(57)【要約】  【課題】  実際に相互作用可能に固定されているかどうかを判別する方法を提供すること。サンプルの採取及び調製が的確に行われているかを評価する方法を提供すること。前記方法を適用可能なセンサーチップを提供すること。  【解決手段】  （１）複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関、又は、（２）特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターン、のいずれかを判断指標として用いたセンサーチップの品質検査方法、を提供する。また、物質間の相互作用の検出に供するサンプルの採取及び調製が的確に行われているか否かを評価する方法であって、上記（１）、（２）のいずれかを判断指標として用いたサンプル評価方法を提供する。さらに、特定の基板領域をセンサーチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いたＤＮＡチップ及びプロテインチップを提供する。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）、（２）のいずれかを判断指標として用いたセンサーチップの品質検査方法。
（１）複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関。
（２）特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターン。
【請求項２】
前記発現レベルは、概日リズム制御遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現レベルであり、前記センサーチップは、ＤＮＡチップであることを特徴とする請求項１記載のセンサーチップ品質の検査方法。
【請求項３】
前記発現レベルは、概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質の発現レベルであり、前記センサーチップはプロテインチップであることを特徴とする請求項１記載のセンサーチップ品質の検査方法。
【請求項４】
物質間の相互作用の検出に供するサンプルの採取及び調製が的確に行われているか否かを評価する方法であって、
次の（１）、（２）のいずれかを判断指標として用いたサンプル評価方法。
（１）複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関。
（２）特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターン。
【請求項５】
前記サンプルは、センサーチップの検出用物質が固定された領域に滴下又は注入される標的物質含有サンプルであることを特徴とする請求項４記載のサンプル評価方法。
【請求項６】
前記標的物質の分解の有無を判定することを特徴とする請求項５記載のサンプル評価方法。
【請求項７】
前記センサーチップは、ＤＮＡチップ又はプロテインチップであることを特徴とする請求項５記載のサンプル評価方法。
【請求項８】
概日リズム制御遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡから逆転写合成されたｃＤＮＡが特定の基板領域に固定され、該基板領域をセンサーチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いたＤＮＡチップ。
【請求項９】
概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質と相互作用するタンパク質が特定の基板領域に固定され、当該基板領域はセンサーチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いたプロテインチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサーチップの品質検査方法、サンプル評価方法、ＤＮＡチップ、プロテインチップに関する。より詳細には、概日リズム制御遺伝子の発現レベルを判断指標として用いたセンサーチップの品質検査方法、及び、物質間の相互作用の検出に供するサンプル評価方法、並びに、特定の基板領域をチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いたＤＮＡチップ及びプロテインチップ、に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、物質間の相互作用解析などに、ＤＮＡチップ（又はＤＮＡマイクロアレイ）、プロテインチップなどのセンサーチップが活用され始めている。センサーチップとは、チップ基板上などに、多種・多数の検出用物質（ＤＮＡ、タンパク質など）を集積して固定したものをいう。例えば、サンプルをセンサーチップに滴下・注入などすることにより、検出用物質と相互作用する標的物質がサンプル中に含まれているかどうかを網羅的に解析することができる。
【０００３】
しかしながら、現在のところ、センサーチップを用いた解析は、精度・再現性が充分でない場合が多い。
【０００４】
そこで、例えば、特許文献１では、チップに、蛍光物質を含有させた検出用物質（ＤＮＡ）を固定し、ＤＮＡチップにおける検出用物質の固定量を検出可能にすることにより、ＤＮＡチップの品質を管理する方法を開示している。この方法により、品質（検出用物質の固定量）が一定の水準に達し、一定の検出精度・再現性を有すると考えられるＤＮＡチップを選び出すことができる。
