(57)【要約】  【課題】  正常時における概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング・発現順序を提供すること。前記発現タイミング・発現順序を用いて、概日リズムの変調を検出すること。前記発現タイミング・発現順序を用いたスクリーニング方法を提供すること。  【解決手段】  正常時において、所定の発現タイミング・発現順序を持つ概日リズム制御遺伝子群（Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｎｐａｓ２遺伝子、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子、Ｄｂｐ遺伝子、Ｐｅｒ３遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子）を提供する。また、概日リズム制御遺伝子群が少なくとも配列されたＤＮＡチップを提供する。さらに、前記ＤＮＡチップを用いた、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングの変調を予測する方法、概日リズムの変調を検出する方法、概日リズム調整剤の選択をする方法、概日リズム調整剤のスクリーニング方法、副作用として概日リズムの変調を伴う物質のスクリーニングを提供する。  【選択図】  図２
2006020524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
概日時間１６時を基準として、次の（１）又は／及び（２）の遺伝子が発現した後、（３）から（７）の遺伝子が順に発現する遺伝子群であって、（１）から（７）の全ての遺伝子を含む概日リズム制御遺伝子群、若しくは、次の（１）から（７）から選択される複数の遺伝子を含む概日リズム制御遺伝子群。
（１）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つＢｍａｌ１遺伝子。
（２）コード領域の上流配列中にＲＯＲＥを持つＮｐａｓ２遺伝子。
（３）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、及び、Ｅ−ＢＯＸを持つＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子。
（４）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥ及びＥ−ＢＯＸを持つＤｂｐ遺伝子。
（５）コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つＰｅｒ３遺伝子。
（６）コード領域の上流配列中にＤＢＰ結合領域及びＥ−ＢＯＸを持つＰｅｒ１遺伝子。
（７）コード領域の上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つＰｅｒ２遺伝子。
【請求項２】
前記概日リズム制御遺伝子群が、概日時間１６時を基準として、
（ａ）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つ遺伝子、
（ｂ）コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つ遺伝子、
（ｃ）コード領域中又はその上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つ遺伝子、
の順で発現することを特徴とする請求項１記載の概日リズム制御遺伝子群。
【請求項３】
概日リズム末梢組織に発現することを特徴とする請求項１記載の概日リズム制御遺伝子群。
【請求項４】
前記（１）又は／及び（２）の遺伝子の正常時の発現ピークが概日時間２０時から２４時、
前記（３）の遺伝子の正常時の発現ピークが概日時間４時から８時、
前記（４）の遺伝子の正常時の発現ピークが概日時間６時から１０時、
前記（５）の遺伝子の正常時の発現ピークが概日時間８時から１２時、
前記（６）の遺伝子の正常時の発現ピークが概日時間１０時から１４時、
前記（７）の遺伝子の正常時の発現ピークが概日時間１２時から１６時、
であることを特徴とする請求項１記載の概日リズム制御遺伝子群。
【請求項５】
請求項１記載の概日リズム制御遺伝子群が少なくとも配列されたことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡチップを用いた、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングの変調を予測する方法。
【請求項７】
コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つ遺伝子の発現タイミングの変調を検出することにより、コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つ他の遺伝子の発現タイミングの変調を予測することを特徴とする請求項６記載の予測方法。
【請求項８】
コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つ遺伝子の発現タイミングの変調を検出することにより、コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つ他の遺伝子の発現タイミングの変調を予測することを特徴とする請求項６記載の予測方法。
