(57)【要約】  【課題】  エキソビボでの造血幹細胞の増幅効率を上げること、そのエキソビボで増幅した造血幹細胞集団を骨髄移植などの臨床に応用すること、さらには造血幹細胞の増幅を調節する因子の同定方法を提供すること。  【解決手段】  サイトカイン存在下でＨｕＨ２８細胞とＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を共培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法、サイトカイン存在下でＨｕＨ２８細胞とＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞を共培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法、上記の方法で増幅された造血幹細胞集団、ＨｕＨ２８細胞を用いることを特徴とする造血幹細胞の増幅を調節する因子の同定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン存在下でＨｕＨ２８細胞とＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を共培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法。
【請求項２】
サイトカイン存在下でＨｕＨ２８細胞とＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞を共培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法。
【請求項３】
サイトカインとしてＳＣＦ、ＩＬ−１１およびＦＬＴを培養液中に含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法で増幅された造血幹細胞集団。
【請求項５】
ＨｕＨ２８細胞を用いることを特徴とする造血幹細胞の増幅を調節する因子の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサイトカイン存在下で肝臓由来の細胞株と系統特異的抗原マーカー陰性細胞および／または系統特異的抗原マーカー弱陽性細胞を共培養することを特徴とする、造血幹細胞の増幅方法に関する。より詳しくは、サイトカイン存在下で胆管上皮癌由来のＨｕＨ２８細胞と系統特異的抗原マーカー陰性細胞および／または系統特異的抗原マーカー弱陽性細胞を共培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法、上記の方法によって増幅された造血幹細胞集団、およびＨｕＨ２８細胞を用いることを特徴とする造血幹細胞の増幅を調節する因子の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、赤血球、白血球、血小板、Ｔリンパ球およびＢリンパ球などすべての血球系細胞を産生する能力（多分化能）と造血幹細胞自体を複製する能力（自己複製能）をあわせ持つ細胞と定義されている。一方、骨髄移植は、移植されるその骨髄細胞中に極微量含まれている造血幹細胞がリンパ球を含むすべての血球系細胞を産生するので、造血幹細胞移植と言い換えることができる。現在骨髄移植は、各種血液疾患、癌、免疫不全症、先天性代謝異常症等多くの難治性疾患に対する根治的治療法として確立されている。しかし移植のためには、ドナーと患者のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が合致しなければならず、ドナー不足が社会的問題になっている。
【０００３】
最近、骨髄に代わる造血幹細胞源として末梢血がしばしば用いられている。造血幹細胞を含むＣＤ３４陽性細胞は、健常人の末梢血にはごく少数しか存在していないが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を連続投与すると骨髄から末梢血に動員される。このＧ−ＣＳＦの連続投与によって造血幹細胞を動員した末梢血から、血液成分分離装置を用いて末梢血造血幹細胞／造血前駆細胞が採取され、移植に用いられている。しかし、この末梢血幹細胞移植は、Ｇ−ＣＳＦをドナーに投与する必要があり、それに伴う副作用などドナーへの負担が大きい。また、Ｇ−ＣＳＦ投与により骨髄から末梢血への造血幹細胞の動員が増えるとはいえ、その効率は低い。
【０００４】
また、造血幹細胞源として臍帯血を用いる臍帯血幹細胞移植も行われている。しかし、臍帯血に含まれる造血幹細胞数が少ないのでその適用は小児に限られている。
【０００５】
このような背景から、造血幹細胞をエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で増幅させる技術が求められ、これまで様々な方法が試みられている。例えば、造血幹細胞を増幅するために、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３（Ｆｌｔ−３）リガンド（ＦＬＴ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）等のサイトカイン存在下で培養した方法の結果が報告されている。造血前駆細胞およびさらに分化した細胞は、これらのサイトカインや増殖因子などと共に培養することによって比較的高い増幅度で増幅可能であるが（非特許文献１〜４を参照）、造血幹細胞の増幅度は数倍程度であり満足できるレベルにはない。
【０００６】
造血前駆細胞とは、多能性幹細胞が分化した細胞であって、各系統の血球細胞への分化は方向付けられているが形態学的にはまだ同定不可能な段階の細胞であって、適当なサイトカインの存在下、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で種々の血球毎のコロニー形成能を有する細胞である。造血前駆細胞は自己複製能がないので長期にわたって血球系細胞を産生することができず、血球細胞源として移植に応用することはできない。
【０００７】
本発明者らは、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）存在下で系統特異的抗原マーカー（本明細書中、Ｌｉｎｅａｇｅ  ＭａｒｋｅｒまたはＬｉｎと略称する）陰性細胞または系統特異的抗原マーカー弱陽性細胞を培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法を報告している（特許文献１を参照のこと）。この報告では、Ｍ−ＣＳＦがＳＣＦ、ＩＬ−１１およびＦＬＴによる造血幹細胞の増幅倍率を約２．２倍、ＳＣＦ、ＩＬ−１１およびＴＰＯによる造血幹細胞の増幅倍率を約２．４倍高めることを明らかにした。このＭ−ＣＳＦの作用は濃度によって厳格に制御されていて、Ｍ−ＣＳＦが高濃度になると逆に造血幹細胞の増幅を抑制することも見出している。これらから、造血幹細胞の増幅を促進するＭ−ＣＳＦ濃度には上限があり、さらなる促進にはＭ−ＣＳＦ以外の因子が必要であると考えている。
【０００８】
造血幹細胞をエキソビボで増幅させる技術としては、他の種類の細胞を支持細胞として用いる共培養系の方法が報告されている。例えば、骨髄間質細胞との共培養によって造血幹細胞を増幅することも試みられている（非特許文献５を参照のこと）。Ｌｅｍｉｓｃｈｋａらは胎生１４日目の肝臓から数百種類以上の骨髄間質細胞を樹立し、その細胞の造血幹細胞増幅促進活性を調べた。樹立したこれらの細胞はすべて繊維芽細胞様であった。Ｌｅｍｉｓｃｈｋａらは造血幹細胞を維持する細胞をいくつか得たが、造血幹細胞の増幅を促進させる細胞は獲得できなかった。
