(57)【要約】【課題】吸水性具材を用いて採取した被検試料であっても、充分な感度を得ることのできるイムノクロマトグラフ法を提供する。【解決手段】前記イムノクロマトグラフ法は、（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料を、吸水性具材により採取する工程；（２）前記吸水性具材から抽出用溶液により前記分析対象物質を抽出すると同時に、あるいは、抽出から連続的に、標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる工程；及び（３）前記工程（２）で得られた抽出液を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料を、吸水性具材により採取する工程；
（２）前記吸水性具材から抽出用溶液により前記分析対象物質を抽出すると同時に、あるいは、抽出から連続的に標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる工程；及び
（３）前記工程（２）で得られた抽出液を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフ法。
【請求項２】
前記工程（２）において、抽出用溶液として、標識化した分析対象物質特異的パートナーを含有する抽出用溶液を用いることにより、吸水性具材から分析対象物質を抽出すると同時に、標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる、請求項１に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項３】
前記工程（２）において、吸水性具材を、標識化した分析対象物質特異的パートナーを含浸するイムノクロマトグラフ用試料添加部に接触させた状態で、抽出用溶液を吸水性具材に添加し、吸水性具材から試料添加部へ展開させることにより、吸水性具材から分析対象物質を抽出すると同時に、あるいは、抽出から連続的に、標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる、請求項１又は２に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項４】
抽出用溶液が界面活性剤を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項５】
抽出溶液が粘性低減物質を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項６】
（１）イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）標識化した分析対象物質特異的パートナーを含有する、被検試料採取用吸水性具材から分析対象物質を抽出するための抽出用溶液
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフキット。
【請求項７】
（１）標識化した分析対象物質特異的パートナーを含浸するイムノクロマトグラフ用試料添加部を含む、イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）被検試料採取用吸水性具材から分析対象物質を抽出するための抽出用溶液
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非浸襲性検体（例えば、涙液、鼻汁、痰、又は咽頭拭い液）を用いたイムノクロマトグラフ法に関する。
本明細書において、「イムノクロマトグラフ法」とは、特に限定されるものではないが、例えば、その工程中にクロマトグラフ法（特には、薄層クロマトグラフ法又はペーパークロマトグラフ法）を用いる工程を含み、１又は複数の抗原抗体反応の少なくとも一部をクロマトグラフ用の薄膜状支持体上で展開しながら実施する免疫学的分析法を挙げることができる。
【背景技術】
【０００２】
各種疾病の指標となる物質を免疫学的に測定する方法が実用化され久しいが、継続的に測定方法の改良が行われ、超高感度に測定する方法とともに、一方では簡便迅速に測定することができる方法が多数製品化されている。特に簡便迅速な方法としてイムノクロマトグラフ法があり、肝炎、インフルエンザ等の感染症、ＣＫ−ＭＢ、トロポニン等の心筋梗塞の検査法が開発されており、今後更に適用対象が拡大されていくことが期待されている。
一方では、近年、花粉症等のアレルギー患者が増えているが、アレルギー疾患の治療のポイントはその原因となる抗原を除去、あるいは回避することにあるため、専門医による問診と、アレルギーの原因（何に対するアレルギーなのか）を把握することが重要になっている。
【０００３】
アレルギー検査には、大きく分けて血液検査、皮膚テスト、誘発テストの３種類があり、特に血液検査と皮膚テストが主に行われている。
例えば、血液検査の場合、血液学的検査で白血球の中の好酸球数を測定することで、アトピー性皮膚炎等を検査する。好酸球は遅発型アレルギーの発症に関与する。また、免疫グロブリンの１種であるＩｇＥは、アレルギーを原因とするアトピー性皮膚炎の主なメカニズムの一つに関与しており、この総ＩｇＥ量を測定する検査（いわゆるＲＡＳＴ法）により、アレルギー疾患をもっているか推定する。また、アレルギー性疾患ではアレルゲンの除去（回避）をすることが主な治療になるため、アレルゲンの同定をすることが重要である。アレルゲンに特異的なＩｇＥを検出する方法（ＲＡＳＴ法）が多用されており、アレルギー性疾患が疑われる場合は、総ＩｇＥ値が基準内であっても、アレルゲンに特異的なＩｇＥの存在が確認をすることは有効である。
