(57)【要約】【課題】  降圧薬であるｄＣＣＢへの感受性の遺伝子診断に用いることができる核酸分子の提供。【解決手段】  本発明によれば、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子における、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる核酸分子が提供される。さらに、本発明によれば、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定しうる核酸分子が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子における、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号１中の第２０３番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドの、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子における、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドの、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項６に記載のプライマーペア。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号１中の第２０３番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものである、請求項６に記載のプライマーペア。
【請求項９】
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の変異を検出することにより、ｄＣＣＢへの感受性を判定する方法であって、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子における、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、ｄＣＣＢへの感受性を判定するためのキット。
【請求項１１】
ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、
ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号４中の第２２８２７番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されたものである、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドの、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドの、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１６に記載のプライマーペア。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号４中の第２２８２７番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されたものである、請求項１６に記載のプライマーペア。
【請求項１９】
ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の変異を検出することにより、ｄＣＣＢへの感受性を判定する方法であって、
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定する工程を含んでなる、方法。
【請求項２０】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、ｄＣＣＢへの感受性を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、降圧薬であるｄＣＣＢへの感受性の遺伝子診断に用いることができる核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
高血圧症患者の９０％以上は、遺伝素因や環境因子がその原因として複雑に関与している本態性高血圧症の患者である。本態性高血圧症は我が国において３０００万人以上が罹患している最も多い疾患と考えられている。本態性高血圧症はそれ自体無症候であることが多いが、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症に強く関与する。従って、本態性高血圧症の制圧により、これらの重篤な疾患の発症を抑制できると考えられる。
【０００３】
本態性高血圧症の治療には塩分制限や減量などの生活習慣の改善が有効であるが、降圧が不十分な場合には種々の降圧薬による薬物療法が施行される。薬物療法を行う際の薬剤の選択については、ガイドラインなどの大まかな目安はあるものの、ほとんど医師の判断に委ねられるのが現状である。主に使用される降圧薬としては、サイアザイド系利尿薬（以下「ＴＺＤ」という）、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（以下「ＡＣＥＩ」という）、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（以下「ＡＲＢ」という）、カルシウム拮抗薬（以下「ＣＣＢ」という）、β受容体遮断薬、およびα１受容体遮断薬が挙げられる。特に、ＣＣＢの一種であるジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬（以下「ｄＣＣＢ」という）は、日本国では最も使用頻度の高い降圧薬であり、日本国の高血圧治療ガイドラインにおいても第１選択薬の一つとされている。
【０００４】
近年、患者によって個々に異なる遺伝的素因が薬剤の効果にも関連することが知られている。これまでに、ＣＣＢの降圧効果に関与すると考えられる遺伝子多型の報告は一つだけ存在する（非特許文献１：Liu Q., Lei H., Wang X. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 17: 340-342, 2000）。この報告には、アンジオテンシン変換酵素遺伝子（ＡＣＥ）のＩＩ型を示す本態性高血圧患者において、ＣＣＢによる15.91mmHgの降圧が認められたのに対し、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥＩ）では9.6mmHgしか降圧しなかった(p<0.05)ことが示されている。さらに、同報告には、同遺伝子のＤＤ型の患者において、ＩＩ型の患者とは逆の傾向が見られたことが開示されている。同様に、レニン・アンジオテンシン系の遺伝子多型のｄＣＣＢによる降圧効果への関与を検討したDudleyらの報告では、ＡＣＥ遺伝子Ｉ／Ｄ多型およびアンジオテンシノーゲンＭ２３５Ｔ多型はともに、ｄＣＣＢの一種であるニフェジピンＳＲによる降圧効果に有意な関係を示さなかったとされている（非特許文献２：Dudley C., Keavney B., Casadei B., Conway J., Bird R., Ratcliffe P.: Prediction of patient responses to antihypertensive drugs using genetic polymorphisms: investigation of renin-angiotensin system genes, J. Hypertens. 14: 259-262, 1996）。
【０００５】
しかし、ｄＣＣＢの薬理作用部位であるＬ型カルシウムチャンネル遺伝子の多型とｄＣＣＢによる降圧効果との関連については、報告されていない。
【０００６】
【非特許文献１】Liu Q., Lei H., Wang X. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 17: 340-342, 2000.
