(57)【要約】【課題】  電気泳動路の広い範囲における目的物質の分離具合を、電気泳動路中の目的物質の位置に関係なく、ほぼ同一の感度で検出可能とする電気泳動装置を提供する。【解決手段】  電気泳動路を構成する材質として、照射光及び目的物質の蛍光に対してほぼ透明であり、且つ照射光波長における屈折率が、泳動液の屈折率よりも小さいものを用いることにより、泳動液に導入された照射光が泳動路壁で全反射され、減衰することなく泳動液中を伝わり、この照射光によって励起される目的物質の蛍光を一次元型検出器又は二次元型検出器で検出することを特徴とする電気泳動装置によって解決される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正極と負極と、両極の間にあって照射光に対してほぼ透明な泳動液又はゲルを保持する泳動路と、前記泳動路中の目的物質を検出するための光学系とから構成される電気泳動装置であって、前記泳動路を構成する材質として、前記照射光及び前記目的物質から発せられる蛍光に対してほぼ透明であり、且つ前記照射光波長における屈折率が前記泳動液又はゲルの屈折率よりも小さいものであり、前記泳動液又はゲルに導入された照射光が前記泳動路壁で全反射されて、前記泳動路の少なくとも一部に沿って伝達されるように構成されていることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項２】
正極と負極と、両極の間にあって照射光に対してほぼ透明な泳動液又はゲルを保持する泳動路と、前記泳動路中の目的物質を検出するための光学系とから構成される電気泳動装置であって、前記泳動路を構成する材質として、前記照射光及び前記目的物質から発せられる蛍光に対してほぼ透明であり、且つ前記照射光波長における屈折率が前記泳動液又はゲルの屈折率よりも小さいものであり、前記泳動液又はゲルに導入された照射光が前記泳動路壁で全反射されて、前記泳動路の少なくとも一部に沿って伝達されるように構成されており、前記目的物質から発せられる蛍光の検出器が一次元型検出器又は二次元型検出器であることを特徴とする電気泳動装置。
【請求項３】
前記照射光を、前記泳動液又はゲルに効率よく導入するため、前記照射光に対する入射端面と出射端面を有し、前記照射光に対して透明であり、且つ前記泳動液又はゲルに対して耐性を有する光導入具の出射端面を、前記泳動路の試料流出端あるいは試料注入端より内側に位置するまで挿入したことを特徴とする請求項１又は２の電気泳動装置。
【請求項４】
直線状、蛇行状又は渦巻き状の泳動路を備えていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の電気泳動装置。
【請求項５】
泳動路の断面が円形、楕円形、矩形又は溝形であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の電気泳動装置。
【請求項６】
複数の泳動路を備え、二次元型検出器を用いて目的物質を同時に測定することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、タンパク質等の生体関連物質や、多環芳香族炭化水素等の環境汚染物質、乳酸菌等の微生物を分離分析するための電気泳動装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸やタンパク質の分析技術はゲノミクスやプロテオミクスの分野で重要であり、ポリアクリルアミドやアガロース等のゲルをキャピラリーに詰めたキャピラリー電気泳動装置やガラス基板上に細い流路を形成させたマイクロチップ電気泳動装置が使われている。
【０００３】
環境汚染物質や微生物の分離でも、分離能の高い迅速分析が重要となっており、ゲルの代わりに泳動液を用いる電気泳動装置が使われている。これらの電気泳動装置では、通常はキャピラリーあるいはマイクロチップの流路の試料流出端部付近に設けた測定用窓を横切る方向に光を照射し、測定用窓まで分離されながら運ばれてきた目的物質の蛍光あるいは吸光度を測定して検出を行ってきた。
しかし、この構成では、目的物質が測定用窓に到達しないと検出できないという問題があった。また、照射光が測定用窓で散乱され、散乱光によるバックグラウンドノイズのため検出限界が悪くなるという問題があった。
【０００４】
これを解決する手段として、照射光がキャピラリーに沿って照射されるように装置を構成し、目的物質から発せられる蛍光を一次元型又は二次元型検出器を用いて測定することにより、キャピラリーの広い範囲における目的物質の分離具合をモニタリングできる装置が考案されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平５−５２８１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のように、従来の電気泳動装置のうち特許文献１に記された電気泳動装置では、照射光をキャピラリーに沿って照射し、蛍光を二次元型検出器等で検出することにより、キャピラリーの広い範囲における目的物質の分離具合をモニタリングできる特長を有する。
