(57)【要約】【課題】  ヒトおよびヒトでない動物におけるこれらおよび他の疾患を予防および処置するための免疫学的方法を提供。【解決手段】  Ｔリンパ球を、組換え核酸によってコードされるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ポリペプチドを発現する樹状細胞と接触させることによりＴリンパ球を活性化する方法ならびに組換えＴＲＴ発現カセットを含む組換え樹状細胞（１つの実施態様では、この組換え発現カセットは、幹細胞に形質導入され、次いでこの幹細胞は樹状細胞に分化される）、ならびに上記の樹状細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、１９９７年１１月１９日に出願された米国特許出願第０８／９７４，５４９号の一部継続出願であり、そして１９９７年１１月１９日に出願された米国特許出願第０８／９７４，５８４号の一部継続出願である。米国特許出願第０８／９７４，５４９号および米国特許出願第０８／９７４，５８４号の両方は、いずれも１９９７年８月１４日に出願された米国特許出願第０８／９１５，５０３号、米国特許出願第０８／９１２，９５１号、および米国特許出願第０８／９１１，３１２号の一部継続出願である。本出願はまた、いずれも１９９７年１０月１日に出願した特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１７８８５号および特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１７６１８号に対する利益を請求する。上記の出願の各々は、その全体が参考として、そして全ての目的のために本明細書中に明快に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒトテロメラーゼの触媒タンパク質サブユニットに関する。本発明は、医学、免疫学、および分子生物学に関連する方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
以下の考察は、本発明の分野を読者に導入することを意図する。この節における参考文献の引用は、先行発明の承認として解釈されるべきでない。
【０００４】
テロメラーゼリボ核タンパク質複合体は、真核生物染色体の末端の特殊化された構造であるテロメアを保持する特殊化されたポリメラーゼである。細胞におけるテロメアの長さおよび統合性は、細胞が老化段階（すなわち、増殖能力の喪失）への進行と、あるいは細胞が老化を免れる能力と相関する。特に興味深いのは、ヒトおよび他の哺乳動物の細胞におけるテロメラーゼ活性と、新形成表現型の発症との間で観察される相関である。例えば、テロメラーゼ活性は、不死化細胞株および多様なセットの腫瘍組織において検出されるが、正常な体細胞培養物または腫瘍に隣接する正常な組織においては検出されない（すなわち、存在しないかまたはアッセイの閾値よりも低い）（米国特許第５，６２９，１５４号；同第５，４８９，５０８号；同第５，６４８，２１５号；および同第５，６３９，６１３号を参照のこと；Ｍｏｒｉｎ，１９８９，Ｃｅｌｌ  ５９：５２１；ＳｈａｙおよびＢａｃｃｈｅｔｔｉ，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３３：７８７；Ｋｉｍら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１；Ｃｏｕｎｔｅｒら，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１９２１；Ｃｏｕｎｔｅｒら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，２９００；Ｃｏｕｎｔｅｒら，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３４１０もまた参照のこと）。さらに、腫瘍におけるテロメラーゼ活性のレベルと、患者の同様な臨床的な結果との相関が報告されている（例えば、米国特許第５，６３９，６１３号；Ｌａｎｇｆｏｒｄら，１９９７，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２８：４１６）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、テロメラーゼは、細胞増殖の制御および腫瘍形成において重要な役割を果たす。これらおよび他の理由のために、ヒトのテロメラーゼは、細胞増殖および老化に関連するヒトの疾患（例えば、癌）の予防および処置のための理想的な標的である。本発明は、ヒトおよびヒトでない動物におけるこれらおよび他の疾患を予防および処置するための免疫学的方法を提供する。
【０００６】
本発明によって、以下が提供される：
（項目１）  Ｔリンパ球を活性化する方法であって、該Ｔリンパ球を、組換え核酸によってコードされたテロメラーゼ逆転者酵素（ＴＲＴ）ポリペプチドを発現する樹状細胞と接触させる工程を包含する、方法。
（項目２）  項目１に記載の方法であって、前記ＴＲＴポリペプチド、ヒトＴＲＴ（ｈＴＲＴ）ポリペプチドである、方法。
（項目３）  項目２に記載の方法であって、ここで、前記ｈＴＲＴポリペプチドが、図１に示された配列、またはそれらの部分配列である、方法。
（項目４）  前記ｈＴＲＴポリペプチドが、全長である、項目２に記載の方法。
（項目５）  前記樹状細胞が、インビボでＴリンパ球と接触する、項目１に記載の方法。
（項目６）  前記樹状細胞が、インビトロでＴリンパ球と接触する、項目１に記載の方法。
（項目７）  前記樹状細胞が、ヒト細胞である、項目１に記載の方法。
（項目８）  組換えＴＲＴ発現カセットを含む、組換え樹状細胞。
（項目９）  項目９に記載の樹状細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１０）  項目８に記載の組換え樹状細胞であって、前記組換え発現カセットが、幹細胞に形質導入され、次いで、該カセットが、該樹状細胞に分化する、組換え樹状細胞。
（項目１１）  項目１０に記載の方法であって、前記幹細胞が、インビトロで、樹状細胞に分化する、方法。
（項目１２）  ヒト患者における免疫応答を惹起する方法であって、以下：
（ａ）ヒト樹状細胞を取得する工程；
