(57)【要約】【課題】  ヒト関節リウマチの発症のメカニズムの解明に有用なポリペプチドおよびポリヌクレオチドを提供するとともに、ヒト関節リウマチの発症または発症可能性を高精度に判定することのできる診断キットおよび診断方法を提供する。【解決手段】  関節リウマチの疾患関与遺伝子ＤＲ３のＳＮＰ部位に結合するポリペプチドを検索し、ＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合するポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに結合しないことを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項４に記載のポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項４に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする関節リウマチの治療薬剤。
【請求項８】
配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを備えることを特徴とするＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合するポリペプチドをスクリーニングするためのスクリーニングキット。
【請求項９】
配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えることを特徴とする請求項８に記載のスクリーニングキット。
【請求項１０】
配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることを特徴とするＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合するポリペプチドをスクリーニングするためのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの発症に関与するポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを用いる関節リウマチの発症またはその発症可能性の診断キット、診断方法、および関節リウマチの治療薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００３】
ＲＡは、その発症の仕方も多種多様であり、その診断には、アメリカリウマチ学会の診断基準が広く利用されている。しかしながら、ＲＡの発症は、通常、緩徐で数週間から数ヶ月にわたり、アメリカリウマチ学会の診断基準における客観的な指標としてのリウマトイド因子の存在は、その陽性率が３ヶ月以内で３３％、１２ヶ月以上においても８８％程度（例えば、非特許文献１を参照のこと）であり、ＲＡと確実に診断するには至っていない。そこで、組換え抗原と反応する患者血清中のリウマチ性関節炎関連抗体ＩｇＭ抗体を検出し、リウマチ性関節炎を診断しようとする試みなどがなされている（例えば、特許文献１を参照のこと）。
【０００４】
また、ＲＡの治療は、ＲＡ病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段は異なるのが通常である。一般的に確定診断が下せない初期では、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、確定診断が下せた場合は、ＮＳＡＩＤに加えて疾患修飾性リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を投与する。特にＲＡ発症の初期には、確定診断を下すことは困難であり、現状では、ＮＳＡＩＤを投与し、経過を慎重に観察しながら膠原病を含む他のリウマチ疾患との鑑別を同時に行っている。さらに症状が進行した場合は、ステロイド薬の投与を行う場合もあり、疼痛のための薬物療法と共に関節機能の維持・回復に対して理学療法・装具療法を行う。また、関節破壊により日常生活が不自由になった場合には、手術療法を行う場合もある。
【０００５】
特許文献２では、本願発明者らが、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、関節リウマチの疾患遺伝子が位置する３カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定している。
（１）ヒト第１染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ１Ｓ２１４および／またはＤ１Ｓ２５３がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
（２）ヒト第８染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
（３）ヒトＸ染色体の、マイクロサテライトマーカーＤＸＳｌ００１、ＤＸＳ１０４７、ＤＸＳ１２０５、ＤＸＳ１２２７および／またはＤＸＳ１２３２がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
【０００６】
また、非特許文献２には、本願発明者らが、前記先願発明の各疾患関与遺伝子にうち、前記（１）の疾患関与遺伝子に関係するマーカーＤ１Ｓ２１４およびＤ１Ｓ２５３の疾患関与遺伝子として、デスレセプター３（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３：「ＤＲ３」または「ＤＲ３遺伝子」ともいう）を挙げ、健常人とＲＡ患者との間にＤＲ３の制限断片長多型を確認し、ＤＲ３がＲＡにおける疾患関与遺伝子である可能性を示唆している。
【０００７】
さらに、特許文献３では、本願発明者らが、ＤＲ３遺伝子のゲノム変異と関節リウマチ（慢性関節リウマチ）発症との関係について開示している。
【特許文献１】特開平１０−５１３２５７号（公開日：平成１０年１２月１５日）
【特許文献２】国際公開ＷＯ９８／５１７９１号（国際公開日：１９９８年１１月１９日）
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／３４９１２（国際公開日：２００２年５月２日）
【非特許文献１】治療、第７３巻、第３号、第２３〜２７頁、１９９１年
【非特許文献２】リウマチ、第３９号、第２号、第４４４頁および第４４５頁（１９９９年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、種々の自己免疫疾患について積極的な研究成果が数多く報告されているが、自己免疫疾患（特に、関節リウマチ）の発症を客観的に診断する技術は未だ十分に確立されているとはいえない。このため、関節リウマチをはじめとする自己免疫疾患の発症についての客観的かつ正確な診断に寄与できる、新たな技術の確立が強く望まれていた。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、関節リウマチの発症について、客観的かつ正確な診断を可能とするための因子、ならびに当該因子を用いる診断キット、診断方法および薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＲＡの疾患遺伝子の１つとして同定したＤＲ３（デスレセプター３）の４ヶ所のＳＮＰ（それぞれＳＮＰａ、ＳＮＰｃ、ＳＮＰｄ、およびＳＮＰｅ）および１４塩基の欠損が、関節リウマチ（ＲＡ）家系発症例において有意に観察されることを見出している（特許文献３を参照のこと）。中でも、ＳＮＰｄは、機能変異を伴うＤＲ３スプラインシングバリアントを産生することが示唆されている。しかし、このようなスプライシングバリアントがどのような機序に基づいて産生されるのかは未だ不明である。そこで、本発明者らは、上記バリアントの産生機構を解明することを目的として、ＤＲ３の変異領域に結合する因子の探索を試みた。具体的には、４つのＳＮＰ（ＳＮＰａ、ＳＮＰｃ、ＳＮＰｄ、およびＳＮＰｅ）に関する多型部位における正常型配列または変異型配列をそれぞれ含むオリゴヌクレオチドプローブを作製し、ＤＲ３遺伝子に対するゲルシフト法によって、ＤＲ３変異領域に結合する因子の存在を検討した。
