(57)【要約】 【課題】  検出時のノイズとなる乱反射を抑え、精度の良い分析を行なうことが出来る生体サンプル測定用プレートを提供する。 【解決手段】  生体サンプル判別用プレート２１には流路２５、液だめ２３が形成されている。透明蓋材３１は励起光４１を透過させる材料でできており、流路２５を覆うように貼り付けられている。また、遮光材入り蓋材３２は流路２５以外の部分に励起光４１を遮光する遮光材４２が貼り付けられている。遮光材４２が貼り付けられているため、遮光材入り蓋材３２は光を通す材料でも、液だめ２３に光が届くことはない。【選択図】    図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遮光性材料からなるプレート基板に形成された、蓋部で覆われた隣接する流路のうち一方の流路に照射された励起光をもとに前記流路に充填された生体サンプルが発する戻り光を測定し前記生体サンプルを判別する装置に使用される、前記流路が形成された生体サンプル判別用プレートにおいて、
前記隣接する流路のうち第１の流路を覆う第１蓋部が入射光と戻り光とを透過する部材で形成されてなり、前記隣接する流路のうち第２の流路を覆う第２蓋部が入射光と戻り光とを遮光する部材で形成されてなる、ことを特徴とする生体サンプル判別用プレート。
【請求項２】
前記第１蓋部と前記第２蓋部とが一体に形成されてなる、ことを特徴とする請求項１に記載の生体サンプル判別用プレート。
【請求項３】
前記第１の流路の流路断面積が前記第２の流路の流路断面積より小さい、ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体サンプル判別用プレート。
【請求項４】
前記第２蓋部が表面に遮光性フィルムを付着されてなる、ことを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の生体サンプル判別用プレート。
【請求項５】
前記第２蓋部と前記プレート基板とが遮光材を含む接着剤により接着されてなる、ことを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の生体サンプル判別用プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやタンパクその他の生体サンプルを緩衝剤中で移動させ、その輸送反応を検出して生体サンプルを判別する生体サンプル判別用プレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料を考えた場合、代表的なものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質が存在している。近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝子の関与がかなり正確に理解されるようになり、遺伝子をターゲットにした医療に注目が集まるようになってきている。
【０００３】
ＤＮＡに関しては、現在ＳＮＰＳ（ＳＩＮＧＬＥ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭＳの略で「１塩基多型」と一般に訳されており、遺伝子における１暗号（１塩基）の違いの総称である。）が注目されている。その理由としては、ＳＮＰＳの分類により、多くの疾患に対する罹患率や各個人の薬剤に対する効果や副作用をあらかじめ予測でき、さらには、地球上に親子兄弟といえども全く同じＳＮＰＳを持つ人間は絶対に存在しないことから個人の完全な特定ができると考えられているからである。
【０００４】
現在ＳＮＰＳを調べる方法としては、ＤＮＡの塩基配列を端から直接読んでいくシーケンシング（塩基配列の決定方法）が最も一般的に用いられている。そして、前記シーケンシングを行う方法としては、いくつかの報告があるが、もっとも一般的に行われているのは、ジデオキシシーケンス法（ＳＡＮＧＥＲ法）である。なお、シーケンシングは、このＳＡＮＧＥＲ法を含め何れの方法においても、分離能の高い変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動か、キャピラリー電気泳動によって１塩基の長さの違いを分離・識別する技術が基になって成り立っている。
【０００５】
そして、このようなシーケンシングによるＳＮＰＳの解析は、ターゲットとする遺伝子を単離した後、増幅・精製し、遺伝子の塩基配列決定法（装置）を用いて、目的遺伝子の塩基配列を読むことによって行うものであるため、実験に膨大な作業量と時間、さらには多大のランニングコストを要し、またその際に使用する塩基配列決定のための自動化装置は、非常に高価で、大きなスペースを占有し、高価な試薬を大量に必要とするという問題を有している。
