(57)【要約】【課題】  低酸素状態の細胞に対して選択的に毒性を発現させかつ逆電子移動の欠点を克服した薬剤を製造する。【解決手段】  光酸化剤と電子受容体とが連結されている化合物であって、該光酸化剤は、光照射によって活性化され、該電子受容体は、該光酸化剤によって酸化された物質から放出される電子を不可逆的に受容する、化合物を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光酸化剤と電子受容体とが連結されている化合物であって、該光酸化剤は、光照射によって活性化され、該電子受容体は、該光酸化剤によって酸化された物質から放出される電子を不可逆的に受容する、化合物。
【請求項２】
前記光照射によって制癌作用を発現する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記光酸化剤および／または電子受容体が制癌作用を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記光照射によって細胞性成分が酸化される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記電子受容体が還元活性化型のアルキル化剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記光照射によって細胞性成分がアルキル化される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記細胞性成分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細胞膜または核膜である、請求項４または６に記載の化合物。
【請求項８】
前記光酸化剤および電子受容体がリンカー部分を介して連結されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記光照射によって前記光酸化剤と電子受容体とが解離する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記光酸化剤が、カンプトセシン誘導体、キノン化合物、酸化性金属錯体、ビオロゲン化合物、またはチアジン系色素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記光酸化剤が、以下の構造式：
【化１】
2006248980.tif 000024
または以下の構造式：
【化２】
2006248980.tif 000025
（ここで、ＸはＣＲ１５またはＮであり、Ｍは、ロジウム（Ｒｈ）、コバルト（Ｃｏ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、マンガン（Ｍｎ）または鉄（Ｆｅ）であり、Ｒ１〜１４は、炭化水素または他の置換基である）を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記電子受容体が、キノン化合物、ニトロ芳香族化合物または芳香族シアノ化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記電子受容体が、以下の構造式：
【化３】
2006248980.tif 000026
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物を含む、光線力学的療法用組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の化合物を備える、光線力学的療法用キット。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物を被験体に投与する工程を包含する、光線力学的療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素状態の細胞に対して選択的に毒性を発現させることができる薬剤に関するものであり、より詳細には、本発明は、光線力学的療法に用いるための新規光感受性薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に癌（腫瘍）の治療として、外科療法、化学療法、放射線療法、免疫療法などが行われている。化学療法とは、抗癌剤を用いる治療法であり、化学療法によって完治する可能性を有する癌もあるが化学療法が有効ではない癌もあり、薬剤の種類によっては、強い副作用を伴うこともある。
【０００３】
腫瘍部位に限局して化学療法を行う腫瘍標的化化学療法も開発されているが、この方法もまた、例えば、新規抗癌分子標的の同定、腫瘍特異性を有する有効な治療剤のスクリーニング、腫瘍標的化薬物送達系の開発といった多くの目標を有している。通常、抗癌剤の多くは、一部の患者または一部の癌に対してのみ作用する。癌のテーラーメイド治療を進めるためには、腫瘍を分子的に特徴付けるためおよび治療効果を予想するために適切な方法の開発がなお必要とされている。
【０００４】
近年、新たな癌治療法として、レーザー光線を用いた光線力学的療法（Ｐｈｏｔｏ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ：ＰＤＴ）が開発された。この方法は、癌に対する親和性を有する光感受性薬剤（すなわち、癌組織に容易に取り込まれかつ強い光感受性を有する薬剤）を静脈注射した後にレーザー光線を癌細胞に照射するものであり、該照射によって癌細胞の中に取り込まれた薬剤が光励起エネルギーを基底状態の三重項酸素に移動して活性な励起一重項酸素（活性酸素）を発生させ、その結果、癌細胞を破壊するものである。ＰＤＴで使用するレーザー光線は、レーザーメスの約１／１００と低出力なうえ、上記薬剤は癌組織に多く集積するので、該方法を用いれば、正常組織への障害を最小限に抑え、癌病巣のみを選択的に治療することができると考えられている。
【０００５】
光線力学的療法は、全ての型の癌に対して作用し得、頭頸部癌、脳腫瘍、乳癌、肺癌、胃腸癌、膵癌、膀胱癌、前立腺癌または皮膚癌の処置において、周囲の健康な組織を損傷させることなく選択的に腫瘍組織を破壊し得る有望な処置として考えられている。光線力学的療法はまた、複数の薬剤耐性（癌化学療法の主要な欠点）を克服し得る。
【０００６】
しかし、臨床応用されている従来の光線力学的療法は、用いる光感受性薬剤が限定されている。さらに、低酸素腫瘍に対する有効性の観点からもなお光線力学的療法の開発が必要である。なぜなら、この療法は、主に、酸素存在下で光感受性薬剤に光照射する間に生成する一重項酸素（１Ｏ２）またはスーパーオキシドラジカルアニオン（Ｏ２・−）に依存しているからである。癌細胞が増殖すると固形組織化が進んで低酸素状態の細胞が顕著に増加するので、酸素濃度の低い低酸素状態の細胞を多く含む癌組織の治療に上記方法を適用した場合は、その効果が非常に低いかまたは全く効果を示さない。
【０００７】
低酸素腫瘍の光線力学的療法のために、光活性化プロドラッグ、すなわち、細胞性成分（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、細胞膜）から光感受性薬剤への電子移動（ＥＴ）を介する直接的な光誘起酸化のような機構によって作用する高効率な光感受性薬剤の開発が必要とされ、ＤＮＡ切断／損傷に対する光感受性薬剤の開発に多くの注目が集まっている。
【０００８】
しかし、慣用的な光感受性薬剤を用いる光誘起一電子酸化的ＤＮＡ損傷は、還元された光感受性薬剤から酸化されたＤＮＡ塩基へ電子が迅速に戻ることによって阻害される。このような光増感系に関連するこの逆電子移動の欠点を克服することを試みた報告はわずかである。
【０００９】
１つの方法は、共増感機構（例えば、光増感剤（光感受性薬剤）と共増感剤としての有機電子受容体（例えば、メチルビオロゲンまたは金属銅イオン）との組み合わせ、光増感剤と有機共増感剤ユニット（例えば、ビオロゲン、アミノキノリン）との複合体化）に基づいている（例えば、非特許文献１などを参照のこと）。
【００１０】
別の試みは、２色２レーザーを使用する方法である：第１のレーザー励起はＤＮＡから増感剤（Ｓ）へ電子を移動して増感剤アニオン（Ｓ−）を形成し、第２のレーザーは、溶媒である水へＳ−の電子を排出して水和した電子（ｅａｑ−）を生成する。
【００１１】
これらの方法はいずれも、光誘起ＤＮＡ損傷をある程度は増強する。
【非特許文献１】Ｆｒｏｍｂｅｒｚ  Ｐ．およびＲｉｅｇｅｒ  Ｂ．Ｊ．  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０８，５３６１−５３６２（１９８６）
