(57)【要約】【課題】  本発明者らは、白質病変を主とするヒトの微小脳血管障害についての、再現性のある霊長類モデル動物を開発することを課題とした。【解決手段】  本発明者らは、非ヒト霊長類動物の末梢血中に光感受性色素を投与し、ラクナ性脳梗塞を発生させたい大脳皮質の領域にコールドランプを直接的かつ限局的に照射することにより、脳内の毛細血管を限局的に閉塞させることにより、霊長類の大脳新皮質の任意の領域に虚血を作製し、その結果、ヒトラクナ性脳梗塞の非ヒト霊長類疾患モデル動物を提供することができることを明らかにし、本発明を完成するに至った。。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大脳皮質の灰白質の所望の領域に限局的な梗塞巣を有し、当該梗塞巣周辺の白質に活性化アストロサイトが高密度で分布した、ヒトラクナ性脳梗塞の非ヒト霊長類疾患モデル動物。
【請求項２】
非ヒト疾患霊長類モデル動物がカニクイザル由来である、請求項1に記載のヒトラクナ性脳梗塞の非ヒト霊長類疾患モデル動物。
【請求項３】
末梢血中に光感受性色素を投与し、梗塞を発生させたい大脳の領域にコールドランプを限局的に照射することにより作出する、請求項1または2に記載のヒトラクナ性脳梗塞の非ヒト霊長類疾患モデル動物。
【請求項４】
光感受性色素がローズベンガルである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のヒトラクナ性脳梗塞の非ヒト霊長類疾患モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳血管性痴呆症に対する薬剤の開発に有効な動物モデルとなりうる、再現性のあるラクナ性脳梗塞の霊長類モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
老人性痴呆症の原因は、アルツハイマー病と脳血管障害（ラクナ性脳梗塞）があることが知られている。ラクナ性脳梗塞は、脳内に存在する直径0.2 mm〜0.3 mm程度の動脈が閉塞して、脳内にできた、直径15 mm以下の小梗塞のことをいう。ラクナ性脳梗塞は、加齢、高血圧、糖尿病、高脂血症、喫煙、脱水などが原因となって生じるが、無症状のまま推移する場合がある一方で、片麻痺やしびれ、言語障害、複視など、様々な症状を引き起こす可能性がある梗塞である。そして、ラクナ性脳梗塞が進行・多発すると、認知機能が低下し、その結果脳血管性痴呆を発症したり、嚥下機能が低下してむせやすくなる等の症状を来す。
【０００３】
日本では、脳血管性痴呆の患者の方がアルツハイマー病の患者よりも数が多いことが報告されており、その結果、脳血管性障害により生じる社会的クオリティ・オブ・ライフ（QOL）の低下が重要な問題となっている。これまで、ヒトのラクナ性脳梗塞に対する治療薬の開発に有効なモデル動物を開発する試みが、当該技術分野において行われてきた。
【０００４】
脳梗塞のモデル動物としては、これまでに主にげっ歯類動物（ラットあるいはマウス）を用いて研究が進められてきた。例えば、げっ歯類動物においては、光感受性色素であるローズベンガルの存在下で、脳にコールドライトを照射すると、照射部位で梗塞が生じる現象が知られている（非特許文献1）。しかしながら、これまでのところ、再現性のあるヒトラクナ性脳梗塞モデル動物は、未だに樹立されていなかった。
【０００５】
そして、これまでのヒトラクナ性脳梗塞モデル動物は、再現性に乏しく、また脳組織のダメージの程度が実施した動物間で非常にばらついてしまうため、薬剤の開発に際しては、とても多くの実験数をこなさなければ、統計的に有意な実験データを得られないなど、痴呆症治療薬の開発における大きなネックになっていた。
【０００６】
