(57)【要約】【課題】  癌の骨転移のリスクを予測する方法の提供。【解決手段】  被検動物における癌の骨転移のリスクを予測する方法であって、被検動物から得た生物学的試料におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）レベルを測定し、このγ−ＧＴＰレベルが、癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、癌の骨転移のリスクが高いと予測することを特徴とする方法が提供される。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検動物における癌の骨転移のリスクを予測する方法であって、
前記被検動物から得た生物学的試料におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）レベルを測定し、
該γ−ＧＴＰレベルが、癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、癌の骨転移のリスクが高いと予測することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記生物学的試料が尿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記γ−ＧＴＰレベルの測定が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、エライザ法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学染色法、高速液体クロマトグラフィー定量法、酵素法、ウェスタン・ブロッティング法、ノーザン・ブロッティング法、またはＲＴ−ＰＣＲにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、または胃癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記閾値がＲＯＣ分析により設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
癌と診断された動物において、癌の骨転移をモニタリングする方法であって、
前記動物から得た生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを測定することを含んでなり、
前記γ−ＧＴＰレベルが経時的に上昇したときに癌の骨転移のリスクが増加したとする、方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が尿である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的試料が癌細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
γ−ＧＴＰの癌の骨転移マーカーとしての使用。
【請求項１１】
前記γ−ＧＴＰが尿中γ−ＧＴＰである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記γ−ＧＴＰが癌細胞から発現されるものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
少なくともγ−ＧＴＰレベル測定用試薬を含んでなる、癌の骨転移のリスクの診断用キット。
【請求項１４】
前記γ−ＧＴＰレベル測定用試薬が、抗γ−ＧＴＰ抗体またはγ−ＧＴＰ活性測定用基質である、請求項１３に記載の診断用キット。
【請求項１５】
前記γ−ＧＴＰレベル測定用試薬が、抗γ−ＧＴＰモノクローナル抗体、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−α−ナフチルアミン、またはＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−１，４−フェニレンジアミンから選択される、請求項１３に記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）を指標とする、癌の骨転移のリスクを予測する方法に関する。
【０００２】
背景技術
近年、生活習慣の欧米化に伴い、日本においても乳癌および前立腺癌などが急激に増加している。これらの癌は、肺癌などと同様に、骨への転移の頻度が極めて高い。そして、骨転移は、癌患者における病状および死亡率を左右する要因となっている。
【０００３】
癌の骨転移の診断は、従前、画像診断法（骨シンチグラフィ、ＣＴ、またはＭＲＩなど）によって行われてきたが、これらの検査を施行できる施設は限られている。また、これらの検査には通常高額の費用がかかる。
【０００４】
また、骨代謝マーカーを、癌の骨転移の指標とする補助的な診断方法が検討されている。癌の骨転移にあっては、破骨細胞による骨吸収の亢進が重要な役割を果たすことが知られている。例えば、尿中デオキシピリジノリン排泄（Ｄｐｄ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴｘ）、および血中Ｉ型コラーゲン−Ｃ−テロペプチド（ＩＣＴＰ）などの骨吸収の生化学マーカーは、癌の骨転移の指標として臨床において使用されている。これらは保険請求することが認められているが、料金は高く、保険請求が認められる測定項目数も限定されている。
【０００５】
