(57)【要約】【課題】ヒトのレジオネラ・ニューモフィラ感染症の研究に有用なマウス、すなわちマクロファージがレジオネラ・ニューモフィラ感受性であり、肺からレジオネラ・ニューモフィラを排除しにくく、ＨＬＡの多様性に対応する多様な組織適合性抗原を有し、さらに実験動物として扱いやすいマウスを提供する。【解決手段】レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するコンジェニックマウス。レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するが、レジオネラ・ニューモフィラを肺から排除する力の強いＡ／Ｊ系マウスを供与親とし、一方、レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性のマクロファージを有するが、レジオネラ・ニューモフィラを肺から排除する力の弱いマウスの系統を反復親として戻し交配を行うことにより、実験に適した遺伝子背景を持ち、かつ、レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するコンジェニックマウスを作製する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）感受性のマクロファージを有するコンジェニックマウス。
【請求項２】
遺伝子型がLgn1ｓ／ｓである請求項1記載のコンジェニックマウス。
【請求項３】
Lgn1ｓ遺伝子がＡ／Ｊ系統のマウスに由来するものである請求項１記載のコンジェニックマウス。
【請求項４】
遺伝子背景がＣ５７ＢＬ／１０である請求項１〜３のいずれか記載のコンジェニックマウス。
【請求項５】
遺伝子背景がＣ５７ＢＬ／１０のＨ−２コンジェニックマウスである請求項４記載のコンジェニックマウス。
【請求項６】
遺伝子背景がＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃである請求項５記載のコンジェニックマウス。
【請求項７】
レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するコンジェニックマウスの作製方法であって、レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性のマクロファージを有するマウスの系統を反復親とし、レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するマウスの系統を供与親として戻し交配することを特徴とする方法。
【請求項８】
戻し交配を１６世代以上行うことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するマウスの系統がＡ／Ｊである請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性のマクロファージを有するマウスの系統がレジオネラ・ニューモフィラを肺から排除しにくい系統である請求項７〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性のマクロファージを有するマウスの系統がＣ５７ＢＬ／１０である請求項７〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性のマクロファージを有するマウスの系統がＣ５７ＢＬ／１０のＨ−２コンジェニックマウスである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性のマクロファージを有するマウスの系統がＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃである請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージのレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）感受性を支配する遺伝子（Lgn1ｓ）を、レジオネラ抵抗性のマクロファージを有するマウスに選択交配により導入した、新規なマウスおよびその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌は細胞内で増殖するグラム陰性の細菌で、ヒトの呼吸器に感染してポンティアック熱あるいは重篤なレジオネラ肺炎を惹き起こす日和見感染菌である。レジオネラ症の９割はレジオネラ・ニューモフィラによるものである。この細菌は、自然界や人工環境（温泉、空調設備、循環式浴槽など）で、原生動物のアメーバに寄生して生存する。ヒトに感染するとマクロファージ／単球内で繁殖するが、その増殖機構はほとんどわかっていない。２００２年に宮崎県において死者が出る集団発生が起こり問題になっている。
【０００３】