【０００９】
造血幹細胞をエキソビボで増幅させる技術としては、サイトカインの存在下、他の種類の細胞を支持細胞として用いる共培養系の方法も報告されている（非特許文献６および７を参照）。Ｋａｗａｄａらは、支持細胞としてマウス骨髄由来のＨＥＳＳ−５細胞を、サイトカインとしてＴＰＯ、ＦＬＴ、ＳＣＦを用いて、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞の増幅を試みている。またＡｎｄｏらもＨＥＳＳ−５細胞とＳＣＦ、ＦＬＴ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６を用いて、ヒト臍帯血由来のＬｉｎ陰性ＣＤ３４陰性細胞の増幅を試みている。しかし、いずれの方法も造血幹細胞の定量的変化を調べていないので、どれくらいの造血幹細胞が増幅されたのかは不明であるし、異種同士の細胞を用いる系であることから、未知のウィルスに感染した細胞を移植してしまう危険性がある。
【００１０】
上記のように、骨髄移植のために造血幹細胞をエキソビボで増幅する方法が求められているにもかかわらず、効率よく造血幹細胞を増幅する方法は得られていない。
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ０３／０３８０７７
【非特許文献１】Ｍｉｌｌｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｌｙｍｐｈｏ−ｍｙｅｌｏｉｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９７，９４，ｐｐ１３６４８−１３６５３
【非特許文献２】Ｙｏｎｅｍｕｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＦＬＴ３／ＦＬＫ２  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ＫＩＴ  ｌｉｇａｎｄ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９７，８９，ｐｐ１９１５−１９２１
【非特許文献３】Ｂｒｙｄｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．，Ｂｌｏｏｄ．，２０００，９６，ｐｐ１７４８−１７５５
【非特許文献４】Ｐｕｒｔｏｎ  ＬＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．，Ｂｌｏｏｄ．，２０００，９５，ｐｐ４７０−４７７
【非特許文献５】Ｍｏｏｒｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．，Ｂｌｏｏｄ．，１９９７，８９，ｐｐ４３３７−４３４７
【非特許文献６】Ｋａｗａｄａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｒａｐｉｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．，１９９９，２７，ｐｐ９０４−９１５
【非特許文献７】Ａｎｄｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｎ−Ｃｄ３４−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｓｔｅｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．，２０００，２８，ｐｐ６９０−６９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、エキソビボでの造血幹細胞の増幅を促進して増幅効率を上げること、そのエキソビボで増幅した造血幹細胞集団を骨髄移植などの臨床に応用すること、さらには造血幹細胞の増幅を調節する因子の同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、造血幹細胞を含む系統特異的抗原マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｍａｒｋｅｒ：Ｌｉｎ）が陰性および／または弱陽性の細胞（本明細書中、Ｌｉｎが陰性の細胞を示す場合Ｌｉｎ−細胞と称し、Ｌｉｎが弱陽性の細胞を示す場合Ｌｉｎｌｏｗ細胞と称し、Ｌｉｎが陰性の細胞および／またはＬｉｎが弱陽性の細胞を示す場合、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞と称する）を、サイトカイン存在下ＨｕＨ２８細胞と共培養することによって、造血幹細胞の増幅が促進されることを見出し、これを造血幹細胞の増幅方法に利用して本発明を完成した。また、本発明者らは、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１が共に陽性であるＬｉｎ−細胞および／またはｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１が共に陽性であるＬｉｎｌｏｗ細胞（本明細書中、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１が共に陽性であるＬｉｎ−細胞を示す場合Ｌｉｎ−  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞と称し、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１が共に陽性であるＬｉｎｌｏｗ細胞を示す場合Ｌｉｎｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞と称し、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１が共に陽性であるＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を示す場合、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞と称する）を、サイトカイン存在下ＨｕＨ２８細胞と共培養することによって、造血幹細胞の増幅が促進されることを見出し、これを造血幹細胞の増幅方法に利用して、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、
［１］サイトカイン存在下でＨｕＨ２８細胞とＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を共培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法、
［２］サイトカイン存在下でＨｕＨ２８細胞とＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞を共培養することを特徴とする造血幹細胞の増幅方法、
［３］サイトカインとしてＳＣＦ、ＩＬ−１１およびＦＬＴを培養液中に含む、［１］または［２］に記載の方法、
