(57)【要約】【課題】新規プテリン化合物を提供する。【解決手段】前記のプテリン化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物（Ｒ１は、置換されていることのある炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基、置換されていることのある炭素数３〜２０の飽和又は不飽和の脂環式炭化水素基、置換されていることのある炭素数６〜１５の芳香族炭化水素基、あるいは、置換されていることのある複素環式環基であり、Ｒ２は、水素原子又はメチル基である）である。【化１】2006248964.tif 000012【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2006248964.tif 000009
（式中、Ｒ１は、炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基、炭素数３〜２０の飽和又は不飽和の脂環式炭化水素基、炭素数６〜１５の芳香族炭化水素基、あるいは、複素環式環基であり、前記の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、及び複素環式環基は、置換されていることがあるものとし、Ｒ２は、水素原子又はメチル基である）
で表されるプテリン誘導体又はその塩。
【請求項２】
式（II）：
【化２】
2006248964.tif 000010
で表される６−ホルミル−プテリンと、一般式（III）：
【化３】
2006248964.tif 000011
（式中、Ｒ１は、炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基、炭素数３〜２０の飽和又は不飽和の脂環式炭化水素基、炭素数６〜１５の芳香族炭化水素基、あるいは、複素環式環基であり、前記の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、及び複素環式環基は、置換されていることがあるものとする）
で表される酸塩化物とを、ジメチルホルムアミド又はジメチルアセトアミド中において、三級アミンの存在下で反応させることを特徴とする、請求項１に記載の一般式（Ｉ）で表されるプテリン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プテリン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
プテリン誘導体、例えば、６−ホルミル−プテリンが、各種生理作用を有することが知られている。前記生理作用として、例えば、一酸化窒素合成酵素発現抑制作用（特許文献１）、活性酸素消去作用（特許文献２）、アポトーシス抑制作用（特許文献３）、白血球殺菌活性増強作用（特許文献４）、免疫抑制作用（特許文献５）、放射線増感作用（特許文献６）を挙げることができる。
【特許文献１】特開平１１−２２２４３４号公報
【特許文献２】国際公開第９８／０４５５８号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−３３５４８６号公報
【特許文献４】特開２００３−１６０４９２号公報
【特許文献５】特開２００３−２３８４０９号公報
【特許文献６】特開２００３−２９２４４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの生理作用に基づいてプテリン誘導体を医薬製剤の有効成分として使用する場合、例えば、使用のしやすさ（例えば、注射又は経口投与）、効果の安定性（沈殿などしないため）等の点から、高い水溶性を示すことが望ましい。しかしながら、例えば、６−ホルミル−プテリンでは、直接、水に溶解させることが困難であり、直接、水に溶解させた場合の溶解度は、約２μｍｏｌ／Ｌである。６−ホルミル−プテリンはアルカリ性で高い溶解性を示すが、塩基性条件下で溶解してから中性に戻した場合でも、せいぜい２ｍｍｏｌ／Ｌ程度の濃度であり、そのまま放置しておくと沈殿を生じて２００μｍｏｌ／Ｌ程度の濃度まで低下する欠点があった。従って、本発明の課題は、水への高い溶解性を示す新規のプテリン誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記課題は、本発明による、一般式（Ｉ）：
【化１】
2006248964.tif 000002
（式中、Ｒ１は、炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基、炭素数３〜２０の飽和又は不飽和の脂環式炭化水素基、炭素数６〜１５の芳香族炭化水素基、あるいは、複素環式環基であり、前記の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、及び複素環式環基は、置換されていることがあるものとし、Ｒ２は、水素原子又はメチル基である）
で表されるプテリン誘導体又はその塩により解決することができる。
【０００５】
また、本発明は、式（II）：
【化２】
2006248964.tif 000003
で表される６−ホルミル−プテリンと、一般式（III）：
