(57)【要約】【課題】  ＨＩＶまたは別のレトロウィルスによる感染と、免疫原性製剤による免疫感作との間を識別することを可能とする非感染性レトロウィルス様粒子の提供【解決手段】  非感染性レトロウィルス様粒子は、ｅｎｖ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物およびｇａｇ遺伝子産物のアセンブリを有し、非レトロウィルス性または非ＨＩＶレトロウィルス性である抗原マーカーを有する。該マーカーは、抗原的に活性な挿入部位のｇａｇ遺伝子産物に挿入されたエピトープを有するアミノ酸配列、あるいは、内因性アンカー形成機能部分に置換するｅｎｖ遺伝子産物に操作的に連結された抗原性アンカー配列である。さらには、ｅｎｖ遺伝子産物の免疫優性領域の修飾により、実質的に免疫優性領域の認識を防止する。抗原マーカーに特異的な抗体の存在は、抗レトロウィルス抗体を有する抗血清が、非感染性レトロウィルス様粒子による免疫感作よって生じたことを証する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｅｎｖ遺伝子産物、
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子産物、
（ｃ）ｇａｇ遺伝子産物、ならびに
（ｄ）非レトロウィルス性または非ＨＩＶレトロウィルス性である少なくとも１個の抗原マーカーのアセンブリを有する非感染性レトロウィルス様粒子。
【請求項２】
前記少なくとも１個の抗原マーカーが約５〜約１００個のアミノ酸残基を有する請求項１記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項３】
前記少なくとも１個の抗原マーカーが約１０〜約７５個のアミノ酸残基を有する請求項２記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項４】
前記少なくとも１個の抗原マーカーが、タバコモザイクウィルスコート蛋白からの少なくとも１個の抗原性エピトープを有する請求項２または３記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項５】
前記少なくとも１個の抗原性エピトープが、アミノ酸配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮあるいは配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮを認識する抗体を誘導することができる該配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項４記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項６】
前記少なくとも１個の抗原マーカーが、ｇａｇ遺伝子産物内にあり、未修飾ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を有するハイブリッドｇａｇ遺伝子産物を形成する請求項２記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項７】
前記少なくとも１個の抗原マーカーが、抗原的に活性な挿入部位でｇａｇ遺伝子産物に挿入される請求項６記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項８】
前記挿入部位が、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｇａｇ遺伝子産物のアミノ酸残基２１０と２１１の間に位置するか、あるいは他のレトロウィルスｇａｇ遺伝子産物の相当する箇所に位置する請求項７記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項９】
前記少なくとも１個の抗原マーカーが、アミノ酸配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮあるいは配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮを認識する抗体を誘導することができる該配列の一部、変化体もしくは突然変異体の１〜４個の直列のコピーを有する請求項８記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１０】
１  前記少なくとも１個の抗原マーカーが、レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列の欠失によって提供される請求項１記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１１】
ｅｎｖ遺伝子産物の免疫優性領域を、その領域からの少なくとも１個のアミノ酸を置換または除去することで修飾して、レトロウィルス感染宿主からの血清によって生じる突然変異において免疫優性領域の認識を実質的に防止する請求項１０記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１２】
レトロウィルスがＨＩＶであり、免疫優性領域がアミノ酸配列ＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ（配列番号２７）を有する請求項１０記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１３】
前記突然変異における修飾アミノ酸配列が、ＬＧＩＷＧＣＴＧＲＩＬＣ（配列番号２８）、ＬＧＩＷＧＣＡＦＲＬＩＣ（配列番号２９）およびＬＧＩＷＧＣＴＬＥＬＩＣ（配列番号３０）からなる群から選択される請求項１２記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１４】
（ａ）内因性アンカー形成機能部分をｅｎｖ遺伝子産物に操作によって連結した異なるアンカー配列によって置換することで、該ｅｎｖ遺伝子産物をレトロウィルス様粒子をアンカーするようにした修飾ｅｎｖ遺伝子産物、
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子産物、および
（ｃ）ｇａｇ遺伝子産物のアセンブリを有してなる非感染性レトロウィルス様粒子。
【請求項１５】
前記アンカー配列が抗原性である請求項１４記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１６】
アンカー配列が、約５〜約１００のアミノ酸残基を有する請求項１４記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１７】
アンカー配列が、約１０〜約７５のアミノ酸残基を有する請求項１６記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１８】
アンカー配列が、膜スパニング蛋白のトランスメンブラン成分の一部を少なくとも有する請求項１６記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項１９】
膜スパニング蛋白が糖蛋白である請求項１８記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２０】
糖蛋白がインフルエンザウィルス蛋白である請求項１９記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２１】
インフルエンザウィルス蛋白がヒトインフルエンザウィルス蛋白である請求項２０記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２２】
アンカー配列が、アミノ酸配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷまたは配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷを認識する抗体を誘発する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項２１記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２３】
インフルエンザウィルス蛋白がトリインフルエンザウィルス蛋白である請求項２０記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２４】
アンカー配列が、アミノ酸配列ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱまたは配列ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱを認識する抗体を誘発する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項２３記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２５】
前記アンカー配列が、ｅｎｖ遺伝子産物の機能性開裂部位の上流の隣接するｅｎｖ遺伝子産物に挿入されている請求項１４記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２６】
前記アンカー配列が、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸残基５０７および５０８の間あるいは他のレトロウィルスｅｎｖ遺伝子産物の相当する箇所に挿入されている請求項２５記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２７】
アンカー配列が、
アミノ酸配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＦＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥまたは
配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＦＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥを認識する抗体を誘発する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項１４記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２８】
ｅｎｖ、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子産物がヒトレトロウィルスのｅｎｖ、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子産物に相当する請求項１記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項２９】
ヒトレトロウィルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２からなる群から選択される請求項２８記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項３０】
ヒトレトロウィルスがＨＩＶ−１であり、ｅｎｖ遺伝子産物がＬＡＩｅｎｖ遺伝子産物、ＭＮｅｎｖ遺伝子産物、一次ＨＩＶ−１単離物からのｅｎｖ遺伝子産物または抗原的にそれに等価なｅｎｖ遺伝子産物である請求項２９記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項３１】
前記のｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子産物が、ｅｎｖ遺伝子産物を誘導するＨＩＶ−１単離物とは異なるＨＩＶ−１単離物から誘導される請求項３０記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項３２】
前記のｅｎｖ遺伝子産物が、初期ＨＩＶ−１単離物由来である請求項３１記載のレトロウィルス様粒子。
【請求項３３】
長い末端反復を欠失し、その天然ゲノム配置にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有する修飾レトロウィルスゲノムと非レトロウィルス性もしくは非ＨＩＶウィルス性である少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分とを有してなる、非感染性レトロウィルス様粒子をコードする核酸分子。
【請求項３４】
前記少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分が約１５〜約３００個のヌクレオチドを有する請求項３３記載の核酸分子。
【請求項３５】
前記少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分が約３０〜約２２５個のヌクレオチドを有する請求項３４記載の核酸分子。
【請求項３６】
前記少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分が、タバコモザイクウィルスコート蛋白からの少なくとも１個の抗原性エピトープをコードしている請求項３４記載の核酸分子。
【請求項３７】
タバコモザイクウィルスコート蛋白からの少なくとも１個の抗原性エピトープが、アミノ酸配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮあるいは配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮを認識する抗体を誘導することができる該配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項３６記載の核酸分子。
【請求項３８】
前記少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分が、ｇａｇ遺伝子産物内にあり、未修飾ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を有するハイブリッドｇａｇ遺伝子産物をコードする修飾ｇａｇ遺伝子を提供する請求項３３記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分が、ｇａｇ遺伝子に挿入されて、ハイブリッドｇａｇ遺伝子産物の抗原的に活性な挿入部位で抗原マーカーを提供する請求項３８記載の核酸分子。
【請求項４０】
前記少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分が、ＨＩＶ−１ＬＡＩ単離物のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド１４１５にあるＰｓｔＩ部位に位置する挿入部位で挿入される請求項３９記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記少なくとも１個の抗原マーカーをコードする部分が、
【化１】
2006020635.tif 000011
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列のコピー１〜４個を有する請求項３６または４０記載の核酸分子。
【請求項４２】
（ｃ）におけるＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である請求項４１記載のＤＮＡ分子。
【請求項４３】
前記核酸分子が、ＨＩＶ−１LAI単離物のゲノムのＳａｃＩからＸｈｏＩ断片に存在する特徴的な遺伝要素を有するＤＮＡ分子を有する請求項３３記載の核酸分子。
【請求項４４】
長い末端反復を欠失し、その天然ゲノム配置にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有する修飾レトロウィルスゲノムを有してなり、該ｅｎｖ遺伝子が修飾されて、ｅｎｖ遺伝子産物をレトロウィルス様粒子にアンカーするためのアンカー配列をコードする部分をそこに提供することで、該修飾ｅｎｖ遺伝子がｅｎｖの内因性アンカー形成機能部分を抗原性アンカー配列によって置換した修飾ｅｎｖ遺伝子産物をコードしている、非感染性レトロウィルス様粒子をコードする核酸分子。
