(57)【要約】【課題】  化石燃料や有機物の燃焼により発生する油分、多環芳香族炭化水素あるいは有機塩素化合物に汚染された土壌の新規評価方法の提供。【解決手段】  本発明に係る評価方法は、汚染土壌又はその抽出物質を、アリル炭化水素受容体およびシトクロムＰ−４５０酵素を含む細胞に接触させた後、又は該細胞の培養液に添加した後、該細胞のシトクロムＰ−４５０酵素に関する、遺伝子の転写量、蛋白質量、および酵素活性の内の少なくともいずれか１の増加量を測定することを特徴とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
汚染土壌又はその抽出物質を、アリル炭化水素受容体およびシトクロムＰ−４５０酵素を含む細胞に接触させた後、又は該細胞の培養液に添加した後、該細胞のシトクロムＰ−４５０酵素に関する、遺伝子の転写量、蛋白質量、および酵素活性の内の少なくともいずれか１の増加量を測定することを特徴とする汚染土壌の汚染度の評価方法。
【請求項２】
前記汚染土壌に対して、密度１〜２ｇ／ｃｍ3の液体を加えて撹拌した後、静置又は遠心分離して、液体の上層に浮遊する粒子、又は土壌粒子の層の上部に堆積する粒子を回収し、回収した粒子又はその抽出物質を、アリル炭化水素受容体を含む細胞の培養液に添加する、又はアリル炭化水素受容体を含む細胞に接触させることを特徴とする、請求項１記載の汚染土壌の汚染度の評価方法。
【請求項３】
前記シトクロムＰ−４５０酵素が、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、およびＣＹＰ１Ｂ１の内の少なくともいずれか１であることを特徴とする、請求項１又は２記載の汚染土壌の汚染度の評価方法。
【請求項４】
前記細胞として、魚類の肝臓若しくは哺乳動物の肝臓、肺、リンパ球、乳腺、胎盤の内の少なくともいずれか１由来の細胞、又は培養細胞を用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の汚染土壌の汚染度の評価方法。
【請求項５】
前記汚染土壌中の汚染物質が、油分、多環芳香族炭化水素、および有機塩素化合物の内の少なくともいずれか１であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の汚染土壌の汚染度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化石燃料や有機物の燃焼により発生する油分、多環芳香族炭化水素あるいは有機塩素化合物に汚染された土壌の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
焼却炉やガス精製工場の跡地などの土壌においては、油分、多環芳香族炭化水素（以下PAHsと略す。）やダイオキシンやＰＣＢなどの有機塩素化合物による汚染が問題になる。PAHsは、例えばフェナントレン、フルオレンやピレン、ベンツ(a)ピレンなど、複数の芳香環を有する物質である。ベンツ(a)ピレンをはじめとして発ガン性や変異原性など、強い毒性を有するPAHsが知られている。PAHsについては発ガン性に関する危険度を表すリスク係数が算出されて公開されている（以下の特許文献１、非特許文献１を参照のこと。）。
【０００３】
またダイオキシンやＰＣＢなどの有機塩素化合物についても内分泌攪乱作用などの強い毒性が報告されている（以下の特許文献２、非特許文献２を参照のこと。）。
【０００４】
油分汚染については、現在、我が国では土壌汚染に関する環境規制がないものの、ｎ−ヘキサン抽出物質やＴＰＨ（全石油系炭化水素）などが土壌の油分汚染の指標として広く用いられている。油分には、有害なＰＡＨｓや有機塩素化合物が含有される場合が多い。
【０００５】
PAHs汚染に関しては現在、我が国では環境規制が一切なく、単環芳香族のベンゼンのみが白血病の原因物質として、環境基準が定められているのみである。しかしながら先述のリスク係数からわかるように、高い毒性を有するPAHsが未規制のまま環境中へ放出されていることになる。オランダではPAHsに関する、厳しい環境規制が既に設定されている。また、米国でも環境保全局(USEPA)がPAHs汚染の指標となる代表的な物質として、１６種類のPAHsを指定している。PAHsは化石燃料などの不完全燃焼により、意図せず発生するものがほとんどである。単一の物質のみが発生することはまずなく、複数種類のPAHsが同時に発生する。また、USEPAにより指定されている１６種類のPAHsの存在量はあくまで汚染の目安にすぎず、これら以外に極めて多種類のPAHsが存在し得る。ニトロ化したPAHsやハロゲン化したPAHsなどきわめて毒性が高い（先述のリスク係数が高い値）未知のPAHsの存在についても十分考慮する必要がある。
【０００６】
