(57)【要約】【課題】    高感度にHBVcccDNAを特異的に測定することができる、HBVcccDNAの測定方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供すること。【解決手段】  検体中のHBVcccDNAを測定する方法は、HBVcccDNAの特定の領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るフォワード側プライマーと、HBVcccDNAの特定のの相補鎖に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るリバース側プライマーと、前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーとの間に挟まれる領域にハイブリダイズし、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識された１５ヌクレオチド以上のサイズを有する核酸プローブとを用いたリアルタイムPCR法により検体中のHBVcccDNAを測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列の1414nt〜1454ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るフォワード側プライマー又は配列番号１に示される塩基配列の1383nt〜1422ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るフォワード側プライマーと、配列番号１に示される塩基配列の1727nt〜1765ntの領域の相補鎖に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るリバース側プライマーと、前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーとの間に挟まれる領域にハイブリダイズし、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識された、１２ヌクレオチド以上のサイズを有する核酸プローブとを用いたリアルタイムPCR法により、検体中のHBVcccDNAを測定する方法。
【請求項２】
前記フォワード側プライマーが、配列番号１に示される塩基配列の1421nt〜1447ntの領域に含まれる連続する少なくとも１８ヌクレオチド又は配列番号１に示される塩基配列の1390nt〜1415ntの領域に含まれる連続する少なくとも１８ヌクレオチドから成り、前記リバース側プライマーが、配列番号１に示される塩基配列の1734nt〜1758ntの領域の相補鎖に含まれる連続する少なくとも１８ヌクレオチドから成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸プローブが、配列番号１に示される塩基配列の1645nt〜1682ntの領域又はその相補鎖に含まれる連続する少なくとも１２ヌクレオチド、又は配列番号１に示される塩基配列の1409nt〜1442ntの領域又はその相補鎖に含まれる連続する少なくとも１２ヌクレオチドから成る請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記フォワード側プライマーが、配列番号２で示される塩基配列を有する２１ヌクレオチドから成る核酸、前記リバース側プライマーが、配列番号３で示される塩基配列を有する１９ヌクレオチドから成る核酸、前記プローブが配列番号４で示される塩基配列を有する１８ヌクレオチドから成る核酸である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記フォワード側プライマーが、配列番号５で示される塩基配列を有する２０ヌクレオチドから成る核酸、前記リバース側プライマーが、配列番号３で示される塩基配列を有する１９ヌクレオチドから成る核酸、前記プローブが配列番号６で示される塩基配列を有する１４ヌクレオチドから成る核酸である請求項３記載の方法。
【請求項６】
配列表の配列番号１に示される塩基配列の1414nt〜1454ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るフォワード側プライマー又は配列番号１に示される塩基配列の1383nt〜1422ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成る、請求項１記載の方法に用いられるフォワード側プライマー。
【請求項７】
配列番号１に示される塩基配列の1727nt〜1765ntの領域の相補鎖に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成る、請求項１記載の方法に用いられるリバース側プライマー。
【請求項８】
配列番号１に示される塩基配列の1645nt〜1682ntの領域若しくはその相補鎖に含まれる連続する少なくとも１２ヌクレオチドから成り、又は配列番号１に示される塩基配列の1409nt〜1442ntの領域又はその相補鎖に含まれる連続する少なくとも１２ヌクレオチドから成り、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識された、請求項３記載の方法に用いられる核酸プローブ。
