(57)【要約】【課題】  本発明は、ウマの運動器障害またはそのリスクを検出する方法を提供することを課題とする。本発明はさらに、ウマの運動器障害が重大な段階に至る前に、不顕性の腱炎や微小骨折の段階でこれを検出することにより、その障害の発症または再発を未然に防ぐことを課題とする。【解決手段】  発明者らは、上記課題について鋭意研究を行った結果、血液中に出現するコラーゲン分解産物の一つであるＩ型コラーゲン架橋-N末端テロペプチド（NTx）のレベルを測定することで、臨床的には判定できない程度の運動器障害を検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、血液中のＩ型コラーゲン架橋-N末端テロペプチド（NTx）のレベルを測定することにより、ウマの運動器障害またはそのリスクを検出する方法、ならびに抗NTx抗体を含むウマの運動器障害またはそのリスクを検出するためのキットを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中のＩ型コラーゲン架橋-N末端テロペプチド（NTx）のレベル
を測定することによる、ウマの運動器障害リスクの検出方法。
【請求項２】
検出する障害が腱炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検出する障害が微小骨折である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
抗NTx抗体を含む、ウマの運動器障害リスクを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来の方法では検出できない競争馬の不顕性の腱炎や微小骨折等の運動器障害リスクの検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在日本国内には、6万頭を越える数の競走馬が飼育され、年間約8500頭のサラブレッドが生産されている。これらの競走馬は、数年間のトレーニングの後、レースに出走する。近年のトレーニング技術の向上ならびに血統的な改善の結果、レースにおけるスピードが向上する一方、馬体にかかるレースの負荷が高まり、それに伴って高速レースに耐える馬体をつくるために、トレーニングにおける負荷も高まっている。そのような状況の下、トレーニング技術の向上にもかかわらず、依然として多くの競走馬に浅指屈筋腱炎等の腱炎（以下、単に腱炎という）や微小骨折等の運動器障害が頻発している。
【０００３】
腱炎は、競走馬にとっては「不治の病」とも呼ばれ、最も深刻な運動器障害の一つである。腱炎は、コラーゲン細線維の断裂が原因となって、突発的に跛行や腫脹などの症状を呈し、触診や超音波診断などを行うことではじめて腱炎と確定される。腱炎の発症に先立って、微小なコラーゲン細線維の断裂がおき腱組織の変性が進行すると考えられている（未発症腱炎）が、この未発症腱炎は外見的に異常を示さないのが特徴であり、腱炎として外見的な症状を認めたときはすでに重篤な段階に至っている。このため、未発症腱炎の状態で未然に腱炎の発症を検出できれば好ましいが、未発症腱炎の状態では、ウマは腱に疼痛を認めず、腱組織の中に血腫などの多量の液性成分を生じることもないため、触診や超音波によって腱組織の変性を臨床的に事前にとらえることは不可能である。したがって、現段階では未発症腱炎を臨床的に検出することはきわめて難しい。
【０００４】
一方、微小骨折は、成長途上の2〜3歳の馬の第三中手骨（管骨）に見られる微小な亀裂骨折で、しばしば激しいトレーニングによって生じる。この骨折を放置すると管骨骨膜炎に発展し、ウマの運動能力を極度に低下させる。微小骨折も腱炎同様、深刻な運動器障害の一つである。しかしながら、現段階ではオートラジオグラフィーやComputed Radiography（CR）と呼ばれるX線撮影の画像処理などの特殊な方法であれば微小骨折を検出することは可能であるが、通常のX線撮影では骨折部位の確定はおろか骨折の有無すら確認することは不可能である。
【０００５】
