(57)【要約】【課題】  本発明は、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物、これを含む食品及び飼料、ならびにその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、ニンニクオリゴ糖を含有するニンニク処理物を有効成分とする、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニンニクオリゴ糖を含有するニンニク処理物を有効成分とする、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物。
【請求項２】
ニンニク処理物がニンニクオリゴ糖を固形成分に対して５質量％以上含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ニンニク処理物がニンニク抽出物である請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
ニンニク処理物がニンニクレクチンをさらに含む請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
ニンニク処理物がニンニクレクチンを固形成分に対して２質量％以上含む請求項４記載の組成物。
【請求項６】
ニンニクに水を加えて粉砕後、濾過して濾液を加熱し、冷却後、遠心分離して上澄みを塩析し、得られた沈殿を水又は緩衝液に溶かし、不溶物を除去することによって得られる、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物を含有する、腫瘍を治療及び／又は予防するための食品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物を含有する、腫瘍を治療及び／又は予防するための飼料。
【請求項９】
腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物の製造方法であって、ニンニクに水を加えて粉砕し濾過する工程、濾液を加熱する工程、冷却後、遠心分離して上澄みを塩析する工程、及び遠心分離し、得られた沈殿を水又は緩衝液に溶かし、不溶物を除去する工程を含む、該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニンニク処理物を含む腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物、その製造方法ならびに該組成物を含む食品及び飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍又は癌は、生活習慣病の中でも依然として死亡率が最も高く、特効薬がないため、その予防及び治療に関する研究は以前にも増して活発に行われている。現在、腫瘍患者に対して用いられている医薬品には、ナイトロジェンマスタードやシクロホスファミドのようなアルキル化剤、６−メルカプトプリンやアザチオプリンのようなプリン代謝拮抗物質、５−フルオロウラシルやシラビタンのようなピリミジン代謝拮抗物質、メトトレキサートやアミノプテリンのような葉酸代謝拮抗物質、マイトマイシンＣやブレオマイシンのような抗腫瘍性抗生物質などがあるが、いずれも核酸合成系を抑制することから、正常細胞に対して毒性を示し、造血障害などの副作用を引き起こす。また、抗腫瘍活性がある食品として、アガリクス茸やメシマコブのような免疫賦活作用を有する多糖類を多く含有する健康食品が市販されており、世間的にも腫瘍の予防及び治療に対する意識は高く、高い抗腫瘍活性を有する医薬品や健康食品の開発が望まれている。
【０００３】
一方、ニンニクは、古来より調味料や香辛料として利用されているが、近年、その中に種々の生理活性成分が含まれていることが明らかとなり、健康食品及び医薬品として広く使用されている。例えば、特許文献１では、ニンニクから分離精製したアリシンが、前立腺癌及び膀胱癌の治療又は予防に有効であることを報告している。しかし、ニンニク由来のオリゴ糖が抗腫瘍活性を有することについては知られていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−３０２５３１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物、これを含む食品及び飼料、ならびにその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ニンニク由来のオリゴ糖が抗腫瘍活性を有すること、ならびに該オリゴ糖をニンニク由来のレクチンと組み合わせることにより、相乗効果により優れた抗腫瘍活性を有することを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ニンニクオリゴ糖を含有するニンニク処理物を有効成分とする、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物。
（２）ニンニク処理物がニンニクオリゴ糖を固形成分に対して５質量％以上含む（１）記載の組成物。
（３）ニンニク処理物がニンニク抽出物である（１）又は（２）記載の組成物。
（４）ニンニク処理物がニンニクレクチンをさらに含む（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）ニンニク処理物がニンニクレクチンを固形成分に対して２質量％以上含む（４）記載の組成物。
（６）ニンニクに水を加えて粉砕後、濾過して濾液を加熱し、冷却後、遠心分離して上澄みを塩析し、得られた沈殿を水又は緩衝液に溶かし、不溶物を除去することによって得られる、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物を含有する、腫瘍を治療及び／又は予防するための食品。
