(57)【要約】【課題】ホルダチンＡに関する４種類の異性体を高い収率で入手することが可能な合成方法を提供すること。【解決手段】ホルダチンＡ前駆体９の合成方法であって、前記合成方法が、パラクマリン酸二量体１５とアグマチン誘導体６ａとを結合させる工程を包含するホルダチンＡ前駆体合成方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルダチンＡ前駆体の合成方法であって、
前記合成方法が、パラクマリン酸二量体とアグマチン誘導体とを結合させる工程を包含するホルダチンＡ前駆体合成方法。
【請求項２】
前記アグマチン誘導体が、アグマチンのＢｏｃ保護体である請求項１に記載のホルダチンＡ前駆体合成方法。
【請求項３】
過酸化水素及びセイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼを含有するｐＨ７のリン酸緩衝液中で２分子のパラクマリン酸を反応させて前記パラクマリン酸二量体を合成する工程を包含する請求項１又は２のいずれか１項に記載のホルダチンＡ前駆体合成方法。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のホルダチンＡ前駆体を用いてベンゾフランカルボキシアミド誘導体を合成する方法であって、
前記ホルダチンＡ前駆体から保護基を脱保護する工程を包含するベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法。
【請求項５】
前記保護基がＢｏｃ基であり、トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護する請求項４に記載のベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法。
【請求項６】
前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化１】
2006273842.tif 000006
に示される化合物を合成する請求項５に記載のベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法。
【請求項７】
前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化２】
2006273842.tif 000007
に示される化合物を合成する請求項５に記載のベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法。
【請求項８】
前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化３】
2006273842.tif 000008
に示される化合物を合成する請求項５に記載のベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法。
【請求項９】
前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化４】
2006273842.tif 000009
に示される化合物を合成する請求項５に記載のベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルダチンＡ前駆体もしくはベンゾフランカルボキシアミド誘導体を合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール中に含まれるホルダチンＡ（ＨｏｒｄａｔｉｎｅＡ）及びそのシス体は、ムスカリンＭ3受容体への結合活性を有しており、消化管平滑筋を収縮させて消化管運動を促進
させることによりビールのドリンカビリティー（ビールを大量に飲んでもまだおいしく飲める性質）を向上させたり、あるいは消化管運動機能異常が原因で発症する様々な消化器系疾患（胃アトニー症、神経性消化不良、胃神経症など）を改善し得ることが報告されている（特許文献１参照）。
一方で、ホルダチンＡは、抗真菌作用物質としても知られており、その合成方法についても開示されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】PCT WO2004/002978  A1
【非特許文献１】Canadian  Journal of chemistry．Volume45，1745（1967）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１に記載されるホルダチンＡ及びそのシス体は、麦芽根より単離されたものであり、図１５に示されるように、その化学構造についても特定されている。尚、前記ホルダチンＡ及びそのシス体に代表される図１５に示す化学構造を有する化合物類をベンゾフランカルボキシアミド誘導体と称する。
【０００５】
図１５からも分かるように、ベンゾフランカルボキシアミド誘導体は、２個の不斉炭素を有しているので、４種類の異性体（シス体及びトランス体の各幾何異性体についてそれぞれ一対の鏡像異性体（エナンチオマー））が存在し得ると考えられる。しかしながら、麦芽根より単離された天然体については、ホルダチンＡ及びそのシス体という、２種類の異性体（前記各幾何異性体（シス体及びトランス体）におけるそれぞれ片方のエナンチオマー）しか言及されておらず、残り２種類の異性体（以下、非天然体のエナンチオマー（シス体及びトランス体）と称する）については言及されていない。
