(57)【要約】      （修正有）【課題】目的のひとつは、炎症に至る初期の過程を最小にする方法を提供することである。また、初期過程に対応する薬剤組成を提供することである。【解決手段】炎症前及び炎症中の初期過程をコントロールするＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン（ＴＭＳ），その誘導体、およびその機能的類似体を使用することによって達成される。もう一つの具現的応用例においてはＴＭＳ，その誘導体とアナログは脂質小胞体及びリポゾーム中に含ませて使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリメチルスフィンゴシン又はその誘導体の示すシグナル矯正活性を利用した炎症の治療法又は予防法。
【請求項２】
トリメチルスフィンゴシンによる内皮細胞のシグナル誘導作用を利用し、セレクチンの発現を介する好中球の炎症巣への移動を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、炎症における初期の情報伝達を阻害することが発見された化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
炎症は、不幸にも白血球浸潤、局所循環障害、組織破壊、浮腫などを伴う複雑な過程である。細胞性及び体液性要素が炎症の過程に含まれることはよく知られているが、どの細胞或いは化合物がどのような特異的役割を演じているかについての合意は得られていない。現在の治療法は炎症症状と炎症のメディエータに対して行われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の要約
本発明の目的のひとつは、炎症に至る初期の過程を最小にする方法を提供することである。本発明のもう一つの目的は炎症における初期過程に対応する薬剤組成を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
これらの目的は、炎症前及び炎症中の初期過程をコントロールするＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン（ＴＭＳ），その誘導体、およびその機能的類似体を使用することによって達成される。もう一つの具現的応用例においてはＴＭＳ，その誘導体とアナログは脂質小胞体及びリポゾーム中に含ませて使用する。
【０００５】
１つの実施形態において、本発明は、以下の項を提供する：
項１．トリメチルスフィンゴシン又はその誘導体の示すシグナル矯正活性を利用した炎症の治療法又は予防法；
項２．トリメチルスフィンゴシンによる内皮細胞のシグナル誘導作用を利用し、セレクチンの発現を介する好中球の炎症巣への移動を抑制する方法。
【０００６】
発明の詳細な説明
炎症過程における最初の変化のひとつは白血球が炎症巣に浸潤することである。例えば、好中球が循環系から炎症巣に集められる。その場合好中球は細網血管内壁に接着する。この過程は血管内皮細胞上のＩＣＡＭあるいはＶＣＡＭが好中球上のそれぞれのリガンド（ＣＤ１８など）と結合することにより仲介される。この接着過程はゆっくり進行し約２０分以上の時間をかけて起こる。接着後、好中球は血管壁を通過して組織炎症巣に浸潤する。そのほかに、内皮細胞による好中球の初期認識には他の知見も知られている。この過程は速やかにおこなわれ、例えばＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンとＳＬｅＸやミエログリカンのようなリガンドによって仲介される。それ故、好中球の初期集積を妨げる手段としては１）ＩＣＡＭ／ＶＣＡＭとＣＤ１８の相互作用の阻止２）セレクチンとＳＬeXあるいはミエログリカンとの相互作用の阻止がある。これらの手段としてＣＤ１８，セレクチンあるいはＳＬeＸに対する抗体が使用されてきた。
【０００７】
