(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＦＳＨＲ遺伝子における多型部位と排卵数との関係を解明し、該多型を用いた排卵数の多いブタの遺伝子検出を可能とし、産子数の多いブタを改良し作出するための手段を提供することを目的とする。【解決手段】  下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子、並びにその用途。（１）ブタ由来の特定なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸。（２）ブタ由来の特定なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子。
（１）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸。
（２）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子。
（１）配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸。
（２）配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子。
（１）配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および／または、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸。
（２）配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および／または、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基および／または該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域にハイブリダイズする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５】
ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基および／または該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸の第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができ、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられるプライマーペア。
【請求項７】
配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸の第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができ、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられるプライマーペア。
【請求項８】
配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および／または、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸の第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができ、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられるプライマーペア。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子および／または請求項６〜８のいずれかに記載のプライマーペアを用いて、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定する工程を含んでなる、排卵数の多いブタを予測および／または診断するための遺伝子検査法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれかに記載のプライマーペアを含んでなる、排卵数の多いブタの予測および／または診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子中の多型を利用した排卵数を改良するためのブタの遺伝子診断法および該検査法に用いられる核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタの産子数は、遺伝素因や環境因子がその原因として複雑に関与している形質である。産子数の遺伝率は、０．１と非常に低く、環境因子の影響が大きいと言われており、その改良が困難とされている。産子数の改善のためには、遺伝素因のひとつである排卵数の多いブタを選抜し、育種していくことが望まれる。
【０００３】
ブタの産子数には遺伝素因が関与するため、その原因遺伝子における遺伝的要因を調べることにより産子数の多いブタを予知することができると考えられる。このような原因遺伝子としては、各種ホルモン遺伝子、その受容体遺伝子などが考えられる。
【０００４】
ブタの排卵数に大きく関与するホルモンに卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）があり、この受容体として、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）が存在する。卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子は、６９５個のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ブタの卵巣の顆粒層細胞からはじめて単離され、同定されたペプチドである（非特許文献１参照）。ＦＳＨは、ＦＳＨＲへの結合を介して、繁殖性をコントロールする中心的な役割を果たしていることが知られている。ＦＳＨＲのペプチドのうち、最初から３４９番目のアミノ酸までは細胞外に存在し、続く２６４個のアミノ酸は細胞膜貫通領域に、最後の６５個のアミノ酸は細胞内に存在することが知られている。ＦＳＨＲは、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）や甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）などの糖タンパクホルモンの受容体と密接に関連している（非特許文献２参照）。
【０００５】
ＦＳＨＲ遺伝子における多型と繁殖形質との関連については、幾つかの報告がある。
