(57)【要約】【課題】本発明はＡＴＬ等のＴリンパ性白血病に関連する遺伝子異常を指標とした、Ｔリンパ性白血病の効果的な検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は生体から単離された検体中のＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルを測定し、前記発現レベルの低下を指標としてＴリンパ性白血病を検出することを特徴とするＴリンパ性白血病の検出方法に関する。本発明はまたＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含むＴリンパ性白血病を検出するためのキットに関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から単離された検体中のＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルを測定し、前記発現レベルの低下を指標としてＴリンパ性白血病を検出することを特徴とするＴリンパ性白血病の検出方法。
【請求項２】
前記Ｔリンパ性白血病が成人Ｔ細胞白血病である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検体が白血球細胞である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含むＴリンパ性白血病を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔリンパ性白血病、特に成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；本明細書において「ＡＴＬ」と略記する場合がある）の検出方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
成人Ｔ細胞白血病はヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １；本明細書において「ＨＴＬＶ−１」と略記する場合がある）がＣＤ４陽性Ｔ細胞に母子感染により感染することに起因する白血病の１種である。ＡＴＬは特に南九州に多く見られる風土病である。ＡＴＬはＨＴＬＶ−１感染者の５％程度にしか発症せず、感染から発症までは５０年程度の期間を要するものの、発症後の予後は極めて悪く効果的な治療方法が存在しない難治性の白血病である。
【０００３】
従来から用いられているＡＴＬの診断法の一つに、サザンブロット法を用いて白血病細胞においてウイルスの組込みを確認する方法がある。この方法は確定診断としては使用できるが発症前の診断法としては用いることができず、また、白血病患者に対する診断に用いても患者予後の予測はできず、適切な治療法の選択のための情報を得ることができないという問題があった。
【０００４】
また特許文献１及び２にはＡＴＬの検出方法が記載されているが、これらの方法も必ずしも満足できるものではない。特許文献３には種々の遺伝子を利用した骨髄系白血病（ＭＤＳ、ＡＭＬ）の診断法が開示されているがＡＴＬを含むＴリンパ性白血病の診断法は開示されていない。
【特許文献１】特許第３３２３２５８号公報
【特許文献２】特開２００４−１６３１２１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００４／０９７０５１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はＡＴＬ等のＴリンパ性白血病に関連する遺伝子異常を指標とした、Ｔリンパ性白血病の効果的な検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）生体から単離された検体中のＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルを測定し、前記発現レベルの低下を指標としてＴリンパ性白血病を検出することを特徴とするＴリンパ性白血病の検出方法。
（２）前記Ｔリンパ性白血病が成人Ｔ細胞白血病である（１）記載の方法。
（３）前記検体が白血球細胞である（１）又は（２）記載の方法。
（４）ＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含むＴリンパ性白血病を検出するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によりＴリンパ性白血病の有効な検出方法が提供される。本発明に係る検出方法は、Ｔリンパ性白血病の発症前診断や、発症した患者の予後判定や、遺伝子以上特異的な治療法の選択のために応用できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明により検出され得るＴリンパ性白血病としては例えば成人Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫等が挙げられる。
【０００９】
被験体はＴリンパ性白血病に罹患し得る動物である限り特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。典型的にはヒトである。
【００１０】
本発明において「生体から単離された検体」とは、典型的には、これらの哺乳動物から単離された白血球細胞、血清、リンパ節から単離されたサンプル等の検体を指す。
【００１１】
ＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルの低下は、例えば、正常検体との比較及び／または対照タンパク質の発現レベルとの比較によって判定することによって検出することができる。正常検体との比較は、具体的には、Ｔリンパ性白血病に罹患していないことが明らかな１または複数の検体におけるＡＲＥＢ６遺伝子の発現を予め調べ、その結果をＡＲＥＢ６遺伝子発現レベルの正常値として使用することができる。あるいはまた、実験条件による誤差を最小にするために、検体におけるＡＲＥＢ６遺伝子発現を検出する際に、同時に対照検体の測定を行っても良い。更に、Ｔリンパ性白血病患者であると判定された患者について、異なる時期に行った複数の測定結果を比較して、Ｔリンパ性白血病の病状の進行との相関性を調べることもできる。
【００１２】
対照タンパク質としては、特に限定されるものではないが、Ｔリンパ性白血病の罹患の有無に関わらずその発現が一定しているタンパク質、例えばβ−アクチン等を選択することができる。
【００１３】
「ＡＲＥＢ６遺伝子の発現」には、ＡＲＥＢ６遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びタンパク質への翻訳が含まれる。したがって、検体におけるＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルは、検体におけるＡＲＥＢ６をコードするｍＲＮＡの存在量、あるいは、検体におけるＡＲＥＢ６の存在量に基づいて測定することができる。
【００１４】
検体におけるＡＲＥＢ６をコードするｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用することができる。
【００１５】
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、ＡＲＥＢ６をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。当該オリゴヌクレオチドの一例としては配列番号２及び３に示すものが挙げられる。
【００１６】
なお本明細書において、「オリゴヌクレオチド」の塩基長は特に限定されないが、通常１５〜１００塩基、好ましくは１７〜３５塩基である。また、「ポリヌクレオチド」の塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１０００塩基、好ましくは１５０〜５００塩基である。
【００１７】
「ＡＲＥＢ６をコードする核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００１８】
ＡＲＥＢ６をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ＡＲＥＢ６をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし得ることが好ましい。「特異的にハイブリダイズし得る」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得ることを意味し、「ストリンジェントな条件」とは、通常、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。
【００１９】
ＡＲＥＢ６をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、被験動物のＡＲＥＢ６遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。ＡＲＥＢ６遺伝子の塩基配列としては、例えば、ヒト、マウス等のＡＲＥＢ６遺伝子の塩基配列が公知である。ヒト由来のＡＲＥＢ６遺伝子は配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡからなる。なおＡＲＥＢ６はマウスではｄｅｌｔａＥＦ１とも称される。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、例えば、ＡＲＥＢ６をコードする核酸のＣＤＳ領域にハイブリダイズし得るように、ＣＤＳ領域の５’末端側又は３’末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５’末端側又は３’末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計される。プライマーの５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加することができる。また、プライマー及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加することができる。
【００２０】
検体におけるＡＲＥＢ６をコードするｍＲＮＡの存在量の測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にしてより具体的に説明する。被験動物から採取した検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＡＲＥＢ６をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、ＡＲＥＢ６をコードするｍＲＮＡの存在量を測定することができる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
【００２１】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく常法により行うことができる。ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用することができる。
