(57)【要約】【課題】エステル加水分解酵素、該酵素をコードする遺伝子DNA、該遺伝子DNAを有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該形質転換体を培養して得られる培養物から採取された該酵素および該形質転換体を培養して得られる培養物から該酵素を採取する該酵素の製造方法並びにそれを用いた光学活性体の製造方法を提供する。  【解決手段】  エステル加水分解酵素、該酵素をコードする遺伝子DNA、該遺伝子DNAを有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体、該形質転換体を培養して得られる培養物から採取された該酵素。該形質転換体を培養して得られる培養物から該酵素を採取して該酵素を製造する。さらに、このように製造された培養物または該処理物をカルボン酸エステルに接触させ、光学活性カルボン酸またはその対掌体エステルを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列に有するエステル加水分解酵素。
【請求項２】
配列番号２に示すアミノ酸配列を内部アミノ酸配列に有するエステル加水分解酵素。
【請求項３】
分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量が４５〜４７ｋＤａである、請求項１または２記載のエステル加水分解酵素。
【請求項４】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2006067962.tif 000008
（式中、Ｒは置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルをＲ選択的に加水分解する請求項１〜３のいずれかに記載のエステル加水分解酵素。
【請求項５】
α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステルに対する反応至適ｐＨをｐＨ７〜７．５付近に有する請求項１〜４いずれかに記載のエステル加水分解酵素。
（式中、Ｒは置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルをR選択的に加水分解する。
Ｅ）反応至適ｐＨ：ｐＨ７〜７．５付近（α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステルに対する）。
【請求項６】
ゴングロネラ（Gongronella）属に属する微生物由来である請求項１〜５のいずれかに記載のエステル加水分解酵素。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載の遺伝子ＤＮＡを有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えベクターを有する形質転換体または形質導入体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または請求項９記載の形質転換体または形質導入体を培養し、得られる培養物から採取されたエステル加水分解酵素。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または請求項９記載の形質転換体または形質導入体を培養し、得られる培養物からエステル加水分解酵素を採取することを特徴とするエステル加水分解酵素の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または請求項９記載の形質転換体または形質導入体を培養して得られる培養物又は該処理物を不斉炭素を有するカルボン酸エステルに接触させ、光学活性加水分解物またはその未反応対掌体エステルを採取することを含む光学活性加水分解物またはその対掌体エステルの製造方法。
【請求項１３】
下記一般式（Ｉ）：
【化２】
2006067962.tif 000009
（式中、Ｒは置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルに、請求項１〜６のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または請求項９記載の形質転換体または形質導入体を培養して得られる培養物または該処理物を接触させ、光学活性α−トリフルオロメチル乳酸またはその対掌体エステルを採取することを含む光学活性α−トリフルオロメチル乳酸またはその対掌体エステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用な新規なエステル加水分解酵素に関する。また、本酵素の利用による、光学活性カルボン酸、あるいは光学活性アルコールの効率的な製造方法、特に、医薬、農薬等の原料又は中間体として有用な光学活性α−トリフルオロメチル乳酸及びその対掌体エステルの効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エステル加水分解酵素を用いた光学活性体の製造は多くの文献に記載されている。また、エステル加水分解酵素は種々の生物由来のものが知られている。しかし、一般に酵素は基質特異性が高く、個々の酵素により受容できる基質に限界があり、利用範囲も限定されたものになっているのが現状である。従って、新規なエステル加水分解酵素が望まれていた。
一方、光学活性α−トリフルオロメチル乳酸及びそのエステルのエステル加水分解酵素を応用した製法については以下の文献に示すように多くの酵素によりその製法が提案されている。これらの方法で使用されている微生物学的触媒は、特許文献１にはキャンディダ(Candida)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属およびリゾプス(Rhizopus)属由来の酵素が記載されている。特許文献２にはキャンディダ(Candida)属およびサーモアナエロビューム（Thermoanaerobium）属由来の酵素が記載されている。特許文献３にはキャンディダ(Candida)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、リゾプス(Rhizopus)属、ムコール(Mucor)属およびフミコーラ(Humicola)属由来の酵素が記載されている。