また、上記非特許文献１に記載されるホルダチンＡの合成方法では、ラセミ体しか得られず、収率（およそ３５％）も低いものであった。
【０００６】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、ベンゾフランカルボキシアミド誘導体に関する４種類の異性体を高い収率で入手することが可能な合成方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１特徴構成は、ホルダチンＡ前駆体の合成方法であって、前記合成方法が、パラクマリン酸二量体とアグマチン誘導体とを結合させる工程を包含するホルダチンＡ前駆体合成方法である点にある。
【０００８】
〔作用及び効果〕
アグマチン（ａｇｍａｔｉｎｅ）誘導体とは、アグマチンのグアニジノ（ｇｕａｎｉｄｉｎｏ）基を適当な保護基で保護したものをいう。アグマチン誘導体は、例えば市販されている１，４-ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔａｎｅを出発物質として、保護基にｔｅｒｔ．-ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（Ｂｏｃ）基等を用いて公知の方法で合成することが可能である。また、パラクマリン酸二量体とは、２分子のパラクマリン酸を反応させたデヒドロ体（ｄｅｈｙｄｒｏｄｉ-ｐ-ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）をいう。
図１４は、従来のホルダチンＡ合成スキームである。この従来の合成スキームは、麦芽根などで行われている生合成経路と同じである。しかしながら、従来の合成スキームでは、４種類の異性体のうちの２種類（ホルダチンＡ（トランス体）のラセミ体（化合物１ｃ及び１ｄ））しか得られず、収率（およそ３５％）も低いものであった。収率の低さの原因としては、図１４にて示される２分子のｐ-Ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌａｇｍａｔｉｎｅ（３）による酸化的フェノールカップリング反応（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでは進み難く、五員環のフラン骨格が形成され難いことが挙げられる。
すなわち、従来の合成方法においては、図１４に示されるように２分子のアグマチン（６）と２分子のｐ-Ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ-ＣｏＡ（パラクマリン酸誘導体：７ａ）とを反応させて２分子のｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌａｇｍａｔｉｎｅ（３）を得た後、その２分子の（３）による酸化的フェノールカップリング反応によって、フラン骨格を形成させていた。しかしながら、本発明においては、図１に示されるように、アシル部分（パラクマリン酸二量体：１５）と、塩基部分（アグマチン誘導体：６ａ）とをそれぞれ別個に合成した後、両者を最終的に縮合させてホルダチンＡ前駆体（９）を合成している。
つまり、本発明では２分子のパラクマリン酸（７）を反応させてパラクマリン酸二量体（１５）を合成することによって、より効率良くフラン骨格を形成させることができる。なお、ホルダチンＡ前駆体とは、アグマチン由来のグアニジノ基が適当な保護基で保護されている化合物をいう。
【０００９】
本発明の第２特徴構成は、前記アグマチン誘導体が、アグマチンのＢｏｃ保護体である点にある。
〔作用及び効果〕
Ｂｏｃ基は、アグマチンを構成するグアニジノ基を確実に保護することができると共に、Ｂｏｃ基を脱保護した際の精製が容易である。
【００１０】
本発明の第３特徴構成は、前記ホルダチンＡ前駆体の合成方法が、過酸化水素及びセイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼを含有するｐＨ７のリン酸緩衝液中で２分子のパラクマリン酸を反応させて前記パラクマリン酸二量体を合成する工程を包含する点にある。
【００１１】
〔作用及び効果〕
過酸化水素及びセイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase）を含有するｐＨ７のリン酸緩衝液中で２分子のパラクマリン酸を反応させた場合、収率良くパラクマリン酸二量体を得ることができる。
【００１２】
本発明の第４特徴構成は、請求項１〜３に記載のホルダチンＡ前駆体を用いてベンゾフランカルボキシアミド誘導体を合成する方法であって、前記ホルダチンＡ前駆体から保護基を脱保護する工程を包含するベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法である点にある。
【００１３】
〔作用及び効果〕
保護基を有するホルダチンＡ前駆体から保護基を脱保護することにより、ベンゾフランカルボキシアミド誘導体を容易に合成することができる。尚、本発明においては、エナンチオマー（鏡像異性体）の片方のみを選択的に合成するといった不斉合成を行う工程等（例えば、金属触媒などを使用する工程）を構成要件としてないので、ベンゾフランカルボキシアミド誘導体に関する複数の異性体（シス体及びトランス体の各幾何異性体についてそれぞれ一対のエナンチオマー）が同時に合成され得る。
【００１４】
