(57)【要約】【課題】  蛍光検出器および細胞生死判定試薬を特に使用せずに生細胞と死細胞との判別をすることができるフローサイトメータを提供することを目的とする。【解決手段】  第１の散乱光の測定データと第２の散乱光の測定データから相関図を作成する相関図作成手段８と、相関図間の差分情報を算出する差分情報算出手段９と、差分情報を閾値と比較することによって、差分情報から大幅増加領域と大幅減少領域とを抽出する閾値比較手段１５と、大幅増加領域と大幅減少領域とを分画する境界線を作成する境界線作成手段１６と、境界線を相関図に重畳することによって相関図を分画し、相関図において生死細胞領域の設定を行う境界線重畳処理手段１７と、生死細胞領域に含まれる細胞の測定データを抜粋する測定データ抜粋手段１８、とを備えたことを特徴とするフローサイトメータ１である。【選択図】      図１
2006230333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、第１の散乱光を検出する第１の散乱光検出器と、第２の散乱光を検出する第２の散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器とを有し、フローサイトメトリの原理に基づいて、細胞からの散乱光と蛍光を検出するフローサイトメータであって、
前記第１の散乱光の測定データと前記第２の散乱光の測定データを記憶手段から取得して相関図を作成する相関図作成手段と、
前記相関図作成手段によって作成された２つ以上の前記相関図間の密度の差分情報を算出する差分情報算出手段と、
前記差分情報を閾値と比較することによって、前記差分情報から密度の増加領域と密度の減少領域とを抽出する閾値比較手段と、
前記増加領域と前記減少領域とを分画する境界線を作成する境界線作成手段と、
前記境界線を前記相関図に重畳することによって前記相関図を分画し、前記相関図において前記増加領域に対応する死細胞領域と前記減少領域に対応する生細胞領域の少なくともいずれか１つの領域の設定を行う境界線重畳処理手段と、
前記生細胞領域と前記死細胞領域の少なくともいずれか１つの領域に含まれる細胞の測定データを抜粋する測定データ抜粋手段、
とを備えたことを特徴とするフローサイトメータ。
【請求項２】
前記測定データ抜粋手段により抜粋される細胞の測定データは、蛍光の測定データであることを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
【請求項３】
前記第１の散乱光および前記第２の散乱光は、前方散乱光および側方散乱光であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のフローサイトメータ。
【請求項４】
前記相関図は、二次元散布図であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のフローサイトメータ。
【請求項５】
少なくとも、第１の散乱光を検出する第１の散乱光検出器と、第２の散乱光を検出する第２の散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器とを有し、フローサイトメトリの原理に基づいて、前記細胞からの散乱光と蛍光を検出するフローサイトメータを用いた細胞の解析方法であって、
１回目の測定に基づく前記第１の散乱光の測定データと前記第２の散乱光の測定データを記憶手段から取得して第１の相関図を作成するステップと、
２回目の測定に基づく前記第１の散乱光の測定データと前記第２の散乱光の測定データを記憶手段から取得して第２の相関図を作成するステップと、
前記第１の相関図と前記第２の相関図間の密度の差分情報を算出するステップと、
前記差分情報を閾値と比較することによって、前記差分情報から密度の増加領域と密度の減少領域とを抽出するステップと、
前記増加領域と前記減少領域とを分画する境界線を作成するステップと、
前記境界線を前記相関図に重畳することによって前記相関図を分画し、前記相関図において前記増加領域に対応する死細胞領域と前記減少領域に対応する生細胞領域の少なくともいずれか１つの領域の設定を行うステップと、
前記生細胞領域と前記死細胞領域の少なくともいずれか１つの領域に含まれる細胞の測定データを抜粋するステップと、
を含むことを特徴とするフローサイトメータを用いた細胞の解析方法。
【請求項６】
前記測定データ抜粋手段により抜粋される細胞の測定データは、蛍光の測定データであることを特徴とする請求項５に記載のフローサイトメータを用いた細胞の解析方法。
【請求項７】
前記第１の散乱光および前記第２の散乱光は、前方散乱光および側方散乱光であることを特徴とする請求項５または請求項６に記載のフローサイトメータを用いた細胞の解析方法。
【請求項８】
前記相関図は、二次元散布図であることを特徴とする請求項５ないし請求項７のいずれか１項に記載のフローサイトメータを用いた細胞の解析方法。
【請求項９】
前記蛍光は前記細胞のマーカに特異的な抗体と、蛍光体とを含む複合体からの蛍光であり、
前記抗体と前記蛍光体の組み合わせを複数用いて、
前記蛍光の測定は、複数の前記マーカに対応する複数の前記蛍光を、複数の前記蛍光検出器を用いて同時に測定するものであり、
前記細胞における発現量が少ない前記マーカを、分光干渉が平均で最も少ない前記蛍光検出器に対応する前記蛍光体で標識した前記抗体を用いて計測すること
を特徴とする請求項５ないし請求項８のいずれか１項に記載のフローサイトメータを用いた細胞の解析方法。
【請求項１０】
少なくとも、第１の散乱光を検出する第１の散乱光検出器と、第２の散乱光を検出する第２の散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器と、コンピュータとを有し、フローサイトメトリの原理に基づいて、前記細胞からの散乱光と蛍光を検出するフローサイトメータによって測定された測定データに基づいて、細胞の解析を行うプログラムであって、前記コンピュータを、
前記第１の散乱光の測定データと前記第２の散乱光の測定データとを記憶手段から読み出して相関図を作成する相関図作成手段と、
前記相関図作成手段によって作成された２つ以上の前記相関図間の密度の差分情報を算出する差分情報算出手段と、
前記差分情報を閾値と比較することによって、前記差分情報から密度の増加領域と密度の減少領域とを抽出する閾値比較手段と、
前記増加領域と前記減少領域とを分画する境界線を作成する境界線作成手段と、
前記境界線を前記相関図に重畳することによって前記相関図を分画し、前記相関図において前記増加領域に対応する死細胞領域と前記減少領域に対応する生細胞領域の少なくともいずれか１つの領域の設定を行う境界線重畳処理手段と、
前記生細胞領域と前記死細胞領域の少なくともいずれか１つの領域に含まれる細胞の測定データを抜粋する測定データ抜粋手段、
として機能させることを特徴とする細胞解析プログラム。
【請求項１１】
前記測定データ抜粋手段により抜粋される細胞の測定データは、蛍光の測定データであることを特徴とする請求項１０に記載の細胞解析プログラム。
【請求項１２】
前記第１の散乱光および前記第２の散乱光は、前方散乱光および側方散乱光であることを特徴とする請求項１０または請求項１１に記載の細胞解析プログラム。
【請求項１３】
前記相関図は、二次元散布図であることを特徴とする請求項１０ないし請求項１２のいずれか１項に記載の細胞解析プログラム。
【請求項１４】
請求項２ないし請求項４のいずれか１項に記載のフローサイトメータにおいて、当該フローサイトメータが備える蛍光検出器の感度設定方法であって、
前記細胞は、蛍光標識された非特異的抗体により染色されてなり、
前記測定データ抜粋手段により抜粋される生細胞領域に含まれる前記細胞の蛍光データに基づいて行うことを特徴とする蛍光検出器の感度設定方法。
【請求項１５】
請求項２ないし請求項４のいずれか１項に記載のフローサイトメータにおいて、当該フローサイトメータを用いた陽性率判定法における基準ゲートの設定方法であって、
前記細胞は、蛍光標識された非特異的抗体により染色されてなり、
前記測定データ抜粋手段により抜粋される生細胞領域に含まれる前記細胞の蛍光データに基づいて行うことを特徴とする陽性率判定法における基準ゲートの設定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の生死判別を行うフローサイトメータ、細胞の生死判別方法を含む細胞の解析方法および細胞生死判別プログラムを含む細胞解析プログラム等に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己複製能と多種類の細胞、組織への分化能（多分化能）を有する未分化な細胞であり、再生医療における３要素（幹細胞、足場材料、分化誘導因子）のうち最も重要な原料である。幹細胞は、発生段階の胚組織から作出される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等と、成体から分離される成体幹細胞とに大別される。
成体幹細胞は、患者本人から採取し、必要な細胞に分化させた後、本人に移植して治療を行ういわゆる自家移植型の再生医療に適用可能であり、倫理的制約の少ない幹細胞源として注目されている。成体幹細胞のうち、間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）は、骨髄等の中にわずかに存在する接着性の幹細胞である。また、ＭＳＣは、骨、軟骨、脂肪、筋、腱、骨髄間質等、主に中胚葉系の様々な細胞、組織へ分化誘導できることが明らかにされ、応用範囲の広い成体幹細胞として注目されている。
【０００３】
再生医療に使用されるこれらの幹細胞は、患者の安全性確保のために、適切な品質管理がなされている。幹細胞の品質評価には、フローサイトメトリが広く採用されている。フローサイトメトリは、蛍光標識または未標識の細胞等を、大きさ、光散乱様式、蛍光等の因子について定量的に解析する方法である。
【０００４】
フローサイトメトリにより細胞表面マーカを解析する場合には、蛍光標識されてかつ細胞表面マーカに特異的な抗体を用いて細胞試料を染色し、蛍光検出器を備えたフローサイトメータを使用して解析する。
フローサイトメトリにより複数の細胞表面マーカを同時に解析する場合には、細胞試料を異なる蛍光波長を有する色素で標識した複数の抗体を用いて多重染色し、多色の蛍光検出器を備えたマルチカラーフローサイトメータを使用して解析する。多色同時解析に使用可能なマルチカラーフローサイトメータとしては、例えば、ベックマンコールター社のエピックスアルトラ型タイプ１や、同社のＦＣ５００型等がある。両者とも細胞の大きさの指標となる前方散乱光、細胞の密度の指標となる側方散乱光の検出器を備え、さらに、前者は４波長、後者は５波長の蛍光検出器を有する。
【０００５】
フローサイトメトリにより複数の細胞表面マーカを同時に解析する場合として、例えば、ＭＳＣ等の成体幹細胞の品質評価を行う場合を挙げることができる。ＭＳＣ等の成体幹細胞については研究途上の段階であって、細胞に特異的な細胞表面マーカが未知である場合が多い。また、試料の均一性が必ずしも保証されていないため、試料の母集団中のある細胞について評価した結果が、他の細胞についても適用できるとは限らない。そのため、現状においては、複数の細胞表面マーカを組み合わせて品質評価指標とせざるを得ない。例えば、ＭＳＣを販売するＣａｍｂｒｅｘ社は、ＭＳＣが発現する陽性マーカとして、ＣＤ１０５，ＣＤ１６６，ＣＤ２９およびＣＤ４４の複数の細胞表面マーカを報告し、一方で、ＭＳＣが発現しない陰性マーカとして、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１４の複数の細胞表面マーカを報告している。ＭＳＣの品質評価を行う際には、これらの細胞表面マーカを組み合わせて測定し、品質評価指標とすることができる。
ただし、このＭＳＣのように、試料の均一性が必ずしも保証されておらず、かつ、複数の細胞表面マーカを組み合わせて品質評価指標とするときには、単に複数の細胞表面マーカを測定するだけでは充分な品質評価を行うことができない。
そこで、細胞の品質評価の精度を高めるためには、個々の細胞ごとに同時に測定する細胞表面マーカ数を多くし、さらに、細胞表面マーカ間の相関情報を評価する必要がある。
