(57)【要約】【課題】  アポトーシスの関与する皮膚における乾燥肌、敏感肌、組織障害、疾患、病態の予防もしくは治療に有用な医薬、化粧品組成物を得る。【解決手段】  下記式［Ｉ］【化１】2006206468.tif 000012（但し、式中、Ｒ1 はグルクロン酸またはアラビノシルグルクロン酸またはグルコシルグルクロン酸、Ｒ2 はＨまたはグルコースを示す）で示されるサポニン類またはその塩を有効成分とするサポニンからなる抗アポトーシス剤である。本抗アポトーシス剤はアポトーシスと細胞新生のバランスを正常化し、皮膚を構成する細胞のアポトーシスの亢進に起因する皮膚疾患、症状、病態、組織障害の予防もしくは治療に有用な組成物となる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
【化１】
2006206468.tif 000010
（但し、式中、Ｒ1 はグルクロン酸またはアラビノシルグルクロン酸またはグルコシルグルクロン酸、Ｒ2 はＨまたはグルコースを示す）で示されるサポニン類またはその塩を有効成分とする抗アポトーシス剤。
【請求項２】
式［Ｉ］で示されるサポニン類が下記表１
【表１】
2006206468.tif 000011
（但し、表中、α−Ｌ−Ａｒａｆ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡｐ−（１→は４−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシヅロン酸を表し、β−Ｄ−ＧｌｃＡｐ−（１→はβ−Ｄ−グルコピラノシヅロン酸を表し、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→２）−β−Ｄ−ＧｌｃＡｐ−（１→は２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシヅロン酸を表し、β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→はβ−Ｄ−グルコピラノースを表す）に記載のチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶまたはポリシアサポニンＰ５である請求項１に記載の抗アポトーシス剤。
【請求項３】
式［Ｉ］で示されるサポニン類、またはそれらの少なくとも一つを含有する組成物を有効成分とするアポトーシス抑制剤。
【請求項４】
式［Ｉ］に示すサポニン類のいずれかを含有する天然素材の粗抽出物もしくはその分画物からなる組成物を有効成分とする抗アポトーシス剤。
【請求項５】
チクセツニンジンの粗抽出物、その分画物からなる組成物を有効成分として含有するアポトーシス抑制剤。
【請求項６】
皮膚の掻痒および／または上皮外層の剥離および／または紅班および／または異常感覚および／または炎症感覚および／または皮膚刺激に対する知覚過敏および／または乾燥および／または肌あれおよび／または敏感肌に対して、これを予防および／または治療するための請求項１から請求項５に記載の組成物を含む皮膚外用剤。
【請求項７】
皮膚の掻痒および／または上皮外層の剥離および／または紅班および／または異常感覚および／または炎症感覚および／または皮膚刺激に対する知覚過敏および／または乾燥および／または肌あれおよび／または敏感肌が皮膚を構成する細胞のアポトーシス亢進に起因するものである請求項６に記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
皮膚、髪、および／または粘膜に請求項１から請求項５に記載の組成物を適用することおよび／または請求項６に記載の皮膚外用剤を使用することを包含する美容方法（治療方法を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚を構成する細胞のアポトーシス亢進に起因する肌荒れ、乾皮症、炎症、掻痒症、敏感肌、湿疹、色素沈着症状の予防および／または改善に有用な医薬、および化粧品組成物に関する。詳しくは、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５またはその塩、およびこれらを含有する植物抽出エキスからなる医薬、および化粧品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラムされた細胞死ともいわれるアポトーシスは元来形態学的に定義された概念であり、細胞壊死（ネクローシス）と対照的な細胞死の様式である。アポトーシスの誘導メカニズムとしては、細胞傷害性Ｔ細胞やＮＫ細胞によるＦａｓ分子とＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）の結合を介した経路やパーフォリンおよびグランザイムを介した経路など種々の機序が明らかとされつつある［Ｎａｇａｔａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，８８，３５５−３６５（１９９７）；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  Ａ．ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ  Ｖ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１，１３０５−１３０８（１９９８）；Ｎａｇａｔａ  Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３３，２９−５５（１９９９）；Ｐｉｎｋｏｓｋｉ  Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｄ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，９，４３−４９（２００２）］。
【０００３】
アポトーシスに陥った細胞は収縮し、核が凝集して断片化する。断片化した核は細胞膜に包まれたアポトーシス小体を形成し、これは食細胞により処理される。この過程は一連の遺伝子により制御され、エネルギーを消費し能動的に遂行される。ネクローシスと異なり原則的に炎症を惹起しないという性質より、生体内の細胞環境のホメオスターシスを維持する重要なメカニズムであると考えられてきた。しかしながら最近、アポトーシスを司るカスパーゼの一部が炎症をはじめとする病変の発症・進展に関与することが示されている［Ｄａｅｍｅｎ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４，５４１−５４９（１９９９）；Ｍｉｗａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｔ．Ｍｅｄ．，４，１２８７−１２９２（１９９８）；Ｌａｗｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌ．，２８，７６１−７６７（１９９８）］。
【０００４】
従って、アポトーシスの抑制によりある種の炎症性反応に対して抑制効果が期待される。事実、ＦａｓＬ中和抗体が実験的炎症性肺線維症や炎症性腸疾患モデル動物に対して優れた治療効果を有することが報告されており［Ｖｉａ  Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７，５３８７−５３９３（１９９６）；Ｍｉｗａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，９２５−９３１（１９９９）；Ｋｕｗａｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０４，１３−１９（１９９９）］、アポトーシス抑制剤は各種炎症性疾患での症状、病態、組織障害の予防もしくは治療において優れた効果が期待されている。
