(57)【要約】【課題】  シナプスの成熟のみが障害されその他のドレプリン関連機能が正常であるモデル動物や、このモデル動物を用いたシナプス成熟障害の候補治療薬のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  マウス由来のドレブリン遺伝子を単離し、ドレブリンＡ特異的エクソン１１Ａを挟むようにｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターを作製し、ＥＳ細胞への相同組み換えを行い、組み換えＥＳ細胞を個体に導入し、ＥＳ細胞由来の体細胞を高割合で有するキメラ個体を親として、組み換え遺伝子を有する子孫Ｆ１を得て、この個体Ｆ１とＣｒｅ遺伝子を発現するマウスとを交配させることによって２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたドレブリンＡ特異的エクソン１１Ａを欠失させた個体を得て、この個体の雌雄を掛け合わせることによってドレブリンＡノックアウトマウスを作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子を有する全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト哺乳動物及びその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ドレブリン変異遺伝子を保有し、ドレブリンＡを発現する機能を失ない、かつドレブリンＡに代えてドレブリンＥを発現する機能を有する非ヒト動物からなるシナプス成熟障害モデル動物。
【請求項２】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いてドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のシナプス成熟障害モデル動物。
【請求項３】
ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子が、ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａの全部とエクソン１１ｂの一部が欠失した変異遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載のシナプス成熟障害モデル動物。
【請求項４】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後に被検物質を投与し、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を評価するシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を指標としてシナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞に被検物質を投与し、シナプス成熟障害の程度を評価するシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、シナプス成熟障害の程度を指標としてシナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナプス成熟障害モデル動物や、該シナプス成熟障害モデル動物を用いたシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法や、シナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、発生過程の神経細胞に多量発現するアクチン結合タンパクドレブリン（Drebrin）を世界に先駆けて発見し（例えば、非特許文献１及び２参照）、このドレブリンがアクチンファイバーの性状を変えることにより神経細胞の形態形成、特に突起形成に関わっていること（例えば、非特許文献３〜５参照）や、発生中で移動している神経細胞では、細胞体と突起全体に存在するが、成熟した神経細胞では棘構造中に特異的に存在すること（例えば、非特許文献６〜８参照）を既に証明している。ドレブリンには、胚性型（embryonic type）のドレブリンＥと成体型（adult type）のドレブリンＡという２つのアイソフォームが存在しており（例えば、非特許文献９参照）、成熟した神経細胞のスパインに特異的に見られるドレブリンＡは、神経細胞にしか発現しないという特徴を有している（例えば、非特許文献１０及び１１参照）。ドレブリンＡはalternative splicing機構によりドレブリンＥに“ｉｎｓ２”と呼ばれる領域が加わった配列をしている。すなわち、５’側から９５６〜１０９３ｂａｓｅにｇｔｃｇｔｃｃｇｔａｃｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｔａａａｇｇｃａｔｃｇｇａｃａｇｔｇｇｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｔｃｃａｃｇｇａｃｔｃｃｃｔｔｔｃｃｃｔａｔａｔｃａｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃａｃｃｃｃａａａｃｃｔｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｃｔｃｃｃａｔ（配列番号１）が挿入されて発現したものである（例えば、非特許文献１２参照）。また、本発明者らは、ドレブリンＡを初代培養神経細胞に発現させると自動的に樹状突起スパインに集まり、しかもその長さを長くすることを見い出した。この発見は、ある一つの蛋白合成量を変化させることによってスパインの形態を変化させることができることを発見した世界で最初の報告である（例えば、非特許文献１３参照）。
