(57)【要約】      （修正有）【課題】成長中の核酸鎖をより少ない量の試薬にしか曝露せず且つ少ないステップ数にてターゲットとなるポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。【解決手段】構造を準備するステップ；〔式中、Ｒ１は置換カルボニル、置換シラン、及び官能基（カーボネート、エステル、アミド、カルバメート、シラン、シロキサン、オルトエステル、アセタール、及びケタールから選択される）であり；Ｒ２はベンジル、置換ベンジル、フェニル、置換フェニル、第三級アルキル、及び置換第三級アルキルから選択され；Ｂはプリン塩基、ピリミジン塩基、及びこれらの類似体を含み；ｎは１〜３５０であり；●は基材である〕；及びｐＨ約６〜１０において酸化剤及び求核試薬として作用する水性緩衝液中で構造を同時に酸化及び脱保護するステップとを包含する。【選択図】図３
2006306873.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを形成する方法であって、
以下の式から選択される構造Ｘを設けること
【化１】
2006306873.tif 000005
〔式中、Ｒ１は置換カルボニル、置換シラン、及び官能基から選択され、ここで前記官能基はカーボネート、エステル、アミド、カルバメート、シラン、シロキサン、オルトエステル、アセタール、及びケタールから選択されるものであり；Ｒ２はベンジル、置換ベンジル、フェニル、置換フェニル、第三級アルキル、及び置換第三級アルキルから選択され；Ｂはプリン塩基、ピリミジン塩基、及びこれらの類似体を含み；ｎは１〜３５０であり；●は基質である〕；及び
構造Ｘを水性緩衝液中において同時に酸化及び脱保護することであって、前記水性緩衝液がｐＨ約６〜１０にて酸化剤及び求核試薬を含む、酸化及び脱保護すること、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記水性緩衝液が、過酸化水素、過酸、過ギ酸、過酢酸、過安息香酸、クロロ過安息香酸、ヒドロペルオキシド、ブチルヒドロペルオキシド、ベンジルヒドロペルオキシド、フェニルヒドロペルオキシド、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水性緩衝液が、過酸化水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１が、オキシカーボネート、アリールエステル、アルキルエステル、アルキルシラン、アリールシラン、アルキルシロキサン、アリールシロキサン、アルキルアリールシラン、及びアルキルアリールシロキサンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ２が、アルキルベンジル、ジアルキルベンジル、トリアルキルベンジル、チオアルキルベンジル、フェニルチオベンジル、ジチオアルキルベンジル、トリチオアルキルベンジル、チオアルキルハロベンジル、アルキルオキシベンジル、ジアルキルオキシベンジル、ハロベンジル、ジハロベンジル、トリハロベンジル、及びエステル化サリチルから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１が、オキシカーボネート、アリールエステル、アルキルエステル、アルキルシラン、アリールシラン、アルキルシロキサン、アリールシロキサン、アルキルアリールシラン、及びアルキルアリールシロキサンから選択され、
Ｒ２が、アルキルベンジル、ジアルキルベンジル、トリアルキルベンジル、チオアルキルベンジル、フェニルチオベンジル、ジチオアルキルベンジル、トリチオアルキルベンジル、チオアルキルハロベンジル、アルキルオキシベンジル、ジアルキルオキシベンジル、ハロベンジル、ジハロベンジル、トリハロベンジル、及びエステル化サリチルから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記水性緩衝液のｐＨが、約６．５〜８．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記水性緩衝液のｐＨが、約６．５〜８である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記水性緩衝液のｐＨが、約７〜８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化及び脱保護することが、不可逆過程である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化及び脱保護することによって、以下の式
【化２】
2006306873.tif 000006
〔式中、ｎは２〜３５０である〕から選択される生成物が生じる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドを合成する方法ならびに組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド鎖を形成するための、ヌクレオチドのカップリング反応に大きな関心が寄せられており、ポリヌクレオチド合成のための種々の化学スキームが開示されている。典型的に、これらの方法では、下式のヌクレオシド試薬が用いられる。
【０００３】
【化３】
2006306873.tif 000003
【０００４】
式中、
Ａは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、又は任意選択的に保護されたヒドロキシ基を表し；
Ｂは、その環外アミン官能基が任意選択的に保護されている、プリン塩基又はピリミジン塩基であり；
Ｍ又はＱの一方は、３'又は５'位のＯＨ官能基のための在来の保護基であり、他方は、下式である。
【０００５】
【化４】
2006306873.tif 000004
【０００６】
式中、ｘは０又は１である。但し、
ａ）ｘ＝１である場合、
Ｒ'はＨを表し且つＲ''は負に帯電した酸素原子を表すか、又は
Ｒ'は酸素原子であり且つＲ''は酸素原子又は保護基を有する酸素原子を表し、
ｂ）ｘ＝０である場合、
Ｒ'は保護基を有する酸素原子であり且つＲ''は水素若しくは二置換アミン基のどちらかである。