【非特許文献２】Dudley C., Keavney B., Casadei B., Conway J., Bird R., Ratcliffe P., J. Hypertens. 14: 259-262, 1996.
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、日本人の本態性高血圧患者において、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドにおけるＣ／Ｔ多型が、ｄＣＣＢへの感受性の判定に利用可能であるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドにおけるＧ／Ａ多型が、ｄＣＣＢへの感受性の判定に利用可能であるとの知見を得た。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、降圧薬であるｄＣＣＢへの感受性の判定に用いることができる核酸分子およびプライマーペアの提供を目的とする。
【０００９】
そして、本発明の第一の態様による核酸分子は、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子における、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１０】
さらに、本発明の第一の態様によるプライマーペアは、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子における、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドの、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
【００１１】
さらに、本発明の第二の態様による核酸分子は、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１２】
さらに、本発明の第二の態様によるプライマーペアは、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドの、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
【００１３】
本発明によれば、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における上記多型位置のヌクレオチド残基を同定することにより、ｄＣＣＢによる降圧効果を予測することが可能となる。これにより、特定の患者について効果的な降圧薬を選択することが可能となり、ひいてはテーラーメード医療の実現に繋がる。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本明細書において「ｄＣＣＢ」とは、ジヒドロピリジン系カルシウムチャンネル拮抗薬を意味する。このような薬剤としては、例えば、アラニジピン、シルニジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、フェロジピン、ベシル酸アムロジピン、塩酸エホニジピン、塩酸ニカルジピン、塩酸バルニジピン、塩酸ベニジピン、塩酸マニジピン等が挙げられる。
【００１５】
本明細書において「ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子」とは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＬ型カルシウムチャンネル１Ｓサブユニットを発現する遺伝子であり、そのｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ配列としては、例えば配列番号２で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列としては、例えばＮＣＢＩデータベースにアクセス番号：ＮＴ＿００４６７１．１５として登録されているものが挙げられ、その一部の配列を配列番号１に示している。配列番号１において、第２０７９〜２０８１残基は翻訳開始コドンである。
【００１６】
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子は、翻訳開始点（翻訳開始コドンのＡ残基）に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドにおいて、シトシン残基（Ｃ）とチミン残基（Ｔ）との一塩基多型（ＪＳＴ０８３９８９：以下「−１８７６Ｃ／Ｔ多型」という。）を有している。この一塩基多型の位置は、配列番号１では第２０３残基に相当する。
【００１７】
本明細書において「ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子」とは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＬ型カルシウムチャンネル１Ｄサブユニットを発現する遺伝子であり、そのｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ配列としては、例えば配列番号５で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子のゲノム配列としては、例えばＮＣＢＩデータベースにアクセス番号：ＮＴ＿０２２５１７．１６として登録されているものが挙げられ、その一部の配列を配列番号４に示している。配列番号４において、第１１９〜１２１残基は翻訳開始コドンであり、第６６７３残基以降は第３イントロンである。
【００１８】
ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子は、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドにおいて、グアニン残基（Ｇ）とアデニン残基（Ａ）との一塩基多型（ＪＳＴ１２９８５９：以下「２２７０９Ｇ／Ａ多型」という。）を有している。この一塩基多型の位置は、配列番号４では第２２８２７残基に相当する。
【００１９】
ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子における−１８７６Ｃ／Ｔ多型は、ｄＣＣＢによる降圧効果を予測するためのファクターとして使用できる。すなわち、この多型部位におけるヌクレオチドを同定することにより、被験者のｄＣＣＢへの感受性の判定が可能となる。この多型部位において、Ｃアレル、特にＣＣ遺伝子型が検出された場合には、その被験者におけるｄＣＣＢによる降圧効果が高いものと判定することができる。
【００２０】
また、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子における２２７０９Ｇ／Ａ多型も、ｄＣＣＢによる降圧効果を予測するためのファクターとして使用できる。すなわち、この多型部位におけるヌクレオチドを同定することにより、被験者のｄＣＣＢへの感受性の判定が可能となる。この多型部位において、Ｇアレル、特にＧＧ遺伝子型が検出された場合には、その被験者におけるｄＣＣＢによる降圧効果が高いものと判定することができる。
【００２１】
本発明によれば、上述の多型部位におけるヌクレオチドを同定することのできる核酸分子が提供される。
【００２２】
