により、低温条件下でＤＮＡポリメラーゼの活性を競合阻害する。そして、昇温により、この阻害性ポリペプチドを不活化または変性させて、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応を開始させる（国際公開第００／６８４１１号パンフレット参照）。
【００３８】
２）−Ｄ．その他
伸長反応を阻害するピロリン酸塩と、ピロリン酸塩を消化するピロリン酸フォスファターゼを利用する方法（例えば、国際公開第０２／０８８３８７号パンフレット参照）等が知られている。
【００３９】
３）物理的手法
ワックスバリアーでプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを、若しくは、酵素活性に必要なＭｇ＋を物理的に隔離する方法等が例示される。かかる方法において、ワックスバリアーは、昇温により融解するためＰＣＲに必要な反応成分は高温条件下でのみ混合され、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応が開始する。
【００４０】
また、市販のキット等によるホットスタート型ＰＣＲにおいても、本発明の組成物は、その効果を発揮することができる。このような市販のキットとしては、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム （ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標） Ｇｏｌｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を例示することができる。
【００４１】
また、本発明の組成物は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の他、ヌクレオチド５´−三リン酸（ただし、前記ヌクレオチド５´−三リン酸はデオキシヌクレオチド５´−三リン酸及びヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸ではない）を含ませることもできる。これにより高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の安定性が向上し、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の有する生物学的機能を十分に発揮できる状態に維持される。それにより、本発明の組成物がさらに有意にその効果を奏することができる。以下の本明細書中「ヌクレオチド５´−三リン酸」との文言には特に注記がない場合には、デオキシヌクレオチド５´−三リン酸及びヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸を含まないものであるとする。また、以下の本明細書中、ヌクレオチド５´−三リン酸は「ＮＴＰ」と略する場合がある。また、デオキシヌクレオチド５´−三リン酸は「ｄＮＴＰ」と略する場合があり、ヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸は「ＮＴＰγＳ」と略する場合がある。
【００４２】
ここで、ＮＴＰとは、核酸残基がＤ−リボフラノースの１位にβグルコシド結合したヌクレオチドのリボースの５位ヒドロキシル基に３分子のリン酸が連続してエステル結合したものである。アデノシン５´−三リン酸、ウリジン５´−三リン酸、グアノシン５´−三リン酸、シチジン５´−三リン酸が好ましく例示される。ただし、本発明の使用においては、ＮＴＰには、ｄＮＴＰを含めるものではない。したがって、デオキシアデノシン５´−三リン酸、デオキシチミジン５´−三リン酸、デオキシグアノシン５´−三リン酸、デオキシシチジン５´−三リン酸は本発明への適用を除外する。更に、ＮＴＰの非加水分解性アナログであるヌクレオチド５´−Ｏ−３−チオ三リン酸も、同様に本発明への適用を除外する。したがって、そのような適応除外となるアナログとしては、アデノシン５´−三リン酸のアナログであるアデノシン５´−Ｏ−３−チオ三リン酸等が挙げられる。
【００４３】
さらに、本発明の組成物は、賦形剤等の製剤学的に許容可能な担体を含ませることができる。このような担体は、固体、液体の別を問わず、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の生物学的活性が安定して維持可能なものであれば、特に制限はない。
【００４４】
以下、本発明のＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の不活性化制御用組成物の作用を詳細に説明する。本発明の組成物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆的な不活性化機能を制御することができる。また、その制御機能はＮＴＰ添加による高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の生物学的安定化によって、更に向上できる。そして、本発明の組成物は、好適には、ホットスタート型ＰＣＲにおいて、そのホットスタート機能を制御することができる。それにより、ＰＣＲに対してホットスタート機能を最適に制御することができ、引いてはホットスタート機能を向上させることができる。したがって、本発明の組成物の存在下で、ホットスタート型ＰＣＲを実行することにより、非特異的増幅を効果的な抑制が達成されて効率的な特異的増幅効果が得られるため、増幅精度が向上する。
【００４５】
更なる、本発明の一実施形態は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が付加されたポリメラーゼ連鎖反応によって、標的核酸を増幅するための核酸増幅方法である。そして、本発明の核酸増幅方法は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下で標的核酸を増幅することを特徴とする。
【００４６】
