(57)【要約】      （修正有）【課題】プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞の細胞増殖抑制剤、並びにプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者を治療するための白血病治療剤及び治療方法を提供すること。【解決手段】BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者に対しては、プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させる細胞増殖抑制剤である白血病治療剤か、またはBASHシグナル伝達系の活性を増強させる細胞増殖抑制剤である白血病治療剤を投与することにより、プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者を治療する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者を治療するための白血病治療剤であって、
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする白血病治療剤。
【請求項２】
BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者を治療するための白血病治療剤であって、
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でBASHシグナル伝達系の活性を増強させることを特徴とする白血病治療剤。
【請求項３】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、BASHの発現が低下することによってBASHシグナル伝達系の活性が低下していることを特徴とする請求項１または２に記載の白血病治療剤。
【請求項４】
前期プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、IL-7受容体が活性化することによってSTAT5シグナル伝達系が活性化していることを特徴とする請求項１または２に記載の白血病治療剤。
【請求項５】
IL-7受容体を阻害することによって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする請求項４に記載の白血病治療剤。
【請求項６】
抗IL-7抗体を含有することを特徴とする請求項５に記載の白血病治療剤。
【請求項７】
SOCS-1の活性を上昇させることによって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の白血病治療剤。
【請求項８】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSOCS-1遺伝子を強制発現させることによりSOCS-1の活性を上昇させることを特徴とする請求項７に記載の白血病治療剤。
【請求項９】
ヒト以外の脊椎動物において、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病の治療方法であって、
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする治療方法。
【請求項１０】
ヒト以外の脊椎動物において、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病の治療方法であって、
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でBASHシグナル伝達系の活性を増強させることを特徴とする治療方法。
【請求項１１】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、BASHの発現が低下することによってBASHシグナル伝達系の活性が低下していることを特徴とする請求項９または１０に記載の治療方法。
【請求項１２】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、白血病細胞がIL-7を分泌していることによってSTAT5シグナル伝達系が活性化していることを特徴とする請求項９または１０に記載の治療方法。
【請求項１３】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、IL-7受容体を阻害することによってSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする請求項１２に記載の治療方法。
【請求項１４】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に抗IL-7抗体を投与することによりIL-7受容体を阻害することを特徴とする請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１５】
SOCS-1の活性を上昇させることによって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の治療方法。
【請求項１６】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSOCS-1遺伝子を強制発現させることによりSOCS-1の活性を上昇させることを特徴とする請求項１５に記載の治療方法。
【請求項１７】
BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞の細胞増殖抑制剤であって、
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする細胞増殖抑制剤。
【請求項１８】
BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞の細胞増殖抑制剤であって、
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でBASHシグナル伝達系の活性を増強させることを特徴とする細胞増殖抑制剤。
