(57)【要約】      （修正有）【課題】  ヒト癌細胞の浸潤と転移を阻害する化合物をスクリーニングする方法および阻害する化合物を提供する。【解決手段】  ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成を阻害する化合物をスクリーニングすればよい。この方法によりヒト由来の特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドが見出された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）癌細胞を候補化合物と共に培養し、細胞抽出液を作成し；
（２）細胞抽出液に抗コルタクチン抗体及び、抗マウスＩｇＧセファロースを加え、インキュベートし；
（３）抗マウスＩｇＧセファロースに吸着させたＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリン複合体を精製し、および
（４）ウエスタンブロット法によりＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体形成を検出し、結合性を評価する；
を含む方法。
【請求項２】
ＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体の形成を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）ＣＯＳ細胞にてヘマグルチニン−ＡＭＡＰ１融合タンパク質を強制発現させて、細胞抽出液を作成し；
（２）細胞抽出液に候補化合物、グルタチオントランスフェラーゼ−コルタクチン融合タンパク質及び、グルタチオンセファロースを加え、インキュベートし；
（３）グルタチオンセファロースに吸着させたＡＭＡＰ１／コルタクチン複合体を精製し、および
（４）ウエスタンブロット法によりＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体形成を検出し、結合性を評価する；
を含む方法。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３のヌクレオチド配列を有する請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号４のヌクレオチド配列を有する請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３または４に記載のポリペプチドを有効成分として含む、ヒト癌細胞の浸潤活性と転移活性を阻害する薬剤。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むヒト癌細胞の浸潤活性と転移活性を阻害する薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト癌細胞の浸潤と転移を阻害する物質およびそのスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
がんの最も大きな脅威はその浸潤・転移性にある。癌細胞の示す浸潤活性や転移活性を阻害することによって、癌の治療や癌患者のＱＯＬの向上を目指す試みは非常に数多くなされてきている。例えば、癌の浸潤には、癌細胞の表面に分泌される蛋白質分解酵素であるＭＭＰｓ（matrix metalloproteinases）やセリンプロテアーゼの活性が必須であることから、これらの酵素類に対する多くの種類の阻害剤が開発された（非特許文献１参照）。
しかし、それらのがん患者への投与例において、臨床適用に耐える良好な結果を与えた例は殆どない。これは、各々の癌において、その浸潤過程に一種類の蛋白質分解酵素のみが関与するのではなく、おそらく複数種の蛋白質分解酵素が同時に関与するためであると考えられている。従って、がんの浸潤に関与するより基本的、根幹的な分子装置を見出し、その活性を阻害することが必用であると考えられる。
【非特許文献１】Coussens LM, Fingleton B, & Matrisian LM, Science, 2002, Mar. 29;295(5564):2387-2392  上皮癌の場合、転移の多くはまず癌細胞の基底膜への浸潤を介して起こる。このことは、ヒト乳癌において顕著であることがその病理学的所見により示されている（非特許文献２参照）。しかし細胞の浸潤や転移をもたらす基本的分子機序やその応用による癌の浸潤を阻害する手立てに関して、世界レベルで既に多くの試みがあるが、有効性が確認されたものが皆無に等しいのが現状であり、新しい方法論や分子標的の検索が行われている段階である。
【非特許文献２】Allred DC, Mohsin SK, & Fuqua SA, Endocr. Relat. Cancer, 2001, Mar;8(1):47-61
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、上にも記したようにまだまだ不完全である癌治療に関して、癌の浸潤、転移を抑制できる手立てを提供することである。本発明の目的は、癌の浸潤、転移を抑制するスクリーニング方法および、癌に対する今までに無い新しくより効果的な治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らはヒト乳癌細胞を用いて、その浸潤や転移活性の制御と細胞内シグナル伝達機構に関する研究を行ってきた。その中で、低分子量Ｇタンパク質であるＡｒｆ６や、その制御因子の一つであるＡＭＡＰ１／ＰＡＧ２／ＡＳＡＰ１と称されるタンパク質（以下、ＡＭＡＰ１と略する）が重要な役割を果たすことを明らかにしてきた。
