(57)【要約】【課題】  人（動物）の免疫機能を向上させることと、アレルギー症状を改善（治癒）することを課題とする。【解決手段】  麹菌を用いて大豆を発酵させた培養物中にエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）菌株に属する乳酸菌、即ち、エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１菌株により達成される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１菌株である、乳酸菌。
【請求項２】
１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基から１４６２番目の塩基までの塩基配列が下記：
TTAAAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGG
AGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAAC
ACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTG
ATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAG
GGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGAC
GAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGG
ATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA
CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCC
CGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGT
GAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGC
GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCC
CTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACG
GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTG
ACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA
TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCC
GGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT
GGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAA
CTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC                 (1462塩基)
で表されるものである、請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
植物性食品から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳酸菌。
【請求項４】
前記植物性食品が豆科植物またはこれを発酵させたものである、請求項３に記載の乳酸菌。
【請求項５】
前記植物性食品が大豆または発酵させた大豆である、請求項４に記載の乳酸菌。
【請求項６】
ナチュラルキラー細胞を活性化させるのに用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌。
【請求項７】
インターフェロンガンマまたはイムノグロブリンＡの生成を増進させるのに用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌。
【請求項８】
インターフェロンガンマの生成を増進させることにより、アレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌。
【請求項９】
インターフェロンガンマの生成を増進し１型ヘルパーＴ細胞を増加させることによりアレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる、請求項８に記載の乳酸菌。
【請求項１０】
インターフェロンガンマの生成を増進し１型ヘルパーＴ細胞を増加させて２型ヘルパーＴ細胞の生成を抑制することにより、アレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる、請求項９に記載の乳酸菌。
【請求項１１】
ナチュラルキラー細胞を活性化させるのに用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌の使用。
【請求項１２】
インターフェロンガンマまたはイムノグロブリンＡの生成を増進させるのに用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌の使用。
【請求項１３】
インターフェロンガンマの生成を増進させることにより、アレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌の使用。
【請求項１４】
インターフェロンガンマの生成を増進し１型ヘルパーＴ細胞を増加させることによりアレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる、請求項１３に記載の乳酸菌の使用。
【請求項１５】
インターフェロンガンマの生成を増進し１型ヘルパーＴ細胞を増加させて２型ヘルパーＴ細胞の発現を抑制することにより、アレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる、請求項１４に記載の乳酸菌の使用。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌を用いることを含んでなる、人を含む動物の免疫機能を向上させる方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌を用いることを含んでなる、人を含む動物のアレルギー症状を治療する方法。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌またはその処方物を、人を含む動物に投与することによる、人を含む動物の免疫機能を向上させる方法。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌またはその処方物を、人を含む動物に投与することによる、アレルギー症状の治療方法。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳酸菌を含んでなる、乳酸菌製剤。
