(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応を行うとき、パーフェクトマッチプローブ（ＰＭ）のハイブリダイゼーション強度を同等以上に維持させつつ、ＰＭ／ミスマッチプローブ（ＭＭ）の比率を向上させ得る遺伝子のハイブリダイゼーション方法を提供する。【解決手段】ハイブリダイゼーション反応溶液が下記化学式（１）2006212031.tif 000008  式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的に直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ５アルキルであり、Ｘ−は、有機酸の陰イオンである：の化合物を含有し、遺伝子マイクロアレイ上に前記ハイブリダイゼーション反応溶液を加えることを含む遺伝子のハイブリダイゼーション方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリダイゼーション反応溶液が下記化学式（１）：
【化１】
2006212031.tif 000006
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的に直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ５アルキルであり、Ｘ−は、有機酸の陰イオンである：
の化合物を含有し、遺伝子マイクロアレイ上に前記ハイブリダイゼーション反応溶液を加えることを含む遺伝子のハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的にエチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有機酸の陰イオンは、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩または酒石酸塩の陰イオンであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学式（１）の化合物は、トリエチルアンモニウム酢酸塩またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウム酢酸塩であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
下記化学式（１）：
【化２】
2006212031.tif 000007
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的に直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ５アルキルであり、Ｘ−は、有機酸の陰イオンである：
の化合物を含む、遺伝子マイクロアレイ上に加えるＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリダイゼーション反応溶液に添加するための添加剤。
【請求項６】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的にエチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルであることを特徴とする請求項５に記載の添加剤。
【請求項７】
前記有機酸の陰イオンは、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩または酒石酸塩の陰イオンであることを特徴とする請求項５または６に記載の添加剤。
【請求項８】
化学式（１）の化合物は、トリエチルアンモニウム酢酸塩またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウム酢酸塩であることを特徴とする請求項５〜７いずれか１項に記載の添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子マイクロアレイ上に遺伝子のハイブリダイゼーション反応溶液を加えることを含む遺伝子のハイブリダイゼーション方法に係り、さらに具体的には、パーフェクトマッチプローブ（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ  ｐｒｏｂｅ：ＰＭ）のハイブリダイゼーション強度を上昇または維持しつつ、ミスマッチプローブ（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｒｏｂｅ：ＭＭ）のハイブリダイゼーション強度に対するＰＭのハイブリダイゼーション強度の比率（ＰＭ／ＭＭ）を向上させることによって、ＰＭのハイブリダイゼーション特異性を向上させるための遺伝子のハイブリダイゼーション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子マイクロアレイは、サンプル中の遺伝子を分析するためのバイオチップである。基板上に固定された遺伝子プローブと、前記遺伝子プローブと相補的な配列を有するサンプル中の遺伝子をハイブリダイゼーション反応させることによって、サンプル中の遺伝子を分析することができる。このような遺伝子マイクロアレイを利用して、サンプル中の遺伝子を分析するために行う遺伝子のハイブリダイゼーション過程において、遺伝子の分析を正確に行うためには、遺伝子マイクロアレイ上の遺伝子プローブの塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有するターゲットサンプルのみが、遺伝子マイクロアレイ上の遺伝子プローブとハイブリダイゼーションされねばならない。しかし、実際のハイブリダイゼーション過程中には、遺伝子マイクロアレイ上の遺伝子プローブの塩基配列とほとんど相補的であるが１個以上の塩基が非相補的な塩基配列を有するサンプルも、遺伝子マイクロアレイ上の遺伝子プローブとハイブリダイゼーション反応が行われて相補的に結合する（この場合、プローブはＭＭとなる）。このような遺伝子チップ上のプローブと、これにミスマッチされる塩基配列を有するサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、サンプル中の遺伝子を正確に分析する際に誤差を発生させる原因となる。したがって、遺伝子マイクロアレイ上でサンプルを反応させるとき、サンプルを正確に分析するためには、ＭＭのハイブリダイゼーション結合強度を相対的に低め、ＰＭのハイブリダイゼーション結合強度を相対的に高めることによって、ＭＭハイブリダイゼーション強度に対するＰＭハイブリダイゼーション強度の比率（ＰＭ／ＭＭ）を向上させることが必要である。