本発明者は、この度、
（ｉ）癌細胞中で、ＡＭＡＰ１（Brown MT, Andrade J, Radhakrishna H, Donaldson JG, Cooper JA, Randazzo PA, Mol. Cell. Biol., 1998, Dec;18(12):7038-7051）が、コルタクチン（Wu H, Parsons JT, J Cell Biol., 1993, Mar.;120(6):1417-1426）およびパキシリン（Turner CE, Glenney JR Jr, Burridge K, J Cell Biol., 1990, Sep.;111(3):1059-68）と呼ばれる特定の蛋白質と複合体を形成すること、
（ｉｉ）この複合体の形成がヒト癌細胞の浸潤や転移活性に関与していること、
（ｉｉｉ）この複合体の形成を阻害することによって浸潤活性と転移活性を効率良く阻害できること
を発見し、この発見に基づいて本発明を完成させた。
【０００５】
即ち本発明は、ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）癌細胞を候補化合物と共に培養し、細胞抽出液を作成し；
（２）細胞抽出液に抗コルタクチン抗体及び、抗マウスＩｇＧセファロースを加え、インキュベートし；
（３）抗マウスＩｇＧセファロースに吸着させたＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリン複合体を精製し；そして
（４）ウエスタンブロット法により複合体を各成分に分離し、ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体形成を検出し、結合性を評価する；
を含む方法に関する。
【０００６】
本発明はまた、ＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体の形成を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）ＣＯＳ細胞にてヘマグルチン−ＡＭＡＰ１を強制発現させて、細胞抽出液を作成し；
（２）細胞抽出液に候補化合物、グルタチオントランフェラーゼ−コルタクチン融合タンパク質及び、グルタチオンセファロースを加え、インキュベートし；
（３）グルタチオンセファロースに吸着させたＡＭＡＰ１／コルタクチン複合体を精製し、そして
（４）ウエスタンブロット法により複合体を各成分に分離し、ＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体形成を検出し、結合性を評価する；
ことを含む方法にも関する。
【０００７】
本発明者は上記スクリーニング方法を用いてＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成を阻害する化合物を見出した。この方法により見出された、ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリン複合体あるいは、ＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体の形成を阻害する化合物はヒト癌細胞の浸潤活性と転移活性を阻害する薬剤となりうる。
【０００８】
即ち、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。このポリペプチドは、ＡＭＡＰ１のプロリンリッチ領域第４配列に相当するポリペプチドであり、ＡＭＡＰ１はこの配列を用いてコルタクチンのＳＨ３領域と結合する
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドにも関する。このポリペプチドはＡＭＡＰ１のＳＨ３領域に相当するポリペプチドであり、ＡＭＡＰ１はこの領域を用いてパキシリンと結合する。
【０００９】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号３のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドの例は、配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。
【００１０】
本発明は、配列番号１または２のポリペプチドを有効成分として含むヒト癌細胞の浸潤活性と転移活性を阻害する薬剤に関する。対象となる癌は乳癌をはじめとする基底膜を介する浸潤過程を経るあらゆる臓器の上皮組織由来の癌である。
【００１１】
これらのポリペプチドは、ポリペプチドの形態で投与してもよいが、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡを、遺伝子導入の方法で細胞に導入し、細胞内で発現させてもよい。
従って、本発明はヒト癌細胞の浸潤活性と転移活性を阻害する薬剤であって、
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む薬剤に関する。
【発明の効果】
【００１２】
