(57)【要約】【課題】  ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品と拮抗せず、且つ薬効の低減を抑制することが可能な納豆菌の選抜方法と、この納豆菌で製造された納豆を提供する。【解決手段】  納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜することによってビタミンＫ低生産性納豆菌が選抜できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項２】
納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する第１の工程と、
前記第１の工程から得られた納豆菌に加熱処理を行い、該加熱処理後の納豆菌から耐熱性納豆菌を選抜する第２の工程と、を含む
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項３】
納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する第１の工程と、
前記第１の工程から得られた納豆菌をビタミンＫ誘導体添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する第２の工程と、を含む
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項４】
納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する第１の工程と、
前記第１の工程から得られた納豆菌をビタミンＫ誘導体添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する第２の工程と、
前記第２の工程から得られた納豆菌に加熱処理を行い、該加熱処理後の納豆菌から耐熱性納豆菌を選抜する第３の工程と、を含む
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項５】
前記抗生物質は、ストレプトマイシンを含むアミノグルコシド系抗生物質であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項６】
前記抗生物質は、ストレプトマイシンまたはクロラムフェニコール、のうち、少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項７】
前記ビタミンＫ誘導体添加培地として、ビタミンＫ３（メナジオン）添加培地を用いたことを特徴とする請求項３または請求項４記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項８】
前記請求項１乃至請求項７のいずれか一項記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法で得られた納豆菌を用いて製造された納豆のうち粘性試験により粘性を有する納豆の納豆菌を選抜する
ことを特徴とするビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法。
【請求項９】
前記請求項１乃至請求項８のいずれか一項記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌。
【請求項１０】
前記請求項９記載のビタミンＫ低生産性納豆菌を用いて製造された納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品と拮抗せず、且つ薬効の低減を抑制することが可能なビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法並びにビタミンＫ低生産性納豆菌と、この納豆菌で製造された納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、稲ワラや枯れ草等に多く生息する枯草菌の一種である納豆菌を繁殖させて作った発酵食品であって、その粘性から糸引き納豆ともいわれている。そして、この納豆は良質なたんぱく質やイソフラボンを豊富に含み、その性質と利用方法が多く報告されてきた。例えば、特許文献１には、血栓溶解酵素活性が高く、かつ粘質物生産量が高い納豆とその製造方法、及びこれを製造するための納豆菌が示されている。
【特許文献１】特開２００１−２３８６６７号公報
【特許文献２】特開平３−２９７３５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上述のような栄養素を含有し、高い血栓溶解酵素活性を示す納豆は、血液凝固因子の生成に必要なビタミンＫ（主にビタミンＫ２）を生産することが知られている。このビタミンＫ（主にビタミンＫ２）は、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品と拮抗し、且つ薬効を低減させてしまうので、医薬品の抗血液凝固作用を低下させる等の影響を与えるおそれがある。従って、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品を服用する血栓塞栓症患者等は、栄養素を豊富に含み、かつ高い血栓溶解酵素活性を示す納豆を食したい場合であっても、納豆中に含まれるビタミンＫ（主にビタミンＫ２）のために納豆の厳格な食餌制限がなされているという問題を抱えている。
