(57)【要約】      （修正有）【課題】  ウニの廃棄内蔵の有価資源化。【解決手段】ウニ内臓由来の、以下の特性を有するスブチラーゼに属するアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイム。（ａ）分子量  ３２ｋＤ（ｂ）至適温度  ４５℃（ｃ）熱安定性  ４５℃以下で安定である。（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ１１において最大活性を示す。（ｅ）酵素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列が、特定のアミノ酸配列を有する。（ｆ）酵素タンパク質の部分アミノ酸配列が、特定のアミノ酸配列を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性を有するスブチラーゼに属するアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイム。
（ａ）分子量  ３２ｋＤ
（ｂ）至適温度  ４５℃
（ｃ）熱安定性  ４５℃以下で安定である。
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ１１において最大活性を示す。
（ｅ）Ｎ末端アミノ酸配列が、配列表の配列番号１で示される配列である。
（ｆ）部分アミノ酸配列が、配列表の配列番号２及び配列番号３で示される配列である。
【請求項２】
ウニ内臓由来である、請求項１記載のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイム。
【請求項３】
ウニの内臓を水性溶媒で処理して粗酵素を得、次いで粗酵素を精製する工程を含む、請求項１又は２記載のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイムの製造方法。
【請求項４】
前記処理工程に先立ち、ウニの内臓を沈殿分離法に従い処理して沈殿物を得る工程を更に含み、前記沈殿物を水性溶媒で処理する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ウニの内臓又は沈殿分離法により得られたウニの内臓からの沈殿物を水性溶媒で処理することにより得られる粗酵素であって、請求項１又は請求項２記載のアルカリセリンプロテアーゼ及びそのアイソザイムを含有する粗酵素。
【請求項６】
ウニの内臓を水性溶媒で処理する工程を含む、請求項５記載の粗酵素の製造方法。
【請求項７】
前記処理工程に先立ち、ウニの内臓を沈殿分離法に従い処理して沈殿物を得る工程を更に含み、前記沈殿物を水性溶媒で処理する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイム或いは請求項５記載の粗酵素を含有する洗浄補助剤。
【請求項９】
請求項８記載の洗浄補助剤を含有する洗剤。
【請求項１０】
請求項１記載のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイムの活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウニ内臓由来の新規なプロテアーゼ、当該プロテアーゼを製造する方法、当該プロテアーゼを含有するウニ内臓由来の粗酵素、並びに、当該プロテアーゼを利用した洗浄助剤及び洗浄剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
北海道のウニ加工場では、雲丹製品（生殖巣）の製造時に、食道、胃、腸管を主体とする内臓組織が大量に廃棄されている。この廃棄内臓の処理費は水産加工場経済の圧迫要因となっており、廃棄に伴う環境汚染も懸念されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、本発明者は、これまでも、海洋生物の廃棄内臓の有効利用の目的の下、例えば、アワビやサザエ等の巻貝類の廃棄内臓中に高活性のセルラーゼが存在することを見出している（特許文献１）。しかしながら、後口動物であるウニの廃棄内臓の有効利用については、これまで殆ど研究が進んでいないのが実情である。そこで、本発明は、ウニの廃棄内臓から各種の有用物質を抽出・製造し、これを有価資源化することを目的とする。
【特許文献１】特開２００３−２３５５５２
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明（１）は、以下の特性を有するスブチラーゼに属するアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイムである。
