(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫原性ポリペプチドと複合体を形成する担体タンパク質の提供。【解決手段】特定の配列を有するクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の外膜タンパク質のＯｐｍＡからなる単離されたタンパク質、該タンパク質免疫原性ペプチド（特に呼吸器多核体ウイルスのプロテインＧ由来）、とを含んでなる複合体、該複合体を含んでなるワクチン組成物（特に呼吸器多核体ウイルス感染予防および／または治療用）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３の配列を有する、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)細菌の外膜タンパク質のＯｐｍＡからなる、単離されたタンパク質。
【請求項２】
組換えＤＮＡ技術により得られた、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)の培養物から得られた、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
担体タンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質と免疫原性ペプチドとを含んでなる複合体であって、免疫原性ペプチドがアミノ酸残基番号１７４と１８７との間のペプチド配列を含んでなり、免疫原性ペプチドが、サブグループＡおよびサブグループＢのヒト呼吸器多核体ウイルスの、またはウシ呼吸器多核体ウイルスのプロテインＧの配列のアミノ酸残基１３０と２３０との間のペプチド配列である配列番号１、２、または５１により保持され、かつ免疫原性ペプチドにおいて、プロテインＧの位置１７３および／または１８６におけるＣｙｓアミノ酸がセリンにより置換されている、複合体。
【請求項６】
化学的カップリングにより得られる、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
可溶性である、請求項５または６に記載の複合体。
【請求項８】
ａ）クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)細菌の膜リポ多糖類を２価のカチオンおよび界面活性剤の存在下で沈降させて、上清中に全体の膜タンパク質を回収し、
ｂ）前記タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにかけて、免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を分離し、
ｃ）免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を濃縮し、
ｄ）免疫アジュバントタンパク質を免疫原性ペプチドと複合化させて可溶性複合体を形成させる
工程を含んでなる方法により得られた、請求項６に記載の複合体であって、
免疫原性ペプチドがアミノ酸残基番号１７４と１８７との間のペプチド配列を含んでなり、免疫原性ペプチドが、サブグループＡおよびサブグループＢのヒト呼吸器多核体ウイルスの、またはウシ呼吸器多核体ウイルスのプロテインＧの配列のアミノ酸残基１３０と２３０との間のペプチド配列である配列番号１、２、または５１により保持され、かつ免疫原性ペプチドにおいて、プロテインＧの位置１７３および／または１８６におけるＣｙｓアミノ酸がセリンにより置換されている、複合体。
【請求項９】
免疫原性ペプチドが、ヒト血清アルブミンへの結合タンパク質（ＢＢ）により担体タンパク質と複合化されている、請求項５〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
ＢＢタンパク質が配列番号７４または７５のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
組換えＤＮＡ技術により得られる、請求項９または１０に記載の複合体。
【請求項１２】
配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列を有する、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載の複合体を含んでなる、ワクチン組成物。
【請求項１４】
注射可能な経路または皮下経路により投与できる、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
薬学上許容される賦形剤を更に含んでなる、請求項１３または１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載のタンパク質を含んでなる、呼吸器多核体ウイルス感染を予防および／または治療するための組成物。
【請求項１７】
配列番号１３のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原の製造においておよび呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを得る際に使用できるポリペプチド、および前記ポリペプチドの製造を可能とするヌクレオチド配列に関する。本発明は、同様に、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) から抽出された免疫アジュバントタンパク質、可能ならばこのようなアジュバントタンパク質とアソシエートした、免疫原性ポリペプチドを含む組成物、およびそれらの製造方法に関する。
【０００２】
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は新生児：気管支肺疾患（細気管支炎）における呼吸器の病気の最も頻繁な原因である。ＷＨＯによればＲＳＶ攻撃は毎年５×１０７  件と概算され、そのうち世界全体において１６０，０００人が死亡する。このウイルスには２つのサブグループ（サブグループＡおよびＢ）が存在する。
【０００３】
ＲＳＶはパラミクソウイルス(Parmyxoviridae)族に分類され、すなわち、１０の特定のタンパク質をコードする、負の極性の非セグメントＲＮＡゲノムを含む肺炎ウイルス属の１型である。
【０００４】
現在、ＲＳＶに対して有効なワクチンは存在しない。不活性化ウイルスのワクチンは無効であることが示され、そして時には保育乳児の感染を悪化することさえある。６０歳代において、ホルマリン不活性化ＲＳＶを使用するワクチン接種の試みは失敗に終わった。ＲＳＶによる再感染時における保護を付与する代わりに、そのワクチンは子供において病気を悪化させた。
【０００５】
出願ＷＯ８７／０４１８５号は、ワクチン、例えば、プロテインＦ（融合タンパク質）またはプロテインＧと呼ばれるエンベロープタンパク質、２２ＫｄのＧタンパク質、９．５Ｋｄのタンパク質、または主要なキャプシドタンパク質（プロテインＮ）を目的としてＲＳＶの構造タンパク質を使用することを提案した。出願ＷＯ８９／０２９３５号は、ＲＳＶの全体のプロテインＦ（多分モノマーまたは脱アセチル化された形態で修飾されている）の保護的性質を記載している。１系列のプロテインＦの断片は、それらの中和性質を研究することを目的としてクローニングされた。
【０００６】
しかしながら、今日まで試験された免疫ワクチンは無効であるか、または肺疾患（細気管支炎または細気管支周囲炎）を誘発することが示された。
【０００７】
現時点において、ＲＳＶのための感染の徹底的な治療は存在しない。
【０００８】
気道上部のＲＳＶの感染：治療は他のウイルスの感染についての治療と同一の薬物による。
【０００９】
気道下部のＲＳＶの感染：保育乳児における治療は正しい水分補給の維持、分泌物の吸引および必要に応じた酸素の投与による。陽性の効果はリバビリン、すなわち、ＲＳＶに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性であるヌクレオチドを使用して観察された。
【００１０】
このことから、本発明の目的は、呼吸器多核体ウイルスのＧタンパク質の配列のアミノ酸残基１３０と２３０との間のペプチド配列、または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を保持することを特徴とする、免疫原の生産において有用なポリペプチドである。この配列はヒトＲＳＶのサブグループＡおよびＢに関し、またはウシＲＳＶに関しわずかに異なる。本発明は、ヒトＲＳＶサブグループＡおよびＢ、またはウシＲＳＶから由来する配列を含む。
【００１１】
プロテインＧは、メチオニンが少ない、分子量８４〜９０ＫｄのＲＳＶエンベロープ糖タンパク質である。
【００１２】
