(57)【要約】【課題】  少ない試料で、精度の高い測定を行う。【解決手段】  ピペット２６によって、エアーとアナライト溶液を交互に吸引した後、エアー５１ｂ、アナライト溶液２７ｂ、エアー５１ａ、アナライト溶液２７ａの順に流路１６へ注入される。流路１６ａに既に注入済みの測定用バッファ５２は、先頭のエアー５２ｂによって押し出されて排出される。ピペット２６は、アナライト溶液２７ｂの一部が排出されるまで吐出動作を行い、その後、吸引を行って、アナライト溶液２７とエアー５１とを逆流させる。これにより、センサ面１３ａ上でアナライト溶液２７とエアー５１とが往復されるので、センサ面１３ａ上において測定用バッファ５２とアナライト溶液２７との液置換が上流側と下流側との間で偏ることなく行われる。これにより、センサ面１３ａ上のａｃｔ領域とｒｅｆ領域とに対応する各信号の比較が可能になり、測定精度が高まる。【選択図】        図３
2006090985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明な誘電体上に形成され一方の面がリガンドが固定されるセンサ面となり、他方の面が光入射面となる薄膜を備えたセンサを用い、このセンサ面と対向して配置された流路へアナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液を注入して前記センサ面上へ送液し、前記光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させその反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の前記リガンドと前記アナライトとの相互作用を測定する全反射減衰を利用した測定装置において、
前記アナライト溶液の前記流路への吐出とそこからの吸引とが可能な第１送排出手段を設け、この第１送排出手段を用いて、吐出により前記アナライト溶液をいったん前記センサ面へ送液した後前記アナライト溶液を吸引して逆流させることにより、前記センサ面上で前記アナライト溶液を少なくとも１回往復させ、この後、再び前記アナライト溶液を前記センサ面へ送液することを特徴とする全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項２】
前記流路には、前記アナライト溶液が注入される前に別の液体が注入されており、この別の液体が前記アナライト溶液の注入によって流路外へ押し出されて排出されることにより、前記流路内の液置換が行われることを特徴とする請求項１記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項３】
前記第１送排出手段は、前記アナライト溶液とエアーとを前記流路へ交互に吐出して前記センサ面上を通過させた後、吸引を行って前記アナライト溶液と前記エアーとを逆流させることを特徴とする請求項１又は２記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項４】
前記エアーによって分割された前記アナライト溶液の複数の部分のうち、前記流路へ先に注入された部分は、前記センサ面上を往復させた後、前記流路外へ排出されることを特徴とする請求項３記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項５】
前記第１送排出手段として、ピペットが使用されることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項６】
前記流路の排出口の外側に、前記排出口から溢れた液を滞留させる液溜部が設けられていることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項７】
前記流路の排出口には、前記第１送排出手段の吐出動作に連動して吸引動作を行い、前記第１送排出手段の吸引動作に連動して吐出動作を行う第２送排出手段が配置されることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の全反射減衰を利用した測定装置。
【請求項８】
透明な誘電体上に形成され一方の面がリガンドが固定されるセンサ面となり、他方の面が光入射面となる薄膜を備えたセンサを用い、このセンサ面と対向して配置された流路へアナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液を注入して前記センサ面上へ送液し、前記光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させその反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の前記リガンドと前記アナライトとの相互作用を測定する全反射減衰を利用した測定方法において、
前記流路に前記アナライト溶液を吐出していったん前記センサ面へ送液した後少なくとも１回の吸引を行って前記アナライト溶液を逆流させることにより、前記アナライト溶液を前記センサ面上で少なくとも１回往復させ、この後、前記アナライト溶液を再び前記センサ面へ送液することを特徴とする全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項９】
前記流路には、前記アナライト溶液が注入される前に別の液体が注入されており、この別の液体は、前記アナライト溶液の注入によって流路外へ押し出して排出されることを特徴とする請求項８記載の全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項１０】
