(57)【要約】【課題】  標本上に任意の測定対象領域を簡単に設定できるとともに、これら測定対象領域の分光情報を精度よく取得できる多点蛍光分光測光顕微鏡および多点蛍光分光測光方法を提供する。【解決手段】  光源からの光を発生する照明光学系からの光を標本Ｓ上に集光させる対物レンズ１の焦点位置と光学的に共役な位置にＤＭＤ３を配置し、標本Ｓより発生する光を撮像するＣＣＤカメラ１３の撮像画面から標本Ｓ上のＲＯＩを設定し、この設定されたＲＯＩに応じてＤＭＤ３の反射パターンを制御するとともに、標本Ｓ上のＲＯＩに対応する領域より発生する光をグレーティング１８とラインフォトセンサアレイ１９により波長分散して取得する。【選択図】      図１
2006171024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源からの光を標本上に照射する照明光学系と、
前記標本像を形成する対物レンズと、
前記照明光学系における前記標本と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子と、
前記対物レンズにより形成された標本像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段の撮像画像から前記標本上の測定対象領域を設定する測定対象領域設定手段と、
前記測定対象領域設定手段で設定された測定対象領域に応じて前記微小偏向素子の光の偏向パターンを制御する制御手段と、
前記標本上の測定対象領域より発生する光を波長分散して取得する分光検出手段と、
を具備したことを特徴とする多点蛍光分光測光顕微鏡。
【請求項２】
光源と、
前記光源からの光を発生する照明光学系と、
前記照明光学系からの光を標本上に集光させる対物レンズと、
前記照明光学系における前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子と、
前記標本より発生する光を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段の撮像画像から前記標本上の測定対象領域を設定する測定対象領域設定手段と、
前記測定対象領域設定手段で設定された測定対象領域に応じて前記微小偏向素子の光の偏向パターンを制御する制御手段と、
前記標本上の測定対象領域より発生する光を波長分散して取得する分光検出手段と、
を具備したことを特徴とする多点蛍光分光測光顕微鏡。
【請求項３】
光源と、
前記光源からの光を発生する照明光学系と、
前記照明光学系からの光を標本上に集光させる対物レンズと、
前記照明光学系における前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子と、
前記対物レンズを通った結像レンズを有する第１の観察光学系における前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され前記標本の投影像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段と光学的に共役な位置に入射面を配置され前記標本の投影像を伝送するファイバと、
前記ファイバから出射された光を波長分散して取得する分光検出手段と、
前記撮像手段の撮像画面から前記標本上の測定対象領域を設定する測定対象領域設定手段と、
前記測定対象領域設定手段で設定された測定対象領域に応じて前記微小偏向素子の偏向パターンを制御するとともに、前記分光検出手段の取得データを処理する制御手段と、
を具備したことを特徴とする多点蛍光分光測光顕微鏡。
【請求項４】
前記測定対象領域設定手段は、前記撮像画面から光を発している任意の領域を測定対象領域として設定することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の多点蛍光分光測光顕微鏡。
【請求項５】
前記測定対象領域設定手段は、前記撮像画面から発せられる光の輝度値の２値化されたデータに基づいて測定対象領域を設定することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の多点蛍光分光測光顕微鏡。
【請求項６】
前記ファイバの入射面は、前記対物レンズを通った他の結像レンズを有する第２の観察光学系における前記撮像手段と光学的に共役な位置に配置されたことを特徴とする請求項２乃至５のいずれかに記載の多点蛍光分光測光顕微鏡。
【請求項７】
光源からの光が照明光学系を介して照射される標本の視野全体の撮像画像を取得する第１のステップと、
前記第１のステップで取得された撮像画像から前記標本上の測定対象領域を設定する第２のステップと、
前記第２のステップで設定された測定対象領域に応じて、前記照明光学系の前記標本と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子の偏向パターンを制御する第３のステップと、
