(57)【要約】【課題】  人体や環境に負荷を与えることがなく、経済的にも優れた有機塩素化合物、多環芳香族化合物を効率的に分解できる分解方法並びに微生物製剤を提供する。【解決手段】  有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方に対する分解能を有する微生物に植物質を接触させて前記微生物の生物活性を増強させることにより前記有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解する分解方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方に対する分解能を有する微生物に植物質を接触させて前記微生物の生物活性を増強させることにより前記有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解する分解方法。
【請求項２】
前記植物質が、木材チップ、おが屑、木粉、樹皮、木酢液、竹酢液および木質成分の抽出物から選択される１又は２種以上である請求項１に記載の分解方法。
【請求項３】
前記微生物の生物活性の増強がモノオキシゲナーゼおよびデハロゲナーゼの少なくとも一方の発現誘導に基づき前記有機塩素化合物を分解する請求項１又は２に記載の分解方法。
【請求項４】
前記有機塩素化合物がトリクロロエチレン又はテトラクロロエチレンである請求項３に記載の分解方法。
【請求項５】
前記微生物の生物活性の増強がジオキシゲナーゼの発現誘導に基づき前記有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解する請求項１又は２に記載の分解方法。
【請求項６】
前記有機塩素化合物が、ポリ塩化ビフェニル類またはダイオキシン類である請求項５に記載の分解方法。
【請求項７】
前記多環芳香族化合物が、ピレン類またはベンゾピレン類である請求項５に記載の分解方法。
【請求項８】
前記有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方により汚染された土壌、水、空気から選択される環境を浄化する環境修復のために行う請求項１〜７のいずれかに記載の分解方法。
【請求項９】
請求項１に記載の生物活性が増強された微生物を含有する微生物製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方の化合物の生物学的分解方法、ならびに、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方の化合物の生物学的分解用微生物製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の産業発達に伴い、様々な有害化学物質、特に、トリクロロエチレン（以下、「ＴＣＥ」と略する場合がある。）、ポリ塩化ビフェニル類（以下、「ＰＣＢ」と略する場合がある。）、多環芳香族化合物等の難分解性物質が、環境中に放出、漏洩する等して地球環境の破壊が進行しており、深刻な社会問題を招いている。このため、微生物の生物浄化機能を利用することにより、汚染された環境を修復するバイオレメディエーション技術が注目されている。
【０００３】
しかしながら、バイオレメディエーション技術における分解処理能力は一般に不安定であり、微生物の生育環境等により著しく変動する。このため、処理能力を維持、向上させる方法が研究され、提案されている。例えば、リグニン、リモネン、ベラトリアルコール等を添加してダイオキシン類の分解能を有する微生物を好気条件下に増殖させることにより、ダイオキシン類を効率的に分解する試みが報告されている（例えば、特許文献１等を参照のこと。）。しかしながら、かかる方法においては、有機塩素化合物分解酵素の誘導に関しては全く考慮されていない。そのため、分解酵素の発現誘導が自然に起こるまで分解が開始されず、また、分解が見られても分解速度が極めて遅いという問題があった。
【０００４】
多くの有機塩素化合物、例えば、ＴＣＥ、ＰＣＢを好気性微生物により分解する場合には、これらの微生物はＴＣＥ、ＰＣＢを単一の炭素源として生育できない。そのため、メタン酸化酵素、芳香族酸化酵素等の酸化酵素が同時にＴＣＥ、ＰＣＢを酸化分解する共代謝のシステムに基づき分解される。したがって、これらの微生物の有する分解能を高めるためには、メタン、塩素置換のないビフェニル、フェノール、トルエン等の芳香族化合物を誘導物質として添加する必要があった（例えば、特許文献２等を参照のこと。）。しかしながら、メタン、ビフェニル等は、それ自体が残留性、毒性、引火性を有する環境汚染物質である。そのため、これらの環境中への添加は、二次汚染や爆発事故を引き起こす可能性が高く、実際にバイオレメディエーションへの適用が事実上極めて困難であるという問題があった。更に、これらの物質は非常に高価であり、施行コスト上の問題もあった。