【０００７】
ｘが１であり、Ｒ'が酸素原子であり、且つＲ''が酸素原子である場合、本方法は所謂ホスホジエステル（phosphodiester）法であり、Ｒ''が保護基を有する酸素原子である場合、本方法は所謂ホスホトリエステル（phosphotriester）法である。
【０００８】
ｘが１であり、Ｒ'が水素原子であり、且つＲ''が負に帯電した酸素原子である場合、本方法は、Ｈ−ホスホネート（phosphonate）法として知られている。
【０００９】
ｘが０であり、Ｒ'が保護基を有する酸素原子であり、且つＲ''がハロゲンである場合、本方法は、ホスファイト（phosphite）法として知られており、Ｒ''が二置換アミン型の脱離基である場合、本方法はホスホアミダイト（phosphoramidite）法として知られている。
【００１０】
式（Ｉ）のタイプの試薬を用いてオリゴヌクレオチドを調製するのに用いられる従来の方法（シーケンス）は、基本的に以下の４つの別個のステップによる：（ａ）保護されたヒドロキシ基を有する所定のヌクレオシドを、第１の反復工程では亜リン酸結合を介して官能基化された支持体（基材）に、その後の反復工程では基材に結合されたヌクレオシド（即ち、ヌクレオシド変性基材）に、カップリングさせるステップ、（ｂ）任意選択的であるが、好ましくは、基材に結合したヌクレオシドの未反応ヒドロキシ基を保護するステップ、（ｃ）ステップ（ａ）の亜リン酸結合を酸化してリン酸結合を形成するステップ、及び（ｄ）ステップ（ａ）においてカップリングさせた基材結合ヌクレオシドから保護基を除去し（「脱保護」）、それによってこれらのステップから成る次のサイクル（反復工程）のための反応サイトを生成させるステップ。（第１サイクルにおいては）官能基化された支持体が、（その後のサイクルにおいては）脱保護されたカップリングされたヌクレオシドが、ステップ（ａ）においてカップリングすべきヌクレオシドとの亜リン酸結合を形成するための結合基を有する基材結合部をもたらす。ヌクレオシド塩基の最終的な脱保護は、水酸化アンモニウム、メチルアミン、又はエタノールアミン等のアルカリ条件を用いて、既知の方法により達成することができる。
【００１１】
前述のポリヌクレオチドの製造方法は周知であり、例えば、Caruthersによる、Science 230: 281-285， 1985; Itakuraらによる、Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356; Hunkapillar らによる、Nature 310: 105-110, 1984;及び''Synthesis of Oligonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction of Oligonucleotide Derivatives'', CRC Press, Boca Raton, Fla., pages 100 et seq.、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，８６９，６４３号、欧州特許第０２９４１９６号等に詳述されている。ホスホアミダイト法及びホスファイトトリエステル法が最も広範に用いられるが、他の方法としては、ホスホジエステル法、ホスホトリエステル法、及びＨ−ホスホネート法が挙げられる。このような方法は、Beaucageらによる、Tetrahedron (1992) 12:2223-2311に記載されている。より最近のポリヌクレオチド合成法は、２００１年４月２４日付けの、Dellingerらによる米国特許第６，２２２，０３０号に記載されている。
【００１２】
典型的な固相オリゴヌクレオチド合成のホスホアミダイト法では、一般的に、合成が３'位から５'位の方向（付加されるヌクレオシドの糖成分に関して）に進行するにもかかわらず、逆方向で容易に合成することができる。付加したヌクレオシドは、一般に、その５'位のヒドロキシ位置にジメトキシトリチル保護基を有し、その３'位のヒドロキシ位置にホスホアミダイト官能基を有する。Beaucageらによる、Tetrahedron Lett. 22:1859(1981)を参照されたい。この技法の概略図については、図１を参照されたい。図１においては、「Ｂ」は、プリン塩基又はピリミジン塩基を示し、「ＤＭＴ」は、ジメトキシトリチル保護基を示し、「ｉＰｒ」はイソプロピルを示す。合成サイクルの第１ステップ、即ち「カップリング」工程では、成長鎖の５'末端は、入ってくる単量体の３'位のホスホアミダイトとカップリングし、それによってホスファイトトリエステル中間体が形成される（５'位のヒドロキシ保護基により、１合成サイクル当たり１つを超える単量体が成長中の鎖に結合することが防止される）。Matteucciらによる、J. Am. Chem. Soc. 103:3185(1981)を参照されたい。次に、任意選択的に「キャッピング反応」を用いて未反応の５'位のヒドロキシを有する鎖での合成を停止させ、それによって合成終了時に１ヌクレオチドの短さとなるであろう。「キャッピング反応」は、酸化ステップの前に、グアノシン上のＯ−６付加物などのヘテロ塩基から、カップリング産物を切断するというさらなる利点を有する。各カップリング反応後にホスファイトトリエステル中間体は酸化（「酸化」ステップ）に供され、それにより、より安定なホスホトリエステル中間体が得られる。酸化しないと、不安定なホスファイトトリエステル結合は、その後の合成ステップの酸性条件下で切断されるであろう。Letsinger らによる、J. Am. Chem. Soc. 98:3655 (1976)を参照されたい。新たに付加した単量体の５'位保護基の除去（「脱保護」ステップ）は、典型的には、酸性溶液との反応によって行われ、それにより保護基を有さない５'位ヒドロキシ基が得られ、これを次の保護ヌクレオチドホスホアミダイトとカップリングさせることができる。この過程を、所望の配列が合成されるまで、付加した各モノマーについて繰り返す。
【００１３】
