(57)【要約】      （修正有）【課題】発光効率が高く、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができる新規な化学発光性化合物及びそれから成る標識剤の提供。【解決手段】一般式［Ｉ］で示される化学発光性化合物。2006306752.tif 000049（Ｒ１〜Ｒ７は、そのうちの１つが、例えばフタルカルバジド基等の化学発光基であり、それ以外は、水素あるいは該化合物の発光を阻害しない基である。Ｒ８，Ｒ９はフッ素又はアルコキシ基である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式[I]で示される構造を有する化学発光性化合物。
【化１】
2006306752.tif 000047
ただし、式中、R1ないしR7は、互いに独立して、それらのうち少なくとも１つが化学発光基であり、それ以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R8及びR9は互いに独立にフッ素又はアルコキシ基である。
【請求項２】
前記一般式[I]中のR1ないしR7の少なくとも１つとして、発光波長調整基を有する請求項１記載の化学発光性化合物。
【請求項３】
前記発光波長調整基がアルキル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基及びこれらの誘導体から成る群より選ばれる基である請求項２記載の化学発光性化合物。
【請求項４】
R1及び／又はR7が前記発光波長調整基である請求項２又は３記載の化学発光性化合物。
【請求項５】
前記一般式[I]中のR1ないしR7であって前記化学発光性基、前記発光波長調整基又は水素以外の基として、結合性基及び／又は嵩高基を有する請求項２ないし４のいずれか１項に記載の化学発光性化合物。
【請求項６】
前記結合性基がアミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフィド基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、スクシンイミジルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基並びにこれらの少なくともいずれかを含む基から成る群より選ばれる請求項５記載の化学発光性化合物。
【請求項７】
前記嵩高基が、分枝アルキル基、分枝アルコキシル基又はそれらを骨格とする基である請求項５又は６記載の化学発光性化合物。
【請求項８】
前記化学発光基がフタルカルバジド誘導体、ジオキセタン誘導体、ロフィン誘導体、アクリジン誘導体、インドール誘導体、シュウ酸誘導体、ジフェノイル誘導体又はルシフェリン誘導体である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の化学発光性化合物。
【請求項９】
前記化学発光基が前記一般式[I]に示されるボロンジピロメテン骨格にスペーサーを介することなく直結されている請求項１ないし８のいずれか１項に記載の化学発光性化合物。
【請求項１０】
下記一般式[II]で示される構造を有する請求項１記載の化学発光性化合物。
【化２】
2006306752.tif 000048
ただし、式中、R1aはアルキル基、アルコキシル基、フェニル基又は置換フェニル基（置換基は１ないし５個のアルキル基、アルコキシル基又はモノ−若しくはジ−アルキルアミノ基）、R3aは水素又はアルキル基、R5aは分枝アルコキシル基である。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の化学発光性化合物から成る標識剤。
【請求項１２】
互いに異なる前記発光波長調整基を有し（ただし、１種類の化学発光性化合物のみは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによって発光波長が異なる複数種類の請求項２ないし１１のいずれか１項記載の化学発光性化合物から成る標識剤の組合せ。
【請求項１３】
前記複数の標識剤が、同一の化学発光基を有する請求項１２記載の標識剤の組合せ。
【請求項１４】
請求項１２記載の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法。
【請求項１５】
互いに異なる前記発光波長調整基を有し（ただし、１種類の化学発光性化合物のみは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによって発光波長が異なる複数種類の請求項２ないし１０のいずれか１項に記載の化学発光性化合物を標識剤として用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の物質を同時に測定することを含む複数の標識物質の同時測定方法。
【請求項１６】
前記複数の標識剤が、同一の化学発光基を有する請求項１５記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光性化合物及びそれから成る標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学発光性化合物は、免疫測定をはじめ種々の分野において標識剤として広く用いられている。その多くは、ルシゲニン誘導体等の性能のよい化学発光物質とローダミン等の蛍光色素をスペーサーを介して連結しているものである（特許文献１〜１３）。しかしながら、これらの公知の化学発光性物質では、発光効率が満足できない、安定性が低い又は合成が容易ではない等の問題がある。また、公知の標識剤では、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることは困難である。一方、ボロンジピロメテン骨格を有する蛍光色素が知られている（特許文献１４）。しかしながら、ボロンジピロメテン蛍光色素を他の化学発光基と結合した化学発光性化合物は知られていない。
【０００３】
【特許文献１】国際公開公報WO98/54574
【特許文献２】特開平9-5238号公報
【特許文献３】特開平10-81659号公報
【特許文献４】特開2004-51490号公報
【特許文献５】特開2004-26665号公報
【特許文献６】特開2003-183641号公報
【特許文献７】特開2003-137824号公報
【特許文献８】特開2002-302483号公報
【特許文献９】特開2001-281257号公報
【特許文献１０】特開2001-115155号公報
【特許文献１１】特開2001-81455号公報
【特許文献１２】特開2000-245499号公報
【特許文献１３】特開2000-178550号公報
【特許文献１４】米国特許第5,723,218号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、発光効率が高く、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができる新規な化学発光性化合物及びそれから成る標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ボロンジピロメテン骨格を有する蛍光色素に化学発光基を結合させることにより、発光効率が高く、ボロンジピロメテン骨格に結合している置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記一般式[I]で示される構造を有する化学発光性化合物を提供する。
【０００７】
【化１】
2006306752.tif 000002
【０００８】
ただし、式中、R1ないしR7は、互いに独立して、それらのうち少なくとも１つが化学発光基であり、それ以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R8及びR9は互いに独立にフッ素又はアルコキシ基である。
【０００９】
また、本発明は、上記本発明の化学発光性化合物から成る標識剤を提供する。さらに本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し、それによって発光波長が異なる複数種類の上記本発明の化学発光性化合物から成る標識剤の組合せを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法を提供する。さらに、本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し、それによって発光波長が異なる複数種類の上記本発明の化学発光性化合物を標識剤として用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の該物質を同時に測定することを含む複数の標識物質の同時測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、発光効率が高く、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができる新規な化学発光性化合物及びそれから成る標識剤が提供された。本発明の化学発光性化合物で採用したボロンジピロメテン骨格は、発光効率が高く、特に、本発明の好ましい態様では、化学発光基をボロンジピロメテン骨格にスペーサーを介することなく直接結合させるのでより一層発光効率を高めることができる。また、本発明の化学発光性化合物では、ボロンジピロメテン骨格上の置換基、好ましくは単一の置換基を変更することにより、他の構造が同一であっても蛍光発光波長を大きく変化させることができる。ボロンジピロメテン骨格上に任意の置換基を導入することは常法により容易に行うことができるので、本発明により、蛍光発光波長の異なる複数の化学発光性化合物を容易に合成することができる。そして、これらは、変更された置換基以外の構造、特に反応により化学発光する化学発光基が同一であってよいので、これらの複数の化学発光性物質は、同一条件下で最適に発光させることができる。このため、単一の反応系に関わる複数種類の物質をそれぞれ異なる本発明の化学発光性化合物で標識することにより、該複数種類の物質のそれぞれを同時に測定することが可能になる。これにより、例えば、免疫測定等において、複数種類の異なる被検物質を同時に測定することが可能となり、したがって、本発明により新たな測定手法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上記の通り、本発明の化学発光性化合物は、上記一般式[I]で示される構造を有する。一般式[I]中、R1ないしR7は、互いに独立して、それらのうち少なくとも１つが化学発光基であり、それ以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R8及びR9はフッ素又はアルコキシ基である。