［４］［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法で増幅された造血幹細胞集団、
［５］ＨｕＨ２８細胞を用いることを特徴とする造血幹細胞の増幅を調節する因子の同定方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によってエキソビボで効率よく造血幹細胞を増幅することが可能となる。本発明の増幅方法および本発明の増幅させた造血幹細胞集団は、造血幹細胞移植に応用することができる。また、ＨｕＨ２８細胞を用いることによって、造血幹細胞の自己増幅に関与する因子の同定が可能となる。さらには、これらの方法で同定された因子を骨髄移植の基礎研究および臨床応用に利用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
胎児期の造血は肝臓で行われており、マウスでは胎生１４日目を過ぎる頃から造血の場は脾臓、骨髄へと移行する。従って、造血幹細胞の自己複製は胎児肝臓において活発に行われていると考えられている。これまでに肝臓由来の細胞を支持細胞とする共培養によって造血幹細胞を増幅させる試みがなされているが、未だ成功していない。本発明者らは、肝臓由来細胞の中でも肝臓癌由来の細胞に着目し、共培養によって造血幹細胞を増幅させる細胞の探索を行った。その結果、本発明者らは、胆管上皮癌由来のＨｕＨ２８細胞がサイトカイン存在下の共培養において造血幹細胞の自己の増幅効率を上げることを見出した。
【００１７】
ＨｕＨ２８細胞とは、１９８８年Ｋｕｓａｋａらにより胆管上皮癌由来の細胞株として報告された付着細胞である（Ｋｕｓａｋａ  Ｙ，Ｔｏｋｉｗａ  Ｔ，Ｓａｔｏ  Ｊ．，、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｒｅｓ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８８；１８８，３６７−３７５）。この細胞は、病理学的診断により胆管上皮癌と診断された３７歳の女性に由来するものである。ＨｕＨ２８細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手可能である（ＪＣＲＢ番号：ＪＣＲＢ０４２６）。ＨｕＨ２８細胞を培養する場合、用いる培地、培養時期、培養プレート、湿度、ＣＯ２濃度等は特に限定されず、細胞が良好な状態で保たれる条件を適宜選択すればよい。ＨｕＨ２８細胞の培養は、好ましくは、組織培養用の１００ミリディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）を用い１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、免疫生物研究所製）含有ＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）中で５％ＣＯ２存在下、３７℃の条件で実施する。共培養に用いる場合、好ましくは、１０％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０でサブコンフルエントにまで培養し、組織培養用６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播きなおし、同培地で３〜４日間培養後、サブコンフルエントになったＨｕＨ２８細胞を共培養に使用した。
【００１８】
Ｌｉｎとは系統特異的抗原マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｍａｒｋｅｒ）を意味し、例えば、赤血球マーカーであるＴｅｒ１１９、顆粒球マーカーであるＧｒ−１、単球・マクロファージ系細胞マーカーであるＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）、Ｔ細胞マーカーであるＬｙ１などが挙げられる。これらの系統特異的抗原マーカーは市販されており、例えば、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入することができる。
【００１９】
Ｌｉｎ−細胞とは、系統特異的抗原マーカーの発現が検出できない細胞であり（図１のＬｉｎ−で示される領域）、Ｌｉｎｌｏｗ細胞とは、系統特異的抗原マーカーの発現が弱く検出できる細胞である（図１のＬｉｎｌｏｗで示される領域）。また、本明細書において、系統特異的抗原マーカーの発現が強く検出できる細胞をＬｉｎｈｉｇｈ細胞という（図１のＬｉｎｈｉｇｈで示される領域）。造血幹細胞はＬｉｎ−細胞画分および／またはＬｉｎｌｏｗ細胞画分に存在するとされている。本発明者らは、用いる細胞集団のうち９５％以上の細胞が図１のＬｉｎ−および／またはＬｉｎｌｏｗで示される領域に含まれる場合に、その細胞集団をＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞とした。
【００２０】
Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞は、細胞表面マーカーを指標として採集するとよい。Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞の採取は、単細胞浮遊液とした骨髄細胞をＬｉｎ認識標識抗体で処理し、フローサイトメーターなどのセルソーターを用いて、処理された細胞から標識された細胞を除去することにより、行うことができる。例えば、マウス細胞では、造血前駆細胞調製用抗体カクテルを含むＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で処理した細胞が、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞として広く用いられている。実施例では、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭを用いて得た細胞は処理前細胞の０．５％程度であった。
【００２１】
かくして得たＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を培養する場合、用いる培地、培養時期、培養プレート、湿度、ＣＯ２濃度等は特に限定されず、細胞が良好な状態で保たれる条件を適宜選択すればよい。例えば、実施例では、得られたＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を５％  ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含有するＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）中、組織培養用６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に１ウェルあたり７×１０４個、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で培養したが、この条件に限定されない。
【００２２】
