(57)【要約】【課題】      アスパラギンのアミノ基窒素が脂溶性の保護基、ビオチン基又はＦＩＴＣ基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法を提供する。【解決手段】  式（１）で表されるアスパラギンのアミノ基窒素が脂溶性の保護基、ビオチン基又はＦＩＴＣ基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体。【化１】 2006022191.tif 000008 〔式中、Ｒ１およびＲ２は異なって、水素原子あるいはガラクトースを示す。Ｑは脂溶性の保護基、ビオチン基またはＦＩＴＣ基を示す。〕【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表されるアスパラギンのアミノ基窒素が脂溶性の保護基、ビオチン基又はＦＩＴＣ基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体。
【化１】
2006022191.tif 000006
〔式中、Ｒ１およびＲ２は異なって、水素原子あるいはガラクトースを示す。Ｑは脂溶性の保護基、ビオチン基またはＦＩＴＣ基を示す。〕
【請求項２】
脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である請求項１記載の３分岐型糖鎖スパラギン誘導体。
【請求項３】
式（２）で表される３分岐型糖鎖アスパラギン。
【化２】
2006022191.tif 000007
〔式中、Ｒ１およびＲ２は異なって、水素原子あるいはガラクトースを示す。〕
【請求項４】
式（２）の３分岐型糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去した３分岐型糖鎖。
【請求項５】
（ａ）１種もしくは２種以上の３分岐型糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該３分岐型糖鎖アスパラギンに、脂溶性の保護基を導入して３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、ならびに
（ｂ）該３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物、または該３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物を、クロマトグラフィーに供して各３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程を含むことを特徴とする、脂溶性の保護基を導入した請求項１に記載の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体（Ｑは脂溶性の保護基）の製造方法。
【請求項６】
式（２）の３分岐型糖鎖アスパラギンをビオチン化することを特徴とする、ビオチン基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項７】
式（２）の３分岐型糖鎖アスパラギンをＦＩＴＣ化することを特徴とする、ＦＩＴＣ基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の脂溶性の保護基、ビオチン基又はＦＩＴＣ基を除去することを特徴とする３分岐型糖鎖アスパラギンの製造方法。
【請求項９】
式（２）の３分岐型糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去することを特徴とする３分岐型糖鎖の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を結合させたマイクロプレート。
【請求項１１】
請求項１に記載のビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を結合させたアフィニティーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、３分岐型糖鎖アスパラギン、３分岐型糖鎖およびそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
【０００４】
Ｅ．Ｍｅｉｎｊｏｈａｎｎｓ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ１，１９９８，ｐ５４９−５６０）らは、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｅｔｕｉｎ（ウシ由来の糖タンパク質）から２分岐型糖鎖アスパラギンを合成している。最初の原料である２分岐型糖鎖を得るためにヒドラジン分解反応を利用している。このヒドラジンは毒性が高く、得られる糖鎖の誘導体を医薬品に応用する場合、微量のヒドラジン混入の可能性があるため安全性の点で問題がある。
【０００５】
本発明の課題は、アスパラギンのアミノ基窒素が脂溶性の保護基、ビオチン基又はＦＩＴＣ基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法を提供することにある。
また、本発明の課題は、３分岐型糖鎖アスパラギン、３分岐型糖鎖およびそれらの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の発明に係る。
１．  式（１）で表されるアスパラギンのアミノ基窒素が脂溶性の保護基、ビオチン基又はＦＩＴＣ基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体。
【０００７】
【化１】
2006022191.tif 000002
〔式中、Ｒ１およびＲ２は異なって、水素原子あるいはガラクトースを示す。Ｑは脂溶性の保護基、ビオチン基またはＦＩＴＣ基を示す。〕
【０００８】
２．  式（２）の３分岐型糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去した３分岐型糖鎖。