【０００３】
【非特許文献１】J. Neurochem. 44, 1210-1216, 1985
【非特許文献２】J. Biochem. 117, 231-236, 1995
【非特許文献３】J. Neurosci. Res. 38: 149-159, 1994
【非特許文献４】Exp. Cell Res. 215:145-153, 1994
【非特許文献５】J. Biol. Chem. 269:29928-29933, 1994
【非特許文献６】J. Neurosci. 15: 7161-7170, 1996
【非特許文献７】Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986
【非特許文献８】Brain Res. 413, 374-378, 1987
【非特許文献９】J. Biochem.117, 231-236, 1995
【非特許文献１０】Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986
【非特許文献１１】Brain Res. 413, 374-378, 1987
【非特許文献１２】Mol. Brain Res. 19, 101-114, 1993、Neuroreport 3, 109-112, 1992
【非特許文献１３】J. Neurosci. 19, 3918-3925, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
樹状突起スパインのアクチン結合蛋白ドレブリンＡの減少は、シナプス機能に障害が生じることがわかっており、この技術を用いてシナプス機能障害治療薬の開発方法の可能性が考えられていた。しかし、従来の技術では、ドレブリンＡの発現を減少させると、ドレブリン総量が減少してしまい、また、動物間での発現抑制が変動するので、多数の均一なドレブリンＡ発現抑制動物を作ることが困難であった。本発明の課題は、シナプスの成熟のみが障害され、その他のドレブリン関連機能が正常であるモデル動物や、このモデル動物を用いたシナプス成熟障害の候補治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、マウス由来のドレブリン遺伝子を単離し、ドレブリンＡ特異的エクソン１１Ａを挟むようにｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターを作製し、ＥＳ細胞への相同組み換えを行い、組み換えＥＳ細胞を個体に導入し、ＥＳ細胞由来の体細胞を高割合で有するキメラ個体を親として、組み換え遺伝子を有する子孫Ｆ１を得て、この個体Ｆ１とＣｒｅ遺伝子を発現するマウスとを交配させることによって２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたドレブリンＡ特異的エクソン１１Ａを欠失させた個体を得た。この雌雄を掛け合わせることによって得たドレブリンＡノックアウトマウスが、シナプスの成熟のみが障害されその他のドレブリン関連機能が正常であるモデル動物となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子を有する全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト哺乳動物及びその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ドレブリン変異遺伝子を保有し、ドレブリンＡを発現する機能を失ない、かつドレブリンＡに代えてドレブリンＥを発現する機能を有する非ヒト動物からなるシナプス成熟障害モデル動物（請求項１）や、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いてドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のシナプス成熟障害モデル動物（請求項２）や、ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子が、ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａの全部とエクソン１１ｂの一部が欠失した変異遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載のシナプス成熟障害モデル動物（請求項３）や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物（請求項４）に関する。
【０００７】
