(57)【要約】【課題】  本発明は、ペプチド又はタンパク質の材料表面への吸着能を測定する、高感度、高精度、汎用性、及び迅速性を備えた新規な方法を提供することを課題とする。【解決手段】  （１）ペプチド又はタンパク質を基板上に吸着させ、必要に応じ未吸着ペプチド又はタンパク質を洗浄により除いた後、基板上に吸着したペプチド又はタンパク質等の試料をを分解してアミノ酸定量することにより検出及び／又は定量する方法、及び（２）、蛍光ナノ粒子（Ｑ−ｄｏｔ）及び任意の試料を結合させ混合し、当該蛍光ナノ粒子結合試料を基盤表層に吸着させ、吸着した試料と当該蛍光ナノ粒子の混合体を検出及び/又は測定することにより、蛍光を用いて当該試料の吸着性を検出及び/又は測定する吸着能測定方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基盤表層に吸着したペプチド又はタンパク質の吸着能を測定する方法であって、基盤表層に吸着した当該ペプチド又はタンパク質の吸着能を検出及び／又は定量することを特徴とするペプチド又はタンパク質の吸着能を測定する方法。
【請求項２】
基盤表面に吸着したペプチド又はタンパク質が基盤表層にて自己集合するペプチド又はタンパク質である請求項１に記載の吸着能測定方法。
【請求項３】
基盤表層に吸着したペプチド又はタンパク質をアミノ酸に分解後、構成するアミノ酸を分析・定量することによって当該ペプチド又はタンパク質を検出及び／又は定量することを特徴とする請求項１又は2に記載の吸着能測定方法。
【請求項４】
基盤表層にペプチド又はタンパク質を吸着させたのち、基盤表層を洗浄し、基盤表層に吸着したペプチド又はタンパク質をアミノ酸に分解後、構成するアミノ酸を分析・定量することによって当該ペプチド又はタンパク質を検出及び定量することを特徴とする請求項１又は2に記載の吸着能測定方法。
【請求項５】
蛍光ナノ粒子（Ｑ−ｄｏｔ）及び試料を混合し、基盤表層に吸着したサンプルと当該蛍光ナノ粒子の混合体を検出することにより、当該試料の吸着能を検出及び/又は測定することを特徴とする吸着能測定方法。
【請求項６】
試料がタンパク質又はペプチドである請求項4記載の方法。
【請求項７】
基盤表面に吸着したペプチド又はタンパク質が基盤表層にて自己集合するペプチド又はタンパク質である請求項5又は6に記載の吸着能測定方法。
【請求項８】
蛍光ナノ粒子（Ｑ−ｄｏｔ）及び試料を混合し、基盤表層に吸着した後、基盤表層を洗浄し、試料と当該蛍光ナノ粒子の混合体を検出することにより、当該試料の吸着又は自己集合性を検出することを特徴とする請求項５、６又は７いずれか1項に記載の吸着能測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、材料表層へのペプチド又はタンパク質等の試料の吸着能を、高感度でかつ正確に測定する方法に関するものであり、特に、吸着したペプチド又はタンパク質を加水分解後、アミノ酸として回収・定量することに特徴を有するペプチド又はタンパク質の材料表面への吸着能を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の中には、炭酸カルシウムやリン酸カルシウムの特定の結晶に結合して、その形成に関与するタンパク質の存在は知られていたが、短いペプチドが特定基盤表層に吸着するとは考えられていなかった。さらには、以前は、タンパク質・ペプチドの改変が容易でなかったので、材料工学や工学の対象とは考えられていなかった。
【０００３】
ところが、十数残基のペプチドが自己集合する(非特許文献１: S. Zhang, 2003, Nature Biotechnol., 21, 1171-1178)ことや、特定の金属表層に吸着する（非特許文献２: S.R. Whaley, et al. 2000, Nature, 405, 665-668）ことが見い出され、さらに遺伝子組み換え技術の発達とペプチド合成装置の進歩にともない、近年、例えば、ペプチドなどの生体分子の自己集合体や吸着体を、再生医療やドラッグデリバリーへ応用することが検討され(非特許文献３: S. Zhang, 2004, Nature Biotechnol., 22, 151-152)、またこれらペプチドの分子自己集合性や吸着性が、ナノテクノロジーのボトムアップ型製造技術に有用であろうと注目を集めている。これらはペプチド性材料と総称される。
【０００４】