前記第３のステップで偏向パターンを制御された前記微小偏向素子を介して光が照射される前記標本上の前記測定対象領域より発生する光を波長分散して取得する第４のステップと
を具備したことを特徴とする多点蛍光分光測光方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本内の複数の測定対象領域の蛍光を分光測光する多点蛍光分光測光顕微鏡および多点蛍光分光測光方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、細胞の活性状態や特定遺伝子の発現等を確認するために、顕微鏡を利用して細胞内物質が発する蛍光を検出する方法が用いられている。そして、このような蛍光検出方法では、特に、標本中の複数の細胞を選別したり個別に蛍光の分光波長特性を解析することを、より高速かつ高精度に行うことが要求されている。
【０００３】
このような背景から、標本中において観察や測定の対象とする測定対象領域として，標的領域(Region  Of  Interest:以下「ＲＯＩ」と称する。)を任意に設定し、これらＲＯＩに対して特定の波長のみを選別するなどの、いわゆる光学的変調手段として、微小偏向素子、例えば、Digital  Micro-mirror  Device(以下「ＤＭＤ」と称する)を使用する技術が実用化されている。ここで、ＤＭＤは、１６μｍ角程のマイクロミラーを１つの画素とし、各画素片ごとに傾き角度を制御可能にしたものである。
【０００４】
このようなＤＭＤを用いた顕微鏡としては、特許文献１に開示されように、照明光学系における標本面と光学的に共役な位置にＤＭＤを配置し、このＤＭＤによって選択的に設定されたパターンの照明光を標本面に投影し、ＤＭＤのパターンによって照明された標本からの光を、観察光学系における標本面と光学的に共役な位置に配置され且つＤＭＤと共役な形状の照明パターンを透過させて分光測光を行う解析手段に入射するようにしたものや、特許文献２に開示されるように照明光学系における標本面と光学的に共役な位置にＤＭＤを配置し、このＤＭＤによって選択的に設定されたパターンの照明光を標本面に投影し、ＤＭＤのパターンによって照明された標本からの光を、観察光学系における標本面と光学的に共役な位置で標本像として観察するようにしたものが考えられている。
【特許文献１】特開平１１−２４９０２３号公報
【特許文献２】特開２００３−１０７３６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、特許文献１のものは、照明光学系における標本面と光学的に共役な位置にＤＭＤを配置し、観察光学系における標本面と光学的に共役な位置にＤＭＤと共役な形状のパターンを配置し、このパターン(引例ではスリット形状)を共焦点絞りとした共焦点分光顕微鏡を構成するため、標本上に任意に設定したＲＯＩの画像を取得するには、パターンをシーケンシャルに走査して二次元画像にする必要があり、ＲＯＩ画像の取得に手間と時間がかかるという問題をあった。
【０００６】
また、特許文献２のものは、照明光学系における標本面と光学的に共役な位置にＤＭＤを配置し、ＤＭＤのパターンによって標本上に任意に設定したＲＯＩを二次元的に照明するため、二次元画像をリアルタイムで取得することはできるが、このように二次元画像として取得されたデータを分光検出することについて何も開示されていない。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、標本上に任意の測定対象領域を簡単に設定できるとともに、これら測定対象領域の分光情報を効率よく取得できる多点蛍光分光測光顕微鏡および多点蛍光分光測光方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１記載の発明は、光源と、前記光源からの光を標本上に照射する照明光学系と、前記標本像を形成する対物レンズと、前記照明光学系における前記標本と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子と、前記対物レンズにより形成された標本像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段の撮像画像から前記標本上の測定対象領域を設定する測定対象領域設定手段と、前記測定対象領域設定手段で設定された測定対象領域に応じて前記微小偏向素子の光の偏向パターンを制御する制御手段と、前記標本上の測定対象領域より発生する光を波長分散して取得する分光検出手段と、を具備したことを特徴としている。
【０００９】
請求項２記載の発明は、光源と、前記光源からの光を発生する照明光学系と、前記照明光学系からの光を標本上に集光させる対物レンズと、前記照明光学系における前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子と、前記標本より発生する光を撮像する撮像手段と、前記撮像手段の撮像画像から前記標本上の測定対象領域を設定する測定対象領域設定手段と、前記測定対象領域設定手段で設定された測定対象領域に応じて前記微小偏向素子の光の偏向パターンを制御する制御手段と、前記標本上の測定対象領域より発生する光を波長分散して取得する分光検出手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１０】