今回の発明において、今まで試されたことがない蛋白質間相互作用に関わるインターフェースを分子標的とし、当該蛋白質複合体形成を阻害することによって非常に効果的に癌の浸潤活性と転移活性を抑制できることが示された。同定されたインターフェースにはいずれもＳＨ３領域と呼ばれる蛋白質間相互作用モジュールが関与している。本出願においては、ペプチドを用いることによって当該蛋白質間相互作用を阻害したが、この知見に基づき、低分子性化合物をデザインし合成することや、これらモジュールに結合し当該蛋白質間相互作用を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能となり、今後、乳癌をはじめとする様々な上皮組織由来癌に対するより有効な薬剤の開発を促すことができると期待される
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（Ｉ）ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成を阻害する化合物をスクリーニングする方法
ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成は以下のようにして確認する。
（１）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のような、浸潤／転移性の高いヒト乳癌細胞を培養し、細胞抽出液を作成する。上述のように、本発明者らは、乳癌細胞の浸潤性／転移性と上記３つのタンパク質の複合体形成とが相関することを見出している。
（２）細胞抽出液に抗コルタクチン抗体及び、抗マウスＩｇＧセファロースを加え、インキュベートする。抗コルタクチン抗体はコルタクチンおよび抗マウスＩｇＧセファロースに結合し、そのコルタクタチンは細胞抽出液中に存在する他の結合可能なタンパク質成分とも結合する
（３）抗マウスＩｇＧセファロースを洗浄、精製する。細胞抽出液中の他のすべての成分が除かれる
（４）ウエスタンブロット法により、ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体形成を検出し、結合性を評価する。電気泳動により複合体は各成分に分離される。ＡＭＡＰ１、コルタクチン、パキシリンの抗体を使って各成分を検出する。細胞抽出液中でＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体が生成していればそれらに対応する３本のバンドが検出される（図１Ａ参照）。
工程（１）の癌細胞の培養に際し、ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成を阻害する化合物を添加すれば、ウエスタンブロットの電気泳動で得られる、パキシリン、あるいは、ＡＭＡＰ１とパキシリンに相当するバンドが消失する（図１Ａ参照）。
候補化合物がポリペプチドの場合、ポリペプチドの形で添加しても良いが癌細胞にそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し、該ポリペプチドを癌細胞内で発現させてもよい
【００１４】
（ＩＩ）ＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体の形成を阻害する化合物をスクリーニングする方法
ＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体の形成は以下のようにして確認する。
（１）ＣＯＳ細胞にてヘマグルチニン（ＨＡ）−ＡＭＡＰ１融合タンパク質を強制発現させて、細胞抽出液を作成する。ヘマグルチニンは検出用タグである。
（２）グルタチオン−Ｓ−トランフェラーゼ（ＧＳＴ）−コルタクチン融合タンパク質を調製する。
（３）上記細胞抽出液にＧＳＴ−コルタクチン融合タンパク質およびグルタチオンセファローズを加えインキュベートする。ＧＳＴ−コルタクチンはグルタチオンセファローズおよび細胞抽出液中のヘマグルチニン−ＡＭＡＰ１と複合体を形成する、
（４）ウエスタンブロット法の電気泳動により複合体を各成分に分離し、ＧＳＴ−コルタクチンおよびヘマグルチニン−ＡＭＡＰ１を、ＧＳＴおよびヘマグルチニンの抗体を用いて検出する。複合体を形成していれば２本のバンドが得られる（図２Ｂ）。
工程（３）にＡＭＡＰ１／コルタクチン複合体の形成を阻害する化合物を添加すれば、ウエスタンブロットの電気泳動で得られるＡＭＡＰ１に相当するバンドが消失する（図２Ｂ参照）。
【００１５】
（ＩＩＩ）配列番号１のポリペプチドの製造
配列番号１のペプチドを製造するには化学的合成法によるのが便利である。化学的合成法としてはメリフィールド固体ペプチド合成法が便利である。この方法では、合成しようとするペプチドのカルボキシ末端アミノ酸のｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）誘導体を、クロロメチル化した架橋ポリスチレンに導入する。次にＢｏｃ基を除去して得られる樹脂上のアミノ基に第二のＢｏｃ−アミノ酸を導入する。この操作を繰り返し、目的とするペプチド鎖が構築できたら、全保護基を除くとともにペプチドを樹脂から切り離す。
【００１６】
（ＩＶ）配列番号２のポリペプチドの製造
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造するには遺伝子組換え法によるのが便利である。