【請求項９】
請求項６記載のフォワード側プライマーと、請求項７記載のリバース側プライマーと、請求項８記載の核酸プローブとを少なくとも含む、HBVcccDNA測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスcccDNAの測定方法並びにそのためのプライマー及びプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
Blumbergが白血病患者血清中に発見したオーストラリア抗原（のちのHBsAg）が、輸血後肝炎に関与していることを大河内らが明らかにしてから約30年が経ち、現在、全世界には、約3億5千万人のB型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus : HBV）キャリアが存在する(非特許文献１)。HBVは、感染後、急性あるいは慢性肝炎を引き起こし、その一部がさらに肝硬変や肝癌に移行する。全世界では、年間数百万人がHBVにより死亡している。日本における癌死の第3位は肝臓癌であり、年間約32,000人が肝癌によって死亡しており、この数は今後10年間増加傾向にあると考えられている。HBVの治療では、強力な抗ウイルス剤であるラミブジンが保険診療で使用可能であるが、長期投与例での耐性ウイルスや急性増悪例の出現、投与終了後の再悪化による重症化などの問題点がある。また、B型肝炎には多くの検査法が用いられているが、血中のHBV DNA量は、ラミブジン治療開始後、速やかに消失し、現在の測定法では検出感度未満となりモニタリングできない。また、長期予後予測についてはいまだ十分なマーカーがなく、より有効な検査の開発が必要とされている(非特許文献２)。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルスの共有結合性閉環状DNA(Hepatitis B virus covalently closed circular DNA（HBV cccDNA）)は、むきだしの閉環状のHBV DNAであり、肝細胞の核内に存在し、ウイルス増殖の際の複製中間体として働く。HBV cccDNAはラミブジンの直接の作用を受けず、ラミブジン治療後も肝細胞中に残存するため、近年、抗ウイルス薬の長期予後予測や肝障害の程度の新しい独立因子として注目されている。
【０００４】
Maisonらは、ラミブジン投与中もHBV cccDNAが残っていると、投与中止後、ウイルスが再増殖することを実験で示している (非特許文献３)。今後は、修飾型IFNやサイトカイン、ワクチン療法などの免疫療法と、リバーストランスクリプターゼをターゲットとした新しい抗ウイルス薬との併用による、HBV cccDNAの完全除去・完全治療の可能性に期待が持たれる (非特許文献４、５)。B型肝炎治療の最終的な効果判定、治療終了時期の決定においては、HBV cccDNAの高感度・高精度な定量法が必要であり、これはまた各患者でのHBVの複製能力を予測する指標にもなると考えられる。特に、治療によって血清HBV DNAが検出感度以下に減少した場合でも、HBV cccDNAは長期にわたって測定されることが予想されるため、HBV cccDNAを特異的に、すなわち、HBV DNA共存下においてHBV cccDNAのみを定量することができる定量法は、B型慢性肝炎の長期予後予測や肝障害の度合いを見る新しい独立因子として、臨床応用されることが期待される。
【０００５】
HBVcccDNAの塩基配列は公知であり、また、血清中に含まれるHBV DNAの塩基配列及び構造も公知である。血清中に含まれるHBV DNAは、Dane粒子と呼ばれる粒子を形成しており、DNAは二本鎖であるが、そのうちの(-)鎖に、共有結合で完全に閉じていない部位が存在する。この不完全領域を含む領域が増幅されるようにプライマーを設定してPCR又はリアルタイムPCRを行なうと、Dane粒子は増幅されず、HBVcccDNAのみを増幅することができるので、Dane粒子の共存下であってもHBVcccDNAのみを測定することができる。この原理に基づき、HBVcccDNAをPCR法又はリアルタイムPCR法により特異的に定量する試みが既に報告されている（非特許文献３、特許文献１）。しかしながら、これらの文献に記載された公知のプライマーを用いてリアルタイムPCR法によりHBVcccDNAを定量しようとすると、日本人の検体では増幅が起きなかったりシグナルが弱かったりするものが少なくなく、その性能は必ずしも満足できるものではない。
【０００６】
【非特許文献１】Hollinger, F. B. 1996. Hepatitis B virus, p. 2739-2807. In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 3rd ed., vol. 3. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.
【非特許文献２】Mahoney, F. J. 1999. Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection. Clin. Microbiol. Rev. 12: 351-366.
