(57)【要約】【課題】  植物体のクロロフィル分解（黄化）を抑制し、緑色を維持する能力を高めることを課題とする。【解決手段】  老化時にも葉が黄化しない突然変異体nyc1-1から、ポジショナルクローニングにより、その原因遺伝子の単離を試みた結果、黄化関連遺伝子NYC1がP0452F10.5遺伝子とP0443E07.24遺伝子との間に存在することが明らかとなった。突然変異体nyc1-1についてこれら２つの遺伝子間の領域の塩基配列を解析したところ、両遺伝子間に存在するP0452F10.4遺伝子の1塩基置換の存在が確認され、突然変異体nyc1-1ではこの遺伝子のスプライシングの異常が起きていることが推定された。さらに、緑色維持の表現型を示す培養変異体nyc1-2について上記領域を解析したところ、P0452F10.4遺伝子がトランスポゾンによって破壊されていることが判明した。野生型のNYC1を含むゲノム断片を緑色維持変異体nyc1-2に導入したところ、野生型のように黄化を示すことが確認された。黄化関連遺伝子NYC1の機能を抑制することにより、緑色を維持する能力を高めることが可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載された、植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載された、単離されたＤＮＡ。
（ａ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｄ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のＤＮＡまたは請求項３に記載のベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項５】
請求項４の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
【請求項６】
請求項５の形質転換植物体のクローンまたは子孫である形質転換植物体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項８】
下記の工程を含む、請求項５に記載の形質転換植物体の製造方法。
（ａ）請求項１もしくは２に記載のＤＮＡまたは請求項３に記載のベクターを細胞に導入する工程
（ｂ）工程（ａ）においてＤＮＡまたはベクターが導入された細胞から植物体を再生する工程
【請求項９】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の内因性DNAが変異することにより黄化しない形質を有する植物体。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項１０】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の内因性DNAに変異を導入することを特徴とする、黄化しない形質を有する植物体の製造方法。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項１１】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の内因性DNAが変異することにより黄化しない形質を有する植物を、該形質を有しない植物と交配させることにより、植物に黄化しない形質を導入することを特徴とする、植物の育種方法。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロロフィル分解に関与する遺伝子および該遺伝子を利用した植物の緑色維持に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロロフィルは緑色植物の光合成において光エネルギーを補足するのに必須の緑色物質であり、高等植物ではクロロフィルａとクロロフィルｂが存在することが知られている。遺伝子工学的に植物に緑色を保持させる方法には、葉の老化を抑制する方法と、クロロフィル分解を抑制する方法が考えられる。前者に関しては、シロイヌナズナにおいて老化を遅延させる突然変異体の遺伝子の報告があるが、クロロフィル分解に直接関わるものではない（非特許文献１および２）。また植物ホルモン制御による老化の遅延の試みもある（非特許文献３および４）。後者は葉の老化過程の全てを抑制するものではない。クロロフィルの分解経路はまだ完全には理解されていないが、いくつかのクロロフィル代謝に関わる酵素の遺伝子は単離されている（非特許文献５-８）。しかし、その遺伝子機能を欠損させることにより通常の光条件下で緑色を保たせることができることが示されている遺伝子は知られていない。
【非特許文献１】Woo et al., 2001 Plant Cell 13:1779-1790
【非特許文献２】Yoshida et al., 2002 Plant J 32:129-137
【非特許文献３】Gan & Amasino, 1995 Science 270:1986-1988
【非特許文献４】Woo et al., 1997 Plant J 12:527-535
【非特許文献５】Tsuchiya et al., 1999 Proc. Natl. Acad.Sci.USA 96:15362-15367
【非特許文献６】Wuthrich et al. 2000 Plant J 21: 189-198
【非特許文献７】Tanaka et al., 2003 Plant Cell Physiol. 44:1266-1274
【非特許文献８】Pruzinska et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:15259-15264
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は植物体のクロロフィル分解（黄化）を抑制し、緑色を維持する能力を高めることにある。
より詳しくは、本発明は、クロロフィル分解に関連する遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該遺伝子を発現する形質転換細胞および形質転換植物体、該形質転換植物体の繁殖材料、並びにそれらの製造方法及び用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決すべく、本発明者らは、クロロフィル分解（黄化）に関連する遺伝子の取得を試みた。
まず、イネをEMS処理することにより、老化時にも葉が黄化しない突然変異体nyc1-1を単離した。この突然変異体の葉を暗黒処理により老化促進し、クロロフィル含量の経時的変化を測定したところ、クロロフィル含量低下が抑制されていることが確認された。
【０００５】
次いで、nyc1-1の原因遺伝子を単離すべく、nyc1-1とインディカ品種カサラスとの交配後代を用い、暗黒下の緑色維持を指標としてポジショナルクローニングを実施した。すると、黄化関連遺伝子NYC1がP0452F10.5遺伝子とP0443E07.24遺伝子との間に存在することがあきらかになった。上記変異体nyc1-1についてこれら２つの遺伝子間の領域の塩基配列を解析したところ、両遺伝子間に存在するP0452F10.4遺伝子に1塩基置換の存在が確認され、突然変異体nyc1-1ではこの遺伝子のスプライシングの異常が起きていることが推定された。さらに、緑色維持の表現型を示す培養変異体nyc1-2について上記領域を解析したところ、P0452F10.4遺伝子がトランスポゾンによって破壊されていることが判明した。逆に、野生型のNYC1を含むゲノム断片を上記の緑色維持変異体nyc1-2に導入したところ、野生型のように黄化を示すことが確認された。すなわち本発明者らは、クロロフィル分解に関与する遺伝子を同定することに成功すると供に、その機能を抑制することにより植物の緑色を維持することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
