(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＲＮＡの塩基部、糖部、リン酸ジエステル部などを大きく損傷することなく、２’−Ｏ−シアノエチルヌクレオシドからシアノエチル基を除去する手段を提供する。【解決手段】    一般式（Ｉ）：2006248929.tif 000011〔式中、Ｘ，Ｙは水素原子などを表し、Ｂは核酸塩基の残基を表す。〕で表される２’水酸基を保護したリボヌクレオシド誘導体などを、フッ素を含む化合物又は塩基性化合物と反応させ、リボヌクレオシドなどに変換する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2006248929.tif 000008
〔式中、Ｘは水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｙは水素原子、水酸基の保護基、又は一般式（III）：
【化２】
2006248929.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なるアルキル基、もしくはＲ１とＲ２が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表わし、Ｒ３はリン酸基の保護基を表す。）
で表される基を表し、Ｂは核酸塩基の残基を表す。〕
で表される２’水酸基を保護したリボヌクレオシド誘導体又はこのリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含むＲＮＡ誘導体を、フッ素を含む化合物又は塩基性化合物と反応させ、一般式（II）：
【化３】
2006248929.tif 000010
〔式中、Ｘ、Ｙ及びＢは前記と同意義を示す。〕
で表されるリボヌクレオシド又はこのリボヌクレオシドを構成単位として含むＲＮＡに変換することを特徴とする２’水酸基の脱保護方法。
【請求項２】
フッ素を含む化合物が、テトラアルキルアンモニウム  フルオリドであることを特徴とする請求項１記載の２’水酸基の脱保護方法。
【請求項３】
テトラアルキルアンモニウム  フルオリドが、テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム  フルオリドであることを特徴とする請求項２記載の２’水酸基の脱保護方法。
【請求項４】
塩基性化合物が、アンモニア、一級アミン、二級アミン、三級アミン、又はアミジン化合物であることを特徴とする請求項１記載の２’水酸基の脱保護方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアノエチル基で保護されたリボヌクレオシドの２’水酸基を脱保護する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的に合成したＲＮＡはリボザイム、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸などの機能性核酸および核酸医薬素材として有用である（ネーチャー  レビュー  ドラッグ  ディスカバリー  ３号  ３１８  ２００４）。ＲＮＡを化学合成するにはその合成工程において、２’水酸基の適切な保護と合成終了後の脱保護が重要である。
【０００３】
現在汎用されているＲＮＡ合成法では２’水酸基の保護基として四級ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）が用いられている（ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  
ソサエティー  引用文献  ９９号  ７７４１  １９７７）。しかし、この保護基はその化学的安定性が十分ではなく、２’水酸基にＴＢＤＭＳ基を導入後、３’水酸基を遊離の状態にすると、ＴＢＤＭＳ基が２’位から３’位へと転位し、２’−ＴＢＤＭＳヌクレオシドと３’−ＴＢＤＭＳヌクレオシドの混合物となることが知られている(ヌクレイックアシッズリサーチ  １８号  ５４３３  １９９０）。またＴＢＤＭＳ基は嵩高い保護基であるため、隣接する３’水酸基と、他のヌクレオシド残基の５’水酸基との間にリン原子を介してインターヌクレオチド結合を形成する反応を立体的に阻害し、インターヌクレオチド結合反応の収率低下や必要反応時間の増大などの問題を有する（ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサエティー  引用文献  １０９号  ７８４５  １９８７）。
【０００４】
一方、これらの問題点を克服しうる保護基としてトリイソプロピルシリルオキシメチル基（ヘルベチカ  ８４号  ３７７３  ２００１）が報告されている。この保護基は上述するＴＢＤＭＳ基の転位の問題や、立体障害の問題を克服しているとされているが、保護基を２’水酸基に選択的に導入する手法が開発されていないため、２’保護ヌクレオシドを合成する段階で、副生する３’保護ヌクレオシドを煩雑なカラムクロマトグラフィーにより分離する必要がある。また、アルキルスズ化合物を用いて保護基を導入するため毒性のほか残留金属への懸念が予想される。
【０００５】
また、ＴＢＤＭＳ基の開発以降に開発された保護基として、ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル基（ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサエティー  １２０号  １１８２０  １９９８）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（テトラへドロンレタース  ４５号  ９５２９  ２００４）が報告されているが、いずれも２’水酸基に直結する炭素原子上にふたつの置換基を有する構造であるため立体障害が高いと予想される、また保護基導入試薬を別途合成する必要があり、合成工程が多い点が最大の問題である。
【０００６】