【０００６】
ところで、フローサイトメトリによって解析する幹細胞等の細胞試料には、調製過程または保管過程において不可避的に死細胞が混入する（一部の細胞が死滅する）ため、データの信頼性が低下する。この死細胞の混入によるデータの信頼性の低下は、当業者間では経験的に理解されているものであるが、本発明者は、実際に比較測定を行ってこの事実を確認している。その比較測定の内容は、後記する実施例における、比較例１と比較例２、あるいは、比較例３−１と比較例３−２との関係を参照することができるが、ここでの説明は省略する。なお、死細胞の混入によりデータの信頼性が低下する理由は、死細胞は、生細胞に比べ、蛍光標識抗体との非特異的結合が起こりやすいためと考えられている。
従って、フローサイトメトリによって幹細胞等の細胞試料を解析する場合には、まず、測定データにおいて生細胞と死細胞とを判別し、死細胞を含まない生細胞の集団だけを指定するゲーティングを行い、そのゲート内の細胞に限定して解析を行う場合がある。
【０００７】
従来、フローサイトメータを用いた細胞の生死判別方法として、ＰＩ（プロピジウムアイオダイド）や７−ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ）等の２本鎖ＤＮＡに特異的に結合するインタカレータである、細胞生死判別試薬により細胞を染色してその蛍光を測定し、蛍光強度が高い細胞を死細胞、蛍光強度が低い細胞を生細胞と判別する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。これらの細胞生死判別試薬の蛍光測定は、それぞれ、フローサイトメータに備わる蛍光検出器の１つを占有して行われる。
【非特許文献１】Schmid I et al., "Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry." Cytometry 13, 204-208 (1992).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ＰＩや７−ＡＡＤ等の細胞生死判別試薬の蛍光測定を行うと、多色の蛍光検出器のうち、少なくとも１つが占有されてしまい、測定可能項目数（測定可能細胞表面マーカ数）が減少するという問題がある。これは単に作業の効率低下をもたらすのみならず、個々の細胞について細胞表面マーカ間のデータの相関関係を示す情報量が低下し、データの信頼性が低下するという問題がある。さらに、これら細胞生死判別試薬は一般に細胞毒性があるため、特に、セルソータにより目的細胞を分取した後に、培養を継続する場合には、細胞活性に対する悪影響が避けられないという問題がある。
【０００９】
そこで本発明は、蛍光検出器および細胞生死判別試薬を特に使用せずに生細胞と死細胞との判別を行い、死細胞によるデータの信頼性低下を回避して、高精度な結果を提供することができるフローサイトメータを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、少なくとも、第１の散乱光を検出する第１の散乱光検出器と、第２の散乱光を検出する第２の散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器とを有し、フローサイトメトリの原理に基づいて、細胞からの散乱光と蛍光を検出するフローサイトメータであって、前記第１の散乱光の測定データと前記第２の散乱光の測定データを記憶手段から取得して相関図を作成する相関図作成手段と、前記相関図作成手段によって作成された２つ以上の前記相関図間の密度の差分情報を算出する差分情報算出手段と、前記差分情報を閾値と比較することによって、前記差分情報から密度の増加領域と密度の減少領域とを抽出する閾値比較手段と、前記増加領域と前記減少領域とを分画する境界線を作成する境界線作成手段と、前記境界線を前記相関図に重畳することによって前記相関図を分画し、前記相関図において前記増加領域に対応する死細胞領域と前記減少領域に対応する生細胞領域の少なくともいずれか１つの領域の設定を行う境界線重畳処理手段と、前記生細胞領域と前記死細胞領域の少なくもいずれか１つの領域に含まれる細胞の測定データを抜粋する測定データ抜粋手段、とを備えたことを特徴とするフローサイトメータである。
このような構成とすることにより、２種類の散乱光の測定データに基づいて細胞の生死判別をすることができる。つまり、蛍光検出器および細胞生死判別試薬を特に使用せずに生細胞と死細胞との判別を行い、死細胞によるデータの信頼性低下を回避して、高精度な結果を提供することができる。細胞の生死判別のために蛍光検出器を占有しないで済むので、その分を細胞表面マーカの測定に割り当てることができ、複数の細胞表面マーカが提示されている細胞の品質管理等を、より高い精度で行うことができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛍光検出器および細胞生死判別試薬を特に使用せずに生細胞と死細胞との判別を行い、死細胞によるデータの信頼性低下を回避して、高精度な結果を提供することができる。従って、蛍光検出器を有効に活用し、多数の細胞表面マーカを同時に解析することができ、細胞の品質管理を高精度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための最良の形態（以下「実施形態」と言う）について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。説明において、同一の構成要素には同一番号を付し、重複する説明は省略する。
【００１３】
図１は、本実施形態に係るフローサイトメータの全体構成を示すブロック図である。図１に示すように、フローサイトメータ１は、測定装置２と、測定データを記録するための測定データデータベース（測定データＤＢ）３と、測定データに基づいて細胞の生死判別を行う細胞生死判別装置４とを備えて構成される。
なお、本実施形態において、「フローサイトメータ」は、少なくともセルアナライザとしての機能（細胞分析機能）を有しているものを示す。従って、例えば、これに細胞の自動選別（ソーティング）機能を備えたセルソータも、「フローサイトメータ」に含まれる。
【００１４】
＜測定装置２＞
測定装置２は、フローサイトメトリの原理に従って細胞の散乱光や蛍光の信号強度を測定するために必要な作動部と、その制御部を有する。作動部は、例えば、細胞懸濁液とシース液の流路、水流生成手段、フローセル、レーザ光源、前方散乱光検出器５、側方散乱光検出器６、（複数の）蛍光検出器７等を含んで構成される。また、制御部は、入力装置（図示せず）を介した測定者による入力や記憶されているプログラムに従って、作動部の検出条件を変更したり、作動部の動作を制御したり、測定結果を測定データＤＢ３に記録したり等、種々の演算処理を行うものであって、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）とメモリによって実現することができる。
なお、本実施形態の測定装置２の構成および動作には、公知技術であるセルアナライザやセルソータの測定装置の構成および動作を適宜適用できる。
【００１５】
前方散乱光検出器５、側方散乱光検出器６および蛍光検出器７は、例えば、光を検出するためのフォトダイオードや光電子増倍管を含んで構成される。
前方散乱光検出器５は、レーザ光の直進方向に配設され、レーザ光が照射された細胞から散乱する光を検出する。前方散乱光検出器５により検出される前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ）の信号強度は、細胞の大きさを反映している。
側方散乱光検出器６は、レーザ光の直進方向に対して垂直に配設され、レーザ光が照射された細胞から散乱する光を検出する。側方散乱光検出器６により検出される側方散乱光（ＳＳ：Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ）の信号強度は、細胞の内部構造を反映している。
蛍光検出器７は、レーザ光が照射された細胞に含まれ、または、それに付着した蛍光性物質がレーザ光によって励起され、さらに脱励する際に放射する所定波長の光（蛍光)を検出する。蛍光検出器７は、通常、レーザ光の直進方向に対して垂直に配設される。また、使用される蛍光検出器７の数と、それぞれの蛍光検出器７が検出する蛍光波長は、測定者の必要なデータに応じて適宜選択される。本実施形態においては、複数の蛍光検出器７を用いて、異なる波長の蛍光強度を測定する場合を説明するが、それぞれの蛍光検出器７は、蛍光検出器７に備えられたフィルタにより検出波長を変えることができ、その他の構成や動作は変わらないため、重複する説明は省略する。
ここで、前方散乱光検出器５、側方散乱光検出器６および蛍光検出器７により、それぞれ検出されたＦＳ、ＳＳおよび蛍光の測定データは、測定データＤＢ３に記録される。
【００１６】
＜測定データＤＢ３＞
測定データＤＢ３は、測定装置２により測定されたＦＳ、ＳＳ、蛍光等の測定データを記憶するためのものであって、例えば、ハードディスクやメモリによって実現できる。
【００１７】
ここで、図２を参照して、測定データＤＢ３に記録される測定データの記録形式の一例を説明する。図２は、本実施形態における測定データの記録形式である測定データテーブルである。図２において、測定データテーブルは、細胞番号と、ＦＳとＳＳと、所定波長の蛍光強度（ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４およびＦＬ５）とを含むフィールドによって構成される。細胞番号は、照射レーザ光を通過した細胞順（測定した細胞順）に、例えば、１，２，３，４，…，ｎと、通し番号を付して個々の細胞データを識別するためのものである。この場合、ｎは、１回の測定で測定した総細胞数であって、測定条件に応じて変化する。ただし、前方散乱光の強度が所定水準以下のイベント(点）については、細胞以外の微粒子由来とみなして、あらかじめ測定対象から除外することが好ましい。
なお、本実施形態においては、１回目の測定と２回目の測定の測定データがそれぞれ記録された、測定データテーブル１００と測定データテーブル２００とが作成される（図１参照）。これらの２回の測定は、例えば、同一の細胞試料を異なる条件で測定したものであって、本実施形態においては、１回目の測定後、この細胞試料を４℃で２時間保管し、２回目の測定を行っている。
【００１８】
＜細胞生死判別装置４＞
図１を参照しての説明を続ける。細胞生死判別装置４は、測定データＤＢ３からＦＳとＳＳとを読み出し、これに基づいて細胞の生死判別を行うものである。細胞生死判別装置４は、二次元散布図作成手段８と、差分規格化細胞密度分布算出手段９と、生死細胞領域設定手段１４と、測定データ抜粋手段１８とを含んで構成される。
なお、特許請求の範囲に記載の「相関図作成手段」は、本実施形態においては二次元散布図作成手段８であり、特許請求の範囲に記載の「差分情報算出手段」は、本実施形態においては、差分規格化細胞密度分布算出手段９である。
なお、細胞生死判別装置４に含まれる各処理手段は、本実施形態において特徴的な部分については命令処理に必要な手段を記載したが、特に記載がなくとも各処理部は適宜演算手段としてＣＰＵ、記憶手段としてメモリを備えることができ、命令処理の際にはメモリにデータやプログラムを呼び出してＣＰＵにより演算することができるものとする。
【００１９】
[二次元散布図作成手段８]
二次元散布図作成手段８は、測定データＤＢ３からＦＳとＳＳとを読み出し、二次元散布図（２パラメータヒストグラム）を作成することができる。例えば、この二次元散布図は、ＦＳまたはＳＳを、それぞれ、ｙ軸パラメータまたはｘ軸パラメータ（いずれも真数スケール）のどちらかに対応させて作成される。二次元散布図作成手段８によって生成された二次元散布図（適宜「元の二次元散布図」と言う）は、差分規格化細胞密度分布算出手段９に出力されるとともに、本実施形態の処理過程の間は一時的にメモリやハードディスク等に記憶されている。
【００２０】