【請求項２１】
他の乳酸菌、他の乳酸菌製剤、ビフィズス菌、ビフィズス菌製剤をさらに含んでなる、請求項２０に記載の乳酸菌製剤。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の乳酸菌製剤を含んでなる、免疫機能向上剤。
【請求項２３】
請求項２０または２１に記載の乳酸菌製剤と、薬学上許容される担体または添加剤とを含んでなる、免疫機能向上剤。
【請求項２４】
請求項２０または２１に記載の乳酸菌製剤を含んでなる、抗アレルギー剤。
【請求項２５】
請求項２０または２１に記載の乳酸菌製剤と、薬学上許容される担体または添加剤とを含んでなる、抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、特にエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌およびそれを用いた乳酸菌製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、発酵産業でよく利用されている菌体である。例えば、我が国の伝統的大豆発酵製品として味噌があるが、味噌と乳酸菌とは非常に密接な関係があるとされている。具体的には、麦味噌または豆味噌において、麹の添加または各仕込みの段階に、乳酸球菌であるエンテロコッカスまたはペディオコッカス（Pediococcus）は自然発酵促進剤またはスターターとして添加され、味噌の風味等に重要な役割を果たすことが報告されている。また、乳酸菌は、人（動物）の腸内細菌として存在し、整腸作用および過剰摂取されたコレステロールの体外排出等、体内調整物質としてよく知られている。
【０００３】
近年、人（動物）は生活環境の変化等によるストレスが原因で腸管粘膜免疫が低下し、アレルギー性疾患等が非常に増加しているとの報告がなされている（非特許文献１）。アレルギー性疾患患者はヘルパーＴ細胞の１型ヘルパーＴ細胞（以下、「Ｔｈ１」という）と２型ヘルパーＴ細胞（以下、「Ｔｈ２」という）の存在バランスが崩れＴｈ２が優位な状態となっているのではないかとと云われている。
【０００４】
このようなアレルギー性疾患に対処するために種々の乳酸菌製剤が開発されているが、これら乳酸菌の殆どが桿菌であるラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する菌体がほとんどである。例えば、特許文献１によれば、抗アレルギー剤として、ラクトバチルス・アシドフィスＣＰ１６１３株および同Ｌ９２株、またはラクトバチル・ファーメンタムＣＰ３４株に属する乳酸菌を有効成分として含んでなる、抗アレルギー剤が開示されている。
【０００５】
また、植物性由来の乳酸菌製剤に関してはラクトバチラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）属に属する菌体がほとんどであり、植物性由来の乳酸菌（球菌）の単離およびそれを用いた乳酸菌製剤は未だ開発されていない。特に、味噌等の植物性食品（植物性発酵食品）由来の有用な乳酸球菌の選択と、このような乳酸球菌のプロバイオティクスとしての利用は十分になされていないのが現状である。
従って、現在、乳酸球菌、とりわけ植物性食品（特に植物性発酵食品）由来の新規有用な乳酸菌の選択と、それを用いた乳酸菌製剤の開発が要求されている。
【特許文献１】特開２００４−２６７２９号
【非特許文献１】「粘膜免疫学の最前線」吉開泰信編；１１６〜１２９頁（医薬ジャーナル社発行）
【発明の開示】
【０００６】
本発明者等は、本発明時において、麹菌を用いて大豆を発酵させた培養物中に乳酸菌の一種であるエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１株の菌体を見出し、その菌体が人（動物）の免疫機能を向上させることと、アレルギー症状を改善（治癒）するとの知見を得た。よって、本発明はかかる知見によるものである。従って、本発明は、新規乳酸菌であるエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１株とその利用方法を提供し、人（動物）の免疫力の向上とアレルギー症状の治癒を高い次元で達成することを目的とするものである。
【０００７】
従って、本発明によれば、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）菌株に属する乳酸菌、即ち、エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１菌株を提供することができる。
【０００８】
本発明による新規乳酸菌によれば、この新規乳酸菌またはそれを処理した製剤物を医薬として投与または食品に添加することにより、人（動物）のＮＫ細胞活性を高め、腸管パイエル板のインターフェロンガンマ（以下、「ＩＦＮ−γ」という）とイムノグロブリンＡ（以下、「ＩｇＡ」という）の生成を増進させて、免疫力を高い次元で向上させる効果がある。また、この新規乳酸菌またはそれを処理した製剤物が医薬物として投与されると、ＩＦＮ−γの生成を増進させＴｈ１を有意に増強し、Ｔｈ２の抑制しアレルギー疾患を高い次元で改善し治癒することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
微生物
本発明による新規微生物はエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１であり、この菌体は、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）属に属する乳酸菌である。
【００１０】
微生物の寄託
エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１は、国際寄託機関ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection (ATCC)：Manassas,VA 20110−2209 USA）に寄託されている。この寄託の寄託者は本出願人と同じ株式会社ニチモウである。また、この寄託の原寄託は平成１６年６月２８日付け行われ、受託番号はＰＴＡ-６１１２である。
【００１１】
菌学的性質および同定
菌学的性質
