(57)【要約】      （修正有）【課題】合成目的に利用できる無細胞蛋白質合成系の調整法の提供。【解決手段】無細胞転写／翻訳系での発現生成物の体外蛋白質調整法に関し、以下のステップからなる。（a）反応容器中で定義の発現生成物用転写／翻訳装置成分、アミノ酸及びエネルギーを供給し定義の蛋白質合成に必要な代謝成分からなる合成用物質を含む反応溶液を作成し、（ｂ）合成を生成物質の分離無しに且つ決まった時間内に消費した合成用物質を加えること無しに、決まった時間反応容器中で行い、（ｃ）決まった時間終了後反応溶液を分離ステップに付し、生成低分子代謝産物及び／又は反応阻害剤を溶液から分離（及び抽出）し、（ｄ）ステップ（ｃ）の直前、直後又は同時に消費した合成用物質を補填し、（e）ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも一回ステップ（ｄ）の反応溶液と繰り返し、ステップ（ｂ）の最終実施に際しステップ（ｃ）及び（ｄ）を省略する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞転写／翻訳系での発現物質の体外蛋白質合成用調整法で、以下のステップからなる。
反応容器中で定義の発現生成物用転写／翻訳装置成分、アミノ酸及びエネルギーを供給し定義の蛋白質合成に必要な代謝成分からなる合成用物質を含む反応溶液を作成し、
合成を生成物質の分離無しに且つ決まった時間内に消費した合成用物質を加えること無しに決まった時間反応容器中で行い、
決まった時間終了後反応溶液を分離ステップに付し、生成低分子代謝産物及び／又は反応阻害剤を溶液から分離し、
ステップ（ｃ）の直前、直後又は同時に消費した合成用物質を補填し、
ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも一度ステップ（ｄ）の反応溶液で繰り返し、ステップ（ｂ）の最終実施に際しステップ（ｃ）及び（ｄ）を省略する。
【請求項２】
ステップ（ｃ）及び／又はそれに続くステップ（e）で発現生成物を溶液から分離する請求項１に従う方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を１回から１０回、好ましくは１回から５回繰り返す請求項１又は２に従う方法。
【請求項４】
決まった時間が０．１と１０時間の間、好ましくは０．５と３時間の間の請求項１乃至３の一つに従う方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）をゲル濾過、限外濾過、透析、ダイアフィルトレーション又は低分子代謝産物及び／又は反応阻害剤と選択的結合性のある基質により実行する請求項１乃至４の一つに従う方法。
【請求項６】
無細胞転写／翻訳系での体外蛋白質合成の調整法で、以下のステップからなる。
（a'）反応容器中で定義の第一発現生成物用転写／翻訳装置成分、任意に第一発現生成物
とは異なる定義の第二発現生成物用転写／翻訳装置成分、アミノ酸及びエネルギー供与と合成に必要な代謝成分からなる合成用物質を含む反応溶液を作成し、
（ｂ'）第一蛋白質の合成を第一の定義時間内に消費した合成用物質を加えること無しに
反応容器中で第一の決まった時間に行い、
（ｃ'）任意に生成低分子代謝産物を溶液から分離し、
（ｄ'）決まった時間終了後反応溶液に消費した合成用物質を補填し、ステップ（a'）で既に添加してない限り定義の第二発現生成物用転写／翻訳装置成分と反応し、
（e'）  第二蛋白質の合成を生成物質の分離なしに決まった時間に消費した合成用物質を加える事なしに反応容器中で第二の決まった時間に行う。
【請求項７】
請求項１乃至５の一つに従う方法を連続的にステップ（e'）まで行い、ついでステップ（ｃ）で始める請求項６に従う方法。
【請求項８】
第一発現生成物及び第二発現生成物用転写／翻訳装置が異なる第一及び第二制御配列を含み、第一発現生成物用のコード化第一遺伝子配列が第一制御配列により制御され、第二発現生成物用のコード化第二遺伝子配列が第二制御配列により制御される請求項６又は７に従う方法。
【請求項９】
ステップ（a'）での第一発現生成物と異なる定義の第二発現生成物用転写／翻訳装置成分からなる実施形態で、第二制御配列がステップ（ｂ'）で抑制され、第一制御配列がステップ（e'）で抑制される請求項６乃至８の一つに従う方法。
【請求項１０】
ステップ（ｄ'）で定義の第二発現生成物用転写／翻訳装置成分を添加する事をからなる実施形態で第一制御配列がステップ（e'）で抑制される請求項６乃至８一つに従う方法。
【発明の詳細な説明】
【発明分野】
【０００１】
本発明は以下のステップからなる無細胞転写／翻訳系での体外蛋白質生合成の調整法に関する。a）反応容器中で定義の蛋白質用転写／翻訳装置成分、アミノ酸及びエネルギー供給と定義の蛋白質合成に必要な代謝成分をからなる合成用物質を含む反応溶液を作成し、ｂ）合成を決まった時間反応容器中で行い、ｃ）決まった時間終了後反応溶液を分離段階にふして、生成代謝産物を溶液から分離（及び抽出）する。本特許での蛋白質合成と云う用語は蛋白質発現を意味する。
【既存技術】
【０００２】
蛋白質の無細胞発現法は例えば公文書欧州特許０３１２６１７Ｂ１、欧州特許０４０１３６９Ｂ１及び欧州特許０５９３７５７Ｂ１の技術で知られている。
【０００３】
それによると転写及び／又は翻訳の必要成分を目的蛋白質コード化用核酸鎖と一緒に反応容器中で培養し、発現後ポリペプチド／蛋白質を反応溶液から単離する。転写と同様翻訳の必要成分は３０，０００ｇ又は１０，０００ｇで遠心分離後、容易に原核又は真核細胞可溶化液の上澄みから抽出出来る。所謂Ｓ−３０或いはＳ−１０抽出物は低分子成分以外の転写及び翻訳の必要成分全部を含む。
【０００４】
多くの場合蛋白質用コード化遺伝子又は核酸鎖はＴ７プロモーターで制御される。これはリファンピシンを用いて既存大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを抑制でき、Ｓ３０抽出物又はベクター標品を起源とするいかなる内在性大腸菌ＤＮＡも転写されないという利点がある。しかしもし大腸菌プロモーター制御下の遺伝子が発現すると、抽出物中に存在しない場合には大腸菌ポリメラーゼが使用され、任意の内在性大腸菌ポリメラーゼが同時発現し、好ましくない内在性蛋白質をもたらす。この発現は通常は３７℃で起こるが、１７℃から４５℃の温度でも可能である。複雑な二次／三次構造が生成する蛋白質表現には温度の調節が特に推奨される。温度を下げると合成速度は低下し、その結果機能的／活性蛋白質を得るために蛋白質に正しい折り畳みの機会が与えられる。更に例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び／又は酸化／還元グルタチオンを加えると反応溶液の還元電位が低下し、発現蛋白質内のジスルフィド結合形成よる影響が生ずる。
【０００５】
全ての新規蛋白質合成以前に各系は理想的に最適化されねばならない。その結果基質とし
て働くＲＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼ及びコード化核酸鎖の二価マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）濃度が変化する。
【０００６】