【請求項４５】
前記部分が、抗原性アンカー配列をコードしている請求項４４記載の核酸分子。
【請求項４６】
アンカー配列をコードする部分が、約１５〜約３００個のヌクレオチドを有する請求項４４記載の核酸分子。
【請求項４７】
アンカー配列をコードする部分が約３０〜約２２５個のヌクレオチドを有する請求項４６記載の核酸分子。
【請求項４８】
アンカー配列をコードする部分が、膜スパニング蛋白のトランスメンブレン成分の少なくとも一部をコードしている請求項４５記載の核酸分子。
【請求項４９】
膜スパニング蛋白が糖蛋白である請求項４８記載の核酸分子。
【請求項５０】
糖蛋白が、インフルエンザウィルス蛋白である請求項４９記載の核酸分子。
【請求項５１】
インフルエンザウィルス蛋白が、ヒトインフルエンザウィルス蛋白である請求項５０記載の核酸分子。
【請求項５２】
アンカー配列が、アミノ酸配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷまたは配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷを認識する抗体を誘発する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項５０記載の核酸分子。
【請求項５３】
アンカー配列をコードする部分が、
【化２】
2006020635.tif 000012
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列から成る群から選択されるＤＮＡ配列を有する請求項４４記載の核酸分子。
【請求項５４】
（ｃ）における配列が、（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である請求項５３記載のＤＮＡ分子。
【請求項５５】
インフルエンザウィルス蛋白が、トリインフルエンザウィルス蛋白である請求項５０記載の核酸分子。
【請求項５６】
アンカー配列が、アミノ酸配列ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱまたは配列ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱを認識する抗体を認識する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項５５記載の核酸分子。
【請求項５７】
アンカー配列をコードする部分が、
【化３】
2006020635.tif 000013
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む請求項５５記載の核酸分子。
【請求項５８】
（ｃ）における配列が、（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である請求項５７記載のＤＮＡ分子。
【請求項５９】
アンカー配列が、
アミノ酸配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＦＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥまたは配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＦＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥを認識する抗体を誘発する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体を含む請求項４４記載の核酸分子。
【請求項６０】
アンカー配列をコードする部分が、
【化４】
2006020635.tif 000014
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む請求項４４記載の核酸分子。
【請求項６１】
（ｃ）における配列が、（ａ）および（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である請求項６０記載のＤＮＡ分子。
【請求項６２】
アンカー配列をコードする部分が、ｅｎｖ遺伝子産物の機能性開裂部位をコードするヌクレオチドの上流の隣接するｅｎｖ遺伝子に位置する請求項４４記載の核酸分子。
【請求項６３】
アンカー配列をコードする前記部分が、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド７７７７と７７７８との間または他のレトロウィルスｅｎｖ遺伝子の相当する箇所に位置している請求項６２記載の核酸分子。
【請求項６４】
前記修飾レトロウィルスゲノムが、プライマー結合部位を欠失している請求項２８または４４記載の核酸分子。
【請求項６５】
前記修飾レトロウィルスゲノムが、ヒトレトロウィルスからの修飾レトロウィルスゲノムである請求項２８または４４記載の核酸分子。
【請求項６６】
ヒトレトロウィルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＬＶ−１およびＨＩＬＶ−２から成る群から選択される請求項６５記載の核酸分子。
【請求項６７】
ヒトレトロウィルスがＨＩＶ−１であり、ｅｎｖ遺伝子がＬＡＩｅｎｖ遺伝子、ＭＮｅｎｖ遺伝子、一次ＨＩＶ−１単離物からのｅｎｖ遺伝子または抗原的にそれに等価なｅｎｖ遺伝子である請求項６５記載の核酸分子。
【請求項６８】
前記のｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が、ｅｎｖ遺伝子を誘導するＨＩＶ−１単離物とは異なるＨＩＶ−１単離物から誘導される請求項６７記載の核酸分子。
【請求項６９】
前記ｅｎｖ遺伝子が、一次ＨＩＶ−１単離物から誘導される請求項６８記載の核酸分子。
【請求項７０】
請求項１もしくは１４記載のレトロウィルス様粒子または請求項３３もしくは４４記載の核酸分子およびそれらに対する担体を有してなる、レトロウィルス特異性免疫応答および非レトロウィルスマーカーに対する特異的免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物。
【請求項７１】
粘膜投与または非経口投与用に製剤される請求項７０記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
経口的、経肛門的、経膣的または鼻腔内投与用に製剤される請求項７０記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
さらに、少なくとも１個の他の免疫原性物または免疫刺激性物を有してなる請求項７１記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
少なくとも１個の他の免疫刺激物がアジュバントである請求項７３記載の組成物。
【請求項７５】
アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデニルエステル、ムラミルジペプチド、リボ蛋白および不完全フロイントアジュバントからなる群から選択される請求項７４記載の組成物。
【請求項７６】
宿主に、免疫的に有効な量の請求項７０記載の免疫原性組成物を投与する段階を有してなる、宿主を免疫感作して、レトロウィルス特異的免疫応答および抗原マーカーに対する特異的免疫応答を起こす方法。
【請求項７７】
検体中のレトロウィルス抗原と特異的に反応する抗体の存在を測定する方法であって、  （ａ）請求項１または１４に記載の非感染性レトロウィルス様粒子と検体とを接触させて、非感染性レトロウィルス様粒子および該粒子と特異的に反応する検体中に存在する前記抗体とを有する錯体を形成する段階、ならびに  （ｂ）前記錯体の形成を確認する段階を有する方法。
【請求項７８】
検体中のレトロウィルス抗原の存在を確認する方法であって、
（ａ）請求項７０記載の免疫原性組成物で宿主を免疫感作して、レトロウィルス抗原特異的抗体を産生する段階、
（ｂ）レトロウィルス抗原特異的抗体と検体とを接触させて、検体中のレトロウィルス抗原とレトロウィルス抗原特異的抗体を有してなる錯体を形成する段階、ならびに
（ｃ）前記錯体の形成を確認する段階を有してなる方法。
【請求項７９】
検体中のレトロウィルス抗原の存在を検出する診断キットであって、
（ａ）請求項７８で産生されるような、少なくとも１個のレトロウィルス抗原特異的抗体、
（ｂ）前記少なくとも１個の抗体を検体と接触させて、検体中のレトロウィルス抗原および前記レトロウィルス抗原特異的抗体を有してなる錯体を形成する手段、ならびに
（ｃ）前記錯体の形成を確認する手段を有してなるキット。
【請求項８０】
請求項７０に記載の免疫原性組成物を用いる免疫感作によって生じる抗血清を確認する方法であって、前記抗血清中の前記抗原マーカーに特異的な抗体を検出する段階を有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫学の分野に関するものであり、詳細には、抗原的に標識した非感染性レトロウィルス様粒子（シュードウィルス粒子（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ）と称される場合もある）に関する。
【０００２】
関連出願の引用
本願は、１９９４年８月１５日出願の米国特許出願０８／２９０１０５号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト免疫不全ウィルスはヒトレトロウィルスであり、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体である。１９８１年に米国でＡＩＤＳが最初に報告されて以来、１９４０００名を超える人がＡＩＤＳによって死亡し、米国のみで３３００００例を超えるＨＩＶ感染が報告されている。世界的には、１４００万人を超える人々がＨＩＶに感染していると推定されている。
【０００４】
１００種類を超えるＡＩＤＳ関連の医薬品がヒトでの治験中であるか、あるいはＦＤＡ承認を待っているが、現在この疾患に対する治療法はない。
【０００５】
従って、ワクチン候補剤として、診断アッセイおよびキットにおける抗原として有用な免疫原性製剤や、ＨＩＶその他のレトロウィルス性の疾患および感染の診断用の免疫試薬の登場が必要とされていることは明らかである。
【０００６】
特定の先行技術の免疫原性製剤には、非感染性非複製性ＨＩＶ様粒子などがある。そこで、１９９３年１０月１４日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９３／２０２２０号および１９９０年５月２日公開のＷＯ９１／０５８６０号（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）では、ゲノムＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に必須のヌクレオチド配列に変化を有するＨＩＶゲノムを有してなる構造体と、哺乳動物細胞でのこれら構造体の発現によって得られる非感染性免疫原性ＨＩＶ粒子の製造が記載されている。
【０００７】
１９９１年５月３０日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９１／０７４２５号（Ｏｎｃｏｇｅｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ）には、発現レトロウィルス蛋白が発生するレトロウィルス粒子中にアセンブリされるような形で成熟レトロウィルスコアおよびエンベロープ構造蛋白の同時発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって得られる非複製性レトロウィルス粒子について記載されている。特定の非複製性ＨＩＶ−１様粒子は、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子とプロテアーゼ遺伝子を有する組換えワクシニアウィルスとＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を有する組換えワクシニアウィルスにより哺乳動物宿主細胞を同時に感染（ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｎｇ）させることで得られている。
【０００８】
本願譲受人の名前で公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／０５８６４号（本願の引用出願に含まれている）には、天然コンホメーションに少なくともｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの蛋白を有し、長い末端反復を欠失し、その天然ゲノム配置にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有する修飾レトロウィルスゲノムによってコードされた特定の非感染性非複製性レトロウィルス様粒子が記載されている。
【０００９】
ＡＩＤＳに対してはワクチンも有効な治療法もなく、しかもそのような先行技術のＨＩＶ様粒子はその天然コンホメーションに多くのＨＩＶ蛋白を有することから、それによって免疫感作された宿主は、ＨＩＶによる感染とは免疫的に識別できない免疫応答を起こす可能性がある。現在は、ＨＩＶ感染者から得た熱失活抗ＨＩＶ抗血清と失活ＨＩＶが多くの診断法の成分として市販されている。安全性、取り扱い易さ、輸送、保管および使用のため、そのような熱失活抗血清および抗原を、上述のような非感染性ＨＩＶ粒子を用いた免疫感作によって生じる非感染性ＨＩＶおよび抗血清に切り換えることが好ましいと考えられる。さらに、これらの非感染性ＨＩＶ粒子を用いた免疫感作によって生じる抗血清は、熱失活による感染性ＨＩＶ除去を行う必要がない。しかしながら、ＨＩＶ感染は重大であることから、失活ＨＩＶとビルレントＨＩＶ粒子および非感染性非複製性ＨＩＶ粒子によって得られた非感染性非複製性ＨＩＶ粒子および抗血清とを区別できることが望ましい。そこで、ＡＩＤＳワクチン候補剤、免疫原性製剤ならびに診断法および診断キットの開発において、免疫的その他の方法でビルレントＨＩＶと識別可能なＨＩＶ様粒子を提供することは有用であると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、ＨＩＶまたは別のレトロウィルス、特にヒトレトロウィルスによる感染と免疫原性製剤による免疫感作との間を識別する能力に関するものである。
【００１１】
本発明はさらに、失活ビルレントＨＩＶ粒子と非感染性非複製性ＨＩＶ様粒子とを識別する能力に関するものでもある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、非感染性レトロウィルス様粒子にマーカーを組み込むものである。
【００１３】
従って１態様において、本発明は、
（ａ）ｅｎｖ遺伝子産物、（ｂ）ｐｏｌ遺伝子産物、（ｃ）ｇａｇ遺伝子産物のアセンブリ、ならびに
（ｄ）非レトロウィルス性または非ＨＩＶレトロウィルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを含んでなる非感染性レトロウィルス様粒子を提供する。
【００１４】
少なくとも１個の抗原マーカーは約５〜約１００個のアミノ酸残基、特には約１０〜約７５のアミノ酸残基を有することができる。抗原マーカーは、別のウィルスからの抗原性エピトープを少なくとも１個有することができる。１実施態様において本発明は、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）コート蛋白からの少なくとも１個の抗原性エピトープ、具体的にはアミノ酸配列ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮ（配列番号１）、あるいはこの配列を認識する抗体を誘導することができる、該配列の一部、変化体もしくは突然変異体、またはそのようなアミノ酸配列の複数（具体的には１〜４個）のコピーなどによって説明される。
【００１５】