（ａ）分子量  ３２ｋＤ
（ｂ）至適温度  ４５℃
（ｃ）熱安定性  ４５℃以下で安定である。
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ１１において最大活性を示す。
（ｅ）Ｎ末端アミノ酸配列が、配列表の配列番号１で示される配列である。
（ｆ）部分アミノ酸配列が、配列表の配列番号２及び配列番号３で示される配列である。
【０００５】
ここで、「分子量」、「至適温度」、「熱安定性」、「至適ｐＨ」における各数値は、実施例に記載の方法に従い測定された値を指す。
【０００６】
本発明（１）に係るプロテアーゼ又はそのアイソザイムは、ＳＤＳ等の界面活性剤（洗剤）に安定であるため、洗浄補助剤として利用できる。また、カゼインや筋肉タンパク質、ホタテガイ廃棄ウロなど各種の不溶性タンパク質資材を本酵素で分解し、生理活性ペプチドや調味料を製造することも可能である。更に、絹の精錬やクリーニングといった工業用途、あるいはゲノムDNAの抽出（精製）・細胞膜の消化、魚卵膜の分解、海藻プロトプラスト作成の前処理など、遺伝子工学や細胞工学分野においても有用である。尚、本酵素は、スブチリシンのような微生物アルカリセリンプロテアーゼと比べて比較的低温に至適温度を有しており、冷水での洗濯や熱に不安定な試料のプロテアーゼ処理など、比較的低温域での用途に適する酵素である。
【０００７】
本発明（２）は、ウニ内臓由来である、前記発明（１）のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイムである。
【０００８】
ここで、「ウニ」とは、特に限定されず、食用のウニとしては、キタムラサキウニ、エゾバフンウニ、ツガルウニ、バフンウニ、ムラサキウニ、アカウニ、シラヒゲウニ、非食用のウニとしては、ガンガゼを挙げることができ、廃棄内臓量の多さからキタムラサキウニが好適である。
【０００９】
「内臓由来」における「内臓」としては、本発明の主目的が廃棄内臓の有効活用であるので、ウニの生殖巣以外の内臓、例えば食道、胃、腸管を用いることが好適であり、胃が最も好適である。尚、生殖巣が含まれていてもよい。また、内臓自体でなく内臓滲出液も「内臓由来」に含まれる。
【００１０】
本発明（３）は、ウニの内臓を水性溶媒で処理して粗酵素を得、次いで粗酵素を精製する工程を含む、請求項１又は２記載のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイムの製造方法である。
【００１１】
ここで、「水性溶媒」とは、タンパク質を溶解する限り特に限定されず、水や各種緩衝液（例えば、リン酸、トリス等のＧｏｏｄバッファー）を例示することができる。また、「処理」も特に限定されないが、乾燥粉末に緩衝液を添加し穏やかに攪拌することにより抽出することが好適である。
【００１２】
「粗酵素」とは、ウニの内臓を水性溶媒で抽出することにより得られる、本発明（１）の特性を有するスブチラーゼに属するアルカリセリンプロテアーゼとそのアイソザイムの両方を含む、ウニ内臓由来プロテアーゼの精製工程の前段階のものを指す。尚、希釈物及び濃縮物並びに他の成分を添加したものも包含する。
【００１３】
「精製」も特に限定されず、当業界で通常行われる手法が採用し得る。例えば、高純度酵素を得るためには、通常、共存するタンパク質、糖などの不純物を除去するため、溶解度の差を利用した硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過、活性炭クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、モノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー等を多段階もしくは適宜組み合わせる。因みに、以下の実施例においては、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー｛例えばＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）｝、ゲル濾過クロマトグラフィー｛例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００（登録商標）｝を組み合わせて精製を行っている。
【００１４】
本発明（４）は、前記処理工程に先立ち、ウニの内臓を沈殿分離法に従い処理して沈殿物を得る工程を更に含み、前記沈殿物を水性溶媒で処理する、前記発明（３）の方法である。
【００１５】
