(57)【要約】【課題】  電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドの断片からなるオリゴヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換細胞、ならびにその組換えベクターを含むキットを提供する。【解決手段】  本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、電位依存的なプロトンチャネル特性を有している。このポリペプチドは、４つの膜貫通部位を有し、従来公知の電位依存性イオンチャネルのＳ１〜Ｓ４の電位センサ部分のみと相同性を有している。よって、このポリペプチドは、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１（Ｃｉｏｎａ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｏｎｌｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）と命名された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号２に示される塩基配列、または
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列、
からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項５】
電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３から５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
請求項２から５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２から５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項９】
請求項２から５の何れか１項に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１０】
請求項６に記載の組換えベクターを含み、かつ、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを細胞に発現させるために用いられることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰを消費することなくプロトンを電位依存的に透過させ得る単一ポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドの断片であるオリゴヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含有するベクターおよび形質転換細胞、ならびにそのベクターを含むキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、これまで、原索動物であるホヤを用いてイオンチャネルを介した電気的活動を解析している。
【０００３】
ホヤは、尾索動物群に属する動物であって、頭索動物（例えば、ナメクジウオ）および脊椎動物（例えば、カエル、ヒトなど）とともに、脊索動物門を構成する。脊索動物であるホヤの遺伝子には、脊椎動物のような遺伝子の重複がなく、遺伝子重複前の脊索動物の基本型を保っている。また、ホヤのオタマジャクシ型幼生の体制は、脊索動物の体制の最も単純な型（原型）を表している。したがって、脊索動物であるホヤは、ヒトを含む脊椎動物全般の発生メカニズムの解明に最適のモデル動物であり、ホヤにおいて発現する遺伝子は、遺伝子治療および再生医療などの医療分野、さらには環境分野、食品分野などの種々の分野に、それら遺伝子は応用できると期待されている。
【０００４】
本発明者らは、以前、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の尾芽胚における遺伝子発現プロファイルを報告している（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００５】
また、本発明者らは、カタユウレイボヤの受精卵、卵割期胚、尾芽胚、幼生、幼若体または精巣で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３’側７６，９２０および５’側７６，２５０のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ：発現配列タグ）解析を行い、これらの中から約５，０００の遺伝子を選んでその発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって調べ、約５００の遺伝子がホヤの尾芽胚、幼生、または幼若体の組織あるいは器官において特異的に発現することを見出し、さらにそれらの中から２６１の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定した（例えば、特許文献１を参照のこと）。
【０００６】
さらに本発明者は、カタユウレイボヤの尾芽胚および幼生で発現する遺伝子のｍＲＮＡに対して、３’側約２３，０００および５’側約２３，０００のＥＳＴ解析を行い、これらの中から約３，０００の遺伝子を選んでその発現をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって調べ、約２００の遺伝子が、ホヤの神経系（中枢神経系または末梢神経系）で発現することを見出し、さらにそれらの中から１０８の遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の全塩基配列を決定した（例えば、特許文献２を参照のこと）。
【０００７】
ところで、イオンチャネルは、細胞膜を貫通して存在するものであり、細胞内外へ特定のイオンが透過するための通路の役割を果たしている。細胞膜をイオンが透過するための他の機構としては、ＡＴＰのエネルギーを利用して輸送を行うナトリウム−カリウムポンプなどが挙げられるが、イオンチャネルは、受動輸送を行う点でこれらのポンプと異なっている。すなわち、イオンチャネルでは、イオンの透過にエネルギーを必要とせず、化学ポテンシャルおよび電気ポテンシャルのエネルギー勾配に従って、イオンが安定な方向へと移動する。
【０００８】
現在までに構造が調べられた一般的なイオンチャネルの中央には、ポア（孔）と呼ばれるイオンの透過口があり、そこには特定のイオンの透過のみを許可するイオン選択フィルターが存在する。また、一般的なイオンチャネルには、ポアを開放および遮断するゲートが存在し、このゲートの開閉によってイオンの透過が制御されている。イオンチャネルの中には、このゲートの開閉が膜電位によって行われるものがあり、これを電位依存性イオンチャネルという。また、イオンチャネルには、透過するイオンの種類に応じて、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、プロトンチャネルなどのいくつかのチャネルが存在する。
【０００９】
イオンチャネルのうち、プロトンチャネル、特に電位依存性プロトンチャネルは、マクロファージや白血球に関する生理学的な研究により、細胞内ｐＨの制御に重要であることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照のこと）。具体的には、これらの細胞がその異物の処理や細胞死を引き起こすには、ＮＡＤＰＨオキシダーゼと呼ばれる膜分子がＡＴＰを消費して活性酸素を分泌することが必須であるが、細胞内の電気的中性を保つために細胞内に貯留するプロトンを細胞外に排出する上で、電位依存性プロトンチャネルが必要であるといわれている。
【特許文献１】特開２００４−５７１２９公報（平成１６年２月２６日公開）
【特許文献２】特開２００４−５７１２７公報（平成１６年２月２６日公開）
【非特許文献１】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８，２８９３−２９０４（２００１）
【非特許文献２】Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels and other proton transfer pathways. Physiol Rev. 2003 Apr;83(2):475-579.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、マクロファージや白血球についての生理学的な研究により、電位依存性プロトンチャネルの存在が予想されていた。しかしながら、電位依存性プロトンチャネルの分子実態、すなわち、遺伝子配列やアミノ酸配列に関する情報は全く得られておらず、さらにはこれがタンパク質であるのかどうかすら明らかにされていなかった。
【００１１】
マクロファージや白血球の貪食機能は、ウイルスやバクテリア、寄生虫などに対する生体の防御に重要であると同時に、アレルギー反応や免疫疾患などの病態に深く関わる現象である。さらに、アルツハイマー病や動脈硬化などの疾患、老人に数十パーセントに見られる骨粗しょう症における骨吸収過程でも重要な鍵を握る現象である。よって、これらの貪食機能について研究する上で、その存在が予想されていた電位依存性プロトンチャネルの分子実態を明らかにすることが望まれていた。また、この電位依存性プロトンチャネルを用いた発現実験を行い、上記の病態を解明することが望まれていた。
