(57)【要約】【課題】莢膜形成細菌による感染に対する防御を付与し得るキャリアタンパク質を提供すること。【解決手段】少なくとも５つのＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含む、キャリアタンパク質であって、一実施形態においては、上記ＣＤ４＋エピトープが、病原性の細菌またはウイルスに由来し、さらなる実施形態においては、上記ＣＤ４＋エピトープが、破傷風トキシン、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍサーカムスポロザイトタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎核コアタンパク質、インフルエンザマトリックスタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキシン変異体ＣＲＭ  １９７、Ｂ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体、百日咳トキシンまたは熱ショックタンパク質７０由来である、キャリアタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に開示されるキャリアタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエピトープキャリアタンパク質に関する。莢膜多糖に結合体化した場合、これらのキャリアタンパク質は、Ｔ細胞依存性免疫応答を惹起し得るワクチンの成分として有用である。詳細には、本発明のタンパク質を用いて、３ヶ月と約２歳との間の年齢の乳児における莢膜形成細菌（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）による感染に対する防御を付与し得る。
【背景技術】
【０００２】
莢膜形成細菌（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界中の新生児および乳児の罹病率および死亡率の有意な原因を構成する（ＴｕｎｋｅｌおよびＳｃｈｅｌｄ、１９９３）。発展途上国では、毎年約１００万人の小児が、肺炎単独によって死亡する。さらに、先進国でさえも、抗生物質耐性の現象の増加は、既存のワクチンに対する改善の大きな必要性が存在することを意味する。
【０００３】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多糖莢膜は、莢膜形成細菌による鼻咽頭コロニー形成および全身侵襲のために重要である主要な毒性因子を示す（ＭｏｘｏｎおよびＫｒｏｌｌ、１９９０）。その結果として、防御免疫原の発見に関する研究の多くは、莢膜多糖に焦点を当ててきた。これらの多糖が、防御抗体の形成を惹起し得るという知見は、成人を疾患から防御するのに効果的である多数のワクチンの開発をもたらした（Ａｎｄｒｅｏｎｉら  １９９３；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔら  １９９２）。
【０００４】
今日までに開発された莢膜多糖ワクチンに伴う問題は、これらが２歳未満の小児を、疾患から本質的に防御できないということを被っていることである（ＨｏｌｍｅｓおよびＧｒａｎｏｆｆ  １９９２）。これは、この小児の集団が高い感染危険性にあることが理解されている場合は、重大な欠点である。それらが感染をブロックできないことは、多糖抗原に対する、身体により用いられる唯一の抗体応答であるＴ細胞非依存性（ＴＩ）型の免疫反応に由来すると考えられる。この型の応答は、Ｔ細胞に対する抗原提示にＭＨＣクラスＩＩ拘束分子を含まない；その結果、Ｔ細胞の助けが妨げられる。ＴＩ応答は成体では十分に働くが、ＴＩ応答は、機能的Ｂ細胞が未成熟であること、Ｂ細胞レセプター媒介シグナル伝達が不活化されていること、および抗原刺激に応じたＢ細胞アネルギーのような因子の組合せに起因して、非常に幼い小児においては不活性である。
【０００５】
この欠点を克服するために、２つの特定のワクチンアプローチが現在調査されている。第１のものは、炭水化物イディオタイプを模倣するペプチドを含む抗イディオタイプワクチンの開発である（ＭｃＮａｍａｒａ  １９８４；Ａｇａｄｊａｎｙａｎ，１９９７）。第２のアプローチは、ペプチドキャリアへのこの多糖の共有結合により、Ｔ細胞非依存性（ＴＩ）多糖抗原をＴ依存性（ＴＤ）抗原へと形質転換するように設計された結合体ワクチンを含む。
【０００６】
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型（Ｈｉｂ）結合体ワクチンは、莢膜形成細菌による感染に対する他のワクチン開発についての主要な例を示す。実際、Ｈｉｂによって引き起こされる髄膜炎および他の感染は、Ｈｉｂ結合体での広範囲なワクチン接種が達成された国では劇的に低下した（Ｒｏｂｉｎｓ，１９９６）。この病原体の完全な除去は可能であり得るが、既存のワクチンのさらなる改善を含むいくつかの因子に依存する（Ｌｉｐｔａｋ，１９９７）。
【０００７】
広範に分布する小児ワクチン抗原破傷風およびジフテリアのトキソイドは、結合体ワクチン注射時で既にプライミングされた集団を利用するということを目的として、キャリアタンパク質として選択されている。小児ジフテリア−破傷風（ＤＴ）またはジフテリア−破傷風−百日咳（ＤＴＰ）ワクチンを用いる以前のワクチン接種は、現状では、キャリアのプライミングを開発して、多糖結合体に対する免疫応答を増強し得ることを意味する。
【０００８】
多数のこのようなワクチンが、首尾良く生成されており、そしてこれらの病原体によって引き起こされる死亡数を減少させるために有効である。これらのワクチンにおいて用いられるキャリアは、大きな抗原（例えば、破傷風トキソイド、非毒性ジフテリアトキシン変異体ＣＲＭ１９７およびＢ群Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）である。しかし、将来的には、同じキャリアタンパク質を含む結合体ワクチンの数が増加するにつれ、このキャリアに対する既存の抗体による免疫応答の抑制が問題となるようであると考えられる。
【０００９】
多くの研究が現在、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを含むキャリアペプチドを含むが、Ｔ細胞抑制（Ｔｓ）機能を有さない、改善されたキャリア分子の開発に向けられている（Ｅｔｌｉｎｇｅｒら  １９９０）。ヘルパー機能のみを保持するペプチド（ＣＤ４＋エピトープ）が、キャリアとして最も適切である。なぜなら、それらの効果は、Ｔ細胞の助けを誘導するために十分であるが、このキャリアは抗キャリア抗体の生成を制限するかまたは生成を完全に回避するに十分小さいからである。
【００１０】
種々の刊行物は、このようなペプチドが、ハプテンと共有結合された場合にハプテンに対してＴ細胞の助けを付与する能力を実証する（Ｅｔｌｉｎｇｅｒ，１９９０；Ｖａｌｍｏｒｉ  １９９２；Ｓａｄｄ  １９９２；Ｋｕｍａｒ  １９９２；Ｋａｌｉｙａｐｅｒｕｍａｌ，１９９５；Ｄｅ  Ｖｅｌａｓｃｏ，１９９５およびＢｉｘｌｅｒ  １９８９）。しかし、今日まで、これらの刊行物は、有効なワクチンの開発をもたらさなかった。従って、乳児および幼い小児における、莢膜形成細菌によって引き起こされる疾患と戦う際に有効である、新規な改善されたワクチンストラテジーの開発についての大きな必要性が残存している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
莢膜形成細菌による感染に対する防御を付与し得るキャリアタンパク質を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
・（項目１）  少なくとも５つのＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含む、キャリアタンパク質。
・（項目２）  上記ＣＤ４＋エピトープが、病原性の細菌またはウイルスに由来する、項目１に記載のキャリアタンパク質。
・（項目３）  上記ＣＤ４＋エピトープが、破傷風トキシン、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍサーカムスポロザイトタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎核コアタンパク質、インフルエンザマトリックスタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキシン変異体ＣＲＭ  １９７、Ｂ群Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体、百日咳トキシンまたは熱ショックタンパク質７０由来である、項目１または２に記載のキャリアタンパク質。
・（項目４）  上記ＣＤ４＋エピトープが、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＣ、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ２ＴＴ、ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨｂｓＡｇ、ＭＴおよびｈｓｐ７０  ＣＤ４＋のエピトープから選択される、項目１〜３のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目５）  Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＣ、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ２ＴＴ、ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨｂｓＡｇおよびＭＴ  ＣＤ４＋のエピトープを含む、項目１に記載のキャリアタンパク質。
・（項目６）  Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＣ、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ２ＴＴ、ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨｂｓＡｇ、ＭＴおよびｈｓｐ７０  ＣＤ４＋のエピトープを含む、項目１に記載のキャリアタンパク質。
・（項目７）  Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＣ、Ｐ３０ＴＴおよびＰ２ＴＴ  ＣＤ４＋のエピトープを含む、項目１に記載のキャリアタンパク質。
・（項目８）  上記ＣＤ４＋エピトープが、ヒトＣＤ４＋エピトープである、項目１〜７のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目９）  １以上のＮ６、Ｎ１０またはＮ１９タンパク質を含む、キャリアタンパク質。
・（項目１０）  オリゴマー形態である、項目１〜９のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目１１）  多糖に結合体化されている、項目１〜１０のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目１２）  上記多糖が、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型多糖である、項目１１に記載のキャリアタンパク質
・（項目１３）  上記多糖が、以下の生物：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａまたはＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのいずれか１つに由来する、項目１１に記載のキャリアタンパク質。
・（項目１４）  上記多糖が、共有結合によってタンパク質に結合体化されている、項目１１〜１３のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目１５）  上記多糖が、還元的アミノ化によってタンパク質に結合体化されている、項目１１〜１３のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目１６）  各多糖単位について２と１０との間のタンパク質単位が存在する、項目１１〜１５のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目１７）  医薬として使用するための、項目１〜１６のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目１８）  項目１〜１６のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質の医薬としての使用。
・（項目１９）  ワクチンまたはワクチンの成分としての使用のための、項目１〜１６のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目２０）  項目１〜１６のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質の、ワクチンまたはワクチンの成分としての使用。
・（項目２１）  項目１〜１６のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質を含む、ワクチン。
・（項目２２）  ワクチン接種の生成方法であって、哺乳動物、好ましくはヒトに項目１〜１６のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質を導入する工程を包含する、方法。
・（項目２３）  莢膜形成細菌により引き起こされる疾患の制御における、防御免疫原としての使用のための、項目１〜１６のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質。
・（項目２４）  項目１〜１０のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質をコードする、核酸分子。
・（項目２５）  ＤＮＡを含む、項目２４に記載の核酸分子。
・（項目２６）  項目２４または項目２５のいずれかに記載の核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現ベクター。
・（項目２７）  項目２６に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
・（項目２８）  項目２４もしくは項目２５のいずれかに記載の核酸分子、または項目２６に記載のベクターによって形質転換された、トランスジェニック動物。
・（項目２９）  項目１〜１０のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質の調製方法であって、項目２６に記載のベクターを、宿主細胞において発現させる工程、および上記宿主細胞を上記タンパク質が発現される条件下で培養する工程、およびこのようにして発現された上記タンパク質を回収する工程を包含する、方法。
・（項目３０）  項目１〜１０のいずれか１項に記載のキャリアタンパク質の生成方法であって、以下の工程：
ａ）ペプチドエピトープをコードするオリゴヌクレオチド分子を構築する工程；
ｂ）上記オリゴヌクレオチド分子をアニーリングさせて二重鎖を形成させる工程；
ｃ）上記オリゴヌクレオチド二重鎖を、融合タンパク質をコードするように発現ベクター中に導入する工程；
ｄ）上記発現ベクターを宿主細胞中に導入して、上記融合タンパク質の発現を可能にする工程；および
ｅ）上記宿主細胞の培養物から生成される上記融合タンパク質を単離する工程、
を包含する、方法。
・（項目３１）  上記融合タンパク質を多糖に結合体化させる工程をさらに含む、項目３０に記載の方法。
・（項目３２）  上記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である、項目２９に記載の方法。
【００１３】
本発明によれば、少なくとも５つのＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含むキャリアタンパク質が提供される。好ましくは、このキャリアタンパク質は、多糖に結合体化される。これらの化合物は、次に細菌性病原体によって引き起こされる疾患に対する防御ワクチンの成分として有用であり得る免疫原性化合物として有用である。
【００１４】
キャリアタンパク質は、キャリア−抗原結合体が導入された生物の免疫系による、それに結合体化された抗原に対する抗体の形成を誘導する抗原性ポリペプチド存在物である。キャリアタンパク質を使用する必要性は、多くの短いエピトープが防御性であるが、これらは免疫原性が乏しいという事実から生じる。このことは、新規でかつ有効なワクチンの生成におけるこれらのエピトープの有用性を無効にする。免疫原性キャリアタンパク質を、非免疫原性である分子に結合体化することによって、このキャリアタンパク質の高い免疫原性をこの結合体分子に付与し得る。このような結合体分子は、この結合体分子の非免疫原性部分に対する免疫応答の生成を刺激し、従って、そうでなければ防御免疫が生成され得ない病原体に対して防御するワクチンにおいて有効に用いられている。
【００１５】
それゆえ、非常に免疫原性のタンパク質（例えば、破傷風トキソイド）は、非免疫原性エピトープに対する抗体の生成のためのＢ細胞に対する助けを提供するＴｈ細胞応答を誘導するために、キャリアとして歴史的に用いられている。しかし、全体としての有効性は、一般に、このアプローチを用いて達成されていない。なぜなら、キャリアタンパク質にカップリングされたハプテン（エピトープ）に対する抗体応答は、レシピエント宿主が、非改変キャリアタンパク質を用いて以前に免疫された場合には阻害され得るからである。この現象は、エピトープ特異的抑制と称され、そして種々のハプテン−キャリア系において現在研究されている。
【００１６】
キャリアタンパク質に対する細菌性多糖のカップリングは、この多糖の免疫原性を改善することが示されており、そして新規な特徴を有する抗原をもたらした。さらに、タンパク質に対する胸腺非依存性（ＴＩ）多糖のカップリングは、この多糖を胸腺依存性（ＴＤ）にする。
【００１７】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩに拘束されるＴ細胞の活性を刺激するペプチドエピトープである。このサブセットのＴ細胞は、Ｔｈ細胞を含む。多くのＣＤ４＋エピトープは、当業者に周知であり、そしてそれらに共有結合された場合にＴ細胞の助けをハプテンに付与することが示されている（Ｅｔｌｉｎｇｅｒら，１９９０；Ｖａｌｍｏｒｉ  １９９２；Ｓａｄｄ  １９９２；Ｋｕｍａｒ  １９９２；Ｋａｌｉｙａｐｅｒｕｍａｌ，１９９５）。
【００１８】
本発明のキャリアタンパク質において用いられるＣＤ４＋  Ｔエピトープは、理想的には、できるだけ短い長さのペプチドを含む。従って、このエピトープは、その特徴を、Ｔ細胞の助けを誘導するに十分な程度までは保持するが、抗キャリア抗体の過剰な生成を最少にするに十分に小さい。このことは好ましい。なぜなら、共通のキャリアタンパク質を含む結合体ワクチンの数が増え続けるならば、キャリアエピトープに対する、既存の抗体による免疫応答の抑制は、将来問題になるようであると考えられるからである。さらに、短いペプチドのキャリアエピトープとしての使用は、適切なＴｈエピトープの合理的選択を提供するが、ＴＩ免疫応答の惹起におけるこのタンパク質の機能に有害であるＢ細胞またはＴサプレッサーエピトープを含む配列のストレッチを回避する。