蛋白質の無細胞発現に関する公文書欧州特許０３１２６１７Ｂ１に開示の方法では、蛋白質用コード化核酸鎖を伝令ＲＮＡとして反応溶液に添加する。従って無細胞系でのポリペプチド合成には、翻訳因子、特にリボソーム、開始因子、伸長因子、終結因子に必要な翻訳装置成分及びアミノアシル転移ＲＮＡ合成酵素、更にはエネルギー供給物質としてのアミノ酸、アデノシン三リン酸及びグアノシン三リン酸のみを反応容器に入れる必要がある。それに続くポリペプチド／蛋白質合成では、ポリペプチド／蛋白質生成に加えて、エネルギー供給物質のアデノシン三リン酸やグアノシン三リン酸及びアミノ酸消費によるアデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸及び無機リン酸塩のような低分子物質が生成する。これによりある時間後アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸又はアミノ酸消費後に或いは生成低分子物質が阻害剤として働き反応停止をもたらす。これを避けるため公文書欧州特許０３１２６１７Ｂ１では翻訳中に消費した物質を翻訳時に運び出し、同時にエネルギー供給物質とアミノ酸を導入して初期濃度を維持する事を開示している。
【０００７】
これとは対照的に公文書欧州特許０４０１３６９Ｂ１に蛋白質用コード化核酸鎖を伝令ＲＮＡ又はＤＮＡとして反応溶液に加える方法が開示されている。後者はＤＮＡが伝令ＲＮＡより遙かに安定であり、反応前にＤＮＡのＲＮＡへの必要転写プロセスが不必要であり、むしろＤＮＡを即ちベクター又は直線コンストラクトとして直接使用できる利点がある。ＤＮＡを用いることで無細胞表現系は上記翻訳因子に加えて、ＲＮＡポリメラーゼ、シグマ因子、ロー蛋白質及びヌクレチドアデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン三リン酸及びシチジン三リン酸のようなＤＮＡのＲＮＡ転写に必要な転写因子を含まねばならない。ここで又転写／翻訳時に消費するアデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸及び無機リン酸塩のような低分子物質を翻訳時に運び出さねばならず、同時にエネルギー供給物質、ヌクレオチド及びアミノ酸を導入して初期濃度を維持しなければならない。公文書欧州特許０５９３７５７Ｂ１より消費した低分子物質以外に、発現ポリペプチドも又翻訳時に限外濾過隔壁により反応溶液から分離する事が知られている。それ故これらの方法は連続合成法である。
【０００８】
連続合成法での長い使用反応時間はそれ自体収率の点で有利であるが、代わりに不都合も又ある。先ず第一に新規合成蛋白質の品質が長い保持時間により、例えば分解、（再）沈殿或いは同位元素標識アミノ酸使用時には他アミノ酸種への同位元素の好ましくない分配
（アミノ酸代謝により起こる）によるマイナスの影響を受ける。他方（連続的）消費物質の添加に関しては、膜や類似物での輸送勾配を予期しなければならず、この目的のためにエネルギー成分のような高価な低分子物質を比較的大量に使用せねばならない。
【０００９】
実践的には無細胞蛋白質生合成用のバッチ法は既存技術で知られており、反応時間中に蛋白質生成物は分離されず又消費した物質も添加されない。初期動力学条件は速いが、しかし継続時間は短くその結果比較的少量の蛋白質しか得られない。それ故これらバッチ法は分析目的だけに利用され合成目的には用いられない。
【発明の技術目的】
【００１０】
本発明の技術目的は連続系に比し高品質の発現蛋白質と高価（エネルギー）な成分の消費の削減と同時に高速動力学、高収率（高生産性）を保証する体外蛋白質合成の調整法を提供する事である。
【発明と好ましい実施形態の基本】
【００１１】
この技術目的達成のため本発明は無細胞転写／翻訳系での発現生成物の体外蛋白質合成における調整法を教示し、この系はa）反応容器中で定義の発現生成物用転写／翻訳装置成分、アミノ酸及びエネルギー供給と定義の蛋白質合成に必要な代謝成分からなる反応溶液を作成し、ｂ）合成を生成物質の分離なしで且つ決まった時間内に消費した合成用物質の添加なしに決まった時間反応容器中で行い、ｃ）決まった時間終了後反応溶液を分離ステップに付して、生成低分代謝産物及び／又は反応阻害剤を溶液から分離し、（ｄ）ステップ（ｃ）の直前、直後又は同時に消費した合成用物質を補填し、（e）ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも一回ステップ（ｄ）の反応溶液を用いて繰り返し、ステップ（ｂ）の最終実施の際にステップ（ｃ）及びステップ（ｄ）を省くステップからなる。
【００１２】
発現生成物は主として蛋白質である。反応阻害剤は反応溶液中に含まれ且つ／又は合成中に生成し、反応阻害剤の無い反応溶液に比べ反応速度（合成動力学）を低下するか完全に合成を阻止する物質である。しかし反応阻害剤と云う用語は本発明の意味では他の理由で好ましくない成分も含む。
【００１３】
おおむねステップ（ｃ）の最終実施で得た溶液は既に種々の目的、例えば分析目的に適する。しかし発現生成物が精製した形で必要なら、ステップ（ｃ）の溶液又はそれに続くステップ（e）の溶液から分離しても良い。これは例えば移動性又は固定性基質を用いて行う。このような基質機能形態はイオン交換、アフィニティ、抗原／抗体相互作用及び疎水性／親水性相互作用のような発現生成物の結合に関する任意の既知精製法に基づく。そこに適する分子が基質表面と結合する。特に有効な分離では一個又は数個のマーカー、例えば数個の窒素又は炭素末端連続ヒスティジンの形で、又は所謂融合蛋白質として一個又は数個の他蛋白質、例えばグルタチオンで同時発現出来る。基質はキメラ融合蛋白質がマーカー／融合パートナーにより基質と効果的に結合出来る本マーカー／本蛋白質に特異的な結合パートナーを含む。基質はアニオン又はカチオン交換材又はヒドロキシアパタイトを含む。もし蛋白質が融合蛋白質として発現され且つ融合パートナーが窒素か炭素末端になるか又は発現蛋白質内にあるならば、融合パートナーと特異的に結合する基質が使用できる。蛋白質は窒素又は炭素末端の数個の連続ヒスチジン、特に３乃至１２個、好ましくは５乃至９個、最も好ましくは６個を含み、基質は特に二価金属イオン好ましくは銅及び／又はニッケルイオンとの金属キレート化合物を有する。蛋白質は融合パートナーとして窒素又は炭素末端グルタチオンーＳ−トランスフェラーゼを含む事ができ、ついでグルタチオンは基質と連結できる。蛋白質はストレプトアビジンと結合できるアミノ酸配列、好ましくはアミノ酸配列ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ、最も好ましくはアミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫを含有でき、ついでストレプトアビジンが基質と連結できる。
【００１４】
おおむね使用成分は既存技術で知られている。翻訳装置は特にリボゾーム、開始因子、伸長因子、終結因子及びアミノアシル転移ＲＮＡ合成酵素からなる。これ等と共に（更なる成分と共に）合成する蛋白質用コード化伝令ＲＮＡの翻訳を実施する。合成する蛋白質用コード化ＤＮＡを用いるときには、更に例えばＲＮＡポリメラーゼ、シグマ因子、ロー蛋白質及びヌクレオチドアデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン三リン酸及びシチジン三リン酸のようなＤＮＡのＲＮＡ転写用転写因子が必要である。反応の必要代謝成分は非閉鎖的集団の“ヌクレオチドアデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン三リン酸及びシチジン三リン酸、ピロリン酸塩、アミノ酸及びこれら物質の混合物”から選ぶ。使用アミノ酸は天然アミノ酸でも良いが、化学誘導非天然アミノ酸や同位体標識アミノ酸でも良い。再循環ステップ（ｃ）で部分的又は完全に（代謝産物種と共に代謝産物の全体性と関連する）分離又は還元される低分子代謝産物は例えばアデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸及び無機リン酸塩である。低分子代謝産物は分子量１０，０００ダルトン以下、好ましくは８，０００ダルトン以下、最も好ましくは５，０００ダルトン以下である。これらは分子量２，０００ダルトン以上を有する。
