(57)【要約】      （修正有）【課題】汚泥処理中に検出される各種汚泥分解菌を特異的に固定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に固定・解析する方法を提供する。【解決手段】上記課題は、特定な配列番号の塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有する汚泥分解菌検出用プライマーおよびプローブとこれを用いた汚泥分解菌の検出方法によって解決される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列番号１−８のいずれかの塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有する汚泥分解菌検出用プライマーおよびプローブ
配列番号１    ５’−ＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＡＣＣＴＴ−３’
配列番号２    ５’−ＣＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＴＴ−３’
配列番号３    ５’−ＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＴＴ−３’
配列番号４    ５’−ＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣ−３’
配列番号５    ５’−ＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣ−３’
配列番号６    ５’−ＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＣ−３’
配列番号７    ５’−ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＧＧＴ−３’
配列番号８    ５’−ＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＧＡＧ−３’
【請求項２】
配列番号１と２、３と４、５と６または７と８のいずれかの塩基配列の組合せまたは該塩基配列の組合せに相補的な配列を有する汚泥分解菌用プライマー
【請求項３】
請求項１または２記載のプライマーをＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において使用することを特徴とする汚泥分解菌の検出方法
【請求項４】
請求項１記載のプローブをＦＩＳＨ法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）において使用することを特徴とする汚泥分解菌の検出方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物による汚泥処理において、汚泥分解菌の同定に有用なＤＮＡプライマー、プローブ、およびこれを用いた汚泥分解菌の検出、同定、定量、解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機性汚水の活性汚泥法などによる生物処理工程からは大量の汚泥が発生しており、汚泥の処理が処理場の最大の課題になっている。これらの課題を解決するために、本発明者らは汚泥をアルカリ処理した後直ちに嫌気、無酸素または微好気条件下で生物学的に可溶化する汚泥の処理方法を出願している（特許文献１）。また、本発明者らは下水処理場から採取した汚泥から汚泥を分解する能力のある微生物の分離に成功し、これらの微生物が汚泥を効率よく分解することを確認している（特許文献２）。
【０００３】
この生物処理による汚泥の処理方法では、汚泥分解菌を如何に適正な条件で働かせ、汚泥の処理効率を向上させるかがポイントとなる。これまで、汚泥分解菌種の同定、また汚泥処理時の微生物相の解析を目的に、対象となる汚泥を嫌気条件下で培養を行ってきたが、この培養には数日から数週間の時間を必要とし、また、人口培養基では生育できない微生物があるため、分離した微生物以外の種類の微生物が実際の汚泥処理で優先になっている可能性も示唆されている。
【０００４】
最近では、有機性廃棄物・廃水等の環境試料の診断や管理等のために、その中に存在する微生物群に由来する遺伝子を調べる微生物群集構造解析が有力視されるようになった。メタン発酵ではメタン生成細菌検出方法（特許文献３）、活性汚泥分離膜の目詰まり防止には原因細菌の検出方法（特許文献４）などが報告されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００１−３４７２９６号公報
【特許文献２】特開２００３−６２５９９号公報
【特許文献３】特開２００４−２６１１２４号公報
【特許文献２】特開２００５−８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、汚泥の生物処理において汚泥を分解する能力をもつ微生物を特異的に検出する方法は存在せず、汚泥分解菌の同定、検出は培養法に頼らざるを得なかった。
【０００７】
本発明の目的は、汚泥処理中に検出される各種の汚泥分解菌を特異的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを用いて菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、汚泥分解菌がどの程度増殖しているかを迅速に把握し、処理施設の運転管理が格段に容易になり、自動化、システム化が可能になる汚泥分解菌の定量化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を進め、下水汚泥の可溶化を目的としたアルカリ前処理後の微生物処理において、汚泥分解に寄与する微生物の同定を遺伝子レベルで実施した。