(57)【要約】      （修正有）【課題】  ポリリン酸化合物を特異的に且つ効率よく捕捉し検出する化合物の提供。【解決手段】  下記式で表されるサイクレン環含有錯体とルテニウムなどリンカー原子よりなる超分子錯体。2006290783.tif 000014  式中、Ａ1及びＡ2は、リンカー原子に配位可能な含窒素環を表す。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で表されるサイクレン環含有超分子錯体。
Ｘ（Ｚ）m  ・・・・（Ｉ）
（式中、Ｘは、ルテニウム、ロジウム、鉄、ニッケル、コバルト、ランタノイドイオンからなる群から選択されたリンカー原子であり、Ｚは、含窒素環を介してリンカー原子に配位する下記式（II）で表されるサイクレン環含有錯体であり、ｍは２から３までの整数を表す。）
【化１】
2006290783.tif 000009
（式（II）中、Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立に、リンカー原子に配位可能な少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員の含窒素環を表し、ｐ及びｑは、それぞれ独立に１〜２の整数を表す。）
【請求項２】
前記リンカー原子がルテニウムであることを特徴とする請求項１記載の超分子錯体。
【請求項３】
前記Ｚが下記式（III）で表される化合物であり、且つ前記ｍが３であることを特徴とする請求項１又は２記載の超分子錯体。
【化２】
2006290783.tif 000010
【請求項４】
下記一般式で表されるポリリン酸化合物検出用プローブ。
Ｘ（Ｚ）m  ・・・・（Ｉ）
（式中、Ｘは、ルテニウム、ロジウム、鉄、ニッケル、コバルト、ランタノイドイオンからなる群から選択されたリンカー原子であり、Ｚは、含窒素環を介してリンカー原子に配位する下記式（II）で表されるサイクレン環含有錯体であり、ｍは２から３までの整数を表す。）
【化３】
2006290783.tif 000011
（式（II）中、Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立に、リンカー原子に配位可能な少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員の含窒素環を表し、ｐ及びｑは、それぞれ独立に１〜２の整数を表す。）
【請求項５】
前記リンカー原子がルテニウムであることを特徴とする請求項４記載のポリリン酸化合物検出用プローブ。
【請求項６】
前記Ｚが下記式（III）で表される化合物であり、且つ前記ｍが３であることを特徴とする請求項４又は５記載のポリリン酸化合物検出用プローブ。
【化４】
2006290783.tif 000012
【請求項７】
イノシトール三リン酸検出用である請求項４乃至６のいずれか１項記載のポリリン酸化合物検出用プローブ。
【請求項８】
請求項４記載のポリリン酸化合物検出用プローブを用いてポリリン酸化合物を検出するポリリン酸化合物検出方法。
【請求項９】
下記一般式（Ｉ）で表されるサイクレン環含有超分子錯体を含むシグナル伝達阻害剤。
Ｘ（Ｚ）m  ・・・・（Ｉ）
（式中、Ｘは、ルテニウム、ロジウム、鉄、ニッケル、コバルト、ランタノイドイオンからなる群から選択されたリンカー原子であり、Ｚは、含窒素環を介してリンカー原子に配位する下記式（II）で表されるサイクレン環含有錯体であり、ｍは２から３までの整数を表す。）
【化５】
2006290783.tif 000013
（式（II）中、Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立に、リンカー原子に配位可能な少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員の含窒素環を表し、ｐ及びｑは、それぞれ独立に１〜２の整数を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超分子錯体、ポリリン酸化合物検出用プローブ及びそれを用いたポリリン酸化合物検出方法並びに、シグナル伝達阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリリン酸化合物、特にイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）には、細胞内シグナル伝達機構において重要なセカンドメッセンジャーの１つである。原形質膜に局在するホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ2）の特徴的なホルホリパーゼＣ（ＰＬＣ）による加水分解によって、ＩＰ3が放出され、生細胞におけるカルシウムイオン（Ｃａ2+）濃度の上昇が生じる。種々の細胞現象において細胞内でのシグナル伝達機構の詳細を解明するために、ＩＰ3の挙動等についての詳細を把握することは重要である。
今日までに、カルシウムイオンに対する多くの蛍光プローブが開発されており、細胞内の遊離カルシウムイオン濃度の上昇に伴う細胞内現象を研究するために用いられてきた。しかしながら、ＩＰ3は発色団を有していないため、ＩＰ3及び関連するリン酸に対する生物学的及び化学的検知システムはごくわずかしかない。
【０００３】
