(57)【要約】      （修正有）【課題】コンドロモジュリン−Ｉに類似した新たなポリペプチド及びそれをコードする遺伝子の提供。【解決手段】ヒト、マウス及びラットｃＤＮＡライブラリーより遺伝子を単離することにより特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡ、並びに該ポリペプチドに対する抗体を得た。上記アミノ酸配列は、軟骨細胞の増殖・分化の調節及び血管新生阻害作用を有するコンドロモジュリン−Ｉに対して相同性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードするヒト遺伝子。
【請求項２】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードするマウス遺伝子。
【請求項３】
配列番号６で表されるアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードするラット遺伝子。
【請求項４】
配列番号１で表される塩基配列を有する請求項１に記載のヒト遺伝子。
【請求項５】
配列番号３で表される塩基配列を有する請求項２に記載のマウス遺伝子。
【請求項６】
配列番号５で表される塩基配列を有する請求項３に記載のラット遺伝子。
【請求項７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を実質的に含む、ヒト遺伝子がコードするポリペプチド。
【請求項８】
配列番号４で表されるアミノ酸配列を実質的に含む、マウス遺伝子がコードするポリペプチド。
【請求項９】
配列番号６で表されるアミノ酸配列を実質的に含む、ラット遺伝子がコードするポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え体ＤＮＡによって形質転換された形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からヒト、マウス及びラット遺伝子がコードするポリペプチドを採取することを特徴とする前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドで免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られる、請求項１４に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１７】
請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子の検出試薬。
【請求項１８】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド、並びに請求項１４に記載のモノクローナル抗体及び／又は請求項１５に記載のポリクローナル抗体を含む診断用キット。
【請求項１９】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドからなる医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１４に記載のモノクローナル抗体又は請求項１５に記載のポリクローナル抗体からなる医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜６に記載の遺伝子の一部と特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜６に記載の遺伝子の少なくとも一部を含む、遺伝子治療に利用しうる核酸からなる医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１あるいは４に記載のＸ染色体上に存在することを特徴とするヒト遺伝子。
【請求項２４】
請求項７〜９に記載のポリペプチドが細胞膜結合型であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載の細胞膜結合型ポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項２６】
請求項７〜９に記載のポリペプチドが血管新生阻害作用を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載の血管新生阻害作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨細胞の増殖・分化を調節し、血管新生阻害作用を有することが知られているＣｈｏｎｄｒｏｍｏｄｕｌｉｎ−Ｉ（ＣｈＭ−Ｉ）とアミノ酸配列に相同性が認められる新規なヒト、マウス及びラットポリペプチド、並びにそれをコードするヒト、マウス及びラット遺伝子（以下、「ＣｈＭ１Ｌ遺伝子」と略記することがある）に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の大部分の骨は、軟骨細胞の増殖、分化を経て石灰化が起こり、最後は骨に置換する、いわゆる「内軟骨骨化」という仕組みによって作られる。この一連の過程には種々のホルモンや成長因子が関与しており、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ１、ＩＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、癌細胞増殖因子（ＴＧＦ）、成長ホルモンなどが知られている。開らは、前記ホルモンや成長因子の他に軟骨細胞の増殖、分化機能を促進する因子としてＣｈＭ−Ｉ遺伝子を単離した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７５，９７１−９７７，１９９１、欧州公開特許第４７３０８０号公報）。ヒトＣｈＭ−Ｉは３３４アミノ酸残基からなるＩＩ型の膜タンパク質として合成され、糖鎖修飾の後、プロセシングを受けて１２０アミノ酸残基で構成されるＣ末端部分が細胞外に分泌される（Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６０，８６９−８７８，１９９９）。ＣｈＭ−Ｉは培養軟骨細胞の増殖を促進するのみならず、プロテオグリカン合成、アガロース中での軟骨細胞のコロニー形成を強力に促進する（Ｉｎｏｕｅｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，３９５−４００，１９９７）。また、ＣｈＭ−Ｉは軟骨だけでなく骨芽細胞の増殖をも促進する（Ｍｏｒｉｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０６  ３１０−３１４，１９９７）。
【０００３】
一方、軟骨は無血管組織であるばかりでなく血管侵入に対して抵抗性を示すことは古くから指摘されてきた。開らは、軟骨組織抽出物から血管内皮細胞に対する増殖抑制因子の精製を試み、その完全精製に成功した。その結果、これがＣｈＭ−Ｉであることが判明した（Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，４１５，３２１−３２４，１９９７、Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３２４１９−３２４２６，１９９７）。軟骨組織は、通常、無血管に保たれているのが特徴であるが、骨組織への置換には軟骨組織への血管侵入が必要であると考えられている。一次骨化中心の形成を準備する血管侵入に先立って、予定血管侵入領域では、軟骨細胞の肥大化と軟骨基質の石灰化がおこる。ＣｈＭ−Ｉは肥大化軟骨とこれに続く石灰化軟骨の出現領域で、劇的に発現が消失する。すなわち、ＣｈＭ−Ｉ遺伝子の発現は軟骨特異的であるが、血管侵入に抵抗性を示す無血管軟骨に限局されていることになる。既に述べたように、ＣｈＭ−Ｉは、軟骨の増殖と分化成熟を促進するのみならず、血管内皮細胞の増殖阻害により血管侵入を抑制するのではないかと考えられる。従って、無血管軟骨での発現と血管侵入に先立つ石灰化層での発現消失は、ＣｈＭ−Ｉのｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌな作用とよく一致している。
【０００４】
また、軟骨組織には強力な血管新生促進因子であるｂＦＧＦがｐｅｒｉｃｅｌｌｕｌａｒｓｐａｃｅに多量に蓄積されているが、ＣｈＭ−ＩはｂＦＧＦを取り囲むようにしてｉｎｔｅｒｔｅｒｒｉｔｏｒｉａｌ ｓｐａｃｅに存在することが明らかにされている（Ｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３２４１９−３２４２６，１９９７）。すなわち、無血管軟骨では、ＣｈＭ−Ｉが血管新生促進因子をマスクするような形で存在しており、ＣｈＭ−Ｉの血管新生阻害作用は軟骨に血管が存在しないことを説明し得るものであると考えられている（蛋白質核酸 酵素 Ｖｏｌ．４０ Ｎｏ．５．１９９５）。また、ＣｈＭ−Ｉは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒト腫瘍細胞への血管侵入を阻害して、癌細胞の増殖を抑制することが確かめられている（Ｈａｙａｍｉｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５８，４３６−４４０，１９９９）。マウスの各組織におけるＣｈＭ−ＩのｍＲＮＡの発現解析から、ＣｈＭ−Ｉは軟骨以外にも眼と胸腺で発現していることが明らかとなったが、これらの組織におけるＣｈＭ−Ｉの機能に関してはいまだ未知である（Ｓｈｕｋｕｎａｍｉｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３，３９−４９，１９９９）。
【０００５】
骨折の治癒、各種軟骨疾患の治癒過程には軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要である。従って、軟骨細胞の増殖と分化を促進する因子であるＣｈＭ−Ｉは、軟骨細胞増殖剤としての応用が期待されている（特開平７−１３８２９５号公報）。癌細胞の増殖、転移においては、エネルギー獲得のために組織内への血管侵入が必須である。従って、血管新生阻害作用を有するＣｈＭ−Ｉは抗腫瘍剤としての応用も期待されている（特開平７−１３８２９５号公報）。以上のように、ＣｈＭ−Ｉは、軟骨細胞の増殖・分化を制御すると共に、血管新生阻害作用をも有する分子であり、その機能から医薬品への応用が期待されている。
【０００６】
近年、バイオテクノロジーは急速な進歩を続けており、ヒトゲノムプロジェクトの進行とも関連して、大量の新規遺伝子がクローニングされている。ヒト遺伝子は、約１０万個存在すると言われているが、その中にはアミノ酸配列に相同性が認められる分子群がファミリーを形成している場合がある。アミノ酸配列に相同性が認められる分子群としては、ＴＮＦファミリー、ＴＮＦレセプターファミリー、ケモカイン及びＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒなど多種の遺伝子ファミリーが存在することが知られている。例えば、ＴＮＦファミリーに属する分子としては、Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α（ＴＮＦα、Ｐｅｎｎｉｃａｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，７２４，１９８４）、Ｆａｓｌｉｇａｎｄ（ＦａｓＬ、Ｓｕｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ７５，１１６７，１９９３）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ、Ｓｔｅｖｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｍｕｎｉｔｙ ３，６７３，１９９５）及びＢ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＢＬＹＳ、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，２６０−２６３，１９９９）など、約２０種類存在することが知られている。
【０００７】
ＴＮＦファミリーに属する分子は、ＩＩ型の膜タンパク質であり、細胞外領域にアミノ酸配列上の相同性が認められる。これらの分子は、アミノ酸配列に相同性が認められるものの、それぞれの分子は固有の機能を有することが明らかにされており、さまざまな疾患に対して医薬品としての適用が試みられている。また、ＴＮＦファミリーの分子にはそれぞれ固有のレセプターが存在することが明らかにされており、これらのレセプターも医薬品としての適用が試みられており、実際に医薬品として認可されたものも存在する（例：可溶性ＴＮＦ受容体，Ｉｍｍｕｎｅｘ社）。また、これらの分子に対する抗体も医薬品としての研究開発が進められており、実際に医薬品として承認されたものも存在する（例：抗ＴＮＦα抗体、Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ社）。アミノ酸配列に相同性が認められる分子を医薬品開発へ応用した例として、ＴＮＦファミリー及びＴＮＦレセプターファミリーを上記に例として示した。これらの分子の医薬品への応用を可能にした背景には、それぞれの分子の機能解析が実施され、その類似性と差異が明らかにされたことが挙げられる。
