(57)【要約】      （修正有）【課題】  ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進因子としてのＬＡＲＧＥ２の用途を提供する。【解決手段】（ａ）特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（ｂ）特定のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド、を含有するポリペプチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤、該因子を含有するラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤ならびに医薬組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
を含有するポリペプチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤。
【請求項２】
配列番号１に示されたアミノ酸配列に８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
を含有するポリペプチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤。
【請求項３】
（ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤。
【請求項４】
配列番号１に示されたアミノ酸配列に８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤。
【請求項５】
配列番号１の３８１番〜４３０番のアミノ酸配列に５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
を含有するポリペプチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤。
【請求項６】
配列番号１の３８１番〜４３０番のアミノ酸配列に５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤。
【請求項７】
請求項１、２、３、４、５または６記載のラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤を有効成分として含有する筋ジストロフィー治療のための医薬組成物。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５または６記載の因子を有効成分として含有する筋ジストロフィー治療のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドＬＡＲＧＥ２の用途およびＬＡＲＧＥ２をコードする核酸配列の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋ジストロフィーは、ジストロフィン結合糖ポリペプチド複合体（ＤＧＣ）の崩壊により引き起こされる先天性筋疾患である。骨格筋におけるＤＧＣの主要構成成分であるジストログリカン（ＤＧ）は、筋収縮のあいだ、剪断応力に対して筋細胞膜を機械的に保護すると考えられている。
ＤＧ前駆体ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００４３８４、配列番号１５）は、Ｎ末端から順にシグナル配列、ムチン様領域および１つの膜貫通領域を有している。ＤＧ前駆体ポリペプチドは、翻訳された後、α−ジストログリカン（αＤＧ）とβ−ジストログリカン（βＤＧ）に切断される。αＤＧは、糖鎖が付加された表在性膜ポリペプチドであり、ウェスタンブロッティングにより、骨格筋においては１５６ｋＤａ、心筋においては１４０ｋＤａ、脳および抹消神経においては１２０ｋＤａの見かけ上の分子量を有するスメアバンド（smear band）として検出される。αＤＧについては、非共有結合により細胞表面上でβＤＧに結合していること、また、細胞外マトリクスの構成成分であるラミニンとも直接結合していることが知られている。βＤＧは、膜貫通ポリペプチドであり、細胞内領域でジストロフィンを介してアクチン骨格に連結することが知られている。すなわち、細胞外マトリクスとアクチン骨格とは、ＤＧ等を介して連結していると考えられている。
【０００３】
福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、ＭＥＢ病（ＭＥＢ）およびウォーカーワルバーグ症候群（ＷＷＳ）などの先天性筋ジストロフィー患者において共通してみられる特徴として、αＤＧのグリコシル化の異常が挙げられる。非特許文献１にて、カナガワらは、ＬＡＲＧＥ（以下、「ＬＡＲＧＥ１」と称する）が存在することにより、αＤＧに対する糖の付加が観察されること、また、そのようなαＤＧはラミニンに対する結合能を有することを示し、ラミニンとαＤＧとの結合に重要なαＤＧのグリコシル化に、ＬＡＲＧＥ１が関わっていることを報告した（非特許文献１）。また、非特許文献２にて、バレシ（Barresi）らは、ｌａｒｇｅ遺伝子（以下、「ｌａｒｇｅ１」と称する）に変異が生じた結果ヒトの筋ジストロフィーに類似の病状を示すモデルマウス（Ｌａｒｇｅmydマウス）においてＬＡＲＧＥ１を過剰発現させた場合、病状の改善がみられたことを報告した（非特許文献２）。なお、現在のところ、筋ジストロフィーの治療に有効であると期待される物質は、ＬＡＲＧＥ１の他に細胞傷害性Ｔ細胞由来ＧａｌＮＡｃ転移酵素（cytotoxic T cell(CT) GalNAc transferase）があり、トランスジェニックmdx-CTマウスで筋ジストロフィーの症状を改善するがαＤＧのラミニンなどのリガンドと結合する能力には変化がないことが報告されている。
【０００４】
【非特許文献１】カナガワら、「セル（Cell）」、２００４年６月２５日発行、第１１７巻、第７号、９５３〜９６４頁
【非特許文献２】バレシら、「ネイチャー  メディシン（Nature Medicine）」、２００４年７月１日発行、第１０巻、６９６〜７０３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤としてのＬＡＲＧＥ２の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＬＡＲＧＥ１とホモロジーを有するＬＡＲＧＥ様ポリペプチド（配列番号１：以下「ＬＡＲＧＥ２」とよぶ）が、ラミニン結合型αＤＧ合成を促進し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