【０００４】
主な測定アレルゲン項目としては、吸入型と食物型の２種類がある。吸入型（主に、アレルギー性鼻炎、気管支喘息用）としては、スギ花粉、ヤケヒョウヒダニ、カモガヤ、ブタクサ、ヨモギ、イヌ上皮、ネコ上皮、ハウスダスト、カビ（真菌）等であり、一方、食物型は卵白、牛乳、小麦、米、大豆、エビ、カニ、マグロ、豚肉、牛肉等に対する特異ＩｇＥが検査されている。これ以外にも、薬剤やラテックスなどもアレルゲンとして、アレルギー検査に使用されている。
特異的ＩｇＥ抗体の測定方法としては、血液中の特異的ＩｇＥ抗体をそのパートナー、即ちアレルゲンと結合させ、その複合体に酵素標識化した抗ＩｇＥ抗体を反応させて、標識した酵素由来の信号を検出する免疫学的手段により、その結果から、アレルギーの鑑別とその重篤度を検査することが多用されている。
【０００５】
また、上述したように、好酸球を測定することも有用で、特に好酸球塩基性タンパク質（eosinophile cationic protein；以下、ＥＣＰと略称することがある）は、体内に存在する好酸球中に含まれる主要なタンパク質の１つであり、１型アレルギー性炎症反応に関連するタンパク質と考えられている。好酸球は、１型アレルギーの遅発相反応において、ＥＣＰをはじめとして、好酸球パーオキシダーゼ（ＥＰＯ）、好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）、及びメジャーベイシックタンパク質（ＭＢＰ）などのタンパク質を放出することにより、組織障害又は炎症を惹起する。従って、ＥＣＰ濃度の測定は、１型アレルギーに由来する炎症の指標になるとされている。血中に含まれるＥＣＰ量は、多くの研究者によって免疫学的に測定されており、その測定の臨床的意義について多くの報告がある（非特許文献１）。
【０００６】
血中の特異ＩｇＥ抗体（ＥＣＰも含む）測定に際しては、患者から血液を採取して血清又は血漿を分離することにより測定用サンプルを得ることが容易である。しかしながら、採血は少量であっても、患者に相応の負担がかかる。特に乳児においては採血することが難しく、血液以外の検体を用いることの可否が検討されてきた。
すなわち、特異ＩｇＥ（ＥＣＰも含む）は血中のみならず、涙液、鼻汁、唾液、痰、尿、便などにも存在する。特に、涙液中、鼻汁中の特異ＩｇＥ抗体（ＥＣＰも含む）は、そのアレルギー症状をよく反映するものであり、血液に換えてこれらを検体試料とする検討は従前より行われていた。
【０００７】
しかしながら、鼻汁又は涙液などの外分泌液などについては、測定用サンプルを定量的に得ることは難しい。例えば、鼻汁の採取方法としては、分泌液そのものを採取する方法、あるいは、鼻腔洗浄液などで鼻腔を洗浄した後、新たに分泌された鼻汁のみを採取する方法等が試みられている（非特許文献２）。
【０００８】
また、涙液を充分量採取することは更に難しい。通常は、キャピラリー等を用いて非常にわずかの量（２μＬ程度）を採取することになるが、これは高度なテクニックを必要とし、同時に患者の恐怖心を惹起し、場合によっては眼を傷つけてしまうことすらあった。また、研究目的では、眼組織を採取する為に、金属器具等による擦過により組織を削りとる方法があるが、これもまた、患者に多大な苦痛と恐怖心を与える為、研究目的以外には用いられなかった。従って、涙液中の特異ＩｇＥ抗体（ＥＣＰも含む）測定に関しては、臨床的有用性は認識されていながら、実用化されるには到っていない。
【０００９】
このような問題を解決する手段として、涙液や鼻汁をいったんろ紙などの吸湿性の素材に吸収させ、これから抽出することによりサンプルとすることが考えられる（非特許文献３）。この方法は、患者に負担をかけずにサンプリングできる良い方法であるが、採取可能な検体量は血液に比べて少ない。現在のＲＡＳＴ法あるいはＣＡＰ−ＲＡＳＴ法にこのようなサンプリング法を適用しようとする場合では、ろ紙等を希釈液（生理食塩水やリン酸緩衝液等）で処理（抽出）し、その一部を検体として用いる試薬構成（アッセイ系）になっているため、結果として検体が数百倍に希釈されてしまう。そのため、弱陽性が陰性となったり、強陽性が弱陽性になったり、特に感度の面で不充分であった。
【００１０】
【非特許文献１】ピー・ベンゲ（Ｐ．Ｖｅｎｇｅ）ら，「クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・アレルジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）」，（英国），１９９９年，第２９巻，Ｐ．１１７２−１１８６
【非特許文献２】ディー・ワング（Ｄ．Ｗａｎｇ）ら，「ヨーロピアン・アーカイブス・オブ・オトライノラリンゴロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ）」，（独国），１９９５年，第２５２巻，Ｐ．Ｓ４０−Ｓ４３
【非特許文献３】鈴木康意ら，「アレルギーの臨床」，１９９０年，第１０巻，Ｐ．４０９−４１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、これまで充分な感度を得ることができなかった、吸水性具材を用いて採取した被検試料に関するイムノクロマトグラフ法の改良法、すなわち、吸水性具材を用いて採取した被検試料であっても、充分な感度を得ることのできるイムノクロマトグラフ法を提供することにある。より具体的には、患者に負担をかけず（いわゆる、非浸襲性検査）に血液以外の生体由来液、例えば、涙液、鼻汁、痰等をサンプルとして、そこに含まれる特定の物質、特に特異ＩｇＥ抗体やＥＣＰといったタンパク質をより正確にまた簡便かつ迅速に測定する方法、そのためのキットを提供することにある。特に、イムノクロマトグラフ法という簡便迅速なアッセイ系を用いて、血液以外の生体由来液を検体とした高感度に測定することができる技術を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題は、本発明による、（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料を、吸水性具材により採取する工程；