特許文献４にはアルスロバクター(Arthrobacter)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、バチルス(Bacillus)属、キャンディダ(Candida)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、フミコーラ(Humicola)属、ムコール(Mucor)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、リゾプス(Rhizopus)属、ストレプトマセス(Streptomyces)属、サーマス(Thermus)属、ブタ肝臓、ブタ膵臓および牛腎臓を起源とする酵素小麦を起源とする酵素が記載されている。特許文献５にはアエロモナス（Aeromonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、アセトバクター（Acetobacter）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、イサタケンキア（Issatchenkia）属、ウイリオポシス（Williopsis）属、エセリキア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、オウレオバクテリウム（Aureobacterium）属、オウレオバシディーム（Aureobasidium）属、オベスムバクテリウム（Obesumbacterium）属、カエトリウム（Chaetomium）属、カルダリオマイセス（Caldariomyces）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ジベレラ（Gibberella）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、クレブシラ（Klebsilla）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、コウニングハメリア（Cunninghamella）属、コクリア（Kocuria）属、コマモナス（Comamonas）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、ジーゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ジーゴリンチス（Zygorhynchus）属、シトロバクター（Citrobacter）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ステノトロホナス（Stenotrophomonas）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、スポリディオボルス（Sporidiobolus）属、セラチア（Serratia）属、デバリヨマイセス（Debaryomyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、トルラスポラ（Torulaspora）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、ノカルデア（Nocardia）属、バーチシリウム（Verticillium）属、パントエア（Pantoea）属、ピキア（Pichia）属、ピチオプシス（Pythiopsis）属、フォトバクテリウム（Photobacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、プロヴィデンシア（Providencia）属、プロテウス（Proteus）属、ペニシリム（Penicillium）属、ボトリオティニア（Botryotinia）属、マイコプラナ（Mycoplana）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、モルゲネリア（Morganella）属、モルテエレラ（Mortierella）属、ヤマダジーマ（Yamadazyma）属、ラクトバチ��ス（Lactobacillus）属、ロイコスポリディーム（Leucosporidium）属、ルテオコッカス（Luteococcus）属、ロッドコッカス（Rhodococcus）属、ロドスポリジーム（Rhodosporidium）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属およびロドバクター（Rhodobactor）属由来の酵素が記載されている。非特許文献１にはバチルス(Bacillus)属およびストレプトマセス(Streptomyces)属由来の酵素が記載されている。
しかし、これらの方法は、既存の酵素や微生物を下記一般式（Ｉ）：
【化３】
2006067962.tif 000002
に示されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルに作用させたに過ぎず、そのため、光学選択性が低く、高い光学純度の生成物を得ようとすれば、理論量以上に反応させ（収率を下げ）、残存エステル（未反応物）を回収する等の工夫が必要であった。また、微生物菌体あるいはその処理物を触媒として用いた場合は、その酵素が特定されておらず、触媒生産を効率的に実施することができないとともに、混合酵素の状態で使用することで、同様に高い選択率で生成物を得るには困難を必要としていた。
【特許文献１】特表２０００-５０９２５４号公報
【特許文献２】独国特許出願公開１９７２５８０２号明細書
【特許文献３】特開平１１-７５８８９号公報
【特許文献４】特開２０００-１４３９７号公報
【特許文献５】特開２００３-０７９３９２号公報
【非特許文献１】Ｋｕｒｔ Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ.ａｌ,Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ, (１９９９),１０(４), ６７９−８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、医薬、農薬等の原料又は中間体として有用な光学活性カルボン酸、あるいは光学活性アルコールの製造を効率的に実施しうる新規な酵素触媒および本酵素触媒を用いた該光学活性体の製造、特にα−トリフルオロメチル乳酸及びその対掌体エステルをより効率的且つ新たな製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決すべく新たな酵素触媒を探索し、鋭意検討を重ねた結果、新規なエステル加水分解酵素を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【０００５】
