(57)【要約】【課題】  新規な核移行性ペプチドを提供する。【解決手段】  複数個のアルギニン残基を含み、核移行性を有する第１のペプチド（例えば、アデノウイルス由来コアペプチドｍｕ）と、複数個のリシン残基を含む第２のペプチド（例えば、シミアンウイルス４０由来核移行性シグナル）とを融合させて得られる核移行性ペプチドを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数個のアルギニン残基を含み、核移行性を有する第１のペプチドと、複数個のリシン残基を含む第２のペプチドとを融合させて得られる核移行性ペプチド。
【請求項２】
前記第１のペプチドにおけるアルギニン残基の含有率が３５％以上である請求項１記載の核移行性ペプチド。
【請求項３】
前記第１のペプチドが、下記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される請求項２記載の核移行性ペプチド。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、核移行性を有するペプチド
【請求項４】
前記第２のペプチドにおけるリシン残基の含有率が２５％以上である請求項１〜３のいずれかに記載の核移行性ペプチド。
【請求項５】
前記第２のペプチドが核移行性を有する請求項４記載の核移行性ペプチド。
【請求項６】
前記第２のペプチドが下記（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される請求項５記載の核移行性ペプチド。
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、核移行性を有するペプチド
【請求項７】
１又は複数個の前記第１のペプチドと１又は複数個の前記第２のペプチドとを融合させて得られる請求項１〜６のいずれかに記載の核移行性ペプチド。
【請求項８】
核酸と、前記核酸と静電的に結合した請求項１〜７のいずれかに記載の核移行性ペプチドとを含む複合体。
【請求項９】
請求項８記載の複合体を細胞内に導入し、前記複合体に含まれる核酸を細胞内で発現させる方法。
【請求項１０】
次式：
【数１】
2006067891.tif 000008
［式中、ＣＰは複合体作製時に使用するペプチドの濃度（μｇ／μＬ）を表し、ｎＫはペプチド１分子あたりのリシン残基数を表し、ｎＲはペプチド１分子あたりのアルギニン残基数を表し、ＭＷＰはペプチドの分子量を表し、ＣＤは複合体作製時に使用する核酸の濃度（μｇ／μＬ）を表し、ＭＷＤは核酸のヌクレオチド１残基あたりの平均分子量を表す。］
で定義される電荷比が１〜４である前記複合体を細胞内に導入する請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核移行性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸等の目的物質を標的部位に確実に送達するためのベクター又はキャリアーの開発が盛んに行われている。
ベクターの一例としては、リポソーム膜の外表面に、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質（例えば、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はその断片、糖鎖）が導入されたリポソーム（特許文献１及び２参照）が挙げられる。このリポソームによれば、リポソームのエンドサイトーシス効率を向上させることができる。
【０００３】
ベクターの別の例としては、リポソーム膜の外表面にＧＡＬＡが導入されたリポソーム（非特許文献１参照）が挙げられる。リポソームはエンドサイトーシスするとエンドソーム内に包含された状態となり、エンドソーム内のリポソームは、エンドソームがリソソームと融合することにより分解されるが、このリポソームによれば、リポソーム封入物質をエンドソームから脱出させ、細胞質中へ放出させることができる。
【０００４】
キャリアーの一例としては、ポリアルギニン、アルギニンリッチペプチド等のポリカチオン性ペプチドキャリアーが開発されている（特許文献３参照)。また、アデノウイルス由来コアペプチドｍｕ等のアルギニンリッチペプチドの核移行性について報告されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
ポリカチオン性ペプチドは静電的相互作用により核酸と複合体化する。ポリカチオン性ペプチドと複合体化した核酸は、外部環境から保護され、核酸分解酵素による分解から逃れることができる。細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質をポリカチオン性ペプチドに共有結合させることにより、ポリカチオン性ペプチドと複合体形成した核酸を、エンドサイトーシスにより細胞内へ導入させることができる。ポリカチオン性ペプチドと複合体形成した核酸がエンドサイトーシスするとエンドソーム内に包含された状態となる。エンドソーム内のｐＨは、エンドソーム膜上のプロトンＡＴＰａｓｅの作用により下がるが、ポリカチオン性ペプチドが生理ｐＨ以下でプロトン化する窒素原子を有していれば、エンドソーム内へ集積してきたプロトンをポリカチオン性物質が消費し、ｐＨの低下を抑制する。そして、エンドソーム内へ塩化物イオンの流入を伴ったプロトンの集積が続くことにより、浸透圧が増大する。その結果、エンドソーム内外の浸透圧のバランスがくずれ、エンドソームが崩壊し、ポリカチオン性ペプチドと複合体形成した核酸は細胞質内へ放出されるものと考えられる。
