(57)【要約】【課題】  基質特異性が改善されたピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）を提供する。【解決手段】    本発明は、野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）において、以下の少なくともいずれかの変異を有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ。          
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における１４２位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２５８位及び４１６位の少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する
（２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位の少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸挿入を有する
【請求項２】
アミノ酸置換が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、Ｋ１４２Ｄ、Ｋ１４２Ｉ、Ｔ２２４Ａ、Ｔ２２４Ｃ、Ｐ２３０Ｉ、Ｐ２３０Ｓ、Ｐ２３０Ｖ、Ｐ２３０Ｙ、Ａ２３６Ｔ、Ａ２３６Ｖ、Ｓ２４４Ｔ、Ｓ２４４Ａ、Ｌ２５８Ｆ、Ｅ４１６Ｒ、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項３】
アミノ酸挿入が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、７４Ｄ、７５Ａ、７５Ｃ、７５Ｆ、７５Ｇ、７５Ｈ、７５Ｉ、７５Ｋ、７５Ｌ、７５Ｍ、７５Ｎ、７５Ｒ、７５Ｓ、７５Ｔ、７５Ｖ、７５Ｗ、７５Ｙ、７６Ａ、７６Ｃ、７６Ｄ、７６Ｇ、７６Ｓ、７６Ｔ、７６Ｙ、１６８Ｈ、１６８Ｎ、１６８Ｐ、１６８Ｓ、１６９Ｘ、１７０Ａ、１７０Ｄ、１７０Ｅ、１７０Ｆ、１７０Ｇ、１７０Ｈ、１７０Ｌ、１７０Ｐ、１７０Ｑ、１７０Ｒ、１７０Ｓ、１７０Ｔ、１７０Ｙ、１７１Ｘ、３４４Ｐ、３４４Ｗ、３４５Ｗ、４３０Ｆ、４３０Ｐ、４３０Ｙ、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸挿入を有する、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項４】
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における３４３位、３４４位あるい３４４位、３４５位あるい３４５位、３４６位はのいずれかの位置、または、他の種における上記と同等の位置において２つ以上のアミノ酸挿入を有する、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項５】
２つ以上のアミノ酸挿入が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、３４３Ｌ−３４４Ｖ、３４３Ｙ−３４４Ｓ、３４３Ｉ―３４４Ｓ、３４４Ｓ―３４５Ｓ、３４４Ｓ−３４５Ｉ、３４４Ｌ−３４５Ｌ、３４４Ｉ−３４５Ｒ、３４４Ｔ―３４５Ｃ、３４４Ｔ―３４５Ｅ、３４４Ｔ―３４５Ｆ、３４４Ｔ―３４５Ｇ、３４４Ｔ―３４５Ｈ、３４４Ｔ―３４５Ｉ、３４４Ｔ―３４５Ｋ、３４４Ｔ―３４５Ｌ、３４４Ｔ―３４５Ｍ、３４４Ｔ―３４５Ｎ、３４４Ｔ―３４５Ｑ、３４４Ｔ―３４５Ｒ、３４４Ｔ―３４５Ｓ、３４４Ｔ―３４５Ｔ、３４４Ｔ―３４５Ｖ、３４４Ｔ―３４５Ｗ、３４４Ｔ―３４５Ｙ、３４５Ｌ−３４６Ｃ、３４５Ｔ−３４６Ｆ、３４５Ｗ−３４６Ｖ、３４５Ｓ−３４６Ｉ、３４６Ｙ−３４７Ｖ、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸挿入を有する、請求項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項６】
二糖類がマルトースである、請求項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
【請求項７】
請求項６に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターで形質転換された形質転換体。  
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
【請求項１５】
ＰＱＱＧＤＨに請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法。
【請求項１６】
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
【請求項１７】
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は基質特異性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、グルコースデヒドロゲナーゼをＧＤＨとも記載する。）に関し、詳しくはピロロキノリンキノン（以下、ピロロキノリンキノンをＰＱＱとも記載する。）を補酵素とする改変型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼをＰＱＱＧＤＨとも記載する。）、その製造法及びグルコースセンサーに関する。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒することから、血糖の測定に用いることが可能である。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されることから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。
【０００３】
我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（たとえば、特許文献１を参照）。しかしながら、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素はグルコースオキシダーゼに比べてその基質特異性に問題があった。
【特許文献１】特開平１１−２４３９４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上を課題としてその改良に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、ＰＱＱＧＤＨの特定の領域においてアミノ酸を置換すること、および／または、アミノ酸を挿入することにより基質特異性を向上させることを可能にし、本発明を完成するに到った。
特に、これまで実質的にほとんど具体的検討がなされてこなかった「アミノ酸の挿入」に着目し詳細に検討することで、本発明を完成するに到った。
即ち本発明は、
［項１］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）において、以下の少なくともいずれかの変異を有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ。          
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における１４２位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２５８位及び４１６位の少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する
（２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位の少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸挿入を有する
［項２］
アミノ酸置換が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、Ｋ１４２Ｄ、Ｋ１４２Ｉ、Ｔ２２４Ａ、Ｔ２２４Ｃ、Ｐ２３０Ｉ、Ｐ２３０Ｓ、Ｐ２３０Ｖ、Ｐ２３０Ｙ、Ａ２３６Ｔ、Ａ２３６Ｖ、Ｓ２４４Ｔ、Ｓ２４４Ａ、Ｌ２５８Ｆ、Ｅ４１６Ｒ、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する、項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項３］
アミノ酸挿入が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、７４Ｄ、７５Ａ、７５Ｃ、７５Ｆ、７５Ｇ、７５Ｈ、７５Ｉ、７５Ｋ、７５Ｌ、７５Ｍ、７５Ｎ、７５Ｒ、７５Ｓ、７５Ｔ、７５Ｖ、７５Ｗ、７５Ｙ、７６Ａ、７６Ｃ、７６Ｄ、７６Ｇ、７６Ｓ、７６Ｔ、７６Ｙ、１６８Ｈ、１６８Ｎ、１６８Ｐ、１６８Ｓ、１６９Ｘ、１７０Ａ、１７０Ｄ、１７０Ｅ、１７０Ｆ、１７０Ｇ、１７０Ｈ、１７０Ｌ、１７０Ｐ、１７０Ｑ、１７０Ｒ、１７０Ｓ、１７０Ｔ、１７０Ｙ、１７１Ｘ、３４４Ｐ、３４４Ｗ、３４５Ｗ、４３０Ｆ、４３０Ｐ、４３０Ｙ、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸挿入を有する、項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項４］
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における３４３位、３４４位あるい３４４位、３４５位あるい３４５位、３４６位はのいずれかの位置、または、他の種における上記と同等の位置において２つ以上のアミノ酸挿入を有する、項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項５］２つ以上のアミノ酸挿入が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における、３４３Ｌ−３４４Ｖ、３４３Ｙ−３４４Ｓ、３４３Ｉ―３４４Ｓ、３４４Ｓ―３４５Ｓ、３４４Ｓ−３４５Ｉ、３４４Ｌ−３４５Ｌ、３４４Ｉ−３４５Ｒ、３４４Ｔ―３４５Ｃ、３４４Ｔ―３４５Ｅ、３４４Ｔ―３４５Ｆ、３４４Ｔ―３４５Ｇ、３４４Ｔ―３４５Ｈ、３４４Ｔ―３４５Ｉ、３４４Ｔ―３４５Ｋ、３４４Ｔ―３４５Ｌ、３４４Ｔ―３４５Ｍ、３４４Ｔ―３４５Ｎ、３４４Ｔ―３４５Ｑ、３４４Ｔ―３４５Ｒ、３４４Ｔ―３４５Ｓ、３４４Ｔ―３４５Ｔ、３４４Ｔ―３４５Ｖ、３４４Ｔ―３４５Ｗ、３４４Ｔ―３４５Ｙ、３４５Ｌ−３４６Ｃ、３４５Ｔ−３４６Ｆ、３４５Ｗ−３４６Ｖ、３４５Ｓ−３４６Ｉ、３４６Ｙ−３４７Ｖ、からなる群のうち少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸挿入を有する、項１に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項６］
二糖類がマルトースである、項１〜５のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
［項７］
項６に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
［項８］
項７に記載の遺伝子を含むベクター。
［項９］
項８に記載のベクターで形質転換された形質転換体。  
［項１０］
項９に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
［項１１］
項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定用組成物。
［項１２］
項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
［項１３］
項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
［項１４］
項１〜６のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定方法。
［項１５］
ＰＱＱＧＤＨに項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法。
［項１６］
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法。
［項１７］
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した酵素である。本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨをグルコースアッセイキット及びグルコースセンサに使用することにより、野生型ＰＱＱＧＤＨを使用したものよりもより高精度な分析が可能となり、さらにはそのような分析が可能な高精度のグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したものである。  