ここで、図３（ａ）を参照して、二次元散布図作成手段８によって作成された二次元散布図の一例を説明する。図３（ａ）は、本実施形態の二次元散布図作成手段８によって、測定データテーブル１００に記録されたＦＳとＳＳから作成された二次元散布図１１０であって、ＦＳをｙ軸パラメータ、ＳＳをｘ軸パラメータとしている。この二次元散布図において、二次元散布図上に表示される各点は個々の細胞を表しており、その座標（ｘ，ｙ）は、各細胞のＳＳとＦＳを表している。
また、図３（ｂ）は、本実施形態の二次元散布図作成手段８によって、測定データテーブル２００のＦＳとＳＳに基づいて作成された二次元散布図２１０である。
【００２１】
[差分規格化細胞密度分布算出手段９]
図１に示すように、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、２つの二次元散布図１１０，２１０間の差分情報として、差分規格化細胞密度分布を算出するものである。差分規格化細胞密度分布算出手段９は、まず、２つの二次元散布図１１０，２１０を比較可能にするために、それぞれの二次元散布図に関して規格化処理を行う。そして、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、２つの規格化処理された二次元散布図（以下「規格化細胞密度分布」と言う）の密度の差分を算出し、さらに、平滑化処理を行う。この平滑化処理を行った差分を、「差分規格化細胞密度分布」と言う。差分規格化細胞密度分布算出手段９で算出された差分規格化細胞密度分布は、生死細胞領域設定手段１４に出力される。
ここで、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、二次元散布図区画化手段１０と、規格化細胞密度分布算出手段１１と、差分算出手段１２と、平滑化手段１３とを備えている。
【００２２】
二次元散布図区画化手段１０は、元の二次元散布図１１０，２１０を区画化し各区画に新たに区画座標Ｓｋ（ｘ，ｙ）を付与するものである。例えば、元の二次元散布図１１０，２１０を、ｘ、ｙ方向ともに、６４分割した場合には、区画の総数はそれぞれ４０９６となる。ここで、「ｋ」は、同一の測定に対して同一の数値が適用され、異なる測定と区別される。本実施形態においては、ｋ＝１の場合には１回目の測定を意味し、ｋ＝２の場合には２回目の測定を意味する。ここで、二次元散布図区画化手段１０により区画化された二次元散布図は、規格化細胞密度分布算出手段１１に出力される。
【００２３】
規格化細胞密度分布算出手段１１は、区画化された二次元散布図において、各区画に含まれる細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ）を計数し、計数された細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ）をもとに、規格化細胞密度分布Ｄｋ（ｘ，ｙ）を算出するものである。
【００２４】
ここで、規格化細胞密度分布算出手段１１が、規格化細胞密度分布Ｄｋ（ｘ，ｙ）を算出する手順について説明する。
まず、規格化細胞密度分布算出手段１１は、各区画内に分布する細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ）の計数を行う。
そして、規格化細胞密度分布算出手段１１は、区画化された二次元散布図全体に分布する総細胞数Ｎｋｔの計数を行う。総細胞数Ｎｋｔは、例えば、各区画内に分布する細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ）を用いて、次の（１）式によって求めることができる。
【００２５】
Ｎｋｔ＝ΣＮｋ（ｘ，ｙ）  …（１）
【００２６】
なお、（１）式は、各区画内に分布する細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ）を、全ての区画（本実施形態においては、４０９６区画）について累計することを意味する。
さらに、規格化細胞密度分布算出手段１１は、規格化細胞密度分布Ｄｋ（ｘ，ｙ）を算出する。規格化細胞密度分布Ｄｋ（ｘ，ｙ）は、例えば、各区画内に分布する細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ）と、総細胞数Ｎｋｔとを用いて、次の（２）式によって求めることができる。
【００２７】
Ｄｋ（ｘ，ｙ）＝Ｎｋ（ｘ，ｙ）／Ｎｋｔ＊１０，０００  …（２）
【００２８】
この処理により、１回目の測定と２回目の測定で測定した総細胞数が異なっているとしても、Ｄ１（ｘ，ｙ）とＤ２（ｘ，ｙ）とを求めることによって、２つの元の二次元散布図１１０，２１０間の密度の比較が同一基準の下で可能となる。
なお、（２）式において、細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ）を総細胞数Ｎｋｔで除した後に、１０，０００を乗じているのは、フローサイトメータの測定において、１回の測定細胞数（総細胞数Ｎｋｔ）が１０，０００個であることが多いために採用している値であって、２つの二次元散布図１１０，２１０の規格化処理に統一して使用されれば、適切な値に変更できる。また、そのときには、後記する閾値も変更される。
ここで、規格化細胞密度分布算出手段１１により算出された規格化細胞密度分布は、差分算出手段１２に出力される。
【００２９】
差分算出手段１２は、２つの規格化細胞密度分布Ｄ１（ｘ，ｙ），Ｄ２（ｘ，ｙ）間の差分ｚｒ（ｘ，ｙ）を算出する。
【００３０】
ここで、差分規格化細胞密度分布算出手段９が、２つの規格化細胞密度分布Ｄ１（ｘ，ｙ），Ｄ２（ｘ，ｙ）間の差分ｚｒ（ｘ，ｙ）を算出する手順について説明する。
差分算出手段１２は、２つの規格化細胞密度分布Ｄ１（ｘ，ｙ），Ｄ２（ｘ，ｙ）の差分ｚｒ（ｘ，ｙ）を、次の（３）式によって算出する。
【００３１】
ｚｒ（ｘ，ｙ）＝Ｄ２（ｘ，ｙ）−Ｄ１（ｘ，ｙ）  …（３）
【００３２】
ここで、差分算出手段１２により算出された差分ｚｒ（ｘ，ｙ）は、平滑化手段１３に出力される。
【００３３】
平滑化手段１３は、差分ｚｒ（ｘ，ｙ）の平滑化処理をおこない、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を算出するものである。
【００３４】
ここで、平滑化手段１３が、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を算出する手順について説明する。
平滑化手段１３は、次の（４）式により２つの規格化細胞密度分布の差分ｚｒ（ｘ，ｙ）の平滑化を行うことによって、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を算出する。
【００３５】
【数１】
2006230333.tif 000003
【００３６】
（４）式においては、算出対象である区画の規格化細胞密度分布の差分ｚｒ（ｘ，ｙ）と、当該区画を包囲する各区画の規格化細胞密度分布の差分ｚｒ（ｘ，ｙ）値とをそれぞれ１０：１（周囲８区画の累計で１０：８）に重みを付け、加重平均することによって、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を算出している。このように差分ｚｒ（ｘ，ｙ）の平滑化を行い、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を算出することによって、測定時のノイズ等の影響を緩和することができる。差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）は各区画における細胞密度の推移を表す定量的パラメータであり、正値は細胞密度の増加、負値は減少を表している。
ここで、平滑化手段１３により算出された差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）は、生死細胞領域設定手段１４に出力される。
【００３７】
＜生死細胞領域設定手段１４＞
生死細胞領域設定手段１４は、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を利用して境界線を生成し、この境界線を元の二次元散布図１１０（または２１０)と重畳させることによって、元の二次元散布図１１０（または２１０)において生死細胞領域を設定するものである。この生死細胞領域設定手段１４によって設定された生死細胞領域は、測定データ抜粋手段１８に出力される。
なお、本実施形態において、「生死細胞領域」とは、生細胞領域と死細胞領域のうち、少なくとも１つの領域を示す。また、「生（または死）細胞領域」とは、未判別の細胞集団と比較して、相対的に生（または死）細胞の比率が高い領域を示す。
ここで、生死細胞領域設定手段１４は、閾値比較手段１５と、境界線作成手段１６と、境界線重畳処理手段１７とを備えている。
【００３８】
閾値比較手段１５は、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を、あらかじめ設定された閾値と比較する。あるいは、測定者により、入力装置（図示せず）を介して閾値を入力するようにしてもよい。そして、閾値比較手段１５は、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）が閾値を超える区画座標Ｓ’ｋ（ｘ，ｙ）を抽出する。
【００３９】
ここで、閾値比較手段１５が、閾値を超える区画座標Ｓ’ｋ（ｘ，ｙ）を抽出する手順を説明する。
閾値比較手段１５は、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）をあらかじめ設定された閾値（＋閾値および−閾値）と比較する。＋閾値を超えた場合には、その区画座標Ｓ’ｋ（ｘ，ｙ）を細胞密度大幅増加区画座標として抽出する。細胞密度大幅増加区画座標とは、２回の測定を比較して、細胞密度が大幅に増加した区画を意味している。また、−閾値を下回った(以下、絶対値で解釈して「超えた」と記す）場合には、その区画座標Ｓ’ｋ（ｘ，ｙ）を細胞密度大幅減少区画座標として抽出する。細胞密度大幅減少区画座標とは、２回の測定を比較して、細胞密度が大幅に減少した区画を意味している。
【００４０】
この手順は、図４および図５を参照して、視覚的に説明することができる。
図４は、区画座標をｘ−ｙ平面に展開し、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）をｚ軸パラメータとして、三次元ヒストグラムで表示したものである。図４において、三次元ヒストグラム中の濃色で表示される領域は、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）が閾値（本実施形態においては、±１０）を超えた領域を示している。なお、濃色で表示した領域のうち、領域ａは、  ｚ（ｘ，ｙ）＞＋１０  を満たす領域であり、１回目の測定に比べて２回目の測定において細胞密度が大幅に増加した領域（大幅増加領域）である。一方で、領域ｂは、  ｚ（ｘ，ｙ）＜−１０  を満たす領域であり、１回目の測定に比べて２回目の測定において細胞密度が大幅に減少した領域（大幅減少領域）である。
図５は、図４で示した濃色の領域を、ｘ−ｙ平面（区画座標）上に投影した図である。図５において、領域ａ’は、大幅増加領域が投影された区画座標を多く含む領域であり、領域ｂ’は、大幅減少領域が投影された区画座標を多く含む領域である。それぞれの区画座標は集中的に分布し、明瞭に分離していることが示される。
ここで、閾値比較手段１５により抽出された区画座標Ｓ’ｋ（ｘ，ｙ）は、境界線作成手段１６に出力される。
【００４１】
境界線作成手段１６は、両区画座標が集中的に分布する領域ａ’,領域ｂ’を、適切に分画する境界線を作成する。
【００４２】
ここで、図６を参照して、境界線作成手段１６が境界線を引くアルゴリズムの一例を説明する。図６は、境界線作成手段１６が境界線を引くアルゴリズムの一例を説明するための図である。図６において、細胞密度大幅増加区画座標と、細胞密度大幅減少区画座標の重心Ｏａ',Ｏｂ'を求め、この重心Ｏａ',Ｏｂ'を円の中心として、２つの隣接する相同の円を描き、その交点における接線を境界線としている。また、境界線を引く方法は、前記したものに限定されず、周知の境界線作成に関するアルゴリズムを適宜適用することができる。また、本実施形態においては、領域ａ’,ｂ’を直線によって分画しているが、必ずしも直線である必要はない。例えば、曲線であってもよいし、多角形や円のように閉じた（無端の）図形であってもよい。また、分画するための線（図形）は複数でもよく、３つ以上の領域（例えば、生細胞領域と死細胞領域と未判別領域）に分画してもよい。