天然のプロテインＧのアミノ酸１３０〜２３０の配列はＲＳＶによる感染に対する有効な保護を誘発するために特に適当であることを出願人は証明した。本発明は、ヒトＲＳＶサブグループＡおよびＢ、またはウシＲＳＶに由来する配列を含む。
【００１３】
さらに詳しくは、本発明は、上記に含まれる免疫原要素として特に有用でありかつＲＳＶプロテインＧ（ヒト、サブグループＡおよびＢ、またはウシ）のアミノ酸残基番号１７４〜１８７のペプチド配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含む、ポリペプチドに関する。
【００１４】
ＲＳＶプロテインＧの前記配列に含まれる免疫原の製造に適合する他のペプチド配列は、ヒトまたはウシのＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１７１〜１８７の配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列により形成される。本発明による関心ある他のペプチドは、ＲＳＶプロテインＧのヌクレオチド番号１５８〜１９０の間の配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列により支持される。
【００１５】
それを実施する他の方法によれば、本発明は、免疫原の生産に有用でありかつヒトまたはウシのＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１４０〜２００のペプチド配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列に相当する配列を有するペプチドに関する。前記ＲＳＶプロテインＧのアミノ酸分析１４０で開始する配列およびそのＣ−末端は、それぞれ、アミノ酸１９８、１９６、１９４、１９２または１９０に相当し、ならびにこれらの断片により支持される配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列は特に有利である。
【００１６】
上記配列の変異型としては、
ａ）位置１７３および／または１８６におけるＣｙｓアミノ酸がジスルフィド架橋を形成しないアミノ酸、特にセリンにより置換されている、および／または  ｂ）位置１７６および１８２におけるアミノ酸がジスルフィド架橋以外の共有結合の架橋を形成することができるアミノ酸、特にアスパラギン酸およびオルニチンである、
配列を含むポリペプチドを挙げることができる。
【００１７】
したがって、ＲＳＶサブグループＡのポリペプチド配列１３０−２３０を完全に、その天然の形態で使用できる。これは配列は記載した配列番号１（またはＧ２Ａ）に相当する。
【００１８】
同一の方法において、ＲＳＶサブグループＢの完全なポリペプチド配列１３０〜２３０をその天然の形態で使用することができる。これは配列は記載した配列番号２（またはＧ２Ｂ）に相当する。
【００１９】
配列番号１はこの出願の残部においてＧ２Ａと記載する。
【００２０】
配列番号２はこの出願の残部においてＧ２Ｂと記載する。
【００２１】
Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂと少なくとも８０％の相同性を有する配列は、また、適当である。
【００２２】
アミノ酸１３０〜２３０の間の配列は、位置１７３および１８６におけるシステイン残基をセリン残基で置換することによって修飾して、位置１７６および１８２におけるＣｙｓ残基により形成されるループの維持のために、すぐれた免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。サブグループＡのためのこのポリペプチドのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号３（Ｇ２ＡδＣｙｓ）で表される。
【００２３】
サブグループＢについて、アミノ酸およびヌクレオチド配列は配列番号４（Ｇ２ＢδＣｙｓ）で表される。
【００２４】
ペプチド配列はＧ２ＡδＣｙｓおよびＧ２ＢδＣｙｓとする。
【００２５】
本発明によれば、本発明の目的は、ＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１７４と１８７との間のペプチド配列または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列からなることを特徴とする、免疫原の生産に有用なポリペプチドである。
【００２６】
この最後の配列において、ペプチド１７４〜１８７サブグループＡは下記の配列を有することができる：
配列番号５：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ。
【００２７】
ペプチド１７４〜１８７サブグループＢは下記の配列を有することができる：配列番号６：
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ。
【００２８】
位置１８６におけるＣｙｓを、また、セリン残基で置換して下記の配列を得ることができる：
サブグループＡについて配列番号７：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ。
【００２９】
サブグループＢについて配列番号８：
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ。
【００３０】
免疫原ペプチドの残基１７４〜１８７の間の配列において、本発明の態様の１つに従い、位置１７６および１８２のアミノ酸残基をそれぞれアスパラギン酸およびオルニチンで置換して、下記の配列の１つを得る：
配列番号９（サブグループＡについて）：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｏｒｎ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ。
【００３１】
配列番号１０（サブグループＢについて）：
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ。
【００３２】
配列番号１１（サブグループＡについて）：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｏｒｎ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ、
配列番号１２（サブグループＢについて）：
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｏｒｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ。
【００３３】
免疫原性の維持は、位置１７６〜１８２のアミド架橋によるジスルフィド架橋（天然のＣｙｓ残基の間）の置換によって得られる。
【００３４】
上に定義したような本発明による他の配列は、本願明細書において名称配列番号１４〜配列番号７３で示される。
【００３５】
本発明の目的は、同様に、上記配列の１つを有する免疫原的薬剤として使用することができかつＮ−末端またはＣ−末端の位置に少なくとも１つの１つのシステイン残基をさらに含むポリペプチドである。
【００３６】
本発明は、同様に、ＲＳＶプロテインＧ配列サブグループＡおよびサブグループＢのアミノ酸残基番号１３０〜２３０の間のペプチド配列、または前記ペプチド配列と少なくとも８８％の相同性を有する配列から成り、かつＢＢＧ２ＡδＣまたはＢＢＧ２ＢδＣと呼ばれる、ヒト血清アルブミンレセプター、または他の結合タンパク質との融合タンパク質の形態であるポリペプチドを包含する。完全なＢＢタンパク質の配列は明細書中に記載されている（配列番号７４）。
【００３７】
本発明は、同様に、これらの機能が天然であるか、否かにかかわらず、異なるペプチドの変異型、例えば、グリコシル化または硫酸化された変異型を包含する。  ポリペプチドは、当業者に知られている、ペプチド合成によるか、または組換えＤＮＡ技術により製造することができる。
【００３８】
特に、ほぼ１００アミノ酸のエピトープをコードする遺伝子配列は、遺伝子の固相アセンブリーにより製造することができ、対応するタンパク質は、細胞内経路により、例えば、大腸菌(E.coli)の中で発現させることができる。
【００３９】
上に定義したタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、本発明の一部分である。
【００４０】
本発明の他の目的は、担体タンパク質、特に免疫アジュバントタンパク質に結合されたポリペプチド、例えば、上に定義したポリペプチドを含む免疫原的薬剤である。
【００４１】
