(57)【要約】【課題】セリンプロテアーゼ、特にトリプシン活性阻害作用を有することにより、ケラチノサイトでのメラノソーム取り込みを抑制する。これにより、メラノサイトで産生されたメラニンの表皮への排出を抑制し美白効果を有する皮膚外用剤と、メラニン産生抑制剤を併用することにより美白効果の高い化粧料を提供する。【解決手段】Thr-Arg、Leu-Leu-Arg 、Thr-Lys-Pro-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Argエチルエステルの中から選ばれるセリンプロテアーゼ活性阻害剤と、アスコルビン酸およびその誘導体、アルブチンおよびその誘導体などの中から選ばれるメラニン産生抑制剤を配合した美白化粧料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリンプロテアーゼ阻害剤とメラニン産生抑制剤を含有することを特徴とする美白用化粧料。
【請求項２】
請求項１記載のセリンプロテアーゼ阻害剤が、C末端アルギニンからなるジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ヘキサペプチドの中から選ばれる１種または２種以上の化合物を含有するセリンプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載のセリンプロテアーゼ阻害剤がThr-Arg、Leu-Leu-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Argエチルエステルの中から選ばれる１種または２種以上の化合物を含有するセリンプロテアーゼ阻害剤。
【請求項４】
請求項１記載のメラニン産生抑制剤がエラグ酸及びその誘導体並びにそれらの塩、エンドセリン拮抗薬、アスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、グルタチオン及びその誘導体並びにそれらの塩、システイン及びその誘導体並びにそれらの塩、レゾルシン及びその誘導体並びにそれらの塩、ハイドロキノン及びその誘導体並びにそれらの塩、グラブリジン、グラブレン、リクイリチン、イソリクイリチン及びこれらを含有するカンゾウ抽出物、胎盤抽出物、カロチノイド類及びこれらを含有する動植物抽出物、イレイセン抽出物、ひまわり種子抽出物、イブキトラノオ抽出物、エイジツ抽出物、オウゴン抽出物、オノニス抽出物、海藻抽出物、クジン抽出物、ゴカヒ抽出物、リノール酸を含有する油脂、リノレン酸を含有する油脂、サイシン抽出物、サンザシ抽出物、シラユリ抽出物、シャクヤク抽出物、センプクカ抽出物、ソウハクヒ抽出物、大豆抽出物、茶抽出物、トウキ抽出物、ビャクレン抽出物、ブナノキ抽出物、ブドウ種子抽出物、ホップ抽出物、マイカイカ抽出物、ユキノシタ抽出物、ヨクイニン抽出物から選ばれる１種または２種以上の化合物を含有するメラニン産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリンプロテアーゼ活性阻害剤に関する。特にトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）に関わるセリンプロテアーゼの活性に対して、優れた拮抗作用を有するセリンプロテアーゼ活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、紫外線による皮膚の黒化や、シミ，ソバカスといった皮膚の色素沈着を防止又は改善するため、メラニン産生を阻害したり、生成したメラニン色素を還元する作用を有する成分がスクリーニングされ美白化粧料に配合されてきた。例えば、アスコルビン酸、システイン、及びこれらの誘導体、胎盤抽出物、植物，藻類よりの抽出物などが利用されている。
【０００３】
しかしながら、アスコルビン酸、システイン、およびこれらの誘導体は、酸化還元反応を受けやすく不安定であった。また、胎盤抽出物や植物，藻類よりの抽出物は有効量を配合すると美白化粧料に好ましくない臭いや着色を伴う。また、美白効果も充分ではなく、多くの問題点があった。
【０００４】