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、適当な宿主系内で組換え配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現する発現ベクターを構築することができる。得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの発現に適した条件下で培養することにより、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを製造することができる。
【００１７】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築することができる。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現に適したベクターは、該ポリヌクレオチドの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろう。適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる。例えば、ＳＶ４０ウィルス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因子ＥＦ−１αのプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、β−アクチンのプロモーター、ＣＭＶウィルスのプロモーター等を動物細胞系での発現で、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターやベーターガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター等を細菌、大腸菌での発現に用いることができる。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入部位下流には転写終結シグナルがあることが望ましい。
【００１８】
ベクター中にはたとえば薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在することが望ましい。あるいは、ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を含有する発現ベクターと別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換してもよい。
【００１９】
発現ベクターを構築するには配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクターに挿入する。適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既知のものから選択する。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入し、培養細胞に導入してこのポリヌクレオチドを発現する目的に用いることができるベクターとして、例えば動物細胞での発現においてはｐＫＣＲ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４ウシパピローマウィルスＤＮＡなど、大腸菌においてはｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ等を挙げることができる。
【００２０】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現に用い得る細胞は複製可能で配列番号４のポリヌクレオチドを発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ．セレビジエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内から配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に適した系を任意に選択することができる。
形質転換した細胞を常法に従い培養することにより所望の蛋白質が得られる。培養に用いる培地は宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が大腸菌である場合にはＬＢ培地やＴＢ培地が、宿主が哺乳動物細胞である場合にはＲＰＭＩ１６４０培地等を適宜用いることができる。
この培養により得られる培養物からの本発明に用いる蛋白質の単離および精製は常法により行うことが可能であり、例えば培養物を蛋白質の物理的および化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。具体的には蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーなどを単独で、または組み合わせて用いることができる。
【００２１】
（Ｖ）配列番号１のペプチドまたは配列番号２のポリペプチドを有効成分とする製剤の調製