ここで、境界線作成手段１６により作成された境界線情報（境界線に加え、重心Ｏａ',Ｏｂ'等の情報も適宜含む）は、境界線重畳処理手段１７に出力される。
【００４３】
境界線重畳処理手段１７は、境界線を元の二次元散布図１１０（または２１０）に重畳する処理を行い、元の二次元散布図１１０（または２１０）において、生細胞領域と死細胞領域とを設定する。
【００４４】
ここで、境界線重畳処理手段１７が、元の二次元散布図において、生細胞領域と死細胞領域とを設定する手順を説明する。
図７は、元の二次元散布図１１０に境界線情報（境界線に加え、重心Ｏａ',Ｏｂ'等の情報も適宜含む）が重畳された図である。図７に示すように、元の二次元散布図１１０は、重畳された境界線によって、大きく２つの領域に分画されている。
さらに、境界線重畳処理手段１７は、境界線により大きく２つに分画されたそれぞれの領域に関し、境界線と同時に重畳された重心Ｏａ'が含まれる領域Ａを死細胞領域と設定し、境界線と同時に重畳された重心Ｏｂ’が含まれる領域Ｂを生細胞領域と設定する。または、このとき、入力装置を介した測定者の入力により、生死細胞領域を設定してもよい。通常、境界線を境にして、ＦＳが大きくＳＳが小さい領域（図７において境界線の左上側）が生細胞領域、ＦＳが小さくＳＳが大きい領域（境界線の右下側）が死細胞領域である。
ここで、境界線重畳処理手段１７により設定された生細胞領域と死細胞領域は、測定データ抜粋手段１８に出力される（図１参照）。
【００４５】
＜測定データ抜粋手段１８＞
図１に示すように、測定データ抜粋手段１８は、生死細胞領域に含まれる、個々の細胞あるいは細胞集団の測定データを測定データＤＢ３から抜粋するものである。測定データ抜粋手段１８は、生死細胞領域に含まれる点の座標（ｘ，ｙ）を抽出し、その座標（ｘ，ｙ）、すなわち、ＳＳおよびＦＳをキーとして、対応する測定データテーブルから蛍光データ等を抜粋する処理を行う。
なお、測定データ抜粋手段１８が行う、測定データの抜粋作業は、従来のフローサイトメータに備えられたゲーティング手段を適用してもよい。
測定データ抜粋手段１８により抜粋された測定データは、例えば、図示しない１パラメータヒストグラム作成手段等の他の演算処理手段や、図示しない表示手段等に出力される。
【００４６】
以上、本実施形態のフローサイトメータ１の構成について説明したが、フローサイトメータ１の細胞生死判別装置４は、一般的なコンピュータにプログラムを実行させ、コンピュータ内の演算装置や記憶装置を動作させることにより実現される。
【００４７】
＜細胞の生死判別方法＞
次に、図８ないし図１０を参照して、本実施形態のフローサイトメータ１を用いて細胞の生死判別を行う方法（以下「密度差分法」と言う）について説明する。
【００４８】
図８は、密度差分法を実行する場合のフローサイトメータ１の全体動作を示すフローチャートである。
まず、フローサイトメータ１の測定装置２は、時刻１と、時刻１から所定時間経過後の時刻２における測定データを、それぞれ、測定データＤＢ３の測定データテーブル１００，２００に記録する（ステップＳ１０）。
そして、フローサイトメータ１の細胞生死判別装置４は、二次元散布図作成手段８によって、測定データテーブル１００，２００に記録されたＦＳとＳＳとを読み出し、二次元散布図１１０，２１０を作成する（ステップＳ２０）。
そして、フローサイトメータ１の細胞生死判別装置４は、差分規格化細胞密度分布算出手段９によって、ステップＳ２０で作成された二次元散布図１１０，２１０から、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)を算出する（ステップＳ３０）。
そして、フローサイトメータ１の細胞生死判別装置４は、生死細胞領域設定手段１４によって、ステップＳ３０で算出された差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)に基づいて、元の二次元散布図１１０（または２１０)に生死細胞領域を設定する（ステップＳ４０）。
そして、フローサイトメータ１の細胞生死判別装置４は、測定データ抜粋手段１８によって、ステップＳ４０で設定された生死細胞領域に含まれる個々の細胞あるいは細胞集団の測定データを測定データテーブル１００（または２００)から抜粋する（ステップＳ５０）。
以下、ステップＳ３０の差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)の算出処理と、ステップＳ４０の生死細胞領域の設定処理について詳細に説明する。
【００４９】
図９は、密度差分法を実行する場合の差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)の算出処理（ステップＳ３０）を詳細に説明するためのフローチャートである。
まず、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、二次元散布図区画化手段１０によって、ステップＳ２０で作成された二次元散布図１１０，２１０を、区画化する（ステップＳ３１）。
そして、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、規格化細胞密度分布算出手段１１によって、ステップＳ３１で区画化された２つの二次元散布図において、各区画に含まれる細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ)を計数する（ステップＳ３２）。
次に、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、規格化細胞密度分布算出手段１１によって、ステップＳ３２で計数した細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ)を全区画について累計し、二次元散布図の総細胞数Ｎｋｔを算出する（ステップＳ３３）。
さらに、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、規格化細胞密度分布算出手段１１によって、ステップＳ３２で算出した各区画に含まれる細胞数Ｎｋ（ｘ，ｙ)と、ステップＳ３３で算出した総細胞数Ｎｋｔとに基づいて、二次元散布図の規格化細胞密度分布Ｄｋ（ｘ，ｙ)を算出する（ステップＳ３４）。
そして、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、差分算出手段１２によって、ステップＳ３４で算出した規格化細胞密度分布Ｄｋ（ｘ，ｙ)の差分ｚｒ（ｘ，ｙ)を算出する（ステップＳ３５）。
そして、差分規格化細胞密度分布算出手段９は、平滑化手段１３によって、ステップＳ３５で算出した規格化細胞密度分布Ｄｋ（ｘ，ｙ)の差分ｚｒ（ｘ，ｙ)を平滑化し、差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)を算出する（ステップＳ３６）。
【００５０】
図１０は、密度差分法を実行する場合の生死細胞領域の設定処理（ステップＳ４０）を詳細に説明するためのフローチャートである。
まず、生死細胞領域設定手段１４は、閾値比較手段１５によって、ステップＳ３６で算出された差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)とあらかじめ設定された閾値とを比較し、閾値を超えた差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)の区画座標Ｓ’ｋ（ｘ，ｙ)を抽出する（ステップＳ４１）。
なお、このとき、前記したように、＋閾値を超えた場合には、細胞密度大幅増加区画座標として抽出し、−閾値を超えた場合には、細胞密度大幅減少区画座標として抽出する。
そして、生死細胞領域設定手段１４は、境界線作成手段１６によって、Ｓ４１で抽出された区画座標Ｓ’ｋ（ｘ，ｙ)に基づき、細胞密度大幅増加区画座標を多く含む領域と細胞密度大幅減少区画座標を多く含む領域とを適切に分割する境界線を作成する（ステップＳ４２）。
なお、このとき、前記したように、境界線作成の過程において、細胞密度大幅増加区画座標の重心と、細胞密度大幅減少区画座標の重心と、を利用している。
そして、生死細胞領域設定手段１４は、境界線重畳処理手段１７によって、ステップＳ４２で作成された境界線と、ステップＳ４２の過程で求められた細胞密度大幅増加区画座標の重心と、細胞密度大幅減少区画座標の重心と、を元の二次元散布図１１０（または２１０）に重畳する（ステップＳ４３）。
そして、生死細胞領域設定手段１４は、境界線重畳処理手段１７によって、ステップＳ４３で重畳された境界線を境にして、細胞密度大幅増加区画座標の重心を含む領域を死細胞領域と設定し、細胞密度大幅減少区画座標の重心を含む領域を生細胞領域と設定する。
【００５１】
以上によれば、本実施形態において、次のような効果を得ることができる。
同一の細胞試料を異なる条件で測定を行い、ＦＳとＳＳに基づいて作成された二次元散布図の差分情報を抽出し、生死細胞領域を設定することによって、細胞の生死判別を客観的かつ適切に行うことができる。従って、細胞の生死判別に蛍光試薬、蛍光試薬の反応のための操作、蛍光試薬を検出するための蛍光検出器７等を必要としない。さらに、蛍光試薬による他のチャンネルへの蛍光漏れ込みが起きず、その補正も必要ない、という特有の効果がある。
【００５２】
さらに、本実施形態によれば、再生医療、すなわち細胞が持つ自然の治癒力を活用して疾病や怪我の治療を行う医療技術において使用される、移植用の細胞や組織、ならびにその主要原料である幹細胞の品質管理を適切に行うことができる。より具体的な例としては、細胞生死判別試薬を用いることなく、また蛍光検出器７を占有することなくＭＳＣ等の幹細胞集団内の生細胞を判別することができる。従って、死細胞によるデータの信頼性低下を回避でき、高精度な結果を提供できる。このことにより、ＭＳＣ等の幹細胞の細胞表面マーカを適切かつ高効率、高信頼性に、しかも蛍光検出器７を割り当てることなく評価解析することができる。
さらに、細胞毒性を有する細胞生死判別試薬を使用せずに細胞の生死判別ができるため、生細胞をセルソータで分取した場合には培養を継続することができる。
【００５３】
なお、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、その技術思想のおよぶ範囲で種々の変更実施を行うことができる。
本実施形態においては、２回の測定を２時間の時間間隔をあけて行っているが、２回の測定方法は、必ずしも前記したものに限定されない。細胞分布の差は必ずしも本実施例のごとく２時間の待ち時間によってのみ生じるわけではなく、例えば、より短い時間や長い時間等、他の時間条件においても生じせしめることができる。通常、時間間隔が長い方が細胞分布の差が大きい傾向がある。また、本実施形態では２つのデータの取得の間は細胞試料を４℃の冷蔵庫に保管したが、他の温度条件に維持することも可能である。通常、細胞試料の保管温度は０℃以上４０℃未満が好ましく、温度が低い方が細胞分布の差が小さい傾向がある。ただし、試料が凍結するとＦＳ，ＳＳが一般の死細胞と異なる領域へ変化するため、０℃（凍結点）以下は好ましくない。
また、必ずしも１回目の測定に用いた細胞試料の残りを全て２回目の測定に用いる必要はない。１回目の測定に用いた細胞試料の残りを複数に分割し、一部をより厳しい保管条件に保管して２回目の測定に供し、別の一部は、より穏和な保管条件に保管して、セルソータによるソーティング等、他の目的に供してもよい。さらには、１回目の測定と２回目の測定によって生死細胞領域の設定（ゲーティング）のみを行い、３回目の測定において生細胞の蛍光データを抜粋し、解析することも可能である。この場合には、生細胞領域の細胞数が所定数になったときに測定を停止するプログラム制御を行うことによって、必要最小限の細胞の測定で十分な生細胞データが得られるという長所がある。
【００５４】
