(57)【要約】【課題】  標識するタンパク質分子の一分子あたりの標識分子の数や、該分子中の導入部位などを制御して標識できる新規のタンパク質標識手段を提供する。【解決手段】  標的タンパク質部分と、アフィニティー精製用の結合タンパク質部分とを含む融合タンパク質を作出する工程と；前記融合タンパク質を、前記結合タンパク質部分が特異的するアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合させる工程と；前記親和性結合基を置換して前記融合タンパク質に結合する溶出物質に標識試薬を結合させ、標識化溶出物質を作出する工程と；前記標識化溶出物質を前記融合タンパク質に作用させ、前記アフィニティーキャリアから前記融合タンパク質を解離させると同時に、前記標識化溶出物質を結合させることにより、前記融合タンパク質が前記標識試薬でラベルされた標識化融合タンパク質を作出する工程と；を具備する方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の高精度の一分子測定を可能にするために、標識試薬の導入を制御しながら前記タンパク質を標識する方法であって、
測定対象である標的タンパク質部分と、アフィニティー精製に用いる結合タンパク質部分とを含む融合タンパク質を作出する工程と、
前記融合タンパク質を、前記結合タンパク質部分が特異的に結合できるアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合させる工程と、
前記アフィニティーキャリアの親和性結合基を置換して前記融合タンパク質に結合する溶出物質に、標識試薬を結合させることにより、標識化溶出物質を作出する工程と、
前記標識化溶出物質を、前記アフィニティーキャリアに結合した前記融合タンパク質に作用させて、前記アフィニティーキャリアから前記融合タンパク質を解離させると同時に、該解離された融合タンパク質に前記標識化溶出物質を結合させることにより、前記融合タンパク質が前記標識試薬でラベルされた標識化融合タンパク質を作出する工程と、
を具備する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記結合タンパク質がＧＳＴ、ＭＢＰ、もしくはＨｉｓタグであり、且つこれら結合タンパク質に対応する前記溶出物質がそれぞれグルタチオン、マルトース、またはイミダゾールである方法。
【請求項３】
タンパク質の高精度の一分子測定を可能にするために、標識試薬の導入を制御しながら前記タンパク質を標識する方法であって、
測定対象である標的タンパク質の所望の位置のアミノ酸残基を遺伝子工学的な手法により操作することにより、該位置におけるシステインの挿入、他のアミノ酸のシステインへの置換、システインの他のアミノ酸への置換、もしくはシステインの削除により、結果として所望数のシステインが前記標的タンパク質中の所望の位置に保持されるように改変した標的タンパク質部分を作出し、該部分中に配置したシステインのスルフヒドリル基（標的分子スルフヒドリル基）を介して他の分子とジスルフィド結合可能な状態にする工程と、
前記標的タンパク質部分と、アフィニティー精製に用いる結合タンパク質部分とを含む融合タンパク質を作出する工程と、
スルフヒドリル基（タグタンパク質スルフヒドリル基）および標識試薬で標識可能な官能基を具備するタグタンパク質を作出する工程と、
前記タグタンパク質の前記標識可能な官能基を標識試薬で標識して標識化タグタンパク質とする工程と、
前記融合タンパク質を、前記結合タンパク質部分が特異的に結合できるアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合させる工程と、
アフィニティーキャリアの親和性結合基に結合した前記融合タンパク質に、前記標識化タグタンパク質を適切に作用させ、前記標的分子スルフヒドリル基と前記タグタンパク質スルフヒドリル基とをジスルフィド結合させて標識化融合タンパク質を作出する工程と、
前記標識化融合タンパク質を適切な切断部位で切断し、少なくとも前記標的タンパク質部分と前記タグタンパク質とを含む標識化断片を単離する工程と、
を具備する方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法であって、前記タグタンパク質が化学合成したペプチドである方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、前記標識試薬が、ＦＩＴＣである方法。
【請求項６】
タンパク質を高精度で一分子測定する方法であって、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法で標識されたタンパク質を、蛍光相関分光法（ＦＣＳ；Fluorescence Correlation Spectroscopy）に準拠して測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を標識する方法に関する。より具体的には、測定対象であるタンパク質一分子に標識分子を制御して導入できる方法であって、特に蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy、以後ＦＣＳと略称する）などの一分子測定技術への適用に有用な標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の標識方法は、生体分子の種類に応じて様々な方式で実施されている。その標識の様式も様々であるが、標的一分子の不特定部位に不特定数の標識試薬をランダムに導入するような非制御的な様式、また標的分子の所望の部分に所望数の標識試薬を制御して導入できる制御的な様式に大別できる。標識の様式は、標識目的に応じて適切な様式を選択して適宜実施される。即ち、被標識分子を検出する目的であれば、標的分子が標識され、その標識に基づいた検出方法によって検出できればよい。しかしながら、被標識分子の定量性を考慮する場合、また溶液中の被標識一分子の挙動を測定する場合などには、制御的な様式をもちいてより均質な標識状態を達成する方が好ましい。
