(57)【要約】【課題】  対象物からの情報取得方法に関し、対象物の種類ごとに空間分解能の高い二次元分布像を得る情報取得方法を提供することである。【解決手段】  対象物を構成する構成物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得し、取得した質量情報に基づいて該構成物の分布状態に関する情報を得る情報取得方法であって、  該構成物のイオン化を促進するためにｐＨが６以下の水溶液を付与する工程と、  集束し、パルス化し、かつ走査可能なイオン、中性粒子、電子、並びに、集光し、パルス化し、かつ走査可能なレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて該構成物をイオン化し、該構成物を飛翔させる工程と、  該飛翔した構成物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する工程と、  該質量を有する構成物の分布状態に関する情報を得る工程と、を備えることを特徴とする情報取得方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物を構成する構成物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得し、取得した質量情報に基づいて該構成物の分布状態に関する情報を得る情報取得方法であって、
該構成物のイオン化を促進するためにｐＨが６以下の水溶液を付与する工程と、
集束し、パルス化し、かつ走査可能なイオン、中性粒子、電子、並びに、集光し、パルス化し、かつ走査可能なレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて該構成物をイオン化し、該構成物を飛翔させる工程と、
該飛翔した構成物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する工程と、
該質量を有する構成物の分布状態に関する情報を得る工程と、
を備えることを特徴とする情報取得方法。
【請求項２】
前記一次ビームが、集束し、パルス化し、かつ走査可能なイオンである請求項１に記載の情報取得方法。
【請求項３】
前記構成物がタンパク質である請求項１又は２に記載の情報取得方法。
【請求項４】
前記ｐＨが６以下の水溶液を付与する工程が、一回の処理であって、かつ、対象物の分布状態の保持が可能である請求項１〜３のいずれかに記載の情報取得方法。
【請求項５】
前記ｐＨが６以下の水溶液を付与する工程が、ピペッター又はインクジェットプリンターより吐出される液滴の対象物への滴下による付与処理、或いは該水溶液中への対象物の浸漬による付与処理である請求項４に記載の情報取得方法。
【請求項６】
前記ｐＨが６以下の水溶液が、トリフルオロ酢酸、塩酸、硝酸、フッ酸、酢酸及びギ酸の中のいずれかの物質を含む水溶液である請求項５に記載の情報取得方法。
【請求項７】
前記ｐＨが６以下の水溶液が、トリフルオロ酢酸を含む水溶液である請求項６に記載の情報取得方法。
【請求項８】
前記構成物の質量に関する情報が、
（１）該構成物そのものの質量（親分子の質量）に、水素、炭素、窒素及び酸素の各元素の中から選ばれる１〜１０のいずれかの数の原子（複数元素の組み合わせを含む）が付加又は脱離した質量数に相当するイオン、
（２）該構成物そのものの質量（親分子の質量）に、Ａｇ、Ａｕ等の金属元素、並びに、Ｎａ、Ｋ等のアルカリ金属元素の中の少なくとも一つが付加し、これに、水素、炭素、窒素及び酸素の各元素の中から選ばれる１〜１０のいずれかの数の原子（複数元素の組み合わせを含む）が付加又は脱離した質量数に相当するイオン、
のいずれかの質量に関する情報である請求項１〜７のいずれかに記載の情報取得方法。
【請求項９】
前記飛翔した構成物の検出結果に基づき、一次ビームの走査により得られる前記構成物の二次元分布状態の情報を取得する請求項１〜８のいずれかに記載の情報取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象物の情報を飛行時間型質量分析計を用いて情報取得する方法に関し、対象物を構成する構成物、特にタンパク質等の有機物を種類ごとにイメージング検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム解析の進展により、生体内に存在する遺伝子産物であるプロテインの解析、特にプロテインチップや生体組織に見られるような分布状態をもったタンパク質の可視化技術が重要となっている。
【０００３】
従来から、プロテインの発現及び機能解析の重要性が指摘されており、その解析手法の開発が進められている。これらの手法は基本的に
（１）二次元電気泳動や高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による分離精製と、