【００１２】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含有するベクターおよび形質転換細胞、ならびにそのベクターを含むキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）のゲノム配列において、イオンチャネル関連遺伝子を網羅的に検索した結果、電位センサー部分を有する新規の遺伝子を見出した。そして、この遺伝子によってコードされるポリペプチドが、細胞膜を透過する外向き電流を電位依存的に誘導することを明らかにした。また、細胞外の陽イオンであるナトリウムイオンやカリウムイオンをＮＭＤＧに置換しても、また、細胞外の陰イオンである塩素イオンをメタンスルフォン酸に置換しても、電流の変化が見られないことから、プロトン（水素）が通ることを明らかにした。さらに、このポリペプチドが、電位依存性プロトンチャネルの性質として予想されていたような、緩やかな電位依存的活性化の性質を有することを明らかにし、ここに本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明に係るポリペプチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る他のポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号２に示される塩基配列；または
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列、
からなることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る他のポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る他のポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る他のポリペプチドは、上記の何れかのポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る他のオリゴヌクレオチドは、上記の何れかのポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなることを特徴とする
また、本発明に係る組換えベクターは、上記の何れかのポリヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る形質転換体は、上記の何れかのポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係るキットは、上記の組換えベクターを含み、かつ、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを細胞に発現させるために用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明を用いれば、免疫疾患、癌、神経変性疾患、動脈硬化、各種肺機能障害、骨粗しょう症、および先天性骨形成異常などに対する医学的研究を効果的に行うことができ、またこれらの疾患に対する医薬を開発することができる。また、エネルギーを消費することなく酸（プロトン）を電位依存的に排出できるナノパーツを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
上述したように、本発明者らはカタユウレイボヤのゲノム配列を網羅的に検索した結果、電位依存性プロトンチャネルの遺伝子を同定し、電位依存性プロトンチャネルポリペプチドを単離することに成功した。単離した電位依存性プロトンチャネルポリペプチドは、公知の電位依存性イオンチャネルとアミノ酸配列を比較した結果、４つの膜貫通部分からなり、公知の電位依存性イオンチャネルのＳ１〜Ｓ４の電位センサ部分のみを有することが見出された。本発明者らは、この単離した電位依存性プロトンチャネルポリペプチドを、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１（Ｃｉｏｎａ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｏｎｌｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）と命名した。
【００２５】
〔１．電位依存性プロトンチャネル〕
電位依存性プロトンチャネルの一般的な性質について以下に説明する。電位依存性プロトンチャネルは、最初、カタツムリの神経細胞における生理現象に関連して報告された。その後、哺乳類の肺上皮細胞、マクロファージ系血球細胞、顆粒球血液細胞、神経系ミクログリア細胞、骨の破骨細胞、腎臓上皮細胞において、その存在が示唆されてきた。電位依存性プロトンチャネルは、その分子構造については全く未知であるものの、生理学的研究からいくつかの性質が明らかにされている。
【００２６】
まず、電位依存性プロトンチャネルはチャネルであることから、透過路が開くと、基本的には細胞内外の双方向にイオン（この場合はプロトン）が透過することができる。すなわち、電位依存性プロトンチャネルは、イオンの透過にＡＴＰエネルギーを必要とせず、細胞内外の電気的な勾配に従ってエネルギー的に安定な方向へとイオンを受動輸送するものである。
【００２７】
これに対して、従来よく研究されてきたプロトンポンプは、ＡＴＰの分解によってプロトンポンプを構成するタンパク質を回転させ、これによってプロトンを一方向性に能動輸送する。すなわち、プロトンポンプは、プロトンの輸送にＡＴＰエネルギーを必要とするものである。
【００２８】
また、例えば、Ｎａ−Ｈ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒと呼ばれる膜タンパク質は、Ｎａイオンと交換にプロトンを輸送するので、細胞の内外でＮａイオンに濃度差があれば、ＡＴＰのエネルギーを必要とせずにプロトンを輸送することができる。しかしながら、Ｎａイオンの濃度差を保つために、ＡＴＰエネルギーを必要とするナトリウム−カリウムポンプの働きを必要とすることから、間接的にＡＴＰを必要とすることになる。
【００２９】
このように、電位依存性プロトンチャネル以外の従来の膜タンパク質は、プロトンの輸送にＡＴＰエネルギーを必要とするのに対して、電位依存性プロトンチャネルはプロトンの輸送にＡＴＰエネルギーを必要としない。
【００３０】
また、電位依存性プロトンチャネルは、プロトンの透過を膜電位に応じて制御している。具体的には、細胞内外のｐＨ差などにより膜電位が脱分極側（つまりゼロまたはプラス側）に傾くとプロトンの透過を許可し、膜電位が過分極側（つまりマイナス側）に傾くとプロトンの透過を禁止する。このように、電位依存性プロトンチャネルは、ＡＴＰのエネルギーを必要としない脱分極側の膜電位に傾くことでプロトンの透過を許可することから、エネルギー状態が悪い場合であってもプロトンの輸送を行うことができる。
【００３１】
一方、既知のプロトンチャネルとして、インフルエンザＭ２タンパク質が知られているが、インフルエンザＭ２タンパク質は、プロトンの透過を膜電位に応じて制御するものではない。つまり、インフルエンザＭ２タンパク質の場合、膜電位がどのような状態であってもチャネルは常に開いたままである。これにより、細胞外のｐＨが低いときには細胞内にプロトンが流入してしまい、さらにインフルエンザウイルスに感染しやすい状態となってしまう。
【００３２】
これに対して、電位依存性プロトンチャネルは、上述したように、プロトンの透過性を膜電位に応じて制御しており、細胞外のｐＨが低い場合にはプロトンの透過を禁止する。これにより、細胞外のｐＨが低いときでもプロトンが細胞内に流入するのを阻止することができる。
【００３３】
このように、電位依存性プロトンチャネルは、チャネルであるにもかかわらず、一方向性（細胞内から細胞外へ）のプロトン輸送を実現している。
【００３４】
現在までに得られている電位依存性プロトンチャネルの性質をまとめると、以下の通りである。
（１）プロトンを選択的に透過させる。
（２）比較的活性化時定数の遅い電位依存的活性化を示す（脱分極側に傾くとプロトンの透過を許可する）。
（３）強い外向き整流性を示す。
（４）細胞内外のプロトン濃度差に依存して活性化電位がシフトする（ｐＨｏ−ｐＨｉが大きいほど過分極側へ移動する）。
（５）膜電流が塩化亜鉛により可逆的に減少する。
（６）単一チャネルコンダクタンス（単一チャネル電流）が他のイオンチャネルと比較して小さい。
【００３５】
以下、本発明に係るポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの利用について詳述する。
【００３６】
〔２．ポリペプチド〕
本明細書において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と同義である。また、本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離したものであっても、化学合成したものであってもよい。
【００３７】
「単離した」ポリペプチドとは、天然の環境から取り出されたポリペプチドを指す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。