本発明によるエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１は発酵大豆（商品名「イムソイ」）より分離された微生物である。また、特定の糖類（ラフィノース、グリセロール、ソルビトール）に対する質化性が典型的なエンテロコッカス・フェシウム（“Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” Vol.2 (1986) Williams & Wilkins.参照）と相違し、さらにそれらのうちラフィノースとソルビトールがエンテロコッカス・フェシウムＪＣＭ  ５８０４基準株と相違する。本発明によるエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１は下記表１の糖類に対して次のような資化性（＋は陽性、−は陰性）を示す。
【００１２】
【表１】
2006067881.tif 000002
【００１３】
エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１と前記エンテロコッカス・フェシウムＪＣＭ  ５８０４基準株および典型的なエンテロコッカス・フェシウムとの菌学的性質とを比較すると表２の通りになる。
【表２】
2006067881.tif 000003
１）表２中、ＩＳ−１株およびＪＣＭ  ５８０４標準菌株について標記された「（＋）」は陽性を、「（−）」は陰性を示す。
２）表２中、典型的なエンテロコッカス・フェシウムについて標記された「＋」は90％以上が陽性を、「（＋）」は80-89％が陽性を、「ｄ」は21-79％が陽性を、「（−）」は11-20％が陽性を、「−」は90％以上陰性を示す。
３）表２中は、Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1994), Williams & Wilkinsおよび一部は食品衛生検査指針を参考にした。
【００１４】
菌学的同定
上記した菌学的性質および１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基から１４６２番目の塩基までについてシーケンスした結果エンテロコッカス・フェシウム標準菌株と９９．６６％の相同性があり、本発明の菌株はエンテロコッカス・フェシウムと同定された。
エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１菌株は、下記の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基から１４６２番目の塩基までにおける塩基配列：
TTAAAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGG
AGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAAC
ACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTG
ATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAG
GGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGAC
GAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGG
ATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA
CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCC
CGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGT
GAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGC
GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCC
CTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACG
GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTG
ACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA
TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG AGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCC
GGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT
GGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAA
CTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC(1462塩基)を有する。
【００１５】
培養／単離
採取
本発明によるエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１菌株は、好ましくは植物性食品から採取されるものが好ましい。植物性食品としては、大豆・小豆・及びその他の穀類などの豆科植物が好ましい。原料としては、豆科植物自体のみならず、加工された豆科植物であってもよく、これらの混合物であってもよい。
【００１６】
豆科植物の中でも好ましいのは大豆である。大豆は、その種類を問わず、また加工された大豆、大豆を原料とした食品、およびその他の物品製造過程で生じた主産物、副産物のいずれのものであってもよい。具体的には、大豆（種類、粒色を問わない）、脱皮大豆、抽出大豆、分離大豆、脱脂大豆、大豆タンパク質、醤油油、醤油粕、たまり粕、味噌、豆味噌、納豆、発酵大豆（麹菌などの、微生物を用いて発酵された大豆も含んでなる）、大豆絞り粕、大豆蒸煮液、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００１７】
培地
本発明によるエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１菌株は、天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源の具体例としては、肉エキス、ペプトン、大豆粉、大豆加水分解物、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が挙げられ、炭素源の具体例としては、グルコース、フラクトース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、水飴、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、等が挙げられる。このほか、無機質として、例えば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、炭酸カルシウム、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その他を添加することができる。