【０００５】
皮膚においては、急性および慢性炎症時に皮膚に浸潤したリンパ球の産生するＩＦＮ−γの作用により角質細胞上のＦａｓ分子の発現が著明に誘導され、リンパ球の発現するＦａｓＬとの反応によってアポトーシスを引き起こすことが明らかとされている［Ｔｒａｕｔｍａｎｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６，２５−３５（２０００）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５，８１０−８１５（１９９５）；Ｍｏｅｒｓ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，５６４−５７２（１９９９）］。また、角質細胞は互いにデスモソームと呼ばれる結合装置で強く結合されており、角質細胞のアポトーシスによってスポンジ様の水泡形成を引き起こし、海綿状態（ｓｐｏｎｇｉｏｓｉｓ）と呼ばれる特徴的な病理変化をもたらして湿疹症状を呈すると考えられている［Ｔｒａｕｔｍａｎｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０８，８３９−８４６（２００１）］。
【０００６】
こうしたアポトーシスによる表皮のバリア機能傷害は、外界からの様々な刺激物質の生体内への侵入を容易にし、さらなる炎症反応を惹起させ症状悪化を招く要因となるものと考えられる。加えて、表皮に傷害を生じると角質細胞のターンオーバーが促進されるが、慢性的炎症状態ではそのターンオーバーの規則性が失われ、未分化な角質層を形成しやすい。このような未分化な角質細胞上では、保湿性の水溶性アミノ酸の産生が低下し皮膚の保湿能が失われやすくなることから乾燥肌傾向を呈すると推測され、知覚異常などの敏感肌になると考えられている［Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．１０（２００２）；田上八郎，皮膚の医学，中公新書（１９９９）］。
【０００７】
これらのことから、皮膚角質細胞のＦａｓ介在性アポトーシスの抑制は、角質細胞のターンオーバーを正常化し、炎症症状の抑制とともに乾燥肌や敏感肌等の種々の症状を伴う皮膚異常の予防や改善につながると考えられる。抗アポトーシス物質としては、ＦａｓＬ中和抗体の他、カスパーゼ系を阻害するＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫなどのような基質アナログの例が知られ、各種の合成ペプチドが研究用試薬として市販されている。これらは蛋白あるいはペプチド類であるため、安全性、すなわち作用および副作用の観点から問題を有し、人体への投与においては安定な作用を発現するに至らないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、皮膚を構成する細胞の新陳代謝、すなわちアポトーシスと細胞新生のバランスを正常化し、皮膚を構成する細胞のアポトーシスの亢進に起因する皮膚疾患、症状、病態、組織障害の予防もしくは治療に有用な組成物を提供することにある。本発明は、医学上または社会問題の解決策として極めて重要であることを鑑みて研究開発されたものである。より詳細には、本発明はアポトーシスの関与する皮膚における乾燥肌、敏感肌、組織障害、疾患、病態の予防もしくは治療に有用な医薬、および化粧品組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
課題を解決すべく本発明者らは、皮膚ケラチノサイト細胞株を用いた抗アポトーシス活性物質のスクリーニングによりアポトーシス抑制剤を自然界に求めて広く探索し、和漢生薬として用いられ、また鎭咳、去痰、抗炎症、中枢抑制作用を有することが知られているチクセツサポニンを含有するチクセツニンジンの熱水エキス、含水アルコールエキスならびにアルコールエキスに、皮膚細胞の新陳代謝を調節する活性、すなわち皮膚ケラチノサイト細胞株のアポトーシスを抑制する活性を見いだした。さらに活性作用を有する化合物が、式［Ｉ］で表されるサポニン類であり、その活性本体がオレアナン型トリテルペン系サポニンのチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５であることを明らかにし、本発明を完成した。
【００１０】
サポニンは、一次代謝産物（アミノ酸、脂肪酸、ブドウ糖）が複合してできる代表的な植物の二次代謝産物のひとつであり、植物界に広く分布する。サポニンは、構造的にはトリテルペンやステロイドにオリゴ糖（二個以上の糖が結合したもの）が結合した配糖体の一種であり、アグリコンの種類によりトリテルペン系サポニンとステロイド系サポニンに大別される［大浦彦吉、熊谷朗、柴田承二、高木敬二郎編、薬用人参、共立出版（１９８１）］。トリテルペン系サポニンはアグリコンがトリテルペン骨格を有し、五環性のオレアナン骨格と四環性のダマラン骨格が存在する。
【００１１】
一方、アグリコンがスピロスタンまたはフロスタン骨格を有するものがステロイド系サポニンと呼ばれている。サポニン類には、トリテルペン系およびステロイド系サポニンを問わず多彩な生物活性が知られているが、これらの活性発現はアグリコンの微細構造の相違や結合する糖の種類、数ならびにアグリコンへの結合位置や糖鎖の構造に大きく依存すると考えられる。すなわち、同一のアグリコンであっても結合する糖の種類、結合位置などの違いにより生物活性が大きく異なる。
【００１２】
身近な例としては、トリテルペン系サポニンのＱＳ−２１のアジュバント活性がそのアグリコン部のアルデヒド基の修飾によりほとんど消失することや、糖鎖構造のみが相違するｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ  Ｒｂ１，ＲｃおよびＲｄは、抗体産生増強活性が全く異なるなどの例が知られている［Ｓｏｌｔｙｓｉｌｃ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３，１４０３−１４１０（１９９５）；Ｍｉｔａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，３１，２２３−２２７（１９７９）］。
【００１３】
さらに本発明者らは、神経細胞のアポトーシスに対し抑制作用を有することが報告されているｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ  Ｒｂ１［特開２００２−２４９４９８号］が、皮膚角質細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞のＦａｓ介在性のアポトーシスに対して抗アポトーシス作用を示さないことを本発明の過程において見いだし、先行文献の知見による予測とは異なり、すべてのサポニン類に皮膚角質細胞に対する抗アポトーシス作用を期待することができないことを明確にしている。このことから、本発明のチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５が皮膚角質細胞のアポトーシスに対し抗アポトーシス活性を有することは、本発明者らの精力的な研究によって初めて明らかとされた新事実である。      
【００１４】