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列に有するエステル加水分解酵素。（２）配列番号２に示すアミノ酸配列を内部アミノ酸配列に有するエステル加水分解酵素。（３）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量が４５〜４７ｋＤａである、請求項１または２記載のエステル加水分解酵素。（４）下記一般式（Ｉ）：
【化４】
2006067962.tif 000003
（式中、Ｒは置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルをＲ選択的に加水分解する（１）〜（３）のいずれかに記載のエステル加水分解酵素。（５）α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステルに対する反応至適ｐＨをｐＨ７〜７．５付近に有する請求項１〜４いずれかに記載のエステル加水分解酵素。
（６）ゴングロネラ（Gongronella）属に属する微生物由来である（１）〜（５）のいずれかに記載のエステル加水分解酵素。（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ。（８）（７）記載の遺伝子ＤＮＡを有する組換えベクター。（９）（８）記載の組換えベクターを有する形質転換体または形質導入体。（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または（９）記載の形質転換体または形質導入体を培養し、得られる培養物から採取されたエステル加水分解酵素。（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または（９）記載の形質転換体または形質導入体を培養し、得られる培養物からエステル加水分解酵素を採取することを特徴とするエステル加水分解酵素の製造方法。（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または（９）記載の形質転換体または形質導入体を培養して得られる培養物又は該処理物を不斉炭素を有するカルボン酸エステルに接触させ、光学活性加水分解物またはその未反応対掌体エステルを採取することを含む光学活性加水分解物またはその対掌体エステルの製造方法。（１３）下記一般式（Ｉ）：
【化５】
2006067962.tif 000004
（式中、Ｒは置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルに、（１）〜（６）のいずれかに記載の酵素を産生する微生物または（９）記載の形質転換体または形質導入体を培養して得られる培養物または該処理物を接触させ、光学活性α−トリフルオロメチル乳酸またはその対掌体エステルを採取することを含む光学活性α−トリフルオロメチル乳酸またはその対掌体エステルの製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
新規なエステル加水分解酵素が提供される。本酵素を利用することにより、光学活性カルボン酸、あるいは光学活性アルコールの効率的な生産方法が提供される。特に、医薬、農薬等の原料又は中間体として有用な光学活性α−トリフルオロメチル乳酸及びその対掌体エステルの効率的な製造方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の新規なエステル加水分解酵素は、下記の部分配列および理化学的性質を有する。
１)  Ｎ末端アミノ酸配列：
配列番号１；Xaa Leu His Met Leu Phe Gln Ile Leu Glu （Xaaは未知アミノ酸）。
２）内部アミノ酸配列：
配列番号２；Glu Thr Arg Gln Phe Ile Xaa Tyr Val Lys （Xaaは未知アミノ酸）。
３）分子量：45〜47kDaの範囲（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）。
４）作用：
下記一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化６】
2006067962.tif 000005
（式中、Ｒは置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルをR選択的に加水分解する。
５）反応至適ｐＨ：ｐＨ７〜７．５付近（α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステルに対する）。
【０００９】
また、本発明は、本酵素をコ−ドする遺伝子ＤＮＡに関する。本発明の遺伝子ＤＮＡは、以下の方法により、当業者が容易に調製することができる。
【００１０】
ゴングロネラ属に属し、下記一般式（Ｉ）：
【００１１】
【化７】
2006067962.tif 000006
で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルをＲ選択的に加水分解する能力を有する微生物を定法により培養する。
【００１２】
培養して得られた菌体を細胞壁分解酵素によりプロトプラストとし、常法により染色体ＤＮＡを調製する。精製した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素（HindIII，EcoRI，BamHI，Sau3AIなど）により完全もしくは部分消化し、2〜8 kb程度のＤＮＡに断片化する。該ＤＮＡ断片を大腸菌の発現ベクター、例えば、pUC18（タカラバイオ）、pTrc99A（）、pET誘導体（Novagen）、pMAL-p2（NEB製）などに導入することにより染色体DNAを含む組換えプラスミド（染色体DNAライブラリー）を作製する。