を含有するポリペプチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤に関する。
本発明はまた、配列番号１に示されたアミノ酸配列に８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチドを含有するポリペプチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤に関する。
さらに、本発明は、
（ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
（ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチド
をコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤に関する。
そのうえさらに、本発明は、配列番号１に示されたアミノ酸配列に８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤に関する。
本発明はまた、前記因子を含むラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤およびラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤を有効成分として含有する筋ジストロフィー疾患治療のための医薬組成物に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、細胞内に導入されることにより、ラミニンと結合し得るαＤＧの細胞外分泌を促進することができる。本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、ラミニン結合型αＤＧの合成を促進するという効果を有するばかりでなく、αＤＧへのグリコシル化量が大きく副産物（ラミニンと結合することができないαＤＧ）の生成が極めて少ないという効果も有しており、医薬として使用するという観点からも非常に優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、ＬＡＲＧＥ２と同等の機能を細胞内で発揮する因子、すなわち、細胞内に導入されることにより、ラミニン結合型αＤＧの細胞外分泌および／またはαＤＧのグリコシル化を生じ得る因子である限り、特に限定されない。尚、本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、糖鎖付加不良型αＤＧの細胞外分泌抑制剤としても使用することができる。尚、糖鎖付加不良型αＤＧとは、充分な糖鎖が付加されていない為に、細胞外（細胞表面を含む）に分泌された場合にラミニンと結合することができないαＤＧを意味する。
【００１０】
たとえば、本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、ポリペプチドＬＡＲＧＥ２またはＬＡＲＧＥ２類似体であってもよく、ＬＡＲＧＥ２またはＬＡＲＧＥ２類似体とともに他の分子等を含有するものであってもよい。他の分子としては、たとえば、ヒスチジンタグ（「Ｈｉｓタグ」または「Ｈｉｓ−６ｔａｇ」とも記載する）またはフラッグタグ（「Ｆｌａｇ」または「Ｆｌａｇタグ」とも記載する）などのタグ、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）などの蛍光ポリペプチド、ルシフェラーゼなどの発光ポリペプチドまたは細胞膜透過シグナル等の各種シグナル配列を挙げることができる。
【００１１】
あるいは、本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、ＬＡＲＧＥ２またはＬＡＲＧＥ２類似体を含有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチド、（たとえば、発現ベクター等）であってもよい。尚、該核酸配列やそれを含んでなるポリヌクレオチドはＬＡＲＧＥ２またはＬＡＲＧＥ２類似体を含有するポリペプチドをコードしていれば特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡやその置換体、合成核酸等いずれでも良い。
【００１２】
さらに、本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤として、配列番号１の３８１番〜４３０番のアミノ酸配列に５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチドを用いることができる。
【００１３】
そのうえさらに、本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤として、配列番号１の３８１番〜４３０番のアミノ酸配列に５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有するポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、α−ジストログリカンのグリコシル化および／またはラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌を生じ得るポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを用いることができる。
【００１４】
本明細書において、ＬＡＲＧＥ２は、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２に示されたＤＮＡ配列がコードするポリペプチドである。
【００１５】
本明細書において、ＬＡＲＧＥ２類似体とは、
（１）配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞内に導入されることにより、ラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌および／またはα−ジストログリカンのグリコシル化を生じ得る因子、
（２）配列番号１に示されたアミノ酸配列に８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、ラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌および／またはα−ジストログリカンのグリコシル化を生じ得るポリペプチド、