なお、上述したように、麦芽根などの天然物から得られた２種類のエナンチオマー（ホルダチンＡ及びそのシス体）については、消化管運動を促進させるアゴニストとしての機能を有することが判明しているが、残り２種類の非天然体のエナンチオマー（シス体及びトランス体）の有する機能についてはまだ解明されていない。一般的に、生体を構成している分子には、一対のエナンチオマーのうち一方のみが有効に機能していることが多く、他方のエナンチオマーは逆の作用を引き起こしてしまうこともある。
つまり、非天然体のエナンチオマー（シス体及びトランス体）は、薬理作用としてはアンタゴニストとして機能し得る場合も考えられる。この場合、非天然体のエナンチオマー（シス体及びトランス体）は、ムスカリンＭ3受容体選択的拮抗剤として働き、アセチルコリンを介した平滑筋収縮を抑制することで、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、頻尿、尿失禁、過敏性腸症候群などに対する治療薬として有効であると考えられる。
【００１５】
本発明の第５特徴構成は、前記保護基がＢｏｃ基であり、トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護する請求項４に記載のベンゾフランカルボキシアミド誘導体の合成方法である点にある。
〔作用及び効果〕
Ｂｏｃ基を保護基として有するホルダチンＡ前駆体に対してトリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護することにより、収率良く確実にベンゾフランカルボキシアミド誘導体の複数の異性体を合成することができる。
【００１６】
本発明の第６特徴構成は、前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化１】
2006273842.tif 000002
に示される化合物を合成する点にある。
〔作用及び効果〕
本発明によって、天然体（PCT WO2004/002978  A1における活性物質α；ホルダチンＡのシス体）と同じ化学構造を有する化合物を合成することができる。
【００１７】
本発明の第７特徴構成は、前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化２】
2006273842.tif 000003
に示される化合物を合成する点にある。
〔作用及び効果〕
本発明により合成された化合物（非天然体のエナンチオマー（シス体））については、本発明者らによって、天然体（PCT WO2004/002978  A1における活性物質α）の有するムスカリンＭ3受容体への結合活性よりも約７倍ほど高い結合活性を有することが見出されている。従って、天然体よりも高い薬理効果が期待されるアゴニスト又はアンタゴニストを提供することが可能となる。
【００１８】
本発明の第８特徴構成は、前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化３】
2006273842.tif 000004
に示される化合物を合成する点にある。
〔作用及び効果〕
本発明によって、天然体（PCT WO2004/002978  A1における活性物質β；ホルダチンＡ）と同じ化学構造を有する化合物を合成することができる。
【００１９】
本発明の第９特徴構成は、前記Ｂｏｃ基を有するホルダチンＡ前駆体がＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅであって、前記トリフルオロ酢酸を用いて前記Ｂｏｃ基を脱保護し、以下の構造式：
【化４】
2006273842.tif 000005
に示される化合物を合成する点にある。
〔作用及び効果〕
本発明により合成された非天然体のエナンチオマー（トランス体）については、本発明者らによって、天然体（PCT WO2004/002978  A1における活性物質β）の有するムスカリンＭ3受容体への結合活性よりも約２０倍ほど高い結合活性を有することが見出されている。従って、天然体よりも高い薬理効果が期待されるアゴニスト又はアンタゴニストを提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
〔第１実施形態〕
図１は、ホルダチンＡ前駆体（９）を中間体として図１５に示されるベンゾフランカルボキシアミド誘導体の各種異性体（４種類：１ａ〜ｄ）を合成する全合成スキームである。尚、図１中に記載される各矢印（→）の上下に記載されている文言は、各種試薬及び反応条件であり、必ずしもこれらに限定されるものでなく、本スキームに従って合成することが可能であるならば、使用される試薬の種類や反応条件については任意に採用することができる。また、各符号（１〜１５）は、化合物を示す。
【００２１】
本実施形態では、アシル部分（７及び１５）と、塩基部分（１０〜１４、６ａ）とを、それぞれを別個に合成した後、両者を最終的に縮合させてホルダチンＡ前駆体（Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅ：９）を合成している。
【００２２】
（Ｉ）塩基部分の合成については、まず１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（１０）から文献（Ｂ．Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９４，５７９）に記載される方法に従ってＮ，Ｎ’−
ｄｉ−Ｂｏｃ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ（１１）を合成する（収率約７４％）。
