(57)【要約】【課題】  固定処理の作業効率を悪化させることなくＳＰＲ測定を行う。【解決手段】  ＳＰＲ測定装置は、センサユニットにリガンドを固定する固定処理を行う固定機１０と固定済みのセンサユニットを用いてリガンドとアナライトとの反応状況を測定する測定処理を行う測定機１１とからなる。センサユニットは、ホルダ５２に収納された状態で各処理が行われる。固定機１０と測定機１１との間には、保管機１０１が配置される。固定が完了したセンサユニットは固定機１０から保管機１０１に送り出される。空になった固定機１０には、未固定のセンサユニットがセットされて、固定処理が開始される。保管機１０１に固定済みセンサユニットが溜まった時点で、センサユニットは測定機１１へ送り出されて、測定処理が実行される。【選択図】        図６
2006090718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な誘導体上に形成され一方の面がリガンドとアナライトとの反応を検知するためのセンサ面となる薄膜を持つセンサを備えるセンサユニットを用い、前記センサ面にリガンドを固定するとともに、前記センサ面の裏側の光入射面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、前記センサ面にアナライトを接触させたときの前記光の反射光の減衰状況を検出することにより、前記リガンドと前記アナライトの反応状況を測定する全反射減衰を利用した測定装置において、
前記センサ面にリガンドを固定化する固定処理を行なう固定ステージと、
前記センサ面にアナライトを接触させて、前記光の減衰状況を検出して測定処理を行なう測定ステージと、
測定処理が行なわれるまで、前記リガンドが注入されたセンサユニットを保管する保管ステージとからなることを特徴とする全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項２】
前記保管ステージは、前記固定ステージおよび前記検出ステージの各ステージを構成する筐体とは別の筐体で構成されることを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項３】
前記固定ステージと前記測定ステージとは、それぞれ別々の筐体に設けられており、前記保管ステージは、前記各筐体のいずれかに設けられていることを特徴とする請求項１または２記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項４】
前記センサユニットは、ホルダに複数個まとめて収納されており、前記ホルダ単位で、前記各ステージ間の引き渡しが行なわれることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項５】
前記保管ステージには、複数の前記ユニットホルダを縦方向に並べて収容するラックが設けられていることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項６】
前記保管ステージには、前記固定ステージから送り出された前記センサユニットを受け取る受け取り手段と、前記測定ステージへ送り出す送り出し手段とが設けられていることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項７】
前記測定ステージにおける処理量に応じて、前記固定ステージの処理量および前記保管ステージに保管する保管量を決定する制御部が設けられていることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項８】
前記保管ステージには、温度を含む環境条件を調整する環境条件調整手段が設けられていることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドとアナライトの反応状況を測定する全反射減衰を利用した測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
透明な誘電体上に形成された薄膜の一方の面であるセンサ面上において試料の反応を生じさせ、前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように光を入射し、その反射光の減衰状況に基づいて前記反応を測定する全反射減衰を利用した測定装置が知られており、その１つに、表面プラズモン共鳴現象を利用した測定装置がある。
【０００３】
金属中では、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。プラズモンとは、この粗密波を量子化した表現であり、このうち、金属の表面に発生する粗密波が表面プラズモンと呼ばれる。この表面プラズモンは金属の表面に沿って進む。表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）現象を利用した測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置という）は、透明な誘電体上に形成された薄膜として金属膜を使用し、この金属膜の一方の面をセンサ面として、このセンサ面に表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲという）を発生させ、そこで生じる物質の反応状況を、表面プラズモン共鳴現象を検出することにより測定する装置である。
【０００４】
金属膜のセンサ面の裏面から、全反射条件を満足するように（臨界角以上の入射角で）光を照射すると、その光入射面において全反射が起こるが、入射光のうちわずかな光は反射せずに金属膜内を通過して、センサ面に染み出す。この染み出した光波がエバネッセント波と呼ばれる。このエバネッセント波と表面プラズモンの振動数が一致して共鳴すると（ＳＰＲが発生すると）、反射光の強度が大きく減衰する。ＳＰＲ測定装置は、前記光入射面で反射する反射光の減衰を捉えることにより、その裏側のセンサ面で発生するＳＰＲを検出する。
【０００５】
ＳＰＲを発生させるための光の入射角（共鳴角）は、エバネッセント波及び表面プラズモンが伝播する媒質の屈折率に依存する。言い換えると、媒質の屈折率が変化すれば、ＳＰＲを発生させる共鳴角が変化する。センサ面と接する物質は、エバネッセント波及び表面プラズモンを伝播させる媒質となるので、例えば、センサ面において、２種類の分子間の結合や解離等の反応が生じると、それが媒質の屈折率の変化として顕れて、共鳴角が変化する。ＳＰＲ測定装置は、この共鳴角の変化を捉えることにより分子間の相互作用を測定する。
