(57)【要約】      （修正有） 【課題】簡便に高精度で幼若白血球や異常白血球等の異常細胞を分類計数すると同時に、正常白血球の分類計数を行うことができる方法を提供する。【解決手段】  血液試料を溶血剤及び下記一般式（Ｉ）で表される色素化合物と混合して測定用試料を調製する工程、測定用試料をフローサイトメータで測定し、１つの散乱光と１つの蛍光を測定する工程、測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて正常な白血球を５つに分類計数する工程、を具備する。2006091024.tif 000008【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１) 血液試料を、
血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤と、
下記一般式（Ｉ）で表される細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素化合物と、
混合することにより血液試料中の有核細胞を蛍光染色して、測定用試料を調製する工程、
【化１】
2006091024.tif 000006
（式中、Ｒ1及びＲ4は、水素原子又はアルキル基を表し、かつ、いずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基であり、他方が水素原子又は炭素数６未満のアルキル基であり；Ｒ2及びＲ3は水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基であり；Ｚは硫黄、酸素又はメチル基を有する炭素であり；ｎは０，１又は２であり；Ｘ-はアニオンである。）
２) 前記１）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する工程、および
３）前記２）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程、
を具備することを特徴とする白血球分類計数方法。
【請求項２】
溶血剤が、少なくとも１つのノニオン性界面活性剤と少なくとも１つのカチオン性界面活性剤を含み、ｐＨが４．５〜１１．０である請求項１記載の白血球分類計数方法。
【請求項３】
溶血剤が、少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩をさらに含有する請求項２記載の白血球分類計数方法。
【請求項４】
散乱光が、前方低角散乱光、前方高角散乱光及び側方散乱光よりなる群から選ばれる少なくとも一つの散乱光である請求項１記載の白血球分類計数方法。
【請求項５】
異常細胞の分類計数を同時に行う請求項１記載の白血球分類計数方法。
【請求項６】
異常細胞が、正常細胞よりもＲＮＡ量の増加した細胞である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の白血球分類計数方法。
【請求項７】
異常細胞が、幼若顆粒球、骨髄芽球、赤芽球及び異形リンパ球よりなる群から選ばれる少なくとも一つの細胞である請求項６記載の白血球分類計数方法。
【請求項８】
１) 血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤、及び
２）下記一般式（Ｉ）で表されるＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素化合物を含む染色液
【化２】
2006091024.tif 000007
（式中、Ｒ1及びＲ4は、水素原子又はアルキル基を表し、かつ、いずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基であり、他方が水素原子又は炭素数６未満のアルキル基であり；Ｒ2及びＲ3は水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基であり；Ｚは硫黄、酸素又はメチル基を有する炭素であり；ｎは０，１又は２であり；Ｘ-はアニオンである。）
の組み合わせからなることを特徴とする白血球分類計数試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフローサイトメトリーによる白血球の分類計数方法及び分類計数試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、白血球の分類計数を行うことにより、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な末梢血液中の白血球には、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５つの正常白血球が一定の比率で存在する。疾患の存在により、これらの白血球の比率は変動することがあり、これらの正常白血球を分類計数する事により各白血球の比率を測定することは疾患の存在についての情報を得るうえで有用である。
【０００３】