（８）（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物を含有する、腫瘍を治療及び／又は予防するための飼料。
（９）腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物の製造方法であって、ニンニクに水を加えて粉砕し濾過する工程、濾液を加熱する工程、冷却後、遠心分離して上澄みを塩析する工程、及び遠心分離し、得られた沈殿を水又は緩衝液に溶かし、不溶物を除去する工程を含む、該方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物、これを含む食品及び飼料、ならびにその製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明においてニンニクとは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち、ユリ科(Liliaceae)、アリウム(Allium)属に属するアリウム・サチバム・リンネ(Allium sativum L.)を意味する。
【００１０】
本発明において、ニンニクオリゴ糖とは、ニンニクに由来するオリゴ糖を意味し、ニンニクに含まれるオリゴ糖、ニンニクから得られるオリゴ糖及びニンニクから抽出したオリゴ糖などを含む。本発明においてニンニクオリゴ糖は、その分子量が、通常１５００〜２０００、好ましくは１７００〜１９００、より好ましくは約１８００である。また、本発明においてニンニクオリゴ糖は、通常、単糖１０〜１２個、好ましくは１１個からなり、グルコース及びフルクトースから構成される。また、グルコース：フルクトースのモル比は、通常１：０．４〜１：１５、好ましくは１：８〜１：１２、好ましくは１：９〜１：１１である。さらに、本発明において、ニンニクオリゴ糖は、好ましくはその非還元末端がグルコースである。
【００１１】
本発明において、ニンニクレクチンとは、ニンニクに由来するレクチンを意味し、ニンニクに含まれるレクチン、ニンニクから得られるレクチン及びニンニクから抽出したレクチンなどを含む。本発明において、ニンニクレクチンは、その分子量が、通常２００００〜２５０００Ｄａ、好ましくは２１０００〜２４０００Ｄａ、より好ましくは約２３０００Ｄａである。また、本発明においてニンニクレクチンは、通常、１１０００〜１２０００Ｄａのサブユニットからなるダイマー構造をとっていると考えられる。本発明においてニンニクレクチンは、好ましくは表４に表されるアミノ酸構成を有する。また、Ｎ−末端付近のアミノ酸配列（１〜３６アミノ酸）は、通常、ＲＮＩＬＭＮＧＥＧＬＹＡＧＥＳＬＤＶＥＰＹＨＦＩＭＱＤＤＣＮＬＶＬＹＸＨ（配列番号１）である。
【００１２】
本発明において、ニンニク処理物とは、ニンニクから製造され、かつニンニクオリゴ糖を含むものであれば特に制限されない。本発明においてニンニク処理物には、乾燥ニンニク粉末、ニンニク抽出物、ニンニク抽出物の乾燥粉末等が含まれる。本発明において、ニンニク処理物は、ニンニクのうち、鱗茎部に由来するものが好ましい。
【００１３】
乾燥ニンニク粉末は、当技術分野において通常用いられる方法、例えば、天日乾燥、加温もしくは加熱室での乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥法などにより製造できる。
【００１４】
ニンニク抽出物を得るための処理方法は、当技術分野において通常用いられる方法を使用できる。ニンニクの抽出は、通常０〜７０℃、好ましくは５〜６０℃、より好ましくは１０〜５０℃の温度で、通常１分以上、好ましくは５分〜２４時間行う。短時間で行う場合には、加圧下で抽出を行ってもよい。抽出に用いる溶媒としては、水、３５％以下のアルコール、ｐＨ４．５〜１０またはＨ４．５〜７．５の緩衝液等を使用できる。水としては、蒸留水、精製水、イオン交換水、水道水等いずれも使用できる。生のニンニク１質量部に対して、溶媒を０．１〜１０質量部、好ましくは０．５〜５質量部、より好ましくは１質量部を使用する。抽出にあたっては、ニンニクを粉砕するのが必要であり、ニンニクの粉砕は加熱前に行うのが好ましい。
【００１５】
得られたニンニク抽出液はそのまま直接に使用することもでき、あるいは、さらに濃縮して流動エキス又は濃縮乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥もしくは凍結乾燥等の慣用の乾燥手段により粉末として使用してもよい。
【００１６】
また、本発明においてニンニク処理物は、以下の方法により調製したものが好ましい。ニンニクに水を加え、ミキサーなどにより粉砕する。このとき水は、好ましくはニンニクの質量と同量加える。これをガーゼ、濾紙や布等で濾過し、濾液を通常３０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃、より好ましくは８０〜１００℃にて、通常５分〜１０時間、好ましくは１０分〜１時間、より好ましくは２０〜４０分加熱する。これを冷却後、遠心分離にかけ上澄みを得る。遠心分離の条件は、通常３０００〜１５０００ｒｐｍで、５分〜１５分程度である。これを塩析し、通常０〜３０℃、好ましくは０〜１０℃で放置する。塩析は、例えば、硫酸アンモニウムを加えることにより実施できる。その後、再び同様の条件で遠心分離し、沈殿を得る。この沈殿を通常、水又はｐＨ４．５〜１０またはｐＨ４．５〜７．５の緩衝液に溶かし、不溶物を遠心分離によって除去する。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液等を使用できる。
【００１７】
好ましくは、得られた処理物をさらに、同緩衝液で平衡化したカラムにかけゲル濾過を行い、２８０ｎｍの吸光度を測定し、二番目のピーク部分を集める。
【００１８】