癌の骨転移は、残念ながら、病的な骨折、痛みまたは麻痺などの神経学的異常によって発見され、その発見の時点では骨転移および原病である癌の治療は困難となっていることが多い。したがって、癌の骨転移の早期発見を可能とする診断技術の開発が依然として望まれるといえる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、今般、被検動物から得た生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルが癌の骨転移の頻度と相関することを見出し、この相関性を利用することにより癌の骨転移リスクの予測を迅速かつ正確に行うことができることを見出した。本発明はかかる知見に基づくのものである。
したがって、本発明は、癌の骨転移リスクの予測方法およびその診断用キットの提供を目的としている。
【０００７】
そして、本発明による被検動物における癌の骨転移のリスクを予測する方法は、被検動物から得た生物学的試料におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）レベルを測定し、このγ−ＧＴＰレベルが癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、癌の骨転移のリスクが高いと予測することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明による癌の骨転移のリスクの診断用キットは、少なくともγ−ＧＴＰレベル測定用試薬を含んでなるものである。
【０００９】
本発明によれば、γ−ＧＴＰを癌の骨転移マーカーとして利用することにより癌の骨転移リスクの予測を簡便かつ安価に行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、既存のγ−ＧＴＰ測定装置・試薬を用いて癌の骨転移を効率的に診断することが可能であり、これにより癌の骨転移を早期に発見・治療することが可能となる。したがって、γ−ＧＴＰを癌の骨転移マーカーとして利用する本発明による方法が提供されることは、極めて意義がある。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明は、被検動物から得た生物学的試料におけるγ−ＧＴＰを癌の骨転移の指標とすることをその特徴とする。γ−ＧＴＰは、ペプチドのＮ末端のグルタミン酸を他のペプチドまたはアミノ酸に転移する作用を有する酵素であり、その血清濃度は肝・胆道系疾患を特異的に反映する指標として広く利用されているが、γ−ＧＴＰが癌の骨転移マーカーとして機能することが見出されたことは、意外な事実である。
【００１１】
本発明における生物学的試料は、好ましくは尿または癌細胞である。
γ−ＧＴＰレベルの測定法としては、γ−ＧＴＰレベルを測定するという目的が達成できればいづれの方法でもよく、例えば、生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを直接的に、またはγ−ＧＴＰの酵素活性などを利用して間接的に測定する方法、癌細胞などの生物学的試料から発現されるγ−ＧＴＰをセカンドメッセンジャーなどを介して間接的に測定する方法などが挙げられ、より具体的には、γ−ＧＴＰに対する特異的抗体を用いた免疫学的測定法（酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、エライザ法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタン・ブロッティング法、免疫組織化学染色法など）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）定量法、生物学的試料におけるγ−ＧＴＰの酵素活性を測定する方法（酵素法）、ノーザン・ブロッティング法、またはＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、γ−ＧＴＰの測定は、ＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色法、ＨＰＬＣ定量法、酵素法、ウェスタン・ブロッティング法、ノーザン・ブロッティング法、またはＲＴ−ＰＣＲにより行われる。これらの方法により、γ−ＧＴＰレベルを定性的および／または定量的に測定することができる。また、生物学的試料が尿である場合、γ−ＧＴＰレベルは必要であれば尿中クレアチニン値による補正を行う。また、これらの方法において、γ−ＧＴＰの測定に通常用いられる自動分析装置を用いれば、短時間でも大量の検体の処理が可能となる。
【００１２】
本発明の対象とされる癌は、好ましくは乳癌、肺癌、前立腺癌、または胃癌であり、より好ましくは乳癌である。
また、本発明における被検動物は、好ましくは非ヒト動物またはヒトであり、より好ましくは非ヒト哺乳動物またはヒトである。
【００１３】
本発明にあっては、測定されたγ−ＧＴＰレベルが、癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを参照して予め設定された閾値よりも高い場合に、癌の骨転移のリスクが高いと予測する。本発明におけるこの閾値は、被検動物の種、性別、生活習慣などによって変動するため、また想定するリスクの高値により変動するため、これらに応じて予め設定する必要がある。本発明における閾値は、癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを上述の方法により測定し、その測定値を参照して設定することができる。