【０００３】
核酸を標識する場合においては、プライマーなどを合成時に標識することができる。この際、プライマー中のどの塩基を標識するか、またいくつの塩基を標識するかなどを任意に設定できる。このようにして作出したプライマーを用いてＰＣＲ反応させることで、測定対象となるＰＣＲ産物一分子のどの領域にいくつの標識分子が存在するかを把握することが可能である。以上のように核酸を標識する場合は、標識する対象分子の一分子あたりの標識分子の数や導入部位などを制御して標識できる方法が存在する。
【０００４】
タンパク質を標識する従来技術としては、例えば、特定の官能基と結合を形成できる活性基と蛍光物質などの標識試薬とが結合した標識試薬活性基と、標識する標的タンパク質とを混合してランダムに標識する方法が存在する。この場合、前記活性基と、それと反応できるタンパク質の官能基とが結合することで、結果として標識試薬がタンパク質に導入され標識が達成される。前記活性基として、アミノ基と反応するN-ヒドロキシル  スクシンイミド（NHS；N-hydroxyl succinimide）やスルフヒドリル基と反応するマレイミド（maleimide）などが公知である。また同様の活性基をその両端に具備する各種のクロスリンカーを用いて、標識試薬と標的タンパク質とをクロスリンカーを介して架橋することで標識する方法などが知られている。しかしながら、これらの方法は上述のとおり何れもランダムにタンパク質を標識する非制御的な方法であり、現在のところタンパク質を制御して標識できる方法はない。
【０００５】
非制御的な方法でタンパク質を標識する場合、標識部位がランダムなため目的のタンパク質の活性部位が標識されることがある。その結果、標識されたタンパク質の活性が阻害されてしまい、この標識されたタンパク質を用いた測定結果が正確な情報を与えているか極めて疑わしいことになる。
【０００６】
また、非制御的な方法による標識では、測定対象であるタンパク質一分子に導入される標識分子数がばらばらなため、蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy、以後ＦＣＳと略称する）などの一分子解析技術により解析する対象としては好ましくない。なぜならＦＣＳは、反応容器中の分子の反応挙動を、それらが担持している標識分子のブラウン運動を利用して、分子の数と分子の大きさ、または形などの物理量を測定する方法であり、従って導入される標識試薬の分子数がばらつく場合には解析結果は各分子の平均としてしか求められなくなるからである。従って、従来技術のタンパク質の標識方法では、一分子測定できるというＦＣＳが本来備えている解析能力を十分発揮できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質の標識に関連した従来技術では上述したように、官能基と化学結合する活性基に標識分子が結合している試薬を利用する方法、クロスリンカーを用いる方法など、何れもランダムに反応させる非制御的な方法である。  
本発明の課題は、標識するタンパク質分子の一分子あたりの標識分子の数や、該分子中の導入部位などを制御して標識できる新規のタンパク質標識手段を提供することである。  
より具体的には、特に蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy、以後ＦＣＳと略称する）などの一分子測定技術への適用に有用なタンパク質の標識方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の手段を提供することによって課題を解決するものである。即ち、  
タンパク質の高精度の一分子測定を可能にするために、標識試薬の導入を制御しながら前記タンパク質を標識する方法であって、  
測定対象である標的タンパク質部分と、アフィニティー精製に用いる結合タンパク質部分とを含む融合タンパク質を作出する工程と、  
前記融合タンパク質を、前記結合タンパク質部分が特異的に結合できるアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合させる工程と、  
前記アフィニティーキャリアの親和性結合基を置換して前記融合タンパク質に結合する溶出物質に、標識試薬を結合させることにより、標識化溶出物質を作出する工程と、  
前記標識化溶出物質を、前記アフィニティーキャリアに結合した前記融合タンパク質に作用させて、前記アフィニティーキャリアから前記融合タンパク質を解離させると同時に、該解離された融合タンパク質に前記標識化溶出物質を結合させることにより、前記融合タンパク質が前記標識試薬でラベルされた標識化融合タンパク質を作出する工程と、  
を具備する方法を提供する。
【０００９】
また、タンパク質の高精度の一分子測定を可能にするために、標識試薬の導入を制御しながら前記タンパク質を標識する方法であって、  