【０００６】
このＳＰＲ測定装置は、例えば、タンパク質やＤＮＡ等の生化学物質の相互作用を調べたり、薬品のスクリーニングを行ったりする等、生化学分野を代表とした各種研究に用いられる。生化学分野の研究においては、タンパク質、ＤＮＡ、薬品等が、リガンドやアナライトとして使用される。例えば、薬品のスクリーニングを行う場合には、リガンドとして、タンパク質等の生体物質を使用し、このセンサ面にアナライトとなる複数種類の薬品を接触させて、それらの相互作用を調べる。
【０００７】
下記特許文献１に記載のＳＰＲ測定装置は、金属膜に光を入射させるための光学系として、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置を採用している。Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置では、金属膜の光入射面と、この光入射面に向けて全反射条件を満足するように照射された光を集光するプリズムとが接合される。センサ面には、リガンドが固定され、センサ面と対向する位置には、アナライトを流す流路が配置される。この流路にアナライトを送液して、アナライトとリガンドとを接触させ、そのときのＳＰＲの発生を検出することによりそれらの相互作用が測定される。
【０００８】
下記特許文献１記載のＳＰＲ測定装置では、装置本体にプリズムと流路とが配置された測定ステージが設けられており、この測定ステージに、透明な誘導体であるガラス基板上に金属膜を形成した略平板上のチップ型のＳＰＲセンサ（以下、単にチップ型センサという）を装着して、測定が行われる。このチップ型センサは、前記装着本体に着脱自在であり、センサ面と装着本体の流路とが対向し、光入射面とプリズムとが対向するように、装着される。測定を行う前には前処理として、チップ型センサの金属膜上にリガンドを固定する処理（リガンド固定処理）が行われるが、下記特許文献１記載のＳＰＲ装置では、このリガンド固定処理についても、チップ型センサを測定ステージに装着した状態で行われる。
【０００９】
このチップ型センサは、センサ面が露出されており、前記流路は、センサ面と対向する部位が解放されている。このため、チップ型センサが測定ステージに装着されると、センサ面によって流路の解放部位が覆われて、流路が密閉される。これにより、流路への送液が可能となる。こうした状態で、流路へリガンドを注入して固定処理が行われ、引き続きアナライトが注入されて測定処理が行われる。
【００１０】
リガンド固定処理では、リガンドを溶媒に溶かしたリガンド溶液を流路へ注入して、溶液中のリガンドをセンサ面に固定させる。溶液注入後、固定化が完了するまでの時間は、数時間を要するので、数秒から数分程度で終了する測定時間に比べて非常に長い。上述したとおり、下記特許文献１のＳＰＲ装置では、リガンドの固定を行う固定ステージと、測定ステージとが同一であるため、固定処理を行っている間、測定処理ができないという問題がある。
【００１１】
そこで、本出願人により、測定ステージと固定ステージを分離したＳＰＲ測定装置が開発されている。このＳＰＲ測定装置は、例えば、測定ステージが設けられた測定機と、固定ステージが設けられた固定機とからなり、各ステージが別々の筐体に設けられている。このＳＰＲ測定装置は、固定ステージが測定ステージの外部に設けられていることから、外固定型ＳＰＲ測定装置と呼ばれる。これによれば、専用の固定ステージが設けられているから、固定処理と測定処理を並行して行うことが可能となるので、作業効率が向上する。また、外固定型ＳＰＲ測定装置では、前記センサチップの代わりに、金属膜，プリズム及び流路が一体化されたセンサユニットが用いられており、このセンサユニットが各ステージ間で引き渡される。このセンサユニットは、センサの主要部となる金属膜と、プリズム及び流路とが一体化されているので、前記センサチップと比較して、各ステージへの装着を簡単に行うことができる。
【００１２】
上述したとおり、測定時間は短いので、作業効率を考えると、固定済みのセンサユニットを多数個作り置きしておき、それらに対してまとめて測定を行うのがよい。固定機には、複数のセンサユニットに対してまとめて固定を行うことができるように、複数のセンサユニットを並べて載置するスペースが確保されている。固定処理では、こうして並べられた複数のセンサユニットに対して、順次リガンドが注入され、注入されたセンサユニットは固定化が完了するまでの間、載置スペース上に留め置かれる。固定化が完了すると、載置スペース上のセンサユニットが測定機へと送られて、順次測定が行われる。
【特許文献１】特開平６−１６７４４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
この外固定型ＳＰＲ測定装置では、作業の簡便化を図るため、固定機と測定機との間にセンサユニットを搬送する搬送機構を設けて、固定機と測定機との間でのセンサユニットの受け渡しを自動化することが検討されている。しかし、そうした搬送機構によって、測定処理の進捗状況に合わせて固定機からセンサユニットを送り出すのでは、固定機の載置スペース上のセンサユニットが全部送り出されるまでの間、次の固定処理ができず、固定処理の作業効率の悪化を招くという問題があった。
【００１４】
本発明は、固定処理の作業効率を悪化させることなく、センサユニットの固定ステージから測定ステージへの引き渡しを自動化できる表面プラズモン共鳴現象を利用した測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の全反射減衰を利用した測定装置は、透明な誘導体上に形成され一方の面がリガンドとアナライトとの反応を検知するためのセンサ面となる薄膜を持つセンサを備えるセンサユニットを用い、前記センサ面にリガンドを固定するとともに、前記センサ面の裏側の光入射面に全反射条件を満たすように光源から光を入射させ、前記センサ面にアナライトを接触させたときの前記光の反射光の減衰状況を検出することにより、前記リガンドと前記アナライトの反応状況を測定する全反射減衰を利用した測定装置において、前記センサ面にリガンドを固定化する固定処理を行なう固定ステージと、前記センサ面にアナライトを接触させて、前記光の減衰状況を検出して測定処理を行なう測定ステージと、測定処理が行なわれるまで、前記リガンドが注入されたセンサユニットを保管する保管ステージとからなることを特徴とする。
