(57)【要約】【課題】従来の付着性細胞の培養方法では、何らかの方法で細胞を培養床、あるいは培養担体から剥離させて回収した後、改めて新しい培養床、あるいは培養担体に播種する継代操作が必要であった。この場合、蛋白質分解酵素による酵素処理、あるいは機械的な処理による細胞へのダメージ、あるいは作業の煩雑さに加えて微生物による汚染の危険性が増加するという問題点があった。【解決手段】付着性細胞を培養容器の培養床表面に、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる低密度で均一に播種して培養を行うことで、継代操作を省いてコンフルエントな細胞密度まで増殖させて目標細胞数を得る。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着性細胞を、培養容器の培養床表面にコンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる低密度で播種し、培養によってコンフルエントな細胞密度まで増殖させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項２】
請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、播種する際には、接触阻害の影響が出ない略等距離の間隔で播種することを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項３】
請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、付着性細胞を浮遊化して懸濁した培地に、細胞に凝集活性を有しない高分子の比重調整剤を添加し、細胞が培養床まで沈降するまでに培養溶液中に均一に拡散するような沈降速度となるように培地の比重を調整することを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項４】
請求項３に記載の付着性細胞の培養方法において、前記比重調整剤がパーコール又はポリビニルピロリドンであることを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項５】
請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域に付着性細胞を接着させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項６】
請求項１に記載の付着性細胞の培養方法において、播種する際には、培地に浮遊化した前記付着性細胞が通過可能で、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを、前記培養床表面から分離可能な状態で密着させ、前記細胞を培養容器の上方向または一方の壁面側から注入して前記細胞を播種し、該細胞が培養床表面に付着した後に、該多孔シートと前記培養床表面とを分離して培養することを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項７】
請求項６に記載の付着性細胞の培養方法において、多孔シートを培養面から分離することを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項８】
請求項６に記載の付着性細胞の培養方法において、培養面を多孔シートから分離することを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項９】
請求項６に記載の付着性細胞の培養方法において、前記注入は、多孔シートの貫通孔に、超音波装置を有する細胞注入手段によって個々の細胞を分別して注入することを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【請求項１０】
細胞付着性材質からなる培養床表面と、液体の流入口及び流出口と、比重調整剤を用いることにより細胞が培養床まで沈降するまでに培養溶液中に均一に拡散するような沈降速度となるように比重調製された溶液を収容する容器とを有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の付着性細胞の培養装置において、前記比重調整された溶液に用いる比重調整剤がパーコール又はポリビニルピロリドンであることを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【請求項１２】
