(57)【要約】      （修正有）【課題】  カリウムチャンネルJファミリー（KCNJ）遺伝子に存在する予後不良なけいれん性疾患に関連した新規の遺伝子変異と、この遺伝子変異を利用したけいれん性疾患診断方法を提供する。【解決手段】乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するKCNJ14変異、乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するKCNJ10変異、良性家族性新生児けいれんに関連するKCNJ13変異、熱性けいれんプラスに関連するKCNJ13変異、および夜間前頭葉てんかんに関連するKCNJ16変異。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
けいれん性疾患である乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するヒトKCNJ14遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列における第1697位cがtに置換した変異を有するKCNJ14変異ポリヌクレオチド。
【請求項２】
けいれん性疾患である乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するヒトKCNJ10遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号３の塩基配列における第544位cがtに置換した変異を有するKCNJ10変異ポリヌクレオチド。
【請求項３】
けいれん性疾患である良性家族性新生児けいれんに関連するヒトKCNJ13遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号５の塩基配列における第522位gがaに置換した変異を有するKCNJ13変異ポリヌクレオチド。
【請求項４】
けいれん性疾患である熱性けいれんプラスに関連するヒトKCNJ13遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号５の塩基配列における第678位aがgに置換した変異を有するKCNJ13変異ポリヌクレオチド。
【請求項５】
けいれん性疾患である夜間前頭葉てんかんに関連するヒトKCNJ16遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号７の塩基配列における第1151位gがaに置換した変異を有するKCNJ16変異ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１のKCNJ14変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ14変異オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項２のKCNJ10変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ10変異オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項３のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項５のKCNJ16変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ16変異オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１のKCNJ14変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
【請求項１２】
請求項２のKCNJ10変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
【請求項１３】
請求項３のKCNJ13変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
【請求項１４】
請求項４のKCNJ13変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
【請求項１５】
請求項５のKCNJ16変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
【請求項１６】
請求項１のKCNJ14変異ポリヌクレオチドまたは請求項６のKCNJ14変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１７】
請求項２のKCNJ10変異ポリヌクレオチドまたは請求項７のKCNJ10変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１８】
請求項３のKCNJ13変異ポリヌクレオチドまたは請求項８のKCNJ13変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１９】
請求項４のKCNJ13変異ポリヌクレオチドまたは請求項９のKCNJ13変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２０】
請求項５のKCNJ16変異ポリヌクレオチドまたは請求項１０のKCNJ16変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２１】
乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する請求項１のKCNJ14変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列における第431位Ala残基がVal残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ14変異ポリペプチド。
【請求項２２】
乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する請求項２のKCNJ10変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号４のアミノ酸配列における第106位Thr残基がIle残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ10変異ポリペプチド。
【請求項２３】
良性家族性新生児けいれんに関連する請求項３のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号６のアミノ酸配列における第129位Gly残基がSer残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ13変異ポリペプチド。
【請求項２４】
