(57)【要約】【課題】  安全で有効な発癌予防剤を提供する。【解決手段】  ニガウリの果実，茎，葉又は根から得られたエキス，又はククルビタン型トリテルペンを発癌予防剤として用いる。これらの成分は，ＥＢＶ活性化抑制試験で優れた抗発癌プロモーター活性及び安全性を示した。【選択図】  図１
2006022018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニガウリの果実，茎，葉及び根のうちの少なくとも一つを溶媒で抽出して得られる抽出物を含有することを特徴とする発癌予防剤。
【請求項２】
ククルビタン型トリテルペンを含有することを特徴とする発癌予防剤。
【請求項３】
前記ククルビタン型トリテルペンが，（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９‐メトキシククルビタ‐６，２３，２５‐トリエン‐３β‐オール，（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β‐メトキシククルビタ‐５，２３，２５‐トリエン‐１９‐アール，（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β，２５‐ジメトキシククルビタ‐５，２３‐ジエン‐１９‐アール，（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９，２５‐ジメトキシククルビタ‐６，２３‐ジエン‐３β‐オール，（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９‐メトキシククルビタ‐６，２３‐ジエン‐３β，２５‐ジオールからなる群から選ばれた少なくとも１種のものであることを特徴とする請求項２に記載の発癌予防剤。
【請求項４】
前記ククルビタン型トリテルペンは，ニガウリを処理して得られることを特徴とする請求項２又は３に記載の発癌予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発癌予防剤に関し，特にトリテルペンを含有する発癌予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から，発癌予防剤として有効なトリテルペン系化合物は知られている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平９−２５２３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら，特許文献１は，具体的に発癌予防に関して十分な効果を有する特定のトリテルペン系化合物を開示するものではない。一方，発癌予防の大きなニーズに鑑みて，安全で有効な発癌予防剤が得られないものかとの期待は大きい。
ところで，ウリ科の一年生つる草であるニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ  Ｌ．）は，東南アジア，西アジアを中心に世界各国で生産される独特の苦味を有する主要な農産物であり，インドなどでは古くから薬用植物として広く利用されている。近年，このニガウリの種子油は，発癌予防作用を有することが報告されており，これは種子油中に含まれている共役リノレン酸に起因すると考えられている（宮下和夫，オレオサイエンス，６巻，３３３頁，２００２年参照）。また，ニガウリ果実の全抽出物，又は凍結乾燥粉末が，血糖値降下作用，血圧降下作用，肥満防止作用，抗ウイルス作用を有することが報告されている（Ｇａｎｇｕｌｙら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．，9巻，２８３頁，２０００年）。ニガウリの苦味成分と言われているのはククルビタン型トリテルペノイドであり，果皮にはモモルジコサイドＫやモモルジコサイドＬが，一方，葉部にはモモルジシンＩＩが含まれており，これらの化合物には血糖値降下作用を有することが報告されている（Ｒａｍａｎ，Ｌａｕ，Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２巻，３４９頁，１９９６年参照）。しかしながら，ニガウリ果実，又はそれ以外の茎，葉や根等に発癌予防作用を有する成分の存在については確認されていない。
