(57)【要約】【課題】中性エンドペプチダーゼ阻害剤を有効成分とする皮膚老化防止剤を提供すること。【解決手段】記一般式（７）で示される化合物を有効成分とする皮膚老化防止剤。  一般式（７）：2006328082.tif 000014〔式中、Ｒ22及びＲ23は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す〕で表されるジペプチド類。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（７）で示される化合物を有効成分とする皮膚老化防止剤。
一般式（７）：
【化１】
2006328082.tif 000013
〔式中、Ｒ22及びＲ23は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す〕
で表されるジペプチド類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の老化によって生じるしわ、たるみの形成やはりの減少などの外観変化を防止又は改善できる皮膚老化防止剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚が老化することにより生じる外観変化の代表例としては、しわ、たるみの発生、はりの減少などがある。かかるしわ、たるみの発生、はりの減少などの皮膚の形態的変化に対して、例えばコラーゲンを配合した化粧料が用いられているが、充分なしわ発生等の防止効果は得られていない。
【０００３】
しわなどの発生については、特に紫外線との関連性が強いとされており、紫外線照射により生じた皮膚の老化を光老化と称して、種々研究されている。しかし、未だ紫外線吸収剤又は紫外線防禦剤に代わる化粧料が開発されていないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は、しわに代表される皮膚の老化によって生じる症状を防止又は改善することのできる薬剤又は化粧料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、真皮線維芽細胞由来の中性エンドペプチダーゼを用いて、その活性と皮膚の老化との関係を検討したところ、中性エンドペプチダーゼ活性を阻害すれば、しわ、たるみ等の皮膚の老化によって生じる症状を防止でき、以下の一般式（１）、（６）又は（７）で示される化合物が皮膚老化防止剤として有用であることを見出した。
【０００６】
一般式（１）：
【０００７】
【化１】
2006328082.tif 000002
【０００８】
〔式中、Ｒ1は水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアラルキル基を示し；Ｒ2は水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル若しくはアラルキル基を示し；Ｒ3  は水素原子、アルキル基又はアルケニル基を示すか、Ｒ4と一緒になって隣接する窒素原子とともに複素環を形成してもよい；Ｒ4は水素原子、又は置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル若しくはアラルキル基を示すか、Ｒ3と一緒になって前記の複素環を形成してもよい；Ｒ5は水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基又はアミノ酸残基を示し；ｎは０〜５の整数を示す〕
で表されるマロン酸アミド誘導体又はその塩。
【０００９】
一般式（６）：
【００１０】
【化２】
2006328082.tif 000003
【００１１】
〔式中、Ｒ19は水素原子又はアルキル基を示すか、Ｒ20と一緒になって隣接する窒素原子とともに複素環を形成してもよい；Ｒ20は水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基又は置換基を有していてもよいアラルキル基を示すか、Ｒ19と一緒になって前記の複素環を形成してもよい；Ｒ21は水素原子、アルキル基、アルケニル基、又はアラルキル基を示し；ｌは０〜４の整数を示す〕
で表されるジペプチド類。
【００１２】
一般式（７）：
【００１３】
【化３】
2006328082.tif 000004
【００１４】
〔式中、Ｒ22及びＲ23は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す〕
で表されるジペプチド類。
【００１５】
このうち、本発明は、下記一般式（７）で示される化合物を有効成分とする皮膚老化防止剤を提供するものである。
【００１６】
一般式（７）：
【００１７】
【化４】
2006328082.tif 000005
【００１８】
〔式中、Ｒ22及びＲ23は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す〕
【発明の効果】
【００１９】
本発明の皮膚老化防止剤を用いれば、しわやたるみ等の皮膚の老化により生じる症状を予防又は改善できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
中性エンドペプチダーゼは、エンケファリンなどのオピオイドペプチドやサブスタンスＰ、ブラジキニンなどの神経ペプチドを分解する酵素であり、この阻害剤はモルヒネ系物質の代替物質、すなわち鎮痛剤として有用であることは知られているが、しわ、たるみ等の皮膚の老化によって生じる症状を防止できることは知られていない。