マウスは実験動物としてきわめて有用であるが、Ａ／Ｊ系を除き、近交系のマウスのマクロファージはレジオネラ・ニューモフィラの増殖に対して抵抗性であり、また、細胞性免疫が活発でレジオネラ・ニューモフィラが排除されやすいため、ヒトにおける日和見感染の有用なモデルにはなっていない。マウスの遺伝子連関の研究から、マウスのレジオネラ・ニューモフィラ感受性を支配しているのは、常染色体上にある単一の劣性遺伝子であるLgn1であることがわかっている（非特許文献１）。Ｌｇｎ１の遺伝子座はヒトの第５染色体に相当するマウスの第１３染色体上にある（非特許文献２）が、この遺伝子座は、マウスの神経細胞アポトーシス阻害タンパク質（Ｎａｉｐ）の高度に多様性のある反復配列を含んでおり、最近の報文によれば、ＢＡＣトランスジェニックマウスでは、レジオネラ・ニューモフィラの増殖抑制はＮａｉｐ５により調節されていることが示された（非特許文献３、非特許文献４）。Ｎａｉｐはアポトーシス制御に関連するシグナル経路に包含されていることが知られており、また、Ｎａｉｐがマクロファージの貪食により惹き起こされる経路に係わっている可能性も示されている（非特許文献５）。
【０００４】
したがって、レジオネラ・ニューモフィラ感受性マクロファージを有するマウス（Lgn1s）は、レジオネラ・ニューモフィラのマクロファージ内での増殖機構の研究、Lgn1の遺伝子機能の解析、Ｌｇｎ１が関与する感染症や潜在的な疾患の病態生理ないし原因の解明あるいは治療法の研究などに有用であると考えられる。レジオネラ・ニューモフィラ感受性マクロファージを有するマウスとしては、これまでにもＡ／Ｊマウスが知られているが、Ａ／Ｊマウスは細胞性免疫によりレジオネラ・ニューモフィラを排除する力が強く、また少産であるため実験動物としては使いにくい。Ａ／Ｊマウスをレジオネラ・ニューモフィラの研究に利用した例としては、マクロファージのレジオネラ・ニューモフィラ抵抗性を支配する遺伝子（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のLgn1ｒ）をＡ／Ｊマウスに選択交配により導入することにより、上記要請とは逆に、レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性マクロファージを有するマウスを作製した例が報告されている（非特許文献６）。なお、所期の実験に用いるための実験動物としては、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の多様性に対応することも必要である。
【非特許文献１】S. Yoshida et al., (1991) Infect. Immun. 59(1):428-432
【非特許文献２】M.C. Beckers et al., (1995) Mamm. Genome. 6(8):540-545
【非特許文献３】E. Diez et al., (2003) Nat. Gentet. 33(1):55-60
【非特許文献４】E.K. Wright et al., (2003) Curr. Biol. 13(1):27-36
【非特許文献５】M. Watarai et al., (2001) J. Exp. Med. 194(8):1081-1096
【非特許文献６】H. Miyamoto et al., (1996) Infect. Immun. 64(5):1842-1845
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ヒトのレジオネラ・ニューモフィラ感染症の研究に有用なマウス、すなわちマクロファージがレジオネラ・ニューモフィラ感受性であり、肺からレジオネラ・ニューモフィラを排除しにくく、ＨＬＡの多様性に対応する多様な組織適合性抗原を有し、さらに実験動物として扱いやすいマウスを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するコンジェニックマウスを提供し、これにより上記課題を解決するものである。より具体的には、本発明は、レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するが、レジオネラ・ニューモフィラを肺から排除する力の強いＡ／Ｊ系マウスを供与親とし、一方、レジオネラ・ニューモフィラ抵抗性のマクロファージを有するが、レジオネラ・ニューモフィラを肺から排除する力の弱いマウスの系統を反復親として戻し交配を行うことにより、実験に適した遺伝子背景を持ち、かつ、レジオネラ・ニューモフィラ感受性のマクロファージを有するコンジェニックマウスを作製するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．反復親マウス
供与親であるＡ／Ｊ系マウスに対して戻し交配する反復親マウスとしては、Ｃ５７ＢＬ／１０マウスに由来するＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）を用いることができる。Ｃ５７ＢＬ／１０マウスでは、Ｈ−２コンジェニックマウスが多数作製されているので、これを反復親とすることにより、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対応する多様性を加味した動物実験が可能となる。本発明者らは、Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃマウスでは他のＨ−２コンジェニックマウス系統と比較して肺から菌が排除されにくい（図１）こと、および、この原因がＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの産生が少ない（図２）ことにあることを見出した。したがって、Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）とＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｓ）を比較することにより、レジオネラ・ニューモフィラの排除されやすいマウスで、レジオネラ・ニューモフィラの増殖をマクロファージレベルで支配するＬｇｎ１の機構を研究し、個体レベルでその働きを研究することができる。