【００１９】
ＣＤ４＋エピトープが選択され得る適切なタンパク質としては、破傷風トキシン（ＴＴ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍサーカムスポロザイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｉｔｅ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎核コアタンパク質、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅマトリックスタンパク質、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ赤血球凝集素、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイド変異体ＣＲＭ１９７、Ｂ群Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、肺炎球菌トキシンニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）、ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓおよびＭ．ｌｅｐｒａｅ由来の熱ショックタンパク質が挙げられる。Ｍ．ｌｅｐｒａｅ  ＨＳＰ７０  ４０８４２７エピトープは、対応するヒトホモログ配列には見出されない（Ａｄａｍｓら，１９９７  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，６５：１０６１−７０）；なぜなら、ワクチン処方物におけるＨＳＰモチーフの使用の可能な制限が、微生物のＨＳＰとヒトのＨＳＰとの間の高い相同性に起因する自己免疫応答を誘導する可能性であり、このエピトープが特に好ましい。他の適切なキャリアペプチドエピトープは、当業者に周知である。これらの抗原から選択されるＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープは、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞によって認識される。
【００２０】
このキャリアタンパク質中に提示されるＴ細胞エピトープの数が、Ｔ細胞ヘルプを、それに結合体化されたオリゴ糖分子に付与する際に有意な影響を有することが見出されている。ポリエピトープキャリアタンパク質は、５以上のＣＤ４＋
Ｔ細胞エピトープを含むべきである。好ましくは、このポリエピトープキャリアタンパク質は、５と５０との間の縮重ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ、より好ましくは５と２０との間のエピトープ、さらにより好ましくは５、６、７、８、９、１０、１１または１９の縮重ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含む。キャリアタンパク質における多数の普遍エピトープの使用は、ペプチド抗原に対して生じる免疫応答の遺伝的制限の問題を低減させることが見出されている。
【００２１】
ＣＤ４＋エピトープに加えて、本発明のキャリアタンパク質は、他のペプチドまたはタンパク質のフラグメント（例えば免疫調節性サイトカイン（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））由来のエピトープ）を含み得る。プロミスカス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ペプチド（Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら  １９８９）、いわゆる「普遍」ペプチド（Ｋｕｍａｒら，１９９２）、クラスターペプチド（Ａｈｌｅｒｓら，１９９３）またはＴ細胞およびＢ細胞エピトープの両方を含むペプチド（Ｌｅｔｔら，１９９４）をまた用いて、必要に応じて、免疫系の種々のエフェクター系を補充し得る。
【００２２】
このポリエピトープキャリアタンパク質は、当業者に明らかなように、任意の適切な手段によって生成され得る。本発明によるキャリアタンパク質の２つの好ましい構築方法は、直接合成および組換えタンパク質の生成による。好ましくは、本発明のポリエピトープキャリアタンパク質は、コード核酸分子からの発現による組換え手段によって生成される。組換え発現は、キャリアタンパク質の生成が、安価で、安全で、容易であり、そしてその後の除去を必要とし得る毒性化合物の使用を含まないという利点を有する。
【００２３】
組換え形態で発現される場合、本発明のキャリアタンパク質は、宿主細胞におけるコード核酸からの発現によって生成される。特定のワクチン系の個々の必要条件に依存して、任意の宿主細胞が用いられ得る。好ましくは、細菌性宿主は、細菌を操作および増殖させ得る容易さに起因して、組換えタンパク質の生成のために用いられる。選り抜きの細菌性宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００２４】
好ましくは、組換えによって生成する場合、このキャリアタンパク質は、合成核酸挿入物を含むプラスミドから発現される。このような挿入物は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープをコードするオリゴヌクレオチド二重鎖をアニーリングすることによって設計され得る。合成リンカーの５’末端および３’末端は、互いにアニーリングするように設計され得る。この技術は、ランダムな順序でのオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にし、エピトープの多数の可能な組合せのうちのいずれか１つを含む潜在的に異なるミニ遺伝子の混合物をもたらす。次いで、この混合物は、任意の適切な発現ベクターにクローニングされ、次いで発現クローンの選択プロセスが行なわれる。このストラテジーは、キャリアタンパク質を発現する細胞の健康に有害でないキャリアタンパク質を生成するクローンのみが選択されることを確実にする。逆に、エピトープの順序の任意選択は、あまり好結果でないことが見出されている。
【００２５】
エピトープコードリンカーの末端は、アニーリングが生じたときに２つのコドンが個々のエピトープの間に導入されるように設計され得る。アミノ酸残基（例えば、グリシンまたはリジン）は、スペーサーにおいて使用するに適切な残基の例である。詳細には、スペーサーにおけるリジン残基の使用は、莢膜多糖に対するキャリアタンパク質のさらなる集合を可能にする。さらに、キャリアタンパク質をコードする核酸がクローニングされる、発現プラスミド中の挿入部位は、タグ（例えば、「ｆｌａｇ」ペプチドまたはポリヒスチジン）に対するポリエピトープキャリアタンパク質の結合を可能にし得る。この配置は、組換えタンパク質のその後の精製を容易にする。
【００２６】
ポリエピトープキャリアタンパク質をコードする核酸は、誘導性プロモーターの制御下にクローニングされ得、それゆえ、キャリアタンパク質発現の正確な調製を可能にする。適切な誘導性系は、当業者に周知であり、そして周知のｌａｃ系（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９）を含む。
【００２７】
本発明のキャリアタンパク質の組換え発現方法は、当業者に周知であるが、明快さの目的のために、本明細書中に手短に考察される。
【００２８】
哺乳動物発現系は、当該分野で公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、かつｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）の転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これは、通常、コード配列の５’末端の近位に配置される）およびＴＡＴＡボックス（通常、転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に配置される）を有する。このＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが正しい部位でＲＮＡ合成を開始するのを指向すると考えられる。哺乳動物プロモーターはまた、通常ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に配置される、上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定し、そしていずれの方向でも作用し得る［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ．」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版］。
【００２９】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば、高度に発現され、そして広い宿主域を有する；それゆえ、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺ガンウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、非ウイルス遺伝子（例えば、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｅｉｏｎｅｉｎ）遺伝子）に由来する配列はまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドを用いて誘導され得るプロモーターに依存して、構成性または調節性（誘導性）のいずれかであり得る。
【００３０】
上記のプロモーターエレメントと組み合わせたエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常、発現のレベルを増加させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結した場合に、正常なＲＮＡ開始部位で合成が始まって、１０００倍まで転写を刺激し得る調節ＤＮＡ配列である。エンハンサーはまた、正常な方向もしくは裏返った方向のいずれかで、またはこのプロモーターから１０００より多くのヌクレオチドの距離を置いて転写開始部位の上流または下流に配置された場合に活性である［Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版］。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、特に有用であり得る。なぜなら、これらは、通常、より広範な宿主域を有するからである。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー［Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１］、ならびにラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター［Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７］およびヒトサイトメガロウイルス由来のエンハンサー／プロモーター［Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１］が挙げられる。さらに、いくつかのエンハンサーは、調節可能であり、そしてインデューサー（例えば、ホルモンまたは金属イオン）の存在下でのみ活性になる［Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７］。
【００３１】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端の第１アミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによってコードされるメチオニンである。所望の場合、このＮ末端は、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによってこのタンパク質から切断され得る。
【００３２】
あるいは、外来タンパク質はまた、この細胞から、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントを含む融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、増殖培地中へと分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間でコードされる、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得るプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、通常、この細胞からのタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。アデノウイルス三分節（ｔｒｉｐａｒｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の一例である。
【００３３】
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメント一緒に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化によって形成される［Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３’ｅｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＲＮＡ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５］。
【００３４】
これらの配列は、このＤＮＡによってコードされるポリペプチドへ翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来の転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルが挙げられる［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ］。
【００３５】
いくつかの遺伝子は、イントロン（介在配列とも呼ばれる）が存在する場合に、より効率的に発現され得る。しかし、いくつかのｃＤＮＡは、スプライシングシグナル（スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位とも呼ばれる）を欠くベクターから効率的に発現されている［例えば、ＧｏｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：６２０を参照のこと］。イントロンは、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む、コード配列内の介在性非コード配列である。これらは、一次転写物のポリアデニル化に続いて、「スプライシング」と呼ばれるプロセスによって除去される［Ｎｅｖｉｎｓ（１９８３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４４１；Ｇｒｅｅｎ（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：６７１；Ｐａｄｇｅｔｔら（１９８６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９；ＫｒａｉｎｅｒおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８８）「ＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）］。
【００３６】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の成分は、発現系構築物中に一緒に入れられる。エンハンサー、機能的スプライスドナー部位および機能的スプライスアクセプター部位を含むイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望の場合、発現系構築物中に含まれ得る。発現系構築物はしばしば、宿主（例えば、哺乳動物細胞または細菌）中での安定な保持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のようなレプリコン中で保持される。哺乳動物複製系としては、複製するためにトランスに作用する因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０［Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５］またはポリオーマウイルス）の複製系を含むプラスミドは、適切なウイルス性Ｔ抗原の存在下で極めて多コピー数まで複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、このレプリコンが例えば、哺乳動物細胞において発現のために保持されることを、そして原核生物宿主においてクローニングおよび増幅のために保持されることを可能にする。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２［Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６］およびｐＨＥＢＯ［Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４］が挙げられる。
【００３７】
使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、当該分野で公知であり、そしてその方法としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【００３８】
発現のために宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該分野で公知であり、そしてその細胞株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不朽化細胞株が挙げられ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および多数の他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
このタンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫発現ベクター中に挿入され得、そして、そのベクター中の制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築は、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、発現系の構成成分は、以下を含む：移入ベクター（通常、細菌性プラスミド）（これは、バキュロウイルスゲノムのフラグメントおよび発現される異種遺伝子または遺伝子群の挿入に好都合な制限部位の両方を含む）：この移入ベクター中のバキュロウイルス特異的フラグメントに相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