（ｂ）ＴＲＴ発現カセットを、該細胞に検出導入して、それによって、該細胞が、ｈＴＲＴポリペプチドを発現可能である、工程；
（ｃ）該ヒト患者に該細胞を投与する工程
を包含する、方法。
（項目１３）項目１２に記載の方法であって、前記樹状細胞は、前記ヒト患者から単離される、方法。
（項目１４）項目１３に記載の方法であって、前記樹状細胞は、造血前駆細胞から取得される、方法。
（項目１５）ヒト患者における免疫応答を惹起する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ヒト樹状細胞を取得する工程；
（ｂ）ｈＴＲＴ抗原で該ヒトをパルスする工程；
（ｃ）該ｈＴＲＴ抗原でパルスされた細胞を、該ヒトに投与する工程
を包含する、方法。
（項目１６）項目１５に記載に方法であって、ここで、前記樹状細胞が、ヒト患者から単離される、方法。
（項目１７）項目１５に記載の方法であって、前記細胞が、１以上のｈＴＲＴ抗原ペプチドでパルスされ、ここで、該ｈＴＲＴ抗原性ペプチドが、５０アミノ酸残基長未満である、方法。
（項目１８）ｈＴＲＴを発現する細胞を同定する工程するための方法であって、
ｈＴＲＴポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現カセットで樹状細胞に形質導入する工程；
該形質導入された細胞とＴリンパ球を接触させて、それによって、活性化Ｔリンパ球を提供する、工程；
該活性化Ｔリンパ球と標的細胞を接触させる工程：
該標的細胞における該活性化Ｔリンパ球の効果をモニタリングする工程
を包含する、方法。
【０００７】
（発明の簡単な要旨）
１つの局面では、本発明は、Ｔリンパ球を、組換え核酸によってコードされるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ポリペプチドを発現する樹状細胞と接触させることによりＴリンパ球を活性化する方法を提供する。本発明の種々の実施態様では、このＴＲＴポリペプチドは、ヒトＴＲＴ（ｈＴＲＴ）ポリペプチドであり、そして図１に示す配列を有し得るかまたはそのサブ配列を有し得る。１つの実施態様では、ｈＴＲＴポリペプチドは、全長である。１つの実施態様では、樹状細胞は、ヒト細胞である。樹状細胞は、Ｔリンパ球とインビボまたはインビトロで接触し得る。
【０００８】
関連する局面では、本発明は、組換えＴＲＴ発現カセットを含む組換え樹状細胞を提供する。１つの実施態様では、この組換え発現カセットは、幹細胞に形質導入され、次いでこの幹細胞は樹状細胞に分化される。１つの実施態様では、この幹細胞はインビトロで分化する。本発明はまた、上記の樹状細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【０００９】
別の局面では、本発明は、ヒト患者において免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、（ａ）ヒト樹状細胞を得る工程、（ｂ）ＴＲＴ発現カセットを細胞内に形質導入し、その結果、これらがｈＴＲＴポリペプチドを発現し得る、工程、および（ｃ）このヒト患者にこの細胞を投与する工程による。特定の実施態様では、この樹状細胞は、樹状細胞が投与されるヒト患者から単離されるか、および／または造血前駆細胞から入手される。
【００１０】
なお別の局面では、本発明は、ヒト患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、（ａ）ヒト樹状細胞を得る工程、（ｂ）この細胞をｈＴＲＴ抗原でパルスする工程、および（ｃ）このヒト患者に、このｈＴＲＴ抗原でパルスされた細胞を投与する工程による。特定の実施態様では、この樹状細胞は、樹状細胞が投与されるヒト患者から単離されるか、および／または造血前駆細胞から入手される。１つの実施態様では、この細胞には、長さが５０アミノ酸残基よりも少ない、１以上のｈＴＲＴ抗原性ペプチドがパルスされる。
【００１１】
別の局面では、本発明は、ｈＴＲＴを発現する細胞を同定するための方法を提供する。この方法によれば、樹状細胞は、ｈＴＲＴポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現カセットで形質導入される；Ｔリンパ球は、この形質導入された樹状細胞と接触させられ、それにより、活性化されたＴリンパ球が提供される；そして標的細胞は、この活性化されたＴリンパ球と接触させられる。次いで、この標的細胞に対する、活性化されたＴリンパ球の効果がモニタリングされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書で使用する場合、「テロメラーゼ逆転写酵素」（ＴＲＴ）とは、テロメラーゼリボ核タンパク質粒子の触媒タンパク質サブユニットをいう。ヒト由来のＴＲＴは、特徴付けされており、ヒトＴＲＴ（ｈＴＲＴ）ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列がクローン化され、その配列が決定されている。例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：９５５および同時係属中の米国特許出願第０８／９１２，９５１号および同第０８／９７４，５４９号を参照のこと。全長ネイティブｈＴＲＴの配列が、ＧｅｎＢａｎｋに寄託され（寄託番号第ＡＦ０１５９５０号）、そしてｈＴＲＴコード配列を有するプラスミドおよびファージベクターがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託されている（寄託番号第２０９０２４号、同第２０９０１６号、および同第９８５０５号）。非ヒトＴＲＴポリペプチド（すなわち、ｈＴＲＴのホモログ）は、同時係属中の米国特許出願第０８／９７４，５８４号、同第０８／９７４，５４９号、同第０８／９１５，５０３号、同第０８／９１２，９５１号に記載される。上記の引用文献および寄託において記載されるアミノ酸配列を有するｈＴＲＴポリペプチドに加え、本発明において使用され得るｈＴＲＴポリペプチドとしては、対立遺伝子改変体およびプロセシング改変体を含む、他の天然に生じる改変体が挙げられる。同時係属中の特許出願（例えば、米国特許出願第０８／９１２，９５１号および同第０８／９７４，５４９号）において詳細に記載されるように、上記の配列および試薬を用いて、そして例えば、標準的な分子生物学的技術を用いて、天然に存在するｈＴＲＴ改変体または誘導体、および非ヒトホモログを得ることは、十分に当業者の技術範囲内である。