(57)【要約】【課題】神経学的障害を処置するための移植において有用な、起源が明らかで、拡大性を有する細胞を提供する。【解決手段】ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９１６０１、０４１１０３０１、および０４０９２３０２を有する細胞株のいずれかから得られる単離細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９１６０１、０４１１０３０１、および０４０９２３０２を有する細胞株のいずれかから得られる単離細胞。
【請求項２】
治療に使用するための請求項１記載の細胞。
【請求項３】
治療上有効な量の請求項１記載の細胞のいずれか、および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４】
脳細胞の喪失または損傷と関連する障害を処置するための医薬の製造における、請求項１記載の細胞の使用。
【請求項５】
虚血または卒中を処置するための請求項４記載の使用。
【請求項６】
アルツハイマー病を処置するための請求項４記載の使用。
【請求項７】
外傷性脳損傷を処置するための請求項４記載の使用。
【請求項８】
クロイツフェルト・ヤコブ病を処置するための請求項４記載の使用。
【請求項９】
細胞の喪失または細胞の損傷と関連する障害の処置方法であって、請求項１記載の細胞を患者に移植することを含む、方法。
【請求項１０】
障害が請求項４から８のいずれかに記載されたもののいずれかである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種類の生物剤または化学剤の神経系疾患または障害に対する作用を決定する方法であって、請求項１から３のいずれかに記載の細胞の培養物を、該剤と接触させ、次に、該剤の該細胞に対する作用を決定する、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療、特に、卒中、ハンチントン病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、および外傷性脳損傷を含む神経学的障害を処置するための移植において有用な細胞株の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
卒中とは、脳領域に供給する動脈の閉塞または出血により最も共通して引き起こされる、突発性の神経学的欠損に与えられた名前である。脳のいずれかの領域が影響され得る。
【０００３】
主たるヨーロッパ、アメリカ、および日本のマーケットに推定１２００万人の卒中の生存者がおり、これらのマーケットにおける件数は新たに毎年７％で増大している。卒中患者の約３０％が看護を受けることを必要とし、アメリカ合衆国単独でも毎年２５０億ドルから３００億ドル要すると推定される。
【０００４】
卒中後に中度または重度の障害を有する生存者のうちの２０％が、神経幹細胞移植治療の可能性のある候補者である。これらの患者に施す既存の薬物処置には限界があり、状態の原因よりむしろ結果に注意が向けられる傾向にある。
【０００５】
ハンチントン病は、希な、遺伝性、進行性、かつ致命的な神経変性障害である。アメリカ合衆国において、約３５，０００人の患者が該疾患の明らかな徴候を示し、さらに７５，０００人が異常遺伝子を保因する。該疾患の現行の処置は存在しない。
【０００６】
痴呆は、最も破壊的かつ年齢と密接に関連する障害である。最も頻繁に遭遇するタイプは、アルツハイマー型老年痴呆（ＡＤ）であるが、アルツハイマー病のある種（しかし、全てではない）の処置は、最終的に他の痴呆へ適用できると判明し得る。現在、もはや自分自身で身の回りのことを安全にできないアルツハイマー病患者の看護コストは、アメリカ合衆国において１兆ドルに近づくと推定される。年齢はそれ自体、アルツハイマー病のリスク因子であり、集団に占めるアルツハイマー病罹患率は、６５歳から７５歳で２倍となり、そして７５歳から８５歳で再び２倍となり、この時点で３５％がＡＤの徴候を示す。集団のエイジングと共に、次の２０年間にわたり、アメリカ合衆国単独でのアルツハイマー病患者数が、４〜５００万から１０００万件に増大するだろう。社会的および財務上の負担が、比例して拡大するだろう。痴呆はまた、脳への血液供給の喪失、例えば、心停止またはある種の心臓バイパス手術、あるいは呼吸困難または脳の多発性梗塞の後、観察される。
【０００７】
クロイツフェルト・ヤコブ病は、希な障害であり、物理化学的に異常なプリオンタンパク質の蓄積に起因して生じる進行性炎症性神経変性を含む、多くの感染性海綿状脳症の１つである。ウシの疾患である「狂牛」病または牛海綿状脳症（ＢＳＥ）を映す、急激に進行する致命的なプリオン疾患である変異型ＣＪＤの場合において、異型が観察される。英国（おそらくほかの場所でも）におけるこの障害の流行の論理上のリスクは残ったままであり、これは１９８０年代から１９９０年代初頭にかけてＢＳＥ感染牛由来の肉製品の広範囲におよぶ消費に起因する。
【０００８】
外傷性脳損傷は、深刻なことに、アメリカ合衆国単独でも１年で５００，０００人を超える個人に影響し、これは軽い脳震盪から昏睡そして死までの種々の影響を含む。１年で８０，０００〜８５，０００人の患者が、非常に深刻な神経学的欠損または障害となる頭部損傷を受ける。総経済コストの見積り額は、アメリカ合衆国単独でもＴＢＩのプライスタグをほぼ５００億ドルとしている。
【０００９】
幹細胞置換治療は、深刻な細胞喪失および損傷が原因または結果であるものについて上述されたものを含み（しかしこれらに限らない）、多くの疾患の実用可能な処置オプションとみられている。幹細胞は、初期胚から成体までの発生のいずれかのステージでヒト組織からもたらされ得る。初期胚性幹細胞は、いずれの組織からでも細胞を形成できるが；しかしながら、該細胞は、移植された場合に腫瘍を形成するようである。組織が胎児ステージから成体ステージを通じて発生するにつれて、内在する幹細胞集団は、発生の可能性を低減させ、そして生来の腫瘍形成能を失って、組織または系列を制限された幹細胞としても知られている、体性幹細胞となる。体性幹細胞は複数の可能性があり、つまり、それらは起源であるそれらの器官からいずれかの分化した細胞タイプとなることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
胚性幹細胞は、胎児または成体組織由来の体性幹細胞に表現型の上では類似し、そしてそれゆえ腫瘍形成能を失っている、体性幹細胞株の集団を形成させるために「分化させられる」か、あるいは選択されることができる（例えば、特許文献１）。体性幹細胞（成体または胎児組織由来、または胚性幹細胞から分化したもの）のみが、現状の知識で細胞治療に安全な幹細胞を表している。本発明に記載の細胞株は、体性神経幹細胞の例である。
【００１１】
脳由来の体性幹細胞は、パーキンソン病、卒中、ハンチントン病、および脊髄損傷を含む難治性神経学的障害のための処置として提案されてきた。逸話的（anecdotal）臨床報告での初期の成功例にも関わらず、パーキンソン病における原始的なヒト胎児脳組織を用いた管理された移植研究は、一貫した利点を少しももたらさなかった［非特許文献１および２］が、かかる移植の広範囲に及ぶ臨床的応用は、いずれにせよ実際の問題および論理上の問題にとらわれている。
【００１２】
細胞純度および質の両方の点から原始的ヒト胎児組織および細胞の不均一性は、かかる臨床試験の解釈を困難にしている。代わりの生成物は、幹細胞の可能性についての新たな知識に基づき、移植のための拡張可能な精製細胞および組織の供給源として構築され得る。例えば、神経上皮幹細胞、有意には、神経上皮幹細胞集団からもたらされたクローン細胞株が、神経系疾患の動物モデルにおいて機能的欠損を回復できるという証明［特許文献２、および非特許文献３および４］に続き、多くのグループが、胎児のヒト神経細胞が、数ヶ月間、さらに成長因子を含む所定の培地中で（異なる不死化遺伝子の形質導入により）遺伝的に不死化された、あるいは拡大された幹細胞として特殊な培養方法（時に「エピジェネティック」な方法として呼ばれる）を用いて拡大され得ることを示した［非特許文献５および６］。先行技術に記載された神経幹細胞は、実験動物に移植され、生存の証拠を示した。しかしながら、これらの細胞および細胞株は、それらの管理されていない起源および製造に起因してヒト患者における使用に適しておらず、かつヒト神経系疾患の有効な動物モデルでの機能的効果の証拠はまだ示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ヒト幹細胞移植における実際の臨床上および産業上の進歩は、迅速に拡大でき、維持可能な供給源として役立ちうるもので、しかも広範な患者集団の要求に応じて利用可能な、管理された供給源および製造による細胞株の利用可能性に依存する。細胞株は、個々の障害に特異的であるか、あるいは障害の種類を超えて一般的なものであり得る。この目的を達成するために、細胞株は、適当な生物学的特徴（組織または細胞特異的表現型）を伴い生成されなければならず、そしてマスター（master）を創るための拡大可能な製造工程、および細胞の凍結バイアルからなる稼働中の細胞バンク（これから、再生産可能、ＧＭＰ規格、臨床的に多く、かつ商業上生存可能な製品バッチがもたらされ得る）となるのに十分強固でなければならない。この課題の１つのアプローチは、細胞株の再生可能性を保護し、かつそれを早期老化に入ることから守るために不死化遺伝子を使用することである。神経幹細胞株を生成するために用いられてきた不死化遺伝子の例は、（１）テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）［非特許文献７］、（２）ＳＶ４０  Ｔ抗原［Sinden等の前記の特許文献２］、（３）ＳＶ４０  ＴとｈＴＥＲＴの組合せ（特許文献３）、およびｍｙｃタンパク質［Flax等の前記の特許文献４］を含むものである。細胞発生中に正常に発現する、天然に存在するプロトオンコジーンであるｃ−ｍｙｃの遺伝子過剰発現は、本発明において、細胞増殖を安定に増強し、細胞核型の変化を防ぎ、それにより細胞表現型の形質転換を回避する手段として示される。
【００１４】
次に、幹細胞株を治療剤として開発する際の相当な実験から、本出願人は、以下の事柄が、臨床での応用のためのヒト幹細胞株の鍵となる特徴を表すと確信している：
・移植の標的である組織に特有の特定の細胞へ発生できる多能性細胞、
・１つの創始細胞からもたらされる細胞（クローン細胞）、
・正常な染色体を有する遺伝子上安定な細胞、
・インビトロおよびインビボで適当な細胞タイプへの分化能を有する細胞、
・多数に成長し、貯蔵できる細胞、
・安全、特に腫瘍形成能を示さない細胞、
・移植されると、遊走が組織損傷範囲に制限される細胞、
・認定された動物モデルにおいて効果を生じる細胞、
・起源が完全に証明されている細胞。
