(57)【要約】  【課題】本発明は、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の治療剤および予防剤を提供することを目的とする。  【解決手段】本発明により、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノン、またはその水和物を有効成分として含む自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の治療剤および予防剤が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンK２またはその水和物を有効成分として含む自己免疫疾患治療用または自己免疫疾患予防用医薬組成物。
【請求項２】
自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ビタミンK２がメナテトレノンである請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ビタミンK２またはその水和物を有効成分として含む医薬組成物を患者に有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法または予防方法。
【請求項５】
自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項４記載の方法。
【請求項６】
ビタミンK２がメナテトレノンである請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
自己免疫疾患治療剤または予防剤を製造するためのビタミンK２またはその水和物の使用。
【請求項８】
自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項７記載の使用。
【請求項９】
ビタミンK２がメナテトレノンである請求項７または８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メナテトレノンを有効成分とする多発性硬化症治療剤および多発性硬化症予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、外部由来の病原体に対して、これらを認識して排除するという機能を有する。しかし免疫系に何らかの異常があると、免疫系は自己の体や組織を異物のように認識して、自己抗体やリンパ球を作り、自己の体や組織を攻撃することがある。このような免疫系の異常に起因する疾患を、自己免疫疾患という。多発性硬化症（multiple sclerosis、MS）は自己免疫疾患の一つである。多発性硬化症では、免疫系による中枢神経系の攻撃に起因して、神経を覆っている髄鞘がはがれて脳と脊髄に硬化斑が形成するという特徴を有する。このような中枢神経系の脱随疾患でもある多発性硬化症は、主に若年成人で発症し、硬化斑のできる場所と大きさにより、種々の臨床症状を呈する。典型的な症状は、病変の場所により大きく異なるが、複視、眼振、運動麻痺、尿失禁などである。また、多発性硬化症の症状は、再発や寛解を繰り返すことが多いことが知られている。
【０００３】
多発性硬化症の治療は、急性期においては副腎皮質ホルモンが一般に用いられるが、副腎皮質ホルモンの投与によって十二指腸潰瘍、高血圧、興奮、肥満、糖尿病などの副作用が生じることが知られている。副作用の程度によっては、多発性硬化症の治療において副腎皮質ホルモンの使用を中止する必要が生じる。そのため、多発性硬化症患者の治療に用いるための、有効性が高く、かつ、安全性に優れた薬剤の開発が強く望まれている。
【０００４】
ところで、ビタミンKは、ビタミンK依存性タンパク質のＮ末端に存在するグルタミン酸残基を、生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸（GLA）に変換する酵素であるγ−グルタミルカルボキシラーゼの補酵素である。そして、ビタミンKは血液凝固ＩＩ因子（プロトロンビン）、ＶＩＩ、ＩＸやＸ等のビタミンK依存性タンパク質の生合成に不可欠なビタミンである。
【０００５】
ビタミンKファミリーは天然体のK１（フィトナジオン）、K２（メナキノン、メナテトレノン）や合成体のK３（メナジオン）から構成される。なかでも、ビタミンK２、特にメナテトレノンは低プロトロンビン血漿の治療薬および骨粗鬆症の治療薬として販売されている（非特許文献１）。
【０００６】
ビタミンK２、特に、メナテトレノンが多発性硬化症の治療に有効であることは、これまでに報告されていなかった。
【非特許文献１】今日の治療薬2004、水島裕編集、南江堂、386, 398-399頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症に対する有効性が高く、安全性に優れた医薬組成物、治療方法および予防方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、自己免疫疾患のモデル動物である実験的自己免疫性脳脊髄炎ラットの症状が、メナテトレノンの投与により改善することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）ビタミンK２またはその水和物を有効成分として含む自己免疫疾患治療用または自己免疫疾患予防用医薬組成物。
