(57)【要約】      （修正有）【課題】  タンパク質、遺伝子、オリゴ核酸等の水溶性薬物および疎水性薬物を担持する生体内で安定なポリマー修飾リポソームの提供とその使用。【解決手段】  非電荷性（ポリエチレングリコール等）セグメントと荷電性（カチオン性またはアニオン性）セグメントとを有するブロック共重合体と荷電性（ブロック共重合体と反対の荷電を有する）リポソームからなる静電結合型ポリマー修飾リポソームの薬物キャリアとしての提供とその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体と反対の荷電を有するリポソームからなることを特徴とする静電結合型ポリマー修飾リポソーム複合体。
【請求項２】
非荷電性セグメントがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である請求項１のリポソーム−ブロック共重合体複合体。
【請求項３】
ブロック共重合体が次式（Ｉ）
（式中、Ｒ１はポリカチオン、およびポリアニオンを表し、その電荷数はブロックポリ
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マー一分子あたり２〜１，０００の整数であり、Ｌ１は単結合または連結基を表し、Ｘは水素原子もしくは、アルキル基、アラルキル基、ヒドロキシル基、ホルミル基、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンドを表し、そしてｎが３〜１，０００の整数であるポリエチレングリコール）で表せるものからなる請求項１のリポソーム薬物キャリア。
【請求項４】
荷電性セグメントがポリカチオンで、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒシチジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサン、ポリエチレンイミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ポリアリルアミン、ポリビニルヒスチジン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルスチレン）、ポリ（メタクリル酸  ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）、スペルミンからなる群より選ばれる請求項１〜３のいずれかに記載のブロックポリマー−リポソーム複合体。
【請求項５】
荷電性セグメントがポリアニオンで、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、オリゴ核酸からなる群より選ばれる請求項１〜３のいずれかに記載のブロックポリマー−リポソーム複合体。
【請求項６】
生理活性物質、タンパク質、遺伝子、オリゴ核酸等の水溶性薬物および疎水性薬物を担持していることを特徴とする請求項１〜５の静電結合型ポリマー修飾リポソーム薬物キャリア。
【請求項７】
請求項６に記載の静電結合型ポリマー修飾リポソーム薬物キャリアの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、脂質２分子膜会合体（リポソームと総称する）と静電的、疎水的あるいは水素結合的など様々な相互作用により高分子を複合化し、液体中で分散安定化したナノ粒子を調製する。得られたナノ粒子複合体は生体内の許容部位にまで薬物を運搬して、薬物の作用効果を安定して発現させるための薬物運搬システム（ＤＤＳ）や免疫診断等に利用することができる。このような、特に生体環境下で安定に存在することができるポリマー修飾（ポリエチレングリコール化）リポソーム薬物キャリアの製造法とその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】  薬物を生体内の標的部位へ送達するための薬物運搬システム（ＤＤＳ）として、リン脂質ニ分子膜の閉鎖小胞体であるリポソームの使用が検討されてきた（非特許文献１参照）。また、体内動態のコントロール、つまり血中安定性の向上と細網内皮系からの回避を目的として、リポソームをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化した「ステルスリポソーム」（非特許文献２参照）等も開発され、実際に臨床試験などが行われており最も期待されうる送達系の１つである。【０００３】  これらリポソームの従来までのＰＥＧ化法は、１）ＰＥＧ修飾リン脂質（ＰＥＧを共有結合でリン脂質につないだもの）を構成成分に用い、リポソームを調製、もしくは、２）リポソームを調製後、ＰＥＧ化コレステロールによるリポソームを構成しているリン脂質ニ分子膜の疎水部への埋め込み。等がなされて来た。しかし、これらのＰＥＧ化法では、リポソーム１つ当たりのＰＥＧ密度が低いこと、リポソームの内水相にＰＥＧが存在し薬物の保持効率が低いこと、および、ＰＥＧ化コレステロールとリポソームとの相互作用が弱いためＰＥＧが脱離してしまうなどの問題があり、上記のＰＥＧ化リポソーム系を利用しても高い血中安定性と細網内皮系からの回避が困難な場合があった（非特許文献３〜６参照。）。
【非特許文献１】Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５１（１９９９）６９１−７４３
【非特許文献２】Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５（１９９５）２６０１−２６２８