ここで、沈殿分離法としては、アセトン、硫酸アンモニウムやエタノールによる沈殿分離法を例示することができ、タンパク質沈殿能や小さい変成作用の点から、アセトンによる沈殿分離法｛所定期間アセトンに浸漬した後、乾燥し、脱脂乾燥粉末（アセトンパウダー）とする方法｝が好適である。また、「沈殿物」とは、タンパク質を主成分とするものであり、例えば、脱脂乾燥粉末状である。
【００１６】
本発明（５）は、ウニの内臓又は沈殿分離法により得られたウニの内臓からの沈殿物を水性溶媒で処理することにより得られる粗酵素であって、前記発明（１）又は（２）のアルカリセリンプロテアーゼ及びそのアイソザイムを含有する粗酵素である。
【００１７】
本発明（６）は、ウニの内臓を水性溶媒で処理する工程を含む、前記発明（５）の粗酵素の製造方法である。
【００１８】
本発明（７）は、前記処理工程に先立ち、ウニの内臓を沈殿分離法に従い処理して沈殿物を得る工程を更に含み、前記沈殿物を水性溶媒で処理する、前記発明（６）の方法である。
【００１９】
本発明（８）は、前記発明（１）又は（２）のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイム或いは前記発明（５）の粗酵素を含有する洗浄補助剤である。
【００２０】
本発明（９）は、前記発明（８）の洗浄補助剤を含有する洗剤である。
【００２１】
本発明（１０）は、前記発明（１）のアルカリセリンプロテアーゼ又はそのアイソザイムの活性阻害剤である。活性阻害剤は、天然由来及び合成物のいずれでもよく、例えば、フェニルメチルスルフォニルフルオリドやアンチパインを挙げることができる。尚、例えば、本活性阻害剤は、例えば、ウニ身崩れ防止用として有用である。
【実施例】
【００２２】
（材料と方法）
1.  ウニ内臓アセトンパウダーの調製
函館市内の水産加工場において、キタムラサキウニ（Strongylocentrotus nudus）生殖巣（雲丹）の採取時に廃棄されている、食道、胃、および腸管を主体とする内臓を回収した。ここに、等体積の-20℃に冷却したアセトンを加え撹拌することにより脱水と脱脂を行った。沈殿物は10,000 x g、15分間の遠心分離、あるいはNo.2ろ紙（東洋ろ紙製）を用いた吸引ろ過により集めた。この沈殿物はもう一度冷アセトンで懸濁し、遠心分離または吸引ろ過により回収した。得られた沈殿物はアルミフォイル上に広げて室温で風乾し、使用時までデシケーター中で-20℃で保存した。なお、廃棄内蔵に殻や食物由来の海藻残渣などが多く混入している場合には、内臓に対して等量の10mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）を加えて0℃で30分間撹拌し、残渣を5 mm程度のメッシュでろ別した。次いで、このろ液に対して等容量のアセトンを加え上記と同様にパウダー化した。通常、廃棄内臓1 kgから20〜40gのアセトンパウダーが得られる。
【００２３】
2. プロテアーゼの基質としたアルカリ変性カゼインの調製
プロテアーゼの基質としたアルカリ変性カゼインは以下のように調製した。すなわち、市販の乳製カゼイン（関東化学）1.0 gに蒸留水を40 ml加え良く懸濁した後、1 M NaOHを1.0 ml加え、室温で10分間撹拌することにより変性させた。次いで15,000 x gで10 min遠心分離し、得られた上清（変性カゼイン）に500 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）を5 ml加えて中和した。これを10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）に4℃で24時間透析した後、15,000 x gで10分間遠心分離して得た上清をアルカリ変性カゼインとした。
【００２４】
3. プロテアーゼ活性の測定法 
プロテアーゼ活性はアルカリ変性カゼインを基質として以下のように測定した。すなわち、5 mg/mlのアルカリ変性カゼイン、0.1 M NaCl、および10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）から成る反応混液1.8 mlに対し、プロテアーゼ液を0.2 ml加えることにより反応を開始した。反応は30℃で30分間行い、10 %のトリクロロ酢酸を2 ml加えることにより停止した。この反応停止液を20,000 x gで15 min遠心分離し、上清に含まれるプロテアーゼ分解断片（可溶性ペプチド）の量を280 nmの吸光度を指標として定量した。なお、プロテアーゼ活性1 Uは、280 nmの吸光度を1分間に0.01上昇させる酵素量と定義した。
【００２５】
4. SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）はPorzio& Pearsonらの方法