【非特許文献３】Mason AL, Xu L, Guo L, Kuhns M, Perrillo RP. Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology.  27:1736-42. 1998
【非特許文献４】加藤直也、小俣政男、新たな抗ウイルス薬、内科、482，2004
【非特許文献５】横須賀  収、B型慢性肝炎のLamivudine治療、内科、vol. 93、457-462，2004
【特許文献１】米国公開公報2004/0058314 A1
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、高感度にHBVcccDNAを特異的に測定することができる、HBVcccDNAの測定方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、HBVcccDNA上の特定の領域に設定したプライマーを用いたリアルタイムPCR法により、高感度かつ特異的にHBVcccDNAを定量できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列の1414nt〜1454ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るフォワード側プライマー又は配列番号１に示される塩基配列の1383nt〜1422ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るフォワード側プライマーと、配列番号１に示される塩基配列の1727nt〜1765ntの領域の相補鎖に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成るリバース側プライマーと、前記フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーとの間に挟まれる領域にハイブリダイズし、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識された１５ヌクレオチド以上のサイズを有する核酸プローブとを用いたリアルタイムPCR法により、検体中のHBVcccDNAを測定する方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法に用いられるフォワード側プライマー、リバース側プライマー及び核酸プローブ、並びにこれらを含むHBVcccDNA測定用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、HBV DNA共存下においてもHBVcccDNAのみを高感度に定量できる、HBVcccDNAの測定方法が提供された。本発明の方法によれば、HBV DNA共存下においてもHBVcccDNAのみを高感度に定量できるので、本発明の方法は、B型肝炎治療の最終的な効果判定、治療終了時期の決定等に大いに貢献するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法は、特定のフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いたリアルタイムPCR法によりHBVcccDNAを特異的に測定する方法である。リアルタイムPCR法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、用いるフォワード側プライマー、リバース側プライマー及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。なお、本明細書において、「測定」は、検出と定量の両者を包含する。もっとも、リアルタイムPCR法は、被検核酸の定量が可能であるので、定量が好ましい。
【００１２】
検体としては、検査対象となる患者の肝臓組織等であるが、これに限定されるものではない。肝臓組織からのDNAの抽出は、市販のDNA抽出試薬キットを用いた常法により行うことができる。
【００１３】
HBVcccDNAの塩基配列は公知であり(GenBank Accession No. D12980)、配列表の配列番号１に示す。なお、配列番号１に示される塩基配列は、HBVcccDNAの(+)鎖であり、(-)鎖はその相補鎖である。HBVcccDNAは、閉鎖完全二重鎖であり、不完全な部位は存在しない。これに対し、血清中に含まれるDane粒子では、(-)鎖の5'末端が配列番号１（(+)鎖）の第1700番目の塩基（本明細書において、「1700nt」と示す。他の塩基も同様に数字の後に「nt」をつけて示す）の位置にあり、(-)鎖の3'末端が配列番号１の1692ntの位置に位置する。このため、1692nt〜1700ntの領域が、共有結合で完全に閉じていない領域である。また、(+)鎖は、所々にギャップが存在し、１つのギャップが配列番号１の1475ntから始まる。本発明の方法では、1692nt〜1700ntにあるDane粒子の(-)鎖の不完全領域及び1475ntから始まる(+)鎖のギャップの両方を含む領域が増幅されるので、Dane粒子では増幅が起きず、閉鎖完全二重鎖であるHBVcccDNAの増幅のみが起きる。
【００１４】