【０００５】
また、実際に、複数のセンサーチップを用いて同じサンプルを解析し、その結果を比較することにより、センサーチップの品質・性能を評価し、検出精度・再現性を向上させる方法も用いられている。
【特許文献１】特開２００３−２７９５７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の方法では、実際に相互作用可能に固定されているかどうかを判別できないという課題があった。例えば、ＤＮＡチップの場合、ｃＤＮＡ合成工程、増幅工程などを経て検出用物質を合成・増幅し、該検出用物質をセンサーチップに固定する場合が多い。その場合、ｃＤＮＡ合成工程、増幅工程などが的確に行われず、目的のものとは違う核酸が合成・増幅された場合でも、蛍光検出されるという問題があった。
【０００７】
また、複数のセンサーチップを用いて同じサンプルを解析し、その結果を比較することにより、チップの品質・性能を評価する方法には、例えば、チップの品質・性能に問題がある場合と、サンプルの状態に問題がある場合と、を区別できないという課題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、実際に相互作用可能に固定されているかどうかを判別する方法を提供すること、サンプルの採取及び調製が的確に行われているかを評価する方法を提供すること、及び、前記方法を適用可能なセンサーチップを提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、今回、概日リズム末梢臓器（心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、精巣）における、概日リズム制御遺伝子の概日発現変化を調べた結果、９種の概日リズム制御遺伝子（Ｂａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｃｒｙ１）が、概日発現リズムを持つことを新規に見出した。そして、前記９種の概日リズム制御遺伝子の、概日リズム末梢臓器おける発現量を時系列的に測定し、概日リズム制御遺伝子の発現レベル及び発現タイミングに関するデータを取得した。
【００１０】
そこで、本発明では、まず、次の（１）、（２）のいずれかを判断指標として用いたセンサーチップの品質検査方法を提供する。
（１）複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関。
（２）特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターン。
【００１１】
ここで、発現レベルは、ＤＮＡチップの場合、概日リズム制御遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現レベルであり、プロテインチップの場合、概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質の発現レベルである。
【００１２】
例えば、予め準備した品質検査用サンプルをセンサーチップで解析した場合の、複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関又は特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターンと、前記のデータとを比較することにより、センサーチップの品質、即ち、センサーチップに検出用物質が実際に相互作用可能に固定されているかどうか、を検査できる。また、本発明では、複数の遺伝子又は複数の時点について解析を行うため、品質検査の精度を向上できるという有利性がある。
【００１３】
次に、本発明では、物質間の相互作用の検出に供するサンプルの採取及び調製が的確に行われているか否かを評価する方法であって、次の（１）、（２）のいずれかを判断指標として用いたサンプル評価方法を提供する。
（１）複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関。
（２）特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターン。
【００１４】
例えば、標的物質含有サンプルについて、センサーチップで解析する場合、センサーチップで標的物質含有サンプルの網羅的解析を行うと同時に、センサーチップの特定の領域で、概日リズム制御遺伝子の発現レベルの解析も行い、複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関又は特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターンと、前記データとを比較することにより、サンプルの採取及び調製が的確に行われているかを評価することができる。
【００１５】
即ち、標的物質含有サンプルの採取又は調製が的確に行われず、標的物質が分解した場合又は合成されなかった場合は、概日リズム制御遺伝子の発現レベルも検出できないため、前記標的物質含有中の概日リズム制御遺伝子の発現レベルと前記データを比較することにより、標的物質の分解の有無を判定することができる。その他、前記と同様、本発明では、複数の遺伝子又は複数の時点について解析を行うため、サンプル評価の精度を向上できるという有利性がある。
【００１６】