【化３】
2006248964.tif 000004
（式中、Ｒ１は、炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基、炭素数３〜２０の飽和又は不飽和の脂環式炭化水素基、炭素数６〜１５の芳香族炭化水素基、あるいは、複素環式環基であり、前記の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、及び複素環式環基は、置換されていることがあるものとする）
で表される酸塩化物とを、ジメチルホルムアミド又はジメチルアセトアミド中において、三級アミンの存在下で反応させることを特徴とする、前記一般式（Ｉ）で表されるプテリン誘導体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の新規プテリン誘導体は高い水溶性を示すため、細胞への取り込み効率が優れており、生理活性の向上も認められる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
一般式（Ｉ）において、基Ｒ１は、置換されていることのある（すなわち、非置換であるか、あるいは、同一又は異なる置換基１又はそれ以上で置換された）飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基（分岐脂肪族炭化水素基及び直鎖脂肪族炭化水素基を含む）、置換されていることのある飽和又は不飽和の脂環式炭化水素基、置換されていることのある芳香族炭化水素基、あるいは、置換されていることのある複素環式環基であることができる。
【０００８】
本明細書において「分岐脂肪族炭化水素基」とは、特に限定されるものではないが、基Ｒ１における少なくともα位の炭素原子（すなわち、Ｒ１と結合するカルボニル基に隣接する炭素原子）において、分岐を有する脂肪族炭化水素基であることが好ましい。
飽和又は不飽和の分岐脂肪族炭化水素基の炭素数（分岐脂肪族炭化水素基が置換されている場合には、置換基を除いた分岐脂肪族炭化水素基部分の炭素数）は、３〜２０であり、好ましくは３〜１２であり、より好ましくは３〜８であり、更に好ましくは３〜７であり、更に好ましくは３〜６であり、更に好ましくは３〜５であり、特に好ましくは３又は４である。
【０００９】
飽和の分岐脂肪族炭化水素基、すなわち、分岐アルキル基としては、例えば、ｉ−プロピル基、ｔ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ペンチル基、又は１−エチルプロピル基を挙げることができる。
不飽和の分岐脂肪族炭化水素基としては、例えば、分岐アルケニル基又は分岐アルキニル基を挙げることができる。前記分岐アルケニル基としては、例えば、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）、１−メチル−１−プロペニル基、又は１−メチルアリル基を挙げることができる。前記分岐アルキニル基としては、例えば、１−メチル−２−プロピニル基を挙げることができる。
【００１０】
飽和又は不飽和の直鎖脂肪族炭化水素基の炭素数（直鎖脂肪族炭化水素基が置換されている場合には、置換基を除いた直鎖脂肪族炭化水素基部分の炭素数）は、１〜２０であり、好ましくは１〜１２であり、より好ましくは１〜８であり、更に好ましくは１〜６であり、更に好ましくは１〜５であり、更に好ましくは１〜４であり、更に好ましくは１〜３であり、特に好ましくは１又は２である。
【００１１】
飽和の直鎖脂肪族炭化水素基、すなわち、直鎖アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、又はｎ−ペンチル基を挙げることができる。不飽和の直鎖脂肪族炭化水素基としては、例えば、直鎖アルケニル基又は直鎖アルキニル基を挙げることができる。前記直鎖アルケニル基としては、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、又は２−プロペニル基を挙げることができる。前記直鎖アルキニル基としては、例えば、エチニル基、１−プロピニル基、又は２−プロピニル基を挙げることができる。
【００１２】
飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基の水素原子と置換可能な置換基としては、例えば、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、又はヨウ素原子）、水酸基、エーテル基、アミノ基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、又は複素環式環基を挙げることができる。
【００１３】
飽和の脂環式炭化水素基（すなわち、シクロアルキル基）又は不飽和の脂環式炭化水素基の炭素数（すなわち、環構成炭素数）は、３〜２０であり、好ましくは３〜１２であり、より好ましくは３〜８であり、更に好ましくは３〜６である。
芳香族炭化水素基の炭素数（すなわち、環構成炭素数）は、６〜１５であり、好ましくは６〜１０であり、より好ましくは６〜８である。
【００１４】
