(57)【要約】【課題】  アミン基により改質された基板の上にエポキシ化合物をリンカとしてＰＮＡプローブを結合するジップコード方式を用いたＰＮＡジップコードチップの製作方法を提供する。【解決手段】  （ａ）アミン基により改質された基板の上にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＰＮＡジップコードプローブ及びエポキシ化合物を含む固定化試料を滴下してＰＮＡジップコードプローブを固定する段階と、（ｂ）前記ＰＮＡジップコードプローブが固定された基板をＳＤＳ溶液により洗浄した後に乾燥する段階と、を含むジップコード方式を用いたＰＮＡチップの製作方法を提供する。  【選択図】  図１
2006153839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含むジップコード方式を用いたＰＮＡチップの製作方法：
（ａ）アミン基により改質された基板の上にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＰＮＡジップコードプローブ及びエポキシ化合物を含む固定化試料を滴下してＰＮＡジップコードプローブを固定する段階；及び
（ｂ）前記ＰＮＡジップコードプローブが固定された基板をＳＤＳ溶液により洗浄した後乾燥させる段階。
【請求項２】
請求項１において、前記（ａ）段階におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＰＮＡジップコードプローブ及びエポキシ化合物の体積比が、１：１：１であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２において、前記エポキシ化合物は、下記式１で表される化合物であることを特徴とする方法。
【化１】
2006153839.tif 000008
【請求項４】
請求項２において、ＰＮＡジップコードプローブの濃度は１０μＭ〜１ｍＭであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１において、ＰＮＡジップコードプローブは複数であり、前記複数のＰＮＡジップコードプローブは互いに３０％以下の相同性を有する塩基配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５において、ＰＮＡジップコードプローブは配列番号１乃至配列番号１０の塩基配列のうち何れか１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５において、ＰＮＡジップコードプローブは配列番号１乃至配列番号１０及び配列番号１６乃至配列番号４５の塩基配列のうち何れか１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至請求項７のうち何れか一つの方法により製造され、エポキシ化合物をリンカ（ｌｉｎｋｅｒ）としてＰＮＡジップコードプローブが結合されていることを特徴とするＰＮＡジップコードチップ。
【請求項９】
請求項８のＰＮＡジップコードチップに目的ＤＮＡを混成化させることを特徴とする目的ＤＮＡの検出方法。
【請求項１０】
請求項９において、前記検出は蛍光信号を用いて行われることを特徴とする方法。
【請求項１１】
次の段階を含むことを特徴とする多重塩基変異の分析方法：
（ａ）対象遺伝子の塩基変異の部分を選定する段階；
（ｂ）ＳＢＥプライマーをデザインする段階；
（ｃ）前記（ａ）段階における対象遺伝子をＰＣＲにより増幅する段階；
（ｄ）前記増幅された対象遺伝子を（ｂ）段階により得られたＳＢＥプライマー及び蛍光物質により標識されたｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＧＴＰを用いてＳＢＥ反応を行う段階；
（ｅ）前記ＳＢＥ反応物を請求項８のＰＮＡジップコードチップに混成化させる段階；及び
（ｆ）蛍光物質を用いて信号を確認する段階。
【請求項１２】
請求項１１において、ＳＢＥプライマーは５’末端部位に請求項８のＰＮＡジップコードチップに固定されているＰＮＡジップコードと相補的な配列を含み、３’末端部位に対象遺伝子と相補的な配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１において、ＳＢＥプライマーは複数であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１において、前記対象遺伝子は糖尿病と関わる遺伝子ＨＮＦ１−ａであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
次の段階を含むことを特徴とする多重塩基変異の分析方法：
（ａ）対象遺伝子の塩基変異の部分を選定する段階；
（ｂ）ＳＢＥプライマーをデザインする段階；
（ｃ）前記（ａ）段階における対象遺伝子をＰＣＲにより増幅する段階；