また、一方、疾患によっては、これらの正常白血球以外に、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などの幼若顆粒球、赤芽球、などの通常骨髄内に存在し末梢血には存在しない幼若白血球や幼若赤血球が末梢血中に出現することがある。さらに、リンパ芽球、異形リンパ球、異常リンパ球等の異常白血球が出現することもある。これらの細胞の出現を検出、さらに、分類計数する事も疾患の診断において極めて有用である。
【０００４】
従来、白血球分類を行うには、血液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は、正常な白血球を高精度に分類することはできるが、上述の幼若白血球などの異常細胞の分類計数を、正常白血球を分類計数するのと同時に行う事はできなかった。
【０００５】
例えば、ＲＦ／ＤＣ測定原理を用いて幼若白血球の出現を高精度に検出する試薬および方法が提供されている（特許文献１）。特許文献１記載の方法は、特定の条件下では正常白血球よりも幼若白血球の方が破壊されにくいという性質を利用して電気的に測定を行うものである。また、散乱光情報によって測定できることも示唆されている。しかし、この方法は幼若白血球の検出のみを目的としており、幼若白血球の検出においては優れた性能を有するが、幼若白血球の測定と同時に正常白血球を分類計数することはできない。正常な白血球を分類計数するには別途、他の方法で行う必要がある。
【０００６】
また、これとは別に蛍光測定原理を用いて白血球を４分類すると同時に種々の幼若白血球を分類計数する方法が提供されている（特許文献２）。この方法は、正常白血球を同時に４分類しかできず、好塩基球を測定するためには別途、他の方法で行う必要がある。また、複数の蛍光信号を測定する必要があり装置が複雑で高価になるという問題もある。
【０００７】
さらに、白血球を５分類すると同時に種々の幼若白血球を分類計数する方法が提供されている（特許文献３）。この方法では、白血球の５分類を行うために複雑な検出器が必要であり、また、２つの蛍光情報が必要であり、装置が大型で高価になるという問題がある。
【０００８】
【特許文献１】特開平６−２７３４１３号公報
【特許文献２】特開平６−２０７９４２号公報
【特許文献３】特開平５−３４２５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、簡便に高精度で幼若白血球や異常白血球等の異常細胞を分類計数すると同時に、正常白血球の分類計数ならびに、白血球計数を行うことができる方法及びこの方法に用いる試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、
１) 血液試料を、
血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤と、
下記一般式（Ｉ）で表される細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素化合物と、
混合することにより血液試料中の有核細胞を蛍光染色して、測定用試料を調製する工程、
【化３】
2006091024.tif 000002
（式中、Ｒ1及びＲ4は、水素原子又はアルキル基を表し、かつ、いずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基であり、他方が水素原子又は炭素数６未満のアルキル基であり；Ｒ2及びＲ3は水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基であり；Ｚは硫黄、酸素又はメチル基を有する炭素であり；ｎは０，１又は２であり；Ｘ-はアニオンである。）
２) 前記１）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する工程、および
３）前記２）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程、
を具備することを特徴とする白血球分類計数方法に関するものである。
【００１１】
本発明でいう血液試料とは、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血液試料など、白血球を含む体液試料をいう。
【００１２】
異常細胞とは、通常骨髄中に存在し、末梢血液には存在しない幼若細胞、例えば、骨髄芽球（Ｂｌａｓｔ）、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などの幼若顆粒球（ＩＧ）等の幼若白血球、さらには異形リンパ球（Ａ−Ｌｙｍｐｈ) 、リンパ芽球（Ｌ−Ｂｌａｓｔ）、異常好中球（Ａｂ−Ｎｅｕｔ）等の異常白血球、および赤芽球（ＮＲＢＣ）等の通常末梢血に存在しない細胞をいう。
【００１３】
本発明でいう、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤と混合する工程とは、血液試料を適当な溶血剤と混合する工程である。本工程の目的は、測定対象とする白血球細胞の細胞膜に少なくとも色素化合物が透過するのに十分な細孔をあけるだけである。この目的に使用する溶血剤は、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ４．５−１１．０、好ましくはｐＨ５．０−１０．０の水溶液である。