【０００５】
更に、Arthrobacter属  Ｂ１Ｂ株のＰＣＢの生物分解活性が、スペアミント油の一般的成分であるカルヴォンによって誘導されること、および、ＰＣＢで汚染された土壌への適用が報告されている（例えば、非特許文献１、２、３等を参照のこと。）。
【０００６】
しかしながら、上述した方法で用いられる微生物はすべて好気性微生物であり、嫌気性微生物の活性化に関する知見はなかった。好気性微生物は一般に高塩素体化合物の分解には作用せず、好気性微生物単独での処理では高塩素体化合物が環境中に多く残留する好ましくない結果を招く。そこで、嫌気性微生物が触媒する脱塩素化反応を組合せて、有機塩素化合物を完全分解する試みが提案されている。ところが、脱塩素化反応に関与するデハロゲナーゼの誘導には、一部の嫌気性微生物では、テトラクロロエチレン（以下、「ＰＣＥ」と略する場合がある。）を一定量添加しないと誘導されないことが報告されている。しかし、ＰＣＥ自体はクロロエチレン類に属する揮発性の高い環境汚染物質であることから、実際のバイオレメディエーションへの適用が困難であるとの問題点があった。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１３６９５７号公報
【特許文献２】特開２００１−１６２２６３号公報
【非特許文献１】E.S.Gilbert他、Plant compounds that induce polychlorinated biphenyl biodegradation by Arthrobacter sp. strain B1B.(Arthrobacter属 B1B株によってポリ塩化ビフェニル生物分解を誘導する植物化合物。)、Applied and Environmental Microbiology、１９９７年５月、第６３巻、第５号、第1933頁〜第1938頁
【非特許文献２】E.S.Gilbert他、Repeated application of carvone-induced bacteria to enhance biodegradation of polychlorinated biphenyls in soil.（土壌におけるポリ塩化ビフェニルの生物分解を増強するカルヴォン−誘導細菌の反復適用。）、Appl. Microbiol. Biotechnol.、 1998年、第50巻、第489頁〜第494頁
【非特許文献３】A.C.Singer他、Bioremediation of polychlorinated biphenyl-contaminated soil using carvone and surfactant-grown bacteria.（カルヴォンと界面活性剤−増殖細菌を使用する塩化ビフェニル汚染土壌のバイオレメディエーション。）、Appl. Microbiol. Biotechnol.、 2000年、第54巻、第838頁〜第843頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、従来の有機塩素化合物、多環芳香族化合物等の難分解性物質の生物分解処理においては、微生物の有する分解能を高めるためには、環境に有害かつ高価な誘導物質の添加を必要とするという問題点を有していた。また、有機塩素化合物を完全に処理するためには、好気性微生物が触媒する酸化的分解反応のみならず、嫌気性微生物が触媒する脱塩素化反応を促進する技術の構築が求められていた。
そこで、本発明は、人体や環境に負荷を与えることがなく、経済的にも優れた有機塩素化合物、多環芳香族化合物を効率的に分解できる有機塩素化合物、多環芳香族化合物の分解方法並びに微生物製剤を提供することを目的とする。また、これらは、好気性微生物および嫌気性微生物双方の生物活性を増強できるものであることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく本発明者らは、安全性の高い天然由来物質に着目し鋭意研究した結果、有機塩素化合物、多環芳香族化合物の分解能を有する微生物を、木材チップ、おが屑、木粉、樹皮、木酢液、竹酢液、木質成分の抽出物等の植物質と接触させることにより、該微生物の生物活性を増強できるとの知見を見出した。更に、該植物質により、好気性微生物のみならず、嫌気性微生物の分解能を高めることができるとの知見を得、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、上記目的を達成するため、本発明は、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方に対する分解能を有する微生物に植物質を接触させて前記微生物の生物活性を増強させることにより前記有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解する分解方法を提供する。
