(57)【要約】      （修正有）【課題】  植物の老化にだけ特異的に発現する遺伝子およびその遺伝子の発現を誘導するプロモータを提供する。【解決手段】  シロイヌナズナをストレス関連植物ホルモンであるサリチル酸処理をして発現増加する遺伝子としてＡｔＣＤＣＰ１を見い出し、その配列を使用して配列データベース検索の結果全長遺伝子を確認した。またプロモーター部分を分離し、レポーター遺伝子を組みこんだプラスミドで形質転換植物を再生育生し、老化した組織に於いてその発現を確認した。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の塩基配列または
（ｂ）配列番号１の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、植物老化に特異的に発現する分離された遺伝子。
【請求項２】
（ａ）配列番号２の塩基配列または
（ｂ）配列番号２の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、植物老化特異的遺伝子の発現を誘導することができる、分離されたプロモータ。
【請求項３】
請求項２のプロモータ塩基配列を含む、組み換えベクター。
【請求項４】
請求項３の組み換えベクターにより形質転換された、微生物。
【請求項５】
請求項４の微生物により形質転換された、植物体。
【請求項６】
配列番号２の塩基配列を含むプロモータのＤＮＡ断片を増幅するための、配列番号５および配列番号６で表されるＰＣＲ用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から由来した、植物老化に特異的に発現する遺伝子およびそのプロモータに係り、より詳しくは分子的機序により環境親和的に植物の老化を調節するのに有用に用いられるシロイヌナズナから分離された植物老化に特異的に発現する遺伝子（植物老化特異的発現遺伝子）およびその遺伝子の発現を誘導するプロモータに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生命体の生老病死に関する研究は生命工学の研究において非常に重要な分野である。このうち、老化は生命体の発達、生育過程の一環であるため、全世界的に老化の原因と調節メカニズムの糾明により、最終に生命体の老化を遅延させようとする研究が活発に進行されているが、関連した研究成果は非常に微弱なものである。
【０００３】
動物だけでなく植物の老化関連遺伝子の調節機序に対する研究も活発に進行されている。高等植物における老化は一連の細包死滅（ＰＣＤ；Programmed Cell Death）の過程に含まれているもので、これは発生の最終段階で葉、花などの植物の全組織で観察されているが、外部の攻撃からの防御のために局所的に起こる。これまで植物における老化は、植物内のホルモン（ethylene、abscisic acidおよびcytokinins）の作用と栄養分の糖の流れにより調節されると知られている。
【０００４】
植物における老化促進または遅延に関与する遺伝子の分子機序を糾明し、老化関連遺伝子を植物体に導入すると、高付加価値の産業に有用に用いることができる。すなわち、バラ、カーネーションなどの花卉作物、稲、麦などの主要食糧作物に導入して環境親和的な方法で老化を遅延させることができる。このような目的で、モデル植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いた老化関連遺伝子およびその遺伝子の発現を調節する調節遺伝子部位であるプロモータに対する研究が活発に進んでいる。
【０００５】
特許文献１は、老化遅延変異体ｏｒｅ９−１に活性化タギング法（activation tagging）を適用して、ｏｒｅ９−１変異体に比べて葉の老化が促進される形質を表す突然変位体を選別して分離したＳＯＲ９遺伝子に関連した発明を開示している。
【０００６】
一方、老化関連遺伝子の特性が植物体の生育に緊密に関係して作用するため、研究に多くの難しさがある。したがって、植物体形質転換において、最も広く使用されているＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ（Cauliflower mosaic virus 35S promoter）などは老化研究のプロモータであって、実験に利用するのに適していない。
【０００７】
最近までは、多くの老化関連遺伝子の形質転換研究においては、化学薬品、ホルモンなどの人為的処理時に一時的に発現すると知られている遺伝子のプロモータを使用して研究に臨んでいる実情である。しかし、外部で化学薬品処理を行うこと自体が植物体に良くない影響を及ぼし得ると同時に、老化関連遺伝子の機能のみ予想し得る程度であり、永久的に植物体に導入して実用化することができないという大きな欠点を持っている。
【０００８】
このような制約を克服するため、老化特異的に反応する遺伝子プロモータを確保して使用する必要性が台頭した。１９９５年にサイエンスに報告されたシロイヌナズナＳＡＧ１２（Senescence-associated gene 12）遺伝子のプロモータが植物体内の分子的機序により老化特異的に反応し調節されると知られており、現在までかかる性質のプロモータはシロイヌナズナ内で前記ＳＡＧ１２とＳＥＮ４（非特許文献１および非特許文献２）程度が知られているので、関連研究成果が非常に不足した状態である。
