(57)【要約】【課題】  ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼ又は菌体外インベルターゼを用いるフルクトース配糖体の製造方法の提供。【解決手段】  フルクトース受容体の存在下、スクロースにザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼを接触させることを含む、フルクトース配糖体の製造方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクトース受容体の存在下、スクロースにザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼを接触させることを含む、フルクトース配糖体の製造方法。
【請求項２】
フルクトース受容体の存在下、スクロースにザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来の菌体外インベルターゼを接触させることを含む、フルクトース配糖体の製造方法。
【請求項３】
フルクトース受容体が、下記一般式（Ｉ）：
Ｘ−ＯＨ          (I)
（式中、Ｘは、置換または無置換のアリール基、炭素数が１から１２の置換または無置換の直鎖あるいは環状アルキル基、置換または無置換の環状エーテル基である。）
で表される化合物である、請求項１または請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
フルクトース受容体がヒドロキノンである、請求項１または請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
フルクトース受容体が３−クロロ−１，２−プロパンジオールである、請求項１または請求項２記載の製造方法。
【請求項６】
フルクトース受容体がフルフリルアルコールである、請求項２記載の製造方法。
【請求項７】
ザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼが配列番号１に示すアミノ酸配列からなる、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
ザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来の菌体外インベルターゼが配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、請求項２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルクトース受容体の存在下、スクロースにフルクトシル基転移酵素を作用させることによるフルクトース配糖体の製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
配糖体は、ヒドロキシル基をもつ化合物と糖とがエーテル結合したものであり、自然界に多数存在している。配糖体の中には、生理活性を示すものも知られている。近年、糖転移活性を有する酵素を利用して配糖体を生産する試みが盛んに行われている。
【０００３】
糖転移酵素を利用したフルクトース配糖体の製法としては、バチルス  サブチリス（Bacillus subtilis）由来のレバンスクラーゼを用いたキシロシルフルクトシドの製法（特許文献１）、ローネラ  アクアティリス由来のレバンスクラーゼを用いたコウジ酸フルクトシドの製法（特許文献２）、アルスロバクター（Arthrobacter sp.）由来のβ−フルクトフラノシダーゼを用いたヒドロキノフルクトシド、エピカテキンフルクトシドの製法(非特許文献１)、酵母由来のインベルターゼを用いたコウジ酸フルクトシドの製法（特許文献３）、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼを用いたキシロシルフルクトシド、ラクトシルフルクトシド、アスコルビン酸フルクトシドの製法（非特許文献２）などが知られている。
【０００４】
しかしながら、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼが、一般式（Ｉ）：Ｘ−ＯＨで示されるような化合物に糖転移作用を示すことは知られていない。また、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来の菌体外インベルターゼが糖転移能を有することは、全く知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開昭５５−１１８３６９
【特許文献２】特開平１０−９９０９１
【特許文献３】特開平５−７８３８３
【非特許文献１】J. Appl. Glycosci. Vol49, No.2, p.115-121 (2002)
【非特許文献２】応用糖質科学  第４４巻  第２号  p.203-211（1997）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼ又は菌体外インベルターゼを用いるフルクトース配糖体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、酵素によるフルクトース配糖体の製造を目的として、各種酵素の探索を行ったところ、フルクトース受容体とスクロースの混合物に、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼ、あるいは菌体外インベルターゼを作用させることにより、フルクトース受容体にフルクトース残基が転移することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、下記に関する。
【０００８】
１．フルクトース受容体の存在下、スクロースにザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼを接触させることを含む、フルクトース配糖体の製造方法。
２．フルクトース受容体の存在下、スクロースにザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来の菌体外インベルターゼを接触させることを含む、フルクトース配糖体の製造方法。
３．フルクトース受容体が、下記一般式（Ｉ）：
Ｘ−ＯＨ          (I)
（式中、Ｘは、置換または無置換のアリール基、炭素数が１から１２の置換または無置換の直鎖あるいは環状アルキル基、置換または無置換の環状エーテル基である。）
で表される化合物である、上記１または２記載の製造方法。