解析する遺伝子のターゲットは、微生物の系統分類の指標として信頼性が高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子とし、また、同定・解析にはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の手段が必要となるため、ＲＮＡではなくＤＮＡをターゲットとした。下水処理場に設置した汚泥可溶化システムの生物処理槽とアルカリ前処理槽の微生物相を１６ＳｒＤＮＡをターゲットとするＰＣＲ−ＤＧＧＥ（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法で比較すると、大きく異なることがわかった。このため、ＤＧＧＥで分離したバンドのうち、生物処理槽に特異的なバンドからＤＮＡ回収し、その塩基配列を決定した。その塩基配列はバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｓｐ）の微生物１種（Ｂａｃ１Ａ）、ならびにクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．ｓｐ）の微生物３種（ＣｌｏＦ，ＣｌｏＧ，ＣｌｏＨ）であることが確認された。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ．ｓｐ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．ｓｐについては、汚泥の主成分であるタンパク質を分解する酵素（プロテアーゼ）を産出することが分かっており、これらの事実から、この４種の微生物は、汚泥を分解、可溶化する能力を有し、かつ可溶化汚泥を基質として増殖することのできる微生物である。
【００１０】
本発明者が決定した塩基配列をデータベース（ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等）に記載の塩基配列と比較・検討することにより、汚泥分解菌（Ｂａｃ１Ａ、ＣｌｏＦ、ＣｌｏＧ、ＣｌｏＨ）に特異的な配列番号１−８の塩基配列を得た。プライマーの設計の際には、同定の対象となる菌とその近縁の菌の配列をアライメントした。その結果、Ｂａｃ１Ａでは可変領域３と可変領域４、ＣｌｏＦでは可変領域４と可変領域５、ＣｌｏＧでは可変領域３と可変領域４、ＣｌｏＨでは可変領域３と可変領域４で特徴的な配列があったので、この領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設計した。
【００１１】
そして、これらのプライマーが、各種の汚泥分解菌を特異的に同定できることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記の配列番号１−８のいずれかの塩基配列または該塩基配列に相補的な配列を有する汚泥分解菌検出用プライマーおよびプローブ
配列番号１    ５’−ＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＡＣＣＴＴ−３’
配列番号２    ５’−ＣＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＴＴ−３’
配列番号３    ５’−ＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＴＴ−３’
配列番号４    ５’−ＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣ−３’
配列番号５    ５’−ＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣ−３’
配列番号６    ５’−ＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＣ−３’
配列番号７    ５’−ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＧＧＴ−３’
配列番号８    ５’−ＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＧＡＧ−３’
と、該プライマーを用いてＰＣＲ法で、あるいはこれをプローグに用いてＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法で汚泥分解微生物を検出する方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１３】
汚泥処理中に検出される各種の汚泥分解菌を培養、単離、同定することなしに、混合微生物系の中で検出し、さらに汚泥処理の管理指標の状態を推測することができる。
【００１４】
また、環境試料からのＤＮＡ抽出ならびに分離・解析は約１日で完了するため、混合微生物系の状態ならびに管理指標の状態を迅速に推測することができる。さらに自動化、システム化により処理施設の運転管理が格段に容易になる。
【００１５】
本発明方法を汚泥処理プロセスに適用することにより、プロセスに障害が起きる前に微生物群集の状態は変化しているので、この状態の変化を検出することにより、微生物群集が悪い状態に変化しているか否かを早い時期に判断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のプライマーとプローブはいずれも汚泥分解菌検出用のものであって、下記の配列番号１−８のいずれかの塩基配列あるいは該塩基配列のいずれかに相補的な配列よりなっている。
配列番号１    ５’−ＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＴＡＣＣＴＴ−３’
配列番号２    ５’−ＣＡＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＴＴ−３’
配列番号３    ５’−ＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＴＴ−３’
配列番号４    ５’−ＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣ−３’
配列番号５    ５’−ＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣ−３’