光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と、液体の流入口及び流出口と、前記底面に付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域を有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の付着性細胞の培養装置において、前記細胞接着性領域が細胞接着性蛋白質膜からなることを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【請求項１４】
光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と、液体の流入口及び流出口と、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の付着性細胞の培養装置において、細胞分離のための超音波発生装置と、細胞を注入する細胞注入手段を有することを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【請求項１６】
請求項１４に記載の付着性細胞の培養装置において、前記多孔シートの厚みが、浮遊化した付着性細胞の平均細胞径の０．５から１．５倍であることを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【請求項１７】
請求項１４に記載の付着性細胞の培養装置において、前記多孔シートの表面材質が、細胞への付着性について難付着性である親水性材質であり、培養床の表面材質が、細胞への付着性について易付着性である疎水性材質であることを特徴とする付着性細胞の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は付着性動物細胞の培養増殖方法及び培養装置に係り、詳しくは、培養基材の表面で動物細胞を大量に増殖させる方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血球系の細胞やガン化した細胞を除き、正常な動物細胞は、一般的には固体表面に付着して伸展した後に増殖する、いわゆる付着性を示す。このような付着性を有する細胞を培養によって増殖させる場合、培養床表面の大半を細胞が単層で覆って細胞密度が過剰となったコンフルエントな状態になると、細胞同士が接触して増殖が抑制される。そこで、細胞を大量に増殖させるためには、コンフルエントな状態になった段階で一旦、細胞を回収し、複数の培養器、あるいは培養床の面積を拡大して播種することで細胞密度を減じる継代と呼ばれる操作を行う必要がある。通常、細胞を播種する密度はコンフルエントな状態の１／１０とされており、この密度より低いと細胞は増殖しないことが知られている。
【０００３】
従来の付着性細胞の継代操作は次のようである。培養用のフラスコやシャーレで細胞を培養し増殖させ、培養容器の培養面いっぱいに細胞が増殖したら、先ず、クリーンベンチ内で培地を除去した後、必要に応じて培養容器内を新しい培地で洗浄する。続いて、所定濃度のトリプシンやプロナーゼ等の蛋白分解酵素を作用させ、細胞が培養面から剥離して、浮遊化してきたらトリプシンインヒビター等の酵素阻害剤を添加するか、酵素反応の阻害効果を有する血清培地を加えて蛋白質の分解反応を停止させる。その後、ピペッティングにより細胞を培養面から十分に剥がし、培地中に細胞を分散させた後、この細胞浮遊液を回収する。このとき細胞浮遊液中にはトリプシン等の酵素がまだ含まれているため、これらの酵素を取り除く目的で、遠心により細胞を遠沈させ、上清の培地を除く。その後、新しい培地を加えて細胞を分散させ、この細胞浮遊液を適度に希釈し、新しい培養容器に分注して培養を行う。
【０００４】
このように、従来の継代操作では、細胞を剥離させる工程で用いるトリプシン等の蛋白質分解酵素による作用で細胞に対する損傷があり、生存率に大きく影響する。また、細胞を分解させる際のピペッティングも細胞へ与える影響が大きい。これらの細胞へのダメージは、継代後の細胞の生存率に影響するほか、細胞の増殖能の回復に要する時間に関して影響する。
【０００５】