測定対象である標的タンパク質の所望の位置のアミノ酸残基を遺伝子工学的な手法により操作することにより、該位置におけるシステインの挿入、他のアミノ酸のシステインへの置換、システインの他のアミノ酸への置換、もしくはシステインの削除により、結果として所望数のシステインが前記標的タンパク質中の所望の位置に保持されるように改変した標的タンパク質部分を作出し、該部分中に配置したシステインのスルフヒドリル基（標的分子スルフヒドリル基）を介して他の分子とジスルフィド結合可能な状態にする工程と、  
前記標的タンパク質部分と、アフィニティー精製に用いる結合タンパク質部分とを含む融合タンパク質を作出する工程と、  
スルフヒドリル基（タグタンパク質スルフヒドリル基）および標識試薬で標識可能な官能基を具備するタグタンパク質を作出する工程と、  
前記タグタンパク質の前記標識可能な官能基を標識試薬で標識して標識化タグタンパク質とする工程と、  
前記融合タンパク質を、前記結合タンパク質部分が特異的に結合できるアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合させる工程と、  
アフィニティーキャリアの親和性結合基に結合した前記融合タンパク質に、前記標識化タグタンパク質を適切に作用させ、前記標的分子スルフヒドリル基と前記タグタンパク質スルフヒドリル基とをジスルフィド結合させて標識化融合タンパク質を作出する工程と、  
前記標識化融合タンパク質を適切な切断部位で切断し、少なくとも前記標的タンパク質部分と前記タグタンパク質とを含む標識化断片を単離する工程と、  
を具備する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
標識するタンパク質分子の一分子あたりの標識分子の数や、該分子中の導入部位などを制御して標識できる。より具体的には、特にＦＣＳなどの一分子測定技術への適用に有用な標識タンパク質を作出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、上述の発明の課題を克服したタンパク質の標識方法、特にＦＣＳなどの一分子測定方法に適用する場合に、高精度の一分子測定が可能となるように標識試薬の導入を制御しながらタンパク質を標識する方法を提供するものである。本発明によると対象のタンパク質一分子に対する標識分子の数が一定となるため均質な標識状態を達成することが可能である。また、対象のタンパク質を直接標識試薬などの標識工程で使用する薬品で処理することが無いため薬品の影響はほとんどない。更に、標識する部位があらかじめ決まっているため、標識試薬が不適切な部位に導入されることによってタンパク質の活性および／またはコンフォメーションなどに変化を生じることはほとんどない。従って、本発明により標識したタンパク質を用いた測定結果は、より正確な情報を与えることになる。  
以下に本発明の代表的な態様を例示して詳細に説明する。  
【００１２】
＜実施態様１＞  
［概要］  
本態様の概要を以下に記載する。  
標識対象のタンパク質とアフィニティー精製時に利用する結合タンパク質との融合タンパク質を作製する。これをアフィニティーカラムで濃縮し、該カラムに結合しない共雑物を除去する。そしてアフィニティーカラムから前記融合タンパク質を溶出する際に標識した溶出物質を用いることで、アフィニティーカラムと結合している前記融合タンパク質を、アフィニティーカラムから溶出すると同時に標識した溶出物質を結合させることにより標識する方法である（図１を参照）。  
本態様の詳細な説明を以下に記載する。
【００１３】
［詳細説明］  
以下に説明される記載を参照して、本態様の各工程が説明される。  
工程１：測定対象である標的タンパク質部分と、アフィニティー精製に用いる結合タンパク質部分とを含む融合タンパク質を作出する工程。  
本態様において、「融合タンパク質」は、「標的タンパク質部分」および「結合タンパク質部分」を少なくとも含む融合タンパク質であり、更に特定の抗体に親和性のあるアミノ酸配列からなる領域などの他の機能的領域をも含んでいてもよい。前記標的タンパク質部分は、標識して実際に測定する対象となるタンパクである。このタンパク質は、特定の遺伝子がコードするタンパク質全体であってもよいが、その断片などであってもよく、目的に応じて適宜適切な領域が選択される。
【００１４】
前記結合タンパク質部分は、アフィニティーキャリアに固相化された親和性結合基に特異的に結合できるタンパク質である。即ち、前記結合タンパク質部分と前記親和性結合基とは、特異的に結合するペアとなる物質である。具体的には両者は、例えば、酵素に対する基質もしくは補酵素、レセプターに対するリガンド、抗原に対する抗体、などの互いに特異的に結合するペアとなる物質である。更に、前記結合タンパク質部分は、前記ペアの何れか一方であって、且つ遺伝子工学により操作可能な核酸によりコードされるタンパク質を使用することができる。前記結合タンパク質部分に使用された前記ペアの一方に対応する、前記ペアの他方が前記親和性結合基となる。以上の定義を非タンパク質性の基質と特異的に結合する酵素タンパク質の場合を例に説明する。この場合の基質はタンパク質ではないため融合タンパク質を作出できない、従って酵素の方を前記結合タンパク質として使用することとなる。従って、自動的にもう一方の前記ペアである基質を前記親和性結合基として使用することになる。
【００１５】