（２）ビタミンK２またはその水和物を有効成分として含む医薬組成物を患者に有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法または予防方法。
（３）自己免疫疾患治療剤または予防剤を製造するためのビタミンK２またはその水和物の使用。
上記（１）〜（３）において、ビタミンK２はメナテトレノンであってもよい。
上記（１）〜（３）において、自己免疫疾患としては、例えば多発性硬化症が挙げられる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の治療剤および予防剤、さらに好ましくは多発性硬化症の治療剤および再発の予防剤としてのビタミンK２、好ましくはメナテトレノンの有効性が確認された。本発明の治療剤および予防剤を用いて、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の患者の治療および予防、さらに好ましくは治療および再発の予防が可能となった。
また、本発明により、有効性が高く、かつ安全性に優れた、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の治療剤および予防剤、さらに好ましくは治療剤および再発の予防剤を得ることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【００１２】
１．本発明の概要
本発明者は、自己免疫疾患のモデル動物である実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）ラットにおいて、ビタミンK２の一種であるメナテトレノンの投与によりEAE症状が改善するという知見を見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノンを有効成分として含む自己免疫疾患用医薬組成物、特に、自己免疫疾患治療剤および自己免疫疾患予防剤に関するものである。また、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノンを有効成分として含む医薬組成物を患者に有効量投与することを特徴とする、自己免疫疾患の治療方法及び予防方法、並びに、自己免疫疾患治療剤および予防剤を製造するためのビタミンK２、好ましくはメナテトレノンの使用も本発明の範囲である。本発明において、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノンには、その水和物も含まれる。
【００１３】
本明細書において「自己免疫疾患」は、例えば、細胞性自己免疫疾患、リウマチ、多発性硬化症、神経自己免疫疾患（ギランバレー症候群、神経ベーチェット病等）、悪性貧血、I型（インスリン依存型）糖尿病、全身エリテマトーデス（SLE）、炎症性腸疾患（IBD）およびシェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、グッドバスチャー症候群、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、糸球体腎炎、重症筋無力症、橋本病からなる群から選択される少なくとも一つを含むが、これらに限定されるものではない。本発明において、自己免疫疾患は、好ましくは多発性硬化症である。
本明細書において「EAE」は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）を意味する。EAEは中枢神経系の脱髄性疾患であり、特に多発性硬化症（MS）によく似た症状を示し、自己免疫疾患に対する薬剤の効果を判断するために、ラットやマウスにおいて実験的に発症させた自己免疫性の脳脊髄炎である。すなわち、EAEを発症させた動物は、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の疾患動物モデルとして薬剤の研究に用いられている。EAEを発症させる動物種は、ラット、マウスなどの齧歯類を用いる場合が多いが、これらに限定されるものではない。EAEモデル動物は、例えば、H37Ra結核菌毒素2 mg/mlを溶解したFreundのアジュバントと共に200μgのミエリン塩基性タンパク質で動物を免疫することにより作製することができる（実施例１参照）。
【００１４】
２．ビタミンK２
ビタミンK２（メナキノン、menaquinone）は、生体中において腸内細菌により合成されるため、構造の類似する種々の同属体が存在することが知られている。メナキノンの構造式を以下の式(I)に示す。
【化１】
2006290772.tif 000002
式(I)中、ｎは１〜７の整数を示す。本発明で使用するビタミンK２のうち、好ましくは代表的なビタミンK２である、ｎ＝４（メナキノン−４）のオールトランス体、メナテトレノンである。
【００１５】
