(57)【要約】【課題】  標的細胞内に医薬品が取り込まれるのに必要な時間だけ血中に滞留し，正常細胞に対して副作用を誘発するほど長い時間の血中滞留性を有しない適切な血中滞留性を示すリポソーム製剤を提供すること。【解決手段】  リン脂質およびコレステロールから構成され，医薬品が封入され，標的細胞指向性のリガンドで誘導化されているリポソーム製剤であって，前記リポソーム製剤は，リン脂質の合計量に対して約１−１２ｍｏｌ％のジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを含み，誘導化されていないホスファチジルエタノールアミンを含まず，前記リガンドは前記ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを介してリポソーム製剤に結合されていることを特徴とするリポソーム製剤。【選択図】  図１
2006248978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質およびコレステロールから構成され，医薬品が封入され，標的細胞指向性のリガンドで誘導化されているリポソーム製剤であって，前記リポソーム製剤は，リン脂質の合計量に対して約１−１２ｍｏｌ％のジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを含み，誘導化されていないホスファチジルエタノールアミンを含まず，前記リガンドは前記ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを介してリポソーム製剤に結合されていることを特徴とするリポソーム製剤。
【請求項２】
ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンが式Ｉ：
【化１】
2006248978.tif 000006
［式中，Ｒ1およびＲ2はアシル基であり，ｍは１−１０である］
で表される，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミン中のジカルボン酸がコハク酸，グルタル酸またはアジピン酸である，請求項２記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
標的細胞指向性のリガンドがトランスフェリン，葉酸，ヒアルロン酸，糖鎖，モノクロナール抗体またはモノクロナール抗体のフラグメントから選ばれることを特徴とする，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
標的細胞指向性のリガンドがトランスフェリンである，請求項４記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
トランスフェリンが鉄と結合していないアポ型ではなく，鉄と結合しているホロ型である，請求項５記載のリポソーム製剤。
【請求項７】
ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンがリン脂質の合計量に対して約１−６ｍｏｌ％である，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項８】
標的指向性のリガンドがトランスフェリンであり，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミン中のジカルボン酸がコハク酸，グルタル酸またはアジピン酸である，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項９】
封入されている医薬品が抗癌剤である，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項１０】
封入されている医薬品が細胞毒である医薬品である，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項１１】
封入されている医薬品が，トポテカン，イリノテカンからなる群より選ばれるトポイソメラーゼ１の阻害剤である，請求項１０記載のリポソーム製剤。
【請求項１２】
封入されている医薬品が，ビンクリスチン，ビンブラスチン，ビンロイロシン，ビンロドシンビンオレルビンおよびビンデシンからなる群より選ばれるビンカアルカロイドである，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項１３】
封入されている医薬品が核酸である，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項１４】
核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである，請求項１３記載のリポソーム製剤。
【請求項１５】
封入されている医薬品が，シスプラチン，カルボプラチン，オルマプラチン，オキザリプラチン，ゼニプラチン，エンロプラチン，ロバプラチン，スピロプラチンからなる群より選ばれる白金化合物である，請求項１記載のリポソーム製剤。