また、有機塩素化合物であるダイオキシンやＰＣＢは、塩素が存在する条件で有機物の不完全燃焼で生成し得るものであり、焼却炉等から発生する粉塵、灰などに含まれる。ダイオキシンやＰＣＢに分類される分子種が複数種類あることも知られている。一般に、油分、PAHsや有機塩素化合物による汚染は、未知の物質も含めて、これら多種類の物質からなる複合汚染の場合がほとんどである。したがって、全汚染物質を分析によって同定してその含有量を定量することは、非常に困難な作業であり、かつ、非常に高コストとなる。
【０００７】
例えば、PAHs汚染については、一般には先述のUSEPAが指定した１６種類のPAHsの含有量が汚染の指標あるいは浄化の指標として用いられている。しかしながら、１６種類のPAHs以外にも例えばニトロ化したPAHsのように強力な毒性を有するPAHsは非常に多種類あり、これらの毒性影響を見落とす危険性が十分あり得るのである。ダイオキシンやPCBなどの有機塩素化合物についても最も毒性の強いとされる２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）の他、毒性のある全有機塩素化合物を分析によって同定してその含有量を定量することも非常に難しく、かつ非常に高コストとなる。
【０００８】
油分、PAHsや有機塩素化合物は一般に化石燃料や含炭素物質の不完全な燃焼に伴い発生するが、燃焼に伴う高温で油分、PAHsや有機塩素化合物はガス化して大気中に放散される。しかしながら、周囲の大気や水分により冷却されてガス化していた油分、PAHsや有機塩素化合物は大気中の塵などを核に凝縮して粒子を形成する。このような粒子が粉塵として土壌に降り積もり、堆積することによって、土壌が油分、PAHsあるいは有機塩素化合物に汚染されることになる。
【０００９】
土壌の浄化に際して、未知のPAHsあるいは有機塩素化合物まで分析により同定して、それらの含有量削減を指標として浄化を確認することは非常に難しく、かつ高コストになることは先に説明した。そこで、これら未知のPAHsあるいは有機塩素化合物も含めて、低コストで浄化を確認できる方法が開発できれば、油分、PAHsあるいは有機塩素化合物に汚染された土壌の浄化を低コストかつ安全に行なうことが可能となるので望まれる。
【特許文献１】特開２００２−１６８７８９号公報
【特許文献２】特開２００３−１４５１３０号公報
【非特許文献１】USEPA（米国環境保全局）、Relative Potency Values for Individual PAH’s、1993
【非特許文献２】関係省庁共通パンフレット ダイオキシン類（環境省）2003
【非特許文献３】BRADLAWら、Ｊ．ＡＳＳＯＣ．ＯＦ ＡＮＡＬ．ＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．６２，Ｎｏ．４，９０４，１９７９
【非特許文献４】伊藤公夫ら、第３６回日本水環境学会年会講演集、2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
油分（ｎ−ヘキサン抽出物質、ＴＰＨ等）、PAHs（フェナントレン、フルオレン、ピレン、ベンツ（ａ）ピレン等）あるいは有機塩素化合物（各種ＰＣＢ、ダイオキシン等）に汚染された土壌に対して、１種のみならず２種以上の複数種類の汚染物質（複合的な汚染物質とも言う）それぞれを同定、定量するような、高コスト且つ多大な労力が必要である定量分析に依存することなく、低コストで労力の少ない汚染土壌の汚染度の評価方法を提供することが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく検討を重ねた結果、複合的な汚染物質の全体量と、その全体量が生物細胞へ与える影響度とを比較することで、汚染土壌の汚染度の評価が可能となることを発見した。
【００１２】
特に、汚染物質である、PAHsやダイオキシン及びPCBなどの有機塩素化合物が生物細胞へ与える影響としては、これらの汚染物質により、生物細胞中の解毒酵素であるシトクロムP-450が、発現誘導すること、及び酵素活性が増加すること（上記非特許文献３を参照のこと。）に着目した。
【００１３】
本発明では、シトクロムP-450酵素のこのような汚染物質への影響を指標とすることで、未知の物質も含めて、PAHs、又はダイオキシン及びPCBなどの有機塩素化合物、に複合的に汚染された土壌について、その汚染度合い又は浄化度合いを評価できる。
【００１４】
すなわち、高コストとなる質量分析技術等を用いる汚染物質の同定、および定量分析を行わずに、低コストの汚染土壌評価方法が確立できる。
【００１５】
本発明の要旨とするところは次の〔１〕〜〔５〕である。
【００１６】
〔１〕  汚染土壌又はその抽出物質を、アリル炭化水素受容体およびシトクロムＰ−４５０酵素を含む細胞に接触させた後、又は該細胞の培養液に添加した後、該細胞のシトクロムＰ−４５０酵素に関する、遺伝子の転写量、蛋白質量、および酵素活性の内の少なくともいずれか１の増加量を測定することを特徴とする汚染土壌の汚染度の評価方法。
【００１７】
〔２〕  前記汚染土壌に対して、密度１〜２ｇ／ｃｍ3の液体を加えて撹拌した後、静置又は遠心分離して、液体の上層に浮遊する粒子、又は土壌粒子の層の上部に堆積する粒子を回収し、回収した粒子又はその抽出物質を、アリル炭化水素受容体を含む細胞の培養液に添加する、又はアリル炭化水素受容体を含む細胞に接触させることを特徴とする前記〔１〕の汚染土壌の汚染度の評価方法。