好ましくは、本発明によるポリペプチドは、好ましくは可溶性複合体の形態で、クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の外膜のＯｍｐＡ型の担体タンパク質に結合されている。
【００４２】
ＲＳＶプロテインＧの配列１７４〜１８７の変異型は免疫原性が弱いが、このようなタンパク質とのそれらの結合は特定の免疫応答を誘発することを、出願人は示すことができた。
【００４３】
免疫応答の強度を、慣用のアジュバント、例えば、フロインドアジュバントと共投与された担体ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）への結合、または担体タンパク質ＴＴ（破傷風トキソイド）への結合、を使用して得られたものと比較した。
【００４４】
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のタンパク質ｐ４０またはタンパク質ｐ４０と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質に結合された本発明による免疫原性ポリペプチドを含む組成物について、特に有利な結果が得られる。
【００４５】
さらに詳しくは、前記ポリペプチドを配列番号１３に記載されるペプチド配列を含むタンパク質に結合させる。
【００４６】
配列番号１３を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、本発明において構築される。
【００４７】
免疫原性ポリペプチドは、当業者に知られている方法により免疫アジュバントタンパク質に結合させることができ、前記方法の例は下記の通りである：
−  グルタルアルデヒド、
−  カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ：１−（３ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）、
−  ビスイミドエステル（例えば、ジメチルアジピミデート）、
−  Ｎ−ヒドロキシスイクシニミジルエステル（例えば、ジスクシニミジルスベレート）、
−  Ｎ−末端またはＣ−末端の位置に補助的システインを含むポリペプチドについて：
＊  マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、ＭＢＳ：マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）。
【００４８】
＊  Ｎ−スクシンイミドブロモアセテート。
【００４９】
ポリペプチドは、結合タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンレセプター（ＢＢ）により、担体タンパク質に複合化することができる。
【００５０】
他の面によれば、本発明の目的は、同様に、
ａ）  クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の膜リポ多糖類を２価のカチオンおよび界面活性剤の存在下に沈降させて、上清の中に全体の膜タンパク質を回収し、
ｂ）  前記タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにかけて、免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を分離し、
ｃ）  免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を濃縮し、
ｄ）  免疫アジュバントタンパク質を免疫原性ポリペプチド、例えば、上に定義したポリペプチドと複合化させて可溶性複合体を形成する、
ことを特徴とする、ＲＳＶの感染の予防または治療用組成物の中に挿入された複合化ペプチドの製造方法である。
【００５１】
工程ａ）において使用する２価のカチオンは、好ましくはカルシウムまたはマグネシウムの塩である。遠心後、上清のタンパク質はエタノールを使用する２回の沈降によりすぐれた収率で回収することができる。
【００５２】
膜タンパク質は、再懸濁後、工業的条件下に使用できるアニオン交換カラムで分離される。このクロマトグラフィーの支持体は非常に安定であり、そして過激な発熱因子除去の処理と適合性であり、これは既に記載されたクロマトグラフィーの支持体には当てはまらなかった。他方において、タンパク質の溶離は無勾配条件下に実施することができ、そして工業的条件下に特に好都合であるＮａＣｌ勾配（以前に記載されたように）は適用されない。
【００５３】
本発明の実施する好ましい方法によれば、工程ｃ）に引き続いて、カチオン交換体を使用する第２のクロマトグラフィー工程を実施し、アジュバントタンパク質を含有する画分を回収し、濃縮する。この補助的工程はリポ多糖類のよりすぐれた排除を可能とする。次いで、アジュバントタンパク質を本発明に従い免疫原性ポリペプチドに複合化する。
【００５４】
他の面によれば、本発明は、上記において特徴づけたポリペプチドを含有することを特徴とする、ＲＳＶにより誘発される感染の予防および／または治療用組成物に関する。
【００５５】
さらに詳しくは、組成物は注射可能な経路による投与に適合した薬学上許容される賦形剤をさらに含有する。
【００５６】
事実、このような組成物の注射は、中性作用ではなく、体の全身的免疫応答により、保護を提供することを出願人は証明した。
【００５７】
体液性および細胞の応答（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＴ細胞）は、長期間の保護およびＲＳＶサブグループａおよびｂに対する免疫学的記憶を同様に誘発する産物により誘発される。
【００５８】
皮下経路によるワクチン組成物の投与を目的として、慣用法により困難である、入手可能な可溶性複合体を有することが望ましい。
【００５９】
このため、本発明は、同様に、免疫原性ペプチドと、クレブシエラ
(Klebsiella)属の膜タンパク質、特にクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のタンパク質ｐ４０との間の複合体を製造する方法に関し、この方法において、カップリングは０．０５％より低いか、またはそれに等しい濃度のグルタルアルデヒドの存在下に実施される。
【００６０】
このカップリング法は、通常使用される濃度と比較してグルタルアルデヒドの濃度をかなり減少させ（ほぼ１％の代わりに２×０．０１％）；グルタルアルデヒドは５日の期間にわたって２つの部分で添加されるが、記載されたプロトコールは２４時間の時間を述べている。
【００６１】
これらの変更は可溶性複合体を、皮下投与に適合の形態で、得ることを可能とした。
【００６２】
通常のプロトコール（グルタルアルデヒドのより高い濃度および短い時間）は、濃厚なゲルの形成（高い確実性で、Ｐ４０−Ｐ４０複合化反応のために）、一般的に投与および操作に不適合な形態により表現される。
【００６３】
複合化されたペプチドは凍結し、そのまま使用するか、または凍結乾燥することができる。
【００６４】
下記の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定しない。
【００６５】
実施例１：Ｇ１  Ａの合成および精製
下記の配列のポリペプチド
【化１】
2006020637.tif 000002
記載されたＧ１  ＡはＢｏｃ化学を使用する固相合成により製造される。
【００６６】
構  築
ペプチドの構築は、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−ｃｌ−Ｚ）−フェニルアセトアミドフェニル架橋剤を使用して開始して、ポリスチレン（ジビニルベンンゼン１％）上の固相ペプチド合成により実施する。
【００６７】
下記の脱保護−カップリング手法により、Ｂｏｃ−ベンジル化学的法を使用した：
１．  ＤＣＭ中の５５％ＴＦＡ            （１×５分）
２．  ＤＣＭ中の５５％ＴＦＡ            （１×２５分）
３．  ＤＣＭ                            （２×１分）
４．  イソプロピルアルコール            （１×１分）
５．  ＤＭＦ                            （２×１分）
６．  ＤＭＦ中の１０％ＤＩＥＡ          （２×２分）
７．  カップリング
８．  ＤＭＦ                            （２×１分）
９．  ＤＣＭ                            （２×１分）
各工程において、２０ｍｌの溶媒をペプチド樹脂の１ｇにつき使用する。
【００６８】
