(57)【要約】【課題】安全で免疫増強作用が高く、かつ安定供給可能なアジュバントの開発及びこのアジュバントを用いたワクチンを提供する。【解決手段】アルミニウムゲルへ高級脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を１〜２０％混合したアジュバントを提供する。このアジュバントは、毒性や副作用の発現が認められず、原料も十分量を安価に調達可能である。このアジュバントと抗原より成るワクチンを動物へ投与することにより、対象となる抗原に対する免疫応答を安全かつ効果的に増強することができた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルミニウムゲルと高級脂肪酸からなるアジュバント。
【請求項２】
アルミニウムゲルがアルミニウム換算で０.２〜１.２ｗ/ｖ％、及び高級脂肪酸が１.０〜２０.０ｗ/ｖ％それぞれ含有される請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
アルミニウムゲルがリン酸アルミニウムである請求項１に記載のアジュバント。
【請求項４】
アルミニウムゲルが水酸化アルミニウムである請求項１に記載のアジュバント。
【請求項５】
高級脂肪酸が不飽和高級脂肪酸である請求項１〜４に記載のアジュバント。
【請求項６】
不飽和高級脂肪酸が炭素数１２〜３０、不飽和度１〜６である請求項１〜５に記載のアジュバント。
【請求項７】
不飽和高級脂肪酸がオレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸から、少なくとも１種選択される請求項１〜６に記載のアジュバント。
【請求項８】
さらに植物油を含む請求項１〜７に記載のアジュバント。
【請求項９】
植物油がダイズ油である請求項８に記載のアジュバント。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載のアジュバントと抗原より成るワクチン。
【請求項１１】
抗原として少なくとも１種類以上の細菌由来成分及び／又はウイルス由来成分を含む請求項１０に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野、特に生物学的製剤であるワクチンに含有される免疫増強物質の調製技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンの免疫付与能の増強を目的として添加される物質は、総称してアジュバントと呼ばれる。アジュバントの用語と概念については西暦１９２０年代には既に提唱されている（非特許文献１を参照。）。アジュバントとして、アルミニウムゲル（非特許文献２を参照。）をはじめ、非イオン性ブロックコポリマー（非特許文献３を参照。）、サポニン（例えば、非特許文献４，特許文献１、特許文献２等を参照。）、ムラミルジペプチド（非特許文献５を参照。）、カーボハイドレートポリマー（非特許文献６を参照。）等種々の物質についての報告がある。またこうした単一の物質に限定されず、流動パラフィン、脂質、あるいは高分子物質と、複数の界面活性剤やアジュバント物質とを組み合わせて形成される微細な粒子を担体とした製剤もアジュバントとして開発されており、フロイントの完全アジュバント（非特許文献７を参照。）をはじめ、イミュノスチミュレイチィング・コンプレクス（略してＩＳＣＯＭ）（非特許文献８を参照。）、あるいはリポソーム（非特許文献９を参照。）等が知られている。このように様々なタイプのアジュバントが考案されてきたが、現在実用化されて主流となっているアジュバントは、アルミニウムゲルアジュバントとオイルアジュバントの２種類に大別される。
【０００３】
アルミニウムゲルはヒト用ワクチンから動物用ワクチンに至るまで、長年に渡る臨床上の実績とデータの蓄積を有し、ワクチンアジュバントを理解する上で不可欠な物質のひとつである（非特許文献１０を参照。）。特にヒト用ワクチンでは、インフルエンザワクチンや破傷風トキソイドワクチンをはじめとする不活化ワクチンにおいて実績がある。またアルミニウムゲルは効果の実績のみならず、安全性、原料の安定供給が容易な点、あるいは比較的低価格である点も高く評価されており、ヒト用のみならず家畜や愛玩動物用のワクチンにおいても広範囲で利用され、人畜の感染症予防に広く貢献してきた。
【０００４】
オイルアジュバントは、流動パラフィンあるいはスクワランを油性基剤として、種々の界面活性剤と混合して調製される乳剤型アジュバントの一種である。広義では粒子状アジュバントに分類される（例えば非特許文献１１を参照。）。オイルアジュバントは油中水滴型（ｗａｔｅｒ-ｉｎ-ｏｉｌ型、以下Ｗ/Ｏ型という。）と水中油滴型（ｏｉｌ-ｉｎ-ｗａｔｅｒ型、以下Ｏ/Ｗ型という。）の２種類に大別される。Ｗ/Ｏ型オイルアジュバントは特にｄｅｐｏｔ（「貯留」を意味する。）効果に優れ、免疫応答を長期間持続させることが可能となる。またＯ/Ｗ型オイルアジュバントは特に抗原提示細胞のｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ（「抗原提示」を意味する。）を賦活する効果が強く、一連の免疫応答を増強することが知られている。