【００１３】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（エシェリヒア・コリ JM109株など）を形質転換する。得られた形質転換株をプラスミドに応じた抗生物質（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子を持つプラスミドではアンピシリンを50 mg/L）を含むＬＢ培地（Bacto-Tryptone 10g, Bacto-Yeast extract 5g, 塩化ナトリウム 5g, 寒天 15g /L）などのプレート上で培養する。適当な誘導物質（例えば、lacレプレッサー及びlacオペレーターにより調節を受けるlac，tac ,trcプロモーター等ではIPTG）などの添加や温度上昇などにより酵素遺伝子を発現させる。
得られた形質転換体株のコロニーをプレートから濾紙などに写し取り、ブロモクレゾールパープル等のpH指示薬を含む反応液（例えば、10mM Tris-HCl (pH8)、0.5%ラセミ体α-トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステル、0.2% ブロモクレゾールパープル ）に濾紙等を浸し反応させる。ゴングロネラ属由来のエステル加水分解酵素生産能が付与されたプラスミドを含む形質転換体のみが変色する。ブロモクレゾールパープルの場合には黄色に変化する。
【００１４】
変色することが確認された形質転換体よりプラスミドを調製し、該プラスミドにより形質転換された大腸菌が同様の変色反応を示すことを確認した後、該形質転換体をラセミ体α-トリフルオロメチル乳酸エステルと反応させ、後述するHPLC等を用いた分析をすることにより、該形質転換体がα-トリフルオロメチル乳酸エステルの立体選択的加水分解能を有することを確認する。
【００１５】
該プラスミドを部分的に欠失させた種々のプラスミドを作成し、欠失プラスミドにより形質転換された大腸菌がα-トリフルオロメチル乳酸エステルの立体選択的加水分解能を有するか否かを上記の方法により調べ、エステル加水分解酵素をコードするDNAの領域を特定する。特定されたＤＮＡの塩基配列を解析し、開始コドン、終止コドン、翻訳産物の分子量などからオープンリーディングフレームを特定することにより、目的のエステル加水分解酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。
【００１６】
なお、ゴングロネラ属の遺伝子中にイントロンを含む場合には、染色体DNAをランダムに大腸菌のプラスミドに挿入せず、メッセンジャーＲＮＡ（mRNA）を調製し、mRNAから逆転写酵素などを利用してｃＤＮＡライブラリーを調製する。mRNAは、AGPC（acid guaniginium  phenol  chloroform）法等を用いて菌体より抽出したtotal RNAを、オリゴdTカラム等を用いて調製する。完全長のcDNAを取得する場合には、GeneRacer Kit (Invitrogen) 等が有効である。  ｃＤＮＡを大腸菌や酵母の発現ベクターに導入することにより機能的に発現させることができる。このとき、酵母の宿主ベクター系としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）などを利用できる。
【００１７】
また、精製された酵素のＮ末端アミノ酸配列あるいは内部アミノ酸配列情報から、目的酵素をコードするＤＮＡを単離することも可能である。この場合、完全なアミノ酸配列を決定するは必要ない。例えば、適切なアミノ酸配列が同定されたら、その配列に関する情報に基づき、ＰＣＲ用のプライマーとしてのオリゴヌクレオチドセットを合成する。本発明において、ＰＣＲによるエステル加水分解酵素遺伝子のクローニングのために用いるプライマーは、ゴングロネラ属から精製されたエステル加水分解酵素遺伝子のＮ末端アミノ酸配列および内部ペプチド断片のアミノ酸配列に基づく。本酵素遺伝子に関するＤＮＡ断片（部分ＤＮＡ配列）は、ゴングロネラ属染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、上述プライマー（オリゴヌクレオチドセット）を用いたＰＣＲ増幅によって生成される。増幅されたＤＮＡ断片は、ゴングロネラ属エステル加水分解酵素遺伝子の全体をコードするＤＮＡ断片をクローニングするためのプローブとして用いることができる。
こうして得られたＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーション法を用い、上述染色体ＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、エステル加水分解酵素遺伝子の全体をコードするＤＮＡ断片を含む目的組換えプラスミドを取得する。
【００１８】
本発明の新規なエステル加水分解酵素はゴングロネラ（Gongronella）属あるいはそれら近縁属から得ることができる。そのような微生物としては、例えばGongronella butleri  が挙げられる。菌株分譲機関より容易に入手することが可能である。特に好ましくはGongronella butleri  R-466株（FERM P-19110）が例示される。この微生物は本発明者らが新たに土壌中より分離したもので、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東１−１−１中央第６)に寄託されており、その受託番号はFERM P-19110である。その生物学的性状は以下の通りである。
【００１９】
【表１】
2006067962.tif 000007
【００２０】
これらの微生物を培養するための培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるいはその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じて適宜添加される。また、高い酵素活性を得るために、一般式（Ｉ）で示されるα−トリフルオロメチル乳酸エステルはもちろん、エステル結合あるいはアミド結合を持つ化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することも有効である。その培養は常法に従って行えばよく、例えば、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４０℃の範囲にて好気的に６〜９６時間培養する。
