(57)【要約】【課題】  育種年限および労力を短縮でき、広大な耕作地を必要とせず、交配相手以外の花粉が混入する危険がなく、育成条件を容易に設定、管理できるホウレンソウの育種法を提供する。【解決手段】  ガラスまたはプラスチックからなる透明な容器に培地を入れ、播種した後、ホウレンソウの生長に必要な気体の透過を阻害せず水滴、雑菌、塵等外部からの異物の容器内への侵入を防止することができるフイルム状蓋材で容器口部を覆い、種子、催芽種子または幼苗を２〜１０℃で１〜４週間培養した後１５〜２５℃、日照１２時間以上の条件で育成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラスまたはプラスチックからなる透明な容器に培地を入れ、播種した後、ホウレンソウの生長に必要な気体の透過を阻害せず水滴、雑菌、塵等外部からの異物の容器内への侵入を防止することができるフイルム状蓋材で容器口部を覆い、種子、催芽種子または幼苗を２〜１０℃で１〜４週間培養した後１５〜２５℃、日照１２時間以上の条件で育成することを特徴とするホウレンソウの育種法。
【請求項２】
該培地は、１〜２％のスクロースを添加した１〜１／２濃度のＭＳ培地であることを特徴とする請求項１記載のホウレンソウの育種法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホウレンソウの育種法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウレンソウはミネラルやビタミンが豊富で栄養的にも優れた野菜であることから、古くから加工原料として利用され、近年においては消費者の健康志向に伴って消費が拡大している野菜ジュースの原料としての利用が増大している。本出願人は、バイオテクノロジーを利用してホウレンソウの有用品種を育成すべく、プロトプラスト培養等の研究を行い、特許文献１記載のとおり、基礎的な技術の確立に成功している。
【０００３】
しかし、ホウレンソウ等種子繁殖性の植物の場合、新しい品種を農場で作り出すためには、有用形質が安定するまでに多くの年月・労力と広い耕作地を必要とする。また農場において交配を行う場合は、交配相手以外の花粉が混入する危険がある。また、農場において育種を行う場合は、温度、日照などの育成条件を設定し制御することが容易なことではない。
【０００４】
また、非特許文献１に記載のように、エンドウについて試験管内（in vitro）で無菌的に培養する方法も知られているが、好適な育成条件は植物の種類によりまったく異なり、他の植物について好適な育成条件であってもホウレンソウに必ずしも適用できるものではない。
【特許文献１】特開平５−１７６６４８号公報
【非特許文献１】園芸学会誌１９９９、６８（１）「無菌発芽したエンドウのin vitroでの開花、結実」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ホウレンソウの育種に関する上記従来技術の問題点にかんがみなされたものであって、育種年限および労力を短縮することができ、広大な耕作地を必要とせず、交配相手以外の花粉が混入する危険がなく、温度、日照などの育成条件を容易に設定し管理することができる新規なホウレンソウの育種法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明者等は研究と実験を重ねた結果、ホウレンソウは、特定の条件を備えた培養容器内に播種した種子に低温処理を行い、その後長日条件下で育成すると容易に抽台し、開花することを発見し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、上記目的を達成する本発明のホウレンソウの育種法は、ガラスまたはプラスチックからなる透明な容器に培地を入れ、播種した後、ホウレンソウの生長に必要な気体の透過を阻害せず水滴、雑菌、塵等外部からの異物の容器内への侵入を防止することができるフイルム状蓋材で容器口部を覆い、種子、催芽種子または幼苗を２〜１０℃で１〜４週間培養した後１５〜２５℃、日照１２時間以上の条件で育成することを特徴とする。  
培地としては、１〜２％のスクロースを添加した１〜１／２濃度のＭＳ培地が好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、１世代に要する期間を約６０日間に早めることができ、育種年限を大幅に短縮することができる。また、交配をin vitroで行うことができるので、交配相手以外の花粉が混入するおそれがない。さらに、温度、日照等の育成条件を容易にかつ完全に制御することができ、季節に関係なく雑種種子を得ることができるので、育種サイクルを大幅に短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下本発明の実施の形態について説明する。  
本発明の方法は培養容器に培地を入れ、ホウレンソウの種子を播種した後培養容器内で培養するものである。培養容器としては、ガラスまたはプラスチックの透明な容器を使用する。
