(57)【要約】      （修正有）【課題】  熱的安定性を有するＡ型ＲＮＡ二重鎖を形成し得る中間体として用い得る、ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を提供すること。【解決手段】  ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物は、例えば、下記化合物、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［３−（Ｎ−トリフルオロアセチル）−アミノプロピン−１−イル］−２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト等が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表わされる、ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物。
【化１】
2006248975.tif 000014
（上記式中、Ｒ１はリン酸保護基を表し、Ｒ２は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表し、Ｒ３はアルコキシ基であるか、又はリボースの４’位炭素と結合して環を形成しており、Ｒ４は、炭素数３個以上のアルキル基、炭素数３個以上のアルケニル基又は炭素数３個以上のアルキニル基を表わし、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基はトリフルオロアセチルアミノ基と結合していてもよく、Ｒ５は水酸基の保護基を表し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表す。）
【請求項２】
Ｒ１がメチル基、２−シアノエチル基、又は２−トリメチルシリルエチル基である、請求項１に記載のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物。
【請求項３】
Ｒ２がジイソプロピルアミノ基である、請求項１に記載のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物。
【請求項４】
Ｒ３がメトキシ基である、請求項１に記載のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物。
【請求項５】
Ｒ４が、トリフルオロアセチルアミノ基と結合したプロピル基又はプロパニル基である、請求項１に記載のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物。
【請求項６】
下記式（２）又は（３）で表される、請求項１に記載のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物。
【化２】
2006248975.tif 000015
【化３】
2006248975.tif 000016
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を用いることで、修飾されたヌクレオシドを構成成分として含有するオリゴ核酸。
【請求項８】
請求項７に記載のオリゴ核酸を含む、遺伝子解析用プローブ。
【請求項９】
請求項７に記載のオリゴ核酸を用いる、特定遺伝子の増幅開始用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物に関する。更に詳細には、熱的安定性を有するＡ型ＲＮＡ二重鎖を形成し得る中間体として用い得る、ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、単鎖ＲＮＡ又は単鎖ＤＮＡにハイブリダイズすることが知られている。ハイブリダイズする（ハイブリダイゼーション）とは、標的ＲＮＡ又はＤＮＡの塩基に対し、オリゴヌクレオチドの塩基が配列特異的な塩基対で水素結合することであり、そのように水素結合する場合、そのような塩基対は相補的であると言われる。
【０００３】
相補的な核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度を決定する場合、相補的な核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対能力は、特定のハイブリダイゼーション複合体の融解温度を測定することによって確認することができる。融解温度（Ｔｍ）は、二重らせんに特徴的な物理特性であり、５０％のらせん形（ハイブリダイズした）対コイル形（ハイブリダイズしていない）が存在する温度を意味する。
【０００４】
Ａ型構造と呼ばれているＲＮＡが存在しているが、ＤＮＡは、通常はＢ型構造で存在しており、一般に、ＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖はＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖よりも安定であるか、又はより高い融解温度（Ｔｍ）を有している。しかし、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖はＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖よりも安定性が低く、それらの配列に依存して、ＤＮＡのＤＮＡ二本鎖よりも安定性が高かったり低かったりする。
【０００５】
一方、ｍＲＮＡやｓｉＲＮＡから生じるとされるｍｉＲＮＡ等の機能性のＲＮＡの細胞内における発現状態や、機能、塩基配列等を網羅的に解析するための技術として、ＤＮＡチップの利用が知られている。しかし、現状のＤＮＡチップでは、特に短鎖であるｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡによって形成されるＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖の熱的安定性が低いことから、これらの検出には不適当である。さらに、ターゲットとするＲＮＡはＤＮＡと比較して高次構造を形成しやすいため、あまり熱安定性の期待できないプローブでは、その高次構造を解きほぐすことができず、検出感度が低下するという問題がある。
【０００６】