【請求項９】
コード領域中又はその上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つ遺伝子の発現タイミングの変調を検出することにより、コード領域中又はその上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つ他の遺伝子の発現タイミングの変調を予測することを特徴とする請求項６記載の予測方法。
【請求項１０】
請求項５記載のＤＮＡチップを用いた、概日リズムの変調を検出する方法。
【請求項１１】
睡眠障害を検出することを特徴とする、請求項１０に記載した概日リズムの変調を検出する方法。
【請求項１２】
不眠症を検出することを特徴とする、請求項１０に記載した概日リズムの変調を検出する方法。
【請求項１３】
時差ぼけを検出することを特徴とする、請求項１０に記載した概日リズムの変調を検出する方法。
【請求項１４】
請求項５記載のＤＮＡチップを用いて、概日リズム調整剤を選択する方法。
【請求項１５】
請求項５記載のＤＮＡチップを用いた、ＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、Ｅ−ＢＯＸのいずれか又は複数に作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記物質は、概日リズム調整剤である請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記物質は、概日リズムの変調を伴うものである請求項１５記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概日リズム制御遺伝子群、該概日リズム制御遺伝子群が少なくとも配列されたＤＮＡチップ、前記ＤＮＡチップを用いた概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングの変調を予測する方法、概日リズムの変調を検出する方法、概日リズム調整剤の選択方法、及び、スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
概日リズム（サーカディアンリズム）は、約２４時間を周期とする生物リズムであり、単細胞生物からヒトに至るまで、多くの生物に普遍的に見られる生体内現象である。各生物は、概日リズムの制御に関わる遺伝子（以下、「概日リズム制御遺伝子」とする。）を持ち、概日リズム制御遺伝子が、概日リズムの調整を行っている。
【０００３】
哺乳類では、概日リズム制御遺伝子の発現量が脳視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）で特に高く、個体レベルでの概日リズム調整の中枢を担っている。一方、生体内のその他の組織（概日リズム末梢組織）においても、概日リズム制御遺伝子は発現しており、概日リズム中枢と同様に、概日リズム制御遺伝子による細胞・組織ごとの概日リズム調整が行われている。その他、概日リズム中枢による個体レベルでの概日リズムが、概日リズム末梢組織の概日リズムを統合する機構が存在すると考えられている。
【０００４】
哺乳類における概日リズム制御遺伝子としては、Ｐｅｒ遺伝子（Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３）、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｂｍａｌ２、Ｂｍａｌ３）、Ｃｒｙ遺伝子、Ｎｐａｓ２遺伝子、Ｄｂｐ遺伝子、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ）などが知られている（以下、これらを総称して、「概日リズム制御遺伝子群」とする）。
【０００５】
概日リズム制御遺伝子のコード領域中又はその上流配列中には、概日リズム制御遺伝子の転写制御領域（特有の塩基配列）が存在する。転写制御領域としては、ＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、Ｅ−ＢＯＸなどが明らかにされている。転写制御領域は、転写因子の結合領域であり、転写因子は、転写制御領域に結合して、概日リズム制御遺伝子の転写・発現を調節する。
【０００６】
ＲＯＲＥは、Ｂｍａｌ１のコード領域中又はその上流配列中に存在する。転写因子であるＲｏｒ転写因子ファミリー（ＲＥＶ−ＥＲＢなど）は、ＲＯＲＥに結合し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を調節することが知られている。なお、ＲＥＶ−ＥＲＢは、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子の転写産物（タンパク質）である。
【０００７】
ＤＢＰ結合領域は、Ｐｅｒ１遺伝子などのコード領域中又はその上流配列中に存在する。転写因子であるＤＢＰ（Ｄｂｐ遺伝子の転写産物）などは、ＤＢＰ結合領域に結合し、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を促進する。
【０００８】