【請求項１６】
白金化合物がオキザリプラチンである，請求項１５項記載のリポソーム製剤。
【請求項１７】
オキザリプラチンが，トレハロース，マルトース，ショ糖，ラクトース，マンニトール，グリセロールおよびデキストロース等の濃度数％の糖溶液に溶解してリポソーム製剤に封入されている，請求項１６項記載のリポソーム製剤。
【請求項１８】
請求項１−１７のいずれかに記載のリポソーム製剤および薬学的に許容される担体を含む，腫瘍を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，腫瘍の治療において用いられる，医薬品（化合物および遺伝子）を封入したリポソーム製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品が正常細胞に及ぼす副作用を軽減させるため，および医薬品が不安定な場合に医薬品を標的とする細胞へ輸送し，到達するまで保護するために，医薬品をリポソーム中に封入して投与することが広く行われている。
【０００３】
しかしながら，初期の頃のリポソームは，卵黄リン脂質および大豆リン脂質等の天然に存在する細胞膜のリン脂質が用いられたが，静脈内投与では肝臓，脾臓などの細網内皮系に取り込まれやすく，血中滞留性が低いことが問題であった。
【０００４】
その後，この問題を解決する手段として，リポソーム膜を硬くするために，リポソーム膜構成成分として脂質部分が飽和結合のみである合成リン脂質等が用いられ，更にリポソーム表面をポリエチレングリコールで修飾したリポソーム（ＰＥＧリポソーム）が開発され，細網内皮系回避可能な血中滞留性の高い画期的なリポソームとして脚光を浴びて来ていた。しかしながら，血中滞留性を高くすることにのみ注力するあまり，それによる副作用（例えば，ドキソルビシンのリポソーム製剤であるドキシルにおける末梢系の副作用であるハンド・フット・シンドローム等）（ドキシル添付文書）が問題視されるようになってきた。
【０００５】
リポソームは，リポソーム中への医薬品の取り込み，このようなリポソーム製剤自体の安定性，適切な血中滞留性および標的細胞への効率的な輸送の点で，更なる改良が必要である。
【特許文献１】ＵＳ４９８３３９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は，医薬品を含有する，標的細胞内に医薬品が取り込まれるのに必要な時間だけ血中に滞留し，正常細胞に対して副作用を誘発するほど長い時間の血中滞留性を有しない適切な血中滞留性を示し，標的とする細胞への薬剤の輸送効率の高いリポソーム製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は，リン脂質およびコレステロールから構成され，医薬品が封入され，標的細胞指向性のリガンドで誘導化されているリポソーム製剤であって，前記リポソーム製剤は，リン脂質の合計量に対して約１−１２ｍｏｌ％のジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを含み，誘導化されていないホスファチジルエタノールアミンを含まず，前記リガンドは前記ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを介してリポソーム製剤に結合されていることを特徴とするリポソーム製剤を提供する。
【０００８】
本発明のリポソーム製剤において，好ましくは，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンは式Ｉ：
【化２】
2006248978.tif 000003
［式中，Ｒ1およびＲ2はアシル基であり，ｍは１−１０である］
で表される。より好ましくは，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミン中のジカルボン酸は，コハク酸，グルタル酸またはアジピン酸である。
【０００９】
本発明のリポソーム製剤の別の好ましい態様においては，標的細胞指向性のリガンドは，トランスフェリン，葉酸，ヒアルロン酸，糖鎖，モノクロナール抗体またはモノクロナール抗体のフラグメントから選ばれる。より好ましくは，標的細胞指向性のリガンドはトランスフェリンである。さらに好ましくは，トランスフェリンは，鉄と結合していないアポ型ではなく，鉄と結合しているホロ型である。また別の好ましい態様においては，本発明のリポソーム製剤においては，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンはリン脂質の合計量に対して約１−６ｍｏｌ％の量で存在する。
【００１０】
本発明のリポソーム製剤の特に好ましい態様においては，標的指向性のリガンドはトランスフェリンであり，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミン中のジカルボン酸は，コハク酸，グルタル酸またはアジピン酸である。