【００１６】
前記保管ステージは、前記固定ステージ及び前記検出ステージの各ステージを構成する筐体とは別の筐体で構成されることが好ましい。
【００１７】
前記固定ステージと前記測定ステージとは、それぞれ別々の筐体に設けられており、前記保管ステージは、前記各筐体のいずれかに設けられていることが好ましい。
【００１８】
前記センサユニットは、ホルダに複数個まとめて収納されており、前記ホルダ単位で、前記各ステージ間の引き渡しが行われることが好ましい。
【００１９】
前記保管ステージには、複数の前記ユニットホルダを縦方向に並べて収容するラックが設けられていることが好ましい。
【００２０】
前記保管ステージには、前記固定ステージから送り出された前記センサユニットを受け取る受け取り手段と、前記測定ステージへ送り出す送り出し手段とが設けられていることが好ましい。
【００２１】
前記測定ステージにおける処理量に応じて、前記固定ステージの処理量及び前記保管ステージに保管する保管量を決定する制御部が設けられていることが好ましい。
【００２２】
前記保管ステージには、温度を含む環境条件を調整する環境条件調整手段が設けられていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、透明な誘導体上に形成され一方の面がリガンドとアナライトとの反応を検知するためのセンサ面となる薄膜を持つセンサを備えるセンサユニットを用い、前記センサ面にリガンドを固定化する固定処理を行なう固定ステージと、前記センサ面にアナライトを接触させて、前記光の減衰状況を検出して測定処理を行なう測定ステージと、これら固定ステージ及び測定ステージとは別に設けられ、測定処理が行なわれるまで、前記リガンドが注入されたセンサユニットを保管する保管ステージとからなる全反射減衰を利用した測定装置を用いることからなるので、固定処理の作業効率を悪化させることなく、センサユニットの固定ステージから測定ステージへの引き渡しを自動化させて測定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１に示すように、ＳＰＲを利用した測定方法は、大きく分けて、固定工程と、測定工程（データ読み取り工程）と、データ解析工程との３つの工程からなる。ＳＰＲ測定装置は、固定工程を行う固定機１０と、測定工程を行う測定機１１と、測定機１１によって得られたデータを解析するデータ解析機９１（図４参照）からなる。
【００２５】
測定は、ＳＰＲセンサであるセンサユニット１２を用いて行われる。センサユニット１２は、一方の面がＳＰＲが発生するセンサ面１３ａとなる金属膜１３と、このセンサ面１３ａの裏面の光入射面１３ｂと接合されるプリズム１４と、前記センサ面１３ａと対向して配置され、リガンドやアナライトが送液される流路１６とを備えている。
【００２６】
金属膜１３としては、例えば、金が使用され、その膜厚は、例えば、５００オングストロームである。この膜厚は、金属膜の素材、照射される光の発光波長等に応じて適宜選択される。プリズム１４は、光入射面１３ｂに向けて、全反射条件を満たすように照射された光を集光する。流路１６は、略Ｕ字形に屈曲された送液管であり、液体を注入する注入口１６ａと、それを排出する排出口１６ｂとを持っている。流路１６の管径は、例えば、約１ｍｍ程度であり、注入口１６ａと排出口１６ｂの間隔は、例えば、約１０ｍｍ程度である。
【００２７】
また、流路１６の底部は、開放されており、この開放部位はセンサ面１３ａによって覆われて密閉される。これら流路１６とセンサ面１３ａによってセンサセル１７が構成される。後述するように、センサユニット１２は、こうしたセンサセル１７を複数個備えている（図２参照）。
【００２８】
固定工程は、センサ面１３ａにリガンドを固定する工程である。固定工程は、センサユニット１２を固定機１０にセットして行われる。固定機１０には、１対のピペット１９ａ，１９ｂからなるピペット対１９が設けられている。ピペット対１９は、各ピペット１９ａ，１９ｂが、注入口１６ａと排出口１６ｂのそれぞれに挿入される。各ピペット１９ａ，１９ｂは、それぞれが流路１６への液体の注入と、流路１６からの吸い出しを行う機能を備えており、一方が注入動作を行っているときには、他方が吸い出し動作を行うというように、互いに連動する。このピペット対１９を用いて、注入口１６ａから、リガンドを溶媒に溶かしたリガンド溶液２１が注入される。
【００２９】
センサ面１３ａのほぼ中央部には、リガンドと結合するリンカー膜２２が形成されている。このリンカー膜２２は、センサユニット１２の製造段階において、あらかじめ形成される。リンカー膜２２は、リガンドを固定するための固定基となるので、固定するリガンドの種類に応じて適宜選択される。
【００３０】
リガンド溶液２１を注入するリガンド固定化処理を行う前に、前処理として、まず、リンカー膜２２に対して、固定用バッファ液を送液してリンカー膜２２を湿らせた後、リンカー膜２２へリガンドが結合しやすくするために、リンカー膜２２の活性化処理が施される。例えば、アミンカップリング法では、リンカー膜２２としてカルボキシメチルデキストランが使用され、リガンド内のアミノ基をこのデキストランに直接共有結合させる。この場合の活性化液としては、Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）との混合液が使用される。この活性化処理の後、固定用バッファによって流路１６が洗浄される。
【００３１】
固定用バッファや、リガンド溶液２１の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐＨ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、リガンドとして生体物質を使用する場合には、ｐＨ値を中性付近に調整した生理的食塩水が使用される場合が多い。しかし、上記アミンカップリング法では、リンカー膜２２は、カルボキシメチルデキストランにより負（マイナス）に帯電するので、このリンカー膜２２と結合しやすいようにタンパク質を陽（プラス）に帯電させるため、生理的とはいえない高濃度のリン酸塩を含む緩衝作用の強いリン酸緩衝液（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ，ｓａｌｉｎｅ）等が使用される場合もある。