配列番号６    ５’−ＡＧＡＴＡＣＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＣ−３’
配列番号７    ５’−ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＧＧＴ−３’
配列番号８    ５’−ＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＧＡＧ−３’
【００１７】
また、これらのオリゴヌクレオチドの長さはプライマーによって異なっており、１９−２２ｂｐとなっている。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に際しては、各々の１６ＳｒＤＮＡ中において、該オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂｐの塩基配列を増幅させてもよい。
【００１８】
上記配列番号１−８は、ＰＣＲ法に使用されるプライマーまたはＦＩＳＨ法に使用されるプローブは、所定のＰＣＲまたはＦＩＳＨ条件下で汚泥中の汚泥分解菌由来の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子にハイブリダイズができるが、それと同一の条件下では真正細菌および非汚泥分解菌由来の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子にハイブリダイズできないような塩基配列を有するように設計され、汚泥分解菌に対し特異性を有する。
ＰＣＲに使用されるプライマーまたはＦＩＳＨに使用されるプローブは、汚泥分解菌の１６ＳｒＤＮＡ鎖とは相補性があるためにハイブリダイズするが、他の微生物の１６ＳｒＤＮＡとは相補性がないため原理上ハイブリダイズできない。
【００１９】
このようにして得られた配列番号１および２記載の塩基配列は汚泥分解菌バクテロイデスＢａｃ１Ａに特異的なオリゴヌクレオチドであり、プライマーとして両者を組み合わせて使用することが好ましい。また、配列番号３および４記載の塩基配列は汚泥分解菌クロストリジウムＣｌｏＦに特異的なオリゴヌクレオチドであり、プライマーとして両者を組み合わせて使用することが好ましい。また、配列番号５および６記載の塩基配列は汚泥分解菌クロストリジウムＣｌｏＧに特異的なオリゴヌクレオチドであり、プライマーとして両者を組み合わせて使用することが好ましい。配列番号７および８記載の塩基配列は汚泥分解菌クロストリジウムＣｌｏＨに特異的なオリゴヌクレオチドであり、プライマーとして両者を組み合わせて使用することが好ましい。ただし、汚泥分解菌検出用プライマーは、上記の組み合わせに限定されているわけではない。
【００２０】
本検出法に使用可能なプライマーには、塩基長やＰＣＲ条件等に依存して、上に列記した塩基配列と実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマー対も含まれる。
【００２１】
これらのプライマーは、下水処理場に設置されている、余剰汚泥を生物学的に可溶化する槽内の微生物から取得することができる。このような、余剰汚泥を生物学的に可溶化する槽の例として、特開２００１−３４７２９６号公報に開示されている汚泥処理装置の生物学的可溶化槽を挙げることができる。この装置は、基本的にアルカリ処理槽と生物学的可溶化槽よりなっており、アルカリ処理槽では、汚水の生物処理工程から引抜いた汚泥に水酸化ナトリウムなどのアルカリを加えて攪拌することにより、汚泥を構成する種々の微生物細胞構成成分などが生物学的分解を受けやすい形に改質する。生物学的可溶化槽は、このアルカリ処理された汚泥を嫌気条件（無酸素あるいは微好気条件も含む。）下で汚泥可溶化菌の作用によってさらに可溶化を進行させる。この汚泥可溶化菌は、下水処理場から採取した余剰汚泥を嫌気条件におくことによって余剰汚泥のなかから増殖し得られたものである。
【００２２】
本発明のプライマーは、上記の生物学的可溶化槽内の微生物に限らず、汚泥を分解する能力を有する如何なる微生物から取得したものであってもよい。本発明は、上記塩基配列を用いて可溶化汚泥等の微生物反応系環境試料中の汚泥分解菌に由来する１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の存在をＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法を介して選択的に検出することによる汚泥分解菌を検出することができる。
【００２３】
すなわち、上記のように本発明のプライマーを使用すると、汚泥分解菌が存在する試料では所望の該酸増幅が起こるが、汚泥分解菌が存在しない試料では有意な核酸増幅は起こらない。従って、期待される核酸が増幅されるか否かを調べるだけで、環境試料中に存在する汚泥分解菌の検出が可能になる。ＰＣＲでの増幅産物が目的の核酸断片であることを確認するためには、増幅産物の電気泳動をおこなってもよいし、使用されたプライマー間の核酸領域に相補的なＤＮＡプローブ等を使用してもよい。
【００２４】
また、増幅された目的核酸の量は、環境試料中に生息していた汚泥分解菌の菌数（あるいはその１６ＳｒＤＮＡ遺伝子コピー数が加味されて）と相関する。すなわち、増幅産物の電気泳動により得られる目的産物のバンドを太さ、あるいはＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ＰＣＲ）法等による定量容易な検出法に基づき、汚泥分解菌数を知ることができる。
ＰＣＲ法では、鋳型となるＤＮＡ２本鎖（ここでは汚泥から抽出したＤＮＡ）を加熱して1本鎖にする。次に、増殖したい特定部位のＤＮＡ鎖（ここでは汚泥分解菌１６ＳｒＤＮＡ特異的領域）の両端に相補的な２種類のオリゴヌクレトチドプライマーを反応系に過剰に加えた状態で温度を下げると、プライマーがＤＮＡ鎖の相補的な部位と２本鎖を形成する。この状態でＤＮＡ構成基質のデオキシヌクレオシド三リン酸(ｄＮＴＰ)とＤＮＡポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく。1回の合成反応で生成したＤＮＡは次の反応の鋳型になるため、その名称の通り連鎖反応的にＤＮＡが合成され、２０〜３０サイクルの反応後には莫大な数のＤＮＡ分子が得られ、増幅したい特定部分（この場合は汚泥分解菌特異的領域）の検出・定量が可能になる。
