(57)【要約】      （修正有）【課題】  より軟らかい納豆を得ること。【解決手段】  バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＫＦＰ８４３菌株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１２３菌株）、及びこの菌株を用いて製造した納豆である。ＫＦＰ８４３は、中国雲南省で採集したトウシから分離したものである。同定の結果、ＫＦＰ８４３の形態学的性質は、直径０．８μｍのかん菌であり、内生胞子を菌体の中央部に１個有する細菌であったので、Bacillus属に属する細菌であると同定した。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＫＦＰ８４３菌株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１２３菌株）。
【請求項２】
バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＫＦＰ８４３菌株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１２３菌株）を用いて製造したことを特徴とする納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然界から分離した菌株と、この菌株を用いて製造した納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、周知のように、蒸煮大豆に納豆菌を接種し、醗酵室の中で所定時間発酵、熟成させて製造されるものであり、従来より健康食品としての地位が与えられている。特許文献１には、納豆の品質を向上すべく改良を施した納豆菌が開示されている。
【特許文献１】特許第２５５４４５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
我が国の高齢者人口は、世界に類を見ないスピードで増加しているが、高齢者に多い疾病として、糖尿病、脳・心血管障害、高血圧症、骨・関節疾患、感染症等があり、高齢者はそれらを併発しやすい。納豆には、整腸効果・血栓予防効果・動脈予防効果や、ビタミンＫ２による骨粗鬆症・骨の老化防止効果等があることが知られている。
【０００４】
高齢者人口の増大に伴い、加齢と共に噛む力や飲み込む力が弱まった高齢者にも、食べ易い食品の需要が高まっている。特別用途食品の1つとして、咀嚼困難者用食品が含まれており、高齢者ばかりではなく、乳幼児や歯の治療などで食事が不自由な一般の人のために、開発が進められている。糸引納豆は、植物性でたんぱく質であるので、栄養学的には高齢者や乳幼児には適した食品であるが、噛む力の弱いものや飲み込む力の弱いものにとっては、豆が硬いのが欠点となる。我が国の市販納豆は、機械化が発達し冷蔵設備が普及するにつれて、以前よりも軟らかい糸引納豆が製造されるようになってきたが、まだ咀嚼困難者用や嚥下困難者用納豆に適する程のものは見当たらない。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、より軟らかい納豆を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ところで、東南アジアには多くの納豆類が存在している。東南アジアの照葉樹林帯に納豆類が分布していることを見出して、これが照葉樹林文化の１つであると提唱されたこともあった。また、中国の無塩大豆発酵食品には、食塩を加えて発酵させた鹹トウシ、食塩を加えないで発酵させた淡トウシ、甘い甜トウシの３種類がある。我が国の糸引納豆は中国のトウシの分類に従えば淡トウシに属するものである。
【０００７】
そして、本願発明者は中国雲南省でトウシの採集を行い、咀嚼困難者用納豆の開発のために検索した結果、採集したトウシから分離したトウシ菌の中に、我が国の市販納豆よりも軟らかく豆のつぶれ易い糸引納豆を製造し得る菌株を見出した。
【０００８】
すなわち、中国雲南省の淡トウシから分離した細菌でわが国の糸引納豆を製造した結果、攪拌すると豆の形が崩れてしまうほど軟らかい納豆を製造することができる菌（ＫＦＰ８４３）を見つけた。同定の結果、ＫＦＰ８４３はバチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）に属する菌であった（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１２３菌株）。かかる菌株を用いることにより、噛む力や飲み込む力の弱い高齢者又は乳幼児に好適な糸引納豆を開発することができた。
【０００９】
