(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプトン量を１．０〜１０．０ｇ／Ｌの範囲と通常用いられている量以下とし、更にキシロースおよびアラビノース、またはマルトース、およびアミノ酸を含有させることにより、一枚の平板で、サルモネラ・エンテリティディスを他菌種と区別し、分離・検出が可能となる。従って、検体中のサルモネラ・エンテリティディスを、特殊な技術や熟練を必要とせず、短時間にかつ容易に検出することができる特定の培地組成物を提供する。【解決手段】硫化水素産生能を利用して黒色コロニーの有無を鑑別する培地中に、キシロースおよびアラビノース、またはマルトース、アミノ酸、およびペプトン１．０〜１０．０ｇ／Ｌを含有することを特徴とするサルモネラ・エンテリティディス分離用培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫化水素産生能を利用して黒色コロニーの有無を鑑別する培地中に、キシロースおよびアラビノース、またはマルトース、アミノ酸、およびペプトン１．０〜１０．０ｇ／Ｌを含有することを特徴とするサルモネラ・エンテリティディス分離用培地。
【請求項２】
キシロースの含有量が０．０５〜８．０ｇ／Ｌであり、アラビノースの含有量が０．００５〜７．０ｇ／Ｌであり、マルトースの含有量が０．５〜２０．０ｇ／Lである請求項１記載の培地。
【請求項３】
アミノ酸がリジンおよび／またはオルニチン、またはそれらの塩類である請求項１記載の培地。
【請求項４】
リジンの含有量が１．０〜２０．０ｇ／Ｌであり、オルニチンの含有量が０．５〜１５．０ｇ／Ｌである請求項３記載の培地。
【請求項５】
請求項１〜４記載の分離用培地に被検体を接種して培養した後、該培地上の黒色コロニーの有無を検出することを特徴とするサルモネラ・エンテリティディスの検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒の原因菌であるサルモネラ・エンテリティディス分離用培地に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ属菌は、大腸菌と同じ腸内細菌科に属し、グラム陰性、通性嫌気性の無芽胞桿菌である。サルモネラによる食中毒は、サルモネラに汚染された食肉、牛乳、卵およびこれらの加工食品を摂取し、腸管内で増殖することによって起こる感染型食中毒で、サルモネラ食中毒は増加の傾向にあるとされている。
【０００３】
従来、サルモネラの検出法としては、サルモネラがチオ硫酸塩含有培地（ＴＳＩ培地）において硫化水素を産生する性質を利用し、培地中に第二鉄イオンを含有せしめておき、硫化水素と第二鉄イオンとの反応により硫化鉄を生成させ、コロニーの黒色化の有無を観察する方法が汎用されていた(例えば、非特許文献１参照)。
【０００４】
しかしながら、この方法では、検体の前増菌培養、増菌培養、分離培養による推定試験のほかに、生化学的分類法および免疫学的判定法による確認試験を必要とし、検体中のサルモネラ菌を同定するまでには極めて長い時間、労力、熟練を要するものであった。
【０００５】
殊に分離培養による推定試験では、培地成分とサルモネラ菌との作用で中心部が黒色で周縁部が半透明の定型的コロニーを生じるが、サルモネラ菌以外にこのコロニーの特徴を有する細菌類も多く、この段階でサルモネラ菌を同定することは困難であった。
【０００６】
この問題を解決するため、検体成分を含硫アミノ酸および第二鉄イオンを含む寒天培地で培養して、培地上に中心部が黒色で周縁部が半透明のコロニーを形成し、かつ集落裏側における培地表面において黒色の痕跡を検出するサルモネラ菌の簡易検出法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
上記のサルモネラ分離用培地としては、ＭＬＣＢ寒天培地が広く使用されている。
しかしながら、従来のＭＬＣＢ寒天培地を用いたサルモネラ検出法では、サイトロバクターに代表される他の硫化水素産生菌との鑑別ができないと言う問題があった。
【０００８】
このため、チオ硫酸塩および第二鉄イオンを含有する培地に、サルモネラによって分解されずサイトロバクターによって分解されて酸を生成しうる糖類を０．１〜３．０重量％の範囲で含有させたサルモネラ分離用培地が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００９】
この培地は、サルモネラによっては分解されず、サイトロバクターによって分解されて酸を生成しうる糖類を一定量添加して用いれば、サイトロバクターは硫化水素を産生するが、同時に糖類を分解して酸を生成するための培地のｐＨが低下して硫化水素と第二鉄イオンとの反応が進行しないため、黒色のコロニーをつくらないことから、サルモネラが選択的に検出できるようにしたものである。
【００１０】
一方、本発明者らは、硫化鉄の産生による黒色集落の有無によりサルモネラを鑑別する培地において、グリセリンを含有させたサルモネラの分離用培地を提案している（例えば、特許文献３参照、特許文献４参照）。
この培地は、グリセリンを添加すると、サルモネラ以外の硫化水素産生菌による硫化水素の産生が抑制され、結果としてサルモネラのみが培地上で硫化水素を産生するようにしたものである。
【００１１】
また、本発明者は、硫化鉄の産生によるサルモネラの黒色集落をより黒色に発色させる物質（例えば、リジンまたはその塩）と、赤痢菌が非分解性の糖（例えば、キシロース）とを含有するサルモネラ・シゲラ検出用培地を既に提案している（例えば、特許文献５参照）。