本発明で使用するメナテトレノンとは、化学名２−メチル−３−テトラプレニル−１，４−ナフトキノン（2-methl-3-tetraprenyl-1,4-naphthoquinone）であり、その構造式を以下の式(II)に示す。
【化２】
2006290772.tif 000003
【００１６】
メナテトレノンは黄色の結晶又は油状の物質であり、におい及び味はなく、光により分解しやすい。また、水にはほとんど溶けない。メナテトレノンは、ビタミンＫ−ＩＩ、ビタミンK2（ＶＫ２）、ＶＫ−ＩＩとも称される。
【００１７】
メナテトレノンなどのビタミンK２の薬理作用は、血液凝固因子（プロトロンビン、VII、IX、X）の生合成過程において、グルタミン酸残基を、生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸に変換する際のカルボキシル化反応に関与するものである。すなわち、メナテトレノンなどのビタミンK２の薬理作用は、正常プロトロンビン等の肝合成を促進し、生体の止血機構を賦活して生理的に止血作用を発現するものである。
【００１８】
本発明の医薬組成物の有効成分であるビタミンK２、好ましくはメナテトレノンは、無水物であってもよいし、水和物を形成していてもよい。また、メナテトレノンには結晶多形が存在することもあるが特定の結晶形に限定されず、いずれかの結晶形が単一であってもよいし、結晶形混合物であってもよい。さらに、本発明に使用するビタミンK２、好ましくはメナテトレノン、またはその水和物が生体内で分解されて生じる代謝物も本発明に包含される。
【００１９】
本発明に使用するビタミンK２またはその水和物は、公知の方法で製造することができ、代表的な例としては、特開昭４９−５５６５０号公報に開示される方法によって、容易に製造することができる。また、合成メーカーから市販品として入手することもできる。
また、本発明に使用するメナテトレノンまたはその水和物も、公知の方法で製造することができ、代表的な例として、特開昭４９−５５６５０号公報に開示される方法によれば容易に製造することができるほか、合成メーカーから市販品として入手することもできる。また、メナテトレノンはカプセル剤（例えば、「ケイツーカプセル」、「グラケーカプセル」（以上、エーザイ株式会社製））、注射剤（例えば、「ケイツーN注」（エーザイ株式会社製））、シロップ剤（例えば、「ケイツーシロップ」（エーザイ株式会社製））等の製剤としても入手できる。
【００２０】
さらに、本発明に使用するビタミンK２には、体内で代謝されてビタミンK２、好ましくはメナテトレノンとなる物質を用いることもできる。体内で代謝されてメナテトレノンとなる物質は特に限定されないが、例えば、ビタミンK１、フィトナジオン等が挙げられる。フィトナジオンはケーワンカプセル（商品名）（エーザイ株式会社製）、ケーワン錠（商品名）（エーザイ株式会社製）またはケーワン散（商品名）（エーザイ株式会社製）として入手することができる。
【００２１】
３．自己免疫疾患用医薬組成物
本発明は、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノン、またはその水和物を有効成分として含む自己免疫疾患用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、自己免疫疾患治療剤および／または自己免疫疾患予防剤として使用することができる。
前述の通り、本発明は、ラットEAEの系においてメナテトレノンを投与すると、EAEの症状が改善するという知見に基づいて、見出されたものである。EAE発症動物は多発性硬化症などの自己免疫疾患の動物モデルとして用いられていることから、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノンまたはその水和物を含む医薬組成物は自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の治療剤および予防剤として有効であると言える。
すなわち、本発明の自己免疫疾患用医薬組成物は、多発性硬化症治療剤および多発性硬化症予防剤として使用することができる。
【００２２】
ここで、本明細書において「自己免疫疾患治療剤」とは、自己免疫疾患に罹患した患者の症状の進行を抑制、低減または消失させる作用を有する自己免疫疾患用医薬組成物をいう。また、本明細書において「多発性硬化症治療剤」とは、多発性免疫に罹患した患者の症状の進行を抑制、低減または消失させる作用を有する多発性硬化症用医薬組成物をいう。
本明細書において「自己免疫疾患予防剤」とは、自己免疫疾患の発症を予防する作用を有する自己免疫疾患用医薬組成物をいう。本発明において、自己免疫疾患予防剤は、好ましくは自己免疫疾患の再発を予防する作用を有する自己免疫疾患用医薬組成物を意味する。また、本明細書において、「多発性硬化症予防剤」とは、多発性硬化症の発症を予防する作用を有する多発性硬化症用医薬組成物をいう。本発明において、多発性硬化症予防剤は、好ましくは多発性硬化症の再発を予防する作用を有する多発性硬化症用医薬組成物を意味する。
【００２３】
ここで、「予防」には、再発を完全に防止する場合のほか、再発はあっても再発までの期間が、臨床的に観察される再発までの統計的な期間や本発明の医薬組成物を患者に投与しない場合の再発までの期間よりも、延期される場合も含まれる。