ＦＩＳＨ法では、微生物の遺伝子配列に基づいて作成された、種に特異的な遺伝子プローブを用いて、特定種を検出する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法である。特定種に特異的なプローブの蛍光色素を結合させ、複合微生物群のサンプルに混合することによって、特定菌のみに結合したプローブから蛍光は発せられ、特定部位を有する微生物を直接可視化する。その結果、特定菌の検出・定量が可能になる。
また、配列番号１−８は汚泥分解菌由来の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子にハイブリダイズできるが、それと同一の条件下では真正細菌および非汚泥分解由来の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子にハイブリダイズできないため、ＦＩＳＨ法のプローブとしても使用できる。
【実施例】
【００２５】
１．汚泥分解菌の１６ＳｒＤＮＡでの同定
下水処理場に設置した汚泥可溶化システムの生物処理槽とアルカリ前処理槽の汚泥中の微生物相を解析した。
【００２６】
（ア）ＤＮＡの抽出
下水汚泥（約５０００ｐｐｍ）１０ｍＬに５０ｍＭトリポリリン酸ナトリウム１ｍＬを添加し、５０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズする。１．５ｍＬを別のチューブに移し、遠心し上清を捨てる。０．２５ｍＬの細胞懸濁溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５Ｍシュクロース、２０ｍｇ／ｍＬリゾチーム）に再懸濁し、３７℃で１０分間保温する。細胞溶解溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％（ｗ／ｖ）２−メルカプトエタノール）０．３７５ｍＬ添加し、５５℃で３０分間保温する。フェノール−クロロフォルム抽出後、２−プロパノール沈殿でＤＮＡを回収後、２００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ(ｐＨ８．０)‐１ｍＭ  ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)(ＴＥ）に再溶解させ、鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００２７】
（イ）ＰＣＲ反応
下水汚水中の全微生物はスモールサブユニットリボゾーム（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子の共通領域をターゲットしたＰＣＲ反応で検出した。（１６ＳｒＤＮＡ）を標的とした。増幅位置は１６ＳｒＤＮＡ（塩基配列の長さ１５４１塩基）の全微生物に共通して保存性の高い部分である３４１から９２６とし、真正細菌用のプライマーとして、それぞれＤＮＡ合成機で合成したＧＣ−３４１Ｆ：５’−ＧＣクランプ−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’と９０７Ｒ：５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴ［Ａ／Ｇ］ＡＧＴＴＴ−３を用いた。
【００２８】
反応液総量を１００μＬとし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣ２、２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物に各々０．２５μＭ上記プライマー、１．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ)１０ｎｇ鋳型ＤＮＡ（１項で得られたもの）を含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーによりＧＣ３４１Ｆ−９０７ＲのＰＣＲ条件は９４℃２分を２サイクル、９４℃３０秒、５８℃４０秒、７２℃１分を２８サイクル、７２℃９分を１サイクル行った。
【００２９】
（ウ）ＤＧＧＥによる分離
上記で得られたＰＣＲ産物はＤＮＡ変性剤の濃度が３０％から５０％の勾配を持つＰＣＲ−ＤＧＧＥ法で分離した。用いた１００％ＤＮＡ変性剤は７Ｍ尿素と４０％ホルムアミドの混合物である。本実験では３０％−５０％勾配のゲルを６％アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’‐メチレンビスアクリルアミド  （３７．５：１）で作成した。電気泳動はＢｉｏ−Ｒａｄ社のＤＣｏｄｅシステムを使い、０．５ｘＴＡＥバッファーで２００Ｖ、６０℃、４時間泳動分離した。
【００３０】
（エ）生物処理槽特異的微生物バンドの同定
ＤＧＧＥの泳動パターン
ＤＧＧＥで分離したＤＮＡはエチジウムブロマイドで染色後、ＵＶ照射で検出し、各処理機に特異的なバンドを検出した。生物処理槽に特異的な４本バンド４本Ｂａｃ１Ａ、ＣｌｏＦ、ＣｌｏＧ、ＣｌｏＨをゲルより切り出し、水で数回洗浄後、ＰＣＲ反応液を添加しＰＣＲ増幅し、塩基配列をジーンアナライザーで決定した。
表１に示す配列番号１〜８の８つの塩基配列を決定した
【００３１】
【表１】
2006296336.tif 000003
得られた泳動パターンを図１に示す。
【００３２】
２．プライマーの設計および合成
データベースより得られた細菌の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子配列を基に、プライマーの設計を行った。
