(57)【要約】【課題】免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供し、これを標的とする新たな機序の免疫調節薬や、そのスクリーニング方法等を提供すること。【解決手段】免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子としてIRAK-4遺伝子が提供される。また、本発明は、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、Ｔ細胞受容体機能調製用組成物、被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、Ｔ細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法等を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、T細胞受容体機能調節用組成物。
【請求項２】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進する物質を有効成分として含有してなる、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進する物質が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、請求項２記載の組成物：
（ｉ）IRAK-4ポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項４】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を有効成分として含有してなる、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、請求項４記載の組成物：
（ｉ）IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）IRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はIRAK-4ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはこれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項６】
医薬である、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
T細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療剤である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
T細胞受容体機能の低下に伴う疾患は、原発性免疫不全症又は続発性免疫不全状態である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療剤である、請求項６記載の組成物。
【請求項１０】
T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患が、自己免疫疾患、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）、乾癬、円形脱毛症、扁平苔癬、Ｔリンパ腫からなる群より選択される、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、請求項１１記載の方法：
（ａ）被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進し得る物質を、T細胞受容体機能を亢進し得る物質として選択する工程。
【請求項１３】
以下の工程を含む、請求項１１記載の方法：
（ａ）被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制し得る物質を、T細胞受容体機能を抑制し得る物質として選択する工程。
【請求項１４】
IRAK-4遺伝子の特定の多型がT細胞受容体機能に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、T細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型の同定方法。
【請求項１５】
生体試料におけるIRAK-4遺伝子の発現量又は機能を測定することを含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項１６】
IRAK-4遺伝子の発現量又は機能の測定用試薬を含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
【請求項１７】
IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドを含有してなる、単離された複合体。
【請求項１８】
IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用を調節する物質を有効成分として含有してなる、T細胞受容体機能調節用組成物。
【請求項１９】
被検物質がIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
IRAK-4遺伝子の特定の多型がIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、T細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型の同定方法。
【請求項２１】
生体試料におけるIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用を測定することを含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
【請求項２２】
被検物質がIRAK-4遺伝子の機能的欠損を有する細胞におけるT細胞受容体機能を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T細胞受容体機能調節用組成物、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物及び非脊椎動物を含む多くの生物は、感染に対しては自然免疫（innate immunity）にのみ依存している。Toll及びToll様受容体（Toll-like receptors: TLR）は、感染性の病原体の認識を担っており、該認識シグナルはMyD88等のアダプター分子及び下流のキナーゼを経て統合され、NF-κBを活性化する（Annu. Rev. Immunol., vol. 20, 197-216, 2002；J. Biol. Chem., vol. 278, p.38105-38108, 2003）。IRAK-4は自然免疫における活性化シグナルのための主要な制御性キナーゼの一つである（非特許文献１）。実際に、本願発明者らは、IRAK-4欠損（-/-）マウスは初期応答を引き起こすことが出来ず、IRAK-4はIL-1R，IL-18R、及びTLRシグナルカスケードにおいて重要な役割を果たしていることを以前示した（非特許文献１〜３）。また、IRAK-4遺伝子に先天的に異常のある患者において、バクテリア由来の抗原、ある種のタンパク抗原、バクテリオファージ等によって誘導される抗体産生が認められないことが報告されている（非特許文献４〜６）。
一方、脊椎動物においては、獲得免疫として知られている高度に組織化されたシステムが、細胞及び抗体（Ab）により調節された特異的認識を提供している。この特異性はB細胞受容体（BCR）及びT細胞受容体（TCR）の体細胞再構成により創造される。獲得免疫におけるT細胞認識は抗原（Ag）特異的TCRを発現しているクローンの拡大を誘導し、同一の病原体のための長期記憶を生じる。獲得免疫応答は抗原提示細胞（APCs）上のペプチド−MHC複合体によるTCRのエンゲージメントに基づくT細胞活性化により開始され、それはエフェクターT細胞の増殖及び分化を導く（J. Leukoc. Biol., vol. 69, p.317-330, 2001）。分子レベルでは、TCRエンゲージメントはSrcファミリーキナーゼであるLckによるTCRに相互作用したCD3鎖のリン酸化、及びSykファミリーキナーゼであるZAP-70のTCR複合体へのリクルートメント、それに引続くLAT、SLP-76及びPKCθのリン酸化を生じる。LAT／SLP-76はNF-ATの活性化を誘導し、一方、PKCθはCarma-1／Bcl10／MALT1の単一の複合体と協調して、NF-κBの活性化を達成する（Nat. Immunol., vol. 3, p.830-835, 2002；Nat. Immunol., vol. 3, p.836-843, 2002；Cell, vol. 104, p.33-42, 2001；Science, vol. 302, p.1581-1584, 2003；Immunity, vol. 19, p. 749-758, 2003）。これらのNF-AT及びNF-κBのための２つの活性化経路は、獲得免疫応答のために必要な遺伝子を誘導するT細胞活性化の特質を代表する。
T細胞受容体は、獲得免疫応答の最も中枢に位置するため、T細胞受容体機能を調節し得る物質は、T細胞の機能を調節するにとどまらず、獲得免疫反応全体を調節し得る。そのため、T細胞受容体シグナルカスケードをターゲットとする数多くの免疫調節薬の開発が行われ、いくつかの優れた免疫調節薬が創出されている。
しかしながら、T細胞受容体シグナルカスケードには極めて多種の分子が複雑に関与しており、その全容は未だ明らかとはなっていない。そこで、このシグナルカスケードの態様をさらに解明することにより、免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供することが切望されていた。
【非特許文献１】スズキ，Ｎら著、トレンズ  イン  イムノロジー(Trends in Immunology)、（イギリス）、第２３巻、ｐ．５０３−５０６、２００２年
【非特許文献２】スズキ，Ｎら著、ネイチャー(Nature)、（イギリス）、第４１６巻、ｐ．７５０−７５６、２００２年
【非特許文献３】スズキ，Ｎら著、ジャーナル  オブ  イムノロジー(Journal of Immunology)、（アメリカ）、第１７０巻、ｐ．４０３１−４０３５、２００３年
【非特許文献４】デイ，Ｎら著、ザ  ジャーナル  オブ  ペディアトリクス(The Journal of pediatrics)、（アメリカ）、第１４４巻、ｐ．５２４−５２６、２００４年
【非特許文献５】ピカード，Ｃら著、サイエンス(Science)、（アメリカ）、第２９９巻、ｐ．２０７６−２０７９、２００３年
【非特許文献６】メドゥヴェデフ，ＡＥら著、ザ  ジャーナル  オブ  エクスペリメンタル  メディシン(The Journal of Experimental Medicine)、（アメリカ）、第１９８巻、ｐ．５２１−５３１、２００３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、T細胞受容体シグナルカスケードにおける、免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子を提供し、これを標的とする新たな機序の免疫調節薬や、そのスクリーニング方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、IRAK-4-/-マウスにおいてはT細胞機能が著しく障害され、獲得免疫応答が不全であること等から、IRAK-4がT細胞受容体シグナリングのために欠くことができない分子であり、免疫調節薬開発等のための新たなターゲット分子として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に関する。
［１］IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、T細胞受容体機能調節用組成物。
［２］IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進する物質を有効成分として含有してなる、上記［１］記載の組成物。
［３］IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進する物質が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、上記［２］記載の組成物：
（ｉ）IRAK-4ポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
［４］IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質を有効成分として含有してなる、上記［１］記載の組成物。
［５］IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質が、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）である、上記［４］記載の組成物：
（ｉ）IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）IRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はIRAK-4ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはこれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
［６］医薬である、上記［１］記載の組成物。
［７］T細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療剤である、上記［６］記載の組成物。
［８］T細胞受容体機能の低下に伴う疾患は、原発性免疫不全症又は続発性免疫不全状態である、上記［７］記載の組成物。
［９］T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療剤である、上記［６］記載の組成物。
［１０］T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患が、自己免疫疾患、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）、乾癬、円形脱毛症、扁平苔癬、Ｔリンパ腫からなる群より選択される、上記［９］記載の組成物。
［１１］被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［１２］以下の工程を含む、上記［１１］記載の方法：
（ａ）被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進し得る物質を、T細胞受容体機能を亢進し得る物質として選択する工程。
［１３］以下の工程を含む、上記［１１］記載の方法：
（ａ）被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制し得るか否かを評価する工程；
（ｂ）IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制し得る物質を、T細胞受容体機能を抑制し得る物質として選択する工程。
［１４］IRAK-4遺伝子の特定の多型がT細胞受容体機能に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、T細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型の同定方法。
［１５］生体試料におけるIRAK-4遺伝子の発現量又は機能を測定することを含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
［１６］IRAK-4遺伝子の発現量又は機能の測定用試薬を含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断薬。
［１７］IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドを含有してなる、単離された複合体。
［１８］IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用を調節する物質を有効成分として含有してなる、T細胞受容体機能調節用組成物。
［１９］被検物質がIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
［２０］IRAK-4遺伝子の特定の多型がIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用に変化をもたらすか否かを解析する工程を含む、T細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型の同定方法。
［２１］生体試料におけるIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用を測定することを含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法。
［２２］被検物質がIRAK-4遺伝子の機能的欠損を有する細胞におけるT細胞受容体機能を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のT細胞受容体機能調節用組成物は、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節し、新たなメカニズムの免疫疾患予防・治療剤等として有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでT細胞受容体機能を調節し得る物質を得ることができるので、免疫調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（１．T細胞受容体機能調節用組成物）