本明細書において、「耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ伸長反応に対する熱可逆性不活性化機能が付加されたポリメラーゼ連鎖反応」とは、特に好適には、いわゆる、ホットスタート型ＰＣＲを意味する。つまり、本発明の方法は、好適にはホットスタート型ＰＣＲと高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲとを共存させた核酸増幅技術である。ホットスタート型ＰＣＲのホットスタート機能については上記で説明した通りである。
【００４７】
続いて、ＰＣＲについて詳細に説明する。ＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて連鎖反応的に標的核酸領域を増幅する方法である。そしてＰＣＲの原理は、プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、３段階の温度変化（熱変性、アニーリング、伸長）をｎサイクル繰り返すことにより増幅対象核酸（以下、標的核酸と略する場合がある。）を２ｎ倍に増幅するものである。
【００４８】
本発明においてＰＣＲ反応液は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質存在の下、標的核酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、並びに適当な緩衝液を含んで調製される。ここで、ＤＮＡポリメラーゼは熱可逆的に不活性化されているか、もしくは、熱可逆的不活性化機能がＤＮＡポリメラーゼに付加されていない場合には前記ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応に対して熱可逆的不活性化機能を付加することができる物質を更に含ませることができる。ここで、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は、ＰＣＲの最初の変性反応時にはＰＣＲ反応液中に含まれていることが必要であり、反応開始時には反応溶液中に含まれていることが好ましい。これにより適切にホットスタート機能を適切に制御することが可能となる。また、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は、上記した本発明の一実施形態である本発明の組成物として添加してもよい。そして、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質のその生物学的機能の向上のため、上記したＮＴＰを含ませて構成することもできる。
【００４９】
また、プライマーＤＮＡ、ｄＮＴＰは必要に応じて検出のため適当な標識物質により標識していても良い。このような標識物質は公知であるので当業者は適宜選択して使用できる。
【００５０】
本発明の方法において、増幅対象となる標的核酸は、その起源、長さ及び塩基配列等に対する制限なく、また、一本鎖、二本鎖を問わず、いかなる核酸であってもよい。具体的には、生物のゲノムＤＮＡでもよく、或いは、該ゲノムＤＮＡを物理的手段若しくは制限酵素消化により切断された断片であっても良い。更に、ＤＮＡ断片をプラスミド、ファージ等に挿入したものに対しても好適に利用できる。さらに、核酸を含む可能性のある試料から調製、あるいは単離したものであってもよい。また、当該技術分野で常用されているＤＮＡ自動合成機等を使用して合成されたＤＮＡ断片、ｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡ断片等の人工的産物等、いずれも標的核酸となり得る。
【００５１】
また、本発明の方法は、一般的なＰＣＲを行った場合に核酸の増幅が阻止又は抑制される二次構造を形成する区域を有する核酸の増幅にも好適に利用できる。
例えば、ＧＣ含量が高い鋳型核酸や短い繰り返し配列を有する鋳型核酸等を挙げられる。これらは、熱変性により一本鎖となると高次構造を生じ核酸増幅の際の阻害要因となっていた。本発明の方法によれば、ホットスタート機能と高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の共存作用により、このような高次構造の形成が抑制され、効率的に鋳型核酸を増幅することができる。
【００５２】
プライマーは、標的核酸の特定配列に対して相補的になるように設計されるものである。特には、増幅すべき標的配列のその両端に相補的な塩基配列を有するものであることが好ましい。もっとも単純な系ではプライマーが２つ要求されるが、マルチプレックスＰＣＲ（Multiplex  ＰＣＲ）等を行う場合は３つ以上でもよく、また、１のプライマーのみでの増幅反応にも好適に利用可能である。プライマーの設計は、ランダムプライマーを用いる場合を除いて、標的核酸の配列を予め調査し決定される。そして、標的核酸の塩基配列の調査には、GeneBank、EBI等のデータベースを好適に利用できる。
【００５３】
プライマーは、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計される。プライマーは合成後、ＨＰＬＣ等の手段により精製される。また、化学合成を行う場合には市販の自動合成装置を利用することも可能である。ここで、相補的とは、プライマーと標的核酸とが塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プライマーと標的核酸が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。その塩基数は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはＧＣ含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、２０〜５０塩基長である。
【００５４】