【００１５】
表面培養または懸濁培養での幹細胞の拡大は、遺伝子不死化なしで可能である（「エピジェネティック培養）一方、ヒト神経幹細胞の拡大は遅く、生じた培養物は分化した子孫を多く含有する。なぜなら、それらは継代培養を生き延びないであろうからである［Vescovi等の特許文献５］。さらに、「エピジェネティック」幹細胞の長期培養は、細胞株の臨床的応用を妨げ得る染色体の変化を誘発し得る。ヒトのエピジェネティック体性細胞株の遺伝子安定性の報告はないが、最近の報告によると、継代回数が増すにつれて胚性幹細胞株の染色体異常が示された［非特許文献８および９］。
【００１６】
それゆえ、エピジェネティックに拡大した細胞株の拡大性は産業上の観点から制限され、生成物は細胞継代から細胞継代で変動し得る。形質転換された細胞の表現型を生じないか、あるいはそうでなければ幹細胞の生物学的有効性または安全性に影響しないが、細胞の産業上の拡大性を増強し、かつ核型を安定させる不死化遺伝子の使用が、非常に望まれている。
【００１７】
過去１０年間にわたり、正常、および細胞増殖、分化、およびアポトーシスでのｍｙｃオンコジーンの役割についての情報が新たに増えてきた。細胞増殖を維持するために、Ｍｙｃタンパク質とＭａｘタンパク質はダイマーを形成し、細胞核に移動し、ここで転写因子として作用する。Recently Coller等［非特許文献１０］は、誘導される２７遺伝子、および初代ヒト胚胎胞においてｃ−ｍｙｃ（細胞ｍｙｃ）の活性化により抑制される９遺伝子を同定した。誘導される標的としては、分裂を維持するために必要とされる細胞周期遺伝子（例えば、Ｇ１サイクリンＤ２）、および細胞死に関与する前アポトーシス遺伝子（例えば、ＴＲＡＰ１）を含み、一方抑制される標的としては細胞外基質および細胞骨格タンパク質をコードする遺伝子を含み、これは細胞接着および構造におけるｍｙｃの役割を示している。最近の報告により、ｖ−ｍｙｃ（ウイルスｍｙｃ）不死化マウス神経幹細胞株が、パーキンソン病の動物モデルにおいて損傷された神経細胞の再生を促進し、かつ機能的回復を促進できることが示された［非特許文献１１］。
【００１８】
細胞増殖を維持するｃ−ｍｙｃの能力は、細胞分裂がインビボで制御され得るという条件で、それを幹細胞不死化の第１の候補とする。ｍｙｃ不死化細胞の治療上の使用のため、好ましい実施態様は、不死化タンパク質が細胞を移植した後に機能しないように、Ｍｙｃタンパク質の機能の制御を可能にするだろう。このことは、移植された細胞による過剰成長または腫瘍形成のリスクを低減するだろう。Ｍｙｃの好ましい条件形態は、Ｍｙｃと修飾エストロゲン受容体のホルモン結合ドメインとの融合体である［非特許文献１２］。
【特許文献１】国際公開第０３／００８６８号
【特許文献２】国際公開第９７／１０３２９号
【特許文献３】国際公開第０１／２１７９０号
【特許文献４】アメリカ特許第５，５８０，７７７号
【特許文献５】国際公開第９９／１１７５８号
【非特許文献１】Freed CR, et al., NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 344 (10): 710-719 MAR 8 2001
【非特許文献２】Olanow et al., ANNALS OF NEUROLOGY 54 (3): 403-414 SEP 2003
【非特許文献３】Sinden et al., NEUROSCIENCE 81 (3): 599-608 DEC 1997
【非特許文献４】Gray et al., PHILOSOPHICAL TRANSACTIONS OF THE ROYAL SOCIETY OF LONDON SERIES B-BIOLOGICAL SCIENCES 354 (1388): 1407-1421 AUG 29 1999
【非特許文献５】Flax et al.,  NATURE BIOTECHNOLOGY 16 (11): 1033-1039 NOV 1998
【非特許文献６】Vescovi et al.,  EXPERIMENTAL NEUROLOGY 156 (1): 71-83 MAR 1999
【非特許文献７】Telomerase immortalization of neuronally restricted progenitor cells derived from the human fetal spinal cord Roy NS, Nakano T, Keyoung HM, Windrem M, Rashbaum WK, Alonso ML, Kang J, Peng WG, Carpenter MK, Lin J, Nedergaard M, Goldman SA NATURE BIOTECHNOLOGY 22 (3): 297-305 MAR 2004
【非特許文献８】Draper et al., NATURE BIOTECHNOLOGY 22 (1): 53-54 JAN 2004
【非特許文献９】Inzunza et al., MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION 10 (6): 461-466 JUN 1 2004
【非特許文献１０】PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 2000; 97:3260-3265
【非特許文献１１】Ourednik et al., NATURE BIOTECHNOLOGY 20 (11): 1103-1110 NOV 2002
【非特許文献１２】Littlewood, et al., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 1995; 23, 1686-1690
【発明の効果】
【００１９】
発明の要約
本発明は、移植治療において有用となる好ましい特徴を有する細胞株の開発に基づくものである。
【００２０】
本発明の第１の態様により、単離された細胞は、ＥＣＡＣＣ受託番号０４０９１６０１、０４０９２３０２、および０４１１０３０１を有する細胞株のいずれかから得られ得る。
本発明の第２の態様により、上で同定された細胞が治療において用いられる。
本発明の第３の態様により、上で同定された細胞が、脳細胞の喪失または損傷と関連する障害の処置のための医薬の製造において用いられる。
【００２１】
本出願人は、神経幹細胞株を、制御可能なｍｙｃ不死化遺伝子を用いて生成させ、修飾して、Ｍｙｃと修飾エストロゲン受容体のホルモン結合ドメインとの融合タンパク質を得た。該融合タンパク質は、人工ホルモン４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）により選択的に活性化される。制御可能な不死化遺伝子を用いることで、培養における無制限な細胞成長および拡大の条件を極大とすることが可能となる一方で、細胞を、移植されたときの４−ＯＨＴの不存下で終末まで分化させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、移植治療に適し、かつ移植の時まで不死である細胞の製造を開示する。
【００２３】
細胞は、エストロゲン受容体により制御される条件形態のＭＹＣオンコジーンの取込みにより修飾される。
【００２４】
本発明の組換え細胞は、治療において用いられる。特に、本発明の細胞は、脳損傷の処置において用いられ得る。脳損傷は、変性疾患により、あるいは外傷または低酸素により引き起こされ得る。好ましい実施態様において、細胞はハンチントン病またはアルツハイマー病の処置において用いられる。
【００２５】
本発明の細胞は、細胞分化において使用の可能性があるか、あるいは神経細胞発生において役割を果たす生物剤または化学剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。スクリーニングアッセイを行い、神経系疾患または障害の処置において可能性のある有益な作用を有する剤も同定され得る。アッセイは、剤を、本発明の１種以上の細胞の培養物と接触させ、次に、該剤が細胞に作用するか否かを決定する、により行われる。アッセイは、懸濁培養にて、あるいは基材表面に接着した接着細胞を用いて行われ得る。作用とは、細胞の分化または細胞の成長特徴に影響する剤の能力であり得る。あるいは、剤は可能性のある薬物であってもよく、スクリーニングアッセイを行い、剤の細胞に対する毒性が研究される。
【００２６】
患者へのデリバリーのための剤形の製剤方法は、当業者に明らであろう。適当な賦形剤、希釈剤などもまた、細胞ベース治療の調製における現行の実践に基づき明らかであろう。デリバリーに必要とされる細胞量は、処置形態、疾患／損傷の重症度、および処置期間にわたり複数用量適用することの必要性に依存して変動するだろう。しかしながら、当業者は、既存の細胞治療に基づき適当な処置を容易に決定できる。
【００２７】
細胞株についてここでさらに詳細に記載する。細胞株を、ＥＣＡＣＣ（European Collection of Animal Cultures, Vaccine Research and Production Laboratories, Public Health Laboratory Services, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, UK）に寄託した。受託番号は次の通りである：
【表１】
2006122045.tif 000002
【実施例１】
【００２８】
（１）細胞株ＣＴＸＯＥ０３の由来および起源
細胞株の概略
ｃ−ＭｙｃＥＲＴＡＭを導入したヒト神経幹細胞は、１２週齢の胎児皮質からもたらされたものである。該株を、ラミニンコート培養フラスコにて、所定の無血清「Reduced Modified Media」（組成については後述）を用いて、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、４−ヒドロキシタモキシフェンの存在下で維持した。日常的培養において、該細胞株は倍加時間およそ２〜３日である。
【００２９】
成長培地において、細胞はネスチン陽性、β−ＩＩＩチューブリン陰性であり、ＧＦＡＰ陽性細胞を低い割合で含んでいる。７日間分化させた後、β−ＩＩＩチューブリン発現がアップレギュレーションされ、神経形態が獲得された。ＧＦＡＰ発現のバックグラウンドは、分化後、低レベルで維持される。
分化後、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ抗原は発現されない。
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲによる分子表現型の決定により、細胞がｍｙｃＥＲ陽性かつネスチン陽性であることを確認した。さらに、一定範囲の神経発生遺伝子が発現していることを同定した。
【００３１】