本発明は、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５のうち少なくとも一つのサポニンを有効成分とする抗アポトーシス剤および前記サポニンを有効成分として含む植物エキスからなる医薬および化粧品組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明でチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５の原材料もしくは本サポニンを含む素材として用いたチクセツニンジンは、ウコギ科のトチバニンジン（Ｐａｎａｘ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）の根茎をそのままもしくは湯通しして乾燥したものである［第十三改訂  日本薬局方解説書  第二部医薬品各条  Ｄ−６９２−６９５；難波恒雄、和漢薬百科図鑑、保育社（１９８０）］。チクセツニンジンは、竹参、竹節三七、土参、和人参、薩摩人参や薩摩小人参、などと呼ばれて市場に流通する場合もあるが、これらはいずれも同一のものである。他に、トチバニンジンの花、種子、茎、葉などの部位、または地上部や全草として用いることができる。抽出はそのまま行っても良く、細切あるいは粉砕などの処理を行った後に行ってもよい。
【００１６】
生薬のチクセツニンジンは古くから和漢生薬として用いられ、漢方薬中に配合されて経口的に服用されてきていることから、安全性に関しては極めて高いと考えられる。チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５を含有する植物素材を一般的なデータベース［ＳｃｉＦｉｎｄｅｒもしくはＳｃｉＦｉｎｄｅｒ  Ｓｃｈｏｌａｒ［（社）科学情報協会］、ＳＴＮ（科学技術振興機構）、ＰｕｂＭｅｄなど］で検索すると、チクセツニンジンやゴシツ、トウキンセンカなどを含めた約３５種の植物およびキノコが検索される。
【００１７】
例えば、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ、Ｓｅｓｂａｎｉａ  ｓｅｓｂａｎ、Ｇａｌｌｉｕｍ  ｒｉｖａｌｅ、Ａｒａｌｉａ  ｄａｓｙｐｈｙｌｌａ、Ａｒａｌｉａ  ｃｏｒｄａｔａ、Ｋｏｃｈｉａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｌａｂｌａｂ、Ｇｏｍｐｈｒｅｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｓｉｐｈｉｕｍ  ｐｅｒｆｏｌｉａｔｕｍ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｈｅｒｉｃｉｕｍ  ｅｒｉｎａｃｅｕｓ、Ｈｙｄｒｏｃｏｔｙｌｅ  ｓｉｂｔｈｏｒｐｉｏｉｄｅｓ、Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ  ｓｐ．、Ｓｔｅｇａｎｏｔａｅｎｉａ  ａｒａｌｉａｃｅａ、Ｆａｇｕｓ  ｓｙｌｖａｔｉｃａ等が挙げられる。
このことから、これらの天然素材の抽出エキスおよび粗サポニン画分などの分画画分を皮膚角質細胞に対する抗アポトーシス剤として応用することが可能である。本発明にいう天然素材とは、上記のチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５を含有する植物およびキノコを包含する。
【００１８】
抽出に用いる溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等のアルコール類、アセトン等の極性の高い有機溶媒より１種または２種以上の任意の混合溶媒のいずれでもよい。これらの溶媒のうちでは、抽出物が最終的に医薬品、化粧品などに配合されることを考慮すると、安全性の観点から、水、エタノールまたはこれらの混合溶媒を用いるのが望ましい。また、抽出物はそのままでも医薬品、化粧品などに配合できるが、水、アルコールなどの溶媒で希釈したり、濃縮、乾固したものを、水、アルコールなどの極性溶媒に再溶解したり、あるいは脱色、脱臭、滅菌などの処理を行った後に添加してもよい。粗サポニン画分や分画画分は、ブタノールなどの種々の有機溶媒を用いた転溶法や、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ−２０などの多孔性ビーズを用いた疎水性クロマトグラフィーによって調製してもよい。チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、ポリシアサポニンＰ５は、一般的に用いられるカラムクロマトグラフィー、液滴向流分配や沈澱法、再結晶法および各種溶媒を用いた分配法などにより調製できる。
【００１９】
本発明における皮膚外用剤とは、皮膚局所に外用で投与される物質ないしは組成物の総称であり、具体的には、皮膚外用医薬品、皮膚外用医薬部外品、化粧品、洗浄料、または浴用剤が含まれる。本発明の皮膚外用剤の効果もしくは適用が期待される皮膚の症状、病態の代表例としては、肌荒れ、乾皮症、炎症、掻痒症、敏感肌、湿疹、色素沈着症状などが挙げられる。しかしながら、これらの症状、疾患、病態に限定されるものではなく、皮膚におけるアポトーシスもしくはアポトーシス様細胞死の係わるすべての皮膚症状や病態が包含される。
【００２０】
本発明に係る皮膚外用剤の剤型は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、粉末剤、顆粒剤など、種々の剤型で提供することができる。また、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パックなどの皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリームなどの下地化粧料、乳液状、油性、固形状などの各剤型のファンデーション、アイカラーなどのメイクアップ化粧料、リップクリーム、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローションなどの身体用化粧料として提供することができる。
【００２１】
本発明による組成物はまた、圧縮推進剤を含有するエアゾール組成物としてパッケージ可能である。本発明による組成物はまた、医薬部外品として口腔内で使用されても良く、具体的には歯磨きペーストに添加可能である。この場合、組成物は通常の歯磨きペーストの添加物、特に界面活性剤類、増粘剤類、研磨剤類、フッ化ナトリウムなどのフッ化物、甘味剤類を含有可能である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗アポトーシス剤は、細胞のアポトーシス死が関与する、あるいはアポトーシスの亢進に起因する組織障害、疾患、病態の予防もしくは治療に有用である。更に、皮膚を構成する細胞の新陳代謝、すなわちアポトーシスと細胞新生のバランスを正常化し、皮膚を構成する細胞のアポトーシスの亢進に起因する皮膚疾患、症状、病態、組織障害の予防もしくは治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
組成物の調製
１．水抽出物
０．５〜２ミリ角程度の細片状に破砕したチクセツニンジン１０ｇに対し、水１００ｍＬを加えて抽出液残量が５０ｍＬになるように煎じた。抽出液をろ過後、再び同様の方法で抽出を行い、得られたそれぞれの抽出液５０ｍＬを合わせて凍結乾燥し抽出物を得た。      
【００２５】
２．アルコール・水混液抽出物
０．５〜２ミリ角程度の細片状に破砕したチクセツニンジン１０ｇに対し、７０ｖ／ｖ％エタノール溶液５０ｍＬで約３日間かけて室温で抽出した。抽出液をろ過後、再び同様の方法で抽出を行い、得られた抽出液５０ｍＬを合わせて減圧留去し抽出物を得た。
【００２６】
３．アルコール抽出物
０．５〜２ミリ角程度の細片状に破砕したチクセツニンジン１０ｇに対し、１００％アルコール５０ｍＬで約３日間かけて室温で抽出した。抽出液をろ過後、再び同様の方法で抽出を行い、得られたそれぞれの抽出液５０ｍＬを合わせて減圧留去し抽出物を得た。