ここで、使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、通常ＰＣＲにおいて使用できる耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであれば、特に制限はない。例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＴａｑポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来のＴｔｈ.ポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）由来のＢｓｔポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcuslitoralis）由来のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼ他、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcusfuriosus）由来のＰｆｕポリメラーゼ等の好熱古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００５５】
ｄＮＴＰとしては、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンの各塩基に夫々対応する４種類のデオキシヌクレオチドが使用される。特には、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰの混合物が好ましく使用される。更に、ＰＣＲで合成され伸長されるＤＮＡ分子中に、ＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ得る限りにおいては、デオキシヌクレオチドの誘導体をも含み得る。そのような誘導体として、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ等が例示され、例えば、夫々ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰに代えて、若しくは、双方を共在させて使用することができる。したがって、核酸合成に必要なアデニン、チミン、グアニン及びシトシンの各塩基に対応する４種類が含まれる限り、いかなる誘導体の使用を排除するものではない。
【００５６】
緩衝液としては、一般的には、適当な緩衝成分及びマグネシウム塩等を含んで調製される。緩衝成分としては、トリス酢酸、トリス塩酸、リン酸ナトリウム並びにリン酸カルシウム等のリン酸塩が好適に使用でき、特にはトリス酢酸の使用が好ましい。緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で調製される。また緩衝液のｐＨは好ましくはｐＨ６.０〜９.５、特に好ましくはｐＨ７．０〜８・０の範囲内で調製される。また、マグネシウム塩としては特に制限はないが、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等を適宜使用でき、特には酢酸マグネシウムが好ましい。更に、必要に応じて、ＫＣｌ等のカリウム塩、ＤＭＳＯ、グリセロール、ベタイン、ゼラチン、Triton等を添加することができる。また、市販のＰＣＲ用耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液を用いることができる。緩衝液の組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類等に応じて適宜変更することができる。特には、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ等のイオン強度の影響、ＤＭＳＯ、グリセロール等のＤＮＡのＴｍに影響を与える各種添加物並びにそれらの濃度を勘案して、適宜設定することができる。
【００５７】
そして、反応液は容量１００μｌ以下、特には、１０〜５０μｌの範囲で調製することが好ましい。各成分の濃度として、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は好ましくは反応溶液中に０．００４〜０．１μｇ／μｌの濃度で含まれるよう使用される。高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質以外の各成分の濃度は、ＰＣＲは公知であることから、当業者は適宜設定することができる。例えば、標的核酸は、好ましくは１００μl当り１０ｐｇ〜１μｇの濃度で、プライマーＤＮＡは好ましくは、最終濃度０．０１〜１０μＭ、特には０．１〜１μＭの濃度に調製される。更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは１００μｌあたり０．１〜５０Ｕｎｉｔ、特には１〜５Ｕｎｉｔの範囲の濃度で使用する。そして、ｄＮＴＰは、好ましくは最終濃度０．１ｍＭ〜１Ｍに調製する。また、マグネシウム塩は最終濃度で０．１〜５０ｍＭ、特には、１〜５ｍＭの範囲に調製することが好ましい。また、ＮＴＰを反応系に添加する場合には、反応系において少なくとも５０μＭ以上含まれることが好ましく、特に好ましくは４００μＭ以上であるが、経済性等の観点から１ｍＭ以下に調製することが好ましい。
【００５８】
そして、ＰＣＲは、具体的には以下の工程に従って実行される。ここでは、上記したようにホットスタート機能が付加されているとともに、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下で実行される。
（１）鋳型核酸の熱変性
（２）プライマーのアニーリング
（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応
【００５９】
上記（１）〜（３）からなる三段階の温度変化を１サイクルとする反応を、適切なサイクルを繰り返すことによって、プライマーが起点となって標的核酸を鋳型として、相補性を有するもう一本の核酸鎖の合成が開始される。その結果、ｎサイクルの反応で標的核酸は２ｎ倍に増幅される。サーモサイクル数は、鋳型となる標的核酸の種類、量及びその純度等に応じて決定されるが、非特異的増幅を抑制し効率的な核酸増幅の観点から２０〜４０サイクル、特には、３２〜３６サイクルで行うことが好ましい。特に、本発明の方法は、ＰＣＲ各段階において非特異的増幅を効果的に抑制できることから、高サイクルのＰＣＲに対しても適用できる。
【００６０】
以下に各工程について詳細に説明する。
（１）鋳型核酸の熱変性