ＤＮＡ二重鎖については、修飾核酸を用いることによる核酸二重鎖の安定化方法が開発されている。修飾核酸を用いた核酸二重鎖を安定化させるために有効な方法として、核酸の塩基部分にカチオン性側鎖を導入することにより、リン酸基上に生じる負電荷同士の静電的反発を減少させ、核酸二重鎖を安定化する技術が知られている（非特許文献１）。Ｂ型ＤＮＡ二重鎖中にカチオン性側鎖を有する様々な修飾核酸が組み込まれ、その挙動が研究されてきているが、二重鎖安定化能を獲得したカチオン性側鎖を有する修飾核酸が存在するが、反対に二重鎖を不安定化するものも報告されている（非特許文献２）。
【０００７】
例えば、下記式（Ｉ）で表わされる化合物（デオキシウリジンのウラシル環の５位にアミノヘプチル基を有する化合物）をＢ型ＤＮＡ二重鎖中に組み込んだ場合、デオキシウリジンが組み込まれたＢ型ＤＮＡ二重鎖との融解温度の差（ΔＴｍ値）は−０．１℃とほぼ同等である（非特許文献３）。また、下記式（II）で表わされる化合物（式（Ｉ）で表わされる化合物のウラシル環の５位の置換基のウラシル環に近い部位にアミノ基を導入した化合物）をＢ型ＤＮＡ二重鎖中に組み込んだ場合、デオキシウリジンが組み込まれたＢ型ＤＮＡ二重鎖との融解温度の差（ΔＴｍ値）は−３．９℃となり、二重鎖は不安定化される（非特許文献２）。また、下記式（III）で表わされる化合物（デオキシウリジンのウラシル環の５位にアミノプロピル基を有する化合物）をＢ型ＤＮＡ二重鎖中に組み込んだ場合、デオキシウリジンが組み込まれたＢ型ＤＮＡ二重鎖との融解温度の差（ΔＴｍ値）は−０．６℃となり、二重鎖は若干不安定化される（非特許文献４）。また、下記式（IV）で表わされる化合物（化合物（III）に比べ、ウラシル環の５位に結合した置換基が不飽和結合を有する化合物）をＢ型ＤＮＡ二重鎖中に組み込んだ場合、デオキシウリジンが組み込まれたＢ型ＤＮＡ二重鎖との融解温度の差（ΔＴｍ値）は＋２〜４℃であり、二重鎖形成が大幅に安定化される（非特許文献４）。
【０００８】
【化１】
2006248975.tif 000002
【０００９】
【化２】
2006248975.tif 000003
【００１０】
【化３】
2006248975.tif 000004
【００１１】
【化４】
2006248975.tif 000005
【００１２】
上述したように、Ｂ型ＤＮＡ二重鎖の場合は、二重鎖を安定化させるための側鎖等の修飾がある程度明らかになっているが、Ｂ型ＤＮＡ二重鎖とは構造が異なる、Ａ型ＲＮＡ二重鎖についての報告はあまりないのが現状であり、Ａ型ＲＮＡ二重鎖の安定化を向上することのできる最適な修飾については未だに明らかとはなっていない。
【００１３】
一方、修飾核酸を用いることによる、Ｂ型ＤＮＡの安定な二重鎖を形成させる他の方法としては、２’水酸基が２’−Ｏ−アルキル化（メチル化、メトキシエチル化等）された修飾核酸や、核酸の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子とを架橋して糖部コンフォメーションを化学的に固定化した修飾核酸等（ＢＮＡ、ＥＮＡ等）を用いることにより、糖部がＡ型ＲＮＡ二重鎖を組み込みやすいコンホメーションををとり、安定な二重鎖を形成されることが知られている（非特許文献５、６及び７）。しかし、Ａ型ＲＮＡ二重鎖の安定化を狙った報告例は未だにあまりないのが現状である。
【００１４】
【非特許文献１】J.Biochemistry, 1982, 21, 5458-5462
【非特許文献２】Chem. Pharm. Bull. 1987, 35, 3558-3567
【非特許文献３】C.J.Am.Chem.Soc. 1993, 115, 7128-7134
【非特許文献４】J.Am.Chem.Soc. 1998, 120, 12165-12166
【非特許文献５】Tetrahedron Lett. 1997, 38, 8735
【非特許文献６】J.Chem. Commun. 1998, 455
【非特許文献７】Helv.Chem Acta. 1995, 78, 486
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の目的は、熱的安定性を有するＡ型ＲＮＡ二重鎖を形成し得る中間体として用い得る、ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、特定のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物が、上記目的を達成し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、下記一般式（１）で表わされるヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を提供するものである。
【００１７】
【化５】
2006248975.tif 000006
【００１８】
（上記式中、Ｒ１はリン酸保護基を表し、Ｒ２は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表し、Ｒ３はアルコキシ基であるか、又はリボースの４’位炭素と結合して環を形成しており、Ｒ４は、炭素数３個以上のアルキル基、炭素数３個以上のアルケニル基又は炭素数３個以上のアルキニル基を表わし、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基はトリフルオロアセチルアミノ基と結合していてもよく、Ｒ５は水酸基の保護基を表し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を表す。）
また、本発明は、上記ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を用いることで、修飾されたヌクレオシドを構成成分として含有するオリゴ核酸を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物は、熱的安定性を有するＡ型ＲＮＡ二重鎖を形成し得る中間体として用い得る。
本発明のオリゴ核酸は、熱的安定性を有しており、アンチセンス医薬、アンチジーン医薬、特定の遺伝子を検出するためのプローブ、又は増幅開始のためのプライマー等として用い得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物について説明する。
本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物は下記一般式（１）で表わされる。
【００２１】
【化６】
2006248975.tif 000007
【００２２】