請求項３記載の発明は、光源と、前記光源からの光を発生する照明光学系と、前記照明光学系からの光を標本上に集光させる対物レンズと、前記照明光学系における前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子と、前記対物レンズを通った結像レンズを有する第１の観察光学系における前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に配置され前記標本の投影像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段と光学的に共役な位置に入射面を配置され前記標本の投影像を伝送するファイバと、前記ファイバから出射された光を波長分散して取得する分光検出手段と、前記撮像手段の撮像画面から前記標本上の測定対象領域を設定する測定対象領域設定手段と、前記測定対象領域設定手段で設定された測定対象領域に応じて前記微小偏向素子の偏向パターンを制御するとともに、前記分光検出手段の取得データを処理する制御手段と、を具備したことを特徴としている。
【００１１】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記測定対象領域設定手段は、前記撮像画面から光を発している任意の領域を測定対象領域として設定することを特徴としている。
【００１２】
請求項５記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記測定対象領域設定手段は、前記撮像画面から発せられる光の輝度値の２値化されたデータに基づいて測定対象領域を設定することを特徴としている。
【００１３】
請求項６記載の発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載の発明において、前記ファイバの入射面は、前記対物レンズを通った他の結像レンズを有する第２の観察光学系における前記撮像手段と光学的に共役な位置に配置されたことを特徴としている。
【００１４】
請求項７記載の発明は、光源からの光が照明光学系を介して照射される標本の視野全体の撮像画像を取得する第１のステップと、前記第１のステップで取得された撮像画像から前記標本上の測定対象領域を設定する第２のステップと、前記第２のステップで設定された測定対象領域に応じて、前記照明光学系の前記標本と光学的に共役な位置に設けられた微小偏向素子のの偏向パターンを制御する第３のステップと、前記第３のステップで偏向パターンを制御された前記微小偏向素子を介して光が照射される前記標本上の前記測定対象領域より発生する光を波長分散して取得する第４のステップとを具備したことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、標本上に任意の測定対象領域を簡単に設定できるとともに、これら測定対象領域の分光情報を効率よく取得できる多点蛍光分光測光顕微鏡を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１７】
(第１の実施の形態)
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる多点蛍光分光測光顕微鏡の概略構成を示している。
【００１８】
図において、Ｓは標本で、この標本Ｓに近接して対物レンズ１が配置されている。対物レンズ１は、標本Ｓ上に照明光を集光させるとともに、焦点位置から入射した光を略平行な光にして観察に供するものである。
【００１９】
対物レンズ１の観察光軸Ａ上には、ミラー２が配置されている。このミラー２は、照明光軸Ｂ１との交点にあって、照明光を対物レンズ１側に反射するようにしている。
【００２０】
この場合、ミラー２は、後述する励起フィルタ７の透過波長域を反射するとともに、吸収フィルタ８の透過波長域を透過する特性を有するもので、例えば、ロングパスダイクロイックミラーもしくは波長によらず反射率が略一定であるハーフミラーが用いられる。
【００２１】
照明光軸Ｂ１上には照明光軸Ｂ２との交点にＤＭＤ３が配置されている。この場合、ＤＭＤ３は、対物レンズ１の焦点位置と光学的に共役な位置関係にある。
【００２２】
ＤＭＤ３とミラー２との間の照明光軸Ｂ１上には、照明光学系を構成する投影レンズ４と励起フィルタ７が配置されている。投影レンズ４は、ＤＭＤ３の像を対物レンズ１の焦点面上に投影するためのものである。また、励起フィルタ７は、所定の波長域の照明光を透過するバンドパスフィルタで、蛍光観察を行う場合において、照明光路中に挿入される。
【００２３】