（２）前記吸水性具材から抽出用溶液により前記分析対象物質を抽出すると同時に、あるいは、抽出から連続的に標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる工程；及び
（３）前記工程（２）で得られた抽出液を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフ法により解決することができる。
【００１３】
本発明方法の好ましい態様によれば、前記工程（２）において、抽出用溶液として、標識化した分析対象物質特異的パートナーを含有する抽出用溶液を用いることにより、吸水性具材から分析対象物質を抽出すると同時に、標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる。
また、本発明方法の別の好ましい態様によれば、前記工程（２）において、吸水性具材を、標識化した分析対象物質特異的パートナーを含浸するイムノクロマトグラフ用試料添加部に接触させた状態で、抽出用溶液を吸水性具材に添加し、吸水性具材から試料添加部へ展開させることにより、吸水性具材から分析対象物質を抽出すると同時に、あるいは、抽出から連続的に、標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる。
また、本発明の更に別の好ましい態様によれば、抽出用溶液が界面活性剤を含有する。
また、本発明の更に別の好ましい態様によれば、抽出用溶液が粘性低減物質を含有する。
【００１４】
また、本発明は、（１）イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）標識化した分析対象物質特異的パートナーを含有する、被検試料採取用吸水性具材から分析対象物質を抽出するための抽出用溶液
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフキットに関する。
更に、本発明は、（１）標識化した分析対象物質特異的パートナーを含浸するイムノクロマトグラフ用試料添加部を含む、イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）被検試料採取用吸水性具材から分析対象物質を抽出するための抽出用溶液
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフキットに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、これまで充分な感度を得ることができなかった、吸水性具材を用いて採取した被検試料であっても、充分な感度を得ることができる。前記効果が得られる理由は、現時点では確定されてはいないが、例えば、吸水性具材からの抽出効率の向上、分析対象物質と標識化パートナーとの複合体の形成効率の向上などが考えられる。
【００１６】
また、本発明方法では、採取した検体をそのまま稀釈せずまたは低稀釈倍率で測定に供することができる。この方法は、従来報告されているように測定物を含んだ吸収具材を緩衝液などで抽出してその一部をサンプルとして測定物の測定を行う場合と比べ、より高感度、簡便、迅速の測定を行うことが可能となる。さらに、本発明では抽出しながら標識化抗体と反応させることにより、反応が速く進行するので迅速な測定が可能であり、測定の操作性もより簡便となる。また、イムノクロマトグラフ法という迅速簡便なアッセイ系であっても、従来の自動分析装置による結果と同等以上の高感度化を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、イムノクロマトグラフ法の改良法であって、被検試料を吸水性具材により採取した後、前記吸水性具材に吸収された被検試料を以下に詳述する適当な方法により抽出した後、イムノクロマトグラフ法により分析するものであり、それ以外の点では、従来公知のイムノクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
【００１８】
本発明方法は、（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料を、吸水性具材により採取する工程（以下、採取工程と称する）；
（２）前記吸水性具材から抽出用溶液により前記分析対象物質を抽出すると同時に、あるいは、抽出から連続的に、標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させる工程（以下、抽出工程と称する）；及び
（３）前記抽出工程（２）で得られた抽出液を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程（以下、展開工程と称する）
を含む。
【００１９】
本発明方法は、抽出工程における、分析対象物質の吸水性具材からの抽出の手段の違いにより、例えば、
（ａ）抽出用溶液として、標識化パートナーを含有する抽出用溶液を用いる態様、
（ｂ）吸水性具材を、標識化パートナーを含浸するイムノクロマトグラフ用試料添加部に接触させた状態で、抽出用溶液を吸水性具材に添加し、吸水性具材から試料添加部へ展開させる態様