【００１５】
合成用物質が高分子合成用物質の場合分離段階以前に消費の合成用物質を添加できる。これらは上述低分子代謝産物の分子量以上の分子量を有する。
【００１６】
本発明に従う方法はおおむね原核系及び真核系で同様に実施できる。転写／翻訳の必要成分は３０，０００ｇ又は１０，０００ｇでの遠心分離により原核又は真核細胞可溶化液の上澄みから容易に抽出出来る。所謂Ｓ−３０或いはＳ−１０抽出物は転写及び翻訳必須成分全部を含む。
【００１７】
ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は一回乃至十回、好ましくは一回乃至五回繰り返す事ができる。決まった時間は０．１と１０時間の間、好ましくは０．５と３時間の間である。ステップ（ｃ）はゲル濾過、限外濾過、透析及びダイアフィルトレーション又は低分子代謝産物及び／又は反応阻害剤と選択的結合性のある基質により実施できる。ゲル濾過、限外濾過、透析及びダイアフィルトレーション法はこの技術を熟知した者にはよく知られている。例えばリン酸分離には塩酸セベラマー（登録商標）（Sevelamer）やレナジェル（登録商標）(Renagel)が基質として使用できる。反応阻害剤はこれら反応阻害剤と選択的に結合する基質であり、発現生成物の分離に関する上記の説明が類似に適用される。
【００１８】
基本的には本発明による方法は繰り返しバッチ法であり、低分子代謝産物を反応溶液から分離し消費した物質を添加する介入型再循環段階後に、同じ反応溶液でバッチを繰り返す。他方本発明により連続法反応時間に比べ反応時間は短くなる。これにより製品蛋白質の品質が改善する。更に濃度勾配の必要性がないので、比較的少量の低分子物質、特にエネルギー供与物が使用される。補填、例えば定義の初期濃度に達するまで添加が必要である。それにもかかわらず高速動力学での高収率とその結果高生産性が得られる。
【００１９】
独自に重要な本発明の変形は以下のステップからなる無細胞転写／翻訳系での体外蛋白質合成の調整法に関する。そのステップは（a'）反応容器中で定義の第一発現生成物用転写／翻訳装置成分、任意に第一発現生成物とは異なる定義の第二発現生成物用転写／翻訳装置成分、アミノ酸及びエネルギー供与と合成に必要な代謝産物を含む合成用物質からなる反応溶液を作成し、（ｂ'）第一蛋白質の合成を第一の決まった時間内に消費の合成用物質を加えること無しに反応容器中で第一の決まった時間行い、（ｃ'）任意に生成低分子代謝産物を溶液から分離し、（ｄ'）決まった時間終了後反応溶液に消費の合成用物質を補填し、ステップ（a）で既に添加しない限り定義の第二発現生成物用転写／翻訳成分と反応し、（e'）第二蛋白質の合成を生成物質を分離せずに且つ決まったの時間に消費の合成用物質を加えること無しに反応容器中で第二の決まった時間に行う事からなる。
【００２０】
続いて発現生成物を溶液から分離するか、又はこのような分離無しに発現生成物含有溶液
を直ちに他目的、例えば分析に或いは物質ライブラリーの篩い分けに用い事もできる。しかしおおむね請求項１乃至５の方法に従い、ついでステップ（ｃ）で始める。ステップ（e）は省略される。請求項１乃至５の一つに従う方法で与えた説明が同様に適用される。
【００２１】
本発明のこの変形では種々の“プログラミング”が可能である。これは種々な発現生成物の合成が種々の段階での制御される方法を意味する。
【００２２】
第一発現生成物及び第二発現生成物用転写／翻訳装置は種々の第一及び第二制御配列を含む事ができ、第一発現生成物のコード化第一遺伝子配列は第一制御配列により制御され、第二発現生成物のコード化第二遺伝子配列は第二制御配列により制御される。
【００２３】
ステップ（a'）の第一発現生成物とは異なる定義の第二発現生成物用転写／翻訳成分からなる実施形態では、第二制御配列はステップ（ｂ'）で抑制され、第一制御配列はステップ（e'）で抑制される。ステップ（ｄ'）で定義の第二発現生成物用転写／翻訳成分を添加する事からなる実施形態では、第一制御配列はステップ（e'）で抑制される。
【００２４】
本発明のこの変形でも又繰り返しのバッチ法が使用されるが、種々の発現生成物、例えば蛋白質が種々の段階で得られる。第二発現生成物は通常実際に希望の製品蛋白質である。しかし第一発現生成物は翻訳因子、折り畳みヘルパー蛋白質、相互作用パートナー或いは転移ＲＮＡのような補助物質である。このような物質は製品蛋白質産出に、例えば収率、溶解度又は機能性に関して役立つ。第一発現生成物は例えば蛋白質製品の溶解度を促進する監視役である。この点では合成と云う用語は蛋白質成熟と云う用語を含む。
【００２５】
おおむね溶液はステップ（ｃ）又は（ｃ'）で例えばポリエチレングリコール溶液に対する透析により濃縮できる。
【００２６】
以下に本発明を実施形態により代表される実施例だけ基づいて更に詳細に説明する。
実施例１  一回再循環ステップによる単一繰り返し
【００２７】
Ｓ−混合に物１７５μｌ、Ｔ−混合物１５０μｌ、Ｅ混合物４０μｌ（ドイツ、ベルリン、リナ社（RiNA GmBH）、カタログ番号Ｐ−１１０２−１４の“リナ体外ＰＢＳキット“(RiNa in Vitro PBS kit)成分として入手可能）、炭素１４標識化ロイシン（１００dpm/pmol）６３μＭ、大腸菌の伸長因子Ｔコード化用プラスミドＤＮＡ５nM及びＲＮＡ分解酵素無含有添加水０．５ｍｌを含む無細胞蛋白質生合成用反応溶液０．５ｍｌを培養（１．５時間、３７℃）
後、限外濾過（１０キロダルトン膜）により５０％（２５０μｌ）に減らし、その後以下成分の補填混合物２５０μｌと反応した。混合物はＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）１００ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸アンモニュウム１００ｍＭ、塩化マグネシウム４６ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸０．２ｍＭ、０．０４％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）、ジチオスレイトール１０ｍＭ、グアノシン二リン酸２０μＭ、８％ポリエチレングリコール３０００（ｗ／ｖ）、葉酸２００μＭ、２０の全アミノ酸１．２ｍＭずつ、炭素１４標識化ロイシン１２６μＭ、アデノシン三リン酸とグアノシン三リン酸２ｍＭずつ、ウリジン三リン酸とシチジン三リン酸１ｍＭずつ、ホスホエノールピルビンサン塩６０ｍＭ、アセチルリン酸２０ｍＭからなる。続く第二回合成を１．５時間３７℃で行った。伸長因子Ｔの取得量は（合計で）第一回合成後１１４μｇであり第二回合成後は２２１μｇであった。その定量は適用放射性標識化炭素１４ロイシンを積算して決定した。
実施例２．四回再循環ステップによるバッチ反応の四回繰り返し
【００２８】