ＤＭＤ３に入射する照明光軸Ｂ２上には、光源５が配置されている。また、光源５とＤＭＤ３の間の照明光軸Ｂ２上には、光源５から発した光を略平行な光にするコレクタレンズ６が配置されている。
【００２４】
この場合、ＤＭＤ３は、反射（偏向）パターンを構成するマイクロミラーがＯＮの状態で、照明光軸Ｂ２の方向から入射する光を照明光軸Ｂ１の方向へ反射し、ＯＦＦの状態で、照明光軸Ｂ２の方向から入射する光を照明光軸Ｂ１から外れた別方向へ反射するようになっている。これにより、光源５から発した光は、ＤＭＤ３の反射パターンによって選択的に照明光軸Ｂ１方向へ導かれ、投影レンズ４、ミラー２、対物レンズ１を介して照明光として標本Ｓに投影される。
【００２５】
ミラー２の標本Ｓからみた透過光路側、つまり観察光軸Ａの延長上には、吸収フィルタ８、結像レンズ９および第１観察光路分岐部１０が配置されている。
【００２６】
吸収フィルタ８は、励起フィルタ７の透過波長域よりも長い波長域のみを透過するロングパスフィルタで、蛍光観察を行う場合において、励起フィルタ７とともに光路中に挿入される。第１観察光路分岐部１０は、複数のプリズムの切換もしくは単一のミラーの挿脱(図１においては複数のプリズムの切換)を可能にしたもので、観察光軸Ａを進んできた光を透過してなる観察光軸Ａ１と、反射してなる観察光軸Ａ２の２つに分岐するようにしている。
【００２７】
観察光軸Ａ１上には、接眼レンズ１１が配置されている。この接眼レンズ１１は、結像レンズ９の結像位置に配置され、標本Ｓの観察像を目視観察可能にしている。
【００２８】
観察光軸Ａ２の延長上には、第２観察光路分岐部１２が配置されている。第２観察光路分岐部１２は、複数のプリズムの切換もしくは単一のミラーの挿脱(図１においては単一のミラーの挿脱)を可能にしたもので、観察光軸Ａ２を進んできた光を透過してなる観察光軸Ａ３と、反射してなるる観察光軸Ａ４の２つに分岐するようにしている。
【００２９】
観察光軸Ａ３上には、撮像手段としてのＣＣＤカメラ１３が配置されている。ＣＣＤカメラ１３は、結像レンズ９の焦点位置(対物レンズ１の焦点位置と光学的に共役な位置)に不図示の撮像面が位置され、標本Ｓの投影像を撮像するようになっている。
【００３０】
観察光軸Ａ４上には、リレーレンズ１４、縮小レンズ１５および光ファイバ１６の入射面１６ａが配置されている。リレーレンズ１４は、結像レンズ９の焦点位置(対物レンズ１の焦点位置と光学的に共役な位置)において標本Ｓの投影像を結んだ後に発散した観察光を略平行な光にするものである。縮小レンズ１５は、リレーレンズ１４からの平行光を集光し、標本Ｓの投影像を縮小倍率で結像させるものである。光ファイバ１６は、入射面１６ａを縮小レンズ１５の焦点位置に配置され、縮小倍率で結像された標本Ｓの投影像が入射される。
【００３１】
ファイバ１６の出射面１６ｂからの光路上には、コリメートレンズ１７、分光検出手段を構成するグレーティング１８およびラインフォトセンサアレイ１９が配置されている。コリメートレンズ１７は、ファイバ１６の出射面１６ｂから出射した光を略平行な光にするものである。グレーティング１８は、コリメートレンズ１７からの平行光を波長分散させるものである。ラインフォトセンサアレイ１９は、グレーティング１８で波長分散された光を受光検出するものである。
【００３２】
ＤＭＤ３、ＣＣＤカメラ１３、およびラインフォトセンサアレイ１９は、それぞれ測定対象領域設定手段および制御手段としてのパーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと称する。）２０と電気的に接続されている。ＰＣ２０は、ＤＭＤ３の反射パターン、つまりＯＮ・ＯＦＦパターンの設定および駆動、ＣＣＤカメラ１３およびラインフォトセンサアレイ１９の取得データの蓄積、読み出し、演算処理等の機能を有する。また、必要に応じて顕微鏡の各部分の駆動および切換動作を行う。
【００３３】
ＰＣ２０には、表示手段としてモニタ２１が電気的に接続されている。モニタ２１は、ＤＭＤ３のＯＮ・ＯＦＦパターン、ＣＣＤカメラ１３の取得画像、ラインフォトセンサアレイ１９の取得分光情報、およびＰＣ２０による演算や電気的処理に必要な情報を表示するものである。
【００３４】
次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。
【００３５】
まず、標本Ｓの投影像について簡単に説明する。例えば焦点距離９ｍｍの対物レンズ１と焦点距離１８０ｍｍの結像レンズ９を用いると、これら対物レンズ１と結像レンズ９で形成される標本Ｓの投影像、すなわち一次投影像は、標本Ｓを２０倍に拡大した像となる(１８０÷９＝２０)。言い方を変えると、対物レンズ１の倍率は２０倍であり、ＣＣＤカメラ１３は標本Ｓの２０倍の拡大像を撮像することになる。一方、例えば焦点距離１８０ｍｍのリレーレンズ１４と焦点距離９ｍｍの縮小レンズ１５を用いると、これらリレーレンズ１４と縮小レンズ１５により形成されるリレー像すなわち二次投影像は、一次投影像を２０分の１に縮小した像となり、標本Ｓから二次投影像への倍率は１倍となる。
【００３６】