特許文献１には、細胞を剥離させるための蛋白質分解酵素処理を無くし、遠心やピペッティング等の細胞にダメージを与える操作を行わない継代方法として、培養面となるゴム状の被覆部を設けた培養容器で細胞を培養した後、その被覆部を裁断して剥がし、剥がした被覆部を別に用意した新しい培養容器の被覆部に移して密着させて培養を継続する方法が記述されている。この場合、滅菌したナイフで切断した後、滅菌したピンセットで移し替えの操作を行うために人手を要する上、自動化によって省力化することは難しい。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−３３５３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上述べたように、従来の付着性細胞の培養方法では、何らかの方法で細胞を培養床、あるいは培養担体から剥離させて回収した後、改めて新しい培養床、あるいは培養担体に播種する継代操作が必要であった。この場合、蛋白質分解酵素による酵素処理、あるいは機械的な処理による細胞へのダメージ、あるいは作業の煩雑さに加えて微生物による汚染の危険性が増加するという問題点があった。近年、再生医療の技術の進歩により、細胞を用いた治療が可能となり、安全かつ大量に細胞を培養する技術が要求され、上記問題点は解決されなければならない課題である。
【０００８】
本発明は、上記のような従来技術に存在する問題点を解決するために、付着性の動物細胞を大量に培養して目標細胞数を得るに際し、継代操作の繰り返しを省いて細胞への損傷を抑えると共に、操作を簡便にする培養方法、培養容器及び培養装置を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を研究した結果、我々はｈＭＳＣが従来の播種密度よりはるかに低い播種密度からでも培養させることが可能であることを見出した。本発明は、この性質を利用し、付着性細胞を培養面に低密度、かつ均一に播種して培養することで、継代操作を省いてコンフルエントな細胞密度まで単層で増殖させて目標細胞数を得ることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、付着性の動物細胞を培養して目標の細胞数まで増殖させる際に、細胞に対する損傷と微生物汚染の危険性がある従来の継代操作を繰り返す必要が無くなり、操作を簡便にできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
細胞同士の接触阻害による増殖の非効率さの改善を、低密度均一播種を行うことにより実現した。また、継代作業による細胞の損傷の改善を、無継代もしくは少ない継代回数で増殖させることを可能にすることにより実現した。
【００１２】
細胞活性を損なうことなく、連続的に増殖させる方法及び装置について説明する。具体的には、次のとおりである。
【００１３】
（１）付着性細胞を、培養容器の培養床表面にコンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる低密度で播種し、培養によってコンフルエントな細胞密度まで増殖させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【００１４】
（２）付着性細胞をコンフルエントになるまで接触阻害の影響が出ない略等距離の間隔で播種し、培養によってコンフルエントな細胞密度まで増殖させることを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【００１５】
（３）付着性細胞を浮遊化して懸濁した培地に、細胞に凝集活性を有しない高分子の比重調整剤を添加し、細胞が培養床まで沈降するまでに培養溶液中に均一に拡散するような沈降速度となるように培地の比重を調整する付着性細胞の培養方法。
【００１６】
（４）比重調整剤がパーコール、ポリビニルピロリドンから成る付着性細胞の培養方法。
【００１７】
（５）付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域に付着性細胞を接着させる培養方法。
【００１８】
（６）培養容器の培養床表面に、浮遊化した付着性細胞が通過可能でコンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを、培養床表面から分離可能な状態で密着させ、前記細胞を培養容器の上方向または一方の壁面側から注入して前記細胞を播種し、該細胞が培養床表面に付着した後に、該多孔シートと培養床表面とを分離して培養することを特徴とする付着性細胞の培養方法。
【００１９】
（７）多孔シートを培養面から分離する培養法。
【００２０】
