(57)【要約】【課題】  軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による職業性の喘息性アレルギーの抗原物質を突き止めると共にgfp（green fluorescence protein）-like protein、cfp（cyan fluorescent protein）等の蛍光性タンパク質を特定する。【解決手段】  本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは、部分アミノ酸配列としてGln-Ser-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe-Ser-Trp-Glu-Arg、又はTyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lysからなる配列を含むもので、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による職業性の喘息性アレルギー疾患の予防、診断又は治療のための試薬・薬剤の開発等に利用できる。【選択図】  図３
2006306858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分アミノ酸配列としてGln-Ser-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe-Ser-Trp-Glu-Argからなる配列を含む、ことを特徴とする軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による喘息性アレルギーのアレルゲン。
【請求項２】
前記請求項１に記載の喘息性アレルギーのアレルゲンにおいて、
Gln-Ser-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe-Ser-Trp-Glu-Argの部分アミノ酸配列からなる蛍光性蛋白質であることを特徴とする軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による喘息性アレルギーのアレルゲン。
【請求項３】
前記請求項１又は２に記載の喘息性アレルギーのアレルゲンにおいて、
軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来し、分子量が約２２kDaであることを特徴とする喘息性アレルギーのアレルゲン。
【請求項４】
部分アミノ酸配列としてTyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lysからなる配列を含む、ことを特徴とする軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による喘息性アレルギーのアレルゲン。
【請求項５】
前記請求項４に記載の喘息性アレルギーのアレルゲンにおいて、
Tyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lysの部分アミノ酸配列からなる蛍光性蛋白質であることを特徴とする軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による喘息性アレルギーのアレルゲン。
【請求項６】
前記請求項４又は５に記載の喘息性アレルギーのアレルゲンにおいて、
軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来し、分子量が約２７kDaであることを特徴とする喘息性アレルギーのアレルゲン。
【請求項７】
前記請求項１ないし６のいずれかに記載の喘息性アレルギーのアレルゲンにおいて、
励起波長２９８nmで励起した状態で、少なくとも３５０nm、４３０nm、４８０nm、５０５nm、５７０nm、及び６６０nmの各蛍光波長にピークのある蛍光スペクトルが得られることを特徴とする喘息性アレルギーのアレルゲン。
【請求項８】
軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来し、部分アミノ酸配列としてTyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lysからなる配列を含み、且つ分子量が約４０kDaであることを特徴とする蛍光性タンパク質。
【請求項９】
軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来し、部分アミノ酸配列としてTyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lysからなる配列を含み、且つ分子量が約１７kDaであることを特徴とする蛍光性タンパク質。
【請求項１０】
軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来し、部分アミノ酸配列としてThr-Met-Thr-Tyr-Glu-Asp-Lys-Gly-Ile-Cys-Thr-Ile-Argからなる配列を含み、且つ分子量が約１７kDaであることを特徴とする蛍光性タンパク質。
【請求項１１】
前記請求項７ないし１０のいずれかに記載の蛍光性タンパク質において、
