(57)【要約】      （修正有）【課題】  生体又は生体組織を迅速且つ正確に正常化できる生体組織正常化方法を提供する。【解決手段】  生体１００の異なる部位に１対のパッド素子１、２を付着し、この１対のパッド素子１、２間に電源からの電流を電流制御手段３が通電して生体又は生体組織における正常化機構を蛋白質を介して活性化させるようにしているので、疾患の異常な生体又は生体組織の正常化を迅速且つ正確に行うことができるという効果を奏する。パッドには発熱層を加え、更に効果を高めることもできる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微弱な直流電流を所定の間隔で間歇的に生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における正常化機構を蛋白質を介して活性化させることを
特徴とする生体組織正常化方法。
【請求項２】
前記請求項１に記載の生体組織正常化方法において、
前記直流電流が通電される生体又は生体組織に温熱を加えることを
特徴とする生体組織正常化方法。
【請求項３】
前記請求項１又は２に記載の生体組織正常化方法において、
前記蛋白質が、ユビキチン化蛋白質であることを
特徴とする生体組織正常化方法。
【請求項４】
前記請求項１ないし３のいずれかに記載の生体組織正常化方法において、
前記蛋白質が、熱ショック蛋白質であることを
特徴とする生体組織正常化方法。
【請求項５】
前記請求項１ないし４のいずれかに記載の生体組織正常化方法において、
前記蛋白質が、ＩκＢ蛋白質であることを
特徴とする生体組織正常化方法。
【請求項６】
前記請求項１ないし５のいずれかに記載の生体組織正常化方法において、
前記直流電流の間歇的な間隔が、３０Ｈｚないし１００Ｈｚであることを
特徴とする生体組織正常化方法。
【請求項７】
前記請求項２ないし６のいずれかに記載の生体組織正常化方法において、
前記温熱が、３８℃以上４５℃以下であることを
特徴とする生体組織正常化方法。
【請求項８】
生体又は生体組織の異なる部位に１対のパッド素子を付着し、当該１対のパッド素子間に電流を電流制御手段が通電して前記生体を治療する治療装置において、
前記パッド素子が生体又は生体組織の表面に付着する導電性のシート体からなる導電層と、当該導電層の背面側に配設され、伝熱特性を有し且つ絶縁性のシート体からなる絶縁層と、当該絶縁層の背面側に配設され、両端部分に１対の電極が配設され、当該１対の電極間に抵抗が配設される発熱層とを備え、
前記電流制御手段が、前記１対のパッド素子における各導電層間に微弱な直流電流を所定の間隔で間歇的に供給制御すると共に、前記１対のパッド素子の各発熱層における各１対の電極間に電流を供給制御することを
特徴とする治療装置。
【請求項９】
前記請求項８に記載の治療装置において、
前記パッド素子の発熱層が、１対の電極が各々短冊状に形成され、当該電極間の抵抗が短冊状の電極に平行な方向に配向性を有するカーボン繊維で形成されることを
特徴とする治療装置。
【請求項１０】
前記請求項８又は９に記載の治療装置において、
前記各導電層に供給される直流電流が、５０Ｈｚないし６０Ｈｚの周期で間歇的に供給制御されることを
特徴とする治療装置。
【請求項１１】
前記請求項８ないし１０のいずれかに記載の治療装置において、
前記１対のパッド素子の各発熱層が、３８℃以上４５℃以下に加熱することを
特徴とする治療装置。
【請求項１２】
前記請求項８ないし１１のいずれかに記載の治療装置において、
前記導電層に供給される直流電流が、１分以上で任意の供給時間とし、当該供給時間に反比例した電圧値を０．４Ｖ以下０．０１Ｖ以上の間で設定して印加されることを
特徴とする治療装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体又は生体組織を活性化させる生体組織正常化方法に関し、特に生体又は生体組織の正常化機構を活性化させる生体組織正常化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、あらゆる細胞に存在するユビキチン（Ubiquitin）は、その機能が解明され、不要となった蛋白質に結合してその目印となる役目を有する。このユビキチンが結合した不要な蛋白質（ユビキチン化蛋白質）は、このユビキチンを目印として酵素プロテアソームに取り込まれて分解される。このような不要な蛋白質を分解する生体正常化機構は、ユビキチン・プロテアソームシステムとして働き、細胞の分裂、ＤＮＡの修復、蛋白質の品質管理、免疫等の多く組織の正常化に関与している。
また、生体正常化機構は、電気温熱式治療器により、生体の所定部位を加熱して熱ショック蛋白質（Heat Shock Protein;以下「ＨＳＰ」という。）を発現誘導して活性化される。
【０００３】
前記ＨＳＰは、ストレス蛋白質とも呼ばれる分子量が数万から約１５万の一群の蛋白質を指し、分子量によりいくつかのファミリーに分類されている。ＨＳＰは、新生蛋白質、変性蛋白質及び異常蛋白質の疎水部分に非共有結合して、蛋白質の折り畳み、細胞内小器官への輸送、変性蛋白質の再折り畳みや分解を介助して、細胞内蛋白質の品質管理を行い、細胞内に異常蛋白質や変性蛋白質が蓄積するのを防いでいる。これらの機能は分子シャペロンと総称されており、ＨＳＰは熱ショックをはじめさまざまな物理的・化学的な傷害因子により誘導される。ＨＳＰを多く発現した細胞は、さまざまな傷害因子に対して強い抵抗力を獲得することは既に確立された事実である。
【０００４】
ＨＳＰ７０ファミリーに属する分子量７２キロダルトンのＨＳＰ７０は、ストレスにより初めて誘導される蛋白質であり、最も研究が進んでいる。細胞を熱ショックなどの非致死的なストレスに曝すことによりＨＳＰ７０を予め過剰発現させておくと、致死的な傷害因子に対しても強い抵抗性を示し、細胞は生き延びることができる。
【０００５】
この抵抗性は、分子シャペロンの機能を介して細胞内に異常蛋白質や変性蛋白質が蓄積するのを防ぐことに加えて、ストレスを受けた細胞のミトコンドリアなどの細胞内小器官の機能を保全し、細胞壊死を抑制して炎症反応を抑え、アポトーシスを抑制して細胞損失を抑えることが示されている（Samali,A. et ai., Cell Stress & Chaperones 3:228, 1998）。
【０００６】