本発明は，安全で有効な発癌予防剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは，ニガウリの特性と発癌予防のニーズとに着目し，安全で有効な発癌予防剤が得られないものかと鋭意検討した結果，ニガウリエキス（抽出物）及び本エキスのククルビタン型トリテルペンが発癌予防剤として優れており，とりわけニガウリを処理して得られるククルビタン型トリテルペンが発癌予防剤として特に優れていることを見出し，本発明を完成するに至った。
このように本発明は，特にニガウリエキス及び本エキス成分に発癌予防作用を見出した点に重要な意味を有する。
本発明の請求項１による発癌予防剤は，ニガウリの果実，茎，葉及び根のうちの少なくとも一つを溶媒で抽出して得られる抽出物を含有することを特徴とする。
【０００５】
本発明の請求項２による発癌予防剤は，ククルビタン型トリテルペンを含有することを特徴とする。
前記ククルビタン型トリテルペンは，ククルビタン骨格を有するトリテルペン又はその誘導体を意味するが，トリテルペンの配糖体は含まない。誘導体としては，アルキル基，ＯＨ基，ケトン基，アセトキシル基，アミノ基，ホルミル基，アルケニル基等の置換基で置換されたトリテルペンがあげられ，これらの中でもＯＨ基で置換されたトリテルペンアルコールが望ましい。
【０００６】
本発明の請求項３による発癌予防剤は，請求項２における前記ククルビタン型トリテルペン系化合物が，（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９‐メトキシククルビタ‐６，２３，２５‐トリエン‐３β‐オール（以下，「化合物１」と称すこともある。），（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β‐メトキシククルビタ‐５，２３，２５‐トリエン‐１９‐アール（以下，「化合物２」と称すこともある。），（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β，２５‐ジメトキシククルビタ‐５，２３‐ジエン‐１９‐アール（以下，「化合物３」と称すこともある。），（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９，２５‐ジメトキシククルビタ‐６，２３‐ジエン‐３β‐オール（以下，「化合物４」と称すこともある。），（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９‐メトキシククルビタ‐６，２３‐ジエン‐３β，２５‐ジオール（以下，「化合物５」と称すこともある。）からなる群から選ばれた少なくとも１種のものであることを特徴とする。
本発明の請求項４による発癌予防剤は，請求項２又は３において，前記ククルビタン型トリテルペンは，ニガウリを処理して得られることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば，安全かつ発癌予防効果に優れた発癌予防剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
次に，実施例により本発明を具体的に説明する。すなわち，ニガウリの果実からの発癌予防効果を有するエキスの抽出方法，本発明に係る発癌予防効果を有する化合物１〜５の単離，化合物１〜５の同定及び構造解析，並びに，本発明に係る発癌予防剤の効果確認試験について説明する。