また、本実施形態においては、所定温度、所定時間の保管により細胞死を待って細胞分布の差を生じせしめたが、積極的に細胞を死亡させる工程を採用することも可能である。例えば、高温、高圧、低圧等の条件や、細胞活性を損なう各種薬品の添加等の方法があり、そのための専用の器具や装置を用いてもよい。その器具や装置はフローサイトメータ１装置と一体化されていてもよい。
細胞死のための装置をフローサイトメータ１に組み込み、見かけ上1回の測定のなかで、１回目の測定と、積極的に細胞を死亡させた２回目の測定を順次行い、全自動で生細胞に限定した解析を行う装置とすることもできる。
また、本実施形態では１回目と２回目の測定データから差分を求めたが、３回以上の連続した測定を行い、平均化や外挿等により、分布の変化をより高精度に求めることも可能である。
【００５５】
さらに、本発明の主なる技術的思想は、細胞から散乱する２種類の散乱光を測定することによって、蛍光検出器や細胞生死判別試薬を特に使用することなく細胞の生死判別を行うものであって、２つ以上の散乱光検出器によって、細胞から散乱する２種類の散乱光を測定できるものであれば、本発明の適用範囲は、個々の細胞を順次検出点へと動かすことによって測定するフローサイトメータだけに限定されない。
例えば、顕微鏡型の検出装置であるイメージサイトメータのように、細胞が収容された容器等を動かすことによって個々の細胞の散乱光を測定する装置に対しても適用される。また、レーザ光源や散乱光検出器を動かすことによって個々の細胞の散乱光を測定する装置に対しても適用される。さらには、これらの装置を用いた細胞の生死判別方法を含む細胞の解析方法、および、これらの装置が有するコンピュータを動作させる細胞生死判別プログラムを含む細胞解析プログラムに対しても適用される。
【実施例】
【００５６】
次に、本発明を用いて細胞の生死判別を行った発明例の効果について、本発明例とは別の技術により細胞の生死判別を行った比較例の効果と比較して、具体的に説明する。
なお、本実施例においては、比較例の技術として、７−ＡＡＤ染色によって細胞の生死判別を行っている。
ここでは、「発明例」は、本発明の要件を満たす場合に使用される「実施例」と同義である。
【００５７】
＜第１実施例＞
第１実施例では、非特異的抗体により細胞を染色した場合における発明例の効果を、比較例の効果と比較している。
【００５８】
細胞は、接着性の成体幹細胞であるヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用した。この細胞はＣａｍｂｒｅｘ社から購入し、同社推奨プロトコルに従って培養して使用した。添付の技術資料によると、購入した細胞はインフォームドコンセントを得て健康なヒトから採取された骨髄を原料とし、密度勾配遠心分離法と、プラスチック製培養容器表面への接着性に基づく選択培養により造血系細胞を除去し、２継代目に凍結保存したものである。
これを解凍し、同社から購入した培地（商品名ＭＳＣＧＭ、以下、培地）５ｍＬに分散し、遠心、上清除去後、細胞を２４ｍＬの培地に再分散し、その一部を使用して細胞数と生細胞率を計測した後、残りをＦａｌｃｏｎ社のＴ−７５型フラスコ（ポリスチレン製）２本に播種した。基本的な培養条件として、３７℃、炭酸ガス濃度５％を採用し、ウォータージャケット式炭酸ガスインキュベータ中で培養した。約８０％コンフルエントになるたびに継代を繰り返した。継代と継代の間において、３〜４日に１回の割合で培地交換を行った。
細胞の継代は、培地除去の後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を６ｍＬ注入し、約３分間３７℃でインキュベートし、容器に軽く振動を与えて細胞を剥離した。直ちに培地６ｍLを投入して反応を停止した。遠沈管に移して遠心分離、上清除去後、適量の培地に再分散させ、細胞数を計測後、次の世代の培養のための播種を行った。播種密度は概ね５，０００個／ｃｍ2とした。
【００５９】
細胞を測定用試料として使用する際には、継代操作の前半と同様の剥離、反応停止、上清除去操作を行った。その後、細胞をＰＢＳ５ｍＬに再分散し、遠心、上清除去、再分散の工程からなる洗浄操作を３回繰り返し、清浄な細胞を分散したＰＢＳ液（細胞濃度約１ｘ１０7個／ｍＬ）を得た。
【００６０】
細胞の染色は、蛍光標識された非特異的抗体（ＩｇＧ１−ＰＥ：マウスＩｇＧ１、ＰＥ標識、コールターイムノテック社）により細胞を直接染色した。
ここで、細胞の染色手順を示す。チューブに蛍光標識抗体（非特異的抗体）を２０μＬ分注後、前記細胞分散液１００μＬ（細胞数約１００万個）を分注し、４℃で４５分間インキュベートした。これに２ｍＬのＰＢＳを加え、分散、遠心、上清除去する洗浄工程を２回繰り返した後、５００μＬのＰＢＳに再分散することにより、細胞試料を調製した。
【００６１】
比較例の技術に基づく細胞の生死判別を行う際は、さらに、７−ＡＡＤによる染色を行った。すなわち、前記の手順で調製した細胞試料５００μＬに対し、コールターイムノテック社製７−ＡＡＤ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ溶液を１０μＬ添加し、冷暗所で１０分以上インキュベート後に測定を行った。
【００６２】
細胞試料の測定には、ベックマンコールター社のセルソータであるエピックスアルトラ型タイプ１をメーカの推奨条件に準拠した条件で使用した。このセルソータは、４８８ｎｍ、１５ｍＷのアルゴンイオンレーザを励起光源として用いＦＩＴＣ，ＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５による蛍光強度をそれぞれ５２５，５７５，６１０，６７５ｎｍのバンドパスフィルタを備えた蛍光検出器（以下、それぞれＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４チャンネルと記す）７で測定できる。また、前方散乱光検出器５と側方散乱光検出器６も備えている。
非特異的抗体に標識されたＰＥの検出は、ＦＬ２チャンネルで行い、検出された蛍光強度をＦＬ２と記載する。
７−ＡＡＤの検出は、ＦＬ４チャンネルで行い、検出された蛍光強度をＦＬ４と記載する。
従って、第１実施例において、使用した検出器は、ＦＳ，ＳＳ，ＦＬ２（ＰＥ用），ＦＬ４（７−ＡＡＤ用）である。
【００６３】
測定の前には、未染色処理の細胞を用いて、各蛍光検出器７の感度を調節した。すなわち、４桁の範囲（対数で−１から＋３）の蛍光強度を横軸とする１パラメータヒストグラムにおいて、未染色処理の細胞集団の９８％が、横軸の左側１／４の領域（対数で−１から０）に概ね収まるように設定した。
なお、特定の色素の蛍光が目的以外の蛍光検出器７に対して分光干渉を及ぼすことによる誤差を補償するため、補正マトリックスを用いて補正している。
また、ＦＳとＳＳが共に極めて低い細胞は、細胞の破壊断片（デブリス）とみなし、データ処理の対象から除外した。
【００６４】
ここで、図１１を参照して、比較例の技術である７−ＡＡＤ染色によって細胞の生死を判別する手順について説明する。図１１は、ＭＳＣを非特異的抗体（ＩｇＧ１−ＰＥ）と７−ＡＡＤとで染色し、セルソータを用いてＦＬ４チャンネルで測定した結果（すなわち、７−ＡＡＤに関する測定結果）を、１パラメータヒストグラムで表示したものである。なお、図１１において、横軸はＦＬ４で検出される蛍光強度（対数スケール）を、縦軸は、それぞれの蛍光強度における細胞累計を示す。
通常、７−ＡＡＤ染色に従って細胞の生死を判別する場合、７−ＡＡＤ添加後において染色されない細胞は生細胞であり、染色された細胞は死細胞を意味する。図１１においては、信号強度の低いピークが生細胞集団（図１１において、「Ａｌｉｖｅ」）、信号強度の高いピークが死細胞集団（図１１において、「Ｄｅａｄ」）である。ここで、比較例１は、図１１において、Ａｌｉｖｅ領域に含まれる細胞集団とし、比較例２は、図１１において、Ｄｅａｄ領域に含まれる細胞集団とした。
【００６５】
本実施例の評価方法として、陽性率判定法と、横軸方向にヒストグラムが位置する範囲の比較による方法とを用いた。陽性率判定法は、基準ゲートを作成し、基準ゲート内の細胞含有率の変化を比較する方法である。両者ともに、フローサイトメトリにおいては、一般的な比較方法であるので、詳細な説明は省略する。
【００６６】
比較例１は、本発明例とは別の技術である７−ＡＡＤ染色に従って判別した生細胞集団であり、比較例２は、死細胞集団である。
発明例１は、本発明によって判別した生細胞集団であり、発明例２は、死細胞集団である。なお、第１実施例における本発明による細胞の生死判別は、１回目の測定後、細胞試料を４℃で２時間保管後に２回目の測定を行った測定データに基づいている。
【００６７】
［比較例１］
図１２は、比較例１における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。図１２に示すように、陽性率判定法のために、比較例１のヒストグラムにおいてゲートＣを設定した。ゲートＣは、対数で約０．３以上の範囲に、その範囲に含まれる細胞の割合（陽性率）が２．０％となるように設定している。また、図１２に示すように、対数で約−１〜０．５の低蛍光強度範囲にやや広いピークの裾が観測された。
【００６８】
［比較例２］
図１３は、比較例２における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。比較例２において、比較例１で設定したゲートＣに含まれる細胞の割合（陽性率）は、９．５％であった。また、図１３に示すように、対数で約０付近の蛍光強度範囲にピークが観測され、また対数で約１以上、２．６付近にも信号がみられた。
【００６９】
［発明例１］
図１４は、発明例１における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。図１４に示すように、対数で約−１〜０．５の低蛍光強度範囲にやや広いピークの裾が観測された。図１４に示すように、陽性率判定法のために、発明例１のヒストグラムにおいてゲートＣを設定した。ゲートＣは、対数で約０．３以上の範囲に、その範囲に含まれる細胞の割合（陽性率）が２．０％となるように設定した。
【００７０】
［発明例２］
図１５は、発明例２における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。発明例２において、発明例１で設定したゲートＣに含まれる細胞の割合（陽性率）は、５．９％であった。図１５に示すように、対数で約０付近の蛍光強度範囲にピークが観測され、また対数で約１以上、２．６付近にも信号がみられた。
【００７１】
比較例１と発明例１、比較例２と発明例２とは、それぞれ同じ傾向を示す一方で、比較例１と発明例２、比較例２と発明例１とは、異なる傾向であることが示された。すなわち、第１実施例によれば、本発明による細胞生死判別は、蛍光検出器７を使用することなしに、本発明例とは別の技術である７−ＡＡＤ染色による細胞生死判別と、同等の効果を奏することが示された。
なお、第１実施例で示した、非特異的抗体により染色した細胞試料は、通常、特異的抗体により染色した細胞の測定の際に、ネガティブコントロールとして使用される。例えば、死細胞が混入した状態でネガティブコントロールを用いて感度設定を行うと、蛍光強度が高い位置に境界点を設定することになるため、結果として未知試料の陽性率が見かけ上低下してしまう。
従って、本発明により判別した生細胞をネガティブコントロールとして使用することで、特異的抗体により染色した細胞の測定をより適切に行うことができる。
【００７２】
＜第２実施例＞
第２実施例では、特異的抗体により細胞を染色した場合における発明例の効果を、比較例の効果と比較している。
なお、第２実施例の測定方法は、基本的に第１実施例と同様であるため、重複する説明は省略し、第２実施例に特徴的な部分についてのみ記載する。
【００７３】
細胞は、第１実施例と同様、ヒトＭＳＣを使用した。
細胞の染色は、蛍光標識された特異的抗体（ＣＤ１６６−ＦＩＴＣ：抗ヒトＣＤ１６６マウスモノクローナル抗体、ＦＩＴＣ標識、ＲＤＩ社）により細胞を直接染色した。前記したように、ＣＤ１６６は、ＭＳＣで発現されていることが報告されている特異的抗体である。
また、ネガティブコントロールとして使用する細胞に対しては、蛍光標識された非特異的抗体（ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ：マウスＩｇＧ１、ＦＩＴＣ標識、コールターイムノテック社）により細胞を直接染色した。