（３）配列番号２に示されたＤＮＡ配列において１または数個のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたＤＮＡ配列がコードするポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、ラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌および／またはα−ジストログリカンのグリコシル化を生じ得るポリペプチド、または
（４）配列番号２に示されたＤＮＡ配列に８０％〜１００％の同一性を有するＤＮＡ配列がコードするポリペプチドであって、かつ、細胞内に導入されることにより、ラミニン結合型α−ジストログリカンの細胞外分泌および／またはα−ジストログリカンのグリコシル化を生じ得るポリペプチド
を意味する。
【００１６】
なお、ラミニン結合型αＤＧ合成促進剤の細胞内導入によるラミニン結合型αＤＧの細胞外分泌および／またはαＤＧのグリコシル化は、常法により当業者が適宜確認することができ、たとえば、本明細書中の実施例に記載する方法によって確認することができる。
【００１７】
本明細書において、「同一性を有する」とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列において同一の配列をもつこと、あるいは、配列において一致するアミノ酸残基またはヌクレオチドが存在することを意味するものである。同一性の値は、たとえば、ＢＬＡＳＴ検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）により得ることができ、ＢＬＡＳＴ検索で得られた結果における“identities”の値を採用することができる。
【００１８】
本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、本明細書中の記載および常法に基づき、当業者により製造されることができる。たとえば、配列番号３に示されたＤＮＡ配列と配列番号６に示されたＤＮＡ配列とを用いるＰＣＲ法によりＬＡＲＧＥ２をコードするＤＮＡ配列を得、ついで同ＤＮＡ配列を哺乳類細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）用の発現ベクターに挿入することによって製造することができる。
あるいはまた、本発明のラミニン結合型αＤＧ合成促進剤は、ＬＡＲＧＥ２、公知の細胞膜透過シグナル配列およびタグからなる融合ポリペプチドの発現ベクターを作製し、同ベクターを哺乳類細胞（たとえば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）にトランスフェクションし、ついで、発現された目的ポリペプチドをタグに対する抗体を用いて分離することによって製造することができる。
【００１９】
本発明のラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤は、前記ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤を含むものである限り、特に限定されない。たとえば、本発明のラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤は、緩衝剤等の他の成分を含有するものであってよい。
あるいは、ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤は、アデノウイルス等のウイルス遺伝子にＬＡＲＧＥ２の遺伝子をサイトメガロウイルスプロモータ等と共に組み込み、その組替えアデノウイルス等を培養し精製後、生理食塩水に溶かして使用することもできる。また、ＬＡＲＧＥ２の遺伝子をＲＮＡとしてレトロウイルスベクター等を利用して使用することもできる。
【００２０】
本発明の筋ジストロフィー治療のための医薬組成物は、有効成分として前記ラミニン結合型α−ジストログリカン合成促進剤を含有し、筋ジストロフィーの治療のために投与され得るものである。本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、症状、体重、投与方法および当業者が認めるその他の因子によって異なる。たとえば、投与量は、前述のアデノウイルスベクターを用いる場合、成人一人あたり筋肉重量１００ｇにつき１×１０7ｐｆｕ〜１×１０12ｐｆｕの範囲とすることができるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、非毒性の薬学的に許容され得る担体を含み得る。たとえば、注射剤の場合には、生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の担体を用いることができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは筋肉内注射である。
【実施例】
【００２２】
本発明をさらに詳細に説明するため、以下に実施例、比較例および参考例を記載する。しかしながら、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２３】
＜試薬＞
抗αＤＧモノクローナル抗体ＩＩＨ６Ｃ４およびＶＩＡ４−１：アップステート  セル  シグナリング  ソリューションズ、アメリカ合衆国、ニューヨーク州
抗ラミニン抗体：シグマーアルドリッチ、アメリカ合衆国、ミズーリ州
抗Ｈｉｓタグ抗体とホースラディッシュペルオキシダーゼとのコンジュゲート（抗Ｈｉｓ−６−ＨＲＰ）：ベクトン、ディッキンソン  アンド  カンパニー、アメリカ合衆国、ニュージャージー州
抗Ｆｌａｇタグ抗体とホースラディッシュペルオキシダーゼとのコンジュゲート（抗Ｆｌａｇ−ＨＲＰ）：シグマ−アルドリッチ、アメリカ合衆国、ミズーリ州
ヒト胎児腎細胞２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）：ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３
【００２４】
実施例１
＜ＬＡＲＧＥ２のｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクターの構築＞
ヒトＬＡＲＧＥ２(配列番号１)をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を、以下のように作製した。