（８）培養面を多孔シートから分離する培養法。
【００２１】
（９）多孔シートの貫通孔に、超音波装置とフローセルによって個々の細胞を分別して注入し、該細胞が培養床表面に付着した後に、該多孔シートを培養床表面から剥離して培養する付着性細胞の培養方法。
【００２２】
（１０）細胞付着性材質からなる培養床表面と液体の流入口及び流出口を有し、比重調整剤を用いることで比重調整された溶液で細胞を分散させる培養装置。
【００２３】
（１１）比重調整剤がパーコール又はポリビニルピロリドンから成る付着性細胞の培養装置。
【００２４】
（１２）光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と液体の流入口及び流出口を有し、前記底面に付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさを持ち、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる低密度で縦及び横方向に等間隔に配列された細胞接着性領域を有する付着性細胞の培養容器。
【００２５】
（１３）前記細胞接着性領域が細胞接着性蛋白質膜からなる付着性細胞の培養容器。
【００２６】
（１４）光透過性を有し、細胞を培養する為の容器底面と液体の流入口及び流出口を有し、コンフルエントな細胞密度の１／１０３以下となる密度の貫通孔を配列した多孔シートを有する培養容器。
【００２７】
（１５）細胞分離のための超音波発生装置とフローセルを有する培養装置。
【００２８】
（１６）多孔シートの厚みが、浮遊化した付着性細胞の平均細胞径の０．５から１．５倍である付着性細胞の培養方法。
【００２９】
（１７）多孔シートの表面材質が細胞への付着性が難付着性である親水性材質であり、培養床表面の材質が細胞への付着性が易付着性である疎水性材質である付着性細胞の培養方法。
【００３０】
自動化を可能とする方法を提供することで、省力化が図れると共に、微生物等による汚染の危険性を低減して、安全性の高い細胞を得ることが可能となる。また、少ない細胞数から効率的に増殖させることができると共に、得られた細胞自身の活性が損なわれることが無く、再生医療などに適用することが可能となる。以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
細胞が付着するよう表面加工された培養フラスコ１（ＦＡＬＣＯＮ）に付着性細胞２である１．２×１０５個のヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を図１（ａ）のようにフラスコ全面に播いた場合（均一播種）と、径２ｃｍ内に播いた場合（局所播種，図１（ｂ））とで細胞の増殖速度を比較した。用いる細胞はＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞等接着性細胞であればよく、ヒト間葉系幹細胞に限定されるものではない。以下の実施例も同様である。細胞を培養するのに用いた培地はウシ胎児血清を含んだＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）を用いた。また、培養は５％ＣＯ２，３７℃，９０％以上湿度の条件下で培養を行った。なお、各操作は無菌的に行っている。
【００３２】
播種後３日間でのｈＭＳＣの比増殖速度を図２に示す。細胞を全面に播いた場合の方が、局所的に播いた場合より増殖速度が速いことがわかる。比増殖速度とは下の式で定義された細胞の増殖速度を示す指標である。
Ｎ＝Ｎ０ｅμｔ（μ：比増殖速度，Ｎ：細胞数，Ｎ０：初期細胞数，ｔ：培養時間）
【実施例２】
【００３３】
培養フラスコ１にそれぞれ０．４，５，５０，５００，５０００，１５０００個／ｃｍ２の播種密度でｈＭＳＣを播種し、５％ＣＯ２、３７℃、９０％以上湿度で培養を行った。培地はＭＳＣＧＭ培地を用いた。
【００３４】
播種後の細胞増殖の様子を示したのが図３である。標準播種密度とされる５０００個／ｃｍ２以下の密度でもｈＭＳＣは増殖可能であることがわかる。細胞を１０万倍に増殖させたいときには、０．４個／ｃｍ２で播種することにより、継代を行うことなく増殖させることが可能であり、また０．４個／ｃｍ２以下の播種密度でも培養は可能である。
【実施例３】
【００３５】
実施例１乃至２により、細胞を低密度に且つ細胞間の距離がなるべく等距離になるようにすると無継代もしくは少ない継代回数で効率的に細胞を増殖させることが可能である。以下では、これを実現するための播種方法及び装置についての実施例を挙げる。