本発明はIRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質を有効成分として含有してなる、T細胞受容体機能調節用組成物を提供する。
【０００７】
IRAK-4遺伝子の発現とは、IRAK-4遺伝子からの翻訳産物（即ち、ポリペプチド）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。
【０００８】
IRAK-4遺伝子の機能とは、IRAK-4遺伝子からの翻訳産物（即ち、ポリペプチド）が有する生物学的機能（活性）をいい、例えば、IRAK-4ポリペプチドの他の分子(ポリペプチド、ヌクレオチド三リン酸等)との相互作用、タンパク質キナーゼ活性（セリン／スレオニンキナーゼ活性等）等をいう。IRAK-4ポリペプチドと相互作用し得るポリペプチドとしては、例えばZAP-70、MyD88、TIRAP(Mal)、TRIF(TICAM)、IRAK-1、IRAK-2、IRAK-M、RIP2、TRAF-6、PKCtheta等を挙げることが出来る。また、IRAK-4ポリペプチドと相互作用し得るヌクレオチド三リン酸としてはＡＴＰを挙げることが出来る。「相互作用」とは分子同士の直接的な結合、又は他の分子を介する間接的な結合をいう。該結合は共有結合又は非共有結合であり得るが、非共有結合が好ましい。非共有結合としては、水素結合、静電結合、ファン・デル・ワールス力、疎水結合等が挙げられる。
【０００９】
T細胞受容体機能とは、T細胞受容体からの刺激を細胞内へ伝達し、T細胞の機能的変化を誘導し得る作用、或いはその誘導過程（シグナルカスケード）の反応を誘導し得る作用をいう。T細胞受容体からの刺激としては、抗原や抗原ミミック等による刺激が挙げられる。抗原（ペプチド、脂質等）は、通常MHC分子（MHCクラスＩ、MHCクラスＩＩ）上に提示され、抗原とMHC分子との複合体がT細胞受容体により認識される。また抗原ミミックとしては、T細胞受容体やT細胞受容体複合体を構成する分子（CD3ε鎖、CD3ζ鎖等）に対する抗体等が挙げられるが、これに限定されない。T細胞の機能的変化としては、T細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（IL-2、IL-4、インターフェロンγ等）産生、細胞障害活性、分化）、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。T細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、T細胞受容体からのシグナルカスケードに関与する分子の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、RAFTへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【００１０】
T細胞受容体からのシグナルカスケードには、NF-ATの活性化へ至る経路と、NF-κBの活性化へ至る経路があり、活性化されたこれらの転写因子が標的遺伝子の発現をコントロールする。概していうと、T細胞受容体からの刺激は、１）LckによるCD3鎖のリン酸化、２）ZAP-70のT細胞受容体複合体へのリクルートメント、３）LAT、SLP-76及びPKCθのリン酸化、を誘導する。LAT／SLP-76はNF-ATの活性化へ関与する。また、PKCθはCarma-1／Bcl10／MALT1の単一の複合体と協調して、NF-κBの活性化へ関与する（Nat. Immunol., vol. 3, p.830-835, 2002；Nat. Immunol., vol. 3, p.836-843, 2002；Cell, vol. 104, p.33-42, 2001；Science, vol. 302, p.1581-1584, 2003；Immunity, vol. 19, p. 749-758, 2003）。
【００１１】
後述の実施例等で示されるように、IRAK-4ポリペプチドはZAP-70ポリペプチドと相互作用し、T細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、PKCθの上流で機能し、NF-κBの活性化に関与し得る。
【００１２】
一実施態様では、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質は、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進する物質であり得る。
【００１３】
IRAK-4遺伝子の発現を促進する物質は、IRAK-4遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書で使用される場合、IRAK-4遺伝子の発現の促進としては、IRAK-4ポリペプチド自体の補充をも含むものとする。
【００１４】
IRAK-4遺伝子の機能を促進する物質は、IRAK-4ポリペプチドに結合し、該ポリペプチドを修飾（リン酸化等）し、或いは該ポリペプチドの安定性を増加させること等により、上述のIRAK-4遺伝子の機能（例えば、他の分子との相互作用、タンパク質キナーゼ活性等）を促進する作用を有する化合物をいう。
【００１５】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）IRAK-4ポリペプチド若しくはその塩；
（ｉｉ）IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【００１６】
本発明において、IRAK-4ポリペプチドとしては、任意の哺乳動物のIRAK-4ポリペプチドを用いることが出来る。
【００１７】
哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００１８】
哺乳動物のIRAK-4ポリペプチドとしては野生型のポリペプチドが好ましく、例えばヒト野生型IRAK-4ポリペプチド（例えば、配列番号２（GenBankアクセッション番号：NP_057207）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、マウス野生型IRAK-4ポリペプチド（例えば配列番号４（GenBankアクセッション番号： NP_084202）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）等が挙げられる。また、野生型IRAK-4ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドも本発明の範囲内である。「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、野生型IRAK-4ポリペプチドのアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型IRAK-4ポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はポリペプチドの表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。
【００１９】
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２０】
「実質的に同質の活性」とは、例えば、IRAK-4ポリペプチドの機能（活性）が性質的に野生型IRAK-4ポリペプチドと同質であることを示す。したがって、IRAK-4ポリペプチドの機能（活性）が野生型IRAK-4ポリペプチドと同等（例えば、約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ここにいうIRAK-4ポリペプチドの機能（活性）としては、上述の機能（他の分子との相互作用、タンパク質キナーゼ活性等）のほか、T細胞受容体シグナルカスケードにおけるシグナル伝達や、T細胞の活性化等が挙げられる。該機能の測定は、例えば、IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞にIRAK-4ポリペプチドを強制発現させ、該細胞のT細胞受容体からの刺激に対する応答（細胞増殖、サイトカイン産生等）を測定することにより行うことができる。
【００２１】
また、本発明においてIRAK-4ポリペプチドは、野生型IRAK-4ポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、野生型IRAK-4ポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをも含む。該ポリペプチドとしては、野生型IRAK-4ポリペプチドのアミノ酸配列又は又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列に、更に１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜２５０個程度、より好ましくは１〜１００個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、野生型IRAK-4と実質的に同質の活性を有するポリペプチドが挙げられる。付加されるアミノ酸配列は特に限定されないが、例えばポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグや、ポリペプチドの細胞内への導入を容易にならしめるためのProtein Transduction Domain（PTD）等のアミノ酸配列を挙げることが出来る。より具体的には、タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を挙げることが出来る。また、PTDとしては、ANTENNAPEDIA、HIV/TAT、HSV/VP-22等の細胞通過ドメイン、７〜１１個のポリアルギニン等を挙げることが出来る。アミノ酸が付加される位置は、当該ポリペプチドの活性を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは、野生型IRAK-4ポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列の末端（Ｎ末端又はＣ末端）である。
【００２２】
IRAK-4ポリペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００２３】
IRAK-4ポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２４】
IRAK-4ポリペプチド又はその塩は、該IRAK-4ポリペプチドを発現する哺乳動物の細胞又は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって調製することができる。IRAK-4ポリペプチドを発現する細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞等のリンパ球等を挙げることが出来るが、特に限定されない。具体的には、該哺乳動物の細胞又は組織をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００２５】
IRAK-4ポリペプチド又はその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。IRAK-4ポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチドを製造することができる。
【００２６】
IRAK-4ポリペプチド又はその塩は、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターが導入された形質転換体を培養してIRAK-4ポリペプチドを生成せしめ、得られる培養物から該ポリペプチドを分離・精製することによって製造することもできる。IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列としては、IRAK-4ポリペプチドをコードするcDNA、mRNA、染色体DNAのヌクレオチド配列が含まれ、より具体的には、例えばヒト野生型IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号１）（GenBankアクセッション番号：NM_016123）、マウス野生型IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば配列番号３）（GenBankアクセッション番号：NM_029926）等を挙げることが出来る。IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA：RNAのハイブリッドでもよい。IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、該ヌクレオチド配列の一部分を有する合成プライマーと、該ヌクレオチド配列を有する染色体DNA、mRNA、cDNA等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。
【００２７】
IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターは、クローン化された該核酸を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、用いる宿主に応じて適切なベクター（プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等）を選択することが出来る。また、プロモーターも、用いる宿主に対応して、適切なものを選択することが出来る。
【００２８】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（サル細胞（COS-7等）、チャイニーズハムスター細胞（CHO細胞等）等）などが用いられる。
【００２９】
IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターを、自体公知の方法に従って宿主へ導入することにより、IRAK-4ポリペプチドを発現可能な形質転換体を製造することが出来る。
【００３０】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができ、形質転換体の細胞内又は細胞外にIRAK-4ポリペプチドを生成させることができる。更に、前記形質転換体を培養して得られる培養物から、IRAK-4ポリペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
【００３１】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進する物質としてIRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を用いる場合、該核酸としては上述と同様のものを用いることが出来る。
【００３２】
IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、適切な発現ベクターに含まれた態様で用いられることが好ましい。即ち、該核酸は適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結され得る。
【００３３】
また、T細胞受容体機能を効果的に調節するため、該発現ベクターは適用対象である哺乳動物の細胞（T細胞等）内で機能可能なものが用いられる。該発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられるが、ヒト等の哺乳動物のT細胞への適用に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００３４】
使用されるプロモーターとしては、適用対象である哺乳動物の細胞（T細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得る限り特に限定されず、例えば、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR、ラウス肉腫ウイルスLTR、MoMuLV由来LTR、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター；β−アクチン遺伝子プロモーター、PGK遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター；Lckプロモーター、CD2プロモーター等のT細胞特異的プロモーター等が挙げられる。
【００３５】
該発現ベクターは、好ましくはIRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【００３６】
一実施態様では、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質は、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質であり得る。IRAK-4遺伝子の発現を抑制する物質は、IRAK-4遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化及び蛋白質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００３７】