配列番号１のペプチドまたは配列番号２のポリペプチドを自体公知の担体と混合希釈して、たとえば液剤などとして製剤化することができる。液剤を調製するには、例えば精製水、生理食塩水、エタノール・プロピレングリコール・グリセリン・ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリアセチン等の溶媒を用いて行うことができる。このように調整した液剤は、たとえば乳酸リンゲル液、輸液用電解質液よりなる維持液、術後回復液、脱水補給液、点滴用生理食塩液等に希釈して用いることができる。通常液剤に適宜選択して用いられる添加剤、例えば、ｐＨ調整用の緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、等張化剤（例えば、ソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール，グルコース、塩化ナトリウム等）を加えても良い。このような製剤にはさらに薬学上許容しうる塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、パラクロルメタキシノール、クロルクレゾール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサール、クロロブタノール等の適当な防腐殺菌剤、タルク等の湿潤剤、モノオレイン酸ポリエチレングリコール等の乳化剤、分散剤、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メタ重亜硫酸塩等の安定剤のような補助剤を加えても良い。またアラビアゴム、カオリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を懸濁化剤として用いた懸濁剤として投与することも好ましい剤型の１つといえる。
【００２２】
投与経路としては非径口的投与が好ましく、例えば経静脈的投与、経脳脊髄液投与、カテーテルによる経動脈的な局所投与、もしくは外科的な局所投与を含む。本発明の有効成分の投与量は、0.1〜1000ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１〜500ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００２３】
（ＶＩ）遺伝子導入法
本発明は、本発明はヒト癌細胞の浸潤活性と転移活性を阻害する薬剤であって、
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドコードするポリヌクレオチド；または
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬剤にも関する。
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号３に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドがある。
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドがある。
これらのポリヌクレオチドを、遺伝子導入（gene transfer）の方法で細胞に導入し、細胞内でポリペプチドを発現させる。遺伝子導入の方法としては、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いるウイルス法、パーティクルガン法等がある。好ましい方法はリポフェクション法である。この方法ではDNAが結合したリポソームを用い細胞融合を利用して細胞にポリヌクレオチドを導入する。人工的に作成した脂質二重層でできた陽イオンリポソームとポリヌクレオチドを混合するとリポソーム−ポリヌクレオチド複合体ができる。この複合体を含む溶液で細胞を培養すると複合体中のポリヌクレオチドが細胞に取り込まれる。陽イオンリポソームを作る人工脂質としてはリポフェクチン（商品名）、リポフェクタミン（商品名）等を好ましく利用できる。
【実施例１】
【００２４】
乳癌細胞におけるAMAP1／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成の確認と、複合体形成の阻害物質
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（the American Type Culture Collection (ATCC)より購入）とマウス乳癌細胞４Ｔ１／ｌｕｃ（Michigami T, Hiraga T, Williams PJ, Niewolna M, Nishimura R, Mundy GR, & Yoneda T.  Breast Cancer Res. Treat. 2002, Oct;75(3):249-258）（米田俊之教授（大阪大学）より分与）を用いて乳癌細胞におけるＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリンの複合体の形成の確認と、複合体形成の阻害物質の探索を免疫沈降法により行った。
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とマウス乳癌細胞４Ｔ１／ｌｕｃに配列番号４のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡをリポフェクション法により導入することによって発現させた。導入にはＴｒａｎｓ IＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ社製）を使用した。