複素環式環基とは、窒素原子、酸素原子、及び／若しくはイオウ原子１又はそれ以上が介在する３〜１０員（好ましくは４〜８員、より好ましくは５〜６員）の飽和若しくは非飽和の環状炭化水素基（以下、ヘテロ環基と称する）、又はそのオキソ誘導体、あるいは、前記ヘテロ環基又はそのオキソ誘導体とベンゼン環１又はそれ以上とからなるベンゾ縮合ヘテロ環を意味する。
【００１５】
飽和若しくは不飽和の脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、又は複素環式環基の水素元素と置換可能な置換基としては、例えば、炭素数１〜４（好ましくは炭素数１〜２、より好ましくは炭素数１）の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基（例えば、アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基）、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、又はヨウ素原子）、水酸基、エーテル基、アミノ基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基、又は複素環式環基を挙げることができる。
【００１６】
置換されていることのある（すなわち、非置換又は置換の）芳香族炭化水素基、複素環式環基、又は飽和若しくは不飽和の脂環式炭化水素基としては、これに限定されるものではないが、非置換のフェニル基、非置換の５若しくは６員の複素環式環基、又は非置換の環構成炭素数５若しくは６の脂環式炭化水素基、あるいは、炭素数１〜４のアルキル基、ハロゲン原子、水酸基、エーテル基、及びアミノ基からなる群から選んだ置換基（より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、更に好ましくはメチル基又はエチル基、特に好ましくはメチル基）１若しくはそれ以上（更に好ましくは１又は２、特に好ましくは１）で置換された、フェニル基、５若しくは６員の複素環式環基、又は環構成炭素数５若しくは６の脂環式炭化水素基が好ましく、非置換のフェニル基、又は前記置換基（より好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、更に好ましくはメチル基又はエチル基、特に好ましくはメチル基）１若しくはそれ以上（更に好ましくは１又は２、特に好ましくは１）で置換されたフェニル基がより好ましい。
【００１７】
本発明のプテリン誘導体は、以下に限定されるものではないが、例えば、本発明の製造方法により合成することができる。本発明の製造方法では、例えば、反応式（１）：
【化４】
2006248964.tif 000005
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味である）に基づいて、前記一般式（Ｉａ）で表されるプテリン誘導体［すなわち、前記一般式（Ｉ）においてＲ２が水素原子であるプテリン誘導体］を合成することができる。すなわち、式（II）で表される６−ホルミル−プテリンと、一般式（III）で表される酸塩化物とを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中において、三級アミンの存在下で反応させることができる。
【００１８】
あるいは、本発明の製造方法では、例えば、反応式（２）：
【化５】
2006248964.tif 000006
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味である）に基づいて、前記一般式（Ｉｂ）で表されるプテリン誘導体［すなわち、前記一般式（Ｉ）においてＲ２がメチル基であるプテリン誘導体］を合成することができる。すなわち、式（II）で表される６−ホルミル−プテリンと、一般式（III）で表される酸塩化物とを、ジメチルアセトアミド中において、三級アミンの存在下で反応させることができる。
【００１９】
本発明の製造方法では、反応試剤を兼ねた溶媒としてジメチルホルムアミド又はジメチルアセトアミドを使用することができる。また、三級アミンとしては、例えば、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、又はトリエチルアミン等を用いることができる。
本発明の製造方法では、６−ホルミル−プテリン（II）１ｍｍｏｌに対して、通常、酸塩化物（III）１〜１０ｍｍｏｌ（好ましくは３〜４ｍｍｏｌ）、三級アミン（例えば、ＤＩＥＡ）１．５〜１５ｍｍｏｌ（好ましくは４〜５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ又はジメチルアセトアミド３〜１５ｍＬ（好ましくは４〜７ｍＬ）を使用することができる。
本発明の製造方法は、通常、５〜１００℃、好ましくは１５〜３０℃で実施することができる。また、この場合の反応時間は、通常、３０分間〜８時間、好ましくは１〜３時間であることができる。本発明の製造方法で得られた一般式（Ｉ）で表される化合物は、常法により、単離・精製することができる。
【００２０】