また本発明は、請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後に被検物質を投与し、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を評価するシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項５）や、請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を指標としてシナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法（請求項６）や、請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞に被検物質を投与し、シナプス成熟障害の程度を評価するシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項７）や、請求項１〜４のいずれか記載のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、シナプス成熟障害の程度を指標としてシナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法（請求項８）に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のシナプス成熟障害モデル動物を用いると、シナプス成熟障害治療薬のスクリーニングや、シナプス成熟障害治療薬を特定する試験が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のシナプス成熟障害モデル動物としては、ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子(アイソフォーム変換不能型の変異を導入したドレブリン変異遺伝子)を有する全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト哺乳動物及びその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記ドレブリン変異遺伝子を保有し、ドレブリンＡを発現する機能を失ない、かつドレブリンＡに代えてドレブリンＥを発現する機能を有する非ヒト動物であれば特に制限されず、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター等を挙げることができるが、マウス等の齧歯類動物を好適に例示することができる。また、上記アイソフォーム変換不能型とは、変異を導入した結果、ドレブリンＡに変換することがないことを意味し、上記全能性細胞としては、ＥＳ（embryonic stem）細胞、ＥＧ（embryonic germ）細胞等を例示することができ、ＥＳ細胞はマウス、ラット、サル、ウサギで、また、ＥＧ細胞はブタで確立している。
【００１０】
上記ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａ（ｉｎｓ２）を含む領域が欠失した変異遺伝子としては、非ヒト動物の内在性ドレブリンＡ遺伝子のエクソン１１ａの全部又は一部とエクソン１１ｂの一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、エクソン１１ａとエクソン１１ｂが転写されないが、エクソン１１ｃは不活化されていないことにより転写されることにより、ドレブリンＡに代えてドレブリンＥを発現するようになったドレブリン変異遺伝子であれば特に制限されないが、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いてドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失した変異遺伝子であることが好ましく、中でもドレブリン遺伝子のエクソン１１ａの全部とエクソン１１ｂの一部が欠失した変異遺伝子が特に好ましい。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１１】
本発明のシナプス成熟障害モデルマウスは、配列番号１に示されるドレブリンＡ特異的挿入配列（ｉｎｓ２、エクソン１１ａに相当）をプローブとして、マウスの遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、ドレブリンのコーディング領域を含む陽性クローンをいくつかの制限酵素で分断し、ドレブリンＡ特異的挿入配列（ｉｎｓ２）を含む断片を単離し、ＰＣＲ等の方法によりエクソン１１ａの上流にｌｏｘＰを、下流にｆｒｔで挟んだｎｅｏ耐性遺伝子、さらにこれより下流にもう一つのｌｏｘＰを挿入し、５’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを構築するか、ドレブリンＡ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたドレブリンＡ遺伝子のエクソン１１ａの全部又は一部とエクソン１１ｂの一部を相同組み換え等により、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを構築し、この構築したターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００１２】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、ドレブリンノックアウトマウスを得ることができる。そして、かかるドレブリンノックアウトマウスにおけるドレブリン遺伝子 が染色体上で欠損していることを確認する方法としては、例えば、マウス尾部からゲノムＤＮＡを単離してサザンブロット法等により調べる方法や、このマウスから抽出したタンパク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
【００１３】