しかし、この電気泳動装置においては、電気泳動路の屈折率が泳動液又はゲルの屈折率よりも大きいため、照射光がキャピラリーに沿って伝達される間に大幅に減衰するので、目的物質の濃度が同じであっても、キャピラリー中の位置によって蛍光強度が大幅に変化し、したがって蛍光強度のみからは濃度を求めることが不可能となる。
また、照射光が導入された位置から遠く離れた位置では、照射光の強度が大幅に減衰するため、検出感度も大幅に低下するという問題があった。さらに、この電気泳動装置では、照射光を電気泳動路に沿って、効率よく泳動液又はゲルに導入するための手段が示されていなかった。
【０００６】
そこで本発明は、キャピラリーあるいはマイクロチップ上の電気泳動路中を移動する目的物質をその位置に関係なく、ほぼ同一の感度で検出可能とする電気泳動装置を提供すること、及び、照射光を効率よく泳動液又はゲルに導入するための手段を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題は、正極と負極と、両極の間にあって照射光に対してほぼ透明な泳動液又はゲルを保持する泳動路と、泳動路中の目的物質を検出するための光学系とから構成される電気泳動装置であって、泳動路を構成する材質として、照射光及び目的物質から発せられる蛍光に対してほぼ透明であり、且つ照射光波長における屈折率が泳動液又はゲルの屈折率よりも小さいものであり、泳動液又はゲルに導入された照射光が泳動路壁で全反射されて、泳動路の少なくとも一部に沿って伝達されるように構成した電気泳動装置によって解決することができる。
【０００８】
このとき、目的物質から発せられる蛍光の検出器として一次元型検出器又は二次元型検出器を用いると、泳動路の広い範囲を同時に測定することができる。
また、照射光を泳動液又はゲルに効率よく導入する課題は、照射光に対する入射端面と出射端面を有し、照射光に対して透明であり、且つ泳動液又はゲルに対して耐性を有する光導入具の出射端面を、前記泳動路の試料流出端あるいは試料注入端より内側に位置するまで挿入することによって解決することができる。
【０００９】
電気泳動装置の泳動路は、直線状、蛇行状又は渦巻き状とすることができる。また、泳動路の断面を円形、楕円形、矩形又は溝形とすることもできる。さらに電気泳動装置に複数の泳動路を設け、二次元型検出器を用いて目的物質を同時に測定することもできる。これらは、測定する物質又は条件に応じて適宜選択することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、キャピラリーあるいはマイクロチップ上の電気泳動路に導入された照射光は、泳動路壁の屈折率が泳動液又はゲルの屈折率よりも低いため、泳動路壁で全反射され、泳動液又はゲルが照射光に対してほぼ透明であれば、すなわち吸光度がほぼゼロであれば、殆ど減衰することなく泳動路を伝わっていく。このため照射光が導入された位置からの距離によらず、泳動路のほぼ全ての位置において、ほぼ同じ強度の照射光が得られることとなり、したがって目的物質の濃度が同じであれば、泳動路中の位置に関係なく、ほぼ同一の感度で目的物質からの蛍光を検出することが可能となるという優れた効果を有する。
また、光源から発せられた照射光は光結合具の入射端面に入射され、出射端面から出射されるが、このとき出射端面の位置を、泳動路の端面よりも内側にしておけば、出射端面から出射された照射光は、泳動路の端面に入射することなく泳動液又はゲルに導入させることができる。
さらに、泳動路壁の屈折率が泳動液の屈折率よりも小さいため、照射光は泳動路壁で全反射されて泳動液又はゲル内を伝達していくという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下では添付の図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。
図１は本発明の電気泳動装置の一実施形態を示す図であり、この電気泳動装置は、正極１と負極２に高電圧を印可するための高圧電源３、正極バッファー槽４と負極バッファー槽５、電気泳動路の役割をするキャピラリー６、キャピラリー６内の泳動液７に照射光源１１から発せられる照射光１６を効率よく導入するための光結合具９、泳動液７を排出し且つ電気的な導通をとるための泳動液排出管８、キャピラリー６と泳動液排出管８と光結合具９を保持するためのコネクター１０、目的物質１２，１３，１４から発せられる蛍光を測定するための光検出器１５を設置した構成を有している。