本発明のプテリン誘導体は、例えば、光線力学的療法（Photodynamic Therapy; PDT）による癌治療に用いることができる。ＰＤＴは、光増感剤を全身投与又は局所投与することにより、破壊したい組織（例えば、癌組織）に取り込ませ、その組織に光照射を行うことで、癌組織などを特異的に破壊する療法である（Journal of the National Cancer Institute 1998;90:889-905）。ＰＤＴは、癌治療だけでなく、真菌又は細菌による皮膚疾患にも応用することができる。本発明のプテリン誘導体は、ＰＤＴにおける光増感剤として使用することができる。
【００２１】
本発明のプテリン誘導体を、光線力学的療法に用いる場合には、前記式（Ｉ）で表されるプテリン誘導体又はその薬剤学的に許容することのできる塩を、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特には、ヒト）に経口的に又は非経口的に投与することができる。
【００２２】
投与剤型としては、特に限定はなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤などの経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、ゼリー、ジェル、ペースト、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００２３】
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００２４】
非経口投与方法としては、クリーム又は軟膏等による局所投与、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分としてのプテリン誘導体の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤等を任意に用いることができる。
【００２５】
本発明のプテリン誘導体を適当な担体又は希釈剤と一緒に用いる場合には、これに限定されるものではないが、前記式（Ｉ）で表されるプテリン誘導体又はその薬剤学的に許容することのできる塩を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明のプテリン誘導体の投与量は、治療対象、ＰＤＴに用いる光線の種類及び照射条件、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などにより異なり、当業者が適宜決定することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２７】
表１に、以下の各製造実施例で合成した生成物［前記反応式（１）における一般式（Ｉａ）で表される本発明のプテリン誘導体］、その合成に用いた酸塩化物［反応式（１）における一般式（II）で表される化合物］、及びその収率をまとめた。また、表２に、各生成物及び６−ホルミル−プテリン（比較用）の水に対する溶解度（すなわち、水に直接溶解した場合の溶解度）をまとめた。
【００２８】
【表１】
2006248964.tif 000007
【００２９】
【表２】
2006248964.tif 000008
【００３０】
《製造実施例１：2-(N,N-ジメチルアミノメチレンアミノ)-6-ホルミル-3-ピバロイルプテリジン-4-オンの合成》
本実施例では、2-(N,N-ジメチルアミノメチレンアミノ)-6-ホルミル-3-ピバロイルプテリジン-4-オン［2-(N,N-Dimethylaminomethyleneamino)-6-formyl-3-pivaloylpteridine-4-one］の合成を行った。
具体的には、１００ｍＬなす型二口フラスコに６−ホルミル−プテリン１．０ｍｍｏｌ（１９１．１ｍｇ）を加え、Ｎ２で置換した。更に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）６ｍＬ及びＤＩＥＡ（N,N-diisopropylethylamine）４．５ｍｍｏｌ（７８０μＬ）を加え、そこに塩化ピバロイル３．５ｍｍｏｌ（４３０μＬ）をゆっくり滴下してＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、溶媒を留去した。生成物をクロロホルムに溶解してシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてクロロホルム：メタノール＝９９：１）で単離した後、へキサンで洗浄したところ、標記化合物を黄色の粉末状の生成物（収率９５％）として得た。
【００３１】
１H-NMR (600 MHz, CDCl3): 10.21 (1H, s, CHO), 9.32 (1H, s, 7-H), 9.02 (1H, s, NCHN), 3,29 (3H, s, CH3), 3.18 (3H, s, CH3), 1.43 (9H, s, tBu).
13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 191.1, 183.8, 160.5, 159.7, 157.9, 157.8, 148.9, 143.1, 130.3, 44.1, 42.2, 36.2, 27.9.