【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲ法の１つであるリアルタイムＰＣＲ法は、微量なＤＮＡを高感度かつ定量的に検出できるという点で本発明の方法に特に適したものの１つである。リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ）法では、５’端を蛍光色素（レポーター）で、３’端を蛍光色素（クエンチャー）で標識され、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【００２３】
検体におけるＡＲＥＢ６タンパク質の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、抗ＡＲＥＢ６抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等を利用することができる。
【００２４】
「抗ＡＲＥＢ６抗体」には、被験動物のＡＲＥＢ６に反応し得る限り、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「その断片」には、被験動物のＡＲＥＢ６に反応し得る限り、いかなる断片も含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。
【００２５】
抗ＡＲＥＢ６抗体又はその断片を用いて、検体におけるＡＲＥＢ６の存在量を測定する際には、例えば、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、組織免疫染色法等を利用することができる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のＡＲＥＢ６を捕捉した後、捕捉されたＡＲＥＢ６を、固相担体に固定化した抗体とはＡＲＥＢ６に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量することができる。
【００２６】
本発明のキットは、ＡＲＥＢ６遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含み、Ｔリンパ性白血病の検出を行うために用いるものである。該キットを用いればＴリンパ性白血病の検出をより簡便に行うことができる。
【００２７】
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を行うことができるものであれば、いかなる構成のものでもよい。該キットは、上述の検出方法に応じて、被験動物のＡＲＥＢ６をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、或いは、被験動物のＡＲＥＢ６に反応し得る抗体又はその断片を含むものであってよい。
【００２８】
本発明のキットは更に任意の試薬、器具等を含むことができる。例えば、本発明のキットが、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えば水、緩衝剤、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種以上を含むことができる。また、本発明のキットが、上記抗体又はその断片を含む場合には、上記抗体又はその断片を固定化するための固相担体、二次抗体、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種以上を含むことができる。
【実施例】
【００２９】
以下に本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが本発明はこれらの実施例には限定されない。
【００３０】
（ＡＴＬ細胞に対するＳＫＹ−ＦＩＳＨ法を用いた染色体分析）
ＡＴＬ細胞に対するＳＫＹ−ＦＩＳＨ法を用いた染色体分析を行った。方法は次の通りである。ＡＴＬ細胞あるいは細胞株から型のごとく染色体標本を作製し、ＳＫＹプローブカクテル(Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ)を３７℃で２日間分子雑種させ、洗浄後に蛍光顕微鏡に装着したＳＤ２００  Ｓｐｅｃｔｒａｃｕｂｅで画像を記録し、附属のソフトウエアを用いて核型を作成した。次に、１０ｐ１１−１３にマップされたＢＡＣクローンをビオチンあるいは蛍光色素で標識しプローブにしてＦＩＳＨ解析を行い、１０ｐ１１−１３領域の切断点と欠失を同定した。１例のＡＴＬ細胞で１．２Ｍｂのホモ欠失を見出した。
【００３１】
ＡＴＬ患者における１０番染色体短腕の染色体異常集中部位ｐ１１−１３の有無と生存率との関係を図１に示す。得られた１０番染色体短腕の染色体異常集中部位ｐ１１−１３を有するＡＴＬ患者は、その異常を持たない患者に比べて予後が悪いことがわかった。すなわち、１０ｐ異常の有無により生存期間に差が見られた。以下に示す通り、この領域にＡＲＥＢ６遺伝子がその原因遺伝子であることがわかったので、ＡＲＥＢ６発現の低下は、予後が悪いという患者の経歴との関連が示唆される。
【００３２】
（遺伝子群の発現解析）
以上の通り、ＡＴＬ細胞において１０番染色体短腕の染色体異常集中部位ｐ１１−１３を同定した。この領域は１．２Ｍｂのホモ欠失領域を含む約２Ｍｂの領域であり、その中に３８遺伝子がマップされた。そこで、その遺伝子群の発現解析を行ったところ、ＡＲＥＢ６遺伝子が原因遺伝子候補であることがわかった。図２は１０番染色体のマップであり、各細胞株、患者検体における欠失領域のマップを示す。最下部にはマップされた遺伝子候補のうち、確実に遺伝子であることが確認されている遺伝子を示す。