【特許文献１】特開平４−３４６９１８号公報
【特許文献２】特開２００４−１０４８１号公報
【特許文献３】特開２００１−１９９９９７号公報
【非特許文献１】T.Kakudo等，「バイオケミストリー（Biochemistry）」，2004年，第43巻，5618-5623頁
【非特許文献２】M. Keller等，「ケムバイオケム（ChemBiocChem）」，2003年，第4巻，296-298頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な核移行性ペプチド、及び当該ペプチドと核酸とを含む複合体を細胞内に導入し、当該複合体に含まれる核酸を細胞内で発現させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、アデノウイルス由来コアペプチドｍｕ（配列番号１）等のアルギニンリッチペプチドが優れた核移行性を有する一方、当該ペプチドと複合体形成した核酸の転写を抑制することを見出すとともに、アデノウイルス由来コアペプチドｍｕ等のアルギニンリッチペプチドにシミアンウイルス４０由来核移行性シグナル（配列番号２）等のリシンリッチペプチドを付加することにより、アルギニンリッチペプチドの優れた核移行性を保持したまま、アルギニンリッチペプチドによる核酸の転写抑制を改善することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）複数個のアルギニン残基を含み、核移行性を有する第１のペプチドと、複数個のリシン残基を含む第２のペプチドとを融合させて得られる核移行性ペプチド。
【０００９】
（２）前記第１のペプチドにおけるアルギニン残基の含有率が３５％以上である前記（１）記載の核移行性ペプチド。
【００１０】
（３）前記第１のペプチドが、下記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される前記（２）記載の核移行性ペプチド。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、核移行性を有するペプチド
【００１１】
（４）前記第２のペプチドにおけるリシン残基の含有率が２５％以上である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の核移行性ペプチド。
【００１２】
（５）前記第２のペプチドが核移行性を有する前記（４）記載の核移行性ペプチド。
【００１３】
（６）前記第２のペプチドが下記（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択される前記（５）記載の核移行性ペプチド。
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、核移行性を有するペプチド
【００１４】
（７）１又は複数個の前記第１のペプチドと１又は複数個の前記第２のペプチドとを融合させて得られる前記（１）〜（６）のいずれかに記載の核移行性ペプチド。
【００１５】
（８）核酸と、前記核酸と静電的に結合した前記（１）〜（７）のいずれかに記載の核移行性ペプチドとを含む複合体。
【００１６】
（９）前記（８）記載の複合体を細胞内に導入し、前記複合体に含まれる核酸を細胞内で発現させる方法。
【００１７】
（１０）次式：
【００１８】
【数１】
2006067891.tif 000002
【００１９】
［式中、ＣＰは複合体作製時に使用するペプチドの濃度（μｇ／μＬ）を表し、ｎＫはペプチド１分子あたりのリシン残基数を表し、ｎＲはペプチド１分子あたりのアルギニン残基数を表し、ＭＷＰはペプチドの分子量を表し、ＣＤは複合体作製時に使用する核酸の濃度（μｇ／μＬ）を表し、ＭＷＤは核酸のヌクレオチド１残基あたりの平均分子量を表す。］
で定義される電荷比が１〜４である前記複合体を細胞内に導入する前記（９）記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の核移行性ペプチドにおいては、第１のペプチドが有する核移行性を保持したまま、第１のペプチドによる核酸の転写抑制が改善されている。したがって、本発明の核移行性ペプチドと複合体形成した核酸は、核内へ効率よく移行することができるとともに、核内において効率よく発現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「核移行性」とは、細胞質から核内へ移行する能力を意味する。
本発明のペプチドは、第１のペプチドと第２のペプチドとを融合して得られるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる全てのペプチドを含む。したがって、本発明のペプチドの製法は、第１のペプチドと第２のペプチドとを融合する方法に限定されるものではない。
【００２２】
本発明のペプチドは、複数個のアルギニン残基と複数個のリシン残基とを含むポリカチオン性ペプチドであるので、静電的結合を介して核酸と複合体を形成することができる。本発明のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入すると、当該複合体は核内に移行し、当該複合体に含まれる核酸は核内で発現する。本発明のペプチドと複合体形成した核酸の転写効率は、第１のペプチドと複合体形成した核酸の転写効率よりも高い。すなわち、本発明のペプチドにおいては、第２のペプチド部分の存在により、第１のペプチド部分による核酸の転写抑制が改善されている。