上記一般式（１）において、Ｒ１はリン酸保護基を表す。リン酸保護基としては、ホスホロアミダイト法に用いられるものであれば、特に制限なく用いることができ、例えば、メチル基、２−シアノエチル基、２−トリメチルシリルエチル基等が挙げられる。
【００２３】
Ｒ２は窒素原子上に炭素数１〜６個の同一又は異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基を表す。なお、２個のアルキル基が互いに結合して環を形成していてもよい。このようなジアルキルアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が挙げられる。
【００２４】
Ｒ３はアルコキシ基であるか、又はリボースの４’位炭素と結合して環を形成していてもよい。アルコキシ基としては、炭素数が１〜６個のアルコキシ基が好ましく、このようなアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、また、２−プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基等のように分枝したアルコキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルメチルオキシ基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルコキシ基も含む。
【００２５】
Ｒ４は、炭素数３個以上のアルキル基、炭素数３個以上のアルケニル基又は炭素数３個以上のアルキニル基を表わし、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基はトリフルオロアセチルアミノ基を結合していてもよい。
ここで、アルキル基とは、炭素数が３〜６個のアルキル基が好ましく、このようなアルキル基としては、例えば、プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などのアルキル基を示し、イソプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ネオペンチル基などのように分枝したアルキル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基も含む。アルケニル基としては、プロペニル基、ブチニル基等が挙げられる。また、アルキニル基としては、プロピニル基等が挙げられる。
【００２６】
また、Ｒ５は水酸基の保護基を表す。水酸基の保護基としては、ホスホロアミダイト法で用いられるものであれば特に制限はなく、例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基等が挙げられる。Ｘは酸素原子又は硫黄原子であり、Ｘが酸素原子の場合は、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物はウラシル誘導体となり、硫黄原子の場合はチオウラシル誘導体となる。
【００２７】
本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物の具体例としては、下記式（２）で表わされる化合物（5’−Ｏ−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−（Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピン−1−イル]−2’−Ｏ−メチルウリジン  3’−Ｏ− (2−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）又は（３）で表わされる化合物（5’−Ｏ− (4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピル]−2’−Ｏ−メチルウリジン  3‘−Ｏ− (2−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトが挙げられる。
【００２８】
【化７】
2006248975.tif 000008
【００２９】
【化８】
2006248975.tif 000009
【００３０】
本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物は、当業者に公知の方法を用いて合成することができる。例えば、本明細書の実施例に記載されている方法に従って合成することができる。
【００３１】
次に、本発明のオリゴ核酸について説明する。本発明のオリゴ核酸は、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を用いることで、修飾されたヌクレオシドを構成成分として含有してなる。本発明のオリゴ核酸に含まれる、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物の種類、数、組み合わせ、位置等も、使用目的及び用途に応じて、当業者が適宜選択することができる。
本発明のオリゴ核酸は、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を用いて、当業者に公知の任意の方法で合成することができる。本発明のオリゴ核酸は、その用途によっても異なるが、ヌクレオチド単位が、通常は１０〜３０個程度からなり、その構成単位として、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を少なくとも１個含有してなる。本発明のオリゴ核酸は、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を含有してなり、熱的安定性に優れたものとなり、以下に説明する種々の用途に用いることができる。
【００３２】
本発明のオリゴ核酸は熱安定性に優れるという特性を有しており、この熱的安定性に優れるという特性を利用し、遺伝子解析用プローブ、核酸間のハイブリダイゼーション法に使用することができる。このようなハイブリダイゼーション法は、ＰＣＲ法及びＤＮＡチップ等の分野で当業者に公知の様々な測定手段において利用されている。
本発明のオリゴ核酸は、ＰＣＲ用のＤＮＡプライマー（特定遺伝子の増幅開始用プライマー）、ＤＮＡ医薬品素材（アンチセンスＤＮＡ、デコイＤＮＡ、オリゴＤＮＡを利用した遺伝子修復用素材）、遺伝子解析用ＲＮＡプローブ、ＲＮＡ医薬品素材（アンチセンスＲＮＡ、アンチジーンＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉを利用した遺伝子発現制御）、ＤＮＡチップ又はＲＮＡチップの材料等としても用いることができる。