これにより、仮に、標本Ｓの観察対象範囲を直径０.２ｍｍとすると、ファイバ１６の入射面１６a上に投影される二次投影像は、直径０.２ｍｍとなり、観察対象範囲の光を受光するためにはコア径０.２ｍｍ以上のマルチモードファイバが使用される。
【００３７】
このようにして、必要とされる標本Ｓの観察対象範囲に応じて、二次投影像の投影倍率とファイバ１６の径が適宜決定される。
【００３８】
そして、ファイバ１６の入射面１６a上に形成された二次投影像は、ファイバ１６により二次投影像の積算した光量として伝送され、コリメートレンズ１７を通って、その全てがグレーティング１８に取り込まれ、波長分散されてラインフォトセンサアレイ１９で受光検出される。すなわち、標本Ｓの観察対象領域内から発する蛍光の積算した光量が分光されて取得される。
【００３９】
次に、標本Ｓの分光情報を測定する手順について詳細に説明する。
【００４０】
標本Ｓの分光情報を測定するに当たっては、まず、ＣＣＤカメラ１３で得られた標本Ｓの画像を元にしてＤＭＤ３のＯＮ・ＯＦＦパターンを設定する。この場合、ＤＭＤ３のＯＮ・ＯＦＦパターンと、ＣＣＤカメラ１３で取得されるＤＭＤ３のＯＮ・ＯＦＦパターンの投影像との相対誤差を事前に把握し、測定時に補正を行なう必要がある。
【００４１】
このための処理として、図２に示すフローチャートにしたがって「測定前処理」を実行する。
【００４２】
まず、ステップ２０１で、蛍光プレートを標本Ｓの位置に設置し、対物レンズ１の焦点を合わせる。この場合、蛍光プレートとしては、蛍光物質が一様に塗布されているガラス板等を用いることが望ましい。
【００４３】
次に、ステップ２０２で、基準パターンをＰＣ２０のメモリー上で作成し、それをＤＭＤ３に送出する。この場合、予めＰＣ２０上で作成した基準パターンをＤＭＤ３に送出して、ＤＭＤ３上にその基準パターンを形成させる。図４は基準パターンの一例を示している。そして、ステップ２０３で，標本Ｓの位置に設置された蛍光プレートをＤＭＤ３上に設定した基準パターンで励起する。このときの励起光は、ＤＭＤ３上に形成された基準パターンで変調された後、蛍光プレートに照射される。基準パターンで励起されて蛍光プレートより蛍光が発せられると、次のステップ２０４で、蛍光をＣＣＤカメラ１３で取得し、その投影像をＰＣ２０上のメモリーに蓄積する。
【００４４】
次に、ステップ２０５で、予めＰＣ２０上で作成しＤＭＤ３上に形成した基準パターンと、ＣＣＤカメラ１３で取得した基準パターンの投影像とを比較し、平行移動量、拡大率および回転角を計算し、ステップ２０６で、これらの値をＰＣ２０上の不図示のメモリに記憶する。
【００４５】
これ以降、ＰＣ２０上で指定したＲＯＩ情報をＤＭＤ３に送出する際に、これらの値をもとに、補正演算を行い、これの情報をＤＭＤ３に送出するようにする。これにより、測定の際、ＣＣＤカメラ１３で取得した標本Ｓの画像をもとにＰＣ２０上で指定したＲＯＩと、実際に標本Ｓ上で照明されるＲＯＩとを完全に一致させることができる。
【００４６】
なお、回転角の補正は、ＣＣＤカメラ１３自体を回転させることで行うことができ、この場合は、ＰＣ２０上での回転角の補正を省略することもできる。
【００４７】
次に、標本Ｓの分光情報の測定を行う。
【００４８】
この場合、標本Ｓの分光情報の測定を行う手順として、図３に示すフローチャートにしたがって「測定手順」が実行される。
【００４９】
まず，ステップ３０１で、ＣＣＤカメラ１３で標本Ｓの視野全体の投影像を取得する。この場合、測定対象物を含んだ標本Ｓに対物レンズ１の焦点を合わせる。次に、標本Ｓに対して励起光が一様に照射されるようにＤＭＤ３を全領域ＯＮにし、この状態で、標本Ｓに励起光を照射し、その蛍光像をＣＣＤカメラ１３で取得する(図５（Ａ）)。
【００５０】
次に、ステップ３０２で、取得した投影像をモニタ２１に表示する。
【００５１】
次に、ステップ３０３で、モニタ２１の表示画像から測定対象物を選択し、この測定対象物を含む範囲を測定対象領域としてＲＯＩを設定する。この場合、図５（Ｂ）に示すように実際のモニタ２１の表示画像を見ながら、蛍光を発している任意の領域を測定対象物として選択し、測定対象物を含む範囲でＲＯＩを設定する。このときのＲＯＩの形状は、図のように円または楕円形のような単純形状にするのが一般的であるが、測定対象物の輪郭を描画するような複雑な形状とすることも可能である。
【００５２】
次に、ステップ３０４で、上述の設定された各ＲＯＩの情報をＰＣ２０上の不図示のメモリに個別に記憶する。また、ＲＯＩを全て設定したら、ＤＭＤ３の全領域をＯＦＦにして、標本Ｓへの照明を遮断する。
【００５３】
次に、ステップ３０５で、第２観察光路分岐部１２の観察光線の向きを観察光軸Ａ３から観察光軸Ａ４に切り換える。つまり、第２観察光路分岐部１２を駆動して、観察光線の向きをＣＣＤカメラ１３に向かう観察光軸Ａ３から、ラインフォトセンサアレイ１９に向かう観察光軸Ａ４に切り換える。
【００５４】
次に、ステップ３０６で、ＰＣ２０のメモリに記憶された各ＲＯＩの情報から、適宜決められた順序に従って単一のＲＯＩを呼び出す（以下、＃１のＲＯＩについて記す。）。