【００４０】
移入ベクターへの、このタンパク質をコードするＤＮＡ配列の挿入後、ベクターおよび野生型ウイルスゲノムは、昆虫宿主細胞中へトランスフェクトされ、ここでこのベクターとウイルスゲノムが組換えられる。パッケージされた組換えウイルスが発現され、そして組換えプラークが同定され、そして精製される。バキュロウイルス／昆虫発現系についての、材料および方法は、キットの形態で特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から市販されている。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書で以後「ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ」）に完全に記載されている。
【００４１】
バキュロウイルスゲノムへの、このタンパク質をコードするＤＮＡ配列の挿入の前に、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望される場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）が、通常中間トランス配置（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）構築物（移入ベクター）へと組み立てられる。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；複数の遺伝子（各々が、その所有する作動可能に連結された調節エレメントのセットを有する）；または複数の遺伝子（同じセットの調節エレメントにより調節される）を含み得る。中間体トランス配置構築物は、しばしば、レプリコン（例えば、細菌のような宿主中での安定な維時が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド））中で維持される。レプリコンは、複製系を有し、これによりクローニングおよび増幅のために適切な宿主中で維持されるのが可能になる。
【００４２】
現在、ＡｃＮＰＶへの外来遺伝子の導入のために最も一般的に使用される移入ベクターは、ｐＡｃ３７３である。多くの他のベクター（当業者に公知）もまた設計されている。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。これは、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴへと変化し、そしてＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと。
【００４３】
プラスミドは、通常、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７）および原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子および複製起点もまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖のために含む。
【００４４】
バキュロウイルス移入ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼと結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（５’から３’へ）のｍＲＮＡへ転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コード配列の５’末端に隣接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス移入ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、存在する場合は、通常構造遺伝子から遠位にある。発現は、調節されるか、または構成的であるかのいずれかであり得る。
【００４５】
構造遺伝子（ウイルス感染サイクルの後期に豊富に転写される）は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては以下が挙げられる：ウイルスポリヘドロンタンパク質をコードする遺伝子に由来する配列、Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開第１２７  ８３９号および同第１５５  ４７６号；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子、Ｖｌａｋら、（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５。
【００４６】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、選択された昆虫タンパク質またはバキュロウイルスタンパク質についての遺伝子（例えば、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ、７３：４０９）に由来し得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）のためのシグナルは昆虫細胞により認識されるようであり、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているようであるので、非昆虫起源のリーダー（例えば、ヒトγインターフェロンをコードする遺伝子由来のもの、Ｍａｅｄａら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２；ヒトガストリン放出ペプチド、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９：ヒトＩＬ−２、Ｓｍｉｔｈら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５８：２７３；ならびにヒトグルコセレブロシダーゼ、Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）もまた、昆虫における分泌を提供するために使用され得る。
【００４７】
組換えポリペプチドまたはポリタンパク質は、細胞内で発現され得るか、または適切な調節配列とともに発現される場合は、分泌され得る。非融合型の外来タンパク質の良好な細胞内発現は、通常は、理想的にはＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を有する異種遺伝子を必要とする。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンが、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、成熟タンパク質から切断され得る。
【００４８】
あるいは、天然に分泌されない組換えポリタンパク質またはタンパク質は、昆虫中で外来遺伝子の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。このリーダー配列フラグメントは、通常、小胞体へのタンパク質の転移を指向する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【００４９】
タンパク質の発現産物前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主は、移入ベクターの異種ＤＮＡと野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡで、通常同時トランスフェクションによって同時形質転換される。この構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常、バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂ部分を含む。バキュロウイルスの所望の部位への異種ＤＮＡの導入方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ前出；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同ダブルクロスオーバー組換えによりポリヘドリンのような遺伝子へと行われ得；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子へ操作された制限酵素部位へ行われ得る。Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ４：９１。ＤＮＡ配列は、発現ベクター中のポリヘドリン遺伝子の代わりにクローニングされた場合に、５’および３’の両方でポリヘドリン特異的配列に隣接し、そしてポリヘドリンプロモーターの下流に位置する。
【００５０】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、続いて、感染性組換えバキュロウイルス中にパッケージングされる。相同組換えが低頻度（約１％と約５％との間）で生じ、それにより、同時トランスフェクション後に生成されたウイルスの大部分は、なお野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。この発現系の利点は、組換えウイルスを区別させる可視的スクリーニングである。ポリヘドリンタンパク質（天然のウイルスにより生成される）が、ウイルス感染後後期に、感染された細胞の核において非常に高いレベルで生成される。蓄積されたポリヘドリンタンパク質は、包理された粒子も含む閉鎖体を形成する。これらの閉鎖体（サイズ１５□ｍまで）は、非常に屈折性があり、この性質は、光学顕微鏡下で容易に可視化される明るく輝く外見を与える。組換えウイルスに感染された細胞は、閉鎖体を欠く。組換えウイルスを野生型ウイルスと区別するために、トランスフェクション上清が、当業者に公知の技術によって、昆虫細胞の単層上にプラーク化される。すなわち、このプラークは、閉鎖体の存在（野生型ウイルスの指標）または非存在（組換えウイルスの指標）について光学顕微鏡下でスクリーニングされる。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」第２巻、（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（補遺１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００５１】
いくつかの昆虫細胞への感染のための組換えバキュロウイルス発現ベクターが開発されている。例えば、とりわけ、以下のための組換えバキュロウイルスが開発されている：Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および一般には、Ｆｒａｓｅｒら（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこと）。
【００５２】
バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のための細胞および細胞培養培地は、市販されており；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出を参照のこと。
【００５３】
次いで、改変された昆虫細胞は、適切な栄養培地中で増殖され得、この培地は、改変された昆虫宿主に存在するプラスミドの安定な維持を可能にする。発現生成物遺伝子が誘導可能な制御下にある場合、宿主は、高密度まで増殖され得、そして発現が誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、生成物は培地中へ連続的に発現され、そして目的の生成物を取り出し、そして欠乏した栄養素を増加すると同時に、栄養培地が連続して循環されなければならない。生成物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心分離；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切な場合、必要ならば、実質的にいかなる昆虫タンパク質（これもまた培地中に分泌されるかまたは昆虫細胞の溶解から生じる）をも除去するために、少なくとも実質的に宿主の破片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）がない生成物を提供するために、生成物はさらに精製され得る。
【００５４】
タンパク質発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞が、組換えタンパク質コード配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択される宿主に依存して変化する。しかし、条件は、当該分野で公知のことに基づいて、当業者に容易に確認可能である。
【００５５】
細菌性の発現技術は、当該分野で公知である。細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常はコード配列の５’末端に隣接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌性プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを有し得、ＲＮＡ合成が始まる、隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。このオペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得るときに、負に調節された（誘導性）転写を可能にし、それにより特定の遺伝子の転写を開始し得るような様式である。構成的発現は、負の調節エレメント（例えば、オペレーター）の非存在下で生じ得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、この配列は、存在する場合には、通常ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に隣接している（５’）。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写を開始するのを助ける［Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。従って、調節された発現は、正または負のいずれかであり得、これにより転写を増強または減少のいずれかをなす。
【００５６】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６］およびマルトースのような糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開第０３６  ７７６号および同第１２１  ７７５号］のような生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージλ  ＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８］ならびにＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系もまた、有用なプロモーター系を提供する。
【００５７】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌性プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る［米国特許第４，５５１，４３３号］。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターであり、ｌａｃリプレッサーにより調節される［Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼと結合しそして転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合可能なＲＮＡポリメラーゼと結合されて、原核生物におけるいくつかの遺伝子の高レベルの発現を生成し得る。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合型プロモーター系［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］の例である。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る［ＥＰＯ公開第２６７  ８５１号］。
【００５８】
機能するプロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、このリボソーム結合部位は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）およびこの開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む［Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４］。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対合によって、リボソームにｍＲＮＡが結合することを促進すると考えられている［Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現するためには、弱いリボソーム結合部位を有する［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ］。
【００５９】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、このＤＮＡ分子に直接結合され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は常にメチオニンであり、これはＡＴＧ開始コドンによりコードされる。所望される場合には、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによってか、あるいは細菌性メチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロいずれかのインキュベーション［ＥＰＯ公開第２１９  ２３７号］によってタンパク質から切断され得る。
【００６０】