前記結合タンパク質部分は、より具体的にはＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、もしくはＨｉｓタグ（ヒスチジンからなるオリゴペプチド）などを使用できる。前記アフィニティーキャリアについては、以下に記載する「各態様に共通する事項の説明」の項で詳細に説明する。
【００１６】
当業者であれば各種の遺伝子工学の手法を適宜使用して本態様の融合タンパク質を作出することができる。例えば、前記標的タンパク質部分をコードする核酸は、ｃＤＮＡライブラリーなどから適切なプライマーを用いたＰＣＲ増幅などによって取得することができる。次に、この核酸を各種の融合タンパク質を発現させるためのベクターであって、前記結合タンパク質部分を組み込んであるベクターなどに適切に挿入する。このような前記結合タンパク質部分となりうるＧＳＴなどを組み込んだ発現ベクターは各種市販されており（例えば、ｐＧＥＸベクター、アマシャムファルマシア社）、そこに融合させるタンパク質をコードする核酸を適切に組み込んで融合タンパク質を作出してもよい。次にこのベクターで適切な宿主に導入して融合タンパク質を発現すればよい。
【００１７】
工程２：前記融合タンパク質を、前記結合タンパク質部分が特異的に結合できるアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合させる工程。この工程は、上記工程で発現させた融合タンパク質をアフィニティーキャリア上に固相化された親和性結合基に結合させる工程である。この工程は周知のタンパク質のアフィニティー精製の方法に従って実施すればよい。簡単に要約した操作手順の例は下記のようなものである。
【００１８】
前記融合タンパク質を発現させた宿主細胞を適切な溶解緩衝液で溶解する溶解操作；  
細胞を溶解させた細胞溶解液の不溶性画分を遠心分離などにより除去する清澄操作；  
前記溶解液の可溶性画分を、前記アフィニティーキャリアを充填したカラムに結合させる、または前記アフィニティーキャリアをもちいたバッチ法で結合させる結合操作；  
適切な洗浄液で洗浄して前記アフィニティーキャリアに非特異的に結合した共雑物を除去する洗浄操作；
【００１９】
続いて、次ぎの段階の工程に移行するか、或いは一旦融合タンパク質を保存する場合などには所望により下記の操作を付加してもよい。即ち、  
カラムに結合した融合タンパク質を前記溶出物質で溶出する溶出操作；  
溶出した融合タンパク質と共に溶出液に混在する前記溶出物質を排除するためのゲル濾過、透析、限外濾過などの緩衝液交換操作；  
融合タンパク質を限外濾過などで濃縮する濃縮操作；などである。  
次に融合タンパク質に適切な条件で保存し、再度本態様の標識を行うには、この工程を最初からやり直す、即ち再度親和性結合基に結合させて本工程を終了させる。
【００２０】
工程３：前記アフィニティーキャリアの親和性結合基を置換して前記融合タンパク質に結合する溶出物質に、標識試薬を結合させることにより、標識化溶出物質を作出する工程。  
本態様において、「標識化溶出物質」は、「溶出物質」に「標識試薬」を結合させることにより作出されるものである。
【００２１】
前記溶出物質は、前記結合タンパク質部分に特異的な親和性を有する物質であり、前記親和性結合基と同一の基本構造を有する物質である。従って、前記親和性結合基と同様に前記溶出物質も、使用される結合タンパク質部分に対応して決定される。従って、前記結合タンパク質部分が、例えばＧＳＴ、ＭＢＰ、もしくはＨｉｓタグであれば、それぞれに対応する前記溶出物質は、グルタチオン、マルトース、もしくはイミダゾールまたはその誘導体が使用される。
【００２２】
前記標識試薬は、以下に説明する本発明の測定手段によって実際に測定される本体である。本発明の「標識試薬」および「測定手段」は、以下に記載する「各態様に共通する事項の説明」の項で説明する。
【００２３】
この工程では、溶出物質に標識試薬を結合させることにより、標識化溶出物質を作出する。この結合には、上述のスクシンイミド、マレイミドなどの活性基、またはこれら活性基を両端に有するクロスリンカーなどを利用して実施することができる。これらの反応基およびクロスリンカーを使用する条件はこれらを供給しているメーカー（例えば、ＰＩＥＲＣＥ社）の推奨する条件で反応させればよい。
【００２４】
また、反応基およびクロスリンカーの選択は、前記溶出物質中に存在する利用可能な官能基により適宜選択されることが好ましい。前記利用可能な官能基とは、一般的には、前記結合タンパク質部分との結合に関与しない前記溶出物質中の官能基であり、結果として標識試薬が結合した標識化溶出物質が前記結合タンパク質部分に対する特異的な親和性を保持していればよい。また、例えば蛍光試薬であるＦＩＴＣにマレイミドが導入されているＦＩＴＣマレイミド（ＰＩＥＲＣＥ社）などの活性基を導入済みの標識試薬も市販されており、これをスルフヒドリル基を有する溶出物質に結合させてもよい。例えば、前記溶出物質としてグルタチオンを使用する場合には、前記ＦＩＴＣマレイミド（ＰＩＥＲＣＥ社）を使用してグルタチオンをＦＩＴＣで標識して前記標識化溶出物質を作出することができる。
【００２５】
更に、この工程の最後に、前記溶出物質と反応しなかった前記標識試薬を除去する操作を加えてもよい。
【００２６】
工程４：前記標識化溶出物質を、前記アフィニティーキャリアに結合した前記融合タンパク質に作用させて、前記アフィニティーキャリアから前記融合タンパク質を解離させると同時に、該解離された融合タンパク質に前記標識化溶出物質を結合させることにより、前記融合タンパク質が前記標識試薬でラベルされた標識化融合タンパク質を作出する工程。