【非特許文献２】Ｋａｗａｉ  Ｋ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４３，２４０６−２４０９（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記方法における還元された共増感剤または水和された電子（ｅａｑ−）は、特に酸素非存在下では、酸化されたＤＮＡ（ＤＮＡ・＋）に電子を戻す方向に進み、その結果、ＤＮＡ損傷の効率は低下する。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、低酸素状態の細胞に対して選択的に毒性を発現させかつ逆電子移動の欠点を克服した薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る化合物は、光酸化剤と電子受容体とが連結されている化合物であって、該光酸化剤は、光照射によって活性化され、該電子受容体は、該光酸化剤によって酸化された物質から放出される電子を不可逆的に受容することを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る化合物は、上記光照射によって制癌作用を発現することが好ましい。
【００１６】
本発明に係る化合物において、上記光酸化剤および／または電子受容体は制癌作用を有することが好ましい。
【００１７】
本発明に係る化合物において、上記光照射によって細胞性成分が酸化されることが好ましい。細胞性成分は、いわゆる生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質など）であってもよい。
【００１８】
本発明に係る化合物において、上記電子受容体は還元活性化型のアルキル化剤であることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る化合物において、上記光照射によって細胞性成分がアルキル化されることが好ましい。
【００２０】
本発明に係る化合物において、上記細胞性成分は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、細胞膜または核膜であることが好ましい。
【００２１】
本発明に係る化合物において、上記光酸化剤および電子受容体はリンカー部分を介して連結されていることが好ましい。
【００２２】
本発明に係る化合物において、上記光照射は３２０〜９１０ｎｍの範囲の波長によって行われることが好ましい。ここで、単光子励起を使用する場合は、３２０〜４５０ｎｍが好ましく、二光子／多光子励起を使用する場合は、４５０〜９１０ｎｍが好ましい。
【００２３】
本発明に係る化合物において、上記光照射はレーザー光によって行われることが好ましい。
【００２４】
本発明に係る化合物において、上記光照射によって上記光酸化剤と電子受容体とが解離することが好ましい。
【００２５】
本発明に係る化合物において、上記光酸化剤は、カンプトセシン誘導体、キノン化合物、酸化性金属錯体、ビオロゲン化合物、またはチアジン系色素であることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る化合物において、上記光酸化剤は、以下の構造式：
【００２７】
【化４】
2006248980.tif 000002
【００２８】
または以下の構造式：
【００２９】
【化５】
2006248980.tif 000003
【００３０】
（ここで、ＸはＣＲ１５またはＮであり、Ｍは、ロジウム（Ｒｈ）、コバルト（Ｃｏ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、マンガン（Ｍｎ）または鉄（Ｆｅ）であり、Ｒ１〜１４は、炭化水素または他の置換基である）を有することが好ましい。
【００３１】
本発明に係る化合物において、上記電子受容体は、キノン化合物、ニトロ芳香族化合物または芳香族シアノ化合物であることが好ましい。
【００３２】
本発明に係る化合物において、上記電子受容体は、以下の構造式：
【００３３】
【化６】
2006248980.tif 000004
【００３４】
を有することが好ましい。
【００３５】
本発明に係る光線力学的療法用組成物は、上記化合物を含むことを特徴としていることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る光線力学的療法用キットは、上記化合物を備えることを特徴としていることが好ましい。
【００３７】
本発明に係る光線力学的療法は、上記化合物を被験体に投与する工程を包含することを特徴としていることが好ましい。
【発明の効果】
【００３８】
本発明に係る化合物は、光照射を行うことによって作用する光活性化プロドラッグとして用いることができる。また、本発明に係る化合物の作用機序は酸素を必要としないため、低酸素状態の癌細胞に対しても治療効果を示すことができる。
【００３９】
さらに、本発明に係る化合物は、長波長の励起光を利用する二光子／多光子励起を化合物の光活性化に適用することができる。本発明により、低酸素状態の細胞を含む癌組織に対する新しい光線力学的療法の開発をさらに促進することができる。
【００４０】
本発明に係る化合物は、低酸素状態の細胞を標的とする癌疾患治療薬として利用され得る。本発明に係る化合物は、特に光線力学的療法に適用可能な光活性化抗腫瘍性プロドラッグとして使用することができる。なお、低酸素状態の細胞に毒性を発現させることができる光線力学的療法用の薬剤はこれまでに存在しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
〔１〕光感受性化合物
本発明は、光線力学的療法に適応可能な化合物を提供する。好ましくは、本発明に係る化合物は、光酸化剤と電子受容体とが連結されており、ここで、光酸化剤は、光照射によって活性化され、電子受容体は、光酸化剤によって酸化された物質から放出される電子を不可逆的に受容する。光酸化剤を用いる従来の光感受性薬剤では、還元された薬剤から酸化された生体分子へ電子が迅速に戻ることによって薬剤効果が阻害されてしまう。しかし、本発明に係る化合物は、上記構成を採ることによって、光照射に基づいて生体分子（例えば、細胞内ＤＮＡ）に対して酸化損傷を効果的に与えることができる。また、本発明に係る化合物は、光照射を行うまで２物質（光酸化剤および電子受容体）を所望の部位に同時に送達させかつ局在させることができる。
【００４２】
好ましくは、本発明に係る化合物は、光照射によって制癌作用を発生し、ここで、光酸化剤および／または電子受容体は、元々制癌作用を有している。これにより、本発明に係る化合物は、それぞれが制癌作用を有する２物質を連結したものであるにもかかわらず、光照射によって初めて該制癌作用を発生することができ、光照射によって、生体分子（例えば、細胞内ＤＮＡ）に対して酸化損傷を与えるとともに、制癌作用により癌細胞、特に低酸素状態の細胞に対して殺細胞効果を示すことができる。
【００４３】
一実施形態において、本発明に係る化合物は、電子受容体が還元活性化型のアルキル化剤であることが好ましい。本発明に係る化合物は、光照射によって、生体分子（例えば、細胞内ＤＮＡ）に対して酸化損傷およびアルキル化損傷を与えるとともに、光酸化能を有する抗癌剤自体の有する抗腫瘍作用により殺細胞効果を示すことができる。また、本発明に係る化合物において、電子受容体としてのアルキル化剤は、受容した電子をアルキル化反応にて消費するので、逆電子移動が生じることなくさらなる電子を受容し得、光酸化剤による酸化反応を促進することができる。
【００４４】
「アルキル化」は、一般に、化合物の水素原子を炭化水素などの有機基で置換する反応が意図されるが、本明細書中において使用される場合、細胞内のＤＮＡやタンパク質、特にＤＮＡ塩基成分のアルキル化が意図される。ＤＮＡ塩基のうち、特に、グアニンおよび／またはアデニンがアルキル化されやすく、ＤＮＡ塩基のアルキル化によって、突然変異の誘発、細胞の癌化、細胞死などが生じる。
【００４５】
アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）の薬理作用に細胞周期依存性はほとんどないが、Ｇ２／Ｍ期およびＧ１／Ｓ期にＤＮＡ（特にグアニンの７位窒素と６位酸素）をアルキル化して増殖中の細胞を傷害することが多い。アルキル化剤分子中に存在するアルキル基が癌細胞のＤＮＡ塩基に付加することにより、ＤＮＡの複製を阻止し、癌細胞を破壊する。アルキル化剤は濃度依存性の殺細胞効果を有しているので、化学療法剤として大量投与も行われている。
【００４６】
しかし、正常細胞のＤＮＡまたはタンパク質をアルキル化することもあるので、異常増殖していない正常細胞に対しても傷害をおよぼし、その結果、発癌性を呈することもある。例えば、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）は、固形癌に有効であるが、重篤な腎障害作用を有する。
【００４７】
本明細書中において光酸化剤としてカンプトテシンを用いて本発明を説明するが、好ましい光酸化剤としてはカンプトテシンに限定されない。本発明に係る化合物において、好ましい光酸化剤としては、カンプトセシン誘導体、キノン化合物、酸化性金属錯体、ビオロゲン化合物、およびチアジン系色素が挙げられ、以下の構造式：
【００４８】
【化７】
2006248980.tif 000005
【００４９】
または以下の構造式：
【００５０】