生物学的ＩＰ3センサーとしては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やフィコシアニン等をＰＬＣδのブレクトストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）に連結させた蛍光プローブが開発されている（特許文献１及び非特許文献１）。これは、原形質膜中のホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ2）及び細胞質中のＩＰ3と結合する。ＰＬＣ仲介ＰＩＰ2加水分解すると、ＩＰ3が生成される。このため、ＰＬＣとＩＰ3との強い結合性を利用したものである。
化学的ＩＰ3センサーとしては、非蛍光レセプターと５−カルボキシフルオレセイン（５−ＣＦ）の組み合わせを用いた置換主体アッセイシステムが開発されている（非特許文献２及び３）。このシステムでは、グアニジニウムカチオンを有するＣ３対称性リセプターが５−ＣＦに強く結合すると共に、ＩＰ3にも結合する。５−ＣＦの蛍光発光は１：１コンプレックスを形成すると増強するが、ＩＰ3が存在すると５−ＣＦがＩＰ3と置換し、蛍光発光が弱くなって、この減少幅からＩＰ3の検出が可能となる。
【特許文献１】特開２０００−６０５６５号公報
【非特許文献１】Science, 1999, Vol.284, p.1527-1530
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc., 1998, Vol.120, 8533-8534
【非特許文献３】Chem. Biol., 2002, Bol.9, p.829-838
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＰＬＣδを用いた生物学的ＩＰセンサーでは、ＩＰ3を直接的に検出しているが、ＩＰ3結合時と非結合時で蛍光が変化しないためＩＰ3を確実に捕捉しているか不明確という問題がある。また、ＩＰ3だけでなく、ＰＩＰ2などにも結合し、基質選択性に欠ける。一方、従来の化学的センサーは、直接ＩＰ3を検出するものではない。
従って、本発明の目的は、ポリリン酸化合物を直接かつ選択的に捕捉し精度よく検出可能な検出用プローブ及び検出方法を提供することである。また、このような化合物を利用したシグナル伝達阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の超分子錯体は、下記一般式（Ｉ）で表されるものである。
Ｘ（Ｚ）m    ・・・・（Ｉ）
式中、Ｘは、ルテニウム、ロジウム、鉄、ニッケル、コバルト、ランタノイドイオンからなる群から選択されたリンカー原子であり、Ｚは、含窒素環を介してリンカー原子に配位する下記式（II）で表されるサイクレン環含有錯体であり、ｍは２から３までの整数を表す。
【０００６】
【化１】
2006290783.tif 000002
【０００７】
式（II）中、Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立に、リンカー原子に配位可能な少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員の含窒素環を表し、ｐ及びｑは、それぞれ独立に１〜２の整数を表す。
また、前記サイクレン環錯体において、前記Ｚが下記式（III）で表される化合物であり、且つ前記ｍが３であることが好ましい。
【０００８】
【化２】
2006290783.tif 000003
【０００９】
本発明のポリリン酸化合物検出用プローブは、上記一般式（Ｉ）で表されるものである。
本発明のポリリン酸化合物の検出方法は、上記一般式（Ｉ）で表されるポリリン酸化合物検出用プローブを用いることを特徴としている。
本発明のシグナル伝達阻害剤は、上記一般式（Ｉ）で表されるサイクレン環含有超分子錯体を含むものである。
【００１０】
本発明の超分子錯体は、複数のサイクレン環含有錯体が、サイクレン環に連結された含窒素環の窒素原子を介してリンカー原子（Ｘ）に配位することにより、超分子を形成したものである。この超分子では、サイクレン環含有錯体をリンカー原子で束ねたような形態を採り、分子の一方の面（例えば上面又は下面）にサイクレン環含有錯体の数に応じたサイクレン環が配置する（図１参照）。サイクレン環含有錯体には、亜鉛（II）イオンが含まれており、この亜鉛（II）イオンがリン酸基に対して強い結合力を有している。一方、リンカー原子は、いずれも発光性または発色性をもつ原子である。この結果、本発明の超分子錯体は、複数のリン酸基を有するポリリン酸化合物に対して選択性の高い強力な検出用プローブとして用いることができる。
また、本発明の超分子錯体はリン酸基に対して強い結合力を有するので、細胞内シグナル伝達機構における重要な役割を担っているイノシトール三リン酸（ＩＰ3）などのポリリン酸化合物に対して強く結合し、その作用を阻害する。その結果、シグナル伝達そのものを阻害することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ポリリン酸化合物を特異的に且つ効率よく捕捉し、精度よく検出することができる新規な超分子錯体、検出用プローブ及び検出方法、並びにこのような化合物を利用したシグナル伝達阻害剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の超分子錯体は、下記一般式（Ｉ）で表されるものである。