【０００８】
また、ＴＮＦファミリーの分子は、ＩＩ型の膜タンパク構造を有する分子であり、主に、血液系、リンパ系の細胞に発現しているものが多いため、実験手法や材料面では共有できる部分が多い。従って、ＴＮＦファミリーに属する新規遺伝子が発見された場合には、その機能解析の速度は初期に発見された分子よりも加速したものと思われる。このように、アミノ酸配列に相同性を有する新規遺伝子を発見し、その機能解析を実施することは、今後発見される新規遺伝子の機能解析の一助となるのみならず、その解析結果により、既知の分子との比較を行うことができるため、既知の分子の機能に関してもより詳細な知見が得られると考えられる。
【０００９】
一般に、既知の分子とアミノ酸配列に相同性が認められるタンパク質をコードする新規遺伝子をクローニングした場合には、機能解析に用いる技術や材料は既知の分子の例を参考にすることができる。しかし、アミノ酸配列に相同性が認められる分子であっても、上記のＴＮＦファミリーのように、それぞれの分子は固有の機能を有していると考えられるため、医薬品への応用を考えた場合には、リコンビナントタンパク質の発現と精製、抗体の作製、各種組織でのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現等を明確にし、既知の分子との構造及び機能面での違いを明らかにすることが必要である。
【００１０】
【特許文献１】欧州公開特許第４７３０８０号公報
【特許文献２】特開平７−１３８２９５号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７５，９７１−９７７，１９９１
【非特許文献２】Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６０，８６９−８７８，１９９９
【非特許文献３】Ｉｎｏｕｅｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，３９５−４００，１９９７
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０６  ３１０−３１４，１９９７
【非特許文献５】Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，４１５，３２１−３２４，１９９７
【非特許文献６】Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３２４１９−３２４２６，１９９７
【非特許文献７】Ｈｉｒａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３２４１９−３２４２６，１９９７
【非特許文献８】蛋白質核酸 酵素 Ｖｏｌ．４０ Ｎｏ．５．１９９５
【非特許文献９】Ｈａｙａｍｉｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５８，４３６−４４０，１９９９
【非特許文献１０】Ｓｈｕｋｕｎａｍｉｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３，３９−４９，１９９９
【非特許文献１１】ＴＮＦα、Ｐｅｎｎｉｃａｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，７２４，１９８４
【非特許文献１２】ＦａｓＬ、Ｓｕｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ７５，１１６７，１９９３
【非特許文献１３】ＴＲＡＩＬ、Ｓｔｅｖｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｍｕｎｉｔｙ ３，６７３，１９９５
【非特許文献１４】ＢＬＹＳ、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５，２６０−２６３，１９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明は、ＣｈＭ−Ｉに類似した新たなポリペプチド及びそれをコードする遺伝子を提供することを目的としている。また、本発明においては、該ポリペプチドに対する抗体の作製、各種組織での該遺伝子及びポリペプチドの発現レベルの解析、リコンビナントタンパク質の発現及び構造解析などを実施して、ＣｈＭ−Ｉとの類似性と差異を明らかにするとともに、機能を解明し、これらの関与する疾患の病態解明や診断、治療等を可能にすることを目的としている。
【００１２】
ＣｈＭ−Ｉは、軟骨細胞の増殖・分化を調節し、血管新生阻害作用を有するＩＩ型の膜タンパク質であり、医薬品への応用が期待されている分子である。従って、ＣｈＭ−Ｉに類似した新たなポリペプチドをコードする遺伝子が提供できれば、その各種細胞での発現レベルや構造及び機能を解析でき、またその発現物の解析等によりこれらの関与する疾患の病態解明や診断、治療等が可能となると考えられる。しかしながら、現在のところＣｈＭ−Ｉのアミノ酸配列と相同性を示す分子の報告はなく、ＣｈＭ−Ｉが遺伝子ファミリーを構成しているのかどうかは不明である。従って、ＣｈＭ−Ｉに類似した新たなポリペプチド及びそれをコードする遺伝子の存在が明らかになれば、その構造及び機能等の解析により、ＣｈＭ−Ｉとの類似性及び相違性を検討することが可能となり、互いの分子の生理的な機能の解明及びこれらの分子が関与する病態の解明、診断及び治療薬の開発等を加速することも期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、ヒト、マウス及びラットｃＤＮＡライブラリーより新たに、上記目的に合致する遺伝子（ＣｈＭ１Ｌ遺伝子）を単離することに成功し、その各組織での発現レベルの解析、該ポリペプチドに対する抗体の作製、該遺伝子がコードするポリペプチドの哺乳動物細胞での発現、検出及び精製などを実施し、該ポリペプチドが血管新生阻害作用を有することを明らかにして、ここに本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は配列番号２、４及び６で表されるアミノ酸配列を実質的に含むポリペプチドをコードする遺伝子である。上記遺伝子としては、例えば配列番号１、３及び５で表される塩基配列が挙げられる。
【００１５】
さらに、本発明は、配列番号２、４及び６で表されるアミノ酸配列を実質的に含む、ヒト、マウス及びラット遺伝子がコードするポリペプチドである。
【００１６】
さらに、本発明は、前記遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１７】
さらに、本発明は、前記遺伝子を含む組換え体ＤＮＡである。
【００１８】
さらに、本発明は、前記組換え体ＤＮＡによって形質転換された形質転換体である。
【００１９】
さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から本発明遺伝子がコードするポリペプチドを採取することを特徴とする前記ポリペプチドの製造方法である。
【００２０】
さらに、本発明は、前記ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００２１】
さらに、本発明は、前記ポリペプチドで免疫された抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることにより得られる、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００２２】
さらに、本発明は、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む遺伝子の検出試薬である。
【００２３】
さらに、本発明は、前記ポリペプチド、及び前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含む診断キットである。
【００２４】
さらに、本発明は、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列を実質的に含む遺伝子がコードするポリペプチドからなる医薬組成物である。
【００２５】
さらに、本発明は、上記ポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体からなる医薬組成物である。
【００２６】
さらに、本発明は、前記の遺伝子の一部と特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる医薬組成物である。
【００２７】
さらに、本発明は、前記の遺伝子の少なくとも一部を含む、遺伝子治療に利用しうる核酸からなる医薬組成物である。
【００２８】
さらに、本発明は、前記のポリペプチドが細胞膜結合型であることを特徴とするポリペプチドである。
【００２９】
さらに、本発明は、前記の細胞膜結合型ポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００３０】
さらに、本発明は、前記のヒト遺伝子がＸ染色体に存在することを特徴とする遺伝子である。
【００３１】
さらに、本発明は、前記のポリペプチドが血管新生阻害作用を有することを特徴とするポリペプチドである。
【００３２】
さらに、本発明は、前記の血管新生阻害作用を有するポリペプチドをコードする遺伝子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明において、「実質的に含む」とあるのは、本発明の遺伝子又はポリペプチドは、その機能を有する限り、配列番号１、３または５で表される塩基配列、あるいは配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列に置換、挿入又は欠失等の変異が生じてもよいことを意味する。
【００３４】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子配列は、ＲＡＣＥ（ＲＡＣＥ：Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ；Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８）法により取得することができるが、その概要を述べれば次のとおりである。
【００３５】
一般的に、ＲＡＣＥ法とは、ｃＤＮＡの一部の配列が既知である場合、これをもとに完全長ｃＤＮＡを効率よく取得する方法である。既知の配列領域から３’末端あるいは５’末端それぞれの方向に伸長できるようにプライマーを作製し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４，１９８５）法により、ｃＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ法を実施する際は、既知領域では特異的にアニールするプライマー、３’末端及び５’末端ではライゲーション反応等により付加した配列にアニールするプライマーを用いる。従って、ＰＣＲ法により増幅させた領域は配列が未知の領域を含んでいる。増幅させたＤＮＡ断片の単離・精製は後述の実施例でも述べるとおり常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動等によればよい。このようにして得られたＤＮＡ断片等の塩基配列の決定も、常法に従うことができ、例えばジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７，１９７７）やマキサム−ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９，１９８０）等により行うことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いても容易に行い得る。
【００３６】
より具体的には、本発明における後述の実施例２で詳細に述べるが、概略は以下の通りである。ヒトＣｈＭ−Ｉのアミノ酸配列を用いて、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ：ＤＮＡｄａｔａ ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）において、ＥＳＴデータベース（ｄｂＥＳＴ、ＥＳＴ：Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）でＴＢＬＡＳＴＮサーチを実施し、ＥＳＴファイル、Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＩ１２３８３９を検出した。ＡＩ１２３８３９は、ｄｂＥＳＴに登録された塩基配列断片であるが、前記のＴＢＬＡＳＴＮサーチによりはじめてＣｈＭ−Ｉに類似したアミノ酸配列をコードする新規遺伝子断片であることが明らかとなった。そこで、このｄｂＥＳＴより得たｃＤＮＡの一部の配列よりプライマーを合成し、ＲＡＣＥ法を用いてヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子の配列を決定するに至った。その後、同様にマウス及びラットＣｈＭ１Ｌ遺伝子の配列を決定した。ヒト、マウス及びラットＣｈＭ１Ｌ遺伝子の配列を配列番号１、３及び５に、それがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２，４及び６に示す。