Ｓ−混合物３５０μｌ、Ｅ混合物８０μｌ（ドイツ、ベルリン、リナ社（RiNa GmbH）、カタログ番号Ｐ−１１０２−１４、“リナ体外ＰＢＳキット“（RiNa in Vitro PBS Kit）成分として入手可能）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）３５ｍＭ、酢酸カリウム７０ｍＭ、酢酸アンモニュウム３５ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸０．０７ｍＭ、０．０１４％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）、ジチオスレイトール５ｍＭ、葉酸１００μＭ、２０の全アミノ酸１．２ｍＭずつ、炭素１４標識化ロイシン６３μＭ、大腸菌の伸長因子Ｔ用コード化プラスミドＤＮＡ５nM及びＲＮＡ分解酵素無含有添加水１ｍｌを含む無細胞蛋白質生合成用反応溶液１ｍｌを培養（１．５時間、３７℃）後セファデックス(Sephadex)基質（Ｇ−２５）でゲル濾過し、限外濾過（１０キロダルトン膜）により初期体積の５０％（５００μｌ）に減じ、以下成分の補填混合物５００μｌと反応した。混合物はＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）１００ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸アンモニュウム１００ｍＭ、塩化マグネシウム２６ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸０．２ｍＭ、０．０４％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）、ジチオスレイトール１０ｍＭ、グアノシン二リン酸２０μＭ、葉酸２００μＭ、２０の全アミノ酸２.4ｍＭずつ、炭素１４標識化ロイシン１２６μＭ、アデノシン三リン酸とグアノシン三リン酸２ｍＭずつ、ウリジン三リン酸とシチジン三リン酸１ｍＭずつ、ホスホエノールピルビンサン塩６０ｍＭ及びアセチルリン酸２０ｍＭからなる。それに続く第二回合成を１．５時間、３７℃で行った。再循環ステップ（ゲル濾過、限外濾過、補填）及び合成ステップを数回繰り返した。（再循環：別に３回＝全部で４回；合成：別に３回＝全部で５回）。伸長因子Ｔの取得量は（全体で）第一回合成後１７１μｇ、第二回合成後３１５μｇ、第三回合成後４４７μｇ、第四回合成後５６１μｇ及び第五回合成後６５０μｇである。その定量は適用放射性標識化１４炭素ロイシンを積算して決定した。
実施例３．二回再循環ステップによる高収率バッチ反応の二回繰り返し
【００２９】
無細胞蛋白質生合成用反応溶液１．８ｍｌを以下の様に作成した。イージーエックスプレス（登録商標）反応緩衝液（EasyXPress Reaction Buffer）７２０μｌを大腸菌抽出物６３０μｌ（ドイツ、ヒルデン、キアーゲン社（Qiagen GmbH）、カタログ番号３２５０６、イージーエックスプレス（登録商標）蛋白質合成マクシキット（EasyXPress Protein Synthesis Maxi Kit）に含まれる両成分）、炭素１４標識化ロイシン（１００dpm/pmol）６３ｍＭ、大腸菌の伸長因子Ｔ用コード化プラスミドＤＮＡ１０ｍＭ及びＲＮＡ分解酵素無含有添加水１．８ｍｌと反応した。この反応物を限外濾過（１０キロダルトン膜）により１ｍｌに濃縮し、１時間３７℃で培養した。この第一回合成段階後、このバッチをナップー１０（Nap-10）カラム(セファデックスＧ−２５（Sephadex  G-25）上でゲル濾過し、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）３００ｍＭ、６００ｍＭ酢酸カリウム、酢酸アンモニュウム３００ｍＭ、塩化マグネシウム１１４ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸０．６ｍＭ、０．１２％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）、ジチオスレイトール６ｍＭ、グアノシン二リン酸６０μＭ、２４％ポリエチレングリコール３０００（ｗ／ｖ）、葉酸６００μＭ、２０の全アミノ酸７．２ｍＭずつ、炭素１４標識化ロイシン３８０μＭ、アデノシン三リン酸とグアノシン三リン酸１０．２ｍＭずつ、ウリジン三リン酸とシチジン三リン酸５．１ｍＭずつ、ホスホエノールピルビンサン塩３０６ｍＭ、１０２ｍＭアセチルリン酸を含む溶液３００μｌを補填した。続く第二回合成を１時間３７℃で行った。この後再循環ステップ（ゲル濾過、補填）及び合成ステップをもう一度繰り返し、且つこの補填混合物は以下組成からなる。ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）３００ｍＭ、酢酸カリウム６００ｍＭ、酢酸アンモニュウム３００ｍＭ、塩化マグネシウム７８ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸０．６ｍＭ、０．１２％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）、ジチオスレイトール６ｍＭ、グアノシン二リン酸６０μＭ、２４％ポリエチレングリコール３０００（ｗ／ｖ）、葉酸６００μＭ、２０の全アミノ酸７.２ｍＭずつ、炭素１４標識化ロイシン３８０μＭ、アデノシン三リン酸とグアノシン三リン６ｍＭずつ酸、ウリジン三リン酸とシチジン酸リン酸３ｍＭずつ、ホスホエノールピルビンサン塩１８０ｍＭ及びアセチルリン酸６０ｍＭ。全体で三回の合成ステップと二回の再循環ステップを通した。伸長因子Ｔの取得量は（全体で）第一回合成後５６３μｇ、第二回合成後１，８０４μｇ及び第三回合成後２，４８７μｇである。それ故二回繰り返すことにより第一回合成ステップの４．４倍の収率が得られた。その定量は適用放射性標識化１４炭素ロイシンを積算して決定した。図１にこの実施例での蛋白質生成物のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動分析を示す。左側にクーマシー染色が見られ、右側にオートラジオグラムを示す。トラックＭは分子量標準であり、トラックＳ１からＳ３は三回の合成ステップに相当する。伸長因子Ｔの理論値は３１．６キロダルトンである。
実施例４．翻訳系のプログラミング／条件付け
【００３０】
第一回合成ステップで第二回合成ステップで生成する製品蛋白質の合成又は品質用遺伝子、例えば監視（製品蛋白質の溶解度促進）用遺伝子を用いる。監視役遺伝子は大腸菌プロモーターの制御下にある。第一回合成ステップ完了後、再循環ステップを実施し、ここでは発現生成物（監視者）を分離せずに、補填だけと製品蛋白質用Ｔ７プロモーター制御下で遺伝子を添加する。更に大腸菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤、例えばリファンピシンを添加する。それ故第二回合成ステップでは実際には全く製品蛋白質発現のみが起こり、第一回合成ステップで監視役が存在するため、後者の溶解度がかなり改善されることになる。第一回合成ステップで用いたＲＮＡポリメラーゼの阻害の代わりに、このステップで用いる遺伝子又は鋳型濃度を第二回合成ステップで、例えば分離又は希釈により減少する事ができる。
実施例５．本発明に従う方法用の装置
【００３１】
図２に本発明に適した装置を示す。反応モジュール１、再循環モジュール２、溶液移動用手段３及び循環ライン４を示す。反応モジュール１ではステップ（ｂ）、（ｂ'）及び／又は（ｅ'）を実施する。再循環モジュール２ではステップ（ｃ）、（ｄ）、（ｃ'） 及び／又は(ｄ')が行われる。溶液移動手段３は決めた時間後本発明に従う各ステップを続いて行うように制御する。更に分離モジュール５があり、ここで発現生成物を溶液から分離する。又分離モジュール５をバイパス７で循環ライン４と連結する切り替え手段６を備える。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例３での蛋白質生成物のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動分析を示す。
【図２】本発明に適した装置を示す。
【図１】
2006020632.tif 000002
【図２】
2006020632.tif 000003
【外国語明細書】
Method for preparative in vitro protein biosynthesis.