【００１２】
化学発光基は、化学反応により発光する構造を有する基である。本発明の化学発光性化合物では、該化学発光基が発する光によりボロンジピロメテン部分が蛍光を発し、この蛍光が測定される。したがって、化学発光基は、必ずしも可視光を発光するものである必要はなく、ボロンジピロメテン部分を励起して蛍光を発せさせることができる光を発するものであればいずれのものをも採用することができる。このような化学発光基としては、この分野において標識剤として用いられているものであればいずれのものをも用いることができ、種々のものが公知ないしは周知である。好ましい例として、フタルカルバジド誘導体、ジオキセタン誘導体、ロフィン誘導体、アクリジン誘導体、インドール誘導体、シュウ酸誘導体、ジフェノイル誘導体又はルシフェリン誘導体を挙げることができ、これらはいずれもこの分野において周知である。これらの化学発光基は、それぞれ以下の一般式で示されるものである。
【００１３】
【化２】
2006306752.tif 000003
【００１４】
【化３】
2006306752.tif 000004
【００１５】
【化４】
2006306752.tif 000005
【００１６】
【化５】
2006306752.tif 000006
【００１７】
【化６】
2006306752.tif 000007
【００１８】
【化７】
2006306752.tif 000008
【００１９】
【化８】
2006306752.tif 000009
【００２０】
なお、上記各一般式において、Ｒは、互いに独立して水素、アルキル基、アリール基、ハロゲン、アルコキシ、アリールアルキル、シクロアルキル、アシル、ホルミル、シアノ、アルケニル、ヘテロアリール、モノ−又はジ−アルキルアミノなどの置換基であり、各一般式における１つのＲは、ボロンジピロメテン骨格に直接又はスペーサーを介して結合される。なお、アルキル基又はアルキル基部分を含む基の中のアルキル基の炭素数は通常１〜１０程度である。また、本明細書及び請求の範囲において単に「アルキル基」という場合には直鎖状アルキル基及び分枝状アルキル基の両者が包含される。アルコキシル基についても同様である。なお、上記したフタルカルバジド誘導体において、４つのＲのうちのいずれかが-NRaRb(式中、RaRbは互いに独立して水素又はアルキル基）がルミノール誘導体である。
【００２１】
上記した各種化学発光基のうち、発光量子収率が高く、ボロンジピロメテン骨格へのカップリング合成が可能な原料フタル酸が容易に合成できるフタルヒドラジド誘導体が好ましい。
【００２２】
なお、上記した化学発光基は、各化合物において通常１種類のものを１個又は複数個用いることが好ましいが、複数種類のものを結合してもよい。また、化学発光基は、アルキレン基等のスペーサーを介してボロンジピロメテン骨格に結合させることもできるが、化学発光基をできるだけボロンジピロメテン骨格に近づけることにより、ボロンジピロメテン部分から発せられる蛍光の強度を大きくするために、化学発光基はスペーサーを介することなく直接ボロンジピロメテン骨格に結合させることが好ましい。ボロンジピロメテン骨格を蛍光色素として選択したことにより、化学発光基を容易に直結させることができる。
【００２３】
ボロンジピロメテン部分は、そのボロンジピロメテン骨格が蛍光を発するので、R1ないしR7のうち、上記化学発光基以外の基は特に限定されるものではなく、水素又は化合物の発光を阻害しない任意の基であってよい。
【００２４】
本発明の化学発光性化合物の重要な特徴の１つとして、ボロンジピロメテン骨格に結合している置換基を変更することにより、他の部分を変更しなくても蛍光発光の波長を大きく変化させることができるということがある。この特徴を利用すべく、R1ないしR7の少なくとも１つとして発光波長調整基を有することが好ましい。ここで、「発光波長調整基」は、この基を結合させることにより、この基を結合していない場合と比較して蛍光の発光波長が変化する基を意味する。発光波長調整基としては、それをボロンジピロメテン骨格に結合させることによりボロンジピロメテン部分が発する蛍光の波長が、発光波長調整基を有さない化合物の蛍光波長と比べて変化する基であれば特に限定されず、また、ボロンジピロメテン骨格は、その置換基により影響を受けて多かれ少なかれ蛍光波長が変化するので、発光波長調整基は任意の基であってよい。もっとも、単一の基を変更することによって比較的大きく蛍光波長が変化することが好ましく、特に発光波長調整基を有さない場合と比べて長波長側に蛍光波長が変化することが好ましいので、発光波長調整基の好ましい例としてアルキル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基及びこれらの誘導体を挙げることができる。ここで、アルキル基又はアルコキシル基中のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましい。また、アリール基としては、フェニル基及びナフタレン基が好ましく、ヘテロアリール基としては、フェニル基及びナフタレン基中の１個又は複数の炭素原子が窒素、酸素及び／又はイオウで置換された基が好ましい。また、アルキル基又はアルコキシル基の誘導体としては、これらの基を構成する１又は複数の炭素原子に結合している水素原子が、ハロゲン、シアノ基、アルコキシル基、アミノ基、水酸基、モノ−若しくはジ−アルキルアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、チオール基、ジスルフィド基等の基で置換されたものが好ましく、これらの置換基中のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましく、１〜６がさらに好ましい。また、上記アルキル基又はアルコキシル基を構成する１個又は複数の炭素原子が、酸素、イオウ及び窒素の少なくともいずれかで置換された基も上記アルキル基又はアルコキシル基の誘導体として好ましい。また、前記アリール基又はヘテロアリール基の誘導体としては、これらの基を構成する１又は複数の炭素原子に結合している水素原子が、ハロゲン、シアノ基、アルコキシル基、アミノ基、水酸基、モノ−若しくはジ−アルキルアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、チオール基、ジスルフィド基等の基で置換されたものが好ましく、これらの置換基中のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましく、１〜６がさらに好ましい。
【００２５】
発光波長調整基としては、ベンゾクラウン、N-アリールアザクラウン、アミド基等の、分子認識や化学反応によって電子構造が変わり発光波長の変わる置換基を用いることもできる。
【００２６】
ボロンジピロメテン蛍光色素の蛍光波長は、一般式[I]中のR1及びR7に結合する置換基の種類により大きく影響されるので、上記した発光波長調整基は、R1及び／又はR7であることが好ましい。また、発光波長調整基は複数個結合させることができ、異なる種類の発光波長調整基を１つのボロンジピロメテン骨格に結合させることもできる。もっとも、後で詳しく説明する、複数種類の被検物質を同時測定するために複数種類の化学発光標識剤を用いる場合には、各標識剤は同じ条件下で化学発光反応に供することが好都合であるので、各標識剤の化学発光基を同一のものにすることが好ましい。
【００２７】
一般式[I]中のR1ないしR7の少なくとも１つとして、結合性基を有することが好ましい。ここで、結合性基は、他の化合物に結合させるために利用できる基を意味する。化学発光標識剤は、タンパク質、ポリペプチド、糖等の生体関連物質に結合されることが多いため、結合性基としては、これらの生体関連物質との結合に好都合な、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフィド基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、スクシンイミジルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基等を好ましい例としてあげることができる。なお、これらの基は、他の化合物との結合のために用いることができればよいので、これらの基の少なくともいずれかを含む任意の基（例えば、アミノアルキル基等）も結合性基として利用することができる。なお、結合性基は、１つあれば足り、また、結合部位を１つに特定するためにも１つであることが通常好ましいが、２個以上の結合性基を含んでいてもよい。また、後述する嵩高基の一部に上記したアミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基等を結合させて結合性基と嵩高基を兼用することも可能である。
【００２８】