【００２１】
本発明において、中性エンドペプチダーゼを阻害するとは、真皮線維芽細胞由来の中性エンドペプチダーゼを阻害することが好ましく、例えば培養ヒト線維芽細胞から０．１％トリトンＸ−１００／０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）で抽出した酵素液を用い、塩化ナトリウム（３００mM）を添加したＭＥＳ緩衝液（１００mM、pH６．５）中でグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−２−ナフチルアミンを基質とした酵素活性測定系において１mMで５０％以上の阻害活性を示すことが挙げられる。
【００２２】
上記式（１）、（６）又は（７）において、アルキル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、メチルチオアルキル基等のアルキル部分の炭素数は１〜６が好ましい。
アラルキル基としては、フェニル−Ｃ1-6アルキル基が好ましい。ヘテロアラルキル基としては、ヘテロアリール−Ｃ1-6アルキル基が好ましく、特にピリジル−Ｃ1-6アルキル基、ピリミジニル−Ｃ1-6アルキル基、プリル−Ｃ1-6アルキル基等が好ましい。アルキレン基としては、炭素数１〜８のアルキレン基が好ましい。アリール基としてはフェニル基、ナフチル基が好ましい。アラルキルオキシ基としては、フェニル−Ｃ1-6アルキル基が好ましい。ヘテロアラルキルオキシ基としては、ヘテロアリール−Ｃ1-6アルキルオキシ基が好ましく、ピリジル−Ｃ1-6アルキルオキシ基、ピリミジニル−Ｃ1-6アルキルオキシ基、プリン−Ｃ1-6アルキルオキシ基が特に好ましい。アルケニル基としては炭素数２〜６のものが好ましい。
アルキル基、アラルキル基、フェニル基等の置換基としては、カルボキシ基、ハロゲン原子、アルコキシ基等が挙げられる。
また、Ｒ3とＲ4又はＲ19とＲ20が一緒になって形成する複素環としてはピロリジン環、ピペリジン環等が挙げられる。
【００２３】
一般式（１）中のＲ1及びＲ3におけるアルキル基又はアルケニル基としては炭素数１〜８のもの、特に炭素数１〜４のもの、さらに炭素数１〜４のアルキル基が好ましい。このうち、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基又はｔ−ブチル基が特に好ましい。アラルキル基としては、フェニルアルキル基、ビフェニルアルキル基、ナフチルアルキル基が挙げられるが、このうち、フェニル−Ｃ1-6アルキル基、ビフェニル−Ｃ1-6アルキル基が好ましく、ベンジル基がさらに好ましい。Ｒ1としては、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、フェニル−Ｃ1-6アルキル基又はビフェニル−Ｃ1-6アルキル基が特に好ましい。Ｒ3としては、水素原子が最も好ましい。
【００２４】
Ｒ2及びＲ4としては、水素原子、炭素数１〜１２の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル若しくはアルケニル基又はアラルキル基が好ましい。このうち、水素原子又は炭素数３〜６の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル若しくはアルケニル基がより好ましく、中でも、水素原子、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が特に好ましい。アラルキル基としては、フェニルアルキル基、ナフチルアルキル基が挙げられるが、このうち、フェニル−Ｃ1-6アルキル基が好ましく、ベンジル基、フェネチル基がさらに好ましい。Ｒ3及びＲ4が一緒になって形成する複素環としては、ピロリジン環、ピペリジン環等が挙げられるが、ピロリジン環が好ましい。
【００２５】
Ｒ5におけるアルコキシ基又はアルケニルオキシ基としては、炭素数１〜８、特に炭素数１〜４のアルコキシ又はアルケニルオキシ基、さらに炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。またアミノ酸残基としては、必須アミノ酸の残基が挙げられる。ここで当該アミノ酸のアミノ基と一般式（１）中のカルボニル基はアミド結合している。Ｒ5としては、水酸基又は炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましく、水酸基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔ−ブチルオキシ基が特に好ましい。ｎは、０又は１が最も好ましい。
【００２６】
一般式（６）中、Ｒ19としては水素原子が好ましい。Ｒ20としては、水素原子、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基、フェネチル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基が好ましい。Ｒ21としては、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基が好ましい。ｎは０、１又は２が好ましい。
【００２７】
一般式（７）中、Ｒ22は水素原子が好ましく、Ｒ23は水素原子又はメチル基が好ましい。
【００２８】
一般式（１）、（６）又は（７）の化合物の塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アミン塩、アミノ酸塩、酸付加塩等が挙げられる。好ましくはアルカリ金属塩又はアミノ酸塩である。