【非特許文献３】Ｓｅｎｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒ．Ｓｙｓｔ．３（１９８７）１２３−１９３
【非特許文献４】Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８（１９９１）１１４６０−１１４６４
【非特許文献５】Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６２（１９９１）１４２−１４８
【非特許文献６】Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９５（２００４）４０３−４１２
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】    以上に述べたポリマー修飾リポソーム、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化リポソームは、薬物運搬システム（ＤＤＳ）の分野で有用なキャリアであることが見出されている。しかしながら、血中安定性のさらなる向上と細網内皮系からの認識を回避し、かつ、薬物の保持率を高め、標的組織・細胞に特異的に薬物を送達しうる、リポソームのＰＥＧ化法は依然として必要である。本発明は、かようなニーズに応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】    本発明者らは、非荷電性（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））−荷電性ポリマー（ポリカチオンおよびポリアニオン）ブロック共重合体およびＰＥＧ−ポリアニオン共重合体と反対の電荷を有するリポソームとが静電結合により、リポソーム表面にのみＰＥＧ化された静電結合型ＰＥＧ化リポソームとして安定に得、さらに通常の生体内環境の下においては、静電結合したブロック共重合体がリポソーム表面からはがれることなく、さらに静電結合型ＰＥＧ化リポソームが一定の大きさを有していることを見出した。しかも、ブロック共重合体のポリアニオンセグメントとしてｓｉＲＮＡを用いた、静電結合型ＰＥＧ化リポソームは動物細胞内へ安定かつ効率的にｓｉＲＮＡを送達でき、標的遺伝子の発現を制御しうることも見出した。また、このような静電結合型ポリマー修飾リポソームキャリアは本発明者らの知る限り、文献未載のものである。したがって、本発明によれば、血中安定性と細網内皮系からの回避に優れた、親水性薬物および疎水性薬物に対するキャリアが供給される。
【０００６】またそして、この発明は、上記のキャリアとして、非電荷性セグメントがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であること、また、ブロック共重合体が一般式（Ｉ）
（式中、Ｒ１はポリカチオン、およびポリアニオンを表し、その電荷数はブロックポリマー一分子あたり２〜１，０００の整数であり、Ｌ１は単結合または連結基を表し、Ｘは水素
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原子もしくは、アルキル基、アラルキル基、ヒドロキシル基、ホルミル基、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンドを表し、そしてｎが２〜１，０００の整数であるポリエチレングリコール）で表せるもの。
【０００７】すなわち、一般式（Ｉ）と反対の荷電を有するリポソームにより、効率的な薬物輸送を行う静電結合型ＰＥＧ化リポソームキャリアが供給される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】本発明に従う、静電結合型ポリマー修飾リポソームキャリアは、薬物のキャリアとしての効果を主たる目的とするものである。したがって、非荷電性セグメントと荷電性セグメントからなるブロック共重合体は、非荷電性セグメントがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であること、また、ブロック共重合体が一般式（Ｉ）
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式中、Ｒ１はポリカチオン、およびポリアニオンを表し、その荷電数はブロックポリマー一分子あたり５〜５００の整数である。【０００９】Ｌ１は単結合または連結基を表し、本発明の目的に沿う限り、Ｘ部とポリエチレングリコール部とを連結しうる如何なる基、例えば、総原子数３〜３０のアルキレン基、アリレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＳＳ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯ−ＮＨ−、−ＳＯ−から選ばれる１種類以上からなるものであってよい、