Ｘ（Ｚ）m  ・・・・（Ｉ）
式中、Ｘは、ルテニウム、ロジウム、鉄、ニッケル、コバルト、ランタノイドイオンからなる群から選択されたリンカー原子であり、Ｚは、含窒素環を介してリンカー原子に配位する下記式（II）で表されるサイクレン環含有錯体であり、ｍは２から３までの整数を表す。
本超分子錯体は、式中Ｚで表される複数の超分子錯体を、リンカー原子によって連結した構造を有している（図１参照）。
【００１３】
式中、Ｚは、含窒素環を介してリンカー原子に配位する下記式（II）で表されるサイクレン環含有錯体である。
【００１４】
【化３】
2006290783.tif 000004
【００１５】
上記式（II）中、Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立に、５又は６員、合成効率および発光・発色特性の観点から好ましくは６員の含窒素環であり、環におけるそれぞれ少なくとも１個の窒素原子はリンカー原子に配位する。Ａ1及びＡ2は、ヘテロ原子を含んでもよく、ヘテロ原子としては例えば硫黄を挙げることができる。少なくとも１個の窒素原子を含む５又は６員環としては、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、トリアジン、チアゾール、トリアゾールを挙げることができるが、合成効率及び生理活性の観点からピリジンであることが好ましい。また、Ａ1とＡ2はそれぞれ、隣接する連結部又は環とパラ−、メタ−、オルト−の各位置で結合することができるが、生理活性、特に、ＩＰ3認識のための構造的な要請から、パラ位であることが好ましい。
Ａ1及びＡ2は同じであっても異なってもよいが、合成効率の観点から同じであることが好ましい。
また式（II）中のｐ及びｑは、本発明の化合物における連結部の長さを決定する繰り返し単位の数であり、それぞれ独立に、合成効率及び生理活性の観点から１〜２の整数を示し、合成効率、ＩＰ3に対する選択的識別の観点から１であることが特に好ましい。
超分子錯体に含まれる複数のサイクレン環含有錯体は互いに、同一であっても異なってもよい。
【００１６】
このようなサイクレン環含有錯体としては、下記式（III）で表されるものが、ＩＰ3に対する選択的識別のための構造的要請から望ましい。
【００１７】
【化４】
2006290783.tif 000005
【００１８】
一般式（Ｉ）中、Ｘはリンカー原子を表す。本発明の錯体におけるリンカー原子は、上記式（II）のサイクレン環含有錯体における含窒素環の窒素原子に配位して、超分子錯体の中心に配置される。このようなリンカー原子は、ルテニウム、ロジウム、鉄、ニッケル、コバルト、ランタノイドイオンからなる群から選択されたものであり、いずれも発光性又は発色性の原子である。このようなリンカー原子のうち、蛍光又はリン光発光能を有するルテニウム、ロジウム、ランタノイドが好ましく、発光能の高さからルテニウムが特に好ましい。
【００１９】
一般式（Ｉ）中、ｍは、本発明の超分子錯体におけるサイクレン環含有錯体の数に相当するものであり、発光能の高さから２から３までの整数を表す。このサイクレン環含有錯体は、サイクレン環の亜鉛イオンがリン酸基と配位結合することによって、リン酸基に対する強い結合力を発揮する。このためサイクレン環含有錯体の数は、標的とするポリリン酸化合物のリン酸基の数と一致させることが好ましい。特に、シグナル伝達機構に重要な役割を果たすイノシトール三リン酸（ＩＰ3）を標的とする場合には、式中ｍが３である化合物にすることが最適である。
なお、ｍ＝２の場合には、リンカー原子に配位可能な窒素原子の数（６）を満たすように他の含窒素化合物を組み合わせてもよい。
【００２０】
本発明に係る超分子錯体にはキラリティがあるため、ラセミ体であってもよく、一方の鏡像体（（＋）型又は（−）型）のみとしてもよい。標的とするポリリン酸化合物の種類によっては、ラセミ体よりもどちらかの鏡像異性体のみとすることが好ましく、このような場合には、標的とするポリリン酸のキラリティにあわせた（＋）型又は（−）型のみを用いることによって、一層、精度よくポリリン酸の検出を行うことができる。鏡像体としての本発明に係る超分子錯体の一例を以下に挙げる。
【００２１】
【化５】
2006290783.tif 000006
【００２２】
本発明に係るサイクレン環含有超分子錯体は、例えば以下のようにして合成することができる。
まず、２，２’−ビピリジル誘導体と、４つの窒素原子のうち３つをｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護されたサイクレン誘導体とを反応させ、脱保護した後、亜鉛（II）イオンを加えることにより、サイクレン環含有錯体（Ｚｎ2Ｌ4）を得る。次いで、得られたサイクレン環含有錯体（Ｚｎ2Ｌ）に、ハロゲン化ルテニウム化合物またはその誘導体を加熱しながら添加し、サイクレン環含有錯体とルテニウム化合物を３：１で反応させ、本発明の超分子錯体（Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3）を得ることができる。
或いは、保護基を有するサイクレン環含有錯体をそのまま、ハロゲン化ルテニウム化合物と３：１で反応させた後に脱保護を行い、本発明の超分子錯体を得ることもできる。
【００２３】
