(57)【要約】【課題】  抗生物質を用いなくても安定にプラスミドを維持することができる新種の形質転換体バチルス属細菌を提供する。【解決手段】  染色体上のｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有し、ｔｒｐＡ遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換されたバチルス属細菌。【選択図】  図１
2006067884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上のｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有し、ｔｒｐＡ遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換されたバチルス属細菌。
【請求項２】
染色体ｔｒｐＡ遺伝子の欠陥に起因する要求性を発現ベクターが相補してなる請求項１記載のバチルス属細菌。
【請求項３】
発現ベクターが、薬剤耐性遺伝子に置換してｔｒｐＡ遺伝子が挿入され、且つ目的タンパク質をコードする遺伝子を含有するものである請求項１又は２記載のバチルス属細菌。
【請求項４】
目的タンパク質をコードする遺伝子が以下の（１）から（３）いずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子である、請求項３記載のバチルス属細菌。
（１）配列番号１３で示される塩基配列、
（２）配列番号１３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（３）配列番号１３で示される塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失、置換あるいは付加され、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項５】
枯草菌である請求項１〜４のいずれか１項記載のバチルス属細菌。
【請求項６】
ｔｒｐＡ遺伝子が欠陥を有するバチルス属細菌を形質転換するためのベクターであって、薬剤耐性遺伝子に置換してｔｒｐＡ遺伝子が挿入され、且つ目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクター。
【請求項７】
目的タンパク質をコードする遺伝子が以下の（１）から（３）いずれかに記載の塩基配列からなる遺伝子である請求項６記載の発現ベクター。
（１）配列番号１３で示される塩基配列、
（２）配列番号１３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有し、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（３）配列番号１３で示される塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失、置換あるいは付加され、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項記載のバチルス属細菌を、薬剤を含有しない培養条件下で培養し、該培養物から目的タンパク質を取得する目的タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現ベクターを菌体内に安定的に維持できるバチルス属細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的にプラスミドを用いた組換え菌による有用物質生産においては、プラスミドを菌体内に安定に保持させるために、プラスミド上には抗生物質耐性遺伝子を導入し、微生物の培養に用いられる培地には適当な抗生物質を添加する方法が用いられている。これは、抗生物質添加培地中で増殖する菌体は、抗生物質耐性遺伝子が導入されたベクターを保持する菌体のみであるという原理に基づく。
【０００３】
しかし、抗生物質を利用したこの培養方法は、抗生物質耐性能を有した組換え菌が大量に増殖してしまうという安全性における問題点や、高価な抗生物質を培地へ大容量に添加しなければならないという経済的な問題点、また、培養終了後には培養上清液から抗生物質を除去しなければならないという工程上の不経済の問題点を有していた。また、大容量の廃液処理により、自然環境への付加も大きいという問題もあった。
【０００４】
そこで、抗生物質を使用しない培養方法を用いることができる組み換え菌の開発が求められていた。そして、このような組み換え菌として、必須遺伝子が破壊された宿主に、その遺伝子を含んだベクターが導入されることにより、そのベクターを安定に維持されている組み換え菌が着想されていた。これは、増殖欠陥を有する宿主に、この欠陥を相補する遺伝子の導入を試みた場合、正しく導入された宿主のみ増殖するであろうという発想に基づく。そして、宿主に枯草菌を用いる系としては、必須遺伝子にａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子を選んだ方法が（特許文献１）、また、酵母の系としては必須遺伝子にＣＤＣ４遺伝子を選んだ方法が（特許文献２）具体化されていた。
【特許文献１】特開平６−８６６６９号公報
