(57)【要約】【課題】  正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化してアミロイド化した変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応する抗体を提供すること、及び該抗体により変形β２−ミクログロブリンを測定する免疫測定方法を提供することを目的とする。【解決手段】  本抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、β２−ミクログロブリンのＣ末端側９２番目から９９番目のアミノ酸配列を含むβ２−ミクログロブリンC-末端相同ペプチドを免疫原として得られたモノクローナル抗体であって、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化して不溶化した変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応することを特徴とするものである。このような抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７５９のハイブリドーマの特性を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
β２−ミクログロブリンのＣ末端側９２番目から９９番目のアミノ酸配列を含むβ２−ミクログロブリンC-末端相同ペプチドを免疫原として得られたモノクローナル抗体であって、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化して不溶化した変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応することを特徴とする抗変形β２−ミクログロブリン抗体。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７５９のハイブリドーマの特性を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される請求項１記載の抗変形β２−ミクログロブリン抗体。
【請求項３】
請求項１記載の抗変形β２−ミクログロブリン抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１又は２記載の抗変形β２−ミクログロブリン抗体と変形β２−ミクログロブリンとの特異的反応を利用して、ヒト体液中の変形β２−ミクログロブリンを測定する免疫測定方法。
【請求項５】
請求項１又は２記載の抗変形β２−ミクログロブリン抗体を試薬として含む未発症透析アミロイドーシスの予知診断用又は透析アミロイドーシス治療効果評価用免疫測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト体液中の変形β２−ミクログロブリン、すなわちアミノ酸配列は正常で三次元構造のみが異なるβ２−ミクログロブリンと特異的に反応し、正常なβ２−ミクログロブリンとの交叉反応がない抗体、それを用いた変形β２−ミクログロブリンの免疫測定方法、及び透析アミロイドーシス予知診断用又は治療効果評価用診断薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
長期血液透析患者には、透析アミロイドーシスと呼ばれる骨や関節構造の破壊を主病変とするアミロイド沈着症を発症することが１９８０年に報告され、その前駆蛋白がβ２−ミクログロブリンであることが１９８５年に確認されている。以来、β２−ミクログロブリンのアミロイドジェネシスーアミロイド蛋白への変形に関する研究がなされ、透析アミロイドーシス発症例の臨床サンプルからこれまで幾つかの化学構造のことなるβ２−ミクログロブリンが報告されてきた。しかしながらアミロイド化したβ２−ミクログロブリン(変形β２−ミクログロブリン)につながる報告はなく、依然として透析現場での診断は臨床所見のみでなされている。本病態は今日２２万人超かつ年間新規発症例約１万５千人を数える透析例に必発の病態であり、この十数年QOL最大の障害要因であったが、近年は脊柱管狭窄、心アミロイドなど生命予後に関わる重大な臨床課題となっている。β２−ミクログロブリンは他のアミロイド蛋白と同様にβシート構造を有しin vitroで不溶性のアミロイド線維を形成するが、その分子メカニズムについて最近の構造解析で線維形成に際してN-末端次いでC−末端がunfoldingすることが確認されている。つまりN-末端,C-末端のunfolding(ミスフォルデイング)はアミロイド化に伴う本質的分子構造変化と理解される。従って、この構造変化を特異的に捉えるツールは透析アミロイドーシスの有用な診断ツールとして期待できる。
【０００３】
C-末端unfoldingに関しては１９９７年Stoppiniグループによりモノクローナル抗体による解析でβ２−ミクログロブリンC末端９２−９９に対する抗体でin vitroでのアミロイド形成が抑制されることが報告されたが、本抗体はC末端のみならず正常なβ２−ミクログロブリンとも反応を示している（非特許文献１）。
【０００４】