【０００９】
したがって、植物体の発育と生長には全く影響を及ぼさないとともに短時間内に効率よく老化関連遺伝子の機能を分析することができ、環境親和的でありながら産業的に永久的形質転換が可能であるように、外部の何の処理もなしで老化に特異的に反応（auto-regulate reaction）するプロモータに対する要求が絶えずに存在してきた。
【特許文献１】大韓民国特許公開第１０−２００４−００２３２５２号明細書
【非特許文献１】Gan S and Amasino RM, 1995. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270: 1986-1988
【非特許文献２】Noh YS and Amasino RM, 1999, Identification of a promoter region responsible for the senescence-specific expression of SAG12. Plant Mol Biol 41: 181-194
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は前記のような問題点および要求を解決するためになされたもので、その目的は、植物の老化にだけ特異的に発現する遺伝子およびその遺伝子の発現を誘導するプロモータを提供することにある。
【００１１】
本発明のほかの目的は、前記老化特異的遺伝子発現の新規のプロモータを含む組み換えベクターおよびこれにより形質転換された植物体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明は、（ａ）配列番号１の塩基配列または（ｂ）配列番号１の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、植物老化に特異的に発現する分離された遺伝子（ＡｔＣＤＣＰ１）を提供する。
【００１３】
また、上記課題を解決するために、本発明は、（ａ）配列番号２の塩基配列または（ｂ）配列番号２の塩基配列と実質的に配列相同性を有する塩基配列を含む、植物老化特異的遺伝子の発現を誘導することができる、分離されたプロモータを提供する。
また、本発明は、前記プロモータの塩基配列を含む組み換えベクターおよび前記組み換えベクターにより形質転換された植物体を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、植物老化に特異的に発現する新規のＡｔＣＤＣＰ１遺伝子、および正常組織では発現せずに老化組織でのみ特異的に遺伝子を発現させ得る新規のプロモータなどを提供して、植物体の発育と生長には全く影響を及ぼさなく、短時間内に効率よく老化関連遺伝子の機能を分析することができ、環境親和的でありながら産業的に永久的な形質転換ができる効果を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、添付図面を参照しながら本発明について詳細に説明する。
【００１６】
シロイヌナズナの全体塩基配列は既に知られている。この塩基配列に基づき、各遺伝子の位置と重要なドメイン（domain）、エクソン（exon）、イントロン（intron）などに関する情報も既に推定して公開されているが、未だ特定ドメインがなく、機能を推定し得ない遺伝子が大部分である。本発明者らは、老化に関連した遺伝子を探すため、ストレスに関連した重要な植物ホルモンであるサリチル酸をシロイヌナズナに処理して発現が増加する未知の遺伝子を見つけ、これをＡｔＣＤＣＰ１と命名した。
【００１７】
これに基づき、出願人はＴＡＩＲ（The Arabidopsis Information Resource）サイトに開示されたシロイヌナズナ配列データベースを前記新規の遺伝子塩基配列と比較して調査した結果、前記遺伝子と相同性を有する遺伝子をシロイヌナズナから見つけることができた（ＴＡＩＲ 第ａｔ４ｇ３４１２０号）（図２参照）。
【００１８】
この遺伝子のプロモータが、老化特異的な遺伝子を発現させるように調節していると結論を下し、この遺伝子のプロモータと推定される塩基配列を分離し、これを確認した（図３参照）。
【００１９】
本発明による植物老化特異的な遺伝子発現を誘導し得るプロモータにＧＵＳを融合させて発現様相を調査した結果、老化した葉でのみＧＵＳ遺伝子が発現することを確認した（図５参照）。
【００２０】
したがって、前記シロイヌナズナから分離された、本発明による新規のプロモータは、正常組織では殆ど発現せずに、老化組織でのみ特異的に遺伝子発現を誘導することができるので、新環境的に老化を調節するのに非常に有用に用いることができる。
【００２１】
前記配列番号１または配列番号２の塩基配列と実質的に配列相同性を有する配列とは、図２（配列番号１）または図３（配列番号２）に示された塩基配列に比べて少しの配列変異を有するが配列機能が同一な塩基配列を言う。前記配列変異は、一つまたは複数の塩基が欠失、置換、または付加された場合などを意味する。