熱性けいれんプラスに関連する請求項４のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号６のアミノ酸配列における第181位Met残基がVal残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ13変異ポリペプチド。
【請求項２５】
夜間前頭葉てんかんに関連する請求項５のKCNJ16変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号８のアミノ酸配列における第222位Arg残基がHis残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ16変異ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２１のKCNJ14変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ14変異オリゴペプチド。
【請求項２７】
請求項２２のKCNJ10変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ10変異オリゴペプチド。
【請求項２８】
請求項２３のKCNJ13変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴペプチド。
【請求項２９】
請求項２４のKCNJ13変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴペプチド。
【請求項３０】
請求項２５のKCNJ16変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ16変異オリゴペプチド。
【請求項３１】
請求項２６のKCNJ14変異オリゴペプチドを抗原として作製され、請求項２１のKCNJ14変異ポリペプチドを認識する抗体。
【請求項３２】
請求項２７のKCNJ10変異オリゴペプチドを抗原として作製され、請求項２２のKCNJ10変異ポリペプチドを認識する抗体。
【請求項３３】
請求項２８のKCNJ13変異オリゴペプチドを抗原として作製され、請求項２３のKCNJ13変異ポリペプチドを認識する抗体。
【請求項３４】
請求項２９のKCNJ13変異オリゴペプチドを抗原として作製され、請求項２４のKCNJ13変異ポリペプチドを認識する抗体。
【請求項３５】
請求項３０のKCNJ16変異オリゴペプチドを抗原として作製され、請求項２５のKCNJ16変異ポリペプチドを認識する抗体。
【請求項３６】
乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に請求項１のKCNJ14変異ポリヌクレオチドおよび／または請求項２のKCNJ10変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項３７】
良性家族性新生児けいれんの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に請求項３のKCNJ13変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項３８】
熱性けいれんプラスの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に請求項４のKCNJ13変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項３９】
夜間前頭葉てんかんの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に請求項５のKCNJ16変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項４０】
乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項２１のKCNJ14変異ポリペプチドおよび／または請求項２２のKCNJ10変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項４１】
良性家族性新生児けいれんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項２３のKCNJ13変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項４２】
熱性けいれんプラスの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項２４のKCNJ13変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項４３】
夜間前頭葉てんかんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項２５のKCNJ16変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、けいれん性疾患（乳児重症ミオクロニーてんかん、良性家族性新生児けいれん、熱性けいれんプラス、夜間前頭葉てんかん）に関連するヒト・カリウムチャンネル遺伝子変異と、けいれん性疾患診断方法に関するものでる。さらに詳しくは、けいれん性疾患に関連した点突然変異によって特徴付けられるカリウムチャンネル遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドと、その遺伝子産物である変異ポリペプチド、並びにこれら変異ポリヌクレオチドまたは変異ポリペプチドを対象とするけいれん性疾患の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳幼児期におけるけいれん発作は、予後が良好なものである場合と、予後が極めて不良なてんかん性疾患等の前兆である場合がある。
【０００３】
例えば、単純性の熱性けいれん（febrile seizure：FS）は、通常は６歳以上になると有熱時のけいれんは生じない。しかしながら、熱性けいれんプラス（FS+）は６歳以上でも有熱時のけんれんを頻発し、無熱性のけいれんを起し、時にてんかんに移行する。また、良性家族性新生児けいれん（benign familial neonatal convulsions: BFNC）は新生児早期のけいれんを特徴とし、一般に数ヶ月で自然消退するが、成長後にてんかんを発症することも少なくない。乳児重症ミオクロニーてんかん（severe myoclonic epilepcy in infancy: SMEI）も、熱性けいれんと同様に発熱時のけいれんを初期症状として発症することが多いが、熱性けいれんが予後良好であるのに対し、SMEIは、その後もれんかん発作が頻発し、知能の退行などの重大な障害を生じさせる。さらに、夜間前頭葉てんかんは、一部で常染色体優性形質として遺伝するものがあり、遺伝性の脳障害の可能性がある。
【０００４】
