(57)【要約】【課題】細胞免疫不全症の動物又は患者を治療する方法を提供すること。【解決手段】患者における細胞性免疫不全症を治療する方法であって、細胞性免疫不全症の存在を決定する工程、および胸腺ペプチドの有効量を、天然サイトカイン製剤の有効量と共に、患者に共投与する工程を含み、上記胸腺ペプチドが、チモシンα１、チモシンα１類似体、チモシンα１フラグメント、チモシンα１１、プロチモシン並びにチモシンα１配列を含む胸腺ペプチド、類似体およびフラグメントからなる群から選択される、治療方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における細胞性免疫不全症を治療する方法であって、
細胞性免疫不全症の存在を決定する工程、および
胸腺ペプチドの有効量を、天然サイトカイン製剤の有効量と共に、患者に共投与する工程、を含む上記治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する技術分野）
本発明は、改良された細胞性免疫不全症の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
近年、免疫系を調節してその応答を改善することが可能になってきており、この場合、その系の成分はその成分の機能を部分的または完全に回復するのに非機能性である。例えば、幹細胞を置換し、または欠けている幹細胞を与えるのに使用される骨髄移植がひどい複合免疫不全症を治癒することができる。別の例において、免疫細胞が癌患者から除去され、治療され、腫瘍退縮がある患者に戻される（非特許文献１；非特許文献２）。更に、γ−グロブリン及び静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の如き体液性免疫系の成分は広い治療用途があることが知られている（非特許文献３；非特許文献４）。また、その他の免疫系成分が治療薬として使用されている（非特許文献５；非特許文献６；Ｔａｌｍａｄｇｅ及びＨａｄｄｅｎ，１９９４）。
【０００３】
免疫調節薬は、免疫機能を調節し、または免疫系の活性に正または負の効果を有する化合物である。臨床医薬中の免疫調節薬の使用は免疫機能の再生（または免疫不全症の修正）及び正常または過度の免疫機能の抑制を含む。免疫調節薬の主要なクラスはサイトカインである。組換え技術により、サイトカインの多くが臨床上の使用に現在利用できる。しかしながら、免疫系は複雑であり、しかも種々の成分の相互作用が免疫機能を有効に調節するのにしばしば必要である。免疫機能を有効に調節する種々の成分及び相互作用を与える製剤を設計することが有益であろう。
【０００４】
サイトカインは、胸腺由来Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球及び単球／マクロファージを含む活性化免疫細胞により産生されるペプチド／タンパク質免疫調節薬である。サイトカインとして、インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１５）、顆粒細胞および／またはマクロファージに関するコロニー刺激因子（ＣＳＦ）（ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−Ｍ、ＣＳＦ−ＧＭ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα＆β）、及びインターフェロン（ＩＦＮα、β＆γ）が挙げられる。
【０００５】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）はＴ細胞成長因子として最初に記載されたリンホカインである（非特許文献７）。化学的には、ＩＬ−２は１３３アミノ酸、１５，０００ダルトン分子量の糖タンパク質である。それは正常な末梢血リンパ球、扁桃及び脾臓のＴ細胞、並びに大顆粒リンパ球により産生される。ＩＬ−２は抗原またはマイトジェン刺激Ｔ細胞の増殖を誘導し、支持する。Ｔリンパ球刺激機能に加えて、ＩＬ−２は免疫応答の開始、増大及び調節、γインターフェロン（ＩＦＮγ）の産生、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の誘導、細胞溶解Ｔ細胞の増殖、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のキラー活性の増強の如きプロセスに重要である。組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）はヒトｃＤＮＡ配列により生成される非グリコシル化タンパク質である。遺伝子操作されたＩＬ−２は非特許文献８及び非特許文献９並びに特許文献１、特許文献２及び特許文献３に記載されたようにして得られてもよい。
【０００６】
天然及び組換えの両方の種々の個々のサイトカインが癌及びその他の疾患の治療について調べられていた。例えば、組換えインターフェロンα２（ｒＩＦＮα２）が有毛状細胞性白血病、カポジ肉腫、尖圭コンジローム、及び慢性肝炎の治療について米国食品薬剤管理局（ＦＤＡ）により認可されている。白血球によりつくられた２０種以上の混合物（アルフレオン（登録商標））としての天然ＩＮＦαが尖圭コンジロームについてライセンスされている。組換えＩＦＮ−γ（ｒＩＦＮ−γ）が慢性肉芽腫性疾患についてライセンスされている。ｒＩＬ−２が腎臓細胞癌についてライセンスされている。これら及びその他のｒＩＬ及びｒＩＦＮが、癌の幾つかの形態を含む種々の疾患において活性評価中である。
【０００７】
更に、ｒＩＬ−２癌治療が多くの診療所及び研究センターで研究されていた。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及び同僚（非特許文献１０，非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）は腎臓細胞癌、及び悪性メラノーマの患者の免疫治療における全身投与されるｒＩＬ−２の使用を報告していた。Ｃｏｒｔｅｓｉｎａら（非特許文献１６，非特許文献１７）は頭部及び首の癌の患者における天然ＩＬ−２及びｒＩＬ−２のロコリージョナル（ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ）注射の効果を記載し、天然ＩＬ−２が腫瘍退縮を生じるのに更に有効であることを見出した。大投薬量のｒＩＬ−２を投与された患者は寿命を短くする毒性に苦しんでいた（非特許文献１１）。
【０００８】
遺伝子操作された（組換え）免疫調節薬の開発及び商業上の利用可能性が癌臨床におけるこれらの薬剤の評価を加速した。高投薬量のｒＩＬ−２、ｒＩＦＮ−γ、γＴＮＦ−α、及びその他の単一治療薬と関連する制限された効力及びかなりの毒性は、治療戦略におけるサイトカインの天然組み合わせの再考を示唆する。更に、百より多い異なるサイトカイン活性が同定され、これが、組換えサイトカインを組み合わせることに基く免疫療法が近い将来の癌診療の成功の妥当な可能性を有することについてかなりの疑問を生じる。
【０００９】
例えば、ＩＬ−２はＴ細胞成長因子としてＴリンパ球増殖を刺激することができるが、その他のインターロイキン及び胸腺ペプチドを含む幾つかのその他の因子が胸腺中で産生され、Ｔリンパ球発育及び機能に必要と考えられる（非特許文献１８）。
【００１０】
天然インターロイキン製剤（ＮＩ）と称される特性決定されていない製剤が本件出願人によりＴリンパ球発育を促進するのに有効であることが示された。この特性決定されていない混合製剤（また、バフィコートインターロイキン、ＢＣ−ＩＬと称される）が前胸腺細胞、未熟胸腺細胞及び成熟胸腺細胞の増殖を均等濃度のｒＩＬ−２よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏで更に有効に刺激した（非特許文献１９）。このＮＩ製剤は新生児マウスのＴリンパ球発育を増進したが、ｒＩＬ−２は不活性であった（非特許文献１９）。更に、このＮＩ製剤はヒドロコルチゾン処理された老化マウスのＴリンパ球発育及び機能を増進したが、均等投薬量のｒＩＬ−２は不活性であった（非特許文献１８）。更に、低投薬量の特性決定されていないＮＩ混合物は悪性メラノーマを有するマウスの寿命を延ばした。均等投薬量のｒＩＬ−２は不活性であった（非特許文献２０）。これらの知見は、天然インターロイキン混合物がＩＬ−２により与えられない活性を有することを示す。