本発明において、ニンニク処理物は、ニンニクオリゴ糖を固形成分に対して、通常５質量％以上、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは２０〜９０質量％、さらにより好ましくは３０〜８０質量％、最も好ましくは５０〜７０質量％含む。本発明において、好ましくはニンニク処理物は、さらにニンニクレクチンを含む。ニンニクレクチンは、固形成分に対して、通常２質量％以上、好ましくは３〜４５質量％、より好ましくは１０〜４０質量％含まれる。
【００１９】
ニンニク処理物がニンニクレクチンを含む場合、ニンニクオリゴ糖とニンニクレクチンの比は、特に制限されないが、通常１０：１〜５：４、好ましくは５：１〜５：３である。
【００２０】
本発明においてニンニク処理物には、精製ニンニクオリゴ糖も包含される。精製ニンニクオリゴ糖の純度は、通常８０〜１００質量％、好ましくは９０〜１００質量％、より好ましくは９５〜１００質量％である。精製物を得るためには、沈殿法、クロマトグラフ法、ゲル濾過法等の当技術分野で通常用いられる方法を使用できる。
【００２１】
例えば、上記でゲル濾過を行って二番目のピーク部分を集めた処理物を濃縮し、リン酸緩衝液で平衡化したカラムに同緩衝液で食塩水の勾配をかけて溶出し、４９０ｎｍのピーク部分を集め、水に対して透析を行うことによって、精製ニンニクオリゴ糖を得ることができる。
【００２２】
ニンニク処理物における、固形成分に対するニンニクオリゴ糖及び／又はニンニクレクチンの濃度は、当技術分野において通常用いられる方法で測定することができ、例えば、クロマトグラフィー、ＴＯＦ−ＭＳ等を使用すればよい。
具体的には、以下のような手順により測定することができる。
【００２３】
クロマトグラフィーでは、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２（ＢＩＯ−ＲＡＤ）カラムを用い、蒸留水で溶出することにより測定する。ＴＯＦ−ＭＳでは、質量分析装置を用い、イオン化方法はＭａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎを使用しレーザー光の波長は３３７ｎｍ（窒素レーザー）を用いる。
【００２４】
本発明の腫瘍を予防及び／又は治療するための組成物は、上記のニンニク処理物を有効成分として含む。本発明の上記組成物は、腫瘍、特に悪性腫瘍の予防及び／又は治療の目的で使用できる。本発明の組成物は、造血器腫瘍、上皮細胞からなる腫瘍及び非上皮性細胞からなる肉腫の予防及び／又は治療に有効である。造血器腫瘍としては、白血病、悪性リンパ腫及び骨髄腫等が挙げられ、上皮細胞からなる腫瘍としては、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸腺腫癌、子宮癌、卵巣癌、咽頭癌、舌癌等が挙げられ、肉腫としては、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫等が挙げられる。本発明の組成物は、造血器腫瘍、特にリンパ腫、上皮細胞からなる腫瘍、特に胃癌及び結腸腺腫癌、の予防及び／又は治療に有効である。
【００２５】
本発明の組成物の有効成分であるニンニクは、通常食用に供されており、一般に低毒性である。従って、本発明の組成物は、安全性が高いと考えられる。さらに、原料であるニンニクは安価に入手可能であることから、抗腫瘍活性を有する組成物を安価に製造することが可能になる。
【００２６】
本発明の組成物は、常法により食品又は飼料としたり、薬学的に許容される担体とともに種々の剤型の医薬とすることができる。このうち経口用固形製剤を調製する場合は、本発明の組成物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ぶどう糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、カルメロースカルシウム、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００２７】
経口用液体製剤を調製する場合は、ニンニク処理物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００２８】
本発明の組成物の投与量及び投与方法は、年齢、体重、症状等により適宜決定することができるが、通常成人１日当たり、ニンニクオリゴ糖に換算して１０〜１００ｍｇを１回又は数回に分けて投与することが好ましい。
【実施例】
【００２９】
（実施例１）ニンニクオリゴ糖の調製
ニンニクに同質量の水を加え、ミキサーに２分間かけ、ガーゼで濾過し、濾液を恒温槽で９０℃、３０分間加熱した。これを冷却後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ上澄みを得た。これに８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、５℃で３０分間放置後、再び８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を得た。この沈殿を０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かし、不溶物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ除去した。これを同緩衝液で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５（ファルマシア製）カラムにかけゲル濾過を行った。各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を測定し、二番目のピーク部分を集め、アミコン限外濾過器で濃縮し、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー）に同緩衝液で０〜２．５Ｍ食塩水の濃度勾配をかけ溶出した。４９０ｎｍの吸光度は単一ピークであり、この部分を集め水に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。