【００１８】
〔３〕  前記シトクロムＰ−４５０酵素が、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、およびＣＹＰ１Ｂ１の内の少なくともいずれか１であることを特徴とする前記〔１〕又は〔２〕の汚染土壌の汚染度の評価方法。
【００１９】
〔４〕  前記細胞として、魚類の肝臓若しくは哺乳動物の肝臓、肺、リンパ球、乳腺、胎盤の内の少なくともいずれか１由来の細胞、又は培養細胞を用いることを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれかの汚染土壌の汚染度の評価方法。
【００２０】
〔５〕  前記汚染土壌中の汚染物質が、油分、多環芳香族炭化水素、および有機塩素化合物の内の少なくともいずれか１であることを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕のいずれかの汚染土壌の汚染度の評価方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、油分、PAHsあるいは有機塩素化合物に汚染された土壌に対する汚染度の評価を低コストかつ効率的に、更には、汚染物質が２種以上の複合汚染であっても行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明では、汚染土壌若しくは浄化した土壌をそのまま、又は有機溶媒によるそれらの抽出物の形態で、生物細胞への影響評価のための試料として用いることが可能である。
【００２３】
さらに、土壌中に含有されるPAHs又は有機塩素化合物が濃化されている粒子を回収できれば、これらの粒子又は有機溶媒によるこれらの抽出物の形態で、生物細胞への影響をより高感度に確認でき、汚染土壌の汚染度の評価が可能である。
【００２４】
そこで、まず、土壌からPAHsあるいは有機塩素化合物が濃化されている粒子を回収する方法について、説明する。汚染土壌から汚染物質が含まれる粒子を土壌粒子から分離して、安価かつ効率的に濃縮して回収するために、液体を用いる処理により、小さな粒径の油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子を、粉塵として大気中に飛散させることなく、回収する。このような油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子が土壌粒子の間隙に存在する汚染土壌に、密度が１〜２ｇ／ｃｍ3の液体を加える。ただし、温度や気圧の変化による密度の変化を考慮し、数値の有効けた数は１けたとする。液体は密度１ｇ／ｃｍ3の水、特に河川水、地下水、海水などが安価であることから、これらを用いることが特に望ましいが、それ以外の液体でも可である。ただし、経済的にコストが掛かり、粒子として存在している油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を粒子として回収できず、分散、可溶化させてしまう恐れがあるため、一般に洗浄法で用いられるような界面活性剤を含む液体は適さない。また、疎水性の液体の使用も適さない。
【００２５】
液体の密度を１〜２ｇ／ｃｍ3とするのは以下の理由による。
粒径が小さなものほど比表面積が大きく、生体内の奧まで浸潤して毒性が懸念される。このような微細な粉は、粉塵となり、汚染土壌を取り扱う作業者が粉塵を吸引する危険性があるなど、大気環境下で取り扱うには安全対策コストがかさむ問題がある。そこで、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子を安全かつコストをあまりかけずに土壌から分離して細胞への影響を評価することがより望ましいが、実験検討を重ねた結果、これら汚染物質を含有する粒子の９５％以上が密度１．７〜２ｇ／ｃｍ3であり、汚染物質を含有しない土壌粒子の９５％以上が密度２．５ｇ／ｃｍ3〜２．８ｇ／ｃｍ3以下であることを見出した。
【００２６】
そこで、汚染物質を含有する粒子と土壌粒子との密度差と更に液体との密度差を利用し、これらの粒子を分離することが可能となる。
【００２７】
すなわち、汚染土壌に対して、密度２ｇ／ｃｍ3以下の液体を加えて、汚染土壌を撹拌した後には、汚染物質を含有する粒子は土壌粒子よりも遅い速度で沈降することから、沈降した土壌粒子の層の上に、汚染物質を含有する粒子を堆積させることが可能となる。
【００２８】
また、液体の密度は低いものでも可能であるが、コストを考えると液体としては水の利用が望ましい。但し、上記液体が水以外の有機溶媒を含有することは、本願発明において、排除されるものではない。河川水、湖沼水、地下水、水道水、工業用水など水の密度は約１ｇ／ｃｍ3であるので、１ｇ／ｃｍ3以上とした。