【００１４】
カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウム塩型およびピリジニウム塩型界面活性剤は、
【化４】
2006091024.tif 000003
〔Ｒ1は炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基、Ｒ2およびＲ3は炭素数１〜４のアルキル又はアルケニル基、Ｒ4は炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原子である。〕
で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。Ｒ1の炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基としてはへキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ2およびＲ3の炭素数１〜４のアルキル、アルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。さらに、Ｒ4の炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。
【００１５】
ノニオン性界面活性剤としては以下の式のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい。すなわち、一般式
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ
〔式中、Ｒ1は炭素数８〜２５のアルキル、アルケニル又はアルキニル基；Ｒ2はＯ、
【化５】
2006091024.tif 000004
またはＣＯＯ；ｎは１０〜５０の整数を表す。〕
で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤を用いるのが、好ましい。
【００１６】
溶血剤の組成は特に限定されるものではないが、例えば、特開平６−２０７９４２号公報又は特開平７−１８１１７７号公報に記載の溶血剤が好適に使用できる。
【００１７】
さらに、溶血剤中に、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有することは、好ましいことである。これは、白血球の散乱光強度分布を、分類により好適なように調整しうるためである。有機酸もしくはその塩としては、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸もしくはその塩などが好適に使用できる。これらの有機酸を含有することにより、特に好酸球の散乱光強度が増加し、結果として、好中球と好酸球の分離が改善される。例えば、実質的に側方散乱光のみを用いて白血球の４分画が可能となる。
【００１８】
溶血剤のｐＨは４．５−１１．０、好ましくは５．０−１０．０であり、ｐＨを一定に保つために、例えば、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩などの緩衝剤を含む。なお、前述の酸が緩衝剤として作用する場合には、緩衝剤は必ずしも必要な成分ではない。ｐＨが低すぎる場合、好酸球、好塩基球の分離が悪くなり、正常白血球を５分画しにくくなる。しかしながら、正常白血球を３分画（リンパ球、単球、顆粒球）並びに幼若白血球、異常白血球を分類計数する事は可能である。一方、ｐＨが高すぎる場合は白血球が損傷を受けやすくなる傾向が生じる。
【００１９】
細胞中のＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素化合物としては、ＲＮＡの存在しない環境では蛍光強度が低く、ＲＮＡと結合することによって蛍光強度の増加する色素化合物が使用できる。本発明においては、このような色素化合物として、以下の一般式（Ｉ）で表される色素化合物を用いる。
【化６】
2006091024.tif 000005
（式中、Ｒ1及びＲ4は、水素原子又はアルキル基を表し、かつ、いずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基であり、他方が水素原子又は炭素数６未満のアルキル基であり；Ｒ2及びＲ3は水素原子、メチル基、エチル基、メトキシ基又はエトキシ基であり；Ｚは硫黄、酸素又はメチル基を有する炭素であり；ｎは０，１又は２であり；Ｘ-はアニオンである。）
【００２０】
大部分の幼若白血球や異常白血球等の異常細胞は、正常な白血球に比べ、ＲＮＡを豊富に含有する。これは、例えば幼若白血球では、成熟途中の細胞であるために、細胞成熟に伴う種々の生産活動（タンパク質合成等）をおこなっており、そのためにＲＮＡが豊富に存在すると考えられる。そして、上記色素化合物は、ＲＮＡと結合することにより、著しく蛍光強度の増加する性質を有する。さらに予期せぬことに、これらの色素化合物を使用することにより、好塩基球を同時に分類することが可能となった。
【００２１】