本発明の特定の実施態様において、特定の被験体に特徴的であるか（例えば、被験体由来の腫瘍細胞中の発現）、または特定の腫瘍型に特徴的なｈＴＲＴポリペプチドまたは改変体（またはそのような改変体をコードする遺伝子またはｃＤＮＡ）が使用される。そのような腫瘍または被験体特異的なｈＴＲＴは、標準的な方法（例えば、ｈＴＲＴ  ＰＣＲプライマーを使用するクローニング、抗ｈＴＲＴ抗体を使用する精製、および他の技術）を使用して得られ得る。ｈＴＲＴポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびに非ヒトホモログの例示的な使用は、米国特許出願第０８／９７４，５４９号（１９９７年１１月１９日出願）、同第０８／９７４，５８４号（１９９７年１１月１９日出願）、同第０８／９１５，５０３号（１９９７年８月１４日出願）、同第０８／９１２，９５１号（１９９７年８月１４日出願）、同第０８／９１１，３１２号（１９９７年８月１４日出願）、同第０８／８５４，０５０号（１９９７年５月９日出願）、同第０８／８５１，８４３号（１９９７年５月６日出願）、同第０８／８４６，０１７号（１９９７年４月２５日出願）、同第０８／８４４，４１９号（１９９６年４月１８日出願）、同第０８／７２４，６４３号（１９９６年１０月１日出願）および同第０８／９７９，７４２号（１９９７年１１月２６日出願）にさらに詳細に記載される。上記の特許出願の各々は、その全体が全���の目的のために、本明細書において参考として明白に援用される。
【００１３】
「樹状細胞」（ＤＣ）は、いくつかの方向において、樹状細胞体から伸長するラメリポディウムを含む特徴的な形態を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。いくつかの表現型の判定基準もまた、代表的であり、これには、高レベルのＭＨＣ分子および同時刺激分子、顆粒球、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、およびＴリンパ球に特異的なマーカーの欠失、が挙げられるが、樹状細胞の供給源に依存して変化し得る。ＤＣは、抗原特異的な初期Ｔリンパ球応答をインビトロおよびインビボにおいて開始し得、そして、末梢血白血球、脾細胞、Ｂ細胞および単球と比較して、強力な混合型白血球応答（ＭＬＲ）を指向する。ＤＣは、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４+前駆細胞）由来であり得る。樹状細胞は、一般的にＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９１、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１〜９６に記載される。
【００１４】
細胞は、選択された核酸が細胞内に転移する場合、その核酸で「形質導入」される。細胞は、選択された核酸が複製され、そして娘細胞に伝播される場合、その選択された細胞で「安定に形質転換」される。細胞は、選択された核酸が細胞のゲノム中に組み込まれる場合、その選択された核酸で「形質転換」される。
【００１５】
「ＴＲＴ発現カセット」は、ＴＲＴポリペプチドまたはフラグメントをコードする核酸およびプロモーターを含む、組換え的にか、または合成的に生成される核酸構築物である。いくつかの実施態様において、この発現カセットはまた、他の遺伝子エレメント（例えば、複製起点、および／またはレトロウイルスＬＴＲのような染色体組込みエレメント）を含む。このＴＲＴ発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノム、核酸フラグメントなどであり得る。
【００１６】
用語「組換え」は、当該分野においてその通常の意味を有する。従って、組換えポリヌクレオチドは、合成されたポリヌクレオチドであるか、そうでなければインビトロにおいて操作されたポリヌクレオチド（例えば、分子生物学的技術を使用する）であり、そして天然において通常連結されない配列（例えば、異種プロモーター、ベクター配列または他の配列）と代表的に連結され、および／あるいは天然に生じる形態と比較した場合の変異（例えば、欠失）を含む；「組換えポリペプチド」は、組換え核酸の発現によって産生されるポリペプチドであり；そして「組換え細胞」は、組換えポリヌクレオチドを含有する細胞である。
【００１７】
Ｔリンパ球に関して使用される場合、用語「活性化」または「活性化する」は、免疫学の分野において通常の意味を有し、Ｔリンパ球と抗原提示細胞との間のリガンド−レセプター相互作用に続く特徴的な変化（例えば、カルシウムイオン流、チロシンキナーゼ活性化）をいう。Ｔ細胞活性化は、抗原反応性Ｔリンパ球のクローン性増殖を、通常生じる。
【００１８】
（ＩＩ．導入）
本発明の方法および試薬は、テロメラーゼ、テロメラーゼタンパク質、および／またはテロメラーゼもしくはテロメラーゼタンパク質発現細胞に対するインビボでの免疫応答を誘発するのに有用である。特に、本発明の方法および試薬は、細胞増殖に関連する疾患または状態（例えば、ガン）を処置または予防するために使用される。
【００１９】
ヒトおよび他の哺乳動物において、永久に増殖する多くの細胞（例えば、ガン細胞）は、内在性テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）遺伝子の発現および検出可能なテロメラーゼ活性の存在によって特徴付けられる。対照的に、哺乳動物におけるほとんどの通常の体細胞は、ＴＲＴ発現のレベルが存在しないか、または非常に低いレベルを有する。従って、ＴＲＴまたはＴＲＴ発現細胞に対する特異的な免疫応答を誘発することによって、免疫学的な破壊のための選択的な増殖細胞の標的化が可能である。テロメラーゼ発現細胞を特異的に標的化するＴリンパ球の分化および増殖を誘導する試薬（例えば、前出に記載の樹状細胞）は、ガンの予防および処置のために使用され得る。ヒトまたは非ヒト被験体における抗ＴＲＴ免疫応答の誘導は、被験体における腫瘍の増殖を阻害する、および／または腫瘍の後退を生じる。本発明の方法および試薬（例えば、細胞）はまた、予防的に使用され得、被験体のガンを発症する危険性を減少する免疫応答を誘発し得る。
【００２０】