また、密度が１〜２ｇ／ｃｍ3の液体としては、廉価に利用できる海水も２０℃で密度が１．０２ｇ／ｃｍ3である他、水に塩類などを溶かした液体も利用可能である。特に、密度が約２ｇ／ｃｍ3の液体としては、水に金属塩などを溶解させた液体が利用できる。このような液体としては、水に塩化亜鉛、ブロモホルム、臭化亜鉛などを溶解させた液体がある。安全性と低コスト性から塩化亜鉛を用いることが特に望ましい。このような金属塩の水溶液の濃度を調整し、密度を２ｇ／ｃｍ3に近づけることで、汚染物質を含有する粒子を液体層に浮かせることができ、より回収が容易となる。
次に、土壌粒子の間隙に存在する汚染物質を含有する粒子を土壌粒子から分離するためには、土壌粒子の間隙に入った液体を効率的に流動させる必要がある。このために液体は十分量加える必要がある。そこで液体と土壌の体積比で少なくとも１：２の割合以上の液体を加えることがより好ましい。液体が１：２の割合よりも少ない場合、土壌粒子の間隙で液体を良好に流動させることができないため、油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子の除去効率が低下してしまうからである。次に、上記のように土壌に液体を加えた後、混合、撹拌する。混合、撹拌方法は如何なる方法を用いても構わないが、例えば、土壌洗浄に用いられるミキサーなどが利用可能である。混合、撹拌時間についても特に制限はない。長時間であるほど土壌粒子の間隙からPAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子を分離する効果が高くなる。ただし長時間すぎるとコスト的に不利になることから、通常、５分間から１時間の範囲で、混合、撹拌をおこなえばよいが、それ以外の時間混合、撹拌しても勿論かまわない。
【００２９】
撹拌した土壌と液体の混合物は、例えば、静置、あるいは遠心分離等により、土壌粒子の間隙に存在していた油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子を、良好に土壌粒子の層の上部にある液体層に浮かせるか、あるいは、土壌粒子の層の上部に堆積させる。静置であれば１時間以上静置時間をかけることが望ましい。遠心分離であれば、例えば、１，０００ｒｐｍで１０分間程度遠心分離する。勿論これ以外の条件で遠心分離してもかまわない。以上の工程によって、土壌粒子の間隙に存在していた油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子を、良好に土壌粒子の層の上部にある液体層に浮かせるか、あるいは、土壌粒子の層の上部に堆積させることが可能となる。
【００３０】
また、液体層の上部に浮かんだ、油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子については、ろ過等により直接回収することも可能である。また、土壌粒子の層の上部に堆積した油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子の層についても、例えば液体をポンプ等を用いて除去後、堆積した、油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子の層を直接回収することが可能である。
【００３１】
以上のように、油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子を土壌粒子から分離して濃化して回収できる。したがって、回収した粒子あるいはその粒子を有機溶媒にて抽出した物質により、細胞への影響をより高感度に検出することが可能となる。
【００３２】
さて、汚染土壌、浄化土壌あるいは上述のように回収した汚染物質を含有する粒子からの汚染物質の抽出方法としては、可能であれば無水硫酸ナトリウムを用いて脱水した後、ジクロロメタン、アセトン、ヘキサンなどの溶媒を用いて、例えばソックスレー抽出などで溶媒抽出することが望ましい。特にジクロロメタン：アセトン（１：１体積比）を用いるソックスレー抽出は効率よく安定に汚染物質を抽出できるので望ましい。（上記非特許文献４を参照のこと。）この他、超音波抽出なども利用できる。尚、抽出によって各成分の濃縮度合いはほとんどかわらないとみなすことができる。汚染物質である油分、PAHsあるいは有機塩素化合物は一般に疎水性であり、細胞への影響を確認しようとしても、培養液に不溶である。したがって、細胞への影響を感度よく確認するためには、抽出した物質は、培養液中に可溶化させることが好ましく、乾燥固化した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などに転溶することが望ましい。
【００３３】
汚染土壌、あるいはその抽出物質、または、回収した汚染物質を含有する粒子、あるいはその抽出物質を用いて、細胞への影響を確認する方法について以下に説明する。
【００３４】
PAHs、あるいはダイオキシン、PCBなど有機塩素化合物は、培養液中の濃度が１マイクロモル濃度以下の低濃度であってもシトクロムＰ−４５０の遺伝子発現、蛋白質合成、酵素活性の増加を誘導することが報告されている。シトクロムＰ−４５０はこれら生体にとって異物であるこれら有害物質を分解する作用、つまり解毒に関わる酵素である。