［ニガウリ果実からの抽出について］
本実施例では，乾燥ニガウリの果実から以下のようにして，発癌予防効果を有するエキスを抽出した。
まず，乾燥ニガウリ果実を粉砕し，このうちの５．３ｋｇをメタノールにより抽出し，メタノールエキス(３８３ｇ)を得た。本エキスを水に懸濁させた後，酢酸エチルを加えて酢酸エチル抽出を行い，酢酸エチル抽出物（５３ｇ）を得た。本抽出物の一部（１５ｇ）をｎ‐ヘキサン／メタノール／水（９５：９５：１０）にて分相し，ｎ‐ヘキサン画分（４．２ｇ），及びメタノール／水画分（９．８ｇ）を得た。さらに，上記酢酸エチル抽出残部である水相はｎ‐ブタノール抽出を行い，ｎ‐ブタノール画分（１７ｇ）及び水画分（１１０ｇ）を得た。
【０００９】
上記のようにして得られた，メタノールエキス，ｎ‐ヘキサン画分，メタノール‐水画分，ブタノール画分，及び水画分について，後述するようにＥＢＶ早期抗原発現阻害率を測定し，発癌予防効果があることを確認した。
なお，本実施例ではニガウリの果実から抽出しているが，果実以外にもニガウリの茎，葉及び根からエキスを抽出してもよい。
【００１０】
また，ニガウリの果実，茎，葉及び根のうちの少なくとも一つから有効成分を抽出するための溶媒しては，水，アルコール類（メタノール，エタノール，イソプロピルアルコール等），ケトン類（アセトン，メチルエチルケトン等），エーテル類（ジエチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジメトキシエタン，テトラヒドロフラン等），脂肪酸エステル類（酢酸エチル，酢酸ブチル等），ハロゲン化炭化水素類（クロロホルム，塩化メチレン，ジクロロエタン等），芳香族炭化水素類（ベンゼン，トルエン等），脂肪族炭化水素類（ｎ−ヘキサン，シクロヘキサン等）等の溶媒の一種又は二種以上の混合溶媒が使用できる。これらのうちのいずれを用いた場合にも抽出物は発癌予防効果を有するが，後述するように，特にヘキサン等の極性の極小さな溶媒を用いると，抽出物が発癌予防効果に優れるので好ましい。
【００１１】
また，抽出方法は，上記方法に限定されず，水溶性又は高極性溶媒から徐々に低極性溶媒に抽出する過程を経ることなく，乾燥ニガウリをヘキサン等の低極性溶媒で直接抽出してもよい。
得られた抽出物は，そのまま又は濃縮し，エキス状で用いてもよいし，溶媒を除去後乾燥粉末にして用いてもよい。
【００１２】
また，抽出物は，適当な医薬用の担体又は希釈剤と組み合わせて医薬とすることができ，通常の如何なる方法によっても製剤化でき，経口又は非経口投与するための固体，半固体又は液体の剤形に処方することができる。処方にあたっては，他の医薬活性成分との配合剤としてもよい。例えば，日本薬局方に記載されている各種製剤，即ち，錠剤，丸剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，乾燥エキス剤，トローチ剤等の内用固形製剤，流エキス剤，エリキシル剤，酒精剤，シロップ剤，リモナーデ剤等の内容液剤，チンキ剤，リニメント剤，ローション剤等の外用液剤，硬膏剤，軟膏剤，パップ剤等の外用剤などに製剤化できる。また，投与可能であるならば，吸入剤，エアゾール剤，注射剤，点眼剤，座剤等にも用途に応じて製剤化してもよい。
【００１３】
さらに，本発明に係る抽出物は発癌予防の薬剤として使用するだけでなく，種々の飲食品に添加し，発癌予防に有効な機能性飲食品を製造するのにも有用なものである。このような機能性飲食品の形態の例としては，顆粒，錠菓，ゼリー，飴，飲料などが挙げられる。また，本発明に係る抽出物は，人間の食べる食品としてだけでなく，ペット，家畜，競技用動物などの人間以外の動物の飼料に添加して利用され得る。
【００１４】
［化合物１〜５の単離について］