（ｄ）前記増幅された対象遺伝子を（ｂ）段階により得られたＳＢＥプライマー及び特定の化合物により標識されたｄｄＮＴＰを用い、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＧＴＰを入れた４本のチューブにおいてそれぞれ別々にＳＢＥ反応を行う段階；
（ｅ）前記ＳＢＥ反応物を請求項８のＰＮＡジップコードチップに混成化させる段階；及び
（ｆ）前記化合物標識を用いて信号を確認する段階。
【請求項１６】
請求項１５において、ＳＢＥプライマーは５’末端部位に請求項８のＰＮＡジップコードチップに固定されているＰＮＡジップコードと相補的な配列を含み、３’末端部位に対象遺伝子と相補的な配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５において、ＳＢＥプライマーは複数であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５において、前記特定の化合物はビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）であり、前記信号を確認する段階は、ビオチンとの親和力が高いタンパク質であるストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）が結合されているフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｉｎ）で染色することにより行われることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項８のＰＮＡジップコードチップを用いることを特徴とするＳＮＰｓの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジップコード方式を用いたペプチド核酸（以下、「ＰＮＡ」と称する）ジップコードチップ及びその製作方法に係り、より詳細には、ジップコードを有するＰＮＡジップコードプローブを、エポキシ化合物をリンカ（ｌｉｎｋｅｒ）として高密度にて固定することを特徴とするＰＮＡジップコードチップ及びその製作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトをはじめとする各種の生物ゲノムプロジェクトの結果、数多くの遺伝情報が放出されるに伴い、かかる遺伝情報を解析し、且つ、その相関関係を分析する研究が盛んに行われつつある。さらに、分子生物学分野と遺伝工学分野の研究方向は、ＤＮＡの構造的な解析から遺伝子の機能的な解析と相互関連性を究める方向へと切り換わりつつある。このような傾向とあいまって各種の遺伝情報の分析方法が開発されてきており、特に、ＤＮＡチップは、ゲノムプロジェクトの結果として得られた膨大な量の遺伝情報に基づいて試料を一層効率よく分析できる方法として注目されている。これは、ＤＮＡチップが膨大な量の遺伝情報を短時間に分析することができ、自動化し易いことに起因する。
【０００３】
ＤＮＡチップは、シリコン、表面改質ガラス、ポリプロピレン、活性化ポリアクリルアミドなどの固体の表面に８〜２５塩基のオリゴヌクレオチドを少なくとも１，０００個、多くは１，０００，０００個まで配列して付着したものである。チップに固定するＤＮＡは、目的遺伝子のＤＮＡ塩基配列から決められる。この種のＤＮＡチップは、組み換え遺伝子技術とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に匹敵するほどに様々な応用分野を有し、しかも、既存の技術よりも優れている。さらに、ＤＮＡチップは、その利用方法によってその適用対象が極めて広いため、応用分野もまた非常に多岐に亘っている。この理由から、ＤＮＡチップを用いることにより、極微量の試料であっても分析が可能であるだけではなく、目的ＤＮＡの塩基配列を多数の個所にて同時に究めることが可能になった。
【０００４】
ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ分析システムは、ＤＮＡの分析速度を数十〜数百倍ほど速め、その結果、現在進行中の、多数の有機体ゲノムプロジェクトの完成時期を大幅に早めるだけでなく、現在の１塩基当たりの分析コストを格段に下げられると期待される。これらの理由から、ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ分析システムは、遺伝病の診断、突然変異の探索、ガンの診断、病原菌の検出、遺伝子の発現分析、新薬開発など幅広い分野に応用されている。
【０００５】
ジップコードを用いたＤＮＡチップ（非特許文献１、非特許文献２参照）は、互いに相同性のない一定長さの塩基配列を有するプローブを固体基板上に固定し、チップの上に混成化させたい目的ＤＮＡの５'末端にはチップに固定されたプローブと相補的な塩基配列を持たせ、且つ、３'末端には診断したい遺伝子と相補的な塩基配列を持たせて製作し、別途のプローブを製作することなく、目的ＤＮＡの塩基配列の部分だけを遺伝子に合わせて製作し直すことにより、同じチップの上で診断結果を見ることができ、チップの製作が手軽に行えるというメリットがある。