培養温度は１０〜５０℃、更に好ましくは２５〜４５℃であり、培養時間は６〜３６時間程度であり、通気振盪、通気撹拌してもよい、培地のｐＨは３〜１０好ましくは５〜７である。
【００１８】
単離精製
培養終了後、菌胆を採取し蒸留水もしくは生理食塩水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりこの操作を繰り返し、遠心分離または濾過等により菌体を採取する。
【００１９】
用途
免疫力向上／アレルギー性疾患の治療
本発明による乳酸菌（乳酸菌製剤）は、人を含む動物の免疫機能を向上させ、またはアレルギー性疾患を予防し、改善（治癒）する効果を示す。よって、本発明の好ましい態様によれば、本発明による乳酸菌は、ナチュラルキラー細胞を活性化させるのに用いられる。また、インターフェロンガンマまたはイムノグロブリンＡの生成を増進させるのに用いられる。そして、本発明による乳酸菌は、インターフェロンガンマの生成を増進させることにより、アレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられ、より好ましくは、インターフェロンガンマの生成を増進し１型ヘルパーＴ細胞を増加させることによりアレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる。また、好ましくはインターフェロンガンマの生成を増進し１型ヘルパーＴ細胞を増加させて２型ヘルパーＴ細胞の生成を抑制することにより、アレルギー症状を緩和または治癒するのに用いられる。
【００２０】
乳酸菌製剤
本発明による乳酸菌は、免疫機能向上剤または抗アレルギー剤として利用することができ、健康食品、または医療用免疫機能向上剤または抗アレルギー剤の有効成分として利用される。
本発明による単離した菌体は、その生菌をそのまま使用し、または乳製品、果実類、穀物またはこれらの加工物（食品）にこの生菌を付与し乳酸発酵させた状態の発酵物（処理物）として利用することができる。本発明による乳酸菌製剤は、このような生菌または発酵物としての利用形態をも含むものである。
【００２１】
また、本発明による乳酸菌製剤は、単離した菌体を、加熱、紫外線照射、ホルマリン処理等により不活性化して投与に適した剤形にすることもできる。分離された生菌体、死菌体はさらに摩砕、破砕処理し、得られた処理物を必要により加熱滅菌、無菌濾過した後に、その濾液を凍結乾燥して製剤とすることもできる。菌体の処理物は、例えば、上記摩砕物、破砕物、それらからの抽出液、凍結乾燥品等の形態が挙げられる。
【００２２】
本発明の乳酸菌製剤は単体でも使用することができるが、他の乳酸菌製剤、ビフィズス菌製剤、真菌製剤等の微生物製剤と混合して使用することもできる。乳酸菌製剤の具体例としては、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属等が挙げられる。ビフィズス菌製剤の具体例としてはビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属のビフィズス菌製剤があげられる。真菌製剤の具体例としては糸状菌であるアスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicilium）属、リゾプス（Rhizopus）属、酵母、および担子菌の真菌製剤が挙げられる。
【００２３】
また、本発明による乳酸菌製剤は、乳酸菌製剤同士の混合のみならず、本発明による乳酸菌と他の微生物とを共培養した形態のものをも包含する。さらに、本発明による乳酸菌製剤は、本発明による乳酸菌と他の免疫力を高める物質とを混合して免疫力を相乗的に高めた製剤をも包含する。
【００２４】
本発明による乳酸菌製剤は、経口および非経口（例えば、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で、人を含む動物に投与することができる。
本発明による乳酸菌製剤は、投与経路に応じた適切な剤形として提供されることが好ましい。例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠等の経口剤、直腸投与剤等の種々に調製することが好ましい。
【００２５】
乳酸菌製剤としての効果をより確実なものとするために、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等、の薬学上許容される担体または添加剤を適宜選択し、組み合わせることによって製造することが望ましい。使用可能な無毒性の上記添加剤は、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２６】
本発明による乳酸菌製剤の投与量は、症状や年齢、性別等を考慮し、個々の場合に応じて適宜決定することが好ましい。
【実施例】
【００２７】
本発明の内容を、以下の実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの内容に限定して解釈されるものではない。
【００２８】
実施例１
エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１乾燥菌体（生菌）の製造
エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１を５ｍＬの小培養用培地（表２参照）に接種し、３７℃で２４時間静置培養した。その乳酸菌培養物の全量を２００ｍＬの三角フラスコに入った１００ｍＬのＭＲＳ培地（表３参照）に加えて３７℃で２４時間振盪培養（１５０ｒｐｍ）して、乳酸菌の前培養物を作った。その全量を２Ｌの三角フラスコに入った１ＬのＭＲＳ培地に加えて３０℃で２４時間振盪培養（１５０ｒｐｍ）した。培養後、６５００ｒｐｍで２５分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く懸濁させ、６５００ｒｐｍで２５分間遠心分離したのち、上清を集め菌体を集めた。これをさらに１回行った。これを凍結乾燥し、乾燥菌体を０．８３ｇ得た。
【表３】
2006067881.tif 000004
【表４】
2006067881.tif 000005
【００２９】
試験例１
本試験例では、実施例１で得たエンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１菌体を用いて、マウスの脾臓ＮＫ細胞活性、腸管パイエル板ＩＦＮ−γおよび腸管パイエル板ＩｇＡの増加を検証した。試験群は下記の３群で比較した
（１）コントロール群 （コントロール）
（２）エンテロコッカス・フェシウム乾燥菌体（生菌）群（LA）
（３）エンテロコッカス・フェシウム乾燥菌体（死菌・熱殺菌）群（LAD）