励起波長２９８nmで励起した状態で、少なくとも３５０nm、４３０nm、４８０nm、５０５nm、５７０nm、及び６６０nmの各蛍光波長にピークのある蛍光スペクトルが得られることを特徴とする蛍光性タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喘息性アレルギーを引き起こす喘息性アレルギーのアレルゲンに関し、特に軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による職業性の喘息性アレルギーのアレルゲンに関する。なお、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）は、花虫綱八放サンゴ亜綱ウミトサカ属ベニウミトサカの種名である。これについて、近年の種名表記では、Scleronephthya gracillima (Kukenthal)（注：Kukenthalのuはウムラウト付）に改められることが一般的となりつつあるが、本明細書及び特許請求の範囲では、Alcyonium gracillimumを使用する。また、種名は一般にイタリック体で表記するが、本明細書では、文中での識別が容易であるため簡略に通常書体での表記とする。
【背景技術】
【０００２】
南方海域では、毎年９月から翌４月までの間、イセエビ漁がおこなわれる。そのイセエビ漁期において、イセエビ漁の網にかかった軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）を網からはずす作業を繰り返し行うことにより、くしゃみ、鼻汁、眼結膜の充血、喘息発作、などのアレルギー症状が報告されていた。これらの症状は漁期のみに起こる、という特徴がある。
【０００３】
このように海洋生物による、職業性アレルギーが発症するようになった原因の１つとして、近年イセエビ漁の方法が変化し、海底３０〜５０ｍを網で操業することで、これまで接触することがなかった、海洋生物との接触が原因であることがわかっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
喘息性アレルギーのアレルゲンは、イセエビ魚を行う職業の職業性アレルギーとして知られていたが、その原因を具体的な原因物質として特定されていなかった。
本発明は、前記課題を解消するためになされたもので、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による職業性の喘息性アレルギーの抗原物質を突き止めると共に、そのアレルゲンと同一タンパク質と考えられるgfp（green fluorescent protein）-like protein、cfp（cyan fluorescent protein）等の蛍光性タンパク質を特定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは、部分アミノ酸配列としてGln-Ser-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe-Ser-Trp-Glu-Arg（配列番号１）からなる配列を含むものである。
また、本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは必要に応じて、Gln-Ser-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe-Ser-Trp-Glu-Arg（配列番号１）の部分アミノ酸配列からなる蛍光性蛋白質であるものである。
【０００６】
また、本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは必要に応じて、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来する分子量が約２２kDaであるものである。
また、本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは、部分アミノ酸配列としてTyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lys（配列番号２）からなる配列を含むものである。
また、本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは必要に応じて、Tyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lys（配列番号２）の部分アミノ酸配列からなる蛍光性蛋白質であるものである。
また、本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは必要に応じて、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来する分子量が約２７kDaであるものである。
また、本発明に係る蛍光性タンパク質は、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）に由来し、部分アミノ酸配列としてThr-Met-Thr-Tyr-Glu-Asp-Lys-Gly-Ile-Cys-Thr-Ile-Arg（配列番号３）からなる配列を含み、且つ分子量が約１７kDaであるものである。