次に，上記の抽出物から発癌予防に有効な化合物１〜５を単離した。
まず，前記乾燥ニガウリ果実から有効成分を抽出したｎ‐ヘキサン画分について，シリカゲル（４００ｇ）カラムクロマトグラフィーを行った。溶出液として，ｎ‐ヘキサン／酢酸エチル［１：０（０．５Ｌ），９５：５（２．４Ｌ），９：１（７．２Ｌ），４：１（２．３Ｌ），７：３（０．２Ｌ），１：１（０．４Ｌ），１：４（０．９Ｌ）］，酢酸エチル（０．５Ｌ），クロロホルム（０．５Ｌ）を用いて順次展開し，７画分（Ｆｒ．Ａ〜Ｇ：Ｆｒ．Ａ（２１ｍｇ），Ｆｒ．Ｂ（３８０ｍｇ），Ｆｒ．Ｃ（２６７ｍｇ），Ｆｒ．Ｄ（１０９９ｍｇ），Ｆｒ．Ｅ（５１７ｍｇ），Ｆｒ．Ｆ（１１３ｍｇ），Ｆｒ．Ｇ（１９２８ｍｇ））に分画した。
【００１５】
Ｆｒ．Ｄについて，更にシリカゲル（１００ｇ）カラムクロマトグラフィー（展開液にはｎ‐ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜０：１を用いた）を行い，６画分（Ｆｒ．Ｄａ〜Ｄｆ）に分画した。
このＦｒ．Ｄについてのカラムクロマトグラフィーにおいて，１番目に溶出したＦｒ．Ｄａ（３９ｍｇ）について逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ  ＯＤＳ  ５μ（２５ｃｍ×内径１０ｍｍ）カラム，センシュー科学（株）製；溶離液：メタノール；流速３．０ｍＬ／分］を行い，１０α‐ククルビタジエノール（１．７ｍｇ；保持時間２４．９分）及びクレロステロール（２．６ｍｇ；保持時間３３．２分）を得た。
【００１６】
また，Ｆｒ．Ｄについてのカラムクロマトグラフィーにおいて，最初から２番目に溶出したＦｒ．Ｄｂ（１５１ｍｇ）は，分取薄層クロマトグラフィーにて精製し，精製Ｆｒ．Ｄｂ（７３ｍｇ）を得た。本画分は次に分取ＨＰＬＣ（溶離液：メタノール／水／酢酸＝９９：１：１；２．０ｍＬ／分）を行い，（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９‐メトキシククルビタ‐６，２３，２５‐トリエン‐３β‐オール（化合物１）（８．５ｍｇ；保持時間１４．２分）を単離した。
【００１７】
Ｆｒ．Ｅについて，更にシリカゲル（５０ｇ）カラムクロマトグラフィー（展開液にはｎ‐ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜０：１を用いた）を行い，９画分（Ｆｒ．Ｅａ〜Ｅｉ）に分画を行った。
このＦｒ．Ｅについてのカラムクロマトグラフィーにおいて４番目に溶出したＦｒ．Ｅｄ（６９．４ｍｇ）について，ＨＰＬＣ（溶離液：メタノール／水／酢酸＝９９：１：１；２．０ｍＬ／分）を行い，（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９，２５‐ジメトキシククルビタ‐６，２３‐ジエン‐３β‐オール（化合物４）（４．５ｍｇ；保持時間１３．３分）を単離した。
【００１８】
また，Ｆｒ．Ｅについてのカラムクロマトグラフィーにおいて５番目に溶出したＦｒ．Ｅｅ（２１．２ｍｇ）について，ＨＰＬＣ（溶離液：メタノール／水／酢酸＝９９：１：１；２．０ｍＬ／分）を行い，（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９‐メトキシククルビタ‐６，２３‐ジエン‐３β，２５‐ジオール（化合物５）（４．６ｍｇ；保持時間１４．８分）を単離した。
【００１９】
更に，Ｆｒ．Ｅについてのカラムクロマトグラフィーにおいて７番目の溶出画分であるＦｒ．Ｅｇ（１０２．１ｍｇ）について，ＨＰＬＣ（溶離液：メタノール／水＝９５：５；流速２．０ｍＬ／分）を行い，（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β‐メトキシククルビタ‐５，２３，２５‐トリエン‐１９‐アール（化合物２）（２．９ｍｇ；保持時間２４．８分）及び（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β，２５‐ジメトキシククルビタ‐５，２３‐ジエン‐１９‐アール（化合物３）（２．８ｍｇ；保持時間１４．４分）を単離した。