４．フルクトース受容体がヒドロキノンである、上記１または２記載の製造方法。
５．フルクトース受容体が３−クロロ−１，２−プロパンジオールである、上記１または２記載の製造方法。
６.フルクトース受容体がフルフリルアルコールである、上記２記載の製造方法。
７．ザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼが配列番号１に示すアミノ酸配列からなる、上記１記載の製造方法。
８．ザイモモナス モビリス（Zymomonas mobilis）由来の菌体外インベルターゼが配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、上記２記載の製造方法。
【０００９】
本発明に使用するフルクトシル基転移酵素としては、フルクトシル基転移能を有するザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼ、あるいは菌体外インベルターゼである限り、特に限定されないが、具体的には配列番号１に示されるアミノ酸配列を持つレバンスクラーゼ、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列を持つ菌体外インベルターゼを挙げることができる。また、これらの酵素は、フルクトシル基転移能を有する限り、配列番号１および配列番号２に示したアミノ酸配列についてアミノ酸の１個または数個の欠失、挿入、置換等があってもよい。
【００１０】
本発明において、フルクトース受容体とは、本発明に用いる酵素によりフルクトシル基が転移されるものであれば特に限定されないが、好ましくは下記一般式（Ｉ）：
Ｘ−ＯＨ          (I)
（式中、Ｘは、置換または無置換のアリール基、炭素数が１から１２の置換または無置換の直鎖あるいは環状アルキル基、置換または無置換の環状エーテル基である。）で示される化合物、より好ましくは、ヒドロキノン、３−クロロー１,２−プロパンジオール、エタノール、フルフリルアルコールである。
【００１１】
フルクトース供与体としては、スクロース、ラフィノース(raffinose)、スタキオース(stachyose)を挙げることができる。
【００１２】
本発明において、フルクトース配糖体とは、フルクトシル基転移反応によって、上記フルクトース受容体にフルクトシル基が移転したフルクトシドである。また、上記フルクトシドに、さらにフルクトシル基が移転したジフルクトシドであることもできる。
【００１３】
本発明のフルクトース配糖体の製造方法は、フルクトース受容体の存在下、スクロースにザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼ、あるいは菌体外インベルターゼを接触させることを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼ、あるいは菌体外インベルターゼを使用することにより、簡便に配糖体を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の方法は、フルクトース受容体存在下、スクロースに酵素を作用させることにより、容易に実施できる。
【００１６】
本発明に使用できる酵素としては、フルクトシル基転移能を有するザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）由来のレバンスクラーゼ、あるいは菌体外インベルターゼである限り特に限定はされず、例えば、ザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）ＩＦＯ−１３７５６株由来のレバンスクラーゼまたは菌体外インベルターゼが挙げられる。
【００１７】
本発明には上記レバンスクラーゼあるいは菌体外インベルターゼを生産する微生物菌体、及びそこから一般的に行われる方法によって調製された粗酵素や精製酵素を使用することができるが、酵素は精製されていることが望ましい。また、場合により、レバンスクラーゼまたは菌体外インベルターゼ遺伝子を組み込んだ形質転換体、例えばザイモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）ＩＦＯ−１３７５６株由来のレバンスクラーゼ遺伝子を組み込んだ組換え体（Escherichia coli JM109/pKZE2：本菌株は、平成１６年７月２３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１３３として寄託されている。）、あるいは菌体外インベルターゼ遺伝子を組み込んだ組換え体（Escherichia coli JM109/pKZE3：本菌株は、平成１６年７月２３日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０１３４として寄託されている。）を利用することにより、上記酵素を効率的に調製することができる。
【００１８】
これらの酵素自体は公知のものではあるが、これらの酵素の本発明における機能は本発明者らが初めて見出したものである。
【００１９】
本発明の方法は、酵素反応を利用するものであり、反応条件は、使用するレバンスクラーゼまたは菌体外インベルターゼのフルクトシル基転移活性が損なわれない温度、ｐＨ、であれば特に限定されないが、好ましくは５℃から３０℃、ｐＨ４からｐＨ６で反応させるのがよい。反応時間は、通常１から５００時間、好ましくは１から１００時間で反応が終了するように酵素量を調節すればよいが、これらに限定されるものではない。また、反応はバッチ法で行うことできるが、菌体あるいは酵素を常法により固定化したものを使用し、酵素を再利用することもできる。
【００２０】
本発明の方法において、フルクトース受容体の化合物の濃度、及びフルクトシル基供与体であるスクロースの濃度は、使用するレバンスクラーゼあるいは菌体外インベルターゼのフルクトシル基転移活性が損なわれない限り特に限定されないが、好ましくは、フルクトース受容体濃度は１％〜１０％、スクロース濃度は１％〜２０％である。
【００２１】
本発明の方法、特にレバンスクラーゼを用いた場合においては、フルクトシル基転移反応によりフルクトシル基がフルクトース受容体に転移したフルクトシドの他に、フルクトシル基がさらに転移したジフルクトシドなども同時に生成され得る。一方、菌体外インベルターゼを用いた場合には、ジフルクトシドなどは、ほとんど生成されない。
【００２２】
反応終了後、ゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー、溶媒抽出、限外ろ過といった一般的な方法を用いて精製することにより、反応液から目的とするフルクトース配糖体を得ることができる。