【００１１】
また別の好ましい態様においては，本発明のリポソーム製剤に封入されている医薬品は抗癌剤であり，特に好ましくは細胞毒である。また好ましくは，封入されている医薬品は，トポテカン，イリノテカンからなる群より選ばれるトポイソメラーゼ１の阻害剤である。また好ましくは，リポソーム製剤に封入されている医薬品は，ビンクリスチン，ビンブラスチン，ビンロイロシン，ビンロドシンビンオレルビンおよびビンデシンからなる群より選ばれるビンカアルカロイドである。また好ましくは，リポソーム製剤に封入されている医薬品は核酸であり，特に好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。また好ましくは，リポソーム製剤に封入されている医薬品は，シスプラチン，カルボプラチン，オルマプラチン，オキザリプラチン，ゼニプラチン，エンロプラチン，ロバプラチン，スピロプラチンからなる群より選ばれる白金化合物であり，特に好ましくはオキザリプラチンである。
【００１２】
本発明の１つの好ましい態様においては，オキザリプラチンは，トレハロース，マルトース，ショ糖，ラクトース，マンニトール，グリセロールおよびデキストロース等の濃度数％の糖溶液に溶解してリポソーム製剤に封入されている。
【００１３】
さらに別の観点においては，本発明は上述の本発明のリポソーム製剤および薬学的に許容される担体を含む，腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のリポソーム製剤は，抗癌剤等の医薬品を含有し，保存安定性が高く，投与された場合に標的とする腫瘍細胞への薬剤の輸送効率が高く，かつ標的細胞に医薬品が取り込まれるのに必要なだけ血中に滞留し，正常細胞に対し副作用を誘発するほど長く血中に滞留性しない，適切な血中滞留性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
リポソームは，水性の内部を有する球形の脂質二重層である。リポソームを形成する時に水性溶液中に存在する分子は，水性の内部に取り込まれる。リポソームの内容物は，外部微小環境から保護され，かつ，リポソームが細胞膜と融合するため細胞質内に効率的に輸送される。
【００１６】
１つの観点においては，本発明のリポソーム製剤は，リン脂質およびコレステロールから構成され，医薬品が封入され，標的細胞指向性のリガンドで誘導化されており，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを含み，これを介して標的細胞指向性のリガンドがリポソーム製剤に結合されており，さらにホスファチジルエタノールアミンを含まないことを特徴とする。
【００１７】
リン脂質としては，ホスファチジルコリン，ホスファチジルイノシトール，スフィンゴミエリン，ホスファチジン酸等を用いることができる。さらに，脂質膜を安定化させるために，コレステロール等の脂質成分を加えることが好ましい。
【００１８】
ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンは，ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基にジカルボン酸を結合させたものであり，例えば，次式：
【化３】
2006248978.tif 000004
［式中，Ｒ1およびＲ2はアシル基であり，ｍは１−１０である］
で表されるものが含まれる。より好ましくは，ｍは１，２または３である。すなわちジカルボン酸として，コハク酸，グルタル酸またはアジピン酸を用いることが好ましい。ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンの好ましい含有量は，リン脂質の合計量に対して約１−１２ｍｏｌ％であり，より好ましくは約１−６ｍｏｌ％である。このジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを用いてリポソームを形成すると，リン脂質部分がリポソームの脂質二重膜中に安定して保持され，外表面に遊離カルボキシル基を有するリポソームが得られる。このカルボキシル基は，標的細胞指向性のリガンドをリポソームに結合するための官能基として利用可能である。さらに，本発明のリポソーム製剤は，上述のジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンに加えて，ホスファチジルグリセロール，スフィンゴシン，セラミドおよびコレステロール誘導体等をジカルボン酸で誘導化したものを含んでいてもよい。
【００１９】
本発明のリポソーム製剤は，リン脂質として遊離のホスファチジルエタノールアミンを含まないことを特徴とする。このことにより，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンへのリガンドの結合の効率をより高くすることができる。
【００２０】