また、本発明者らは、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞の中でもｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１の両方が陽性の細胞をＨｕＨ２８細胞との共培養に用いると、造血幹細胞の増幅がさらに促進されることを見出した。ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１はいずれも造血幹細胞のマーカーである。Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞とは、Ｌｉｎ−／ｌｏｗにさらに選別を加えて造血幹細胞としての純度を上げた細胞である。Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞は、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞をｃ−Ｋｉｔ抗体およびＳｃａ−１抗体で染色し、フローサイトメーターなどのセルソーターを用いて陽性の画分を分取することによって得ることができる。ｃ−Ｋｉｔ抗体およびＳｃａ−１抗体は、市販されており、例えば、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入することができる。
【００２３】
Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞の培養は、上記のようにＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞の培養と同様に行うことができる。例えば、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞は、５％  ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含有するＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）中、組織培養用６ウェルマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に１ウェルあたり７×１０４個、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で培養することができるが、この条件に限定されない。
【００２４】
サイトカイン存在下でＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞とＨｕＨ２８細胞を共培養する場合も、サイトカイン存在下でＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞とＨｕＨ２８細胞を共培養する場合も、用いる培地、培養時期、培養プレート等は特に限定されず、細胞が良好な状態で保たれる条件を適宜選択すればよい。培地としては、好ましくは、ＲＰＭＩ−１６４０もしくはＩｓｃｏｖｅｓ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍを用いる。６ウェルマイクロプレートでは、サブコンフルエント状態のＨｕＨ２８に対して、４〜７×１０４個のＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞または５〜１０×１０３個のＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞を用いるとよいが、この条件に限定されるものではない。
【００２５】
上記の共培養は、サイトカインとして少なくともＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１（ＩＬ−１１）、およびｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ（ＦＬＴ）を含むことが好ましい。これらのサイトカインはＰｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．などから購入することができる。あるいは、これらのサイトカインをコードする遺伝子を適当な蛋白質発現用ベクターに組み込み、通常の遺伝子工学的手法により製造することもできる。また、用いる動物細胞の種にあわせてこれらのサイトカインを用いることが望ましいが、反応性が得られる範囲で、他種由来のサイトカインを用いることもあり得る。添加するサイトカインの濃度は、それぞれ、０．１〜３００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００２６】
また、共培養には、上記のサイトカイン以外にも適当なサイトカインおよび増殖因子を添加することが好ましい。添加するサイトカインおよび増殖因子としては、造血幹細胞の維持、増殖促進、分化誘導等に有効であることが報告されている、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３６４８−１３６５３，１９９７；Ｍａｔｓｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２，４５２−４６１，１９９８；Ｂｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９６，１７４８−１７５５，２０００）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのサイトカインおよび増殖因子はＰｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．などから購入することができる。あるいは、これらのサイトカインおよび増殖因子をコードする遺伝子を適当な蛋白質発現用ベクターに組み込み、通常の遺伝子工学的手法により製造することもできる。これらのサイトカインおよび増殖因子は、使用する動物細胞の種にあわせて用いることが望ましいが、反応性が得られる範囲で、他種由来のサイトカインおよび増殖因子を用いることもあり得る。添加するサイトカインおよび増殖因子の濃度は、それぞれ、０．１〜３００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１〜２００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０〜１００ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。
【００２７】
造血幹細胞は前述したように、すべての血球系細胞を産生する能力（多分化能）と造血幹細胞自体を複製する能力（自己複製能力）をあわせ持つ細胞と定義されている。従って、造血幹細胞が増幅されるかどうかの確認方法としては、この二つの能力を確認できる方法が好ましい。例えば、マウス細胞を用いるのであれば、長期骨髄再構築法（Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）により行うことができる。本方法は、造血幹細胞を含む細胞群をある動物に移植して、長期にわたりその幹細胞由来の血球系細胞がその動物の血液に存在するかを確認するものであり、造血幹細胞の定量法として信頼性の高い方法である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２１，２０６−２１９，１９９３）。ヒト細胞を用いる場合、確立された定量法はないものの、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（Ｎｏｎ−Ｏｂｅｓｅ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ／Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）マウスやβ２−マイクログロブリンが欠損したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを移植動物として使用する方法が提唱されている（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２，１３２９−１３３７，１９９６；Ｋｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９５，３１０２−３１０５，２０００）。