【００３３】
本発明のオリゴ核酸を医薬素材として投与する場合の投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等による経口投与又は注射剤若しくは坐剤等による非経口投与が挙げられる。これらの製剤は、従来公知の、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
医薬素材として用いる場合、その使用量は症状、年齢、投与方法等により異なり、適宜選択することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
比較製造例１
5’−Ｏ− (4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[Ｎ− (トリフルオロアセチル)−メチルアミノメチル]−2’−Ｏ−メチルウリジン 3’−Ｏ− (2−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
2’−Ｏ−メチルウリジン(9.80 g, 40.1 mmol)を0.5 M KOH水溶液(80 mL)に溶解し、パラホルムアルデヒド(20.0 g, 667 mmol)を加えて、65 ℃の温度で1週間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール=96：4）で精製し、更にメタノールで再結晶させ、5−ヒドロキシメチル−2’−Ｏ−メチルウリジンを得た（4.40 g、収率；40%)を得た。
mp 183.0-185.0 ℃; １H NMR (270 MHz, DMSO) δ3.33 (3H, s, 2’−OCH3), 3.52−3.64 (2H, m, 5’−H), 3.78−3.84 (2H, m, 3’−H, 4’−H), 4.11 (3H, bs, CH２, OH), 4.88 (1H, bs, OH), 5.08 (1H, bs, OH), 5.14−5.16 (1H, m, 2’−H), 5.89 (1H, d, 1’−H,Ｊ１’、２’ =5.6 Hz), 7.81 (1H, s, 6−H), 11.35 (1H, s, 3−NH);１３C NMR (67.8 MHz, DMSO) δ56.30, 57.46, 60.83, 68.45, 82.42, 85.25, 85.69, 114.39, 136.88, 150.51, 162.64; ESI−mass m/z Calcd for C１１H１７N２O７289.1036; Observed [M + H] 289.1034
【００３５】
上述のようにして得られた5−ヒドロキシメチル−2’−Ｏ−メチルウリジン (1.0 g, 3.65 mmol)を4.0 M  HCl ジオキサン溶液(10 mL)に溶解し、0℃の温度で2.5時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、無水ジオキサンでHClを共沸した。残留物を無水ジオキサン(10 mL)に溶解し、40% CH３NH２  （メタノール溶液）(20 mL)を加えて、室温で10時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残留物を無水ピリジンで3回共沸脱水した後、無水ピリジン(30 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸無水物(772 μL, 5.47 mmol)を加えて、室温で3時間撹拌した。１ｍｌのメタノールを加えて反応を停止した後、溶媒を減圧下留去した。残留物を無水ピリジンで3回共沸脱水した後、無水ピリジン(30 mL)に溶解し、4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(1.36 g, 4.02 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。メタノールを加えて反応を停止した後、反応溶液を２００ｍｌのクロロホルムで希釈して水で2回洗浄した。さらに5%炭酸水素ナトリウム水溶液で3回洗浄し、有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル=50：50）で精製し、5’−Ｏ− (4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[Ｎ−(トリフルオロアセチル)−メチルアミノメチル]−2’−Ｏ−メチルウリジンを得た (900 mg、収率： 36%)。
１H NMR (270 MHz, CDCl3) δ3.18 (3H, s, CH３−N), 3.46−3.85 (14H, m, 2’−OCH３, OCH３of DMTr, CH２, 4’−H, 5’−H), 4.06−4.11 (1H, m, 3’−H), 4.23−4.26 (1H, m, 2’−H), 5.92 (1H, d, 1’−H,Ｊ1’,2’=2.1 Hz), 6.79−7.45 (13H, m, ArH of DMTr), 7.87(1H, s, 6−H);１３C NMR (67.8 MHz, CDCl３) δ36.80, 46.84, 55.17, 58.77, 62.65, 68.96, 83.28, 83.48, 86.66, 87.56, 108.41, 113.20, 114.05, 118.28, 126.89, 127.91, 128.24, 130.26, 135.56, 135.68, 141.61, 144.63, 149.77, 156.63, 157.16, 158.57, 163.21; ESI−mass m/z Calcd for C３５H３７F３N３O９722.2301; Observed [M + H] 722.2301
【００３６】