二本鎖核酸を加熱により、変性させ一本鎖に解離させる。好ましくは、９２〜９８℃で１０〜６０秒行われる。また、長いＤＮＡ領域を増幅する場合には、鋳型ＤＮＡの分解を防止するため、一番初めの熱変性のみを比較的低い温度（例えば、９２℃程度）に設定することができる。
【００６１】
（２）プライマーのアニーリング
温度を下げることにより上記（１）において熱変性され一本鎖となった鋳型核酸とプライマーとのハイブリッドを形成する。アニーリングは、好ましくは３０〜６０秒間行われる。また、アニーリング温度はプライマーに用いるオリゴヌクレオチドのＴｍを推定し、このＴｍをアニーリング温度として設定することが好ましい。通常は、５０〜７０℃で行われる。
【００６２】
（３）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーからの核酸鎖の伸長反応が３´末端において行われる。伸長反応温度は、ＤＮＡポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定されるものであるが、６５〜７５℃で行うことが好ましい。また、伸長時間は、標的配列が１ｋｂ以下のときは１分程度で十分であり、それより長い場合には、１ｋｂにつき１分の割合で長くすることが好ましい。
【００６３】
以上のように、ホットスタート型ＰＣＲと高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲを共存させることにより、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応の不活性化が最適化される。そのため、ホットスタート型ＰＣＲにおけるホットスタート機能をＰＣＲに対して最適に制御することができ、引いては、ホットスタート機能を向上させることができる。したがって、ＰＣＲサイクルにおいてプライマーの標的配列以外へのアニーリング、あるいはプライマー同士がアニーリング等のミスプライミングに起因する非特異的な増幅を抑制できると共に、標的配列以外へのアニーリングしたプライマーからの非特異的増幅を抑制することができる。これにより、非特異的増幅が効果的に抑制され、効率的かつ標的核酸特異的な増幅が行うことが可能となり、増幅精度が向上する。かかる効果は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の生物学的機能を向上できるＮＴＰの添加によって、更に向上する。
【００６４】
そして本発明の増幅方法は、様々な用途に利用可能である。例えば、医療分野、生物化学分野、環境分野、食品分野等の多岐にわたる用途に利用可能である。具体的には、医療分野での利用として、一塩基多型性の検出をはじめとする遺伝子診断、ＳＡＲＳ、インフルエンザ等のウイルスや細菌等の病原体の検出等が例示される。また、生物化学分野での利用として、個人の同定、偽ブランド食物の検定等の生物種の同定が挙げられる。そして、環境分野における利用においては、環境中における細菌、ウイルス等の病原体検出等の環境測定、新規有用微生物の探索等が例示される。さらに、食品分野における利用としては、遺伝子組み換え作物含有の判定等が例示される。しかしながら、これに限定されるものではない。ＰＣＲの適用可能な用途であれば、制限されることなく本発明の方法を適用できる。
【００６５】
なかでも、本発明は一塩基多型の検出方法をも提供する。本発明の一塩基多型の検出方法は、上述した本発明の核酸増幅方法によって増幅された増幅産物をスクリーニングすることにより一塩基多型を検出するものである。本発明の増幅方法によれば、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を存在下にホットスタート型ＰＣＲにより核酸を増幅することにより、プライマーの鋳型ＤＮＡ並びにプライマー同士の非特異的な結合を抑制することができる。その効果はＰＣＲ全サイクルによって保持されるため、効果的にプライマーのミスプライミングを抑制できる。したがって、所望の一塩基多型を有する核酸に相補的なプライマーを用いることにより、かかる一塩基多型を有する核酸が効率的に増幅できる。その一方で、かかる一塩基多型を有しない核酸は増幅されないか、または増幅が抑制されることから、かかる一塩基多型を有する核酸を特異的に増幅することが可能となる。これにより、一塩基多型を感度良く、かつ、効率的に検出することができる。
【００６６】
また、本発明は、好適には、ホットスタート型ＰＣＲにより核酸を増幅させるための核酸増幅用キットを提供する。本発明の核酸増幅用キットは、熱可逆性不活性化機能が付加された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を含んで構成される。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと前記ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応に対して熱可逆性不活性化機能を付加する物質と、ｄＮＴＰ、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を含んで構成してもよい。このとき、前記ＤＮＡポリメラーゼ自体には熱可逆性不活性化機能が付加されていないものである。更に、適当な緩衝液、マグネシウム塩等のＰＣＲに必要な成分を適宜含んで構成してもよい。また、所望の核酸をもって病原体等を検出するためのキットのような場合には、所望の核酸増幅に特異的な任意のプライマー等を含ませてもよい。更に、ＮＴＰを含んで構成してもよい。このようにＰＣＲ増幅に必要な成分をキットして構成することにより、簡便且つ迅速なＰＣＲ増幅が可能となる。
【００６７】
（別実施の形態）
本発明の核酸増幅方法は、様々なＰＣＲの変法に利用可能である。たとえば、アダプター付加ＰＣＲ、アレル特異的増幅法（ＭＡＳＡ法）、非対称ＰＣＲ、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法）、アービトラリリーポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、ＲＡＣＥ、マルチプレックスＰＣＲ（multiplex  ＰＣＲ）等が挙げられる。しかしながら、これらに限定するものではなく、あらゆるＰＣＲの変法に利用可能である。