【００２４】
特に、多発性硬化症においては、再発の確率が高いことから、本発明の医薬組成物は多発性硬化症の再発予防にきわめて有用である。
【００２５】
本発明の医薬組成物の効果の有無は、多発性硬化症の症状の改善、体重減少の改善、自己免疫反応の改善、病理組織像の改善等の所見により判断することができる。特に多発性硬化症治療の効果の有無は、磁気共鳴画像(MRI)検査またはコンピューター断層撮影(CT)を用いた病巣の検出、脳脊髄液検査、誘発電位の測定などにより判断することができる。
脳脊髄液検査は、疾病により誘発される炎症反応を、脳脊髄液中のリンパ球数の増加、タンパク質の増加、IgGの増加、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）の増加などを指標に用いて検査する方法である。
誘発電位の測定は、脱髄による電気伝導速度の遅延を、脳波で捉える方法である。
また、自己免疫疾患では、MHCクラスII分子の発現が亢進していることが知られている（Youssef, S. et al. Nature. 2002, 420: 78-84、Stuve, O et al. J. Immunol. 2002, 169: 6720-6732）。したがって、本発明の医薬組成物の効果の有無は、EAEモデル動物を用いた場合、免疫組織化学やウェスタンブロットの手法を用いて、グリア細胞または脊髄などにおけるMHCクラスII分子の発現抑制を解析することで判断することもできる。また、培養したミクログリアやアストロサイトに種々の刺激を加えた際に誘導されるiNOS (inducible NO synthase)の発現を、本発明の医薬組成物の存在下でどの程度抑制するかを評価することによっても、効果を判断することができる（ Koprowski, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993, 90: 3024-3027、Ding, M. et al. J. Immunol. 1998, 160:2560-2564）。
【００２６】
本発明のビタミンK２、好ましくはメナテトレノンまたはその水和物を有効成分として含む医薬組成物は、通常、適当な添加剤を混和し製剤化したものを使用する。
上記添加剤としては、一般に医薬に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。
【００２７】
上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等を挙げることができ、
上記結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を挙げることができ、
上記滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、コロイドシリカ等を挙げることができ、
上記崩壊剤としては、例えば結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができる。
上記着色剤としては、例えば三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、カルミン、カラメル、β−カロチン、酸化チタン、タルク、リン酸リボフラビンナトリウム、黄色アルミニウムレーキ等、医薬品に添加することが許可されているものを挙げることができ、
上記矯味矯臭剤としては、例えばココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、竜脳、桂皮末等を挙げることができ、
上記乳化剤または界面活性剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができ、
上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、安息香酸ベンジル、エタノール、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド等を挙げることができ、
上記懸濁化剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子を挙げることができ、
上記等張化剤としては、例えばブドウ糖、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール等を挙げることができ、
上記緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液を挙げることができ、
上記防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができ、
上記抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等を挙げることができる。
上記安定化剤としては、一般に医薬に使用されるものを挙げることができる。
上記吸収促進剤としては、一般に医薬に使用されるものを挙げることができる。
【００２８】