この細胞株は、３１継代（１００より多くの集団に倍加している）において、遺伝子上正常であり、雄性ＸＹ核型である。該細胞株はサザンブロットによるとクローンであり、ゲノム統合部位は１３番染色体内にあると同定した。既知の遺伝子のうち、この挿入により破壊されるものはない。
【００３２】
妊婦の血清学により、ドナーが偶発的な感染のないことを示したが、サイトメガロウイルス感染の既往歴を見出した（ＣＭＶ抗体  ＩｇＧ陽性、ＩｇＭ陰性）。
【００３３】
ｐＬＮＣ−ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭ
強力なプロモーターによりもたらされるｍｙｃ−ＥＲを生成するために、ｍｙｃＥＲＴＡＭ導入遺伝子を、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）およびネオマイシン耐性遺伝子を含有する、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ−２（clontech）にさらにクローン化した。プラスミドＤＮＡのｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ−ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭを上述の通り増幅した。ｐＢａｂｅ−ｐｕｒｏ−ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭ中のＭｙｃ−ＥＲＴＡＭ配列を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉにより切断した。ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭの２．３ｋｂフラグメントを単離し、ｐＬＮＣＸ−２レトロウイルスベクターのＳｔｕ  Ｉ部位に平滑末端ライゲーションによりライゲーションし、ｐＬＮＣ−ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭを生成した。ｐＬＮＣ−ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭ中のｍｙｃ−ＥＲＴＡＭ遺伝子の向きを、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、およびＢｇｌ  ＩＩを用いた制限酵素切断により決定する。ストックプラスミドＤＮＡのｐＬＮＣ−ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭを「マキシ・プレップ」により精製した。
【００３４】
ＴＥＦＬＹ−Ａ産生株の生成
ＴＥＦＬＹ−ＡおよびＴＥＦＬＹ−ＲＤウイルスパッケージング細胞株（ＣＲＣ  ＵＫからライセンス許諾のもと得た；米国特許第６，１６５，７１５号；フランス、エヴリー、ジェネトンに保管されたＧＭＰ細胞バンクストック）を用いて、ＭＭＬＶベースのレトロウイルスを産生した。細胞株は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を保持している一方で、ウイルスゲノムを、操作する導入遺伝子の選択によりレトロウイルスプラスミドにおいて置き換えている。ＴＥＦＬＹ−ＲＤを用いて、ＴＥＦＬＹ−Ａ株を含む制限した感染性を有するウイルスをパッケージングさせる。ＴＥＦＬＹ−Ａを用いて、哺乳類細胞に対して広範囲の感染性を有する両種性ウイルスをパッケージング／生成した。
【００３５】
ｐＬＮＣ−ｍｙｃＥＲＴＡＭウイルス
ＴＥＦＬＹ−ＲＤ産生細胞を凍結ストックから起こし（revived）、新しい種ストックを確立した。拡大させたストックから、細胞１５０万個を１０ｃｍディッシュに播種し、ｐＬＮＣ−ｍｙｃＥＲＴＡＭプラスミド１２μｇで、Ｆｕｇｅｎｅ−６を用いて標準的方法によりトランスフェクションした。新たなＴＥ培地をトランスフェクションした細胞に一晩加え、パッケージされたウイルスを細胞から翌朝回収した。この一過性のウイルス生成物を用いて、ＴＥＦＬＹ−Ａ産生株を感染させた。
【００３６】
新たに取得したＴＥＦＬＹ−Ａ産生細胞（ＴＥＦＬＹ−Ａ  ロット９７−８−０２Ａ）を凍結ストックから起こし、種ストックを確立した。種ストックから、細胞を起こし、播種し、次にｐＬＮＣ−ｍｙｃＥＲＴＡＭパッケージウイルス含有ＴＥＦＬＹ−ＲＤ由来上清を用いて、８μｇ／ｍｌ  ポリブレン存在下で感染させた。感染ＴＥＦＬＹ−Ａ産生細胞を、２〜３週間、ネオマイシン（Ｇ４１８／ジェネテシン）存在下で拡大培養し、ｍｙｃＥＲＴＡＭウイルス産生細胞の（抗生物質耐性により）選択したバルク集団を生成した。このバルク集団を低密度で播種し、個々のクローンを単離した。６４個のクローンをリング（ring）クローニングにより単離し、２４ウェルプレートに継代した（１クローン／ウェル）。個々のＴＥＦＬＹ−ＡクローンをＴ２５培養フラスコまで拡大させた時点で、細胞を、ウイルス回収のため、８時間より長い間新たなＴＥ培地中で調製した。Ｔｅ６７１細胞に対するウイルスタイターを、回収培地の連続希釈により、ポリブレン８ｍｇ存在下にて決定した。明らかにタイター＞１０６ｃｆｕ／ｍｌであるクローンを拡大させ、等分量（１ｍｌ）５×１０６細胞  ４０本からなるワーキングストックを作成した。「Reduced Modified Media」および「Human Media」に回収したウイルスストックを、初代細胞培養のレトロウイルス形質導入のために得た。
【００３７】
Reduced Modified Media
ＤＭＥＭ：Ｆ１２に以下の成分を添加した。
【表２】
2006122045.tif 000003
細胞拡大のため、塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）および上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）をプラス。
【００３８】
細胞株由来
ＣＴＸＯＥ０３を、臨床上使用するために、指定株を前進させるのに適した品質保証条件下で得た。供給材料として、ヒト神経幹細胞を、解剖後に１２週齢の胎児皮質（ＧＳ０３１）から、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンでの酵素消化により単離した。培養して確立した後、胎児神経細胞に、ｃ−ＭｙｃＥＲＴＡＭオンコジーンをコードする両種性レトロウイルスを感染させ、一定範囲のクローン集団および混合集団細胞株を単離した。
【００３９】
この一連の株全てを、ラミニンコート培養製品にて、上記の指定添加剤および成長因子（上記のｂＦＧＦおよびＥＧＦ）をプラスした、ＤＭＥＭ：Ｆ１２基礎培地を含む無血清Reduced Modified Media（ＲＭＭ）を用いて得た。
【００４０】
成長特徴決定
日常的培養条件下で細胞を凍結ストックから、通常Ｔ１８０培養フラスコ中２〜４００万細胞数まで拡大させる。数回培地交換した後、該細胞をサブコンフレントまで継代する。過程の記録から、ＣＴＸＯＥ０３についての集団の倍加時間は３〜４日であると見積もった。この倍加時間は対数期成長のものより長く、継代培養過程中の細胞の喪失も含んでいる。
【００４１】
ＣＴＸＯＥ０３についての対数期成長のより代表的な評価として、細胞増殖アッセイを、Ｃｙｑｕａｎｔ蛍光ダイ（Molecular Probes, Invitrogen Inc.）を用いてセットアップした。細胞数を、Ｔｅｃａｎ  Ｍａｇｅｌｌａｎ蛍光プレートレーダー；ｅｘ  ４８０ｎｍ；ｅｍ  ５２０ｎｍを用いて測定する。
【００４２】
ＣＴＸＯＥ０３細胞を継代し、成長因子をプラスしたＲＭＭに再懸濁し、ラミニンコート９６ウェルのストリップウエルプレートに４０００細胞／ウェルにて播種した。経時的研究を、ストリップをプレートから取り出し、培地を除去し、次に細胞を−７０℃にて凍結する、により行った。培地（ＲＭＭ／ＨＭ＋ＧＦ＋４−ＯＨＴ）を残りのストリップに入れた。それぞれ翌日、培地をプレートの次の２つのストリップから除去し、−７０℃にて凍結した。時間経過の最後に、全凍結ストリップを一緒にプレートに戻し、Ｃｙｑｕａｎｔアッセイを用いて分析した。一時的に細胞を溶解バッファー中で溶解させ、次にＣｙｑｕａｎｔ試薬を加え、暗所で５分間置いた。次に、各ウェルの試料１５０μｌを、Ｔｅｃａｎ  Ｍａｇｅｌｌａｎプレートリーダー上で読み取るため、黒色Ｏｐｔｉｌｕｘプレートに移した。データを数値平均化するため、スプレッドシートに転送し、分析のためＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにさらに転送した。結果を図１に示す。
【００４３】
ｃ−ｍｙｃ成長促進タンパク質の条件制限
数回の研究を行い、ｃ−ｍｙｃＥＲの４−ヒドロキシタモキシフェン条件制限を一貫して示した。成長因子の存在下または不存下での細胞成長は、培地中への４−ヒドロキシ−タモキシフェンの適用により増強された。この作用は、β−エストラジオールにより模倣されなかった。このことは、エストロゲン受容体上の選択的変異が機能的に維持されていることを示している。結果を図２に示す。
【００４４】
表現型
ＣＴＸＯＥ０３の表現型を免疫細胞化学を用いてプロファイルし、神経幹細胞マーカーであるネスチンについて染色し、次に分化の成熟マーカーであるβ−ＩＩＩチューブリン（神経）およびＧＦＡＰ（星状細胞）について染色した。
【００４５】
アッセイを確立し、成長因子かつ４−ＯＨＴ存在下および不存下にてＣＴＸＯＥ３表現型をプロファイルした。細胞を日常的培養物から継代し、９６ウェル組織培養プレートに４０００細胞／ウェルにて播種した。２つのプレートをセットアップした。３日後、４−ＯＨＴをプラスした成長培地中の１つのプレートの細胞を４％  パラホルムアルデヒド中で固定し、一方で成長因子および４−ＯＨＴを他のプレートから取り除いた。成長因子なしでさらに５日間培養した後、第２の「分化」プレートの細胞を同様の方法で固定した。このアッセイを数回繰り返した。
【００４６】
分化ＩＣＣ画像
細胞を４％  パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温にて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、次に０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ／ＰＢＳを用いて１５分間透過処理した。次に、非特異的結合を、ＰＢＳ中の１０％  正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で１時間、室温にてブロッキングした。次に、細胞に、ネスチンに対する抗体（１：２００；Chemicon；ＭＡＢ  ５３２６）、β−ＩＩＩチューブリンに対する抗体（１：５００；Sigma）、およびＧＦＡＰに対する抗体（１：５０００；DAKO）を用いて、室温にて一晩プローブ結合させた。ＰＢＳで洗浄後、次に、それらを、１％  ＮＧＳ／ＰＢＳに溶解した、フィルター処理したアレクサヤギαマウス４８８（１：２００；Molecular Probes）およびアレクサヤギαウサギ５６８（１：２５００；Molecular Probes）を用いて、１時間、室温にて処理した。次に、それらをＰＢＳを用いて洗浄し、蛍光顕微鏡での分析前に１μｇ／ｍｌ  ヘキスト（Hoechst）３３３４２（Sigma）を用いて、２分間対比染色した。