さまざまな病的状態では、細胞は物理的・化学的ストレスに曝される。実験動物を用いた多くの疾患モデルにおいて、ＨＳＰ７０を何らかの方法で過剰に発現させると、傷害が軽減されることが明らかにされており、ＨＳＰ７０の臨床応用についての期待が高まっている（Minowada,G. et al., J.Clin.Invest., 95:2,1995とその引用文献を参照）。
【０００７】
ヒトの疾患との関連で、細胞が遭遇するさまざまなストレスについて言及すると、まず、代表的なストレスとして虚血があげられる。予め実験動物に全身の熱ショック負荷を行いＨＳＰ７０を過剰発現させておくと、脳動脈や冠状動脈を結紮した場合でも、脳（Kitagawa,K. et al., J.Cereb. Blood Flow Metab., 11:449,1991）や心臓（Donnelly,T.J. et al., Circulation 85 :1048,1992）の梗塞部位が縮小することが示されている。また、ＨＳＰ７０の遺伝子導入を行ったマウスでも、心筋梗塞の抑制効果が示されている（Maber, M.S. et al., J.Clin.Invest.,95:1446,1995）。ＨＳＰ７０の虚血による細胞障害の抑制効果は、脳と心臓に限らず総ての臓器についても適応される。
【０００８】
活性酸素・フリーラジカルは、感染、炎症、変性疾患、自己免疫疾患、動脈硬化、老化にともない産生量が増加して細胞障害を引き起こす。ＨＳＰ７０は、これらの活性酸素・フリーラジカルによる細胞障害を抑制することが示されている（Polla B.S. et al., Proc.Natl.Acad Sci.USA,93:6458,1996）。
【０００９】
虚血・再灌流傷害は、再灌流時の活性酸素の産生亢進が主要な病因の一つとして確率されており、ＨＳＰが脳、心臓、肝、小腸などにおいて軽減されることが知られている。このＨＳＰによる保護作用は、総ての臓器に適応される。また、臓器移植は、虚血再灌流傷害の典型例の一つである。事実、ＨＳＰ７０を過剰発現させておくと、皮膚の移植片の生着率が改善することが示されており（Koenig,W.J. et al., Plast Recontsr. Surg., 90:659,1992）、肝移植の際にも、移植肝がＨＳＰ７０を多く発現するほど急性拒絶反応が軽減することも報告されている（Flohe,S. et al., Traspl.lnt., 11:89,1998）。また、紫外線、放射線、重金属、アルコール、抗癌剤やパラコートは、主に活性酸素・フリーラジカルによる傷害を引き起こす。ＨＳＰ７０は、紫外線、放射線による皮膚、粘膜、目のレンズや網膜の傷害の予防と治療、さらにアルコール性臓器傷害、重金属や薬物中毒の治療効果も期待できる。
【００１０】
また、癌細胞は、ＨＳＰ７０を細胞表面に発現し、このＨＳＰ７０がＮＫ細胞を活性化することから（kurosawa,S. et al., Eur.J.lmmunol., 23:1029,1993）、このＨＳＰ７０の発現を介して癌免疫を賦活化させることもできる。また、微生物の侵入に対しても、宿主マクロファージのＨＳＰの発現が強いほど感染抵抗性が増すことも示されており（Denagel,D.C. et al., Crit.Rev.lmmunol., 13:71, 1993）、免疫賦活−生体防御能の増強効果も期待できる。
【００１１】
ＨＳＰ７０による細胞内蛋白質の品質管理の働きに注目して、細胞内に異常蛋白質が蓄積する疾患、例えば、βアミロイドの沈着によるアルツハイマー病、異常プリオン蛋白質の沈着するクロイツフェルド・ヤコブ病、さらにアミロイドーシス、ウィルソン病、パーキンソン病などの変性疾患の予防と治療にも効果が期待できる。
【００１２】
また、外科手術、外傷などの生体侵襲などの身体的ストレスに対する耐性効果が期待されるばかりでなく、精神的ストレスによるアレルギー疾患、ストレス潰瘍、慢性炎症性疾患などの発症や増悪を抑制する効果も期待できる。ＨＳＰ７０は、敗血症による多臓器不全・ショックの軽減（Hauser,G.J. et al., Am.J.Physiol., 271:H2529,1996）や、成人呼吸窮迫症候群（adult respiratory distress syndrome）の予後を改善することも報告されており（Villar,J. et al., Am.Rev.Respir.Dis., 147:177,1993）、これらの重度の生体侵襲時の治療薬としてもその効果が期待される。
【００１３】
ＨＳＰは、細胞内（生体内）物質であるため、その誘導にともない副作用が発生する可能性は少ない。またＨＳＰ７０の過剰発現が原因となる疾患も報告されていない。動物実験では、全身の熱ショック、一過性の阻血操作、ＨＳＰ７０の遺伝子導入などが行われているが、実際の臨床に応用することは困難である。このため、組織や細胞に害を与えず、しかも選択的にＨＳＰを誘導する機器は臨床的にも優れた治療装置といえる。
【００１４】
転写因子は外界からのシグナル伝達系の最下位に位置するため、それを標的にすることで副作用を最小限にとどめることができると考えられる。ＮＦ−κＢは転写因子の一つであり、細胞質内では阻害蛋白質であるＩκＢと結合して不活性化されている。細胞が種々の刺激を受けるとＩκＢがリン酸化を受け、それに引き続きユビキチン化を受けてプロテアソームにより分解される。遊離状態となったＮＦ−κＢは核へ移行し、さまざまな遺伝子を特異的に活性化する。ＮＦ−κＢの制御下にある遺伝子には、免疫系の細胞で重要な働きをするサイトカイン（ＴＮＦ−α，β，ＩＬ−２，６，８等）等があげられる。これらの遺伝子は、細胞が刺激を受けた際に発現誘導されるため、免疫応答にＮＦ−κＢが深く関わっていることが分かる。しかし、その炎症応答が過剰になってしまうと、さまざまな疾患を引き起こすことが知られている。例えば、リウマチや喘息、皮膚炎等さまざまな炎症性の疾患、自己免疫疾患、ウィルス性疾患、動脈硬化症等などの疾患にＮＦ−κＢが関与していることから、ＮＦ−κＢを制御することの意義は臨床的にも極めて大きいものである（Anning Lin. Cancer Biology, 2003, Aggarwal BB et al. Indian J Exp Biol ,2004, Alok C. Bharti et al. Biochemical Pharmacology, 2002）。