【０００６】
こうした問題点は、アフィニティキャピラリー電気泳動によってＤＮＡを分離する方法を用いればほぼ解決できる。アフィニティキャピラリー電気泳動は、分子間親和力、とくに生態系における特異的親和力（ＤＮＡとそれを相補するＤＮＡ、ＤＮＡとそのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、酵素と基質、抗原と抗体の親和力等）を利用して分離に特異性を持たせるものであり、具体的には、キャピラリー管中の泳動溶液に、相互作用する二成分のうちの一方を添加しておき、他方の成分を電気泳動させると、試料混合物中で相互作用する分子種だけが移動速度に変化を生じることに着目して分析を行うものである（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
ここで、従来のアフィニティキャピラリー電気泳動では、塩基配列を特異的に認識するアフィニティ物質として、被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係にある１本鎖ＤＮＡを使うが、ポリヌクレオチドを成分とするＤＮＡは負電荷を有しているため、電圧を印加すると、このアフィニティ物質として用いているＤＮＡがキャピラリー外に流出してしまう。これを防ぐため、従来では、アフィニティのために用いるＤＮＡである、前記被検体ＤＮＡの塩基配列と相補的関係の１本鎖ＤＮＡを、キャピラリー内に固定化している。
【０００８】
そして、固定化の方法としては、ビニル化ＤＮＡをリニアポリマー化したポリアクリルアミドと共重合し、それをキャピラリー内壁に共有結合的に固定化するものが提案されている。これにより、前記被検体ＤＮＡは、アフィニティ物質である固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）と強く相互作用してキャピラリー内に吸着され、一方ノイズＤＮＡは該固定的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）に吸着されずキャピラリー外に流出され、この結果、前記被検体ＤＮＡを検出することが可能となる（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
しかしながら、この方法では、アフィニティのために用いるＤＮＡ（以下：アフィニティＤＮＡ）がキャピラリー内壁にしか固定化できないので、アフィニティＤＮＡと試料ＤＮＡとの相互作用が壁面近傍に限られ、測定が難しく、且つ測定精度が悪くなるという問題がある。
【００１０】
そこで、本出願人は、アフィニティＤＮＡと試料との相互作用が壁面近傍に限られないように、該アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法を開発し、それぞれに電極を配置した第１容器と第２容器間を、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管で連絡し、次いで、このキャピラリー管の緩衝液の中に、該ＤＮＡ試料に含まれる異常ＤＮＡに水素結合可能な塩基配列を結合したリニアポリマーからなる分離用ＤＮＡコンジュゲートを充填した後、続いて被検体であるＤＮＡ試料を充填し、その後、両電極間に電圧を印加して、キャピラリー管内の被検体ＤＮＡ試料を電気泳動させることで、該ＤＮＡ試料を分離する遺伝子診断装置と遺伝子診断方法を提案している（例えば、特許文献２参照）。
【００１１】
以下、アフィニティＤＮＡをキャピラリー内で擬似的に固定する方法について説明すると、ＤＮＡは二本鎖を形成するものと一本鎖を形成するものと存在するが、ＤＮＡのもつＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ４つの塩基は互いにＡとＴ、ＧとＣが結合しペアを形成する性質を有しており、ＤＮＡの二本鎖においてもＡＴ，ＧＣで対をなしている。従って、一方のＤＮＡがＡＴＣＧＣＧＴと配列されている場合、他方のＤＮＡはＴＡＧＣＧＣＡという塩基配列をもっている。
【００１２】
ＤＮＡ試料を分離する分離用ＤＮＡコンジュゲートは、前述したようなＤＮＡの相補的関係を利用するために、該分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分に、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡと相補的関係をもつＤＮＡ配列を与えている。例えば、ＤＮＡ試料の異常ＤＮＡのＤＮＡ配列がＡＴＣＧＣＧＴを含み、正常ＤＮＡがＡＴＣＡＣＧＴを含む場合、下線で示した部分で異常ＤＮＡと正常ＤＮＡの塩基が異なっている。このとき、分離用ＤＮＡコンジュゲートのＤＮＡ部分の配列をＴＡＧＣＧＣＡとすると、正常ＤＮＡは下線部においてＤＮＡコンジュゲートと相補的ではなくなる。これにより、全体の結合力は異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより１塩基分大きくなり、電気泳動時に異常ＤＮＡの方が正常ＤＮＡより遅延して泳動される。