【非特許文献１】Schroeter et al., Journal of Neuroscience Methods, 117, 43-49, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、白質病変を主とするヒトの微小脳血管障害についての、再現性のある霊長類モデル動物を開発することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、光感受性色素を用いて、ラクナ性脳梗塞を発生させたい大脳皮質の領域に限局的に虚血を作製し、ラクナ性脳梗塞を発生させることができることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、非ヒト霊長類動物の末梢血中に光感受性色素を投与し、ラクナ性脳梗塞を発生させたい大脳皮質の領域にコールドランプを直接的かつ限局的に照射することにより、照射部位の脳内に血栓を形成させて、毛細血管を限局的に閉塞させることにより、霊長類の大脳新皮質の任意の領域に虚血を作製し、その結果、ヒトラクナ性脳梗塞の非ヒト霊長類疾患モデル動物を提供することを特徴とする。
【００１０】
本発明において使用することができる動物は、非ヒト霊長類動物である。本発明においては、非ヒト霊長類動物として、カニクイザル、アカゲザル、リスザル、マーモセット等を使用することができる。この場合、脳構造、遺伝的バックグラウンド、タンパク質プロファイルなどの生物情報が多い非ヒト霊長類動物を使用することにより、ヒトと非ヒト霊長類動物との間で存在する脳の構造における差異、遺伝的バックグラウンドの差異、タンパク質プロファイルの差異などに基づく疾患状態の差異を、最小化することが可能になる。本発明においては、これらの生物情報がより多く知られているカニクイザルを使用することが好ましい。
【００１１】
本発明において使用することができる光感受性色素は、末梢血中で外部からの光エネルギーを受けた際、末梢血管に損傷を生じることができるものであれば、どのようなものを使用してもよい。そのような特性を有する光感受性色素の作用機序としては、外部からの光エネルギーを受けて末梢血中でフリーラジカルを発生し、そのフリーラジカルにより末梢血管に損傷を生じさせるタイプの光感受性色素、光増感物質、等が知られている。このような光感受性色素の例としては、ローズベンガル、エリスロシンB等を使用することができる。より好ましくはローズベンガルを使用する。例えば、光感受性色素としてローズベンガルを使用する場合、ローズベンガルを生理食塩水中に溶解し、5〜40 mg/kg体重を静脈注射で被検体動物に投与する。
【００１２】
コールドランプの照射の条件は、使用する光感受性色素の種類によって異なり、それぞれの光感受性色素に適した波長、強度、照射時間を、当業者が適宜選択することができる。例えば光感受性色素としてローズベンガルを使用する場合、ローズベンガルが562 nmにおいて励起されることから、560 nm（緑色光）の波長域において測定したエネルギーが350〜1300 J/cm2の強度であるコールドランプまたはレーザー光等のいずれかの光源を使用することができるが、これらには限定されない。好ましくは560 nm（緑色光）の波長域において測定したエネルギーが650 J/cm2の強度である白色光を、5〜20分間照射、ラクナ性脳梗塞を発生させたい大脳皮質上の部位に照射する。
【００１３】
大脳皮質における梗塞巣は、実験の目的に応じて、大脳皮質のどの領域にも発生させることができる。例えば、ラクナ性脳梗塞が随意運動機能に与える影響を調べる場合には、大脳皮質の運動機能を司る運動野にラクナ性脳梗塞を発生させることができ、また、ラクナ性脳梗塞が認知・記憶に与える影響を調べる場合には、大脳前頭前野にラクナ性脳梗塞を発生させることができる。そして、発生させるラクナ性脳梗塞の数も、目的に応じて自由に変更することができ、そして発生させたい梗塞の重傷度も、自由に変更することができる。
【００１４】