を挙げることができる。
【００２０】
前記態様（ａ）では、分析対象物質の吸水性具材からの抽出と同時に、標識化パートナーと接触させることができる。
また、前記態様（ｂ）では、抽出用溶液として、標識化パートナーを含有しない抽出用溶液を用いることもできる［態様（ｂ１）］し、あるいは、標識化パートナーを含有する抽出用溶液を用いることもできる［態様（ｂ２）］。前記態様（ｂ１）では、分析対象物質の吸水性具材からの抽出から連続的に、標識化パートナーと接触させることができる。一方、前記態様（ｂ２）では、分析対象物質の吸水性具材からの抽出と同時に標識化パートナーと接触させた後、更に、抽出直後にも標識化パートナーと接触させることができる。
【００２１】
本発明方法における採取工程では、分析対象物質を含む可能性のある被検試料を、吸水性具材により採取する。
前記被検試料としては、吸水性具材により採取可能な試料である限り、特に限定されるものではないが、吸水性具材を用いる必要のない試料（例えば、血液、血清、血漿）以外の試料であることが好ましい。例えば、外分泌液、更に具体的には、涙液（好適には、結膜と眼球表面との間の涙液）、鼻汁（例えば、鼻腔吸引液等）、痰、咽頭拭い液、粘膜組織、唾液、又はリンパ液を挙げることができる。これらの生体試料は、吸水性具材を用いて採取することにより、患者への負担が大きく軽減されるものである。
【００２２】
前記被検試料に含まれる分析対象物質としては、イムノクロマトグラフにより分析可能な物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗体（特に、特異的ＩｇＥ）又は抗原（例えば、ＥＣＰ、アレルゲン）を挙げることができる。例えば、涙液の場合、アデノウイルス等の感染性物質を検出するのに好適に使用することができる。また、鼻汁（例えば、鼻腔吸引液等）を検体とするインフルエンザウイルスの検査、痰（喀痰）を検体とする肺癌検査等の各種ガンマーカーの検査にも適応することができる。
【００２３】
前記吸水性具材としては、水分を吸収可能なあらゆる素材が使用可能であり、例えば、紙［例えば、ろ紙（セルロース）］、布帛（例えば、織物、編物、綿棒、不織布）、線維（例えば、木綿、ナイロン）、膜［例えば、セルロース誘導体の膜（例えば、ニトロセルロース膜）］、親水性樹脂を挙げることができる。
安価で、且つ入手が容易なことから、ろ紙（セルロース）が最も一般的である。また、被検試料の吸収量を定量的にコントロールすることができる点で、特に涙液の場合には、目盛を付けた吸水性具材、例えば、シルメル試験紙（昭和薬品化工株式会社製造、株式会社メニコン発売）を用いることが好ましい。また、咽頭拭い液の場合は、綿棒が好適に用いられる。
【００２４】
本発明方法における抽出工程で用いる標識化パートナー（すなわち、標識化した分析対象物質特異的パートナー）は、通常のイムノクロマトグラフ法と同様に、分析対象物質の種類と、シグナル検出手段に応じて、適宜選択することができる。
【００２５】
分析対象物質特異的パートナーとしては、分析対象物を特異的に捕捉する物質、例えば、抗体、抗原等が用いられる。抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであることもでき、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ等のフラグメントとして用いることもできる。
また、標識物質としては、例えば、酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ）、着色粒子（例えば、金コロイド、カラーラテックス）、蛍光物質、発光物質などを挙げることができる。
【００２６】
前記態様（ａ）、すなわち、抽出用溶液として、標識化パートナーを含有する抽出用溶液を用いる態様では、例えば、被検試料を吸収させた吸水性具材を、抽出用溶液を含む適当な抽出用容器中に移し、前記容器中で抽出を行った後、得られた抽出液（好ましくは、全量又はその大部分）を次の展開工程で使用することができる。
前記抽出に用いる抽出用溶液の液量は、吸水性具材の大きさに応じて適宜決定することができるが、通常、１０〜１００μＬで実施することができる。また、抽出時の温度は、通常、２０〜４０℃で実施することができる。抽出時間は、液量又は温度等の条件により適宜決定することができるが、通常、１分以内〜１０分で実施することができる。
【００２７】
前記態様（ｂ）、すなわち、吸水性具材を、標識化パートナーを含浸するイムノクロマトグラフ用試料添加部に接触させた状態で、抽出用溶液を吸水性具材に添加し、吸水性具材から試料添加部へ展開させる態様では、前記試料添加部は、例えば、試料添加用パッドであることもできるし、あるいは、試料滴下口であることもできる。この態様では、被検試料を吸収させた吸水性具材に抽出用溶液を添加すると、被検試料中の含有成分（例えば、分析対象物質）を含む抽出液は、試料添加部にし、更に、次の展開工程において、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開される。この過程で、吸水性具材から分析対象物質を抽出すると同時に、あるいは、抽出直後（連続的に）に、標識化した分析対象物質特異的パートナーと接触させることにより、分析対象物質と標識化した分析対象物質特異的パートナーとの反応を抽出工程とほぼ同時に行うことが可能となる。また、標識化パートナーを含浸しないイムノクロマトグラフ用試料添加部に吸水性具材を接触させ、標識化パートナーを含有する抽出液を添加し、抽出と同時に反応を行わせ更に同時に展開を行わせる態様も可能である。
