(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムの５’非翻訳領域の効率的な逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を改良することを目的としてなされた。【解決手段】ＨＣＶのＲＴ−ＰＣＲ増幅のための特定の改良されたオリゴヌクレオチドプライマー類を提供する。さらに、ＨＣＶ増幅のための前記プライマーを含むキット、及び前記プライマーの使用を含むＨＣＶ核酸の検出方法が提供される。【選択図】図２
2006020642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＴ７７８ＡＡ）の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸のポリメラーゼ連鎖反応増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、前記対がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＴ７７８ＡＡ）の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを含む、上記オリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＫＹ８０）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＴ７７８ＡＡ）の配列からなる請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対。
【請求項４】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の検出のためのキットであって、請求項２または３の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を含んでなる上記キット。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅のための方法であって、請求項２または３の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドプライマー対を使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含んでなる上記方法。
【請求項６】
試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の検出方法であって、
（ａ）前記試料を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＴ７７８ＡＡ）の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対を含んだポリメラーゼ連鎖反応増幅混合物中において、存在する場合にＨＣＶ核酸が増幅されるような増幅条件下において処理し；そして
（ｂ）ＨＣＶ核酸の存在を示す増幅が起こるかどうかを検出すること
を含んでなる上記方法。
【請求項７】
前記プライマー対の配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＫＹ８０）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＳＴ７７８ＡＡ）からなる請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び核酸化学の分野に関するものである。さらに特定的には、本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸の増幅のための方法および試薬に関するものである。従って、本発明は、ＨＣＶの検出、一般的な医学的診断の分野、及び分子生物学の分野において応用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、単一の正のセンスの、約１０，０００ヌクレオチドの長さを有するＲＮＡ分子を含んだ小型のＲＮＡウイルスである。原型的ＨＣＶは、Choo等、1989,Science  244: 359-362; Choo等、1991,Proc. Natl. Acad. Sci. USA  88: 2451-2455;及び欧州特許公開第318,216; 288,232; 及び398,748 号に記述されている。ゲノムは、単一の大きいポリタンパク質に翻訳され、次いで加工をうける単一の長い開放された読み枠を含むものと考えられている。該ゲノムは、開放された読み枠の上流に、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことが知られている。
【０００３】
ＨＣＶのゲノムは、株及び単離物間で程度の大きい核酸異種性を示す（Simmonds, 1995,Hepatology  21: 570-583 、及びBukh等、1994, Proc.  Natl. Acad. Sci. USA  91: 8239-8243 参照）。しかしながら、５’ＵＴＲ配列は比較的保存されていることが知られている。
【０００４】
特定の核酸の増幅方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、以前は検出不能なほど少量の試料中に存在する核酸の迅速な検出を可能とする（米国特許4,683,195; 4,683,202; 及び4,965,188 参照）。ＨＣＶゲノムＲＮＡは、ＨＣＶゲノムＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、及び増幅生成物の存在を検出することにより検出されうる。
【０００５】
ＨＣＶゲノム配列のＰＣＲ増幅に基づくＨＣＶ検出アッセイは、米国特許5,527,699 ；欧州特許公開529,493; Young等、1993, J.Clin. Microbiol. 31(4):  882-886;及びYoung 等、1995, J.Clin. Microbiol. 33(3);654-657に記述されている。それらに記述されるように、ＨＣＶ  ＲＮＡの増幅は、結合逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅により実施され得、これにおいては単一の酵素が、最初のゲノムＲＮＡテンプレートからのプライマー伸長（即ち、逆転写）及び増幅工程にて合成されるＤＮＡテンプレートからのプライマー伸長の両方について触媒作用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムの５’非翻訳領域の効率的な逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅のための改良されたオリゴヌクレオチドプライマー類を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のプライマーの、従来技術に記載されるプライマーを上回る重要な優位点は、本発明のプライマーが顕著に高い効率をもってＨＣＶ核酸の増幅を可能とすることである。例に示されるように、本発明のプライマーを使用するＨＣＶ核酸の増幅は、従来技術に記述されるプライマーを使用する増幅より効率が１００倍高い。本発明のプライマーを使用して得られる有意に高い増幅効率は、従来技術から見て驚くべきものであり、かつ予期されないものである。