【００３７】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子がコードするポリペプチドは、３１７アミノ酸で構成される（配列番号２，４及び６）。ＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列はＣｈＭ−Ｉと相同性を有するが、特にＣｈＭ−Ｉのプロセシングを受けて細胞外に分泌されるＣ末端部分と非常に高い相同性を有する（図１（ａ））。また、ＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列はヒト、マウス及びラットの間で非常に高い相同性を有する（図１（ｂ））。アミノ酸配列の疎水性度の解析から、ＣｈＭ１ＬはＣｈＭ−Ｉと同様にＩＩ型の膜タンパク構造を有する分子であると考えられる（図２）。図２に示すように、該ポリペプチド及びＣｈＭ−Ｉは共に、膜結合性を有する分子に特徴的に認められる約２０アミノ酸からなる疎水性のドメインが、Ｎ末端から数十アミノ酸付近に存在する。該ポリペプチドがＩＩ型の膜タンパク構造を有する分子であることは、該ポリペプチドをＣＯＳ７細胞に発現させた実施例８の結果からも明らかにされた（図４）。
【００３８】
本発明のヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子は、後述の実施例１２で述べるとおりヒトＸ染色体に存在することが明らかとなった（Ｇｅｎｂａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬＯ３５６０８）。
【００３９】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子は、ｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びそれらの組み合わせがある。該ゲノムＤＮＡは標準的な技法を用いて、本明細書中に開示されたＣｈＭ１Ｌ遺伝子に対するハイブリッド形成によっても単離することができる。該ＣｈＭ１Ｌ遺伝子から転写されたＲＮＡもまた、本発明によって包含される。配列番号１、３及び５で示される本発明遺伝子の配列は、これによりコードされる各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組み合わせ例であり、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子はこれに限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組み合わせ選択したＤＮＡ配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮することができる（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，４３−７４，１９８１）。
【００４０】
さらに本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子には、配列番号２、４及び６で表されるアミノ酸配列の一部が置換、欠失、付加した変異体をコードするＤＮＡ配列もまた包含される。これらポリペプチドの製造、改変（変異）等は、天然に生じることもあり、また翻訳後の修飾により、或いは遺伝子工学的手法により、例えばサイトスペシフィック・ミュータジェネシス（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２，１９８７；同１００，４６８，１９８３；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，９４４１，１９８４；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」，日本生化学会編，１０５，１９８６）等の方法により収得することができる。
【００４１】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の製造は、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に実施できる（ＭｏｌｅｃｕｌｅｒＣｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ＥＤ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ」、日本生化学会編，１９８６等参照）。
【００４２】
これは例えばｃＤＮＡライブラリー（ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現される適当な起源細胞より常法に従い調製されたもの）から、本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，６６１３，１９８１；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８，１９８３等）。
【００４３】
上記方法において、起源細胞としては、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示され、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡへの変換（合成）とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されてもおり、本発明ではそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばクローンテック社より市販の各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。
【００４４】
ｃＤＮＡライブラリーからの本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子のスクリーニングは前記通常の方法に従い実施することが出来る。該スクリーニング方法としては、例えばｃＤＮＡの産生するポリペプチドに対して、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子がコードするポリペプチドに対する特異的抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的の塩基配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組み合わせを例示できる。ここで用いられるプローブとしては、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ配列、既に取得された本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子やその断片がかかるプローブとして利用できる。
【００４５】
また、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従い合成することができる。
【００４６】
より具体的には、実施例２で詳細に述べるが概略は以下のとおりである。ＣｈＭ１Ｌ遺伝子のｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅを含むようにプライマーを合成し、これを用いてＰＣＲ法によりＣｈＭ１Ｌ遺伝子を増幅する。その後、アガロース電気泳動を行い、目的のバンドを切り出した後、ＤＮＡを精製する。精製したＤＮＡとプラスミドベクターをｌｉｇａｔｉｏｎ反応させ、大腸菌で形質転換を行う。その後、大腸菌培養液よりプラスミドを精製し、ＤＮＡシークエンサーにより目的の配列が組み込まれたことを確認する。このようにしてクローニングされたＣｈＭ１Ｌ遺伝子は、適切な制限酵素を用いることにより、他のプラスミドベクターやウィルスベクターに移しかえることが可能である。
【００４７】
このようにして得られたＣｈＭ１Ｌ遺伝子（ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ）を利用すれば、常法に従い、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現が増加、減弱及び消失した遺伝子改変動物を作成することが可能である。
【００４８】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の配列情報を基にすれば、該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を利用することにより、各種組織における本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現を検出することができる。これは常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ＲＮＡ．Ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，２１−２７，１９８９）法、ノーザンブロッティング解析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）等により、いずれも良好に実施しうる。ＲＴ−ＰＣＲ法のプライマー及びノーザンブロッティング解析のプローブは、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子を特異的に検出しうる配列である限り何ら制限はなく、かかる配列は本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の塩基配列により適宜設定することが可能である。従って、本発明は、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の検出に有用なプライマー及び／またはプローブを提供するものである。尚、該プローブは、サザンブロッティンング解析によるゲノムＤＮＡの検出にも利用可能である。
【００４９】
ＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現を検出する手段としては、実施例６で述べるＲＴ−ＰＣＲ法を例示できる。詳細は実施例６で述べるが、概略は以下のとおりである。
【００５０】
各組織を摘出してＲＮＡを抽出した後、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲ反応を行い、得られた反応液をアガロースゲルで電気泳動し、紫外線照射下でバンドを観察することにより、各組織でのＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現量を検出した。その結果、成体マウスの各組織におけるＣｈＭ１ＬｍＲＮＡの発現は、脳、眼球、骨格筋、ｗｈｏｌｅ ｒｉｂ及び甲状腺で認められた（図３（ａ））。一方、マウスにおけるＣｈＭ−ＩｍＲＮＡの発現は、眼球、胸腺、軟骨及びｗｈｏｌｅ ｒｉｂで確認されている（Ｓｈｕｋｕｎａｍｉｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ ４３，３９−４９，１９９９）。従って、ＣｈＭ１ＬとＣｈＭ−Ｉは生体内において異なる組織に発現していることが明らかとなり、その生理的な機能は異なると考えられた。ＣｈＭ１Ｌは、ＣｈＭ−Ｉでは発現が確認されていない組織である脳、骨格筋及び甲状腺で発現が認められた。
【００５１】
また、ＣｈＭ−Ｉでも発現が認められている組織であり、血管侵入に対して抵抗性のある組織である眼球及び軟骨を含むｗｈｏｌｅｒｉｂで発現していることから、ＣｈＭ１Ｌは血管新生に関与していると考えられる。これらの結果からＣｈＭ１Ｌは、アルツハイマー病等の脳が関連した疾患、筋ジストロフィー等の骨格筋が関連した疾患、バセドウ病などの甲状腺が関連した疾患、糖尿病性網膜症等の眼球が関連した疾患、変形性関節症やリウマチ性疾患などの軟骨組織が関連した疾患及び癌を含む血管新生が関連した疾患に関与していると考えられる。従って、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子、ＣｈＭ１Ｌポリペプチド、ＣｈＭ１Ｌに結合する抗体を含むＣｈＭ１Ｌに対するアンタゴニスト及びアゴニスト、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現を促進あるいは減弱させる物質等をこれらの疾患の治療薬として適用することができると考えられる。尚、ここで挙げたアゴニストやアンタゴニストなどの物質は、ペプチド、タンパク質及び低分子化合物などが考えられ、その機能を有する限り物質の性状に制限はないものとする。
【００５２】