ペプチドを用いた自己集合系としては、Aggeli等が、短いペプチドを非水溶性溶媒で、長いポリマー上のナノテープにする報告をしている（非特許文献４：A．Aggeli, et al.  1997, Nature 386, 259-262）。
【０００５】
また、親水性領域と疎水性領域と２つのことなる領域を有するポリマー活性剤の様に、水溶液中で、疎水性部分を水相から離れさせるように互いに作用することで、自己集合を起こすことが知られており、種々の単純なペプチドを用いた実験がなされている（非特許文献５：S. Vauthey, et al. 2002, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 99, 5355-5360）。
【０００６】
また、塩濃度依存的自己集合により形成されるペプチド性素材としては、例えば、アルギニンーアラニンーアスパラギン酸のような親水性と疎水性アミノ酸が交互に繰り替えす両親媒性ペプチド（非特許文献６：TC. Holmes, et al. 2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 6728-6733）、及び（非特許文献７：S. Zhang, et al. 2002, Curr.Opin.Chem.Biol., 6, 865-871）について多くの研究がある。
【０００７】
しかし、現在まで提供されている、ペプチド性材料の多くは、限られた雛型タンパク質に基づいてデザインされたペプチドであり、さらに多様な展開が求められている。
【０００８】
【非特許文献１】：S. Zhang, 2003, Nature Biotechnol., 21, 1171-1178
【非特許文献２】：S.R. Whaley, et al. 2000, Nature, 405, 665-668
【非特許文献３】：S. Zhang, 2004, Nature Biotechnol., 22, 151-152
【非特許文献４】：A．Aggeli, et al.  1997, Nature 386, 259-262
【非特許文献５】：S. Vauthey, et al. 2002, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 99, 5355-5360
【非特許文献６】：TC. Holmes, et al. 2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 6728-6733
【非特許文献７】：S. Zhang, et al. 2002, Curr.Opin.Chem.Biol., 6, 865-871
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一般に、タンパク質やペプチド性サンプルは大きな多様性をもち、かつ化学合成、組み換え技術の両者での調整ができるが、サンプル量を確保することが難しい。一方、吸着や自己集合等の物性解析は主にポリマー材料等を対象に開発が進められてきたため、グラムオーダーのサンプルを用いて測定することが一般的である。タンパク質やペプチド性の材料開発には微量な分析手法開発が重要である。
【００１０】
特定基盤表層に吸着性を示すペプチドとしては、ファージディスプレイ法による探索がある（非特許文献２：S.R. Whaley, et al. 2000, Nature, 405, 665-668）が、その場合、ペプチドよりも遥かに大きなファージが吸着性に影響を与えることは否めない。
【００１１】
人工歯根から人工関節や人工臓器にいたる多岐に渡るインプラントには、抗感染性と抗血栓性が強く求められる。その際、前者ではインプラント表層性質の改変のための吸着性物質の開発が、後者では体液タンパク質の吸着を抑制する表層性質が重要である。そのため、インプラント表層へのタンパク質の吸着測定法が必要であり、いくつかのタンパク質やペプチドの吸着測定法が開発されて来た。それらタンパク質やペプチドの基盤への吸着測定法としては、サンプルにラベルを施す方法（RIラベルや蛍光ラベル等（Wagner, VE. Et al., 2004, Biomaterials, 25, 2247-2263）、間接的に定量する方法（ELIZA法等（Peluso, P. et al., 2003, Anal. Biochem., 312, 113-124））や、専用の機器を用いる方法（QCM（Hook, F. et al., 1998, Proc.Natl.Acad.Sci., 95, 12271-12276）、SPR（Roberts, C. et al., 1998, J.Am.Chem.Soc., 120, 6548-6555）、ToF-sims( Leufgen, K. et al., 2003, J.Am.Chem.Soc., 125, 8911-8915等）がある。