上述のようにして得られた5’−Ｏ− (4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[Ｎ−(トリフルオロアセチル)−メチルアミノメチル]−2’−Ｏ−メチルウリジン (300 mg, 0.43 mmol)を無水アセトニトリルで3回、無水ジクロロメタンで1回共沸脱水した後、無水ジクロロメタン(4.3 mL)に溶解し、1−H テトラゾール(30.1 mg, 0.43 mmol)とジイソプロピルアミン(60 μL, 0.43 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で10分撹拌した。さらに、(2-シアノエトキシ)−ビス−(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(273 μL, 0.86 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。１ｍｌの水を加えて反応を停止した後、３０ｍｌのクロロホルムで希釈して飽和食塩水で3回洗浄し、有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をジエチルエーテル：ジイソプロピルエーテル=1：1の混合溶媒で希釈して0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で5回洗浄し、有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をリサイクル分取HPLC（アセトニトリル）で精製し、5’−Ｏ− (4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[Ｎ− (トリフルオロアセチル)−メチルアミノメチル]−2’−Ｏ−メチルウリジン 3’−Ｏ− (2−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（下記式（４）で表わされる化合物）を得た (210 mg, 収率：55%)。
1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ0.95-0.97 (4H, m), 1.10-1.15(12H, m), 2.35-2.39(1H, m),2.60-2.70 (1H, m), 3.17 (3H, s), 3.30-3.50 (7H,m), 3.71-3.83 (7H,m), 3.90-3.98 (1H, m), 4.18-4.25 (1H, m),5.90-5.99(1H, m), 6.75-6.90 (4H, m),7.20-7.46 (13 H, m), 7.83, 7.90 (1H, 2s); 13C NMR (67.8 MHz, CDCl3) δ20.10, 20.27, 22.85, 24.42, 24.54, 36.59, 43.08, 43.24, 43.42, 46.84, 55.16, 55.20, 58.36, 58.51, 58.78, 62.92, 68.34, 70.01, 82.32, 82.57, 86.69, 88.04, 108.24, 108.34, 112.95, 113.17, 126.98, 127.89, 128.36, 128.42, 130.32, 130.38, 135.65, 141.59, 144.57, 149.51, 158.60, 158.79, 162.68; 31P NMR (109.4 MHz, CDCL3) δ151.13, 151.15; ESI-mass m/z Calcd for C44H54F3N5O10P 900.3560; Observed [M + H] 900.3580
【００３７】
【化９】
2006248975.tif 000010
【００３８】
比較製造例１の合成反応を式で表わすと以下の通りである。
【００３９】
【化１０】
2006248975.tif 000011
【００４０】
製造例２
3’， 5’−ビス−アセチル−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピル]−2’−Ｏ−メチルウリジン(400 mg, 0.80 mmol)を、ピリジン、28%アンモニア水(v/v=1:1)の混合溶媒(8 mL)に溶解し、50℃の温度で8時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残留物をエタノール(8 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸エチルエステル(191μL, 1.60 mmol)及びトリエチルアミン(455μL, 2.40 mmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残留物を無水ピリジンで3回共沸脱水した後、無水ピリジン(8 mL)に溶解し、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(325 mg, 0.96 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。１ｍｌのメタノールを加えて反応を停止した後、反応溶液を５０ｍｌのクロロホルムで希釈して5%炭酸水素ナトリウム水溶液で3回洗浄し、有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル=50：50）で精製し、5’−Ｏ−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−（Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピル]−2’−Ｏ−メチルウリジンを得た(450 mg,収率：80%)。
１H NMR (270 MHz, CDCl３)δ1.69−1.74 (2H, m, CH２), 2.14−2.19 (2H, m, CH２), 2.32−2.40 (2H, m, CH２), 3.53 (3H, s, 2’−Ｏ−Me), 3.70−3.85 (8H, m, OCH３ of DMTr, 5’−H), 3.91−3.99 (2H, m, 3’−H, 4’−H), 4.23−4.31 (1H, m, 2’−H), 5.76 (1H, d, 1’−H, Ｊ1’,2’=3.3 Hz), 6.77−6.80 (4H, d, ArH of DMTr, Ｊ1’,2’=8.9 Hz), 7.15−7.39 (10H, m, ArH of DMTr, NH), 7.59 (1H, s, 6−H); １３C NMR (67.8 MHz, CDCl３)δ24.22, 28.18, 42.70, 55.19, 58.63, 60.91, 68.43, 69.99, 82.89, 84.80, 89.19, 113.09, 114.40, 126.24, 127.82, 128.42, 129.72, 136.68, 138.33, 146.52, 149.80, 157.86, 162.82; ESI−mass m/z Calcd for C３６H３８F３N３NaO９736.2458; Observed [M + Na] 736.2736