【００２１】
本発明の酵素組成物は、以下の調製方法により得ることができる。すなわち、上記微生物菌体あるいは培養液等を冷却下、超音波、フレンチプレス等によりすりつぶした後、リン酸バッファー等のｐＨ６〜８の緩衝液に懸濁する。
上記菌体破砕液を遠心分離または濾過等により残渣を除去する。このようにして、清澄な酵素含有抽出溶液を得る。
【００２２】
酵素の精製に常用される(１)沈澱による分画、(２)各種クロマトグラフィー、(３)透析、限外濾過等による低分子物質の除去方法などを、単独で、適宜組み合わせて、または繰り返して使用することにより該抽出液から目的の酵素を単離することができる。
【００２３】
(１)の沈澱による分画に使用される物質は、水に対する溶解度が高く、溶解度の温度変化が少ない点で硫酸アンモニウム（硫安）が好ましい。添加する濃度は特に制限はないが、目的酵素を収率良く回収でき、しかも他の蛋白質成分と分離できる条件が好ましい。例えば、３０〜７０％硫酸アンモニウムを用いることにより、効率よく分画することができる。
【００２４】
(２)のクロマトグラフィーとしては、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２５】
ａ）ゲル濾過法は、タンパク質を分子量の大きさで分ける手法であり、ゲル粒子が持つ網目構造により、目的とするタンパク質の分子量に応じて選択することができる。ゲル濾過に使用されるカラムとしては、例えばSephadex 系、Seperose系、 Sephacryl系カラム（いずれもＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
ｂ）イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質が両性電解質であることを利用した分離法であり、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーがある。陽イオン交換クロマトグラフィーのための交換基にはカルボキシメチル(CM)が用いられ、例えばCM-Toyopearl（東ソー）、CM-Cellulofine（生化学工業）、CM-Sephadex（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラム等が挙げられる。また、陰イオン交換クロマトグラフィーのための交換基にはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）が用いられ、例えばDEAE-Toyopearl系（東ソー）、DEAE-Cellulofine系（生化学工業）、DEAE-Sephadex系、DEAE-Seperose系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラム等が挙げられる。そのほか、SP-Seperose系、Q-Seperose系、Mono−Q系等のカラムも挙げられる。但し、これらのカラムに限定されるものではない。
【００２７】
ｃ）疎水性クロマトグラフィーは、タンパク質とゲルに結合したリガンド間の疎水的相互作用に基づく分離手法であり、例えば、Butyl-Superose系、Phenyl-Superose系、Octyl-Superose系のカラムが用いられる。また、移動相を極性有機溶媒、固定相を長鎖の無極性リガンドとし、両相間で溶質の分配を行う逆相クロマトグラフィー（例えばPEP-PRC, TSK-ODS等）を利用することもできる。
【００２８】
ｄ）アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質や酵素に特異的に結合する物質をカラムにつけ、特異的結合反応を利用して目的とするタンパク質等を分離することを特徴とするものであり、アガロース（Sepharose）、デキストラン（Sephadex）、セルロース、ポリアクリルアミド（Biogel P）、多孔性シリカビーズ等を支持体に用いたものがある。
【００２９】
(３)透析、限外濾過等
透析は、セロハン製の透析チューブに試料液を入れ、大量の純水又は低濃度の緩衝液に浸すことにより低分子化合物をセロハンチューブの外側に透過させる手法である。
限外濾過法は、限外濾過膜（平板膜、中空繊維ホロファイバー）を用いて、目的のタンパク質を濃縮する手法である。カットオフ分子量は５００〜５００，０００程度の範囲である。手法としては加圧撹拌法、強制循環式濃縮法（ホロファイバー）、遠心法がある。
【００３０】
本発明においては、上記精製手法のうち硫安塩析、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを組み合わせて用いることが好ましい。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて酵素の単一性の確認あるいは分子量の測定ができる。精製されたエステル加水分解酵素は上述したような性質を有している。
また、本発明の酵素組成物は、上記特性を有し、複数の酵素活性物質を含む混合物であってもよく、それらの活性物質が単離された個別の活性物質からなる酵素組成物（又は酵素自体）をも包含する。
【００３１】
光学活性加水分解物またはその未反応対掌体エステルの製造について説明する。
本発明の酵素、または、該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物を、不斉炭素を有するカルボン酸エステルに接触させ、不斉加水分解することで、光学活性加水分解物またはその未反応対掌体エステルを採取することできる。不斉炭素を有するカルボン酸エステルは、カルボン酸側に不斉炭素を有する場合、アルコール側に不斉炭素を有する場合あるいはカルボン酸側およびアルコール側両方に不斉炭素を有する場合がある。また、不斉炭素の数としてもひとつまたは複数個の場合がある。本発明である新規エステル加水分解酵素により、不斉加水分解が実施される限りにおいて特に制限はない。通常、ひとつの不斉炭素を有する化合物に応用する。カルボン酸側に不斉炭素を有する化合物が好ましい。一般式（Ｉ）に示されるようなα位に不斉炭素に作用させることが特に好ましい。
【００３２】
本発明において、光学活性加水分解物とは該エステル結合を不斉加水分解して、カルボン酸側に不斉炭素を持つ場合は、光学活性カルボン酸ことを表す。また、アルコール側に不斉炭素を持つ場合は、光学活性アルコール表す。