しかし、サンプルをラベルする方法の場合、サンプル量が必要でありかつ、複数のサンプルを処理することは困難であり、またRIの煩雑さや蛍光の安定性等も大きな問題である。また間接法であるELIZAでは、なにより抗体作製が必要であり、また微量サンプルでは正確さにかける。ATR、エリプソメトリーといった手法は定量性が大きく劣り、SPRは金を基本とした表層しか適用できない。QCMはSPRよりは基盤選択性があるが、微量サンプルでの解析はできない。いずれにせよ、高価な装置と専用の限られた材質の基盤を購入して使用しなければならないのである。
【００１２】
本発明は、ペプチド又はタンパク質の材料表面への吸着能を測定する新規な方法を提供することを課題とする。特に、従来の吸着能を測定する方法は分光学的な原理に基づく間接的測定法であることが多く、定量性に関しての問題を残すことが多い。また定量性の高い測定方法の場合は数100pmol以上のサンプル量を必要とすることが一般的である。なにより専用の装置を購入し、専用の限られた基盤で測定することが必要となる。サンプルになんらかのラベルを施す場合は、そのための前処理の煩雑さと、それに関するサンプルロスが大きな問題である。抗体に依存する手法は、抗体作製に多量のサンプルが必要とされ、長期の抗体作製期間を必要とする。またその場合精度は高くない。高感度、高精度、汎用性、迅速性、低コストのすべてを兼ね備えた手法は現状では見当たらない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは鋭意検討を重ねた結果、材料表面に吸着したペプチド又はタンパク質及び／又は当該ペプチド又はタンパク質を構成するアミノ酸を検出及び／又は定量することにより、当該ペプチド又はタンパク質の吸着能を測定する方法を開発した。発明者らは、フジツボ第７接着タンパク質（特開2004-105143、 Mrcp19kとも呼ぶ）を基盤表層上でincubationし、基盤ごと酸加水分解した後、アミノ酸分析計で当該接着タンパク質を構成するアミノ酸を検出・定量することにより、ガラス表層への吸着能を測定することができることを確認し、本発明を完成した。
【００１４】
さらに、蛍光性ナノ粒子と混合した塩濃度依存的自己集合性ペプチドを吸着させ、基盤上に吸着したペプチドと共に基盤上に固定されたナノ粒子の蛍光度を測定することによって当該ペプチドの吸着能を検出及び/又は測定することが可能であることを確認した。
【発明の効果】
【００１５】
専用の装置を購入する必要がなく、通常の実験環境で、微量サンプル（low pmol以下）で、しかも正確に（直接測定法であるため）吸着サンプルの量を測定することができる。サンプルには特別な前処理が必要ではなく、そのような煩雑でサンプルをロスするようなステップはない。これら方法を用いることにより、特定の表層や非選択的に吸着性を示すタンパク質やペプチド性材料を見出すことができる。さらには、特定条件でのみ吸着性を示すものや、特定の条件でのみ剥離性を示すもの等の探索も可能である。
【００１６】
それらタンパク質性あるいはペプチド性材料は、様々な生体インプラントにおける材料表層の改変に特に重要であり、また温和な条件でのタンパク質やペプチド、薬剤、ポリマー等の基盤表層への固定が必要とされる医療診断薬や研究に用いられるアレイの作製での基盤技術ともなる。その他、基盤表層上に規則的なパターンを示すものを見出すことで、ナノテクノロジーのボトムアップ技術の基盤ともなる。また、生体内で用いられる材料表層への体液タンパク質の吸着は大きな問題であるが、新たな材料開発におけるインプランタビリティーを見積もるための吸着性試験としても用いることができる。
【００１７】