また、最近では、特許文献１に記載されているような、ケラチノサイトによるメラノソームの貪食を抑制することにより、皮膚の色素沈着を抑制しようとする試みがなされている。メラニンはメラノサイトのなかのメラノソーム中で産生され、これがケラチノサイトに貪食される。これによりメラニンが表皮全体に分布されることになる。これをトリプシンインヒビターを用いることにより、ケラチノサイトによるメラノソームの貪食を抑制し、メラニンの拡散を防止しようとするものであるが、この方法によってもトリプシンインヒビターが直接メラニン産生に作用するもので無いため、美白化粧料として充分な効果を発揮するものではなかった。
【０００５】
セリンプロテアーゼは、活性部位にセリン残基のあるプロテアーゼであり、代表的なものにトリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼなどがあり、特許文献２や特許文献３にはセリンプロテアーゼ阻害剤に関する記載があるが何れも老化防止効果や肌荒れ改善効果に関するもので美白に関する内容は開示及び示唆されていない。
【特許文献１】特表２００１−５０２３６０号公報
【特許文献２】特開平１１−１２４３２５号公報
【特許文献３】特開２０００−３２７５５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、上記のような問題点を解決し、強い皮膚のメラニン産生阻害作用を有し、かつ産生されたメラニンのケラチノサイトへの分散を阻害することにより、皮膚刺激性や皮膚感作性といった安全性上の問題がなく、効果の高い美白化粧料の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、セリンプロテアーゼの活性を阻害させることが有効であると考え、広く種々の物質についてセリンプロテアーゼ活性阻害作用を調べた結果、Thr-Arg、Leu-Leu-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Argエチルエステルの中から選ばれる１種または２種以上の化合物を含有するセリンプロテアーゼ阻害剤とメラニン産生抑制剤を含有させることにより、極めて高い美白効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、セリンプロテアーゼによりケラチノサイトの細胞膜上のプロテアーゼアクチベートレセプター-２（PAR-2）が活性化されることにより、ケラチノサイトへのメラノソームの取り込みが活性化される。本発明のセリンプロテアーゼ活性阻害剤は、ケラチノサイト細胞膜上のPAR-2の活性化を阻害することにより、ケラチノサイトへのメラノソームの取り込みを抑制し、角質層へのメラニンの拡散が防止される。このメラニンの拡散防止により、皮膚色に黒ずみが無くなる。さらに、直接メラノサイトでのメラニン産生を阻害する素材であるメラニン産生抑制剤、例えばアスコルビン酸誘導体とを併用して、メラニン自体の産生量を減少させることにより強い美白効果を有する美白用化粧料が提供されるのである。
【発明の効果】
【０００９】
以上詳述したごとく、本発明は、メラニン産生抑制物質とセリンプロテアーゼ阻害剤を配合することにより、極めて高い美白効果を有するとともに高い安全性を有する為、広く化粧料に応用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳述する。本発明に用いるセリンプロテアーゼ阻害作用を示すThr-Arg、Leu-Leu-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Argエチルエステルは、市販の試薬類を利用することができる。また、各種タンパク類から加水分解および酵素分解によってランダムに分解したものなかから抽出精製することも可能である。
【００１１】
本発明に用いるメラニン産生抑制剤はエラグ酸及びその誘導体並びにそれらの塩、エン
ドセリン拮抗薬、アスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、グルタチオン及びその誘導体並びにそれらの塩、システイン及びその誘導体並びにそれらの塩、レゾルシン及びその誘導体並びにそれらの塩、ハイドロキノン及びその誘導体並びにそれらの塩は市販の試薬類を利用することが出来る。また、これらの化合物を多く含有する植物から各種の溶媒、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いて抽出し、精製して使用することが出来る。さらには、化学的な合成によっても上記化合物を作成することが可能である。