（２）放射線分析、光学的分析、質量分析等の検出系と、
の組み合わせにより行われてきた。
【０００４】
プロテイン解析技術の展開としては、その基盤ともいえるプロテオーム解析（細胞内プロテインの網羅的解析）によるデータベース構築と、そこで得られたデータベースに基づく診断デバイスや創薬（薬剤候補スクリーニング）デバイスに大別されるが、いずれの応用形態に対しても上記のような分析時間、スループット、感度、分解能及び柔軟性に問題のある従来方法とは異なった、小型化、高速化、自動化に適したデバイスが求められてきており、これらの要求を満たす手法としてプロテインを高密度に集積したいわゆるプロテインチップの開発が注目されている。
【０００５】
プロテインチップに捕捉されたターゲット分子は、以下に示す様々な検出手段により検出される。
【０００６】
プロテインの質量分析（ＭＳ）法においては、高感度な質量分析手段あるいは表面分析手段として近年、飛行時間型二次イオン質量分析法（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下ＴＯＦ−ＳＩＭＳと略す）が使われるようになってきた。ＴＯＦ−ＳＩＭＳとは、固体試料の最表面にどのような原子又は分子が存在するかを調べるための分析方法であり、以下のような特徴を持つ。すなわち、１０９ａｔｏｍｓ／ｃｍ２の極微量成分の検出能があること、有機物、無機物のどちらにも適用できること、表面に存在する全ての元素や化合物を測定できること、試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能なことである。
【０００７】
以下、この方法の原理を簡単に説明する。
【０００８】
高真空中で、高速のパルスイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射すると、スパッタリング現象によって表面の構成成分が真空中に放出される。このとき発生する正又は負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を電場によって一方向に収束し、一定距離だけ離れた位置で検出する。一次イオンをパルス状に固体表面に照射すると、試料表面の組成に応じて様々な質量をもった二次イオンが発生するが、軽いイオンほど速く、反対に重いイオンほど遅い速度で飛行するため、二次イオンが発生してから検出されるまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。一次イオンが照射されると固体試料表面の最も外側で発生した二次イオンのみが、真空中へ放出されるので、試料の最表面（深さ数ｎｍ程度）の情報を得ることができる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは一次イオン照射量が著しく少ないため、有機化合物は化学構造を保った状態でイオン化され、質量スペクトルから有機化合物の構造を知ることができる。ただし、ポリエチレンやポリエステル等の人工高分子、プロテイン等の生体高分子等を通常の条件でＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析した場合は、小さな分解フラグメントイオンとなってしまい、元の構造を知ることが一般的には難しい。また、固体試料が絶縁物の場合には、パルスで照射される一次イオンの間隙に電子線をパルスで照射することにより、固体表面に蓄積する正の電荷を中和できるため絶縁物を分析することも可能である。加えて、ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは、一次イオンビームを走査することによって、試料表面のイオン像（マッピング）を測定することもできる。
【０００９】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳでプロテインを分析した例としては、ＭＡＬＤＩ法と同様の前処理の適用、すなわちプロテインをマトリックス物質と混合することにより、分子量の大きなプロテイン親分子を検出するもの（非特許文献１）、特定のプロテインの一部分を１５Ｎ等でアイソトープラベル化し、当該プロテインをＣ１５Ｎ−のような二次イオンを用いてイメージング検出するもの（非特許文献２）、アミノ酸残基に対応するフラグメントイオン（二次イオン）の種類やその相対強度からプロテインの種類を推定するもの（非特許文献３）、更には各種基板上に吸着させたプロテインについてのＴＯＦ−ＳＩＭＳ検出限界を調べたもの（非特許文献４）、等が知られている。
【００１０】
また、プロテインを対象としたこの他の質量分析法として電界放出を利用したものがある（特許文献１）。この方法は、金属電極上に前記プロテインを、印加エネルギーに応じて分裂可能な開放基を介して共有結合又は配位結合させ、強電界を印加することで前記プロテインを質量分析計へ導くというものである。