Field of the invention.
The invention relates to a method for preparative in vitro protein synthesis in a cell-free transcription/translation system, comprising the following steps: a) in a reaction vessel, a reaction solution is prepared, comprising the following synthesis substances: components of the transcription/translation apparatus for a defined protein, amino acids, and metabolic components supplying energy and being necessary for the synthesis of the defined protein, b) the synthesis is performed in the reaction vessel in a defined period of time, c) after expiration of the defined period of time, the reaction solution is subjected to a separation step, in which generated metabolic products are separated from the solution (and extracted). The term protein synthesis means in this invention the expression of the protein.
Prior art.
Methods for the cell-free expression of proteins are for instance known in the art from the documents EP 0312 617 B1, EP 0401 369 B1 and EP 0593 757 B1.
According thereto, the components necessary for a transcription and/or translation are incubated together with a nucleic acid strand coding for a desired protein in a reaction vessel and after the expression, the polypeptides/proteins are isolated from the reaction solution. The components necessary for the transcription as well as for the translation can easily be extracted from the supernatants of prokaryotic or eukaryotic cell lysates after a 30,000 g or 10,000 g centrifugation. The so-called S-30 or S-10 extract contains all the components necessary for the transcription and translation, except low-molecular components.
In most cases, the gene or the nucleic acid strand coding for the protein is under control of a T7 promoter. This has the advantage that by using rifampicin, existing E.coli RNA polymerase can be inhibited, and thus any endogenous E.coli DNA originating from the S30 extract or from the vector preparation is not transcribed. If however a gene being under control of an E.coli promoter is expressed, an E.coli polymerase can be used, if not yet present in the extract, which may lead to a co-expression of any endogenous E.coli DNA and thus to undesired endogenous proteins. The expression typically takes place at 37℃, may however also be made at temperatures from 17℃ to 45℃. The adjustment of the temperature is in particular recommended for the expression of proteins, in which a complex secondary/tertiary structure is to be formed. By lowering the temperature, the synthesis rate can be reduced, and thus the proteins are given the opportunity to correctly fold, in order to obtain a functional/active protein. Further, influence can be obtained on the formation of disulfide bridges within the expressed proteins by the reduction potential of the reaction solution, by the addition of for instance dithiothreitol (DTT) and/or oxidized/reduced glutathione.
Before every new protein synthesis, the respective systems should ideally be subjected to an optimization. Thereby, the concentrations of bivalent magnesium ions (Mg2+), of RNA/DNA polymerase and of the coding nucleic acid strand serving as a matrix are varied.
In the method disclosed in the document EP 0312 617 B1 for the cell-free expression of proteins, the nucleic acid strand coding for the protein is added to the reaction solution as mRNA. Thus, for preparing polypeptides in the cell-free system, only the components of the translation apparatus necessary for the translation, in particular ribosomes, initiation, elongation, release factors and aminoacyl-tRNA synthetases as well as amino acids and ATP and GTP as energy-supplying substances need to be brought into a reaction vessel. In the subsequent polypeptide/protein synthesis, in addition to the generation of polypeptides/proteins, low-molecular substances will also be generated, such as ADP, AMP, GDP, GMP and inorganic phosphates under consumption of the energy-supplying substances ATP and GTP and of amino acids. This will lead to that the reaction will after some time come to a halt after the consumption of ATP or GTP or of an amino acid or by the generated low-molecular substances acting as inhibitors. In order to avoid this, the document EP 0312 617 B1 discloses that the substances consumed during the translation are moved out during the translation and simultaneously the energy-supplying substances and the amino acids are introduced for maintaining the initial concentrations.
In contrast thereto, the document EP 0401 369 B1 discloses a method, wherein the nucleic acid strand coding for the protein is added to the reaction solution as mRNA or DNA. The latter has the advantage that DNA is substantially more stable than mRNA, and the necessary transcription process of the DNA into RNA before the reaction is not necessary, rather the DNA, e.g. as a vector or a linear construct, can directly be used. By using the DNA, the cell-free expression system must include, in addition to the above translation factors, also the transcription factors necessary for the transcription of the DNA into RNA, such as RNA polymerase, sigma factor or rho protein and the nucleotides ATP, UTP, GTP and CTP. Here, too, the low-molecular substances consumed during the transcription/translation, such as ADP, AMP, GDP, GMP and inorganic phosphates, have to be moved out during the translation, and simultaneously the energy-supplying substances, nucleotides and the amino acids have to be introduced for maintaining the initial concentration. From the document EP 0593 757 B1 it is known to separate, beside the consumed low-molecular substances, also the expressed polypeptides from the reaction solution by an ultrafiltration barrier during the translation. Therefore, these methods are continuous synthesis methods. 
In the continuous synthesis methods, the obtained long reaction times are per se advantageous with regard to yield, but in turn have disadvantages, too. Firstly, the quality of the newly synthesized proteins are negatively affected by the long retention time, for instance because of degradation, (re-)precipitation, or - when using isotope-marked amino acids - undesired distribution of the isotopes on other amino acid species (caused by amino acid metabolism). On the other hand, for the (continuous) addition of consumed substances, transport gradients over membranes and the like have to be expected, and for this purpose the expensive low-molecular substances, such as energy components, have to be employed in relatively high amounts. 
