(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類に於けるＤＮＡ修復機構の解明及び関連疾患の治療法、診断法の提供。【解決手段】ヒトＴＦＩＩＨ  ８ｋＤａサブユニットおよび関連する配列をコード化している核酸配列に関する。前記核酸は、ＴＦＩＩＨサブユニットを産生するための方法に使用し得る、また転写およびＮＥＲ欠乏（特に裂毛症（ＴＴＤ）のいくつかの形態における）を診断する又は治療するための方法に使用し得る。ｈＴＦＢ５／ＴＴＤＡ遺伝子およびコード化されたタンパク質は、先天性のＮＥＲ障害を治療することを対象とする、治療の又は遺伝子治療の製品のために使用でき、またＴＴＤＡに特異的な分子プローブまたは抗体を用いて、哺乳類の基礎の転写、ＮＥＲおよびＴＣＲ活性における障害を診断する方法に使用し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＦＩＩＨと相互作用する能力を有するポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が：
ａ）配列番号１と少なくとも５０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２または３と少なくとも５０％ヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）ヌクレオチド配列であって、その相補鎖が（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）遺伝暗号の縮重によって（ｃ）のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列；
から選択される核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸であって、前記ポリペプチドがＴＦＩＩＨ安定化活性を有する核酸。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸であって、前記ポリペプチドがＮＥＲ促進活性を有する核酸。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の核酸であって、前記ヌクレオチド配列が哺乳類ＴＦＩＩＨ  ８ｋＤａサブユニット  ＴＴＤＡをコード化する核酸。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸であって、前記ヌクレオチド配列がヒトもしくはマウスのＴＴＤＡ又はその誘導体をコード化する核酸。
【請求項６】
核酸プローブであって、前記プローブが配列番号２に記載されたヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列のうち少なくとも１０の近接するヌクレオチドを含む核酸プローブ。
【請求項７】
固体の支持体上に固定化された、請求項６に記載の核酸プローブ。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に規定した、核酸分子またはプローブを含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、前記ベクターのための宿主細胞において、前記ポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、コード配列の発現に方向付ける能力を有するプロモーターに動作可能に連結された発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターであって、前記ポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、分子タグをコード化している第２のヌクレオチド配列を含み、第２のコード配列が前記ポリペプチドをコード化している配列にインフレームに融合された発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターであって、前記分子タグが蛍光タグまたはアフィニティータグである発現ベクター。
【請求項１２】
請求項８〜１１の何れか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
ＴＦＩＩＨの相互作用または安定化活性を有するポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１２に規定した宿主細胞を前記ポリペプチドの発現を助成する条件下で培養することと、および、随意に前記ポリペプチドを回収することと、を含む方法。
【請求項１４】
トランスジェニック動物であって、その体細胞性（ｓｏｍａｔｉｃ）の及び胚性（ｇｅｒｍ）の細胞中に請求項８〜１１に記載のベクターを含むトランスジェニック動物。
【請求項１５】
請求項１４に記載のトランスジェニック動物であって、前記ベクターが内在性のＴＴＤＡ座位に相同的組換えを介して統合されるトランスジェニック動物。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載のトランスジェニック動物であって、前記ポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が変異を含むトランスジェニック動物。
【請求項１７】
請求項１６に記載のトランスジェニック動物であって、前記変異が不活性化変異（ａｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）であるトランスジェニック動物。
【請求項１８】
ＴＦＩＩＨ相互作用活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＴＦＩＩＨ安定化活性を有しているポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１８に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＮＥＲ促進活性を有しているポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１８〜２０の何れか１項に規定したポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗体断片。
【請求項２２】
被験者のＴＴＤＡ遺伝形質を分析するための方法であって、請求項１〜７の何れか１項に規定した核酸分子またはプローブの使用を含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ＮＥＲ欠乏（ＮＥＲ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）を診断するための方法。
【請求項２４】
ＮＥＲ欠乏を診断するための方法であって、請求項２１に規定した抗体または抗体断片の使用を含む方法。
【請求項２５】
請求項８〜１１に記載の発現ベクターであって、遺伝子治療に適切なベクター。
【請求項２６】
請求項２５に規定したベクターを含む薬学的製剤。
【請求項２７】
請求項２５に規定したベクターの又は請求項１〜７に規定した核酸分子の医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）としての使用。
【請求項２８】
請求項２５に規定したベクターの又は請求項１〜７に規定した核酸分子の、ＵＶ感受性症候群（ＵＶ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）またはＮＥＲ欠乏の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項２９】
被験者におけるＵＶ感受性障害を治療するための方法であって、請求項１８〜２０の何れか１項に規定したポリペプチドの供給源を投与することを含む方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記ポリペプチドの供給源が請求項２５に規定したベクターまたは請求項１〜７に規定した核酸分子である方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学および医学の分野に関し、特に遺伝子転写およびＤＮＡ修復系に、更に特に哺乳類および哺乳類細胞における基礎の及び活性化した転写、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）および転写共役修復システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ）における欠陥（ｄｅｆｅｃｔｓ）の検出および治療に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ＴＦＩＩＨは、複数コンポーネント性の基礎転写因子複合体である。転写因子ＩＩＨは、転写の間に様々な因子と相互作用し、それには核内受容体、組織特異的な転写因子、染色質再構築複合体（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）およびＲＮＡが含まれる、このことはＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩに関する転写開始における必須の役割に加え、調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）としても関与することを示唆している。現在まで、少なくとも９つのサブユニットが、哺乳類におけるＴＦＩＩＨホロ酵素複合体内で同定されている。様々な酵素活性（ＤＮＡ修復、ヘリカーゼ、およびサイクリン依存性キナーゼ活性を含む）が報告されている。ＴＦＩＩＨ複合体の９つの既知のサブユニットを、表２に要約する。
【０００３】
ＴＦＩＩＨは、ＲＮＡポリメラーゼＩ（リボソームＲＮＡの）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ（メッセンジャーＲＮＡ）の転写に関与する。ＴＦＩＩＨは、プロモーター融解（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｅｌｔｉｎｇ）、二重螺旋を形成するＤＮＡ鎖の分離、および／またはプロモータークリアランス（即ち、ｐｏｌ  ＩＩに関して、開始複合体（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を自由にして伸長モードにする）に必須である。驚くことに、ＴＦＩＩＨは、傷害されたＤＮＡ鋳型のヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ；Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｐａｉｒ）のコア反応にも必須である。加えて、ＴＦＩＩＨは、ＮＥＲのサブ経路（ＤＮＡにおいて活発に転写される領域の優先的な修復）；いわゆる転写共役ＤＮＡ修復（ＴＣＲ）プロセス（これはＮＥＲ型の傷害の修復に限定されるが、酸化的なＤＮＡ傷害のＴＣＲをも含む）において重要な役割を有していると思われる。  
【０００４】
ＸＰＢ、ＸＰＤ、ｐ６２、ｐ５２、ｐ４４、およびｐ３４サブユニットは、ＴＦＩＩＨ転写機構の「コア」を構成すると考えられる。２つの最大のＴＦＩＩＨサブユニット、ＸＰＢおよびＸＰＤは、プロモーター融解に重要な逆の極性のＡＴＰ依存性のヘリカーゼである。２つのより小さいサブユニットは、ジンクフィンガードメインの可能性のあるドメインを有している。ｐ４４およびｐ３４サブユニットは明確な（ｄｅｆｉｎｅｄ）酵素活性を有さないにもかかわらず、それらのジンクフィンガー構造は、それらが可溶性の転写因子との相互作用を仲介し得るＤＮＡ結合タンパク質であろうことを示唆する。ＴＦＩＩＨは、プレ開始複合体（基礎転写因子および転写された遺伝子のプロモータ上のポリメラーゼの会合体）への取り込みに関してＴＦＩＩＥに依存していると思われる。Ｃｄｋ−活性化キナーゼ（ＣＡＫ）  サブ複合体（ｓｕｂｃｏｍｐｌｅｘ）は、サブユニット  Ｃｄｋ７、サイクリンＨ、およびＭＡＴ１を含み、いくつかのサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋｓ）をリン酸化する。付随するキナーゼ活性（ＴＦＩＩＫとも称される）は、ＲＮＡｐｏｌ  ＩＩ最大サブユニットのＣ末端のドメインをリン酸化できる。セリンおよびスレオニンでの、このリン酸化は、ＤＮＡ転写に、即ち、ＲＮＡ鎖の伸長に必須である。  
【０００５】
ＴＦＩＩＨは、中心的な役割のほか、ＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩ転写において作用し、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）および転写共役修復（ＴＣＲ）にも関与する（Ｅｇｌｙ，  Ｊ．Ｍ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４９８，  １２４−１２８  （２００１））。ＮＥＲは、ＤＮＡ螺旋歪曲傷害（ＤＮＡ  ｈｅｌｉｘ−ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ）の広範囲（紫外線（ＵＶ）誘発性の傷害を含む）を除去する（Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，  ３６６−３７４，  ２００１）。ＴＣＲは、転写された鎖からの、古典的なＮＥＲ傷害および酸化的なＤＮＡ傷害の両方を排除する修復経路である（ｄｅ  Ｂｏｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，  １２７６−１２７９，  ２００２およびＬｅ  Ｐａｇｅ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １０１，  １５９−１７１，  ２０００  ）。