すなわち本発明はカルボン酸側に不斉炭素を持つ場合は、光学活性カルボン酸およびその対掌体エステルを製造することができる。アルコール側に不斉炭素を持つ場合は光学活性アルコールおよびその対掌体エステルを製造することができる。
例えば、一般式（Ｉ）で表されるラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルを不斉加水分解させ、光学活性α−トリフルオロメチル乳酸及びその対掌体エステルを製造することができる。
【００３３】
一般式（Ｉ）においてＲは置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基等の炭素原子数１〜８のアルキル基；ビニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基等の炭素原子数２〜８のアルケニル基；エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等の炭素原子数２〜８のアルキニル基等が例示される。また、この炭化水素基は、その炭素原子に結合する水素原子がハロゲン等の置換基で置換されていてもよい。好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基のような炭素原子数１〜６の非置換の直鎖炭化水素基である。
【００３４】
なお、本発明において、酵素とは、その使用形態は特に限定されず、粗酵素、精製酵素または公知の方法により固定化された固定化物等も含まれる。また、本発明において、形質転換体または形質導入体とは、本発明の酵素をコードする遺伝子を導入され、該遺伝子が機能的に発現した異種生物体をいい、処理物とはアセトン沈殿、凍結乾燥、機械的並びに酵素的方法による細胞壁の破砕した無細胞抽出物、界面活性剤、有機溶媒などにより細胞壁の透過性を変化させたものなどをいう。
【００３５】
本発明において、不斉炭素を持つカルボン酸エステルの光学選択的加水分解は、例えば以下の方法で行うことができる。反応溶媒に基質を溶解もしくは懸濁する。また、基質を反応溶媒に添加する前および/または添加した後に触媒となる本発明の酵素および/または該酵素を産生する形質転換体もしくはその処理物を添加する。そして、反応温度、必要により反応液のｐＨを制御しながら反応を行う。基質がラセミ体の場合は通常半量程度が加水分解されるまで反応を行う。場合によっては反応の初期段階で反応を中断したり、あるいは過剰に反応させることもある。
【００３６】
反応液の基質濃度は、０．１ 〜８０重量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．５〜５０重量％の濃度で実施するのが好ましい。反応液の触媒濃度は、その活性で適宜決定するもので特に制限はないが、通常、０．０００１〜２０重量％であり、好ましくは ０．００１ 〜１０重量％である。反応液のｐＨは、用いる触媒の至適ｐＨに依存するが、一般的にはｐＨ３〜１１の範囲である。化学的加水分解反応による光学純度の低下および収率の低下を抑えることができるという点でｐＨ４〜９の間で反応を行うのが好ましい。また、反応が進行するに従いｐＨが低下してくるが、この場合は適当な中和剤、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム水溶液等を添加して最適ｐＨに調整することが望ましい。反応温度は化学的加水分解反応の抑制および用いる触媒の至適温度によって適宜決定されるもので特に制限はないが、０〜７０℃が好ましく、５〜５０℃がより好ましい。
【００３７】
反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応を行うことができる。有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコール、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。また、これらの有機溶媒を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行うことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させることで、選択率、変換率、収率等が向上することもある。
【００３８】
反応時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件を選択することが好ましい。尚、以上のような基質濃度、触媒濃度、ｐＨ、温度、溶媒、反応時間またはその他の反応条件は該条件における反応収率、光学収率等を勘案して目的とする光学活性化合物が最も多く採取できる条件を適宜選択することが望ましい。
【００３９】
上述の反応により、不斉炭素を持つカルボン酸エステルは不斉加水分解される。カルボン酸側に不斉炭素を持つ場合においては光学活性カルボン酸およびその対掌体エステルを、アルコール側に不斉炭素を持つ場合においては光学活性アルコールおよびその対掌体エステルを製造することができる。
【００４０】
生成した光学活性カルボン酸あるいは光学活性アルコールを単離後、再びエステル化したもの、またはそれぞれの未反応対掌体エステルを再度同様な反応に供することで、さらに高光学純度の光学活性体の製造も可能である。
【００４１】
生成した光学活性体とそれぞれの未反応対掌体エステルの反応混合液からの単離は抽出、蒸留、昇華、カラム分離等通常の単離法で行うことができる。
例えば、α−トリフルオロメチル乳酸類の場合は、反応液のｐＨを中性付近に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等、一般的な有機溶媒によりＳ体α−トリフルオロメチル乳酸エステルを抽出分離することができる。一方、Ｒ体α−トリフルオロメチル乳酸は、上記抽出残液に硫酸、塩酸等の強酸を加えた後に、上記と同様の一般的な有機溶媒で抽出分離することができる。
【００４２】
なお、光学活性α−トリフルオロメチル乳酸の定量および光学純度は、以下に示す高速液体クロマトグラフィー条件により容易に測定することができる。
カラム： Sumichiral OA-5000、住化分析センター株式会社製、４．６×１５０ ｍｍ, 
