(57)【要約】【課題】  標的ＤＮＡの検出のために従来用いられていたハイブリダイゼーションでは、二本鎖ＰＣＲ産物の一方が他方のハイブリダイゼーションを競合的に阻害し、効率が悪く、検出感度が上がらないという問題があった。【解決手段】  支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分と、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡに特異的に結合し得る第２のオリゴヌクレオチド部分とを連結してなる仲介オリゴヌクレオチドを、上記検出用オリゴヌクレオチドと接触させることを含む、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法を提供する。【選択図】  図２
2006020591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分と、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡに特異的に結合し得る第２のオリゴヌクレオチド部分とを連結してなる仲介オリゴヌクレオチドを、上記検出用オリゴヌクレオチドと接触させることを含む、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
前記仲介オリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチド部分と前記第２のオリゴヌクレオチド部分との間にスペーサー部分を有するものである、請求項１記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
前記スペーサー部分が第３のオリゴヌクレオチド部分である、請求項２記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項４】
前記第１のオリゴヌクレオチド部分及び前記スペーサー部分が試料中のＤＮＡ／ＲＮＡと特異的に結合しない、請求項２または３記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
前記第１のオリゴヌクレオチドと前記検出用オリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーションによって特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項６】
更に前記仲介オリゴヌクレオチドと前記検出用オリゴヌクレオチドとの結合を検出することを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項７】
更に前記仲介オリゴヌクレオチドを試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを鋳型とする伸長反応によって標識することを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項８】
仲介オリゴヌクレオチドを標識後、検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする、請求項７記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項９】
仲介オリゴヌクレオチドを、予め標識した試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと作用させた後、検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【請求項１０】
支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分と、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡに特異的に結合し得る第２のオリゴヌクレオチド部分とを連結してなる、仲介オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記第１のオリゴヌクレオチド部分と前記第２のオリゴヌクレオチド部分との間にスペーサー部分を有する、請求項１０記載の仲介オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
スペーサー部分が第３のオリゴヌクレオチド部分である、請求項１１記載の仲介オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
第１のオリゴヌクレオチド部分の配列が10〜1000塩基の長さである、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の仲介オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
第２のオリゴヌクレオチド部分の配列が10〜1000塩基の長さである、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の仲介オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
第３のオリゴヌクレオチド部分の配列が0〜1000塩基の長さである、請求項１２〜１４のいずれか１項記載の仲介オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
互いに異なる１種以上の検出用オリゴヌクレオチドが固定された支持体と、
該支持体上に固定された１種の検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分を有する１種以上の請求項１０〜１５のいずれか１項記載の仲介オリゴヌクレオチドと、