本発明の方法に用いられるフォワード側プライマーは、配列番号１に示される塩基配列の1414nt〜1454ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチド又は配列番号１に示される塩基配列の1383nt〜1422ntの領域に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成り、リバース側プライマーは、配列番号１に示される塩基配列の1727nt〜1765ntの領域の相補鎖に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチドから成る。好ましくは、フォワード側プライマーが、配列番号１に示される塩基配列の1421nt〜1447ntの領域に含まれる連続する少なくとも１８ヌクレオチド、又は配列番号１に示される塩基配列の1390nt〜1415ntの領域に含まれる連続する少なくとも１８ヌクレオチドから成り、リバース側プライマーが、配列番号１に示される塩基配列の1734nt〜1758ntの領域の相補鎖に含まれる連続する少なくとも１８ヌクレオチドから成る。これらのフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いることにより、HBVcccDNAを、HBVの遺伝子型にかかわらず特に高感度、かつ、特異的（すなわちDane粒子共存下でもHBVcccDNAのみを測定）に測定することができる。
【００１５】
本発明の方法に用いられる核酸プローブは、所定の塩基配列を有する核酸断片に例えばFAM等のリポーター色素と、例えばTAMRA、MGB等のクエンチャー色素が結合されたものである。リアルタイムPCR法に用いられるリポーター色素やクエンチャー色素自体は周知であり、市販のキットに含まれているので、それらを用いることができる。
【００１６】
本発明の方法に用いられる核酸プローブは、フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーとの間に挟まれる領域（両プライマーよりも内側の領域で、プライマーとは重複しない）にハイブリダイズする１２ヌクレオチド以上のものであれば特に限定されず、(+)鎖にハイブリダイズするものでも(-)鎖にハイブリダイズするものでもよく、それらの混合物でもよい。ここで、「ハイブリダイズする」とは、通常のリアルタイムPCR条件下においてハイブリダイズするという意味であり、配列番号１中の領域又はその相補鎖に相補的な塩基配列を持つ断片であることが好ましいが、全体の１０％以下程度のミスマッチがある場合でも通常使用可能である。好ましくは、配列番号１に示される塩基配列の1645nt〜1682ntの領域若しくはその相補鎖、又は配列番号１に示される塩基配列の1409nt〜1442ntの領域又はその相補鎖に含まれる連続する少なくとも１２ヌクレオチドから成る。
【００１７】
なお、測定には、それぞれ必ずしも単一のプライマー及びプローブを用いる必要はなく、遺伝子型によりSNPが存在する位置にプライマー又はプローブを設定する場合には、各SNPに相補的な塩基を有する複数のプライマー又はプローブの混合物を用いることも可能である。
【００１８】
本発明の最も好ましい態様では、フォワード側プライマーとして、配列番号１の1424nt〜1444ntから成るDNA断片（配列番号２、プライマー名：cccF2）、リバース側プライマーとして、配列番号１の1737nt〜1755ntに相補的なDNA断片（配列番号３、プライマー名：cccR4）、プローブとして、配列番号１の1655nt〜1672ntから成るDNA断片（配列番号４（相補鎖も含む）、プローブ名：cccP2)を用いる。また、別の好ましい態様では、フォワード側プライマーとして、配列番号１の1393-1412nt（配列番号５(その11ntがy(c又はt)、プライマー名cccF3）、リバース側プライマーとして上記cccR4、プローブとして配列番号１の1419nt〜1432nt（配列番号６、プローブ名：cccP3)を好ましく用いることもできる。
【００１９】
上記の通り、リアルタイムPCR法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、用いるフォワード側プライマー、リバース側プライマー及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができ、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００２０】
検体中にHBVcccDNAが存在すると、これを鋳型として増幅が起きる。増幅が起きると、核酸プローブが増幅産物にハイブリダイズする。プローブがハイブリダイズした鎖が鋳型となってその相補鎖がDNAポリメラーゼにより形成される際、プローブは、DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。このため、プローブに結合しているリポーター色素とクエンチャー色素が離れ離れになり、リポーター色素が検出されるようになる。すなわち、検体中に標的核酸が存在すれば、リポーター色素が検出される。リポーター色素のシグナルは、検体中の標的核酸のコピー数に依存して、あるサイクル数で急激に増大する。種々の既知のコピー数の標準試料を用いて、シグナルが急激に大きくなるサイクル数（閾値）を調べ、コピー数の対数を横軸、閾値を縦軸にとるとほぼ直線状の検量線が描かれる。未知試料について、この閾値を調べ、検量線に当てはめることにより未知試料中の標的核酸のコピー数を知ることができる。
【００２１】
