(57)【要約】  【課題】  炎症性サイトカインの過剰分泌によって誘導される敗血症等の疾患の予防又は治療剤の提供。  【解決手段】  制御性樹状細胞を含む、炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患（敗血症等）の予防又は治療剤、ＩＬ−１０産生促進剤、アポトーシス抑制剤等。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
制御性樹状細胞を含む、ＩＬ−１０産生促進剤。
【請求項２】
制御性樹状細胞がヒト由来である、請求項１記載のＩＬ−１０産生促進剤。
【請求項３】
制御性樹状細胞を含む、炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患の予防又は治療剤。
【請求項４】
炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患が全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、請求項３記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が、敗血症及び細菌性髄膜炎からなる群より選択される少なくとも１種の細菌感染を伴う全身性炎症であるか、又は細菌感染を伴わない全身性炎症である、請求項４記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患が敗血症又は細菌性髄膜炎である、請求項３記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患が炎症性腸疾患である、請求項３記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
炎症性腸疾患が、クローン病又は大腸炎である、請求項７記載の予防又は治療剤。
【請求項９】
大腸炎が、潰瘍性結腸炎、肉芽腫性結腸炎、虚血性結腸炎、放射性結腸炎及び感染性結腸炎からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項８記載の予防又は治療剤。
【請求項１０】
制御性樹状細胞がヒト由来である、請求項３〜９のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【請求項１１】
制御性樹状細胞を含む、アポトーシス抑制剤。
【請求項１２】
制御性樹状細胞がヒト由来である、請求項１１記載のアポトーシス抑制剤。
【請求項１３】
制御性樹状細胞を含む、リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患の予防又は治療剤。
【請求項１４】
リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患が全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、請求項１３記載の予防又は治療剤。
【請求項１５】
全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が、敗血症及び細菌性髄膜炎からなる群より選択される少なくとも１種の細菌感染を伴う全身性炎症であるか、又は細菌感染を伴わない全身性炎症である、請求項１４記載の予防又は治療剤。
【請求項１６】
リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患が敗血症又は細菌性髄膜炎である、請求項１３記載の予防又は治療剤。
【請求項１７】
リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患が炎症性腸疾患である、請求項１３記載の予防又は治療剤。
【請求項１８】
炎症性腸疾患が、クローン病又は大腸炎である、請求項１７記載の予防又は治療剤。
【請求項１９】
大腸炎が、潰瘍性結腸炎、肉芽腫性結腸炎、虚血性結腸炎、放射性結腸炎及び感染性結腸炎からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１８記載の予防又は治療剤。
【請求項２０】
制御性樹状細胞がヒト由来である、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性疾患の予防又は治療剤に関し、特に制御性樹状細胞を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は治療剤に関する。具体的には、炎症性サイトカインの過剰分泌によって誘導される敗血症等の疾患の予防又は治療剤に関する。さらに本発明は、ＩＬ−１０産生促進剤、アポトーシス抑制剤及びリンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣｓ）は、炎症のみならずＴ細胞応答をも増強することによって自然免疫系と獲得免疫系を繋ぐ決定的な要素である。幾つかのタイプの樹状細胞がＴ細胞免疫寛容の誘導を介して獲得免疫系の制御因子として働いていることが報告されている（非特許文献１〜５）。しかしながら、宿主の炎症応答の制御については明らかにされていないのが現状である。本発明者らは、近年、Ｔ細胞アナジー誘導能と制御性Ｔ（Ｔｒ）細胞誘導能とを有する強力な免疫寛容誘導性の樹状細胞集団、制御性樹状細胞（ＤＣｒｅｇ）を樹立した（非特許文献４）。さらに、ＤＣｒｅｇを用いた免疫療法がマウス異系骨髄移植モデル（ＢＭＴ）での急性移植片対宿主病（ＧＶＤＨ）の抑制に効果的であることも報告されている（非特許文献４）。
一方、敗血症は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の代表的なものであり、新生児ＩＣＵ等における罹患率及び死亡率の主要な原因となっている。しかしながら現在のところ、敗血症を予防・治療するのに効果的な手段は存在しない。敗血症は菌体成分（例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ））による宿主の免疫細胞、特にマクロファージの過剰な刺激によって、様々な炎症性サイトカインが産生されることによって発症する（非特許文献６〜８）。敗血症による致死に、増加したリンパ球の、特に胸腺でのアポトーシスが寄与し、このアポトーシスを妨害することにより敗血症マウスの生存率を改善できることを示した報告がある（非特許文献９）。さらにアデノウイルス導入により強制的にＩＬ−１０を発現させることにより敗血症（実験的）マウスの生存率が改善されることが報告されている（非特許文献１０及び１１）。
また、特許文献１には、ヒト免疫制御性樹状細胞の調製方法；ヒト免疫制御性樹状細胞を含む医薬組成物；移植片拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、関節リウマチ又は多発性硬化症の治療に用いるヒト免疫制御性樹状細胞を含む医薬組成物が開示されている。
【特許文献１】特開２００４−２９８１８１号公報
【非特許文献１】Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, Pulendran B, Palucka K. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2000;18:767-811.
【非特許文献２】Steinman RM, Nussenzweig MC. Avoiding horror autotoxicus: the importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Jan 8;99(1):351-8.
【非特許文献３】Morelli AE, Thomson AW. Dendritic cells: regulators of alloimmunity and opportunities for tolerance induction. Immunol Rev. 2003 Dec;196:125-46.