【００１１】
その結果、ＳＮＰｄを含むプローブを用いた場合でのみバンドシフトが認められ、ＳＮＰｄに対して特異的に結合する因子が存在することが示された。
【００１２】
このように、本発明者らは、ＤＲ３ゲノムＤＮＡにおけるｄ領域に結合する因子が存在することを見出し、当該因子がＤＲ３スプライシングバリアントを産生させる要因の１つであることを示した。また、当該因子を用いることによって、被験体または被験体由来のサンプル（例えば、細胞）における、ＤＲ３の変異に基づくＲＡの発症またはその発症可能性を判定することができることを見出した。さらに、当該因子が、関節リウマチの新たな予防法、治療法および治療薬剤としても有用であることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
【００１３】
本発明に係るポリペプチドは、ＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合することを特徴としている。
【００１４】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに結合することを特徴としている。
【００１５】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに結合しないことが好ましい。
【００１６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、上記のポリヌクレオチドを備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、上記のポリペプチドを用いることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、上記のポリヌクレオチドを用いることを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る薬剤は、関節リウマチを治療するために、上記のポリペプチドを含むことを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る薬剤は、関節リウマチを治療するために、上記のポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るスクリーニングキットは、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを備えることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係るスクリーニングキットは、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えることが好ましい。
【００２５】
本発明に係るスクリーニング方法は、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることを特徴としている。
【００２６】
本発明に係るスクリーニングキットは、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ヒト関節リウマチの発症のメカニズムの解明に有効に利用することができる。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、関節リウマチの診断、関節リウマチの発症可能性の判定、関節リウマチの適切な治療薬剤の開発に利用することができる。
【００２８】
また、本発明に係る関節リウマチの診断キットおよび診断方法によれば、関節リウマチの発症、または、その発症可能性の判定を、高精度かつ簡便に行うことができる。それゆえ、関節リウマチの予防および治療に役立てることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明者らは、特許文献３に示すように、被験者から得られた細胞において、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＲ３のゲノムＤＮＡ配列中の下記の変異を見出している：
（ａ）第１７５５位の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換（ＳＮＰａ）；
（ｂ）第２４４３〜２４５６位の塩基の欠損；
（ｃ）第２５３１位の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換（ＳＮＰｃ）；
（ｄ）第２６７８位の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）への置換（ＳＮＰｄ）；および
（ｅ）第２８２６位の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換（ＳＮＰｅ）。
【００３０】
図１に示すように、第１７５５位の塩基は、ＤＲ３ゲノムＤＮＡのエキソン領域（エキソン５）内にあり、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＤＲ３ポリペプチドにおいては、上記（ａ）の変異に伴って第１５９位のアミノ酸のアスパラギン酸からグリシンへ変異する。一方、上記（ｂ）〜（ｅ）の変異は、ＤＲ３ゲノムのイントロン領域にある。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「ａ領域」は、ＤＲ３のゲノムＤＮＡにおける上記（ａ）の変異を含む領域が意図される。用語「ｂ領域」〜「ｅ領域」もまた、本明細書中で同様に使用される。
【００３２】