融合タンパク質は、直接発現に対する代替法を提供する。通常、内因性細菌タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列が、異種コード配列の５’末端に融合される。発現に際し、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子が、外来遺伝子の５’末端に連結され得、そして細菌において発現される。得られる融合タンパク質は、好ましくは、この外来遺伝子からバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素（第Ｘａ因子）のための部位を保持する［Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：８１０］。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ遺伝子［Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６０：１９７］、ｔｒｐＥ遺伝子［Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１］、およびＣｈｅｙ遺伝子［ＥＰＯ公開第３２４  ６４７号］由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の結合部のＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、またはコードしていなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からこのユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を保持するユビキチン領域を用いて作製される。この方法を通じて、ネイティブ外来タンパク質が単離され得る［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８］。
【００６１】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から分泌され得る［米国特許第４，３３６，３３６号］。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地中へ（グラム陽性細菌）かまたはペリプラズム空間中へ（細胞の内膜と外膜との間に位置する）（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。好ましくは、プロセシング部位が存在し、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得、シグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされる。
【００６２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される細菌性タンパク質のための遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）［Ｍａｓｕｉら（１９８３）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＥＭＢＯ
Ｊ．３：２４３７］およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）［Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２］）に由来し得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰＯ公開第２４４  ０４２号］。
【００６３】
通常、細菌により認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターとともにコード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによりコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、頻繁に、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｔｒｐ遺伝子ならびに他の生合成遺伝子）に由来する転写集結配列が挙げられる。
【００６４】
通常、上記の構成成分（プロモーター、シグナル配列（所望される場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、発現構築物へと組み立てられる。発現構築物はしばしば、レプリコン（例えば、細菌のような宿主において安定な維持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド））において維持される。レプリコンは、複製系を有しており、これにより発現、またはクローニングおよび増幅いずれかのために、原核生物宿主において維持されるのが可能である。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５から約２００、そして通常は約１０から約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかは、宿主に対するベクターおよび外来遺伝子の効果に依存して選択され得る。
【００６５】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて細菌ゲノム中へと組み込まれ得る。組み込みベクターは通常、そのベクターを組み込ませる細菌染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡを用いて構築された組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体へと組み込む（ＥＰＯ公開第１２７  ３２８号）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージ配列またはトランスポゾン配列から構成され得る。
【００６６】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された細菌株の選択を可能にするための選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、そして細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンのような薬物に耐性にする遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９］。選択マーカーはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン生合成経路、トリプトファン生合成経路、およびロイシン生合成経路中のもの）も含み得る。
【００６７】
あるいは、上記の構成成分のいくつかは、形質転換ベクターへと組み立てられ得る。形質転換ベクターは、上記のように、通常、レプリコン中で維持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかいずれかである選択マーカーから構成される。
【００６８】
多くの細菌への形質転換のための発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか）が、開発されている。例えば、とりわけ、以下の細菌のための発現ベクターが開発されている：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰＯ公開第０３６  ２５９号および同第０６３  ９５３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８４／０４５４１号］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰＯ公開第０３６  ７７６号、同第１３６  ８２９号および同第１３６  ９０７号］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第４，７４５，０５６号］。
【００６９】
細菌性宿主へ外因性ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で周知であり、そして通常、ＣａＣｌ2かまたは他の薬剤（例えば、２価カチオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションにより細菌細胞へと導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換される細菌種により変化する。例えば、［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰＯ公開第０３６  ２５９号および同第０６３  ９５３号；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８４／０４５４１号、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］；［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］；［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］を参照のこと。
【００７０】
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に隣接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し、これは、存在する場合には、通常構造遺伝子から遠位にある。このＵＡＳは、調節された（誘導性）発現を可能にする。構成的発現が、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節された発現は、正または負のいずれかであり得、これにより転写を増強または減少のいずれかをする。
【００７１】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵生物であり、従って、代謝経路中の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーターを提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰＯ公開第２８４  ０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ公開第３２９  ２０３号）。酵母ＰＨＯ５遺伝子（酸性ホスファターゼをコードする）もまた、有用なプロモーター配列を提供する［Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１］。
【００７２】
さらに、天然に生じない合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と結合され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成する。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、解糖酵素遺伝子（例えば、ＧＡＰまたはＰｙｋ）の転写活性化領域と結合された、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーター（ＥＰＯ公開第１６４  ５５６号）が挙げられる。さらに、酵母プロモーターとしては、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合しそして転写を開始する能力を有する、非酵母起源の天然に生じるプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：［Ｃｏｈｅｎら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ  １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９］。
【００７３】
ＤＮＡ分子は、酵母において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、組換えタンパク質のＮ末端の最初のアミノ酸は、常にメチオニン（ＡＴＧ開始コドンによってコードされる）である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンを、ブロモシアンとともにインビトロでインキュベートすることによってタンパク質から切断し得る。
【００７４】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物発現系、バキュロウイルス発現系、および細菌発現系における代替手段を提供する。通常、内因性酵母タンパク質のＮ末端部分または他の安定なタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端で連結され得、そして酵母中で発現され得る。２つのアミノ酸配列の連結部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰＯ公開番号１９６  ０５６を参照のこと。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）の部位を保持するユビキチン領域を用いて作製される。従って、この方法によって、ネイティブな外来タンパク質が単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【００７５】
あるいは、外来タンパク質はまた、外来タンパク質の酵母における分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地中へ分泌され得る。好ましくは、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在し、このことによって、インビボまたはインビトロでのいずれかでこれらが切断され得る。リーダー配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。
【００７６】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌酵母タンパク質の遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰＯ公開番号０１２  ８７３；ＪＰＯ公開番号  ６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号））に由来し得る。あるいは、非酵母起源のリーダー（例えば、インターフェロンリーダー）が存在し、これもまた、酵母における分泌を提供する（ＥＰＯ公開番号０６０  ０５７）。
【００７７】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは、「プレ」シグナル配列と「プロ」領域との両方を含む。使用され得るα因子フラグメントの型は、全長プレプロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮型α因子リーダー（通常は、約２５〜約５０アミノ酸残基）（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰＯ公開番号３２４  ２７４）が挙げられる。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーとしては、第２の酵母α因子由来のプロ領域を除いて、第１の酵母のプレ配列を用いて作製されたハイブリッドα因子リーダーが挙げられる。（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【００７８】
通常は、酵母により認識される転写終結配列は、翻訳停止コドンに対して３’に位置した調節領域であり、従って、コード配列に隣接するプロモーターとともに存在する。これらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドへ翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指示する。転写終結配列および他の酵母認識終結配列の例は、解糖酵素をコードする配列である。
【００７９】
通常は、上記の成分（プロモーター、リーダー（所望であれば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、発現構築物中に、ともに配置される。発現構築物は、しばしば、レプリコン（例えば、酵母または細菌のような宿主中で安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド））において維持される。レプリコンはまた、２つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために酵母中で、そしてクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持することが可能であり得る。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、ＹＥｐ２４［Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７−２４］、ｐＣｌ／１［Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２−４６４６］およびＹＲｐ１７［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８−１５７］が挙げられる。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般に、約５〜約２００、そして通常は、約１０〜約１５０の範囲に及ぶコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含有する宿主は、好ましくは少なくとも約１０、そしてより好ましくは、少なくとも約２０のプラスミドを有する。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、高コピー数または低コピー数のベクターが選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【００８０】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて酵母ゲノム内へ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常は、ベクターを組み込ませる酵母染色体に相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同な配列を含む。組み込みは、ベクターの相同ＤＮＡと酵母染色体との間の組換えの結果、生じるようである［Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８−２４５］。組み込みベクターは、ベクターにおける包含のための適切な相同配列を選択することによって酵母の特定の遺伝子座に指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つより多い発現構築物が組み込まれ得、おそらく生成される組換えタンパク質のレベルに影響を及ぼし得る［Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７５０］。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクター中に単一のセグメントとして（完全なベクターの組み込みを生じる）、または染色体中の隣接セグメントに相同であり、そしてベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメントとして（発現構築物のみの安定な組み込みを生じ得る）のいずれかとして存在し得る。