【００１０】
ホウレンソウの種子を培地に播種した後、培養容器の口部を蓋で覆うが、実験の結果、この蓋材としては、ホウレンソウの生長に必要な気体の透過を阻害せず水滴、雑菌、塵等外部からの異物の容器内への侵入を防止することができるフイルム状蓋材を使用することが重要であることが判った。
【００１１】
一般に、植物を培養容器内で生育させると、水分を含んだ緑色でガラス様の透明な状態すなわちビトリフイケーションを生じることがある。この状態が生じると、葉や茎の組織内部に水が湿潤し、気孔の発達が貧弱になるなど正常な発育が望めない。実験の結果、ホウレンソウのin vitro培養の場合は培養容器の蓋を通気性の悪い材料で形成すると、培養容器の内部に多くの結露が生じ、播種した種子の発芽率が悪くなり、発芽してもビトリフイケーションの発生率が高くなることが判った。
【００１２】
また、蓋材としては、容器口部に綿栓をしても充分な通気性を得ることができるが、外部からの異物侵入防止機能は確実性を欠き、また長期間使用すると吸湿してカビ発生の原因となるので好ましくない。
【００１３】
本発明では蓋材として通気性を有するプラスチックフイルム等のフイルム状蓋材を使用することにより、空気、水蒸気、炭酸ガス等の気体の交換（透過）を阻害せず、充分な異物侵入防止機能を有する上に、長期間使用しても吸湿することがなく、カビ発生のおそれがない利点を有する。
【００１４】
フイルム状蓋材としては、たとえば、厚さ０．２ｍｍで孔径０．４５μｍの多数の小孔を有する疎水性PTFEからなるミリラップ（商標）等のプラスチックフイルムが好適な材料である。
【００１５】
培地としては、植物のin vitro培養に通常使用する種々の培地を使用することができるが、１〜１／２濃度のＭＳ培地が好ましい。
【００１６】
培地の炭素源はホウレンソウの生育に大きな影響を及ぼすものである。実験の結果、１％〜２％のスクロースを添加した培地でホウレンソウを培養すると、成長が他の糖に比べてもっとも早く、草丈、展開葉数とも大きい値を示すことがわかった。スクロースの添加量が２％を超えると根の生育が抑制され、添加量１〜２％の場合に比べて生育状態が劣る。また、スクロースを添加した培地では抽台率も６５〜７９％と高く、添加濃度による影響はほとんどない。この抽台率は他の糖たとえばグルコース（２１％程度）に比べて顕著に高いものである。
【００１７】
培養容器内の培地に播種し、容器口部に蓋をした後、種子催芽種子又は幼苗を２〜１０℃で１〜４週間培養した後１５〜２５℃、日照１２時間以上の条件で育成する。低温処理は播種した種子または催芽種子の段階から開始してもよいが、低温処理中種子が菌に汚染されることがあり、汚染防止の対策を採らねばならないが、幼苗から低温処理を開始すればこのような菌による汚染は生じないので、幼苗から低温処理を開始することが好ましい。
【００１８】
この低温処理の期間中ホウレンソウの生育は著しく抑制されるが、培養条件を１５〜２５℃、日照１２時間以上の常温の生育条件に戻すと、生育量が急激に増加し、抽台期（生殖生長期）までには常温のみで生育したホウレンソウとまったく差はなくなる。そして、低温処理を行ったホウレンソウは、抽台率と開花率が常温のみで生育したホウレンソウに比べて顕著に高くなるとともに、開花までの期間も短縮される。したがって、ホウレンソウの培養容器内での 交配および採種までの期間を短縮することが可能となり、ホウレンソウの育種サイクルを短縮することができる。また、この方法は、非常に簡便で、しかも薬剤などを使用しないので変異が生じる危険もなく、この点でも有益な方法である。
【実施例１】
【００１９】
培養容器内でのホウレンソウの交配および種子形成に適した条件を見出すため、培養容器の蓋の種類によるホウレンソウの生育状態、抽台の様子などを調べた。  
ホウレンソウ（品種「次郎丸」）の果皮を取り除き、中性洗剤で洗浄後、アルコールに約１分間浸漬した。次亜塩素酸ナトリウムで１０分間殺菌した後、滅菌水で３回洗浄した。ＭＳビタミン、２％スクロースおよび０．２５％ジェランガムを添加した１／２ＭＳ培地を入れた試験管（直径３０ｍｍ、高さ２００ｍｍ）に殺菌した種子を置床した。
【００２０】
この培養容器を通気性が高いプラスチックフイルムであるミリラップ(商標)（日本ミリポア株式会社製）のフイルム（実施例）、アルミホイル（比較例）またはポリ塩化ビニリデンフイルム(比較例)でそれぞれ蓋をして、２５℃、１６時間日照条件で培養を行った。培養開始後４０日に植物体の草丈、展開葉数および抽台状況について観察した。
【００２１】
１．生育状態
その結果、培養４０日における苗の生育は蓋の種類によって顕著に異なることが判った。最も生育が良かったのはミリラップで蓋をした容器内の苗で、濃い緑色で厚みのある葉を形成していた。通気性が低いアルミホイルで蓋をした容器の苗は、やや葉の栄養状態が悪く、葉は黄緑色で厚みが薄い傾向を示した。同様に通気性が低いポリ塩化ビニリデンで蓋をした容器の苗は、生育が悪いものが多く、細胞がガラス化してビトリフイケーション状態を呈した苗も見られた。  