【００２２】
また、本発明は、前記プロモータの塩基配列を含む組み換えベクター（図４参照）および前記組み換えベクターにより形質転換された植物体（図５参照）を提供する。
【００２３】
本発明によるプロモータ塩基配列を含む組み換えベクターを製造し、この組み換えベクターを植物体内に導入するため、本発明が属する分野の通常の知識を持った者に知られた多様な技術を用いることができる。たとえば、アグロバクテリウム−媒介形質転換を用いることができる（参考文献：Clough SJ and Bent AF, 1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43）。  
また、本発明は、配列番号２の塩基配列を含むプロモータのＤＮＡ断片を増幅するための配列番号５および配列番号６で表されるＰＣＲ用プライマーを提供する。
【００２４】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。下記実施例は本発明を具体的に説明するためのもので、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではないことは本発明が属する技術分野で通常の知識を持った者に自明であろう。
【実施例】
【００２５】
［実施例１：新規の遺伝子（ＡｔＣＤＣＰ１）の発見］
本発明者らは、老化に関連した遺伝子を探すため、ストレスに関連した重要な植物ホルモンであるサリチル酸をシロイヌナズナに処理して発現が増加する未知の遺伝子を見つけ、これをＡｔＣＤＣＰ１と命名した。
【００２６】
これに基づき、出願人はＴＡＩＲ（The Arabidopsis Information Resource）サイトに開示されたシロイヌナズナ配列データベースを前記新規の遺伝子塩基配列と比較して調査した結果、前記遺伝子と１００％相同性を有する遺伝子をシロイヌナズナから見つけることができた（ＴＡＩＲ 第ａｔ４ｇ３４１２０号）。
【００２７】
［実施例２：ターゲット遺伝子（ＴＡＩＲ第ａｔ４ｇ３４１２０号）のＲＴ−ＰＣＲ］
ＴＡＩＲサイトで推定された前記ＡｔＣＤＣＰ１遺伝子のＯＲＦ（Open Reading Frame）が実際にシロイヌナズナで転写されるかを調べるため、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００２８】
ＲＴ−ＰＣＲに用いられる標準ｃＤＮＡを合成するため、ヌクレオスピンＲＮＡプラントキット（Nucleospin RNA plant kit, Macherey-Nagel）を用いて、シロイヌナズナ（Arabidopsis thalina ecotype Columbia）の各組織、つまり花、茎出葉（cauline leaves）、根出葉（rosette leaves）、茎、根の総ＲＮＡを抽出した。
【００２９】
定量した総ＲＮＡ ４μｇ、１０ｍＭの各々のｄＮＴＰ、１００Ｍのランダムデカマー（random decamer）、およびヌクレアーゼのない滅菌水をよく混ぜ合わせた後、６５℃で５分間処理し、そのチューブを氷に移し、ＲＴ−ＰＣＲバッファ、ＲＮａｓｅ阻害剤（RNase inhibitor）、０．１Ｍ ＤＴＴを添加し、４２℃で２分間処理した。
【００３０】
さらに氷に移した後、逆転写酵素（reverse transcriptase）２００ユニットを入れ、４２℃で１時間処理した。この生成物を７０℃で１５分間不活性化させて組織別ｃＤＮＡプール（pool）を作り、このｃＤＮＡプールをＲＴ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【００３１】
ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、ＴＡＩＲサイトの塩基配列に基づき、遺伝子のエクソン連結部位で合成した。ＲＴ−ＰＣＲに使用されたターゲット遺伝子特異的プライマーは表１に具体的に示されている。この際、ＰＣＲ反応は、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ(R) ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７００（Perkin Elmer, USA）を使用し、９５℃で２分間初期変性させた後、タッチダウン（touch-down）ＰＣＲ方法で５回［９５℃で４０秒、６２℃→５７℃（サイクル当たり１℃ずつ減少）で１５秒、７２℃で１分］実施し、正常ＰＣＲ方法で２０回［９５℃で４０秒、５７℃で１５秒、７２℃で１分］と７２℃で５分行った。
［表１］ＲＴ−ＰＣＲに使用されたターゲット遺伝子特異的プライマー
5’CCT-CTA-CGT-CGG-TCG-ATG-ATG-CG(配列番号３)    23-mer
5’CCA-TAT-GTC-TTA-CTG-ATC-AGT-TTC-TGT-AGT-TCG (配列番号４)  33-mer