【請求項１９】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、BASHの発現が低下することによってBASHシグナル伝達系の活性が低下していることを特徴とする請求項１７または１８に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２０】
前期プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、IL-7受容体が活性化することによってSTAT5シグナル伝達系が活性化していることを特徴とする請求項１７または１８に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２１】
IL-7受容体を阻害することによって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする請求項２０に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２２】
抗IL-7抗体を含有することを特徴とする請求項２１に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２３】
SOCS-1の活性を上昇させることによって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２４】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSOCS-1遺伝子を強制発現させることによりSOCS-1の活性を上昇させることを特徴とする請求項２３に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２５】
BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が恒常的に活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病を発症するプレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウス。
【請求項２６】
Bash遺伝子突然変異をホモ接合に有することを特徴とする請求項２５に記載のプレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウス。
【請求項２７】
前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞がIL-7を異所的に発現していることを特徴とする請求項２５または２６に記載のプレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウス。
【請求項２８】
活性化STAT5の発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項２５または２６に記載のプレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウス。
【請求項２９】
BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ白血病細胞株。
【請求項３０】
Bash突然変異をホモ接合に有するBash突然変異マウスから樹立されたことを特徴とする請求項２９に記載のプレＢ白血病細胞株。
【請求項３１】
IL-7を異所的に発現していることを特徴とする請求項２９または３０に記載のプレＢ白血病細胞株。
【請求項３２】
活性化STAT5の発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスから樹立されたことを特徴とする請求項２９または３０に記載のプレＢ白血病細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプレＢ細胞急性リンパ性白血病治療剤及び治療方法、細胞増殖抑制剤、プレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウス、並びにプレＢ白血病細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukaemia ; ALL）は子供の悪性腫瘍の中では最も多く、その多くがプレＢ細胞から発生する。最近、小児プレＢ細胞ALL患者の約半数例でBASHの発現が消失しているか、非常に弱く、少なくともタンパク質レベルでは検出できなかったと報告された（非特許文献１参照）ことから、BASHは、プレＢ細胞の癌化と関係があると考えられている。
【０００３】
BASH（SLP65またはBLNKとも記載されている）はＢ細胞系列に特異的に発現するアダプタータンパクで、Sykによりリン酸化され、種々のシグナル因子と結合し、抗原受容体（BCR）及びpre-BCRからのシグナルを細胞内へ伝える役割を持つ。
【０００４】
生体におけるBASHの機能を明らかにするために、BASHノックアウトマウスが作製され、その表現型が解析された。Ｂ細胞は、骨髄内の造血幹細胞からプロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞を経て、分化するのであるが、BASHノックアウトマウスでは、この骨髄内でのＢ細胞初期分化過程に障害があり、pre-BCR陽性の大型プレＢ細胞が蓄積し、それ以降の分化が停滞するため、脾臓やリンパ節など、末梢組織で成熟Ｂ細胞の数が減少した。これは、大型プレＢ細胞において細胞周期がG0/G1期で完全に停止するためであることが示された。従って、BASHは、プレＢ細胞の増殖及び分化を誘導するpre-BCRからのシグナル伝達に必要であることが明らかになってきた（例えば、非特許文献２〜４参照）。
【０００５】
このように、Ｂ細胞系列にあるBASH欠損細胞は、大型プレＢ細胞の段階で細胞周期が停止するにも関わらず、BASHノックアウトマウスの４〜１０％が、preBCR陽性大型プレＢ細胞からなる単クローン性の急性リンパ性白血病を発症し、BASHのプレＢ細胞の癌化に対する関与が単純ではないことを窺わせた（例えば、非特許文献５，６参照）。