抗原マーカーには、いずれか簡便な方法で、ｅｎｖ、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子産物のアセンブリ中に組み込むことができる。
【００１６】
本発明の１実施態様においては、マーカー配列をｇａｇ遺伝子産物内に持たせて、未修飾ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を有するハイブリッドｇａｇ遺伝子産物を形成する。マーカー配列は、抗原的に活性な挿入部位でｇａｇ遺伝子産物に抗原マーカーを挿入することでｇａｇ遺伝子産物中に入れることができる。
【００１７】
本発明の具体的な１実施態様においては、挿入部位は、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｇａｇ遺伝子産物のアミノ酸残基２１０と２１１の間に位置する部位あるいは他のレトロウィルスｇａｇ遺伝子産物の相当する箇所とすることができる。
【００１８】
マーカー配列は、レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列の産生を欠失させるかあるいは防止することで得ることもできる。例えばそのようなエピトープは、内因性アンカー形成機能部分（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を与える免疫優性領域ｇｐ４１を有することができる。そのような内因性アンカー形成機能部分をこのようにして除く場合、別の抗原性アンカー配列によってアンカー形成機能部分を与える。別法として、ｅｎｖ遺伝子産物の免疫優性領域を、その領域からの少なくとも１個のアミノ酸を置換または除去することで修飾して、レトロウィルス感染宿主からの血清によって生じる突然変異において免疫優性領域の認識を実質的に防止することができる。
【００１９】
本発明のこの実施態様においては、レトロウィルスをＨＩＶとすることができ、その免疫優性領域はアミノ酸配列ＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ（配列番号２７）を含むものとなる。そこにおいてもたらされる変異の具体的なアミノ酸配列には、ＬＧＩＷＧＣＴＧＲＫＩＬＣ（配列番号２８）、ＬＧＩＷＧＣＡＦＲＬＩＣ（配列番号２９）およびＬＧＩＷＧＣＴＬＥＬＩＣ（配列番号３０）が含まれる。
【００２０】
従って、本発明の別の態様においては、
（ａ）内因性アンカー形成機能部分が、レトロウィルス様粒子に当該ｅｎｖ遺伝子産物をアンカーする機能を果すように、当該ｅｎｖ遺伝子産物に対して連結しされている異種のアンカー配列によって置換されてなる、修飾ｅｎｖ遺伝子産物、
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子産物、
（ｃ）ｇａｇ遺伝子産物のアセンブリを有してなる非感染性レトロウィルス様粒子が提供される。
【００２１】
アンカー配列は抗原性であることができ、約５〜約１００のアミノ酸残基、好ましくは約１０〜約７５のアミノ酸残基を有することができる。アンカー配列は、膜スパニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）蛋白のトランスメンブラン成分の一部、特には糖蛋白を少なくとも有することができる。そのような糖蛋白はインフルエンザウィルス蛋白、特にはヒトインフルエンザウィルス蛋白もしくはトリインフルエンザウィルス蛋白などの簡便な糖蛋白であることができる。
【００２２】
アンカー配列には、
アミノ酸配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷ（配列番号２）またはその配列を認識する抗体を産生する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体、
アミノ酸配列ＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＩＡＧＬＳＦＷＭＣＳＮＧＳＬＱ（配列番号３）またはその配列を認識する抗体を産生する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体、あるいは
アミノ酸配列ＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＣＷＧＳＳＣＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＦＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥ（配列番号４）またはその配列を認識する抗体を産生する能力を有するその配列の一部、変化体もしくは突然変異体などがあり得る。
【００２３】
好ましくは、アンカー配列は、ｅｎｖ遺伝子産物の機能性開裂部位の上流で、かつ隣接させて、ｅｎｖ遺伝子産物内に挿入する。挿入部位は好ましくは、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸残基５０７および５０８の間あるいは他のレトロウィルスｅｎｖ遺伝子産物の相当する箇所とする。
【００２４】
本発明のいずれかの態様に従って提供されるレトロウィルス様粒子は好ましくは、ｅｎｖ、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子産物がヒトレトロウィルスのｅｎｖ、ｐｏｌおよびｇａｇ遺伝子産物に相当するもの、特にはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２とする。具体的には、ヒトレトロウィルスをＨＩＶ−１とすることができ、ｅｎｖ遺伝子産物をＬＡＩｅｎｖ遺伝子産物、ＭＮｅｎｖ遺伝子産物、一次ＨＩＶ−１単離物からのｅｎｖ遺伝子産物または抗原的にそれに等価なｅｎｖ遺伝子産物とすることができる。ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子産物は、ｅｎｖ遺伝子産物を誘導するＨＩＶ−１単離物とは異なるＨＩＶ−１単離物から誘導することができる。特に、そのような粒子では、ｅｎｖ遺伝子産物を一次ＨＩＶ−１単離物から誘導することができる。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の非感染性レトロウィルス様粒子をコードする核酸分子をも含むものである。従って、本発明の別の態様においては、長い末端反復を欠失し、その天然ゲノム配置のｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子ならびに、非レトロウィルス性もしくは非ＨＩＶウィルス性である少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片とを含んでなる修飾レトロウィルスゲノムからなる、非感染性レトロウィルス様粒子をコードする核酸分子が提供される。その核酸分子は、ＨＩＶ−ＩLAI単離物のゲノムのＳａｃＩからＸｈｏＩ断片に存在する特徴的な遺伝要素を有するＤＮＡ分子を有することができる。修飾ゲノムも、プライマー結合部位を欠失するものとすることができる。
【００２６】
本発明のこの態様の具体的な１実施態様例においては、少なくとも１個の抗原マーカーをコードした配列をｇａｇ遺伝子、具体的にはＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｇａｇ遺伝子のヌクレオチド１４１５におけるＰａｔＩ部位または他のレトロウィルスｇａｇ遺伝子の相当する箇所に挿入する。一つの具体的部分は、
【００２７】
【化１】
2006020635.tif 000002
【００２８】
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列のコピー１〜４個を有するものである。
【００２９】
各種ハイブリッド形成条件を用いて、ハイブリッド形成の選択性の程度を変化させることができる。選択性を高度なものとする場合、例えば約５０〜７０℃の温度で０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌという低塩濃度および／または高温条件のような厳しい条件を用いて、二本鎖を形成する。適用場面によっては、温度範囲約２０℃〜５５℃、塩濃度０．１５Ｍ〜０．９Ｍのように、ハイブリッド形成条件をそれほど厳しくする必要がない場合もある。加えるホルムアミドを増量することによってハイブリッド形成条件をより厳しくして、ハイブリッド二本鎖を不安定にすることもできる。
【００３０】
本発明のさらに別の態様においては、長い末端反復を欠失し、かつ天然ゲノム配置のｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含んでなり、レトロウィルス様粒子にｅｎｖ遺伝子産物をアンカーする機能を果たす抗原性アンカー配列をコードする断片をその内に擁する修飾ｅｎｖ遺伝子を持ち、それによって、この修飾ｅｎｖ遺伝子は、ｅｎｖの内因性アンカー機能を抗原性のアンカー配列により置き換えられている改変ｅｎｖ遺伝子産物をコードしている、修飾レトロウイルスゲノムからなる非感染性レトロウィルス様粒子をコードする核酸分子を提供される。
【００３１】
本発明のこの態様の具体的な１実施態様例においては、抗原マーカー配列をコードした部分は、ｅｎｖ遺伝子、具体的にはＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド７７７７と７７７８との間または他のレトロウィルスｅｎｖ遺伝子の相当する箇所に挿入する。アンカー配列をコードした一つの具体的部分は、
【００３２】
【化２】
2006020635.tif 000003
【００３３】
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列などがある。
【００３４】
アンカー配列をコードした別の具体的部分は、
【００３５】
【化３】
2006020635.tif 000004
【００３６】
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列などがある。アンカー配列をコードしたさらに別の具体的部分は、
【００３７】
【化４】
2006020635.tif 000005
【００３８】
（ｃ）厳しい条件下に（ａ）または（ｂ）とハイブリッド形成するＤＮＡ配列、特には（ａ）または（ｂ）の配列と少なくとも約９０％配列が同一である配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列などがある。
【００３９】
本発明はさらに、別の態様において、本発明で提供されるレトロウィルス様粒子または核酸分子およびそれらに対する担体とを含む、レトロウィルス特異的免疫応答および非レトロウィルスマーカーに対する特異的免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物をも含むものである。そのような組成物は、粘膜投与または非経口投与用に製剤して、経口的、経肛門的、経膣的もしくは鼻腔内経路で投与することができる。その免疫原性組成物は、少なくとも１個の他の免疫原性物もしくは免疫刺激性物、具体的にはリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデニルエステル、ムラミルジペプチド、リポ蛋白または不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントを含むことができる。
【００４０】
さらに別の態様において、本発明には、宿主を免疫感作してレトロウィルス特異的免疫応答および抗原マーカーに対する特異的非レトロウィルス性免疫応答を起こす方法であって、宿主に対して本発明で提供される免疫原性組成物を免疫的に有効な量で投与する段階を有する方法が含まれる。
【００４１】
本発明はさらに、これら材料を利用する診断方法および診断キットをも含むものである。具体的には、本発明の別の態様においては、検体中のレトロウィルス抗原と特異的に反応する抗体の存在を確認する方法であって、
（ａ）検体を本発明で提供される非感染性レトロウィルス様粒子と接触させて、非感染性レトロウィルス様粒子および該粒子との特異的反応性を有する検体中に存在するそのような抗体を有してなる錯体を生成する段階、ならびに
（ｂ）該錯体の生成を確認する段階を有してなる方法が提供される。
【００４２】
本発明のさらに別の態様においては、検体中のレトロウィルス抗原の存在を確認する方法であって、
（ａ）宿主を本発明で提供される免疫原性組成物で免疫感作してレトロウィルス性抗原特異的抗体を生成する段階、
（ｂ）検体を前記レトロウィルス性抗原特異的抗体と接触させて、検体中のレトロウィルス抗原と前記レトロウィルス性抗原特異的抗体とを有してなる錯体を生成する段階、および
（ｃ）該錯体の生成を確認する段階を有してなる方法が提供される。
【００４３】
本発明のさらに別の態様は、
（ａ）本発明で提供されるそのような少なくとも１個のレトロウィルス性抗原特異的抗体、
（ｂ）検体と該少なくとも１個の抗体とを接触させて検体中のレトロウィルス性抗原とレトロウィルス性抗原特異的抗体とを有してなる錯体を生成する手段、および
（ｃ）該錯体の生成を確認する手段を有してなる、検体中のレトロウィルス性抗原の存在を検出するための診断キットを提供するものである。
【００４４】
さらに、本発明のさらに別の態様においては、本発明で提供される免疫原性組成物による免疫感作によって生じる抗血清を確認する方法であって、抗原マーカーに特異的な抗血清中の抗体を検出する段階を有してなる方法が提供される。
【００４５】
本発明の利点には、
−非感染性および非複製性となっている、天然コンホメーションにｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物を有してなる免疫原性レトロウィルス様粒子、および
−ビルレントレトロウィルスと免疫的に識別可能な免疫原性レトロウィルス様粒子などがある。
【００４６】
図面の簡単な説明
図面を参照しながら、以下の説明により、本発明についての理解を深めることができる。
【００４７】
図１は、本発明の１実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶ−Ａ）の構造図式である。
【００４８】
図２は、本発明の別の実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶＢＲＵ）の構造図式である。
【００４９】
図３は、本発明のさらに別の実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐ８３−１９）の構造図式である。
【００５０】
図４は、本発明の１実施態様によるプラスミド（ｐＳｅＢＳ−ＨＡ２）の構造図式である。
【００５１】
図５は、遺伝子アセンブリを用いた突然変異誘発の工程系統図である。
【００５２】
図６は、本発明のさらに別の実施態様によるヒトインフルエンザヘマグルチニン糖蛋白のトランスメンブラン成分の一部を有する抗原マーカー配列を有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１）の構造図式である。
【００５３】
図７は、本発明のさらに別の実施態様による非天然マーカーを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２）の構造図式である。
【００５４】
図８は、本発明のさらに別の実施態様による非天然マーカーを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５）の構造図式である。
【００５５】
図９は、本発明のさらに別の実施態様による非感染性非複製性レトロウィルス様粒子のｇａｇ遺伝子産物に挿入されたタバコモザイクウィルスからの抗原性エピトープをコードするオリゴヌクレオチドの詳細図である。
【００５６】
図１０は、タバコモザイクウィルスからの抗原性エピトープを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミドの構造図式である。
【００５７】
図１１は、本発明の抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子（シュードウィルス粒子）のイムノブロット分析を示す図である。