まず、ブタのＦＳＨＲ遺伝子の全領域にわたる配列決定により２０箇所のアミノ酸置換を伴う多型が同定されており（非特許文献１）、一方、これとは別に、第１０エクソンに存在する３７７番目のコドンでのイソロイシン／スレオニンのアミノ酸置換を伴う多型（Ｉｌｅ３７７Ｔｈｒ）が、中国の品種であるErhualian（３４７腹からの産子数）と西洋の品種であるランドレース種（５０１腹からの産子数）において、産子数に関連することが報告されている（非特許文献３参照）。
【０００６】
また、ヒトにおいても、ＦＳＨＲ遺伝子の多型と繁殖性の変化に関する報告がある（非特許文献４参照）。該報告によれば、細胞外領域でのＡｌａ１８９Ｖａｌ多型は、ＦＳＨの結合能力を減少させ、シグナル伝達を阻害することが報告されている。
【０００７】
さらに、細胞膜貫通領域でのＡｌａ４１９Ｔｈｒ多型は、フィンランド人において、シグナル伝達がうまくいかないため、原発性の卵巣機能不全に関与することが報告されている（非特許文献５参照）。そして、同じ非特許文献５中には、その他の変異箇所として、細胞外領域に存在するＩｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１９１Ｉｌｅ、Ａｓｐ２２４Ｖａｌ、およびＬｅｕ６０１Ｖａｌ、並びに、細胞内に存在するＡｒｇ５７３Ｃｙｓが挙げられており、これらがＦＳＨＲを不活性化すると知られている。
【０００８】
ブタのＦＳＨＲ遺伝子における多型としては、第１エクソンである第７４番目の塩基におけるＣ／Ｇの一塩基多型、および、第６エクソンである第５３２番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型が知られている（非特許文献１参照）が、この多型がどの形質に関連するのかについては知られていなかった。
【０００９】
【非特許文献１】Remy，J J．et al．，The porcine follitropin receptor：cDNA cloning，functional expression and chromosomal localization of the gene．，Gene．163，257-261，1995
【非特許文献２】Simori M．et al．，The follicle-stimulating hormone receptor：biochemistry，molecular biology，physiology，and pathophysiology．，Endocr．Rev．18，739-773，1997
【非特許文献３】Jiang Z．et al．，A missense mutation in the follicle stimulating hormone receptor（FSHR）gene shows different allele effects on litter size in chinese Erhualian and German Landrace pigs．J．Anim．Breed．Genet．119，335-341，2002
【非特許文献４】Aittomauki K．et al．，Mutation in the follicle-stimulating hormone receptor gene causes hereditary hypergonadotropic ovarian failure．Cell．82，959-968，1995
【非特許文献５】Doherty E．et al．，A novel mutation in the FSH receptor inhibiting signal transduction and causing primary ovarian failure．J．Clin．Endocrinol．Metab．87，1151-1155，2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、ブタＦＳＨＲ遺伝子における多型部位と排卵数との関係を解明し、該多型を用いた排卵数の多いブタの遺伝子検出を可能とし、産子数の多いブタを改良し作出するための手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ブタのＦＳＨＲ遺伝子上の、第１エクソンである第７４番目の塩基におけるＣ／Ｇの一塩基多型、および、第６エクソンである第５３２番目の塩基におけるＡ／Ｇの一塩基多型が、ブタの排卵数と関係があることを見出し、該多型が産子数の多いブタの予測および／または診断に利用可能であることを見出して、核酸分子およびプライマーペア、診断用キット、ならびに排卵数の多いブタの予知・検出方法を提供するに至った。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１２】
請求項１記載の本発明は、下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子である。
（１）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸。
（２）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。
【００１３】
請求項２記載の本発明は、下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子である。
（１）配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸。
（２）配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。
【００１４】
請求項３記載の本発明は、下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子である。
（１）配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および／または、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸。
（２）配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および／または、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。
【００１５】
請求項４記載の本発明は、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基および／または該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域にハイブリダイズする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子である。
請求項５記載の本発明は、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基および／または該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子である。
【００１６】