【００８１】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。選択マーカーとしては、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７）ならびにＧ４１８耐性遺伝子（これは、ツニカマイシンおよびＧ４１８に対して酵母細胞に耐性を付与する）がそれぞれ挙げられ得る。さらに、適切な選択マーカーはまた、毒性化合物（例えば、金属）の存在下で増殖する能力を有する酵母を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在によって、銅イオンの存在下での酵母の増殖が可能である［Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｒｅｖ．５１：３５１］。
【００８２】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターとともにおかれ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のようにレプリコンにおいて維持されるか、または組み込みベクター中へ発現されるかのいずれかである選択マーカーから構成される。
【００８３】
発現および形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれか）は、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、特に以下の酵母のために開発されてきた：
【００８４】
【表４】
2006193534.tif 000002
【００８５】
外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野で周知であり、そして通常、それらの方法としては、スフェロプラストまたはアルカリ性カチオンで処理したインタクトな酵母細胞の形質転換のいずれかが挙げられる。形質転換手順は、通常、形質転換される酵母種によって変化する。例えば、以下を参照のこと：
【００８６】
【表５】
2006193534.tif 000003
【００８７】
組換えタンパク質の単離および精製のための方法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に要約されている。特に、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において、組換えタンパク質は、細菌細胞内で封入体を形成し、従って、その調製が容易である。封入体中で生成された場合、キャリアタンパク質は、その天然のコンホメーションに再折りたたみされる必要がある。それらの天然の折り畳みされた状態にタンパク質を再生するための方法は、当該分野で周知である。
【００８８】
本発明のキャリアタンパク質が免疫原性であり、従って、免疫応答を惹起するにおいて有効である種としては、全ての哺乳動物、特にヒトが挙げられる。大部分の場合において、本発明のキャリアタンパク質が活性であることは、ヒトにおいて免疫応答を惹起するために好ましい。莢膜形成細菌によって引き起こされる疾患からの防御を最も必要とするヒト集団は、約３ヶ月齢〜２歳の乳児である。一般に、乳児が母乳から防御を与えられず、そして彼らが、多糖抗原に対して免疫応答を生成するために十分に発達した免疫系自体をまだ持たないのがこの期間である。
【００８９】
本発明のさらなる局面に従って、本発明の第１の局面に従うキャリアタンパク質をコードする核酸分子もまた提供する。当業者に明らかであるように、このような核酸分子は、所望されるエピトープをコードするように遺伝コードを使用して設計される。
【００９０】
さらに、コードされたキャリアタンパク質の正確な特性を正確に仕立てるために、当業者は、公知のエピトープ配列からのヌクレオチドレベルでの変化が、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換、欠失または挿入によって行われ得ることを理解する。部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）は、本発明に従う変異キャリアタンパク質を生成するために使用される優先的な方法である。今や、当業者に公知のＳＤＭの多くの技術が存在し、これらとしては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されるかまたは市販のキットを使用するＰＣＲを用いるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発が挙げられる。
【００９１】
このような変異誘発の技術によって生成される大部分のキャリアタンパク質は、野生型タンパク質よりはあまり有効ではない。しかし、数少ない場合においては、このような変化が、所望されるように、改善されたキャリアタンパク質機能（例えば、特定の生物におけるより大きな免疫原性）を有する分子を生成することがあり得る。
【００９２】
本発明のこの局面に従う核酸分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡが挙げられ得、そしてコード配列中のヌクレオチドアナログをさらに含み得る。好ましくは、核酸分子は、ＤＮＡを含む。
【００９３】
本発明のさらなる局面は、キャリアタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。なおさらなる局面は、宿主細胞または生物へコード核酸を導入する工程を包含する方法を提供する。核酸の導入は、任意の利用可能な技術を用い得る。真核生物細胞において、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＮＡ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクションまたはレトロウイルスもしくは他のウイルス（例えば、ワクシニア）を使用する形質導入が挙げられ得る。細菌細胞において、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、またはバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられ得る。核酸の導入は、核酸からの発現を引き起こすかまたはそれを可能にすること（例えば、遺伝子の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって）によって行われ得る。
【００９４】
１つの実施態様において、核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の包含によって促進され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。
【００９５】
本発明のさらなる実施態様に従って、多糖に結合体化された、少なくとも５つのＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含むキャリアタンパク質が提供される。多糖により、通常は、グリコシド結合によって連結されるモノサッカライド残基からなる、任意の直鎖状または分枝状ポリマーを意味し、従って、オリゴサッカライドを含む。好ましくは、この多糖は、２〜５０のモノサッカライド単位、より好ましくは６〜３０のモノサッカライド単位を含む。
【００９６】
多糖成分は、多くのグラム陽性細菌病原体およびグラム陰性細菌病原体（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の多糖莢膜の多糖成分に基づき得るか、またはそれに由来し得る。この莢膜は、鼻咽頭のコロニー形成および全身的な侵襲のために重要である、主要なビルレンス因子の代表である。多糖成分が本発明のキャリアタンパク質に結合体化され得る他の細菌としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅが挙げられる。本発明のこの局面に従う使用のために適切な多糖成分は、Ｈｉｂオリゴサッカライド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のリポ多糖（ＳｅｉｄおよびＳａｄｏｆｆ、１９８１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ由来のリポ多糖（Ｋｏｎａｄｕら、１９９６）およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ由来のＯ特異的多糖（Ｃｈｕら、１９９１）が挙げられる。本発明に従う使用のために適切な他の多糖成分は、当業者に周知である。
【００９７】
細菌莢膜多糖のフラグメントは、任意の適切な方法によって（例えば、酸加水分解または超音波照射によって）生成され得る（Ｓｚｎら、１９８６）。多糖成分を調製する他の方法は、当業者に周知である。
【００９８】
結合体ワクチンの多糖成分は、好ましくは、共有結合によってキャリアタンパク質にカップリングされるべきである。多糖とタンパク質とをカップリングする特に好ましい方法は、還元的アミノ化による方法である。他の方法としては、以下が挙げられる：ブロモシアンでの多糖の活性化、次いでアジピン酸ジヒドラジド（スペーサー）との反応および可溶性カルボジイミドを使用するキャリアタンパク質のカルボキシド（ｃａｒｂｏｘｉｄｅ）基への結合体化（Ｓｈｎｅｅｒｓｏｎら、１９８６）；アジピン酸ジヒドラジドでのキャリアタンパク質の官能化、次いでブロモシアン活性化多糖へのカップリング（Ｄｉｃｋら、１９８９）；キャリアタンパク質および多糖の両方の化学的修飾、次いで、それらのカップリング（Ｍａｒｂｕｒｇら、１９８６；Ｍａｒｂｕｒｇら、１９８７および１９８９）。いくつかの場合、カルボキシド基を含有する多糖（例えば、Ｃ群髄膜炎菌多糖）は、可溶性カルボジイミドを使用して、タンパク質に直接結合体化され得る。多糖はまた、代替試薬（例えば、ＣＤＡＰ（１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート））を使用して活性化され得、次いで、キャリアタンパク質に直接結合体化され得る（Ｋｏｎａｄｕら、１９９６）。過ヨウ素酸処理多糖またはオリゴサッカライドは、還元的アミノ化によってタンパク質に全て結合体化され得る（ＪｅｎｎｉｎｇｓおよびＬｕｇｏｗｓｋｙ、１９８２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９８３；Ｉｎｓｅｌ、１９８６）。あるいは、酸加水分解により得られたオリゴサッカライドは、それらの還元末端基に、活性エステル末端を有する炭化水素スペーサーを導入することによって化学的に誘導体化され得る；この活性化されたオリゴサッカライドは、選択されたキャリアタンパク質に結合体化され得る（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら、１９９２）。
【００９９】
多糖分子は、スペーサー分子（例えば、アジピン酸）によってキャリアタンパク質にカップリングされ得る。このスペーサー分子を使用して、タンパク質と多糖とのカップリングを容易にし得る。カップリング反応が行われた後、結合体をダイアフィルトレーションまたは他の公知の方法によって精製して、未反応のタンパク質または多糖成分を除去し得る。
【０１００】
本発明のさらなる局面に従って、本発明の第１の局面に従うキャリアタンパク質を生成する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ペプチドエピトープをコードするオリゴヌクレオチド分子を構築する工程；
（ｂ）このオリゴヌクレオチド分子をアニールさせて、二重鎖を形成する工程；
（ｃ）融合タンパク質をコードするように、オリゴヌクレオチド二重鎖を発現ベクターに導入する工程；
（ｄ）細菌宿主細胞にこの発現ベクターを導入して、融合タンパク質の発現を可能にする工程；
（ｅ）生成された融合タンパク質をこの細菌の培養物から単離する工程。
【０１０１】
必要に応じて、この方法は、多糖分子とキャリアタンパク質とを結合体化する工程をさらに包含し得る。
【０１０２】
好ましくは、本方法で使用される細菌宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌宿主細胞である。
【０１０３】
本発明のさらなる局面に従って、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせて、多糖に結合体化された、少なくとも５つのＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含むキャリアタンパク質を含む組成物が提供される。このような組成物は、例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳ．ｔｙｐｈｉのような病原体細菌によって引き起こされる疾患に対する防御を提供するように合理的に設計され得、従って、ワクチンとして使用され得る。本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【０１０４】
薬学的に受容可能な賦形剤によって、それ自体が、組成物を受ける個体に有害な抗体の生成を誘導しない任意の化合物が意味される。賦形剤は、経口、皮下、筋肉内、局所的または静脈内投与のために適切であるべきである。適切な化合物は、代表的には、大きな、緩慢に代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子）である。このような化合物は、当業者に周知である。さらに、これらの化合物は、免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原が、細菌トキソイドに結合体化され得る。
【０１０５】
組成物の有効性を増強するために好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：（１）例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）水中油型エマルジョン処方物（例えば、ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤を含むか、または含まない）、例えば、（ａ）５％  スクアレン、０．５％  ＴｗｅｅｎTM８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５を含む、マイクロフルイダイザーを使用してミクロン以下粒子に処方されたＭＦ５９TM（ＷＯ９０／１４８３７）（必要でないが、必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、（ｂ）１０％  スクアラン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ８０、５％  プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ミクロン以下のエマルジョンにマイクロフルイダイザー処理されたか、もしくはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされるかのいずれかによるＳＡＦ、および（ｃ）２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ８０、および以下からなる群より選択される１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉTMアジュバント系（ＲＡＳ）：モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM）が使用され得るか、または粒子がそれから作製される（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；（４）フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント（ＣＦＡおよびＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮγ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；および（６）組成物の有効性を増強する免疫刺激剤として働く他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９TMが好ましい。
【０１０６】
上記のように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的には、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）がこのようなビヒクル中に存在し得る。
【０１０８】
代表的には、免疫原性組成物は、液体溶液もしくは懸濁物としてのいずれかで注射可能物質として調製され；注射前に、液体ビヒクル中の溶液またはその中の懸濁液に適切な固体形態としてもまた調製され得る。調製物はまた、上記で議論されたように、増強したアジュバント活性効果のために乳化され得るか、またはリポソーム中にカプセル化され得る。
【０１０９】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の、キャリアタンパク質、ならびに必要な場合、上記の成分のいずれか他のものを含む。「免疫学的に有効な量」によって、単一用量または一連の用量の一部としてのいずれかで、処置または予防のために有効である、個体に対する投与量が意味される。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、処置される個体群の分類（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変化する。この量は、慣用的な治験を通して決定され得る比較的広範な範囲に入ることが予測される。
【０１１０】
免疫原性組成物は、従来通り、皮下もしくは筋肉内のいずれかで、非経口的（例えば、注射により）投与される。それらはまた、粘膜表面（例えば、経口もしくは鼻内）に、または肺処方物、坐剤、もしくは経皮適用の形態で投与され得る。投薬処置は、単回用量スケジュールでもよいし、複数用量スケジュールでもよい。ワクチンは、他の免疫調節薬剤とともに投与され得る。
【０１１１】
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチン接種が利用され得る［例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８］。従って、ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドの化合物を含むよりむしろ、本発明のワクチンは、これらの化合物をコードする核酸を含み得る。
【０１１２】
本発明のさらなる局面に従って、免疫原性組成物を処方するプロセスが提供され、このプロセスは、以下の工程を包含する：本発明の第１の局面に従うキャリアタンパク質を、薬学的に受容可能なキャリア（必要に応じて、アジュバント）と会合させて、多糖に結合体化させる工程。
【０１１３】
本発明のなおさらなる局面に従って、疾患に対して哺乳動物（好ましくは、ヒト）をワクチン接種する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：多糖と結合体化されたキャリアタンパク質（必要に応じて、アジュバントのような薬学的に受容可能なキャリアとともに）組成物を哺乳動物に投与する工程。
【０１１４】