【００１２】
本装置においては、キャピラリー６の材質として、照射光に対してほぼ透明であり、且つ屈折率が泳動液の屈折率よりも小さいものを用いる。これにより泳動液に導入された照射光はキャピラリー壁で全反射されて、殆ど減衰することなく、泳動液７の中を伝わって行く。このような材質のものとして、例えばテフロンＡＦ（DuPont社：登録商標）があげられる。
また、別の例として、テフロンＡＦを、酸素雰囲気で低温プラズマ処理又は真空紫外線照射等の公知の方法により表面に水酸基を導入したもの、あるいは疎水結合や化学結合などによりイオン性物質を吸着させたもの等の表面改質を施したものを用いることもできる。
【００１３】
泳動液７としては、照射光に対してほぼ透明なものを選択して用いるようにする。本装置において、泳動液７は電気浸透流によって正極から負極方向に流れ、目的物質１２，１３，１４もその流れに乗って負極方向に運ばれるが、電荷や分子の大きさ等の違いによってキャピラリー６中を移動する間に分離される。
この目的物質１２，１３，１４が蛍光性物質であれば、光で励起してその蛍光を検出することにより、キャピラリー６中での位置と濃度を知ることが可能となる。また、微生物などでは蛍光の替わりに散乱光を検出してもよい。
【００１４】
泳動液７に照射光源１１からの照射光を効率よく導入するためには、光結合具９として入射端面が大きく出射端面が小さいロート形状の石英ガラスを用いることができるが、照射光に対して透明なものであれば他の材質、形状のものを用いてもよいことは勿論である。
また、キャピラリーの形状は、断面が円形の細管状に限定するものではなく、断面が円形、楕円形、矩形以外の細管や、平板上に形成した溝等も含まれる。
【００１５】
照射光源１１としては、レーザーやＬＥＤを用いれば高感度検出が可能となるが、目的物質を励起し、蛍光を発生させるものであれば、他の光源を用いてもよいことは言うまでもない。
このようにして泳動液７に導入された照射光は、泳動液７を伝わり、目的物質を励起して、全方向に蛍光を発生させるため、その一部の蛍光はキャピラリー６の壁を透過して、光検出器１５によって検出される。
一方、泳動液７を伝わる照射光１６は、キャピラリー壁の屈折率が泳動液７の屈折率よりも小さいため、壁で全反射されてキャピラリー６の壁を透過することがない。このため、照射光は光検出器１５に達せず、バックグラウンド光によるノイズが無視できるほど小さくなり、高感度検出が可能となる。
【００１６】
光検出器１５として、フォトダイオードアレイ等の一次元型検出器や、ＣＣＤのような二次元型検出器を用いることにより、キャピラリー６の広い範囲を一度に測定することが可能となり、分離の具合をモニタリングすることも可能となる。
さらに、キャピラリー壁の屈折率が泳動液７の屈折率よりも小さいため、照射光の減衰が無視できるほど小さく、同一の目的物質はキャピラリー中の位置によらずに、ほぼ等しい感度で測定が可能となる。
【００１７】
図２は本発明の電気泳動装置において、照射光を泳動路壁端面に導入することなく、泳動液又はゲルに効率よく入射させるための、光導入部の一実施形態を示す図である。
この光導入部は、泳動路の試料流出端あるいは試料注入端のいずれにも設置することが可能であるが、注入された試料の分離能を維持するためには、試料流出端に設置することが、より望ましい。
【００１８】
照射光源１１から発せられた照射光１６は光結合具９の入射端面１７に入射され、出射端面１８から出射される。このとき出射端面１８の位置を、キャピラリー６の試料流出端１９よりも内側（図２では左側）にしておけば、出射端面１８から出射された光は、キャピラリー壁の屈折率が泳動液７の屈折率よりも小さいため、キャピラリー６の壁で全反射されて泳動路壁内部に入射することなく、泳動液７に入射される。
これにより照射光はキャピラリー６に沿って伝達され、キャピラリー壁から外部に漏れることが殆どなくなるため、バックグラウンド光が著しく減少し、微弱な蛍光を検出しやすくなる。
【００１９】
光結合具９としては、石英ファイバーやプラスチックファイバーを用いることができる。もちろん、これらの材質に限らず、照射光に対して透明であり且つ泳動液に対して耐性のあるものであれば、他の材質を用いてもよい。また、ファイバーを屈折率の大きいコアと屈折率の小さいクラッドからなる光ファイバー型としてもよい。
【００２０】
図３は、本発明の電気泳動路の、別の実施形態を示す図である。キャピラリーは一般に直線状のものが用いられるが、図３（ａ）に示すように蛇行しているもの（ミアンダー状）や、図３（ｂ）のように渦巻き状のものでもよい。