本発明の超分子錯体は、サイクレン環とリン酸基との結合性が高く、またリンカー原子によって発光・発色能が発揮されるため、ポリリン酸化合物検出用プローブとして用いることができる。
超分子錯体では、前述したように、超分子錯体に含まれるサイクレン環含有錯体の数（一般式（Ｉ）中のｍ）に対応したサイクレン環が超分子錯体の一方の面に配置される。この結果、検出対象のポリリン酸化合物を錯体の上面及び下面において合計２つのポリリン酸化合物と結合することができる。
特に、前述したようにサイクレン環含有錯体を３つ有する超分子錯体では、６個のサイクレン環をそれぞれ３つずつ、超分子錯体の一方の面に有する（図１参照）。このとき、この面に配置された３つのサイクレン環間の距離と、３つのリン酸基を有するポリリン酸化合物、特にＩＰ3におけるリン酸基の距離とが一致するため、非常に効率よく、２つのＩＰ3と結合する。従って、本超分子錯体は、このようなポリリン酸化合物、特にＩＰ3に対して精度よい検出用プローブとして非常に有効である。
【００２４】
また本発明のポリリン酸化合物の検出方法は、本発明の超分子錯体を用いることを特徴としている。
これにより、例えば細胞内のポリリン酸を直接、精度よく検出することができる。
ポリリン酸化合物の検出を行うには、上記一般式（Ｉ）で表される超分子錯体を試料に対して適量添加すること及び検出用プローブに応じた指標に基づいて検出をすることによって、容易に検出することができる。例えば、発色性の鉄等の原子をＸ原子として含む検出用プローブの場合には、発色の程度によってポリリン酸化合物を容易に検出することができる。
【００２５】
本検出方法は、好ましくは、超分子錯体添加後の試料に励起光を照射すること、励起光によって励起された発光発色を検出すること、を含む。これにより、発光能を有する原子、即ち、ルテニウム、ロジウム、ランタノイドイオンをリンカー原子として含む検出用プローブを用いて、ポリリン酸化合物を容易に精度よく検出することができる。
【００２６】
ポリリン酸化合物を発光発光によって検出する際には、励起光が照射される。励起光の照射は、通常、蛍光染色に用いられている方法に従って行えばよい。一般的には、上記化合物を細胞に添加後、励起光の照射を行い、照射後に、本発明の検出用プローブの発光を検出することによってポリリン酸化合物を検出することができる。検出用プローブの発光は、超分子錯体の励起光は、生体試料に対してより刺激の少ない長波長の光（４６０ｎｍ）を用いることができ、例えば３００〜４６０ｎｍの励起光を照射すればよい。例えば上記式（III）で表される化合物では、３００ｎｍの励起光を照射することによって、５８４ｎｍの発光を発色することができる。
【００２７】
また、ポリリン酸を検出用試料のｐＨは、ｐＨ６〜１０、好ましくは、ｐＨ６．５〜９とすることができる。この範囲であれば、錯体形成能が良好で、精度よく検出することができる。検出時の温度は、通常の条件をそこまま適用すればよく、例えば、２５℃とすることができる。
【００２８】
本発明のポリリン酸化合物検出用プローブによって検出可能なポリリン酸化合物としては、超分子錯体中のサイクレン環含有錯体の数によって異なるが、前記式（Ｉ）中ｍ＝２の場合には、１，３−シクロヘキサンジオール二リン酸（ＣＤＰ2）、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ2）、ペプチド（例えば、セリン、スレオニン）二リン酸化合物等の二リン酸化合物、ｍ＝３の場合には、イノシトール三リン酸（ＩＰ3）、シクロヘキサントリオール三リン酸（ＣＴＰ）、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ3）等の三リン酸化合物を挙げることができる。
【００２９】
本発明のシグナル伝達阻害剤は、上記式（Ｉ）で表される本発明の超分子錯体を含むものである。
上述したように、本超分子錯体は、ポリリン酸化合物に対して強い結合力を有するので、細胞内に存在し、特定の生理活性を有するポリリン酸化合物に結合すると、その生理活性を阻害することができる。特に、細胞内シグナル伝達機構に関与するポリリン酸に結合することによって、細胞内シグナル伝達機構そのものを阻害することができる。
シグナル伝達阻害剤として用いる場合には、本超分子錯体を、有効量、例えば、１μＭ〜１ｍＭの濃度で試料に添加すればよい。
また、本シグナル伝達阻害剤は、本超分子錯体のみで構成してもよく、対象物の種類によって各種の添加剤を含めてもよい。
【００３０】
本発明の超分子錯体は、ポリリン酸化合物に対して強い結合能を有する検出用プローブ及びシグナル伝達阻害剤等として使用することができるので、細胞内でのＩＰ3の検出や、ＩＰ3による細胞内機構の阻害を含む研究目的又は治療目的を始めとする広い用途で使用することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００３２】
［実施例１］
超分子錯体の合成
本発明の化合物の合成方法を、代表的な化合物を例に、以下に説明する。実施例中の化合物番号は、下記のスキーム中の化合物番号に対応している。