【０００９】
二糖類に対する作用性とは、二糖類を脱水素する作用を意味する。二糖類としては、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。本願発明では、二糖類に対する作用性が低下したことを、基質特異性の向上とも表現する。
【００１０】
二糖類に対する作用性が低下しているかどうかの判断は、次のように行う。
後述の試験例１に記載の活性測定法において、野生型ＰＱＱＧＤＨを用いて、Ｄ−グルコースを基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ａ）と、Ｄ−グルコースのかわりに当該二糖類を基質溶液とした場合のＰＱＱＧＤＨ活性値（ｂ）を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合に対する相対値（（ｂ）／（ａ）×１００）を求める。次いで、改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて同様の操作を行い、その値を比較して判断する。
【００１１】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
【００１２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものを含む。好ましくは、マルトースに対する作用性が低下したものである。マルトースに対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの９０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に２０％以下である。
【００１３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であるものが好ましい。より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは４０％以下、特に２０％以下である。
【００１４】
野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えば、
ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）において、以下の少なくともいずれかの変異を有する、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨ。          
（１）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における１４２位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２５８位及び４１６位の少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸置換を有する、
（２）Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列における７４位、７５位、７６位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、３４４位、３４５位及び４３０位の少なくとも１つの位置、または、他の種における上記と同等の位置においてアミノ酸挿入を有する
が例示される。
【００１５】
好ましくは、Ｋ１４２Ｄ、Ｋ１４２Ｉ、Ｔ２２４Ａ、Ｔ２２４Ｃ、Ｐ２３０Ｉ、Ｐ２３０Ｓ、Ｐ２３０Ｖ、Ｐ２３０Ｙ、Ａ２３６Ｔ、Ａ２３６Ｖ、Ｓ２４４Ｔ、Ｓ２４４Ａ、Ｌ２５８Ｆ、Ｅ４１６Ｒ、７４Ｄ、７５Ａ、７５Ｃ、７５Ｆ、７５Ｇ、７５Ｈ、７５Ｉ、７５Ｋ、７５Ｌ、７５Ｍ、７５Ｎ、７５Ｒ、７５Ｓ、７５Ｔ、７５Ｖ、７５Ｗ、７５Ｙ、７６Ａ、７６Ｃ、７６Ｄ、７６Ｇ、７６Ｓ、７６Ｔ、７６Ｙ、１６８Ｈ、１６８Ｎ、１６８Ｐ、１６８Ｓ、１６９Ｘ、１７０Ａ、１７０Ｄ、１７０Ｅ、１７０Ｆ、１７０Ｇ、１７０Ｈ、１７０Ｌ、１７０Ｐ、１７０Ｑ、１７０Ｒ、１７０Ｓ、１７０Ｔ、１７０Ｙ、１７１Ｘ、３４４Ｐ、３４４Ｗ、３４５Ｗ、４３０Ｆ、４３０Ｐ、４３０Ｙ、３４３Ｌ−３４４Ｖ、３４３Ｙ−３４４Ｓ、３４３Ｉ−３４４Ｓ、３４４Ｓ−３４５Ｓ、３４４Ｓ−３４５Ｉ、３４４Ｌ−３４５Ｌ、３４４Ｉ−３４５Ｒ、３４４Ｔ−３４５Ｃ、３４４Ｔ−３４５Ｅ、３４４Ｔ−３４５Ｆ、３４４Ｔ−３４５Ｇ、３４４Ｔ−３４５Ｈ、３４４Ｔ−３４５Ｉ、３４４Ｔ−３４５Ｋ、３４４Ｔ−３４５Ｌ、３４４Ｔ−３４５Ｍ、３４４Ｔ−３４５Ｎ、３４４Ｔ−３４５Ｑ、３４４Ｔ−３４５Ｒ、３４４Ｔ−３４５Ｓ、３４４Ｔ−３４５Ｔ、３４４Ｔ−３４５Ｖ、３４４Ｔ−３４５Ｗ、３４４Ｔ−３４５Ｙ、３４５Ｌ−３４６Ｃ、３４５Ｔ−３４６Ｆ、３４５Ｗ−３４６Ｖ、３４５Ｓ−３４６Ｉ、３４６Ｙ−３４７Ｖ、からなる群から選ばれるアミノ酸置換または挿入のうち少なくとも１つを有する改変型ＰＱＱＧＤＨである。
【００１６】
ここで、例えば、「Ｋ１４２Ｄ」は、１４２位のＫ（Ｌｙｓ）をＤ（Ａｓｐ）に置換することを意味する。また、「７４Ｄ」は、７４位の前の位置にＤ（Ａｓｐ）を挿入することを意味する。即ち、７３位のアミノ酸の後にＤを挿入したことを意味する。多重変異体については、同様の原則によって表記したものをハイフンでつなげて表記している。
【００１７】
本願発明はまた、ＰＱＱＧＤＨに上記のアミノ酸挿入を行うことを特徴とする、ＰＱＱＧＤＨの二糖類に対する作用性を低下させる方法である。
【００１８】
本願発明は、また、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有することを特徴とする、グルコース測定系における、測定の正確性を向上させる方法である。
【００１９】
本願発明はまた、ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコース測定系において、請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ酸挿入を行ったＰＱＱＧＬＤを含有させることを特徴とする、測定の正確性が向上したグルコース測定用組成物を、製造する方法である。
【００２０】
上記のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列は、好ましくはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ由来ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列である。中でも好ましくは配列番号１である。配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とするものであり、特開平１１−２４３９４９号公報に開示されている。なお、上記および配列番号１において、アミノ酸の表記は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けされている。
【００２１】
アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株は、以前、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓに分類されていた。
【００２２】
なお、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、好ましくは二糖類に対する作用性に対して実質的な悪影響を及ぼさない限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されていてもよい。
【００２３】
ところで、本願出願時において、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）  ＬＭＤ７９．４１株由来の酵素のＸ線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした該酵素の高次構造が明らかとなっている（非特許文献１，２，３，４を参照。）。
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８９，３１９−３３３（１９９９）
【非特許文献２】ＰＮＡＳ，９６（２１），１１７８７−１１７９１（１９９９）
【非特許文献３】Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１８（１９），５１８７−５１９４（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，９，１２６５−１２７３（２０００）
【００２４】
その高次構造に関する知見を基に、該酵素の構造と機能の相関に関する研究が進められているが、まだ完全に明らかになったとは言えない。例えば、水溶性グルコース脱水素酵素の第６番目のＷ−モチーフ、のＢストランドとＣストランドを結ぶループ領域（Ｗ６ＢＣ）中のアミノ酸残基の構造遺伝子の特定の部位に変異を導入することによりグルコースに対する選択性を改良しうることが考察されている（例えば、特許文献２を参照。）しかしながら、効果が実証されているのは実施例に開示されているものだけである。
【特許文献２】特開２００１−１９７８８８
【００２５】
ここで、本願発明の成果をもとにこれらの高次構造に関する知見を見直すと、二糖類に対する作用性の改変には、ＰＱＱの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸  の少なくとも１つ以上が関わっている可能性が考えられる。また、今回、これらの活性中心から比較的離れたタンパク質表層に近い４１６位のようなアミノ酸においても二糖類に対する作用性の改変の可能性が示された。
【００２６】
以上の教示にしたがって、当業者は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＮＣＩＭＢ１１５１７株を起源とする配列番号１で示される野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質および配列番号２で示されるその塩基配列を参照し、これらとの相同性が高い（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する）他の起源（天然のもの、改変されたもの、人工的に合成されたものを問わない）に由来する改変型ＰＱＱＧＤＨについても、配列番号１に対応する位置（同等の位置）を探し出し、当該領域でアミノ酸残基を置換することにより、過度に試行錯誤を行うことなく、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。
【００２７】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＬＭＤ７９．４１株由来酵素のアミノ酸配列を比較すると、相違箇所はわずかで、相同性は９２．３％（シグナル配列含む）となり、非常に類似しているので、配列番号１におけるある残基が、他起源の酵素のどのアミノ酸残基に該当するかを容易に認識することができる。そして、本発明にしたがって、そのような１またはそれ以上の箇所においてアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換および／または他のアミノ酸を挿入することにより、野生型のＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下した改変型ＰＱＱＧＤＨを得ることができる。これらの改変型ＰＱＱＧＤＨグルコース脱水素酵素も本発明の範囲内に含まれる。
【００２８】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、微生物など種々の起源より得られる野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を改変することにより得られる可能性がある。具体的には、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス等の酸化細菌やアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリヒア・コリ、クレブシーラ・エーロジーンズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等の腸内細菌を挙げることができる。ただし、エシェリヒア・コリなどに存在する膜型酵素を改変して可溶型にすることは困難であり、起源としてはアシネトバクター属、さらに好ましくは相同性の高いアシネトバクター・カルコアセティカスもしくはアシネトバクター・バウマンニのいずれかの可溶性ＰＱＱＧＤＨを選択することが好ましい。
【００２９】
野生型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００３０】
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。