【００３６】
培養フラスコにｈＭＳＣを入れた。ＭＳＣＧＭ培地には比重調整のため、パーコールを（細胞の比重）：（培地の比重）＝１．０５：１となるように加えた。この比重の比は、細胞が均一に分布するのに必要な沈降速度によって決まり、この値に限定されるものではない。培地よりわずかに比重の大きい細胞は、拡散しながらゆっくりと沈降していき、培養容器底面に達する。細胞が培養床に付着したところで、培地交換を行った。このときの細胞の分布を観測すると比重調整を行った培養フラスコの培養床では細胞がほぼ均一に配列したのに対し、比重調整を行わなかった培養フラスコでは、培養床の中心付近に細胞が密に寄り集まった状態で培養底面に付着した（図４）。
【００３７】
３日に１度培地交換を行い、培養を続けたところ、比重調整を行った培養では培養床表面の大半を細胞が単層で覆って細胞密度が過剰となったコンフルエントな状態まで達したのに対し、比重調整を行わなかった培養では細胞がフラスコの真ん中に凝集しコンフルエントまで達しなかった。これに用いる比重調整剤としては、パーコールの他、ポリビニルピロリドン等も適用できる。
【実施例４】
【００３８】
培養プレートの表面に各付着性蛋白（フィブロネクチン、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニン）をコートした培養プレート上にｈＭＳＣを５０００個／ｃｍ２の密度で播種した。ＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  Ｉ培地を用いてｈＭＳＣを培養すると各付着性蛋白を表面コートした培養プレートでの付着率は図５のようになった。ｈＭＳＣをＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  Ｉで培養すると付着性蛋白の有無に関わらず、ｈＭＳＣは培養プレート上に付着することがわかる。同様にしてＱＢＳＦ−６０培地を用いたｈＭＳＣの培養を行った結果、付着率は図６のようになった。ｈＭＳＣをＱＢＳＦ−６０で培養すると付着性蛋白が培養皿にコートされている場合にはｈＭＳＣは培養床に付着し、付着性蛋白が培養皿にコートされていない場合にはｈＭＳＣは培養床に付着しないことを示している。
【００３９】
上記に示したＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  ＩとＱＢＳＦ−６０の性質を用いて、次のような播種法を実施した。用いる培地は上記の性質をもった培地であればよく、ＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  ＩとＱＢＳＦ−６０に限定されるものではない。細胞接着性領域は、細胞を接着させる為に細胞付着に接着性物質が必要な培地を用い、細胞を増殖させる培地には、細胞付着に接着性物質が不必要な培地を用いる。
（構成の説明）
図９に示すように、培養容器内底面８を培養床とした四角箱状に形成された培養容器６で、培養床表面は細胞非接着性の親水性ポリマーを材質とした表面８に図７に示すように付着性細胞の大きさと実質的に同じ大きさ（ｄ）を持つ細胞接着性物質７がコートされた領域４が、数密度が０．１個／ｃｍ２となるように、縦方向及び横方向に等間隔に配列されている。この数密度は、増殖させる倍数によって規定されるもので、この値に限定されるものではない。接着因子としてフィブロネクチンを用いている。他にコラーゲン、ラミニン等の細胞接着性蛋白乃至物質を用いてもよい。培養容器の側面には液体の流入口１２と流出口１０を設け、更にＣＯ２ガスの通気口１１、排気口９が設けてある。この培養装置を用いて細胞を培養する際の動作を次に説明する。
（動作の説明）
上記培養容器に流入口１２を通してＱＢＳＦ−６０培地を加え、細胞の生育温度（例えば３７℃）を保つように培養容器外部の熱源を通して制御する。送液口１２からＱＢＳＦ−６０培地中に細胞を懸濁させた溶液を入れ、図１２（ｂ）に示すように培養容器を傾け、培地排出用チューブより徐々に培地を取り除き、細胞を細胞接着性領域７に付着させる。この傾斜させた液を取り除く作業は、細胞を均一に培養底面に行き渡らせるためであり、この操作がないと培養容器の隅の壁面に細胞が集中するためである。図１０のように細胞の付着後、培地をＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  Ｉに換え、培養容器を水平に静置した状態で培養を続ける（図１１）。培地交換は、適時、送液口１２と廃液口１０を通して行う。細胞がコンフルエントになるまで培養する。細胞の回収は、送液口１２を通して、洗浄液やトリプシン溶液等の酵素を培養容器内に送液し、細胞を培養床から剥離し、培養側面の排出口１０から細胞懸濁液として回収する。