なお、ＩＲスペクトルは、室温でホリバ FTIR-710 スペクトロフォトメータを用いて記録した。油状サンプルのＩＲスペクトルは、ＩＲカード（３Ｍ、タイプ６２、ポリテトラフルオロエチレン１９ｍｍアパチャー）において実施した。１Ｈ（５００MHz）、１３Ｃ（１２５MHz）及び３１Ｐ（２００MHz）ＮＭＲスペクトルは、３５±０．１℃で、JEOL Delta 500 スペクトロメータを用いて記録した。元素分析には、Perkin-Elmer CHN 2400 アナライザーを用いて行った。薄層（ＴＬＣ）及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Merck 5554（シリカゲル） TLC プレート及びFuji silysia Chemical FL-100Dをそれぞれ使用した。
【００３３】
【化６】
2006290783.tif 000007
【００３４】
（Ａ）合成経路１
（１）  ［５，５’−ビス（４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イルメチル］−２，２’−ビピリジン［１６］の合成
１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［１５］（J. Am. Chem. Soc. 1997, Vol.119, p.3068-3076）（３．３ｇ，７．０ｍｍｏｌ）を、５，５’−ビス（ブロモメチル）−２，２’−ビピリジル［１４］（１．１ｇ，３．２ｍｍｏｌ）及びＮａ2ＣＯ3（１．７ｇ，１６．０ｍｍｏｌ）の混合物を、７０℃で一晩撹拌した。不溶性の無機物を濾去した後、濾液を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：３）で分離精製し、無色のアモルファス固体として得た（２．６９ｇ，６３％収率）。
【００３５】
（２）  ［５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イルメチル）−２，２’−ビピリジン］・７ＨＢｒ・５Ｈ2Ｏ（［１７］・７ＨＢｒ・５Ｈ2Ｏ）の合成
４７％のＨＢｒ（３０ｍＬ）をゆっくりと、メタノール（４０ｍＬ）中の［１６］の溶液（２．０ｇ、１．７４ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。室温で一晩撹拌した後、反応液を減圧下で濃縮した。得られた粗粉末を２０％ＨＢｒ水溶液によって結晶化し、無色の粉末として［１７］を得た（１．８５ｇ、９０％収率）。融点：２２１−２２２℃。
【００３６】
（３）  ［５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イルメチル）−２，２’−ビピリジン］（Ｚｎ（ＮＯ3）2）2錯体  ５水和物（［８］・４ＮＯ3・５Ｈ2Ｏ・ＥｔＯＨ）の合成
１７・７ＨＢｒ・５Ｈ2Ｏ（１．６ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の水溶液（１０ｍＬ）を１ＮのＮａＯＨ溶液でｐＨ＞１２に調整した。このアルカリ溶液をＣＨＣｌ3によって抽出した（５０ｍＬ）。複合有機相を無水Ｎａ2ＳＯ4において乾燥し、精製して、減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ（１／１、５ｍＬ）に溶解して、これにエタノール中のＺｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏの溶液を添加した。この溶液を、一晩７０℃で撹拌し、溶媒を留去した後、残渣をＨ2Ｏ／ＥｔＯＨで結晶化して、無色粉末として［８］を得た（１．２ｇ、９０％収率）。融点は２５０℃以上であった。
【００３７】
（４）  トリス［５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イルメチル）］−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（II）二亜鉛（II）錯体（［９］・１４（ＮＯ3）・２１Ｈ2Ｏ・３ＥｔＯＨ、Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3・１４（ＮＯ3）・２１Ｈ2Ｏ・３ＥｔＯＨ］の合成
［８］・４ＮＯ3・５Ｈ2Ｏ・ＥｔＯＨ（０．４ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）と、ＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ（１：１、４０ｍＬ）中のＲｕ（ＤＭＳＯ）4Ｃｌ2（６２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1973, p.204-209）の混合物を８０℃で３日間撹拌した。反応液を冷却して濾過した後、濾過物を減圧下で濃縮した。残渣粉末をＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ（１００ｍｇのＮａＮＯ3を含有）によって１週間にわたり再結晶化して、本実施例にかかる超分子錯体［９］・１４（ＮＯ3）・２１Ｈ2Ｏ・３ＥｔＯＨをオレンジ粉末として得た（１８６ｍｇ、４２％収率）。融点は２５０℃以上。
【００３８】