【非特許文献１】Jumaa, H., et al.  Nature 423, 452-456, 2003
【非特許文献２】Jumaa, H., et al.  Immunity 11, 547-554, 1999
【非特許文献３】Pappu, R., et al.  Science 286, 1949-1954, 1999
【非特許文献４】Hayashi, K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2755-2760, 2000
【非特許文献５】Flemming, A., et al. Nat Immunol 4, 38-43, 2003
【非特許文献６】Hayashi, K., et al. Immunity 18, 825-836, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、プレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウス及びプレＢ白血病細胞株を作製し、それらを用いてBASHの関与するプレＢ細胞急性リンパ性白血病発症の分子機構を解明し、それを通じてプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞の細胞増殖抑制剤、並びにプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者を治療するための白血病治療剤及び治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、BASHノックアウトマウス（以下、ヘテロ接合体をB/+と記し、ホモ接合体をB/Bと記す。）を解析している間に、白血病を発症したBASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株においてSTAT5が恒常的に活性化していることを発見した。このプレＢ白血病細胞株を解析した結果、この細胞株は本来発現しないIL-7を発現していることが明らかになり、オートクラインによって、IL-7シグナル伝達系が活性化されていることが示唆された。
【０００８】
一方、BASHノックアウトマウスをSTAT5を恒常的に発現するトランスジェニックマウス（以下、STAT5B-CA/+と記す。）と交配することにより、BASH変異をホモあるいはヘテロに有し、STAT5シグナル伝達系が活性化している変異マウス（B/+;STAT5B-CA/+及びB/B; STAT5B-CA/+）を作製したところ、どちらの場合においても、ほぼ１００％のマウスがプレＢ細胞急性リンパ性白血病を発症することを見出した。これらのマウスにおいて、BASHの発現を調べたところ、どちらの場合もほとんど検出限界以下だった。
【０００９】
STAT5シグナル伝達系が恒常的に活性化しているトランスジェニックマウスやBASHノックアウトマウスは、それら単独ではプレＢ細胞急性リンパ性白血病は高頻度には発症しないため、上記の結果から、プレＢ細胞において、BASHシグナル伝達系の活性の低下とSTAT5シグナル伝達系の活性化の両方が生じることにより、正常プレＢ細胞がプレＢ白血病細胞になることが明らかになった。
【００１０】
そこで、上記プレＢ白血病細胞株に対し、抗IL-7受容体抗体の投与またはSOCS1の強制発現によってSTAT5シグナル伝達系を阻害したところ、細胞増殖が抑制されることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
以上の知見に鑑み、本発明にかかる白血病治療剤は、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者を治療するための白血病治療剤であって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする白血病治療剤である。この白血病治療剤は、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でBASHシグナル伝達系の活性を増強させてもよい。
【００１２】
上記白血病治療剤の対象となる前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、BASHの発現が低下することによってBASHシグナル伝達系の活性が低下していてもよい。また、IL-7受容体が活性化することによってSTAT5シグナル伝達系が活性化していてもよい。
【００１３】
上記白血病治療剤が、IL-7受容体を阻害することによってSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させてもよい。この場合、白血病治療剤が、抗IL-7抗体を含有してもよい。また、上記治療剤が、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSOCS-1の活性を上昇させることによってSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させてもよい。この場合、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内で、SOCS-1を強制発現させてもよい。
【００１４】
本発明にかかる治療方法は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物において、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病の治療方法であって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする治療方法である。この治療方法として、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でBASHシグナル伝達系の活性を増強させてもよい。
【００１５】