【非特許文献４】Sato K, Yamashita N, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Regulatory dendritic cells protect mice from murine acute graft-versus-host disease and leukemia relapse. Immunity. 2003 Mar;18(3):367-79.
【非特許文献５】Wakkach A, Fournier N, Brun V, Breittmayer JP, Cottrez F, Groux H. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 2003 May;18(5):605-17.
【非特許文献６】Efron P, Moldawer LL. Sepsis and the dendritic cell. Shock. 2003 Nov;20(5):386-401.
【非特許文献７】Yan JJ, Jung JS, Lee JE, Lee J, Huh SO, Kim HS, Jung KC, Cho JY, Nam JS, Suh HW, Kim YH, Song DK. Therapeutic effects of lysophosphatidylcholine in experimental sepsis. Nat Med. 2004 Feb;10(2):161-7.
【非特許文献８】Alexander S, Bramson J, Foley R, Xing Z. Protection from endotoxemia by adenoviral-mediated gene transfer of human bactericidal/permeability-increasing protein. Blood. 2004 Jan 1;103(1):93-9.
【非特許文献９】Hotchkiss RS, Chang KC, Swanson PE, Tinsley KW, Hui JJ, Klender P, Xanthoudakis S, Roy S, Black C, Grimm E, Aspiotis R, Han Y, Nicholson DW, Karl IE. Caspase inhibitors improve survival in sepsis: a critical role of the lymphocyte. Nat Immunol. 2000 Dec;1(6):496-501.
【非特許文献１０】Oberholzer C, Oberholzer A, Bahjat FR, Minter RM, Tannahill CL, Abouhamze A, LaFace D, Hutchins B, Clare-Salzler MJ, Moldawer LL. Targeted adenovirus-induced expression of IL-10 decreases thymic apoptosis and improves survival in murine sepsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Sep 25;98(20):11503-8.
【非特許文献１１】Oberholzer A, Oberholzer C, Bahjat KS, Ungaro R, Tannahill CL, Murday M, Bahjat FR, Abouhamze Z, Tsai V, LaFace D, Hutchins B, Moldawer LL, Clare-Salzler MJ. Increased survival in sepsis by in vivo adenovirus-induced expression of IL-10 in dendritic cells. J Immunol. 2002 Apr 1;168(7):3412-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、炎症性疾患、特に炎症性サイトカインの過剰分泌によって誘導される敗血症等の疾患の予防又は治療剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、ＩＬ−１０産生促進剤、アポトーシス抑制剤及びリンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患の予防及び／又は治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、Ｔ細胞アナジー誘導能と制御性Ｔ細胞誘導能とを有する強力な免疫寛容誘導性の樹状細胞集団である制御性樹状細胞が、炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患、特に敗血症等の細菌感染を伴う全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）に対して、ＩＬ−１０産生を促進し、また、リンパ球のアポトーシス抑制作用を有することを見出して本発明を完成するに至った。即ち本発明は以下の通りである。
【０００５】
〔１〕制御性樹状細胞を含む、ＩＬ−１０産生促進剤。
〔２〕制御性樹状細胞がヒト由来である、上記〔１〕記載のＩＬ−１０産生促進剤。
〔３〕制御性樹状細胞を含む、炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患の予防又は治療剤。
〔４〕炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患が全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、上記〔３〕記載の予防又は治療剤。
〔５〕全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が、敗血症及び細菌性髄膜炎からなる群より選択される少なくとも１種の細菌感染を伴う全身性炎症であるか、又は細菌感染を伴わない全身性炎症である、上記〔４〕記載の予防又は治療剤。
〔６〕炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患が敗血症又は細菌性髄膜炎である、上記〔３〕記載の予防又は治療剤。
〔７〕炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患が炎症性腸疾患である、上記〔３〕記載の予防又は治療剤。
〔８〕炎症性腸疾患が、クローン病又は大腸炎である、上記〔７〕記載の予防又は治療剤。
〔９〕大腸炎が、潰瘍性結腸炎、肉芽腫性結腸炎、虚血性結腸炎、放射性結腸炎及び感染性結腸炎からなる群より選択される少なくとも1種である、上記〔８〕記載の予防又は治療剤。
〔１０〕制御性樹状細胞がヒト由来である、上記〔３〕〜〔９〕のいずれかに記載の予防又は治療剤。