【００４７】
結果は、ネスチンがダウンレギュレーションされること、および神経マーカーであるβ−ＩＩＩチューブリンがアップレギュレーションされること示した。このことは、成長因子および４−ＯＨＴ不存下での５日間で、細胞はより成熟した神経表現型に分化したことを示している。ＧＦＡＰ（星状細胞）のバックグラウンドが存在し、これは多かれ少なかれ一様に染色されるものであった。
【００４８】
ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ
細胞株上でのＭＨＣ抗原の発現は、細胞のホストによる拒絶に対する感受性に関与し得る。本発明者らは、対照ＣＴＸＯＥ０３細胞および分化した（成長因子を使用せずに１４日間）ＣＴＸＯＥ０３細胞上のＭＨＣクラスＩおよびＩＩの発現をプロファイルした。細胞を、４％  パラホルムアルデヒド中で室温にて固定し、次に、メタノール中で−２０℃にて２０分間固定した。正常ヤギ血清を用いてブロッキングした後、１次抗体を１：１００希釈；［クラスＩ，ＨＬＡ−ＡＢＣ番号７８５５（ＡｂＣａｍ）またはクラスＩＩ，ＨＬＡ−ＤＲ番号７８５６（ＡｂＣａｍ）］にて加えた。ＣＴＸＯＥ０３は、対照細胞株ＯＥ３３と対照的にクラスＩＩを発現しない。同様に、ＣＴＸＯＥ０３は、未分化細胞および分化細胞共に、クラスＩＩ発現陰性であった。
【００４９】
遺伝子安定性
Ｇ結合核型分析
核型決定を以下の通り行った：
Ｔ２５フラスコ培養物から、７０〜８０％  コンフルエントな細胞を洗浄し、ブロモデオキシウリジンで染色し、コルチミド（Colcimid）で処理し、次に低張溶解の対象とした。次に、試料をメタノール：氷酢酸［３：１］中で固定し、−２０℃にて保存した。次に、試料を分析し、正常な核型を有することを示した。Ｇ結合分析を５継代から４０継代でおよそ１０継代毎に行い、異常が検出されない、正常な二倍体染色体を得た。
【００５０】
ＣＴＸＯＥ−０３についてのクローン性／サザンブロット
サザンのトランスファーおよびハイブリダイゼーションを用いて、細胞株のゲノム内のレトロウイルスで形質導入した遺伝子構造物のクローン性および組込を、該構造物に特異的なプローブを用いたマッピングにより、研究することができる。ゲノムＤＮＡ（ＧＤＮＡ）をまず制限酵素を用いて切断し、生じたフラグメントをサイズによってアガロースゲル電気泳動により分離する。次に、ＤＮＡをインサイツで変性させ、ゲルから固体支持体（ニトロセルロースメンブレン）に移した。該メンブレンに接着したＤＮＡを、構造物の特定の部分に対する３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせ、該プローブに相補的なバンドをオートラジオグラフィーにより位置決定する。細胞株がクローンで、１箇所のみの組込部位を有すると、特定のサイズの１本のバンドのみが存在するだろうし、クローンでないと、異なる組込部位に対応する２本以上のバンドが存在するであろう。
【００５１】
結果
ＣＴＸＯＥ−０３についてのサザンブロットは、この細胞株が６ｋｂに存在する１本のバンドを有するクローンであることを示している。
【００５２】
ゲノム組込部位
標的細胞ゲノムへのレトロウイルスＤＮＡの組込は、主として無作為な現象である。インバースＰＣＲを幅広く用いて、多くの細胞株でのレトロウイルス導入遺伝子の組込部位が検出されてきた（Schmidt et al., ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES. 2001. 938:146-155）。それはクローン性を同定するための強力なツールでもある。本明細書において、インバースＰＣＲを用いて、ＣＴＸＯＥ０３株におけるｐＬＮＣ−ｍｙｃ−ＥＲＴＡＭ組込部位を同定した。
【００５３】
ゲノムＤＮＡをＣＴＸＯＥ０３（５×１０６細胞）から単離し、一晩Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した。切断したＤＮＡを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、環状ＤＮＡを形成させた。ｍｙｃＥＲ遺伝子の特定の領域を標的とする２組のプライマーを用いて、環状ＤＮＡ全体をＰＣＲ増幅した。この方法を用いて、ｃ−ＭｙｃＥＲ挿入物のフランキング配列を回収する。ゲノム統合部位に対応するフランキング領域を含有する、〜６ｋｂのフラグメントを１．２％  アガロースゲルにおいて検出した。
【００５４】
安全性
妊婦の血清学により、ドナーが以下の感染を有していないことが示される；
【表３】
2006122045.tif 000004
【００５５】
以下の陽性血清を見出した。
【表４】
2006122045.tif 000005
【実施例２】
【００５６】
（ＩＩ）ｃ−ＭｙｃＥＲＴＡＭ不死化細胞株ＳＴＲＯＣ０５の由来および起源
概略
ｃ−ＭｙｃＥＲＴＡＭを形質導入した神経幹細胞株を、１２週齢の胎児線条体から得た。該株を、ラミニンコート培養フラスコにて、所定の無血清「Human Media」を用いて、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、および４−ヒドロキシタモキシフェン存在下で維持する。日常的な培養において、細胞株は倍加時間３〜４日であるが、短期間の培養においては倍加時間２０〜３０時間が観察された。
【００５７】
成長培地において、細胞は、ネスチン陽性、β−ＩＩＩチューブリンン陰性であり、ＧＦＡＰ陽性細胞を低い割合で含んでいる。７日間分化させた後、β−ＩＩＩチューブリンの低レベルの発現およびＧＦＡＰの強い発現を伴い、ネスチンがダウンレギュレーションされる。このことは、該細胞株が主に星状細胞となることを示唆している。
【００５８】
この細胞株は、５０回の集団倍加にわたり遺伝学的に正常であり、雄性ＸＹであり、かつ安定である。
【００５９】
導入
本明細書に記載の株を、臨床上の使用のために、指定された株を前進させるのに安定な品質保証条件下で得た。供給材料として、ヒト神経幹細胞を、解剖後に妊娠１２週齢の胎児（ＧＳ００６）の線条体から、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンでの酵素消化により単離した。培養して確立した後、これらの初代神経細胞を、ｃ−ＭｙｃＥＲＴＡＭオンコジーン（上でＣＴＸＯＥ０３細胞株について上述）を用いたレトロウイルスの形質導入により形質転換し、一定範囲のクローン集団および混合集団細胞株を単離した。この一連の株全てを、ラミニンコート培養製品にて、Human Media（ＨＭ）；下記の指定添加剤をプラスしたＤＭＥＭ：Ｆ１２を用いて得た。
【００６０】
Human Media（ＨＭ）
下記の成分を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２
【表５】
2006122045.tif 000006
細胞拡大のため、塩基性線維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）および上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）をプラスした。
【００６１】
成長特徴決定
日常的な培養条件下で、細胞を凍結ストックから、通常Ｔ１８０培養フラスコ中２〜４００万細胞数に拡大させる。数回培地交換した後、細胞をコンフルエントまで継代する。過程の記録から、ＳＴＲＯＣ０５についての集団倍加時間は、３〜４日間であると見積もった（添付のグラフに示す）。この倍加時間は、対数期成長のものより長く、また継代中の細胞の喪失を含むものである。
【００６２】
ＳＴＲＯＣ０５についての対数期成長のより代表的な評価として、細胞増殖アッセイを、Ｃｙｑｕａｎｔ蛍光ダイ（Molecular Probes）を用いてセットアップした。細胞数を、Ｔｅｃａｎ  Ｍａｇｅｌｌａｎ蛍光プレートリーダー；ｅｘ  ４８０ｎｍ；ｅｍ  ５２０ｎｍを用いて測定する。
【００６３】
ＳＴＲＯＣ０５細胞を継代し、成長因子をプラスしたＨＭに懸濁し、次にラミニンコート９６ウェルストリッププレートに５０００細胞／ウェルにて播種した。経時的研究を、ストリップを日常ベースのプレートから取り出し（１時間点当たりｎ＝１６ウェル）、培地を除去し、次に細胞を−７０℃にて凍結させる、により行った。
【００６４】
時間経過の最後に、全凍結ストリップを一緒にプレートに戻し、Ｃｙｑｕａｎｔアッセイを用いて分析した。一時的に細胞を溶解バッファー中で溶解させ、次にＣｙｑｕａｎｔ試薬を加え、暗所に５分間置いた。次に、各ウェルの試料１５０μｌを、Ｔｅｃａｎ  Ｍａｇｅｌｌａｎプレートリーダー上での読み取りのため、黒色Ｏｐｔｉｌｕｘプレートに移した。データを数値平均化のためスプレッドシートに転送し、次に分析のためＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにさらに転送した。
【００６５】
結果は、細胞が確立した倍加時間２０〜３０時間で７日間にわたり着実に成長したことを示した。
【００６６】
表現型
ＳＴＲ０Ｃ０５の表現型を免疫組織化学を用いてプロファイルし、神経幹細胞マーカーであるネスチンについて染色し、次に、分化の成熟マーカーであるβ−ＩＩＩチューブリン（神経）およびＧＦＡＰ（星状細胞）について染色した。
【００６７】
ＳＴＲＯＣ０５表現型を、成長因子プラス４−ＯＨＴの存在下および不存下で決定した。細胞は、本来ＳＴＲＯＣ０５ワーキングストックから供給されたものである。細胞を継代し、９６ウェルプレートに播種した。
【００６８】
細胞を、４％  パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温にて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、次に、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００／ＰＢＳを用いて１５分間透過した。次に、非特異的結合を、ＰＢＳ中の１０％  正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を用いて、１時間、室温にてブロッキングした。次に、細胞に、ネスチンに対する抗体（１：２００；Chemicon）、β−ＩＩＩチューブリンに対する抗体（１：５００；Sigma）、およびＧＦＡＰに対する抗体（１：５０００；DAKO）を用いて、室温にて一晩プローブ結合させた。ＰＢＳを用いて洗浄後、次に、それらを、１％  ＮＧＳ／ＰＢＳに溶解した、フィルター処理したアレクサヤギαマウス４８８（１：２００；Molecular Probes）およびアレクサヤギαウサギ５６８（１：２５００；Molecular Probes）を用いて、１時間、室温にて処理した。次に、それらをＰＢＳを用いて洗浄し、蛍光顕微鏡での分析前に、ヘキスト３３３４２（Sigma）を用いて、２分間対比染色した。