胎児の各組織においてＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現は、眼球、腎臓、胃、ｗｈｏｌｅｒｉｂ及び気管で認められた（図３（ｂ））。成体マウスでは、腎臓及び胃でのＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現は認められていないが、胎児においてこれらの組織にＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡが発現していることは、これらの臓器の発生・形態形成にＣｈＭ１Ｌが関与していることを示しているものと考えられる。従って、ＣｈＭ１Ｌは、成体においてもこれらの臓器の修復や再生にも関与していると考えられる。また、気管においてもＣｈＭ１ＬｍＲＮＡが発現していることが明らかとなった。従って、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子、ＣｈＭ１Ｌポリペプチド、ＣｈＭ１Ｌに結合する抗体を含むＣｈＭ１Ｌに対するアンタゴニスト及びアゴニスト、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現を促進あるいは減弱させる物質等を、慢性腎不全等の腎臓が関連した疾患、胃がんや胃潰瘍などの胃が関連した疾患及び慢性気管支炎や喘息などの気管が関連した呼吸器系疾患に対する治療薬として適用することができると考えられる。
【００５３】
胎児発生段階においてＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現は、妊娠１０日目では非常に弱く、１１日目から１３日目にかけて発現が上昇している（図３（ｃ））。一方、ＣｈＭ−ＩもＣｈＭ１Ｌと同様に胎児の発生に伴って発現が上昇するが、妊娠１０日目及び１１日目では明らかにＣｈＭ１Ｌよりも強い発現を示した。従って、胎児発生段階において、ＣｈＭ１ＬはＣｈＭ−Ｉよりも遅れて発現が上昇することが明らかとなり、両分子が胎児発生において異なる機能を有することが明らかとなった。また、胎児発生段階においてＣｈＭ１Ｌの発現が上昇することは、ＣｈＭ１Ｌが臓器や骨格の形成に深く関与していることを示している。従って、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子、ＣｈＭ１Ｌポリペプチド、ＣｈＭ１Ｌに結合する抗体を含むＣｈＭ１Ｌに対するアンタゴニスト及びアゴニスト、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現を促進あるいは減弱させる物質等は、臓器の不十分な発達による先天性疾患や後天的に臓器が損傷した場合に、臓器を再生及び修復させる薬剤として適用できるものと考えられる。また、ＣｈＭ１ＬとＣｈＭ−Ｉでは成体及び胎児の各組織における発現、胎児発生段階における発現に違いが認められることから、これらの分子及びこれらの分子をターゲットにした薬剤を各種疾患の治療薬として適用する場合には、その用途は異なる場合があると考えられる。
【００５４】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子の配列を使用すれば、遺伝子工学的手法により該遺伝子がコードするポリペプチドを製造することが可能である。
【００５５】
該ポリペプチドの製造は、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換え体ＤＮＡを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養することにより行われる。ここで宿主細胞としては、真核性宿主細胞及び原核性宿主細胞のいずれを用いることもできる。
【００５６】
該真核性宿主細胞には、脊椎動物、酵母及び昆虫細胞等が含まれる。脊椎動物細胞としては、例えばＣＨＯ細胞及びＣＯＳ細胞等が挙げられる。
【００５７】
脊椎動物の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用できる。該発現ベクターとしては例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８５４，１９８１）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）等を例示できる。
【００５８】
真核細胞中で目的ポリペプチドを発現させる手段は、それ自体当該分野では多くの系が周知である。
【００５９】
例えば酵母中で発現させる系としては特開昭５７−１５９４８９号公報に記載された「酵母中でのポリペプチドの発現」が挙げられ、昆虫細胞中で発現させる系としては特開昭６０−３７９８８号公報に記載された「組換えバキュロウイルス発現ベクターの製法」が挙げられ、哺乳類動物細胞中で発現させる系としては特開平２−１７１１９８号公報に記載された「真核性発現の改良」が挙げられるが、もちろんこれら以外にも多数存在する。
【００６０】
本発明ＣｈＭ１Ｌ遺伝子は、例えば、大腸菌、枯草菌およびストレプトマイセス等の原核性宿主細胞内でも発現し得る。例えば、上記宿主としての大腸菌はＥｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定されず公知の各種菌株及びベクターも利用できる。プロモーターとしては、例えば、大腸菌ラクトース（ｌａｃ）、大腸菌ｔｒｐ等のプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。また、上記のプロモーターは、いずれも既に特性化されており、当業者が熟知しているものであって、合成的にあるいは、既知のプラスミドから組み立てることができるものである。
【００６１】
本発明の例示ＤＮＡ配列、プラスミドおよびウイルスには多くの修飾や変更が可能である。例えば、遺伝暗号の同義性により、ポリペプチドの暗号領域全体を通して、ヌクレオチドの置換を行うことができる。そのような配列は、本発明ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の塩基配列又はそれがコードするポリペプチドのアミノ酸配列から推定することができ、下記の従来からの合成法により組み立てることができる。そのような合成法は、実質上、イタクラらの方法（Ｉｔａｋｕｒａｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８，１０５９，１９７７）ならびにクレアらの方法（Ｃｒｅａｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５，５７６５，１９７８）に従って行うことができる。従って、本発明は特に例示した塩基配列、プラスミドおよびウイルスに限定されるものではない。
【００６２】
かくして得られる所望の本発明の組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。また、得られる形質転換体は常法に従い培養でき、該培養により本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子がコードするポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、その培養も宿主細胞の成育に適した条件下で実施できる。
【００６３】
上記により、形質転換体の細胞内、細胞外あるいは細胞膜上に該ポリペプチドが生産される。該ポリペプチドは、所望によりその物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作［「生化学データブックＩＩ」、１１７５−１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４−８２７７（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３−３２１（１９８７）等参照］により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、ポリペプチド沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外ろ過、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合わせ等を例示できる。また、該ポリペプチドにアフィニティータグを融合したタンパク質を発現させれば、このタグを利用してアフィニティー精製を実施することが可能である。ここで述べるアフィニティータグとは例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ、Ｓｉｓｋｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，７６６，１９９４）及びＦＬＡＧタグ（Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１２０４−１２１０，１９８８）が挙げられる。これらのアフィニティータグを融合したＣｈＭ１Ｌポリペプチドの発現及び検出は、実施例８及び９で述べるように実施することが可能であり、これらのタグを用いてＣｈＭ１Ｌポリペプチドを精製することも実施し得る。
【００６４】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子がコードするポリペプチドの製造方法は、より具体的には実施例８で詳細に述べるが概略は以下のとおりである。
【００６５】
本発明のヒト及びマウスＣｈＭ１Ｌ遺伝子及びＣ末端にＨｉｓタグが融合したＣｈＭ１Ｌタンパク質をコードする遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングし（実施例４）、これをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。約４８時間後に、培養上清及び細胞成分を回収してＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法によりＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質の検出を試みた。しかし、培養上清及び細胞成分のいずれにおいてもＣｈＭ１Ｌタンパク質の発現を検出することはできなかった。
【００６６】
そこで、ＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質の発現を検出する条件を検討したところ、発現ベクターにｐＣＡＧＧＳを使用することによりＣＯＳ７細胞での該ポリペプチドの発現を検出することが可能となった。本発明のヒト及びマウスＣｈＭ１Ｌ遺伝子及びＣ末端にＨｉｓタグが融合したＣｈＭ１Ｌタンパク質をコードする遺伝子をｐＣＡＧＧＳベクターにクローニングし（実施例４）、これをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。約４８時間後に、培養上清及び細胞成分を回収してＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法によりＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質を検出した。培養上清ではＣｈＭ１Ｌタンパク質の発現は確認されず、細胞成分では４０ｋＤａ付近に２本のバンドが検出された。
【００６７】
従って、ＣｈＭ１Ｌタンパク質は膜結合性タンパク質であることが明らかになった。一方、ＣｈＭ−ＩをＣＯＳ７細胞で発現させると培養上清中に可溶性のタンパク質として分泌されることが確認されている（Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，３２４１９−３２４２６，１９９７）。従って、ＣＯＳ７細胞による解析からＣｈＭ１ＬとＣｈＭ−Ｉは異なる構造を有するタンパク質であることが明らかとなった。すなわち、ＣｈＭ１Ｌは細胞膜結合型のタンパク質であり、ＣｈＭ−Ｉは分泌性のタンパク質であり、両分子のプロセシングの機構が異なることが明らかとなった。尚、ＣｈＭ１Ｌタンパク質の２本のバンドのうち、高分子量側のバンドは、Ｎ結合型の糖鎖により修飾されたフォームであることが、後述する実施例１０により明らかになった（図６）。
【００６８】
このようにして発現させたＣｈＭ１Ｌタンパク質は、ＣｈＭ１Ｌ特異的抗体あるいはヒスチジンが６残基融合したタグ（Ｈｉｓタグ）などに対する抗体及びニッケルカラムなどを用いてアフィニティー精製することが可能である。
【００６９】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子がコードするポリペプチドは、膜結合性ポリペプチド及び細胞膜結合性を有しない可溶性のポリペプチドでもあり得る。例えば、細胞膜上に膜結合性ポリペプチドとして発現した後、切断されて可溶性になる場合等が考えられる。ＣＯＳ７細胞における発現ではＣｈＭ１Ｌタンパク質は膜結合型のタンパク質として検出されたが（実施例８）、宿主細胞や培養条件などが異なればプロセシングを受けて可溶性タンパク質となることもありうる。また、膜貫通領域を欠く可溶性の該ポリペプチドは、異種シグナルペプチドをＮ末端に融合することにより発現させることができる。
【００７０】
より具体的には、実施例９で詳細に述べるが可溶性のＣｈＭ１Ｌタンパク質を発現させる方法の概略は以下のとおりである。
【００７１】
