(57)【要約】【課題】複数のジャガイモそうか病菌種のゲノムDNAを菌種特異的に増幅できるPCR用のプライマー対、及びそれを用いて、そうか病罹患の塊茎の病斑組織における菌種の特定、又ジャガイモ畑等のそうか病菌種の存在の有無及び菌種の特定、また、培養そうか病菌の特定、を迅速・簡便かつ安価に行う方法を提供すること。【解決手段】そうか病菌種の16S rRNA遺伝子及び16S-23S内部転写スペーサー（ITS）領域の菌種特異的塩基配列にハイブリダイズし、増幅されるべきDNA断片サイズ（base pairs）が菌種間で明瞭に異なるPCR用プライマー対、それらを用いることによる、ハイブリダイズしたプライマー間のゲノムDNAの増幅方法、更に増幅産物の識別方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャガイモそうか病（以下、単にそうか病という。）菌種Streptomyces scabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子から16S-23S内部転写スペーサー(internal transcribed spacer:ＩＴＳ)領域（以下、単にＩＴＳ領域という。）間を増幅するためのＰＣＲ用フォワードプライマー（Ｓｃａ−Ｆ）と、当該菌種のＩＴＳ領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するためのＰＣＲ用リバースプライマー（Ｓｃａ−Ｒ）からなる新規なプライマー対。
Ｓｃａ−Ｆ：cggtggccya acccgtaag (5'→3') （ｙ：ｔ／ｕ又はｃ）
Ｓｃａ−Ｒ：ttccacaccc acaaggggta gt (5'→3')
【請求項２】
そうか病菌種Streptomyces acidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのＰＣＲ用フォワードプライマー（Ａｃｉ−Ｆ）と、当該菌種の16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのＰＣＲ用リバースプライマー（Ａｃｉ−Ｒ）からなる新規なプライマー対。
Ａｃｉ−Ｆ：atatcactyc tgcctgcatg g (5'→3') （ｙ：ｔ／ｕ又はｃ）
Ａｃｉ−Ｒ：cctaccgaac tctagcctgc (5'→3')
【請求項３】
そうか病菌種Streptomyces turgidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するためのＰＣＲ用フォワードプライマー（Ｔｕｒ−Ｆ）と、当該菌種のＩＴＳ領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するためのＰＣＲ用リバースプライマー（Ｔｕｒ−Ｒ）からなる新規なプライマー対。
Ｔｕｒ−Ｆ：cggaaacatc cagagatggg tg (5'→3')
Ｔｕｒ−Ｒ：cttcaccgct tccctcatcg (5'→3')
【請求項４】
そうか病菌種Streptomyces scabiei、Streptomyces acidiscabiei、及びStreptomyces turgidiscabieiの少なくとも一菌種のゲノムＤＮＡ（16S rRNA遺伝子若しくは16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を含む。）含有物又はそれからの抽出物及び／又は精製物からなる一つの系に、請求項１、２及び３に記載のプライマー対の少なくとも一対を添加し、一菌種のゲノムＤＮＡ若しくは同時に複数菌種のゲノムＤＮＡについて、核酸増幅反応を行うことを特徴とするそうか病菌種のゲノムＤＮＡの新規増幅方法。
【請求項５】
ゲノムＤＮＡ含有物が、ジャガイモをはじめとする根菜類栽培の畑土壌、ジャガイモをはじめとする根菜類の塊茎若しくは葉の病斑組織、そうか病菌株の培養物の何れかである請求項４に記載のそうか病菌種のゲノムＤＮＡの新規増幅方法。
【請求項６】
核酸増幅反応方法がＰＣＲ方法である請求項４又は５に記載のそうか病菌種のゲノムＤＮＡの新規増幅方法。
【請求項７】
請求項４又は５に記載の核酸増幅反応を行い、得た増幅産物の分子サイズ分析の結果に基づいて、そうか病菌種Streptomyces scabiei、Streptomyces acidiscabiei、及びStreptomyces turgidiscabieiからなる群の一菌種若しくは同時に複数の菌種を検出・識別することを特徴とするそうか病菌種の検出・識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャガイモそうか病原因菌種のゲノムＤＮＡ増幅のための新規プライマー対、及びそれらを用いたジャガイモそうか病原因菌種の検出・識別方法に関する。詳しくは、ジャガイモそうか病原因菌種の一種若しくは同時に複数菌についてのゲノムＤＮＡを増幅するための新規プライマー対であり、及びジャガイモそうか病原因菌種を、一種若しくは同時に複数菌について、種レベルで迅速・簡便にかつ特異的に検出・識別（タイピング）する方法に関する。例えば、培養されたそうか病菌種の一種若しくは同時に複数菌種の簡易同定や、ジャガイモの病斑組織を対象として遺伝子レベルでそうか病原因菌種を、一種若しくは同時に複数菌種について、検出・識別する遺伝子診断技術として、更にジャガイモ畑土壌を対象として遺伝子レベルでそうか病原因菌種を、一種若しくは同時に複数菌種についての存在の有無及び存在種の検出・識別を可能とする遺伝子診断技術として応用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ジャガイモそうか病はジャガイモ塊茎表面に暗褐色の直径１ｃｍ程度のコルク化した病班が現れるジャガイモの病気である。そうか病の発症したジャガイモは、見た目の悪さとともにデンプンの含量・質が低下するために、食用・加工用ともに市場価値は著しく低下する。その経済的損失はジャガイモ生産者にとって極めて深刻である。更に、そうか病は極めて防除の困難な病害の一つに数えられており、我が国のみならず、北米諸国、英国、フランス、ドイツ、ハンガリー、フィンランド、イスラエル、インド、韓国等、ほとんどのジャガイモ栽培地域において報告がなされ、世界的に問題となっている（非特許文献１）。