本発明に従って、被験体における免疫応答は、ＴＲＴタンパク質ならびにそのフラグメントおよび誘導体、そのようなＴＲＴタンパク質、フラグメントおよび誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびに上記のポリペプチドおよびポリヌクレオチド試薬を含有する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）（例えば、ペプチド／ＭＨＣ複合体の状況においてＴＲＴ抗原を提示する樹状細胞ＴＲＴ）の投与によって誘発され得る。惹起される免疫応答は、もっぱら液性（例えば、抗体媒介性）、もっぱら細胞性（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介性）であり得るか、または液性および細胞性の両方の成分を有し得る。あるいは、Ｔリンパ球は、エキソビボにおいて活性化され得、そして被験体に投与され得る。
【００２１】
従って、本発明の種々の局面において、ＴＲＴまたはＴＲＴ発現細胞に対する免疫応答は、（１）被験体に対して、ＴＲＴ抗原ペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を投与する工程；（２）被験体に対して、ＴＲＴペプチド／ＭＨＣ複合体を認識するＴリンパ球を投与する工程；（３）ＴＲＴタンパク質、ポリペプチドまたはフラグメントをコードするポリヌクレオチドの免疫原生量を投与する工程；（４）ＴＲＴタンパク質、ポリペプチドまたはフラグメントの免疫原生量を投与する工程、の１つ以上の工程を包含する方法によって惹起される。（３）のポリヌクレオチドまたは（４）のポリペプチドは、ＴＲＴタンパク質を発現する細胞に対して、クラスＩ  ＭＨＣ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る量において通常投与されるか、または被験体において抗体の産生を誘導し得る量において通常投与される。
【００２２】
（ＩＩＩ．抗ＴＲＴ免疫応答の誘発のための抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用）
本発明の１つの実施態様において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、インビボまたはエキソビボにおいてＴリンパ球を活性化するために使用され、ＴＲＴ発現細胞に対する免疫応答を誘発する。ＡＰＣは、高度に特殊化した細胞であり、マクロファージ、単球、および樹状細胞（ＤＣ）を含み、抗原をプロセスして、そのペプチドフラグメントをリンパ球活性化に必要な分子とともにその細胞表面に提示する。しかし、一般的に、樹状細胞は、Ｔリンパ球媒介性応答（例えば、初期免疫反応）の誘導について、他の抗原提示細胞より優れる。ＤＣは、サブグループに分類され、例えば、濾胞樹状細胞、ランゲルハンス樹状細胞、および上皮樹状細胞が挙げられる。
【００２３】
ＤＣは、Ｔヘルパー（Ｔｈ）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の両方の強力な刺激因子であることが示されている。Ｓｃｈｕｌｅｒら、１９９７、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：３１７〜２２を参照のこと。インビボにおいて、ＤＣは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩタンパク質と複合体化した抗原性ペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子の装填は、細胞質性タンパク質（究極的に核に輸送されるＴＲＴのようなタンパク質を含む）がプロセスされ、そしてＭＨＣクラスＩ分子を含有する分泌画分に輸送されたときに通常生じる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、細胞外環境のＡＰＣによるサンプリング（例えば、エンドサイトーシスによる）後に、インビボにおいて通常装填される。ＤＣは、ＤＣが抗原特異的Ｔリンパ球（すなわち、ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体を認識するＴｈ細胞およびペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体を認識するＣＴＬ）の増殖および分化を誘導するリンパ様器官に移動する。Ｔリンパ球の導入および細胞媒介性免疫は、Ｐａｕｌ、１９９３、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第３版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹおよびそこに引用される参考文献において見出される。
【００２４】
ＤＣ（またはＤＣ前駆細胞）が、抗原ペプチドフラグメントに対してエクソビボにおいて曝露され得るか（「抗原パルシング（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｕｌｓｉｎｇ）」という）、またはエキソビボにおいて遺伝子改変され得、所望の抗原を発現し、その後患者に投与され、抗抗原免疫応答を誘導することが理解される。あるいは、パルスされるか、または遺伝子改変されたＤＣは、Ｔリンパ球（例えば、ＨＬＡ適合Ｔリンパ球）とともにエキソビボにおいて培養され得、選択された抗原に対して特異的なＴ細胞を活性化し得る。本発明と特に関連するのは、抗原を多数有するＤＣが使用され、腫瘍に対する宿主の防御を高め得ることである（例えば、Ｈｓｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：５２〜５８；Ｙｏｕｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：７〜１１；ＭｃＡｒｔｈｕｒら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：４１〜４７；Ｔｕｔｉｎｇら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２７０２〜２７０７；Ｎａｉｒら、１９９７、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０：７０６〜７１５）。標的抗原（例えば、標的「腫瘍」抗原）が細胞表面に天然に発現される必要はないことが理解される。なぜなら、細胞質性タンパク質および核タンパク質（例えば、ＴＲＴ）は、通常プロセスされ、ＭＨＣにコードされる産物に細胞内で付着し、そしてペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に移送されるからである。