【００６８】
特に、マルチプレックスＰＣＲへの利用が好適に例示される。本発明の方法はホットスタート型ＰＣＲと高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲを共存させることにより、ホットスタート機能を向上させるものである。ホットスタート機能の向上により、プライマーに特異的な標的核酸の存在に対応する増幅が可能となることから、複数のプライマーを使用するマルチプレックスＰＣＲに好適に利用できる。マルチプレックスＰＣＲとは、標的核酸の複数の標的配列を一の反応容器内で同時に増幅するものである。各標的配列を増幅し得るプライマーセットを一反応容器に入れて単一のＰＣＲ操作により増幅させる。複数の標的配列を増幅し得るプライマーセットを利用することにより、単一ＰＣＲに比べて標的ＤＮＡの増幅に要する時間、労働力及び試薬コストを大きく低減させることが可能となる。また、微量試料をも対象とすることができる共に、操作が簡便であることから現場レベルでの対応が可能となる。
【００６９】
また、本発明は、マルチプレックスＰＣＲ反応に供するための核酸増幅用キットを提供する。本発明の核酸増幅用キットは、熱可逆性不活性化機能が付加された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を含んで構成される。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと前記ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応に対して熱可逆性不活性化機能を付加する物質と、ｄＮＴＰ、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を含んで構成してもよい。このとき、前記ＤＮＡポリメラーゼ自体には熱可逆性不活性化機能が付加されていないものである。更に、適当な緩衝液、マグネシウム塩等のＰＣＲに必要な成分を適宜含んで構成してもよい。また、所望の核酸をもって病原体等を検出するためのキットのような場合には、所望の核酸増幅に特異的な任意のプライマー等を含ませてもよい。更に、ＮＴＰを含んで構成してもよい。また、更に必要な検出装置を含ませてもよい。このようにマルチプレックスＰＣＲ増幅に必要な成分をキットして構成することにより、更に簡便且つ迅速なＰＣＲ増幅が可能となり、医療現場等における利用性が向上する。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を示し、さらに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７１】
実施例１：ホットスタート型ＰＣＲにおける高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の効果−１
高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質が、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼを用いたホットスタート型ＰＣＲに与える影響を確認するための検討を行った。また、比較として、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼではない標準的なＤＮＡポリメラーゼを用いた標準的なＰＣＲでの検討を並行して行った（なお、ここでは、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼではない一般的なＤＮＡポリメラーゼを「非ホットスタート型ポリメラーゼ」と、また、非ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼを用いた一般的なＰＣＲを「非ホットスタート型ＰＣＲ」と称する場合がある。）。
【００７２】
（試薬）
鋳型ＤＮＡとしては、ヒトゲノムＤＮＡ（Promega社製：Human genomic DNA  カタログ番号G3041）を使用した。
【００７３】
ＤＮＡポリメラーゼは、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼとして、ホットスタート型ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ−Ｂｉｏ社製）を用いた。かかるホットスタート型ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｓｅは、ＤＮＡポリメラーゼをその抗体と組み合わせたものである。これにより、高温で抗体が機能しなくなるまでＤＮＡポリメラーゼと鋳型の結合を阻害することができる。また、非ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼとして、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ−Ｂｉｏ社製）を用いた。
【００７４】
プライマーセットとしては、プライマーセット１、プライマーセット２を用いた。以下に、プライマーの配列を開示する。
プライマーセット１
5'- GACTACTCTAGCGACTGTCCATCTC -3'（配列番号１）
5'- GACAGCCACCAGATCCAATC -3'（配列番号２）
GenBank ACCESSION No. M59486 J05600
Human S100 protein beta-subunit gene
プライマーセット２
5'- ACAATGGGCTCACTCACCC-3'（配列番号３）
5'- CTAAGACCAATGGATAGCTG-3'（配列番号４）
GenBank ACCESSION No. AY495328
Homo sapiens isolate V1-23 mitochondrion,
complete genome
【００７５】