ヒトの皮質（灰白質）から白質にかけてラクナ性脳梗塞が発生した場合に、白質の梗塞巣周辺に活性化アストロサイトが高密度にそして広範囲に、分布するという特徴を有することが知られている（Leonard & Julio, H., Stroke, 26, 1293-1301, 1995）。従って、本発明においては、高い再現性で白質部位に一定の傷害部位を有するヒトのラクナ性脳梗塞のモデル動物を作製するため、大脳回（Cerebral gyrus）の部位から白質に向けて一定の大きさの脳梗塞巣を作ることが好ましい。そして、本発明の方法にしたがって非ヒト霊長類の灰白質に形成されたラクナ性脳梗塞を病理学的に解析すると、梗塞巣は主として大脳皮質の灰白質に生じ、その梗塞の発生に対する反応として、活性化アストロサイトが白質に高密度でかつ広範囲に分布することが明らかになった。その一方で、実際に梗塞巣が発生している皮質（灰白質）においては、活性化アストロサイトの密度が白質と比べて低いことも明らかになった。このような病理学的所見は、ヒトにおけるラクナ性脳梗塞の病理学的所見と類似していた。
【００１５】
一方、マウスにおいて同様の方法により大脳皮質に形成されたラクナ性脳梗塞の梗塞巣を病理学的に解析すると、梗塞の発生に対する反応として、活性化アストロサイトが梗塞巣周辺の灰白質および白質の両方ともに、比較的低密度で均一に分布することが明らかになった。ヒトおよび本発明において作出した非ヒト霊長類でのラクナ性脳梗塞の病理学的所見は、ラットにおけるこの様な活性化アストロサイトの分布とは、全く異なるものである。
【００１６】
活性化アストロサイトの分布様式にこのような相違が存在する原因として、ヒトの脳構造とげっ歯類の脳構造とが大きく異なること、すなわち、ヒトでは、神経繊維が密集し伝達を司る白質領域が、ニューロンが集積する大脳皮質の灰白質領域に比べて非常に広い体積を占め、発達しているという特徴を有するが、げっ歯類では、白質領域がほとんど発達していないということ、が考えられる。また、脳神経細胞の細胞死に対する感受性、グリア細胞の反応性に関しても、ヒトとげっ歯類とでは種差があることも、原因として考えられる。そして、このような活性化アストロサイトの分布様式の相違が存在していたために、げっ歯類動物を用いるこれまでの研究で、再現性のあるヒトラクナ性脳梗塞のモデル動物が樹立できなかったと考えられた。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法により、非ヒト霊長類動物の所望の大脳領域の灰白質に限局的なラクナ性脳梗塞の梗塞巣を有し、当該梗塞巣周辺の白質に活性化アストロサイトが高密度で分布した、ラクナ性脳梗塞の疾患モデル霊長類動物を作出することができる。
【００１８】
これまでは再現性のあるラクナ性脳梗塞の動物モデルはなかったことから、本発明のラクナ性脳梗塞の動物モデルは、虚血症状の軽減を目指した研究に、痴呆症に対する薬剤の開発に、再生医療研究のための疾病モデルとして、または脳機能（特に高次機能）研究のためのモデル動物として、有効な動物モデルとなる。
【発明の実施の形態】
【００１９】
白質部位が傷害される脳梗塞モデルを開発するために、脳構造、遺伝子、タンパク質などの生物情報が多く、医科学実験に用いられている、代表的な非ヒト霊長類実験動物であるカニクイザルを選定した。カニクイザルを用いた非ヒト疾患モデル動物の作出は、次の様にして行う。
【００２０】
まず、カニクイザルを全身麻酔して、虚血を誘導したい大脳皮質部位を露出させ、続いて光感受性色素であるローズベンガル（Rose Bengal）（Aldrich社）を静脈から注入する。静脈注射したローズベンガルが脳に到達するまで5〜10分間経過した後、露出させた大脳皮質部位に、560 nmの波長域において測定したエネルギーが約650 J/cm2の強度のコールドライト（林時計工業株式会社）を20分間照射する。コールドライトの照射を受けてローズベンガルから発生された活性酸素により、ライト照射部位に存在する大脳皮質内の微細な血管の内皮細胞が傷害されて血栓ができ、その結果、ライト照射部位にのみ選択的に限局的な虚血が誘導される。
【００２１】