【００３８】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）において組換え技術によって産生された産物を含む。なお、本発明に係るポリペプチドは、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化されたり、非グリコシル化されたりしたものであってもよい。さらに、本発明に係るポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、翻訳開始を示すメチオニン残基が改変されたものであってもよい。
【００３９】
本発明に係るポリペプチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドである。本明細書において、「電位依存的なプロトンチャネル特性を有する」とは、（ａ）電位に基づいて作動性（チャネル活性）が制御され、（ｂ）プロトンを透過させ、（ｃ）受動輸送を行う、ことを意味する。
【００４０】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００４１】
上記の「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列であるともいえる。
【００４２】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であり、かつ電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドであることが好ましい。
【００４３】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基から別の残基への置換―ただし、通常は強い親水性の残基を強い疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、通常そのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００４４】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸を、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響を及ぼすことなく人為的に容易に改変できることは、当該分野において周知である。さらに、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４５】
当業者は、周知技術によって、ポリペプチドのアミノ酸配列中の１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を置換することができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、作製した変異体が所望の電位依存的なプロトンチャネル特性を有するか否かは、例えば、本明細書の実施例に記載された方法を用いて判断することができる。
【００４６】
好ましい変異体としては、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する変異体が挙げられ、好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらによって、本発明に係るポリペプチドの電位依存的なプロトンチャネル特性が変化することはない。
【００４７】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅのうちの何れかのアミノ酸から別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの交換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの交換である。
【００４８】
上述したさまざまな変異のうち、いずれのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントになる傾向が強いか（すなわち、本発明のポリペプチドの機能に対して有意に有害な影響を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０  （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００４９】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列、からなるポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする。
【００５０】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする。
【００５１】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるである塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする。
【００５２】
これらのポリペプチドを規定するポリヌクレオチドの詳細については後述する。
【００５３】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、本発明はこれに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００５４】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００５５】
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されてもよい。
【００５６】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現されていてもよい。例えば、本発明に係るポリペプチドは、宿主細胞内での、精製操作時や保存時の安定性および持続性を改善するために、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域がポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されていてもよい。
【００５７】
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、当該ポリペプチドの精製を容易にするために、タグ標識（タグ配列またはマーカー配列）がＮ末端またはＣ末端に付加されていてもよい。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。このようなタグアミノ酸配列は、例えば、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）などであり、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されているように、ヘキサヒスチジンにより、融合タンパク質を簡便に精製することができるようになる。また、他のタグ標識である「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。
【００５８】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成しても、化学合成してもよい。組換え生成には、当該分野において周知の方法を使用することができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いることができる。
【００５９】
合成ペプチドは、公知の化学合成方法を使用して合成することができる。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００６０】
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはその活性を保持した変異体であればよいといえる。すなわち、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とが連結されたポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、上記ポリペプチドと特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されたものであってもよい。
【００６１】
つまり、本発明の目的は、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記以外の方法によって取得される電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００６２】
〔３．ポリヌクレオチド〕
本発明のポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００６３】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分を指す。
【００６４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の何れであってもよい。さらに、ＤＮＡの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。さらに、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）でもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）でもよい。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものを指し、「ポリヌクレオチド」ということもある。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成してもよいし、化合合成してもよい。