Ｅ−ＢＯＸは、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子などのコード領域中又はその上流配列中に存在する。転写因子であるＣＬＫ−ＢＭＡＬ複合体（Ｃｌｏｃｋ遺伝子の転写産物とＢｍａｌ遺伝子の転写産物の複合体）は、Ｅ−ＢＯＸに結合し、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子の発現を促進する。
【０００９】
以上のように、各概日リズム制御遺伝子の発現は、概日リズム制御遺伝子の転写産物（タンパク質）により、調節されている。なお、非特許文献１には、上記した、概日リズム制御遺伝子、及び、転写制御領域（Ｅ−ＢＯＸ、ＤＢＰ結合領域、ＲＯＲＥ）について、記載されている。
【非特許文献１】「時計遺伝子の分子生物学」、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社、岡村均・深田吉孝編、２００４年４月５日発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
細胞単位の概日リズム形成は、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングにより制御されていると考えられるため、各概日リズム制御遺伝子の発現タイミング・発現順序を明らかにすることが重要となる。即ち、各概日リズム制御遺伝子の発現タイミング・発現順序を明らかにすることは、概日リズム調整機構の解明の一助となる。
【００１１】
また、正常時における概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング・発現順序を明らかにすることにより、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング・発現順序のずれから、概日リズムの変調を容易に検出できる。
【００１２】
さらに、正常時における概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング・発現順序を明らかにすることにより、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング・発現順序を前後に移動させる物質の探索が可能になる。
【００１３】
そこで、本発明は、正常時における概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング・発現順序を提供すること、前記発現タイミング・発現順序を用いて、概日リズムの変調を検出すること、前記発現タイミング・発現順序を用いたスクリーニング方法を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ほぼ全ての概日リズム末梢組織において、下記（１）から（７）の概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングが、概日変化を表すことを新規に見出した。また、それらの概日リズム制御遺伝子群の正常時における発現順序に規則性があることを新規に見出した。さらに、下記（１）から（７）の概日リズム制御遺伝子に関わる転写制御領域（ＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、Ｅ−ＢＯＸ）の存在位置及び存在個数を新規に見出した。
【００１５】
そこで、本発明では、概日時間１６時（例えば、明条件開始時間を通常時間の８時にした場合、通常時間の午前０時）を基準として、下記（１）又は／及び（２）の遺伝子が発現した後、下記（３）から（７）の遺伝子が順に発現する遺伝子群であって、（１）から（７）の全ての遺伝子を含む概日リズム制御遺伝子群、若しくは、（１）から（７）から選択される複数の遺伝子を含む概日リズム制御遺伝子群を提供する。
（１）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つＢｍａｌ１遺伝子。
（２）コード領域の上流配列中にＲＯＲＥを持つＮｐａｓ２遺伝子。
（３）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、及び、Ｅ−ＢＯＸを持つＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子。
（４）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥ及びＥ−ＢＯＸを持つＤｂｐ遺伝子。
（５）コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つＰｅｒ３遺伝子。
（６）コード領域の上流配列中にＤＢＰ結合領域及びＥ−ＢＯＸを持つＰｅｒ１遺伝子。
（７）コード領域の上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つＰｅｒ２遺伝子。
【００１６】
上記の通り、概日リズム制御遺伝子群は、概日時間１６時を基準として、
（ａ）コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つ遺伝子、
（ｂ）コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つ遺伝子、
（ｃ）コード領域中又はその上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つ遺伝子、
の順で発現する。
【００１７】