【０００３】
そうか病はStreptomyces属に属する数種の病原細菌種によって引き起こされることが知られているが（非特許文献２及び３）、日本においてはStreptomyces scabiei（以下、S. scabieiという。）、Streptomyces acidiscabiei（以下、S. acidiscabieiという。）、Streptomyces turgidiscabiei（以下、S. turgidiscabieiという。）の３種が主な原因菌種として報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
前述の通り、そうか病は防除の極めて困難な植物病害として知られているが、本病害の防除を図る上で、その原因菌となるStreptomyces属細菌種の土壌及びジャガイモ組織における生態解明を図る必要性が指摘されている。特に、土壌中において原因菌種の存在の有無を明らかにする検出技術、更に原因菌種を特定する識別技術は、そうか病菌の生態解明を図る上で根本的かつ必須の技術である。それと同時に、実際のジャガイモ畑のそうか病土壌診断技術としての実用性を有するものである。即ち、畑土壌におけるそうか病菌の存在の有無を明らかにすることでそうか病発症ポテンシャルを把握できる。又、原因菌を特定できればその原因菌種にあわせた防除対策を実施することが可能となる。
【０００５】
（従来の検出・識別手法）
現在までに、そうか病菌種の検出・識別法として、（ｉ）病原細菌種間の基質利用性の違いに基づいた識別法（非特許文献５）、（ii）血清学的手法による識別法（前記非特許文献１及び非特許文献６）及び（iii）ＰＣＲ（polymerase chain reaction）を用いた検出・識別法（前記非特許文献１及び６）が提案されている。
【０００６】
（ｉ）基質利用性の違いに基づいた識別法は、先ずそうか病菌種を選択的に分離・培養し、その後、糖類等の基質の利用性の違いに基づいて、原因菌種の識別を行なう方法である。本手法は、先ず第一に分離・培養作業が必要なため多大な労力と時間がかかるという欠点がある。更に、分離培養操作には専門的知識と経験に基づいた技術が必要である。従って、土壌診断のような多くのサンプル数に対応するタイピング技術としては実用性に乏しい。
【０００７】
（ii）血清学的手法による識別法は、それぞれのそうか病菌種に対する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）等の手法でそうか病菌種を識別する方法である。本手法は質の良い抗体が作製できれば、精度、感度ともに高い識別手法となりうる。本手法は識別技術としての優位性はあるものの、そうか病菌の検出のためには分離・培養操作を必要としており、前述したように、多大な労力と時間がかかる手法であり、土壌診断への応用は困難である。
【０００８】
（iii）ＰＣＲを用いた検出・識別法は、そうか病菌種のゲノムＤＮＡ塩基配列の違いに対するプライマー塩基配列の一致、不一致の結果がＤＮＡ断片の増幅につながるもので、検出感度は高く、プライマーの配列次第で特異的検出が可能となる。ＰＣＲを用いた手法の最大のメリットは、土壌試料から直接抽出したＤＮＡを鋳型としてそうか病菌種を検出・識別できる点である。つまり、そうか病菌種の分離・培養操作を介さないため、他の方法に比べ大幅な時間の短縮が可能となる。又、コストの面では、プライマーの配列やＰＣＲ反応の条件が決定できれば、その後のコストは比較的安く、多量のサンプルにも対応可能である。
【０００９】
これまでに、ＰＣＲを用いたそうか病菌種の検出・識別手法について、幾つかの報告がなされている。既往の手法は、３種のそうか病菌種（S. scabiei、S. acidiscabiei、S. turgidiscabiei）をそれぞれ特異的に検出できるＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマー対（計３対）を設計し、それぞれのプライマー対毎に独立したＰＣＲ反応を１回（one running）ずつ、合計３回行なった後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅されたＤＮＡ断片の有無から、試料中のそうか病菌の存在の有無及び存在種の特定を行なうものである（前記非特許文献１及び６、非特許文献７）。
【００１０】
本手法は、上記の（ｉ）及び（ii）の手法に比べればはるかに時間と労力を削減でき、実用に耐えうるものであるが、１試料につき３回のＰＣＲ反応が必要である点については、コスト的にも簡便性・迅速性の観点からも問題である。更に、既存のプライマー配列は公共データベース上にて公開されている遺伝子配列情報と照らし合わせても、その特異性（信頼性）に大きな問題があることを現在の発明中の調査で明らかにした。
【００１１】
即ち、ＰＣＲ用のプライマー対について幾つかの問題点として以下のような点を挙げることができる。
１）個々のプライマー配列のＴｍ（melting temperature：融解温度）が大きく異なるため、一反応ＰＣＲによる検出・識別が不可能である。
２）S. scabieiを検出するためのフォワードプライマーが、S. scabieiに分類される細菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列とハイブリダイズしない場合がある。
３）S. acidiscabieiを検出するためのフォワードプライマーが、S. acidiscabieiに分類される細菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列にハイブリダイズしない場合がある。
４）S. acidiscabieiを検出するためのリバースプライマーがS. scabieiとS. acidiscabieiの両方の16S rRNA遺伝子の塩基配列にハイブリダイズする。
５）S. turgidiscabieiを検出するためのリバースプライマーは、系統分類学的に別種として再分類されたS. reticuliscabiei(前記非特許文献５)のＩＴＳ領域遺伝子の塩基配列にもハイブリダイズする。