【０００８】
２．Lgn1ｓマウスの選択
６週齢以上のマウスの腹腔にチオグリコレート培地を３ｍｌ投与し、４日後に腹腔滲出マクロファージを取り出して、２４穴プレートに付着させる。これにレジオネラ・ニューモフィラ長崎８０−０４５株を感染させたものを、抗菌剤を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清添加）で培養する。２〜３日後に０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００でマクロファージを破壊する。培養液の一定量をＢＣＹＥαプレートに接種して広げ、そのプレートを３５℃で４日間培養する。レジオネラ・ニューモフィラが１００倍以上増殖しているものを、Lgn1ｓとして選択する。
【０００９】
３．交配手順
Ａ／Ｊ（Lgn1ｓ／ｓ）マウスとＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ／ｒ）マウスをかけ合わせ、Ｆ１世代（Lgn1ｓ／ｒ）を得る。Ｌｇｎ１ｓは劣性形質なので、Ｆ１世代をかけ合せて得たＦ２世代から上述の選択法を用いて遺伝子型がLgn1ｓ／ｓであるマウスを選択する。得られたＬｇｎ１ｓ／ｓマウスをふたたびＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ／ｒ）と戻し交配する。この戻し交配−世代内交配−Lgn1ｓ／ｓ選択を１サイクルとして、これを１６サイクル繰り返す。最後の世代内交配で得られたホモ接合体のオスとメスを一匹づつ選ぶことにより、Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ−Lgn1ｓ／ｓコンジェニックマウスを確立する。
【００１０】
４．飼育条件
このコンジェニック系統は兄妹交配で維持する。コンジェニックマウスは動物実験棟の特定病原体除去環境下プラスチックケージで飼育し、ケージ内では５０ｐｐｍの次亜塩素酸を含む滅菌水を使用する。
【００１１】
５．細菌
臨床分離株である強毒性のレジオネラ・ニューモフィラ長崎８０−４５株を使用する（この菌株については次の文献を参照）。
斉藤  厚ら,(1981) 感染症学雑誌,55(2):124-128
F. Kura et al. (1994) Infect. Immun. 62(12): 5419-5423
【００１２】
６．ＤＮＡ
マウスのゲノムＤＮＡは、マウスの脾臓を１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼK溶液（ＰＢＳ溶液）とともに５６℃で１２時間培養した後、ＱＩAmp ＤＮＡ Bloodキット（ＱＩＡＧＥＮ製）を用い、使用説明書にしたがって精製する。
【００１３】
７．塩基配列タグ部位マッピング（Sequence Tagged Sites Mapping）
第１３染色体上のＳＴＳ（Sequence Tagged Sites；塩基配列タグ部位）を増幅するためにＰＣＲを行うが、これに使用するマーカーとしては、D１３Ｍｉｔ１２８、 D１３Ｍｉｔ１９４、D１３Ｍｉｔ３６、D１３Ｄｉｅ２６、Ｄ１３Ｄｉｅ４０、Ｄ１３Ｄｉｅ１２、Ｄ１３Ｄｉｅ３、Ｄ１３Ｍｉｔ７０、Ｄ１３Ｍｉｔ２８７、Ｄ１３Ｍｉｔ７３、Ｄ１３Ｄｉｅ１４８、Ｄ１３Ｍｉｔ７６、Ｄ１３Ｍｉｔ５３がある。これらのマーカーの増幅に使用するプライマーはすでに報告されているものである（これについては次の文献を参照）。
W.F. Dietrich et al., (1994) Nat. Genet. 7(2 Spec No):220-245 
J.M. Scharf et al., (1996) Gonomics 38(3):405-417
M. Endrizzi et al., (1999) Gonomics 60(2):137-151
Ａ／Ｊマウス、Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）マウスおよびＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃLgn1ｓコンジェニックマウスのそれぞれのゲノムＤＮＡ２５ｎｇを、順方向および逆方向のプライマーを各４μＭ、ｄＮＴＰを各２００μＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、ＴａｑｇｏｌｄＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ含む溶液２５μｌ中で増幅する。増幅はGene Amp ＰＣＲシステム２４００（パーキンエルマー製）中、始めに９５℃で９分間の変性、次いで９４℃で３０秒間→５５℃で３０秒間→７２℃で３０秒間を３５サイクル、最後に７２℃で８分間の工程を実施することにより行う。ＰＣＲ産物は４％アガロース（Amplisize Agarose、バイオラド製）ゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色し、ＣＣＤカメラ（アト−社製）で撮影する。