即ち、３つの転写制御領域（ＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、Ｅ−ＢＯＸ）のうち、まず、ＲＯＲＥのみを持つＢｍａｌ１及びＮｐａｓ２が発現し、次に、ＲＯＲＥの他にＤＢＰ結合領域とＥ−ＢＯＸを持つＲｅｖ−ｅｒｂαが発現し、次に、ＲＯＲＥの他にＥ−ＢＯＸを持つＤｂｐが発現する（ａ）。次に、ＤＢＰ結合領域のみを持つＰｅｒ３が発現し、次に、ＤＢＰ結合領域の他にＥ−ＢＯＸも持つＰｅｒ１が発現する（ｂ）。次に、Ｅ−ＢＯＸのみを持つＰｅｒ２が発現する（ｃ）。
【００１８】
なお、（１）から（７）の各遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ（米国立バイオテクノロジー情報センター）の公共データベースで公開されている。ＮＣＢＩのデータベースにおける、各遺伝子の遺伝子番号は次の通りである。カッコ内は、遺伝子中のどの領域かを示す。（１）Ｂｍａｌ１：ヒトＮＴ＿００９２３７（１２０５４３１８〜１２０６９３１８）、マウスＮＴ＿０８１１２９．１（１０７７８１〜１２２７８１）、ラットＮＷ＿０４７５６２．１（１３７７４０７３〜１３７８９０７３）。（２）Ｎｐａｓ２：ヒトｈＣＧ２７６１４（９５６３２２２６〜６５６４６２２６）、マウスｍＣＧ８４３７（３５９８０１０２〜３５９９４１０２）、ラットｒＣＴ２２４３１（３９２０４４９９〜３９２１８４９９）。（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂα：ヒトｈＣＧ９３８６２（３４９２６０９４〜３４９１２０９４）、マウスｍＣＧ１５３６０（１０５４３８９２５〜１０５４２４９２５）、ラットｒＣＧ３３２９２（８２４９２７９６〜８２４７８７９６）。（４）Ｄｂｐ：ヒトＮＴ＿０１１１０９．１５（ｃ２１４１７７７８〜２１４０２７７８）、マウスＮＴ＿０７８４４２．１（５９７１１〜７４７１１）、ラットＮＷ＿０４７５５８．１（５１２０７３４〜５１３５７３４）。（５）Ｐｅｒ３：ヒトＮＴ＿０２１９３７．１６（１９６２８２２〜１９７７８２２）、マウスＮＴ＿０３９２６８．２（ｃ４３３１５２８〜４３１６５２８）、ラットＮＷ＿０４７７２７．１（ｃ８０１６５６〜８００１９５６）。（６）Ｐｅｒ１：ヒトＮＴ＿０１０７１８．１４（ｃ６９０５７０８〜６８９０７０８）、マウスＮＴ＿０３９５１５．２（６５６６１２１６〜６５６７６２１６）ラットｒＣＧ３４３９０（５２９６０４３０〜５２９７４４３０）。（７）Ｐｅｒ２：ヒトＮＴ＿００５１２０．１４（ｃ５１３６５６２〜５１２１５６２）、マウスＮＴ＿０３９１７３．２（ｃ５８３３７５７〜５８１８７５７）、ラットＮＷ＿０４７８１７．１（ｃ６８２７７０３〜６８１２７０３）。
【００１９】
また、概日リズム制御遺伝子の転写制御領域である、ＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、Ｅ−ＢＯＸの塩基配列を、配列表に示す（配列番号１から配列番号３）。
【００２０】
なお、上記（１）から（７）の概日リズム制御遺伝子群の正常時における発現ピークは、それぞれ、
（１）又は／及び（２）の遺伝子が概日時間２０時から２４時、
（３）の遺伝子が概日時間４時から８時、
（４）の遺伝子が概日時間６時から１０時、
（５）の遺伝子が概日時間８時から１２時、
（６）の遺伝子が概日時間１０時から１４時、
（７）の遺伝子が概日時間１２時から１６時、
である。
【００２１】
次に、本発明に係る概日リズム制御遺伝子群を少なくとも配列したＤＮＡチップを提供する。前記ＤＮＡチップは、例えば、（Ａ）概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングの変調を予測する方法、（Ｂ）概日リズムの変調を検出する方法、（Ｃ）概日リズム調整剤を選択する方法、（Ｄ）概日リズム調整剤のスクリーニング、（Ｅ）副作用として概日リズムの変調を伴う薬剤などのスクリーニング、などに用いることができる。以下、詳述する。
【００２２】
＜（Ａ）概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングの変調を予測する方法＞
上述の通り、本発明者らは、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングと転写因子の結合領域（ＲＯＲＥ、ＤＢＰ結合領域、Ｅ−ＢＯＸ）との相関を明らかにした。従って、この相関を用いることにより、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングの変調を予測することができる。即ち、コード領域中又はその上流配列中に特定の転写因子結合領域を持つ概日リズム制御遺伝子における発現タイミングの変調を検出することにより、上記転写因子結合領域を持つ他の概日リズム制御遺伝子における発現タイミングの変調を検出することができる。
【００２３】