請求項６記載の本発明は、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸の第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができ、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられるプライマーペアである。
請求項７記載の本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸の第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができ、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられるプライマーペアである。
請求項８記載の本発明は、配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および／または、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸の第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができ、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられるプライマーペアである。
【００１７】
請求項９記載の本発明は、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子および／または請求項６〜８のいずれかに記載のプライマーペアを用いて、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定する工程を含んでなる、排卵数の多いブタを予測および／または診断するための遺伝子検査法である。
請求項１０記載の本発明は、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、および／または請求項６〜８のいずれかに記載のプライマーペアを含んでなる、排卵数の多いブタの予測および／または診断用キットである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ブタＦＳＨＲ遺伝子における多型部位の塩基を同定することにより、排卵数の多いブタを正確にかつ簡便に予測および／または診断することが可能となるので、産子数の多いブタを改良し作出する手段として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において用いられるブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子（ＦＳＨＲ遺伝子）は、１０個のエクソン（エクソン１〜１０）と９個のイントロン（イントロン１〜９）とからなるものであり、その塩基配列は、配列表の配列番号１に示す通りである。
ブタＦＳＨＲ遺伝子は、第１エクソン中第７４番目（配列表の配列番号１記載の塩基配列中、７４番目）の塩基、および、第６エクソン中第５３２番目（配列表の配列番号１記載の塩基配列中、５３２番目）の塩基において、それぞれＣ／Ｇの一塩基多型（以下、「Ｃ７４Ｇ多型」と言うことがある。）、および、Ａ／Ｇの一塩基多型（以下、「Ａ５３２Ｇ多型」と言うことがある。）を有する。
【００２０】
Ｃ７４Ｇ多型におけるＣアレル、特にＣ／Ｃの遺伝子型は、排卵数のリスクファクターとして使用できる。従って、本発明の核酸分子により、ブタＦＳＨＲ遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断が可能となる。
また、Ａ５３２Ｇ多型おけるＡアレル、特にＡ／Ａの遺伝子型は、排卵数のリスクファクターとして使用できる。従って、本発明の核酸分子により、ブタＦＳＨＲ遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断が可能となる。
また、本発明の核酸分子により、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるこれらの多型の両方を同定することによっても、排卵数の多いブタの予測および／または診断が可能となる。
【００２１】
本発明の核酸分子は、下記の（１）または（２）の核酸を含み、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定しうる、排卵数の多いブタの予測および／または診断に用いられる核酸分子である。
（１）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸。
（２）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチド。
【００２２】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明に係る核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。
ストリンジェントな条件は、本発明に係る核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J．Sambrook，E．F．Frisch，T．Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory（１９８９）等を参照することができる。すなわち、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下（具体的には例えば、７０℃の融解温度の場合、６５℃でのハイブリダイゼーションが好ましい。）でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。
上記（２）配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチドについて、本発明の好ましい実施態様によれば、その核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチドを含んでなるものとすることができる。
【００２３】
本発明において「核酸分子」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２４】
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸は、Ｃ７４Ｇ多型部位の塩基がシトシン（Ｃ）であるブタＦＳＨＲ遺伝子のゲノムＤＮＡを基に設計することができる。前記ゲノムＤＮＡは、ブタＦＳＨＲ遺伝子の全エクソン（エクソン１〜１０）および全イントロン（イントロン１〜９）を含むものとすることができる。