このような測定値を参照して閾値を設定する手法としては、例えば、生物学的試料におけるγ−ＧＴＰと既知の癌の骨転移マーカー（ＮＴｘ、ＩＣＴＰ、Ｄｐｄなど）との相関関係に基づき、上記測定値および既知の癌の骨転移マーカーにおける骨転移の判定基準値から本発明における閾値を設定する手法、生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルと癌の骨転移の有無との相関関係に基づき、本発明における閾値を設定する手法などが挙げられる。このような閾値の具体的な設定方法としては、例えば、（癌の骨転移のある動物の生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルの平均値±標準偏差）、またはＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic)分析などが挙げられるが、好ましくはＲＯＣ分析である。後記する実施例においてこれらの手法により得られた具体的な閾値としては、骨転移のある乳癌患者の尿中γ−ＧＴＰレベルの平均値から算出された値５２±１８．９ ＩＵ／ｇ  Ｃｒ（mean±S.D.）、ＲＯＣ分析に基づき算出された乳癌患者の尿中γ−ＧＴＰレベルのカットオフ値４０〜５０ＩＵ／ｇ  Ｃｒであり、より好ましくはＲＯＣ分析に基づき算出された乳癌患者の尿中γ−ＧＴＰレベルのカットオフ値４０〜５０ ＩＵ／ｇ  Ｃｒである。このようにして設定した閾値と、被検動物から得た生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルとを比較し、このγ−ＧＴＰレベルが閾値より高ければ、その動物は癌の骨転移のリスクが高いと予測することができる。
【００１４】
また、本発明によれば、個々の動物について生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを複数回測定して、癌の骨転移のモニタリングを行うことが可能となる。したがって、本発明の別の態様によれば、癌と診断された動物において癌の骨転移をモニタリングする方法であって、この動物から得た生物学的試料におけるγ−ＧＴＰレベルを測定することを含んでなり、γ−ＧＴＰレベルが経時的に上昇したときに癌の骨転移のリスクが増加したとする方法が提供される。このようなモニタリングを行うことにより、癌と診断された動物において、治療薬（ビスフォスフォネート薬、抗癌剤など）の選択やその効果の判定などを有利に行うことができる。
また、本発明の別の態様によれば、γ−ＧＴＰの癌の骨転移マーカーとしての使用が提供される。
【００１５】
また、本発明は、本発明による方法を実施するために使用できる癌の骨転移のリスクの診断用のキットを提供する。このキットに含まれるγ−ＧＴＰ測定用試薬としては、各種市販のγ−ＧＴＰ測定用試薬を使用することが可能である。
このようなγ−ＧＴＰ測定用試薬としては、例えば、免疫学的測定方法に用いる抗γ−ＧＴＰ抗体またはγ−ＧＴＰ活性測定用基質などが挙げられる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、γ−ＧＴＰ測定用試薬は抗γ−ＧＴＰ抗体またはγ−ＧＴＰ活性測定用基質である。
【００１６】
免疫学的測定方法に用いる抗γ−ＧＴＰ抗体としては、好ましくは抗γ−ＧＴＰモノクローナル抗体である。γ−ＧＴＰを免疫学的手法により測定する場合、本発明によるキットはさらに、抗体の固相化、抗体の検出などに用いることのできる物質および／または器具を含んでもよい。抗体の固相化のためには、マイクロタイタープレートなどの担体、炭酸緩衝液などの固相化用液体、ゼラチン含有ＰＢＳなどのブロッキング液などを含むことができる。抗体の検出のためには、抗体を予め標識しておくことが好ましく、その場合には、本発明によるキットはその検出用試薬を含むことができる。例えば、標識物質としてビオチンを使用する場合には、検出用試薬としてストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲート、並びにＨＲＰの作用によって発色する発色液を含むことができる。
【００１７】
また、γ−ＧＴＰ活性測定用基質としては、市販のγ−ＧＴＰ測定用試薬に含まれる各種の合成基質が挙げられ、好ましくはＬ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド、Ｌ−γ−グルタミル−α−ナフチルアミン、またはＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−１，４−フェニレンジアミンなどである。なお、γ−ＧＴＰ活性測定用基質を使用する場合、通常、Ｌ−グルタミル基の受容体物質としてグリシルグリシンが添加される。
【００１８】
本発明によるキットの用法、各種試薬の用量などは、当業者であれば適切に設定することができる。また、本発明によるキットは、必要であれば、説明書などを含んでもよい。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２０】
実施例１：尿中γ−ＧＴＰを指標とする癌の骨転移リスクの評価
乳癌患者３６人を対象に尿中γ−ＧＴＰレベル（ＩＵ／ｇ Ｃｒ）を同意のもとに測定した。この測定は AU5232型自動分析装置（Olympus社製）を用いて酵素法により行った。ここで、尿中γ−ＧＴＰレベル（ＩＵ／ｇ Ｃｒ）は、尿中に排泄されるクレアチニン１ｇ当たりのγ−ＧＴＰ排泄量として表示した。また、対照の骨吸収マーカーとして尿中のＩ型コラーゲンＮ末端テロペプチド断片（ＮＴｘ）を測定した。この測定は、ＥＬＩＳＡ法により行った（測定試薬：Osteomark（登録商標）、OSTEX社製）。そして、ＮＴｘ値（nmoL BCE(Bone Collargen Equivalents)/mmoL Cr)もまた、クレアチニン補正値として表示した。また、患者における癌の骨転移の有無はシンチグラフィーによって診断し、ＣＴまたはＭＲＩにて確認した。なお、尿サンプルは測定まで室温にて保存した。