【０００６】
ＰＮＡはＤＮＡの類似体であって、ペプチド結合を骨格とし、ＤＮＡのように４種類の塩基を含んでおり、ＤＮＡとは異なって骨格に負電荷を帯びない（非特許文献３参照）。図１には、糖−リン酸骨格を有するＤＮＡとペプチド結合骨格を有するＰＮＡの構造が示してある。ＰＮＡは、ＤＮＡに比べて核酸分解酵素や各種の化学物質に安定的な性質を有し、かつ、広範にわたる温度及びｐＨにおいてもＤＮＡよりも安定した性質を示す。ＰＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡに強く結合する性質を有しており、ＤＮＡよりも高い特異性と選択性を有していることから（非特許文献４参照）、抗原抗体反応、混成化技術、薬物伝達などへの各種の応用が可能である（非特許文献５参照）。
【０００７】
今までのＤＮＡチップは、どの塩基変異やＳＮＰｓを診断するかによってチップに固定するプローブの塩基配列を対象ＤＮＡに合わせて製作する必要があり、煩雑であった。つまり、どの対象ＤＮＡを診断するかによってＤＮＡチップを構成するプローブを製作し直す必要性が生じるために、煩雑であるだけではなく、製作コストが増す原因となっていた。
【０００８】
そこで、本発明者らは、上記のごとき不都合を解決するために鋭意努力を続けてきた結果、ＤＮＡよりも優れた物性を有するＰＮＡを用いてジップコード方式によりＰＮＡチップを製作し、このＰＮＡチップを用いることにより、多重塩基の分析、塩基変異の分析及びＳＮＰｓの分析が的確でかつ高い感度にて行えることを知見し、本発明を完成するに至った。
【非特許文献１】Ｇｅｒｒｙ，  Ｎ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２９２：２５１，１９９９
【非特許文献２】Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｊ．Ｎ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，９７：１２１６４, ２０００
【非特許文献３】Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．，２５４:１４９７, １９９１
【非特許文献４】Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｐ．Ｅ．，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，３２: ６２４, １９９９
【非特許文献５】Ｄｅａｎ，Ｄ．Ａ．，  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，４４:８１, ２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主たる目的は、アミン基により改質された基板の上にエポキシ化合物をリンカとしてＰＮＡプローブを結合するジップコード方式を用いたＰＮＡジップコードチップの製作方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記方法により得られたエポキシ化合物をリンカとしてＰＮＡジップコードプローブが結合されているＰＮＡジップコードチップを提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＮＡチップを用いるＤＮＡの検出方法、多重塩基変異の分析方法及びＳＮＰｓの分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、（ａ）アミン基により改質された基板の上にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＰＮＡジップコードプローブ及びエポキシ化合物を含む固定化試料を滴下してＰＮＡジップコードプローブを固定する段階と、（ｂ）前記ＰＮＡジップコードプローブが固定された基板をＳＤＳ溶液により洗浄した後に乾燥させる段階と、を含むジップコード方式を用いたＰＮＡチップの製作方法を提供する。  
【００１３】
本発明において、前記（ａ）段階におけるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＰＮＡジップコードプローブ及びエポキシ化合物の体積比は、１：１：１であり、前記エポキシ化合物は、下記式１で表されることを特徴とすることができる。
【００１４】
【化１】
2006153839.tif 000003
【００１５】