【０００９】
【化２】
2006022191.tif 000003
〔式中、Ｒ１およびＲ２は異なって、水素原子あるいはガラクトースを示す。〕
【００１０】
３．  ビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を結合させたマイクロプレート。
４．  ビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を結合させたアフィニティーカラム。
【００１１】
本発明者は、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｅｔｕｉｎ（ウシ由来の糖タンパク質）から、種々の単離された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を容易かつ大量、高純度に得ることができる、３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、３分岐型糖鎖の製造方法を開発した。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、医薬品開発等の分野において有用な単離された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる。また本発明によれば、３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体と共に有用な単離された３分岐型糖鎖アスパラギンおよび３分岐型糖鎖をそれぞれ従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる。
更に本発明によれば、ビオチン・アビジンの結合特異性を利用し、ビオチン化した複数の糖鎖をアビジン化されたマイクロプレート上で反応させるだけで簡単に糖鎖マイクロチップを製造することができる。これにより、特定の糖鎖と結合能を有するタンパク質を解明することができる。
また、ある特定のタンパク質を分離精製する目的で、アビジン化したアフィニティーカラムに特定のビオチン化した糖鎖を結合し固定化し、そこに、ビオチン化した糖鎖と特異的結合能を有するタンパク質を含む混合物を通すことにより目的とするタンパク質のみを単離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、例えば、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖アスパラギン、好ましくはアスパラギン結合型糖鎖から得られる糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該３分岐型糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを１つの大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
【００１４】
前記するように、天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基がランダムに欠失した糖鎖の混合物である。本発明者らは、意外にも天然の糖タンパク質に由来する糖鎖、具体的には糖鎖アスパラギンの混合物に含まれる当該３分岐型糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、当該保護基が導入された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易に個々の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。それにより、本発明の構造を有する３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を大量に調製することが可能となった。
【００１５】
このように、３分岐型糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化することにより個々の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能となったが、これは、脂溶性の保護基を導入したことにより３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、例えば、好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、その結果、より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体が分離されるようになったことによると考えられる。例えば、本発明において好適に使用される脂溶性の保護基であるＦｍｏｃ基の脂溶性は非常に高い。すなわち、Ｆｍｏｃ基のフルオレニル骨格は、中心の５員環にベンゼン環が２つ結合した非常に脂溶性の高い性質の構造をとっており、例えば、逆相系カラムの１つであるＯＤＳカラムのオクタデシル基と非常に強い相互作用を生み、似た構造の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の分離が可能になったものと考えられる。
【００１６】
さらに本発明によれば、後述するように、得られた３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の保護基を除去することにより種々の３分岐型糖鎖アスパラギンを、また、得られた３分岐型糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基を除去することにより種々の３分岐型糖鎖を、容易かつ大量に得ることができる。
【００１７】
本発明の脂溶性の保護基により修飾された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、具体的には、