ａ領域は、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列の第１７４４〜１７６７位からなり、より好ましくは、配列番号３に示される塩基配列からなる。ａ領域におけるＳＮＰ（ＳＮＰａ）は、配列番号１に示される塩基配列の第１７５５位の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）に置換されている（配列番号４）。ｃ領域は、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列の第２５２０〜２５４３位からなり、より好ましくは、配列番号５に示される塩基配列からなる。ｃ領域におけるＳＮＰ（ＳＮＰｃ）は、配列番号１に示される塩基配列の第２５３１位の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に置換されている（配列番号６）。ｄ領域は、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列の第２６６７〜２６９０位からなり、より好ましくは、配列番号７に示される塩基配列からなる。ｄ領域におけるＳＮＰ（ＳＮＰｄ）は、配列番号１に示される塩基配列の第２６７８位の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に置換されている（配列番号８）。ｅ領域は、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列の第２８１５〜２８３８位からなり、より好ましくは、配列番号９に示される塩基配列からなる。ｅ領域におけるＳＮＰ（ＳＮＰｅ）は、配列番号１に示される塩基配列の第２８２６位の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）に置換されている（配列番号１０）。
【００３３】
塩基配列に関して本明細書中で使用される場合、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。また、転写産物とは、ゲノムが転写および翻訳される結果として生じる産物であり、たとえば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびタンパク質（ポリペプチド）などが挙げられる。
【００３４】
配列番号１に示される塩基配列の第１７５５位の塩基は、ｃＤＮＡとしてジーンバンクに登録されている配列（アクセッション番号ＮＭ＿００３７９０）の５６４番目の塩基に相当する。このゲノムＤＮＡのエキソン５の３’末端の塩基を基準とし、一塩基後のイントロンの塩基を１番目とすると位置２４４３〜２４５６の欠損は、エキソン５の３’末端から６２２〜６３５番目の塩基の欠損に相当する。また、エキソン６の５’末端の塩基を基準とし、一塩基前のイントロンの塩基番号を−１番目とすると、位置２５３１の変異は、−５３８番目、位置２６７８の変異は−３９１番目、位置２８２６の変異は−２４３番目の塩基に相当する（図１）。なお、Ｔが２８塩基連続する領域（位置２４４３〜２４７０）においては、その数が３塩基分増減する可能性があり、変異型ゲノムのＴが１４塩基連続する領域も同様にしてその数が３塩基分増減する可能性がある。
【００３５】
以下、本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３６】
〔１〕ポリペプチド
本発明は、ＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合するポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに結合することが好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに結合するが、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドに結合しないことが好ましい。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよい。
【００３８】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００３９】
本発明に係るポリペプチドは、天然の細胞もしくは組織由来の精製産物、化学合成手順の産物、または原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生されることが好ましい。
【００４０】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、被験体由来の細胞または組織の抽出液から精製されることが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞または組織から細胞抽出液（例えば、核抽出液）を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。
【００４１】
使用する細胞は、公知の方法に従って被験体の全ての細胞（例えば、末梢リンパ球、滑膜細胞、および各臓器など）から得ることができる。得られた細胞は、適宜、培養し、増殖させて利用することができる。好ましい細胞としては、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＴＦ−１細胞、ＭＯＬＴ４細胞などが挙げられる。
【００４２】
また、本発明に係るポリペプチドは、ＤＲ３シグナル伝達に関与することが示唆される。従って、使用する細胞を、ＤＲ３シグナル伝達経路を駆動するために刺激することが好ましい。刺激に利用する試薬としては、例えば、デスレセプターのリガンド（例えば、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦ、ＤＲ３リガンドなど）、抗Ｆａｓ抗体、アクチノマイシンＤ、放射線、グルココルチコイド、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などが挙げられるがこれらに限定されない。また、これらを２種以上組合わせて利用してもよい。これらの試薬のうち、好ましくは、ＤＲ３リガンド、ＰＭＡ、およびＰＨＡ、より好ましくは、ＤＲ３リガンドである。
【００４３】
試薬を添加する時間は、特に限定されないが、例えば、１時間〜７２時間程度であればよく、好ましくは、１２〜４８時間であればよい。また、刺激を与えないコントロール細胞を用意する必要がある。
【００４４】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、発現させた細胞または組織などから単離精製されてもよい。
【００４５】
上記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために、種々のベクターが使用され得る。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００４６】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００４７】
上記選択マーカーを用いれば、上記ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００４８】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【００４９】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００５０】
また、本実施形態に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【００５１】
遺伝子が細胞に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換細胞からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００５２】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００５３】