現在のところ、これらの運動器障害に対する治療法は充分に確立されていないため、ひとたび腱炎や微小骨折が一因と考えられている骨膜炎が発症し重大な段階に至ると、完治は困難である。また治療に専念する期間（最低でも約一年間）は、競走馬としてレースに参加できず、また治療の経過とともに炎症などの運動器障害の症状は、外見上は消長して治癒するが、仮に治癒したとしてもトレーニングの再開やレースなどによる負荷が引き金となって同じタイプの運動器障害を比較的高い確率で再発する。しかしながら、外見的な運動器障害が消長しており、また再発についての指標も知られていなかったので、獣医臨床的には、再発の可能性を発見するのはきわめて難しい。
【０００６】
これまでは、このようなトレーニングやレースをどのような回復の程度の時に再開すべきかは、もっぱら獣医師が経験に基づいて判断していたため、その判断は獣医師によってもまちまちであり、その時期を客観的に知ることができなかった。しかしながら、現実にはトレーニングを再開する時期は、関係者にとっては非常に重要な判断事項であり、この判断を誤って運動器障害を再発すれば、場合によってはウマの死を意味しており、できるだけ客観的な判断基準が求められている。このように、これらの運動器障害は競馬界においては深刻な問題である。
【０００７】
発明者らは、運動器障害がすでに発症した場合において、血液中のＩ型コラーゲン架
橋-N末端テロペプチド（NTx）の量が正常と比較して有意に上昇することを見いだした（第16回日本ウマ科学会学術集会、平成15年12月2日、「腱損傷後における治癒過程をモニターする分子マーカーとしてのNTxの有用性」、保坂善真、樋口豪紀、翁長武紀、山本悦子、植田弘美、竹花一成）。しかしこれまでのところ、不顕性の腱炎や微小骨折を検出するための技術は確立されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ウマの運動器障害リスクを検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、上記課題について鋭意研究を行った結果、血液中に出現するコラーゲン分解産物の一つであるＩ型コラーゲン架橋-N末端テロペプチド（NTx）のレベルを測定
することで、臨床的には判定できない程度の不顕性の運動器障害、すなわち運動器障害リスクを検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、血液中のＩ型コラーゲン架橋-N末端テロペプチド（NTx）のレ
ベルを測定することにより、臨床的には判定できないウマの不顕性の腱炎若しくは微小骨折を検出し、その結果、ウマの運動器障害リスクを検出する方法に関する。
【００１１】
I型コラーゲン分子は、骨基質の主要な構成タンパク質であることが知られているコラーゲンであり、両端のテロペプチド領域を中心に、ピリジノリンまたはデオキシピリジノリンと呼ばれる物質を介して、分子間で安定な架橋構造を形成している。ヒトの場合、何らかの原因で骨吸収が生じると、I型コラーゲンが分解され、N末端側からI型コラーゲンの分解産物であるNTxが、血中に放出されることが知られており、この知見を利用して、血中NTxレベルの検出が骨粗鬆症の診断等に使用されている。
【００１２】
本発明の発明者らは以前に、実際に運動器障害をすでに発症しているウマにおいて、血中のNTx濃度が上昇していることを見いだした。本発明の発明者らは、この知見をさらに発展させ、外見上は運動器障害の症状を示していないものの、運動器障害を発症するリスクを有しているウマ、すなわち不顕性の運動器障害を有している場合においても、その値が上昇していることを見いだした。したがって、血中のNTx濃度を測定することにより、外見上は運動器障害の症状を示していない状態であっても、そのウマがその後運動器障害を発症するリスクを検出することができる。
【００１３】
ウマの血中NTx濃度は、正常な状態で10 ng BCE/L程度である（ここで、BCEとは、Bone Collagen Equivalentの略）（実施例1を参照）。本発明においては、ウマが外見上は運動器障害の症状を示していない場合であっても、血中NTx濃度が高いウマほど、その後運動器障害を発症する可能性が統計的に有意に高まることを明らかにした。すなわち、血中NTx濃度が、不顕性の運動器障害の指標として機能し、ひいては運動器障害を発症する可能性を示す指標として機能することを明らかにした。本発明においては、外見上は運動器障害の症状を示していない場合であっても、ウマの血中NTx濃度が15 ng BCE/L以上の場合に、そのウマが運動器障害を発症するリスクを非常に高く有する、すなわち「高度リスク群」と判断することができ、ウマの血中NTx濃度が12 ng BCE/L以上の場合に、そのウマが運動器障害を発症するリスクを有する、すなわち「中程度リスク群」と判断することができる。また、いったん運動器障害を発症したことがあるウマの場合には、ウマの血中NTx濃度が12〜15 ng BCE/Lの場合であっても「高度リスク群」に分類されると判断することもできる。
