(57)【要約】    【課  題】  工業的有利にフェルラ酸を製造できる新規製造方法の提供。    【解決手段】シュガービートパルプを唯一の炭素源としてペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）に属する菌株を培養し、得られた培養液をシュガービートパルプと接触させることによりフェルラ酸を生成させ、これを採取することを特徴とするフェルラ酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュガービートパルプを唯一の炭素源としてペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）菌株を培養し、得られた培養液をシュガービートパルプと接触させることによりフェルラ酸を遊離生成させ、これを採取することを特徴とするフェルラ酸の製造方法。
【請求項２】
ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）菌株がペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）である請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフェルラ酸の製造方法に関し、更に詳しくは、シュガービートパルプより微生物の培養液を用いてフェルラ酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェルラ酸は植物細胞壁中に広く存在するフェノール化合物であり、抗酸化作用、紫外線吸収作用、種子の発芽抑制作用、抗菌作用、抗がん作用など様々な機能を有しており、医薬、農薬、化粧品、食品添加物などの原料として有用である。
【０００３】
フェルラ酸の製造方法については、非特許文献１に、バニリンとマロン酸との縮合反応によってフェルラ酸を製造する方法が記載されている。しかしながら、この方法は反応時間が長いなどの問題があり、工業的に満足のいくものではなかった。
特許文献１には、オリザノールからアルカリ加水分解によってフェルラ酸を得る方法が記載されている。しかしながら、この方法は、フェルラ酸の収率が低いなどの問題点を有しており、これもまた工業的に満足のいくものではなかった。
【０００４】
特許文献２には、オイゲノールからシュードモナス・フルオレッセンスＥ１１８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５１８５）の培養液を用いてフェルラ酸を製造する方法が記載されている。しかしながら、この方法もまた、工業的にまだまだ満足のいくものではなかった。
【０００５】
非特許文献２には、シュガービートパルプからペニシリウム・フニクロスム（Penicillium funiculosum）のフェルラ酸エステラーゼとエンドアラビナナーゼおよびα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼの混合物とを併用してフェルラ酸を製造する方法が記載されている。しかしながら、この方法は、環境保護の観点から農業廃物であるシュガービートパルプを利用できるという点で優れているが、収率があまり好ましくなく、シュガービートパルプをアルカリ分解してフェルラ酸を製造した場合に比べると、その収率はアルカリ分解のときの３５％であった。
【特許文献１】特開平５−３３１１０１号公報
【特許文献２】特開平９−１５４５９１号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ，７４巻，５３４６〜５３４８頁，１９５２年
【非特許文献２】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｖｏｌ．２６７，６７４０〜６７５２頁，２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、シュガービートパルプより工業的有利にフェルラ酸を製造できる新規製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、シュガービートパルプを唯一の炭素源としてペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）菌株を培養し、得られた培養液をシュガービートパルプと接触させることによりフェルラ酸を遊離生成させ、これを採取することにより、工業的有利にフェルラ酸を製造できることを見出した。また、本発明者らは、上記知見を得た後、さらに検討を重ねて本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、
１）シュガービートパルプを唯一の炭素源としてペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）菌株を培養し、得られた培養液をシュガービートパルプと接触させることによりフェルラ酸を遊離生成させ、これを採取することを特徴とするフェルラ酸の製造方法、および