そして、前記植物質が、木材チップ、おが屑、木粉、樹皮、木酢液、竹酢液および木質成分の抽出物から選択される１または２種以上であることが好ましい。
また、前記微生物の生物活性の増強が、モノオキシゲナーゼおよびデハロゲナーゼの少なくとも一方の発現誘導に基づき前記有機塩素化合物を分解するものであり、特に好ましくは、前記有機塩素化合物がトリクロロエチレンまたはテトラクロロエチレンである。
更に、前記微生物の生物活性の増強が、ジオキシゲナーゼの発現誘導に基づき前記有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解するものであり、特に好ましくは、前記有機塩素化合物がポリ塩化ビフェニル類またはダイオキシン類、更に、前記多環芳香族化合物がピレン類またはベンゾピレン類である。
そして、前記有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方により汚染された土壌、水、空気から選択される環境を浄化する環境修復のために行うことが好ましい。
更に、本発明は、前記本発明の生物活性が増強された微生物を含有する、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解する微生物製剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、環境および人体に負荷を与えることなく有機塩素化合物分解、多環芳香族化合物分解の効率化を図れると同時に、高塩素体化合物も含めた広範な有害物質の分解処理が可能となる。加えて、廃棄物処理並びに経済性の観点からも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、具体的な本発明の実施の形態について説明するが、これはあくまでも本発明を例示するにとまり、本発明を限定するものではない。
【００１３】
本発明の方法は、有機塩素化合物分解能および多環芳香族化合物の少なくとも一方に対する分解能を有する微生物に植物質を接触させて前記微生物の生物活性を増強させることにより前記有機塩素化合物分解能および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解する分解方法である。本発明の方法によれば、天然由来の安全、かつ、入手容易な植物質を用いて有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方の分解に関与する微生物(以下、「分解微生物」と略する場合がある。)の生物活性の増強を行うものである。したがって、従来のような環境等に有害な誘導物質を添加することなしに、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方に対する分解能を有する微生物の生物活性を制御できる。これにより、有機塩素化合物、多環芳香族化合物の効率的な分解が達成できる。
【００１４】
ここで、微生物の生物活性の増強には、少なくとも、微生物の有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方の分解に関与する物質の発現が誘導されることにより、当該微生物の有する該化合物に対する分解能が向上することが含まれる。そして、更に、好ましくは、微生物の生育並びに増殖が促進されることを含む。ここで、微生物分解に関与する物質とは、典型的には、酵素である。発現誘導がなされる酵素としては、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方の分解に関与する酵素であれば特に制限はない。特に、モノオキシゲナーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ等が対象となる。つまり、本発明の方法によれば、好気性微生物のみならず、嫌気性微生物の生物活性の増強を行うことができ、脱塩素化反応を触媒するデハロゲナーゼの発現をも誘導できる。したがって、本発明の方法は、高塩素体の有機塩素化合物の分解を促進することに好適に利用できる点で有用である。
【００１５】