【００１４】
本発明において「運動器障害」という場合、獣医学的に診断した場合に、実際にウマの歩様に異常が検出される場合や、腱炎、骨折などの障害ならびにそれに伴う炎症等の異常が検出される場合の、外見的に症状を検出することができる運動器障害のことをいう。これまで運動器障害を発症したことがない個体が初めて運動器障害を発症する「初発」の運動器障害と、一旦運動器障害を発症した後に再度運動器障害を発症する「再発」の運動器障害とにおいて生じる炎症などの病態を比較した場合、両者の間には差異は存在しない。
【００１５】
一方、運動器障害の「リスク」を有するという場合、外見上はウマの行動に異常は見られず、また腱炎、骨折などの障害ならびにそれに伴う炎症等の異常が検出されないため（いわゆる不顕性の状態）、獣医臨床学的にも運動器障害とは診断できないが、ウマの体内では不顕性の腱炎や微小骨折などの運動器障害の前触れが生じている場合をいう。前述したとおり、「初発」の運動器障害の病態と、「再発」の運動器障害の病態とのあいだには差異は存在しないことからも明らかなように、このような「リスク」の概念には、これまで運動器障害を発症したことがない個体が初めて運動器障害を発症するリスク、および一旦運動器障害を発症した後運動器障害を再発するリスクの両方ともが含まれる。
【００１６】
運動器障害のリスクを「検出する」ことにより、ウマの運動器障害が重大な段階に至る前に、または運動器障害の治癒後に再度の運動器障害を発症する前に、外見的な運動器障害を発症するリスクを不顕性の腱炎や微小骨折の段階でこれを検出することができ、その運動器障害の発症または再発を未然に防ぐことが可能になる。
【００１７】
ウマの血中NTx濃度を測定するための方法としては、当該技術分野において既知のタンパク質定量法を使用することができ、例えばELISA法、ウェスタンブロット法、プロテインチップ法などを使用することができる。本発明の方法においては、定量の迅速性、容易性ならびにコストなどの観点から総合的に判断すると、上述した様々な既知のタンパク質定量法のうち、ELISA法を使用することが望ましい。
【００１８】
これらの方法においては、検出すべきNTxを認識する抗体を使用することが必要である。本発明で使用される抗体の種類は、NTxと反応するものであれば種類を限定しないが、例えば、マウス抗ヒトNTx抗体1H11（ATCC HB 10611ハイブリドーマ由来抗体）を使用することができる。
【００１９】
本発明はさらに、ウマの運動器障害リスクを検出するための、抗NTx抗体を含むキットにも関する。例えば、NTxを結合させた固相およびNTx検出用抗NTx抗体を含む競合的反応型ELISAキット、または抗NTx抗体を結合させた固相、およびNTx検出用抗NTx抗体を含むサンドイッチ型ELISAキット、等の種々のELISAキットを提供することができる。
【００２０】
また、本発明で使用するNTx検出用抗NTx抗体を検出する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、NTx検出用抗NTx抗体をペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ；HRP）などの検出可能な分子で標識しておき発色基剤を発色させることにより検出する方法、NTx検出用抗NTx抗体をビオチン標識しておき、ビオチンをアビジンを使用した検出系により検出する方法、あるいはNTx検出用抗NTx抗体を認識する標識二次抗体（例えば抗NTx抗体がマウス由来のIgG抗体であれば抗マウスIgG抗体）を使用し、この二次抗体を上述したHRP系またはビオチン-アビジン系等を用いて検出する方法、等のいずれの方法であっても、本発明において使用することができる。
【００２１】