このようにして虚血を誘導したカニクイザルの大脳について、病理学的解析を行う。病理学的解析では、通常の脳組織切片染色に用いられるNissl染色、NeuN染色の他、細胞死をおこした細胞を特定するためのTUNEL染色、梗塞修復時に出現する活性化アストロサイトを特異的に染色する免疫組織化学染色、その他の免疫組織化学染色などを用いて、梗塞巣とその周辺領域における組織学的変化を網羅的に解析し、虚血後の細胞死の状態、ミクログリアの増殖と活性化、血管新生等についての知見を得て、本件発明の方法で作製した梗塞の特徴を確認することを目的とする。
【実施例】
【００２２】
実施例1：カニクイザルでの大脳ラクナ性脳梗塞の作製
本実施例は、カニクイザルにおいて、ラクナ性脳梗塞を作出することを目的として行った。
【００２３】
被検動物としては、6歳のオスのカニクイザル（体重4.5 kg）を使用した。この動物を、塩酸ケタミン（筋注）を用いて麻酔導入し、イソフルレン（吸入麻酔）を用いて麻酔を維持した。1回目の光照射は、右半球前頭前野および左半球運動野に梗塞巣を作製することを目的としており、該当する部分の頭蓋骨を切開し、目的とする大脳領域を露出させた。
【００２４】
この被検動物に対して、20 mg/kg体重のローズベンガル（すなわちこの動物の場合には90 mg）を静脈から投与し、10分間経過した後、目的とする右半球前頭前野および左半球運動野に、560 nmの波長域において測定したエネルギーが約650 J/cm2の光照射エネルギーを持つコールドランプを、1回につき20分間照射した。右半球前頭前野については、4回の光照射を行い、左半球運動野については、1回の光照射を、それぞれ行った。
【００２５】
右半球前頭前野および左半球運動野に光照射を行った9日後に、この動物に対して、さらに左半球前頭前野および右半球運動野に、上述した照射条件と同一の条件を用いて、2回目の光照射を行い、梗塞巣の誘導を行った。左半球前頭前野については、4回の光照射を行い、右半球運動野については、1回の光照射を、それぞれ行った。
【００２６】
なお、対照として、ローズベンガルを投与する前に、右半球の体性感覚野に、上述した照射条件と同一の条件を用いて、コールドランプの照射を1回行った。
【００２７】
2回目の照射の1日後（すなわち1回目のの照射の10日後）に、被検動物を犠死せしめ、当該動物から大脳全体を採取した。
次いで、梗塞巣の誘導後の大脳の外観を観察した（図1）。図1において、（A）虚血後10日目の右半球前頭葉；（B）虚血後10日目の左半球運動野；（C）虚血後1日目の左半球前頭葉；（D）虚血後1日目の右半球運動野をそれぞれ示す。（E）は、ローズベンガル投与の前に光照射した対照部位の1日後の部位である。この外観の観察から、ローズベンガル投与後に上述した照射条件でコールドランプを照射すると、照射した領域（A）〜（E）で虚血に伴う限局的な梗塞巣が形成されることが明らかになった。その一方で、ローズベンガル投与前に同様の照射条件でコールドランプを照射しても、その場所では外観上梗塞巣は形成されていなかった。このことから、任意の領域に、複数の梗塞巣を作製することができることが明らかになった。また、虚血の誘導の1日後には、外観的に梗塞巣が形成され、その梗塞巣は10日間経過してもほぼそのまま維持された。
【００２８】
実施例2：光照射の回数と梗塞巣の状態との関連性
本実施例においては、このカニクイザルの大脳において虚血作製後に生じた梗塞巣について、光照射の回数と発生した梗塞巣の状態との関係を調べた。
【００２９】
具体的には、採取した脳をコンパウンド中で凍結固定し、クリオスタットを使用して脳の凍結薄切切片を作製した後、切片をクレシルバイオレットによりNissl染色した。結果を図3に示す。（A）は、実施例1で示した照射条件で、光照射を1回行うことにより虚血を作製した後1日目の運動前野（6野）〜一次運動野（4野）の組織像を；（B）は、実施例1で示した照射条件で、光照射を4回行うことにより虚血を作製した後1日目の前頭前野（9野〜46野）の組織像をそれぞれ示す。バーは5 mmを示す。