【００２７】
本態様において、「標識化融合タンパク質」は、前記融合タンパク質に前記標識化溶出物質が結合したタンパク質であり、結果として前記融合タンパク質が前記標識試薬でラベルされたタンパク質である。この標識化融合タンパク質が、実際の測定に使用されるものであり、本発明の課題である一分子あたりの標識分子の数や、該分子中の導入部位などを制御した標識状態が達成されたタンパク質である。
【００２８】
この工程は、アフィニティー精製において特異的に結合した物質を溶出する方法に従って実施できる。具体的には、前記標識化溶出物質を、前記アフィニティーキャリアに結合した前記融合タンパク質に作用させて、前記アフィニティーキャリアから前記融合タンパク質を解離させればよい。この解離は結合タンパク質部分が結合している固相化された前記親和性結合基を、前記標識化溶出物質が置換することから生じる現象である。従って、前記アフィニティーキャリアから解離して溶液中に溶出してきたということは、即ち前記標識化溶出物質が前記融合タンパク質中の前記結合タンパク質部分に結合したことを意味している。従って、本工程で溶出された融合タンパク質は前記標識試薬でラベルされているものである。
【００２９】
更に、本工程は、ゲル濾過、透析、限外濾過などで未反応の前記標識化溶出物質を除去する操作を付加してもよい。
【００３０】
＜実施態様２＞  
［概要］  
本態様の概要を以下に記載する。  
標識対象のタンパク質に遺伝子操作などでシステインを付加し、ジスルフィド結合可能にする。また、ジスルフィド結合可能でかつ標識可能な官能基を有するタグタンパク質を遺伝子操作や化学合成法などを用いて作出する。タグタンパク質を濃縮し、タグタンパク質の標識可能な官能基に標識する。次に標識対象となるタンパク質とタグタンパク質とをジスルフィド結合で結合することで標識する（図２を参照）。  
本態様の詳細な説明を以下に記載する。
【００３１】
［詳細説明］  
以下に説明される記載を参照して、本態様の各工程が説明される。  
工程１：測定対象である標的タンパク質の所望の位置のアミノ酸残基を遺伝子工学的な手法により操作することにより、該位置におけるシステインの挿入、他のアミノ酸のシステインへの置換、システインの他のアミノ酸への置換、もしくはシステインの削除により、結果として所望数のシステインが前記標的タンパク質中の所望の位置に保持されるように改変した標的タンパク質部分を作出し、該部分中に配置したシステインのスルフヒドリル基（標的分子スルフヒドリル基）を介して他の分子とジスルフィド結合可能な状態にする工程。この工程は、前記標的タンパク質の標識試薬を導入する位置にシステインが存在するように遺伝子操作して前記標的タンパク質部分を作出する工程である。
【００３２】
前記標的タンパク質部分は、実施者が標識したい測定対象となるタンパク質であって、そのタンパク質全体またはその断片をコードするＤＮＡを以下に説明する操作を施したものである。即ち、測定対象である標的タンパク質の所望の位置のアミノ酸残基を遺伝子工学的な手法により操作することにより、該位置において、システインの挿入、他のアミノ酸のシステインへの置換、システインの他のアミノ酸への置換、もしくはシステインの削除などにより、結果として所望数のシステインが前記標的タンパク質中の所望の位置に保持されるように改変した標的タンパク質部分を作出し、該部分中に配置したシステインのスルフヒドリル基（標的分子スルフヒドリル基）を介して他の分子とジスルフィド結合可能な状態にする操作である。もし、測定対象である標的タンパク質中に本来存在するシステインを使用してもよく、この場合上記の操作を実施しない未操作の前記標的タンパク質を標的タンパク質部分として使用する。
【００３３】
工程２：前記標的タンパク質部分と、アフィニティー精製に用いる結合タンパク質部分とを含む融合タンパク質を作出する工程。  
本態様において、「融合タンパク質」は、「標的タンパク質部分」および「結合タンパク質部分」を少なくとも含む融合タンパク質であり、更に特定の抗体に親和性のあるアミノ酸配列からなる領域などの他の機能的領域をも含んでいてもよい。前記結合タンパク質部分は、上述の実施態様１において定義した結合タンパク質部分と同じものを使用できる。しかしながら、本態様における前記結合タンパク質部分は、上述の工程１において説明した標的タンパク質と同様にシステインに関して遺伝子操作してもよい。即ち、結果として所望数のシステインが結合タンパク質部分中の所望の位置に保持されるように改変した結合タンパク質部分が作出される。このように改変した結合タンパク質部分を前記結合タンパク質部分として使用する場合には、前記融合タンパク質全体のシステインの存在が制御されることとなる。
【００３４】
この工程は、遺伝子操作などを利用して、前記標的タンパク質部分と前記結合タンパク質部分とを融合した本態様の融合タンパク質を作出するものである。当業者であれば各種の遺伝子工学の手法を適宜使用して本態様の融合タンパク質を作出することができるが、例えば次に説明する方法によって作出することができる。前記標的タンパク質部分をコードする核酸は、ｃＤＮＡライブラリーなどから適切なプライマーを用いたＰＣＲ増幅などによって取得することができる。次に、この核酸を各種の融合タンパク質を発現させるためのベクターであって、前記結合タンパク質部分を組み込んであるベクターなどに適切に挿入する。このような前記結合タンパク質部分となりうるＧＳＴなどを組み込んだ各種の発現ベクターは市販されており、そこに融合させるタンパク質をコードする遺伝子を適切に組み込んで融合タンパク質を作出してもよい。次にこのベクターで適切な宿主に導入して融合タンパク質発現すればよい。