６）土壌試料からS. acidiscabieiの検出を行った場合、S. acidiscabieiのＤＮＡに由来しない非特異的ＤＮＡ増幅断片が多数検出される（前記非特許文献７）。
実用レベルでのそうか病菌種の特異的迅速タイピング技術の確立のためにはこれらの問題点を解決することが必要不可欠である。
【００１２】
【非特許文献１】田中文夫：北海道立農業試験場報告（２０００）、第９６号、ｐｐ．１−６６
【非特許文献２】Lambert, D. H. et al.,: Int J Syst Bacteriol (1989), 39, pp.387-392
【非特許文献３】Miyajima, K. et al., Int J Syst Bacteriol (1998), 48, pp.495-502
【非特許文献４】Kobayashi K., Proceedings of the International Potato Scab Symposium (IPSS 2004), pp.161-181
【非特許文献５】Bouchek-Mechiche K. et al., Res Microbiol (1998), vol. 149, pp.653-663
【非特許文献６】田中文夫、土と微生物(2003)、vol. 58、pp.69-77
【非特許文献７】Barrera, V. A. et al., Proceedings of the International Potato Scab Symposium (IPSS 2004), pp.279-283
【非特許文献８】Song J. et al., Int J Syst Evol Microbiol (2004), vol. 54, pp.203-209
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前述のように、これまでに提案されてきたジャガイモそうか病菌種の特異的検出・識別法のうち、（ｉ）病原細菌種間の基質利用性の違いに基づいた識別法及び（ii）血清学的手法による識別法は、分離・培養操作を介した手法であり多大な労力と時間がかかるため、土壌診断等への応用は極めて困難である。又、（iii）ＰＣＲを用いた検出・識別法は実用に耐えうる手法として期待できるが、既存のＰＣＲ用プライマーはその特異性自体に問題があることに加え、３種のそうか病菌種のタイピングのために３回（three runnings）の独立したＰＣＲ反応が必要であり、簡便性、迅速性、コストの面で問題がある。
【００１４】
本発明は上記の問題点を鑑みてなされたものであり、その目的はジャガイモそうか病の原因細菌種を正確に検出・識別するためのＰＣＲ用プライマー対、及び当該プラマーを用いた特異的検出・識別技術（タイピング技術）、更にタイピング技術の迅速化、簡便化及び低コスト化に資する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち、本発明は、
１）ジャガイモそうか病菌種S. scabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するためのＰＣＲ用フォワードプライマー（Ｓｃａ−Ｆ）と、当該菌種のＩＴＳ領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するためのＰＣＲ用リバースプライマー（Ｓｃａ−Ｒ）からなる新規なプライマー対、
Ｓｃａ−Ｆ：cggtggccya acccgtaag (5'→3') （ｙ：ｔ／ｕ又はｃ）
Ｓｃａ−Ｒ：ttccacaccc acaaggggta gt (5'→3')
２）そうか病菌種S. acidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのＰＣＲ用フォワードプライマー（Ａｃｉ−Ｆ）と、当該菌種の16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子増幅のためのＰＣＲ用リバースプライマー（Ａｃｉ−Ｒ）からなる新規なプライマー対、
Ａｃｉ−Ｆ：atatcactyc tgcctgcatg g (5'→3') （ｙ：ｔ／ｕ又はｃ）
Ａｃｉ−Ｒ：cctaccgaac tctagcctgc (5'→3')
３）そうか病菌種S. turgidiscabieiの16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するためのＰＣＲ用フォワードプライマー（Ｔｕｒ−Ｆ）と、当該菌種のＩＴＳ領域に特異的にハイブリダイズし、かつ下記の塩基配列を有する、当該菌種の16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を増幅するためのＰＣＲ用リバースプライマー（Ｔｕｒ−Ｒ）からなる新規なプライマー対、
Ｔｕｒ−Ｆ：cggaaacatc cagagatggg tg (5'→3')
Ｔｕｒ−Ｒ：cttcaccgct tccctcatcg (5'→3')
【００１６】
４）そうか病菌種S. scabiei、S. acidiscabiei、及びS. turgidiscabieiの少なくとも一菌種のゲノムＤＮＡ（16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域を含む。）含有物又はそれからの抽出物及び／又は精製物からなる一つの系に、前記１）、２）及び３）に記載のプライマー対の少なくとも一対を添加し、一菌種のゲノムＤＮＡ若しくは同時に複数菌種のゲノムＤＮＡについて、核酸増幅反応を行うことを特徴とするそうか病菌種のゲノムＤＮＡの新規増幅方法、
５）ゲノムＤＮＡ含有物が、ジャガイモをはじめとする根菜類栽培の畑土壌、ジャガイモをはじめとする根菜類の塊茎若しくは葉の病斑組織、そうか病菌株の培養物の何れかである前記４）に記載のそうか病菌種のゲノムＤＮＡの新規増幅方法、
６）核酸増幅反応方法がＰＣＲ方法である前記４）又は５）に記載のそうか病菌種のゲノムＤＮＡの新規増幅方法、