我々の発明はＴＭＳを用いて好中球の集積を阻止する方法に関する。従来知られている過程および阻止の方法は緩慢なプロセスに依存しているのに対してＴＭＳによる抗炎症作用は極めて速やか、かつ微量で効果がみられる。例えば、ラット抗中球を、腸間膜細網血管における好中球接着を促進する酸化剤であるＮ6-ニトロ−Ｌ−アルギニン−メチルエステル（L-NAME）に暴露すると接着する細胞数は２時間に亘って増加する。しかしながら、Ｌ−ＮＡＭＥとＴＭＳ１５ug/kgを加えた系では接着した白血球数はコントロール群と同レベルであった。Ｐ−セレクチンを染める染色剤で細網血管を染色するとＬ−ＮＡＭＥに暴露した細網血管の半数がＰ−セレクチンを発現した。一方、５０uMのＬ−ＮＡＭＥと１８ug/kgのTMSを暴露した細網血管ではコントロール群と同量のP-セレクチンしか発現しなかった。即ち、P-セレクチンの発現量は１０％以下であり、L-NAMEにもTMSにも暴露していない場合と同レベルであった。TMSは水溶性であり、とくに生理的ｐHにおいてそうである。TMSはD体、L体、あるいはエリスロ体、スレオ体を問わない。更に、再灌流障害を治療するのに有用な等価構造を有する構造を生じさせる種々の修飾をＴＭＳに対してすることができる。例えば、再灌流障害の治療に用いられる等価構造をもつ適当な誘導体、アナログ、変異体としては米国特許６０３１１３５に開示されているものを含む。徹底的メチル化によるスフィンゴシンの直接四級アミン化が実施可能である。また、ＴＭＳは米国特許６０３１１３５に開示したように商業的に利用可能な未置換体から合成することができる。炎症の初期過程を修飾する有益な性質を保ちながら、延長された半減期など他の望ましい特長を持つよう、既知の方法と薬理学的原理を駆使してＴＭＳを修飾することができる。例えば多くのプロドラッグは活性化合物のエステルであることが知られている。ＴＭＳ誘導体の作成法は米国特許６０３１１３５に開示されている。本発明は、人及び動物における炎症の初期過程を修飾するための薬剤および治療法を提供するものであり、治療的有効量のＴＭＳおよびその治療的類似体、あるいはその薬剤的に許容される塩、および薬剤的に許容されるキャリア、希釈剤、あるいは賦形剤からなる。
【０００８】
本発明の医薬品の適量は疾患の重症度、個人の体重や年齢、体内循環時の半減期などにより左右されるが、当該分野の専門家により容易に決めることができる。投与回数、一日用量、投与ルート、投与レジメは個人により異なるかもしれない。例えば動物実験において、ＴＭＳは５−４０ug/kgの低用量、より好ましくは７−３０ug/kgの低用量、さらにより好ましくは１０−２０ug/kgの低用量で有効である。ＴＭＳは経口、注射、局所投与等種々の投与ルートで投与できるが、より好ましくは特定の部位に到達させるために静脈内内投与が望ましい。ＴＭＳはステントなどの医療用具の成分として留置できる。本発明の医薬品のためのキャリア、希釈剤、賦形剤は投与形態等により異なるが、当該分野の専門家により容易に決定できる。そのような業界に知られた賦形剤、充填剤等には崩壊剤、結合剤、潤滑剤、表面活性剤、乳化剤、湿潤剤、溶解剤、保存剤が含まれる。当該分野の専門家は、ＴＭＳを含む薬剤組成を例えば”グッドマンとギルマン著、治療の薬理学的基礎”（第６版、グッドマンら著、マクミラン出版社、ニューヨーク、１９８０年）を参照して作ることができる。ＴＭＳ製剤は錠剤、カプセル、大量あるいは投与単位の粉末あるいは顆粒として投与可能である。また、ＴＭＳはリポゾーム内に含ませることができる。リポゾームとしては大きな単層リポゾーム、多層リポゾーム、及びＴＭＳ水溶液を保持できるいかなる脂質も含まれる。またこの薬剤は溶液、乳化液、懸濁液、軟膏、ペースト、クリーム、ゲル、泡あるいはゼリーであってもよい。ＴＭＳ投与による治療は他の薬剤と組み合わせてもよい。例えば、ＴＭＳによる治療は好中球のインテグリン受容体とＩＣＡＭまたはＶＣＡＭとの結合を阻害する化合物による治療と組み合わせてもよい。