(57)【要約】【課題】通常の飲食品として摂取することで大腸ガン、肝ガン、膵臓ガン、胆管ガンおよび胆石症の発症リスクを低減できる組成物を提供すること。【解決手段】ルミノコッカス（Ruminococcus）属細菌および／またはジフルクトース・ジアンヒドリド３（di-D-fructofuranose-1，2’：2，3’-dianhydride、略称DFAIII）を含有する２次胆汁酸抑制剤並びに該抑制剤を含有する飲食品または動物用資料。これらの組み合わせに加えて、ラフィノース、メリビオースあるいは、フラクトオリゴ糖を加えた２次胆汁酸抑制剤並びに該抑制剤を含有する飲食品または動物用資料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルミノコッカス（Ruminococcus）属細菌および／またはジフルクトース・ジアンヒドリド３（di-D-fructofuranose-1，2’：2，3’-dianhydride、略称DFAIII）を含有する２次胆汁酸抑制剤。
【請求項２】
ルミノコッカス（Ruminococcus）属細菌が、ルミノコッカス  エスピー  AHU1760株（FERM
AP-20042）である請求項1記載の２次胆汁酸抑制剤。
【請求項３】
請求項１または２記載の２次胆汁酸抑制剤を含む飲食品。
【請求項４】
請求項１または２記載の２次胆汁酸抑制剤を含む動物用飼料。
【請求項５】
ルミノコッカス属菌を発酵スターターとして製造した発酵食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管での２次胆汁酸の生成を抑制することによって、大腸ガン、肝ガン、胆石症などの病気のリスクを低減する飲食品、動物飼料およびその素材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胆汁酸は、肝臓で作られる。すなわち、肝臓においてコレステロールから、コール酸およびケノデオキシコール酸等（1次胆汁酸）が、生合成される。これらは、グリシンおよびタウリンと抱合して胆管を通じて消化管内へと分泌される。これらの胆汁酸は、消化管においては、その界面活性作用によって食品中の脂肪成分を分散させ消化と吸収を助けている。分泌された胆汁酸は、回腸から吸収され門脈を通って肝臓へと戻って行く肝臓循環をしている。
【０００３】
しかし、すべての胆汁酸が、回腸で吸収されるのではなく、そのまま消化管下流方向へと流されて行く胆汁酸もある。消化管に残った胆汁酸は、消化管内で腸内細菌の作用を受けて脱抱合や７α−脱水酸化、酸化、還元、エピマー化等の修飾を受けて２次胆汁酸へと変換される。２次胆汁酸を構成する成分としては、デオキシ・コール酸（Deoxycholic acid）、リソ・コール酸（Lithocholic acid）、ヒドロキシ・コール酸（Hydroxycholic
acid）、7-デヒドロ・コール酸（7-Dehydrocholic acid）などの分子である。
２次胆汁酸は、腸管内容物とともに消化管下部への移動し、大腸においてから吸収されて、血中より肝臓へと移行する。２次胆汁酸の引き起こす影響は、単に消化管だけにとどまらず肝臓、そして体内へと広い範囲におよぶ。２次胆汁酸は、発ガン性を持っており、大腸ガン、肝ガン、膵臓ガン、胆管ガンの発症を促進することが報告されている（非特許文献１〜３参照）。また、２次胆汁酸
の発ガンプロモーター活性は、１次胆汁酸に比べてはるかに強いことも示されている（非特許文献４，５参照）。さらに、最近、デオキシコール酸に関しては、ガン以外にも胆石症の発症に関係し得ることが示されている（非特許文献６参照）。
２次胆汁酸の害を防ぐ方法としては、乳酸菌やビフィズス菌を活性化して、１次胆汁酸を菌体内に蓄積せしめ、腸管内より１次胆汁酸濃度を減少させることによって２次胆汁酸濃度を減少させる方法（特許文献１参照）、あるいは、酵母によって胆汁酸を吸着させて、腸管内の２次胆汁酸濃度を減少させる方法（特許文献２参照）などが、知られている。しかし、本出願のように、ＤＦＡIIIを摂取することによって腸管内でルミノコッカス属菌を増加させる、あるいは、ルミノコッカス属菌を摂取して、腸管内で本属菌を増加させ、あるいは、ラフィノース、メリビオース、フラクトオリゴ糖をルミノコッカス属細菌とともに摂取して、腸管内でルミノコッカス属細菌の活動を活発化させ、生成する酢酸などの有機酸によって腸管内のpHを低下させ、２次胆汁酸の生成を抑制する方法は知られていなかった。
【非特許文献１】Narisawa, T., et al., J. Natl.Cancer Inst, 53, 1093-1097, 1974