本発明に係るポリペプチドは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するため方法およびキット、ならびに関節リウマチを治療するための薬剤において有用である。
【００５４】
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、ＤＲ３遺伝子のｄ領域（好ましくは、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）に結合するポリペプチドであればよいといえる。すなわち、当該ポリペプチドが、特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドと連結されている場合もまた本発明に含まれることに留意すべきである。また、当該ポリペプチドおよび当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００５５】
つまり、本発明の目的は、ＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるポリペプチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００５６】
〔２〕ポリヌクレオチド
本発明は、本発明に係る上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「遺伝子配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００５７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（例えば、本発明に係るＤＲ３結合タンパク質をコードするｃＤＮＡ全長からなるポリヌクレオチド）の切断フラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００５８】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００５９】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００６０】
つまり、本発明の目的は、ＤＲ３のｄ領域に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００６１】
〔３〕診断キットおよび診断方法
本発明は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キットを提供する。本明細書中で使用される場合、関節リウマチの「発症可能性」とは、関節リウマチ（ＲＡ）が発生する危険度を示す指標をいい、発症可能性が高ければそれだけＲＡになりやすく、逆に発症可能性が低ければＲＡになり難いということを示す。一実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に係るポリペプチドを備えることが好ましい。他の実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に係るポリヌクレオチドを備えることが好ましい。また、本発明に係る診断キットは、他の試薬を併せて備えてもよい。
【００６２】
本発明はまた、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に係るポリペプチドを用いることが好ましい。他の実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に係るポリヌクレオチドを用いることが好ましい。また、本発明に係る診断方法は、他の工程を包含してもよい。
【００６３】
本発明に係る診断（判定）キットおよび診断（判定）方法を使用することにより、ＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
【００６４】
〔４〕治療薬剤および治療方法
本発明は、関節リウマチを治療するための薬剤を提供する。一実施形態において、本発明に係る治療薬剤は、本発明に係るポリペプチドを含むことが好ましい。他の実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に係るポリヌクレオチドを含むことが好ましい。また、本発明に係る診断キットは、薬学的に受容可能なキャリアを併せて含んでもよい。
【００６５】
本発明はまた、関節リウマチを治療するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る治療方法は、本発明に係るポリペプチドを用いることが好ましい。他の実施形態において、本発明に係る治療方法は、本発明に係るポリヌクレオチドを用いることが好ましい。また、本発明に係る治療方法は、他の工程を包含してもよい。
【００６６】
本発明に係る治療薬剤および治療方法を使用することにより、ＲＡを有意に治療することができる。
【００６７】
〔５〕スクリーニングキットおよびスクリーニング方法
本発明は、ＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合するポリペプチドをスクリーニングするためのスクリーニングキットを提供する。一実施形態において、本発明に係るスクリーニングキットは、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを備えることが好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係るスクリーニングキットは、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに備えることが好ましい。
【００６８】
本発明はまた、ＤＲ３遺伝子のｄ領域に結合するポリペプチドをスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供する。一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることが好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをさらに用いることが好ましい。
【００６９】
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７０】
〔実施例１：ＤＲ３遺伝子の変異領域ａ、ｃ、ｄ、ｅに対するオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフト法による解析〕
本発明者らは、４つのＳＮＰ（ＳＮＰａ、ＳＮＰｃ、ＳＮＰｄ、およびＳＮＰｅ）に関する正常型配列または変異型配列をそれぞれ含む２４ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブを作製し、ＤＲ３遺伝子に対するゲルシフト法によって、ＤＲ３変異領域に結合する因子の存在を検討した。