【発明の効果】
【０００７】
（１）本発明に係る喘息性アレルギーのアレルゲンは、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による職業性の喘息性アレルギー疾患の予防、診断又は治療のための試薬・薬剤の開発等に利用できるという効果を有する。
【０００８】
（２）通常、アレルギー診断においてアレルゲンを特定する場合、抗原と１次抗体反応、及び２次抗体反応、ラベル化、染色などをおこなっていき、３段階以上の操作が必要であるが、本発明に係る蛍光性タンパク質を用いると、患者血清中の抗体とこの蛍光性タンパク質抗原との反応を行わせることで、１段階の操作後に、その抗原抗体複合体を蛍光ランプで検出し定性的に診断できる。更に、その抗原抗体複合体を蛍光光度計で定量的に診断できる可能性があるなど、簡易方法で診断薬キットとして利用できる。さらに、この抗原タンパク質は複数の蛍光波長を有しているので、それぞれの蛍光色で、複数の抗体タンパク質を特定していくことにも応用可能である。
【０００９】
（３）本発明に係る蛍光性タンパク質に、励起波長として１波長（２９８nm）で励起をおこなったとき、同時に最大５波長の蛍光が得られる。それぞれの蛍光スペクトルのピークトップは、350nm（purpleより紫外部）、430nm（purple）、480nm（cyan）、505nm（green）、570nm（orange）、660nm（deep red）の５種類であり、多蛍光色を特徴とする。こうした多蛍光色を有する特徴を持つので、生物素子として、抗体にこの蛍光性タンパク質を標識して、同時に複数の反応を多蛍光色でセンサーできる機能の利用が可能である。しかも、それぞれの蛍光色が、かなり強い蛍光強度を有し、そして安定した蛍光である。350nm（Purpleより紫外部）については、蛍光光度計の相対強度のmax値を超えるほど強い蛍光強度である。
【００１０】
（４）本発明では、マーカーとして他のタンパク質を標識する場合、１種の励起波長を与えることで、標識する部位やタンパク質の種類に応じて、それぞれを異なる蛍光色で識別できるという特徴を有する。このことは、様々な化学的、生化学的な標識を行う際に、例えば、アフィニティーカラムで、タンパク質を分離する場合などに、分離する状態を蛍光色で識別できる等、応用可能と考えられる。
【００１１】
（５）通常電気泳動の分子量マーカーには、数種類の分子のタンパク質がまぜてあり、未知試料と同時に泳動して、その分子量検出のために使用するが、この多蛍光色のタンパク質を分子量マーカーとして使い、暗室で行う必要のある電気泳動などで使用する分子量マーカーとして応用することが可能である。
【００１２】
（６）さらに、本蛍光性タンパク質の遺伝子を、他の目的タンパク質の遺伝子に導入して、その目的タンパク質の発現の過程や発現様式などのサーチをおこなうことに利用できるほか、蛍光イムノアッセイ試薬として応用したり、ＰＣＲ産物を蛍光で定量するときの蛍光試薬として利用したりすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（本発明の第１の実施形態）
軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による喘息性アレルギーの抗原物質を特定する解析を行った過程及び結果について説明する。
まず、ホモジナイズ処理から粗抗原への試料の抽出精製として、軟サンゴを10mM-PBS溶液中でホモジナイズし、抽出液を遠心分離したものについて80％飽和硫安沈殿を行い、その沈殿タンパク質を透析膜により透析したのち、溶液を凍結乾燥したものを粗抗原とした。
【００１４】
この段階での試料をSDS-PAGEで電気泳動後に、CBB染色した分子量約２２kDaのタンパク質バンドの切り出しを行い、この試料について、ゲルの脱色、システイン残基の還元アルキル化、ゲルの洗浄、トリプシン消化、ペプチド断片の抽出、減圧乾燥、サンプル溶解液への溶解、LC/MS/MS により質量分析をおこなったところ、Gln-Ser-Phe-Pro-Glu-Gly-Phe-Ser-Trp-Glu-Arg（配列番号１）というアミノ酸配列が得られた。
このアミノ酸配列を、ホモロジー検索としてデータベース（MASCOT SEARCH）検索をおこなったところ、その結果、このタンパク質はgfp（green fluorescent protein）-like proteinであると同定された。
【００１５】
この粗抗原タンパク質について、ゲルろ過カラム（Sephadex-75）を通し、その全ての フラクションについて、UV280nm波長でタンパク質量の測定、及びELISA法を行ってアレルギー活性値を490nm波長で測定した。それぞれの結果は図１にまとめて示している。この図１においてタンパク質量を示すグラフ（折れ線グラフ）は二つのピーク特性を有することを示しているが、アレルゲン活性の強さを表すELISA活性値のグラフ（棒グラフ）から判断すると、フラクションの前半の部分（Fr.13〜Fr.37）に特に強いアレルゲン活性を持つタンパク質が存在することが解った。
【００１６】