上記治療方法の治療対象である前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、BASHの発現が低下することによってBASHシグナル伝達系の活性が低下していてもよい。また、白血病細胞がIL-7を分泌していることによってSTAT5シグナル伝達系が活性化していてもよい。
【００１６】
上記治療方法は、IL-7受容体を阻害することによってSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させてもよい。この場合、抗IL-7抗体を投与することにより、IL-7受容体を阻害してもよい。また、上記治療方法が、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内で、SOCS-1の活性を上昇させることによってSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させてもよい。この場合、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内で、SOCS-1を強制発現させてもよい。
【００１７】
本発明にかかる細胞増殖抑制剤は、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞の細胞増殖抑制剤であって、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることを特徴とする細胞増殖抑制剤である。この細胞増殖抑制剤は、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でBASHシグナル伝達系の活性を増強させてもよい。
【００１８】
上記細胞増殖抑制剤の対象となる前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞において、BASHの発現が低下することによってBASHシグナル伝達系の活性が低下していてもよい。また、IL-7受容体が活性化することによってSTAT5シグナル伝達系が活性化していてもよい。
【００１９】
上記細胞増殖抑制剤が、IL-7受容体を阻害することによってSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させてもよい。この場合、細胞増殖抑制剤が、抗IL-7抗体を含有してもよい。また、上記細胞増殖抑制剤が、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でSOCS-1の活性を上昇させることによってSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させてもよい。この場合、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内で、SOCS-1を強制発現させてもよい。
【００２０】
本発明にかかるプレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウスは、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が恒常的に活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病を発症する。このマウスは、Bash突然変異をホモ接合に有していてもよい。また、前記プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞がIL-7を異所的に発現していてもよい。また、活性化STAT5の発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスであってもよい。
【００２１】
本発明にかかるプレＢ白血病細胞株は、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化している。このプレＢ白血病細胞株は、Bash突然変異をホモ接合に有するBash突然変異マウスから樹立されたものであってもよい。また、IL-7を異所的に発現していてもよい。また、活性化STAT5の発現ベクターが導入されたトランスジェニックマウスから樹立されたものであってもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって、プレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウス、プレＢ白血病細胞株、プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞の細胞増殖抑制剤、並びにプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病患者を治療するための白血病治療剤及び治療方法を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２５】
STAT5シグナル伝達系が恒常的に活性化しているSTAT5B-CAマウス（STAT5B-CA/+）（Burchill et al. J. Immunol. 171: 5853-5864, 2003）やBASHシグナル伝達系の活性が低下しているBASHノックアウトマウス（B/B）では、ほとんどプレＢ白血病を発症しない（それぞれ、約１％及び約５％）にもかかわらず、これらのマウスを交配して作製した変異マウス（B/+;STAT5B-CA/+またはB/B;STAT5B-CA/+）においては、ほぼ100%プレＢ白血病を発症する。従って、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が恒常的に活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病を発症する遺伝子改変マウスは、プレＢ細胞急性リンパ性白血病モデルマウスとして有用である。このモデルマウスの作製に関し、BASHシグナル伝達系の活性を低下させる方法は、Bash遺伝子のノックアウトマウスを作製することによってBash突然変異をホモ接合にすることに限らず、マウスにおいてBASHアンチセンスＲＮＡやＲＮＡｉを恒常的に発現させる等、特に限定はされない。また、STAT5シグナル伝達系を恒常的に活性化させる方法は、マウスにおいて、活性化STAT5を恒常的に発現させることに限らず、IL-7を異所的にあるいは恒常的に発現させる等、特に限定はされない。これら遺伝子操作は、マウス全身の細胞で効果を有するように、ノックアウトマウスや恒常的発現ベクターのトランスジェニックマウスとしてもよく、プレＢ細胞特異的に効果を有するように、条件的ノックアウトマウスや細胞特異的プロモーターを有する発現ベクターのトランスジェニックマウスとしてもよい。