本発明において、前記ＰＮＡジップコードプローブの濃度は１０μＭ〜１ｍＭであり、前記ＰＮＡジップコードプローブは複数設けられ、前記複数のＰＮＡジップコードプローブは互いに３０％以下の相同性を有する塩基配列を含むことを特徴とする。また、前記ＰＮＡジップコードプローブは配列番号１〜配列番号１０の塩基配列のうち何れか１つを含んでも良く、配列番号１〜配列番号１０及び配列番号１６〜配列番号４５の塩基配列のうち何れか１つを含んでも良い。
【００１６】
また、本発明は、前記方法により製造され、エポキシ化合物をリンカとしてＰＮＡジップコードプローブが結合されていることを特徴とするＰＮＡジップコードチップを提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、前記ＰＮＡジップコードチップに目的ＤＮＡを混成化させることを特徴とする目的ＤＮＡの検出方法を提供する。本発明において、前記検出は、蛍光信号を用いて行われることを特徴とする。
【００１８】
さらに、本発明は、（ａ）対象遺伝子の塩基変異の部分を選定する段階と、（ｂ）ＳＢＥプライマーをデザインする段階と、（ｃ）前記（ａ）段階における対象遺伝子をＰＣＲにより増幅する段階と、（ｄ）前記増幅された対象遺伝子を（ｂ）段階により得られたＳＢＥプライマー及び蛍光物質により標識されたｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＧＴＰを用いてＳＢＥ反応を行う段階と、（ｅ）前記ＳＢＥ反応物を前記ＰＮＡジップコードチップに混成化させる段階と、（ｆ）蛍光物質を用いて信号を確認する段階と、を含むことを特徴とする多重塩基変異の分析方法を提供する。
【００１９】
本発明において、前記ＳＢＥプライマーは５'末端部位に前記ＰＮＡジップコードチップに固定されているＰＮＡジップコードと相補的な配列を含み、３'末端部位に対象遺伝子と相補的な配列を含むことを特徴とすることができ、前記ＳＢＥプライマーは複数であることを特徴とすることができる。さらに、本発明において、前記対象遺伝子は糖尿病と関わる遺伝子ＨＮＦ１−ａであることを特徴とする。
【００２０】
さらに、本発明は、（ａ）対象遺伝子の塩基変異の部分を選定する段階と、（ｂ）ＳＢＥプライマーをデザインする段階と、（ｃ）前記（ａ）段階における対象遺伝子をＰＣＲにより増幅する段階と、（ｄ）前記増幅された対象遺伝子を（ｂ）段階により得られたＳＢＥプライマー及び特定の化合物により標識されたｄｄＮＴＰを用い、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＧＴＰを入れた４本のチューブにおいてそれぞれ別々にＳＢＥ反応を行う段階と、（ｅ）前記ＳＢＥ反応物を前記ＰＮＡジップコードチップに混成化させる段階と、（ｆ）前記化合物標識を用いて信号を確認する段階と、を含むことを特徴とする多重塩基変異の分析方法を提供する。
【００２１】
本発明において、ＳＢＥプライマーは５'末端部位に前記ＰＮＡジップコードチップに固定されているＰＮＡジップコードと相補的な配列を含み、３'末端部位に対象遺伝子と相補的な配列を含むことを特徴とすることができるし、前記ＳＢＥプライマーは複数であることを特徴とすることができる。
【００２２】
本発明において、前記特定の化合物はビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）であり、前記信号を確認する段階は、ビオチンとの親和力が高いタンパク質であるストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）が結合されているフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｉｎ）で染色することにより行われることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明は、前記ＰＮＡチップを用いることを特徴とするＳＮＰｓの分析方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、アミン基により改質された基板の上に、エポキシ化合物をリンカとしてＰＮＡプローブを結合するジップコード方式を用いたＰＮＡジップコードチップの製作方法を提供することができ、前記方法により得られたエポキシ化合物をリンカとして基板とＰＮＡジップコードプローブを結合する形を有するＰＮＡジップコードチップを提供することができる。さらに、本発明は、前記ＰＮＡチップを用いるＤＮＡの検出方法、多重塩基変異の分析方法及びＳＮＰｓの分析方法を提供することができる。
【００２５】
本発明によれば、ＤＮＡよりも物性に優れたＰＮＡを用いてＤＮＡチップよりも一層優れた感度にて正確に遺伝病や塩基変異を診断することができ、ジップコード方式を用い、目的遺伝子に応じて毎回プローブを直接的に基板に固定することなく、混成化反応だけで手軽に遺伝子変異を診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、添付した図面に基づき、本発明について詳細に説明する。