本発明で使用する色素化合物は、ＤＮＡとの結合の影響を少なくし、ＲＮＡに対する特異性を高めたものである。すなわち、ＤＮＡとの親和性（特異性）の低い色素化合物を用いている。そして、このため、一般式（Ｉ）中、Ｒ1あるいはＲ4のいずれか一方が長鎖の（炭素数６〜１８の）アルキル基であり、他方が水素原子又は炭素数６未満のアルキル基となっている。ＤＮＡに対して特異性を有する場合、ＲＮＡからの蛍光信号に、ＤＮＡからの蛍光信号が重畳され、正常白血球と幼若白血球、異常白血球との間の蛍光強度差が小さくなり、好ましくない。
【００２２】
本発明で用いる色素化合物の作用機序は明確ではないが、長鎖アルキル基（炭素数６〜１８アルキル基）を分子構造内に有するために細胞核膜を透過できない、あるいは、立体障害のためにＤＮＡ分子への結合が阻害されるため、ＤＮＡに起因する蛍光増加が少なく、よりＲＮＡ主体の蛍光を測定できるという利点があると考えられる。これによって、幼若白血球や異常白血球等の異常細胞と正常白血球の分離が著しく改善されるのである。
【００２３】
長鎖アルキル基（炭素数６〜１８アルキル基）の鎖長（炭素数）は長いほどＤＮＡに起因する蛍光強度増加が抑制され、ＲＮＡ特異性が高まるが、一方、分子が疎水性になる傾向があり、水に難溶となって、使用不可能ではないが、取り扱いにくくなる。これらの点を勘案すると、Ｒ1もしくはＲ4のアルキル基の炭素数が６、８、１０の色素化合物が特に好適である。
【００２４】
Ｒ2およびＲ3は、水素原子、メチル基、メトキシ基、エチル基又はエトキシ基である。
【００２５】
Ｘ-として好適なアニオンにはＦ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-等のハロゲンイオン、又はＣＦ3ＳＯ3-若しくは、ＢＦ4-などを含む。
【００２６】
Ｚとしては、硫黄原子、酸素原子、又はメチル基で置換されている炭素原子が用いられる。
【００２７】
色素化合物の濃度は使用する色素化合物により異なるが、一般に０．００１−１０００ｐｐｍ、好ましくは０．０１−１００ｐｐｍ、さらに好ましくは０．１−１０ｐｐｍである。この濃度は、溶血剤と色素化合物とを混合した状態での濃度である。本発明においては、血液試料を溶血剤と混合した後に色素化合物を混合して測定用試料を調製してもよいし、予め溶血剤と色素化合物とを混合した後に、血液試料と混合して測定用試料を調製してもよい。いずれの場合においても、濃度は溶血剤と色素化合物とを混合した状態でのものである。したがって、色素化合物を含む染色液と溶血剤を別々にして組み合わせた試薬キットの場合でも、色素化合物を含む染色液と溶血剤とを混合した状態での濃度である。本発明で用いる色素化合物を含む染色液は、エチレングリコール、メタノール、ＤＭＳＯなどの水溶性有機溶媒に、色素化合物を溶解して得られる。
【００２８】
調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する。
【００２９】
本発明でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光であり、側方散乱光、前方低角散乱光（受光角度０〜５度付近）、前方高角散乱光（５〜２０度付近）等をいい、白血球の大きさもしくは内部構造情報を反映する散乱角度が選ばれる。このうち側方散乱光がもっとも好適である。
【００３０】
また、散乱光を１つ以上使用することにより、より分類精度をあげることができる。特に、前方低角散乱光を使用すると、細胞の大きさに関する情報が得られるため、例えば、Hairy Cell Leukemia 等の大きさのみが変わって、ＲＮＡ量の増加しない異常球の検出にも本発明を用いることができ、有用である。また、前方高角散乱光を使用した場合、前方低角散乱光と側方散乱光の中間の情報が得られる。つまり、細胞の大きさ情報と細胞の内部構造情報の両方を含む情報が得られる。
【００３１】
蛍光は、本発明で使用する色素化合物がＲＮＡ，ＤＮＡ等の細胞成分と結合して発せられるもので、使用する色素化合物によって好適な受光波長が選択される。
【００３２】
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素化合物の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザ、水銀アークランプなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価かつ小型であり、装置コストを大幅に下げることができ、さらに小型化できるため、好適である。
【００３３】
「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて正常な白血球を少なくとも５つに分類計数する工程」とは、（１）例えばＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラム（２次元分布図）を描いた場合、例えば、図１に示すように、各白血球細胞は各細胞毎に集団を形成する；そして（２）この集団を、適当な解析ソフトで解析することにより、各白血球細胞の数と割合を算出する、工程をいう。例えば、各細胞集団を囲むウインドウを設け、その中の細胞数を算出することにより、各白血球細胞の数と割合を算出することができる。