【００３０】
（実施例２）凍結乾燥物の組成分析
得られた凍結乾燥物について、糖質含量、タンパク質含量及び水分含量を測定した。糖質含量は、グルコースを標準物質とし、フェノール・硫酸法によって測定した。タンパク質含量は、牛血清アルブミンを標準物質とし、Ｌｏｗｒｙ法によって測定した。水分含量は、常圧加熱乾燥法（１０５℃）によって測定した。
【００３１】
結果を以下の表1に示す。
【００３２】
【表１】
2006206572.tif 000002
【００３３】
表1の結果から、得られた凍結乾燥物中にはタンパク質はほとんど含まれず、糖質が主成分であることが明らかとなった。
【００３４】
（実施例３）糖質の純度と分子量の測定
実施例１で得られた凍結乾燥物に含まれる糖質の純度と分子量をゲル濾過法及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法により測定した。
【００３５】
（１）ゲル濾過法
Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２（ＢＩＯ−ＲＡＤ）カラム（２．０×６４．１ｃｍ）を用い、蒸留水で溶出することにより純度を測定した。また、分子量は標準物質として、Ｄ−グルコース（分子量１８０）、スクロース（分子量３４２）、ラフィノール（分子量５０５）、スタキオース（分子量６４９）とマルトヘプタオース（分子量１０９０）を用いて行った。
【００３６】
（２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法
蒸留水とエタノールを１：４で混合したマトリックス溶媒に２，５−ジヒドロキシベンゾイック酸を溶解して、１０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製した。次に、試料とマトリックス溶液を１：１で混合し、ターゲット上に１．５μｌ滴下して風乾した。
質量分析装置はＢＩＦＬＥＸ III（ＢＲＵＫＥＲ）を用い、イオン化方法はＭａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎを使用しレーザー光の波長は３３７ｎｍ（窒素レーザー）を用いた。
【００３７】
（３）結果
Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２カラムクロマトグラフィーの結果では、４９０ｎｍのピークは単一ピークを示し、この糖質が純粋であることを示した。また、この糖質の分子量は約１８００であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果も、糖質の分子量が約１８００であることを示した。
【００３８】
以上から、実施例１で得られた凍結乾燥物に含まれる糖質は、分子量約１８００のオリゴ糖であることが明らかとなった。
【００３９】
（実施例４）オリゴ糖の構成単糖の分析
オリゴ糖の構成単位の分析をポストラベル蛍光検出法を用いるＨＰＬＣによって分析した。加水分解は２Ｍトリフルオロ酢酸を用い、１００℃で６時間加熱する方法と、フルクトース解析用には、０．１Ｍ ＨＣｌを用い、６０℃で３０分間加熱する方法を用いた。
【００４０】
ＨＰＬＣのカラムは、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ（東ソー）４．６ｍｍ×１５ｃｍを用い、０．５Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．７）を用いた。
【００４１】
その結果、実施例１で得られたオリゴ糖は、グルコースとフルクトースより成ることがわかり、そのモル比は１．５：１であった。以上から、このオリゴ糖は六単糖１１個から構成され、グルコース７個及びフルクトース４個、又はグルコース６個及びフルクトース５個より構成されることが示された。
【００４２】
（実施例５）オリゴ糖のメチル化分析
オリゴ糖の完全メチル化は、箱守法によって行い、精製したメチル化オリゴ糖を加水分解して各単糖に分解した後、還元アセチル化し、部分メチル化糖アルコールのアセチル誘導体（部分メチル化アルジトールアセテート）の形にして、ＧＣとＧＣ／ＭＳ測定を行った。
【００４３】
なお、フルクトースが含まれていたので、加水分解は弱い条件、すなわち０．０２Ｍ ＨＣｌを用い、６０℃で３０分間行った。メチル化糖の還元はＮａＢＤ４を用いて行った。
【００４４】
ＧＣ測定は、装置としてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＨＰ５８９０Ａを用い、カラムはＳＰＢ−５（スペルコジャパン）０．２５ｍｍ×２５ｍを使用した。
【００４５】
ＧＣ／ＭＳの測定はＪＭＳ ＤＸ−３０３質量分析計、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄガスクロマトグラフを用いた。
【００４６】
結果を以下の表２に示す。
【００４７】
【表２】
2006206572.tif 000003
【００４８】
このオリゴ糖の非還元末端はフルクトースであり、１→６結合のフルクトース、１→１結合のフルクトース又は１→２結合のグルコース、１→６結合のグルコース、１→２、１→６結合のグルコースなど種々の結合様式で連結していることが示された。
【００４９】
（実施例６）ニンニクレクチンの調製