【００１４】
８．マクロファージ
オスのマウスに４％チオグリコレート培地（Difco製）３ｍｌを腹腔内投与した後、腹膜マクロファージを集める。このとき、熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone製）１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ，ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、２−メルカプトエタノール５０μＭ、グルタミン２ｍＭを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌあたりに、マクロファージが１０６個含まれるよう調整する。それぞれのマクロファージ懸濁液１ｍｌを２４穴平底組織培養プレート（Falcon 3047）の各ウェルに入れ単層を形成させる。別に、１０％ＦＢＳを含み抗生物質を含まないＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌあたり２×１０６ＣＦＵのレジオネラ・ニューモフィラを含む菌液を調製する。このレジオネラ菌液０．５ｍｌを、PBSで洗浄して抗生物質を除去したマクロファージの単層に接種し、プレートを４５０ｘｇで１０分間遠心した後、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃１時間培養する。貪食されなかったレジオネラ・ニューモフィラをハンクス平衡化塩溶液ＨＢＳＳ（−）で洗って除いた後、プレートを１〜３日間５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で培養し、最後に、培養物に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを加え、室温で１５分間処理し、細胞溶解物を超音波処理する。各溶解物中の生菌数を緩衝チャコール酵母エキス（ＢＣＹＥ）平板を用いた標準平板法で求める。生菌数は接種平板を３５℃で４日間培養した後、平板上に生育したコロニー数から計算する。遺伝子型あたり５〜７匹のマウスを用い、培養は一匹あたり３連で行い、結果は（ＣＦＵの対数の平均）±ＳＤとして記録する。
【００１５】
９．ゲンタマイシン保護アッセイ
レジオネラ・ニューモフィラを感染させたマクロファージ培養物をＨＢＳＳで洗浄して貪食されなかったレジオネラ・ニューモフィラを除去し、これにゲンタマイシン２５μｇ／ｍｌとＦＢＳ１０％を含むＲＰＭＩ培地を加えて、３７℃で１時間、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養する。培地を捨て、培養物を温ＨＢＳＳで１回洗浄した後、これを抗生物質を含まない１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、０、１、３、４、８、１２、２４時間、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で培養する。最後に、培養物に１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを加え、室温で１５分間処理し、細胞溶解物を超音波処理する。各溶解物中の生菌数は、ＢＣＹＥ平板培地を用いた標準的平板計測法で求める。接種平板を３５℃で４日間培養した後、平板上に生育したコロニー数から計算しＣＦＵとしてあらわす。遺伝子型あたり５〜７匹のマウスを用い、培養は一匹あたり３連で行い、結果は（ＣＦＵの対数の平均）±ＳＤとして記録する。
【００１６】
１０．マウス鼻腔内レジオネラ・ニューモフィラ接種
６−１５週齢のオスのマウスを使用する。マウスは体重１ｋｇあたり６０ｍｇのケタミン塩酸（シグマ）と体重１ｋｇあたり１２ｍｇのキシラジン（シグマ）の混合物を筋肉内注射して麻酔した後、鼻腔内に０．０４ｍｌのレジオネラ菌懸濁液を接種する。鼻腔内に接種したレジオネラ・ニューモフィラの約５分の２が３０分後には肺で認められる。接種後１日目から４日目にマウスの肺を無菌的に取り出し、０．９ｍｌの生理食塩水中を加え乳鉢と乳棒を用いて均一にする。肺中のレジオネラ・ニューモフィラの数は、肺のホモジネートの希釈液を２連でＢＣＹＥ寒天平板上に広げ、３５℃で４日間培養する標準的平板計測法で求める。データは各群３〜５匹のマウスについての平均±ＳＤとして表示する。
【００１７】
１１．ＬＤ５０
個々のマウスに種々の濃度の菌液を鼻腔内投与し、感染後３０日までに死亡したマウスを数える。各テスト群および対照群の間の統計的有意差はプロビット法で検定する。
Finney, D. J. 1971. Probit analysis. Cambridge University Press. New York.