【００３２】
こうした活性化処理及び洗浄が行われた後、センサセル１７へリガンド溶液２１が注入されてリガンド固定化処理が行われる。リガンド溶液２１が流路１６へ注入されると、溶液中で拡散しているリガンド２１ａが徐々にリンカー膜２２へ近づいて、結合する。こうしてセンサ面１３ａにリガンド２１ａが固定される。固定化には、通常、約１時間程度かかり、この間、センサユニット１２は、温度を含む環境条件が所定の条件に設定された状態で、保管される。なお、固定化が進行している間、流路１６内のリガンド溶液２１を静置しておいてもよいが、流路１６内のリガンド溶液２１を攪拌して流動させることが好ましい。こうすることで、リガンドとリンカー膜２２との結合が促進され、リガンドの固定量を増加させることができる。
【００３３】
センサ面１３ａへのリガンド２１ａの固定化が完了すると、前記流路１６からリガンド溶液２１が排出される。リガンド溶液２１は、ピペット１９ｂによって吸い出されて排出される。固定化が完了したセンサ面１３ａは、流路１６へ洗浄液が注入されて洗浄処理が行われる。この洗浄後、必要に応じて、ブロッキング液を流路１６へ注入して、リンカー膜２２のうち、リガンドが結合しなかった反応基を失活させるブロッキング処理が行われる。ブロッキング液としては、例えば、エタノールアミン−ヒドロクロライドが使用される。このブロッキング処理の後、再び流路１６が洗浄される。流路１６内の洗浄処理が完了した後、センサユニット１２は測定機１１へ搬送される。
【００３４】
測定工程は、センサユニット１２を測定機１１にセットして行われる。測定機１１にも、固定機１０のピペット対１９と同様のピペット対２６が設けられている。このピペット対２６によって、注入口１６ａから、流路１６へ各種の液が注入される。測定工程では、まず、流路１６へ測定用バッファが注入される。この後、アナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液２７を注入し、その後、再び測定用バッファが注入される。なお、最初に測定用バッファを注入する前に、いったん流路１６の洗浄を行ってもよい。データの読み取りは、基準となる信号レベルを検出するために、最初の測定用バッファを注入した直後から開始され、アナライト溶液２７の注入後、再び測定用バッファが注入されるまでの間、行われる。これにより、基準レベルの検出、アナライトとリガンドとの反応状況（結合状況）、測定用バッファ注入による結合したアナライトとリガンドとの脱利までの信号を測定することができる。
【００３５】
また、図示しないが、リンカー膜２２上には、リガンドが固定されアナライトとリガンドとの反応が生じる反応領域（ａｃｔ）と、リガンドが固定されず、前記反応領域の信号測定に際しての参照信号を得るためのリファレンス領域（ｒｅｆ）とが形成される。このリファレンス領域は、上述したリンカー膜２２を製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、リンカー膜２２に対して表面処理を施して、リンカー膜２２の半分程度の領域について、リガンドと結合する結合基を失活させる。これにより、リンカー膜２２の半分が反応領域となり、残りの半分がリファレンス領域となる。
【００３６】
これら各領域のａｃｔ信号とｒｅｆ信号は、基準レベルの検出から結合反応を経て脱離に至るまで、同時に計測される。データ解析は、こうして得られたａｃｔ信号とｒｅｆ信号の差や比を求めて行われる。データ解析機９１は、例えば、ａｃｔ信号とｒｅｆ信号との差分データを求め、この差分データを測定データとし、これに基づいて解析を行う。こうすることで、センサユニットや各センサセルの個体差や、装置の機械的な変動や、液体の温度変化等、外乱に起因するノイズをキャンセルすることが可能となり、Ｓ／Ｎ比の良好な信号が得られる。
【００３７】
測定用バッファや、アナライト溶液２７の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐＨ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、アナライトを溶けやすくするために、生理的食塩水にＤＭＳＯ（ジメチル−スルホ−オキシド）を含ませてもよい。このＤＭＳＯは、信号レベルに大きく影響する。上述したとおり測定用バッファは基準レベルの検出に用いられるので、アナライトの溶媒中にＤＭＳＯが含まれる場合には、そのＤＭＳＯ濃度と同程度のＤＭＳＯ濃度を持つ測定用バッファを使用することが好ましい。
【００３８】
なお、アナライト溶液２７は、長期間（例えば、１年）保管されることも多く、そうした場合には、経時変化によって、初期のＤＭＳＯ濃度と測定時のＤＭＳＯ濃度との間に濃度差が生じてしまう場合がある。厳密な測定を行う必要がある場合には、こうした濃度差をアナライト溶液２７を注入したときのｒｅｆ信号レベルから推定し、測定データに対して補正（ＤＭＳＯ濃度補正）が行われる。このＤＭＳＯ濃度補正のための補正データは、アナライト溶液２７を注入する前に、ＤＭＳＯ濃度が異なる複数種類の測定用バッファをセンサセル１７に注入して、このときのＤＭＳＯ濃度変化に応じた、ｒｅｆ信号レベルとａｃｔ信号レベルのそれぞれの変化量を調べることにより求められる。
【００３９】
測定部３１は、照明部３２と検出器３３とからなる。上述したとおり、リガンドとアナライトの反応状況は、共鳴角（光入射面に対して照射された光の入射角）の変化として顕れるので、照明部３２は、全反射条件を満足する様々な入射角の光を光入射面１３ｂに対して照射する。照明部３２は、例えば、光源３４と、集光レンズ、拡散板、偏光板を含む光学系３６とからなり、配置位置及び設置角度は、照明光の入射角が、上記全反射条件を満足するように調整される。
【００４０】