データベースｃｌｕｓｔａｌＷで解析した汚泥分解菌Ｂａｃ１Ａ、ＣｌｏＦ、ＣｌｏＧ、ＣｌｏＨの４種について汚泥分解菌特異的プライマーを設計した。初めに、４種の汚泥分解菌の１６ｓ‐ｒＤＮＡ（３４１‐９０７）の保存領域と可変領域を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の配列との比較より決定し、各汚泥分解菌に特異的領域を決定した。次に、Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｏｌｉｇｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔ）を用いて、正方向ならびに逆方向の２種類の汚泥分解菌特異的プライマーの組み合わせを設計した。
こうして設計した塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機を用いてプライマー合成した。
【００３３】
３．プライマー特異性の確認
上記のプライマーが実際に特異性を有しているかを確認するために、下水処理場から余剰汚泥、汚泥可溶化装置アルカリ処理槽内汚泥、汚泥可溶化装置生物処理槽内汚泥を採取して、プライマーとの反応性を検討した。
【００３４】
（ア）ＤＮＡの抽出
下水汚泥（約５０００ｐｐｍ）１０ｍＬに５０ｍＭトリポリリン酸ナトリウム１ｍＬを添加し、５，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズする。１．５ｍＬを別のチューブに移し、遠心し上清を捨てる。０．２５ｍＬの細胞懸濁溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５Ｍシュクロース、２０ｍｇ／ｍＬリゾチーム）に再懸濁し、３７℃で１０分間保温する。細胞溶解溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％（ｗ／ｖ）２−メルカプトエタノール）０．３７５ｍＬ添加し、５５℃で３０分間保温する。フェノール−クロロフォルム抽出後、２−プロパノール沈殿でＤＮＡを回収後、２００μＬのＴＥに再溶解させ、鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００３５】
（イ）ＰＣＲ反応
反応液総量を１００μＬとし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭｄＮＴＰ混合物に各々０．５μＭ前記プライマー、１．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｎｇ上記鋳型ＤＮＡを含む反応液でＤＮＡサーマルサイクラーによるＰＣＲ反応を行なった。条件は表２の通りである。
【００３６】
【表２】
2006296336.tif 000004
【００３７】
（ウ）プライマー特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によってプライマーと各種汚泥のＤＮＡとの結合能を確認することにより、プライマーの特異性を判定した。１．５％アガロースで１００Ｖ、２５分電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶランプ下でバンドを確認した。得られた泳動パターンを図２に示す。その結果、生物処理槽にはバンドが確認された。余剰汚泥、アルカリ処理槽では確認されなかった。
【００３８】
４．汚泥分解菌特異的プライマーでの定量
（ア）ＤＮＡの抽出
下水汚泥（約５０００ｐｐｍ）１０ｍＬに５０ｍＭトリポリリン酸ナトリウム１ｍＬを添加し、５，０００ｒｐｍで２分間ホモジナイズする。１．５ｍＬを別のチューブに移し、遠心し上清を捨てる。０．２５ｍＬの細胞懸濁溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５Ｍシュクロース、２０ｍｇ／ｍＬリゾチーム）に再懸濁し、３７℃で１０分間保温する。細胞溶解溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、２％（ｗ／ｖ）２−メルカプトエタノール）０．３７５ｍＬ添加し、５５℃で３０分間保温する。フェノール−クロロフォルム抽出後、２−プロパノール沈殿でＤＮＡを回収後、２００μＬのＴＥに再溶解させ、鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００３９】
（イ）リアルタイムＰＣＲ反応
反応液総量を１００μＬとし、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．４），５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３００μＭ  ｄＮＴＰ混合物に各々１２５ｎＭ前記プライマー、５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｎｇ上記鋳型ＤＮＡを含む反応液でリアルタイムＰＣＲ反応を行なった。条件は表３の通りである。
【００４０】
【表３】
2006296336.tif 000005
【００４１】
配列番号１と配列番号２の組み合わせで、汚泥可溶化装置生物処理槽内の汚泥分解菌の量を定量モニタリングした。
【００４２】
得られた結果を図３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、汚水処理現場における余剰汚泥を安定して可溶化処理できる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の実施例で下水汚泥から抽出したＤＮＡをＰＣＲ反応させた産物をＤＧＧＥで電気流動させたパターンである。
【図２】図１のパターンで得られた生物処理槽に特異的なバンドの塩基配列に従って合成したプライマーの特異性を調べた泳動パターンである。
【図３】このプライマーを用いてＰＣＲ反応させて調べた汚泥分解菌の安定性を示すグラフである。
【図１】
2006296336.tif 000006
【図２】
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【図３】
2006296336.tif 000008