合成の収率を上げるために、一般式[I]中のR1ないしR7の少なくとも１つとして、嵩高基を有していることが好ましい。本発明の化学発光性化合物は、ボロンジピロメテン骨格部分の平面性が高く、また、化学発光基も平面性が高い場合が多いので、化合物が全体として平面的になる場合が多い。このような場合、平面的な化合物が積層され、それぞれの芳香環のπ結合間で生じて各分子同士がπ−π結合され（π−πスタッキング）て凝集が生じ、収率が低下することがある。このような事態を避け、合成収率が低下しないように、π−πスタッキングを防止する嵩高な基を一般式[I]中のR1ないしR7の少なくとも１つとして有していることが好ましい。ここで、嵩高基は、少なくとも直鎖状のアルキル基よりも厚さ方向（ボロンジピロメテン骨格を平面として、該平面に垂直な方向）に厚みのある基であり、好ましくは炭素数１０以上、さらには炭素数１０〜２０の分枝アルキル基や分枝アルコキシル基が好ましい。
【００２９】
さらに、必要に応じ、R1ないしR7の少なくとも１つとして、溶解性を調整する基を含ませてもよい。化学発光標識剤は、水系で用いられることが多いので、化学発光性化合物の親水性を高めて水系中での溶解性を向上させることが望まれる場合には、R1ないしR7の少なくとも１つとして親水性基を含ませてもよい。このような親水性基としては、水酸基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、エーテル結合等の親水性の基を１個又は複数含むアルキル基やアルコキシル基（炭素数は１〜６が好ましい）等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。また、このような親水性の基は上記した嵩高基、結合性基、発光波長調整基等と兼用させてもよい。
【００３０】
一般式[I]中、R8及びR9は互いに独立にフッ素又はアルコキシル基であり、アルコキシル基の炭素数は１〜６が好ましい。
【００３１】
本発明の化学発光性化合物の好ましい例として、下記一般式[II]で示される構造を有する化合物を挙げることができる。
【００３２】
【化９】
2006306752.tif 000010
【００３３】
（ただし、式中、R1aはアルキル基、アルコキシル基、フェニル基又は置換フェニル基（置換基は１ないし５個のアルキル基、アルコキシル基又はモノ−若しくはジ−アルキルアミノ基）、R3aは水素又はアルキル基、R5aは分枝アルコキシル基である）。なお、R1a及びR3a中のルキル基又はアルキル基部分の炭素数は１〜１０が好ましく、R5aの炭素数は１０〜２０が好ましい。一般式[II]中、フタルカルバジド誘導体部分が化学発光基、R1aが発光波長調整基、R3aが水素又は任意の置換基、R5aが嵩高基に相当する。
【００３４】
本発明の化学発光性化合物は、必要に応じて上記した置換基を結合させたボロンジピロメテン骨格に化学発光基を結合させることにより製造することができる。ボロンジピロメテン骨格及び化学発光基はそれぞれ公知であり、その製造方法も公知であるので、本発明の化学発光性化合物は、通常の化学合成により容易に製造することができ、そのいくつかの具体例が下記実施例に詳細に記載されている。
【００３５】
本発明の化学発光性化合物は、化学発光標識剤として用いることができる。化学発光標識剤自体は周知であり、本発明の化学発光性化合物も従来の化学発光標識剤と同様にして用いることができる。すなわち、本発明の化学発光性化合物を、標識すべき被標識物質に結合させることにより被標識物質を標識する。本発明の化学発光性化合物が上記した結合性基を有する場合には、常法により上記結合性基を介して本発明の化学発光性化合物を被標識物質に結合する。結合性基を有さない場合には、常法により結合性基を導入した中間体を調製し、これを被標識物質と結合することができる。
【００３６】
化学発光標識剤の使用の態様は従来と全く同様であり、上記のように被標識物質を標識した後、標識した物質（本明細書において「標識物質」という）を反応に供し、必要に応じて洗浄工程等を行なった後、標識を化学発光させ、該発光を測定する。例えば、化学発光標識剤が広く用いられている免疫測定の場合、次のようにして標識剤を利用することができる。例えば、サンドイッチ法により被検試料中の標的抗原を免疫測定する場合、標的抗原に対する一次抗体を固相に結合し、これを被検試料と反応させて、被検試料中の標的抗原を固相化一次抗体に結合させる。洗浄後、化学発光標識剤で標識した第二抗体を反応させる。洗浄後、標的抗原に結合した第二抗体の化学発光標識剤を、常法に従い化学反応により化学発光させ、発光を測定する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において「測定」には検出、定量、半定量のいずれもが包含される。標識剤の化学発光は、常法により各化学発光標識剤中の化学発光基に応じた化学反応を行なうことにより行うことができる。例えば、化学発光基の好ましい例であるフタルカルバジド誘導体を化学発光基として用いる場合には、周知の通り、触媒であるヘキサシアノ鉄(III)カリウム（フェリシアン化カリウム）の存在下、過酸化水素と反応させることにより化学発光基を発光させることができる。化学発光基からの光でボロンジピロメテン骨格が励起され、ボロンジピロメテン骨格から蛍光が発せられ、この蛍光発光を測定する。
【００３７】
本発明の有利な特徴の１つとして、上記した発光波長調整基を変更することにより、蛍光波長を識別可能な程度に大きく変化させることができるということがある。ボロンジピロメテン骨格上に置換基を結合させることは、通常の化学合成により容易に行うことができる。したがって、蛍光発光の波長が異なる複数種類の本発明の化学発光性化合物を容易に製造することができる。蛍光発光の波長が識別可能な程度に異なる複数種類の本発明の化学発光性化合物を化学発光標識剤として用いることにより、複数種類の物質をそれぞれ異なる化学発光標識剤で標識することが可能となり、ひいては、異なる複数の被検物質を同時に測定することが可能となる。例えば、上記したサンドイッチ法による免疫測定に複数種類の化学発光標識剤を用いる場合、異なる複数種類の二次抗体を蛍光波長が識別可能な程度に異なる標識剤で標識することができ、各標識剤からの発光を識別して測定することにより、複数種類の抗原を同時に免疫測定することができる。なお、用いる複数種類の標識剤は、それぞれの蛍光発光の波長が識別可能な程度に異なっていればよい（すなわち、発光波長域が全くあるいはほとんど重複しない）ので、そのうちの１つは発光波長調整基を有さないものであってもよい。すなわち、本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し（ただし、１種類の化学発光性化合物のみは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによって発光波長が異なる複数種類の本発明の化学発光性化合物を標識剤として用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の該物質を同時に測定することを含む複数の標識物質の同時測定方法をも提供するものであり、また、この同時測定方法に用いられる複数の標識剤の組合せをも提供するものである。
【００３８】
従来、蛍光発光波長が互いに異なる種々の化学発光標識剤が知られているが、それらを組み合わせて用いて複数種類の被検物質を同時に測定しようとしても、各化学発光標識剤を化学発光させる反応自体や最適な反応条件が異なるため、いずれかの標識剤の測定感度が低下したり測定が煩雑になったりする問題がある。これに対し、本発明の化学発光標識剤では、化学発光基や蛍光色素の骨格部分が互いに同一で、ボロンジピロメテン骨格上の置換基のみが異なる複数種類の化学発光標識剤が利用可能であるので、化学発光基の発光反応やその最適な条件が同一である複数種類の標識剤で複数種類の物質をそれぞれ標識することが可能であるから、同一の反応により、いずれの標識剤も高感度に同時に測定することが可能である。これにより、例えば、免疫測定等において、複数種類の異なる被検物質を同時に測定することが可能となり、したがって、本発明により新たな測定手法が提供される。
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
KCB-limeの製造
下記式１３で表される構造を有する本発明の化学発光性化合物(「KCB-lime」と命名）を製造した。
【００４１】
【化１０】
2006306752.tif 000011
【００４２】
化学合成スキームは次の通りである。
【００４３】
【化１１】
2006306752.tif 000012
【００４４】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００４５】
(1)  3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-カルバアルデヒドの合成
【００４６】
【化１２】
2006306752.tif 000013
【００４７】
Ar気流下で2,4-ジメチルピロール (30 g, 315 mmol, 1 eq) とジメチルホルムアミド(DMF) (53.1 mL, 690 mmol, 2.2 eq) をヘキサン (600 mL) に溶解し，1 L三口フラスコに加えて攪拌した．そこに氷冷下，塩化ホスホリル (105.8 g, 690 mmol, 2.2 eq) を1.5時間かけて滴下した．反応系をろ過し，残渣の固体を5 N NaOH水溶液で洗浄した．得られた液体を0℃に冷却し，析出した固体をろ別して目的化合物 (2) (28.8 g, 収率；74.2 %) を黄色固体として得た．
【００４８】
TLC；Rf=0.1 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 9.50 (s, 1 H), 9.46 (s, 1 H), 5.86 (s, 1 H), 2.32 (s, 3 H), 2.30 (s, 3 H). 