７）前記４）又は５）に記載の核酸増幅反応を１回行い、得た増幅産物について、分子サイズ分析の結果に基づいて、そうか病菌種S. scabiei、S. acidiscabiei、及びS. turgidiscabieiからなる群の一菌種若しくは同時に複数の菌種を検出・識別することを特徴とするそうか病菌種の検出・識別方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一対若しくは複数対のＰＣＲ用プライマーを用いてＰＣＲを行うと、１回（one running）で一種若しくは同時に複数種のそうか病菌種のゲノムＤＮＡを検出可能なレベルまで同時に増幅できる。よって、そうか病菌種の検出・識別が、従来より、格段に簡便・容易・安価に、かつ短時間にできるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明を具体的に説明する前に、本発明で使用する用語を定義する。
本発明において使用する技術用語は、特別に断りがない限り、分子生物学、遺伝子工学、植物病理学の分野において現在使用されているものと同じ意味を有する。
“プライマー”とは、遺伝子増幅用（ＰＣＲ用）オリゴヌクレオチドプライマーのことをいう。そしてフォワードプライマー（forward primer）、リバース（reverse primer）プライマーからなる。プライマー対とは、この両者の対をいう。
“１回”、“２回”のＰＣＲを行うなどの表現における“回”とは、runningの意味である。そして、１回のＰＣＲにおいては、少なくとも１サイクル（cycle）以上のＰＣＲからなっている。
【００１９】
“オリゴヌクレオチドプライマー”の“オリゴヌクレオチド”とは、一本鎖のオリゴヌクレオチドで、デオキシ体、リボキシ体、又はキメラ体で出来ているものである。
“ＩＴＳ領域”とは“16S-23S内部転写スペーサー（internal transcribed spacer:ＩＴＳ）領域”を意味するものとする。
“ハイブリダイズする”とは、ある一本鎖の核酸分子がそれに相補的な一本鎖の核酸分子と熱力学的に結合し二本鎖になることであり、プライマーがハイブリダイズするとは、標的核酸若しくは標的塩基配列、又は標的遺伝子中のプライマー配列に相補的な塩基配列に特異的に結合することを意味する。
“そうか病”は、ジャガイモそうか病を意味するものとする。
“特異的”とは菌種特有という意味である。
“分析する”とは、定性分析の他に、定量分析をも意味するものとする。
【００２０】
本発明の第一は、表１に記載のそうか病菌種の16S rRNA遺伝子に特異的にハイブリダイズし、かつ表１に記載の塩基配列を有する、当該菌種のゲノムＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ用フォワードプライマーと、当該菌種の16S rRNA遺伝子またはＩＴＳ領域に特異的にハイブリダイズし、かつ表１に記載の塩基配列を有する、当該菌種のゲノムＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ用リバースプライマーからなる新規なプライマー対である。
S. scabiei菌種については、フォワードプライマー（forward primer）がＳｃａ−Ｆ、リバースプライマー（reverse primer）がＳｃａ−Ｒなる名称が与えられている。
同様に、S. acidiscabiei菌種については、Ａｃｉ−Ｆ及びＡｃｉ−Ｒ、又、S. turgidiscabiei菌種については、Ｔｕｒ−Ｆ及びＴｕｒ−Ｒなる名称が与えられている。
これらのプライマー対は、一種若しくは同時に複数のそうか病菌種、好ましくは表１に記載の３菌種の16S rRNA遺伝子及びＩＴＳ領域間のゲノムＤＮＡを核酸増幅方法、好ましくはＰＣＲ方法を用いて特異的に増幅できるものである。
上記のプライマーにより増幅されるゲノムＤＮＡ断片は、表１に記載されている通りである。又、ＧＣ含量、Ｔｍ値も表１に記載されているものである。
【００２１】
又、本発明のプライマーは、定量的ＰＣＲ用のプライマーとして以外に、更にＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法及びメンブレンハイブリダイゼーション法等の核酸ハイブリダイゼーション技術に基づいたそうか病菌検出用プローブとして利用可能である。
【００２２】
2006217828.tif 000002
【００２３】
（プライマーの設計・作製）
本発明では、既存のプライマー対（前記非特許文献１及び７）では不可能であった一反応ＰＣＲによるジャガイモそうか病菌種S. scabiei、S. acidiscabiei及びS. turgidiscabieiの特異的検出・識別を可能とする新規なプライマー対を設計・作製した（表１）。特に、本発明のプライマー対は、前記した従来のプライマー対の問題点を解決しており、従来のものとは明確に異なる新規なプライマー対である。
【００２４】
即ち、本発明において新たに設計したオリゴヌクレオチドプライマーセットは、
・一反応ＰＣＲによる検出・識別
・S. scabieiを正確に検出
・S. acidiscabieiを正確に検出
・S. turgidiscabieiを正確に検出
・土壌試料を用いた場合でも、S. acidiscabieiを検出するプライマーセット（Ａｃｉ−Ｆ及びＡｃｉ−Ｒ）は非特異的なＤＮＡ断片の増幅を抑制（実施例参照）
することを可能とした。
【００２５】
本発明の第二は、前記のプライマーを用いて、前記菌種の前記遺伝子を増幅し、増幅産物の分子サイズを分析する方法である。
先ず、前記菌種の少なくとも一菌種のゲノムＤＮＡ（16S rRNA遺伝子若しくは16S rRNA遺伝子からＩＴＳ領域間を含む。）含有物からなる一つの系に、前記三種類のプライマー対の少なくとも一対を添加し、一菌種のゲノムＤＮＡ若しくは同時に複数菌種のゲノムＤＮＡについて、核酸増幅反応を行う。
前記ゲノムＤＮＡ含有物として、ジャガイモをはじめとする根菜類栽培の畑土壌、ジャガイモをはじめとする根菜類の塊茎若しくは葉の病斑組織、そうか病菌株の培養物の何れをも用いることが出来る。これらのゲノムＤＮＡ含有物をそのまま用いてもよいのであるが、好適には、通常の公知の方法で、前記のゲノムＤＮＡ含有物からゲノムＤＮＡを抽出及び/又は精製して用いるのがよい。具体的には以下の実施例等で示した。
【００２６】