【００１５】
【非特許文献１】Samali,A. et ai., Cell Stress & Chaperones 3:228, 1998
【非特許文献２】Minowada,G. et al., J.Clin.Invest., 95:2,1995とその引用文献
【非特許文献３】Kitagawa,K. et al., J.Cereb. Blood Flow Metab.,11:449,1991
【非特許文献４】Donnelly,T.J. et al., Circulation 85 :1048,1992
【非特許文献５】Maber, M.S. et al., J.Clin.Invest.,95:1446,1995
【非特許文献６】Polla B.S. et al., Proc.Natl.Acad Sci.USA,93:6458,1996
【非特許文献７】Koenig,W.J. et al., Plast Recontsr. Surg., 90:659,1992
【非特許文献８】Flohe,S. et al., Traspl.lnt., 11:89,1998
【非特許文献９】kurosawa,S. et al., Eur.J.lmmunol., 23:1029,1993
【非特許文献１０】Denagel,D.C. et al., Crit.Rev.lmmunol., 13:71, 1993
【非特許文献１１】Hauser,G.J. et al., Am.J.Physiol., 271:H2529,1996
【非特許文献１２】Villar,J. et al., Am.Rev.Respir.Dis., 147:177,1993
【非特許文献１３】Anning Lin. Cancer Biology, 2003
【非特許文献１４】Aggarwal BB et al. Indian J Exp Biol ,2004
【非特許文献１５】Alok C. Bharti et al. Biochemical Pharmacology, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、前記ユビキチン・プロテアソームシステムに基づく生体正常化機構は、生体組織の正常（健康）時においてはあらゆる細胞に存在するユビキチンの量が十分でなく、不要となった蛋白質を迅速且つ確実に分解して排除できないという課題を有していた。また、生体組織の異常（疾患）時においては、ユビキチンが結合した不要となった蛋白質を分解して排除することから、細胞内のユビキチンも減少することとなり、この異常（疾患）の細胞が計画的な細胞死に至らず、腫瘍等の異常な細胞が減少せず異常（疾患）を改善できないという課題を有していた。
【００１７】
他方、電気温熱式治療器等によるＨＳＰに基づく生体正常化機構は、生体に対して極めて高い温度（例えば、４２℃）を１時間以上加熱しなければＨＳＰが十分に発現誘導せず活性化されないことから、加熱による生体組織の損傷等を伴い、迅速且つ正確な生体の正常化ができないという課題を有していた。
さらに、ＮＦ−κＢの活性を制御するＩκＢの量及びリン酸化状態に影響することにより生体を正常化する方法はなかった。
【００１８】
本発明は、前記課題を解消するためになされたもので、生体又は生体組織を迅速且つ正確に正常化できる生体組織正常化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明に係る生体組織正常化方法は、微弱な直流電流を所定の間隔で間歇的に生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における正常化機構を蛋白質を介して活性化させるものである。このように本発明においては、微弱な直流電流を所定の間隔で間歇的に生体又は生体組織に通電し、当該生体又は生体組織における正常化機構を蛋白質を介して活性化させることにより、疾患の異常な生体又は生体組織の正常化を迅速且つ正確に行うことができるという効果を奏する。
【００２０】
また、本発明に係る生体組織正常化方法は必要に応じて、前記直流電流が通電される生体又は生体組織に温熱を加えるものである。このように本発明においては、直流電流が通電される生体又は生体組織に温熱を加えることにより、生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２１】
また、本発明に係る生体組織正常化方法は必要に応じて前記蛋白質が、ユビキチンであるものである。このように本発明においては、蛋白質が、ユビキチンであることから生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２２】
また、本発明に係る生体組織正常化方法は必要に応じて、前記蛋白質が、熱ショック蛋白質であるものである。このように本発明においては、生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２３】
また、本発明に係る生体組織正常化方法は必要に応じて、前記蛋白質が、ＩκＢ蛋白質であるものである。このように本発明においては、蛋白質が、ＩκＢ蛋白質であることから生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２４】
また、本発明に係る生体組織正常化方法は必要に応じて、前記直流電流の間歇的な間隔が、３０Ｈｚないし１００Ｈｚであるものである。このように本発明においては、直流電流の間歇的な間隔が、５０Ｈｚないし６０Ｈｚであることから生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２５】
また、本発明に係る生体組織正常化方法は必要に応じて、前記温熱が、３８℃以上４５℃以下であるものである。このように本発明においては、温熱が、３８℃以上４５℃以下であることから生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２６】