IRAK-4遺伝子の機能を抑制する物質は、IRAK-4ポリペプチドに結合したり、該ポリペプチドを修飾したり、或いは該ポリペプチドの安定性を低下させたりすること等により、上述のIRAK-4遺伝子の機能（例えば、他の分子との相互作用、タンパク質キナーゼ活性等）を抑制する作用を有する化合物をいう。
【００３８】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質としては、例えば以下の（ｉ）、（ｉｉ）等を挙げることが出来る。
（ｉ）IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸；
（ｉｉ）IRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体、又はIRAK-4ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体、或いはこれらをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。
【００３９】
目的核酸の標的領域と相補的なヌクレオチド配列を有する核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。ここで「相補的である」とは、ヌクレオチド配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。
【００４０】
IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸（以下、「アンチセンスIRAK-4」ともいう）は、クローン化された、あるいは決定されたIRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、IRAK-4遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスIRAK-4は、IRAK-4ポリペプチドをコードする遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズすることができ、mRNAの合成（プロセッシング）または機能（タンパク質への翻訳）を阻害することができる。
【００４１】
アンチセンスIRAK-4の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてIRAK-4ポリペプチドへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該ポリペプチドをコードするmRNAまたは初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでmRNAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、IRAK-4をコードする核酸（例えばmRNA又は初期転写産物）の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、IRAK-4をコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、IRAK-4遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスIRAK-4は、IRAK-4ポリペプチドをコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、IRAK-4ポリペプチドをコードする二本鎖DNAと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００４２】
アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA／RNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’-Ｏ-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。
【００４３】
IRAK-4をコードするmRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスIRAK-4に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
【００４４】
IRAK-4をコードするmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴRNA（siRNA）もまた、アンチセンスIRAK-4に包含され得る。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAの一方の鎖に相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。siRNAの大きさは、RNAiを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、15bp以上、好ましくは20bp以上であり得る。RNAｉ活性を有するsiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA／RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００４５】
上述のIRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞（T細胞等）内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（T細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に、IRAK-4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
【００４６】
IRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、IRAK-4ポリペプチドに結合することにより、IRAK-4遺伝子の機能（例えば、他の分子との相互作用、タンパク質キナーゼ活性等）を抑制し得る。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体の結合性フラグメント（例えば、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００４７】
例えば、ポリクローナル抗体は、IRAK-4ポリペプチドあるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
【００４８】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作成することができる。例えば、マウスにIRAK-4ポリペプチドあるいはそのフラグメントを市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合してIRAK-4ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清又は動物の腹水から取得できる。
【００４９】
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、上記抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、６月号、第40〜第50頁、1995年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
【００５０】
IRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体は、より効果的にIRAK-4遺伝子の機能を抑制するために、IRAK-4ポリペプチドの機能性部位（他のタンパク質との相互作用に関与する部位、キナーゼ活性部位、ATP結合部位、Deathドメイン等）を特異的に認識し、当該部位が担う機能の低下をもたらすような抗体が選択され得る。
【００５１】
IRAK-4ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体とは、IRAK-4ポリペプチドに対する変異の導入によりその機能（活性）が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、IRAK-4ポリペプチドと競合することで間接的にその機能（活性）を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、IRAK-4ポリペプチドをコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位（他の分子との相互作用に関与する部位、キナーゼ活性部位、ATP結合部位、Ｄｅａｔｈドメイン等）における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、PCRや公知の変異導入試薬を用いる自体公知の方法により作製できる。
【００５２】
上述のIRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体や、IRAK-4ポリペプチドのドミナントネガティブ変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸も、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制する物質として好ましい。該核酸は、適切な発現ベクター（例えば、適用対象である哺乳動物の細胞（T細胞等）内で機能可能な発現ベクター）中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（T細胞等）でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に機能的に連結された態様で提供され得る。
【００５３】
本発明の組成物は、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
【００５４】
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５５】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００５６】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００５７】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の組成物は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リプフェクタミン（lipfectamine）、DOGS（トランスフェクタム；ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、DOPE（1,2-ジオールエオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）、DOTAP（1,2-ジオールエオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン）、DDAB（ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物）、DHDEAB（N,N-ジ-n-ヘキサアデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、HDEAB（N-n-ヘキサアデシル-N,N-ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
【００５８】
また、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節する物質がポリペプチドである場合、該ポリペプチドの細胞内への導入効率を高めるために、本発明の組成物は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト（ナカライテスク社製）、プロベクチン（IMGENEX社製）等を用いることが出来る。
【００５９】
本発明の組成物の適用量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約５０００ｍｇ／ｋｇである。
【００６０】
本発明の組成物は、例えば、医薬または研究用試薬として有用である。例えば、本発明の組成物が医薬組成物である場合、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の予防・治療剤として使用され得る。
【００６１】
詳細には、本発明の医薬組成物が、有効成分としてIRAK-4遺伝子の発現または機能を促進する物質を含有する場合、該物質は、T細胞受容体シグナルカスケードにおけるIRAK-4より下流の経路（例えばNF-κB活性化）を増強し得るので、例えば、T細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。T細胞受容体機能の低下に伴う疾患としては、例えば、T細胞の不活化（抗原に対するT細胞応答の低下、T細胞数の低下等）により引き起こされる免疫不全疾患であり得る。該疾患としては、原発性免疫不全症（例えば、重症複合免疫不全症、Bloom症候群、DiGeirge症候群、ataxia-telangiectasia、PNP欠損症、Wiskott-Aldrich症候群、突発性CD4+T細胞減少症、ADA欠損症、慢性皮膚粘膜カンデダ症、Duncan症候群（EBウイルスに対する特異的免疫不全）等）、続発性免疫不全状態（後天性免疫不全症候群（AIDS）、アナジー（Ｔ細胞不応答）、感染症（麻疹、結核）サルコイドーシス、リンパ系悪性腫瘍、薬剤（副腎皮質ホルモン、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン等）老化、栄養障害等）等が挙げられる。
【００６２】
また、本発明の医薬組成物が、有効成分としてIRAK-4遺伝子の発現または機能を抑制する物質を含有する場合、該物質は、T細胞受容体シグナルカスケードにおけるIRAK-4より下流の経路（例えばNF-κB活性化）を抑制し得るので、例えば、T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療に使用され得る。T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患としては、例えば、T細胞の異常な活性化（抗原に対するT細胞応答の上昇、T細胞数の上昇等）により引き起こされる免疫不全疾患であり得る。該疾患としては、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性血球減少症、重症筋無力症、強皮症、多発性筋炎、続発性アディソン病、不妊症、自己免疫性糸球体腎炎、シェーグレン病、脈管炎、自己免疫性脊髄炎、Ｉ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病等）、アレルギー疾患（例えばＩ型アレルギー疾患（例えば、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、じんま疹、アトピー性皮膚炎）、ＩＩ型アレルギー疾患（例えば、グッドパスチャー症候群、溶血性血小板紫斑症）、ＩＩＩ型アレルギー疾患（例えば、全身性血管炎、クリオグロブリン血症、血清症、ウイルス性肝炎、アレルギー性肺胞炎）、ＩＶ型アレルギー疾患（例えば、接触性皮膚炎、臓器移植拒絶反応、結核病変、サルコイドーシス、薬疹）等）、移植片対宿主症（ＧＶＨＤ）、乾癬（炎症性角化症）、円形脱毛症、、扁平苔癬、Ｔリンパ腫（皮膚Ｔ細胞リンパ腫白斑等）等が挙げられる。
【００６３】
さらに、本発明の組成物が研究用試薬である場合、例えば、実験動物におけるT細胞受容体機能の異常に伴う疾患の誘発剤として使用され得る。詳細には、本発明の研究用試薬が、有効成分としてIRAK-4遺伝子の発現または機能を促進する物質を含有する場合、例えば、T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の誘発に使用され得る。本発明の研究用試薬が、有効成分としてIRAK-4遺伝子の発現または機能を抑制する物質を含有する場合、例えば、T細胞受容体機能の低下に伴う疾患の誘発に使用され得る。
【００６４】
（２．T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、IRAK-4ポリペプチドはT細胞受容体シグナリングに寄与し、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節し得る物質は、T細胞受容体機能を調節し得る。従って、本発明は、被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法により得られる物質、及び当該物質を有効成分として含有してなるT細胞受容体機能調節用組成物を提供する。
【００６５】
スクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００６６】
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）被検物質がIRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節（促進又は抑制）し得るかを評価する工程；
（ｂ）IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節（促進又は抑制）し得る物質を選択する工程；
（ｃ）IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進し得る物質を、T細胞受容体機能を亢進し得る物質として得、或いはIRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制し得る物質を、T細胞受容体機能を抑制し得る物質として得る工程。