〔１１〕制御性樹状細胞を含む、アポトーシス抑制剤。
〔１２〕制御性樹状細胞がヒト由来である、上記〔１１〕記載のアポトーシス抑制剤。
〔１３〕制御性樹状細胞を含む、リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患の予防又は治療剤。
〔１４〕リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患が全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である、上記〔１３〕記載の予防又は治療剤。
〔１５〕全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が、敗血症及び細菌性髄膜炎からなる群より選択される少なくとも１種の細菌感染を伴う全身性炎症であるか、又は細菌感染を伴わない全身性炎症である、上記〔１４〕記載の予防又は治療剤。
〔１６〕リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患が敗血症又は細菌性髄膜炎である、上記〔１３〕記載の予防又は治療剤。
〔１７〕リンパ球のアポトーシスにより誘導される疾患が炎症性腸疾患である、上記〔１３〕記載の予防又は治療剤。
〔１８〕炎症性腸疾患が、クローン病又は大腸炎である、上記〔１７〕記載の予防又は治療剤。
〔１９〕大腸炎が、潰瘍性結腸炎、肉芽腫性結腸炎、虚血性結腸炎、放射性結腸炎及び感染性結腸炎からなる群より選択される少なくとも1種である、上記〔１８〕記載の予防又は治療剤。
〔２０〕制御性樹状細胞がヒト由来である、上記〔１３〕〜〔１９〕のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に有効成分として含められる制御性樹状細胞は、敗血症及び他の全身性及び局所性の炎症性疾患の予防能及び治療能を有し、従って、これらの疾患の細胞免疫療法に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明に有効成分として含められる制御性樹状細胞とは、Ｔ細胞アナジー誘導能と制御性Ｔ細胞誘導能とを有する強力な免疫寛容誘導性の樹状細胞集団を意味する。例えば樹状細胞又はその前駆細胞をインビトロでＩＬ−１０及びＴＧＦ−βと共に培養することによって調製することができる。より具体的には、単球にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを添加して誘導される樹状細胞及び当該樹状細胞に更に炎症性刺激（例えばＴＮＦ−α、ＬＰＳ等）を加えたものが制御性樹状細胞として調製される。ここで、ヒト単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによりヒト単球はＤＣに分化し、ＤＣがＩＬ−１０およびＴＧＦ−βにより未成熟な免疫制御性ＤＣになる。この際、ヒト単球を最初にＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で刺激しＤＣに分化させた後にＩＬ−１０およびＴＧＦ−βで刺激してもよいし、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βで同時に刺激してもよい。さらに、ＴＮＦ−αやＬＰＳ等により炎症性刺激を与えることにより、成熟したヒト免疫制御性細胞となる。
【０００８】
ヒトＤＣは前述のようにヒト単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養することにより得られる。この際の単球はヒト末梢血由来でも、ヒト骨髄由来でも、ヒト脾臓細胞由来でも、ヒト臍帯血由来でもよい。さらに、これらの組織、器官から樹状細胞をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）またはフローサイトメーター等によりＣＤ１ａ等のＤＣ特異的な表面抗原の発現を指標に単離することもできる。ＦＡＣＳによる特定の細胞集団の単離は公知の方法により行なえばよい。ＦＡＣＳ、フローサイトメーターとしては例えばＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いることができる。
【０００９】
ヒト単球、ＤＣの培養は、周知のヒトリンパ系細胞の培養技術により行なうことができる。培養液としては例えばＲＰＭＩ１６４０やＤＭＥＭを用いることができ、これらの基本培地に適当な抗生物質や動物血清等を添加して培養すればよい。培養容器も限定されず、培養規模に応じて市販のプレート、ディッシュ、フラスコを適宜選択して用いることができる。
【００１０】
培養に用いるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである。また、刺激に必要な培養日数は、限定されないが、例えばヒト単球をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳと共に数日から１０日間程度培養すればよい。ヒト単球またはヒトＤＣの表面抗原の発現をＦＡＣＳ等で調べることにより、目的の分化程度の細胞が得られる培養期間を適宜決定することができる。刺激に用いるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳの濃度、刺激期間等の条件は、異系ＣＤ４陽性Ｔ細胞の抗原不応答性の誘導やＤＣ表現型を指標として決定できる。
【００１１】
より詳細な調製方法が特許文献１及び非特許文献４に記載され、それらの記載に準じて本発明で用いる制御性樹状細胞を調製することができる。制御性樹状細胞は好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ等の哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
【００１２】
制御性樹状細胞にＬＰＳ等の炎症刺激を与えても炎症性サイトカインの産生が見られず、また、ＩＬ−１０を多く産生する。さらに制御性樹状細胞を投与された投与対象は、ＬＰＳ等の炎症性刺激負荷時に観察される炎症性サイトカイン産生の上昇が抑制され、且つＩＬ−１０の産生が増強される。従って、本発明の制御性樹状細胞を含むＩＬ−１０産生促進剤とは、投与対象に投与された場合、炎症性刺激負荷時の投与対象のＩＬ−１０産生能を促進することが可能な剤であって、促進の程度は対照（制御性樹状細胞を投与していない投与対象）のＩＬ−１０産生能と比較して有意差があれば特に制限されない。
【００１３】