【００２６】
上記のように、STAT5シグナル伝達系が恒常的に活性化しているSTAT5B-CAマウス（STAT5B-CA/+）やBASHシグナル伝達系の活性が低下しているBASHノックアウトマウス（B/B）では、ほとんどプレＢ白血病を発症しないのであるから、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病は、そのプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内でBASHシグナル伝達系の活性を増強させるか、あるいはSTAT5シグナル伝達系の活性を低下させることにより、治療することができる。
【００２７】
治療対象は、ヒトでもヒト以外の脊椎動物でもよく、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞に起因する白血病に罹患していれば、生物種を問わない。
【００２８】
BASHシグナル伝達系の活性を増強させるための方法は、特に限定されないが、例えば、プレＢ白血病細胞にBASHの強制発現ベクターを導入し、プレＢ白血病細胞においてBASHの発現を増強させることが考えられる。BASHの強制発現ベクターの導入方法は特に限定されないが、BASHの強制発現はプレＢ白血病細胞特異的に行うことが好ましい。例えば、プレＢ細胞特異的なプロモーター（例えば  l5遺伝子プロモーター）を有する発現ベクターを組み込んだウイルスを用いたり、プレＢ白血病細胞特異的な表面抗原（例えばpreBCR）に対する抗体にポリカチオンを介してBASHの強制発現ベクターを結合した複合体を治療剤とし、プレＢ白血病を罹患している動物に静脈注射によって投与（特開平７−２１６０００）したりすることによって、プレＢ白血病細胞特異的強制発現が実現できる。
【００２９】
また、STAT5シグナル伝達系の活性を低下させるための方法は、特に限定されないが、例えば、プレＢ白血病細胞に、SOCS-1やDominant negative STAT5（例えばY694F変異体）の強制発現ベクターを導入したり、STAT5のアンチセンスＲＮＡやＲＮＡｉを導入したり、これらＲＮＡの発現ベクターを導入したりすればよい。ベクター導入は、特に、プレＢ白血病細胞特異的な導入が好ましく、BASHの強制発現ベクターの導入と同様の上記方法を用いることができる。また、IL-7がオートクラインで、あるいはパラクラインで供給され、IL-7受容体が活性化することによってSTAT5シグナル伝達系が活性化している場合は、治療剤としてIL-7受容体の阻害剤を投与すればよい。例えば、抗IL-7抗体が一例であるが、阻害剤はこれに限らず、IL-7受容体活性を阻害する薬剤であれば、どんなものでもよい。他の例として、STAT5シグナル伝達系上にあるJak1、Jak3、STAT5の阻害剤を投与してもよい。
【００３０】
ここで用いることのできる治療剤は、上記の治療剤に限らず、プレＢ細胞急性リンパ性白血病細胞内で、BASHシグナル伝達系の活性を増強させるか、STAT5シグナル伝達系の活性を低下させることができるものであれば、どんなものでもよい。
【００３１】
このような治療剤は、常法に従って、薬理上許容される担体と配合し、乳剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤にして経口投与してもよいし、バッファーや生理食塩水に溶解し、注射剤などの製剤にして皮下、筋肉内、腹腔内や静脈内へ注射する、あるいは、坐薬（座剤）などの製剤にして直腸内投与する、あるいは、噴霧剤などの製剤にして口腔または気道粘膜へ噴霧することにより粘膜投与する、あるいは、軟膏やテープ剤などの製剤にして患部（例えば、皮膚や粘膜など）に塗布又は貼付することにより経皮投与あるいは粘膜投与する、というような態様で非経口投与してもよい。
【実施例】
【００３２】
（１）BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株におけるSTAT5の恒常的活性化
まず、C57BL/6由来のES細胞Bruce4（Kontgen et al. Int. Immunol. 5:957-964, 1993）において、BASHターゲッティングベクター（Hayashi et al., 2000）を用いて相同組換えを行うことにより、BASHノックアウトマウスを作製した。
【００３３】
上述したように、BASHノックアウトマウス（B/B）の約5％がプレＢ白血病を発症する。そこで、プレＢ白血病を発症したBASHノックアウトマウス（B/B）の骨髄細胞を20％ Fetal BovineSerum(SIGMA)（以下FBSと省略）含有RPMI-1640培養液にて37℃5% CO2条件下で約１ヶ月間培養し、細胞株として樹立した。以下、これらのpreBCR陽性細胞株をBKO84及びBKO408と称する。
【００３４】
これらの細胞株から、細胞抽出液を調整し、抗Phospho-STAT5(Tyr694)抗体(ウサギ血清：#9351 Cell Signaling)を500分の１に希釈して一次抗体として用いてWestern blottingを行うことにより、STAT5の活性化を検出した。ここでは、ポジティブコントロールの細胞株として、Abelson virusによりプレＢ細胞を形質転換し樹立された18-81（マウス）（Riley et al., Nature 289: 804-806, 1981）を、ネガティブコントロールの細胞株として、Ｂリンパ腫細胞株WEHI231（マウス）（Taussig et al., Immunology 39: 57-60, 1980）を使用した。
【００３５】