【０００３】
従来、遺伝子のハイブリダイゼーション反応において、ＰＭ／ＭＭを向上させるための方法が検討されてきた。このような方法は、主に遺伝子のハイブリダイゼーション反応に対して厳しい条件を付加する方向で行われてきた。例えば、サンプルであるハイブリダイゼーション反応液でのＮａＣｌの濃度を低める方法、ハイブリダイゼーション反応の温度を上昇させる方法、ハイブリダイゼーション反応液に変性剤を添加する方法などがある。このような厳しい条件は、ＰＭのハイブリダイゼーション強度を低める程度より、ＭＭのハイブリダイゼーション強度を低める程度が相対的に大きいので、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させ得る（特許文献１）。
【０００４】
しかし、前記厳しい条件を利用する方法は、何れもＰＭ／ＭＭの比率を向上させることはできるが、ＰＭ自体の絶対的なハイブリダイゼーション強度は低下して、ＰＭのハイブリダイゼーションを測定するための測定感度が低下するという問題点がある。
【０００５】
特に、前記ハイブリダイゼーション反応の温度を上昇させる方法は、温度の上昇によって遺伝子マイクロアレイで基板上に固定された遺伝子が基板から離脱する恐れがあって、問題となる（特許文献１）。
【０００６】
また、前記方法のうち変性剤を添加する方法において、変性剤としては、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、グリセロール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＧｕＳＣＮ、またはヨウ素など主に有機変性剤が使用されうるが、このような有機変性剤は、ハイブリダイゼーション溶液内で使用するとき、溶解度が低いため塩析が起こり、高濃度で使用し難いという問題点がある。また、有機変性剤には毒性があって、ユーザーが取り扱い難いという問題点がある。
【０００７】
一方、一般的に、遺伝子のハイブリダイゼーション反応においては、ハイブリダイゼーションされた遺伝子の安定化のために、ＮａＣｌをハイブリダイゼーション反応溶液内に添加剤として使用する。ＮａＣｌのナトリウム陽イオンは、遺伝子のリン酸塩中の酸素陰イオンと静電気的な引力によりイオン結合して、核酸のリン酸塩陰イオン間の反撥力による遺伝子ハイブリダイゼーションの不安定化を低下させて、遺伝子のハイブリダイゼーション結合を安定化させる役割を行う。このようなナトリウム陽イオンが、遺伝子のハイブリダイゼーション結合において、リン酸塩中の陰イオンと静電気的相互作用により結合される様相を図１に示した。このような遺伝子のハイブリダイゼーション結合を安定化させる役割を行うＮａＣｌの塩の濃度を低めることは、前記のように、遺伝子のハイブリダイゼーションに対する厳しい条件に該当し、このようなＮａＣｌ濃度の低下は、たとえＰＭ／ＭＭの比率を向上させることはできるとしても、ＰＭ自体のハイブリダイゼーションの強度が低下するという問題点がある。
【０００８】
さらに一方では、遺伝子マイクロアレイ上で遺伝子のハイブリダイゼーション反応に使用される添加剤として、ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いたものがある（非特許文献１）。また、特許文献１は、４級アンモニウム塩であるベタインを、マイクロアレイ上で遺伝子のハイブリダイゼーション反応に使用される添加剤として開示している。しかし、ここで提起されたＴＭＡＣまたはベタインは、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させるためのものではなく、核酸プローブの塩基配列のうちアデニンとチミンとの水素結合と、シトシンとグアニンとの水素結合の強度を同程度にすることによって、ハイブリダイゼーション強度の差を核酸プローブの塩基配列の種類に依存せずに、単に塩基配列の長さにのみ依存させるためのものであった。
【０００９】
したがって、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させつつも、ＰＭのハイブリダイゼーション強度を、上昇または維持させうる新たなハイブリダイゼーション方法が必要である。
【特許文献１】米国特許第６，６３２，６０５号明細書
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５８２：１５８５〜１５８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、遺伝子マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応を行うとき、ＰＭのハイブリダイゼーション強度を同等以上に維持させつつ、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させ得る遺伝子のハイブリダイゼーション方法を提供することである。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、ＰＭのハイブリダイゼーション強度を同等以上に維持させつつ、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させ得る、遺伝子マイクロアレイ上に加えるサンプルであるハイブリダイゼーション反応溶液に添加するための添加剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、ハイブリダイゼーション反応溶液が下記化学式（１）の化合物を添加剤として含有し、遺伝子マイクロアレイ上に前記ハイブリダイゼーション反応溶液を加えることを含む遺伝子のハイブリダイゼーション方法、を提供する：