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ／external TSP）：δ ２．０３（brs、６Ｈ）、２．２５（brs、６Ｈ）、２．４７（brs, ６Ｈ）、２．６２−３．１５（ｍ、７８Ｈ）、３．９１（ｄ、Ｊ＝１４．９Ｈｚ、６Ｈ）、４．００（ｄ、Ｊ＝１４．９Ｈｚ、６Ｈ）、７．８４（ｓ、６Ｈ）、８．２２（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、６Ｈ）、８．７８（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ／、１２５ＭＨｚ、external TSP）：δ ４４．５、４４．８、４６．５、４７．４、５４．８、１２６．９、１３５．７、１４３．９、１５６．２。ＩＲ（ＫＢｒペレット）：３４１０、３２４８、２９２９、２８７７、１６３０、１３８５、１０８８、９７８ｃｍ-1。Anal. Calcd for Ｃ90Ｈ204Ｎ44Ｏ66Ｚｎ6Ｒｕ；Ｃ、３１．７７；Ｈ、５．４９；Ｎ、１７．８５。Found：Ｃ、３１．７７；Ｈ、５．４９；Ｎ、１７．７７）。
【００３９】
［９］の単結晶Ｘ線回折分析では、電位差ｐＨ滴定（ｐＨは７．５に調整）後の０．１MのＮａＮＯ3を含むＲｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3・１４（ＮＯ3）・２１Ｈ2Ｏ・３ＥｔＯＨの水溶液（４３ｍｇ、０．０１２５ｍｍｏｌ）を減圧下で濃縮して、Ｈ2Ｏで再結晶化し、Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3・３（ＨＯ-）・１１（ＮＯ3）・２０Ｈ2Ｏ（２３ｍｇ、５８％）としての［９］のオレンジプリズムを得た。Anal. Calcd for Ｃ84Ｈ187Ｎ41Ｏ56Ｚｎ6Ｒｕ：Ｃ、３１．９２；Ｈ、５．９６；Ｎ、１８．１７。Found：Ｃ、３１．６５；Ｈ、６．１２；Ｎ、１７．８４。Ｘ線結晶解析像を図２に示す。
【００４０】
（Ｂ）合成経路２
（１）  ［１６］からのトリス［５，５’−［（４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イルメチル）］−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（II）二亜鉛（［１８］・Ｃｌ2）の合成
［１６］（１．１５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）とＲｕ（ＤＭＳＯ）4Ｃｌ2（１５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をエタノール（７５ｍＬ）に溶解して、５日間還流し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン：ＡｃＯＥｔで分離精製し、赤色のアモルファス固体として［１８］・Ｃｌ2を得た（１．１ｇ，９７％収率）。
【００４１】
（２）  トリス［５，５’−（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イルメチル）−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（ＩＩ）二臭素２１ＨＢｒ塩（［１９］・Ｂｒ2・２１ＨＢｒ、Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3・Ｂｒ2・２１ＨＢｒ）の合成
４７％のＨＢｒ（５ｍＬ）をゆっくりと、メタノール（２０ｍＬ）中の［１８］・Ｃｌ2の溶液（７８４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、０℃で添加した。室温で一晩撹拌した後、反応液を減圧下で濃縮した。残渣をＨ2Ｏ／ＥｔＯＨで再結晶化して、オレンジの粉末として［１９］・Ｂｒ2・２１ＨＢｒを得た（５５１ｍｇ、７１％収率）。融点：＞２５０℃。
【００４２】
（３）  ［１９］からのトリス［５，５’−ビス（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イルメチル）］−２，２’−ビピリジン］ルテニウム（II）二亜鉛（II）錯体５水和物（［９］・１４（ＮＯ3）・２１Ｈ2Ｏ・３ＥｔＯＨ）の合成
［１９］・Ｂｒ2・２１ＨＢｒ（３５０ｍｇ、０．００９９ｍｍｏｌ）を、イオン交換樹脂（ＩＲＡ−４００、ＨＯ-フォーム）を通して酸フリー型に転換した。得られた酸フリー［１８］をエタノール（１５ｍＬ）に溶かし、この溶液に、エタノール（１０ｍＬ）中のＺｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ（２０６ｍｇ。０．６９ｍｍｏｌ）を添加し、一日室温で撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏで再結晶化して、オレンジの粉末として［９］・１４（ＮＯ3）・２１Ｈ2Ｏ・３ＥｔＯＨを得た（２４６ｍｇ、７２％収率）。
【００４３】
［実施例２］
超分子錯体によるＵＶ吸収
実施例１で合成された超分子錯体（Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3）の蛍光特性について調べた。