【００２９】
なお、一般式（１）、（６）又は（７）の化合物は光学活性を有していてもよく、立体配置はＲ、Ｓのいずれでも、ラセミ体でもよい。また、本化合物は水和物の形態であってもよい。
【００３０】
一般式（１）の化合物のうち、特に好ましい化合物としては、次のようなものを例示できる。
【００３１】
【化５】
2006328082.tif 000006
【００３２】
一般式（１）で表される化合物は、例えば次式のようなNakanoらの方法（Chem. Lett., 505-8(1990)）により合成することができる。
【００３３】
【化６】
2006328082.tif 000007
【００３４】
（Ｒ1〜Ｒ5、ｎは前記と同じ）
すなわち、マロン酸ハーフエステル（２）とアミノ酸エステル（３）を脱水縮合剤の存在下で反応させる。必要に応じて水酸化ナトリウムなどの塩基を反応させて目的物を得る。
【００３５】
また、一般式（１）で表される化合物は次式のKatsuki らの方法（Bull. Chem. Soc. Jpn., 49, 3287-3290(1976)）によっても合成することができる。
【００３６】
【化７】
2006328082.tif 000008
【００３７】
（Ｒ1〜Ｒ5、ｎは前記と同じ）
すなわち、マロン酸ハーフエステル酸クロリド（４）とアミノ酸エステル（３）を塩基の存在下で反応させる。必要に応じてハロゲン化アルキルによるアルキル化反応や水酸化ナトリウムなどの塩基による加水分解反応を行ない目的物を得る  。
【００３８】
一般式（６）で表されるジペプチド類の例としては、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−β−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｓｐ等が挙げられる。
これらは、例えばＫ．Ｉｅｎａｇａ，Ｋ．Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｋｉｍｕｒａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３５，１２４９−１２５４（１９８７）に記載の方法により合成できる。
また、一般式（７）で表されるジペプチド類としてはＡｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ（アスパルテーム）、Ａｓｐ−Ｐｈｅ等が挙げられる。
これら一般式（６）及び（７）の化合物は市販品を用いることもできる。
【００３９】
本発明の皮膚老化防止剤は、皮膚の老化により生じる形態的変化、例えばしわ、たるみの形成やはりの減少に対して防止又は改善作用を有するが、特にしわ形成防止又は改善作用に優れている。
【００４０】
本発明の皮膚老化防止剤の投与形態としては皮膚外用剤、経口剤などが挙げられるが、皮膚外用剤とすることが好ましい。皮膚外用剤とする場合の植物抽出物の配合量は、皮膚老化防止・改善の観点から、蒸発残分として０．００００１〜１０重量％（以下、単に％で示す）、特に０．０００１〜５％とするのが好ましい。
【００４１】
本発明の皮膚老化防止剤には、上記植物抽出物以外に紫外線吸収剤、紫外線防禦剤、コラーゲン、保湿剤、抗炎症剤、抗酸化剤等の成分を配合できるが、皮膚老化防止・改善の観点から、特に紫外線吸収剤及び／又は紫外線防禦剤を配合することが好ましい。
【００４２】
紫外線吸収剤としては、ベンゾフェノン系、パラアミノ安息香酸系、ｐ−メトキシ桂皮酸系（ｐ−メトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル等）又はサリチル酸系紫外線吸収剤が挙げられる。紫外線防禦剤としては、酸化チタン、酸化亜鉛等が挙げられる。紫外線吸収剤、紫外線防禦剤等は、皮膚老化防止・改善の観点から、本発明の皮膚老化防止・改善剤中に０．００１〜９９％、特に０．００１〜５０％配合することが好ましい。
【００４３】
本発明の皮膚老化防止剤の具体的な剤型としては、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、溶液、パック、ファンデーション等が挙げられ、これらの剤型とするにあたって各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、キレート剤、増粘剤、色素、香料、水等を配合できる。
【実施例】
【００４４】
［合成例１］化合物１の合成
グリシンエチルエステル塩酸塩１６．０５ｇ（１１４mmol）及びトリエチルアミン２３．２７ｇ（２２８mmol）をクロロホルム５０mLに溶解し、氷冷で５℃まで冷却した。そのままの温度でエチルマロン酸クロリド１０．００ｇ（５７mmol）を滴下し、滴下終了後、薄層クロマトグラフィーで原料消失を確認した後、５％リン酸水溶液を加えて反応を終了した。有機層を蒸留水及び飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。次いで溶媒を留去し、残留物をカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒で溶出した。溶媒を留去して化合物１  ９．４０ｇ（収率７６％）を得た。
【００４５】
NMR(DMSO-d6)δ：2.48-2.51(m,6H), 3.30(d,2H,J=9Hz), 3.85(d,2H,J=6Hz), 4.02-4.20(m,4H), 8.49(t,1H,J=5Hz).