前記アナライト溶液とエアーとを前記流路へ交互に吐出して前記センサ面上を通過させた後、吸引を行って前記アナライト溶液と前記エアーとを逆流させることを特徴とする請求項８又は９記載の全反射減衰を利用した測定方法。
【請求項１１】
前記エアーによって分割された前記アナライト溶液の複数の部分のうち、前記流路へ先に注入された部分は、前記センサ面上で往復させた後、前記流路外へ排出されることを特徴とする請求項１０記載の全反射減衰を利用した測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全反射減衰を利用した測定装置及び方法に関するものであり、更に詳しくは、リガンドが固定されるセンサ面へアナライト溶液を送液して測定を行う装置及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
透明な誘電体上に形成された薄膜の一方の面であるセンサ面上において試料の化学反応を生じさせ、前記センサ面の裏面の光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させ、その反射光の減衰状況に基づいて前記化学反応を測定する全反射減衰を利用した測定装置が知られており、その１つに、表面プラズモン共鳴現象を利用した測定装置がある。
【０００３】
金属中では、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。プラズモンとは、この粗密波を量子化した表現であり、このうち、金属の表面に発生する粗密波が表面プラズモンと呼ばれる。この表面プラズモンは金属の表面に沿って進む。表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）現象を利用した測定装置（以下、ＳＰＲ測定装置という）は、透明な誘電体上に形成された薄膜として金属膜を使用し、この金属膜の一方の面をセンサ面として、このセンサ面に表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲという）を発生させ、そこで生じる物質の反応状況を表面プラズモン共鳴現象を検出することにより測定する装置である。
【０００４】
金属膜のセンサ面の裏面から、全反射条件を満足するように（臨界角以上の入射角で）光を照射すると、その光入射面において全反射が起こるが、入射光のうちわずかな光は反射せずに金属膜内を通過して、センサ面に染み出す。この染み出した光波がエバネッセント波と呼ばれる。このエバネッセント波と表面プラズモンの振動数が一致して共鳴すると（ＳＰＲが発生すると）、反射光の強度が大きく減衰する。ＳＰＲ測定装置は、前記光入射面で反射する反射光の減衰を捉えることにより、その裏側のセンサ面で発生するＳＰＲを検出する。
【０００５】
ＳＰＲを発生させるための光の入射角（共鳴角）は、エバネッセント波および表面プラズモンが伝播する媒質の屈折率に依存する。言い換えると、媒質の屈折率が変化すれば、ＳＰＲを発生させる共鳴角が変化する。センサ面と接する物質は、エバネッセント波および表面プラズモンを伝播させる媒質となるので、例えば、センサ面において、２種類の分子間の結合や解離などの化学反応が生じると、それが媒質の屈折率の変化として顕れて、共鳴角が変化する。ＳＰＲ測定装置は、この共鳴角の変化を捉えることにより分子間の相互作用を測定する。
【０００６】
このＳＰＲ測定装置は、例えば、タンパク質やＤＮＡなどの生化学物質の相互作用を調べたり、薬品のスクリーニングを行ったりするなど、生化学分野を代表とした各種研究に用いられる。生化学分野の研究においては、タンパク質、ＤＮＡ、薬品などが、リガンドやアナライトとして使用される。例えば、薬品のスクリーニングを行う場合には、リガンドとして、タンパク質などの生体物質を使用し、このセンサ面にアナライトとなる複数種類の薬品を接触させて、それらの相互作用を調べる。
【０００７】
下記特許文献１に記載のＳＰＲ測定装置は、金属膜に光を入射させるための光学系として、Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置を採用している。Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置では、例えば、透明な誘電体であるガラス基板上に金属膜が形成されたセンサを用い、前記金属膜の光入射面と対向するように前記ガラス基板とプリズムとが接合される。プリズムは、前記光入射面に向けて全反射条件を満足するように照射された光を集光する。センサ面には、リガンドが固定されるとともに、センサ面と対向する位置には、アナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液を流す流路が配置される。この流路にアナライト溶液を送液して、アナライトとリガンドとを接触させ、そのときの反射光の減衰を検出することによりそれらの相互作用が測定される。
【０００８】
流路には、アナライト溶液が注入される前に、予めバッファが注入されており、このバッファはアナライト溶液を注入することにより押し出されて流路から排出される。これにより流路内の液置換が行われる。そして、アナライトとリガンドとの反応を停止させる場合には、再度流路へバッファを注入してアナライト溶液を排出する。信号の測定は、アナライト溶液が注入される前から開始され、再度バッファを注入した後、所定時間が経過するまでの間行われる。こうすることで、バッファ注入時に信号のベースラインを測定するとともに、アナライトとリガンドの反応から脱離までの信号を測定することができる。