【００４１】
上述のようにして得られた5’−Ｏ−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−（Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピル]−2’−Ｏ−メチルウリジン (250 mg, 0.35 mmol) を無水アセトニトリルで3回、無水ジクロロメタンで1回共沸脱水した後、無水ジクロロメタン(3.5 mL)に溶解し、1−H テトラゾール(14.7 mg, 0.21 mmol)及びジイソプロピルアミン(29.5 μL, 0.21 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で10分撹拌した。さらに、(2−シアノエトキシ)−ビス−(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(133μL, 0.42 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で5時間撹拌した。１ｍｌの水を加えて反応を停止した後、２０ｍｌのクロロホルムで希釈して飽和食塩水で3回洗浄し、有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をジエチルエーテル：ジイソプロピルエーテル=1：1の混合溶媒で希釈し、0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で5回洗浄した。有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をリサイクル分取HPLC（アセトニトリル）で精製し、5’−Ｏ− (4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピル]−2’−Ｏ−メチルウリジン  3’−Ｏ−(2−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（式（３）で表わされる化合物）を得た(140 mg, 収率：44%)。
１H NMR (270 MHz, CDCl３)δ0.91−1.10 (14H, m), 1.19−1.28 (2H, m), 1.50−1.88 (2H, m), 2.26−2.31 (1H, m), 2.52−2.57 (1H, m), 2.81−3.23 (2H, m), 3.43 (3H, s), 3.43−3.57 (2H, m), 3.68, 3.69 (6H, 2s), 3.80−3.91 (1H, m), 4.05−4.19 (1H, m), 4.32−4.48 (1H, m), 5.90−6.06 (1H, m), 7.17−7.35 (10H, m), 7.44, 7.50 (1H, 2s);１３C NMR (67.8 MHz, CDCl３)δ20.05, 20.16, 20.24, 20.32, 23.05, 24.39, 24.50, 24.59, 28.28, 38.27, 42.95, 43.13, 43.31, 55.17, 57.70, 57.99, 58.18, 58.50, 58.74, 61.64, 62.40, 70.11, 70.33, 82.39, 82.82, 83.52, 86.70, 86.84, 87.32, 113.12, 113.79, 114.02, 117.47, 117.99, 127.24, 127.86, 128.22, 128.39, 128.94, 130.18, 130.30, 135.05, 135.13, 136.38, 144.05, 156.69, 157.23, 158.71;３１P NMR (109.4 MHz, CDCL３)δ151.17, 151.23; ESI−mass m/z Calcd for C４５H５６F３N５O１０P 914.3717; Observed [M ＋ H] 914.3711
【００４２】
製造例１の合成反応を式で表わすと以下の通りである。
【００４３】
【化１１】
2006248975.tif 000012
【００４４】
製造例２
5’−Ｏ− (4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピン−1−イル]−2’−Ｏ−メチルウリジン  3’−Ｏ− (2−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
既知の化合物である、3’， 5’−ビス-アセチル−5−ヨード−2’−Ｏ−メチルウリジン(2.0 g, 4.3 mmol)を、３ｍｌの無水アセトニトリルで3回、３ｍｌの無水ジメチルホルムアミドで1回共沸脱水した後、無水ジメチルホルムアミド(23 mL)に溶解し、減圧しながら超音波脱気を5回行い、アルゴン置換した。トリエチルアミン(1.63 mL, 8.6 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）(248 mg, 0.215 mmol)、ヨウ化銅(81.9 mg, 0.43 mmol)を加えて、室温で10分間撹拌した。Ｎ−トリフルオロアセチル-アミノプロピン(730 μL, 6.4 mmol)を脱気済みの無水ジメチルホルムアミド(20 mL)に溶解させ、滴下ロートを用いて反応系に滴下させ、アルゴン雰囲気下、室温で10時間撹拌した。反応溶液を１５０ｍｌの酢酸エチルで希釈し、5%炭酸水素ナトリウム水溶液で3回洗浄し、1%アンモニア水で2回洗浄した。有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル=60：40, ヘキサン：クロロホルム=20:80）で精製し、3’, 5’−ビス-アセチル−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピン−1−イル]−2’−Ｏ−メチルウリジンを得た(1.41 g,収率： 67%)。