いくつかのプロトコルによれば、カップリング、キャッピング（保護）、酸化、及び脱保護の合成サイクルは、キャッピング（保護）ステップを省略したり、又は酸化ステップをサイクルの「外部」に配し、完成した鎖に対して一回の酸化反応を行うことによって短縮される。例えば、Ｈ−ホスホネートプロトコルによるオリゴヌクレオチド合成では、酸化ステップは、合成サイクルの終りに１回行われるであろう。しかしながら、カップリング収率は、ホスホアミダイト化学反応によるカップリング収率よりも低く、アミダイト化学反応よりも長い時間及び強い試薬が必要である。
【００１４】
オリゴヌクレオチドの従来の合成プロトコルに欠点がないわけではない。例えば、酸性条件下でのＤＭＴ保護基の切断により、共鳴安定化され、且つ寿命が長いビス（ｐ−アニシル）フェニルメチルカルボカチオンが得られる。Gilhamらによる、J. Am. Chem. Soc. 81:4647 (1959)を参照されたい。従って、ＤＭＴを用いた水酸基の保護及び脱保護は、容易に可逆的な反応であり、それによって、オリゴヌクレオチド合成時に反応が不完全になり、配列が欠失し、他で得ることができる収率よりも低くなる。このような問題を回避するために、ＤＭＴと共に非常に過剰な量の酸を用いて、量的脱保護を達成することができる。しかしながら、ＤＮＡ配列を酸に繰り返し曝露することにより、酸を触媒として糖環からヘテロ塩基が除去されてしまう。ヘテロ塩基の除去は、プリン塩基、アデノシン、及びグアノシンで最も起こりやすく、それによって脱プリンが起こるが、全てのヘテロ塩基及び修飾ヘテロ塩基は、酸により触媒される除去の影響を受け得る。ポリマーの総体積は合成規模が大きくなるほど増加するため、さらにより大量の酸が必要になる。従って、オリゴデオキシリボヌクレオチド合成時に生じる酸触媒脱プリンは、合成規模によって増加する。Genetic Engineering: Principles and Methods, J. K. Setlow et al., Eds. (New York: Plenum Press, 1982)におけるCaruthersらの記事を参照されたい。合成の規模が大きくなるほど使用される溶媒も非常に増加し、さらにより洗浄する必要がある。特に、カップリングステップで使用される試薬は、通常、加水分解に非常に影響を受けやすく、無水溶媒が必要であり、さらに溶媒の費用がかかる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従来技術の上記問題点に鑑み、本発明は、成長中の核酸鎖をより少ない量の試薬にしか曝露せず且つ少ないステップ数にてターゲットとなるポリヌクレオチドを製造する方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
簡単に述べれば、本開示の実施形態は、ポリヌクレオチドを形成する方法を含む。例示的な１つの方法は、本明細書において図示する構造Ｃ'（図３）及びＯ'（図５）〔式中、Ｒ１は、置換カルボニル、置換シラン、及び官能基から選択され、該官能基は、カーボネート、エステル、アミド、カルバメート、シラン、シロキサン、オルトエステル、アセタール、及びケタールから選択され；Ｒ２は、ベンジル、置換ベンジル、フェニル、置換フェニル、第三級アルキル、及び置換第三級アルキルから選択され；Ｂは、プリン塩基、ピリミジン塩基、及びこれらの類似体を含み；ｎは１〜３５０であり；●は基材である〕から選択される構造Ｘを準備すること；及び構造Ｘを水性緩衝液中において同時に酸化及び脱保護することであって、前記水性緩衝液が約ｐＨ６〜１０において酸化剤及び求核試薬として作用する物質である、酸化及び脱保護することを包含する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、成長中の核酸鎖をより少ない量の試薬にしか曝露せず且つ少ないステップ数にてターゲットとなるポリヌクレオチドを製造する方法を提供することができる。本開示のさらなる目的、利点、及び新規な特徴は、以下の説明及び実施例に記載されているが、これらは以下の明細書の内容を検討すれば当業者に或る程度自明であったり、本開示を実施することによって確認したりすることができるであろう。本開示の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で詳細に指摘する装置、組み合わせ、組成物、及び方法によって実現し、且つ達成することができる。
【００１８】
以下、図面を参照する。図面中の要素は必ずしも縮尺通りではないことに留意されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本開示の実施形態は、別途記載のない限り、当業者の知識の範囲内の有機合成化学、生化学、及び分子生物学等の従来の技術を使用するであろう。このような技術は、文献で十分に説明されている。
【００２０】
以下の実施例は、本明細書に開示し且つ特許請求している方法をどのようにして実施し、組成物をどのようにして使用するかについての完全な開示及び説明を、当業者に提供するために記載するものである。数値（例えば、量、温度等）に関しては正確に記載するよう努めたが、いくらかの誤差及び偏差が存在するであろう。別途記載のない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧又はおよそ大気圧である。標準的な温度及び圧力を、２０℃及び１気圧と定義する。
【００２１】
本発明の実施形態を詳細に説明するにあたり、別途記載のない限り、本発明は、特定の材料、試薬、反応材料、又は製造ステップ等に制限されることなく、幾らか変更し得ることを理解されたい。本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限する意のないことを理解されたい。論理的に可能である場合、各ステップを異なる順序で実施し得ることも理解されたい。
【００２２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いる場合、別途明確に指示のない限り、単数形は、複数形の意も包含することに留意されたい。従って、例えば、「支持体」という場合、複数の支持体が含まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、数多くの用語について言及するが、これらは、別途指示のない限り、以下の意味を有するものとして定義する。