（実験例）
細胞接着領域パターンが付与された培養皿上にＱＢＳＦ−６０培地を用いてｈＭＳＣを播種した。ＱＢＳＦ−６０培地を用いて培養すると図８のように細胞接着領域のスポット上に細胞２が接着し、細胞非接着領域には細胞は接着しなかった。十分細胞が接着した播種後４時間後に培養皿上にあるＱＢＳＦ−６０培地を図１２に示すように培養容器を傾けることで完全に培地を取り除き、ＰＢＳで３回洗った後に、ＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  Ｉ培地を加え、３日に１度の培地交換を行い、そのまま培養を続けた。ＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  Ｉ培地に換えてからは、ｈＭＳＣは細胞非接着領域にも付着し、そのまま細胞は増殖し、コンフルエントな状態となった。５が増殖した細胞である。
【実施例５】
【００４０】
（構成の説明）
図１３に、多孔シートを培養床表面から分離可能な状態で密着させた方法を実現するための培養装置の１例を示す。培養容器内部の底面８には細胞の接着が可能なように表面が疎水性加工された材質を用い、その上に径５０μｍ（細胞１個通る大きさ）の貫通口１９が等間隔に並んでいる細胞非付着性の親水性ポリマー加工シート１８（厚さ５０μｍ）をかぶせる。シートの厚みは、厚すぎると細胞が一つの貫通口に２つ以上入り、薄すぎると細胞が貫通口から出易くなるため、細胞の大きさの０．５から１．５倍が望ましい。培養容器の側面には、培地の送液口１２、廃液口１０、ＣＯ２ガス用の通気口１１、排気口９を取り付けている。多孔シートの材質は、親水性ポリマー加工シートの他、細胞への付着性が難付着性である親水性材質を用いることができる。培養床表面の材質は、表面が疎水性加工された材質の他、細胞への付着性が易付着性である疎水性材質を用いることができる。
（動作の説明）
培地の送液口１２から培地に細胞を懸濁させた溶液を入れ、振とう器を用いてゆっくりと振とうし、細胞を貫通孔内の培養容器底面８に付着させる。その後、培地を、廃液口１０を通して捨て、親水性ポリマー加工シート１８を取り外し、新たに培地を加える。そのまま、適時培地交換を繰り返しながら細胞を培養し、コンフルエントな状態まで増殖させる。細胞の回収は、送液口１２を通して、洗浄液やトリプシン溶液等の酵素を培養容器内に送液し、細胞を培養床から剥離し、培養側面の排出口１０から細胞懸濁液として回収する。
（実験例）
ｈＭＳＣを、上記培養装置を用いて培養を行った。あらかじめ培養容器に培地を入れておき、３７℃に保温した。培地はＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）を用いた。ｈＭＳＣを培養装置に送液し、２４時間ゆっくりと振とうし、細胞を貫通孔のある培養底面に付着させた。親水性ポリマー加工シートを取り外し、そのまま培養を続けた。その結果、細胞はほぼコンフルエントまで増殖した。
【実施例６】
【００４１】
（構成の説明）
図１４に示すように、培養容器内の底面は細胞の接着可能な表面疎水性加工材質であり、その上方に径５０μｍ（細胞１個通る大きさ）の貫通口１９が等間隔に並んだ細胞非付着性の親水性ポリマー加工シート１８（厚さ５０μｍ）が設けてある。貫通口の径、親水性ポリマー加工シートの厚さは細胞の大きさによって規定されるものであり、この値に限定されない。培養容器の側面には、親水性ポリマー加工シート１８上部に培地を入れるための送液口３５が、親水性ポリマー加工シート１８の下部かつ培養床上部にはＣＯ２ガス用の通気口３７と試薬等を入れるための試薬送液口３６が設けてある。また、廃液用に、親水性ポリマー加工シート１８上部に１箇所（上部排出口３３）、親水性ポリマー加工シート１８下部かつ培養床８上部に１箇所孔（下部排出口３４）を取り付けた。培養容器底面には通気口３８が設けてある。図１４において、２０は培地、３９は培地タンク、４０は試薬タンク、４１は送液ポンプ、４２はガスボンベである。
（動作の説明）