【００６９】
成長因子および４−ＯＨＴを培地から取り除くことにより、ネスチンのダウンレギュレーションに付随する、細胞の形態的変化および表現型の変化が誘導される。特に、小集団の細胞が、神経マーカーであるβ−ＩＩＩチューブリン陽性となり、樹状／軸索伸長物へと伸びる円形の細胞体を有する神経形態を獲得する。しかしながら、より主要な表現型の変化はＧＦＡＰのアップレギュレーションであり、これは星状細胞系統優位を示唆している。
【００７０】
クローン性
ＳＴＲＯＣ０５についてのサザンブロット
２度の別々の実験でのデータによると、他の細胞株を用いて観察される明らかなバンドとは対照的に、プローブハイブリダイゼーションの証拠はない。
【実施例３】
【００７１】
（ＩＩＩ）ｃ−ｍｙｃＥＲＴＡＭ不死化細胞株ＨＰＣＯＡ０７の由来および起源
概略
不死化神経幹細胞株を、１２週齢の胎児海馬からもたらした。該株をラミニンコート培養フラスコにて、所定の無血清「Reduced Modified Media」を用いて、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、および４−ヒドロキシタモキシフェンの存在下で維持する。日常的な培養において、該細胞株は倍加時間約２日であり；短期間の培養においては倍加時間２０〜３０時間が観察される。
【００７２】
成長培地において、細胞は、ネスチン陽性、β−ＩＩＩチューブリン陰性であり、ＧＦＡＰ陽性細胞を低い割合で含んでいる。７日間の分化後、β−ＩＩＩリューブリン発現がアップレギュレーションされ、神経形態が獲得される。ＧＦＡＰ発現のバックグラウンドは分化後、低レベルで維持される。
【００７３】
分化後、ＭＨＣクラスＩＩ抗原がアップレギュレーションされるが、クラスＩはされない。
【００７４】
ＲＴ−ＰＣＲによる分子表現型決定により、細胞がｍｙｃＥＲ陽性かつネスチン陰性であることを確認した。さらに、一定範囲の神経発生遺伝子が存在することを同定した。
【００７５】
この細胞株は、８継代（２０回より多くの集団倍加）にて核型上正常であり、雌性ＸＸである。その後の継代データは現在処理中である。
妊婦の血清学により、ドナーが主な感染症を有していないことが示される。
【００７６】
導入
供給材料として、ヒト神経幹細胞を、解剖後、妊娠１２週齢の胎児海馬から、機械的粉砕と組み合わせたトリプシンでの酵素切断により単離した。培養して確立した後、胎児神経細胞を、ｍｙｃＥＲＴＡＭオンコジーンでのレトロウイルスの形質導入により形質転換し、一定範囲のクローン集団および混合集団産生細胞株を単離した。
【００７７】
この一連の株全てを、ラミニンコート培養製品にて、Reduced Modified Media（ＲＭＭ）（上記参照）として、指定添加剤をプラスしたＤＭＥＭ：Ｆ１２基礎培地を含む組成について知られている無血清培地を用いて得た。
【００７８】
成長特徴決定
日常的な培養条件下で、細胞を凍結ストックから、通常Ｔ１８０培養フラスコ中２〜４００万細胞数まで拡大させる。数回培地を交換した後、細胞をコンフルエントまで継代する。過程の記録から、ＨＰＣＯＡ０７についての集団倍加時間は３〜４日であると見積もった。この倍加時間は、対数期成長のものより長く、そして継代中の細胞の喪失を含むものである。
【００７９】
細胞増殖アッセイ
ＨＰＣＯＡ０７についての対数期成長のより代表的な評価として、細胞増殖アッセイをＣｙｑｕａｎｔ蛍光ダイ（Molecular Probes）を用いてセットアップした。細胞数を、Ｔｅｃａｎ  Ｍａｇｅｌｌａｎ蛍光プレートリーダー；ｅｘ  ４８０ｎｍ；ｅｍ  ５２０ｎｍを用いて測定する。
【００８０】
ＨＰＣＯＡ０７細胞を継代し、成長因子をプラスしたＲＭＭに再懸濁し、ラミニンコート９６ウェルストリッププレートに４０００細胞／ウェルにて播種した。経時研究を、ストリップをプレートから取り出し、培地を取り除き、次に細胞を−７０℃にて凍結する、により行った。培地（ＲＭＭ／ＨＭ＋ＧＦ＋４−ＯＨＴ）を残りのストリップに再び入れた。それぞれ翌日に培地をプレート上の次の２つのストリップから取り出し、−７０℃で凍結した。
【００８１】
時間経過の最後に、全凍結ストリップを一緒にプレートに戻し、Ｃｙｑｕａｎｔアッセイを用いて分析した。一時的に細胞を溶解バッファー中で溶解し、次に、Ｃｙｑｕａｎｔ試薬を加え、暗所に５分間置く。各ウェルの試料１５０μｌを、Ｔｅｃａｎ  Ｍａｇｅｌｌａｎプレートリーダー上での読み取りのため、黒色Ｏｐｔｉｌｕｘプレートに移した。
細胞を、４〜５日間にわたり、倍加時間１〜２日で拡大させた（図３に示す）。
【００８２】
表現型
ＨＰＣＯＡ０７の表現型を免疫細胞化学を用いてプロファイルし、神経幹細胞マーカーであるネスチンについて染色し、次に、分化の成熟マーカーであるβ−ＩＩＩチューブリン（神経）およびＧＦＡＰ（星状細胞）について染色した。
【００８３】
実験を行い、成長因子プラス４−ＯＨＴ存在下および不存下でＨＰＣＯＡ０７表現型をプロファイルした。対照（未分化）細胞、および成長因子および４−ＯＨＴの不存下で７日間成長させた細胞を、４％  パラホルムアルデヒド中で固定し、上述の免疫細胞化学の対象とした。
【００８４】
細胞を、４％  パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温にて固定し、ＰＢＳを用いて洗浄し、次に、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００／ＰＢＳを用いて１５分間透過した。次に、非特異的結合をＰＢＳ中の１０％  正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を用いて、１時間、室温にてブロッキングした。次に、細胞を、β−ＩＩＩチューブリンに対する抗体（１：５００；Sigma）、およびＧＦＡＰに対する抗体（１：５０００；DAKO）を用いて、室温にて一晩プローブ結合させた。ＰＢＳを用いて洗浄した後、次に、それらを、１％  ＮＧＳ／ＰＢＳに溶解した、フィルター処理したアレクサヤギαマウス４８８（１：２００；Molecular Probes）およびアレクサヤギαウサギ５６８（１：２５００；Molecular Probes）を用いて、１時間、室温にて処理した。次に、それらをＰＢＳを用いて洗浄し、蛍光顕微鏡で分析する前に、ヘキスト３３３４２（Sigma）を用いて、２分間対比染色した。
【００８５】
画像は、神経細胞と一致する形態変化に付随した、神経マーカーであるβ−ＩＩＩチューブリンのアップレギュレーションを示している。ＧＦＡＰ染色により示されるように、対照細胞および分化細胞共に星状細胞は低レベルで存在する。
【００８６】
ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ
細胞をラミニンコート９６ウェルプレートにセットアップし、成長因子プラス４−ＯＨＴをプラスしたＲＭＭにて拡大させた。細胞を、成長因子および４−ＯＨＴを培地から取り除くことにより、７日間または１４日日間分化させた。
【００８７】
ＭＨＣクラスＩは、７日または１４日後、対照細胞または分化細胞において発現しない。対照的にＭＨＣ  ＩＩは、分化細胞において、特に１４日で強く発現する。未分化細胞はＭＨＣ  ＩＩ発現を示さない。
【００８８】
遺伝子安定性
核型決定分析
細胞は、正常雌性核型を有すると示された。
【００８９】
クローン性
ＨＰＣＯＡ０７についてのサザンブロットは５ｋｂの１本のバンドを示し、これは、この細胞株がクローンであることを示唆している。
【００９０】
安全性
ＧＳ０１１の由来である妊婦の血清学により、ドナーが以下の感染症を有さないことが示される；
【表６】
2006122045.tif 000007
【実施例４】
【００９１】
細胞の治療上の使用
ＣＴＸＯＥ０３幹細胞株は、ラットにおいてＭＣＡｏ卒中後の欠損を低減する。
【００９２】
この研究の目的は、本発明により開発されたヒト神経幹細胞株の、ヒト閉塞性卒中の確立モデルであるラットにおける中大脳動脈閉塞後の機能的回復を促進する際の有効性を試験することであった。
【００９３】
２種類のヒト細胞株、ＣＴＸＯＥ０３（ｎ＝１０）、および線条体から得られた同様の表現型を有する細胞株ＳＴＲＯＢ０５（ｎ＝９）を、７０分間の腔内右中大脳動脈閉塞により誘発された卒中後、３から４週間で皮質および線条体（両側）に移植した。２種類のビークル移植対照群は：卒中（ｎ＝７）および偽手術（ｎ＝１１）であった。移植の６から１２週後、全４群を、損傷体積、細胞分布および分化の組織学的検証前に、両側性非対称の、触毛誘発性前肢置き直し（placing）、旋回の偏向性、および空間学習課題について試験した。
【００９４】
細胞株移植物を有するラットは、卒中対照動物と比較して、低減した両側非対称性およびアンフェタミン誘発性旋回を示した。ＳＴＲＯＢ０５群もまた、卒中対照と比較して、前肢の置き直し試験において低減した機能不全を示した。これらの改善は偽対照レベルには至らなかった。細胞株移植群のいずれも、卒中のみの群と比較して、空間学習課題において低減した機能不全、または損傷体積の差を示さなかった。ＳＴＲＯＢ０５移植物は良好な生存を示したが、移植細胞は、ＣＴＸＯＥ０３群の同数のラットにおいて観察された。細胞株のいずれも、移植後１４週目において、神経系の分化を示さなかった。結論として、移植した細胞株の両方が、行動回復を研究過程にわたって促進した。
【００９５】
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）は、神経学的な、感覚運動試験および空間記憶試験を用いて明らかとされる、行動上の欠損を生じる。閉塞後３０日目までに、動物の多くの欠損が自発的に緩和され、並行して、回復が卒中後何ヶ月にもわたり患者において観察される。本発明者らは、試験を、長期間の欠損を同定し、改善が実際の回復（低減した卒中の損傷または加速したリハビリテーションではなく）に影響することを確認する際の強固なこの研究において用いた。
【００９６】
材料と方法
ＭＣＡｏ
オスＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（Charles Rivers）を、閉塞に先立ち、７日間、無制限の食事を与えて収容し（１２：１２時間  明・暗）、群化した。手順は、ＵＫ動物（科学的）手順法（１９８６）およびＲｅＮｅｕｒｏｎ  Ｌｔｄの倫理的再検討プロセスに従った。