なお，本実施例では，ニガウリ果実の抽出エキスから化合物１〜５を単離しているが，ニガウリの茎，葉，根及び種子から化合物１〜５を単離してもよい。
【００２０】
［化合物１〜５の同定及び構造解析について］
次に，上記のようにして単離した５種の化合物１〜５について，同定及び構造解析を行ったので説明する。
５種の化合物１〜５の構造解析はＭＳ，ＩＲ，ＵＶ，1Ｈ‐ＮＭＲ，13Ｃ‐ＮＭＲ，ＮＭＲの一種である相関分光法（1Ｈ−1Ｈ  ＣＯＳＹ），異種核多量子コヒーレンス法（ＨＭＱＣ），異種核遠隔多量子相関法（ＨＭＢＣ），及び，核オーバーハウザー交換分光法（ＮＯＥＳＹ）を用いて行った。化合物１〜５の化学構造式を図１に示す。これらのうち，化合物１〜３の３種はこれまで文献記載のない新規化合物である。新規化合物１〜３の1Ｈ‐ＮＭＲ及び13Ｃ‐ＮＭＲデータをＨＭＢＣデータとともに表１〜表３に示した。また，図２に，新規化合物１〜３のＮＯＥＳＹスペクトル法により得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を立体構造式とともに両方向の矢印で示したが，これらのＮＯＥ相関は化合物１〜３について与えた構造と矛盾はしない。既知の化合物４及び５の構造は，対応する化合物との種々のスペクトルデータの文献値（Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５巻，３９１頁，１９９７年）との比較により確認した。
【００２１】
新規化合物１〜３の諸性質及びスペクトルデータを次に示す。
（１）（２３Ｅ）‐５β，１９−エポキシ‐１９‐メトキシククルビタ‐６，２３，２５‐トリエン‐３β‐オール（化合物１）
無色結晶
ｍｐ：１６６〜１６９℃
比旋光度［α］25D：−７４．０°（濃度ｃ＝０．１０（ｇ／１００ｍｌ），溶媒：アセトン）
ＵＶ（溶媒：エタノール）λmax  （単位：ｎｍ）：２４０（ｌｏｇε４．０８），２３１（ｌｏｇε４．３３），２２５（ｌｏｇε４．３０）
ＩＲ  νmax  （単位：ｃｍ-1）：３４７９（ＯＨ）；２９４１；１６５０，１６０５（共役二重結合）；８７９（＞Ｃ＝ＣＨ2）
ＥＩ‐ＭＳ  （検出されたそれぞれのピークについて，ｍ／ｚ値，（相対イオン強度），検出された分子の状態を示す）：
４０８（１００）［Ｍ−ＨＣＯＯＣＨ3］+，３９３（１４）（ｍ／ｚ４０８−ＣＨ3），３９０（２０）（ｍ／ｚ４０８−Ｈ2Ｏ），３８９（２２），３７５（１７）（ｍ／ｚ４０８−ＣＨ3−Ｈ2Ｏ），３２７（１０）［ｍ／ｚ４０８−（Ｃ22〜Ｃ27）］，３０９（ｍ／ｚ３２７−Ｈ2Ｏ），２９９（３２）［ｍ／ｚ４０８−側鎖（Ｃ8Ｈ13）］，２８１（３８）（ｍ／ｚ２９９−Ｈ2Ｏ），１７２（５９），１０９（５７）[Ｃ8Ｈ13]+
ＦＡＢ‐ＭＳ  （検出されたそれぞれのピークのｍ／ｚ値，検出された分子の状態を示す）：
５０７［Ｍ＋Ｋ］+，４６９［Ｍ＋Ｈ］+，４３７［Ｍ−ＭｅＯＨ］+，４１９（ｍ／ｚ４３７−Ｈ2Ｏ）
高分解能ＥＩ‐ＭＳ  （ｍ／ｚ値）：４０８．３３９９（理論値Ｃ29Ｈ44Ｏ＝［Ｍ−ＨＣＯＯＣＨ3］+，４０８．３３９２５６．２５１１）
高分解能ＦＡＢ‐ＭＳ  （ｍ／ｚ値）：５０７．３２４４（理論値Ｃ31Ｈ48Ｏ3Ｋ＝［Ｍ＋Ｋ］+，５０７．３２４０）
13Ｃ‐ＮＭＲ，1Ｈ‐ＮＭＲ及びＨＭＢＣのデータを表１に示す：
【００２２】
【表１】
2006022018.tif 000003
【００２３】
（２）（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β‐メトキシククルビタ‐５，２３，２５‐トリエン‐１９‐アール（化合物２）