上記の通り、本発明の方法では、Dane粒子における(-)鎖の不完全領域及び(+)鎖のギャップを含む領域が増幅されるので、Dane粒子では増幅が起きず、HBVcccDNAのみが特異的に測定される。もっとも、Dane粒子を鋳型とする増幅が起きる可能性をさらに完全に排除するために、Dane粒子の不完全領域やギャップ領域にハイブリダイズするが、PCRのプライマーとしては機能しない阻害用オリゴヌクレオチドを共存させてもよい。オリゴヌクレオチドの3'末端をリン酸標識したり、オリゴヌクレオチドの材料としてPNA(protein nucleic acid)を用いることにより、ハイブリダイズは可能であるが、プライマーとしては機能しない阻害用オリゴヌクレオチドを得ることができる。このような阻害用オリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号１の1475nt〜1498ntである5'-ttc ayg gyg gty tcc  atg yra cgt-3'リン酸及び配列番号１の1674nt〜1700ntの相補鎖である5'-stg ykc acc agc acc atg yaa ctt ttt c-3'リン酸等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。なお、これらの塩基配列から明らかなように、これらの好ましい各阻害用オリゴヌクレオチドは、複数の遺伝子型のいずれをも阻害できるように、複数のオリゴヌクレオチドの混合物である。これらの阻害用オリゴヌクレオチドの濃度は、用いるプライマーの濃度と同程度であることが好ましい。
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
３名のＢ型肝炎患者の生体肝組織から、DNA抽出試薬キット、QIAamp DNA Mini Kit (50)  品番51304 (商品名、(株)キアゲン)を用い、キットマニュアルに従いＤＮＡを抽出した。  Ribonuclease [DNase free] (10mg/ml)  品番 313-01461（商品名、和光純薬工業（株）)を用いてリボヌクレアーゼ処理を行った。溶出液の一部をTE bufferで希釈し、OD260nmの吸光度を測定し、定量を行った。(計算式 ; DNA濃度(μｇ/μL) = OD260nm値 × 0.05 × 測定時の希釈倍率)。上記cccF2（配列番号２）、上記cccR4（配列番号３）、上記cccP2（配列5'FAM accaatttatgcctacag- MGB-3'）、TaqMan Universal Master Mix  品番 4304437  (アプライドバイオシステムズジャパン（株）) を用い定量を行った。PCR反応は、1反応チューブあたり、次の量の試薬を混合した。TaqMan Universal Mater Mix 25μL、5μM TaqMan probe (cccP2) 2.5μL (終濃度250nM)、20μM フォワード側プライマー (cccF2) 0.75μL (終濃度300nM)、20μMリバース側プライマー (cccR4) 0.75μL (終濃度300nM)、sample DNA 0.50μｇ  滅菌水  全体の液量を50μLとした。50℃ 2分、95℃ 10分インキュベートした。95℃ 15秒、60℃ 90秒のサイクルを40サイクル繰り返した。同様に上記cccF3（配列番号５）、上記cccR4（配列番号３）、上記cccP3（配列：5'-FAMctccccgtctgtgc-MGB-3'）、TaqMan Universal Master Mix  品番 4304437（アプライドバイオシステムズジャパン（株）) を用い定量を行った。TOPO XLクローニングキット  (インビトロジェン社)を用いて、HBV genotype Cの遺伝子増幅産物  (3.2kb)  を、PCR-XL-TOPOベクター(3.5kb)に、キット取扱説明書に従ってクローニングした(全長6.7kb)。このクローンより、キアゲンプラスミド抽出キット(（株）キアゲン)  を用いてプラスミドを抽出し、OD260nmの値からコピー数を計算して、標準曲線の作成に使用した。 検出結果は、25コピー/測定まで検出可能であった。
【実施例２】
【００２４】
cccF2、cccR4、cccP2を用いて、実施例１と同様に、臨床材料（Ｂ型肝炎患者の生体肝組織）３検体を用いて、同時に3回測定を行った。下記表１に示すように、CV（変動係数）8.5 - 8.8% と、良好な値であった。また、測定日を変えて3回測定を行った。下記表２に示すようにCV  5.3 - 25.8% と、良好な値であった。
【００２５】
【表１】
2006217864.tif 000002
【００２６】
【表２】
2006217864.tif 000003
コピー/μg
【００２７】
比較例１
特許文献１に記載のフォワード側プライマー（配列番号１の1674nt〜1691nt）及びリバース側プライマー（配列番号１の1796nt〜1776ntの相補鎖）を用いたことを除き、実施例１と同様に測定を行った。その結果、増幅が起きず、測定ができなかった。
【００２８】
比較例２
非特許文献３に記載のフォワード側プライマー（配列番号１の1553nt〜1572nt）及びリバース側プライマー（配列番号１の1830nt〜1851ntの相補鎖及び配列番号１の2040nt〜2061ntの相補鎖）を用いたことを除き、実施例１と同様に測定を行った。その結果、増幅が起きず、測定ができなかった。
【配列表】
2006217864000001.app