【００２７】
ジップコードチップは、互いに相同性のない一定長さの塩基配列よりなるプローブ（ジップコード）を固体基板に固定したチップであって、前記プローブの塩基配列と相同性を持つ配列を５'末端に有し、目的ＤＮＡの塩基配列と相補的な配列を３'末端に有するオリゴヌクレオチドを前記チップに混成化させて信号の読み込みを行うチップを言う。
【００２８】
つまり、本発明において、前記プローブは、プローブの塩基配列の間に相同性が最も低い配列を選定し、前記のごとき塩基配列を有するプローブをジップコードと言う。
【００２９】
本発明において、前記ジップコードチップのプローブとしては、ＰＮＡを用いる。
【００３０】
本発明において、混成化に使われる目的物質には特に制限がなく、ＰＮＡプローブと反応または結合して検出されるものであれば何れも使用可能である。好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡなど生体由来分子が使用できる。
【００３１】
本発明においては、ＰＮＡジップコードプローブを、アミンにより表面改質された固体基板に固定させた。このとき、固定は、エポキシ化合物をリンカとしてアミンにより改質された固体基板の上にＰＮＡを化学的に結合することにより行われる。
【００３２】
本発明におけるエポキシ化合物は、下記式１のごとき構造を有する化合物であって、図２に示すように、アミン基により表面改質されたガラス基板とエポキシ化合物のエポキシ基が化学結合され、ＰＮＡプローブのアミン基と前記ガラス基板と結合されたエポキシ化合物の他のエポキシが化学結合され、その結果、ＰＮＡプローブがガラス基板に固定され、部分的にはＰＮＡジップコードプローブとガラス基板との間の物理的な吸着による結合も起こる。
【００３３】
【化２】
2006153839.tif 000004
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は単に本発明を具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨を逸脱しない限り、本発明の範囲が下記の実施例により限定されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００３５】
＜実施例１＞ＰＮＡジップコードチップの製作
実施例１では、表面がアミンにより改質されたガラス基板をＰＮＡチップの基板として使用した。チップに固定するＰＮＡジップコードプローブは１０本であり、１２個の塩基を有し、互いに低い相同性を有する下記の１０個の塩基配列よりなる（配列番号１〜配列番号１０）。ＰＮＡプローブのＮ末端にはアミン（−ＮＨ２）基が付着しているため、下記のプローブを基板に固定するのに前記アミン基とエポキシ基との結合が使われている。
【００３６】
配列番号１:Ｎ−ＴＧＣＧＧＧＴＡＡＴＣＧ−Ｃ
配列番号２:Ｎ−ＴＧＣＧＡＣＣＴＡＴＣＧ−Ｃ
配列番号３:Ｎ−ＡＴＣＧＴＧＣＧＡＣＣＴ−Ｃ
配列番号４:Ｎ−ＡＴＣＧＧＧＴＡＴＧＣＧ−Ｃ
配列番号５:Ｎ−ＣＡＧＣＡＴＣＧＴＧＣＧ−Ｃ
配列番号６:Ｎ−ＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＧ−Ｃ
配列番号７:Ｎ−ＧＧＴＡＡＴＣＧＡＣＣＴ−Ｃ
配列番号８:Ｎ−ＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＣＴ−Ｃ
配列番号９:Ｎ−ＧＡＣＣＣＡＧＣＡＴＣＧ−Ｃ
配列番号１０:Ｎ−ＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧ−Ｃ
【００３７】
前記ＰＮＡジップコードプローブを下記の方法によりガラス基板に固定し、ＰＮＡジップコードチップを製作した。
【００３８】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＰＮＡジップコードプローブ及びエポキシ化合物を体積比１：１：１にて混合してＰＮＡの最終的な濃度が１００μＭになるべく製造した固定化試料を、アミンにより改質されたガラス基板の上にスポッタを用いて滴下し、０．２％のＳＤＳ溶液により洗浄した後、室温にて乾燥を行い、ＰＮＡジップコードチップを製作した。
＜実施例２＞ＰＮＡジップコードチップ上におけるＤＮＡ混成化
【００３９】
ＰＮＡジップコードのＤＮＡとの混成化能を試験するために、実施例１の方法に従い製作された配列番号３、配列番号６、配列番号７及び配列番号９の塩基配列を有する４本のＰＮＡジップコードプローブが固定されたＰＮＡジップコードチップを用い、混成化実験を行った。
【００４０】