（ａ）１種もしくは２種以上の３分岐型糖鎖アスパラギンを含む混合物に含まれる該３分岐型糖鎖アスパラギンに、脂溶性の保護基を導入して３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物を得る工程、ならびに
（ｂ）該３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物、または該３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物を、クロマトグラフィーに供して各３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、を含むものである。
【００１８】
工程（ａ）において使用される１種もしくは２種以上の３分岐型糖鎖アスパラギンを含む混合物としては、アスパラギンの結合した状態の糖鎖を１種もしくは２種以上含む混合物であれば特に限定されるものではない。例えば、アスパラギンが１または複数個結合した糖鎖を１種もしくは２種以上含む混合物であってもよい。中でも、入手の容易性の観点から、還元末端にアスパラギンが結合した糖鎖を１種もしくは２種以上含む混合物が好適である。なお、本明細書において「糖鎖」とは、任意の単糖が２以上結合したものをいう。
【００１９】
かかる３分岐型糖鎖アスパラギンの混合物は、公知の方法により、好ましくは天然の原料、例えば、ウシ由来フュチュインから糖タンパク質および／または糖ペプチドの混合物を得、当該混合物に、例えば、タンパク質分解酵素、例えば、プロナーゼ（和光純薬社製）、アクチナーゼ−Ｅ（科研製薬社製）や、一般のカルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼなどの酵素を添加して、公知の反応条件下に反応を行ってペプチド部分を切断し、当該反応後の反応液として、または反応液より糖鎖アスパラギン以外の成分を公知の方法、例えば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを用いた各種クロマトグラフィーや、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた精製法に従って除去することにより、得ることができる。
【００２０】
以上のようにして得られた３分岐型糖鎖アスパラギンを含む混合物を用い、それに含まれる３分岐型糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基の導入を行う。当該保護基としては特に限定されるものではなく、例えば、Ｆｍｏｃ基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカーボネート基、アセチル基などの、カーボネート系またはアミド系の保護基などを使用することができる。得られた３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、Ｆｍｏｃ基またはＢｏｃ基などが好ましく、Ｆｍｏｃ基がより好ましい。Ｆｍｏｃ基はシアル酸など比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。また、保護基の導入は公知の方法（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＩＮＣ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１，ＩＳＢＮ  ０−４７１−６２３０１−６を参照）に従って行えばよい。
【００２１】
例えば、Ｆｍｏｃ基を用いる場合、３分岐型糖鎖アスパラギンを含む混合物に対し水およびＤＭＦを適量加えた後、さらに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、２５℃にてアスパラギン残基へのＦｍｏｃ基の結合反応を行うことにより、当該３分岐型糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基にＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の混合物が得られる。
【００２２】
次いで、上記脂溶性の保護基が導入された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物を公知のクロマトグラフィー、特に分取型のクロマトグラフィーに供して各３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体に分離する。各３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。
【００２３】
例えば、得られた３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、例えば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、例えば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
【００２４】
また、上記で得られた種々の３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体に糖転移酵素により、種々の糖（例えば、シアル酸）を転移することにより所望の糖鎖構造を有する３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。例えば、糖転移酵素によりシアル酸を転移することによりシアル酸を含む所望の糖鎖構造を有する３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。また、使用する糖転移酵素により、結合様式の異なった所望の糖鎖構造を有する３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