【００９７】
動物（３２０〜３７０ｇ）に手術の準備をし、シリコンでコートした３〜０プロレンフィラメント（Halford's UK）を用いた、７０分間の中大脳動脈閉塞の対象とした。ハロタン（７０％  ＮＯ２／３０％  Ｏ２中）麻酔をフィラメントの挿入および除去のため、直腸プローブおよび加温パッドにより３７±１℃に保った温度で用いた。フィラメントを挿入（〜２０ｍｍ）し、動物を麻酔から回復させた。閉塞中６０分の時点で、動物の行動の機能不全（前肢の屈曲および対称性旋回行動）について評価した。機能不全を示さなかった動物を、研究から除外した。閉塞期間の最後に、動物を再び麻酔し、フィラメントを一部回収し、ＭＣＡの基礎を明らかにした。傷を閉じ、生理食塩水を投与し、次に、動物を加温チャンバーに２時間置いた。動物を術後ケアした。偽ＭＣＡｏ動物を麻酔し、５〜６ｍｍのフィラメントを配置した。
【００９８】
ＭＣＡｏ後２日間、水分補給治療（生理食塩水中のＤｕｐｈａｌｙｔｅ［Fort Dodge］５ｍｌ  ５０：５０混合物）を受けた動物全てを、神経学的機能不全について記録し、計量した（さらに、水分補給治療を、続けて記録し、計量する必要に応じて施した）。閉塞前の体重に達したら、動物をテープ取り除き（tape removal）課題およびローターメーター（rotameter）課題（以下参照）で試験し、試験バッテリーについての基礎となるスコアを用意し、実験群のバランスをとることを可能とした。ラットを、いずれかの偽、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）のビークル注入、ＳＴＲＯＢ０５移植またはＣＴＸＯＥ０３移植のいずれかに割り当てた。
【００９９】
ＳＴＲＯＢ０５およびＣＴＸＯＥ０３細胞株を回収し、ＮＡＣ（Sigma）中〜５０，０００細胞／μｌの密度で懸濁した。細胞を移植期間中２回調製した。細胞生存率を、移植手術開始時および移植後の両方でトリパンブルー排除（Sigma）により記録した。細胞生存率は、移植前および後で高かった（８５％を超えた）。対照ＭＣＡｏおよび偽動物の両方に、移植ビークルであるハンクス干渉塩溶液（Sigma）中のＮＡＣ（Sigma）を挿入した。
【０１００】
閉塞後３〜４週間にて、動物に、クレマホールｅｌ（Cremaphore el）（Sigma）中のシクロスポリンＡ（ＣＳＡ）(Sandimmun，１０ｍｇ／ｋｇ  皮下：Sandoz）を注射し、次に２４時間後に移植した。動物を、塩酸メデトミジン（ドミター（Domitor），０．５ｍｇ／ｋｇ，腹腔内  Pfizer）で前麻酔し、次に、塩酸ケタミン（ベタラール（Vetalar）  ８０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内  Pharmacia Upjohn）で麻酔した。準備後、動物を定位の枠内に入れ、頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させ、次に、プレグマを配置した。移植物を、平ら状の１０μｌ  ハミルトンシリンジを用いて４部位に、プレグマに対して次の座標で閉塞された大脳に対して同側性かつ対称性に沈着させた：（＋０．７ｍｍ  ＡＰ、±３．０ｍｍ  Ｌａｔ、−５．５、−２．０ｍｍ  Ｖｅｒｔ；−０．３ｍｍ  ＡＰ、±０．３５ｍｍ  Ｌａｔ、−５．５、−２．０ｍｍ  Ｖｅｒｔ）。細胞を１μｌ／分の速度で注入し、シリンジを流れを低減させるためにさらに１分間同じ場所に入れたままにした。全細胞（４００，０００個／動物）を注入したら、傷を縫合し、動物に生理食塩水の水分補給を施し、次に抗炎症処置；（メチルプレドニゾロン；メドロン  ２０ｍｇ／ｋｇ  皮下  Pharmacia Upjohn）およびＣＳＡを施した。塩酸アチパメゾール（アンチセダン，０．１ｍｇ／ｋｇ，Pfizer）を用いて麻酔をさまし、塩酸ブプレノルフィン（vetergesic，０．１ｍｇ／ｋｇ，Alstoe  Animal Health）を含む鎮痛剤を与えた。動物が麻酔から完全に回復したら、それらに、水分補給治療を含む術後ケアを術後２日間施した。動物は、２０日間毎日、メドロンで、そして研究過程にわたり毎週３回ＣＳＡで術後免疫抑制処置を受けた。
【０１０１】
移植後６週間にて、動物に感覚運動試験バッテリーを開始した。動物は、１セッションあたり３トライアルの前肢の置き直し試験を１週間当たり１回、１セッション当たり２トライアルの粘着性テープ試験を２回、そして生理食塩水とアンフェタミンとを交互に１週間当たり０．５時間のローターメーター試験を１回受けた。移植後１２週間で、感覚運動試験を終了し、動物を、１０日の実施日についてのモリス水迷路での習得について試験した。
【０１０２】
触毛誘発性前肢の置き直し試験
動物を、１本の前肢を自由にしたままで、テーブルトップまで移動させた。触毛がテーブルをなでると、同側の肢をテーブル上に置く。片側当たり３回なでた後の適当な肢の置き直し回数を記録した。
【０１０３】
両側非対称性
感覚運動機能不全の両側非対称性試験により、影響された前肢および影響されていない前肢の周りを覆った粘着性テープストリップ（〜１×６ｃｍ）と接触させ、取り除くのにかかる時間の格差を３００秒間測定した。
【０１０４】
ローターメーター
ローターメーター（ＴＳＥ  ＧｍｂＨ）により、アンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ  皮下，Sigma）または生理食塩水投与に応答したモーター旋回非対称性を測定した。旋回の偏向性を、両方向の合計回転数で割った反右回り回転数として、計算した。
【０１０５】
組織学的評価
動物にペントバルビタール（Animalcare）を過剰投与し、ヘパリン添加生理食塩水を用いて心臓経由で流し、次に、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ中の４％  パラホルムアルデヒドを用いて潅流した。脳を、３０％  スクロースにより凍結保護し、凍結ミクロトーム（Frigomobile：Leica）をスライドさせて、５０μｍの切片に切り出した。損傷体積を、シンプソンのルールにより２０個の切片毎に、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（Media Cybernetics）により分析したデジタル顕微鏡画像を使用して計算した。移植した細胞を、ヒトの核タンパク質に対して生じた抗体（ＨｕＮｕｃ  Chemicon Inc）を使用して同定した。移植した細胞の分化を、表現型マーカーである、神経線維およびＫＩ−６７をヒトタンパク質を用いた共局在決定により、決定した。１次抗体と一晩インキュベーションし、蛍光抗マウスまたは抗ウサギ２次抗体を１時間適用した。
【０１０６】
統計的分析
両側非対称性試験の結果を、対象因子間としての群、および対象因子内としてのトライアル／日数を用いた両方向ＡＮＯＶＡ（Prism）により分析した。ｔ検定を用いて、ローターメーター試験における損傷前の能力対損傷後の能力を分析した。ローターメーター、ヒゲ、および損傷体積における群差について、１方向ＡＮＯＶＡを用いた。ｈｏｃ検定後にボンフェロニーを用いて、群を比較した。
【０１０７】
結果
閉塞された動物は、著しい神経学的機能不全を閉塞後最初の７から１４日間示した。この機能不全は中程度の体重減少（＜３０％）を伴って生じた。機能不全および体重減少は、通常、閉塞後１４日以内に解消された。ｈｏｃ後分析により、閉塞後７日目における体重減少は、本研究において全ての動物を分析したときの最終損傷体積に対応した（ｒ＝−０．７０５，ｐ＜０．０，００１）。
【０１０８】
触毛誘発性前肢の置き直し試験
全３つの閉塞群において、影響された肢と影響されていない肢との間で肢の置き直し回数に有意な差があった（ｐ＜０．０００１）。偽群内において、肢の置き直しに差はなかった。偽群と閉塞された群との間で影響された肢の置き直しに有意な差があった（ｐ＜０．００１  全ての群）。また、ＳＴＲＯＢ０５移植対照と卒中対照（ｐ＜０．０１）、およびＣＴＸＯＥ０３（ｐ＜０．００１）移植群との間で影響された肢の置き直しに有意な差があった。ＳＴＲＯＢ０５群は、影響された肢についての偽群で観察された置き直しレベルに至らなかった。
【０１０９】
両側非対称性試験
対照；影響を受けた（左）肢上のテープを、卒中対照処置動物（これは偽ＳＴＲＯＢ０５より長くかっかた）およびＣＴＸＯＥ０３移植群と接触させる時間に有意な差があった（ｐ＜０．０１  全ての群，ＡＮＯＶＡ）。また、偽動物（卒中対照より長くかかった）を含む群とＣＴＸＯＥ０３群との間で、影響を受けていない肢上のテープを接触させる際に有意な差があった（ｐ＜０．０５，  ＡＮＯＶＡ）。
【０１１０】
取り除き；ＮＡＣ処置動物を含む群（偽ＳＴＲＯＢ０５より長くかかった）とＣＴＸＯＥ０３移植群との間で、テープを影響を受けた（左）肢から取り除く際に有意な差があった（ｐ＜０．００１  全ての群  ＡＮＯＶＡ）。偽動物を含む群（ＮＡＣ、ＳＴＲＯＢ０５より長くかかった）とＣＴＸＯＥ０３移植群との間で有意な差があった（ｐ＜０．０００１  全ての群，２方向性ＡＮＯＶＡ）。
【０１１１】
ローターメーター
生理食塩水：生理食塩水投与後の自発的旋回の非対称性は、移植後ＮＡＣ処置群と比較して、ＣＴＸＯＥ０３および偽群で有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＳＴＲＯＢ０５（ｐ＜０．０１）およびＣＴＸＯＥ０３（ｐ＜０．０５）群での移植前の能力と比較して、移植後の自発的旋回の偏向性は有意に低減した。
【０１１２】
アンフェタミン：損傷に対して同側のアンフェタミン誘発性旋回の非対称性は、移植後の閉塞ＮＡＣ処置動物と比較して、細胞株移植動物および偽動物で低減された（ｐ＜０．００１）。偽群と細胞株移植群との間で有意な差は依然として存在し（ｐ＜０．０１）、かつ移植群はカウンター右回り旋回をより高い割合で有していた。ＳＴＲＯＢ０５（ｐ＜０．０５）群およびＣＴＸＯＥ０３（ｐ＜０．０１）群の移植前の能力と比較して、移植後のアンフェタミン誘発性非対称性は有意に低減された。
【０１１３】
損傷体積；偽群（２４．０  ＜≡〜５．１ｍｍ３）とＮＡＣ群（２２０．６  ＜≡〜３２．５ｍｍ３）、ＳＴＲＯＢ０５群（２５０．０  ＜≡〜３７．０ｍｍ３）とＣＴＸＯＥＯ３（２１４．２  ＜≡〜３６．５ｍｍ３）群の間で、損傷組織体積に有意な差があり（ｐ＜０．００１  全ての群，ＡＮＯＶＡ）、ＮＡＣ群と移植群との間では差がなかった。損傷は、典型的には、感覚皮質および運動皮質、および線条体中で生じていた。視床の萎縮は続発性の変性を示したが、海馬に対する著しい損傷は明らかではなかった。
【０１１４】
免疫組織化学