さらに，本発明のリポソーム製剤は，標的細胞指向性のリガンドで誘導化されていることを特徴とする。標的細胞指向性のリガンドとは，標的とする細胞表面上に存在するレセプターまたは表面抗原と結合することができる物質をいう。標的細胞指向性のリガンドは，好ましくはトランスフェリン，葉酸，ヒアルロン酸，ガラクトース，マンノースなどの糖鎖，モノクロナール抗体またはモノクロナール抗体のＦａｂ’フラグメントである。
【００２１】
本発明の特に好ましい態様においては，標的細胞指向性のリガンドはトランスフェリンである。トランスフェリンは生体内に存在する鉄結合蛋白質であり，細胞表面上のトランスフェリンレセプターと結合して細胞内に取り込まれることにより，鉄を細胞に供給する役割を有する。トランスフェリンレセプターは，癌種を問わず正常組織に比べて発現量が高いため，薬剤をトランスフェリンと結合させることにより，トランスフェリンレセプターを介して薬剤の腫瘍細胞内への取り込みを促進することができると考えられる。
【００２２】
本発明のリポソーム製剤の１つの好ましい例は，医薬品として抗癌剤であるオキザリプラチンを含有し，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを介してリガンドで誘導化されているリポソーム製剤である。オキザリプラチン（トランス−１−１，２−ジアミノシクロヘキサンの白金（ＩＩ）シスオキサラト錯体）は，次式：
【化４】
2006248978.tif 000005
を有する白金錯体化合物である。オキザリプラチンは，シスプラチンと同等の治療活性を示し，かつ比較低い腎毒性および嘔吐性を示すため，抗腫瘍剤として有用である。オキザリプラチンの製造方法は当該技術分野において知られている（例えば，特開平９−４０６８５）。本発明のリポソーム製剤は，例えば，９％ショ糖溶液中８ｍｇ／ｍｌの濃度のオキザリプラチンを含む。
【００２３】
好ましくは，本発明のリポソーム製剤は，１−５０μｇ／ｍｇ脂質のオキザリプラチンおよび１−１５０μｇ／ｍｇ脂質のリガンドを有する。また，オキザリプラチンはトレハロース，マルトース，ショ糖，ラクトース，マンニトール，グリセロールおよびデキストロース等の糖溶液に溶解するのが好ましい。糖溶液の濃度は数％程度が好ましい。
【００２４】
本発明のリポソーム製剤は，リン脂質を適切な有機溶媒中に溶解し，これを薬剤を含有する水性溶液中に分散させて超音波処理または逆相蒸発法を行うことにより製造することができる。非限定的例としては，逆相蒸発法（ＲＥＶ法）を用いて製造することができる（米国特許４，２３５，８７１号）。勿論，単純水和法やエタノール注入法等の一般的なリポソーム作成法をも用いることが出来る。ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを脂質二重層中に安定して保持させるためには，あらかじめジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを調製し，これをリン脂質およびコレステロールと共に用いてリポソームを調製することが好ましい。ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンは，非限定的例としては，例えば，米国特許４，５３４，８９９号に記載のようにして調製することができる。簡単には，ジカルボン酸の無水物をホスファチジルエタノール等のリン脂質と反応させて，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを得る。
【００２５】
非限定的例としては，リン脂質（例えばジステアロイルホスファチジルコリン），脂質
（例えばコレステロール）およびジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンを混合し，適切な有機溶媒中に溶解する。リン脂質と脂質との混合比率は，２：１である。ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンの混合比率は，リン脂質に対して６％である。次にこの溶液をオキザリプラチンの水性緩衝液中の溶液と混合する。オキザリプラチンの水溶液中の濃度は８ｍｇ／ｍｌの濃度の９％ショ糖溶液である。この溶媒混合物を超音波処理した後，溶媒を蒸発させる。次に，形成されたリポソームをサイズ分画して，約０．２ミクロンの直径を有するオキザリプラチン含有リポソームを調製することができる。リポソーム液を濃縮するために限外濾過を使用する。
【００２６】
次に，このリポソームの外表面にリガンドを結合させる。非限定的例として，リガンドとしてトランスフェリンを用いる場合，トランスフェリンは精製された蛋白質として市販されている。勿論，遺伝子組み換え体を使用しても良い。リポソームの外表面にトランスフェリンを結合させるためには，ジカルボン酸誘導化ホスファチジルエタノールアミンの末端カルボキシル基を利用する。これに，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）を結合させる。次に，このリンカーを付加したリポソームをトランスフェリンと反応させると，外表面にトランスフェリンが結合したアポ型のトランスフェリン結合リポソームを得ることができる。これを，クエン酸鉄−クエン酸ナトリウムで処理して，ホロ型のトランスフェリン結合リポソームを得る。勿論，最初からホロ型のトランスフェリンを使用しても良い（図１）。