を含むことを特徴とする、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法に関し、より詳細には、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと結合するオリゴヌクレオチド部分と、検出のためのオリゴヌクレオチド部分とを有する仲介オリゴヌクレオチドを用いた上記検出方法に関する。本発明は更に、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出に用いる上記仲介オリゴヌクレオチド及び試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症等の検査として、その原因となる細菌やウイルスなどの特定のＤＮＡ断片をＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)で増幅し、ゲル電気泳動やハイブリダイゼーションによる検出法がある。ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列の特定にはハイブリダイゼーションが有効であるが、これは既知のＤＮＡを基材(基板、メンブレン等)に固定化し、蛍光物質などで標識した病原菌等の標的遺伝子由来のＰＣＲ産物を反応させて行なうものである。固定化されたＤＮＡと相補鎖を形成したＰＣＲ産物の標識物質を検出することで、感染の有無、あるいは原因菌の特定をすることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
固定化ＤＮＡとのＰＣＲ産物のハイブリダイゼーション（図１)は、一般的に溶液中で一本鎖に解離した後に行なうが、解離した一本鎖ＰＣＲ産物は、その相補鎖が溶液中に共存するため、固定化ＤＮＡと相補鎖を形成するよりも速い反応速度でＰＣＲ産物同士の二本鎖を形成してしまう。つまり、二本鎖ＰＣＲ産物の一方が他方のハイブリダイゼーションを競合的に阻害してしまうため、ハイブリダイゼーションの効率が悪く、検出感度が上がらないという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、上記課題を解決するために、標識したＰＣＲ産物と固定化したオリゴヌクレオチドとを仲介するオリゴオリゴヌクレオチドを添加する、新規のハイブリダイゼーション法を開発した(図２)。本発明の仲介オリゴヌクレオチドは、溶液中でＰＣＲ産物とハイブリダイズする配列を有するため、容易に相補鎖を形成することができる。また、他方のＰＣＲ産物同士が再度ハイブリダイズすることを阻害する。さらに、一本鎖部分が露出するため、固定化した検出用のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが容易である。
【０００５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１６）を提供する。
（１）支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分と、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡに特異的に結合し得る第２のオリゴヌクレオチド部分とを連結してなる仲介オリゴヌクレオチドを、上記検出用オリゴヌクレオチドと接触させることを含む、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【０００６】
（２）前記仲介オリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチド部分と前記第２のオリゴヌクレオチド部分との間にスペーサー部分を有するものである、上記（１）記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
（３）前記スペーサー部分が第３のオリゴヌクレオチド部分である、上記（２）記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【０００７】
（４）前記第１のオリゴヌクレオチド部分及び前記スペーサー部分が試料中のＤＮＡ／ＲＮＡと特異的に結合しない、上記（２）または（３）記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
（５）前記第１のオリゴヌクレオチドと前記検出用オリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーションによって特異的に結合する、上記（１）〜（４）のいずれか記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
（６）更に前記仲介オリゴヌクレオチドと前記検出用オリゴヌクレオチドとの結合を検出することを含む、上記（１）〜（５）のいずれか記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【０００８】
（７）更に前記仲介オリゴヌクレオチドを試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを鋳型とする伸長反応によって標識することを含む、上記（１）〜（６）のいずれか記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
（８）仲介オリゴヌクレオチドを標識後、検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする、上記（７）記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
【０００９】
（９）仲介オリゴヌクレオチドを、予め標識した試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと作用させた後、検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれか記載のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出方法。
（１０）支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分と、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡに特異的に結合し得る第２のオリゴヌクレオチド部分とを連結してなる、仲介オリゴヌクレオチド。
【００１０】
（１１）前記第１のオリゴヌクレオチド部分と前記第２のオリゴヌクレオチド部分との間にスペーサー部分を有する、上記（１０）記載の仲介オリゴヌクレオチド。
（１２）スペーサー部分が第３のオリゴヌクレオチド部分である、上記（１１）記載の仲介オリゴヌクレオチド。
【００１１】
（１３）第１のオリゴヌクレオチド部分の配列が10〜1000塩基の長さである、上記（１０）〜（１２）のいずれか記載の仲介オリゴヌクレオチド。
（１４）第２のオリゴヌクレオチド部分の配列が10〜1000塩基の長さである、上記（１０）〜（１３）のいずれか記載の仲介オリゴヌクレオチド。
【００１２】