ヒト細胞をＳＴＲＯＢ０５移植群とＣＴＸＯＥ０３移植群の両方で同定した。たいていのＳＴＲＯＢ０５移植動物（７／９）で良好に生存していたが、ＣＴＸＯＥ０３動物では、９匹中たった２匹の動物で良好に生存していた。いずれの細胞株も、長期生存した動物のいずれにおいても神経細胞への分化を示さなかった。ＳＴＲＯＢ０５細胞は、実質外の腔領域におけるヒトの核タンパク質およびＫＩ−６７タンパク質発現（細胞分裂のマーカー）のある種の共局在性を有しており、このことは、局在の合図が細胞分裂を促進したことを示唆している。ＣＴＸＯＥ０３移植動物の１匹において、切片中への細胞の遊走を含む良好な遊走が生じた。
【実施例５】
【０１１５】
ＳＴＲＯＣ０５およびＣＴＸＯＥ０３幹細胞株は、ラットの線条体のキノリン酸損傷（ハンチントン病モデリング）後の欠損を低減した
本研究は、ハンチントン病（ＨＤ）の部分モデルとしての片側（左側）キノリン酸線条体損傷により誘発された欠損を有するラットにおける、ヒトＭｙｃＥＲＴＡＭ細胞株ＳＴＲＯＣ０５およびＣＴＸＯＥ０３の作用を評価することを目的とする。
【０１１６】
キノリン酸は、線条体においてＤＡＲＰＰ３２陽性神経細胞への選択的損傷を生じ、これは、一様であり、かつ他の細胞タイプ群にわたる。これらの別個の損傷は、空間学習におけるアンフェタミン誘発性旋回偏向性または欠損を生じなかった。しかしながら、欠損は、特に右肢の感覚運動試験（粘着性テープ取り除き時間）および運動機能（階段上での球粒の回収）試験において観察された。誘発性潅流応答性において顕著な損傷作用があり、これは体旋回試験およびヒゲ試験で示された。ＳＴＲＯＣＯ５移植群は、階段上での球粒の回収試験、体旋回偏向性、およびヒゲ刺激後の肢の置き直しにおいて、損傷のみの動物と比較して優位な改善を示した。ＣＴＸＯＥ０３移植群は、体旋回偏向性およびヒゲ刺激後の肢の置き直しにおける能力で同様の改善を示した。移植物を、移植ラットの約５０％において長期間視覚化できた。これらの結果は、神経細胞へアウトプットする中位突起線条体のＨＤ様喪失のあるラットにおける一定範囲の運動応答性の回復の可能性を示す。
【０１１７】
材料と方法
オスＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（Charles Rivers）を、手術に先立ち７日間、無制限の食事を与えて収容し（１２：１２  明・暗）、群化した。手順は、ＵＫ動物（科学的）手順法（１９８６）およびＲｅＮｅｕｒｏｎ  Ｌｔｄの倫理的再検討プロセスに従った。
【０１１８】
動物（平均体重  ３７９ｇ）に手術の準備をした。損傷のため、ラットをケタミン（ケタラール，８０ｍｇ／ｋｇ，PharmaciaおよびUpjohn Ltd. UK）およびメデトミジン（ドミター  ０．５ｍｇ／ｋｇ，Pfizer, UK）を用いて麻酔し、アティパメゾル（アンチセダン；Pfizer, UK）を用いてさまし、定位の枠（Kopf，Tujunga CA）に入れた。恒温毛布を用いて、体温を保った。頭蓋骨に穴をドリルであけ、ポンプにより動かされる１０μｌ  ハミルトンシリンジ（ハーバードの器具）に注入することにより、接着したカニューレの挿入を可能とした。次の座標を、平らな位置（とりわけ、耳のラインより下３．５ｍｍ）にある頭蓋骨の左側の損傷について用いた。
（１）ＡＰ＝０．０；Ｌ＝＋３．５；Ｖ＝−４．５、および（２）ＡＰ＝＋１．２；Ｌ＝＋２．８；Ｖ＝−４．５
【０１１９】
０．０８Ｍ  キノリニン酸（Sigma, UK）を、キノリン酸（２，３−ピリジンジカルボン酸，Sigma UK）１３．３６８ｍｇ量り取り、ＰＢＳ  ０．５ｍｌおよび１Ｍ  水酸化ナトリウム溶液  １０〜２０μｌを加え、次に溶解するまで超音波処理して、調製した。ｐＨをチェックし、必要に応じて調節し、次に該溶液をＰＢＳを用いて１ｍｌにした。キノリン酸１．０μｌを２分かけて注入した。カニューレをさらに２分間同じ場所に置いたままにし、毒素を拡散させた。手術は２週間かけて行った。
【０１２０】
手術−移植：ラットを麻酔し、枠内に入れ、次に損傷のため頭蓋骨部位を用意した。次の座標の損傷部位にある１０μｌ  平ら状ハミルトンシリンジが細胞懸濁液を供給した：
１）ＡＰ＝０．０；Ｌ＝＋３．６；Ｖ＝−５．５，−４．５、および（２）ＡＰ＝＋１．２；Ｌ＝＋２．８；Ｖ＝−５．５，−４．５。
【０１２１】
５０，０００細胞／μｌの密度の２つの沈着物３μｌを、各部位に３分かけて供給した（すなわち、６μｌ＝３００，０００細胞／ラット）。シリンジを最初に最も深いポイントまで下げ、細胞１．５μｌを分注し、次に、針を上部へ持ち上げ、残りの懸濁液１．５μｌを供給した。分注後２分間まち、シリンジをゆっくり回収した。各部位の懸濁液を新たに採取した。細胞を新たに調製し、１日に２回（ａｍ、ｐｍ）に供給し、ベンチ（bench）上での劣化を低減させた。
【０１２２】
全ラットは、１：４の比のクレマホールＥＬ（ＣＳＡ／ＣＥＬ）中のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ  皮下）からなる免疫抑制処置を受け、これは手術前日に開始し、潅流まで３日／週間で続けた。さらに、ラットに、ｎ−メチルプレドニサロン（Solumedron）を毎日２週間注射（２０ｍｇ  皮下）し、これは手術前日に開始した。
【０１２３】
最終的な群の大きさは：損傷および偽移植：Ｎ＝７、対照：Ｎ＝９、ＳＴＲＯＣ０５：Ｎ＝９、ＣＴＸＯＥ０３：Ｎ＝１２であった。
移植後６週間にて、ラットに行動試験を開始した。
【０１２４】
反射運動応答試験：
体旋回試験（ＢＳＴ）  ラットを実験装置前のオープンケージに入れ、尾の付け根を床面より上に１０秒間持ち上げた。後肢が中線を動物の左または右にまたぐ、明瞭なキックとして定義される旋回を記録した。好ましくは、２回の実験、保持するために１回、そして記録するために１回を用いた。これにより内部実験信頼性が与えられた。ラットがまず損傷側（この場合、左）に旋回したら、旋回の強度についてスコア１〜３を記録した。対称性の旋回をスコア０と記録した。スコアの評定内信頼性は比較的低く、そのためこの質的測定値を、偏向性を測定するための結果の最終分析には用いず、％  左旋回を用いた。
【０１２５】
各セッション（ブロック）は、３回の１０秒間のリフトからなった。１セッションを、損傷手術後の週において行い、該損傷を評価し、次に、６ブロックを、移植後６〜１２週にわたり１週間の間隔で行い、移植の効果を評価した。
【０１２６】
触毛刺激に応答した肢の置き直し
ラットは一方の前肢を自由に、そして他方を固定し、自由な肢に隣接したヒゲがテーブルの側面を優しくなでた。ラットは即時にテーブルに触れることができた。しかしながら、片側性損傷のあるラットは、しばしば、損傷と対称性の肢をテーブルトップに置くことができなかった。各セッションは、片側について３回のトライアル（交互）からなった。ラットに、達したらスコア１を、そして５秒内に応答できなかったらスコア０を記録した。４回のセッションを移植後９〜１０週間目の行動試験の最後に行った。
【０１２７】
感覚運動機能不全試験：
階段試験：
装置は、各段に球粒のためのへこみのある、２つの７段の階段に隣接したプラットホームにアクセスできるエントリーチャンバーからなる。ラットは、プラットホームを登ると、各段上の球粒（２  Ｃｏｃｏ  Ｐｏｐｓ；Kellogs Ltd.）に至る。プラットホームの端にある狭い縁がラットが球粒を粉々にするのを防ぎ、十分な回復のためには、各側について右前肢および左前肢を用いて、球粒をつかみ、次に口まで持ち上げなければならない。ラットに、１セッション当たり５分間のトライアルを２回行った。ラットを損傷前にトレーニング（２セッション）し、損傷後（２セッション）および移植後（４セッション）に、ＢＡＴ試験と同じ期間にわたり試験した。
【０１２８】
組織学
潅流および切片法：
ラットを一時的に、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）中の４％  パラホルムアルデヒドで潅流し、脳を取り出し、固定剤中４℃で一晩保存し、次に、ＰＢＳ中の３０％  スクロースに移した。連続切片５０μｍを凍結ミクロトーム上で切り出し、２４ウェル培養プレート中のスクロース中に回収し、処理まで−２０℃にて保存した。
【０１２９】
損傷被害：
損傷を、左線条体中のＤＡＲＰＰ  ３２陽性細胞の喪失の程度として定量し：免疫反応の範囲および染色強度を、線条体のＡＰ軸中を走るｃ．８切片を用いて測定した。
【０１３０】
移植細胞の生存：
移植細胞を、Human Nuclear（ＨｕＮｕｃ−Chemicon Inc）染色により同定し、次に、移植された線条体中の損傷評価のために用いたものと隣接する連続切片においてカウントした。注入部位に近い切片を主要な精査の焦点とした。
【０１３１】
結果
階段試験
全ての群にわたり、右肢より左肢で、より多くの球粒を回収した（ｐ＜０．０５）。損傷されたラットは、ＳＴＲＯＣ０５移植群および対照群（ｐ＜０．０１）よりすくない球粒を回収したので、群の間で実質的な差があった（ｐ＜．００１）。
【０１３２】
体旋回試験
損傷されたラットは、６ブロックの移植後試験を通じて左に旋回する実質的な偏向性を示し、ゆえに群は左旋回の割合が異なる（ｐ＜０．００１：図参照）。ゆえに、群の間で実質的な差があった：ＣＴＸＯＥ０３移植群とＳＴＲＯＣ０５移植群の両方、並びに対照群は、低減した偏向性（すなわち、ｃ．５０％が左および右へ旋回する）、および損傷されたラットとの実質的な差（ｐ＜０．０１）を示した。左および右への実際の旋回数の点で、群とサイドとの間の相互作用（ｐ＜０．００１）は、偏向性を損傷群において強調するが、対象群または移植群においてはしなかった。
【０１３３】
同側性触毛刺激に応答した肢の置き直し
損傷されたラットは、右側のヒゲ刺激に一貫して応答できなかったが、左肢でテーブルトップに達するのが、左側の刺激後、速くかつ正確であった。対照群および移植群は、両側の刺激に応答した。それゆえ、片側で有意に差があり（ｐ＜０．００１）、群と片側との間の強力な対象（ｐ＜０．００１）、並びに群の間で実質的な差があった（ｐ＜０．００１）。対照群、およびＳＴＲＯＣ０５移植群およびＣＴＸＯＥＯ３移植群は、損傷されたラットと差があった（ｐ＜０．００１）。しかしながら、移植群の両方が、対照ラットより応答性がより低く（ｐ＜０．０２）、それらはなおある種の怠慢を示した。
【０１３４】
組織学的知見
損傷の大きさおよび特異性
損傷は線条体を上手く標的とし、ＤＡＲＰＰ  ３２陽性細胞の欠如は別として組織の喪失はほとんどなく、いくぶんかの腔の拡大があった。細胞の喪失範囲は、損傷のみの群および移植群の両方で平均１０ｍ３であった。また、生存細胞を有する移植ラットと有しない移植ラットにおいて、損傷体積／強度に差は無かった。
【０１３５】
移植物の生存：
生存ＨｕＮｕｃ陽性細胞は、４／９のＳＴＲＯＣ０５移植ラットおよび５／１２のＣＴＸＯＥ０３移植ラットで観察された。良好な遊走が、移植物を有する動物の７５％で観察された。長期間生存した移植細胞の神経細胞への明らかな分化は無かった。