【００４９】
(2)  4-メトキシ-1,5-ジヒドロ-ピロール-2-オンの合成
【００５０】
【化１３】
2006306752.tif 000014
【００５１】
500 mLナスフラスコに10%アンモニア水溶液 (300 mL) を入れ，65℃に加熱した．これに滴下ロートから4-クロロ-3-メトキシ-2(E)-ブテノン酸メチルエステル (75.8 g, 461 mmol) を1.5時間かけて滴下した．滴下終了後そのまま4時間攪拌した．反応終了後，放冷し，塩化メチレンを加え，有機相を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をトルエンに溶解させ，過熱し，徐々に温度を下げた．得られた結晶をろ別し，目的化合物 (4) (32.6 g, 収率；62.7%) を白色針状固体として得た．
【００５２】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；クロロホルム/酢酸エチル= 4/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 5.88 (s, 1 H), 5.08 (s, 2 H), 3.93 (s, 2 H), 3.82 (s, 1 H).
【００５３】
(3)   4-(2-ブチル-オクチロキシ)-1,5-ジヒドロ-ピロール-2-オンの合成
【００５４】
【化１４】
2006306752.tif 000015
【００５５】
200 mL三口フラスコに化合物 (4) (30.0 g, 265 mmol, 1 eq) と1,2-ブチル-1-オクタノール (118 mL, 530 mmol, 2 eq) とメタンスルホン酸 (2.4 mL, 33 mmol, 0.13 eq) を加え，80℃で15分攪拌した．その次に80℃のまま減圧下で24 時間攪拌した．反応終了後，放冷し，析出した固体をろ別し，ろ液に飽和NaHCO3水溶液と塩化メチレンを加え，有機相を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム/酢酸エチル= 2/1) で分離精製し，目的化合物 (5) (47.5 g, 収率；67.0%)を白色固体として得た．
【００５６】
TLC ；Rf = 0.1 (溶離液；クロロホルム/酢酸エチル= 2/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 5.65 (s, 1 H), 5.03 (s, 1 H), 3.93 (s, 2 H), 3.82 (d, J =4 Hz, 1 H), 1.74-1.65 (m, 1 H), 1.34-1.28 (m, 16 H), 0.94-0.89 (m, 6 H).
【００５７】
(4)   4-(2-ブチル-オクチロキシ)-5-(3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イルメチレン)
-1,5-ジヒドロ-ピロール-2-オンの合成
【００５８】
【化１５】
2006306752.tif 000016
【００５９】
500 mL三口フラスコに化合物 (5) (16.0 g, 60 mmol, 1 eq) と化合物 (2) (7.4 g, 60 mmol, 1 eq) とDMSO (192 mL) と2N NaOH aq. (172 mL) を加えた．これをAr気流下，60℃で20時間攪拌した．反応終了後，放冷し，析出した固体をろ別し，水で洗浄した．得られた固体 (茶色) を酢酸エチルに溶解させ，水を加えて有機相を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮し，目的化合物 (6) (15.5 g , 収率；69.3%) を茶色固体として得た．
【００６０】
TLC ；Rf = 0.1 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 10.80 (s, 1 H), 10.30 (s, 1 H), 6.34 (s, 1 H), 5.81 (s, 1 H), 5.05 (s, 1 H), 3.54 ( d, J = 5 Hz, 2 H), 2.39 (s, 3 H), 2.16 (s, 1 H), 1.85-1.83 (m, 1 H), 1.39-1.28 (m ,16 H), 0.91-0.86 (m, 6 H).
【００６１】
(5)   トリフルオロ-メタンスルホン酸-4-(2-ブチル -オクチロキシ)-5-(3,5-ジメチル -1H-ピロール-2-イルメチレン)-5H-ピロール-2-イルエステルの合成
【００６２】
【化１６】
2006306752.tif 000017
【００６３】
Ar下，300 mL三口ナスフラスコに化合物 (6) (12.7 g, 34.2 mmol, 1 eq) と塩化メチレン(100 mL) を入れ，0℃に冷却した．そこに塩化メチレン (100 ml) に溶解させたトリフルオロメタンスルホン酸無水物 (14.5 g, 51.3 mmol, 1.5 eq) を滴下ロートから3時間かけて滴下した．その後室温で2日間攪拌した．反応終了後，反応系にsat. NaHCO3 aq.と酢酸エチルを加え，有機相を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル= 40/1)で分離精製し，目的化合物 (7) (5.1 g, 収率；29.7%) を赤褐色オイルとして得た．冷凍保存すると黄色固体になった．
【００６４】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル=40/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 10.70 (s, 1 H), 7.03 (s, 1 H), 5.87 (s, 1 H), 5.37 (s, 1 H), 3.87 (d, J = 6 Hz, 2 H), 2.30 (s, 3 H), 2.20 (s, 1 H), 1.83-1.81 (m, 1 H), 1.39-1.24 (m ,16 H), 0.90-0.86 (m, 6 H).
【００６５】
(6)   5-ブロモ-2-メチル-イソインドール-1,3-ジオンの合成
【００６６】
【化１７】
2006306752.tif 000018
【００６７】
100 mL二口フラスコにトルエン (30 mL)，メチルアミン溶液 (8.2 mL, 88.9 mmol, 1.5 eq) を入れ，4-ブロモフタル酸無水物 (13.5 g, 59.2 mmol, 1 eq) を加えてDean-Starkで7時間還流した．黄緑色透明な溶液になった．放冷後，吸引ろ過し，得られた白色固体を真空乾燥した．目的化合物 (9) ( 10.1 g, 収率；71.0%) を白色固体として得た．
【００６８】
TLC；Rf=0.5 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.98 (s, 1 H), 7.85 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.70 (d, 1 H), 3.18 (s, 3 H).