納豆の硬さは、市販納豆の硬さが２５１〜６００ｇであったのに対し、温度プログラムの初発温度を４３℃に設定した時納豆の硬さは５１〜３００ｇで軟らかい納豆であった。ホルモール窒素は市販納豆のそれが０．９４％であったのに対し、０．２８乃至０．３８％であった。ＫＦＰ８４３納豆の糸引きは市販納豆よりもやや弱く、相対粘度は市販納豆のそれが２．０６であったのに対し、１．１０乃至１．２１であった。官能検査では糸引きは弱いが、豆が軟らかいという評価を得た。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、より軟らかい納豆を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、トウシ菌たるＫＦＰ８４３の分離源になったトウシを図１に示す。これは、中国雲南省の「ｗａ  ｙａｏ」で採集したもので、細長く切った生姜や粉砕した唐辛子を加えてあり、トウシの大豆は大粒で粒の形を保っていた。味は、生姜の味が強く、ピリピリと辛いがまろやかであった。うま味が強く旨かった。この試料から平板塗抹法によって細菌を５株分離したが、そのうちの１株がＫＦＰ８４３であった。
【００１２】
かかる分離菌は、Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology 第２巻（以下Bergey's Manualと称す）に準拠して同定した（図２参照）。同定の結果、ＫＦＰ８４３の形態学的性質は、直径０．８μｍの桿菌で、内生胞子を菌体の中央部に１個有する細菌であったので、Bacillus属に属する細菌であると同定した。
【００１３】
更に、生理学的性質は、両株とも７％食塩を含むNutrient brothに生育し、胞子の耐熱性を有し、カタラーゼテスト陽性、嫌気条件下での生育なし、V-P brothのｐＨは６と７の間にあり、D-グルコース、L-アラビノース、D-キシロース、D-マンニトール添加による酸の生成、D-グルコースからのガス生産、カゼイン・ゼラチン・デンプンの加水分解は陽性、クエン酸資化性は陽性、チロシン分解は陰性、フェニルアラニンの脱アミノ反応は陰性、卵黄テストは陰性、硝酸塩の還元性は陽性、インドール反応は陰性、NaCl又はKClの要求性は陰性、ｐＨ６又は８のNutrient
brothでの生育は陽性で、Bergey's Manualの記載と一致した。その他に、１０℃及び５０℃での生育はd(11-89％の株が陽性)となっているが、これらの性質は、１０℃が陰性、５０℃が陽性であった。
【００１４】
以上の通り、菌学的性質は、Bergey's Manualに記載されたバチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）に属する株であると同定した。
【００１５】
本願発明者は、ＫＦＰ８４３を用いて実際に糸引納豆を製造し、その検証を行った。以下、その内容を詳述する。
【００１６】
供試菌としては、前述した中国雲南省で採集したトウシから分離したトウシ菌、ＫＦＰ８４３を用いた。純枠分離した菌株の菌学的性質は、Bergey's Manualに準拠して行った。
【００１７】
供試大豆としては、米国産大豆（２００１年産）を使用した。
【００１８】
培地としては、生育用と保存用にＮＢＰ培地又はＮＢＰ寒天傾斜培地を使用した。
【００１９】
糸引納豆を製造するにあたり、ＫＦＰ８４３の最適生育温度を測定した。具体的には、ＮＢＰ寒天に菌体を一白金耳接種し、温度を調整した水槽で培養し、最適生育温度を測定した。最適生育温度は４３℃であった。
【００２０】
納豆の製造は、納豆自動製造装置を用いて行った。酸素濃度と品温の測定には、それぞれ（株）センス製ガルバニタイプの酸素電極と温度センサを用いた。
【００２１】
納豆の硬さの測定、ホルモール窒素、粘度、及び官能検査は、納豆試験法に準拠して分析した。官能検査の統計処理は、ＳＰＳＳ社のソフトを使用した。
【００２２】
納豆の揮発成分の分析は、ガスクロマトグラフィーで分析した。
【００２３】
納豆の製造には最適温度で発酵するのがよい。図３に示すように、納豆製造温度は、ＫＦＰ８４３の最適温度が４３℃であることを考慮して、０〜８時間目までは４３℃、１０〜１３時間目は４８℃、１５〜２０時間目は４３℃、その後２０時間目から温度勾配を直線的に下げて２４時間目では５℃になるように設定した。尚、最適生育温度での製造の他に、発酵温度をそれぞれ最適生育温度よりも＋４℃高く設定した場合も納豆を製造した。
【００２４】
図４は、酸素濃度変化を示すものであって、発酵温度を４３℃又は４７℃に設定し、１０時間目から１４時間目までそれぞれ５℃ずつ上げて４８℃又は５２℃に設定したときの発酵中の納豆容器内の酸素濃度の変化を示している。
【００２５】
すなわち、ＫＦＰ８４３の発酵では、発酵開始６時間目から酸素吸収が激しくなり、１０時間目に５％以下になり、２０時間目まで続いた。酸素濃度の低下は菌の生育が活発になったことを示し、発酵が盛んに行われたことを示している。２０時間目以降酸素濃度が上昇したのは、菌の生育が停止し、ＰＳＰ容器は通気性があるため外部から酸素が流入したためであると推察される。発酵温度４７℃では、６時間目から１７時間目まで酸素濃度が低下したが、酸素濃度が５％以下である時間は短くなった。