【００３４】
本発明に係る方法を用いると、正常な白血球を少なくとも５つに分類計数できるのみでなく、異常細胞の分類計数を同時に行うことができる。本発明に係る方法で分類計数するのに適した異常細胞は、正常細胞よりもＲＮＡ量の増加した細胞であり、例えば幼若顆粒球、骨髄芽球、赤芽球及び異形リンパ球から選択される１つ以上である。
【００３５】
本発明はさらに、測定用試料を調製するための試薬キットを提供する。この試薬キットは、１) 血液試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、正常または異常細胞を染色に好適な状態にする溶血剤、及び２）上記一般式（Ｉ）で表されるＲＮＡに特異的に結合し蛍光強度の増加する色素化合物を少なくとも１つ含む染色液の組み合わせからなる。試薬キットに用いられる溶血剤の具体例は、前述したとおり、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ４．５−１１．０、好ましくはｐＨ５．０−１０．０の水溶液である。また、染色液の具体例も、前述したとおり、一般式（Ｉ）で表される色素化合物を、エチレングリコール、メタノール、ＤＭＳＯなどの水溶性有機溶媒に溶解したものである。
【００３６】
この試薬キットを用いて測定用試料を調製する方法としては、血液試料に溶血剤を混合した後、染色液を混合して調製してもよいし、溶血剤と染色液を混合した混合液を、血液試料に混合して調製してもよい。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に係る白血球分類計数方法によれば、血液試料を溶血剤と混合し、同時に又はその後、一般式（Ｉ）で表される色素化合物と混合することにより血液試料中の有核細胞を蛍光染色し、フローサイトメータにより少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定するだけで簡便に高精度で幼若白血球や異常白血球の異常細胞を分類計数すると同時に、正常白血球の分類計数ならびに白血球計数を行うことができる。
【実施例】
【００３８】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。なお、添付の各図において、以下の略号はそれぞれ次の物を意味する。
Ｌｙｍｐｈ：リンパ球                Ｅｏ：好酸球
Ｍｏｎｏ：単球                Ｂａｓｏ：好塩基球
Ｎｅｕｔ：好中球                  ＷＢＣ：白血球
ＩＧ：幼若顆粒球            Ｂｌａｓｔ：骨髄芽球
ＮＲＢＣ：赤芽球      Ａ−Ｌｙｍｐｈ：異形白血球
【００３９】
［色素化合物Ａの合成］
色素化合物Ａ（Ｒ1＝メチル，Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ，Ｒ4＝ｎ−オクチル，ｎ＝１，Ｚ＝Ｓ，Ｘ-＝ＣＦ3ＳＯ3-）を以下のようにして製造した。
３−メチル−２−メチルベンゾチアゾリウムメタンサルフェート１当量と、Ｎ, Ｎ−ジフェニルホルムアミジン３当量を酢酸中で、９０℃の油浴上で１．５時間加熱撹拌した。反応液をヘキサンにあけ、赤色油状物をさらにヘキサンで懸濁洗浄し、酢酸を除いた。粗生成物を酢酸エチルーヘキサンで再結晶した（収率４８％）。これに１−オクチルレピジニウムトリフレート１当量とピリジンを加え、９０℃の油浴上で3 時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った青色粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてメタノール−クロロホルムで精製した（収率６２％）。
【００４０】
以上のようにして色素化合物Ａよりなる粉末が得られ、これは濃暗青色であった。また、この色素化合物Ａの特性は、以下のとおりであった。
ＴＬＣ（シリカゲル、１０％メタノール- 塩化メチレン）：Ｒf=０．５
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ（ＴＭＳ）：０．８８（ｔ，３Ｈ）  １．２８（ｂＲ，１０Ｈ）  １．６４（ｓ，２Ｈ）  １．８２（ｂＲ，２Ｈ）  ３．６０（ｓ，３Ｈ）  ４．２３（ｔ，２Ｈ）  ６．３５（ｄ，１Ｈ）  ６．８２〜７．２６（ｍ，２Ｈ）  ７．３９〜７．９０（ｍ，６Ｈ）  ８．１０〜８．２６（ｄｄ，２Ｈ）
ＩＲ（ｃｍ-1）：１６２５，１５６０，１５４０，１５２０，１４８０，１４６０，１４１０，１４００，１３１０，１２６０，１２１０，１１５０，１１３０，７４０，６４０
ＭＡＳＳ（ＦＡＢｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ＝４２９
ＴＬＣ９５．７％（１０％メタノール−塩化メチレン）
極大吸収スペクトル６２９ｎｍ（メタノール）
【００４１】
［色素化合物Ｂの合成］
色素化合物Ｂ（Ｒ1＝ヘキシル，Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ，Ｒ4＝メチル，ｎ＝１，Ｚ＝Ｓ，Ｘ-＝ＣＦ3ＳＯ3-）を以下のようにして製造した。