光源３４としては、例えば、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）、ＬＤ（Ｌａｓｅｒ Ｄｉｏｄｅ）、ＳＬＤ（Ｓｕｐｅｒ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｉｏｄｅ）等が使用される。これらの発光素子を点光源として使用してもよいし、複数個配列して面光源として使用してもよい。拡散板は、光源３４からの光を拡散して、発光面内の光量ムラを抑える。偏光板は、照射光のうち、ＳＰＲを生じさせるｐ偏光のみを通過させる。なお、ＬＤを使用する場合等、光源が発する光線自体の偏光の向きが揃っている場合には、偏光板は不要である。また、偏光が揃っている光源を使用した場合でも、拡散板を通過することにより、偏光の向きが不揃いになってしまう場合には、偏光板を使用して偏光の向きが揃えられる。こうして拡散及び偏光された光は、集光レンズによって集光されてプリズム１４に照射される。これにより、光強度にバラツキが無く、様々な入射角を持つ光線を光入射面１３ｂに入射させることができる。
【００４１】
検出器３３は、光入射面１３ｂで反射する光を受光して、その光強度を検出する。光入射面１３ｂには、様々な角度で光線が入射するので、光入射面１３ｂでは、それらの光線が、それぞれの入射角に応じて様々な反射角で反射する。アナライトとリガンドの反応状況に応じて共鳴角が変化すると、光強度が減衰する反射角も変化する。検出器３３は、例えば、ＣＣＤエリアセンサが使用され、この反射角の変化を、受光面内における反射光の減衰位置の推移として捉える。検出器３３は、こうして得た、反応状況を表す測定データを、データ解析機９１に出力する。データ解析処理では、測定機１１で得た測定データを解析して、アナライトの特性を分析する。
【００４２】
なお、測定部３１の構成が明確になるように、便宜的に、図上、光入射面１３ｂへの入射光線及びそこで反射する反射光線の向きが、流路１６内の液体の流れ方向と平行になるように、照明部３２及び検出器３３を配置した形態で示しているが、本実施形態では、入射光線及び反射光線の向きが、前記流れ方向と直交する方向に照射されるように、照明部３２及び検出器３３が配置される（図４参照）。もちろん、測定部３１をこの図１に示しているように配置して測定してもよい。
【００４３】
図２は、センサユニット１２の分解斜視図である。センサユニット１２は、流路１６が形成される流路部材４１と、上面に金属膜１３が形成されたプリズム１４と、流路部材４１を、その底面をプリズム１４の上面と接合させた状態で、保持する保持部材４２と、保持部材４２の上方に配置される蓋部材４３とからなる。
【００４４】
流路部材４１には、例えば、３つの流路１６が形成されている。流路部材４１は、長尺状をしており、３つの流路１６は、その長手方向に沿って配列されている。この流路１６は、その底面に接合される金属膜１３とともにセンサセル１７（図１参照）を構成する。そのため、流路部材４１は、金属膜１３との密着性を高めるために、弾性部材、例えば、ゴムやＰＤＭＳ（ポリジメチルシリコン）で形成されている。これにより、流路部材４１の底面をプリズム１４の上面に圧接すると、流路部材４１が弾性変形して金属膜１３との接合面の隙間が埋められて、各流路１３の開放された底部がプリズム１４の上面によって水密に覆われる。なお、本例では、流路１６の数を３つの例で説明したが、もちろん、流路１６の数は、３つに限らず、１つ又は２つであってもよいし、４つ以上でもよい。
【００４５】
プリズム１４には、その上面に、蒸着によって金属膜１３が形成される。この金属膜１３は、流路部材４１に形成された複数の流路１６と対向するように短冊状に形成される。さらに、この金属膜１３の上面（センサ面１３ａ）には、各流路１６に対応する部位に、リンカー膜２２が形成される。また、プリズム１４の長手方向の両側面には、保持部材４２の係合部４２ａと係合する係合爪１４ａが設けられている。これらの係合により、流路部材４１が保持部材４２とプリズム１４とによって挟み込まれ、その底面とプリズム１４の上面とが圧接した状態で保持される。こうして、流路部材４１、金属膜１３及びプリズム１４が一体化される。
【００４６】
また、プリズム１４の短辺方向の両端部には、突部１４ｂが設けられている。後述するように、センサユニット１２は、ホルダ５２（図３参照）に収納された状態で、固定が行われる。突部１４ｂは、ホルダ５２と係合することにより、センサユニット１２をホルダ内の所定の収納位置に位置決めするためのものである。
【００４７】
保持部材４２の上部には、各流路１６の注入口１６ａ及び排出口１６ｂに対応する位置に、ピペット（１９ａ，１９ｂ，２６ａ，２６ｂ）の先端が進入する受け入れ口４２ｂが形成されている。受け入れ口４２ｂは、ピペットから吐出される液体が各注入口１６ａへ導かれるように、漏斗形状をしている。保持部材４２が流路部材４１を挟み込んでプリズム１４と係合すると、受け入れ口４２ｂの下面は、注入口１６ａ及び排出口１６ｂと接合して、受け入れ口４２ｂと流路１６とが連結される。
【００４８】
また、これら各受け入れ口４２ｂの両脇には、円筒形のボス４２ｃが設けられている。これらのボス４２ｃは、蓋部材４３に形成された穴４３ａと嵌合して、蓋部材４３を位置決めするためのものである。蓋部材４３は、受け入れ口４２ｂ及びボス４３ａに対応する位置に穴が開けられた両面テープ４４によって、保持部材４２の上面に貼り付けられる。
【００４９】
蓋部材４３は、流路１６に通じる受け入れ口４２ｂを覆うことで、流路１６内の液体の蒸発を防止する。蓋部材４３は、弾性部材、例えば、ゴムやプラスチックで形成されており、各受け入れ口４２ｂに対応する位置に、十字形のスリット４３ｂが形成されている。蓋部材４３は、流路１６内の液体の蒸発を防止するためのものであるから、受け入れ口４２ｂを覆う必要があるが、完全に覆ってしまっては、ピペットを受け入れ口４２ｂに挿入することができない。そこで、スリット４３ｂを形成することで、ピペットの挿入を可能とするとともに、ピペットを挿入していない状態では、受け入れ口４２ｂが塞がれるようにしている。スリット４３ｂは、ピペットが押し込まれると、スリット４３ｂの周辺が弾性変形（図１参照）して、スリット４３ｂの口が大きく開いて、ピペットを受け入れる。そして、ピペットを抜くと、弾性力によってスリット４３ｂが初期状態に復帰して、受け入れ口４２ｂを塞ぐ。
【００５０】
図３に示すように、固定機１０は、筐体のベースとなる筐体ベース５０上に、複数のセンサユニット１２を載置する載置スペース５１が確保されている。センサユニット１２は、この載置スペース５１で載置された状態で固定処理のすべての処理が施される。したがって、この載置スペース５１は、センサユニット１２に対して固定処理を実行する固定ステージとなる。
【００５１】