ニンニクに同質量の水を加え、ミキサーに２分間かけ、ガーゼで濾過し、濾液を恒温槽で９０℃、３０分間加熱した。これを冷却後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ上澄みを得た。これに８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、５℃で３０分間放置後再び８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を得た。この沈殿を０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶かし、不溶物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ除去した。これを同緩衝液で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５（ファルマシア製）カラムにかけゲル濾過を行った。各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を測定し、二番目のピーク部分を集め、アミコン限外濾過器で濃縮し、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー）に同緩衝液で０〜２．５Ｍ食塩水の濃度勾配をかけ溶出した。２８０ｎｍの吸光度のピーク部分を集め、水に対して透析を行った後、凍結乾燥を行った。
【００５０】
（実施例７）凍結乾燥物の組成分析
実施例６で得られた凍結乾燥物について、実施例２と同様の方法により、糖質含量及びタンパク質含量を測定した。結果を以下の表３に示す。
【００５１】
【表３】
2006206572.tif 000004
【００５２】
ここで得られた糖質は、共有結合によりタンパク質に結合していると考えられる。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、シングルバンドを示した。
【００５３】
（実施例８）分子量測定及びアミノ酸分析
実施例６で得られた精製物（タンパク質）について、分子量測定及びアミノ酸分析を行った。分子量の測定は、０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−７５カラム（２．０×４９ｃｍ）を用いたゲル濾過法によって行った。ゲル濾過において、得られたタンパク質の分子量は、２３０００Ｄａであった。
【００５４】
アミノ酸分析は、日立８３５型のアミノ酸分析機を用いて行った。結果を以下の表４に示す。
【００５５】
【表４】
2006206572.tif 000005
【００５６】
また、タンパク質の一次構造を、アプライドバイオシステム４７７Ａタンパク質シークエンサーを用いて測定した。その結果、Ｎ−末端付近のアミノ酸配列（１〜３６アミノ酸）、ＲＮＩＬＭＮＧＥＧＬＹＡＧＥＳＬＤＶＥＰＹＨＦＩＭＱＤＤＣＮＬＶＬＹＸＨ（配列番号１）が得られた。
【００５７】
（実施例９）リンパ腫細胞に対する抗腫瘍活性の試験
腫瘍細胞として、ヒトのリンパ腫細胞（Ｕ９３７）を使用し、実施例１で得られたニンニクオリゴ糖及び実施例６で得られたニンニクレクチンの抗腫瘍活性について試験した。
【００５８】
Ｕ９３７細胞の培養方法及びマイクロプレートへの播種の仕方は以下のとおりである（参考文献：Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ３４（２００１）７−１３）。
(１)培養液ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）に１０％の牛胎児の血清ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）と抗生物質ゲンダマイシン５０μｇ／ｍｌを加えたものを細胞培養液とした。
(２)細胞数を１０５細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（１０４個）を９６穴マイクロプレートの１つずつのウェルに加えた。
(３)５〜６時間経過した後、ニンニクオリゴ糖（実施例１で得られた凍結乾燥物）、レクチン（実施例６で得られた凍結乾燥物）、又はニンニクオリゴ糖とニンニクレクチンの混合物をそれぞれ記載の濃度で溶かした上記の細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。なお、表７において、（レクチン＋オリゴ糖）１０ｍｇ／ｍｌとあるのは、実施例１において、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−７５（ファルマシア製）カラムにかけゲル濾過を行い、各フラクションの２８０ｎｍの吸光度を測定し、二番目のピーク部分を集めた後、透析し、凍結乾燥して得られる、ニンニクレクチン及びニンニクオリゴ糖を含むニンニク処理物Ａである。表９においても同義である。なお、このニンニク処理物Ａにおいて、ニンニクレクチン及びニンニクオリゴ糖の構成比は、質量比で、ニンニクレクチン：ニンニクオリゴ糖＝１：２である。
(４)３７℃のＣＯ２インキュベーターの中で細胞を培養し、適当な時間経過とともに細胞数を顕微鏡下で数えた。
【００５９】
結果を以下の表５〜７に示す。
【００６０】
【表５】
2006206572.tif 000006
【００６１】
【表６】
2006206572.tif 000007
【００６２】
【表７】
2006206572.tif 000008
【００６３】
以上の結果から、ニンニクオリゴ糖がリンパ腫細胞に対して抗腫瘍活性を有すること、ならびにニンニクオリゴ糖とニンニクレクチンとの相乗効果により、優れた抗腫瘍活性が得られることが明らかとなった。
【００６４】
（実施例１０）結腸腺腫癌細胞に対する抗腫瘍活性の試験