本発明において「炎症性サイトカインの過剰分泌により誘導される疾患」とは、大腸菌、クレブシェラ菌、緑膿菌、腸球菌等のグラム陰性桿菌、黄色ブドウ球菌、表皮性ブドウ球菌、ＭＲＳＡ等のグラム陽性球菌、カンジダ等の真菌等の細菌やそれらから遊離される毒素（エンドトキシン・エキソトキシン）並びにそれらの成分（例えばＬＰＳ）などの感染及び／又は刺激によって投与対象が各種炎症性サイトカインを過剰に分泌することによって誘導される疾患、並びに外傷、熱傷、膵炎、侵襲の強い術後等により投与対象が各種炎症性サイトカインを過剰に分泌することによって誘導される疾患である。炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０等が例示され、好ましくはＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６である。
【００１４】
対象となる疾患としては例えば、高サイトカイン血症を示すＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）や炎症性腸疾患等の全身性及び局所性の炎症性疾患が挙げられる。ＳＩＲＳには、感染に起因するＢａｃｔｅｒｅｍｉａ、Ｆｕｎｇｅｍｉａ、Ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ、Ｖｉｒｅｍｉａ等の敗血症や細菌性髄膜炎の全身性炎症と外傷、熱傷、膵炎、侵襲の強い術後等の感染を伴わない全身性炎症が挙げられる。炎症性腸疾患にはクローン病や潰瘍性・肉芽腫性・虚血性・放射性・感染性結腸炎等の大腸炎が挙げられる。
【００１５】
さらに後述の実施例からも明らかなように、本発明に含められる制御性樹状細胞は、リンパ球のアポトーシス、特に敗血症誘導時に観察される胸腺でのアポトーシスに対して保護作用を有する。従って、本発明の制御性樹状細胞を含むアポトーシス抑制剤、特にリンパ球のアポトーシス抑制剤とは、投与対象に投与された場合、細菌感染時等に観察される胸腺でのリンパ球アポトーシスを抑制し得る剤を意味し、抑制の程度は対照（制御性樹状細胞を投与していない投与対象）のリンパ球アポトーシスの程度と比較して有意差があれば特に制限されない。
制御性樹状細胞の投与対象への投与がリンパ球の胸腺でのアポトーシス抑制作用をもたらすことから、当該制御性樹状細胞はリンパ球のアポトーシス、特に胸腺でのアポトーシスにより誘導される疾患の予防又は治療剤として用いることができる。
【００１６】
対象となる疾患としては例えば、高サイトカイン血症を示すＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）や炎症性腸疾患等の全身性及び局所性の炎症性疾患が挙げられる。ＳＩＲＳには、感染に起因するＢａｃｔｅｒｅｍｉａ、Ｆｕｎｇｅｍｉａ、Ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ、Ｖｉｒｅｍｉａ等の敗血症や細菌性髄膜炎の全身性炎症と外傷、熱傷、膵炎、侵襲の強い術後等の感染を伴わない全身性炎症が挙げられる。炎症性腸疾患にはクローン病や潰瘍性・肉芽腫性・虚血性・放射性・感染性結腸炎等の大腸炎が挙げられる。
【００１７】
投与する制御性樹状細胞は、投与対象自身の単球または樹状細胞をインビトロで刺激し調製したものでもよいし、投与対象以外の同種の第三者の単球又は樹状細胞をインビトロで刺激し調製したものでもよい。好ましくは投与対象自身のものである。
【００１８】
本発明のＩＬ−１０産生促進剤、（リンパ球）アポトーシス抑制剤並びに各種疾患の予防又は治療剤に含められる制御性樹状細胞の量は、投与対象に所望する効果が認められる用量で投与対象に投与され得るように適宜設定され、具体的には、投与対象に対して０．５×１０５〜１０９細胞程度の制御性樹状細胞が、静脈内あるいは皮下、皮内（好ましくは静脈内）に投与される。投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ等の哺乳動物が挙げられ、特に好ましくはヒトである。
【００１９】
投与対象へのＩＬ−１０産生促進剤、（リンパ球）アポトーシス抑制剤並びに各種疾患の予防又は治療剤の投与時期に関しては特に限定されず随時行うことができるが、本発明の対象となる疾患の多くが急性であり、また致死性であることを考慮すると、原因となる細菌が同定されていなくても細菌感染が認められた時点で予防的に投与することが好ましい。
【００２０】
必要に応じて、制御性樹状細胞以外の、医薬上許容し得る添加物を本発明に含めても良く、それらは当分野で通常用いられているものが利用できる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。本出願全体を通して引用されたすべての刊行物は参照として本明細書に組み入れられる。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
実施例１：ＬＰＳ刺激時のサイトカイン産生における比較
各種の樹状細胞を用いてＬＰＳ刺激によるサイトカイン産生に与える影響について調べた。
１．細胞調製
非特許文献４に準じて各種樹状細胞を調製した。雌性Ｃ５７／ＢＬ６マウスあるいはＢＡＬＢ/ｃマウスから得られた骨髄細胞を、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で８日間培養することによって未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を得た。成熟樹状細胞（ｍＤＣ）は、ｉＤＣをＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で２日間刺激することによって得た。制御性樹状細胞前駆細胞（ｐＤＣｒｅｇ）は、雌性Ｃ５７／ＢＬ６マウスから得られた骨髄細胞を、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、マウスＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＴＧＦ−β１（２０ｎｇ／ｍｌ）で８日間培養することによって得た。制御性樹状細胞は（ＤＣｒｅｇ）は、ｐＤＣｒｅｇの集団をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で２日間処理することによって得た。
２．ＬＰＳ刺激
上記で得られた各種樹状細胞（１０６細胞）を２４穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に入れ、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で６時間又は２４時間刺激した。対照にはＬＰＳで刺激しなかったものを用いた。
３．サイトカイン測定
ＬＰＳ刺激した（あるいはしていない）細胞の培養上清を回収しサイトカイン測定時迄−８０℃で保存した。
培養上清中のサイトカインの測定は、それぞれのサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１０）についてＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いて測定した。
４．結果
結果を図１に示す。各データは２サンプルの平均±標準偏差で示した。同じ実験を４回繰り返したが同様の結果であった。