【０００５】
これらアジュバントを組み合わせる手段についても開発されてきた。例えば、アルミニウムゲルアジュバントとオイルアジュバントからなる動物用ワクチン製剤が知られている（特許文献３を参照。）。これは混合されたアジュバントというよりも、アジュバントの異なる２種のワクチン製剤を混合したものである。また、アルミニウムゲルへ他の物質が混合されたアジュバントとしては、スクワレン、グリセリン又はリン脂質および界面活性剤からなるアジュバントにアルミニウム塩を添加したアジュバント（特許文献４、５を参照。）、３価金属イオンと有機陰イオンの塩（サリチル酸アルミニウム等）からなるアジュバントにオイルアジュバントを加えるもの（特許文献６を参照。）、生体適合性最適化アジュバント（ＳＢＡ）として、固体脂質をベースとする粒子にさらにアルミニウムゲルを添加するもの（特許文献７を参照。）、並びに、脂肪相と有機金属ゲル（アニオン性ポリマーと多価金属カチオンの錯化合物）を含む組成物（特許文献８を参照。）等がある。ただし、これら発明に使用されるアジュバントはいずれも、本発明のワクチンアジュバントに含有される高級脂肪酸そのものを用いていない。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２１９６３８号公報
【特許文献２】特開平１１−３２２６３２号公報
【特許文献３】特開平８−２７０２８号公報
【特許文献４】特開平８−３１５１６２号公報
【特許文献５】特開平８−３１５１６３号公報
【特許文献６】特表２０００−５０７６１０号公報
【特許文献７】特表２００３−５００３６５号公報
【特許文献８】特表２００４−５２７６１５号公報
【非特許文献１】レーヴィスとルーミス、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ４０、５０３、１９２４
【非特許文献２】グプタ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ３２、１５５-７２、１９９８（１９９８）
【非特許文献３】ヒュンターら、Ｖａｃｃｉｎｅ ９、２５０-６、１９９１
【非特許文献４】小田ら、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３８１、６７-７４、２０００
【非特許文献５】レフランシエールら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １１、２８９-９６、１９７８
【非特許文献６】チナーら、Ｖａｃｃｉｎｅ １０、５５１-７、１９９２
【非特許文献７】スチュアート-タル、Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ、１-１９、１９９５
【非特許文献８】モラインら、Ｎａｔｕｒｅ ３０８、４５７-６０、１９８４
【非特許文献９】アルビンク、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｍｂｒ １１１３、３０７-２２、１９９２
【非特許文献１０】アイクホッフとマイヤー、Ｖａｃｃｉｎｅ ２０ Ｓｕｐｐｌ、Ｓ１-Ｓ４、２００２
【非特許文献１１】コックスとコールター、Ｖａｃｃｉｎｅ １５、２４８-５６、１９９７
【非特許文献１２】片山ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １７、２７３３-９、１９９９
【非特許文献１３】小田ら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２２、２８１２-２１、２００４
【非特許文献１４】オーコートゥリエール、Ｖａｃｃｉｎｅ １９、２６６６-７２、２００１
【非特許文献１５】ティザード、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ. Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.  ２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アルミニウムゲルは、ワクチンアジュバントとして広く利用されてきた経緯があるが、Ｔｈ１型免疫の賦活能が弱いために、Ｔｈ１型免疫の賦活が必要な疾病ではアジュバント効果が満足に発揮できないことが指摘されていた（非特許文献１２を参照。）。またアルミニウムゲルの抗体産生誘導能は、オイルアジュバントと比較すると若干劣るとの指摘もある（非特許文献１３を参照。）。このようにアルミニウムゲル単体では、必ずしもすべての抗原や疾病に対応できるとは限らず、改良の余地が残されていた。
【０００８】