本発明の方法により分解対象物とされるのは有機塩素化合物、多環芳香族化合物である。分解対象となる有機塩素化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，１−ジクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、トランス−１，２−ジクロロエチレン等のクロロエチレン類、ＰＣＢ、ダイオキシン類等が挙げられる。ここで、ＰＣＢとは、上述した通り、ポリ塩化ビフェニル類の略称であり、ビフェニル骨格への置換塩素の数や位置による多数の塩素化異性体の総称である。そして、ダイオキシン類とは、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ダイオキシン及びポリ塩化ジベンゾフラン並びにコプラナーポリ塩化ビフェニルの総称であり、ＰＣＢ同様、置換塩素の数や位置による多数の塩素化異性体が含まれる。
【００１６】
また、分解対象となる多環芳香族化合物としても、特に限定されるものではないが、例えば、ピレン類、ベンゾピレン類等が例示される。ここで、多環芳香族化合物とは、６角のベンゼン環を２個以上持つ化合物の総称であり、立体構造の異なる多くの異性体ならびにその誘導体が含まれる。
【００１７】
また、本発明の分解対象物となる有機塩素化合物、多環芳香族化合物の形態は、特に制限されるものではない。例えば、有機塩素化合物、多環芳香族化合物自体でもよく、また、溶媒に溶解した状態でもよく、更に、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を含有する汚染環境媒体にも特に好ましく適用できる。したがって、本発明の分解方法は、環境汚染修復に有用である。ここで、汚染環境媒体とは、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方によって汚染された土壌、底質、地下水、河川水、湖沼水、工場等からの排水、大気等を含むものである。
【００１８】
例えば、汚染土壌に適用する場合にあたっては、現場で掘削を伴わないで汚染土壌等の修復処理を行う原位置バイオレメディエーション法に基づいて処理を行うことができる。更に、汚染土壌等を掘削してオンサイト若しくはオフサイトの土壌処理プラントで修復処理を行うオンサイト／オフサイトバイオレメディエーション法、スラリーリアクター法を含む、一般的なバイオレメディエーション技術のいずれのケースにおいても適用可能である。ここで、リアクターを構築する場合には、リアクターの形態に関しては特に制限はなく、バッチ方式、連続方式、いずれをも採用することが可能である。
【００１９】
本発明において使用される植物質は、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方に対する分解能を有する微生物の生物活性を増強するものである。ここで、植物質とは、草木、樹木等の植物由来物質を総称するものである。したがって、本発明の方法は、このような自然界に存在する物質を用いることから、環境および人体への負荷がない点で有用である。本発明への適用形態としては、木材チップ、おが屑、木粉、樹皮、木酢液、竹酢液、木質成分の抽出物等が例示される。ここで、木質成分の抽出物は、空気を遮断した状態で４５０℃前後での加熱処理による抽出が好ましい。原料となる草木、樹木の種類は、テルペン類を主体とする不揮発性油含量が高い草木、樹木が分解微生物の効率的な活性化の観点から好ましい。具体的には、針葉樹であり、針葉樹の種類に特に制限はないが、杉、ヒノキ、松、ヒバ等が例示される。しかしながら、これらに限定されず、分解対象物の種類ならびに、土質等の適用する汚染媒体の状態等に応じて適宜選択することが好ましい。樹木、草木は製材用に使用する木材でもよいが、再利用の観点から、間伐材、枝材等の廃材、製材工程で生じる残廃材であることが好ましい。廃材を使用することにより、森林資源の有効利用を図れると共に、分解処理コストを低く抑えることができる。また、植物質に内包されるテルペン類を、分離、必要に応じて液体クロマトグラフィー等で精製された特定画分であってもよい。
【００２０】
植物質として木材チップ等を施用する場合には、木材に内包する不揮発性油を木材チップ表面に付着させた状態として適用することが好ましい。かかる処理により、微生物と誘導物質との接触が容易となり、効果的に微生物の生物活性の増強が達成でき、分解効率の向上が図れる。
このような状態に処理する手段としては、例えば、木材チップを、空気を遮断した状態で４５０℃前後にて加熱し、チップ内部から内包成分を表面に抽出させることにより行うことができる。
【００２１】