そこで、そのゲルろ過フラクション（Fr.18,Fr.19,Fr.20,Fr.21,Fr.22）の５本の試料を、蛍光光度計で蛍光測定を行った。励起波長EX298nmを照射することによって、蛍光波長EM505nm,570nm,660nm（いずれもピークトップの波長）の３種類の蛍光スペクトルが図２に示すように強い蛍光強度として得られた。このアレルゲンは蛍光性を有することが示唆されている。
【００１７】
この図２において蛍光スペクトルは、励起波長をEX298nmで励起し、蛍光波長450nmから700nmをスキャンし、バンド幅（EX:5nm）、（EM:5nm）で検出した。また、測定試料は、ゲルろ過フラクションのFr.18（二点鎖線）、Fr.19（三点鎖線）、Fr.20（一点鎖線）、Fr.21（実線）、Fr.22（破線）の５本をそれぞれ同じ測定条件で測定し、重ねてグラフ表示している。
前記軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）は、花虫綱八放サンゴ亜綱ウミトサカ属ベニウミトサカである。この軟サンゴから抽出されたgfp（green fluorescent protein）-like proteinは、未知であり、新規性の蛍光性タンパク質である。
【００１８】
更に、この蛍光性タンパク質に、アレルゲン性が同時に存在するというデータも得られているので、これに関連する検討をおこなった。試料の分離、精製を行うため、ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephadex-75）による粗抗原の精製、患者血清でのELISA、陰イオンカラム（QAE-Sephadex A-25）による分離後、２０％アクリルアミドゲルによる、電気泳動、Western Blotting，免疫反応、免疫染色、をおこなっている。
粗抗原80mg/5mLの試料をbuffer 10mM-PBS（pH-8.5）溶液で、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにかけ、分子量によって分画し、各フラクション試料について患者血清とのELISAをおこなったところ、前半の部分にアレルゲン活性が強いことがわかった。
【００１９】
ゲルろ過カラムの全フラクション溶液の電気泳動をおこない、約２２kDaのバンドがでており、しかもアレルゲン活性の強い前半の部分のフラクションの数本（Fr.18〜Fr.22に相当）をあわせて凍結乾燥し、これをつぎに陰イオンカラムの試料とした。
【００２０】
陰イオン交換クロマトグラフィーカラム分画（QAE-Sephadex A-25）については、まず10ｍM Tris-HCL buffer（pH 7.5）で試料を分画し、次にこれにNaClをくわえて、溶出バッファー溶液で分画した。この溶出画分について、そのなかの分画試料陰イオンのフラクションのFr.12，Fr.15 について電気泳動、銀染色をおこなったところ、およそ２２kDaのバンドがでていることを確認した。
【００２１】
この陰イオンフラクションFr.12，Fr.15の分画試料と分子量マーカー（アマシャム社製）を、２０％アクリルアミドゲルを使って、SDS-PAGE（電気泳動法）をおこないタンパク質を分子量毎に分離した。そのゲル膜からPVDF膜へ分離されたタンパク質を電気的に転写（Western blotting法）した。次に、患者血清、正常者血清のそれぞれについて、PVDF膜上で抗原抗体反応をおこなった（免疫反応）。次に、二次抗体として、HRP-anti Human IgEを使って反応させ、その後ECLキットを用いて蛍光反応をおこない、それをＸ線フイルムに感光させた結果を図３に示す。
同図において（a）患者血清との反応では、Fr.12は、約２２kDaバンドにアレルゲン性タンパク質としての反応がでているが、Fr.15にはアレルゲンの反応はでていない。また、（b）において正常者血清との反応では、Fr.12、Fr.15ともにアレルゲン反応がでていない。
LMW（Low Molecular Weight）は、通常の電気泳動の分子量マーカーとして使われ、この一連の実験では分子量マーカー内の３０kDaのタンパク質が、反応を呈することで、positive controlとして用いている。
【００２２】
以上のように、本実施形態においては、まず軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）からホモジナイズ、塩析、透析などを経た粗抗原タンパク質をゲルろ過カラムと陰イオンカラムを使って分離・精製した。このときの、約２２kDaのタンパク質バンドのプロテオーム解析およびホモロジー検索からこのタンパク質は、gfp-like proteinを含むものであった。
【００２３】
前記ゲルろ過カラムの分画試料のSDS-PAGE（電気泳動）法で、およそ２２kDaのバンドが３本認められたので、これを陰イオンカラムを通し分画試料を得た。陰イオンカラム分画試料をSDS-PAGE（電気泳動）法、Western Blotting（転写操作）法、免疫反応、蛍光染色をおこなったところ、このフラクション12、には患者血清との免疫反応が認められ、正常血清では認められなかった。ECL免疫染色の結果フラクション12にはアレルゲン性があることが認められた。さらに、この約２２kDa のタンパク質バンドは糖鎖が結合した糖タンパク質の可能性もある。
【００２４】
（本発明の第２の実施形態）