図１に示すように、BASHノックアウトマウス(B/B)で生じたプレＢ白血病細胞株においては、STAT5が恒常的に活性化していることが明らかになった。
【００３６】
（２）BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株におけるIL-7の異所的発現（ectopic expression）
BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株BKO84及びBKO408において、IL-7の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた。ここでは、ネガティブコントロールの細胞株として、18-81及びWEHI231を使用した。ポジティブコントロールとして、クローン化したIL-7産生ストローマ細胞株ST2（Gunji et al., Blood 77:2612-2617, 1991）及びOP9（Kodama et al., Exp. Hematol. 22:979-984, 1994）を用いた。
【００３７】
これらの細胞株BKO84、BKO408、18-81、WEHI231、ST2及び0P9 について各1×107個の細胞を準備し、TRIZOL Reagentを用いて全RNAを抽出した。この全RNA 5μgにoligo (dT)20  1μl、10mM dNTP Mix 1μlを加え、全容量が13μlになるよう蒸留水で調整し、65℃にて5分間の熱処理後、氷上で1分間冷却した。5×First Strand buffer 4μl、0.1M DTT 1μl、RNase inhibitor 1μl、SuperScriptIII 1μl を加え50℃にて60分間の逆転写反応をおこないcDNAを合成した。
【００３８】
IL-7発現検証の為のPCRはHOT Start法を用いて行った。以下のプライマーを用い、Taq Polymerase Buffer（10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2）にてPCRを行った。PCRの条件は95℃にて5分間の熱変性後、85℃にて5分間の時間を設けTaq polymerase (SIGMA)を添加した。95℃1分−53℃1分−72℃1分間サイクルを35回行った後、72℃にて10分間の伸長反応をおこなった。
【００３９】
マウスIL-7 5’ : TGT CAC ATC ATC TGA GTG CC （配列番号１）
マウスIL-7 3’ : CTC TCA GTA GTC TCT TTA GG （配列番号２）
得られた産物をアガロースゲルで電気泳動した。
【００４０】
図２に示したように、プレＢ細胞株18-81や未熟Ｂ細胞株WEHI231ではIL-7の発現が検出されないのに対し、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株BKO84及びBKO408は、いずれもIL-7を発現していた。
【００４１】
このように、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株は、本来発現しないはずのIL-7を発現していることが明らかになった。
【００４２】
（３）BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株におけるIL-7のオートクライン
こうして検出されたBKO84及びBKO408におけるIL-7の発現によるオートクラインが、実際に、これら細胞株の増殖に寄与しているかどうか、抗IL-7受容体抗体による阻害実験によって調べた。
【００４３】
抗IL-7受容体抗体産生性ハイブリドーマA7R34(Sudo et al., 1993)を75cm2フラスコにて培養し、満杯（confluent）になったら、細胞を含む培養液をファルコンチューブに移し、1200rpm にて5分間遠心後、上清を新しいチューブに移し保存した。Hi Trap affinity columns（Pharamacia Biotech社）を用いて、上記の上清より抗IL-7 受容体抗体の精製を行った後、PD-10 Columns（Amersham Biosciences社）を用いバッファーをPBSに置換した。
【００４４】
BKO84、BKO408、及び18-81の各細胞をファルコンチューブに移し、1200rpm で5分間遠心後、上清を廃棄した。PBS(-)20mlで、細胞を４回洗浄後、各細胞を１０％FBS含有RPMI-1640培養液に懸濁し、６ウェルプレートの各ウェルに2.5×105個の細胞を播種した。培地に抗IL-7受容体抗体を最終濃度20μg/mlになるよう抗体を添加して、37℃5% CO2条件下で培養した。同時に、コントロールとして、抗体を添加しないで各細胞を培養した。２４時間ごとに3日間細胞数を数えて細胞増殖曲線を作成し、抗-IL-7受容体抗体が上記細胞株の増殖にどの程度影響を及ぼすのかを調べた。
【００４５】
図３に示したように、BKO84及びBKO408には、抗-IL-7受容体抗体による細胞増殖の著しい阻害効果が、抗体添加後２４時間以降に観察されたが、18-81には、細胞増殖に対する抗-IL-7受容体抗体の影響は認められなかった。
【００４６】
このように、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株は、その自律的増殖をIL-7のオートクラインに依存しており、STAT5シグナル伝達系が恒常的に活性化していることが明らかになった。同時に、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株に抗-IL-7受容体抗体を投与することにより、プレＢ白血病細胞の増殖を阻害することができることが明らかになった。
【００４７】
（３）BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化している変異マウス（B/+;STAT5B-CA/+及びB/B; STAT5B-CA/+）の表現型の解析
BASHシグナル伝達系及びSTAT5シグナル伝達系のプレＢ白血病発症に対する関与を調べるため、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化している変異マウスを作製し、表現型を調べた。