本発明に係る治療装置は、生体又は生体組織の異なる部位に１対のパッド素子を付着し、当該１対のパッド素子間に電流を電流制御手段が通電して前記生体を治療する治療装置において、前記パッド素子が生体又は生体組織の表面に付着する導電性のシート体からなる導電層と、当該導電層の背面側に配設され、伝熱特性を有し且つ絶縁性のシート体からなる絶縁層と、当該絶縁層の背面側に配設され、両端部分に１対の電極が配設され、当該１対の電極間に抵抗が配設される発熱層とを備え、前記電流制御手段が、前記１対のパッド素子における各導電層間に微弱な直流電流を所定の間隔で間歇的に供給制御すると共に、前記１対のパッド素子の各発熱層における各１対の電極間に電流を供給制御するものである。
【００２７】
このように本発明においては、生体又は生体組織の異なる部位に付着する１対のパッド素子が生体又は生体組織の表面に付着する導電性のシート体からなる導電層、伝熱特性を有し且つ絶縁性のシート体からなる絶縁層、両端部分に１対の電極が配設され、当該１対の電極間に抵抗が配設される発熱層を順次積層して形成され、前記各導電層間に微弱な直流電流を所定の間隔で間歇的に供給制御すると共に、前記各発熱層における各１対の電極間に電流を電流制御手段が供給制御することにより、電流が通電される生体又は生体組織に同時に加熱できることとなり、生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２８】
また、本発明に係る治療装置は必要に応じて、前記パッド素子の発熱層が、１対の電極が各々短冊状に形成され、当該電極間の抵抗が短冊状の電極に平行な方向に配向性を有するカーボン繊維で形成されるものである。このように本発明においては前記パッド素子の発熱層が、１対の電極が各々短冊状に形成され、当該電極間の抵抗が短冊状の電極に平行な方向に配向性を有するカーボン繊維で形成されることにより、電極間がカーボン繊維により短絡されることなくこの各平行なカーボン繊維相互間の適度な抵抗値により発熱できることとなり、生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００２９】
また、本発明に係る治療装置は必要に応じて、前記各導電層に供給される直流電流が、５０Ｈｚないし６０Ｈｚの周期で間歇的に供給制御されるものである。このように本発明においては、各導電層に供給される直流電流が、５０Ｈｚないし６０Ｈｚの周期で間歇的に供給制御されることにより、生体又は生体組織による電流刺激を効果的に行うことができることとなり、生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００３０】
また、本発明に係る治療装置は必要に応じて、前記１対のパッド素子の各発熱層が、３８℃以上４５℃以下に加熱するものである。このように本発明においては、１対のパッド素子の各発熱層が、３８℃以上４５℃以下に加熱することにより、生体又は生体組織による適度な温熱刺激を与えることができることとなり、生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【００３１】
また、本発明に係る治療装置は必要に応じて、前記導電層に供給される直流電流が、１分以上で任意の供給時間とし、当該供給時間に反比例した電圧値を０．４Ｖ以下０．０１Ｖ以上の間で設定して印加されるものである。このように本発明においては、前記導電層に供給される直流電流が、１分以上で任意の供給時間とし、当該供給時間に反比例した電圧値を０．２Ｖ以下０．０３Ｖ以上の間で設定して印加されることにより、電流刺激と温熱刺激とを適度にバランスをとることができることとなり、生体又は生体組織の正常化をより迅速且つ正確に行うことができるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の一実施形態に係る治療装置を生体組織正常化方法と共に、図１ないし図３に基づいて説明する。この図１は本実施形態に係る治療装置の全体概略構成図、図２は図１に記載の治療装置におけるパッド素子の平面図、図３は図２に記載のパッド素子のＡ−Ａ線断面図、図４は図３に記載のパット素子のＢ−Ｂ線断面図を示す。
【００３３】
前記各図において本実施形態に係る治療装置は、生体１００の異なる部位に１対のパッド素子１、２を付着し、この１対のパッド素子１、２間に電源２００からの電流を電流制御手段３が通電して前記生体１００を治療する治療装置において、前記パッド素子１、２が、生体１００表面に付着する導電性のシート体からなる導電層１１、２１と、この導電層１１、２１の背面側に配設され、伝熱特性を有し且つ絶縁性のシート体からなる絶縁層１２、２２と、この絶縁層１２、２２の背面側に配設され、両端部分に１対の電極１３ａ・１３ｂ、２３ａ・２３ｂが配設され、この１対の電極１３ａ・１３ｂ、２３ａ・２３ｂ間に抵抗１３ｃ、２３ｃが配設される発熱層１３、２３と、この発熱層１３、２３の背面最外側に配設され、断熱特性を有し且つ絶縁性のシート体からなる被覆層１４、２４とを備え、電流制御手段３が、前記１対のパッド素子１、２における各導電層１１、２１間に微弱な直流電流を所定の間隔で間歇的に供給制御すると共に、前記１対のパッド素子１、２の各発熱層１３、２３における各１対の電極１３ａ・１３ｂ、２３ａ・２３ｂ間に直流電流を供給制御する構成である。
【００３４】
前記発熱層１３、２３は、１対の電極１３ａ・１３ｂ、２３ａ・２３ｂが各々短冊状に形成され、この電極１３ａ・１３ｂ、２３ａ・２３ｂ間の抵抗１３ｃ、２３ｃが短冊状の電極１３ａ・１３ｂ、２３ａ・２３ｂに平行な方向に配向性を有するカーボン繊維１６でで形成され、加熱温度４２℃に加熱される構成である。
前記電流制御手段３は、導電層１１、２１に対して５５Ｈｚの周期で間歇的にＯＮ状態となるように１０分以上３０分以下の間だけ微弱電流を供給し、印加電圧を０．２Ｖ以下０．０３Ｖ以上に制御する構成である。
【００３５】
前記電流制御手段３が生体又は生体組織に通電する微弱電流、印加電圧及び間歇的な通電（印加）の周波数についてヒトを対象とした試験結果に基づいて説明する。このヒト対象の試験はヒトの両足の印加部位に０．２［Ｖ］から０．４［Ｖ］の印加電圧を印加し、ヒトの抵抗値（ヒト口腔内の抵抗値）を約０．２［ＭΩ］とすると、ヒトの体内での電圧降下（電位差）が０．１［Ｖ］ないし０．２［Ｖ］が発生している。この電位差０．１［Ｖ］ないし０．２［Ｖ］及びヒトの抵抗値約０．２［ＭΩ］より前記微弱電流は、０．５［μＡ］ないし１．０［μＡ］が前記電流制御手段３により通電制御される。
【００３６】
このヒト対象の試験において、被試験者におけるヒトの両足に印加電圧０．３［Ｖ］を印加し、周波数を３５［Ｈｚ］から１５０［Ｈｚ］で変化させて被試験者の感覚（快適感〜不快適感）を次の通り検出した。