このようにして作製するキットには、ウマの運動器障害のリスクの指標などを明記した使用説明書、すなわち、ウマの血中NTx濃度が15 ng BCE/L以上の場合には「高度リスク群」に分類され、またウマの血中NTx濃度が12 ng BCE/L以上の場合には「中程度リスク群」に分類されること、ならびにいったん運動器障害を発症したことがあるウマの場合には、ウマの血中NTx濃度が12〜15 ng BCE/Lの場合であっても「高度リスク群」に分類されること、などを明記した使用説明書、が含まれていてもよい。
【００２２】
キットにはさらに、反応時に使用する緩衝液や、NTx検出用抗NTx抗体を検出するために使用するいずれの構成要素が含まれていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、ウマより採取した血液より血清を分離後、抗NTx抗体を使用して、血清中のNTxを測定する。測定は、合成NTxを固定化した測定プレートに、血清と酵素標識1H11抗体を添加して、固相上に固定化された合成NTxと血清中に含まれるNTxとの間で競合的に反応させることにより行う。測定プレートを洗浄したのちに発色試薬を添加して、酵素反応によって発色した反応液の吸光度を測定し、血清中のNTx量を算出する。酵素標識1H11抗体は固定化された合成NTxまたは血清中のNTxと競合的に反応するので、血清中のNTxが多いほど固定化された合成NTxと反応してプレート内に残る酵素標識1H11抗体の量は減少する。つまり、サンプル血清中のNTx濃度が高いほど、発色が少ないことになる。
【００２４】
以上の方法によってウマの血液中のNTx値を測定すると、特異的に高値を示した個体が、外見上は運動器障害の臨床的所見を示していないものの、その後に高い頻度で腱炎や骨膜炎を発症した。このように、血清中のNTx値を測定することでウマの不顕性の腱炎や微小骨折を重大な段階に至る前に検出することを可能とし、その障害を未然に防ぐことができる技術であることが判明した。
[発明の効果]
【００２５】
本発明により、ウマに頻発する腱炎や微小骨折を、外見上は運動器障害の臨床的所見を示していない早期に検出し、トレーニングの停止や出走の取りやめを決定できることにより、重大な運動器障害の発生を未然に防止することができる。また、いったん運動器障害を発症してしまった後、ウマが実際にトレーニングを再開できる状態まで回復しているか否かを客観的に判定することができ、運動器障害の再発を未然に防止することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。
実施例1：ウマ血中のNTx濃度
この実施例においては、まずウマの血中NTxが、腱の状態とどのような関係にあるのかを明らかにした。
【００２７】
被検ウマ個体として、腱炎や骨折などの運動器障害を示さない「正常群」個体（23個体）、運動器障害である腱炎を発症して100日以内の「急性および亜急性群」個体（33個体）、腱炎を発症して100日を越えた「慢性群」個体（12個体）、そして対照として腱鞘炎を発症している「腱鞘炎群」個体（6個体）を使用した。腱鞘炎は、炎症は起こっているものの、その症状自体が腱炎などの運動器障害とは異なるものとして獣医学的に検出できる症状であり、予後も良好であることが知られている。
【００２８】
これらのウマより採取した血液を20分間室温に放置した後、遠心分離機によって血清を分離後、市販ELISA法測定キットであるOSTEOMARK NTx Serum（Ostex International社製）を用いて計測を行った。
【００２９】
すなわち、合成NTxを固定化した測定プレートの各ウェルに、検体希釈液で5倍に希釈した標準溶液、コントロール血清または被検ウマ個体から採取した血清のいずれかを100μL加えた。さらに、各ウェルに酵素標識1H11抗体（ATCC HB 10611ハイブリドーマ由来抗体）溶液を100μL加え、プレートシールをした後に15〜20秒間撹拌した。その後20〜25℃で90分間静置し、抗原抗体反応の原理を利用して血清中のNTxないし固定化合成NTxと酵素標識1H11抗体とを競合的に反応させた。抗原抗体反応終了後、各ウェルの溶液を除去し、洗浄液で5回洗浄した。洗浄液を完全に除去した後、発色試液200μLを各ウェルに加え、プレートシールをして20〜25℃で30分間静置し酵素反応をおこした。反応時間を経過したら停止剤100μLを各ウェルに加え、酵素反応を停止した。15〜20秒間撹拌しその後20〜25℃で5分間静置し、波長450 nmにおける吸光度を測定した。標準溶液を元に得られた吸光度を用いて標準線を作成し、また、コントロール血清およびウマから採取した血清を測定して得られた吸光度からNTx濃度を読みとり、ウマの血清中のNTx濃度を算出した。