【化８】
2006248980.tif 000006
【００５１】
（ここで、ＸはＣＲ１５またはＮであり、Ｍは、ロジウム（Ｒｈ）、コバルト（Ｃｏ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、マンガン（Ｍｎ）または鉄（Ｆｅ）であり、Ｒ１〜１４は、炭化水素または他の置換基である）を有することがより好ましい。
【００５２】
本明細書中において電子受容体としてアルキル化剤を用いて本発明を説明するが、好ましい電子受容体としてはアルキル化剤に限定されない。本発明に係る化合物において、好ましい電子受容体としては、キノン化合物、ニトロ芳香族化合物、および芳香族シアノ化合物が挙げられ、以下の構造式：
【００５３】
【化９】
2006248980.tif 000007
【００５４】
を有することがより好ましい。また、本明細書中においてアルキル化剤としてインドールキノン（ＩＱ）またはマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を用いて本発明を説明するが、好ましいアルキル化剤としてはこれらに限定されず、好ましいアルキル化剤としては、キノン化合物が挙げられる。
【００５５】
本発明に係る化合物において、光酸化剤と電子受容体との連結は特に限定されず、直接連結されてもリンカーを介して連結されてもよい。本発明に係る化合物に新たな特性（例えば、水溶性または薬物動態特性）を付与する場合は、リンカーが使用されることが好ましい。水溶性を高めると薬剤の有する効力（毒性）が低下することが多いが、薬剤としての効力は血中濃度および／または吸収性能に依存するので薬剤が水溶性であることが好ましいことを当業者は容易に理解する。
【００５６】
また、水溶性を付与するために必要な構造は、当該分野において公知のものを利用すればよいが、必要に応じて切断可能なリンカーが好ましく、特に、本発明に係る化合物においては、以下の化学式：
【００５７】
【化１０】
2006248980.tif 000008
【００５８】
（ここで、ｎは１〜３０の整数であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＲ２ｎ＋１であり、Ｙは、Ｏ、ＮＨまたはＮＲ２ｎ＋２であり、Ｚは、Ｏ、ＮＨまたはＮＲ２ｎ＋３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、・・・Ｒｎ、・・・Ｒ２ｎ、Ｒ２ｎ＋１、Ｒ２ｎ＋２またはＲ２ｎ＋３は、水素、炭化水素、アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、アルコール、有機酸、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＰＥＧ、デキストラン、シクロデキストリン、または他のポリマー構造、あるいは１つ以上の光感受性薬剤および還元活性化アルキル化剤を組み合わせて含む構造である。）によって示される化合物をリンカーとして用いることが好ましいが、以下の化学式：
【００５９】
【化１１】
2006248980.tif 000009
【００６０】
（ここで、Ｘ＝Ｏ、ＳまたはＲ９であり、Ｙ＝Ｏ、ＮＨまたはＮＲ１０であり、Ｚ＝Ｏ、ＮＨまたはＮＲ１１であり、Ｅ＝Ｏ、ＳまたはＮＲ１２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１またはＲ１２は、Ｈ、炭化水素、アミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、アルコール、有機酸、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＰＥＧ、デキストラン、シクロデキストランまたは他のポリマー構造、あるいは１つ以上の光感受性薬剤および還元活性化アルキル化剤を組み合わせて含む構造である。）によって示される化合物をリンカーとして用いることもまた好ましい。このようなリンカーを使用すれば、本発明に係る化合物が還元雰囲気下に到達した場合には、該リンカーと結合する光酸化剤および電子受容体がそれぞれリンカーから解離し得る。
【００６１】
本発明に係る化合物を光線力学的療法に用いる場合、光照射によって光酸化剤と電子受容体とが分離されてもよい。分離される場合は、用いる光酸化剤および電子受容体が互いに干渉することなく標的細胞に直接作用することができ、分離されない場合は、上述したように、逆電子移動を抑えて光酸化剤の酸化反応をよりよく促進し得る。
【００６２】
好ましい実施形態において、本発明は、低酸素状態の細胞の光線力学的療法（ＰＤＴ）に対応可能な光酸化剤−還元活性化型ＤＮＡアルキル化剤複合体として、化学修飾を加えた抗腫瘍剤カンプトテシン誘導体を提供する。抗癌剤カンプトテシンは、ＤＮＡに挿入し得かつ３６５ｎｍの光照射下においてグアニンで選択的にＤＮＡの酸化的損傷を誘導する効果的な光増感剤として同定された薬剤である。このため、本発明者らは、カンプトテシン（ＣＰＴ）を、代表的な光酸化剤ユニットとして選択した。また、本発明者らは、生体還元活性化型抗癌剤であるインドールキノン（ＩＱ）およびマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（Ｐａｌｏｍ  Ｙ．，２０００，Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１３，４７９−４８８；Ｋｕｍａｒ  Ｇ．Ｓ．，１９９６，ＪＡＣＳ，１１８：９２０９−９２１７）を、還元活性化型アルキル化剤ユニットとして使用し、レーザーフラッシュ光分解（ＬＦＰ）によって電子移動に及ぼす効果を確認した（図１）。
【００６３】
このような物質を用いて、本発明者らは、インドールキノン（ＩＱ）およびマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）のいずれもが、カンプトテシンの光反応における電子受容体であること、およびこれらがカンプトテシンでの２’−デオキシグアニジン（ｄＧ）の光誘起酸化に対する効果的な共増感剤であることを、レーザーフラッシュ光分解（ＬＦＰ）によって確認し、本実施形態に係る化合物において、光照射に基づいて光酸化剤がＤＮＡ（グアニン）を酸化し得ると同時にインドールキノン（ＩＱ）またはマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）がＤＮＡアルキル化を誘導するラジカルを生成し得ることを実証した。
【００６４】
本発明に係る化合物は、光線力学的療法に適用され得る。従来の光感受性薬剤は、生体内、特に患部周辺の酸素濃度に依存し、さらに一電子酸化を受けたＤＮＡ（ＤＮＡ．＋）と放出された電子との再結合によってその効力が減弱されるが、本発明に係る化合物は、低酸素およびＤＮＡ．＋−電子再結合の両方に対する解決策を提供し、光線力学的療法において光誘起ＤＮＡ／ＲＮＡの損傷効果を増強させることができる。
【００６５】
つまり、本発明の目的は、光酸化剤−還元活性化型薬剤ハイブリッド分子（Ｐ−Ａ）の戦略に基づく、新規な種類の光感受性薬剤を開発することにある。この戦略において生じる正味の反応としてのＤＮＡからＰ−Ａへの光誘起電子移動（ＥＴ）は不可逆である。光照射下において、ハイブリッド分子Ｐ−Ａの光酸化剤ユニットＰがＤＮＡのグアニン塩基を一電子酸化した後、ＰがＤＮＡから得た電子は還元活性化型薬剤ユニットＡにリレーされ、Ａを活性化してＤＮＡのアルキル化に誘導し、その結果、一電子酸化的損傷だけでなくアルキル化作用も併発し、光誘起ＤＮＡ損傷がさらに増強され得る（スキーム１）。
（スキーム１：光酸化剤−還元活性型アルキル化剤ハイブリッド分子（Ｐ−Ａ）を用いた低酸素条件下での光誘起ＤＮＡ損傷）
【００６６】
【化１２】
2006248980.tif 000010
【００６７】
このようなＰ−Ａハイブリッド分子は、酸化された生体分子と還元性［Ｐ−Ａ］−との間での逆電子移動が生じないという効果を奏する。また、Ｐ−Ａハイブリッド分子は、光照射によって光感受性薬剤と電子受容体（または還元活性型アルキル化剤）との間の化学結合が切断され得、その結果、光感受性薬剤および電子受容体（または還元活性型アルキル化剤）がそれぞれ遊離して作用し得る。この場合、光感受性薬剤および還元活性型アルキル化剤は共増感剤として作用し得る。
【００６８】
なお、治療目的を癌として本発明を説明したが、光酸化剤−還元活性化型薬剤ハイブリッド分子戦略は必ずしも癌治療目的にのみ適用可能なのではなく、光線力学的療法が適用可能な疾患であれば限定されることなく該ハイブリッド分子戦略が適用可能であることを、当業者は容易に理解する。
【００６９】
〔２〕光感受性化合物の利用
（１）光線力学的療法用組成物
本発明は、光線力学的療法用の組成物を提供する。本発明に係る組成物は、液体溶液もしくは懸濁液、または注射のための液体ビヒクル中の溶液もしくは懸濁液のために適切な固体形態として調製され得る。
【００７０】