【０００８】
本発明の別の側面は、本発明のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応を実施することを含むＨＣＶゲノム領域の増幅方法に関する。本発明のプライマーを使用して得られる有意に向上した増幅効率のために、本発明の増幅方法は、有意に増量した増幅生成物を与え、その一方で形成されるプライマー−二量体の量を低減する。結果として、本発明の方法は、有意に向上した感度のＨＣＶ検出アッセイを可能とする。従って、本発明は、試料中のＨＣＶ核酸の存在の検出方法であって：
（ａ）前記試料を、本発明のプライマーを含むＰＣＲ反応混合物中において増幅条件下で、ＨＣＶ核酸が存在する場合に増幅すべく処理し；及び
（ｂ）ＨＣＶ核酸の存在を示す増幅が起きたか否かを検出すること、
を含んでなる試料中のＨＣＶ核酸の存在の検出方法をも提供する。
【０００９】
本発明の他の側面は、本発明の増幅プライマーを含んでなるキットに関するものである。これらのキットは、増幅核酸の検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ、並びにポリメラーゼ、緩衝剤及びヌクレオシド三リン酸等の付加的試薬を含みうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の理解の手助けとして幾つかの用語が以下に定義される。
“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”なる用語は、プライマー類、プローブ類及び増幅または検出されるべきオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）について、またポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）について、並びに他のプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基のＮグリコシドであるポリヌクレオチドの何れかのタイプについて総称的である。“核酸”及び“オリゴヌクレオチド”なる用語の間で、長さにおける意図的な区別はなく、従って、これらの用語は、可換的に使用されるであろう。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従ってこれらの用語は、二重鎖及び単鎖ＤＮＡ、並びに二重鎖及び単鎖ＲＮＡを含む。
【００１１】
オリゴヌクレオチドは、例えば、クローニング及び適切な配列への制限、並びにＮａｒａｎｇ等、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ等、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ等、１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホラミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持方法等の直接化学合成を含む適当な方法により調製され得る。標識オリゴヌクレオチドの合成方法は、Ａｇｒａｗａｌ及びＺａｍｅｃｎｉｋ、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８（１８）：５４１９−５４２３；ＭａｃＭｉｌｌａｎ及びＶｅｒｄｉｎｅ、１９９０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５９３１−５９３３；Ｐｉｅｌｅｓ等、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７（２２）：８９６７−８９７８；Ｒｏｇｅｔ等、１９８９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７（１９）：７６４３−７６５１；及びＴｅｓｌｅｒ等、１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：６９６６−６９７６に記述されている。合成方法の総説は、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １（３）：１６５−１８７に提供される。
【００１２】
“ハイブリダイゼーション”なる用語は、相補的塩基対形成による２本の単鎖核酸による二重構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に（正確に）相補的な核酸鎖の間、または僅かな食い違い領域を含む“実質的に相補的な”核酸鎖の間で起こりうる。完全に相補的な核酸鎖においてのみハイブリダイズするであろう条件は、“緊縮なハイブリダイゼーション条件”または“配列特異的なハイブリダイゼーション条件”と称される。実質的に相補的な配列の安定な二重鎖は、より緊縮さが低いハイブリダイゼーション条件下で達成され得る。核酸技術における当業者は、この技術により提供される案内（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に従って、二重鎖の安定性を経験的に決定しうる。
【００１３】
一般的に、緊縮な条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列についての熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、５０％の塩基対が解離する温度（所定のイオン強度及びｐＨにて）である。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の緩和は、配列の不一致を許容するようにし；また許容される不一致の程度は、ハイブリダイゼーション条件の適当な調節により制御可能である。
【００１４】
“プライマー”なる用語は、核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、即ち適切な緩衝溶液及び適当な温度にて４種類の異なるヌクレオシド三リン酸及びポリマー化試薬（即ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下でのＤＮＡ合成の開始点として作用しうるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、好ましくは単鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的に依存するが、典型的には１５から３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般的にテンプレートと十分に安定したハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレート核酸の正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートにハイブリダイズするために充分に相補的でなければならない。プライマーは、該プライマーの検出または固定を可能とするが、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本的性質を変更しない付加的な特徴を組み入れ得る。例えば、プライマーは、標的核酸配列にハイブリッドしないが、増幅生成物のクローニングを容易にする付加的な核酸配列を５’末端に含みうる。ハイブリダイズするためにテンプレートに充分に相補的なプライマーの領域は、ここにおいてはハイブリダイズ領域と称される。