【非特許文献２】Tsuda, H., et al., Gann, 75,871-5, 1984
【非特許文献３】Makino, T., et al., J. Natl.Cancer Inst., 76, 967-75, 1986
【非特許文献４】Narisawa, T., et al., J. Natl.Cancer Inst., 53, 1093-1097, 1974
【非特許文献５】Reddy, BS., et al., Cancer Res.,37, 3238-3242, 1977
【非特許文献６】Marcus, SN., Heaton, KW., Gut,29, 522-533, 1988
【特許文献１】P2001-253829A
【特許文献２】P2001-97870A
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
解決しようとする課題は、腸管内において２次胆汁酸の生成を抑制することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、腸管内でルミノコッカス属細菌の活動を高め、生成する酢酸などの有機酸によって腸管内のpHを低下させ、２次胆汁酸の生成を抑制することである。そのための方法として、ルミノコッカス属細菌を摂取すること、加えてルミノコッカス属細菌の増殖を促進する食品素材としてジフルクトース・ジアンヒドリド３（ＤＦＡIII）、ラフィノース、メリビオース、フラクトオリゴ糖あるいは、これらを混合して摂取することを特徴としている。これらは、それぞれ単独でも効果が期待できる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の２次胆汁酸産生抑制微生物及び飲食品は、通常の食品のように摂取することで、腸管内で機能を発揮し、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を抑制する。その結果、腸管内での発ガン因子が減少し、発ガンリスクを減少させるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
ジフルクトース・ジアンヒドリド３（ＤＦＡIII）の摂取は、粉末のままでも水に溶いた状態でも、どんな状態でも良く、さらに、他の食品と同時に摂取するのも問題はない。ジフルクトース・ジアンヒドリド３の摂取量は、成人１日あたり０．５ｇから２０ｇの範囲で有効であり、好ましくは、１ｇから１０ｇである。１日1度の摂取でも、数度に分けても有効である。ジフルクトース・ジアンヒドリド３をルミノコッカス属細菌と併用することなく単独で摂取した場合、もし摂取した人において、元来の腸内細菌として、ジフルクトース・ジアンヒドリド３を資化することの可能なルミノコッカス属細菌を保有していた人においては、自分の元来持っている該属菌をジフルクトース・ジアンヒドリド３によって増殖を促進し、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を抑制する。さらに、ルミノコッカス属菌の腸内での増殖を促進することのできる糖類として、ラフィノース、メリビオース、フラクトオリゴ糖をあげることができ、これらも混合して摂取することも有効である。これらの糖の使用量は、成人１日１ｇから２０ｇであり、好ましくは、２ｇから１０ｇである。
元来の腸内細菌としてジフルクトース・ジアンヒドリド３を資化することの可能なルミノコッカス属細菌を保有していない人にとっても、ジフルクトース・ジアンヒドリド３と併せてルミノコッカス属細菌を摂取することによって、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を抑制することができる。
さらに、ジフルクトース・ジアンヒドリド３を摂取することが無くとも、ルミノコッカス属細菌を大量（百万個を超える量）に摂取することによって、１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換を抑制することができる。
ルミノコッカス属細菌の摂取は、本属菌が生きている状態での摂取が必要である。生きている状態であれば、凍結乾燥などの乾燥菌体でも可能である。ルミノコッカス属菌を菌体として、あるいはこの菌体を含む培養物として、顆粒状等の製剤やこれらを添加した飲食品の形態で摂取できる。顆粒状等の製剤および食品は、製剤化や粉末化が知られている普通の方法で製造できる。また、ルミノコッカス属菌をスターターの１つとして発酵させた発酵飲食品としての摂取も可能である。ルミノコッカス属菌を含有した発酵乳、チーズ、バター等の乳製品、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料等の飲料等としても摂取できる。