カップリングはＤＭＦ中でヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを使用して３０分間実施する。カップリングの各工程において、残留遊離アミン官能性がニンヒドリン試験により存在するかどうかを評価する。必要に応じて、二重のカップリングを実施する。
【００６９】
Ｇ１  Ａペプチドの合成のために、下記の側鎖の保護を使用した：
−  リジンについて２−クロロベンジルオキシカルボニル、
−  セリンおよびスレオニンについてベンジル、
−  システインについて４−メチルベンジル、
−  トリプトファンについてホルミル。
【００７０】
最終の脱保護／切断工程の前に、ＤＭＦ中のピペリジンの２５％溶液で３０分間処理することによって、ホルミル基を除去する。ポリペプチド樹脂をＤＣＭおよびエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥する。
【００７１】
切断
ペプチドを樹脂から切断し、液体フッ化水素で処理して完全に脱保護する。トラップとしてｐ−クレゾールおよびエタンジオールの存在下に、１０ｍｌのフッ化水素／ｇのペプチド樹脂を０℃において４５分間普通に使用する。フッ化水素を蒸発させた後、粗反応混合物をエーテルで洗浄し、ＴＦＡ中に溶解し、エーテルで沈降させ、乾燥する。
【００７２】
環化および精製
ＨＰＬＣによる精製の一般的条件：
静止相：    Ｃ１８シリカ、１５〜２５μｍ、１００オングストローム、
移動相：    溶媒Ａ：水０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ａ、６０／４０％（ｖ／ｖ）
線状勾配：  ２０〜５０％Ｂ、３０分（第１精製工程）
１５〜４０％Ｂ、３０分（第２精製工程）
流速：      ４０ｍｌ／分
検出：      紫外線（２１０ｎｍ）
切断後に得られた粗ペプチドを前述の条件（勾配、２０〜５０％Ｂ）下に精製する。７０〜８０％（ＨＰＬＣ）の純度を有する画分を一緒にし、凍結乾燥する。次いでペプチドをアセトニトリル、水およびＤＭＳＯ（１ｍｇ／ｍｌ）の混合物中で精製し、結晶化が完結するまで（４〜６日）撹拌する。反応の進行をＨＰＬＣにより確認する。反応混合物を最後に調製用ＨＰＬＣで濃縮し、１５〜４０％のＢの勾配を３０分間適用してペプチドを精製する。
【００７３】
一般に、凍結乾燥後、同一条件下に精製を実施して、要求される純度を得る。
【００７４】
最終生成物の純度および同一性を分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびＦＡＢ質量スペクトル分析によりチェックする。
【００７５】
こうして得られたペプチドにおいて、位置１３におけるセリン残基は天然ペプチドのＣｙｓ残基で置換され、こうして、免疫原性に対して有害であることがあるジスルフィド架橋の形成における不均一性を回避する。
【００７６】
実施例２：エピトープＧ２  ＡδＣｙｓの調製
遺伝子の構築：材料および方法
エッペンドルフ・マイクロチューブにおいて、３００μｇのビーズを洗浄／結合緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、次いで０．２ｐｍｏｌのビオチニル化オリゴヌクレオチドを添加し、周囲温度において結合のために１５分間インキュベートする。固定化されたオリゴヌクレオチドを有するビーズをすすぎ、沈降させる。６０μｌのハイブリダイゼーション／結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２  、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭの１，４−ジチオスレイトール［ＤＴＴ］、５％のポリエチレングリコール［ＰＥＧ］８０００）中の０．２ｐｍｏｌの下記の５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを添加する。ハイブリダイゼーション混合物を７０℃において５分間インキュベートし、３７℃にした後、３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を添加し、次いで３７℃において１５分間インキュベートする。反応混合物をすすいだ後、０．２ｐｍｏｌの下記のオリゴヌクレオチドを添加する。新しい５’−リン酸化相補的オリゴヌクレオチドを添加するときと同じ回数で、ハイブリダイゼーション／結合操作を反復する。終わりにおいて、適当な制限酵素を使用する切断により、磁性ビーズ上に固定化されたＤＮＡ二本鎖を支持体から分離する。
【００７７】
配列Ｇ２ＡδＣｙｓに相当し、かつＢＢＧ２ＡδＣｙｓと記載されるヒト血清アルブミン（ＢＢ）に対する結合タンパク質に結合された配列Ｇ２ＡδＣｙｓに相当するＤＮＡを調製する。
【００７８】
ヌクレオチド配列を大腸菌(E.coli)において発現させて、対応するタンパク質を回収する。
【００７９】
発現ベクター
ｐＶＡＢＢＧ２ＡδＣは細胞内型の発現ベクターであり、それは大腸菌
(E.coli)由来のプロモーター、トリプトファン（Ｔｒｐ）操作、次いでヒト血清アルブミンＢＢのレセプターをコードする遺伝子(P- ÅNygren et al. 、J.Mol. Recognit. 、1988 、1、60)および最後にＲＳＶのＧ２ＡδＣをコードする遺伝子を含有する。異種遺伝子の発現はＩＡＡ（３−β−インドレアクリル酸）の存在下に誘発することができる。ＢＢＧ２ＡδＣの融合産物は、大腸菌(E.coli)の細胞質タンパク質を遊離した後、ＨＳＡ−セファローズカラム上のアフィニティーにより精製することができる。
【００８０】
５００ｍｌの培養物から出発するタンパク質の精製の実施例
プラスミドｐＶＡＢＢＧ２ＡδＣにより形質転換された大腸菌(E.coli)ＲＶ３０８株(Maurer et al.、J.Mol.Biol.、1980 、139、147) を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（８μｇ／ｍｌ）を含有する寒天上で選択した。この株を１００ｍｌのＴＳＢ培地(Tryptic Soy broth、Dfco)（３０ｇ／ｌ）［酵母(Yeast Extract、Dfco)（５ｇ／ｌ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（８μｇ／ｍｌ）およびトリプトファン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した］を含有するエルレンマイヤーフラスコに接種した。３２℃において撹拌（１９０ｒｐｍ）しながら１２時間インキュベートした。４×初期体積（４００ｍｌのＴＳＢ＋酵母＋同一抗生物質、同一濃度において）を含有する他のエルレンマイヤーフラスコ（５リットル）に、培養物を移した。培地の光学密度（５５０ｎｍにおいて）がほぼ１．５のＯ．Ｄ．に到達したとき、ＩＡＡを培地に２５μｇ／ｍｌの最終濃度に添加することによって、タンパク質の生産を誘発させる。３２℃において撹拌（１９０ｒｐｍ）しながら５時間インキュベートした後、培養を停止した。遠心後、ほぼ６０ｍｌの冷ＴＳＴ溶液（５０ｍＭの  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のツイーン２０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）を含む容器の中に細菌プラグを再懸濁させる。
【００８１】
標準的超音波処理装置のプローブ（ＶＩＢＲＡ−ＣＥＬＬ、Ｓｏｍｉｃｓ、Ｍａｔ、米国）を容器の中に導入する。超音波処理を５のパワーにおいてほぼ２分間実施する。遠心後溶液の上清を０．４５μｍにおいて濾過し、そしてほぼ３ｍｌのＨＳＡ−セファローズゲルを含有するカラムの中に通過させる(STAHLet al.、J.Immunol. Meth. 、1989 、124、43)。
【００８２】
ファスト・システム(Phast System)装置(PHARMACIA) またはミニ・プロテアン・バイオラド(Mini Protean BIORAD) 上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製されたタンパク質を分析する。ゲルをクーマッシーブルーにより可視化する。タンパク質ＢＢＧ２ＡδＣは、９０％より大きい純度を表し、既知の分子量標準に関して期待される大きさ（３９．３Ｋｄａ）によく相当する。
【００８３】
プロブロット(Problott)膜（ＡＢＩ）に対するこのタンパク質の免疫転移は、特定の抗体を使用するＲＳＶ（ｓｓ−グループＡ）の抗ＢＢおよび／または抗プロテインＧの同定を可能とする。大腸菌(E.coli)の細胞質から出発して精製されたタンパク質の収量は、培養物の１リットル当たりほぼ５０ｍｇである。
【００８４】
２リットルの発酵槽において、最適な培養条件下に培養物の１リットル当たり５００〜８００ｍｇのＢＢＧ２ＡδＣタンパク質を得ることができる。
【００８５】
実施例３：天然ｐ４０タンパク質の単離および精製
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) Ｉ−１４５株のバイオマスから出発するｐ４０タンパク質の精製法は、１つの主要な目的をもって、すなわち、大規模かつ工業的推定への転換を可能とする方法を開発するために、開発した。この方法は膜タンパク質に富んだ画分の調製およびクロマトグラフィーによるｐ４０タンパク質の精製において首尾よく実施される。
【００８６】
材料および方法
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) （Ｉ−１４５株、４０ｇの乾燥細胞）のバイオマスを、純粋な酢酸によりｐＨ２．５に調節する。
【００８７】
６％のセトリミド、６０％のエタノール、１．５ＭのＣａＣｌ ２  を含む溶液（そのｐＨは酢酸で２．５に調節されている）の１／２体積を添加した後、混合物を周囲温度において１６時間撹拌する。
【００８８】
４℃において１５，０００ｇで２０分間遠心した後、上清のタンパク質をエタノールで沈降させる。中間の遠心（１０分、１０，０００ｇ、４℃）を使用して２回の連続的沈降（２０から５０％、次いで５０から８０％）を実施する。
【００８９】
第２回の沈降後に得られたプラグを、双性界面活性剤(zwittergent) ３−１４、１％の溶液の中に再懸濁させる。
【００９０】
周囲温度において４時間撹拌した後、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨにより６．５に調節する。
【００９１】
混合物を４℃において１０，０００ｇで２０分間遠心により、膜タンパク質に富んだ画分（ＭＰ画分）を得ることができる。
【００９２】
ＭＰ画分のタンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０；双性界面活性剤３−１４、０．１％に対して透析する。前述の緩衝液中で平衡化した強アニオン交換体型の支持体を含有するカラム（カラム直径＝５０ｍｍ×高さ＝２５０ｍｍ、Biorad Macroprep High Q ゲル）に、透析物を適用する。ｐ４０タンパク質を平衡化緩衝液中で５０ｍＭのＮａＣｌ濃度により溶離する。
【００９３】
ｐ４０を含有する画分を集め、２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０；双性界面活性剤３−１４、０．１％に対して透析する。２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液ｐＨ３．０；双性界面活性剤３−１４、０．１％中で平衡化した強カチオン交換体型の支持体を含有するカラム（カラムの寸法：カラム直径＝２５ｍｍ×高さ＝１６０ｍｍ、Biorad Macroprep High S ゲル）に、透析物を適用する。ｐ４０タンパク質を０．７ＭのＮａＣｌ濃度により溶離する。ｐ４０を含有する画分を集め、１０ｋＤａのカットオフの限界値を有する膜シートとともに使用するミニタン・ミリポア(Minitan Millipore) 接線方向の流れの濾過系を使用する限外濾過により濃縮する。
【００９４】
結果
各クロマトグラフィー工程後に得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、ｐ４０タンパク質を含有する画分を集める。
【００９５】
タンパク質量をＬｏｗｒｙの方法により測定する（表Ｉ）。ｐ４０タンパク質の純度および均質度を、分子量標準の存在下に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推定する。
【００９６】
カチオン交換クロマトグラフィー工程後、ｐ４０タンパク質はＭＰ画分の中に存在する主要な混入物質を含有せず（タンパク質は１８ｋＤａの見掛けの分子量を有する）そして９５％より大きい純度を有する。
【００９７】
ｐ４０の電気泳動のプロフィルはいくつかのバンドを明らかにする。マウスにおいて得られたｐ４０モノクローナル抗体を使用するイムノブロット後、これらのバンドは同定される。上の主要なバンドは変性タンパク質（ＳＤＳの存在下に１００℃において１５分間処理する）に対応し、そして下の小さいバンドはその天然の形態のタンパク質に対応する。
【００９８】
ｐ４０は事実「熱修飾可能な」タンパク質であり、そして我々はＳＤＳの存在下に１００℃に加熱した場合の速度論によりこの性質を評価することができた。加熱しないと、天然の形態のタンパク質はα−らせん構造を有し、これはより多いＳＤＳを固定し、こうして変性された形態（変性は１００℃において５分後に完結する）よりアノードに向かっていっそう遠くに移動し、そして変性された形態はβ−プリーツシート構造を有する(K.B.KELLER(1978)J.Bacteriol.134、1181-1183)  。
【００９９】
リポ多糖類（ＬＰＳ）の混入は、β−ヒドロキシミリスチン酸、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のＬＰＳの脂肪酸マーカーの気相クロマトグラフィーによる決定により推定される（表Ｉ）。
【表１】
2006020637.tif 000003
【０１００】
この方法は、異なる精製工程からの試料中のＬＰＳの含量を概算するために使用される。
【０１０１】
カチオン交換クロマトグラフィー後のｐ４０画分の中に存在するβ−ヒドロキシミリスチン酸の量は決定の定量限界値より少なく、残留ＬＰＳの量が１％より少ないことを推定することができる。
【０１０２】
実施例４：ｐ４０タンパク質のクローニングおよびＢＢｐ４０の発現
細菌株
＊  大腸菌(E.coli)：ＲＶ３０８：ＡＴＣＣ３１６０８株(MAURER R.、MEYER B.J. 、PTASCHNE M.、J.Mol.BIOL.、1980 、139、147-161) 。
＊  K.pneumoniae:IP145:C.I.B.P.F株
【０１０３】
ベクター
＊  ｐＲＩＴ２８(Hultman et al. 、1988 、7:629-638) ：アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌(E.coli)およびファージＦ１の複製起点ならびに大腸菌(E.coli)のｌａｃ−ｚ遺伝子の一部分（β−ガラクトシダーゼ）を含有するベクターのクローニングおよび配列決定。
＊  ｐＶＡＢＢ：遺伝子融合発現ベクター。
【０１０４】
溶  液
＊  遺伝子増幅：
溶解緩衝液：                  ２５ｍＭのＴａｐｓ  ｐＨ９．３
２ｍＭのＭｇＣｌ２
増幅緩衝液：                  ２５ｍＭのＴａｐｓ  ｐＨ９．３
２ｍＭのＭｇＣｌ２
ツイーン２０  ０．１％
２００ｍＭのｄＮＴＰ。
【０１０５】
＊  タンパク質の精製：
ＴＳＴ（２０×）：            Ｔｒｉｓ塩基      ０．５Ｍ
ＨＣｌ            ０．３Ｍ
ＮａＣｌ          ４Ｍ
ツイーン２０      １％
ＥＤＴＡ          ２０ｍＭ
洗浄緩衝液：                  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ５０ｍＭ
ｐＨ８．５
ＭｇＣｌ２        ５ｍＭ
変性溶液：                    Ｇｕａ−ＨＣｌ    ７．８Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２８ｍＭ
ｐＨ８．５
復元溶液：                    Ｇｕａ−ＨＣｌ    ０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２５ｍＭ
ｐＨ８．５
ＮａＣｌ          １５０ｍＭ
ツイーン２０      ０．０５％。
【０１０６】
材料および方法
−  オリゴヌクレオチドの合成
エンテロバクテリア(E.coli 、S.tryphimurium 、S.marcescens 、S.dysenteriaec 、E.aeroginosae) の５  ＯＭＰＡの配列の整列からのコンセンサス配列のクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のＯＭＰＡの配列の発表された部分(LAWRENCE 、G.J. 、et al. 、Journal of General Microbiology、1991 、137、1911-1921)、ならびにマニュアル配列により得られたペプチドの配列から出発して、ヌクレオチドプライマーを決定した。
【０１０７】