【００５８】
図１２は、抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子のイムノブロット分析を示して、ｇａｇ遺伝子産物に抗原マーカーが含まれていることを示す図である。
【００５９】
図１３は、ｍＨＡ２配列を有することによって抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子で免疫感作したモルモットにおける免疫応答を示す図である。
【００６０】
図１４は、ＴＭＶマーカー配列を有することによって抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子で免疫感作したモルモットにおける免疫応答を示す図である。
【００６１】
図１５は、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０中の、ＨＩＶ−１と抗原的に識別できる非感染性レトロウィルス様粒子を提供する修飾を行う免疫優性領域の位置を示す図である。
【００６２】
図１６は、ＨＩＶ−１の臨床的一次単離物のエンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０を有するレトロウィルス様粒子のイムノブロット分析を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
発明の一般的説明
本発明の各種実施態様が予防接種、診断、ＨＩＶ感染治療、および免疫試薬生成の分野において多くの利用場面を有することは当業者には明らかである。そのような用途についての考察を以下に行うが、本発明はその記載内容に限定されるものではない。
【００６４】
図１および図２に関しては、長い末端反復、プライマー結合部位ならびにＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）配列を欠失する修飾レトロウィルスゲノムを有し、しかもその天然ゲノム配置にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有するベクターｐＭＴＨＩＶＢＲＵ（ＡＴＣＣ名称７５８５２）の構造が図示してある。ｐＭＴＨＩＶＢＲＵのｐｏｌ遺伝子は、それの一部の欠失による修飾を受けて、それの逆転写酵素活性およびインテグラーゼ活性を実質的に失っている。さらに、本発明のこの特定の実施態様例においては、欠失ｐｏｌ遺伝子内にオリゴヌクレオチドが挿入されていることで、３つの異なる読み枠に３つの終止コドンを導入して、インテグラーゼの残りの配列が翻訳されるのを防ぐようになっている。ｐＭＴＨＩＶＢＲＵのｇａｇ遺伝子も修飾されて、最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックスにおける２つのシステイン残基（Ｃｙｓ387およびＣｙｓ395）がセリンに置き換えられている。
【００６５】
そうして、プラスミドｐＭＴＨＩＶＢＲＵは、ＨＩＶの感染性および／または複製に必要であるがウィルス様粒子生成に必須ではない複数の要素が欠失しているＨＩＶ様粒子をコードする。
【００６６】
プラスミドｐＭＴＨＩＶＢＲＵは、ＨＩＶ−１LAI単離物のものに相当するエンベロープ蛋白を有するＨＩＶ様粒子をコードする。図３に関しては、ｐＭＴＨＩＶＢＲＵのＬＡＩエンベロープが実質的にＭＮエンベロープ配列によって置き換わっているプラスミドｐ８３−１９が示してある。そうして、プラスミドｐ８３−１９は、ＨＩＶの感染性および／または複製に必要であるがウィルス様粒子生成に必須ではない複数の要素が欠失しているＨＩＶ様粒子をコードし、ＨＩＶ−１単離物ＭＮのエンベロープを実質的にｅｎｖ遺伝子産物として有する。ＨＩＶ様粒子は、他のｅｎｖ産物、特には特異的単離物ｂｘ０８などのクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＯからの一次ＨＩＶ−１単離物などのＨＩＶ−１感染患者からの臨床的単離物からのものを有することができる。ｅｎｖ遺伝子産物はさらに、ＭＮ／ＬＡＩ、ｂｘ０８／ＬＡＩおよびクレード−ＬＡＩキメラ（ｃｈｉｍｅｒ）などのように、ある発生源からのｇｐ１２０蛋白と別の起源からの残りの部分とのキメラであることもできる。
【００６７】
図４〜６に関しては、長い末端反復、プライマー結合部位ならびにＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）配列を欠失している修飾ＨＩＶゲノムを有し、しかもその天然ゲノム配置にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有するベクターｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１の構造が図示してある。ｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１のｅｎｖ遺伝子は修飾されて、その中で異なったアンカー配列をコードする遺伝子を提供して、レトロウィルス様産物にｅｎｖ遺伝子産物をアンカーすることで、修飾ｅｎｖ遺伝子がｅｎｖの内因性アンカー形成機能部分がその異なったアンカー配列によって置換されている修飾ｅｎｖ遺伝子産物をコードするようにしたものである。ｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１によってコードされたレトロウィルス様粒子においては、ｇｐ４１の免疫優性エピトープ（内因性アンカー形成機能部分を提供するもの）は発現されなくなっている。そこで、そのようなレトロウィルス様粒子は、レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列がないことにより、陰性の形で抗原的に標識される。その異なったアンカー配列自体を抗原性として、レトロウィルス様粒子についての陽性の非レトロウィルス性または非ＨＩＶレトロウィルス性抗原マーカーを提供することができる。
【００６８】
本発明のこの特定の実施態様例においては、ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子からのコード化ＤＮＡ断片と終止コドンを有する１３５−ｂｐ配列が、ＨＩＶ−１LAIエンベロープ遺伝子のヌクレオチド７７７７（Ｇ）と７７７８（Ａ）の間に挿入されて、ＨＩＶ−１LAIｇｐ４１トランスメンブレン糖蛋白の合成を防止している。そうして、プラスミドｐＭＴＨＵＶＨＡ２−７０１は、ｇｐ４１トランスメンブレン糖蛋白アンカー形成機能部分がヒトインフルエンザＨＡ２蛋白からのアンカー配列によって置換され、ＨＡ２蛋白がさらに抗原マーカーを提供するＨＩＶ様粒子をコードする。
【００６９】
図７に関しては、ｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１と類似しているが、ｅｎｖの内因性アンカー形成機能部分に置換する抗原マーカー配列として、公知の天然蛋白とは相同性を持たないアミノ酸配列を有するプラスミドｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２を図示している。
【００７０】
図８に関しては、長い末端反復、プライマー結合部位ならびにＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）配列を欠失している修飾ＨＩＶゲノムを有し、その天然配置にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有するベクターｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５（ＡＴＣＣ名称７５８５３）を図示している。ｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５のｐｏｌ遺伝子は、その一部の欠失によって修飾されて、その逆転写酵素活性およびインデグラーゼ活性を実質的に失っている。さらに、欠失ｐｏｌ遺伝子内にオリゴヌクレオチドを挿入して、３つの異なる読み枠に３つの終止コドンを導入して、インテグラーゼの残りの配列が翻訳されるのを防ぐようになっている。ｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５のｇａｇ遺伝子も修飾されて、ｇａｇの最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックスにおける２つのシステイン残基がセリンに置き換えられている。ｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５では、ｅｎｖの内因性アンカー形成機能部分は、天然蛋白と相同性を持つことが知られていないアミノ酸配列によって置換されている。プラスミドｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５でトランスフェクションされたベロ細胞から産生されるＨＩＶ様粒子を精製して、モルモットの免疫感作に使用した。抗血清を回収し、表１に示したような抗Ｖ３（すなわち抗エンベロープ）抗体および抗ｍＨＡ２（すなわち抗抗原マーカー）抗体についてのＥＬＩＳＡによるアッセイを行った。これらの実験を、他のモルモットで繰り返し、抗ｇａｇ抗体についてのアッセイにも拡大し、得られた結果を図１３に示してある。この結果は、ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産物が実質的にその生コンホメーションに存在すること、ならびに抗原マーカーが免疫原性であることを示している。
【００７１】
以上、ｅｎｖの内因性アンカー形成機能部分が特定の天然および非天然蛋白の抗原性アンカー配列によって置換された特定のレトロウィルス様粒子について説明したが、本発明の本質を逸脱しなければ、内因性アンカー形成機能部分を置換できる特定の手段に対して多くの変更、調節および改良を施すことができることは明らかである。
【００７２】
図９および１０に関しては、ＴＭＶからの抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配列のコピー１〜４個を有するプラスミド（ｐＨＩＶ−Ｔ１；ｐＨＩＶ−Ｔ２（ＡＴＣＣ名称７５８５１）；ｐＨＩＶ−Ｔ３およびｐＨＩＶ−Ｔ４）を図示している。この図示した特定の実施態様では、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子にＴＭＶエピトープが挿入されてハイブリッドのｇａｇ遺伝子産物を生成し、前述のようにプラスミドはＨＩＶの感染性および／または複製に必要であるがウィルス様粒子生成には必須ではない複数の要素が欠失している。プラスミドｐＨＩＶ−Ｔ１、ｐＨＩＶ−Ｔ２（ＡＴＣＣ名称）、ｐＨＩＶ−Ｔ３およびｐＨＩＶ−Ｔ４（それぞれ、１、２、３および４個の抗原エピトープコピーを有する）を用いて安定な細胞系を形成し、それによってｇａｇ蛋白に挿入された抗原マーカーを有するＨＩＶ様粒子を得た。これらのＨＩＶ様粒子を精製し、その抗ＨＩＶモノクローナル抗体（図１１）および抗ＴＭＶマーカー抗血清（図１２）との反応性を求めた。結果を図１１および図１２に示してある。その結果は、ＨＩＶ様粒子が、実質的にその天然コンホメーションにｇｐ１２０、ｇｐ４１およびｐ２４を有し、抗マーカー抗体がＴＭＶマーカーを認識することができることを示している。
【００７３】
プラスミドｐＨＩＶ−Ｔ２によって産生された精製ＨＩＶ様粒子を用いて、モルモットの免疫感作を行った。抗血清を回収し、図１４に示したように、抗ｇａｇ抗体抗Ｖ３（すなわち、抗エンベロープ）抗体および抗ＴＭＶ（すなわち抗抗原マーカー）抗体についてＥＬＩＳＡによるアッセイを行った。これらの結果は、ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産物が実質的にその生コンホメーションに存在し、抗原マーカーが免疫原性であることを示している。
【００７４】
さらに、これらの免疫感作から得られたモルモット血清について、ウィルス感染阻害アッセイを実施した。表２に示したように、中和抗体を形成した。そのような中和抗体の形成は、ワクチン候補剤としておよび診断的利用場面でこのレトロウィルス様粒子が有用性を有することを示している。
【００７５】
図１６に関しては、臨床（一次）単離物ｂｘ０８からのエンベロープ糖蛋白を発現するレトロウィルス様粒子（シュードウィルス粒子）のイムノブロット分析を図示している。ＨＩＶ−１  ｂｘ０８は、フランスで単離されたクレードＢからの臨床的単離物である。この分析は、非臨床単離物ｇａｇ蛋白を有する分子における臨床単離物からのエンベロープ糖蛋白の発現を示している。
【００７６】
本明細書においては、アンカー配列でもあり得るマーカー配列の具体的実施態様について説明しているが、レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列不在など、マーカーおよび／またはアンカー形成機能部分を提供する他のいかなる簡便なアミノ酸配列も本発明に用いることができることは明らかである。レトロウィルス蛋白のエピトープに相当するアミノ酸配列の不在は、表３に示したように、ｅｎｖ遺伝子産物の免疫優性領域からの１以上のアミノ酸の突然変異誘発が関与することで、レトロウィルス感染宿主からの血清による得られた突然変異における免疫優性領域の認識が実質的に防止されると考えられる。マーカー機能部分を与えるアミノ酸配列は、公知の蛋白とは相同性を持たない非天然抗原配列を有するものとすることができる。そのような配列の例としては、上記の突然変異体ＨＡ２配列である。他の例には、非ヒトまたは非哺乳動物病原性または共生性微生物などの非ヒトまたは非哺乳動物蛋白の抗原性領域などがあり得る。
【００７７】
そのような配列の例としては、前述のＴＭＶがある。
【００７８】
本発明の各種実施態様は、予防接種、診断、ＨＩＶ感染治療および免疫試薬生成の分野で多くの利用場面を有することは当業者には明らかである。そのような用途についての考察を以下に行うが、本発明はその記載に限定されるものではない。
ワクチンの製造および用途
本発明による免疫原性製剤が免疫応答を誘発し得ることは上記で示した。従って、本発明の用途で可能性のあるものとしては、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連状態を含めたレトロウィルス疾患に対するワクチンの基礎としてのものである。そこで別の態様において本発明は、本発明による免疫原性組成物を有してなるＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連状態に対するワクチンを提供するものである。
【００７９】
ワクチンとして使用するのに適した免疫原性組成物は、本願で開示のような非感染性レトロウィルス様粒子から得ることができる。免疫原性組成物は、抗ウィルス性の抗体を産生する免疫応答を誘発する。ワクチン形成者に対してＨＩＶなどのレトロウィルスによる攻撃があっても、抗体がウィルスに結合し、それによってウィルスが失活する。
【００８０】
ワクチンは注射剤として、すなわち液剤または乳剤として製剤することができる。非感染性レトロウィルス様粒子は、レトロウィルス様粒子と適合する医薬的に許容される賦形剤と混合することができる。賦形剤には、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびこれらを組み合わせたものなどがある。
【００８１】