本発明の方法により生物活性が増強され有機塩素化合物、多環芳香族化合物の分解処理に適用される微生物は、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解し得る能力を有する微生物であれば、特に制限はない。具体的には、有機塩素化合物を分解する微生物としては、Acinetobacter、Arthrobacter、Burkholderia、Comamonas、Desulfitobacterium、Janibacter、Paenibacillus、Pseudomonas、Rhodococcus、そして、Ralstonia属等が例示され、これらの微生物を１種もしくは、２種以上組合せて使用することができる。例えば、本発明をＴＣＥの分解に施用する場合には、モノオキシゲナーゼ産生能を有する微生物であるBurkholderia、Comamonas、Janibacter、そして、Ralstonia属等が好ましく例示される。更には、デハロゲナーゼ産生能を有する微生物であるDesulfitobacterium属等が好ましく例示される。そして、ＰＣＥの分解に際しては、モノオキシゲナーゼ産生能を有する微生物とデハロゲナーゼ産生能を有する微生物の混合系、若しくは、双方の産生能を有する微生物であることが特に好ましい。本発明をＰＣＢ、ダイオキシン類並びに多環芳香族化合物の分解に施用する場合には、ジオキシゲナーゼ産生能を有する微生物であるAcinetobacter、Arthrobacter、Burkholderia、Paenibacillus、Pseudomonas、そして、Rhodococcus属等が好ましく例示される。
【００２２】
これらの微生物は、自然界から既に単離されているもの、また、環境中から目的に応じて新たにスクリーニングされたものを利用することも可能である。そして、複数の株の混合系でもかまわず、いわゆる微生物群を含むものである。したがって、本明細書において使用される微生物との文言には、単一系のみならず、数種類を混合した微生物群をも含む。また、土壌等の汚染環境媒体中に存在する土着の微生物であっても良い。更に、人為的な変異を施した微生物も好適に利用でき、遺伝子工学的手段により改変した微生物であっても良い。
【００２３】
また、本発明の有機塩素化合物、多環芳香族化合物の分解処理に当たっては、植物質によって分解微生物の生物活性の増強作用を充分発揮でき、かつ、増強された生物活性を十分に発揮し得ることが必要である。したがって、その効果を十分発揮できる限り、その処理形態は特に制限はなく、公知のいずれの手段および方法をも適用できる。
【００２４】
例えば、分解対象物が環境媒体中に含まれた形態で存在する場合には、植物質を該汚染環境媒体に添加して汚染現場に生息している土着微生物の生物活性を増強することにより行なうことができる。また、植物質と分解微生物とを汚染環境媒体に投入することができる。このとき、植物質と分解微生物の投入時期の前後に制限はない。したがって、分解微生物を投入した後に植物質を投入してもよく、また、分解微生物を投入に先立って植物質を投入してもよいし、同時に投入しても良い。更には、汚染環境媒体への投入に先立って、予め植物質の存在下で活性化処理した微生物を投入することにより行なうこともできる。このとき、植物質も投入することが好ましく、これにより微生物の生物活性化状態が良好に保持される。ここで、活性化処理は、植物質と微生物を培養することにより行われる。培養は適切な栄養源を含む培地であれば、液体培地若しくは固体培地のいずれの培地でもよく、また、静置培養、振とう培養のいずれで行ってもよい。
【００２５】
上述した通り、バイオオーギュメーション技術にも本発明の方法が好適に適用できる。一般に、バイオオーギュメーション技術においては、微生物は投入直後から、その生物活性を十分に発揮できることが好ましい。しかしながら、微生物が新しい環境に順応し、酵素誘導を開始するまで、ある程度の時間を要するのが現状である。本発明の方法によれば、予め植物質の存在下で活性化処理した微生物を投入することから、分解対象物の分解処理が非常に迅速に行うことが可能となる。
【００２６】
ここで、微生物を分解対象物と接触させるに際しては、培養液をそのまま投入して良い。また、投入に先立って当該分解微生物を遠心分離若しくは濾過等により集菌し、必要に応じて洗浄した菌体を投入しても良い。更には、適当な担体に結合、架橋、及び、包括固定した菌体を投入しても良い。また、固定化担体として、微生物の生物活性を保持して固定化できるものであれば、いずれをも使用できる。例えば、セルロース、アガロース、多孔質ガラス、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、グルタルアルデヒド、シリカゲル、アルギン酸、カラーギナン、ナイロン等を使用することが可能である。
【００２７】
また、木材チップ等を植物質として使用する場合には、木材チップ上に分解微生物を担持させた状態として接触させることもできる。したがって、分解微生物を担持させた木材チップ等を、分解対象物に投入することによっても、本発明の生物分解処理を行うことができる。