【００６９】
(7)   2-メチル -5-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-イソインドール-1,3-ジオンの合成
【００７０】
【化１８】
2006306752.tif 000019
【００７１】
100 mLナスフラスコに4-ブロモメチルフタルイミド (3.0 g, 12.5 mmol, 1 eq) を入れ，DMSO (75 mL) に溶解した．そこにビス(ピナコレート)ジボロン (3.3 g, 13 mmol, 1.05 eq) ，PdCl2(dppf) (0.3 g, 0.38 mmol, 0.03 eq) ，KOAc (3.7 g, 37.5 mmol, 3 eq) を加え，Ar下80℃で27時間攪拌した．黒褐色溶液になった．反応終了後，放冷し，トルエンと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム) で分離精製し，目的化合物 (10) (948 mg, 収率；26.3 %) を白色固体として得た．
【００７２】
TLC；Rf=0.2 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.23 (s, 1 H), 8.14 (d, J = 7Hz, 1 H), 7.83 (d, J = 7Hz, 1 H), 3.18 (s, 3 H), 1.37 (s, 12 H ).
【００７３】
(8)   5-[4-(2-ブチル-オクチロキシ)-5-(3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イルメチレン)-5H-ピロール-2-イル]-2-メチル-イソインドール-1,3-ジオンの合成
【００７４】
【化１９】
2006306752.tif 000020
【００７５】
300 mL三口フラスコにジピロメテントリフラート (7) (100 mg, 0.2 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (50 ml) に溶解し，次いで (10) (86.1 mg, 0.3 mmol, 1.5 eq)，K2CO3 (220 mg, 1.6 mmol, 8 eq)，Pd(pph3)4 (116 mg, 0.1 mmol, 0.5 eq) を加えた．Ar気流下，85℃で1日攪拌した．反応終了後放冷し，クロロホルムと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル=40/1) で分離精製し，目的化合物 (11) (20 mg, 収率；19.4%) を赤褐色固体として得た．
【００７６】
TLC；Rf=0.2 (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル= 40/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.36 (s, 1 H), 8.30 (d, J = 5 Hz, 1 H), 7.89 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 5 Hz, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 6.12 (s, 1 H ), 5.93 (s, 1 H), 4.97 (d, J = 2 Hz, 2 H), 3.22 (s, 3 H), 2.44 (s, 3 H), 2.27 (s, 3 H), 1.87-1.80 (m, 1 H), 1.49-1.20 (m ,16 H), 0.95-0.78 (m, 6 H).
【００７７】
(9)   ボロンジピロメテン誘導体の合成
【００７８】
【化２０】
2006306752.tif 000021
【００７９】
50 mLナスフラスコに (11) (20 mg, 0.04 mmol, 1 eq) をトルエン (15 mL) に溶かて入れた．次いでEt3N (0.5 mL)，BF3・Et2O (0.75 mL) を加え，1 時間還流した．反応終了後，放冷し，飽和NaHCO3水溶液を加えて有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；トルエン/酢酸エチル=19/1) で分離精製し，赤色固体を得た．得られた固体をGPCでさらに精製し，目的化合物 (12) (4 mg, 収率；19.4%) を赤色固体として得た．
【００８０】
TLC；Rf=0.2 (溶離液；トルエン/酢酸エチル= 19/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.36 (dd, J = 2, 8 Hz, 1 H), 8.23 (s, 1 H), 7.90 (dd, J = 2, 8 Hz, 1 H), 7.28 (s, 1 H), 6.11 (s, 1 H ), 6.04 (s, 1 H), 4.00 (d, J = 6 Hz 2 H), 3.21 (s, 3 H), 2.49 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 1.89-1.85 (m, 1 H), 1.42-1.25 (m ,16 H), 0.95-0.87 (m, 6 H).
【００８１】
(10)  KCB-limeの合成
【００８２】
【化２１】
2006306752.tif 000022
【００８３】
50 mLナスフラスコに (12) (8.67 mg, 0.02 mmol, 1 eq) を取り，エタノール (4 mL) に溶かした．そこにヒドラジン一水和物 (40 μL, 0.82 mmol, 57 eq) を入れて30 分還流した．反応終了後，放冷し，エーテルと１N HCl aqを加えて有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．目的化合物 (13) (12.5 mg, 収率；147%) を赤色固体として得た．
【００８４】
TLC；Rf=0.1 (溶離液；トルエン/ 酢酸エチル= 1/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.64 (s, 1 H), 8.57 (s, 1 H), 8.30 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.26 (s, 1 H), 6.17 (s, 1 H ), 6.10 (s, 1 H), 4.00 (d, J = 5 Hz, 2 H), 2.51 (s, 3 H), 2.30 (s, 3 H), 1.87-1.83 (m, 1 H), 1.62-1.28 (m ,16 H), 1.05-0.85 (m, 6 H).
【００８５】
(7')  4-ボロナートメチルフタルイミドの合成
【００８６】
【化２２】
2006306752.tif 000023
【００８７】
100 mLナスフラスコに4-ブロモメチルフタルイミド (879 mg, 3.7 mmol, 1 eq) を入れ，DMSO (45 mL) に溶解した．そこにビス(ネオペンチルグリコラート)ジボロン (867 mg, 3.8 mmol, 1.05 eq)，PdCl2(dppf) (89.8 mg, 0.11 mmol, 0.03 eq) ，KOAc (1.08 g, 11 mmol, 3 eq) を加え，Ar下80℃で7 時間攪拌した．黒褐色溶液になった．反応終了後，放冷し，トルエンと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム) で分離精製し，目的化合物 (10') (614 mg, 収率；61.4%) を白色固体として得た．
【００８８】
TLC；Rf=0.2 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.27 (s, 1 H), 8.13 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7.80 (d, J = 7 Hz, 1 H), 3.81 (s, 4 H), 3.18 (s, 3 H), 1.04 (s, 6 H).
【００８９】
(8')   5-[4-(2-ブチル -オクチロキシ)-5-(3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イルメチレン)-5H-ピロール-2-イル]-2-メチル-イソインドール-1,3-ジオンの合成
【００９０】
【化２３】
2006306752.tif 000024
【００９１】
300 mL三口フラスコにジピロメテントリフラート (7) (126 mg, 0.25 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (50 mL) に溶解し，次いで (10') (100 mg, 0.37 mmol, 1.5 eq)，K2CO3 (276 mg, 2.0 mmol, 8 eq)，Pd(pph3)4  (144 mg, 0.13 mmol, 0.5 eq) を加えた．Ar気流下，85℃で1日攪拌した．反応終了後放冷し，クロロホルムと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル=40/1) で分離精製し，目的化合物 (11) (61 mg, 収率；47.2 %) を赤褐色固体として得た．
【００９２】
TLC；Rf=0.2 (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル= 40/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.36 (s, 1 H), 8.30 (d, J = 5 Hz, 1 H), 7.89 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 5 Hz, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 6.12 (s, 1 H ), 5.93 (s, 1 H), 4.97 (d, J = 2 Hz 2 H), 3.22 (s, 3 H), 2.44 (s, 3 H), 2.27 (s, 3 H), 1.87-1.80 (m, 1 H), 1.49-1.20 (m ,16 H), 0.95-0.78 (m, 6 H).