従って、本発明の核酸分子は、エクソン１の５’末端からエクソン１０の３’末端までの塩基配列、すなわち、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸、または配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチドを含んでなるものであることが好ましい。
【００２５】
また、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸は、Ｃ７４Ｇ多型部位の塩基がグアニン（Ｇ）であるブタＦＳＨＲ遺伝子のゲノムＤＮＡを基に設計することができる。前記ゲノムＤＮＡは、ブタＦＳＨＲ遺伝子の全エクソン（エクソン１〜１０）および全イントロン（イントロン１〜９）を含むものとすることができる。
従って、本発明の核酸分子は、エクソン１の５’末端からエクソン５の３’末端まで、すなわち、配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸、または、配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００２６】
更に、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸は、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基がアデニン（Ａ）であるブタＦＳＨＲ遺伝子のゲノムＤＮＡを基に設計することができる。前記ゲノムＤＮＡは、ブタＦＳＨＲ遺伝子の全エクソン（エクソン１〜１０）および全イントロン（イントロン１〜９）を含むものであれば良い。
従って、本発明の核酸分子は、エクソン１の５’末端からエクソン１０の３’末端まで、すなわち、配列表の配列番号１記載の塩基中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸、または、配列表の配列番号１記載の塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００２７】
そして、本発明の核酸分子は、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸は、Ｃ７４Ｇ多型部位の塩基がグアニン（Ｇ）であると共に、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基がアデニン（Ａ）であるブタＦＳＨＲ遺伝子のゲノムＤＮＡを基に設計することができる。前記ゲノムＤＮＡは、ブタＦＳＨＲ遺伝子の全エクソン（エクソン１〜１０）および全イントロン（イントロン１〜９）を含むものであれば良い。
従って、本発明の核酸分子は、エクソン１の５’末端からエクソン１０の３’末端まで、すなわち、配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸、または、配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸に相補的な核酸に対してハイブリダイズする核酸またはオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００２８】
本発明の核酸分子は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子のイントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２９】
本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位の塩基の同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基を含む領域にハイブリダイズすることが好ましい。
【００３０】
また、本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＡ５３２Ｇ多型部位の塩基の同定において、核酸プローブとして用いることができる。特に、核酸プローブとして用いる場合、本発明の核酸分子は、上記核酸またはこれに相補的な核酸の、第６エクソンである第５３２番目の塩基を含む領域にハイブリダイズすることが好ましい。
【００３１】
本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位およびＡ５３２Ｇ多型部位の塩基のハイブリダイゼーション法等による同定において、核酸プローブとして用いることができる。特に、核酸プローブとして用いる場合、本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基および該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域にハイブリダイズすることが好ましい。
【００３２】
本発明に係る核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は連続した１０〜１００塩基の配列とすることが好ましく、より好ましくは連続した１２〜１００塩基の配列、さらに好ましくは連続した１５〜１００塩基の配列、さらにより好ましくは連続した１５〜５０塩基の配列とする。
【００３３】
一方、本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位の塩基の同定において、核酸増幅法による増幅の際に用いることができる。この目的のためには、本発明の核酸分子は、上記核酸の、第１エクソンである第７４番目の塩基を含む領域を増幅することができるものであることが好ましい。
【００３４】
また、本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＡ５３２Ｇ多型部位の塩基の同定において、核酸増幅法による増幅の際に用いることができる。この目的のためには、本発明の核酸分子は、上記核酸の、第６エクソンである第５３２番目の塩基を含む領域を増幅することができるものであることが好ましい。
【００３５】
更に、本発明に係る核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位およびＡ５３２Ｇ多型部位の塩基の同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明の核酸分子は、ブタＦＳＨＲ遺伝子における第１エクソン中第７４番目の塩基および該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を増幅することができるものであることが好ましい。
【００３６】
本発明の核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は連続した１０〜５０塩基の配列とすることが好ましく、より好ましくは連続した１２〜５０塩基の配列、さらに好ましくは連続した１５〜５０塩基の配列、さらにより好ましくは連続した１５〜３０塩基の配列とする。
【００３７】