【００２８】
さらに、必要に応じて、分解微生物の増殖促進用に栄養源を添加してもよく、例えば、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の窒素源、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩類、ビタミン類等が例示される。
【００２９】
分解微生物、植物質の投入形態についても特に制限はなく、当該分野において公知の如何なる手段および方法を好適に用いることができる。具体的には、汚染土壌に適用する場合には、以下のような手段および方法が好適に利用できる。原位置バイオレメディエーション法を採用して浄化する場合、例えば、地下汚染箇所の近傍の飽和層に２本以上の井戸を掘削し、地下水流の下流側に掘削された揚水井戸から揚水した地下水の少なくとも一部に投入し、これを上流側に掘削された注入井戸に注入し循環することにより行うことができる。また、オンサイト／オフサイトバイオレメディエーション法を採用する場合、例えば、土壌に直接噴霧、散布する方法、土壌中に埋設した配管を通して投入する方法等により行うことができる。また、噴霧、散布後、必要に応じて耕耘、攪拌することが好ましい。
【００３０】
また、汚染水に適用する場合には、分解微生物と排水との接触は、例えば、通水可能なリアクターを構築して、該リアクター内で汚染水と微生物とを、微生物が膜に付着された状態で接触させる生物膜法、担体に固定化された状態で接触させる固定化法、細菌が浮遊状態で接触させる浮遊法等、のいずれをも適用することができる。
【００３１】
植物質を投入する場合における植物質の投入量、および、微生物を投入する場合の投入量は、添加する植物質の種類、分解対象物の種類、濃度、並びに、汚染媒体の種類、状態等によって適宜設定されるものである。また、投入回数、投入間隔についても特に制限はなく、適宜設定されるものであるが、好ましくは１〜３回投入する。
【００３２】
本発明の分解方法によれば、従来、分解微生物の生物活性の増強のために必要とされていたメタン、ビフェニル等の環境汚染物質を用いずとも、分解微生物の生物活性の増強が可能となる。つまり、植物質は天然由来の成分であり、二次汚染や爆発事故等を引き起こすことがない安全な物質であるので、環境および人体に負荷を与えることなく有機塩素化合物、多環芳香族化合物分解の効率化が可能となる。加えて、植物質は入手が容易であり、上述した通り、木材チップ等の製材工程等で生じる産業廃棄物を再利用でき、廃棄物処理並びに経済性の観点からも有用である。また、本発明の方法によれば、デハロゲナーゼの誘導も可能である。したがって、好気性微生物のみならず、嫌気性微生物をも活性化でき、高塩素体化合物をも含めた広範な難分解性の有機塩素化合物の完全分解が可能である。そして、これら有機塩素化合物、多環芳香族化合物を主成分としない植物質が、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方の分解に関与する酵素の発現を誘導する誘導物質となり得、これらの化合物に対する分解能を高めるとの知見は非常に興味深い。したがって、かかる分解酵素の発現には、広域な発現制御機構の関与が想定される。してみると、本発明の分解方法は、有機塩素化合物並びに多環芳香族化合物等の広範な難分解性物質の分解を効率化できる有用な技術として期待される。
【００３３】
また、本発明の一形態として、微生物の活性化方法も含まれる。かかる方法は、分解微生物に上述した植物質を接触させることにより、該微生物の生物活性を増強するものである。したがって、環境および人体に負荷を与えることなく有機塩素化合物、多環芳香族化合物分解微生物の生物活性の増強が可能となる。その詳細については上述した。
【００３４】
また、本発明の一形態として、本発明の方法によって生物活性が増強された微生物を含む有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解する微生物製剤も含まれる。本発明の微生物製剤は、分解対象物となる有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方に対する分解能が増強された微生物を含む微生物製剤である。かかる微生物製剤は、分解対象物を効率的に分解処理することができる。したがって、本発明の微生物製剤は、特に汚染環境媒体の浄化に施用でき、環境浄化作用の促進に有用である。また、微生物製剤と処方しておくことにより、取り扱いが容易となり更に実用価値が高まる。
【００３５】