ｐＣＡＧＧＳベクターにＮ末側から、プレプロトリプシンのシグナルシークエンス、ＦＬＡＧタグ、ＣｈＭ１Ｌの細胞外領域のＣ末端側が融合したタンパク質コードする塩基配列を組み込んだベクターを構築した（実施例５）。このベクターを用いて発現させたＣｈＭ１Ｌタンパク質は、プレプロトリプシンのシグナルシークエンスが切断を受けた後、可溶性タンパク質として培養液中に分泌された（実施例９、図５）。
【００７２】
このようにして培養液中に分泌された可溶性のＣｈＭ１Ｌポリペプチドは、抗ＣｈＭ１Ｌ抗体あるいは、ＦＬＡＧタグが融合しているため抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いて精製することが可能である。また、ＦＬＡＧ融合タンパク質をエンテロキナーゼで切断することにより、ＦＬＡＧタグを除去することも可能である。
【００７３】
より具体的には、実施例１３で詳細に述べるが可溶性ＣｈＭ１Ｌタンパク質の精製方法の概略は以下のとおりである。
【００７４】
リポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて製品説明書に従って、ｐＳＦ−ｓｈＣｈＭ１ＬをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトして約４８時間後に培養上清を回収した。この培養上清から、抗ＦＬＡＧＭ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌタンパク質を精製した（図８）。
【００７５】
本発明のＣｈＭ１Ｌポリペプチドは、ポリペプチド精製試薬として用いることができる。固体支持材料に結合した該ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーによる該ポリペプチドに結合し得るポリペプチドの精製に有用である。ＣｈＭ１Ｌポリペプチドに結合し得るポリペプチドとしては、可溶性ポリペプチド、膜結合性ポリペプチド及び抗体などが考えられる。可溶性のＣｈＭ１Ｌポリペプチドは、ｉｎｖｉｔｒｏでは細胞培養液中への添加、ｉｎ ｖｉｖｏでは静脈内投与などに容易に適用し得る。
【００７６】
本発明ＣｈＭ１Ｌポリペプチドの活性を検索する目的で、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨｕｍａｎＵｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣｓ）を用いて血管新生阻害作用の有無を解析した。詳細は、後述の実施例１４で述べるが概略は以下のとおりである。ＨＵＶＥＣｓをマトリゲル（ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）でコートしたプレート上で培養すると、血管内皮細胞が管腔様の構造を形成する（図９）。この培養液中に、前述のアフィニティークロマトグラフィーにより精製したＣｈＭ１Ｌポリペプチドを加えるとＨＵＶＥＣｓの管腔様構造の形成が阻害された（図９）。従って、ＣｈＭ１Ｌは血管新生阻害作用を有することが明らかとなり、可溶性のＣｈＭ１Ｌポリペプチドは糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチなどの血管新生を伴う疾患の治療薬として適用できることが明らかとなった。
【００７７】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子がコードするポリペプチドは、これを用いて特異抗体を作製することもできる。ここで使用される抗原は、上記遺伝子工学的手法に従って大量に産生されるポリペプチド又は化学的に合成されたポリペプチドがあり、得られる抗体はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、これらの抗体は該ポリペプチドの精製、測定、識別等に有効に利用できる。従って、該ポリペプチドに対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は該ポリペプチドによって（直接的に又は間接的に）媒介される疾患の治療及び治療法の開発に使用することができ、上記疾患の診断用試薬として使用することも可能である。
【００７８】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子がコードするポリペプチドに特異的に結合する抗体は、実施例７に示すように作製することができる。作製した抗ＣｈＭ１Ｌポリペプチド抗体が該ポリペプチドと特異的に結合することは、実施例８のＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔの結果により確かめられた（図４）。
【００７９】
抗ＣｈＭ１Ｌポリペプチド抗体は、実施例１１に示したように組織切片の免疫染色にも使用可能である。肋軟骨組織を抗ＣｈＭ１Ｌポリペプチド抗体を用いて染色すると、軟骨組織周囲を取り囲むようにして存在する線維芽細胞様の扁平な形態を示す細胞が特異的に染色された（図７）。一方、ＣｈＭ−Ｉは軟骨細胞に特異的に発現しており、免疫染色によっても軟骨細胞及び軟骨細胞外のマトリックスに蓄積されていることが明らかにされている（Ｈｉｒａｋｉｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２７２，３２４１９−３２４２６，１９９７）。従って、ＣｈＭ１ＬとＣｈＭ−Ｉは軟骨を含む組織において異なる細胞に発現していることが明らかとなった。従って、ＣｈＭ１ＬはＣｈＭ−Ｉと異なる機能を有する分子であることが明らかとなった。
【００８０】
免疫染色によってＣｈＭ１Ｌタンパク質を発現していることが明らかになった線維芽細胞様の形態を示す細胞群を含む組織は、従来より軟骨膜（ｐｅｒｉｃｈｏｎｄｒｉｕｍ）と呼ばれている（Ｓｕｄａｅｔ ａｌ，骨形成と骨吸収及びそれらの調節因子１、２，１９９５）。軟骨膜という組織に関しては現在のところ明確な定義はないが、本明細書中では軟骨細胞周囲を取り囲む線維芽細胞様の形態を示す細胞を含む組織のことを指すものとする。
【００８１】
軟骨膜に存在する細胞は、内軟骨性骨化の過程で軟骨組織が成長する際の軟骨細胞の供給源であると考えられている。従って、軟骨膜は発生過程における骨格形成や成体における骨、軟骨の損傷時に軟骨細胞を供給する重要な組織である。また、軟骨組織には血管、神経、リンパ管が存在しないことが特徴であるが、軟骨組織と他の組織の境界に存在するのが軟骨膜であることから、軟骨膜は軟骨細胞への血管、神経、リンパ管の侵入を制御していると考えられる。このように、軟骨膜は重要な組織であることが認識されているが、上述のように明確に定義された組織ではなく、現在のところ詳細な研究は行われていない。その理由としては、軟骨膜特異的に発現する分子が全く明らかにされていないことが挙げられる。
【００８２】
従って、軟骨組織周囲を取り囲む軟骨膜と呼ばれる組織に特異的に発現する分子の存在が明らかになれば、軟骨膜及び軟骨組織の研究に非常に重要なツールとして利用できる。
【００８３】
本発明のＣｈＭ１Ｌは、軟骨膜特異的に発現していることが明らかにされた唯一の分子であり、血管、神経、リンパ管の軟骨組織への侵入を制御していると考えられる。
【００８４】
従って、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発見と本発明に含まれるＣｈＭ１Ｌの機能解析の結果は、今後、軟骨膜及び軟骨組織を含むＣｈＭ１Ｌが発現しているその他の組織が関与する疾患の原因や治療法の開発に新たな視点を与えうるものであると考えられる。
【００８５】
従って、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子、ＣｈＭ１Ｌポリペプチド、ＣｈＭ１Ｌに結合する抗体を含むＣｈＭ１Ｌに対するアンタゴニスト及びアゴニスト、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現を促進あるいは減弱させる物質等は、上記のＣｈＭ１Ｌを発現している細胞が関与している疾患の治療薬として適用することができると考えられる。
【００８６】
本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子及びそれがコードするポリペプチドは、上記のｍＲＮＡの発現解析及び免疫染色の結果から、脳、眼球、骨格筋、甲状腺、軟骨を含むｗｈｏｌｅｒｉｂ、腎臓、胃、気管及び軟骨組織周囲を取り囲むようにして存在する線維芽細胞様の扁平な形態を示す細胞に発現していることが明らかとなった。従って、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子及びそれがコードするポリペプチドは、それが発現していることが確認された上記の組織が関連する疾患、例えば糖尿病性網膜症、筋ジストロフィー、バセドウ病、慢性腎不全、胃癌、慢性気管支炎、変形性関節症及びリウマチ性疾患などに関与していると考えられる。
【００８７】
従って、本発明のＣｈＭ１Ｌ遺伝子、ＣｈＭ１Ｌポリペプチド、ＣｈＭ１Ｌに結合する抗体を含むＣｈＭ１Ｌに対するアンタゴニスト及びアゴニスト、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子の発現を促進あるいは減弱させる物質等はこれらの疾患に対する治療薬として適用することができると考えられる。
【実施例】
【００８８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するためのものでない。
【００８９】
実施例１．ＣｈＭ１Ｌアミノ酸配列の解析 
ＣｈＭ−ＩとＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列の相同性を比較した（図１（ａ））。尚、アミノ酸配列はアルファベット１文字で表示した。ＣｈＭ１Ｌは、分子全体を通してＣｈＭ−Ｉと相同性を有するが、ＣｈＭ−Ｉのプロセシングを受けて細胞外に分泌されるＣ末側と特に高い相同性を有することが明らかになった。
【００９０】
ヒト、マウス及びラットＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列の相同性を比較した（図１（ｂ））。ＣｈＭ１Ｌポリペプチドは、ヒト、マウス及びラットともに、３１７アミノ酸で構成されるが、３種間で３００アミノ酸残基が同一であった（約９５％）。
【００９１】
ＣｈＭ−ＩとＣｈＭ１Ｌの疎水性度の図を示す（図２）。ＣｈＭ−Ｉ及びＣｈＭ１Ｌ共にＮ末側に疎水性の大きなピークが認められる。この疎水性の領域は、細胞膜結合型のタンパク質に特徴的に認められるものであり、ＣｈＭ１ＬはＣｈＭ−Ｉと同様にＩＩ型の膜結合性タンパク質であることが示された。
【００９２】
実施例２．ＣｈＭ１Ｌ遺伝子のクローニング 
日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ：ＤＮＡ ｄａｔａ ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）から、ヒトＣｈＭ−Ｉのアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ１６４４１）を用いて、Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇデータベース（ｄｂＥＳＴ）上でＴＢＬＡＳＴＮサーチを実施した。その結果、ＣｈＭ−Ｉと相同性を有する新規遺伝子断片として、ＥＳＴファイル、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＩ１２３８３９を検出した。
【００９３】
クローンテック社製Ｈｕｍａｎ ｆｅｔｕｓ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡを用いて製品説明書に従い、ＲＡＣＥ法によりｃＤＮＡの増幅を行った。プライマーは上記のｄｂＥＳＴより得られた塩基配列より合成し、ＥｘＴａｑ  ｐｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を製品説明書に従って使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ登録商標 ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、反応サイクルは９６℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分を３０回繰り返すこととし、最後に７２℃で６分間インキュベートしてＰＣＲ反応液を得た。この反応液をテンプレートとして１／１０量加え、同条件で２度目のＰＣＲ行った。
【００９４】
得られたＰＣＲ産物をエチジウムブロマイド入りの１％アガロースゲルで電気泳動を行い、このゲルを紫外線下で観察することによりＤＮＡバンドを調べた。増幅されたフラグメントをゲルから切り取り、製品説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。
【００９５】
精製フラグメントの塩基配列は製品説明書に従い、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて決定した。
【００９６】
ヒトＣｈＭ１Ｌ ｃＤＮＡの核酸塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２を示す。