腎臓の全ＲＮＡ（クロンテック社、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）1μgを基にSuperScript First-Strand Synthesis for RT-PCR(インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン)を用いて合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、プライマー１とプライマー２とのペア（ｌａｒｇｅ２の５′末端側ＤＮＡ配列増幅用）またはプライマー３とプライマー４とのペア（ｌａｒｇｅ２の３′末端側ＤＮＡ配列増幅用）を用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲのキットとしてはPyrobest DNA Polymerase(タカラ、日本)を使用した。反応液において、ｃＤＮＡ１μl、プライマー各25pmolを用いた。ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、ならびに緩衝液は、キットに添付の物を使用し添付の手順書に従い計５０μｌの反応溶液を調製した。同ＰＣＲは、始めに95℃で5分間インキュベーションした後、９８℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間のインキュベーションを１サイクルとして合計３５サイクル、ついで７２℃で１０分間インキュベーションすることにより実施した。プライマー配列は以下のとおりである。
プライマー１：５′−AGCTGATATCACCATGCTGCCCCGAGGGCGCCC−３′（配列番号３）
プライマー２：５′−TGGGGATCCAGGAGACCTGGGGCT−３′（配列番号４）
プライマー３：５′−CCTGGATCCCCAACAAGCACTACTCCGG−３′（配列番号５）
プライマー４：５′−ACTGGCGGCCGCTCAGCCTCGGGCAGGGCTCT−３′（配列番号６）
【００２５】
プライマー１とプライマー２とのペアを用いて得られたＤＮＡ配列を、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理し、ついで得られたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（ストラタジーン社、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）に挿入することにより、ｌａｒｇｅ２の５′末端側領域を含有するベクター（以下、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−Ｌａｒｇｅ２Ｎ」とする）を構築した。
プライマー３とプライマー４とのペアを用いて得られたＤＮＡ配列をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで処理し、ついで得られたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−Ｌａｒｇｅ２ＮのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入することにより、ＬＡＲＧＥ２全長をコードするＤＮＡ配列を含有するベクター（以下、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−Ｌａｒｇｅ２」とする）を構築した。
つぎに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−Ｌａｒｇｅ２をＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで処理し、得られたＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン）にサブクローニングすることにより、ＬＡＲＧＥ２全長を発現するための発現ベクター（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−Ｌａｒｇｅ２」とする）を構築した。
【００２６】
参考例１
＜ＬＡＲＧＥ１のｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクターの構築＞
ヒトＬＡＲＧＥ１（配列番号１３）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１４）を、以下のように作製した。
腎臓の全ＲＮＡ（クロンテック社、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）1μgを基にSuperScript First-Strand Synthesis for RT-PCR(インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン)を用いて合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、プライマー５とプライマー６とのペア（ｌａｒｇｅ１の５′末端側ＤＮＡ配列増幅用）またはプライマー７とプライマー８とのペア（ｌａｒｇｅ１の３′末端側ＤＮＡ配列増幅用）を用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲのキットとしてはPyrobest DNA Polymerase(タカラ、日本)を使用した。反応液において、ｃＤＮＡ１μl、プライマー各２５pmolを使用した。ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、ならびに緩衝液はキットに添付の物を使用し添付の手順書に従い計５０μｌの反応溶液を調製した。また、同ＰＣＲは、始めに９５℃で５分間インキュベーションした後、９８℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間のインキュベーションを１サイクルとして合計３５サイクル、ついで７２℃で１０分間インキュベーションすることにより実施した。
プライマー５：５′−ATGCGGTACCACCATGCTGGGAATCTGCAGGGG−３′（配列番号７）
プライマー６：５′−TGGGGATCCAGGAAACTTCAGACTTGA−３′（配列番号８）
プライマー７：５′−CCTGGATCCCCAATAAACATTACTCTG−３′（配列番号９）
プライマー８：５′−AGTCTCTAGACTAGCTGTTGTTCTCGGCTGT−３′（配列番号１０）
【００２７】