（１５）第３のオリゴヌクレオチド部分の配列が0〜1000塩基の長さである、上記（１２）〜（１４）のいずれか記載の仲介オリゴヌクレオチド。
（１６）互いに異なる１種以上の検出用オリゴヌクレオチドが固定された支持体と、
該支持体上に固定された１種の検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分を有する１種以上の上記（１０）〜（１５）のいずれか記載の仲介オリゴヌクレオチドと、
を含むことを特徴とする、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出のためのキット。
【発明の効果】
【００１３】
仲介オリゴヌクレオチド中のＰＣＲ産物との相補鎖領域の配列のみを変更すれば、それ以外の仲介オリゴヌクレオチドの配列及び固定化オリゴヌクレオチドの配列を変えずに別のＰＣＲ産物を標的とすることができる。つまり、仲介オリゴヌクレオチドの配列の一部を変更すれば、支持体に固定化した検出用オリゴヌクレオチドはあらゆるＰＣＲ産物に対応することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において、「仲介オリゴヌクレオチド」とは、従来直接ハイブリダイズさせることによって検出を行っていたPCR産物等の標的オリゴヌクレオチドと、支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドとの双方に結合する（双方を仲介する）ことによって、標的ヌクレオチドの存在を間接的に検出し得るオリゴヌクレオチドをいう。仲介オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、またこれらの混合体であっても良く、場合によってペプチド核酸（ＰＮＡ）であっても良い。また、後述するように、仲介オリゴヌクレオチドの全体がオリゴヌクレオチドであっても良いが、部分的に他のポリマー構造を有するものであっても良い。
【００１５】
本発明において「試料」とは、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡが含まれ、または含まれる可能性があるあらゆる試料をいい、特に限定するものではない。試料として、例えば血液、唾液などの体液、細菌等の微生物が含まれる土壌、動物及び植物組織からの抽出物等が含まれる。
【００１６】
本発明において、「特異的な結合」とは、オリゴヌクレオチド同士のハイブリダイゼーション、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質とＤＮＡの相互作用等が挙げられ、特に限定するものではないが、ハイブリダイゼーションが好ましい。
【００１７】
本発明において、仲介オリゴヌクレオチドは、機能の異なる３つの領域、第１のオリゴヌクレオチド部分、第２のオリゴヌクレオチド部分、及び場合によって該第１のオリゴヌクレオチド部分及び第２のオリゴヌクレオチド部分の間にスペーサー部分を有する（図３）。仲介オリゴヌクレオチドの一態様は、１本鎖のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチド部分、第２のオリゴヌクレオチド部分、及び該第１及び第２のオリゴヌクレオチド部分の間にスペーサー部分としての第３のオリゴヌクレオチド部分を有する。第１のオリゴヌクレオチド部分は５’側に位置しても、３’側に位置しても良いが、標的オリゴヌクレオチドを鋳型とする伸長反応によって仲介オリゴヌクレオチドを標識する場合には、第３のオリゴヌクレオチド部分が３’側となるようにする。
【００１８】
第１のオリゴヌクレオチド部分は、支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る配列を有する。第１のオリゴヌクレオチド部分は、10〜1000塩基の長さであり、好ましくは、支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列の少なくとも一部を含む、少なくとも１０塩基長、好ましくは１５〜１００塩基長、より好ましくは３０〜７０塩基長のオリゴヌクレオチドである。本発明においては、第１のオリゴヌクレオチド部分の配列は、検出用オリゴヌクレオチドとの結合によって標的オリゴヌクレオチドの存在を検出するためのものであり、標的オリゴヌクレオチドの種類に関わらず任意に設定し得るものである。従って、検出用オリゴヌクレオチドの配列を予め設定し、その配列及び第１のオリゴヌクレオチド部分の塩基配列は互いに相補的な配列を有するようにすることが最適である。また、複数の標的ヌクレオチドを同時に検出する場合には、特異的な検出のために、それぞれの検出に用いる仲介オリゴヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチド部分は、互いに相同性が低い方が好ましい。例えばＤＮＡチップを用いて10000種類までの標的オリゴヌクレオチドの同時検出が可能であるが、その場合、第１のオリゴヌクレオチド部分の配列は、互いに50％以下、好ましくは30％以下、より好ましくは10％以下の配列同一性を有することが好ましい。
【００１９】
第２のオリゴヌクレオチド部分は、試料中の標的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）と特異的に結合し得る。第２のオリゴヌクレオチド部分は、10〜1000塩基長、好ましくは１５〜１００塩基長、より好ましくは３０〜７０塩基長のオリゴヌクレオチドである。
【００２０】
第２のオリゴヌクレオチド部分は、標的となる試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと相補的な配列に対して約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、標的となる試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと特異的にハイブリダイズする核酸も包含される。
【００２１】
特異的にハイブリダイズするとは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、目的の核酸とハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１９〜４０ｍＭ、好ましくは１９〜２０ｍＭで、温度が５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が１９ｍＭで温度が６５℃の場合が最も好ましい。