【００３７】
まず、３５Ｈｚでは、まだ違和感があり、長時間の処理で気持ちが悪くなることが解った。４５Ｈｚでは、しびれ感が強く、気持ちが悪く（不快）感じ、長時間の処理が無理であることが解った。５０Ｈｚでは、快適感の許容範囲であることが解った。５５Ｈｚでは、極めて快適であることが解った。６０Ｈｚでは、快適感の許容範囲であることが解った。
【００３８】
また、６５Ｈｚでは、少し刺激が感じられなくなり、０．３５０Ｖに挙げると５５Ｈｚ時に近いような刺激を感じることができるものの、ただ、最適ではないことが解った。７０Ｈｚでは、ほとんど刺激を感じられないことが解った。７５Ｈｚでは、ほとんど刺激を感じられず、印加電圧を０．４００Ｖに上げると少し刺激を感じることが解った。１００Ｈｚでは、全く刺激を感じられず、印加電圧を０．４５０Ｖに上げると少し刺激を感じることが解った。１５０Ｈｚでは、全く刺激を感じられず、印加電圧を０．６００Ｖにまで上げたが感じないことが解った。
【００３９】
また、印加電圧を０．２５［Ｖ］、０．３［Ｖ］、０．３５［Ｖ］及び０．４［Ｖ］とした場合におけるこの直流電圧を間歇印加する周波数の最適周波数を試験にて求めた。この印加電圧が０．２５０［Ｖ］の場合に周波数を３５＜Ｈｚ＜５０で変化させると、３５［Ｈｚ］以下はしびれ感が強く気持ちが悪く感じ、５０［Ｈｚ］以上では感じない。また、印加電圧が０．３００［Ｖ］の場合に周波数を４５＜Ｈｚ＜６０で変化させると、４５［Ｈｚ］以下はしびれ感が強く気持ちが悪く感じ、７５［Ｈｚ］以上では感じない。また、印加電圧が０．４００［Ｖ］の場合に周波数を６５＜Ｈｚ＜７５で変化させると、７５［Ｈｚ］以下は強く筋肉の収縮が現れるか、気持ちが悪く感じ、７５［Ｈｚ］以上では感じない。
【００４０】
以上の試験結果より、印加電圧が０．３［Ｖ］で周波数５５（±１）［Ｈｚ］が最適周波数であり、５０［Ｈｚ］ないし６０［Ｈｚ］の範囲で電流制御手段３が制御することが望ましいことが解る。
また、生体又は生体組織に対する電気信号の機能から、前記電流制御手段３は次の通り微弱電流を制御することできる。即ち、生体又は生体組織の非興奮性細胞に生体電流に相当する微弱電流を強制的に通電して、体内のタンパク質を介して活性化するものである。このように非興奮性細胞にのみ生体電流に相当する微弱電流を通電し、筋肉性細胞等の興奮性細胞に生体電流に相当する外部からの電流を通電しないので収縮等の刺激を与えることがない。
従って、電流制御手段３は、興奮性細胞が、例えば筋肉性細胞を不快に収縮させない電流レベルの微弱電流を通電するように制御する。
【００４１】
次に、本実施形態における治療装置の動作により発現する蛋白質の誘導効果をヒトの培養細胞系、ヌードマウス、ΔＦ５０８ＣＦＴＲを安定高発現させた培養細胞系について、以下の実験に基づいて具体的に説明する。
【実施例】
【００４２】
（検討項目）
（１）ヒトの培養細胞系における評価を以下のi)、ii) 、iii)の三点について行った。
【００４３】
i) ＨＳＰ７０の誘導
ii) 細胞障害の有無
iii) ユビキチン化の促進
（２）ヌードマウスにおける評価を以下のi)、ii) 、iii)、ｉｖ）の四点について行った。
【００４４】
i) 一回処置における正常組織中のＨＳＰ７０の誘導
ii) 一回処置による腫瘍組織中のＨＳＰ７０の誘導
iii) 腫瘍組織におけるユビキチン化の促進
iv) １日１回処置あるいは１日１回の3日間処置による正常組織中のＩκＢ−α及びそのリン酸化体の発現
【００４５】
（３）ΔＦ５０８ＣＦＴＲを安定高発現させた培養細胞系における評価を以下のi)、ii) の二点について行った。
i) ＨＳＰ７０の誘導
ii) ユビキチン化の促進
【００４６】
（４）２型糖尿病モデルマウス（高脂肪食負荷マウス）における評価を以下のi）、ii）、  iii）、iv）、v）、vi）、vii）、viii）、ix）の九点について行った。以下の検討は，本発明に係る生体組織正常化方法を１週間に２回処置し続けて１０週間後に行った。
ｉ）空腹時血糖値
ii）インスリン値
iii）血清アディポネクチン値
iv）グルコース負荷試験
ｖ）インスリン負荷試験
vi）内臓脂肪の組織重量
vii）皮下脂肪の組織重量
viii）肝重量
ix）褐色脂肪細胞中のＵＣＰ１ｍＲＮＡの誘導
【００４７】
（５）急性胃潰瘍モデルマウスにおける評価を以下の点について行った。以下の検討は、本発明に係る生体組織正常化方法を１週間に２回処置し続けて２週間後に行った。
ｉ）胃粘膜損傷割合
【００４８】
（６）正常マウスにおける評価を以下の点について行った。以下の検討は、本発明を最初の血球測定２週間前から１週間に１回処置し続けて２週間ごとに行った。
ｉ）血液１ｍＬあたりの白血球数
【００４９】
（実施方法）
１）ＨＳＰ７０の測定はマウス抗ＨＳＰ７０モノクローナル抗体を用いたイムノブロットを行い、結合した抗体を増感化学発光法（Enhanced chemiluminescence;ＥＣＬ）ウエスタンブロット検出キット(アマシャム社製)で検出し測定した。ローディングコントロールとしてカルネキシン（ＣＮＸ）を検出した。
２）ユビキチン化蛋白質の測定は、マウス抗ユビキチン化蛋白質モノクローナル抗体を用いたイムノブロットを行い、 結合した抗体を増感化学発光法（Enhanced chemiluminescence;ＥＣＬ）ウエスタンブロット検出キット(アマシャム社製)で検出し測定した。
【００５０】
３）ＩκＢ−α及びＩκＢ−αリン酸化体の測定はラビット抗ＩκＢ−αポリクローナル抗体及びラビット抗リン酸化ＩκＢ−αポリクローナル抗体を用いたイムノブロットを行い、結合した抗体を増感化学発光法（Enhanced chemiluminescence;ＥＣＬ）ウエスタンブロット検出キット（アマシャム社製）で検出し測定した。
４）倒立型実体顕微鏡(オリンパス社製)を用いて、治療装置処置による細胞傷害の有無を、形態変化を撮影して確認した。
５）血糖値の測定は、自己血糖測定器（ロシュ社製）を用いて測定した。
【００５１】
６）インスリン値および血清アディポネクチン値の測定は、スカイライト・バイオテック（株）の  ＬｉｐｏＳＥＡＲＣＨ（高感度ゲルろ過ＨＰＬＣによる網羅的解析システム）により測定した。
７）ＵＣＰ１ｍＲＮＡの測定は、ＲＴ−ＰＣＲを行うためにＲＴ−ＰＣＲキット（タカラ社製）で検出し測定した。