【００２３】
本明細書で用いるとき、「ポリヌクレオチド」には、一本鎖又は複数鎖の形態が含まれ、そこでは、１つ又は複数の鎖が別の鎖と完全に整列していても、整列していなくても良い。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、及び従来の骨格が、天然に存在しない骨格（即ち、合成された骨格）により置換されているか、又は１つ又は複数の従来の塩基が、天然に存在しない塩基（即ち、合成された塩基）によって置換されている他のポリマーに対する総称である。
【００２４】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、糖類、及び含窒素塩基を含む核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの類似体）のサブユニット、並びにこのようなサブユニットの類似体をいう。
【００２５】
「ヌクレオシド」は、糖類及び含窒素塩基を含む核酸サブユニットをいう。本明細書では、本発明の実施形態を説明するために用語「ヌクレオチド」を用いるが、当業者は「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語はほとんどの例において交換して用いることができると理解するであろうことに留意されたい。当業者であれば、ヌクレオシドに対しさらなる修飾が必要であると理解するであろうし、当業者はこのような知識を有している。
【００２６】
「ヌクレオシド成分」とは、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はヌクレオシドホスホアミダイト等の、より巨大な分子の一部として、糖類及び含窒素塩基（ヌクレオシド等の場合）を有する分子をいう。
【００２７】
「ヌクレオチド単量体」とは、より大きなオリゴヌクレオチド鎖又はポリヌクレオチド鎖中に組み込まれていない、単一のヌクレオチドサブユニットに対応する分子を表す。ヌクレオチド単量体はまた、当該ヌクレオチド単量体の意図する用途に活性化基又は保護基が必要な場合には、活性化基又は保護基も有し得る。
【００２８】
「ポリヌクレオチド中間体」とは、ポリヌクレオチドの化学合成ステップの間に生じる分子を表す。当該ポリヌクレオチド中間体は、意図する最終産物を得るべくさらなる反応に供されるもの（例えば、その後の合成ステップでホスフェートへと酸化されるホスファイト中間体）、又はその後脱保護される保護されたポリヌクレオチドである。
【００２９】
「オリゴヌクレオチド」とは、一般に、約２〜１００ヌクレオチド長のヌクレオチド多量体を表し、一方、「ポリヌクレオチド」は、１つよりも多い任意の数のヌクレオチドを有するヌクレオチド多量体を表す。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語には、天然に存在するプリン塩基及びピリミジン塩基（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、又はウラシル（Ｕ））を含むだけでなく、修飾されたプリン塩基及びピリミジン塩基並びに修飾された他のヘテロ環式塩基を含む成分（これらの成分は、時折、本明細書中では、集合的に「プリン塩基及びピリミジン塩基並びにそれらの類似体」と称される）が含まれることは理解されよう。そのような修飾には、例えば、ジアミノプリン及びその誘導体、イノシン及びその誘導体、アルキル化プリン若しくはピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン及びチオール化プリン若しくはピリミジン等や、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバメート等のような保護基の付加が含まれる。プリン塩基又はピリミジン塩基はまた、上記の類似体であり得る。適切な類似体は当業者に既知であり、関連する文書や文献に記載されている。一般的な類似体としては、限定はしないが、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル類似体（異性体）、１−メチルウラシル類似体（異性体）、ケオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリン、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００３１】
「ヌクレオチド間結合」とは、天然に見出される核酸中のリン酸ジエステル結合等の又は核酸及び核酸類似体合成の分野で周知の結合等の、２つのヌクレオシド成分の間の化学結合をいう。ヌクレオチド間結合には、ホスホ基又はホスファイト基が含まれ、そして、ホスホ基又はホスファイト基の１つ又は複数の酸素原子が置換基で修飾されているか、又は別の原子（例えば、硫黄原子、又はモノ−若しくはジ−アルキルアミノ基の窒素原子）と置換された結合が含まれ得る。
【００３２】
別途指示のない限り、「アレイ」には、アドレス指定可能な（addressable）領域（例えば、ポリヌクレオチド配列）から成る任意の一次元、二次元、又は三次元配置が含まれ、それは、アドレス指定可能な領域に関連する特定の１つ又は複数の化学成分を有する。アレイは、異なる成分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）から成る複数の領域を有し、それによって、アレイ上の特定の位置（「アドレス」）に存在する或る領域（アレイの「フィーチャー」又は「スポット」と称される）により、特定のターゲット（標的）又はターゲット類を検出し得る（フィーチャーが偶然にそのフィーチャーのターゲット以外の物質を検出するとしても）点で、「アドレス指定可能」である。アレイに関していう場合、「ターゲット」とは、基材の種々の領域に結合したプローブ（「ターゲットプローブ」）によって検出されることになる、移動相（典型的には、流動物）中の成分を表す。ここで、「ターゲット」や「ターゲットプローブ」は、一方が他方によって評価され得る対とし得る（従って、一方には、他方との結合によって評価されることになる未知のポリヌクレオチド混合物を用いることができる）。本発明のプローブ及びターゲットは、典型的に一本鎖であるが、これは必ずしも必要とはされない。「アレイのレイアウト」とは、フィーチャーの位置、フィーチャーの寸法、及び所与の位置における或る成分の表示等の、１つ又は複数のアレイの特徴をいう。ポリヌクレオチドに関しては、「ハイブリダイズ」と「結合」を、互いに交換可能な用語として使用する。