ここで、細胞の染色手順を示す。チューブに蛍光標識抗体（特異的抗体２μＬ、または、非特異的抗体２０μＬ）を分注後、前記細胞分散液１００μＬ（細胞数約１００万個）を分注し、４℃で４５分間インキュベートした。これに２ｍＬのＰＢＳを加え、分散、遠心、上清除去する洗浄工程を２回繰り返した後、５００μＬのＰＢＳに再分散することにより、細胞試料を調製した。
【００７４】
細胞試料の測定には、第１実施例と同様に、ベックマンコールター社のセルソータであるエピックスアルトラ型タイプ１をメーカの推奨条件に準拠した条件で使用した。
特異的抗体および非特異的抗体に標識されたＦＩＴＣの検出は、ＦＬ１チャンネルで行い、検出された蛍光強度をＦＬ１と記載する。
７−ＡＡＤの検出は、ＦＬ４チャンネルで行い、検出された蛍光強度をＦＬ４と記載する。
従って、第２実施例において、使用した検出器は、ＦＳ，ＳＳ，ＦＬ１（ＦＩＴＣ用），ＦＬ４（７−ＡＡＤ用）である。
【００７５】
測定の前には、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣを用いて第１実施例と同様に染色したネガティブコントロールを用いて、各蛍光検出器７の感度を調節した。すなわち、４桁の範囲（対数で−１から＋３）の蛍光強度を横軸とする１パラメータヒストグラムにおいて、ネガティブコントロールの細胞集団の９８％が、横軸の左側１／４の領域（対数で−１から０）に概ね収まるように設定した。
また、第２実施例においては、陽性率判定法のために、ネガティブコントロールのヒストグラムにおいて陽性率が２．０％となるように、ゲートＡを設定した。より詳細な説明は後記する［比較例３−１］、［比較例３−２］、［発明例３］の項目において、適宜記載している。
【００７６】
比較例３−１は、本発明例とは別の技術である７−ＡＡＤ染色に従って判別した生細胞集団であり、比較例３−２は、未判別細胞集団である。
発明例３は、本発明によって判別した生細胞集団である。
【００７７】
［比較例３−１］
図１６は、比較例３−１における特異的抗体の染色を示す、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）のヒストグラムである。比較例３−１のネガティブコントロールとして、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣで細胞を染色し、７−ＡＡＤ染色により判別した生細胞集団を用いている。ゲートＡは、このネガティブコントロールを使用して測定した際に、対数で約０．３以上の範囲に、その範囲に含まれる細胞の割合（陽性率）が２．０％となるように設定されたものである。
比較例３−１において、ゲートＡに含まれる細胞の割合（陽性率）は８９．９％であった。すなわち、細胞試料の約９割がＣＤ１６６陽性と判別された。 また、図１６に示すように、対数で約０〜１．４の蛍光強度範囲にピークが観測された。
【００７８】
［比較例３−２］
図１７は、比較例３−２における特異的抗体の染色を示す、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）のヒストグラムである。比較例３−２のネガティブコントロールとして、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣで細胞を染色し、生死未判別の細胞集団を用いている。ゲートＡは、このネガティブコントロールを使用して測定した際に、対数で約０．３以上の範囲に、その範囲に含まれる細胞の割合（陽性率）が２．０％となるように設定されたものである。
比較例３−２において、ゲートＡに含まれる細胞の割合（陽性率）は８５％であった。すなわち、ＣＤ１６６陽性細胞の割合は比較例３−１の場合よりも５％低いと判別された。これは、死細胞が混入した状態でネガティブコントロールを用いて感度設定を行ったため、蛍光強度が高い位置に境界点を設定してしまい、結果として、測定した細胞試料の陽性率が見かけ上低下したためと考えられる。この様に、細胞の生死を判別せずに測定を行うと、測定値に誤差が入り、結果の信頼性が低下することが理解される。
また、図１７に示すように、対数で約０〜１．４の蛍光強度範囲に主なピークが観測された点は、比較例３−１（図１６参照）と同様であるが、それ以外の領域のバックグラウンドが高い点が異なった。
【００７９】
［発明例３］
図１８は、発明例３における特異的抗体の染色を示す、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）のヒストグラムである。発明例３のネガティブコントロールとして、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣで細胞を染色し、密度差分法により判別した生細胞集団を用いている。ゲートＡは、このネガティブコントロールを使用して測定した際に、対数で約０．３以上の範囲に、その範囲に含まれる細胞の割合（陽性率）が２．０％となるように設定されたものである。
発明例３において、ゲートＡに含まれる細胞の割合（陽性率）は８８．８％であった。すなわち、ＣＤ１６６陽性細胞の割合は、比較例３−１（図１６参照）とほぼ同等と判別された。また、図１８に示すように、対数で約０〜１．４の蛍光強度範囲に主なピークが観測された点は比較例３−１（図１６参照）および比較例３−２（図１７参照）と同様であり、それ以外の領域のバックグラウンドが低い点は比較例３−１（図１６参照）と同様である一方で、比較例３−２（図１７参照）と異なった。
【００８０】
このように、発明例３は、比較例３−１とは同じ傾向を示す一方で、比較例３−２とは、異なる傾向であることが示された。すなわち、第２実施例によれば、本発明による細胞生死判別は、蛍光検出器７を使用することなしに、本発明例とは別の技術である７−ＡＡＤ染色による細胞生死判別と、同等の効果を奏することが示され、結果の信頼性が高いことが理解される。さらに、第２実施例によれば、細胞表面マーカの解析においても、死細胞混入による測定誤差を排除し、信頼性の高い結果を得ることができることを示した。
【００８１】
＜第３実施例＞
第３実施例では、複数の抗体により細胞を多重染色した場合における発明例（発明例４）の効果を比較例（比較例４）の効果と比較した。
【００８２】
ここで、発明例４は、本発明を用いて判別した生細胞集団に関する解析である。
比較例４は、本発明例とは別の技術である７−ＡＡＤ染色に従って判別した生細胞集団に関する解析である。
発明例４は、ＭＳＣの７種類の細胞表面マーカを同時に測定することを目的とした。測定対象であるＭＳＣの７マーカの内、４種類は（ＭＳＣで発現するとされている）陽性マーカであり、残りの３種類は（ＭＳＣで発現しないとされている）陰性マーカである。
具体的には、ＭＳＣに対して７マーカそれぞれに対応する７種類の抗体を反応させ、これらの抗体を５種類の異なる蛍光色素により直接あるいは間接に標識することにより、ＭＳＣを多重染色して、各抗体に対応する各細胞表面マーカを同時に測定し解析した。７種類の抗体の内、４種類はＭＳＣの陽性マーカに対する抗体であり、それぞれ異なる４種類の蛍光色素で直接あるいは間接に標識した抗体を使用した。残りの３種類の抗体はＭＳＣの陰性マーカに対する抗体であり、第５の（同一の）蛍光色素で標識した抗体を使用した。これらの７種の抗体を用いて、５色の蛍光色素で多重染色した細胞を、５色の蛍光検出器を備えるフローサイトメータにより測定し、測定対象であるＭＳＣの７マーカについて同時計測を行った。
比較例４は、測定対象であるＭＳＣの７マーカについて分割して測定し、全てのデータを同時に計測しなかった点で、発明例４とは異なる。
【００８３】
なお、第３実施例の測定方法は、基本的に第１実施例および第２実施例と同様であるが、複数の抗体を多重化して用いた点が異なる。以下重複する説明は省略し、第３実施例に特徴的な部分についてのみ記載する。
【００８４】
細胞は、第１実施例および第２実施例と同様、ヒトＭＳＣを使用した。
細胞の染色は、蛍光色素またはビオチンで標識された、あるいは無標識の各細胞表面マーカに対する抗体により、細胞を直接または間接に多重染色した。
ここで、細胞の染色に用いた抗体は、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ，ＣＤ４５−ＦＩＴＣ，ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（以上コールターイムノテック社），ＣＤ１０５−ＰＥ（ＡＮＣＥＬＬ社），ＣＤ１６６−ビオチン（ＡＮＣＥＬＬ社），ＣＤ２９−ＰＣ５（Ｃａｌｔａｇ社）およびＣＤ４４−無標識（コールターイムノテック社）であって、それぞれの抗体の詳細な説明は表１に示す。
【００８５】
【表１】
2006230333.tif 000004
【００８６】
ＣＤ１６６−ビオチンに対するＥＣＤの間接標識のため、ストレプトアビジン−ＥＣＤ、すなわちＥＣＤ（ＰＥとＴｅｘａｓＲｅｄのタンデム色素）標識のストレプトアビジンを用いた。
また、ＣＤ４４の無標識抗体に対するＰＣ７の間接標識のため、二次抗体−ＰＣ７、すなわち、抗マウスＩｇＧのヤギ抗体のＦ（ａｂ’）2断片をＰＣ７で標識した二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いた。
それぞれの間接標識用試薬の詳細な説明は表２に示す。
【００８７】
【表２】
2006230333.tif 000005
【００８８】
前記したように、ＣＤ１０５，ＣＤ１６６，ＣＤ２９およびＣＤ４４は、ＭＳＣで発現すると報告されている陽性マーカであり、またＣＤ３４，ＣＤ４５およびＣＤ１４はＭＳＣで発現しないと報告されている陰性マーカである。
【００８９】
また、ネガティブコントロールとして使用する細胞に対しては、前記した測定対象である７マーカの抗体にそれぞれ対応するアイソタイプの非特異的抗体を用いて、細胞を直接または間接に、対応する標識を用いて多重染色した。すなわち、表１で示した抗体にそれぞれ対応するアイソタイプの非特異的抗体であり、かつそれぞれ対応する蛍光色素またはビオチンで標識され、あるいは無標識の抗体を用い、細胞を直接または間接に多重染色した。
具体的には、ネガティブコントロールとして使用する細胞の染色に用いた抗体は、ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ，ＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ，ＩｇＧ１−ＰＥ，ＩｇＧ１−ＰＣ５，無標識のＩｇＧ１（以上コールターイムノテック社）およびＩｇＧ１−ビオチン（Ａｎｃｅｌｌ社）であって、それぞれの抗体の詳細な説明を、表３に示す。
ＩｇＧ１−ビオチンに対するＥＣＤの間接標識のため、ストレプトアビジン−ＥＣＤを用いた。また、無標識のＩｇＧ１に対するＰＣ７の間接標識のため、二次抗体−ＰＣ７を用いたのは前記同様である。
【００９０】
【表３】
2006230333.tif 000006
【００９１】
ここで、細胞の染色手順を示す。チューブにメーカ推奨量の無標識の抗体（ＣＤ４４−無標識）を分注後、前記細胞分散液１００μＬ（細胞数約７０万個）を分注し、４℃で３０分間インキュベートした。２ｍＬのＰＢＳで洗浄後、ペレットに０．１ｍＬのＰＢＳを加えて分散した。この細胞分散液を含む（以下同様）チューブに１．４μｇの二次抗体−ＰＣ７を分注し、４℃で３０分間インキュベートした。２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄後、ペレットに０．１ｍＬのマウス血清を加えて分散し、室温で１５分間インキュベートして二次抗体をブロッキングした。このチューブにメーカ推奨量の蛍光標識抗体（ＣＤ３４−ＦＩＴＣ，ＣＤ４５−ＦＩＴＣ，ＣＤ１４−ＦＩＴＣ，ＣＤ１０５−ＰＥ，ＣＤ２９−ＰＣ５）並びにビオチン標識抗体（ＣＤ１６６−ビオチン）を分注し、４℃で３０分間インキュベートした。２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄後、ペレットに０．１ｍＬのＰＢＳを加えて分散した。このチューブに１０μＬのストレプトアビジン−ＥＣＤを分注し、４℃で３０分間インキュベートした。さらに２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄後、５００μＬのＰＢＳに再分散することにより、細胞試料を調製した。