【特許文献２】特開平７−６７６８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ａｌｒ遺伝子を用いた手法は、汎用性やプラスミドの安定性、また目的タンパク質の生産性などにおいて問題があり、実用的で、かつ、より有用な系の開発が待たれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはバチルス属の細菌の生育に必須な遺伝子について検討を行った結果、染色体上において、トリプトファンを合成する酵素をコードする遺伝子であるｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有するバチルス属細菌を用い、これをｔｒｐＡ遺伝子を含む発現ベクターで形質転換体した場合に、薬剤をもちいずに当該プラスミドを菌体中に安定に保持できること、また、これを薬剤を含有しない培養条件下で培養することにより目的タンパク質を取得できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、染色体上のｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有し、ｔｒｐＡ遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換されたバチルス属細菌を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、ｔｒｐＡ遺伝子が欠陥を有するバチルス属細菌を形質転換するためのベクターであって、薬剤耐性遺伝子に置換してｔｒｐＡ遺伝子が挿入され、且つ目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターを提供するものである。
【０００９】
さらにまた、本発明は、本発明のバチルス属細菌を、薬剤を含有しない培養条件下で培養し、該培養物から目的タンパク質を取得する目的タンパク質の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、薬剤を用いなくても安定にプラスミドを維持することができるバチルス属細菌、及び抗生物質等の薬剤を使わなくても菌体の培養を行うことができるタンパク質製造方法が提供される。抗生物質を使用しない条件で菌体を培養できることは、有用な物質等を大量に生産する場合に抗生物質耐性菌が出現する危惧を払拭できる。また、培養後の後処理工程が軽減されることにより、要するエネルギー並びに排水量が減少され、環境負荷も低減もされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のバチルス属細菌は、染色体上のｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有し、ｔｒｐＡ遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換されたものである。
すなわち、本発明の形質転換されたバチルス属細菌は、宿主の染色体ｔｒｐＡ遺伝子の欠陥に起因する要求性を発現ベクターが相補してなるものである。ｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有している菌体が生育することができない条件下で当該形質転換体を培養した場合、ｔｒｐＡ遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片が脱落した菌体は増殖できず、ｔｒｐＡ遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片を保持する菌が優先的に増殖する。
【００１２】
本発明の形質転換されたバチルス属細菌は、たとえば、（１）染色体上のｔｒｐＡ遺伝子に欠陥があるバチルス属細菌に、（２）ｔｒｐＡ遺伝子を含む発現ベクターを細胞内に導入し、（３）導入された細胞を選択することにより得ることができる。
（１）染色体上のｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有するバチルス属細菌とは、染色体上のｔｒｐＡ遺伝子の発現産物としてのＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量が野生型のバチルス属細菌に比べて低いバチルス属細菌、及び／又は染色体上のｔｒｐＡ遺伝子内における変異のために、染色体上のｔｒｐＡ遺伝子の発現産物としてのＲＮＡ及び／又はタンパク質の活性が野生型のＲＮＡ及び／又はタンパク質の活性に比べて低下しているバチルス属細菌をいい、たとえば、ｔｒｐＡ遺伝子由来の配列を含むＤＮＡ断片をバチルス属細菌に導入し、バチルス属細菌内で組みかえ反応を起こさせ、染色体上のｔｒｐＡ遺伝子が導入したＤＮＡ断片と置換した細胞を選択することにより作製することができる。上記変異は、天然に存在するアレル変異、天然に存在しない変異、又は、改変（欠失、置換、付加および挿入）のなされた変異を含む。
【００１３】
ここで、バチルス属細菌としては、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）等が挙げられるが、枯草菌が好ましい。また、バチルス属細菌は、野生型であることが好ましいが、生育することができる限り変異を有していてもよい。ＤＮＡ断片の導入は、例えば、公知のコンピテントセルを用いる方法(C. Anagnostopoulos and J. Spizizen, J. Bacteriol., 81, 741-746, 1961.)に準じて行うことができる。