通気口３７からガスを通気し、培養床８を親水性ポリマー加工シート１８に密着させる。この状態で、送液口３５から培地と細胞懸濁液を注入する。振とう器でゆっくり培養容器を振とうし、細胞を親水性ポリマー加工シートの貫通口１９に落とす。細胞が培養床上に接着したところで、通気口３８からガスを排気し、培養床を親水性ポリマー加工シートから引き離す。廃棄口３４を通して、培地を廃棄し、送液口３６を通して、培地を注入する。適時培地交換を行いながら、そのまま細胞を培養する。培地交換は送液口３６と廃液口３４を用いて行う。細胞はコンフルエントになったら送液口３６から細胞洗浄液を注入し、廃液口３４から洗浄液を廃液する。これを数回繰り返し、細胞を洗浄する。送液口３６からトリプシン等の酵素を送液する。細胞が培養床表面から剥がれたら、振とう器を作動し、細胞を懸濁させる。廃液口３４から細胞懸濁液を回収する。
（実験例）
培養容器底面の通気口からＣＯ２ガスを通気し、図１４（ａ）に示すように、培養床シートを膨張させ、親水性ポリマー加工シートと密着させた。この状態で、培地で懸濁したｈＭＳＣを親水性ポリマー加工シート上部の送液口から注入し、親水性ポリマー加工シート上に拡散させた。細胞が親水性ポリマー加工シートの貫通口に入り、培養床上に付着するように３時間静置した。その後、培養床シート下部のＣＯ２ガスを脱気し、培養床を親水性ポリマー加工シートから離し、水平に保った。培養床上に親水性ポリマー加工シート下部の口から培地を加え、培養床上を浸す。余分な培地は廃棄口から排出した。通気口からＣＯ２ガスを通気し、３７℃で細胞を培養した。
【００４２】
この時点で培養床を顕微鏡で観察したところ細胞は、親水性ポリマー加工シートの貫通口と同じ配置で付着していた。培地交換は培養容器側面の口を通して、図１４（ｂ）に示すように、培地の注入、排気口からの排出より行った。培地交換を２、３日に１度行い、細胞がコンフルエントまで増殖し、この時点で、細胞を回収した。細胞の回収は、まず、培地を廃棄口から排出し、注入口からＰＢＳを加えて、排気口から排出することで洗浄を行い、洗浄後、トリプシン溶液を加え、細胞が剥離するまで静置した。細胞が剥離した時点で、培地を加え、培養容器を揺することで溶液を混合し、この混合された細胞懸濁液を排水口から回収した。
【実施例７】
【００４３】
（構成の説明）
図１５は、本発明装置の実施例の縦断側面図であり、図１６はその上面図である。細胞懸濁液２１（サンプル液）はサンプルライン２２を通り、ピエゾ振動板（超音波発生装置）に取り付けてあるフローセルボディ２３に送り込まれる。クォーツガラスで作成され、断面が正方形の細長い中空チャンバーであるフローセルがフローセルボディの下端に取り付けてある（図１７）。フローセルは細胞を注入する細胞注入手段としての一例である。シース液３０とサンプル液２１がフローセルに注入され、圧によって送り出されたシース液は、フローセル内を上方から下方に向かって流れる。
【００４４】
フローセル内におけるシース液の流れの途中で、サンプル流と合流する。圧のかかった層流状態のシース流が、サンプル流の回りを混ざり合うこと無く取り囲む状態が出来る。これにより細胞がフローセル中を１列に１個ずつ通過することが可能となる。また、流体力学に基づく絞り込みを行うことにより、いつも一定の流路で細胞が１個ずつフローセル中央を通過する。そのため、測定精度を上げている。そして、レーザー光２４をフローセルの中央に焦点が位置するように照射する。フローセル内を細胞が流れるとレーザー光により強い前方散乱光を発する。
【００４５】
レーザー光の直進方向には、図１８に示す集光レンズ３１が設置されており、前方散乱光を集光する。散乱せずにフローセルを通り直進してきたレーザー光は遮蔽板３２によって遮断される。前方散乱光の検出にはフォトダイオード２５（感光性半導体素子）を用いる。細胞によって発せられた前方散乱光は電圧パルス信号として処理される。
【００４６】
ピエゾ振動板によりフローセルボディを上下に振動させると、細胞の含まれた流束は次第に下方で液滴２６になる。液滴化された液滴には、１個以下の細胞が含まれている。
【００４７】
フローセルの下方には２つの分離可能な培養皿Ａ２８、培養皿Ｂ２９が図１５に示すように組み合わさって置かれている。培養皿Ａ２８には等間隔に並んだ穴２７が空いており、穴の径は下部にいくに従って小さくなっており、最下点の径は播種する細胞の大きさより大きく作ってある。これらの穴の表面は細胞が付着しないように親水性加工している。また、培養皿Ｂ２９の表面上には細胞が付着するように加工している。
【００４８】
培養皿（Ａ、Ｂ）は検出器（フォトダイオード）による細胞による前方散乱光の検出に同期して位置を変更できるようになっている。