【０００９】
アナライト溶液のセンサ面への送液は、例えば、測定を行っている間中、流路にアナライト溶液を連続的に流し続ける（連続送液）ことにより行われる。しかし、こうした連続送液を行うと、多量のアナライト溶液が必要になる。アナライトは一般に高価であるため、実験コストを考慮すると、できるだけ使用量が少ない方が好ましい。そこで、アナライト溶液の送液を開始し、所定量の送液が完了した時点で送液を停止するといういわゆるフローアンドストップ方式が検討されている。
【特許文献１】特開平６−１６７４４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、図６に示すように、流路８１には、例えば、ピペット８５によってアナライト溶液８２が注入されて、既に注入済みのバッファ８４との液置換が行われる。注入されたアナライト溶液８２は流路１６内の中心部分から管壁に向かって速度勾配を持つので、センサ面８３のうち、流れ方向の下流側では、上流側と比べて、バッファ８４とアナライト溶液８２との液置換が遅れる。このため、アナライトとリガンドとの結合反応を精度よく測定することができなかった。
【００１１】
というのは、センサ面８３には、リガンドが固定されアナライトとの反応が生じる測定領域（ａｃｔ領域）８６と、リガンドが固定されない参照領域（ｒｅｆ領域）８７とが設けられており、これらの各領域８６，８７は、流路１６の流れ方向に沿って並べて配置される。信号検出は、これら各領域８６，８７に対して同時に行われ、それぞれａｃｔ信号及びｒｅｆ信号として取得される。そして、例えば、こうして検出した２チャンネルの信号の差を求め、その差分データが測定データとして用いられる。こうすることで、異なるセンサ間の個体差や溶液の濃度等、誤差を生じる各種の要因をキャンセルすることができるため、精度の高い測定を行うことができる。
【００１２】
しかし、２チャンネルの信号検出は同時に行われるため、それらの検出時点において、各領域８６，８７の液置換の進行度合いが同じレベルに無いと、両者を比較しても意味がなく、２チャンネルの信号検出によって期待される効果を得ることができない。フローアンドストップ方式では、注入後送液を停止して流路内にアナライト溶液を滞留させた状態で信号測定を行うため、流路内のアナライト溶液の流動性が高い連続送液と比較すると、液置換の進みが悪く、注入直後において生じた上流部分と下流部分との液置換の進行度の差が解消されにくい。このため、２チャンネルの信号検出を行っても、精度の高い測定データを得ることが難しかった。
【００１３】
本発明は、少ない試料で、精度の高い測定を行うことができる全反射減衰を利用した測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の全反射減衰を利用した測定装置は、透明な誘電体上に形成され一方の面がリガンドが固定されるセンサ面となり、他方の面が光入射面となる薄膜を備えたセンサを用い、このセンサ面と対向して配置された流路へアナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液を注入して前記センサ面上へ送液し、前記光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させその反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の前記リガンドと前記アナライトとの相互作用を測定する全反射減衰を利用した測定装置において、前記アナライト溶液の前記流路への吐出とそこからの吸引とが可能な第１送排出手段を設け、この第１送排出手段を用いて、吐出により前記アナライト溶液をいったん前記センサ面へ送液した後前記アナライト溶液を吸引して逆流させることにより、前記センサ面上で前記アナライト溶液を少なくとも１回往復させ、この後、再び前記アナライト溶液を前記センサ面へ送液することを特徴とする。
【００１５】
前記流路には、例えば、前記アナライト溶液が注入される前に別の液体が注入されており、この別の液体が前記アナライト溶液の注入によって流路外へ押し出されて排出されることにより、前記流路内の液置換が行われる。
【００１６】
前記第１送排出手段は、前記アナライト溶液とエアーとを前記流路へ交互に吐出して前記センサ面上を通過させた後、吸引を行って前記アナライト溶液と前記エアーとを逆流させることが好ましい。
【００１７】
前記エアーによって分割された前記アナライト溶液の複数の部分のうち、前記流路へ先に注入された部分は、前記センサ面上を往復した後、前記流路外へ排出されることが好ましい。
【００１８】
前記第１送排出手段としては、例えば、ピペットが使用される。また、前記流路の排出口の外側に、前記排出口から溢れた液を滞留させる液溜部を設けてもよい。また、前記流路の排出口には、前記第１送排出手段の吐出動作に連動して吸引動作を行い、前記第１送排出手段の吸引動作に連動して吐出動作を行う第２送排出手段を配置してもよい。
【００１９】