センサユニット１２は、ホルダ５２に収納された状態で固定機１０にセットされる。ホルダ５２は、センサユニット１２を複数個（例えば、８個）収納できるようになっている。ホルダ５２には、センサユニット１２の突部１４ｂと嵌合して、センサユニット１２を位置決めする嵌合部が設けられている。また、ホルダ５２の底部は、センサユニット１２の両端部を支持する支持部を除いて、開口になっている。後述するように、測定処理において、センサユニット１２をホルダ５２から取り出す場合には、この開口から押し上げ部材８１（図４参照）が挿入されてセンサユニット１２が押し上げられる。
【００５２】
載置スペース５１には、ホルダ５２を、例えば、１０個並べて配置することができるようになっており、その数に応じた台座５３が設けられている。各台座５３上には、ホルダ５２を位置決めする位置決め用のボスが設けられている。
【００５３】
固定機１０には、ヘッド本体にピペット対１９を３組連装したピペットヘッド５４が設けられている。このピペットヘッド５４が、ベルトコンベア５５上のセンサユニット１２にアクセスして、液体の注入や排出を行う。ピペットヘッド５４には、ピペット対１９が３組設けられているので、１つのセンサユニット１２に含まれる３つのセンサセル１７に対して、同時に液体を注入（及び排出）することができる。固定機１０には、コントローラ（図示しない）が設けられており、このコントローラによって、各ピペット対１９の吸い込みや吐き出しの動作に関して、そのタイミング、吸い込み量及び吐き出し量等が、ピペットヘッド５４ごとにそれぞれ制御される。
【００５４】
固定処理が終了した後、センサユニット１２は、ホルダ５２ごと、後述する保管装置を経由して、測定機１１へ送られる。載置スペース５１には、前記ホルダ５２を搬送して固定機１０の外部へ送り出すベルトコンベア５５が設けられている。ベルトコンベア５５は、モータによって駆動される。ホルダ５２は、このベルトコンベア５５上に、５個１列に並べて配置される。固定処理は、このベルトコンベア５５を停止させた状態で行われる。１回の固定処理で処理できるホルダ５２の個数は、最大で、ベルトコンベア５５上に載置可能な数、すなわち、５個となる。もちろん、本例では、５個としているが、これに限定されるものではなく、その数は、ベルトコンベアの長さや、ベルトコンベアの列数に応じて適宜決定される。
【００５５】
ベルトコンベア５５上には、ホルダ５２の配置間隔を開けて、複数のリブ５５ａが設けられている。リブ５５ａは、ホルダ５２を保管装置へ引き渡す際にホルダ５２の端部と当接して、ホルダ５２を保管装置側へ押し出す押し出し部材として機能する。ベルトコンベア５５は、固定が完了した後、回転して、ホルダ５２を保管装置へ送り出す。ベルトコンベア５５の動作タイミングは、システムコントローラ１１４（図６参照）によって制御される。
【００５６】
筐体ベース５０には、このピペットヘッド５４をＸ、Ｙ、Ｚの３方向に移動させるヘッド移動機構５６が設けられている。ヘッド移動機構５６は、例えば、搬送ベルト、プーリ、キャリッジ、モータ等から構成される周知の移動機構であり、ピペットヘッド５４を上下させる昇降機構と、この昇降機構ごとピペットヘッド５４をＹ方向へ移動自在に保持するガイドレール５８を含むＹ方向移動機構と、前記ガイドレール５８を両端で保持し、ガイドレール５８毎、ピペットヘッド５４をＸ方向へ移動させるＸ方向移動機構とからなる。ヘッド移動機構５６は、コントローラによって制御されており、コントローラは、このヘッド移動機構５６を駆動して、ピペットヘッド５４の上下左右の位置を制御する。
【００５７】
筐体ベース５０上には、流路１６へ注入する種々の液体（リガンド溶液、洗浄液、固定用バッファ，乾燥防止液，活性化液，ブロッキング液等）を保管する複数の液保管部６１が設けられている。液保管部の数は、使用する液体の種類に応じて決定される。各液保管部６１には、挿入口が６個並べて設けられている。この挿入口の数及び配列ピッチは、ピペットヘッド５４のピペットの数と配列ピッチに応じて決められる。ピペットヘッド５４は、センサセル１７へ液体を注入する場合には、各液体保管部６１へアクセスして、所望の液体を吸い込み、その後、載置スペース５１へ移動して、センサユニット１２へ注入する。
【００５８】
また、筐体ベース５０上には、ピペットチップ６２を保管するピペットチップ保管部６３が設けられている。ピペットチップ６２は、ピペット１９ａ，１９ｂの先端部に交換可能に取り付けられる。ピペットチップ６２は、液体と直接接触するので、このピペットチップ６２を介して異種の液体の混液が生じないように、使用する液体毎に交換される。各ピペット１９ａ，１９ｂには、ピペットチップ６２のピックアップとリリースを行う機構が設けられており、ピペットチップ６２の交換が自動的に行われるようになっている。ピペットチップ６２を交換する際には、ピペットヘッド５４は、まず、使用済みのピペットチップ６２を廃却部（図示しない）でリリースし、この後、ピペットチップ保管部６３にアクセスして未使用のピペットチップ６２をピックアップする。
【００５９】
また、符合６４は、複数のウエル状の升がマトリックスに配列されたウエルプレートであり、ピペットで吸い上げた液体を一時的に保管したり、複数種類の液体を混合して混合液を調整したりする際に用いられる。
【００６０】
固定を開始する際には、固定機１０の筐体はカバー（図示しない）によって覆われて、載置スペース５１を含む固定機１０の内部は、外部から遮蔽される。固定機１０内の温度は、温度調節器（図示しない）によって調節が可能になっている。センサセル１７にリガンドを注入後、センサ面１３ａへのリガンド２１ａの固定化が完了するまでの間、センサユニット１２は、載置スペース５１上で所定時間保管される。この保管中に、必要に応じて流路１６内のリガンド溶液２１が攪拌される。この間の固定化の進行度合いは、センサユニット１２の環境条件（温度）によって左右される。そのため、温度調節器によって固定機１０の内部温度が所定の温度に保たれる。設定される温度や保管時間等は、リガンド２１ａの種類等に応じて適宜決められる。
【００６１】