例えば、ドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域を欠失させるため、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを採用すると、脳内部特異的に変異を持ち込むことが可能となり、シナプスの成熟障害（シナプスの脆弱性）を惹起させうることから、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いることによりドレブリン遺伝子のエクソン１１ａを含む領域が欠失するように構築された変異遺伝子は、種々のヒト精神疾患のモデルとなる。上記バクテリオファージP１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムに代えて、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＦＬＰ−ＦＲＴシステム、醤油酵母（Zygosaccharomyces rouxii）由来のＲ−ＲＳシステム、バクテリオファージＭｕ由来のＧｉｎ−ｇｉｘシステムも使用することができる。
【００１４】
本発明のシナプス成熟障害モデル動物は、シナプス成熟障害発症のメカニズムの解析に有用であり、本発明のシナプス成熟障害モデル動物を用いると、シナプス成熟障害治療薬のスクリーニングや、シナプス成熟障害治療薬を特定する試験が可能となる。すなわち、かかるシナプス成熟障害モデル動物を用いると、精神分裂病、精神分裂病的挙動、うつ病、老人性脳機能低下、アルツハイマー病、パーキンソン病等のシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニングや、これらシナプス成熟障害治療薬を特定する試験を行うことができる。
【００１５】
本発明のシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本発明のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後に被検物質を投与し、行動の変化の程度、及び／又は、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を評価する方法や、本発明のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞に被検物質を投与し、シナプス成熟障害の程度を評価する方法であれば特に制限されず、また、本発明のシナプス成熟障害治療薬を特定する試験方法としては、本発明のシナプス成熟障害モデル動物に対し、出生前または出生後にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、行動の変化の程度、及び／又は、テタヌス刺激により誘導される海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度を指標とする方法や、本発明のシナプス成熟障害モデル動物に由来する神経細胞にシナプス成熟障害の候補治療薬を投与し、シナプス成熟障害の程度を評価する方法であればどのような方法でもよく、行動の変化の程度や海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度、及びシナプス成熟障害の程度の評価は、対照となる野生型、特に同腹の野生型と比較することが好ましい。上記被検物質やシナプス成熟障害の候補治療薬としては、抗精神薬、神経興奮薬、麻酔薬など、神経細胞の興奮を変化させる薬を好適に例示することができる。また、行動の変化としては、学習や記憶を調べる実験、反射的行動を取り入れた実験を具体的に挙げることができ、テタヌス刺激としては、条件刺激と無条件刺激の組合せ刺激を挙げることができ、海馬シナプス伝達の長期増強の改善の程度としては、コンテクスト依存性の恐怖反応（すくみ反応、フリージング）の程度を挙げることができる。
【００１６】
上記本発明のシナプス成熟障害の予防・治療剤のスクリーニング方法により得られる予防・治療剤を医薬品として用いる場合、経口的あるいは非経口的に投与することができるが、静脈投与等の非経口的投与が好ましい。非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。また、経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
【００１７】
以下、実施例により本発明のノックアウトマウスの作製方法をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
（ドレブリン遺伝子の単離）
ラットドレブリンｃＤＮＡのA型特異的挿入配列（ｉｎｓ２）をプローブとして、Ｂ６ＪマウスＢＡＣライブラリー（ＲＰＣＩ−２３）（アメリカ合衆国Children’s Hospital Oakland Research Institute BAC／PAC Resources）をスクリーニングし、ドレブリンのコーディング領域を含む陽性クローンを得た。
【実施例２】
【００１９】
（ターゲティングベクターの構築）