【０００６】
修復／転写因子ＴＦＩＩＨサブユニット中のいくつかの遺伝性の変異は、人間（ｍａｎ）における３つの光過敏性症候群（ｐｈｏｔｏ−ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）と関連する、即ち：１）色素性乾皮症（ＸＰ）、２）ＸＰ混合型のコケーン症候群（ＣＳ）、神経発生障害および３）ＣＳ類似の脆弱毛病（ｂｒｉｔｔｌｅ  ｈａｉｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）裂毛症（ｔｒｉｃｈｏｔｈｉｏｄｙｓｔｒｏｈｐｙ）（ＴＴＤ）（  Ｌｅｈｍａｎｎ，  Ａ．Ｒ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，  １５−２３，  ２００１  ａｎｄ  Ｂｏｏｔｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ：  Ｘｅｒｏｄｅｒｍａ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ，  Ｃｏｃｋａｙｎｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，  Ａｎｄ  Ｔｒｉｃｈｏｔｈｉｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．，  ２４５−２７４，  Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ，  １９９８  ）（表１に要約する）である。ＸＰ患者の光感受性の特性は欠陥のあるＮＥＲによって主に生じ、一方ＣＳおよびＴＴＤ特性は影響を受けたＴＣＲおよび転写機能に起因し、これは早発の又は増強した加齢の症状または表現型を生じる。
【０００７】
裂毛症（ＴＴＤ；Ｔｒｉｃｈｏｔｈｉｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、硫黄欠乏性の脆弱毛（ｂｒｉｔｔｌｅ  ｈａｉｒ）および魚鱗癬（ｉｃｈｔｈｙｏｓｉｓ）により特徴づけられる稀な常染色体劣性障害である（Ｉｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１  ）。毛幹（Ｈａｉｒ  ｓｈａｆｔｓ）は長軸方向に小さい線維へと分割される、この脆性は毛のタンパク質におけるシステイン／シスチンのレベル（正常な個体におけるレベルの１５から５０％である）と関連する。その毛は、偏光下で視認できる特徴的な「トラの尾状（ｔｉｇｅｒ−ｔａｉｌ）」バンドを有する。前記患者は、たち耳（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  ｅａｒｓ）および引っ込んだ顎（ｒｅｃｅｄｉｎｇ  ｃｈｉｎ）を伴う、異常な顔面の外観をしばしば有している。精神的な能力は、低正常（ｌｏｗ  ｎｏｒｍａｌ）から重度の遅延までの範囲にわたる。いくつかの前記疾病のカテゴリーは、ＵＶダメージへの細胞応答の基準（ｂａｓｉｓ）および影響された遺伝子において認識できる。  
【０００８】
細胞融合実験による相補性試験からの証拠により、ＴＴＤ表現型が２つの別々の遺伝子の変異により生じ得ることを同定した、即ち：ＥＲＣＣ２／ＸＰＤおよびＥＲＣＣ３／ＸＰＢであって、これらは転写／修復因子  ＴＦＩＩＨの２つのヘリカーゼサブユニットをコード化する（Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ，  Ｂ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０，  ２５３９−２５４７，  ２００１，  Ｂｏｔｔａ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６３，  １０３６−１０４８，  １９９８，  Ｗｅｅｄａ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６０，  ３２０−３２９，  １９９７，  Ｇｒａｈａｍ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６９，  ２９１−３００，  ２００１  ）。ＸＰグループ  ＢおよびＤの他に、ＴＴＤ−Ａと称される例外的な裂毛症相補性グループがＳｔｅｆａｎｉｎｉ等により同定された（Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５３，  ８１７−２１，  １９９３  ）。第三の、光感受性ＴＴＤの原因である未同定遺伝子（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５９，  ３１７−３２９，  １９９４  ）は、ＴＴＤＡと称され、同様にＴＦＩＩＨと関連すると思われる（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２６，  ３０７−１３，  ２０００  ）。表１に、全ての既知のＴＴＤ−Ａ症例（２つの新たなグループＡファミリーを含む）の臨床および細胞の特性を要約する。ＴＴＤ−Ａ患者からの細胞は、低いＵＶ誘発性のＤＮＡ修復合成（予定外のＤＮＡ合成（ＵＤＳ）、細胞周期のＧ１−、Ｓ−、およびＧ２期を含む完全な細胞周期を通して生じる非複製的なＤＮＡ合成）にもかかわらず、僅か軽度にＵＶ感受性である。意外なことに、ＤＮＡ修復欠乏性のＴＴＤ相補性グループＡの第三形態において、９つのＴＦＩＩＨコード化しているサブユニットが変異を保持していなく；代わりに全体の複合体の定常状態レベルが重度に減少していた。ヒトにおける３６３ＴＴＤ、ＣＳおよびＸＰ変異の包括的な最新のリストは、ｗｗｗ．ｘｐｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ｏｒｇ．で見つけることが可能である。
【０００９】
以前、発明者は、高度に精製されたＴＦＩＩＨがＴＴＤ−Ａ細胞のＮＥＲ欠陥を修正したが、ＴＴＤ−Ａにおいて何れの９つのＴＦＩＩＨ遺伝子も変異していないことを見出した。そのうえ、ＴＴＤ−Ａ細胞から分離されたＴＦＩＩＨは、正常なインビトロ酵素活性を示し、またマイクロインジェクション後にＴＴＤ−Ａ細胞におけるＮＥＲ欠陥を一過性に回復させた、このことはＴＦＩＩＨが質的に影響されていなかったか又は僅か軽度に影響されていたことを示唆している。
【００１０】
本発明は、ＴＦＩＩＨの新規な８ｋＤａサブユニットをコード化し、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）欠乏、転写共役修復（ＴＣＲ）欠乏およびＤＮＡ転写欠乏（特に裂毛症における）の診断または治療に使用し得る核酸を提供する。
【発明の詳細記述】
【００１１】
本明細書に我々は、ヒトＴＦＢ５の相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）の同定及びそのヒトＴＦＩＩＨとの会合を記載する。最近、新規の第１０番目のＴＦＩＩＨサブユニット（ＴＦＢ５）が酵母において同定された。酵母の核抽出物（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｔｒａｃｔｓ）からの、プロモーターに相互作用したＲＮＡポリメラーゼＩＩプレ開始複合体の定量的なプロテオームスクリーニングで、新規の非常に小さい７２アミノ酸（〜８ｋＤａ）のタンパク質が同定され、それは酵母ＴＦＩＩＨのコアコンポーネントであることが示され、ＴＦＢ５と命名された（Ｒａｎｉｓｈ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００４  ）。このタンパク質は、例外的に小さいサイズが原因で、ＴＦＩＩＨの以前の分析では見落とされていた。
【００１２】
データベース  スクリーニングにより、推定されたヒト相同体を含む、いくつかのＴＦＢ５の相同分子種を同定した（図５）。ヒトＴＦＢ５遺伝子は、７１アミノ酸ポリペプチドをコード化しており、その推定された分子量は８ｋＤａである（ｐ８と称される）。ＴＦＢ５は、ヒトおよび酵母間で２５％および５６％類似度の配列同一性を有する、高度に保存されたものと思われた。各ＴＦＩＩＨサブユニットの強い進化上の保存性（表２および図５）に加え、前記複合体の全体的な構造上の相同性（Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １０２，  ５９９−６０７，  ２０００  およびＣｈａｎｇ，  Ｗ．Ｈ．  ＆  Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，  Ｒ．Ｄ．，  Ｃｅｌｌ  １０２，  ６０９−６１３，  ２０００  ）は、ヒトＴＦＢ５も哺乳類のＴＦＩＩＨの一部であるかどうか、またそれが謎の（ｅｎｉｇｍａｔｉｃ）ＴＴＤＡ因子であるかどうかについて我々が調査するきっかけとなった。
【００１３】
ｈＴＦＢ５  ｃＤＮＡのマイクロインジェクションがＴＴＤ−Ａ細胞のＤＮＡ修復欠陥を修正し、また３つの機能的な不活性化変異が３つの無関係のＴＴＤ−Ａファミリーにおいて同定された。このＴＴＤＡ遺伝子産物はＴＦＩＩＨのレベルの制御に作用することが示された、またそれはインビボでＴＦＩＩＨ複合体を有意に安定化する。ＴＴＤ−Ａに関係するＴＦＩＩＨの新しい進化的に保存されたサブユニットの同定は、転写におけるＴＦＩＩＨ機能不全、ＤＮＡ修復系（特にＮＥＲおよびＴＣＲ系における）並びにＮＥＲおよびＴＣＲ機能不全に関連するヒト疾患を診断する及び治療するための重要な解決策を提供する。
【００１４】
第一側面において、本発明は、ＴＦＩＩＨ安定化活性および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドをコード化している配列を含む核酸分子に関する。前記核酸分子は、好ましくは以下からなる群から選択される：  
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコード化している核酸分子；
（ｂ）核酸分子であって、その相補鎖が、配列番号２に記載されたヌクレオチド配列を有している核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；および
（ｃ）核酸分子であって、その配列が、遺伝暗号の縮重によって（ａ）または（ｂ）の核酸分子とは異なる核酸分子。  
【００１５】
ＴＦＩＩＨ安定化および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドは、本明細書において、機能的なアッセイ（好ましくは実施例４に提供されるアッセイ）で決定されるＴＦＩＩＨを安定化する能力を有するポリペプチド、および／または、機能的なＮＥＲアッセイおよび／またはＴＣＲサブ経路に特異的なアッセイ（好ましくは実施例３に提供されるアッセイ）で決定されるＮＥＲ促進活性が活性状態であるポリペプチドを意味する。更なるＴＦＩＩＨ安定化および／またはＮＥＲ促進化の活性に関する機能的アッセイは、ＴＴＤ−Ａ細胞（即ち、ＴＴＤ−Ａ相補性グループに属するＴＴＤ細胞）の相補性によって提供される。ＴＦＩＩＨ安定化および／またはＮＥＲ促進化を伴うポリペプチドは、ＴＴＤ−Ａ細胞のＤＮＡ修復欠陥を修正する能力を有するものである（例えば、前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを発現する能力を有する核酸構築物のマイクロインジェクションによって）。
【００１６】
「配列同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、本明細書において、２以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列間の又は２以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の（前記配列を比較することによって決定される）関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）と定義される。また当該技術において、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、アミノ酸または核酸配列の間の、場合に応じて（ａｓ  ｔｈｅ  ｃａｓｅ  ｍａｙ  ｂｅ）、かかる配列のストリング（ｓｔｒｉｎｇｓ）間の適合（ｍａｔｃｈ）により決定される、配列関連性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似度（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、アミノ酸配列と、その１つのポリペプチドから第二のポリペプチドの配列への保存されたアミノ酸置換とを比較することにより決定される。「同一性」および「類似度」は、文献（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：１０７３  （１９８８））に記載された方法を含む既知の方法により容易に計算することが可能であるが、それら方法に限定されない。  
【００１７】