【００３５】
工程３：スルフヒドリル基（タグタンパク質スルフヒドリル基）および標識試薬で標識可能な官能基を具備するタグタンパク質を作出する工程。  
この工程は、タグタンパク質を作出する工程である。前記タグタンパク質は、スルフヒドリル基（タグタンパク質スルフヒドリル基）および標識試薬で標識可能な官能基を具備するタンパク質またはその断片などであり、好ましくは化学合成したペプチドである。前記標識可能な官能基とは、標識試薬をその官能基に共有結合で結合させ導入することができる官能基であり、好ましくは上述の活性基であるスクシンイミド、マレイミドなどが反応できる官能基である。従って、前記標識可能な官能基とは、アミノ基もしくはスルフヒドリル基であり、好ましくはリジン、システインなどが具備するアミノ基もしくはスルフヒドリル基である。
【００３６】
前記標識試薬は、以下に説明する本発明の測定手段によって実際に測定される本体である。本発明の「標識試薬」および「測定手段」は、以下に記載する「各態様に共通する事項の説明」の項で説明する。
【００３７】
工程４：前記タグタンパク質の前記標識可能な官能基を標識試薬で標識して標識化タグタンパク質とする工程。  
この工程では、タグタンパク質の標識可能な官能基に標識試薬を結合させることにより、標識化タグタンパク質を作出する。この結合は、上述のスクシンイミド、マレイミドなどの活性基、またはこれら活性基を両端に有するクロスリンカーなどを利用して実施することができる。これらの活性基およびクロスリンカーを使用する条件はこれらを供給しているメーカー（例えば、ＰＩＥＲＣＥ社）の推奨する条件で反応させればよい。また、活性基およびクロスリンカーの選択は、前記タグタンパク質の前記標識可能な官能基により適宜選択されるものである。  
更に、この工程の最後に、前記タグタンパク質と反応しなかった前記標識試薬を除去するためにゲル濾過、透析、限外濾過などの操作を加えてもよい。
【００３８】
工程５：前記融合タンパク質を、前記結合タンパク質部分が特異的に結合できるアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合させる工程。この工程は、上述の実施態様１の工程２と同様に実施すればよい。
【００３９】
工程６：アフィニティーキャリアの親和性結合基に結合した前記融合タンパク質に、前記標識化タグタンパク質を適切に作用させ、前記標的分子スルフヒドリル基と前記タグタンパク質スルフヒドリル基とをジスルフィド結合させて標識化融合タンパク質を作出する工程。
【００４０】
本態様において、「標識化融合タンパク質」は、前記融合タンパク質に前記標識化タグタンパク質がジスルフィド結合したタンパク質であり、結果として前記融合タンパク質が前記標識試薬でラベルされたタンパク質である。前記融合タンパク質と前記標識化タグタンパク質との結合は、両者のスルフヒドリル基をジスルフィド結合させて達成される。より具体的には、前記融合タンパク質中の前記標的分子スルフヒドリル基と、前記タグタンパク質中の前記タグタンパク質スルフヒドリル基とをジスルフィド結合させて達成される。この結合は、好ましくは前記融合タンパク質がアフィニティーキャリアの親和性結合基に結合した状態で達成されるが、解離させた後に反応させて達成してもよい。次にこの標識化融合タンパク質を適切な洗浄液で洗浄して、反応しなかった前記標識化タグタンパク質を除去することが好ましい。次に前記溶出物質でアフィニティーキャリアからこの標識化融合タンパク質を溶出して測定に使用できる。この標識化融合タンパク質は、本発明の課題である一分子あたりの標識分子の数や、該分子中の導入部位などを制御した標識状態が達成されたタンパク質である。
【００４１】
工程７：前記標識化融合タンパク質を適切な切断部位で切断し、少なくとも前記標的タンパク質部分と前記タグタンパク質とを含む標識化断片を単離する工程。この工程は、前記標識化融合タンパク質が前記アフィニティーキャリアに結合したまま、測定に必須の部分を切断して溶出させる工程である。本態様は、上記の工程６で作出された標識化融合タンパク質を測定の対象としてもよいが、本工程で作出される標識化断片を測定の対象としてもよい。
【００４２】
本態様において、「適切な切断部位」は、その部位で切断でした場合に少なくとも、前記標的タンパク質部分と前記タグタンパク質とを含む前記標識化断片が生成されればよい。上述のように前記標識化断片も、本発明の課題である一分子あたりの標識分子の数や、該分子中の導入部位などを制御した標識状態が達成されたタンパク質である。前記切断部位は、プロテアーゼが認識且つ切断する特定のアミノ酸配列を含む部位であり、遺伝子操作などにより前記融合タンパク質の切断したい部分に導入すればよいが、好ましくは前記結合タンパク質部分に、より好ましくは前記結合タンパク質部分と前記標的タンパク質部分との連結部に、導入される。前記プロテアーゼには、例えばファクターＸなどの特異的なアミノ酸配列を認識して、該配列部分を分解するプロテアーゼなどを好適に使用できる。
【００４３】
＜各態様に共通する事項の説明＞  
［アフィニティーキャリア］  