（Biochim. Biophys. Acta, 490, 27-34 (1977)）に従い、10 cm x 10 cm x 0.1 cmの10 ％ポリアクリルアミド平板ゲルを用いて行った。プロテアーゼ試料は、電気泳動中の自己消化を防ぐために、等量の10 % トリクロロ酢酸を加えることにより変性・沈殿させた後、遠心分離で回収し、無水エタノールで2回洗浄・乾燥させた。次いで、この沈殿を5 M尿素 - 0.5 % SDS . 25 mM Tris-HCl(pH 8.9) - 0.01 %ブロモフェノールブルー . 5 % 2-メルカプトエタノールに溶解し、電気泳動に供した。電気泳動後のゲルは、0.2 %クマシブリリアントブルー . 50 %メタノール . 10 %酢酸で染色し、7 %酢酸 . 5 %メタノールで脱色した。分子量マーカーには、Perfect Protein Marker, 15-150-kDa（Novagen社製）を用いた。
【００２６】
5. 部分アミノ酸配列の分析法 
タンパク質のN-末端アミノ酸配列および部分アミノ酸配列は以下のように分析した。すなわち、SDS-PAGEに供したタンパク質試料をATTO社製のセミドライブロッターを用いてPVDFメンブレン（アプライドバイオシステムズ社製、Problot膜）に転写した。メンブレンは0.1 ％クマシブリリアントブルー . 50 %メタノール . 7 %酢酸で30秒間染色し、タンパク質非局在部を50 %メタノールで1分間脱色した。次いで、メンブレン上のタンパク質存在部を鋏で切り取り、これをアプライドバイオシステムズ社製473A型プロテインシーケンサーに供し、アミノ酸配列を分析した。タンパク質の内部配列を分析する場合には、試料を10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）中で、1/100 (W/W)のリジルエンドペプチダーゼにより37℃で2分間消化し、これを上述と同様にPVDF膜に転写した。得られたタンパク質断片のうち、分離が良くかつ収量も多いものについてN末端アミノ酸配列を分析した。
【００２７】
6. ポリクローナル抗体の作成 
精製プロテアーゼに等量のフロイント完全アジュバント（Freunds’ complete adjuvant、和光純薬製）を加えミキサーにより乳化させた後、これを抗原として背部皮下に0.5 mlずつ3ヶ所接種した。一方、外耳静脈にも抗原タンパク質を0.5 ml接種した。2週間後にアジュバント抗原を背部皮下にさらに1ヶ所追加免疫した。追加免疫から1週間後に外耳静脈から1ml採血し、37℃で1時間、次いで4℃で1晩静置して凝固させた後に、1,000xgで20分間遠心分離し、上清にアジ化トリウムを加えて抗プロテアーゼ抗血清標品とした。
【００２８】
7. ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロットはTowbinらの方法 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76,4350-53(1979))に従って行った。すなわち、SDS-PAGE後のゲルをTransfer buffer(0.1M Tris - 0.192M glycine- 20% Methanol)に浸漬し、室温で30分間平衡化した。次いで、セミドライ型泳動転写装置(ATTO社製)を用いて、120mAの定電流で60分間通電することによりゲル内のタンパク質をニトロセルロースフィルター（アドバンテック社製）に転写した。転写後、ニトロセルロースフィルターのタンパク質非局在部をBlocking solution(TBS溶液（0.15 M NaCl-10 mM Tris-HCl(pH 7.5)）20 mlに対してスキムミルク0.4gを溶解したもの)でブロックした後、Blocking solutionの1/400容量の抗プロテアーゼ血清を加えた一次抗体溶液を、室温で振とうしながら12時間反応させた。反応後ニトロセルロース膜を蒸留水、TTBS溶液(TBS溶液に0.05% polyxyethylene(20) sorbitanmonolaurate (Tween-20)を加えたもの)、TBS溶液の順で洗浄し、再びBlocking solutionで10分間ブロックした後、Blocking solutionに1/5000容量の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG抗血清（DAKO社製）を加えた二次抗体溶液で90分間反応させた。反応後のニトロセルロース膜は上記と同様、蒸留水、TTBS溶液、TBS溶液により順次洗浄し、最後に発色試薬(0.6%4-chloro-1-naphthol, 20%methanol, 0.3%H2O2)に浸して抗体の反応部分を発色させた。