【００２７】
別の観点においては，医薬品が兼ね備えるべき要件として，有効性，安全性および品質の確保の３つがある。いかに薬効に優れ，安全性が確認された医薬品であろうとも，実際に製造され，流通するとき一定の品質を保つことが出来ないのであれば，その医薬品は医薬品としての存在意義が失われることはもとより，むしろ有害な事態を惹起することになると考えられる。
【００２８】
このように医薬品において品質の確保は極めて重要なものの一つであり，規格および試験方法はそれを規定するものとして重要視される。したがって，承認審査の際，規格および試験方法は厳重に審査され，また，承認後製造される医薬品の品質は承認された内容と完全に合致することが法的に義務づけられている。
【００２９】
医薬品を承認申請する際には，試験方法すなわち分析法バリデーションに関するテキスト（実施項目）およびこれを補完するための分析法バリデーションに関するテキスト（実施方法）を参考にした分析法バリデーションに関する資料を合わせて当該申請資料に添付することとなっている。
【００３０】
このように分析法は非常に重要であるので，実施例８に示したように，分析定量方法が簡単になることの意義は大変に大きい。
【００３１】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明のリポソーム製剤および薬学的に許容される担体を含む，腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。担体としては，滅菌水，緩衝液および食塩水を用いることができる。医薬組成物は，さらに，種々の塩類，糖類，蛋白質，澱粉，ゼラチン，植物油およびポリエチレングリコール等を含んでいてもよい。本発明の組成物は，ボーラス注射または連続注入により非経口的に投与することができる。投与量は，投与経路，症状の重篤度，患者の年齢および状態，副作用の程度等により様々でありうるが，一般に，１０−１００ｍｇ／ｍ2／日の範囲である。
【００３２】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。
【実施例１】
【００３３】
オキザリプラチンの細胞毒性試験
オキザリプラチン（ｌ−ＯＨＰ）溶液は，オキザリプラチンを９％ショ糖溶液に８ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより調製した。細胞生存率の測定には，市販の細胞毒性アッセイキットを用いた。１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養したＡｓＰＣ−１細胞を，種々の濃度のｌ−ＯＨＰ溶液で，３７℃，５％ＣＯ2で４８時間処理した。次に培地を除去し，基質を加えて，３７℃，５％ＣＯ2で２時間呈色させ，４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００３４】
結果を図２に示す。ｌ−ＯＨＰの細胞毒性はＬＤ５０＞８μｇ／ｍｌであった。
【実施例２】
【００３５】
オキザリプラチン含有リポソーム製剤の製造
リポソームの組成は以下のとおりである：
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）
コレステロール（ＣＨ）
Ｎ−グルタリル−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
（ＤＳＰＥ−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨ；以下，ＮＧ―ＤＳＰＥと表す）
ＤＳＰＣ：ＣＨ：ＮＧ−ＤＳＰＥ＝２：１：０．２（ｍ／ｍ）
水相としては，ｌ−ＯＨＰ溶液（８ｍｇ／ｍｌ，９％ショ糖溶液中）を用いた。
【００３６】
ＤＳＰＣ，コレステロール，ＮＧ−ＤＳＰＥの２：１：０．２（ｍ／ｍ）混合物をクロロホルムおよびイソプロピルエーテルに溶解した。これにｌ−ＯＨＰ溶液（９％ショ糖溶液中）を加えて超音波処理した。６０℃で溶媒を蒸発させ，凍結融解を５回繰り返した。次にＥＸＴＲＵＤＥＲフィルターを用いて６０℃でサイジング（４００ｎｍで２回，次に１００ｎｍで５回）した後，限外濾過した。９％ショ糖溶液またはＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）に置換して，ｌ−ＯＨＰ封入ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームを得た。
【００３７】
次に，ＮＧ―ＤＳＰＥリポソームをトランスフェリン（Ｔｆ）で誘導化した。上述のように調製したｌ−ＯＨＰ封入ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームに，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）（脂質重量の２．７％）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）（脂質重量の７．３％）を加え，室温で１０分間放置した。次に，トランスフェリン（Ｔｆ）（脂質重量の２０％）を加えて，室温で３時間撹拌した。脱塩膜を使用して脱塩し，その後限外濾過した。９％ショ糖溶液に置換した。
【００３８】
このようにして得たアポ型Ｔｆ−ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームにクエン酸鉄−クエン酸ナトリウムを加え，室温で１５分間撹拌した。これを限外濾過した。９％ショ糖溶液に置換して，ホロ型Ｔｆ−ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームを得た。以後，このリポソームをＴｆ−ＮＧ−ＤＳＰＥリポソーム（４２６）と称する。
【００３９】
また，ＰＥＧで誘導化したリポソームを同様の方法により作成した。
Ｔｆ−ＰＥＧ―ＤＳＰＥリポソーム（３２４）
DSPC：コレステロール：DSPE-PEG(2K)-OMe：DSPE-PEG(3.4K)-COOH＝
2：1：0.16：0.03
このリポソームは，PEG脂質として6mol%，PEG-COOH脂質として1mol%を含有しており，ＴｆはPEG-COOHを介してリポソームに結合している。
Ｔｆ／ＰＥＧ―ＤＳＰＥリポソーム（４２７）
DSPC：コレステロール：DSPE-PEG(2K)-OMe：NG-DSPE＝2：1：0.16：0.03
このリポソームはPEGで誘導化されており，ＴｆはNG-DSPEを介してリポソームに結合している。
【実施例３】
【００４０】
細胞表面のトランスフェリンレセプターの数の測定
細胞としては，ヒト正常白血球およびヒト悪性腫瘍由来の細胞株（Ｋ５６２，ＭＫＮ４５ＰおよびＨＬ６０）を用い，細胞の表面にあるＴｆレセプター数をスキャッチャード解析により行った。４℃において，125Ｉ標識したＴｆ溶液を種々の濃度で細胞の培養液中に添加し，１時間インキュベートした。Ｔｆの濃度は蛋白質定量により求め，同時にγカウンターで放射活性を測定した。遠心分離により細胞を沈降させ，細胞画分を氷冷したバッファーで洗浄し，γカウンターで測定し，結合濃度を求めた。同時に，蛋白質定量により細胞数を求めた。既知の添加濃度より，結合濃度を差し引いて遊離型濃度を求めた。スキャッチャードプロット，つまり横軸に結合濃度，縦軸に結合濃度／遊離型濃度の比をプロットし，ｘ切片より結合数（レセプター数）を求めた。それぞれの細胞の表面に結合した125Ｉ−Ｔｆの量を図３に示す。すなわち，正常白血球と比較して，ヒト悪性腫瘍由来の細胞においては，細胞表面に存在するトランスフェリンレセプターの数が有意に多いことが認められた。
【実施例４】
【００４１】
担癌マウスにおけるｌ−ＯＨＰ内封Ｔｆ修飾リポソーム製剤の血中滞留性および臓器移行性について比較検討した。５週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い，腫瘍細胞としてはＣｏｌｏｎ２６細胞（マウス大腸癌由来）を用いた。
【００４２】
インビトロで継代・培養したＣｏｌｏｎ２６細胞（２ｘ１０6セル）をマウスの背部皮下に移植した。腫瘍径が約８〜１０ｍｍ（平均的に８〜１０日後）に達したものをＣｏｌｏｎ担癌マウスとして用いた。実施例２で作成した各リポソームまたはｌ−ＯＨＰ溶液（８ｍｇ／ｍｌ，９％ショ糖溶液中）を尾静脈注射した。オキザリプラチンの濃度はいずれも５ｍｇｌ−ＯＨＰ／ｋｇ体重に調節した。リポソームとしては，Ｔｆ−ＮＧ―ＤＳＰＥリポソーム（４２６），Ｔｆ−ＰＥＧ―ＤＳＰＥリポソーム（３２４）およびＴｆ／ＰＥＧ―ＤＳＰＥリポソーム（４２７）を用いた。
【００４３】
採血および採材部位は，血液，血漿，肝臓，脾臓，腎臓，心臓，肺および癌組織とした。採血および採材時間は投与後，１，３，６，２４，４８，７２時間とし，例数は各時間３例とした。得られた血液，各臓器および癌組織中のＰｔ濃度をＩＰ−ＭＡＳＳを用いて測定し，ｌ−ＯＨＰ濃度を算出し，投与量に対する％で示す。血液中の濃度を図４に示す。Ｔｆ−ＮＧ―ＤＳＰＥ−リポソーム（４２６）は，３時間まではＴｆ−ＰＥＧ―ＤＳＰＥリポソーム（３２４）およびＴｆ／ＰＥＧ―ＤＳＰＥリポソーム（４２７）と比較して同等程度の血中滞留性を示すが，６時間値以降は血中滞留性は示すもののＰＥＧリポソームと比較すると血中からの消失が早い。一方，癌組織中の濃度を図５に示す。Ｔｆ−ＮＧ―ＤＳＰＥ−リポソーム（４２６）は，Ｔｆ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥリポソーム（３２４）およびＴｆ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥリポソーム（４２７）と同等程度の癌組織への移行を示す。