【００２５】
１つの局面において、本発明は、ポリペプチドおよびＴＲＴをコードするポリヌクレオチド（特に、ヒトｈＴＲＴ）、および抗原提示細胞（特に樹状細胞）の使用に関し、被験体中のＴＲＴ発現細胞（例えば、ガン細胞）に対する免疫応答を誘発する。体表的には、（１）造血性幹細胞を単離する工程、（２）ＴＲＴポリペプチドを発現する細胞を遺伝子改変する工程、（３）前駆細胞をＤＣに分化する工程、および（４）ＤＣを被験体（例えば、ヒト患者）に投与する工程を包含する。代替的な実施態様において、このプロセスは、（１）ＤＣを単離する工程（またはＤＣ前駆細胞の単離および分化）、（２）ＴＲＴペプチドでこの細胞をパルスする工程、および（３）このＤＣを被験体に投与する工程、を包含する。これらのアプローチは、下記において詳細に討論される。関連する実施態様において、本発明のＴＲＴパルスされたＤＣまたはＴＲＴ発現ＤＣが、エキソビボにおいてＴリンパ球を活性化するために使用される。しかし、下記に記載される各手順の多くの改変は、当該分野において公知であり（例えば、ＷＯ９７／２９１８２；ＷＯ９７／０４８０２；ＷＯ９７／２２３４９；ＷＯ９６／２３０６０；ＷＯ９８／０１５３８；Ｈｓｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：５２〜５８を参照のこと）、なお他の改変が将来見出され得る。
【００２６】
（Ａ．樹状細胞前駆体の遺伝子改変）
１つの実施態様において、ＤＣ幹細胞は、ＴＲＴをコードするポリヌクレオチドを用いる形質導入のために単離され、そして樹状細胞への分化が誘導される。遺伝子改変されたＤＣは、ＴＲＴポリペプチドを発現し、そしてペプチドフラグメントを細胞表面に提示する。
【００２７】
（１）ＤＣ前駆細胞の単離
組換えＴＲＴをコードする核酸を用いるトランスフェクションに適切なＤＣ前駆細胞を単離する多くの方法が公知である。ヒト造血前駆細胞およびヒト造血幹細胞が、精製に使用され得るＣＤ３４表面膜抗原の存在によって特徴付けられる。例えば、１つの実施態様において、ヒト造血幹細胞が、骨髄吸引によって得られ、そしてこの骨髄単核細胞がＦｉｃｏｌ濃度勾配遠心分離およびプラスチックへの接着の手段によって他の成分から分離される。低密度の非接着細胞が得られ、そして標準的な方法（例えば、細胞と抗ＣＤ３４抗体とのインキュベーション、次に、固定化２次抗体との結合、および非結合成分の除去；例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）により、抗ＣＤ３４抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を使用してさらに選択される。あるいは、細胞は、末梢血の白血球搬出および抗ＣＤ３４クロマトグラフィーによって得られ得る（例えば、Ｒｅｅｖｅｓら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５６７２〜７７を参照のこと）。
【００２８】
（２）ＴＲＴポリペプチドを発現するための細胞の遺伝子改変
本発明の１つの実施態様において、ＤＣまたはＤＣ前駆細胞は、遺伝子改変され、ＴＲＴポリペプチドを発現する（例えば、ＴＲＴをコードするポリヌクレオチドを用いるエキソビボでの形質導入）。外来性のＴＲＴをコードするポリヌクレオチドは、下記に記載の方法を使用して、ＴＲＴ発現カセットとしてＤＣ中に組み込まれ得る。代表的には、このＤＣは、ＴＲＴポリペプチド（またはその１つ以上のフラグメント）をコードする領域を含有する発現カセットで形質転換される。その細胞中でのＴＲＴ発現カセットの発現の際に、そのＴＲＴポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ表面分子との複合体として、ＤＣの表面に発現される抗原性ペプチドへプロセスされる。代表的には、そのＴＲＴ発現カセットは、（ＴＲＴコード配列の発現の駆動のため）作動可能に連結したプロモーターを含有する。通常、ｔ−ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのような強力なプロモーター、または強力な構成性発現を有するｐｏｌ  ＩＩプロモーターを使用する。適切なプロモーターとしては、構成性のアデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン−誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成性ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン−誘導性ＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト前初期ＣＭＶプロモーター）、構成性ＣＭＶプロモーター、および当該分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組み合わせが挙げられる。代替的な実施態様において、ＴＲＴコード配列は、連結したプロモーターを用いずに、ＤＣ前駆細胞中に導入される。そのような場合、ＴＲＴ転写は、内在性プロモーターによって指向される（例えば、ＴＲＴコード配列の細胞染色体への組込み後）か、または別に導入されたプロモーターによって指向される（例えば、組換えによって連結する）。しばしば、ＴＲＴ発現カセットは、プラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクター中に含有され、これらはまた、他のエレメント（例えば、複製起点、レトロウイルスＬＴＲのような染色体組込みエレメント、および／または選択（例えば、薬剤耐性）配列）を含み得る。
【００２９】