上述の方法は、いずれもＤＮＡチップ又はプロテインチップに適用できる。そこで、本発明では、さらに、概日リズム制御遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡから逆転写合成されたｃＤＮＡが特定の基板領域に固定され、該基板領域をセンサーチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いたＤＮＡチップ、及び、概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質と相互作用するタンパク質が特定の基板領域に固定され、当該基板領域はセンサーチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いたプロテインチップ、を提供する。
【００１７】
なお、本発明に係る概日リズム制御遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ（米国立バイオテクノロジー情報センター）の公共データベースで公開されている。ＮＣＢＩのデータベースにおける、各遺伝子の遺伝子番号は次の通りである。カッコ内は、遺伝子中のどの領域かを示す。（１）Ｂｍａｌ１：ヒトＮＴ＿００９２３７（１２０５４３１８〜１２０６９３１８）、マウスＮＴ＿０８１１２９．１（１０７７８１〜１２２７８１）、ラットＮＷ＿０４７５６２．１（１３７７４０７３〜１３７８９０７３）。（２）Ｎｐａｓ２：ヒトｈＣＧ２７６１４（９５６３２２２６〜６５６４６２２６）、マウスｍＣＧ８４３７（３５９８０１０２〜３５９９４１０２）、ラットｒＣＴ２２４３１（３９２０４４９９〜３９２１８４９９）。（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂα：ヒトｈＣＧ９３８６２（３４９２６０９４〜３４９１２０９４）、マウスｍＣＧ１５３６０（１０５４３８９２５〜１０５４２４９２５）、ラットｒＣＧ３３２９２（８２４９２７９６〜８２４７８７９６）。（４）Ｄｂｐ：ヒトＮＴ＿０１１１０９．１５（ｃ２１４１７７７８〜２１４０２７７８）、マウスＮＴ＿０７８４４２．１（５９７１１〜７４７１１）、ラットＮＷ＿０４７５５８．１（５１２０７３４〜５１３５７３４）。（５）Ｐｅｒ３：ヒトＮＴ＿０２１９３７．１６（１９６２８２２〜１９７７８２２）、マウスＮＴ＿０３９２６８．２（ｃ４３３１５２８〜４３１６５２８）、ラットＮＷ＿０４７７２７．１（ｃ８０１６５６〜８００１９５６）。（６）Ｐｅｒ１：ヒトＮＴ＿０１０７１８．１４（ｃ６９０５７０８〜６８９０７０８）、マウスＮＴ＿０３９５１５．２（６５６６１２１６〜６５６７６２１６）ラットｒＣＧ３４３９０（５２９６０４３０〜５２９７４４３０）。（７）Ｐｅｒ２：ヒトＮＴ＿００５１２０．１４（ｃ５１３６５６２〜５１２１５６２）、マウスＮＴ＿０３９１７３．２（ｃ５８３３７５７〜５８１８７５７）、ラットＮＷ＿０４７８１７．１（ｃ６８２７７０３〜６８１２７０３）。
【００１８】
その他、本発明では、各技術用語を、以下のように定義する。
【００１９】
「概日リズム制御遺伝子群」は、生体内における概日リズムの制御機構に関連する遺伝子を総称したものである。「概日リズム制御遺伝子」は、概日リズムの制御機構に関連する遺伝子である。
【００２０】
「センサーチップ」とは、ＤＮＡチップ、プロテインチップなど、チップに多種・多数の検出用物質を集積して固定したものをいう。「検出用物質」とは、核酸・タンパク質など、標的物質と相互作用する物質をいう。「標的物質」とは、前記検出用物質と特異的に相互作用する物質をいう。
【００２１】
「相関」とは、２つ又は複数の量の間に一定の関係がある場合をいう。
【００２２】
「概日リズム末梢組織」は、生体内の概日リズム中枢（脳視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ））以外の組織をいい、例えば、心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、腎臓などを含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、センサーチップの品質を検査し、実際に相互作用可能に固定されているかどうかを判別することができる。また、本発明により、サンプルの採取及び調製が的確に行われているかを評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明者らは、今回、概日リズム末梢臓器（心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、精巣）における、概日リズム制御遺伝子の概日発現変化を調べた結果、９種の概日リズム制御遺伝子（Ｂａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｃｒｙ１）が、概日発現リズムを持つことを新規に見出した。そして、図１に示すとおり、前記９種の概日リズム制御遺伝子の、概日リズム末梢臓器おける発現量を時系列的に測定し、概日リズム制御遺伝子の発現レベル及び発現タイミングに関するデータを取得した（実験手順などは、後述する実施例１参照）。
【００２５】