ファーマシア(Pharmacia) からの「遺伝子アセンブラー・プラス(Gene Assembler Plus) 」装置でホスホルアミダイト化学的方法に従い、オリゴヌクレオチドを合成した。
【０１０８】
−  ｐ４０遺伝子のＰＣＲによる遺伝子の増幅
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のＯＭＰＡのＤＮＡを下記の方法において増幅した。
【０１０９】
クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のコロニーを１０μｌの溶解緩衝液中で９５℃に５分間加熱することによって溶解する。
【０１１０】
この溶液の１μｌを増幅反応のＤＮＡ源として使用する。
【０１１１】
これらは１００μｌの増幅緩衝液（添付書類参照）中で、５ｐｍｏｌの各プライマーおよび１単位のＴａｑポリメラーゼ酵素(Perkin Elmer Cetus)を使用して実施する。各サイクルは９５℃における３０秒の１変性工程および引き続くＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションおよび７２℃における延長を含む。このようにして、パーキン・エルマー・シータス９０００「ゲン・アンプ・ＰＣＲ(Gen Amp PCR) サーモサイクライザーにより、３０サイクルを実施する。  下記のＰＣＲを上記において増幅したＤＮＡ断片から出発して調製する。
【０１１２】
次いで増幅されたＤＮＡ断片を消化し、精製し、ベクターｐＲＩＴ２８に結合する。
【０１１３】
配列決定
アプライド・バイオシステム(Applied Biosystem) ３７３ＤＮＡシークエンサー(Sequencer) 自動化配列決定装置により、このようにしてクローニングされた断片を配列決定する。遺伝学的増幅後にまたはマクシプレプ(maxiprep)から得られた二本鎖ＤＮＡについて、または変性されたＰＣＲ断片からの一本鎖ＤＮＡについて、「色素ターミネーター(dye Terminator)」キットを供給業者の推奨に従いを使用して、配列決定反応を実施する(Hultman et al. 、Nucleic Acids Res. 、1989、17:4937-4946)。
【０１１４】
タンパク質の発現
全体のｐ４０遺伝子を発現ベクターｐＶＡＢＢ中でクローニングする。このベクターはアフィニティーテイル「ＢＢ」のｐ４０への結合を可能とする；Ｂは血清アルブミンを結合する連鎖球菌Ｇタンパク質の部分である(Nygren P.A. et al．、J.Mol.Recognit.1988、1、69-74) 。
【０１１５】
酵母エキス、アンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（８μｇ／ｍｌ）およびトリプトファン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した１００ｍｌのＴＳＢ中で、ベクターｐＶＡＢＢＰ４０により形質転換された大腸菌(E.coli)ＲＶ３０８株を３７℃において撹拌しながら一夜培養する。次の日に、５８０ｎｍの波長についてＯ．Ｄ．＝１の培養物をＴＳＢ＋酵母エキス＋ａｍｐｉ＋ｔｅｔｒａ中で調製する。
【０１１６】
１０分間培養した後、培地にＩＡＡを２５μｇ／ｍｌの濃度に添加することによって、タンパク質の発現を誘発する。培養物を４℃において２４６０ｇで１０分間遠心する。
【０１１７】
２０ｍｌのＴＳＴ  １×ｐＨ７．４でプラグを取り、次いでこの溶液を４℃において２３，０００ｇで３０分間遠心する。
【０１１８】
上清をセファローズを通して濾過し、これにより可溶性であるタンパク質を単離することができる。プラグを洗浄緩衝液で洗浄し、次いで４℃において２３，０００ｇで３０分間遠心する。次いで封入体を含有するプラグを９００μｌの変性溶液＋１００μｌの１０ｍＭのジチオスレイトールで取り、３７℃において２時間インキュベートする。
【０１１９】
次いでこの溶液を周囲温度において撹拌しながら一夜インキュベートし、１００ｍｌの復元緩衝液中の２３００ｇで１時間遠心する。
【０１２０】
上清をＨＳＡセファローズを通して濾過する。
【０１２１】
２つの場合において、固定化されたタンパク質を０．５Ｍの酢酸ｐＨ２．８で溶離し、１ｍｌの画分で集める。
【０１２２】
次いで、集めた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル上およびイムノブロットにより分析する。
【０１２３】
結果
第４図に表されている方法に従い３段階において、遺伝子のクローニングを実施した。
【０１２４】
第１段階において、我々は位置１０３におけるＡの代わりのＴを除外して配列の発表された部分を確認した。
【０１２５】
次いで、我々は遺伝子の３’−配列を決定し、最後に５’−配列を決定した。
【０１２６】
全体の遺伝子を２つの部分８／４および３／１４の融合により構築し、次いで発現ベクターｐＲＩＴ２８中でクローニングした。配列は配列番号１３に相当する。
【０１２７】
タンパク質はＢＢＰ４０の形態で発現される。
【０１２８】
それは本質的に封入体から出発して得られる。２００ｍｌの培養物について、１５ｍｇのタンパク質が精製される。
【０１２９】
電気泳動のプロフィルは、変性後に得られたＢＢＰ４０が高い純度であることを示す。見掛けの分子量は、６３ｋＤａである計算した理論的分子量に相当する。  イムノブロットの特性決定は、精製されたタンパク質が事実ウサギ抗Ｐ４０血清により認識されることを示す。
【０１３０】
実施例５：Ｇ１  Ａペプチドへのｐ４０タンパク質のカップリング
ｐ４０（５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ）を３００体積の０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７、双性界面活性剤３−１４、０．１％に対して透析する。
【０１３１】
０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９、双性界面活性剤３−１４、０．１％により、透析物を２ｍｇ／ｍｌの濃度に調節する。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を４％の最終濃度に添加する。
【０１３２】
Ｇ１  ペプチド（１０ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９；０．１％の双性界面活性剤３−１４）をｐ４０溶液に添加する。ｐＨを確認する（ｐＨ９およびｐＨ１０の間）。
【０１３３】
２２０μｌのグルタルアルデヒド（水中の２．５％）を添加し、４℃において２４時間撹拌する。
【０１３４】
５ｍｌの０．１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９、０．１％の双性界面活性剤３−１４を添加し、ｐＨを確認し（ｐＨ９およびｐＨ１０の間）、４℃において７２時間撹拌する。
【０１３５】
２２０μｌのグルタルアルデヒド（水中の２．５％）を添加し、ｐＨを確認し、＋４℃において２４時間撹拌する。
【０１３６】
１００μｌの１Ｍのリジンの添加により、反応を停止させる。この溶液を４℃において２４時間透析する。
【０１３７】
ＳＤＳを二重ＫＣｌ沈降により排除する。
【０１３８】
ｐ４０複合体を含有する溶液を凍結させ、そのまま使用するか、または凍結乾燥させる。
【０１３９】
実施例６：活性
材料および方法
アジュバントの存在下に、必要に応じて担体にカップリングした、１０μｇのＧ１で皮下投与により、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝５）を第０日、第１０日および第２０日に免疫化する。血清を集め、ＥＬＩＳＡにより試験する。抗Ｇ１または抗担体ＩｇをＢＳＡ−Ｇ１支持体上に、および「担体」支持体（ＫＬＨまたはＴＴまたはｐ４０）上に単離する。Ｉｇを抗Ｉｇウサギペルオキシダーゼ複合体により可視化する。光学密度を４５０ｎｍにおいて読み、バックグラウンドの雑音を２倍にする最後の希釈を逆数プロットすることによって、抗Ｇ１抗体の力価を得る。結果は５匹のマウスの力価の平均±標準偏差を表す。
【０１４０】
結  果
Ｇ１Ａに対する免疫応答の誘発
同一の免疫化スキームに従い、マウスを異なる形態のＧ１Ａで免疫化する。異なる形態のＧ１Ａにより誘発された抗体の応答を、実験の開始後２８日に比較する。
【０１４１】
純粋な形態で投与した合成Ｇ１Ａペプチドは、それをフロインドアジュバントと同時に投与した場合でさえ、免疫応答を誘発しない。担体ＫＬＨとともに投与すると、Ｇ１Ａは弱い応答を誘発し、これはフロインドアジュバント（ＦＡ）の同時投与により有意に増加される。ｐ４０とともに投与すると、Ｇ１Ａは慣用のＫＬＨ／Ｇ１＋ＡＦ、「自己アジュバント担体」性質に対するｐ４０免疫化スキームにおいて得られた応答より大きい応答を誘発する。