このため、乳幼児期にけいれん発作を示した患者に対しては、それが予後良好なけいれん発作（例えば熱性けれん）であるのか、あるいは予後に危険性を伴う疾患によるものであるかを速やかに診断し、後者である場合には早期の治療処理が必要とされる。その診断は現在、国際抗てんかん連盟の分類および用語委員会（Commission on Classification and Terminology of the International League against Epilepsy）により提出されたガイドラインに基づいて行なわれている（非特許文献1）。
【０００５】
しかしながら、熱性けいれん等の予後良好なけいれん発作と、予後不良なけいれん性疾患（乳児重症ミオクロニーてんかん、良性家族性新生児けいれん、熱性けいれんプラス、夜間前頭葉てんかん等）に関連するけいれん発作とは発作状態が極めて類似している。このため、初発時の身体症状の観察によって両者を診断することは極めて困難である。そこで、乳幼児期のけいれん発作と疾患との関連を診断するための手段として、遺伝子レベルでの診断に大きな期待が寄せされている。すなわち、けいれん発作を伴う予後不良が疾患の発症には家族性の因果関係が存在するためである（例えば、非特許文献2-4）。
【０００６】
乳児重症ミオクロニーてんかんに関連した遺伝子変異としては、ニューロンの電位依存性Na＋チャンネルα1サブユニット遺伝子（SCNA1A）の異常が多く報告されており（非特許文献5-7）、この出願の発明者らも、従来知られていた変異とは異なるSCNA1A変異が乳児重症ミオクロニーてんかんに関連することを見出し、それらの変異を指標とする乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法を特許出願している（特許文献１）。
【０００７】
良性家族性新生児けいれんに関連した遺伝子変異としては、ニューロンの電位依存性K+チャンネル遺伝子（KCNQ2）の塩基置換変異が報告されている（非特許文献8）。
【０００８】
熱性けいれんプラスに関連する遺伝子変異としては、Na+チャンネルβサブユニット（SCN1B）遺伝子の突然変異が同定されている（非特許文献9）。また、Na＋チャンネルαサブユニット遺伝子（SCN1A）の変異も幾つか報告されている（例えば、非特許文献10−13）。またこの出願の発明者らも、熱性けいれんプラスに関連したSCN1A遺伝子およびSCN2A遺伝子の従来未知の変異を特定し、特許出願を行っている（特許文献2）。
【０００９】
さらにヒト染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連する遺伝子変異としては、例えばニューロンニコチン性アセチルコリン受容体α4サブユニット（CHRNA4）遺伝子の変異が知られており（非特許文献14）、そしてCHRNA4遺伝子の変異が具体的には第284位SerがLeuに置換することであることも報告されている（非特許文献15）。
【特許文献１】特開2004-329153号公報
【特許文献２】特開2002-136289号公報
【非特許文献１】Commission on Classification and Terminology of the ILAE (1989) Epilepsia, 30, 389-399.
【非特許文献２】Kaneko, S. et al. (2002) Neurosci. Res., 44(1), 11-30.
【非特許文献３】Oguni, H. et al. (2001) Brain Dev., 23(7), 736-748.
【非特許文献４】Dravet, C. et al. (2002) John Libbey Co Ltd., Eastleigh, UK, 81-103.
【非特許文献５】Claes, L. et al. (2001) Am. J. Hum. Genet.,68(6),1327-1332.
【非特許文献６】Ohmori, I. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 295(1), 17-23.
【非特許文献７】Suagawara, T. et al. (2002) Neurology, 58(7), 1122-1124.
【非特許文献８】Hirose S. et al. Ann Neurol. 47(6):822-6, 2000.
【非特許文献９】Wallace R.H. et al. Nature Genet. 19:366-370, 1998.
【非特許文献１０】Escayg A. et al. Nature Genet. 24:343-345, 2000.
【非特許文献１１】Abou-Khalil B. et al. Neurology 57:2265-2272, 2001.
【非特許文献１２】Escayg A. et al. Am. J. Hum. Genet. 68:866-873, 2001.
【非特許文献１３】Wallace R.H. et al. Am. J. Hum. Genet. 68:859-865, 2001.
【非特許文献１４】Hirose, S. et al., Neurology 53:1749-1753, 1999.
【非特許文献１５】Matsushima, N. et al., Epilepsy Res. 48:181-186, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
遺伝子の突然変異が同定されたことによって、乳幼児期のけいれん発作を初発症状とする予後不良なけいれん性疾患の診断や、あるいは予防・治療法の開発に新たな可能性がもたらされている。例えば、けいれん発作を発症した乳幼児を対象として、変異遺伝子の存在や、変異遺伝子が発現する変異タンパク質の存在を調べることによって、そのけいれん発作が予後不良な疾患によるものであるか否かを事前に高い確率で診断することが可能となる。また、そのような事前診断によって、予防や治療のための処置を早い段階から処方することも可能となる。
【００１１】
しかしながら、けいれん発作を初発症状とする予後不良なけいれん性疾患（乳児重症ミオクロニーてんかん、良性家族性新生児けいれん、熱性けいれんプラス、夜間前頭葉てんかん等）は、その表現型の浸透度が不完全であり、また家族内変異も頻繁にみられるため、遺伝子変異をできる限り多く同定し、複数の変異の総合判断によって診断を行うことが必要である。
【００１２】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、予後不良なけいれん性疾患に関連する、カリウムチャンネルJファミリー遺伝子の変異と、この遺伝子変異を利用したけいれん性疾患診断方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（A）から（I）の発明群に属する(1)〜(43)の発明を提供する。
(A)群発明：変異ポリヌクレオチド
（1）  けいれん性疾患である乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するヒトKCNJ14遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列における第1697位cがtに置換した変異を有するKCNJ14変異ポリヌクレオチド。
