(57)【要約】【課題】より実用性の高い薬剤放出プロフィールを有する温度感受性リポソームを提供することを課題とする。【解決手段】感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとが、リポソーム膜に担持されてなる温度感受性リポソームにより、上記の課題を解決する。【選択図】図２
2006306794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとが、リポソーム膜に担持されてなる温度感受性リポソーム。
【請求項２】
リポソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとから構成されてなり、
リポソーム膜構成脂質：高分子化合物：ポリエチレングリコールのモル比が１：０.００３〜０.２：０.００１〜０.２の割合で、リポソーム膜構成脂質と高分子化合物とポリエチレングリコールとを用いて得られる温度感受性リポソーム。
【請求項３】
高分子化合物とポリエチレングリコール誘導体とを、リポソーム膜構成脂質と接触させることにより得られる請求項１または２に記載の温度感受性リポソーム。
【請求項４】
ポリエチレングリコール誘導体がポリエチレングリコール−脂質複合体であり、該ポリエチレングリコール−脂質複合体を構成する脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ジアシルグリセロールおよびコレステロールからなる群より選択される請求項３に記載の温度感受性リポソーム。
【請求項５】
ポリエチレングリコールの分子量が、３５０〜１２０００である請求項１〜４のいずれか１つに記載の温度感受性リポソーム。
【請求項６】
高分子化合物が、水和可能なヘテロ原子を１個以上含む感熱応答性ビニル系モノマーと、疎水性ビニル系モノマーとのブロック共重合体である請求項１〜５のいずれか１つに記載の温度感受性リポソーム。
【請求項７】
高分子化合物が、以下の式（Ｉ）：
【化１】
2006306794.tif 000006
〔式中、Ｒ1は水素原子、以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2006306794.tif 000007
（式中、Ｘは同一または異なって、水素原子またはハロゲン原子であり、Ｒ11は水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基またはアリール基である。）
で表される基または重合開始剤に由来する基であり；
Ｒ2は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のハロゲン化アルキル基、アルデヒド基、フェニル基、ビフェニル基または炭素数７〜１４のアラルキル基であり；
Ｒ3は炭素数４〜３０の炭化水素基であり；
Ｒ4は、水素原子または炭素数１〜１０のアルコキシ基または重合停止剤に由来する基であり；
ｍは５〜５００であり；
ｎは１〜１０であり；
ｙは０〜１００である。〕
で表される化合物である請求項１〜６のいずれか１つに記載の温度感受性リポソーム。
【請求項８】
高分子化合物が、リビングカチオン重合により得られるものである請求項１〜７のいずれか１つに記載の温度感受性リポソーム。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１つに記載の温度感受性リポソームと薬剤とからなる温度感受性薬剤放出システム。
【請求項１０】
薬剤が、抗癌剤である請求項９に記載の温度感受性薬剤放出システム。
【請求項１１】
少なくとも１種の医薬添加剤をさらに含む請求項９または１０に記載の温度感受性薬剤放出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定温度でその膜構造が崩壊する温度感受性リポソーム、および該温度感受性リポソームと薬剤とからなる温度感受性薬剤放出システム関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、リン脂質などからなる脂質二重膜で構成され、数十〜数百ｎｍ程度の粒径を持つ閉鎖小胞体で、様々な物質を封入することができるナノカプセルとして機能することが知られている。近年、生体由来のリン脂質を用いて作成したリポソームと、抗癌剤や治療用遺伝子のような薬剤とからなる、目的の部位に薬剤を送達するための薬物送達システム（ＤＤＳ）が開発されている。このような用途に用いられるリポソームは、親水性の薬剤を閉鎖小胞体の内部の親水性領域に内包するか、そして／または疎水性の薬剤を脂質二重膜に担持する。
【０００３】
リポソームを用いたＤＤＳの開発は広く行われており、血管中でのリポソームの滞留性を向上させたり、目的とする臓器に確実にリポソームを送達するためにリポソーム表面を抗体で修飾したりすることなどが行われている。
【０００４】
リポソームを用いて例えば抗癌剤を目的部位に送達するメカニズムとしては、次のようなことが考えられる。癌細胞周辺の微小血管には２００ｎｍ程度の穴が多く存在している。よって、抗癌剤を含有するリポソームの粒径を２００ｎｍ程度とすることにより、該リポソームは目的とする癌細胞付近で微小血管から漏れ出して、目的の癌細胞に到達することができる。このようにして、抗癌剤含有リポソームは、目的とする癌細胞周辺部位に特異的にかつ高濃度で蓄積することができる。一方、正常な細胞の周辺の微小血管にはこのような穴が存在しないので、正常な細胞周辺ではリポソームが血管から漏れ出すことはない。
【０００５】
しかしながら、リポソームが含有する薬剤の効能を得るためには、薬剤含有リポソームが上記のメカニズムで目的部位に到達した後に、該薬剤がリポソームから効率的に放出されることが必要である。
【０００６】