【００１４】
ＤＮＡ断片としては、ｔｒｐＡ遺伝子、好ましくは当該ＤＮＡ断片を導入する宿主菌のｔｒｐＡ遺伝子の一部を含む断片であって、その含む部分のｔｒｐＡ遺伝子内における位置関係及び／又はその配列に導入された変異から全長のｔｒｐＡタンパク質が発現しないことが明らかな、若しくはｔｒｐＡ遺伝子の翻訳及び／又は転写効率が阻害されることが明らかな断片であればよい。ここにおいて、ｔｒｐＡ遺伝子は、コード領域のみならず、遺伝子調節領域といった非コード領域も含む。また、ここにおいて、変異とは、天然に存在するアレル変異、天然に存在しない変異、又は、改変（欠失、置換、付加および挿入）のなされた変異を含む。上記断片としては、ｔｒｐＡ遺伝子上の配列ではない任意の配列、好ましくは選択マーカー配列、より好ましくは薬剤耐性遺伝子配列が、ｔｒｐＡ遺伝子中の一部の配列、好ましくは、ｔｒｐＡ遺伝子コード領域の両端を含まない部分の配列と置換されたｔｒｐＡ遺伝子配列を有する断片が好ましい。上記薬剤耐性遺伝子としては、クロラムフェニコールが好ましい。なお、当該断片の内部及び／又は端部には、必要に応じて公知の方法により制限酵素認識部位を導入してもよい。
【００１５】
上記断片に含めるｔｒｐＡ遺伝子由来の配列のｔｒｐＡ遺伝子内における位置関係及び／又はその配列に導入する変異の設計は、１９９７年にＫｕｎｓｔらの国際協力プロジェクトにより明らかとなった、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの全ゲノム配列(Kunst F., et.al., Nature, 108(1), 74-80, 1997)等をもとに公知の方法をもとに行うことができる。そして、上記断片の作製は、公知の方法により摂取したｔｒｐＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をもとにすれば、公知の変異導入方法、ＰＣＲを用いた公知の方法及び／又は公知の制限酵素を用いた方法により行うことができる。
【００１６】
上記ＤＮＡ断片の細菌内での組みかえは、ＤＮＡ断片を導入すると、挿入したＤＮＡ断片においてバチルス属細菌染色体上の配列に相同性がある配列が、その相同性がある配列と自然に組みかわることにより行われる。
【００１７】
染色体上のｔｒｐＡ遺伝子を導入したＤＮＡ断片と置換した細胞の選択は、公知の方法により行うことができるが、たとえば、導入ＤＮＡ断片に付加したマーカー遺伝子のマーカーを指標に行うことができ、たとえば、クロラムフェニコール存在化で培養し、生育した細胞を摂取することにより行うことができる。
【００１８】
（２）におけるｔｒｐＡ遺伝子を含む発現ベクターは、公知の方法により作製されるが、例えば、ｔｒｐＡ遺伝子を含む断片及び、薬剤耐性遺伝子配列を除いたベクターＤＮＡ断片を得て、両断片をつなぎあわせることにより行うことができる。
【００１９】
ここで、ｔｒｐＡ遺伝子とは、ｔｒｐＡ遺伝子のコード領域及び／又はその遺伝子調節配列を含んだ配列をいい、プロモーターやターミネーターを含んでいてもよい。ｔｒｐＡ遺伝子断片とは、バチルス属細菌のｔｒｐＡ遺伝子配列、バチルス属細菌ｔｒｐＡ遺伝子とホモログであることが知られている他の生物における遺伝子配列、又は、その遺伝子配列及び／又はドメインの構成からｔｒｐＡと類似の機能を果たすことが明らかである遺伝子配列を含む断片をいうが、バチルス属細菌由来のｔｒｐＡ遺伝子を含む断片が好ましく、枯草菌由来のｔｒｐＡ遺伝子を含む断片であることが特に好ましい。また、当該断片を導入する宿主菌体内における野生型遺伝子を含む断片が好ましい。また、当該断片には、新たにｔｒｐＡ遺伝子由来でないプロモーターを付加してもよく、付加されるプロモーターとしては、異質プロモーターを用いることができ、プロモーターの変異体も用いることができる。異質プロモーター等を用いることにより、遺伝子の発現量を調整することができる。また、当該遺伝子断片は、ｔｒｐＡ遺伝子中に変異を有する断片であっても良い。ここで変異は、天然に存在するアレル変異、天然に存在しない変異、又は、改変（欠失、置換、付加および挿入）のなされた変異であって、コードする遺伝子の機能を実質的に阻害しない変異を意味する。
【００２０】
上記ｔｒｐＡ遺伝子断片は、公知の方法により得ることができるが、例えば、染色体ＤＮＡを含む抽出液を用いて、ＰＣＲ反応をおこない、ｔｒｐＡ遺伝子を含む断片を増幅することにより得ることができる。ここで、染色体ＤＮＡは、例えば、ｔｒｐＡを採取することを目的とする生物の抽出液から公知の方法によりＤＮＡを精製することにより採取することができる。また、上記ＰＣＲ反応に用いるプライマーは、１９９７年にＫｕｎｓｔらの国際協力プロジェクトにより解読された、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの全ゲノム配列(Kunst F., et.al., Nature, 108(1), 74-80, 1997)等を参酌することにより公知の方法により設計することができ、例えば、配列番号９及び１０で示されるプライマーが挙げられる。また、このプライマーの中には、必要により制限酵素認識配列を含めることもできる。ｔｒｐＡ遺伝子及びプロモーターへの変異の導入は、ＰＣＲ法を用いた公知の方法等により容易に行うことができる。