【００２７】
４．チクセツニンジン抽出物からの粗サポニン画分の調製
メタノールに溶解したチクセツニンジン抽出物はヘキサンで分配後、メタノール層を減圧留去した。本画分を水に再溶解した後、中性もしくは酸性条件下（ｐＨ３）で酢酸エチル、ｎ−ブタノールで順次抽出し、有機層可溶性画分として粗サポニン画分を得た。
【００２８】
５．チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ及びポリシアサポニンＰ５の調製
上記で得た粗サポニン画分のうち、ｎ−ブタノール可溶性画分を高速液体クロマトグラフィー［カラム：Ｓｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ（２０φ×２５０ｍｍ）、移動相：０．０１％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ3 ＣＮを用いたグラジェント溶出（２０％→１００％ＣＨ3 ＣＮ：４５分間、流速：９ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：島津ＳＰＤ−６Ａ、測定波長：ＵＶ２０３ｎｍ）］により分画を行い、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶおよびポリシアサポニンＰ５を得た。
【００２９】
チクセツサポニンＩＶの理化学的性質は下記の通りである。
高分解能質量スペクトル［ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＦＡＢ，（Ｍ−Ｈ）- ］
計算値；９２５．４７９７
実測値；９２５．４８０１
低分解能質量分析（ＦＡＢ，ｍ／ｚ）：９２５［Ｍ−Ｈ］- 、７９３［Ｍ−１３２］- 、７６３［Ｍ−１６２］- 
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（δｐｐｍ  ｉｎ  Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）；表１に示す。
【００３０】
チクセツサポニンＩＶａの理化学的性質は下記の通りである。
高分解能質量スペクトル［ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＦＡＢ，（Ｍ−Ｈ）- ］
計算値；７９３．４３７４［Ｍ−Ｈ］- 
実測値；７９３．４４０７［Ｍ−Ｈ］- 
低分解能質量分析（ＦＡＢ，ｍ／ｚ）：７９３［Ｍ−Ｈ］- 、６３１［Ｍ−１６２］- 、５８５［Ｍ−２０９］- 
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（δｐｐｍ  ｉｎ  Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）；表１に示す。
【００３１】
チクセツサポニンＶの理化学的性質は下記の通りである。
高分解能質量スペクトル［ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＦＡＢ，（Ｍ−Ｈ）- ］
計算値；９５５．４９０３
実測値；９５５．４８６３
低分解能質量分析（ＦＡＢ，ｍ／ｚ）：９５５［Ｍ−Ｈ］- 、７９３［Ｍ−１６２］- 、７４７［Ｍ−２０９］- 
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（δｐｐｍ  ｉｎ  Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）；表１に示す。
【００３２】
ポリシアサポニンＰ５の理化学的性質は下記の通りである。
高分解能質量スペクトル［ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＦＡＢ，（Ｍ−Ｈ）- ］
計算値；７９３．４３７４
実測値；７９３．４３９６
低分解能質量分析（ＦＡＢ，ｍ／ｚ）：７９３［Ｍ−Ｈ］- 、６３１［Ｍ−１６２］- 、４５５［Ｍ−３３８］-  
13Ｃ核磁気共鳴スペクトル（δｐｐｍ  ｉｎ  Ｃ5 Ｄ5 Ｎ）；表１に示す。
【００３３】
【表１】
2006206468.tif 000002
【実施例２】
【００３４】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５の抗アポトーシス活性の評価      
【００３５】
４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞（ヒト白血病Ｔリンパ腫由来）を９６穴プレートに分注し、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶまたはポリシアサポニンＰ５（終濃度：１２．５−５０μｇ／ｍＬ）を添加して１時間培養した後、５ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに２４時間培養した。対照としてカスパーゼ・ファミリー・インヒビター［Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ，Ｃａｓｐａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ），Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．］を２μＭとなるように加えた。細胞の生存率はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ法［Ｐａｇｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．３，４７３−４７６（１９９３）］により測定し、アポトーシス抑制率を［（抽出物あるいは組成物およびＦａｓＬを添加した細胞の生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）／（未処理の細胞生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）］×１００の式より算出して抗アポトーシス活性の評価を行った。その結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2006206468.tif 000003
【００３７】
表２はＦａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５の抗アポトーシス活性を示したものである。表中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。本検討により、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５はＦａｓ分子介在性のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００３８】
アポトーシスの指標のひとつとして、内在性のエンドヌクレアーゼの作用を介したＤＮＡ断片の生成が挙げられることから［Ｓｃｈｗａｒｔｚｍａｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｉｄｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ａ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，１４，１３３−１５１（１９９３）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１，１０７８−１０８５（１９９１）；Ｏｂｅｒｈａｍｍｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２，３６７９−３６８４（１９９３）；Ｒｏｙ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２００，４１６−４２４（１９９２）］、ＴＵＮＥＬ法によりＤＮＡの断片化を検出し、チクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価した。
