(57)【要約】【課題】  新規な作用機序を有し高い阻害活性を有するＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質、及びそれを用いた医薬、機能性食品などを提供すること。【解決手段】  新規ＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質として、南米産薬用植物（Peumus boldus MOLINA.）から下記の式（１）により表される化合物を単離精製した。この化合物は、ＮＥＳ非依存的にＭＡＰＫＫの核外移行を阻害し、かつ高い阻害活性を有することから、抗がん剤などの医薬品に好適に利用できるほか、機能性食品としても有用である。2006206542.tif 000012【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）により表される化合物。
【化１】
2006206542.tif 000010
【請求項２】
下記の式（２）により表される化合物。
【化２】
2006206542.tif 000011
（ただし、ｎは５〜１５の整数である。）
【請求項３】
請求項１記載の式（１）又は請求項２記載の式（２）により表される化合物、あるいはこれらの薬理上許容される塩を有効成分とするＭＡＰＫＫ核外移行阻害剤。
【請求項４】
請求項１記載の式（１）又は請求項２記載の式（２）により表される化合物、あるいはこれらの薬理上許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
【請求項５】
請求項１記載の式（１）又は請求項２記載の式（２）により表される化合物、あるいはこれらの薬理上許容される塩を含有する食用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核外移行シグナル（ＮＥＳ）非依存的な作用によるＭＡＰＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）核外移行阻害物質とその利用に関するものであり、ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きが関係する様々な疾患に対する治療薬・予防薬として、さらには食用組成物（機能性食品）等として利用し得るものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、これまで不明であった核から細胞質へのタンパク質の輸送メカニズムの一端が解明され、核外移行シグナル（ＮＥＳ）を保有する蛋白は、輸送担体ＣＲＭ１と結合して核外へと移行することが判明した（例えば、下記の非特許文献１参照）。
【０００３】
また、大腸ガン、膵臓ガン、腎臓ガン由来の数種の腫瘍細胞で活性化を受けているＭＡＰＫＫ（「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ」、「ＭＥＫ」とも呼ばれる。）がＮＥＳを有しており、細胞質へ輸送された後に機能を発現することが明らかにされた。
【０００４】
これまで、ＭＡＰＫＫの核外移行阻害物質としてleptomycin Bが知られており、同物質は、ＣＲＭ１の５２９番目のシステイン残基に結合し、ＮＥＳとＣＲＭ１との結合を阻害することでＭＡＰＫＫの核外移行を阻害することが判明している。しかしながら、この作用機序とは異なるメカニズムでＭＡＰＫＫの核外移行を阻害する化合物は従来知られていなかった。
【非特許文献１】Kudo, N. et al., Experimental Cell Research, 1998, 242, 540-547頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＭＡＰＫＫは、ＭＡＰキナーゼ系（ＭＡＰキナーゼカスケード）の一員としてＭＡＰキナーゼをリン酸化する。ＭＡＰキナーゼは、様々な転写因子を活性化することにより細胞内の情報伝達に重要な役割を果たし、細胞増殖促進のほか、細胞分化誘導、細胞運動性亢進など多岐にわたる細胞活動に関わっている。
【０００６】
このように、ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰキナーゼ系は生命活動に重要な役割を担っており、多くの疾患がＭＡＰＫＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きに関係していると考えられる。例えば、各種ガンにおいては、癌細胞の増殖はＭＡＰキナーゼ系の働きに依るところが大きいと考えられる。したがって、ＭＡＰキナーゼ系の一員であるＭＡＰＫＫの機能を阻害する物質は、各種ガンに対する治療薬（即ち、抗がん剤・制がん剤）としてガン治療に広く利用できる可能性がある。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、新規なＭＡＰＫＫ阻害物質を提供すること、とりわけ新規な作用機序を有し高い阻害活性を有するＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質、並びにそれを用いた医薬、機能性食品などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように、ＭＡＰキナーゼカスケードが正常に機能するためには、鍵となるＭＡＰＫＫが細胞質内に局在していることが必須である。ＭＡＰＫＫは多くのガン細胞において異常亢進していることが確認されていることから、ＭＡＰＫＫの核外移行を阻害することでＭＡＰキナーゼカスケードを停止させ、細胞増殖を抑制できると考えられる。