【００２１】
薬剤耐性遺伝子配列を除いたベクターＤＮＡ断片としては、薬剤耐性遺伝子配列を有していたベクターＤＮＡをもとに、（ａ）当該薬剤耐性遺伝子の配列の一部もしくは全部の、好ましくは全部の配列を除去した断片、若しくは（ｂ）薬剤耐性遺伝子内に変異を導入して失活させた断片が挙げられる。ここにおいてベクターＤＮＡとしては、環状ＤＮＡ、直鎖状一本鎖ＤＮＡ又は直鎖状二本鎖ＤＮＡがあげられるが、環状ＤＮＡが好ましく、環状プラスミドＤＮＡがより好ましい。環状プラスミドＤＮＡとしては、ｐＨＹ２３７が好ましい。また、上記薬剤耐性遺伝子としては、クロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の耐性遺伝子が挙げられるが、テトラサイクリン耐性遺伝子が好ましい。上記断片は、公知の方法により作製されるが、例えば、公知のベクターＤＮＡを、薬剤耐性遺伝子の両側に存在する制限酵素認識部位において制限酵素により切断し、薬剤耐性遺伝子断片を分離除去することにより行うことができる。または、例えば、薬剤耐性遺伝子配列又はそのプロモーター若しくはターミネーター等の調節配列の中途の位置に、公知の方法により任意の配列を導入し、コドンの読み枠をずらすこと、あるいは公知の方法によりプロモーター及び／又はターミネーターの配列の全部又は一部、好ましくは全部を除去することによって行うことができる。また、当該ＤＮＡ断片には、必要に応じて公知の方法により制限酵素認識配列を付加することができる。
【００２２】
両ＤＮＡ断片のつなぎ合わせは、公知の方法により行うことができ、例えば、制限酵素認識配列が付加された両者断片を制限酵素で消化したのち、公知のライゲーションの方法を行うことによりつなぎ合わせることができる。
【００２３】
また、本発明の発現ベクターには、必要に応じて、公知の方法により目的タンパク質をコードする外来遺伝子配列を含めておくこともできる。目的タンパク質をコードする外来遺伝子としては、バチルス属細菌由来の遺伝子に限定されず、あらゆる生物由来のあらゆる遺伝子を導入することができるが、アルカリプロテアーゼやアルカリセルラーゼをコードする遺伝子が好ましく用いられる。特に、特開２０００−２１００８１号公報記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０６７）の耐熱性アルカリセルラーゼ遺伝子、すなわち、配列番号１３で示される塩基配列からなる遺伝子や、当該塩基配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、アルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号１３で示される塩基配列の1若しくは数個の塩基が欠失、置換あるいは付加加された塩基配列からなり、かつアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が好適に用いられる。同様に、特開２００３−３１０２７０号公報記載の配列番号１３記載の遺伝子を変異させたアルカリセルラーゼをコードする遺伝子も好適に用いられる。塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science, 227, 1435, (1985)）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発)のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to complete(ktup)を２として解析を行うことにより計算される。発現ベクターへの目的タンパク質をコードする外来遺伝子の導入は、制限酵素を用いた公知の方法により行うことができ、例えば、ｔｒｐＡ遺伝子を含む断片とつなぐ以前のベクターＤＮＡ断片にあらかじめ当該遺伝子配列を挿入することによっても行うことができ、ベクターＤＮＡにｔｒｐＡ遺伝子と同時に当該遺伝子配列を挿入することによって行うこともでき、また、ｔｒｐＡが挿入された後の発現ベクターに当該遺伝子配列を挿入することにより行うこともできるが、ｔｒｐＡ遺伝子を含む断片とつなぐ以前のベクターＤＮＡ断片にあらかじめ当該遺伝子配列を挿入することによって行うことが好ましい。
【００２４】
得られた発現ベクターのバチルス属細菌内への導入は、公知の方法により行うことができるが、例えば、宿主菌を公知の方法によりコンピテントセル化することにより行うことができる。
【００２５】
（３）導入された細胞の選択は、例えば、最小培地、好ましくはＰＳＭ培地において培養し増殖した細胞を選択することにより行うことができる。
【００２６】
かくして選択された本発明の形質転換体の宿主であるバチルス属細菌は、生育に必要な遺伝子であるｔｒｐＡについて染色体上に欠陥を有しているため、ｔｒｐＡ遺伝子に欠陥を有している菌体が生育することができない培地上などの条件下で当該形質転換体を培養した場合、ｔｒｐＡ遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片を脱落した菌体は増殖できず、ｔｒｐＡ遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片を保持する菌が優先的に増殖する。この結果、薬剤を使用しなくても、当該菌体内に、外来ＤＮＡ断片が安定に保持される。よって、ｔｒｐＡ遺伝子を含む外来ＤＮＡ断片に目的タンパク質をコードする外来遺伝子配列を含めることにより、薬剤を含まない培地中においても、目的タンパク質を安定に供給させることができる。