非特許文献１および２には、特定温度で崩壊して内包物を放出できるリポソームについて、抗癌剤を内包させたリポソームを癌の温熱療法と併用することにより、優れた治療効果が得られることが報告されている。
【０００７】
特許文献１には、感熱応答性部分と疎水性部分とを有する高分子化合物を、その疎水性部分を介してリポソーム膜に保持したリポソームが開示されている。このようなリポソームは、内包物を特定温度で放出することができるので、例えば医薬品を内包してなるリポソームをヒトに投与し、患部を温めることによりその部分で内包物を放出させることができることが記載されている。
【０００８】
また特許文献１には、このリポソームは、１０〜１００℃程度の温度範囲で脂質二重膜の構造が崩壊し、該リポソームに内包される成分が放出されることが記載されている。
【０００９】
しかしながら、上記の特許文献１に開示のリポソームは、リポソームに内包される物質が、ヒトの体温に近い３６℃付近である程度放出されるので、該リポソームを人体に投与しても目的部位に到達する前に該物質が放出され、目的部位で特異的にかつ効率よく物質を放出させるのには不充分であった。
【００１０】
また、特許文献１に記載のリポソームは、血中滞留時間が短く、目的部位に到達する前に体外に排出される傾向が高かった。
【特許文献１】特開２００３−２１２７５５号公報
【非特許文献１】「癌の臨床」第３２巻、第１３号（１９８６）
【非特許文献２】「総合臨床」第３７巻、第１号（１９８８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
薬剤などを保持するリポソームを、医薬分野においてより実用性の高い温度感受性リポソームとするためには、次の特性を有することが望まれる。
（１）哺乳動物、特にヒトの体温に近い温度、すなわち３４〜３９℃付近では薬剤を安定的に保持することができる；
（２）哺乳動物、特にヒトの体温から離れた温度、すなわち３８℃以上、好ましくは４０〜４５℃付近で急激に薬剤を放出することができる；
（３）哺乳動物、特にヒトの体内での血中滞留時間が長い。
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討の結果、リポソーム膜構成脂質と、感熱性応答部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とから構成されるリポソームは、リポソーム膜構造の崩壊温度が従来のリポソームのリポソーム膜構造崩壊温度よりも５〜９℃高く、上記の（１）〜（３）の特性を有することを見出して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとが、リポソーム膜に担持されてなる温度感受性リポソームである。
本発明は、リポソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコールとから構成されてなり、リポソーム膜構成脂質：高分子化合物：ポリエチレングリコールのモル比が１：０.００３〜０.２：０.００１〜０.２の割合で、リポソーム膜構成脂質と高分子化合物とポリエチレングリコールとを用いて得られる温度感受性リポソームでもある。
また本発明は、上記の温度感受性リポソームと薬剤とからなる温度感受性薬剤放出システムである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の温度感受性リポソームを用いることにより、従来のリポソームの崩壊温度よりも高温の温度範囲、すなわち人間の体温から離れた温度範囲でリポソームの膜構造が崩壊してリポソームが保持する薬剤を放出することができる、より実用性に優れた薬剤放出プロフィールを示す温度感受性薬剤放出システムを提供することができる。また、本発明の温度感受性リポソームは、ポリエチレングリコールを含むことから、より長い血中滞留性を示すこともできる。
例えば本発明の温度感受性リポソームに薬剤として抗癌剤を含有させて、対象に投与し、患部を４０〜４５℃程度に加熱する温熱療法を施すことにより、患部で特異的に効率よく抗癌剤を放出させることができ、より好ましいＤＤＳとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のリポソームは、リポソーム膜構成脂質と、感熱応答性部分および疎水性部分を有する高分子化合物と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とから構成される。具体的には、高分子化合物およびＰＥＧがリポソーム膜に担持されてなる。本明細書において、物質が「リポソーム膜に担持される」とは、該物質がリポソーム膜に結合してリポソーム膜表面から突出していてもよいし、リポソーム膜を構成する脂質二重膜に該物質の一部分もしくは全体が埋め込まれていてもよい。
【００１６】
本発明の温度感受性リポソームは、３４〜３９℃付近ではリポソーム膜構造が安定に構成されてリポソームに保持され得る薬剤を安定的に保持することができ、かつ４０〜４５℃付近で急激にリポソーム膜構造が崩壊して該薬剤を放出することができるのが好ましい。すなわち、３７℃で３分間インキュベートした後のリポソームからの薬剤の放出率が５％以下、より好ましくは４.５％以下であり、かつ４５℃で３分間インキュベートした後のリポソームからの薬剤の放出率が８５％以上、より好ましくは８７％以上であるのが好ましい。本明細書における薬剤の放出率は、以下の実施例に記載のアドリアマイシン（ADR）の放出率の測定方法にしたがって測定される値である。
【００１７】
本発明において、リポソーム膜構造が特定の温度で崩壊される機構は明確ではないが、おそらく、温度が上昇すると高分子化合物の感熱応答性部分が脱水和し、感熱応答性部分の疎水性が増大して、当初リポソーム膜外で担持されていた感熱応答性部分の全体または一部がリポソーム膜に入り、リポソーム膜の構造が崩壊すると考えられる。本発明では、両親媒性であるＰＥＧが脱水和した高分子化合物に何らかの相互作用を及ぼすことにより、脱水和した高分子化合物がリポソーム膜の構造を崩壊させる温度（以下、リポソーム膜崩壊温度ともいう）を、従来のリポソームのリポソーム膜崩壊温度に比べてより高くすることができると考えられる。