【００２３】
第１のペプチドは、複数個のアルギニン残基を含み、核移行性を有するペプチドである。
第１のペプチドにおけるアルギニン残基の含有率は、第１のペプチドが核移行性を有する限り特に限定されるものではないが、通常３５％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上である。なお、第１のペプチドにおけるアルギニン残基の含有率の上限値は１００％である。第１のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入すると、当該複合体は核内に移行し、当該複合体に含まれる核酸は核内で発現するが、第１のペプチドにおけるアルギニン残基の含有率が３５％以上であると、核酸との静電的結合力が強固となるため、核酸への転写因子の結合阻害が顕著となり、核酸の転写抑制が顕著となる。
【００２４】
第１のペプチドは、核移行性を有する限り、アルギニン残基のみから構成されていてもよいし、他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。第１のペプチドにおけるリシン残基の含有率は、通常１０％以下、好ましくは５％以下、さらに好ましくは０％である。第１のペプチドにおけるリシン残基の含有率が１０％以下であると、第１のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入したときの核酸の転写抑制は顕著なままである。
【００２５】
第１のペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は、複数個のアルギニン残基を含み、核移行性を有する限り特に限定されるものではないが、通常５〜３５個、好ましくは１０〜３０個、さらに好ましくは１５〜２０個である。
【００２６】
第１のペプチドのアミノ酸配列は、複数個のアルギニン残基を含み、核移行性を有する限り特に限定されるものではない。
【００２７】
第１のペプチドは、例えば、下記（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択することができる。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド（ａ）」という場合がある。）
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、核移行性を有するペプチド（以下「ペプチド（ｂ）」という場合がある。）
【００２８】
ペプチド（ａ）は、アデノウイルス由来コアペプチドｍｕであり、核移行性を有する。ペプチド（ａ）を構成するアミノ酸残基の総数は１９個であり、ペプチド（ａ）に含まれるアルギニン残基は９個（アルギニン残基の含有率は約４７％）であり、リシン残基は０個（リシン残基の含有率は０％）である。
【００２９】
ペプチド（ｂ）には、ペプチド（ａ）に対して人為的に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入したペプチドの他、変異が導入された状態で天然に存在するペプチドや、それに対して人為的に変異を導入したペプチドも含まれる。変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、多型によって生じ得るペプチドが挙げられる。
【００３０】
配列番号１記載のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の個数は、ペプチド（ｂ）が核移行性を有する限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個である。欠失に関する具体的範囲は、通常１〜３個、好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個であり、置換に関する具体的範囲は、通常１〜３個、好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個であり、挿入に関する具体的範囲は、通常１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的範囲は、通常１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００３１】
配列番号１記載のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の位置は、ペプチド（ｂ）が核移行性を有する限り特に限定されるものではない。
【００３２】
第２のペプチドは、複数個のリシン残基を含むペプチドである。
第２のペプチドにおけるリシン残基の含有率は特に限定されるものではないが、通常２５％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは３５％以上である。なお、第２のペプチドにおけるリシン残基の含有率の上限値は１００％である。第２のペプチドにおけるリシン残基の含有率が２５％以上であると、第１のペプチドによる核酸の転写抑制を効果的に改善することができるので、本発明のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入すると、当該複合体は核内に移行し、当該複合体に含まれる核酸は核内で効率よく発現することができる。