例えば、コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つ遺伝子（例えばＢｍａｌ１）の発現タイミングの変調を検出することにより、コード領域中又はその上流配列中にＲＯＲＥを持つ他の遺伝子（例えば、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ）の発現タイミングの変調を予測することができる。同様に、コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つ遺伝子（例えば、Ｐｅｒ３）の発現タイミングの変調を検出することにより、コード領域中又はその上流配列中にＤＢＰ結合領域を持つ他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂαなど）の発現タイミングの変調を予測することができ、コード領域中又はその上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つ遺伝子（例えば、Ｐｅｒ２）の発現タイミングの変調を検出することにより、コード領域中又はその上流配列中にＥ−ＢＯＸを持つ他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ）の発現タイミングの変調を予測することができる。
【００２４】
＜（Ｂ）概日リズムの変調を検出する方法について＞
例えば、採取した細胞などにおいて、上記概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング（発現ピークの時刻）が移動していた場合、特定の概日リズム制御遺伝子の発現が見られなかった場合、または、上記概日リズム制御遺伝子群の発現順序が正常時と異なっていた場合、概日リズムが変調している。従って、例えば、時刻ごとに採取した細胞などから抽出したＤＮＡなどと、ＤＮＡチップ上のＤＮＡなどを相互作用（ハイブリダイゼーションなど）させることにより、概日リズムの変調を簡易に検出することができる。
【００２５】
なお、概日リズムの変調を伴う疾患としては、例えば、睡眠障害、覚醒障害、時差ぼけ、不眠症、自律神経失調症、うつ病、老人性痴呆、夜間勤務・交代勤務など生活リズムの不規則化による体調の悪化、自閉症などにおける生活リズムの不規則化による消耗、などがある。また、概日リズムの変調が誘因となる疾患として、例えば、夜間勤務による看護婦などの乳がん発生率上昇などがある。
【００２６】
＜（Ｃ）概日リズム調整剤を選択する方法＞
概日リズムが変調している場合、本発明に係るＤＮＡチップを用いることにより、概日リズムの変調が、概日リズム制御遺伝子群のうち、どの遺伝子の発現異常に基づくものであるかを、容易に検出できる。従って、例えば、Ｐｅｒ３（配列中にＤＢＰ結合領域を持つ）の発現が見られない場合やＰｅｒ３の発現タイミングの移動が検出された場合、Ｄｂｐ結合領域に作用する概日リズム調整剤を選択することにより、概日リズムの変調を改善できる。同様に、例えば、Ｂｍａｌ１（プロモーター領域にＲＯＲＥを持つ）の発現が見られない場合やＢｍａｌ１の発現タイミングの移動が検出された場合、ＲＯＲＥに作用する概日リズム調整剤を選択することにより、概日リズムの変調を改善できる。その他の概日リズム制御遺伝子の場合も同様である。
【００２７】
＜（Ｄ）概日リズム調整剤のスクリーニング＞
本発明に係るＤＮＡチップを用いることにより、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングを移動させる物質、即ち、概日リズム調整剤の候補物質を網羅的に探索できる。例えば、Ｐｅｒ３遺伝子の発現タイミングが前方に移動した場合（発現タイミングが早くなった場合）、その物質は、Ｐｅｒ３遺伝子の発現を促進する因子、又は、ＤＢＰ結合領域に直接的又は間接的に作用する物質として、概日リズム調整剤の有力な候補になりうる。その他の概日リズム制御遺伝子の場合も同様である。
【００２８】
＜（Ｅ）副作用として概日リズムの変調を伴う物質などのスクリーニング＞
薬剤などに利用される全ての物質に対して、本発明に係るＤＮＡチップを用いて網羅的な探索を行うことにより、例えば、副作用として、概日リズムの変調を伴う物質を検出することができる。
【００２９】
また、概日リズムの変調を伴う物質が検出された場合、該物質の投与タイミングを検出することもできる。例えば、スクリーニングの結果、その物質が、Ｐｅｒ３遺伝子の発現タイミングを移動させる物質であった場合、Ｐｅｒ３遺伝子の発現タイミングを移動させない投与タイミングを見つけ出すことにより、該物質の副作用を予防できる。その他の概日リズム制御遺伝子の場合も同様である。
【００３０】
本発明では、各技術用語を、以下のように定義する。
【００３１】
「概日リズム制御遺伝子群」は、生体内における概日リズムの制御機構に関連する遺伝子を総称したものである。「概日リズム制御遺伝子」は、概日リズムの制御機構に関連する遺伝子である。
【００３２】
「概日時間（ＣＴ：Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  Ｔｉｍｅ）」は、明条件開始時を０時（ＣＴ０）とした時間である。それに対し、「通常時間」は、１日を午前０時から午後１２時とした、通常の時間をいう。
【００３３】
「コード領域」は、塩基配列上の遺伝子をコードする領域であり、転写開始地点から転写終了地点までの配列である。「上流配列」とは、コード領域の転写開始地点よりも上流の配列である。
【００３４】
「概日リズム末梢組織」は、生体内の概日リズム中枢（脳視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ））以外の組織をいい、例えば、心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、腎臓などを含む。