２）ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）菌株がペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）である前記１）記載の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、農業廃物であるシュガービートパルプからフェルラ酸を収率よく、かつ工業的有利に製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のフェルラ酸の製造方法は、シュガービートパルプを唯一の炭素源としてペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）菌株を培養し（酵素液製造工程）、得られた培養液をシュガービートパルプと接触させることによりフェルラ酸を遊離生成させ（フェルラ酸生成工程）、ついでこれを採取する（フェルラ酸採取工程）ことからなることを特徴とする。
【００１１】
（酵素液製造工程）
本工程では、シュガービートパルプを唯一の炭素源としてペニシリニウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）を培養する。
本工程で使用される唯一の炭素源であるシュガービートパルプは、公知のものであってよく、甜菜（ビート）から砂糖分・糖蜜分等を抽出した後の残渣である。このようなシュガービートパルプは、例えばビート根を常法に従い、順に洗浄、裁断、温水抽出し、抽出物（砂糖分・糖蜜分等）が除かれた残渣を、順に洗浄・脱水、乾燥・粉砕することにより製造される。
【００１２】
本工程で使用されるペニシリニウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）としては、たとえばペニシリニウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）３１Ｂが好適にあげられ、この菌株は独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３として寄託されている。
【００１３】
菌株の培養に使用される培地としては、シュガービートパルプを唯一の炭素源とする以外は特に限定されず、シュガービートパルプの他に、窒素源、無機塩類などを添加した培地が用いられる。
【００１４】
窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか肉エキス、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが挙げられる。無機塩類としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素カリウム、塩化カリウム、食塩、硫酸鉄、硫酸マンガンなどが挙げられる。さらには、必要により、各種ビタミン類などを添加することもできる。
【００１５】
培養は、ｐＨ４〜６、好ましくはｐＨ４．５〜５．５、温度２５〜３５℃、好ましくは温度２８〜３２℃で好適に実施される。培養日数は１〜３０日、好ましくは５〜２５日である。本発明では、本工程で得られる培養液をそのまま酵素液として次の工程に使用してもよいし、所望により該培養液を遠心分離し、その上清を酵素液として使用してもよい。
【００１６】
（フェルラ酸生成工程）
本工程は、上記酵素液製造工程で得られた培養液を酵素液として用いて、シュガービートパルプと接触させることによりフェルラ酸を遊離させる。詳しいメカニズムは不明であるが、上記酵素液とシュガービートパルプとを接触させることにより、酵素反応が生じ、該シュガービートパルプのフェルラ酸が遊離するものと思われる。本工程で使用されるシュガービートパルプ(基質)は、酵素液の調製に際して使用されるシュガービートパルプ（唯一の炭素源）と同一であっても、異なっていてもよい。
【００１７】
上記酵素反応は、基質であるシュガービートパルプに上記酵素液を加えて静置、あるいは攪拌することにより実施することができる。本工程では、シュガービートパルプを所望により適当な緩衝液（たとえば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液など）、あるいは有機溶媒（例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなど）と前記緩衝液との混合物に溶解もしくは懸濁させてから、これに酵素液を加えてもよい。
【００１８】
上記シュガービートパルプの添加量は、上記酵素液（培養液）に対して、好ましくは０．０１〜５質量％であり、より好ましくは０．１〜１．５質量％である。
【００１９】