本発明に使用される遺伝子増幅方法は、特に限定されるものではないが、ＰＣＲ方法が好適である。反応条件は公知の通常のものでよい。また、使用される核酸増幅酵素も通常の公知のものでよい。好適な条件は以下に示した。しかし、本発明はこれらの条件に限定されるものではない。
前記の核酸増幅方法で得られた増幅産物の分子サイズを分析することにより、本発明の目的、即ち、そうか病菌種の識別が可能となる。この分析は、通常・公知の方法でよい。好適には、電気泳動、キャピラリー電気泳動などを使用すればよい。それらを行う条件は、通常の公知の条件でよい。具体的な例は、実施例に示した。
更に、本発明方法は、次の手順からなる、内部標準遺伝子（制限酵素切断部位が挿入されている。）を用いたT-RFLP（Terminal restriction fragment length polymorphism）分析によるそうか病菌種の存在量を測定する方法でもある。
1）前記の本発明のプライマー対の少なくとも一方の5'末端部（5'末端を含む。）に蛍光標識したプライマー対を用いて、前記内部標準遺伝子とそうか病菌種のゲノムＤＮＡとを競合的に前記のＰＣＲ方法で増幅する。
2）増幅産物を制限酵素処理する。
3）得られた末端断片の多型を、遺伝子解析システムを用いて分析する。
4）得られた結果に基づいて、一菌種若しくは同時に複数の菌種を検出・識別すると同時に得られた蛍光の変化量からそれぞれの制限酵素処理断片量を定量する。
5）当該定量値からそうか病菌種の存在量を決める。
【００２７】
そうか病菌種の遺伝子タイピング用プライマー対の設計方法を以下に記す。３種類のそうか病菌種（S. scabiei、S. acidiscabiei、S. turgidiscabiei）の遺伝子配列は、近年の系統分類学的解析結果（前記非特許文献８）に基づき、公共データベースＧｅｎＢａｎｋ（http:/www.ncbi.nim.nih.gov）上で公開されているそれらの16S rRNA遺伝子と16S-23S  ＩＴＳ領域の遺伝子配列を収集した（表２）。収集したＤＮＡ配列をＡＴＧＣソフトウェア（バージョン３：ＧＥＮＥＴＹＸ社製）を用いたアライメント配列比較により、各そうか病菌種の16S rRNA遺伝子及び16S-23S  ＩＴＳ領域の塩基配列に特異的な領域を探索・特定した。ここで特異的とは、あるそうか病菌種のもつＤＮＡ塩基配列が他の近縁なそうか病菌種のもつ同等な部位のＤＮＡ塩基配列に対して異なっていることを意味する。各そうか病菌種に対してそれぞれ特異的領域の中でプライマー対に適した配列を探した。一般的に、ＰＣＲ用プライマー対に適した配列とは、各配列の長さが５〜２５ヌクレオチドであり、好ましくは１７〜２３ヌクレオチド程度からなり、目的のそうか病菌種のＤＮＡ塩基配列にはハイブリダイズするが、その他の生物のＤＮＡ塩基配列には両プライマーがハイブリダイズしない塩基配列を持つもののことである。
【００２８】
2006217828.tif 000003
【００２９】
本発明において設計したプライマー対を表１に示した。公共データベースＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いたＤＮＡ塩基配列相同性検索により、各プライマー対は検出対象とするそうか病菌種以外には完全に一致するＤＮＡ配列が存在しないことを確認した。さらに、各そうか病菌種に対応する各プライマー配列は、他の２種のそうか病菌種のゲノムＤＮＡ配列に対していずれも８５％以下の相同性しか示さないことから、その特異性は高いものと考えられる。
【００３０】
２種のそうか病菌種S. scabieiとS. turgidiscabieiについては、16S rRNA遺伝子及び16S-23S  ＩＴＳ領域の両方のＤＮＡ配列上の特異的領域をプライマー対の設計に利用した。又、S. acidiscabieiについては、16S rRNA遺伝子配列中の２箇所の特異的領域をプライマー設計に利用した。
【００３１】
S. scabieiに対するフォワードプライマーはS. scabiei標準菌株の16S rRNA遺伝子配列（Accession No. AB026199）の１４２１−１４３９  ｂｐにハイブリダイズし（Ｓｃａ−Ｆと命名する）、リバースプライマーは同様にＩＴＳ領域（Accession No. AB026199）の１６７２−１６５１  ｂｐにハイブリダイズする（Ｓｃａ−Ｒと命名する）。このプライマー対を用いて、S. scabieiのゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを実施した場合、プライマー対に挟まれた領域（１４２１−１６７２  ｂｐの領域：２５２  ｂｐ）が特異的に増幅される。ただし、いくつかのS. scabiei細菌株は、上記のＩＴＳ（Accession No. AB026199）とは長さの異なるＩＴＳ塩基配列を有するものが存在する。このタイプのＩＴＳ塩基配列を持つ細菌株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記のプライマー対でＰＣＲを行うと、理論上、２５２  ｂｐではなく２６１  ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される（表１）。
【００３２】
S. acidiscabieiに対するフォワードプライマーはS. acidiscabiei標準菌株の16S rRNA遺伝子配列（Accession No. AB026220）の１７２−１９２  ｂｐに一致し（Ａｃｉ−Ｆと命名する）、reverseプライマーは６３９−６２０  ｂｐにハイブリダイズする（Ａｃｉ−Ｒと命名する）。従って、理論上、ＰＣＲにより４６８  ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される（表１）。
【００３３】
S. turgidiscabieiに対するフォワードプライマーはS. turgidiscabiei標準菌株の16S rRNA遺伝子配列（Accession No. AB026221）の９７８−９９９  ｂｐにハイブリダイズし（Ｔｕｒ−Ｆと命名する）、リバースプライマーはＩＴＳ領域（Accession No. AB026221）の１７００−１６８１  ｂｐにハイブリダイズする（Ｔｕｒ−Ｒと命名する）。従って、理論上、ＰＣＲにより７２３  ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅される（表１）。