無色結晶
ｍｐ：１２７〜１３０℃
比旋光度［α］25D：＋１９．１°（濃度ｃ＝０．２１（ｇ／１００ｍｌ），溶媒：クロロホルム）
ＵＶ（溶媒：エタノール）λmax  （単位：ｎｍ）：２３９，２３１，２２４
ＩＲ  νmax  （単位：ｃｍ-1）：３４４５（ＯＨ）；２９２８；１７１３（＞Ｃ＝Ｏ；アルデヒド）；１６７０，１６１０（共役二重結合）；８８０（＞Ｃ＝ＣＨ2）；８２０（＞Ｃ＝ＣＨ−）
ＥＩ‐ＭＳ  （検出されたそれぞれのピークについて，ｍ／ｚ値，（相対イオン強度），検出された分子の状態を示す）：
４６８（１２）［Ｍ］+，４５０（７）  ［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+，４３６（４）  ［Ｍ−ＭｅＯＨ］+，４０８（１００）  ［Ｍ−（ＣＨ3Ｏ＋ＣＨＯ）］+，３９３（１０）（ｍ／ｚ４０８−ＣＨ3），３９０（１０），３７５（１２）（ｍ／ｚ４０８−ＣＨ3−Ｈ2Ｏ），３２７（９）［ｍ／ｚ４０８−（Ｃ22〜Ｃ27）］，３０９（３５）（ｍ／ｚ３２７−Ｈ2Ｏ），２９９（１７）［ｍ／ｚ４０８−側鎖（Ｃ8Ｈ13）］，２８１（２３）（ｍ／ｚ２９９−Ｈ2Ｏ），２０３（３５），１７２（６１），１０９（７５）［Ｃ8Ｈ13］+
高分解能ＥＩ‐ＭＳ  （ｍ／ｚ値）：４６８．３６０５（理論値Ｃ31Ｈ48Ｏ3＝［Ｍ］+，４６８．３６０３）
13Ｃ‐ＮＭＲ，1Ｈ‐ＮＭＲ及びＨＭＢＣのデータを表２に示す：
【００２４】
【表２】
2006022018.tif 000004
【００２５】
（３）（２３Ｅ）‐３β‐ハイドロキシ‐７β，２５‐ジメトキシククルビタ‐５，２３‐ジエン‐１９‐アール（化合物３）
無色結晶
ｍｐ：１０４〜１０７℃
比旋光度［α］25D  ：＋２５．９°（濃度ｃ＝０．２６（ｇ／１００ｍｌ），溶媒：クロロホルム）
ＩＲ  νmax  （単位：ｃｍ-1）：３４４４（ＯＨ）；２９２９；１７１２（＞Ｃ＝Ｏ；アルデヒド）；８４５，８２０（＞Ｃ＝ＣＨ−）
ＥＩ‐ＭＳ（検出されたそれぞれのピークについて，ｍ／ｚ値，（相対イオン強度），検出された分子の状態を示す）：
４８２（６）［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+，４４０（７４）  ［Ｍ−Ｈ2Ｏ−ＭｅＯＨ］+，４２１（２２），４０８（１００）  ［Ｍ−Ｈ2Ｏ−２ＭｅＯＨ］+，３９３（１１）（ｍ／ｚ４０８−ＣＨ3），３８９（１５），３７５（１６）（ｍ／ｚ４０８−ＣＨ3−Ｈ2Ｏ），３０９（２５），２９９（１７）［ｍ／ｚ４０８−側鎖（Ｃ9Ｈ17Ｏ）］，２９３（１３），２８１（１９），１７２（９４），１０９（８６），９９（１００）
高分解能ＥＩ‐ＭＳ  （ｍ／ｚ値）：４８２．３７５９（理論値Ｃ32Ｈ50Ｏ3［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+，４８２．３７６０）
ＦＡＢ‐ＭＳ  （ｍ／ｚ値）：５３９［Ｍ＋Ｋ］+
13Ｃ‐ＮＭＲ，1Ｈ‐ＮＭＲ及びＨＭＢＣのデータを表３に示す：
【００２６】
【表３】
2006022018.tif 000005
【００２７】
なお，化合物１〜３は，上記のような化学構造式で示されるものであれば，天然物から抽出した天然化合物に限られず，天然化合物を修飾し，或いは，化学合成することにより得るものであってもよい。
また，本発明の化合物１〜５には，一般に生体内において遊離形と実質的に同様の生理活性または薬理活性を発揮するもの，例えば，本発明の化合物１〜５のＫ，Ｎａなどの医薬的に許容され得る塩，水和物なども含まれるものである。
また，本発明の化合物１〜５は，上述の抽出物と同様に，適当な医薬用の担体又は希釈剤と組み合わせて医薬とし，飲食品に添加して発癌予防に有効な機能性飲食品とし，あるいは，飼料に添加して用いることもできる。