【実施例６】
【０１３６】
ＨＰＣＯＡ０７細胞株およびＣＴＸＯＥ０３細胞株は、全体的虚血（４血管閉塞法）後の認識能力を回復させる
本実施例は、２種類の制御されたヒトｃ−ＭｙｃＥＲＴＡＭ幹細胞株からなる移植物が、４血管閉塞法により誘発された虚血性海馬損傷後に欠損を示したラットにおいて、空間学習および記憶を改善できるか否かをみることを目的とするものである。虚血後、ラットに海馬（ＨＰＣＯＡ０７）および皮質（ＣＴＸＯＥ０３）株由来の細胞を移植した。６週間後、それらを、直径２ｍの円形プール中の水没したプラットホームを見つけることを、２トライアル／日で合計６日間訓練し、次に、その場所を思い起こすことを試験するために、プラットホームを取り除いて探知トライアルを行った。偽移植虚血ラットは、無虚血対照より、プラットホームを見つけるのに長くかかり、それを探知するのにより長く泳ぎ、プラットホームが位置するプールエリアではほとんど時を過ごさなかった。移植ラットの能力は、虚血対照と無虚血対照のものとの中間であり、一般にどちらとも有意な差は無かった。しかしながら、虚血ラットのレベルを上回る改善は、待ち時間および経路の長さのような鍵となる測定値における有意性と非常に密接に関連し、このことは、信頼性のある機能回復の可能性を示している。
【０１３７】
実験手順
手術−４血管閉塞法：ラットを電気焼灼機（Surgitron coagulator）による４  ＶＯの対象とし、脊椎動脈にハロセイン麻酔（Merial Animal Health）し、頸動脈周辺を結んだ。翌日、軽いハロセインでの麻酔下で、頸動脈を持ち上げ、止血小鉗子動脈瘤クルップを用いて２０分間固定した。麻酔を止めた後に立ち直り反射がないよう維持した、大脳の血流の低減を９０％＋示した。対照は、脊椎動脈を焼灼し、次に結ぶことで偽手術したが、頸動脈の血流の制限は行わなかった。体と頭の温度を直腸プローブおよび頭部プローブによりモニターし、１分毎に記録し、恒温毛布（Harvard Apparatus）および頭上のランプにより３７±２℃に維持した。
【０１３８】
手術−移植：ラットをケタミン（ケタラール，８０ｍｇ／ｋｇ，Pharmacia and Upjohn Ltd. UK）およびメデトミジン（ドミター  ０．５ｍｇ／ｋｇ，Pfizer, UK）を用いて麻酔し、術後アティパメゾル（アンチセダン，２０ｍｇ／ｋｇ，Pfizer, UK）でさまし、次に定位の枠（Kopf，Tujunga CA）内に入れた。恒温毛布（Harvard Apparatus）を用いて、体温を維持した。穴を頭蓋骨にドリルであけ、１０μｌの平ら状のハミルトンシリンジの挿入を可能にした。密度５０，０００細胞／μｌの２つの沈着物２μｌ（すなわち、８μｌ＝４００，０００細胞／ラット）を各部位へ２分かけて、次の座標：
ＡＰ：−３．３    Ｌ：＋１．３    Ｖ：−２．８    ２μｌ／部位
ＡＰ：−４．２    Ｌ：＋３．４    Ｖ：−３．１
へデリバーした。
【０１３９】
シリンジを分散のため２分間待った後にゆっくりと回収した。懸濁液を新たに各部位で採取した。細胞を新たに調製し、１日に２回デリバーし、ベンチ上での劣化を低減させた。
【０１４０】
全てのラットは、１：４の割合のクレマホールＥＬ（ＣＳＡ／ＣＥＬ）中のシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ  皮下）からなる免疫処置を受け、これは手術の前日に開始し、潅流まで３日／週間続けた。さらに、ラットにプレドニゾロンを毎日（２０ｍｇ  皮下）、２週間注射し、これは手術日から開始した。
【０１４１】
空間記憶機能不全についての行動試験：
モリス水迷路  動物を、水面下２ｃｍに水没したプラットホーム（直径９ｃｍの円）を有し、２４±２℃に保たれた温度の円形プール（２ｍ）に入れた。動物を４箇所のスタート地点の１つに置き、最大１分間泳がせた。動物がプラットホームに登ってきたら、それらを１０秒間そのままにし、取り出した。１分以内にプラットホームを見つけられなかった動物をプラットホーム上に置いた。動物をプラットホーム上に２０秒間そのままにし、次に取り出した。泳いだ経路を画像分析システム（HVS Image, UK）により記録した。毎日の１セッション当たりトライアルを２回、８〜１０分間の間隔で行った。訓練を、４日および３日をひとまとめにして、９日間行った。しかしながら、４日目に装置の破損により、信頼性のないデータ収集となったので、結果を破棄した。それゆえ、３日目で隔て、１〜３および４〜６をひとまとめにして、分析するデータを６日にわたり収集した。探知トライアルを、最後の習得トライアルの２４時間後に行い、次に、翌日可視化したプラットホーム課題を行った。水面より上１０ｃｍに上げた円筒型の手がかりによりマークしたプラットホーム位置を用いたトライアルを３回行った。
【０１４２】
組織学
潅流および切片法：
ラットを、一時的に０．１Ｍ  ナトリウム緩衝溶液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）中の４％  パラホルムアルデヒドで潅流し、脳を取り出し、４℃で一晩固定し、次にＰＢＳ中の３０％  スクロースに移した。連続切片５０μｍを凍結ミクロトーム上で切り出し、２４ウェル培養プレート中のスクロース中に回収し、処理まで−２０℃で保存した。
【０１４３】
神経細胞の喪失：
細胞の喪失を、移植物／ビークル注入管の２箇所のレベルで、両側性に、ＣＡ１野の中央−側面の広がりを横切るＮｅｕＮ標識皮質切片において定量した。これは、細胞体および樹状領域を示した。ＮｅｕＮ免疫反応範囲および染色強度の両方を測定した。
【０１４４】
移植細胞の生存：
移植細胞をHuman Nuclear（ＨｕＮｕｃ）染色により同定し、連続切片に隣接し、細胞の喪失を見積もるために用いた対象（ＲＰＩ）と同じ領域由来の連続切片においてカウントした。
【０１４５】
結果
実験には、３３匹のラット、ＣＴＸＯＥ０３移植物を有する１０匹、ＨＰＣＯＡ０７移植物を有する９匹、４  ＶＯかつ偽移植物を有する８匹、偽閉塞かつ偽移植物対照６匹を用いた。
【０１４６】
水迷路における習得
移植後５から６週間、ラットを、水迷路中の水没したプラットホームを見つけることを、８〜１０分間の間隔で２回のトライアル／日で訓練した。
【０１４７】
潜在性：全ての群が、ブロックを超えてプラットホームを見出すのにかかる時間において実質的に直線的な増加（Ｆ  ｌｉｎ［１，２９］＝４６．７６，ｐ＜０．００１）を示し、そしてこれはいくつかの群が漸近的行動に達すると横ばい状態となった（Ｆ  ｑｕａｄ［１，２９］＝５．２６，ｐ＜０．０２５）。損傷されたラットと比較して、対照での浸かっている時間の増大は、群と直線的傾向のブロックとの間での対象（Ｆ［３，２９］＝４．０７，ｐ＜０．０２）、および群の間での全体的な差の傾向（Ｆ［３，２９］＝２．４７，ｐ＝０．０８）となった。平均値の比較により、インタクト（intact）な対照が損傷対照と異なり（ｐ＜０．０１５）、一方移植群は対照レベルの能力があったことを示した。移植群は、病変のみのラットと比較して改善傾向（ｐ＝０．０８，ｐ＝０．０９）を示したが、これらの差は有意ではなかった。それゆえ、移植動物はインタクトな対照と損傷対照との中間であった。
【０１４８】
組織学的知見
虚血性損傷：ＣＡ１細胞の喪失の程度を、注射管によりマークした、樹状野および体性野を含む、２つのレベルで同定した。ＮｅｕＮ染色を、エリアにより、および免疫蛍光強度によりマッピングした。両方の測定値は、虚血群が対照で観察される細胞の２０〜２５％のみを保持していることを示した。損傷は一様であり、ＣＡ１野に局在し、同様に全ての群に及んだ。
【０１４９】
移植細胞の生存：ＨｕＮｕｃ標識移植細胞は、ＣＴＸＯＥ０３移植物を有する２／１０匹のラット、およびＨＰＣＯＡ０７群の６／９匹のラットで観察され；ＨＰＣ移植物を有する３匹のラットも良好な遊走を示した。移植細胞の神経細胞への分化の証拠は無かった。
【０１５０】
ホストの脳の変化：ＣＡ１野におけるＮＦ染色により測定した朋芽（Sprouting）は、虚血対照群において有意に増大し、偽手術動物および移植動物両方のレベルより上であった。それゆえ、移植物は、対照レベルに対して朋芽活性を低減した。対照的に、変性脳回におけるホストの神経発生は、ＨＰＣ移植物を有するラットにおいて有意に増大し、虚血対照において観察されるレベルより上であった。しかしながら、Ｋｉ６７−ＩＲは、損傷対照およびＣＴＸ移植物を有するラットで等しく、これらの細胞の潅流時における神経発生に対する作用の証拠は無かった。
【０１５１】
組織学的測定値と行動測定値との間の相関
障害物１〜３、４〜６を超えて、全６個のトレーニング用ブロックを越えてプラットホームを見つける平均時間は、４つの実験群のそれぞれにおいて、ＮｅｕＮ−ＩＲの範囲および強度の両方でＣＡ１細胞喪失の程度と相関した。各群内で、ＮｅｕＮ染色のいずれかの測定値による、ＣＡ１細胞の喪失の程度と、プラットホームを見つけ出すのにかかる時間の増大との間に関連は無かった。
【０１５２】
同様に、変性脳回における神経線維染色の範囲および強度により測定した朋芽と、プラットホームを見つけるまでの時間との間の関連を調べた。有意な関連を見出さなかった。
【０１５３】
結論
本明細書に記載の３種類の異なる神経幹細胞株は、安定かつ拡大可能な、神経系疾患の患者への移植のための細胞供給源となることが示された。可能性のある治療範囲は、機能的回復を、一定範囲の脳疾患および変性の動物モデルにおいて示すことで、例証した。１種類より多くの疾患モデルにおける機能回復の際のこれらの細胞株の典型的な成功は、これらの細胞株の１種類以上が、種々の神経系疾患において機能を回復させ得ることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明により、移植治療において有用となる好ましい特徴を有する細胞株が提供されるので、医薬品等の分野、例えば、脳細胞の喪失または損傷と関連する障害の予防薬または治療薬等の開発、製造分野等において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ＣＴＸＯＥ０３と命名された細胞株の成長特徴を示すグラフである。
【図２】図２は、成長因子を添加した細胞株ＣＴＸＯＥ０３の細胞増殖を示すグラフである。
【図３】図３は、ＨＰＣ−ＯＡ０７と命名された細胞株の成長特徴を示すグラフである。
【図１】
2006122045.tif 000008
【図２】
2006122045.tif 000009
【図３】
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【外国語明細書】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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