また、いずれの方法も、たとえば、サンプルをアレイに吸着させることにより、多検体処理を処理することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本願発明は、ペプチド又はタンパク質を基板上に吸着させ、未吸着ペプチド又はタンパク質を洗浄により除いた後、基板上に吸着したペプチド又はタンパク質等の試料を分解してアミノ酸定量することにより検出及び／又は定量してタンパク質又はペプチドの吸着を測定する方法を包含する（以下、アミノ酸分析定量によるタンパク質又はペプチドの吸着測定法とも呼ぶ）。この方法は、タンパク質又はペプチドの吸着能の測定方法として用いることができる。
【００１９】
また、本願発明は、蛍光ナノ粒子（Ｑ−ｄｏｔ）及び任意の試料を結合させ混合し、当該蛍光ナノ粒子結合試料を基盤表層に吸着させ、吸着した試料と当該蛍光ナノ粒子の混合体を検出及び/又は測定することにより、蛍光を用いて当該試料（ペプチド又はタンパク質等）の吸着性を検出及び/又は測定する吸着を測定する方法も包含される（以下、Qdot法を利用した試料の吸着の測定方法とも呼ぶ）。この方法も、タンパク質又はペプチドの吸着能の測定方法として用いることができる。試料としては、糖、脂質、タンパク質又はペプチド、低分子化合物などの各種生体分子や、合成ポリマーに加え、酵素反応や化学反応により吸着する系の評価など、任意の試料の吸着能を測定できる。ただし、自家蛍光を有するサンプルの場合は、それと重複しない蛍光域での検出が可能なナノ粒子を適宜選択する必要がある。
【００２０】
１．アミノ酸分析定量によるタンパク質又はペプチドの吸着能測定法
本発明は、材料表層(基盤表層)へのタンパク質やペプチドの吸着能を、特別な装置を用いずに高感度でかつ正確に測定するための方法である。
【００２１】
（１）はじめに：タンパク質やペプチドの吸着
特定の配列をもつペプチドやタンパク質は、特定の基盤表層、例えば酸化チタンや金等の金属や炭酸カルシウムやリン酸カルシウム等の結晶、あるいはコラーゲンやキチン、セルロース等の有機物に、選択的あるいは非選択的に吸着する。また塩濃度の変化や温度の変化により吸着が誘導される場合もある。一方、生体内に導入される材料表層には体液タンパク質が選択的あるいは非選択的に吸着し、それが生体防御システムに認識されて炎症を引き起こしたり、血栓を形成することにより問題を引き起こすことが知られている。体液タンパク質の吸着度合いの測定は、特に生体適合材料開発においては重要な検討項目である。
【００２２】
固体表層へのタンパク質やペプチドの吸着能はその配列に起因する。特定の配列を持ったサンプルは固有の吸着力をもつため、サンプル間の誤差なく一定の割り合いで吸着体を回収することは極めて難しい。しかし、構成単位であるアミノ酸にまで分解すればほぼ完全に、またサンプル間の誤差なく吸着体を回収することができる。
【００２３】
（２）被吸着タンパク質又はペプチド並びに溶媒
本発明で使用できる被吸着タンパク質やペプチドは特に限定されず、どのようなものでもよく、RIや蛍光試薬等で事前にラベルしたりする必要もない。適当な溶媒（一般に水溶液）に溶解したサンプルを準備する。ただし、用いる溶媒や液体ハンドリング器具はアミノ酸の汚染のないものか、汚染を事前に除いたものを用いることが重要である。吸着条件はそのサンプル自体と用いる基盤の安定性に依存し、サンプルおよび基盤の変性を引き起こさない条件であれば問題ない。用いる溶媒は、アミノ酸への分解処理後のアミノ酸の定量法を妨害しないことが求められる。吸着処理に関係する全ての液体は一定温度にすることが望ましい。
【００２４】
（３）吸着基盤
本発明で使用できる吸着基盤は特に限定されず、どのようなものでもよい。ただし、アミノ酸の汚染のない基盤を準備するか、事前に基盤の洗浄により除いておく。ガラス基盤等は500℃で一晩処理することでアミノ酸の汚染は完全に除去できる。基盤形状は問わないが、小さな試験管状を用いれば、サンプル滴下が容易である。具体的には、素材はガラス、テフロン等、用いるアミノ酸への分解処理に耐えうるものは適用可能である。形状は小試験管（市販品、例えば直径7mm、長さ30mm、肉圧1mm）が使用に際して平易であるが、板状（例えば8mm角。特に問わない。）でも適用可能である。
【００２５】
また、多数の試験管を並べて使用する、又は、くぼみ若しくは穴が開いているプレートを用いることもできる。例えば、９６穴プレートの様な形態の多検体用ガラスプレートを専用で作製することもできる。
【００２６】
（４）ペプチド又はタンパク質の基盤への吸着
適当な溶媒（一般に水溶液）に溶解した試料のタンパク質又はペプチドを準備し、吸着を調べたい条件（温度、pH、塩濃度、圧力）で、基盤上に正確に滴下するだけで良い。なお、吸着処理時の基盤はサンプル等と同じ温度に恒温することが望ましい。