またオイルアジュバントは、Ｗ/Ｏ型でワクチン組成中のおよそ５０から７０％、Ｏ/Ｗ型ではおよそ１５から２５％という高い含有比率で油性基剤が添加されているために（非特許文献１４を参照。）、これがワクチン注射部位での注射痕や残留性の原因となることが指摘されてきた。オイルアジュバントによる注射痕や残留の問題は、特に家畜では可食部位すなわち食肉の価値の低下につながる。愛玩動物あるいはヒトでは、その部位の脱毛、腫脹、しこり、あるいは痛みの発生の原因となり好ましくない（非特許文献１５を参照。）。
【０００９】
さらに、アルミニウムゲル及びオイルアジュバント以外のその他のアジュバント物質については、基礎的研究は進歩しているが、毒性、量産・安定供給、コスト、あるいは化学物質であるがゆえの様々な規制等が障壁となって、実用化に至らないものが多かった。
【００１０】
アジュバント活性を有する新規化合物の探究は今後も継続する必要があるが、そのスクリーニングには膨大な時間と労力を要する場合が多い。また新規化合物を得た場合でも、新規ゆえに副作用の強さが未知な点や強い毒性を有する可能性があることも、早期実用化においては不安材料と成り得る。今後市場で求められるワクチンアジュバントにおいては、単に免疫賦活能のみならず、前述のとおり、安全、安定供給が可能、低コストであることが製品上望ましいことが自明であると同時に、製品の実用化に至る過程そのもののコストの削減や開発期間の短縮も重要である。
【００１１】
また社会のグローバル化にともない、物資輸送や交通手段が飛躍的に発達し、快適な社会生活を営むことが実現された。しかしながら、重篤な感染症が勃発した場合はこれらネットワークを介して過去には想定し得なかった速度で蔓延し、社会生活に悪影響を与えかねない時代となった。特に、重篤な、あるいは新興の感染症予防には、ワクチンの早期開発・生産が不可欠である。こうした社会的なニーズに即応すべく、今後アジュバントに求められる条件として早期実用が可能であることが重要懸案である。
【００１２】
以上の背景を配慮すると、従来技術の長所を活かす方法を応用することが、こうした条件を満たすひとつの手段として有用であると考えた。そこで前述の代表的かつ実績の高い２種類のアジュバントに焦点をあてて検討を重ねた結果、本発明のワクチンアジュバントの考案に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、従来のアルミニウムゲルの長所、すなわち比較的高いアジュバント活性を有し、安全、安定供給可能、低コストである点を活かしつつ、さらにそのアジュバント活性を増強することを目的としている。生体由来成分である高級脂肪酸を、ワクチンアジュバントとして臨床実績のあるアルミニウムゲルのパートナーとして添加する本発明は、前述した種々の課題解決の条件を満たす発明である。
【００１４】
何らかの物質を添加することで、アルミニウムゲルの性能を改良する方法そのものは、グプタらの報告（非特許文献２を参照。）をはじめ既に提唱されており、公知のことである。しかしながら、アルミニウムゲルと高級脂肪酸との具体的な組み合わせについての発明は、本発明が新規であり、濃度検討や種々の抗原を用いた実施例の報告はこれまでに無かった。
【００１５】
本発明は、アルミニウムゲルとしてリン酸アルミニウムあるいは水酸化アルミニウムを用いる。これらアルミニウムゲルは、既にワクチンアジュバントとして用いられているものを用いることができる。また抗原原液に共存するリン酸イオンや水酸化物イオンとが反応することで偶発的に、あるいは抗原の吸着効果等を調整する目的で意図的に、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムとが混合されたアルミニウムゲルが調製されることもある。こうしたリン酸／水酸化アルミニウムゲルの混合物も本発明に用いることができる。これらのアルミニウムゲルは、後述の実施例（アジュバントの調製方法）に記載したように、アルミニウム換算濃度でアジュバント液中０．２〜１．２ｗ/ｖ％、好ましくは０．３〜０．５ｗ/ｖ％の範囲で使用される。
【００１６】
本発明で用いる高級脂肪酸は、最終的にワクチンとなった時に、室温から体温域で均一に分散された状態になる必要がある。このような条件を満たす高級脂肪酸は、炭素数１２〜３０、不飽和度１〜６の脂肪酸から選択される。例えばオレイン酸、リノール酸、あるいはリノレン酸等の不飽和高級脂肪酸は、この条件を満たす比較的入手容易な高級脂肪酸である。また近年、その生理活性が注目を浴びているドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸等も使用可能な高級脂肪酸の一種である。これら高級脂肪酸は、単一の種類で使用可能であるが、複数の高級脂肪酸が混合されていても使用できる。ワクチンとした時のワクチン液の粘性を調節する場合等、目的に応じて複数の高級脂肪酸を混合状態で使用することは不可欠である。また、高級脂肪酸材料としてはじめから混合物として入手された高級脂肪酸を使用することもある。