１つの実施態様において、ＴＲＴタンパク質のほとんど全て（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％）がＴＲＴ発現カセットにおいて発現される（すなわち、コードされる）。しかし、ある場合には、より短いフラグメントが発現され得る。通常ＴＲＴコード配列は、少なくとも約８、よりしばしば１２、なおよりしばしば少なくとも３０または少なくとも５０の連続するＴＲＴアミノ酸残基をコードする。
【００３０】
いくつかの実施態様において、発現したＴＲＴポリペプチドは、天然に存在するＴＲＴの配列を有する。しかし、本発明は、天然に存在する配列に限定されないことが認識される。既に認められているように、天然に存在するＴＲＴタンパク質のフラグメントが使用され得る；さらに、発現されたＴＲＴポリペプチドは、少なくとも１つのＴＲＴペプチドエピトープがＤＣによって処理され得、そしてＭＨＣクラスＩまたはＩＩの表面分子上に提示され得る限り、天然に存在するＴＲＴポリペプチドと比較した場合に、欠失、挿入またはアミノ酸置換のような変異を含み得る。ときに、例えば、ＴＲＴペプチドの抗原性を増加させるか、またはＴＲＴペプチド発現レベルを増加させるために、［野生型」以外のＴＲＴ配列を使用することが所望され得る。いくつかの実施態様において、導入されたＴＲＴ配列は、ＴＲＴ改変体（例えば、多型性改変体（例えば、特定のヒト患者によって発現される改変体）または特定のガンに特徴的な改変体（例えば、特定の患者におけるガン）をコードする。
【００３１】
ＴＲＴ発現配列は、種々の標準的な方法のいずれかにおいてＤＣまたは幹細胞に導入（形質導入）され得、これには、トランスフェクション、組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルス（例えば、Ｒｅｅｖｅら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５６７２；Ｂｒｏｓｓａｒｔら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３２７０；Ｒｉｂａｓら、１９９７、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５７：２８６５；Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、１９９４、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｓｐｅｃｈｔら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１２１３−１２２１を参照のこと）、粒子媒介遺伝子移入技術（Ｔｕｔｉｎｇら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２７０２−２７０７）または幹細胞を形質転換させるための他の慣用方法が公知である（例えば、リン酸カルシウム沈降；例えば、Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、第１巻〜第３巻；およびＡｕｓｕｂｅｌら、編、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）。あるいは、ＴＲＴコードポリヌクレオチドは、パッケージング細胞株を用いてウイルス粒子へとパッケージングされ得る。この粒子は、ＤＣ幹細胞とともにインキュベートされる。
【００３２】
（３）前駆体細胞からＤＣへの分化
上記に記載のＴＲＴペプチドを発現する造血前駆体細胞を、慣用方法（例えば、サイトカイン（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、腫瘍壊死因子α  ｃ−ｋｉｔリガンド（これは、スチール（ｓｔｅｅｌ）因子またはマスト細胞因子とも呼ばれる））への曝露による）によってＤＣへと分化するように誘導した。インターロイキン４（ＩＬ−４）の単球培養物への添加は、樹状細胞へと発達するように細胞を駆動する際の補助をすることが報告されている。そして、ＴＮＦ−αは、未分化幹細胞と混合したときには、その幹細胞が樹状細胞へと発達する確率が上昇する（Ｓｚａｂｏｌｃｓら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５８５１−５８６１）。あるいは、カルシウムイオノフォアを使用して、単離した単球の樹状細胞への成熟を刺激する（米国特許第５，６４３，７８６号）。１つの実施態様において、ＤＣは、Ｂｅｒｎｈａｒｄら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１０９９−１０４に記載される方法に従って、（例えば、ガン患者の）血液由来のＣＤ３４＋造血前駆体細胞から得られる。ＤＣ成熟因子は、「未熟なＤＣ」に樹状細胞の特徴（例えば、樹状細胞マーカーｐ５５およびＣＤ８３；ＷＯ９７／２９１８２を参照のこと）を安定に発現させるために使用され得る。あるいは、未熟なＤＣは、Ｔ細胞を活性化するために使用され得る（Ｋｏｃｈら、１９９５、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：９３−１００）。
【００３３】
本発明に関連して使用される細胞のような細胞（幹細胞および樹状細胞を含む）の培養は、当該分野において周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９９４、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００３４】
（４）被験体（例えば、ヒト患者）へのＤＣの投与
本発明の形質転換されたＤＣは、被験体（例えば、ヒト患者）に導入され、そこで、そのＤＣは、免疫応答を誘発する。代表的には、免疫応答は、ＴＲＴ抗原性ペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体）を有する標的細胞に対するＣＴＬ応答を含む。これらの標的細胞は，代表的には、ガン細胞である。
【００３５】
本発明のＤＣが、患者に投与されるべき場合は、ＤＣは、好ましくは、その患者から単離されているか、または前駆体細胞に由来する（すなわち、そのＤＣは、自己患者へと投与される）。しかし、その細胞は、ＨＬＡ適合性同種異系の患者またはＨＬＡ不適合性同種異系の患者へと注入され得る。後者の場合、免疫抑制性薬物がそのレシピエントへと投与され得る。
【００３６】