固定が完了すると、センサセル１７に対して、バッファ（洗浄液）が注入される。バッファは、センサセル１７をリガンド溶液で満たしたままの状態で、バッファを吸い込んだピペット１９ａをスリット４３ｂへ挿入して、センサセル１７へ注入される。バッファが注入口１６ａから流路へ吐き出されると、流路１６に注入済みのリガンド溶液が排出口１６ｂに向けて押し出されて、排出される。そして、ピペット１９ａの注入動作に連動して吸い込み動作を行うピペット１９ｂによって、排出されるバッファが吸い込まれる。これにより、センサセル１７内の液の置換（入れ替え）が行われる。
【００６２】
図４に示すように測定機１１は、ホルダ搬送機構７１、ピックアップ機構７２、ヘッド移動機構７３、測定ステージ７４からなり、これらの各部が筐体７５に収容されている。ホルダ搬送機構７１は、搬送ベルト７６と、この搬送ベルト７６に取り付けられたキャリッジ７７と、このキャリッジ７７に取り付けられ、固定済みのセンサユニット１２が収納されたホルダ５２を載置するプレート７８とからなる。ホルダ搬送機構７１は、ホルダ５２が載置されたプレート７８をＸ方向へ移動させることにより、ホルダ５２内の各センサユニット１２を、ピックアップ機構７２がピックアップするピックアップ位置へ運ぶ。
【００６３】
ピックアップ機構７２は、ホルダ５２からセンサユニット１２をピックアップする機構であり、ホルダ５２に収納されたセンサユニット１２を下方から上方に向けて押し上げる押し上げ部材８１と、この押し上げ部材８１によってホルダ５２の上方に押し上げられたセンサユニット１２を両脇から挟み込んで掴むハンドリングヘッド８２とからなる。押し上げ部材８１は、押し上げ部材駆動機構８３によって上下に昇降する。上述したとおり、ホルダ５２の底部は開口になっており、また、プレート７８も、その開口に対応する位置が中空になっている。押し上げ部材８１は、プレート７８を通過して、ホルダ５２の開口へ進入して、センサユニット１２の底面と当接して、これを押し上げる。
【００６４】
ハンドリングヘッド８２は、ピックアップしたセンサユニット１２を測定ステージ１１へ運ぶことができるようにＹ方向へ移動自在に設けられている。ハンドリングヘッド８２は、ヘッド本体８２ａがナット８４を介してボールネジ８６に取り付けられており、ピックアップ位置と、測定ステージ７４との間で移動する。
【００６５】
測定ステージ７４には、センサユニット１２が配置される位置の下方に、照明部３２と、検出器３３とが配置されている。この図に示すように、センサユニット１２へ照射される入射光線及びセンサ面１３ａで反射する反射光線の向きと、センサセル１７の配列方向、すなわち、流路１６の水平部分の流れ方向とが直交するように、照明部３２及び検出器３３が配置される。
【００６６】
測定ステージ７４の傍らには、アナライト溶液２７を保管するウエルプレート８８がプレート上に載置される。例えば、このウエルプレート８８の各ウエルには、異なる種類のアナライト溶液２７が収容される。なお、図示しないが、測定機１１には、ピペット対２６がアクセス可能な位置に、測定用バッファや洗浄液を収容するウエルプレート、交換用ピペットチップを収容するピペットチップ保管部が設けられている。
【００６７】
ヘッド移動機構７３は、ピペット対２６を有するピペットヘッド８７を、Ｘ，Ｙ，Ｚの３方向に移動させて、ピペットヘッド８７を測定位置にあるセンサユニット１２と、ウエルプレート８８とに運ぶ。ヘッド移動機構７３は、固定機１０のヘッド移動機構５６とほぼ同様の構成である。ピペットヘッド８７は、測定対象となる特定のセンサセル１７に対して、１つずつ、液体の注入及び排出を行うものであるから、固定機１０のピペットヘッド５４とは異なり、ピペット対２６が１組だけ設けられている。
【００６８】
上述したとおり、センサユニット１２は、複数のセンサセル１７を持っている。このため、測定ステージ７４では、ヘッド移動機構７３が、センサユニット１２を各センサセル１７の配列ピッチでＹ方向に移動させることにより、各センサセル１７を、照明部３２の光路上の測定位置に順次進入させる。
【００６９】
測定の際には、ピペットヘッド８７が、ウエルプレート８８にアクセスして、所望のアナライト溶液２７を吸い込み、測定ステージ７４へ移動して、測定位置にあるセンサセル１７にアナライト溶液２７を注入する。固定機１０から送り出されたセンサユニット１２は、アナライト溶液２７が注入されるまでの間、各センサセル１７内には乾燥防止液が収容されている。この乾燥防止液は、測定用バッファが注入されて測定が開始される際に、注入された測定用バッファに押し出されてセンサセル１７から排出され、ピペット１９ｂによって吸い込まれる。
【００７０】
この測定時に、検出器３３によって読み取られた測定データは、データ解析機９１に送信される。データ解析機９１は、この測定データに基づいてアナライトとリガンドの反応状況を分析する。
【００７１】
図５に示す保管機１０１は、測定処理が行われるまでの間、固定済みのセンサユニット１２を保管する保管ステージである。この保管機１０１は、固定機１０と測定機１１との間に配置され、固定機１０から、センサユニット１２が収納されたホルダ５２を受け取り、これを一時的に保管して、測定機１１へ引き渡す（図６参照）。
【００７２】
保管機１０１は、ホルダ５２を複数個収容するラック１０２を備えている。ラック１０２は、ホルダ５２を載置する複数の棚１０２ａと、これらの棚１０２ａを支持する支持部材１０２ｂとからなる。ラック１０２は、棚１０２ａを縦方向に配置した縦型のラックである。縦型を採用したことにより、設置スペースを少なくしている。棚１０２ａは、１０個設けられており、ホルダ５２を１０個収容できるようになっている。固定機１０が１回に処理できるホルダ５２の数は、５個なので、２回分のホルダ５２を保管することができる。
【００７３】
このラック１０２は、棚１０２ａの配置方向に延びたボールネジ１０３に取り付けられており、このボールネジ１０３の回転により、ボールネジ１０３の軸方向に沿って昇降する。ガイドレール１０４は、ラック１０２の移動をガイドするガイド部材である。ラック１０２の側方には、固定機１０からホルダ５２を受け取る受け取りローラ１０６と、測定機１１へホルダ５２を供給する送り出しローラ１０７とが配置されている。ラック１０２は、上下に昇降することにより、各棚１０２ａを、受け取りローラ１０６及び送り出しローラ１０７の高さに移動する。
【００７４】