同一性を決定するための好適な方法が設計され、試験された配列間の最大適合（ｌａｒｇｅｓｔ  ｍａｔｃｈ）が算出される。同一性および類似度を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータ・プログラムに体系化（ｃｏｄｉｆｉｅｄ）されている。２つの配列間の同一性および類似度を決定するための好適なコンピュータプログラムは、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  （１）：  ３８７  （１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０））を含む。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０））。また、周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを、同一性を決定するために使用してもよい。  
【００１８】
ポリペプチド配列比較のための好適なパラメータは、以下に記載するものを含む、即ち：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３  （１９７０）；  比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８９：１０９１５−１０９１９  （１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；  ギャップペナルティー：１２；  およびギャップ長ペナルティー：４である。これらのパラメータに関して有用なプログラムは、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）から、「０ギャップ」プログラムとして公に利用可能である。上述のパラメータは、アミノ酸比較に関する初期設定パラメータ（ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）である（エンドギャップに対してペナルティーなしの基準に従う）。  
核酸配列比較のための好適なパラメータは、以下に記載するものを含む、即ち：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３  （１９７０）；  比較マトリックス：適合（ｍａｔｃｈｅｓ）＝＋１０、非適合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）＝０；  ギャップペナルティー：５０；  ギャップ長ペナルティー：３である。ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）から、ギャッププログラムとして公に利用可能である。上記の記載は、核酸比較のための初期設定パラメータである。  
【００１９】
アミノ酸類似度の程度を決定することにおいて、随意に、当業者は、当業者には明確な所謂「保存された」アミノ酸置換をも考慮し得る。保存されたアミノ酸置換は、類似する側鎖を有する残基の可換性（ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；脂肪族―ヒドロキシルの側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニン；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン酸  およびグルタミン酸並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好適な保存されたアミノ酸置換の群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書中に開示される、アミノ酸配列の置換変異体（Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ）は、開示された配列において少なくとも１残基が除去され、その場所に異なる１残基が挿入されるものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存性の変化である。天然のアミノ酸の各々に対する、好適な保存性の置換は、次の通りである、即ち：Ａｌａに対してｓｅｒ；Ａｒｇに対してｌｙｓ；Ａｓｎに対してｇｌｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐに対してｇｌｕ；Ｃｙｓに対してｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｌｎに対してａｓｎ；Ｇｌｕに対してａｓｐ；Ｇｌｙに対してｐｒｏ；Ｈｉｓに対してａｓｎまたはｇｌｎ；Ｉｌｅに対してｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕに対してｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓに対してａｒｇ；ｇｌｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔに対してｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅに対してｍｅｔ，  ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒに対してｔｈｒ；Ｔｈｒに対してｓｅｒ；Ｔｒｐに対してｔｙｒ；Ｔｙｒに対してｔｒｐまたはｐｈｅ；および，Ｖａｌに対してｉｌｅまたはｌｅｕである。  
【００２０】
ＴＦＩＩＨ安定化活性および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドをコード化している核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド配列（の相補鎖と）と、好ましくは中等度の条件下、より好ましくは厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブダイズする能力により規定されてもよい。厳密なハイブリダイゼーション条件は、本明細書中で次の条件として規定される、即ち、少なくとも約２５、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５または１００および最も好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約１Ｍの塩（ｓａｌｔ）、好ましくは６ｘＳＳＣを含む溶液中で又は匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液中で約６５℃の温度でハイブリダイズさせ、約０，１Ｍ以下の塩、好ましくは０，２ｘＳＳＣを含む溶液中で又は匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液中で６５℃で洗浄する条件である。好ましくはハイブリダイゼーションは、一晩、即ち、少なくとも１０時間実施され、好ましくは洗浄は、少なくとも１時間、少なくとも洗浄溶液を２回交換して実施される。通常これらの条件は、約９０％以上の配列同一性を有している配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能とする。中等度（Ｍｏｄｅｒａｔｅ）の条件は、本明細書中で次の条件として規定される、即ち、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列を、約１Ｍの塩、好ましくは６ｘＳＳＣを含む溶液中で又は匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液中で約４５℃の温度でハイブリダイズさせ、約１Ｍの塩（ｓａｌｔ）、好ましくは６ｘＳＳＣを含む溶液中又は匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液中室温で洗浄する条件である。好ましくはハイブリダイゼーションは、一晩、即ち、少なくとも１０時間実施され、好ましくは洗浄は、少なくとも１時間、少なくとも洗浄溶液を２回交換して実施される。通常これらの条件は、５０％までの配列同一性を有している配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能とする。当業者は、これらのハイブリダイゼーション条件を、５０％および９９％間で同一性が変化している配列を特異的に同定するために修飾することができる。
【００２１】
本発明の核酸分子は、好ましくはＴＦＩＩＨ安定化および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチド（該ポリペプチドは、哺乳類の、好ましくはヒトのＴＴＤＡタンパク質またはマウスのＴＴＤＡタンパク質である）をコード化している。  
【００２２】
更なる側面において、本発明は、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列又はその相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と少なくとも９０％を有するヌクレオチド配列の一部を含む核酸プローブに関する。好ましくは、前記プローブは、配列番号２（ポジション１から３３１まで、より好ましくはポジション６０から２７５まで）に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％を有するヌクレオチド配列の一部を含む。核酸プローブを使用して、ＴＦＩＩＨ安定化およびＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドをコード化している核酸が分析される。かかる分析は、ＴＴＤＡをコード化している配列に関する被験者の遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）の分析（例えば、特定の変異または対立遺伝子の存在または非存在）を含んでいてもよく、或いはＴＴＤＡをコード化している核酸の発現の分析が関与するものであってもよい。前記被験者は、哺乳類であってもよく、好ましくはヒトである。かかる分析は、診断上の目的に関して実施し得る（以下を参照のこと）。核酸プローブは、それゆえハイブリダイゼーションプローブとして、配列決定または増幅のためのプライマーとして使用するための及びオリゴヌクレオチド・ライゲーション（−アンプリフィケーション）アッセイ（例えば、ＵＳ  ４，９８８，６１７；  ＵＳ  ５，８７６，９２４；  ＷＯ  ９６／１５２７１；およびＷＯ  ９７／４５５５９を参照されたい）または一重鎖構造多形アッセイ（例えば、Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：  ８７４−８７９を参照されたい）などの技術に使用するためのポリおよびオリゴヌクレオチドを含む。更なる核酸分析テクニックに関して、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ  ）が参照される。好適な核酸プローブは、少なくとも７０、８０または９０％の同一性を配列番号２に記載されたヌクレオチド配列に対して有するヌクレオチド配列の、少なくとも１０、１２、１４、１６または２０の近接する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ヌクレオチドを含むプローブである（この配列番号２は、ヒトｈＴＦＢ５／ＴＴＤＡ遺伝子の全体のコード配列にわたるものである）。従って、配列番号２またはゲノムのＴＴＤＡ遺伝子座（配列番号３、４、及び５）に由来するプローブを使用して、エキソン及びイントロン両方を並びにＴＴＤＡ／ｈＴＦＢ５遺伝子発現の制御に関与し得る転写単位から上流または下流の非コード配列を分析し得る。核酸のある範囲（ａ  ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む本発明のプローブは、固体の支持体（例えば、ＤＮＡ（マイクロ）アレイであるが、これに限定されない）に有利に物理的に連結（ｌｉｎｋｅｄ）されてもよい。
【００２３】
別の側面において、本発明は、上記に規定した核酸分子またはプローブを含むベクターに関する。好ましくは前記ベクターは、適切な宿主において前記ベクターの増殖を保証する複製起点（または自律的な複製配列）を含む、複製的なベクター（ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ）である。或いは、前記ベクターは、例えば相同的組換え、ランダムな統合または別の手段を介して、宿主細胞のゲノムに統合される能力を有する。  
【００２４】
特に好適なベクターは発現ベクターであって、上記に規定した、ＴＦＩＩＨ安定化および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、前記ベクターのための宿主細胞においてコード配列の発現に方向付ける能力を有するプロモーターに、動作可能に連結される発現ベクターである。  
【００２５】
本明細書中の「プロモーター」の用語は核酸断片を意味し、該断片は、機能して１以上の遺伝子の転写をコントロールし、前記遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対し上流に配置され、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位および任意の他のＤＮＡ配列（転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質の結合部位、および当業者に既知の、前記プロモーターからの転写量を直接的または間接的に作用して制御するヌクレオチドの任意の他の配列を含むが、それらに限定されない）の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターは、大抵の（ｍｏｓｔ）生理的な及び発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）の条件下で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理的な又は発生の状態に依存して制御されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、分化した細胞／組織の特定のタイプにおいてのみ活性がある。  