移動相：２ｍＭ ＣｕＳＯ４水溶液／2-プロパノール＝８５／１５
流速：１．０ ｍＬ/分
検出：ＵＶ ２３０ｎｍ
【００４３】
光学純度（エナンチオマー過剰率；％ｅ.ｅ.）は、一般的に、高速液体クロマトグラフィーによる(Ｓ)-α−トリフルオロメチル乳酸及び(Ｒ)-α−トリフルオロメチル乳酸の各ピーク面積から、以下の式によって算出することができる。
Ｒ＞Ｓの場合：Ｒ体の光学純度（％ｅ.ｅ.）＝（Ｒ−Ｓ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ＞Ｒの場合：Ｓ体の光学純度（％ｅ.ｅ.）＝（Ｓ−Ｒ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ：(Ｓ)-α−トリフルオロメチル乳酸のピーク面積
Ｒ：(Ｒ)-α−トリフルオロメチル乳酸のピーク面積
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
【００４５】
[実施例１]  
（ａ）粗酵素抽出液の調整
培地（トリプトン１５ｇ/ｌ、酵母エキス３ｇ/ｌ、グルコース３０ｇ/ｌ、Ｔｗｅｅｎ２０ 1.0ｇ/ｌ）１０００ｍｌを三角フラスコに１００ｍｌづつ分注し、１２１ ℃で２０分間蒸気滅菌した。Gongronella butleri  R-466株（FERM P-19110）を該フラスコ培地に植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。洗浄後の菌体を吸引濾過により回収した(１０℃以下)。５０ ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で該回収菌体を洗浄し、該菌体を５０ ｍｌチューブに移した。該チューブを−８０℃でいったん凍結し、氷上で一晩かけてゆっくり該チューブ内の菌体を解凍した。解凍した菌体を、乳鉢ですりつぶした。得られたGongronella粗破砕液をフレンチプレス(１００ 〜１５０ ＭＰａ)で３回破砕した。菌体破砕後の溶液は、４℃、１２０００〜１４０００ｒｐｍ、３０分の条件で遠心分離し、不溶性沈殿物を取り除いた。
【００４６】
（ｂ）硫安塩析
（ａ）の方法で得られた粗酵素抽出液に、６０％飽和となるように硫酸アンモニウムをゆっくり時間をかけて加えた。該溶液を氷上で一晩放置後、４℃、１４０００ｒｐｍ、３０分遠心分離をおこなった。回収した沈殿を５０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁した。
【００４７】
（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィーよる精製
（ｂ）の方法で得られた粗酵素液に1.5mol/lになるように硫安を添加し、疎水性相互作用カラムＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)に供した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で硫酸アンモニウムの濃度勾配(１．５〜０ Ｍ)を利用して目的酵素を精製した。この条件で精製をおこなうと、硫酸アンモニウム濃度が０ Ｍとなった後に目的エステラーゼのカラムからの溶出が確認された。
【００４８】
（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー
陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)に（ｃ）の方法で得られた粗酵素液を供した。リン酸緩衝液(ｐＨ８．０)で塩化ナトリウムの濃度勾配（０〜１ Ｍ）により溶出した。得られた活性画分をさらに同操作を繰り返すことで精製した。
【００４９】
（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量決定
（ｄ）の方法で得られた精製画分をmicrocon YM-10(Millipore)で１０倍に濃縮後、その画分に含まれる酵素の単一性を、以下に示す条件のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した（銀染色;ATTO社製シルバーステインキット）。基準タンパク質の分子量の対数と、そのバンドの移動度をグラフ上にプロットし、酵素の移動度の実測値に対応する分子量を推定した。その結果、４６ｋＤの分子量を有することが示された（図１）。
【００５０】
分離ゲル：７５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、８％アクリルアミド（アクリルアミド：メチレンビスアクリルアミド＝１９:１）、０．１％ ＳＤＳ
濃縮ゲル：１２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、４．５％アクリルアミド（アクリルアミド：メチレンビスアクリルアミド＝１９:１）、０．１％ ＳＤＳ
泳動緩衝液：２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％ ＳＤＳ
泳動条件：定電流１０→２０ ｍＡ（濃縮ゲルに到達後から２０ ｍＡに変更）
【００５１】
（ｆ）Ｎ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列の決定
（ｅ）記載のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動後、CBB染色し、ＰＶＤＦ膜（イモビロンPSQ：ミリポア社）へブロッティングした。メインバンドを切り取り、プロテインシーケンサーProcise 494 cLC(Applied Biosystems)によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。内部アミノ酸配列決定には、同様の操作で得られたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのメインバンドを切り抜いて、回収後、リジルエンドペプチダーゼにより部分消化した。ＨＰＬＣによりペプチドを分取後、プロテインシーケンサーにより配列を決定した。それぞれの分析結果は以下の通りである。
【００５２】
Ｎ末端アミノ酸配列
配列番号１；Xaa Leu His Met Leu Phe Gln Ile Leu Glu （Xaaは未知アミノ酸）。