（2）  けいれん性疾患である乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するヒトKCNJ10遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号３の塩基配列における第544位cがtに置換した変異を有するKCNJ10変異ポリヌクレオチド。
（3）  けいれん性疾患である良性家族性新生児けいれんに関連するヒトKCNJ13遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号５の塩基配列における第522位gがaに置換した変異を有するKCNJ13変異ポリヌクレオチド。
（4）  けいれん性疾患である熱性けいれんプラスに関連するヒトKCNJ13遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号５の塩基配列における第678位aがgに置換した変異を有するKCNJ13変異ポリヌクレオチド。
（5）  けいれん性疾患である夜間前頭葉てんかんに関連するヒトKCNJ16遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドであって、配列番号７の塩基配列における第1151位gがaに置換した変異を有するKCNJ16変異ポリヌクレオチド。
(B)群発明：変異オリゴヌクレオチド
（6）  前記発明（1）のKCNJ14変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ14変異オリゴヌクレオチド。
（7）  前記発明（2）のKCNJ10変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ10変異オリゴヌクレオチド。
（8）  前記発明（3）のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴヌクレオチド。
（9）  前記発明（4）のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴヌクレオチド。
（10）  前記発明（5）のKCNJ16変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ16変異オリゴヌクレオチド。
(C)群発明：プライマーセット
（11）  前記発明（1）のKCNJ14変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
（12）  前記発明（2）のKCNJ10変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
（13）  前記発明（3）のKCNJ13変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
（14）  前記発明（4）のKCNJ13変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
（15）  前記発明（5）のKCNJ16変異ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異をPCR検出するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補配列であるプライマーセット。
(D)群発明：マイクロアレイ
（16）  前記発明（1）のKCNJ14変異ポリヌクレオチドまたは前記発明（6）のKCNJ14変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
（17）  前記発明（2）のKCNJ10変異ポリヌクレオチドまたは前記発明（7）のKCNJ10変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
（18）  前記発明（3）のKCNJ13変異ポリヌクレオチドまたは前記発明（8）のKCNJ13変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
（19）  前記発明（4）のKCNJ13変異ポリヌクレオチドまたは前記発明（9）のKCNJ13変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
(20)  前記発明(5)のKCNJ16変異ポリヌクレオチドまたは前記発明(10)のKCNJ16変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
(E)群発明：変異ポリペプチド
(21)  乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する前記発明(1)のKCNJ14変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列における第431位Ala残基がVal残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ14変異ポリペプチド。
(22)  乳児重症ミオクロニーてんかんに関連する前記発明(2)のKCNJ10変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号４のアミノ酸配列における第106位Thr残基がIle残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ10変異ポリペプチド。
(23)  良性家族性新生児けいれんに関連する前記発明(3)のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号６のアミノ酸配列における第129位Gly残基がSer残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ13変異ポリペプチド。
(24)  熱性けいれんプラスに関連する前記発明(4)のKCNJ13変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号６のアミノ酸配列における第181位Met残基がVal残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ13変異ポリペプチド。
(25)  夜間前頭葉てんかんに関連する前記発明(5)のKCNJ16変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号８のアミノ酸配列における第222位Arg残基がHis残基に置換したアミノ酸配列からなるKCNJ16変異ポリペプチド。
(F)群発明：変異オリゴペプチド
（26）  前記発明（21）のKCNJ14変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ14変異オリゴペプチド。