【００２６】
発現ベクターにより、本発明のＴＦＩＩＨ安定化および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドを調製し得る、この際、組換え技術が用いられ、この技術により所望のポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が適切な細胞（培養された細胞または多細胞生物の細胞）において発現される、この技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｄ．，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００３））並びにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１，  上記）などに記載され；その双方は本明細書中に参照によりその全体が援用される。また、Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８２：４８８（部位特異的突然変異誘発を記載している）およびＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４またはＷｅｌｌｓ，  Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｇｅｎｅ  ３４：３１５  （カセット突然変異誘発を記載している）を参照されたい。  
【００２７】
典型的には、所望のポリペプチドをコード化している核酸は、発現ベクターに使用される。「発現ベクター」の用語は、ヌクレオチド配列であって、かかる配列に適合性の宿主において、遺伝子の発現に影響する能力を有するヌクレオチド配列を一般的に意味する。典型的には、これらの発現ベクターは、少なくとも適切なプロモーター配列および随意に転写終結シグナル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ）を含む。効果的な発現に必要な又は役立つ付加的因子も、本明細書中に記載のとおり使用できる。ポリペプチドをコード化しているＤＮＡは、インビトロ細胞培養での導入および発現が可能なＤＮＡ構築物に導入される。具体的には、ＤＮＡ構築物は、原核生物の宿主（例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの細菌）における複製に関して適切なものであるか、又は培養された哺乳類の、植物の、昆虫の（例えばＳｆ９）、酵母の、菌類の若しくは他の真核生物の細胞株に導入できるものである。  
【００２８】
特定の宿主に導入するために調製されるＤＮＡ構築物は、複製システム（宿主により認識される）、意図するＤＮＡセグメント（所望のポリペプチドをコード化している）、並びに転写の開始および終結の制御配列（ポリペプチドコード化セグメントに動作可能に連結される）を典型的に含む。ＤＮＡセグメントが「動作可能に連結される」とは、それが別のＤＮＡセグメントと機能的に関連付けられ配置された場合である。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に動作可能に連結されるとは、それが前記配列の転写を刺激する場合である。シグナル配列に関するＤＮＡがポリペプチドをコード化しているＤＮＡに動作可能に連結されるとは、それが前記ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現された場合である。一般に、動作可能に連結されるＤＮＡ配列は、近接するものである、またシグナル配列の場合は、近接するもの及び読み相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）内であるものという両方の条件を満たすものである。しかしながら、エンハンサーは、それらがコントロールするコード配列に近接する必要はない。連結（Ｌｉｎｋｉｎｇ）は、便利な制限酵素部位で又はその代わりに挿入されるアダプター若しくはリンカーでライゲーションすることにより達成される。  
【００２９】
一般に、適切なプロモーター配列の選択は、ＤＮＡセグメントの発現に関して選択された宿主細胞に依存する。適切なプロモータ配列の例には、当該技術において周知の原核生物および真核生物のプロモータが含まれる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  ２００１，  上記）。転写制御配列は、典型的には前記宿主により認識される、異種性のエンハンサーまたはプロモーターを含む。適切なプロモータの選択は宿主に依存するが、ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージ・プロモータ、ｔＲＮＡプロモータおよび糖分解酵素プロモータなどのプロモーターは、既知であり、入手可能である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  ２００１，  上記）。セグメントをコード化しているポリペプチドのための挿入部位と共に、複製システム（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）並びに転写および翻訳の制御配列を含む発現ベクターを使用することができる。細胞株および発現ベクターの実施可能な組み合わせの例は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１，  上記）並びにＭｅｔｚｇｅｒ等（Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：  ３１−３６）に記載されている。例えば、適切な発現ベクターは、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）および細菌細胞（例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ）において発現させることが可能である。
【００３０】
インビトロ突然変異誘発および変異体タンパク質の発現は、Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００３，  上記）並びにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１，  上記）に一般的に記載されている。また、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，  上記；部位特異的突然変異誘発を記載している）およびＲｏｂｅｒｔｓ等（１９８７，  上記；カセット突然変異誘発を記載している）を参照されたい。  
【００３１】
ポリペプチドを調製するための別の方法は、インビトロ転写／翻訳システムを用いることである。ポリペプチドをコード化しているＤＮＡは、上記の発現ベクターにクローン化される。前記発現ベクターは、次にインビトロにおいて、転写され、翻訳される。翻訳産物は、直接使用し得る又は最初に精製してもよい。インビトロ翻訳から生じたポリペプチドは、インビボで合成されたポリペプチドに存在する翻訳後修飾を含まないが、ミクロソームの固有の影響力（ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ）により、ある種の翻訳後修飾が生じる可能性がある。インビトロ翻訳によるポリペプチドの合成のための方法は、例えば、文献（Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １５２，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  １９８７  ）に記載されている。  
【００３２】
従って、更なる側面において、本発明は、上記で規定したベクターを含む宿主に関する。宿主細胞は、上記で指摘された原核生物の又は真核生物の宿主細胞であってもよい。宿主細胞は、液体中で又は固形の培地上で培養するために適切な宿主細胞であってもよい。或いは、宿主細胞は、多細胞生物（例えば、遺伝子組換え植物または動物、好ましくは非ヒト動物）の一部の細胞である。  
【００３３】
更なる側面として、本発明は、ＴＦＩＩＨ安定化活性および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドを産生するための方法に関する。前記方法は、上記で規定した宿主細胞を前記ポリペプチドの発現を助成（ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ）する条件下で培養することを含む。随意に、前記方法は、前記ポリペプチドの回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を含んでいてもよい。前記ポリペプチドは、例えば、培地から標準のタンパク質精製テクニックにより回収されてもよい（この方法には、それ自体は当該技術において既知である種々のクロマトグラフィー方法が含まれる）。  
【００３４】
本発明の別の側面は、トランスジェニック動物に関し、該トランスジェニック動物は、その体細胞性の及び胚性の細胞中に上記で規定したベクターを含んでいる。前記トランスジェニック動物は、好ましくは非ヒト動物である。トランスジェニック動物を作出するための方法は、例えばＷＯ  ０１／５７０７９に及びその中で引用された文献に記載されている。かかるトランスジェニック動物は、ＴＦＩＩＨ安定化活性および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドを産生するための方法に使用でき、該方法は、体液または組織をトランスジェニック動物（該トランスジェニック動物は前記ベクター又はその雌性の子孫を含む）から回収することを含み（前記体液は前記ポリペプチドを含有する）、および、随意に前記ポリペプチドの前記体液からの回収を含む。かかる方法は、ＷＯ  ０１／５７０７９に及びその中で引用された文献にも記載されている。前記ポリペプチドを含んでいる体液は、好ましくは血液、又は、より好ましくはミルクである。別の態様において、前記トランスジェニック動物はノックアウト動物であってもよく、該ノックアウト動物において、内在性のＴＴＤＡ対立遺伝子は、機能障害性の（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）又は変異した対立遺伝子へと既知の相同的組換えテクニックにより置換されている。例えば、ＴＴＤＡの読み枠は、配列の挿入によって除去され又は破壊され（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）ていてもよく、および／または、選択可能なマーカー  ネオマイシンＲ（耐性）、ハイグロマイシン  Ｒ、ＤＨＦＲ、ピューロマイシン  Ｒ、ＨＳＶｔｋまたはレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）と融合されていてもよい。また、ＴＴＤＡのバイ―シストロン性のメッセンジャーおよびマーカー対立遺伝子は、ＩＲＥＳ配列を用いて構築されてもよい。他の態様において、条件的ノックアウト（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔｓ）またはノックイン（ｋｎｏｃｋ  ｉｎ）動物を、Ｃｒｅ−ＬｏｘまたはＦｒｔ／Ｆｌｐリコンビナーゼシステムを用いて構築し得る。なお別の態様において、前記トランスジェニック動物は、ＴＴＤＡ対立遺伝子の一方または双方のコピーがタグ形態（ｔａｇｇｅｄ  ｆｏｒｍｓ）のＴＴＤＡをコード化している配列によって置換されているノックイン動物である。ＴＴＤＡ読み枠との融合に関して適切な、様々なタグ（例えば、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ及びその変形）、同様にアフィニティータグが含まれる）は、当該技術において周知である（以下の記載を参照されたい）。なお別の態様において、当該技術において既知の、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）戦略およびＲＮＡｉ分子を適用して、ＴＴＤＡの発現を局所的に又は全身性に、哺乳類において又は細胞において不活性化し得る。
【００３５】