【００４６】
［合成例２］化合物２の合成
化合物１  ５．００ｇ（２３．０mmol）を無水テトラヒドロフラン５０mLに溶解した。これを、水素化ナトリウム１．１０ｇ（２７．６mmol）のテトラヒドロフラン３０mLに懸濁した溶液中に加え、５０℃に加熱した。さらにベンジルブロミド３．７４ｇ（２１．９mmol）をゆっくりと滴下しそのままの温度で３時間攪拌した後、反応を終了した。冷却後、反応溶液に５％リン酸水溶液を加え、酢酸エチル３００mLで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水及び飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。次いで溶媒を留去し、残留物をカラムクロマトグラフィーに付し、酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒で溶出した。溶媒を留去して化合物２  ３．８９ｇ（収率５５％）を得た。
【００４７】
NMR(DMSO-d6)δ：1.16(t,1H,J=7Hz), 2.93-3.19(m,2H), 3.71(t,1H,J=7Hz), 3.80(d,2H,J=6Hz), 4.06(q,4H,J=7Hz), 7.13-7.29(m,5H), 8.61(t,1H,J=6Hz).
【００４８】
［合成例３］化合物３の合成
化合物２  ３．００ｇ（９．８mmol）をメタノール３０mLに溶解した。水素化カリウム１．２０ｇ（２１．５mmol）を水１０mLに溶解したものを加え、室温で２時間攪拌し反応を終了した。メタノールを減圧留去した後、５％リン酸水溶液を加え、生成する結晶をろ過した。結晶を水洗し減圧乾燥し、化合物２  ２．１７ｇ（収率８８％）を得た。
【００４９】
NMR(DMSO-d6)δ：2.90(m,2H), 3.59(t,1H,J=7Hz), 3.74(d,2H,J=6Hz), 7.12-7.32(m,5H), 8.37(t,1H,J=6Hz), 12.49(br.s,2H).
【００５０】
［合成例４〜６］
化合物４〜６を、表１に示すアミノ酸エステル、ハロゲン化アルキルを用い、合成例１〜３の方法に順じて合成した。
【００５１】
【表１】
2006328082.tif 000009
【００５２】
試験例１
培養ヒト線維芽細胞の中性エンドペプチダーゼ活性抑制試験
大日本製薬社より市販されている正常ヒト線維芽細胞は１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ培地で継体培養し、本試験に供した。ラバーポリスマンを用いてシャーレからはがした細胞は、リン酸緩衝生理食塩水中に浮遊させ、低速の遠心分離器を使って細胞を集め、同生理食塩水で３回洗浄した。細胞は、０．１％トリトンＸ−１００／０．２Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に浮遊させ、超音波破砕し、酵素液とした。
酵素活性測定は、塩化ナトリウム（３００mM）を添加したＭＥＳ緩衝液（１００mM、pH６．５）１００μＬに酵素液２μＬ、当該化合物溶液１μＬ、酵素活性測定の基質として２０mMグルタリル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−４−メトキシ−２−ナフチルアミン１μＬを添加し、３７℃で１時間反応させ、最終濃度０．４μＭとなるようホスホラミドンを添加して反応を停止した。最終濃度２０ｍＵのアミノペプチダーゼＭを添加し、３７℃で１５分間反応させ、生成した４−メトキシ−２−ナフチルアミン量は蛍光分光光度計で励起波長３４０nm、蛍光波長４２５nmにて蛍光強度を測定し、当該化合物の酵素活性阻害率を求めた。結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
2006328082.tif 000010
【００５４】
試験例２  ヘアレスマウスによるしわ形成抑制試験
ヘアレスマウス（HR／ICR ，実験開始時６週齢）の背部に、健康線用ランプ（東芝製、SE20）で、１回の照射量を１ＭＥＤ以下に調節してＵＶ−Ｂ照射し、直後に被験化合物を含む８０％エタノール溶液（被験体）を１００μＬを塗布した。この作業を２０週間にわたって行なった。照射エネルギー量はＵＶ−Radiometer（TOKYOOPTICAL社製、UVR-305/365D）を用いて測定した。また、コントロールとして８０％エタノールのみを塗布したものを同様に試験した。試験終了後、形成されたしわの度数を肉眼により下記の基準（しわスコア）で評価した。結果を表３に示す。
【００５５】
＜しわスコア＞
０：しわが無形成
１：しわがかすかに形成
２：しわが微量形成
３：しわが若干形成
４：しわが強固に形成
【００５６】
【表３】