本発明の測定方法は、透明な誘電体上に形成され一方の面がリガンドが固定されるセンサ面となり、他方の面が光入射面となる薄膜を備えたセンサを用い、このセンサ面と対向して配置された流路へアナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液を注入して前記センサ面上へ送液し、前記光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させその反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の前記リガンドと前記アナライトとの相互作用を測定する全反射減衰を利用した測定方法において、前記流路に前記アナライト溶液を吐出していったん前記センサ面へ送液した後少なくとも１回の吸引を行って前記アナライト溶液を逆流させることにより、前記アナライト溶液を前記センサ面上で少なくとも１回往復させ、この後、前記アナライト溶液を再び前記センサ面へ送液することを特徴とする。
【００２０】
前記流路には、前記アナライト溶液が注入される前に別の液体が注入されており、この別の液体は、前記アナライト溶液の注入によって流路外へ押し出して排出されることが好ましい。
【００２１】
前記アナライト溶液とエアーとを前記流路へ交互に吐出して前記センサ面上を通過させた後、吸引を行って前記アナライト溶液と前記エアーとを逆流させることが好ましい。
【００２２】
前記エアーによって分割された前記アナライト溶液の複数の部分のうち、前記流路へ先に注入された部分は、前記センサ面上で往復させた後、前記流路外へ排出されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、全反射減衰を利用した測定に際して、流路にアナライト溶液を吐出していったんセンサ面へ送液した後少なくとも１回の吸引を行ってアナライト溶液を逆流させることにより、前記アナライト溶液を前記センサ面上で少なくとも１回往復させ、この後、前記アナライト溶液を再び前記センサ面へ送液するようにしたから、フローアンドストップ方式で送液を行った場合でも、前記センサ面内において偏りなく液置換を行うことができる。このため、少ない試料で、精度の高い測定が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１に示すように、ＳＰＲを利用した測定方法は、大きく分けて、固定工程と、測定処工程（データ読み取り工程）と、データ解析工程との３つの工程からなる。ＳＰＲ測定装置は、固定工程を行う固定機１０と、測定工程を行う測定機１１と、測定機１１によって得られたデータを解析するデータ解析機からなる。
【００２５】
測定は、ＳＰＲセンサであるセンサユニット１２を用いて行われる。センサユニット１２は、一方の面がＳＰＲが発生するセンサ面１３ａとなる金属膜１３と、このセンサ面１３ａの裏面の光入射面１３ｂと接合されるプリズム１４と、前記センサ面１３ａと対向して配置され、リガンドやアナライトが送液される流路１６が形成された流路部材４１とを備えている。
【００２６】
金属膜１３としては、例えば、金が使用され、その膜厚は、例えば、５００オングストロームである。この膜厚は、金属膜の素材、照射される光の発光波長などに応じて適宜選択される。プリズム１４は、その上面に前記金属膜１３が形成される透明な誘電体であり、光入射面１３ｂに向けて、全反射条件を満たすように照射された光を集光する。流路１６は、略Ｕ字形に屈曲された送液管であり、液体を注入する注入口１６ａと、それを排出する排出口１６ｂとを持っている。流路１６の管径は、例えば、約１ｍｍ程度であり、注入口１６ａと排出口１６ｂの間隔は、例えば、約１０ｍｍ程度である。
【００２７】
また、流路１６の底部は、開放されており、この開放部位はセンサ面１３ａによって覆われて密閉される。これら流路１６とセンサ面１３ａによってセンサセル１７が構成される。
【００２８】
固定工程は、センサ面１３ａにリガンドを固定する工程である。固定工程は、センサユニット１２を固定機１０にセットして行われる。固定機１０には、１対のピペット１９ａ，１９ｂからなるピペット対１９が設けられている。ピペット対１９は、各ピペット１９ａ，１９ｂが、注入口１６ａと排出口１６ｂのそれぞれに挿入される。各ピペット１９ａ，１９ｂは、それぞれが流路１６への液体の注入と、流路１６からの吸い出しを行う機能を備えており、一方が注入動作を行っているときには、他方が吸い出し動作を行うというように、互いに連動する。このピペット対１９を用いて、注入口１６ａから、リガンドを溶媒に溶かしたリガンド溶液２１が注入される。
【００２９】
センサ面１３ａのほぼ中央部には、リガンドと結合するリンカー膜２２が形成されている。このリンカー膜２２は、センサユニット１２の製造段階において予め形成される。リンカー膜２２は、リガンドを固定するための固定基となるので、固定するリガンドの種類に応じて適宜選択される。
【００３０】
リガンド溶液２１を注入するリガンド固定化処理を行う前に、前処理として、まず、リンカー膜２２に対して、固定用バッファ液を送液してリンカー膜２２を湿らせた後、リンカー膜２２へリガンドが結合しやすくするためにリンカー膜２２の活性化処理が施される。例えば、アミンカップリング法では、リンカー膜２２としてカルボキシメチルデキストランが使用され、リガンド内のアミノ基をこのデキストランに直接共有結合させる。この場合の活性化液としては、Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）との混合液が使用される。この活性化処理の後、固定用バッファによって流路１６が洗浄される。
【００３１】