そして、本発明の第一の態様による核酸分子は、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の−１８７６Ｃ／Ｔ多型にかかるヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。一つの実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。他の実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号１中の第２０３番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものとされる。
【００２３】
本発明の第二の態様による核酸分子は、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の２２７０９Ｇ／Ａ多型にかかるヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。一つの実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。他の実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号４中の第２２８２７番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されたものとされる。
【００２４】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。
【００２５】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２６】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、プロモーター領域、ターミネーター領域、エクソン、およびイントロンのいずれにハイブリダイズする部分をも含むことができる。
【００２７】
本発明による核酸分子は、各標的遺伝子における多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、それぞれの多型部位を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２８】
従って、本発明の第一の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の−１８７６Ｃ／Ｔ多型にかかるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。本発明の第二の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の２２７０９Ｇ／Ａ多型にかかるヌクレオチドを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２９】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１３ヌクレオチド、さらに好ましくは１３〜５０ヌクレオチドとする。
【００３０】
また、本発明による核酸分子は、各標的遺伝子における多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、多型部位を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００３１】
従って、本発明の第一の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の−１８７６Ｃ／Ｔ多型にかかるヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。本発明の第二の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の２２７０９Ｇ／Ａ多型にかかるヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００３２】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、各標的遺伝子上の多型部位のヌクレオチドを同定する上で好ましいものである。
【００３４】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。よって、本発明によれば、各標的遺伝子上の上記多型部位におけるヌクレオチドの同定に用いることのできるプライマーペアが提供される。
【００３５】
本発明の第一の態様によるプライマーペアは、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の−１８７６Ｃ／Ｔ多型にかかるヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドの、翻訳開始点に対して１８７６ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。一つの実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。他の実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号１中の第２０３番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換されたものとされる。
【００３６】
本発明の第二の態様によるプライマーペアは、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の２２７０９Ｇ／Ａ多型にかかるヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定しうる、ｄＣＣＢへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子のゲノム配列を含むポリヌクレオチドの、第３イントロン中の第１６１５５番目のヌクレオチドを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。一つの実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。他の実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、配列番号４中の第２２８２７番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されたものとされる。
【００３７】
このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００３８】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、各標的遺伝子における上記多型部位のヌクレオチドを同定することができ、これにより、ｄＣＣＢへの感受性を判定することができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いる、ｄＣＣＢへの感受性を判定する方法が提供される。
【００３９】