【００３３】
第２のペプチドは、リシン残基のみから構成されていてもよいし、他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。第２のペプチドにおけるアルギニン残基の含有率は、通常２０％以下、好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下である。第２のペプチドにおけるアルギニン残基の含有率が２０％以下であると、第１のペプチドによる核酸の転写抑制を効果的に改善することができるので、本発明のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入したときの、核酸の発現効率を向上させることができる。
【００３４】
第２のペプチドを構成するアミノ酸残基の総数は、第１のペプチドの核移行性を抑制しない限り特に限定されるものではないが、通常５〜３０個、好ましくは５〜２０個、さらに好ましくは５〜１５個である。
【００３５】
第２のペプチドのアミノ酸配列は、複数個のリシン残基を含み、第１のペプチドの核移行性を抑制しない限り特に限定されるものではない。
【００３６】
第２のペプチドは、核移行性を有するペプチドであることが好ましい。第２のペプチドが核移行性を有するペプチドであると、本発明のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入したときに、当該複合体が効率よく核内に移行することができる。
【００３７】
第２のペプチドは、例えば、下記（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択することができる。
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ペプチド（ｃ）」という場合がある。）
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、核移行性を有するペプチド（以下「ペプチド（ｄ）」という場合がある。）
【００３８】
ペプチド（ｃ）は、シミアンウイルス４０由来核移行性シグナル（ＳＶ４０−ＮＬＳ）であり、核移行性を有する。ペプチド（ｃ）を構成するアミノ酸残基の総数は１１個であり、ペプチド（ｃ）に含まれるアルギニン残基の個数は１個（アルギニン残基の含有率は約９％）であり、リシン残基の個数は４個（リシン残基の含有率は約３６％）である。
【００３９】
ペプチド（ｄ）には、ペプチド（ｃ）に対して人為的に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入したペプチドの他、変異が導入された状態で天然に存在するペプチドや、それに対して人為的に変異を導入したペプチドも含まれる。変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、多型によって生じ得るペプチドが挙げられる。
【００４０】
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の個数は、ペプチド（ｄ）が核移行性を有する限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個である。欠失に関する具体的範囲は、通常１〜３個、好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個であり、置換に関する具体的範囲は、通常１〜３個、好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個であり、挿入に関する具体的範囲は、通常１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的範囲は、通常１〜１５個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００４１】
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の位置は、ペプチド（ｄ）が核移行性を有する限り特に限定されるものではない。
【００４２】
本発明のペプチドに含まれる第１のペプチド部分の個数は特に限定されるものではなく、１個であってもよいし複数個であってもよい。第１のペプチド部分の個数は、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００４３】
本発明のペプチドに含まれる第２のペプチド部分の個数は特に限定されるものではなく、１個であってもよいし複数個であってもよい。第２のペプチド部分の個数は、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
【００４４】
本発明のペプチドにおいて、第１のペプチド部分と第２のペプチド部分との配列順序は特に限定されるものではない。
【００４５】
本発明のペプチドに第１のペプチド部分が複数個含まれる場合、第１のペプチド部分同士が連続していてもよいし、第１のペプチド部分間に第２のペプチド部分が介在していてもよい。
【００４６】
本発明のペプチドに第２のペプチド部分が複数個含まれる場合、第２のペプチド部分同士が連続していてもよいし、第２のペプチド部分間に第１のペプチド部分が介在していてもよい。