本発明で使用するアフィニティーキャリアは、前記親和性結合基を固相化した担体を使用することができる。この担体は、通常タンパク質の精製に使用される担体であればよく、例えばアガロース、セルロースなどの各種の多糖類の架橋物などを好適に使用することができる。
【００４４】
［測定手段］  
本発明の方法で標識されたタンパク質を測定する測定手段は、以下に説明する本発明で使用される「標識試薬」を測定できる測定手段を使用することができる。また、本発明の課題の１つは「一分子測定技術への適用に有用なタンパク質の標識方法を提供すること」であり、ＦＣＳ、偏光、フローサイトメトリー、散乱光などに準拠する一分子測定技術が本発明により標識したタンパク質の好適な測定手段である。
【００４５】
次に本発明の測定手段として好適なＦＣＳについて説明する。ＦＣＳの基本的な特徴は、均一系の溶液に含まれる蛍光試薬などの標識試薬で標識された分子の濃度や分子間作用を、顕微鏡視野下の極微小領域において平均数個の標識された分子のブラウン運動に由来する標識試薬から生じた光の「ゆらぎ」を通してモニタできることである。更にこの時に物理的な分離過程を経ずに、しかもほぼ実時間でモニタ出来ることも特徴である。このようにＦＣＳは溶液中の自由な分子運動を検出しているため、幅広い研究対象に応用できると期待されている技術である。
【００４６】
ＦＣＳ測定部の特徴を次に述べる。ＦＣＳは、レーザー光励起の共焦点光学系を試料測定部として使用し、そこでの光を検出器で捉えた後、ディジタル相関器でデータの記録と解析を行うようになっている。励起光であるレーザー光は試料溶液中の１点に集中され、かつ共焦点光学系の特性からその１点からの光を検出系でとらえることになる。実際の溶液中の測定領域は理想的な点ではなく円柱状の領域であり、その領域の大きさは例えば、直径約４００ｎｍ、軸長約２０００ｎｍ、容積としてフェムトリットル（１０-15Ｌ）程度である。ＦＣＳの測定する対象は溶液であり、溶液中の測定領域中に存在する標識試薬分子はブラウン運動を行っている。したがって、一定の測定領域における分子の数は常に一定ではなくある値を中心に変動して「数ゆらぎ」が起きている。更にこの数ゆらぎに起因して、測定される標識試薬分子が発する光の強度に「強度ゆらぎ」が発生する。この光強度のゆらぎを解析することで拡散速度に関する情報と分子の数に関する情報を得ることが出来る。
【００４７】
［標識試薬］  
本発明で使用される標識試薬は、前記測定手段により測定可能な標識試薬を使用することができる。前記測定手段がＦＣＳである場合には、光学的に測定できる標識試薬であればよいが、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなどの蛍光試薬を好適に使用することができる。また、発光試薬としての酵素（例えば、ＰＯＤ、ＡＬＰ、ルシフェラーゼ）及びそれら酵素に対応する基質（例えば、ルミノール／Ｈ２Ｏ２、ＡＭＰＤＤ、ルシフェリン）といった化学発光や生物発光を利用した試薬を使用してもよい。また、前記測定手段が偏光に準拠する測定手段である場合には、金コロイド、ラッテクスなどの試薬を使用することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４９】
［実施例１］  
実施態様１に基づくタンパク質の標識方法を本実施例に示す。  
本実施例においては、結合タンパク質としてグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、標的タンパク質としてｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を用いた例を示す。即ち、実施態様１の融合タンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）との融合タンパク質（ＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ）である。
【００５０】
＜方法＞  
ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）融合タンパク質（ＵＢＩ社）を、グルタチオン結合ビーズと、Ｔ−ＴＢＳ〔0.1%Triton  X-100，TBS pH7.4(10mM  Tris-HCl，150mM NaCl)〕中で４℃で１時間反応させ、融合タンパク質をビーズに特異結合させる。ビーズに結合しなかった融合タンパク質をＴ−ＴＢＳで洗浄して除去した。
【００５１】
一方、還元型グルタチオンをＦＩＴＣマレイミドで標識し、未反応のＦＩＴＣマレイミドはカラム操作で取り除いた。このＦＩＴＣ標識は、フルオレセインマレイミド（Fluorescein maleimide、ＰＩＥＲＣＥ社）を用いてＰＩＥＲＣＥ社の説明書に従って行った。
【００５２】
融合タンパク質が会合したビーズに１０ｍＭのＦＩＴＣ標識したグルタチオン溶液を添加して室温で１時間反応させた。この操作の結果、ビーズに固相化されているグルタチオンとＦＩＴＣ標識したグルタチオンとが置換されることにより、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質１分子が１分子のＦＩＴＣにより標識されることとなる。また同時に、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質はビーズ上のグルタチオンから乖離するのでビーズから遊離して溶液中に溶出されることになる。
【００５３】