この細胞は、任意の適切な様式において投与され、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水）とともに投与される。通常、投与は、静脈内であるが、関節内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路もまた受容可能である。投与（すなわち、免疫化）は、時間間隔をおいて反復され得る。ＤＣの注入は、ＤＣ数および活性を維持するに作用するサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２）の投与と組み合せられ得る。
【００３７】
本発明の状況において、患者に投与される用量は、Ｔ細胞増殖、Ｔリンパ球細胞傷害性を測定するアッセイによって検出されるような免疫応答を誘発する、そして／または患者に対して経時的に利益のある治療的応答をもたらす（例えば、ガン細胞の増殖の阻害、またはガン細胞数もしくは腫瘍の大きさの減少をもたらすこと）に充分であるべきである。代表的には、利用可能である場合、１０6〜１０9以上のＤＣが注入される。
【００３８】
（Ｂ．樹状細胞のペプチドパルシング）
本発明の関連する実施態様において、ＤＣが得られ（患者からか、または前駆体細胞のインビトロ分化によってかのいずれかで）、そしてＴＲＴ（例えば、ｈＴＲＴ）の配列を有する抗原性ペプチドを用いてパルスする。このパルシングは、その細胞の表面ＭＨＣ分子上へのＴＲＴペプチドの提示をもたらす。細胞表面上に提示されたＴＲＴペプチド／ＭＨＣ複合体は、ＴＲＴポリペプチドを発現する標的細胞（例えば、ガン細胞）に対するＭＨＣ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘発し得る。
【００３９】
（１）ＤＣの単離
ＤＣは、上記のように、ＤＣ前駆体細胞を単離すること、およびその前駆体のＤＣへの分化を誘発することをによって得られ得る。あるいは、ＤＣは、リンパ様組織および非リンパ様組織の両方から単離され得る。代表的には、ＤＣは、末梢血から精製され得る。ヒトＤＣの血液からの単離のための方法としては、アフェレーシス、続いて、密度勾配方法を包含する手順、陽性選択（例えば、ＤＣ表面マーカーに対して嗜好される抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー）、陰性選択、またはそれらの組合せが挙げられる（例えば、ＷＯ９７／２２３４９；ＷＯ９５／３４６３８；ＷＯ９８／０１５３８；ＷＯ９４／０２１５６を参照のこと）。
【００４０】
ＤＣは、正常なヒトまたは疾患に罹患している患者から単離され得る。いずれの場合でも、個体は、コロニー刺激因子を用いて処置されて、そのＤＣ数を単離前に増加させ得る。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、個体に、２５０μｇ／ｍ2／日で、数日間〜３週間までの間、静脈内注入され得る。その後、ＤＣ精製のための末梢血単核白血球（ＰＢＭＬ）を得る。この手順は抗原パルシングおよび続く注入のためのＤＣの収量を増加させ得る。
【００４１】
本発明の一つの実施態様において、「不死化」または「超寿命の樹状細胞」が使用されることが理解される。不死化ＤＣは、同時係属中の出願ＵＳＳＮ０８／９１２，９５１および０８／９７４，５４９の方法に従って調製され得る。別の実施態様において、エプスタイン−バーウイルス（ＷＯ９７／０４８０２を参照のこと）、オンコジーンを含むレトロウイルスベクター（例えば、ＷＯ９４／２８１１３を参照のこと）など（米国特許第５，６４８．２１９）を用いて形質転換されたＤＣが使用され得る。
【００４２】
（２）ＴＲＴペプチドを用いたＤＣのパルシング
ＤＣを、ＴＲＴ抗原にエキソビボで曝露する。そして、ＤＣに抗原を処理させて、その結果、ＴＲＴエピトープが、ＭＨＣクラスＩ（またはＭＨＣクラスＩＩ）複合体の状況において細胞の表面上に提示される。この手順を、「抗原パルシング」と称する。次いで、「パルスされたＤＣ」を用いて、Ｔリンパ球を活性化し得る。
【００４３】
ＤＣをパルスするために使用されるＴＲＴペプチド抗原は、少なくとも１つのＴＲＴタンパク質に由来する線状エピトープを含む。ＴＲＴタンパク質またはその実質的なフラグメントは、それらがＤＣによって取り込まれそして処理される場合に使用され得る。あるいは、短い「ペプチド」が、ＤＣに投与され得る。
【００４４】
ＴＲＴペプチドがパルシングのために使用される場合、通常少なくとも約６〜８のアミノ酸を、そして約３０アミノ酸未満、または約５０アミノ酸残基長未満を有する。１つの実施態様において、免疫原性ＴＲＴペプチドは、約８と約１２との間のアミノ酸を有する。ｈＴＲＴタンパク質フラグメントの混合物が使用され得る。あるいは、規定された配列の特定のペプチドが使用され得る。ＴＲＴペプチド抗原は、デノボペプチド合成、精製したｈＴＲＴまたは組換えｈＴＲＴの酵素消化、天然供給源からのテロメラーゼの精製（例えば、患者または患者からの腫瘍細胞）、またはｈＴＲＴフラグメントをコードする組換えポリヌクレオチドの発現によって生成され得る。
【００４５】
種々のクラスＩ  ＭＨＣ対立遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、特定数のアミノ酸によって分離されている第一、第二および／または第三の保存されたアミノ酸残基を有するペプチドを結合することが見出された。いくつかのヒトＨＬＡ−Ａ対立遺伝子についての結合モチーフは、ＷＯ９４／０３２０５において提供される。従って、本発明の一つの実施態様において、ＴＲＴフラグメントまたはペプチドは、クラスＩＭＨＣ結合モチーフを有する少なくとも１つの線状ＴＲＴエピトープ、および特に、ＨＬＡ−Ａ１結合モチーフ、ＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフ、ＨＬＡ−Ａ３．２結合モチーフ、ＨＬＡ−Ａ１１結合モチーフ、ＨＬＡ−Ａ２４．１結合モチーフまたはＨＬＡ−Ｂ７結合モチーフを含む。ＴＲＴの核酸およびタンパク質の配列（例えば、図１および図２において提供されるｈＴＲＴ配列）が提供されると、特定のＨＬＡ結合モチーフを含む種々の大きなまたは小さなポリペプチドもしくはペプチドを同定および生成することは、当業者の能力の範囲内である。所望の場合、ＴＲＴペプチドの混合物が使用され得、その結果か、広汎な種々のＨＬＡ結合モチーフが表される。