【００５５】
次に、ステップ３０７で、設定された各ＲＯＩのうち＃１のＲＯＩについて、上述した「測定前処理」で求めた計算結果に基づいて補正演算を行い、反射パターンとしての第１のマスクパターンを構築する。
【００５６】
次に、ステップ３０８で、第１のマスクパターンをＤＭＤ３に送出し、標本Ｓ上の＃１のＲＯＩを照明する。この場合、ＤＭＤ３は、第１のマスクパターンに基づいてマイクロミラーの傾きが設定される。これによって励起光が変調をうけ、標本Ｓ上に照射される。この時、照射される領域は、＃１のＲＯＩとして設定した領域のみである(図５（Ｃ）)。
【００５７】
次に、ステップ３０９で、ラインフォトセンサアレイ１９により＃１のＲＯＩの蛍光の分光情報を取得し、その結果をメモリに記憶する。この場合、標本Ｓ上の＃１のＲＯＩと設定された領域から発した蛍光は、ファイバ１６を通り、グレーティング１８で分光された後、ラインフォトセンサアレイ１９に入射する。これにより、＃１のＲＯＩの蛍光の分光情報が取得され、この測定結果がＰＣ２０のメモリに記憶される。
【００５８】
以下、同様な動作を全てのＲＯＩに対して繰り返す（ステップ３１０）。つまり、＃１のＲＯＩに続けて、＃２のＲＯＩのついて、上述と同様の手順で蛍光の分光情報を取得し、測定結果をＰＣ２０のメモリに記憶し(図５（Ｄ）)、さらに、＃３のＲＯＩ、＃４のＲＯＩ…、についても同様な動作を行い、全てのＲＯＩについて同じ動作を繰り返すことにより、設定された全てのＲＯＩに関する蛍光の分光情報が(図５（Ｅ）)、ＰＣ２０のメモリに記憶される。
【００５９】
従って、このようにすれば、標本Ｓの撮像画面上で測定対象物を含むＲＯＩを設定し、これらＲＯＩに基づいて設定されるマスクパターンによりＤＭＤ３の反射パターンを設定して標本Ｓ上に照明光を照射するようにしたので、測定対象物を含むＲＯＩのみを選択的に励起することができる。これにより、それぞれ設定された標本Ｓ上の各ＲＯＩから発する蛍光の分光情報を、他の領域からの不要な蛍光によるクロストークを発生させることなく、高精度に測定することができる。
【００６０】
また、各々の時点で測定対象となっていないＲＯＩには、光源５からの励起光が照射されることがないので、蛍光物質の無用な退色や光毒性変化が生じるのを抑制することができる．
さらに、設定されたＲＯＩ全体から発する蛍光の積算した光量を分光測定することができるので、指定したＲＯＩから発する蛍光の密度が低い場合でも、確実な分光測定を行うことが可能となる。
【００６１】
さらに、標本Ｓに対して観察視野内の全ての位置における測定対象物の分光情報を取得することができるため、測定中に測定対象物を観察視野の中心に移動させるなど、標本Ｓを移動させる必要がなく、能率的に分光測定を行うことが可能となる。
【００６２】
さらに、一つのＲＯＩに対して二次元領域を走査することなく分光情報が取得できることや、ＤＭＤ３によるＲＯＩの高速切換が可能なことにより、分光測定のための時間の短縮が可能となる。
【００６３】
(第２の実施の形態)
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。
【００６４】
この場合、本発明の第２の実施の形態にかかる多点蛍光分光測光顕微鏡の概略構成については、図１と同様なので、同図を援用するものとする。
【００６５】
この第２の実施の形態は、上述した第１の実施の形態と同一の構成において、「測定手順」を異にするものである。
【００６６】
この場合、標本Ｓの分光情報を測定する手順をとして、図６に示すフローチャートにしたがって「測定手順」が実行される。
【００６７】
まず、ステップ６０１で、ＣＣＤカメラ１３で標本Ｓの視野全体の投影像を取得する。この場合も、測定対象物を含んだ標本Ｓに、対物レンズ１の焦点を合わせ、次に、標本Ｓに対して励起光が一様に照射されるようにＤＭＤ３を全領域ＯＮにして、標本Ｓに励起光を照射し、その蛍光像をＣＣＤカメラ１３で取得する(図７（Ａ）)。
【００６８】
次に、ステップ６０２で、取得した蛍光像を適切な閾値により発光の有無を選別する２値化画像処理をする。この場合、取得した蛍光像の輝度値をもとに、閾値を適切に設定し、この閾値により発光の有無により選別され２値化画像データを取得する。
【００６９】
次に、ステップ６０３で、２値化した画像データから測定対象物の輪郭を抽出して、ＲＯＩを自動設定する。この場合、２値化した画像データから２値の境界の位置をＰＣ２０の演算処理で算出して測定対象物の輪郭を抽出する(図７（Ｂ）)。そして、この輪郭により形成された領域をＲＯＩとして個々に自動設定していく。
【００７０】
なお、上述では、蛍光像の輝度値をもとに２値化することとしたが、この他に、複数の異なる蛍光フィルターを用いて順次取得した蛍光像の比をもとに２値化してもよい。
【００７１】
次に、ステップ６０４で、自動設定された個々のＲＯＩの情報をＰＣ２０上のメモリに個別に記憶する(図７（Ｃ）)。また、ＲＯＩの自動設定の終了により、ＤＭＤ３の全領域をＯＦＦにして、標本Ｓへの照明を遮断する。