【００３１】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＰＱＱＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００３２】
本発明において、ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えばアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７  の染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
なお、アシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７は、ＮＣＩＭＢまたはＵＫＮＣＣから入手することができる。
【００３３】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＧＤＨをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体であるアシネトバクター・カルコアセティカスＮＣＩＢ１１５１７  の染色体ＤＮＡは、具体的には以下のようにして採取される。
【００３４】
該遺伝子供与微生物を例えば１〜３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００３５】
上記のようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００３６】
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。
【００３７】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０  、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１  などが例示される。また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９  、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  などが例示される。
【００３８】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＧＤＨをコードする遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００３９】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば特に制限されない。一般的には、エシェリヒア・コリＷ３１１０  、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１  、エシェリヒア・コリＪＭ１０９  、エシェリヒア・コリＤＨ５  αなどを用いることができる。
【００４０】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００４１】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＧＤＨを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＰＱＱの添加によりＧＤＨ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＧＤＨを生成する微生物を選択すればよい。
【００４２】
上記の方法により得られたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００４３】
上記のようにして、一度選択されたＰＱＱを補欠分子族とするＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、ＰＱＱ生産能を有する微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによるＰＱＱ生産能を有する微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００４４】
ＰＱＱ生産能を有する微生物としては、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等のメタノール資化性細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ）属やグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ）属の酢酸菌、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス属、アシネトバクター属等の細菌を挙げることができる。なかでも、シュードモナス属細菌とアシネトバクター属細菌が利用できる宿主−ベクター系が確立されており利用しやすいので好ましい。
【００４５】
シュードモナス属細菌では、シュードモナス・アエルギノサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダなどを用いることができる。また、アシネトバクター属細菌ではアシネトバクター・カルコアセティカス、アシネトバクター・バウマンニ等を用いることができる。
【００４６】
上記微生物にて複製できる組換えベクターとしては、ＲＳＦ１０１０  由来のベクターもしくはその類似のレプリコンを有するベクターがシュードモナス属細菌に利用可能である。例えば、ｐＫＴ２４０、ｐＭＭＢ２４等（Ｍ．Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ  ら，Ｇｅｎｅ，２６，２７３（１９８３））、ｐＣＮ４０  、ｐＣＮ６０  等（Ｃ．Ｃ．Ｎｉｅｔｏ  ら，Ｇｅｎｅ，８７，１４５（１９９０））やｐＴＳ１１３７  等を挙げることができる。また、ｐＭＥ２９０等（Ｙ．Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｅ，３６，２７（１９８５））、ｐＮＩ１１１、ｐＮＩ２０Ｃ（Ｎ．Ｉｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，６１４（１９９１））も利用できる。
【００４７】
アシネトバクター属細菌では、ｐＷＭ４３  等（Ｗ．Ｍｉｎａｓ  ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ，５９，２８０７（１９９３））、ｐＫＴ２３０、ｐＷＨ１２６６  等（Ｍ．Ｈｕｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ，８７，４５（１９９０））がベクターとして利用可能である。
【００４８】
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００４９】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００５０】
培養温度は菌が成育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、上記のようなＰＱＱ生産能を有する微生物の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変型ＰＱＱＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは菌が発育し、改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。
【００５１】
培養物中の改変型ＰＱＱＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、改変型ＰＱＱＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、改変型ＰＱＱＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変型ＰＱＱＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００５２】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００５３】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ  （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ  （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００５４】
上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥、真空乾燥やスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。その際、精製酵素はリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液やＧＯＯＤの緩衝液に溶解しているものを用いることができる。好適なものはＧＯＯＤの緩衝液であり、なかでも、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳもしくはＭＯＰＳ緩衝液が特に好ましい。また、カルシウムイオンまたはその塩、およびグルタミン酸、グルタミン、リジン等のアミノ酸類、さらに血清アルブミン等を添加することによりＧＤＨをより安定化することができる。
【００５５】
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００５６】
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの７４位、７５位、７６位、１４２位、１６８位、１６９位、１７０位、１７１位、２２４位、２３０位、２３６位、２４４位、２５８位、３４４位、３４５位、４１６位及び４３０位に着目し、その位置においてアミノ酸を置換、および／または、アミノ酸を挿入したところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、
Ｋ１４２Ｄ、Ｋ１４２Ｉ、Ｔ２２４Ａ、Ｔ２２４Ｃ、Ｐ２３０Ｉ、Ｐ２３０Ｓ、Ｐ２３０Ｖ、Ｐ２３０Ｙ、Ａ２３６Ｔ、Ａ２３６Ｖ、Ｓ２４４Ｔ、Ｓ２４４Ａ、Ｌ２５８Ｆ、Ｅ４１６Ｒ、７４Ｄ、７５Ａ、７５Ｃ、７５Ｆ、７５Ｇ、７５Ｈ、７５Ｉ、７５Ｋ、７５Ｌ、７５Ｍ、７５Ｎ、７５Ｒ、７５Ｓ、７５Ｔ、７５Ｖ、７５Ｗ、７５Ｙ、７６Ａ、７６Ｃ、７６Ｄ、７６Ｇ、７６Ｓ、７６Ｔ、７６Ｙ、１６８Ｈ、１６８Ｎ、１６８Ｐ、１６８Ｓ、１６９Ｘ、１７０Ａ、１７０Ｄ、１７０Ｅ、１７０Ｆ、１７０Ｇ、１７０Ｈ、１７０Ｌ、１７０Ｐ、１７０Ｑ、１７０Ｒ、１７０Ｓ、１７０Ｔ、１７０Ｙ、１７１Ｘ、３４４Ｐ、３４４Ｗ、３４５Ｗ、４３０Ｆ、４３０Ｐ、４３０Ｙ、３４３Ｌ−３４４Ｖ、３４３Ｙ−３４４Ｓ、３４３Ｉ―３４４Ｓ、３４４Ｓ―３４５Ｓ、３４４Ｓ−３４５Ｉ、３４４Ｌ−３４５Ｌ、３４４Ｉ−３４５Ｒ、３４４Ｔ―３４５Ｃ、３４４Ｔ―３４５Ｅ、３４４Ｔ―３４５Ｆ、３４４Ｔ―３４５Ｇ、３４４Ｔ―３４５Ｈ、３４４Ｔ―３４５Ｉ、３４４Ｔ―３４５Ｋ、３４４Ｔ―３４５Ｌ、３４４Ｔ―３４５Ｍ、３４４Ｔ―３４５Ｎ、３４４Ｔ―３４５Ｑ、３４４Ｔ―３４５Ｒ、３４４Ｔ―３４５Ｓ、３４４Ｔ―３４５Ｔ、３４４Ｔ―３４５Ｖ、３４４Ｔ―３４５Ｗ、３４４Ｔ―３４５Ｙ、３４５Ｌ−３４６Ｃ、３４５Ｔ−３４６Ｆ、３４５Ｗ−３４６Ｖ、３４５Ｓ−３４６Ｉ、３４６Ｙ−３４７Ｖ、が特に好ましい。
【００５７】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質は、グルコース測定用組成物として用いることが出来る。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨタンパク質またはグルコース測定用組成物は、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーとして用いることができる。本発明のグルコース測定用組成物は、その形態や使用方法に応じて、精製された状態であっても良いし、種々の添加物が加えられていても良い。
例えば、精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。
【００５８】
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
【００５９】
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
【００６０】
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
【００６１】
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
【００６２】
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
【００６３】