【００３５】
「概日リズム調整剤」は、概日リズムの変調を改善する作用のある薬剤その他の物質・組成物を広く含む。
【発明の効果】
【００３６】
本発明により、概日リズム制御遺伝子群の発現タイミング・発現順序やその異常が検出可能になる。
【実施例１】
【００３７】
実施例１では、概日リズム末梢各組織における概日リズム制御遺伝子の時刻ごとの発現ピークを調べた。手順は以下のとおりである。
【００３８】
まず、実験に用いたマウスの概日リズムを同調させた。即ち、マウスを、二週間、８時から２０時まで明条件、２０時から翌８時までを暗条件にした部屋で飼育して、マウスの概日リズムを同調させた。なお、実験には、ＳＬＣ社から購入したＩＣＲマウス（オス、５週齢）を用いた。
【００３９】
次に、マウスから概日リズム末梢組織として、心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、精巣を所定の時刻に採取し、すぐに液体窒素で凍結した。なお、各臓器の採取時刻は、概日リズムの同調を行った直後の８時から、４時間ごとに設定した（８時、１２時、１６時、２０時、２４時、翌４時）。
【００４０】
次に、採取した各臓器をホモジナイズ後、、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｔｏｔａｌ  ＳＶ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。次に、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応）を行い、概日リズム制御遺伝子の発現量を測定した。
【００４１】
測定した概日リズム制御遺伝子は、次の１４種類である。Ｂａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｌｏｃｋ、Ｃｋ１δ、Ｃｋ１ε、Ｔｉｍ。
【００４２】
なお、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＰＣＲの際には、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ社）を用いて、５０℃、２分／９５℃、１０分／（９５℃、１５秒／６０℃、１分）×４０サイクルを行った。用いたプライマーは、次の通りである。
Ｂａｌ１（センスプライマー：配列番号４、アンチセンスプライマー：配列番号５）、Ｎｐａｓ２（センスプライマー：配列番号６、アンチセンスプライマー：配列番号７）、Ｒｅｖ−ｅｒｂα（センスプライマー：配列番号８、アンチセンスプライマー：配列番号９）、Ｄｂｐ（センスプライマー：配列番号１０、アンチセンスプライマー：配列番号１１）、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ（センスプライマー：配列番号１２、アンチセンスプライマー：配列番号１３）、Ｐｅｒ３（センスプライマー：配列番号１４、アンチセンスプライマー：配列番号１５）、Ｐｅｒ１（センスプライマー：配列番号１６、アンチセンスプライマー：配列番号１７）、Ｐｅｒ２（センスプライマー：配列番号１８、アンチセンスプライマー：配列番号１９）、Ｃｒｙ１（センスプライマー：配列番号２０、アンチセンスプライマー：配列番２１）、Ｃｒｙ２（センスプライマー：配列番号２２、アンチセンスプライマー：配列番号２３）、Ｃｌｏｃｋ（センスプライマー：配列番号２４、アンチセンスプライマー：配列番号２５）、Ｃｋ１δ（センスプライマー：配列番号２６、アンチセンスプライマー：配列番号２７）、Ｃｋ１ε（センスプライマー：配列番号２８、アンチセンスプライマー：配列番号２９）、Ｔｉｍ（センスプライマー：配列番号３０、アンチセンスプライマー：配列番号３１）。
【００４３】
上記実験において、各遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子の発現量を基準に算定した相対的な値である。まず、上記実験手順中、逆転写ＰＣＲを行う際に抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの中から、β−アクチン及びＧ３ＰＤＨの転写産物を同時に増幅させて、β−アクチン及びＧ３ＰＤＨのｃＤＮＡを合成した。β−アクチン及びＧ３ＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子であり、発現量がほぼ一定である。そこで、各遺伝子の発現量を、β−アクチン又はＧ３ＰＤＨの発現量と比較することにより、相対的な発現レベルを算定した。なお、発現レベルの算定に際して、二種類のハウスキーピング遺伝子（β−アクチン、Ｇ３ＰＤＨ）を用いて各遺伝子の発現レベルを求め、β−アクチンを用いた場合とＧ３ＰＤＨを用いた場合の誤差を補正・調整することにより、各遺伝子の発現レベルの正確性を向上させた。
【００４４】
結果を図１に示す。図１中、「ｈｅａｒｔ」は心臓、「ｌｕｎｇ」は肺、「ｌｉｖｅｒ」は肝臓、「ｓｔｏｍａｃｈ」は胃、「ｓｐｌｅｅｎ」は脾臓、「ｋｉｄｎｅｙ」は腎臓、「ｔｅｓｔｉｓ」は精巣、である。各遺伝子の記載のうち、「ｍ」は（例えば、「ｍＢｍａｌ１」中の最初の「ｍ」）、哺乳類（ｍａｍａｌｉａｎ）を意味する。各グラフの横軸は概日時間（ＣＴ）を、縦軸は相対的な発現レベル（％）である。概日時間（ＣＴ）は、ＣＴ０〜ＣＴ１２が明条件（主観的昼）、ＣＴ１２〜ＣＴ２４が暗条件（主観的夜）である。