また、融点の比較的高い飽和高級脂肪酸、例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、あるいはラウリン酸等を前述の不飽和高級脂肪酸と混合使用することもあり得る。なお、本発明においては、アジュバント液中の高級脂肪酸の含有濃度を１.０〜２０.０ｗ/ｖ％の範囲で実施例として検討したが、それ以上の含有濃度においてもアジュバント活性は発揮し得る。すなわち高級脂肪酸の含有濃度は、抗原要因（抗原性状や量）、コスト、あるいはアジュバント活性の強さを追跡しながら検討を重ねて、希望に応じた範囲に決定すれば良い。例えば、組み換えタンパク抗原や、分子量の比較的小さいペプチド抗原等は、一般的なタンパク抗原と比較すると抗原性が低い場合がある。こうした抗原でワクチンを調製する場合、１）抗原そのものの添加濃度を増やす方法、もしくは、２）アジュバントの含有濃度を増やす方法等がある。特に添加する抗原の量の確保が困難な場合は、後者の方法を選択することができる。
【００１７】
また高級脂肪酸に、適当な物質、例えば分散剤である界面活性剤を適量添加することで、均一かつ安定な分散液が容易に得られる。この分散剤としては、非イオン型界面活性剤として、例えばポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、マンニトール脂肪酸エステル、オリゴ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油・硬化ヒマシ油、あるいはポリオキシエチレンステロール・水素添加ステロール等が使用可能である。これらの界面活性剤は、市販品として入手可能で、例えば日光ケミカルズ株式会社等が高度な品質管理下で取り扱っている。以上の界面活性剤は、単一種類を添加する場合と、組成、添加量、使用目的、ワクチンの調製手順、あるいはコストを配慮して、複数を組み合わせて使用しても良い。なお、界面活性剤を組み合わせて使用する方法そのものは公知の手段である。また、高級脂肪酸の分散補助に植物油、例えばダイズ油、オリーブ油、ブドウ種子油、サフラワー油、アーモンド油、コーン油、ヒマワリ油、ゴマ油、ヘーゼルナッツ油、杏仁油、ククイナッツ油、ホホバ油、マカデミアナッツ油、メドウフォーム油、あるいはローズヒップ油等を補助的に添加することも可能である。その他、均一な分散を実現するために、特殊な分散装置、例えば特開２０００−１５０７３号公報に記載の高速撹拌装置等にて、本発明のアジュバント材料に強い撹拌エネルギーを与える方法を用いれば、前述した界面活性剤等の添加剤の量を抑えることが可能である。
【００１８】
本発明で使用する高級脂肪酸は、動植物の生命維持に不可欠な生体成分のひとつであり、β酸化をはじめとして脂肪酸の代謝経路が存在することが知られている。そこで、これらの脂肪酸を用いれば、生体に対して高い親和性を示す、すなわち投与後早い速度で代謝されることが予測され、単にアジュバント活性の増強効果のみならず残留のないアジュバントとなる可能性が高い。以上に述べた方法により得られる、アルミニウムゲルへ高級脂肪酸を添加した本発明のワクチンアジュバントを使用することで、次項に示す特徴と効果が得られることを確認した。
【発明の効果】
【００１９】
（１）アジュバント活性：  マウスを用いた基礎試験により、高級脂肪酸を添加することで、従来のアルミニウムゲルアジュバント単味の場合よりも高い抗体産生能を引き出すことが確認された。さらに豚による実用試験においては、単に抗体産生能の増強効果のみならず、豚マイコプラズマ肺炎の肺病変面積率の減少効果をも増強することが攻撃試験により確認できた。
【００２０】
（２）安全性：  マウスの腹腔に免疫原を注射した後の体重変動を観察したところ、本発明の高級脂肪酸を添加した群のマウスの体重変動は、従来のアルミニウムゲルアジュバント単味の群の変動と有意差が無く、低毒性であることが確認できた。豚による試験では、試作ワクチン注射後に一過性の発熱が認められたが、その発熱の温度及び発熱期間は従来のアルミニウムゲルアジュバント単味の群と同等であった。注射後に元気消失、食欲減退、嘔吐、下痢、あるいは座り込みの臨床症状を認めなかった。また、注射部位の注射痕も認められなかった。以上の試験成績より、本発明のアルミニウムゲルへ高級脂肪酸を添加したアジュバントは、従来のアルミニウムゲルアジュバント単味と同等の、安全性が高いアジュバントであることがわかった。
【００２１】
（３）安定供給：  アルミニウムゲルの原料であるアルミニウムは、鉱物資源のひとつとして地球上に大量に存在する元素のひとつで、地下埋蔵資源として得られる。社会情勢により多少の相場変動はあるが、現在のところ原料そのものの枯渇はなく、アジュバントとしての安定供給は可能である。また高級脂肪酸は通常、動物もしくは植物より得られる。また石油からも合成される。高級脂肪酸は、そのものが利用されるだけでなく、種々のエステル化合物の原料として不可欠な物質である。エステル化合物は、医薬品、医薬部外品、食品、あるいは工業用品等、あらゆる産業分野で需要があるため、その原料の高級脂肪酸の供給経路は現在のところ十分に確保されている。
【００２２】