【００３３】
（ＤＮＡマイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析）
１０ｐの共通欠失領域にマップされた遺伝子に対してＤＮＡマイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析を行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社マイクロアレイＨＵ９５Ａを用い、目的細胞より取り出したＲＮＡ  ５μｇを逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によりＴ７−ｄＴ２４プライマーを用いてｃＤＮＡに変換、さらに、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてビオチン付加ｃＲＮＡに転写した。転写したｃＲＮＡをＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより増幅し、これをプローブとしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社プロトコールに従い、ＤＮＡマイクロアレイを処理した。染色したアレイはＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒにより取り込み、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社解析ソフトによりデータ解析を行った。
【００３４】
結果を図３に示す。横軸はそれぞれのコントロール細胞とＡＴＬ患者白血病細胞を示す。縦軸は遺伝子発現量を示し、この中にマップされた３遺伝子（ＩＴＧＢ１、ＥＰＣ１、ＡＲＥＢ６）における遺伝子発現を棒グラフで表している。ＡＲＥＢ６において、コントロール細胞では１０００−２０００の発現量を示すが、ＡＴＬ患者白血病細胞では全例発現量が低下していることがわかる。
【００３５】
（ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた遺伝子発現解析）
図２中マップされた遺伝子群のうち、確実に発現が確認された遺伝子の発現を、インフォームドコンセント後同意を得られた、４例の健常人コントロールＣＤ４陽性Ｔ細胞と８例のＡＴＬ細胞においてＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定した。ＡＲＥＢ６遺伝子を増幅するために５’末端側プライマーｃｇｔｃａｃａｔｇａｃａｔｃａｃａｔａａａｔｃａ及び３’末端側プライマーａａｇｃａａｃｃａｃｔａｔｇｇｇｔｔｔｇａａｔｔを用いた。ｔｏｔａｌＲＮＡ  １μｇよりｔａｋａｒａ  Ｔ４  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡに変換後、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４度５分加熱後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を２５サイクルで行った。
【００３６】
結果を図４に示す。ＡＲＥＢ６についてコントロールでは確実に発現が見られるが、ＡＴＬではその発現量が低下している。
【００３７】
（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いたＡＲＥＢ６遺伝子発現解析）
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いて、ＡＴＬ患者白血病細胞のＡＲＥＢ６発現レベルを測定した。インフォームドコンセント後同意を得られた、健常人末梢血リンパ球（ＣＤ４陽性）４例、ＡＴＬ患者末梢血白血病細胞６例につき、ＡＲＥＢ６遺伝子発現を検討した。上記サンプルＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡを合成、このＤＮＡを鋳型としてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００を用い、ＡＢＩリアルタイムＰＣＲプロトコールに準じてＰＣＲを行った。プライマーとしてＡＢＩ  ４３２３９６９  ＡＲＥＢ６−３０８Ｔ  （ＦＡＭラベル）を用い、コントロールとしてヒトｂ−ａｃｔｉｎプローブ（４３２６３１５Ｅ）（ＶＩＣラベル）を用いた。
【００３８】
結果を図５に示す。ＡＴＬ全例で正常リンパ球に比べてＡＲＥＢ６遺伝子発現レベルが低下していた。
【００３９】
（各種白血球細胞におけるＡＲＥＢ６遺伝子発現解析）
ＲＴ−ＰＣＲを用いてＡＴＬ細胞株（６），ＨＴＬＶ１感染細胞株（３），Ｔ−ＡＬＬ細胞株（２）についてＡＲＥＢ６遺伝子発現を検討した。ＡＲＥＢ６遺伝子を増幅するために５’末端側プライマーｃｇｔｃａｃａｔｇａｃａｔｃａｃａｔａａａｔｃａ及び３’末端側プライマーａａｇｃａａｃｃａｃｔａｔｇｇｇｔｔｔｇａａｔｔを用いた。ｔｏｔａｌＲＮＡ  １μｇよりｔａｋａｒａ  Ｔ４  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡに変換後、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４度５分加熱後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を２５サイクルで行った。ＫＯＢ，ＳＯ４，ＫＫ１，ＯＭＴ細胞株は長崎大学医学部山田先生より、Ｓｕ９Ｔ，Ｓ１Ｔは鹿児島大学医学部有馬先生より、ＥＤ細胞株は京都大学医学部前田先生より、Ｊｕｒｋａｔ，ＭＯＬＴ４，ＨＵＴ１０２，ＭＴ２は理研細胞センターより分与していただいた。