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品の拮抗せず、且つ薬効の低減を抑制することが可能な納豆菌の選抜方法と、この納豆菌で製造された納豆を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、請求項１の発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法は、納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する構成となっている。
【０００６】
この選抜方法は、ビタミンＫ生成能が低下すると抗生物質の取り込み能が低下し耐性を得るという特性を活用したものである。つまり、培養された納豆菌は抗生物質を添加した培地で選抜するので、抗生物質に対して高い耐性を有し、かつビタミンＫ生産性が低い納豆菌である。
【０００７】
また、請求項２の発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法は、納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する第１の工程と、前記第１の工程から得られた納豆菌に加熱処理を行い、該加熱処理後の納豆菌から耐熱性納豆菌を選抜する第２の工程と、を含む構成となっている。
【０００８】
この請求項２の発明によれば、請求項１の作用に加え、芽胞を形成していて熱に強く生育速度の良好な納豆菌を選抜することができる。
【０００９】
また、請求項３の発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法は、納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する第１の工程と、前記第１の工程から得られた納豆菌をビタミンＫ誘導体添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する第２の工程と、を含む構成となっている。
【００１０】
この請求項３の発明によれば、請求項１の作用に加え、ビタミンを栄養源として選抜し増殖する納豆菌のみを選抜することができるので、この納豆菌はビタミン要求性株であることが判明する。尚、この培地に添加するビタミンＫ誘導体はビタミンＫ３（メナジオン）であることが好ましい（請求項７）。
【００１１】
また、請求項４の発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法は、納豆菌が生息し得る抗生物質を添加した培地に納豆菌を接種し、該培地に接種された該納豆菌から培養可能な納豆菌を選抜する第１の工程と、前記第１の工程から得られた納豆菌をビタミンＫ誘導体添加培地で培養し、培養された納豆菌から増殖可能な納豆菌を選抜する第２の工程と、前記第２の工程から得られた納豆菌に加熱処理を行い、該加熱処理後の納豆菌から耐熱性納豆菌を選抜する第３の工程と、を含む構成となっている。
【００１２】
この請求項４の発明によれば、請求項１乃至請求項３の作用と同様の作用を有し、優れたビタミンＫ低生産性納豆菌を選抜することができる。
【００１３】
また、請求項８の発明に係るビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法は、前記請求項１乃至請求項７のいずれか一項から得られた納豆菌で製造された納豆の粘性試験により納豆菌を選抜する。
【００１４】
この請求項８の発明によれば、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ （ｎａｔｔｏ））の繁殖によって生じる特有の粘性（糸引き）を示す納豆を製造することが可能な納豆菌を選抜することができる。
【００１５】
また、請求項９の発明は、前記請求項１乃至請求項８のいずれか一項記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法によってビタミンＫ低生産性納豆菌が得られる。
【００１６】
さらに、請求項１０の発明は、請求項９の発明で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌を用いて納豆が製造される。
【００１７】
この請求項１０の発明によれば、請求項１０の発明で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌を用いて製造された納豆は、通常の納豆菌から製造された納豆と比較してビタミンＫ（主にビタミンＫ２）の含有量が低い。このため、本発明の納豆は、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品と拮抗せず、且つ薬効の低減を抑制することができる。従って、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品を服用する血栓塞栓症患者等は安心して本発明の納豆を食すことができる。
【００１８】