播種後４０日におけるホウレンソウの草丈および展開葉数を測定した結果を表１に示す。
【００２２】
表１
蓋の種類              草丈(ｃｍ）    展開葉数          生育状態           
ミリラップ            10.0±3.4      11.1±3.9      葉が厚く、緑が濃い
アルミホイル          8.2±3.9        7.9±2.8      葉が黄緑色で厚みが薄い
ポリ塩化ビニリデン    8.0±1.9        9.3±1.4      葉が黄緑色で厚みが薄い
【００２３】
ミリラップで蓋をした容器のホウレンソウは草丈、展開葉数とも最も大きく、濃い緑色をした健全な葉を展開していた。これに対して、アルミホイルまたはポリ塩化ビニリデンで蓋をした容器の苗は、草丈、展開葉数とも少なく、貧弱でクロロシスを起こしていた。
【００２４】
２．発芽、ガラス化（ビトリフイケーション）および抽台
播種後２日頃から種子の発芽が観察され始め、ほとんどの種子が５日までに発芽したが、アルミホイルおよびポリ塩化ビニリデンで蓋をしたものの中で発芽しない種子も観察された。種子の発芽率はミリラップでは１００％であったのに対してアルミホイルでは９０％、ポリ塩化ビニリデンでは８５％であった。
【００２５】
展開された培養容器内ではしばしば培養物の組織がガラス化（ビトリフイケーション）することがある。ビトリフイケーションはアルミホイルおよびポリ塩化ビニリデンの蓋の容器の場合観察されたがミリラップの蓋の場合はまったく観察されなかった。  
抽台個体数については、蓋の種類の影響はほとんど見られなかった。  
蓋の種類と発芽個体数、ビトリフイケーション個体数および抽台個体数との関係を表２に示す。
【００２６】
表２
蓋の種類            供試      発芽        ビトリフイケーション  抽台
種子数    個体数(率）  個体数(率）          個体数(率）
ミリラップ          ２０    ２０(１００）    ０(０）            ８（４０）
アルミホイル        ２０    １８(９０）      ２(１０）          ９（４５）
ポリ塩化ビニリデン  ２０    １７(８５）      ５(２５）          ７（３５）
【実施例２】
【００２７】
培地の糖組成がホウレンソウの生育に及ぼす影響について調べた。  
ホウレンソウ（品種「次郎丸」）の果皮を取り除き、中性洗剤で洗浄後、アルコールに約１分間浸漬した。次亜塩素酸ナトリウムで１０分間殺菌した後、滅菌水で３回洗浄した。ＭＳビタミン、１％、２％または４％スクロースおよび０．２５％ジェランガムを添加したＭＳまたは１／２ＭＳ培地を入れた試験管（直径３０ｍｍ、高さ２００ｍｍ）に殺菌した種子を置床した。
【００２８】
この培養容器をミリラップ(商標)（日本ミリポア株式会社製）のフイルムで蓋をして、２０℃、１６時間日照条件で培養を行った。培養開始後４０日に植物体の草丈、展開葉数および抽台状況について観察した。
【００２９】
１．生育状態
培養４０日目の草丈および展開葉数を測定した。その結果を図１（草丈）および図２（展開葉数）に示す。図１および図２の横軸において、「Ｓ」はスクロースを、「Ｇ」はグルコースを示す。図１および図２から明らかなように、植物体の伸長は１％および２％スクロース添加培地で最も早く、草丈および展開葉数ともに大きい値を示した。それらの展開葉は他に比べて葉長が長く、生育が旺盛であった。草丈にはほとんど差は見られなかったが、２％スクロース添加培地の方が１％添加培地よりも展開葉がやや多かった。また糖濃度が高いと緑色の濃い葉が形成される傾向が見られた。スクロース添加量を４％にすると、草丈が低くなり、葉の生育も抑制された。特に根の生育抑制が著しく、水分および養分の吸収が充分でなかったため伸長が遅れたと思われる。
【００３０】
比較例として、糖組成を１％、２％または４％グルコースとした以外は実施例２と同一方法で培養を行った。その結果、グルコース添加培地で培養した植物体は生育が明らかに悪く、展開した葉もスクロース添加培地の植物体と比べると半分の大きさに満たないものが多かった。グルコース添加培地で培養した植物体はいずれの濃度においてもスクロース添加培地で培養した植物体に比べて生育が劣っていたが、その傾向はグルコース添加濃度が高くなるにつれて顕著に現われた。
【００３１】
２．抽台
表３に培養４０日における抽台個体数および抽台所要日数を示す。  
表３
糖含量              播種数  抽台個体数  抽台率(％)  抽台所要日数  生育状態
１％スクロース      ２０      １３        ６５        ３４          良
２％スクロース      ２０      １４        ７０        ３４          優