From the practice, batch methods for the cell-free protein biosynthesis are known in the art, wherein during the reaction time neither protein products are separated nor consumed substances are added. The initial kinetic conditions are fast, however the time duration is short, so that relatively little protein is obtained. Therefore, these batch methods are only used for analytical and not for preparative purposes.
Technical object of the invention.
It is the technical object of the invention to provide a method for preparative in vitro protein synthesis, which guarantees high yields with fast kinetics (high productivity) simultaneously with high quality of the expressed proteins and reduced consumption of expensive (energy) components compared to continuous systems.
Basics of the invention and preferred embodiments.
For achieving this technical object, the invention teaches a method for preparative in vitro protein synthesis of an expression product in a cell-free transcription/translation system, comprising the following steps: a) in a reaction vessel, a reaction solution is prepared, comprising the following synthesis substances: components of the transcription/translation apparatus for a defined expression product, amino acids, and metabolic components supplying energy and being necessary for the synthesis of the defined protein, b) the synthesis is performed in the reaction vessel in a defined period of time, without separating generated substances and without adding consumed synthesis substances within the defined period of time, c) after expiration of the defined period of time, the reaction solution is subjected to a separation step, in which generated low-molecular metabolic products and/or reaction inhibitors are separated from the solution, d) immediately before, after or at the same time as step c) consumed synthesis substances are supplemented, e) steps b), c) and d) are repeated at least once with the reaction solution of step d), and at the last execution of step b) steps c) and d) may be left out.
Expression products are mainly proteins. Reaction inhibitors are substances, which are contained in the reaction solution and/or which are generated during the synthesis and reduce the reaction speed (kinetics of the synthesis) or completely prevent the synthesis, compared to a reaction solution without the reaction inhibitors. The term reaction inhibitors in the meaning of the invention also comprises however components being undesired for other reasons.
In principle, the solution obtained with the last execution of step c) is already suitable for various purposes, for instance analytical purposes. If however the expression product is needed in a purified form, it may be separated from the solution in step c) or subsequently to step e). This may take place for instance by using a mobile or immobilized matrix. The mode of functioning of such a matrix may be based on any purification methods known for the binding of expression products, such as ion exchange, affinity, antigen/antibody interaction, and hydrophobic/hydrophilic interaction. Therein, the suitable molecules are bound to the surface of a substrate. For a particularly efficient separation, they may be co-expressed with one or several markers, e.g. in the form of several N or C-terminal successive histidines, or one or several other proteins, e.g. glutathione, as a so-called fusion protein. The matrix then includes a binding partner being specific for this marker/this protein, which permits an efficient binding of the chimeric fusion protein by the marker/the fusion partner to the matrix. The matrix may contain anion or cation exchange material or hydroxyapatite. If the proteins are expressed as fusion proteins, and the fusion partners are placed N, C-terminally or within the expressed protein, a matrix may be used, which specifically binds the fusion partner. The protein may contain N or C-terminally several successive histidines, in particular 3 to 12, preferably 5 to 9, most preferably 6, and the matrix may then carry a metal-chelate compound, in particular with bivalent metal ions, preferably copper and/or nickel ions. The protein may contain N or C-terminally glutathione-S-transferase as a fusion partner, and then glutathione may be coupled to the matrix. The protein may contain an amino acid sequence permitting a binding to streptavidin, preferably the amino acid sequence AWRHPQFGG, most preferably the amino acid sequence WSHPQFEK, and then streptavidin may be coupled to the matrix.
In principle, the components to be used are known from prior art. The translation apparatus comprises in particular ribosomes, initiation, elongation, release factors and aminoacyl-tRNA synthetases. Therewith (and with further components) the translation of mRNA coding for a protein to be synthesized can be performed. When using DNA coding for the protein to be synthesized, in addition transcription factors for the transcription of the DNA into RNA are necessary, as for instance RNA polymerase, sigma factor or rho protein and the nucleotides ATP, UTP, GTP and CTP. The necessary metabolic components of the reaction are selected from the not closed group "ATP, UTP, GTP and CTP, pyrophosphate, amino acids and mixtures of these substances". The used amino acids may be natural amino acids, but also chemically derivatized non-natural amino acids or isotope-marked amino acids. Low-molecular metabolic products, which are partially or completely (related to a metabolic product species as well as to the totality of the metabolic products) separated or reduced in the recycling step c), are for instance ADP, AMP, GDP, GMP and inorganic phosphate. Low-molecular metabolic products have a molecular weight of less than 10,000 Da, preferably less than 8,000 Da, and most preferably less than 5,000 Da. They may have a molecular weight above 2,000 Da.
An addition of consumed synthesis substances before the separation step can be made in the cases where the synthesis substances are high-molecular synthesis substances. They have molecular weights exceeding the molecular weights of the low-molecular metabolic products described above.
The method according to the invention can in principle be executed with prokaryotic as well as with eukaryotic systems. The components necessary for the transcription/translation can easily be extracted from the supernatants of prokaryotic or eukaryotic cell lysates after a 30,000 g or 10,000 g centrifugation. This so-called S-30 or S-10 extract contains all components being essential for the transcription and translation.
Steps b), c) and d) can be repeated one to ten times, preferably one to five times. The defined period of time may be between 0.1 and 10 hours, preferably between 0.5 and 3 hours. Step c) may be executed by means of gel filtration, ultrafiltration, dialysis, diafiltration or matrices having selective binding properties for low-molecular metabolic products and/or reaction inhibitors. The methods gel filtration, ultrafiltration, dialysis and diafiltration are well known to the man skilled in the art. For instance, for separating phosphate, Sevelamer (trademark registered) HCl or Renagel (trademark registered) may be used as matrices. Reaction inhibitors may be matrices selectively binding these reaction inhibitors, and the above explanations with regard to the separation of expression products apply in an analogous manner.
Basically, the method according to the invention is a repetitive batch method, wherein a batch is repeated with the same reaction solution after an interposed recycling step, in which low-molecular metabolic products are separated from the reaction solution, and consumed substances are added. By means of the invention, on the one hand, shorter reaction times than those of continuous methods are obtained. This results in an improved quality of the product protein. Further, comparatively less low-molecular substances, in particular energy suppliers, have to be used, since concentration gradients are not necessary. Only a supplementation, i.e. an addition until achieving a defined initial concentration, is required. Nevertheless, high yields with fast kinetics and consequently high productivities are obtained.
A variant of the invention having an independent importance relates to a method for preparative in vitro protein synthesis in a cell-free transcription/translation system, comprising the following steps: a') in a reaction vessel, a reaction solution is prepared, comprising the following synthesis substances: components of the transcription/translation apparatus for a defined first expression product, optionally components of the transcription/translation apparatus for a defined second expression product being different from the first expression product, amino acids, and metabolic components supplying energy and being necessary for the synthesis, b') the synthesis of the first protein is performed in the reaction vessel in a first defined period of time, without adding consumed synthesis substances within the first defined period of time, and c') optionally generated low-molecular metabolic products are separated from the solution, d') after expiration of the defined period of time, the reaction solution is supplemented with consumed synthesis substances and, as far as not added already in step a), reacted with components of the transcription/translation apparatus for the defined second expression product, e') the synthesis of the second protein is performed in the reaction vessel in a second defined period of time, without separating generated substances and without adding consumed synthesis substances within the defined period of time.