【００２２】
上記のように、第２のオリゴヌクレオチドは、予め目的の長さのものとして調製し得るが、検出のために、標的となる試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを鋳型とする伸長反応を利用して標識することができる。その際、第１のオリゴヌクレオチド部分及びスペーサー部分（好ましくは第３のオリゴヌクレオチド部分）に連結した状態で10〜1000塩基長の第２のオリゴヌクレオチド部分を合成し、これをプライマーとして伸長反応が進行する。
【００２３】
すなわち、本発明の方法の一態様において、仲介オリゴヌクレオチドは、予め標識した試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと作用させた後、支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした複合体の標識を検出することによって、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを同定し、及び／またはその量を検出することができる。
【００２４】
あるいはまた、本発明の方法の別の態様において、仲介オリゴヌクレオチドは、標識していない試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと接触させ、伸長反応時に標識した後、支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした複合体の標識を検出することによって、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを同定し、及び／またはその量を検出することができる。
【００２５】
本発明の仲介オリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチド部分と第２のオリゴヌクレオチド部分とを直接連結させた構成のものとすることができる。あるいはまた、本発明の仲介オリゴヌクレオチドは、上記第１のオリゴヌクレオチド部分と第２のオリゴヌクレオチド部分との間にスペーサー部分を有する構成のものとすることもできる。
【００２６】
スペーサー部分を介在させる本発明の好ましい態様において、スペーサー部分は第３のオリゴヌクレオチド部分である。
【００２７】
第３のオリゴヌクレオチド部分は、第１のオリゴヌクレオチド部分と第２のオリゴヌクレオチド部分とを連結するスペーサー配列として機能し、支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドとも、また試料中の標的オリゴヌクレオチドとも相互作用しない配列を有する。第３のオリゴヌクレオチド部分の長さは、第１及び第２のオリゴヌクレオチド部分がそれぞれ支持体上の検出用オリゴヌクレオチド、標的オリゴヌクレオチドと結合するのを妨害しないようにするために、0〜1000塩基の範囲であることが好ましい。第３のオリゴヌクレオチド部分はハイブリダイズすることを前提とするものではないため、複数の仲介オリゴヌクレオチドを使用する場合にも、同じ配列であっても良い。
【００２８】
本発明の別の態様において、スペーサー部分は、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド等の他のポリマー構造を有していても良い。この場合、スペーサー部分は、10〜500nmの範囲の長さであることが好ましい。スペーサー部分がこうしたポリマー構造であっても、仲介オリゴヌクレオチドは上記と同様にして機能し得る。
【００２９】
本発明の方法は、上記支持体上には、それぞれ上記第１のオリゴヌクレオチド部分と特異的に結合し得る検出用オリゴヌクレオチドを１種以上固定する。検出用オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、またこれらの混合体であっても良く、場合によってはペプチド核酸であっても良い。検出用オリゴヌクレオチドの配列は、その全長が上記仲介オリゴヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチド部分と特異的に結合する、好ましくは相補的な配列であっても良いが、支持体に固定された末端を除く5〜95塩基が第１のオリゴヌクレオチド部分と特異的に結合する、好ましくは相補的な配列であっても良い。検出用オリゴヌクレオチドの長さは10〜100塩基の範囲であることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法は、上記構成の仲介オリゴヌクレオチドを、支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと接触させ、該検出用オリゴヌクレオチドとの結合を検出することによって、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを検出するものである。検出用オリゴヌクレオチドとの接触の際には、仲介オリゴヌクレオチドは全体で30〜1000塩基の長さ、10〜500nmの長さであることが好ましい。
【００３１】
検出用オリゴヌクレオチドを固定化する支持体としては、当技術分野で通常用いられるものであればいずれでも良く、特に限定するものではない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれら半導体材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。
【００３２】
例えば、支持体として、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の表面層を有する固体支持体を用いるのが好ましい。
【００３３】
上記固体支持体に用いられる基板の材料としては、例えば、シリコーン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂）、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられる。
【００３４】
固体支持体は、基板上に表面層を有する。この表面層により、核酸と共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定化することができる。
【００３５】
