(57)【要約】【課題】製品の出所・履歴を個別具体的に特定できる情報化核酸を含有させた製品から、該情報化核酸を検出し製品を認証する方法を提供すること。【解決手段】任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備える情報化核酸を、例えば塗料、樹脂、油脂、繊維、皮、木材、印刷、紙又は接着材及びこれらの組み合わせに係る製品から抽出し、次いで、抽出された情報化核酸をＰＣＲ法により増幅し、しかる後、増幅された情報化核酸の塩基配列を決定して、製品を認証する製品認証方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備える情報化核酸を製品から抽出し、該情報化核酸をＰＣＲ法により増幅し、該情報化核酸の塩基配列を決定することを特徴とする製品認証方法。
【請求項２】
塩基配列を決定するに当たり、製品から抽出される該情報化核酸のデータと、該情報化核酸のデータを少なくとも含む情報化核酸データベースとを対比することを特徴とする請求項１に記載の製品認証方法。
【請求項３】
上記情報化核酸は塩基配列の少なくとも両端にプライマー対応部位を備え、該プライマー対応部位の塩基数が１０〜３０であることを特徴とする請求項１又は２に記載の製品認証方法。
【請求項４】
ＰＣＲ法により増幅させるに当たり、製品から抽出された情報化核酸の溶液、ＰＣＲ緩衝液、滅菌蒸留水、少なくとも１種のプライマー、２，３−ジデオキシヌクレオシド三リン酸及びポリメラーゼを混合し、所定の加熱処理を実施することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つの項に記載の製品認証方法。
【請求項５】
上記所定の加熱処理が、（１）９２〜９５℃で２〜５分間加熱し、次いで、（２ａ）９２〜９５℃で３０〜６０秒間、（２ｂ）２０〜５０℃で３０〜６０秒間、（２ｃ）７０〜８０℃で３０〜１２０秒間、の加熱サイクルを２０〜５０回繰り返し、しかる後、（３）７０〜８０℃で１〜１０分間加熱する処理であることを特徴とする請求項４に記載の製品認証方法。
【請求項６】
上記情報化核酸が人工型である場合に、上記ポリメラーゼとして人工型ポリメラーゼを用いることを特徴とする請求項４に記載の製品認証方法。
【請求項７】
上記人工型ポリメラーゼが、ＨＩＶ逆転写酵素及び／又はこのアミノ酸変異体であることを特徴とする請求項６に記載の製品認証方法。
【請求項８】
上記製品が、塗料、樹脂、油脂、繊維、皮、木材、印刷、紙及び接着材から成る群より選ばれた少なくとも１つであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つの項に記載の製品認証方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製品認証方法に係り、更に詳細には、個別認証に利用できる情報化核酸を含有する製品から該情報化核酸を抽出し、ＰＣＲ法により増幅し、塩基配列を決定して製品を認証する製品認証方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、個別認証には、ナンバープレート、紙幣などの透かし印刷、ＩＣチップ及びクレジットカードの写真などが利用されている。
しかし、これらの個別認証手段は、剥離、切断、消去などにより製品から除去することができるという欠点があった。このため、製品から取り除くことのできない、即ち消失しない認証情報の開発が期待されていた。
【０００３】
一方、ＤＮＡは、元来全ての生物が保有し、それぞれの生物において、全ての遺伝情報を含む情報生体分子である。その多くは多数のタンパク質のアミノ酸配列に対応するものである。即ち、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）及びデオキシチミン（ｄＴ）がリン酸エステル結合を介し一定の方向性をもって結合して成り、その塩基数をｎ個とすると、その長さのＤＮＡは４ｎ種類存在することになる。従って、例えばわずか１６種類の塩基数でも約４３億種類のそれぞれ区別できるＤＮＡが存在し得る。現在では、数十塩基配列を有するＤＮＡであれば、どのような配列のものでも任意に合成することができる。また、ＤＮＡは、ある程度以上の量があれば、自動配列読み取り装置（シーケンサー）で自動的にその配列を決定することができる。
【０００４】
このような背景から、水不溶性媒体にＤＮＡを含ませた偽造防止ラベルを製品に用いることにより、該ＤＮＡの存在・不存在を手掛かりにして、その製品の真偽を明らかにすることが提案されている（例えば特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００４−１５９５０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１に記載の技術は、基本的にはＤＮＡと水不溶媒体の混合方法に係るものであり、製品の真偽確認方法としては、ＰＣＲ法によるリボ核酸の増幅の有無を確認することにより、リボ核酸入りの対象製品を同定することが示されているに過ぎない。