【００９７】
配列番号１で表されるヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列が、ヒトＣｈＭ−Ｉと相同性を示すことから、この遺伝子をＣｈＭ１Ｌ遺伝子（ＣｈＭ−Ｉｌｉｋｅ ｇｅｎｅ）と呼ぶこととした。
【００９８】
ヒトＣｈＭ１Ｌ ｃＤＮＡのｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）をＰＣＲにより増幅、アガロース電気泳動後、精製し、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ａｍｐクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製品説明書に従ってクローニングした。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号８（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）に示した。ベクターに組み込まれたＣｈＭ１Ｌ遺伝子配列は製品説明書に従い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて決定した。
【００９９】
ヒトＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列（配列番号２）を用いて、上記ヒトの場合と同様にＴＢＬＡＳＴＮサーチを実施した。その結果、マウスＣｈＭ１Ｌをコードする遺伝子断片としてＥＳＴファイル、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＶ００９１９１、ラットＣｈＭ１Ｌをコードする遺伝子断片としてＥＳＴファイル、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＩ１１２００３が検出された。クローンテック社製Ｍｏｕｓｅ１１−ｄａｙ Ｅｍｂｒｙｏ Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡ及びＲａｔ Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ  ｃＤＮＡを用いてヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子の単離と同様にＲＡＣＥ法によりマウス及びラットＣｈＭ１Ｌ遺伝子配列を決定した。
【０１００】
マウスＣｈＭ１Ｌ ｃＤＮＡの核酸塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。ラットＣｈＭ１ＬｃＤＮＡの核酸塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【０１０１】
マウス及びラットＣｈＭ１Ｌ ｃＤＮＡのｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）をＰＣＲにより増幅、アガロース電気泳動後、精製し、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ａｍｐクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製品説明書に従ってクローニングした。マウス遺伝子のＰＣＲに用いたプライマーの配列を配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１０（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）に、ラット遺伝子のＰＣＲに使用したプライマーの配列を配列番号１１（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１２（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）に示した。ベクターに組み込まれたＣｈＭ１Ｌ遺伝子配列は製品説明書に従い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて決定した。
【０１０２】
本実施例で作製した、ヒト、マウス及びラットＣｈＭ１Ｌ遺伝子を組み込んだベクターは、以下の略称を用いることとする。
・ヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子を含むベクター：ｐＣＲ−ｈＣｈＭ１Ｌ
・マウスＣｈＭ１Ｌ遺伝子を含むベクター：ｐＣＲ−ｍＣｈＭ１Ｌ
・ラットＣｈＭ１Ｌ遺伝子を含むベクター：ｐＣＲ−ｒＣｈＭ１Ｌ
【０１０３】
実施例３．Ｃ末端にヒスチジン６残基が融合したヒト及びマウスＣｈＭ１Ｌタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの構築
ヒト及びマウスＣｈＭ１Ｌ ｃＤＮＡのｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）をＰＣＲにより増幅、アガロース電気泳動後、精製し、Ｃ末端にヒスチジン６残基（Ｈｉｓタグ）が融合するように改良したｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）及びｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ａｍｐクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製品説明書に従ってクローニングした。ヒト遺伝子のＰＣＲに用いたプライマーの配列を配列番号７（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１３（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）に、マウス遺伝子のＰＣＲに使用したプライマーの配列を配列番号９（Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１４（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）に示した。ＣｈＭ１ＬのＣ末端にＨｉｓタグが融合したタンパク質をコードする塩基配列が組み込まれていることは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを製品説明書に従って使用し確認した。Ｃ末端にＨｉｓタグが融合したヒト及びマウスＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列を配列番号１７及び１８に、それをコードする核酸塩基配列を配列番号１５及び１６に示した。
【０１０４】
本実施例で作製したＨｉｓタグが融合したＣｈＭ１Ｌタンパク質をコードする遺伝子をクローニングしたベクターは、以下の略称を用いることとする。
・ヒトＣｈＭ１ＬとＨｉｓタグが融合したタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター：ｐＣＲ−ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ
・マウスＣｈＭ１ＬとＨｉｓタグが融合したタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター：ｐＣＲ−ｍＣｈＭ１ＬＨｉｓ
【０１０５】
実施例４．発現ベクターの構築 
哺乳動物細胞でＣｈＭ１Ｌ遺伝子を発現させることを目的として、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びｐＣＡＧＧＳベクター（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００，１９９１）に、前記のｐＣＲ−ｈＣｈＭ１Ｌ、ｐＣＲ−ｍＣｈＭ１Ｌ、ｐＣＲ−ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ及びｐＣＲ−ｍＣｈＭ１ＬＨｉｓベクターからＣＤＳを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切り出し、アガロース電気泳動後、目的のバンドを精製し、Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ（東洋紡）を製品説明書に従って使用してライゲーション反応を行った。ライゲーション反応後の溶液を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（宝酒造）を用いて製品説明書に従ってトランスフォーメーションを行った。プラスミドを精製後、目的の遺伝子が組み込まれていることは制限酵素反応とアガロース電気泳動により確認した。
【０１０６】
本実施例で作製したベクターは、以下の略称を用いることとする。
・ｈＣｈＭ１Ｌ、ｍＣｈＭ１Ｌ、ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ及びｍＣｈＭ１Ｌ遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター：
ｐｃＤＮＡ−ｈＣｈＭ１Ｌ、ｐｃＤＮＡ−ｍＣｈＭ１Ｌ、ｐｃＤＮＡ−ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ及びｐｃＤＮＡ−ｍＣｈＭ１ＬＨｉｓ
・ｈＣｈＭ１Ｌ、ｍＣｈＭ１Ｌ、ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ及びｍＣｈＭ１Ｌ遺伝子を含むｐＣＡＧＧＳベクター：
ｐＣＡＧＧＳ−ｈＣｈＭ１Ｌ、ｐＣＡＧＧＳ−ｍＣｈＭ１Ｌ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ及びｐＣＡＧＧＳ−ｍＣｈＭ１ＬＨｉｓ
【０１０７】
実施例５．ＦＬＡＧタグが融合したヒト可溶性ＣｈＭ１Ｌタンパク質を発現するベクターの構築
本実施例で述べるＦＬＡＧタグ（Ｓｉｇｍａ社）とは、８アミノ酸からなる親水性のマーカーペプチド（Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ ＡｓｐＡｓｐ Ａｓｐ ＡｓｐＬｙｓ）であり、最後の５アミノ酸（Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ）は、エンテロキナーゼの認識配列となっている。本実施例によって作製されたベクターは、Ｎ末側から、プレプロトリプシンのシグナルシークエンス、ＦＬＡＧタグ、ＣｈＭ１Ｌの細胞外領域のＣ末端側が融合したタンパク質を発現させることが可能である。このベクターを用いて発現させたタンパク質は、後述する実施例９で詳述するように、プレプロトリプシンのシグナルシークエンスが切断を受けた後、可溶性タンパク質として培養液中に分泌される。また、このベクターにより発現されたタンパク質は、ＦＬＡＧタグが融合しているため、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いて精製することが可能であり、融合タンパク質をエンテロキナーゼで切断することにより、ＦＬＡＧタグを除去することも可能である。
【０１０８】
ｐＣＡＧＧＳベクターに、Ｎ末端からプレプロトリプシンのシグナルシークエンスとＦＬＡＧタグ（配列番号２０）をコードする塩基配列（配列番号１９、Ｓｉｇｍａ社製ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１ベクターに含まれる）を組み込んだベクターを構築した（以下、ｐＳＦベクターとする）。ｐＳＦベクターに配列番号２で表されるヒトＣｈＭ１Ｌのアミノ酸番号２１２から３１７及び翻訳停止コドンを含む領域をコードする塩基配列（配列番号１の塩基配列番号６８４から１０２０）をＰＣＲ法により増幅し、この増幅産物をｐＳＦベクターのＦＬＡＧタグをコードする塩基配列の３’側に組み込んだ。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を配列番号２１（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号８（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）に示した。構築したベクターに目的とする塩基配列が組み込まれていることは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを製品説明書に従って使用し確認した。本実施例で、ベクターに組み込んだ核酸塩基配列を配列番号２２に、それがコードするアミノ酸配列を配列番号２３に示した。本実施例で作製したベクターは、ｐＳＦ−ｓｈＣｈＭ１Ｌという略称を用いることとする。
【０１０９】
実施例６．ＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現解析
成体（１０週齢）の各組織におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現解析：図３（ａ） 