2006328082.tif 000011
【００５７】
表３の結果から、中性エンドペプチダーゼ阻害剤である一般式（１）、（６）又は（７）の化合物は、顕著なしわ形成抑制作用を有し、優れた皮膚老化防止効果を示した。
【００５８】
試験例３  ラットによる皮膚弾力性維持試験
３週齢のＳＤ系雄性ラットの両足底を４群に分け、被験物質（８０％エタノール溶液）塗布群、溶媒（８０％エタノール）塗布群、無処理群とした。ＵＶ−Ｂ（１ＭＥＤ以下）照射後、被験物質又は溶媒を１足当たり１０μＬを塗布した。この作業を、隔日、週３回、６週間にわたって行なった。
皮膚の弾力性測定はキュートメーターＳＥＳ５７５（クレージュ・カザカ社製）を用い、５００mbで３秒間吸引後、解放し、その後３秒間の計６秒間の変位を測定した。測定は１足当たり５回行ない、Ｕｅ値及びＵｆ値を求めた。
弾性繊維の直線性の解析はＳＥＭ写真の画像解析を用いたImokawa らの方法（J. Invest. Dermatol., 105, 254-258(1995)）によった。すなわち、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）用試料は、試験終了後、ラット足底をメルコックス（大日本インキ（株））にて還流固定後、ギ酸消化を行ないＳＥＭに供した。各試料ごとに採取１０００倍のＳＥＭ写真からそれぞれ代表的な１０枚を抽出し、拡大コピーをした後、均等に１６分割した。各領域で任意の弾性繊維を一本抽出し、透明フィルム上に一定太さの線（８ピクセル幅）でトーレスした。この弾性繊維をトーレスした線の占める面積をＡ、トーレスが囲まれる最小面積の長方形の縦長をＢ、横長をＣとして弾性繊維の直線性はＡ／（Ｂ×Ｃ）で表わされる。例えば、弾性繊維のトーレスが直線であれば直線性は１となる。結果を表４に示す。
【００５９】
【表４】
2006328082.tif 000012
【００６０】
表４の結果から、中性エンドペプチダーゼ阻害剤である一般式（１）、（６）又は（７）の化合物はＵＶ−Ｂによる皮膚の弾力性低下及びその原因となる弾性繊維の３次元構造の変性を強く予防する効果を示し、皮膚のはりを保持できる。
【００６１】
配合例１
次に示す配合で皮膚老化改善用クリームを常法に従い製造した。
（重量％）
化合物２、Ｐｈｅ−β−Ａｌａ又はアスパルテーム    ０．２
ステアリン酸                                      ２．０
セタノール                                        ４．０
スクワレン                                        ８．０
ワセリン                                          ５．０
硬化パーム油                                      ４．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート
（20E.O.）                                      １．４
親油性モノステアリン酸グリセリン                  ２．４
ブチルパラベン                                    ０．１
グリセリン                                        ３．０
Ｌ−アルギニン１０．０重量％水酸化カリウム        ０．２
香料                                              ０．１
精製水                                            バランス
合計                                        １００．０
【００６２】
配合例２
次に示す配合で皮膚老化防止・改善用パックを常法に従い製造した。
（重量％）
化合物３、Ｐｈｅ−β−Ａｌａ又はアスパルテーム    ３．０
ポリビニルアルコール                            ２０．０
グリセリン                                        ５．０
エタノール                                      １６．０
香料                                              ０．１
色素                                              ０．１
精製水                                          バランス
合計                                        １００．０