【００２８】
［発癌予防効果の確認試験について］
次に，本発明の効果を確認するために行った試験について説明する。
（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）活性化抑制試験）
ＥＢＶ活性化抑制試験は，抗発癌プロモーター探索の一次スクリーニング法として知られた試験であり，迅速，かつ定量性に優れ，加えて，微量活性成分の検出が可能な点で優れた試験である。本試験でＥＢＶ活性化を抑制する化合物の多くはマウス皮膚二段階発癌試験で抗発癌プロモーターとして作用することが確認されている。
【００２９】
まず，試験の手順について図１のスキームを参照しながら説明する。なお，本手順は，徳田らの方法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０巻，３０９頁（１９８８）］に準拠している。
（１）１×１０6／ｍＬのＲａｊｉ（ラジ）細胞に，発癌プロモーターとして，２０ｎｇ／ｍＬの濃度の１２‐Ｏ‐テトラデカノイルホルボール‐１３‐アセテート（ＴＰＡ）を３２ｐｍｏｌ加え，さらにＴＰＡの活性発現のために相乗作用として働くｎ‐酪酸を加えた。
（２）そこに，水，エタノール，又はジメチルスルホキシドに溶解した所定量の被検物質を添加して，３７℃で４８時間培養した。
（３）培養終了後，上咽頭癌患者の血清（ＴＰＡにより活性化された細胞由来の抗体を含む）を用いた間接蛍光抗体法によりＥＢＶ早期抗原の発現を検出した。
【００３０】
上記の手順に従って試験を行った後，ＴＰＡのみを加えた群（コントロール）のＥＢＶ早期抗原の発現率を１００％として，被検物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率を求め，次式（１）により被検物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を算出した。
ＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）＝
１００  −  被検物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率（％）・・・式（１）
前述の［ニガウリ果実からの抽出について］の項の記載に従って得た，ニガウリメタノールエキス，ｎ‐ヘキサン画分，メタノール‐水画分，ブタノール画分及び水画分を被検物質として用い，ＥＢＶ早期抗原発現阻害率を測定し，その結果を表４に示した。
【００３１】
【表４】
2006022018.tif 000006
【００３２】
なお，被検物質の濃度が１００μｇ／ｍＬの欄の括弧内の数値は，ラジ細胞の生存率（％）を示す。この数値が高い方が正常細胞に対する悪影響が小さい，すなわち安全性が高いと言える。
表４に示すように，ニガウリのメタノールエキスは１００μｇ／ｍＬの濃度で，ＥＢＶ早期抗原発現を８９．３％阻害し，活性を示した。従って，本エキスは抗発癌プロモーター活性を有するとみなすことができる。同様に，ｎ‐ヘキサン画分，メタノール‐水画分，ブタノール画分及び水画分の何れにも活性が認められたが，ｎ‐ヘキサン画分に最も強い活性を認めた（１００μｇ／ｍＬの濃度で９１．５％阻害）。
【００３３】
また，化合物１〜５を被検物質として行ったＥＢＶ活性化抑制試験結果を表５に示した。なお，参照化合物として，ビタミンＡ誘導体であり，発癌予防効果が種々の動物モデル実験でも確認されているβ‐カロテン［村上ら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０巻，１頁（１９９６）］を用い，これについてもＥＢＶ活性化抑制試験を行った。
【００３４】
【表５】
2006022018.tif 000007
【００３５】