【００２５】
シアル酸としては、一般に市販されているシアル酸あるいは化学合成したものを使用することができる。
シアル酸転移酵素としては、一般に市販されているもの、天然由来のもの、遺伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、転移させるシアル酸の種類により適宜選択することができる。具体的には、α２,３転移酵素であるＲａｔ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ由来のもの、α２,６転移酵素であるＲａｔ  Ｌｉｖｅｒ由来のもの等を挙げることができる。また、シアル酸加水分解酵素を用いてｐＨ調整等により平衡をずらすことにより、シアル酸を転移させてもよい。
【００２６】
また本発明は、種々の単離された３分岐型糖鎖アスパラギンを大量に得ることができる３分岐型糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。当該方法は、前記３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法に従う３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体の製造工程に続き、さらに、得られた３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体から保護基を除去する工程を含むものである。
３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体からの保護基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＩＮＣ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１，ＩＳＢＮ  ０−４７１−６２３０１−６を参照）。例えば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体にモルホリンを加えて反応を行うことによりＦｍｏｃ基を除去することができる。また、Ｂｏｃ基は弱酸を反応させることで除去することができる。保護基除去後、所望により適宜、公知の方法、例えば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製することにより、３分岐型糖鎖アスパラギンを得てもよい。
【００２７】
また、保護基がベンジル基である場合、ベンジル基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＩＮＣ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１，ＩＳＢＮ  ０−４７１−６２３０１−６を参照）。
【００２８】
本発明では、３分岐型糖鎖アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化またはＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンを提供する。
上記ビオチン化とは３分岐型糖鎖アスパラギンのアミノ基と、ビオチン（ビタミンＨ）のカルボキシル基の反応によりアミド結合を生成させることである。
また上記ＦＩＴＣ化とは３分岐型糖鎖アスパラギンのアミノ基と、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のイソチオシアネート基の反応によりイソチオアミド結合を生成させることである。
【００２９】
また本発明では、３分岐型糖鎖アスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化またはＦＩＴＣ化した糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。
本発明のビオチン化またはＦＩＴＣ化３分岐型糖鎖アスパラギンの製造方法としては、例えば、上記の単離された３分岐型糖鎖アスパラギンのアスパラギンのアミノ基窒素をビオチン化又はＦＩＴＣ化することにより得ることができる。
ビオチン化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、３分岐型糖鎖アスパラギンを水に溶かし重炭酸ナトリウムを加え、ここに、Ｄ−（＋）−ビオチニルスクシンイミドを溶かしたジメチルホルムアミドを加え、室温で２０分反応させ、ゲル濾過カラム等で精製し、ビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギンを得ることができる。
【００３０】
本発明のビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギンを結合させたマイクロプレートは、市販のアビジン化したマイクロプレート（例えば、ピアス社製）に、ビオチン化した３分岐型糖鎖アスパラギンを反応させることにより製造することができる。
また、本発明のビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギンを結合させたアフィニティーカラムは、市販のアビジン化したアフィニティーカラムに、ビオチン化した３分岐型糖鎖アスパラギンを反応させることにより製造することができる。
本発明のＦＩＴＣ化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、３分岐型糖鎖アスパラギンを水に溶かして、アセトン、重炭酸ナトリウムを加え、ここに、フルオレセインイソチオシアネートを加え、室温で２時間反応させ、ゲル濾過カラム等で精製し、ＦＩＴＣ化３分岐型糖鎖アスパラギンを得ることができる。
【００３１】
本発明で得られたＦＩＴＣ化３分岐型糖鎖アスパラギンは、例えば、生体組織中の糖類を認識する受容体の研究、レクチンの糖結合特異性の研究に有用である。