そして、本発明の第一の態様による方法は、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の変異を検出することにより、ｄＣＣＢへの感受性を判定する方法であって、本発明の第一の態様による核酸分子、および／または本発明の第一の態様によるプライマーペアを用いて、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子の−１８７６Ｃ／Ｔ多型にかかるヌクレオチドがシトシン（Ｃ）であるかチミン（Ｔ）であるかを同定する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくは、−１８７６Ｃ／Ｔ多型部位におけるＣアレル、特にＣＣ遺伝子型が検出される。
【００４０】
本発明の第二の態様による方法は、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の変異を検出することにより、ｄＣＣＢへの感受性を判定する方法であって、本発明の第二の態様による核酸分子、および／または本発明の第二の態様によるプライマーペアを用いて、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子の２２７０９Ｇ／Ａ多型にかかるヌクレオチドがグアニン（Ｇ）であるかアデニン（Ａ）であるかを同定する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくは、２２７０９Ｇ／Ａ多型部位におけるＧアレル、特にＧＧ遺伝子型が検出される。
【００４１】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸増幅法において、プライマーとして用いることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被験者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中において上記各多型部位のヌクレオチドを同定する工程を含んでなる、ｄＣＣＢへの感受性を判定する方法が提供される。
【００４２】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸増幅法およびこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００４３】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００４４】
本発明による判定法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００４５】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドの同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子と被験者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、ｄＣＣＢへの感受性の判定方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、上記各多型にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００４６】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。
【００４７】
各標的遺伝子における上記各多型が一塩基多型である場合において、該一塩基多型部位のヌクレオチドを同定するためには、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００４８】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被験者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４９】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被験者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５０】
各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００５１】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法においては、上記各多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、両アレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被験者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭ、ＶＩＣ、およびＴＥＴのいずれかの組合せを用いる。
【００５２】
（１）−１８７６Ｃ／Ｔ多型用
プライマー：
フォワード：CGCCTCTGCTGAGTCTGTAGGT（配列番号７）、
リバース：CGAGAAAGGAACCCAGAGGAA（配列番号８）；
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用： FAM-TGCTGCTGGCGCT-MGB（配列番号９）、
Ｃアレル用： VIC-TTGCTGCCGGCGC-MGB（配列番号１０）。
【００５３】
（２）２２７０９Ｇ／Ａ多型用
プライマー：
フォワード：GTATTTACTGTGCTTGTGACATGCA（配列番号１１）、
リバース：GGGTTACAGGCCTATCCATTATGAG（配列番号１２）；
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ａアレル用： FAM-ACTGCAAATAATTCTT-MGB（配列番号１３）、
Ｇアレル用： VIC-TGCAAATGATTCTTG-MGB（配列番号１４）。
【００５４】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被験者の遺伝子型が容易に決定される。
【００５５】
本発明によるｄＣＣＢへの感受性の判定方法においては、ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子において、−１８７６Ｃ／Ｔ多型におけるＣアレル、特にＣＣ型が検出されたサンプルは、ｄＣＣＢを投与した場合の降圧効果が高いものと、あるいはその可能性があるものと判定することができる。また、ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子において、２２７０９Ｇ／Ａ多型におけるＧアレル、特にＧＧ型が検出されたサンプルは、ｄＣＣＢを投与した場合の降圧効果が高いものと、あるいはその可能性があるものと判定することができる。本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００５６】
以上のようなｄＣＣＢへの感受性を判定するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、上記各種標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるれものではない。
【００５８】