【００６７】
上記において、IRAK-4遺伝子の発現を調節し得る物質を選択する場合、例えば工程（ａ）において、被検物質とIRAK-4遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被検物質を接触させた細胞におけるIRAK-4遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるIRAK-4遺伝子の発現量と比較する。
IRAK-4遺伝子の発現を測定可能な細胞とは、IRAK-4遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。IRAK-4遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、IRAK-4遺伝子を天然で発現可能な細胞であり得、一方、IRAK-4遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、IRAK-4遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。IRAK-4遺伝子の発現を測定可能な細胞は、動物細胞、好ましくは上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００６８】
IRAK-4遺伝子を天然で発現可能な細胞は、IRAK-4遺伝子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。IRAK-4遺伝子が発現している細胞としてはT細胞、B細胞、樹状細胞等のリンパ球等が挙げられるが、T細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、T細胞（T細胞由来の細胞株（Jurkat等）を含む）を用いることが好ましい。
【００６９】
IRAK-4遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、IRAK-4遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。IRAK-4遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。IRAK-4遺伝子転写調節領域は、IRAK-4遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つIRAK-4遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばGFP（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、GUS（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、LUC（ルシフェラーゼ）遺伝子、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００７０】
IRAK-4遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、IRAK-4遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、IRAK-4遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、IRAK-4遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、IRAK-4遺伝子を天然で発現可能な細胞が好ましい。また、T細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、T細胞（T細胞由来の細胞株（Jurkat等）を含む）を用いることがより好ましい。
【００７１】
IRAK-4遺伝子の発現を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、適切な培養培地中で行われ得る。当該培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００７２】
次に先ず、被検物質を接触させた細胞におけるIRAK-4遺伝子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、IRAK-4遺伝子の発現を測定可能な細胞として、IRAK-4遺伝子を天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、IRAK-4遺伝子の産物、例えば、転写産物（mRNA）又は翻訳産物（ポリペプチド）を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT-PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、蛍光抗体法、ウェスタンブロッティング法などが使用できる。一方、IRAK-4遺伝子の発現を測定可能な細胞として、IRAK-4遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００７３】
次いで、被検物質を接触させた細胞におけるIRAK-4遺伝子の発現量が、被検物質を接触させない対照細胞におけるIRAK-4遺伝子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるIRAK-4遺伝子の発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるIRAK-4遺伝子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００７４】
上記方法の工程（ｂ）では、（ａ）の結果に基づき、IRAK-4遺伝子の発現を調節（促進又は抑制）し得る被検物質が選択される。
【００７５】
上記において、IRAK-4遺伝子の機能を調節し得る物質を選択する場合、例えば工程（ａ）において、被検物質の存在下でIRAK-4遺伝子の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被検物質の不在下におけるIRAK-4遺伝子の機能（活性）と比較する。
【００７６】
IRAK-4遺伝子の機能として、IRAK-4ポリペプチドと他の分子（例えばZAP-70ポリペプチド等のポリペプチド）との相互作用を測定する場合、該相互作用は自体公知の方法、例えば単離されたIRAK-4ポリペプチドとその相互作用対象分子とを用いて、バインディングアッセイ、表面プラズモン共鳴を利用する方法（例えば、Biacore(登録商標）の使用）により行うことができる。当該相互作用に関与し得る部位を含むIRAK-4ポリペプチドのフラグメントを用いてもよい。
【００７７】
また、細胞内におけるIRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用を測定することも好ましい。この場合、IRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用を測定可能な細胞と被検物質とを接触させ、被検物質を接触させた細胞における相互作用を測定し、これを被検物質を接触させない対照細胞における相互作用と比較する。
【００７８】
用いられる細胞としては、目的とする相互作用を測定可能な細胞であれば特に限定されず、IRAK-4ポリペプチド及び相互作用対象分子を機能可能な態様で発現する細胞等を挙げることが出来る。IRAK-4ポリペプチド及び相互作用対象分子は、天然に発現しているものであっても、遺伝子導入により強制的に発現しているものであってもよい。該相互作用を測定可能な細胞は、動物細胞、例えば上述の哺乳動物の細胞であり得る。
【００７９】
IRAK-4ポリペプチドと他のタンパク質との相互作用を測定可能な細胞としては、上述のIRAK-4遺伝子を天然で発現している細胞と同様の細胞を用いることが出来るが、T細胞受容体機能を調節し得る物質を得るという目的より、T細胞（T細胞由来の細胞株（Jurkat等）を含む）を用いることが好ましい。IRAK-4と他の分子との相互作用が細胞の活性化等に依存する場合は、細胞を適切に処理することにより活性化させてもよい。例えば、T細胞を用いる場合、抗原や抗原ミミックにより該細胞は刺激され得る。
【００８０】
IRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地）中で行われ得る。培養条件は、用いられる細胞や、測定される相互作用の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。
【００８１】
次に先ず、被検物質を接触させた細胞におけるIRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用が測定される。相互作用の測定は、用いた細胞や相互作用対象分子の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、IRAK-4ポリペプチドに対する抗体等により細胞の抽出液からIRAK-4ポリペプチドが免疫沈降され、IRAK-4ポリペプチドと共に沈殿した相互作用対象分子が、自体公知の方法（例えばウェスタンブロッティング法、マススペクトル法等）により定量される。
【００８２】
次いで、被検物質を接触させた細胞におけるIRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用が、被検物質を接触させない対照細胞における該相互作用と比較される。相互作用の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるIRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用は、被検物質を接触させた細胞におけるIRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用の測定に対し、事前に測定した相互作用であっても、同時に測定した相互作用であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した相互作用であることが好ましい。
【００８３】
IRAK-4遺伝子の機能として、IRAK-4ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を測定する場合、IRAK-4ポリペプチドを適切な基質（例えばIRAK-1、PKCtheta等）と反応させて、キナーゼ活性が直接測定され得る。この場合、当該キナーゼ活性に関与し得る部位（例えばキナーゼドメイン）を含むIRAK-4ポリペプチドのフラグメントを用いてもよい。
【００８４】
工程（ｂ）では、（ａ）の結果に基づき、IRAK-4遺伝子の機能を調節（促進又は抑制）し得る被検物質が選択される。
【００８５】
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で選択されたIRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進し得る物質がT細胞受容体機能を亢進し得る物質として、或いはIRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制し得る物質がT細胞受容体機能を抑制し得る物質として獲得される。
【００８６】
更に工程（ｂ）と（ｃ）の間に、工程（ｂ´）として工程（ｂ）で選択された物質がT細胞受容体機能を調節し得るか確認し、該効果が確認された物質を工程（ｃ）においてT細胞受容体機能を調節し得る物質として得ることも出来る。これにより、より高い効率で目的とする物質を獲得することが出来る。
【００８７】
工程（ｂ´）においては、例えば、工程（ｂ）で選択された物質（候補物質）とT細胞（T細胞由来の細胞株を含む）とを接触させ、候補物質を接触させたT細胞におけるT細胞受容体機能を測定し、該機能を候補物質を接触させない対照細胞におけるT細胞受容体機能と比較する。
【００８８】
T細胞に対する候補物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地）中で行われ得る。培養条件は、測定されるT細胞受容体機能の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。このとき、T細胞は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【００８９】
次に先ず、候補物質を接触させたT細胞におけるT細胞受容体機能が測定される。T細胞受容体機能として、T細胞受容体からの刺激により誘導されるT細胞の機能的変化やその誘導過程の反応が測定される。T細胞の機能的変化としては、T細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（IL-2、IL-4、インターフェロンγ等）産生、細胞障害活性、分化）、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。T細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、T細胞受容体からのシグナルカスケードに関与する分子（タンパク質等）の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、RAFTへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【００９０】
上述のように、IRAK-4はT細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、PKCθの上流で機能し、NF-κBの活性化に関与し得る。従って、候補物質がT細胞受容体からのシグナルカスケードにおけるIRAK-4の機能を選択的に調節し得ることを確認する目的で、T細胞受容体からのシグナルカスケードにおいてIRAK-4より下流で機能する分子（例えば、PKCθ、Carma-1、Bcl10、MALT1、NF-κB、IκB等）の修飾、分子間相互作用、細胞内局在の変化等を測定してもよい。或いは、NF-κBの標的遺伝子の発現の変化を測定してもよい。
【００９１】
T細胞受容体機能の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、細胞増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、サイトカイン産生はELISA法等により、細胞障害活性は５１Ｃｒ放出アッセイ等により、T細胞分化（例えばTh1やTh2への分化）はサイトカイン遺伝子発現パターン変化の測定により、アポトーシスは染色体DNAの断片化の測定により、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化はウェスタンブロッティング法等により、タンパク質の分解はウェスタンブロッティング法等により、分子間相互作用は免疫沈降法等により、細胞内局在の変化は免疫染色により、RAFTへの局在化は密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法等により、遺伝子発現の変化はRT-PCRやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【００９２】
次いで、候補物質を接触させたT細胞におけるT細胞受容体機能が、候補物質を接触させない対照細胞におけるT細胞受容体機能と比較される。T細胞受容体機能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。候補物質を接触させない対照細胞におけるT細胞受容体機能は、候補物質を接触させたT細胞におけるT細胞受容体機能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、候補物質によるT細胞受容体機能の調節作用が確認される。
【００９３】
本発明のスクリーニング方法はまた、被検物質の動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の哺乳動物が挙げられる。動物を用いて本発明のスクリーニング方法が行われる場合、例えば、IRAK-4遺伝子の発現量を調節する被検物質が選択され得る。
【００９４】
IRAK-4遺伝子の発現又は機能を促進し得る物質はT細胞受容体機能を亢進し得るので、T細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。また、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を抑制し得る物質はT細胞受容体機能を抑制し得るので、T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。従って、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を指標として、種々の免疫疾患の予防・治療剤等の医薬、又は研究用試薬のための候補物質を選択することが可能となる。
【００９５】
（３．T細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型の同定方法）
本発明はまた、IRAK-4遺伝子の特定の多型がT細胞受容体機能の異常をもたらすか否かを解析する工程を含む、T細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型の同定方法、当該方法により同定されるT細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型を含むポリペプチド・核酸分子を提供する。