腫瘍細胞として、ＷｉＤｒ細胞（ヒト結腸腺腫癌細胞）を使用し、実施例１で得られたニンニクオリゴ糖及び実施例６で得られたニンニクレクチンの抗腫瘍活性、ならびに抗癌剤として知られるクレスチンについて抗腫瘍活性を試験した。ＷｉＤｒ細胞は、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団  ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手した。
【００６５】
（１）培養液（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ナカライテスク株式会社製）に１０％のＦＢＳと抗生物質ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ株式会社製）５０μｇ／ｍｌを加えたものを細胞培養液とした。細胞数を２×１０４細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（２×１０３個）を９６穴マイクロプレートの一つずつのウェルに加えた。
（２）一夜経過した後、レクチン、又はオリゴ糖などの試薬を溶かした上記細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。
（３）３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で細胞を培養した。
（４）２４時間毎に、細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（株式会社同人化学研究所製）で測定した。すなわち、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を各ウェルに１０μｌずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った。マイクロリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
結果を以下の表８〜１２に示す。
【００６７】
【表８】
2006206572.tif 000009
【００６８】
【表９】
2006206572.tif 000010
【００６９】
【表１０】
2006206572.tif 000011
【００７０】
【表１１】
2006206572.tif 000012
【００７１】
【表１２】
2006206572.tif 000013
【００７２】
以上の結果から、ニンニクオリゴ糖が結腸腺腫細胞に対して抗腫瘍活性を有すること、ならびにニンニクオリゴ糖とニンニクレクチンとの相乗効果により、優れた抗腫瘍活性が得られることが明らかとなった。
【００７３】
（実施例１１）胃癌細胞に対する抗腫瘍活性の試験
腫瘍細胞として、）ＫＡＴＯIII細胞（ヒト胃癌細胞）を使用し、実施例１で得られたニンニクオリゴ糖及び実施例６で得られたニンニクレクチンの抗腫瘍活性について抗腫瘍活性を試験した。ＫＡＴＯIII細胞は、財団法人ヒューマンサイエンス振興財団  ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手した。
【００７４】
（１）培養液（ＲＰＭＩ１６４０  ｍｅｄｉｕｍとＥａｇｌｅ  ＭＥＭを１：１に混合）に１０％のＦＢＳと抗生物質ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ株式会社製）５０μｇ／ｍｌを加えたものを細胞培養液とした。
（２）細胞数を２×１０４細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（２×１０３個）を９６穴マイクロプレートの一つずつのウェルに加えた。
（３）一夜経過した後、レクチン、又はオリゴ糖などの試薬を溶かした上記細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。
（４）３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で細胞を培養した。
（５）２４時間毎に、細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（株式会社同人化学研究所製）で測定した。すなわち、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を各ウェルに１０μｌずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った。マイクロリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７５】
結果を以下の表１３及び１４に示す。
【００７６】
【表１３】
2006206572.tif 000014
【００７７】
【表１４】
2006206572.tif 000015
【００７８】
以上の結果から、ニンニクオリゴ糖が胃癌細胞に対して抗腫瘍活性を有すること、ならびにニンニクオリゴ糖とニンニクレクチンとの相乗効果により、優れた抗腫瘍活性が得られることが明らかとなった。
【００７９】
（実施例１２）ニンニク処理物Ｂの調製
ニンニク２１０ｇと蒸留水２１０ｍｌをミキサーにかけたあと、ガーゼで濾過した。濾液を９０℃で３０分間、加熱処理した。冷却して遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）した。上澄み液に、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、溶解後、５℃で１５分間以上、冷却した。遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）し、沈殿物を蒸留水１００ｍｌに溶かし、再び遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた上澄み液を水に対して透析を行い、脱塩後、凍結乾燥し、ニンニク処理物Ｂを得た。得られた凍結乾燥物について、組成を分析したところ、ニンニクオリゴ糖が４７質量％、ニンニクレクチンが２３質量％含まれていた。