（４）ＢＳＥ対策：  近年、ＢＳＥいわゆる狂牛病の問題が発端となって、食品や医薬品の原料として牛の臓器に由来する原料を可能な限り使用しないことが求められている。やむを得ず使用する場合でも、１）ＢＳＥ非発生国であることが証明された原産国由来の牛を利用すること、２）ＢＳＥの原因物質であるプリオンの含有量がなるべく少ない、もしくはプリオンが含有されない臓器を原料とすること、さらには３）プリオンを分解消失させるための適当な加熱、精製、加工処理をおこなうこと等が要求される。本発明においては、特に家畜用ワクチンのアジュバントとして使用することにも配慮して、高級脂肪酸は石油を原料とする合成品あるいは植物由来品等、牛臓器由来でない原料を用いることを前提としている。牛臓器由来の高級脂肪酸は、基本的には使用しない。したがって投与対象や、投与対象が家畜の場合それを食するヒトや動物に、本発明のアジュバントが原因となってＢＳＥが発生することはない。本発明のアジュバントは、単にアジュバント活性が高いのみならず、安全性が高い、安定供給可能な材料から成る、かつ低コストに加えて、ＢＳＥ対策をも満たすアジュバントである。以上の検証と確認の実施例を次に示す。
【実施例１】
【００２３】
（１）マウスによる基礎試験：  以下に本発明のアジュバントの性能について、マウスを用いた実施例を示す。アジュバントの実用化は、ヒト用、家畜用、及び愛玩動物用のワクチンでの使用を前提に進められる（例えば非特許文献７を参照。）。動物種によって免疫応答や毒性が異なることが知られているが（例えば非特許文献２を参照。）、アジュバントの基礎研究でも他の医薬品と同様に、まずマウス等の小動物を用いることが基本とされている。
【００２４】
１．１  材料と方法
１．１．１  アジュバントの調製：  アルミニウムゲルをアルミニウム換算で０.４ｗ/ｖ％、高級脂肪酸を１.０、２.０、５.０、１０.０、あるいは２０.０ｗ/ｖ％、及び高級脂肪酸の分散補助剤としてポリソルベート８０を高級脂肪酸と等量、滅菌精製水へ加えて、分散機Ｔ.Ｋ.ロボミックス（特殊機化工業社）を用いて室温下３,０００ｒｐｍで５分間、均一に分散してアジュバント液とした。なおアルミニウムゲルはリン酸アルミニウムを基本に検討し、水酸化アルミニウムと比較した。高級脂肪酸はオレイン酸を基本に検討し、高級脂肪酸の種類の検討では、オレイン酸の他に、パルミトオレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸を用いた。
【００２５】
１．１．２  抗原の調製：  卵白アルブミン（以下ＯＶＡという）（シグマ-アルドリッチ社製）を生理食塩水へ溶解後、４℃、１００,０００×ｇ、９０分間遠心して、不溶性成分及び凝集成分を除去した。この遠心上清を可溶性ＯＶＡ抗原とした。
【００２６】
１．１．３  免疫原の調製：  前述のアジュバント液３０ｍＬと、ＯＶＡ量が免疫原中濃度１００μｇ/ｍＬとなるようにＯＶＡ抗原液を混合調製し、免疫原１００ｍＬを調製した。この免疫原０.１ｍＬずつを１群５匹の６週齢ｄｄＹマウス雌（日本エスエルシー社）それぞれの脚部筋肉内に１回注射して、４週間後の血清中の抗ＯＶＡマウス抗体価を測定した。
【００２７】
１．１．４  血清中抗体価の測定：  小田らの報告（例えば非特許文献１３、特許文献１及び２等）を参考に実施した抗体価測定方法を記載する。ポリカーボネート製９６穴丸底プレート（グライナー・バイオワン社製）を用いてエンザイムリンクト・イムノソルベントアッセイ（以下、ＥＬＩＳＡという。）を実施した。炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）で調製された０.１％（ｗ/ｖ）ＯＶＡ液を１穴あたり１５０μＬずつ分注し、４℃、一晩、固相処理した。このプレートを０.０５％ツイーン２０加リン酸緩衝食塩液（以下、Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳという）で３回洗浄して、Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて１００倍希釈されたマウス被験血清を１００μＬずつ分注し、３０℃、１時間感作した。３回洗浄の後、Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで希釈した抗マウス総ＩｇＧ-ＰＯＤ標識抗体（バイオソース社製）をそれぞれ１００μＬずつ分注し、３０℃、１時間感作した。再び３回洗浄の後に、リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５.６）で調製された１０ｍｇ/ｍＬ オルトフェニレンジアミン液（０.００３％過酸化水素水添加）を１００μＬずつ分注した。３０℃、１時間感作後、１ｍｏｌ/Ｌの硫酸水溶液を５０μＬずつ分注し、発色反応を停止した。波長４９２ｎｍにおける吸光度をもって血清中の抗ＯＶＡマウスＥＬＩＳＡ抗体価とした。
【００２８】