融合タンパク質が溶出した溶液を別のチュウブに回収した。さらに未反応のＦＩＴＣ標識したグルタチオンを取り除くため、ＰＤ−１０ゲル濾過カラム（アマシャム社）を用いてゲル濾過を行い、ＦＩＴＣ標識ＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ融合タンパク質を回収した。
【００５４】
＜結果＞  
このようにして作出したＦＩＴＣ標識ＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ融合タンパク質をＦＣＳにて測定した結果を図３、表１に示す。
【００５５】
【表１】
2006266919.tif 000002
【００５６】
［実施例２］  
実施態様２に基づくタンパク質の標識方法を本実施例に示す。  
本実施例においては、実施態様２の融合タンパク質は、結合タンパク質部分であるグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、標的タンパク質部分であるｃ−Ｊｕｎ（１−７９）との融合タンパク質（ＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓ）である。同様に、実施態様２の標識化タグタンパク質は、ＦＩＴＣ標識ペプチドである。
【００５７】
＜標識するタンパク質＞  
最初にｃ−Ｊｕｎ（１−７９）をコードする核酸をＰＣＲで増幅する。次にＧＳＴ融合タンパク質の発現ベクター（ｐＧＥＸベクター、アマシャムファルマシア社）に前記核酸を翻訳時の読み枠が同じになるように挿入して、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）融合タンパク質をコードする融合タンパク質遺伝子を作出する。更に以下のように改変して、本実施例において標識する対象であるＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓを作出した。即ち、Ｊｕｎのアミノ酸１−７９をコードする領域に存在する全てのシステイン残基をメチオニン残基に置換し、更にＣ末端のアミノ酸をシステインに置換してＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓを作出した。従って、ＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓ中のシステイン残基は、次ぎの（ａ）、（ｂ）を有することになる。
【００５８】
（ａ）ＧＳＴ領域中に存在するシステイン残基。この領域中に存在するシステイン残基は、ＧＳＴタンパク質中に元来存在するシステイン残基である。  
（ｂ）ｃ-Ｊｕｎ領域のＣ末端に新規に導入した１つのシステイン残基。
以下に説明するように、ＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓ融合タンパク質中のＧＳＴ領域はファクターＸで切断してしまい、ＦＣＳによる解析工程には持ち込まれない。従って、本実施例において実質上解析を行う対象となるのは（ｂ）のシステインの標識状態である。（ｂ）のシステインは１つのみ存在しているので、実施態様２の標識化タグタンパク質が反応できるのはこのシステインのみとなる。
【００５９】
＜方法＞  
上記のＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓ融合タンパク質を大腸菌を用い発現誘導させ、それを遠心で集めて溶解した。溶解物を遠心した後、その上清をＴ-ＴＢＳで希釈しグルタチオン結合ビーズと１時間４℃で反応させた。その後、ＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓ融合タンパク質をビーズに特異結合させ、未反応の融合タンパク質をＴ-ＴＢＳで洗浄した。
【００６０】
一方、Ｎ末端に１つのシステイン、中央部に６つのヒスチジン、およびＣ末端部に１つのリジンからなるペプチド〔Ｃ（６ｘ  Ｈ）Ｋのように表されるペプチドであり、ここでＣはシステイン、Ｈはヒスチジン、Ｋはリジンを意味する〕のリジンのεアミノ基をＦＩＴＣ標識してＦＩＴＣ標識ペプチドを作出した。
【００６１】
ビーズに結合したＧＳＴ-ｃ-Ｊｕｎ-Ｃｙｓ融合タンパク質にＦＩＴＣ標識ペプチドを反応させ、融合タンパク質のシステインとＦＩＴＣ標識ペプチドのシステインをジスルフィド結合させた。その後、未反応のペプチトをＴ-ＴＢＳで洗浄した。次にＧＳＴ領域中に存在するファクターＸ切断部位にファクターＸを反応させて、融合タンパク質のＧＳＴよりＣ末端側の部分を切り離す。この処理により、ｃ-Ｊｕｎと蛍光標識ヒスチジンペプチドとの複合体（ＦＩＴＣ標識ｃ-Ｊｕｎタンパク質）がビーズから乖離するので、それを回収した。
【００６２】
＜結果＞  
このようにして作製したＦＩＴＣ標識ｃ-Ｊｕｎタンパク質をＦＣＳにて測定した結果を表２に示す。
【００６３】
【表２】
2006266919.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の実施態様１の方法を示す図である。
【図２】本発明の実施態様２の方法を示す図である。
【図３】実施例１において標識したタンパク質をＦＣＳで測定した結果を示すグラフである。
【図１】
2006266919.tif 000004
【図２】
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【図３】
2006266919.tif 000006