【００８０】
（実施例１３）ニンニク処理物/癌細胞懸濁液のマウスへの移植
１３−１．癌細胞培養
癌細胞としてｃｏｌｏｎ−２６癌細胞を用いた。マウス由来ｃｏｌｏｎ−２６癌細胞は金沢大学がん研究所よりご提供いただいた。この癌細胞について以下の表に示す。
【００８１】
【表１５】
2006206572.tif 000016
【００８２】
（１）培地の調製
ＲＰＭＩ １６４０培地の粉末を測り、超純水にとかし、ろ過滅菌した。１０％ＮａＨＣＯ３溶液を１００ｍｌ調製し、オートクレーブにて滅菌した。ＲＰＭＩ １６４０培地に、ＮａＨＣＯ３溶液を２ｍｇ／ｍｌになるように、ペニシリン・ストレプトマイシン液を１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌになるように、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、牛胎児血清）を１０％になるようにそれぞれを添加し、培地を調製した。具体的には、ＲＰＭＩ １６４０  ８６ｍｌ、１０％ＮａＨＣＯ３２ｍｌ、およびペニシリン・ストレプトマイシン液２ｍｌを混合し、色の変化を確認後、ＦＢＳ１０ｍｌを添加した。
【００８３】
（２）細胞培養
上記培地およびＨａｎｋｓ溶液を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で温め、凍結しているｃｏｌｏｎ−２６癌細胞を３７℃の恒温槽で温めた。まだ少し凍っている状態でＨａｎｋｓ溶液の入ったファルコンチューブへ移した。ピペッティングおよび遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清をパスツールで吸引除去した。Ｈａｎｋｓ溶液を１ｍｌ加え、ピペッティングを行った。細胞懸濁液３０μｌおよびトリパンブルー３０μｌをエッペンチューブに採取した。ヘモサイトメーターおよび顕微鏡を用いて細胞数をカウントし、３×１０５細胞／ディッシュで１００ｍｍディッシュに播種した。１０ｍｌ／ディッシュで培地を加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで細胞を培養した。
【００８４】
（３）細胞継代
細胞がサブコンフルエントまで増殖しているか顕微鏡にて確認し、増殖していたならば以下の操作により細胞の継代を行った。ディッシュからパスツールピペットを用いて培地を除去し、Ｈａｎｋｓ溶液を５ｍｌ加えて洗浄後、パスツールピペットで除去した。トリプシン・ＥＤＴＡ液を３ｍｌ加え、３７℃のインキュベーター内で約４分間放置した。ディッシュの底を指ではじき、顕微鏡ではがれているかを確認した。はがれていたら、直ちに７ｍｌの培地を加えてトリプシン作用をとめ、撹拌後にメスピペットでファルコンチューブに採取した。ディッシュをＨａｎｋｓ溶液２ｍｌで洗浄し、これもメスピペットで採取した。続いて上記細胞培養手順における遠心分離以降の操作を行った。
【００８５】
１３−２．ニンニク処理物/癌細胞懸濁液の調製
以下の表に示す要領でニンニク処理物と癌細胞とをマウスに移植すべく、ニンニク処理物/癌細胞懸濁液を調製した。ニンニク処理物としては、実施例１２で調製したニンニク処理物Ｂを用いた。
【００８６】
【表１６】
2006206572.tif 000017
【００８７】
（１）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ、リン酸緩衝化生理食塩水）を用いて、各々の目的のニンニク処理物Ｂ濃度の倍の濃度になるようにニンニク処理物溶液を１ｍｌずつ調製した。
（２）培養したｃｏｌｏｎ−２６癌細胞をトリプシン処理後、ファルコンチューブに移し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。
（３）上清を取り除いた後、培地を加え、ピペッティングし、トリパンブルーとヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。
（４）カウント後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を取り除き、細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌになるようにＰＢＳで細胞懸濁液を作製した。
（５）（１）で作製したニンニク処理物Ｂ溶液、（４）で作製した細胞懸濁液を１：１の割合で（１ｍｌずつ）合計２ｍｌになるように混合した。
【００８８】
１３−３．マウスへのニンニク処理物/癌細胞懸濁液の移植
移植には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オス）を用いた。
移植前に、マウスの体重を計測した。ニンニク処理物Ｂを各濃度で含むニンニク処理物／細胞懸濁液を上記のように調製後、１０分間静置した。７匹のマウスからなるマウス群５群に対し、ニンニク処理物Ｂを各濃度で含むニンニク処理物／細胞懸濁液を右側腹部の皮下に０．２ｍｌ（１×１０６細胞）ずつ移植した（この日を０日目とした）。
【００８９】
腫瘍が顕著に見られるようになった７日後に体重およびノギスを用いた腫瘍の面積[ｍｍ２］（＝腫瘍の最長直径×腫瘍の最短直径）の計測を開始した。その後、４日毎に移植して１９日目まで同様に計測を行った。１５日目、１９日目には腫瘍の高さの計測も行うことで腫瘍体積も求めた（腫瘍体積［ｍｍ３］＝（腫瘍の最長直径）×（腫瘍の最短直径）×（腫瘍の高さ））。
【００９０】
統計分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いてｔ検定を行った。結果を以下の表１７および図１に示す。