本発明の種々の局面および実施態様が、ＨＩＢ莢膜多糖に結合体化された、キャリアタンパク質Ｎ６およびＮ１０を特に参照することによって、ここで例示によってより詳述される。詳細部分の改変が本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることは明らかである。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、完全に参考として援用される。
【発明の効果】
【０１１５】
莢膜形成細菌による感染に対する防御を付与し得るキャリアタンパク質を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１６】
（発明の詳細な説明）
（材料および方法）
（標準的な手順および技術の要旨）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術範囲内である、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、例えば、以下の文献に完全に説明される；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｉｒａｔｉｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ
Ｇｌｏｖｅｒら編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｌｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｕｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）（特に第１５４巻および１５５巻）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）。
【０１１７】
（プラスミド、株およびＴ細胞クローン）
ＰＥＭＢＬｅｘ２プラスミドは、ｐＥＭＢＬ８Ｍ（Ｄｅｎｔｅ  Ｌ．およびＣｏｒｔｅｓｅ  Ｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７），１５５：１１１−９）のＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位にλＰLプロモーターおよびポリリンカーを挿入することによって、得られた。市販のベクターｐＴｒｃ−ＨｉｓおよびｐＱＥ３０は、それぞれ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＱｉａｇｅｎから購入した。上記プラスミドのレシピエントとして使用したＥ．ｃｏｌｉ株は、ｐＥＭＢＬｅｘ２についてはＫ１２ΔＨ１ΔＴｒｐ、ｐＴｒｃ−ＨｉｓについてはＴＯＰ１０、およびｐＱＥ３０についてはＴＧ１であった。
【０１１８】
ヒトＴ細胞クローンＫＳＭＩＫ  １４０およびＧＧ−２２（それぞれ、Ｐ２ＴＴおよびＰ３０ＴＴに特異的）は、Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ博士（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から恵与された。
【０１１９】
（Ｎ６ポリエピトープキャリアタンパク質を発現する組換えプラスミドの構築）
Ｐ２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３０ＴＴ１、Ｐ３２ＴＴおよびＰｆＴ３  Ｔ細胞エピトープ（表１）ならびにＦｌａｇペプチドをコードする相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチド対は、ＤＮＡ合成器ＡＢＩ３９４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から購入した試薬を使用して合成した。オリゴ対を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で別々にアニールし、そして等量の各々のアニーリング反応液を混合して、そしてＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）を使用して、３時間、室温で連結した。
【０１２０】
次いで、リガーゼ反応液を１％アガロースゲル上にロードし、そして電気泳動に供した。予期される大きさのＤＮＡフラグメントに対応するバンドを、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて、単離し、精製し、そしてｐＥＭＢＬｅｘ２発現ベクター内にクローニングした。形質転換後、Ｆｌａｇペプチドに特異的なウサギ抗血清を使用して、コロニースクリーニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を行い、組換えタンパク質を産生するクローンを同定した。陽性クローンからのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、さらに組換えタンパク質の大きさに基づいてクローンについて選択した。
【０１２１】
【表１】
2006193534.tif 000004
【０１２２】
選択されたクローンのヌクレオチド配列決定後、ｐＥＭＢＬＮ６と称するクローンが、反復配列を有さない、６つの異なるＴ細胞エピトープを含むことが示された。次いで、Ｎ６挿入物をＰＣＲ増幅し、そして標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用してｐＴｒｃ−Ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移入した。Ｎ６発現プラスミドの生成を、図１に要約する。
【０１２３】
（Ｎ１０ポリエピトープキャリアタンパク質を発現する組換えプラスミドの構築）
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドおよび標準的なクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用して、４つのさらなるＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープをＮ６タンパク質に付加した：ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨｂｓＡｇ、およびＭＴ（表１）。ＨＢＶｎｃおよびＨＡを、引き続いて２つの継続的なクローニング工程によってｐＴｒｃ−Ｎ６に導入し；生じたプラスミドに、ＨｂｓＡｇエピトープおよびＭＴエピトープを１つのクローニング工程で付加した。
【０１２４】
ＤＮＡ配列決定後、予期される１０個のエピトープポリペプチドタンパク質をコードする正確な構築物（ｐＴｒｃ−Ｎ１０）を同定した。次いで、Ｎ１０コード挿入物を、ＰＣＲによってｐＴｒｃ−Ｎ１０からｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）に移入した。次いで、生じたｐＱＥ−Ｎ１０構築物の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１２５】
（Ｎ１１ポリエピトープキャリアタンパク質を発現する組換えプラスミドの構築）
２つの相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、そしてアニールさせてＨＳＰ７０  ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（表１）をコードするＤＮＡリンカーを得た。このリンカーを、ｐＴｒｃ−Ｎ１０プラスミド中のＮ１０コード領域の下流に、かつＮ１０コード領域とインフレームで挿入した。ＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ株における形質転換後、形質転換体をタンパク質発現およびＤＮＡ配列決定分析を用いて選択した。正確なコード配列を有し、かつ予期される分子量のタンパク質を発現する選択されたクローン（ＴＯＰ１０／ｐＴｒｃ−Ｎ１１）のグリセロールバッチを、−８０℃で保存した。
【０１２６】
（Ｎ１９ポリエピトープキャリアタンパク質を発現する組換えプラスミドの構築）
Ｐ２３ＴＴからＨＢｓＡｇまでのコード領域を含むＤＮＡフラグメントを、テンプレートとしてプラスミドｐＴｒｃ−Ｎ１０、および２つのオリゴヌクレオチドプライマー（これらは、ＰＣＲ産物の５’末端および３’末端に、それぞれＢｇｌＩＩ制限部位およびＰｓｔＩ制限部位の挿入を可能にする）を使用してＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＴｒｃ−Ｎ１０を、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、そしてＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣＲ産物に連結した。ＴＯＰ１０細胞における形質転換、ならびにタンパク質発現およびＤＮＡ配列決定分析を用いる形質転換体の選択後、正確なコード配列を有し、かつ予期される分子量のタンパク質を発現する選択されたクローン（ＴＯＰ１０／ｐＴｒｃ−Ｎ１９）のグリセロールバッチを、−８０℃で保存した。
【０１２７】
ｐＴｒｃ−Ｎ１９プラスミドを、ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで消化し、そしてその挿入物を、同酵素で消化したｐＱＥ−Ｎ１０にクローニングした。ＴＧ１細胞における形質転換、ならびにタンパク質発現およびＤＮＡ配列決定分析を用いる形質転換体の選択後、正確なコード配列を有し、かつ予期される分子量のタンパク質を発現する選択されたクローン（ＴＧ１／ｐＱＥ−Ｎ１９）のグリセロールバッチを、−８０℃で保存した。
【０１２８】
（ポリエピトープキャリアタンパク質の精製）
全ての組換えポリエピトープキャリアタンパク質を、同様のストラテジーを使用して精製した。手短には、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５００ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で増殖した。０．３〜０．５のＯＤ600で、ポリエピトープタンパク質の発現を、０．１〜１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって３〜５時間誘導した。細胞を、超音波処理またはフレンチプレスで破壊し、不溶性画分を遠心分離によって収集し、緩衝液Ａ（６Ｍ  グアニジウム−ＨＣＬ、１００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ８）で溶解し、そして２ｍｌのＮｉ2+ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）で吸着した。
【０１２９】
次いで、樹脂をカラムに充填し、緩衝液Ａで洗浄した。グアニジウム−ＨＣｌを、緩衝液Ｂ（８Ｍ  尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ８で洗浄することによってカラムから除去した。緩衝液Ｂ  ｐＨ６．５での洗浄後、組換えタンパク質を、２０ｍｌの緩衝液ＢのｐＨ６．５からｐＨ４への勾配で溶出した。精製組換えタンパク質を含む各分をプールし、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して透析した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてタンパク質含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて決定した。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物から得られた細胞ペレットを、緩衝液Ａ中、３７℃で加熱することによって可溶化し、溶解物を、１５，０００ｇで、２０分間遠心分離した。上清を、Ｎｉｃｋｅｌ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのカラムクロマトグラフィーに供した。緩衝液Ａでの洗浄および緩衝液Ｂ、ｐＨ７での洗浄後、タンパク質を、緩衝液Ｂ、ｐＨ７中の０〜２００ｍＭのイミダゾールの勾配から画分を収集することによって分離した。精製組換えタンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって判断されるように）を含む画分をプールし、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．２に対して透析した。
【０１３０】
（Ｈｉｂオリゴ糖の調製および活性化）
Ｈｉｂ莢膜多糖は、Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：８９１５−８９２１に記載のプロトコールに従って調製され得る。
【０１３１】
１．９９Ｌの１０ｍｇ／ｍｌのＨｉｂ多糖の溶液を、０．０１Ｍの酢酸中、７６℃で５時間加水分解した。冷却、中和および０．２μｍでの濾過の後、生じたオリゴ糖集団は、リボースと還元基との間の化学的な比によって測定した場合、８の平均重合度（ａｖＤＰ）を有した。
【０１３２】
次いで、ＮａＣｌを、０．１６Ｍの濃度に達するまで、その加水分解産物に添加し、次いで、０．１６Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  アセテート  ｐＨ６で１：１で希釈し、そして１０ｋＤａ膜上での接線流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）限外濾過に供して、高分子量の種を除去した。
【０１３３】
限外濾過は約１１倍濃縮に続いて０．１６Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  アセテート、ｐＨ６に対する１５サイクルのダイアフィルトレーションを含んだ。残留物を廃棄した。透過物を水で１：１で希釈し、そして０．２２μｍで濾過した。化学的分析によって、８．１のａｖＤＰが明らかになった。
【０１３４】
１０ｋＤａの限外濾過（ＵＦ）から得られた透過物を、０．０８Ｍ  ＮａＣｌ／０．０５Ｍ酢酸ナトリウム  ｐＨ６で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム［１０ｃｍ（ＩＤ）；５．５ｃｍ（ｈ）］上に、１５０ｃｍ／時間の直線的流速でロードした。吸着後、低分子量のフラグメント（５反復まで）を、１０カラム容量の平衡化緩衝液でカラムを洗浄することによって除去し、次いで、３カラム容量の０．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００５Ｍ  酢酸ナトリウム  ｐＨ６で溶出した。溶出液を０．２μｍで濾過し、次いでａｖＤＰおよびイオン交換分析クロマトグラフィーについて分析した。ａｖＤＰ  １７．３が得られ、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５上でのイオン交換分析クロマトグラフィーによって、ＤＰ５までのいかなる小さなフラグメントも存在しないことが示された。
【０１３５】
末端アミノ基を導入するために、次いで、還元的アミノ化を行った；Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーから得た分画したＨｉｂオリゴ糖に対して、最終濃度３５ｍｇ／ｍｌの塩化アンモニウムおよび１２ｍｇ／ｍｌのシアノホウ化水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｙａｎｏｂｏｒｏｉｄｒｉｄｅ）を添加した。攪拌後、溶液を、０．２μｍで濾過し、そして３７℃で１２０時間インキュベートした。次いで、アミノオリゴ糖を、９５°のＥｔＯＨ（最終濃度８１°）を用いた１５〜２０時間の冷却下での沈殿によって、過剰の試薬から精製した。次いで、沈殿したオリゴ糖を遠心分離によって回収し、開始容量の約１／４を使用する０．４ＭのＮａＣｌ中に可溶化し、そして８１°のＥｔＯＨを用いて１５〜２０時間の冷却下で再度沈殿させた。
【０１３６】
アミノオリゴ糖を、遠心分離によって再度回収し、そして約３００ｍｌの０．０２ＭのＮａＣｌに可溶化した。分析用のサンプルを採取した後、次いで、生じた溶液を、ロータリーエバポレーターを使用して乾燥した。
【０１３７】
比色アミノ基分析によって、そのオリゴ糖内への一級アミノ基の導入を確認した。
【０１３８】
次いで、以下のように、活性エステルへの誘導体化を行った。アミノオリゴ糖を、１ｍｌあたりアミノ基４０μモルの濃度で蒸留水に可溶化した。次いで、この溶液を、ＤＭＳＯで１０倍希釈した。トリエチルアミンを、アミノ基に対して２：１のモル比で添加した。次いで、アジピン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、アミノ基に対して１２：１のモル比で添加した。この反応混合物を、室温で２時間、緩やかな攪拌下に維持した。次いで、活性化オリゴ糖を、１０容量の１−４ジオキサン内への攪拌下での沈殿によって過剰の試薬から精製した。３０分の冷却後、この沈殿を、焼結（ｓｙｎｔｅｒｅｄ）ガラスフィルター上に収集し、ジオキサンによってこのフィルター上で洗浄し、次いで減圧下で乾燥した。乾燥した活性化オリゴ糖を、比色法によって、その活性エステル基の含量について分析した；この試験によって、１ｍｇの乾燥オリゴ糖あたり６２．１μモルの活性エステルの存在が示された。
【０１３９】
次いで、先で得られた活性化オリゴ糖を、結合実験に使用した。
【０１４０】
（Ｈｉｂ莢膜オリゴ糖とのポリエピトープキャリアタンパク質の結合およびその結合体の精製）
最終容量０．５ｍｌの１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７中の３３．４ナノモルの組換えキャリアタンパク質および６６９ナノモルの活性化Ｈｉｂオリゴ糖を、室温で一晩緩やかに攪拌し、そして１Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭ  ホスフェート  ｐＨ７になるよう、５ｍｌに容量を増大した。このサンプルを、１ｍｌのＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ５／５  ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のＦＰＬＣに供した。１ｍｌの画分を、洗浄（１Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭ  ホスフェート  ｐＨ７）および溶出（１０ｍＭ  ホスフェート  ｐＨ７）の両方の間で収集した。非吸着物質および溶出物質に対応する２つのピークを得た。非吸着物質に対応するプールした画分および溶出ピークに対応するプールした画分を、タンパク質およびリボース含量の決定、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。
【０１４１】
組換えタンパク質をオリゴ糖へＮｉ2+−ＮＴＡ樹脂上で直接的に結合するためのプロトコルもまた開発した。組換えタンパク質を先に記載のように精製したが、最終の透析工程は省略した。８Ｍの尿素画分プールのタンパク質含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定した。溶出タンパク質のｐＨを、ｐＨ８に調整し、そして１ｍｌの予め平衡化したＮｉ2+−ＮＴＡ樹脂上での吸着を、再度バッチ様式で行った。尿素を、４回、２５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄することによって除去した。樹脂を、１ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５中に懸濁し、そして２０倍モル濃度過剰の活性化Ｈｉｂオリゴ糖（樹脂上に吸着したタンパク質と比較して）を、この懸濁液に添加した。この混合物を室温で一晩、緩やかに攪拌し、カラムに充填し、そして５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄して、非結合オリゴ糖を除去した。