（27）前記発明（22）のKCNJ10変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ10変異オリゴペプチド。
（28）  前記発明（23）のKCNJ13変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴペプチド。
（29）  前記発明（24）のKCNJ13変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ13変異オリゴペプチド。
（30）  前記発明（25）のKCNJ16変異ポリペプチドの一部であって、その変異箇所を含むKCNJ16変異オリゴペプチド。
(G)群発明：抗体
（31）  前記発明（26）のKCNJ14変異オリゴペプチドを抗原として作製され、前記発明（21）のKCNJ14変異ポリペプチドを認識する抗体。
（32）  前記発明（27）のKCNJ10変異オリゴペプチドを抗原として作製され、前記発明（22）のKCNJ10変異ポリペプチドを認識する抗体。
（33）  前記発明（28）のKCNJ13変異オリゴペプチドを抗原として作製され、前記発明（23）のKCNJ13変異ポリペプチドを認識する抗体。
（34）  前記発明（29）のKCNJ13変異オリゴペプチドを抗原として作製され、前記発明（24）のKCNJ13変異ポリペプチドを認識する抗体。
（35）  前記発明（30）のKCNJ16変異オリゴペプチドを抗原として作製され、前記発明（25）のKCNJ16変異ポリペプチドを認識する抗体。
(H)群発明：変異ポリヌクレオチドを指標とする診断方法
(36)  乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に前記発明(1)のKCNJ14変異ポリヌクレオチドおよび／または前記発明(2)のKCNJ10変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
(37)  良性家族性新生児けいれんの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に前記発明(3)のKCNJ13変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
(38)  熱性けいれんプラスの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に前記発明(4)のKCNJ13変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
(39)  夜間前頭葉てんかんの診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に前記発明(5)のKCNJ16変異ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
(I)群発明：変異ポリペプチドを指標とする診断方法
(40)  乳児重症ミオクロニーてんかんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明(21)のKCNJ14変異ポリペプチドおよび／または前記発明(22)のKCNJ10変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
(41)  良性家族性新生児けいれんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明(23)のKCNJ13変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
(42)  熱性けいれんプラスの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明(24)のKCNJ13変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
(43)  夜間前頭葉てんかんの診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に前記発明(25)のKCNJ16変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【００１４】
すなわち、この出願の発明者らは、けいれん発作を呈した日本人の患者２７５例についてカリウムチャンネルJファミリー遺伝子（KCNJ）群の変異を直接シークエンス方により検索した。その結果、予後不良なけいれん性疾患の患者から、従来は知られていなかった遺伝子変異（ミスセンス変異）を見出した。
【００１５】
前記の発明(1)〜(43)は、以上のとおりの新規な知見に基づいて完成されたものである。
【００１６】
なお、この発明において「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ヌクレオチドATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が100個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは10-99個連結した分子を言う。なお、この発明におけるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは1本鎖または2本鎖であり、1本鎖の場合はセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方である。
【００１７】
「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した34個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、「オリゴペプチド」は5-33個のアミノ酸残基からなる分子を意味する。
【００１８】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
この出願の（A）群発明は、
発明(1)：乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するKCNJ14変異ポリヌクレオチド−配列番号１（ヒトKCNJ14遺伝子cDNA）の1697c>t変異、
発明(2)：乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するKCNJ10変異ポリヌクレオチド−配列番号３（ヒトKCNJ10遺伝子cDNA）の544c>t変異、
発明(3)：良性家族性新生児けいれんに関連するKCNJ13変異ポリヌクレオチド−配列番号５（ヒトKCNJ13遺伝子cDNA）の522g>a変異、
発明(4)：熱性けいれんプラスに関連するKCNJ13変異ポリヌクレオチド−配列番号５（ヒトKCNJ13遺伝子cDNA）の678a>g変異、