IRスペクトル (NaCl, cm-1): 1766, 1693, 1639.
【００３２】
《製造実施例２：2-(N,N-ジメチルアミノメチレンアミノ)-6-ホルミル-3-イソブチリルプテリジン-4-オンの合成》
本実施例では、2-(N,N-ジメチルアミノメチレンアミノ)-6-ホルミル-3-イソブチリルプテリジン-4-オン［2-(N,N-Dimethylaminomethyleneamino)-6-formyl-3-isobutyrylpteridine-4-one］の合成を行った。
具体的には、１００ｍＬなす型二口フラスコに６−ホルミル−プテリン１．０ｍｍｏｌ（１９２．０ｍｇ）を加え、Ｎ２で置換した。更に、ＤＭＦ６ｍＬ及びＤＩＥＡ４．５ｍｍｏｌ（７８０μＬ）を加え、そこに塩化イソブチリル３．５ｍｍｏｌ（４３０μＬ）をゆっくり滴下してＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、溶媒を留去した。生成物をクロロホルムに溶解してシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてクロロホルム：メタノール＝９９：１）で単離した後、へキサンで洗浄したところ、標記化合物を黄色の粉末状の生成物（収率８８％）として得た。
【００３３】
１H-NMR (600 MHz, CDCl3): 10.22 (1H, s, CHO), 9.32 (1H, s, 7-H), 9.00 (1H, s, NCHN),  3.29 (3H, s, CH3), 3.21 (1H, m, CH), 3.16 (3H, s, CH3), 1.37 (6H, d, iPr).
13C-NMR (150 MHz, CDCl3): 191.1, 180.1, 160.4, 159.4, 157.9, 157.7, 148.8, 143.1, 130.5, 42.0, 40.3, 35.9, 18.3.
IRスペクトル (NaCl, cm-1): 1778, 1697, 1643.
【００３４】
《製造実施例３：2-(N,N-ジメチルアミノメチレンアミノ)-6-ホルミル-3-o-トルオイルプテリジン-4-オンの合成》
本実施例では、2-(N,N-ジメチルアミノメチレンアミノ)-6-ホルミル-3-o-トルオイルプテリジン-4-オン［2-(N,N-Dimethylaminomethyleneamino)-6-formyl-3-o-toluoylpteridine-4-one］の合成を行った。
具体的には、１００ｍＬなす型二口フラスコに６−ホルミル−プテリン１．０ｍｍｏｌ（１９０．１ｍｇ）を加え、Ｎ２で置換した。更に、ＤＭＦ６ｍＬ及びＤＩＥＡ４．５ｍｍｏｌ（７８０μＬ）を加え、そこに塩化ｏ−トルオイル３．５ｍｍｏｌ（４３０μＬ）をゆっくり滴下してＮ２雰囲気下、室温で２時間撹拌しながら反応させた。反応終了後、溶媒を留去した。生成物をクロロホルムに溶解してシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてクロロホルム：メタノール＝９９：１）で単離した後、へキサンで洗浄したところ、標記化合物を黄色の粉末状の生成物（収率５２％）として得た。
【００３５】
１H-NMR (600MHz, CDCl3): 10.23 (1H, s, CHO), 9.34 (1H, s, 7-H), 8.94 (1H, s, NCHN), 7.59 (1H, d, Ph), 7.48 (1H, t, Ph), 7.37 (1H, d, Ph), 7.23 (1H, t, Ph), 3.20 (3H, s, CH3), 2.88 (3H, s, CH3), 2.77 (3H, s, PhCH3).
13C-NMR (150MHz, CDCl3): 191.2, 168.7, 160.7, 159.2, 158.1, 158.0, 148.9, 143.1, 142.5, 133.7, 132.2, 131.2, 131.1, 130.6, 126.4, 41.9, 35.6, 21.9.
IRスペクトル (NaCl, cm-1): 1743, 1695, 1633.