Ｘは水素原子もしくは、アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル等）、アラルキル基（例、ベンジル、フェネチル等）、ヒドロキシル基、アルデヒド（もしくはホルミル基：−ＣＨＯ）、アセタール化されたホルミル基、アミノ基、保護されたアミノ基、マレイミド基、カルボキシル基および保護されたカルボキシル基（なお「保護された」と称する場合の保護基は、限定されるものでないが、ペプチド合成で慣用されるアミノ基およびカルボキシル基に対する保護基を意味する。）からなる群より選ばれる官能基または該官能基を介して結合したリガンド（例、ビオチン、ハプテン、ホルモン、抗体、糖、葉酸、ペプチド、酵素の基質等）の残基であり、ｎは５〜５００の整数であるポリエチレングリコール基である。【００１０】荷電性セグメントがポリカチオンとしては、たとえばポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒシチジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサン、ポリエチレンイミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ポリアリルアミン、ポリビニルヒスチジン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルスチレン）、ポリ（メタクリル酸  ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）等が例示される。【００１１】荷電性セグメントがポリアニオンセグメントとしては、たえばポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、オリゴ核酸等が例示される。【００１２】また、本発明に従う、静電結合型ポリマー修飾リポソームキャリアは、薬物のキャリアとしての使用を主たる目的とするものである。したがって、ポリアニオンセグメントのオリゴ核酸は特定の遺伝子（または標的遺伝子）の発現に関与するｍＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対して相補的配列であるか、または相補的配列とアンチセン配列からなるニ本鎖を含むものである。【００１３】本発明にいうオリゴ核酸は、「オリゴ」が意味する数個から１０数個の核酸塩基からなるものに限定されず、最大、２００個までの核酸塩基からなるものを内包する。また、限定されるものでないが、本発明で用いることを意図しているオリゴ核酸の例としては、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖、ｓｉＲＮＡが挙げられる。【００１４】本発明のオリゴ核酸が標的とする遺伝子は、本発明の目的に沿う限り、如何なる遺伝子であってもよいが、好ましくは、動物の病原遺伝子およびそれらの発現に関与するＤＮＡまたはＲＮＡ部分であることができる。限定されるものでないが、標的遺伝子には、非小細胞肺癌などに関係のあるＰＫＣ・、悪性黒色腫などに関係のあるＢＣＬ−２、クーロン病に関係のあるＩＣＡＭ−１、Ｃ型肝炎に関係のあるＨＣＶ、関節リウマチ、乾鮮に関係のあるＴＮＦ・、喘息に関係のあるアデノシンＡ１受容体、卵巣癌などに関係のあるｃ−ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ、冠動脈疾病癌に関係のあるｃ−ｍｙｃ、大腸癌に関係のあるＰＫＡ  ＲＩ・、膵臓癌に関係のあるＨ−ｒａｓ、エイズに関係のあるＨＩＶ、固形癌に関係のあるＤＮＡメチル−トランスフェラーゼ、癌に関係のあるＶＥＧＦ受容体、腎臓癌に関係のあるリボヌクレオチド還元酵素、ＣＭＶ性網膜炎に関係のあるＣＭＶＩＥ２、前立腺癌に関係のあるＭＭＰ−９、悪性グリオーマに関係のあるＴＧＦ・２、多発性硬化症に関係のあるＣＤ４９ｄ、糖尿病に関係のあるＰＴＰ−１Ｂ、癌に関係のあるｃ−ｍｙｂ、乳癌などに関係のあるＥＧＦＲ、癌に関係のあるｍｄｒ１、ＧＬＵＴ−１、およびａｕｔｏｔａｘｉｎの遺伝子を挙げることができる。そしてこれらの遺伝子の発現を効果的に抑制することのできる配列も、それ自体公知の配列のものを利用できる。【００１５】また、本発明においては、たとえばブロック共重合体とリポソームからなる静電結合型ポリマー修飾リポソームに担持させることのできる薬物としては、特にその種類に限定はないが、ペプチドホルモン、タンパク質、遺伝子、オリゴ核酸等の高分子性薬物、アドリアマイシン、パクリタキセル、シスプラチン等の疎水性の低分子性薬物が例示される。
【発明の効果】
【００１６】  本発明で得られた静電結合型ポリマー修飾（ＰＥＧ化）リポソームの分散液は高塩濃度、および生理条件下でも凝集せずに安定である。また、当該リポソームはＰＥＧ化リン脂質を構成成分とするＰＥＧ化リポソームと比較すると、リポソーム１つ当りのＰＥＧ密度を高く、血中安定性を向上させることが可能である。また、ブロック共重合体の荷電セグメントとしてリポソーム表面に固定されたオリゴ核酸は、ＤＮＡ分解酵素に対して耐性を示し、オリゴ核酸がある特定の遺伝子（標的遺伝子）の発現を効率的に制御することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】    以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明する。【００１８】実施例１：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ポリ（メタクリル酸  ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）（ＰＡＭＡ）ブロック共重合体の製造。【００１９】  アルゴン下、ナスフラスコ中、室温において、開始剤３，３−ジエトキシ−１−プロパノール１．０ｍｍｏｌ（０．１６ｍｌ）を溶媒テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５０ｍｌにマイクロシリンジで加え、Ｋ−ナフタレン１．０ｍｍｏｌ（０．３７０ｍｏｌ／ｌ−ＴＨＦ溶液、２．７ｍｌ）を加えて１０分間メタル化を施した。次いで、エチレンオキシド１１０ｍｍｏｌ（５．