リポゾームの調製法としては、例えばゾーカ他著、アニュアルレビュー・オブ・バイオフィジックス・アンド・バイオエンジニアリング、９巻、４６７頁（１９８０年）、米国特許４１８６１８３，４２１７３４４，４２３５８７１，４２６１９７５，４４８５９５４，４５０１７２８，４７７４０８５，４８３７０２８，４９４６７８７，PCT出願番号WO９１／１７４２４，ゾーカとパパハドポラス著、米国科学アカデミー紀要７５巻、４１９４−４１９８頁（１９７８年）、ディーマーとバンガム著、バイオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、８１２巻、５５−６５頁（１９８５年）、マイヤー他著、ビオヒミカ・バイオフィジカ・アクタ、８５８巻、１６１−１６８頁（１９８６年）、ウイリアムズ他著、米国科学アカデミー紀要、８５巻、２４２−２４６頁（１９８８年）、オステロ編、リポゾーム、第１章（１９８３）、ホープ他著、リポゾームの化学と物理、４０巻、８９頁（１９８６）などに述べられている種々の方法が利用できる。また、最近のリポゾーム調製法の進歩により、通常条件で作製したリポゾームを圧力下に一定の直径の穴を持つポリカーボネート膜を繰り返し通過させて作成した均一な径を有するリポゾームが優れた薬剤効果を示すことが明らかにされているので、TMSリポゾームもこの加圧濾過法により作ることが望ましい。即ち、フォスファチディルエタノールアミン、コレステロール、TMSを適当な比率に混合し、クロロホルムーメ���ノール溶液に溶解し、減圧乾固させ、PBS中で多層リポゾームを作製する。これを適当な大きさの穴を持つ膜を順次通過させて均一な径を持つTMS-リポゾームを作製する。この操作には例えばライペックス・バイオメンブレイン社（カナダ）やランダ・ブリンクマン・インストルメント社の装置等を用いて行うことができる。
【実施例】
【０００９】
ウサギの耳を用い、血流循環障害を起こさせ，次いで血流循環再開によりおきる耳組織の炎症状態を観察する方法は組織再灌流障害のモデルとして広く薬剤効果を判定する方法として用いられてきた（ベダー他、米国科学アカデミー紀要、８７巻、２６４３−２６４６頁（１９９０年）。ＣＤ１８インテグリンに対する抗体、ＳＬeX、抗セレクチン抗体の作用などは何れもこのモデルを用いて、ＣＤ１８，セクレチン、ＳＬeXなどが炎症の過程で重要であることが示されてきた。ＴＭＳの抗炎症作用は上述の抗体やＳＬeXの作用より顕著であることが示された（ヴェダー、五十嵐、箱守ら、未発表）。ウサギの耳を無菌状態で中央動脈、中央静脈、知覚神経のみを残し根元から切断し、中央動脈をクリップで閉鎖し、耳組織は縫合する。中央動脈遮断は６時間で止め、血流を再開する。この操作によりウサギ耳の全体が循環不全になり、再灌流により強い炎症作用、組織壊死、浮腫を起こし、そのまま放置すれば耳の脱落も起きる（図１左）。ウサギの静脈に体重１KgあたりＴＭＳ７５ugを投与した場合には炎症性変化は全く消失し殆ど正常と同じ様相を示す（図１右）。ＴＭＳの強い抗炎症作用は繰り返し行われた実験でも確かめられてきたが、その場合の組織像も大きな相違を示した。ＴＭＳ投与例では血管を中心とした結合組織も全く正常で炎症像を示していないが（図２右）、ＴＭＳを投与しない例では白血球浸潤、結合組織の破壊像がはっきり認められた（図２左）。ウサギ耳切断と中央動脈遮断６時間後、動脈再灌流と同時にＰＢＳ（コントロール、ｎ＝７）またはＴＭＳ（７５ug/Kg、１時間点滴投与、ｎ＝７）またはＴＭＳ（同量、１０時間点滴投与、ｎ＝７）を投与した場合の耳の体積変化を図３に示す。ＴＭＳ投与は明らかにＰＢＳ投与に比べて耳体積の減少を示した。以上の７例のウサギ耳組織の虚血領域と壊死領域の比を図４に示した。ＴＭＳ投与例では壊死領域の明らかな減少を示した（ｐ＜０．０５）。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はウサギ耳再灌流障害モデルにおける浮腫及び壊死を含む炎症性変化に対するＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルスフィンゴシン（ＴＭＳ）の抑制効果を示す。
【図２】図２はウサギ耳再灌流障害モデルにおけるＴＭＳの効果を組織染色図で示す。
【図３】図３はウサギ耳再灌流障害モデルにおける浮腫による耳体積に対するＴＭＳの抑制効果を示す。
【図４】図４は壊死の大きさに対するＴＭＳの効果を虚血領域に対する比率で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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