このデータは、末梢臓器における概日リズム制御遺伝子の概日発現リズムの基準となる。従って、このデータにおける、各概日リズム制御遺伝子の発現レベル、複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関、及び、特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターンと、センサーチップにサンプルを滴下又は注入して解析し、得た値と、を比較することにより、例えば、センサーチップの品質検査、及び、採取・調製したサンプル評価を、行うことができる。
【００２６】
そこで、まず、本発明に係るセンサーチップの品質検査方法の実施形態について、ＤＮＡチップの品質検査方法を例に説明する。
【００２７】
まず、センサーチップの製造段階において、センサーチップの基板領域に、相互作用の網羅的解析などを目的とした、多種・多数のｃＤＮＡを固定すると同時に、例えば、センサーチップの特定の基板領域に、概日リズム制御遺伝子の転写産物のｍＲＮＡから逆転写合成したｃＤＮＡを固定する。
【００２８】
本実施形態では、センサーチップの特定の基板領域に、９種の概日リズム制御遺伝子（Ｂａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｃｒｙ１）をコードするｃＤＮＡを、それぞれ固定する。なお、９種全ての概日リズム制御遺伝子を固定する必要はないが、少なくとも、前記９種の中から選択される複数の概日リズム制御遺伝子を固定することが好ましい。また、発現レベルの経時的パターンを調べるため、同じｃＤＮＡを固定した領域を複数設けることが好ましい。
【００２９】
一方、品質検査用サンプルを準備する。品質検査用サンプルは、例えば、心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、精巣のいずれかの臓器を採取し、該臓器中の細胞からｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡから逆転写して合成したｃＤＮＡが好ましい。また、臓器の採取時間は、概日時間（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  Ｔｉｍｅ；ＣＴ）の０時、４時、８時、１２時、１６時、２０時、２４時、のいずれかであることが好ましい。ここで、概日時間とは、明条件の開始時間を０時とした場合の時刻をいう（以下同じ）。
【００３０】
次に、センサーチップの、概日リズム制御遺伝子のｃＤＮＡを固定した特定の基板領域に、品質検査用サンプルを滴下又は注入する。そして、概日リズム制御遺伝子のｃＤＮＡと品質検査用サンプル中のｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出し、概日リズム制御遺伝子の発現レベルを測定する。そして、品質検査用サンプル中における概日リズム制御遺伝子の発現レベルと、前記データとを比較し、センサーチップの品質検査を行う。
【００３１】
例えば、概日時間８時に採取した心臓から作製した品質検査用サンプルを用いて、品質検査を行った結果、Ｐｅｒ１とＰｅｒ２の発現が検出された場合、まず、Ｐｅｒ１又はＰｅｒ２の発現が検出されたことにより、センサーチップに検出用物質が、標的物質との相互作用可能に固定されていることを、判別できる。
【００３２】
また、Ｐｅｒ１とＰｅｒ２の発現レベルが、前記データと同じ相関を示している場合、センサーチップへの固定量を推定できる。前記データでは、概日時間８時に採取した心臓におけるＰｅｒ１の発現レベルは９６．５３％、Ｐｅｒ２の発現レベルは５６．４４％である。品質検査の結果が、前記データの値よりも低かった場合でも、Ｐｅｒ１の発現レベルとＰｅｒ２の発現レベルが相関を示している場合には、単に、検出用物質の固定量が少なかっただけで、センサーチップへの固定は正常に行われたと推定できる。また、前記データとの比較により、検出用物質の固定量をおおよそ推定できる。
【００３３】
同様に、例えば、概日時間８時に採取した心臓から作製した品質検査用サンプルと、概日時間１２時に採取した心臓から作製した品質検査用サンプルとを用いて、品質検査を行った結果、両者からＰｅｒ１が検出された場合、まず、Ｐｅｒ１の発現が検出されたことにより、センサーチップに検出用物質が、標的物質との相互作用可能に固定されていることを、判別できる。
【００３４】
また、概日時間８時に採取したものと概日時間１２時に採取したもののＰｅｒ１の発現レベルを比較することにより（Ｐｅｒ１の発現レベルの経時的パターンを解析することにより）、前記と同様に、検出用物質の固定量を推定できる。
【００３５】
なお、プロテインチップの場合も、同様の方法により、品質検査を行うことができる。その場合、まず、相互作用検出の目的となるタンパク質をセンサーチップに固定するとともに、例えば、概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質と相互作用するタンパク質（抗体など）を、特定の基板領域に固定する。そして、同様に、品質検査用サンプル中の、概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質の発現レベルをセンサーチップで検出し、概日リズム制御遺伝子の発現レベルの相関又は経時的パターンを、図１と比較することにより、センサーチップの品質を検査できる。
【００３６】
続いて、以下、本発明に係るサンプル評価方法の実施形態について、ＤＮＡチップを用いたサンプル評価方法を例に説明する。
【００３７】