【０１４２】
結合体の溶出を１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ４で行った。ピークの画分をプールして、そしてＰＢＳ，ｐＨ７．２に対して透析した。この結合体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色および抗ｆｌａｇウサギ抗体を使用するウェスタンイムノブロットによって分析した。糖結合体のタンパク質／炭水化物の比を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイおよびリボース含量決定で決定した。
【０１４３】
（ＰＢＭＣおよびＴ細胞クローンの培養）
ＰＢＭＣのための培養培地は、以下を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）であった；２ｍＭのＬ−グルタミン、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、および５％ヒト血清（ＲＰＭＩ−ＨＳ）または１０％ウシ胎仔血清（ＲＰＭＩ−ＦＣＳ）。Ｔ細胞株およびＴ細胞クローンの増殖のために、ＲＰＭＩ−ＨＳに、１ｍｌあたり５０Ｕの組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２：Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を補充した。
【０１４４】
（ＰＢＭＣ増殖アッセイ）
破傷風トキソイドに免疫のある健常成体由来の凍結ＰＢＭＣ（１０5）を融解し、そして９６ウェル平底マイクロプレートの２連のウェルにおいて、０．２ｍｌのＲＰＭＩ−ＨＳ（Ｄｉ  Ｔｏｍｍａｓｏら、１９９７）中で培養した。組換えタンパク質および破傷風トキシン（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｓｉｅｎａ）を、最終濃度１０μｇ／ｍｌでウェルに添加した。培養５日後、１μＣｉの［3Ｈ］チミジン（比活性：５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を各ウェルに添加し、そしてＤＮＡに組込まれた放射活性を、さらに１６時間後に液体シンチレーション計数によって測定した。
【０１４５】
（Ｔ細胞クローンの増殖アッセイ）
２つのヒトＴ細胞クローン、ＫＳＭＩＫ  １４０およびＧＧ−２２（それぞれ、Ｐ２ＴＴおよびＰ３０ＴＴに特異的）、ならびにそれぞれのペプチドは、Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ博士（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から恵与された。Ｔ細胞（２×１０4）を、２連のウェルの９６ウェル平底マイクロプレートで０．２ｍｌのＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で、自己由来の照射されたエプスタイン−バーウイルスで形質転換したＢリンパ球（３×１０4）とともに培養した。合成ペプチド、および結合体化組換えタンパク質または非結合体化組換えタンパク質を、最終濃度１０μｇ／ｍｌで培養物に添加した。２日後、１μＣｉの［3Ｈ］チミジンを添加し、そして組込まれた放射活性を、さらに１６時間後に液体シンチレーション計数によって測定した。
【０１４６】
いくつかの実験において、キャリアタンパク質およびそれらの結合体を、ＡＰＣと２〜４時間プレインキュベートし、次いで、ＡＰＣを洗浄し、そしてＴ細胞クローンと共に培養した。この手順を使用して、血清プロテアーゼによる起こり得るタンパク質分解性の分解を制限し、エピトープの提示が、細胞内でプロセシングされたエピトープに起因することをより確信的にした。
【０１４７】
（免疫原性試験）
第一の実験において、アジュバントとして０．５ｍｇの水酸化アルミニウムの存在下の、等用量の糖結合体および多糖（多糖として２．５μｇ）を、８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群およびＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）の群に、０日目、２１日目および３５日目に皮下注射した。マウスを、−１日目（免疫前）、２０日目（免疫前２）、３４目（免疫前３）、および４５日目（免疫後３）に採血し、個々の血清を収集し、そしてＥＬＩＳＡアッセイまで−８０℃で保存した。
【０１４８】
第二の実験において、アジュバントとして０．５ｍｇの水酸化アルミニウムの存在下の、等用量の糖結合体および多糖（多糖として２．５μｇ）を、８匹のＳｗｉｓｓ（‘Ｄ１マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウス）（雌、７週齢）の群に、０日目、１０日目および２０日目に皮下注射した。次いで、０．５ｍｇの水酸化アルミニウムの存在下の２．５μｇの精製Ｈｉｂ多糖（ＨｉｂＣＰＳ）で、７０日目に各マウスにブーストした。マウスを、−１日目（免疫前）、３５日目（ワクチン接種後）、６８目（ブースト前）、および８５日目（ブースト後）に採血し、個々の血清を収集し、そしてＥＬＩＳＡアッセイまで−８０℃で保存した。
【０１４９】
第三の実験において、アジュバントとして０．５ｍｇの水酸化アルミニウムの存在下の、等用量のＣＲＭ−Ｈｉｂ、Ｎ１０−Ｈｉｂ，およびＮ１９−Ｈｉｂ（多糖として２．５μｇ）を、６匹のＳｗｉｓｓ  ＣＤ１マウス（雌、７週齢）の群に、０日目、１５日目および２８日目に皮下注射し、キャリアの効果を比較した。異なる群のマウスもまた、潜在的な免疫抑制現象をチェックするために非結合体化キャリアで予めプライムしたことを除き、同じスケジュールに供した。後者の群に、０．５ｍｇのミョウバン中の等用量のキャリアタンパク質（５０μｇ）を、−３０日目に注射した。全てのマウスを、−３２日目（プライム前）、−２日目（免疫前）、１４日目（免疫後１）、２７日目（免疫後２）、および４５日目（免疫後３）に採血し、血清を収集し、そしてＥＬＩＳＡアッセイまで−８０℃で保存した。
【０１５０】
（ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェル平底プレートを、１μｇ／ｍｌ（多糖として）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型多糖との結合体（ＨＳＡ−Ｈｉｂ）を用いて、４℃で一晩のインキュベーションによってコーティングした。洗浄後、ウェルを、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の１％（ｗ／ｖ）ゼラチンを使用して、３７℃でさらに３時間オーバーコーティングした。血清サンプルを、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡおよび０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む、５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２中、１：５０で希釈し、そのウェル内に二連に分注した。非処置マウス由来の血清をプールし、そして上記のように１：５０で希釈し、そして８ウェルに分配した。４℃で一晩のインキュベーション後、プレートを、７５ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む、５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２で３回洗浄した。次いで、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡおよび０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む、５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２で１：１０００に希釈したアルカリホスフェート結合ヤギＩｇＧ抗マウスＩｇＧを、各ウェルに添加し、そして３７℃で３時間インキュベートした。
【０１５１】
洗浄を繰り返した後、１００μｌのクロモゲン基質、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ジエチレンアミン溶液中）を、各ウェルに添加した。反応を、２０分後に４Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加することによって停止した。次いで、プレートを、５９５ｍＭの基準波長で４０５ｍＭと読取った。力価を、４０５ｍＭでの吸光度（Ａ405mm）として表した。マウスを、平均Ａ405mmが、非処置の動物由来の血清での８ウェルの吸光度の平均の４倍以上と見出される場合に、応答動物とみなした。ヨーロッパ薬局方［ＰＡ／ＰＨ／Ｅｘｐ１５／Ｔ（９３）３ＡＮＰ］に従うと、８匹のマウスの内４匹が、応答動物であるはずである。
【０１５２】
第二の実験において、マウスを、平均Ａ405mmが、同じ処置グループの免疫前の血清での８ウェルの吸光度の平均の４倍以上と見出される場合に、応答動物とみなした。
【０１５３】
抗キャリア応答を、Ｎ１０またはＮ６でコートされたプレート（コーティング濃度＝２μｇ／ｍｌ）を使用して抗Ｈｉｂ応答について上述のようにアッセイした。
【０１５４】
（結果）
（ポリエピトープキャリアタンパク質の構築）
材料および方法で記載されたアプローチを使用して、本発明者らは、異なるキャリアタンパク質を発現するいくつかのＥ．ｃｏｌｉクローンを作製した。以下の表は、本発明者らが組換えポリエピトープキャリアタンパク質を精製するために利用した６つのクローンのみを列挙する。
【０１５５】
【表６】
2006193534.tif 000005
【０１５６】
Ｎ６タンパク質を発現するクローンは、Ｔｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ株に形質転換されたプラスミドｐＴｒｃ−Ｎ６を含んでいた。プラスミドＤＮＡ配列決定から推定されるように、このプラスミドは、６ヒスチジンアミノ末端テール、これに続くｆｌａｇペプチド、ＦＸａ部位、および以下のＴ細胞エピトープをこの順序で有するタンパク質をコードする：Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＴ３、Ｐ３０ＴＴ、およびＰ２ＴＴ。全てのエピトープは、ＫＧアミノ酸配列によって間隔を空けられていた（図２）。
【０１５７】
Ｎ１０タンパク質を産生した２つのクローンは、プラスミドｐＴｒｃ−Ｎ１０を含有するＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ株、およびプラスミドｐＱＥ−Ｎ１０を含有するＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ株であった。これら両方のクローンは、４つのさらなるＴ細胞エピトープ（ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨＢｓＡｇ、およびＭＴ（図２））をこの順序でコードするカルボキシ末端配列と融合したＮ６コード配列を含有した。
【０１５８】
Ｎ１１タンパク質を産生するクローンは、Ｔｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ株に形質転換されたプラスミドｐＴｒｃ−Ｎ１０を含有した。プラスミドＤＮＡ配列決定から推定されるように、このプラスミドは、ＨＳＰ７０  Ｔ細胞エピトープをコードするカルボキシ末端配列と融合したＮ１０配列からなるタンパク質をコードする（図７）。
【０１５９】
Ｎ１９タンパク質を産生する２つのクローンは、プラスミドｐＴｒｃ−Ｎ１９を含有するＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ株、およびプラスミドｐＱＥ−Ｎ１９を含有するＴＧ１  Ｅ．ｃｏｌｉ株であった。これら両方のクローンは、９つのさらなるＴ細胞エピトープ（Ｐ２３ＴＴ、Ｐ３２ＴＴ、Ｐ２１ＴＴ、ＰｆＴ３、Ｐ３０ＴＴ、Ｐ２ＴＴ、ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、およびＨＢｓＡｇ（図８））をこの順序でコードするカルボキシ末端配列と融合したＮ１０コード配列を含有した。
【０１６０】
（タンパク質の発現および精製）
図３および４は、３つの合成タンパク質のタンパク質発現を示す。Ｎ１０タンパク質（レーンＣ）を得るための、ｐＴｒｃ−Ｈｉｓ中のＮ６（レーンＤ）への、さらなる４つのエピトープ（ＨＢＶｎｃ、ＨＡ、ＨＢｓＡｇ、およびＭＴ）の付加は、タンパク質発現の顕著な減少を生じた。Ｎ１０の発現レベルを上昇させる試みは、単純に発現ベクター（ｐＴｒｃ−ＨｉｓからＰＱＥ３０へ）およびＥ．ｃｏｌｉ株（Ｔｏｐ１０からＴＧ１へ）の変更を包含した。図３および４に見られるように、ＴＧ１中のｐＱＥ３０−Ｎ１０によって発現されたＮ１０の量（レーンＢ）は、ｐＴｒｃ−Ｎ１０によって発現された同一のタンパク質（レーンＣ）よりも特に多かった。このことは、Ｎ６タンパク質がその生物にとって最も適切なエピトープの順番でＥ．ｃｏｌｉ株によって効果的にアセンブリされるが、その一方、４つのさらなるエピトープの添加は、効果的に押し込まれ、従って、より天然でないことに起因する可能性があると考えられる。しかし、Ｎ１０発現レベルが、単純に発現ベクター（ｐＴｒｃ−ＨｉｓからＰＱＥ３０へ）およびＥ．ｃｏｌｉ株（Ｔｏｐ１０からＴＧ１へ）の変更によって顕著に増加したという事実は、エピトープの組み合わせ以外のさらなる因子がタンパク質発現において役割を担うことを示唆する。
【０１６１】
図９は、Ｎ１１タンパク質のタンパク質発現および精製を示す（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色）。誘導された培養物由来の総抽出物（レーンＢ）は、非誘導抽出物（レーンＡ）中に存在しない、Ｎ１１タンパク質の予想された分子量にほぼ相当する誘導されたバンドを示す。誘導されたバンドの同一性もまた、抗ｆｌａｇ抗体を使用するウエスタンブロットによって確立され、そしてまたプラスミドＤＮＡ配列決定から推定された（図７）。Ｎ１１精製（図９、レーンＣ）を、グアニジニウム中で細胞全体のペレットを可溶化すること、および抽出物全体をＩＭＡＣクロマトグラフィーに供することによって行い、この手順を用いて、本発明者らは、１リットルのＴｏｐ１０−Ｔｒｃ−Ｎ１１フラスコ培養物から、１４ｍｇの組換えＮ１１タンパク質を得た。ＨＳＰ７０  Ｔ細胞エピトープの、Ｎ１０のカルボキシ末端への付加は、ｐＴｒｃ−Ｎ１０より得られた発現と比較して、ポリエピトープタンパク質の発現を顕著に改善し得る構築物（ｐＴｒｃ−Ｎ１１）を生じた。
【０１６２】
Ｎ１０タンパク質についての場合と同様に、Ｎ１９タンパク質の発現もまた、発現ベクター（ｐＴｒｃ−ＨｉｓからｐＱＥ３０へ）および宿主株（Ｔｏｐ１０からＴＧ１へ）の変更によって改善された。ＴＧ１（ＱＥ−Ｎ１９）を使用して、Ｎ１９ポリエピトープタンパク質を精製した。可溶化された封入体をＩＭＡＣクロマトグラフィーに供することにより、本発明者らは、１リットルのフラスコ培養物から５．４２ｍｇのＮ１９タンパク質を精製した（図１０Ａを参照のこと）。Ｎ１９の同一性を、抗ｆｌａｇ抗体を使用する免疫ウェスタンブロットにおいて、予想された分子量を有する誘導されたバンドとしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定し、そしてまた、プラスミドＤＮＡ配列決定後に推定した（図８）。
【０１６３】
組換えポリエピトープタンパク質を発現する全てのクローンは、これらタンパク質を主に封入体の形態において産生した。８Ｍ尿素存在下での固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）手順を使用して、８Ｍ尿素で可溶化された封入体からのＮ６およびＮ１０タンパク質の精製は、６．５〜４のｐＨ勾配で溶出可能なタンパク質の高い百分率の損失を生じた（データは示さず）。
【０１６４】
対照的に、ほとんど全てのヒスチジンタグ化タンパク質は、開始封入体が６Ｍグアニジニウム塩酸塩を用いて可溶化された場合、６．５〜４ｐＨの勾配で溶出された（図５および６）。このプロトコールを使用して、７．８ｍｇのＮ６が１リットルの培養物から精製された。免疫およびＴ細胞増殖実験に使用されたＮ１０タンパク質を、ｐＴｒｃ−Ｎ１０クローンから精製した。
【０１６５】
このクローンによって示される組換えタンパク質の、より低い発現を考慮して、本発明者らは、ＩＭＡＣ精製について可溶性および不溶性（封入体）のタンパク質を利用するような方法において、グアニジニウムを用いて細胞全体を可溶化することによってＮ１０タンパク質を精製することを決定した。この手順を使用して、１．５ｍｇの精製Ｎ１０タンパク質が１リットルの培養物から得られた。６Ｍのグアニジニウムを使用する可溶化のより高い成功は、この化合物がモノマー形態においてキャリアタンパク質を可溶化する能力に起因すると考えられる。
【０１６６】
（ポリエピトープタンパク質とのＨｉｂオリゴサッカライド結合体）
フェニルセファロースＦＰＬＣプロトコールを使用して、本発明者らは、７９．４μｇ／ｍｌのタンパク質含量、および４２．７μｇ／ｍｌのオリゴサッカライド含量を有する、精製Ｎ６−Ｈｉｂ結合体を得た。
【０１６７】
本発明者らは、３０％の結合体化タンパク質が１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4の存在下でフェニルセファロースに結合し得ないことを観察した。さらに、３０〜４０％のキャリアタンパク質は、結合体反応の前の尿素を除去するための透析工程の間に予め失われた。これらの問題を克服するために、タンパク質をＮｉ2+−ＮＴＡ樹脂に吸着させた場合に、結合体反応を行うことが可能か確認した。本発明者らは、ＨｉｂオリゴサッカライドがいずれのｐＨでもＮｉ2+−ＮＴＡ樹脂に結合し得ないことを観察した。このことは、このアプローチの実行可能性を示唆し、そしてオリゴサッカライドに起因する障害が、一旦結合体化が生じたタンパク質の溶出に影響を与え得ないということを予測する。
【０１６８】
従って、８Ｍ尿素存在下におけるＮｉ2+−ＮＴＡ樹脂へのタンパク質の吸着、尿素の除去、オリゴサッカライドとの結合体化、洗浄、および結合体の溶出を包含する反応を設定した。凝集の現象は、溶出した結合体について観察されなかった。この手順を用いて、本発明者らは、３２０μｇ／ｍｌのタンパク質含量および３７０μｇ／ｍｌのオリゴサッカライド含量を有する精製したＮ６−Ｈｉｂ結合体、ならびに１１３μｇ／ｍｌのタンパク質含量および１１４μｇ／ｍｌのオリゴサッカライド含量を有する精製したＮ１０−Ｈｉｂを得た。
【０１６９】