【００６６】
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。例えば、「少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」の場合、配列番号２に示す塩基配列における２０以上の連続した塩基を含む塩基配列を有するフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号２に示される塩基配列が提供されるので、当業者は、配列番号２に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、種々のサイズのフラグメントを作製するために、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断を使用することができる。あるいは、このようなフラグメントを化学合成して作製してもよい。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）をｊ化学合成するために、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどを使用することができる。
【００６７】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側に、上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。
【００６８】
また、本発明は、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば、配列番号１で示されるポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドであってもよい。「変異体」は、対立遺伝子変異体のように、天然にも存在する。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００６９】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドであって、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００７０】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００７１】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された変異体であってもよい。
【００７２】
変異体は、コード領域、非コード領域の何れか、あるいはその両方における変異（欠失、置換、挿入、付加）を含むものであってもよい。また、コード領域における変異は、同義置換であることが好ましい。
【００７３】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってもよい。
【００７４】
ハイブリダイゼーションには、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されているような周知の方法を用いることができる。通常、温度が高いほど、また、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００７５】
本明細書において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを意味する。
【００７６】
また、ハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【００７７】
また、他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号２に示す塩基配列）と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。
【００７８】
例えば、「参照されるポリヌクレオチドの（ＱＵＥＲＹ）塩基配列（参照塩基配列）と少なくとも９５％同一の塩基配列（対象塩基配列）からなるポリヌクレオチド」の場合、対象塩基配列が、参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含むことを除いて、参照配列と同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列と少なくとも９５％同一の対象塩基配列では、参照配列における全塩基の５％以下が欠失および／または置換されていてもよいし、あるいは、参照配列における全塩基の５％以下の数の塩基が参照配列に挿入されていてもよい。参照配列におけるこれらの不一致は、どの部分で起こったものであってもよい。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはその変異体であり得る。
【００７９】
任意の特定のポリヌクレオチドが、例えば、配列番号２に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を使用して決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出すものである（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９（１９８１））。特定の配列が参照配列に対して、例えば９５％同一であるか否かをＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて決定する場合、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、かつ、参照塩基配列におけるヌクレオチド数全体の５％までのギャップが許容されるように、各種パラメーターを設定する。
【００８０】
あるいは、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）を、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定してもよい。同一性の百分率を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この方法に従って、対象配列が５’または３’端の欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合は、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する際に対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、結果に対して手動の補正を行うものとする。具体的には、対象配列よりも突出したＱＵＥＲＹ配列の塩基数をＱＵＥＲＹ配列の総塩基で除算して、百分率補正値を算出する。そして、この百分率補正値を、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定された同一性の百分率値から減算することによって、目的の同一性の百分率を算出する。
【００８１】
より具体的に説明すると、例として、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列されるとする。ここで、対象塩基の欠失が対象塩基配列の５’末端、または３’末端で生じたものである場合、上述したように、ＦＡＳＴＤＢ整列は参照塩基配列の５’末端または３’末端の端部を起点とする１０塩基を考慮しない。この場合、１０個の考慮されない塩基配列は、参照塩基配列の１０％（考慮されない５’末端および３’末端の塩基の数／参照塩基配列中の総塩基数）であることから、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性百分率のスコアから、１０％分が差し引かれる。例えば、残りの９０塩基が完全に整合する場合、最終的な同一性百分率は９０％となる。
【００８２】
別の例として、９０塩基の対象塩基配列を１００塩基の参照塩基配列と比較するとする。ここで、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列の５’末端または３’末端の塩基と整列しない対象塩基配列の塩基は存在しないとする。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出される同一性百分率に対して補正を行わない。
【００８３】
以上のようにして、参照配列と塩基配列との間の同一性を算出することができる。
【００８４】
また、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなることが好ましい。
【００８５】
本発明に係るオリゴヌクレオチドが本発明に係るポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用できることを容易に理解する。本発明に係るオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおけるプライマーとして用いる場合、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分的な塩基配列のみであってもよいが、この５’末端に制限酵素サイトなどのリンカー配列を連結させてもよい。またさらに、制限酵素による消化が充分に行われるように、５’末端に数塩基（例えば１から５塩基）程度の余分な塩基配列を追加してもよい。このようなオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３および配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００８６】