３−へキシル−２−メチルベンゾチアゾリウムトリフレート１当量と、Ｎ, Ｎ−ジフェニルホルムアミジン４当量を酢酸中で、９０℃の油浴上で１０時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてヘキサン−酢酸エチルで精製した（収率２７％）。これにヨウ化１−メチルレピジニウム１．３当量とピリジンを加え、９０℃の油浴上で３時間加熱撹拌した。反応液を濃縮し、残った青色粗製物をフラッシュクロマトグラフィーにてメタノール−クロロホルムで精製した（収率７５％）。
【００４２】
以上のようにして色素化合物Ｂよりなる粉末が得られ、これは濃暗青色であった。また、この色素化合物Ｂの特性は、以下のとおりであった。
ＴＬＣ（シリカゲル、１０％メタノール- 塩化メチレン）：Ｒf=０．５
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ（ＴＭＳ）：０．９０（ｔ，３Ｈ）  １．１７〜１．８１（ｍ，１２Ｈ）  ４．１２（ｓ，３Ｈ）  ６．５０（ｍ，１Ｈ）  ６．９６〜８．２６（ｍ，１０Ｈ）
ＩＲ（ｃｍ-1）：１６２０，１５６０，１５３０，１５１０，１４８０，１４６０，１４１０，１３８０，１３１０，１２５０，１２１０，１１５０，１１００，７５０，６４０
ＭＡＳＳ（ＦＡＢｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ＝４０１
ＴＬＣ９３．０％（１０％メタノール−塩化メチレン）
極大吸収スペクトル６２９ｎｍ（メタノール）
【００４３】
実施例１
溶血剤と色素化合物Ａを含む溶液を、以下のとおり準備した。
ＨＥＰＥＳ                                      １０ｍＭ  市販品
フタル酸２Ｎａ                                  ２０ｍＭ  市販品
ＢＣ３０ＴＸ（ポリオキシエチレン（３０）セチルエーテル）
１５００ｐｐｍ  日光ケミカルズ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド    ５５０ｐｐｍ  市販品
色素化合物Ａ                                ０．５ｐｐｍ
ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整
上記溶液１．０ｍｌに抗凝固剤処理した健常人の血液（検体Ｎｏ．１）３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させて、測定用試料を調製した。
【００４４】
フローサイトメータ（ＦＣＭ）で、この測定用試料について、側方散乱光、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光（赤蛍光）を測定した。
【００４５】
図１にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを示す。図２にＸ軸に前方低角散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを示す。白血球はリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５つの集団に分かれる。各々の集団にウインドウを設けウィンドウ内の細胞数の計数、細胞比率の算出を行う。
【００４６】
図５〜９に従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と本法（図１）との白血球分類の相関図を示す。図１０に従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と本法（図１）との白血球数の相関図を示す。いずれの項目も、従来法と良好な相関がある。
【００４７】
ここで、従来法の測定は以下の測定試薬を用い、操作はＳＥ−９０００で全自動で行った。
・白血球数：セルパック−３Ｄ（II）TM（東亞医用電子）とストマトライザ−ＥＯ（II）TM（東亞医用電子）の１：１混合物に血液を加えて測定した。
・リンパ球及び単球：セルパック−３Ｄ（II）TM（東亞医用電子）により溶血後、ストマトライザ−３Ｄ（II）TM（東亞医用電子）を添加して測定した。
・好酸球：ストマトライザ−ＥＯ（II）TM（東亞医用電子）を使用して測定した。
・好塩基球：ストマトライザ−ＢＡ（II）TM（東亞医用電子）を使用して測定した。
・好中球：（白血球数) −｛（リンパ球数) ＋（単球数) ＋（好酸球) ＋（好塩基数) ｝により求めた。
【００４８】
なお、参考までに図３に、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとったスキャッタグラムを、図４に側方散乱光強度のヒストグラムを示す。白血球はリンパ球、単球、好中球、好酸球の４つの集団に分かれる。
【００４９】
実施例２
血液試料として、以下の検体を用いた他は、実施例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。