このような鎖長を有する本発明に係る核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、上記Ｃ７４Ｇ多型部位、および／またはＡ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定する上で好ましいものである。
【００３８】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施されることから、本発明によれば、上記本発明の核酸分子を基にして、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子（ＦＳＨＲ遺伝子）における第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、該遺伝子における第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することにより、排卵数の多いブタの予測および／または診断を行うためのプライマーペアが提供される。
本発明のプライマーペアは、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、言い換えれば、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含む核酸の、第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
また、本発明のプライマーペアは、配列表の配列番号１記載の塩基配列中第７４番目のシトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、および／または、同塩基配列中第５３２番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換されてなる塩基配列を含む核酸の第１エクソン中第７４番目の塩基および／または第６エクソン中第５３２番目の塩基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであっても良い。
【００３９】
このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、増幅の対象となる領域の塩基配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域の塩基配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖の塩基配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
このようなプライマーペアの具体例として、Ｃ７４Ｇ多型部位の塩基を同定するためのプライマーとしては、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列表の配列番号４記載の塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーペアを挙げることができ、一方、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定するためのプライマーとしては、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列表の配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーペアを挙げることができる。
【００４０】
本発明の核酸分子および／またはプライマーペアを用いることにより、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、すなわち、第１エクソン中第７４番目の塩基がシトシン（Ｃ）であるかグアニン（Ｇ）であるか、および／または、Ａ５３２Ｇ多型部位、すなわち、第６エクソン中第５３２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを同定することができ、これにより、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子の変異を検出し、排卵数の多いブタを予測（予知）および／または診断（検出）し、ブタの産子数を改良するための遺伝子検査法として利用することができる。
【００４１】
排卵数の多いブタを予測（予知）および／または診断（検出）する場合の判断手法は、例えば、Ｃ７４Ｇ多型部位の塩基がシトシン（Ｃ）であった場合、および／または、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基がアデニン（Ａ）であった場合には、排卵数が少ないブタであると予測されたと判断することができると共に、排卵数が少ないブタとして検出することができる。
【００４２】
また、Ｃ７４Ｇ多型部位の場合、Ｃアレルを有する場合の遺伝子型としてはＣ／Ｃ、Ｃ／ＧおよびＧ／Ｃが考えられるが、検査対象となるブタがＣ／Ｇを有する場合よりもＣ／Ｃを有する場合の方が、より確実に排卵数が少なくなると予知または検出を判断することができる。
一方、Ａ５３２Ｇ多型部位の場合、Ａアレルを有する場合の遺伝子型としてはＡ／Ａ、Ａ／ＧおよびＧ／Ｃが考えられるが、検査対象となるブタがＡ／Ｇを有する場合よりもＡ／Ａを有する場合の方が、より確実に排卵数が少ないと予測および／または判断することができる。
従って、本発明の遺伝子検出法の好ましい態様によれば、本発明の核酸分子および／または本発明のプライマーペアを用いて、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位および／またはＡ５３２Ｇ多型部位の遺伝子型を同定する工程を含んでなるものとすることができる。
【００４３】
具体的には、本発明の核酸分子および／または本発明のプライマーペアを、核酸増幅法のプライマーとして用いることにより、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、および／またはＡ５３２Ｇ多型部位の塩基部分を増幅して、ブタ卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子の変異を検出することができる。
従って、本発明によれば、本発明の核酸分子および／またはプライマーペアを用いて、検査対象となるブタ由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中においてＣ７４Ｇ多型部位、および／またはＡ５３２Ｇ多型部位の塩基をそれぞれ同定する工程を含んでなり、排卵数の多いブタの予測および／または診断することを特徴とする、ブタの産子数を改良するための遺伝子検査法が提供される。
【００４４】
核酸増幅法によるブタの予測および／または診断の一例を挙げると、次の通りである、