【００１５】
ここにおいて使用されるように、“上流”プライマーは、その伸長生成物がコード配列の結果を生じるプライマーを指し；“下流”プライマーは、その伸長生成物が相補的非コード鎖の結果を生じるプライマーを指す。“ＲＴプライマー”と称される逆転写に使用されるプライマーは、コード鎖にハイブリダイズし、従って、下流プライマーである。
【００１６】
ここにおいて使用される“オリゴヌクレオチドプローブ”なる用語は、相補的塩基対形成のために標的核酸の配列と二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、標的核酸の検出または捕捉のために使用される。プローブは、好ましくは単鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プローブは、典型的には標的配列の領域に対応する好ましくは１０から５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１５から３５ヌクレオチドからなる“ハイブリッド領域”からなるか、またはそれを含んでなる。“対応する”は、指定される核酸またはその相補体の何れかに対して少なくとも実質的に相補的であることを意味する。プローブは、標的核酸の正確な配列を反映する必要はないが、選択されるハイブリダイゼーション条件下で標的とハイブリッドするために充分相補的でなければならない。プローブオリゴヌクレオチドは、該プローブの検出または固定化を許容するが、ハイブリダイズ領域のハイブリダイゼーションの特徴を著しく変更しない付加的な特徴を含みうるか、あるいはそれに結合され得る。例えば、プローブは放射標識ヌクレオチドの取り込みにより、または独立した検出可能な残基に結合されることにより標識されうる。
【００１７】
ここにおいて使用されるように、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、該オリゴヌクレオチドと標的配列との間の不一致の個数が、該オリゴヌクレオチドと非標的配列との間の不一致の個数より少ない場合において、標的配列に対して“特異的”である。ハイブリダイゼーション条件は、存在する不一致の個数がオリゴヌクレオチドと標的配列との間の不一致の個数を越えない場合にのみ安定な二重鎖が形成されるよう選択されうる。そのような条件下では、標的特異的オリゴヌクレオチドは標的配列とのみ安定な二重鎖を形成しうる。適当な緊縮増幅条件下での標的特異的プライマーの使用は、標的プライマー結合部位を含むそれらの標的配列の特異的増幅を可能とする。同様にして、適当な緊縮ハイブリダイゼーション条件下での標的特異的プローブの使用は、特異的標的配列の検出を可能とする。
【００１８】
“標的領域”及び“標的核酸”なる用語は、増幅、検出または別途分析されるべき核酸の領域を指す。
【００１９】
“熱安定性なポリメラーゼ”なる用語は、熱に対して相対的に安定であり、ヌクレオシド三リン酸のポリマー形成に触媒作用して、標的配列の核酸鎖のひとつに対して相補的なプライマー伸長生成物を形成する酵素を指す。該酵素は、プライマーの３’末端から合成を開始し、テンプレートの５’末端に向けて合成が終了するまで進行する。精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴから商業的に入手可能である。
【００２０】
“増幅反応混合物”及び“ポリメラーゼ連鎖反応混合物”なる用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するために好適な試薬の組合せを指す。該反応混合物は、典型的にはオリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼを、適当な緩衝溶液中に含む。好適な増幅反応混合物は、例中に与えられる。
【００２１】
“増幅条件”なる用語は、ここにおいて使用されるように標的核酸配列の増幅のために好適な反応条件を指す。増幅条件は、増幅反応混合物及び反応の間に使用される温度サイクル条件の両者を指す。本発明のプライマーを使用する増幅条件下では、存在する場合にはＨＣＶ核酸の増幅が起こるであろう。好ましい増幅条件は、例中に与えられる。
【００２２】
“増幅効率”なる用語は、ここにおいて使用されるように所定の増幅サイクル数において、標的配列の所定の初期個数から生成される生成物の量を指す。従って、プライマーにおいてのみ異なる二つの反応の増幅効率は、それぞれの反応で形成される生成物の量を定量的に測定することによって比較される。
【００２３】
図１は、例２に記述されるように、プライマー対（Ａ）ＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）／ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、（Ｂ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）／ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、（Ｃ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（４０ピコモル）及び（Ｄ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（６０ピコモル）をそれぞれ使用した場合の増幅反応の比較を示す。
【００２４】
図２は、下記例３に記述されるように、５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ７７８ＡＡ／ＫＹ８０（−■−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲−）を使用する増幅反応の比較を示す。
【００２５】
図３は、下記例４に記述されるように、５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ６７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−ｘ−）を使用する増幅反応の比較を示す。
【００２６】
この技術の熟練の内にある分子生物学及び核酸化学の慣用の技術は、文献中に完全に記述されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照。上記及び下記の両者においてここに述べる全ての特許、特許出願及び刊行物を、参考として組み入れる。
【００２７】
ＨＣＶ増幅プライマー
プライマー類のヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で示して表１に掲げられている。上流プライマーを何れかの下流プライマーと共に用いる増幅は、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域からの２４０塩基対の生成物を増幅する。該プライマーは、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域内の比較的保存された領域にハイブリダイズし、他のウイルス由来またはヒトゲノムＤＮＡ由来の非標的配列の同時的増幅を伴うことなく、既知のＨＣＶ単離物由来の核酸の増幅を可能とする。
【００２８】