【０００９】
ＭＡＰＫＫ核外移行阻害剤である前記leptomycin Bは、ＣＲＭ１に結合してＮＥＳ依存的にＭＡＰＫＫの核外移行を阻害し、ＭＡＰＫＫが活性化された培養腫瘍細胞に選択的な毒性を示した。一方、本発明者らは、ＮＥＳ非依存的なＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質の探索を行い、中央アフリカの薬用植物（Annona senegalensis）より２種のkaurenol類を活性物質として単離した（特願２００３−４１８７９７号）。しかしながら、これらの物質は、核外阻害活性を示すのに比較的高い濃度を要したため、より強力な阻害剤の探索を継続して行ったところ、遂に南米産薬用植物（Peumus boldus MOLINA.）より、約５μＭという低濃度でＮＥＳ非依存性ＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を示す新規化合物を単離精製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、医療上および産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｅ）の発明を包含するものである。
Ａ）  下記の式（１）により表される化合物。
【化３】
2006206542.tif 000002
Ｂ）  下記の式（２）により表される化合物。
【化４】
2006206542.tif 000003
（ただし、ｎは５〜１５の整数である。）
Ｃ）  上記の式（１）又は式（２）により表される化合物、あるいはこれらの薬理上許容される塩を有効成分とするＭＡＰＫＫ核外移行阻害剤。
Ｄ）  上記の式（１）又は式（２）により表される化合物、あるいはこれらの薬理上許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
Ｅ）  上記の式（１）又は式（２）により表される化合物、あるいはこれらの薬理上許容される塩を含有する食用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物は、新規なＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質であり、（１）ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きが関係する種々の疾患に対する治療薬・予防薬として、とりわけ（２）大腸ガン、膵臓ガン、腎臓ガンなど各種ガンにおいて癌細胞の増殖を抑制する抗がん剤（制がん剤）として、さらに、（３）抗がん作用等の効果を有する食用組成物（機能性食品）、（４）ＭＡＰＫＫ核外移行阻害による細胞応答を解析する生化学実験用試薬として効果が見込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
本発明者らは、南米産薬用植物（Peumus boldus MOLINA.）の抽出物から、ＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を有する画分を得た。さらに、得られた画分に含まれる化合物について、その構造を1Ｈ−核磁気共鳴スペクトル法、13Ｃ−核磁気共鳴スペクトル法、および高速電子衝撃質量分析法等により決定したところ、上記式（１）に示す構造の新規化合物（「Peumusolide A」）であると同定した。
【００１３】
上記の新規化合物について、抗ＭＡＰＫＫ抗体を用いて更にＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を調べたところ、約５μＭという低濃度においてＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性が認められた。なお、これら実験方法、実験結果の詳細は後述の実施例において説明する。
【００１４】
さらに、本発明の上記化合物は、ＮＥＳ非依存的にＭＡＰＫＫの核外移行を阻害する（換言すれば、ＣＲＭ１のＮＥＳ認識部位への結合を作用機序とはしない）と考えられる。このことは、以下の知見に基づくものである。即ち、ＮＥＳと競合してＣＲＭ１と結合する化合物をもとに合成したプローブ分子を用いて、細胞抽出物からＣＲＭ１をバンドとして可視的に検出することができるが、このとき、元の化合物を共存させることで競合作用が起き、ＣＲＭ１のバンドは消失する。しかし、本発明の上記化合物を共存させてもＣＲＭ１のバンドは消失しないことから、本発明の化合物は、ＮＥＳとＣＲＭ１との結合を阻害するものではないと考察される。
【００１５】