内的対照群（Internal control）としては１８Ｓ ｒＲＮＡ（Ambion）を使用し、組織別ｃＤＮＡプールで同一量が発現されることを確認した。前記ターゲット遺伝子特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲの結果は図１に示すようである。図１に示すように、ターゲット遺伝子が花、茎出葉、根出葉で強く発現されることを確認することができた。
【００３２】
［実施例３：老化特異的発現遺伝子（ＴＡＩＲ第ａｔ４ｇ３４１２０号）のプロモータ塩基配列確認］
前記ＡｔＣＤＣＰ１遺伝子（ａｔ４ｇ３４１２０）の直前にある遺伝子（ａｔ４ｇ３４１１０）の３’ＵＴＲ（untranslated region）から前記遺伝子（ａｔ４ｇ３４１２０）の開始部(ATG)まで１，０９４塩基対をこの遺伝子のプロモータ部位であると推定した。
【００３３】
まず、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出し、両末端にＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）とＢａｍＨＩ（３’末端）サイトを含んでいる、配列番号５および配列番号６で表されるプライマーを合成した（表２参照）。前記ｇＤＮＡを鋳型とし、合成した前記プライマーと校正（proofreading）機能を有するＤＮＡ重合酵素（pyrobest、TAKARA）を使用してプロモータ部位を増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ(R) ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２７００（Perkin Elmer, USA）を使用し、９５℃で２分間初期変性させた後、タッチダウン（touch-down）ＰＣＲ方法で５回［９５℃で４０秒、６０℃→５５℃（サイクル当たり１℃ずつ減少）で１５秒、７２℃で１分３０秒］実施し、正常ＰＣＲ方法で３０回［９５℃で４０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１分３０秒］と７２℃で３０秒行った。
［表２］プロモータクローニングに使用したプライマー
5’-CTA-AAG-CTT-GTG-TTC-ACG-GAA-GAT-GAA-TTT-GAT-T(配列番号５)  34-mer
5’-CAT-GGA-TCC-ATT-CGC-TTA-TCC-TCT-GTT-ACT-CAC-AGA (配列番号６)    36-mer
ＰＣＲで得た産物の末端を各制限酵素で切った後、ｐＢＩ１０１ベクターへクローニングを行った。このクローンをシーケンシングした結果、正確な塩基配列がクローニングされたことが確認できた（図３参照）。
【００３４】
［実施例４：ターゲットプロモータクローニングおよびプロモータの老化特異的発現様相確認］
ターゲットプロモータクローニングに用いたｐＢＩ１０１ベクターは、レフトボーダ（left boarder）とライトボーダ（right boarder）との間にＧＵＳ（β−glucuronidase）レポーター遺伝子を持っており、形質転換可能なバイナリーベクター（binary vector）であった（図４参照）。このベクターを用いてアグロバクテリウム（Agrobacterium, GV3101）を形質転換させた後、花浸漬法（flower dipping method, Clough et al., Plant J., 16(6): 735 - 743, 1998）でシロイヌナズナを形質転換させた。
【００３５】
形質転換させたシロイヌナズナを３回にかけて選抜することにより、Ｔ３系統（line）を確保することができた。ＧＵＳ（β−glucuronidase）は特定の基質（X-GlcA）を分解させて青色を表すので、ＧＵＳ遺伝子の導入された植物体をＸ−ＧｌｃＡ溶液に浸けておくと、この遺伝子が発現する組織でのみ青色を呈することになる。
【００３６】
このような特徴を有するＧＵＳ遺伝子の発現様相を観察した結果、正常に生きている組織では全く観察されなく、専ら老化した（葉緑素のない）葉でのみ特異的に強く発現することを観察することができた（図５参照）。老化した葉を拡大して見ると、このプロモータは老化特異的なプロモータであることを明らかに確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明による、植物老化に特異的に発現する遺伝子の転写発現様相を示す図である。
【図２】本発明による、植物老化に特異的に発現する遺伝子の全体塩基配列を示す図である。
【図３】本発明による、植物老化に特異的に発現する遺伝子の発現を誘導するプロモータの全体塩基配列を示す図である。
【図４】本発明による、植物老化に特異的に発現する遺伝子の発現を誘導するプロモータのクローニングに用いられるｐＢＩ１０１ベクターのレフトボーダとライトボーダカセットを示す図である。
【図５】本発明による、植物老化に特異的に発現する遺伝子の発現を誘導するプロモータにＧＵＳを融合させて発現様相を観察した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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