内部アミノ酸配列：
配列番号２；Glu Thr Arg Gln Phe Ile Xaa Tyr Val Lys （Xaaは未知アミノ酸）。
【００５３】
[実施例２]
（反応至適ｐＨの測定）
実施例１（ｄ）の方法で得られた精製酵素画分を用いて至適ｐＨを測定した。すなわち、１０％量の精製酵素画分、１．０％量のラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステルを各ｐＨの８０ ｍＭ リン酸緩衝液あるいは１００ ｍＭクエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液に加え、３０℃で４時間反応させた。生成するα−トリフルオロメチル乳酸の量をＨＰＬＣで定量することで測定した。なお、リン酸緩衝液はｐＨ６．０〜７．５の範囲で、クエン酸−リン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ４．０〜８．０の範囲の測定に用いた。結果を図２に示す。各ｐＨにおける相対活性はｐＨ７で示した最大活性を１００とした相対値で示した。ｐＨ７．０〜７．５ において最も高活性を示した。
【００５４】
[実施例３]
実施例１（ｂ）の方法と同様にしてGongronella butleri  R-466株（FERM P-19110）由来の硫安塩析沈殿を得た。その沈殿物に0.5Mリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を加え、全量を１０ｇ に調製した。この懸濁液にラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸メチルエステル０．５ｇを加え、３０℃にて１０時間、振盪しながら反応した。
反応終了液中のα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率４５％（ラセミ体基準の収率、以下同様）で９８％ｅｅの(Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００５５】
[実施例４]
実施例３の方法と同様にして酵素懸濁液１０ｇを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステル１．０ｇを加え、３０℃にて１０時間、振盪しながら反応した。反応液中のα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率４０％で９９％ｅｅの(Ｒ)α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００５６】
[実施例５]
実施例１の（ａ）〜（ｄ）の方法と同様にして酵素溶液１０ｍｌを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸メチルエステル０．１ｇを加え、３０℃にて１０時間、振盪しながら反応した。反応終了液中のα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率２４％で９９％ｅｅの(Ｒ)α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００５７】
[実施例６]
実施例１の（ａ）〜（ｄ）の方法と同様にして酵素溶液１０ｍｌを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステル０．３ｇを加え、３０℃にて２４時間、振盪しながら反応収率５０％になるまで反応させた。反応終了後、それぞれ １０ｍｌのｎ-ヘキサンで２回抽出を行った。抽出操作で得られたn-ヘキサン層を一つにまとめて無水硫酸マグネシウムを加えて脱水した後、減圧下n-ヘキサンを留去した。このようにして得られたα−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステルについて、光学分割カラム（クロムパック社製Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ ＣＢ カラム；カラム温度75℃、インジェクション温度200℃、ディテクター温度200℃）をつけたキャピラリーガスクロマトグラフィーにて分析したところ、Ｓ体であり、光学純度は９８．５％ｅ.ｅ.であった。
【００５８】
上記で得られた光学活性エステルに５％水酸化ナトリウム水溶液５ｍｌを加えて、室温にて２時間加水分解反応を行った。次いで、硫酸を加えてｐＨを１．５ に調整し、それぞれ１０ｍｌの酢酸エチルにて２回抽出を行った。抽出操作で得られた酢酸エチル層を一つにまとめて硫酸マグネシウムで脱水した後、溶媒を除去した。トルエンで再結晶させた。このようにして得られたα−トリフルオロメチル乳酸についてジアゾメタンでエステル化後、光学分割カラム（ジーエルサイエンス株式会社製Chirasil-DEX CB カラム；カラム温度50℃）をつけたキャピラリーガスクロマトグラフィーにて分析したところ、光学活性体（Ｓ体）であり、光学純度は９９．５％ｅ.ｅ.であった。
【００５９】
また、(S)-α−トリフルオロメチル乳酸n-ブチルエステル抽出残液（水層）に濃硫酸を加えてｐＨ１．０ に調整した。調整後、それぞれ１０ｍｌの酢酸エチルを加えて２回抽出を行った。抽出操作で得られた酢酸エチル層を一つにまとめて無水硫酸マグネシウムを加えて脱水した後、溶媒を除去した。このようにして得られたα−トリフルオロメチル乳酸についてジアゾメタンでエステル化後、同様に分析したところ、Ｒ体であり、光学純度は９８％ｅ.ｅ.であった。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号１：N terminal peptide
配列番号２：Internal peptide 
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動結果である。
【図２】反応至適ｐＨを示す図である。
【図１】
2006067962.tif 000010
【図２】
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【配列表】
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