まず、検査対象となるブタから血液等を採取し、ゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出する。得られた核酸試料を鋳型として、本発明の核酸分子および／またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物の塩基配列を解析することにより、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、および／またはＡ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定することができる。
核酸増幅法およびこれによる前記塩基の同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００４５】
続いて、核酸増幅法により得られた増幅産物の塩基配列の解析を行う。解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００４６】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とによりＣ７４Ｇ多型部位の塩基を同定する場合には、例えば、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列表の配列番号４記載の塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーペアを用いて核酸増幅法を行ない、このフォワードプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
一方、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定する場合には、例えば、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列表の配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーペアを用いて核酸増幅法を行ない、このフォワードプライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
特に、これらのプライマーペアを用いてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を行うことにより、ブタＦＳＨＲ遺伝子における各多型部位の遺伝子型の決定（タイピング）を簡単に行うことができる点で好ましい。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法とは、次のような方法である。すなわち、まず、多型部位を増幅するようなプライマーペアによりＰＣＲをした後、多型部位で制限酵素サイトが出現あるいは消滅する特定の制限酵素を利用して、ＰＣＲ産物を消化する。その結果、多型部位で切断されたＰＣＲ産物と変化しないＰＣＲ産物とに分けられるので、電気泳動により、それぞれを分離することで多型部位を判定することができる。
【００４７】
一方、核酸増幅法としてアレル特異的ＰＣＲ法を利用する場合は、該方法を実施できるようなプライマーペアを設計して用いることもできる。
具体的には例えば、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００４８】
本発明の核酸分子は、前記したようにハイブリダイゼーション法等によるブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、および／または、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基の同定において、プローブとして用いることができる。
従って、本発明によれば、プローブとしての本発明の核酸分子を用いて、検査対象となるブタ由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出し、Ｃ７４Ｇ多型部位、および／または、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基をそれぞれ同定する工程を含んでなり、排卵数の多いブタを予測および／または診断することを特徴とする、ブタの産子数を改良するための遺伝子検査（診断）法が提供される。
【００４９】
ハイブリダイゼーション複合体の存在とは、言い換えれば、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型、および／またはＡ５３２Ｇ多型に係るいずれかのアレルの存在である。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる遺伝子検査法の過程で得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション法による予測および／または診断の一例を以下に示す。
まず、検査対象のブタから血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明に係る核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、および／または、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定することができる。
核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。
ハイブリダイゼーション法とこれによる前記塩基の同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J．Sambrook，E．F．Frisch，T．Maniatis；Molecular cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory（1989）を参照することができる。
【００５１】
ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、および／またはＡ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定するには、本発明の核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。