【００４７】
第１のペプチド部分と第２のペプチド部分とは、第１のペプチド部分のＮ末端と第２のペプチド部分のＣ末端とが結合していてもよいし、第１のペプチド部分のＣ末端と第２のペプチド部分のＮ末端とが結合していてもよい。
【００４８】
第１のペプチド部分と第２のペプチド部分とは、直接結合していてもよいし、適当なリンカーを介して結合していてもよい。リンカーのアミノ酸配列は、本発明のペプチドの核内移行性を抑制しない限り特に限定されるものではない。リンカーを構成するアミノ酸残基の総数は、本発明のペプチドの核内移行性を抑制しない限り特に限定されるものではないが、通常１〜１０個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００４９】
本発明のペプチドは、例えば、本発明のペプチドを生産し得る形質転換体を培養することにより得ることができる。本発明のペプチドを生産し得る形質転換体は、第１のペプチドをコードするオープンリーディングフレームと第２のペプチドをコードするオープンリーディングフレームとが所望の順序で連結されたＤＮＡを、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換えベクターを作製し、当該組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００５０】
ペプチド（ａ）をコードするＤＮＡは、例えば、アデノウイルスを感染させた細胞から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、ペプチド（ａ）をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。また、ペプチド（ａ）をコードするＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
【００５１】
ペプチド（ｂ）をコードするＤＮＡは、ペプチド（ａ）をコードするＤＮＡに、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることができる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。また、ペプチド（ｂ）をコードするＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。
【００５２】
ペプチド（ｃ）をコードするＤＮＡは、例えば、シミアンウイルスを感染させた細胞から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、ペプチド（ｃ）をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。また、ペプチド（ｃ）をコードするＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。
【００５３】
ペプチド（ｄ）をコードするＤＮＡは、ペプチド（ｃ）をコードするＤＮＡに、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることができる。また、ペプチド（ｄ）をコードするＤＮＡは、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。
【００５４】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。
【００５５】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
【００５６】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用することができる。
【００５７】
形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
形質転換体の培養物より本発明のペプチドを採取することにより、本発明のペプチドを得ることができる。培養物には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
【００５８】
本発明のペプチドが形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、本発明のペプチドを抽出する。本発明のペプチドが形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
【００５９】
得られたペプチドは、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００６０】
本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することができる。この際、市販のペプチド合成機を使用することができる。
【００６１】
本発明のペプチドは、複数個のアルギニン残基と複数個のリシン残基とを含むポリカチオン性ペプチドであるので、静電的結合を介して核酸と複合体を形成することができる。本発明のペプチドと核酸との複合体は、本発明のペプチドと核酸とを例えば４〜３７℃で０．５〜３時間インキュベーションすることにより作製することができる。本発明のペプチドと複合体形成させる核酸としては、例えば、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡが組み込まれたプラスミド等を使用することができる。