また、ＤＮＡの存在・不存在を検定指標とする真偽確認データは元より、ＤＮＡの配列を検定指標とし、同種製品であっても個々の製品毎の認証を可能とする、個別認証に関するデータは開示されていない。
【０００６】
一方、自動車事故において加害者が逃走したときなどには、事故現場に残された塗膜片やガラス片、プラスチック片などから対象車両を特定したいという要請がある。
【０００７】
本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、どのような出所・履歴の製品であるかを個別具体的に特定できる情報化核酸を含有させた工業製品から、該情報化核酸を検出し製品を認証する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＤＮＡに代表される核酸を一つの認証情報としてとらえ、製品中の情報化核酸を抽出し、ＰＣＲ法により増幅し、塩基配列を決定することにより、上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明の製品認証方法は、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備える情報化核酸を製品から抽出し、該情報化核酸をＰＣＲ法により増幅し、該情報化核酸の塩基配列を決定し、製品を認証する方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、工業製品などの量産品であっても、微量に含まれる情報化核酸の配列を決定することにより、対象となる製品を個別的に認証できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の製品認証方法について詳細に説明する。
上述の如く、本発明の製品認証方法は、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備える情報化核酸を製品から抽出し、該情報化核酸をＰＣＲ法により増幅し、該情報化核酸の塩基配列を決定することを特徴とする。
これにより、製品又はその材料に含有するのが容易である一方、該製品から除去することが困難な微量な情報化核酸を検出し、製品の出所・履歴など個別具体的に特定することができる。
【００１２】
ここで、情報化核酸とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）及びこれらの誘導体をいい、天然型でも人工型でも良いが、使用環境が厳しい製品中に含めることを考慮すると、構造的に安定している人工型を使用するのが好ましい。人工型においては天然型には存在しない配列を形成できる。
また、情報化核酸において、塩基配列部位が任意であるとは、検出可能な塩基配列である限り無作為に選択され得ることを示し、塩基配列部位が既知であるとは、個別認証に用いられる塩基配列が予め把握されていることを示す。
【００１３】
更に、情報化核酸の大きさは、核酸全体における塩基数が２００以下であることが好ましい。２００を超えると合成の段階でごくわずかずつ未反応部位が生成し、塩基が欠けたものの含有量が増大し易い。より好ましくは１００塩基程度であることが良い。
更にまた、上記塩基配列においてチミン同士が隣接しないことが好ましい。これより、チミンがダイマー化するのを抑制できる。
【００１４】
また、情報化核酸は、ＯＨ基と反応する化合物と併用する場合や厳しい環境下で使用される場合の安定性を向上させる観点から、保護基により誘導化されていることが好ましい。具体的には、５´位、３´位のいずれか一方又は双方にある水酸基を、リン酸エステル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、ベンジル基、置換ベンジル基及びアリル基などを用いて誘導化することができる。図１の（Ａ）に天然型ＤＮＡ、（Ｂ）に５´位を誘導化したＤＮＡを示す。
なお、情報化核酸としてＲＮＡを用いるときは、安定性を向上させる観点から２´位の水酸基を上記保護基により誘導化することもできる。
このように、安定化させた情報化核酸は、本発明の製品認証方法に供した場合に、より容易に精度良く検出することができる。
【００１５】
また、任意且つ既知の塩基配列を有する部位を備える情報化核酸ではあるが、ＰＣＲ法により増幅させる場合には、塩基配列の両端ないしほぼ全体がポリメラーゼ連鎖反応に必要なプライマー対応部位に相当することになる。
つまり、ＰＣＲ法で増幅させる場合には、プライマー対応部位が必須であり、プライマー対応部位を予め設定しない場合には、任意の且つ既知の塩基配列を備える情報化核酸の例えば両端がプライマー対応部位に相当するため、ＰＣＲ法により増幅させる場合には、両端の塩基配列を予め把握されるだけプライマーとして準備する必要があり、試料が多量存在する場合には検出することが可能であるが、効率的ではない。
そこで、情報化核酸の両端をプライマー対応部位として任意ではあるが、ある程度そろえておくことによって、プライマーの種類も少なくて済み、効率良くＰＣＲ法により増幅でき、製品の認証を短時間で行うことができる。