【００４６】
ＤＣをパルスするために用いられるＴＲＴ抗原の量は、そのペプチドまたはポリペプチドの性質、大きさおよび純度に依存する。代表的には、０．０５μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、最も頻繁には、約１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌのＴＲＴペプチドが使用される。ＴＲＴペプチド抗原を培養されるＤＣに添加した後、次いで、その細胞に、充分な時間、その抗原を取り込ませ、そして処理させ、クラスＩまたはクラスＩＩのいずれかのＭＨＣと会合する細胞表面上の抗原ペプチドを発現させる。代表的には、これは、約１８〜３０時間で起こり、そして最も頻繁には約２４時間で起こる。１つの例示的な実施態様において、富化されたＤＣがＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）において再懸濁され（１０6細胞／ｍｌ）、そしてｈＴＲＴペプチド抗原（５０μｇ／ｍｌ）とともに一晩、標準的な条件下で（例えば、３７℃加湿インキュベーター／５％ＣＯ2）で培養される。
【００４７】
（３）ＤＣの被験体への投与
パルスされたＤＣを、生理食塩水中で洗浄し、そして前出の第Ａ４節に記載のように被験体へと投与する。
【００４８】
（Ｃ：ＴＲＴ反応性Ｔリンパ球の投与）
抗原特異的なＴリンパ球は、エキソビボで、個体から未処置のＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔリンパ球）を収集すること、この細胞を本発明のＤＣ（例えば、ＴＲＴで形質転換したＤＣまたはＴＲＴでパルスしたＤＣ）と接触させ、その結果ＴＲＴ反応性Ｔリンパ球を増殖させることによって調製され得る。別の実施態様において、ＤＣを、ＴＲＴ抗原で、Ｔリンパ球との同時培養時にパルスする。次いで、拡大したＴＲＴ反応性のＴリンパ球集団を、その個体へと投与し得、またはインビトロアッセイについて使用し得る。患者に投与される場合、エキソビボで活性化したＴリンパ球は、ＴＲＴ抗原ペプチドを有する標的細胞（例えば、ガン細胞）に対して細胞傷害性である（例えば、ＷＯ９４／０２１５６を参照のこと）。
【００４９】
Ｔリンパ球を単離するためのいくつかの技術が、公知である。１つの方法において、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離が使用されて、赤血球からＰＢＭＣおよび好中球が、確立された手順に従って分離される。細胞を、２ｍＭグルタミン、１０μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１％ウシ胎仔血清を補充したＡＩＭ−Ｖ（ＧＩＢＣＯ）を用いて洗浄する。標準的な技術に従って、カラムまたは磁気ビーズに結合された適切なモノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２，抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、および抗ＣＤ８）を用いて、Ｔリンパ球についての富化を、陰性選択または陽性選択によって行う。あるいは、蛍光活性化細胞選別が用いられる。細胞のアリコートを、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ１４を含む細胞表面表現型について分析する。細胞を洗浄し、そして上記のように補充し、そして５％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ１ｍｌあたり５×１０5細胞の濃度で再懸濁する。次いで、このＴリンパ球を、パルスしたＤＣまたは遺伝子改変したＤＣを用いて、必要に応じて、低用量のＩＬ−４およびＩＬ−２の存在下で培養する。
【００５０】
次いで、活性化したＴリンパ球を、ＤＣについて上記したように、被験体に投与（例えば、注入）する。増大したＴリンパ球は、単独で、またはＩＬ−２および／またはＩＬ−４のようなリンホカインと組み合せて投与され得る。
【００５１】
（ＩＶ．インビトロアッセイ）
本発明は、商業的に価値のある（例えば、ＴＲＴ発現細胞を同定するための）アッセイを提供する。本発明のアッセイにおいて、樹状細胞は、ＴＲＴコード核酸を用いて形質転換されるか、またはＴＲＴペプチドを用いてパルスされる。ＤＣを用いて、単離されたＴリンパ球を活性化し、次いで、これを、ＴＲＴを発現することを通じて細胞の一つのクラスに対する細胞傷害性について試験する。細胞傷害性（例えば、「51Ｃｒ放出アッセイ」前出のような標準的なアッセイにおいて示されるような）は、その細胞がＴＲＴを発現することが、その細胞のＴリンパ球認識を媒介するに充分な量であることを示す。これは、ＴＲＴ発現細胞についてのアッセイを研究者に提供する。
【００５２】
ＣＴＬが、細胞（例えば、ＴＲＴを発現する細胞、例えばガン細胞）に対する細胞傷害性を有することを実証するために、標的抗原提示細胞およびエフェクターＣＴＬ細胞を培養物中で混合し、そして標的細胞溶解を観察する。細胞溶解を測定するための任意の適切な方法が当業者によって使用され得る。例えば、放射能放出アッセイを使用して、その標的細胞の溶解を測定し得る。例えば、その標的細胞を、放射性試薬（例えば、51Ｃｒ）を用いて標識する。この試薬は、生きている細胞によって取り込まれる。標識後、その標識細胞を洗浄し、そして特定のＣＴＬと混合する。上清を、適切な時間の後に採取し、そして計数して、放射能放出割合を決定する。細胞溶解の量を決定するための他の方法としては、トリパンブルー排除が挙げられる。この方法では、色素を排除する生きている細胞を計数し、そして同様の様式で処置された非提示細胞のコントロールサンプルと比較する。
【００５３】
本願において引用した全ての刊行物および特許文献は、それぞれ各々の刊行物または特許文献が、個々に記載されているのと同じ程度にまで全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、１１３２残基のｈＴＲＴタンパク質のアミノ酸配列（１文字記号）を示す。
【図２】図２は、図１に示すｈＴＲＴタンパク質をコードするｃＤＮＡの核酸配列を示す。
【図１】
2006020648.tif 000002
【図２】
2006020648.tif 000003