固定用バッファや、リガンド溶液２１の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐｈ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、リガンドとして生体物質を使用する場合には、ｐｈを中性付近に調整した生理的食塩水が使用される場合が多い。しかし、上記アミンカップリング法では、リンカー膜２２は、カルボキシメチルデキストランにより負（マイナス）に帯電するので、このリンカー膜２２と結合しやすいようにタンパク質を陽（プラス）に帯電させるため、生理的とはいえない高濃度のリン酸塩を含む緩衝作用の強いリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ：phosphatic−buffered，saline）などが使用される場合もある。
【００３２】
こうした活性化処理及び洗浄が行われた後、センサセル１７へリガンド溶液２１が注入されてリガンド固定化処理が行われる。リガンド溶液２１が流路１６へ注入されると、溶液中で拡散しているリガンド２１ａが徐々にリンカー膜２２へ近づいて、結合する。こうしてセンサ面１３ａにリガンド２１ａが固定される。固定化には、通常、約１時間程度かかり、この間、センサユニット１２は、温度を含む環境条件が所定の条件に設定された状態で、保管される。なお、固定化が進行している間、流路１６内のリガンド溶液２１を静置しておいてもよいが、流路１６内のリガンド溶液２１を攪拌して流動させることが好ましい。こうすることで、リガンドとリンカー膜２２との結合が促進され、リガンドの固定量を増加させることができる。
【００３３】
センサ面１３ａへのリガンド２１ａの固定化が完了すると、前記流路１６からリガンド溶液２１が排出される。リガンド溶液２１は、ピペット１９ｂによって吸い出されて排出される。固定化が完了したセンサ面１３ａは、流路１６へ洗浄液が注入されて洗浄処理が行われる。この洗浄後、必要に応じて、ブロッキング液を流路１６へ注入して、リンカー膜２２のうち、リガンドが結合しなかった反応基を失活させるブロッキング処理が行われる。ブロッキング液としては、例えば、エタノールアミン−ヒドロクロライドが使用される。このブロッキング処理の後、再び流路１６が洗浄される。この後、後述するように、流路１６には、乾燥防止液が注入される。こうして、センサユニット１２は、センサ面１３ａが乾燥防止液に浸された状態で、測定までの間保管される。
【００３４】
測定工程は、センサユニット１２を測定機１１にセットして行われる。測定機１１には、ピペット２６が設けられており、このピペット２６を用いて、注入口１６ａから流路１６への各種の液の注入が行われる。このピペット２６は、吸引量及び吐出量の調節が可能であり、駆動部２５によって駆動される。ピペット２６の先端の直径は、注入口１６ａの内径とほぼ同じであり、ピペット２６の先端を注入口１６ａに配置すると、注入口１６ａが塞がれる。これにより、注入時に注入口１６ａからの空気の進入が防止されるので、ピペット２６から流路１６へのアナライト溶液２７の注入がスムーズに行われる。
【００３５】
測定（データ読み取り）工程では、まず、流路１６へ測定用バッファが注入される。この後、アナライトを溶媒に溶かしたアナライト溶液２７を注入し、その後、再び測定用バッファが注入される。なお、最初に測定用バッファを注入する前に、いったん流路１６の洗浄を行ってもよい。流路１６には予め決められた量のアナライト溶液２７が注入される。そして、このアナライト溶液２７を所定時間流路１６内で滞留させた状態で、リガンドとの結合反応が調べられる。
【００３６】
データの読み取りは、基準となる信号レベルを検出するために、最初に測定用バッファを注入した直後から開始され、アナライト溶液２７の注入後、再び測定用バッファが注入されるまでの間行われる。これにより、基準レベル（ベースライン）の検出、アナライトとリガンドの反応状況（結合状況）、測定用バッファ注入による結合したアナライトとリガンドの脱離までのＳＰＲ信号を測定することができる。
【００３７】
測定用バッファや、アナライト溶液２７の溶媒（希釈液）としては、例えば、各種のバッファ液（緩衝液）の他、生理的食塩水に代表される生理的塩類溶液や、純水が使用される。これらの各液の種類、ｐｈ値、混合物の種類及びその濃度等は、リガンドの種類に応じて適宜決められる。例えば、アナライトを溶けやすくするために、生理的食塩水にＤＭＳＯ（ジメチル−スルホ−オキシド）を含ませてもよい。このＤＭＳＯは、信号レベルに大きく影響する。上述したとおり測定用バッファは基準レベルの検出に用いられるので、アナライトの溶媒中にＤＭＳＯが含まれる場合には、そのＤＭＳＯ濃度と同程度のＤＭＳＯ濃度を持つ測定用バッファを使用することが好ましい。
【００３８】
なお、アナライト溶液２７は、長期間（例えば、１年）保管されることも多く、そうした場合には、経時変化によって、初期のＤＭＳＯ濃度と測定時のＤＭＳＯ濃度との間に濃度差が生じてしまう場合がある。厳密な測定を行う必要がある場合には、こうした濃度差をアナライト溶液２７を注入したときのｒｅｆ信号レベルから推定し、測定データに対して補正（ＤＭＳＯ濃度補正）が行われる。このＤＭＳＯ濃度補正のための補正データは、アナライト溶液２７を注入する前に、ＤＭＳＯ濃度が異なる複数種類の測定用バッファをセンサセル１７に注入して、このときのＤＭＳＯ濃度変化に応じた、後述するｒｅｆ信号レベルとａｃｔ信号レベルのそれぞれの変化量を調べることにより求められる。
【００３９】