（ｉ）幼若顆粒球（後骨髄球、骨髄球）の出現した検体（検体Ｎｏ．２）については、図１１に示したスキャッタグラムを得た。図１１では４．０％と計数された。この検体を従来法（目視）で計数すると、４．５％であった。
（ii）骨髄芽球の出現した検体（検体Ｎｏ．３）については、図１２に示したスキャッタグラムを得た。図１２では８５．１％と計数された。この検体を従来法（目視）で計数すると、８１．５％であった。
（iii ）赤芽球の出現した検体（検体Ｎｏ．４）については、図１３に示したスキャッタグラムを得た。図１３では２１．５％と計数された。この検体を従来法（目視）で計数すると、２５％であった。
（iv）異形リンパ球と幼若顆粒球の出現した検体（検体Ｎｏ．５）については、図１４に示したスキャッタグラムを得た。図１４で、異形リンパ球は１．８９％、幼若顆粒球は２．１７％と計数された。この検体を従来法（目視）で計数すると、異形リンパ球は２．０％、幼若顆粒球は２．０％であった。
【００５０】
実施例２に係る方法によれば、いずれの幼若顆粒球、異常白血球も正常白血球と明確に分離され分類計数する事ができる。なお、前記した従来法は、塗抹標本をメイーグリュンワルドーギムザ染色法で二重染色し、白血球を顕微鏡（倍率：ｘ１０００）で２００個分類計数したものである。
【００５１】
実施例３
血液試料として、正常検体（検体Ｎｏ．６）を用いた他は、実施例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図１７に示した。
【００５２】
実施例４
血液試料として、幼若顆粒球の出現した検体（検体Ｎｏ．７）を用いた他は、実施例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図１８に示した。
【００５３】
実施例５
溶血剤と色素化合物Ｂを含む溶液を、以下のとおり準備した。
ＨＥＰＥＳ                                      １０ｍＭ  市販品
フタル酸２Ｎａ                                  ２０ｍＭ  市販品
ＢＣ３０ＴＸ（ポリオキシエチレン（３０）セチルエーテル）
１５００ｐｐｍ  日光ケミカルズ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド    ５５０ｐｐｍ  市販品
色素化合物Ｂ                                ０．３ｐｐｍ
ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整
上記溶液１．０ｍｌに抗凝固剤処理した正常検体（実施例３で使用した検体Ｎｏ．６）３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させて、測定用試料を調製した。そして、実施例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図１９に示した。
【００５４】
実施例６
血液試料として、幼若顆粒球の出現した検体（実施例４で使用した検体Ｎｏ．７）を用いた他は、実施例５と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図２０に示した。
【００５５】
比較例１
溶血剤と色素化合物Ｂを含む溶液を、以下のとおり準備した。
ＨＥＰＥＳ                                      １０ｍＭ  市販品
フタル酸２Ｎａ                                  ２０ｍＭ  市販品
ＢＣ３０ＴＸ（ポリオキシエチレン（３０）セチルエーテル）
１５００ｐｐｍ  日光ケミカルズ
ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド    ５５０ｐｐｍ  市販品
ＤＱＴＣＩ（色素化合物）                    ０．１ｐｐｍ  Lambda Physik 社
ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整
ここで、ＤＱＴＣＩとは、上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1＝Ｒ4＝エチル，Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ，ｎ＝１，Ｚ＝Ｓ，Ｘ-＝Ｉ-である色素化合物である。
上記溶液１．０ｍｌに抗凝固剤処理した正常検体（実施例３で使用した検体Ｎｏ．６）３０μｌを加え、３５℃で４０秒間反応させて、測定用試料を調製した。そして、実施例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図１５に示した。
【００５６】
比較例２
血液試料として、幼若顆粒球の出現した検体（実施例４で使用した検体Ｎｏ．７）を用いた他は、比較例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図１６に示した。
【００５７】