【００５２】
８）急性胃潰瘍モデルマウスはマウスに塩酸エタノールを経口投与することによって作成した。胃粘膜損傷割合の測定は、損傷胃粘膜面積を解剖顕微鏡下で測定し、以下の式に従って求めた。
胃粘膜損傷割合＝（損傷胃粘膜総面積／胃粘膜総面積）×１０
９）白血球数の測定は、血球数測定装置ＳｙｓｍｅｘＦ−５２０（Ｓｙｓｍｅｘ社製）を用いて測定した。
【００５３】
（実施結果）
（１）  ヒト培養細胞系については、前記実験方法により図５、図６、図７に示すようにな以下の評価結果が得られた。
【００５４】
ｉ) ＨＳＰ７０の誘導（図５（Ａ）、（Ｂ）を参照）
ＨＳＰ７０の誘導レベルを微弱電流単独（実施１−１）及び温熱単独（実施１−２）、微弱電流及び温熱の同時併用（実施１−３）について治療１０分処置後に５時間、静置・培養して、ウエスタンブロット法により検出した。その結果、微弱電流単独（実施１−１）と温熱単独（実施１−２）においてＨＳＰ７０の誘導が約３．５倍、約１．９倍（図５（Ｂ）を参照）であることがみられ、同時併用（実施１−３）の場合には、特に約５．２倍という明確なＨＳＰ７０の誘導がみられた。
【００５５】
ii)  細胞障害の有無（図６参照）
上記の条件下で電子顕微鏡を用いて細胞障害の有無を調べた。その結果、微弱電流単独（実施２−１）及び温熱単独（実施２−２）、微弱電流及び温熱の同時併用（実施２−３）治療処置により細胞傷害が起こらないことを確認した。
【００５６】
iii)  ユビキチン化の促進（図７（Ａ）、（Ｂ）を参照）
前記図５における微弱電流及び温熱の同時併用を治療処置を条件とし、１０分間の治療処置後に０時間（実施３−１）、２時間（実施３−２）、５時間（実施３−３）、８時間（実施４）、静置・培養した時のユビキチン化蛋白質の量をウエスタンブロット法により検出した。その結果、５時間経過時には１０倍、８時間経過時には６８倍という指数関数的にユビキチン化が促進されていることを認めた。
（２）ヌードマウスにについては、前記実施方法により図８、図９、図１０及び図１１に示すような以下の評価結果が得られた。
【００５７】
ｉ)  一回処置における正常組織中のＨＳＰ７０の誘導（図８（Ａ）、（Ｂ）を参照）
このヌードマウスの正常組織に微弱電流及び温熱を同時に併用した治療処理条件とし、治療処置を経時的に１０分（実施４−１）、２０分（実施４−２）の各処置後に６時間飼育し、正常組織中（大腸の例を示す）のＨＳＰ７０の誘導レベルをウエスタンブロット法により検出した。その結果、２０分（実施４−２）の処置の場合には、約２．７倍という明確なＨＳＰ７０の誘導が認められた。
【００５８】
ii)  一回処置による腫瘍組織中のＨＳＰ７０の誘導（図９（Ａ）、（Ｂ）を参照）
このヌードマウスの腫瘍組織に微弱電流及び温熱を同時に併用した治療処置条件とし、この治療処置を２０分間処置した後に６時間飼育し、腫瘍組織中におけるＨＳＰ７０の誘導レベルを（実施５ａ−１）、（実施５ｂ−１）に示すようにウエスタンブロット法により検出した。その結果、腫瘍組織においても約１．９倍及び２．４倍という明確なＨＳＰ７０の誘導が認められた。
【００５９】
iii)  腫瘍組織におけるユビキチン化の促進（図１０（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）を参照）
ヌードマウスの腫瘍組織に対して微弱電流単独（実施６−１）、温熱単独（実施６−２）及び同時併用（実施６−３）の場合について、治療処置２０分間処置した後に６時間飼育し、腫瘍組織においてユビキチン化蛋白質を、ウエスタンブロット法により検出した。その結果、微弱電流単独（実施６−１）及び温熱単独（実施６−２）においては、共に１．５倍というＨＳＰ７０の誘導が認められ、１．３倍及び１．６倍のユビキチン化蛋白質の増加が認められた。特に、同時併用（実施６−３）の場合は、約２．３倍というＨＳＰの明確な誘導が認められ、３．５倍という著明なユビキチン化蛋白質の増加が認められた。
【００６０】
iv)  １日１回処置あるいは１日１回の３日間処置による正常組織中のＩκＢ−α及びそのリン酸化体の発現（図１１（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）を参照）
ヌードマウスの正常組織に対して微弱電流及び温熱を同時に併用して処置を1日1回（実施７−１）・（実施７−２）、あるいは１日１回の３日間（実施７−３）・（実施７−４）行い、このヌードマウスの正常組織中（大腸の例を示す）のＩκＢ及びＩκＢ−αリン酸化体をウエスタンブロット法により検出した。その結果、１日１回の３日間（実施７−３）・（実施７−４）の処置においてＩκＢの量及びＩκＢ−αリン酸化体が比較例より明確に増加していることを見出した。
【００６１】
（３）ΔＦ５０８ＣＦＴＲを安定高発現させた培養細胞系にについては、前記実施方法により図１２及び図１３に示すような以下の評価結果が得られた。
ｉ)  ＨＳＰ７０の誘導（図１２（Ａ）、（Ｂ）を参照）
ＨＳＰ７０の誘導レベルを微弱電流単独（実施８−１）、温熱単独（実施８−２）及び微弱電流と温熱との同時併用（実施８−３）について、治療処置を１０分間処置した後に５時間、静置・培養して、ウェスタンブロット法により検出した。その結果、微弱電流単独（実施８−１）と温熱単独（実施８−２）において６２倍と１８倍のＨＳＰ７０の誘導がみられたが、同時併用（実施８−３）はより明確な約１０５倍というＨＳＰ７０の誘導がみられた。
【００６２】
ii)  ユビキチン化の促進（図１３（Ａ）、（Ｂ）を参照参照）
微弱電流単独（実施９−１）、温熱単独（実施９−２）及び微弱電流と温熱との同時併用（実施９−３）について、治療処置を１０分間処置した後に５時間、静置・培養した後、ユビキチン化ΔＦ５０８ＣＦＴＲをウエスタンブロット法により検出した。その結果、微弱電流単独（実施９−１）及び同時併用（実施９−３）の各処置により、共に検出３．９倍というΔＦ５０８ＣＦＴＲのユビキチン化が促進されることを見出した。
【００６３】
（４）２型糖尿病モデルマウス（高脂肪食負荷マウス）については、前記実施方法により図１４，図１５，図１６，図１７，図１８，図１９，図２０，図２１及び図２２に示すような以下の評価結果が得られた。