測定部３１は、照明部３２と検出器３３からなる。上述したとおり、リガンドとアナライトの反応状況は、共鳴角（光入射面に対して照射された光の入射角）の変化として顕れるので、照明部３２は、全反射条件を満足する様々な入射角の光を光入射面１３ｂに対して照射する。照明部３２は、例えば、光源３４と、集光レンズ、拡散板、偏光板を含む光学系３６とからなり、配置位置および設置角度は、照明光の入射角が、上記全反射条件を満足するように調整される。
【００４０】
光源３４としては、例えば、ＬＥＤ（Light Emitting Diode），ＬＤ（Laser Diode），ＳＬＤ（Super Luminescent Diode）などの発光素子が使用される。こうした発光素子を１個使用し、この単一光源から１つのセンサセルに向けて光が照射される。なお、複数のセンサセルを同時に測定するような場合には、単一光源からの光を分光して複数のセンサセルに照射してもよいし、各センサセルに対して発光素子が１つずつ割り当てられるように複数の発光素子を並べて使用してもよい。拡散板は、光源３４からの光を拡散して、発光面内の光量ムラを抑える。偏光板は、照射光のうち、ＳＰＲを生じさせるｐ偏光のみを通過させる。なお、ＬＤを使用する場合など、光源が発する光線自体の偏光の向きが揃っている場合には、偏光板は不要である。また、偏光が揃っている光源を使用した場合でも、拡散板を通過することにより、偏光の向きが不揃いになってしまう場合には、偏光板を使用して偏光の向きが揃えられる。こうして拡散および偏光された光は、集光レンズによって集光されてプリズム１４に照射される。これにより、光強度にバラツキがなく様々な入射角を持つ光線を光入射面１３ｂに入射させることができる。
【００４１】
検出器３３は、光入射面１３ｂで反射する光を受光して、その光強度に応じたレベルの電気信号を出力する。光入射面１３ｂには、様々な角度で光線が入射するので、光入射面１３ｂでは、それらの光線が、それぞれの入射角に応じて様々な反射角で反射する。検出器３３は、これらの様々な反射角の光線を受光する。センサ面１３ａ上の媒質（表面プラズモンの）に変化が生じると屈折率が変化して、光強度が減衰する反射角（ＳＰＲが発生する共鳴角）も変化する。センサ面１３ａ上にアナライトを送液すると、アナライトとリガンドの反応状況に応じて共鳴角が変化するため、光強度が減衰する反射角も変化する。
【００４２】
検出器３３は、例えば、ＣＣＤエリアセンサやフォトダイオードアレイが使用され、光入射面１３ｂにおいて様々な反射角で反射する反射光を受光し、それらを光電変換してＳＰＲ信号として出力する。リガンドとアナライトの反応状況は、この受光面内における反射光の減衰位置の推移として顕れる。例えば、アナライトがリガンドと接触する前後では、センサ面１３ａ上の屈折率が異なり、ＳＰＲが発生する共鳴角（反射光の減衰位置）が異なる。そして、アナライトがリガンドと接触して反応を開始すると、それに応じて反射光の共鳴角が変化を開始して、前記受光面内における反射光の減衰位置が移動し始める。こうして得た反応状況を表すＳＰＲ信号が、データ解析機に出力される。データ解析工程では、測定機１１で得たＳＰＲ信号を解析して、リガンドとアナライトの相互作用を分析する。
【００４３】
なお、測定部３１の構成が明確になるように、便宜的に、図１では、光入射面１３ｂへの入射光線およびそこで反射する反射光線の向きが、流路１６内の液体の流れ方向と平行になるように、照明部３２および検出器３３を配置した形態で示しているが、図２に示すように、本実施形態では、入射光線および反射光線の向きが、前記流れ方向と直交する方向に照射されるように、照明部３２および検出器３３が配置される。もちろん、測定部３１をこの図１に示しているように配置して測定してもよい。
【００４４】
図２に示すように、リンカー膜２２上には、リガンドが固定されアナライトとリガンドとの反応が生じる測定領域（ａｃｔ領域）２２ａと、リガンドが固定されず、前記測定領域の信号測定に際しての参照信号を得るための参照領域（ｒｅｆ領域）２２ｂとが形成される。これら各領域２２ａ，２２ｂは、一方が流路１６の流れ方向の上流側に、他方が下流側になるように、流れ方向に沿って並べて配置されている。なお、本例では、ａｃｔ領域２２ａを上流側に、ｒｅｆ領域２２ｂを下流側に配置しているが、反対でもよい。
【００４５】
ｒｅｆ領域２２ｂは、上述したリンカー膜２２を製膜する際に形成される。形成方法としては、例えば、リンカー膜２２に対して表面処理を施して、リンカー膜２２の半分程度の領域について、リガンドと結合する結合基を失活させる。これにより、リンカー膜２２の半分がａｃｔ領域２２ａとなり、残りの半分がｒｅｆ領域２２ｂとなる。
【００４６】
検出器３３は、ａｃｔ領域２２ａに対応するＳＰＲ信号をａｃｔ信号として出力し、ｒｅｆ領域２２ｂに対応するＳＰＲ信号をｒｅｆ信号として出力する。これらａｃｔ信号とｒｅｆ信号は、基準レベルの検出から結合反応を経て脱離に至るまで、ほぼ同時に計測される。データ解析は、こうして得られたａｃｔ信号とｒｅｆ信号の差や比を求めて行われる。データ解析機は、例えば、ａｃｔ信号とｒｅｆ信号との差分データを求め、この差分データを測定データとし、これに基づいて解析を行う。こうすることで、センサユニットや各センサセルの個体差や、装置の機械的な変動や、液体の温度変化など、外乱に起因するノイズをキャンセルすることが可能となり、Ｓ／Ｎ比の良好な信号が得られる。
【００４７】