かかるプライマー対応部位について、塩基数の下限は５以上であることが好ましい。より好ましくは１０以上であることが良い。塩基数が１０〜３０であることがＰＣＲ法の効率の観点から特に好ましい。
塩基数が５未満では、区別できる核酸の数が減少し、多くの製品の識別に時間がかかるようになる。一方、塩基数の上限は１００以下であることが好ましい。塩基数が１００を超えると、いずれかの位置の塩基を欠いた副生成物の比率が高くなり、精製に手間がかかり、場合によっては困難となってしまう。
なお、情報化核酸としてＲＮＡを用いるときは、逆転写酵素を用いて配列の相補的なＤＮＡを得、このＤＮＡを用いＰＣＲ法を行うことができる。
【００１６】
また、本発明の情報化核酸は、両端にプライマー対応部位を備え、更に認証情報部位を有することが好ましい。このときは、より詳細な情報設定により個別認証を実行できる。
例えば、図２に示すように、情報化ＤＮＡであれば、中央にｍ個の塩基数の配列を置き（Ｂ１〜Ｂｍ）、この部分の配列情報を認証情報に対応させる。その両端には、それぞれｌ（エル）個、ｎ個のプライマーに相補的な配列（Ｘ１〜Ｘｌ，Ｐ１〜Ｐｎ）を連結する。  情報化ＤＮＡはこの１本鎖のもの又はそれと相補的な配列のＤＮＡと複合体を形成した２本鎖のものを情報素子として用いることができる。このプライマー対応部位の配列は、できるだけ相補的配列の結合が安定になり且つＰＣＲ法による増幅が円滑に進行するように工夫できる。
【００１７】
更に、本発明に供される製品としては、具体的には塗料、樹脂、油脂、繊維、皮、木材、印刷、紙又は接着材及びこれらの組み合わせに係る工業製品などを挙げることができる。
【００１８】
また、本発明の製品認証方法において、塩基配列を決定するに当たり、製品から抽出される該情報化核酸のデータと、該情報化核酸のデータを少なくとも含む情報化核酸データベースとを対比することが望ましい。予め把握された情報化核酸のデータベースと比較することにより製品認証にかかる時間を大幅に減らすことが可能となる。
かかるデータベースに蓄えられるデータとしては、例えば電気泳動時間やゲル濾過した際の移動距離（これは、情報化核酸自体をコントロールレーンに流せば足りる）などを挙げることができる。
【００１９】
更に、本発明の製品認証方法において、ＰＣＲ法により情報化核酸を増幅させるに当たり、製品から抽出された情報化核酸の溶液、ＰＣＲ緩衝液、滅菌蒸留水、少なくとも１種のプライマー、２，３−ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びポリメラーゼを混合し、（１）９２〜９５℃で２〜５分間加熱し、次いで、（２ａ）９２〜９５℃で３０〜６０秒間、（２ｂ）２０〜５０℃で３０〜６０秒間、（２ｃ）７０〜８０℃で３０〜１２０秒間、の加熱サイクルを２０〜５０回繰り返し、しかる後、（３）７０〜８０℃で１〜１０分間加熱処理することが好ましい。なお、情報化核酸の塩基配列の任意性を高めるという観点からはより２種のプライマーを用いることが好ましい。
【００２０】
（１）において、９４℃で５分が特に好ましい。９２℃で２分より短いとＤＮＡの２本差への分離が困難になり、９５℃で５分より長いと、酵素が失活するからである。なお、製品に含まれる情報化核酸が１本鎖である場合には不要である。
また、（２ａ）において９４℃で３０秒が特に好ましい。９２℃で３０秒より短いと増幅率が低下し、９５℃で６０秒より長いと、酵素が失活する。
更に、（２ｂ）において４０℃で３０秒が特に好ましい。２０℃で３０秒より短いとプライマーとＤＮＡの結合が困難になり、５０℃で６０秒より長いと、酵素が失活する。
また、（２ｃ）において７２℃で３０秒が特に好ましい。７０℃で３０秒より短いと伸長が不十分になり、８０℃で１２０秒より長いと酵素が失活する。
更に、（３）において７２℃で７分が特に好ましい。７０℃で１分より短いと伸長が不十分になり、８０℃で１０分より長いと時間の無駄になる。
更にまた、加熱サイクル（２ａ）〜（２ｃ）の繰り返しは、３０回が特に好ましく、２０回より少ないと増幅率が低下し、５０回より多いと時間の無駄になる。
【００２１】
図３に、本発明の製品認証方法の一実施形態のフロー図を示す。
同図に示すように、Ｓ１において、製品から情報化ＤＮＡを抽出する。Ｓ２において、凍結乾燥により濃縮する。Ｓ３において、２種類のプライマーとポリメラーゼを加える。ここで、情報化核酸が人工型である場合には、ポリメラーゼとして人工型ポリメラーゼを用いることが、ＰＣＲ法の効率及び精度向上の観点から好ましい。人工型ポリメラーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えばＨＩＶ１−ＲＴなどのＨＩＶ逆転写酵素及びそのアミノ酸変異体のいずれか一方又は双方を使用することができる。Ｓ４において、ＰＣＲを繰り返すことによりＤＮＡを増幅する。Ｓ５において、残った余分なプライマーを一本鎖ＤＮＡ開裂酵素により分解する。Ｓ６において、二本鎖である情報化ＤＮＡをゲル濾過で精製する。Ｓ７において、シーケンサーにより配列決定を行う。なお、Ｓ５およびＳ６については、必要に応じて行なえばよく、省略できる場合は省略してもかまわない。
【００２２】