陽性クローン（全長約２００ｋｂｐ）をいくつかの制限酵素で分断し、Ａ型特異的挿入配列（ｉｎｓ２、エクソン１１ａに相当）を含む断片  ＨＫ（１３．５ｋｂ）（図１；drebrin gene HK 13.5Kb 参照）を単離した。ＰＣＲの方法を使ってエクソン１１ａの２１６塩基上流にｌｏｘＰを、１５４塩基下流にｆｒｔで挟んだｎｅｏ耐性遺伝子（ｐＫＧ−ｎｅｏ）、さらにこれより６７塩基下流にもう一つのｌｏｘＰを挿入した。これにより、ドレブリンＡ特異的エクソン１１ａはｆｒｔで挟まれたｎｅｏ遺伝子とともに２つのｌｏｘＰで挟まれた形（…〈エクソン１０〉…〈ｌｏｘＰ〉…〈エクソン１１ａ〉…〈ｆｒｔ・ｎｅｏ・ｆｒｔ〉…〈ｌｏｘＰ〉…〈エクソン１１ｃ〉…）となる（図１；targeting vector 参照）。また、ターゲティングベクター５’端となるBサイトに後の組み換え体のネガティヴ選別のためにジフテリア毒素A遺伝子を挿入した。図１には、ターゲティングベクター構築の概略が示されている。
【実施例３】
【００２０】
（ＥＳ細胞への相同組み換え）
実施例２で構築したターゲティングベクターを直鎖状として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで樹立したＥＳ細胞（ＭＳ１２）にエレクトロポレーション（電気穿孔法）により導入し、Ｇ４１８存在下で生存、増殖するＥＳクローンを単離した。単離したＥＳクローンのうちターゲティングベクターが相同組み換えされたものをサザンブロットで選別した（図２参照）。すなわち、ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡをKpnIで消化しアガロースゲル電気泳動後ナイロン膜に転写し、ＲＩ標識したドレブリン遺伝子SacI-EcoRI断片あるいはエクソン１１Ａをプローブとしてハイブリッド形成させ、オートラジオグラムにより陽性バンドを検出した。野生型では、いずれのプローブによっても約５．８ｋｂのバンドのみ検出されるが、相同組み換えを起こしたものでは野生型のバンドの他に約７．９ｋｂのバンドも検出される。
【実施例４】
【００２１】
（組み換えＥＳ細胞の個体への導入及びＦｌｏｘマウスの作製）
組み換えＥＳ細胞をＩＣＲ由来の桑実胚へマイクロインジェクションし、これを偽妊娠の仮親子宮内に移植した。ＥＳ細胞由来の体細胞を高割合で有するキメラ個体を親として、組み換え遺伝子を有する子孫Ｆ１を得た。また、組み換え遺伝子を有する個体Ｆ１と、Ｃ５７ＢＬ／６とを掛け合わせて得た受精卵に組み換え酵素ｆｌｉｐｐａｓｅの発現ベクターをマイクロインジェクションし、それを仮親に移植し組み換えｆｒｔで挟まれたｎｅｏ遺伝子を欠失した個体を得た。この個体では組み換えＥＳ細胞クローンの選別に用いたｎｅｏ遺伝子を欠失している（…〈エクソン１０〉…〈ｌｏｘＰ〉…〈エクソン１１ａ〉…〈ｆｒｔ〉…〈ｌｏｘＰ〉…〈エクソン１１ｃ〉…）が、２つのｌｏｘＰがドレブリンＡ特異的なエクソン１１ａ（ｉｎｓ２）を挟む形で挿入されている。このＦｌｏｘマウスでは細胞種、発生時期や薬物誘導などにより時期限定して組み換え酵素Ｃｒｅを発現するマウスとの掛け合わせにより、ｌｏｘＰで挟まれた領域（ｉｎｓ２を含む）を条件性（conditional）に欠失させることが可能となる。
【実施例５】
【００２２】
（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを使った遺伝子組み換えによるドレブリンＡノックアウトマウスの作製）
組み換え遺伝子を有する個体Ｆ１を片親とし、発生初期から全細胞で組み換え酵素Ｃｒｅを発現しているトランスジェニックマウス（Ｅ２Ａ−Ｃｒｅ）をもう一方の片親とし、これらを掛け合わせることで、２つのｌｏｘＰで挟まれた領域（ｉｎｓ２とｎｅｏ遺伝子を含む）を欠失したマウスのヘテロ個体を得た。この結果生じた２つのｌｏｘＰ配列にはさまれたドレブリンＡ特異的エクソン１１Ａを欠失させたヘテロマウスの雌雄を掛け合わせることによってドレブリンＡ特異的ノックアウトマウスを得た。ノックアウトのホモ個体は尾のＤＮＡを使ったgenotyping（ＰＣＲによる）によって同定した。すなわち、エクソン１１Ａ周辺のプライマーを使うことにより野生型（ＷＴ：１，１７１ｂｐ）、ノックアウトヘテロ（８０２ｂｐと１，１７１ｂｐ）、ノックアウトホモ（ＫＯ：８０２ｂｐ）を判別した。このドレブリンＡ特異的ノックアウトマウスではドレブリンＡアイソフォームだけが欠失し、ドレブリンＡの代わりにドレブリンＥが発現されることから、ドレブリンＥアイソフォームは残っている（…〈エクソン１０〉…〈ｌｏｘＰ〉…〈エクソン１１ｃ〉…）。
【実施例６】
【００２３】
（ドレブリンの発現）
（１）ウェスタンブロット分析１
生後５〜６週齢のドレブリンＡノックアウトマウス（ホモ）と生後１１週齢の野生型マウスとをエーテルで麻酔後、頚椎を脱臼させ、大脳皮質を取り出し、それぞれ１００μｇ（湿重量）を用いてウェスタンブロット分析を行った。結果を図３に示す。図３において、１，３，５レーンは野生型マウス、２，４，６レーンはドレブリンＡノックアウトマウスであり、１，２レーンにはドレブリンＡ及びドレブリンＥのＣ末端を共に認識するＭ２Ｆ６モノクローナル抗体を用い、２，４レーンにはシナプスタンパク質であるＰＳＤ９５を認識する抗ＰＳＤ９５抗体を用い、５，６レーンにはドレブリンＡ及びドレブリンＥのＮ末端を共に認識する抗ドレブリンＡＤＦ−Ｈドメイン血清を用いた。図３の１レーンのバンドはドレブリンＡを示し（本来大脳皮質においてはドレブリンＡのみが発現する）、２レーンは（ドレブリンＡより分子量が小さい）ドレブリンＥを示しており、ノックアウトマウスではドレブリンＡを発現することはないが新たにドレブリンＥを発現していることがわかる。また、図３の３レーンのバンドに比べて４レーンのバンドは薄く、ノックアウトマウスではシナプス異常が生じていることが示唆されている。図３の５レーンのバンドはドレブリンＡを示し、６レーンは（ドレブリンＡより分子量が小さい）ドレブリンＥを示しており、本ノックアウトマウスではドレブリンのＮ末端部を有するドレブリン分解物ではなく、ドレブリンＡの代わりに完全長のドレブリンＥが発現していることがわかる。