吸収性具材に添加する抽出用溶液の液量は、吸水性具材の体積に応じて適宜決定することができるが、通常、１０〜１００μＬで実施することができる。また、添加した後、次の展開工程に移るまでの時間は、液量又は温度（通常、室温）等の条件により適宜決定することができるが、通常、１分以内〜１０分であることができる。
【００２８】
抽出工程で使用する抽出用溶液は、所望に応じて、界面活性剤及び／又は粘性低減物質を含有することができる。
前記界面活性剤としては、例えば、非イオン界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は両性界面活性剤のいずれも使用可能である。抽出用溶液に界面活性剤を含有させることにより、吸水性具材からの抽出効率を向上させることができる。なお、抽出用溶液に、標識化パートナーを含有させることなく、界面活性剤を含有する溶液を使用した場合にも、吸水性具材からの抽出効率を向上させることができ、本態様も本発明に含まれる。すなわち、本発明には、
（１）分析対象物質を含む可能性のある被検試料を、吸水性具材により採取する工程；
（２）界面活性剤を含有する抽出用溶液により、前記吸水性具材を抽出する工程；及び
（３）前記工程（２）で得られた抽出液を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフ法
が含まれる。
【００２９】
非イオン界面活性剤として、具体的には、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、又はアルキルアルカノールアミド等を挙げることができる。
陰イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルフォン酸塩、アルキルナフタレンスルフォン酸塩、又はアルキルスルホコハク酸塩等を挙げることができる。
陽イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルアミン塩、又は第４級アンモニウム塩等を挙げることができる。
両性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルベタイン、アミンオキサイド、又はジメチルアンモニオプロパンスルホン酸等を挙げることができる。
更に、前記分類の他に、膜タンパク質可溶化剤として知られる、例えば、ステロイド骨格を有するコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム等も本発明で使用可能な界面活性剤である。
本発明方法では、これらの界面活性剤を、１種類のみ単独で、あるいは、２種類以上を組み合わせて使用することができる。また、これらの添加濃度は、０．０１〜３０％の間で、適宜選択し使用することができる。
【００３０】
前記粘性低減物質は、粘性のある被検試料、例えば、鼻汁又は痰を取り扱う際に、取り扱いの向上を目的として、その粘性を低下させるために使用される物質である。例えば、痰や鼻汁を粘性低減物質で処理し、粘性の低くなった検体をろ紙で吸水し、その含浸部を切り取り、抽出用溶液で処理することが可能である。また、抽出液に粘性低減物質を含有させることもできる。粘性低減物質としては、例えば、界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００）、４級アンモニウム塩（例えば、セチルピリジニウム塩）、ジスルフィド結合還元剤（例えば、ジチオスレイトール）、カオトロピック物質（例えば、尿素、グアニジン）、粘性の原因となるムチン等を分解するタンパク質分解酵素若しくは多糖類分解酵素が公知である（例えば、特開２００３−２８７５２９号、特開平２−２７３１９７号）。抽出用溶液に粘性低減物質を含有させることにより、吸水性具材からの抽出効率を向上させることができる。
【００３１】
本発明の展開工程は、前記抽出工程で得られた抽出液を用いること以外は、通常のイムノクロマトグラフ法と同様に実施することができる。
例えば、イムノクロマトグラフ展開膜上での展開は、標識化パートナーとは異なる分析対象物質特異的パートナーを固定化した膜上で実施することができる。この場合に用いられる膜は、例えば、ニトロセルロース又はポリアミド等、イムノクロマトグラフ法に使用されるあらゆる膜が利用可能である。また、固定化パートナーとして、分析対象物質が抗原である場合は、その抗原に対して結合する抗体又は結合タンパク質を用いることができ、分析対象物質が特異的ＩｇＥ抗体である場合は、アレルゲンを用いることができる。
【００３２】
また、標識物質が酵素の場合は、続いて、基質物質を含む洗浄液をイムノクロマトグラフ展開膜上で展開させることにより、イムノクロマトグラフ展開膜上の共雑物質を除去すると同時に、固定化パートナーに補足された免疫複合物を検出することができる。標識物質が着色粒子の場合は、膜上に結合した着色粒子を目視又は測定器で検出することができる。
【００３３】
本発明のイムノクロマトグラフキットは、
（１）イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）標識化した分析対象物質特異的パートナーを含有する、被検試料採取用吸水性具材から分析対象物質を抽出するための抽出用溶液
を含むことができる。このイムノクロマトグラフキットは、例えば、本発明方法の前記態様（ａ）に用いることができる。
【００３４】
また、本発明のイムノクロマトグラフキットは、