【００１１】
Ｔリンパ球欠陥を修正しようとする試みが老化、癌、エイズ、及びその他の免疫不全症で生じるＴリンパ球枯渇（リンパ球減少症）及びＴリンパ球不全（アネルギー）を含む種々のセッティングにおいて実験で試みられた。例えば、ｒＩＬ−２及び胸腺ペプチドが種々の結果でエイズ（ＨＩＶ）ウイルス感染症に使用された（非特許文献２１）。連続注入による高投薬量のｒＩＬ−２はＨＩＶ感染症の患者の血液中でＴリンパ球カウントを一時的に増加することが示されたが、かなりの毒性を有していた（非特許文献２２）。百万〜３百万単位のペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ｒＩＬ−２は毒性を殆ど生じなかったが、ＨＩＶ感染症のヒトのリンパ球カウントにごくわずかの作用を生じた（非特許文献２３）。ＮＩ製剤は毒性なしにリンパ球減少癌患者のＴリンパ球カウントをかなり高めた（非特許文献２４）。これらの知見は、天然インターロイキンがヒト中で低投薬量で作用して毒性を生じないでＴ細胞を増加すること及びｒＩＬ−２が高投薬量で活性ではあるものの医療用途にはあまりに毒性であることを示す。また、これらの知見はマウスデータからヒトへの外挿を支持する。
【００１２】
上記の知見は、他の因子と混合された天然に産生されたサイトカイン製剤の使用が、免疫系においてより有効であり、より毒性が少ないことを示唆している。しかし、最近得られた製剤についてその特性はよく研究されておらず、生産するのは困難である。免疫系を、再現性よく調節するためには、容易に産生することができ、再現性のある低毒性投与量を確立することが可能なサイトカイン製剤の特性をよく研究することが有用である。発明者による以前の研究（非特許文献２５）および出願中の特許出願には、このような天然のサイトカイン製剤（ＮＩ，ＮＩＭ  ｏｒ  ＮＣＭ）が記載されており、この内容は全てここに引用する。
【００１３】
ヒトにおける細胞免疫性欠損症はまた、様々な胸腺のホルモン／ペプチド製剤（例えば、チモスチムリン、チモシンフラクションＩＶ、チモシンα１、ジンク−チムリン、チモポエチン、チモペンチン、および胸腺体液性因子（非特許文献２６）により治療されてきた。これらの製剤のうち幾つかは、ヨーロッパ、特にイタリーおよびドイツにおいて臨床使用の許可を受けている。
【００１４】
チモシンα１（Ｔ−α１）は、始めウシ胸腺から得られ、後に合成されるようになった、２８アミノ酸ペプチドである（非特許文献２７；特許文献４，特許文献５，特許文献６，特許文献７）。チモシンα１は、実験的にマウスおよびヒトにおける細胞性免疫不全症および癌の治療に使用された（非特許文献２８）。免疫化を改良するためにインフルエンザワクチンと共に使用することが、イタリーで許可されており、慢性肝炎および胸部および肺癌における治験中であり、有望な結果が期待される。
【００１５】
免疫薬理学に基づき、チモシンα１は、Ｔリンパ球機能を促進するが、チモシンα１を含む胸腺ペプチドのいずれも、胸腺退行を逆転させ、およびＴリンパ球数を増加することが、明白に示されたものはない。
【００１６】
チモシンα１のアナログおよびフラグメントは、特許文献８，特許文献９，特許文献１０，特許文献１１，特許文献１２，特許文献１３に記載されるように、免疫系における効果を示す。プロチモシンおよびチモシンαｌ１はまた、チモシンα１の作用をミミックし、かつマクロファージによるその生産を誘導する（非特許文献２９；非特許文献３０；特許文献１４，特許文献１５および特許文献１６）。
【００１７】
出願人は、３５のペプチドを過剰に有する粗胸腺抽出物であるチモシンフラクションＶは、それ自身では、ヒドロコルチゾン処理を行った老齢マウスにおける、胸腺の重さ、リンパ球の含有量、または機能に影響しない。しかし、チモシンフラクションＶは、脾細胞および胸腺細胞の分裂促進因子およびインターロイキンに対する応答における天然インターロイキン製剤の効果を増強した（非特許文献３１）。
【特許文献１】米国特許第４，６０４，３２７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，５６９，７９０号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５１８，５８４号明細書
【特許文献４】米国特許第４，０７９，１２７明細書
【特許文献５】米国特許第４，１４８，７８８明細書
【特許文献６】米国特許第４，２９３，４５５明細書
【特許文献７】米国特許第４，５０４，４１５明細書
【特許文献８】米国特許第４，１１６，９５１明細書
【特許文献９】米国特許第４，３５３，８２１明細書
【特許文献１０】米国特許第４，４６６，９１８明細書
【特許文献１１】米国特許第４，４７０，９２６明細書
【特許文献１２】米国特許第４，６１２，３６５明細書
【特許文献１３】米国特許第４，９１０，２９６明細書
【特許文献１４】米国特許第４，６５９，６９４明細書
【特許文献１５】米国特許第４，７１６，１４８明細書
【特許文献１６】米国特許第４，６１４，７３１明細書
【非特許文献１】ＨｗｕおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４年，７１６：１８８−２０３
【非特許文献２】ＨｗｕおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ．Ｐｒｅｖ．１９９４年，１８（１）：４３−５０
【非特許文献３】ＤｅＳｉｍｏｎｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１９９０年，４：３１３−３１７
【非特許文献４】Ｈａｌｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９３年１１月−１２月，１３（６）：５６４−７３
【非特許文献５】ＨａｄｄｅｎおよびＳｍｉｔｈ，ＪＡＭＡ，１９９２年，２６８：２９６４−２９６９
【非特許文献６】Ｈａｄｄｅｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９９３年，２７６，第１４巻，第６号
【非特許文献７】Ｍｏｒｇａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７６年，１９３：１００７−８
【非特許文献８】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３年，３０２：３０５−３１０
【非特許文献９】Ｄｅｖｏｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８３年，１１：４３０７−４３２３
【非特許文献１０】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８５年，３１３：１４８５−１４９２
【非特許文献１１】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８７年，３１６：８８９−８９７
【非特許文献１２】ＭｕｌｅおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｇ．Ｃ１ｉｎ．Ｂｉｏｌ．，１９８７年，２４４：７９−９１
【非特許文献１３】ＣｈａｎｇおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１９８９年，５（６）：３８５−３９０
【非特許文献１４】ＢｅｌｌｄｅｇｒｕｎおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｓ．，１９８９年，４６：２１３−２３３
【非特許文献１５】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐ．Ｍｏｄ．，１９９４年，３：５０１−５１１
【非特許文献１６】Ｃｏｒｔｅｓｉｎａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８８年，６２：２４８２−２４８５
【非特許文献１７】Ｃｏｒｔｅｓｉｎａら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９４年，６９：５７２−５７６
【非特許文献１８】Ｈａｄｄｅｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９２年，１４：３４５−３５２