【００３５】
特に、シトクロムＰ−４５０のなかでも、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１の３種類の酵素は、PAHsやダイオキシン、PCBなどの有機塩素化合物の影響を受けて、その遺伝子発現すなわち転写の亢進と、蛋白質合成の増加、酵素活性の増加が起きることが知られている。PAHsやダイオキシン、PCBなどの有機塩素化合物が細胞に対してこのような作用を起こす原因の一つとしては、これらの汚染物質がAh（アリル炭化水素）受容体に結合することによって、上記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子の転写が亢進されることが明らかにされている。
【００３６】
本発明はこれらシトクロムＰ−４５０、すなわちＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１を発現できる細胞を用いて、前述の汚染土壌、若しくはその抽出物質、または、濃化して回収した汚染物質を含有する粒子、若しくはその抽出物質を用いて、細胞への影響を指標として、汚染土壌の評価をおこなうものである。このような条件を満たすアリル炭化水素受容体およびシトクロムＰ−４５０を含む細胞としては、魚類の肝臓、哺乳動物の肝臓、肺、リンパ球、乳腺、胎盤などの少なくともいずれか由来の細胞、あるいは培養細胞があり、使用に適している。特に肝臓由来の細胞あるいは培養細胞は解毒酵素である上記酵素の高い遺伝子発現と酵素活性が誘導され得ることから、より望ましい。
【００３７】
汚染土壌、あるいはその抽出物質、または、回収した汚染物質を含有する粒子、あるいはその抽出物質を用いて、生物細胞への影響を確認する方法であるが、汚染土壌、あるいはその抽出物質、または、回収した汚染物質を含有する粒子、あるいはその抽出物質を、影響をみようとする細胞の培養液中に存在させるか、あるいは細胞に接触させることによって行なう。
【００３８】
抽出物質であれば、前述のようにＤＭＳＯなどに溶解させて、培養液中に添加することにより、疎水性の油分、PAHsあるいは有機塩素化合物を培養液に可溶化して存在させることができ、のぞましい。培養液中のＤＭＳＯ濃度は１％以下で使用することが望ましい。これ以上の濃度になると細胞へのＤＭＳＯの影響が著しくなり、汚染度の評価に影響してしまうからである。
【００３９】
汚染土壌や濃化して回収した粒子を細胞に接触させる場合には、抽出方法による人為的な影響を除いた、細胞への影響を確認できる利点がある。この場合、培養液に微生物が混入して増殖することによるコンタミネーションが起こる可能性があるため、抗生物質等を培養液に添加することが望ましい。接触させる方法としては、汚染土壌や濃化して回収した粒子を前記細胞あるいは培養細胞と接触するように振りかけて接触させる方法や、培養液中に汚染土壌や濃化して回収した粒子を懸濁させて前記細胞あるいは培養細胞と接触させる方法などがある。
【００４０】
次に、細胞への影響の確認方法について説明する。
任意の時間、細胞と汚染物質を共存させることで、以下に示すような遺伝子の発現や蛋白質量の増加、酵素活性の亢進が誘導される。可能であれば、４時間から７２時間の範囲で細胞と汚染物質を共存させることが、遺伝子発現や酵素活性の誘導を明確にする観点から好ましい。
【００４１】
細胞への影響については、上述のように、シトクロムＰ−４５０遺伝子の発現の亢進、あるいはシトクロムＰ−４５０の蛋白質量の増加、あるいはシトクロムＰ−４５０の酵素活性の増加を、詳細にはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１のいずれかの遺伝子の発現の亢進、あるいは蛋白質量の増加、あるいは酵素活性の増加を調べることになる。
【００４２】
まず、シトクロムＰ−４５０遺伝子、さらに詳細にはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子の発現の亢進、すなわち転写量の増加を調べる方法についてであるが、転写によって生成するこれら遺伝子のｍ−ＲＮＡ量を測定することで、遺伝子発現量、すなわち転写量の増加を調べることが可能である。ｍ−ＲＮＡ量は、ノーザンブロッティングやドットハイブリダイゼーションで確認可能であるほか、逆転写酵素を用いてｍ−ＲＮＡをＤＮＡに逆転写したのち、定量ＰＣＲを用いてｍ−ＲＮＡ量を推定するなどの方法が利用できる。多環芳香族炭化水素あるいはダイオキシンやＰＣＢなどの有機塩素化合物はアリル炭化水素レセプターに結合してこれら遺伝子の転写を促進してｍ−ＲＮＡ量を増加させる。したがって、異なる汚染土壌の相対的な汚染度の比較、あるいは汚染土壌の浄化にともなう原土と浄化処理された土の相対的な汚染度の比較などが可能となる。また、異なる濃度の既知物質、例えばベンツ（ａ）ピレンなど、によるｍ−ＲＮＡの増加量から検量線を書いておいて、複合汚染物質による毒性が既知物質ではどのくらいの濃度に相当するのか、定量的に汚染度を評価することも可能である。