本発明の微生物製剤は、本発明の方法によって活性化された分解微生物を水等の液体に単に懸濁することにより製造することができる。更に、例えば、担体（増量剤）、界面活性剤、補助剤等の添加剤を１種または２種以上配合して常法により、液剤、粉剤、粒剤、錠剤、乳剤、噴霧剤、水和剤等の製剤として製造することができる。製剤化に際しては、製剤化される微生物が良好な分解効率を発揮できるような形態を選択する。ここで、微生物製剤は、培養液から調製したものでも良いし、培養液から当該分解微生物を遠心分離若しくは濾過等により集菌し、また必要に応じて洗浄した菌体から調製したものでもよい。好ましくは、凍結乾燥体として製剤化される。
【００３６】
添加剤は、分解微生物に対して無害であるか、もしくは、ほとんど影響を与えないものであるものが好ましい。前記担体としては、液体担体としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が例示される。また、固体担体としては、クレー、タルク、炭酸カルシウム、珪藻土、ゼオライト、ベンナイト、ホワイトカーボン、デンプン、デキストリン、粉末セルロース、白糖等を使用することができる。界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン性界面活性剤、アルキルサルフェート、アルキルスルホネート等のカチオン性界面活性剤、アルキルトリメチルアンモニウムクロライド、アルキルジメチルベンザルコニウムクロライド等のカチオン性界面活性剤等が例示される。補助剤として適切な結合剤、分散剤、乳化剤、懸濁剤等を必要に応じて添加することができる。
【００３７】
微生物の含有量は、製剤として、好ましくは、１０５〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ程度であるが、これらの濃度は仕様態様等に応じて適宜変更してもよい。
【００３８】
また、本発明の微生物製剤の適用の方法は、剤型等の使用形態、適用する分解対象物の種類並びに形態、更には汚染状況等に応じて適宜選択される。そして、上述した分解微生物並びに植物質の適用形態に準じて行うことができる。また、本発明の微生物製剤の使用時期、並びに頻度についても特に制限はないが、好ましくは１〜３回適用する。
【００３９】
本発明の微生物製剤は、さらに、上述したような分解微生物の増殖用の栄養源となる成分を含有してもよく、また、植物質を共に含むように構成してもよい。そして、植物質と、植物質で生物活性が増強された微生物、若しくは、植物質で生物活性が増強され得る微生物を含むキットの形態でも構成することもできる。
【実施例】
【００４０】
実施例１．木質成分の抽出物によるビフェニル分解酵素の誘導確認
本実施例において、Paenibacillus属 KBC101株（以下、「KBC101株」と略する場合がある。：受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３６）を使用して、木質成分の抽出物によるビフェニル分解酵素の誘導確認の検討を行なった。使用した木質成分の抽出物は市販品の竹酢液を用いた。
上記KBC101株をO.D.600＝0.968となるまで、100mlのＬＢ培地中で培養後、４℃で、5,000rpm、10分間遠心分離を行い集菌した。続いて得られた菌体を100mlのＳ培地中に懸濁し、懸濁液を50mlずつに２分割した。ここで、使用したＳ培地の組成を以下の表１に示す。
【００４１】
【表１】
2006217819.tif 000002
【００４２】
次に、上記で調製した１の懸濁液に対し、竹酢液を２％添加した（誘導）。対照として、もう一方の懸濁液には誘導物質となり得る物質は何も添加しなかった（非誘導）。これらのサンプルを、30℃において、200rpm、12時間振とう培養を行った後、４℃で、5,000rpm、10分間遠心分離を行い集菌した。得られた菌体をO.D.600＝20程度となるよう夫々2.7mlのリン酸緩衝液中に再懸濁した。続いて、該懸濁液に2，3−ジヒドロキシビフェニルを添加し、15ml容のコーニングチューブ内で30℃にて反応させた。ここで、添加した2,3−ジヒドロキシビフェニルの初濃度は１mMであった。添加後、経時的に434nmにおける吸光度を測定し、434nmに最大吸収波長を有する2,3−ジヒドロキシビフェニルのメタ開裂物質量を追跡した。
【００４３】
結果を図１に示す。木質成分の抽出物を添加すると（誘導）、対照としての添加しなかった場合（非誘導）に比べ、2，3−ジヒドロキシビフェニルのメタ開裂物質量が著しく低下した。かかる結果により、本発明の方法により、2,3−ジヒドロキシビフェニルを分解する酵素の誘導が有意に生じ、2,3−ジヒドロキシビフェニルが効率的に分解、代謝されていることが確認された。