【００２３】
以下実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
酵素活性測定法
０.３Ｍスクロースを含む０.２Ｍ酢酸緩衝液(ｐＨ５.５)、０.３ｍｌに酵素液０.３ｍｌを加えて、３７℃で反応させた。この反応液中に生じた還元糖をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法にて定量した。酵素活性１単位は、１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量と定義した。
【００２５】
酵素の調製
１．レバンスクラーゼの調製
ペプトン１.０％(w/v)、酵母エキス０.５％(w/v)、塩化ナトリウム０.５％(w/v)からなる培地(ｐＨ７.０)１０００mlを、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、アンピシリンナトリウム（終濃度１００μg/ml）を添加し、Escherichia coli JM109/pKZE2を植菌した。３０℃で１６時間の振盪培養後、遠心分離により菌体を集めた。集めた菌体を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)で洗浄した。菌体を同緩衝液に再懸濁し、超音波処理した後、遠心分離により上澄液を得た。上澄液に１０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、析出した沈殿を遠心分離にて回収した。沈殿を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)に溶解し、同緩衝液に対して透析を行い、脱塩したものをレバンスクラーゼの粗酵素標品とした。
【００２６】
２．菌体外インベルターゼの調製
ペプトン１.０％(w/v)、酵母エキス０.５％(w/v)、塩化ナトリウム０.５％(w/v)からなる培地(ｐＨ７.０)１０００mlを、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した後、アンピシリンナトリウム（終濃度１００μg/ml）、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(終濃度  ０.１ｍＭ)を添加し、Escherichia coli JM109/pKZE3を植菌した。３０℃で１６時間の振盪培養後、遠心分離により菌体を集めた。集めた菌体を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)で洗浄した。菌体を同緩衝液に再懸濁し、超音波処理した後、遠心分離により上澄液を得た。上澄液に３０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、析出した沈殿を遠心分離にて回収した。沈殿を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.０)に溶解し、同緩衝液に対して透析を行い、脱塩したものを菌体外インベルターゼの粗酵素標品とした。
【００２７】
１０％スクロースおよび２％ヒドロキノンを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５.０)５mlに、菌体外インベルターゼを５０単位加え、３０℃で６時間反応させた。反応液を５％エタノールで平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２カラム（１.５×７０cm）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、精製した。さらに、濃縮及び凍結乾燥を行い、目的物を得た。
【００２８】
得られた目的物についてＬＣ−ＭＳを用いた質量分析による分子量測定及び１３Ｃ−ＮＭＲによる構造解析をおこなった。その結果、得られた配糖体は４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−フルクトフラノシドであった。
【実施例２】
【００２９】
１０％スクロースと１０％  ３−クロロ−１，２−プロパンジオールを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５.０)５mlに、菌体外インベルターゼを５０単位加え、３０℃で６時間反応させた。反応液をメルク社製のＰＬＣ(分取用薄層クロマトグラフィー  シリカゲル６０)にスポットし、展開溶媒としてｎ−ブタノール：エタノール：水＝２：１：１の混合溶媒を使用し、上昇法にて展開し、分離した。乾燥後、目的物の部分を削り取り、メタノールで抽出した。これを、濃縮及び凍結乾燥を行い、目的物を得た。
【００３０】
得られた目的物についてＬＣ−ＭＳを用いた質量分析による分子量測定及び１３Ｃ−ＮＭＲによる構造解析をおこなった。その結果、得られた配糖体は２−（１−クロロ−３−ヒドロキシ）プロピル−β−Ｄ−フルクトフラノシドであった。
【実施例３】
【００３１】
１０％３−クロロ−１，２−プロパンジオールを１０％エタノールに変更した以外は実施例２と同様にして行った。その結果、得られた配糖体はエチル−β−Ｄ−フルクトフラノシドであった。
【実施例４】
【００３２】
１０％  ３−クロロ−１，２−プロパンジオールを１０％フルフリルアルコールに変更した以外は実施例２と同様にして行った。その結果、得られた配糖体は２−オキソラニル−β−Ｄ−フルクトフラノシドであった。
【実施例５】
【００３３】
酵素をレバンスクラーゼに変更した以外は実施例１と同様に行った。その結果、得られた配糖体は４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−フルクトフラノシドであった。
【実施例６】
【００３４】
酵素をレバンスクラーゼに変更した以外は実施例２と同様に行った。その結果、得られた配糖体は２−（１−クロロ−３−ヒドロキシ）プロピル−β−Ｄ−フルクトフラノシドであった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明により得られるフルクトース配糖体は、揮発性物質の固定化、酸化に不安定な物質の保護、界面活性剤などに利用され、化粧品、化成品などの分野に有用である。
【配列表】
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