プライマー５とプライマー６とのペアを用いて得られたＤＮＡ配列を、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ついで得られたＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン）にクローニングすることにより、ＬＡＲＧＥ１のＮ末端側領域の発現ベクター（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−Ｌａｒｇｅ１Ｎ」とする）を構築した。
プライマー７とプライマー８とのペアを用いて得られたＤＮＡ配列は、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで処理し、ついで得られたＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１−Ｌａｒｇｅ１ＮのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位にクローニングすることにより、ＬＡＲＧＥ１全長を発現するための発現ベクター（以下、「ｐｃＤＮＡ３．１−Ｌａｒｇｅ１」とする）を構築した。
【００２８】
参考例２
＜αＤＧのｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクターの構築＞
αＤＧのアミノ酸残基３０〜６５３（αＤＧのアミノ酸残基１〜２９（分泌シグナル配列）およびアミノ酸残基６５４〜８９５（βＤＧ）を除く領域）の発現ベクターを作製するために、以下の操作を行った。
腎臓の全ＲＮＡ（クロンテック社、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）1μgを基にSuperScript First-Strand Synthesis for RT-PCR(インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン)を用いて合成したｃＤＮＡを鋳型として用い、プライマー９とプライマー１０とのペアを用いて、ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲのキットとしてはPyrobest DNA Polymerase(タカラ、日本)を使用した。反応液において、ｃＤＮＡ１μl、プライマー各２５pmolを使用した。ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰならびに緩衝液は、キットに添付の物を使用し添付の手順書に従い計５０μｌの溶液を調製した。また、同ＰＣＲは、始めに９５℃で５分間インキュベーションした後、９８℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間のインキュベーションを１サイクルとして合計３５サイクル、ついで７２℃で１０分間インキュベーションすることにより実施した。
プライマー９：５′−CTTGCGGCCGCGCACTGGCCCAGTGAACCCT−３′（配列番号１１）
プライマー１０：５′−GATGAATTCGCGCCCCGGGTGATATTCTGCAGGG−３′（配列番号１２）
【００２９】
得られたＤＮＡ配列をＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで処理した。
ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３（シグマ社、アメリカ合衆国、ミズーリ州）のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位にヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列を導入した（以下、本ベクターを「ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｈｉｓ」とする）。ついで、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで処理した前記αＤＧ（アミノ酸残基３０〜６５３）をコードするＤＮＡ断片を、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−ＨｉｓのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、αＤＧ（アミノ酸残基３０〜６５３）の発現ベクター（以下、「ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−αＤＧ−Ｈｉｓ」とする）を構築した。このｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−αＤＧ−Ｈｉｓにより、αＤＧ（アミノ酸残基３０〜６５３）は、Ｎ末端側にプレプロトリプシンリーダー（分泌シグナル）およびＦｌａｇ、Ｃ末端側にＨｉｓ−６ｔａｇが融合されたポリペプチドとして発現される。そのように発現された融合ポリペプチドを、以下、αＤＧ30-653と称する。
【００３０】
実施例２および比較例１
直径１０ｃｍの培養皿にＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１×１０6細胞/枚）を播種し、１０％ウシ胎仔血清、２５．０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地１５ｍｌにおいて、３７℃で１日間培養した。ついで、Lipofectamine（商品名）2000（インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン）を用いて、その添付文書に記載の手順にしたがってトランスフェクションを実施した。発現ベクターは、表１に示した濃度および組み合わせで使用した。
【００３１】
【表１】
2006206508.tif 000002
【００３２】
トランスフェクション開始から７２時間後、培地を回収し、以下の操作を行った。
【００３３】
＜αＤＧ30-653の精製＞
遠心式フィルターユニットのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ミリポア、アメリカ合衆国、マサチューセッツ州）を用い、回収した培地１０ｍｌを濃縮し、ついでHis-Tag結合用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾールおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。