ｉ）１０週間処置後の空腹時血糖値（図１４を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１０）では，空腹時血糖値の有意な低下が認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
ii）１０週間処置後のインスリン値（図１５を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１１）では，インスリン値の有意な低下が認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
iii）１０週間処置後の血清アディポネクチン値（図１６を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１２）では，血清アディポネクチン値の有意な増加が認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
【００６４】
iv）グルコース負荷試験（図１７を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１３）では，耐糖能の改善が有意に認められた。（Ｐ＜０．００１，ｎ＝８）
ｖ）インスリン負荷試験（図１８を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１４）では，インスリン感受性の改善が有意に認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
vi）１０週間処置後の内臓脂肪の組織重量（図１９を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１５）では，内臓脂肪の組織重量が有意に減少していることが認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
【００６５】
vii）１０週間処置後の皮下脂肪の組織重量（図２０を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１６）では，皮下脂肪の組織重量が有意に減少していることが認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
viii）１０週間処置後の肝重量（図２１を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１７）では，肝重量が有意に減少していることが認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
xi）１０週間処置後のＵＣＰ１ｍＲＮＡの誘導（図２２を参照）
この高脂肪食負荷マウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１８）では，褐色脂肪細胞中のＵＣＰ１ｍＲＮＡ発現量が有意に増加していることが認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝８）
【００６６】
（５）急性胃潰瘍モデルマウスについては，前記実施方法により図２３に示すような以下の評価結果が得られた。
ｉ）２週間処置後の胃粘膜損傷割合（図２３を参照）
微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１９・１）、急性胃潰瘍モデルマウス群（実施１９・２）、急性胃潰瘍モデルマウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１９・３）で、胃粘膜損傷割合を測定した。その結果、急性胃潰瘍モデルマウスに微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施１９・３）で、胃粘膜損傷割合の有意な低下が認められた。（Ｐ＜０．０５，ｎ＝４・７）
【００６７】
（６）正常マウスについては，前記実施方法により図２４に示すような以下の評価結果が得られた。
ｉ）２週間ごとの白血球数変化率（図２４を参照）
微弱電流及び温熱を同時に併用した群（実施２０）では，血球１ｍＬ当りの白血球数が有意に増加していることが認められた。（Ｐ＜０．０１，ｎ＝５）
以上のように本発明に係る生体組織正常化方法及び治療装置は、極めて優れたＨＳＰ誘導能を有し、各種疾患に有効であることが明らかである。また、本発明に係る生体組織正常化方法及び治療装置は、その安全性の高さから考えても、臨床上極めて優れた有用性が期待できる。前記各種疾患の具体例としては、脳神経疾患、心脈管系疾患、消化器系疾患、、代謝性疾患、自己免疫疾患、変性疾患、虚血性神経細胞障害、虚血・再灌流傷害、嚢胞性繊維症、悪性腫瘍、感染症、肝不全、腎不全、薬物中毒、重金属中毒、放射線傷害、紫外線傷害、生体侵襲、又は老化等がある。脳神経疾患には、脳卒中、脳卒中後遺症、遅発性神経細胞死、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症又はクロイツフェルド・ヤコブ病等がある。
【００６８】
また、本発明に係る生体組織正常化方法及び治療装置は、エビキチン化蛋白質を介して生体又は生体組織における正常化機構を活性化されるものであり、細胞内の約８０％の蛋白質がユビキチン化された後にプロテアソームで分解される。しかし、プロテアソームの働きが阻害されると、細胞内に分解されないユビキチン化蛋白質が増加するため、細胞は計画的な細胞死の道を選択する。この原理を利用して、プロテアソーム阻害剤が現在、抗癌剤として注目されている（Julian A.Cancer Cell, 2003, Angelika Ｍ. B et al. European Journalof Cancer, 2004）。
【００６９】
プロテアソーム阻害剤は、蛋白質の合成や分解が盛んな増殖期に作用しやすい。正常細胞と比較して、腫瘍細胞内では細胞増殖に関連する蛋白質の調節異常が生じているため、細胞の増殖率が非常に速い。そのため腫瘍組織は、増殖期の細胞に作用するプロテアソーム阻害剤の影響を受けやすい。本発明に係る生体組織正常化方法及び治療装置は、ユビキチン化を促進するため、細胞内のユビキチン化蛋白質が非常に増加する。そのためプロテアソームが飽和状態となり、プロテアソームの働きが阻害された時と同様な状態になる。
【００７０】