【特許文献１】特表２００１−５２１２７５号公報
【非特許文献１】Ｋｕａｎｇ  Ｊｅｎ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８，８７３（１９９６）
【非特許文献２】Ａ．Ｍ．Ｂｅｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３，１４３（２００１）
【非特許文献３】Ｄ．Ｓ．Ｍａｎｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６５，１４３１（１９９３）
【非特許文献４】Ｍ．Ｓ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｌ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，１３，４０７（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、分布状態を持つ複数のタンパク質が存在する対象物について、該タンパク質の分布状態を分析する方法として質量分析法を応用したものは種々提案されている。
【００１２】
しかしながら、従来の質量分析法は対象物そのものを分析するものではなく、溶出したタンパク質等を対象としているため得られる情報には制限がある。また、この方式で質量分析する場合はチップ表面への非特異吸着を直接評価できなかった。
【００１３】
また、ＭＡＬＤＩ法や、その改良型であるＳＥＬＤＩ法は、現在知られている中で最もソフトなイオン化法であり、分子量が大きく壊れ易いプロテインをそのままイオン化し、親イオン若しくはそれに準じるイオンを検出できるという優れた特長を有する。現在ではプロテインの質量を分析する際の標準的なイオン化法の一つとなっている。一方、これらの方法をプロテインチップの質量分析に応用する場合にはマトリクス物質の存在により、高い空間分解能を持ったプロテインの二次元分布像（質量情報を用いたイメージング）は得られ難い。すなわち、励起源であるレーザー光自体は１〜２μｍ径程度に容易に集光できるが、分析対象のプロテインの周辺に存在するマトリクス物質が蒸発、イオン化するため、上記の方法でプロテインの二次元分布像を計測する場合の空間分解能は一般的には１００μｍ程度となってしまう。また、集光させたレーザーを走査するには、レンズやミラーを複雑に動作させる必要がある。つまり、上記の方法でプロテインの二次元分布像を計測する場合、レーザー光を走査させることは一般的には難しく、被分析試料を載せた試料ステージを動かす方式に限られる。空間分解能の高いプロテインの二次元分布像を得ようとする場合、試料ステージを動かす方式は一般的には好ましくない。
【００１４】
更に、従来の方法は、対象物の二次元分布像を得ることは難しく、また、対象試料の形態に制限がある。
【００１５】
上記の方法に比べ、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法は一次イオンを使用するため容易に収束かつ走査させることができるため、高空間分解能の二次イオン像（二次元分布像）を得ることができ、１μｍ程度の空間分解能を得ることも可能である。しかしながら、基板上の対象物に対し、通常の条件でＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定を行うと、先に述べたように、生成する二次イオンは小さな分解フラグメントイオンがほとんどで、元の構造を知ることは一般的には難しい。そのため、複数のプロテインが基板上に配置されたプロテインチップのような試料に対し、当該プロテインの種類を判別できる高空間分解能の二次イオン像（二次元分布像）を得るには何らかの工夫が必要となる。Ｋｕａｎｇ  Ｊｅｎ  Ｗｕらの方法は、分子量の大きなプロテインでも一次イオン照射による分解を抑制し、元の質量を保持したまま親分子を検出できる方法である。しかし、該方法ではプロテインとマトリックス物質とを混合したものを測定試料とするため、前記プロテインチップのような試料の場合には、元の二次元分布情報を取得することができない。また、Ａ．Ｍ．Ｂｅｌｕらの方法は特定のプロテインの一部分をアイソトープラベル化するもので、ＴＯＦ−ＳＩＭＳの持つ高空間分解能を十分生かせる方法である。しかしながら反面、特定のプロテインを毎回アイソトープラベル化するのは一般的ではない。また、Ｄ．Ｓ．Ｍａｎｔｕｓらが示したアミノ酸残基に対応するフラグメントイオン（二次イオン）の種類やその相対強度からプロテインの種類を推定する方法は、アミノ酸の構成が似たプロテインが混在する場合は判別が難しくなる。
【００１６】