表面層は、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種から形成される。ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物としては、例えば、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたもの、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を挙げることができる。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されないが、軟ダイヤモンドを用いるのが好ましい。
【００３６】
基板が、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成されている場合は、基板上に新たに表面層を形成させる必要はないが、基板がそれ以外の材料で形成されている場合は、表面処理を施すことによりダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも１種の材料で形成される表面層を形成させる。
【００３７】
表面処理を施した基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
【００３８】
表面処理によって形成される表面層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００３９】
基板への表面処理は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Chemical Vapor Deposit）法、ＥＣＲＣＶＤ（Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit）法、ＩＣＰ（Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Electric Cyclotron Resonance）スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ（Electron Beam）蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００４０】
また、前記の基板材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））を形成することにより、表面層としてもよい。
【００４１】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００４２】
また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００４３】
基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（JIS B 0601）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のプローブ核酸を高密度で固定化できる点で好都合である。
【００４４】
また、固体支持体には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が設けられていてもよい。静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００４５】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；4,4',4''-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００４６】
静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。また、静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と表面層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００４７】
静電層を表面層と共有結合させて形成する場合には、例えば、表面層を有する基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、4,4',4''-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００４８】
また、静電層が施された基板に核酸と共有結合しうる官能基を導入する反応（例えば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬した後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、Ｎ−メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。
【００４９】
静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予めＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応をＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び／又はカルボジイミド類の存在下に行うことが好ましい。
【００５０】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸の固定化量がより向上する。
【００５１】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
固体支持体は、核酸と共有結合しうる官能基を有し得る。該官能基は、基板表面に化学修飾を施すことにより形成することができる。
【００５２】
前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基が挙げられる。
【００５３】
官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−Ｒ１−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ１は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、３−クロロアクリル酸、４−クロロ安息香酸；式：ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ２は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：Ｒ３−ＣＯ−Ｒ４−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基、Ｒ４は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ５−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ５は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００５４】