尚、請求項１乃至請求項４記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法で用いる抗生物質は、ストレプトマイシンを含むアミノグルコシド系抗生物質であることが好ましい（請求項５）。また、請求項１乃至請求項４記載のビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜方法で用いる抗生物質は、ストレプトマイシンまたはクロラムフェニコールのうち、少なくとも一方を含むことが好ましい（請求項６）。
【発明の効果】
【００１９】
以上説明したように本発明によれば、ビタミンＫ（主にビタミンＫ２）の生産性が低い納豆菌を分離し、ビタミンＫ含有量の低い納豆を製造することができる。従って、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品と拮抗せず、且つ薬効の低減を抑制することができるビタミンＫ含有量の低い納豆菌を選抜する選抜方法と、この納豆菌で製造された納豆により、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品を服用する血栓塞栓症患者等でも安心して納豆を食し、納豆に豊富に含まれる栄養素（例えばナットウキナーゼ）を摂取することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、（１）抗生物質添加培地中で納豆菌を培養後分離する第１の工程、（２）ビタミンＫ誘導体添加培地中で選抜増殖した納豆菌のみを選抜する第２の工程、（３）加熱試験に耐性を示した納豆菌のみを選抜する第３の工程、（４）上記第１の工程乃至第３の工程で得られた納豆菌で納豆を製造し粘性実験により粘性を示した納豆菌のみを選抜する第４の工程、の（１）〜（４）の手順により納豆からビタミンＫ低生産性納豆菌の選抜を行う。
【００２１】
また、本発明は、上記（１）〜（４）の手順で選抜されたビタミンＫ低生産性納豆菌によって納豆を製造する。この納豆は、まず、大豆を水に浸漬して水切りした後に蒸煮し、そして得られた大豆にビタミンＫ低生産性納豆菌を接種した後、発酵及び熟成させて得られる。
【００２２】
本発明のビタミンＫ低生産性納豆菌株であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ (ｎａｔｔｏ) Ｂ−１７株は、平成１６年９月１日に、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１９５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２３】
本発明に用いる納豆菌は、自然界、具体的には土壌、落ち葉、枯れ草花、及び稲ワラ等より選抜されて得られるものが好ましいが、これに限られず、例えば市販されている納豆から分離した納豆菌や保存株から分離した納豆菌を用いてもよい。また、本発明における納豆菌は、通常の納豆菌と同様にナットウキナーゼやプラスミノーゲンアクチベータ等の血栓溶解酵素の生産が認められる。これにより、ビタミンＫ低生産性とともに血栓溶解性も示すので、血栓予防にも効果を示す。
【００２４】
本発明に用いる抗生物質は、ストレプトマイシン、カナマイシン、フラジオマイシン、ゲンタマイシン、トプラマイシン、ネチルマイシン、アミカシン等のアミノグルコシド系抗生物質、クロラムフェニコール及びチアンフェニコールであることが好ましい。また、本発明に用いる抗生物質の濃度は、１ｐｐｍ〜５０ｐｐｍの範囲が好ましく、より好ましくは１０ｐｐｍ〜３０ｐｐｍの範囲である。
【００２５】
本発明におけるビタミンＫ誘導体添加培地は、ビタミンＫ３（メナジオン）添加ＴＢＡＢ培地であることが好ましい。尚、本実施形態では、ビタミンＫ３（メナジオン）を培地に添加したがこれに限られず、メナキノン標準品（和光純薬社製）を添加しても良い。
【００２６】
本発明における粘性試験とは、まず上記（１）〜（３）の工程で得られた納豆菌で製造された納豆に含まれる豆を２つ採取した後、採取された豆と豆との間に粘性（糸引き現象）を示すか否かを確認する試験のことである。
【００２７】
本発明におけるビタミンＫは血液凝固因子の生成に必要なものであり、特に血液凝固因子の生成機能の高いビタミンＫ２（メナキノン）を生産抑制するようにしている。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
まず、東京都内３カ所（採取場所Ａ、Ｂ、Ｃ）、愛知県１カ所（採取場所Ｄ）の土壌、落ち葉、枯れ草花または稲ワラから採取した納豆菌試料から０．１ｇを秤量し蒸留水にて１０倍希釈後、加熱温度８０℃〜１２０℃、加熱時間３分間の条件下で納豆菌試料を加熱処理した。分離した納豆菌試料の株数を表１に示す。これにより、本実施例で用いる納豆菌試料を採取した。
【００３０】
【表１】
2006067973.tif 000002
【００３１】
次に、第１スクリーニング（選抜）工程を示す。すなわち、加熱処理後に得られた納豆菌試料を１００倍希釈した後、培養温度３７℃、培養時間２４時間の条件下で、乾燥ブイヨン１．５％、ビオチン１００μｇ、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールを混合した抗生物質２０ｐｐｍ、寒天１．５％を含む抗生物質添加ブイヨン培地にて納豆菌を培養し、培養できた納豆菌のみを選抜した。この第１スクリーニング後の納豆菌株数は、表２に示すとおりである。この第１スクリーニングによりメナキノン生産性が低い納豆菌が選抜された。尚、培地に含まれる抗生物質は、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールに限られず、アミノグルコシド系抗生物質を含んでいれば良い。