【００３９】
すなわち、４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞を６穴プレートに分注し、チクセツサポニンＩＶを終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、５ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞をスライドガラスに付着させ４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いてＤＮＡの３’−ＯＨ末端にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰを取り込ませ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰでラベルされたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察し、ＤＮＡの断片化を検出した。その結果を図１に示す。本検討によりチクセツサポニンＩＶはＦａｓ分子介在性のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００４０】
アポトーシス細胞では、ＤＮＡの断片化に加えクロマチンの凝集が観察されることから［Ｗｙｌｌｉｅ  Ａ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８４，５５５−５５６（１９８０）；Ａｒｅｎｄｓ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１３６，５９３−６０８（１９９０）］、ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、チクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価した。すなわち、４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞を６穴プレートに分注し、チクセツサポニンＩＶを終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、５ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞をスライドガラスに付着させ４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。核酸をＤＡＰＩ色素で染色後、クロマチンの凝集を蛍光顕微鏡により観察した。その結果を図２に示す。本検討により、チクセツサポニンＩＶはＦａｓ分子介在性のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００４１】
上記表２、図１および図２に示すように、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５は、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＦａｓ分子介在性アポトーシスに対し、抗アポトーシス活性を有することが明らかとなった。
【実施例３】
【００４２】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５の抗アポトーシス活性の評価
【００４３】
１．８×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＰａｍ２１２細胞（マウスケラチノサイト株）を９６穴プレートに分注し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、一晩培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５（終濃度：１２．５−５０μｇ／ｍＬ）を添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに２４時間培養した。細胞の生存率はＭＴＴ法により測定し、アポトーシス抑制率を［（抽出物あるいは組成物およびＦａｓＬを添加した細胞の生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）／（未処理の細胞生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）］×１００の式より算出して抗アポトーシス活性の評価を行った。その結果を表３に示す。
【００４４】
【表３】
2006206468.tif 000004
【００４５】
表３はＦａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５の抗アポトーシス活性を示したものである。表中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。本検討により、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５はＦａｓ分子介在性のＰａｍ２１２細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００４６】
ＴＵＮＥＬ法を用いてＤＮＡの断片化を検出し、チクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価した。すなわち、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、Ｐａｍ２１２細胞（５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をチャンバースライド上で２日間培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツサポニンＩＶを終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いてＤＮＡの３’−ＯＨ末端にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰを取り込ませ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰでラベルされたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察し、ＤＮＡの断片化を検出した。その結果を図３に示す。本検討により、チクセツサポニンＩＶはＦａｓ分子介在性のＰａｍ２１２細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００４７】
ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、チクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価した。すなわち、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、Ｐａｍ２１２細胞（５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をチャンバースライド上で２日間培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツサポニンＩＶを終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。核酸をＤＡＰＩ色素で染色後、クロマチンの凝集を蛍光顕微鏡により観察した。その結果を図４に示す。本検討により、チクセツサポニンＩＶはＦａｓ分子介在性のＰａｍ２１２細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００４８】
上記表３、図３および図４に示すように、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、ＶあるいはポリシアサポニンＰ５は、ケラチノサイトのＦａｓ分子介在性アポトーシスに対しても抗アポトーシス活性を有することが明らかとなった。
【実施例４】
【００４９】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介したアポトーシスに対するチクセツサポニンの抗アポトーシス作用の特異性
４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞（ヒト白血病Ｔリンパ腫由来）を９６穴プレートに分注し、チクセツニンジンアルコール抽出物、チクセツサポニンＶ、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅあるいはＲｇ１（終濃度：１０および１００μｇ／ｍＬ）を添加して１時間培養した後、５ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに２４時間培養した。細胞の生存率はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ法により測定し、アポトーシス抑制率を［（抽出物あるいは組成物およびＦａｓＬを添加した細胞の生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）／（未処理の細胞生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）］×１００の式より算出して抗アポトーシス活性の評価を行った。その結果を図５に示す。
【００５０】
１．８×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＰａｍ２１２細胞（マウスケラチノサイト株）を９６穴プレートに分注し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、一晩培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツニンジンアルコール抽出物、ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅあるいはＲｇ１（終濃度：２５μｇ／ｍＬ）を添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに２４時間培養した。細胞の生存率はＭＴＴ法により測定し、アポトーシス抑制率を［（抽出物あるいは組成物およびＦａｓＬを添加した細胞の生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）／（未処理の細胞生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）］×１００の式より算出して抗アポトーシス活性の評価を行った。その結果を図６に示す。
【００５１】
上記図５および図６により、チクセツサポニンはＦａｓ分子介在性のアポトーシスを抑制できるのに対して、構造の異なるジンセノサイド類は本作用が極めて弱く、本作用の発現にサポニンの構造特異性が関与していることが明らかになった。
【実施例５】
【００５２】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツニンジン水抽出物、アルコール・水混液抽出物およびアルコール抽出物の抗アポトーシス活性
【００５３】
４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞を９６穴プレートに分注し、チクセツニンジン水抽出物、アルコール・水混液抽出物およびアルコール抽出物（終濃度：１２．５−１００μｇ／ｍＬ）を添加して１時間培養した後、５ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに２４時間培養した。細胞の生存率はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ法により測定し、アポトーシス抑制率を［（抽出物あるいは組成物およびＦａｓＬを添加した細胞の生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）／（未処理の細胞生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）］×１００の式より算出して抗アポトーシス活性の評価を行った。その結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
2006206468.tif 000005
【００５５】
表４はＦａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツニンジン水抽出物、アルコール・水混液抽出物およびアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を示したものである。本検討により、チクセツニンジン水抽出物、アルコール・水混液抽出物およびアルコール抽出物はＦａｓ分子介在性のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００５６】
ＴＵＮＥＬ法を用いＤＮＡの断片化を検出し、チクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価した。すなわち、４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞を６穴プレートに分注し、チクセツニンジンアルコール抽出物を終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、５ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞をスライドに付着させ４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いてＤＮＡの３’−ＯＨ末端にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰを取り込ませ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰでラベルされたＤＮＡを蛍光顕微鏡により観察した。その結果を図７に示す。本検討により、チクセツニンジンアルコール抽出物はＦａｓ分子介在性のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００５７】
ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、チクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価した。すなわち、４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞を６穴プレートに分注し、チクセツニンジン抽出物を終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、５ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞をスライドに付着させ４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。核酸をＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡により観察した。その結果を図８に示す。本検討により、チクセツニンジンアルコール抽出物はＦａｓ分子介在性のＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。
【００５８】
上記表４、図７および図８に示すように、チクセツニンジン水抽出物、アルコール・水混液抽出物およびアルコール抽出物は、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＦａｓ分子介在性アポトーシスに対し、抗アポトーシス活性を有することが認められた。
【実施例６】
【００５９】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性
１．８×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＰａｍ２１２細胞（マウスケラチノサイト株）を９６穴プレートに分注し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、一晩培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツニンジンアルコール抽出物（終濃度：１２．５−５０μｇ／ｍＬ）を添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに２４時間培養した。細胞の生存率はＭＴＴ法により測定し、アポトーシス抑制率を［（抽出物あるいは組成物およびＦａｓＬを添加した細胞の生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）／（未処理の細胞生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）］×１００の式より算出して抗アポトーシス活性の評価を行った。その結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
2006206468.tif 000006
【００６１】
表５はＦａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を示したものである。表中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。本検討により、チクセツニンジンアルコール抽出物はＦａｓ分子介在性のＰａｍ２１２細胞のアポトーシスを著明に抑制することが明らかとなった。      
【００６２】
ＴＵＮＥＬ法を用いＤＮＡの断片化を検出し、チクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価した。すなわち、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、Ｐａｍ２１２細胞（５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をチャンバースライド上で２日間培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツニンジンアルコール抽出物を終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いてＤＮＡの３’−ＯＨ末端にｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰを取り込ませ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＤＰでラベルされたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察し、ＤＮＡの断片化を検出した。その結果を図９に示す。本検討により、チクセツニンジンアルコール抽出物はＦａｓ分子介在性のＰａｍ２１２細胞のアポトーシスを抑制することが明らかとなった。
【００６３】
ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、チクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価した。すなわち、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、Ｐａｍ２１２細胞（５×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をチャンバースライド上で２日間培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツニンジンアルコール抽出物を終濃度５０μｇ／ｍＬになるように添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに５時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を用いて透過処理を行った。核酸をＤＡＰＩ色素で染色後、クロマチンの凝集を蛍光顕微鏡により観察した。その結果を図１０に示す。
【００６４】
上記表５、図９および図１０に示すように、チクセツニンジンアルコール抽出物はケラチノサイトのアポトーシスに対しても抗アポトーシス活性を有することが認められた。
【実施例７】
【００６５】
チクセツニンジンおよびトチバニンジン地上部由来粗サポニン画分のケラチノサイトに対する抗アポトーシス活性の評価
【００６６】
１．８×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＰａｍ２１２細胞を９６穴プレートに分注し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、一晩培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツニンジン由来粗サポニン画分であるｎ−ブタノール可溶性画分もしくはトチバニンジン地上部由来の粗サポニン画分（ｎ−ブタノール可溶性画分）（終濃度：２５−２００μｇ／ｍＬ）を添加して１時間培養した後、２０ｎｇ／ｍＬのＦａｓＬで刺激してさらに２４時間培養した。細胞の生存率はＭＴＴ法により測定し、アポトーシス抑制率を［（抽出物あるいは組成物およびＦａｓＬを添加した細胞の生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）／（未処理の細胞生存率）−（ＦａｓＬを添加した細胞の生存率）］×１００の式より算出して抗アポトーシス活性の評価を行った。その結果を表６に示す。
【００６７】
【表６】
2006206468.tif 000007
【００６８】