すなわち、本発明に係る生体組織正常化方法及び治療装置は、プロテアソームを阻害することによる抗腫瘍効果も有している。また、その効果は、これらの原理に基づき、腫瘍細胞特異的に発揮されることも期待できる。このようにユビキチン化蛋白質を介したユビキチン・プロテアソームシステムの正常化機構成により改善される疾患としては、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ミオクロニーてんかん等）、癌疾患（例えば、家族性乳がん、卵巣がん等）、色素性乾皮症等がある。
【００７１】
ＮＦ−κＢが過剰に活性化されると、リウマチや喘息、皮膚炎等さまざまな炎症性疾患、自己免疫疾患、ウィルス性疾患、動脈硬化症等が引き起こされるため、ＮＦ−κＢを制御することの意義は臨床的にも極めて大きいものである。したがって、本発明の治療装置は、その微弱電流等の効果によりＩκＢの量を増加させるつつ、ＩκＢのリン酸化を適度に抑制するため、ＮＦ−κＢによる過剰な免疫応答の結果として引き起こされる種々の病態を改善することが期待される。
【００７２】
なお、本発明は、前記実施の形態においてヒトの培養細胞系、ヌードマウス、ΔＦ５０８ＣＦＴＲを安定高発現させた培養細胞系の動物の組織細胞を対象として説明したが、植物の組織細胞に対しても適用することができ、同様の作用・効果が奏し得られる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の一実施形態に係る治療装置の全体概略構成図である。
【図２】図１に記載の治療装置におけるパッド素子の平面図である。
【図３】図２に記載のパッド素子のＡ−Ａ線断面図である。
【図４】図３に記載のパット素子のＢ−Ｂ線断面図である。
【図５】ヒトの培養細胞系におけるＨＳＰ７０の誘導の評価結果である。
【図６】ヒトの培養細胞系における細胞障害の有無の評価結果である。
【図７】ヒトの培養細胞系におけるユビキチン化の促進の評価結果である。
【図８】ヌードマウスに対する一回処置による正常組織中のＨＳＰ７０の誘導の評価結果である。
【図９】ヌードマウスに対する一回処置による腫瘍組織中のＨＳＰ７０の誘導の評価結果である。
【図１０】ヌードマウスに対する一回処置による腫瘍組織中のユビキチン化の促進の評価結果である。
【図１１】ヌードマウスに対する１日１回処置あるいは１日１回の３日間処置によるＩκＢ−α及びそのリン酸化体の発現量の検討の評価結果である。
【図１２】遺伝子変異細胞ΔＦ５０８ＣＦＴＲを安定高発現させた培養細胞系におけるＨＳＰ７０の誘導の評価結果である。
【図１３】遺伝子変異細胞ΔＦ５０８ＣＦＴＲを安定高発現させた培養細胞系におけるユビキチン化の促進の評価結果である。
【図１４】２型糖尿病モデルマウス（高脂肪食負荷マウス）について行った実験評価で１０週間処置後の空腹時血糖値である。
【図１５】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で１０週間処置後のインスリン値である。
【図１６】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で１０週間処置後の血清アディポネクチン値である。
【図１７】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価でグルコース負荷試験結果である。
【図１８】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価でインスリン負荷試験結果である。
【図１９】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で１０週間処置後の内臓脂肪の組織重量である。
【図２０】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で１０週間処置後の皮下脂肪の組織重量である。
【図２１】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で１０週間処置後の肝重量である。
【図２２】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で１０週間処置後のＵＣＰ１ｍＲＮＡの誘導である。
【図２３】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で２週間処置後の胃粘膜損傷割合である。
【図２４】２型糖尿病モデルマウスについて行った実験評価で２週間ごとの白血球数変化率である。
【符号の説明】
【００７４】
１、２  パッド素子
３  電流制御手段
１１、２１  導電層
１２、２２  絶縁層
１３、２３  発熱層
１３ａ・１３ｂ、２３ａ・２３ｂ  電極
１６  カーボン繊維
１４、２４  被覆層
１００  生体
２００  電源
【図１】
2006263456.tif 000003
【図２】
2006263456.tif 000004
【図３】
2006263456.tif 000005
【図４】
2006263456.tif 000006
【図５】
2006263456.tif 000007
【図６】
2006263456.tif 000008
【図７】
2006263456.tif 000009
【図８】
2006263456.tif 000010
【図９】
2006263456.tif 000011
【図１０】
2006263456.tif 000012
【図１１】
2006263456.tif 000013
【図１２】
2006263456.tif 000014
【図１３】
2006263456.tif 000015
【図１４】
2006263456.tif 000016
【図１５】
2006263456.tif 000017
【図１６】
2006263456.tif 000018
【図１７】
2006263456.tif 000019
【図１８】
2006263456.tif 000020
【図１９】
2006263456.tif 000021
【図２０】
2006263456.tif 000022
【図２１】
2006263456.tif 000023
【図２２】
2006263456.tif 000024
【図２３】
2006263456.tif 000025
【図２４】
2006263456.tif 000026