また、生体組織中の例えば、タンパク質分子に対して、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を応用する際、タンパク質分子を構成するペプチド鎖が「ｈｏｌｄｉｎｇされた状態」のままでは、二次イオン種の生成効率が大幅に低下する。また、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を用いる測定では、高真空中において一次イオン照射を行うため、測定対象試料は予め乾燥処理が施される。その乾燥処理の際、生体組織中に存在しているタンパク質分子と他の生体物質との間で相互作用を起こし、分子間結合によって凝集化を起こすと、二次イオン種の生成効率がなお一層低下する。
【００１７】
従って、生体組織中に存在している特定のタンパク質分子の存在量を、高い検出感度、ならびに高い定量性で分析し、生体組織の切断面上における、特定タンパク質分子の存在量分布に関して、二次元的なイメージングを行う上では、生体組織中では、「ｈｏｌｄｉｎｇされた状態」となっている、タンパク質分子を構成するペプチド鎖を解いておくことが好ましい。更には、タンパク質分子と他の生体物質との間の相互作用を抑制して、「ｈｏｌｄｉｎｇ」が解かれたペプチド鎖から、二次イオン種生成が高い効率でなされる状態を維持することが好ましい。あるいは、生体組織の切断面上に存在しているタンパク質分子からの二次イオン種生成を促進、増加することが好ましい。
【００１８】
一方、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法においては、分析対象の分子を一次イオン照射によってイオン・スパッタリングを行うが、その一次イオン照射を行う表面形状によってスパッタリング効率に差違が生じる。結果として、分析対象の分子に由来す二次イオン種の生成効率にも差違が引き起こされ、定量精度のバラツキを生む要因ともなる。従って、この一次イオン照射を行う表面形状のバラツキに起因する、二次イオン種の生成効率の変動をも抑制することが好ましい。しかしながら、従来開示されているものについては、これらの点で必ずしも十分なものではなかった。
【００１９】
本発明の目的は、前記課題を解決することであり、対象物からの情報取得方法に関し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより、対象物の種類ごとに空間分解能の高い二次元分布像を得る情報取得方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記の課題について鋭意検討した結果、本発明に至った。
【００２１】
本発明に従って、対象物を構成する構成物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得し、取得した質量情報に基づいて該構成物の分布状態に関する情報を得る情報取得方法であって、
該構成物のイオン化を促進するためにｐＨが６以下の水溶液を付与する工程と、
集束し、パルス化し、かつ走査可能なイオン、中性粒子、電子、並びに、集光し、パルス化し、かつ走査可能なレーザー光の中から選ばれる一つの一次ビームを用いて該構成物をイオン化し、該構成物を飛翔させる工程と、
該飛翔した構成物の質量に関する情報を飛行時間型質量分析計を用いて取得する工程と、
該質量を有する構成物の分布状態に関する情報を得る工程と、
を備えることを特徴とする情報取得方法が提供される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の対象物に対する増感物質の付与処理により、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析において該対象物を構成する構成物の親分子イオンを効率良く生成させることができ、かつ該構成物の二次元分布状態を保持したままイメージング検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に、本発明の実施の形態をより詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、対象物のイオン化を促進するための物質を用いて前記対象物を飛翔させ、前記飛翔した対象物を識別できる二次イオンの質量に関する情報を得ることを特徴としている。更に、一次イオンの走査により得られる前記対象物の二次元分布状態を検出（イメージング）できることを特徴としている。前記対象物をイオン化し、前記対象物を飛翔させるために用いられる一次ビームとしては、集束し、パルス化した走査可能なイオンビームを用いるのが好ましいが、他にも集束し、パルス化し、かつ走査可能な中性粒子、電子、もしくは集光し、パルス化し、かつ走査可能なレーザー光等が挙げられる。
【００２５】