ここで、Ｓ１においては、例えば製品を粉末にして少量の水と混ぜればよいが、例えば情報化ＤＮＡを微粒子に担持させる際に化学的結合させた場合には、加水分解などすることにより効率良く抽出することができる。また、Ｓ２においては、例えば遠心エバポレーターを用いて濃縮してもよい。更に、Ｓ５においては、一本鎖ＤＮＡ切断酵素として、例えばＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｂｃａ  ＢＥＳＴポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼなどを使用できる。また、Ｓ６とＳ７との間に、更にＳ３及び４と同様の操作を繰り返して、目的のＤＮＡを増幅させてもよい。Ｓ７においては、質量分析装置によって配列決定を行ってもよく、シーケンサーによる配列決定と組み合わせてもよい。
【００２３】
また、情報化核酸の単離や精製の利便性を高める観点から、５´位の水酸基をビオチン又は蛍光分子により誘導化することが好ましい。具体的には、ビチオンを用いるとアビジンというタンパク質を結合したカラムに選択的に吸着され易くなる。一方、フルオレセインなどの蛍光分子を用いると核酸自体が蛍光をもつようになるため、感度よく検出でき精製等が容易になる。このように、単離や精製の利便性を高めると、個別認証が極めて容易になる。
更にまた、例えば５´位を硫黄に置換した場合には、水で抽出したものを更に金（Ａｕ）をコーティングした担体のカラムを通すことで容易に分離をすることができる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明をいくつかの実施例により更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
［製品の仕様］
配列番号１で表される情報化ＤＮＡ（配列番号２で表される可認証ＤＮＡを含む）をクリヤー塗料（日本ペイント社製、スーパーラックＯ−１３０  ＧＮ３）に添加量５μｇ／樹脂１００ｇの割合で添加して、１時間撹拌して混合して、情報化ＤＮＡ含有クリヤー塗料を得た。
リン酸亜鉛処理した厚み０．８ｍｍ、７０ｍｍ×１５０ｍｍのダル鋼板に、カチオン型電着塗料（日本ペイント社製、パワートップＵ６００Ｍ）を乾燥膜厚が２０μｍとなるように電着塗装した後、１６０℃で３０分間焼き付けた。次いで、中塗り塗料（日本油脂社製、ハイエピコ  Ｎｏ．５００、カラー：グレー）を乾燥膜厚が３０μｍとなるように塗装し、１４０℃で３０分間焼き付けた。その後、上記得られた情報化ＤＮＡ含有クリヤー塗料を乾燥膜厚が３０μｍとなるように塗装し、１４０℃で３０分間焼き付けた。
このようにして得られた塗膜について、情報化ＤＮＡの検出を行った。
【００２６】
（実施例１）
（１）上記塗膜片をカッターを用いて、細かく裁断した。
【００２７】
（２）塗膜細片に滅菌蒸留水５ｍＬを加え、マグネチックスターラーにより攪拌して、ＤＮＡを水層に抽出した。
【００２８】
（３）遠心機を用いて、塗膜細片と水層を分離し、水層を遠心エバポレータを用いて濃縮した。
【００２９】
（４）溶出回収したＤＮＡ溶液（５μＬ）、ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．２５μＬ）、滅菌蒸留水（２４．７５μＬ）、配列番号３で表される５μＭのプライマー１（５μＬ）、配列番号４で表される５μＭのプライマー２（５μＬ）、及び２ｍＭのｄＮＴＰ（５μＬ）を混合した。
【００３０】
（５）９４℃で５分間加熱後、［９４℃で３０秒→４０℃で３０秒→７２℃で３０秒］を３０回繰り返した。
【００３１】
（６）７２℃で７分処理後、４℃で保存した。
【００３２】
（７）１本鎖ＤＮＡ開裂酵素（Ｓ１ヌクレア−ゼ（一本鎖ＤＮＡに特異的に反応））を用いて、余分なプライマーを分解し、目的の２本鎖情報化ＤＮＡをゲル濾過で精製した。
【００３３】
（８）精製した情報化ＤＮＡに１種類のプライマー（配列番号３で表されるプライマー１）及び蛍光標識した２，３−ジデオキシヌクレオシド三リン酸を混合した。
【００３４】
（９）上記工程（５）と同様の操作を行った。
【００３５】
（１０）ゲル濾過精製後、自動シーケンサーに供し、配列決定を行った。
【００３６】
その結果、初めに製品に含有させた情報化ＤＮＡが検出された。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】天然ＤＮＡとこの５´位を誘導化したＤＮＡを示す構造式である。
【図２】認証情報部位に両端にプライマーを有する情報化核酸を示す概略図である。
【図３】本発明の製品認証方法の一実施形態を示すフロー図である。
【図１】
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【図２】
2006122042.tif 000003
【図３】
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【配列表】
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