【００３４】
このように、本発明の三種のプライマー対によりそうか病菌種特異的に増幅されるＤＮＡ断片の長さは、各プライマー対により異なっている（S. scabiei由来の増幅断片長：２５２  ｂｐ、S. acidiscabiei由来の増幅断片長：４６８  ｂｐ、S. turgidiscabiei由来の増幅断片長：７２３  ｂｐ）。従って、これらのＤＮＡ断片はＤＮＡ分子サイズの分析により、明確に識別できる。
本発明においては、ＤＮＡ分子サイズの分析には、２％のアガロースゲル（タカラバイオ社製）を用いた電気泳動、キャピラリー電気泳動等を用いるのが好適である。
又、本発明において設計した各６種のプライマー配列は、同一かつ１回のＰＣＲ反応で適切なアニーリングが可能なＴｍ（融解温度）となるように設計した。
【００３５】
（本発明におけるそうか病菌種の遺伝子タイピングの定義）
本発明により設計した一種若しくは三種のプライマー対を用いたそうか病菌種の遺伝子タイピングとは、１回のＰＣＲ反応を行った後、１回（１レーン）のアガロース等のゲルを用いた電気泳動法或いはキャピラリーを用いた電気泳動法等により、異なる長さのＤＮＡ増幅断片を分離・検出することによって、試料中におけるそうか病菌種の存在の有無を判定するとともに、そうか病菌種を識別・特定することである。
【００３６】
本発明により、従来は少なくとも３回のＰＣＲ反応ならびに３レーンを使用した電気泳動が必要であったところを、１回のＰＣＲ反応ならびに１レーンのみを使用した電気泳動によりそうか病菌種の検出・識別が可能となるが、このことは検出・識別（タイピング）の迅速化ならびに簡便化につながり、同時にＰＣＲ反応に必要な高価な酵素やその他の試薬、器具の使用量を単純に三分の一に低減できることから低コスト化にも寄与する。
【００３７】
（１回のＰＣＲ反応によるそうか病菌種の遺伝子タイピング条件の最適化）
１回のＰＣＲ反応によるそうか病菌株の遺伝子タイピングを適切に実施するため、反応条件の最適化を行なった。
使用したそうか病菌株はStreptomyces scabiei OBM-1株、Streptomyces acidiscabiei ATCC49003T株及びStreptomyces turgidiscabiei ATCC700248T株である。S. scabiei OBM-1株は長崎畑土壌から分離培養されたそうか病菌種であるが、その16S rRNA遺伝子配列が公共データベースに公開されているStreptomyces scabieiの配列と１００％一致することを確認している。
細菌からのＤＮＡ抽出法は種々の方法があり、どの方法も好適に本発明に利用出来る。本発明においては、それらの中のFast Prep instrument(Q-BIOgene)を用いる手法を用いた。
【００３８】
３種類のそうか病菌種S. scabiei、S. acidiscabiei、S. turgidiscabieiをＧＹＭ培地（以下のものを１Ｌの脱イオン水に溶かし、最終的にｐＨ７．３の１Ｌの水溶液とする；グルコース４ｇ、Yeast extract（Becton Dickinson社製）４ｇ、Malt extract（Becton Dickinson社製）１０ｇ）にて３０℃、２日間振盪培養後、遠心処理（８，０００ｒｐｍ、５分間）により集菌した。得た菌体を滅菌水に懸濁・洗浄し、再度遠心集菌後、２ｍｌチューブ（アシスト社製）に菌体を移した。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ）を４０μｌ、BL buffer（以下のものを併記の濃度になるよう混合：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４．０ｍＭ；ＥＤＴＡ（Ethylenediamine tetraacetic acid）、１ｍＭ；Ｔｗｅｅｎ  ２０、１％；Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．５％）を２００μｌ、２５％  ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を２０μｌ加えて混合した。更に５Ｍ  ＮａＣｌを６０μｌ、フェノールクロロホルム溶液（フェノール：クロロホルム：イソミルアルコール＝２５：２４：１）を４００μｌ加え、細胞破砕用ガラスビーズ（０．１ｍｍ径）０．５ｇを溶液に加えた。チューブをFast Prep instrumentにセットし、強度５．５で２０秒間の振動を加え、菌体を破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心処理し、ゲノムＤＮＡを含む上清画分を別のチューブに移した。上清画分に対して再びフェノールクロロホルム溶液を加え混合した後、１５，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清画分を別のチューブ移し、そうか病菌ゲノムＤＮＡ抽出の操作を完了した。
【００３９】
更に、そうか病菌ゲノムＤＮＡ溶液をＲＮａｓｅＡ（終濃度１０μｇ／ｍｌ）で処理し、その後フェノールクロロホルム処理により、残存ＲＮＡを除いた。本精製ＤＮＡ溶液に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と２．５倍量のエタノールを加え、−７０℃にて２０分間静置後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心操作を行い、そうか病菌ゲノムＤＮＡを沈殿させた。沈殿ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥後、５００μｌの純水に溶解させた。
各そうか病菌種のゲノムＤＮＡ溶液は純水で１０μｇ／ｍｌになるように調整し、それらを単独で、若しくは混合したものを適宜希釈し、ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００４０】