（１）標識化した分析対象物質特異的パートナーを含浸するイムノクロマトグラフ用試料添加部を含む、イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）被検試料採取用吸水性具材から分析対象物質を抽出するための抽出用溶液
を含むことができる。このイムノクロマトグラフキットは、例えば、本発明方法の前記態様（ｂ）に用いることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３６】
《実施例１》
（１）酵素法イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
（１−１）アレルゲン固定化膜の作製
ニトロセルロース膜（ＨＦ１８０；ポアサイズ５〜８μｍ；ミリポア社製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに切断した。膜の一端（上流方向）から１５ｍｍの位置に、ダニアレルゲン抽出タンパク質水溶液（ヤケヒョウヒダニ抽出物；グリア社製）［濃度１ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈後、透析した水溶液］を幅１ｍｍの直線状に塗布した。
そのまま、室温下で１時間静置し、続いて、３７℃で３０分間静置して、ダニ抽出タンパク質を固定化した。シリカゲルデシケーター内に保存し、室温下で一夜乾燥させることにより、ダニアレルゲン固定化膜を作製した。
【００３７】
（１−２）酵素標識化抗ＩｇＥ抗体の調製
抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体をペプシン処理した後、２−メルカプトエチルアミンにより還元し、ゲル濾過により精製Ｆａｂ’フラグメント１ｍｇを調製した。
一方、これとは別に、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ２ｍｇを、２ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で希釈した後、透析し、７．５ｍｍｏｌ／Ｌに調製したＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）１００μＬを加えた。４℃にて５時間反応させた後、リン酸緩衝液で透析してピリジルジチオプロピオネート（ＰＤＰ）導入アルカリフォスファターゼを調製した。
前記抗ＩｇＥ抗体Ｆａｂ’と前記ＰＤＰ導入アルカリフォスファターゼとを１ｍＬずつ等量混合してから、１ｍｏｌ／Ｌヒドロキシルアミン４０μＬを添加した。４℃で３日間反応させた後、ゲル濾過カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ；東ソー社製）を用いてゲル濾過し、未反応の抗ＩｇＥ抗体Ｆａｂ’及びＰＤＰ導入アルカリフォスファターゼを除去し、酵素標識化抗ＩｇＥ抗体水溶液を作製した。
【００３８】
（１−３）吸収パッドの作製
セルロースパッド（ＡＰ２５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに切断し、吸収パッドとした。
【００３９】
（１−４）展開パッドの作製
セルロースパッド（ＡＰ２５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、５ｍｍ×１７ｍｍのサイズに切断し、展開パッドとした。
【００４０】
（１−５）展開液の作製
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル酸（ＢＣＩＰ；ベーリンガーマンハイム社製）の１００μｇ／ｍＬ濃度水溶液を調製し、展開液とした。
【００４１】
（１−６）イムノクロマトグラフグラフ用ストリップの作製
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流側から下流側に向かって、実施例１（１−４）で作製した展開パッド、実施例１（１−１）で作製したダニアレルゲン固定化膜、及び実施例１（１−３）で作製した吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ程度重ね合わせて貼付することにより、イムノクロマトグラフグラフ用ストリップを作製した。これを、イムノクロマトグラフ用ケースに入れてイムノクロマトグラフデバイスとした。
【００４２】
（２）試料の調製とイムノクロマトグラフ測定
（２−１）抽出用溶液の調製
脱イオン水、生理食塩水（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム液）、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）を調製し、また、トライトンＸ−１００（和光純薬工業株式会社）、ツイーン２０（シグマ社）、ドデシル硫酸ナトリウム、又はエマルゲン１０８（花王）を前記リン酸緩衝液でそれぞれが、５．０％濃度となるよう調製した。これに、実施例１（１−２）で作製した酵素標識化抗ＩｇＥ抗体を１μｇ／ｍＬとなるように溶解し、抽出用溶液とした。
【００４３】
（２−２）サンプルの採取
サンプルはアレルギー症状のある患者から採取した。涙液を採取する場合、シルメル紙（昭和薬品化工製）の先端を結膜と眼球の間に数分間はさむことで、充分量の涙液を浸潤させ、先端５ｍｍ分を切断することで一定量の涙を採取した。鼻汁を採取する場合は、シルメル紙を鼻孔深部に挿入すること以外は同様の方法で行った。痰の場合は、容器に喀痰を吐き出し、そこにシルメル紙を浸し吸水した。それぞれ６検体を用意した。
【００４４】
（２−３）測定