【００３０】
この組織切片から、（A）においては灰白質に限局的な梗塞像が見られるのに対して、（B）においては、灰白質だけではなく白質に至るまで、広範囲な梗塞像が見られた。この結果から、実験条件により、虚血の強度を調節することができ、ひいては梗塞巣の範囲や重傷度を調節することができることが明らかになった。
【００３１】
実施例3：梗塞巣およびその周辺における細胞死の検出
本実施例においては、梗塞巣およびその周辺における細胞死の状況を組織学的に検討した。
【００３２】
具体的には、実施例2と同様にして脳の組織切片を作製し、その切片をNissl染色およびTUNEL染色した。TUNEL染色は、TUNEL染色用キット（Intergen社から購入）を用いて行った。結果を図3に示す。（A）は梗塞巣中心部のNissl染色像；（B）は梗塞巣周辺部のNissl染色像；（C）は健常部位のNissl染色像；そして（D）は梗塞巣中心部のTUNEL染色像；をそれぞれ示す。（D）において、緑色の蛍光はTUNEL染色により染色されたゲノム断片化をおこしている核を示し、青色の蛍光はDAPIにより染色されたゲノム断片化をおこしていない核を示す。バーは50μmを示し、（B）および（C）は（A）と同じ倍率である。
【００３３】
この組織切片から、梗塞巣の中心部では、Nissl染色で見ても明らかに細胞が激減していることがわかる（A）。そして梗塞巣の中心部では、TUNEL染色により多くの細胞が染色されることから（D）、梗塞巣の中心部においてはゲノム断片化を伴う細胞死が生じた結果細胞が減少したことがわかった。また、梗塞巣の周辺部でも、健常部位と比較して、明らかに細胞が減少していることがわかった（B）。
【００３４】
実施例4：梗塞巣およびその周辺における活性化アストロサイトの検出
本実施例は、本発明の方法により作製した大脳皮質の梗塞巣およびその周辺において、活性化アストロサイトがどのように分布するかを明らかにするために行った。
【００３５】
実施例2と同様の方法により、虚血誘導後10日目のカニクイザル由来の脳の組織切片を作製し、これを活性化アストロサイトの細胞表面マーカーであるGFAPに対する抗体を用いて、免疫組織化学を行った。結果を図4に示す。（A）は、梗塞巣周辺の低倍率像；（B）は、梗塞巣周辺の灰白質の高倍率像；（C）は、梗塞巣周辺の白質の高倍率像；をそれぞれ示す。
【００３６】
この図からも明らかなように、梗塞が発生した際に損傷部位の修復のために集積する活性化アストロサイトが、梗塞が実際に存在する灰白質の周辺部領域よりも、梗塞巣の深部に位置する白質において、より高密度に存在していることが明らかになった。
【００３７】
通常のアストロサイトは、グリア線維性酸性タンパク質（Glial Fibrillary Acidic Protein；GFAP）は陽性であるが、結合組織成長因子（Connective Tissue Growth Factor；CTGF）は陰性であるという特徴を有する（すなわち、GFAP+／CTGF-）のに対して、活性化アストロサイトでは、GFAPおよびCTGFがともに陽性であるという特徴を有する（すなわち、GFAP+／CTGF+）。この知見に従って、本実施例においてはさらに、梗塞誘導後の梗塞巣周辺組織におけるGFAP+／CTGF+細胞を活性化アストロサイトとして検出した。
【００３８】
マウスでは、本発明の方法と同様にして梗塞を作製した後1ヶ月経過すると、活性化アストロサイトの細胞頻度が梗塞を発生させた後4日後における細胞頻度の約20％まで減少するのに対して、本発明の方法で作製したカニクイザルの脳では、活性化アストロサイトが、梗塞を発生させた後1ヶ月後においても、梗塞を発生させた後10日後における細胞頻度とほぼ同じく高頻度を維持していた（図5）。また、カニクイザルでは、白質において高密度で活性化アストロサイトが存在しているという特徴が、1ヶ月経過後も維持されていた。
【００３９】