【００１８】
本発明の温度感受性リポソームに用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、通常、リポソームに用いられるものを好適に用いることができる。このようなＰＥＧの分子量は、１２０〜１２０００が好ましく、より好ましくは３５０〜１２０００、さらに好ましくは３５０〜５０００である。このような範囲の分子量を有するＰＥＧを用いると、リポソーム崩壊温度を好ましい範囲内にすることができる。
【００１９】
上記のＰＥＧは、ＰＥＧ誘導体を高分子化合物およびリポソーム膜構成脂質と接触させることにより、本発明の温度感受性リポソームを構成することとなるのが好ましい。ＰＥＧ誘導体とは、次の式（ＩＩＩ）：
Ｒ'−（ＰＥＧ）−Ｘ−Ｒ                        （ＩＩＩ）
（式中、（ＰＥＧ）は上記のような分子量のポリエチレングリコールを表し、Ｒ'は、水素原子、メトキシ基、または（ＰＥＧ）と２価の結合手を介して結合していてもよい反応性基であり、Ｒは、リポソーム膜構成脂質が有する基と反応性を有する基または脂質に由来する基であり、Ｘはリンカーである）
で表される化合物である。
【００２０】
式（ＩＩＩ）におけるＲ'が反応性基である場合、該反応性基としては特に限定されないが、例えばアミノ基、N-ヒドロキシスクシンイミドとのエステルを形成していてもよいカルボキシル基、ビオチニル基、マレイミド基、ニトロフェニル基、アルデヒド基、アセタール基、トレシル基、チオール基などが挙げられる。２価の結合手としては、例えば−COO−、−CH2−、−CH2CH2−、−CH2CH2CH2−、−COCH2CH2−、−COCH2CH2CH2−、−NHCO−、−NHCO−CH2CH2−などが挙げられる。
式（ＩＩＩ）におけるＸとしてのリンカーは、Ｒの種類に応じて適宜選択することができ、例えば−CO−、−COCH2CH2CO−、−COCH2CH2CH2CO−などが挙げられる。
【００２１】
式（ＩＩＩ）におけるＲがリポソーム膜構成脂質の有する基と反応性を有する基であるＰＥＧ誘導体については、例えばＷＯ９８／３２４６６号などに記載されており、これらを用いることができる。このようなＰＥＧ誘導体は、リポソーム膜構成脂質の有する基、例えばホスファチジルエタノールアミンやホスファチジルセリンが有するアミノ基と結合できるので、リポソーム膜にＰＥＧが結合されることとなる。
【００２２】
上記のＰＥＧ誘導体は、式（ＩＩＩ）におけるＲが脂質に由来する基である化合物が好ましい。このような化合物は、ＰＥＧ−脂質複合体と表すことができる。このようなＰＥＧ誘導体は、リポソーム膜構成脂質と接触することにより、ＰＥＧ−脂質複合体を構成する脂質部分がリポソーム膜に入り込むことができるので、ＰＥＧがリポソーム膜に担持されることとなる。
【００２３】
上記のＰＥＧ−脂質複合体を構成する脂質は、天然脂質であってもよいし、合成脂質であってもよい。天然脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロールなどのグリセロリン脂質；セレブロシドなどのスフィンゴ糖脂質；ジアシルグリセロールなどのグリセリド；コレステロール、ラノステロール、エルゴステロールなどのステロイドが挙げられる。合成脂質としては、アミノ基、水酸基、カルボキシル基などの反応性官能基を有する合成脂質が挙げられる。なかでも、ホスファチジルエタノールアミン、ジアシルグリセロールおよびコレステロールからなる群より選択されるのが好ましい。これらの脂質は、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。上記のリン脂質の構成脂肪酸としては特に限定されないが、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラウリン酸などが挙げられる。
【００２４】
上記のようなＰＥＧ−脂質複合体は市販品を用いることができ、その例としては次のようなものが挙げられる（いずれもAvanti Polar Lipids社製、商品名）。
１,２−ジミリストイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]；
１,２−ジミリストイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[ポリ(エチレングリコール)]；
１,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]；
１,２−ジオレオイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[ポリ(エチレングリコール)]；
１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[アミノ(ポリエチレングリコール)]；
１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[ビオチニル(ポリエチレングリコール)]；
【００２５】
１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[カルボキシNHSエステル(ポリエチレングリコール)]；
１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[マレイミド(ポリエチレングリコール)]；
１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]；