[表１]
表１
ＨＣＶ増幅プライマー
上流 SEQID NO 
ST280A  １        5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
下流（ＲＴ）
ST778AA ２        5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA
ST678A  ３        5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA
【００２９】
増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅工程は、この技術分野において周知であり、また米国特許第４，６８３，１９５号；４，６８３，２０２号；及び４，９６５，１８８号に記述されている。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）等の商業的販売者は、ＰＣＲ試薬を販売し、またＰＣＲプロトコールを発行している。本発明により提供される優位点の理解を容易にするために、ＰＣＲの要点を示す。
【００３０】
ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、二重鎖標的配列は変性され、プライマーが該変性された標的の各鎖にアニールされ、該プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長される。該工程は、典型的には少なくとも２５回反復される。２種のプライマーは、標的核酸配列の反対側の末端に、各プライマーの伸長生成物が標的配列の相補的複写物となり、かつその相補体から分離された場合に他方のプライマーにハイブリッドしうるような配向をもってアニールする。１００％の効率を仮定すると、各サイクルは存在する標的配列数の二倍化を生じるであろう。
【００３１】
ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列のいずれもが、ＰＣＲにより増幅されうる。ここに記述されるように、ＨＣＶゲノム核酸の増幅のようにＲＮＡ標的の場合には、第一工程は、標的配列のＤＮＡ複写物（ｃＤＮＡ）の合成からなる。逆転写は、独立した工程として、または好ましくはＲＮＡ増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の変法である組み込み逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）において実施され得る。ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅はこの分野で周知であり、米国特許第５，３２２，７７０号及び５，３１０，６５２号；Ｍｙｅｒｓ及びＧｅｌｆａｎｄ、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（３１）：７６６１−７６６６；米国特許第５，５２７，６６９号；Ｙｏｕｎｇ等、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（４）：８８２−８８６；及びＹｏｕｎｇ等、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（３）：６５４−６５７に記述されている。
【００３２】
ＲＴ−ＰＣＲに好適な種々の試料調製方法が、文献中に記述されている。例えば、生物学的試料からのリボ核酸の抽出技術は、Ｒｏｔｂａｒｔ等、１９８９、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中、及びＨａｎ等、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１６１７−１６２５に記述されている。使用される個別の方法は、本発明の重要な部分ではない。当業者は、既知の試料調製方法を用いて使用する反応条件の至適化を行い得る。ＨＣＶ  ＲＮＡの検出に使用するための好ましい試料調製方法は、米国特許第５，５２７，６６９号、前出のＹｏｕｎｇ等、１９９３及び前出のＹｏｕｎｇ等、１９９５に記述されている。
【００３３】
ＰＣＲ工程をもって膨大な増幅が可能であるため、高いＤＮＡ濃度を持った試料、正の対照テンプレート、または先行する増幅に由来する低濃度のＤＮＡ夾雑物は、目的を持って添加したテンプレートＤＮＡが存在しない場合にもＰＣＲ生成物を生じうる。交差夾雑を最小とするであろう実験器具及び技術は、Ｋｗｏｋ及びＨｉｇｕｃｈｉ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：２３７−２３８並びにＩｎｎｉｓ等編、１９９０、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ中のＫｗｏｋ及びＯｒｒｅｇｏに議論されている。先行する反応に由来する増幅核酸によるＰＣＲの夾雑の問題を低減するための酵素的方法は、ここにそれぞれ参考として取り入れるＰＣＴ特許公開ＵＳ９１／０５２１０、米国特許第５，４１８，１４９号及び米国特許第５，０３５，９９６号、並びに前出のＹｏｕｎｇ等、１９９５に記述されている。
【００３４】
増幅反応混合物は、典型的にはプライマーハイブリダイゼーション特異性を保証するために必要な温度より充分に低い室温にて組み上げられる。室温においては、プライマーが部分的にのみ相補的な核酸配列を持つ他のものに非特異的に結合するであろうから、非特異的な増幅が生じえて、望まれない核酸配列の合成が開始される。これらの新たに合成された望まれない配列は、増幅反応の間に所望の標的配列と競合しえて、所望の配列の増幅効率を顕著に低減しうる。非特異的増幅は、温度が必要とされるハイブリダイゼーション特異性を与える為に充分に上昇するまでプライマー伸長が阻害される“ホットスタート”を使用して低減されうる。
【００３５】
ホットスタートの１方法においては、温度が必要とされるハイブリダイゼーション特異性を与える為に充分に上昇するまで、１種以上の試薬が反応混合物に与えられない。反応成分を分離または隔離するためのロウ等の熱不安定性材料を使用するホットスタート法は、米国特許第５，４１１，８７６号及びＣｈｏｕ等、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０（７）：１７１７−１７２３に記述されている。他のホットスタート法においては、増幅に先行して、または増幅の第１工程として高温度のインキュベーションにより活性化されるまでプライマー伸長に触媒作用しない、可逆的に不活性化されたＤＮＡポリメラーゼが使用される。この様な可逆的に不活性化されたＤＮＡポリメラーゼの例は、ＡｍｐｌｉＴａｑTMＧＯＬＤである（総説としてＢｉｌｃｈ等、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：４４５−４４６参照）。非特異的増幅は、米国特許第５，４１８，１４９号に記述されるように増幅の初期の高温工程に先立って形成される伸長生成物を、酵素的に分解することによっても低減される。
【００３６】
増幅生成物の分析
本発明の好ましい実施態様において、ＨＣＶゲノム核酸の増幅は、ＨＣＶ検出アッセイの一部として実施される。増幅は、ＨＣＶ核酸の量を検出可能な水準まで増大させる。ＰＣＲ増幅核酸の検出方法は、この技術において周知である。例えば、増幅生成物の存在及び量は、この技術において周知のプロトコールを使用してゲル電気泳動を用い直接にアッセイされうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９の前出文献参照）。