【００１８】
１２．Ｏ２−アッセイ
スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）は、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム硝酸塩）化学発光法を用いて測定する。ＴＧＣ誘導したマクロファージをＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃLgn1ｓコンジェニックマウスとＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃマウスから採取し、ＨＢＳＳで洗浄し、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ，ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。細胞懸濁液を０．２ｍｌ（３×１０５マクロファージ）ずつ、９６穴組織培養プレート（ＤＩＡ−Ｃｅｌｌ  ＰＬＡＴＥ  Ｓ、三菱化学ヤトロン）にいれて接着させ、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で一晩培養する。接着しなかった細胞は洗って除く。単層を洗った後、１０μＭルシゲニンを含みフェノールレッドを含まないＨＢＳＳ０．２ｍｌ中に再懸濁する。得られた細胞は０.５ｍｇ／ｍｌのザイモサン、５０ｎｇ／ｍｌのメゼレイン、種々の濃度のレジオネラ・ニューモフィラＡＭ５１１ＳｏｄＣ：：Ｋｍｒ株あるいは熱殺菌したレジオネラワクチンで処理する。ＡＭ５１１ＳｏｄＣ：：Ｋｍｒ株は、ＨＢＳＳで７回洗って懸濁液中の残存ＳＯＤ活性を排除したものである。レジオネラワクチンは１２１℃で３０分間加熱して調製したものである。４５０ｘｇで５分間遠心した後、プレートをＬＢ９６Ｐマイクロプレートルミノメーター（ＥＧ＆Ｇ  ＢＥＲＴＨＯＬＤ）で６０分間測定する。酸化バーストの量は相対化学発光ユニット（ＲＬＵ）の６０分間の積分値としてあらわす。スーパーオキサイドアニオンの生産は種々の刺激を加えたマクロファージ培養物のＲＬＵ値から培養培地のＲＬＵ値を引いて求める。
【００１９】
１３．統計分析
結果は平均値±ＳＤであらわす。いくつかの実験においては３回の独立の実験の平均値±ＳＤを示す。各試験群と対照群の間の統計的に有意な差はスチューデントのｔ検定（ＣＦＵ計数）、およびプロビット分析（ＬＤ５０）で検定する。
【００２０】
１４．入手可能性
得られたコンジェニックマウスは国立感染症研究所で保存されている。また対照となるＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）マウスは日本エスエルシー株式会社から購入できる。
【実施例】
【００２１】
A.  コンジェニックマウスの作製
日本エスエルシー株式会社から購入したＡ／Ｊマウスのメス（６週齢）とＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃマウスのオス（６週齢）を用いて上述の戻し交配／選択のサイクルを１６回行い、Lgn1ｓ／ｓのコンジェニックマウスを得た。
【００２２】
B.  組換え位置の確認
第１３番染色体上の位置が判明している、特異的なマーカーとそれに対応するＰＣＲプライマー（ＪＡＸ(R) Mice databaseに登録）を用いて、塩基配列タグ部位マッピングを行うことにより、組換え位置の確認を行った。その結果、Ａ／Ｊマウス由来の少なくとも０．１６ｃMのＤＮＡ領域が、コンジェニックマウスＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ−Lgm1ｓに、Ｄ１３Ｄｉｅ４０近傍で導入されていることが判明した（図３）。
【００２３】
C.  マクロファージ内での菌の増殖
作製したＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ−Lgm1ｓマウス、および対照のＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）マウス、それぞれ５〜７匹ずつに対し、上述の方法でチオグリコール誘導を行って腹腔マクロファージを採取し、レジオネラ・ニューモフィラをＭＯＩ＝１の割合で感染させ、マクロファージにおけるレジオネラ・ニューモフィラの増殖性を検討した。この菌はＲＰＭＩ１６４０培地のみでは増殖できない。感染実験は３回行い、合計したマウス５〜７匹で平均と標準偏差を求めた。Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃLgn1ｓコンジェニックマウスでは、感染０日目と比較して感染２日目では約１００倍程度菌が増殖していたが、対照のＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃマウスでは、菌はほとんど増殖できないことが明らかになった（図４Ａ）。
【００２４】
D.  マクロファージ感染における早期の増殖の違い
レジオネラ・ニューモフィラをＭＯＩ＝１の割合で感染させたマクロファージを、上述した方法でゲンタマイシン処理してマクロファージ外のレジオネラ・ニューモフィラを殺菌し、マクロファージ内でのレジオネラ・ニューモフィラの増殖性を経時的に検討した。感染４時間後までは、両マウスのマクロファージとも菌が減少し、Ｌｇｎ１遺伝子の違いによる差は認められなかった。その後は両系統で菌の増殖が始まるが、その速度はコンジェニックマウスのマクロファージで速く、２４時間後には両マウスで有意な差が認められた（図４Ｂ）。
【００２５】
E.  マウス肺におけるレジオネラ・ニューモフィラの増殖