遺伝子導入後２４時間、各細胞抽出液を１％ ＮＰ−４０バッファー(1% ノニデット（Nonidet）-40, 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.4, 5mM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM フェニルメチルスルホニルクロライド, 5μg/ml アプロチニン, 2μg/ml リュウペプチン（leupeptin） および3μg/ml ペプスタチン A)により作成した。
５００μｇの細胞抽出液に対して、１μｇの抗コルタクチン  マウスモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を加え、４℃で１２時間インキュベートした。
抗マウスＩｇＧセファロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いてＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリン複合体を１％ ＮＰ−４０バッファーにより精製した。
引き続き、ウエスタンブロット法によりＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリン複合体形成を検出した。
【００２５】
結果を図１Ａに示す。「ＮＴ」はＤＮＡ導入操作をしていない細胞の場合、「ベクター」はｃＤＮＡを含まないベクター ＤＮＡのみを導入した細胞の場合、「ＳＨ３」は配列番号２のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（配列番号４）、即ちＡＭＡＰ１のＳＨ３領域をコードするポリヌクレオチドを導入した細胞の場合、「ＷＬ」はタンパク質結合性を失わせた変異型ＡＭＡＰ１ ＳＨ３に対応するｃＤＮＡ（配列番号５）を導入した細胞の場合である。
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とマウス乳癌細胞４Ｔ１／ｌｕｃとにおいて配列番号２のポリペプチド（ＡＭＡＰ１のＳＨ３領域）を強制発現させることにより、ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリン複合体におけるパキシリンの結合性が特異的に阻害された。
【実施例２】
【００２６】
乳癌細胞の浸潤活性の阻害
（１）：マトリゲル浸潤活性の抑制
実施例１で得た２４時間培養したヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とマウス乳癌細胞４Ｔ１／ｌｕｃのそれぞれのマトリゲル上での浸潤活性を測定した。細胞をマトリゲルを塗布したBoyden チャンバーの上に播き、その後１２時間における浸潤活性を測定した。結果を図１Ｂに示す。縦軸は未処理の細胞の示すマトリゲル浸潤活性を１００とした時の、各々の処理細胞の相対的浸潤活性を示す。「ＳＨ３」の場合、浸潤活性がヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とマウス乳癌細胞４Ｔ１／ｌｕｃの両方で大幅に低下している。
（２）ゼラチンマトリックスに対する分解活性の抑制
実施例１で得た２４時間培養したヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のゼラチンマトリックスに対する分解活性を測定した。細胞を，蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識しさらにパラホルムアルデヒドにて架橋したゼラチン膜上に移し、その後１６時間におけるゼラチンの分解活性を常法に従って測定することにより評価した。即ち、分解された標識ゼラチンの面積を測定することにより一細胞当たりのマトリックス分解活性を評価した。縦軸は未処理の細胞の示すゼラチン分解活性を１００とした時の、各々の処理細胞の相対的分解活性を示す。結果を図１Ｃに示す。「ＳＨ３」の場合、ゼラチンマトリックスの分解活性が大幅に低下している。
【実施例３】
【００２７】
配列番号１のペプチド導入による乳癌細胞浸潤活性の阻害
ＣＯＳ細胞において強制発現させたＡＭＡＰ１と大腸菌において発現／精製したコルタクチンを用いてＡＭＡＰ１／コルタクチンの複合体の形成の確認と、複合体形成の阻害物質の探索をプルダウン法により行った。
配列番号１のペプチドをメリフィールド固体ペプチド合成法により製造した。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを付加したコルタクチンのｃＤＮＡを大腸菌に導入し、常法により発現誘導し、グルタチオンセファロース（Amersham Biosciences）によりＧＳＴ−コルタクチンを精製した。
ＣＯＳ細胞にヘマグルチニン（ＨＡ）タグを付加したＡＭＡＰ１のｃＤＮＡをリポフェクション法により導入することにより強制発現させた。導入にはＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。遺伝子導入後３６時間、細胞抽出液を１％ ＮＰ−４０バッファーにより作成した。
３００μｇの細胞抽出液に対して、０．１ｍＭの配列番号１のペプチド及び、５μｇの精製したＧＳＴ−コルタクチン及び、１０μｌのグルタチオンセファロースを加え、４℃で２時間インキュベートした。グルタチオンセファロースに吸着したＡＭＡＰ１／コルタクチン複合体を１％ ＮＰ−４０バッファーにより精製した。引き続き、ウエスタンブロット法によりＡＭＡＰ１／コルタクチン複合体形成を検出した。