【非特許文献１９】Ｈａｄｄｅｎら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，１９８９年，４４：５−１２
【非特許文献２０】Ｋａｍｅｄａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９２年，８：１−５
【非特許文献２１】Ｈａｄｄｅｎ，ＴＩＰＳ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１年
【非特許文献２２】ＬａｎｅおよびＦａｕｃｉ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ  ＡＩＤＳ，１９８６年，Ｐａｒｉｓ
【非特許文献２３】Ｍｅｒｉｇａｎ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ２，ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＧａｒａｃｉ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３年，ｐ２２５−２２９
【非特許文献２４】Ｈａｄｄｅｎら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．，１９９４年，１２０：３９５−４０３
【非特許文献２５】Ｈａｄｄｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９２年，１：１−６４
【非特許文献２６】Ｓｈｕｌｏｆｆ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９８５年，３：３３０９−３７６
【非特許文献２７】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９７７年２月，７４（２）：７２５−７２９
【非特許文献２８】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９３年，２，ｐ３９−４８
【非特許文献２９】Ｍａｒｉｃら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９１年，５９：１３５−１４２
【非特許文献３０】Ｆｒｉｌｌｉｎｇｏｓら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９２年，第２９６巻，第１号，７月，ｐ．３５６−２６３
【非特許文献３１】Ｈａｄｄｅｎら，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２年，１４４：２２８−２３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そのため、チモシンのような胸腺ペプチドと天然サイトカイン製剤を混合することは有効であり、該混合物は、細胞性免疫不全症のようなＴリンパ球の機能、発達および数の減少を含む疾病および他の症状の治療において、治療的に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（本発明の概要及び利点）
本発明により、細胞免疫不全症の存在を測定し、かつ細胞免疫不全症の患者に、チモシンα１等の胸腺ペプチドの効果的な量と天然のサイトカイン製剤の効果的な量とを共に投与する工程により、細胞免疫不全症の動物又は患者を治療する方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の利点は、添付の図面と共に考えた場合に以下の詳細な説明を参照することで理解が深まるとき容易に認められる。
（項目１）
患者における細胞性免疫不全症を治療する方法であって、
細胞性免疫不全症の存在を決定する工程、および
胸腺ペプチドの有効量を、天然サイトカイン製剤の有効量と共に、患者に共投与する工程、を含む上記治療方法。
（項目２）
該胸腺ペプチドが、チモシンα１、チモシンα１類似体、チモシンα１フラグメント、チモシンα１１、プロチモシン並びにチモシンα１配列を含む胸腺ペプチド、類似体およびフラグメントからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
該胸腺ペプチドがチモシンα１である、項目２に記載の方法。
（項目４）
天然サイトカイン製剤が、天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）、天然インターロイキン混合物（ＮＩＭ）および天然インターロイキン製剤（ＮＩ）からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
ＩＬ−１を１０−２０００ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−２を１００−５００単位／ｍｌ、ＩＬ−６を２５０−１０，０００ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−８を１２，０００−１００，０００ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−１２を１００−１０，０００ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γを５０−１５，０００ｐｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−αを５０−１５，０００ｐｇ／ｍｌ、ＣＳＦ−Ｇを５０−１５００ｐｇ／ｍｌ、ＣＳＦ−ＧＭを１０−１５６０ｐｇ／ｍｌ、および微量のＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７を含むサイトカインプロフィールを含む項目４に記載のサイトカインの天然混合物。
（項目６）
治療される細胞性免疫不全症が、加齢、癌、ＨＩＶ感染および他の急性および慢性感染により生じる細胞性免疫不全症群から選択される、項目１に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（好ましい実施の態様）
本発明は、免疫調節物質としての天然サイトカイン製剤を、チモシンα１のような胸腺ペプチドとともに投与することによって、細胞免疫不全を治療する方法を提供する。免疫調節物質は、免疫機能を調節し又は免疫系の活性に対して正又は負の効果を有し、かつサイトカインを含む化合物である。
【００２２】
好ましい態様においては、免疫調節性天然サイトカイン製剤は、同一の発明者による出願であって、本発明の譲り受け人に譲渡され、本発明と同一の日に出願された継続出願（参照によってここに導入し、以下の実施例で記載する）において説明されている天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）である。簡単にのべれば、ＮＣＭは、４−アミノキノロン抗生物質の連続的存在の下でかつマイトジェン（有糸分裂促進物質、好ましい態様では、ＰＨＡである）の連続的存在下で調製される。
【００２３】
しかしながら、本発明は、４−アミノキノロン抗生物質の連続的存在下で、但し、パルス的な、ＰＨＡのようなマイトジェンの存在下で、製造される天然インターロイキン混合物（ＮＩＭ）でも実施することができる。他の免疫調節性天然サイトカイン製剤、例えば、ＮＩ製剤は、本発明でも使用することができる。種々の製剤は、ＩＬ−２含量によって比較され、その投与量は、ＩＬ−２当量で表示される。
【００２４】
胸腺ペプチドは、本発明において、免疫調節物質−サイトカイン製剤とともに投与する。チモシンα１（Ｔ−α１）又はその類縁体及びフラグメントが、本発明の好ましい態様で使用される。更に、チモシンα１１及びプロチモシンのような他の胸腺ペプチド及びその類縁体を使用することができる。チモシンα１配列を有する胸腺ペプチド、類縁体及びフラグメントも使用することができる。
【００２５】