Subsequently, the expression product may be separated from the solution, the solution containing the expression product may however also immediately be used for other purposes, for instance analytics or for screenings of a substance library without such a separation. In principle, however, the method of claims 1 to 5 may follow, beginning with step c) thereof. Step e) may be left out. The explanations given for the method according to one of claims 1 to 5 apply in an analogous manner.
In this variant of the invention, various "programmings" are possible. This means the way, in which the synthesis of the various expression products in the various steps is controlled.
The transcription/translation apparatuses for the first expression product and the second expression product may include various first and second regulatory sequences, and a first gene sequence coding for the first expression product is under control of the first regulatory sequence and a second gene sequence coding for the second expression product is under control of the second regulatory sequence.
In the embodiment comprising components of the transcription/translation apparatus for a defined second expression product being different from the first expression product in step a'), the second regulatory sequence may be inhibited in step b'), and the first regulatory sequence may be inhibited in step e'). In the embodiment comprising the addition of the components of the transcription/translation apparatus for the defined second expression product in step d'), the first regulatory sequence may be inhibited in step e'). 
In this variant of the invention, too, a repetitive batch method is used, but various expression products, for instance proteins, are obtained in various steps. The second expression product typically is the actually desired product protein. The first expression product however is an auxiliary substance, such as translation factors, folding helper proteins, interaction partners, or tRNA. Such substances are helpful for the generation of the product protein, for instance with regard to yield, solubility or functionality. First expression products may for instance be chaperones promoting the solubility of the protein product. Insofar, the term synthesis also comprises the term maturation of a protein.
In principle, the solution may also be concentrated up in step c) or c'), for instance by dialysis against a PEG solution.
In the following the invention will be explained in more detail, based on examples representing embodiments only. 
Example 1:    simple repetition with one recycling step.
0.5 ml of a reaction solution for the cell-free protein biosynthesis, containing 175 μl S-mix, 150 μl T-mix, 40 μl E-mix (available as components of the "RiNA in-vitro-PBS Kit", Cat. No. P-1102-14, RiNA GmbH, Berlin, Germany), 63 μM 14C leucine (100 dpm/pmol), 5 nM plasmid DNA, coding for the elongation factor Ts from E.coli, and RNase free water ad 0.5 ml, were reduced to 50％ (250 μl) after incubation (1.5 h, 37℃) by means of ultrafiltration (10 kDa membrane), and thereafter reacted with 250 μl supplementation mix of the following composition: 100 mM HEPES (pH 7.6), 200 mM potassium acetate, 100 mM ammonium acetate, 46 mM magnesium chloride, 0.2 mM EDTA, 0.04％ sodium azide (w/v), 10 mM DTT, 20 μM GDP, 8％ PEG3000 (w/v), 200 μM folic acid, 1.2 mM each of all 20 amino acids, 126 μM 14C leucine, 2 mM each of ATP and GTP, 1 mM each of UTP and CTP, 60 mM phosphoenolpyruvate and 20 mM acetyl phosphate. The following second synthesis took place for 1.5 h at 37℃. The obtained amounts of EF-Ts are (in total) 114 μg after the first synthesis and 221 μg after the second synthesis. The quantification was performed by determination of the integration of applied radioactively marked 14C leucine.
Example 2:    quadruple repetition of a batch reaction with four recycling steps.
1 ml of a reaction solution for the cell-free protein biosynthesis, containing 350 μl S-mix, 80 μl E-mix (available as components of the “RiNA in-vitro-PBS Kit”, Cat. No. P-1102-14, RiNA GmbH, Berlin, Germany), 35 mM HEPES (pH 7.6), 70 mM potassium acetate, 35 mM ammonium acetate, 10 mM magnesium chloride, 0.07 mM EDTA, 0.014％ sodium azide (w/v), 5 mM DTT, 100 μM folic acid, 1.2 mM each of all 20 amino acids, 63 μM 14C leucine, 5 nM plasmid DNA, coding for the elongation factor Ts from E.coli, and RNase free water ad 1 ml, were gel-filtrated after incubation (1.5 h, 37℃) by a Sephadex matrix (G-25), reduced to 50％ of the original volume (500 μl) by means of ultrafiltration (10 kDa membrane), and thereafter reacted with 500 μl supplementation mix of the following composition: 100 mM HEPES (pH 7.6), 200 mM potassium acetate, 100 mM ammonium acetate, 26 mM magnesium chloride, 0.2 mM EDTA, 0.04％ sodium azide (w/v), 10 mM DTT, 20 μM GDP, 200 μM folic acid, 2.4 mM each of all 20 amino acids, 126 μM 14C leucine, 2 mM each of ATP and GTP, 1 mM each of UTP and CTP, 60 mM phosphoenolpyruvate and 20 mM acetyl phosphate. The following second synthesis took place for 1.5 h at 37℃. The recycling step (gel filtration, ultrafiltration, supplementation) and the synthesis step were then repeated several times (recycling: another three times = four times in total; synthesis: another three times = five times in total). The obtained amounts of EF-Ts are (in total) 171μg after the first synthesis, 315 μg after the second synthesis, 447 μg after the third synthesis, 561 μg after the fourth synthesis, and 650 μg after the fifth synthesis. The quantification was performed by determination of the integration of applied radioactively marked 14C leucine.
Example 3:    double repetition of a high-yield batch reaction with two recycling steps.
1.8 ml of a reaction solution for the cell-free protein biosynthesis were prepared as follows: 720 μl EasyXPress(trademark registered) Reaction Buffer were reacted with 630 μl E.coli extract (both components included in the EasyXPress(trademark registered) Protein Synthesis Maxi Kit, Cat. No. 32506, Qiagen GmbH, Hilden, Germany), 63 μM 14C leucine (100 dpm/pmol), 10 mM plasmid DNA, coding for the elongation factor Ts from E.coli, and RNase free water ad 1.8 ml. The reaction was then concentrated up by means of ultrafiltration (10 kDa membrane) to 1 ml, and incubated for 1 h at 37℃. After this first synthesis phase, the batch was gel-filtrated over a Nap-10 column (Sephadex G-25) and supplemented with 300μl of a solution containing 300 mM HEPES (pH 7.6), 600 mM potassium acetate, 300 mM ammonium acetate, 114 mM magnesium chloride, 0.6 mM EDTA, 0.12％ sodium azide (w/v), 6 mM DTT, 60 μM GDP, 24％ PEG3000 (w/v), 600 μM folic acid, 7.2 mM each of all 20 amino acids, 380 μM 14C leucine, 10.2 mM each of ATP and GTP, 5.1 mM each of UTP and CTP, 306 mM phosphoenolpyruvate and 102 mM acetyl phosphate. The following second synthesis took place for 1.0 h at 37℃. Thereafter the recycling step (gel filtration, supplementation) and the synthesis step were repeated once again, and the supplementation mix now had the following composition: 300 mM HEPES (pH 7.6), 600 mM potassium acetate, 300 mM ammonium acetate, 78 mM magnesium chloride, 0.6 mM EDTA, 0.12％ sodium azide (w/v), 6 mM DTT, 60 μM GDP, 24％ PEG3000 (w/v), 600 μM folic acid, 7.2 mM each of all 20 amino acids, 380 μM 14C leucine, 6 mM each of ATP and GTP, 3 mM each of UTP and CTP, 180 mM phosphoenolpyruvate and 60 mM acetyl phosphate. In total, three synthesis steps and two recycling steps were passed. The obtained amounts of EF-Ts are (in total) 563 μg after the first synthesis, 1,804 μg after the second synthesis and 2,487 μg after the third synthesis. By repeating twice, therefore, a yield of 4.4 times the first synthesis step was obtained. The quantification was performed by determination of the integration of applied radioactively marked 14C leucine. Fig. 1 shows an SDS-PAGE analysis of the protein product from this example. On the left-hand side, the Coomassie staining can be seen, and on the right-hand side the autoradiogram is shown. The track M is the molecular weight standard, the tracks S1 to S3 are the three synthesis steps. The theoretical value of the EF-Ts is 31.6 kDA.