【００１３】
ＤＮＡ試料は血液などから、細胞を破壊してＤＮＡを抽出し、ＰＣＲなどによって目的のＤＮＡ配列を含む部分を増幅する。このとき、所定の塩基数にして増幅すると相補的配列を持つＤＮＡコンジュゲートの塩基数も決定できる。
【００１４】
前述した方法によれば、負に帯電した分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを、電気泳動させる際に、アフィニティＤＮＡと被ＤＮＡ検体との相互作用が壁面近傍に限られないように擬似的に固定し、そのＤＮＡ試料の移動速度差から、該正常ＤＮＡと異常ＤＮＡとを分離することができ、この結果、ＳＮＰＳの遺伝子異常を短時間、且つ簡単、正確に判別することが可能になる。
【００１５】
しかし、前述した特許文献２の遺伝子診断装置と診断方法においては、リニアポリマーとＤＮＡ結合制御剤とを含む緩衝液を充たしたキャピラリー管に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料とを充填する必要がある。このように、キャピラリー管１本１本に、分離用ＤＮＡコンジュゲートとＤＮＡ試料を充填するのは面倒な作業であるが、この問題に対しては、特許文献３，４に記載されているように、プラットホームであるプレートに微細な流路を形成し、該プレートの回転速度を変化させることで、該回転から生じる向心力を変化させて試料を移動させるという方法が提案されている。
【００１６】
ここまでで説明した方法により、ＤＮＡ試料を分離し、流路と相対的に移動するようにした光学検出部が前記ＤＮＡ試料の蛍光度を検出することで、ＳＮＰＳの有無を判定することができる。
特に、多数の流路を一つのプレート上に形成し、効率よく測定を行なう場合、隣接する流路やプレートの端面など隣接するプレート形状により検出する信号にノイズが含まれるという問題がある。
【００１７】
この隣接する形状によりノイズが発生する問題を解決するために、特許文献５に示すような技術が提案されている。これは、スリットから出てくる光を分光することによってノイズを減らすことが出来る。
【特許文献１】特開平７−３１１１９８号公報
【特許文献２】特開２００２−３４０８５９号公報
【特許文献３】特表２０００−５１３８１３号公報
【特許文献４】特表２００１−５２３３４１号公報
【特許文献５】特開２００２−１９５９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、特許文献３、４に記載されているような複雑な形状がプレート上に形成されている構成では、隣接する形状に蛍光を発するサンプルを溜めておくタンクの役割をする形状や蛍光を発する液体が流れる流路が存在する可能性がある。なので、蛍光を分光によって検出する方法では隣接する形状から発せられる蛍光を検出してしまいノイズとなってしまうという課題を有していた。
【００１９】
そこで、本発明は、前記従来の課題を解決するもので、流路を光を用いて検出する際にプレート上の隣接形状の影響を受けないとした生体サンプル判別用プレートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、遮光性材料からなるプレート基板に形成された、蓋部で覆われた隣接する流路のうち一方の流路に照射された励起光をもとに前記流路に充填された生体サンプルが発する戻り光を測定し前記生体サンプルを判別する装置に使用される、前記流路が形成された生体サンプル判別用プレートにおいて、
前記隣接する流路のうち第１の流路を覆う第１蓋部が入射光と戻り光とを透過する部材で形成されてなり、前記隣接する流路のうち第２の流路を覆う第２蓋部が入射光と戻り光とを遮光する部材で形成されてなる、ことを特徴とする。
【００２１】
さらに、本発明は、前記第１蓋部と前記第２蓋部とが一体に形成されてなる、ことを特徴とする。
【００２２】
さらに、本発明は、前記第１の流路の流路断面積が前記第２の流路の流路断面積より小さい、ことを特徴とする。
【００２３】
さらに、本発明は、前記第２蓋部が表面に遮光性フィルムを付着されてなる、ことを特徴とする。
【００２４】