１．１．５  マウス急性毒性試験：  農林水産省発行の動物用生物学的製剤基準（ｐ６５０、２００２）にて定められている異常毒性否定試験法に準じて、感作材料の毒性を調べた。１群１０匹の５週齢 ｄｄＹマウス雌（体重およそ２４ｇ）（日本エスエルシー社）の腹腔内に感作材料０.５ｍＬを注射して、１日１回７日間、各個体の体重を測定し、体重回復の推移を群間で比較した。
【００２９】
１．２  結果
１．２．１  高級脂肪酸の添加量：  マウス血清中ＥＬＩＳＡ抗体価は、アルミニウムゲル単味の免疫原注射群よりも、高級脂肪酸を添加したアジュバントの群の方が高値を示した。また高級脂肪酸を添加した群の中でも、添加量が多い群ほど高値傾向を示した（以上図１）。マウス急性毒性については、いずれのマウスも注射後極端な体重減少は無く、注射後４日目には回復した。検討した高級脂肪酸量の範囲内では強い毒性は認められず、アルミニウムゲル単独の免疫原の注射群との間に有意差はなかった（図２）。以上の成績より、アルミニウムゲルへ高級脂肪酸を添加することで、従来のアルミニウムゲルアジュバントと同等の安全性を保持したままに、アルミニウムゲルのアジュバント活性をさらに増強できることが確認された。
【００３０】
１．２．２  高級脂肪酸及びアルミニウムの種類：  前述の検討は、高級脂肪酸としてオレイン酸１種類と、アルミニウムゲルとしてリン酸アルミニウム１種類とを組み合わせた試験であった。そこで次に、高級脂肪酸を５種類（オレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸）、またアルミニウムゲルとしてリン酸アルミニウムの他に水酸化アルミニウムを用いた場合について調べた。その結果、どの高級脂肪酸を添加してもオレイン酸の場合と同等のアジュバント活性の増強効果を示した（図３）。また高級脂肪酸を添加した水酸化アルミニウムに関しても、リン酸アルミニウムの場合と同等のアジュバント活性の増強効果が得られることが確認された（図４）。
【００３１】
１．２．３  高級脂肪酸の混合例：  前述のアジュバントの応用例として、アルミニウムゲルへ添加する高級脂肪酸を複数種類より構成し、さらに植物油を添加した組成について実施例として記載する。ステアリン酸単独ではアジュバントの調製が出来なかったが、オレイン酸と植物油としてダイズ油（日本薬局方）を加えた組成とすることで、アジュバントの調製が可能となった。これを元に免疫原を調製してマウスに注射した結果、血清中抗体価の上昇が確認できた。以上の結果を下記の表に示す。この成績は、融点が高いためにもともと調製困難であった高級脂肪酸を用いた組成であっても、複数の高級脂肪酸や分散補助剤を適量使用することで、本発明のアジュバントの調製が可能であることが確認された。
【００３２】
【表１】
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複数の高級脂肪酸を混合した場合に得られる効果（アジュバント物性の改良）。
【実施例２】
【００３３】
（２）豚での応用試験：  動物種により感受性が異なる可能性があるが、高級脂肪酸を添加することによって得られるアルミニウムゲルのアジュバント活性の増強効果は動物種がかわっても以上の成績に準じることが予測された。そこでマウス以外の動物種における効果の確認に併せて、実用化に最適なワクチンの候補のひとつとして、動物用ワクチン、その中でも豚用ワクチンについて検討した成績を以下に示す。
【００３４】
豚の慢性呼吸器病は、養豚経営において現在衛生対策上最も重要な課題の一つである。豚の呼吸器病のうちマイコプラズマ性肺炎及びパスツレラ・ムルトシダによる萎縮性鼻炎は共に離乳前後が感染の好発時期であり、他の病原体との混合感染により呼吸器症状を重篤化させる。また、豚インフルエンザは、前述の病原体をはじめ、呼吸器感染症に関与する種々の病原体の感染の温床となり、やはり呼吸器症状を重篤化させる。そこで、離乳期前後の呼吸器複合感染症の軽減を目的として、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（以下Ｍｈｐという）、パスツレラ・ムルトシダ（以下Ｐｍという）、及び豚インフルエンザの抗原を添加した肥育豚用の混合ワクチンを試作し、その有用性を調べて、本発明のアジュバントの性能を評価した。
【００３５】
２．１  材料と方法
２．１．１  試作ワクチンの調製：  試作ワクチンの調製は、前述の免疫原の調製方法に準じた。アルミニウムゲルとしてリン酸アルミニウム（アルミニウム換算でアジュバント液中０.４ｗ/ｖ％）、高級脂肪酸としてオレイン酸（アジュバント液中１０ｗ/ｖ％）を用いた。抗原として、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｈｐ）不活化全菌体、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐｍ）不活化皮膚壊死毒素（トキソイド）、及び不活化インフルエンザウイルス（以下ＳＩＶという）を用いた。各抗原の具体的な調製方法について以下に示す。