まず、前記と同様に、センサーチップの製造段階において、センサーチップの基板領域に、相互作用の網羅的解析などを目的とした、多種・多数のｃＤＮＡを固定すると同時に、例えば、センサーチップの特定の基板領域に、概日リズム制御遺伝子の転写産物のｍＲＮＡから逆転写合成したｃＤＮＡを固定する。センサーチップに固定する、概日リズム制御遺伝子の転写産物から合成したｃＤＮＡは、前記と同様である。
【００３８】
次に、標的物質含有サンプルの採取及び調製を行う。標的物質含有サンプルは、例えば、心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、精巣のいずれかの臓器を採取し、該臓器中の細胞からｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写合成して調製する。臓器の採取時間は、概日時間（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  Ｔｉｍｅ；ＣＴ）の０時、４時、８時、１２時、１６時、２０時、２４時、のいずれかであることが好ましい。
【００３９】
次に、センサーチップに、標的物質含有サンプルを滴下又は注入する。そして、標的物質含有サンプル中の標的物質をセンサーチップで検出するのと同時に、センサーチップに固定した概日リズム制御遺伝子のｃＤＮＡと、標的物質含有サンプル中の概日リズム制御遺伝子の転写産物から逆転写合成されたｃＤＮＡと、のハイブリダイゼーションを検出する。そして、センサーチップで検出された概日リズム制御遺伝子の発現レベルと、前記データとを比較し、サンプルの採取又は調製が的確に行われたかどうかを評価する。
【００４０】
例えば、所定の時間に臓器などを採取し、該臓器で発現したｍＲＮＡから逆転写合成してｃＤＮＡを調製し、標的物質含有サンプルを作製した場合、該標的物質含有サンプル中には、概日リズム制御遺伝子の転写産物から逆転写合成されたｃＤＮＡも含まれる。そこで、まず、該標的物質含有サンプルをセンサーチップに滴下又は注入する際に、同時に、センサーチップ中の、概日リズム制御遺伝子のＤＮＡを固定した領域にも、該標的物質含有サンプルを滴下又は注入する。そして、標的物質含有サンプル中の概日リズム制御遺伝子の発現レベルと、前記データとを比較することにより、サンプルの採取及び精製、特に、増幅工程や逆転写工程などが、的確に行われたことかどうかを評価できる。
【００４１】
また、例えば、標的物質含有サンプルの調製の際の、増幅工程や逆転写工程などにおいて、標的物質含有サンプル中のｃＤＮＡ量にばらつきが生じる場合も多い。そのような場合でも、標的物質含有サンプル中の、複数の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける相関、又は、特定の概日リズム制御遺伝子の発現レベルにおける経時的パターン、と上記データを比較することにより、単にｃＤＮＡ合成量が少なかった場合と、標的物質含有サンプルの調製が的確に行われなかった場合を明確に判別できる。
【００４２】
なお、プロテインチップの場合も、同様の方法により、サンプル評価を行うことができる。即ち、センサーチップを用いて標的物質含有サンプルの網羅的な解析を行う際に、同時に、該標的物質含有サンプル中の概日リズム制御遺伝子から発現したタンパク質の発現レベルと、前記データとを比較することにより、標的物質含有サンプルの採取及び精製が、的確に行われたことかどうかを評価できる。
【００４３】
続いて、図２を用いて、本発明に係るＤＮＡチップなどのセンサーチップについて、説明する。
【００４４】
図２に示されたセンサーチップは、ＣＤ様の円盤状をなす基板Ｌ上に、複数の相互作用検出部１が、周方向、螺旋状、放射状に配列された構成を持っている。図２のセンサーチップにおける相互作用検出部１は、ウエル形状であり、検出用物質、概日リズム制御遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡから逆転写合成されたｃＤＮＡ、概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質と相互作用するタンパク質、などをウエル内に固定することができる。
【００４５】
基板Ｌは、ＣＤ（Compact  Disc）、ＤＶＤ（Degital  Versatile  Disc）、ＭＤ(Mini  Disc)などの光情報記録媒体と同様の基材から形成することができる。また、基板Ｌの形状は、図２に示す円板状に特に限定されず、目的に応じて、自由に形成することができる。なお、基板Ｌを安価な合成樹脂を用いて成形することで、センサーチップ製造のランニングコストを、従来使用されていたガラスチップに比して、低く抑えることができる。
【００４６】
センサーチップがＤＮＡチップの場合、例えば、概日リズム制御遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡから逆転写合成されたｃＤＮＡを、基板Ｌの特定の基板領域２に固定し、その基板領域２をセンサーチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いてもよい。
【００４７】
センサーチップがプロテインチップである場合も、同様に、概日リズム制御遺伝子の転写翻訳産物であるタンパク質と相互作用するタンパク質を特定の基板領域２に固定し、その基板領域２をチップの品質検査用領域又はサンプル評価用領域として用いてもよい。
【実施例１】
【００４８】
実施例１では、概日リズム末梢各組織における概日リズム制御遺伝子の時刻ごとの発現ピークを調べた。手順は以下のとおりである。
【００４９】