【００４５】
図１に示す通り、概日リズム制御遺伝子発現の概日変化は、１４種類中８種類の遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２）で、精巣を除く各臓器において、みられた。
【００４６】
図２に、各遺伝子の発現ピークを模式的に示す。図２の上部の囲み中、白抜き部分は明条件（ＣＴ０〜ＣＴ１２）を、黒塗り部分は暗条件（ＣＴ１２〜ＣＴ２４）を示す。横軸は概日時間（ＣＴ）を示す。横軸の上には、転写因子結合領域である「ＤＢＰＥ」、「Ｅ−ＢＯＸ」、「ＲＯＲＥ」に対する、転写因子の結合タイミング予測時間を示している。
【００４７】
図２に示すとおり、各遺伝子の発現ピークは、Ｂｍａｌ１とＮｐａｓ２がＣＴ２０〜ＣＴ０、Ｒｅｖ−ｅｒｂαがＣＴ４〜ＣＴ８、ＤｂｐがＣＴ６〜ＣＴ１０、Ｐｅｒ３がＣＴ８〜ＣＴ１２、Ｐｅｒ１がＣＴ１０〜ＣＴ１４、Ｐｅｒ２がＣＴ１２〜ＣＴ１６、であった。各臓器における各概日リズム制御遺伝子の発現ピークは、ほぼ同時刻であった。
【００４８】
上述の結果は、まず、概日リズム制御遺伝子のうち、概日リズム末梢組織の概日リズム（分子生物時計）を制御する遺伝子は、主に、８種類の遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２）であることを示唆している。
【００４９】
また、上述の結果は、概日リズム末梢各組織における概日リズム制御各遺伝子の発現順序に、規則性があることを示している。即ち、概日リズム制御遺伝子群は、正常時のＣＴ０〜ＣＴ２４の一日の中で、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２の順で、時系列的に発現し、次に、Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２が同時刻に発現することを示している。
【００５０】
さらに、上述の結果は、概日リズム末梢組織全体が、同様の機構で、概日リズムをリセットしている可能性を示唆する。即ち、概日リズム制御遺伝子の発現ピークが概日リズム末梢組織全体でほぼ同時刻であることは、概日リズム末梢各組織が、概日リズム中枢（ＳＣＮ）の概日リズムに基づき、それぞれ同様の機構により、概日リズムをリセットしている可能性を示唆している。
【００５１】
その他、図１中、精巣における結果は、Ｐｅｒ１が、概日リズム形成以外の他の役割を果たしている可能性を示唆している。本実験において、精巣では、図１に示すように、四つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ）で弱い概日変化が見られたのみであった。一方、Ｐｅｒ１遺伝子では、Ｐｅｒ１遺伝子発現の概日変化は見られなかったが、発現量は他の概日リズム制御遺伝子と比較して高かった。従って、本実験結果は、精巣では、Ｐｅｒ１が、概日リズム形成以外の他の役割、例えば、精子形成の際の発生制御など、を果たしている可能性を示唆している。
【実施例２】
【００５２】
実施例２では、ＮＣＢＩデータベース及びセレーラ・データベース・システムを用いて、８種類の概日時計制御遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２）中に存在する、概日時計制御遺伝子の転写制御領域（Ｅ−ＢＯＸ、ＤＢＰ結合領域、ＲＯＲＥ）を探索した。
【００５３】
探索の結果は、以下のとおりである（図３参照）。
（１）Ｂｍａｌ１遺伝子のプロモーター領域、及び、（２）Ｎｐａｓ２遺伝子のプロモーター領域には、ＲＯＲＥが存在した。
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子には、一つのＲＯＲＥ、一つのＤＢＰ結合領域、五つのＥ−ＢＯＸが存在した。
（４）Ｄｂｐ遺伝子には、二つのＲＯＲＥ、二つのＥ−ＢＯＸが存在した。
（５）Ｐｅｒ３遺伝子のプロモーター領域には、それ自身の遺伝子内にＤＢＰ結合領域が存在した。
（６）Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域には、５つのＥ−ＢＯＸ、ＤＢＰ結合領域が存在した。
（７）Ｐｅｒ２遺伝子のプロモーター領域には、Ｅ−ＢＯＸが存在した。Ｐｅｒ２遺伝子におけるＥ−ＢＯＸ（ＣＡＣＧＴＴ）は、典型的なＥ−ＢＯＸ（ＣＡＣＧＴＧ）とは配列が異なっていた。
【００５４】
これらの結果は、以下に示す、概日リズム調整機構の存在を示唆する。
【００５５】
（１）Ｂｍａｌ１遺伝子及び（２）Ｎｐａｓ２遺伝子の発現は、ＲＯＲＥに結合する転写因子（Ｒｅｖ−ｅｒｂなど）に制御される。一方、Ｂｍａｌ１遺伝子は、ＢＭＡＬ１（タンパク質）を発現する。発現したＢＭＡＬ１（タンパク質）は、ＣＬＫ（タンパク質）と結合して、ＣＬＫ−ＢＭＡＬ１複合体を形成する。ＣＬＫ−ＢＭＡＬ１複合体は、プロモーター領域にＥ−ＢＯＸを持つ遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子、Ｄｂｐ遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子）の発現を促進する。なお、Ｎｐａｓ２遺伝子は、ＮＰＡＳ２（タンパク質）を発現する。
【００５６】