【００２７】
（５）吸着後の洗浄操作：洗浄液の種類：洗浄方法：
洗浄液としては、用いる基盤を浸蝕せず、また用いるタンパク質やペプチドを変性させないものであれば、あらゆるものが適用可能である。通常は適当量の塩を含む水系緩衝液が用いることができる。洗浄方法は、用いる実験条件により、通常は吸着体を物理的に剥離させないものであればあらゆる方法を用いることができるが、目的によっては一定の圧力での洗浄もあり得る。小試験管の場合は、ディスペンサー（ピペットマン(Gilson)等）で静かに吸引することが一般的である。小片基盤の場合は、ろ紙で静かに吸い上げることが挙げられるが、基盤ごと洗浄液に漬ける方法もある。
【００２８】
（６）アミノ酸にまで完全分解する方法
目的に応じた条件でサンプル吸着を終えた基盤は、加水分解等によりアミノ酸にまで完全分解する。アミノ酸にまで完全分解する方法は特に限定されず、どのようなものでもよいが、好ましくは揮発性酸あるいはアルカリによるものが、処理後の除去に際して簡便である。
【００２９】
なお、アミノ酸までの分解処理の具体的態様としては、5.7N HClでの加水分解が一般的であるが、4Mメタンスルフォン酸も用いることができる。またアルカリとしては、NaOHを用いる方法(Hugli, TE., et al., J.Bio.Chem., 247, 2828(1972))がある。酵素的処理としては、複数の酵素を組み併せる方法がある（Hill, RL. et al., J. Bio.Chem.237, 389(1962), Matsumura, Y. et al., Agr. Biol. Chem., 39, 379(1975)）。
【００３０】
（７）定量
アミノ酸にまで完全分解された被吸着サンプルは希塩酸溶液等で洗浄することで定量的に回収され、適当な方法でアミノ酸を定量し、いずれかの安定なアミノ酸の量を基に吸着したサンプル量を見積もることができる。本発明で使用できるアミノ酸定量法は特に限定されず、どのようなものでもよいが、基盤や溶媒、アミノ酸への分解に用いられる溶液等の影響を受けづらく、感度の高いものがより望ましい。具体的な、アミノ酸定量：微量な定量方法としては、陽イオン交換樹脂によりアミノ酸を分離しニンヒドリンで発色後定量する手法（Spackman, DH. et al. Anal. Chem., 30, 1190(1958)）が一般的である。また、Watersより市販されているAccQ-tagTM法や Pico-tagTM法は迅速かつ高感度でより容易に使用できる。
【００３１】
２．Qdot法を利用した試料の吸着能の測定方法
（１）はじめに
近年、従来からの有機化合物に基づく蛍光色素に変わり、半導体ナノ粒子を用いた蛍光測定方法が注目されている。従来からの蛍光標識は、光により退色しやすく長時間の観察には不適であり、又は多種の蛍光標識をする場合、種々の蛍光標識をしても蛍光波長に重なりが生じやすく問題となった。これに対し、蛍光ナノ粒子を用いた方法では、粒子サイズを変えることにより蛍光波長を紫外線側から赤外線側まで変えることができしかも、蛍光波長が非常に狭いバンドスペクトルを有しているため、多数の試料を同時に計測することができる。
【００３２】
発明者等は、この蛍光ナノ粒子を用いて、種々のサンプル（試料）が基盤表層に吸着又は基盤表層で自己集合するかを蛍光により検出できることを見出した。
【００３３】
蛍光性ナノ粒子を用いたペプチド又はタンパク質などの試料の材料表層(基盤表層)への吸着測定方法は、以下の工程を包含する。
【００３４】
（２−１）被吸着試料
吸着を検出したいサンプルは、タンパク質／ペプチドの他、糖、脂質、低分子化合物などの各種生体分子や、合成ポリマーなど、あらゆる化合物が可能である。
【００３５】
（２−２）蛍光ナノ粒子