【００３３】
「基」には、置換形態及び非置換形態の両方が含まれる。典型的な置換基としては、１つ又は複数の低級アルキル、任意のハロゲン、ヒドロキシ基、若しくはアリール、又は１つ又は複数の利用可能な炭素原子上がシアノ、ニトロ、ハロゲン、若しくはヒドロキシ基等の非ヒドロカルビル置換基により任意選択的に置換されているものが挙げられる。何れの置換基も、典型的に、反応収率に実質的に悪影響を与えないように選択される（例えば、特定の置換基若しくは置換基の組み合わせを使用することなく得られる収量に対し、２０％以上（又は、１０％、５％、又は１％）低下しないように選択される）。「酢酸」には、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の置換酢酸が含まれる。
【００３４】
「ホスホ」基としては、ホスホジエステル基、ホスホトリエステル基、及びＨ−ホスホネート基が挙げられる。ホスホ基又はホスファイト基のいずれかの場合には、５員の置換フリル環（substituted 5-membered furyl ring）以外の化学成分がホスホ基又はホスファイト基のＯに結合することによって、フリル環とＰ原子との間が結合され得る。
【００３５】
「保護基」は、特定の反応条件下において、官能基を可逆的に非反応性とさせるような基を表し、これは、従来の化学的な意と同じである。反応後に、保護基を除去することで、保護された官能基を脱保護することができる。全ての保護基は、合成中の分子の大部分を分解させないような条件下で除去可能である（即ち、不安定となる）べきである。保護基とは対照的に、「キャッピング基（capping group）」は、分子のある領域に恒久的に結合し、その領域がさらに化学変化することを防止する。
【００３６】
「ヒドロキシ保護基」とは、保護の対象となる基がヒドロキシである保護基をいう。「反応サイトのヒドロキシ」とは、３'−５'ポリヌクレオチド合成時の末端５'−ヒドロキシであり、且つ５'−３'ポリヌクレオチド合成時の３'−ヒドロキシである。「酸不安定性保護ヒドロキシ」とは、酸性条件によって除去され得る保護基によって保護されたヒドロキシ基を表す。同様に、「酸不安定性保護基」とは、酸性条件によって除去され得る保護基である。酸性条件で除去され得る好ましい保護基（「酸不安定性保護基」）としては、テトラヒドロピラニル基（例えば、テトラヒドロピラン−２−イル及び４−メトキシテトラヒドロピラン−２−イル）；ｎ個のアリール基（ここで、ｎ＝１〜３）を有するアリールメチル基及び任意選択的に置換されたトリチル基等の３−ｎアルキル基（例えば、オリゴリボヌクレオチド合成のためのモノメトキシトリチルや、オリゴデオキシリボヌクレオチド合成のためのジメトキシトリチル）；ピキシル（pixyl）；イソブチルオキシカルボニル；ｔ−ブチル；並びにジメチルシリル等が挙げられる。トリチル基は、トリフェニルメチル基である。適切な保護基は、T. W. Green, Wiley Interscienceによる"Protective Groups in Organic Synthesis"に記載されている。
【００３７】
本明細書で用いるとき、用語「アルキル」は、別途明確に指示のない限り、直鎖状、分岐状又は環状の、炭素数１〜２４、典型的に１〜１２の飽和炭化水素基を表し、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチル等がある。用語「低級アルキル」とは、炭素数１〜８のアルキル基を意図しており、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチルが挙げられる。用語「シクロアルキル」は、環状アルキル基を表し、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチル等である。
【００３８】
本明細書で用いるとき、用語「アリール」は、縮合又は結合した１〜５個の芳香環を含み、且つ置換されていないか又は典型的には、アミノ、ハロゲン、及び低級アルキルから成る群から選択される１つ又は複数の置換基で置換されている、芳香族化学種を表す。好ましいアリール置換基は、１〜３個の縮合芳香環を含み、特に好ましいアリール置換基は１個の芳香環又は２個の縮合芳香環を含む。本明細書に記載の芳香族基は、ヘテロ環であってもなくてもよい。用語「アラルキル」とは、アルキル種とアリール種の両方を含む成分であって、典型的には、その成分のアルキル領域の炭素数が約２４未満、より典型的には約１２未満であり、典型的には、１〜５個の芳香環を含む成分を意図している。用語「アラルキル」は、通常、アリールで置換されたアルキル基を表すために用いられる。用語「アラルキレン」は、典型的に、アリールで置換されたアルキレンを表すために用いられ、それは、アルキレン種とアリール種の両方を含み、典型的にはアルキレン成分中に約２４個未満の炭素原子を含み、アリール成分中に１〜５個の芳香環を含む成分である。例示的なアラルキル基は、構造−（ＣＨ２）ｊ−Ａｒ（式中、ｊは１〜２４、より典型的には１〜６の範囲の整数であり、Ａｒは単環式アリール成分である）を有する。
【００３９】
本発明の実施形態には、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド（以後、「ポリヌクレオチド」）を製造するための方法；ヌクレオチドの糖部分のヒドロキシを脱保護し且つ同時に初期ヌクレオチド間結合を脱保護する方法；ヌクレオチドの糖部分のヒドロキシ基のための保護基；２つのヌクレオチド間の初期ヌクレオチド間結合のための保護基；並びにヌクレオチドの糖部分のヒドロキシ基のための保護基及び２つのヌクレオチド間の初期ヌクレオチド間結合のための保護基を含んで成るヌクレオチド化合物が含まれ、これらは全て上記で考察した方法等の先行技術の方法と比較して多数の利点を有する。
【００４０】