ｉＤＣをＬＰＳで刺激すると顕著なＴＮＦ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生増加を認めたが、ｐＤＣｒｅｇにおけるこれらの炎症性サイトカインの産生は著しく低かった。ｍＤＣでは本質的にＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生量が多くＴＮＦ−α及びＩＬ−βの産生量は低かった。加えて、ｍＤＣのＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０産生量はｉＤＣに比べると僅かに低い程度であったが、ＴＮＦ−α及びＩＬ−β産生量についてはｍＤＣはｉＤＣに比べ顕著に低かった。対照的にＤＣｒｅｇではＬＰＳ誘導性の炎症性サイトカインの産生が見られなかった。ＩＬ−１０についてはｐＤＣｒｅｇ及びＤＣｒｅｇにおける産生量は他に比べて多かった。
【００２２】
実施例２：実験的内毒素血症時の炎症性サイトカイン産生における樹状細胞の効果
実験的内毒素血症マウスにおけるＬＰＳ誘導性の炎症性サイトカイン産生における樹状細胞の効果について調べた。
１．サンプル調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて実験的内毒素血症を誘発させた。各種樹状細胞（１０６細胞／マウス）を腹腔内投与して２時間後にＬＰＳ（１μｇ／マウス）とＤ−ガラクトサミン（Ｄ−ＧａｌＮ；１０ｍｇ／マウス）との混合物を腹腔内投与してマウスにＬＰＳ誘導性の内毒素血症を誘発した。ＬＰＳ投与後所定の時間で、内毒素血症を誘発させたＤ−ＧａｌＮ感作マウスから血液を採取した。血液から血清を回収しサイトカイン測定時迄−８０℃で保存した。
２．サイトカイン測定
実施例１と同様にしてそれぞれのサイトカインのＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
３．結果
結果を図２に示す。各データは２サンプルの平均±標準偏差で示した。同じ実験を４回繰り返したが同様の結果であった。
Ｄ−ＧａｌＮで感作されたマウスに低用量のＬＰＳ（１μｇ／マウス）を投与することによって血清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０濃度の一過的な上昇を誘導した。ＬＰＳを投与する２時間前にｍＤＣを１回投与すると血清中のＴＮＦ−α、ＩＬ−β及びＩＬ−６の産生が僅かに減少した。一方で、この処置によって血清中のＩＬ−１２ｐ４０の産生は増加した。対照的にＤＣｒｅｇの１回投与は血清中のＬＰＳ誘導性の炎症性サイトカイン産生を顕著に抑制しＩＬ−１０の産生を増強した。
【００２３】
実施例３：内毒素血症及び細菌性腹膜炎による致死に対する樹状細胞の保護効果
インビボでの炎症性応答における制御性樹状細胞の役割を明確にするために、本発明者らは実験的内毒素血症及び細菌性腹膜炎によって誘発された敗血症における制御性樹状細胞の効果を調べた。
１．内毒素血症及び細菌性腹膜炎モデルの作成
内毒素血症及び細菌性腹膜炎を誘発させるためにＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた。各種濃度の樹状細胞（１０５〜１０６細胞／マウス）を腹腔内投与して２時間後に低用量のＬＰＳ（１μｇ／マウス）とＤ−ＧａｌＮ（１０ｍｇ／マウス）との混合物を腹腔内投与し（実験的内毒素血症）、あるいは高用量のＬＰＳ（１ｍｇ／マウス）を腹腔内投与し（内毒素血症）、２時間後に各種樹状細胞（１０６細胞／マウス）を腹腔内投与して、マウスにＬＰＳ誘導性の内毒素血症を誘発した。細菌性腹膜炎を誘発させるためには、熱殺菌（９５℃、３０分間）した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；５×１０８細胞／マウス）を腹腔内投与してから２時間後に各種樹状細胞（１０６細胞／マウス）を腹腔内投与した。
２．生存率の測定
生存率は、４８時間（Ｄ−ＧａｌＮ感作による内毒素血症及び細菌性腹膜炎）あるいは１日１回６日間（内毒素血症）、モニタリングした。
３．結果
結果を図３に示す。同じ実験を４回繰り返したが同様の結果であった。
低用量のＬＰＳを投与する２時間前にｍＤＣを単回投与することによって、Ｄ−ＧａｌＮ感作マウスにおける致死率が僅かに減少した（図３ａ）。対照的にＬＰＳを投与する２時間前にＤＣｒｅｇを単回投与した場合にはＤ−ＧａｌＮ感作マウスにおけるＬＰＳ誘導性致死からは強く保護され、保護効果は濃度依存的であった（図３ｂ）。内毒素血症に対するＤＣｒｅｇの治療効果を調べる為に、マウスに高用量のＬＰＳ（マウスあたり１ｍｇ）を投与しＤＣｒｅｇで処理し生存期間をモニタリングした(図３ｃ)。ＬＰＳ投与して２時間後にＤＣｒｅｇを１回投与することによってマウスの生存期間は顕著に延長されたが、ｍＤＣによる処理では効果はなかった。著者らはまた、細菌性腹膜炎による致死に対するＤＣｒｅｇの治療効果を調べた（図３ｄ）。熱殺菌した大腸菌を投与して２時間後にｍＤＣではなくＤＣｒｅｇでマウスを処置することにより、生存期間が著しく延長した。
【００２４】
実施例４：マクロファージにおける炎症性サイトカインの産生に及ぼす樹状細胞の効果
制御性樹状細胞による炎症反応の抑制の基礎となるメカニズムを明らかにするために、ＬＰＳによって誘導されるマクロファージにおけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０の産生に及ぼす各種樹状細胞の影響を調べた。
１．細胞の調製
ｍＤＣ及びＤＣｒｅｇは実施例１に準じて調製した。
マクロファージは以下のようにして調製した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに１％チオグリコレート（ＤＩＦＣＯ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）１ｍＬを腹腔内投与し、４日後、腹腔から腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を単離した。ＰＥＣをビオチニル化抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体とＩＭａｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｐｌｕｓ−ＤＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とを用いて選別した。