このように、上記式（１）の本発明の化合物は、ＮＥＳ非依存的にＭＡＰＫＫの核外移行を阻害し、かつ高い阻害活性を有する。また、南米で実際に飲用に供されている薬用植物由来物質であるため、薬として使用した場合に副作用も少ないと考えられる。
【００１６】
上記式（２）に含まれる化合物は、上記式（１）中のアルキル基の長さが変更されたものであるが、このように、アルキル基の長さが適当に短く、或いは長く変更された場合であっても、実質的には元の活性をそのまま備えていることが、当業者であれば容易に考察され、これらの化合物も同様に阻害活性を有していると考えられる。
【００１７】
ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰキナーゼ系は、前述のように、細胞の増殖、分化など生命活動に重要な役割を担っており、多くの疾患がＭＡＰＫＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きに関係していると考えられる。したがって、本発明のＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質は、このような様々な疾患に対する治療薬・予防薬として医薬品への利用が可能である。なお、医薬品への利用には、本発明のＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質を医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することも含まれる。
【００１８】
とりわけ、本発明のＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質は、癌細胞の増殖を抑制することで、各種ガンに対する治療薬（即ち、抗がん剤・制がん剤）としての効果が見込まれる。また、本発明の化合物（およびその薬理上許容される塩）は、ＮＥＳ非依存性という新規作用機序を有することから、既存の抗がん剤に対する感受性の低い大腸、膵臓、腎臓ガンにおいて活性化されているＭＡＰＫＫの核外移行を阻害し、癌細胞の増殖を抑制することで、新規作用機序の抗がん剤としての効果が見込まれる。
【００１９】
なお、「薬理上許容される塩」の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などを例示することができる。
【００２０】
本発明の化合物は、植物などから単離・精製したものであってもよいし、公知の化学合成法を用いて合成したものであってもよい。さらに、天然物から得られた物質を原材料として反応等の処理を施し、製造してもよい。
【００２１】
化学合成法としては、例えば、文献報告(Nokami, J. et al., Chemistry Lett. 1992, 1647-1650頁)されている方法を用いて、同文献p1649の下図中の化合物11から６および７への変換時にRが(Ｚ)-1２-heptadecenyl基であるヨウ素化体を使用することで合成できると考えられる。また、必要となるこのヨウ素化体は文献(Ramiandrasoa, F. et al., Synth. Commun. 1989, 19, 2703-2712頁)に報告されている方法によって、調製できる。
【００２２】
本発明の用途は、上記抗がん剤としての用途に限定されるものではない。本発明の化合物は、例えば、ＭＡＰＫＫ核外移行阻害による細胞応答を解析する生化学実験用試薬として、あるいは、抗がん作用等の効果を有する機能性食品（食用組成物）の原材料として利用可能である。また、本発明の化合物は、ＭＡＰＫＫ核外移行阻害剤として、抗がん剤以外の医薬品にも利用できる可能性がある。
【００２３】
本発明の化合物をＭＡＰＫＫ核外移行阻害剤として医薬品（医薬用組成物）に用いる場合の一例について説明する。本発明の化合物は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、ヒト（または動物）に投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２４】
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００２５】
非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度などに応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００２６】
なお、公知のＤＤＳを利用し、例えば、本発明の化合物をリポソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよい。このとき標的部位の細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明の化合物を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００２７】