ワクチンにはさらに、湿展剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤あるいはアジュバントなどの補助物質を含有させて、ワクチンの有効性を高めることができる。ワクチンに対するアジュバント効果を得る方法には、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（アルム）などの試薬を使用し、一般的にはそれをリン酸緩衝生理食塩水と他のアジュバント（Ｑ８２１およびフロイント不完全アジュバントなど）の０．０５〜０．１％溶液として使用する方法などがある。ワクチンは、皮下注射または筋肉注射により、非経口的に投与することができる。別法として、本発明によって形成される免疫原性組成物を、粘膜表面で免疫応答を起こすような形で製剤・運搬することができる。そこで、免疫原性組成物を、例えば経鼻的または経口的（胃内）に粘膜に投与することができる。別法として、坐剤および経口投与製剤などの他の投与形態が望ましい場合がある。坐剤の場合、結合剤および担体には例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドなどがあり得る。経口製剤には、医薬用のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用されるインシピエント（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔ）などがあり得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉剤の形を取り、本発明のレトロウィルス様粒子を１０〜９５％で含有する。
【００８２】
ワクチンは、製剤に適合した方法と、治療上有効性、予防性かつ免疫原性を有する量で投与する。投与量は、例えば抗体を合成し細胞介在免疫応答を生じる免疫系の個人的能力など、治療を受ける患者によって決まる。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断によって決まるものである。しかしながら、好適な用量範囲は当業者には容易に決定できるものであり、μｇ単位のレトロウィルス様粒子になると考えられる。初回投与用量および補助投量についての好適な投与方法も変動し得るが、初回投与後に以降の投与を行う方法などがあり得る。免疫感作スケジュールの１例としては、本発明によるレトロウィルス様粒子で少なくとも１回の予備免疫感作を行ってから、本願の譲受人に譲渡された欧州特許公開番号０５７０９８０号に記載の合成ペプチドによって少なくとも１回免疫感作を行うものがある。ワクチンの用量も投与経路によって決まり得るものであり、宿主の大きさによっても変動する。
【００８３】
本発明のレトロウィルス様粒子をコードする核酸分子は、例えば宿主に対する注射による直接の核酸分子投与によって、免疫感作に直接用いることもできる。
【００８４】
遺伝的免疫感作の被験者にＤＮＡを直接注射する方法は、例えばウルマーらの文献（Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；本開示の最後に引用文献リストがあり、掲載の各引用文献については言及してあるのみで、それ以上の記載は行っていない）に記載されている。
【００８５】
本発明による分子にはさらに、ＨＩＶウィルスのヒト細胞もしくは動物細胞への結合に取って代わる作用を行うか、あるいはウィルスの３次元構成を攪乱することで、ＡＩＤＳもしくは関連状態の治療（予防的または治療的）での用途もあり得る。
【００８６】
そこで、本発明のさらに別の態様は、有効量の本発明による免疫原性組成物を投与する段階を有してなるＡＩＤＳまたは関連状態の予防方法または治療方法を提供するものである。
イムノアッセイ
本発明のレトロウィルス様粒子は、免疫原として、すなわち、酵素結合性免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合性抗体結合アッセイなどのイムノアッセイ、あるいは抗レトロウィルス（例：ＨＩＶ）ＨＩＶ抗体およびレトロウィルス抗原（例：ＨＩＶ）の検出に関して当業界で公知の方法における抗原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、レトロウィルス様粒子を、ポリスチレン微量力価測定プレート孔などの蛋白を結合する能力を有する表面などの所定の表面に固定化する。洗浄によって吸着が不完全なレトロウィルス様粒子を除去した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはカゼインの溶液などの被験検体に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的蛋白を所定の表面に結合させることができる。それにより、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断ができ、従ってその表面への抗血清の非特異的結合によって生じるバックグラウンドが低下する。
【００８７】
次に固定化表面を、免疫錯体（抗原／抗体）形成ができるような形で、試験対象の臨床検体または生物検体などの検体と接触させる。それには、検体をＢＳＡ溶液、ウシγ−グロブリン（ＢＧＧ）溶液および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎなどの希釈剤で希釈する方法などがあり得る。次に検体を、約２５℃〜３７℃程度などの温度で約２〜４時間インキュベーションする。
【００８８】
インキュベーション後、検体に接触した表面を洗浄して、免疫錯体形成していない材料を除去する。洗浄方法には、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸緩衝液などの溶液で洗浄する方法などがあり得る。
【００８９】
被験検体と結合したレトロウィルス様粒子との間で特異的免疫錯体を形成してから洗浄を行った後、免疫錯体形成が起こったか否かおよびその量も、第１の抗体に対する特異性を有する第２の抗体にその免疫錯体を曝露することで確認することができる。被験検体がヒト起源のものである場合、第２の抗体はヒト免疫グロブリン（一般にはＩｇＧと表記される）に対する特異性を有する抗体である。
【００９０】
検出手段を提供するため、第２の抗体には、例えば適切な色原性基質とともにインキュベーションすることで発色する酵素活性などの活性を持たせることができる。次に、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて発色程度を測定することで、定量を行うことができる。
【００９１】
複数のＨＩＶ単離物を識別する抗体を確認することが望ましい診断の１実施態様においては、本発明の免疫的に区別される複数のレトロウィルス様粒子を所定の表面に固定化する。別法として、抗ＨＩＶ抗体が各種ＨＩＶ単離物中でかなり保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）エピトープ（例：ｇａｇまたはｇｐ４１からのＢ細胞エピトープ）を認識する場合、単一または限られた数のレトロウィルス様粒子を固定化することができる。単一のＨＩＶ単離物（例：ＬＡＩ、ＭＮ、ＳＦ２またはＨＸＢ２）を認識する抗体を特異的に確認することが望ましい診断のさらに別の実施態様においては、本発明の単一の特定レトロウィルス様粒子を固定化することができる。その別の診断実施態様は、医学、臨床試験、法律および法科学という、抗体応答などの免疫応答を発生させた特定のＨＩＶ単離物を測定することが必須である分野において特に有用である。
【００９２】
さらに別の実施態様においては、異なったクレードに属するＨＩＶ単離物などの免疫的に区別されるレトロウィルスを特異的に確認することが望ましい場合がある。免疫的に区別されるＨＩＶ単離物には例えば、ＬＡＩ、ＭＮ、ＳＦ２、ＨＸＢ２または一次ＨＩＶ−１単離物などがある。この診断実施態様においては、本発明の特定のレトロウィルス様粒子は、免疫的に区別されるＨＩＶ単離物を特異的に認識するモノクローナル抗体などの抗体を生成する上で有用である。
【００９３】
免疫的に区別されるレトロウィルス様粒子の混合物を、ワクチンなどにおける免疫原としてあるいは診断試薬として用いることができることは明らかである。
【００９４】
レトロウィルス様粒子の混合物を用いて交差単離物の保護および／または診断を行うような状況があり得る。その場合、免疫原の混合物は通常、「カクテル」製剤と称される。
【００９５】
本発明は、その利点として、天然コンホメーションに実質的にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物を有するレトロウィルス様粒子を提供する。そうして、そのようなレトロウィルス粒子は、変性形のＨＩＶ抗原またはそのようなＭＩＶ抗原に相当する合成ペプチドを認識することができないコンホメーションの抗ＨＩＶ抗体（例：抗ｅｎｖ抗体）によって認識される。従って、本発明のレトロウィルス様粒子は、抗原としておよび診断実施態様における抗レトロウィルス抗体（モノクローナル抗体を含む）の形成での免疫原として特に有用である。
【００９６】
さらに、マーカーが存在することで、それに対する特異的免疫応答を発生させ、それを前述の方法によって検出することで、本発明で提供される免疫原性組成物による宿主の免疫感作と、ビルレントレトロウィルスによる実際の（ｍａｔｅｒｉａｌ）感染とを容易に識別することができる。そのような診断および鑑別が可能であることは、疫学、臨床試験、法科学および免疫学の分野で非常に有用である。
他の用途
本発明の基礎となるレトロウィルス様粒子に結合する分子、特には抗体、抗体関連分子およびそれらの構造的類縁体も、ＡＩＤＳおよび関連状態の治療および診断に試薬として有用である可能性がある。
【００９７】
本発明のレトロウィルス様粒子に対して特異的であるキメラ抗体、人体に適応させた（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、合体させた（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体および人為的に形成した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体などの抗体の変化したもの（抗原結合部位の変化したものを含む）は、本発明の範囲に含まれる。
【００９８】
本発明のレトロウィルス様粒子に結合する抗体および他の分子は、以下に記載のような多くの各種形態で治療（予防および治療）および診断目的に使用することができる。
【００９９】
−抗体（恐らくは人体に適応させた抗体）をＨＩＶ感染患者に対して適切に投与することにより受動感作を行う。
【０１００】
−好適なサブクラスまたはイソタイプ（恐らくは適切な抗体の形成によって得られる）の抗体を用いることで抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化、補足または媒介することにより、所望の機能を行うことができるようにする。
【０１０１】
−例えば、抗体および細胞毒性部分の接合体を有するイムノトキシンを使用することで毒物その他の試薬を標的部分に運搬し、ＨＩＶ感染細胞（例：ｇｐ１２０）の細胞表面に露出したＨＩＶ蛋白に直接または間接的に結合させる。
【０１０２】
−免疫原性の高い材料をＨＩＶ感染細胞の表面を標的として運搬し、宿主の体液または細胞の免疫系のいずれかによってそのような細胞の除去を行う。
【０１０３】
−各種イムノアッセイ法を用いてＨＩＶの検出を行う。
【０１０４】
そこで、さらに別の診断実施態様においては、本発明の免疫原性組成物（個別に、またはカクテル製剤などの混合物として）は、生体検体などの検体中のＨＩＶまたは抗原の検出またはＨＩＶの中和を行うのに使用することができるＨＩＶ抗原特異的抗体（モノクローナル抗体を含む）の形成に有用である。
【０１０５】
別の診断実施態様においては、本発明のレトロウィルス様粒子を用いて、例えばＨＩＶ感染者から得た生体検体中のＨＩＶ特異的Ｔ細胞を特異的に刺激して診断または治療を行うのに使用することができる。
生物寄託
本明細書において記載・言及される本発明の各種態様によるレトロウィルス様粒子をコードするある種のプラスミドは、ブダペスト条約に従い、本願出願に先だって、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，２０８５２）に寄託した。寄託プラスミドのサンプルは、本米国特許出願に基づく特許交付時に公表される。寄託した実施態様は、単に本発明の例とすることを意図したものであることから、本願で説明され特許請求される発明は、寄託したプラスミドに限定されるものではない。本願に記載のものと類似または等価なレトロウィルス様粒子をコードする等価もしくは類似のプラスミドは、本発明の範囲に含まれる。
【０１０６】
寄託の要旨
【０１０７】
【化５】
2006020635.tif 000006
【０１０８】
上記の開示内容は、本発明の概要を説明するものであり、以下の具体的実施例を参照することで、本発明をより完全に理解することができる。これら実施例は、単に例示を目的としたものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０９】
本明細書においては具体的な用語を使用しているが、そのような用語は説明のためのものであり、限定を目的としたものではない。免疫法および組換えＤＮＡ法は本開示に明瞭に記載されていない場合があるが、当業者の能力の範囲内に十分入るものである。
【実施例】
【０１１０】
実施例
本開示および以下の実施例に明瞭には記載されていないが使用した分子遺伝学、蛋白生化学および免疫学の方法は、科学文献中に数多く報告されており、当業者の能力の範囲内のものである。
【０１１１】
実施例１
本実施例は、プラスミドｐＭＴＨＩＶＢＲＵの構造を説明するものである。
【０１１２】
プラスミドｐＭＴＨＩＶＢＲＵは、図１および図２に示したような構造を持っていた。
【０１１３】
このプラスミドは、ロビンスキーらの報告（Ｒｏｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；この引用文献は、明細書末にある）に記載され、ＲＮＡパッケージング欠失を有し、一連の突然変異／欠失を有するよう形成した発現ベクターｐＭＴＨＩＶｄ２５の修飾物である。
【０１１４】
そこで、Ｃｙｓ−Ｈｉｓボックス突然変異においては、図１に示したように、ｇａｇ蛋白の最初のＣｙｓ−Ｈｉｓボックス（配列番号１４）で、２個のコドン（配列番号１３中）が２個のセリンコドンによって置換されている。これは、ＰＣＲに基づく突然変異誘発法によって行った。２個のプライマーを合成し、
上流プライマーは５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧ−３’（配列番号１５）の配列を持ち、５’末端にＳｐｅＩ部位を有するＨＩＶ−１LAIのヌクレオチド１５０７〜１５６７を有し（ヌクレオチドの番号付けは、ウエイン−ホブソンら（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ；１９８５）による）、
下流のプライマーは５’−ＣＴＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＣＴＡＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＴＡＡＣＡＡＴＣ−３’（配列番号１６）の配列を持ち、５’末端にＡｐａＩ部位を持つヌクレオチド２０１１〜１９５３の逆補体である。下流側プライマーでは、ヌクレオチド１９６３および１９７２（Ｗａｉｎ  Ｈｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；  Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）の逆補体を表す２個のアデノシン残基がチミジンに変わって、ｇａｇ遺伝子産物のアミノ酸位置３９２および３９５の２個のシステインが２個のセリンによって置換されている（図１）。これら２つのプライマーを用いて、ｐＭＴＨＩＶのＳｐｅＩ−ＡｐａＩ  ＤＮＡ断片（ヌクレオチド１５０７〜２００８）（Ｒｏｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）を増幅し、それを鋳型として用いた。ＰＣＲ増幅ＳｐｅＩ−ＡｐａＩ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、制限酵素ＳｐｅＩおよびＡｐａＩで消化させた。この断片を用いて、ｐＭＴＨＩＶｄ２５の相当する断片を置換した（Ｒｏｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）。得られたプラスミドはｐＭＴＨＩＶ−Ａと称し、ＲＮＡパッケージング配列欠失およびＣｙｓ−Ｈｉｓボックス突然変異の両方を有している。
【０１１５】