発明(5)：夜間前頭葉てんかんに関連するKCNJ16変異ポリヌクレオチド−配列番号７（ヒトKCNJ16遺伝子cDNA）の1151g>a変異、
である。
【００２０】
この（A）群発明の各変異ポリヌクレオチドは、例えば、後記の（B）群発明の変異オリゴヌクレオチドをプローブとして、それぞれのけいれん性疾患患者の全mRNAから調製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。また後記の（C）群発明のプライマーセットを用い、患者のmRNAを鋳型とするRT-PCRによって単離することもできる。あるいは、野生型KCNJのcDNAに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。得られたcDNAは、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２１】
また、この変異ポリヌクレオチドには、ヒト染色体DNA由来のポリヌクレオチド（ゲノムDNA）も含まれる。このようなゲノムDNAは、前記の変異ポリヌクレオチドまたは後記の変異オリゴヌクレオチドをプローブとするストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーション法によって、例えば患者の染色体DNAから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。ここで、ストリンジェント（stringent）な条件とは、前記の変異ポリヌクレオチドまたは変異オリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約75 mM以下、より好ましくはNaCl約500 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約50 mM以下、最も好ましくはNaCl約250 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約25 mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、最も好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、より好ましくは約37℃以上、最も好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、およびキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好まし態様としては、750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウムおよび1% SDSの条件で、30℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、500 mM NaCl、50 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、100 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、37℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、250 mM NaCl、25 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、200 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、42℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはNaCl約30 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約3 mM以下、最も好ましくはNaCl約15 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約1.5 mM以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約25℃以上、より好ましくは約42℃以上、最も好ましくは約68℃以上である。１つの好ましい態様としては、30 mM NaCl、3 mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、25℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、42℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、68℃の温度により洗浄を行うことである。
【００２２】
以上のとおりの（A）群発明の変異ポリヌクレオチドは、後記の診断方法に使用することができる。また、後記（E）群発明の変異ポリペプチドを遺伝子工学的に作成する場合の材料としても使用することができる。
【００２３】
（B）群発明は、前記（A）群発明の変異ポリヌクレオチドの一部であって、各々の変異箇所を含む20〜99の連続したDNAからなる変異オリゴヌクレオチドである。この（B）群発明の変異オリゴヌクレオチドは、公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。また、（A）群発明の変異ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
【００２４】
このような変異オリゴヌクレオチドは、特にプローブとして使用する場合には、標識物質によって標識化することができる。標識は、ラジオアイソトープ（RI）法または非RI法によって行うことができるが、非RI法を用いることが好ましい。非RI法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Cy Dye TMシリーズのCy3、Cy5等）、ローダミン6G試薬、N-アセトキシ-N2-アセチルアミノフルオレン（AAF）、AAIF（AAFのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。（B）群発明の変異オリゴヌクレオチドもまた、後記の診断方法に使用することができる。
【００２５】
この出願の（C）群発明は、前記（A）群発明の変異ポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、または変異ポリヌクレオチドから転写されるmRNAをPCR増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、置換変異箇所を含む15〜30ntの連続したDNA配列またはその相補配列からなっている。これらのプライマーセットは、配列番号１〜４の変異箇所含む塩基配列に基づいて公知のDNA合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。さらに、配列の設計には、市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００２６】