以上は測定対象である７種類のマーカに関する染色法を例示したが、ネガティブコントロールとして使用する細胞についても前記したとおり、それぞれ対応するアイソタイプと標識の非特異的抗体を用いた点以外は同様の手順により細胞を染色した。
【００９２】
細胞試料の測定には、ベックマンコールター社のセルアナライザであるＦＣ５００型をメーカの推奨条件に準拠した条件で使用した。
このセルアナライザは、４８８ｎｍ、１５ｍＷのアルゴンイオンレーザを励起光源として用いＦＩＴＣ，ＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５，ＰＣ７による蛍光強度をそれぞれ５２５，５７５，６１０，６７５ｎｍのバンドパスフィルタ並びに７５０ｎｍのロングパスフィルタを備えた蛍光検出器（以下、それぞれＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４，ＦＬ５チャンネルと記す）７で測定できる。また、前方散乱光検出器５と側方散乱光検出器６も備えている。
ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５，ＰＣ７の検出は、それぞれＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４，ＦＬ５チャンネルで行い、検出された蛍光強度をそれぞれＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４，ＦＬ５と記載する。
従って、第３実施例の発明例４において、ＦＳ，ＳＳ，ＦＬ１（ＦＩＴＣ用），ＦＬ２（ＰＥ用），ＦＬ３（ＥＣＤ用），ＦＬ４（ＰＣ５用），ＦＬ５（ＰＣ７用）の検出器を全て同時に使用した。比較例４では、ＦＬ４を７−ＡＡＤ用に用いた。
【００９３】
測定の前には、ネガティブコントロールを用いて、対応する各蛍光検出器７の感度を調節した。このネガティブコントロールは、細胞を非特異的抗体により染色した点は第２実施例と同様であるが、複数の非特異的抗体を多重化して用いた点が異なる。発明例４においては密度差分法によって、比較例４においては７−ＡＡＤ染色によって、判別した生細胞集団を計測した。
【００９４】
次に、以下の手順により蛍光検出器の混色補正（分光干渉の補正）を行った。すなわち、ＭＳＣと散乱特性の近い標準細胞（本実施例ではＨｅＬａ細胞）を別途用意した。この細胞が強発現する細胞表面マーカ（ＣＤ１６６）に対するビオチン化抗体と、ＭＳＣの染色に用いたものと同じ５種の蛍光色素（ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５，ＰＣ７）で標識したストレプトアビジンとを用いた間接標識により、５種類の蛍光色素でそれぞれ単独に染色した単染色試料を５種調製し、混色補正用試料とした。これらを前記セルアナライザにより測定し、定法に従い、検出器間の蛍光の漏れ込みを補正する補正マトリクス（以下、補正係数）を作成した。以降のデータ解析は、この補正係数を用いて蛍光の漏れ込み補正（混色補正）を行ったデータに基づいて行った。
【００９５】
［発明例４］
図１９は、発明例４におけるＭＳＣの細胞表面マーカに対する抗体の染色の結果の一例を示すヒストグラムであって、（ａ）はＦＬ１（ＦＩＴＣ）、（ｂ）はＦＬ２（ＰＥ）、（ｃ）はＦＬ３（ＥＣＤ）、（ｄ）はＦＬ４（ＰＣ５）、（ｅ）はＦＬ５（ＰＣ７）の蛍光強度（対数）を横軸、細胞数（頻度）を縦軸に表示したヒストグラムである。図１９（ａ）〜（ｅ）において、ピークＳは、ＭＳＣの細胞表面マーカに対する抗体の染色を示すピークであって、ピークＮは、ネガティブコントロールのピークである。また、ゲートＡ〜Ｅは、陽性率判定のために、ネガティブコントロールのヒストグラムにおいて陽性率が約２％となるように、それぞれ設定した。
なお、第３実施例において設定したゲートは、第１実施例および第２実施例において設定したゲートと符号が同じであっても、同一のものとは限らない。
前記したように、図１９（ａ）〜（ｅ）に示すこれらの細胞表面マーカ（陽性マーカ４種および陰性マーカ３種）に関する測定結果は、同一の細胞試料を多重染色して得た測定試料について、本発明のフローサイトメータを用い、同時に計測値を取得したものである。
【００９６】
図１９における、ゲートＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅに含まれる細胞の割合（陽性率）はそれぞれ２．５５％，９９．８３％，９９．５０％，９９．９０％，９９．８５％であった。すなわち、ＭＳＣで陽性とされるＣＤ１０５，ＣＤ１６６，ＣＤ２９，ＣＤ４４に関して、ほとんどの細胞が陽性を示した（それぞれ、図１９(ｂ)，(ｃ)，(ｄ)，(ｅ)を参照)。その一方で、ゲートＡの陽性率、すなわち、ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ１４の少なくとも何れかが陽性な細胞の割合は２．５５％であったことから、残りの９７．４５％の細胞は、ＭＳＣで陰性とされるＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ１４の３種の細胞表面マーカに関して、いずれも陰性であることを示した（図１９（ａ）参照）。以上の各マーカ毎の陽性率の結果は、多重染色を行わずに各マーカを単独で染色して評価した場合（単染色法）における陽性率（図示省略）と同等であったことから、発明例４による多重染色は細胞表面マーカの発現強度を高い信頼性で評価解析できる。３種の陰性マーカを同一の色素で標識した抗体を用いて同一の検出器でまとめて測定しても陽性率を高精度に評価できるため、検出器を効率的に活用できる、という効果がある。
【００９７】
なお、前記した結果はＭＳＣの７種のマーカの同時計測のための条件を以下のごとく検討し、信頼性の高い結果をもたらす方法を探索しそれを見出した後に初めて得られた結果である。代案としては、ＣＤ４４検出のための抗体として市販のＦＩＴＣ標識品、またＣＤ１６６についてはビオチン化抗体を用いてＰＣ７で間接標識、さらにＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ１４については市販のＥＣＤ標識品を用いる方法がある。この代案による検討結果によると、陰性マーカであるＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ１４の陽性率が約７％程度となる場合が多く、極端なケースでは６０％を越す場合もあった。この代案による陽性率は単染色法の結果から大きく乖離しており、測定法に基づく誤差があることが示された。この原因を追究した結果、混色補正に原因があることが明らかになった。すなわち、代案における陰性マーカに対応するＥＣＤ計測のためのＦＬ３検出器にはＰＥやＦＩＴＣなどの異なる色素からの蛍光の漏れ込み（分光干渉、混色）が多い。分光干渉を補正するための補正係数（値が大きいほど影響が大きい）は、ＦＬ３検出器に対して、ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＣ５，ＰＣ７の各色素についてそれぞれ１１，７３，０．８，０．１であった（いずれも典型値、以下同様）。代案はＭＳＣで発現しているＣＤ１０５やＣＤ４４の標識としてＰＥやＦＩＴＣを使用しており、これらの色素は強い蛍光信号を発する。前記したとおり、これらの色素のＥＣＤに対する補正係数も大きいため、補正係数を誤って少なめに算定すると、ＣＤ１０５やＣＤ４４に基づく強い信号がＥＣＤの計測値に対して大きな正の誤差要因となることが判明した。
【００９８】
そこで補正係数の算定誤差の影響を低減すべく工夫したのが本発明第３実施例の発明例４である。すなわち、陰性マーカを計測する検出器として、混色の影響が最も少ないＦＩＴＣ用のＦＬ１を使用した。ちなみにＦＬ１に対する補正係数は、ＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５，ＰＣ７についてそれぞれ１，０．５，０．３，０であった。これらの平均値は約０．４５であり、前記代案におけるＦＬ３に対する多色素の補正係数の平均値約２１．２と比較すると、約１／４７と極めて小さく、混色の影響が極めて少ない。同様に算出したＦＬ２，ＦＬ４，ＦＬ５に関する他の４色素の補正係数の平均値はそれぞれ、６．３，２３．３，１９．６である。従って、本発明で使用したフローサイトメータの光学系と色素の組合せや感度設定などの条件下においては、目的色素以外の他色素からの混色の影響が最も少ない検出器はＦＬ１であり、その程度は他の検出器を用いる場合と比較して１／１４〜１／５２である。従ってＦＬ１に対応するＦＩＴＣを用いて陰性マーカに対する抗体を標識し、ＦＬ１を用いて陰性マーカを計測することにより、信号が微弱な陰性マーカの陽性率の計測誤差を劇的に低減でき、陽性率の計測精度を劇的に改善できる、という効果があることが判明した。
【００９９】
一方、４種の陽性マーカの信号強度に注目すると、それらは必ずしも一定ではなく、やや強弱があることが理解される（図１９（ｂ）〜（ｅ）参照）。この例では、図１９（ｄ）と（ｅ）に示したＣＤ２９とＣＤ４４の信号が他の２マーカよりやや高い。発明例４は、陰性マーカに割り当てた検出器（ＦＬ１）における補正係数が小さい検出器（発明例４の例ではＦＬ５とＦＬ４）を用いて、これらの信号強度がやや高いマーカを計測するように、それらの標識を割り当てた（発明例４の例ではＦＬ５に対応するＰＣ７をＣＤ４４に、またＦＬ４に対応するＰＣ５をＣＤ２９に割り当てた）。この構成により、信号強度が高い陽性マーカからの混色の影響を最小限にとどめ、陰性マーカの計測精度を改善できる、という効果が得られた。
【０１００】
以上の検討結果に基づいて、発明例４は、陰性マーカであるＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ１４の標識として混色の影響の最も少ない検出器であるＦＬ１に対応するＦＩＴＣを採用した。また陽性マーカであるＣＤ１０５，ＣＤ１６６、ＣＤ２９，ＣＤ４４の標識にはＦＬ２〜５に対応するＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５，ＰＣ７を採用し、そのうち特に信号強度が高めのＣＤ２９とＣＤ４４については、陰性マーカの検出器であるＦＬ１に対する補正係数が小さいＦＬ４，ＦＬ５に対応するＰＣ５，ＰＣ７を採用した。この構成により、陰性マーカの陽性率を高精度に計測できる、という効果が得られた。
【０１０１】
前記した方法は現状容易に入手できる試薬、装置を前提に最適化した結果であるが、本発明の基本的な考え方を他の実施形態に適用することも可能である。例えば、発明例４はＣＤ４４の無標識抗体を二次抗体−ＰＣ７を用いてＰＣ７標識し、またＣＤ１６６のビオチン化抗体をＥＣＤ標識のストレプトアビジンを用いてＥＣＤ標識したが、例えば、あらかじめＰＣ７で標識されたＣＤ４４抗体、ＥＣＤで標識されたＣＤ１６６抗体を入手して、それを用いて直接標識による染色を行えば、染色工程を大幅に簡略化できる。発明例４では最短波長の検出器であるＦＬ１に対する他色素からの混色が最も少なかったため、ＦＬ１に対する補正係数の平均値が最小であり、陰性マーカをＦＬ１に対応するＦＩＴＣで標識することが高精度化に有効であった。また発明例４では陰性マーカの検出器の波長から遠い長波長側の検出器に対応する色素を、信号強度が高い陽性マーカに割り当てることが高精度化に有効であった。しかし装置と標識色素の組合せ、感度設定によっては最短波長の検出器に対する補正係数の平均値が必ずしも最小とはならない可能性もあり、また最短波長の検出器に対して長波長側の検出器に対応する色素の補正係数が必ずしも最小とはならない可能性もある。一般には、他の色素からの補正係数の平均値を各検出器について求め、補正係数の平均値が最小となる検出器を陰性マーカ測定用の検出器として選択し、またその陰性マーカの検出器に対する補正係数が小さな色素を発現強度が高い陽性マーカ用の標識として選択することにより、前記したものと同様に高精度化の効果が得られる。
【０１０２】