【００２７】
目的タンパク質の製造は、公知の方法により、上記により得られた形質転換体を培養し、当該培養物から公知の方法によりタンパク質を精製することにより行うことができる。培地は、公知の培地を用いることができるが、最小培地が好ましく、ＰＳＭ培地がより好ましい。また、培地は、トリプトファンを有さない培地が好ましいが、少量ならば有している培地でも構わない。また、培地には、抗生物質を加えなくても培養を行うことができるが、必要に応じて適宜加えてもかまわない。
【実施例】
【００２８】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明する。
【００２９】
［実施例１］枯草菌ゲノム上のｔｒｐＡ遺伝子破壊株の構築
１．遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の構築
遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の調製を行った（図１）。ｔｒｐＡ遺伝子破壊ＤＮＡ断片のマーカーにはＴｃ耐性遺伝子を用いた。先ず、プライマーI（配列番号１）及びプライマーIII（配列番号３）（Ｔｃ耐性遺伝子のプロモーター上流３１ｂｐを５‘末端に付加）を用いて枯草菌（（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＳＷ１２１４）のゲノム上のｔｒｐＡ遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行った（図中：断片１）。同様にプライマーII（配列番号２）及びプライマーIV（配列番号４）（Ｔｃ耐性遺伝子のターミネーター下流３３ｂｐを５‘末端に付加）を用いて枯草菌ゲノム上のｔｒｐＡ遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行った（図中：断片２）。次ぎにプライマーＶ（配列番号５：プライマーIIIのｔｒｐＡ遺伝子の塩基配列を５‘末端に付加）及びプライマーVI（配列番号６：プライマーIVのｔｒｐＡ遺伝子の塩基配列を５‘末端に付加）を用いて、Ｔｃ耐性遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行った（図中：断片３）。得られたＤＮＡ断片３を鋳型にしてプライマーI、プライマーVI及びＤＮＡ断片１を用いてＰＣＲを行った（図中：断片４）。更にＤＮＡ断片４を鋳型にしてプライマーVII（配列番号７）、プライマーVIII（配列番号８）及びＤＮＡ断片２を用いてＰＣＲを行い、Ｔｃ耐性遺伝子の両端にｔｒｐＡ遺伝子領域の上流及び下流それぞれ約１．５ｋｂを付加したｔｒｐＡ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の約６ｋｂｐを調製した（図中：断片５）。使用したプライマーの塩基配列は表１に記載した。標準的なＰＣＲの条件は下記の如く行った。即ち、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ（１０ｎｇ）、センスプライマー１０μＬ（１μＭ）、アンチセンスプライマー１０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液５μＬ、１０ｍＭ  ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混液４μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ（２．５  ｕｎｉｔｓ、タカラ製）及び脱イオン水２０μＬを混合した後、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（アマシャムファルマシア製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃、１分間（熱変性）、５５℃１分間（アニーリング）、７２℃２分間（伸長、３０サイクル）及び７２℃４分間（伸長）で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  キット（アマシャムファルマシア製）で精製した。得られたＤＮＡ断片は次のＰＣＲにプライマーとして用いる場合には必要に応じて末端のリン酸化処理を行った（精製ＤＮＡ溶液４３．５μＬに５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及び１μＬ（１０ｕｎｉｔｓ）のｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを加え、３７℃で１時間処理した）。ＰＣＲにおいてアニーリング温度は用いたプライマーのＴｍ値（約５０℃〜６０℃）より決定し、伸長は１ｋｂｐのＤＮＡ伸長に付き１分として行った。
【００３０】
２．ｔｒｐＡ遺伝子破壊株の選択