逆転写酵素およびインテグラーゼの欠失を行うため、ＨＩＶ−１LAIのヌクレオチド２６５５および４５８７の２個のＢａｌＩ認識部位を用いた（図３）。その２個のＢａｌＩ部位の間の１．９−ｋｂｐ断片は、逆転写酵素の９５％以上およびインテグラーゼの最初の１０％のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を有する。プラスミドｐＭＴＨＩＶ−ＡをＢａｌＩで消化させた。ゲル電気泳動によって１．９−ｋｂｐＢａｌＩ断片を除去した後、プラスミドの残りの部分を、３つの異なる読み枠に３個の終止コドンを有してインテグラーゼの残りの配列が翻訳されるのを防止する二本鎖オリゴヌクレオチド：５’−ＧＴＡＴＡＡＧＴＧＡＧＴ
ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣ−３’（１本鎖のみを示した−配列番号１７）と連結し
た。得られたプラスミドは、ｐＭＴＨＩＶＢＲＵと名付けた。
【０１１６】
実施例２  本実施例は、抗原的に標識されたエンベロープアンカーを有するＨＩＶ様粒子をコードするプラスミドの構造を説明するものである。
【０１１７】
プラスミドｐ８３−１９を、図３に示したように、発現ベクターｐＭＴＨＩＶＢＲＵから構成した。このプラスミドは、ｇｐ１２０LAIのほとんどをコードするＤＮＡをｇｐ１２０MNをコードする同起源のＤＮＡで置換することで形成したハイブリッドエンベロープ遺伝子を有している。これは、ＨＩＶ−１LAIからのＫｐｎＩ／ＢａｌＩＩＤＮＡ断片（ヌクレオチド６３７９〜７６６８）をＨＩＶ−１MNからのＫｐｎＩ／ＢａｌＩＩＤＮＡ断片（ヌクレオチド６３５８〜７６４１）で置換することで行った。
【０１１８】
図４〜６に示したように、プラスミドｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１を、発現ベクターｐＢＴ１（Ａｌｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４）およびｐＭＴＨＩＶｄ２５（Ｒｏｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）から構成した。
【０１１９】
ｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１ベクターは、ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子（Ｍｉｎ  Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）からのコード化ＤＮＡ断片と終止コドンとを有する１３５−ｂｐ配列を有し、ＨＩＶ−１LAIエンベロープ遺伝子（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５；  Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）のヌクレオチド７７７７（Ｇ）および７７７８（Ａ）の間に挿入されている。停止コドンは、ＨＩＶ−１LAIｇｐ４１トランスメンブラン糖蛋白の合成を防止するために挿入したものである。ｐＢＴ１からのＳａｌＩ（ヌクレオチド５８２１）／ＢａｍＨＩ（ヌクレオチド８５２２）ＤＮＡ断片をｐＳｅｌｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングして、ｐＳｅＢｓを得た（図４）。本願において「遺伝子アセンブリを用いる突然変異誘発（ＧＡＡＭ）」と称した方法により、後者のプラスミドを１３５−ｂｐの挿入に用いた。ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子からのコード化ＤＮＡ断片を有する１３５−ｂｐ配列を有するよう設計された突然変異誘発性プライマー（Ｍｉｎ  Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）を、図５に示したようにアセンブリした。オリゴヌクレオチドＩはＨＩＶ−１LAIのヌクレオチド７７４８〜７７７７（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）と相補的な３０個の塩基とＨＡ２蛋白のアミノ酸１８０〜２０２をコードするＨＡ２遺伝子配列（Ｍｉｎ  Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）と相補的な６９個の塩基を有する（３’から５’）９９マーである。オリゴヌクレオチドＩＩは、ｉ）ＨＡ２蛋白のアミノ酸２０３〜２２１をコードし、ＨＡ２終止コドンを有するＨＡ２遺伝子配列（Ｍｉｎ  Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９８０）と相補的な６０個の塩基、ｉｉ）さらに２個の終止コドンを決定する６個の塩基（ＡＴＣＡＴＴ  −配列番号１８）およびｉｉｉ）ＨＩＶ−１LAIのヌクレオチド７７７８〜７８０７（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）と相補的な３０個の塩基を有する（３’から５’）９６マーである。オリゴヌクレオチドＩＩＩは、オリゴヌクレオチドＩの５’末端と相補的な１５個のヌクレオチドとオリゴヌクレオチドＩＩの３’末端と相補的な１５個のヌクレオチドを有する架橋３０マーである。オリゴヌクレオチドＩおよびオリゴヌクレオチドＩＩ  １０ｐｍｏｌを、オリゴヌクレオチドＩＩＩ  ２０ｐｍｏｌと混合し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２単位を含むキナーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび０．５ｍＭ  ＡＴＰ）２０μＬ中で、３７℃で１．５時間リン酸化した。混合物を９５℃で５分間加熱し、次にゆっくり冷却して室温とすることで、オリゴヌクレオチドをアニーリングした。この混合物に、１０×リガーゼ緩衝液（０．５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０〜１Ｍ  ＭｇＣｌ2、０．１Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  スペルミジンおよび１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）３μＬ、１０ｍＭ  ＡＴＰ３μＬおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼ５単位を加え、得られた連結混合物を１６℃で終夜インキュベーションして、突然変異誘発性プライマーのアセンブリを完了させた（図５）。このプライマーをそれ以上精製せずに、突然変異誘発法に使用した。
【０１２０】
突然変異誘発は、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の突然変異誘発系（Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。突然変異誘発の鋳型は、突然変異キットで提供されるｐＳｅｌｅｃｔファーゲミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターにクローニングされたＨＩＶ−１LAIエンベロープ遺伝子（ヌクレオチド５８２１〜８５２２）の２．７−ｋｂｐＳａｌＩ／ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を有するｐＳｅＢＳプラスミドから成るものであった（図４）。突然変異誘発法後、32Ｐ標識オリゴヌクレオチドＩＩＩプローブを用いたコロニーハイブリッド形成によって、推定されるクローンを確認した。陽性クローンを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。これらのクローンのうちの一つをｐＳｅＢＳ−ＨＡ２と称し、最終ベクターの構成に使用した。
【０１２１】
そのため、ｐＳｅＢＳ−ＨＡ２からの修飾ＢａｌＩ／ＢａｍＨＩ挿入物をｐＭＴＨＩＶｄ２５−ｄＳａｌＩにサブクローニングした。後者は、ＳａｌＩによる部分消化とそれに続くクレノウ処理によりプラスミド骨格中のＳａｌＩ部位を除去することでｐＭＴＨＩＶｄ２５（Ｒｏｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）から誘導されたプラスミドである。最終発現構造は、ｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１と称した。
【０１２２】
ＨＩＶ−１LAIエンベロープ遺伝子（Ｒｏｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；  Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）のヌクレオチド７７７７（Ｇ）および７７７８（Ａ）の間に挿入した異種ＤＮＡ配列を有する発現ベクターｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２（図７に示してある）を上記のように形成した。この場合、ヒトインフルエンザウィルスＨＡ２遺伝子（Ｍｉｎ  Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）からのコード化ＤＮＡ断片と、ＨＡ２配列に融合した場合に、公知の天然蛋白とは相同性を持たないアミノ酸配列をコードする６８個のヌクレオチドを有する１３４−ｂｐ配列を、ＨＩＶ−１LAIのヌクレオチド７７７７の下流に挿入した（図７）。その挿入により、ＨＩＶ−１LAIコード化配列のトランスロケーションにおけるフレームシフトと終止コドン（ＴＡＧ）形成が生じて、ＨＩＶ−１LAIのｇｐ４１トランスメンブラン糖蛋白の合成が防止された。最終発現構造は、ｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２と称した（図７）。
【０１２３】
図８に示したように、発現ベクターｐ８３−１９およびｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２からプラスミドｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５を構成した。このプラスミドは、ｐ８３−１９の感染性および／または複製に必要な要素の突然変異を全て有し、ｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２の１３４−ｂｐ挿入物配列を有するように設計した（図７）。そのために、ｐ８３−１９をＢａｌＩＩ（ヌクレオチド７６４１）およびＸｈｏＩ（ヌクレオチド８９４４）によって消化させて、１２７６−ｂｐ  ＤＮＡ断片を除去し、ｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２の同起源ＢａｌＩＩ／ＸｈｏＩ断片によって置換した。
【０１２４】
実施例３
本実施例は、ＴＭＶからの抗原性エピトープを有するＨＩＶ様粒子をコードするプラスミドの構成について説明する。
【０１２５】
プラスミドｐＨＩＶ−Ｔ１、ｐＨＩＶ−Ｔ２、ｐＨＩＶ−Ｔ３およびｐＨＩＶ−Ｔ４は、ＴＭＶコート蛋白からの少なくとも１個の抗原性エピトープ（Ｗｅｓｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ，１９８４；  Ｔｒｉｆｉｌｌｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）を有してなる二本鎖オリゴヌクレオチド（図９、１０および１１）のコピーをそれぞれ１個、２個、３個または４個有するｐ８３−１９構造体の修飾版を表す。これら４つのベクターの構成は、図９および図１０に図示してある。全ての構造体を形成するには、プラスミドｐＭＴＨＩＶ−Ａ（図１）を最初にＳａｃＩＩおよびＡｐａＩによって消化させて、１３２８−ｂｐ  ＤＮＡ断片を単離し、それを次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。次にその組換えプラスミドを、ｇａｇ遺伝子中のヌクレオチド１４１５でＨＩＶ−１LAIＤＮＡを開裂させるＰｓｔＩで消化させた。次に、図９に示した二本鎖オリゴヌクレオチド（コード化鎖：配列番号１９、相補鎖：配列番号２０、コードされたアミド酸：配列番号２１）の１個、２個、３個または４個のコピーのいずれかをこの制限部位に挿入した。最後に、得られた組換えプラスミドをＳａｃＩＩおよびＡｐａＩによって消化させて、修飾挿入物を放出し、次にそれを、プラスミドｐ８３−１９の同起源領域にクローニングした（図１０）。
【０１２６】
ｍＨＡ２エピトープまたはＴＭＶエピトープの各種コピーのいずれかを有するレトロウィルス様粒子の発現を図１１に示してある。ベロ細胞を集密度８０％まで成長させ、トランスフィニティ（ｔｒａｎｓｆｉｎｉｔｙ）（ＢＲＬ）リン酸カルシウム法によりプラスミドＤＮＡ２０μｇでトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後に、培養上清について、蛋白発現を分析した。個々の発現構造体でトランスフェクションした細胞からの培地（１０ｍＬ）を回収し、４℃で１５分間の２０００×ｇでの遠心（ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ  ６０００Ｂ；Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）を行って透明とした。超遠心によってレトロウィルス様粒子を単離した。ペレット化した粒子をＴＮＥ４０μＬに懸濁し、５×レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル緩衝液１０μＬと混和し、３分間沸騰させた。次に、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによってウィルス蛋白を分離し、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）に移した。膜をブロット（ＢＬＯＴＴＯ）緩衝液（カーネイション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）インスタント脱脂乾燥乳５％、チメロサール０．０００１％（重量／容量）および消泡剤Ａ乳剤０．０１％（容量／容量）を含むＰＢＳ）で２５℃にて２時間遮断し、抗体の適切な希釈液とともに４℃で終夜のインキュベーションを行った。次にフィルターを、アルカリ性ホスファターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）に接合したヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体とインキュベーションし、アルカリ性ホスファターゼ色原性基質ニトロブルー（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ）テトラゾリウムクロライドおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩（ＢＲＬ）と反応させた。パネル（Ｐａｎｅｌ）Ａでは抗ｇｐ１２０、抗ｇｐ４１および抗ｐ２４の混合物を用い、パネルＢでは抗ｇｐ１２０および抗ｐ２４抗体の混合物を用いた。
【０１２７】
図１１に示した結果は、抗原的に標識したＨＩＶ様粒子が、実質的にその天然コンホメーションにｇｐ１２０、ｇｐ４１およびｐ２４を形成することを示している。
【０１２８】
実施例４
本実施例は、抗原的に標識したＨＩＶ様粒子の免疫原性および免疫反応性を説明するものである。
【０１２９】