この（C）群発明のプライマーセットは、後記の診断方法等に使用することができる。
【００２７】
この出願の（D）群発明は、前記の変異ポリヌクレオチドおよび／または変異オリゴヌクレオチドをキャプチャープローブとして備えているマイクロアレイ（DNAチップ）である。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明のマイクロアレイは、このいずれの方法でも作成することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Fodor, S.P.A. Science 251:767, 1991）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、感応基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Lamture, J.B. et al. Nucl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4913, 1996）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Sosnowski, R.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1119-1123, 1997）。この発明のマイクロアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。
【００２８】
この出願の（E）群発明は、
発明(21)：乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するKCNJ14変異ポリペプチド−配列番号２（ヒトKCNJ14）のA431V変異、
発明(22)：乳児重症ミオクロニーてんかんに関連するKCNJ10変異ポリペプチド−配列番号４（ヒトKCNJ10）のT106I変異、。
発明(23)：良性家族性新生児けいれんに関連するKCNJ13変異ポリペプチド−配列番号６（ヒトKCNJ13）のG129S変異、
発明(24)：熱性けいれんプラスに関連するKCNJ13変異ポリペプチド−配列番号６（ヒトKCNJ13）のM181V変異、
発明(25)：夜間前頭葉てんかんに関連するKCNJ16変異ポリペプチド−配列番号８（ヒトKCNJ16）のR222H変異、
である。
【００２９】
すなわち、この変異ポリペプチドは、前記（A）群発明の変異ポリヌクレオチドにおける塩基置換によってコドンが変化した結果、野性型のKCNJタンパク質とは前記のとおりの１アミノ酸残基が変化している。
【００３０】
この変異ポリペプチドは、患者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、あるいは前記（A）群発明の変異ポリヌクレオチド（変異cDNA）を用いて組換えDNA技術で生産する方法などにより取得することができる。この（E）群発明の変異ポリペプチドは、例えば、後記の（H）群発明の診断方法の検査対象とすることができる。
【００３１】
この出願の（F）群発明は、前記の変異ポリペプチドの一部であって、その変異アミノ酸部分を含む変異オリゴペプチドである。このようなオリゴペプチドは、それぞれの変異アミノ酸残基を含む配列番号２、４、６、８のアミノ酸配列に基づき化学合成によって作成することができる。このような変異オリゴペプチドは、例えば前記（E）群発明の変異ポリペプチドを特異的に認識する抗体作成のための抗原分子として利用することができる。
【００３２】
この出願の（G）群発明の抗体は、前記（F）群発明の変異オリゴペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、（E）群発明の変異ポリペプチドの変異アミノ酸を含む領域をエピトープとする全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、前記の変異オリゴペプチドを免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従って作成することができる。これらの抗体は、（E）群発明の変異ポリペプチドを特異的に認識することができ、後記の診断方法等に使用することができる。
【００３３】
この出願の（G）群発明は、被験者が後年、それぞれのけいれん性疾患を発症するか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体DNAを単離し、このDNA中に、（A）群発明の変異ポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者をけいれん性疾患のハイリスクと判定する。被験者は、熱性けいれん経験者やその家族とすることができるが、それらの者に限定されるものではない。変異ポリヌクレオチドの検出は、それを直接シークエンシングする方法によっても行うことができるが、以下の方法を採用することもできる。
【００３４】
すなわち、被験者から単離した染色体DNAまたはそのmRNAと、前記（B）群発明の変異オリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者が疾患に関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体DNAまたはそのmRNAと変異オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、例えば、前記の標識プローブやマイクロアレイを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばAllele-specific Oligonucleotide Probe法、Oligonucleotide Ligation Assay法、Invader法等の公知の方法を採用することができる。また、マイクロアレイでの診断は、例えば以下のとおりに行うことができる。すなわち、被験者の生体試料（例えば血液等）から単離したmRNAを鋳型として、cDNAを合成し、PCR増幅する。その際に、標識dNTPを取り込ませて標識cDNAとする。この標識cDNAをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチド）にハイブリダイズしたcDNAを検出する。ハイブリダイゼーションは、96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注して標識cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、1〜100nl程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜70℃の温度範囲で、6〜20時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識cDNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００３５】