【００９１】
【表１７】
2006206572.tif 000018
【００９２】
以上の結果から、本発明のニンニクオリゴ糖を含むニンニク処理物が、癌に対して、in vivoにおいて抗癌活性を有することが実証された。
【００９３】
（実施例１４）癌細胞移植マウスへのニンニク処理物の経口投与
１４−１．癌細胞懸濁液の調製
実施例１３で培養したｃｏｌｏｎ−２６癌細胞をトリプシン処理した後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。上清を取り除いた後、培地を加え、ピペッティングし、トリパンブルー、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントした。カウント後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）し、細胞濃度が５×１０６細胞／ｍｌになるようにＰＢＳで細胞懸濁液を作製した。
【００９４】
１４−２．癌細胞懸濁液の移植およびニンニク処理物の投与
マウスとしては、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オス）を用いた。癌細胞懸濁液の移植およびニンニク処理物の投与の前に、マウスの体重を計測した。８匹のマウスからなるマウス群４群に対し、上記癌細胞懸濁液を右側腹部の皮下に０．２ｍｌ（１×１０６細胞）ずつ移植した（この日を０日目とした）。
【００９５】
ニンニク処理物Ｂをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で含むニンニク処理物Ｂ溶液をＰＢＳを用いて調製し、各マウス群のマウスに、２日毎に０．５ｍｌずつ投与した。コントロール群にはＰＢＳを投与した。腫瘍が顕著に見られるようになった１０日後から体重、ノギスを用いた腫瘍の面積[ｍｍ２］（＝腫瘍の最長直径×腫瘍の最短直径）の計測を開始し、その後、３日毎に癌細胞を移植して２８日目まで同様に計測を行った。１６日目、２２日目には腫瘍の高さの計測も行うことで腫瘍体積も求めた（腫瘍体積［ｍｍ３］＝（腫瘍の最長直径）×（腫瘍の最短直径）×（腫瘍の高さ））。
【００９６】
統計分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いてｔ検定を行った。結果を以下の表１８および図２に示す。
【００９７】
【表１８】
2006206572.tif 000019
【００９８】
以上の結果から、本発明のニンニクオリゴ糖を含むニンニク処理物を経口摂取することにより、in vivoにおいて癌抑制効果が得られることが実証された。
【００９９】
（実施例１５）ニンニク処理物のｃｏｌｏｎ−２６癌細胞に対する抗癌活性試験
（１）培養液（ＲＰＭＩ１６４０： ナカライテスク株式会社製）に１０％のＦＢＳを加えたものを細胞培養液とした。単層培養（付着）細胞なので、０．２５％トリプシン＋１ｍＭのＥＤＴＡでフラスコより細胞をはがして、細胞数を１×１０５細胞／ｍｌに希釈し、０．１ｍｌ（１×１０４個）を９６穴マイクロプレートの一つずつのウェルに加えた。
（２）一夜経過した後、実施例１２で調製したニンニク処理物Ｂを各種濃度で溶かした上記細胞培養液の０．１ｍｌを各ウェルに加えた。
（３）３７℃の炭酸ガスインキュベーターの中で細胞を培養した。
（４）２４時間毎に、細胞数をｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（株式会社同人化学研究所製）で測定した。すなわち、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８を各ウェルに１０μｌずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１〜４時間呈色反応を行った。マイクロリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度に基づき細胞数を測定した。結果を以下の表１９に示す。
【０１００】
【表１９】
2006206572.tif 000020
【０１０１】
以上から、本発明のニンニクオリゴ糖を含むニンニク処理物がｃｏｌｏｎ−２６癌細胞に対して、in vitroでも抗癌活性を示すことが確認された。また、in vitroにおける抗癌活性が、in vivoにおける抗癌活性と相関関係を有することが実証された。
【０１０２】
（実施例１６）ＮＭＲによるニンニクオリゴ糖の分析
ニンニクオリゴ糖について、各種二次元NMR（ＤＥＰＴ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＲＯＥＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ）を測定した。さらにイヌリンについて１Ｈ ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを測定し、解析を行った。
【０１０３】
その結果、ニンニクオリゴ糖の主成分は、非還元末端にグルコースを有する以下のβ−２，１−フルクタンと推定された。
【０１０４】
【化１】
2006206572.tif 000021
【０１０５】
従って、グルコースとフルクトースの比は１：１０と推定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ニンニク処理物を各種濃度で含むニンニク処理物/癌細胞懸濁液をマウスに移植したときの、腫瘍面積の変化を示す。
【図２】癌細胞を移植したマウスにニンニク処理物を各種濃度で含むニンニク処理物溶液を経口摂取させたときの、腫瘍面積の変化を示す。
【図１】
2006206572.tif 000022
【図２】
2006206572.tif 000023
【配列表】
2006206572000001.app