【非特許文献１】M Stoppini. Et al. Eur. J. Biochem. 249. Pp21-26, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来より、透析アミロイドーシスの患者血清や病変組織からN-末端欠如、AGE(advanced glycation)修飾されたβ２−ミクログロブリンなどが検出され、β２−ミクログロブリンアミロイドジェネシスに関連する物質として透析アミロイドーシスの診断又は治療評価に有用なツールの開発に繋がることが期待されてきたが、臨床病態との関連性も確認されておらず未だ臨床の場で活用されるに至っていない。
【０００６】
本発明は、これらの点に鑑みてなされたものであり、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化してアミロイド化した変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応する抗体を提供すること、及び該抗体により変形β２−ミクログロブリンを測定する免疫測定方法を提供することを目的とし、特に透析アミロイドーシス患者の診断及び治療のモニタリングに適したβ２―ミクログロブリン抗体及び免疫測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、β２−ミクログロブリンのＣ末端側９２番目から９９番目のアミノ酸配列を含むβ２−ミクログロブリンC-末端相同ペプチドを免疫原として得られたモノクローナル抗体であって、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化して不溶化した変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応することを特徴とするものである。このような抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７５９のハイブリドーマの特性を有するハイブリドーマ細胞系によって産生される。
【０００８】
また、本発明は、前記抗変形β２−ミクログロブリン抗体と変形β２−ミクログロブリンとの特異的反応を利用して、ヒト体液中の変形β２−ミクログロブリンを測定する免疫測定方法であり、更には、該抗変形β２−ミクログロブリン抗体を試薬として含む未発症透析アミロイドーシスの予知診断用又は透析アミロイドーシス治療評価用免疫測定試薬である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る抗変形β２−ミクログロブリン抗体は、アミロイド化遷移過程で分子表面に露出してくるβ２−ミクログロブリンのＣ末端側９２番目から９９番目のアミノ酸配列を認識し、正常なβ２−ミクログロブリンに反応せず、立体構造が変化して不溶化したあるいは不溶化しつつある変形β２−ミクログロブリンに特異的に反応する。これにより、ヒト体液中の変形β２−ミクログロブリンに特異的な免疫測定が実現され、未発症透析アミロイドーシスの予知診断、透析アミロイドーシス治療効果のマーカーとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明に係るモノクローナル抗体は、β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチドを作製し、KLHと結合させてBalb/cマウス等の宿主動物に免疫し、その脾細胞を分離しミエローム細胞と融合させハイブリドーマを作製しスクリーニングして得られる。抗原に用いたβ２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチドの検証はマススペクトロメトリーおよびアミノ酸分析器で確認できる。得られたモノクローナル抗体の特異性の確認は直接ELISA および競合ELISA等で行うことができ、さらに血清、血漿炉液、変形β２−ミクログロブリンおよびアミロイド組織(手根管横靭帯)との反応性を確認することが好適である。また、変形β２−ミクログロブリンとして文献的に確立されている酸性処理による酸変性β２−ミクログロブリンを用い、その検証は構造解析の最も一般的手法Circular Dichroism(円二色法)にて行うことができる。
【００１１】
〔β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチド〕
β２−ミクログロブリンのＮ末端より９２番目から９９番目のペプチド鎖は、Cys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Aspのアミノ酸配列であり、これらは正常なβ２−ミクログロブリンの立体構造では完全には分子表面に表出されずに一部分子内に埋没しているが、アミロイド化した或いはアミロイド化しつつある変形β２−ミクログロブリンでは、分子の表面に露呈されると考えられる。このβ２−ミクログロブリンのＮ末端より９２番目から９９番目のアミノ酸配列をエピトープとして、該ペプチド領域に特異的なモノクローナル抗体を作製する為、β２−ミクログロブリンC-末端相同ペプチドを合成し抗原として用いた。
【００１２】