前記第１の実施形態同様、軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）による喘息性アレルギーの抗原物質を特定する解析を行った過程及び結果について説明する。
まず、ホモジナイズ処理から粗抗原への試料の抽出精製として、軟サンゴを10mM-PBS溶液中でホモジナイズし、抽出液を遠心分離したものについて80％飽和硫安沈殿を行い、その沈殿タンパク質を透析膜により透析したのち、溶液を凍結乾燥したものを粗抗原とした。
【００２５】
粗抗原をゲル濾過カラム（Sephadex-75）にかけ、その中のタンパク質量の多い数本の試料を濃縮し、さらに陰イオンカラム（Q-Sepharose High Performance）にかけ、分画した試料を、SDS-PAGEで電気泳動後に、CBB染色した分子量約２７kDaのタンパク質バンドの切り出しを行い、この試料について、ゲルの脱色、システイン残基の還元アルキル化、ゲルの洗浄、トリプシン消化、ペプチド断片の抽出、減圧乾燥、サンプル溶解液への溶解、LC/MS/MS により質量分析をおこなったところ、Tyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lys（配列番号２）というアミノ酸配列が得られた。このアミノ酸配列を、ホモロジー検索としてデータベース（MASCOT SEARCH）検索をおこなった結果、このタンパク質はcfp（cyan fluorescent protein）であると同定された。
【００２６】
この粗抗原タンパク質について、ゲルろ過カラム（Sephadex-75）を通し、その全ての フラクションについて、UV280nm波長でタンパク質量を測定した結果を、図４に示している。図４は、粗抗原溶液を、ゲルろ過カラム （Sephadex-75） にとうした、全てのフラクションの溶液を分光光度計の波長２８０nm の吸光度を測定した特性図である。この図４において、タンパク質量を示すグラフは二つのピーク特性を有している。前記第１の実施形態同様、アレルゲン活性の強い、フラクションの前半の部分（Fr.36,Fr.37,Fr.38,Fr.39）の４本の分画溶液を集め、ULTLA FILTER UNIT USY-1（ADVANTEC社製）で濃縮して、その濃縮試料を陰イオンカラムの試料とした。
【００２７】
この濃縮試料を、buffer 10mM-Tris HCl（pH-8.5）2mLに溶解して、陰イオンカラム（Q-Sepharose High Performance）で分離をおこなった。溶出バッファーは、10mM-Tris HCl（pH 8.5）0.1N-NaClを用いた。その10mM-Tris HCl（pH-8.5）0.1N-NaClで溶出させて得られた分画試料を、UV280nm波長でタンパク質量を測定した。測定した中、（Fr.3,Fr.4,Fr.5,Fr.6）の４本の分画試料はタンパク質量が多いので、これら４本の試料に対し蛍光光度計で蛍光測定を行った。蛍光スペクトルは、励起波長をEX298nmで励起し、蛍光波長250nmから700nmをスキャンし、バンド幅（EX:5nm）、（EM:5nm）で検出した。測定結果、すなわち、陰イオンカラム溶出フラクション（0.1N-NaCl溶出バッファー）の、フラクションFr.3，Fr.4，Fr.5，Fr.6の蛍光スペクトルの特性図を図５に示す。
励起波長EX298nmで励起すると、同時に４種類の蛍光波長に強い蛍光強度のスペクトルが得られている。測定試料は、陰イオンフラクションのFr.3（実線）、Fr.4（破線）、Fr.5（一点鎖線）、Fr.6（二点鎖線）の４本をそれぞれ同じ測定条件で測定し、重ねてグラフ表示している。
【００２８】
前記軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）は、花虫綱八放サンゴ亜綱ウミトサカ属ベニウミトサカである。この軟サンゴから抽出されたcfp（cyan fluorescent protein）は、未知であり、新規性の蛍光性タンパク質である。
更に、この蛍光性タンパク質に、アレルゲン性が同時に存在するというデータも得られているので、これに関連する検討をおこなった。試料の分離、精製を行うため、ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephadex-75）による粗抗原の精製、陰イオンカラム（Q-Sepharose High Performance）による分離後、２０％及び１２．５％アクリルアミドゲルによる、電気泳動、Western Blotting，免疫反応、免疫染色、ＥＣＬ反応、をおこなっている。
アレルゲン活性の強い前半の部分のフラクションの数本（Fr.36〜Fr.41に相当）をあわせて濃縮し、これをつぎに陰イオンカラムの試料とした。
【００２９】
陰イオン交換クロマトグラフィーカラム分画については、まず10mM Tris-HCL buffer（pH-8.5）で試料を分画し、次にこれにNaClをくわえて、溶出バッファー溶液で分画した。この溶出画分について、そのなかの陰イオン分画試料のフラクションのFr.2-7〜Fr.2-15について電気泳動、銀染色をおこなったところ、およそ２７kDaのバンドがでていることを確認した。
【００３０】