【００４８】
恒常的に活性化しているSTAT5Bを発現しているSTAT5B-CAマウスは、299番目のヒスチジンがアルギニンへ、711番目のセリンがフェニルアラニンに置換されたSTAT5B cDNAを、Lck遺伝子近位プロモーターと免疫グロブリンH鎖遺伝子Emエンハンサーを有するベクターp1026x（Iritani et al, EMBO J. 16:7019-7031, 1997）に挿入したトランスジーンをマウス受精卵にマイクロインジェクションすることによって作製された（Burchill et al. J. Immunol. 171: 5853-5864, 2003）。
【００４９】
このSTAT5B-CAマウス（STAT5B-CA/+）とBASHノックアウトマウス（B/+またはB/B）を交配して（B/+;STAT5B-CA/+）または（B/B；STAT5B-CA/+）の遺伝子型を有する変異マウスを作製したところ、各遺伝子型において、９４％及び１００％のマウスがプレＢ細胞急性リンパ性白血病を発症した。
【００５０】
なお、白血病を発症した変異マウス（B/+;STAT5B-CA/+）及びSTAT5B-CAマウス（STAT5B-CA/+）について、腫大したリンパ節からwhole cell lysateを調整し、抗マウスBASH抗体（Hayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 2755-2760, 2000）を用いて、Western blot法にてBASHの発現を調べた（図４上段）。コントロールとして白血病を発症していないB/+マウスの脾臓細胞より抗B220抗体及びMACSビーズを用いて精製したB細胞、及び正常マウスの脾臓、胸腺から抽出したwhole cell lysateを用いた。なお、Ｂ細胞由来の蛋白量のコントロールとして、同じフィルターをヤギ抗Btk抗体（Santa Cruz Biotechnology、Btk(C20)、1000倍希釈）および二次抗体としてHRP-ウサギ抗ヤギIgG（Zymed、2000倍希釈）を用いて反応させ、Btkの蛋白量を調べた（図４下段）。
【００５１】
なお、抗BASH抗体は、マウスBASH蛋白質の42番目から52番目まで（ヒトBASHと１残基のみ異なる）に相当するペプチドを合成し、これをkeyhole limpet hemocyaninに結合させ、ウサギを免疫することによって作製した。この抗BASH抗体を一次抗体として、500分の1の希釈率で用いた。また、二次抗体は、HRP-ヤギ抗ウサギIgG (Zymed)を10000分の1の希釈率で用いた。
【００５２】
結果として、図４に示すように、白血病を発症した変異マウス（B/+;STAT5B-CA/+）及びSTAT5B-CAマウス（STAT5B-CA/+）のリンパ節細胞では、BASHの発現がほとんど検出できないくらいに低下していた。
【００５３】
このように、BASHシグナル伝達系の活性が低下し、STAT5シグナル伝達系が活性化しているプレＢ細胞がプレＢ白血病細胞になり、急性リンパ性白血病が引き起こされることが示唆された。
【００５４】
（４）ヒト・プレＢ白血病細胞株におけるBASH及びSTAT5の発現
以上のマウスの系を用いた研究から、BASHの発現低下にSTAT5の活性化が加わるとプレＢ細胞の癌化頻度が高まり、マウスは高頻度にプレＢ細胞白血病を発症することがわかった。そこで、ヒトpre-B ALL細胞でも、BASHの発現消失とSTAT5の活性化が同時にみられるのかどうか、ヒト・プレＢ細胞白血病細胞株９株におけるBASHの発現及びSTAT5の活性化をWestern blotting法を用いて調べた。なお、BASHの検出に用いた抗体は、上記抗BASH抗体を用いた。また、STAT5の活性化の検出に用いた一次抗体は、抗Phospho-stat5(Tyr694)抗体(ウサギ血清: #9351 Cell Signaling)で、500分の１に希釈して用いた。
【００５５】
その結果、図５に示すように、NALL-1、INC、udd-88及びHPB-Nullの４株について、BASHの発現が、タンパク質レベルで、コントロールのRamos（Ｂ細胞株）と比べて著しく低く、またその他の細胞株でもLAZ-221以外はBASHの発現が比較的低かった（図５ａ）。その中で、少なくともNALM6、udd-88とHPB-NullではSTAT5が有意に活性化していた（図５ｂ）。このように、調べたプレＢ細胞白血病細胞株のうち1/3においてBASHの発現低下とSTAT5の恒常的活性化が同時に起こっていることがわかった。
【００５６】
従って、実際のヒト・プレＢ細胞白血病患者においても、BASHの発現低下にSTAT5の活性化が加わることによって発症している場合がかなりの割合で存在することが明らかになった。
【００５７】
（５）BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株における、SOCS-1強制発現によるSTAT5シグナル伝達系の阻害
BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株に対し、レトロウイルスベクターを用い、JAKキナーゼの抑制蛋白であるSOCS1を上記プレB白血病細胞中で過剰発現させ、細胞増殖に与える影響を調べた。
【００５８】
５０μg/ml フィブロネクチン(SIGMA)溶液１mlを６ウェル連結プレートの各ウェルに加え、37℃5% CO2条件下で９０分間静置し、プレートをコラーゲンコートした。フィブロネクチン溶液を除去し、P/Sを含まない10%FBS含有RPMI-1640培養液でウェルを洗浄した。ウイルス産生能のあるPlat-E（Morita et al., Gene Ther. 7: 1063-1066, 2000）を3×105 cells / ウェルの濃度で播種し、37℃ 5% CO2条件下で24時間培養した。
【００５９】
