(57)【要約】【課題】  信頼性の高いタンパク質アレイ又はペプチドアレイを容易に形成し得るマイクロアレイの製造方法の提供。【解決手段】  液体の供給口と、当該供給口に微細流路を介して連結され、当該供給口から供給された液体を外部に吐出する吐出口とを備える液滴吐出ヘッドを用いて、固相担体上にタンパク質又はペプチドと安定化剤とを含む液体をインクジェット方式により吐出し、当該固相担体上にタンパク質又はペプチドを固定するマイクロアレイの製造方法により上記課題を解決する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を外部に吐出する吐出口を備える液滴吐出ヘッドを用いて、固相担体上にタンパク質又はペプチドと安定化剤とを含む液体をインクジェット方式により吐出し、当該固相担体上にタンパク質又はペプチドを固定することを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
【請求項２】
前記安定化剤がトレハロースである、請求項１に記載のマイクロアレイの製造方法。
【請求項３】
前記安定化剤の濃度が１〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は請求項２に記載のマイクロアレイの製造方法。
【請求項４】
前記固相担体上に吐出後、すみやかに前記タンパク質又はペプチドと安定化剤とを含む液体を乾燥させる、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロアレイの製造方法。
【請求項５】
前記液滴吐出ヘッドの駆動方式が、圧電駆動方式又は静電駆動方式である、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロアレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイの製造方法に関し、詳しくは、液滴吐出ヘッドを用いたタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質の発現・相互作用をハイスループットに行うための解析技術としてタンパク質マイクロアレイ（プロテインチップ）が期待されており、多様なタンパク質マイクロアレイを容易に製造し得る技術の開発が望まれている。
【０００３】
このような状況下、特許文献１（特開平１１−１８７９００号公報）では、インクジェット法を利用してタンパク質を基板上に固定化する方法が提案されている。インクジェット法によれば、安定したスポット形状を迅速に基板上に形成することができ、また、ノズル間ピッチを狭くすることで高密度にスポットが形成されたタンパク質マイクロアレイを容易に作製し得るなどの利点がある。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１８７９００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、タンパク質は固体表面に付着し易いため、インクジェット法に用いる液滴吐出ヘッドの微細な流路や吐出口に付着して、液体の流動を妨げたり、吐出濃度の安定性を低下させてしまう虞があった。また、タンパク質が液滴吐出ヘッドの内壁と接触することにより、立体構造が変化してタンパク質本来の活性が失われてしまうなどの虞があった。このような現象が生じると、タンパク質マイクロアレイの信頼性が損なわれる。
【０００６】
そこで、本発明は、このような不具合を解消し、信頼性の高いタンパク質アレイ又はペプチドアレイを容易に形成し得るマイクロアレイの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明は、液体を外部に吐出する吐出口を備える液滴吐出ヘッドを用いて、固相担体上にタンパク質又はペプチドと安定化剤とを含む液体をインクジェット方式により吐出し、当該固相担体上にタンパク質又はペプチドを固定するマイクロアレイの製造方法を提供するものである。
【０００８】
このように吐出溶液中に安定化剤を含有させることで、液滴吐出ヘッドの微細流路やノズル孔を介して吐出を行った際にも安定したタンパク質又はペプチドの吐出を行うことが可能となる。よって、より信頼性の高いタンパク質アレイ又はペプチドアレイといったマイクロアレイを簡便に形成し得る。