１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを解剖して各組織を取り出し、直ちに液体窒素で凍結した。凍結した組織を細かく砕き、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を製品説明書に従って使用して、各組織のｔｏｔａｌＲＮＡを得た。得られた各組織のｔｏｔａｌ ＲＮＡ １ｕｇをテンプレートとして、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｐｒｅａｍｐｒｅｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を製品説明書に従って使用して、ｃＤＮＡ２０ｕＬを合成した。ＲＴ−ＰＣＲは反応系の総液量を５０ｕＬとし、各組織のｃＤＮＡ ０．５ｕＬ、ＥｘＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を０．２５ｕＬ使用して、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号９）及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１０）をそれぞれ０．２ｕＭとなるように加えて、ＧｅｎｅＡｍｐ登録商標ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、９６℃３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分で３０サイクル増幅させた。得られた反応液をエチジウムブロマイド入りの１％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルを紫外線照射下で撮影して、各組織におけるＣｈＭ１ＬｍＲＮＡの発現を検討した。
【０１１０】
図３（ａ）に示したように、成体マウスの各組織におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現は、脳、眼球、骨格筋、ｗｈｏｌｅ ｒｉｂ及び甲状腺で認められた。マウスにおけるＣｈＭ−Ｉの発現は、眼球、胸腺、軟骨及びｗｈｏｌｅｒｉｂで確認されている。従って、ＣｈＭ１ＬとＣｈＭ−Ｉは、生体内において異なる組織に発現していることが明らかとなり、その生理的な機能は異なることが示唆された。
【０１１１】
胎児（妊娠１７日目）の各組織におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現解析：図３（ｂ）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの妊娠１７日目の胎児を帝王切開により取り出し、各組織を取り出し直ちに液体窒素で凍結した。凍結した組織からのｔｏｔａｌＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲの実施は上述の＜成体マウスの各組織におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現解析＞と同様に実施した。
【０１１２】
図３（ｂ）に示すように、胎児の各組織におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現は、眼球、腎臓、胃、ｗｈｏｌｅ ｒｉｂ及び気管で認められた。胎児マウスにおいては、成体マウスでは発現が認められなかった腎臓及び胃で発現が認められた。従って、ＣｈＭ１Ｌはこれらの臓器の発生・形態形成に関与している可能性があり、臓器修復や再生にも関与すると考えられる。また、気管においてもＣｈＭ１ＬｍＲＮＡが発現がしていることが明らかとなった。
【０１１３】
胎児発生段階におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現解析：図３（ｃ） 
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの妊娠１０日目から出生日までの各日齢の胎児を帝王切開により取り出し、胎児を丸ごと液体窒素で凍結した。凍結した胎児からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲの実施は上述の＜成体マウスの各組織におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現解析＞と同様に実施した。
ＣｈＭ−Ｉ ｍＲＮＡの解析は、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２３）及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２４）を使用して、同条件で実施した。
【０１１４】
図３（ｃ）に示すように、胎児発生段階におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現は、妊娠１０日目では非常に弱く、１１日目から１３日目にかけて発現が上昇している。一方、ＣｈＭ−Ｉの発現もＣｈＭ１Ｌと同様の発現上昇を示すが、妊娠１０日目及び１１日目では明らかに、ＣｈＭ１Ｌよりも強い発現を示した。従って、胎児発生段階においては、ＣｈＭ１ＬはＣｈＭ−Ｉよりも遅れて発現が上昇することが明らかとなり、両分子が胎児発生において異なる機能を有することが明らかとなった。
【０１１５】
実施例７．抗ＣｈＭ１Ｌペプチドポリクローナル抗体の作製 
ヒトＣｈＭ１Ｌの配列番号２に示した２４５〜２５２残基までの配列のＣ末端にシステインを有するペプチドを化学合成した。この合成ペプチドにＭＢＳ／ＫＬＨ（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ／ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、ベーリンガーマンハイム社）をカップリングさせた。この複合体を生理食塩液に溶解させた後、等量のＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）を加え、超音波処理してエマルジョンを調製した。このエマルジョンをウサギの皮下に投与し、初回免疫とした。初回免疫から４週間後にＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）を用いて大腿筋に追加免疫を行い、その後は約２週間又は約４週間の間隔で皮下投与により４回免疫を行った。追加免疫の間に耳介から部分採血、最終免疫後は全採血を行い血清を分離し、ペプチドカラムによるアフィニティー精製を実施して抗ＣｈＭ１Ｌペプチドポリクローナル抗体を得た。
【０１１６】
実施例８．ヒト及びマウスＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による解析：図４
リポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて、製品説明書に従い、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＣｈＭ１Ｌ及びｐＣＡＧＧＳ−ｍＣｈＭ１Ｌ（図４（ａ）及び（ｃ））あるいは、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ及びｐＣＡＧＧＳ−ｍＣｈＭ１ＬＨｉｓ（図４（ｂ）及び（ｄ））をＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションしてから約４８時間後に、培養上清及び細胞成分を１２．５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った後、ニトロセルロース膜にトランスファーした。一次抗体反応及び二次抗体反応を行い、ＥＣＬｐｌｕｓ試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて製品説明書に従い、発色反応を行った。ｐＣＡＧＧＳ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＣｈＭ１Ｌ及びｐＣＡＧＧＳ−ｍＣｈＭ１Ｌをトランスフェクトした場合のＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔは、一次抗体に前述の実施例で述べた抗ＣｈＭ１Ｌポリクローナル抗体、二次抗体にｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｄａｓｅ（ＨＲＰ）で標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社）を、ｐＣＡＧＧＳ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＣｈＭ１ＬＨｉｓ及びｐＣＡＧＧＳ−ｍＣｈＭ１ＬＨｉｓをトランスフェクトした場合のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔには一次抗体に抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、二次抗体にＨＲＰで標識された抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて実施した。
【０１１７】
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔと同じサンプルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した結果を図４（ａ）及び（ｂ）に示した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔの結果、すべての培養上清でＣｈＭ１Ｌのバンドは確認されなかった。細胞成分では、図４（ｂ）及び（ｄ）に示したようにリコンビナントＣｈＭ１Ｌタンパク質は、抗ＣｈＭ１Ｌペプチド抗体及び抗Ｈｉｓタグ抗体のいずれを使用しても、４０ｋＤａ付近に２本のバンドとして検出された。後述の実施例で詳しく述べるが、糖鎖構造の解析により、高分子量側のバンドはＮ結合型の糖鎖が結合したフォームであることが確認された。
【０１１８】
実施例９．可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法による解析：図５
リポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて、製品説明書に従い、ｐＣＡＧＧＳ及びｐＳＦ−ｓｈＣｈＭ１ＬをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。培養上清を１２．５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜にトランスファーした。一次抗体には抗ＦＬＡＧＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ社）を、二次抗体にはＨＲＰで標識された抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社）を使用し、ＥＣＬｐｌｕｓ試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて製品説明書に従い、発色反応を行った。
【０１１９】
図５に示すように、可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌタンパク質は１７−１８ｋＤａ付近に１本のバンドとして検出された。
【０１２０】
実施例１０．ＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質の糖鎖構造解析
リポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて、製品説明書に従い、ｐＣＡＧＧＳ−ｍＣｈＭ１ＬＨｉｓをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。ディッシュに２％ＳＤＳを含むＰＢＳを加え、スクレイパーで細胞を回収し、この懸濁液を９５℃で６０分間加熱した後、その上清をＳＤＳ−ＯＵＴＴＭＳＤＳ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて処理してＳＤＳを除いた。このようにして得られたタンパク質溶液を用いて、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を用いて製品説明書に従って、ＮＡＮａｓｅＩＩ、Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ＤＳ及びＰＮＧａｓｅ Ｆで上記のタンパク質溶液を処理して、糖鎖消化反応を実施した。この反応液を１２．５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜にトランスファーした。一次抗体には抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、二次抗体にはＨＲＰで標識された抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムファルマシアバイオテク社）を使用し、ＥＣＬｐｌｕｓ試薬（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて製品説明書に従い、発色反応を行った。