【００２１】
上記のようにして得られた各測定値について相関を調べた。
骨転移のある乳癌患者における、尿中γ−ＧＴＰレベルおよび尿中ＮＴｘレベルの相関は図１に示される通りであり、正の相関（Ｒ２＝０．１６７５）を示した。
また、乳癌患者において、骨転移のある患者および骨転移のない患者の尿中γ−ＧＴＰレベルは図２に示される通りであった。尿中γ−ＧＴＰレベルの測定値（平均値±標準偏差）は、骨転移のある患者では５２．５±１８．９（ＩＵ／ｇ  Ｃｒ）であり、骨転移のない患者では３７．１±６．９（ＩＵ／ｇ  Ｃｒ）であった。
また、乳癌患者において、骨転移のある患者および骨転移のない患者の尿中ＮＴｘレベルは図３に示される通りであった。尿中ＮＴｘレベルの測定値（平均値±標準偏差）は、骨転移のある患者では１３８．３±１１５．６（ＩＵ／ｇ  Ｃｒ）であり、骨転移のない患者では４９．９±４．９（ＩＵ／ｇ  Ｃｒ）であった。
【００２２】
また、乳癌患者における尿中γ−ＧＴＰレベルおよび尿中ＮＴｘレベルに関するＲＯＣ分析を行った。尿中ＮＴｘレベル５４．３nmoL BCE/mmoL Cr以上を骨吸収亢進陽性とした場合、感度および特異度から得られた尿中γ−ＧＴＰ値のカットオフ値は４０〜５０（ＩＵ／g Cr）程度であった。
また、乳癌患者における尿中γ−ＧＴＰレベルおよび癌の骨転移の有無に関するＲＯＣ分析を行った。骨転移を有する場合を陽性とした場合、感度および特異度から得られた尿中γ−ＧＴＰのカットオフ値は４０〜５０（ＩＵ／g Cr）程度であった。
【００２３】
実施例２：癌細胞に対するγ−ＧＴＰの骨転移促進能評価
（１）γ−ＧＴＰｃＤＮＡの単離
Mus musculus γ-GTP (NCBI U30509) のＮ末端にkozac配列を配置し、更にその両端にMfe1 siteを配置したプライマーを設計した。各プライマーの塩基配列を次に示す。
Mfe1-GGT 5’ : 5’-ccgcaattgccaccatgaagaataggtttatgg-3’（配列番号：１）
Mfe1-GGT 3’ : 5’-ggcggggaacctgctggctactgacaattg-3’（配列番号：２）
C57BL6/crslcマウス(8週齢、オス)の両側腎臓を採取し、Trizol Reagent （商標）(Invitrogen)を用いて total RNAを抽出した。このtotal ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより約１．７ｋｂｐのγ-ＧＴＰ ｃＤＮＡフラグメント（配列番号３に記載のＣＤＳの１６１−１８６７に相当）を得た。
【００２４】
（２）ベクターの構築
CMV-IE enhancer + chicken β-actin promoterの下流にEcoR1 site + rabbit β-globin polyAが配置されているプラスミドベクターを常法に従って構築した。次に、このベクターをEcoR1にて切断し、（１）にて得られたγ−ＧＴＰ ｃＤＮＡフラグメントを挿入し、得られたベクターを以下の骨転移能評価に用いた。
【００２５】
（３）骨転移能評価
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、（２）にて得られたγ−ＧＴＰ ｃＤＮＡフラグメントを挿入したベクターをリポフェクション法にてトランスフェクトし、この細胞をヌードマウス （Balb/c nu/nu、８週齢、１０匹、メス、日本エスエルシー社製）の心臓に移植し、４週間経過後、骨転移を評価した。対照としては、空のベクターをトランスフェクトした細胞を用いた。癌の骨転移は大腿骨および脛骨の軟線レントゲン撮影にて確認した。
結果は、図４に示される通りであった。γ−ＧＴＰ ｃＤＮＡを遺伝子導入した細胞を移植したマウスでは癌の骨転移巣がより多く形成されていた（検定法: Unpaired student t-test）。
【００２６】
参考例１
実施例２において用いたγ−ＧＴＰを遺伝子導入した細胞またはコントロール細胞を、ヌードマウスの皮下に移植し、４週間経過後、これらの細胞の細胞重量を比較した。
結果は図５に示される通りであった。両者の細胞重量に有意差はなく、腫瘍の発育についてγ−ＧＴＰの影響は認められなかった（検定法: Unpaired student t-test）。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】乳癌の骨転移患者における、尿中γ−ＧＴＰレベルおよびＮＴｘレベルの相関を示す図である。
【図２】乳癌患者における、骨転移の有無と尿中γ−ＧＴＰレベルとの関係を示す図である。
【図３】乳癌患者における、骨転移の有無と尿中ＮＴｘレベルとの関係を示す図である。
【図４】γ-ＧＴＰ ｃＤＮＡを遺伝子導入したヒト乳癌細胞株MDA-MB-231細胞（ＭＤＡ／γ-ＧＴＰ）またはコントロール細胞（ＭＤＡ／ベクター）を心臓に移植したヌードマウスにおける、癌の骨転移能評価の結果を示す図である。
【図５】γ-ＧＴＰ ｃＤＮＡを遺伝子導入したヒト乳癌細胞株MDA-MB-231細胞（ＭＤＡ／γ-ＧＴＰ）またはコントロール細胞（ＭＤＡ／ベクター）を皮下に移植したヌードマウスにおける、癌細胞の発育の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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