【０００９】
前記安定化剤としては、タンパク質及び／又はペプチドの近傍に存在し、タンパク質及び／又はペプチドが液滴吐出ヘッド１の内壁に付着するのを回避し、安定に保つことができる材料であれば特に限定されない。特にタンパク質の場合には、タンパク質の構造・形態の安定化に用いられる安定化剤が好適に用いられる。このような安定化剤としては、特にトレハロースが好ましい。これによれば、タンパク質及びペプチドを含む液体の吐出安定化に効果的であるとともに、乾燥後においてもタンパク質の構造を保持し得る。
【００１０】
前記安定化剤の濃度が１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌであることが望ましい。安定化剤の濃度がこのような範囲にあるとタンパク質又はペプチドを含む液体の吐出安定化を一層図ることが可能となる。
【００１１】
前記固相担体上に吐出後、すみやかに前記タンパク質又はペプチドと安定化剤とを含む液体を乾燥させることが好ましい。これによれば、タンパク質又はペプチドをより均一に固層担体上に固定化し、活性を長期間維持することが可能となる。
【００１２】
前記液滴吐出ヘッドの駆動方式が、圧電駆動方式又は静電駆動方式であることが好ましい。このような方式によれば、吐出時にタンパク質又はペプチドに熱がかかることがないので、吐出時にタンパク質又はペプチドの変性を低減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。
【００１４】
図１は、本発明に用いられる液滴吐出ヘッドの一例を説明するための上面図である。図２は、図１におけるａ点〜ｊ点に沿った液滴吐出ヘッドの断面を説明する断面図である。
【００１５】
図１及び図２に示すように、本実施形態に用いられる液滴吐出ヘッド１は、電極１０８が形成された第１の基板（以下、電極基板という）、試料溶液を吐出するための圧力を付与する加圧室１０５を備えた第２の基板（以下、加圧室基板という）、吐出口（ノズル）１０６を有する第３の基板（以下、ノズル基板という）、及び上記試料溶液を収容するための収容室１０１を有する収容部１２０を備え、構成されている。また、必要に応じて、収容室１０１と加圧室１０５を繋ぐマイクロチャンネル１３１（以下、単に流路ともいう）が形成された流路基板１２４が含まれていてもよい。
【００１６】
加圧室基板１２２、ノズル基板１２３、電極基板１２１を構成する材料は、特に限定するものではないが、生体試料に与える影響をより低減し得るという観点からは、例えばガラス基板又はシリコン基板が用いられる。また、収容部１２０の材料についても、特に限定されず、ガラス、シリコン、樹脂等のいずれを用いてもよいが、加工性等の観点から、例えばアクリル樹脂（例：ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ））又はポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）などの樹脂が好ましく用いられる。
【００１７】
液滴吐出ヘッド（インクジェットヘッド）１は、タンパク質又はペプチドを含む一又は複数種類の液体を収容し得る複数の収容室１０１を備えている。これらの収容室１０１の上部は開口されており、液体を液滴吐出ヘッド１内に供給するための供給口となっている。収容室１０１に供給されたタンパク質等を含有する液体は、各々マイクロチャンネル１３１を通じて加圧室１０５内に導入される。加圧室１０５では、図示しない共通電極と電極１０８との間に電圧を付与することで、振動板１０９が弾性変位して内部圧力の変動を生じ、これによって吐出口（ノズル孔）１０６から液滴が吐出される。
【００１８】
このように液滴吐出ヘッド１により液体を吐出する場合には、供給口から吐出口１０６に至る微細流路を通って液体が吐出されることになる。ところで、吐出試料に用いられるタンパク質又はペプチドは、一般に固体表面に付着し易く、特にこのような微細流路に付着した場合には、液体の流動の妨げ、ノヅル詰まりなどの吐出不良を生じ易い。また、液滴吐出ヘッド１の内壁と接触することにより、タンパク質が構造変化を生じ、本来の機能を発揮し得ない場合も生じる。
【００１９】
しかしながら、タンパク質又はペプチドを含む液体中に、安定化剤を添加することでこのような吐出不良やタンパク質の変性によるタンパク質アレイ又はペプチドアレイの信頼性の低下を回避することが可能となる。