【００４０】
結果を図６に示す。ＨＴＬＶ１感染細胞株とＡＴＬ細胞株においてその発現がほぼ全例で低下していることがわかった。
【００４１】
（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ添加によるＡＴＬ細胞株におけるＡＲＥＢ６転写の亢進）
ＡＲＥＢ６プロモーター領域のＤＮＡメチル化が転写低下に関係するかどうかを検討するために、ＡＴＬ細胞株を５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ添加培養液にて５日培養しその転写の変化をＲＴ−ＰＣＲ法にて検討した。ＡＲＥＢ６遺伝子を増幅するために５’末端側プライマーｃｇｔｃａｃａｔｇａｃａｔｃａｃａｔａａａｔｃａ及び３’末端側プライマーａａｇｃａａｃｃａｃｔａｔｇｇｇｔｔｔｇａａｔｔを用いた。ｔｏｔａｌＲＮＡ  １μｇよりｔａｋａｒａ  Ｔ４  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡに変換後、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４度５分加熱後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を２５サイクルで行った。ＫＫ１，ＫＯＢ細胞株は長崎大学医学部山田先生より、ＥＤ細胞株は京都大学医学部前田先生より分与していただいた。それぞれの細胞株に培養液中に５−Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ  １ｍＭを添加、もしくは無添加し４日間培養し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出、１μｇをｃＤＮＡに変換し、これを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００４２】
結果を図７に示す。５−Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ  １ｍＭを添加（＋）した３つのＡＴＬ細胞株において転写の亢進が確認されたことから、ＡＲＥＢ６プロモーター領域はＤＮＡメチル化されていることがわかった。
【００４３】
（ヒストンタンパク質の脱アセチル化阻害剤によるＡＲＥＢ６転写活性化）
ヒストンタンパク質のアセチル化の影響がＡＲＥＢ６の転写に関連するかどうか検討するため、抗ガン剤として用いられている脱アセチル化阻害剤Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ（ＴＳＡ）処理による転写の変化をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。ＡＲＥＢ６遺伝子を増幅するために５’末端側プライマーｃｇｔｃａｃａｔｇａｃａｔｃａｃａｔａａａｔｃａ及び３’末端側プライマーａａｇｃａａｃｃａｃｔａｔｇｇｇｔｔｔｇａａｔｔを用いた。ｔｏｔａｌＲＮＡ  １μｇよりｔａｋａｒａ  Ｔ４  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡに変換後、このＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは９４度５分加熱後、９４度３０秒、５８度３０秒、７２度１分を２５サイクルで行った。ＳＯ４細胞株は長崎大学医学部山田先生より、ＥＤ細胞株は京都大学医学部前田先生より分与していただいた。それぞれの細胞株に培養液中にＴＳＡ  １ｍＭを添加、もしくは無添加し、培養前（Ｐｒｅ）、培養後２４時間後（２４）、４８時間後（４８）に細胞より、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出、１μｇをｃＤＮＡに変換し、これを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００４４】
結果を図８に示す。ＥＤ及びＳＯ４の二つのＡＴＬ細胞株において両者ともＴＳＡ処理により転写が活性化されたことから、ヒストン脱アセチル化の影響によりＡＲＥＢ６の転写が低下していることがわかった。
【００４５】
図７，８の結果を表にまとめた。ＫＯＢ、ＫＫ１、ＫＯＢの３細胞株はそれぞれ１０ｐの欠失があった。ＫＯＢ、ＫＫ１、ＫＯＢ、ＳＯ４の４細胞株はそれぞれＤＮＡメチル化されていた。ＫＯＢ、ＫＫ１、ＫＯＢ、ＳＯ４、ＭＯＬＴ４、ＨＵＴ１０２、ＭＴ２の７細胞株はヒストン脱アセチル化による転写阻害を受けていた。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
（ＣＴＬＬ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ法によるタンパク質発現解析）