好ましくは、本発明に係る組成物は、一般に、注射（皮下、皮内、腹腔内、管腔内、胃内、腸内、静脈内または筋肉内）により達成される。
【００７１】
一実施形態において、本発明は、上述した本発明に係る光感受性化合物を含有する、癌を処置するための医療組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、症状の軽減または排除が意図され、予防的（発症前）または治療的（発症後）に行われ得るもののいずれもが包含される。
【００７２】
本発明に係る医療組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。本明細書中において使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、組成物を受容した個体において有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない任意のキャリアが意図される。適切なキャリアとしては、代表的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子のような、大きな、穏やかに代謝される高分子である。このようなキャリアは当業者に周知である。また、薬学的に受容可能な賦形剤については、当該分野において公知であり、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，  Ｎ．Ｊ．１９９１）に十分に記載されている。薬学的に受容可能なキャリアは、塩（例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など））を含み得る。
【００７３】
本発明に係る医療組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、医療組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。非経口剤の場合、当該分野において公知の方法に従って、本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。
【００７４】
さらに、本発明に係る組成物は、水、生理食塩水、グリセロール、またはエタノールのような１つ以上の成分をさらに含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質、安定化剤、抗酸化剤などのような補助物質が、本発明に係る組成物中に存在し得る。
【００７５】
本発明に係る医療組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明に係る医療組成物における本発明に係る光感受性化合物の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医療組成物を用いて後述の投与量範囲で本発明に係る光感受性化合物を投与できるような量であれば特に限定されない。
【００７６】
なお、組成物は一般に、物質Ａ単独を含有する組成物、物質Ａと物質Ｂとを含有する単一の組成物、または物質Ａ単独を含有する組成物と物質Ｂ単独を含有する組成物のいずれかであり得る。これらの組成物は、物質Ａおよび物質Ｂ以外に他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含有してもよい。本発明に係る組成物は、物質Ａとして上述した本発明に係る光感受性化合物を含有することを特徴としているので、本発明に係る光感受性化合物を含有する組成物を他の成分（物質Ｂ）を含有する組成物と併用する場合は、これらを全体として一組成物として認識し得ないが、この場合は、後述する「キット」の範疇に入り得、組成物としてではなくキットとして提供され得ることを当業者は容易に理解する。
【００７７】
（２）光線力学的療法用キット
本発明はまた、上述した本発明に係る光感受性化合物を備える、光線力学的療法用のキットを提供する。本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備える」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、光線力学的療法に適用するために必要な器具をあわせて備えてもよい。
【００７８】
本発明に係るキットにおける本発明に係る光感受性化合物およびその他の物質の使用方法は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００７９】
（３）光線力学的療法
本発明はさらに、光線力学的療法を提供する。本発明に係る方法は、上述した本発明に係る化合物を被験体に投与する工程を包含する；および、異常組織（例えば、癌組織）と正常組織との間での薬品濃度差が最大となる時点で光酸化剤を活性化し得る波長のレーザーを患部に照射する工程、を包含することを特徴としている。異常組織と正常組織との間での薬品濃度差が最大となるために必要な時間は、通常６〜１０８時間、好ましくは１２〜９６時間、より好ましくは４８〜７２時間である。
【００８０】
本発明に係る方法における本発明に係る光感受性化合物およびその他の物質の適用は、上述した組成物の使用形態に準じればよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００８１】
また、本明細書において、光感受性薬剤および還元活性型アルキル化剤が連結されている形態を例に挙げて本発明を説明してきたが、本明細書を読んだ当業者は、光感受性薬剤および電子受容体（または還元活性型アルキル化剤）が結合していなくても同時に用いることによって、本明細書中に記載した組成物、キットまたは光線力学的療法に適用可能であることを、容易に理解する。
【００８２】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００８３】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００８４】
〔１．試薬および細胞〕
２０（Ｓ）−カンプトテシン（ＣＰＴ）を、Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｓｅｉ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より得た。４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２−プロパノール、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、β−ニコチンアミンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩（ＮＡＤＨ）、培養培地ＰＲＭＩ−１６４０、およびＥａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）を、Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。インドールキノンを、Ｍｒ．Ａｒｉｍｉｃｈｉ  Ｏｋａｚａｋｉより供与戴いた。Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンを、Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄ．（Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より得た。チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトース、４−ニトロフェニルクロロホルメートおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＴ−ジアホレース（ＤＴＤ）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より得た。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４−ニトロフリルアルコール、４−ニトロベンジルアルコールおよび他の薬品を、Ｗａｋｏ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。
【００８５】
ＨＴ−１０８０ヒト線維芽細胞腫細胞株を、ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｅｎｄａｉ，Ｊａｐａｎ）より得た。ＥＭＴ６／ＫＵマウス乳腺腫瘍細胞株を、Ｋｙｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて継代培養した。ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ａｔｔｃ．ｏｒｇ）より得た。
【００８６】
〔２．クロマトグラフィーおよび質量分析〕