前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドやカルボジイミド（例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド）などの脱水縮合剤とＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することができる。
【００５５】
官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：Ｘ−ＯＣ−Ｒ６−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｘはハロゲン原子、Ｒ６は単結合又は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジハライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。
【００５６】
官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：ＨＯ−Ｒ７−ＣＯＯＨ（式中、Ｒ７は炭素数１〜１２の２価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸又はフェノール酸が挙げられる。
【００５７】
官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。
【００５８】
前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。
【００５９】
支持体として上記のような固体支持体を用いた場合には、検出用オリゴヌクレオチドを強固に固定化することができるため、検出感度と信頼性の高い診断が可能になる。本発明で用いるために好適な市販の支持体として、例えば東洋鋼鈑社製のジーンシリコン（登録商標）、ジーンスライド（登録商標）、ジーンダイヤ（登録商標）、ジーンメタル（登録商標）等が挙げられる。
【００６０】
本発明の方法は、具体的には、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと特異的に結合した仲介オリゴヌクレオチドのみを、未結合のオリゴヌクレオチドを除去した後に、支持体上に固定された検出用オリゴヌクレオチドと接触させれば良い。この場合、複数の仲介オリゴヌクレオチドを予め標識しておいても良い。あるいはまた、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡと特異的に結合し得る仲介オリゴヌクレオチドを伸長反応を利用して標識する場合等には、未結合の仲介オリゴヌクレオチドを除去することなく、そのまま検出用オリゴヌクレオチドと接触させることができる。
【００６１】
本発明の方法の一態様として、以下の手順が挙げられる。まず、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡをＰＣＲによって増幅し、その産物と仲介オリゴヌクレオチドの第３のオリゴヌクレオチド部分をハイブリダイズさせ、その際に伸長反応によって標識物質を導入する。これによって得られる仲介オリゴヌクレオチドのＰＣＲ産物と、ハイブリダイズを形成していない第１のオリゴヌクレオチド部分を支持体上に固定化した検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。次いで、検出用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしていない仲介オリゴヌクレオチドを全て洗い流し、ハイブリダイズした仲介オリゴヌクレオチドの標識をスキャナーなどで検出する。
【００６２】
試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡは、当技術分野で公知の方法によって抽出・調製できる。例えば、試料から単離された全ＲＮＡをＲＴプライマーおよび適当なバッファーを含む反応混合物中に添加する。プライマーアニーリングのためのインキュベート後、ＲＴバッファー、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅインヒビターおよび逆転写酵素をさらに添加する。ＲＮＡの逆転写が完了するようにインキュベーション後、ＲＴ産物を標識化プライマーを用いるＰＣＲ反応に付す。別法では、プライマーを標識せずに、標識化ｄＮＴＰをＰＣＲ反応混合物中でインキュベートしてもよい。ＰＣＲ増幅は、従来の技術に従って、ＤＮＡサーマルサイクラー中で行うことができる。
【００６３】
標識としては、核酸に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなど）、放射能標識（α−３２Ｐ、γ−３２Ｐ、３５Ｓなど）などが挙げられる。
【００６４】
支持体と接触させる場合、ハイブリダイズさせるオリゴヌクレオチドは、濃度が通常０．００２〜５０μＭ、好ましくは０．２〜０．５μＭとなるようにスポッティング用バッファーに溶解することによって、スポッティング溶液として調製する。このスポッティング溶液を、上記で調製した検出用オリゴヌクレオチドが固定化された支持体上に滴下し、インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning ２nd（J. Sambrookら, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。
【００６５】
インキュベーションは、通常２５〜９５℃、好ましくは４０〜６５℃で、通常０．０１〜１００時間、好ましくは１〜１６時間で行う。ハイブリダイゼーション工程においても、高湿度雰囲気下でインキュベーションを行うのが好ましい。最後に、支持体を洗浄し、乾燥後、ハイブリダイズした核酸に由来する標識を読みとることによりハイブダイゼーションの有無を検出することができる。