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター（National Cardiovascular Center of Japan）にて受診中の本態性高血圧患者であって、ｄＣＣＢを新たに処方された１７９人の患者を対象とした。遺伝子解析に先立ち、被験者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結可能匿名化した。ｄＣＣＢの投与により５ｍｍＨｇ以上の平均血圧の降圧が認められた患者を反応群（Ｒ）とし、５ｍｍＨｇ未満の平均血圧の降圧しか認められなかった患者および血圧上昇が認められた患者を未反応群（ＮＲ）とした。両群における患者の数、男女比、平均年齢、平均ＢＭＩ（体格指数：Body Mass Index）、平均収縮期血圧、および平均拡張期血圧を表１に示す。
【００５９】
【表１】
2006067886.tif 000002
【００６０】
例１：ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子中の多型とｄＣＣＢによる降圧効果との関連
Ｌ型カルシウムチャンネル・サブユニットα１Ｓ遺伝子（ＣＡＣＮＡ１Ｓ遺伝子）中の一塩基多型のうち、両アレルが５％以上の頻度を示す多型として、−１８７６Ｃ／Ｔ（配列番号１の第２０３番目のヌクレオチドにおけるＣ／Ｔ多型：ＪＳＴ０８３９８９）を選択した。この一塩基多型に関し、被験者全員についてＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。
【００６１】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎシステム（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ABI PRISM（登録商標）7900HT Sequence Detection System（ABI）を用いて測定した。使用したプライマー、ＴａｑＭａｎプローブ、アニーリング温度、およびサイクル数を以下に示す。
【００６２】
プライマー：
フォワード：CGCCTCTGCTGAGTCTGTAGGT（配列番号７）（４８０ｎＭ）、
リバース：CGAGAAAGGAACCCAGAGGAA（配列番号８）（４８０ｎＭ）；
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用： FAM-TGCTGCTGGCGCT-MGB（配列番号９）（１０７ｎＭ）、
Ｃアレル用： VIC-TTGCTGCCGGCGC-MGB（配列番号１０）（１０７ｎＭ）；
アニーリング温度：５８℃；
サイクル数：４０サイクル。
【００６３】
次いで、Ｒ群とＮＲ群との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。この検定では、ＣＣ型とＴアレル（ＣＴ型およびＴＴ型）とを比較した。その結果を下記の表２に示す。
【００６４】
【表２】
2006067886.tif 000003
【００６５】
表２から明らかなように、ＣＣ型の頻度は、ＮＲ群と比較して、Ｒ群において有意に高率であった（オッズ比：２．５、９５％ＣＩ：１．２８８〜４．８５８、ｐ＝０．００１）。
【００６６】
次いで、各遺伝子型間でｄＣＣＢ投与による降圧度を比較した。その結果を下記の表３に示す。
【００６７】
【表３】
2006067886.tif 000004
【００６８】
表３から明らかなように、両遺伝子型において、収縮期血圧（ＳＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）、および平均血圧（ＭＢＰ）のいずれもが有意に降圧されていたが、平均血圧（ＭＢＰ）の降圧度は、Ｔアレルに比較して、ＣＣ型の被験者において有意に大きかった（ＣＣ型：−１１．６±１０．３ｍｍＨｇ，Ｔアレル：−８．０±９．６ｍｍＨｇ，ｐ＝０．０２４）。
【００６９】
以上の解析結果から、ＣＡＣＮＡ１Ｓ−１８７６Ｃ／Ｔ多型におけるＣＣ遺伝子型を有する本態性高血圧患者では、ｄＣＣＢによる降圧効果が高いものと予測できることがわかる。
【００７０】
例２：ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子中の多型とｄＣＣＢによる降圧効果との関連
Ｌ型カルシウムチャンネル・サブユニットα１Ｄ遺伝子（ＣＡＣＮＡ１Ｄ遺伝子）中の一塩基多型のうち、両アレルが５％以上の頻度を示す多型として、２２７０９Ｇ／Ａ（配列番号４の第２２８２７番目のヌクレオチドにおけるＧ／Ａ多型：ＪＳＴ１２９８５９）を選択した。この一塩基多型に関し、被験者全員についてＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。
【００７１】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎシステム（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ABI PRISM（登録商標）7900HT Sequence Detection System（ABI）を用いて測定した。使用したプライマー、ＴａｑＭａｎプローブ、アニーリング温度、およびサイクル数を以下に示す。
【００７２】
プライマー：
フォワード：GTATTTACTGTGCTTGTGACATGCA（配列番号１１）（４８０ｎＭ）、
リバース：GGGTTACAGGCCTATCCATTATGAG（配列番号１２）（４８０ｎＭ）；
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ａアレル用： FAM-ACTGCAAATAATTCTT-MGB（配列番号１３）（１０７ｎＭ）、
Ｇアレル用： VIC-TGCAAATGATTCTTG-MGB（配列番号１４）（１０７ｎＭ）；
アニーリング温度：５８℃；
サイクル数：４０サイクル。
【００７３】
次いで、Ｒ群とＮＲ群との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。この検定では、ＧＧ型とＡアレル（ＧＡ型およびＡＡ型）とを比較した。その結果を下記の表４に示す。
【００７４】
【表４】
2006067886.tif 000005
【００７５】
表４から明らかなように、ＧＧ型の頻度は、ＮＲ群と比較して、Ｒ群において有意に高率であった（オッズ比：２．２、９５％ＣＩ：１．０１８〜４．７６５、ｐ＝０．０４）。
【００７６】
次いで、各遺伝子型間でｄＣＣＢ投与による降圧度を比較した。その結果を下記の表５に示す。
【００７７】
【表５】
2006067886.tif 000006
【００７８】
表５から明らかなように、両遺伝子型において、収縮期血圧（ＳＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）、および平均血圧（ＭＢＰ）のいずれもが有意に降圧されていたが、平均血圧（ＭＢＰ）の降圧度は、Ａアレルに比較して、ＧＧ型の被験者において有意に大きかった（ＧＧ型：−１１．２±１０．３ｍｍＨｇ，Ａアレル：−５．５±８．９ｍｍＨｇ，ｐ＝０．００３）。
【００７９】
以上の解析結果から、ＣＡＣＮＡ１Ｓ−１８７６Ｃ／Ｔ多型におけるＣＣ遺伝子型を有する本態性高血圧患者では、ｄＣＣＢによる降圧効果が高いものと予測できることがわかる。
【配列表】
2006067886000001.app