【００３７】
増幅生成物の検出は、増幅ＨＣＶ核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して実施され得る。プローブと標的核酸配列との間に形成されるハイブリッドを検出するための好適なプロトコールは、この技術において知られている。表１のプライマーを使用して増幅されるＨＣＶ核酸は、米国特許第５，５２７，６６９号；Ｙｏｕｎｇ等の１９９３前出文献；及びＹｏｕｎｇ等の１９９５前出文献に記述されるプローブ及び方法を使用して検出されうる。
【００３８】
５’−ヌクレアーゼアッセイとして引用される好適なアッセイ法は、米国特許第５，２１０，０１５号及びＨｏｌｌａｎｄ等、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０に記述されている。５’−ヌクレアーゼアッセイにおいては、標識された検出プローブはＰＣＲ増幅反応混合物に含まれる。該プローブは、ＤＮＡ合成のプライマーとして作用することが阻害されるように修飾される。合成工程、即ちプライマー伸長の間に標的ＤＮＡとハイブリダイズする任意のプローブは、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性により切り取られる。切り取られたプローブの存在は、プローブと標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションが起きたこと、及び増幅が起きたことの両方を示している。プローブ切断物の検出方法は、米国特許第５，２１０，０１５号、ＥＰ−Ａ−６９９７６８、ＥＰ−Ａ−７１３９２１及び下記例に記述されている。
【００３９】
上述したプローブに基づくアッセイ構成は、典型的にはハイブリッド二重鎖の検出を容易にするために標識オリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な標識を取り込むことにより標識されうる。有用な標識は、32Ｐ、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡにおいて通常使用されると同様に）、ビオチン、またはハプテン並びに抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能なタンパク質を含む。本発明の標識オリゴヌクレオチドは、上述の技術を使用して合成されうる。
【００４０】
反応混合物中の二重鎖ＤＮＡの全量について増加がモニターされる、ＨＣＶ核酸増幅の検出のための別の方法は、Ｈｉｇｕｃｈｉ等、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３−４１７；Ｈｉｇｕｃｈｉ等、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３０；並びにヨーロッパ特許公開４８７，２１８及び５１２，３３４号に記述されている。二重鎖標的ＤＮＡの検出は、二重鎖ＤＮＡに結合した場合にエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合標識が示す増大した蛍光に依っている。増幅は二重鎖ＤＮＡの量を増大させ、蛍光における検出可能な増大を生じる。非特異的増幅、及び特にはプライマー二量体は、二重鎖ＤＮＡの形成を生じるため、非特異的増幅の低減が望ましい。本発明のプライマーは、非特異的増幅生成物の予想されない低水準の背景をもって増幅を可能とすることから、特に有用である。
【００４１】
本発明の増幅方法及びプライマーは、検出アッセイにおけるようとに限定されるものではない。例えばこの技術でよく知られているように、増幅される核酸は、クローニングまたは配列決定において使用され得る（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号参照）。本発明のプライマーは、増幅核酸の高い収率及び得られる非特異的増幅生成物のより低い水準のために概して有用である。
【００４２】
本発明は、キット、換言すると本方法を実施するために有用な成分を含む複数の容器ユニットにも関連する。有用なキットは、ＨＣＶ核酸の増幅のためのプライマーを含む。キットは、オリゴヌクレオチドプローブ等の増幅ＨＣＶ核酸検出の為の手段を含むことができる。キットの他の選択的成分は、例えばプライマー伸長生成物の合成を触媒する試薬、ヌクレオチド三リン酸基質、増幅またはハイブリダイゼーション反応用の適当な緩衝溶液、及び本方法を実施するための指示書を含む。下記に提示される本発明の例は、例示の目的のために提供されるもので、本発明の範囲を制限するものではない。例に従った特許請求の範囲内の発明の多くの実施態様は、上述の説明及び以下の例を読むことにより当業者には明らかなものとなろう。
【実施例】
【００４３】
例１
ＨＣＶ  ＲＮＡの増幅
ＨＣＶ  ＲＮＡの増幅を、下記のプロトコールを使用して実施した。
【００４４】
試料の調製
増幅を、合成ＲＮＡテンプレートの使用、及び臨床的試料から単離されたＲＮＡの使用の両者にて実施した。合成テンプレートの使用は、各反応物に添加される標的ＲＮＡ分子の数に亘って、調整を可能とした。合成ＲＮＡは、Ｙｏｕｎｇ等、１９９３前出文献に記述されているように、ＨＣＶ  ＲＮＡ転写ベクターを使用して、転写された。臨床的試料由来のＨＣＶ  ＲＮＡの増幅のために、ＲＮＡをＹｏｕｎｇ等、１９９５前出文献に記述されているように、ＲＮＡを血清から単離した。
【００４５】
増幅
増幅を、１００μｌの反応体積にて実施した。各反応物は、以下の試薬を含んでいた。
ＨＣＶ  ＲＮＡテンプレート
４００ｎＭの各プライマー（特記しない限り）
１μＭの標識プローブ
５０ｍＭ  ビシン（ｐＨ８．３）
１００ｍＭ  ＫＯＡｃ
２００μＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ
３．６ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）2
８％  グリセロール
２０単位のｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ*、並びに
２単位のＵＮＧ*
*Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅにより製造及び開発され、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴにより販売される。
【００４６】
検出プローブは、下記の通り５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して増幅生成物を検出可能とするために、各反応混合物に含まれていた。使用されたプローブは、米国特許第５，５２７，６６９号及びＹｏｕｎｇ等、１９９５前出文献に記述されるＫＹ１５０であった。該プローブは、５’末端にフルオレセイン（ＦＡＭ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を結合し、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻止するために３’−ＯＨに代えて３’−ＰＯ4を結合して合成された。
【００４７】