【００２８】
本明細書中に使用される「造血幹細胞集団」とは、本発明の造血幹細胞の増幅方法によって増幅された細胞集団全体のことをいい、増幅された細胞集団の中から造血幹細胞のみを精製することを必要としない。一般に、造血幹細胞をエキソビボで増幅させると、造血幹細胞のみを純粋に増幅することはできず、得られる細胞集団にはリンパ球系細胞、骨髄球系細胞などへの分化が少し進んだ血球系細胞も含まれることが知られている。これは、常に分化方向に向かって進もうとする造血幹細胞の性質によるものである。現在、増幅した造血幹細胞のみを分化が進んだ血球系細胞の集団から分離する方法は確立されていないため、増幅した造血幹細胞のみを骨髄移植に使用することはできない。本発明の増幅方法においても、増幅後に得られる細胞集団には造血幹細胞以外の分化が進んだ血球系細胞を含む。しかし、移植する造血幹細胞集団に分化が進んだ血球系細胞が含まれていても、分化が進んだ血球系細胞自体患者にとっては必要な細胞であるといえ、本発明の増幅方法によって増幅した細胞集団から造血幹細胞のみを分離しなくても、その増幅した細胞集団を造血幹細胞集団としてそのまま骨髄移植に用いることができる。
【００２９】
本発明の造血幹細胞の増幅方法において、増幅させた後のＨｕＨ２８細胞と造血幹細胞集団との分離は、容易に実施できる。具体的には、ＨｕＨ２８細胞は付着細胞であり、造血幹細胞集団は浮遊細胞なので、まず造血幹細胞集団を含む培養上清をピペッティング操作により回収する。次いで、この造血幹細胞集団にわずかに混入するＨｕＨ２８細胞を除くため、５％  ＦＢＳを含むハンクス平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）で細胞を懸濁し、４５％パーコール溶液に重層し、８００×ｇで２０分間遠心し、沈殿した細胞を造血幹細胞集団として回収することができる。あるいは、ＨｕＨ２８細胞と造血幹細胞集団との分離は、ポアサイズ０．４５ミクロンの多孔性の膜で隔離して培養することによっても、容易に実施することができる。
【００３０】
本発明によって、サイトカイン存在下でＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞とＨｕＨ２８細胞を共培養することによって造血幹細胞が増幅されることが明らかとなった。本発明の共培養系による造血幹細胞増幅の詳細なメカニズムは明らかではないが、少なくともＨｕＨ２８細胞を用いることによって造血幹細胞の増幅を調節する因子を同定することができるといえる。具体的には、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞とＨｕＨ２８細胞との共培養系において、試験化合物の存在下または非存在下での造血幹細胞の増幅の程度を比較することによって、その試験化合物が造血幹細胞を増幅するか否かを調べることができる。また、ＨｕＨ２８細胞による造血幹細胞増幅機構を解明することにより、増幅活性を有する、ＨｕＨ２８由来の膜蛋白質や分泌蛋白質を同定することができる。上記試験には、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞として、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞を用いることができる。上記試験には、共培養にＳＣＦ、ＩＬ−１１、およびＦＬＴを加えた系をコントロールとして用いることができる。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
（１．骨髄細胞の採取）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎラボラトリーズ）の大腿骨と脛骨より採取した骨髄細胞を５％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，免疫生物研究所製）を含むハンクス平衡塩類溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）（以下、ＨＢＳＳと略す）に懸濁後、２２ゲージの注射針を取り付けた１ｍＬのシリンジを用いて細胞浮遊液を調製し、ポアサイズ４０μｍのナイロンメッシュ（ファルコン社製）に通して細胞塊を除去した。１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心による洗浄後、ＨＢＳＳに懸濁して単細胞浮遊液とした。
【００３２】
（２．Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞の精製）
マウス造血前駆細胞調製用のＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）を用いてＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を添付マニュアルに従って調製した。まず、単細胞浮遊液に分化抗原に対するビオチン標識抗体カクテルを加え、氷上で２０分間反応後、ＨＢＳＳで洗浄し、１，１００ｒｐｍ、５分間遠心した。細胞をＨＢＳＳで再懸濁し、ビオチン標識抗体結合用Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ抗体複合体カクテルを加え、氷上で４０分間反応後、磁気コロイドを加え、４０分間反応させた。ＭＡＣＳ  ＬＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．社製）に細胞懸濁液を通すことにより、分化抗原強陽性細胞を吸着させ、カラムに吸着しないＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を回収した。
【００３３】
（３．Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞とＨｕＨ２８細胞の共培養）
Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞とＨｕＨ２８細胞の共培養では、まず、１０％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０でサブコンフルエントにまで培養したＨｕＨ２８細胞をｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏａｔｅｄ  ６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ社製）に播きなおした。次いで、同培地でＨｕＨ２８細胞を３〜４日間培養後、サブコンフルエントになったＨｕＨ２８細胞の上に７×１０４個のＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を播種し、５％  ＦＢＳと１０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）とサイトカインを含有するＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いて５％  ＣＯ２存在下、３７℃の条件で５日間培養した（本明細書中、この条件を、「サイトカイン＋ＨｕＨ２８細胞との共培養」とも称する）。培養液中に添加するサイトカインは、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ）をいずれも１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。使用したサイトカインはすべて、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入した。また、比較対照として、サイトカインの添加もＨｕＨ２８細胞との共培養もしていない「未処理」、およびサイトカインは添加するがＨｕＨ２８細胞と共培養はしない「サイトカインのみ」の処理を並行して実施した。「未処理」のＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞では、上記の２．で得られたＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞を直接次の４．１．に示すマウスへの移植に用いた。「サイトカインのみ」処理したＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞は、ＨｕＨ２８細胞の上ではなくプレートに直接播種したこと以外は上記の「サイトカイン＋ＨｕＨ２８細胞との共培養」と同様に培養し、次の４．１．に示すマウスへの移植に用いた。
【００３４】
（４．長期骨髄再構築法による造血幹細胞増幅の評価）
（４．１．培養細胞のマウスへの移植）
造血幹細胞の増幅については、造血幹細胞のみを区別および／または分取することはできないので、現在最も信頼性が高い長期骨髄再構築法（ＬｏｎｇＴｅｒｍＲｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２１，２０６−２１９，１９９３）を用いて評価した。この方法は、造血幹細胞の多分化能および自己複製能の両方を確認できる方法である。
【００３５】
「サイトカイン＋ＨｕＨ２８細胞との共培養」のＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞は、５日間サイトカイン存在下で共培養後、ピペッティング操作によりマイクロプレートから血球細胞を回収した。わずかに混入するＨｕＨ２８細胞を除くため、ＨＢＳＳで懸濁した細胞を、４５％パーコール溶液に重層し、８００×ｇで２０分間遠心した。沈殿した細胞をＨＢＳＳで懸濁後、競合細胞（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）として１×１０６個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウス（日本クレア）から採取した新鮮骨髄細胞（本明細書中、「Ｌｙ５．２マウス由来骨髄細胞」とも称する）を加えて１，１００ｒｐｍ、５分間遠心した。そして、最終的に細胞を４００μＬの１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有ハンクス塩類溶液に懸濁し、致死量放射線（８００レントゲン）を照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウス（本明細書中、「放射線照射Ｌｙ５．２マウス」とも称する）に尾静脈から移植した。「未処理」のＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞は、上記の２．で得られたＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞（７×１０４個）を用い、上記の方法と同様に１×１０６個のＬｙ５．２マウス由来骨髄細胞と混合し放射線照射Ｌｙ５．２マウスに移植した。「サイトカインのみ」処理したＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞は、７×１０４個のＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞をサイトカインのみの存在下で５日間培養し、プレートから回収後、上記の方法と同様に１×１０６個のＬｙ５．２マウス由来骨髄細胞と混合し放射線照射Ｌｙ５．２マウスに移植した。
【００３６】
（４．２．移植した細胞に由来する白血球の検出）
移植後６ヶ月経過したマウスの尾末端からヘパリンコート毛細管を用いて約２５μＬの末梢血を採取後、直ちに１０ｕｎｉｔ／ｍＬのヘパリンを含む５００μＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に懸濁した。上清を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって除去後、細胞をＨＢＳＳ  ５００μＬに懸濁した。そしてＰＢＳ（−）で１０倍希釈したＦＩＴＣ標識の抗マウスＬｙ５．１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１０μＬ加えて、氷中で遮光、３０分間の抗体反応を行った。細胞を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって回収し、室温で１５５ｍＭ  塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、１０ｍＭ  重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）から構成される溶血溶液５００μＬに懸濁する溶血操作を２回行った。細胞はＨＢＳＳで洗浄後、１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって回収し、２μｇ／ｍＬ  ７−アミノアクチノマイシンＤ、０．２％  牛血清アルブミン、０．０５％  アジ化ナトリウム，０．０２％  ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩類溶液に懸濁してＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメーターによりＬｙ５．１陽性細胞率の解析を行った。
【００３７】
（４．３．骨髄再構築活性（ＲＵ）の算定）