ところで、本発明者らは、以前、リボヌクレオシドの２’水酸基にシアノエチル基を導入した２’−Ｏ−シアノエチルヌクレオシドについて報告を行っている（非特許文献１）。
【０００７】
【非特許文献１】ヌクレイック  アシッド  リサーチ  シンポジウム  シリーズ  ４８号、１３−１４ページ  ２００４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＲＮＡ合成の際のリボヌクレオシドの２’水酸基の保護基としては、１）安価な原料を用いて導入可能であること、２）適当に保護したヌクレオシドを用いて２’水酸基に選択的に導入可能であること、３）立体障害が少なくなるよう２’水酸基に直結する炭素上に置換基をひとつしか有しないこと、４）ホスホロアミダイト法を用いたＲＮＡ化学合成の各工程で用いられる化学反応に対して安定であること、５）ＲＮＡ化学合成の最終段階で、合成したＲＮＡの塩基部、糖部、リン酸ジエステル部などを大きく損傷することなく脱保護可能であることなどの条件が求められる。以前報告した２’−Ｏ−シアノエチルヌクレオシドのシアノエチル基は、上記１）〜４）の条件を満たしているが、５）の条件を満たす脱保護方法が確立されていなかった。本発明の目的は、ＲＮＡの塩基部、糖部、リン酸ジエステル部などを大きく損傷することなく、２’−Ｏ−シアノエチルヌクレオシドからシアノエチル基を除去する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、２’−Ｏ−シアノエチルヌクレオシドを含むＲＮＡの脱保護に際し、テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム  フルオリドなどを用いることにより、ＲＮＡの塩基部、糖部等を損傷させることなく、脱保護可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（４）を提供するものである。
【００１１】
（１）一般式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
2006248929.tif 000002
〔式中、Ｘは水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｙは水素原子、水酸基の保護基、又は一般式（III）：
【００１３】
【化２】
2006248929.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なるアルキル基、もしくはＲ１とＲ２が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表わし、Ｒ３はリン酸基の保護基を表す。）
で表される基を表し、Ｂは核酸塩基の残基を表す。〕
で表される２’水酸基を保護したリボヌクレオシド誘導体又はこのリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含むＲＮＡ誘導体を、フッ素を含む化合物又は塩基性化合物と反応させ、一般式（II）：
【００１４】
【化３】
2006248929.tif 000004
〔式中、Ｘ、Ｙ及びＢは前記と同意義を示す。〕
で表されるリボヌクレオシド又はこのリボヌクレオシドを構成単位として含むＲＮＡに変換することを特徴とする２’水酸基の脱保護方法。
【００１５】
（２）フッ素を含む化合物が、テトラアルキルアンモニウム  フルオリドであることを特徴とする（１）記載の２’水酸基の脱保護方法。
【００１６】
（３）テトラアルキルアンモニウム  フルオリドが、テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム  フルオリドであることを特徴とする（２）記載の２’水酸基の脱保護方法。
【００１７】
（４）塩基性化合物が、アンモニア、一級アミン、二級アミン、三級アミン、又はアミジン化合物であることを特徴とする（１）記載の２’水酸基の脱保護方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、ＲＮＡの塩基部、糖部、リン酸ジエステル部などを損傷することなく、シアノエチル基で２’水酸基が保護されたＲＮＡを脱保護できるようになる。これにより、効率的なＲＮＡの合成が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明の２’水酸基の脱保護方法は、一般式（Ｉ）：
【００２１】
【化４】
2006248929.tif 000005
で表される２’水酸基を保護したリボヌクレオシド誘導体又はこのリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含むＲＮＡ誘導体を、フッ素を含む化合物又は塩基性化合物と反応させ、一般式（II）：
【００２２】
【化５】
2006248929.tif 000006
で表されるリボヌクレオシド又はこのリボヌクレオシドを構成単位として含むＲＮＡに変換することを特徴とするものである。
【００２３】
一般式（Ｉ）及び（II）におけるＸは、水素原子又は水酸基の保護基を表す。水酸基の保護基としては、ヌクレオシドの５’水酸基や３’水酸基の保護に使われる一般的な保護基が使用でき、例えば、置換基を有していてもよいシリル基（例えば、tert-ブチルジフェニルシリル基）、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基などを用いることができる。また、Ｘは、Ｙは一体となって保護基を形成してもよい。このような一体となった保護基としては、例えば、１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン、ジ(t−ブチル）シランジイルなどの環状シリル基を挙げることができる。
【００２４】
一般式（Ｉ）及び（II）におけるＹは、水素原子、水酸基の保護基、又は一般式（III）：
【００２５】
【化６】