【００３０】
（２）および（３）は乳酸菌数をそれぞれ同じ数に調製し、餌に０．５％重量％含有するように粉末飼料ＣＥ−２に混和し、固形ペレット状に成形して飼料とした。添加した各製剤１００ｇにおける乳酸菌数および賦形剤の添加量は表４の様に調製した。
【表５】
2006067881.tif 000006
マウスは６週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（日本クレア株式会社製）を用い、次の環境で飼育した。
（１）設定温湿度：２３±２℃、５５±１０％
（２）空調方式：換気（１５回／時間）
（３）照明時間：８：００ａ．ｍ．〜６：００ｐ．ｍ．
（４）飼育設備：プラスチックケージ
（５）給水：井水（３ｐｐｍ塩素添加）の自由摂取
【００３１】
７日間の予備飼育後、本発明のエンテロコッカス・フェシウム乾燥菌体を用いた試験群等は表４に示すように乾燥菌体をデキストリンで希釈した物を餌に０．５％添加し、粉末飼料ＣＥ−２と良く混和し固形ペレット状に成形した飼料として２８日間連続投与した。
投与開始日と、その後１週間ごとに全マウスの体重と接餌量を測定し、餌の投与終了後から１２時間の絶食を行い、翌日全マウスにネンプタール麻酔を施して解剖した。
【００３２】
マウスから脾臓を摘出後、スライドグラスを用いて押しつぶして細胞を回収し、培養液で洗浄した後ステンレスメッシュで濾過し、細胞浮遊液として用いた。この液を１６００ｒｐｍ（５℃）で２時間遠心後、さらに１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ―１６４０培地中に浮遊させ、脾臓ＮＫ細胞活性を５１Ｃｒ遊離法により測定した。
【００３３】
パイエル板は小腸より摘出した後、スライドグラスで押しつぶして細胞を回収し、培養液で洗浄した後にステンレスメッシュで濾過した。これを遠心分離し、沈殿物をバーコールを用いた比重遠心を行い、界面に残った細胞を回収し、さらに培養液で洗浄して５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に調製した。調製した細胞を１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地に調製し、２４穴プレートに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｗｅｌｌとなるように分注した後、ＣｏｎＡ５０μｇ／ｍＬを最終濃度になるように１００μＬ加えて、３７℃で５％ＣＯ２インキュベータ内において２４時間培養した。培養後、各ｗｅｌｌの細胞浮遊液を０．４５μｍシリンジフィルターで濾過し、濾過液を測定用とした。ＩＦＮ−γおよびＩｇＡの測定は市販キットを用いて測定した。
【００３４】
体重の測定結果は表６、接餌量の測定結果は表７に示すとおりとなり、本発明の乳酸菌製剤に対するマウスの体重および接餌量は他の群と有意差がないことが分かった。
【表６】
2006067881.tif 000007
【表７】
2006067881.tif 000008
【００３５】
脾臓ＮＫ細胞活性、腸管パイエル板ＩＦＮ−γ産生能、腸管パイエル板ＩｇＡ産生能の測定結果は表８に示すとおりとなった。すなわち、脾臓ＮＫ細胞活性はコントロール群と比較してＬＡ群は有意に高くなり（Ｐ＜０．０５）、ＬＡＤ群は有意ではないものの高くなった。腸管パイエル板ＩＦＮ−γの産生能についてもコントロール群と比較してＬＡ群は有意に高くなり（Ｐ＜０．０１）、ＬＡＤ群は有意ではないものの高くなった。ＩＦＮ−γはＴｈ１によって分泌されるサイトカインで、この上昇はＴｈ２が減少しＴｈ１が増加する事を意味し、本発明の乳酸菌製剤を摂取することによってアレルギー症状を緩和する事ができる。パイエル板ＩｇＡ産生能に関してはコントロール群と比較してＬＡ群、ＬＡＤ群ともに有意に高くなった（Ｐ＜０．０１）。
【表８】
2006067881.tif 000009
【００３６】
エンテロコッカス・フェシウムＩＳ−１株のDNAシーケンスデータ
（１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の配列）
TTAAAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGG
AGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAAC
ACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTG
ATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAG
GGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGAC
GAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGG
ATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA
CGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCC
CGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGT
GAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGC
GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCC
CTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACG
GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTG
ACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA
TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG AGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCC
GGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT
GGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAA
CTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC
ACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACC                       (1462 bases)