【００６２】
本発明のペプチドと核酸との複合体は、脂質を含んでいてもよい。脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等が挙げられる。糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等が挙げられる。ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
【００６３】
本発明のペプチドと核酸との複合体は、リポソーム内に封入してもよい。本発明のペプチドと核酸との複合体の存在下、脂質膜を水和し、次いで攪拌又は超音波処理することにより、本発明のペプチドと核酸との複合体が封入されたリポソームを製造することができる。
【００６４】
本発明のペプチドと核酸との複合体の粒子径は特に限定されるものではないが、通常３０〜１０５ｎｍ、好ましくは３０〜１００ｎｍ、さらに好ましくは３０〜９５ｎｍである。本発明のペプチドと核酸との複合体の粒子径が上記範囲にあると、当該複合体が効率よく核内に移行することができる。
【００６５】
本発明のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入する方法は特に限定されるものではなく、常法に従って行うことができる。
本発明のペプチドと核酸との複合体を細胞内に導入する方法としては、例えば、エンドサイトーシスを利用した方法、細胞質内へのインジェクション、核内へのインジェクション、エレクトロポレーション、ハイドロダイナミックインジェクション等が挙げられる。
【００６６】
エンドサイトーシスを利用する場合、本発明のペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を封入したリポソームを、細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質で修飾することにより、当該複合体を細胞内へ効率よく導入することができる。
【００６７】
エンドサイトーシスによる細胞内導入は、本発明のペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を封入したリポソームを、細胞とともに例えば４〜３７℃で０．５〜４８時間インキュベーションすることにより行うことができる。
【００６８】
細胞膜の表面上に存在する受容体又は抗原と結合できる物質の種類は特に限定されるものではなく、細胞膜結合性物質としては、例えば、トラスフェリン、インシュリン、葉酸、ヒアルロン酸、抗体又はその断片、糖鎖、成長因子、アポリポタンパク質等が挙げられる。成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等が挙げられる。アポリポタンパク質としては、例えば、アポＡ−１、アポＢ−４８、アポＢ−１００、アポＥ等が挙げられる。抗体の断片としては、例えば、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が挙げられる。
【００６９】
本発明のペプチドと核酸との複合体において、次式：
【００７０】
【数２】
2006067891.tif 000003
【００７１】
［式中、ＣＰは複合体作製時に使用するペプチドの濃度（μｇ／μＬ）を表し、ｎＫはペプチド１分子あたりのリジン残基数を表し、ｎＲはペプチド１分子あたりのアルギニン残基数を表し、ＭＷＰはペプチドの分子量を表し、ＣＤは複合体作製時に使用する核酸の濃度（μｇ／μＬ）を表し、ＭＷＤは核酸のヌクレオチド１残基あたりの平均分子量を表す。］
で定義される電荷比は１〜４であることが好ましく、２〜３であることがさらに好ましい。本発明のペプチドと核酸との複合体の電荷比が１〜４であると、当該複合体に含まれる核酸を効率よく核内で発現させることができる。
【００７２】
本発明のペプチドと核酸との複合体を導入する細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００７３】
１．ポリカチオン性ペプチドと核酸との複合体の作製
ポリカチオン性ペプチドとして、アデノウイルス由来コアペプチドｍｕ（以下「ｍｕ」という。）、シミアンウイルス４０由来核移行性シグナル（ＳＶ４０−ＮＬＳ）とｍｕとの融合ペプチド（以下「ＮＬＳ−ｍｕ」という。）、及びポリＬ−リシン（以下「ＰＬＬ」という。）を使用した。ｍｕのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＮＬＳ−ｍｕのアミノ酸配列を配列番号２に示し、融合ペプチドのアミノ酸配列を配列番号３に示す。ｍｕの分子量は２４４０．８９であり、ＮＬＳ−ｍｕの分子量は３８１０．４８であり、ＰＬＬの分子量は２５７００である。なお、ポリカチオン性ペプチドの合成は、ペプチド合成業者に委託した。
【００７４】
核酸としては、ＥＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）をコードするＤＮＡ（クロンテック社製）を組み込んだプラスミドｐｃＤＮＡ３．１(＋)（インビトロジェン社製）（以下「ｐｃＤＮＡ３．１(+)−ＥＧＦＰ」という。）を使用した。
【００７５】