【００３６】
《実施例１：本発明のプテリン誘導体を用いた光線力学的療法（ＰＤＴ）による細胞死の評価》
本実施例では、以下に示す手順に従って、製造実施例１で合成した2-(N,N-ジメチルアミノメチレンアミノ)-6-ホルミル-3-ピバロイルプテリジン-4-オン（以下、ＢＤＦＰと称する）のヒト膵臓癌細胞株に対する作用を、蛍光試薬及び共焦点レーザー顕微鏡を用いて評価した。なお、比較のために、６−ホルミル−プテリン（以下、６ＦＰと称する）を使用した。６ＦＰは、ＢＤＦＰと比較して、水溶性が低い化合物である。
【００３７】
まず、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ１（ATCC: CRL-1469）を４ウェルチャンバースライドに１ウェル当たり１Ｘ１０５細胞になるように撒いた後、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータ内にて一晩培養した。なお、培地としては、ダルベッコ修飾イーグル培地［Dulbecco’s modified Eagle’s medium（ＤＭＥＭ）］を使用した。続いて、各ウェルに、ＢＤＦＰ又は６ＦＰの水溶液（培養時の最終濃度として、０．１、０．２５、０．５、１、又は２ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加し、更に４時間培養した。なお、６ＦＰ水溶液は、一旦アルカリ条件下で溶解した後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でｐＨを中性に調整することにより調製した。培地を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＤＭＥＭ培地を添加し、波長３６０ｎｍの紫外線を１時間照射した。
【００３８】
紫外線照射前のＢＤＦＰ又は６ＦＰの細胞内への取り込みは、プテリジン骨格に由来する自家蛍光を利用して、励起波長４０５ｎｍ及び蛍光波長４５０／３５ｎｍで蛍光（青色）を測定することにより評価した。紫外線照射の終了直後の細胞内一重項酸素の蓄積は、市販の蛍光試薬（Singlet Oxygen Sensor Green Reagent; Molecular Probes社）を用いて、励起波長４８８ｎｍ及び蛍光波長５１５／３０ｎｍで蛍光（緑色）を測定することにより評価した。紫外線照射から２４時間経過後の細胞死の有無は、市販の蛍光試薬［Calcein AM（生細胞用）, Ethidium homodimer-1（死細胞用）; Molecular Probes社］を用いて、生細胞については励起波長４８８ｎｍ及び蛍光波長５１５／３０ｎｍで蛍光（緑色）を、死細胞については励起波長５４３ｎｍ及び蛍光波長６０５／７５ｎｍで蛍光（赤色）を測定することにより評価した。また、細胞死については、ミトコンドリアの活性、すなわち、細胞の生理活性を反映するＭＴＴ［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；Nacalai, Kyoto, Japan］活性の測定も実施した。
【００３９】
共焦点レーザー顕微鏡を用いて得られたＢＤＦＰに関する結果をモノクローム（白黒）写真として図１に示す。また、ＭＴＴ活性に関する結果を図２に示す。
図１において、列（Ａ）は、ＢＤＦＰの細胞内への取り込み（青色蛍光）を示し、列（Ｂ）は、紫外線照射直後の細胞内一重項酸素の蓄積（緑色蛍光）を示し、列（Ｃ）は、紫外線照射から２４時間経過後の生細胞（緑色蛍光）及び死細胞（赤色蛍光）の有無を示し、左端の数値は、ＢＤＦＰの濃度を示す。
【００４０】
また、図２において、レーン１〜レーン６は、６ＦＰを用いた場合の結果（レーン１：無添加、レーン２：０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン３：０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン４：０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン５：１ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン６：２ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、レーン７〜レーン１２は、ＢＤＦＰを用いた場合の結果（レーン７：無添加、レーン８：０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン９：０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン１０：０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン１１：１ｍｍｏｌ／Ｌ、レーン１２：２ｍｍｏｌ／Ｌ）である。図２の縦軸の数値は、ＭＴＴ活性［単位＝ＯＤ（optical density）］を示す。