【実施例２】
【００９３】
KCB-orangeの製造
下記式２２で表される構造を有する本発明の化学発光性化合物(「KCB-orange」と命名）を製造した。
【００９４】
【化２４】
2006306752.tif 000025
【００９５】
化学合成スキームは次の通りである。
【００９６】
【化２５】
2006306752.tif 000026
【００９７】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００９８】
(1)   2-(4-メトキシ-フェニル)-ピロール-1-カルボン酸tert-ブチルエステルの合成
【００９９】
【化２６】
2006306752.tif 000027
【０１００】
300 mL三口フラスコにN-tert-ブトキシカルボニル-2-ブロモピロール(7.5 g , 30.5 mmol, 1 eq)，4-メトキシフェニルボロン酸 (4.6 g, 30.5 mmol, 1 eq)， Pd(PPh3)4 (347 mg, 0.3 mmol, 0.01 eq) を入れ，次いで超音波脱気した2 N Na2CO3 aq (18 mL, 36.6 mmol, 1.2 eq) を入れた．そこにトルエン (150 mL)，メタノール (30 ml) を加え，真空脱気し，Ar気流下80℃で20 時間攪拌した．反応終了後，水を加え，有機相を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル= 29/1) で分離精製し，目的化合物 (15) (4.3 g , 収率；51.8%) を無色透明の油状物として得た．
【０１０１】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル=29/1 , v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.32 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 7.27 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.20 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.13 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 3.83 (s, 3 H), 1.39 (s, 9 H).
【０１０２】
(2)   2-(4-メトキシ-フェニル)-1H-ピロールの合成
【０１０３】
【化２７】
2006306752.tif 000028
【０１０４】
200 mL二口フラスコに化合物 (15) (4.3 g, 15.7 mmol, 1 eq) を入れ，THF (70 mL) に溶解した．次いで28% NaOMeメタノール溶液 (15 mL) を加え，室温で3 時間攪拌した．反応終了後，トルエンと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．目的化合物 (16) (2.64 g, 収率；97.8%) を茶白色固体として得た．
【０１０５】
TLC ；Rf = 0.1 (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル=29/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.30 (s, 1 H), 7.38 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.80 (d, J = 2 Hz, 1 H), 6.40 (s, 1 H), 6.28 (d, J = 3 Hz, 1 H ), 3.81 (s, 3 H).
【０１０６】
(3)   5-(4-メトキシ-フェニル)-1H-ピロール-2-カルバアルデヒドの合成
【０１０７】
【化２８】
2006306752.tif 000029
【０１０８】
100 mL三口フラスコにN2気流下化合物 (16) (2.6 g, 15 mmol, 1 eq) を塩化メチレン (30 mL) に溶解して入れ，DMF (2.6 mL, 30 mmol, 2 eq) を加えた．次いでPOCl3 (4.6 g, 30 mmol, 2 eq) を0℃氷浴中で滴下した．茶色の透明溶液から黒緑色の透明溶液に変化した．滴下終了後，5 N NaOH aq (30 mL) を加え，加水分解し，塩化メチレンと水を加えて有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル=40/1) で分離精製し，目的化合物 (17) (2.56 g, 収率；84.8%) を桃色固体として得た．
【０１０９】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル=40/1, v/ v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 10.10 (s, 1 H), 9.47 (s, 1 H), 7.60 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.02 (d, J = 4 Hz, 1 H), 6.95 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.50 (d, J = 9 Hz, 1 H), 3.84 (s, 3 H).
【０１１０】
(4)   4-(2-ブチル -オクチロキシ)-5-[5-(4-メトキシ -フェニル)-1H-ピロール -2-イルメチレン]-1,5-ジヒドロ-ピロール-2-オンの合成
【０１１１】
【化２９】
2006306752.tif 000030
【０１１２】
50 mL三口フラスコにAr気流下，化合物 (17) (284 mg, 1.4 mmol, 1 eq) をDMSO (4.5 mL) に溶かして入れ，化合物 (5) (750 mg, 2.8 mmol, 2 eq)，2 N NaOH aq (4.5 mL) を加えた．Ar気流下60℃で48時間攪拌した．反応終了後，水を加えて吸引ろ過を行ない，得られたろ物を酢酸エチルに溶かして水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム/酢酸エチル=19/1) で分離精製し，目的化合物 (18) (153 mg, 収率；24.3%) を黄色固体として得た．
【０１１３】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；クロロホルム/酢酸エチル=19/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 11.4 (s, 1 H), 10.5 (s, 1 H), 7.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.94 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.52 (s, 2 H), 6.34 (s, 1 H), 5.09 (s, 1 H), 3.92 (d, J = 5 Hz, 2 H), 3.86 (s, 3 H), 1.87-1.83 (m, 1 H), 1.42-1.28 (m, 16 H), 0.95-0.83 (m, 6 H).
【０１１４】
(5)   トリフルオロ-メタンスルホン酸4-(2-ブチル -オクチロキシ)-5-[5-(4-メトキシ -フェニル)-1H-ピロール-2-イルメチレン]-5H-ピロール-2-イルエステルの合成
【０１１５】
【化３０】
2006306752.tif 000031
【０１１６】
Ar下，50 mL三口フラスコに化合物 (18) (153 mg, 0.34 mmol, 1 eq) を塩化メチレン (15 mL) に溶かして入れ，0 ℃に冷却した．そこに塩化メチレン (5 mL) に溶解させたトリフルオロメタンスルホン酸 (677 mg, 2.4 mmol, 2 eq) を滴下ロートから10分間かけて滴下した．その後室温で2時間攪拌した．反応終了後，反応系に飽和NaHCO3水溶液と酢酸エチルを加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別し，溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン/塩化メチレン=9/1) で分離精製し，目的化合物 (19) (35 mg, 収率；17.7%) を黄色固体として得た．
【０１１７】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；ヘキサン/塩化メチレン= 9/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 10.5 (s, 1 H), 7.50 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.23 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.96 (s, 1 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.55 (s, 1 H), 5.30 (d, J = 5 Hz, 1 H), 3.82 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.79 (s, 3 H), 1.78-1.72 (m, 1 H), 1.23-1.03 (m, 16 H), 0.85-0.72 (m, 6 H).
【０１１８】
(6)   5-{4-(2-ブチル -オクチロキシ)-5-[5-(4-メトキシ -フェニル)-1H-ピロール -2-イルメチレン]-5H-ピロール-2-イル}-2-メチル-イソインドール-1,3-ジオンの合成
【０１１９】
【化３１】
2006306752.tif 000032
【０１２０】
300 mL三口フラスコに化合物 (19) (35 mg, 0.06 mmol, 1 eq) を1,4-dioxane (20 mL) に溶解し，次いで (10') (24.6 mg, 0.09 mmol, 1.5 eq)，K2CO3 (66.3 mg, 0.48 mmol, 8 eq)，Pd(pph3)4 (34.7 mg, 0.03 mmol, 0.5 eq) を加えた．Ar気流下，85℃で1日攪拌した．反応終了後放冷し，クロロホルムと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル=80/1) で分離精製し，目的化合物 (20) (10 mg, 収率；28.1%) を赤褐色固体として得た．
【０１２１】
TLC；Rf=0.5 (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル=80/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ8.23 (s, 1 H), 8.20 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.80 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.41 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.03 (s, 1 H), 7.01 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.66 (s, 1 H), 6.09 (s, 1 H), 3.95 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.92 (s, 3 H), 3.18 (s, 3 H), 1.88-1.80 (m, 1 H), 1.50-1.15 (m, 16 H), 0.95-0.80 (m, 6 H).