本発明に係るポリペプチドをコードしない本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下のものが挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中の本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子（以下、電位依存性プロトンチャネル遺伝子という）またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）電位依存性プロトンチャネル遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織における電位依存性プロトンチャネル遺伝子のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【００８７】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツール（例えば、モルフォリノオリゴヌクレオチド）として使用することもできる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るオリゴヌクレオチドを導入することによって、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドの含量を低下させることができる。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００８８】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。
【００８９】
このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチド（例えば、カタユウレイボヤ生体由来のポリヌクレオチド）が挙げられるが、カタユウレイボヤ生体以外に由来するポリヌクレオチドであってもよい。
【００９０】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【００９１】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、ヒト、マウス、またはカタユウレイボヤなどの諸器官のような生物材料であることが好ましい。本明細書において、「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）を意味する。後述する実施例においては、カタユウレイボヤ成体を用いているが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９２】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチド（モルフォリノオリゴヌクレオチド）として使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞において、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。
【００９３】
本発明の目的は、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントからなるオリゴヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００９４】
〔４．組換えベクター〕
本発明は、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを生成するために使用される組換えベクターを提供する。本発明に係る組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【００９５】
本発明に係る組換えベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００９６】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００９７】
本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００９８】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【００９９】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、例えば真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１００】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１０１】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【０１０２】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１０３】
本発明に係る組換えベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係る組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを選択的に合成することができる。
【０１０４】
このように、本発明に係る組換えベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１０５】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に依存するわけではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１０６】
〔５．形質転換体〕
本発明に係る形質転換体は、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体である。一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、上記の組換えベクターによって形質転換された細胞又は個体であってもよい。
【０１０７】
形質転換をする際のベクターの導入方法は特に限定されるものではなく、公知の遺伝子工学的手法を用いることができる。具体的には、コンピテントセルの使用、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ウイルスによる感染、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等が挙げられる。
【０１０８】
上記形質転換体は大きく分けて２つの用途がある。１つ目は、上記ベクターを増殖させるための形質転換体（増殖用形質転換体）としての利用である。上記増殖用形質転換体としては、上記ベクターを複製することのできる細胞であればよい。当該細胞を培養し増殖させることによって、細胞に含まれる上記ベクターを任意に増殖させ、大量生産を行うことができる。上記の増殖用形質転換体の種類は特に限定されるものではないが、大腸菌、枯草菌又は酵母等の細菌類又は真菌類が好ましい。また、上記ベクターがウイルスベクターである場合は、当該ウイルスの宿主となる細胞を選択すればよく、当該細胞として、例えば、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞等を用いることができる。
【０１０９】
上記形質転換細胞の２つ目の用途は、上記組換えベクターによって電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを発現させるための形質転換体（発現用形質転換体）としての利用である。ここで、「形質転換された」細胞とは、上記組換えベクターを有する細胞であってもよいし、或いは、導入された当該組換えベクターのうち、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む領域がゲノムＤＮＡ等に組み込まれ、当該組換えベクター自体は分解された細胞であってもよい。換言すれば、「形質転換された」細胞とは、上記組換えベクターが導入された結果として、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる細胞であればよい。例えば、培養細胞等に上記組換えベクターを導入した後、恒常的に転写抑制因子を発現する細胞を選別したり、あるいは、トランスポゾンを利用したベクターやレトロウイルスベクター等を用いたりすることによって、ゲノムＤＮＡ等に上記転写抑制因子ポリヌクレオチドを組み込んだ細胞等を挙げることができる。そのような細胞では、導入されたベクターは分解されていても、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは細胞内に残存し、それによってプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを発現することができるので、形質転換された細胞と定義される。
【０１１０】