高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質として、サーモス・サーモフィラス由来のＲｅｃＡタンパク質（以下、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質と略する。）を用いた。Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質は、Masui R, Mikawa T, Kato R, Kuramitsu S.著、Characterization of the oligomeric states of RecA protein: monomeric RecA protein can form a nucleoprotein filament.,Biochemistry.1998年10月20日、第37巻、第42号、第14788〜14797頁の記載を参照して本発明の発明者が調製したものを用いた。
【００７６】
（方法）
高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質が増幅反応に与える影響を検討するため、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼを用いたホットスタート型ＰＣＲを行った。また、比較として、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼではない一般的なＤＮＡポリメラーゼを用いた一般的なＰＣＲでの検討を並行して行った。具体的には以下の通りの実験を行った。
【００７７】
実験系Ａ：
非ホットスタート型ＰＣＲ
（−）高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質
実験系Ｂ：
非ホットスタート型ＰＣＲ
（＋）高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質（最初の熱変性前）
実験系Ｃ：
ホットスタート型ＰＣＲ
（−）高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質
実験系Ｄ：
ホットスタート型ＰＣＲ
（＋）高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質（最初の熱変性前）
実験系Ｅ：
ホットスタート型ＰＣＲ
（＋）高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質（最初の熱変性後）
【００７８】
なお、鋳型核酸上の異なる領域に対する増幅効果を比較するべく、上記実験系毎に、プライマーセット１、プライマーセット２による検討を、夫々一連で行った。
【００７９】
ＰＣＲ反応は、９４℃、３０秒の熱変性の後、９４℃、１０秒、５５℃、３０秒、７０℃、２分を１サイクルとした３５サイクルの増幅反応後、７０℃、３分、４℃、１０分の１サイクルの最終反応によって行った。
【００８０】
ＰＣＲに供する反応液は以下の通り調製した。
反応液：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
10ng  鋳型ＤＮＡ
0.7Unit  ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  塩化マグネシウム
以上を含むよう、１×ExTaq buffer に混合して、全量25μlとした。
【００８１】
高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の添加は、最初の熱変性の前に添加する場合（実験系Ｂ及びＤ）には、ＰＣＲに供する前に上記反応液に添加した。また、最初の熱変性後に添加する場合（実験系Ｅ）には、上記ＰＣＲの９４℃、３０秒の熱変性の後、第１サイクル目の９４℃、１０秒、５５℃、３０秒の反応後に添加した。また、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の添加量は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を添加するいずれの実験系においても０．４μｇであった（実験系Ｂ、Ｄ及びＥ）。
【００８２】
ＰＣＲ後の反応液１０μｌを、１．２％アガロースゲル上で電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロミド染色によりバンドを可視化し、泳動ゲルの写真撮影を行った
【００８３】
(結果)
結果を図１に示す。
レーン１、２は、実験系Ａの結果、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の不在下で非ホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行った結果を示すものであり、レーン１がプライマーセット１で、レーン２がプライマーセット２により増幅反応を行なった。
レーン３、４は、実験系Ｂの結果、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下で非ホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行った結果を示すものであり、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は最初の熱変性の前に添加した。ここで、レーン３がプライマーセット１で、レーン４がプライマーセット２により増幅反応を行った結果を示す。
レーン５、６は、実験系Ｃの結果、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の不在下でホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行った結果を示すものであり、レーン５がプライマーセット１で、レーン６がプライマーセット２により増幅反応を行なった。
レーン７、８は、実験系Ｄの結果、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下でホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行った結果を示すものであり、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は最初の熱変性の前に添加した。ここで、レーン７がプライマーセット１で、レーン８がプライマーセット２により増幅反応を行った結果を示す。