【実施例１】
【０００８】
ジフルクトース・ジアンヒドリド３（ＤＦＡIII）（３％）添加飼料をSD系ラットに与えて、ルミノコッカス属細菌の増加の時期と腸内細菌叢の変化、盲腸内容物の短鎖脂肪酸、糞中の胆汁酸組成を調べた。
ラットの飼育条件
SD系オスラット (日本SLC)を５週齢で導入し、AIN-93Gにもとづいた基本飼料で1週間予備飼育を行なった。その後、ラットの体重差が出ないように6匹ずつ２群に分け、２週間の試験飼育を行った。コントロール群は基本飼料のままで、ジフルクトース・ジアンヒドリド３群は基本飼料のセルロース8%のうち3%をジフルクトース・ジアンヒドリド３に置き換えたものを与えた。ラットは金属製ゲージで個別飼いし、飼料および水は自由に摂取させた。
【０００９】
その結果、生育状況は、2週間の飼育後、各群間では、摂食量および体重増加量には有意な差は認められなかった。
盲腸内ｐＨは、試験終了後の盲腸内容物を蒸留水で約4倍に薄め、ホモジナイズした後にpHメーター（ホリバ）で測定した。コントロール群はpH
7.82±0.11、ジフルクトース・ジアンヒドリド３群はpH 5.82±0.04 (p<0.01) だった。3%ジフルクトース・ジアンヒドリド３飼料で2週間飼育することによって、盲腸内ｐＨは有意に低下した。
盲腸内容物の有機酸組成をHPLC（島津製作所）を用いて調べたところ。ジフルクトース・ジアンヒドリド３摂取群では、酢酸の濃度が、有意に増加しており、このため、盲腸内pHが低下したことが判った（図１）。
盲腸内のルミノコッカス属細菌の濃度をリアルタイムPCR（Prisum 7000、アプライドバイオシステム社、米国）を用いて測定した。測定に用いるルミノコッカス特異的プライマーは、次の２本のセットを用いた。
Primer 932F:  5'-TCGAAGCAAC GCGAAGAAC-3'
Primer 999R:  5'-GGGAAGGCCC CGTTACG-3'
Taq Man プローブとして下記を用いた。
Taq Man probe: 5'-(FAM)-CAAGTCTTGA
CATCCCTCTG ACCGGC-(TAMRA)-3'
反応条件は、摂氏50度で2分の後、95度で10分、そして95度で15秒、60度で1分のサイクルを40回行いルミノコッカス属細菌の細胞数を明らかにした。
その結果、ジフルクトース・ジアンヒドリド３摂取群では、どのラットも摂取とともにルミノコッカス属細菌の数は、急速に増加した（図２）。図中で、Ｄの記号を付したのがジフルクトース・ジアンヒドリド３摂取区、Ｃが、コントロール区のラットを表している。数値は、ラットのナンバーである。
【００１０】
一方、糞便中のジフルクトース・ジアンヒドリド３濃度の変化をHPLC（日本分光）で定量したところ、ジフルクトース・ジアンヒドリド３摂取群では、摂取３日目までは、ジフルクトース・ジアンヒドリド３濃度は、上昇を続け、摂取量の40%がそのまま排泄されていることが判った（図３）。しかし、５日目からは、その濃度は漸次減少し始め１４日目では、ジフルクトース・ジアンヒドリド３のほとんどが、分解を受け、糞便中に排泄されたのは、数％にまで減少した。この挙動とルミノコッカス属細菌の菌数の挙動には、関連性が見られた。すなわちジフルクトース・ジアンヒドリド３摂取とともにルミノコッカス属細菌は増加して行き、５日目あたりでプラトーに達し、それと機を一にして、糞便中のジフルクトース・ジアンヒドリド３は減少した。このことは、ジフルクトース・ジアンヒドリド３が、ルミノコッカス属細菌にほとんど特異的な炭素源として位置していることを示している。このことは糞便から分離したルミノコッカス属細菌が、ジフルクトース・ジアンヒドリド３を試験管内で分解できる実験結果からも証明できる。
【００１１】
胆汁酸量は、2週間後の凍結乾燥糞を約20mg小型遠心管に測りとり、1N NaOH
入りのエタノール0.5mlと内部標準物質 (ノルデオキシ・コール酸) 50nmolをいれ、80度で１時間２回抽出した。ヘキサンで中性ステロールを除去後、Bond
Elut C18（Varian社、米国）に吸着、エタノールで溶出し、減圧乾固させた。0.5mlのメタノールに溶解後、メチルエステル化、トリメチルシリルエーテル化して、胆汁酸組成をGC-MS（島津製作所）で測定した。同定は選択イオン検出モードで、定量は内部標準法で行った。