照明部３２及び検出器３３は、これら各ａｃｔ信号及びｒｅｆ信号の２チャンネルの計測を行うことができるように構成されている。例えば、照明部３２を、１個の発光素子を反射ミラー等を用いて、ａｃｔ領域２２ａとｒｅｆ領域２２ｂのそれぞれに向けて入射する複数の光線に分光する。そして、各チャンネル用の複数のフォトダイオードアレイで構成した検出器３３により、各光線をそれぞれ受光する。
【００４８】
また、検出器３３として、ＣＣＤエリアセンサを用いた場合には、同時に受光した各チャンネルの反射光を画像処理によってａｃｔ信号とｒｅｆ信号として認識することもできる。しかし、こうした画像処理による方法が難しい場合には、ａｃｔ領域２２ａとｒｅｆ領域２２ｂに対して入射させるタイミングを微小時間ずらして、各チャンネルの信号を受光するようにしてもよい。入射タイミングをずらす方法としては、例えば、光路上に、配置角度が１８０℃ずれた位置に２つの孔が形成された円板を配置し、この円板を回転させることにより、各チャンネルの入射タイミングがずらされる。各孔は、中心からの距離が各領域２２ａ，２２ｂの間隔だけ異なる位置に配置されており、これにより、一方の孔が光路内に進入したときには、ａｃｔ領域２２ａに光線が入射し、他方の孔が光路内に進入したときには、ｒｅｆ領域２２ｂに光線が入射する。
【００４９】
図３は、測定の際に、アナライト溶液２７を流路１６に注入する手順を示す説明図である。図３（Ａ）に示すように、ピペット２６は、まず、測定機１１内に配置されたウエルプレートからアナライト溶液２７を吸引して、その後、その先端が注入口１６ａに配置される。ピペット２６の先端の直径と流入口１６ａの内径とはほぼ同じなので、注入口１６ａはピペット２６によって塞がれる。
【００５０】
アナライト溶液２７の吸引においては、アナライト溶液２７とエアー５１とが交互に吸引される。例えば、最初に、流路１６を満たすのに必要な量（例えば、２０μｌ）のアナライト溶液２７ａを吸引し、次に、エアー５１ａを２μｌ吸引し、この後、最初に吸引した量の半分程度（１０μｌ）のアナライト溶液２７ｂを吸引する。そして、最後にエアー５１ｂを２μｌ吸引する。こうして注入の準備が整った後、アナライト溶液２７を注入する前に、信号測定が開始される。
【００５１】
そして、測定開始後、所定時間経過した後、図３（Ｂ）に示すように、ピペット２６が吸引したアナライト溶液２７とエアー５１とを吐出して、流路１６への注入が開始される。流路１６には、エアー５１ｂ、アナライト溶液２７ｂ、エアー５１ａ、アナライト溶液２７ａの順で注入される。注入口１６ａはピペット２６によって塞がれているので、ピペット２６内のエアー５１が外部に漏れ出てしまうことはない。これにより、先頭のエアー５１ｂがセンサ面１３ａを通過し、測定用バッファ５２を排出口１６ｂへ押し出す。また、アナライト溶液２７に先だってエアー５１ａを注入することで、アナライト溶液２７と測定用バッファ５２との混液が抑制される。
【００５２】
そして、図３（Ｃ）に示すように、ピペット２６は、さらに吐出を続けて、先頭のエアー５１ｂを排出口１６ｂから排出する。この吐出動作は、後から注入されたエアー５１ａがセンサ面１３ａを通過し、アナライト溶液２７ｂの一部が排出口１６ｂから排出されるまで続く。
【００５３】
これにより、流路１６内において、測定用バッファ５２とアナライト溶液２７との置換が行われる。しかし、この状態では、センサ面１３ａには測定用バッファ５２の一部が残留しており、その残留量は、流体の速度勾配に起因して、上流部分よりも下流部分で多い。
【００５４】
そこで、図３（Ｄ）に示すように、ピペット２６が吸引動作を開始して、アナライト溶液２７とエアー５１を逆流させる。この吸引動作は、図３（Ｅ）に示すように、アナライト溶液２７ａ、エアー５１ａに引き続き、アナライト溶液２７ｂがセンサ面１３ａを通過するまで続ける。こうして、アナライト溶液２７とエアー５１とをセンサ面１３ａ上で往復させる。そして、図３（Ｆ）に示すように、ピペット２６は、再度、吐出動作を行って、アナライト溶液２７とエアー５１とを流路１６へ注入する。この吐出動作は、アナライト溶液２７ｂとエアー５１ａとがセンサ面１３ａを通過して、排出口１６ｂから排出され、流路１６が、アナライト溶液２７ａで満たされるまで続く。こうして、流路１６にアナライト溶液２７ａが満たされた後、そのアナライト溶液２７ａが流路１６内に所定時間滞留されて、測定が行われる。所定時間経過した後、再び測定用バッファ５２が注入されて、測定が終了する。
【００５５】
このように、アナライト溶液２７とエアー５１とをセンサ面１３ａ上で複数回通過させるので、センサ面１３ａ上に残留した測定用バッファ５２を排出することができる。しかも、往復させることで、順方向と逆方向の流れが生じるため、上記速度勾配に起因して、センサ面１３ａ上に発生する残留量の偏りを解消することができる。これにより、ａｃｔ領域２２ａとｒｅｆ領域２２ｂの液置換の進行度を揃えることができるので、ａｃｔ信号とｒｅｆ信号の２チャンネル測定によって期待される効果が得られ、その結果、測定精度を向上させることができる。また、前記往復により、アナライト溶液２７の流動性が高まり、アナライトとリガンドとの接触量が向上する。
【００５６】
また、アナライト溶液２７と、エアー５１ｂを注入することで、アナライト溶液２７のみを注入する場合と比較して、高い置換効率を得ることができる。また、アナライト溶液２７を、エアー５１ａによって複数の部分に分割し、先に流路１６に注入される部分（アナライト溶液２７ｂ）は、センサ面１３ａ上を往復させた後、流路１６外へ排出するようにしている。これにより、アナライト溶液２７ｂによる流路１６の共洗いが行われるとともに、先に注入されたアナライト溶液２７ｂよりも、混液の少ないアナライト溶液２７ａを流路１６内に滞留させることができるので、精度の高い信号を検出することができる。