１：１０のタンパク質対糖のモル比を使用してオリゴサッカライドを組換えキャリアと結合体化するために、本発明者らは、タンパク質の画分が結合体化されていないままであることを観察した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色およびウエスタン免疫ブロットによる判断；データは示さず）。１：２０のタンパク質対糖の化学量論的比を使用した場合、全ての精製された組換えタンパク質が完全に結合体化されたことが、実際にクマシー染色ゲルおよび抗Ｆｌａｇ抗体を使用するウエスタン免疫ブロットを分析することによって、見出された。本発明者らは、Ｎ６およびＮ１０と、Ｈｉｂオリゴサッカライドとの結合体化の後、これらの分子がその分子量を増加させ、高分子量のスメアとして出現し、そしてタンパク質はＮ６およびＮ１０のモノマーについて予測された分子量でもはや見られなかったことを、観察した。このことは、合成タンパク質が、Ｈｉｂオリゴサッカライドと完全に結合体化したことを示唆した（データは示さず）。
【０１７０】
活性化Ｈｉｂオリゴサッカライドと、Ｎ１９タンパク質との結合体は、１７３μｇ／ｍｌのタンパク質含量および１２７μｇ／ｍｌのオリゴサッカライド含量のタンパク質を生じた。図１０Ｂは、Ｈｉｂポリサッカライドと結合体化したＮ１９のＩＭＡＣクロマトグラフィーより得られた画分の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色分析を示す。高分子量の結合体、および結合体化していない４３．０００ｋＤａのＮ１９タンパク質の不在から判断すると、全てのＮ１９タンパク質は結合体化を生じた。図１０Ｃは、抗ｆｌａｇ抗体を使用する、対応するウエスタン免疫ブロットを示す。またここでは、全てのＮ１９タンパク質がＨｉｂポリサッカライドとの結合体化の後、非常に高分子量として移動すること、および４３．０００ｋＤａで移動する結合体化していないＮ１９タンパク質が存在しないことが理解され得る。
【０１７１】
（ヒトＴリンパ球による、キャリアタンパク質およびその結合体の認識）
ポリペプチドに含まれるＴ細胞エピトープが、ヒトＴ細胞によって認識されるか否かを調べるために、本発明者らは、ＴＴユニバーサルエピトープｐ２ＴＴおよびｐ３０ＴＴに特異的なＴ細胞クローンを使用した（Ｄｅｍｏｔｚら、１９９３）。図１１は、Ｎ６が、単純なポリペプチドとしてのみではなく、ポリサッカライドと結合体化した後もまた、両方のクローンによって認識されることを示す。注目すべきことに、Ｎ６−Ｈｉｂは、Ｐ２ＴＴ特異的Ｔ細胞クローンによって、結合体化されていないＮ６よりもさらに良好に認識される。Ｎ１０−Ｈｉｂはｐ２ＴＴに特異的なクローンによって認識されるが、Ｐ３０ＴＴに特異的なクローンによっては不完全に認識される。両方の場合において、Ｎ１０−Ｈｉｂは、合成ペプチドと同一の刺激活性を発揮する。Ｎ１０クローンは、これらの実験において試験されなかった。
【０１７２】
一旦、これらキャリアタンパク質に含有されるＴ細胞エピトープがＴリンパ球に正確に提示されることが評価されると、本発明者らは、これらのキャリアがＰＢＭＣのような不均一なリンパ球集団に対して提示される場合、その刺激能を維持するか、調べた。このことは、キャリア自体にそのエピトープが含有される抗原に対して免疫性の被験体中に注入された場合、本発明者らのキャリアがそのように機能し得るか否かを予測し得る。この目的のために、本発明者らは、ＴＴに対して免疫性のドナー由来のＰＢＭＣを使用した（Ａ．Ｄｉ  Ｔｏｍｍａｓｏら、１９９７）。なぜならＴＴエピトープは、本発明者らのポリペプチドにおいて最も提示されたからである。図１２は、全ての処方物が、ＰＢＭＣ増殖を刺激し得たことを示す。
【０１７３】
しかし、ＰＢＭＣと、Ｎ６およびＮ１０の構築物の両方に含まれるエピトープの１つを表す合成ペプチドとのインキュベーションは、刺激効果を示さなかった。ポジィティブコントロールとして、ＰＢＭＣをまた、１０μｇ／ｍｌのＴＴとともにインキュベートし、これは、その全ての場合において増殖応答を誘導した。興味深いことに、Ｎ６ポリエピトープタンパク質は、試験した３人のボランティア中の２人において、最も強力なＰＢＭＣ刺激剤であることが判明した。
【０１７４】
（免疫原性試験）
ＣＲＭ１９７との比較におけるタンパク質Ｎ１０およびＮ６のキャリア効果を、いくつかの糖結合体ワクチンにおいて、マウスでアッセイした。一旦、Ｈｉｂオリゴサッカライドと結合体化したら、このキャリアタンパク質を異なるマウス系統中に注入し、それらのキャリア効果の可能性を確認した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＣＲＭ１９７およびＮ１０をキャリアタンパク質として使用した場合、等価の抗Ｈｉｂ応答が見出された。その一方、Ｎ６をキャリアタンパク質として使用した場合、より低い応答が見出された。この結果は、結果を力価を使用して示した場合、明らかであった。その一方で、応答動物の百分率からは、Ｎ６タンパク質キャリアを用いて得られたより低度の抗Ｈｉｂ応答が証明されなかった。
【０１７５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、Ｎ６タンパク質は、ネガティブな結果を示した。その一方、ポジィティブな結果は、より低い程度であったとしても、ＣＲＭ１９７およびＮ１０を用いて得られた。これらの結果は、結果を示すために力価または応答動物の百分率の両方を使用して、明らかであった。結果を応答動物の百分率で示した場合、ＣＲＭ１９７およびＮ１０の高度なキャリア効果が、Ｎ６に関して十分明らかであった。その結果は、匹敵する初期応答（プレー２採血、２０日目）の後、３４日目および４５日目の採血において、５０％より低かった。
【０１７６】
表２は、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおける実験の結果を報告する。
【０１７７】
Ｓｗｉｓｓ  ＣＤＩマウスにおいて、Ｎ１０キャリアタンパク質を用いて得られた力価は、ＣＲＭ１９７を用いて得られた結果と等価であった。抗Ｈｉｂ力価は、免疫後７０日目まで増加し、７０日目に、ポリサッカライド追加免疫を与え、処置したマウスにおいて免疫学的記憶が誘導されたか否かアッセイした。追加免疫の効果は、いずれのキャリアにおいても観察されなかったが、ＣＲＭ１９７またなＮ１０をキャリアタンパク質として使用した場合、力価は減少しなかった。このマウス系統において、Ｎ６−Ｈｉｂ糖結合体を用いる免疫は、コントロール（ポリサッカライドおよびミョウバン）と非常に類似した結果を生じる。追加免疫の効果は、Ｓｗｉｓｓ  ＣＤ１マウスと比較してより低度の応答を惹起するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてさえ明らかでなかった。
【０１７８】
結果を表３に概説する。
【０１７９】
異なるマウス系統の、人工キャリアタンパク質と結合体化したＨｉｂオリゴサッカライドでの免疫は、Ｎ１０によって発揮される良好なキャリア効果を生じた。その一方、Ｎ６は、満足できない結果を生じた。このことは、タンパク質のサイズまたはＴ細胞エピトープの数が、オリゴサッカライドに対するＴ細胞補助を提供する場合に、高度の影響を有すること示唆する。
【０１８０】
本発明者らは、異系交配したＣＤ１マウスを使用して、Ｎ１９タンパク質のキャリア効果をＮ１０およびＣＲＭ１９７のキャリア効果と比較した免疫原性実験を行った。さらに、可能性のあるキャリア誘導性免疫抑制現象を探索するために、Ｎ１０−Ｈｉｂ、Ｎ１９−ＨｉｂおよびＣＲＭ−Ｈｉｂの３つの用量を、キャリアの初回免疫を受けなかったマウスの群、および５０μｇのそれぞれの非結合体化キャリアで１ヶ月前に初回免疫されたマウスの群に対して与えた（材料および方法を参照のこと）。
【０１８１】
【表２】
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【０１８２】
【表３】
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【０１８３】
実験のスケジュールは以下のとおりであった：
【０１８４】
【表７】
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【０１８５】
結果を図１３に示す。初回免疫されていないマウスにおいて、最も良好な抗Ｈｉｂ力価は、Ｎ１９−Ｈｉｂを使用して得られた。その一方、ＣＲＭ−ＨｉｂおよびＮ１０−Ｈｉｂは、より低い力価を生じた。キャリア分子のサイズと発揮されるキャリア効果との間の公知の正比例に従って、Ｎ１９−Ｈｉｂは、Ｎ１０−Ｈｉｂと比較して、明らかに改善された抗Ｈｉｂ応答を惹起した。さらに、Ｎ１９−Ｈｉｂは、ＣＲＭ−Ｈｉｂと比較した場合にもまた、若干優れているようである。このことは、「古典的」なキャリアタンパク質を、組換えＣＤ４＋ポリエピトープタンパク質で置き換える実行可能性を示唆する。Ｎ１０およびＣＲＭ−１９７のキャリア効果が類似していた、ＣＤ１マウスにおいて実施された以前の免疫原性試験と対照的に、この新規の試験においてＮ１０−Ｈｉｂによって惹起された抗Ｈｉｂ力価の平均は、ＣＲＭ−Ｈｉｂによって得られた抗Ｈｉｂ力価の平均よりも顕著に低かった。
【０１８６】
初回免疫されたマウスにおいて、最も良好な結果は、Ｎ１９−Ｈｉｂを用いて得られ、Ｎ１９−Ｈｉｂは、初回免疫しなかったマウスにおいて得られた応答と比較した場合にも良好な応答を惹起した。このことは、Ｎ１９タンパク質を用いる初回免疫に起因する増強を示唆する。わずかな増強もまた、Ｎ１０を用いて初回免疫した後に得られた。逆に、初回免疫されたマウスにおいてＣＲＭ−Ｈｉｂを用いて得られた抗Ｈｉｂ応答は、初回免疫されなかったマウスにおいて得られた応答よりも、顕著に低かった。このことは、現在使用されているキャリアについてしばしば観察される、キャリア誘導性免疫抑制を確認する。
【０１８７】
Ｎ１０およびＮ１９は、それぞれ５個および１０個の破傷風トキソイドＴ細胞エピトープを含むので、本発明者らは、Ｎ１０−ＨｉｂおよびＮ１９−Ｈｉｂを、破傷風トキソイドで初回免疫されたＣＤ１マウスにおける免疫原性試験に供した。この実験の目標は、初回免疫されたマウスにおいて、抗Ｈｉｂ力価が、初回免疫しなかったマウスとの比較において改善されたか否かを確認することであった。驚くべきことに、破傷風トキソイドの初回免疫は、Ｎ１０−Ｈｉｂを用いて免疫されたマウスにおいてＨｉｂに対する免疫応答を増強したが、Ｎ１９−Ｈｉｂを受容したマウスにおいては、増強しなかった（データは示さず）。
【０１８８】
行った免疫原性試験より、本発明者らは、以下のいくつかの結論が得られ得る：
１．ポリエピトープタンパク質のキャリア効果は、そのサイズと直接関係する。
２．組換えポリエピトープタンパク質Ｎ１０およびＮ１９は、キャリアとしてＣＲＭ−１９７と匹敵し得るか、またはこれを超え得る。
３．ポリエピトープキャリアタンパク質は、キャリア誘導性抑制の影響を受けない。
【０１８９】
【表８】
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【０１９０】
【表９】
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【０１９１】
【表１０】
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【０１９２】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】図１は、Ｎ６タンパク質の構築の模式図である。
【図２−１】図２は、Ｎ６構築物およびＮ１０構築物、ならびにそれらのそれぞれのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を例示する。ヒスチジンタグ、ｆｌａｇペプチド、Ｆｘａ切断部位、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープに下線を付す。
【図２−２】図２は、Ｎ６構築物およびＮ１０構築物、ならびにそれらのそれぞれのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を例示する。ヒスチジンタグ、ｆｌａｇペプチド、Ｆｘａ切断部位、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープに下線を付す。
【図２−３】図２は、Ｎ６構築物およびＮ１０構築物、ならびにそれらのそれぞれのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を例示する。ヒスチジンタグ、ｆｌａｇペプチド、Ｆｘａ切断部位、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープに下線を付す。
【図３】図３は、種々のポリエピトープタンパク質を生成する、誘導したＥ．ｃｏｌｉクローンから調製した総タンパク質抽出物のクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーンＡ：ネガティブコントロール（挿入物のないｐＱＥ３０ベクターを含むＴＧ１細胞）；レーンＢ：ｐＱＥ３０−Ｎ１０プラスミドを含むＴＧ１細胞；レーンＣ：ｐＴｒｃ−Ｎ１０プラスミドを含むＴＯＰ１０細胞；レーンＤ：ｐＴｒｃ−Ｎ６プラスミドを含むＴＯＰ  １０細胞；レーンＥ：低分子量マーカー。
【図４】図４は、図３に例示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの免疫ブロットである。このウェスタンブロットを、ｆｌａｇペプチドに特異的なウサギ抗血清とともにインキュベートし、次いで、ペルオキシダーゼを結合させた（ｐｅｒｏｘｉｄａｔａｄ）抗ウサギＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。次いで、この免疫反応を、４−クロロ−１−ナフトールをペルオキシダーゼの基質として用いて明らかにした。
【図５】図５は、Ｎ６タンパク質の精製手順の間に得られた種々のサンプルを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色したゲルである。レーンＡ：出発物質（ｐＴｒｃ−Ｎ６プラスミドを含む、誘導されたＴＯＰ１０  Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞の総タンパク質；レーンＢ：可溶性タンパク質（総タンパク質サンプルの遠心分離後に得られた上清）；レーンＣ：１Ｍ尿素中で可溶なタンパク質（１Ｍ尿素で不溶性タンパク質を洗浄した後に得られた上清）；レーンＤ：インクルージョンボディ（１Ｍ尿素で不溶性タンパク質を洗浄した後に得られたペレット）；レーンＥ：固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）技術を用いるＮｉ2+  ＮＴＡ樹脂での精製後に得られたＮ６タンパク質；レーンＦ：低分子量マーカー。
【図６】図６は、図５に例示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの免疫ブロットである。このウェスタンブロットを、ｆｌａｇペプチドに特異的なウサギ抗血清とともにインキュベートし、次いで、ペルオキシダーゼを結合させた（ｐｅｒｏｘｉｄａｔａｄ）抗ウサギＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。次いで、この免疫反応を、４−クロロ−１−ナフトールをペルオキシダーゼの基質として用いて明らかにした。
【図７−１】図７は、Ｎ１１構築物、ならびにそのＤＮＡ配列およびタンパク質配列の模式図である。ヘキサヒスチジンタグ、ｆｌａｇペプチド、ＦＸａ切断部位、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープに下線を付す。
【図７−２】図７は、Ｎ１１構築物、ならびにそのＤＮＡ配列およびタンパク質配列の模式図である。ヘキサヒスチジンタグ、ｆｌａｇペプチド、ＦＸａ切断部位、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープに下線を付す。
【図８−１】図８は、Ｎ１９構築物、ならびにそのＤＮＡ配列およびタンパク質配列の模式図である。ヘキサヒスチジンタグ、ｆｌａｇペプチド、ＦＸａ切断部位、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープに下線を付す。
【図８−２】図８は、Ｎ１９構築物、ならびにそのＤＮＡ配列およびタンパク質配列の模式図である。ヘキサヒスチジンタグ、ｆｌａｇペプチド、ＦＸａ切断部位、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープに下線を付す。
【図９】図９は、Ｔｏｐｌ０−Ｔｒｃ−Ｎ１１  Ｅ．ｃｏｌｉクローン由来のタンパク質のＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびクーマシー染色である。・レーンＡ：誘導していない培養物の総抽出物。・レーンＢ：ＩＰＴＧを用いて誘導した培養物の総抽出物。・レーンＣ：精製したＮ１１タンパク質（グアニジニウムおよびＩＭＡＣクロマトグラフィーを用いての細胞全体の可溶化）。
【図１０】Ａ：ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびクーマシー染色。Ｎ１９タンパク質を精製するために行なわれたＩＭＡＣクロマトグラフィーから得られた画分の分析。レーンａ：予備染色した分子量マーカー。レーンｂ：フロースルー。レーンｃ〜レーンｍ：精製されたＮ１９タンパク質を示す勾配画分；Ｎ１９よりも小さい分子量を有し、そして過量にロードしたレーンｆ、ｇ、およびｈにおいて可視可能なバンドは、Ｎ１９タンパク質の分解産物を示す。・Ｂ：ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびクーマシー染色。Ｈｉｂ多糖に結合体化されたＮ１９のＩＭＡＣクロマトグラフィーから得られた画分の分析。高分子量の結合体によって、および４３．０００  ｋＤａの非結合体化Ｎ１９タンパク質が存在しないことによって判断したところ、全てのＮ１９タンパク質は、結合体化されていると結論された。・Ｃ：写真Ｂにおいて用いたのと同じ結合体サンプルを、抗ｆｌａｇ抗体を用いるウェスタン免疫ブロットに供した。ここではまた、全てのＮ１９タンパク質が、Ｈｉｂ多糖への結合体化後に非常に高分子量として移動したこと、および４３．０００ｋＤａで移動する、結合体化されていないＮ１９タンパク質は存在しないことが認識され得る。
【図１１】図１１：それぞれの合成ペプチド（コントロール）および結合体化されているかまたは結合体化されていないポリエピトープタンパク質を用いて刺激した後のＰ３０ＴＴ  （ＧＧ２２クローン）およびＰ２ＴＴ（ＫＳＩＭＫ−１４０クローン）に特異的な２つのヒトＴ細胞クローンの増殖応答（ｃｐｍ：１分間あたりのカウント数）。
【図１２】図１２：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖アッセイ。破傷風トキソイドに対して免疫性の３人の健常なドナー（ＲＲ、ＥＢおよびＭＣ）由来のＰＢＭＣを、破傷風トキソイド、Ｐ２ＴＴ、Ｎ６、Ｎ６−ＨｉｂおよびＮ１０−Ｈｉｂを用いて刺激した。
【図１３】図１３：Ｎ１０、Ｎ１９、およびＣＲＭ−１９７のキャリア効果を比較するため、およびキャリア誘導性免疫抑制現象についてチェックするために行った免疫原性試験の結果。種々の結合体を用いてプライムしたＣＤ１マウスおよびプライムしていないＣＤ１マウスを免疫した後に得られた抗Ｈｉｂ力価。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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