プライマーエクステンション法は、当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的塩基配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００５２】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位の塩基が同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的塩基配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５３】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、検査対象のブタからの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位の塩基が同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的塩基配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００５４】
ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、および／またはＡ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定する場合には、さらに、本発明の核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。
遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順や、使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的塩基配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００５５】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法においては、Ｃ７４Ｇ多型部位の塩基を含む領域に対して、ＣアレルおよびＧアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。また、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基を含む領域に対して、ＡアレルおよびＧアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明の核酸分子を用いることができ、それらの具体的な塩基配列は、当業者であれば適宜決定することができる。
【００５６】
また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、Ｃ７４Ｇ多型部位では、検査対象のブタの遺伝子型（Ｃ／Ｃ、Ｃ／Ｇ、またはＧ／Ｇ）が容易に決定される。また、Ａ５３２Ｇ多型部位では、検査対象のブタの遺伝子型（Ａ／Ａ、Ａ／Ｇ、またはＧ／Ｇ）が容易に決定される。
【００５７】
本発明の遺伝子診断法において、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位の塩基がグアニン（Ｇ）であると評価されたサンプル、特に遺伝子型がＧ／Ｇであると評価されたサンプルは、排卵数が多いブタであると、あるいは将来においてその可能性があるものと予測（予知）および／または診断（検出）することができる。また、本発明によれば、核酸試料さえ用意できればよく、検査対象となるブタの条件は問わないことから、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００５８】
本発明の遺伝子診断法において、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＡ５３２Ｇ多型部位の塩基がグアニン（Ｇ）であると評価されたサンプル、特に遺伝子型がＧ／Ｇであると評価されたサンプルは、排卵数が多いブタであると、あるいは将来においてその可能性があるものと予測（予知）および／または診断（検出）することができる。また、本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００５９】
以上のような排卵数の多いブタの遺伝子診断のために、必要な試薬をまとめて排卵数予測および／または診断用キットとすることができる。従って、本発明に係るキットは、本発明の核酸分子および／または本発明のプライマーペアを含んでなる。本発明に係るキットはさらに、ブタＦＳＨＲ遺伝子におけるＣ７４Ｇ多型部位、および／または、Ａ５３２Ｇ多型部位の塩基を同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００６０】
実施例１〔ブタＦＳＨＲ遺伝子上の多型と黄体数との関連〕
本実施例１の遺伝子解析においては、独立行政法人家畜改良センター（National Livestock Breeding Center）にて造成した梅山豚１頭とデュロック種１頭との交配からなる雑種第二世代に及ぶ資源家系を対象とした。
この家系について、多型性ＤＮＡマーカーを用いて黄体数と連鎖するブタ染色体の領域を決定した。すなわち、連鎖地図上にあるＤＮＡマーカーのうち黄体数と最も強く連鎖するマーカーを選抜した。ブタの人工大腸菌染色体（ＢＡＣ）ライブラリー［独立行政法人農業生物資源研究所ジーンバンク、および、CHILDREN'S HOSPITAL OAKLAND-BACPAC RESOURCES製］からこの領域に存在するＢＡＣクローンを分離した。
このＢＡＣのクローンを材料に、当該領域に存在する遺伝子として知られていたブタＦＳＨＲ遺伝子の一部を増やすように設計したプライマーペアによってＰＣＲ法を実施した。ＰＣＲは、Ａｎｉｍａｌ  Ｔａｑ（日本ジェネティックス）０．５μｌ、１０×ＰＣＲバッファーおよび２０ｎｇのＢＡＣのＤＮＡを含む全１５μｌの反応溶液を９６ウェルプレート上に調製し、９５℃で４分間の反応の後、９４℃で３０秒間−５５℃で３０秒間−７２℃で３０秒間の反応を３０サイクル行なった。その結果、増幅産物が確認された。つまり、この領域にブタＦＳＨＲ遺伝子が存在していることを確認した。
その結果、増幅産物が確認された。つまり、この領域にブタＦＳＨＲ遺伝子が存在していることを確認した。
【００６１】
次に、梅山豚１頭とデュロック種１頭について、ブタＦＳＨＲ遺伝子をダイレクトシークエンスした。すなわち、ブタＦＳＨＲ遺伝子全てをカバーするＢＡＣクローンを単離し、エクソン部分にプライマーを設計して、ＢＡＣをシークエンスすることでイントロン配列を解読した。その後、イントロン配列にエクソンを増幅するプライマーペアを設計し、ＰＣＲ法により増幅した。その産物をＰＣＲ法で用いたフォワードプライマーでシークエンスするダイレクトシークエンス法を行なった。
これにより、ブタＦＳＨＲ遺伝子の塩基配列が明らかとなると共に、該配列中９箇所の一塩基多型が同定された。このうち、アミノ酸置換を伴う多型は、第１エクソンである第７４番目の塩基におけるＣ／Ｇ多型（Ｃ７４Ｇ多型）、第６エクソンである第５３２番目の塩基におけるＡ／Ｇ多型（Ａ５３２Ｇ多型）、および排卵数との関連が報告されているＩｌｅ３７７Ｔｈｒ多型の３種類であった。ブタＦＳＨＲ遺伝子の第１エクソン中のＣ７４Ｇ多型（ａ）、および第６エクソン中のＡ５３２Ｇ多型（ｂ）の位置、および各多型部位を検出するためのプライマーペアの位置（矢印）を示す。また、ブタＦＳＨＲ遺伝子の塩基配列および該塩基配列がコードするペプチドのアミノ酸配列を、それぞれ配列表の配列番号１および配列番号２に示す。