１,２−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[ポリ(エチレングリコール)]；
１,２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)]；
１,２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[ポリ(エチレングリコール)]。
【００２６】
上記の温度感受性リポソームは、ＰＥＧを、リポソーム膜構成脂質、高分子化合物およびＰＥＧの全モル数に対して０.１〜３０モル％の量で用いて得られるのが好ましく、より好ましくは１〜６モル％である。
【００２７】
本発明の温度感受性リポソームに用いられる高分子化合物は、感熱応答性部分を有する高分子化合物である。特に、感熱応答性部分と疎水性部分とを有する高分子化合物であることが好ましい。このような高分子化合物は、水和可能なヘテロ原子を１個以上含む感熱応答性ビニル系モノマーと、疎水性ビニル系モノマーとのブロック共重合体が好ましい。
【００２８】
水和可能なヘテロ原子としては、酸素原子、窒素原子などが挙げられる。水和可能なヘテロ原子の数の上限は、重合を行える範囲であれば特に限定されない。水和可能なヘテロ原子を含む基としては、−CH2−CH2−O−、−CO−、−COO−、−CONH−、−NHCOO−などが挙げられる。
【００２９】
また、疎水性ビニル系モノマーとしては、炭素数３〜４０個程度、特に炭素数４〜３０個程度の各種の脂肪族、脂環族または芳香族の炭化水素基を有するビニル系モノマーを使用できる。
【００３０】
前記のブロック共重合体において、ヘテロ原子を１個以上含む感熱応答性ビニル系モノマーと疎水性ビニル系モノマーとの共重合比率は、各モノマーの種類によっても異なるが、通常３００：１〜３：１程度、特に２００：１〜１０：１程度が好ましい。この範囲内であれば、高分子化合物をリポソーム膜に安定に保持できる。
【００３１】
高分子化合物の数平均分子量のうち感熱応答性部分に該当する量は、特に制限されないが、通常、数百〜数十万程度である。特に、１,０００〜３０,０００程度、さらに特に１０,０００〜２０,０００程度とすることが好ましく、これによりリポソーム膜構造の崩壊温度をより狭い温度範囲とすることができる。
【００３２】
上記の高分子化合物全体の分子量は、特に制限されないが、通常、数平均分子量で数百〜数十万程度とすればよい。この範囲内であれば、リポソーム膜に安定に保持される。より好ましくは２,０００〜５０,０００程度、さらに好ましくは１０,０００〜２１,０００程度、特に好ましくは１１,０００〜２１,０００程度であり、これによりリポソーム膜構造の崩壊温度をより狭い温度範囲とすることができる。
【００３３】
上記の高分子化合物の分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、通常１〜４程度、特に１.０〜１.５程度が好ましい。この範囲内であれば、リポソーム膜構造の崩壊温度をより狭い温度範囲とすることができる。
本発明に用いられる高分子化合物の数平均分子量および重量平均分子量は、それぞれ以下の実施例に記載の方法により測定した値である。
【００３４】
本発明の温度感受性リポソームは、上記の高分子化合物を、リポソーム膜構成脂質、高分子化合物およびＰＥＧの全モル数に対して０.１〜２０モル％程度用いて得られるのが好ましく、より好ましくは０.５〜５モル％程度である。この範囲内であれば、リポソームを充分に温度感受性とすることができるとともに、実用上充分に安定なリポソームが得られる。
【００３５】
高分子化合物の好適な具体例としては、以下の式（Ｉ）：
【００３６】
【化１】
2006306794.tif 000003
【００３７】
〔式中、Ｒ1は水素原子、以下の式（ＩＩ）：
【００３８】
【化２】
2006306794.tif 000004
【００３９】
（式中、Ｘは同一または異なって、水素原子またはハロゲン原子であり、Ｒ11は水素原子、炭素数１〜２０のアルキル基またはアリール基である。）
で表される基または重合開始剤に由来する基であり、Ｒ2は炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のハロゲン化アルキル基、アルデヒド基、フェニル基、ビフェニル基または炭素数７〜１４のアラルキル基であり、Ｒ3は炭素数４〜３０の炭化水素基であり、Ｒ4は水素原子または炭素数１〜１０のアルコキシ基または重合停止剤に由来する基であり、ｍは５〜５００、ｎは１〜１０、ｙは０〜１００である。〕
で表される化合物が挙げられる。
【００４０】
上記の高分子化合物は、リビングカチオン重合により得られるものが好ましい。
リビングカチオン重合の重合開始剤としては、例えば特開平1-108202号公報または特開平1-108203号公報に記載の重合開始剤、イニファー法（米国特許4276394号）で用いられている重合開始剤（α位に芳香環を有する塩素化合物）から得られる置換基（特開2001-055408号公報）、東村らによりMacromolecules,17,265,1984において報告されている重合開始剤(ヨウ化水素とヨウ素とを組み合わせた重合開始剤)、特開昭62-48704号公報、特開昭64-62308号公報に記載されている重合開始剤などが挙げられる。
【００４１】
上記の式（Ｉ）におけるR2は、上記列挙した基のうち、特に炭素数１〜４個程度のアルキル基であることが好ましい。
【００４２】
上記の式（Ｉ）におけるR3は、炭素数４〜３０個程度の炭化水素基であるが、このような基としては、アルキル基、アリール基、アラルキル基などが挙げられる。特に、炭素数８〜３０個程度の直鎖アルキル基が好ましい。
【００４３】