陰イオンフラクションFr.3、Fr.5（図５）の分画試料と分子量マーカー（アマシャム社製）を、１２．５％アクリルアミドゲルを使って、SDS-PAGE（電気泳動法）をおこないタンパク質を分子量毎に分離した。そのゲル膜からPVDF膜へ分離されたタンパク質を電気的に転写（Western blotting法）した。次に、患者血清、正常者血清のそれぞれについて、PVDF膜上で抗原抗体反応をおこなった（免疫反応）。次に、二次抗体として、HRP-anti Human IgEを使って反応させ、その後ECL-plusキット（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて蛍光反応をおこない、それをＸ線フイルムに感光させた結果を図６に示す。
【００３１】
同図において（ｂ）患者血清との反応では、試料Fr.5は、約２７kDaバンド（Ａ）にアレルゲン性タンパク質としての反応がでているが、試料Fr.3にはアレルゲンの反応はでていない。また、（ａ）において正常者血清との反応では、試料Fr.3、試料Fr.5ともにアレルゲン反応がでていない。なお、試料Fr.5において、正常者血清、患者血清共に反応がでているバンド（Ｂ）は非特異的反応である。
LMW（Low Molecular Weight）は、通常の電気泳動の分子量マーカーとして使われ、この一連の実験では分子量マーカー内の３０kDaのタンパク質が、反応を呈することで、positive controlとして用いている。
【００３２】
以上のように、本実施形態においては、まず軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）からホモジナイズ、塩析、透析などを経た粗抗原タンパク質をゲルろ過カラムと陰イオンカラムを使って分離・精製した。このときの、約２７kDaのタンパク質バンドのプロテオーム解析およびホモロジー検索からこのタンパク質は、cyan fluorescent proteinを含むものであった。
【００３３】
前記ゲルろ過カラムの分画試料のSDS-PAGE（電気泳動）法で、約２７kDaのバンドが認められたので、さらに、これを陰イオンカラムに通し分画試料を得た。陰イオンカラム分画試料をSDS-PAGE（電気泳動）法、Western Blotting（転写操作）法、免疫反応、蛍光染色をおこなったところ、この試料Fr.5には患者血清との免疫反応が認められ、正常者血清では認められなかった。ECL免疫染色の結果、試料Fr.5にはアレルゲン性があることが認められた。
【００３４】
陰イオンカラム分画試料を、電気泳動後、ＣＢＢ染色した約２７kDaのタンパク質バンドの切り出しをおこない、ゲルの脱色、システイン残基の還元アルキル化、ゲルの洗浄、トリプシン消化、ペプチド断片の抽出、減圧乾燥、サンプル溶解液への溶解、LC/MS/MSにより質量分析をおこなったところ、Tyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lys（配列番号２）というアミノ酸配列が得られた。
このアミノ酸配列を、ホモロジー検索としてデータベース（MASCOT SEARCH）検索をおこなった結果、このタンパク質はcfp（cyan fluorescent protein）であると同定された。
【００３５】
（本発明の第３の実施形態）
前記第２の実施形態で解析した本軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）由来、蛍光性タンパク質について、これを特定する解析を行った過程及び結果について説明する。
１）ホモジナイズ処理から粗抗原への試料の抽出精製
軟サンゴを10mM-PBS 溶液中でホモジナイズし、抽出液を遠心分離したものについて80％飽和硫安沈殿を行い、その沈殿タンパク質を透析膜により透析したのち、溶液を凍結乾燥したものを粗抗原としている。
２）粗抗原試料を、ゲルろ過カラム（Sephadex-75）にかけて、10mM-PBS（pH-7.5）で流し、すべてのフラクションのタンパク質量を、分光光度計の波長280nmで測定した。その吸光度が高いフラクションを集めて、濃縮し次に陰イオンカラム（Q Sepharose High Performance）にかけて、10mM-Tris HCl buffer（pH-8.5）で流し、分離精製したのちの溶出画分を濃縮した。その分画試料を、12.5％アクリルアミドゲルで電気泳動後に、CBB染色したタンパク質バンドの中で、（a）約４０kDaタンパク質、および（b）約１７kDaタンパク質、について、それぞれLC/MS/MS法で分析を行った。
（a）約４０kDaタンパク質の結果は  アミノ酸配列Tyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lys（配列番号２）が得られて、ホモロジー検索をデータベース（MASCOT SEARCH）でおこなったところ、このタンパク質は蛍光性タンパク質のcfp（cyan fluorescent protein）であると同定された。
（b）約１７kDaタンパク質においては、アミノ酸配列Tyr-Pro-Ala-Asp-Leu-Pro-Asp-Tyr-Phe-Lys（配列番号２）が得られて、ホモロジー検索をデータベース（MASCOT SEARCH）でおこなったところ、このタンパク質は蛍光性タンパク質のcfp（cyan fluorescent protein）であると同定された。