【０１４２】
結果を第１図に表す。
【０１４３】
Ｇ１Ａに対する免疫応答の速度論
同一の免疫化スキームに従い、マウスを異なる形態のＧ１Ａで免疫化する。異なる形態のＧ１Ａにより誘発された抗体の応答を下記の時間において比較する：実験の開始後７、１７、２８、３５、４２日。
【０１４４】
マウスをより普通のＴＴ／Ｇ１ＡおよびＫＬＨ／Ｇ１Ａ＋ＡＦの免疫化よりもｐ４０／Ｇ１Ａで免疫化したとき、抗Ｇ１Ａの応答は有意により高くかついっそう急速である。ｐ４０／Ｇ１Ａの１回の注射により、７日までに１０００の抗体力価を得ることができる。この力価はＴＴ／Ｇ１ＡまたはＫＬＨ／Ｇ１Ａ＋ＡＦを使用して２８日に得られる。３回の注射後に、２８日までに得られる最大の応答（力価＝１／３８０，０００）は、ＫＬＨ／Ｇ１Ａ＋ＡＦで得られるよりほぼ３０倍大きく、そしてＴＴ／Ｇ１Ａで得られるより７０倍大きい。抗Ｇ１Ａ抗体の力価は、第４２日まで弱化しないで、一定に持続する。
【０１４５】
結果を第２図に表す。
【０１４６】
担体に対する免疫応答の速度論
同一の免疫化スキームに従い、マウスを担体にカップリングしたＧ１Ａで免疫化する。異なる担体により誘発された抗体の応答を下記の時間において比較する：実験の開始後７、１７、２８、３５、４２日。
【０１４７】
抗ｐ４０の応答（１０，０００に近い力価）は、抗ＫＬＨの応答より高いが、抗ＴＴの応答と有意に異ならない。
【０１４８】
結果を第３図に表す。
【０１４９】
結  論
ｐ４０タンパク質へのＧ１Ａペプチドの化学的カップリングは、ＫＬＨ／Ｇ１Ａ＋ＡＦまたはＴＴ／Ｇ１Ａの参照モデルにより誘発される応答より、有意により重要なかつより急速な抗Ｇ１Ａ応答の誘発を可能とする。Ｇ１Ｂペプチドのカップリングは同様な応答を誘発すると考えられる。
【０１５０】
実施例７：  ｐ４０担体タンパク質にカップリングされた呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）サブグループＡの糖タンパク質Ｇのペプチドおよび組換えペプチドの保護的可能性の評価
ＢＡＬＢ／ｃマウスを下記の異なる調製物で免疫化する。
１）  ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）にカップリングされた
Ｇ１Ａ合成ペプチド＝ＫＬＨ・Ｇ１Ａ。
２）  ｐ４０担体タンパク質にカップリングされたＧ１Ａ合成ペプチド
＝ｐ４０・Ｇ１Ａ。
３）  ｐ４０対照単独。
４）  ｐ４０担体タンパク質にカップリングされた大腸菌(E.coli)中で生産された組換えタンパク質：ＢＢＧ２ＡδＣ＝ｐ４０・ＢＢＧ２ＡδＣ。
５）  破傷風トキソイド（ＴＴ）担体タンパク質にカップリングされたＧ１Ａ合成ペプチド＝ＴＴ・Ｇ１Ａ。
６）  ＴＴ対照単独。
７）  ＢＢ対照単独。
８）  長いＲＳＶ対照（サブグループＡ）。
【０１５１】
マウスにアジュバントとして水酸化アルミニウム（人間において現在使用されている）とともに３回の筋肉内投与（２００μｇ／マウス）を与えた。保護試験の結果ならびに血清の免疫学的プロフィルを表２に記載する。
【０１５２】
下記の調製物は、ＴＴ・Ｇ１Ａ（これは、また、ペプチドＫＬＨ・Ｇ１Ａに匹敵する非常にすぐれた保護を与える）に関して、長いＲＳＶ（株Ａ）：ｐ４０・Ｇ１Ａ、ｐ４０・ＢＢＧ２ＡδＣで試験（challenge ）した後、完全な保護を与える。ＥＬＩＳＡ試験において、それらのすべてはＲＳＶ抗原を認識し、ｐ４０・Ｇ１Ａについて最大の力価＝１／１２８００が得られる。
【０１５３】
中和試験に関して、調製物のいずれもｉｎ  ｖｉｔｒｏの中和活性をもたない。
【表２】
2006020637.tif 000004
2006020637.tif 000005
2006020637.tif 000006
実施例８
ＫＬＨにカップリングされた呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）サブグループＡおよびサブグループＢの糖タンパク質Ｇのペプチドの保護の可能性の評価。ＲＳＶの２つのサブグループを用いて実施した試験に対する保護。
【０１５４】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを下記の異なる調製物で免疫化した：
１．  ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）にカップリングされたＧ１Ａ合成ペプチド＝ＫＬＨ−Ｇ１Ａ。
２．  ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）にカップリングされたＧ１Ｂ合成ペプチド＝ＫＬＨ−Ｇ１Ｂ。Ｇ１ＢペプチドはサブグループＢの配列Ｇ（１７４−１８７）δＣｙｓに相当し、その配列は下記の通りである：
【化２】
2006020637.tif 000007
３．  ＫＬＨ対照。
４．  長いＲＳＶ対照（サブグループＡ）。
５．  ８／６０ＲＳＶ対照（サブグループＢ）。
【０１５５】
マウスにフロインドアジュバントとともに３回の筋肉内投与（２００μｇ／マウス）を与えた。保護試験の結果ならびに血清の免疫学的プロフィルを表３に記載する。
【０１５６】
調製物ＫＬＨ・Ｇ１ＡはＲＳＶサブグループＡに対する完全な保護を可能とするが、ＲＳＶサブグループＢに対して保護を可能としない。反対に、調製物ＫＬＨ・Ｇ１ＢはＲＳＶサブグループＢに対する完全な保護を可能とするが、ＲＳＶサブグループＡに対して保護しない。ＥＬＩＳＡ試験は同一として状況を反映する。
【表３】
2006020637.tif 000008
【０１５７】
実施例９：獣医学的適用
ＫＬＨ担体タンパク質にカップリングされた呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）のウシ株(Lerch et al. 、1990 、J.Virol.64:5559) のプロテインＧ由来のＧ１ｖ△Ｃペプチドの保護的可能性の評価。
【０１５８】
174                                                  187 
Ser Thr Cys Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Ser Leu Ser His 
（位置１７６−１８２にジスルフィド架橋を有する）
Ｂｏｃ化学を使用する固相合成により製造されたペプチドを、グルタルアルデヒドを使用してＫＬＨにカップリングする(Schaaper et al.、Mol.Immunol.(1989）26:81-85) 。
【０１５９】
２頭の仔ウシを不完全フロインドアジュバントとともに５００μｇのＧ１ｖ△Ｃ−ＫＬＨで筋肉内経路により３週の間隔で３回免疫化した。一方の仔ウシをＧ１ｖ△Ｃペプチドを含まないＫＬＨと、不完全フロインドアジュバントとで免疫化した。
【０１６０】
動物を最後の接種後２１日にＳｎｏｏｋ株で、鼻内および気管内の経路により、各々２×１０５／ｍｌの滴定ウイルス力価１ｍｌで試験する。
【０１６１】
プラーク法に従い仔ウシ腎細胞について滴定されたウイルスを、試験後それぞれ３および２日の鼻咽頭の洗浄において、そして７日に殺した動物の肺において決定する。
【０１６２】
循環する抗体の応答：
【表４】
2006020637.tif 000009
仔ウシに５００μｇのＧ１ｖ△Ｃ−ＫＬＨ＋不完全フロインドアジュバントを３週の間隔で３回投与した。
【０１６３】
【表５】
2006020637.tif 000010
【表６】
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【表７】
2006020637.tif 000012
【０１６４】
本発明により開示される配列は下記の通りである。
【表８】
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【０１６５】
本発明は下記の通りである。
（１）サブグループＡおよびサブグループＢのヒト呼吸器多核体ウイルス、またはウシ呼吸器多核体ウイルス、またはウシのＧタンパク質の配列のアミノ酸残基１３０と２３０との間のペプチド配列、または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を保持することを特徴とする、免疫原要素として使用できるポリペプチド。
【０１６６】
（２）ＲＳＶプロテインＧのアミノ酸残基番号１７４と１８７との間のペプチド配列または対応する配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むことを特徴とする、（１）に記載のポリペプチド。
【０１６７】