【００２３】
また、市販もされている１，４−ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔａｎｅ（１２）の１個のアミノ基を図１に記載されるような反応条件下でｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ（Ｃｂｚ）基で保護して４−Ｃｂｚ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ−ａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（１３）を得る（Ａ．Ｇｒａｈａｍ  ｅｔａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，１０３２）。先に調製した（１１）と（１３）とを、トリエチルアミンの存在下で反応させると、４−ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙａｍｉｎｏ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉ−Ｂｏｃ−ａｇｍａｔｉｎｅ
（１４）が得られる（収率約８７％）。
【００２４】
（１４）を水素気流中、５％パラジウム炭素存在下にｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ反応に付すと、Ｎ，Ｎ’−ｄｉ−Ｂｏｃ−ａｇｍａｔｉｎｅ（６ａ）が得られる。尚、（６
ａ）については、その塩酸塩が市販されているので、市販品を使用しても良い。
また、脱保護した際の精製の容易さから、アグマチンを構成するグアニジノ基の保護基としては、文献上Ｂｏｃ基あるいはＣｂｚ基（カルボベンゾキシ基）が汎用されているが、Ｂｏｃ基で保護することが好ましい。ホルダチンは分子内に二重結合を有するため、接触還元的に脱保護を行うＣｂｚ基は利用できないためである。Ｃｂｚ基以外のアミノ基やイミノ基のＮ−  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐの保護基としての利用は理論的には可能と思われる。
【００２５】
（ＩＩ）アシル部分の合成については、例えば市販のパラクマリン酸（７）を用いて、図１に記載されるように、２％の過酸化水素（酸化補助剤）及びセイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を含有するｐＨ７のリン酸緩衝液中で反応させて、ｄｅｈｙｄｒｏｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ（１５）を得る。なお、この（１５）の1Ｈ−ＮＭＲにおけるジヒドロフラン環上の２個のプロトンは、７．２Ｈｚの結合定数を示し、この結果は両プロトンがトランスであることを示唆するものである。また、上記酵素反応は、リン酸緩衝液（ｐＨ７）中で行うが、反応基質の溶解性がその収率を左右していると考えられる。同様の条件下での反応で、パラクマリン酸は相当するエステル（終夜反応）に比べ非常に早く反応が完結すること（５ｇスケールで４０分程度）、また、反応終了後は直ちに酵素を失活させないと連続的なカップリング反応が進行することも見出された。尚、本実施形態で得た（１５）は、相当するＭｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒの加水分解で得たものとＮＭＲでの一致を確認した。
【００２６】
次いで、得られた（６ａ）及び（１５）をＨＯＢＴ，ＷＳＣ存在下にて反応させＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅ（９）を得る（収率約
８０％）。尚、ＷＳＣはペプチド結合を形成させる縮合剤のひとつであり、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド・塩酸塩の慣用名でありＷＳＣＩ・Ｈ
Ｃｌとも略記される。ＷＳＣの慣用名は、Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅに由来している。この縮合剤は単独あるいは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）等の添加剤と組み合わせて用いられる。このＨＯＢＴの存在は、縮合剤単独の場合よりも反応が早く進行し、縮合に伴う副反応を防止する働きがある。また、（９）については、1Ｈ−ＮＭＲにおいてシス体において認められる４．５ｐｐｍ付近での９．５Ｈｚのｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔを示すピークが全く認められなかったことから、トランス体であることが判明している。
【００２７】