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
【００６４】
また、カルシウムイオンを添加しても安定化効果が得られる。すなわち、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。
【００６５】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させることによる安定化効果は、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、さらに向上する。
【００６６】
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
【００６７】
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００６８】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００６９】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００７０】
本願発明のグルコース測定用組成物は、宿主由来のタンパク質成分以外のタンパク質成分（例えばＢＳＡ等の生体由来物質）を含有しない構成とすることもできる。
【００７１】
この場合、組成物は、改変型ＰＱＱＧＤＨとカルシウムまたはカルシウム塩、及び緩衝剤から基本的に成る。また、これらを含有した上で、アミノ酸、あるいは有機酸をさらに加えてもかまわない。また、これらを含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
【００７２】
カルシウムの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。また、粉末組成物において、カルシウムの含有量（Ｗ／Ｗ）は、０．０５％〜５％であることが望ましい。
【００７３】
緩衝剤としては、一般的に使用されるものであれば良く、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。但し、リン酸バッファーのようにカルシウムと不溶性の塩を形成するものは好ましくない。またトリスアミノメタンのようにアミノ基末端を有するものは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼのＰＱＱ結合を不安定とするために好ましくない。このため、緩衝剤としてさらに好ましくは、ホウ酸や酢酸といった緩衝剤や、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＣＨＥＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅといったグッド緩衝剤が挙げられる。
また、粉末組成物において、緩衝剤の含有量（Ｗ／Ｗ）は、１．０％〜５０％であることが望ましい。
【００７４】
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００７５】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００７６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１  ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）  ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
【００７８】
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
それぞれの変異導入に用いた合成オリゴヌクレオチド対は、変異導入する部位のアミノ酸に相当するＤＮＡ配列をＮＮＮ（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）とし、そこから５’側、３’側にそれぞれ１８ヌクレオチド付随させたものを作製して、これと相補鎖を成す合成オリゴヌクレオチドを作製して使用した。野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と前記合成オリゴヌクレオチド対を基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、目的の部位に元のアミノ酸種とは異なる変異が導入された遺伝子ライブラリーを作製した。更に塩基配列を決定して、配列番号１記載のアミノ酸配列の１４２番目のリシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｋ１４２Ｄ）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号１記載のアミノ酸配列の１４２番目のリシンがイソロイシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｋ１４２Ｉ）を取得した。
その他上記と同様に、目的のアミノ酸部位を置換するよう設計した合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、配列番号１記載のアミノ酸配列の２２４番目のトレオニンがアラニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ）、２２４番目のトレオニンがシステインに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ｃ）、２３０番目のプロリンがイソロイシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｉ）、２３０番目のプロリンがセリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｓ）、２３０番目のプロニンがバリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｖ）、２３０番目のプロリンがチロシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｙ）、２３６番目のアラニンがトレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ａ２３６Ｔ）、２３６番目のアラニンがバリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ａ２３６Ｖ）、２４４番目のセリンがトレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｓ２４４Ｔ）、２４４番目のセリンがアラニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｓ２４４Ａ）、２５８番目のロイシンがフェニルアラニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｌ２５８Ｆ）、４１６番目のアスパラギン酸がアルギニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−Ｅ４１６Ｒ）、７５番目にアスパラギン酸が挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７４Ｄ）、７５番目にアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ａ）、７５番目にシステインが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｃ）、７５番目にフェニルアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｆ）、７５番目にグリシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｇ）、７５番目にヒスチジンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｈ）、７５番目にイソロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｉ）、７５番目にリシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｋ）、７５番目にロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｌ）、７５番目にメチオニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｍ）、７５番目にアスパラギンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｎ）、７５番目にアルギニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｒ）、７５番目にセリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｓ）、７５番目にトレオニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｔ）、７５番目にバリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｖ）、７５番目にトリプトファンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｗ）、７５番目にチロシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７５Ｙ）、７６番目にアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７６Ａ）、７６番目にシステインが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７６Ｃ）、７６番目にアスパラギン酸が挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７６Ｄ）、７６番目にグリシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７６Ｇ）、７６番目にチセリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７６Ｓ）、７６番目にトレオニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７６Ｔ）、７６番目にチロシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−７６Ｙ）、１６８番目にヒスチジンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１６８Ｈ）、１６８番目にアスパラギンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１６８Ｎ）、１６８番目にプロリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１６８Ｐ）、１６８番目にセリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１６８Ｓ）、１６９番目に必須アミノ酸が挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする２０種類の組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１６９Ａ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｃ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｄ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｅ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｆ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｇ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｈ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｉ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｋ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｌ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｍ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｎ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｐ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｑ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｒ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｓ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｔ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｖ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｗ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｙ）、１７０番目にアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ａ）、１７０番目にアスパラギン酸が挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｄ）、１７０番目にグルタミン酸が挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｅ）、１７０番目にフェニルアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｆ）、１７０番目にグリシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｇ）、１７０番目にヒスチジンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｈ）、１７０番目にロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｌ）、１７０番目にプロリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｐ）、１７０番目にグルタミンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｑ）、１７０番目にアルギニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｒ）、１７０番目にセリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｓ）、１７０番目にトレオニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｔ）、１７０番目にチロシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７０Ｙ）、１７１番目に必須アミノ酸が挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換え２０種類のプラスミド（ｐＮＰＧ５−１７１Ａ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｃ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｄ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｅ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｆ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｇ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｈ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｉ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｋ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｌ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｍ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｎ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｐ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｑ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｒ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｓ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｔ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｖ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｗ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｙ）、３４４番目にプロリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｐ）、３４４番目にトリプトファンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｗ）、４３０番目にトリプトファンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４５Ｗ）、４３０番目にフェニルアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−４３０Ｆ）、４３０番目にプロリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−４３０Ｐ）、４３０番目にチロシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−４３０Ｙ）、３４３、３４４番目にロイシン、バリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４３Ｌ−３４４Ｖ）、３４３、３４４番目にチロシン、セリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４３Ｙ−３４４Ｓ）、３４３、３４４番目にイソロイシン、セリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４３Ｉ―３４４Ｓ）、３４４、３４５番目にセリン、セリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｓ―３４５Ｓ）、３４４、３４５番目にセリン、イソロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｓ−３４５Ｉ）、３４４、３４５番目にロイシン、ロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｌ−３４５Ｌ）、３４４、３４５番目にイソロイシン、アルギニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｉ−３４５Ｒ）、３４４、３４５番目にトレオニン、システインが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｃ）、３４４、３４５番目にトレオニン、グルタミン酸が挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｅ）、３４４、３４５番目にトレオニン、フェニルアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組
換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｆ）、３４４、３４５番目にトレオニン、グリシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｇ）、３４４、３４５番目にトレオニン、ヒスチジンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｈ）、３４４、３４５番目にトレオニン、イソロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｉ）、３４４、３４５番目にトレオニン、リシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｋ）、３４４、３４５番目にトレオニン、ロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｌ）、３４４、３４５番目にトレオニン、メチオニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｍ）、３４４、３４５番目にトレオニン、アスパラギンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｎ）、３４４、３４５番目にトレオニン、グルタミンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｑ）、３４４、３４５番目にトレオニン、アルギニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｒ）、３４４、３４５番目にトレオニン、セリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｓ）、３４４、３４５番目にトレオニン、トレオニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｔ）、３４４、３４５番目にトレオニン、バリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｖ）、３４４、３４５番目にトレオニン、トリプトファンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｗ）、３４４、３４５番目にトレオニン、チロシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｙ）、３４５、３４６番目にロイシン、システインが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４５Ｌ−３４６Ｃ）、３４５、３４６番目にトレオニン、フェニルアラニンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４５Ｔ−３４６Ｆ）、３４５、３４６番目にトリプトファン、バリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４５Ｗ−３４６Ｖ）、３４５、３４６番目にセリン、イソロイシンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４５Ｓ−３４６Ｉ）、３４５、３４６番目にチロシン、バリンが挿入された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５−３４６Ｙ−３４７Ｖ）を取得した。