まず、実験に用いたマウスの概日リズムを同調させた。即ち、マウスを、二週間、８時から２０時まで明条件、２０時から翌８時までを暗条件にした部屋で飼育して、マウスの概日リズムを同調させた。なお、実験には、ＳＬＣ社から購入したＩＣＲマウス（オス、５週齢）を用いた。
【００５０】
次に、マウスから概日リズム末梢組織として、心臓、肺、肝臓、胃、脾臓、精巣を所定の時刻に採取し、すぐに液体窒素で凍結した。なお、各臓器の採取時刻は、概日リズムの同調を行った直後の８時から、４時間ごとに設定した（８時、１２時、１６時、２０時、２４時、翌４時）。
【００５１】
次に、採取した各臓器をホモジナイズ後、、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｔｏｔａｌ  ＳＶ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。次に、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応）を行い、概日リズム制御遺伝子の発現量を測定した。
【００５２】
測定した概日リズム制御遺伝子は、次の１４種類である。Ｂａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｄｂｐ、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｃｌｏｃｋ、Ｃｋ１δ、Ｃｋ１ε、Ｔｉｍ。
【００５３】
なお、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＰＣＲの際には、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ社）を用いて、５０℃、２分／９５℃、１０分／（９５℃、１５秒／６０℃、１分）×４０サイクルを行った。用いたプライマーは、次の通りである。Ｂａｌ１（センスプライマー：配列番号１、アンチセンスプライマー：配列番号２）、Ｎｐａｓ２（センスプライマー：配列番号３、アンチセンスプライマー：配列番号４）、Ｒｅｖ−ｅｒｂα（センスプライマー：配列番号５、アンチセンスプライマー：配列番号６）、Ｄｂｐ（センスプライマー：配列番号７、アンチセンスプライマー：配列番号８）、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ（センスプライマー：配列番号９、アンチセンスプライマー：配列番号１０）、Ｐｅｒ３（センスプライマー：配列番号１１、アンチセンスプライマー：配列番号１２）、Ｐｅｒ１（センスプライマー：配列番号１３、アンチセンスプライマー：配列番号１４）、Ｐｅｒ２（センスプライマー：配列番号１５、アンチセンスプライマー：配列番号１６）、Ｃｒｙ１（センスプライマー：配列番号１７、アンチセンスプライマー：配列番１８）、Ｃｒｙ２（センスプライマー：配列番号１９、アンチセンスプライマー：配列番号２０）、Ｃｌｏｃｋ（センスプライマー：配列番号２１、アンチセンスプライマー：配列番号２２）、Ｃｋ１δ（センスプライマー：配列番号２３、アンチセンスプライマー：配列番号２４）、Ｃｋ１ε（センスプライマー：配列番号２５、アンチセンスプライマー：配列番号２６）、Ｔｉｍ（センスプライマー：配列番号２７、アンチセンスプライマー：配列番号２８）。
【００５４】
上記実験において、各遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子の発現量を基準に算定した相対的な値である。まず、上記実験手順中、逆転写ＰＣＲを行う際に抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの中から、β−アクチン及びＧ３ＰＤＨの転写産物を同時に増幅させて、β−アクチン及びＧ３ＰＤＨのｃＤＮＡを合成した。β−アクチン及びＧ３ＰＤＨは、ハウスキーピング遺伝子であり、発現量がほぼ一定である。そこで、各遺伝子の発現量を、β−アクチン又はＧ３ＰＤＨの発現量と比較することにより、相対的な発現レベルを算定した。なお、発現レベルの算定に際して、二種類のハウスキーピング遺伝子（β−アクチン、Ｇ３ＰＤＨ）を用いて各遺伝子の発現レベルを求め、β−アクチンを用いた場合とＧ３ＰＤＨを用いた場合の誤差を補正・調整することにより、各遺伝子の発現レベルの正確性を向上させた。
【００５５】
結果を図３に示す（数値データは図１参照）。図３中、「ｈｅａｒｔ」は心臓、「ｌｕｎｇ」は肺、「ｌｉｖｅｒ」は肝臓、「ｓｔｏｍａｃｈ」は胃、「ｓｐｌｅｅｎ」は脾臓、「ｋｉｄｎｅｙ」は腎臓、「ｔｅｓｔｉｓ」は精巣、である。各遺伝子の記載のうち、「ｍ」は（例えば、「ｍＢｍａｌ１」中の最初の「ｍ」）、哺乳類（ｍａｍａｌｉａｎ）を意味する。各グラフの横軸は概日時間（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｔｉｍｅ；ＣＴ）を、縦軸は相対的な発現レベル（％）である。概日時間（ＣＴ）は、ＣＴ０〜ＣＴ１２が明条件（主観的昼）、ＣＴ１２〜ＣＴ２４が暗条件（主観的夜）である（以上、図４から図１３おいて同じ）。
【００５６】
図３に示す通り、１４種類中９種類の概日リズム制御遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｄｂｐ、Ｐｅｒ３、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２）で、精巣を除く各臓器において、概日発現リズムがみられた。