本発明の更なる側面は、ＴＦＩＩＨ安定化活性および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドに関し、これは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０、９０、９５、９８または９９％同一性を有しているアミノ酸配列を含む。前記ポリペプチドは、上記のとおり更に好ましい。本発明の範囲内に含まれるものは、ＴＦＩＩＨ安定化活性および／またはＮＥＲ促進活性を有すると共に、例えば、変更された特異性（ａｌｔｅｒｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）または付加的な特性（例えば、精製／単離、同定、可視化／局在化または免疫化の目的（しかし、これらに限定されない）に使用し得る分子タグへの融合であるが、これに限定されない）を有している変異体ポリペプチドである。配列番号１のアミノ酸配列は、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、複数のＨｉｓ、二重のＨＡ、チューブリン、ＧＳＴ、プロテインＡ、ＭＢＰ、ビオチンまたは当該技術において既知の任意の他のタグと融合させてもよい。また、蛍光タグを有利に適用でき、それらは例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｅＣＦＰ、ｅＹＦＰ、ｄｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＧＦＰ２、ＦＬＡＳＨ、ＳＮＡＰおよび他の蛍光タンパク質タグ、或いは蛍光性の小さい分子の実体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）、量子ドットまたは当該技術において既知の任意の分子と特異的に結合するタグである。ＴＦＩＩＨを安定化すること、ＮＥＲおよびＴＣＲを促進すること、並びにＤＮＡ転写を促進することにおけるＴＴＤＡの特異的な活性に基づいて；マイナーなアミノ酸の置換および／または削除、挿入および融合により、その細胞の活性を変更させ、ＴＦＩＩＨ複合体における天然の又は人為的な結合パートナーに対する親和性を増加または減少させ、前記タンパク質の半減期を増加させ、上記で説明したタグまたは蛍光レポーターに融合させるために、如何に必須アミノ酸を修飾するかを当業者は理解する。配列番号１に記載の酵素に基づくＴＴＤＡタンパク質の三次構造を、上記と同じ原理を前記構造に適用することにより変更することが可能であり、これにより前記タンパク質の相互作用部位の構造を調節し、引き続いて前記変異体をそのＴＦＩＩＨ安定化活性および／またはそのＮＥＲ、ＴＣＲおよびＤＮＡ転写に対する促進活性に関してアッセイし得る。
【００３６】
本発明の別の側面は、上記で規定したＴＦＩＩＨ安定化および／またはＮＥＲ促進活性を有するポリペプチドと特異的に結合する、抗体または抗体断片に関する。特定のポリペプチドと特異的に結合するモノクローン性の又はポリクローン性の抗体または抗体断片を産生するための方法は、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  （１９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）およびＷＯ  ９１／１９８１８；ＷＯ  ９１／１８９８９；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／０６２０４；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＵＳ  ６，４２０，１１３およびＷＯ０２／０８５９４４及びそれらの中で引用された文献に記載され、これらには、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ２断片、同様にラクダの単鎖抗体またはファージディスプレイライブラリーからの抗体または抗体断片が含まれる。本明細書中に使用される「特異的な結合」の用語は、低および高親和性両方の特異的な結合を含む。特異的な結合は、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性の抗体または抗体断片により提示される。また、特異的な結合は、高親和性の抗体または抗体断片（例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有している抗体または抗体断片、或いは少なくとも約１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ以上のＫｄを有し得る抗体または抗体断片）により提示（ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ）される。抗体は、任意の哺乳類において産生でき、また抗体は好ましくはヒト化又は脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）される。  
【００３７】
本発明の別の側面は、上記で規定した核酸またはポリペプチドを含むマイクロアレイ（または他のハイスループットなスクリーニング装置）に関する。マイクロアレイは、核酸またはアミノ酸の配列又はその混合物を分析するための、１以上の固定化された核酸またはポリペプチドの断片を含有している固体の支持体またはキャリアである（例えば、ＷＯ  ９７／２７３１７、ＷＯ  ９７／２２７２０、ＷＯ  ９７／４３４５０、ＥＰ  ０  ７９９  ８９７、ＥＰ  ０  ７８５  ２８０、ＷＯ  ９７／３１２５６、ＷＯ  ９７／２７３１７、ＷＯ  ９８／０８０８３並びにＺｈｕおよびＳｎｙｄｅｒ，  ２００１，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５：  ４０−４５を参照されたい）。前記核酸を含むマイクロアレイを、例えば、下記のＴＴＤＡ遺伝子型を分析するための方法に適用し得る。ポリペプチドを含むマイクロアレイを、結合パートナーに対して変化した親和性を有する又は変化した活性を有するＴＴＤＡ変異体の適切な候補の検出のために使用し得る。  
【００３８】
別の側面において、本発明は、被験者、組織サンプルまたは細胞または細胞株、特にそのＴＴＤＡ／ｈＴＦＢ５遺伝形質の、ＮＥＲ状態または遺伝形質を分析するための方法に関する。本明細書中においてＮＥＲ状態の遺伝形質を分析することは、遺伝的な欠陥が、ＴＦＩＩＨ安定性および／またはレベルにおける欠陥、ＤＮＡ転写における欠陥、一般的なＮＥＲにおける欠陥および特にＴＣＲサブ経路における欠陥を有するサンプルに存在しているかどうかを分析することを意味している。好ましくは、前記方法は、上記で規定した核酸分子またはプローブまたは抗体の使用を含む。好ましくは、前記方法は、ＴＴＤ欠乏を診断するための方法である。或いは、ＤＮＡ転写欠乏またはＮＥＲ／ＴＣＲ欠乏を診断するための方法は、上記に規定した抗体または抗体断片の使用を含む方法である。  
【００３９】
別の側面において、本発明は、上記に規定した発現ベクターに関し、前記ベクターは遺伝子治療に適切なベクターである。遺伝子治療に適切なベクターは、文献（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  １９９８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：  ２５−３０；  Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，  ２０００，  Ｄｒｕｇｓ  ６０：  ２４９−７１；  Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７：  ３３−４０；  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２０００，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：  ２５７３−６０４；  Ａｍａｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  ６７４−６；  Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，  １９９９，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：  ４４８−５３；  Ｖｉｇｎａ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，  ２０００，  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２：  ３０８−１６；  Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｔｏｄａｙ  ３：  ３９６−４０３；  Ｐｅｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  １９９９，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：  ４５４−７；  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ，  １９９９，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：  ３０４９−６４；  Ｒｅｉｓｅｒ，  ２０００，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：  ９１０−３；）及びその中に引用された文献に記載されている。前記ベクターは、好ましくは以下に規定される適切な薬学的キャリアを含む薬学的組成物に製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）される。投与可能な組成物を調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｂｙ  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｕｎｅ  １，  ２００３）を含む様々な情報源に詳細に記載されている。
【００４０】
更なる側面において、本発明は、ＮＥＲの治療、ＤＮＡ転写欠乏、特にＴＴＤＡ遺伝子における遺伝的な欠陥のための医薬の製造における、上記に規定した遺伝子治療に適切なベクターの使用に関する。同様に本発明は、ＴＴＤＡ遺伝的欠陥および／またはＴＦＩＩＨ安定化欠乏を治療するための方法に関し、該方法は、ＴＴＤＡ欠乏を罹患している被験者に、上記に規定した遺伝子治療に適切なベクターを含む薬学的組成物を、前記欠乏を克服するのに効果的な量で投与する工程を含む。  
【００４１】
更に本発明は、上記に規定したＴＴＤＡ安定化およびＮＥＲ、ＴＣＲおよびＤＮＡ転写促進活性を有するポリペプチドを含む薬学的製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）に関する。前記組成物は、好ましくは薬学的に許容されるキャリアを含む。いくつかの方法において、ＴＦＩＩＨ安定化活性を有し、哺乳類、昆虫、または微生物の細胞の培養物から、トランスジェニック哺乳類または他の供給源のミルクから精製された前記ポリペプチドは、精製形態で、薬学的キャリアと共に薬学的組成物として投与される。好適な形態は、投与の及び治療適用（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の意図されるモードに依存する。薬学的キャリアは、前記ポリペプチドを前記患者に送達するために適切な、任意の適合性の（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）非毒性物質であってもよい。滅菌水、アルコール、脂質（ｆａｔｓ）、ワックスおよび不活性な固体（ｓｏｌｉｄｓ）を前記キャリアとして使用し得る。また、薬学的に許容されるアジュバンド、緩衝剤、分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）などを、前記薬学的組成物に導入してもよい。  
【００４２】
経口投与に関して、活性成分を、固形の剤形（ｓｏｌｉｄ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ）、例えば、カプセル、錠剤、および粉剤として、または液体の剤形（ｌｉｑｕｉｄ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ）、例えば、エリキシル剤、シロップ、および懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）として、投与してもよい。活性コンポーネント（Ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ｓ））は、ゼラチンカプセルに、不活性成分および粉化されたキャリア（例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸、サッカリンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｉｎ）、タルカム（ｔａｌｃｕｍ）、マグネシウム炭酸塩（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）など）と共に被包（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）されてもよい。付加的な不活性成分の例（これらを添加して、望ましい色、食味、安定性、緩衝作用能力、分散または他の既知の望ましい特性が提供される）は、赤色の鉄酸化物（ｒｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ）、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、二酸化チタン（ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｄｉｏｘｉｄｅ）、食用のホワイト・インク（ｗｈｉｔｅ  ｉｎｋ）などである。同様の希釈剤を使用して圧縮錠剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ  ｔａｂｌｅｔｓ）を作出することができる。錠剤およびカプセルの双方を、徐放性製品（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）として製造して、何時間（ａ  ｐｅｒｉｏｄ  ｏｆ  ｈｏｕｒｓ）にもわたる薬物（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）の連続的な放出を提供できる。圧縮錠剤を、糖被覆して又はフィルム被覆して、任意の不快な食味をマスクできる、また前記錠剤を大気から防御できる、或いは胃腸管における選択的な崩壊のために腸溶性に被覆（ｅｎｔｅｒｉｃ−ｃｏａｔｅｄ）できる。経口投与のための液体の剤形は、着色（ｃｏｌｏｕｒｉｎｇ）および味（ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ）を含有させて、患者の認容性（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ）を高めてもよい。投与可能な組成物を調製するための方法は、当該技術において既知であり、様々な情報源（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｂｙ  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｕｎｅ  １，  ２００３  を含む）に更に詳細に記載されている。