レーン９、１０は、実験系Ｅの結果、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下でホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行った結果を示すものであり、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は最初の熱変性の後に添加した。ここで、レーン９がプライマーセット１で、レーン１０がプライマーセット２により増幅反応を行った結果を示す。
【００８４】
まず、プライマーセット１を用いた場合（レーン１、３、５、７、９）を比較する。非ホットスタート型ＰＣＲにおいては、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の添加により増幅特性が向上することは認められるが、非特異的増幅も生じていることが確認された（レーン１と３の比較）。一方、ホットスタート型ＰＣＲにおいては、非ホットスタート型ＰＣＲで観察された非特異的増幅産物をある程度は抑制できるが、依然として非特異的増幅も生じていることが確認された（レーン１とレーン５の比較）。そして、この非特異的増幅は高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下でホットスタート型ＰＣＲを行うことにより効果的に抑制することができることが確認された（レーン５とレーン７の比較）。しかしながら、この非特異的増幅の抑制効果は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を最初の増幅反応の前に添加した場合にのみ観察され、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質を最初の増幅反応の後に添加した場合には観察されなかった（レーン７とレーン９の比較）。
【００８５】
次に、プライマーセット２を用いた場合（レーン２、４、６、８、１０）を比較したところ、上記したプライマーセット１を用いた場合（レーン１、３、５、７、９）と同様の結果が得られた。
【００８６】
以上の結果から、非特異的増幅を抑制する方法として公知である、ホットスタート法もしくは高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質によっても抑制できない非特異的増幅を、本発明の方法であるホットスタート型ＰＣＲもしくは高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲの共存により、効果的に抑制でき、非特異的な増幅を抑制して標的核酸のみを特異的に増幅できることが判明した。また、かかる効果は、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の存在下で最初の熱変性を行うことが必要であり、最初の熱変性の後に添加してもその効果は認められないことが判明した。これは、ホットスタート機能、つまり、高温になるまでＤＮＡポリメラーゼの伸長反応が熱可逆的に不活性化される機能、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ抗体とＤＮＡポリメラーゼの結合、に高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質が作用していることが推測される。つまり、ＤＮＡポリメラーゼの伸長反応の熱可逆的な不活性化がＰＣＲの反応に対して最適化するべく、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質がＤＮＡポリメラーゼの伸長活性を制御しているものと考えられる。それにより、ホットスタート型ＰＣＲのホットスタート機能が向上しているとの理論が導ける。したがって、ホットスタート機能と、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質が個々、独立して効果を奏しているのではなく、これらが相互に作用することにより効果を奏しているものと考えられる。
【００８７】
実施例２：ホットスタート型ＰＣＲにおける高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の効果−２
高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質が、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼを用いたホットスタート型ＰＣＲに与える影響を確認するための検討を行った。
【００８８】
（試薬）
鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ及び高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質は、実施例１と同じものを使用した。
【００８９】
プライマーセットは、プライマーセット１、プライマーセット２を用いた。ここで、用いたプライマセットは実施例１で用いたものと同じであった。
【００９０】
（方法）
高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質が増幅反応に与える影響を検討するため、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼを用いたホットスタート型ＰＣＲを行った。
【００９１】
具体的には以下の通りの実験を行った。
【００９２】
実験系Ａ：
ホットスタート型ＰＣＲ
（−）高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質
実験系Ｂ：
ホットスタート型ＰＣＲ
（＋）高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質
【００９３】