【００１２】
また、グラブリジン、グラブレン、リクイリチン、イソリクイリチン及びこれらを含有するカンゾウ抽出物、胎盤抽出物、カロチノイド類及びこれらを含有する動植物抽出物、イレイセン抽出物、ひまわり種子抽出物、イブキトラノオ抽出物、エイジツ抽出物、オウゴン抽出物、オノニス抽出物、海藻抽出物、クジン抽出物、ゴカヒ抽出物、リノール酸を含有する植物抽出物、リノレン酸を含有する植物抽出物、サイシン抽出物、サンザシ抽出物、シラユリ抽出物、シャクヤク抽出物、センプクカ抽出物、ソウハクヒ抽出物、大豆抽出物、茶抽出物、トウキ抽出物、ビャクレン抽出物、ブナノキ抽出物、ブドウ種子抽出物、ホップ抽出物、マイカイカ抽出物、ユキノシタ抽出物、ヨクイニン抽出物の調製は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。とりわけ、水、エチルアルコール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。
【００１３】
本発明に用いるセリンプロテアーゼ阻害作用を示すThr-Arg、Leu-Leu-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Argエチルエステルの配合量は、０．０００１〜1０．０重量％が好ましく、特に０．０１〜１．０重量％の範囲が最適である。
【００１４】
メラニン産生抑制剤として用いるエラグ酸及びその誘導体並びにそれらの塩、エンドセリン拮抗薬、アスコルビン酸及びその誘導体並びにそれらの塩、グルタチオン及びその誘導体並びにそれらの塩、システイン及びその誘導体並びにそれらの塩、レゾルシン及びその誘導体並びにそれらの塩、ハイドロキノン及びその誘導体並びにそれらの塩、グラブリジン、グラブレン、リクイリチン、イソリクイリチン及びこれらを含有するカンゾウ抽出物、胎盤抽出物、カロチノイド類及びこれらを含有する動植物抽出物、イレイセン抽出物、ひまわり種子抽出物、イブキトラノオ抽出物、エイジツ抽出物、オウゴン抽出物、オノニス抽出物、海藻抽出物、クジン抽出物、ゴカヒ抽出物、リノール酸を含有する植物抽出物、リノレン酸を含有する植物抽出物、サイシン抽出物、サンザシ抽出物、シラユリ抽出物、シャクヤク抽出物、センプクカ抽出物、ソウハクヒ抽出物、大豆抽出物、茶抽出物、トウキ抽出物、ビャクレン抽出物、ブナノキ抽出物、ブドウ種子抽出物、ホップ抽出物、マイカイカ抽出物、ユキノシタ抽出物、ヨクイニン抽出物については、それぞれの素材を乾燥した後、細かく粉砕したものを重量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。
【００１５】
以上のような条件で得られる上記各抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。
【００１６】
本発明の化粧料におけるメラニン産生抑制剤の配合量は、蒸発乾燥分に換算して０．０００１〜２０．０重量％が好ましく、特に０．０１〜１０．０重量％の範囲が最適である。
【００１７】
本発明の化粧料は、上記必須成分のほか、水性成分、油性成分、植物抽出物、動物抽出物、粉末、賦形剤、界面活性剤、油剤、アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、甘味剤、色素、香料等を必要に応じて混合して適宜配合することにより調製される。本発明の化粧料の剤型は特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム、パック、パウダー、スプレー、軟膏、分散液、洗浄料等種々の剤型とすることができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明によるセリンプロテアーゼ阻害剤およびメラニン産生抑制剤による美白効果に関する実施例を示すと共にその素材を用いた化粧料への応用処方例等について述べるが、ここに記載された実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００１９】