【実施例】
【００４３】
酵母ＴＦＢ５のヒト相同分子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）をコード化しているｃＤＮＡおよびゲノムクローン（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｌｏｎｅ）の単離および特性分析
【００４４】
実施例１  ｈＴＦＢ５／ＴＴＤＡのクローニング
我々は、初代線維芽細胞からヒトＴＦＢ５  ｃＤＮＡを、その酵母ＴＦＢ５との相同性に基づいて、当該技術において既知の通常の技術を用いてクローン化した。ｈＴＦＢ５（ｐ８−ＨＡ）のＨＡタグされたバージョンを、従来の分子クローニング方法により構築し（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  上記）、そしてＴＴＤ−Ａ線維芽細胞中で発現させ、そして次に抗ＨＡによる免疫沈降に使用した（図１ａ）。ＸＰＢコアＴＦＩＩＨ及び関連するＣＡＫコンポーネント（ＣＤＫ７）は、ｐ８−ＨＡと共沈した（複製／修復因子ＲＰＡ１とは対照的に）（データ示さず）。逆に、抗−ｐ４４（別のコア−ＴＦＩＩＨコンポーネント）は、ｐ８−ＨＡと共沈した。我々は、酵母と同様に、この小さいポリペプチドが哺乳類細胞におけるＴＦＩＩＨと関連していると結論づけた。
【００４５】
我々は、ｐ８のＴＦＩＩＨとの相互作用を、Ｈｅｌａ細胞から精製したＴＦＩＩＨを用いて更に分析した（Ｇｅｒａｒｄ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６，  ２０９４０−２０９４５，  １９９１  ）。〜８ｋＤａのタンパク質バンドが、他のＴＦＩＩＨサブユニットと並びに転写およびＤＮＡ修復活性と共に共沈した（図１ｂ）ことを、銀染色は示した。この〜８ｋＤａバンドのトリプシン消化物のＭＡＬＤＩペプチド・マス・フィンガープリント分析は、全ての同定されたペプチドがｈＴＦＢ５の一部であることを示した（図１ｃ）。最終的に、この８ｋＤａのポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体を用いたイムノ−ブロッティングは、それがＴＦＩＩＨと共沈することを示した（図１Ｂ）。これらの実験により、このポリペプチドは、ＴＦＢ５のヒト相同分子として、また本物の（ｇｅｎｕｉｎｅ）新規の第十のＴＦＩＩＨコンポーネントとして認められた。
【００４６】
ｈＴＦＢ５がＴＴＤ−Ａにおいて影響される遺伝子であることを確認するために、我々は前記ｃＤＮＡを多核化した（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅａｔｅｄ）ＴＴＤ−Ａ線維芽細胞にマイクロインジェクトし、そしてインジェクトされた細胞のＤＮＡ修復能力をＵＶ誘導性のＵＤＳ（予定外のＤＮＡ合成）を測定することにより決定した。図２ａは、二核性の（ｂｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ）ｐ８を注射した細胞（２）を示しており、非注射の隣接するＴＴＤ−Ａ細胞（１）における低いＵＤＳと比較して、明瞭に増加したＵＤＳ（粒子数の上昇）を有している。ｐ８  ｃＤＮＡは、並行してアッセイされた野生型細胞において観察されたレベルと匹敵するレベルにまでＴＴＤ−Ａ細胞の修復欠陥を修正し、このことはｈＴＦＢ５（ｐ８）がＴＴＤグループＡにおいて影響を受けたことを指摘している。
【００４７】
実施例２  被験者のＴＴＤＡ診断
ｈＴＦＢ５がＴＴＤ−Ａにかかわるかを検証するために、我々は３つの無関係のＴＴＤ−ＡケースのゲノムＤＮＡを分析した（表１）。３つ全てのＴＴＤ−Ａ患者は、ｈＴＦＢ５遺伝子内に不活性化している（しかし区別しえる）変異を示した（図２ｂ）。患者ＴＴＤ９９ＲＯは、ホモ接合性のＣ→Ｔ遷移をコドン５６に保持し、これによりＣＧＡ（アルギニン）はＴＧＡ終止コドンへと変換され、前記タンパク質を２３％まで切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）する。同胞（Ｓｉｂｌｉｎｇｓ）ＴＴＤ１３ＰＶおよびＴＴＤ１４ＰＶは、開始コドンに変異を（ホモ接合性に）保持し、これによりＡＴＧをＡＣＧへと変換する。この変異は、タンパク質合成の完全な欠損か又はＮ末端切断型ポリペプチド（最初の最も保存された１５のアミノ酸（２１％）を欠損している）の産生か（コドン１６での下流のＡＵＧが使用された場合）の何れかを生じる。ただ１つの対立遺伝子が検出されたので、両方の変異は機能的にホモ接合性であると考えられる。    
【００４８】
最終的に、患者ＴＴＤ１ＢＲは、合成異型接合体（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）であると思われた：一方の対立遺伝子はＴＴＤ９９ＲＯと同一であり、他方はＴ→Ｃ遷移をコドン２１に保持しており、保存されたロイシン残基をプロリンへと変換する。また、ゲノムの変異が分離されたｍＲＮＡにおいて同定され（ＲＴ−ＰＣＲにより示された）、このことは、これらの対立遺伝子が発現されることを示している（データ示さず）。我々のデータは、ｈＴＦＢ５をＴＴＤグループＡにおいてＮＥＲ欠陥を生じる遺伝子として明確に同定した。我々は、この新規のＴＦＩＩＨサブユニットをＴＴＤＡと命名した（アクセッション番号  ＡＪ６３４７４３）。
【００４９】
配列表（各々、配列番号１および配列番号２）に記載されるＴＴＤＡのタンパク質およびＤＮＡ  コード配列は、ＴＴＤＡ遺伝子における遺伝子欠陥の存在に関して被検者を診断するための手段を提供する。遺伝子欠陥の検出は、被験者からの試料（例えば、組織サンプル、血液サンプル、毛髪サンプル、糞便、尿、唾液）に関して、当該技術において既知の様々な方法によりインサイチューまたはインビトロで実施可能である。様々な技術を、被験者におけるＴＴＤＡの変異分析に適用でき、例えば、次に示すようなものが含まれるが、それらに限定されない：それは、即ち、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのＤＮＡ配列決定、ＰＣＲまたはＮａｓｂａ分析、サザンブロッティングを用いる分析、ノーザンブロットまたはウエスタンブロット法を用いた発現分析、ＤＮＡマイクロアレイまたはタンパク質マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ分析、ＥＳＴまたはＳＮＰ分析である。  
【００５０】
実施例３  ＮＥＲ修復に関与するＴＴＤＡ（ＴＴＤＡ活性に関するアッセイ）
ＮＥＲにおけるＴＴＤＡの役割を更に探索するために、我々はＨＡタグされたＴＴＤＡを安定的に発現しているＴＴＤ１ＢＲ−ＳＶ細胞を作出した。ＴＴＤＡ−ＨＡ発現細胞のＵＶ−Ｃライトへの暴露（図３ａ）は、前記細胞が、並行してアッセイされたＮＥＲに熟達した細胞に匹敵するＵＶ感受性レベルを呈したことを明瞭に示した。ＵＶダメージが細胞核に、（５μｍ）ポアを有するフィルターを通して照射されることによって局所的に負荷される（ｉｎｆｌｉｃｔｅｄ）アッセイを用いて、ＴＦＩＩＨコンポーネントが一過性にこれらの部位に蓄積することを我々は以前に実証した（Ｍｏｎｅ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ２，  １０１３−１０１１７，  ２００１、Ｖｏｌｋｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ８，  ２１３−２２４，  ２００１およびＨｏｏｇｓｔｒａｔｅｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌ．  １０，  １１６３−１１７４，  ２００２  ）。我々は、同じ手順をＴＴＤＡ−ＨＡ発現細胞に適用して、ＮＥＲ反応におけるＴＴＤＡの関与をインビボで試験した。局所の傷害部位（内在性のＸＰＢの蓄積によってマークされる）で、ＴＴＤＡ−ＨＡが蓄積される（図３ｂ）。このことは、ＴＴＤＡが、他のＮＥＲ因子と同様にＮＥＲ反応に関与することを指摘する（Ｒａｄｅｍａｋｅｒｓ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３，  ５７５５−５７６７，  ２００３）。
【００５１】
我々は、更にＮＥＲにおけるＴＴＤＡの関与を試験するためのアッセイを開発した、このアッセイは、インビトロで切断／除去修復アッセイを再構成し、組換え型ＮＥＲ因子、精製したＴＦＩＩＨおよびシスプラチン付加物（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ａｄｄｕｃｔ）を含んでいるプラスミドを用いるものである。固定量の精製ＴＦＩＩＨと共にインキュベーションした、精製した抗−ＴＴＤＡ（ｐ８）ポリクローナル抗体を増加させて添加すると、修復反応を明らかに阻害したが、プレ−免疫血清での処理は効果がなかった（図３ｃ）。結論として、これらの結果は、ＴＴＤＡがＴＦＩＩＨの一部としてＮＥＲに関与していることを実証している。  
【００５２】
そのうえ、機能的なアッセイが本発明によって提供され、このアッセイは、ＮＥＲ促進活性に関して、ＴＴＤＡタンパク質の調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）と変異させ又は化学的に若しくは翻訳後修飾されたＴＴＤＡタンパク質とにおける試験を可能とする。上記の（また、以前にＳｈｉｖｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ，  １１３，  ３７３−３９２に記載された）インビトロで再構成された切断／除去修復アッセイは、（内在性の）ＴＴＤＡタンパク質をポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いた従来の技術（例えば、固定化した二次抗体又は固定化したプロテインＡ若しくはプロテインＧへの結合）を用いて取り除き（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）／消去（ｃｌｅａｒｅｄ）し得る。次に、様々な供給源および調製物からのＴＴＤＡタンパク質（特に本明細書で説明した該タンパク質の変異型）、化学的に合成され、インビトロ翻訳された調製物またはインビボ供給源（例えば、微生物、植物または動物）から精製したＴＴＤＡを、ＮＥＲ促進活性に関して、再構成アッセイのインビトロ修復反応でアッセイし得る。  
【００５３】
実施例４  ＴＦＩＩＨ安定化アッセイ
ＴＴＤ−ＡにおけるＮＥＲ欠陥およびＴＴＤ−特異的な特性は、ＴＦＩＩＨの総量の定常状態レベル（ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｌｅｖｅｌ）の減少に関連しているように思われる（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２６，  ３０７−１３，  ２０００）。図４に示すとおり、ＴＴＤＡ−ＨＡを発現する細胞は、随伴性の（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）高いＸＰＢレベルを有しており、このことはＴＴＤＡが安定化機能を有し、ＴＦＩＩＨを分解から防御することを示唆している。同様の観察が、他のＴＦＩＩＨコンポーネント（即ち、ｐ６２、ｐ４４およびＣＤＫ７）に対する抗体で染色した細胞においてなされ、これは全体のＴＦＩＩＨ複合体の核内（ｉｎｔｒａ−ｎｕｃｌｅａｒ）レベルが増加することを示している。対照的に、非ＴＦＩＩＨ  ＮＥＲ因子（ＥＲＣＣ１）は増加しない（図４ｂ）。また、免疫ブロット実験（図１ａ）において、上昇したレベルのＸＰＢおよびＣＤＫ７がＴＴＤＡ発現後に観察された。    
【００５４】
これらの実験は、ＴＦＩＩＨ濃度がＴＴＤＡタンパク質の存在に依存することを示しており、その結果、ＴＴＤＡタンパク質活性に関する機能的アッセイが提供される。本発明において提供されるアッセイは、多様な供給源および調製物、ＴＴＤＡ変異体、（天然で生じた変異体および構築された変異体）および修飾されたタンパク質からのＴＴＤＡの機能的な試験を可能とする。我々は、ＭＲＣ５（野生型  ＳＶ４０−不死化）においてＴＴＤＡ−ＨＡを一過性に過剰発現させた。これらのＴＴＤＡが豊富な細胞（ＴＴＤＡ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）においてさえ、ＴＴＤＡ遺伝子の一過性過剰発現は、細胞のＴＦＩＩＨ量（図４ｃ）を増加させるように思われ、このことはＴＴＤＡ発現がインビボにおけるＴＦＩＩＨ濃度を制御することを示している。ＴＴＤＡ−欠乏細胞（ＴＴＤＡ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ）における（機能的な）ＴＴＤＡ遺伝子の過剰発現は、相対的なＴＦＩＩＨ安定化効果を増強し、機能障害性のＴＴＤＡ変異体は、変異体の残効性（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）によって減少した効果を有するか又は効果を有していない。