類縁体は、機能的に関連する部分において、少なくとも７０％の相同性を通常有する。更に好ましい態様では、相同性は、胸腺ペプチド、特に、チモシンα１配列に対して、少なくとも８０％であり、９５％まで上げることができる。類縁体のアミノ酸配列は、少なくとも１つの残基が欠失、挿入又は置換される場合には、胸腺ペプチドのアミノ酸配列と異なり得る。グリコシル化の相違によって類縁体が形成され得る。米国特許第４，１１６，９５１号、同４，３５３，８２１号、同４，４６６，９１８号、同４，４７０，９２６号、同４，６１２，３６５号、同４，９１０，２９６号明細書に示されている類縁体は、このような類縁体の例示であり、本発明において使用することができる。
【００２６】
加齢、ガン、ＨＩＶ感染、及びその他の急性及び慢性感染に関連する細胞免疫不全は、本発明で治療することができる。この急性及び慢性感染には、結核、サルモネラ及びハンセン病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明の方法は、本発明のプロトコールに従った、天然サイトカイン製剤の有効量及びチモシンα１（例えば体表面積１ｍ２あたり０．６〜９．６ｍｇ）の哺乳動物宿主、好ましくはヒトへの副投与（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）を必要とする。好ましい態様におけるＮＣＭは特定のサイトカインプロフィールを有し、一般にＩＬ−２（ＩＬ−２相当物）の投与量当たり２００〜５００単位を有する。
【００２８】
治療を受けるべき患者は、細胞性免疫不全症と診断されたか、又は細胞性免疫不全と他の病的状態とが複合した患者である。患者のＴ細胞機能、発達及び総数は、当業界に知られたように評価され、もし正常より低ければ、細胞性免疫不全を有することで、特にＴ細胞異常の治療するために設計された本発明を用いた治療のための候補者になるだろう。
【００２９】
ＮＣＭの初期投与は、チモシンα１と同時に投与するか、他の薬物に続いて、一般には、そして好ましくは同じ日に薬物を投与することができる。効果が失われ毒性が増加するような高い濃度（１０００単位／投与量）を使用しないことが重要であるため、ＩＬ−２相当物の低濃度（２００〜５００単位）でＮＣＭが投与される。
【００３０】
ＮＣＭ及びチモシンα１の好ましい組み合わせ（以下、組み合わせ療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）という）、それぞれの個々の療法又は免疫調節天然サイトカイン製剤及びチモシンα１及びその類似体等の胸腺ペプチドは、良好な医療行為により投与及び投薬され、個々の患者の臨床状態、投与部位及び方法、投与計画、及び医師に知られるその他の要因が考慮される。従って、本明細書における目的のための「有効量」は、当業界で知られているこのような考慮によって決定される。その量は、細胞性免疫機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定、ｉｎ  ｖｉｖｏの増大されたＴリンパ球レベル、再生抗原またはＮＣＭに対する改善された皮膚試験応答、改善された生存率、一層迅速な回復、または症候の改善もしくは排除並びに腫瘍塊の癌減少における改善された応答を含む（しかし、これらに限定されない）、治療患者の２５％の免疫機能の改善を示すように有効である必要がある。ＮＣＭはその他の治療とともに使用されて免疫機能を改善し、癌を治療し得る。ＮＣＭまたはＮＩＭの臨床上の使用の例が頭部及び首の癌においてＨａｄｄｅｎら（１９９４）により例示される。
【００３１】
本発明の方法において、複合治療薬、またはその成分を様々なルートで投与することができる。複合治療薬は、化合物単独で、または薬学的に許容される担体とのコンビネーションで投与することができる。それは皮下投与でき、または静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、外リンパ投与、リンパ内投与及び鼻内投与を含む、非経口投与し得る。アジュバント効果が判るように、もし可能な場合には、ガン患部への投与などの部位特異的投与が好ましい（Ｐｕｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，１９８６；Ｈａｄｄｅｎ，１９９４）。化合物の移植または注入がまた有益である。ガイダンスがＨａｄｄｅｎら（１９８５）及びＨａｄｄｅｎら（１９９２）により与えられる。
【００３２】
ヒトにおける非経口投与について、複合治療薬またはその成分は、一般に単位投薬注射形態で製剤化され、好ましくは医薬上許されるキャリヤー媒体中で製剤化される。また、好適なキャリヤー媒体として、食塩水、スクアレン、デキストロース溶液、通常の血清アルブミン、リンゲル液、ｘ−ｖｉｖｏ  １０等が挙げられるが、これらに限定されない。必要により、少量の添加剤、例えば、安定剤、防腐剤または緩衝剤がこのようなビヒクル中に含まれてもよい。このような製剤は非経口投与のために水性注射液中の再生に適している。上述したＮＣＭを含む複合治療薬は典型的には約５０〜５００単位のＩＬ−２（当量）／ｍｌ、好ましくは約１５０〜３５０単位のＩＬ−２（当量）／ｍｌの濃度でキャリヤー媒体中で製剤化されるであろう。複合治療薬は上述したようにＮＣＭを含み、また０．６〜９．６ｍｇ／ｍ２（体表面積）のチモシン−α１を含み、または他の態様において、ＮＣＭはチモシンα１と共投与される。さらにＮＣＭは他のサイトカインとプロフィールが一致する。
【００３３】
ＰＨＡがマイトジェンとして使用される好ましい実施態様において、ＮＣＭのサイトカインプロフィールは以下のプロフィールを有する。
【００３４】
サイトカイン                  量
ＩＬ−１                      １０−２０００  ｐｇ／ｍｌ
ＩＬ−２                      １００−５００単位／ｍｌ
ＩＬ−６                      ２５０−１０，０００ｐｇ／ｍｌ
ＩＬ−８                      １２，０００−１００，０００ｐｇ／ｍｌ
ＩＬ−１２                    １００−１０，０００ｐｇ／ｍｌ
ＩＦＮ−γ                    ５０−１５，０００ｐｇ／ｍｌ
ＴＮＦ−α                    ５０−１５，０００ｐｇ／ｍｌ
ＣＳＦ−Ｇ                    ５０−１５００ｐｇ／ｍｌ
ＣＳＦ−ＧＭ                  １０−１５００ｐｇ／ｍｌ
ＩＬ−３／ＩＬ−４／ＩＬ−７  痕跡量
必要により、複合治療薬またはその成分は無菌の安定な凍結乾燥製剤にされ、その中で活性成分が水溶性キャリヤー、及び必要により、安定剤または無毒性防腐剤と混合される。抗菌性防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む組成物の安定性、無菌性、及び等張性を増強するこれらの種々の添加剤が使用し得る。微生物の作用の防止はシプロフロキサシンの存在及び種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確実にし得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことが望ましいであろう。注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされる。しかしながら、本発明によれば、使用されるあらゆるビヒクル、希釈剤、または添加剤もしくは送出ビヒクルはＮＣＭと適合性にされる必要があり、また本発明の生物活性を変化しないであろう。
【００３５】
投薬量及び投薬レジメは主として治療される個々の患者（哺乳類ホスト）、患者の履歴、患者に対する生物学的損傷の型及び大きさ、複合治療薬が単独で投与されるか、混合物で投与されるか、治療の長さ及び治療のプロトコルに依存するであろう。投薬は数日の期間にわたって単一投薬または多投薬であってもよい。最も好ましい投薬量は、癌の場合の疾患の最大の退縮またはその他の症状における症候の最大の減少を得る投薬量である。ヒトは本明細書に例示されたマウスよりも一般に長く治療され、その治療は疾患プロセスの長さ及び薬剤有効性に比例する長さを有することが注目される。
【００３６】
ＮＩＭを使用する、ヒトにおける二種類の処置プロトコールが研究中である。一つは、頭部および首または胸部癌の除去前に、ＮＥＭを使用する１０日処置プロトコールである（２００ユニットのＩＬ−２当量／日）。他のプロトコールは２１日サイクルの処置の一部として７日またはより長い１０日処置を行うものである。これらの両プロトコールはＨａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）により示されている。チモシンα１とのコンビネーション投与も同様に使用することができる。