蛍光ナノ粒子はCdSeやCdTe、InAsのような紫外線照射により強い蛍光を発する粒子を挙げることができる。また、これらの粒子をZnSやCdSといった安定化合物で被覆したものも本発明の測定法に用いることができる。このように安定化物を被覆した蛍光ナノ粒子として、米国Quantum Dot CorporationやEvident Technologies, Incから市販されているQdotTMやEviDotsTMのような製品も入手できる。さらに、本発明のように水系の溶液中で利用するためには、自己凝集を抑制する処理が施されているナノ粒子であれば用いることができる。水懸濁性を向上させる方法はWuらによって様々な方法が開示されている（Wu, X. et al., Nat. Biotechnol. 21,41(2003)）。本発明では、チオグリセロール被覆処理により水懸濁性を向上させている（Akiyoshi Hoshino, et al., Nano letters, in press）。この他、Gaoらはポリメタクリル酸で被覆処理している（Gao, et al., Nat. Biotechnol. 22, 969(2004)）。サンプルのナノ粒子への吸着をさまたげない程度であればナノ粒子の球径は問わないが、10nm以下であることが望ましく、さらに望ましくは5〜3nm以下であることがよい。
【００３６】
（３）基盤：基盤表層
基盤は検出工程を考え、ガラスあるいは表層処理したガラスが好ましい。吸着処理時の基盤、サンプル、ナノ粒子液等の温度は一定に保つことが望ましい。
【００３７】
無蛍光ガラス等蛍光測定ができるものに限られる。全反射顕微鏡で検出する場合はエバネッセント光発生に障害のないガラス製カバーガラスが望ましい。形状、大きさは問わない。
（４）試料及び蛍光ナノ粒子の基盤への吸着
適当な溶媒（一般に水溶液）に溶解した試料を準備し蛍光ナノ粒子と混合ししばらく放置する。混合溶液を、吸着を調べたい条件（温度、pH、塩濃度、圧力）で、基盤上に正確に滴下するだけで良い。なお、吸着処理時の基盤はサンプル等と同じ温度に恒温することが望ましい。
【００３８】
（５）洗浄工程
基盤上にて、それぞれの溶液条件にて一定時間処理したサンプルは、除去後洗浄を行う。これに関しては、例えばろ紙で静かに吸い上げることが挙げられるが、その他吸着体を物理的に剥離しない方法であれば適用可能である。
【００３９】
（６）蛍光検出及び/又は測定
サンプルが基盤に吸着する際に結果的に取り込まれた蛍光ナノ粒子の蛍光を読みよることで吸着を簡便に検出することが本発明の利点である。例えば、全反射顕微鏡を用いてガラス基盤表層に吸着した蛍光ナノ粒子を半定量することができるが、ナノ粒子の蛍光量が読み取れる方法であれば、この限りではない。
【００４０】
（７）  Qdotアレイの調製
なお、Q-dot法は、アレイ上に試料を吸着させ、ハイスループットで大量に試料を1度の吸着能を検出又は測定することも可能である。
【００４１】
例えば、アレイは次のようにして調製することができる。恒温器上に置かれたガラス板を基盤とし、そこに溶媒（例えば、塩濃度やpHを変えた一連の緩衝液等）を非接触式マイクロディスペンサー（X-Yプロッターにより位置制御され得る）により順次吐出する。次に、その溶媒スポットに、サンプル（タンパク質やペプチド水溶液）と蛍光ナノ粒子の混合液を順次吐出し、適当な時間Incubation後、洗浄用オートピペッター等でサンプル液体を吸引除去、設定された条件での洗浄工程（例えば洗浄液の滴下と除去の繰り返し等）を経た後、吸着したペプチドあるいは蛋白質を、取り込まれて一緒に吸着したナノ粒子の蛍光を測定することにより検出し、特定条件での吸着性ペプチドや蛋白質を特定する。吐出圧を変化させて、特定圧で吸着性を示すペプチド／蛋白質やIncubation時に恒温器の温度を変化させることによる温度感受性吸着性ペプチド／蛋白質等、多検体処理を通した材料の探索に利用できる。
【実施例】
【００４２】
[実施例１]
接着タンパク質の海水中での吸着活性の加水分解法による測定
フジツボ第７接着タンパク質は、つぎのように調製したものを用いた。フジツボ第７接着タンパク質（水中接着タンパク質、Mrcp19kとも呼ぶ）の遺伝子は、特開2004-105143記載の実施例に従い遺伝子を調製した（なお、調製された第７接着タンパク質遺伝子を含む微生物は、平成14年9月17日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P-19015として寄託されている）。
【００４３】
調製された第７接着タンパク質遺伝子は、適当な組み換え発現ベクターに制限酵素サイトで挿入し、ホスト大腸菌により第７接着タンパク質を産生させた後、カラムクロマトグラフィーにより単一に精製した。
【００４４】
BSAは市販品を用いた。ガラス製小験管（市販品、例えば直径7mm、長さ30mm、肉圧1mm）および加水分解試験管（軟質試験管、市販品、小試験管が入るものならよい））を洗浄後、500℃にて１２時間処理し、アミノ酸の汚染を除いた。人工海水を二倍濃度に調製し、限外ろ過（分子量3000カットオフ）したものを２×海水とした。