【００１２】
【非特許文献１】食品衛生検査指針((社)日本食品衛生協会編)
【特許文献１】特開平６−２２７９１号公報
【特許文献２】特開平６−６２８３３号公報
【特許文献３】特開２０００−１１６３９５号公報
【特許文献４】特開２００２−２５３２１６号公報
【特許文献５】特開２００２−３３５９９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記培地ではサルモネラ・シゲラについては、確かに検出できるものの、サルモネラ・エンテリティディスについては、未だ検出することができず、他のサルモネラと区別して分離・検出できる培地の開発が強く望まれている。
従って本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、サルモネラ・エンテリティディスを確実に検出することのできるサルモネラ・エンテリティディス分離用培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、ペプトン量を１．０〜１０．０ｇ／Ｌの範囲とし、更にキシロースおよびアラビノース、またはマルトース、およびアミノ酸を含有させることにより、サルモネラ・エンテリティディスのみを簡易かつ確実に分離・検出できることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明は、下記のような構成からなるものである。
（１）硫化水素産生能を利用して黒色コロニーの有無を鑑別する培地中に、キシロースおよびアラビノース、またはマルトース、アミノ酸、およびペプトン１．０〜１０．０ｇ／Ｌを含有することを特徴とするサルモネラ・エンテリティディス分離用培地。
（２）キシロースの含有量が０．０５〜８．０ｇ／Ｌであり、アラビノースの含有量が０．００５〜７．０ｇ／Ｌであり、マルトースの含有量が０．５〜２０．０ｇ／Ｌである（１）記載の培地。
（３）アミノ酸がリジンおよび／またはオルニチン、またはそれらの塩類である（１）記載の培地。
（４）リジンの含有量が１．０〜２０．０ｇ／Ｌであり、オルニチンの含有量が０．５〜１５．０ｇ／Ｌである（３）記載の培地。
（５）（１）〜（４）記載の分離用培地に被検体を接種して培養した後、該培地上の黒色コロニーの有無を検出することを特徴とするサルモネラ・エンテリティディスの検出法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ペプトン量を１．０〜１０．０ｇ／Ｌの範囲と通常用いられている量以下とし、更にキシロースおよびアラビノース、またはマルトース、およびアミノ酸を含有させることにより、一枚の平板で、サルモネラ・エンテリティディスを他菌種と区別し、分離・検出が可能となる。従って本発明によれば、検体中のサルモネラ・エンテリティディスを、特殊な技術や熟練を必要とせず、短時間にかつ容易に検出することができる特定の培地組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明のサルモネラ・エンテリティディス分離用培地の特徴は、培地中にペプトンを１．０〜１０．０ｇ／Ｌ、好ましくは３．０〜７．０ｇ／Ｌ、最も好ましくは５．０ｇ／Ｌで含有させることにある。
【００１８】
従来の培地では、ペプトン量が通常１５〜２２ｇ／Ｌの範囲にあったため、ペプトンの分解からｐＨが高くなり、どのような種類の糖を添加しても、培地がアルカリ性になり、サルモネラ以外にサイトロバクターも黒色のコロニーを形成する。
そのため、本発明においては、ペプトン量を１．０〜１０．０ｇ／Ｌ程度に減らし、キシロースおよびアラビノース、またはマルトースを添加することでｐＨを低下させ、さらにアミノ酸を添加することで、サイトロバクターの黒色形成を抑制し、サルモネラ・エンテリティディスのみに黒色を形成させることができる。
【００１９】
本発明においては、糖としてキシロースおよびアラビノース、またはマルトースを含有させる。キシロース、アラビノース、マルトースのいずれも、サイトロバクターが分解して桃色のコロニーを形成する。このキシロースの含有量は０．０５〜８．０ｇ／Ｌであることが好ましく、アラビノースの含有量は０．００５〜７．０ｇ／Ｌであることが好ましく、マルトースの含有量は０．５〜２０．０ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００２０】
サルモネラ・エンテリティディスもキシロース、アラビノースまたはマルトースを分解して僅かに桃色コロニーを形成するものがあり、サイトロバクターと区別が付かない場合がある。そのため、本発明においては、キシロース、アラビノースまたはマルトースを分解しても極端に酸性にならなようにアミノ酸を添加する。このアミノ酸としては、リジンおよび／またはオルニチン、またはそれらの塩類が好適である。また、リジンの含有量は１．０〜２０．０ｇ／Ｌであることが好ましく、オルニチンの含有量は０．５〜１５．０ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００２１】
本発明は、サルモネラ・エンテリティディスの有する硫化水素産生能を利用して、黒色コロニーの有無によりサルモネラ・エンテリティディスを検出することを原理としている。本発明は、この硫化水素産生能を確認できる培地として従来から用いられているもの、例えば、ＴＳＩ培地、ＳＳ寒天培地、ＳＳ−ＳＢ寒天培地、ＤＨＬ寒天培地、マカライトグリーン寒天培地、ＸＬＤ寒天培地、ＭＬＣＢ寒天培地などに応用可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２３】