また、形状も必ずしもキャピラリー状である必要はなく、マイクロチップ上に形成させた溝状の流路であってもよい。このような場合でも、ＣＣＤのような二次元型検出器を用いることにより、泳動路の広い領域を同時に測定することが可能となる。
【００２１】
図４は、本発明の複数の泳動路を用いる電気泳動装置の一実施形態を示す図であり、照射光源１１から出射された光１６は、光ファイバーバンドル２０に入射され、光ファイバー２１，２２，２３を伝わって、各々電気泳動路２４，２５，２６に入射される。この場合にもＣＣＤのような二次元型検出器を用いることにより、複数の泳動路での分離状況を一度に測定することが可能となる。
【実施例】
【００２２】
図１に例示した構成において、キャピラリー６としては内径0.10 mm、外径0.99 mm、長さ750 mmのDuPont社製Teflon（登録商標）AFチューブを使用したが、必要な分離能が得られるものであれば、他の寸法のものを用いることができる。もちろんTeflon（登録商標）AFチューブ以外にも、照射光に対して透明であり、泳動液よりも屈折率の低い材質のチューブを用いることができる。
照射光源１１としては、出力10 mWのArイオンレーザーを使用し、488 nmの波長の光を励起光として利用した。この励起光をキャピラリー６の内部の泳動液７に入射するための光結合具９としては、図２に示す構造のものを使用し、コア径25μm、クラッド層15μm、長さ50 mmの石英製光ファイバーを、キャピラリーの試料流出端より約5 mm内部に挿入した。  
【００２３】
目的物質として抗乳酸菌抗体に蛍光試薬Fluorescein-isothiocyanate（FITC）で誘導体化したものを、泳動液７としてホウ酸緩衝液（pH9.0）にアルギン酸ナトリウムを添加したものを用いたときに得られる蛍光強度とバックグラウンド光強度との比を、従来型のキャピラリーを横切る方向から励起光を照射する装置と、本発明の電気泳動装置で測定した値とを比較したものを、表１に示す。
もちろん、目的物質と蛍光試薬及び泳動液の組合せはこれに限るものではなく、目的物質の種類に応じて、様々な種類の蛍光試薬と泳動液を選ぶことが可能であることは言うまでもない。
【００２４】
【表１】
2006153683.tif 000003
【００２５】
本発明では、キャピラリー壁面での励起光の漏れが少ないため、蛍光／バックグラウンド光の比が従来型の装置より、約8倍向上している。
また、表２は、泳動時間を変化させることにより、上記目的物質のキャピラリー６中での泳動液流出端からの位置を変化させたときの蛍光強度とバックグラウンド光強度を示したものであるが、両者とも位置にかかわらず、ほぼ同じ強度を与えていることが分かる。
【００２６】
【表２】
2006153683.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、キャピラリーあるいはマイクロチップ上の電気泳動路に導入された照射光は、導入された位置からの距離によらず、泳動路のほぼ全ての位置において、ほぼ同じ強度の照射光が得られるので、キャピラリーあるいはマイクロチップ上の電気泳動路中を移動する目的物質をその位置に関係なく、ほぼ同一の感度で検出可能となり、物質の検出又は分析用電気泳動装置として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の電気泳動装置の一実施形態を示す図である。
【図２】本発明の電気泳動装置において、泳動液に照射光を導入するための光導入部の一実施形態を示す図である。
【図３（ａ）】本発明の電気泳動装置において用いることができる泳動路の一実施形態として、蛇行している泳動路を示す図である。
【図３（ｂ）】本発明の電気泳動装置において用いることができる泳動路の一実施形態として、渦巻き状の泳動路を示す図である。
【図４】本発明の複数の泳動路を用いる電気泳動装置の一実施形態を示す図である。
【符号の説明】
【００２９】
１  正極
２  負極
３  高圧電源
４  正極バッファー槽
５  負極バッファー槽
６  キャピラリー
７  泳動液
８  泳動液排出管
９  光結合具
１０  コネクター
１１  照射光源
１２、１３，１４  目的物質
１５  光検出器
１６  照射光
１７  入射端面
１８  出射端面
１９  キャピラリー試料流出端
２０  光ファイバーバンドル
２１，２２，２３  光ファイバー
２４，２５，２６  電気泳動路
【図１】
2006153683.tif 000005
【図２】
2006153683.tif 000006
【図３（ａ）】
2006153683.tif 000007
【図３（ｂ）】
2006153683.tif 000008
【図４】
2006153683.tif 000009