【００２０】
このような安定化剤としては、タンパク質及び／又はペプチドの近傍に存在し、タンパク質及び／又はペプチドが液滴吐出ヘッド１の内壁に付着するのを回避し、安定に保つことができる材料であれば特に限定されない。特にタンパク質の場合には、タンパク質の構造・形態の安定化に用いられる安定化剤が好適に用いられる。具体的には、例えば、トレハロース等の水溶性糖誘導体、生体分子親和性ポリマー（例：StabilGuard（登録商標、SurModics社製））、或いは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル等の界面活性剤等が挙げられる。
【００２１】
また、タンパク質等を含む液体を固相担体上に固定する場合、液体を乾燥することにより固定する場合がある。液滴吐出ヘッドで吐出される液滴は、通常、数ｐｌ〜数１００ｐｌ程度と非常に微量であるので、液滴の吐出後、すぐに液体が乾燥してしまう。このような場合には、乾燥後においてもタンパク質の構造変化を抑制し、その活性を保持する必要がある。そこで、乾燥後においてもタンパク質の立体構造を保持し、活性の低下を抑制し得るものであることが更に望まれる。
【００２２】
上掲した安定化剤の中でも、特にトレハロースが効果的にタンパク質又はペプチドを含む液体の吐出を安定化し得るので好ましい。また、トレハロースは、液体の乾燥後においてもタンパク質の立体構造を長期にわたり保持することができ、タンパク質の失活を最小限に留めることが可能である。
【００２３】
前記安定化剤の濃度は、例えばトレハロースを用いる場合には、１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌであることが望ましい。トレハロースの濃度がこのような範囲にあるとタンパク質又はペプチドを含む液体の吐出安定化を一層図ることが可能となる。
【００２４】
本発明で用いられるタンパク質又はペプチドとしては、液滴吐出ヘッドにより吐出可能なものであれば特に限定されるものではない。また、ペプチドには、分子量約１０個以下のアミノ酸からなる比較的小さいオリゴペプチドから、それより大きいポリペプチドをも含み、天然由来のペプチド及び合成ペプチドの両方を含む。
【００２５】
また、タンパク質又はペプチドを分散又は溶解させる液体としては、タンパク質又はペプチドの機能を阻害しないものであり、液滴吐出に良好な溶媒であれば特に限定されない。このような溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）が用いられる。
【００２６】
本発明のマイクロアレイは、上記のような液滴吐出ヘッド１を用いて、例えば、固相担体（例：ガラス製の基板等）上の所望の位置に、前記タンパク質又はペプチドを含む液体を吐出し、固相担体上にタンパク質又はペプチドを固定化することで製造することができる。
【００２７】
この際、タンパク質又はペプチドを含む液体は、固相担体上に吐出後、すみやかに乾燥させることが好ましい。これにより、タンパク質又はペプチドをより均一に固層担体上に固定化することが可能となる。
【００２８】
本発明のマイクロアレイの製造方法によれば、吐出溶液中に安定化剤を含有させることで、液滴吐出ヘッドの微細流路やノズル孔を介して吐出を行った際にも安定したタンパク質又はペプチドの吐出を行うことが可能となる。また、インクジェット法を利用することにより、効率よく安定した高密度のスポットを形成することが可能である。よって、より信頼性の高いタンパク質アレイ又はペプチドアレイといったマイクロアレイを容易に形成し得る。また、上記のような複数の収容室１０１を有する液滴吐出ヘッド１を用いることで、多種類のタンパク質又はペプチドを吐出可能となるので、多様なマイクロアレイを効率よく製造することが可能となる。
【００２９】
また、一般に、液滴吐出ヘッドを用いてインク等の液体を吐出する場合においても、長時間放置すると、溶液粘度が上昇し、吐出不良が発生する場合がある。このような場合には、通常、吸引装置によってノズルを吸引することにより液滴吐出ヘッド１を復帰させている。しかし、タンパク質を吐出する場合には、吸引装置を用いても液滴吐出ヘッドを復帰させることが困難であることが発明者の実験により明らかにされている。よって、本発明の製造方法は、インクジェット法を用いる上では、特に有用なものと考えられる。