まず、蛍光物質（Ｃｙ３）により標識された２５個の塩基を有する目的ＤＮＡ（配列１１）を用意した。１ｎＭの目的ＤＮＡを混合して得られる６×ＳＳＰＥＴ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＥＤＴＡ）混成化溶液を総体積３０μｌとしてＰＮＡジップコードチップに載置し、混成化チャンバに入れて３７℃にて１２時間混成化を行った。前記目的ＤＮＡは、チップの上に固定されている４本のＰＮＡプローブのうち、配列番号７の配列を有するプローブと相補的な塩基配列を有する。
【００４１】
配列１１：５'−ＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＴＴＡＣＣＡＡＡＧＧＡ−３'（目的ＤＮＡ）
【００４２】
このため、前記ＰＮＡジップコードチップと混成化させた場合に単に１本のプローブから蛍光が見られるべきであり、図３に示すように、４種類のプローブのうち目的ＤＮＡと相補的な配列を有する３番目のＰＮＡプローブ（配列番号７）でのみ混成化が起こる結果、蛍光が見られた（図３）。
＜実施例３＞混成化溶液の濃度によるＰＮＡジップコードチップの感度変化
【００４３】
本発明に係るＰＮＡジップコードチップが最も効果的な感度を示す条件を見つけるために、混成化溶液の濃度を変えながら混成化を行った。実施例２に使われたＰＮＡチップと目的ＤＮＡ（配列番号１１）に対し、それぞれ０．１×、０．３×、０．５×、１×、３×及び６×濃度のＳＳＰＥＴ混成化溶液を用いて混成化を行った。その結果、０．１×ＳＳＰＥＴ混成化溶液から最も高い蛍光信号値が見られ、濃度が最も高い６×ＳＳＰＥＴ混成化溶液から最も低い蛍光信号値が見られた（図４）。これより、混成化溶液の濃度が薄まるほど一層効率よいＰＮＡジップコードチップの混成化が起こるということが分かった。
＜実施例４＞ＰＮＡジップコードチップとＤＮＡジップコードチップの１塩基差の区別能に関する実験
【００４４】
ＰＮＡジップコードチップの塩基差の区別能がＤＮＡジップコードチップよりも優れていることを確かめるために、同じ配列を有するＰＮＡジップコードプローブとＤＮＡジップコードプローブをアミンにより表面改質されたガラス基板の上に固定して比較した。
【００４５】
塩基差の区別能の実験に使われたプローブの配列を下記に示した。また、ＤＮＡジップコードプローブの場合、固定時にエポキシ化合物と結合させるために、５'末端にアミン基を付加した。
【００４６】
ＤＮＡ（ＰＭ）−５'−ＮＨ２−ＧＧＴＡＡＴＣＧＡＣＣＴ−３'（配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡプローブ）
ＤＮＡ（ＭＭ）−５'−ＮＨ２−ＧＧＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴ−３'（配列番号７の単一の変異配列を有するＤＮＡプローブ）
ＰＮＡ（ＰＭ）−Ｎ−ＧＧＴＡＡＴＣＧＡＣＣＴ−Ｃ（配列番号７の塩基配列を有するＰＮＡプローブ）
ＰＮＡ（ＭＭ）−Ｎ−ＧＧＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴ−Ｃ（配列番号７の単一の変異配列を有するＰＮＡプローブ）
【００４７】
塩基差の区別能を確かめるために、相異なる濃度（０．１×ＳＳＰＥＴ、０．３×ＳＳＰＥＴ、１×ＳＳＰＥＴ、３×ＳＳＰＥＴ、６×ＳＳＰＥＴ）の混成化溶液にて混成化を行った。
【００４８】
図５に示すように、ＰＮＡジップコードチップの場合には、混成化溶液の濃度が濃くなるに伴い全体的な蛍光信号値は下がる傾向を示すものの、塩基差の区別能は上がるということが確かめられた。これに対し、ＤＮＡジップコードチップの場合には、混成化溶液の濃度が濃くなるに伴い、塩基差の区別能と蛍光信号値が共に上がるものの、蛍光信号の絶対値はＰＮＡジップコードチップの場合よりも格段に低くなっていることが確かめられた。
＜実施例５＞ＰＮＡジップコードチップ上におけるマルチプレクスによる塩基検査（１）
【００４９】
実施例５では、糖尿病の一種であるＭＯＤＹ−３と関わる遺伝子であるＨＮＦ１−ａ遺伝子（配列番号１２）を目的遺伝子として使用し、前記遺伝子のエクソン２に含まれた３個所の塩基変異の部分を表１のように選定した。
【００５０】
【表１】
2006153839.tif 000005
【００５１】
ＰＮＡジップコードプローブと結合する５'末端のＳＢＥプライマーはＰＮＡジップコードチップに固定されたそれぞれのＰＮＡプローブと相補的な配列を有し、３'末端のＳＢＥプライマーは塩基変異を含む対象遺伝子と相補的な配列を有するようにデザインされている。この実施例に使われたＳＢＥプライマーは、Ｔｍ値を６０℃の辺りに均一にするためにそれぞれ別々の長さにデザインした。すべてのＳＢＥプライマーは目的遺伝子の塩基変異部分の１塩基分の前まで製作した。
【００５２】