【００７２】
次に、ステップ６０５で、第２観察光路分岐部１２の観察光線の向きを観察光軸Ａ３から観察光軸Ａ４に切り換える。つまり、第２観察光路分岐部１２を駆動して、観察光線の向きをＣＣＤカメラ１３に向かう観察光軸Ａ３から、ラインフォトセンサアレイ１９に向かう観察光軸Ａ４に切り換える。
【００７３】
次に、ステップ６０６で、ＰＣ２０のメモリに記憶された各ＲＯＩの情報から、適宜決められた順序に従って単一のＲＯＩを呼び出す（以下、＃１のＲＯＩについて記す。）。
【００７４】
次に、ステップ６０７で、自動設定された各ＲＯＩのうち＃１のＲＯＩについて、前述した「測定前処理」で求めた計算結果に基づいて補正演算を行い、第１のマスクパターンを構築する。
【００７５】
次に、ステップ６０８で、＃１のマスクパターンをＤＭＤ３に送出し、標本Ｓ上の＃１のＲＯＩを照明する。この場合、ＤＭＤ３は、第１のマスクパターンに基づいて各マイクロミラーの傾きが設定される。これによって励起光が変調をうけ、標本Ｓ上に照射される。この時、照射される領域は、＃１のＲＯＩとして設定した領域のみである(図７（Ｄ）)。
【００７６】
次に、ステップ６０９で、ラインフォトセンサアレイ１９により＃１のＲＯＩの蛍光の分光情報を取得し、その結果をメモリ記憶する。この場合、標本Ｓ上の＃１のＲＯＩと設定された領域から発した蛍光は、ファイバ１６を通り、グレーティング１８で分光された後、ラインフォトセンサアレイ１９に入射する。これにより、＃１のＲＯＩの蛍光の分光情報が取得され、この測定結果がＰＣ２０のメモリに記憶される。
【００７７】
以下、同様な動作を全てのＲＯＩに対して繰り返す（ステップ６１０）。つまり、＃１のＲＯＩに続けて、＃２のＲＯＩのついて、上述と同様の手順で蛍光の分光情報を取得し、測定結果をＰＣ２０のメモリに記憶し(図７（Ｅ）)、さらに、＃３のＲＯＩ、＃４のＲＯＩ…、についても同様な動作を行い、全てのＲＯＩについて同じ動作を繰り返すことにより、設定された全てのＲＯＩにかかる蛍光の分光情報が、ＰＣ２０のメモリに記憶される(図７（Ｆ）)。
【００７８】
従って、このようにしても、第１の実施の形態で述べたと同様な効果を得ることができる。さらに、ＣＣＤカメラ１３で取得した標本Ｓの蛍光像の輝度値に対し、適切な閾値により発光の有無を選別する２値化画像処理を行うことで、標本Ｓに対して最適な複数のＲＯＩを自動的に設定することができる。さらに、設定された複数のＲＯＩの分光情報を順次取得する手順をＰＣ２０の処理プログラムとして用意することで、観察視野中の測定対象物の分光測定を全て自動で行うことが可能になり、分光測光のための作業を効率的に行うことができる。
【００７９】
(第３の実施の形態)
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。
【００８０】
図８は、本発明の第３の実施の形態にかかる多点蛍光分光測光顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００８１】
この場合、ミラー２の標本Ｓからみた透過光路側、つまり観察光軸Ａの延長上の吸収フィルタ８と結像レンズ９との間の光路上には、第３観察光路分岐部３１が配置されている。
【００８２】
第３観察光路分岐部３１は、複数のプリズムの切換もしくは単一のミラーの挿脱(図５においては単一のミラーの挿脱)を可能としたもので、観察光軸Ａを進んできた光を透過してなる観察光軸Ａ５と、反射してなる観察光軸Ａ６の２つに分岐するようにしている。
【００８３】
観察光路Ａ５上には、結像レンズ９と第１観察光路分岐部１０が配置されている。第１観察光路分岐部１０は、複数のプリズムの切換もしくは単一のミラーの挿脱(図５においては複数のプリズムの切換)を可能にしたもので、観察光軸Ａ５を進んできた光を透過してなる観察光軸Ａ７と、反射してなるる観察光軸Ａ８の２つに分岐するようにしている。
【００８４】
観察光軸Ａ７上には、接眼レンズ１１が配置されている。この接眼レンズ１１は、結像レンズ９の結像位置に配置され、標本Ｓの観察像を目視観察可能になっている。
【００８５】
観察光軸Ａ８上には、撮像手段としてのＣＣＤカメラ１３が配置されている。ＣＣＤカメラ１３は、結像レンズ９の焦点位置(対物レンズ１の焦点位置と光学的に共役な位置)に不図示の撮像面が位置され、標本Ｓの投影像を撮像するようになっている。
【００８６】
第３観察光路分岐部３１を反射してなる観察光軸Ａ６上には、他の結像レンズとしての結像レンズ３２、リレーレンズ３３、縮小レンズ３４および光ファイバ１６の入射面１６ａが配置されている。リレーレンズ３３は、第２結像レンズ３２の焦点位置(対物レンズ１の焦点位置と光学的に共役な位置)において標本Ｓの投影像を結んだ後に発散した観察光を略平行な光にするものである。縮小レンズ３４は、リレーレンズ３３からの平行光（標本Ｓの投影像）を縮小倍率で結像させるものである。光ファイバ１６は、入射面１６ａを縮小レンズ３４の焦点位置に配置され、縮小倍率で結像された標本Ｓの投影像が入射される。