上記の式（Ｉ）におけるmとnとの比率は、R1、R2、R3、R4の種類およびオキシエチレン鎖の長さなどによっても異なるが、m：nが300：1〜3：1程度、特に200：1〜10：１程度となるようにすればよい。
【００４４】
上記のように、yは０〜１００程度であり、y＝０の場合にはオキシエチレンは存在しない。yは特に０〜１０程度であることが好ましい。オキシエチレン鎖が長いほど、リポソーム膜構造の崩壊温度を高くすることができる。
【００４５】
上記の式（ＩＩ）におけるＸとしてのハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子から選択される。
【００４６】
上記の式（Ｉ）の高分子化合物は、ビニルモノマーの種類によっても異なるが、カチオン重合などの公知の方法でモノマーを重合させることにより得ることができる。重合方法としては、特に、リビングカチオン重合が好ましい。リビングカチオン重合法は、例えば特開平1-108202号公報、特開平1-108203号公報、特開2001-055408号公報、特開2000-198825号公報、特開平8-269118号公報に記載されている。
【００４７】
リビングカチオン重合によると、モノマーが無くなるかまたは重合停止剤を添加するまで成長末端が消滅しないため、感熱応答性部分および疎水性部分の各鎖長ひいては高分子化合物の分子量を容易に所望の値にすることができる。また、他の重合法に比べて、狭い分子量分布の高分子材料を得ることができる。
【００４８】
本発明の温度感受性リポソームにおいて、リポソーム膜構成脂質としては、リポソームの膜脂質として通常用いられる両親媒性の脂質を用いることができる。このような脂質としては、例えばホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリンなどのリン脂質が挙げられる。これらのリン脂質の構成脂肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸などが挙げられる。これらは単独でまたは２種以上組み合わせて使用できる。特に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００４９】
また、活性物質として遺伝子を含有する場合には、上記のリン脂質の他に、公知のカチオン性の合成脂質を用いることができる。このようなカチオン性の合成脂質としては、例えばＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシルグルタメート、Ｎ−〔１−（２,３−ジオレイルオキシ）プロピル〕−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドおよび１,２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパンなどの第４級アンモニウム塩が挙げられる。これらの脂質は、単独でまたは２種以上組み合わせて用いることができる。
【００５０】
リポソーム膜構成脂質には、コレステロール、ラノステロール、エルゴステロールなどのステロールが含まれていてもよい。
【００５１】
本発明の温度感受性リポソームの粒径は、0.05〜10μm程度であればよく、使用目的に応じて種々の粒径とすることができる。例えば、抗癌剤を温度感受性リポソームに保持させて、癌細胞に送達するための温度感受性薬剤放出システムとして用いる場合には、通常0.05〜0.2μm程度、特に0.05〜0.1μm程度の粒径であることが好ましい。
【００５２】
本発明の温度感受性リポソームは、上記の粒径の範囲内であれば、一層の脂質二重膜からなる単層リポソーム、または複数の脂質二重膜からなる多重層リポソームのいずれであってもよい。
【００５３】
本発明の温度感受性リポソームは、公知のリポソームの製造方法において、上記のようなリポソーム膜構成脂質と、高分子化合物と、ＰＥＧ誘導体とを、リポソーム膜構成脂質：高分子化合物：ＰＥＧのモル比が、１：０.００３〜０.２：０.００１〜０.２の割合で接触させることにより製造することができる。リポソーム膜構成脂質：高分子化合物：ＰＥＧのモル比は、より好ましくは１：０.００３〜０.１：０.０１〜０.０６であり、さらに好ましくは１：０.０１〜０.０５：０.０１〜０.０３である。
公知のリポソームの製造方法としては、エクストルーダー法、超音波法、フレンチプレス法などが挙げられる。これらの方法の詳細は、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
【００５４】
例えば、エクストルーダー法により本発明のリポソームを製造する方法について説明する。所定量のリポソーム膜構成脂質、高分子化合物およびＰＥＧ誘導体を、クロロホルムなどの適当な有機溶媒に溶解させた溶液をそれぞれ調製し、容器内に入れて混合する。次いで、エバポレーターを用いて溶媒を除去し、容器壁にリポソーム膜構成脂質と高分子化合物とＰＥＧとからなる薄膜を形成させる。この膜は、さらに3〜12時間程度真空乾燥させることが好ましい。次いで、この容器内に緩衝液などの適当な溶液を投入し、超音波処理またはボルテックスミキサーなどを用いて強く攪拌することによりリポソームを形成させることができる。得られたリポソーム分散液をエクストルーダーに通し、そのフィルター孔径を適宜設定することにより、リポソームの粒径を調節することができる。
【００５５】
上記のようにして得られたリポソーム分散液から、担持されなかった高分子化合物、ＰＥＧ誘導体などを、ゲルろ過法、超遠心法、透析法などにより除去することができる。除去したい物質が電荷を有する場合には、イオン交換クロマトグラフィーを用いることもできる。
【００５６】