【００２９】
8. 洗浄補助剤としての評価 
約3 x 2.5 cmの木綿布に対し、ウサギ外耳静脈から採取した生鮮血液を60μl付加し、これを30℃で一晩凝固させた。この血液汚染布を50 mlの反応管（ファルコン管）に入れ、そこに洗浄液として0.01 % SDSおよび種々の濃度のプロテアーゼを含む洗浄液を20 ml加え、回転撹拌装置により12回転/分の速度で撹拌しながら30℃で1時間洗浄した。洗浄後、汚染布を写真撮影し洗浄効果を評価した。 
【００３０】
（結果） 
I. キタムラサキウニ・プロテアーゼの精製 
I-１.粗酵素の抽出 
キタムラサキウニ・アセトンパウダー20 gに対し、1,000 mlの10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）を添加し、4℃で30分間静かに撹拌した。これを10,000 x gで10 min遠心分離して得た上清を粗酵素とした。粗酵素の比活性は1.67 U/mg、得られたタンパク質量は3,530 mg、全活性は5,890 Uであった（表１）。
【００３１】
【表１】
2006067804.tif 000002
【００３２】
I-2. 硫安分画
粗酵素に固形硫安を加えることによって硫安分画し、40-70 %飽和で沈殿する画分を10,000 x g、10 minの遠心分離で集めた。この沈殿は40 mlの10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）に溶解した後、同溶液1 lに透析した。透析外液は3時間ごとに計8回交換し、透析中に生じた不溶物は10,000 x g、10 minの遠心分離で除去した。ここで得た酵素液の比活性は4.20 U/mgであり、タンパク質量は1,050 mg、全活性は4,390 Uであった（表１）。 
【００３３】
I-3. DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィー 
硫安分画により部分精製したキタムラサキウニ・プロテアーゼを、10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）で平衡化したDEAE-Toyopearl 650Mカラム（2 x 26 cm）に供した。非吸着成分を10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）で洗浄した後、吸着したタンパク質を10 mMのリン酸ナトリウム（pH 7.0）を含む0〜0.3 M NaClの直線濃度勾配により溶出した。なお、溶出緩衝液の体積は合計1,000mlとし、１画分10mlを分取した。各画分について280 nmの吸光度を測定するとともに、そのプロテアーゼ活性を測定した。それによれば、キタムラサキウニのプロテアーゼはNaCl濃度約0.17 M付近に２つの主ピークとして溶出することが分かった（図１）。また、この画分は約32-kDaのタンパク質を主成分としていたが、それより高分子量および低分子量の不純物を多く含んでいた。そこで、これらのプロテアーゼ画分をさらに精製するために、いったん画分57〜66を合一し、10mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）に透析した後、再度同溶液で平衡化したDEAE-Toyopearl 650Mカラムに供した。なお、合一した時点で比活性は46 U/mgであり、タンパク質量は61.2 mg、全活性は2,820 Uであった（表１）。図２に示したDEAT-Toyopearl再クロマトグラフィーの結果によれば、再クロマトグラフィーにおいてもプロテアーゼ活性画分は、約32-kDaのタンパク質を主成分とする２つのピークとして溶出することが分かった。なお、この2つのピーク画分に含まれる32-kDaタンパク質のうち、前のピークで溶出したものの分子量がわずかに大きいことが分かった。一方、これらのタンパク質をSDS-PAGE後PVDF膜に転写し、そのN末端アミノ酸配列を分析したが、いずれも配列表の配列番号１に記載の配列で、同一であった。さらに、いずれの成分も、セリンプロテアーゼの阻害剤であるフェニルメチルスルフォニルフルオリド（PMSF）と、システインプロテアーゼを中心に広い阻害活性をもつアンチパインによって強く阻害された。従って、この2つのピークのタンパク質は構造的に極めて近い関係（例えばC末端の長さがわずかに異なるアイソザイム）にある可能性が高いと考えられた。なお、前のピーク成分の比活性は54.2 U/mg、後のピーク成分の比活性は75.9 U/mgであり、後者の方がやや高かった。そこで、本研究においては後者のプロテアーゼを完全精製し、その酵素特性を解析することにした。すなわち、画分48〜51を集め凍結乾燥した。この画分のタンパク質収量は8.3 mgで全活性は630 Uであった（表１）。この画分は、さらにSephacryl S-200ゲルろ過により精製した。 