【００８７】
その他の構成は、図１の構成と同一である。
【００８８】
次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。
【００８９】
まず、標本Ｓの投影像について簡単に説明する。例えば焦点距離９ｍｍの対物レンズ１と焦点距離１８０ｍｍの結像レンズ９を用いると、これら対物レンズ１と結像レンズ９で形成される標本Ｓの投影像、すなわち一次投影像は、標本Ｓを２０倍に拡大した像となる(１８０÷９＝２０)。言い方を変えると、対物レンズ１の倍率は２０倍であり、ＣＣＤカメラ１３は標本Ｓの２０倍の拡大像を撮像することになる。一方、観察光軸Ａ６において、例えば第２結像レンズ３２として焦点距離が９０ｍｍのレンズを使用すると、対物レンズ１と第２結像レンズ３２により形成される標本Ｓの投影像、すなわち一次投影像は、第２結像レンズ３２から９０ｍｍ離れた光路上の位置において標本Ｓを１０倍に拡大した像となる(９０÷９＝１０)。さらに、焦点距離９０ｍｍのリレーレンズ３３と焦点距離９ｍｍの縮小レンズ３４を用いると、これらリレーレンズ３３と縮小レンズ３４により形成されるリレー像すなわち二次投影像は、一次投影像を１０分の１に縮小した像となり、標本Ｓから二次投影像への倍率は１倍となる。
【００９０】
この倍率は、第１の実施の形態で述べたと同様であり、この場合も、必要とされる標本Ｓの観察対象範囲に応じて適宜決定される。
【００９１】
従って、このようにすれば、顕微鏡の目視あるいはＣＣＤカメラ１３での観察に供される結像レンズ９とは別に独立した結像レンズ３２を用いることで、顕微鏡の拡大倍率に依存することなく、分光情報取得のための光学系を構成することができる。これにより、第２結像レンズ３２やリレーレンズ３３の焦点距離を短くすることで、第３観察光路分岐部３１からファイバ１６に至る観察光軸Ａ６の全長を短くすることができ、コンパクトな構成を実現できる。
【００９２】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した標本Ｓの投影像の倍率は、あくまでも一例であり、目的となる測定対象物の大きさや必要な観察視野に応じて適宜設定できる。また、通常の顕微鏡に用いられる対物レンズ１は、異なる倍率を持つ複数個を、選択的に観察光軸上に配置できるようになっており、本発明においても同様に複数の対物レンズ１を用いて倍率を切り換えることができるのは明白である。また、ＣＣＤカメラ１３に至る観察光軸、ファイバ１６に至る観察光軸、および目視に供される観察光軸の配置、すなわち各々の観察光路分岐部における透過側と反射側に何を配置するかは任意であり、本発明の主旨を逸脱しない範囲で自由に構成できる。また、照明光学系は落射照明に限らず、透過照明においても構成可能である。また、上述では、対物レンズ１を標本Ｓの下側に配置した、倒立顕微鏡の例を述べたが、対物レンズ１を標本Ｓの上側に配置した正立顕微鏡にも適用することができる。
【００９３】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の第１の実施の形態にかかる多点蛍光分光測光顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の測定前処理を説明するためのフローチャート。
【図３】第１の実施の形態の測定手順を説明するためのフローチャート。
【図４】第１の実施の形態の基準パターンの一例を示す図。
【図５】第１の実施の形態のＲＯＩの取得から分光情報取得までを説明する図。
【図６】本発明の第２の実施の形態の測定手順を説明するためのフローチャート。
【図７】第２の実施の形態のＲＯＩの取得から分光情報取得までを説明する図。
【図８】本発明の第３の実施の形態にかかる多点蛍光分光測光顕微鏡の概略構成を示す図。
【符号の説明】
【００９５】
１…対物レンズ、２…ミラー
３…ＤＭＤ、４…投影レンズ
５…光源、６…コレクタレンズ
７…励起フィルタ、８…吸収フィルタ
９…結像レンズ、１０…観察光路分岐部
１１…接眼レンズ、１２…観察光路分岐部
１３…ＣＣＤカメラ、１４…リレーレンズ
１５…縮小レンズ、１６…光ファイバ
１６ａ…入射面、１６ｂ…出射面
１７…コリメートレンズ、１８…グレーティング
１９…ラインフォトセンサアレイ、２０…ＰＣ
２１…モニタ、３１…観察光路分岐部
３２…結像レンズ、３３…リレーレンズ、３４…縮小レンズ
【図１】
2006171024.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006171024.tif 000007
【図６】
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【図７】
2006171024.tif 000009
【図８】
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