【００４４】
以上の結果から，マウスにおいて，癌組織中へ移行した医薬品の濃度を有意である程度以上にするためには，血中滞留性は投与後から６時間程度の血中滞留性が必要であり，かつ十分であることが判明した。これ以上長い血中滞留性は，正常細胞に対する副作用を引き起こす可能性が高くなると考えられる。
【実施例５】
【００４５】
ｌ−ＯＨＰ内封Ｔｆ修飾リポソーム製剤（４２６，３２４および４２７：（＋）ＴＦ；各９匹）ならびにトランスフェリンが結合されていないそれぞれのリポソーム（（―）ＴＦ；各６匹）について，大腸がんＣｏｌｏｎ２６担癌マウスに対する抗腫瘍性を比較検討した。担癌マウスは，実施例４と同様に準備した。対照としては，ｌ−ＯＨＰ溶液（８ｍｇ／ｍｌ，９％ショ糖溶液中）を用いた。ｌ−ＯＨＰ５ｍｇ／ｋｇを投与した日を開始日とし，４日後にｌ−ＯＨＰ５ｍｇ／ｋｇを再び投与した。０日の腫瘍の大きさを１として，それに対する比で示した。０，２，５，７，１０，１３，１５，１８，２１日に腫瘍の大きさを測定し生存日数を数えた。
【００４６】
結果を図６に示す。トランスフェリンが結合したリポソーム製剤は腫瘍増殖抑制を示した。これに対し，トランスフェリンが結合していないリポソーム製剤は，トランスフェリンが結合したものに比べて腫瘍増殖抑制効果が弱い。実施例４および実施例５の結果から，腫瘍増殖抑制効果を有し，かつ腫瘍組織へ移行した医薬品の濃度が有意で同等程度にするためには，トランスフェリンが結合したリポソームは投与後から６時間程度の血中滞留性が必要であり，かつ十分であることが判明した。これ以上長い血中滞留性は正常細胞に対する副作用を引き起こす可能性が高くなると考えられる。
【実施例６】
【００４７】
リポソームを構成するＮＧ−ＤＳＰＥの最適配合比を決定するために，正常マウスにおいて，抗癌剤未封入ＮＧ−ＤＳＰＥの血中滞留性について検討した。抗癌剤未封入のリポソームは，水相としてｌ−ＯＨＰ溶液の代わりに水を用いて，種々のＮＧＰＥ含有量で，実施例２と同様にして作製した。ＮＧＰＥの含有量は，リポソームを構成する全脂質組成の総ｍｏｌ量を１００％とした時の，ＮＧＰＥが全脂質組成に占める割合（ｍｏｌ％）で示す。また，構成脂質としてＭＰＢ脂質またはＰＤＰ脂質を各６ｍｏｌ％含むリポソームも作製した。ＭＰＢリポソームは，脂質のエタノールアミンのアミノ基にマレイミドフェニルブチレート（ＭＰＢ）を結合させてリポソームを形成し，ＭＰＢを介してリポソームにＴｆを結合させたものである。ＰＤＰリポソームは，脂質のエタノールアミンのアミノ基に（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＰＤＰ）を結合させてリポソームを形成し，ＰＤＰを介してリポソームにＴｆを結合させたものである。
【００４８】
実験には，マウス（ＩＣＲ雄，６週齢）を用いた。トレーサーとして125Ｉをチラミニルイヌリンと結合させ，各組成のリポソームにこのイヌリン溶液を内封させた。採取した血液および摘出臓器の全例について重量を測定後，γカウンター（アロカ・オート・ガンマシステム，エイアールシ−３００）を用いてリポソームマーカの放射能活性（単位：ｃｐｍ）を定量した。また，各投与液（１００μｌ）および尾の放射活性を定量する。投与液１００μｌ（スタンダード：Ｓｔｄ．）の放射活性を１００％として，各臓器あたりの値を％換算（％  オブ  投与量）して表示した。血中リポソーム量は，体重の７．３％を全血量と想定し，全血量に換算して算出した。空の測定チューブのカウント値をバックグラウンド（ｂ．ｇ．）値として，各々のカウント値より差し引いた。
血液中の分布量（％）
＝（血液のカウント値―ｂ．ｇ．値）×マウス体重（ｇ）×０．０７３×１００／｛（Ｓｔｄ．のカウント値―尾のカウント値）×血液重量（ｇ）｝
【００４９】
結果を図７に示す。６時間後の血中での濃度を見ると，ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームは脂質の含有量が３ｍｏｌ％以上で高い血中滞留性を示している。マレイミドリポソーム（ＭＢＰ６％）では，血中滞留性が低かった。
【実施例７】
【００５０】
トランスフェリン結合の有る無し，およびジカルボン酸の種類の影響を検討するために，正常マウスにおける抗癌剤未封入トランスフェリン結合リポソームの血中滞留性を調べた。実験方法は実施例６と同様である。
【００５１】
グルタル酸の代わりにコハク酸を結合させたリン脂質を含むリポソームを作製した。ＮＧ−ＤＳＰＥは以下のようにして製造した。遮光並びに窒素気流下で，ＤＳＰＥをＤＳＰＥの１０倍容量の脱水クロロホルムに懸濁させ，トリエチルアミンを１．３当量加え，室温下で無水グルタル酸の脱水クロロホルム溶液（ＤＳＰＥの１倍容量の脱水クロロホルムに溶解）を滴下した。滴下終了後，３０℃で２時間攪拌して反応させた。その後，酢酸バッファ（ｐＨ４．５）で反応液を３回程度洗浄し，有機層を硫酸マグネシウムで脱水後ろ過し，ろ液を３０℃で減圧濃縮した。オイル状（ＤＳＰＥの２倍容量程度）になった時点で，メタノールを加えて，晶析させ，ろ取した。これを再度クロロホルムに溶解させ，この操作を２回程度繰り返してから，室温で減圧乾燥して，目的物を白色結晶として得た。ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームは実施例２と同様の方法により作製した。