セリンプロテアーゼ阻害作用を示すThr-Arg、Leu-Leu-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Argエチルエステルは、全て市販の試薬類を用いた。すなわち、Thr-Argはシグマ社のThr-Argを、Leu-Leu-Argは和光純薬工業のLeupeputinを、Thr-Lys-Pro-Argは和光純薬工業のTuftsinを、Tyr-Ile-Gly-Ser-Argは和光純薬工業のLaminin  Pentapeptideを、Argエチルエステルはシグマ社のL-アルギニンエチルエステルジハイドロクロライドを使用した。
【００２０】
（トリプシン阻害活性の測定）
〔試  薬〕
・リン酸緩衝液：0.1M−NaH2PO4と0.1M−Na2HPO4を5：25で混ぜPH7.4に調製する。
・基質溶液：カゼイン（Hammerstein  Cazein）0.6gを0.05M−Na2HPO4  80mlに加え、沸騰水浴中で加熱溶解させる。冷却後、PHを7.4に調製する。
・トリプシン溶液：1:250トリプシン(DIFCO)を10μg/mlになるようにリン酸緩衝液に溶解する。
・沈澱試薬：トリクロル酢酸、酢酸Na、酢酸溶液を、それぞれ0.11M，0.22M，0.33M濃度になるように溶液を調製する。
・試料溶液：所定の濃度になるように水またはエタノールを加え調製する。
〔測  定〕
カゼイン基質溶液0.9mlに試料溶液0.1mlを加え混合する。さらに、トリプシン溶液2mlを加え撹拌し、37℃で10分間放置する。沈澱試薬3ml加えよく撹拌し、室温で15分間放置する。その後3.000rpm、15分間遠心し、上澄み液をとり280nmの吸光度を測定する。
〔阻害率の測定〕
・コントロール（C）は、トリプシン溶液を沈澱試薬の後に添加する。
・対照（T）は、試料の代わりに蒸留水を用いたもの。
・試験区（S）は、各試料を用いて上記の操作を行ったもの。
【００２１】
【数１】
2006273808.tif 000002
【００２２】
【表１】
2006273808.tif 000003
【００２３】
表1に各種サンプルのトリプシン阻害率を示した。ベンザミジンはトリプシン阻害剤として各種用途に使用されている物質であり、0.1%濃度で10.3%の阻害率を示した。N末端にArgがあるジペプチドとしてArg-Ala、およびArg-グルタメートの試験を実施したが、0.1%濃度で1.7%、および-3.3%の阻害活性しか示さなかった。また、Argを含まないジペプチドとしてGly-Glyの試験を実施したが、0.1%濃度で-4.5%となり、阻害活性は示さなかった。これに対して、C末端がArgのジペプチドであるThr-Argは、0.1%濃度で14.6%の阻害活性を示した。また、Argエチルエステルは、0.1%濃度で11.1%の阻害活性を示した。さらに、C末端アルギニンのトリペプチド、テトラペプチド、ヘキサペプチドであるLeu-Leu-Arg、Thr-Lys-Pro-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Argの試験を実施したが、それぞれ0.1%濃度で65.0%、29.4%、52.2%と高い阻害活性を示した。また、アルギニンを含まないトリペプチドとしてGly-Tyr-Ala、Tyr-Gly-Gly、Val-Tyr-Valの試験を実施したが、0.1%濃度でそれぞれ阻害活性が2.5%、3.6%、0.3%であり、阻害活性は示さなかった。以上の結果から、C末端にアルギニンを有するペプチドのトリプシン阻害活性が高いことがわかった。
【００２４】
次に、本発明の各種成分を配合した化粧料の処方例の例を示すが、本発明はこれに限定されるものでない。
化粧料の処方例
【００２５】
（１）化粧用クリーム                              
（重量％）
a)ミツロウ                                            
2.0
b)ステアリルアルコール                               
5.0
c)ステアリン酸                                  
8.0
d)スクワラン                                        
10.0
e)自己乳化型グリセリルモノステアレート               
3.0
f)ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.)            