また、本発明に係るモノクローナル抗体の特異性の検証には、アミロイド化β２−ミクログロブリンのモデルとなる変形β２−ミクログロブリンを作製して用いることが好適である。変形β２−ミクログロブリンは、リコンビナントβ２−ミクログロブリンの６N−HCl処理或いはヒト血漿等から得られたβ２−ミクログロブリンを酢酸緩衝液等の酸性溶液中で酸処理して得られる。ヒト血漿はプール血漿等を用いることができ、また、透析患者の血漿ろ過液から精製してもよい。ヒト血漿等からのβ２−ミクログロブリンの精製は、公知且つ任意の方法が使用できる。得られたミクログロブリンは、酢酸緩衝液等により酸性下で所定時間処理される。酸処理のｐＨ領域は２．０〜５．０が好適であり、処理温度及び時間は、ｐＨにより異なるが３７℃で約１０〜６０分間が好適である。また、酢酸緩衝液等の酸性溶液は、塩化カリウムや塩化ナトリウム等を加えて塩濃度を適宜調整する。
【００１３】
〔抗変形β２−ミクログロブリン抗体〕
前記合成ペプチドをKLHと結合させて動物に免疫することにより、変形β２−ミクログロブリンに特異的なモノクローナル抗体を得ることが可能となる。宿主動物は特に限定されるものではなく、マウスやウサギ、ヤギ等を宿主動物とできるが、Balb/cマウスが好適である。該モノクローナル抗体は既に確立された周知の方法（Galfre and Milstein,）により得ることができる。一般には、免疫動物から回収した抗体産生細胞をマウス由来のミエローマ細胞と細胞融合することによってハイブリドーマとし、産生される抗体の活性を指標としてスクリーニングを行う。即ち、ハイブリドーマのクローニングにより得られた抗体と変形β２−ミクログロブリンとの反応性を確認し、更に、正常なβ２−ミクログロブリンとの交差反応を確認し、免疫測定方法において実質上交差反応のない抗体を産生するクローンを選択する。反応性の確認は、直接ELISAや競合ELISA法で可能である。
【００１４】
〔免疫測定法及び免疫測定試薬〕
前記抗体を用いた免疫測定法は、酵素免疫測定法や放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、ビオチンを用いる方法等、また、直接ＥＬＩＳＡや競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ等の周知の免疫測定法を用いることができ、これらの測定手順も公知且つ任意の手順を採用できる。例えば２ステップＥＩＡであれば、先ず検体となる患者血清等ビオチン標識された抗β２−ミクログロブリンポリクローナル抗体と反応させ、その反応液を抗ビオチンポリクローナル抗体を吸着させた９６穴マイクロプレートのウェルに添加し、更に酵素標識された前記モノクローナル抗体、即ち抗変形β２−ミクログロブリン抗体を各ウェルに添加して反応させる。洗浄後、抗変形β２−ミクログロブリン抗体を標識した酵素の基質を添加して反応させて発色させることにより、変形β２−ミクログロブリンを比色定量する。この免疫測定法では、抗ビオチンポリクローナル抗体吸着９６穴マイクロプレート、ビオチン標識抗β２−ミクログロブリンポリクローナル抗体含有第１試薬、酵素標識抗変形β２−ミクログロブリン抗体含有第２試薬、及び基質液で免疫測定試薬が構成される。このような免疫測定試薬は、定性試薬又は定量試薬のいずれでもよい。これら免疫測定法又は免疫測定試薬は、透析アミロイドーシスの診断や治療効果の評価に有用である。検体としては、血清、尿等のヒト体液や、血漿ろ過液等のヒト体液と同等のものを用いることができる。
【実施例】
【００１５】
本モノクローナル抗体の特異性ならびに有用性は患者血清、組織ホモジネートなどの臨床検体との免疫反応およびアミロイド組織での免疫組織化学で検討した。以下、本発明の実施例を示すが、本発明がこれら実施例に限定されるものでないことは当然である。
【００１６】
〔β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９ペプチド〕
β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９相同ペプチドは、バイオシステム／モデル４３０Ａを用いて合成さした。このβ２−ミクログロブリンC-末端９２−９９相同ペプチド（Boc-Cys-Ile-Val-Lys-Trp-Asp-Arg-Asp-Met）を、ＭＢＳ（m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）によりＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin）と結合して抗原とした。
【００１７】
〔抗変形β２−ミクログロブリン抗体〕
Balb/cマウスに、０．５ｍｇの前記変形β２−ミクログロブリンを皮内注射により投与し、更に２週間毎に０．２５ｍｇでの前記変形β２−ミクログロブリンを皮内注射により投与して免疫した。免疫されたマウスのリンパ球を、ポリエチレングリセロール環境下でＰ３Ｕ１ミエローマ細胞と融合し、得られたハイブリドーマを１０％牛胎児血清を含有するＨＡＴ培地で培養した。その培養上静を透析した後、ＤＥＡＥ−セルロース・クロマトグラフィーにより精製して、抗変形β２−ミクログロブリン抗体を得た。
【００１８】
〔特異性試験〕
得られた抗変形β２−ミクログロブリン抗体の特異性は、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨ、酸処理した変形β２−ミクログロブリン及びリコンビナントβ２−ミクログロブリンを用い、直接ＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡで確認した。