【００３７】
複合治療薬またはその成分の薬理学的製剤はあらゆる適合性キャリヤー、例えば、種々のビヒクル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤を含む注射可能な製剤中で患者に投与でき、または本発明に使用される化合物が徐放性皮下移植体または標的送出系、例えば、注入ポンプ、ポリマーマトリックス、リポソーム、及び微小球体の形態で患者に非経口投与し得る。本発明における使用に適した移植体は、移植された後に徐々に溶解するペレットまたは当業者に公知の生体適合性送出モジュールの形態をとり得る。このような公知の投薬形態及びモジュールは、活性成分が数日〜数週間の期間にわたって徐々に放出されるように設計される。
【００３８】
例えば、注入送出系に関するこのような徐放性形態は、癌の付近の局所のリンパ節に本明細書に記載されたＮＣＭを送出するように肺癌及び食道癌に使用されることが考えられるであろう。その他の癌は同様の局所送出技術を使用するであろう。
【００３９】
本発明に有益な公知の移植体及びモジュールの例として、米国特許第４，４８７，６０３号明細書（これは薬物を調節された速度で分配するための移植可能な超小型注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４８６，１９４号明細書（これは薬物を皮膚中に投与するための治療装置を開示している）、米国特許第４，４４７，２３３号明細書（これは薬物を正確な注入速度で送出するための薬物注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２２４号明細書（これは連続薬剤送出のための可変流量の移植可能な注入装置を開示している）、米国特許第４，４３９，１９６号明細書（これはマルチチャンバー区画を有する浸透圧薬剤送出系を開示している）、及び米国特許第４，４７５，１９６号明細書（これは浸透圧薬剤送出系を開示している）が挙げられる。これらの特許が参考として本明細書に含まれる。多くのその他のこのような移植体、送出系、及びモジュールが当業者に公知である。
【００４０】
本発明で使用する複合治療薬、又はその成分を、ヒトの癌に関連する免疫不全の処置に使用する場合には、ＮＣＭの投与レベルは通常１５０〜５００単位／日のＩＬ−２含量に相当するものとする。投与量が過剰であると、リンパ周辺及びリンパ内の経路が失われる可能性がある。複数回投与する場合には、投与の頻度は、受容者の種類及び癌の種類、投与の量及び連続性に依存することとなる。例えば、ある種の癌については連日投与することが有効である一方、他の癌については投与の間に休止期間を設ける必要がある場合がある。
【００４１】
免疫不全の処置の分野における通常の知識を有する医療従事者であれば、受容者及び免疫不全についての通常の検査を行うことにより、過剰な実験を行うことなく、任意の特定の場合について最も有効な休止期間、投与経路、投与の頻度及び期間を確定することが可能であると考えられる。
【００４２】
好ましい１つの態様においては、前記複合治療薬成分を、連日、ヒトである患者に対し、ＮＣＭを２００単位／日のＩＬ−２に相当する量で投与し、その際実質的に同時に、チモシンα１、チモシンα１の類縁体あるいはプロチモシン等の胸腺ペプチドを、体表面積について０．６〜９．６ｍｇ／ｍ２の範囲の投与量（好ましい投与量は約１．２ｍｇ／ｍ２）で投与する。
【００４３】
前記複合治療薬は、胸腺細胞の数及び機能を向上させること、及び２次免疫不全を後退させることに関して有効である。更に、該複合治療薬を、出産直後の期間に、あるいは重度の複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）又は白血病に対する放射線照射又は骨髄移植後に使用して、初期発生を促進することができる。あるいは、該複合治療薬は、これを抗ウイルス治療に使用して、新規なウイルスのないＣＤ４＋Ｔリンパ球をＨＩＶに感染した患者の体内に生成するのに有用であると考えられる。更に、本発明によるプロトコルは、免疫抑制又は免疫不全に関連する他の非腫瘍性疾病（例えば、症状及び老化に関連するものを含む）に関して、有益な結果を提供するものと考えられる。
【００４４】
本発明の方法は、入院患者並びに外来患者を処置するのに使用することができるが、後者の方が好ましい。
【００４５】
上記の記載から、ＮＣＭ等の天然サイトカイン製剤及びチモシン−α１等の胸腺ペプチドの複合治療薬の利用についての事実による根拠が付与される。本発明について使用する方法及び本発明の有用性を、以下の実施例により示す。
【００４６】
実施例はマウス系における本発明の実用性を実証する。ヒト以外に、マウスが免疫系の構造及び機能に関して最も良く研究された種であり、またヒト応答を高度に予測するものとして当業者により認められているため、マウス系が選択された。今までのところ、わずかに微小の差異がマウスとヒトの間で観察されていた（Ｃｈｉｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｔａｌｍａｄｇｅら，１９８５；Ｔａｌｍａｄｇｅら，１９８５；Ｈａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２ａ）。マウスが種々の病原体及び腫瘍に対しそれ自体を防御するメカニズムの殆どがヒトと実質的に同じである。マウスモデルがヒト用の免疫調節薬の評価に広範囲で使用されていた（Ｈａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２ａ；Ｔａｌｍａｄｇｅら，１９８５）。この従来技術のために、現行のマウス実験からの結果がヒト応答を予測する。
【００４７】
三つの例は免疫調節薬によるマウス系の予想の性質を実証する。マウス腫瘍モデルの広いスペクトルを使用して、インターフェロン（ＩＦＮ）の抗腫瘍活性が示されており（Ｂｏｒｄｅｎ，１９７９；Ｔａｌｍａｄｇｅら，１９８５）、それに応じてヒトでは、ＩＦＮは多種の腫瘍に対して活性を示した（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ及びＬａｓｌｏ，１９８８）。
【００４８】
第二の例において、マウス腫瘍モデルを使用して、腫瘍に対して単独で使用されたレバミゾールの効果がなかったが、活性が化学療法後に見られた（Ｓｙｍｏｅｎｓ及びＲｏｓｅｎｔｈａｌ，１９７７；Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ，１９８０）。同様にヒトでは、レバミゾールは５フルオロウラシルとともに使用された時にヒト結腸癌に活性を示したが、単独では示さなかった（Ｍｕｔｃｈ及びＨｕｔｓｏｎ，１９９１）。
【００４９】
第三の例において、マウス腫瘍モデルを使用して、低投薬量のインターロイキン２（ＩＬ−２）は毒性を生じないで抗腫瘍活性を有することが示されたが、高投薬量のＩＬ−２は特にリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞で活性を有していたが（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９８５）、潜在的に致死性の毒性を有していた。また、ヒト研究は悪性メラノーマ及び腎臓細胞癌における高投薬量のＩＬ−２±ＬＡＫ細胞の有効性を示したが、大きな毒性があった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９９４）。そうであっても、それは現在腎臓細胞癌についてＦＤＡによりライセンスされている。最近の研究は毒性を生じないヒト癌における低投薬量のＩＬ−２の有効性を示す（Ｃｏｒｔｅｓｉｎａら，１９８８及び１９９４）。これらのメカニズムはマウス系で見られた低投薬量の効果と同様である（Ｃｈｉｒｉｇｏｓ及びＴａｌｍａｄｇｅ，１９８５）。
【００５０】
免疫調節薬の上記の三つの例は癌における臨床上の使用について現在認可されており、マウス腫瘍研究により良く予想された。
【００５１】