結果を図２Ｂに示す。「ＮＴ」はペプチドによる処理をしていない場合、「４ｔｈ Ｐｒｏ」は配列番号１のペプチド、即ちＡＭＡＰ１のプロリンリッチ領域第４配列(SKKRPPPPPPGHKRT)により処理をした場合、「AMAP2 Pro」はコルタクチンに対する結合性を示さないＡＭＡＰ２のプロリンリッチ領域からのペプチド（AMVLQPPAPMPRKSQ）（配列番号６）により処理をした場合である。
配列番号１のペプチドがＡＭＡＰ１とコルタクチンとの結合を効果的に阻害することがわかる。このペプチドは０．１ｍＭでインビトロにおけるＡＭＡＰ１とコルタクチンとの結合を９０％以上阻害した。
図２Ｂは、各ペプチドをヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にマイクロインジェクション法にて導入し、ゼラチンマトリックスに対する分解活性を実施例２（２）と同様の方法で調べたものである。配列番号１のペプチドはゼラチンマトリックスに対する分解活性を抑制する。
【実施例４】
【００２８】
配列番号２のポリペプチドの強制発現による乳癌細胞転移活性の阻害（インビボ試験）
配列番号４のヌクレオチド配列を有する（ＡＭＡＰ１のＳＨ３領域に相当する）ｃＤＮＡ（ＳＨ３ ＷＴ）を恒常的に発現した４Ｔ１／ｌｕｃ細胞クローンを作成し、マウスにおけるそれらの転移活性を調べた。結果を図３に示す。コントロールとして、ベクター ＤＮＡのみ、もしくはＳＨ３ ＷＬ ｃＤＮＡ（配列番号５）を発現させた細胞を用いた。
４Ｔ１／ｌｕｃ細胞はルシフェラーゼを発現させたものである。転移活性は１×１０６個の細胞をＢａｌｂ／ｃマウス（メス、６−８週齢）の右側の鼡頚部乳房脂肪組織に注入し、１９日目における左肺への転移を、肺組織抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した（図３Ａ）。ルシフェラーゼ活性の測定には、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いた（Michigami T, Hiraga T, Williams PJ, Niewolna M, Nishimura R, Mundy GR, & Yoneda T.  Breast Cancer Res. Treat. 2002, Oct;75(3):249-258）。また、１９日目における元の注入部位に形成された腫瘍の重さを示す（図３Ｂ）。各々のアッセイには、各細胞クローンに対してマウスを２０匹づつ用いた。配列番号２のポリペプチドを強制発現したマウスでは肺への転移がほとんど認められないことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】ＡＭＡＰ１／コルタクチン／パキシリン複合体の生成と、配列番号２のポリペプチドによる複合体の生成の阻害を示すウエスタンブロット電気泳動図を示す。「ＮＴ」はＤＮＡ導入操作をしていない細胞の場合、「ベクター」はｃＤＮＡを含まないベクター  ＤＮＡのみを導入した細胞の場合、「ＳＨ３」は配列番号２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（配列番号４）のポリヌクレオチドを導入した細胞の場合、「ＷＬ」はタンパク質結合性を失わせた変異型ＡＭＡＰ１ ＳＨ３に対応するｃＤＮＡ（配列番号５）を導入した細胞の場合である。
【図１Ｂ】配列番号２のポリペプチドの強制発現による乳癌細胞浸潤活性（マトリゲルに対する浸潤活性）の阻害を示す。
【図１Ｃ】配列番号２のポリペプチドの強制発現による乳癌細胞浸潤活性（ゼラチンマトッリクスに対する分解活性）の阻害を示す。
【図２Ａ】配列番号１のポリペプチドによる乳癌細胞浸潤活性の阻害：ゼラチンマトッリクスに対する分解活性を示す。ＮＴはＤＮＡ導入操作をしていない細胞の場合、コントロールはｃＤＮＡを含まないベクター ＤＮＡのみを導入した細胞の場合、「４ｔｈ  Ｐｒｏ」は配列番号１のペプチドにより処理をした場合、「ＡＭＡＰ２ Ｐｒｏ」はコルタクチンに対する結合性を示さないＡＭＡＰ２のプロリンリッチ領域からのペプチド（AMVLQPPAPMPRKSQ）（配列番号６）により処理した場合である。
【図２Ｂ】ＡＭＡＰ１／コルタクチン複合体の生成と配列番号１のポリペプチドによる複合体の生成の阻害を示すウエスタンブロット電気泳動図である。
【図３Ａ】配列番号２のポリペプチドの強制発現による乳癌の肺への転移の抑制を示す。  Ｖ-１、Ｖ-２はベクターＤＮＡのみを導入した４Ｔ１／ｌｕｃ細胞クローンを示し、ＳＨ３−１、ＳＨ３−２、ＳＨ３−３は配列番号４のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを恒常的に発現した４Ｔ１／ｌｕｃ細胞クローンを示し、ＷＬ−１、ＷＬ−２、ＷＬ−３は配列番号５のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡ（タンパク質結合性を失わせた変異型ＡＭＡＰ１ ＳＨ３に対応する）を導入した細胞を示す。
【図３Ｂ】乳癌細胞注入部位での腫瘍重量を示す。
【図１Ａ】
2006067968.tif 000002
【図１Ｂ】
2006067968.tif 000003
【図１Ｃ】
2006067968.tif 000004
【図２Ａ】
2006067968.tif 000005
【図２Ｂ】
2006067968.tif 000006
【図３Ａ】
2006067968.tif 000007
【図３Ｂ】
2006067968.tif 000008
【配列表】
2006067968000001.app