一般に、本法は、ヌクレオチドの糖部分のヒドロキシ基用の保護基と、２つのヌクレオチド間の初期ヌクレオチド間結合用の保護基とを含むヌクレオチド化合物を用いて、ターゲット生体高分子（以後、「ターゲットポリヌクレオチド」）を形成することを含む。概して、本法は、カップリングステップと、同時に行われる脱保護及び酸化ステップとを包含する。この同時に行われる脱保護及び酸化ステップでは、ヌクレオチドの糖部分のヒドロキシの脱保護及び２つの隣接ヌクレオチド間の初期ヌクレオチド間結合の脱保護が同時又はほぼ同時に起こる。詳細には、同時に行われる脱保護及び酸化ステップは、実質的に不可逆又は不可逆である。実質的に不可逆とは、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が不可逆であることを意味する。
【００４１】
さらに、ターゲットポリヌクレオチドを合成する方法で必要となるステップ数は、図１記載の従来法と比較して少ない。詳細には、本法は、５'→３'方向又は３'→５'方向のいずれかでターゲットポリヌクレオチドを産生するために用い得る２つのステップからなる合成サイクルからなる。上記のように、本法は、反復様式で反復して目的のターゲットポリヌクレオチドを産生し得るカップリングステップと脱保護／酸化ステップを含む。
【００４２】
図２は、典型的な条件下における、５'→３'方向での２ステップによるターゲットポリヌクレオチド合成法の一実施形態の概略図である。構造Ａを準備し、構造Ｂとカップリングさせ、それによって構造Ｃを形成する。「Ｂ」成分としては、プリン塩基、ピリミジン塩基、及びこれらの類似体が挙げられる。「Ｒ１」としては、限定はしないが、置換カルボニル、置換シラン、並びに官能基（カーボネート、エステル、アミド、カルバメート、シラン、シロキサン、オルトエステル、アセタール、及びケタール等）等の基を挙げることができる。詳細には、「Ｒ１」としては、限定はしないが、オキシカーボネート、アリールエステル、アルキルエステル、アルキルシラン、アリールシラン、アルキルシロキサン、アリールシロキサン、アルキルアリールシラン、及びアルキルアリールシロキサン等の基を挙げることができる。さらに、「Ｒ１」としては、限定はしないが、アリールオキシカルボニル（Ａｒｃｏ）、メチルチオフェニルオキシカルボニル、フルオロメチルチオフェニルオキシカルボニル、メトキシメチルチオベンジルカルボニル、ジメチルチオフェニルカルボニル、アセチルサリチレート、ジアセチルフェノキシサリチレート、メチルチオアセチルサリチレート、ジメチルチオアセチルサリチレート、ニトロアセチルサリチレート、フルオロアセチルサリチレート、シクロドデシルオキシジ（トリメトキシシリル）シロキサン、及びジフェニルメトキシジ（トリメトキシシリル）シロキサン等を挙げることができる。「Ｒ２」としては、限定はしないが、ベンジル、置換ベンジル、フェニル、置換フェニル、第三級アルキル、及び置換第三級アルキル等の基を挙げることができる。詳細には、「Ｒ２」としては、アルキルベンジル、ジアルキルベンジル、トリアルキルベンジル、チオアルキルベンジル、フェニルチオベンジル、ジチオアルキルベンジル、トリチオアルキルベンジル、チオアルキルハロベンジル、アルキルオキシベンジル、ジアルキルオキシベンジル、ハロベンジル、ジハロベンジル、トリハロベンジル、及びエステル化サリチル等の基を挙げることができる。さらに、「Ｒ２」としては、２−メトキシベンジル、メチルチオフェニルオキシカルボニル、フルオロメチルチオフェニルオキシカルボニル、メトキシメチルチオベンジルカルボニル、ジメチルチオフェニルカルボニル、アセチルサリチル、ジアセチルフェノキシサリチル、メチルチオアセチルサリチル、ジメチルチオアセチルサリチル、ニトロアセチルサリチル、及びフルオロアセチルサリチル等を挙げることができる。
【００４３】
構造Ｃの酸化及び脱保護を水性緩衝液中で同時又はほぼ同時に行うことによって、構造Ｄが形成される。水性緩衝液は、約６〜１０、約６．５〜８．５、約６．５〜８及び約７〜８のｐＨにおいて、酸化剤及び求核試薬の両方として作用する化合物又は化合物の混合物を含む。この混合物としては、求核試薬として作用する酸化剤（限定はしないが、ヒドロペルオキシド又は過酸等）、又は求核試薬として作用する酸化剤と作用しない酸化剤との混合物（限定はしないが、過酸化物と過酸との混合物等）を挙げることができる。水性緩衝液は、約１〜１１、約３〜１１、約７〜１１のｐＫａを有する化合物を含む。水性緩衝液は、限定はしないが、過酸化水素、過酸、過ギ酸、過酢酸、過安息香酸、及びクロロ過安息香酸等、ヒドロペルオキシド、ブチルヒドロペルオキシド、ベンジルヒドロペルオキシド、フェニルヒドロペルオキシド、他の類似の化合物、並びにこれらの組み合わせ等の化合物を含むことができる。
【００４４】
さらに、水性緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アミノメチルプロパノール、クエン酸、Ｎ，Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシ−メチル）−１，３−プロパンジオール、２−（シクロヘキシルアミノ）エタン−２−スルホン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ'−３−プロパンスルホン酸、モルホリノエタンスルホン酸、モルホリノプロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、及びこれらの組み合わせ等の緩衝剤を含むことができる。
【００４５】
過酸化水素、過酸、及びヒドロペルオキシドは、典型的には３０重量／ｖｏｌ％未満、より典型的には０．１重量／ｖｏｌ％〜１０重量／ｖｏｌ％、最も典型的には１重量／ｖｏｌ％〜５重量／ｖｏｌ％である。
【００４６】
脱保護及び酸化は、ほぼ同時又は同時に起こる。言い換えれば、両反応は一度に起こる。２つの反応の速度は異なる場合があるため、競合時間（反応時間）は異なり得る。特定の反応の場合には、保護基の酸化により、脱保護速度が高まり得る。これは、脱保護反応が実質的に不可逆又は不可逆である場合、最も望ましい。理論に囚われるわけではないが、当該反応の実質的に不可逆な性質は、少なくとも一部は、「Ｒ１」基が３つの複合体に分裂し、「Ｒ１」を再形成する逆反応の機会が実質的に減少することに起因する。不可逆性は、全ての保護基というわけではないが、ほとんどの保護基の望ましい性質であり、Ｒ２でも望ましい。