ポリリン酸化合物としては、下記に示されるシクロヘキサントリオール三リン酸（ＣＴＰ3）を用いた。ＣＴＰ3は、以下のようにして合成したものを使用した。ジベンジル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（３．７０ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬ）中のｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオール（アルドリッヒ社製、３００ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）及び１−Ｈ−テトラゾール（１．１１２ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加し、３時間後に反応溶液を−４０℃まで冷やし、ｍ−ＣＰＢＡの溶液（２．７７ｇ、１５．０５ｍｍｏｌ）に滴下した。反応溶液を、５％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3水溶液及び飽和ＮａＨＣＯ3で数回洗浄したのちに、有機抽出物を飽和ＮａＣｌで、乾燥して、精製し、得られた有機相を減圧下で除去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフで精製して、無色油状物質としてｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオールのトリス（ジベンジルリン酸）エステル）を得た。この化合物をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、１０%パラジウム-炭素（２０ｍｇ）を加えたのち、水素ガス雰囲気下、室温で１０時間攪拌した。パラジウム-炭素をセライトで濾去した後、濾液を減圧下濃縮した。残渣を極少量の水に溶解し、１ＮのＮａＯＨ水溶液（６等量）を加え、減圧下濃縮し、９３９ｍｇ（８６％）のシクロヘキサントリオール三リン酸（ＣＴＰ3）[２３］を無色粉末化合物として得た。
【００４４】
【化７】
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【００４５】
上記のようにして作成されたＣＴＰ3を、超分子錯体［９］（５０μＭ）に、ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｉ＝０．１（ＮａＮＯ3））及び２５℃の条件下で、反応させて、超分子錯体［９］、即ちＲｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3のＵＶ吸収を調べた。また同様に、３００ｍｍの励起光を照射して、発光を調べた。結果をそれぞれ図３及び図４に示す。
【００４６】
図３に示されるように、超分子錯体［９］は、ＣＴＰ3と結合すること及び、１：２で錯体を形成することが明らかになった（図３（Ｂ））。このことは、本超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3には、上下面にそれぞれ１つずつＣＴＰ3が配位することを示している。ここで、超分子錯体［９］のみの場合（図３において波線）では、４５２ｎｍ（ε452＝１．１×１０4）に吸収極大を示しており、これは、Ｒｕ（ｂｐｙ）3の特徴的なＭＬＣＴ［metal-to-ligand charge transfer、即ち、金属イオンから配位子への電荷移動］に由来する吸収である。ＣＴＰ3の添加によって、吸収極大は、４５２ｎｍから４７０ｎｍに移動する。
また、超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3とＣＴＰ3との錯体化は、図４に示されるように、５８４ｎｍの発光を生じる。このとき、非結合状態での発光が６１０ｎｍであるため、ＣＴＰ3の結合に伴って発光が変化した。このため、蛍光発光のピークを調べることによって精度よくポリリン酸化合物の検出を行うことができることが明らかとなった。また、この発光強度はＣＴＰ3の量に依存して強度が上昇する。従って、定量的な検出についても、本超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3が有効であることが明らかとなった。
【００４７】
［実施例３］
超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3の発光特性
次に、本実施例の超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3と、Ｚｎ2Ｌ（４４０ｎｍ）及びＲｕ（ｂｐｙ）（５９０ｎｍ）とで発光特性の違いを調べた。それぞれ（ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｉ＝０．１（ＮａＮＯ3））及び２５℃の条件下で反応させ、各化合物に対して適切な励起光を照射して、発光強度、本超分子錯体［９］のＣＴＰ3非存在下での５８４ｎｍでの発光強度をＩ0とした相対強度で比較した。
【００４８】
図５に示されるように、ＣＴＰ3の添加によって本超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3は２：１で錯体を形成して発光強度が上昇し、約４倍の強度を示すことが示された。これに対して、この超分子錯体の構成成分であるサイクレン環含有錯体だけでは、本実施例の化合物ほど高い発光強度の上昇はない。このため、５倍量のＣＴＰ3を用いても３倍程度にしか強度の上昇は認められず、効率的ではない。一方、Ｒｕ（ｂｐｙ）3自体は発光化合物として広く認識されているが、ＣＴＰ3の添加に伴って殆ど錯体を形成せず、発光も認められなかった。