図６に示すように、受け取りローラ１０６は、固定機１０のベルトコンベア５５の高さに合わせて配置されており、他方、送り出しローラ１０７は、測定機１０のプレート７８の高さに合わせて配置されている。受け取りローラ１０６及び送り出しローラ１０７は、それぞれ１対のローラで構成されている。受け取りローラ１０６は、固定機１０のベルトコンベア５５から送り出されたホルダ５２を挟み込んで、ホルダ５２を、ラック１０２の各棚１０２ａに送り込む。押し込み部材１０８は、受け取りローラ１０６によって、ラック１０２に送り込まれたホルダ５２の後端と当接して、ホルダ５２を棚１０２ａの中央付近まで押し込む。押し込み部材１０８は、図上実線で示す初期位置では、ホルダ５２の進路内から退避しており、受け取りローラ１０６によってホルダ５２が棚１０２ａに送り込まれた後、図上二点鎖線で示すように、前記進路へ進入して、ホルダ５２の押し込みを行う。押し込みを行った後、初期位置へ復帰する。
【００７５】
送り出しローラ１０７は、ラック１０２に収容されたホルダ５２を挟み込んで測定機１１へ運ぶ。押し出し部材１０９は、ホルダ５２を後端と当接して、棚１０２ａの中央に載置されたホルダ５２を送り出しローラ１０７へ押し出す。これにより、送り出しローラ１０７は、ホルダ５２をニップする。
【００７６】
保管機１０１には、ケース１０１ａ内の温度を調節する温度調節器１１０が設けられている。これにより、固定済みセンサユニット１２の保管温度が適切な値に調整される。なお、温度に加えて湿度等の他の環境条件を調節できるようにしてもよい。
【００７７】
また、固定機１０、保管機１０１、測定機１１は、パーソナルコンピュータやワークステーションによって構成されるシステムコントローラ１１４に接続されており、これによって制御される。システムコントローラ１１４は、固定機１０及び測定機１１の処理開始及び終了時間や、処理量を把握しており、これらの処理量に応じて、保管機１０１の保管量や、測定機１１への送り出しタイミング及び送り出し量等を決定する。さらに、固定ステージと保管ステージと測定ステージとは、それぞれ別の筐体で構成されている。これにより、固定処理と測定処理を同時に行うことが可能となるために、作業効率を悪化させることなく測定を行うことができる。
【００７８】
以下、上記構成による作用について説明する。固定工程では、センサユニット１２がホルダ５２に収容された状態で、固定機１０の載置スペース５１に載置される。固定工程では、まず、各センサセル１７に固定用バッファを注入して、センサ面１３ａを湿化させる。次に、活性化液を注入してセンサ面１３ａを活性化させる。洗浄後、センサセル１７にリガンド溶液２１を注入して、固定化を開始させる。この状態で、センサユニット１２を載置スペース上で所定時間保管する。この間に、リガンド溶液２１中のリガンド２１ａと、リンカー膜２２との結合が行われて、固定化が進行する。
【００７９】
所定時間経過して、固定化が完了すると、洗浄後、ブロッキング処理が行われる。ブロッキング処理が終了すると、ベルトコンベア５５が回転して、ホルダ５２が保管機１０１へ搬送されて、ラック１０２へ収容される。ラック１０２では、内部温度が所定の温度に調整されて固定済みのセンサユニット１２が保管される。固定済みのセンサユニット１２を送り出した固定機１０には、未処理のセンサユニット１２がセットされて、固定処理が開始される。このように、保管機１０１を設けたことで、固定済みのセンサユニット１２を一時的に保管することができるので、次の固定処理をすぐに開始することができるので、固定処理の作業効率を悪化させることがない。
【００８０】
保管機１０１に、作り置きした固定済みのセンサユニット１２が溜まると、それらは順次測定機１１へ供給されて、測定工程が行われる。固定処理、保管量、測定処理のタイムスケジュールは、システムコントローラ１１４によって作業効率が最適になるように決定される。
【００８１】
上記実施形態では、３つのセンサセルを１列に並べたセンサユニットを使用した例で説明しているが、１ユニットに含まれるセンサセル数は、複数あればよく、２つでもいいし、３つ以上でもよい。また、センサセルを１列ではなく、複数列に並べてもよい。これらは、測定装置の構成に応じて適宜選択される。
【００８２】
また、上記実施形態では、縦型のラックで説明したが、もちろん、ラックの構成等は、これに限定されず、複数のホルダを並置する等種々の構成が考えられ、いずれの形式でもよい。
【００８３】
また、上記実施形態においては、固定ステージと測定ステージと保管ステージを、それぞれ別々の筐体に設けた例で説明してるが、保管ステージと固定ステージを１つの筐体に設けてもよいし、保管ステージと測定ステージを１つの筐体に設けてもよい。
【００８４】
なお、本実施形態では、センサ面上にＳＰＲを発生させて、そのときの反射光の減衰を検出するＳＰＲセンサを例に説明したが、ＳＰＲセンサに限らず、本発明を、全反射減衰を利用した測定に用いられる他のセンサに適用することができる。全反射減衰を利用するセンサとしては、ＳＰＲセンサの他に、例えば、漏洩モードセンサが知られている。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を通過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において弾性表面波（surface acoustic wave，SAW）が生じると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。弾性表面波が生じる入射角は、ＳＰＲの共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の反応が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＳＰＲ測定方法の説明図である。
【図２】センサユニットの構成図である。
【図３】固定機の構成図である。
【図４】測定機の構成図である。
【図５】保管機の構成図である。
【図６】ホルダの受け渡し方法を示す説明図である。
【符号の説明】
【００８６】
１０  固定機
１１  測定機
１２  センサユニット
１０１  保管機
１０２  ラック
【図１】
2006090718.tif 000003
【図２】
2006090718.tif 000004
【図３】
2006090718.tif 000005
【図４】
2006090718.tif 000006
【図５】
2006090718.tif 000007
【図６】
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