ＰＮＡジップコードチップの上において多重塩基の変異分析を行うために、糖尿病と関わる遺伝子であるＨＮＦ１−ａのエクソン２部分をＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡに対し、蛍光物質（ＴＡＭＲＡ）により標識されたｄｄＣＴＰを用いてＳＢＥ反応を行い、ＳＢＥ０１−６Ｐ（配列番号１３）、ＳＢＥ０１−１８Ｐ（配列番号１４）及びＳＢＥ０１−３１Ｐ（配列番号１５）の３つのＳＢＥプライマーを用いて同チューブ中にて同時にＳＢＥ反応を行った。ＳＢＥ反応済み反応物は、４０個のジップコードが固定されているＰＮＡジップコードチップに混成化させた（表２）。
【００５３】
ＳＢＥ０１−６Ｐ:５'−ＴＡＣＣＡＧＧＴＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧ−３'(配列番号１３)
ＳＢＥ０１−１８Ｐ:５'−ＣＧＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣ−３'(配列番号１４)
ＳＢＥ０１−３１Ｐ:５'−ＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧＴ−３'(配列番号１５)
【００５４】
【表２】
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【００５５】
その結果、６番位置にあるＰＮＡジップコードプローブ（配列番号１９）、１８番位置にあるＰＮＡジップコードプローブ（配列番号６）及び３１番位置にあるＰＮＡジップコードプローブ（配列番号９）から蛍光信号が見られた（図６）。これにより、本発明に係るＰＮＡジップコードチップを用いれば、単一のジップコードチップにおいて塩基変異の多重分析が行えるということが分かる。
＜実施例６＞ＰＮＡジップコードチップ上におけるマルチプレクスによる塩基検査（２）
【００５６】
実施例６では、実施例５で使われた目的遺伝子に対し、ＴＡＭＲＡの代わりにビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が標識されたｄｄＮＴＰを用いてＳＢＥ反応を行った後、これを実施例１により得られた１０本のＰＮＡジップコードプローブが固定されたチップに混成化させた。そして、蛍光信号を観察するために、混成化済みチップをビオチンとの親和力の優れたタンパク質であるストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）が結合されているフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｉｎ）により蛍光染色を行った。ＳＢＥ反応は、ビオチン−ｄＡＴＰ、ビオチン−ｄＴＴＰ、ビオチン−ｄＣＴＰ及びビオチン−ｄＧＴＰをそれぞれ付加した４種類の反応溶液を製造してから行った（表３）。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
前記４種類の反応溶液には、１０個の塩基変異の部分を含む下記の１０個のＳＢＥプライマー（配列番号４６〜配列番号５５）を全部入れた。塩基変異の分析に使われたＳＢＥプライマー配列を示すものであって、ＰＮＡジップコード配列の相補的な配列には下線が引かれている。
【００５９】
配列４６:５'−ＣＧＡＴＴＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧＣ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ１)
配列４７:５'−ＣＧＡＴＡＧＧＴＣＧＣＡＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ２)
配列４８:５'−ＡＧＧＴＣＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＴＧＧＣＧＴＧＴＧＧＣＧ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ３)
配列４９:５'−ＣＧＣＡＴＡＣＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ４)
配列５０:５'−ＣＧＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＣＧ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ５)
配列５１:５'−ＣＧＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ６)
配列５２:５'−ＡＧＧＴＣＧＡＴＴＡＣＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＣ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ７)
配列５３:５'−ＡＧＧＴＣＧＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧＴＣＣＣＡＡＣ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ８)