ＩＬ−１０ノックアウトマウス（ＩＬ−１０ＫＯマウス；Kuhn R, Lohler J, Rennick D, Rajewsky K, Muller W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 1993 Oct 22;75(2):263-74.）由来の樹状細胞は、以下のようにして調製した。ＩＬ−１０ＫＯマウスから得られた骨髄細胞を、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で８日間培養することによって未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を得た。成熟樹状細胞（ｍＤＣ）は、ｉＤＣをＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で２日間刺激することによって得た。制御性樹状細胞前駆細胞（ｐＤＣｒｅｇ）は、ＩＬ−１０ＫＯマウスから得られた骨髄細胞を、マウスＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、マウスＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＴＧＦ−β１（２０ｎｇ／ｍｌ）で８日間培養することによって得た。制御性樹状細胞（ＤＣｒｅｇ）は、ｐＤＣｒｅｇの集団をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で２日間処理することによって得た。
ＩＬ−１０ＫＯマウス由来のｍＤＣをｍＤＣ（ＩＬ−１０ＫＯ）、ＤＣｒｅｇをＤＣｒｅｇ（ＩＬ−１０ＫＯ）とそれぞれ称する。
２．ＬＰＳ刺激
実施例１と同様にしてｍＤＣ及びＤＣｒｅｇをＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。またマクロファージ（１０６細胞）を、樹状細胞（ｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ；２×１０５〜１０６）、コントロールＩｇ（１０μｇ／ｍＬ：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）あるいは抗ＩＬ−１０抗体（１０μｇ／ｍＬ：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の存在下又は非存在下、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。
３．サイトカイン測定
ＬＰＳ刺激した（あるいはしていない）細胞の培養上清を回収し測定時迄−８０℃で保存した。培養上清中のサイトカインの測定は、実施例１と同様にしてそれぞれのサイトカインのＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
４．結果
結果を図４に示す。データは２サンプルの平均値±標準偏差で示し、４回実験を行って同様の同様の結果を得た。
マクロファージをＬＰＳで刺激するとｍＤＣあるいはＤＣｒｅｇを刺激した場合よりよりＴＮＦ−αの産生量が多かった（図４ａ）。一方、ｍＤＣにおけるＬＰＳ誘導性のＩＬ−１２ｐ４０の産生はマクロファージやＤＣｒｅｇのそれに比べて多かった（図４ｂ）。ＬＰＳ刺激したマクロファージにｍＤＣを添加すると、ＬＰＳ刺激されたマクロファージによって産生される場合に比べてＴＮＦ−αの産生量が減少し（図４ａ）、一方、ｍＤＣの添加はＩＬ−１２ｐ４０の産生を増強した（図４ｂ）。対照的に、ＬＰＳ刺激したマクロファージにＤＣｒｅｇを添加した場合にはＴＮＦ−αの産生もＩＬ−１２ｐ４０の産生も顕著に抑制された（図４ａ，４ｂ）。
上記の知見及び実施例１（図１）よりＤＣｒｅｇがＬＰＳに応答して優先的にＩＬ−１０を産生したことが示唆される。そこで、ＬＰＳによって誘導されるマクロファージによるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０産生のＤＣｒｅｇ介在性の抑制効果におけるＩＬ−１０の役割について調べた。マクロファージ及びｍＤＣをコントロールＩｇではなく抗ＩＬ−１０抗体で処理したところＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０のＬＰＳ誘導性の産生が僅かに増強された（図４ａ，４ｂ）。一方、抗ＩＬ−１０抗体での処理は、ＬＰＳ刺激されたマクロファージによるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０の産生に及ぼすＤＣｒｅｇの抑制効果を大きく阻害した（図４ａ，４ｂ）。それらの抑制効果における、ＤＣｒｅｇによって分泌されたＩＬ−１０の直接的な役割を調べる為に、ＩＬ−１０ＫＯマウス由来ＤＣｒｅｇの、ＬＰＳ刺激されたマクロファージによるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０の産生における効果を調べた（図４ｃ，４ｄ）。ｍＤＣとｍＤＣ（ＩＬ−１０ＫＯ）では同様なＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０を産生する能力が見られた。一方、ＤＣｒｅｇ（ＩＬ−１０ＫＯ）ではＬＰＳに応答したこれらの炎症性サイトカインの、ＤＣｒｅｇに比べて高い産生を示した。このことは、ＤＣｒｅｇによるＩＬ−１０のオートクリン産生が炎症性サイトカインの産生の欠損に部分的に関与しているということを示唆している。さらに、ＤＣｒｅｇ（ＩＬ−１０ＫＯ）ではＤＣｒｅｇに比べてＬＰＳ誘導性の炎症性サイトカイン産生に対する抑制効果が弱かった。
【００２５】
実施例５：複数細菌性敗血症に対する樹状細胞の治療効果
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）によって誘発させた，より臨床に近いモデルである複数細菌性敗血症（非特許文献７）に対するＤＣｒｅｇの治療効果を評価した。
１．盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをペントバルビタール（１ｍｇ／マウス、ｉ．ｐ．）で麻酔し、腹部正中線を小さく切り開いて盲腸を露出させた。盲腸を切断、結紮し、１８Ｇの針で１回、両表面に孔を開けた後腹部を閉じた。
２．樹状細胞の投与
ＣＬＰ処置６時間後に、各種樹状細胞（１０６細胞／マウス）を、コントロールＩｇ（１ｍｇ／マウス）あるいは抗ＩＬ−１０抗体（１ｍｇ／マウス）と組み合わせて、あるいは単独で投与した（図５ａ，図５ｂ）。また、別にＩＬ−１０ＫＯマウス由来の樹状細胞（１０６細胞／マウス）をＣＬＰ処置マウスに腹腔内投与した（図５ｃ）。ＩＬ−１０ＫＯマウス由来の樹状細胞であるｍＤＣ（ＩＬ−１０ＫＯ）及びＤＣｒｅｇ（ＩＬ−１０ＫＯ）は実施例４に準じて調製した。
３．生存率の測定
生存率は、１日１回６日間、モニタリングした。
４．結果
結果を図５に示す。同じ実験を４回繰り返したが同様の結果であった。ＣＬＰ６時間後でさえＤＣｒｅｇを単回投与することによりＣＬＰによる致死に対して保護効果があった。一方でｍＤＣを用いた処置では効果がなかった(図５ａ)。
さらにＣＬＰによって誘導される致死に対するＤＣｒｅｇの保護効果におけるＩＬ−１０の役割を調べた。ＤＣｒｅｇのみを投与したＣＬＰ処置マウスに比べて、ＤＣｒｅｇと抗ＩＬ−１０抗体（対照イムノグロブリンではない）とを同時に投与することにより生存期間が短縮された（図５ｂ）。さらにＤＣｒｅｇ（ＩＬ−１０ＫＯ）は、通常マウス由来のＤＣｒｅｇに比べてＣＬＰ誘導性の致死に対する保護効果が弱いことが示された（図５ｃ）。