表６は、チクセツニンジンおよびトチバニンジン地上部由来粗サポニン画分のケラチノサイトのアポトーシスに対する抗アポトーシス活性を評価したものである。表中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。その結果、表６に示すように本活性成分であるサポニン類が転溶されるｎ−ブタノール画分抽出物に抗アポトーシス活性が認められた。また、チクセツニンジンと同様にトチバニンジン地上部のｎ−ブタノール画分においても、抗アポトーシス活性が確認された。また、トチバニンジン地上部粗サポニン画分中には、ＴＬＣでの検討によりチクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、ポリシアサポニンＰ５が含まれていることが確認された。
【実施例８】
【００６９】
チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、ポリシアサポニンＰ５およびチクセツニンジンアルコール抽出物の毒性試験
４×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＪｕｒｋａｔ細胞を９６穴プレートに分注し、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、ポリシアサポニンＰ５あるいはチクセツニンジンアルコール抽出物（終濃度１００μｇ／ｍＬ）を添加して２４時間培養した。細胞の生存率はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ法により測定した。その結果、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、ポリシアサポニンＰ５あるいはチクセツニンジンアルコール抽出物は、１００μｇ／ｍＬの濃度においてＪｕｒｋａｔ細胞の生存率に影響を与えなかった。
【００７０】
１．８×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整したＰａｍ２１２細胞を９６穴プレートに分注し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ存在下、一晩培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを含む新しい培養液に交換後、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、ポリシアサポニンＰ５あるいはチクセツニンジンアルコール抽出物（終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加して２４時間培養した。細胞の生存率はＭＴＴ法により測定した。その結果、チクセツサポニンＩＶ、ＩＶａ、Ｖ、ポリシアサポニンＰ５あるいはチクセツニンジンアルコール抽出物は、５０μｇ／ｍＬの濃度においてＰａｍ２１２細胞の生存率に影響を与えなかった。
【実施例９】
【００７１】
アポトーシス抑制皮膚化粧水の処方を下記表７に示す。
【００７２】
【表７】
2006206468.tif 000008
【００７３】
表中の（９）に（５）、（６）を加えてそれぞれ膨潤させ、（１）、（２）、（４）、（７）を混合後加熱溶解して８０℃とし、溶解後、４０℃に冷却、（３）、（８）を添加し、混合する。表中（８）のチクセツニンジン抽出分画液は、チクセツニンジン５００ｇを５Ｌの５０％エタノールにて室温で１週間抽出し、調製した。また、表中（８）の替わりにエタノールを配合したものを比較例とした。
【００７４】
続いて本発明の実施例及び比較例について使用試験を行った。アポトーシスが抑制されると、肌荒れが改善されることが推察されるため、以下の試験を行った。肌荒れを感じているパネラー２０名を１群とし、各群にそれぞれ実施例および比較例をブラインドにて顔面に使用させ、肌荒れの改善及び水分量の変化を観察し、評価した。使用期間は１１月から約１ヶ月とした。肌荒れについては、「改善」、「変化なし」、「やや悪化」、「悪化」の４段階、水分量については「上昇」、「変化なし」、「やや低下」、「低下」の４段階で評価し、各評価を得たパネラー数は下記表８に示した。
【００７５】
【表８】
2006206468.tif 000009
【００７６】
上記に示すように、エタノール配合の比較例と比べ、チクセツニンジン抽出分画液を含有する本発明の実施例の使用により、肌荒れが改善し、水分量が顕著に上昇することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の抗アポトーシス剤は細胞のアポトーシス死が関与する、あるいはアポトーシスの亢進に起因する組織障害、疾患、病態の予防もしくは治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＴＵＮＥＬ法を用いてＤＮＡの断片化を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【００７９】
【図２】ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【００８０】
【図３】ＴＵＮＥＬ法を用いてＤＮＡの断片化を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【００８１】
【図４】ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツサポニンＩＶの抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【００８２】
【図５】Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物、チクセツサポニンＶおよびジンセノサイド類の抗アポトーシス活性を比較したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。
【００８３】
【図６】Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物およびジンセノサイド類の抗アポトーシス活性を比較したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。
【００８４】
【図７】ＴＵＮＥＬ法を用いてＤＮＡの断片化を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【００８５】
【図８】ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【００８６】
【図９】ＴＵＮＥＬ法を用いてＤＮＡの断片化を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【００８７】
【図１０】ＤＡＰＩを用いた核酸染色によりクロマチンの凝集を検出し、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路を介して誘導したケラチノサイトのアポトーシスに対するチクセツニンジンアルコール抽出物の抗アポトーシス活性を評価したものである。図中のＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであり、ポジティブコントロールとして使用した。図中、左は明視野観察結果、右は蛍光観察結果である。
【図５】
2006206468.tif 000013
【図６】
2006206468.tif 000014
【図１】
2006206468.tif 000015
【図２】
2006206468.tif 000016
【図３】
2006206468.tif 000017
【図４】
2006206468.tif 000018
【図７】
2006206468.tif 000019
【図８】
2006206468.tif 000020
【図９】
2006206468.tif 000021
【図１０】
2006206468.tif 000022