配列５４:５'−ＣＧＡＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＣ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ９)
配列５５:５'−ＣＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡ−３'(ＳＢＥ０２−Ｐ１０)
【００６０】
ＳＢＥ反応を行った後、それぞれの反応溶液をＰＮＡジップコードチップに混成化させた。
【００６１】
図８は、実施例６の塩基変異の分析方法を示した。
【００６２】
図７は、それぞれのセットにてＳＢＥ反応を行った反応物をＰＮＡジップコードチップに混成化させた後、ストレプタビジンが共役されたフィコエリスリンにより染色し、その結果を蛍光スキャナにより観察した結果を示している。図７Ｂから見ると、ＡＡ形質を示すべき（ビオチン−ｄｄＡＴＰ入れ）チップにおいては、予想の通りにＡＡの形質にのみ蛍光信号が入っていた。そして、残りの３種類の場合（ＧＧ、ＣＣ、ＴＴ）にもいずれも予想の通りに同じ結果が得られた。これにより、１本のチューブ内にて１０個の塩基変異の部分を１回のＳＢＥ反応により正確に診断することができた。そこで、この方法を用いれば、各種の疾病に関する塩基変異の部分やＳＮＰｓを同時に大量に分析することができる。
【００６３】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者であれば、このような具体的な記述は単なる好適な実施の様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されないということは理解できるであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物によって定義されるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上説明したように、本発明は、アミン基により改質された基板の上に、エポキシ化合物をリンカとしてＰＮＡプローブを結合するジップコード方式を用いたＰＮＡジップコードチップの製作方法を提供することができ、前記方法により得られたエポキシ化合物をリンカとして基板とＰＮＡジップコードプローブを結合する形を有するＰＮＡジップコードチップを提供することができる。さらに、本発明は、前記ＰＮＡチップを用いるＤＮＡの検出方法、多重塩基変異の分析方法及びＳＮＰｓの分析方法を提供することができる。又、本発明によれば、ＤＮＡよりも物性に優れたＰＮＡを用いてＤＮＡチップよりも一層優れた感度にて正確に遺伝病や塩基変異を診断することができ、ジップコード方式を用い、目的遺伝子に応じて毎回プローブを直接的に基板に固定することなく、混成化反応だけで手軽に遺伝子変異を診断することができる。従って産業界に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＰＮＡおよびＤＮＡの構造式を示す図である。
【図２】本発明に係るエポキシ化合物を用い、ＤＮＡ、ＰＮＡなどをアミンにより表面改質されたガラス基板の上に固定する方法を示す図である。
【図３】６×ＳＳＰＥＴ混成化溶液において、蛍光物質（Ｃｙ３）により標識された目的ＤＮＡをＰＮＡジップコードチップに混成化させた蛍光イメージを示す図である。
【図４】混成化溶液内のＳＳＰＥＴ混成化溶液の濃度変化による混成化の傾向を示す図である。
【図５】混成化溶液の濃度によるＰＮＡジップコードチップとＤＮＡジップコードチップの１塩基差の区別能を示す図であって、Ａは、ＰＮＡジップコードチップにおける混成化溶液の濃度による１塩基差の区別能を示し、Ｂは、ＤＮＡジップコードチップにおける混成化溶液の濃度による１塩基差の区別能を示す。
【図６】ＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰを用いたＰＮＡジップコードチップにおける多重塩基変異の分析を示す図である。
【図７】本発明の実施例により得られたＰＮＡジップコードチップにおいて、同時に多数の塩基変異の部分を分析した蛍光イメージを示す図であって、Ａは、ＰＮＡジップコードチップの配列を示す図（数字は遺伝子の位置であり、ＡＡ、ＧＧ、ＣＣ、ＴＴはその遺伝子の正常形質を示す）であり、Ｂは、４つのチップを用いて同時に１０個の塩基変異を糾明した蛍光イメージを示す図である。
【図８】本発明の実施例６に採用された、ジップコードを用いた塩基変異の分析方法を簡単に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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