上記の製造方法において、リポソーム膜構成脂質、高分子化合物およびＰＥＧ誘導体を混合する順序としては特に限定されない。例えば、リポソーム膜構成脂質、高分子化合物およびＰＥＧ誘導体を一度に混合してもよいし、リポソーム膜構成脂質を用いて上記のようなエクストルーダー法などにより予めリポソームを形成させた後に、高分子化合物およびＰＥＧ誘導体を同時にまたは別々に添加して、これらの成分をリポソーム膜に担持させてもよい。
【００５７】
上記のような方法により製造される本発明の温度感受性リポソームにおいて、高分子化合物の感熱応答性部分およびＰＥＧは、リポソーム膜の外側表面に担持されるものであってもよいし、リポソーム膜の内側表面に担持されるものであってもよいし、リポソーム膜の外側表面および内側表面の両方に担持されるものであってもよい。上記の製造方法において、リポソーム膜構成脂質、高分子化合物およびＰＥＧ誘導体を一度に混合する場合は、高分子化合物の感熱応答性部分およびＰＥＧは、リポソーム膜の外側表面および内側表面の両方に担持されるが、リポソームを形成させた後に高分子化合物およびＰＥＧ誘導体を同時にまたは別々に添加する場合は、高分子化合物の感熱応答性部分およびＰＥＧは、リポソーム膜の外側表面にのみ担持される。
【００５８】
上記の温度感受性リポソームと薬剤とからなる温度感受性薬剤放出システムも本発明の一つである。
上記の薬剤は、親水性物質および疎水性物質のいずれであってもよい。親水性物質である場合は、温度感受性リポソームの内部の閉鎖空間の親水性領域に含有され、疎水性物質である場合は、温度感受性リポソーム膜に担持されることとなる。
【００５９】
上記の薬剤としては、特に限定されないが、例えば温熱療法と併用される抗癌剤、抗炎症剤などが挙げられる。抗癌剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、テトラプラチン、イプロプラチンなどの金属錯体；アドリアマイシン(ADR)、マイトマイシン、アクチノマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、Ara-C、ダウノマイシンなどの制癌抗生物質；5-FU、メトトレキセート、TAC-788などの代謝拮抗剤；BCNU、CCNUなどのアルキル化剤；インターフェロン（α、β、γ）、各種インターロイキンなどのリンホカインなどが挙げられる。また、抗炎症剤としては、プレドニン、リンデロン、セレスタミンなどが挙げられる。
【００６０】
上記の薬剤は、疾患の治療のための遺伝子も含み得る。このような遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、重症複合型免疫不全症の治療のためのアデノシンデアミナーゼ遺伝子、家族性高コレステロール血症の治療のためのLDL受容体遺伝子、癌治療のためのインターフェロン(IFN)−α、β又はγ遺伝子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）遺伝子、各種インターロイキン（IL）遺伝子、腫瘍壊死因子(TNF)−α遺伝子、リンホトキシン(LT)−β遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）遺伝子、T細胞活性化共刺激因子遺伝子などが挙げられる。その他、アルツハイマー病、脊椎損傷、パーキンソン病、動脈硬化症、糖尿病、高血圧症などの治療のための遺伝子も挙げられる。
上記の薬剤の量は特に限定されず、薬剤の種類などにより適宜選択することができる。
【００６１】
上記の温度感受性薬剤放出システムの製造において、温度感受性リポソームに薬剤を含有させる方法としては、薬剤の種類に応じて公知の方法を用いることができる。該方法としては限定されないが、例えば上記の温度感受性リポソームの製造方法に従って温度感受性リポソームを形成させた後に、薬剤を含む溶液に該リポソームを浸漬させて薬剤をリポソームの内部に取り込ませる方法、上記の温度感受性リポソームの製造方法において薄膜が形成された容器内に、薬剤を含む溶液を投入した後にリポソーム膜構造を形成させて薬剤を封入する方法などが挙げられる。
【００６２】
本発明の温度感受性薬剤放出システムは、さらに少なくとも１種の医薬添加剤を含むのが好ましい。該温度感受性薬剤放出システムは、錠剤、粉末などの固形製剤の形態であってもよいが、注射製剤のような液体製剤の形態が好ましい。
【００６３】
上記の温度感受性薬剤放出システムが液体製剤である場合、医薬添加剤は、担体（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含み得る。上記の担体は、温度感受性リポソームを製造する際に用いる溶媒であり得る。
【００６４】
上記の温度感受性薬剤放出システムが固形製剤である場合、医薬添加剤は、賦形剤(例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど)、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤(例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含み得る。
【００６５】
上記の温度感受性薬剤放出システムは、上記の薬剤を含む温度感受性リポソームをそのまま、または凍結乾燥させて、上記の医薬添加剤と混合することにより製造することができる。薬剤を含む温度感受性リポソームを凍結乾燥する場合、凍結乾燥する前に適当な賦形剤を添加しておくのがよい。
【００６６】
本発明の温度感受性薬剤放出システムを対象に投与して、患部の温度を４０℃以上、好ましくは４０〜４５℃付近の温度に加熱することにより、温度感受性リポソームの膜構造を崩壊させて薬剤を患部で放出させることができる。このような方法により、患部に到達したリポソームから薬剤を特異的に効率よく放出させることが可能になる。
上記の対象としては、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
【００６７】