【００９６】
IRAK-4遺伝子の多型とは、ある母集団において、IRAK-4遺伝子を含むゲノムDNAに一定頻度で見出されるヌクレオチド配列の変異を意味し、IRAK-4遺伝子を含むゲノムDNAにおける１以上のDNAの置換、欠失、付加（例えば、SNP、ハプロタイプ）、並びに該ゲノムDNA中の部分領域の反復、逆位、転座などであり得る。本発明の方法により同定されるIRAK-4遺伝子の多型のタイプは、IRAK-4遺伝子における全てのタイプの多型のうち、T細胞受容体機能に異常（亢進又は低下）を有する動物と異常を有していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異、又はT細胞受容体機能の異常に伴う疾患に罹患した動物と罹患していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列の変異であり、例えば、IRAK-4遺伝子の発現または機能の変化をもたらすものであり得る。なお、IRAK-4遺伝子多型の解析対象となる動物は上述の哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。
【００９７】
解析工程は、連鎖解析等の自体公知の方法により行われ得る。T細胞受容体機能の異常、又はT細胞受容体機能の異常に伴う疾患の有無により特定の遺伝子多型の保有頻度に有意差が認められたとき、そのタイプの遺伝子多型を保有する対象は、保有しない対象よりもT細胞受容体機能に異常を有するリスク、又はT細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクが相対的に高い又は低いと判定される。
【００９８】
本発明の同定方法は、哺乳動物由来の生体試料から調製されたDNAサンプルをシークエンシング (sequencing) に供し、IRAK-4多型の新たなタイプを決定する工程をさらに含むこともできる。生体試料は、IRAK-4遺伝子の発現組織又は細胞（例えば、T細胞）を含む試料（例えば、血液）のみならず、毛髪、爪、皮膚、粘膜等のゲノムDNAを含む任意の組織も使用できる。入手の容易性、人体への負担等を考慮すれば、生体試料は、毛髪、爪、皮膚、粘膜、血液、血漿、血清、唾液などが好ましい。遺伝子多型の決定は、由来が異なる生体試料に含まれるゲノム又は転写産物のヌクレオチド配列を多数解析し、決定されたヌクレオチド配列中に一定頻度で見出される変異を同定することで行われ得る。
【００９９】
更に、見出された変異が実際にIRAK-4遺伝子の発現や機能に変化をもたらし得るか、確認してもよい。例えば、該変異を有するIRAK-4遺伝子を、IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞（又はその細胞株）へ導入し、該T細胞における該IRAK-4遺伝子の発現又は機能を、該変異を有さないIRAK-4遺伝子（野生型IRAK-4遺伝子等）の発現又は機能と比較することが出来る。或いは該変異を有するIRAK-4遺伝子が導入されたT細胞における、T細胞受容体機能を、該変異を有さないIRAK-4遺伝子が導入されたT細胞におけるものと比較してもよい。IRAK-4遺伝子の発現や機能、T細胞受容体機能の測定は、上述と同様に行うことが出来る。
【０１００】
見出されたIRAK-4遺伝子の変異がT細胞受容体機能の低下をもたらすものである場合、該変異はT細胞受容体機能の低下に伴う疾患をもたらし得るものであるとすることができる。また、見出されたIRAK-4遺伝子の変異がT細胞受容体機能の亢進をもたらすものである場合、該変異はT細胞受容体機能の亢進に伴う疾患をもたらし得るものであるとすることが出来る。
【０１０１】
本発明の同定方法および当該方法により決定されたT細胞受容体機能の異常をもたらすIRAK-4遺伝子多型は、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定に有用である。
【０１０２】
（４．T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症または発症リスクの判定方法）
（４−１．発現量の測定に基づく判定方法および診断剤）
上述の様に、IRAK-4ポリペプチドはT細胞受容体からのシグナルカスケードに深く関与し、T細胞受容体機能を調節している。従って、本発明は、動物由来の生体試料におけるIRAK-4遺伝子の発現量又は機能を測定することを含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物由来の生体試料におけるIRAK-4遺伝子の発現量又は機能を測定する工程；
（ｂ）IRAK-4遺伝子の発現量又は機能に基づきT細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクを評価する工程。
【０１０４】
上記方法の工程（ａ）では、生体試料におけるIRAK-4遺伝子の発現量又は機能が測定される。生体試料は動物、好ましくは哺乳動物由来であれば特に限定されないが、ヒトが由来の試料が最も好ましい。生体試料は、IRAK-4遺伝子を発現している組織又は細胞（例えば、T細胞）を含む試料（例えば、血液）、あるいは該試料から分離された細胞であり得るが、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクを判定する目的より、生体試料は、T細胞またはそれを含む試料が好ましい。また、IRAK-4遺伝子の発現量又は機能の測定は、上述と同様に行われ得る。
【０１０５】
上記方法の工程（ｂ）では、IRAK-4遺伝子の発現量又は機能に基づき、生体試料が由来する動物がT細胞受容体機能の異常に伴う疾患に罹患しているか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。
詳細には、先ず、測定されたIRAK-4遺伝子の発現量又は機能が、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患に罹患していない動物（例えば、正常動物）由来の生体試料におけるIRAK-4遺伝子の発現量又は機能と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【０１０６】
次いで、IRAK-4遺伝子の発現量又は機能の比較結果より、生体試料が由来する動物が免疫疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した動物では、当該疾患に関連する遺伝子の発現又は機能の変化がしばしば観察されることが知られている。また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現又は機能の変化がしばしば観察されることが知られている。実際に、後述の実施例に示すように、IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有する動物においては、ウイルス感染細胞に対するT細胞の細胞傷害性が低下しており、ウイルス感染に対する抵抗性が低下している。従って、IRAK-4遺伝子の発現又は機能が低下している場合には、T細胞受容体機能の低下に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。また、本明細書中に開示された知見より、IRAK-4遺伝子の発現又は機能が亢進している場合には、T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患に罹患している可能性、又は将来的に罹患する可能性が相対的に高いと考えられる。
【０１０７】
本発明はまた、IRAK-4遺伝子の発現量又は機能の測定用試薬を含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断剤を提供する。本発明の診断剤を用いれば、上記判定方法により、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクを容易に判定することが出来る。
【０１０８】
IRAK-4遺伝子の発現量の測定用試薬は、IRAK-4遺伝子の発現を定量可能である限り特に限定されないが、例えば、IRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体、IRAK-4遺伝子転写産物に対する核酸プローブ、またはIRAK-4遺伝子転写産物を増幅可能な複数のプライマーを含むものであり得る。これらは、標識用物質で標識されていても標識されていなくともよい。標識用物質で標識されていない場合、本発明の診断剤は、該標識用物質をさらに含むこともできる。標識用物質としては、例えば、FITC、FAM等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、3H、14C、32P、35S、125I等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。
【０１０９】
IRAK-4遺伝子転写産物に対する核酸プローブは、DNA、RNAのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとDNAが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、IRAK-4遺伝子の転写産物を検出可能である限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１０００ｂｐ、より好ましくは約５０〜５００ｂｐである。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【０１１０】
IRAK-4遺伝子を増幅可能な複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、検出可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。検出可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、IRAK-4遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。IRAK-4遺伝子転写産物を定量可能な試薬がプライマーである場合、本発明の診断薬は、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【０１１１】
IRAK-4遺伝子の機能の測定用試薬は、IRAK-4遺伝子の機能を定量可能である限り特に限定されない。例えば、免疫沈降法及びウェスタンブロット法によりIRAK-4ポリペプチドと他の分子との相互作用を測定する場合、該試薬として、IRAK-4ポリペプチドを特異的に認識する抗体及び相互作用対象分子を特異的に認識する抗体、プロテインＡ結合ビーズ等を挙げることが出来る。また、IRAK-4ポリペプチドのタンパク質キナーゼ活性を測定する場合、該試薬として、キナーゼの基質（例えばIRAK-1ポリペプチド等）を挙げることが出来る。
【０１１２】
本発明の上記判定方法及び診断剤は、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の有無、あるいは該疾患に罹患する可能性の判定を可能とする。従って、本発明は、例えば、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の容易且つ早期の発見などに有用である。
【０１１３】
（４−２．多型の測定に基づく判定方法および診断剤）
本発明は、動物の生体試料を用いてIRAK-4遺伝子の多型を測定することを含む、動物におけるT細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
【０１１４】
一実施形態では、本発明の判定方法は、以下の工程（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）動物から採取した生体試料においてIRAK-4遺伝子の多型を測定する工程；
（ｂ）多型のタイプに基づきT細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症可能性を評価する工程。
【０１１５】
上記方法の工程（ａ）では、動物から採取された生体試料においてIRAK-4遺伝子の多型のタイプが測定される。動物としては、上述の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。生体試料は、本発明の多型の同定方法で使用し得るものと同様である。
【０１１６】
多型のタイプの測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、RFLP（制限酵素切断断片長多型）法、PCR-SSCP（一本鎖DNA高次構造多型解析）法、ASO（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ARMS（Amplification Refracting Mutation System）法、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法、RNAseA切断法、DOL（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、TaqMan PCR法、インベーダー法などが使用できる。
【０１１７】
上記方法の工程（ｂ）では、多型のタイプに基づき、動物がT細胞受容体機能の異常に伴う疾患に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。特定の疾患を発症しやすい動物では、当該疾患に関連する遺伝子に特定のタイプの多型をしばしば有することが知られている。実際に、後述の実施例に示すように、IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有する動物においては、ウイルス感染細胞に対するT細胞の細胞傷害性が低下しており、ウイルス感染に対する抵抗性が低下している。従って、IRAK-4遺伝子の機能を低下させるような多型を含む動物は、T細胞受容体機能の低下に伴う疾患を発症する可能性が相対的に高いと考えられる。同様に、IRAK-4遺伝子の機能を促進するような多型を含む動物は、T細胞受容体機能の亢進に伴う疾患を発症する可能性が相対的に高いと考えられる。従って、IRAK-4遺伝子の多型の解析より、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症可能性を判断することが可能である。なお、本工程で測定対象となる多型のタイプは、例えば、本発明の同定方法により得られたものであり得る。
【０１１８】
本発明はまた、IRAK-4遺伝子の多型の測定用試薬を含む、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの診断剤を提供する。
【０１１９】
IRAK-4遺伝子の多型の測定用試薬は、IRAK-4遺伝子の多型を決定可能である限り特に限定されない。該試薬は、標識用物質で標識されていてもよい。また、該試薬が標識用物質で標識されていない場合、本キットは、該標識用物質をさらに含むこともできる。
【０１２０】
詳細には、IRAK-4遺伝子の多型の測定用試薬は、特定のタイプの多型を有するIRAK-4遺伝子を特異的に測定可能である核酸プローブ、あるいは特定のタイプの多型を有するIRAK-4遺伝子を特異的に増幅可能である複数のプライマーを含むものであり得る。核酸プローブ、プライマーは、IRAK-4遺伝子を含むゲノムDNAまたはIRAK-4遺伝子転写産物に対するものであり得る。核酸プローブ、プライマーは、転写産物またはゲノムDNAの抽出用試薬とともに提供されてもよい。
【０１２１】
特定のタイプの多型を有するIRAK-4遺伝子を特異的に測定可能である核酸プローブは、特定のタイプの多型を有するIRAK-4遺伝子を選別可能である限り特に限定されない。該プローブはDNA、RNAのいずれでもよいが、安定性等を考慮するとDNAが好ましい。また、該プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。該プローブのサイズは、特定のタイプの多型を有するIRAK-4遺伝子を選別可能とするため短ければ短いほどよく、例えば、約１５〜３０ｂｐのサイズであり得る。該プローブは、マイクロアレイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。該プローブにより、例えばＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法が可能となる。
【０１２２】
特定のタイプの多型を有するIRAK-4遺伝子を特異的に増幅可能である複数のプライマー（例えば、プライマー対）は、測定可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。このような複数のプライマーは、例えば、いずれか一方のプライマーの３’末端に多型部位を含むように設計される。測定可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約１００ｂｐ以上、好ましくは約２００ｂｐ以上、より好ましくは約４００ｂｐ以上の長さを有し得る。プライマーのサイズは、IRAK-4遺伝子を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約１５〜１００ｂｐ、より好ましくは約１８〜５０ｂｐ、さらにより好ましくは約２０〜３０ｂｐであり得る。IRAK-4遺伝子の多型を測定し得る手段がIRAK-4遺伝子転写産物に対するプライマー対である場合、判定キットは、逆転写酵素をさらに含むことができる。
【０１２３】