【００７１】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（２×１０６細胞）を、２０ｎｇ／ｍｌ  ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）および１μｇ／ｍｌ  フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）によって刺激（または未刺激）した。
【００７２】
刺激２４時間後、上記の細胞を５００μｌの低張緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μＭ  ロイペプチン、１μＭ  アプロチニン）に懸濁し、氷冷下にて１０分間放置した。さらに、１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）５μｌを添加して、氷冷下にて２０分間インキュベートした後、２，０００×ｇで３分間遠心分離して核画分を得た。
【００７３】
この核画分に２００μｌの溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１０％グリセロール、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μＭ  ロイペプチン、１μＭ  アプロチニン）を添加して、氷上で３０分間振盪した後に１５，０００×ｇで１５分間遠心分離して得た上清を核抽出液とした。
【００７４】
４つのＳＮＰ（ＳＮＰａ、ＳＮＰｃ、ＳＮＰｄ、およびＳＮＰｅ）に関する多型部位における正常型配列または変異型配列をそれぞれ含む２４ｂｐのオリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００７５】
【化１】
2006067829.tif 000003
【００７６】
これらのプローブを、ＤＩＧ−１１−ｄｄＵＴＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて末端標識して、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識２本鎖オリゴヌクレオチドプローブを得た。
【００７７】
２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１０％グリセロール、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μｇ  ＢＳＡ、０．５μｇ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）（アマシャムバイオサイエンス社）を含む全量２０μｌの反応系において、核抽出液５μｇおよび上記ＤＩＧ標識２本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（各０．５ｐｍｏｌｅ）を反応させた。
【００７８】
反応後のサンプルを、１×ＴＧＥ緩衝液（ｐＨ８．５）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３８０ｍＭ  グリシン、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸）を用いて、４％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した後、ナイロンメンブレンプラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）に転写した。ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドを転写したメンブレンを、アルカリホスファターゼ標識Ｆ（ａｂ）２抗ＤＩＧ抗体（ロシュ・ダイアグノスティックス社）と反応させた後、１００μｇ／ｍｌ  ＣＳＰＤ基質（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた化学発光反応によって可視化した（図２）。
【００７９】
その結果、ＳＮＰｄを含むプローブでのみバンドシフトが認められ、ＳＮＰｄに対して特異的に結合する因子が存在することが示された。この因子は、ＳＮＰｄを含む変異型配列と比較して正常型配列に強く結合し、この結合は、細胞をＰＨＡおよびＰＭＡによって刺激することによってさらに増強した（図２）。
〔実施例２：ＵＶクロスリンク法を用いたｄ領域結合タンパク質の分子量の解析〕
未刺激のＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０６細胞）を、５００μｌの低張緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カリウム、０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μＭ  ロイペプチン、１μＭ  アプロチニンを含む）に懸濁した後、氷冷下で１０分間放置した。さらに、１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）５μｌを加え、氷冷下で２０分間インキュベートした後、２０００×ｇにて３分間遠心した。核分画を回収し、２００μｌの溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１０％  グリセロール、４２０ｍＭ  塩化ナトリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、０．２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μＭロイペプチン、１μＭアプロチニンを含む）を加え、氷上で３０分間振湯した後、１５０００×ｇにて１５分間遠心した。得られた上清を核抽出液とした。
【００８０】
ｄ領域に対するビオチン標識２本鎖ＤＮＡプローブ（配列番号７および８）を、Ｐｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（アンビオン社製）を用いて標識した。全量２０μｌの反応系において、上記核抽出液５μｇおよび４０ｆｍｏｌの上記プローブを含む反応液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  塩化亜鉛、１２．５％  グリセロール）を室温で２０分間反応させた。
【００８１】
反応後のサンプルにＵＶ光（２５４  ｎｍ）を氷冷下に１０分間照射し、次いで１００ｍＭ  硫酸マグネシウム、１００ｍＭ  塩化カルシウムを各２μｌ加えた。さらに、デオキシリボヌクレアーゼＩ（和光純薬工業社製）５μｇおよびミクロコッカルヌクレアーゼ（フェルメンタス社製）１ｕｎｉｔを加えた後、３７℃で３０分間反応させた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−サンプル緩衝液（０．０６２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％  ＳＤＳ、５％  β−メルカプトエタノール、１０％  グリセロール、０．００２％  ブロモフェノールブルーを含む）を加えて反応を停止し、９５℃で５分間加熱して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）のサンプルとした。
【００８２】