その他に、動物研究は組換えインターロイキン（ｒＩＬ）により共有されない天然インターロイキン混合物（ｎＩＬ）の効果を示した。ｒＩＬ−２ではなく、ｎＩＬは胸腺依存性免疫応答を回復し、促進するのに活性であり（Ｈａｄｄｅｎら，１９９２ｂ）、シクロホスファミドとともに悪性メラノーマに対する耐性を促進するのに活性である（Ｋａｍｅｄａら，１９９２）。この同じパターンは、天然ＩＬが組換えＩＬ−２により共有されない方法でヒトの頭部及び首の癌に活性であった点でヒトで見られた（Ｃｏｒｔｅｓｉｎａ，１９８８，１９９４；Ｈａｄｄｅｎら，１９９４；Ｍａｔｔｉｊｉｓｓｅｎら，１９９１）。
【実施例】
【００５２】
下記に述べる実施例において、天然インターロイキン製剤はＩＬ−２と同濃度で使用される、同等の生物学的活性を与えるＮＣＭおよび／またはＮＩＭである。簡単にいうと、データはプールされ、以下ＮＣＭとして示される。
【００５３】
（全般の方法）
細胞培養に関する全ての工程を無菌条件下で行う。本明細書に記載されなかった細胞免疫学の全般の方法を、細胞免疫学技術に関する一般的な文献、例えば、Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（１９８１）に記載されたようにして、また当業界で知られているようにして行う。
【００５４】
（物質）
チモシンフラクションＶ（ＴＦ５）および精製したチモシン−α１は、Ａ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉ博士（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．））から得た。うしＴＦ５は、チモシン−α１、チモポエチンおよびチムリンを含む多数の胸腺ペプチドを含むことが知られている。
【００５５】
組換えヒトインターロイキンβ１（ｒＩＬ−１β）はＣ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ博士（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ．ＮＣＩ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ））からの贈答品であった。ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２；比活性６４０Ｕ／ｍｌ）をファーマシアＡＢ（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）から入手した。組換えＩＬ−２はＧ．Ｃａｓｐｒｉｔｚ（Ｈｏｅｓｃｈｔ  Ｐｈａｒｍ．，Ｆｒａｎｋｆｏ−ｒｔ，ドイツ）からの贈答品であった。シプロフロキサシンをマイルズ社（Ｗｅｓｔ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から購入し、オフロキサシンをマックネイル・ファーマシューティカル（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ，ＰＡ）から購入し、ノルフロキサシンをメルク社（Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ）から購入した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をアーマー・ファーマシューティカルズ（Ｋａｎｋａｋｅｅ，ＩＬ）から入手した。Ｘ−ｖｉｖｏ培地をホイットテーカー・バイオプロダクツから購入した。ヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネート及びＣｏｎ  Ａをシグマ・ケミカルズ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＰＨＡ（ＨＡ−１６）をムレックス・ディアグノスチックス社（Ｄａｒｔｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）から入手した。ＯＫＴ３をオルト・ファーマシューティカルズ（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）から購入した。
【００５６】
（天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ）の調製）
多数のＨＩＶ陰性、肝炎ウイルス陰性のドナーからのヒト血液のバフィコート白血球を回収する。別の実施態様において、動物は獣医学上の使用のための細胞源であり得る。ドナーからの細胞を溜め、フィコールハイペーク勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上で層形成して好中球及び赤血球を含まないリンパ球を得る（米国特許第４，３９０，６２３号及び同第４，４４８，８７９号）。当業界で知られているような同じ出発リンパ球集団をもたらす別法が使用し得る。
【００５７】
ＮＣＭ生産の好ましい態様において、リンパ球を洗浄し、フラスコ（ＭｉｃｒｏＣＥＬＬｅｃｔｏｒＴＭＴ−２５細胞培養フラスコ）中でＸ  ｖｉｖｏ−１０培地（ホイットテーカー・バイオプロダクツ）中に分配し、そのフラスコ中に固定された刺激物質、即ち、マイトジェンがある。実験の一つの組において、Ｘ  ｖｉｖｏ−１５及びＸ  ｖｉｖｏ−２０培地を示されるように使用し、Ｘ  ｖｉｖｏ−１５の方がＸ  ｖｉｖｏ−２０培地の使用より好ましい。刺激物質に関する固定化方法は、フラスコ中のパンニング操作、即ち、細胞分離のための種々の物質を固定化することについて製造業者により記載されたとおりである。
【００５８】
細胞を３７℃でＣＯ２／空気インキュベーター中で８０μｇ／ｍｌのシプロフロキサシン（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂ）を含むＸ  ｖｉｖｏ−１０培地中で２４〜４８時間インキュベートする。また、最小必要培地（ＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地を使用することができた（Ｗｅｂｂら，１９７３）。インキュベーション後に、上澄みを注いで除き、回収する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加してインターロイキンを更に安定化することができる。一般にＨＳＡを０．１〜０．５％（重量／容積）で使用する。上澄みを４℃〜−７０℃で貯蔵する。
【００５９】
または、ＮＩはＨａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に従って、またはＮＩＭは出願中の特許に記載されるように調製することができ、マイトジェンに対するパルス化暴露（ｐｕｌｓｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）が使用される。
【００６０】
（上澄みの特性決定）
サイトカイン含量をＩＬ−２についてバイオアッセイにより、また残りのインターロイキンＩＬ−１〜ＩＬ−１５、ＣＳＦ、ＴＮＦ、及びＩＦＮについてＥＬＩＳＡにより測定することにより、溜めた上澄みを特性決定する。無菌性をチオグルコレートブロース中の培養により試験し、内毒素を当業界で知られているようにリムルス細胞分解産物アッセイにより測定する。
【００６１】
（サイトカイン含量に関する上澄みの標準化）
比較を行うことができるように、夫々の上澄みを投与された濃度または量により標準化する。特に、各上澄み液に対するＩＬ−２当量が使用される。
【００６２】
（上澄みに関する汚染物質の除去）
使用する場合、ＤＮＡ及びウイルス排除は限外濾過、エタノール分別、ポリエチレングリコール／ベントナイト沈殿、および／または静脈内γグロブリン及びモノクローナル抗体に使用されたような溶媒／洗剤処理（例えば、ＩＧＩＶ  Ｎｅｗｓ  Ｕｐｄａｔｅパンフレット）の如き技術を使用するであろう。光化学的失活化、アルミニウムフタロシアニンまたはガンマ線照射を使用してもよい。
【００６３】
（モデル）
特に示されない限り、老化マウスにおけるヒドロコルチゾン誘導胸腺退縮のモデルを使用した（Ｈａｄｄｅｎら，１９９２）。
【００６４】
（実験動物）
胸腺が退縮し始めた雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬ）老化した引退したブリーダーマウス（８−９ケ月）をｉｎ  ｖｉｖｏ試験に使用した。マウスを体重マッチングし、５匹のグループでランダムに溜めた。動物に随時飲用水とともに通常の実験食で給餌した。対照グループを除く、全てのマウスを連続２日間にわたってヒドロコルチゾン（０．９％の塩化ナトリウム０．１  ｍｌ中５ｍｇ／マウス）で腹腔内（ｉ．ｐ．）処理して化学的胸腺除去及び脾臓重量の減少を誘導した。