患部の温度を４０℃以上にする方法としては、通常の癌の温熱療法において用いられる方法であれば特に限定されず、例えばレーザー、マイクロ波のような電磁波を照射する方法が挙げられる。
【００６８】
上記の温度感受性薬剤放出システムは、非経口および経口経路のいずれによっても投与することができる。例えば薬剤として抗癌剤を用いる場合は、非経口経路、特に静脈注射による投与が好ましい。
【００６９】
上記の温度感受性薬剤放出システムの投与量は、対象の重篤度およびリポソームに含有される薬剤の量に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００７０】
本発明を、以下の実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
＜分子量の測定方法＞
高分子化合物の重量平均分子量（Mw）および数平均分子量（Mn）は、それぞれゲルろ過クロマトグラフィー(GPC)の結果から算出した。GPCは、高速液体クロマトグラフ（TSKgelカラムG-200HXL+G-3000 HXL+G-4000HXL（東ソー社製）、溶離液：クロロホルム）を用いて行い、そのクロマトグラフィーの結果から、被験化合物の分子量をポリスチレンを標準物質として算出することにより、ポリスチレン換算Mw及びMnとして求めた。
【００７１】
＜アドリアマイシンの放出試験＞
薬剤として、蛍光物質であり、抗癌剤として知られるアドリアマイシン(ADR)を用いて、以下の方法でリポソームからのADRの放出について調べた。
ADRを含有するリポソームをHBS緩衝液(20mM Hepes、150mM NaCl 、pH7.4)に分散させ、このリポソーム分散液の温度を10℃に設定した。種々の濃度（0〜50％）で牛胎児血清（FCS）を含有したHBS緩衝溶液を所定の温度にし、このFCS含有HBS緩衝溶液に、該リポソーム分散液をリポソーム脂質濃度が５μＭとなるように加え、所定の時間経過後に蛍光強度を測定した。
【００７２】
ADRは高濃度において消光するので、リポソーム内部に封入されているときには蛍光を発しないが、リポソーム内部からリポソーム外部の緩衝液中に放出されると蛍光を発する。よって、緩衝液を昇温させながらリポソーム分散液の蛍光をモニターすることにより、リポソームからのADRの放出の程度を調べることができる。ADRの励起波長および蛍光波長はそれぞれ470 nmおよび590 nmとした。
【００７３】
リポソームからのADRの放出率（％）は、以下の式を用いて算出した。
放出率（％）＝（Ｆt×Ｆf／Ｆ'f−Ｆi）／（Ｆf−Ｆi）×１００
ここで、Ｆtは、所定の温度で所定の時間インキュベートしたときの蛍光強度；
Ｆ'fは、所定の温度で３０分経過後にトリトンＸ−１００を添加してリポソームを破壊したときの蛍光強度；
Ｆiは、１０℃における初期の蛍光強度；
Ｆfは、１０℃において３０分経過後にトリトンＸ−１００を添加してリポソームを破壊したときの蛍光強度を表す。
【００７４】
＜高分子化合物の製造＞
溶媒としてトルエン(6.2 ml)、添加塩基として酢酸エチル(10 mmol)、モノマーとして（2-エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル（EOEOVE）(4 mmol)、重合開始剤として１-メトキシエトキシエチルアセテート(0.04 mmol)を用いた。これらをシュレンク管に分取して0℃に冷却後、同様に冷却したエチルアルミニウムセスキクロライド溶液(0.2 mmol)を添加することで重合を開始した。さらに、ブロック共重合体を合成するため、EOEOVEモノマーの重合終了時に、トルエンで希釈したオクタデシルビニルエーテル（ODVE）(0.2 mmol)を逐次添加した。ODVEモノマーの重合終了時にアンモニア性メタノールを重合系中に添加することによって重合反応を停止した。
次いで、ジクロロメタンで希釈したブロック共重合体溶液を希塩酸で洗浄して重合開始剤の残渣を除去することにより、ブロック共重合体を精製した。その後、系を中性に戻し、溶媒、未反応モノマー種残渣などを除去するためにエバポレートした。完全に未反応モノマーを除去するために、減圧乾燥機で8時間乾燥した（80℃、0.1 mmHg）。得られたブロック共重合体（高分子化合物）の分子量分布（Mw/Mn）およびMnはGPCで、組成比はNMRにより求めた。これにより、Mn=15000、Mw/Mn=1.24のブロック共重合体が得られた。得られた共重合体のODVE/EOEOVEの共重合比率は、ほぼ100/5であった。
【００７５】
実施例１  温度感受性リポソームの製造
リポソーム膜構成脂質として、10 mg/mlの卵黄ホスファチジルコリン(EYPC)のクロロホルム溶液0.5 mLおよび10 mg/mlのコレステロールのクロロホルム溶液0.218 mLを用い、20 mg/mLの上記で製造した高分子化合物（Mn=15000）のクロロホルム溶液0.281 mLと、5 mg/mLのＰＥＧ５０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）複合体（１,２−ジステアロイル−sn−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−N−[ポリ(エチレングリコール)５０００]、Avanti Polar Lipids社製）のクロロホルム溶液290 μLと共に容積10 mLのフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去することにより、フラスコ内壁にリポソーム膜構成脂質と高分子化合物とＰＥＧとの薄膜を形成させた（EYPC：コレステロール：高分子化合物：ＰＥＧ＝５０：４５：３：２（モル比））。
【００７６】