【０１２１】
図６に示したように、ＣｈＭ１Ｌタンパク質の高分子量側のバンドは、ＰＮＧａｓｅ Ｆで処理した場合（レーン２及び５）にのみ消失した。従って、ＣｈＭ１Ｌタンパク質はＮ結合型の糖鎖で修飾されていることが明らかとなった。
【０１２２】
実施例１１．肋軟骨におけるＣｈＭ１Ｌタンパク質の免疫染色法による解析
約１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを解剖して、ｗｈｏｌｅ ｒｉｂを取り出し、４％パラホルムアルデヒドを含む１０ｍＭリン酸緩衝バッファー、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中で固定し、パラフィンで包埋した後、切片を作成した。免疫染色の各工程は、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイ）を用いて製品説明書に従って実施したが、概略は以下のとおりである。脱パラフィン処理の後、３％過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼを消化した。ＰＢＳで洗浄し、１０％正常ヤギ血清でブロッキングした後、前述の抗ＣｈＭ１Ｌペプチド抗体を１／１６０希釈で加え、４℃で一晩インキュベートした。ネガティブコントロールとしてはウサギＩｇＧを使用した。ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体及びペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応させた後、３，３−ジアミノベンチジン・４ＨＣｌを加えて発色反応を行った。核をヘマトキシリンで染色、封入後、観察を実施した。
【０１２３】
図７に示すように、ＣｈＭ１Ｌタンパク質は肋軟骨組織において軟骨細胞周囲に存在する扁平な線維芽細胞様の形態を示す細胞に発現していることが明らかになった。一方、ＣｈＭ−Ｉが発現していると報告されている軟骨細胞では発現が認められなかった。
【０１２４】
実施例１２．ヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子の染色体マッピング
日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ：ＤＮＡ ｄａｔａ ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）から、ヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子配列（配列番号１）を用いて、ＤＤＢＪ全データを対象にしてＢＬＡＳＴＮサーチを実施した。その結果、ＣｈＭ１Ｌ遺伝子のゲノム配列としてＧｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＬＯ３５６０８を検出した。ＡＬＯ３５６０８は、ヒトＸ染色体にマッピングされている配列である。従って、ヒトＣｈＭ１Ｌ遺伝子は、Ｘ染色体上に存在することが明らかとなった。
【０１２５】
実施例１３．可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質の精製
リポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて製品説明書に従って、ｐＳＦ−ｓｈＣｈＭ１ＬをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、約４８時間後に培養上清を回収した。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、アフィニティーカラムを作製し、培養上清をカラムにアプライした。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）でカラムを３回洗浄後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）を用いて溶出し、１／２０容量の１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を用いて溶出液を中和した。
【０１２６】
培養上清及び溶出液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を実施した結果を図８に示した。培養上清中には多種のタンパク質が存在するが（図８、レーン１）、溶出液中では可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌタンパク質が約２０ｋＤａのバンドとして確認され、上記操作によって可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌタンパク質が濃縮、精製されたことが明らかになった（図８、レーン２）。
【０１２７】
実施例１４．ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた血管新生阻害作用の検討
ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ＶｅｉｎＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣｓ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）は、内皮細胞専用培地（ＥＧＭ登録商標−２Ｂｕｌｌｅｔ Ｋｉｔ登録商標、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）で培養した。１２ウェルプレートに、Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）を６００ｕＬ／ウェルで加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。ヘパリンを含まない内皮細胞専用培地を内皮細胞基本培地（ＥＢＭ登録商標−２、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）で１／８に希釈した培地を用いて、５×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨＵＶＥＣｓを含む細胞懸濁液を調製した。
【０１２８】
各被験物質溶液は、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．５）に１／２０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を加えた溶液で調製し、２００ｕＬ／ウェルの容量で処理を行った。陰性対象として上記のバッファー及びＢＳＡ（ｂｏｖｉｎ  ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を２０ｕｇ／ウェルで、陽性対象物質としてＰｌｅｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ ４（ＰＦ−４、ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）を１及び１０ｕｇ／ウェルで、可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌリコンビナントタンパク質は実施例１３の溶出画分を１０及び２０ｕｇ／ウェルで処理した。細胞懸濁液２ｍＬ（１×１０５ ｃｅｌｌｓ）と各被験物質溶液２００ｕＬを混合して、Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌでコートした１２ウェルプレートにシーディングし、９時間後に管腔様構造の形成を観察して写真を撮影した。その結果を図９に示した。陰性対象ではＨＵＶＥＣｓが管腔様構造を形成しているが（図９（ａ）及び（ｂ））、ＣｈＭ１Ｌを２０ｕｇ／ウェルで処理した場合には（図９（ｄ））、陰性対象と比較して管腔様構造の形成が阻害された。
【０１２９】
従って、ＣｈＭ１Ｌは血管新生阻害作用を有することが明らかとなり、可溶性のＣｈＭ１Ｌポリペプチドは糖尿病性網膜症、癌、慢性関節リウマチなどの血管新生を伴う疾患の治療薬として適用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１Ａ】ヒトＣｈＭ１ＬとヒトＣｈＭ−Ｉのアミノ酸配列の相同性を比較した結果を示す。
【図１Ｂ】ヒト、マウス及びラットＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列の相同性を比較した結果を示す。
【図２】ヒトＣｈＭ−Ｉ、ヒトＣｈＭ１Ｌ及びマウスＣｈＭ１Ｌのアミノ酸配列の疎水性プロフィールを示す。
【図３】マウスの成体及び胎児の各組織におけるＣｈＭ１Ｌ ｍＲＮＡの発現解析、並びにマウスの胎児発生段階におけるＣｈＭ１Ｌ及びＣｈＭ−Ｉ ｍＲＮＡの発現解析の結果を示す。
【図４】ＣＯＳ７細胞においてヒト及びマウスＣｈＭ１Ｌタンパク質を発現させ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔにより検出した結果を示す。（ａ）は、Ｍｏｃｋ（レーン１）、ヒトＣｈＭ１Ｌ（レーン２）及びマウスＣｈＭ１Ｌ（レーン３）をトランスフェクトして細胞成分を電気泳動後、クーマシーブリリアントブルー染色した結果を、（ｃ）は同サンプルを抗ＣｈＭ１Ｌペプチド抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔにより検出した結果を示す。（ｂ）は、Ｍｏｃｋ（レーン１）、ヒトＣｈＭ１Ｌ（Ｈｉｓタグ付き）（レーン２）及びマウスＣｈＭ１Ｌ（Ｈｉｓタグ付き）（レーン３）をトランスフェクトして細胞成分を電気泳動後、クーマシーブリリアントブルー染色した結果を、（ｄ）は同サンプルを抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔにより検出した結果を示す。
【図５】ＣＯＳ７細胞において発現させた可溶性ＣｈＭ１Ｌ（レーン２）及びＭｏｃｋ（レーン１）を抗ＦＬＡＧＭ２抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法により検出した結果を示す。
【図６】ＣＯＳ７細胞においてマウスＣｈＭ１Ｌ（Ｈｉｓタグ付き）タンパク質を発現させ、細胞成分を回収して糖鎖消化反応を行い、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによりＣｈＭ１Ｌタンパク質を検出し糖鎖構造の解析を行った結果を示す。レーン１は未処理、レーン２はＮＡＮａｓｅ ＩＩ＋Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ＤＳ＋ＰＮＧａｓｅ処理、レーン３はＮＡＮａｓｅ ＩＩ処理、レーン４はＯ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ＤＳ処理、レーン５はＰＮＧａｓｅ処理のサンプルのＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔの結果を示す。
【図７】マウスの肋軟骨組織におけるＣｈＭ１Ｌタンパク質の発現を、抗ＣｈＭ１Ｌポリペプチド抗体を用いた免疫染色により検出した結果を示す。
【図８】ＣＯＳ７細胞の培養液中に発現させた可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌタンパク質を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、電気泳動後、クーマシーブリリアントブルー染色した結果を示す。レーン１は、ＣＯＳ７細胞の培養上清、レーン２は精製したＣｈＭ１Ｌタンパク質の電気泳動の結果を示す。
【図９】ヒト臍帯静脈内皮細胞の管腔様構造形成系に、（ａ）バッファーのみ、（ｂ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）２０ｕｇ、（ｃ）可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌ １０ｕｇ、（ｄ）可溶性ヒトＣｈＭ１Ｌ ２０ｕｇ、（ｅ）ＰＦ−４（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ４）１ｕｇ、（ｆ）ＰＦ−４ １０ｕｇを処理した結果を示す。
【図１Ａ】
2006296429.tif 000002
【図１Ｂ】
2006296429.tif 000003
【図２】
2006296429.tif 000004
【図３】
2006296429.tif 000005
【図４】
2006296429.tif 000006
【図５】
2006296429.tif 000007
【図６】
2006296429.tif 000008
【図７】
2006296429.tif 000009
【図８】
2006296429.tif 000010
【図９】
2006296429.tif 000011
【配列表】
2006296429000001.app