【００５７】
なお、図４から図１２は、図３の結果について、概日リズム制御遺伝子ごとに示したグラフである。図４はＰｅｒ１、図５はＰｅｒ２、図６はＰｅｒ３、図７はＢｍａｌ１、図８はＮｐａｓ２、図９はＤｂｐ、図１０はＲｅｖ−ｅｒｂα、図１１はＲｅｖ−ｅｒｂβ、図１２はＣｒｙ１についての結果である。
【実施例２】
【００５８】
実施例２では、肺から採取し調製したサンプルにおけるＰｅｒ１の発現レベルと、前記データ（図１参照）を比較して、品質検査及びサンプル評価を行った。
【００５９】
まず、実施例１と同様に、実験に用いたマウスの概日リズムを同調させた。次に、マウスから肺を所定の時刻に採取し、すぐに液体窒素で凍結した。なお、肺の採取時刻は、概日リズムの同調を行った直後（ＣＴ０）から、４時間ごとに設定した（ＣＴ０、ＣＴ４、ＣＴ８、ＣＴ１２、ＣＴ１６、ＣＴ２０）。なお、ＣＴとは、概日時間をいい、明条件開始時刻を０時（ＣＴ０）とした時刻である。
【００６０】
次に、採取した各肺をホモジナイズ後、、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｔｏｔａｌ  ＳＶ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。次に、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応）を行い、概日リズム制御遺伝子の発現量を測定した。なお、前記と同様、本実験における各遺伝子の発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子の発現量を基準に算定した相対的な値である。
【００６１】
結果を図１３に示す。図１３中、左上の「データベース」は前記データの値である。右上の「測定結果」は、本実験の測定結果である。図１３中、下のグラフは、「データベース」の値と「測定結果」の値との相関を示している。このグラフの横軸は「データベース」の値を、縦軸は「測定結果」の値を、それぞれ示している。
【００６２】
図１３が示すように、「データベース」の値と「測定結果」の値は、それぞれ一致しないが、相関する。即ち、本実験結果は、まず、Ｐｅｒ１の発現レベルの経時的パターンを比較することにより、センサーチップに検出用物質が、標的物質との相互作用可能に固定されていることを判別できるだけでなく、検出用物質の固定量を推定できることを示している。本実験結果は、また、標的物質含有サンプル中のｃＤＮＡ量にばらつきがある場合でも、サンプルの採取及び精製、特に、増幅工程や逆転写工程などが、的確に行われたことを、判別できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に係るセンサーチップの検査方法を用いることにより、センサーチップの品質・性能を一定の水準に保つことができる。本発明に係るサンプル評価方法は、サンプル調製が的確に行われたかどうかを、目的のセンサーチップを用いた解析と同時に行うことができる。従って、本発明は、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】概日リズム制御遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベル。
【図２】センサーチップの一例を示す外観斜視図。
【図３】概日リズム制御遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図４】Ｐｅｒ１遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図５】Ｐｅｒ２遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図６】Ｐｅｒ３遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図７】Ｂｍａｌ１遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図８】Ｎｐａｓ２遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図９】Ｄｂｐ遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図１０】Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図１１】Ｒｅｖ−ｅｒｂβ遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図１２】Ｃｒｙ１遺伝子の、概日時間、臓器ごとの発現レベルを示した図。
【図１３】実施例２の結果を示す図。
【符号の説明】
【００６５】
１  検出用物質固定用部位
２  基板領域
Ｌ  センサーチップ
【図１】
2006020501.tif 000003
【図２】
2006020501.tif 000004
【図３】
2006020501.tif 000005
【図４】
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【図５】
2006020501.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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