リボゾームエントリー部位（IRES）の下流にGFPを配置したレトロウイルスベクターであるpMX-IRES-GFP（Onishi et al., 1996）のBamHI/XhoI部位に、Myc-tagを5’端に付加した野生型SOCS1のcDNAあるいはJAKに対して抑制効果のない変異型SOCS1(F59D)（59番目のアミノ酸をフェニルアラニンからアスパラギン酸に置換したもの）のcDNAを組み込んだ、pMX-SOCS1/WT-IRES-GFP及びpMX-SOCS1/F59D-IRES-GFPを作製した。
【００６０】
pMX-SOCS1/WT-IRES-GFPまたはpMX-SOCS1/F59D-IRES-GFP  1μg、PLUS Reagent（GibcoBRL社） 6μl、無血清のOPTI-MEM培地（GibcoBRL社）100μlを1ウェル分の分量とし、必要量を混合して1.5ml微量遠心チューブに移し室温で15分間静置した。Lipofect AMINE（GibcoBRL社）4μl、OPTI-MEM 100μlを1 ウェル分の分量とし、必要量を上記微量遠心チューブに添加し、室温で15分間静置した。PlatEをウェルに播いてから24時間後、培養液を除去した。OPTI-MEMでウェルを洗浄後、再びOPTI-MEMを各ウェル 800μlずつ加え、調整したプラスミドベクター、PLUS Reagent、Lipofect AMINEの混合溶液を各ウェルに添加し、37℃ 5%CO2条件下で3時間培養した。P/S含まない20%FBS含有RPMI-1640培養液を各ウェル 1mlずつ添加し、37℃ 5% CO2条件下で21時間培養した。プラスミドベクター、PLUS Reagent、Lipofect AMINEを含む上清を除去後、P/Sを含まない10%FBS含有RPMI-1640培養液で各ウェルを洗浄した。P/Sを含まない10%FBS含有RPMI-1640培養液を各ウェル 2ml添加し、37℃ 5%CO2条件下で24時間培養後、ウイルスを含む上清を回収した。
【００６１】
BKO84、BKO408及び300-19を12ウェル連結プレート中の8ウェルに5×105 /500μl/ウェルの濃度で播種し、DOTAP Liposomal Transfection Reagent(Roche社)を各ウェル 15μlずつ添加した後、ウイルスを含む上清を各ウェル 1mlずつ加えた。ウイルスに感染し、SOCS1を発現している細胞はGFP陽性細胞として標識されるので、24時間ごとに4日間FACSsort （Becton Dickenson Immunocytometry Systems社）を用いてGFP陽性細胞の割合を測定し、SOCS1による細胞増殖抑制効果を調べた。図６に結果を示す。結果はCELLQuest（Becton Dickenson Immunocytometry Systems）ソフトウェアーを用いて解析した。Forward Scatter 及びSide Scatter を指標として生細胞にゲートをかけて、その中の細胞についてFL1（横軸：GFPの蛍光）及びFL2（縦軸：細胞死による自家蛍光）の蛍光強度をドットで表示し、生細胞中のGFP陽性の細胞の割合(%)を求めた（図中に数字で示した）。
【００６２】
BKO84に対して野生型SOCS1を感染させた後、24、48、72、96時間後のGFP陽性細胞の割合は、14.3%、13.4%、4.5%、1.2%と減少していった。BKO408についてはBKO84と同様の現象がみられた。一方で、変異型SOCS1を感染させたGFP陽性細胞の割合は、約23%と、時間が経過してもほぼ一定であった。A-MLVでトランスフォームしたプレＢ細胞株である300-19は野生型及び変異型のいずれのSOCS1によってもGFP陽性細胞の割合の減少はみられなかった。
【００６３】
この結果は、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞の自律的増殖はSTAT5シグナル伝達系の恒常的活性化によること、及びこのシグナル伝達系の活性化はSTAT5自身の異常によるのではなく、STAT5より上流の、JAKあるいはさらに上流の異常によるということを示す。さらに、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞に対し、STAT5シグナル伝達系を阻害することにより、細胞を死滅させることができることも明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明にかかる一実施例において、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株BKO84及びBKO408におけるSTAT5の恒常的活性化を示す図である。
【図２】本発明にかかる一実施例において、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株BKO84及びBKO408におけるIL-7の異所的発現を示した図である。
【図３】本発明にかかる一実施例において、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株BKO84及びBKO408に対する抗-IL-7受容体抗体による細胞増殖の阻害効果を示した図である。
【図４】本発明にかかる一実施例において、白血病を発症した変異マウス（B/+;STAT5B-CA/+）及びSTAT5B-CAマウス（STAT5B-CA/+）について、腫大したリンパ節の抽出物を用いたWestern blottingの結果を示した写真（上段）である。なお、Ｂ細胞由来の蛋白量のコントロールとして、同じフィルターに対しBtkの発現を調べた結果を示した（下段写真）。
【図５】本発明にかかる一実施例において、ヒト・プレＢ細胞白血病細胞株におけるBASHの発現(a)及びSTAT5の活性化(b)をWestern blottingを用いて調べた結果を示した図である。
【図６】本発明にかかる一実施例において、BASHノックアウトマウス(B/B)から樹立したプレＢ白血病細胞株BKO84及びBKO408に対するSOCS-1の強制発現による細胞増殖の阻害効果を示した図である。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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