上記発現用形質転換体の種類は特に限定されるものではない。実験に本発明を適用する場合には、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物；シロイヌナズナ等の植物；マウス、ラット、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫、カタユウレイボヤ等の動物；等に由来する細胞を用いることができる。さらに、医薬産業・医療産業分野では、ヒト又はヒト由来の培養細胞等を対象とすることもできる。また、上記の実験及び農業に適用される形質転換体は、培養細胞のみでなく、生体に含まれる細胞、臓器、器官あるいは個体をも含む。
【０１１１】
〔６．キット〕
本発明に係るキットは、上述した組換えベクターを含み、かつ、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを細胞に発現させるために用いられるキットである。
【０１１２】
本発明に係るキットには、上記の組換えベクター以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、組換えベクターを宿主細胞に導入するための導入用試薬、その宿主細胞、組換えベクターが宿主細胞内に導入されているかどうかを検定するためのプローブ群などが挙げられるがこれに限定されない。つまり、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドの発現実験を、確実に、かつ簡便にできるように支援する試薬であればどのようなものが含まれていてもよい。
【０１１３】
本発明に係るキットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、電位依存的なプロトンチャネル特性を有するポリペプチドを発現させることができる。
【実施例】
【０１１４】
以下、本発明の一実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本実施例では、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１という）が、電位依存的なプロトンチャネル特性を有することを以下の実験によって検証した。
【０１１５】
〔１．発現ベクターの作製およびｃＲＮＡの調製〕
カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）の成体から抽出したトータルＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマーを用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）による逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。そして、合成したｃＤＮＡを鋳型として、プライマー（５’−ｃｇｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇａａｇｇｃｇａｔａａｔｔｇｃ−３’（配列番号３）；５’−ａｔａｇｔｔｔａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａａａｃａｔｃａｇｃａｇａｇｇｃｔｇ−３’（配列番号４））を用いて、ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲを行い、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１  ＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲは、９５℃３０秒、５５℃５秒、７２℃２分を１サイクルとして、３０サイクル行った。
【０１１６】
次に、ＰＣＲ産物（Ｃｉ−ＶＳＯＰ１  ＤＮＡ）をＸｈｏＩ、ＮｏｔＩで消化し、ｐＳＤ６４ＴＦ（Ｔｅｒｒｙ  Ｓｎｕｔｃｈ博士より供与）のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトにサブクローニングした。なお、ｐＳＤ６４ＴＦは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用ベクターであるとともに、アフリカツメガエル卵母細胞での発現に必要な各種シスエレメントを含んだものである。
【０１１７】
続いて、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１を含むｐＳＤ６４ＴＦを直鎖化し、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによるｃＲＮＡ合成をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行った。ｃＲＮＡ合成には、ｍＭｅｓｓａｇｅ−ｍＭａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用い、条件はマニュアル通りとした。得られたＣｉ−ＶＳＯＰ１  ｃＲＮＡを水で溶解し、約０．５ｎｇ／ｎｌのＣｉ−ＶＳＯＰ１  ｃＲＮＡ水溶液を調製した。
【０１１８】
〔２．アフリカツメガエル卵母細胞への発現実験〕
アフリカツメガエル（Ｘｕｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）雌成体を０．１５％トリカイン溶液で麻酔した後、卵母細胞を外科的に単離した。単離した卵母細胞に、上述のＣｉ−ＶＳＯＰ１  ｃＲＮＡ水溶液をガラス微小管によって５０ｎｌ注入した。注入には通常の手法を用いた。Ｃｉ−ＶＳＯＰ１  ｃＲＮＡ水溶液を注入した卵母細胞を、ＮＤ９６溶液（９６ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＫＣｌ，１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５，８０μｇ／ｍｌ  ペニシリンＧ，１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン，５５０ｍｇ／ｌｉｔｅｒ  ピルビン酸ナトリウム）中で、１７±１℃の条件下で２〜４日培養した。
【０１１９】
〔アフリカツメガエル卵母細胞を用いた電気生理学実験〕
殻剥き用の高浸透圧溶液中で、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１を発現させた上記の卵母細胞からビテリン膜を除去し、これを倒立顕微鏡上のペトリ皿の上に載せた。この卵母細胞について、パッチクランプ法によってパッチ電流を計測した。なお、パッチクランプ法の条件は以下の通りである。
【０１２０】
パッチ電流の計測・記録には、ＥＰＣ９（ＨＥＫＡ社）パッチクランプアンプを用いた。パッチ電極は、抵抗が２〜１０ＭΩ程度で、ガラスの外側がワックスでコートされたものを使用した。また、パッチクランプの細胞内液及び細胞外液には、基本的に以下の組成のものを使用した。
【０１２１】
【表１】
2006325490.tif 000002
【０１２２】
【表２】
2006325490.tif 000003
【０１２３】
また、パッチ電流は、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチ法（内側外面パッチ法）によって計測した。具体的には、電極を細胞に密着させてギガオームシールを形成し、ランプ波形によって外向き電流を確認した後、マイクロマニピュレーターを手動で制御することによってパッチ膜を細胞から引き剥がしてｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチを形成した。なお、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチの形成は、（ａ）外向き電流が減少すること、及び（ｂ）テール電流の減衰速度が著明に加速すること、の両方が起こることによって確認した。
【０１２４】
ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチ法は、二本微小電極法やｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｌａｍｐ法と比較して、以下の利点があるために採用した。（イ）細胞膜容量が小さく、アクセス抵抗が小さいため、容量補正、抵抗補償回路の使用を行わずに計測が可能である。これにより、アーチファクトの混入を回避できる。（ロ）細胞内外の溶液条件を一定にできる。（ハ）パッチが長時間安定であるため、長時間にわたっての計測が可能になる。
【０１２５】
以下、パッチクランプ法によって行った実験を詳述する。
【０１２６】
（２−１：電位依存性外向き電流の検出）
Ｃｉ−ＶＳＯＰ１タンパク質を発現させた卵母細胞について、上述した方法によってマクロパッチ電流を記録した。図１は、各脱分極電位（−７０ｍＶから＋１２０ｍＶまで１０ｍＶおき）での外向き電流のトレースを重ね書きしたものである。縦軸は外向き電流、横軸は時間を表す。この図より、４００ｍｓ程度の時間では定常状態に達しない程度で、時間依存的に活性化することが示された。また、活性化する速度は、膜電位（脱分極電位）が高ければ高いほど速くなることも示された。
【０１２７】
図２は、４００ｍｓの周期で、脱分極電位（膜電位）が−７０ｍＶ〜＋１２０Ｖの脱分極パルスを与えたときの、外向き電流の最大値をプロットしたものである。縦軸は外向き電流の最大値、横軸は膜電位（脱分極電位）を表す。この図から、約＋３０ｍＶより脱分極側（右側）では、膜電位の増加に伴って外向き電流の最大値が著明に増加していくことが見て取れる。