【００４５】
まず、２５℃恒温機上にガラス製小験管とサンプル及び２×海水を置き、保温した。5μlのサンプルをガラス製小験管底部に滴下し、そこに5μlの２×海水を滴下した。１０分後、それらの液を除去し、50μlの1×海水を滴下、さらにそれを除去した。この洗浄操作をもう一度行い、残った水分を遠心エバポレーターで除去した。加水分解試験管の底部にまず100μlの二回蒸留定沸点塩酸を加え、次に処理済みの小試験管を置いた。その加水分解試験管を減圧封管し、130℃、3時間加水分解を行った。処理後、低速遠心を行い、加水分解試験管を開管して小試験管を回収、小試験管内部の加水分解物を0.1N HCl / 30% メタノールにて数回洗浄回収し、併せて遠心エバポレーターにて乾固した。加水分解物をアミノ酸分析（AccQ-TagTM, Waters）にて定量した。その結果を図３に示す。図３より、ガラス表層に吸着するとされるBSAでは約15％の吸着が確認されたのに対し、Mrcp-19kでは35%の吸着が確認された。Mrcp-19kは水中接着における基盤との相互作用にその役割があることが明らかとなった。
【００４６】
[実施例２]
自己集合性ペプチドの海水中での吸着活性のQdotによる測定
塩濃度依存的自己集合性を示すペプチドAC519の吸着を評価した。AC519は、配列番号1（Ser Lys Leu Pro Cys Asn Asp Glu His Pro Cys Tyr Arg Lys Glu Gly  Gly Val Val Ser Cys Asp Cys Lys）で表されるペプチドで特願2003‐417215号記載の方法でした。具体的には、ABI430A 型全自動固相合成機を用い、Boc法にて配列番号1のアミノ酸配列で表されるペプチドを合成した。Boc-アミノ酸４当量ずつ使用して縮合し、保護ペプチド樹脂を得た。得られた保護ペプチド樹脂を、無水フッ化水素/p-クレゾール（8：2）で-2〜-5℃下60分間処理し、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。得られた粗ペプチドを逆相HPLCカラム（ODS）を用い、0.1％TFAを含むH2O−CH3CNの系でグラジエント溶出を行い精製した。目的物を高純度に含む分画を集め凍結乾燥して、用いた。
【００４７】
蛍光ナノ粒子は表層にOH基を導入し分散性を高めたもの(thioglycerol被覆処理（Akiyoshi Hoshino, et al., Nano letters,; 2004; 4(11) pp 2163 - 2169)を用いた。人工海水を二倍濃度に調製し、限外ろ過（分子量3000カットオフ）したものを２×海水とした。
【００４８】
まず２５℃恒温機上にカバーガラスとサンプル、蛍光ナノ粒子懸濁液及び２×海水を置き、保温した。2.5μlのサンプルと等量の蛍光ナノ粒子懸濁液をポリプロピレンチューブ内で事前に混合し、ガラス基盤上に滴下した。そこに5μlの２×海水を滴下し、10分間処理後、ろ紙片にて隅より液を吸い上げ、除去した。15μlの1×海水を滴下、ろ紙片にて隅より液を吸い上げることで洗浄とした。洗浄操作は二回行った。サンプル吸着面を内側にしてカバーガラスをスライドガラス上に載せ、全反射顕微鏡にて蛍光ナノ粒子の存在を確認した。その結果を図４に示す。図４より、サンプルのないコントロールではナノ粒子は観察されなかったが、サンプルのある場合には、蛍光ナノ粒子の存在が確認され、AC519が海水中で基盤上に吸着することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本願発明は、試料の吸着能の検出/測定の技術分野で使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ハイスループット蛋白質・ペプチド吸着測定法のフロー図
【図２】アミノ酸分析定量に基づく蛋白質・ペプチド吸着測定法
【図３】接着タンパク質の海水中での吸着活性の加水分解法による測定
【図４】AC519の全反射顕微鏡の写真
【図１】
2006153718.tif 000002
【図２】
2006153718.tif 000003
【図３】
2006153718.tif 000004
【図４】
2006153718.tif 000005
【配列表】
2006153718000001.app