プラスミドｐＨＩＶ−Ｔ１、ｐＨＩＶ−Ｔ２、ｐＨＩＶ−Ｔ３またはｐＨＩＶ−Ｔ４のいずれか（図１０）を、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏによりベロ細胞に同時トランスフェクションし、ＨＩＶ様粒子を産生する安定な細胞系を得た。ＨＩＶ様粒子を精製し、ｇａｇ遺伝子産物に挿入されたＴＭＶマーカーに相当するペプチドで免疫感作したモルモットからの免疫血清に対するその反応性をイムノブロット分析によって測定した。免疫血清を得るため、ＫＬＨに接合したＴＭＶマーカーからなるペプチド１００μｇでモルモットを免疫感作し、完全フロイントアジュバント中でアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）した。いずれの動物も、３週間間隔で３回、不完全フロイントアジュバントでアジュバントした同じペプチドで追加免疫した。最終追加免疫から２週間後に、免疫血清を回収した。図１２に示した結果は、各種ＨＩＶ様粒子に存在する各種形態のｇａｇ遺伝子産物に対する免疫血清の反応性を図示し、修飾ＨＩＶ−１様粒子に関するＴＭＶマーカーの抗原性を示したものである。
【０１３０】
さらに別の試験で、ｇａｇ１０μｇに等価な量のＨＩＶ様粒子でＴＭＶマーカー配列（ＧＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮＧＡ：配列番号２１）のコピー２個を有するものでモルモットを免疫感作し、３週間間隔で同じＨＩＶ様粒子５μｇで追加免疫した。ＨＩＶ様粒子を完全フロイントアジュバント（追加免疫用量は、不完全フロイントアジュバントでアジュバントした）またはＱＳ２１でアジュバントした。最初の免疫感作から１１週間後に血清検体を採り、ＨＩＶ−１  ＭＮのＶ３中和エピトープ（ＴＲＰＮＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩＲＱＡＨＣ：配列番号３１）、ＴＭＶマーカー配列（ＡＦＤＴＲＮＲＩＩＥＶＥＮ：配列番号１）および組換え源から産生されたｐ２４（ｇａｇ）蛋白を有するアミノ酸配列に相当するペプチドとの反応性を、ＥＬＩＳＡによって調べた。結果を図１４に示しているが、この結果は、ＴＭＶマーカー配列を有するＨＩＶ様粒子が免疫応答を生じて、ｐ２４（ｇａｇ）、ｇｐ１２０（および特異的にＶ３中和エピトープ）およびＴＭＶマーカー配列を特異的に認識する抗体を産生することができることを示している。スキナーらの報告（Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）に記載の方法に従って、ウィルス感染阻害アッセイを用いて、モルモット抗血清についてのウィルス中和も調べた。表２に終点力価を示したが、この結果は、ＴＭＶマーカー配列を発現するレトロウィルス様粒子を用いる免疫感作によって産生される抗体がＨＩＶによる細胞感染を阻害することができることを示している。
【０１３１】
プラスミドｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５をプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏとともにベロ細胞に同時トランスフェクションし、ＨＩＶ様粒子を産生する安定な細胞系を得た。次に、ＨＩＶ様粒子を精製し、完全フロイントアジュバントでアジュバントしたｇａｇＰ２４１０μｇに等価な量のＨＩＶ様粒子でモルモットを免疫感作した。いずれの動物も、３週間間隔で３回、不完全フロイントアジュバントでアジュバントしたＨＩＶ様粒子で追加免疫した。最終追加免疫から２週間後に、免疫血清を回収し、それについて、ＥＬＩＳＡによって抗Ｖ３および抗ｍＨＡ２マーカー反応性のアッセイを行った。以下の表１に示した結果は、ｍＨＡ２マーカーを有するＨＩＶ様粒子で免疫感作したモルモットが、ｍＨＡ２マーカー（ＭＨＡ−１）およびＶ３ループ中和ドメイン（ＣＬＴＢ５６、ＣＬＴＢ７１およびＣＬＴＢ７３）を表すペプチドを認識することができる抗体を産生したことを示している。
【０１３２】
さらに別の試験で、ｇａｇｐ２４  １０μｇに等価な量のＨＩＶ様粒子でｍＨＡ抗原マーカー配列を有するものでモルモットを免疫感作し、３週間間隔で３回、同じＨＩＶ様粒子５μｇで追加免疫した。ＨＩＶ様粒子を完全フロイントアジュバント（追加免疫用量は、不完全フロイントアジュバントでアジュバントした）、ＱＳ２１またはリン酸アルミニウム（ＡＬＵＭ）でアジュバントした。最初の免疫感作から１１週間後に動物から血清検体を採り、ＨＩＶ−１MNのＶ３中和エピトープ（ＴＲＰＮＹＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩＲＱＡＨＣ：配列番号３１）、ｍＨＡ２配列（ＧＰＡＫＫＡＴＬＧＡＴＦＡＦＤＳＫＥＥＷＣＲＥＫＫＥＱＷＥ：配列番号２２）および組換え源から産生されたｐ２４（ｇａｇ）蛋白を有するアミノ酸配列に相当するペプチドとの反応性を、ＥＬＩＳＡによって調べた。結果を図１３に示しているが、この結果は、ｍＨＡ２マーカー配列を有するＨＩＶ様粒子が免疫応答を生じて、ｐ２４（ｇａｇ）、ｇｐ１２０（具体的にはＶ３中和エピトープ）およびｍＨＡ２マーカー配列を特異的に認識する抗体を形成することができることを示している。スキナーらの報告（Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）に記載の方法に従って、モルモット抗血清について、ＨＩＶMNによる感染を防止する能力も調べた。表２に終点力価を示したが、この結果は、ｍＨＡ２マーカー配列を発現するレトロウィルス様粒子を用いる免疫感作によって産生される抗体がＨＩＶによる細胞感染を阻害することができることを示している。従ってこれらのデータは、ＨＩＶ様粒子に関して提供された場合に、ｍＨＡ２マーカーが免疫原性であり、各種ＨＩＶ単離物からのＶ３ループの主要中和決定基に対しても抗体が産生されることを示している。
【０１３３】
実施例５
本実施例は、ｇｐ４１の免疫優性領域に対する突然変異によって抗体的に標識されたＨＩＶ様粒子の形成について説明するものである。
【０１３４】
アミノ酸配列ＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ（配列番号２８）を有する免疫優性領域を有するｇｐ１６０（ｇｐ４１）のトランスメンブランドメインとこの配列を認識する抗体は全てのＨＩＶ−１感染者に存在する。実際、この免疫優性領域に特異的な抗体の検出が、ＨＩＶ−１感染の臨床診断に利用される。そのようなこの免疫優性領域に特異的な抗体はＨＩＶ−１感染の臨床診断に利用される。しかしながら、そのような抗体はＨＩＶ−１を中和しないのが普通である。そこで、免疫優性領域の突然変異誘発によって、野生型ＨＩＶ−１と抗原的に識別可能なＨＩＶ様粒子を形成した。ＨＩＶ感染患者からの血清によって認識されない免疫優性領域の突然変異体を、表３に示したような血清で突然変異体配列を有するペプチドを認識することによって確認した。アマシャム・ライフサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＣ）製造のスカルプチャー（Ｓｃｕｌｐｔｕｒｅ：登録商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発系キットを用いる部位特異的突然変異誘発によって突然変異を導入した。エンベロープをコードする配列を有するｐ８３−１９からのＳａｌＩ  ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をＫ１３にサブクローニングし、表３に示した突然変異を指定するＤＮＡを有するオリゴヌクレオチドを用いて、ｇｐ４１内の免疫優性領域に対して適切な突然変異を起こして、構造体ｓｍＩＤＲ、クローン４およびクローン１６を得た。これら構造体のそれぞれをベロ細胞にトランスフェクションし、イムノブロッティングによってレトロウィルス様粒子を得た。これらのレトロウィルス様粒子について、エンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０およびｇｐ１６０およびｇｐ４１の発現を分析した。これらの糖蛋白はいずれも、各種レトロウィルス様粒子に存在していた。特に、ｇｐ４１の免疫優性領域にアミノ酸置換ＳＧＫ→ＡＦＲを有するクローン４を選択した。
【０１３５】
開示の要旨
本開示をまとめると、本発明は、例えば予防接種すなわちレトロウィルス特異的抗血清の形成に有用な免疫原性製剤ならびに診断法・診断キットにおける抗原としてのある種の非感染性非複製性レトロウィルス様粒子およびそれをコードする核酸分子を提供する。レトロウィルス様粒子は、ｐｏｌおよび／またはｇａｇ遺伝子産物に対する修飾によって非感染性になったと考えられる。特定のレトロウィルス様粒子は、非レトロウィルス性非抗原マーカーを有する。本発明の範囲内での改良は可能である。
【０１３６】
【表１】
2006020635.tif 000007
【０１３７】
【表２】
2006020635.tif 000008
【０１３８】
【表３】
2006020635.tif 000009
【０１３９】
【表４】
2006020635.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、本発明の１実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶ−Ａ）の構造図式である。
【図２】図２は、本発明の別の実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶＢＲＵ）の構造図式である。
【図３】図３は、本発明のさらに別の実施態様によるレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐ８３−１９）の構造図式である。
【図４】図４は、本発明の１実施態様によるプラスミド（ｐＳｅＢＳ−ＨＡ２）の構造図式である。
【図５】図５は、遺伝子アセンブリを用いた突然変異誘発の工程系統図である。
【図６】図６は、本発明のさらに別の実施態様によるヒトインフルエンザヘマグルチニン糖蛋白のトランスメンブラン成分の一部を有する抗原マーカー配列を有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶＨＡ２−７０１）の構造図式である。
【図７】図７は、本発明のさらに別の実施態様による非天然マーカーを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶｍＨＡ２）の構造図式である。
【図８】図８は、本発明のさらに別の実施態様による非天然マーカーを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミド（ｐＭＴＨＩＶＭＮｍＨＡ２−５）の構造図式である。
【図９】図９は、本発明のさらに別の実施態様による非感染性非複製性レトロウィルス様粒子のｇａｇ遺伝子産物に挿入されたタバコモザイクウィルスからの抗原性エピトープをコードするオリゴヌクレオチドの詳細図である。
【図１０】図１０は、タバコモザイクウィルスからの抗原性エピトープを有するレトロウィルス様粒子をコードするプラスミドの構造図式である。
【図１１】図１１は、本発明の抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子（シュードウィルス粒子）のイムノブロット分析を示す図である。
【図１２】図１２は、抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子のイムノブロット分析を示して、ｇａｇ遺伝子産物に抗原マーカーが含まれていることを示す図である。
【図１３】図１３は、ｍＨＡ２配列を有することによって抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子で免疫感作したモルモットにおける免疫応答を示す図である。
【図１４】図１４は、ＴＭＶマーカー配列を有することによって抗原的に標識されたレトロウィルス様粒子で免疫感作したモルモットにおける免疫応答を示す図である。
【図１５】図１５は、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０中の、ＨＩＶ−１と抗原的に識別できる非感染性レトロウィルス様粒子を提供する修飾を行う免疫優性領域の位置を示す図である。
【図１６】図１６は、ＨＩＶ−１の臨床的一次単離物のエンベロープ糖蛋白ｇｐ１２０を有するレトロウィルス様粒子のイムノブロット分析を示す図である。
【図１】
2006020635.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006020635.tif 000019
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月18日(2005.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子であって、
前記粒子は、
（ａ）ｅｎｖ遺伝子産物、
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子産物、  および
（ｃ）ｇａｇ遺伝子産物のアセンブリを有し、  かつ
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを有しており、
該ｇａｇ遺伝子産物は、ＨＩＶの野生型ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を保持し；
該ｅｎｖ遺伝子産物は、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物中のｇｐ１２０の部分を含んでおり；
該少なくとも１個の抗原マーカーは、該ｇａｇ遺伝子産物あるいは該ｅｎｖ遺伝子産物中に含まれている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項２】
前記少なくとも１個の抗原マーカーは、ｇａｇ遺伝子産物内に含まれ、未修飾ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を保持するハイブリッドｇａｇ遺伝子産物を構成する請求項１に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項３】
前記少なくとも１個の抗原マーカーは、抗原的に活性な挿入部位において、未修飾ｇａｇ遺伝子産物中に挿入されている請求項２に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項４】
前記挿入部位は、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｇａｇ遺伝子産物のアミノ酸残基２１０と２１１の間、あるいは他のＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物中の相当する箇所に位置する請求項３に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項５】
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子であって、
前記粒子は、
（ａ）ｅｎｖ遺伝子産物、
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子産物、  および
（ｃ）ｇａｇ遺伝子産物のアセンブリを有し、  かつ
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを有しており、
該ｇａｇ遺伝子産物は、ＨＩＶの野生型ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を保持し；
該ｅｎｖ遺伝子産物は、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物中のｇｐ１２０の部分を含んでおり；
該ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物のエピトープに相当するアミノ酸配列を除去して、該少なくとも１個の抗原マーカーが、与えられている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項６】
ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物の免疫優性領域は、その領域の少なくとも１個のアミノ酸の置換または削除による修飾がなされ、ＨＩＶ感染宿主からの血清による、この変異を施した前記免疫優性領域の認識を実質的に防いでいる請求項５に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項７】