また、上記製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤のような経口剤；坐剤、軟膏剤、眼軟膏剤、テープ剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤のような外用剤または注射剤を挙げることができる。
上記経口剤は、上記添加剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。なお、必要に応じてこれらの表面をコーティングしてもよい。
上記外用剤は、上記添加剤のうち、特に賦形剤、結合剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤または吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。
上記注射剤は、上記添加剤のうち、特に乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤または吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。
【００２９】
またメナテトレノンのカプセル剤は商品名ケイツーカプセル（エーザイ株式会社製）、グラケーカプセル（エーザイ株式会社製）として、またシロップ剤は商品名ケイツーシロップ（エーザイ株式会社製）として、注射剤は商品名ケイツーＮ注（エーザイ株式会社製）として入手することができる。
【００３０】
さらに、上記のとおり本発明に使用するビタミンK２には、体内で代謝されてビタミンK２、好ましくはメナテトレノンとなる物質（例えば、ビタミンK１、フィトナジオン等）を用いることもできる。フィトナジオンのカプセル剤は商品名ケーワンカプセル（エーザイ株式会社製）として、また、錠剤は商品名ケーワン錠（エーザイ株式会社製）として、散剤は商品名ケーワン散（エーザイ株式会社製）として入手することができる。
【００３１】
また、本発明には、自己免疫疾患治療剤または自己免疫疾患予防剤を製造するための、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノン、またはその水和物の使用も含まれる。上記自己免疫疾患としては、好ましくは多発性硬化症が挙げられる。
【００３２】
本発明において、ビタミンK２、好ましくはメナテトレノン、またはその水和物の有効な投与量（有効量）としては、成人（体重６０ｋｇ）あたり、通常、１０〜２００ｍｇ／日であり、好ましくは１５〜１３５ｍｇ／日であり、さらに好ましくは３０〜６０ｍｇ／日（例えば４５ｍｇ／日）である。投与期間は、特に限定されるものではなく、例えば、１〜１０００日、好ましくは７〜３００日である。投与量および投与期間は、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の治療効果または予防効果と患者の状態とを勘案しながら、適宜設定することができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物を患者に投与すると、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症の治療効果および予防効果を得ることが可能である。
【００３４】
以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。実施例中、「ビタミンK２」として、メナテトレノンを用いた。
【実施例１】
【００３５】
ラットEAEに対するビタミンK２の効果
ラットEAEの系においてビタミンK２を連日腹腔内投与し、ラットEAEに対するビタミンK２の効果を検討した。
ビタミンK２は、60mg/mlポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60（日本サーファクタント工業）、10mg/mlセスキオレイン酸ソルビタン（日本サーファクタント工業）、20mg/mlポリソルベート80（日本サーファクタント工業）、30mg/mlプロピレングリコールの溶媒（以下vehicleと称す）に溶解した。
38匹（ビタミンK２投与群18匹、vehicle投与群20匹）のラットに、200μgのミエリン塩基性タンパク質をH37Ra結核菌毒素2 mg/mlを溶解したFreundのアジュバントと共に免疫し、その前日からビタミンK２ 62.5 mg/kgあるいはvehicleを毎日１日１回腹腔内投与した。EAEの重症度をFujimotoらの方法によりスコア化し（1999 J. Neuroimmunol. Vol.95(1-2), p35-42）、また体重を測定して免疫前体重に比した体重減少率を算出した。
結果を図１に示す。実験は2回行い、グラフは2回の結果の平均値を示す。図1左は、縦軸が臨床スコア、横軸が免疫後の日数を示す。図１右は、縦軸が免疫前体重に比した体重減少率（％）、横軸が免疫後の日数を示す。対照として用いたvehicle投与群（図１中「○」）に比べて、ビタミンK２投与群（図1中、「●」）では、有意にEAEの重症度は改善していた（p<0.001）（図１左）。また、ビタミンK２投与群で、EAEに伴う体重減少についても改善傾向が認められた（図１右）。