薄層クロマトグラフィーを、シリカゲル被覆ガラスシート（Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４  ＴＬＣ  ｐｌａｔｅｓ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にて行った。予備的薄層クロマトグラフィー（ＰＬＣ）もまた同じシートを用いて行った。Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｄ−７０００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍによってＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣにはＩｎｔｅｒｓｔｉｌ  ＯＤＳ−３  ｃｏｌｕｍｎ（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を使用した。０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン（ＴＥＥＡ）（ｐＨ７）の混合溶媒（６０分間にわたる１０〜６０％アセトニトリル直線勾配、流速０．６ｍＬ／分）を用いてサンプルを溶出し、そして２６０ｎｍおよび３５０ｎｍでのＵＶ吸収を検出した。１ＨＮＭＲスペクトルおよび１３ＣＮＭＲスペクトルを、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＸ２７０Ｊ分光計（２７０ＭＨｚ）またはＪＮＭ−ＡＬ３００分光計（３００ＭＨｚ）で記録した。３−ニトロベンジルアルコール（ＮＢＡ）マトリクスを用いて、ＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＳＸ１０２Ａ質量分析機にてＦＡＢ  ＭＳ（ｔｈｅ  ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を行った。ＵＶ可視吸収スペクトルを、ＵＶ／ＶＩＳ分光計Ｖ５３０（Ｊａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ）にて記録した。
【００８７】
〔３．ＣＰＴからＩＱまたはＭＭＣへの光誘起電子移動〕
図２（ａ）は、５０μＭ  ＣＰＴ、１５０μＭ  ＩＱおよび５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含むＡｒ飽和アセトニトリル−Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１）溶液の３５５ｎｍレーザーフラッシュ光分解（ＬＦＰ）後に観察した一過性の吸収を示す。ＩＱなしのＣＰＴ溶液におけるＬＦＰでの同様の観察に従えば、ＬＦＰの光励起終了後での３７０ｎｍ付近のネガティブな吸収帯は基底状態での枯渇に起因し、４３０ｎｍ付近のポジティブな吸収帯は、ＣＰＴの励起三重項状態に起因すると判断される。ＣＰＴ励起三重項状態の減衰後に、３５０ｎｍ付近にＩＱセミキノンラジカルアニオン（ＩＱ・−）に特徴的な吸収として認識され得る新たな過渡吸収の増大が観察された（図２（ｂ））。２００μｓ以降の時間領域において残存する４３０ｎｍ付近の吸収部分は、以前の研究を参照すれば、より安定な別のＣＰＴラジカルカチオン（ＣＰＴ・＋）に起因すると判断される。これらの中間体の安定性は、ｐＨに依存する。３５０ｎｍでの過渡吸収（ＩＱ・−）は、ｐＨ９でより安定であるが、ｐＨ５では安定ではない。これに対して、４３０ｎｍでの過渡吸収（ＩＱ・＋）は、酸性条件下（ｐＨ５）でもより安定である。これらの観察結果は、ＩＱがＣＰＴの光反応における電子受容体であることを示す。３５０ｎｍでの増強にしたがって、ＣＰＴ励起状態からＩＱへの光誘起電子移動の速度定数は、ｋＣＰＴ＊／ＩＱ＝１．３×１０８Ｍ−１Ｓ−１と算出された。
【００８８】
図３に示すように、３３０ｎｍ付近でのＭＭＣセミキノンラジカルアニオン（ＭＭＣ・−）および４３０ｎｍ付近でのＣＰＴラジカルカチオン（ＭＭＣ・＋）に特徴的な過渡の吸収を、１０μＭ  ＣＰＴ、５０μＭ  ＭＭＣおよび５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含むＡｒ飽和アセトニトリル−Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１）溶液のＬＦＰ後に観察した。３３０ｎｍでのＭＭＣ・−の増強を考慮すると、ＣＰＴ励起状態からＭＭＣへの光誘起電子移動の速度定数は、ｋＣＰＴ＊／ＭＭＣ＝３．６×１０７Ｍ−１Ｓ−１と算出された。
【００８９】
〔４．ＩＱまたはＭＭＣの存在下でのＣＰＴ光誘起ｄＧ酸化の共増感〕
図４（ａ）は、５０μＭ  ＣＰＴ、３．３ｍＭ  ｄＧおよび５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含むＡｒ飽和アセトニトリル−Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１）溶液の３５５ｎｍレーザーフラッシュ光分解（ＬＦＰ）後に観察した過渡吸収スペクトルを示す。ＬＦＰ後、λｍａｘ＝４３０ｎｍ付近でのＣＰＴ励起三重項状態の減衰は、２０μｓ内での３２０ｎｍでの増強と一致した（図４（ｂ））。この増強は、ＣＰＴ励起状態による光誘起ｄＧ酸化において生成するｄＧカチオンラジカル（ｄＧ・＋）に起因し得る。同様の観察が、ＣＰＴとグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）とのＬＦＰにおいて以前に報告されている。λｍａｘ＝４２０ｎｍおよびλｍａｘ＝５１０ｎｍを有する広範な吸収は、一電子酸化されたＧＭＰのグアニン塩基部位のカチオンラジカル（ｄＧ・＋）および還元されたＣＰＴアニオンラジカル（ＣＰＴ・−）の混合吸収に起因する。
【００９０】
ＣＰＴおよびｄＧの混合溶液にＩＱを添加した場合、３５０ｎｍ付近での新たな過渡吸収の増大が、２５μｓのＬＦＰ後に観察され、ＩＱの非存在下でのＣＰＴおよびｄＧのＬＦＰにおける観察を参照してλｍａｘ＝５１０ｎｍでの減衰と一致することを確認した（図４および５）。これらの結果は、ＣＰＴ、ｄＧおよびＩＱの混合系の光照射において生成したＣＰＴ・−が、ＩＱにさらに電子を移動してセミキノンラジカルアニオンＩＱ・−を生成し得ることを示す（スキーム２）。
（スキーム２：ＣＰＴの光誘起一電子酸化におけるＩＱの共同的増感機構）
【００９１】
【化１３】
2006248980.tif 000011
【００９２】
換言すれば、ＩＱは、この光反応系における共増感剤であるといえる。３５０ｎｍでのＩＱ・−の増強にしたがって、ＣＰＴ態からＩＱへの光誘起電子移動の速度定数は、ｋＣＰＴ・−／ＩＱ＝６．９×１０８Ｍ−１Ｓ−１と算出された。
【００９３】
ＩＱと同様に、ＭＭＣもまた、ＣＰＴ、ｄＧおよびＭＭＣを含むＡｒ飽和緩衝化系（ｐＨ７）において産生されるＣＰＴ・−から電子を受容する共増感剤（ｋＣＰＴ・−／ＭＭＣ＝６．６×１０７Ｍ−１Ｓ−１を有する）であることがわかった。
【００９４】
〔５．ＣＰＴ−ＭＭＣの合成〕
【００９５】
【化１４】
2006248980.tif 000012
【００９６】
以上のレーザーフラッシュ光分解測定の結果から、インドールキノン（ＩＱ）およびマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）はいずれも、カンプトテシンの光誘起一電子酸化作用を増強する電子受容体であり、カンプトテシンによる２’−デオキシグアニジン（ｄＧ）の光誘起酸化における効果的な共増感剤であることがわかった。よって、ＣＰＴ−ＩＱおよびＣＰＴ−ＭＭＣを、光酸化剤−還元活性化型アルキル化剤ハイブリッド分子の戦略に基づいて、新規な種類の光感受性薬剤を設計した。
【００９７】
〔５−Ａ．化合物１の合成〕
【００９８】
【化１５】
2006248980.tif 000013
【００９９】
９−フルオロメチロキシカルボニル−Ｌ−５−アミノ吉草酸（Ｆｍｏｃ−Ｖａｒ，１００ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）およびペンタクロロフェニル（７９ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４ｍＬ）中に溶解した。氷中にて冷却した後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，６１ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）を添加し、氷中にて２時間、次いで、室温で８時間攪拌し続けた。得られた反応混合物をさらなるＴＨＦ（３ｍＬ）に添加した。濾過によって沈殿を回収した後、濾過物を減圧乾燥して化合物１を白色粉末として得た（１５０ｍｇ，８８％）。
１ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１．５４−１．７８（ｍ，４Ｈ）；２．６３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；３．１９（ｍ，２Ｈ）；４．１４（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ）；４．３５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）；７．１９−７．７１（ｍ，８Ｈ）．１３ＣＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝２１．８，２９．２，３２．９，４０．４，４７．３，６６．６，１１９．９，１２４．９，１２６．９，１２７．６，１３９．６，１４１．２，１４２．９，１４３．８，１５６．３，１６９．１．ＦＡＢ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ＮＢＡ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ＝５８５［Ｍ＋Ｈ］＋，ＨＲＭＳ  Ｃ２６Ｈ２１Ｃｌ５ＮＯ４について（計算値）５８５．９９１３、（実測値）５８５．９９１０。
【０１００】
〔５−Ｂ．化合物２の合成〕
【０１０１】
【化１６】
2006248980.tif 000014
【０１０２】
化合物１（１４０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）およびＭＭＣ（８０ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、ピリジン（０．１ｍＬ）を添加した。この反応混合物を、暗環境下にて室温で４８時間攪拌し続けた。溶媒を吸引除去した後、残渣からＰＬＣ（ＤＭＣ／ＭｅＯＨ，９：１）によって精製してＭＭＣ誘導体である化合物２を得た（１４６ｍｇ，８０％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１．４７−１．５７（ｍ，４Ｈ）；１．７３（ｓ，３Ｈ）；２．４（ｍ，２Ｈ）；２．８６（ｓ，１Ｈ）；２．９４（ｓ，１Ｈ）；３．１２−３．１８（ｍ，５Ｈ）；３．４７（ｍ，３Ｈ）；４．１０（ｍ，１Ｈ）；４．３７（ｍ，２Ｈ）；４．８１（ｍ，２Ｈ）；７．２８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．３７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．５６（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；７．７３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）．１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８，２１．３，２９．１，３５．５，３９．６，４０．３，４２．４，４７．３，４８．５，４９．８，６１．９，６６．５，７７．８，１０５．１，１１０．２，１１９．９，１２５．０，１２７．０，１２７．７，１４１．３，１４３．９，１４７．１，１５３．９，１５６．３，１５６．５，１７５．６，１７８．４，１８３．５．ＦＡＢ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ＮＢＡ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ＝６５６［Ｍ＋Ｈ］＋，ＨＲＭＳ  Ｃ３５Ｈ３８Ｎ５Ｏ８について（計算値）６５６．２７２０、（実測値）６５６．２７２０。
【０１０３】
〔５−Ｃ．化合物３の合成〕
【０１０４】
【化１７】
2006248980.tif 000015
【０１０５】
化合物２（１４０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ中２０％のピペリジン（０．５ｍＬ）で１０分間処理した。減圧濃縮後、ＰＬＣによって残渣を精製してＭＭＣ誘導体である化合物３を黒色粉末として得た（７０ｍｇ，７６％）。
１ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ＝１．６８（ｍ，４Ｈ）；１．９１−２．２４（２ｍ，７Ｈ）；２．７６（ｓ，１Ｈ）；２．８５（ｓ，１Ｈ）；３．１５（ｓ，３Ｈ）；３．１９（ｍ，２Ｈ）；３．４０（ｍ，１Ｈ）；４．０２−４．２２（２ｍ，２Ｈ）．ＦＡＢ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ＮＢＡ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ＝４３４［Ｍ＋Ｈ］＋，ＨＲＭＳ  Ｃ２０Ｈ２８Ｎ５Ｏ６について（計算値）４３４．２０４０，（実測値）４３４．２０３６。
【０１０６】
〔５−Ｄ．ハイブリッド分子ＣＰＴ−ＭＭＣの合成〕
【０１０７】
【化１８】
2006248980.tif 000016
【０１０８】
化合物３（４３ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）とＤＭＣ（２ｍＬ）との混合溶媒中にて、ｐ−ニトロフェニルカンプトテシンカーボネート（５１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）（後述する化合物４）と混合した。この反応混合物を、暗環境下にて４時間攪拌し続けた。減圧濃縮後、ＰＬＣ（酢酸エチル）によって残渣を精製して黒色粉末としてハイブリッド分子ＣＰＴ−ＭＭＣを得た（４１ｍｇ，５０％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）：δ＝１．０７（ｍ，３Ｈ）；１．５９（ｍ，４Ｈ）；１．７４（ｓ，３Ｈ）；１．７６−１．８３（ｍ，２Ｈ）；２．３６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）；２．９２（ｓ，１Ｈ）；２．９９（ｓ，１Ｈ）；３．１２（ｍ，２Ｈ）；３．１９（ｓ，３Ｈ）；３．３０（ｍ，２Ｈ）；３．４７（ｍ，１Ｈ）；４．２２（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，２Ｈ）；５．２０（ｓ，２Ｈ）；５．３０−５．３８（２ｍ，２Ｈ）；６．８９（ｍ，１Ｈ）；７．５８−８．１７（ｍ，５Ｈ）．ＦＡＢ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ＮＢＡ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ＝８０８［Ｍ＋Ｈ］＋，ＨＲＭＳ  Ｃ４１Ｈ４２Ｎ７Ｏ１１について（計算値）８０８．２９４２、（実測値）８０８．２９３５。
【０１０９】
〔５−Ｅ．化合物４の合成〕
【０１１０】
【化１９】
2006248980.tif 000017
【０１１１】
カンプトテシン（ＣＰＴ）誘導体である化合物４、５および６を、Ｐｅｓｓａｈらによって最近報告された方法を改変した方法に従って調製した。
【０１１２】
ＣＰＴ（３３８ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）および４−ニトロフェニルクロロホルメート（４０８ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）中にて０℃で混合し、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，４００ｍｇ，３．２８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合溶液を室温で２時間攪拌し、０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した（４×１０ｍＬ）。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、１０ｍＬまで減圧濃縮し、ヘキサンで沈殿させた。沈殿物を、ジクロロメタン−ヘキサンで再結晶化して化合物４を淡い黄色粉末として得た（４０３ｍｇ，８１％）。
１ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１．０５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）；２．１５−２．３９（ｍ，２Ｈ）；５．３１（ｓ，２Ｈ）；５．４０（ｄ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ，１Ｈ）；５．７０（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，１Ｈ）；６．９２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）；７．３９−７．４５（ｍ，２Ｈ）；７．７６−８．２６（ｍ，６Ｈ）；８．４３（ｓ，１Ｈ）．