【００６２】
次いで、このアミノ酸置換を伴う多型のうちのＣ７４Ｇ多型に関し、黄体数を測定した雑種第２世代の雌（２４８頭）についてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるタイピングを行なった。
ＰＣＲは、まず、Ａｎｉｍａｌ  Ｔａｑ（日本ジェネティックス）０．５μｌ、１０×ＰＣＲバッファー、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、および、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるフォワードプライマー並びに配列番号４記載の塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーペアを含む全１５μｌの反応溶液を、９６ウェルプレート上に調製した。９５℃で４分間の反応の後、９４℃で３０秒間−５５℃で３０秒間−７２℃で３０秒間の反応を３０サイクル行なった。
【００６３】
その後、反応溶液のうちの１０μｌを制限酵素処理する反応を行なった。制限酵素ＡｌｕＩ（ＴｏＹｏＢｏ）５ｕｎｉｔｓを含む全１５μｌの反応溶液を９６ウェルプレート上に調製し、３７℃で３時間の反応を行なった。
最後に、全反応液をエチジウムブロマイド（ＳＩＧＭＡ）入りの３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅで電気泳動することで、ＤＮＡ断片を分離した。その結果を、図２（ａ）に示す。
図２（ａ）に示されるように、１９０ｂｐのみの場合をＣ／Ｃ、１９０ｂｐ、１２０ｂｐおよび７０ｂｐの場合をＣ／Ｇ、１２０ｂｐと７０ｂｐの場合をＧ／Ｇと判定した。
【００６４】
次いで、Ａ５３２Ｇ多型に関しても、黄体数を測定した雑種第２世代の雌（２４８頭）についてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によるタイピングを行なった。
ＰＣＲは、まず、Ａｎｉｍａｌ  Ｔａｑ（日本ジェネティックス）０．５μｌ、１０×ＰＣＲバッファー、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、および、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるフォワードプライマー並びに配列番号６記載の塩基配列からなるリバースプライマーのプライマーペアを含む全１５μｌの反応溶液を９６ウェルプレート上に調製した。９５℃で４分間の反応の後、９４℃で３０秒間−５５℃で３０秒間−７２℃で３０秒間の反応を３０サイクル行なった。
【００６５】
その後、反応溶液のうちの１０μｌを制限酵素処理する反応を行なった。制限酵素ＮｌａＩＩＩ（Ｎ．Ｅ．Ｂ．）５ｕｎｉｔｓを含む全１５μｌの反応溶液を９６ウェルプレート上に調製し、３７℃で３時間の反応を行なった。
最後に、全反応液をエチジウムブロマイド（ＳＩＧＭＡ）入りの３％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅで電気泳動することで、ＤＮＡ断片を分離した。その結果を、図２（ａ）に示す。
図２（ａ）に示されるように、１９０ｂｐ、９７ｂｐおよび３２ｂｐの場合をＡ／Ａ、２８８ｂｐ、１９０ｂｐ、９７ｂｐおよび３２ｂｐの場合をＡ／Ｇ、２８８ｂｐと３２ｂｐの場合をＧ／Ｇと判定した。
【００６６】
次いで、得られたデータを分散分析によって解析し、各遺伝子型間で排卵数（黄体数）を比較した。その結果を下記の表１に示す。
【００６７】
【表１】
2006067925.tif 000002
【００６８】
表１から明らかなように、この資源家系内では、第１エクソンであるＣ７４Ｇ多型部位と第６エクソンであるＡ５３２Ｇ多型部位が連鎖を示していた。よって、表１に示すように３つの遺伝子型に分けられた。すなわち、第１エクソンであるＣ７４Ｇ多型がＧ／Ｇであり、第６エクソンであるＡ５３２Ｇ多型がＧ／Ｇである第１の遺伝子型３１頭は、黄体数の平均が１５．０６、第１エクソンであるＣ７４Ｇ多型がＣ／Ｇであり、第６エクソンであるＡ５３２Ｇ多型がＡ／Ｇである第２の遺伝子型８５頭は、黄体数の平均が１３．０１、および、第１エクソンであるＣ７４Ｇ多型がＣ／Ｃであり、第６エクソンであるＡ５３２Ｇ多型がＡ／Ａである第３の遺伝子型１３２頭は、黄体数の平均が１１．８３であった。従って、第１の遺伝子型は、第２の遺伝子型および第３の遺伝子型の黄体数に対し有意差が認められた。
【００６９】
実施例２
第１エクソンであるＣ７４Ｇ多型部位と第６エクソンであるＡ５３２Ｇ多型部位を品種別に頻度を調査した。
調査対象とした４品種は、産子数が多いとされる梅山豚４９頭（または５０頭）、産子数が比較的多いとされる品種であるランドレース種と大ヨークシャー種それぞれ１０１頭と４９頭、産子数が比較的少ないとされる品種であるデュロック種４２頭である。
多型部位の頻度の調査は、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により行った。Ｃ７４Ｇ多型部位およびＡ５３２Ｇ多型部位の頻度を、それぞれ表２および表３に示す。
【００７０】
【表２】
2006067925.tif 000003
【００７１】
【表３】
2006067925.tif 000004
【００７２】
表２および表３から明らかなように、各個体の黄体数および排卵数は測定されていないが、産子数が比較的少ない品種のデュロック種において第１エクソンであるＣ７４Ｇ多型がＣ／Ｃの頻度が１００％であることが顕著である。
以上の解析結果から、Ｃ７４Ｇ多型におけるＣアレル、特にＣＣの遺伝子型は、排卵数が少ないブタのリスクファクターとして使用できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、ブタＦＳＨＲ遺伝子における多型部位の塩基を同定することにより、排卵数の多いブタを正確にかつ簡便に予測および／または診断することが可能となるので、産子数の多いブタを改良し作出する手段として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ブタＦＳＨＲ遺伝子の第１エクソン中のＣ７４Ｇ多型（ａ）、および第６エクソン中のＡ５３２Ｇ多型（ｂ）の位置、および各多型部位を検出するためのプライマーペアの位置（矢印）を示す。
【図２】ブタＦＳＨＲ遺伝子の第１エクソン中のＣ７４Ｇ多型（ａ）、および第６エクソン中のＡ５３２Ｇ多型（ｂ）を示すＰＣＲ−ＲＦＬＰでの電気泳動パターン図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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