ｐＮＰＧ５−Ｋ１４２Ｄ、ｐＮＰＧ５−Ｋ１４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ａ、ｐＮＰＧ５−Ｔ２２４Ｃ、ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｉ、ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｓ、ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｖ、ｐＮＰＧ５−Ｐ２３０Ｙ、ｐＮＰＧ５−Ａ２３６Ｔ、ｐＮＰＧ５−Ａ２３６Ｖ、ｐＮＰＧ５−Ｓ２４４Ｔ、ｐＮＰＧ５−Ｓ２４４Ａ、ｐＮＰＧ５−Ｌ２５８Ｆ、ｐＮＰＧ５−Ｅ４１６Ｒ、ｐＮＰＧ５−７４Ｄ、ｐＮＰＧ５−７５Ａ、ｐＮＰＧ５−７５Ｃ、ｐＮＰＧ５−７５Ｆ、ｐＮＰＧ５−７５Ｇ、ｐＮＰＧ５−７５Ｈ、ｐＮＰＧ５−７５Ｉ、ｐＮＰＧ５−７５Ｋ、ｐＮＰＧ５−７５Ｌ、ｐＮＰＧ５−７５Ｍ、ｐＮＰＧ５−７５Ｎ、ｐＮＰＧ５−７５Ｒ、ｐＮＰＧ５−７５Ｓ、ｐＮＰＧ５−７５Ｔ、ｐＮＰＧ５−７５Ｖ、ｐＮＰＧ５−７５Ｗ、ｐＮＰＧ５−７５Ｙ、ｐＮＰＧ５−７６Ａ、ｐＮＰＧ５−７６Ｃ、ｐＮＰＧ５−７６Ｄ、ｐＮＰＧ５−７６Ｇ、ｐＮＰＧ５−７６Ｓ、ｐＮＰＧ５−７６Ｔ、ｐＮＰＧ５−７６Ｙ、ｐＮＰＧ５−１６８Ｈ、ｐＮＰＧ５−１６８Ｎ、ｐＮＰＧ５−１６８Ｐ、ｐＮＰＧ５−１６８Ｓ、ｐＮＰＧ５−１６９Ａ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｃ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｄ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｅ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｆ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｇ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｈ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｉ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｋ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｌ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｍ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｎ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｐ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｑ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｒ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｓ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｔ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｖ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｗ、ｐＮＰＧ５−１６９Ｙ、ｐＮＰＧ５−１７０Ａ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｄ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｅ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｆ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｇ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｈ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｌ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｐ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｑ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｒ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｓ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｔ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｙ、ｐＮＰＧ５−１７１Ａ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｃ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｄ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｅ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｆ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｇ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｈ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｉ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｋ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｌ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｍ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｎ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｐ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｑ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｒ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｓ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｔ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｖ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｗ、ｐＮＰＧ５−１７１Ｙ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｐ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｗ、ｐＮＰＧ５−３４５Ｗ、ｐＮＰＧ５−４３０Ｆ、ｐＮＰＧ５−４３０Ｐ、ｐＮＰＧ５−４３０Ｙ、ｐＮＰＧ５−３４３Ｌ−３４４Ｖ、ｐＮＰＧ５−３４３Ｙ−３４４Ｓ、ｐＮＰＧ５−３４３Ｉ―３４４Ｓ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｓ―３４５Ｓ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｓ−３４５Ｉ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｌ−３４５Ｌ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｉ−３４５Ｒ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｃ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｅ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｆ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｇ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｈ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｉ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｋ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｌ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｍ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｎ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｑ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｒ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｓ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｔ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｖ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｗ、ｐＮＰＧ５−３４４Ｔ―３４５Ｙ、ｐＮＰＧ５−３４５Ｌ−３４６Ｃ、ｐＮＰＧ５−３４５Ｔ−３４６Ｆ、ｐＮＰＧ５−３４５Ｗ−３４６Ｖ、ｐＮＰＧ５−３４５Ｓ−３４６Ｉ、ｐＮＰＧ５−３４６Ｙ−３４７Ｖの各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００７９】
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５−Ｋ１４２ＤのＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６−Ｋ１４２Ｄと命名した。
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５−３４２Ｉ、ｐＮＰＧ５−３４２Ｖ、ｐＮＰＧ５−３４２Ｐ、ｐＮＰＧ５−３４２Ａ、ｐＮＰＧ５−１４６Ａ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｌ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｍ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｉ、ｐＮＰＧ５−１７０Ｆの各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６−３４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−３４２Ｖ、ｐＮＰＧ６−３４２Ｐ、ｐＮＰＧ６−３４２Ａ、ｐＮＰＧ６−１４６Ａ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｌ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｍ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｉ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｆと命名した。
【００８０】
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６−Ｋ１４２Ｉを０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ、ｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ｃ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｓ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｖ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｙ、ｐＮＰＧ６−Ａ２３６Ｔ、ｐＮＰＧ６−Ａ２３６Ｖ、ｐＮＰＧ６−Ｓ２４４Ｔ、ｐＮＰＧ６−Ｓ２４４Ａ、ｐＮＰＧ６−Ｌ２５８Ｆ、ｐＮＰＧ６−Ｅ４１６Ｒ、ｐＮＰＧ６−７４Ｄ、ｐＮＰＧ６−７５Ａ、ｐＮＰＧ６−７５Ｃ、ｐＮＰＧ６−７５Ｆ、ｐＮＰＧ６−７５Ｇ、ｐＮＰＧ６−７５Ｈ、ｐＮＰＧ６−７５Ｉ、ｐＮＰＧ６−７５Ｋ、ｐＮＰＧ６−７５Ｌ、ｐＮＰＧ６−７５Ｍ、ｐＮＰＧ６−７５Ｎ、ｐＮＰＧ６−７５Ｒ、ｐＮＰＧ６−７５Ｓ、ｐＮＰＧ６−７５Ｔ、ｐＮＰＧ６−７５Ｖ、ｐＮＰＧ６−７５Ｗ、ｐＮＰＧ６−７５Ｙ、ｐＮＰＧ６−７６Ａ、ｐＮＰＧ６−７６Ｃ、ｐＮＰＧ６−７６Ｄ、ｐＮＰＧ６−７６Ｇ、ｐＮＰＧ６−７６Ｓ、ｐＮＰＧ６−７６Ｔ、ｐＮＰＧ６−７６Ｙ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｈ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｎ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｐ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｓ、ｐＮＰＧ６−１６９Ａ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｃ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｄ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｅ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｆ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｇ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｈ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｉ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｋ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｌ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｍ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｎ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｐ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｑ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｒ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｓ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｔ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｖ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｗ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｙ、ｐＮＰＧ６−１７０Ａ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｄ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｅ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｆ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｇ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｈ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｌ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｐ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｑ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｒ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｓ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｔ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｙ、ｐＮＰＧ６−１７１Ａ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｃ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｄ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｅ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｆ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｇ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｈ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｉ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｋ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｌ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｍ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｎ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｐ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｑ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｒ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｓ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｔ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｖ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｗ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｙ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｐ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｗ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｗ、ｐＮＰＧ６−４３０Ｆ、ｐＮＰＧ６−４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−４３０Ｙ、ｐＮＰＧ６−３４３Ｌ−３４４Ｖ、ｐＮＰＧ６−３４３Ｙ−３４４Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４３Ｉ―３４４Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｓ―３４５Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｓ−３４５Ｉ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｌ−３４５Ｌ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｉ−３４５Ｒ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｃ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｅ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｆ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｇ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｈ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｉ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｋ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｌ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｍ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｎ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｑ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｒ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｔ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｖ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｗ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｙ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｌ−３４６Ｃ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｔ−３４６Ｆ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｗ−３４６Ｖ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｓ−３４６Ｉ、ｐＮＰＧ６−３４６Ｙ−３４７Ｖの各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
【００８１】
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ  →  Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ）  ＋  ＮＴＢ  →  ２ＰＭＳ  ＋  ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ  Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ  Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液，  ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える。５Ｎ  ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ  Ｄ−グルコース溶液          （Ａ）
２４．６ｍｌ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）    （Ｂ）
２．０ｍｌ  ＰＭＳ溶液                              （Ｃ）
１．０ｍｌ  ＮＴＢ溶液                              （Ｄ）
【００８２】
上記アッセイ混合物中の濃度は次のとおり。
ＰＩＰＥＳ緩衝液  ４２ｍＭ
Ｄ−グルコース  ３０ｍＭ
ＰＭＳ  ０．２０ｍＭ
ＮＴＢ  ０．２２ｍＭ
【００８３】
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ  ｍｇ／ｍｌ）
【００８４】
実施例５：ホロ型発現精製酵素の調製
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６−７４Ｖ）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約３０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