本実施例で示すこのような特徴は、実際にヒトのラクナ性脳梗塞の梗塞巣周辺で生じている病理学的特徴と類似していたことから、本発明の方法により作製した梗塞巣が、活性化アストロサイトの集積の観点でも、ヒトのラクナ性脳梗塞のモデルとして有用であることが示された。
【００４０】
実施例5：梗塞の学習に対する影響
本実施例においては、本発明の方法で作製した梗塞が、学習に対してどのような影響を与えるかを明らかにすることを目的に行った。
【００４１】
被検動物として、3歳のオスのカニクイザル（体重3.7 kg）を使用した。この被検動物には、虚血を作製する前に、2週間にわたり、短期記憶課題である遅延反応課題の学習期間を設けた。遅延反応課題とは、空間位置（例えば、左または右に呈示せれる手掛かり刺激の位置）を覚えていて、遅延時間の後、記憶している手掛かり刺激の方向を選択する課題である。そして、本実施例においては、遅延時間10秒における正答率が約9割に達した時点で学習を終了した。
【００４２】
この学習を終了した後、実施例1と同様の方法により、この被検動物の左右両半球の前頭前野に、560 nmの波長域において測定したエネルギーが約650 J/cm2の光照射エネルギーを持つコールドランプを、20分間照射して、虚血を誘導した。
【００４３】
次いで、学習に対する虚血の影響を評価するため、上述した学習期間と同様の遅延反応課題を2週間にわたって再び行い、虚血作製の前後における成績（正答率）を比較した。結果を図6に示す。
【００４４】
この結果、虚血の作製後は、全般的に正答率が顕著に低下した。特に、短い遅延時間での正答率の低下は著しかった。また、虚血作製後は、遅延時間の長さ（10〜60秒）に関わらず、ほぼ同じ正答率であったことから、学習の効果が全く見られないことが明らかになった。この結果から、本発明の方法により作製したカニクイザルの梗塞モデルは、ヒトにおけるラクナ性脳梗塞の症状と同様、学習能力が低下するという特徴を示し、疾患モデル動物として有用であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の方法により、非ヒト霊長類動物の所望の大脳領域の灰白質に限局的なラクナ性脳梗塞の梗塞巣を有し、当該梗塞巣周辺の白質に活性化アストロサイトが高密度で分布した、ラクナ性脳梗塞の疾患モデル霊長類動物を作出することができる。
【００４６】
これまでは再現性のあるラクナ性脳梗塞の動物モデルはなかったことから、本発明のラクナ性脳梗塞の動物モデルは、虚血症状の軽減を目指した研究に、痴呆症に対する薬剤の開発に、再生医療研究のための疾病モデルとして、または脳機能（特に高次機能）研究のためのモデル動物として、有効な動物モデルとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1は、右半球前頭前野（A）および左半球運動野（B）の虚血後10日目の外観ならびに左半球前頭前野（C）および右半球運動野（D）の虚血後1日目の外観を示す図である。（E）は照射1日後の対照部位を示す。
【図２】図2は、光照射を1回行って虚血を作製した後に形成される梗塞巣と光照射を4回行って虚血を作製した後に形成される梗塞巣の範囲および重傷度を、組織学的に解析した結果を示す図である。
【図３】図3は、梗塞巣の中心部および周辺部での細胞死の状況を示す図である。
【図４】図4は、カニクイザルにおいて梗塞を誘導した後10日目における梗塞巣のGFAP染色像を示す図である。
【図５】図5は、カニクイザルとマウスにおいて、梗塞後の活性化アストロサイト数の経時的変化を示す図である。
【図６】図6は、虚血作製前における遅延反応課題の正答率と比較して、虚血作製後における遅延反応課題の正答率が著しく低下することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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