得られた試料の濃縮液にHisタグ結合用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾールおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を添加して５００μｌとし、Ｈｉｓタグ標識ポリペプチド精製用ビーズＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）１００μｌと混合し、４℃にて１時間穏やかに撹拌した。つぎに、ポリペプチド（αＤＧ30-653）が結合したビーズを洗浄用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾールおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３回洗浄した。ついで、溶出用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾールおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）５０μｌを用い、αＤＧ30-653の溶出を３回実施した。３回の溶出で得られた溶出液は、１つのチューブにまとめた。
【００３４】
＜ウェスタンブロッティング＞
精製したαＤＧ30-653を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってゲル上に展開し、ニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュル社、アメリカ合衆国）に移し、ついで、抗Ｈｉｓ−６−ＨＲＰ抗体、抗αＤＧモノクローナル抗体ＩＩＨ６Ｃ４またはＶＩＡ４−１で処理した。ＩＩＨ６Ｃ４およびＶＩＡ４−１に対しては、それぞれ、抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ（ジャクソン  イムノ  リサーチ社、アメリカ合衆国）および抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（バイオ−ラッド  ラボラトリーズ社、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）を用いて、ニトロセルロース膜をさらに処理した。なお、ＩＩＨ６Ｃ４およびＶＩＡ４−１は、αＤＧの糖鎖部分を認識するモノクローナル抗体である。
αＤＧ30-653は、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システムおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム  バイオサイエンシーズ、英国）を用いて検出した。結果を図１に示す。なお、本実施例においては、マウス骨格筋より精製した天然のαＤＧを陽性コントロールとして用いた。
【００３５】
図１ＡはＩＩＨ６Ｃ４Ｂを用いて得られた結果であり、レーン１はコントロール１、レーン２は比較例１、レーン３は実施例２およびレーン４は陽性コントロールの結果を示す。
図１ＢはＶＩＡ４−１を用いて得られた結果であり、レーン１はコントロール１、レーン２は比較例１、レーン３は実施例２およびレーン４は陽性コントロールの結果を示す。
図１Ｃは抗Ｈｉｓ−６−ＨＲＰ抗体を用いて得られた結果であり、レーン１はコントロール２、レーン２はコントロール１、レーン３は比較例１およびレーン４は実施例２の結果を示す。
【００３６】
ウエスタンブロットの結果、ラミニンと結合する糖鎖を認識する抗体ＩＩＨ６Ｃ４とＶＩＡ４−１は、ＬＡＲＧＥ１またはＬＡＲＧＥ２と共発現したαＤＧ30-653にのみ反応し、それぞれ分子量２５０ｋＤ、３５０ｋＤにスメアなバンドが認められた。ともにポリペプチドのみの理論値の７３ｋＤと比較して非常に大きな糖鎖の付加が認められた。αＤＧ30-653のみを単独に発現してもこれらの抗体との反応性は認められなかった。またＬＡＲＧＥ１よりもＬＡＲＧＥ２を働かせたαＤＧ30-653の方が付加される糖鎖の量が多かった。
抗Ｈｉｓ抗体を用いて調べてみると、αＤＧ30-653のみを単独に発現した場合とＬＡＲＧＥ１と共発現したαＤＧ30-653では、ポリペプチドのみの７３ｋＤ付近に強く染まるスメアなバンドが認められた。銀染色でも同様のバンドが認められる(データは示さず)。ＬＡＲＧＥ２と共発現したαＤＧ30-653では、このバンドが認められず、糖鎖付加不良のαＤＧ30-653ができていなかった。
ＩＩＨ６Ｃ４ＢおよびＶＩＡ４−１で検出された高分子量のαＤＧ30-653は、抗Ｈｉｓ抗体でも銀染色でも検出されなかった。これは、高分子量のαＤＧ30-653が量的に少なく、抗Ｈｉｓ抗体の感度では検出できなかったためと推定される。
なお、αＤＧ、ＬＡＲＧＥ１およびＬＡＲＧＥ２のmRNAの発現については、各遺伝子の転写をリアルタイムＰＣＲによりモニタリングすることにより確認した。
【００３７】
実施例３および比較例２
＜ラミニン  オーバーレイ  アッセイ＞
直径１０ｃｍの培養皿にＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１×１０6細胞/枚）を播種し、１０％ウシ胎仔血清、２５．０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地１５ｍｌにおいて、３７℃で１日間培養した。ついで、Lipofectamine（商品名）2000（インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン）を用いて、その添付文書に記載の手順にしたがってトランスフェクションを実施した。発現ベクターは、表２に示した濃度および組み合わせで使用した。
【００３８】
【表２】
2006206508.tif 000003
【００３９】
トランスフェクション開始から７２時間後、培地を回収し、実施例２と同様の手順によりαＤＧ30-653を分離精製した。