実施例１．本培地の作製
表１に示した本培地、および対照として表２に示した市販の白糖加ＳＳＳ培地（栄研化学社製）に精製水を加えて全量を１０００ｍＬとし、１００℃で３０分間加温溶解した。５０〜５６℃に冷却後、２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。固化後、３０分間乾燥させた。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
【表２】
2006020629.tif 000003
【００２６】
実施例２．本培地におけるサルモネラ・エンテリティディスの発育
実施例１で作製した本培地および対照培地に表３記載の菌種を接種し、３７℃で１８時間培養し、コロニーの発育状況を調べた。その結果を表３に示す。尚、検体として１０４ＣＦＵ／ｍＬの各菌液５μＬを各培地に接種した。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
表３の結果からも明らかなように、本発明のサルモネラ・エンテリティディス分離用培地では、サルモネラ・エンテリティディスのコロニーにのみ黒色が見られ、サイトロバクターは全て桃色に呈色したことが判る。これに対し、従来品である白糖加ＳＳＳ培地では、サイトロバクターに黒色と桃色のコロニーが観察された。
【００２９】
実施例３．本培地と従来品との比較
実施例２で用いた対照培地である白糖加ＳＳＳ培地に代えて従来品であるＸＬＤ培地としてＡ社製品（栄研化学社製の商品名：ＸＬＤ寒天培地‘栄研’）、Ｂ社製品(ベクトン ディッキンソン社製の商品名：ＸＬＤ Ａｇａｒ）、Ｃ社製品（日本製薬社製の商品名：ＸＬＤ寒天培地「ダイゴ」)をそれぞれ用いた以外は、実施例２と全く同様な方法でサルモネラ・エンテリティディスの発育を調べた。
【００３０】
【表４】
2006020629.tif 000005
【００３１】
表４の結果からも明らかなように、本発明のサルモネラ・エンテリティディス分離用培地では、サルモネラ・エンテリティディスのコロニーにのみ黒色が見られ、サイトロバクターは全て桃色に呈色したことが判る。従って、本発明品によれば、サルモネラ・エンテリティディスと、サイトロバクターを精度良く区別することができる。
これに対し、従来品であるＸＬＤ培地では、いずれもサイトロバクターに黒色と黄色のコロニーが観察され、白糖加ＳＳＳ培地を用いた場合と同様にサルモネラ・エンテリティディスとサイトロバクターを区別することができなかった。
【００３２】
実施例４．本培地とサルモネラ・シゲラ培地との比較
実施例２で用いた対照培地である白糖加ＳＳＳ培地に代えてサルモネラ・シゲラ培地を用いた以外は、実施例２と全く同様な方法でサルモネラ・エンテリティディスの発育を調べた。
【００３３】
【表５】
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【００３４】
表５の結果からも明らかなように、本発明のサルモネラ・エンテリティディス分離用培地では、サルモネラ・エンテリティディスのコロニーにのみ黒色が見られ、サイトロバクターは全て桃色に呈色したことが判る。
これに対し、サルモネラ・シゲラ培地では、サルモネラ・エンテリティディスにも桃色が見られ、サルモネラ・エンテリティディスとサイトロバクターを区別することができなかった。
【００３５】
実施例５．マルトースを用いた場合の効果
実施例１で示した本培地で用いたL-アラビノースおよびD-キシロースに代えてマルトースを用いた以外は、実施例２と全く同様な方法でサルモネラ・エンテリティディスの発育を調べた。
【００３６】
【表６】
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【００３７】
表６の結果からも明らかなように、本発明のサルモネラ・エンテリティディス分離用培地では、サルモネラ・エンテリティディスのコロニーにのみ黒色が見られ、サイトロバクターは桃色に呈色したことが判る。従って本培地の成分としてマルトースを用いることでサルモネラ・エンテリティディスとサイトロバクターを区別することができる。
【００３８】
比較例
実施例１で作製した本培地からＤ−キシロースのみを除いたもの（Ｌ−アラビノースのみ添加）、Ｌ−アラビノースのみを除いたもの（Ｄ−キシロースのみ添加）、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースの両者を除いたもの（両方なし）を作製し、表３記載の菌種を接種し、３７℃で１８時間培養し、コロニーの発育状況を調べた。その結果を表７に示す。
【００３９】
【表７】
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【００４０】
表７の結果からも明らかなように、本培地からＤ−キシロースのみを除いたもの、Ｌ−アラビノースのみを除いたもの、Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースの両者を除いたものは、サイトロバクターに黒色と桃色のコロニーが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、検体中のサルモネラ・エンテリティディスを、特殊な技術や熟練を必要とせず、短時間にかつ容易に検出することができる。