１H NMR (270 MHz, CDCl３)δ2.13, 2.17 (6H, 2s, Ac), 3.48 (3H, s, 2’−Ｏ−Me), 4.04−4.07 (1H, m, 5’−H), 4.29−4.42 (5H, m, 3’−H, 4’−H, 5’−H, CH２−NH), 4.89−4.94 (1H, m, 2’-H), 5.90 (1H, d, 1’-H, Ｊ1’,2’=2.3 Hz), 7.69 (1H, bs, NH), 7.92 (1H, s, 6−H), 9.77 (1H, s, 3−NH);１３C NMR (67.8 MHz, CDCl３) δ20.56, 20.68, 30.26, 59.00, 61.77, 69.37, 75.23, 79.35, 81.77, 87.87, 88.63, 99.02, 113.55, 117.78, 142.96, 148.98, 156.75, 157.31, 162.02, 1770.23, 170.32; ESI−mass m/z Calcd for C１９H２１F３N３O９492.1230; Observed [M + H] 492.1290
【００４５】
上述のようにして得られた3’, 5’−ビス-アセチル−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピン−1−イル]−2’−Ｏ−メチルウリジン(870 mg, 1.77 mmol)をピリジン、28%アンモニア水(v/v=1:1)の混合溶媒(18 mL)に溶解し、50℃の温度で8時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、残留物をエタノール(18 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸エチルエステル(844μL, 7.08 mmol)とトリエチルアミン(1.68 mL, 8.85 mmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残留物を無水ピリジンで3回共沸脱水した後、無水ピリジン(18 mL)に溶解し、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(718.3 mg, 2.12 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。メタノールを加えて反応を停止した後、反応溶液を５０ｍｌのクロロホルムで希釈して5%炭酸水素ナトリウム水溶液で3回洗浄し、有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル=50：50）で精製し、5’−Ｏ−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピン−1−イル]−2’−Ｏ−メチルウリジンを得た (800 mg,収率：50%)。
１H NMR (270 MHz, CDCl３)δ3.47 (2H, s, CH２), 3.63 (3H, s, 2’−Ｏ−CH３), 3.77−3.81 (8H, m, OCH３of DMTr, 5’−H), 3.92−3.97 (1H, m, 4’−H), 4.08−4.11(1H, m, 3’−H), 4.52−4.55 (1H, m, 2’−H), 5.93 (1H, s, 1’−H), 6.82−6.86 (4H, m, ArH of DMTr), 7.21−7.54 (10H, m, ArH of DMTr, NH), 8.25 (1H, s, 6−H);１３C NMR (67.8 MHz, CDCl３)δ30.17, 55.12, 58.74, 61.64, 68.45, 75.02, 83.72, 86.84, 87.51, 98.95, 113.31, 117.63, 121.87, 126.87, 127.81, 128.00, 129.88, 129.94, 135.40, 135.43, 143.20, 144.52, 149.31, 155.66, 156.22, 156.77, 157.33, 158.51, 158.55, 162.46; ESI−mass m/z Calcd for C３６H３４F３N３NaO９732.2145; Observed [M + Na] 732.2127
【００４６】
上述のようにして得られた5’−Ｏ−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピン−1−イル]−2’−Ｏ−メチルウリジン (400 mg, 0.56 mmol)を無水アセトニトリルで3回、無水ジクロロメタンで1回共沸脱水した後、無水ジクロロメタン(5.6 mL)に溶解し、1−H テトラゾール(23.8 mg, 0.34 mmol)とジイソプロピルアミン(47.8 μL, 0.34 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で10分撹拌した。さらに、(2のシアノエトキシ)−ビス−(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン(212 μL, 0.67 mmol)を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。１ｍｌの水を加えて反応を停止した後、３０ｍｌのクロロホルムで希釈して飽和食塩水で3回洗浄し、有機層を集めて無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残留物をジエチルエーテル：ジイソプロピルエーテル=1：1の混合溶媒で希釈し、0.1 M水酸化ナトリウム水溶液で5回洗浄した。この際に析出した粉体を、無水テトラヒドロフラン(5.6 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸エチルエステル(267μL, 2.24 mmol)とトリエチルアミン(850 mL, 4.48 mmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、残留物をリサイクル分取HPLC（アセトニトリル）で精製し、5’−Ｏ−(4,4’−ジメトキシトリチル)−5−[3−(Ｎ−トリフルオロアセチル)−アミノプロピン−1−イル]−2’−Ｏ−メチルウリジン  3−Ｏ−(2−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（式（２）で表わされる化合物）を得た(200 mg,収率：40%)。