ｐＮＰＧ６−Ｋ１４２Ｄ、ｐＮＰＧ６−Ｋ１４２Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ａ、ｐＮＰＧ６−Ｔ２２４Ｃ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｉ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｓ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｖ、ｐＮＰＧ６−Ｐ２３０Ｙ、ｐＮＰＧ６−Ａ２３６Ｔ、ｐＮＰＧ６−Ａ２３６Ｖ、ｐＮＰＧ６−Ｓ２４４Ｔ、ｐＮＰＧ６−Ｓ２４４Ａ、ｐＮＰＧ６−Ｌ２５８Ｆ、ｐＮＰＧ６−Ｅ４１６Ｒ、ｐＮＰＧ６−７４Ｄ、ｐＮＰＧ６−７５Ａ、ｐＮＰＧ６−７５Ｃ、ｐＮＰＧ６−７５Ｆ、ｐＮＰＧ６−７５Ｇ、ｐＮＰＧ６−７５Ｈ、ｐＮＰＧ６−７５Ｉ、ｐＮＰＧ６−７５Ｋ、ｐＮＰＧ６−７５Ｌ、ｐＮＰＧ６−７５Ｍ、ｐＮＰＧ６−７５Ｎ、ｐＮＰＧ６−７５Ｒ、ｐＮＰＧ６−７５Ｓ、ｐＮＰＧ６−７５Ｔ、ｐＮＰＧ６−７５Ｖ、ｐＮＰＧ６−７５Ｗ、ｐＮＰＧ６−７５Ｙ、ｐＮＰＧ６−７６Ａ、ｐＮＰＧ６−７６Ｃ、ｐＮＰＧ６−７６Ｄ、ｐＮＰＧ６−７６Ｇ、ｐＮＰＧ６−７６Ｓ、ｐＮＰＧ６−７６Ｔ、ｐＮＰＧ６−７６Ｙ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｈ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｎ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｐ、ｐＮＰＧ６−１６８Ｓ、ｐＮＰＧ６−１６９Ａ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｃ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｄ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｅ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｆ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｇ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｈ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｉ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｋ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｌ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｍ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｎ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｐ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｑ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｒ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｓ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｔ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｖ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｗ、ｐＮＰＧ６−１６９Ｙ、ｐＮＰＧ６−１７０Ａ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｄ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｅ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｆ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｇ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｈ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｌ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｐ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｑ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｒ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｓ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｔ、ｐＮＰＧ６−１７０Ｙ、ｐＮＰＧ６−１７１Ａ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｃ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｄ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｅ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｆ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｇ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｈ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｉ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｋ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｌ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｍ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｎ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｐ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｑ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｒ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｓ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｔ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｖ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｗ、ｐＮＰＧ６−１７１Ｙ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｐ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｗ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｗ、ｐＮＰＧ６−４３０Ｆ、ｐＮＰＧ６−４３０Ｐ、ｐＮＰＧ６−４３０Ｙ、ｐＮＰＧ６−３４３Ｌ−３４４Ｖ、ｐＮＰＧ６−３４３Ｙ−３４４Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４３Ｉ―３４４Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｓ―３４５Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｓ−３４５Ｉ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｌ−３４５Ｌ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｉ−３４５Ｒ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｃ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｅ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｆ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｇ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｈ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｉ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｋ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｌ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｍ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｎ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｑ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｒ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｓ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｔ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｖ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｗ、ｐＮＰＧ６−３４４Ｔ―３４５Ｙ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｌ−３４６Ｃ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｔ−３４６Ｆ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｗ−３４６Ｖ、ｐＮＰＧ６−３４５Ｓ−３４６Ｉ、ｐＮＰＧ６−３４６Ｙ−３４７Ｖによるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
【００８５】
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。マルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性に際しては、０．５Ｍのマルトース溶液を調製して活性測定に用いた。結果を表１〜６に示す。
なお、表１〜６において、左欄「Ｔ２２４Ｘ」は２２４位のＴを左から２列目に示した各アミノ酸に置換したことを表す。また、左欄の「３４４＋（３４５）」は３４４位の後ろに左から２列目に示した各アミノ酸を挿入したことを表す。また、左欄の「３４３＋ＸＳ」は３４４位の後ろに左から２列目に示した各アミノ酸を挿入し、さらにその後ろにＳを挿入したことを表す。また、左欄の「３４３＋ＴＸ」は３４４位の後ろにＴを挿入し、さらにその後ろに左から２列目に示した各アミノ酸を挿入したことを表す。また、左欄の「Ｍ３４２＋２」は、３４２位の後ろに左から２列目に示した各アミノ酸（３４３Ｓ−３４４Ｔの場合は３４２位の後ろにＳ、次いでＴ）を挿入したことを表す。「Ａ３４３＋２」および「Ｔ３４４＋２」「Ｉ３４５＋２」も同様である。Ｍａｌ／Ｇｌｃは、マルトースに対する反応性をグルコースに対する反応性で割った比（マルトース／グルコース比）を示す。生産性（％）は、改変型酵素の生産性をＷＴ（野生型）の生産性で割った比を百分率で示す。
生産性は以下の方法で確認した。
まず、ＰＱＱＧＤＨ生産能を持つ各形質転換体を５ｍｌ ＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有）で３０℃終夜培養した。これらの培養液から等量の菌体を回収し、ＫＰＢバッファーを加えて超音波破砕して、破砕液中のＧＤＨ活性を測定した。野生型のＰＱＱＧＤＨ遺伝子を持つ形質転換体の活性値を１００％として、各形質転換体の活性値をこれと比較して生産性（％）を調べた。
【００８６】
【表１】
2006217810.tif 000002
【００８７】
【表２】
2006217810.tif 000003
【００８８】
【表３】
2006217810.tif 000004
【００８９】
【表４】
2006217810.tif 000005
【００９０】
【表５】
2006217810.tif 000006
【００９１】
【表６】
2006217810.tif 000007
【００９２】
野生型ＰＱＱＧＤＨでは、グルコースとマルトースの反応性がほぼ等しくなっているのに対し、本願発明の改変型ＰＱＱＧＤＨではマルトースの反応性が低下している。
Ｍａｌ／Ｇｌｃが野生型より低下したもの、さらには生産性が野生型に対して優れている改変型ＰＱＱＧＤＨが得られていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。この改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーに利用できる。
【配列表】
2006217810000001.app