タイピングＰＣＲ反応条件の最適化を行なうため、３菌種のそうか病菌ゲノムＤＮＡの等量混合溶液を鋳型（テンプレート）として、又、３種類のプライマー対を等量ずつ混合した溶液（各１０ｎｍｏｌ／ｍｌの各プライマー溶液を混合したもの。以後プライマーセット混合溶液とする）を調整した。これらの混合鋳型ＤＮＡ溶液ならびにプライマーセット混合溶液を用いてＰＣＲを行い、最適なアガロースゲル電気泳動結果となる条件を検討した。ここで最適なアガロースゲル電気泳動結果とは、３種類のそうか病菌種由来のバンドが同等の濃さで検出でき、かつ３種類のそうか病菌種に由来しない非特異的増幅ＤＮＡ断片が現れないことを意味する。
【００４１】
ＰＣＲ条件の最適化のため検討した項目は、１）そうか病菌ゲノムＤＮＡ鋳型の濃度、２）プライマーセット混合溶液の濃度、３）ＰＣＲ反応のサイクル数、４）アニーリング温度、５）ＰＣＲ反応溶液のバッファー組成、の５項目である。尚、最適条件の判明した項目に関しては、以後のＰＣＲにおいてその最適条件を用いて他の項目の最適化を図った。
【００４２】
上記１）〜４）の項目については常法により検討した。項目５）については、通常詳細に検討するものではないが、本発明手法の最適化にあたり極めて重要な要素であったことから、詳細に述べる。ＰＣＲ反応溶液のバッファー組成はAmpliTaq Gold DNA Polymerase, 6 x 250 units with Buffer I （Applied Biosystems社製）に添付されているGeneAmp 10×PCR Bufferの組成と同等のものを調整し、含有塩濃度の検討を行った。GeneAmp 10×PCR Bufferに含まれている塩はＭｇＣｌ2とＫＣｌの２種類である。終濃度はＭｇＣｌ2が１．５ｍＭ、ＫＣｌが５０ｍＭであるため、その周辺の濃度で先ず４段階の濃度を設定した。ＭｇＣｌ2に関しては１．０、１．５、２．０、２．５ｍＭの４段階、ＫＣｌに関しては２５、５０、７５、１００ｍＭの４段階を設定し、全ての組み合わせ（１６通り）の塩濃度のバッファーを調整し、最適なバッファー組成について検討した。その後、ＫＣｌについては１０ｍＭ刻みで更に細かく条件検討した。
【００４３】
以下に各項目毎の検討結果を示す。
１）そうか病菌ゲノムＤＮＡ鋳型の最適濃度は、終濃度で５ｎｇ／ｍｌであった。これは２０μｌのＰＣＲ反応溶液に対して、０．１μｇ／ｍｌの鋳型ＤＮＡ混合溶液を１μｌ加えた条件に相当する。
２）プライマーセット混合溶液の濃度は２０μｌのＰＣＲ反応溶液に対して、プライマーセット混合溶液（各１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）を１．６μｌ加えた条件が最適であった。
３）ＰＣＲのサイクル数は３５サイクルが最適であった。
４）アニーリング温度は６４．０℃が最適であった。
５）ＰＣＲバッファー溶液に含まれる塩の最適濃度は、終濃度でＭｇＣｌ2が２．０ｍＭ、ＫＣｌは２５ｍＭであった。
【００４４】
以上の結果を踏まえ、本発明のプライマー対を用いたＰＣＲ反応の最適条件は以下のようにまとめられる。
１チューブのＰＣＲ反応溶液量（表３）は２０μｌで行う。純水１３．３μｌに対して１０×ＰＣＲバッファーは組成（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２５０ｍＭ  ＫＣｌ）のものを２μｌ添加し、ｄＮＴＰ混合溶液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを２ｍＭずつ含む（市販のもの：例Applied Biosystems社製））を２μｌ添加する。プライマーセット混合溶液（各１０ｎｍｏｌ／ｍｌプライマー溶液を混合）は１．６μｌ、鋳型ＤＮＡ溶液（０．１μｇ／ｍｌ）は１μｌ添加する。AmpliTaq Gold DNA Polymerase溶液（Applied Biosystems社製）は０．１μｌ添加する。
【００４５】
ＰＣＲ反応はｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって温度制御を行なう。温度制御の条件は、９５℃、９分間の予備加熱により、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼの活性化ならびにゲノムＤＮＡの変性反応に続いて、３５サイクルの増幅サイクル（９５℃の変性を６０秒間、プライマーのアニーリングを６４℃にて３０秒間、ＤＮＡの伸長反応を７２℃にて６０秒間）を行い、最後に７２℃で３分間のＤＮＡ伸長反応を行う。反応終了後は４℃にて保温し、その後の電気泳動による解析に供す。
尚、本発明の適用にあたっては、上述以外の機器、試薬ならびに反応条件に限定されるものではない。
【００４６】
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【実施例】
【００４７】
以下に本発明の実施例を具体的に示すが、本発明の適用はここに限定されるものではない。
実施例１．そうか病菌種のゲノムＤＮＡを鋳型とした遺伝子タイピングの実施例
そうか病菌種より抽出したゲノムＤＮＡに対する本発明技術（遺伝子タイピング技術）の適用例を示す。
先ず、従来の方法と同様に、３回の独立したＰＣＲ反応（１種のそうか病菌種のゲノムＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー対を用いたＰＣＲを３回行なうこと）により、それぞれのそうか病菌種をそれぞれ検出する実験を試みた（図１のレーン１〜３及び表４参照）。ＰＣＲ反応の条件は、前述の最適条件とした。ＰＣＲ反応終了後、反応液３μｌを２％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動槽はミニゲル泳動層ｉ−ｍｕｐｉｄ  Ｊ（コスモバイオ）を用い、１００Ｖ、２５分間の電気泳動の後、エチジウムブロマイド溶液中にゲルを浸し、１５分間染色を行った。染色後のゲルは紫外線照射によりバンドの有無及び位置を確認した（図１）。その結果、S. scabieiのゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｓｃａ−Ｆ及びＳｃａ−ＲによるＰＣＲ検出を行なったところ、予想サイズの増幅断片（２５２  又は  ２６１  ｂｐ）が確認された（図１のレーン１）。同様に、S. acidiscabiei及びS. turgidiscabieiについても、それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型とし、それぞれに特異的なプライマー対（Ａｃｉ−ＦとＡｃｉ−Ｒの対及びＴｕｒ−ＦとＴｕｒ−Ｒの対）によるＰＣＲ検出を試みたところ、予想サイズの増幅断片（４６８  ｂｐ及び７２３  ｂｐ）を確認した（図１のレーン２及び３）。