（９）は、トリフルオロ酢酸中、脱保護（脱Ｂｏｃ化）した後、４Ｎ  ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅ溶液を加え減圧下で濃縮する。なおトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用する理由は、Ｂｏｃ基の酸による脱離は、ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅやＨＣｌ／ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅなども使用されるが、反応基質の溶解性や反応速度に問題が多く、その点ＴＦＡは溶解性も高く、反応も早いことから汎用される。また、４Ｎ  ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅ溶液を使用する理由は、Ｂｏｃ基は通常トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で脱離させるが、この際生成したトリフルオロ酢酸塩を塩酸塩に変換するために用いる。規定液を用いるのは、化学量論的に処理するため、また、ジオキサン溶液は脱離溶媒ＴＦＡと混和可能（ｍｉｓｃｉｂｌｅ）なため選択される。
濃縮後の残渣はベンゾフランカルボキシアミド誘導体の４種類の異性体（化合物１ａ〜１ｄ）を含み得、適当な分離条件下において、まず、そのシス体（化合物１ａ及び化合物１ｂ）とトランス体（化合物１ｃ及び化合物１ｄ）とに分離される。以下に分離条件の一例（ゲルカラムクロマト）を示すが、これに限定されるものではなく、シス体とトランス体を分離可能な条件であるならば、任意の分離条件を設定し得る。
【００２８】
濃縮後の残渣（ベンゾフランカルボキシアミド誘導体の４種類の異性体（化合物１ａ〜ｄ）を含む）を、ｈｉｇｈ  ｐｏｒｏｕｓ  ｓｔｙｌｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ２０Ｐ  （７５〜１５０μ）［Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｒｐ．］カラムにチャージし、ポンプ加圧下に水のみで展開して酸性の画分が溶出したのち、展開溶媒を２０％メタノール／水系に換え、溶出展開を継続すると、まずシス体のラセミ体（１ａ及び１ｂ）（Ｒｆ＝０．２４）が先に溶出しついでトランス体のラセミ体（１ｃ及び１ｄ）（Ｒｆ＝０．３３）［ＴＬＣ  ｐｌａｔｅ：Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  Ｆ254  ＭＥＲＣＫ，展開溶媒；ｎＢｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ2Ｏ（４：１：１）］が溶出する。それぞれの画分を凍結乾燥（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）すれば、両者の塩酸塩が白色粉末として得られる（トランス体の収率：約６４％、シス体の収率：約３０％）。シス体およびトランス体のフリー体は、それぞれの塩酸塩のメタノール溶液を、非水系の塩基性イオン交換樹脂  Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ(登録商標)Ａ−２１（Ｏｒｇａｎｏ）で処理後、凍結乾燥（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）して得られる。
最後に、得られたシス体のラセミ体及びトランス体のラセミ体をそれぞれキラルカラム（例えば、ダイセル化学社製のＣＨＩＲＡＬＣＥＬ(登録商標)など）により光学分割して、図３及び図４に示されるような４種類のエナンチオマー（化合物１ａ〜ｄ）を分離する。
【００２９】
〔第２実施形態〕
図２は、ホルダチンＡ前駆体（９ａ及び９ｂ）を中間体として、図１５に示されるベンゾフランカルボキシアミド誘導体の各種異性体（４種類：１ａ〜ｄ）を合成する全合成スキームである。尚、図２中に記載される各矢印（→）の上下に記載されている文言は、各種試薬及び反応条件であり、必ずしもこれらに限定されるものでなく、本スキームに従って合成することが可能であるならば、使用される試薬の種類や反応条件については任意に採用することができる。また、各符号（１〜１６）は、化合物を示す。
図２に示す実施形態では、光学活性なアシル部分を合成した後、塩基部分を縮合させて光学活性なホルダチンＡ前駆体（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈ
ｏｒｄａｔｉｎｅ：９ａおよび９ｂ）を合成し、それらを脱Ｂｏｃ化することで光学活性なベンゾフランカルボキシアミド誘導体の４種類の異性体（化合物１ａ〜１ｄ）を合成している。
【００３０】
（Ｉ）塩基部分の合成については、まず１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（１０）から文献（Ｂ．Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９４，５７９）に記載される方法に従ってＮ，Ｎ’−
ｄｉ−Ｂｏｃ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ（１１）を合成する（収率約７４％）。
また、市販もされている１，４−ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔａｎｅ（１２）の１個のアミノ基を図２に記載されるような反応条件下でｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ（Ｃｂｚ）基で保護して４−Ｃｂｚ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ−ａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（１３）を得る（Ａ．Ｇｒａｈａｍ  ｅｔａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，１０３２）。先に調製した（１１）と（１３）とを、トリエチルアミンの存在下で反応させると、４−ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙａｍｉｎｏ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉ−Ｂｏｃ−ａｇｍａｔｉｎｅ