【００３４】
I-4. Sephacryl S-200ゲル濾過
DEAE-Toyopearl 650Mの再クロマトグラフィーで得た活性画分を、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）で平衡化したSephacryl S-200カラム（2.5 x 57 cm）に供した。タンパク質は10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）で溶出し、溶出液は5 mlずつ分取した。その結果、図３に示すように、プロテアーゼ活性は画分31〜34付近に単一ピークとして溶出し、SDS-PAGEにおいてもほぼ単一のバンドを示すことが分かった。これらの画分を合一した試料の比活性は188 U/mgであり、タンパク質収量は2.64 mg、全活性は496 Uであった（表１）。さらに、純度を確認するためにこの画分を凍結乾燥し、2 mlの冷蒸留水で溶解した後、同じSephacryl S-200カラムによりゲル濾過した。その結果、図４に示すようにタンパク質溶出ピークと活性ピークがほぼ完全に一致し、SDS-PAGEにおいても32-kDaの単一バンドとなった。以上の結果より、本酵素の精製が完了したと判断した。この活性画分の比活性は202 U/mg、タンパク質収量は2.0 mg、全活性は404 Uであり、粗酵素からの活性収量は6.86 %で比活性は121倍に増大した（表１）。 
【００３５】
II. キタムラサキウニ・プロテアーゼの酵素特性 
II-1. 温度依存性と温度安定性 
精製したキタムラサキウニ・プロテアーゼの至適温度を測定した。すなわち、酵素を加える前の反応混液1.8mlをあらかじめ10〜70℃で15分間プレインキュベートしておき、そこに0.2mlの酵素液を加えることにより反応を開始した。各温度で30分間反応させた後、10%トリクロロ酢酸で反応を停止し、遠心分離して得た上清の280nmの吸光度を測定した。次いで、その値から得た最大活性値を100%とし、各温度での相対活性値をプロットした（図５）。それによれば、キタムラサキウニ・プロテアーゼの至適温度は約45℃にあり、35〜55℃の温度範囲において最大の約60％の活性が示されることが明らかになった。一方、既に報告されている幾つかのアルカリプロテアーゼにおいては、至適温度は60℃前後のものが多く、このことからキタムラサキウニ・プロテアーゼは比較的低温域に特性を有する酵素であることが分かる。
【００３６】
次に、キタムラサキウニ・プロテアーゼの熱安定性を測定した。すなわち、10 mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）に溶解しているプロテアーゼ0.2 mlを、10〜60℃で30分間加熱した後氷冷し、その残存活性を30℃で測定した。その結果、図６に示すように残存活性が50 ％になる温度は45℃であり、35℃までの温度であれば30分間の加熱によってもほとんど活性は低下しないことが明らかになった。
【００３７】
II-2. pH依存性 
キタムラサキウニ・プロテアーゼ活性のpH依存性を測定した。すなわち、pH 4〜13に調製した10 mMリン酸ナトリウムを含む反応混液中、30℃で活性を測定した。なお、反応混液のpHはpHメータにより実測した。それによれば、本プロテアーゼはpH 11において最大活性を示し、pH 8〜12において最大活性の60％以上の活性を示すことが分かった（図７）。この結果は、本酵素が高pH域で活性化されるアルカリプロテアーゼであることを示している。
【００３８】
II-3. 阻害剤の影響 
キタムラサキウニ・プロテアーゼに対する各種の阻害剤の影響を検討した（表２）。その結果、本酵素は、セリンプロテアーゼの阻害剤であるPMSFと、システインプロテアーゼなど多くのプロテアーゼを阻害するアンチパインによって強く阻害されることが分かった。また、トリプシンの阻害剤であるTLCK、大豆トリプシンインヒビターや、キモトリプシンの阻害剤であるTPCK、多くのプロテアーゼを阻害するLeupeptin、E64、システインのブロック試薬であるモノヨード酢酸、Nエチルマレイミド、DTNB、システインの還元剤である2-メルカプトエタノール、金属プロテアーゼの阻害剤であるEDTA、ペプシン、カテプシンなどのアスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤であるペプスタチンによっては阻害されなかった。