本発明では、試料表面に対して、増感物質を含む溶液を作用させ、表面に存在するタンパク質分子に由来する二次イオン種の生成効率を向上させることができる。この増感物質は、一次イオンを照射する際、表面に存在するタンパク質分子に由来する二次イオン種の生成を促進・増加させる機能を示す物質である。例えば、増感物質を含む溶液として、希薄な酸性水溶液を用いると、該水溶液中で解離している酸は、タンパク質分子に作用して、タンパク質分子を構成するペプチド鎖の「ｈｏｌｄｉｎｇされた状態」を解き、その結果、二次イオン種の生成が促進される。このように本発明では、増感物質自体、あるいは、増感物質の構成要素が、タンパク質分子に作用して、結果的に、タンパク質の絡み合いが解かれた状態となる。本発明おいて利用される増感物質としては、例えば、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。
【００２６】
また、本発明の対象物のイオン化を促進する物質は、
（１）基板上に対象物を配置した後に付与する、
（２）基板上に配置される対象物の特定の一種類又は複数に対し、予め付与する、
（３）基板上に対象物が配置される前に、予め基板表面に付与する、
のいずれかである。
【００２７】
このうち、（１）の方式はあらゆる形態の対象物の解析に応用できる、即ち汎用性が高い方式である。一方で、基板上に二次元的に分布している対象物に対しイオン化を促進する物質の付与を行う際は、同処理により対象物を拡散させないことに注意する必要がある。物質付与処理で対象物の二次元分布状態が変化してしまっては、本発明の目的を達成できないからである。対象物の二次元分布状態が変化したかどうかは、例えば、同処理を行わないプロテインチップに対するＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析の結果との比較等から判断できる。
【００２８】
次に（２）の方式は、予め特定の対象物に、対象物のイオン化を促進しＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析で感度が上昇する物質（増感物質）を付与するものだが、この方式は特定の対象物の二次元分布状態を選択的にかつ高感度で検出できるという利点を持つ。一方で、対象物ごとに予め付与処理等を行わなければならず、操作がやや煩雑になるという短所がある。
【００２９】
更に（３）の方式は、対象物のイオン化を促進し、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析で感度が上昇する物質（増感物質）を予め基板表面に形成しておくものである。この方式では該増感物質の存在により新たな非特異吸着の問題が発生しないかどうかを十分調べておくことが重要である。この増感物質は、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析で感度が上昇させるものであれば特に制限はなく、即ち、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析で二次イオンを発生させる過程で、該対象物のイオン化効率を高める効果があればよい。更に、この増感物質は基板の最表面に形成させることが好ましいが、非特異吸着を防止するため、該増感物質の上に単分子膜程度の別の物質を配置することも可能である。
【００３０】
本発明にかかる付与処理とは、上記のように、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析で二次イオンを発生させる過程で、プロテインのイオン化効率を高める効果があり、該プロテインの二次元分布状態を変化させない処理であれば特に制限はないが、増感剤として酸を含む物質を用いることが好ましい。酸の種類としては、本発明者らが検討した限りではトリフルオロ酢酸、塩酸、硝酸、フッ酸、酢酸及びギ酸が好ましく、トリフルオロ酢酸が特に好ましかったが、上記の効果を持つものであればこれ以外の酸であってもよい。
【００３１】
本発明にかかる付与処理では、構成物であるタンパク質のイオン化を促進させるためにｐＨが６以下の水溶液を付与する工程が、一回の処理であって、かつ、対象物の分布状態の保持が可能であることが好ましく、具体的には、ピペッター又はインクジェットプリンターより吐出される液滴の対象物への滴下による付与処理、或いは水溶液中への対象物の浸漬による付与処理であることが特に好ましい。
【００３２】
また、基板上に二次元的に分布しているプロテインに対し、二次元分布状態を変化させることなく前記付与処理を利用する場合は、該プロテインを拡散させないよう注意を払う必要があるが、基板上にプロテインが配置された部位に前記水溶液を静かに滴下することによって一回の処理工程で簡便に該プロテインの二次元分布状態を変化させることなく増感物質を付与することができる。しかしながら、増感物質の付与処理の方法は上記に限られず、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析における対象物の二次イオン化効率を高める効果があり、該対象物の二次元分布状態を変化させない処理であればいかなる方法を用いてもよい。