したがって本発明は、植物のクロロフィル分解（黄化）に関与する遺伝子およびその利用に関するものであり、より具体的には、以下の発明を提供するものである。
[１]  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載された、植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
[２]  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載された、単離されたＤＮＡ。
（ａ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｂ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｃ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（ｄ）植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
[３]  [１]または[２]に記載のＤＮＡを含むベクター。
[４]  [１]もしくは[２]に記載のＤＮＡまたは[３]に記載のベクターが導入された形質転換細胞。
[５]  [４]の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
[６]  [５]の形質転換植物体のクローンまたは子孫である形質転換植物体。
[７]  [５]または[６]に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
[８]  下記の工程を含む、[５]に記載の形質転換植物体の製造方法。
（ａ）[１]もしくは[２]に記載のＤＮＡまたは[３]に記載のベクターを細胞に導入する工程
（ｂ）工程（ａ）においてＤＮＡまたはベクターが導入された細胞から植物体を再生する工程
[９]  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の内因性DNAが変異することにより黄化しない形質を有する植物体。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
[１０]  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の内因性DNAに変異を導入することを特徴とする、黄化しない形質を有する植物体の製造方法。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
[１１]  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の内因性DNAが変異することにより黄化しない形質を有する植物を、該形質を有しない植物と交配させることにより、植物に黄化しない形質を導入することを特徴とする、植物の育種方法。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【発明の効果】
【０００７】
NYC1あるいはそのオーソログをアンチセンス法、RNAi法あるいはリボザイム法等により機能を欠損させることにより、植物の葉を老化時も緑色に保たせることが出来ると考えられる。この方法は、芝、観葉植物や葉菜類、あるいは花を楽しむのもであっても葉の黄化によって市場価値が下がる植物等に利用価値があるものと考えられる。さらに、茶、しめ縄、い草などの緑色であることが重要な加工品の原料植物にも応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、植物のクロロフィル分解（黄化）を促進する活性を有するタンパク質をコードする単離されたDNAを提供する。本発明者らは、黄化しないイネ突然変異体においてNYC1が変異していることを初めて見出し、さらに、NYC１の導入により該変異体が野生型と同様に黄化することを確認した。したがって、NYC1は植物の黄化を促進する活性を有する。また本発明者らは、NYC1変異株ではクロロフィル分解が抑制されていることを確認した。したがってNYC１は、クロロフィル分解に関与していると考えられる。クロロフィル代謝関連酵素はいくつか知られているが、その遺伝子機能を欠損させることによりクロロフィル分解を抑制し緑色を保たせることができることが確認されたのは、NYC1が最初である。イネNYC1のゲノムDNAを配列番号：１に、推定アミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【０００９】
本発明における植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするDNAの形態に特に制限はなく、ゲノムDNAであってもcDNAであってもよい。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。例えば、ゲノムDNAは植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするDNAの塩基配列情報（例えば、配列番号：１）から適当なプライマー対を設計して、目的の植物から調製したゲノムDNAを鋳型にPCRを行い、得られる増幅DNA断片をプローブとしてゲノミックライブラリーをスクリーニングすることによって調製することができる。また、同様にプライマー対を設計して、目的の植物から調製したcDNAまたはmRNAを鋳型にPCRを行い、得られる増幅DNA断片をプローブとして用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするcDNAを調製することができる。さらに市販のDNA合成機を用いれば、目的のDNAを合成により調製することも可能である。
【００１０】
本発明には、配列番号：２に記載のNYC1タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAも含まれる。本発明のDNAの由来する植物種および本発明のDNAを導入する植物種には特に制限は無く、単子葉植物であっても双子葉植物であってもよいが、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはイネ科植物であり、最も好ましくはイネである。ここで「NYC1タンパク質と機能的に同等な機能を有する」とは、植物のクロロフィル分解（黄化）を促進する活性を有することをいう。
【００１１】
このようなDNAには、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１２】
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154: 350-367）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のNYC1タンパク質をコードするアミノ酸配列（配列番号：２）において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。改変されるアミノ酸の数は、改変後のタンパク質が、植物の黄化を促進する機能を有している限り、特に制限はないが、一般的には、50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、より好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。アミノ酸の改変は、好ましくは保存的置換である。改変前と改変後の各アミノ酸についてのhydropathic index（Kyte and Doolitte,1982）やHydrophilicity value（米国特許第4,554,101号）の数値は、±2以内が好ましく、さらに好ましくは±１以内であり、最も好ましくは±0.5以内である。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００１３】