構築したｔｒｐＡ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を用いて、枯草菌のゲノム上のｔｒｐＡ遺伝子を破壊した株を選別した。ｔｒｐＡ遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の枯草菌への導入はコンピテントセル法( Anagnostopoulos and Spizizen, J. Bacteriol., 81, 741-746, 1961)に準じ行った。枯草菌をＬＢプレート上で画線し３７℃で一晩培養後、Ｓｐｉｚｉｚｅｎ１（ＳＰ１）培地［０．２％硫酸アンモニウム、１．４％Ｋ2ＨＰＯ4、０．６％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％クエン酸三ナトリウム、０．０２％カザミノ酸テクニカル、０．０５ｍｇ／ｍＬリジン、０．０５ｍｇ／ｍＬトリプトファン、０．５％グルコース、５ｍＭ硫酸マグネシウム７水和物］に２〜３コロニーを懸濁し６００ｎｍによる吸光度を測定した。最終Ｏ．Ｄが０．０３となるようにＳＰ１培地１ｍＬに添加して３７℃、１８０ｒｐｍ、４〜５時間培養した後、０．１ｍＬをＳＰ２培地［０．２％硫酸アンモニウム、１．４％Ｋ2ＨＰＯ4、０．６％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％クエン酸三ナトリウム、０．０１％カザミノ酸テクニカル、０．００５ｍｇ／ｍＬリジン、０．００５ｍｇ／ｍＬトリプトファン、０．５％グルコース、５ｍＭ硫酸マグネシウム７水和物］０．９ｍＬに加え更に３７℃、１８０ｒｐｍで４時間培養した。培養後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３分間）して上清０．９ｍＬを除去し残りの菌体にｔｒｐＡ遺伝子破壊用ＤＮＡ溶液１〜５μＬを添加して懸濁後、さらに３７℃、１８０ｒｐｍで２時間振盪培養した。培養終了後１５μｇ／ｍＬ濃度のＴｃ及び２０μｇ／ｍＬのトリプトファンを含有した最小培地選択プレートに塗布し、生育してきたコロニーを選別した。
【００３１】
［実施例２］枯草菌のｔｒｐＡ遺伝子のクローニング
配列番号１３の塩基配列の塩基番号５７３〜３０４４に示す塩基配列を含むセルラーゼ生産用の発現ベクターｐＨＹ２３７上のテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子と置換するためｔｒｐＡ遺伝子のクローニングを行った。ｔｒｐＡ遺伝子のクローニングは枯草菌由来のゲノムを用い、ｔｒｐＡ遺伝子上流及び下流に制限酵素認識部位ＳａｃＩを付加したプライマーIX（配列番号９）及びプライマーX（配列番号１０）を用いてゲノムＰＣＲを行った。一方で、ｐＨＹ２３７(Hakamadaら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 2281-2289, 2000)のＴｃ耐性遺伝子を欠落させるようなＳａｃＩを付加したプライマーXI（配列番号１１）及びプライマーXII（配列番号１２）を構築し、ｐＨＹ２３７を鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は［実施例１］に記載した方法に順じて行った。得られたｔｒｐＡ遺伝子及びＴｃ耐性遺伝子を欠落させた発現ベクターｐＨＹ２３７のＤＮＡ断片をＳａｃＩ処理した後、双方をリガーゼ反応により連結した。得られたライゲーションＤＮＡ混液を用いてｔｒｐＡ遺伝子を破壊した宿主をコンピテントセル法により形質転換し、コロニー周辺にハローを形成し、且つｐＨＹ２３７上のＴｃ耐性遺伝子とｔｒｐＡ遺伝子が置換したプラスミドを保持した枯草菌を最小培地プレートにて取得した。
【００３２】
［実施例３］ｔｒｐＡ遺伝子破壊株のアルカリセルラーゼ生産能
枯草菌にｔｒｐＡ遺伝子破壊株を用い、アルカリセルラーゼの発現ベクターｐＨＹ２３７上のＴｃ耐性遺伝子をｔｒｐＡ遺伝子に置換した宿主・ベクター系において、培養時に抗生物質であるＴｃを使用せずアルカリセルラーゼの生産能を評価した（図２）。組換え枯草菌の培養は、３％ポリペプトンＳ（日本製薬製）、０．５％魚肉エキス（和光純薬製）、０．０５％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、及び５％マルトース（別滅菌）を含んだ培地（ＰＳＭ培地）を用いて、３０℃で７２時間行った。その結果、従来通りテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を使用した組換え枯草菌によるアルカリセルラーゼ生産能を１００％とした時、ｔｒｐＡ遺伝子破壊株を組換え枯草菌としたアルカリセルラーゼ生産能は４５％であった。
【００３３】
＜セルラーゼ活性測定法（３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法＞
２ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）、０．４ｍＬの２．５％カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙製）、０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃で２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ｔｒｐＡ遺伝子破壊株作製に用いたＤＮＡ断片を作製する工程を示した図である。
【図１】
2006067884.tif 000003
【配列表】
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