【００４３】
あるいは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１のいずれかの遺伝子のプロモーター領域にレポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子など）をつなげたカセット遺伝子を構築して、細胞に導入して、このレポーター遺伝子の発現活性（例えば、ルシフェラーゼ活性など）を指標にして、転写量の増加を調べることも可能である。多環芳香族炭化水素あるいはダイオキシンやＰＣＢなどの有機塩素化合物はアリル炭化水素レセプターに結合してレポーター遺伝子の転写を促進してレポーター遺伝子の発現活性を増加させる。したがって、異なる汚染土壌の相対的な汚染度の比較、あるいは汚染土壌の浄化にともなう原土と浄化処理された土の相対的な汚染度の比較などが可能となる。また、異なる濃度の既知物質、例えばベンツ（ａ）ピレンなど、によるレポーター遺伝子の発現活性の増加から検量線を書いておいて、複合汚染物質による毒性が既知物質ではどのくらいの濃度に相当するのか、定量的に汚染度を評価することも可能である。
【００４４】
シトクロムＰ−４５０の蛋白質量、さらに詳細にはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１の蛋白質量の増加を調べる方法についてであるが、これら蛋白質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング等により調べることが可能である。多環芳香族炭化水素あるいはダイオキシンやＰＣＢなどの有機塩素化合物はアリル炭化水素レセプターに結合してこれら蛋白質の量を増加させる。したがって、異なる汚染土壌の相対的な汚染度の比較、あるいは汚染土壌の浄化にともなう原土と浄化処理された土の相対的な汚染度の比較などが可能となる。また、異なる濃度の既知物質、例えばベンツ（ａ）ピレンなど、によるこれら蛋白質量の増加から検量線を描いておいて、複合汚染物質による毒性が既知物質ではどのくらいの濃度に相当するのか、定量的に汚染度を評価することも可能である。
【００４５】
シトクロムＰ−４５０の酵素活性、さらに詳細にはＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性の増加を調べる方法についてであるが、これら酵素の酵素反応に関わる基質を加えて、反応生成物の生成量を調べることで可能である。特に有効な酵素反応として、４種類のＣＹＰ依存性酵素活性（ＡＲＯＤ活性；アルコキシレゾルフィン  Ｏ−脱アルキル化活性）が報告されている。すなわち、ＥＲＯＤ（エトキシレゾルフィン  Ｏ−脱エチル化）活性、  ＭＲＯＤ（メトキシレゾルフィン  Ｏ−脱メチル化）活性、  ＰＲＯＤ（ペントキシレゾルフィン  Ｏ−脱ペンチル化）活性、  ＢＲＯＤ（ベンジロキシレゾルフィン  Ｏ−脱ベンジル化）活性  である。例えば、ＥＲＯＤ（エトキシレゾルフィン  Ｏ−脱エチル化）活性を用いた、汚染物質による細胞への影響を調べる場合、基質として7-エトキシレゾルフィンを用いることにより、これが蛍光物質であるレゾルフィンにＥＲＯＤ活性により変換されるのである。レゾルフィンは励起波長530ｎｍ、蛍光波長588ｎｍで蛍光を発するので、蛍光光度計をもちいて、酵素活性を測定可能である。以上のように、汚染物質の細胞への影響を、シトクロムＰ-４５０の酵素活性であるＥＲＯＤ活性の誘導を調べることで確認できるのである。多環芳香族炭化水素あるいはダイオキシンやＰＣＢなどの有機塩素化合物はアリル炭化水素レセプターに結合してこれら酵素活性を増加させる。したがって、異なる汚染土壌の相対的な汚染度の比較、あるいは汚染土壌の浄化にともなう原土と浄化処理された土の相対的な汚染度の比較などが可能となる。また、異なる濃度の既知物質、例えばベンツ（ａ）ピレンなど、によるこれら酵素活性の増加から検量線を書いておいて、複合汚染物質による毒性が既知物質ではどのくらいの濃度に相当するのか、定量的に汚染度を評価することも可能である。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の内容は実施例の内容に限定されるべきではない。
【００４７】
（実施例１）ＰＡＨｓに汚染された土壌の汚染浄化の評価
石炭使用に起因する複合的な未同定のPAHsに汚染された土壌を原土とし、この土壌を３０日間、水と空気を供給して、土着微生物利用によるバイオレメディエーション（生物的土壌浄化）をおこなった土壌に対して、汚染度（浄化度）の評価を試みた。
【００４８】
原土、処理土を１ｋｇずつ別々に厚手のビニール袋内でよく混ぜ合わせて、それぞれ均質化した後、20ｇ（湿重量）ずつ採取した。無水硫酸ナトリウムを用いて脱水後、アセトン+ジクロロメタン（1：１体積比）を用いてソックスレー抽出をおこなった。抽出した試料を乾固後、ＤＭＳＯ1ｍＬに溶解した。このＤＭＳＯに溶解した試料をＤＭＳＯ濃度が1％以下になるように、培養細胞であるｒａｔＨ4ＩＩＥ細胞の培養液に添加した。対照として、0.1μｍｏｌ／Ｌから1000μｍｏｌ／Ｌのベンゾ（ｋ）フルオランセン（ＰＡＨｓの一種）を含む培養液の影響についても同様の試験を実施した。