（動作の説明）
細胞懸濁液を圧によって送りだし、フローセルから流す。ピエゾ振動板によって液滴化され、そのまま下方の培養皿上の穴に落ちる。フローセルは測定中常時レーザー光２４が照射されており、細胞による前方散乱光が検出されると、電圧パルス信号として制御装置に読取られ、細胞が通過したことを確認する。
【００４９】
その後、制御装置により次の細胞がまだ入っていない培養皿上の穴がフローセルの直下に来るように培養皿を移動させる。上記の繰り返しにより、最終的に培養皿の各穴に１つずつ細胞が入る。よって、培養する前の細胞数が少ない場合に適している。
【００５０】
このまま重力によって細胞を培養皿Ｂ２９の表面上にまで沈降させ、細胞が培養皿Ｂ２９の表面上に付着するまで待つ。各細胞が十分に培養皿Ｂ２９の表面上に付着したところで、培養皿Ａ２８を脱離する。脱離後、新たな培地を培養皿Ｂ２９上に供給する。
【００５１】
培地を適度に交換することで、無継代で目的の細胞数まで培養を続ける。
（実験例）
ｈＭＳＣを、フローセルを通して、径３０ｃｍ２の培養皿Ｂ上に等間隔に播種した。６時間培養し、細胞が培養皿底面に付着したところで培養皿Ａを取り外した。その後、３日に１度培地交換を行いながら、培養を続け、細胞はコンフルエントな状態まで増殖した。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】均一播種と局所播種を示す平面図である。
【図２】均一播種と局所播種でそれぞれ培養した際の細胞の比増殖速度を示す図である。
【図３】各播種密度でのｈＭＳＣの増殖曲線である。
【図４】培地の密度調整を行って振とう培養行ったときと、密度調整を行わずに振とう培養を行ったときの細胞の状態を示した図である。
【図５】ＩＢＬ  Ｍｅｄｉａ  Ｉを用い各細胞接着性領域上でｈＭＳＣを培養した際の細胞接着性領域への細胞への接着率を示した図である。
【図６】ＱＢＳＦ−６０を用い各細胞接着性領域上でｈＭＳＣを培養した際の細胞接着性領域への細胞への接着率を示した図である。
【図７】基板上の細胞接着性領域パターンを示す図である。
【図８】基板上の細胞接着性領域パターンにおける培養細胞の接着状態を示す図である。
【図９】培養床表面に細胞接着性領域を縦方向及び横方向に等間隔に配列した付着性細胞の培養容器を有する培養装置を示す図である。
【図１０】細胞付着に接着性物質を必要とする培養で培養する培養装置を示す図である。
【図１１】細胞付着に接着性物質を必要としない培養で培養する培養装置を示す図である。
【図１２】培養容器を傾斜させることで培地の交換を行うことを示す図である。
【図１３】取り外し可能に密着させた多孔シートを、細胞が培養床表面に付着した後に、多孔シートを培養床表面から剥離して培養することを特徴とする付着性細胞の培養装置を示した図である。
【図１４】多孔平板と密着、あるいは剥離することが可能な形態で固定したことを特徴とする付着性細胞の培養容器を示す図である。
【図１５】均一播種装置の縦断測面図である。
【図１６】上記均一播種装置の上面図である。
【図１７】フローセルの構造を示す略図である。
【図１８】前方散乱光の検出法を説明した図である。
【符号の説明】
【００５３】
１…培養フラスコ、２…付着性細胞、３…局所播種の範囲、４…            細胞接着性物質がコートされた領域、５…増殖した細胞、６…培養容器、７…接着性物質、８…培養床、９…排気口、１０…廃液口、１１…通気口、１２…送液口、１３…細胞付着に接着性物質が必要な培地の容器、１４…細胞付着に接着性物質が必要ない培地の容器、１５…細胞付着に接着性物質が必要な培地、１６…細胞付着に接着性物質が必要ない培地、１７…培地排出用チューブ、１８…親水性ポリマー加工シート、１９…貫通口、２０…培地、２１…細胞懸濁液、２２…サンプルライン、２３…フローセルボディ、２４…レーザー光、２５…フォトダイオード、２６…液滴、２７…穴、２８…培養皿Ａ、２９…培養皿Ｂ、３０…シース液、３１…集光レンズ、３２…遮蔽版、３３…上部廃液口、３４…下部廃液口、３５…上部送液口、３６…下部送液口、３７…側面通気口、３８…底面通気口、３９…培地タンク、４０…試薬タンク、４１…送液ポンプ、４２…ガスボンベ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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