また、IRAK-4遺伝子の多型の測定用試薬として、特定のタイプの多型部位を認識する制限酵素を含むものを挙げることもできる。このような試薬によれば、ＲＦＬＰによる多型解析が可能となる。
【０１２４】
本発明の上記判定方法及び診断剤は、T細胞受容体機能の異常に伴う疾患の発症リスクの判定を可能とする。従って、本発明の判定方法及び診断剤は、免疫疾患の予防を目的とする生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。
【０１２５】
（５．IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドを含有してなる、単離された複合体）
上述の通り、T細胞受容体シグナルカスケードにおいて、IRAK-4ポリペプチドはZAP-70ポリペプチドと相互作用し、シグナルを下流に伝達し得る。従って、本発明はIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドを含有してなる、単離された複合体を提供する。複合体中において、IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとは相互作用し得る。
【０１２６】
本発明において、ZAP-70ポリペプチドとしては、IRAK-4ポリペプチドと同様に、任意の哺乳動物のものを用いることが出来る。哺乳動物のZAP-70ポリペプチドとしては野生型のポリペプチドが好ましく、例えばヒト野生型ZAP-70ポリペプチド（例えば、配列番号６（GenBankアクセッション番号：AAH39039）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）、マウス野生型ZAP-70ポリペプチド（例えば配列番号８（GenBankアクセッション番号：AAA19250）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）等が挙げられる。また、野生型ZAP-70ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドも本発明の範囲内である。「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、野生型ZAP-70ポリペプチドのアミノ酸配列と約９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、野生型ZAP-70ポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが挙げられる。
【０１２７】
「実質的に同質の活性」とは、例えば、ZAP-70ポリペプチドの機能（活性）が性質的に野生型ZAP-70ポリペプチドと同質であることを示す。したがって、ZAP-70ポリペプチドの機能（活性）が野生型ZAP-70ポリペプチドと同等（例えば、約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。ここにいうZAP-70ポリペプチドの機能（活性）としては、他の分子（例えば、IRAK-4ポリペプチド等のタンパク質）との相互作用のほか、T細胞受容体シグナルカスケードにおけるシグナル伝達や、T細胞の活性化等が挙げられる。該機能の測定は、例えば、ZAP-70遺伝子の機能的欠損を有するT細胞にZAP-70ポリペプチドを強制発現させ、該細胞におけるIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用や、T細胞受容体からの刺激に対する応答（細胞増殖、サイトカイン産生等）を測定することにより行うことができる。
【０１２８】
また、本発明においてZAP-70ポリペプチドは、野生型ZAP-70ポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、野生型ZAP-70と実質的に同質の活性を有するポリペプチドをも含む。該ポリペプチドとしては、野生型ZAP-70ポリペプチドのアミノ酸配列又は該配列と実質的に同一のアミノ酸配列に、更に１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜２５０個程度、より好ましくは１〜１００個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列からなり、野生型ZAP-70ポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドが挙げられる。付加されるアミノ酸配列は特に限定されないが、例えばポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグや、ポリペプチドの細胞内への導入を容易にならしめるためのProtein Transduction Domain（PTD）等のアミノ酸配列を挙げることが出来る。タグやPTDの種類、アミノ酸配列が付加される位置は、IRAK-4ポリペプチドと同様である。
【０１２９】
ZAP-70ポリペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【０１３０】
IRAK-4ポリペプチドと同様に、ZAP-70ポリペプチドは、ZAP-70遺伝子を発現する哺乳動物の細胞（例えばT細胞）又は組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって調製することができる。又、ZAP-70ポリペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。或いは、ZAP-70ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含有する発現ベクターを導入した形質転換体を培養してZAP-70ポリペプチドを生成せしめ、得られる培養物から該ポリペプチドを分離・精製することによって製造することもできる。
【０１３１】
IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドを含有してなる、単離された複合体は、任意の方法により製造することが可能である。例えば、IRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの両方を発現している細胞（例えばT細胞等）を、適切な緩衝液中で、適切な界面活性剤（ＮＰ−４０、ジギトニン等）を用いて可溶化し、IRAK-4ポリペプチド又はZAP-70ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、免疫沈降法や抗体カラム等によりIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドを含有してなる複合体を単離する。ウェスタンブロット法などにより、得られた複合体中に、IRAK-4ポリペプチド及びZAP-70ポリペプチドが含まれていることを確認することが好ましい。また、単離されたIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとを、適当な緩衝液中で混合することによっても、本発明の複合体を得ることが出来る。
【０１３２】
本発明の複合体は、被検物質がIRAK-4ポリペプチドとZAP-70ポリペプチドとの相互作用を調節し得るか否かを評価することを含む、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法などにおいて有用である。
【０１３３】
（６．IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞を用いる、T細胞受容体機能を調節し得る物質のスクリーニング方法）
上述のように、IRAK-4ポリペプチドはZAP-70ポリペプチドと相互作用し、T細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、PKCθの上流で機能し、NF-κBの活性化に関与し得る。従って、被検物質がIRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞におけるT細胞受容体機能を調節（例えば亢進）し得るか否かを評価することにより、IRAK-4遺伝子の機能的欠損を補うこと等により、T細胞受容体機能を調節（例えば亢進）し得る物質をスクリーニングすることが出来る。
【０１３４】
IRAK-4遺伝子の機能的欠損とは、IRAK-4遺伝子が本来有する正常な機能が十分に発揮できない状態をいい、例えば、IRAK-4遺伝子が全く発現していない状態、またはIRAK-4遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、あるいはIRAK-4遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、または遺伝子変異などによりIRAK-4遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にIRAK-4遺伝子産物の機能が低下した状態が挙げられる。
【０１３５】
IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞は、例えば、IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有する動物からT細胞を単離する事により得ることが可能である。IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有する動物（例えばIRAK-4ノックアウト動物）は、例えば自体公知のジーンターゲッティング法によりIRAK-4遺伝子に機能的欠損が導入されたＥＳ細胞を用いることにより作成することが可能である（Nature, vol. 416, p.750-756, 2002）。
【０１３６】
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む：
（ａ）被検物質がIRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞におけるT細胞受容体機能を調節（亢進等）し得るかを評価する工程；
（ｂ）IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞におけるT細胞受容体機能を調節（亢進等）し得る物質を選択する工程；
【０１３７】
例えば工程（ａ）において、被検物質とIRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞とを接触させ、被検物質を接触させた細胞におけるT細胞受容体機能を測定し、該機能を被検物質を接触させない対照細胞におけるT細胞受容体機能と比較する。
【０１３８】
T細胞に対する被検物質の接触は、上述と同様に適切な培養培地（例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地）中で行われ得る。培養条件は、測定されるT細胞受容体機能の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１分間〜約７２時間である。T細胞は抗原や抗原ミミックにより適宜刺激され得る。
【０１３９】
次に先ず、被検物質を接触させたT細胞におけるT細胞受容体機能が測定される。ここでT細胞受容体機能として、T細胞受容体からの刺激により誘導されるT細胞の機能的変化やその誘導過程の反応が測定される。T細胞の機能的変化としては、T細胞の活性化（細胞増殖、サイトカイン（IL-2、IL-4、インターフェロンγ等）産生、細胞障害活性、分化）、アポトーシス、アナジー等が挙げられる。T細胞の機能的変化を誘導する過程の反応としては、T細胞受容体からのシグナルカスケードに関与する分子（タンパク質等）の修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、分解等）、分子間相互作用、細胞内局在の変化（核内移行、RAFTへの局在化、細胞内濃度変化等）、遺伝子発現の変化等が挙げられる。
【０１４０】
上述のように、IRAK-4はT細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、PKCθの上流で機能し、NF-κBの活性化に関与し得る。従って、被検物質がT細胞受容体からのシグナルカスケードにおけるIRAK-4の機能を選択的に調節し得ることを確認する目的で、T細胞受容体からのシグナルカスケードにおいてIRAK-4より下流で機能する分子（例えば、PKCθ、Carma-1、Bcl10、MALT1、NF-κB、IκB等）の修飾、分子間相互作用、細胞内局在の変化等を測定してもよい。或いは、NF-κBの標的遺伝子の発現の変化を測定してもよい。
【０１４１】
T細胞受容体機能の測定は、自体公知の方法により行うことが可能である。例えば、細胞増殖は３Ｈ−サイミジンの取り込み等により、サイトカイン産生はELISA法等により、細胞障害活性は５１Ｃｒ放出アッセイ等により、分化はサイトカイン遺伝子発現パターン変化の測定により、アポトーシスは染色体DNAの断片化の測定により、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化はウェスタンブロッティング法等により、タンパク質の分解はウェスタンブロッティング法等により、分子間相互作用は免疫沈降法等により、細胞内局在の変化は免疫染色により、RAFTへの局在化は密度勾配遠心法及びウェスタンブロッティング法等により、遺伝子発現の変化はRT-PCRやフローサイトメトリー等により、それぞれ測定することが出来る。
【０１４２】
次いで、被検物質を接触させたT細胞におけるT細胞受容体機能が、被検物質を接触させない対照細胞におけるT細胞受容体機能と比較される。T細胞受容体機能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるT細胞受容体機能は、被検物質を接触させたT細胞におけるT細胞受容体機能の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したものであることが好ましい。比較結果に基づき、被検物質によるT細胞受容体機能を調節作用が確認される。
【０１４３】
上記方法の工程（ｂ）では、（ａ）の結果に基づき、IRAK-4遺伝子の機能的欠損を有するT細胞におけるT細胞受容体機能を調節（促進等）し得る物質が選択される。
【０１４４】
IRAK-4ポリペプチドはT細胞受容体からのシグナルカスケードにおいて、PKCθの上流で機能し、NF-κBの活性化に関与し得るので、本発明のスクリーニング方法により得られるT細胞受容体機能を促進し得る物質は、例えばT細胞受容体からのシグナルカスケードのうち、特にNF-κBの活性化に至る経路においてIRAK-4よりも下流において作用する等して、IRAK-4の機能的欠損を迂回してT細胞受容体シグナリングを活性化させる物質であり得る。このような物質の例として、PKCθの活性化剤(ホルボール12-ミリスチン酸エステル 13-酢酸塩(PMA)等)とカルシウムイオノフォア（イオノマイシン等）との組み合わせ等を挙げることが出来る。
【０１４５】
また、本発明のスクリーニング方法により得られるT細胞受容体機能を促進し得る物質は、T細胞受容体からのシグナルカスケードには直接は作用しないが、間接的にIRAK-4遺伝子の機能的欠損を補填し、T細胞受容体機能を促進させ、結果としてT細胞の機能的な変化をIRAK-4の機能的欠損がないＴ細胞のレベルに近づける物質であり得る。このような物質の例として、T細胞の増殖性サイトカイン（例えば、IL-2ポリペプチド等）や、当該サイトカインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等を挙げることが出来る。該核酸は、適当な発現ベクター（適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能な発現ベクター）中のプロモーター（適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能なプロモーター）の下流に機能的に連結され得る。
【０１４６】
本発明のスクリーニング方法により得られるT細胞受容体機能を調節（促進等）し得る物質はT細胞受容体機能の低下に伴う疾患の予防・治療薬となり得る。当該予防・治療薬は、T細胞受容体機能の低下がIRAK-4遺伝子の機能的欠損によるものである場合に、特に有効であり得る。
【０１４７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１４８】
〔１〕実験方法
（マウス及び抗体）
C57BL/6及びBALB/cマウスは、Jackson及びCrea Laboratoryから購入した。IRAK-4-/-マウスは以前作成し（Nature, vol. 416, p.750-756, 2002）、C57BL/6マウスに８世代以上戻し交配した。活性化、ウェスタンブロット、免疫沈降及び画像化のために用いられた抗体は以下の通りである。IκB、JNK及びリン酸化cJunに特異的な抗体はNew England Biolabsから、PKCθ、リン酸化PKCθ、ZAP-70、リン酸化ZAP-70、LAT、リン酸化LATに特異的な抗体はCell Signaling Technology, Inc.から、アクチンに特異的な抗体はFisher Scientificから、抗Flag M2モノクローナル抗体はSigmaから購入した。
【０１４９】
（細胞調製）