（１４）が得られる（収率約８７％）。
（１４）を水素気流中、５％パラジウム炭素存在下にｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ反応に付すと、Ｎ，Ｎ’−ｄｉ−Ｂｏｃ−ａｇｍａｔｉｎｅ（６ａ）が得られる。尚、（６
ａ）については、その塩酸塩が市販されているので、市販品を使用しても良い。
また、脱保護した際のホルダチン精製の容易さから、アグマチンを構成するグアニジノ基の保護基としては、文献上Ｂｏｃ基あるいはＣｂｚ基（カルボベンゾキシ基）が汎用されているが、Ｂｏｃ基で保護することが好ましい。ホルダチンは分子内に二重結合を有するため、接触還元的に脱保護を行うＣｂｚ基は利用できないためである。Ｃｂｚ基以外のアミノ基やイミノ基のＮ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐの保護基としての利用は理論的には可能と思われる。
【００３１】
（ＩＩ）アシル部分の合成については、１／１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）／ｄｉｏｘａｎｅ中に、ｐ−クマリン酸（７）、セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を加える。室温下で撹拌しつつ、０．５時間かけて１Ｍ  過酸化水素水溶液を滴下させる。
反応の進行をＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝９：１：０．２）により確認し、反応液に酢酸エチル、クエン酸を加え撹拌した後、酢酸エチルにて３回抽出を行う。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで脱水し濃縮乾固した。得られた黄色残渣をメタノールに溶解させＳｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)  ＬＨ２０（メタノール）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)  ＬＨ２０（８０％メタノール）、およびＳｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)  Ｇ１５（８０％メタノール）カラムクロマトグラフィーで順次精製し、ｄｅｈｙｄｒｏｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ（１５）を得る。
キラルカラムＣＨＩＲＡＬＰＡＫ(登録商標)  ＯＪ−ＲＨ［Φ２．０×１５ｃｍ、溶媒：３０％ＭｅＣＮ  ０．１％ＴＦＡ、流速：５．０ｍｌ／ｍｉｎ、波長：２８０ｎｍ］により、ｄｅｈｙｄｒｏｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ（１５）から光学活性な［Ｓ，Ｓ］−ｄｅｈｙｄｒｏｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ（１６ａ）および［Ｒ，Ｒ］−ｄｅｈｙｄｒｏｄｉ−ｐ−ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ（１６ｂ）を分取する。
次いで、得られた（１６ａ）及び（１６ｂ）をジメチルホルムアミドに溶解し、ＷＳＣおよびＨＯＢｔを加えて、室温下撹拌する。その後、（６ａ）をジメチルホルムアミドに溶解し反応液に加え、さらに１時間攪拌する。反応の進行をＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝９：１：０．２）で確認し、反応液に水を加え酢酸エチルで３回抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。得られた残査をＳｉＯ2カラムクロマトグラフ法［Φ１．５×１０ｃｍ，Ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝３：７→１：４］にて精製し、［Ｓ，Ｓ］−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒ
ａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅ（９ａ）および［Ｒ，Ｒ］−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’
’−ｔｅｔｒａ−Ｂｏｃ−Ｈｏｒｄａｔｉｎｅ（９ｂ）を得る（収率約８０％）。夾雑物
を含むフラクションは更にＳｉＯ2（球状、中性）カラムクロマトグラフ法［ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９９：１→９８：２］によって精製を行う。尚、ＷＳＣはペプチド結合を形成させる縮合剤のひとつであり、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボ
ジイミド・塩酸塩の慣用名でありＷＳＣ・ＨＣｌとも略記される。ＷＳＣの慣用名は、Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅに由来している。この縮合剤は単独あるいは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）等の添加剤と組み合わせて用いられる。このＨＯＢＴの存在は、縮合剤単独の場合よりも反応が早く進行し、縮合に伴う副反応を防止する働きがある。
【００３２】
（９ａ）および（９ｂ）にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、脱保護（脱Ｂｏｃ化）した後、１Ｎ  ＨＣｌ溶液を加え減圧下で濃縮する。なおトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用する理由は、Ｂｏｃ基の酸による脱離は、ＨＣｌ／ｄｉｏｘａｎｅやＨＣｌ／ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅなども使用されるが、反応基質の溶解性や反応速度に問題が多く、その点ＴＦＡは溶解性も高く、反応も早いことから汎用される。
また、１Ｎ  ＨＣｌ溶液を使用する理由は、Ｂｏｃ基は通常トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で脱離させるが、この際生成したトリフルオロ酢酸塩を塩酸塩に変換するために用いる。規定液を用いるのは、化学量論的に処理するため選択される。
上述のようにして、濃縮後に得られた２つの残渣には、それぞれ２種類の異性体が含まれ得る（９ａ由来の残渣には化合物１ｂ及び１ｄ、９ｂ由来の残渣には化合物１ａ及び１ｃ）。各残渣をＳｅｐｈａｄｅｘ(登録商標)  Ｇ−１５（Φ１．６×３０ｃｍ，ｓｏｌｖｅｎｔ＝０．０１Ｎ  ＨＣｌ，Ｖｔ＝５８ｃｍ3，Ｖｉ＝２９ｃｍ3，Ｖｇ＝１１．６ｃｍ3，Ｖｏ＝１７．４ｃｍ3，ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ＝２５０μＬ／ｍｉｎ，ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ＝２．５ｍｌ／ｆｒ．）カラムにかけて、２種類の異性体を分離溶出させて、各溶出画分を採取して凍結乾燥することで、図３及び図４に示されるような４種類のエナンチオマー（化合物１ａ〜ｄ）を得ることができる。なお、化合物１ａ〜ｄは、塩としての形態で得ることもでき、そのような塩としては、塩酸塩など、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
〔実施例１〕構造解析
上記実施形態にて合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体のシス体（化合物１ａ及び１ｂ）及びトランス体（化合物１ｃ及び１ｄ）について、核磁気共鳴スペクトルデータ、質量分析スペクトル測定による解析を行った。
【００３４】
１．核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル
上記シス体（塩酸塩）及びトランス体（塩酸塩）について、その核磁気共鳴（1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ）スペクトル解析を行った。溶媒としてＤＭＳＯ−ｄ6を用い、測定は、Bruker Biospin社 DMX-750（1Ｈ−ＮＭＲ）または DMX-500（13Ｃ−ＮＭＲ）で行った。
上記シス体及びトランス体の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル解析データをそれぞれ第５図（シス体）および第６図（トランス体）に、また13Ｃ−ＮＭＲスペクトル解析データをそれぞれ第７図（シス体）および第８図（トランス体）に示した。その結果、天然体（ホルダチンＡ（トランス体）及びそのシス体）とほぼ同じスペクトルを示した。
【００３５】
２．質量分析スペクトル
次に、上記シス体について、その質量分析を行った（図９）。
シス体を３−ニトロベンジルアルコールに溶解して、質量分析を行った結果を第９図として示した。その結果、分子イオンとして、質量／電荷（ｍ／ｚ）が、５５１（Ｍ＋Ｈ）+となり、分子量は５５０を有するものであることが判明した。
【００３６】
３．構造の決定
以上のように、合成した化合物について、核磁気共鳴スペクトルデータ、及び質量分析による解析の結果、それぞれの立体構造は、シス体については図３の化合物１ａ及び化合物１ｂ、またトランス体については図４の化合物１ｃ及び化合物１ｄで示される化学構造式を有するものであることが判明した。尚、化合物１ｃ及び化合物１ａは、それぞれ天然体のホルダチンＡ（トランス体）及びそのシス体と同じ化学構造式を有するものであり、化合物１ｂ及び化合物１ｄが、上述の非天然体のエナンチオマー（シス体及びトランス体）である。
【００３７】
〔実施例２〕キラル分析