【００３６】
２．１．２  Ｍｈｐ不活化全菌体抗原原液の調製：  ＭｈｐをＦｒｉｉｓの液体培地（ロスら、Ａｍ Ｊ Ｖｅｔ Ｒｅｓ ４５、１８９９-１９０５、１９８４）で３７℃、２１０時間通気撹拌培養し、採取した培養菌液にホルマリンを０.１ｖｏｌ％の割合に加え、３７℃、２４時間以上静置し、不活化した。不活化後、この菌液を遠心分離により集菌した。遠心沈渣を生理食塩液を用いて不活化前の生菌数に換算して１.０×１０10ＣＣＵ以上/ｍＬとなるように浮遊させたものをＭｈｐ原液とした。
【００３７】
２．１．３  Ｐｍトキソイド原液の調製：  Ｐｍをダイズ製ペプトン液体培地で３７℃、６０時間通気撹拌培養し、その遠心上清を限外ろ過（分画分子量３００,０００）により３０倍に濃縮した。１０,０００×ｇ、３０分間遠心して得られた上清にホルマリンを０.５ｖｏｌ％の割合で添加し、３７℃、３日間感作し、不活化した。この抗原液を不活化前皮膚壊死毒素価に換算して１０,０００Ｕ/ｍＬとなるように希釈したものをＰｍトキソイド原液とした。
【００３８】
２．１．４  不活化ＳＩＶ原液の調製：  ＳＩＶ京都株（Ｈ１Ｎ１）及び和田山株（Ｈ３Ｎ２）（“京都微研”豚インフルエンザワクチンの抗原として使用されている株）を各々発育鶏卵の尿膜腔内に接種し、３７℃、３日間培養した後４℃に一晩静置し、感染尿膜腔液を採取した。これを限外ろ過（分画分子量３００,０００）により濃縮後、ホルマリンを０.０４ｖｏｌ％の割合に添加し、２２℃、４８時間感作し、不活化原液とした。更に１００,０００×ｇにてゾーナル遠心して抗原分画を採取し、濃縮調製したものをインフルエンザウイルス原液とした。
【００３９】
２．１．５  試作ワクチン中の抗原量：  試作ワクチン１０ｍＬ中のそれぞれの最終抗原量が、Ｍｈｐ 不活化前生菌数１.０×１０10ＣＣＵ、Ｐｍ不活化前皮膚壊死毒素活性１０,０００Ｕ、不活化ＳＩＶ京都株（Ｈ１Ｎ１）原液１,２８０ＨＡ、及び和田山株（Ｈ３Ｎ２）原液１,２８０ＨＡとなるように添加した。なお試作ワクチンとして、リン酸アルミニウムゲルへオレイン酸を添加したアジュバントを使用したものと、リン酸アルミニウムゲル単味のものとを調製した。
【００４０】
２．１．６  豚への注射と臨床観察：  １群あたり５頭の豚を割り付けて、前述の試作ワクチン２ｍＬを生後２３日齢の離乳豚（特定病原体フリー豚。去勢雄豚）の頚部筋肉内に、４週間隔で２回注射した。また比較対照群には抗原量が同じで、リン酸アルミニウムゲル単味をアジュバントとした試作ワクチンを同じワクチンプログラムで注射した。各注射後の臨床観察を実施すると共に、初回注射時と２回目注射後４週間後の各抗原に対する血清中各抗体価を測定した。また解剖時に注射部位のワクチンの注射痕の有無を観察した。
【００４１】
２．１．７  Ｍｈｐ攻撃試験：  Ｍｈｐ攻撃試験では上記に準じた群の割り付けで、２回目注射後４週間後に鼻腔内経由でＭｈｐの生菌を接種し、その４週間後の肺のマイコプラズマ肺炎の病変面積率を算出した。攻撃試験は、下地らの報告（Ｖａｃｃｉｎｅ ２１、５３２-７、２００３）に記載の術式に準じた。なおＭｈｐ攻撃試験では、試作ワクチン未注射の陰性対照群も設定した。
【００４２】
２．１．８  血清中抗体価の測定
（ａ）抗Ｍｈｐ抗体価及び抗Ｐｍトキソイド抗体価の測定：  前述のマウス血清中のＥＬＩＳＡ抗体価測定方法を参考に、豚血清測定用の術式に改編して実施した。ポリカーボネート製９６穴丸底プレート（グライナー・バイオワン社）を用いて、炭酸緩衝液（ｐＨ９.６）で調製されたＭｈｐ不活化全菌体破砕ＥＬＩＳＡ抗原液（Ｍｈｐ抗体価測定）、あるいはＰｍ皮膚壊死毒素（Ｐｍ抗体価測定）を１穴あたり１５０μＬずつ分注し、４℃、一晩、固相処理した。このプレートをＴｗｅｅｎ ＰＢＳで３回洗浄して、Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳにて２倍階段希釈された豚被験血清を１００μＬずつ分注し、３０℃、１時間感作した。３回洗浄の後、Ｔｗｅｅｎ ＰＢＳで希釈した抗豚総ＩｇＧ-ＰＯＤ標識抗体（キャッペル社製）をそれぞれ１００μＬずつ分注し、３０℃、１時間感作した。再び３回洗浄の後に、リン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５.６）で調製された１０ｍｇ/ｍＬ オルトフェニレンジアミン液（０.００３％過酸化水素水添加）を１００μＬずつ分注した。３０℃、１時間感作後、１ｍｏｌ/Ｌの硫酸水溶液を５０μＬずつ分注し、発色反応を停止した。波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定する。吸光度０.５以上を示した血清の最高希釈倍数を抗Ｍｈｐ豚ＥＬＩＳＡ抗体価あるいは抗Ｐｍ豚ＥＬＩＳＡ抗体価とした。
【００４３】