【００４７】
２ステップによるプロセスは、構造Ｂを、各脱保護／酸化ステップ後に生成した反応産物と置換することにより、反復様式で繰り返すことができる。例えば、構造Ｄを、構造Ａとカップリングさせる。図３には、構造Ｃ'及び構造Ｄ'の実施形態を図示しており、この実施形態は、図２記載の方法を用いて反復様式で生成することができる構造を示している。「ｎ」は、１〜３５０、５〜１５０、及び１５〜１００とし得、合成すべきターゲットポリヌクレオチドの長さに依存する。
【００４８】
本明細書に記載の化学合成法は、成長中の核酸鎖をより少ない量の試薬に曝露する点、合成サイクルを標準的なプロセスよりも簡単な自動化様式（オートメーション法）により実施し得る点で有利である。成長中のオリゴヌクレオチドをより少ない量の化学試薬に曝露する本発明の方法では、望ましくない化学修飾を受ける機会がより少なくなり、これらの化学修飾をより容易に制御（抑制）することができる。製造の点では、簡単なオートメーション法により、より頑強で再現性のある製造プロセスを得ることができる。反応の非可逆性は、微小規模及び平らな表面上での合成に特に有利である。反応の可逆性が高い場合、これらの条件下で反応を完了することは非常に困難であり得る。典型的には、より厳しい（ストリンジェントな）条件下で反応させて、表面から試薬の副産物を完全に除去する。
【００４９】
図４は、典型的な条件下における、３'→５'方向での２ステップによるポリヌクレオチド合成法の一実施形態を示す概略図である。構造Ｍを準備し、構造Ｎとカップリングさせることにより、構造Ｏが形成される。「Ｂ」、Ｒ１、及びＲ２は、図２及びそれに対応する説明において記載した「Ｂ」、Ｒ１、及びＲ２と同じである。
【００５０】
構造Ｏの酸化及び脱保護を水性緩衝液中で同時又はほぼ同時に行うことにより、構造Ｐが形成される。水性緩衝液は、図２及びそれに対応する説明において記載した水性緩衝液と同じである。
【００５１】
さらに、水性緩衝液には、上記の緩衝剤が含まれる。
【００５２】
この２ステップによるプロセスは、構造Ｎを、各脱保護／酸化ステップ後に生成した反応産物と置換することにより、反復様式で繰り返すことができる。例えば、構造Ｐを、構造Ｍとカップリングさせる。図５は、構造Ｏ'及び構造Ｐ'の実施形態を図示しており、この実施形態は、図４記載の方法を用いて反復様式で生成することができる構造を示している。「ｎ」は、１〜３５０、５〜１５０、及び１５〜１００とし得、合成すべきターゲットポリヌクレオチドの長さに依存する。
【００５３】
上記のように、本法の実施形態は、３'→５'方向又は５'→３'方向のいずれかにてアレイ基材上でポリヌクレオチドを合成するのに役立つ。前者の場合、合成プロセスの最初のステップは、３'位にて最初のヌクレオシドをアレイ基材に結合させ、５'位をその後の単量体との共有結合に利用可能なままとすることを含む。後者の場合、合成プロセスの最初のステップは、５'位にて最初のヌクレオシドをアレイ基材に結合させ、３'位をその後の単量体との共有結合に利用可能なままとすることを含む。合成の後、ポリヌクレオチドを、所望であれば、固体支持体から切り離すことができる。３'→５'方向又は５'→３'方向のいずれかにおける合成の詳細は、先行技術及び本明細書の開示に基づいて、当業者には容易に理解されよう。
【００５４】
さらに、本発明の実施形態は、基材上において、アドレス指定可能なポリヌクレオチドアレイを生成する方法を提供する。本法の実施形態には、アレイ基材に接触することでオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを形成するところのヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチドのうちの１つを含む溶液が包含され、そして、対象となるターゲットポリヌクレオチドは、反覆様式で、本明細書に記載の１つ又は複数の方法及びヌクレオチド化合物を使用することで製造することができる。
【００５５】
そのような一実施形態では、基材上の複数の異なるアドレス（例えば、少なくとも１００箇所、少なくとも１，０００箇所、又は少なくとも１０，０００箇所のアドレス）の各々において、ｉｎ ｓｉｔｕ合成サイクルを繰り返し、それによって、基材上の１つ又は複数の異なるアドレスに同一又は異なるポリヌクレオチド配列を有するアドレス指定可能なアレイが形成される。このアレイ形成方法では、各アドレスに結合されるべき化合物は、例えば、インクジェットプリントシステムを利用して、これらのアドレスに液滴として付着させることができる。本明細書に記載の方法にしたがって、反復プロセスにおける特定の順序で、特定のアドレス指定可能な位置に溶液（例えば、各々が異なるヌクレオチドを含有する４つの溶液から選択される）を付着させることによって、ポリヌクレオチドを産生することができる。
【００５６】
本発明はまた、２つのポリヌクレオチド間若しくはオリゴヌクレオチド間又はポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの間のヌクレオチド間結合の形成を含み、これにより、アレイ表面上に固定化された伸長ポリヌクレオチドが得られる。この場合、本明細書に記載の方法にしたがって、１つのポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを溶媒に溶解し、ターゲットポリヌクレオチドを作製することができる。
【００５７】