Example 4:    programming/conditioning of a transation system.
In a first synthesis step, a gene for the synthesis or quality of the product protein to be generated in the second synthesis step, for instance a gene for a chaperone (promoting solubility for the product protein) is used. The chaperone gene is under control of the E.coli promoter. After completion of the first synthesis step, a recycling step is performed, wherein there is no separation of the expression product (chaperone), but only a supplementation and the addition of a gene under control of the T7 promoter for the product protein. Further, an inhibitor of the E.coli RNA polymerase, for instance rifampicin, is added. In the second synthesis step, therefore, there takes place practically exclusively the expression of the product protein, and the latter is obtained with an appreciably improved solubility, because of the presence of the chaperones from the first synthesis step. Alternatively to the inhibition of an RNA polymerase used in the first synthesis step, the concentration of the gene or template used in this step can be reduced for the second synthesis step, for instance by separation or by dilution.
Example 5:    apparatus for a method according to the invention.
Fig. 2 shows an apparatus being suitable for the invention. There is shown a reaction module 1, a recycling module 2, means 3 for moving solutions and a circle line 4. In the reaction module 1, steps b), b') and/or e') are performed. In the recycling module 2 follow steps c), d), c') and/or d'). The means 3 for moving solutions are controlled such that the steps according to the invention take successively place after the defined periods of time. Further, there is a separation module 5, where the expression product can be separated from the solution. There are also provided switching means 6 connecting the separation module 5 into the circle line 4 at the place of the by-pass 7.
Patent claims.
1.                  A method for preparative in vitro protein synthesis of an expression product in a cell-free transcription/translation system, comprising the following steps: 
a) in a reaction vessel, a reaction solution is prepared, comprising the following synthesis substances: components of the transcription/translation apparatus for a defined expression product, amino acids, and metabolic components supplying energy and being necessary for the synthesis of the defined protein, 
b) the synthesis is performed in the reaction vessel in a defined period of time, without separating generated substances and without adding consumed synthesis substances within the defined period of time, 
c) after expiration of the defined period of time, the reaction solution is subjected to a separation step, in which generated low-molecular metabolic products and/or reaction inhibitors are separated from the solution, 
d) immediately before, after or at the same time as step c) consumed synthesis substances are supplemented, 
e) steps b), c) and d) are repeated at least once with the reaction solution of step d), wherein at the last execution of step b) the steps c) and d) may be omitted. 
2.                  A method according to claim 1, wherein in step c) and/or subsequently to step e), expression products are separated from the solution.
3.                  A method according to claim 1 or 2, wherein steps b), c) and d) are repeated one to ten times, preferably one to five times.
4.                  A method according to one of claims 1 to 3, wherein the defined period of time is between 0.1 and 10 hours, preferably between 0.5 to 3 hours. 
5.                  A method according to one of claims 1 to 4, wherein step c) is executed by means of gel filtration, ultrafiltration, dialysis, diafiltration or matrices having selective binding properties for low-molecular metabolic products and/or reaction inhibitors. 
6.                  A method for preparative in vitro protein synthesis in a cell-free transcription/translation system, comprising the following steps: 
a') in a reaction vessel, a reaction solution is prepared, comprising the following synthesis substances: components of the transcription/translation apparatus for a defined first expression product, optionally components of the transcription/translation apparatus for a defined second expression product being different from the first expression product, amino acids, and metabolic components supplying energy and being necessary for the synthesis, 
b') the synthesis of the first protein is performed in the reaction vessel in a first defined period of time, without adding consumed synthesis substances within the first defined period of time, 
c') optionally generated low-molecular metabolic products are separated from the solution, 
d') after expiration of the defined period of time, the reaction solution is supplemented with consumed synthesis substances and, as far as not added already in step a'), reacted with components of the transcription/translation apparatus for the defined second expression product, 
e') the synthesis of the second protein is performed in the reaction vessel in a second defined period of time, without separating generated substances and without adding consumed synthesis substances within the defined period of time.
7.                  A method according to claim 6, wherein subsequently to step e') the method according to one of claims 1 to 5 is performed, beginning with step c).
8.                  A method according to one of claims 6 or 7, wherein the transcription/translation apparatuses for the first expression product and the second expression product include different first and second regulatory sequences, wherein a first gene sequence coding for the first expression product is under control of the first regulatory sequence and a second gene sequence coding for the second expression product is under control of the second regulatory sequence.
9.                  A method according to one of claims 6 to 8 in the embodiment comprising components of transcription/translation apparatus for a defined second expression product being different from the first expression product in step a'), wherein the second regulatory sequence is inhibited in step b'), and wherein the first regulatory sequence is inhibited in step e'). 
10.                A method according to one of claims 6 to 8 in the embodiment comprising the addition of the components of the transcription/translation apparatus for the defined second expression product in step d'), wherein the first regulatory sequence is inhibited in step e').
Abstract.
The invention relates to a method for preparative in vitro protein synthesis of an expression product in a cell-free transcription/translation system, comprising the following steps: a) in a reaction vessel, a reaction solution is prepared, comprising the following synthesis substances: components of the transcription/translation apparatus for a defined expression product, amino acids, and metabolic components supplying energy and being necessary for the synthesis of the defined protein, b) the synthesis is performed in the reaction vessel in a defined period of time, without separating generated substances and without adding consumed synthesis substances within the defined period of time, c) after expiration of the defined period of time, the reaction solution is subjected to a separation step, in which generated low-molecular metabolic products and/or reaction inhibitors are separated from the solution (and extracted), d) immediately before, after or at the same time as step c) consumed synthesis substances are supplemented, e) steps b), c) and d) are repeated at least once with the reaction solution of step d), and at the last execution of step b) steps c) and d) may be left out.
【図１】
2006020632.tif 000004
【図２】
2006020632.tif 000005