さらに、３分岐型糖鎖アスパラギンからのアスパラギン残基の除去は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、３分岐型糖鎖アスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化することによりアスパラギン残基を除去して３分岐型糖鎖を得ることができる。また、３分岐型糖鎖アスパラギンを塩基性水溶液で加熱還流後、アセチル化することによってもアスパラギン残基を除去して３分岐型糖鎖を得ることができる。アスパラギン残基除去後、所望により適宜、公知の方法、例えば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製してもよい。
このように、本発明によれば、３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体、３分岐型糖鎖アスパラギンおよび３分岐型糖鎖（以下、３つ併せて糖鎖類という場合がある）を安価かつ効率的に大量に製造することができる。
【００３２】
かかる糖鎖類は医薬品開発等の分野において非常に有用である。例えば、医薬品開発における応用例としては、例えば、ガンのワクチン合成があげられる。細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。また、当該糖鎖を化学的に合成し、ワクチンとして個体に投与すると、ガンの増殖が抑制されることも知られている。そこで、本発明により糖鎖類を製造することができれば、ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。また、本発明により得られる糖鎖類を、さらに化学的な反応および糖転移酵素による反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規なワクチンの合成を行うことも可能である。
【００３３】
また、例えば、糖タンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、その赤血球増殖能により貧血の治療薬として使われているが、このＥＰＯは糖鎖が結合していないと活性がでないことが判明している。このように、タンパク質には糖鎖の結合によって生理活性を発現するものがあるので、例えば、糖鎖を結合させることができない大腸菌発現系によりタンパク質のみを大量に調製し、次いで所望の糖鎖構造を有する、本発明により製造した糖鎖を導入することにより生理活性の発現を付与したり、また、任意のタンパク質に種々の糖鎖構造を有する、本発明により製造した３分岐型糖鎖を導入することにより、新たな生理活性を有する新規な糖タンパク質を合成することも可能である。
【００３４】
また、天然の糖タンパク質に存在する糖鎖を本発明により製造した３分岐型糖鎖と置換することにより新たな生理活性を付与することも可能である。糖タンパク質が有する糖鎖を本発明により得られた３分岐型糖鎖と置換する技術としては、例えば、Ｐ．Ｓｅａｒｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，ｖｏｌ２９１，ｐ２３４４〜２３５０に記載の方法をあげることができる。すなわち、糖タンパク質をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｈ）で処理してタンパク質表面のアスパラギン残基にはＮ−アセチルグルコサミン残基が１つだけ結合した状態にする。次いで、本発明により得られた所望の３分岐型糖鎖をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｍ）を用いて、前記Ｎ−アセチルグルコサミン残基に結合させるという方法があげられる。また、ｔＲＮＡにＮ−アセチルグルコサミンを結合させておいて、大腸菌などの発現系を利用してＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖タンパク質を合成後、本発明により得られた所望の３分岐型糖鎖をＥｎｄｏ−Ｍを用いて導入することも可能である。
【００３５】
また、現在、糖タンパク質を治療薬として利用する際の問題として、投与された糖タンパク質の代謝速度が速いことがあげられる。これは、糖タンパク質の糖鎖末端に存在するシアル酸が生体内で除去されると直ちに当該糖タンパク質が肝臓により代謝されることによる。そのため、ある程度の量の糖タンパク質を投与する必要がある。そこで、本発明により糖鎖の末端に除去されにくいシアル酸を新たに組み込んだ糖鎖を製造し、対象タンパク質に当該糖鎖をＥｎｄｏ−Ｍを利用して導入すれば、生体内での糖タンパク質の代謝速度を制御することが可能となり、投与する糖タンパク質の量を低くすることも可能である。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００３７】
実施例１
ＦＥＴＵＩＮ（ＳＩＧＭＡ社製、１ｇ）を、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７.０，２０ｍｌ）に溶解させた後、ＮａＮ３（1０ｍｇ）を加える。このものに、オリエンターゼＯＮＳ（ＨＢＩ社製、１００ｍｇ）を加え５０℃で約２４時間静置させる。反応の終了をＴＬＣにて確認した後、反応液をセライトにて濾過する。濾液を濃縮により減じ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，２.５×１００ｃｍ，Ｈ２Ｏ）で精製する。目的とする糖が含まれるフラクションを集めて濃縮、次いで凍結乾燥を行う。得られた残留物（約４００ｍｇ）に、トリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ｐＨ＝７.５，２０ｍｌ）、ＮａＮ３（２０ｍｇ）を加え、溶解させる。このものに、アクチナーゼＥ（４０ｍｇ）を加え１２時間おきにｐＨをチェックしながら２４時間静置させる。ここで、アクチナーゼＥ（２０ｍｇ）をさらに追加して、１２時間おきにｐＨをチェックしながら４８時間静置させる。反応の終了をＴＬＣで確認した後、セライトろ過を行い、濾液を濃縮して減じ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，２.５×１００ｃｍ，Ｈ２Ｏ）で精製する。目的とする糖が含まれるフラクションを集めて濃縮、次いで凍結乾燥を行う。