【００２６】
実施例６：アポトーシスに対する制御性樹状細胞の保護効果
胸腺でのリンパ球のアポトーシスが敗血症による致死に関与しているということ、アポトーシスの妨害が敗血症マウスの生存を改善するということが報告されている（非特許文献９）。一方、外因性のＩＬ−１０の全身投与とは異なり、胸腺におけるアデノウイルス導入性のＩＬ−１０の局所産生及びリンパ節ドレインが実験的敗血症マウスの生存を改善し、この生存における改善が、Ｂｃｌ−２発現の増強及びカスパーゼ３活性の減少を通じたＴ細胞アポトーシスの抑制と関連していることが報告されている（非特許文献１０及び１１）。
本実施例では、ＣＬＰ処置したマウスにおける敗血症誘導性の胸腺細胞のアポトーシスを調べた（図６ａ，６ｂ）。
１．胸腺アポトーシスの検出
ＣＬＰ処置２４時間後に胸腺組織切片から胸腺細胞を調製した。胸腺細胞の総数をトリパンブルー色素排除法によって測定し、胸腺細胞のアポトーシスをアネキシン  Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
２．Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生
正常マウスあるいはＣＬＰ処置したマウス（ＣＬＰ処置２４時間後）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た放射線照射（線源１３７Ｃｓ、１５Ｇｙ、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ４０  Ｅｘａｃｔｏｒ，ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）した同種異系のｍＤＣと一緒に９６穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養した。３日目の最後１８時間に[３Ｈ]チミジンの取り込みを測定した。サイトカインの測定のために培養上清を回収し、測定時迄−８０℃で保存した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６マウスの脾臓単核細胞からｍｏｕｓｅ  ＣＤ４  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｅｔ−ＤＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてネガティブ選択した。
３．結果
胸腺細胞の顕著な減少及び目立った胸腺細胞のアポトーシスがＣＬＰのあと何も処理しなかったマウスでは観察された。加えて、ｍＤＣではなく、ＤＣｒｅｇで処理した場合、ＣＬＰ処置マウスにおける胸腺細胞の減少及び胸腺細胞のアポトーシスが改善された。
敗血症によって引き起こされた全身性の炎症性応答が、敗血症症候群に見られる全体的な免疫抑制を導く宿主のＴ細胞免疫応答に影響を与えると仮定された。さらに、ＣＬＰ処置マウスにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞が増殖しサイトカインを産生する能力を調べた（図６ｃ，６ｄ）。ＣＬＰ処置２日後の未処理マウス並びにｍＤＣ投与処理マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、同種異系のｍＤＣで刺激した際の増殖応答及びＩＬ−２及びＩＦＮ−γの著しい減少を示した。対照的にＤＣｒｅｇは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能力及びサイトカイン産生能力の敗血症による低下を抑制した。従って、ＤＣｒｅｇによる宿主の急性炎症性応答の抑制は敗血症によって誘導される胸腺アポトーシス及びＣＤ４＋Ｔ細胞の機能障害の抑制に貢献し、そうして敗血症ショックに対する保護効果を誘導するのかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＬＰＳ刺激時の各種樹状細胞のサイトカイン産生能を比較した結果を表す図である。縦軸は培養上清中の各サイトカインの濃度を示している〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（ｉＤＣと比較して、あるいは２群間で）〕。
【図２】実験的内毒素血症時の炎症性サイトカイン産生における樹状細胞の効果を調べた結果を表す図である。縦軸はマウス血清中の各サイトカインの濃度を示している〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（未処理マウスと比較して、あるいは２群間で）〕。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：未処理（いずれの樹状細胞も投与していない）。
【図３】内毒素血症及び細菌性腹膜炎による致死に対する樹状細胞の保護効果を調べた結果を示す図である。ａは、Ｄ−ＧａｌＮ感作マウスにおける内毒素血症の致死に対するｍＤＣの保護効果について、生存期間をモニタリングした結果を示している。ｂは、Ｄ−ＧａｌＮ感作マウスにおける内毒素血症の致死に対するＤＣｒｅｇの保護効果について、生存期間をモニタリングした結果を示している。ｃは、マウスに高用量のＬＰＳを投与しＤＣｒｅｇで処置した場合の生存期間をモニタリングした結果を示している。ｄは、細菌性腹膜炎の致死に対するｍＤＣ又はＤＣｒｅｇの保護効果について、生存期間をモニタリングした結果を示している。〔Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（未処理マウスと比較して）〕。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：未処理（いずれの樹状細胞も投与していない）。
【図４ａ】ＬＰＳによって誘導されるマクロファージにおけるＴＮＦ−α産生に及ぼす各種樹状細胞の影響を調べた結果を示す図である。横軸は培養上清中のＴＮＦ−αの濃度を示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した、あるいは刺激していないマクロファージ、ｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ（それぞれ１０６細胞）の培養上清中のＴＮＦ−αの濃度、あるいは、各種樹状細胞（２．５×１０５〜１０６細胞）、コントロールＩｇ（１０μｇ／ｍＬ）あるいは抗ＩＬ−１０抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したマクロファージ（１０６細胞）の培養上清中のＴＮＦ−αを測定した結果である。〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（マクロファージと比較して）〕。