【００４１】
ＢＤＦＰの細胞内への取り込みについては、図１の列（Ａ）に示すとおり、ＢＤＦＰを添加しなかった場合（ＢＤＦＰ濃度＝０ｍｍｏｌ／Ｌ）には、青色蛍光が認められなかったのに対して、ＢＤＦＰを添加した場合（ＢＤＦＰ濃度＝０．２５、０．５、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ）には、その添加濃度に従って、青色蛍光量の増加が認められた。すなわち、ＢＤＦＰは、細胞内に取り込まれることが判明した。なお、図１の列（Ａ）では、青色蛍光は、灰色（弱い青色蛍光）又は白色（強い青色蛍光）として示される。
【００４２】
細胞内一重項酸素の蓄積を示す図１の列（Ｂ）では、ＢＤＦＰを添加しなかった場合（ＢＤＦＰ濃度＝０ｍｍｏｌ／Ｌ）でも、多少の緑色蛍光が認められたが、ＢＤＦＰを添加した場合（ＢＤＦＰ濃度＝０．２５、０．５、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ）には、その添加濃度に従って、緑色蛍光量の増加が認められた。すなわち、ＢＤＦＰを取り込んだ細胞では、紫外線照射により細胞内一重項酸素の蓄積が認められ、その蓄積量は、細胞内に取り込まれたＢＤＦＰ量と正の相関を示した。なお、図１の列（Ｂ）では、緑色蛍光は、灰色（弱い緑色蛍光）又は白色（強い緑色蛍光）として示される。
【００４３】
細胞の生死を示す図１の列（Ｃ）では、ＢＤＦＰを添加しなかった場合（ＢＤＦＰ濃度＝０ｍｍｏｌ／Ｌ）には、全ての細胞が、緑色蛍光を示す生細胞であった。ＢＤＦＰ濃度が０．２５ｍｍｏｌ／Ｌの場合には、数個の死細胞（赤色蛍光）が認められたが、ほとんどの細胞は生細胞（緑色蛍光）であった。ＢＤＦＰ濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌの場合には、数個の生細胞が認められた以外は、ほとんどの細胞は死細胞であった。ＢＤＦＰ濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌの場合には、全ての細胞が死細胞であった。なお、図１の列（Ｃ）では、緑色蛍光は、灰色（弱い緑色蛍光）又は白色（強い緑色蛍光）として示され、赤色蛍光は、灰色（弱い赤色蛍光）又は白色（強い赤色蛍光）として示される。
【００４４】
以上、図１に示す結果より、ＢＤＦＰの濃度が増すほど、細胞内への取り込みと一重項酸素の蓄積が増え、それに付随して細胞死が惹起されていることが判明した。
【００４５】
ＭＴＴ活性については、ＢＤＦＰを用いた場合には、図２（レーン７〜レーン１２）に示すとおり、ＢＤＦＰの濃度が増すほど、ＭＴＴ活性が低下しており、細胞死が増加していることを示している。一方、水溶性の低い６ＦＰでは、図２（レーン１〜レーン６）に示すとおり、６ＦＰの濃度が増しても、ＭＴＴ活性に変化はなく、細胞への取り込み効率が低いことを示している。
以上、本発明の新規プテリン誘導体であるＢＤＦＰは、水溶性の低い６ＦＰと比較して、細胞への取り込み効率に優れており、更に、紫外線照射により癌細胞を破壊することが可能であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のプテリン誘導体は、光線力学的療法（ＰＤＴ）の用途に適用することができる。前記ＰＤＴは、例えば、癌治療、又は真菌若しくは細菌による皮膚疾患の治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＢＤＦＰを用いた光線力学的療法（ＰＤＴ）による細胞死の結果を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図２】ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ１におけるＢＤＦＰ又は６ＦＰのＭＴＴ活性を示すグラフである。
【図１】
2006248964.tif 000013
【図２】
2006248964.tif 000014