これらの阻害剤の効果と、活性の至適pHがアルカリ性であることを考え合わせると、本酵素はアルカリセリンプロテアーゼと同定できる。また、トリプシンやキモトリプシンの阻害剤によって阻害されないことから、スブチリシン様のプロテアーゼと考えられる。一方、界面活性剤であるSDSにはかなり安定で、0.5%のSDSの添加でも約60%の活性が残存し、1%でも約20%の活性が残存していた。また、透析によってSDSを除去すると活性は回復したことから、このSDSの活性阻害作用は可逆的であることが分かった。また、過酸化水素にもかなり安定で、0.1Mの添加によっても55%の活性が残存した。このような界面活性剤や酸化剤（漂白剤）に耐性があることは、本プロテアーゼが洗剤添加用の酵素としても有用であることを示している。
【００３９】
【表２】
2006067804.tif 000003
【００４０】
II-4. タンパク質汚染の除去能 
ウサギ静脈血を付加凝固させた汚染木綿布を、以下の7種類の洗浄液を用いて30℃で1時間、回転撹拌により洗浄した。
洗浄液： 
１） 2 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0） 
２） 2 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）- 0.01% SDS 
３） 2 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）- 0.01% SDS - 1 U/mlプロテアーゼ 
４） 2 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）- 0.01% SDS - 3 U/mlプロテアーゼ 
５） 2 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）- 3 U/mlプロテアーゼである。
【００４１】
上記の洗浄液で血液汚染布を洗浄した結果、図８に示すように、リン酸緩衝液またはSDSを含むリン酸緩衝液に比べてプロテアーゼを加えた洗浄液３）〜５）の洗浄効果が著しく高いことが明らかである。また、プロテアーゼのみの洗浄液（５）でも十分な除染ができていることから、血液のようなタンパク質汚染は本酵素だけでも（界面活性剤無しでも）十分に除去できることが分かる。 
【００４２】
II-5. 部分アミノ酸配列 
精製酵素をSDS-PAGE後PVDF膜にブロッティングし、そのN末端アミノ酸配列をABI473Aプロテインシーケンサーにより分析した。その結果、N末端配列は、配列表の配列番号１記載の配列と決定された。この配列を、一次構造データベースを用いて検索した結果、Vibrio alginolyticusのアルカリセリンプロテアーゼ（DDBJ Accession No. P16588）の内部配列（141〜169番残基）と48.3 ％の同一率を示すことが明らかになった。また、精製酵素を1/100 (W/W)のリジルエンドペプチダーゼにより37℃で2分間限定分解し、得られた断片のうちの２つについてアミノ酸配列を分析した結果、一つは、配列表の配列番号２記載の配列と決定され、もう一つは、配列表の配列番号３記載の配列と決定された（図９）。これらの配列は、V.lginolyticusのアルカリセリンプロテアーゼの197〜225残基部分と51.7%、267〜291残基部分と48.0%、プロテイナーゼK（DDBJ Accession No. P06873）の161〜186残基部分と55.2%、233〜257残基部分と48.0%、スブチリシン（DDBJ Accession No. P58371）の208〜236残基部分と37.90%、292〜316残基部分と44.0%、アクアリシン（DDBJ Accession No. P08594）の180〜209残基部分と55.2%、251〜275残基部分と40.0%の同一率を示すことが明らかになった（表３）。これらの既知プロテアーゼは、いずれもスブチラーゼに属する酵素である。したがって、本研究においてキタムラサキウニから単離したアルカリセリンプロテアーゼは、スブチラーゼに属する酵素であると考えられる。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
II-6. ウエスタンブロッティングによるプロテアーゼの発現部位の解析 