【００２６】
そして、初発温度を最適生育温度にして製造した製品を、納豆試験法に準拠して市販納豆と比較した。図５には、その結果を示す。市販納豆の硬さは、２５１〜６００ｇであった。温度プログラムの初発温度をＫＦＰ８４３の最適生育温度に設定した時、硬さは５１〜３００ｇであった。同じく４７℃に設定した時には１０１〜３５０ｇで、４３℃の時よりもやや硬い納豆になった。ＫＦＰ８４３の納豆は市販納豆に比べて軟らかく、特に初発温度を最適生育温度（４３℃）に設定すると軟らかい糸引納豆ができた。
【００２７】
こうして得られた軟らかい糸引納豆（すなわちＫＦＰ８４３納豆）に含まれるホルモール窒素の含有量を分析した。図６に示すように、ホルモール窒素含有量は市販納豆が０．９４％であったのに対し、ＫＦＰ８４３納豆のそれは０．３８％であり、更に発酵温度を＋４℃上げた場合は０．２８％であり、いずれもたんぱく質の分解があまり進んでいないことを示した。ＫＦＰ８４３納豆のホルモール窒素含有量は、我が国の市販納豆菌で製造した納豆のそれよりも低かった。
【００２８】
ＫＦＰ８４３納豆の相対粘度を図７に示す。市販納豆の相対粘度が２．０６であったのに対して、ＫＦＰ８４３納豆では１．１０であった。ＫＦＰ８４３納豆の相対粘度は、設定温度を４℃上げて製造しても市販納豆のそれよりも低かった。設定温度の違いによって相対粘度にあまり差が見られなかったので、発酵温度は相対粘度にあまり影響を及ぼさず、菌株による粘質物の生産による影響が大きいと推察された。
【００２９】
納豆の揮発性成分は、キャピラリーガスクロマトグラフィーとＧＣ−ＭＳにて分析することができる。図８には、ＫＦＰ８４３納豆の揮発性画分のガスクロマトグラフィーを示す。納豆の臭い成分としては、以下の１０成分が挙げられる。
【００３０】
すなわち、ethanol、2,3-butanedione(diacetyl)、pyrazine、2-methylpyrazine、3-hydroxy-2-butanone(acetoin)、2,5-dimethylpyrazine、2,3,5-trimethylpyrazine、2-methylpropanoic
acid(isobutyric acid)、3-methylbutanoic acid(isovareric acid)、2-methylbutanoic
acidである。図８に示すように、ＫＦＰ８４３納豆の揮発性成分を同定したところ、ＫＦＰ８４３納豆には、2,3-butanedione(diacetyl)、3-methylbutanoic
acid(isovareric acid)、2-methylbutanoic acidのピークが検出されなかった。
【００３１】
図９は、ＫＦＰ８４３納豆の官能評価を示すものである。統計処理はＳＰＳＳ社のソフトを用いて行った。ＫＦＰ８４３納豆は、やや甘い香がし、豆の割れやつぶれは無かった。初発温度４３℃のプログラムで製造したものは、非常に軟らかく、かき回すと容易に豆がつぶれ、あたかも餡のようになった。糸引きは少なかった。発酵温度を４℃上げて製造したものはやや被りが良かった。
【００３２】
以下、ＫＦＰ８４３納豆について考察する。我が国の糸引納豆は、大豆を納豆菌で発酵させただけのものが大部分であり、唐辛子やニンニクを加えて市販するものは見当たらない。中国の淡トウシの市販品の中には豆の状態で市販するばかりでなく、豆をつぶしたり唐辛子やニンニクを加えて市販するものもあり、それらは調味のためというよりもハエ等の虫除けのためというのが第一義的な目的のようである。本願発明者が研究室でトウシ菌を分離したトウシも唐辛子や生姜を含んでいた。大韓民国の清国醤においても市販品に唐辛子とニンニクを加えて市販しているものがある。
【００３３】
我が国の糸引納豆菌は、沢村真氏がBacillus nattoと命名して以来、枯草菌Bacillus subtilisとは異なる種に属すると長い間みなされていたが、Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology第７巻（1957）において後者に属するとされて以来、Bacillus subtilisであるということになったものの、Bacillus
subtilisでは糸引納豆は作れないという理由で、Bacillus subtilis（natto）と表記されてきた。
【００３４】
本願発明者も我が国の市販納豆菌の同定を行ってきたが、市販菌の分類学的性質がBergey's Manual of Determinative Bacteriology第７巻、同８巻、Bergey's Manualに記載のBacillus
subtilisのそれらと一致することが多く、Bacillus subtilisに属するものであった。トウシの菌株を同定した結果もその分類学的性質からBacillus
subtilisに属するものと見なすことができた。清国醤菌はBacillus subtilis（natto）であり、我が国の納豆菌と同種の糸引納豆と同じものであること、清国醤はそれに唐辛子とニンニクと食塩約７％を加えて磨砕したものであることを記載したが、淡トウシから分類されたＫＦＰ８４３は、枯草菌（Bacillus