１３ＣＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８，３１．９，５０．２，６７．１，９６．０，１１５．６，１２０．４，１２１．６，１２５．２，１２６．１，１２８．２，１２８．３，１２９．２，１３１．１，１３１．６，１４４．９，１４５．４，１４６．３，１５１．１，１５４．９，１５７．１，１６６．６．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ＮＢＡ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ  ５１４．１２５７［ＭＨ＋］，Ｃ２７Ｈ２０Ｎ３Ｏ８  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ５１４．１２５０。
【０１１３】
〔５−Ｆ．化合物５の合成〕
【０１１４】
【化２０】
2006248980.tif 000018
【０１１５】
ジクロロメタン（３ｍＬ）中のモノ−Ｂｏｃ−Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレン−ジアミン（８０ｍｇ，０．４２５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の化合物４（１００ｍｇ，０．１９５ｍｍｏｌ）に滴下した。室温で４時間攪拌した後、この反応混合物を、減圧下で濃縮し、ＰＬＣ（酢酸エチル）で精製して化合物５を黄色粉末として得た（９８ｍｇ，８９％）。
１ＨＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．９３（ｍ，３Ｈ）；１．３７（ｍ，９Ｈ）；２．０２−２．２７（ｍ，２Ｈ）；２．２７−３．５０（ｍ，１０Ｈ）；５．２１（ｓ，２Ｈ）；５．３２（ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，１Ｈ）；５．６１（ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，１Ｈ）；７．１９（ｍ，２Ｈ）；７．５１−８．３２（ｍ，４Ｈ）．
１３ＣＮＭＲ（６８ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．８，２８．５，２９．７，３５．５，３５．７，４７．３，４９．９，６７．１，７５．９，９７．７，１２０．０，１２５．２，１２７．９，１２８．１，１２８．２，１２８．５，１２９．３，１３０．７，１３１．３，１４５．７，１４６．７，１４８．５，１５２．３，１５２．７，１５４．３，１５５．７，１５７．３，１６７．９．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ＮＢＡ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ５６３．２４９９［ＭＨ＋］，Ｃ３０Ｈ３５Ｎ４Ｏ７  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ５６３．２５０６。
【０１１６】
〔５−Ｇ．化合物６の合成〕
【０１１７】
【化２１】
2006248980.tif 000019
【０１１８】
化合物５（４０ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を用いて室温で１５分間処理した。溶媒を減圧で除去した後、残渣をＰＬＣ（酢酸エチル／メタノール＝２：１）で精製して化合物６を緑色〜黄色の油として得た（３０ｍｇ，９３％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．９２（ｍ，３Ｈ）；２．０２（ｍ，２Ｈ）；２．５９−３．６４（ｍ，１０Ｈ）；５．３０−５．６６（２ｍ，４Ｈ）；７．１９（ｍ，２Ｈ）；７．４４−８．３０（ｍ，４Ｈ）．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ  ４６３．１９８０［ＭＨ＋］，Ｃ２５Ｈ２７Ｎ４Ｏ５  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ４６３．１９８１。
【０１１９】
〔５−Ｈ．ハイブリッド分子ＣＰＴ−ＩＱの合成〕
【０１２０】
【化２２】
2006248980.tif 000020
【０１２１】
インドールキノン（５８ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、４−ニトロフェニルクロロホルメート（５０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．０４ｍＬ，０．５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中に０℃で溶解した。この混合溶液を、窒素雰囲気下にて室温で２時間攪拌し、ｐ−ニトロフェニルインドールキノンカーボネート（ＩＱ１）を生成した。化合物５（５０ｍｇ，０．０８９ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸を用いて室温で１５分間処理した。トリフルオロ酢酸を除去した後、残渣の化合物６を、ＩＱ１含有溶液に添加し、さらに０．５ｍＬ  トリエチルアミンを添加した。この反応混合物を、さらに１５分間攪拌し続けた後、減圧濃縮した。残渣をＰＬＣ（酢酸エチル）によって精製して、ハイブリッド分子ＣＰＴ−ＩＱを赤色粉末として得た（６０ｍｇ，９３％）。
１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．９２（ｍ，３Ｈ）；２．０６−２．２４（ｍ，５Ｈ）；２．７１−３．７９（３ｍ，１６Ｈ）；５．０８−５．６０（ｍ，７Ｈ）；７．１６（ｍ，２Ｈ）；７．５６−８．２９（ｍ，４Ｈ）．
１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７，８．４，２９．６，３１．９，３２．３，３５．４，３６．０，４５．６，４７．４，４７．７，４９．９，５７．５，６６．９，７５．９，９６．３，１０６．６，１１６．４，１２７．９，１２８．１，１２８．２，１２８．５，１２９．５，１３０．５，１３１．１，１３８．０，１４５．９，１４８．７，１５２．５，１５７．４，１５９．６，１６８．１，１７８．８．
ＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，ＮＢＡ  ａｓ  ｍａｔｒｉｘ）：ｍ／ｚ  ７２４．２６３１［ＭＨ＋］，Ｃ３８Ｈ３８Ｎ５Ｏ１０  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ７２４．２６１９。
【０１２２】
〔６．レーザーフラッシュ光分解（ｌａｓｅｒ  ｆｌａｓｈ  ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ）〕
３５５ｎｍでの第３の調波を生成するＣｏｎｔｉｎｕｕｍ  Ｓｕｒｅｌｉｔｅ−Ｉ  Ｎｄ−ＹＡＧ  （Ｑ−ｓｗｉｔｃｈｅｄ）ｌａｓｅｒを使用して、ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ  Ｕｎｉｓｏｋｕ  ＴＳＰ−６０１  ｆｌａｓｈ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒでレーザーフラッシュ光分解（ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ）を行った。Ｈａｍａｍａｔｓｕ  １５０  Ｗ  ｘｅｎｏｎ  ｓｈｏｒｔからのプローブビームを、励起レーザービームに対して垂直方向に配行された光ファイバースコープを用いてガイドした。Ｕｎｉｓｏｋｕ  ＭＤ２００  ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅを用いてＨａｍａｍａｔｓｕ  ｉｍａｇｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ  ＤＧ５３５  （１０２４  ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅｓ）を介して、プローブビームをモニタリングした。励起パルスレーザー、プローブビームおよび検出系のタイミングを、ＩＢＭ  Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰ  ｃｏｍｐｕｔｅｒに連結したＴｅｋｔｒｏｎｉｘ  ｍｏｄｅｌ  ＴＤＳ  ３０１２  ｄｉｇｉｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｏｓｃｉｌｌｏｓｃｏｐｅを介して達成した。Ｕｎｉｓｏｋｕ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｖｅｒ２．２２を用いて、ＬＦＰデータを記録および分析した。サンプルすべてをＡｒまたはＮ２Ｏのバブリングによって通気した後、レーザーフラッシュ光分解を行った。ｐＨ依存性実験において、酸反応条件としてサンプルのｐＨを５に、塩基性反応条件としてサンプルのｐＨを９に調整した。サンプル全てを５ｍＭリン酸緩衝液によって緩衝化した。３．３ｍＭ  ｄＧおよび５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含むＡｒ飽和アセトニトリル−Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１）溶液のＬＦＰの後、最終産物をＦＡＢ−ＨＲＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ，  ＮＢＡ）によって以下のように決定した：