【図４ｂ】ＬＰＳによって誘導されるマクロファージにおけるＩＬ−１２ｐ４０の産生に及ぼす各種樹状細胞の影響を調べた結果を示す図である。横軸は培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度を示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した、あるいは刺激していないマクロファージ、ｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ（それぞれ１０６細胞）の培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度、あるいは、各種樹状細胞（２．５×１０５〜１０６細胞）、コントロールＩｇ（１０μｇ／ｍＬ）あるいは抗ＩＬ−１０抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したマクロファージ（１０６細胞）の培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度を示す。〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（マクロファージと比較して）〕。
【図４ｃ】ＬＰＳによって誘導されるマクロファージにおけるＴＮＦ−αの産生に及ぼす各種樹状細胞の影響を調べた結果を示す図である。横軸は培養上清中のＴＮＦ−αの濃度を示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した、あるいは刺激していないマクロファージ、正常マウスのｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ、ＩＬ−１０ノックアウトマウスのｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ（それぞれ１０６細胞）の培養上清中のＴＮＦ−αの濃度、あるいは、各種樹状細胞（２．５×１０５〜１０６細胞）の存在下又は非存在下、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したマクロファージ（１０６細胞）の培養上清中のＴＮＦ−αの濃度を示す。〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（マクロファージと比較して）〕。
【図４ｄ】ＬＰＳによって誘導されるマクロファージにおけるＩＬ−１２ｐ４０の産生に及ぼす各種樹状細胞の影響を調べた結果を示す図である。横軸は培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度を示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した、あるいは刺激していないマクロファージ、正常マウスのｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ、ＩＬ−１０ノックアウトマウスのｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ（それぞれ１０６細胞）の培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度、あるいは、各種樹状細胞（２．５×１０５〜１０６細胞）の存在下又は非存在下、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激したマクロファージ（１０６細胞）の培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０の濃度を示す。〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（マクロファージと比較して）〕。
【図５】ＣＬＰ処置によって誘発される複数細菌性敗血症による致死に対する樹状細胞の保護効果を調べた結果を示す図である。ａは、ＣＬＰ処置後６時間でｍＤＣ又はＤＣｒｅｇを腹腔内投与したマウスの生存期間をモニタリングした結果を示している。ｂは、ＣＬＰ処置後６時間でコントロールＩｇ（１ｍｇ／マウス）あるいは抗ＩＬ−１０抗体（１ｍｇ／マウス）と組み合わせてｍＤＣ又はＤＣｒｅｇを腹腔内投与したマウスの生存期間をモニタリングした結果を示している。ｃは、ＣＬＰ処置後６時間で正常マウスあるいはＩＬ−１０ノックアウトマウスから得たｍＤＣ又はＤＣｒｅｇを腹腔内投与したマウスの生存期間をモニタリングした結果を示している。〔Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（未処理マウスと比較して）〕。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：未処理（いずれの樹状細胞も投与していない）。ＤＣｒｅｇ／ｃｏｎｔ．Ｉｇ：制御性樹状細胞をコントロールＩｇと組み合わせて投与。ＤＣｒｅｇ／ａｎｔｉ−ＩＬ−１０Ａｂ：制御性樹状細胞を抗ＩＬ−１０抗体と組み合わせて投与。
【図６】ＣＬＰ処置したマウスにおける敗血症誘導性の免疫制御異常に対する制御性樹状細胞の保護効果について調べた結果を示す図である。ＣＬＰ処置後６時間でｍＤＣ又はＤＣｒｅｇ（１０６細胞／マウス）をマウスに腹腔内投与した。続いて、ＣＬＰ処置後２４時間で胸腺細胞及び脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を得た。（ａ，ｂ）胸腺細胞を正常マウスあるいはＣＬＰ処置マウスから得た。胸腺細胞の総数（ａ）又はアポトーシスの出現頻度をフローサイトメトリーで測定した（ｂ）。（ｃ，ｄ）正常マウス及びＣＬＰ処置したマウスから得られたＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５細胞）を種々の数（１．２５×１０３〜１０５細胞）の放射線照射した同種異系ｍＤＣとともに３日間培養した。増殖反応（ｃ）又は培養上清中のＩＬ−２産生（左パネル）及びＩＦＮ−γ産生（右パネル）を測定した（ｄ）。データは３サンプルの平均±標準偏差で表した。４回実験を行い、同様の結果を得た。〔Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ；＊ｐ＜０．０１（正常マウスから得た胸腺細胞（ａ，ｂ）又はＣＤ４＋Ｔ細胞（ｃ，ｄ）と比較して）〕。Ｎｏｒｍａｌ：ＣＬＰ処置していない正常マウスに投与。Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：未処理（いずれの樹状細胞も投与していない状態）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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