subtilis）というよりも糸引納豆菌（すなわち、Bacillus subtilis（natto））と同じものであると見なすことができた。トウシ菌も同じくBacillus
subtilisと同定されたことは、トウシ、清国醤、糸引納豆が同一の系統の大豆発酵食品であることを裏付けるものである。
【００３５】
うま味の指標としてホルモール窒素を測定したが、ＫＦＰ８４３で製造した納豆のホルモール窒素含有量は、市販納豆のそれよりも低かった。ＫＦＰ８４３の納豆では初発設定温度４３℃の納豆の方が同４７℃の納豆よりも高い値を示した。納豆のうま味は強すぎてもよくないが、弱い場合はたれを使用することで補うことができるので、納豆として問題はないといえる。
【００３６】
納豆は糸引きが特徴であるが、糸引きを好む者と好まない者とがいるので、相対粘度が低いことはこれらの菌株の納豆を製造する場合に注意すべき問題点であろう。納豆の糸を強くするために、玄米粉、米粉、アワ等の穀粉や麦を加えて製造する場合があり、また一般に収穫直後の大豆は納豆を製造すると糸の強い納豆ができるといわれている。また、大豆中のグルコースやスクロースよりもラフィノースやスタキオースが納豆の糸引きと関連するとの報告もある。大豆の可溶性糖分は糸引きと関連するであろうが、同時に対照として市販納豆菌で製造した納豆よりもＫＦＰ８４３の納豆の糸引きが弱かったことは、糸引きに対する納豆菌の影響が強かったことを示している。
【００３７】
本願発明者は、市販納豆菌の揮発性成分の中で納豆の臭い成分とされるものを比較し、既に報告した。それによれば、納豆の主要な臭い成分は業者間で異なり、大豆と納豆菌で製造した納豆よりもビール酵母を加えた納豆は臭いがまろやかであったが、それはイソ酪酸が少ないためであろうと推察した。また、納豆臭の主要成分である短鎖分岐脂肪酸を生成しない突然変異株を使用した納豆では、官能的にも他の納豆とは異なりイソ吉草酸とメチル酪酸の含量が新規納豆菌を用いて製造したことを示していた。本発明において、分離されたＫＦＰ８４３で製造した納豆のピークには、イソ酪酸もメチル酪酸も含まれていることが多かったが、揮発性成分の抽出法とガスクロマトグラフィーのカラムが上述の本願発明者の既報の報告と異なるので量的な比較はできない。製品の臭いに関してはＫＦＰ８４３の揮発性成分において２−メチル酪酸が検出されず、一般の納豆菌と本研究で製造した納豆で若干臭いに差が感じられたが、糸引納豆として見なしても差し支えないものと思われた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によれば、軟らかい納豆を得ることができ、咀嚼困難者用又は嚥下困難者用納豆に適した納豆を得ることができる。
【００３９】
尚、本発明において寄託した微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにて、平成１６年７月２０日に受領され、受領番号は前記のとおり、「ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０１２３」である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３の分離源になったトウシを示す説明図である。
【図２】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３の菌学的性質を示す説明図である。
【図３】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３納豆の製造温湿度プログラムを示す説明図である。
【図４】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３納豆の製造中における酸素濃度変化を示す説明図である。
【図５】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３納豆の硬さを示す説明図である。
【図６】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３納豆のホルモール窒素含有量を示す説明図である。
【図７】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３納豆の相対粘度を示す説明図である。
【図８】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３納豆の揮発性画分のガスクロマトグラフィーを示す説明図である。
【図９】本発明の実施例に係り、ＫＦＰ８４３納豆の品質を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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