【００５５】
培養したＴＴＤ−Ａ細胞の最も明白な細胞の表現型の１つは、ＴＦＩＩＨレベルの顕著な減少（〜３０％）である（表１）。ＴＴＤＡが野生型細胞においてさえも一過性にＴＦＩＩＨのレベルを増加させたという事実（図４ｃ）は、この８ｋＤａタンパク質がＴＦＩＩＨレベルの定常状態の制御に関与していることを実証する。ＴＦＩＩＨコンポーネントのｍＲＮＡレベルはＴＴＤ−Ａ細胞において減少しないので（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００  上記）、ＴＴＤＡによるＴＦＩＩＨ量の制御は翻訳後修飾にちがいない。翻訳又は翻訳後レベルでの制御は、複合体会合または複合体構造の維持に関するＴＴＤＡのシャペロン類似機能を示唆している。変化したＴＦＩＩＨの三次構造（ＴＴＤＡが存在しないことによる）は、この複合体の生存期間（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）並びにその修復および転写活性の双方を妨害（ｉｍｐｅｄｅ  ）し得る。
【００５６】
ヒトと酵母との間のＴＦＩＩＨの組成、構造および機能における著しい類似性（ｐａｒａｌｌｅｌｓ）にもかかわらず（表２）、転写効率に対するＴＦＢ５’ｓの相対的な寄与の差異が観察される。酵母においてＴＦＢ５の非存在は、転写およびＮＥＲの効率に影響するように思われるが、ヒトにおいてＴＴＤＡ変異は、ある程度転写に影響する（Ｔｉｒｏｄｅ，  Ｆ．，  Ｂｕｓｓｏ，  Ｄ．，  Ｃｏｉｎ，  Ｆ．  ＆  Ｅｇｌｙ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ３，  ８７−９５，  １９９９）。さらにまた、ヒトにおいてＴＴＤＡの非存在は、主にＴＦＩＩＨの安定性および／または定常状態レベルに影響するように思われるが、酵母においてはＴＦＢ５の非存在はＴＦＩＩＨレベルを減少させなかった。
【００５７】
ＮＥＲ機能における重度の影響は、ＮＥＲが、転写よりも高い濃度のＴＦＩＩＨを必要とすることを示唆する。最近の生細胞の研究は、ＴＦＩＩＨが、転写よりもＮＥＲに有意に長く関与することを示した（Ｈｏｏｇｓｔｒａｔｅｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌ．  １０，  １１６３−１１７４，  ２００２）、このことはＮＥＲにおけるＴＦＩＩＨ（の十分量に対する）の必要性の増大に関して可能性のある説明を提供する。また、変異したＴＴＤＡによるＴＦＩＩＨの変化した構造は、主にＮＥＲ機能に影響し得る。
【００５８】
結論として、新規の進化的に保存されたＴＦＩＩＨの第十サブユニットとしてのＴＴＤＡの同定は、ＤＮＡ修復、転写、およびヒトの疾患におけるＴＦＩＩＨの分子機構を理解するための必須の情報を提供する。これらの所見は、明確にＴＴＤグループＡにおけるＮＥＲ欠陥の原因遺伝子としてＴＴＤＡを同定し；被験者においてｐｏｌ  Ｉおよびｐｏｌ  ＩＩ  ＤＮＡ転写における欠乏、ＮＥＲ欠乏および特にＴＣＲ欠乏を生じるだろう、ＴＦＩＩＨの不十分な細胞レベルにより生じる障害を診断および治療する機会（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）を提供する。
【００５９】
材料および方法  
クローニング。分子クローニング技術に関して、一般的な文献は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ２００１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  並びに  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｄ．，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００３である。核酸修飾酵素、キット、設備および自動ＤＮＡ合成機を、製造者の指示にしたがって使用した。  
【００６０】
細胞株、培養条件およびトランスフェクション。初代ヒト繊維芽細胞  ＴＴＤ９９ＲＯ、ＴＴＤ１ＢＲ、ＴＴＤ１３ＰＶ、ＴＴＤ１４ＰＶ（全てＴＴＤ−Ａ）およびＣ５ＲＯ（野生型、ＮＥＲに熟達）を標準の条件下、１２％  ＦＣＳおよび抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を添加したハムのＦ−１０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２および３％酸素で培養した。ＳＶ−４０で形質転換した細胞株  ＴＴＤ１ＢＲ−ＳＶ（ＴＴＤ−Ａ）およびＭＲＣ５−ＳＶ（野生型）を、３７℃、５％ＣＯ２で、８％ＦＣＳおよび抗生物質を添加した、Ｆ−１０およびＤＭＥＭ（ギブコ）の１：１混合物中で培養した。Ｃ−末端にＨＡ−タグをつけたＴＴＤＡを、発現ベクター  ｐＣＤＮＡ３（インビトロゲン）にクローン化し、この構築物をＴＴＤ１ＢＲＳＶ繊維芽細胞にＦＵＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬（ロッシュ）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクタント（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）を、８Ｊ／ｍ２のトリプル紫外−Ｃ照射に、二日間のインターバルで供試し、ＴＴＤＡ−ＨＡ発現細胞の集団を豊富化した。最後の照射の１週後、安定なトランスフェクタントを、単一細胞にソートした（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）。単一細胞に由来するコロニーを、融合遺伝子の発現に関して抗−ＨＡ免疫蛍光により試験した。選択したクローン（安定してＴＴＤＡ−ＨＡを発現している）を、その修復能力（ＵＶ−生存，  以下を参照されたい）に関して試験した。
【００６１】
免疫沈降および免疫ブロット分析。ＭＲＣ５ＳＶ、ＴＴＤ１ＢＲＳＶおよびＴＴＤ１ＢＲＳＶ＋ｈＴＦＢ５ＨＡからの細胞全体の抽出物を、６ペトリ皿／細胞株（１３ｃｍ）から分離した細胞で調製した。集めた細胞ペレットを、溶解前にＰＢＳ中で１回洗浄し、緩衝剤Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．９；  １５０ｍＭ  塩化ナトリウム；２０％グリセリン；０．１％  ＮＰ４０；  ５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に抗−プロテアーゼを添加した２ｍｌの溶液中でダウンシング（ｄｏｕｎｃｉｎｇ）により（１２．６１ｍｍのダウンスホモジナイザーを用いて２０ストローク，  Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ，  ＩＮＣ．，  ＵＳＡ）溶解させた。ＭＲＣ５ＳＶ、ＴＴＤ１ＢＲＳＶおよびＴＴＤ１ＢＲＳＶ＋ｈＴＦＢ５ＨＡからの細胞抽出物を、緩衝剤Ａ中で、プロテインＡ−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＵＫ）にクロスリンクした、それぞれ抗−ＨＡ（１２ＣＡ５）および抗−ｐ４４（１Ｈ５）抗体と４℃で一晩インキュベーションした。免疫沈降前に、クロスリンクしたビーズを緩衝液Ａ中で３回洗浄した。抽出物とのインキュベーション後、ビーズを緩衝液Ａで頻繁に洗浄し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びに抗−ＸＰＢ（１Ｂ３）、抗−ｃｄｋ７（２Ｆ８）および抗−ＨＡ（３Ｆ１０）を用いた免疫ブロットにより分析した。
【００６２】
質量分析。
ＴＦＩＩＨサブユニットを１５％ポリアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色した（Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ，  Ｔ．  Ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ２−Ｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｇｅｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１２，  ２９７−３０５，  １９９９）。１０ｋＤａマーカー以下に移動したバンドを切り出し、ゲル中でトリプシンで消化した（Ｃａｖｕｓｏｇｌｕ，  Ｎ．，  Ｂｒａｎｄ，  Ｍ．，  Ｔｏｒａ，  Ｌ．  ＆  Ｖａｎ  Ｄｏｒｓｓｅｌａｅｒ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３，  ２１７−２２３，  ２００３）。ペプチド抽出物をスピードバックで濃縮し、Ｃ１８逆相「ＺｉｐＴｉｐ」ピペットチップ（ミリポア）でクロマトグラフィー精製し、そして最終的に２μｌのアセトニトリル５０％中に溶出した。０．５μｌのペプチドを、等量の飽和アルファ―シアノ―４ヒドロキシケイ皮酸（５０％アセトニトリルに溶解）又は同容量の飽和２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２０％アセトニトリルに溶解）の何れかと混合した。両方のマトリックスは、ＬａｓｅｒＢｉｏ  Ｌａｂｓから入手した。質量分析をＢｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＶ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメーターで陽イオンリフレクターモードで実施した。質量の獲得範囲は、８００〜３０００Ｄａであり、低質量ゲート（ｌｏｗ  ｍａｓｓ  ｇａｔｅ）を７００  Ｄａにセットした。内部較正を自己融解のトリプシンペプチド類（ｍ／ｚ＝８４２．５１、２２１１．１１および２８０７．４７を有するＭＨ＋）を用いて実施した。モノアイソトピックペプチド質量を、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｘ−ＴＯＦソフトウェアを用いてマニュアルで割り当てた。パラメータを用いた、データベースサーチ（ＮＣＢＩ，  ヒト起源のタンパク質）：０〜１０ｋＤａの間のＭＷ；トリプシン消化（１つのミス切断は許容される）、カルバミドメチレーションにより修飾したシステイン、メチオニン酸化および質量許容性７５ｐｐｍを、Ｐｒｏｆｏｕｎｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／）で実施した：４つの（５つのうち）ｐ８ペプチドが、アルファ−シアノ−４ヒドロキシケイ皮酸（データ示さず）および２，５−ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとして用いて検出された。
【００６３】
マイクロニードル注射およびＤＮＡ修復アッセイ。ＨＴＦＢ５  ｃＤＮＡ構築物（ＨＡ−タグ有り及び無し）を、ＴＴＤ−Ａ線維芽細胞（ＴＴＤ９９ＲＯ，  ＴＴＤ１ＢＲ）に、文献（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ，．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５４，  １９１−２００，  １９９４）のとおりにマイクロインジェクションした。簡単に説明すると、マイクロインジェクションの３日前に、細胞を不活化したセンダイウイルスを用いて融合し、カバーグラス上に播種した。注射の２４ｈｒｓ後、注射された遺伝子の発現を可能とするため、細胞を１５Ｊ／ｍ２  ＵＶ−Ｃに暴露し、そして３Ｈ−チミジンを添加した培地中で２ｈｒインキュベーションした。遊離した３Ｈ−チミジンの過剰分を除去した後、細胞を固定した。ＤＮＡ修復能力（ＵＶ−誘導した予定外のＤＮＡ修復合成またはＵＤＳ）を、核上のオートラジオグラフィー上の粒子量として決定し、それはＮＥＲ欠乏細胞において通常非常に減少している（詳細に関してはＶｅｒｍｅｕｌｅｎ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２６，  ３０７−１３，  ２０００を参照されたい）。
【００６４】
ＴＴＤ１ＢＲＳＶ（ＴＴＤ−Ａ）線維芽細胞、ＴＴＤ１ＢＲＳＶ＋ｈＴＦＢ５−ＨＡ（ＴＴＤ−Ａ  修正された）およびＮＥＲに熟達したＭＲＣ５ＳＶ（ｗｔ）ヒト繊維芽細胞の紫外線に対する感受性を、３Ｈ−チミジン取り込みにより、以前の記載（Ｓｉｊｂｅｒｓ，  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４，  ３３７０−３３８０，  １９９６およびｖａｎ  Ｇｏｏｌ，  Ａ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｂｏ  Ｊ．  １６，  ５９５５−５９６５，  １９９７）とおり決定した。
【００６５】
ｈＴＦＢ５遺伝子およびｃＤＮＡにおける変異分析。  
トータルＲＮＡ（１０μｇ）を、野生型（Ｃ５ＲＯ）およびＴＴＤＡ初代線維芽細胞（ＴＴＤ９９ＲＯ；  ＴＴＤ１ＢＲ；  ＴＴＤ１３ＰＶおよびＴＴＤ１４ＰＶ）から、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラム（キアゲン，  ＵＳＡ）を用いて抽出し、そして逆転写によるｃＤＮＡの調製のために使用した。逆転写を、ＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｔｍ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロゲン，  ＵＳＡ）を用いて実施した。ｈＴＦＢ５  ｃＤＮＡの増幅を、ｐｕＲｅＴａｑＴＭＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭＰＣＲビーズ（アマシャム，  ＵＳＡ）および１０ｐｍｏｌのプライマー（Ｔｍ：６０°）を用いて実施した。