ジフルクトース・ジアンヒドリド３を投与することによって、一次胆汁酸の占める割合が劇的に増え、二次胆汁酸は大幅に減った（図４および図５）。これは盲腸内pHが下がり、腸内細菌の7α-脱水酸化酵素の活性が低下し、それによって１次胆汁酸から２次胆汁酸への変換反応が減少したためである。
２次胆汁酸比率の大幅な減少は、大腸ガンをはじめ肝ガン、膵臓ガン、胆管ガンの発症リスクも大幅に減少させる結果である。
【実施例２】
【００１２】
ヒトでのジフルクトース・ジアンヒドリド３摂食試験
投与条件：4０歳女性にジフルクトース・ジアンヒドリド３を一日３ｇ  (１回)  11日間投与した。その他の食事や生活の条件は、それまでと同じ条件として、特別に制御は、行わなかった。
胆汁酸量は、実施例１と同様にして測定した。ジフルクトース・ジアンヒドリド３を投与することによって、一次胆汁酸の占める割合が劇的に増え、二次胆汁酸は急速に減った（図６）。この例のように毎日わずか３ｇの摂取によって２次胆汁酸濃度は、劇的に減少した。図で示したように普通の食生活をしているので、日々の胆汁酸量には波があるが、１次と２次の比率は劇的に変化した。２次胆汁酸比率の減少は、大腸ガンをはじめとした発症のリスクを大幅に低減できたといえる。
【００１３】
本実験者の糞便からルミノコッカス属細菌を単離した。単離株の16SrDNA塩基配列を決定し（配列表１）、Ruminococcus
productus と98%の相同性を持つジフルクトース・ジアンヒドリド３資化性細菌であることを確かめ、本株をRuminococcus sp. AHU1760と命名して特許生物寄託センターに寄託し、FERM
AP-20042として保存されている。
【実施例３】
【００１４】
Ruminococcus sp. AHU1760（FERM AP-20042）をスターターとしてヨーグルトを製造した。スキムミルク10%溶液に本菌を摂取し、摂氏37度で16時間発酵させた。初期pH6.3であった溶液は、発酵の結果pH5.0に低下し、液体であったものがヨーグルト様のゲル化した食品となった。この発酵食品は、乳酸菌で作ったヨーグルトとは、趣の変わった味を持つ独特のおいしさのヨーグルトであった。
この様にして製造されたヨーグルトを毎日100ｇ、１週間摂取したところ、糞便中に含有される胆汁酸のうち、２次胆汁酸類の比率は、10
%以下に減少した。よって、ルミノコッカス属菌をスターターとして用いた発酵食品を摂取することによって、大腸内の２次胆汁酸量は、減少し、大腸ガンのリスクも減少させることが可能である。
ルミノコッカス属細菌を増加させることを目的とした食品は、大腸ガンリスク低下食品として使用できる。また、このヨーグルトにジフルクトース・ジアンヒドリド３あるいは、ラフィノース、メリビオース、フラクトオリゴ糖を添加した発酵食品も可能である。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
通常の食生活の中で本発明の飲食品、あるいは食素材を摂取することによって大腸ガンをはじめとした重大な病気のリスク低減が可能となる。ヒトおよび動物ともに効果があり、動物用飼料としても使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ラットの盲腸内容物の有機酸組成を示した図である。（実施例１）
【図２】ラット盲腸内容物のミクロコッカス属細菌数の変化を示した図である。（実施例１）
【図３】ラット盲腸内容物のミクロコッカス属細菌数の変化と糞便中に排泄されたジフルクトース・ジアンヒドリド３量を示した図である。（実施例１）
【図４】ラットの盲腸内容物の胆汁酸組成を示した図である。（実施例１）
【図５】図４の内容を１次と２次胆汁酸が分かり易いように示した図である。（実施例１）
【図６】ヒト糞便の胆汁酸組成の変化を示した図である。（実施例２）
【符号の説明】
【００１７】
DFA３      ジフルクトース・ジアンヒドリド３
CA        コール酸(１次胆汁酸)
CDCA      ケモデオキシ・コール酸(１次胆汁酸)
α-MCA    α-ムリ・コール酸(１次胆汁酸)
β-MCA    β-ムリ・コール酸(１次胆汁酸)
7-dehydroCA  7-デヒドロ・コール酸(２次胆汁酸)
DCA      デオキシ・コール酸(２次胆汁酸)
LCA      リソ・コール酸(２次胆汁酸)
HDCA      ヒドロキシ・コール酸(２次胆汁酸)
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【配列表】
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