本発明の化合物を食品（食用組成物）に用いる場合は、各種飲料や各種加工食品の原材料として本発明の化合物を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や保健食品等として利用できる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
南米産薬用植物（Peumus boldus MOLINA.）から本発明の化合物を、そのＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を指標として以下のような手順で抽出、単離した。
【００２９】
（１）メタノールによる抽出
粉砕した南米産薬用植物（Peumus boldus MOLINA.）５５ｇに、６００ｍＬのメタノールを加え、室温で３時間抽出した。これを濾過し、残査に６００ｍＬのメタノールを加え、加熱還流下２時間抽出した。この加熱抽出を３回行った。全ての濾液を濃縮し、１６ｇの固体（以下「メタノール抽出物」という。）を得た。
【００３０】
（２）酢酸エチル／Ｈ2Ｏ処理
上記（１）で得たメタノール抽出物１５ｇを酢酸エチル／Ｈ2Ｏの４００ｍＬ／４００ｍＬ混合液に加え、良く攪拌し、両層に分配溶解させた。不溶物について同じ操作を繰り返した。層分離を行い、酢酸エチル層を水分を含まないように絶乾して、９.１ｇの固体（以下「酢酸エチル抽出物」という。）を得た。
【００３１】
（３）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分別
上記（２）で得た酢酸エチル抽出物６.２ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分別した。すなわち、酢酸エチル抽出物６.２ｇをＳｉＯ2（２００ｇ）を充填したガラスカラムに吸着させた。このとき、充填溶媒として、ノルマルヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）：酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝２０：１を用いた。
【００３２】
溶出溶媒として、ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝２０：１を通導させ、画分Ａ（１.２ｇ）を得た。さらに、溶出溶媒をｎ−ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１、５：１、ＥｔＯＡｃ、及びメタノールと順次変化させ、それぞれ画分Ｂ(３ｇ)、画分Ｃ(０.９ｇ)、画分Ｄ(０.４ｇ)、及び画分Ｅ(０.７ｇ)を得た。
【００３３】
（４）画分Ａ〜ＥのＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性
上記画分Ａ〜ＥのＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を次のようにして測定した。培地中に２×１０4 cell/mLの濃度に調製したＨｅＬａ細胞をセルデスクの入った２４穴プレートに１ｍＬずつ分注し、３７℃で２４時間前培養を行った。培地を除去し、被検薬物（上記画分Ａ〜Ｅ、メタノール抽出物および酢酸エチル抽出物）をＤＭＳＯに溶解させ培地を用いて適切な濃度に希釈した後５００μＬ添加した。添加したＤＭＳＯの終濃度は１％である。３時間培養後、培地を除去し、氷冷したダルベッコ−リン酸緩衝液（−金属イオン非添加）（Ｄ−ＰＢＳ（−））溶液で洗浄し、１０％ホルマリン溶液１ｍＬを添加し、３０分間室温で固定化した。これを氷冷したＤ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、１ｍＬのメタノールで１０分間室温で脱脂し、再度洗浄した後、３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液で２０分間室温でブロッキングした。
【００３４】
次に、氷冷した１ｍＬの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液にマウス抗ＭＡＰＫＫ１抗体１μＬ、及びマウス抗ＭＡＰＫＫ２抗体１μＬの割合で添加した溶液を２００μＬ添加し、１時間室温で反応させた。続いて、氷冷したＤ−ＰＢＳ（−）溶液で洗浄後、氷冷した１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液で３００倍に希釈したＦＩＴＣ標識マウス抗マウスＩｇＧ抗体２００μＬと３０分間室温で反応させた。氷冷したＰＢＳ（−）溶液、及び蒸留水で洗浄し、セルデスクに付着した細胞をスライドグラスにマウントし、顕微鏡下でＭＡＰＫＫの細胞内局在を観察した。ＭＡＰＫＫの核外移行が阻害され蛍光が細胞内に一様に分布しているＨｅＬａ細胞の割合が５０％以上の場合を（＋）、５０％以下のものを（±）、コントロールと差のないものを（−）として、ＭＡＰＫＫの核内への局在を３段階にして評価した。結果を表１に示す。
【表１】
2006206542.tif 000004
表１中、「ｎｄ」は非決定（not determined）であることを示す。
この実験の結果、画分Ｂに注目し、さらに分析検討を行った。