骨髄再構築活性（Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｕｎｉｔ；ＲＵ）とは、１×１０６個の骨髄細胞と同等の骨髄再構築能を示す活性を１単位とした、造血幹細胞の増幅の程度を表す１つの指標である。ＲＵは、ドナーキメリズムから算定することができる。ドナーキメリズムとは、ドナー由来の細胞が占める割合のことである。本実施例の場合、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスにドナー細胞としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．１マウス由来の細胞を移植したので、ドナーキメリズムとは、Ｌｙ５．２陽性細胞に対するＬｙ５．１陽性細胞の割合（％  Ｌｙ５．１）のことである。共培養後に含まれる造血幹細胞のＲＵを、サイトカイン存在下とサイトカイン非存在下で比較した。計算には、式：ＲＵ＝％  Ｌｙ５．１／（１００−％  Ｌｙ５．１）を用いた。さらに、このＲＵから造血幹細胞の増幅倍率を計算した。具体的には、未処理の場合のＲＵを１．０として、各条件下でＲＵが何倍に増えたかを計算した。
【００３８】
ＳＣＦ＋ＩＬ−１１＋ＦＬＴのサイトカインのみの存在下では、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞を５日間培養しても造血幹細胞は１．５倍にしか増えないが、ＨｕＨ２８細胞との共培養がさらに加わると、サイトカインの効果を３倍以上高め、全体として４．６倍の増幅が認められた（表１）。
【００３９】
【表１】
2006067858.tif 000002
【００４０】
（実施例２）
（１．Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞の調製）
骨髄細胞の採取およびＬｉｎ−／ｌｏｗ細胞の取得は実施例１に従った。Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞をｃ−Ｋｉｔ抗体およびＳｃａ−１抗体で染色後、各マーカーがともに陽性の画分を分取することによって、造血幹細胞の純度を上げることができた。Ｌｉｎ−／ｌｏｗ細胞をＦＩＴＣ標識した抗マウスｃ−ＫｉｔおよびＰＥ標識した抗マウスＳｃａ−１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で染色後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＥｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅ  ＥＳＰを用いてｃ−Ｋｉｔ陽性およびＳｃａ−１陽性の細胞集団を分取した。
【００４１】
（２．Ｌｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞とＨｕＨ２８細胞との共培養）
ＨｕＨ２８細胞との共培養においては、１０％  ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０でサブコンフルエントにまで培養したＨｕＨ２８細胞をｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏａｔｅｄ  ６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ社製）に播きなおした。そして、同培地で３〜４日間培養後、サブコンフルエントになった細胞の上に１×１０４個のＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞を播種し、５％  ＦＢＳと１０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）とサイトカインを含有するＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いて５％  ＣＯ２存在下、３７℃の条件で培養した。培養液中に添加するサイトカインは、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）およびｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ）をいずれも１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。使用したサイトカインはすべて、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から購入した。
【００４２】
（３．長期骨髄再構築法による造血幹細胞増幅の評価）
（３．１．培養細胞のマウスへの移植）
６日間サイトカイン存在下で共培養後、ピペッティング操作によりマイクロプレートより血球細胞を回収した。わずかに混入するＨｕＨ２８細胞を除くため、ＨＢＳＳで懸濁した細胞を、４５％パーコール溶液に重層し、８００×ｇで２０分間遠心した。細胞をＨＢＳＳで懸濁後、その半分の量の細胞に対して、競合細胞としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウス（日本クレア）から採取した２×１０６個の新鮮骨髄細胞を加えて１，１００ｒｐｍ、５分間遠心した。そして、最終的に細胞は１．６ｍＬの１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有ハンクス塩類溶液に懸濁し、致死量放射線（８００レントゲン）を照射した４匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスに４００μＬずつ尾静脈から移植した。また、サイトカインの添加もＨｕＨ２８細胞との共培養もしていない未処理のＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞には、実施例２の１．で得た新鮮な２．５×１０３個のＬｉｎ−／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞を用い、上記と同様の方法で放射線照射マウス１匹あたり５×１０５個のＬｙ５．２マウス由来骨髄細胞とともに移植した。
【００４３】
（３．２．培養細胞の継代と培養細胞のマウスへの移植）
残り半分の細胞は、実施例１に記載されたようにあらかじめ１００ミリディッシュに準備しておいたサブコンフルエントのＨｕＨ２８細胞を用いてさらに共培養を継続した。サイトカイン存在下で４日間培養後、ピペッティング操作により１００ミリディッシュより細胞を回収した。わずかに混入するＨｕＨ２８細胞を除くため、ＨＢＳＳで懸濁した細胞を、４５％パーコール溶液に重層し、８００×ｇで２０分間遠心した。細胞をＨＢＳＳで懸濁後、その半分の量の細胞に対して、競合細胞としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウス（日本クレア）から採取した２×１０６個の新鮮骨髄細胞を加えて１，１００ｒｐｍ、５分間遠心した。そして、最終的に細胞は１．６ｍＬの１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有ハンクス塩類溶液に懸濁し、致死量放射線（８００レントゲン）を照射した４匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｌｙ５．２マウスに４００μＬずつ尾静脈から移植した。
【００４４】
（３．３．移植した細胞に由来する白血球の検出）