マウスＣＴＬＬ細胞株にアンチセンスｄｅｌｔａＥＦ１（マウスにおけるＡＲＥＢ６）を導入し、ｄｅｌｔａＥＦ１抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ法によりタンパク質発現を検討した。ｐｃＤＮＡ３ベクターにｄｅｌｔａＥＦ１遺伝子を逆向きに挿入し、マウスＣＴＬＬ２細胞株にｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法により導入した。導入後Ｇ４１８  ８００μｇ／ｍｌを添加約３週間培養した。生き残った細胞株をそれぞれ分画し、細胞株を６株得た。それぞれのクローン（ｃｌｏｎｅ  １，ｃｌｏｎｅ２など）について、ｄｅｌｔａＥＦ１のたんぱく質発現をＷｅｓｔｅｒｎ法により同定した。コントロール細胞（ＣＴＬｌ／ｎｅｏ，ＣＴＬＬ／ＧＦＰ）および、得られたクローン細胞株（ＣＴＬＬ／３及びＣＴＬＬ／４）について５ｘ１０６細胞よりより得られた蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写し、一次抗体である３０００倍希釈抗ｄｅｌｔａＥＦ１抗体（大阪大学医学部東先生より供与）で処理し、二次抗体である４０００倍希釈ビオチン標識抗ラビットＩｇＧ抗体で処理し、さらに４０００倍希釈ＨＲＰ標識ストレプトアビジンで処理後、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により発色させＬＡＳ３０００（富士フィルム）を用いてｄｅｌｔａＥＦ１蛋白質を同定した。
【００４８】
結果を図９に示す。４つのクローンのうちクローン１，３，４についてｄｅｌｔａＥＦ１（ＡＲＥＢ６）の発現が低下していることがわかった。
【００４９】
これらの細胞を使ってＴＧＦβに対する反応性を検討したところ、Ｃｌｏｎｅ  ３，  ４においてＴＧＦβに抵抗性が出現し、細胞死が４０％程度抑えられていた（図１０）。
【００５０】
（ＥＤ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ法によるタンパク質発現解析）
ＡＴＬ細胞株ＥＤにｄｅｌｔａＥＦ１（マウスにおけるＡＲＥＢ６）を導入し、ｄｅｌｔａＥＦ１抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ法にて発現レベルを検討した。ｐｃＤＮＡ３ベクターにｄｅｌｔａＥＦ１遺伝子を組み込み、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法（Ｂｉｏｌａｄ社）にてヒトＡＴＬ細胞株ＥＤに遺伝子導入を行った。導入後Ｇ４１８  ８００μｇ／ｍｌの条件で３週間培養し、３種類の細胞株（ｄＥＦ１−１，  ｄＥＦ１−２，  ｄＥＦ１−３）を作成した。それぞれの細胞株５ｘ１０６細胞より蛋白質を抽出し、ＳＤＳ−ＧＡＧＥゲル電気泳動により蛋白質を分離し、ナイロン膜に転写した。この膜に対して、一次抗体である３０００倍希釈抗ｄｅｌｔａＥＦ１抗体（大阪大学医学部東先生より供与）で処理し、二次抗体である４０００倍希釈ビオチン標識抗ラビットＩｇＧ抗体で処理し、さらに４０００倍希釈ＨＲＰ標識ストレプトアビジンで処理後、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）により発色させＬＡＳ３０００（富士フィルム）を用いてｄｅｌｔａＥＦ１蛋白質を同定した。
【００５１】
結果を図１１に示す。ｄＥＦ１−１，−２，−３細胞株において、ｄｅｌｔａＥＦ１タンパク質の高発現が見られた。
【００５２】
これらの細胞株に対するＴＧＦβに対する反応性を検討した（図１２）。オリジナルのＥＤ細胞株（ＥＤ／ｐ）、ＥＤ／ｎｅｏクローンは、ＴＧＦβに対して、不反応性を獲得しており、１０ｎｇ／ｍｌを添加しても細胞死は起こらない。しかしｄＥＦ１−１、−２、−３においては、約４０％の細胞で細胞死を起こしており、ｄｅｌｔａＥＦ１（ＡＲＥＢ６）の発現はＴＧＦβの反応性を上昇させ、細胞死をもたらすことが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号２及び３：プライマー
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＡＴＬ患者における１０番染色体短腕の染色体異常集中部位ｐ１１−１３の有無と生存率との関係を示す図である。
【図２】１０番染色体の遺伝子マップを示す図である。
【図３】ＤＮＡマイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図５】Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を用いたＡＲＥＢ６遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図６】各種白血球細胞におけるＡＲＥＢ６遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図７】５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ添加によるＡＴＬ細胞株におけるＡＲＥＢ６転写の亢進を示す図である。
【図８】ヒストンタンパク質の脱アセチル化阻害剤によるＡＲＥＢ６転写活性化を示す図である。
【図９】ＣＴＬＬ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ法によるタンパク質発現解析の結果を示す図である。
【図１０】ＴＧＦβに対する反応性を示す図である。
【図１１】ＥＤ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ法によるタンパク質発現解析の結果を示す図である。
【図１２】ＴＧＦβに対する反応性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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