実施例３〜６と比較例１及び２の結果を示した図１５〜図２０から明らかなように、色素化合物として、一般式（Ｉ）のＲ1及びＲ4の両方がエチル基であるものを用いた場合（比較例１及び２の場合）には、正常好中球と幼若顆粒球の弁別は困難であるが、Ｒ1及びＲ4のいずれか一方に炭素数が６及び８のアルキル基を導入し、他方にメチル基を導入した色素化合物Ａ又はＢを用いた場合（実施例３〜６の場合）には、正常好中球と幼若顆粒球は明確に弁別できる。
【００５８】
実施例７
溶血剤と色素化合物Ａを含む溶液として、フタル酸２Ｎａに代えてクエン酸を用い、血液試料として正常検体（検体Ｎｏ．８）を用いる他は、実施例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図２１に示した。
【００５９】
実施例８
溶血剤と色素化合物Ａを含む溶液として、フタル酸２Ｎａに代えてフタル酸を用い、血液試料として正常検体（実施例８で使用した検体Ｎｏ．８）を用いる他は、実施例１と同一の方法で、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に赤蛍光をとったスキャッタグラムを得た。これを、図２２に示した。
【００６０】
実施例７及び８の結果を示した図２１及び図２２から明らかなように、酸類として、分子構造中に芳香環を有する有機酸であるフタル酸を使用した場合（実施例８の場合）、芳香環を有しない有機酸であるクエン酸を使用した場合（実施例７の場合）に比べて、好中球と好酸球の分離が改善される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１に係る方法で得られた側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図２】実施例１に係る方法で得られた前方低角散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図３】実施例１に係る方法で得られた側方散乱−前方低角散乱スキャッタグラムである。
【図４】実施例１に係る方法で得られた側方散乱ヒストグラムである。
【図５】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例１に係る分類計数法によるリンパ球比率の相関図である。
【図６】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例１に係る分類計数法による単球比率の相関図である。
【図７】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例１に係る分類計数法による好中球比率の相関図である。
【図８】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例１に係る分類計数法による好酸球比率の相関図である。
【図９】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例１に係る分類計数法による好塩基球比率の相関図である。
【図１０】従来法（東亞医用電子ＳＥ−９０００）と実施例１に係る分類計数法による白血球数の相関図である。
【図１１】幼若顆粒球（後骨髄球、骨髄球）の出現した検体（検体Ｎｏ．２）について、実施例２に係る方法で得られた側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１２】骨髄芽球の出現した検体（検体Ｎｏ．３）について、実施例２に係る方法で得られた側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１３】赤芽球の出現した検体（検体Ｎｏ．４）について、実施例２に係る方法で得られた側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１４】異形リンパ球と幼若顆粒球の出現した検体（検体Ｎｏ．５）について、実施例２に係る方法で得られた側方散乱−赤蛍光スキャッタグラムである。
【図１５】比較例１に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１６】比較例２に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１７】実施例３に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１８】実施例４に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１９】実施例５に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図２０】実施例６に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図２１】実施例７に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図２２】実施例８に係る方法で得られた側方散乱−蛍光スキャッタグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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