【００６６】
ゲノムのｈＴＦＢ５のコード領域を、コード領域のエクソン２および３をカバーしている、２セットのプライマーを用いて増幅した。プライマー配列は、請求により利用可能（ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｏｎ  ｒｅｑｕｅｓｔ）である。
ゲノムＤＮＡ（１００−５００ｎｇ）を、ｐｕＲｅＴａｑＴＭＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＴＭＰＣＲビーズ（アマシャム，  ＵＳＡ）および１０ｐｍｏｌの各プライマーセットを用いて増幅した。増幅産物を、Ｔ−ｅａｓｙベクター（プロメガ，  ＵＳＡ）にクローン化した。各細胞株に関して、１８の独立したクローンを、ＢａｓｅＣｌｅａｒ  ｌａｂｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＢａｓｅＣｌｅａｒ，  オランダ）で配列決定した。  
【００６７】
免疫蛍光。マイクロニードル注射またはトランスフェクションの２日後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ−１００（ＰＢＳ−Ｔ）を含有しているＰＢＳ中で１０分間２回水洗することにより透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）し、次にＰＢＳ＋（ＰＢＳ＋０．１５％グリシンおよび０．５％ＢＳＡ）で洗浄した。ＰＢＳ＋で希釈した抗体を、２ｈ、湿室（ｍｏｉｓｔ  ｃｈａｍｂｅｒ）中でＲＴでインキュベーションした、希釈は：抗−ＸＰＢ（ＩＢ３），１０００ｘ；  抗−ＨＡ（３Ｆ１０，  ロシュ），１０００ｘである。引き続いて、カバーグラスをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄（５ｘ；  ５ｍｉｎ）し、それぞれ二次抗体とインキュベーションした：ヤギ抗−マウス、Ｃｙ３−抱合（ジャクソン研究室）；ヤギ抗−ラット、Ａｌｅｘａ４８８−抱合（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、各々ＰＢＳ＋中で１０００ｘ希釈した。同じ洗浄手順の後、カバーグラスを、ＤＡＰＩ（４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール）を含有しているベクタシールド・マウンティングメディウム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）  １．５μｇ／μｌでマウントした。落射蛍光（Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）および位相差イメージを、落射蛍光光学（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｐｔｉｃｓ）を備えたＬｅｉｔｚ  Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ顕微鏡およびＰＬＡＮＡＰＯ  ６３ｘ／１．４０油浸レンズにより取得した。
【００６８】
二重切断ＮＥＲアッセイ（Ｄｕａｌ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ  ＮＥＲ  ａｓｓａｙ）。二重切断アッセイを、以前に記載（Ｒｉｅｄｌ，  Ｔ．，  Ｈａｎａｏｋａ，  Ｆ．  ＆  Ｅｇｌｙ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｅｍｂｏ  Ｊ．  ２２，  ５２９３−５３０３，  ２００３）されたとおり、２５μｌの二重切断緩衝剤（２ｍＭ  ＡＴＰを添加した）中で実施した。各反応には、表示されたとおり、５ｎｇのＸＰＧ、１５ｎｇのＸＰＦ／ＥＲＣＣ１、１０ｎｇのＸＰＣ−ｈＨＲ２３Ｂ、５０ｎｇのＲＰＡ、２５ｎｇのＸＰＡおよびＴＦＩＩＨを含有させた。１０ｍｉｎのプレ−インキュベーション（３０°Ｃでの）後、３０ｎｇのＰｔ  ＤＮＡを添加し、反応を９０ｍｉｎ  ３０°Ｃで継続する。摘出した断片を１４％尿素アクリルアミド上で、９ｎｇの相補的なオリゴヌクレオチドでアニーリングさせ、４つの放射性標識したｄＣＭＰα−Ｐ３２（３０００μＣｉ／ｍｍｏｌ）残基（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖ２．１（ＵＳＢ）により）を添加した後に検出した。修復反応への添加前に、ＴＦＩＩＨを、ｐ８ポリクローナル抗体またはプレ免疫血清の何れかとプレインキュベーションした。ウサギポリクローナルを、ペプチド  ＶＧＥＬＭＤＱＮＡＦＳＬＴＱＫ（５７−７１）を卵白アルブミンに連結し、それをウサギに注射することで産生した。
【００６９】
局所の紫外線照射。培養細胞を、以前の記載（Ｍｏｎｅ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ２，  １０１３−１０１１７，  ２００１およびＶｏｌｋｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ８，  ２１３−２２４，  ２００１）のとおり、直径５μｍの孔を有するアイソポア（ｉｓｏｐｏｒｅ）ポリカーボネートフィルター（ミリポア）を介して、４０Ｊ／ｍ２でＵＶ−照射（２５４ｎｍ）した。引き続いて、フィルター除去後、細胞をパラフォルムアルデヒドで固定し、更に免疫細胞化学のために処理した（上記の通りに）。
【００７０】
アクセッション番号。完全なヒトＴＴＤＡ  ｃＤＮＡ配列は、ＢＣ０６０３１７、ＡＫ０５５１０６またはＡＪ６３４７４３の番号で利用可能である。ヒトゲノムのＴＴＤＡ配列は、ヒト染色体６ｑ２５．３コンティグに見つけられ、これはＨｓ  ３５６２２４およびＮＴ−００７４２２，  ｃｈｒ６コンティグＨｓ＿７５７９の番号で利用可能である。
【００７１】
【表１】
2006020540.tif 000002
【００７２】
【表２】
2006020540.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１ａ】ＴＴＤＡ（ｈＴＦＢ５）がＴＦＩＩＨ複合体の一部であることを示す写真。    ａ．免疫沈降（Ｉ．Ｐ．）アッセイ。レーン１：分子量マーカー；レーン２〜４：ＭＲＣ５ＳＶ（ｗｔ）、ＴＴＤ−ＡおよびＴＴＤ−Ａ＋ｐ８からの全細胞抽出物（ＷＣＥ）；レーン５〜６：ＴＴＤ−ＡおよびＴＴＤ−Ａ＋ｐ８細胞抽出物からのＩ．Ｐ．。右パネル：１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに、ＷＣＥ’ｓからの１０μｇのタンパク質およびα−ｐ４４  Ｉ．Ｐ．細胞抽出物（ＴＴＤ−ＡおよびＴＴＤ−Ａ＋ｐ８からの）をロード。ブロットをα―ＨＡで免疫染色した；矢印はＨＡタグを付けたｐ８に対応する免疫染色されたバンドを示す。中央および左パネル：１１％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、ＷＣＥおよびα−ＨＡ  Ｉ．Ｐ．細胞抽出物（ＴＴＤ−ＡおよびＴＴＤ−Ａ＋ｐ８からの）をロード。ブロットを各々α―ＸＰＢおよびα―ｃｄｋ７で免疫染色した；矢印は対応する免疫染色されたタンパク質を示す。
【図１ｂ】ＴＴＤＡ（ｈＴＦＢ５）がＴＦＩＩＨ複合体の一部であることを示す写真。  ｂ．  ポリペプチドｐ８（ＨＡＰカラムから高度に精製されたＴＦＩＩＨに含有される）は、パネルのトップに示される他の９つの同定されたコンポーネント（１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色および免疫ブロット）と及びＴＦＩＩＨの転写および修復活性と共精製（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｓ）される。下のパネル：イムノブロッティングにより、ＨＡＰ画分中のｐ８が同定される。ウサギポリクローナル抗体（ｐ８のＣ末端側の終端に対して産生されたもの）を、ＴＦＩＩＨを含んでいるＨＡＰ画分におけるｐ８の検出に使用した。
【図１ｃ】ＴＴＤＡ（ｈＴＦＢ５）がＴＦＩＩＨ複合体の一部であることを示す図。  ｃ．ｐ８のＭＡＬＤＩ−ＭＳ同定。上部のパネル：ＭＡＬＤＩペプチド質量フィンガープリント法によるｐ８同定。表に実験的に決定した値およびｐ８トリプシン消化ペプチドの対応する理論的な質量（ｍａｓｓｅｓ）を列挙する。質量の正確性（ａｃｃｕｒａｃｙ）（ｐｐＭ）およびアミノ酸配列も、各ペプチドに対して示される。中央のパネル：ＭＡＬＤＩペプチドフィンガープリント法の結果の概略図。Ｐ８は、ＮＣＢＩデータベースにおけるＣＧ１４０３７遺伝子産物と同定された。
【図２】ＴＴＤ−ＡのＤＮＡ修復欠乏のｈＴＦＢ５による修正（Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）を示す図。  ａ．  ＴＴＤ９９ＲＯ（ＴＴＤ−Ａ）の初代線維芽細胞における、ｈＴＦＢ５（ｐ８）のｗｔ  ｃＤＮＡを含んでいる発現ベクターのマイクロニードル注射。ＤＮＡ修復活性におけるｐ８発現の効果を示す顕微鏡写真。未注射の周囲を取り囲むＴＴＤ−Ａ線維芽細胞（ＴＴＤ−Ａに関して典型的な低い残りの（ｒｅｓｉｄｕａｌ）ＵＤＳレベルを発現する）（１）と比較した場合に、注射された多核化した初代線維芽細胞（２）（矢印で示される）は、それらの核の上部の銀粒子の数から明らかなとおり、高い（野生型）レベルのＵＶ誘導性のＵＤＳを示した。ｐ８マイクロインジェクションによるＵＤＳ修正は、他のＴＴＤグループＡ細胞（ＴＴＤ１ＢＲおよびＴＴＤ１３ＰＶ）に注射した際にも観察された（示さず）。  ｂ．  ３つの無関係のＴＴＤ−Ａ症例に由来する、分析された４つの細胞株において発見された変異を要約する図である。太字で、コドンにおいて変異した塩基を示している。
【図３】ＴＴＤＡのヌクレオチド除去修復の特性を示す図。  ａ．  野生型のＭＲＣ５ＳＶ（クローズの黒色菱形）、ＴＴＤ１ＢＲＳＶ（クローズの赤色三角）およびＴＴＤＡ−ＨＡを発現しているＴＴＤ１ＢＲＳＶ（クローズの緑色四角）の細胞集団を用いたＵＶ生存。生存している細胞のパーセンテージを、ＵＶ−Ｃ用量（Ｊ／ｍ２で）に対してプロットする。  ｂ．  局所的にＵＶ照射（４０Ｊ／ｍ２）されたＴＴＤ１ＢＲＳＶを発現しているＴＴＤＡ−ＨＡは、α−ＨＡ（左のパネル）およびα−ＸＰＢ（右のパネル）抗体で染色される。局所的に傷害された領域が矢印で示される。  ｃ．  ＴＦＩＩＨ  ＨＡＰ分画６（１μｌ）を、抗体なし（レーン１）で、或いはＡｂ−ｐ８（それぞれ、１、５および１０μｇ；レーン２−４）、またはＡｂコントロール（それぞれ、１、５および１０μｇ；レーン５−７）の増加量の何れかでプレ−インキュベーションした、これは二重切断を測定するための傷害されたＤＮＡに加えて、全ての他のＮＥＲ因子；ＸＰＣ−ｈＲ２３ｂ、ＸＰＡ、ＲＰＡ、ＸＰＧおよびＥＲＣＣ１−ＸＰＦを添加する前に実施された。
【図４】ＴＴＤＡ−ＨＡを発現しているＴＴＤ−Ａ線維芽細胞において減少したＴＦＩＩＨ濃度の回復を示す写真。  ａ．  ＴＴＤＡ−ＨＡを発現しているＴＴＤ１ＢＲＳＶの一般的集団（Ｍａｓｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）。ＴＴＤＡ−ＨＡを発現している細胞（左パネル）は、ＸＰＢタンパク質（右パネル）の増加したレベルを示す。  ｂ．  ＴＴＤＡ−ＨＡを発現しているＴＴＤ１ＢＲＳＶの一般的集団（Ｍａｓｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）。ＥＲＣＣ１レベル（右パネル）は、ＴＴＤＡ−ＨＡ発現（左パネル）により影響されない。  ｃ．  ＴＴＤＡ−ＨＡを発現しているＭＲＣ５ＳＶ細胞（左パネル）は、ＸＰＢタンパク質（右パネル）の増加したレベルを示す。
【図５】ヒトＴＦＢ５の一次アミノ酸配列アライメント（そのホモログと共に示す）を示す図。  進化ライン（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｅ）に沿ったｈＴＦＢ５の保存されたホモロジーを示す。アライメント。示されているものは、Ｈ．  Ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍ．  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ａ．  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ（全て７１ａａ）、Ｃ．  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（７８ａａ）、Ｓ．  ｐｏｍｂｅ（６８ａａ）およびＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホモログ（７２ａａ）におけるＴＦＢ５ホモログである。同一のアミノ酸を黒色の網掛けで示し、また物理化学的に関連する残基を淡黒色の網掛けで示す。
【図１ａ】
2006020540.tif 000004
【図１ｂ】
2006020540.tif 000005
【図１ｃ】
2006020540.tif 000006
【図２】
2006020540.tif 000007
【図３】
2006020540.tif 000008
【図４】
2006020540.tif 000009
【図５】
2006020540.tif 000010
【配列表】
2006020540000001.app
【外国語明細書】
2006020540000001.pdf