【００３８】
得られた残留物（約２５０ｍｇ）に、水（１.２５ｍｌ）、重炭酸ナトリウム（６６ｍｇ）を加え溶解させる。反応液を、氷冷した後、ＤＭＦ（１.７５ｍｌ）を滴下させる。さらに、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕを（１３０ｍｇ）を加え、室温で２時間反応させた。原料の消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、反応液を、アセトン（約６０ｍｌ）中にゆっくりと滴下させる。析出してきた結晶を濾別したのち、乾燥させる。結晶を、水に溶解させた後、ＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ−ＯＰＮ、ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）にて、一度精製を行う。目的の糖鎖群が含まれるフラクションを、ＨＰＬＣにて確認した後、それらを集め濃縮する。この液を、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４  ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７.５ｍｌ／ｍｉｎ.，ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）。１５分付近に出てくる糖鎖群（１）、および２０分付近に出てくる糖鎖群（２）を分取後、濃縮、次いでＯＤＳカラムにて脱塩処理を行う。これを分取後、ＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ−ＯＰＮ、ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥させる。
【００３９】
それぞれの糖鎖群を、４０ｍＭのＨＣｌ溶液で２％濃度となるように溶解させ、５０℃で、反応をＨＰＬＣでモニターしながら約３４時間反応させる。それぞれ、原料がほぼ消失したのを確認した後、氷冷下に飽和重炭酸ナトリウム水溶液で中和する。反応液をメンブランフィルターでろ過した後に、濃縮を行う。それぞれの液を、ＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４  ｂｕｆｆｅｒ＝１８／８２，７.５ｍｌ／ｍｉｎ.，ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）。
糖鎖群（１）からは、３７分後に得られるピーク、糖鎖群（２）からは、３７分後に得られるピークを集め、それぞれ濃縮を行った後、ＯＤＳカラム（コスモシール７５Ｃ−ＯＰＮ、ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）にて脱塩処理を行い、濃縮、凍結乾燥させると、糖鎖群（１）からは、化合物１が約３.８ｍｇ、糖鎖群（２）からは化合物２が約８.３ｍｇ得られた。
【００４０】
【化３】
2006022191.tif 000004
【００４１】
得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４.８１）
７.９６，７.７６（ｅａｃｈ  ｄ，ｅａｃｈ  ２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７.５５，７.４８（ｅａｃｈ  ｔ，ｅａｃｈ  ２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５.１７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ１），５.０５（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ１），４.９８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ１），４.６６−４.５８（ｍ，４Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ１×４），４.５２（ｂｄ，３Ｈ，Ｇａｌ−Ｈ１×３），４.３７（ｂｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４.２６（ｂｓ，２Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ２×２），４.１６（ｄ，１Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ２），２.７８，２.５９（ｅａｃｈ  ｂｄｄ，ｅａｃｈ  １Ｈ，Ａｓｎ−ＣＨ２），２.１３，２.１０（ｅａｃｈ  ｓ，ｅａｃｈ  ６Ｈ，Ａｃ×４），１.９４（ｂｓ，３Ｈ，Ａｃ）
【００４２】
【化４】
2006022191.tif 000005
【００４３】
得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４.８１）