本実施例では、透析患者の血漿ろ過液から混在するアルブミンを除去してβ２−ミクログロブリンを単離し、６N−HCLを添加してβ２−ミクログロブリンをアミロイド化した。β２−ミクログロブリンのアミロイド化は光学的構造解析法円二色法にて確認したところ、CDスペクトル(far UV)では波長205nmでのpositive peakの消失および波長218nmでのnegative peakの左方移動とアミロイド様変形が確認された。
【００１９】
〔直接ＥＬＩＳＡ〕
９６穴マイクロプレートにβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨを結合させ、これに抗変形β２−ミクログロブリン抗体を反応させた。詳細には、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１μｇ／ｍｌで溶解し、これをマイクロプレートの各ウェルに０．０５ｍｌ添加して、３７℃で１時間反応させた。各ウェルは、洗浄後ブロックエース（大日本製薬）でブロックした。ビオチン標識した前記抗変形β２−ミクログロブリン抗体を各ウェルに０．０５ｍｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。洗浄後、アビジン−アルカリホスファターゼ標識抗ビオチン複合体を各ウェルに０．０５ｍｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。その後、ｐ−ニトロフェニルリン酸を反応させて、４０５ｎｍで吸光度測定を行い、前記抗変形β２−ミクログロブリン抗体がβ２ミクログロブリンのＣ末端９２−９９と反応することを確認した。
【００２０】
〔競合ＥＬＩＳＡ〕
競合物質は、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨ、前記酸処理β２−ミクログロブリン、及びリコンビナントβ２−ミクログロブリンを用いた。５０μｇ／ｍｌビオチン標識抗変形β２−ミクログロブリン抗体含有リン酸緩衝液に、前記各競合物質を各々０，１０，２０，１００，２００μｇ／ｍｌで含有したリン酸緩衝液を等量で添加して３７℃で１時間反応させ、その反応液を、前述と同様にβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨを結合させたマイクロプレートに添加して反応させ、吸光度を測定した。その結果を表１に示すが、β２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド結合ＫＬＨでは濃度２０μｇ／ｍｌで約１００％の反応阻害がみられ、酸処理β２−ミクログロブリンでは濃度１００μｇ／ｍｌで約７０％、濃度２００μｇ／ｍｌで１００％の反応阻害がみられた。一方、リコンビナントβ２−ミクログロブリンでは顕著な反応阻害はみられなかった。
【００２１】
【表１】
2006022059.tif 000002
【００２２】
〔免疫組織化学〕
透析アミロイドーシス発症症例由来の１７アミロイド組織において、抗変形β２−ミクログロブリン抗体はアミロイド線維形成を示すコンゴーレッド染色陽性部位では一様に陽性であったが、β２−ミクログロブリン蓄積が見られてもコンゴーレッド陰性部位では多くは陽性、一部陰性の二様の染色パターンを示した。このことは抗変形β２−ミクログロブリン抗体がアミロイド化β２−ミクログロブリンのみならずアミロイド化に至る遷移過程上の中間体とも反応しうることを示している。
【００２３】
〔臨床検体〕
抗変形β２−ミクログロブリン抗体はイムノブロッティングで酸処理β２−ミクログロブリン、アミロイド組織ホモジネートと反応を示したが、血清β２−ミクログロブリン、濾液β２−ミクログロブリンとの反応は示さなかった。
【００２４】
〔透析アミロイドーシス患者血清の測定〕
前述の競合ＥＬＩＳＡと同様に、競合物質としてβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチドを用いて０〜１０μｇ／ｍｌの低濃度域での競合ＥＬＩＳＡ測定系を確立して、３２名の透析アミロイドーシス患者から採取した血清を検体として変形β２−ミクログロブリンを測定した。また、表２は０〜１０μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンＣ末端９２−９９ペプチド標準品の測定結果である。この標準品の測定結果から検量線を作成して、透析アミロイドーシス患者血清中の変形β２−ミクログロブリン量を算出したところ、平均値が０．７６μｇ／ｍｌ、標準偏差が０．１５μｇ／ｍｌであり、透析アミロイドーシス患者血清中に変形β２−ミクログロブリンが存在することが確認された。このように、β２−ミクログロブリンC-末端９２−９９の構造異常を特異的に捉える本変形βミクログロブリン抗体は、本病態の前駆蛋白のアミロイド化遷移過程をとらえている可能性が高く、臨症上極めて有望な診断ツールである。
【００２５】
【表２】
2006022059.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明に係る抗変形β２−ミクログロブリン抗体、及びそれを用いた変形β２−ミクログロブリンの免疫測定方法は、ヒト組織中又はヒト体液中の変形β２−ミクログロブリンの特異的検出に用いることができ、透析アミロイドーシス予知診断用又は治療効果評価用診断薬として利用可能である。