精製したαＤＧ30-653を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってゲル上に展開し、ニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュル社、アメリカ合衆国）に移した。同膜を、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印、東京）を用いて４℃で一晩ブロッキングし、ついでラミニン−１（シグマ−アルドリッチ社、アメリカ合衆国、ミズーリ州）を１μｇ／ｍｌ含有するオーバーレイ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および３％  ＢＳＡ）中、室温で２時間インキュベーションを行った。つぎに、同膜を、洗浄緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有するＰＢＳ）で洗浄し、洗浄緩衝液で希釈した抗ラミニン抗体ともに室温で２時間インキュベーションを行った。膜を洗浄緩衝液で洗浄し、更に洗浄緩衝液で希釈した抗ウサギＩｇとホースラディッシュパーオキシダ−ゼのコンジュゲート(アマシャムバイオサイエンス、英国)と室温で２時間インキュベーションを行った。
ラミニンを、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システムおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム  バイオサイエンシーズ、英国）を用いて検出した。結果を図２に示す。なお、本実施例における陽性コントロールとして、マウス骨格筋より精製した天然のαＤＧを用いた。
【００４０】
図２において、レーン１はコントロール１、レーン２は比較例１、レーン３は実施例２およびレーン４は陽性コントロールの結果を示す。
ラミニンとの結合性もＬＡＲＧＥ１またはＬＡＲＧＥ２と共発現したαＤＧ30-653で各々２５０ｋＤ、３５０ｋＤのスメアなバンドとして確認できた。αＤＧ30-653単独で発現した場合は１５０ｋＤ付近に薄いながらもバンドが認められ、またマウスの骨格筋より精製したαＤＧも１５０ｋＤ付近にスメアなバンドが認められた。ＬＡＲＧＥ１またはＬＡＲＧＥ２をαＤＧ30-653と共発現した場合、ラミニンと結合するαＤＧ30-653の量が大きく増えた。またαＤＧ30-653に結合する糖鎖の量はＬＡＲＧＥ２と共発現した場合が最も多かった。
【００４１】
実施例４および比較例３
＜ツニカマイシン添加＞
直径１０ｃｍの培養皿にＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１×１０6細胞/枚）を播種し、１０％ウシ胎仔血清、２５．０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地１５ｍｌにおいて、３７℃で１日間培養した。ついで、Lipofectamine（商品名）2000（インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン）を用いて、その添付文書に記載の手順にしたがってトランスフェクションを実施した。発現ベクターは、表１に示した濃度および組み合わせで使用した。
【００４２】
【表３】
2006206508.tif 000004
【００４３】
一晩インキュベーションした後、培地を、ツニカマイシン（カルバイオケム社、アメリカ合衆国）１０μｇ／ｍｌを含有するまたは含有しない新鮮な培地に交換し、さらに24時間インキュベーションを実施した。ついで、培地および細胞をそれぞれ回収し、実施例２と同様の操作を行うことによりαＤＧ30-653を分離精製した。
【００４４】
＜ウェスタンブロッティング＞
精製したαＤＧ30-653を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってゲル上に展開し、ニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュル社、アメリカ合衆国）に移し、ついで、抗Ｈｉｓ−６−ＨＲＰ抗体、抗αＤＧモノクローナル抗体ＩＩＨ６およびＶＩＡ４−１で処理した。ＩＩＨ６Ｃ４およびＶＩＡ４−１に対しては、それぞれ、抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ（ジャクソン  イムノ  リサーチ社、アメリカ合衆国）および抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（バイオ−ラッド  ラボラトリーズ社、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）を用いて、ニトロセルロース膜をさらに処理した。
αＤＧはＥＣＬウェスタンブロッティング検出システムおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム  バイオサイエンシーズ、英国）を用いて検出した。結果を図３に示す。図３ＡはＩＩＨ６Ｃ４を用い得られた結果であり、図３Ｃは抗Ｈｉｓ−６−ＨＲＰ抗体を用いて得られた結果である。図３のＡおよびＣにおいて、レーン１および５はコントロール１、レーン２および６はコントロール２、レーン３および７は比較例３およびレーン４およびレーン８は実施例４の結果を示す。ＶＩＡ４−１を用いて得られた結果は、ＩＩＨ６Ｃ４を用いて得られた結果と同様であった（データは示さず）。
【００４５】
＜ラミニン  オーバーレイ  アッセイ＞
精製したαＤＧ30-653を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってゲル上に展開し、ニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュル社、アメリカ合衆国）に移した。同膜を、Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印、東京）を用いて４℃で一晩ブロッキングし、ついでラミニン−１（シグマ−アルドリッチ社、アメリカ合衆国、ミズーリ州）を１μｇ／ｍｌ含有するオーバーレイ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および３％  ＢＳＡ）中、室温で２時間インキュベーションを行った。つぎに、同膜を、洗浄緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有するＰＢＳ）で洗浄し、洗浄緩衝液で希釈した抗ラミニン抗体ともに室温で２時間インキュベーションを行った。膜を洗浄緩衝液で洗浄し、更に洗浄緩衝液で希釈した抗ウサギＩｇとホースラディッシュパーオキシダ−ゼのコンジュゲート(アマシャムバイオサイエンス、英国)と室温で２時間インキュベーションを行った。
ラミニンを、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システムおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム  バイオサイエンシーズ、英国）を用いて検出した。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂにおいて、レーン１はコントロール１、レーン２はコントロール２、レーン３は比較例３およびレーン４は実施例４の結果を示す。