【００３５】
（５）画分Ｂのシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分別
上記（３）で得られた画分Ｂ(１.５ｇ)のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分別を次のように行った。
【００３６】
画分Ｂの１.５ｇをシリカゲル（１００ｇ）を充填したガラスカラムに吸着させた。このとき、充填溶媒として、ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１を用いた。溶出溶媒として、ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝１０：１を通導させ、薄層クロマトグラフィーによって成分をモニタリングすることにより、画分Ｂ１（３８０ｍｇ）、画分Ｂ２（２９０ｍｇ）、画分Ｂ３（２５０ｍｇ）を得た。さらに、溶出溶媒として、メタノールを用い画分Ｂ４（５００ｍｇ）を得た。
【００３７】
（６）画分Ｂ１〜Ｂ４のＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性
上記画分Ｂ１〜Ｂ４のＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を、上記（４）と同様の方法により測定した。結果を表２に示す。
【表２】
2006206542.tif 000005
この実験の結果、画分Ｂ２に注目し、さらに分析検討を行った。
【００３８】
（７）画分Ｂ２のシリカゲルＨＰＬＣによる分別
上記（５）で得られた画分Ｂ２（２９０ｍｇ）のシリカゲルＨＰＬＣによる分別を次のように行った。
【００３９】
画分Ｂ２の１７７ｍｇをカラム（cosmosil 5SL 10 mm i.d. x 250 mm）、移動相（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ：ＣＨＣｌ3＝８：１：１）、流速４.０ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ検知器（λ＝２５４ｎｍ）を用いて、分離精製し、５種類の画分を得た。このようにして、画分Ｂ２１（５２.１ｍｇ）、画分Ｂ２２（５.６ｍｇ）、画分Ｂ２３（３.２ｍｇ）、画分Ｂ２４（４.６ｍｇ）、及び画分Ｂ２５（９０.６ｍｇ）を得た。
【００４０】
（８）画分Ｂ２１〜Ｂ２５のＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性
上記画分Ｂ２１〜Ｂ２５のＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を、上記（４）と同様の方法により測定した。結果を表３に示す。
【表３】
2006206542.tif 000006
この実験の結果、画分Ｂ２２に注目し、さらに分析検討を行った。
【００４１】
（９）画分Ｂ２２のＯＤＳ  ＨＰＬＣによる分別
上記（７）で得られた画分Ｂ２２(５.６ｍｇ)のＯＤＳ  ＨＰＬＣによる分別を次のように行った。
画分Ｂ２２の３.２ｍｇをカラム（cosmosil 5C18 AR-II 10 mm i.d. x 250 mm）、移動相（ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ＝８５：１５）、流速４.０ｍＬ／ｍｉｎ、ＵＶ検知器（λ＝２２０ｎｍ）を用いて、分離精製し、画分Ｂ２２１（２.０ｍｇ）を得た。
【００４２】
（１０）画分Ｂ２２１の同定
上記画分Ｂ２２１について、旋光度、赤外吸収スペクトル、1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、及びＦＡＢ−ＭＳの測定を行った。測定結果を表４に示す。
【表４】
2006206542.tif 000007
表４に示すデータより、画分Ｂ２２１中の物質は、次の構造を有する新規化合物１と決定した。
【化５】
2006206542.tif 000008
【００４３】
（１１）新規化合物１のＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性
新規化合物１について、ＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を、上記（４）と同様の方法により測定した。結果を表５に示す。
【表５】
2006206542.tif 000009
この実験の結果、新規化合物１は、高いＭＡＰＫＫ核外移行阻害活性を有することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上のように、本発明の新規ＭＡＰＫＫ核外移行阻害物質は、（１）ＭＡＰＫＫおよびＭＡＰキナーゼ系の働きが関係する種々の疾患に対する治療薬・予防薬として、とりわけ（２）大腸ガン、膵臓ガン、腎臓ガンなど各種ガンにおいて癌細胞の増殖を抑制する抗がん剤として、さらに、（３）抗がん作用等の効果を有する機能性食品、（４）ＭＡＰＫＫ核外移行阻害による細胞応答を解析する生化学実験用試薬などとして産業上幅広く利用できるものである。