以上に示したように、本実施例は混色の影響の最も少ない検出器に対応する標識を用いて陰性マーカに対する抗体を標識し、またそれ以外の検出器に対応する標識を用いて陽性マーカに対する抗体を標識し、特にその陰性マーカの検出器に対する補正係数が小さな色素を用いて発現強度が高い陽性マーカに対する抗体を標識し、それらを用いて細胞試料を多重染色して測定試料を調製し、測定試料を多色同時に検出することにより、陰性マーカの陽性率等の計測において、混色による誤差を劇的に低減し、信頼性の高い結果を提供できる、という特有の効果がある。
【０１０３】
発明例４においては、これらの個々の細胞について同時に多重計測した表面マーカの陽性率の解析に基づいて、さらに、以下のマーカ間の相関関係に関する解析を行うことができた。
４種の陽性マーカ全てが陽性であった細胞は全体の９９．４５％であった。この値は各陽性マーカを単独で評価した場合におけるそれぞれの陽性率（前記したように、ＣＤ１０５，ＣＤ１６６，ＣＤ２９，ＣＤ４４についてそれぞれ９９．８３％，９９．５０％，９９．９０％，９９．８５％）と比較して概ね低いばかりでなく、単独における陽性率の最小値である９９．５０％よりも低いことから、４種の陽性マーカ全てが陽性である細胞（以下「陽性合致細胞」という）の集団は、これらのマーカを単独で独立に計測して得られる細胞分画のいずれとも異なる分画であることが理解できる。換言すると、陽性合致細胞分画は４種の陽性マーカを個別に単染色したのでは評価できず、多重染色により４種同時に計測することによって初めて評価可能である。このことは、特に陽性合致細胞分画だけをセルソータなどで分取する場合や、細胞の純度を精密に評価する場合などにおいて重要な意味をもつ。
【０１０４】
単独で最も陽性率が低いＣＤ１６６についてさらに詳細に解析を行った。ＣＤ１６６陽性の細胞の割合は、陽性マーカが４種とも陽性である細胞の割合に近く、換言するとＣＤ１６６陽性の細胞は他の３種の陽性マーカも陽性である場合が多かった。特にＣＤ１６６陽性の細胞は、全てＣＤ２９も陽性であった。例外的にＣＤ１６６陽性なものの他の陽性マーカが陰性だった細胞の割合は、ＣＤ１０５陰性が０．０２５％、ＣＤ４４陰性が０．０２５％（細胞数はそれぞれ２個）であった。これらの２種の例外的細胞は重複しておらず、換言するとＣＤ１６６陽性細胞は３つの分画に分けられ、それぞれの構成比率は以下の通りであった（＋は陽性、−は陰性を示し、構成比率はＣＤ１６６陽性細胞に対する割合を示す）。
分画１：CD166＋，CD29＋，CD105＋，CD44＋  構成比率：99.95％
分画２：CD166＋，CD29＋，CD105＋，CD44−  構成比率：0.025％
分画３：CD166＋，CD29＋，CD105−，CD44＋  構成比率：0.025％
（それ以外のＣＤ１６６＋，ＣＤ２９＋，ＣＤ１０５−，ＣＤ４４−分画や、ＣＤ１６６＋，ＣＤ２９−分画は検出されなかった）
【０１０５】
もっとも、ＣＤ１６６が陰性でも他の陽性マーカ３種が陽性となる細胞も全体の０．３％強あったことから、真のＭＳＣ分画を評価するためには、ＣＤ１６６だけではなく、複数の陽性マーカを個々の細胞について同時に計測して解析する必要がある。発明例４はこの複数マーカの同時計測機能を提供するため、各マーカの発現パターンに応じて分類した細胞分画を詳細に評価解析が行える、という効果がある。
【０１０６】
３種の陰性マーカのいずれかが陽性であった細胞は全体の２．５５％（図１９（ａ）参照）であったことから、３種の陰性マーカの全てが陰性であった細胞（以下「陰性合致細胞」という）は全体の９７．４５％であることが理解される。このうち、さらに陽性合致細胞の条件も満たす、すなわち、全マーカについてＭＳＣについて提唱されている細胞表面マーカ発現パターンを示す細胞（以下完全合致細胞）の割合は、全体の９６．９０％であった。残り０．５５％は４種の陽性細胞のいずれかが陰性、すなわちＭＳＣについて提唱されている細胞表面マーカの発現パターンから一部逸脱した細胞である可能性がある。完全合致細胞の割合は、陰性マーカ条件を満たす細胞の割合（９７．４５％）や、陽性マーカ条件を単独で満たす細胞の割合（９９．５０％〜９９．９０％）よりも有意に低い。従って、ＭＳＣの7種のマーカを多重染色して同時に計測することにより、この完全合致細胞の分画を、初めて評価解析可能となる、という効果がある。
【０１０７】
発明例４により実現される複数マーカの多重計測は、前記したように、ほぼ純粋なＭＳＣの純度評価においてばかりでなく、多様なマーカ発現パターンを示す様々な系統や分化段階の細胞が混在した細胞集団の分画、評価解析やソーティングなどにおいても、有効な手段を提供できるという効果がある。
【０１０８】
このように、発明例４によれば、個々の細胞について複数の細胞表面マーカを同時に測定することにより、単に母集団中の個々の細胞表面マーカの陽性率を単独で解析できるばかりでなく、細胞表面マーカ間の相関情報を取得し、高精度の解析を行うことができることを示した。
また、発明例４によれば、母集団が例え不均一であっても、細胞を個々の細胞表面マーカの発現強度の組合せに応じたサブグループに分割してサブポピュレーションを解析したり、細胞表面マーカ間の相関解析を行えるため、高精度の評価解析結果を提供でき、細胞の品質管理を高度化できることを示した。
さらに、発明例４によれば、多重染色における陰性マーカ計測に際し、混色による誤差を回避し、高精度な解析を行えることを示した。
【０１０９】
［比較例４］
ここで、図示はしないが、複数の抗体により細胞を同時に染色した場合における比較例４の効果を検証する。前記したように、比較例４は、本発明例とは別の技術である７−ＡＡＤ染色に従って判別した生細胞集団に関する解析である。
比較例４は、発明例４と類似する測定手順であるが、ＦＬ４が７−ＡＡＤの測定に占有されてしまう点で、発明例４とは大きく異なる。従って、比較例４において、発明例４で用いたものと同じ数（５つ）の蛍光検出器を有するセルアナライザを用いて測定を行うときには、１つの細胞表面マーカ（ＦＬ４に対応するＣＤ２９）の測定を、他の細胞表面マーカの測定と同時に行うことができない。そこで、前記７種の細胞表面マーカを測定するために、細胞試料を試料１と試料２とに分割して調製し、それぞれの試料に関して以下の組み合わせで染色し、２回に分割して測定を行った。
ここで、試料１はＣＤ３４−ＦＩＴＣ，ＣＤ４５−ＦＩＴＣ，ＣＤ１４−ＦＩＴＣ，ＣＤ１０５−ＰＥ，ＣＤ１６６−ＥＣＤ，７−ＡＡＤおよびＣＤ４４−ＰＣ７による染色の組み合わせであって、試料２はＣＤ２９−ＰＥおよび７−ＡＡＤによる染色の組合せである。
【０１１０】
比較例４によれば、測定を２回に分割したため、細胞の必要量や、染色工程や蛍光測定の手間が発明例４の２倍必要であった。さらに、測定を２回に分割したことにより、ＣＤ２９と、他の細胞表面マーカとについて、同一の細胞について同時に測定値を得ることが不可能であった。従って、比較例４では、ＣＤ２９と他の細胞表面マーカの相関関係を評価することが不可能であった。
具体的には、比較例４においては、４種の陽性マーカ全てが陽性であった細胞の割合や、４種の陽性マーカ全てが陽性であり、かつ、３種の陰性マーカが陰性であった細胞（完全合致細胞）の割合や、単独で最も陽性率が低いＣＤ１６６陽性の細胞が全て他の３種の陽性マーカも陽性であるかどうかの考察や、陰性マーカ３種が陰性だった細胞の内の完全合致細胞の割合や、それから逸脱した細胞の割合等に関する解析や考察を行うことができなかった。
【０１１１】
さらに、前記した発明例４と比較例４とを比較し、発明例４に特有の効果を以下に示す。
すなわち、発明例４は、細胞の必要量が少なく、染色工程や蛍光測定の手間が少なく、ＭＳＣの評価パラメータである７種類の細胞表面マーカを同時に測定でき、細胞表面マーカ間の関連情報を取得でき、細胞表面マーカ間の相関解析を行え、細胞表面マーカの発現の組合せに応じたサブグループに分割してサブポピュレーションを解析できるものである。
第３実施例の結果によれば、本発明を用いることによって、高精度の細胞の測定結果を提供でき、高度な細胞の品質管理を行うことができることを示した。
本発明の精神は前記した実施例の範疇に留まらず、広くフローサイトメトリを用いる幹細胞等を含む細胞の評価解析手法、装置一般に適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本実施形態のフローサイトメータの構成を示すブロック図である。
【図２】本実施形態における測定データの記録形式である測定データテーブルである。
【図３】二次元散布図作成手段によって作成された二次元散布図であって、（ａ）は１回目の測定に基づく二次元散布図であって、（ｂ）は２回目の測定に基づく二次元散布図である。
【図４】差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ）を三次元ヒストグラムで表示した図である。
【図５】図４において濃色で示した領域を、ｘ−ｙ平面（区画座標）上に投影した図である。
【図６】境界線作成手段が境界線を引くアルゴリズムの一例を説明するための図である。
【図７】元の二次元散布図に境界線情報が重畳された図である。
【図８】密度差分法を実行する場合のフローサイトメータ１の全体動作を示すフローチャートである。
【図９】密度差分法を実行する場合の差分規格化細胞密度分布ｚ（ｘ，ｙ)の算出処理（ステップＳ３０）を詳細に説明するためのフローチャートである。
【図１０】密度差分法を実行する場合の生死細胞領域の設定処理（ステップＳ４０）を詳細に説明するためのフローチャートである。
【図１１】ＭＳＣを非特異的抗体（ＩｇＧ１−ＰＥ）と７−ＡＡＤとで染色し、セルソータを用いてＦＬ４チャンネルで測定した結果を、１パラメータヒストグラムで表示したものである。
【図１２】比較例１における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。
【図１３】比較例２における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。
【図１４】発明例１における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。
【図１５】発明例２における非特異的抗体の染色を示す、ＦＬ２（ＰＥ）のヒストグラムである。
【図１６】比較例３−１における特異的抗体の染色を示す、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）のヒストグラムである。
【図１７】比較例３−２における特異的抗体の染色を示す、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）のヒストグラムである。
【図１８】発明例３における特異的抗体の染色を示す、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）のヒストグラムである。
【図１９】発明例４におけるＭＳＣの細胞表面マーカに対する抗体の染色を示すヒストグラムであって、（ａ）はＦＬ１（ＦＩＴＣ）、（ｂ）はＦＬ２（ＰＥ）、（ｃ）はＦＬ３（ＥＣＤ）、（ｄ）はＦＬ４（ＰＣ５）、（ｅ）はＦＬ５（ＰＣ７）に関するヒストグラムである。
【符号の説明】
【０１１３】
１      フローサイトメータ
２      測定装置
３      測定データＤＢ（記憶手段）
４      細胞生死判別装置
５      前方散乱光検出器（第１の散乱光検出器）
６      側方散乱光検出器（第２の散乱光検出器）
７      蛍光検出器
８      二次元散布図作成手段（相関図作成手段）
９      差分規格化細胞密度分布算出手段（差分情報算出手段）
１０    二次元散布図区画化手段
１１    規格化細胞密度分布算出手段
１２    差分算出手段
１３    平滑化手段
１４    生死細胞領域設定手段
１５    閾値比較手段
１６    境界線作成手段
１７    境界線重畳処理手段
１８    測定データ抜粋手段
１００，２００  測定データテーブル
１１０，２１０  二次元散布図（相関図）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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