Ｇについて、ｍ／ｚ  １５２．０５７４  ［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ５Ｈ６Ｎ５Ｏ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  １５２．０５７２；
ＩＱ−Ｇについて、ｍ／ｚ  ３６９．１３１１  ［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１７Ｈ１７Ｎ６Ｏ４  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ３６９．１２９４；
化合物６について、ｍ／ｚ  ４６３．１９８０  ［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ２５Ｈ２６Ｎ４Ｏ５  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ４６３．１９８１。ＨＰＬＣ分析（Ｒｔ＝３６．６分）によって、化合物６をさらに確認した。
【０１２３】
〔７．ＣＰＴ−ＩＱハイブリッド分子のＬＦＰ〕
図６は、５０μＭ  ＣＰＴ−ＩＱおよび５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含むＡｒ飽和アセトニトリル−Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１）溶液の３５５ｎｍレーザーフラッシュ光分解（ＬＦＰ）後に観察した過渡吸収スペクトルを示す。ＣＰＴ・＋構造（λｍａｘ＝４３０ｎｍ）およびセミキノンラジカルアニオンＩＱ・−構造（λｍａｘ＝３５０ｎｍ）は、ＣＰＴおよびＩＱの混合溶液のＬＦＰにおいて生成するものより迅速に形成された（図６（ｂ）および図２（ｂ））。この観察は、ハイブリッド分子ＣＰＴ−ＩＱにおけるＣＰＴ・＋およびＩＱ・−の生成機構が、この励起状態での電荷分離（分子間電子移動）を介するということを示唆する。
【０１２４】
〔８．ＣＰＴ−ＩＱのｄＧとの光誘起反応〕
この新規な種類の光誘起ＤＮＡ損傷剤を同定するために、代表例としてのＣＰＴ−ＩＱを使用して、ＤＮＡのグアニン塩基構造のモデル化合物として２’−デオキシグアニジン（ｄＧ）を用いた光誘起反応を調べた。
【０１２５】
図７は、５０μＭ  ＣＰＴ−ＩＱ、３．３ｍＭ  ｄＧおよび５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を含むＡｒ飽和アセトニトリル−Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ＝１：１）溶液の３５５ｎｍレーザーフラッシュ光分解（ＬＦＰ）後に観察した過渡吸収スペクトルを示す。４３０ｎｍ付近でのＣＰＴ−ＩＱ励起状態の減衰に続いて、３２０ｎｍ（ｄＧ・＋）および３６０ｎｍ（ＣＰＴ−［ＩＱ・−］）の２つの吸収帯が同時に観察された。３２０ｎｍでの吸収が最初に最大に達した（図７（ｂ））。これらの観察は、ｄＧ・＋およびＣＰＴ−［ＩＱ・−］）が２つの経路によって生成することを強く示唆する（スキーム４）。
（スキーム４：ｄＧからＣＰＴ−ＩＱへの光誘起電子移動経路）
【０１２６】
【化２３】
2006248980.tif 000021
【０１２７】
ＣＰＴ−ＩＱおよびｄＧのＬＦＰにおいて生成するこれらの過渡的な中間体は、さらに反応して、出発物質と比較して異なるＵＶ吸収特性を有する新たな最終生成物に変化する（図８）。ｄＧ・＋は、ＦＡＢ−ＨＲＭＳによって確認されるように、グアニンに分解し得る。ＣＰＴ−［ＩＱ・−］は、酸性の中間体［ＩＱＨ２・＋］および［ＣＰＴ３−］を生成し得る。活性なラジカル［ＩＱＨ２・＋］は、ＦＡＢ−ＨＲＭＳによって確認されたように、空気雰囲気下でｄＧをアタックして、アルキル化されたグアニン（ＩＱ−Ｇ）を生成し得る。同様の反応が、ＭＭＣとｄＧとの生体還元活性化型反応に関する以前の研究において観察された。プロトンを受容した後、中間体［ＣＰＴ３−］は、ＨＰＬＣ分析およびＦＡＢ−ＨＲＭＳによって決定されたように、ＣＰＴ３に変化し得る（スキーム５）。
（スキーム５：ｄＧとＣＰＴ−ＩＱとの光誘起反応機構）
【０１２８】
【化２４】
2006248980.tif 000022
【０１２９】
この種の光増感ハイブリッド分子は、アルキル化剤ユニットを活性化するためにＤＮＡから受容した電子を消費することによってＤＮＡの酸化的損傷を増強するように、従来の光酸化剤における逆電子移動の欠点を克服し得、ＤＮＡのアルキル化による損傷をさらに誘導し得る。そのため、この種の光増感ハイブリッドは、効果的な光誘起ＤＮＡ損傷剤である。これらによる光誘起ＤＮＡ損傷の機構は、酸素の存在に依存しないので、低酸素腫瘍の光線力学的療法に適用可能である。
【０１３０】
〔９．ＣＰＴおよびその誘導体の細胞毒性〕
抗癌剤としての能力を評価するために、種々の型の腫瘍細胞株に対するＣＰＴ誘導体の細胞毒性（ＩＣ５０；５０％阻害濃度）をＭＴＴ法によって測定した。用いた細胞は、ＨＴ−１０８０細胞、ＥＭＴ６／ＫＵ細胞およびＨＴ−２９細胞である。
【０１３１】
表１に示すように、ハイブリッド分子ＣＰＴ−ＩＱの細胞毒性（すなわち、抗癌剤としての能力）は、ＣＰＴ単独と比較して有意に減少しており、何ら処理を施さない状態でのハイブリッド分子ＣＰＴ−ＩＱが、低毒性であることを示す。
【０１３２】
【表１】
2006248980.tif 000023
【０１３３】
以上の実施例に示したように、新規な種類の光感受性薬剤である光増感ハイブリッド分子が、光未照射時においては無毒であること、および、光照射下においては個々の部分が互いにその機能を阻害することなく作用することもまた確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明に係る化合物であるハイブリッド分子は、低酸素腫瘍に対する光線力学的療法に適用可能な光感受性薬剤であるので、本発明により、細胞内の酸素に依存しない光線力学的療法用薬剤が提供できる。従って、光線力学的療法ではこれまで治療できなかった低酸素状態の腫瘍細胞を治療することができ、本発明に従うハイブリッド分子戦略は光線力学的療法のための新規光感受性薬剤の開発を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、本発明に係る化合物である光感受性薬剤ハイブリッド分子の例を示す。
【図２】図２は、本発明に係る化合物に対するレーザーフラッシュ光分解後に観察した過渡吸収の動的挙動を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明に係る化合物に対するレーザーフラッシュ光分解後に観察した過渡吸収の動的挙動を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係る化合物に対するレーザーフラッシュ光分解後に観察した過渡吸収の動的挙動を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明に係る化合物に対するレーザーフラッシュ光分解後に観察した過渡吸収の動的挙動を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明に係る化合物に対するレーザーフラッシュ光分解後に観察した過渡吸収の動的挙動を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明に係る化合物に対するレーザーフラッシュ光分解後に観察した過渡吸収の動的挙動を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明に係る化合物に対するレーザーフラッシュ光分解後に観察した過渡吸収スペクトルである。
【図１】
2006248980.tif 000027
【図２】
2006248980.tif 000028
【図３】
2006248980.tif 000029
【図４】
2006248980.tif 000030
【図５】
2006248980.tif 000031
【図６】
2006248980.tif 000032
【図７】
2006248980.tif 000033
【図８】
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