酵素反応の温度は、本発明の目的を阻害しない限り特に限定されないが、２５〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。また、酵素反応のｐＨは、４〜７．５が好ましく、４．５〜７がより好ましい。反応時間は特に制限されないが、通常１〜１００時間が好ましく、２〜２４時間がより好ましい。
【００２０】
反応液中にフェルラ酸が所望量に達したのち、加熱によって反応を停止する。
（フェルラ酸採取工程）
反応終了後、反応液からフェルラ酸を採取する。採取手段は、反応液を常法（溶媒抽出、遠心分離、各種クロマトグラフィー、晶出、再結晶など）に従い精製処理することにより、目的とするフェルラ酸を採取することができる。
【００２１】
製造されるフェルラ酸は、抗酸化作用、紫外線吸収作用、種子の発芽抑制作用、抗菌作用、抗がん作用など様々な機能を有するため、種々の用途に用いられ得る。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
（１）下記表１に示す組成の培地にペニシリニウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）を接種し、３０℃、２１日間静置培養した。培養終了後、得られた培養液をガーゼでこし、さらに遠心分離機にて沈殿物を除去して、上清を得た。得られた上清を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析し、これを酵素液とした。
【００２３】
【表１】
2006067803.tif 000002
【００２４】
（２）上記で得られた酵素液１０ｍｌをシュガービートパルプ１００ｍｇに加え、マグネティックスターラー（５００ｒｐｍ）で撹拌しながら、３７℃、２４時間酵素反応を行った。煮沸にて反応を終了した後、遠心分離し、得られた上清を膜ろ過した。ろ液を高速液体クロマトグラフィー［メタノール：０．２％酢酸＝２５：７５、カラム（Mightysil RP-18GP250-4.6（５μｍ)、関東化学社製）、流速１ｍｌ／分］に付してフェルラ酸量を測定した。フェルラ酸の標準曲線から計算した結果、約０．５２ｍｇのフェルラ酸が得られたことがわかった。この生成量はアルカリ分解法（後記参考例２）で得られるフェルラ酸量の約８７％であった。
（参考例１）
【００２５】
（１）糖質分解酵素の測定
０．１％基質溶液（基質を２０ｍＭ酢酸緩衝液に溶解して調製、各酵素の基質は下記表２のとおり）２００μｌに実施例１の（１）で得られた酵素液５μｌ（ラムノガラクチュローナーゼの場合のみ２０μｌ）を加え、３７℃２０分間（ラムノガラクチュローナーゼの場合のみ６０分間）反応させ、ソモギー試液（ナカライテスク社製）２００μｌを加え、１００℃で１０分間インキュベートする。その後０℃（氷水）にて、１０分間インキュベートし、ネルソン試液（ナカライテスク社製）２００μｌを加える。その後、水１．８ｍｌを加え、吸光度計にて６６０ｎｍの吸収を測定した。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成させる酵素量を１Ｕとした。
【００２６】
【表２】
2006067803.tif 000003
【００２７】
（２）フェルラ酸エステラーゼ活性測定
０．１％フェルラ酸メチルエステル溶液２００μｌに実施例１の（１）で調製した酵素液２０μｌを加え、３７℃で２時間反応させた後、煮沸して反応を停止し、遊離してくるフェルラ酸量を液体高速クロマトグラフィーにて測定した。１分間に１μｍｏｌのフェルラ酸を遊離させる酵素量を１Ｕとした。
なお、フェルラ酸メチルエステルは次のようにして調製した。即ち、アセトン１００ｍｌにフェルラ酸（シグマ社製）５．９ｇと硫酸ジメチル３．８３４ｇとトリスイソプロパノールアミン６．９９２ｇを混合し、油浴中で６５℃に加熱しながら、１時間反応させた。反応が終了したことをＴＬＣで確認した後、トルエンで抽出し、抽出液をエバポレーターにより濃縮乾固することにより、フェルラ酸メチルエステル５．６４ｇを得た。
【００２８】
（３）結果
酵素液の酵素活性は下記表３の通りである。
【表３】
2006067803.tif 000004
【００２９】
(参考例２)
シュガービートパルプ１００ｍｇに０．５Ｎ水酸化カリウム溶液６ｍｌを加え、５０℃で６時間インキュベートした。その後、２Ｎ塩酸２ｍｌを加え、反応を中止させた。反応液を遠心分離し、上清５００μｌをとり、酢酸エチル５００μｌで抽出した。酢酸エチル層４００μｌを集め、濃縮乾固し、高速液体クロマトグラフィー溶媒（メタノール：０．２％酢酸＝２５：７５）に溶解し、高速液体クロマトグラフィーにてフェルラ酸量を測定した。フェルラ酸の標準曲線より計算した結果、約０．６ｍｇのフェルラ酸を認めた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明の製造方法により、抗酸化作用、紫外線吸収作用、種子の発芽抑制作用、抗菌作用、抗がん作用などの活性を有する有用なフェルラ酸を工業的有利に製造することができる。