（ｂ）インフルエンザＨＩ抗体価の測定：  赤血球凝集抑制（以下ＨＩという）試験により測定した。被験血清をＲＤＥ及びニワトリ赤血球で処理する。これをＰＢＳにて２倍階段希釈し、各希釈液０.２ｍＬに０.２ｍＬ中８単位の赤血球凝集抗原を等量ずつ加え、室温で６０分間処理する。これに２ｖｏｌ％のニワトリ赤血球浮遊液を０.１ｍＬずつ加え、室温に６０分間静置し、赤血球凝集の有無を判定する。赤血球凝集を抑制した血清の最高希釈倍数をＨＩ抗体価とする。
【００４４】
２．２  結果
２．２．１  注射後の臨床観察：  第１回目注射時は、高級脂肪酸添加試作ワクチン注射群で１時間後に発熱する個体が認められた。発熱は注射後９時間目をピークとして回復し、１８時間目には平常時体温へと回復した。リン酸アルミニウムゲル単味の群では発熱のピークは３から６時間目で、高級脂肪酸添加試作ワクチン注射群より早期傾向であった。ただし２群間で体温の変動の全体に有意差は認められなかった。第２回目注射時は、発熱のピークは２群とも注射後６時間目で、その後は第１回目注射時と同様に１８時間目にはもとの体温に回復した（図５）。また、注射後の元気消失、食欲減退、下痢、嘔吐、あるいは座り込みの症状はどの個体にも認められなかった。さらにその後の飼育期間中に、試作ワクチンによる臨床症状の異常は認められなかった。結果を表に示す。
【００４５】
【表２】
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本発明のワクチン注射後の豚の臨床症状観察記録。
【００４６】
２．２．２  抗体応答：  Ｍｈｐ、Ｐｍ、及びＳＩＶに対する各抗体価は、高級脂肪酸添加試作ワクチン注射群においてアルミニウムゲル単味群よりもいずれも高値を示した。Ｐｍに関しては、既報（“京都微研”ピッグウィンＡＲ-ＢＰ２技術資料集、２００３）に記載の発症予防に必要な最小有効抗体価（抗Ｐｍ豚ＥＬＩＳＡ抗体価２以上）、ＳＩＶに関しては、発症予防に必要とされている最小有効抗体価（ＨＩ抗体価８０以上）を満たした（以上図６）。
【００４７】
２．２．３  Ｍｈｐ攻撃試験：  高級脂肪酸添加試作ワクチン注射群の個体が示したマイコプラズマ肺炎の病変面積率は、アルミニウムゲル単味群よりも低値を示し、より強い予防効果を示すことが判明した（図７）。
【００４８】
２．２．４  注射部位におけるワクチンの残留：  攻撃試験の個体について、解剖時に頚部筋肉の注射痕の有無を観察した。解剖時で注射後２か月目（＝２回目注射部位）及び注射後３か月目（＝１回目注射部位）を観察したが、いずれの個体においても注射部位筋肉に著変は認められず、膿瘍、筋肉の変色、あるいは線維化組織は認められなかった。この成績より、本発明のアジュバントは、長くとも注射後２か月目には肉眼的にはすでに消失していることが判明した。本発明のアジュバントは、アルミニウムゲル単味の場合と同等の期間で注射痕が消失することが確認された。結果を表に示す。
【００４９】
【表３】
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本発明のワクチン注射部位における解剖時の肉眼所見（注射痕の有無）。
【００５０】
以上の成績より、本発明のアジュバントは、マウス以外の動物種、例えば実施例では豚において、アジュバント効果の増強が確認できた。また、従来のアルミニウムゲルと同等に副作用が低いことも判明し、本発明の有用性について証明された。なおこの検討では、細菌の不活化全菌体、トキソイド、及びウイルスを含む計３種類の性状の異なる抗原に対する試作ワクチンの効果、ひいては本発明のアジュバントの幅広い抗原の種類に対するアジュバント効果が確認された。同時にマウスでの基礎試験成績が異種動物（実施例では豚）でも応用可能である可能性も確認できたことから、豚のみに限定されず、牛や鶏等の家畜動物、犬及びネコ等の愛玩動物をはじめ、ヒト用ワクチンへの応用、また近年予防衛生対策が強化されている養殖魚、魚類用ワクチンへの応用も考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】アジュバント中の高級脂肪酸濃度とマウス血清中抗ＯＶＡ抗体価との関係。アルミニウムゲルはリン酸アルミニウム、高級脂肪酸はオレイン酸を使用した。
【図２】本発明のアジュバントをマウス腹腔内へ注射した後の経過日数とマウス平均体重との関係。アルミニウムゲルとしてリン酸アルミニウム、高級脂肪酸としてオレイン酸を使用し、高級脂肪酸の添加量と体重変動との関係を比較した。
【図３】種々の高級脂肪酸を使用した場合のマウス血清中抗ＯＶＡ抗体価。高級脂肪酸は、アジュバント液中それぞれ１０ｗ/ｖ％で添加した。
【図４】２種類のアルミニウムゲルを使用した場合のマウス血清中抗ＯＶＡ抗体価。アルミニウムゲル量は、アルミニウム換算でアジュバント液中０.４ｗ/ｖ％を添加した。
【図５】本発明のワクチンを注射後の豚の体温変動。
【図６】本発明の試作ワクチン２回目注射４週後の豚の抗体価の成績。
【図７】マイコプラズマ肺炎の病変面積率（Ｍｈｐ攻撃試験）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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