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子であって、
前記粒子は、
（ａ）修飾ｅｎｖ遺伝子産物、
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子産物、  および
（ｃ）ｇａｇ遺伝子産物のアセンブリを有し、  かつ
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス性である少なくとも１個の抗原マーカーを有しており、
該ｇａｇ遺伝子産物は、ＨＩＶの野生型ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を保持し；
該修飾ｅｎｖ遺伝子産物中では、その内因性のアンカー形成機能部分が、該ＨＩＶ様粒子に当該ｅｎｖ遺伝子産物をアンカーする機能を果たすように、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物のｇｐ１２０の部分に対して連結されている、非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス由来の異種のアンカー配列により置換され；かつ
該非レトロウイルス性または非ＨＩＶレトロウイルス由来の異種のアンカー配列による置換によって、該少なくとも１個の抗原マーカーが与えられている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項８】
前記非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の異種のアンカー配列が抗原性である請求項７に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項９】
前記非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の異種のアンカー配列は、少なくとも、該非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の膜スパニング蛋白のトランスメンブラン部分の一部を含んでいる請求項７または８に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１０】
膜スパニング蛋白が糖蛋白である請求項９に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１１】
前記異種のアンカー配列は、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物のｇｐ１２０タンパク質とｇｐ４１タンパク質との間の機能性開裂部位の上流で、かつ隣接させて、該野生型ｅｎｖ遺伝子産物内に挿入されている請求項７または８に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１２】
前記異種のアンカー配列は、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物の野生型ｅｎｖ遺伝子産物のアミノ酸残基５０７と５０８の間、あるいは他のＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物中の相当する箇所に挿入されている請求項１１に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１３】
該ＨＩＶは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２から選択されている請求項１〜１２のいずれかに記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１４】
該ＨＩＶは、ＨＩＶ−１である請求項１３に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１５】
下記
（ａ）ＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物のｇａｇ依存性ＲＮＡパッケージングを抑制する、
（ｂ）ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物の逆転写酵素活性を実質的に除去する、
（ｃ）ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物のインテグラーゼ活性を実質的に除去する、
（ｄ）ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物のＲＮアーゼ  Ｈ活性を実質的に除去する、
のうち、少なくとも１つの作用を果たすように、該ｐｏｌおよび／またはｇａｇ遺伝子産物に対して、少なくとも１つの更なる改変が施されている請求項１〜１４のいずれかに記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１６】
ｇａｇ依存性ＲＮＡパッケージングの抑制が、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物中のｇａｇ依存性ＲＮＡパッケージングに関与する少なくとも１個のアミノ酸残基の置換または欠失により果たされている請求項１５に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１７】
ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物の逆転写酵素活性の実質的な除去が、少なくともその逆転写酵素活性に関与する一部分の欠失により果たされている請求項１５に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１８】
ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物のインテグラーゼ活性の実質的な除去が、少なくともそのインテグラーゼ活性に関与する一部分の欠失により果たされている請求項１５に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項１９】
ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物のＲＮアーゼ  Ｈ活性の実質的な除去が、少なくともそのＲＮアーゼ  Ｈ活性に関与する一部分の欠失により果たされている請求項１５に記載の非感染性ＨＩＶ様粒子。
【請求項２０】
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子であって、
前記核酸分子は、長い末端反復ならびにＲＮＡパッケージングシグナルを欠失し、かつ
（ａ）ｅｎｖ遺伝子；
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子；
（ｃ）ｇａｇ遺伝子；ならびに
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶウイルス性の少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片
を含んでいる、ＨＩＶの修飾ウイルスゲノムを含んでなり、
該ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、ＨＩＶのゲノムＲＮＡ中に存在する際の天然ゲノム配置で含まれており、
該ｇａｇ遺伝子は、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を保持する該ｇａｇ遺伝子産物部分をコードしており、
該ｅｎｖ遺伝子は、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物のｇｐ１２０部分をコードしており、かつ
少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片は、該ｇａｇ遺伝子またはｅｎｖ遺伝子中に含まれている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子。
【請求項２１】
少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片が、該ｇａｇ遺伝子中に含まれ、ＨＩＶの未修飾ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を保持するハイブリッドｇａｇ遺伝子産物をコードする修飾ｇａｇ遺伝子とされている請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片が、該ｇａｇ遺伝子中に挿入されており、未修飾ｇａｇ遺伝子産物中に、その抗原的に活性な挿入部位において、少なくとも１個の抗原マーカーが挿入されている、ハイブリッドｇａｇ遺伝子産物を与えている、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｇａｇ遺伝子の核酸塩基１４１５のＰｓｔＩサイト、あるいは他のＨＩＶのｇａｇ遺伝子中の相当する部位に位置する挿入部位において、少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片が、該ｇａｇ遺伝子中に挿入されている請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
ＨＩＶのゲノムに相当する一本鎖ＲＮＡを有していない非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子であって、
前記核酸分子は、長い末端反復ならびにＲＮＡパッケージングシグナルを欠失し、かつ
（ａ）修飾ｅｎｖ遺伝子；
（ｂ）ｐｏｌ遺伝子；
（ｃ）ｇａｇ遺伝子；ならびに
（ｄ）非レトロウイルス性または非ＨＩＶウイルス性の少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片
を含んでいる、ＨＩＶの修飾ウイルスゲノムを含んでなり、
該ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は、ＨＩＶのゲノムＲＮＡ中に存在する際の天然ゲノム配置で含まれており、
該ｇａｇ遺伝子は、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｇａｇ遺伝子産物の粒子形成性を保持する該ｇａｇ遺伝子産物部分をコードしており、
少なくとも１個の抗原マーカーをコードする断片は、非レトロウイルスかつ非ＨＩＶウイルス由来の抗原性アンカー配列をコードする断片であり、かつ
該修飾ｅｎｖ遺伝子は、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物のｇｐ１２０部分を保持し、また、少なくとも、野生型ｅｎｖ遺伝子のｇｐ１２０のコード領域に対して、機能的に連結されている、非レトロウイルスかつ非ＨＩＶウイルス由来の抗原性アンカー配列をコードする断片を含んでおり、それによって、該修飾ｅｎｖ遺伝子は、その内因性アンカー機能が、少なくとも、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物のｇｐ１２０部分に対して、該ＨＩＶ様粒子に該改変ｅｎｖ遺伝子産物をアンカーするように機能的に連結されている、非レトロウイルスかつ非ＨＩＶウイルス由来の抗原性のアンカー配列により置き換えられている改変ｅｎｖ遺伝子産物をコードしている
ことを特徴とする非感染性ＨＩＶ様粒子をコードする核酸分子。
【請求項２５】
非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の抗原性のアンカー配列による置換は、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物中のｇｐ４１タンパク質のエピトープに対応するアミノ酸配列の欠失を引き起こす請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
アンカー配列をコードする断片は、少なくとも、非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の膜スパニング蛋白のトランスメンブラン部分の一部をコードする請求項２４または２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルス由来の膜スパニング蛋白が糖蛋白である請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
アンカー配列をコードする断片は、ＨＩＶの野生型ｅｎｖ遺伝子産物中のｇｐ１２０タンパク質とｇｐ４１タンパク質の間の機能性開裂部位をコードする核酸塩基の上流で、かつ隣接して、該修飾ｅｎｖ遺伝子内に位置している請求項２４または２５に記載の核酸分子。
【請求項２９】
該ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物のｅｎｖ遺伝子の塩基７７７７と７７７８の間、あるいは他のＨＩＶのｅｎｖ遺伝子中の相当する部位に、前記アンカー配列をコードする断片が位置している請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
前記修飾レトロウイルスゲノムは、さらにプライマー結合部位を欠失している請求項２０〜２９のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記修飾レトロウイルスゲノムは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２由来の修飾レトロウイルスゲノムである請求項２０〜３０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記修飾ＨＩＶウイルスゲノムは、ＨＩＶ−１由来の修飾ＨＩＶウイルスゲノムである請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
下記
（ａ）ＨＩＶのｇａｇ遺伝子産物のｇａｇ依存性ＲＮＡパッケージングを抑制する、
（ｂ）ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物の逆転写酵素活性を実質的に除去する、
（ｃ）ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物のインテグラーゼ活性を実質的に除去する、
（ｄ）ＨＩＶのｐｏｌ遺伝子産物のＲＮアーゼ  Ｈ活性を実質的に除去する、
のうち、少なくとも１つの作用を果たすように、該ｐｏｌまたはｇａｇ遺伝子中の少なくとも１つの更なる改変が施されている請求項２０〜３２のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記修飾ＨＩＶウイルスゲノムは、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ単離物の遺伝子のＳａｃＩ（６７８）からＸｈｏＩ（８９４４）断片中に存在する特徴的な遺伝子要素を保持する修飾ＤＮＡ分子である請求項２０〜３３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３５】
前記修飾ＨＩＶウイルスゲノムは、プライマー結合部位および／またはＲＮＡパッケージングシグナルを欠く請求項２０〜３４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項３６】
請求項１〜１９のいずれかに記載するＨＩＶ様粒子または請求項２０〜３５のいずれかに記載する核酸分子、ならびに担体を含む、ＨＩＶ特異的な免疫反応ならびに非レトロウイルスかつ非ＨＩＶレトロウイルスマーカーに対して特異的な免疫反応を誘発することができる免疫原組成物。
【請求項３７】
抗血清中の、前記ＨＩＶ様粒子の抗原性マーカーに対する特異的な抗体を検出することを特徴とする、請求項３６に記載の免疫原組成物を用いる免疫感作により生成された抗血清の同定方法。