【００４９】
評価方法としては、酵素活性の増加、中でもＥＲＯＤ活性の増加により評価した。
ラットの肝がん由来培養細胞 H4IIEをα-MEM+10% FBSで5%CO2存在下３７℃で培養した。２４ウェルプレート各ウェルへ 3×104 cells/mL  で 200μlずつ添加後、上記培養液を800μlずつ添加した。ほぼ80% コンフルエントになった状態で、緩やかに培養液を取り除き、試験試料が入った上記培養液を１ｍｌずつ添加、４８時間培養した。培養液を緩やかに抜き取り、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で2回各ウェルを洗浄した。  続いて、5  μｍｏｌ／Ｌ  ジヒドロクマリン（Dihydrocoumarin）、   ４  μｍｏｌ／Ｌ  エトキシレゾルフィン（Ethoxyresorufin） （PBSに溶解したもの） を  400μl ずつ各ウェルへ添加した。  ３７℃で３０  分間インキュベート後、ピペッティングにより各ウェルの試験液と細胞をエッペンチューブへ回収、氷温で反応停止した。蛍光光度計（Ｆ−２０００、日立）を用いて、励起波長  ５３０ｎｍ、  蛍光波長  ５８8ｎｍ  にて生成した  レゾルフィン（resorufin）  による蛍光を測定した。対照としての0ｍｏｌ／Ｌから1000μｍｏｌ／Ｌのベンゾ（ｋ）フルオランテンを含む培養液の影響についてそのＥＲＯＤ活性の誘導結果を図１に示す。
【００５０】
ＥＲＯＤ活性は、ベンゾ（ｋ）フルオランテン無添加の場合の588ｎｍの蛍光光度を基準とした588ｎｍの蛍光光度の増加量として測定した。0.1μｍｏｌ／Ｌから1000μｍｏｌ／Ｌのベンゾ（ｋ）フルオランテンの影響を受けて、シトクロムＰ-450の酵素活性、すなわちＥＲＯＤ活性が増加していることがわかる。一方、原土からの抽出物質、３０日間処理土からの抽出物質を、ＤＭＳＯに溶解した試料を培養液に添加した場合のＥＲＯＤ活性の誘導結果を以下の表１に示す。
【００５１】
【表１】
2006110479.tif 000002
原土からの抽出物質を添加した場合、588ｎｍ  蛍光光度増加は 0.03 であり、これは、複合的なＰＡＨｓによる原土の汚染が、図1のようにベンゾ（ｋ）フルオランセンでいうと30μｍｏｌ／Ｌ程度に相当する汚染土であると評価できる。一方、３０日間処理土からの抽出物質を添加した場合、蛍光光度増加は0であった。これは図1のベンゾ（ｋ）フルオランセンの活性でいうと0.1μｍｏｌ／Ｌ未満に相当する。したがって、複合的なＰＡＨｓによる汚染が、ベンゾ（ｋ）フルオランセンで置き換えると３０μｍｏｌ／Ｌ相当から、0.1μｍｏｌ／Ｌ未満相当に減少しており、相対的に浄化がすすんだことが評価できた。
【００５２】
（実施例２）ＰＣＢに汚染された土壌の汚染浄化の評価
有機塩素化合物であるＰＣＢに汚染された原土、および、この土壌に３０日間、水を供給して、土着微生物利用によるバイオレメディエーションをおこなった土壌に対して、汚染度（浄化度）の評価を試みた。
【００５３】
原土、処理土を１ｋｇずつ別々に厚手のビニール袋内でよく混ぜ合わせて、それぞれ均質化した後、20ｇ（湿重量）ずつ採取した。無水硫酸ナトリウムを用いて脱水後、アセトン+ジクロロメタン（1：１体積比）を用いてソックスレー抽出をおこなった。抽出した試料を乾固後、ＤＭＳＯ1ｍＬに溶解した。このＤＭＳＯに溶解した試料をＤＭＳＯ濃度が1％以下になるように、ｒａｔＨ4ＩＩＥ細胞の培養液に添加した。対照として、１ｎｍｏｌ／Ｌから10μｍｏｌ／Ｌの３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ（四塩化ビフェニル）を含む培養液の影響についても同様の試験を実施した。
【００５４】
ラットの肝がん由来培養細胞 H4IIEをα-MEM+10% FBSで5%CO2存在下３７℃で培養した。２４ウェルプレート各ウェルへ 3×104 cells/mL  で 200μlずつ添加後、上記培養液を800μlずつ添加した。ほぼ80% コンフルエントになった状態で、緩やかに培養液を取り除き、試験試料が入った上記培養液を１ｍｌずつ添加、４８時間培養した。培養液を緩やかに抜き取り、ＰＢＳで2回各ウェルを洗浄した。  続いて、5  μｍｏｌ／Ｌ  ジヒドロクマリン（Dihydrocoumarin）、４  μｍｏｌ／Ｌ  エトキシレゾルフィン（Ethoxyresorufin）（リン酸バッファに溶解したもの）を  400μl ずつ各ウェルへ添加した。  ３７℃で３０  分間インキュベート後、ピペッティングにより各ウェルの試験液と細胞をエッペンチューブへ回収、氷温で反応停止した。蛍光光度計（Ｆ−２０００、日立）を用いて、励起波長  ５３０ｎｍ、  蛍光波長  ５８8ｎｍ  にて生成した  レゾルフィン（resorufin）  による蛍光を測定した。