【００６６】
本発明はまた、
互いに異なる１種以上の検出用オリゴヌクレオチドが固定された支持体と、
該支持体上に固定された１種の検出用オリゴヌクレオチドと特異的に結合し得る第１のオリゴヌクレオチド部分を有する１種以上の上記仲介オリゴヌクレオチドと、
を含むことを特徴とする、試料中のＤＮＡ及び／またはＲＮＡの検出のためのキットを提供する。本発明のキットには、必要に応じて、標識のための蛍光色素、緩衝剤、デオキシヌクレオチド（dNTP）等の、本発明の方法を実施する上で必要となり得る試薬を含めることができる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６８】
A. 仲介オリゴDNAの合成
以下に示すヌクレオチド配列：
5'-AGTCCCCTGTACCCGCGACTATCCCTCTGTGACTGACTGACTGACTCAGACGTATCCAGAATCACGGTATCCGGCT-3'（配列番号１）を有する仲介オリゴヌクレオチドを合成した。この仲介オリゴヌクレオチドは、別途作製する基材上に固定化されるオリゴヌクレオチドと相補的な第１のオリゴヌクレオチド部分（下線）と、スペーサー部分である第３のオリゴヌクレオチド部分（下線なし）と、試料中のDNAと相補的な第２のオリゴヌクレオチド部分（二重下線）から構成される。
【００６９】
B. 検出用オリゴヌクレオチドの固定化
基材としてジーンシリコン（登録商標、東洋鋼鈑社製、3×3mm)を用いて、これに20％PEGに溶解した以下の配列を有する5μMの検出用オリゴヌクレオチド：
5'-ACAGAGGGATAGTCGCGGGTACAGGGGACTGATCACTGTTCTCAGCCACAATTACTGAGG-3'（配列番号２、3'末端がアミノ化されている）をスポットし、80℃で1時間乾燥した。この検出用オリゴヌクレオチドにおいて、下線箇所の配列が上記で合成した仲介オリゴヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチド部分の配列と相補的になっている。
【００７０】
乾燥後、2×SSC/0.2％SDSで15分間、更に95℃の2×SSC/0.2％SDSで洗浄した。超純水でリンスした後、遠心乾燥を行なった。
【００７１】
C. 標的オリゴヌクレオチドの調製
サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて温度変化を行い、λファージ由来のDNA（配列番号５）を標的DNAとしてPCRで増幅した（Takara  PCR  Amplification  kitを使用）。プライマーとして、以下のものを用いた。
Fw  5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3'（配列番号３）
Rv  5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3'（配列番号４）
【００７２】
次いで、10μMの仲介オリゴヌクレオチドを2μL、1mMのCy5-dCTPを1μL加え、95℃、5分間で変性させ、55℃で5分間アニーリングを行なった後、72℃で5分間の伸長反応を行なった。仲介オリゴヌクレオチドを加えない対照実験では、仲介オリゴヌクレオチド不存在下で、ＰＣＲ増幅の際にCy5-dCTPを取り込むことにより標識を行なった。
【００７３】
これに3MのNaOAcを5μL、100％EtOHを125μL加え、-20℃で10分間静置した後、4℃、14000rpmで15分間遠心分離した。上清を取り除き、70%EtOHでリンスし、4℃、14000rpmで遠心分離した後、上清を取り除き、ペレットを乾燥した。
【００７４】
D．ハイブリダイゼーション
上記Cで作製した標的ヌクレオチドに20×SSC、10％SDSをそれぞれ最終濃度5×SSC、0.5％SDSとなるように加え、さらに仲介オリゴヌクレオチドを加え、95℃で熱変性を行った後、55℃でアニーリングを行なった。上記Bで作製したジーンシリコンを0.2mLチューブに入れ、50℃で3時間静置し、ハイブリダイゼーションを行なった。
【００７５】
仲介オリゴヌクレオチドを用いない対照実験においては、仲介オリゴヌクレオチドの5’末端をアミノ化したオリゴヌクレオチドをプローブとして、ジーンシリコンに前記Bと同様にしてスポットして固定化したアレイに対し、前記標的オリゴヌクレオチドを同様にしてハイブリダイズした。
【００７６】
E. ハイブリダイゼーションの有無の検出
チューブからシリコンを取り出し、2×SSC/0.2％SDSでリンスした後、2×SSCでリンスした。その後、すばやく遠心乾燥を行い、FLA8000(フジフィルム社製)でスキャンを行なった。
【００７７】
仲介オリゴヌクレオチドの有無で比較を行なった結果を図４に示す。図４から明らかなように、仲介オリゴヌクレオチドを加えることで検出強度が強くなり、視覚的にはっきり確認することができた。これに対して仲介オリゴヌクレオチドを用いない場合は、蛍光強度が弱く、用いた条件下では蛍光を確認することができなかった。
【００７８】
仲介オリゴヌクレオチドを加えることでPCR産物の二本鎖再形成を阻害し、さらに検出用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの効率が上がり、それによって検出強度を高めることができた。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】従来のPCR産物をそのまま用いたハイブリダイゼーションを模式的に示す。
【図２】本発明の仲介オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションを模式的に示す。
【図３】本発明の仲介オリゴヌクレオチドの構造を模式的に示す。
【図４】本発明の仲介オリゴヌクレオチドの非存在下（左）及び存在下（右）におけるハイブリダイゼーション後のスキャナーによる検出画像を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１：仲介オリゴヌクレオチド
配列番号２：検出用オリゴヌクレオチド
配列番号３：PCRのためのフォワードプライマー
配列番号４：PCRのためのリバースプライマー
配列番号５：λファージ由来のＤＮＡ
【図１】
2006020591.tif 000003
【図２】
2006020591.tif 000004
【図３】
2006020591.tif 000005
【図４】
2006020591.tif 000006
【配列表】
2006020591000001.app