増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐＴＣ９６００  ＤＮＡ熱サイクラー中で薄壁のＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブ（共にＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用し、下記の温度プロフィルにて実施された：
反応前インキュベーション  ５０℃にて２分間；
逆転写    ６０℃にて３０分間
２サイクル：
変性  ９５℃にて１５秒間
アニール／伸長  ６０℃にて２０秒間
４６サイクル：
変性  ９０℃にて１５秒間
アニール／伸長  ６０℃にて２０秒間
保持    ７２℃にて１５分間以上。
温度サイクルに次いで、反応物を分析前には−２０℃に維持した。
【００４８】
増幅生成物の検出
増幅されたＨＣＶ核酸は、ゲル電気泳動、及び５’−ヌクレアーゼアッセイの両者により分析された。ゲル電気泳動は、増幅生成物の存在の容易に視覚的に確認すること、および生成した増幅生成物の相対量の大まかな評価を与える。５’−ヌクレアーゼアッセイは、生成した増幅生成物の量の正確な定量的評価を与えるために使用された。
【００４９】
Ａ．ゲル電気泳動
増幅生成物の存在は、以下のようにしてゲル電気泳動により検出された。反応生成物をアガロースゲル（３％  ＮｕＳｉｅｖｅTM及び１％  ＳｅａＣｈｅｍTM）並びに１Ｘ  ＴＢＥ（０．０８９Ｍ  トリス、０．０８９Ｍ  ほう酸、０．００２５Ｍ  ＥＤＴＡ二ナトリウム）操作緩衝溶液を使用して分画した。電気泳動を１００ボルトにて約１時間実施した。電気泳動に続いて、存在する任意のＤＮＡを染色するためにエチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍｌ）を添加した。ゲルを水中で大まかに脱色し、ＤＮＡのエチジウムブロマイド染色バンドをＵＶ輻射を使用して可視化した。
【００５０】
Ｂ．５’−ヌクレアーゼアッセイ
上述したように、増幅は、フルオレセイン標識され、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を妨害すべく修飾されたＨＣＶ−特異的検出プローブの存在下で実施された。２個のプライマー結合部位の間に位置するＨＣＶ標的配列の領域に相補的なプローブは、プライマー伸長の間にｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性により切断される。増幅に続いて、残留する非切断プローブは反応混合物から分離され、次いで残留する切断プローブ断片の蛍光が、合成された増幅生成物の量を示すものとして測定される。
【００５１】
非切断プローブは、増幅に続いて、完全長の非切断プローブに結合するが、切断プローブ断片に感知可能に結合しないポリエチレンイミン（ＰＥＩ）にて被覆されたビーズを用いて反応混合物から抽出される。ＰＥＩビーズは、反応混合物に添加され、非切断プローブの結合が許容され、得られたＰＥＩ−プローブ複合体が遠心分離により除去される。残留するプローブ切断断片の量は、蛍光測定により決定される。ＰＥＩビーズ抽出の詳細は以下に記述される。
【００５２】
使用に先立って、ＰＥＩビーズ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪからのＢａｋｅｒ  Ｂｏｎｄ広孔ＰＥＩビーズ）は、４℃にて少なくとも数時間（または一夜）蒸留脱イオン（ｄｄ）水に浸漬された。該ＰＥＩビーズは、下記を使用して順次洗浄された：（１）ｄｄ水、（２）エタノール、（３）ｄｄ水、（４）１Ｍ  トリス（ｐＨ８．３）、（５）５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．３）、１Ｍ  ＮａＣｌ、及び（６）結合緩衝溶液（１０ｍＭ  トリス、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び８Ｍ  尿素）。最後の洗浄の後、ビーズは３００μｌの結合緩衝溶液あたり６０ｍｇ（湿重量）のＰＥＩビーズとなるように結合緩衝溶液中に再懸濁された。
【００５３】
非結合プローブの捕捉のために、７５μｌのＰＣＲ反応混合物が３００μｌのＰＥＩビーズ懸濁物（約６０ｍｇのＰＥＩビーズ）に添加された。該混合物を１０分間回転撹拌して混合し、ＰＥＩビーズに非切断プローブを結合させる。微量遠心機（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で最高速度にて２分間遠心分離してＰＥＩ−プローブ複合体を除去した後、２００μｌの上澄みをピペットにてマイクロウエルプレートのウエルに移した。蛍光を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒTMマイクロタイタープレート読み取り装置（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）において、室温にて４８５ｎｍの励起フィルタ（２０ｎｍの透過バンド幅）及び５３０ｎｍの輻射フィルタ（２５ｎｍの透過バンド幅）を使用して測定した。
【００５４】
例２
先行技術プライマーとの比較−ゲル電気泳動による分析
この例は、本発明のプライマーと、本プライマーに最も類似する先行技術に記載されたプライマーとの比較を記述する。比較されるプライマーの性質は、所定数の増幅サイクルにおいて生成される生成物の量として定義される増幅効率である。
【００５５】
本発明のプライマーに最も類似する先行技術に記載のプライマーは、米国特許第５，５２７，６６９号；ヨーロッパ特許公開５２９，４９３号；及びＹｏｕｎｇ等の、１９９３前出文献に記載されたＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）である。これらの先行技術プライマー及び本発明のプライマーの配列の比較は下記に示される。
【００５６】
[表２]
プライマー配列の比較
上流 SEQID NO 
ST280A  １        5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
KY80    ４        5'-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT
下流
ST778AA ２        5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA
ST678A  ３        5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA
KY78    ５        5'-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT
【００５７】
増幅を、合成ＨＣＶ  ＲＮＡテンプレートの０、１０、２５及び１００コピーを含む試料を使用して、例１に記述されるように実施した。反応を、下記に示されるプライマーの組合せを使用して実施した。反応（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれのプライマーを４００ｎＭ含んでいた。反応（ｄ）は、プライマー濃度を６００ｎＭに増大した点で（ｃ）とは異なっていた。
（ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ ID NO ：５）