1.0
g)ホホバ油                                           
10.0
h)
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg                                
0.5
i)アスコルビン酸グルコシド                            2.0
j)1,3-ブチレングリコール                              
5.0
k)水酸化カリウム                                     
0.3
l)防腐剤・酸化防止剤                                 
適量
m)精製水                                             
残部
製法  a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。H)〜m)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。その後、g)を加え、攪拌し均一に溶解する。
【００２６】
（２）乳液                                         
（重量％）
a)ミツロウ                                           
0.5
b)ワセリン                                           
2.0
c)スクワラン                                          8.0
d)ソルビタンセスキオレエート                         
0.8
e)ポリオキシエチレンオレイルエーテル(20E.O.)           1.2
f)Thr-Arg                                  
1.0
g)アルブチン                                         
2.0
h)1,3-ブチレングリコール               
7.0
i)カルボキシビニルポリマー                           
0.2
j)水酸化カリウム                                     
0.1
k)精製水                                            
残部
l)防腐剤・酸化防止剤                                 
適量
m)エタノール                     
7.0
製法  a)〜e)までを加熱溶解し、80℃に保つ。h)〜l)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。50℃でf)、g)、m)を添加し、40℃まで攪拌、冷却する。
【００２７】
（３）化粧水                                          
(重量%)
a)Leu-Leu-Arg                                        
0.1
b)アスコルビン酸リン酸マグネシウム                     1.0
c)グリセリン                                           
5.0
d)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.)    1.0
e)エタノール                                           
6.0
f)香料                                                
適量
g)防腐剤・酸化防止剤                                    適量
h)精製水                                              
残部
製法  a)とｂ）を均一に混合する。ｃ)〜h)までを混合し、均一に溶解する。使用時に2剤を混合して使用する。
【００２８】
（４）化粧水                                          
(重量%)
a)
Thr-Lys-Pro-Arg                                      0.05
b)グルタチオン                                          0.1
c)グリセリン                                           
5.0
d)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.)     1.0
e)エタノール                                           
6.0
f)香料                                                
適量
g)防腐剤・酸化防止剤                                    適量
h)精製水                                              
残部
製法  a)〜b)までを混合する。ｃ)〜h)までを混合し、均一に溶解する。使用時に2剤を混合して使用する。
【００２９】
（５）洗顔剤                                  
(重量%)
a)Thr-Arg                                          
0.5
b)アスコルビン酸グルコシド                 
2.0
c)シャクヤク抽出液                                    0.5
d)タルク                                            
残部
e)セルロース                              
20.0
f)ミリスチン酸カリウム                              
30.0
g)ラウリルリン酸ナトリウム                 
10.0
h)香料                                              
適量
i)防腐剤                                            
適量
製法 a)〜i)までを混合し、よく撹拌、分散させ均一にする。
【００３０】
〔効果確認試験〕
（１）塗布によるヒトでの効果確認試験
被験者として、２５〜５５歳の女性２０名に１日２回（朝、夜）連続２ヵ月間、本発明品と比較品のそれぞれを使用させ、塗布部位の状態を試験前後で比較し、改善効果を調べた。本試験には、実施例１として００２５で示した化粧料を用い、比較例 1 には００２５に示した化粧料からTyr-Ile-Gly-Ser-Argを除いた化粧料、比較例 2 には００２５に示した化粧料からアスコルビン酸グルコシドを除いた化粧料を作成し、その使用による効果について調べた。本発明の有効成分を配合した化粧料を毎日使用しながら肌のクスミおよび美白効果を塗布開始前及び2ヶ月塗布後におけるアンケートで集計し、効果の確認を行った。結果及び評価基準は表２及び表３に示す。
【００３１】
【表２】
2006273808.tif 000004
【００３２】
【表３】
2006273808.tif 000005
【００３３】
表２からも明らかなように、従来のメラニン産生抑制剤のみからなる比較例１
、セリンプロテアーゼ阻害剤のみからなる比較例２と比較して、メラニン産生抑制物質およびセリンプロテアーゼ阻害物質からなる実施例１は評点合計が７３点となった。これに対して比較例１は５１点、比較例２の評点合計は４９点であり、本発明品の高い美白効果が認められた。また、実施例１を使用した被験者2０名は、試験期間中に肌の異常を感じたパネラーは１名も発生しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のメラニン産生抑制物質とセリンプロテアーゼ阻害剤を配合した化粧料は、美白効果の優れると共に高い安全性を有するため、種々の美白化粧料に応用が可能である。