電荷比（charge ratio (+/-)）を１，２，５，１０の４種類に設定し、ｍｕ又はＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体を作製した。
【００７６】
ｍｕ又はＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体に関する電荷比は、ペプチド中の１個のリジン残基、１個のアルギニン残基をそれぞれ＋１の電荷、ＤＮＡ中の１個のリン酸基を−１の電荷として次式により算出した。
【００７７】
【数３】
2006067891.tif 000004
【００７８】
［式中、ＣＰは複合体作製時に使用するペプチドの濃度（μｇ／μＬ）を表し、ｎＫはペプチド１分子あたりのリジン残基数を表し、ｎＲはペプチド１分子あたりのアルギニン残基数を表し、ＭＷＰはペプチドの分子量を表し、ＣＤは複合体作製時に使用する核酸の濃度（μｇ／μＬ）を表し、ＭＷＤは核酸のヌクレオチド１残基あたりの平均分子量を表す。］
【００７９】
なお、ｍｕに関し、ｎＫは０であり、ｎＲは９であり、ＭＷＰは２４４０．８９であり、ＮＬＳ−ｍｕに関し、ｎＫは４であり、ｎＲは１０であり、ＭＷＰは３８１０．４８である。また、ｐｃＤＮＡ３．１(+)−ＥＧＦＰに関し、ＭＷＤは３０８であり、ＣＤは０．１に設定した。
【００８０】
電荷比が１のとき、ｍｕに関するＣＰは０．０８７５に設定し、ＮＬＳ−ｍｕに関するＣＰは０．０８８５に設定した。電荷比が２のとき、ｍｕに関するＣＰは０．１７５に設定し、ＮＬＳ−ｍｕに関するＣＰは０．１７７に設定した。電荷比が５のとき、ｍｕに関するＣＰは０．４３７５に設定し、ＮＬＳ−ｍｕに関するＣＰは０．４４２５に設定した。電荷比が１０のとき、ｍｕに関するＣＰは０．８７５に設定し、ＮＬＳ−ｍｕに関するＣＰは０．８８５に設定した。
【００８１】
電荷比（charge ratio (+/-)）を２に設定し、ＰＬＬと核酸との複合体を作製した。
ＰＬＬと核酸との複合体に関する電荷比は次式により計算した。
【００８２】
【数４】
2006067891.tif 000005
【００８３】
［式中、ＣＰは複合体作製時に使用するペプチドの濃度（μｇ／μＬ）を表し、ＭＷＫはリジン１残基あたりの分子量を表し、ＣＤは複合体作製時に使用する核酸の濃度（μｇ／μＬ）を表し、ＭＷＤは核酸のヌクレオチド１残基あたりの平均分子量を表す。］
【００８４】
なお、ＭＷＫは１２８であり、ＭＷＤは３０８であり、ＣＰは０．０８３に設定し、ＣＤは０．１に設定した。
【００８５】
ポリカチオン性ペプチド溶液（１００μＬ）を攪拌し、０．１μｇ／μＬのｐｃＤＮＡ３．１(+)−ＥＧＦＰ／Ｈ２Ｏを、２０μＬずつを５回滴下して加えた。滴下後、３０秒間攪拌を継続し、室温で３０分間静置した。静置後、ＥＬＳ−８０００を用いて、ポリカチオン性ペプチドと核酸との複合体の粒子径測定を行った。なお、Ｈ２Ｏとしては、ＤＩＳＭＩＣ−１３ＣＰ（cellulose acetate, pore size = 0.20μm）を用いて濾過したＨ２Ｏを用いた。
各複合体の粒子径（ｎｍ）は表１に示すとおりである。
【００８６】
【表１】
2006067891.tif 000006
【００８７】
２．各複合体に関する核膜透過及び核内転写効率の評価
各複合体について、核膜透過及び核内転写効率の評価を行った。なお、ＰＬＬと核酸との複合体（電荷比＝２）はコントロールとして使用した。
【００８８】
（１）マイクロインジェクション
インジェクションを行う前日に、glass base dish（IWAKI）上に５×１０４細胞／ｍＬの濃度でＨｅＬａ細胞を培養した。各複合体を、濾過済み０．５％ ローダミン（Ｒｈ）／Ｈ２Ｏを用いて、ｐｃＤＮＡ換算で３３．２ｆｍｏｌ／μＬ（= 1000 copies/cell)、０．３３ｆｍｏｌ／μＬ（= 10 copies/cell）となるように希釈した。３３．２ｆｍｏｌ／μＬのものを細胞質インジェクションに、０．３３ｆｍｏｌ／μＬのものを核インジェクションに使用した。
【００８９】
細胞質インジェクションにおいては、ＨｅＬａ細胞の細胞質に1000 copies/cellの濃度のサンプルをインジェクションした（インジェクション条件：Pi = 50-70 hPa, Pc = 30 hPa, Ti = 0.2 s）。インジェクションは４００個の細胞に行った。インジェクション後、新しいＤ’ＭＥＭに培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。インジェクション２４時間後、蛍光顕微鏡にて細胞を観察し、Ｒｈ発色細胞数及びＥＧＦＰ発現細胞数をカウントし、遺伝子発現率をＥＧＦＰ発現細胞数／Ｒｈ発色細胞数より算出した。
【００９０】
核内インジェクションにおいては、ＨｅＬａ細胞の核内に10 copies/cellの濃度のサンプルをインジェクションした（インジェクション条件：Pi = 50 hPa, Pc = 30 hPa, Ti = 0.2 s）。インジェクションは４００〜４５０個の細胞に行った。インジェクション後、新しいＤ’ＭＥＭに培地を交換し、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートした。インジェクション２４時間後、蛍光顕微鏡にて細胞を観察し、Ｒｈ発色細胞数及びＥＧＦＰ発現細胞数をカウントし、遺伝子発現率をＥＧＦＰ発現細胞数／Ｒｈ発色細胞数より算出した。
【００９１】