C57BL/6又はBALB/cマウスからのBMDCsが、 “J. Exp. Med., vol. 197, p.323-331, 2003”に記載された様に、20 ng/mlのGM−CSF（Peprotech）と共に５〜１０日間培養された。リンパ節又は脾臓からのCD4+及びCD8+T細胞並びにB細胞が、MACS（Miltenyi Biotec）を用いて単離された。Jurkat T細胞及びエコトロピックウイルス受容体発現Jurkat（J.EcoR）細胞（Mol. Cell. Biol., vol. 23, p.2515-2529, 2003）は10% FCSを含むRPMI 1640中で維持された。IRAK-4-/-トランスフェクタントのために、J.EcoR細胞は、FlagタグされたIRAK-4を含むpMX-puroレトロウイルスにより感染され、ピューロマイシンで選択された。
【０１５０】
（インビボ免疫応答）
マウスは、アラム（Sigma）へ吸収させた100μg NP-OVA（Biosearch Technologies）により免疫（i.p.）された。抗NP抗体の血清抗体価がELISAにより決定された。インビボでのLCMV感染のために、2000 PFUのLCMV（Armstrong株）がマウスへ注入（i.v.）され、CD8+及びVα2+細胞の増殖をフローサイトメトリーにより測定するために、１日おきに採血された。脾臓が感染８日後に摘出され、CTL活性が51Cr放出アッセイにより測定された。養子移植（adoptive transfer）実験のために、LCMV特異的TCR-Tg（P14）マウスからの5 x 105個の脾臓細胞又はOVA特異的TCR-Tg（OT-II）マウスからの5 x 106個の脾臓細胞が単離され、C57BL/6マウス中へ養子移植（i.v.）された（J. Exp. Med., vol.195, p.423-435, 2002）。
【０１５１】
（Ｔ及びB細胞のインビトロ機能解析）
同種異系（allogenic）T細胞応答のために、BALB/cマウスから精製されたT細胞（5 x 104個）が、C57BL/6マウスからの、未処理で放置され或いは10μMのCpG-ODNで2日間刺激され、放射線照射（15 Gy）されたBMDCs（2 x 104個）と共に48時間培養された。増殖解析のために、精製されたT細胞（1 x 105個）が、抗CD3ε（5μg/ml）＋抗CD28（1μg/ml）、PMA（50 ng/ml）＋イオノマイシン（50 ng/ml）、又は放射線処理された同種同系（syngenic）BMDCsと共にSEB（0.5〜5000μg/ml、SC Bioscience）の何れかにより刺激された。精製されたB細胞が、1μg/mlの抗IgM F(ab’)2（Jackson ImmunoResearch）及び1又は3μg/mlの抗CD40（BD Pharmingen）により刺激された。48又は72時間後の培養物が1μCiの［3H］−サイミジン（Amersham）により８時間パルスされ、回収された。取り込まれた［3H］−サイミジンがMicrobeta又はMatrix 96（Packard）を用いて測定された。72時間後の増殖のためのものと同一の培養物の上清中のIL-2及びIFN-γ産生がELISAキット（R&D Systems）を用いて決定された。細胞周期解析のために、T細胞が70％エタノール中で固定され、DNAが既述（Gene Dev., vol. 17, p.883-895, 2003）のように5μg/ml PIにより染色された。G0/G1、S、G2/M及びサブG1値がModFit LT解析ソフトウェア（Verify Software House Inc.）を用いて決定された。LCMV特異的CTL細胞傷害性アッセイのために、レスポンダー細胞が、10-7MのLCMV特異的MB6ペプチド及び51Cr（NEN Dupont）でパルスされた104個のEL4ターゲット細胞と共に5時間インキュベートされた。特異的溶解が、（試験における放出−自発的放出）／（全放出−自発的放出） x 100として算出された。アデノウイルス特異的ペプチド（AV）（J. Exp. Med., vol. 195, p.423-435, 2002）がコントロールとして用いられた。
【０１５２】
（NF-ATレポーターアッセイ）
野生型及びIRAK-4-/-マウスからの脾臓CD4+T細胞が、プレート結合抗CD3ε（3μg/ml）＋IL-2（10ng/ml）と共に３日間培養された。そして細胞が洗浄され、３日間以上IL-2のみと共にインキュベートされた。トランスフェクション効率を標準化することができるTKレポーター（5μg）と共に、NF-AT依存的ルシフェラーゼレポーター（100μg）をエレクトロポレーションにより一過性に1.2 x 107個の細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は可溶性抗CD3ε（10μg/ml）又はPMA（10 ng/ml）＋イオノマイシン（1μM）により８時間活性化された。ルシフェラーゼ活性が既述（Nature, vol. 416, p.750-756, 2002）のように測定された。
【０１５３】
（フローサイトメトリー）
胸腺、リンパ節、骨髄、及び脾臓の単一細胞懸濁液がFITC、PE、又はビオチン結合抗体により染色された。ビオチン化された抗体はストレプトアビジン−RED670（GIBCO BRL）を用いて可視化された。用いられた抗体はB220、IgM、IgD、CD4、CD8、CD5、Thy-1、CD3、DX5、CD25、CD44及びCD69に対するものである。細胞周期解析のために、刺激直後のリンパ節T細胞（1 x 106個）がプロピジウムイオダイド（PI；Sigma）で染色された。全ての染色された試料はFACS Calibur（Becton Dickinson）を用い、CellQuest software（BD Biosciences）により解析された（Immunity, vol. 18, p.763-775, 2003）。Ca2+流入の解析のために、精製されたT細胞は3mMのIndo-1（Molecular Probes）と共に37℃で1時間インキュベートされ、抗CD3/28刺激直後にFACS解析に供された（Immunity, vol. 18, p.763-775, 2003）。
【０１５４】
（ウェスタンブロット解析及び免疫沈降）
RIPA緩衝液中に調製された細胞溶解液が10% SDS-PAGE上で展開され、ニトロセルロース膜上へブロットされた。該膜が多様な抗体と共に4℃で終夜インキュベートされ、引き続きHRP−結合二次抗体と共にインキュベートされ、ECL detection system（Amersham Pharmacia）により現像された。ZAP-70との相互作用の解析のために、Flagタグを付加したIRAK-4が抗Flag M2 モノクローナル抗体（Sigma）により免疫沈降された。
【０１５５】
（脂質ラフト画分の単離）
脂質ラフト分画は、既述（Mol, Cell Biol., vol. 23, p.2515-2529, 2003）のように、標準的なショ糖密度勾配超遠心分離を用いて行われた。即ち、抗CD3/28により刺激されたT細胞（1 x 108個）が、4℃で30分間、1% Triton X-100及び阻害剤（50μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイペプチン、50μg/mlのペプスタチンＡ、1mMのフェニルメチルスルホニル  フルオリド、400mMのバナデイン酸ナトリウム、10mMのフッ化ナトリウム、及び10mMのピロリン酸ナトリウム）の混合物を含む、1mlのモルフォリンエタンスルホン酸（MES）緩衝生理食塩水（MBS）（25mM MES、pH 6.5、150mM NaCl）中で溶解された。溶解物が1mlの80％ショ糖（MBS中）とチューブ内で混合され、6.5mlの30％ショ糖（MBS中）が積層され、さらに3.5mlの5％ショ糖（MBS中）が積層され、引き続き4℃、Beckman SW55 Tiローター中、45000rpmでの16時間の超遠心に供された。1ml画分が連続的に移された。
【０１５６】
（共焦点顕微鏡検査）
Flag-IRAK-4を発現しているJurkat細胞が、既述（Mol, Cell Biol., vol. 23, p.2515-2529, 2003）のように、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）をパルスされたRaji B細胞と共に37℃で5又は30分間インキュベートされた。細胞はポリＬリジンコートされたカバースリップ上に置かれ、Triton X-100で浸透化され、コレラトキシンB-FITC（CTx；緑色）、抗Flag M2モノクローナル抗体（赤色）、及び抗PKCθ抗体（青色）で染色され、画像は共焦点顕微鏡（LSM510；Carl Zeiss、Oberkochen、Germany）により解析された。
【０１５７】
〔２〕結果
（IRAK-4-/-マウスにおける障害されたインビボT細胞応答）
本願発明者らは、最初にIRAK-4-/-マウスにおける獲得免疫を制御する細胞集団を解析した。本願発明者らはIRAK-4-/-マウスにおける全てのリンパ球の正常な発生を見出した（図１）。次に、本願発明者らはIRAK-4-/-マウスの抗原特異的インビボ応答を解析した。野生型及びIRAK-4-/-マウスが、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（lymphocytic choriomeningitis virus：LCMV）（Nature, vol. 416, p.750-756, 2002）により感染されることにより免疫された。LCMVが野生型及びIRAK-4-/-マウスに注入され、末梢血中のLCMV特異的CD8+T細胞の割合がフローサイトメトリーによりモニターされた。野生型マウスにおいては、感染後６日においてCD8+T細胞の劇的な増加が観察された（J. Exp. Med., vol. 187, p.1383-1393, 1998）が、IRAK-4-/-マウスにおいては観察されなかった (図２)。更に、LCMVに感染したIRAK-4-/-マウスは、LCMV特異的CD8+T細胞（CTLs）をほとんど産生出来なかった(図３)。これらの結果は、IRAK-4はインビボT細胞増殖及びエフェクターCTL機能に必須であることを示唆する。
【０１５８】
IRAK-4は自然免疫にとって必須であって、IRAK-4-/-マウスはDC機能の障害を示す（J. Immunol., vol. 171, p.6065-6071, 2003）ことから、障害されたT細胞応答は不完全なAPC機能を反映し得る。T細胞応答において観察された障害がT細胞における不全のせいであるか、養子移植系により解析された。LCMV gp33/H-2Dbに特異的な、P14 TCR-TgマウスからのＶα2+CD8+T細胞が、C57BL/6マウス内へ養子移植され、引き続きLCMV感染させた。LCMV感染は、感染６日後をピークとして、Ｖα2+CD8+T細胞の有意な増殖を誘導した。しかしながら、LCMV感染に対するIRAK-4-/-Ｖα2+CD8+T細胞の応答は重度に障害されていた（図４）。LCMV感染マウスからの脾細胞のエクソビボCTL機能が、LCMVペプチドMB6でコートされたターゲット細胞に対して試験され、養子移植されたP14T細胞のCTL活性を選択的に確認した（J. Exp. Med., vol. 195, p.423-435, 2002）。IRAK-4-/-Ｖα2+CD8+T細胞は大きく減少したCTL活性を示した（図５）。これと一致して、IRAK-4-/-Ｖα2+CD8+T細胞の増殖も減少した（データ示さず）。インビボにおけるIRAK-4-/-T細胞の機能的障害を含む同様の結果が、CD4+ TCR-Tgの養子移植系によって得られた。OT-II Tg/ IRAK-4-/-マウスからのCD4+OVA特異的T細胞が野生型マウス内へ移入され、OVAで免疫された。IRAK-4-/-マウスからのT細胞は、OVA刺激に対して重度に障害された増殖(図６)及びIL-2産生(図７)を示すことが明らかとなった。これらの結果はIRAK-4-/-マウスからのT細胞は増殖及び機能において重度の障害を有することを立証する。
尚、図２〜７の結果はトリプリケイトの平均値±標準偏差で表す。
【０１５９】
（IRAK-4はインビトロにおけるT細胞活性化に必須である）
インビボにおける解析がIRAK-4-/-T細胞の障害された機能を示唆したことから、本願発明者らは精製されたT細胞のインビトロにおける刺激を用いて、広範囲な解析を行った。本願発明者らは始めに、インビトロにおける同種異系刺激に対するIRAK-4-/-T細胞の能力を評価した。無処理の、或いはCpG-ODNにより活性化された、野生型マウスからの骨髄由来樹状細胞（bone marrow-derived dendritic cells：BMDCs）が刺激物として用いられた。野生型T細胞と比較して、IRAK-4-/-T細胞は同種異系DCsに対して減弱した応答を示した(図８)。APC存在下でのスーパー抗原による刺激に対するIRAK-4-/-T細胞の増殖も著明に減少していた（図９）。更に、OVAペプチド／APCによる刺激に対する、OT-II Tg/ IRAK-4-/-マウスからの抗原特異的T細胞応答も重度に減少していた（図１０）。そこで、本願発明者らはAPCの不在下においても、刺激に対するT細胞応答が障害されているか、試験した。本願発明者らは、IRAK-4-/-T細胞は抗CD3単独、或いは抗CD28との併用による刺激に対して極めて低い増殖を示すことを見出した（図１１）。該不全が、外来のIL-2添加により消失させることが出来たことは特筆に価する。増殖と同様に、同一の刺激に対するIL-2産生もIRAK-4-/-T細胞において重度に減弱していたが、一方、IRAK-4-/-T細胞はPMA/イオノフォアによる刺激に対しては正常に応答することが出来た(図１２)。PMA/イオノフォア刺激はTCR複合体を迂回し、直接PKCθを刺激することから、IRAK-4はTCRシグナリングにおいてPKCθの上流で機能し得ることが示唆される。［3H］−サイミジン取り込みの結果と一致して、TCR刺激によるIRAK-4-/-T細胞の細胞分裂が阻害されており、外来のIL-2添加は細胞周期進行を回復させた（図１３）。対照として、IRAK-4-/-T細胞はPMA/イオノフォア刺激により、正常に細胞分裂進行した（データ示さず）。また、抗CD3による刺激は、IRAK-4-/-T細胞上の活性化マーカーである、CD25、CD44及びCD69を上昇させることは出来なかったが、PMA/イオノフォア刺激はIRAK-4-/-T細胞上の活性化マーカーの発現を上昇させた（図１４）。
【０１６０】
T細胞とは対照的に、IRAK-4不全はB細胞活性化には影響を及ぼさなかった。抗IgM又は抗CD40による刺激に対する、IRAK-4-/-マウスからのB細胞の増殖は、野生型B細胞のそれと同等であった(図１５)。更に、全てのイムノグロブリンアイソタイプの血清レベルは、野生型マウスとIRAK-4-/-マウスとの間では同等であった（データ示さず）。
【０１６１】
まとめると、これらの結果は、IRAK-4はT細胞の活性化には不可欠であるが、B細胞についてはそうではなく、T細胞の増殖及びエフェクター機能をもたらすTCR介在シグナルカスケードにおいて、PKCθの上流で機能し得ることを示唆する。
尚、図８〜１２、１４及び１５の結果はトリプリケイトの平均値±標準偏差で表している。
【０１６２】
（IRAK-4不全はT細胞においてNF-κBの活性化に影響を及ぼすが、NF-ATには及ぼさない。）
TCRシグナリング経路においてIRAK-4が役割を果たすメカニズムを調べるため、本願発明者らは、まずNF-κB活性化を解析した。抗CD3刺激に対する障害されたIκB分解及びJNK活性化（図１６）から明らかなように、IRAK-4-/-T細胞はNF-κB活性化における重度の不全を示した。対照的に、IRAK-4-/-B細胞においては、抗IgM、抗CD40又はPMA/イオノフォアに応答してNF-κB活性化は正常に誘導された（図１７）。
【０１６３】
本願発明者らは、次に、チロシンリン酸化やCa2+動員等の他のシグナリングイベントを解析した。野生型マウスとIRAK-4-/-マウスとの間では、TCR刺激に対する、全チロシンリン酸化パターン（図１８）も、細胞内Ca2+動員（図１９）も、明らかな差異はなかった。TCRエンゲージメントは、２つの代表的な転写因子であるNF-κB及びNF-ATの活性化を引き起こすので、次にNF-AT活性化が調べられた。IRAK-4-/-T細胞において、TCRエンゲージメントにより引き起こされるNF-ATの脱リン酸化及びNF-ATルシフェラーゼは、共に、野生型T細胞において観察されるそれらと同様であった（図２０、２１）。これらの結果は、IRAK-4は、NF-κB及びJNKを活性化する、TCRにより誘導されるT細胞活性化のためのシグナリング経路に特異的に関与するが、NF-ATを活性化する該経路には関与しないことを示唆する。
【０１６４】
（IRAK-4は脂質ラフト内においてPKCθの上流で機能する。）
本願発明者らは、TCR介在NF-κB活性化におけるシグナルカスケード内のどこでIRAK-4が機能しているか決定しようと試みた。PMA/イオノフォアがIRAK-4不全のT細胞活性化の欠損を迂回するとの機能解析は、IRAK-4がPKCθの上流で機能し得ることを示唆する。実際、PKCθのリン酸化は抗CD3/CD28刺激後のIRAK-4-/-T細胞において障害されていた（図２２）。PKCθを含むT細胞活性化のために重要な多様なシグナリング分子はTCR刺激により脂質ラフト内へリクルートされるので（Immunity, vol. 9, p.787-796, 1998）、本願発明者らはIRAK-4もTCR刺激により脂質ラフトへリクルートされるか、試験をした。標準的なショ糖密度勾配超遠心による分画と、脂質ラフトのためのマーカーとしてアダプタータンパク質であるLATを用い、TCR刺激によりPKCθとIRAK-4の著量がラフト画分に検出された（図２３）。
【０１６５】