【００３０】
統計的処理は、SAS Stat View version J 5.0 for Macintoshソフトウェアを使用して、データをスチューデントのtテストにより処理し、p＜0.05の場合に、有意差が存在すると設定した。結果を表1にまとめた。表1において、データは、平均±標準偏差で示した。
【００３１】
【表１】
2006090786.tif 000002
【００３２】
その結果、血中のNTx濃度は、腱炎などの運動器障害を起こしていない正常群では、9.8±0.9 nmol BCE/Lであったのに対して、腱炎群では、「急性および亜急性群」と「慢性群」とを合わせた「腱炎群」では、18.5±2.1 nmol BCE/Lであり、両者の間には統計学的に有意な差が見られた。すなわち、運動器障害である腱炎を発症している場合には、血中のNTx濃度が有意に上昇することが明らかになった。
【００３３】
一方、「腱鞘炎群」の個体について血中のNTx濃度を測定したところ、10.7±2.3 nmol BCE/Lであり、この値は「正常群」での9.8±0.9 nmol BCE/Lとのあいだで有意差が見られなかった。このことから、「腱炎群」の個体の体内では、「腱鞘炎群」の個体の体内で生じている事象とは全く異なる事象が発生しており、両者が全く別の症状であることが、分子的にも明らかになった。
【００３４】
上述の腱炎群をより詳細に、「急性および亜急性群」と「慢性群」とに分けてさらに調べたところ、それぞれ血中のNTx濃度が23.4±2.9 nmol BCE/Lならびに11.9±1.0 nmol BCE/Lであることがわかった。「急性および亜急性群」での血中のNTx濃度は、「腱炎群」と比較しても「腱鞘炎群」と比較しても、有意な差が存在することがわかった。
【００３５】
以上の結果から、血中のNTx濃度を測定することにより、運動器障害を発症していない「正常群」と腱炎を発症している「腱炎群」とを明瞭に区別することができ、一方で外見上炎症という共通する症状を示す「腱炎群」と「腱鞘炎群」とも、明瞭に区別することができることが明らかになった。
【００３６】
一方、「慢性群」での血中のNTx濃度は、「正常群」の個体の血中NTx濃度と比較した場合、統計学的には有意差が見られないものの、その平均値が明らかに上昇しているという傾向を有することがわかった。
【００３７】
実施例2：不顕性の運動器障害の検出例
本実施例は、外見上は腱炎や骨折などの運動器障害を発症していないウマ個体において、運動器障害の兆候が見られるかどうかを調べるために行った。
【００３８】
腱炎や骨折などの運動器障害を外見上は示さない10個体を、被検ウマ個体として使用した。
各個体の血中NTx濃度の測定は、実施例1と同一の方法により行った。
【００３９】
表２に過去に運動器障害がなく、また採血の段階で獣医師によって運動器に異常なしと診断されたウマから採取した血液中のNTx濃度と、その後の運動器障害についての転帰を示す。
【００４０】
【表２】
2006090786.tif 000003
【００４１】
多くのウマのNTx濃度はおよそ10 nmol BCE/L前後の値を示しているが、15 nmol BCE/ L以上の値を示した個体は、高い頻度で腱炎あるいは骨膜炎等の運動器障害を発症しやすいことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明により、ウマに頻発する腱炎や微小骨折を、外見上は運動器障害の臨床的所見を示していない早期に検出し、トレーニングの停止や出走の取りやめを決定できることにより、重大な運動器障害の発生を未然に防止することができる。また、いったん運動器障害を発症してしまった後、ウマが実際にトレーニングを再開できる状態まで回復しているか否かを客観的に判定することができ、運動器障害の再発を未然に防止することができる。