なお、鋳型核酸上の異なる領域に対する増幅効果を比較するべく、上記実験系毎に、プライマーセット１、プライマーセット２による検討を、夫々一連で行った。
【００９４】
ＰＣＲ反応は、実施例１と同様に行った。なお、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の添加は、最初の熱変性の前に添加した。また、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の添加量は０．４μｇであった。
【００９５】
ＰＣＲに供する反応液は以下の通り調製した。ここで、ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼは、その機能を対するＲｅｃＡタンパク質の影響を詳細に検討すべく、添加量を0.7、0.35又は0.18Unitとした反応液を実験系毎に夫々調製した。
【００９６】
反応液：
0.6μM（最終濃度）  プライマーセット
10ng  鋳型ＤＮＡ
0.7、0.35又は0.18Unit  ホットスタート型ＤＮＡポリメラーゼ
0.2mM（最終濃度）  ｄＮＴＰ混合物
1.5mM（最終濃度）  塩化マグネシウム
以上を含むよう、１×ExTaq buffer に混合して、全量25μlとした。
【００９７】
ＰＣＲ後の反応液を実施例１と同様に電気泳動を行い、泳動ゲルの写真撮影を行った
【００９８】
(結果)
結果を図２に示す。
レーン１〜６は、プライマーセット１を用いてホットスタート型ＰＣＲにより増幅反応を行った結果を示す。
そして、レーン１〜３は、実験系Ａ、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の不在下でホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行い、レーン１が0.7Unit、レーン２が0.35Unit、レーン３が0.18UnitのＤＮＡポリメラーゼを添加した。
レーン４〜６は、実験系Ｂ、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の不在下でホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行い、レーン１が0.7Unit、レーン２が0.35Unit、レーン３が0.18UnitのＤＮＡポリメラーゼを添加した。
レーン７〜１２は、プライマーセット２を用いてホットスタート型ＰＣＲにより増幅反応を行った結果を示す。
そして、レーン７〜９は、実験系Ａ、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の不在下でホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行い、レーン７が0.7Unit、レーン８が0.35Unit、レーン９が0.18UnitのＤＮＡポリメラーゼを添加した。
レーン１０〜１２は、実験系Ｂ、即ち、高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の不在下でホットスタート型ＰＣＲによる増幅反応を行い、レーン１０が0.7Unit、レーン１１が0.35Unit、レーン１２が0.18UnitのＤＮＡポリメラーゼを添加した。
【００９９】
プライマーセット１を用いた場合（レーン１〜６）を比較する。高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の添加せずにホットスタート型ＰＣＲを行った場合において、非特異的増幅が生じていることが確認された（レーン１〜３）。一方、かかる非特異的増幅はＴｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を添加してホットスタート型ＰＣＲを行うことによって、効果的に抑制することができることが確認された（レーン４〜６）。
次に、プライマーセット２を用いた場合（レーン７〜１２）を比較したところ、プライマーセット１を用いた場合（レーン１〜６）と同様の結果が得られた。
【０１００】
以上の結果から、非特異的増幅を抑制する方法として公知である、ホットスタート法もしくは高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質によっても抑制できない非特異的増幅を、本発明の方法であるホットスタート法もしくは高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の併用により、効果的に抑制でき、非特異的な増幅を抑制して標的核酸のみを特異的に増幅できることが判明した。この結果は、実施例１の結果を追認するものであり、また、本実施例においても異なる増幅領域で検討した結果も合致していた。このため、かかるホットスタート型ＰＣＲと高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲ技術の共存によって奏される、非特異的増幅の抑制、並びに、効率的かつ特異的な標的核酸の増幅効果の、再現性、並びに、普遍性が立証された。したがって、ホットスタート型ＰＣＲと高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質−ＰＣＲの共存技術が、効率的な標的核酸特異的な増幅技術として有用であることが明確となった。
【０１０１】
以上により、医療分野、生物化学分野、環境分野、食品分野等において有用な核酸の増幅方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ホットスタート型ＰＣＲにおける高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の効果を検討した実施例１の結果を示す電気泳動パターン
【図２】ホットスタート型ＰＣＲにおける高度好熱菌ＲｅｃＡタンパク質の効果を検討した実施例１の結果を示す電気泳動パターン
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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