得られたサンプルをビオチン標識分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社製）とともに、７．５〜１５％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（バイオクラフト社製）にて、常法に従って泳動した。泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離したサンプルを、ナイロンメンブレン  プラスチャージ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）に転写した。ビオチン標識ＤＮＡプローブをアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（アンビオン社製）と反応させた後、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ基質（アンビオン社製）を用いた化学発光反応によって可視化して、目的蛋白質を検出した。
【００８３】
〔実施例３：ｄ領域結合タンパク質のアフィニティー精製〕
未刺激のＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０６細胞）を、５００μｌの低張緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  塩化カリウム、０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μＭ  ロイペプチン、１μＭ  アプロチニンを含む）に懸濁した後、氷冷下で１０分間放置した。さらに、１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）５μｌを加え、氷冷下で２０分間インキュベートした後、２０００×ｇにて３分間遠心した。核分画を回収し、２００μｌの溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１０％  グリセロール、４２０ｍＭ  塩化ナトリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、０．２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、０．５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μＭロイペプチン、１μＭアプロチニンを含む）を加え、氷上で３０分間振湯した後、１５０００×ｇにて１５分間遠心した。得られた上清を核抽出液とした。
【００８４】
１００μｌの５０％ストレプトアビジン−アガロースビーズ溶液に洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  塩化カリウム、０．０１％  ＮＰ−４０を含む）を加えて、ビーズを洗浄した。ブロッキング緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、３００ｍＭ  塩化カリウム、０．０１％  ＮＰ−４０、０．５ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン（ＢＳＡ））を加えて、４℃で３０分間反応させた後、洗浄緩衝液でビーズを洗浄し、１００μｌの洗浄緩衝液中に懸濁した。
【００８５】
全量１００μｌの反応系において、得られたビーズ懸濁液２０μｌと１μｇのｄ領域を３回繰り返したビオチン末端標識２本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号７および８）を含む反応液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  塩化カリウム、０．０１％  ＮＰ−４０、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む）を４℃で１時間反応させた。
【００８６】
次いで、結合緩衝液１（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭ  塩化カリウム、２ｍＭ  塩化マグネシウム、０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、１０％  グリセロール、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてビーズを洗浄し、２０μｌの結合緩衝液１に懸濁した。全量２００μｌの反応系において、得られたビーズ懸濁液２０μｌと核抽出液１００μｇを含む結合緩衝液２（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭ  塩化カリウム、２ｍＭ  塩化マグネシウム、０．５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、１０％  グリセロール、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０、５０ｎｇ／μｌ  Ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ）（アマシャムバイオサイエンス社製）、０．２μｇ／μｌ牛血清アルブミン）を４℃で３０分間反応させた。
【００８７】
反応後に、結合緩衝液１でビーズを洗浄し、蛋白抽出緩衝液（５８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、６％  グリセロール、１．７％  ＳＤＳ、０．００２５％  ブロモフェノールブルー、０．８％  β−メルカプトエタノールを含む）を加えて、９５℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）のサンプルとした。得られたサンプルをプロテインマーカー（アプロサイエンス社製）とともに７．５〜１５％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（バイオクラフト社製）にて、常法に従って泳動した。泳動後、分離したタンパク質を、銀染色ＩＩキットワコー（和光純薬工業）を用いて銀染色して、目的蛋白質を検出した。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、関節リウマチの発症のメカニズムの解明に有効に利用することができる。また、本発明を用いれば、関節リウマチの発症またはその発症可能性を高精度に簡便かつ確実に診断（検出）することができる。それゆえ、本発明は関節リウマチの予防および治療の分野において、高い利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ＤＲ３ゲノム配列におけるＳＮＰの部位を示す図である。
【図２】図２は、４つのＳＮＰ（ＳＮＰａ、ＳＮＰｃ、ＳＮＰｄ、およびＳＮＰｅ）に関する正常型配列または変異型配列をそれぞれ含むオリゴヌクレオチドプローブを用いたゲルシフト法の結果を示す図である。
【図１】
2006067829.tif 000004
【図２】
2006067829.tif 000005
【配列表】
2006067829000001.app