（ｂ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
（ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQID NO ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
（ｄ）ＳＴ２８０Ａ（SEQID NO ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
【００５８】
それぞれのプライマー対を使用した増幅及び標的数の投入を、３組にて実施した。増幅生成物を、前述したようにゲル電気泳動にて分析した。結果を図１に示してある。増幅ＨＣＶ標的配列に対応するバンドが示され；下方のバンドは非特異的増幅生成物（プライマー二量体）に対応する。
【００５９】
それぞれのＨＣＶ標的濃度について、最大量の増幅生成物に対応する最も強度が高いバンドは、プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して生成された。このプライマー対のみが、１０コピーの標的から検出可能な量の増幅生成物を生じた。また明らかなことは、特に１００コピーの標的を使用した増幅において、ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して非特異的増幅生成物の量が顕著に減少することである。増幅（ｃ）及び（ｄ）の比較は、４００ｎＭのプライマー濃度が、６００ｎＭのプライマー濃度より良好な結果を生じることを示している。
【００６０】
本発明のＲＴプライマーに起因する改良点を評価するために、ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して実施する増幅を含めた。２５及び１００コピーの標的配列を用いた増幅（ａ）及び（ｂ）で得られた結果は、本発明のＲＴ及び上流プライマーの両者の組合せを使用した増幅（ｃ）及び（ｄ）により得られるほどに優れるものではないが、本発明のＲＴプライマーの従来技術の上流プライマーとの組合せにおける使用が、生成物の収率においてかなりの改良をもたらすことを示している。
【００６１】
ゲル分析は、プライマーＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の優位性の容易に視覚化される証拠を提供するものではあるが、バンドの強度は、増幅生成物の正確な定量的比較を与えるものではない。定量的比較のために、５’−ヌクレアーゼアッセイが使用された。
【００６２】
例３
従来技術プライマーとの比較−５’−ヌクレアーゼ分析
この例は、例２に記述したプライマーの組合せを使用し、増幅生成物の分析が５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して行われた増幅を記述するものである。増幅は、合成ＨＣＶ  ＲＮＡテンプレートを０、１０、２５、１０2、１０3、１０4、１０5及び１０6コピー含む試料並びに各プライマーについて４００ｎＭのプライマー濃度を使用して例１に記述されるのと同様に実施された。各プライマー対による増幅及び標的数の投入は、３組にて実施された。上記例２と同様に、下記のプライマーの組合せが使用された。
（ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ ID NO ：５）
（ｂ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＳＴ７７８ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
（ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQID NO ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
【００６３】
増幅生成物は、例１に記述されると同様に５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して分析された。データは、初期ＨＣＶ標的配列のコピー数の対数に対する、切断プローブ断片の蛍光シグナルとしてプロットして図２に示される。各蛍光値は、反復測定の平均値である。各値の標準誤差は、図２に示されている。
【００６４】
図２に示されるデータは、上述した図１に示されるゲル電気泳動分析にて観察されるのと同様に、本発明のプライマーを使用して得られる増幅効率における顕著な改善の確認を与える。プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して得られる標的配列の１０−１０5コピーの増幅にて生じる蛍光シグナルは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用して対応する増幅により生じる蛍光シグナルに比べて顕著に大きい。さらに、図１においても分かるように、本発明のＲＴプライマー、ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を従来技術の上流プライマー、ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）との組合せにおいて使用する増幅は、本発明のＲＴ及び上流プライマーの両者の組合せを使用して得られるほどに優れるものではないが、生成物の収率においてかなりの改良をもたらすことを示している。
【００６５】
相対的増幅効率のひとつの基準が、所定の蛍光シグナルを得るために必要なＨＣＶの投入コピー数の比較により与えられる。図２に示されるように、プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して１０コピーのＨＣＶ標的の増幅から得られる平均シグナルは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用して１０3コピーのＨＣＶの増幅から得られる平均蛍光シグナルとほぼ等しい。従って、１００倍少ない投入コピー数から同様な量の増幅生成物が得られ、あるいは換言すれば、プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用する増幅は、従来技術のプライマーを使用する増幅に比べて約１００倍効率が高い。
【００６６】
相対的増幅効率の別の基準は、検出可能な最小ＨＣＶ標的数の比較により与えられる。プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して、１０コピーのＨＣＶ  ＲＮＡの増幅は明確に検出可能なシグナルを与えた。対照的に、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用すると１０コピーのＨＣＶ  ＲＮＡの増幅は検出可能なシグナルを生じなかった。１００コピーより少ないＨＣＶでは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用して検出可能なシグナルが生じなかった。
【００６７】
上流プライマーＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）との間の配列の類似性、並びに下流プライマーＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）との間の配列の類似性が与えられても、増幅効率におけるこの様な劇的な改善を予期しうる理由は存在しない。本発明のプライマーを使用して得られた観察される改善は、驚くべきものであり、従来技術から見ても予期されないものである。