抗原刺激によるIRAK-4及びPKCθの移行を可視化するために、Flagタグを付加したIRAK-4を発現しているJurkat細胞株が樹立され、APCsとしてRaji B細胞に提示されたスーパー抗原である黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（SEE）で刺激され（Mol. Cell Biol., vol. 23, p.2515-2529, 2003）、その免疫シナプス（IS）内へのリクルートが共焦点顕微鏡により解析された。SEEの不在下では、コレラトキシンＢ（CTx）染色により検出される脂質ラフトの分布は、形質膜上で均等であり、IRAK-4及びPKCθの双方とも主に細胞質中に検出された（図２４）。SEE刺激により、PKCθ及び脂質ラフトの大部分はISの中心に移行し、このPKCθの局在は少なくとも１時間持続した。興味深いことに、IRAK-4はPKCθの周囲にリクルートされた（図２４）。これらの結果は、IRAK-4がTCRエンゲージメントに引続き脂質ラフトへ移行するが、PKCθと直接共局在又は相互作用しないであろうことを示唆する。
【０１６６】
（IRAK-4はZAP-70との相互作用を介して機能する）
脂質ラフトは、TCRシグナルカスケードにおけるPKCθの上流シグナルを調節する多様なアダプター及びキナーゼを含む（Nat. Immunol., vol. 2, p.556-563, 2001）。本願発明者らは、PKCθの上流のどの分子がIRAK-4と相互作用し、IRAK-4を脂質ラフト内へリクルートし得るのか、調べた。TCRシグナリング複合体と相互作用し得る分子の中で、本願発明者らはIRAK-4がZAP-70と相互作用することを見出した。Jurkat細胞の細胞溶解液からIRAK-4を免疫沈降すると、IRAK-4とZAP-70との間の相互作用がTCR刺激依存的様式で観察された（図２５）。一方、IRAK-4と、Lck、c-Cbl、Grb2、LAT及びVav等の他のシグナリング分子との明らかな相互作用は観察されなかった（データ示さず）。更に、TCRエンゲージメントに引続き、リン酸化された形態のZAP-70（p-ZAP-70）がIRAK-4と相互作用した（図２５）。速度論的解析により、ZAP-70のチロシンリン酸化のピークは、IRAK-4とZAP-70との間の最大の相互作用に先立つことが明らかとなった（図２５）。
【０１６７】
脂質ラフトにおける、IRAK-4とZAP-70との間の活性化誘導相互作用を確認するために、共焦点顕微鏡によりこれらの分子の局在が解析された。SEE刺激の不在下では、IRAK-4及びZAP-70の双方とも細胞質中に均一に分布していた。SEE刺激に引続き、これらの染色の重なりにより示されるように、相当量のIRAK-4及びZAP-70がISの周囲の同一の領域にリクルートされた（図２６）。これらの結果は、共免疫沈降データと一致している（図２５）。
【０１６８】
ZAP-70活性化にIRAK-4が必要であるか決定するために、本願発明者らはIRAK-4-/-T細胞における刺激に対するZAP-70のリン酸化を試験した。リン酸化ZAP-70のレベルは、野生型T細胞とIRAK-4-/-T細胞との間で同等であり（図２７）、ZAP-70はIRAK-4とは独立にTCR刺激により活性化され、IRAK-4の上流若しくはIRAK-4と平行に機能することが示唆された。興味深いことに、ZAP-70の直接下流基質であるLATのリン酸化は、IRAK-4の不在下においても刺激により正常に誘導され、ZAP-70/LAT経路の活性化はIRAK-4により制御されていないことが示された（図２７）。本願発明者らは、ZAP-70の上流にあるCD3ζ及びLckのリン酸化がIRAK-4-/-T細胞においても正常に誘導されることも確認した（図２８）。まとめると、これらのデータは、IRAK-4とZAP-70との間の相互作用は、NF-κB活性化の誘導に重要であるが、ZAP-70/LAT経路を経て調節されるNF-AT活性化を誘導するシグナリング経路はIRAK-4から独立であることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明のT細胞受容体機能調節用組成物は、IRAK-4遺伝子の発現又は機能を調節し、新たなメカニズムの免疫疾患予防・治療剤等として有用である。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、新たなメカニズムでT細胞受容体機能を調節し得る物質を得ることができるので、免疫調節薬等の医薬品の開発や免疫学の研究等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】IRAK-4-/-マウスにおけるリンパ球の正常な発生を示す図である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからの(a)骨髄細胞、(b)胸腺細胞、(c)リンパ節T細胞、(d)脾臓B細胞、(e)腹腔内CD5+B細胞、(f)脾臓Ｔ及びB細胞、並びに(g)CD3-DX5+NK細胞がフローサイトメトリーにより解析された。各マーカーを発現している細胞のパーセントを各四分画内に示す。
【図２】IRAK-4-/-マウスのインビボLCMV感染に対する不完全なT細胞増殖を示す図である。野生型（白色印）及びIRAK-4-/-（黒色印）マウスをLCMVにより感染させ、末梢血中のCD8+T細胞の増殖が、フローサイトメトリーにより表示日においてモニターされた。
【図３】LCMV感染したIRAK-4-/-マウスからのCTLによる細胞傷害活性を示す図である。図２におけるマウス（白色印は野生型マウスを、黒色印はIRAK-4-/-を示す）からの脾細胞が、LCMV感染の８日後に、ターゲット細胞としてgp33（LCMVペプチドのひとつ）がパルスされたEL4細胞を用いて、細胞傷害性について評価された。
【図４】養子移植されたIRAK-4-/-マウスからのCD8+T細胞のインビボ増殖の障害を示す図である。P14-Tg/野生型マウス（白色印）又はP14-Tg/ IRAK-4-/-マウス（黒色印）からの5 x 105個のT細胞がC57BL/6マウス中に養子移植され、引き続きLCMVによる感染を行った。血中のCD8+Vα2+T細胞の数が、感染から表示日数後において解析された。
【図５】養子移植されたIRAK-4-/-マウスからのT細胞による障害された細胞傷害活性を示す図である。感染８日後の図４と同一のマウスからの脾臓CD8+T細胞が、P14 T細胞特異的MB6ペプチドに対するLCMV特異的CTL活性について解析された。アデノウイルス特異的ペプチド（AV）がコントロールとして用いられた。
【図６】養子移植されたIRAK-4-/-マウスからのCD4+T細胞による障害された増殖を示す図である。OT-II-Tg/野生型マウス（白色カラム）又はOT-II-Tg / IRAK-4-/-マウス（黒色カラム）からの5 x 105個のCD4+T細胞が精製され、C57BL/6マウス中に養子移植され、引き続きCFA中の300μgのOVAペプチド323-339による免疫を行った。免疫から１０日後、脾臓CD4+T細胞が精製され、多様な濃度のOVAペプチド323-339又はPMA（5ng/ml）＋イオノマイシン（0.5μM）（PMA+IM）と共に、放射線照射された同種同系脾細胞（5 x 105個）と共培養され、増殖が［3H］−サイミジンの取り込みにより評価された。
【図７】養子移植されたIRAK-4-/-マウスからのCD4+T細胞による障害されたIL-2産生を示す図である。図６と同一の培養物の上清中のIL-2産生がELISAにより測定された。白色カラムはOT-II-Tg/野生型マウスを、黒色カラムはOT-II-Tg / IRAK-4-/-マウスを示す。全ての結果はトリプリケイトの平均値±標準偏差で表す。
【図８】IRAK-4-/-T細胞による障害された同種異系応答を示す図である。BALB/cマウスからの無処理の或いはCpG-ODNにより活性化された２ x 104個のBMDCsが、同種異系のC57BL/6野生型（白色カラム）又はIRAK-4-/-（黒色カラム）マウスからのリンパ節T細胞（1 x 105個）と混合された。48時間後にT細胞増殖が［3H］−サイミジンの取り込みにより測定された。
【図９】IRAK-4-/-T細胞の障害されたスーパー抗原誘導増殖を示す図である。野生型（白色印）又はIRAK-4-/-（黒色印）マウスからの1 x 105個のT細胞がBMDCs（2 x 104個）の存在下で段階的な濃度のSEBにより刺激された。
【図１０】OT-II Tg/IRAK-4-/-マウスにおける初期抗原特異的T細胞応答の障害を示す図である。OT-II Tg野生型（白色カラム）及びOT-II Tg/IRAK-4-/-（黒色カラム）マウスからのCD4＋T細胞が精製され、段階的な量のOVAペプチド、又はＰＭＡ（5ng/ml）＋イオノマイシン（0.5μM）（PMA+IM）と共に、APCとしてC57BL/6マウスからの放射線照射された脾細胞（5 x 105個）と共培養された。24時間後に増殖が［3H］−サイミジン取り込みにより評価され、48時間後にIL-2及びIFNγ産生がELISAにより決定された。
【図１１】抗CD3＋抗CD28による刺激に対するIRAK-4-/-T細胞の障害された増殖を示す図である。野生型（白色カラム）又はIRAK-4-/-（黒色カラム）マウスからの精製されたリンパ節CD4+T細胞が、抗CD3（5μg/ml）単独、抗CD3（5μg/ml）＋抗CD28（1μg/ml）、又はPMA（50ng/ml）＋Ca2+イオノフォア（50ng/ml）（P+I）により刺激された。72時間後に増殖が［3H］−サイミジンの取り込みにより測定された。
【図１２】抗CD3＋抗CD28による刺激に対するIRAK-4-/-T細胞の障害されたIL-2産生を示す図である。図１１と同一の培養物の上清中のIL-2産生がELISAにより測定された。N.D.は検出限界以下であることを示す。
【図１３】TCR刺激に対するIRAK-4-/-T細胞における障害された細胞周期を示す図である。IL-2（10ng/ml）の存在下又は非存在下で、野生型又はIRAK-4-/-T細胞が抗CD3ε（10μg/ml）により刺激された。48時間後に、細胞がPIにより染色され、細胞周期プロファイルがフローサイトメトリーにより決定された。S期にある細胞のパーセンテージを示す。
【図１４】IRAK-4-/-T細胞上の活性化マーカーの上昇の障害を示す図である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからの精製されたリンパ節T細胞が、無処理で放置されるか（None）、抗CD3ε（１μg/ml）、又はPMA（50ng/ml）＋Ca2+イオノフォア（50ng/ml）（P+I）により２４時間刺激され、CD25（左パネル）、CD44（中央パネル）、及びCD69（右パネル）の表面発現のために染色された。
【図１５】IRAK-4はB細胞活性化には必要ではないことを示す図である。野生型（白色カラム）又はIRAK-4-/-（黒色印）マウスからの脾細胞が抗IgM F(ab’) （1μg/ml）、又は抗CD40（1又は3μg/ml）により刺激され、48時間後に増殖が［3H］−サイミジンの取り込みにより測定された。
【図１６】IRAK-4-/-T細胞における障害されたIκB分解及びJNK活性化を示すウェスタンブロットの結果である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからのリンパ節T細胞が、PMA（50ng/ml）＋Ca2+イオノフォア（50ng/ml）（P+I）、又は抗CD3ε（10μg/ml）により刺激され、引き続きヤギ抗ハムスター抗体（100μg/ml）によりクロスリンクした。活性化されたJNKは抗リン酸化JNK抗体により検出された。各パネルの上部の数字は刺激後の時間（分）を示す。
【図１７】IRAK-4-/-B細胞における正常なIκB分解を示すウェスタンブロットの結果である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからの脾臓B細胞がPMA（50ng/ml）＋Ca2+イオノフォア（50ng/ml）（P+I）、抗CD40、又は抗IgM F(ab’)2（10μg/ml）により刺激された。各パネルの上部の数字は刺激後の時間（分）を示す。また、各パネルの下部の数字はアクチンの量により補正された、IκBの相対的な検出シグナル強度を示す。結果は３つの独立した試験を表す。
【図１８】IRAK-4-/-T細胞における全チロシンリン酸化は正常であることを示すウェスタンブロットの結果である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-T細胞が抗CD3ε（10μg/ml）により刺激され、細胞溶解液が抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体と共にブロットされた。パネルの上部の数字は刺激後の時間（分）を、右側の数字は分子量（KDa）を示す。
【図１９】IRAK-4-/-T細胞におけるTCR刺激に対する正常なCa2+動員。野生型及びIRAK-4-/-T細胞がIndo-1によりロードされ、抗CD3ε＋抗CD28（10μg/ml）により刺激され、引き続きヤギ抗ハムスター抗体（100μg/ml）によりクロスリンクした。Ca2+流入がフローサイトメトリーにより測定された。
【図２０】IRAK-4-/-T細胞における正常なNF-AT活性化を示すウェスタンブロットの結果である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからのT細胞が抗CD3ε＋抗CD28（10μg/ml）により処理され、引き続きヤギ抗ハムスター抗体（100μg/ml）によりクロスリンクされた。細胞溶解液が抗NF-ATを用いるウェスタンブロットにより解析された。パネルの下部の数字はNF-ATの相対的なシグナル強度を示す。
【図２１】IRAK-4-/-T細胞における正常なNF-AT活性化を示すNF-ATルシフェラーゼレポーターアッセイの結果である。NF-AT活性が、野生型（白色カラム）及びIRAK-4-/-（黒色カラム）マウスからの脾臓CD4+T細胞へのNF-ATルシフェラーゼレポーターの一過性トランスフェクションにより決定された。T細胞は抗CD3ε（CD3）又はＰＭＡ＋イオノマイシン（PMA+IM）により刺激されたか、或いは無刺激のまま放置された（Con）。
【図２２】IRAK-4-/-T細胞におけるTCR刺激に対する障害されたPKCθのリン酸化を示す図である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからのT細胞が抗CD3ε＋抗CD28（10μg/ml）により刺激され、引き続きヤギ抗ハムスター抗体（100μg/ml）によりクロスリンクされた。全PKCθ及びリン酸化PKCθ（p-PKCθ）がウェスタンブロッティングにより検出された。パネルの上部の数字は刺激後の時間（分）を示す。
【図２３】刺激に対するIRAK-4及びPKCθの脂質ラフト内への局在を示す図である。Jurkat細胞が５分間、無刺激で放置される（-）か、あるいは抗CD3εにより刺激（+）された。細胞溶解液がショ糖勾配超遠心により分画され、該勾配の上部からの連続的な画分を番号により示す。LATがラフト内に局在したコントロールとして用いられた。
【図２４】スーパー抗原刺激に対するIRAK-4のPKCθ及び脂質ラフトとの共局在を示す写真である。Flag-IRAK-4を発現しているJurkat細胞が200ng SEE/mlの存在下又は非存在下(-)で、表示された時間（分）、Raji細胞と共培養された。細胞は固定され、CTx、抗PKCθ、又は抗Flag（IRAK-4）で染色された。DIC：示差的干渉コントラスト（differential interference contrast）。
【図２５】TCR刺激によるIRAK-4とPKCθとの相互作用を示す図である。Flag-IRAK-4を発現しているJurkat細胞が抗CD3ε＋抗CD28（10μg/ml）により刺激され、引き続きヤギ抗ハムスター抗体（100μg/ml）により表示された時間（分）クロスリンクされた。細胞溶解液が抗Flag（IRAK-4）で免疫沈降（IP）され、抗ZAP-70（上パネル）又は抗リン酸化ZAP-70（下パネル）でブロット（Blot）された。WCL：全細胞溶解液（whole cell lysate）。
【図２６】抗原刺激によるIRAK-4とZAP-70との免疫シナプスにおける共局在を示す写真である。Flag-IRAK-4を発現しているJurkat細胞が200ng SEE/mlの存在下又は非存在下(-)で、表示された時間（分）、Raji細胞と共培養された。細胞は固定され、図２４と同様に染色された。
【図２７】IRAK-4-/-T細胞におけるZAP-70及びIRAK-4のチロシンリン酸化を示す図である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからのT細胞が抗CD3ε＋抗CD28（10μg/ml）により刺激され、引き続きヤギ抗ハムスター抗体（100μg/ml）によりクロスリンクされた。個々のリン酸化されたタンパク質が個々のリン酸化チロシン（リン酸化タンパク質）特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングにより検出された。
【図２８】IRAK-4-/-T細胞におけるCD3ζ及びLckのチロシンリン酸化を示す図である。野生型（WT）及びIRAK-4-/-マウスからのT細胞が抗CD3ε＋抗CD28（10μg/ml）により刺激され、引き続きヤギ抗ハムスター抗体（100μg/ml）によりクロスリンクされた。個々のリン酸化されたタンパク質が個々のリン酸化チロシン（リン酸化タンパク質）特異的抗体を用いるウェスタンブロッティングにより検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１９】
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【図２１】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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