2006248929.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２は同一または異なるアルキル基、もしくはＲ１とＲ２が互いに結合してヘテロ原子を含んでもよい環を形成した基を表わし、Ｒ３はリン酸基の保護基を表す。）
で表される基を表す。水酸基の保護基は、前記と同じ保護基を用いることができる。一般式（III）におけるＲ１、Ｒ２としてはイソプロピル基などが挙げられ、Ｒ３としては２−シアノエチル基などを挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
一般式（Ｉ）及び（II）におけるＢは、核酸塩基の残基を表す。ここで、「核酸塩基」とは、生物の染色体ＤＮＡ，プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソーマルＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、核内小分子ＲＮＡなど、天然に存在する核酸に見出される全ての核酸塩基および、核酸の合成に使用可能な、置換基を有してもよいヘテロ芳香環全般を含む。代表的な核酸塩基としてはアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンなどを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。また、核酸塩基には保護基を有するものも含まれる。
【００２７】
なお、「一般式（Ｉ）で表される２’水酸基を保護したリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含むＲＮＡ誘導体」とは、一般式（Ｉ）におけるＸとＹを除いた式で表されるヌクレオシド誘導体の残基が、ＲＮＡ誘導体中に含まれるという意味である。「一般式（II）で表されるリボヌクレオシドを構成単位として含むＲＮＡ」もこれと同様の意味である。
【００２８】
フッ素を含む化合物はシアノエチル基を脱離させることのできるものであれば特に限定されず、テトラメチルアンモニウム  フルオリド、テトラエチルアンモニウム  フルオリド、テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム  フルオリドのようなテトラアルキルアンモニウム  フルオリドを例示できる。テトラアルキルアンモニウム  フルオリドの中では、テトラ（ｎ−ブチル）アンモニウム  フルオリド（ＴＢＡＦ）が特に好適である。
【００２９】
反応に用いるフッ素を含む化合物の量は特に限定されないが、例えば、テトラアルキルアンモニウム  フルオリドの場合、一般式（Ｉ）で表されるリボヌクレオシド誘導体等１モルに対し、１〜３０００モル程度使用するのが好ましい。
【００３０】
塩基性化合物もシアノエチル基を脱離させることのできるものであれば特に限定されず、アンモニア、一級アミン、二級アミン、三級アミン、アミジン化合物などを例示できる。これらの化合物の中では、アンモニアが好適である。
【００３１】
反応に用いる塩基性化合物の量も特に限定されないが、例えば、アンモニアの場合、一般式（Ｉ）で表されるリボヌクレオシド誘導体等１モルに対し、１〜３０００モル程度使用するのが好ましい。
【００３２】
上記反応は、水系溶媒を含んでもよい有機溶媒中で行う。有機溶媒と水系溶媒との体積比は特に限定されないが、０：１００〜１００：０とするのが好ましい。有機溶媒は反応を阻害しないものであれば特に限定されず、また、反応を阻害しない複数の有機溶媒同士を任意の体積比で混合した混合有機溶媒を用いてもよい。また水系溶媒としては水だけでなく任意の緩衝溶液を用いることができ、複数の緩衝溶液同士を任意の濃度で混合した混合緩衝溶液を用いてもよい。
【００３３】
反応温度は特に限定されないが、−７８℃〜１００℃の範囲内であることが好ましい。
【００３４】
なお、リボヌクレオシドの２’水酸基にシアノエチル基を導入し、２’−Ｏ−シアノエチルヌクレオシドを合成する方法は、例えば、ヌクレイック  アシッド  リサーチ  シンポジウム  シリーズ  ４８号、１３−１４ページ  ２００４年に記載されている。
【実施例】
【００３５】
凍結乾燥させた２’−Ｏ−シアノエチル化ウリジル酸二量体（０．５マイクロモル）を、ＴＢＡＦのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ、２００μｌ）に加え、ボルテックスを用いて溶解させた。室温で２４時間放置した後、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（３ｍｌ）で希釈して有機溶媒を減圧留去した。得られた残渣をＯＡＳＩＳ ＭＣＸ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを用いて試薬の残渣を取り除いた。脱保護されたウリジル酸二量体は、逆相ＨＰＬＣで分析し、その後、ホスホジエステラーゼＩ（０．１  Ｕ）及びアルカリホスファターゼ（１  Ｕ）を加え、３７度で２４時間酵素分解処理し、ウリジンを得た。
【００３６】
ウリジル酸二量体の逆相ＨＰＬＣのプロファイルを図１Ｂに示す。また、２’−Ｏ−シアノエチル化ウリジル酸二量体及びウリジンの逆相ＨＰＬＣのプロファイルもそれぞれ図１Ａ及び図１Ｃに示す。
【００３７】
図１Ａ及び図１Ｂに示すＨＰＬＣプロファイルの変化より、上記条件にて２−シアノエチル基の脱保護が完了していることが確認された。
【００３８】
また、図１Ｃに示すように、酵素分解処理物中にウリジンのみが観測されることより、塩基部、糖部に副反応を起すことなく、この脱保護が進行していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】２’−Ｏ−シアノエチル化ウリジル酸二量体（Ａ）、ウリジル酸二量体（Ｂ）、ウリジン（Ｃ）の逆相ＨＰＬＣのプロファイルを示す図。
【図１】
2006248929.tif 000012