２％スクロース
（１／２ＭＳ培地)   ２０      １３        ６５        ３３          良
４％スクロース      １９      １５        ７９        ３５        やや良
１％グルコース      １９        ３        １６        ３１        不良
２％グルコース      ２０        ４        ２０        ３０        不良
４％グルコース      １９        ４        ２１        ３４        不良
【００３２】
抽台は草丈が高く、展開葉数も多かったスクロース培地で培養した植物体に多く見られ、抽台率は６５〜７９％であった。グルコース添加培地で培養した植物体の抽台率は最高でも２１％程度で、炭素源の違いによる差が生長速度より顕著に現われた。しかし、播種から抽台までにかかった日数(抽台所要日数)には大きな差は見られなかった。
【実施例３】
【００３３】
図３に示す方法で培養容器内のホウレンソウの幼苗に一定期間低温処理を行い、開花期までの期間短縮を試みた。  
ホウレンソウ（品種「次郎丸」）の果皮を取り除き、中性洗剤で洗浄後、アルコールに約１分間浸漬した。次亜塩素酸ナトリウムで１０分間殺菌した後、滅菌水で３回洗浄した。この種子を１／２ＭＳ培地入り培養ボトル（直径９ｃｍ、高さ１８ｃｍ）へ播種し、３日間２０℃で催芽させた後８℃、１０時間日照で０（対照）、１０、１５日間培養した。低温処理後は、２０℃、１６時間日照条件で１０日間培養した後、培養ビンあたり６本になるように間引きを行った。培養開始後５０日における植物体の草丈、葉数、抽台および開花率を測定した。
【００３４】
１．生育状態
８℃で１０日間の低温処理でも植物体は生長したが、対照（８℃、０日）と比較すると明らかな差が見られ、生育速度は非常に緩慢であった。  
培養１７日後において、８℃、１０日間処理区の植物体は、低温から常温に移動させてから5日間しか経ていないのに生育が非常に早く、対照と比較すると、草丈はやや劣るものの、葉の色や展開葉数にほとんど差はなかった。８℃、１５日間処理区の生育は、低温から常温に移した頃の８℃、１０日間処理区に比べるとやや大きかったが、３処理区の中では最も生長が遅れていた。
【００３５】
低温処理した植物体は、処理によって生育量に差が見られたものの、２０℃へ移動させると速やかに生長が促進された。培養後４０日になると、草丈や展開葉数など外観の様子にほとんど差は見られなかった。培養４０日後における植物体の草丈を測定した結果を、図４に示し、展開葉数を図５に示す。
【００３６】
２．抽台および開花
幼苗の低温処理が抽台および開花に及ぼす影響を調べた結果（培養５０日）を表４に示す。
【００３７】
表４
低温処理       供試数   抽台個体数   抽台率(％)   開花個体数   開花率(％)
８℃、０日      １８        ６          ２８        １          ５．６
８℃、１０日    １２      １１          ９２        ７        ５８．３
８℃、１５日    １６      １６        １００        ８        ５０．０
【００３８】
表４から明らかなように、幼苗に低温処理を行うと、抽台率は顕著に高くなり、８℃、１０日で９２％、８℃、１５日では１００％となり、ほとんどの植物体が培養５０日までに抽台した。  
抽台した植物体のほとんどが、抽台後１０日程度で開花した。低温処理区の植物体は抽台個体数だけでなく、抽台時期も早かったため、培養５０日における開花率は、８℃、１０日で５８．３％、８℃、１５日で５０％となり、５．６％しか開花しなかった対照と比較すると非常に早かった。
【００３９】
以上の結果、幼苗期に一定期間低温処理を行うと、低温処理によって花芽分化が促進され、抽台率が顕著に高くなるとともに、抽台に要する時間も短縮されることが明らかになった。植物体の生長は、低温処理によって一時的に抑制されたが、培養条件を常温に戻すと生育量が急増し、抽台期までには対照とまったく差がなくなった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】培地の糖濃度が異なるホウレンソウの草丈を示すグラフである。
【図２】培地の糖濃度が異なるホウレンソウの展開葉数を示すグラフである。
【図３】幼苗の低温処理方法を示す説明図である。
【図４】低温処理が草丈に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】低温処理が展開葉数に及ぼす影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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