【００６５】
ヒドロコルチゾン処理した成体マウスは２日で急性胸腺退縮（対照の３０％未満）及び脾臓サイズの減少（対照の８０％未満）、１０日までに進行性回復を示す。このモデルは、ストレスおよび加齢が関係した胸腺退縮の性質を合わせたものである。
【００６６】
（実験設計）
夫々の処理グループは５匹の動物を有し、夫々の実験を２〜５回繰り返した。
処理を３日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）で開始し、合計５日間にわたって毎日１回続けた。
処理グループに本明細書に示されたようにして下記のｉｎ  ｖｉｖｏ処理の一つを注射した。
１．発熱物質を含まない食塩水（対照）；
２．チモシンフラクションアルファ１（ＴＦα１；投与量は明細書に示された通り）；
３．チモシンフラクション５（ＴＦ５；１００μｇ／マウス）；
４．天然サイトカイン混合物（ＮＣＭ；５０単位ＩＬ−２当量）
５．ＮＣＭ＋ＴＦ５（夫々、５０単位および１００μｇ）
６．ＮＣＭ＋チモシンα１（夫々、５０単位および５ｍｇ）
８日目に、マウスを計量し、頸部脱臼により犠牲にし、それらの脾臓及び胸腺を除去し、計量した。臓器を細断し、塩化アンモニウムを使用して残留赤血球を溶解し（Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，１９８１）、細胞をカウントした。
【００６７】
次いで種々の物質に対する細胞の増殖応答を測定した。細胞のサンプルを、５％のウシ胎児血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び２−メルカプトエタノール（２  ｘ  １０−５Ｍ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中３７℃、５％のＣＯ２での細胞培養のために調製した。細胞を４回の反復実験で０．２ｍｌのミクロウェルプレートに１．５  ｘ  １０６／ｍｌの濃度で塗布し、本明細書に示されたようにして下記の一つとともに７２時間インキュベートした。
１．対照希釈剤（完全ＲＰＭＩ  １６４０培地）：
２．ｒＩＬ−１（１ｎｇ／ｍｌ）；
３．ｒＩＬ−２（１６単位／ｍｌ）；
４．ＮＣＭ（２単位／ｍｌのＩＬ−２当量）
５．コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ；１．５μｇ／ｍｌ）
６．植物性血球凝集素（ＰＨＡ；０．５μｇ／ｍｌ）
培養を終了して、トリチウム標識チミジン（３Ｈ−チミジン；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；比活性６．７Ｃｉ／ｍＭ）の１８時間パルスでＤＮＡ合成、ひいては細胞増殖を測定し、多重自動サンプル回収装置で回収、液体シンチレーションカウンティングのために処理した。結果を夫々の動物について四つのサンプルからのｃｐｍの算術平均として表した。異なる動物で得られたデータの代表を簡素化するために、異なる動物による結果を溜め、一緒に計算し、幾つかの場合にコントロール＋標準偏差（ＳＥＭ）に対する比として表した。
【００６８】
（統計分析）
スチューデントＴテストを使用して適当にデータを分析した。
【００６９】
（実施例１）
一連の実験において、退縮した胸腺を持つマウスを、ＮＣＭ、チモシンα１、チモシンフラクションＶ、これらのファクターの組合せ、及び生理食塩水すなわち培地コントロールによりインビボで処理した。脾臓と胸腺を取り出し、これらの細胞を、インターロイキン（ＩＬ１、ＩＬ２、ＮＣＭ）又はマイトジェン（ＰＨＡ；ＣｏｎＡ）によるインビトロでの刺激に対する細胞増殖応答について試験した。
【００７０】
図１及び図２は、処理した動物から単離した胸腺細胞及び脾臓細胞の、インターロイキン（ｒＩＬ−１、ｒＩＬ−２、ＮＣＭ）及びマイトジェン（ＰＨＡ及びＣｏｎＡ）に対する応答に及ぼす、インビボチモシンα１処理の投与量応答曲線を示している。このデータは、コントロールに対する比として表され；最良の効果は、５μｇ／マウスで観察された。この値は、他に明記しない限り、後の実験においても使用される。
【００７１】
図３〜６には、生理食塩水（コントロール）、チモシンα１（５μｇ／マウス）、ＮＣＭ、及びＮＣＭ＋チモシンα１の組合せでインビボで処理した結果が示されている。
【００７２】
図３及び図４には、培地（白抜きバー）、ｒＩＬ−１（黒バー）、ｒＩＬ−２（斜交）及びＮＣＭ（斜線）による刺激に対するインビトロの胸腺細胞（図３）及び脾臓細胞（図４）応答に及ぼすインビボ処理の結果が示されている。チモシンα及びＮＣＭ単独では、中枢リンパ器官の両者において多数の応答を増加させた。この組合せは、４種の応答のすべてにおいて劇的かつ大幅な増加をもたらした。これらのデータはインターロイキンシグナルに対するこれらの細胞の顕著な感作を示している。
【００７３】
図５及び図６には、マイトジェンＰＨＡ（白抜きバー）及びＣｏｎＡ（黒バー）に対する胸腺細胞（図５）及び脾臓細胞（図６）応答に及ぼす図３及び図４に記載したインビボ処理の結果が示されている。チモシンα１及びＮＣＭ単独で、両者の応答を増加し、その組合せは、両者の応答を、顕著に大幅に増加した。これらの増加はある程度は、増加した成熟Ｔ細胞の数を反映するものかもしれないが、この増加の大きさは、細胞数の増加をはるかに上回るものであり（以下の表ＩＶ及びＶ参照）、これらの細胞の応答性が極めて上昇したことを示すものである。
【００７４】
さらに実験を行い、チモシンフラクションＶ又はチモシンα１単独で（図７及び図８）インビボ処理した場合と、ＮＣＭとチモシンフラクションＶ又はチモシンα１との組合せで（図９及び図１０）インビボ処理した場合との応答の差異を測定した。
【００７５】
図７及び図８において、チモシンフラクションＶ（ＴＦ５）は単独で、ハデンら（Ｈａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２））によって報告されているように、ｒＩＬ−１（白抜きバー）、ＩＬ−２（詰まったバー）、ＮＣＭ（斜交バー）またはＣｏｎＡ（斜線）への脾細胞（図８）、及び胸腺細胞（図７）応答に対して効果を有しなかった。これに対し、チモシンα１（５μｇ／ｍｌ）は脾細胞及び胸腺細胞の両方において全ての反応を増大させた。
【００７６】
図９及び１０において、胸腺細胞（図９）及び脾細胞（図１０）のｒＩＬ−１（白抜きバー）、ＩＬ−２（詰まったバー）、ＮＣＭ（斜交バー）又はＣｏｎＡ（斜線）への応答に対するＮＣＭの効果及びＮＣＭとチモシンフラクションＶ（ＴＦ５）、又はＮＣＭとチモシンα１を組み合わせた効果が示される。ＮＣＭとの組み合わせでのチモシンα１の効果は、チモシンフラクションＶとの効果よりもずっと大きい。この予期しない知見は、チモシンα１が、胸腺ホルモン製剤（純粋なまたは抽出されたペプチド）に関して以前に記載されたことのない独特の免疫薬理学的な特徴を有することを示している。
【００７７】
これらの２種の中枢性リンパ性器官におけるＴリンパ球応答の刺激へのチモシンα１とＮＣＭとの組み合わせの予期しない、印象的な効果は、それらが、腹膜内注射が全システムをサイトカイン及びマイトジエンによる刺激に感作させたことを示唆しているように、独特である。多くの場合、ＮＣＭとチモシンα１の相互作用は付加的以上のものであり（即ち、相乗的であって）、これらの効果の大きさは従来技術に基づくと予期し得ないものであった。また予期しないことに、チモシンα１はそれ自身で活性があった。
【００７８】
（実施例２）
脾臓及び胸腺の両者の応答重量へのＮＣＭとチモシンα１の効果が、表ＩＶに示される。
【００７９】
動物、ヒドロコルチゾン処理、及び実験的な注射は、一般的な方法に示されるとおりであった。ＮＣＭは、マウス１匹に１日当たり５０ＵのＩＬ−２で注射した。チモシンα１（Ｔアルファ−１又はＴα１）は、マウス１匹に１日当たり５又は２０マイクログラムで注射した。これらの実験は同等であることが見出され、よってプールされた。
【００８０】
【表４】
2006306898.tif 000002
【００８１】
【表５】
2006306898.tif 000003