【００６８】
例４
従来技術プライマーとの比較：５’−ヌクレアーゼアッセイ
この例は、下記のプライマーの組合せを使用する増幅の比較を記述する。
（ａ）ＫＹ８０（SEQ ID NO ：４）及びＫＹ７８（SEQ ID NO ：５）
（ｂ）ＳＴ２８０Ａ（SEQID NO ：１）及びＳＴ６７８Ａ（SEQ ID NO ：３）
（ｃ）ＳＴ２８０Ａ（SEQID NO ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（SEQ ID NO ：２）
【００６９】
増幅は、合成ＨＣＶ  ＲＮＡテンプレートを０、１０、２５、１０2、１０3、１０4、１０5及び１０6コピー含む試料並びに各プライマーについて４００ｎＭのプライマー濃度を使用して上述されるのと同様に実施された。各プライマー対による増幅及び標的数の投入は、３組にて実施された。増幅生成物は、上述と同様に５’−ヌクレアーゼアッセイを使用して分析された。データは、初期ＨＣＶ標的配列のコピー数の対数に対する、切断プローブ断片の蛍光シグナルとしてプロットして図３に示される。各蛍光値は、反復測定の平均値である。各値の標準誤差は、図３に示されている。
【００７０】
プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、またはプライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の何れかを使用した１０−１０4コピーの標的の増幅から生じた蛍光シグナルは、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用した対応する増幅から生じた蛍光シグナルを上回った。この結果は、本発明の両プライマー対が、従来技術のプライマーより高い効率でＨＣＶ標的ＲＮＡを増幅したことを示している。
【００７１】
プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用した１０コピーのＨＣＶ標的の増幅から得られる平均シグナルの、プライマー対ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）及びＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を使用した１０2コピーのＨＣＶ標的の増幅から得られる平均シグナルに対する比較は、プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用した増幅が１０倍以上に効率的であることを示している。同様に、プライマー対ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及びＳＴ６７８Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）も、初期ＨＣＶ標的コピー数の同じ範囲内で、ほぼ１０倍ほど効率的であることを示している。
【００７２】
例５
トリシン緩衝溶液中での増幅
上述の５’−ヌクレアーゼアッセイは、５’末端がフルオレセイン（ＦＡＭ）にて標識され、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻止するために３’−ＯＨに代えて３’−ＰＯ4を有するプローブを使用する。増幅は、やはりＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手されるヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）を使用しても実施される。ＦＡＭ−標識プローブとは異なって、ＨＥＸ−標識プローブは例１に記述されるビシン増幅緩衝溶液中では不安定であった。しかしながら、ＨＥＸ−標識プローブが、トリシン増幅緩衝溶液中で安定であることが見い出された。
【００７３】
試薬濃度の型どおりの再至適化が推奨されるが、ビシン及びトリシンを使用する増幅は、本質的に同等である。トリシン緩衝溶液を使用する増幅のために指摘であることが見い出された反応混合物は下記に示される。温度サイクルの変更は必要でない。
【００７４】
ＨＣＶ  ＲＮＡテンプレート
４００ｎＭの各プライマー
１μＭのＨＥＸ−標識プローブ
２００μＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ
５５ｍＭ  トリシン（ｐＨ８．３）
９０ｍＭ  ＫＯＡｃ
３．０ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）2
８％  グリセロール
２０単位のｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ*、並びに
２単位のＵＮＧ*
*Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅにより製造及び開発され、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴにより販売される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、例２に記述されるプライマー対（Ａ）ＫＹ７８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）／ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、（Ｂ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）／ＫＹ８０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、（Ｃ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（４０ピコモル）及び（Ｄ）ＳＴ７７８ＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）／ＳＴ２８０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（６０ピコモル）をそれぞれ使用した場合の増幅反応の比較を示す電気泳動図である。
【図２】図２は、例３に記述される５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ７７８ＡＡ／ＫＹ８０（−■−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲−）を使用する増幅反応の比較を示すグラフである。
【図３】図３は、例４に記述される５’末端ヌクレアーゼアッセイに基づくプライマー対ＫＹ７８／ＫＹ８０（−−◆−−）、ＳＴ６７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−▲−）及びＳＴ７７８ＡＡ／ＳＴ２８０（−ｘ−）を使用する増幅反応の比較を示すグラフである。
【図２】
2006020642.tif 000003
【図３】
2006020642.tif 000004
【図１】
2006020642.tif 000005
【配列表】
2006020642000001.app