【００４６】
＜結果＞
ＬＡＲＧＥ１またはＬＡＲＧＥ２と共発現したとき、培地中に分泌されるαＤＧ30-653は、ツニカマイシン処理（Nグリカンの付加を阻害）をしても、抗体ＩＩＨ６Ｃ４、ＶＩＡ４−１（データは示さず）、ラミニンと反応するそれぞれ分子量２５０ｋＤ、３５０ｋＤの高度にグリコシル化されたスメアなバンドが認められ、ツニカマイシンの効果がなかった。一方、抗Ｈｉｓ抗体を用いて調べたところ、単独であるいはＬＡＲＧＥ１と共発現し培地中に分泌されるαＤＧ30-653で認められる糖鎖付加不良の７３ｋＤ（タンパク質部分の分子量）付近のバンドがツニカマイシン処理で消失した。ＬＡＲＧＥ２と共発現し培地中に分泌されるαＤＧ30-653では、ツニカマイシン処理に関りなくこのバンドが認められず、糖鎖付加不良のαＤＧ30-653ができていなかった。すなわち、ツニカマイシンはＬＡＲＧＥ２と同様に、糖鎖付加不良のαＤＧ30-653の培地中への分泌をほぼ阻害することが判明した。
【００４７】
実施例５および比較例４
＜ラクタシスチン（Lactacystin）添加＞
直径１０ｃｍの培養皿にＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１×１０6細胞/枚）を播種し、１０％ウシ胎仔血清、２５．０ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地１５ｍｌにおいて、３７℃で１日間培養した。ついで、Lipofectamine（商品名）2000（インビトロジェン社、オランダ、フローニンゲン）を用いて、その添付文書に記載の手順にしたがってトランスフェクションを実施した。発現ベクターは、表４に示した濃度および組み合わせで使用した。
【００４８】
【表４】
2006206508.tif 000005
【００４９】
一晩インキュベーションした後、培地を、ラクタシスチン（バイオモル  リサーチ  ラボラトリーズ社、アメリカ合衆国）１０μＭを含有するまたは含有しない新鮮な培地に交換し、さらに２４時間インキュベーションを実施した。
【００５０】
＜細胞からのαＤＧ30-653の精製＞
回収した細胞を、５００μｌのHisタグ結合用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾールおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）に懸濁し、同懸濁液を４℃で３０分間超音波処理することにより細胞を溶解させた。得られた細胞溶解液を遠心し（４℃、１０分間、１００００×ｇ）、上清を回収した。
上清を１００μｌのＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン、アメリカ合衆国、カルフォルニア州）と混合し、４℃にて１時間穏やかに撹拌した。ついで、前述の方法と同様にしてαＤＧ30-653を溶出した。
【００５１】
＜ウェスタンブロッティング＞
精製したαＤＧ30-653は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってゲル上に展開し、ニトロセルロース膜（シュライヒャー  ＆  シュル社、アメリカ合衆国）に移し、ついで、抗Ｆｌａｇ−ＨＲＰ抗体で処理した。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システムおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム  バイオサイエンシーズ、英国）を用いて、αＤＧ30-653を検出した。結果を図４に示す。図４において、レーン１および５はコントロール１、レーン２および６はコントロール２、レーン３および７は比較例４、ならびにレーン４および８は実施例５の結果を示す。
【００５２】
＜結果＞
ラクタシスチンは、ゴルジ体において、ゴルジ体からプロテアソーム（変性ポリペプチドの分解系）への輸送を阻害するものである。ラクタシスチン未添加の場合、細胞内に分泌されるαＤＧ30-653は、αＤＧ30-653単独またはＬＡＲＧＥ１と共発現したときだけ、抗Ｆｌａｇ抗体と反応する分子量約９０ｋＤのバンドとして認められた。一方、ＬＡＲＧＥ２との共発現の場合は、細胞内におけるαＤＧ30-653の蓄積が認められなかった。この細胞内に蓄積したαＤＧ30-653は、ポリペプチド部分の分子量７３ｋＤに短い糖鎖などが付加して９０ｋＤとなっており、抗体ＩＩＨ６Ｃ４とＶＩＡ４−１と反応しなかった(データは示さず)。
ラクタシスチン添加により、αＤＧ30-653は、αＤＧ30-653単独かＬＡＲＧＥ１と共発現した場合とともに、ＬＡＲＧＥ２と共発現した場合にも、抗ＦＬＡＧ抗体と反応する分子量９０ｋＤのバンドとして認められた。これにより、αＤＧ30-653とＬＡＲＧＥ２との共発現により変性ポリペプチドの分解が促進されていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、実施例２および比較例１におけるウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図２】図２は、実施例３および比較例２におけるラミニンオーバーレイアッセイの結果を示す。
【図３】図３は、実施例４および比較例３におけるウェスタンブロッティングおよびラミニンオーバーレイアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、実施例５および比較例４におけるウェスタンブロッティングの結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号３：プライマー配列
配列番号４：プライマー配列
配列番号５：プライマー配列
配列番号６：プライマー配列
配列番号７：プライマー配列
配列番号８：プライマー配列
配列番号９：プライマー配列
配列番号１０：プライマー配列
配列番号１１：プライマー配列
配列番号１２：プライマー配列
【図１】
2006206508.tif 000006
【図２】
2006206508.tif 000007
【図３】
2006206508.tif 000008
【図４】
2006206508.tif 000009
【配列表】
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