アレイは、非常に多くのフィーチャーを含むことができ、一般に、少なくとも何十ものフィーチャー、通常は少なくとも数百、より通常は数千、数十万又はそれ以上のフィーチャーを含む。フィーチャーの全てが異なるものでもよく、いくつか又は全部が同一でもよい。各フィーチャーは、所定の成分又は所定の成分の混合物（例えば、特定のポリヌクレオチド配列又は所定のポリヌクレオチド混合物）を保持している。アレイのフィーチャーを、任意の所望のパターン（例えば、組織化されたフィーチャー行及び列（例えば、基材表面全体にわたるフィーチャーグリッド））；基体表面を横切る一連の曲線的な行（例えば、フィーチャーから成る一連の同心円又は半円等）等として配置することができる。非常に小さなフィーチャーサイズが望ましい実施形態では、基材上のフィーチャー密度は、１平方センチメートル当たり少なくとも約１０フィーチャー、１平方センチメートル当たり少なくとも約３５フィーチャー、１平方センチメートル当たり少なくとも約１００フィーチャー、１平方センチメートル当たり約１，０００フィーチャーまで、１平方センチメートル当たり約１０，０００フィーチャーまで、又は１平方センチメートル当たり約１００，０００フィーチャーまでの範囲とし得る。各フィーチャーは、所定のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列の混合物の場合もある）を含む。
【００５８】
一実施形態では、約１０〜１００個のこのようなアレイを、１つの基材（ガラス等）上に構築することができる。このような実施形態では、基材表面上にポリヌクレオチドを形成した後、基材をいくつかの基材セグメントに切断することができ、これらは各々１つ又は２つのアレイを有し得る。アレイを互いに分離させるいかなる空隙も必要ないことが認識されよう。アレイパターンが望ましい場合、任意の種々の幾何学的配置（geometry）（例えば、組織化されたアレイ行及び列（例えば、基材表面全体にわたるアレイグリッド）及び基材表面を横切る一連の曲線的な行（例えば、アレイから成る一連の同心円又は半円）等）等を構築することができる。
【００５９】
アレイ基材は、単純な構成から複雑な構成まで、任意の種々の構成を取り得る。即ち、基材は、一般的に、例えば、スライド又はプレート状の構成（長方形、正方形、又はディスク等）のような平面形態を有し得る。多数の実施形態において、基材は、一般的に、長方形の固体として成形され、これは、長さが約４ｍｍ〜３００ｍｍ、通常は約４ｍｍ〜１５０ｍｍ、より通常は約４ｍｍ〜１２５ｍｍであり、幅が約４ｍｍ〜３００ｍｍ、通常は約４ｍｍ〜１２０ｍｍ、より通常は約４ｍｍ〜８０ｍｍであり、厚さが、約０．０１ｍｍ〜５．０ｍｍ、通常は約０．１ｍｍ〜２ｍｍ、より通常は約０．２ｍｍ〜１ｍｍである。ポリヌクレオチドが結合する基材表面は、平滑、即ちほぼ平らであっても、くぼみ又は隆起等を有する不規則な基材表面ともし得る。アレイの構成は、製造、操作、及び用途を検討して選択され得る。
【００６０】
アレイの製造に関して、利用可能なポリヌクレオチド量は、通常は、非常に少量であり、且つ高価である。さらに、試験に利用可能なサンプルの量も通常は非常に少量であるため、非常に多数の異なるプローブに対して同一のサンプルを同時にアレイ上で試験することが望ましい。従って、本発明の一実施形態では、非常に多数の非常に小さな密集したフィーチャーを有するアレイの製造が提供される。アレイは、最小で約１０μｍから最大で約１．０ｃｍの範囲の幅（又は、円形スポットについては直径）を有し得るフィーチャーを使用して製造され得る。非常に小さなスポットサイズ又はフィーチャーサイズが望ましい実施形態では、本発明に従って、約１．０μｍ〜１０ｍｍの幅、通常約５．０μｍ〜０．５ｍｍ、より通常は約１０μｍ〜２００μｍの幅を有する小さいスポットとして材料を付着させることができる。典型的には（しかし必ずしも必要とはされない）、ポリヌクレオチドを何ら有さないフィーチャー間領域が存在するであろうが、フィーチャー間領域は、種々のサイズ及び構成とし得ることは理解されよう。
【００６１】
適切な基材は、種々の形態及び組成を有することができ、天然に存在する材料（天然材料）、合成により修飾された天然材料、又は合成材料から得ることができる。適切な支持材料の例としては、限定はしないが、ニトロセルロース、ガラス、シリカ、テフロン、及び金属（例えば、金及びプラチナ等）が挙げられる。適切な材料としては、高分子材料（プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、及びこれらのブレンド等）、多糖（アガロース（例えば、PharmaciaからSepharose（登録商標）として市販されているアガロース）及びデキストラン（例えば、PharmaciaからSephadex（登録商標）及びSephacyl（登録商標）という商品名で市販されているデキストラン）等）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、及びヒドロキシエチルメタクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマー等が含まれる）等も挙げられる。
【００６２】
上述の実施形態は本発明の完全な開示を目的として非常に詳細に記載したが、本発明の趣旨及び原理から逸脱することなく、このような詳細な形態に多数の変更をなすことが可能であることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によりのみ制限される。
【００６３】
本明細書に記載の全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照することで、その内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】先行技術の多ステップによるポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド合成法の概略図
【図２】５'→３'方向での２ステップによるポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド合成法の一実施形態の概略図
【図３】図２記載の合成で得られた構造の実施形態
【図４】３'→５'方向での２ステップによるポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド合成法の別の実施形態の概略図
【図５】図４記載の合成で得られた構造の実施形態
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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