さらに、本発明は、前記第２蓋部と前記プレート基板とが遮光材を含む接着剤により接着されてなる、ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の生体サンプル判別用プレートによれば、隣接する流路から発生される光の乱反射を防ぐことにより、戻り光検出時のベースラインノイズを抑え、精度の良い検出を行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
図１は、本発明の実施例１における蛍光分析装置の構成例を示した図である。
生体サンプル判別用プレート１には微細な流路２が形成されている。流路２には予め蛍光標識された試料を含む液体が充填されており、光源４より励起光６が照射されることにより、試料が蛍光を発する。
【００２７】
受光側では、試料が発した蛍光７を受光素子５で検出する。生体サンプル判別用プレート１と受光素子５との間には、生体サンプル判別用プレート１の表面で反射した励起光の成分をカットするための光学フィルタ３が配置されている。
【００２８】
また、光源４は生体サンプル判別用プレート１と相対的に移動可能であり、流路２をなぞるように、励起光のスポットを移動させる。これにより、流路２上の任意位置の蛍光度を検出することができる。
【００２９】
次に図２を用いて生体サンプル判別用プレート１の詳細な構造について説明する。
【００３０】
図２は生体サンプル判別用プレート１の基板２１の平面図である。生体サンプル判別用プレートの基板２１はアクリルなどで光を透過しない色を発する材料で形成されており、保持用穴２２を使って分析装置に保持される。
【００３１】
図３は試料の液体や、コンジュゲートは注入口３３から注入され、液だめ２３に一旦保持され、その後、流路２５に充填される。充填された後電圧を印加し電気泳動を行い、流路２５の蛍光を検出する。
【００３２】
図３は生体サンプル判別用プレート１の上面図である。基板２１の上の、光で検出を行なう流路２５の上には入射光と戻り光とを透過する透明蓋材３１、それ以外の部分には入射光と戻り光とを遮光する遮光材入り接着剤４２を介して入射光と戻り光とを遮光する遮光材入り蓋材３２が貼り付けられる。
【００３３】
図４は生体サンプル判別用プレート１の流路２５と液だめ２３を含む断面図である。生体サンプル判別用プレート２１には流路２５、液だめ２３が形成されている。透明蓋材３１は励起光４１を透過させる材料でできており、流路２５を覆うように貼り付けられている。また、遮光材入り蓋材３２は流路２５以外の部分に遮光材４２が貼り付けられている。
【００３４】
ここで、遮光材４２が貼り付けられているため、遮光材入り蓋材３２は光を通す材料でも、液だめ２３に光が届くことはない。
【００３５】
また、遮光材４２の部分を遮光材入りの接着剤とすることで、遮光材入り蓋材と生体サンプル判別用プレート２１を接着することが出来る。
また、フィルムなどに遮光材４２を印刷する等で付着させ（遮光性フィルム）、生体サンプル判別用プレート２１と接合することで、透明蓋材３１と遮光材入り蓋材３２を一つの部材で構成することが出来る。
【００３６】
励起光４１は流路２５を照射し、充填された液体試料に含まれる蛍光標識が蛍光を発生させる。ここで、遮光材入り蓋材３２、生体サンプル判別用プレート２１、遮光材４２によって生体サンプル判別用プレート内に迷光が発生せず、隣接する液だめ２３から蛍光は発生しない。
以上のように、本実施例１においては遮光材入り蓋材３２により光が乱反射するのを防ぐことができ、生体サンプル判別用プレート内の隣接する要素の影響を受けず、精度の良い分析を行なうことが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明にかかる生体サンプル測定用プレートは、流路に隣接する形状により発生する光の乱反射を防ぐことにより、検出時のベースラインノイズを抑えることができるため、ＳＮＰＳ解析装置などの用途にも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の実施例１における蛍光分析装置の構成図
【図２】本発明の実施例１における生体サンプル判別用プレート基板の平面図
【図３】本発明の実施例１における生体サンプル判別用プレートの上面図
【図４】本発明の実施例１における生体サンプル判別用プレートの断面図
【符号の説明】
【００３９】
１  生体サンプル判別用プレート
２  流路
３  光学フィルタ
４  光源
５  受光素子
６  励起光
７  蛍光
２１  基板
２２  保持用穴
２３  液だめ
２５  流路
３１  透明蓋材
３２  遮光材入り蓋材
３３  注入口
４１  励起光
４２  遮光材入り接着剤
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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