あるいは、変異ポリヌクレオチドを指標とする診断方法では、被験者から単離した染色体DNAまたはmRNAを鋳型とし、前記（C）群発明のプライマーセットを用いてPCRを行った場合のPCR産物の有無を検出するようにしてもよい。被験者が対象疾患に関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのPCR産物が得られる。PCRまたはRT-PCRは公知の方法により行うことができる。ヌクレオチド変異の検出は、PCR産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばPCR-SSCP法、PCR-CFLP法、PCR-PHFA法等を行ってもよい。また、Rolling Circle Amplification法、Primer Oligo Base Extension法の公知の方法を採用することもできる。
【００３６】
この出願の（H）群発明もまた、被験者が後年、けいれん性疾患を発症するか否かを診断する方法であり、被験者から単離した生体試料中に、前記（E）群発明の変異ポリペプチドが存在する場合に、その被験者をけいれん性疾患のハイリスクと判定する。変異ポリペプチドの存在は様々な公知方法によって行うことができるが、前記（G）群発明の抗体（特に標識化抗体）を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ELISA法」）も好ましく用いることができる。
【００３７】
なお、以上の各診断は、これまでに知られている他の遺伝子変異（特許文献1、2、非特許文献5−15など）の検出と組み合わせて行うこともできる。
【００３８】
以下、前記発明の基礎となった遺伝子変異を確認したスクリーニングの手続と結果を示す。
1．方法
1-1．患者
疾患の診断は、てんかん専門医及び小児神経科医により、国際抗てんかん連盟の分類および用語委員会のガイドライン（非特許文献1）等における基準に従って行った。調査は、乳児重症ミオクロニーてんかん患者７９例、良性家族性新生児けいれん患者３９例、熱性けいれんプラス患者１００例、夜間前頭葉てんかん患者１０例、健康なボランティア１７５例を対象に行った。
1-2．遺伝子分析
EDTA処理した全血標本より、QIAamp DNA Blood kit(Qiagen社、ドイツ)を用いてゲノムDNAを調製した。KCNJ遺伝子全てのエクソンをPCR増幅し、自動シーケンサーによる直接的な配列決定法を用いて行った。PCR反応にはTakara LA-taqを用い、反応条件は、製品添付の使用説明書に従った。PCRプライマー、シークエンスプライマーおよびmRNAの参考配列はそれぞれ以下のとおりである。
KCN14 A431V：PCRプライマーの配列は、5’-tttctctgcatctcttcc-3’（配列番号９）、5’-attgccactgcttccttgac-3’（配列番号10）、シークエンスプライマーの配列は、5’-ccatcgcacttatgaggtcc-3’（配列番号11）、5’-gggcattccataaccttccc-3’（配列番号12）。mRNA参考配列はヒトKCNJ14 cDNA（GenBank/NM_013348）を用いた。
KCN10 T106I：PCRプライマーの配列は、5’-gttgagaacgcagaagctgg-3’（配列番号13）、5’-tggcctggaaggatttcaac-3’（配列番号14）、シークエンスプライマーの配列は、5’-gtcagctggatttctacg-3’（配列番号15）、5’-aaagtcaccctcaccactgc-3’（配列番号16）。mRNA参考配列はヒトKCNJ10 cDNA（GenBank/NM_002241）を用いた。
KCNJ13 G129S：PCRプライマーの配列は、5’-ccctttccaaacacctgtag-3’（配列番号17）、5’-cgagagagttggcaaagttg-3’（配列番号18）、シークエンスプライマーの配列は、5’-aaagtccatgagctctcc-3’（配列番号19）、5’-aagacaaattacctgtg-3’（配列番号20）。mRNA参考配列はヒトKCNJ13 cDNA（GenBank/NM_002242）を用いた。
KCNJ13 M181V：PCRプライマーの配列は、5’-gagggtgaactgtgtaagtg-3’（配列番号21）、5’-ttcctgactcactgaaaggc-3’（配列番号22）、シークエンスプライマーの配列は、5’-ttcctgactcactgaaaggc-3’（配列番号23）、5’-ttcagggacagtcttgtc-3’（配列番号24）。mRNA参考配列はヒトKCNJ13 cDNA（GenBank/NM_002242）を用いた。
KCN16 R222H：PCRプライマーの配列は、5’-agatggtatgacactgctcc-3’（配列番号25）、5’-ccaattctgaccacatcagc-3’（配列番号26）、シークエンスプライマーの配列は、5’-gatggcagctgtaatgtc-3’（配列番号27）、5’-ccttggtgtccgacgtgc-3’（配列番号28）。mRNA参考配列はヒトKCNJ16 cDNA（GenBank/NM_018658）を用いた。
2．結果
(1)  乳児重症ミオクロニーてんかん患者の遺伝子分析の結果、KCNJ14遺伝子mRNAにおける1697c>tの変異と、それに伴うKCNJ14タンパク質のA431Vの変異が、さらにKCNJ10遺伝子mRNAにおける544c>t変異と、それに伴うKCNJ10タンパク質のT106I変異が見出された。一方、これらの変異は、健常者１７５名には全く認められなかった。
(2)  良性家族性新生児けいれん患者の遺伝子分析の結果、KCNJ13遺伝子mRNAにおける522g>aの変異と、それに伴うKCNJ13タンパク質のG129S変異が見出された。一方、これらの変異は、健常者１７５名には全く認められなかった。
(3)  熱性けいれんプラス患者の遺伝子分析の結果、KCNJ13遺伝子mRNAにおける678a>gの変異と、それに伴うKCNJ13タンパク質のM181V変異が見出された。一方、これらの変異は、健常者１７５名には全く認められなかった。
(4)  夜間前頭葉てんかん患者の遺伝子分析の結果、KCNJ16遺伝子mRNAにおける1151g>aの変異と、それに伴うKCNJ16タンパク質のR222H変異が見出された。一方、これらの変異は、健常者１７５名には全く認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、カリウムチャンネルJファミリー遺伝子に存在する、けいれん性疾患に関連した新規な遺伝子変異と、この遺伝子変異を利用したけいれん性疾患の診断方法が提供される。これらの発明によって、予後不良なけいれん性疾患の事前診断を確実に行うことが可能となる。
【配列表】
2006325500000001.app