切断したシルメル紙先端を、実施例１（２−１）で調製した抽出用溶液２０μＬ中で１分間、特異ＩｇＥ抗体を抽出しながら標識抗体と反応させた。得られた抽出液２０μＬを、実施例１（１−６）で作製したイムノクロマトグラフデバイスの検体滴下部に滴下した。その後、実施例１（１−４）で作製した展開パッドに、実施例１（１−５）で調製した展開液２００μＬを滴下し、展開を行った。２０分後にアレルゲン塗布部のＢＣＩＰによる発色を目視検出した。
【００４５】
同様に、シルメル紙を用いて涙液、鼻汁、及び痰を採取し、その先端部を生理食塩水１００μＬに浸して抽出し、得られた抽出液をサンプルとして、市販のアレルギー測定試薬（製品名：ＤＰＣ・イムライズ  アラスタットＩｇＥ  ヤケヒョウヒダニ；三菱化学ヤトロン製）の測定方法に従って測定を行った。測定はイムライズ２０００（ＤＰＣ社製）で行った。
【００４６】
（２−４）測定結果
目視検出した結果を表１に示す。表中、本発明方法の各記号「−」、「±」、「＋」及び「＋＋」は、それぞれ、着色なし、微弱な着色、明確な着色、及び強い着色を意味する。着色度が強いほどアレルギーの度合いが高い。従来法による結果は、クラス０を「−」、クラス１を「±」、クラス２〜４を「＋」、クラス４以上を「＋＋」として置き換えて表示した。クラスが大きいほどアレルギーの度合いが強い。なお、本発明方法の結果は、界面活性剤としてトライトンＸ−１００を使用した場合の結果であるが、それ以外の界面活性剤でも同様の傾向が認められた。
表１に示すとおり、従来法と本発明方法では充分な相関があった。また、特に感度の面では、従来法は感度の高い発光法を用いているが、本発明方法は従来法に比較して良好であった。
【００４７】
《表１》
検体        本発明方法                      従来法
番号    涙液    鼻汁    痰            涙液    鼻汁    痰  
１      ＋＋    ＋＋    ＋＋          ＋      ＋      ＋
２      ＋      ＋      ＋            ±      ±      ±
３      ＋＋    ＋      ＋            ＋      ＋      ＋
４      ±      ±      ±            −      −      −
５      ＋      ＋＋    ＋＋          ＋      ＋      ＋
６      ＋＋    ＋＋    ＋            ＋      ＋      ＋  
【００４８】
《実施例２》
実施例１と同様にイムノクロマトグラフデバイスを調製し、検体も同様に採取した。但し、シルメル紙の先端をデバイスの検体滴下部に載せ、前記抽出用溶液３０μＬを滴下する操作とし、それ以外は同様に行った。結果を表２に示す。
表１に示すとおり、従来法と本発明方法では充分な相関があり、特に涙液の場合、実施例１の抽出液の滴下操作と同程度の充分な感度が得られた。なお、本発明方法の結果は、界面活性剤としてトライトンＸ−１００を使用した場合の結果であるが、それ以外の界面活性剤でも同様の傾向が認められた。また、更にセチルピリジニウム塩、あるいはグアニジンを添加した場合も同様の傾向が認められた。
【００４９】
《表２》
検体        本発明方法                      従来法
番号    涙液    鼻汁    痰            涙液    鼻汁    痰  
１      ＋＋    ＋＋    ＋＋          ＋      ＋      ＋
２      ＋      ＋      ±            ±      ±      ±
３      ＋＋    ＋      ＋＋          ＋      ＋      ＋
４      ±      ＋      ±            −      −      −
５      ＋      ＋＋    ＋＋          ＋      ＋      ＋
６      ＋＋    ＋＋    ＋＋          ＋      ＋      ＋  
【００５０】
《実施例３》
（１）金コロイド法イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
（１−１）アレルゲン固定化膜の作製
ニトロセルロース膜（ＨＦ１８０；ポアサイズ５〜８μｍ；ミリポア社製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに切断した。膜の一端（上流方向）から１５ｍｍの位置に、ダニアレルゲン抽出タンパク質水溶液（ヤケヒョウヒダニ抽出物；グリア社製）［濃度１ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈後、透析した水溶液］を幅１ｍｍの直線状に塗布した。
そのまま、室温下で１時間静置し、続いて、３７℃で３０分間静置して、ダニ抽出タンパク質を固定化した。シリカゲルデシケーター内に保存し、室温下で一夜乾燥させることにより、ダニアレルゲン固定化膜を作製した。
【００５１】
（１−２）金コロイド標識化抗ＩｇＥ抗体の調製
抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体１ｍｇを、０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（２ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）で希釈した後、透析した。続いて、金コロイド懸濁液（ＧＯＬＤ  ＣＯＬＬＯＩＤ  ２０；Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを撹拌しながら、前記抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体水溶液１０ｍＬをゆっくり滴下し、室温下で１０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ウシ血清アルブミン（Ａ−７８８８；Ｓｉｇｍａ製；以下、ＢＳＡと称する）水溶液１０ｍＬをゆっくり滴下した後、室温下で更に１０分間撹拌した。この水溶液に５％ショ糖と０．２％ツイーン２０とを含む水溶液１５ｍＬを加え、混和した後、１０℃にて１６，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。
【００５２】
沈殿した金コロイド標識化抗体を、０．５％ショ糖及び０．０２％ツイーン２０を含むボラックス緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに再懸濁し、１０℃にて１６，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識化抗体を、０．５％ショ糖及び０．０２％ツイーン２０を含むボラックス緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに再懸濁し、１０℃にて１６，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識化抗体を、０．５％ショ糖及び０．０２％ツイーン２０を含むボラックス緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した後、粒子密度が約１０13／ｍＬ（波長５２０ｎｍにおける吸光度＝約１４）になるように濃度調整し、金コロイド標識化抗ＩｇＥ抗体懸濁液とした。
【００５３】
（１−３）金コロイド標識化抗体パッドの作製
実施例３（１−２）で調製した金コロイド標識化抗ＩｇＥ抗体懸濁液を、抗体１μｇ量となるように、５．０％ショ糖を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した後、その希釈液１０μＬを５ｍｍ×５ｍｍに切断した吸収パッド（ＰＲＥＭ１４２０；ポール社製）に塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦１００ｍｍＨｇ）乾燥して、金コロイド標識化抗体パッドを作製した。
【００５４】
（１−４）試料添加パッドの作製
セルロースパッド（ＡＰ２５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、５ｍｍ×１７ｍｍのサイズに切断し、試料添加パッドとした。
【００５５】
（１−５）吸収パッドの作製
セルロースパッド（ＡＰ２５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに切断し、吸収パッドとした。
【００５６】
（１−６）イムノクロマトグラフグラフ用ストリップの作製
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流側から下流側に向かって、実施例３（１−４）で作製した試料添加パッド、実施例３（１−３）で作製した金コロイド標識化抗体パッド、実施例３（１−１）で作製したダニアレルゲン固定化膜、及び実施例３（１−５）で作製した吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ程度重ね合わせて貼付することにより、イムノクロマトグラフグラフ用ストリップを作製した。これを、イムノクロマトグラフ用ケースに入れてイムノクロマトグラフデバイスとした。
【００５７】
（２）試料の調製とイムノクロマトグラフ測定
（２−１）検体の採取
実施例１（２−２）と同様に、涙液、鼻汁、及び痰の各サンプルを採取した。
【００５８】
（２−２）測定
切断したシルメル紙先端を、実施例３（１−６）で作製したイムノクロマトグラフデバイスの検体滴下部に載せ、金コロイド標識抗体パッドと接触させた。その後、実施例１（１−５）で調製した展開液２００μＬをシルメル紙の上から滴下し、特異ＩｇＥ抗体の抽出と反応を同時に行った。２０分後にアレルゲン塗布部の金コロイドによる発色を目視検出した。
【００５９】
（２−３）測定結果
結果を表３に示す。また、更にセチルピリジニウム塩、あるいはグアニジンを添加した場合も同様の傾向が認められた。
《表３》
検体        本発明方法                      従来法
番号    涙液    鼻汁    痰            涙液    鼻汁    痰  
１      ＋＋    ＋      ＋            ＋      ＋      ＋
２      ＋      ＋      ±            ±      ±      ±
３      ＋      ＋      ＋            ＋      ＋      ＋
４      ＋＋    ＋＋    ＋            ＋      ＋      ＋
５      ＋      ＋      ±            −      −      −
６      ＋＋    ＋＋    ＋            ＋      ＋      ＋  
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、非浸襲性検体（例えば、涙液、鼻汁、又は痰）分析の用途に適用することができる。