【０１２８】
以上のように、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１は、細胞膜を通過する電位依存的な外向き電流を誘導することが明らかとなった。
【０１２９】
（２−２：Ｔａｉｌ  ｃｕｒｒｅｎｔ計測によるｐＨ透過性の検証）
次に、−７０ｍＶの保持電位から＋１００ｍＶへと脱分極させた後、−７０ｍＶ〜＋１０ｍＶの範囲内の各電位へ電圧を下げ、最後に−７０ｍＶに電位を戻した。この実験をさまざまなｐＨ条件下で行い、電流のトレースを記録した。
【０１３０】
図３は、細胞内ｐＨ（ｐＨｉ）６で、細胞外ｐＨ（ｐＨｏ）７としたときの各電位についての外向き電流のトレースを重ね書きしたものである。縦軸は外向き電流、横軸は時間を表す。図に示すように、ｔａｉｌ電流が−３０ｍＶと−４０ｍＶの間で反転したことから、反転電位は−３０ｍＶと−４０ｍＶの間であることが示された。
【０１３１】
なお、本実験では、Ｐ  ｏｖｅｒ  Ｎによる容量の補正を行っていないが、ワックスコートしたパッチ電極を用いて卵母細胞のマクロパッチ電流の記録を行う場合は容量成分が極めて小さいため、この程度の時間分解能であれば容量成分の補正は必要ないと考えられる。
【０１３２】
同様に様々なｐＨ条件下での反転電位を求めた結果、反転電位がネルンスト（Ｎｅｒｎｓｔ）の式で予測される値と一致することが明らかとなった。
【０１３３】
（２−３：Ｆａｓｔ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍのチェック）
次に、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１における電流特性のｐＨ依存性について、一つの細胞膜断片を用いて計測できるかどうかを、細胞内のｐＨを短時間で変化させることによって確認した。具体的には、テフロン（登録商標）被覆された還流装置であるＤＡＤ−１２（ＡＬＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって、細胞内のｐＨを５秒以内で急速に変化させた。パッチ電流をＥＰＣ９（ＨＥＫＡ社）によって増幅し、ＰｕｌｓｅプログラムによってＡＤ変換してデジタルデータとして取得し、ＩｇｏｒＰｒｏ（Ｗａｖｅｍａｔｒｉｃｓ社）によって解析した。
【０１３４】
図４は、細胞内ｐＨを６から５へと変化させたときの、ランプパルスでの電流と膜電位との関係をプロットしたものである。実線はｐＨｉ＝５のときで、図５の還流直後の点（矢印）に対応する。また、破線はｐＨｉ＝６のときで、図５の還流直前の点（三角印）に対応する。
【０１３５】
図５は、時間軸に沿って外向き電流の値をプロットしたものである。四角で示した領域は、還流したタイミングを表している。この図に示すように、溶液を交換（還流）すると、その前後で電流が数秒以内で増大し、その後安定していることから、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１によって細胞内ｐＨが瞬時に（数秒以内に）完全に転換されることが明らかとなった。
【０１３６】
（２−４．Ｃｉ−ＶＳＯＰ１のプロトン特異的透過性）
次に、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１による反転電位のプロトン濃度依存性を計測した。具体的には、上述したアフリカツメガエル卵母細胞にＣｉ−ＶＳＯＰ１のｃＲＮＡを注入して、２〜３日間１８℃にて培養後、引き抜きパッチ法によって膜電流を計測した。ここで、細胞内溶液にはｐＨ４〜８までのものを用い、それぞれのｐＨにおける反転電位を求めた。
【０１３７】
細胞内溶液の還流には、テフロン（登録商標）コートしたチューブを用いて１００ミリ秒以内に溶液の交換が可能なＡＬＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＤＡＤ−１２を用いた。また、細胞内溶液の交換は、−１００ｍＶから＋１５０ｍＶのランプパルスを１０秒間隔で与え、電流波形の変化が飽和することを確認することによって判断した。
【０１３８】
本実験における細胞外液の組成は、７５ｍＭ  ＮＭＤＧ−メタンスルフォン酸、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ緩衝剤、Ｇｌｕｃｏｓｅとした。なお、ｐＨ緩衝剤には、ｐＨｏ７〜８では１１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨｏ６〜７では１５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨｏ８では４７ｍＭ  ＣＨＥＳを用いた。Ｇｌｕｃｏｓｅは浸透圧の調整に用いた。また、細胞内液の組成は、ｐＨ５．９４では、６５ｍＭ  ＮＭＤＧ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５０ｍＭ  ＭＥＳ、７０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅとし、ｐＨ７．１では、１０５ｍＭ  ＮＭＤＧ−グルタミン酸、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとした。
【０１３９】
図６は、反転電位と細胞内外のｐＨ差（ｐＨｏ−ｐＨｉ）との関係を示すものである。図中における丸印は、ｐＨｏが７の条件で、同じパッチについて記録した反転電位をプロットしたものである。
【０１４０】
この図より、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の反転電位は、プロトン濃度依存性を有することが明らかとなった。
【０１４１】
（２−５．Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の電位依存的ゲーティングとｐＨ依存性）
次に、細胞内ｐＨを様々な値に変化させたときの外向き電流を調べた。図７は、様々な細胞内ｐＨ条件（ｐＨｉ５．０、６．０、Ｏｎ  Ｃｅｌｌ、７．０）での、外向き電流と膜電位との関係を示したものである。縦軸は外向き電流、横軸は膜電位を表す。また、図８は、各細胞内ｐＨ条件（ｏｎ  ｃｅｌｌ、ｐＨｉ７．０、６．０、５．０）での、外向き電流のトレースを重ねがきしたものである。
【０１４２】
これらの図より、細胞内のｐＨが低いほど、（ａ）早く活性化し、（ｂ）電流が大きく、かつ（ｃ）活性化する膜電位が左側にシフトする（低い膜電位で活性化する）、ことが示された。
【０１４３】
（２−６．Ｃｉ−ＶＳＯＰ１のｐＨ依存的電位依存特性）
Ｃｉ−ＶＳＯＰ１を発現させたアフリカツメガエルの卵母細胞におけるプロトン電流を、様々な細胞内ｐＨ条件下（ｐＨｉ６．０、７．０）で計測し、反転電位からコードコンダクタンスを求めた。なお、反転電位は、各ｐＨ条件下におけるテール電流を測定することによって求めた。
【０１４４】
図９は、各ｐＨ条件下での、コンダクタンスと膜電位との関係を示したものである。縦軸はコンダクタンス、横軸は膜電位を表す。なお、図中において、系列１はｏｎ  ｃｅｌｌの状態における測定値を示す。
【０１４５】
この図より、細胞内ｐＨが低い方が、（ａ）低い膜電位で活性化し、かつ（ｂ）最大コンダクタンス量が大きい、ことが見て取れる。これは、電位依存性プロトンチャネルの性質として従来知られていた傾向と一致する。
【０１４６】
（２−７．Ｚｎ２＋によるＣｉ−ＶＳＯＰ１の抑制効果）
電位依存性プロトンチャネルの特異的ブロッカーとして知られているＺｎ２＋を用いて、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１に対する抑制効果を調べた。具体的には、アフリカツメガエル卵母細胞に微少量のＣｉ−ＶＳＯＰ１  ｃＲＮＡを注入して、１８℃で２日間培養した。この卵母細胞について、細胞外液に１０μｍｏｌのＺｎＣｌ２を含む溶液を還流し、膜電流の計測を行った。なお、膜電流の計測には、２本微小電極による電位固定法を用いた。細胞外液のベースとしては、７５ｍＭ  ＮＭＤＧ−メタンスルフォン酸、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、１１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを用いた。
【０１４７】
図１０は、縦軸を膜電流、横軸を時間として、塩化亜鉛投与前の膜電流（実線）、塩化亜鉛投与後の膜電流（破線）をプロットしたものである。また、図１１は、縦軸を膜電流、横軸を膜電位として、塩化亜鉛投与前（丸）、塩化亜鉛投与後（三角）、塩化亜鉛洗浄後（四角）の外向き電流をプロットしたものである。
【０１４８】
図に示すように、塩化亜鉛を含む溶液を還流したところ、電流の約２０％が抑制された。これにより、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の電位依存的プロトンチャネル特性は、Ｚｎ２＋で抑制されることが明らかとなった。また、塩化亜鉛を含まない溶液で洗浄したところ、元の電流に戻ったことから、この変化は可逆的であることが示された。
【０１４９】
（２−８．Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の単一チャネルコンダクタンスの推定）