５ｍｌ）を加えて水冷下で２日間撹拌し、アニオン開環重合を行った。その後、メタクリル酸  ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル２５．４ｍｍｏｌ（４．３ｍｌ）を加え、室温において５分間反応を行った。その後、その後溶媒をエバポレートし、蒸留水に溶解させｐＨを５．０に調製した後凍結乾燥した。回収物についてはソックスレー抽出による精製を二回行ない、脱プロトン処理後１ＨＮＭＲによる構造解析を行った結果、ＰＥＧ分子量：５９００とＰＡＭＡ２５量体（分子量：４０００）のブロックポリマーをであることを確認した。【００２０】実施例２：静電結合型ＰＥＧ−ＰＡＭＡ化リポソームの製造。【００２１】  アニオン電荷を有する市販品のリポソーム、コ−トソ−ムＥＬ−Ａ−０１（日本油脂より購入、７．６３ｍｇ）に蒸留水（７．６３ｍＬ）加え、室温で撹拌しｐＨを７．４に調整し、１ｍｇ／ｍｌのアニオン性リポソーム溶液を調製した。そこに、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ／ＰＡＭＡブロック共重合体（実施例１で製造した）の水溶液を様々な割合で添加し静電結合型ＰＥＧ化リポソームを得た。【００２２】  ゼータ電位測定より、ブロック共重合体の添加量増加に伴い、リポソームのアニオン電荷がブロック共重合体により中和され、ゼータ電位の値が０に近づくことが確認された（図１参照）。【００２３】  また、ブロック共重合体の添加前後でのＤＬＳ測定より、大きな粒径の変化は認められなかった（図２参照）。また、ブロック共重合体添加後のリポソームは、電荷を有していないにもかかわらず、ＰＥＧ修飾により高い分散安定性を示すことを確認した。【００２４】実施例４：静電結合型ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ化リポソームの製造。【００２５】  カチオン電荷を有する市販品のリポソーム、リポフェクトアミン（インビィトロジェンより購入、２ｍｇ／ｍｌ）の水溶液６．１μｌに、ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡブロック共重合体の水溶液（１０μＭ）を４０μｌと滅菌蒸留水（１５３．９μｌ）を加え、静電結合型ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ修飾リポソーム溶液（ｓｉＲＮＡ濃度＝２００ｎＭ）を調製した。【００２６】実施例４：静電結合型ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ化リポソームのＲＮＡｉ効果【００２７】  ２４穴ポリスチレン製細胞培養プレート（ファルコン社製）に、人肝癌細胞（ＨｕＨ−７ｃｅｌｌ）を５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した後、市販の遺伝子導入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（１．２２μＬ／ｗｅｌｌ，インビィトロジェン社製）を用い、ホタルルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３，０．０８４μｇ��ｗｅｌｌ，プロメガ社製）とウミシイタケルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＲＬ−ＴＫ，０．７５μｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社製）のレポーター遺伝子を細胞にトランスフェクションした。次に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する配列を有する静電結合型ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ修飾リポソーム溶液（実施例３で調製した）、ｓｉＲＮＡ／リポフェクトアミン複合体およびＰＥＧ−ｓｉＲＮＡブロック共重合体単独の溶液を所定量加え（培地濃度換算２００〜０．５ｎＭ）、２４時間細胞と接触させた。培地交換後、さらに２４時間培養した後、細胞を回収し両レポーター遺伝子の発現量をＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）により測定しアンチセンス効果を評価した（ｎ＝３）。【００２８】  以上の結果を図３に示した。静電結合型ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ修飾リポソームは、ｓｉＲＮＡ／リポフェクトアミン複合体およびＰＥＧ−ｓｉＲＮＡブロック共重合体単独よりも高いＲＮＡｉ効果を示すことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図２は静電結合型ＰＥＧ−ＰＡＭＡ化リポソームのゼータ電位測定の結果である。
【図２】図３は静電結合型ＰＥＧ−ＰＡＭＡ化リポソームのＤＬＳ測定の結果である。
【図３】図４は種々の濃度における静電結合型ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ化リポソーム、ＰＥＧ−ｓｉＲＮＡ単独およびｓｉＲＮＡ／リポフェクトアミン複合体のＲＮＡｉ効果の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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