あるDNAが「NYC1タンパク質と機能的に同等な機能」を有するか否かは、実施例に記載のように、被験DNAを適当なベクターに組み込んで、NYC1突然変異系統に導入し、この突然変異系統における黄化が復元されるか否か、あるいはその発現抑制時にクロロフィル含量の低下が抑制されるか否かを観察することにより評価できる。
【００１４】
イネ由来のNYC1タンパク質（配列番号：２）に構造的に類似したタンパク質をコードするDNAとしては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E.M. (1975) Journal of Molecular Biology, 98, 503）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. (1985) Science, 230, 1350-1354、Saiki, R. K. et al. (1988) Science, 239, 487-491）を利用して調製したものを用いることも可能である。即ち、本発明のDNAには、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAが含まれる。このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指すが、特にこれらの条件に限定されるものではない。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられるが、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、イネ由来のNYC1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％,96％,97％,98％,99％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００１５】
本発明のDNAは、例えば、黄化しやすい植物体の作製に利用することが可能である。
一方、植物の黄化が抑制された植物体を作製する場合には、植物の黄化を促進する活性を有するタンパク質をコードするDNAの発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のタンパク質をコードするDNAの発現の抑制」には、遺伝子の転写・転写後の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として、アンチセンス技術を利用する方法を挙げることができる。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した（J.R.EckerおよびR.W.Davis,(1986)Proc.Narl.Acad.USA.83:5372）。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（A.R.van der Krolら（1988）Nature 333:866）、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００１６】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（A）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制、RNA silencingを介したmRNAの分解などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害あるいはmRNAの分解して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座2  核酸IV  遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人，p.319-347，1993, Serio ら (2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6506-6510）。
【００１７】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用しうる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば、96％,97％,98％,99％以上）の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００１８】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, (1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191)。
【００１９】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett.228:225)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら,(1988) FEBS Lett. 239:285、小泉誠および大塚栄子,(1990) 蛋白質核酸酵素,35:2191、M.Koizumiら, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7059)。例えば、NYC1遺伝子のコード領域（配列番号：１）中には標的となりうる部位が複数存在する。
【００２０】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.Kikuchi およびN.Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751、菊池洋, (1992) 化学と生物 30:112)。
【００２１】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Tairaら, (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.GrosshansおよびR.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Tairaら (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyamaら Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２２】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」には転写抑制型と転写後抑制型の2種類が知られているが、いずれも植物に標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことを指し、植物においてはしばしば観察される(Curr.Biol.7:R793,1997, Curr.Biol.6:810,1996)。例えば、NYC1遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、NYC1遺伝子もしくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％,96％,97％,98％,99％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した手法により決定できる。
【００２３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、RNAiをコードするDNAを利用して行うことができる。RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA（以下dsRNA）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００２４】