【００３６】
上記２種類のタンパク質（約４０kDa、約１７kDa）と前記第２の実施形態におけるアレルゲン（約２７kDa）の計３種類のタンパク質において、cfp（cyan fluorescent protein）であると同定されたが、このことは軟サンゴのもつアミノ酸配列のなかで共通配列の性格をもち、遺伝子の転写のときにおこるsplicingがその理由であることが考えられる。なお、これらの３種類のタンパク質には、糖鎖が結合している糖タンパク質の可能性も考えられる。
【００３７】
（本発明の第４の実施形態）
前記第３の実施形態で解析した本軟サンゴ（Alcyonium gracillimum）由来、蛍光性タンパク質について、これを特定する解析を行った過程及び結果について説明する。
１）ホモジナイズ処理から粗抗原への試料の抽出精製
軟サンゴを10mM-PBS 溶液中でホモジナイズし、抽出液を遠心分離したものについて80％飽和硫安沈殿を行い、その沈殿タンパク質を透析膜により透析したのち、溶液を凍結乾燥したものを粗抗原としている。
【００３８】
２）粗抗原試料を、ゲルろ過カラム（Sephadex-75）にかけて、10mM-PBS（pH-7.5）で流し、すべてのフラクションのタンパク質量を、分光光度計の波長280nmで測定した。その吸光度が高いフラクションを集めて、濃縮し次に陰イオンカラム（Q Sepharose High Performance）にかけて、10mM-Tris HCl buffer（pH-8.5）で流し、分離精製したのちの溶出画分を濃縮した。その分画試料を、12.5％アクリルアミドゲルで電気泳動後に、CBB染色したタンパク質バンドの中で、約１７kDaタンパク質について、LC/MS/MS法で分析を行った。
約１７kDaタンパク質においては、アミノ酸配列として、Thr-Met-Thr-Tyr-Glu-Asp-Lys-Gly-Ile-Cys-Thr-Ile-Arg（配列番号３）が得られた。ホモロジー検索のために、データベース（MASCOT SEARCH）で検索をおこなったところ、このタンパク質は蛍光性タンパク質のgfp（green fluorescent protein）であると同定された。
【実施例】
【００３９】
軟サンゴ由来タンパク質についての解析を行う過程で蛍光スペクトルを測定した結果について説明する。
１）ホモジナイズ処理から粗抗原への試料の抽出精製
軟サンゴを10mM-PBS 溶液中でホモジナイズし、抽出液を遠心分離したものについて80％飽和硫安沈殿を行い、その沈殿タンパク質を透析膜により透析したのち、溶液を凍結乾燥したものを粗抗原としている。
【００４０】
２）粗抗原試料を、ゲルろ過カラム（Sephadex-75）にかけて、10mM-PBS（pH-7.5）で流し、すべてのフラクションのタンパク質量を、分光光度計の波長280nmで測定した（図４参照）。ここで、吸光度が高いフラクションについて、蛍光スペクトルを測定した結果を図７、図８に示す。図７はゲルろ過カラム（Sephadex-75）をとうしたフラクションのなかの、フラクション（Fr.38，Fr.39，Fr.40）を蛍光光度計で測定した蛍光スペクトルの特性図である。この特性図では、同じ測定条件で測定したFr.38（実線）、Fr.39（一点鎖線）、Fr.40（破線）の三つを重ねてグラフ表示している。１種の励起波長（２９８nm）で励起すると、５種類の蛍光波長（ピークトップ：350nm，480nm，505nm，570nm，660nm）が得られた。一方、図８はゲルろ過カラム（Sephadex-75）をとうしたフラクションのなかの、フラクション（Fr.43，Fr.44，Fr.45）の３本を蛍光光度計で測定した蛍光スペクトルの特性図である。この特性図では、同じ測定条件で測定したFr.43（実線）、Fr.44（一点鎖線）、Fr.45（破線）の三つを重ねてグラフ表示している。１種の励起波長（２９８nm）で励起すると、５種類の蛍光波長（ピークトップ：350nm，430nm（ショルダーとして見えている），505nm，570nm，660nm）が得られている。なお、505nm及び 570nm、660nmの相対蛍光強度の比は、Fr.45/Fr.40においては、（505nm：238/67=3.5倍）、（570nm：149/31=4.8倍）、（660nm：79/111=0.7倍）と変化した。
【００４１】
３）さらに、吸光度が高いフラクションを集めて、濃縮し次に陰イオンカラム（Q Sepharose High Performance）にかけて、10mM-Tris HCl buffer（pH-8.5）で吸着させたのち、0.1N-，0.15N-と順次NaClの塩濃度をあげて、溶出させた。ここで、溶出フラクションの中の一部フラクションについて蛍光スペクトルを測定した結果を図９、図１０に示す。図９は陰イオンカラムをとうした溶出フラクション（10mM-Tris HCl 0.1N-NaCl pH-8.5 溶出バッファー）のなかの、フラクション（Fr.2-5，Fr.2-6，Fr.2-7，Fr.2-8，Fr.2-9）の５本を蛍光光度計で測定した蛍光スペクトルの特性図である。この特性図では、同じ測定条件で測定したFr.2-5（実線）、Fr.2-6（一点鎖線）、Fr.2-7（破線）、Fr.2-8（二点鎖線）、Fr.2-9（点線）の五つを重ねてグラフ表示している。