【００３３】
本発明において分析対象となるプロテインを配置する基板としては、金基板もしくは金の膜を基板表面に付した基板が好ましいが、特に限定するものではなく、該プロテインの質量情報を得ることを妨げるような質量の二次イオンを発する物質でなければ、シリコン基板等の導電性基板及び有機ポリマー、ガラスといった絶縁性基板のプロテインチップに対しても適用し得る。更に、分析対象となるプロテインを配置するための媒体としては基板の形態に限定されるものではなく、粉末状や粒状等あらゆる形態の固体物質を用いることができる。
【００３４】
本発明における構成物の質量に関する情報は、
（１）前記構成物そのものの質量（親分子の質量）に、水素、炭素、窒素及び酸素の各元素の中から選ばれる１〜１０のいずれかの数の原子（複数元素の組み合わせを含む）が付加又は脱離した質量数に相当するイオン、
（２）前記構成物そのものの質量（親分子の質量）に、Ａｇ、Ａｕ等の金属元素、並びに、Ｎａ、Ｋ等のアルカリ金属元素の中の少なくとも一つが付加し、これに、水素、炭素、窒素及び酸素の各元素の中から選ばれる１〜１０のいずれかの数の原子（複数元素の組み合わせを含む）が付加又は脱離した質量数に相当するイオン、
のいずれかの質量に関する情報、つまり親分子に付加又は脱離した質量数に相当するイオンである二次イオンの検出により得られる。
【００３５】
本発明は、前記飛翔した構成物の検出結果に基づき、一次ビームの走査により得られる前記構成物の二次元分布状態の情報を取得することができる。
【００３６】
本発明における対象物の二次元分布状態の検出（イメージング）は、前記対象物を識別できる二次イオンを用いることを特徴としており、この二次イオンは質量／電荷比が５００以上のイオンであることが好ましく、質量／電荷比が１０００以上のイオンであることが特に好ましい。
【００３７】
また、一次イオン種としては、イオン化効率や質量分解能等の観点からガリウムイオン、セシウムイオン、また、場合によっては金（Ａｕ）イオン等のクラスターイオンを形成し易い金属が、好適に用いられる。このクラスター性金属イオンを用いると、極めて高感度の分析が可能となる点で好ましい。金の多原子イオンであれば、Ａｕ２イオン、Ａｕ３イオンを用いることができ、この順で感度の上昇が図られる場合も多く、金の多原子イオンの利用は、更に好ましい形態となる。
【００３８】
更に、一次イオンビームパルス周波数は、１ｋＨｚ〜５０ｋＨｚの範囲であることが好ましく、また、一次イオンビームエネルギーは、１２ｋｅＶ〜２５ｋｅＶの範囲であること、更には、一次イオンビームパルス幅は、０．５ｎｓ〜１０ｎｓの範囲であることが好ましい。
【００３９】
また、本発明は、定量精度を向上させるために、高い質量分解能を保持し、比較的短時間で測定を完了させる必要があることから（一測定が数１０秒から数１０分のオーダー）、一次イオンビーム径は多少犠牲にして測定することが好ましい。具体的には、一次イオンビーム径をサブミクロンオーダーまで絞らずに、１μｍ〜１０μｍの範囲に設定することが好ましい。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。以下に示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる具体的形態に限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）
Ａｕ／Ｓｉ基板へのタンパク質のスポッティング及びＴＦＡ処理と、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析
基板としては、不純物を含まないシリコン（Ｓｉ）基板をアセトン及び脱イオン水の順番で洗浄し、金（Ａｕ）を１００ｎｍ成膜させたものを用いた。ＳＩＧＭＡ社より購入したＢｏｖｉｎｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｃ２５４Ｈ３７７Ｎ６５Ｏ７５Ｓ６（平均分子量：５７２９．６０、同位体存在比が最も高い元素からなる分子の質量：５７３３．５７）、以下ではＩｎｓｕｌｉｎと記載）の１０μＭ水溶液を脱イオン水を用いて調製した。この水溶液を、マイクロピペッターを用いて、前記Ａｕ付きＳｉ基板上にスポッティングした。このようにして作製した基板を自然乾燥した後、前記Ｉｎｓｕｌｉｎ水溶液をスポッティングした位置に重ねて０．１質量％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液をマイクロピペッターを用いて、スポッティングした。この基板を自然乾燥した後、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析に用いた。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析では、ＩＯＮ  ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ  ＩＶ型装置を用いた。測定条件を以下に要約する。