ここで、本実施例において使用した2,3−ジヒドロキシビフェニルはビフェニル代謝の中間体である（図２を参照のこと。）。そして、公知のＰＣＢを分解するＰＣＢ分解菌は、ＰＣＢを単一の炭素並びにエネルギー源として生育できない。そのため、塩素置換のないビフェニルなどの芳香族化合物を生育基質として、その時に誘導される酵素（例えば、図２で示されるＢｐｈＡ、Ｂ、Ｃ）によりＰＣＢを分解する共代謝の形態をとる。つまり、ビフェニルとＰＣＢは塩素置換の有無が相違するのみの同一の骨格を有する化合物であることから、両者を分解する酵素は同一であることが知られている。以上を鑑みると、本実施例において2,3−ジヒドロキシビフェニルを分解する酵素の誘導が生じることが確認された事から、本発明の方法によってＰＣＢ分解酵素の効率的な誘導が可能であることが理解される。
【００４４】
実施例２.木質成分の抽出物によるＰＣＢ分解に関する検討
次に、実施例１で使用したKBC101株の、木質成分の抽出物によるＰＣＢ分解能確認のための検討を行なった。上記KBC101株をO.D.600＝1.0となるまで、100mlのＬＢ培地中で培養後、４℃で、5,000rpm、10分間遠心分離を行い集菌した。続いて菌体を最終O.D.600＝4.0となるよう25mlのＳ培地中に懸濁し、懸濁液を5mlずつ25ml容のバイアル瓶に分注した。このサンプルを４本作製した。ここで、使用したＳ培地の組成は実施例１で使用したものと同一であった。
【００４５】
次に、上記で調製した２本のサンプルに、Kanechlor mixture（ＧＬサイエンス社製）を添加した後、液体培地に対し竹酢液を２％添加した（誘導）。対照として残りの２本のサンプルにはKanechlor mixtureのみを添加し誘導物質となり得る物質は何も添加しなかった（非誘導）。ここで、添加したKanechlor mixtureの最終濃度は10ppmであった。次に、これらのサンプルを、30℃において、180rpm、60時間振とう培養を行い反応させた後、100μlの濃塩酸を添加し反応を止め、各サンプル中に残存するＰＣＢ量を置換塩素数毎に定量した。ここで、ＰＣＢの定量は、反応終了後のバイアル瓶をブチルゴム栓およびアルミシールにより密閉した後、分析に供した。
【００４６】
結果を図３に示す。なお、図３は、各サンプルの二連の定量値の平均値を求めてグラフに表したものである。木質成分の抽出物を添加したサンプル（誘導）は、対照としての誘導物質を添加しなかったサンプル（非誘導）に比べ、ＰＣＢの残存量が塩素置換数を問わず低下することが確認された。特に、７、８、９塩素置換体等の高塩素置換体量の著しい低下が確認された。かかる結果により、本発明の方法によりＰＣＢを分解する酵素が有意に誘導され、それにより、難分解性の高塩素置換体をも含めてＰＣＢが効率的に分解、代謝されていることが判明した。
【００４７】
また、同様にして、誘導物質として、木質成分の抽出物、ビフェニルを添加した場合のＰＣＢの分解率を比較した。結果を表２に示す
【００４８】
【表２】
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【００４９】
木質成分の抽出物を添加することにより、ビフェニルを添加した場合と比べて、同等並びにそれ以上にＰＣＢを効率的に分解できることが確認された。特に、７、８および９塩素置換体の高塩素置換体においては、ビフェニルを添加した場合には、分解率が30〜40％に止まるに対し、木質成分の抽出物を添加することによって非常に高い分解率が得られることが確認された。かかる結果により、本発明の方法によりビフェニルのような有害物質を添加せずとも、ＰＣＢを分解する酵素の誘導が可能であり、これによりＰＣＢ、特に高塩素置換体ＰＣＢが効率的に分解、代謝できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、微生物の生物活性を増強することにより有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方を分解するものである。特に、有機塩素化合物および多環芳香族化合物の少なくとも一方の化合物で汚染された、土壌、地下水、河川水、湖沼水等の環境修復技術に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】木質成分の抽出物によるビフェニル分解酵素の誘導確認の検討を行った実施例１の結果を示す図
【図２】ビフェニルの分解代謝経路を示す図
【図３】木質成分の抽出物によるＰＣＢ分解に関する検討を行った実施例２の結果を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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