作製したＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃLgn1sコンジェニックマウスと対照Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）マウスにレジオネラ・ニューモフィラを鼻腔内感染させた。使用したマウスは０日目でそれぞれ３匹ずつ、１〜４日目まではそれぞれ５匹ずつ使用し、その平均と標準偏差を用いた。３×１０４の菌を投与した場合、感染２日目までは両マウスとも菌の増殖が見られたが、コンジェニックマウスでの増殖速度は速く感染１日目で約１０倍の差が認められた。感染２日目を境に両マウスとも似たような速度で菌が減少していった（図５Ｃ）。またさらに高濃度の菌（３×１０５、３×１０６）を投与した場合、感染１日目までは両マウスで増殖が認められたが、対照マウスではコンジェニックマウスより１日早く有意な菌の減少が始まった（図５Ａ、５Ｂ）。
【００２６】
F.  マウスの鼻腔内感染におけるＬＤ５０の決定
コンジェニックマウスと対照マウスとに種々の濃度の菌液を鼻腔内投与し、感染後３０日までに死亡したマウスを数えた。投与した菌の濃度は３×１０８、１０８、３×１０７、１０７、３×１０６、１０６、３×１０５，１０５である。１群あたり５〜１２匹のマウスを使用し、３回行った。ＬＤ５０値はプロビット法（ｐ＜０．０５）により求めた。コンジェニックマウスのほうが対照マウスと比較して約２．３倍ほどＬＤ５０値が低かった（表１）。さらにLgn1ｓ遺伝子が由来したＡ／Ｊ（Lgn1ｓ）マウスで同様の実験を行ったところ、ＬＤ５０は１.２×１０７であり、両系統よりも高かった。
【表１】
2006020567.tif 000002
【００２７】
G.  スーパーオキサイド産生の違い
チオグリコールで刺激した腹腔滲出マクロファージに様々のマクロファージ刺激物質を添加し、スーパーオキサイドの産生量をルシゲニンによる化学発光量を測定することにより求めた。酵母の細胞壁粗各分であるザイモサンを０.５ｍｇ／ｍｌで加えた場合、大量のスーパーオキサイドが産生されたが、対照マウスのほうが産生量が多かった。レジオネラ・ニューモフィラの加熱死菌を様々な濃度（ＭＯＩ＝１０、１００、１０００）で加えた場合、ＭＯＩ＝１０００で対照マウスのほうが産生量が有意に高かった（図５）。このことからコンジェニックマウスのマクロファージはスーパーオキサイド生産能が低下していることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
以上述べたように、本発明はレジオネラ・ニューモフィラを肺から排除する能力が低く、かつマクロファージがレジオネラ・ニューモフィラ感受性であるコンジェニックマウスを提供するものである。このようなコンジェニックマウスはＬｇｎ１遺伝子の機能解析を可能にし、感染症、Ｌｇｎ１の関与が推定される感染症、特にレジオネラ症の病態生理研究や治療法の研究にとって非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】種々のＨ−２コンジェニックマウスの肺からのレジオネラ・ニューモフィラ排除能力を示す図である。黒丸はＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Ｈ−２ａ）、白丸はＣ５７ＢＬ／１０（Ｈ−２ｂ）、黒三角はＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）、白四角はＢ１０．ＢＲ（Ｈ−２ｋ）、黒菱形はＢ１０．Ｓ（Ｈ−２ｓ）、白菱形はＢ１０．ＱＢＲ（Ｈ−２ｂｑ４）系統を表わす。
【図２】レジオネラ・ニューモフィラ投与後のＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（黒丸）とＣ５７ＢＬ／１０（白丸）における肺のサイトカイン量の推移を示すグラフである。＊はスチューデントのｔ検定の結果ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【図３】マウス第１３染色体の組換え位置を示す。黒棒で示す領域が、Ａ／Ｊマウスに由来する領域である。右端の矢印はＣ５７ＢＬ／６で報告されている転写位置とその方向を示している。
【図４】Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌLgn1ｓコンジェニックマウス（黒丸）およびＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）マウス（白丸）の腹腔からとったマクロファージでのレジオネラ・ニューモフィラの増殖を示すグラフである。Aは感染後にマクロファージを洗浄して残った菌の増殖を示す。Bはゲンタマイシン処理をして細胞外の菌を殺菌した後の菌の増殖を示す。＊はスチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【図５】Ｂ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃLgn1ｓコンジェニックマウス（黒丸）およびＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）マウス（白丸）の鼻腔内に種々の菌量を投与したときの肺における生菌数の推移を示す図である。＊はスチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【図６】各種マクロファージ刺激剤に応答してマクロファージが産生するスーパーオキサイドの量を示すグラフである。白棒は対照のＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃ（Lgn1ｒ）マウス、黒棒はＢ１０．Ａ／ＳｇＳｎＳｌｃLgn1ｓコンジェニックマウスである。＊はスチューデントのｔ検定の結果ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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