【０１２２】
(7)   ボロンジピロメテン誘導体の合成
【０１２３】
【化３２】
2006306752.tif 000033
【０１２４】
50 mLナスフラスコに (20) (10 mg, 0.017 mmol, 1 eq) をトルエン (15 mL) に溶かして入れた．次いでEt3N (0.5 mL)，BF3・Et2O (0.75 mL) を加え，1 時間refluxした．反応終了後，放冷し，sat.NaHCO3 aqを加えて有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；トルエン/酢酸エチル=49/1) で分離精製し，その後GPCでさらに精製し，目的化合物 (21) (6 mg, 収率；55.5%) を赤紫色固体として得た．
【０１２５】
TLC；Rf=0.2 (溶離液；トルエン/酢酸エチル=49/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.20 (dd, J = 2, 8 Hz, 1 H), 8.05 (d, J = 2 Hz 1 H), 7.80 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.33 (s, 1 H), 7.24 (d, J = 9 Hz, 2 H ), 7.23 (s, 1 H), 6.89 (d, J = 9 Hz 2 H), 6.87 (s, 1 H), 5.96 (s, 1 H), 4.00 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.83 (s, 3 H), 3.17 (s, 1H), 1.86-1.82 (m, 1 H), 1.33-0.93 (m ,16 H), 0.90-0.81 (m, 6 H).
【０１２６】
(8)   KCB-orangeの合成
【０１２７】
【化３３】
2006306752.tif 000034
【０１２８】
50 mLナスフラスコに (21) (2.5 mg, 0.004 mmol, 1 eq) を取り，エタノール (4 mL) に溶かした．そこにヒドラジン一水和物 (40 μL, 0.82 mmol, 57 eq) を入れて30分refluxした．反応終了後，放冷し，ジエチルエーテルと１N HCl aqを加えて有機層を抽出した．
有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．目的化合物 (22) (2.6 mg, 収率；104%) を赤色固体として得た．
【０１２９】
TLC；Rf=0.1 (溶離液；トルエン/酢酸エチル= 1/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.50 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.48 (s, 1 H), 8.24 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.34 (s, 1 H), 7.32 (s, 1 H), 7.31 (d, J = 9 Hz, 2 H ), 6.90 (d, J = 9 Hz 2 H ), 6.88 (s, 1 H), 6.09 (s, 1 H), 4.03 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.83 (s, 3 H), 3.17 (s, 1H), 1.90-1.82 (m, 1 H), 1.40-1.11 (m, 16 H), 0.98-0.85 (m, 6 H).
【実施例３】
【０１３０】
KCB-appleの製造
下記式３０で表される構造を有する本発明の化学発光性化合物(「KCB-apple」と命名）を製造した。
【０１３１】
【化３４】
2006306752.tif 000035
【０１３２】
化学合成スキームは次の通りである。
【０１３３】
【化３５】
2006306752.tif 000036
【０１３４】
以下、各工程について詳細に説明する。
【０１３５】
(1)   2-(4-ジメチルアミノ)-ピロール-1-カルボン酸tert-ブチルエステルの合成
【０１３６】
【化３６】
2006306752.tif 000037
【０１３７】
300 mL三口フラスコにN-tert-ブトキシカルボニル-2-ブロモピロール (6.67 g , 27 mmol, 1 eq)，4-ジメチルアミノボロン酸 (4.47 g, 27 mmol, 1 eq)，Pd(PPh3)4 (312 mg, 0.3 mmol, 0.01 eq) を入れ，次いで超音波脱気した2 N Na2CO3 aq (20 mL, 32.4 mmol, 1.2 eq) を入れた．そこにトルエン (150 mL)，メタノール (30 mL) を加え，真空脱気し，Ar気流下80℃で22 時間攪拌した．反応終了後，水を加え，有機相を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル=29/1) で分離精製し，目的化合物 (23)  (3.39 g , 収率；44.0 %) をうすい灰色固体として得た．
【０１３８】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル=29/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.29 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 7.23 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.71 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.19 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.11 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H ), 2.96 (s, 6 H), 1.41 (s, 9 H).
【０１３９】
(2)  ジメチル-[4-(1H-ピロール-2-イル)-フェニル]-アミンの合成
【０１４０】
【化３７】
2006306752.tif 000038
【０１４１】
100 mL二口フラスコに化合物 (23) (3.39 g, 11.8 mmol, 1 eq) を入れ，THF (60 mL) に溶解した．次いで28% NaOMeメタノール溶液 (11 mL) を加え，室温で1時間攪拌した．反応終了後，トルエンと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．目的化合物 (24) (1.98 g, 収率；90.0%) を銀白色固体として得た．
【０１４２】
TLC ；Rf = 0.1 (溶離液；ヘキサン/酢酸エチル= 29/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.30 (s, 1 H), 7.35 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.80 (dd, J = 4,4 Hz, 1 H), 6.75 (dd, J = 9 Hz, 2 H), 6.35 (dd, J = 4,6 Hz , 1 H), 6.27 (dd, J = 4,6 Hz, 1 H ), 2.96 (s, 6 H).
【０１４３】
(3)  5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-1H-ピロール-2-カルバアルデヒドの合成
【０１４４】
【化３８】
2006306752.tif 000039
【０１４５】
100 mL三口フラスコにN2気流下化合物 (24) (1.98 g, 10.6 mmol, 1 eq) を塩化メチレン(45 mL) に溶解して入れ，DMF (3.0 mL, 21.2 mmol, 2 eq) を加えた．次いでPOCl3 (2.1 mL, 21.2 mmol, 2 eq) を0℃氷浴中で滴下し，2時間攪拌した．こげ茶色の透明溶液から青緑色の透明溶液に変化した．滴下終了後，5 N NaOH aq (30 mL) を加え，加水分解し，塩化メチレンと水を加えて有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム) で分離精製し，目的化合物 (25) (1.05 g, 収率；46.3%) を緑白色固体として得た．
【０１４６】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 9.43 (s, 1 H), 9.33 (s, 1 H), 7.47 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.99 (dd, J = 4,6 Hz, 1 H), 6.75 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.50 (dd, J = 4,6 Hz, 1 H), 3.02 (s, 6 H).
【０１４７】
(4)   4-(2-ブチル -オクチロキシ)-5-[5-(4-ジメチルアミノ -フェニル)-1H-ピロール -2-イルメチレン]-1,5-ジヒドロ-ピロール-2-オンの合成
【０１４８】
【化３９】
2006306752.tif 000040
【０１４９】
50 mL三口フラスコにAr気流下，化合物 (25) (350 mg, 1.6 mmol, 1 eq) をDMSO (5 mL) に溶かして入れ，化合物 (5) (655 mg, 2.5 mmol, 1.5 eq)，2 N NaOH aq (5 mL) を加えた．Ar気流下60℃で48時間攪拌した．反応終了後，水を加えて吸引ろ過を行ない，得られたろ物を酢酸エチルに溶かして水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム/酢酸エチル=40/1) で分離精製し，目的化合物 (26) (335mg, 収率；44.3%)をオレンジ色固体として得た．
【０１５０】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；クロロホルム/酢酸エチル=40/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 11.7 (s, 1 H), 10.5(s, 1 H), 7.82 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.76 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.51 (dd, J = 3,3 Hz, 1 H), 6.46 (dd, J = 3,3 Hz, 1 H), 6.34(s, 1 H), 5.12(s, 1 H), 3.88 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.00 (s, 6 H), 1.87-1.81 (m, 1 H), 1.40-1.30 (m, 16 H), 0.92-0.87 (m, 6 H).