核内インジェクションにおける遺伝子発現が、核内における転写効率を反映するパラメーターと考えられる。また、核インジェクション時の発現率を細胞質インジェクション時の発現率で除することにより、核移行性の指標となる核移行スコアー（nuclear transfer score : NT score）を算出した。
各複合体の細胞質インジェクション時におけるＥＧＦＰ発現率を図１に示す。
図中、各値は平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【００９２】
図１に示すように、電荷比が１のとき、各複合体のＥＧＦＰ発現率はいずれも２０％前後であった。電荷比が２のとき、ＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体が最も高いＥＧＦＰ発現率を示し（３２．６％）、コントロールであるＰＬＬと核酸との複合体のＥＧＦＰ発現率（１２．３％）の２．７倍、ｍｕと核酸との複合体のＥＧＦＰ発現率（２０．１％）の１．６倍であり、各複合体のＥＧＦＰ発現率に顕著な違いが認められた。ＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体のＥＧＦＰ発現率は、電荷比が２よりも大きくなるに従って減少した。
【００９３】
核インジェクション時における各複合体のＥＧＦＰ発現率の比較は、細胞質インジェクション時における各複合体のＥＧＦＰ発現率に顕著な違いが認められた電荷比が２の場合にて行った。各複合体の核インジェクション時におけるＥＧＦＰ発現率を図２に示す。
【００９４】
図２に示すように、ＰＬＬと核酸との複合体のＥＧＦＰ発現率が最も高く（８６．７％）、ＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体のＥＧＦＰ発現率（７３．６％）も同程度であったが、ｍｕと核酸との複合体のＥＧＦＰ発現率は低かった（３５．０％）。
以上の結果から、電荷比が２のときの各複合体の核移行スコアーを算出し、ＰＬＬと核酸との複合体の核移行スコアーを１としたときの相対値を表２に示す。
【００９５】
【表２】
2006067891.tif 000007
【００９６】
表中、各値は平均値±標準偏差を表す。
電荷比が２のとき、ｍｕと核酸との複合体の核移行スコアー及びＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体の核移行スコアーは、ＰＬＬと核酸との複合体の核移行スコアーの３〜４倍であった。
【００９７】
以上の結果から、ＳＶ４０−ＮＬＳをｍｕに付加することにより、ｍｕの核移行性を保持しつつ、ｍｕによる核酸の転写抑制を緩和することができ、これにより、ＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体を細胞内に導入したときの、核酸の発現を亢進することができることが示された。
【００９８】
アルギニンに富むペプチドは、リシンに富むペプチドと比較して、核酸と強固な複合体を形成することが示唆されている（Plank. C. et al., Hum Gene Ther 10 : 319-322 (1999)）。ｍｕはアルギニンに富むペプチド（アルギニン残基の含有率は約４７％、リシン残基の含有率は０％）であるので、ｍｕと核酸との強い相互作用により、転写因子の核酸への結合が阻害され、ｍｕと複合体形成した核酸の転写が抑制されたものと考えられる。一方、ＳＶ４０−ＮＬＳは、リシンに富むペプチド（リシン残基の含有率は約３６％、アルギニン残基の含有率は約９％）であるので、ＳＶ４０−ＮＬＳをｍｕに付加することにより（融合ペプチドにおけるアルギニン残基の含有率は約３３％、リシン残基の含有率は約１３％）、ｍｕと核酸との強い相互作用が緩和され、ｍｕによる核酸の転写抑制を緩和されたものと考えられる。
【００９９】
通常、ポリカチオン性ペプチドと核酸との複合体は、核膜孔を透過して核内へ移行するものと考えられており、核膜孔を透過し得る粒子サイズの上限値は３９ｎｍであると考えられている（N. Psnte et al., Mol Biol Cell 13: 425-434 (2002)）。ＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体の粒子サイズは、表１に示すように３９ｎｍを超えており、ＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体の場合は、柔軟性に富んだ構造であるため核膜孔を透過することができるものと考えられる。但し、電荷比が１０のとき、ＮＬＳ−ｍｕと核酸との複合体の核移行スコアーは１．５６（細胞質インジェクション時のＥＧＦＰ発現率は１０．５％、核内インジェクション時のＥＧＦＰ発現率は４７．３％）であり、電荷比の増大とともに核移行スコアーの低下が認められた。電荷比の増大とともに粒子サイズも増大するので、核膜孔を透過し難くなり、核移行スコアーが低下したものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】各複合体の細胞質インジェクション時におけるＥＧＦＰ発現率を示す図である。
【図２】各複合体の核インジェクション時におけるＥＧＦＰ発現率を示す図である。
【図１】
2006067891.tif 000009
【図２】
2006067891.tif 000010
【配列表】
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