１種の励起波長（２９８nm）で励起すると、５種類の蛍光波長（ピークトップ：350nm，480nm（ショルダーとして見えている），505nm，660nm）が得られた。一方、図１０は陰イオンカラムをとうした溶出フラクション（10mM-Tris HCl 0.15N-NaCl pH-8.5 溶出バッファー）のなかの、フラクション（Fr.3-5，Fr.3-6，Fr.3-7，Fr.3-8，Fr.3-9）の５本をを蛍光光度計で測定した蛍光スペクトルの特性図である。この特性図では、同じ測定条件で測定したFr.3-5（実線）、Fr.3-6（一点鎖線）、Fr.3-7（破線）、Fr.3-8（二点鎖線）、Fr.3-9（点線）の五つを重ねてグラフ表示している。１種の励起波長（２９８nm）で励起すると、５種類の蛍光波長（ピークトップ：350nm，480nm（ショルダー），505nm，570nm，660nm）が得られた。
【００４２】
励起波長として１波長（298nm）で励起をおこなったとき、同時に最大６波長の蛍光が得られる。それぞれの蛍光スペクトルのピークトップは、350nm（purpleより紫外部），430nm（purple），480nm（cyan），505nm（green），570nm（orange），660nm（deep red）の６種類であり、多蛍光色を特徴とする。しかも、それぞれが、かなり強い蛍光強度を有し、そして安定した蛍光が得られた。350nm（Purpleより紫外部）については、蛍光光度計の相対強度のmax値を超えるほど強い蛍光強度である。なお、350nm（Purpleより紫外部）は強度が強く、波長幅の広い（300nm 〜 450nm）蛍光シグナルであり、この蛍光シグナルの中に430nm の波長は含まれてしまう場合が多い。ここで、図１１は、ゲルろ過カラムフラクション（Fr.37）の蛍光スペクトル（実線）と、Fr.37を20%ゲル SDS-PAGEで電気泳動したゲルの切り出し中の抽出溶液（Fr.37−6）を蛍光光度計で測定した蛍光スペクトル（一点鎖線）の特性図である。励起波長（２９８nm）で励起すると、試料（Fr.37−6）では、430nmをピークトップとする蛍光スペクトルが得られており、単離していくと、この図１１のように、蛍光スペクトルが得られていることがわかる。
【００４３】
なお、全ての蛍光スペクトル図の中で、励起波長である298nmと、この励起波長の２倍の波長（596nm：２次励起波長）に強いピークが現れているが、通常、１次励起波長と２次励起波長において発生するものであり、これらは測定対象とする蛍光スペクトルのピークではない。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る喘息性アレルギーのタンパク質を、ゲルろ過カラムに通した全てのフラクションについて、UV-280nmの吸光度測定および、各画分のELISA活性測定［490nm］の各特性図である。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る喘息性アレルギーのアレルゲンのタンパク質バンドについて、ゲルろ過フラクションを蛍光測定した蛍光スペクトル特性図である。
【図３】本発明の第１の実施形態に係る喘息性アレルギーのアレルゲン性タンパク質の蛍光反応をＸ線フイルムに感光させた結果である。
【図４】本発明の第２の実施形態に係る喘息性アレルギーのタンパク質を、ゲルろ過カラムに通した全てのフラクションについて、UV-280nmの吸光度測定の特性図である。
【図５】本発明の第２の実施形態に係る喘息性アレルギーのアレルゲンのタンパク質バンドについて、陰イオンカラムフラクション（Fr.3，Fr.4，Fr.5，Fr.6）を蛍光測定した蛍光スペクトル特性図である。
【図６】本発明の第２の実施形態に係る喘息性アレルギーのアレルゲン性タンパク質の蛍光反応をＸ線フイルムに感光させた結果である。
【図７】本発明の実施例における蛍光性タンパク質のタンパク質バンドについて、ゲルろ過フラクション（Fr.38，Fr.39，Fr.40）を蛍光測定した蛍光スペクトル特性図である。
【図８】本発明の実施例における蛍光性タンパク質のタンパク質バンドについて、ゲルろ過フラクション（Fr.43，Fr.44，Fr.45）を蛍光測定した蛍光スペクトル特性図である。
【図９】本発明の実施例における蛍光性タンパク質のタンパク質バンドについて、陰イオンカラムフラクション（Fr.2-5，Fr.2-6，Fr.2-7，Fr.2-8，Fr.2-9）を蛍光測定した蛍光スペクトル特性図である。
【図１０】本発明の実施例における蛍光性タンパク質のタンパク質バンドについて、陰イオンカラムフラクション（Fr.3-5，Fr.3-6，Fr3-7，Fr.3-8，Fr.3-9）を蛍光測定した蛍光スペクトル特性図である。
【図１１】本発明の実施例における蛍光性タンパク質のタンパク質バンドについて、ゲルろ過フラクション（Fr.37）及びゲル切り出し中の抽出溶液（Fr.37−6）を蛍光測定した蛍光スペクトル特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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