上記RNAiは、当初、線虫において発見されたが（Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)、Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)、Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)）。これら生物では、実際に外来よりdsRNAを導入することにより標的遺伝子の発現が抑制されることが確認され、さらにはノックダウン個体を創生する方法としも利用されつつある。
【００２５】
RNAiの登場当初、dsRNAはある程度の長さ(40塩基)以上でなければ効果がないと考えられていたが、米ロックフェラー大のTuschlらは21塩基対前後の単鎖dsRNA(siRNA)を細胞に導入すれば、哺乳動物細胞においてもPKRによる抗ウイルス反応を起こさず、RNAiの効果があることを報告し（Tuschl, Nature, 411, 494-498(2001)）、RNAiは分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術として俄然注目を集めることになった。
【００２６】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００２７】
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【００２８】
例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびカルスにアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）ならびに種子にアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、形質転換体を得る方法（特許第3141084号)など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００２９】
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３０】
このようにして作出された植物体は、野生型植物体と比較して、黄化が促進または抑制されうる。例えば、NYC1タンパク質をコードするDNAが導入された植物体は、暗黒条件下において黄化が促進され、一方、アンチセンスDNAなどの導入によりNYC1タンパク質をコードするDNAの発現が抑制された植物体は、黄化が抑制され緑色が保持される。このようにNYC1遺伝子の発現を制御することにより、植物の黄化を調節することができる。本発明の手法を用いれば、緑色であることが求められる植物、例えば、芝、観葉植物、葉菜類、茶、い草といった植物の緑色を保持し、市場価値を高めることができると考えられる。また一方、老化中に蓄積する物質を利用する植物の場合は、黄化促進による高い利用価値が期待できる。例えば、タバコは老化過程（成熟過程）において様々な香味成分が合成されるため、黄化の促進は、このような物質生産において有利であると考えられる。  
【００３１】
本発明はまた、内因性DNAが変異することにより黄化しない形質を有する植物体を提供する。「内因性DNAが変異することにより黄化しない形質を有する植物」としては、配列番号1記載の配列またはオーソログ配列に変異が生じた突然変異体や自然突然変異体を用いることができる。植物の突然変異処理は、当業者に公知の様々な手段により行うことができる。公知突然変異処理として、各種突然変異誘発剤への曝露や、X線、ガンマ線、紫外線、中性子線、重粒子線、イオンビーム等の照射を例示することができる。突然変異誘発剤の例としては、塩基類似物質、アルキル化剤、アジ化物等の各種化学物質を挙げることができ、より具体的にはEMS（エチルメタンスルホン酸）、DES（ジエチル硫酸）、アジ化ナトリウム等を例示することができる。突然変異処理を行った結果得られた個体の中から、黄化しない表現型を有し、かつ配列番号1記載の配列またはオーソログ配列に変異がある個体を選抜し、黄化しない形質を有する植物体を作出することができる。変異を生じさせる植物については特に制限はなく、単子葉植物であっても双子葉植物であってもよいが、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくはイネ科植物であり、最も好ましくはイネである。これにより作出された植物を、黄化しない形質を有しない植物と交配させることにより、植物に黄化しない形質を導入することが可能であり、これにより黄化が抑制された植物体を育種することが可能となる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。
【００３３】
〔実施例１〕コシヒカリ突然変異体nyc1-1の単離
イネ（コシヒカリ）のEMS処理により誘発した突然変異体の中から、圃場において黄化しない突然変異体nyc1-1を単離した（図１）。この突然変異体を暗黒処理して老化を誘導し、暗黒処理７日までのクロロフィル含量を測定した。結果を図２に示す。nyc1-1では特にクロロフィルb含量の低下が抑制され、最終的に黄化は起きないことが分かった。
【００３４】
〔実施例２〕緑色維持に関連する遺伝子の検索
nyc1-1とインディカ品種（カサラース）との交配後代(F2)集団を用いて、暗黒下における緑色維持を指標にポジショナルクローニングを試みた。遺伝的組換え点の解析により、第１染色体のPACクローンP0443E07上のP0443E07.24遺伝子とPACクローンP0452F10上のP0452F10.5遺伝子の間に、緑色維持に関連する遺伝子：NYC1が存在することが分かった。P0443E07.24遺伝子とP0452F10.5遺伝子に挟まれる約38kbの領域に予測された遺伝子のうち、P0452F10.4の塩基配列を検討したところ、nyc1-1では第１イントロンと第１エクソンの境界領域に１塩基の塩基置換が確認され（図3）、この結果スプライシングに異常が起きていることが考えられた。
【００３５】
培養変異体から得られたこの遺伝子の破壊株(nyc1-2)も同様の表現型を示すことが確認され、P0452F10.4がNYC1であると推定された（図3, 4）。実際、nyc1-2にこの遺伝子を含むゲノム断片をアグロバクテリウムを用いた形質転換法により導入したところ、野生型と同様に暗黒下で葉が黄化を示すことが確認された（図4）。導入DNA断片の塩基配列を配列番号：１に、NYC1蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。以上のことからこの遺伝子の機能欠損によりこれらの突然変異体は緑色を保つようになることが示された。この遺伝子は酸化還元酵素に相同性を示す蛋白質をコードしていることから、クロロフィル分解に関与する酵素であることが推察される。また、データベースの検索によりこの遺伝子に対するオーソログが少なくともトウモロコシ、シロイヌナズナに存在することが判明した。このことはこの遺伝子が少なくとも単子葉植物・双子葉植物で機能していることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】野生型コシヒカリおよびnyc1-1の登熟期の葉を示す写真である。
【図２】野生型コシヒカリおよびnyc1-1を暗黒下で栽培したときのクロロフィル含量の減少を示す図である。
【図３】nyc1突然変異体におけるNYC1の変異箇所を示す図である。
【図４】形質転換法による相補性検定の結果を示す写真である。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【配列表】
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