本酵素がウニの内臓組織のどの部位に発現しているかを、ウエスタンブロッティングにより解析した。すなわち、図10に示すように解体したウニから、食道（gullet）、胃（stomach）、小腸（intestine）、直腸（rectum）を採取し、それぞれに約5倍量の10mMリン酸ナトリウム（pH 7.0）を加え0℃で1時間酵素を抽出した。10,000 x g、10分間の遠心分離により上清を得て、ここに等量の10％クロロ酢酸を加え、タンパク質を沈殿させた。これを100%エタノールで洗浄、風乾後SDS-PAGEに供した。SDS-PAGE後、タンパク質をニトロセルロース膜に泳動転写し、精製キタムラサキウニ・プロテアーゼを抗原としてウサギに免疫して得たポリクローナルを用いて、ウエスタンブロットを行った。その結果、精製酵素と同一の分子量を示す陽性タンパク質は、胃部からの抽出液のみに認められた（図１１）。この結果は、本酵素がウニの胃部に特異的に発現していることを強く示唆している。一方、食道では約25-kDaのタンパク質、胃部では50-kDaのタンパク質が本抗体と交叉反応している。これらは、本酵素のアイソザイム、前駆体あるいは分解物である可能性が考えられるが、現在のところ同定できていない。なお、小腸や直腸には抗体と反応する成分は認められなかった。
【００４５】
以上、キタムラサキウニの廃棄内臓から得られるプロテアーゼは、活性の至適pH、阻害剤の効果、部分一次構造などからスブチラーゼに属するアルカリセリンプロテアーゼであることが明らかになった。また、本酵素には優れた血液汚染除去能（タンパク質汚染除去能）があり、SDSや過酸化水素にも比較的安定であることから洗浄補助剤として利用可能であることが確認できた。 
【００４６】
ところで、雲丹製品製造の際、生殖巣は２％程度の食塩水洗浄液中でいったん内臓組織と共に懸濁・浮遊された後分離回収されている。その際、この洗浄液中で雲丹製品がプロテアーゼと接触・混合されることが避けられない。そこで、このプロテアーゼが雲丹製品の品質にどのような影響を及ぼすかを知るために、生きているウニから内臓との接触が無いように丁寧に回収した雲丹と、これに精製したプロテアーゼを加えた場合とで貯蔵中の身崩れの程度を比較した（図１２）。それによれば、本プロテアーゼは雲丹製品の身崩れを著しく早めることが分かった。したがって、雲丹製品の製造においては、洗浄液中のプロテアーゼ活性が高くならないよう何らかの対策をとることにより、製品の品質をより長期間維持できるようになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、キタムラサキウニ・プロテアーゼのＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Mカラムクロマトグラフィー（１回目）の処理物について、各画分とプロテアーゼ活性との関係を示したものである。
【図２】図２は、キタムラサキウニ・プロテアーゼのＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Mカラムクロマトグラフィー（２回目）の処理物について、各画分とプロテアーゼ活性との関係を示したものである。
【図３】図３は、キタムラサキウニ・プロテアーゼのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ゲルろ過（１回目）の処理物について、各画分とプロテアーゼ活性との関係を示したものである。
【図４】図４は、キタムラサキウニ・プロテアーゼのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ゲルろ過（２回目）の処理物について、各画分とプロテアーゼ活性との関係を示したものである。
【図５】図５は、精製キタムラサキウニ・プロテアーゼの温度依存性を示したものである。
【図６】図６は、精製キタムラサキウニ・プロテアーゼの温度安定性を示したものである。
【図７】図７は、精製キタムラサキウニ・プロテアーゼのpH安定性を示したものである。
【図８】図８は、精製キタムラサキウニ・プロテアーゼによる、ウサギ静脈血で汚染した木綿布の汚染除去能の様子を示した写真である。
【図９】図９は、精製キタムラサキウニ・プロテアーゼの部分アミノ酸配列を示したものである。
【図１０】図１０は、キタムラサキウニを解剖した際の写真である。
【図１１】図１１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる、キタムラサキウニ・プロテアーゼの組織特異的発現の様子を示した写真である。
【図１２】図１２は、精製キタムラサキウニ・プロテアーゼによる雲丹（生殖巣）の身崩れの様子を示した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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