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の発現は、ＲＯＲＥに結合する転写因子（Ｒｅｖ−ｅｒｂなど）、ＤＢＰ結合領域に結合する転写因子（ＤＢＰなど）、Ｅ−ＢＯＸに結合する転写因子（ＣＬＫ−ＢＭＡＬ１複合体）による調節を受けていると推定される。即ち、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の発現は、フィードバック機構による、発現量の調節を受けていると推定される。一方、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子は、ＲＥＶ−ＥＲＢα（タンパク質）を発現する。ＲＥＶ−ＥＲＢα（タンパク質）は、転写因子として、ＲＯＲＥを持つ遺伝子（Ｂｍａｌ１遺伝子及びＮｐａｓ２遺伝子）の発現を制御する。
【００５７】
（４）Ｄｂｐ遺伝子の発現は、ＲＯＲＥに結合する転写因子（Ｒｅｖ−ｅｒｂなど）、Ｅ−ＢＯＸに結合する転写因子（ＣＬＫ−ＢＭＡＬ１複合体）による調節を受けていると推定される。一方、Ｄｂｐ遺伝子は、ＤＢＰ（タンパク質）を発現する。ＤＢＰは、転写因子として、ＤＢＰ結合領域に結合し、ＤＢＰ結合領域を持つ遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子、Ｐｅｒ３遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子）の発現を促進する。
【００５８】
（５）Ｐｅｒ３遺伝子の発現は、ＤＢＰなどＤＢＰ結合領域に結合する転写因子により、促進される。
【００５９】
（６）Ｐｅｒ１遺伝子の発現は、ＤＢＰなどＤＢＰ結合領域に結合する転写因子、及び、Ｅ−ＢＯＸに結合する転写因子（ＣＬＫ−ＢＭＡＬ１複合体）による調節を受けている。
【００６０】
（７）Ｐｅｒ２遺伝子の発現は、Ｅ−ＢＯＸに結合する転写因子（ＣＬＫ−ＢＭＡＬ１複合体）による調節を受けている。
【００６１】
まとめると、図４に模式的に示すとおり、概日時計制御遺伝子が、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子、Ｂｍａｌ１遺伝子、Ｄｂｐ遺伝子、Ｐｅｒ遺伝子、の順で発現する可能性を示している。即ち、各遺伝子から発現したタンパク質が、その下流の遺伝子の発現を制御している可能性を示している。そして、前記した発現順序は、実施例１で示した概日発現タイミング（図２参照）と、おおよそ一致する。
【００６２】
なお、図４において、概日時計制御遺伝子から発現したタンパク質による、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子に対する作用を示す矢印は省略した。上記の実施例１（図２）において、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の発現タイミングがＢｍａｌ１・Ｎｐａｓ２とＤｂｐの間にあるのは、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子が、複数の転写因子（一つのＲＯＲＥ、一つのＤＢＰ結合領域、五つのＥ−ＢＯＸ）を持つため、即ち、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の発現が、複雑なフィードバック機構により、調節されているためと、推定される。また、図２中、ＣＴ４〜ＣＴ８で発現したＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の転写産物（ＲＥＶ−ＥＲＢα）は、ＣＴ６〜ＣＴ１０に発現するＤｂｐ遺伝子と、翌ＣＴ２０〜ＣＴ２４のＢｍａｌ１遺伝子の発現タイミングを調節している可能性がある。
【００６３】
その他、上記の実施例１（図２）における、Ｐｅｒ３遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子の発現タイミングのずれは、転写因子結合領域の種類・個数・配列に違いがあるため、または、さらに複雑な調整機構が存在するため、であると推定される。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明に係る概日リズム制御遺伝子群は、ＤＮＡチップなどに適用可能であるほか、例えば、上記概日リズム制御遺伝子群を少なくとも有する培養細胞などにも適用可能である。前記培養細胞は、例えば、上述した、副作用として概日リズムの変調を伴う物質などのスクリーニング方法にも適用できる可能性がある。以上より、本発明に係る概日リズム制御遺伝子群は、産業上有用である。
【００６５】
本発明に係るＤＮＡチップは、上記の通り、概日リズムの変調を検出する方法、概日リズム調整剤の選択をする方法、スクリーニングなどに利用でき、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図。
【図２】概日リズム制御遺伝子群の発現タイミングを模式的に示した図。
【図３】各概日リズム制御遺伝子における、転写制御領域の位置を示した図。
【図４】概日リズム制御遺伝子群の発現調節機構を模式的に示した図。
【図１】
2006020524.tif 000003
【図２】
2006020524.tif 000004
【図３】
2006020524.tif 000005
【図４】
2006020524.tif 000006
【配列表】
2006020524000001.app