天然体（ホルダチンＡ（トランス体）及びそのシス体）並びに合成した非天然体（上記化合物１ａ〜ｄ）について、キラルカラムを用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を実施した。分析試料としては、天然体として（１）ホルダチンＡのシス体及び（２）ホルダチンＡ（トランス体）を用意し、合成した非天然体として（３）シス体のラセミ体（化合物１ａ、１ｂ）及び（４）トランス体のラセミ体（化合物１ｃ、１ｄ）を用意した。上記分析試料（１）及び（３）、並びに上記分析試料（２）及び（４）をそれぞれ共射出し、分析を行った。ＨＰＬＣの分析条件は、カラム：CHIRALCEL(登録商標) OD-RH、カラムサイズ：0.46I.D×15ｃｍ、移動相：25％MeCNを含有する0.5M  NaClO4の水溶液、流速：0.8ml／min、測定波長：280nm、チャートスピード：15ｃｍ/ｈである。結果を図１０（分析試料（１）及び（３））及び図１１（分析試料（２）及び（４））に示す。この結果から、キラルカラムを使用することにより、合成したシス体のラセミ体及びトランス体のラセミ体はそれぞれ単一のエナンチオマーに分離することが可能であり、その一方のエナンチオマーが天然体と同じものであると判断される。
【００３８】
〔実施例３〕ムスカリンＭ3受容体結合性試験
ムスカリンＭ3受容体結合性試験法は、次の通りである。
ヒトのムスカリンＭ3受容体を発現させた組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株の膜標品の懸濁液に、検体（ビール乾燥物およびその分画物）と、リガンド：０．２ｎＭの［3Ｈ］４−ＤＡＭＰ（ジフェニルアセトキシ−Ｎ−メチルピペリジン  メチオダイド）を添加し、２２℃で６０分間インキュベートした。反応液をガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｂ：Packard社製）にて吸引濾過して反応を停止させ、氷冷した緩衝液で数回洗浄した。フィルターにシンチレーションカクテル（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ０：Packard社製）を加え、フィルター上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ：Packard社製）で計測した。［3Ｈ］４−ＤＡＭＰの特異的結合量は、［3Ｈ］４−ＤＡＭＰの全結合量から１μＭアトロピン存在下の非特異的結合量を差し引くことにより算出した。
【００３９】
非天然体（化合物１ｂ（シス体）及び化合物１ｄ（トランス体））を第１図又は第２図に示す方法で化学合成し、得られたそれぞれの非天然体について、上記のムスカリンＭ3受容体結合性試験を行い、用量−作用曲線を求め、天然体（ホルダチンＡ及びそのシス体）と比較した。
その結果を、第１２図（ホルダチンＡのシス体、化合物１ｂ）及び第１３図（ホルダチンＡ、化合物１ｄ）に示した。図中に示した結果から明らかなように、非天然体には天然体と同様の用量依存性が確認され、そのＩＣ50はそれぞれ、シス体では０．０８×１０-6ｇ／ｍＬ、トランス体では０．１１×１０-6ｇ／ｍＬであった。天然体と比較したところ、合成品のムスカリンＭ3受容体結合作用の強さは、化合物１ｂ（シス体）で天然体の約７倍、化合物１ｄ（トランス体）で天然体の約２０倍に相当した。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】第１実施形態の全合成スキームを示す図
【図２】第２実施形態の全合成スキームを示す図
【図３】合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体（シス体）の化学構造式を示す図
【図４】合成した合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体（トランス体）の化学構造式を示す図
【図５】合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体（シス体）に関する1Ｈ−ＮＭＲスペクトル解析データを示す図
【図６】合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体（トランス体）に関する1Ｈ−ＮＭＲスペクトル解析データを示す図
【図７】合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体（シス体）に関する13Ｃ−ＮＭＲスペクトル解析データを示す図
【図８】合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体（トランス体）に関する13Ｃ−ＮＭＲスペクトル解析データを示す図
【図９】合成したベンゾフランカルボキシアミド誘導体（シス体）についての質量分析スペクトル解析データを示す図
【図１０】天然体（ホルダチンＡのシス体）と非天然体（シス体のラセミ体）に対してキラルカラムを用いてＨＰＬＣを実施したクロマトグラムを示す図
【図１１】天然体（ホルダチンＡ）と非天然体（トランス体のラセミ体）に対してキラルカラムを用いてＨＰＬＣを実施したクロマトグラムを示す図
【図１２】天然体（ホルダチンＡのシス体）及び非天然体（化合物１ｂ）のムスカリンＭ3受容体結合性試験結果を示す図
【図１３】天然体（ホルダチンＡ）及び非天然体（化合物１ｄ）のムスカリンＭ3受容体結合性試験結果を示す図
【図１４】従来のホルダチンＡの合成スキームを示す図
【図１５】ベンゾフランカルボキシアミド誘導体の化学構造式を示す図
【符号の説明】
【００４１】
６ａ  アグマチン誘導体
９  ホルダチンＡ前駆体
１５  パラクマリン酸二量体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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