【００３６】
免疫13日目、および15日目に、それぞれの群のラットを屠殺し、左室より氷冷リン酸緩衝液（PBS）を潅流した。脊髄腰膨大部を摘出し、４％パラホルムアルデヒド-PBS溶液に４℃で一晩浸潰固定し、30%スクロース-PBS溶液にて４℃で一晩洗浄した後、液体窒素にてOCTコンパウンドに包埋した。10μmのクリオスタット切片を作製し、マウス抗MHCクラスII抗体（Immunotech社）、あるいはウサギ抗iNOS抗体（BD Biosciences Pharmingen社）を用いて染色を行った。次いで、蛍光標識した抗マウスIg抗体（Vector Laboratories社）あるいは抗ウサギIg抗体（Vector Laboratories社）を各々用いて蛍光発色させ蛍光顕微鏡による観察を行った。
免疫15日目のvehicle投与ラットEAE脊髄後索において、MHCクラスII分子の発現が顕著に認められた（図２A）。一方、ビタミンK２投与ラットにおいては、MHCクラスII分子の発現はわずかしか認められなかった（図２B）。免疫13日目のvehicle投与ラットEAE脊髄腹側において、iNOS分子の発現が顕著に認められた（図２C）が、ビタミンK２投与ラット脊髄には、iNOS分子の発現はほとんど認められなかった（図２D）。図２において、スケールバーは25μmを示す。
また、EAE脊髄におけるMHCクラスII分子の発現をウェスタンブロットで検討した結果を図３に示した。図３は、左から、脾臓（Spleen、陽性コントロール）、EAE免疫をしていないラット脊髄（Wild、陰性コントロール）、vehicle投与したEAE脊髄（EAE-vehicle）、ビタミンK２投与したEAE脊髄（EAE-K2）を、いずれもホモジネートして抽出したタンパク質をウェスタンブロットした結果を示す。ビタミンK２投与群において、MHCクラスIIの発現がvehicle投与したEAE脊髄における発現よりも抑制されていた。
【実施例２】
【００３７】
培養ミクログリアにおけるiNOSの発現に対するビタミンK２の効果
培養したミクログリアおよびアストロサイトに種々の刺激を加えると、iNOS（inducible NO synthase）が発現してくることが知られている（Pahan, K. et al. J. Clin. Invest. 1997, 100: 2671-2679）。このiNOS発現系において、ビタミンK２を共培養し、ウェスタンブロットによりiNOSを検出して、iNOS発現に対するビタミンK２の効果を検討した。
ミクログリア細胞株の培養系において、培地にビタミンK２（25μMあるいは100μM）あるいはvehicleを添加し24時間培養した。さらにインターフェロンγ（IFN-γ、10 U/ml、Genzyme-Techne社）、抗CD40抗体（HM40-3、１μg/ml、BD Biosciences Pharmingen社）、LPS（0.5μg/ml）を培地に添加し、24時間培養した。細胞を回収、溶解し、12000 rpmにて遠心し、上清をタンパク質抽出液として回収した。タンパク質抽出液を、タンパク質として同量となるようにアクリルアミドゲルに注入、電気泳動し、PVDFメンブレンにトランスファーした。メンブレンをウサギ抗iNOS抗体を用いて染色し、ECLにて発色し（アマシャム社）、X線フィルムにて撮影した。ビタミンK２ 25μM存在下で培養した細胞のウェスタンブロットの結果を図４ (i)に、100μM存在下での結果を図４ (ii)に示した。また、加えた刺激及びビタミンK２の有無はレーンの下に記載した。
図４に示す通り、培養ミクログリア細胞株においてIFN-γ、抗CD40抗体、LPSによる刺激によりiNOSの発現が誘導された。それぞれに25μMのビタミンK２を共培養すると、iNOSの発現が抑制され（図４ (i)）、また100μMのビタミンK２を共培養すると、その抑制効果はさらに顕著であった（図４ (ii)）。
これらの結果より、ビタミンK２には、EAEに対する抑制効果があることが示された。そして、その抑制作用の機序のひとつとして、MHCクラスII、iNOSといったEAE発症に重要な役割を担う分子に対する抑制効果が考えられた。
以上のことから、ビタミンK２が、自己免疫疾患、特に多発性硬化症の治療剤及び予防剤として有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ラットのEAE重症度および体重減少に対するビタミンK２の効果を示す図である。
【図２】図２は、MHCクラスII分子およびiNOSの発現に対するビタミンK２の効果を、ラットEAEモデルにおける免疫組織染色により示す図である。
【図３】図３は、EAE脊髄におけるMHCクラスII分子に対するウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図４】図４は、培養ミクログリアにおけるiNOSに対するウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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