７.９８，７.７７（ｅａｃｈ  ｄ，ｅａｃｈ  ２Ｈ，Ｆｍｏｃ），７.５７，７.４９（ｅａｃｈ  ｔ，ｅａｃｈ  ２Ｈ，Ｆｍｏｃ），５.１７（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ１），５.０６（ｄ，１Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ１），４.９８（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ１），４.６７−４.５０（ｍ，４Ｈ，ＧｌｃＮＡｃ−Ｈ１×４），４.５４，４.５２，４.５０（ｅａｃｈ  ｄ，ｅａｃｈ  １Ｈ，Ｇａｌ−Ｈ１×３），４.４０（ｂｔ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４.２７（ｂｓ，２Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ２×２），４.１７（ｄ，１Ｈ，Ｍａｎ−Ｈ２），２.７８，２.５９（ｅａｃｈ  ｂｄｄ，ｅａｃｈ  １Ｈ，Ａｓｎ−ＣＨ２），２.１３，２.１１（ｅａｃｈ  ｓ，ｅａｃｈ  ６Ｈ，Ａｃ×４），１.９５（ｂｓ，３Ｈ，Ａｃ）
【００４４】
実施例２  （ビオチン化）
実施例１で得られた糖鎖アスパラギンＦｍｏｃ体１μｍｏｌあたりに２４０μＬのＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、１６０μｌのモルホリンを加え、室温下アルゴン雰囲気で反応させた。ＴＬＣ（展開溶媒として１Ｍ  酢酸アンモニウム：イソプロパノール＝８：５を用いた）にて反応終了を確認した後、氷水で冷却した。ここにジエチルエーテルを反応溶液の１０倍量加えて１５分間攪拌した後、析出した沈殿物をろ別した。得られた残渣を水に溶解させ、３５℃でエバポレートした。更にトルエンを３ｍｌ加えエバポレートするという操作を３回繰り返した。残留物をゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）により精製して、Ｆｍｏｃ基の除去された糖鎖アスパラギンを得た。
上記で得られた化合物（６ｍｇ，２.５８μｍｏｌ）を水（３００μｌ）溶かし重炭酸ナトリウム（２.１ｍｇ，２４.９μｍｏｌ）を加えた。ここに、Ｄ−（＋）−ビオチニルスクシンイミド（４.２ｍｇ，１２.３μｍｏｌ）を溶かしたジメチルホルムアミド（３００μｌ）を加え、室温で２０分反応させた。原料消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、エバポレーターを用いて濃縮した。残渣をゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）で精製し、下記に示すビオチン化３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体（６.２ｍｇ，９４％）を得た。
【００４５】
実施例３  （ビオチン化）
化合物１を化合物２に変えた以外は、実施例２と同様にしてビオチン化を行った。
【００４６】
実施例４  （ＦＩＴＣ化）
実施例２と同様にして、Ｆｍｏｃ基の除去された糖鎖アスパラギンを得た。
上記で得られた化合物（１.４ｍｇ、０.６０μｍｏｌ）を、精製水  ７０μｌに溶解させた。このものにアセトン７０μｌ、ＮａＨＣＯ３（０.７６ｍｇ，９μｍｏｌ）を加え、室温化に撹拌した後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ，０.９５ｍｇ，２.４ｍｍｏｌ，ＳＩＧＭＡ社製）を加え約２時間撹拌した。２時間後、ＴＬＣにて反応の終了を確認した後、アセトンを減圧下に留去させ、残った水溶液をゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて精製し目的物の含まれる分画を集めた。集めた分画を濃縮後、ＨＰＬＣ（ＹＭＣ−  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４  ｂｕｆｆｅｒ＝１０／９０，７.５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）で分取した後、濃縮、次いでゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて脱塩処理を行った。目的物の含まれる分画を集め、濃縮後、凍結乾燥を行うと下記に示す蛍光標識化（ＦＩＴＣ化）された３分岐型糖鎖アスパラギン誘導体（１.２ｍｇ，７３.５％  ｙｉｅｌｄ）が得られた。
【００４７】
実施例５  （ＦＩＴＣ化）
化合物１を化合物２に変えた以外は、実施例４と同様にしてＦＩＴＣ化を行った。
【００４８】
実施例６  （マイクロプレートの製造）
９６穴ＢＤバイオコートストレプトアビジン（ＢＤバイオサイエンス社製：バイオアッセイ用、結合能：５ｎｇ／１穴）に、実施例２のビオチン化糖鎖アスパラギン１００μｇ（ビオチン結合能の約１０倍相当量）を蒸留水に溶かし１０００μｌとした。この調整溶液を１穴当り１０μｌとなるように各ウェルに加え、蒸留水で３回洗浄し、マイクロプレートを製造した。各ビオチン化糖鎖アスパラギンの結合収率は、９５％以上であった。固定化率の確認は、洗い出された非固定化糖鎖残量より算出した。
【００４９】
実施例７  （マイクロプレートの製造）
実施例２で得られた化合物を実施例３で得られた化合物に変えた以外は、実施例６と同様にしてマイクロプレートの製造を行った。
【００５０】
実施例８  （アフィニティーカラムの製造）
アビジンコートビーズ（日立ソフトウェアーエンジニアリング社製、ｘＭＡＰ  ＬｕｍＡｖｉｄｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  １ｍｌ）１０ｍｌと実施例２のビオチン化糖鎖アスパラギン３０ｍｇをスラリー状態で撹拌し、ビーズをろ過、洗浄した。洗浄は、ビーズ体積の２倍量の蒸留水を使用して、３回ろ紙上で洗浄した。固定化の確認は、洗浄回収されたビオチン化糖鎖アスパラギンの残量により確認した。次に上記のビオチン化糖鎖アスパラギン固定ビーズ１０ｍｌを３０ｍｌの蒸留水でスラリー状態のまま、ガラス製のオープンクロマトカラム（φ２０ｍｍ、長さ３００ｍｍ）に充填し、アフィニティーカラムを製造した。
【００５１】
実施例９  （アフィニティーカラムの製造）
実施例２で得られた化合物を実施例３で得られた化合物に変えた以外は、実施例８と同様にしてアフィニティーカラムの製造を行った。