【００２４】
（２）ウェスタンブロット分析２
上記ウェスタンブロット分析１で用いたドレブリンＡノックアウトマウス（ＫＯ（-/-））と野生型マウス（ＷＴ（WT / WT））の大脳皮質のホモジェネートを８％ゲルで泳動して、ウェスタンブロット分析を行った。１次抗体としては、ドレブリンＡを特異的に認識するＤＡＳ２抗血清（×１００００）を用い、２次抗体としてはＨＲＰ α ｍｏｕｓｅ（×１００００）を用いた。結果を図４に示す。図４から、ドレブリンＡノックアウトマウス（ホモ）は、野生型マウスが発現するドレブリンＡを発現していないことがわかる。
【００２５】
（３）ウェスタンブロット分析３
生後１０週齢のドレブリンＡノックアウトマウスと同腹の野生型マウス（ＫＯ（WT / WT））をエーテルで麻酔後、頚椎を脱臼させ、脳を取り出し、大脳、小脳、海馬を分離し、各々について５０×量のサンプルバッファーでホモゲナイズし、各５μＬを用いてウェスタンブロット分析を行った。１次抗体としては、ドレブリンのＣ末端エピトープを認識するＭ２Ｆ６モノクローナル抗体（×１００００）を用い、２次抗体としてはＨＲＰ α ｍｏｕｓｅ（×１００００）を用いた。ＫＯ（WT / WT）と同様に、ノックアウトヘテロ（ＫＯ（WT/-））や、ドレブリンＡトランスジェニックマウス（Ｎｏ４３＋）や、（Ｎｏ４３＋）と同腹の野生型マウス（Ｎｏ４３−）についても、ウェスタンブロット分析を行った。なおウェスタンブロットにおける陽性対照としてベーターアクチン（×１００００）を用いた。結果を図４に示す。図５において、左のレーンからＫＯ（-/-）、ＫＯ（WT/-）、Ｎｏ４３＋、Ｎｏ４３−を示す。大脳や海馬では本来ドレブリンＡのみが発現し、小脳ではドレブリンＥが発現する。図５の大脳や海馬におけるＫＯ（WT / WT）、（Ｎｏ４３＋）及び（Ｎｏ４３−）のバンドはドレブリンＡを示し、ＫＯ（WT/-）の上下近接した２つのバンドはドレブリンＡと（ドレブリンＡより分子量が小さい）ドレブリンＥを示しており、ドレブリンＡとドレブリンＥが共に発現していることがわかる。図５の小脳におけるバンドは（小脳において本来発現する）すべてドレブリンＥを示している。
【００２６】
（４）まとめ
図３〜５に示される結果から、ドレブリンＡノックアウトマウス（ホモ）は、ドレブリンＡを発現しない（図４）が、本来ドレブリンＡが主に発現する大脳皮質や海馬においては、ドレブリンＡに代わってドレブリンＥが発現し、ドレブリンとしての発現総量は、野生型マウスのドレブリン発現総量に匹敵していることから、ドレブリンＡ欠損に起因するシナプスの成熟のみが障害され、その他のドレブリン関連機能が正常であることが示唆された。
【実施例７】
【００２７】
（ドレブリンA特異的欠失によるコンテクスト依存性恐怖条件づけの障害）
（１）方法
ドレブリンA特異的ノックアウトマウス（ＫＯ、ｎ＝９）およびその同腹の野生型マウス（ＷＴ、ｎ＝１０）をショック箱に入れ１分後に条件刺激（７０ｄＢの１０ｋＨｚトーンを１０秒間）と無条件刺激（０．５ｍＡの床からの電撃ショック、１秒間）の組合せ刺激（トーンの開始から９秒後にショック）を２０秒間隔で２回提示し、その後１分後にホームケージに戻した。条件づけの１日後にマウスを再びショック箱に入れ、コンテクスト依存性の恐怖反応（すくみ反応、フリージング）を調べた。
【００２８】
（２）結果
ＷＴは１日前にショックを受けた箱に入れられると直ちに強いフリージングを起こした（コンテクスト依存性の恐怖反応、２分間の計測の平均７１．５±４．９％）。一方ＫＯではフリージングのレベルはＷＴに比べ有意に低かった（２分間の計測の平均４４．３±１１．７％、ｐ＜０．０５）。生得的な情動を調べる行動テストではＫＯとＷＴに大きな違いはなかった。したがってドレブリンＡアイソフォームの欠失は基本的な行動には影響しないが、少なくともある種の学習を障害する。学習記憶はそれに関連する神経回路上の機能的、構造的変化が必要であると考えられており、樹状突起スパインにおけるドレブリンＡがその機序の鍵となる分子であることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のドレブリンＡノックアウトマウス作製に用いられるターゲティングベクターの構築の概略を示す図である。
【図２】本発明のドレブリンＡノックアウトマウス（ＫＯ（-/-））の構築に用いられるターゲティングベクターのサザンブロットの結果を示す図である。
【図３】本発明のドレブリンＡノックアウトマウス（ＫＯ（-/-））と野生型マウス（ＷＴ（WT / WT））の大脳皮質におけるドレブリンの発現結果やシナプスタンパク質ＰＳＤ９５の発現結果を示す図である。
【図４】本発明のドレブリンＡノックアウトマウス（ＫＯ（-/-））と野生型マウス（ＷＴ（WT / WT））の大脳皮質におけるドレブリンＡの発現結果を示す図である。
【図５】本発明のドレブリンＡノックアウトマウスと同腹の野生型マウス（ＫＯ（WT / WT））、ノックアウトヘテロ（ＫＯ（WT/-））や、ドレブリンＡトランスジェニックマウス（Ｎｏ４３＋）や、（Ｎｏ４３＋）と同腹の野生型マウス（Ｎｏ４３−）の脳（大脳、小脳、海馬）におけるドレブリンＡの発現結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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