これらのデータは、ＮＣＭとチモシンα１との組み合わせには、胸腺の重さに有意な効果がないということを示す。胸腺の成熟Ｔ−細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）は、コントロールにおいて２７±３．５％平均であり、ＮＣＭとチモシンα１とで処理したマウスにおいて３２．５±平均である。脾臓における成熟Ｔ−細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）では、コントロールにおいて７０±１％平均であり、ＮＣＭとチモシンα１とで処理したマウスにおいて７６．５±５％平均である。胸腺及び脾臓における成熟Ｔ−細胞の割合の小さな増加は統計的に有意ではないが、ＮＣＭとチモシンα１とで処理した脾臓が有意な３１％増加に対する関連を検討した場合、その処置が脾臓におけるＴ−細胞の絶対数で大きな増加を誘導したことは明らかである。
【００８２】
また、細胞増殖アッセイにおいて見られるような免疫系の刺激、又はダメージを受け或いは欠陥のある免疫系の一部機能の回復において求められる治療上の評価に治療を行う上で関連する、Ｔ−リンパ球の機能（ＩＬ応答）及び発達（マイトジェン応答）を、該組成物は潜在的に促進する。例えば、化学療法剤は、免疫応答におけるＴ−リンパ球を含む細胞にダメージを与えることがある。Ｔ−リンパ球の機能及び発達を刺激することにより、本発明は、ダメージを受けた場合に免疫系のこの特徴を、一部において又は全体的に回復させることができる。
【００８３】
この出願を通して、米国特許出願を含む多くの刊行物を引用又は通し番号により参照した。刊行物に関する完全な引用においては、以下にリストを挙げた。本発明に関連する先行技術の記載を完全に記述するために、本願明細書において、全体的なこれらの刊行物及び特許の開示は、引用文として本件出願に取り込まれている。
【００８４】
本発明は、実証的なやり方で記載されており、使用されている用語は、限定的ではなく、記述の用語の本来の意味となるよう意図されていると、理解すべきである。
【００８５】
明らかなことではあるが、本発明の改良及び変形は、前記の教示に照らし可能である。したがって、このような改良等は、添付されている請求項の範囲内にあると理解されるべきであり、本発明は具体的な記載と異なるように実施することができる。
【００８６】
【化１】
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【００８７】
【化２】
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【００８８】
【化３】
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【００８９】
【化４】
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、チモシンα１の投与量を変化させて（０．２〜２０μｇ／動物／日）ｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、インターロイキン（ｒＩＬ−１、ｒＩＬ−２及びＮＣＭ）及びマイトジェン（ＰＨＡ及びＣｏｎＡ）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胸腺細胞のプールした応答（ｐｏｏｌｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）のグラフである；インターロイキン（黒丸），マイトジェン（三角）。
【図２】図２は、図１のように、チモシンα１の投与量を変化させてｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、インターロイキン（ｒＩＬ−１、ｒＩＬ−２及びＮＣＭ）及びマイトジェン（ＰＨＡ及びＣｏｎＡ）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脾臓細胞のプールした応答のグラフである；インターロイキン（黒丸），マイトジェン（三角）。
【図３】図３は、食塩水、チモシンα１（５μｇ／動物／日）、ＮＣＭ（５０ユニットＩＬ−２当量）及びチモシンα１（５μｇ／動物／日）＋ＮＣＭ（５０ユニットＩＬ−２当量）によりｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、培地（白抜き）、ｒＩＬ−１（クローズドバー）、ｒＩＬ−２（斜交）及びＮＣＭ（斜線）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胸腺細胞の応答の棒グラフである。
【図４】図４は、図３のように、食塩水、チモシンα１、ＮＣＭ及びチモシンα１＋ＮＣＭによりｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、培地（白抜き）、ｒＩＬ−１（クローズドバー）、ｒＩＬ−２（斜交）及びＮＣＭ（斜線）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脾臓細胞の応答の棒グラフである。
【図５】図５は、図３のように、食塩水、チモシンα１、ＮＣＭ及びチモシンα１＋ＮＣＭによりｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、ＰＨＡ（白抜き）及びＣｏｎＡ（クローズドバー）、に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胸腺細胞の応答の棒グラフである。
【図６】図６は、図５のように、食塩水、チモシンα１、ＮＣＭ及びチモシンα１＋ＮＣＭによりｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、ＰＨＡ（白抜き）及びＣｏｎＡ（クローズドバー）、に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脾臓細胞の応答の棒グラフである。
【図７】図７は、食塩水処理したコントロールに対する比として表した、チモシンα１（５μｇ／マウス／日）及びチモシンフラクションＶ（ＴＦ５、１００μｇ／マウス／日）ｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、ｒＩＬ−１（白抜き）、ｒＩＬ−２（クローズドバー）、ＮＣＭ（斜交）及びＣｏｎＡ（斜線）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胸腺細胞の応答の棒グラフである。
【図８】図８は、図７のように、チモシンα１（５μｇ／マウス）及びチモシンフラクションＶ（ＴＦ５、１００μｇ／マウス）ｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、ｒＩＬ−１（白抜き）、ｒＩＬ−２（クローズドバー）、ＮＣＭ（斜交）及びＣｏｎＡ（斜線）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脾臓細胞の応答の棒グラフである。
【図９】図９は、食塩水処理したコントロールと比較した、ＮＣＭ、ＮＣＭ＋チモシンフラクションＶ（１００μｇ／マウス）及びＮＣＭ＋チモシンα１（５μｇ／マウス）でｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、ｒＩＬ−１（白抜き）、ｒＩＬ−２（クローズドバー）、ＮＣＭ（斜交）及びＣｏｎＡ（斜線）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胸腺細胞の応答の棒グラフである。
【図１０】図１０は、食塩水処理したコントロールと比較した、ＮＣＭ、ＮＣＭ＋チモシンフラクションＶ（１００μｇ／マウス）及びＮＣＭ＋チモシンα１（５μｇ／マウス）でｉｎ  ｖｉｖｏで処理後の、ｒＩＬ−１（白抜き）、ｒＩＬ−２（クローズドバー）、ＮＣＭ（斜交）及びＣｏｎＡ（斜線）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脾臓細胞の応答の棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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