ノイズ解析によって、単一のＣｉ−ＶＳＯＰ１チャネルを透過するプロトン電流を推定した。具体的には、上述した卵母細胞を用いて、細胞内外ｐＨ７の条件下で、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチ法によって電流を記録した。まず、膜電位を１００ｍＶにステップ状に変化させ、そのときの電流トレースを５０回記録した。図１２は、各電流トレースのパターンを示すものである。そして、次に、この５０個の電流トレースを加算平均した。その結果を図１３に示す。
【０１５０】
さらに、５０個の電流トレースの分散値を各時間について求めた（図１４の右側）。図１４の左側は、平均電流トレースと分散とを重ねたものである。そして、この値をフィットすることにより、パッチ内のチャネル数Ｎと、単一チャネル電流の値を求めた。その結果、Ｎ＝８０００、単一チャネルの電流値＝７８ｆＡであった。
【０１５１】
上記の値は、哺乳類のプロトンチャネルの単一チャネル電流と比べて数倍大きいが、他のイオンチャネル（カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル）などと比較すると、１０分の１程度である。
【０１５２】
同様にして、膜電位を＋８０ｍＶ、＋６０ｍＶにそれぞれ変化させたときの単一チャネル電流を求めた。その結果を図１５に示す。縦軸は単一チャネル電流、横軸は膜電位を表す。このグラフの傾きから、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の単一チャネルコンダクタンスは約１ｐＳであることが明らかとなった。この値は、これまで分子が同定されたチャネルの中で、チャネルコンダクタンスが最も小さい部類に含まれる。
【０１５３】
以上の実験により、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１は、
（１）プロトンを選択的に透過させる
（２）比較的活性化時定数の遅い電位依存的活性化を示す（ゲートが脱分極側で開きやすい）
（３）強い外向き整流性を示す
（４）細胞内外のプロトン濃度差に依存して活性化電位がシフトする（ｐＨｏ−ｐＨｉが大きいほど過分極側へ移動する）
（５）膜電流が塩化亜鉛により可逆的に減少する
（６）単一チャネルコンダクタンス（単一チャネル電流）が他のイオンチャネルと比較して小さい
という特性を有するポリペプチドであることが示され、電位依存的なプロトンチャネル特性を有することが検証された。
【０１５４】
なお、本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１５５】
また、本明細書で示した数値範囲以外であっても、本発明の趣旨に反しない合理的な範囲であれば、本発明に含まれることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【０１５６】
電位依存性プロトンチャネルは、貪食細胞が活性酸素を産生する上で必須の役割を担っていることが知られている。貪食細胞の活性酸素産生率は、癌細胞の除去や感染症の防御に影響を及ぼすだけでなく、アレルギー反応などの免疫反応異常、癌の発症、アルツハイマー病などの神経変性疾患、動脈硬化など、多岐にわたる病態と深く関係している。よって、これらの病態を研究する上で、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、およびキットは重要な研究ツールとなる。さらに、これらの病態を改善する治療薬を開発するためにも有用である。
【０１５７】
また、電位依存性プロトンチャネルは、肺胞におけるＣＯ２の排出にも関与していることが知られている。よって、肺がん、慢性肺疾患、急性呼吸器不全などの各種肺機能障害について研究する上で、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、およびキットは重要な研究ツールとなる。また、電位依存性プロトンチャネルは、エネルギーを必要とせずに細胞内から酸（プロトン）を排出することができるため、患者に負担をかけない末期がんの治療薬などを開発するためにも、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、およびキットは有用である。具体的には、本発明のポリペプチドの分子構造に基づいて創薬研究を行うことが挙げられる。
【０１５８】
さらに、電位依存性プロトンチャネルは、破骨細胞に多く発現し、骨の形成や再構築に関与していると考えられている。よって、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、およびキットは、骨粗しょう症や先天性骨形成異常に対する医学的研究や治療薬の開発において、重要な研究ツールとなる。
【０１５９】
また、電位依存性プロトンチャネルは、イオンチャネルとトランスポーターとの中間的な性質を有している。具体的には、イオンチャネルのようなゲート機構を有するとともに、トランスポーターのような一方向性の透過性を示す。よって、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、およびキットを用いて、電位依存性プロトンチャネルにおけるプロトン感受性やプロトン透過性について研究することによって、イオンチャネル分子やトランスポーター分子の構造機能連関の解明にも繋がり、分子創薬分野で大きな貢献が期待できる。
【０１６０】
最後に、本発明に係るポリペプチドは、電位依存的なプロトンチャネル特性を有している。よって、プロトンの排出を電気的に制御できるナノパーツとして重要な生物材料となり得る。例えば、内在性の電位依存性プロトンチャネルが発現していない細胞において、本発明に係るポリペプチドを発現させることによって、エネルギーを消費することなく酸（プロトン）を電位依存的に排出させることが可能となる。よって、ｐＨの制御が必要な細胞に対して遺伝子操作を行う際に、本発明に係るポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、およびキットは好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の電位依存的な外向き整流特性を示すものであり、外向き電流と時間との関係を示す図である。
【図２】Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の電位依存的な外向き整流特性を示すものであり、外向き電流と膜電位との関係を示す図である。
【図３】Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の反転電位を求めるための、外向き電流と時間との関係を示す図である。
【図４】還流によってｐＨを急激に変化させた際の、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の外向き電流と膜電位との関係の変化を示す図である。
【図５】還流によってｐＨを急激に変化させた際の、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の外向き電流と時間との関係を示す図である。
【図６】Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の反転電位と細胞内外ｐＨ差との関係を示した図である。
【図７】様々な細胞内ｐＨ条件下での、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１による外向き電流と膜電位との関係を示した図である。
【図８】様々な細胞内ｐＨ条件下での、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１による外向き電流と時間との関係を示した図である。
【図９】様々な細胞内ｐＨ条件下での、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１のコンダクタンスと膜電位との関係を示した図である。
【図１０】塩化亜鉛の投与による、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の外向き整流特性の変化を示す図である。
【図１１】塩化亜鉛の投与および洗浄による、Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の外向き整流特性の変化を示す図である。
【図１２】ノイズ解析実験における電流トレースを示す図である。
【図１３】ノイズ解析実験における電流トレースを平均したものを示す図である。
【図１４】ノイズ解析実験において平均した電流トレースに分散値を加えた図である。
【図１５】Ｃｉ−ＶＳＯＰ１の単一チャネルコンダクタンスを求めるための、外向き電流と膜電位との関係を示す図である。
【図１】
2006325490.tif 000004
【図２】
2006325490.tif 000005
【図３】
2006325490.tif 000006
【図４】
2006325490.tif 000007
【図５】
2006325490.tif 000008
【図６】
2006325490.tif 000009
【図７】
2006325490.tif 000010
【図８】
2006325490.tif 000011
【図９】
2006325490.tif 000012
【図１０】
2006325490.tif 000013
【図１１】
2006325490.tif 000014
【図１２】
2006325490.tif 000015
【図１３】
2006325490.tif 000016
【図１４】
2006325490.tif 000017
【図１５】
2006325490.tif 000018
【配列表】
2006325490000001.app