（３）ａ）位置１７３および／または１８６におけるＣｙｓアミノ酸がジスルフィド架橋を形成しないアミノ酸、特にセリンにより置換されている、および／または
ｂ）位置１７６および１８２におけるアミノ酸がジスルフィド架橋以外の共有結合の架橋を形成することができるアミノ酸、特にアスパラギン酸およびオルニチンである、
配列を含むことを特徴とする、（１）または（２）に記載のポリペプチド。
【０１６８】
（４）ＲＳＶプロテインＧの配列のアミノ酸残基番号１４０と２００の間とのペプチド配列または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列から成ることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【０１６９】
（５）ＲＳＶプロテインＧの配列のアミノ酸残基番号１５８と１９０との間のペプチド配列または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列から成ることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【０１７０】
（６）ヒトＲＳＶ、サブグループＡおよびサブグループＢのプロテインＧまたはウシＲＳＶの配列のアミノ酸残基番号１３０と２３０との間のペプチド配列または前記ペプチド配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列から成ることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【０１７１】
（７）下記の配列：
配列番号５：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ、
配列番号６：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ、
配列番号７：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ、
配列番号８：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ、
配列番号９：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｏｒｎ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ、
配列番号１０：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｏｒｎ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｌｙｓ、
配列番号１１：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｏｒｎ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ、
配列番号１２：
Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｏｒｎ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ、
の中の１つを有することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【０１７２】
（８）配列番号１４〜７３の中の１つを有することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【０１７３】
（９）Ｎ−末端またはＣ−末端の位置に少なくとも１つのシステイン残基をさらに含むことを特徴とする、（１）〜（８）のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【０１７４】
（１０）担体タンパク質に結合した（１）〜（９）のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする免疫原的薬剤。
【０１７５】
（１１）担体タンパク質が免疫アジュバントタンパク質であることを特徴とする、（１０）に記載の免疫原的薬剤。
【０１７６】
（１２）担体タンパク質がＯｍｐＡタンパク質であることを特徴とする、（１０）および（１１）に記載の免疫原的薬剤。
【０１７７】
（１３）ポリペプチドがクレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の外膜のタンパク質との可溶性複合体の形態であることを特徴とする、（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載の薬剤。
【０１７８】
（１４）免疫アジュバントタンパク質がクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae) のタンパク質ｐ４０またはタンパク質ｐ４０と少なくとも８０％の相同性を有するタンパク質であることを特徴とする、（１１）〜（１３）のいずれか一項に記載の薬剤。
【０１７９】
（１５）ポリペプチドが結合タンパク質により担体タンパク質に複合化されていることを特徴とする、（１０）〜（１４）のいずれか一項に記載の薬剤。
【０１８０】
（１６）結合タンパク質がヒト血清アルブミンレセプターであることを特徴とする、（１５）に記載の薬剤。
【０１８１】
（１７）前記ポリペプチドが配列番号１３を含むタンパク質に結合されていることを特徴とする、（１０）〜（１６）のいずれか一項に記載の薬剤。
【０１８２】
（１８）結合が共有結合であることを特徴とする、（１０）〜（１７）のいずれか一項に記載の薬剤。
【０１８３】
（１９）生物学的経路により得られることを特徴とする、（１０）〜（１８）のいずれか一項に記載の薬剤。
【０１８４】
（２０）（１）〜（９）のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは（１０）〜（１９）のいずれか一項に記載の薬剤を含有することを特徴とする、ヒトＲＳＶ、サブグループＡおよび／またはサブグループＢ、またはウシＲＳＶにより誘発される感染の予防および／または治療用組成物。
【０１８５】
（２１）注射可能な経路による投与に適合した薬学上許容される賦形剤をさらに含有することを特徴とする、（２０）に記載の組成物。
【０１８６】
（２２）非特異的免疫アジュバントを含むことを特徴とする、（２０）または（２１）に記載の組成物。
【０１８７】
（２３）（１）〜（９）のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするヌクレオチド配列。
【０１８８】
（２４）配列番号１３を含むタンパク質をコードすることを特徴とするヌクレオチド配列。
【０１８９】
（２５）ａ）クレブシエラ(Klebsiella)属の細菌の膜リポ多糖類を２価のカチオンおよび界面活性剤の存在下に沈降させて、上清中に全体の膜タンパク質を回収し、
ｂ）前記タンパク質をアニオン交換クロマトグラフィーにかけて、免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を分離し、
ｃ）免疫アジュバントタンパク質を含有する画分を濃縮し、
ｄ）免疫アジュバントタンパク質を（１）〜（９）のいずれか一項に記載のポリペプチドと複合化させて可溶性複合体を形成する、
ことを特徴とする、（２０）または（２１）に記載の組成物の中に挿入された複合化ペプチドを製造する方法。
【０１９０】
（２６）工程ｄ）を０．０５％より低いか、またはそれに等しい濃度のグルタルアルデヒドの存在下に５日より長いか、またはそれに等しい期間の間実施することを特徴とする、（２５）に記載の方法。
【０１９１】
（２７）抗原の免疫原性を改良するための、配列番号１３または少なくとも８０％の相同性を有する配列を有するタンパク質の使用。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】異なる形態のＧ１Ａに対して誘発された免疫応答の強度を示した図である。
【図２】異なる形態で提示されたＧ１Ａに対して誘発された免疫応答の速度論（kinetics）を示した図である。
【図３】担体単独に対して誘発された免疫応答の速度論を示した図である。
【図４】ｐ４０の遺伝的増幅によるクローニング法を示した図である。
【図１】
2006020637.tif 000090
【図２】
2006020637.tif 000091
【図３】
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【図４】
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