移植後６ヶ月経過したマウスの尾末端からヘパリンコート毛細管を用いて約２５μＬの末梢血を採取後、直ちに１０ｕｎｉｔ／ｍＬのヘパリンを含む５００μＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に懸濁した。上清を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって除去後、細胞をＨＢＳＳ  ５００μＬに懸濁した。そしてＰＢＳ（−）で１０倍希釈したＦＩＴＣ標識の抗マウスＬｙ５．１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を１０μＬ加えて、氷中で遮光、３０分間の抗体反応を行った。細胞を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって回収し、室温で１５５ｍＭ  塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、１０ｍＭ  重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、０．１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）から構成される溶血溶液５００μＬに懸濁する溶血操作を２回行った。細胞はＨＢＳＳで洗浄後、１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって回収し、２μｇ／ｍＬ  ７アミノアクチノマイシンＤ、０．２％  牛血清アルブミン、０．０５％  アジ化ナトリウム，０．０２％  ＥＤＴＡを含むハンクス平衡塩類溶液に懸濁してＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメーターによりＬｙ５．１陽性細胞率の解析を行った。
【００４５】
（３．４．骨髄再構築活性（ＲＵ）の算定）
移植した細胞に由来する白血球の検出、ドナーキメリズムからの造血幹細胞が持つ骨髄再構築活性（ＲＵ）の算定は、実施例１に記載した方法でおこなった。本実施例では、１匹のレシピエントマウスに５×１０５個の競合細胞を移植したので、５×１０５個の骨髄細胞と同等の骨髄再構築能を示す活性を１単位とした。
【００４６】
表２に示したように培養日数とともに造血幹細胞の増幅が認められ、１０日間の培養で、１２．８倍の増幅効率であった。このことから、ＨｕＨ２８細胞との共培養が造血幹細胞の増幅に有用であることがわかる。
【００４７】
【表２】
2006067858.tif 000003
（４．移植した細胞に由来する白血球上の分化抗原の検出）
１０日間ＨｕＨ２８細胞と共培養した細胞を移植して６ヶ月経過したマウスの尾末端からヘパリンコート毛細管を用いて約１００μＬの末梢血を採取後、直ちに１０ｕｎｉｔ／ｍＬのヘパリンを含む２ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に懸濁し、抗体染色のために３等分した。細胞を洗浄後、ＨＢＳＳ  ５００μＬに懸濁し、分化抗原に対する抗体としてビオチン標識した抗マウスＭａｃ−１および抗マウスＧｒ−１，抗マウスＢ２２０，抗マウスＣＤ３ｅをそれぞれチューブあたり２μＬ添加し、氷中で２０分間抗体反応を行った。Ｍａｃ−１は、マクロファージ、Ｇｒ−１は顆粒球、Ｂ２２０はＢ細胞、ＣＤ３ｅはＴ細胞のマーカーである。反応後、ＨＢＳＳで細胞を２回洗浄し、５００μＬのＨＢＳＳに再懸濁した。さらにＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を０．５μＬとＦＩＴＣ標識抗マウスＬｙ５．１を１μＬ添加し、氷中遮光下で２０分間反応した。細胞を１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって回収し、室温で１５５ｍＭ  塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、１０ｍＭ  重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）、０．１ｍＭ  エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）から構成される溶血溶液５００μＬに懸濁する溶血操作を２回行った。ＨＢＳＳを用いて細胞を洗浄後、１，１００ｒｐｍ、５分間の遠心によって細胞を回収し、２μｇ／ｍＬ  ７−アミノアクチノマイシンＤ、０．２％  牛血清アルブミン、０．０５％  アジ化ナトリウム，０．０２％  エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含むハンクス平衡塩類溶液に懸濁してＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のＥＰＩＣＳ−ＸＬフローサイトメーターによりＬｙ５．１陽性細胞率の解析を行った。
【００４８】
上述したように、造血幹細胞は自己複製する能力とすべての血球系細胞に分化する能力を持つ細胞である。もし、造血幹細胞が存在しなければ、移植細胞由来の血球細胞は移植後３ヶ月程度で消失するはずである。図２に示すように、移植後６ヶ月を経過したマウスにおいても、移植した細胞由来（Ｌｙ５．１マウス骨髄由来）で骨髄球、リンパ球の分化抗原を示す細胞が検出されること（図２の各フローサイトメトリーの図の右上）から、移植した細胞集団の中に造血幹細胞が含まれていることが明確になった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＳｔｅｐＳｅｐＴＭ処理後のマウス骨髄由来細胞群をＬｉｎで標識し、フローサイトメトリーにより解析した図である。図中、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔは相対的細胞数、Ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒはＬｉｎ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌは陰性対照、Ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎはカラム処理前、Ｐｏｓｔ−ｃｏｌｕｍｎはカラム処理後を意味する。
【図２】ＳＣＦ、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ−３リガンド存在下でＨｕＨ２８細胞と１０日間処理した細胞を移植して６ヶ月目のマウス末梢血白血球の各種分化マーカーの発現を示す図である。各種分化マーカー標識抗体で標識後、フローサイトメトリーにより解析した。図中、縦軸のＭａｃ−１／Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ３ｅはそれぞれの分化マーカー発現量を示し、横軸はＬｙ５．１（移植細胞由来）の発現量を示す。Ｍａｃ−１は、マクロファージ、Ｇｒ−１は顆粒球、Ｂ２２０はＢ細胞、ＣＤ３ｅはＴ細胞のマーカーであるので、Ｍａｃ−１およびＧｒ−１では骨髄球系の細胞への分化を検出し、Ｂ２２０ではＢ細胞への分化を検出し、ＣＤ３ｅではＴリンパ球系の細胞への分化を検出している。
【図１】
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【図２】
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