【００５２】
結果を図８に示す。ジカルボン酸を介してトランスフェリンが結合しているリポソーム（ＮＧ−ＤＳＰＥ：Ｎ−グルタリルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン，ＮＳ−ＤＳＰＥ：Ｎ−サクシニルジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）では，高い血中滞留性を示すが，マレイミドによるＳ−Ｓ結合を介してトランスフェリンが結合しているリポソーム（ＭＰＢ）の場合，同じリガンドであるトランスフェリンを結合していても血中滞留性は低かった。
【実施例８】
【００５３】
分析方法の一例として，電気泳動の一例を示す。７．５％から１０％程度のポリアクリルアミドゲル（フナコシ，EASY-GEL（II）プリキャスト・ゲル）を用いて，サンプル各５μｌを穴に準備し，２０ｍＡの定電流下で泳動を１〜２時間行った。泳動終了後，銀染色キット（和光純薬，銀染色IIキットワコー）を用いてゲルを銀染色した。結果を図９に示す。本発明の一例であるトランスフェリン−Ｎ−グルタリル−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−リポソーム（Ｔｆ−ＮＧ−ＤＳＰＥリポソーム）（４２６）および比較例としてトランスフェリン−ポリエチレングリコールージステアロイルホスファチジルエタノールアミン−リポソーム（Ｔｆ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥリポソーム）（３２４）を示す。比較例の３２４の場合は，ポリエチレングリコールが分子量分布を有するために，帯が何本も連なる複雑な泳動像となるのに対して，本発明の一例である４２６では，一本の帯となった。すなわち，本発明にしたがうリポソーム製剤は，ＰＥＧ誘導化リポソーム製剤と比較して，分析定量法が簡単である。
【実施例９】
【００５４】
リポソーム中の遊離のホスファチジルエタノールアミンの存在の影響を検討するために，Ｔｆ−ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームと，ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を加えて製造したリポソームについて，Ｔｆの結合能力を調べた。Ｔｆ−ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームは，ＤＳＰＣ（６４部），ＣＨ（３２部）およびＮＧ−ＤＳＰＥ（４部）から，Ｔｆ−ＮＧ−ＤＳＰＥ＋ＤＳＰＥリポソームは，ＤＳＰＣ（６４部），ＣＨ（３２部），ＮＧ−ＤＳＰＥ（４部）およびＤＳＰＥ（１０部）から，それぞれ実施例２と同様にして製造した。次に，ＮＧ−ＤＳＰＥに対して，１０当量のＮＨＳおよびＥＣＤ・ＨＣｌおよび０．０５当量のＴｆを用いてＴｆを結合させた後，脂質１ｍｇに相当する量のリポソームのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，銀染色により可視化した。
【００５５】
結果を図１０に示す。ＮＧ−ＤＳＰＥリポソームと比較して，１０ｍｏｌ％のＤＳＰＥを添加したＮＧ−ＤＳＰＥ＋ＤＳＰＥリポソームは，Ｔｆの結合量が著しく低いことがわかった。これは，ＮＧ−ＤＳＰＥのカルボキシル基にＴｆを結合させる反応の際に，Ｔｆのアミノ基とＤＳＰＥのアミノ基とが競合するためであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は，本発明のリポソームの製造方法を示す。
【図２】図２は，オキザリプラチンの細胞毒性を示す。
【図３】図３は，正常白血球および腫瘍由来細胞株の細胞表面に存在するトランスフェリンレセプターの数を示す。
【図４】図４は，本発明のリポソームの血液中の濃度を示す。
【図５】図５は，本発明のリポソームの癌組織中の濃度を示す。
【図６】図６は，本発明のリポソームの腫瘍増殖抑制効果を示す。
【図７】図７は，本発明のリポソームの血中滞留性を示す。
【図８】図８は，本発明のリポソームの血中滞留性を示す。
【図９】図９は，本発明のリポソームの電気泳動による分析例を示す。
【図１０】図１０は，本発明のリポソームのトランスフェリン結合能を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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