【０１５１】
(5)   トリフルオロ-メタンスルホン酸4-(2-ブチル -オクチロキシ)-5-[5-(4-ジメチルアミノ-フェニル)-1H-ピロール-2-イルメチレン]-5H-ピロール-2-イルエステルの合成
【０１５２】
【化４０】
2006306752.tif 000041
【０１５３】
Ar下，50 mL三口フラスコに化合物 (26) (335 mg, 0.72 mmol, 1 eq) を塩化メチレン (15 mL) に溶かして入れ，0℃に冷却した．そこに塩化メチレン (5 mL) に溶解させたトリフルオロメタンスルホン酸 (406 mg, 1.44 mmol, 2 eq) を滴下ロートから10分間かけて滴下した．その後室温で2時間攪拌した．反応終了後，反応系に飽和NaHCO3 水溶液と酢酸エチルを加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別し，溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン/クロロホルム=6/1) で分離精製し，目的化合物 (27) (163 mg, 収率；38.0%) を赤色光沢固体として得た．
【０１５４】
TLC ；Rf = 0.2 (溶離液；ヘキサン/クロロホルム=6/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 11.4 (s, 1 H), 7.52 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7.01 (s, 1 H), 6.78 (s, 1 H), 6.75 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.52 (s, 1 H), 5.37 (s, 1 H), 3.88 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.02 (s, 6 H), 1.82-1.76 (m, 1 H), 1.40-1.29 (m, 16 H), 0.94-0.87 (m, 6 H).
【０１５５】
(6)   5-{4-(2-ブチル-オクチロキシ)-5-[5-(4-ジメチルアミノ -フェニル)-1H-ピロール-2-イルメチレン]-5H-ピロール-2-イル}-2-メチル-イソインドール-1,3-ジオンの合成
【０１５６】
【化４１】
2006306752.tif 000042
【０１５７】
100 mL三口フラスコに化合物 (27) (163 mg, 0.27 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (70 mL)に溶解し，次いで (10') (110 mg, 0.41 mmol, 1.5 eq)，K2CO3 (299 mg, 2.16 mmol, 8 eq)，Pd(pph3)4 (156 mg, 0.14 mmol, 0.5 eq) を加えた．Ar気流下，85℃で1日攪拌した．反応終了後放冷し，クロロホルムと水を加え，有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；塩化メチレン/酢酸エチル=40/1) で分離精製し，目的化合物 (28) (41 mg, 収率；24.7%) を黒青緑色固体として得た．
【０１５８】
TLC；Rf=0.3 (溶離液；塩化メチレン/ 酢酸エチル= 40/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.49 (s, 1 H), 8.32 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.86 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.84 (s, 1 H), 7.72 (s, 1 H), 7.64 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.02 (s, 1 H), 6.89 (d, J = 8 Hz, 1 H), 6.14 (s, 1 H), 3.96 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.19 (s, 6H), 3.08 (s, 3 H), 1.88-1.80 (m, 1 H), 1.50-1.15 (m, 16 H), 0.93-0.89 (m, 6 H).
【０１５９】
(7)  ボロンジピロメテン誘導体の合成
【０１６０】
【化４２】
2006306752.tif 000043
【０１６１】
50 mLナスフラスコに (28) (38 mg, 0.06 mmol, 1 eq) をトルエン (15 mL) に溶かて入れた．次いでEt3N (0.5 mL)，BF3・Et2O (0.75 mL) を加え，1時間還流した．反応終了後，放冷し，飽和NaHCO3水溶液を加えて有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；トルエン/酢酸エチル=40/1) で分離精製し，その後GPCでさらに精製し，目的化合物 (29) (16 mg, 収率；39.0%) を青緑色固体として得た．
【０１６２】
TLC；Rf=0.2 (溶離液；トルエン/酢酸エチル=40/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.33 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.87 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.86 (s, 1 H), 7.27 (s, 1 H), 7.07 (d, J = 4 Hz, 1 H ), 6.72 (s, 1 H), 6.70 (d, J = 4 Hz, 1 H), 6.01 (s, 1 H), 4.00 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.20 (s, 3 H), 3.02 (s, 6 H), 1.85-1.83 (m, 1 H), 1.44-1.25 (m ,16 H), 0.95-0.88 (m, 6 H).
【０１６３】
(8)   KCB-appleの合成
【０１６４】
【化４３】
2006306752.tif 000044
【０１６５】
50 mLナスフラスコに (29) (2.0 mg, 0.003 mmol, 1 eq) を取り，エタノール (4 mL) に溶かした．そこにヒドラジン一水和物 (40μL, 0.82 mmol, 57 eq) を入れて30 分還流した．反応終了後，放冷し，ジエチルエーテルと１N HCl aqを加えて有機層を抽出した．有機層を飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した．目的化合物 (30) (1.9 mg, 収率；95%) を青緑色固体として得た．
【０１６６】
TLC；Rf=0.1 (溶離液；トルエン/酢酸エチル= 1/1, v/v)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.60 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8.59 (s, 1 H), 7.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.31 (s, 1 H), 7.29 (s, 1 H), 7.07 (d, J = 4 Hz, 1 H ), 6.70 (d, J = 9 Hz 2 H ), 6.15 (s, 1 H), 4.31 (s, 1 H), 4.03 (d, J = 6 Hz, 2 H), 3.01 (s, 6H), 2.28-2.00 (m, 1 H), 1.55-1.26 (m,16 H), 0.99-0.83 (m, 6 H).
【実施例４】
【０１６７】
実施例１、２及び３でそれぞれ合成したKCB-lime、KCB-orange及びKCB-appleの発光状態を目視観察した。KCB(lime/orange/apple)のエタノール溶液に，A液(30％H2O2水溶液:10％NaOH水溶液=10:1)とB液(1 mmol/l ヘキサシアノ鉄(III)カリウム)を加え，よく振り混ぜたところ，それぞれ黄緑色・オレンジ色・赤色の発光色が目視ではっきり識別できた．
【０１６８】
次に、上記と同様の条件下でKCB-lime、KCB-orange及びKCB-appleを発光させ、発光スペクトルを測定した。測定には，ダブルビーム型分光光度計（日立U-2001）と分光蛍光光度計（日立F-4500）を用いた．なお，発光スペクトルの測定では，分光蛍光光度計（日立F-4500）において「発光」モードを選択した．発光スペクトル測定の際の装置条件を下記表１に示す．なお、KCB-appleに関しては，発光強度が弱かったため，他の２つより装置条件の感度をあげて測定した．
【０１６９】
【表１】
2006306752.tif 000045
【０１７０】
測定した発光スペクトルを図１に示す。図１に示されるように、KCB-limeの発光波長のピークは545nm、KCB-orangeは567nm、KCB-appleは672nmと、互いに明瞭に異なっていた。このことから、本発明の化学発光性化合物では、ボロンジピロメテン骨格に結合する置換基を変えるだけで、同一の条件下で発光させた際に、発光波長ピークが明らかに異なる複数の化学発光性化合物を製造することが可能であることが明らかになった。
【０１７１】
KCB-appleの発光波長のピークである672nmでは、他の２つの発光はほとんど全く観察されない。また、KCB-lime及びKCB-orangeの発光波長ピークである545nm及び567nmでは、互いに他の化学発光性化合物の発光も一部観察されるが、図１によりそれぞれの発光強度の比率が明らかになっているので、各ピーク波長で発光強度を測定することによりそれぞれの濃度を算出することが可能である。したがって、これらの化学発光性化合物で、複数の異なる物質をそれぞれ標識することにより、複数の被検物質の同時測定が可能である。
【０１７２】
ちなみに、各化学発光性化合物の発光後の蛍光スペクトルを測定し、発光スペクトルと比較した。結果を下記表２に示す。
【０１７３】
【表２】
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【０１７４】
表２に示されるように、発光後の蛍光スペクトルは、発光スペクトルにほぼ一致している。このことから、発光は、ボロンジピロメテン部分の蛍光発光であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】本発明の実施例で合成した各化学発光性化合物の発光スペクトルを示す図である。
【図１】
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