1H NMR (270 MHz, CDCl３)δ0.96−0.98 (4H, m), 1.07−1.11(10H, m), 2.29−2.31(1H, m),2.51−2.55 (1H, m), 3.31−3.52 (6H, m), 3.52−3.83 (7H, m), 3.98−4.05 (1H, m), 4.13−4.22 (1H, m), 4.40−4.59(1H, m), 5.57−5.86 (1H, m), 6.75−6.78 (4H, m), 7.04 (1H, bs), 7.07−7.41 (9H, m), 8.15, 8.19 (1H, 2s,); １３C NMR (67.8 MHz, CDCl３)δ7.47, 20.27, 20.31, 20.37, 24.36, 24.43, 24.47, 24.54, 24.64, 30.12, 43.04, 43.23, 55.13, 58.18, 58.37, 58.40, 58.46, 58.83, 58.87, 75.34, 75.51, 76.53, 82.74, 86.64, 86.80, 86.84, 86.86, 88.14, 88.60, 98.61, 98.91, 113.22, 113.33, 117.56, 117.59, 117.75, 126.81, 126.85, 127.90, 127.93, 128.10, 130.03, 135.32, 135.39, 135.44, 135.46, 143.40, 144.49, 144.63, 149.32, 149.40, 156.10, 156.65, 158.51, 158.55, 162.13, 162.27; ３１P NMR (109.4 MHz, CDCL３) δ150.58, 150.97; ESI−mass m/z Calcd for C４５H５１F３N５NaO１０P 932.3223; Observed [M ＋ Na] 932.3892
製造例２の合成反応を式で表わすと以下の通りである。
【００４７】
【化１２】
2006248975.tif 000013
【００４８】
実施例１
製造例１及び２、比較製造例１で得られたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を用いて、配列５’−ＣＧＵＵＵ＊ＵＵＧＣ−３’（配列番号：１）の２’−Ｏ−メチル化された９量体中Ｕ＊の部位に修飾核酸を組み込んだオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの合成は、通常のホスホロアミダイト法によりＡＢＩ３９２自動合成機（Applied Biosystems）により行い、固相担体からの切り出し、及び塩基部の脱保護操作を行った後、Ｓｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジカラムによりトリチルＯＮ簡易精製を行い、必要に応じて陰イオンＨＰＣＬによって更に精製を行った。合成した各オリゴヌクレオチドと、別途合成を行った相補鎖（配列５’−ＧＣＡＡＡＡＡＣＧ−３’（配列番号：２）又は５’−ＧＣＡＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号：３）とを混和し、溶液中二重鎖形成時に、二重鎖の濃度が２μＭの濃度となるように、５００μＬのリン酸バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解させた測定試料を調整した。測定には、Ｐｈａｒｍａ  Ｓｐｅｃ  ＵＶ−１７００（島津製作所（株）製）を用いた。測定は、まず試料を８０℃の温度に３０分間保持し、オリゴヌクレオチドをランダムコイル状態とした後、１．０℃／分で温度を５℃まで変化させてアニーリングを行い、次いで、１．０℃／分の速度で昇温させて、１．０℃毎にＵＶ吸光度を測定することにより行った。
測定により得られたＵＶ吸光度を温度変化に対してプロットし、二重鎖融解曲線とした。Ｓｔａｖｉｌｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法（２５point）を用いて融解曲線をスムージングした後、曲線を一次微分することにより変曲点を求め変曲点を二重鎖融解温度（Ｔｍ値）とした。なお、二重鎖のアニーリング時の曲線から得られる値と二重鎖融解時の曲線から得られる値において、１．０℃以上値のずれが観測された場合には、各測定温度における系内の平衡が不完全であるとみなし、変温レートを０．５℃／分に変更する等、適宜条件を変更して再度測定を行った。
【００４９】
比較製造例１で得られた化合物を用いてＡ型ＲＮＡ二重鎖に組み込んだ場合、２’−Ｏ−メチルウリジンが組み込まれた場合と比較し、融解温度の差（ΔＴｍ値）は−１．２℃であり、比較製造例１で得られた化合物をＡ型ＲＮＡ二重鎖に組み込んだ場合でも二重鎖の安定化は認められなかった。製造例１で得られた化合物をＡ型ＲＮＡ二重鎖に組み込んだ場合、２’−Ｏ−メチルウリジンが組み込まれた場合と比較し、融解温度の差（ΔＴｍ値）は＋３．２℃であり、Ａ型ＲＮＡ二重鎖が安定化されることがわかった。これは、二重鎖を歪ませることなく、アミノ基とリン酸基とが近づいていることを示し、Ａ型ＲＮＡ二重鎖を安定化させるためには、炭素数３のリンカーを導入することがよいことが示される。また、製造例２で得られた化合物をＡ型ＲＮＡ二重鎖に組み込んだ場合、２’−Ｏ−メチルウリジンが組み込まれた場合と比較し、融解温度の差（ΔＴｍ値）は＋６．９℃であり、大幅にＡ型ＲＮＡ二重鎖を安定化することが認められた。
【００５０】
実施例２
製造例１及び２、比較製造例１の相補的位置の塩基がＡの時のＴｍ値から、相補的位置の塩基がＧの時のＴｍ値を差し引き、その値を塩基識別能力とした。
【００５１】
結果を図１に示す。図１は、塩基識別能力の測定結果を示すグラフであり、比較製造例１で得られたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物においては、ΔＴｍＡ−Ｇは７．４℃であり、製造例１及び製造例２で得られたヌクレオシドホスホロアミダイト化合物においては、ΔＴｍＡ−Ｇは、それぞれ、８．１℃及び１０．３℃であった。Ａ型ＲＮＡ二重鎖を安定化する修飾体においては、しばしば塩基識別能力が低下することが知られているが、本発明のヌクレオシドホスホロアミダイト化合物を用いた場合、塩基識別能力が低下せず、むしろ塩基識別能力が向上していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】塩基識別能力の測定結果を示すグラフである。
【図１】
2006248975.tif 000017
【配列表】
2006248975000001.app