【００４９】
従って、本実施例の超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3は、ルテニウム原子をリンカー原子として超分子錯体を構成することによって、ポリリン酸化合物と錯体を効率よく形成すると共に、強く発光することができることが明らかであった。この結果、本実施例の超分子錯体は、ポリリン酸化合物を発光検出する場合に、高いレベルで有効な検出用発光プローブであることが明らかであった。
【００５０】
［実施例４］
次に、超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3とポリリン酸化合物中のリン酸基との関係について調べた。本超分子錯体は、３つのサイクレン環含有錯体とルテニウム原子とで構成されているので、理論上、三リン酸化合物に対して高い親和性を有する。これを確認するために、本超分子錯体［９］（１０μＭ）を一リン酸化合物（フェニルホスフェート、Ｄ−グルコース−６リン酸：白丸）、二リン酸化合物（ＣＤＰ2、Ｄ−フルクトース−１，６二リン酸：白四角）及び三リン酸化合物（ＣＴＰ3：黒丸）と反応させた。それぞれ（ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｉ＝０．１（ＮａＮＯ3））及び２５℃の条件下で、反応させ、３００ｎｍで励起させた。本超分子錯体［９］のＣＴＰ３非存在下での５８４ｎｍでの発光強度をＩ0とした相対強度で比較した。結果を図６に示す。
【００５１】
図６に示されるように、本実施例の超分子錯体は、三リン酸化合物に対して約４倍まで発光強度が上昇する一方で、二リン酸化合物や一リン酸化合物に対する発光強度は、わずかに上昇又は殆ど上昇しないことが示された。このことにより、３つの亜鉛錯体で構成された本実施例の超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3は、三リン酸化合物に対して高い特異性を有することが明らかであった。
【００５２】
［実施例５］
超分子錯体Ｒｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3とイノシトール三リン酸との結合
本実施例の超分子錯体が、ＣＴＰ3以外の他の三リン酸化合物、キラルなＩＰ3に対しても同様に強い結合力を有するか次に調べた。超分子錯体１０μＭと、ＩＰ3（２０μＭ）、ＣＴＰ3（２０μＭ）又はＨＯＰＯ32-（１００μＭ）をそれぞれ、ｐＨ７．４（ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｉ＝０．１（ＮａＮＯ3））及び２５℃の条件下で、反応させて、超分子錯体［９］、即ちＲｕ（Ｚｎ2Ｌ4）3の発光（励起光３６５ｎｍ）を調べた。結果を図７に示す。
【００５３】
図７（Ｂ）に示されるように、ＩＰ3又はＣＴＰ3を添加した場合に顕著な発光が認められ、本実施例の超分子錯体が三リン酸化合物の種類に拘らず強い発光を示すことが明らかとなった。このことは、本実施例の超分子錯体が、三リン酸化合物の検出用発光プローブとして有効であることを示している。
また、ＩＰ3との反応による発光強度は、ＣＴＰ3との反応による発光強度の約半分であることが示された。これは、ＩＰ3がキラリティを有することから、本実施例の超分子錯体（ラセミ体）と反応させたときに、約半数の超分子錯体とのみ結合するためである。このため、ＩＰ3を検出する際には、ＩＰ3のキラリティを認識するのに適したエナンチオマーを用いることが効率的であり精度がよいことを示唆している。
【００５４】
このような本発明の超分子錯体は、リンカー原子を中心に複数のサイクレン環含有錯体と組み合わせて構成されているので、サイクレン環含有錯体の数に応じた種類のポリリン酸化合物を精度よく効率的に検出することができる。
また、本発明の超分子錯体は、ポリリン酸化合物に対して強い結合力を有するので、細胞内に存在し特有の生理活性を有するポリリン酸化合物と結合したときには、ポリリン酸化合物の生理活性を阻害することができる。特に、細胞内シグナル伝達機構で重要な役割を果たしているポリリン酸化合物、特に、ＩＰ3に対して本発明の超分子錯体を用いた場合には、シグナル伝達の阻害剤としても機能することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の超分子錯体の構造特性を概念的に示した模式図である。
【図２】本発明の超分子錯体のＸ線結晶解析像である。
【図３】（Ａ）本発明の実施例にかかる超分子錯体とＣＴＰ3との結合状態を説明するＵＶ吸収スペクトルを示すグラフ、（Ｂ）は（Ａ）の反応時の結合割合を説明するグラフである。
【図４】本実施例にかかる超分子錯体のＣＴＰ3に対する発光特性を説明するグラフである。
【図５】本実施例にかかる超分子錯体と、他の化合物との発光強度の違いを説明するグラフである。
【図６】本実施例にかかる超分子錯体の種々のポリリン酸化合物に対する反応性を説明するグラフである。
【図７】（Ａ）本実施例にかかる超分子錯体とＩＰ3又はＣＴＰ3との混合液の様子を示す写真像、（Ｂ）は（Ａ）に対してＵＶ光を照射したときの発光の様子を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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