【００４８】
次に、前記３種のプライマー対を混合したプライマーセットを用いて、１回のＰＣＲ反応による遺伝子タイピング技術の適用を試みた（表４及び図１のレーン４〜１０）。ここでは、試料中にそれぞれ１種のそうか病菌種のゲノムＤＮＡが存在する場合（表４及び図１のレーン４〜６）、試料中に２種のそうか病菌種のゲノムＤＮＡが存在する場合（表４及び図１のレーン７〜９）、更に試料中に３種全てのそうか病菌種が存在する場合（表４及び図１のレーン１０）の実験を行なった。その結果、いずれの場合においても、試料中に存在するそうか病菌種由来のＤＮＡが、予想された断片サイズで増幅されていることが確認された（図１のレーン４〜１０）。
【００４９】
この結果は、本発明の遺伝子タイピング技術の適用により、１回のＰＣＲ反応により、試料中に存在するそうか病菌種の検出・識別が可能であることを実証するものである。
尚、本手法は培養されたそうか病菌の簡易同定のみならず、培養された放線菌がそうか病菌であるかどうかの判別等にも適用可能である。
【００５０】
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【００５１】
実施例２．遺伝子診断実施例：土壌、ジャガイモ組織からの検出
本発明の１回の反応ＰＣＲによる遺伝子タイピング技術がジャガイモ畑土壌ならびにジャガイモ病斑組織を対象とした遺伝子診断法として適用可能かどうかについて検証した。
土壌試料ならびにジャガイモ試料は、日本におけるジャガイモ生産量１位の北海道及び２位の長崎県において採取したものをそれぞれ用いた（図２の説明参照）。
【００５２】
土壌試料やジャガイモ病班部組織からのＤＮＡ抽出はFast DNA SPIN kit for soil（Q-BIOgene社製）を用い、同キットの標準プロトコルに従って実施した。土壌試料は約０．４ｇ、ジャガイモ病班組織は約０．３ｇからＤＮＡ抽出を行い、最終的に５０μｌのＤＮＡ抽出溶液を得た。ＤＮＡ抽出溶液は１００倍に希釈し、タイピングＰＣＲ用のテンプレート溶液として用いた。尚、土壌やジャガイモ組織からのＤＮＡ抽出手法として既に多くの手法が開発されており、本発明技術の適用にあたっては、上述のＤＮＡ抽出法に限定されるものではない。
【００５３】
ＰＣＲサイクル数を除いて、ＰＣＲ反応溶液組成ならびに反応条件は前記と同様とした。本実験において抽出したＤＮＡ溶液中にはそうか病菌種に由来するテンプレートＤＮＡ量が少ないことを考慮し、ＰＣＲの増幅サイクル数を３５サイクルから４０サイクルに増やした。
【００５４】
（図２の説明）
長崎、北海道網走を含む３箇所のジャガイモ畑土壌試料とジャガイモ病班組織より抽出したＤＮＡに対して、本発明技術に基づく遺伝子診断を行った結果である。
レーン１：長崎じゃがいも畑Ａの土壌試料
レーン２：北海道網走じゃがいも畑Ｂの土壌試料
レーン３：北海道網走じゃがいも畑Ｃの土壌試料
レーン４：長崎じゃがいも畑Ａのジャガイモ病班組織試料
レーン５：北海道網走じゃがいも畑Ｂのジャガイモ病班組織試料
レーン６：北海道網走じゃがいも畑Ｃのジャガイモ病班組織試料
レーン７：ポジティブコントロール（３種のそうか病菌種のゲノムＤＮＡの等量混合試料）
【００５５】
土壌及びジャガイモ組織より抽出したＤＮＡを鋳型として用い、本発明技術に基づくそうか病菌種の遺伝子タイピングを試みた（図２）。その結果、土壌試料から抽出したＤＮＡ溶液をテンプレートとして用いた場合でも、S. turgidiscabiei単独、若しくはS. acidiscabieiとS. turgidiscabieiの両菌種に由来すると考えられる増幅ＤＮＡ断片が、そのサイズの違いから明確に検出・識別可能であった（図２のレーン１〜３）。又、ジャガイモ病班組織から抽出したＤＮＡをテンプレートとして用いた場合にも、同様に、S. turgidiscabiei単独、若しくはS. acidiscabieiとS. turgidiscabieiの両菌種由来の増幅ＤＮＡ断片が、そのサイズの違いからはっきりと識別可能であった（図２のレーン４〜６）。
【００５６】
以上の結果は、１試料あたり１回のＰＣＲ反応及び１レーンの電気泳動により、土壌試料ならびにジャガイモ組織におけるそうか病菌の検出ならびに存在種の識別が可能であることを実証するものである。このことは同時に、本発明の遺伝子タイピング技術に基づき、迅速、簡便かつ低コストなそうか病遺伝子診断が可能であることを明確にするものである。
尚、本発明技術は、ジャガイモ畑土壌及びジャガイモ組織に限定されるものではなく、様々な環境試料及び農作物組織に適用されうる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーセットならびに最適反応条件を用いることにより、純粋培養されたそうか病菌種の同定はもとより、ジャガイモ組織（特に病斑部位）及び土壌等の環境試料中におけるそうか病菌種の特異的かつ高感度な検出・識別が可能となり、同時に、従来の手法に比べ迅速化、簡便化、低コスト化を実現しうる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】３種類のそうか病菌種のゲノムＤＮＡをテンプレートとした遺伝子タイピングの結果（各レーンの説明は表４を参照のこと）。
【図２】環境試料より抽出したＤＮＡに対するそうか病菌種遺伝子タイピング結果。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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