【００３０】
なお、上記例では、液滴吐出ヘッドとして、静電駆動方式を例示したが、本発明はこれに限らず、ピエゾ素子を用いた圧電駆動方式を用いてもよい。
【００３１】
（実施例）
（実施例１）
図１及び図２に示した静電駆動式の液滴吐出ヘッド１を用いてマイクロアレイの製造を行った。
【００３２】
牛血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ社）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解する。これに、２０ｇ／ｍｌ濃度になるように安定化剤としてのトレハロース（林原生物化学研究所より入手）を添加する。このようにして得られたタンパク質含有溶液１を液滴吐出ヘッド１の収容室１０１に供給し、吸引装置を用いて収容室１０１内の溶液を加圧室１０５及び吐出口１０６を含む微細流路に充填する。吐出される液滴の平均重量を電子天秤を用いて測定した。
【００３３】
（実施例２）
トレハロースの代わりにタンパク質安定化剤としてStabiGuard (SurModics社)を用い、このStabiGuardをＰＢＳで１０倍に希釈した溶液にＢＳＡを５ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう溶解したタンパク質含有溶液２を準備した。このタンパク質含有溶液２を、実施例１と同様に、液滴吐出ヘッド１に充填し、平均の液滴重量を測定した。
【００３４】
（比較例１）
実施例１において、安定化剤を添加しない以外は同様の方法で平均の液滴重量の測定を行った。
【００３５】
（吐出速度の評価結果）
安定化剤としてトレハロースや生体分子親和性ポリマーを添加した実施例１及び実施例２のタンパク質含有溶液を用いた場合と、安定化剤を添加しない比較例１の充填直後における平均液滴重量は、それぞれ以下のようになった。
実施例１    １８０ｎｇ
実施例２    １７６ｎｇ
比較例１    １８３ｎｇ
このように、タンパク質溶液を液滴吐出ヘッドに充填した直後においては、液滴の平均重量に殆ど差はなく、吐出の状態はどれも良好であった。
【００３６】
続いて、液滴吐出ヘッドに充填されたタンパク質溶液を、吸引装置を用いて除去し、乾燥させた後に、再度同じ実施例１、実施例２、比較例１のタンパク質溶液を液滴吐出ヘッドに充填し、平均液滴重量を測定した。
実施例１    １７０ｎｇ
実施例２    １５０ｎｇ
比較例１      ５０ｎｇ
このように安定化剤を添加していないものは、安定吐出ができず、平均液滴重量が著しく低下している。一方、安定化剤を添加したものは、平均液滴重量の低下がごくわずかに抑制されていることがわかる。
【００３７】
比較例１では、ＢＳＡが、液滴吐出ヘッド１のノズル内壁に付着するため吐出不良が生じたものと考えられる。また、液滴吐出ヘッド１の内壁とタンパク質が直接接触することにより、比較例１では、タンパク質の構造が壊れて変性しているものと推測される。
【００３８】
しかし、実施例１及び実施例２のトレハロースや生体分子親和性ポリマー等の安定化剤を添加したタンパク質含有溶液では、トレハロースや生体分子親和性ポリマー等の安定化剤により、ＢＳＡの形態（構造）が安定化されるため、液滴吐出ヘッドの内壁への吸着を抑制することが可能となる。これにより、タンパク質の安定な吐出が図られているものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の第１の実施形態に係る液滴吐出ヘッドの上面図である。
【図２】図２は、図１におけるａ〜ｊを通る断面図を示す。
【符号の説明】
【００４０】
１・・・液滴吐出ヘッド、１０１・・・収容室、１０５・・・加圧室、１０６・・・吐出口、１０８・・・電極、１０９・・・振動板、１２０・・・収容部、１２１・・・電極基板、１２２・・・加圧室基板、１２３・・・ノズル基板、１２４・・・流路基板、１３１・・・マイクロチャンネル（流路）
【図１】
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【図２】
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