【００５７】
なお、上記実施形態のアナライト溶液とエアーの注入量は、１例であり、流路の容積等に応じて適宜決められる。また、エアーとアナライト溶液とをそれぞれ２回ずつ交互に注入しているが、この回数は２回以上でもよい。
【００５８】
なお、上記実施形態では、アナライトとともにエアーを流路へ注入しているが、エアーは必ずしも必要ではなく、アナライト溶液のみを注入してそれだけをセンサ面上で往復させてもよい。エアーをまったく使用せずに、アナライト溶液のみを注入した場合には、エアー注入による種々の効果（混液の防止効果や液置換効率のさらなる向上など）は期待できない。しかし、エアーを使用しなくても、アナライト溶液の順方向と逆方向の両方の流れを生じさせることによって、センサ面上における測定用バッファの残留量の偏りを解消させるという効果は得られる。
【００５９】
また、アナライト溶液を注入する前に１回エアーを注入し、その後、アナライト溶液を注入した後に、再びエアーを注入するというように、エアーを２回に分けて注入しているが、１回目のエアーを使用せず、アナライト溶液を複数の部分に分割するためだけにエアーを使用してもよい。１回目のエアーを使用しないと、共洗いを行うための洗浄用のアナライト溶液と測定用バッファとが直接接触することになる。このため、当然に、洗浄用のアナライト溶液に測定用バッファが混入する量が多くなり、洗浄効果の低下につながる。しかし、この洗浄用のアナライト溶液は排出されるものであるため、洗浄効果の低下分が信号のノイズとして顕在化する量はそれほど多くはなく、測定に与える影響は小さいと考えられる。こうしたエアーの使用の有無と、使用する場合の程度等は、要求される測定精度の高低によって適宜使い分けるとよい。
【００６０】
上記実施形態では、流路の排出口からいったん排出された液はそのまま廃却され、再び流路へ進入することはない。しかし、図４に示すように、流路１６の排出口１６ｂの外側に排出した液を滞留させる液溜部５６を設け、いったん排出されたアナライト溶液２７を流路１６内に逆流させてもよい。こうすると、より多くの量のアナライト溶液２７が逆流されるので、液置換効率が向上する。
【００６１】
また、図５に示すように、排出口１６ｂにピペット２６の動作と連動するピペット５８を配置してアナライト溶液２７の注入を行ってもよい。ピペット５８は、ピペット２６の吸引動作に連動して吐出動作を行うとともに、ピペット２６の吐出動作に連動して吸引動作を行う。このようなピペット５８を配置することで流路１６内のアナライト溶液２７の流速を上げることができるので、液置換効率が向上する。
【００６２】
また、流路へ液を吐出して注入するとともにいったん注入した液を吸引して排出する送排出手段としてピペットを使用しているが、ピペットでなくてもよく、例えば、配管とこれに接続されたポンプとから構成してもよい。また、注入側にピペットを使用し、排出側にポンプを使用するなど、これらを併用してもよい。
【００６３】
また、本実施形態では、センサ面上にＳＰＲを発生させて、そのときの反射光の減衰を検出するＳＰＲセンサを例に説明したが、ＳＰＲセンサに限らず、全反射減衰を利用した測定に用いられる他のセンサの固定量を測定する場合にも適用することができる。全反射減衰を利用するセンサとしては、ＳＰＲセンサの他に、例えば、漏洩モードセンサが知られている。漏洩モードセンサは、誘電体と、この上に順に層設されたクラッド層と光導波層とによって構成された薄膜とからなり、この薄膜の一方の面がセンサ面となり、他方の面が光入射面となる。光入射面に全反射条件を満たすように光を入射させると、その一部が前記クラッド層を通過して前記光導波層に取り込まれる。そして、この光導波層において弾性表面波（surface acoustic wave，SAW）が生じると、前記光入射面における反射光が大きく減衰する。弾性表面波が生じる入射角は、ＳＰＲの共鳴角と同様に、センサ面上の媒質の屈折率に応じて変化する。この反射光の減衰を検出することにより、前記センサ面上の化学反応が測定される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＳＰＲ測定方法の説明図である。
【図２】リンカー膜上のａｃｔ領域とｒｅｆ領域の説明図である。
【図３】測定に際してのアナライト溶液の注入手順を示す説明図である。
【図４】排出口に液溜部を設けた例の説明図である。
【図５】排出口にピペットを配置した例の説明図である。
【図６】アナライト溶液とバッファとの置換方法の説明図である。
【符号の説明】
【００６５】
１０  固定機
１１  測定機
１２  センサユニット
１３  金属膜
１３ａ  センサ面
１６  流路
１７  センサセル
２２  リンカー膜
２２ａ  ａｃｔ領域
２２ｂ  ｒｅｆ領域
２７  アナライト溶液
３１  測定部
３２  照明部
３３  検出器
５１  エアー
５２  測定用バッファー
【図１】
2006090985.tif 000003
【図２】
2006090985.tif 000004
【図３】
2006090985.tif 000005
【図４】
2006090985.tif 000006
【図５】
2006090985.tif 000007
【図６】
2006090985.tif 000008