対照としての0ｎｍｏｌ／Ｌから10μｍｏｌ／Ｌの３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ（四塩化ビフェニル）を含む培養液の影響についてそのＥＲＯＤ活性の誘導結果を図２に示す。ＥＲＯＤ活性は、３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ（四塩化ビフェニル）無添加の場合の588ｎｍの蛍光光度を基準とした588ｎｍの蛍光光度の増加量として測定した。１ｎｍｏｌ／Ｌから10μｍｏｌ／Ｌの３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ（四塩化ビフェニル）の影響を受けて、シトクロムＰ-450の酵素活性、すなわちＥＲＯＤ活性が増加していることがわかる。一方、原土からの抽出物質、３０日間処理土からの抽出物質を、ＤＭＳＯに溶解した試料を培養液に添加した場合のＥＲＯＤ活性の誘導結果を以下の表２に示す。
【００５５】
【表２】
2006110479.tif 000003
【００５６】
原土からの抽出物質を添加した場合、588ｎｍ  蛍光光度増加は 0.0５ であり、これは、図２の３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ（四塩化ビフェニル）の活性でいうと１０0ｎｍｏｌ／Ｌ程度に相当する汚染土であることが評価された。一方、３０日間処理土からの抽出物質を添加した場合、蛍光光度増加は0であった。これは図２の３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ（四塩化ビフェニル）の活性でいうと1ｎｍｏｌ／Ｌ未満に相当するので、浄化された土壌であることが評価できた。
【００５７】
（実施例３）ＰＡＨｓに汚染された土壌の汚染浄化の評価
未同定のPAHsと有機塩素化合物に汚染された土壌を原土とし、この土壌を６０日間、土着微生物利用によるバイオレメディエーションをおこなった土壌に対して、それぞれ毒性成分を濃化した粒子を回収して、汚染度（浄化度）の評価を試みた。
【００５８】
原土、処理土を１ｋｇずつ別々に密度１ｇ／ｃｍ3の水を４Ｌ加えて、３０分間よく撹拌し、スラリー状にした。撹拌した土壌と水のスラリーは、１時間静置して、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子を、土壌粒子の層の上部にある液体層に浮かせること、および、土壌粒子の層の上部に堆積させることにより土壌粒子から分離した。液体層の上部に浮かんだ、PAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子については、ろ過により回収した。土壌粒子の層の上部に堆積したPAHsあるいは有機塩素化合物を含有する粒子については、水をポンプを用いて除去後、回収した。上述のように回収した汚染物質を含有する粒子を無水硫酸ナトリウムを用いて脱水した後、ジクロロメタン：アセトン（１：１体積比）を用いるソックスレー抽出により抽出した。抽出した試料を乾固後、ＤＭＳＯ1ｍＬに溶解した。このＤＭＳＯに溶解した試料をＤＭＳＯ濃度が1％以下になるように、ＣＹＰ１Ａ遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼのｃＤＮＡをつないだ構造のレポーター遺伝子を有するラット肝細胞の培養液に添加した。この細胞はα-MEM+10% FBSで5%CO2存在下３７℃で９６ウェルプレートでコンフルエントになるように培養したものである。ＤＭＳＯに溶解した抽出物添加後も5%CO2存在下３７℃で４時間培養した。培養後、Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ルシフェリンを基質とするルシフェラーゼ活性の測定を行った。Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭに含まれる試薬により細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性による発光をルミノメータを用いて測定した。結果を図３に示す。原土から回収した粒子の抽出物質と比較して、処理土から回収した粒子の抽出物質ではルシフェラーゼ活性が相対的に低くなっており、浄化がすすんでいることが評価できた。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】は実施例１に係る、ベンゾ（ｋ）フルオランセンによるＥＲＯＤ活性の結果をあらわす図である。
【図２】は実施例2に係る、３，３’，４，４’−Ｔ４ＣＢ（四塩化ビフェニル）によるＥＲＯＤ活性の結果をあらわす図である。
【図３】は実施例３に係る、ルシフェラーゼ活性の結果をあらわす図である。
【図１】
2006110479.tif 000004
【図２】
2006110479.tif 000005
【図３】
2006110479.tif 000006