なお，被検物質の濃度が１０００倍の欄の括弧内の数値は，ラジ細胞の生存率（％）を示す。
表５に示すように，ニガウリから得たククルビタン型トリテルペンは，前述の５種のβ‐カロテンよりも高いＥＢＶ早期抗原発現阻害率を示した。また，これらの化合物１〜５は，試験において高いラジ細胞生存率を示したことから，高い安全性を持つ発癌予防剤として期待できる。
【００３６】
さらに，本試験で活性を確認した化合物２及び４について，マウス皮膚二段階発癌試験を行い，活性を確認したので説明する。
（マウス皮膚二段階発癌試験）
（１）発癌イニシエーション抑制作用
ＩＣＲ雌性マウス背部体毛を剃毛し，翌日に一酸化窒素（ＮＯ）産生試薬であるパーオキシナイトライト（Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒａｔｅ）を３５μｇ塗布し，イニシエーションを行った。１週間後より，被験マウスを１５匹ずつ２群に分け，両群とも同一部位に１μｇのＴＰＡを週２回塗布し続けプロモーションを行った。第１群は試験中通常の飲料水を自由摂取させ，これを対象群とした。第２群はイニシエーションを行った前後１週間，０．００２５％（２．５ｍｇ／１００ｍＬ水）濃度に調整した被験物質含有飲料水を自由摂取させた。ＴＰＡ塗布開始後１週間毎にマウスに発生する腫瘍個数の平均値及び発生率を対照群と比較し，抑制効果を算出した。
【００３７】
（２）発癌プロモーション抑制作用
ＩＣＲ雌性マウスの背部皮下に，７，１２‐ジメチルベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）３９０ｎＭｏｌを塗布してイニシエートし，１週間後よりＴＰＡ  １．７ｎＭｏｌの塗布を週２回，２０週間にわたって行った。それと並行して，８５ｎＭｏｌの被験物質（化合物２あるいは４）を，ＴＰＡ塗布の６０分前に同一部位に塗布した。マウスは１群１５匹を用いて試験し，腫瘍を形成したマウスの匹数及びマウス１匹当りの腫瘍個数を調べ，被験物質を塗布しない対象群と比較した。
【００３８】
化合物２及び化合物４のマウス皮膚二段階発癌試験における発癌イニシエーション抑制効果は図４に示した。対象群では１２週後に全てのマウスに腫瘍の発生が認められ，２０週後には１匹当り７個の腫瘍が認められたのに対し，化合物２及び４塗布群では何れも腫瘍の発生が明らかに遅延し，２０週後でも腫瘍の発生率は８０％，また，１匹当りの腫瘍数でも４．５〜４．７個と抑制効果が認められた。
【００３９】
また，化合物２及び化合物４のマウス皮膚二段階発癌試験における発癌プロモーション抑制効果効果は図５に示した。対象群では１０週後に全てのマウスに腫瘍の発生が認められ，２０週後には１匹当り９個の腫瘍が認められたのに対し,化合物２及び４塗布群では何れも腫瘍の発生を明らかに遅延させ，２０週後でも腫瘍の発生率は８０％，また，１匹当りの腫瘍数でも４．０と著しい抑制効果が認められ，これらが発癌予防物質として期待できることが裏付けられた。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明に係る化合物１〜５の化学構造式を示す図である。
【図２】本発明に係る化合物１〜３のＮＯＥＳＹスペクトル法により得られた核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）相関関係を説明する図である。
【図３】ＥＢＶ活性化抑制試験の手順を説明する図である。
【図４】マウス皮膚二段階発癌試験における発癌イニシエーション抑制効果を示すグラフである。
【図５】マウス皮膚二段階発癌試験における発癌プロモーション抑制効果効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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