【００３２】
【表２】
2006067973.tif 000003
【００３３】
続いて、第２スクリーニング工程を示す。すなわち、第１スクリーニングで選抜された納豆菌を、５μｇ／ｍｌビタミンＫ３（第１化学薬品株式会社製）を添加したメナジオン添加ＴＢＡＢ培地及び無添加ＴＢＡＢ培地にそれぞれ接種した後、メナジオン添加ＴＢＡＢ培地で選抜増殖した納豆菌のみを選抜した。この第２スクリーニング後の納豆菌の株数は、表３に示すとおりである。この第２スクリーニングにより、ビタミン要求性納豆菌が選抜された。
【００３４】
【表３】
2006067973.tif 000004
【００３５】
さらに、第３スクリーニング工程を示す。すなわち、まず、第２スクリーニングで選抜された納豆菌を用いて加熱温度８０℃、加熱時間３０分間の条件下でヒートショック試験を行った。その後、吸光度を用いてＯ．Ｄ．（光学濃度）６６０の波長を指標として納豆菌の生菌濁度を測定し、ヒートショック試験前後の生菌濁度の差が０．５以上の納豆菌のみを選抜した。以後、ヒートショック試験前後の生菌濁度の差が０．５以上の納豆菌のみを選抜する工程を、第３スクリーニングと呼ぶ。この第３スクリーニングにより、芽胞を形成していて熱に強く生育速度の良好な納豆菌が選抜された。
【００３６】
その後、第３スクリーニングで選抜した納豆菌を用いて納豆を製造した。まず、市販大豆１ｋｇを約４℃の水に１２時間浸漬して水切りした後、１時間蒸煮する。このとき水は市販大豆の３倍量を用いた。蒸煮した大豆に第３スクリーニングで選抜した納豆菌懸濁液を５ｍｌ接種して、発酵温度３７℃、発酵時間２４時間の条件下で発酵させた。そして、発酵後の納豆を、温度４℃、時間２４時間の条件下で熟成させた。
【００３７】
そして、第４スクリーニング工程を示す。すなわち、第３スクリーニングで選抜した納豆菌を用いて製造した納豆を試料とする粘性試験を行い、糸引き現象を示した納豆の製造に使われた納豆菌のみを選抜した。この第４スクリーニングにより、粘性（糸引き現象）を示す納豆菌が選抜された。
【００３８】
以上、第１スクリーニング工程乃至第４スクリーニング工程によりビタミンＫ低生産性納豆菌が得られた。
【００３９】
最後に、第１スクリーニング工程乃至第４スクリーニング工程により得られたビタミンＫ低生産性納豆菌で製造された納豆と市販の納豆菌で製造された納豆とを用いて、各納豆中のメナキノン含有量の測定を行った。まず、各試料納豆５ｇに蒸留水２０ｍｌを添加後、抽出温度１００℃、抽出時間１０分間から１５分間の条件下熱水抽出を行った。次に、得られた各抽出液を、回転数３０００ｒｐｍ、回転時間１５分間から２０分間の条件下遠心分離を行った。続いて、遠心分離により得られた各沈殿物にアセトン５ｍｌ及びポリエチレングリコール１ｍｌを添加した後、その上澄み液をメタノールで適宜希釈した。その後、紫外線吸収スペクトル（波長２６４〜２７０ｎｍ）によって、各納豆中のメナキノン含有量を測定した。その結果、市販の納豆菌で製造された納豆は１０３４．７μｇ／１００ｇものメナキノン含有量を示したが、本発明で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌から製造された納豆は４６７μｇ／１００ｇのメナキノンを含有していた。従って、本発明で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌から製造された納豆は、市販の納豆菌から製造された納豆と比較して、メナキノン含有量が５６７．７μｇ／１００ｇも低くなった。
【００４０】
以上により、本発明で得られたビタミンＫ低生産性納豆菌から製造された納豆は、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品と拮抗せず、且つ薬効の低減を抑制することができる。従って、ビタミンＫ低生産性納豆菌から製造された納豆は、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品を服用する血栓塞栓症患者等でも安心して食べられる上に、納豆に豊富に含まれる栄養素（例えばナットウキナーゼ）を摂取することができる。
【００４１】
尚、本実施例は、第１スクリーニング工程乃至第３スクリーニング工程を経た後、第４スクリーニング工程にて粘性（糸引き現象）を示す納豆菌をビタミンＫ低生産性納豆菌としたが、これに限られない。例えば、第１スクリーニング工程乃至第３スクリーニング工程を経た後、第４スクリーニング工程にて粘性（糸引き現象）を示さない納豆菌もビタミンＫ低生産性納豆菌である。この粘性（糸引き現象）を示さないビタミンＫ低生産性納豆菌から製造された納豆は、納豆の粘性が苦手な人にとっても食べ易い上に、加工食品への応用が容易になる等の利点をもつ。さらに、ビタミンＫ低生産性納豆菌から製造された粘性を示さない納豆は、本実施例と同様に、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品と拮抗せず、且つ薬効の低減を抑制することができる。これにより、ワルファリン等の抗血液凝固作用を有する医薬品を服用する血栓塞栓症患者等でも安心して食べられる上に、納豆に豊富に含まれる栄養素（例えばナットウキナーゼ）を摂取することができる。