次に、この容器に硫酸アンモニウム溶液（125 mM硫酸アンモニウム、10 mM HEPES、2 mM EDTA、pH 5.2） 1 mLを添加し、超音波を２分間照射してリポソームを形成させ、さらにエクストルーダー（Avestin社製、フィルター孔径100 nm）を用いてリポソームの粒径を調節した。このリポソーム分散液をＨＢＳ緩衝液で平衡化したセファロース4Bカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に通すことにより、リポソームの内部を酸性に、外部を中性にした。次いで、リン脂質Ｃテストワコー（和光純薬工業社製）キットの使用説明書に沿って、リポソーム分散液の脂質濃度を測定した。得られた結果から１μmolの脂質に対して１００μｇの割合となるようにADRを添加して、３０℃で１時間放置して、ADRをリポソーム内部に取り込ませた。
【００７７】
得られたADR含有リポソーム分散液５μＬをメタノールで２００倍に希釈し、波長477 nmで吸光度を測定した。残りのADR含有リポソーム分散液をＨＢＳで平衡化したセファロース4Bカラムに通し、回収した分散液の脂質濃度をリン脂質−テストワコーキットにより測定した。また、回収した分散液５μＬをメタノールで２００倍希釈し、波長477 nmで吸光度を測定した。これらの値から、リポソームへのADRの封入効率を計算した。
【００７８】
実施例２
実施例１においてＰＥＧ−ＰＥ複合体の量を435μLにする以外は実施例１と同様にして、ＰＥＧをEYPC：コレステロール：高分子化合物：ＰＥＧ＝５０：４５：３：３（モル比）の比で含む温度感受性リポソームを製造した。
【００７９】
比較例１
実施例１においてＰＥＧ−ＰＥ複合体を添加しない以外は実施例１と同様にして、ＰＥＧを保持しないリポソームを製造した。
実施例１および２ならびに比較例１の各リポソームについて、ADRの封入率を測定した結果を以下の表１に示す。
【００８０】
【表１】
2006306794.tif 000005
【００８１】
表１の結果から、ＰＥＧを保持することによるリポソームへのADRの封入効率に対する影響はほとんどないと考えられる。
【００８２】
試験例１
実施例１および２ならびに比較例１のリポソームについて、上記のADRの放出試験を用いて、リポソームからのADRの放出率の時間変化を３０℃、３７℃、３９℃、４２℃、４３℃、４５℃および５０℃でそれぞれ測定した。
結果を図１に示す。図１は、Ａ：実施例１のリポソーム；Ｂ：実施例２のリポソーム；Ｃ：比較例１のリポソームについての結果を示す。
図１の結果から、ＰＥＧを導入することにより、３９℃以下の温度でのADRの放出率が減少することがわかる。
【００８３】
試験例１で得られた結果において、各温度に到達してから３分後の放出率の値を用いて各温度と放出率の関係についてまとめたグラフを図２に示す。
図２の結果から、本発明の温度感受性リポソームは、ＰＥＧを保持しないリポソームに比べて、ADRが放出される温度がより高温側にシフトしていることがわかる。また、実施例１の温度感受性リポソームは、特に、４０℃を超える温度においてADRの放出率が急激に増加することがわかる。
【００８４】
試験例２
より生体内に近い条件下で、温度感受性リポソームからのADRの放出挙動を調べるために本試験を行った。ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を０、１０、３０または５０重量％の量で含むＨＢＳ緩衝液中で、実施例１の温度感受性リポソームからのADRの放出率を、上記のADRの放出試験の手順に従って調べた。
結果を図３に示す。
図３は、実施例１のリポソームを３７℃または４５℃でインキュベートしてから３分後のADRの放出率を示すグラフである。
図３の結果から、本発明の温度感受性リポソームからのADRの放出は、血清の影響をあまり受けないことがわかる。
【００８５】
実施例３
実施例１において高分子化合物の量を0.094 mLにする以外は実施例１と同様にして、ＰＥＧをEYPC：コレステロール：高分子化合物：ＰＥＧ＝５０：４５：１：２（モル比）の比で含む温度感受性リポソームを製造した。
【００８６】
比較例２
実施例１において高分子化合物を添加しない以外は実施例１と同様にして、高分子化合物を保持しないリポソームを製造した。
【００８７】
試験例３
実施例１および３ならびに比較例２のリポソームについて、試験例１と同様にして各温度に到達してから３分後のADR放出率を測定した。結果を図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明により、薬剤を目的部位で放出させることができ、かつヒトの血液内に投与した場合に血中滞留時間が長い温度感受性リポソームを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、Ａ：実施例１；Ｂ：実施例２；およびＣ：比較例１のリポソームからのADRの放出率の時間変化を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１および２ならびに比較例１のリポソームからのADRの放出率の温度依存性を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の温度感受性リポソームを、ウシ胎児血清を含む条件下で、３７℃または４５℃でインキュベートしたときのADRの放出率を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例１および３ならびに比較例２のリポソームからのADRの放出率の温度依存性を示すグラフである。
【図１】
2006306794.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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