【００４２】
一次イオン：２５ｋＶ  Ｇａ＋、２．４ｐＡ（パルス電流値）、ｓａｗｔｏｏｔｈスキャンモード
一次イオンのパルス周波数：３．３ｋＨｚ（３００μｓ／ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：約０．８ｎｓ
一次イオンビーム直径：約３μｍ
測定領域：３００μｍ×３００μｍ
二次イオン像のｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算時間：約４００秒
【００４３】
このような条件で正及び負の二次イオン質量スペクトルを測定した。その結果、正の二次イオン質量スペクトルにおいて、Ｉｎｓｕｌｉｎの親分子に水素が１つ及び２つ付加した質量に相当する二次イオンを検出することができた。この領域のスペクトル拡大図を図１（ａ）に、また図１（ａ）中において水素が１つ付加したイオン［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（Ｈ）］＋の拡大図を図１（ｂ）に、水素が２つ付加したイオン［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（２Ｈ）］２＋の拡大図を図１（ｃ）に示す。加えて、同位体存在比を基に算出した理論スペクトルを図１（ｄ）に示す。図１（ａ）中、矢印を付けたピークは上記のイオン［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（Ｈ）］＋及び［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（２Ｈ）］２＋に相当するもので、それらのｍ／ｚ値は、［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（Ｈ）］＋の理論値（５７３４．５８）及び［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（２Ｈ）］２＋の理論値（５７３５．５８／２＝２８６７．７９）とほぼ一致した。また、［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（Ｈ）］＋について、図１（ｂ）の実測スペクトル形状と（ｄ）の理論スペクトル形状とがほぼ一致した。更に、Ｉｎｓｕｌｉｎの親イオンに準じる、これらの二次イオンを用いることで、該Ｉｎｓｕｌｉｎの二次元分布状態を反映した二次元イメージ像を得ることができた。図１（ｆ）に該二次元イメージ像を示す。図１（ｆ）において、明るい領域がよりイオン強度が強いことを示しており、このイメージ像によりＩｎｓｕｌｉｎの分布状態も知ることができた。
【００４４】
（比較例１）
Ａｕ／Ｓｉ基板上へのペプチドのスポッティング（ＴＦＡ処理なし）と、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析
実施例１と同様にして、Ｉｎｓｕｌｉｎ水溶液をＡｕ付きＳｉ基板上にスポッティングした。この基板を自然乾燥した後、０．１質量％ＴＦＡ水溶液のスポッティングは行わず、そのままＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析に用いた。実施例１と同じ条件で正及び負の二次イオン質量スペクトルを測定した。その結果正の二次イオン質量スペクトルにおいて、図２に示されるように実施例１で観測されたようなＩｎｓｕｌｉｎの親イオンに準じるピークは観測されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１における正の二次イオン質量スペクトル図であり、（ａ）実測スペクトル（広域）、（ｂ）［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（Ｈ）］＋の実測スペクトル、（ｃ）［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（２Ｈ）］２＋の実測スペクトル、（ｄ）同位体存在比を基に算出した［（Ｉｎｓｕｌｉｎ）＋（Ｈ）］＋の理論スペクトル、（ｅ）得られた二次イオン質量スペクトルを用いたイメージング像、である。
【図２】比較例１における正の二次イオン質量スペクトル図である。
【図１】
2006153493.tif 000002
【図２】
2006153493.tif 000003