【００１３】
【化１】
2006212031.tif 000002
【００１４】
前記化学式（１）で、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的に直鎖型または分枝鎖型のＣ１−Ｃ５アルキルであり、Ｘ−は、有機酸の陰イオンである。
【００１５】
前記化学式（１）で、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的にエチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルであるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００１６】
前記化学式（１）で、好ましくはＸ−は、具体的にギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、または酒石酸塩の陰イオンであるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００１７】
化学式（１）の化合物は、好ましくは、トリエチルアンモニウム酢酸塩またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウム酢酸塩である。
【００１８】
本発明は、また、前記他の目的を達成するために、下記化学式（１）の化合物を含む、遺伝子マイクロアレイ上に加える遺伝子のハイブリダイゼーション反応溶液に添加するための添加剤を提供する：
【００１９】
【化２】
2006212031.tif 000003
【００２０】
前記化学式（１）で、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的に直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ５アルキルであり、Ｘ−は、有機酸の陰イオンである。
【００２１】
前記添加剤として使用される化学式（１）の化合物で、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、好ましくはそれぞれ独立的にエチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルでありうる。
【００２２】
また、前記化学式（１）で有機酸の陰イオンは、好ましくはギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩または酒石酸塩でありうる。
【００２３】
前記化学式（１）の化合物として、好ましくは、トリエチルアンモニウム酢酸塩またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウム酢酸塩が使用され得る。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、遺伝子マイクロアレイ上にハイブリダイゼーション反応溶液を加えてハイブリダイゼーション反応を行うとき、添加剤として化学式（１）の化合物を使用することによって、ＰＭのハイブリダイゼーション強度を同等以上に高めつつ、ＭＭのハイブリダイゼーションに対するＰＭのハイブリダイゼーション特異性を向上させうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、添付された図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２６】
本発明は、遺伝子マイクロアレイ上にサンプルであるハイブリダイゼーション反応液を加えてハイブリダイゼーション反応させる過程で、ＰＭのハイブリダイゼーション強度は同等以上に維持しつつ、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させるための方法として、下記化学式（１）の化合物をサンプルであるハイブリダイゼーション反応液に加える方法を利用する：
【００２７】
【化３】
2006212031.tif 000004
【００２８】
前記化学式（１）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的に直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ５アルキルであり、Ｘ−は有機酸の陰イオンである。ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立的にＣ１−Ｃ５アルキル基である。アルキル基の炭素数が５個を超えれば、化学式（１）の化合物が固体となる可能性が高まり、本発明のハイブリダイゼーション方法に適用されるには適していない。
【００２９】
また、前記アルキル基としては、炭素数２個〜３個のアルキルが好ましく、具体的には、エチル、ｎ−プロピル、またはイソプロピルが使用され得る。
【００３０】
また、Ｘ−は、有機酸の陰イオンであって、具体的に、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、または酒石酸塩の陰イオンであるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００３１】
好ましくは、前記化学式（１）の化合物は、トリエチルアンモニウム酢酸塩またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウム酢酸塩である。
【００３２】
このような化学式（１）の化合物は、トリアルキルアンモニウムの陽イオン部分と有機酸の陰イオン部分とに区分され得る。化学式（１）の化合物を、サンプルのハイブリダイゼーション反応液に添加すれば、その反応液内でトリアルキルアンモニウム陽イオンが生成される。このようなトリアルキルアンモニウム陽イオンは、ハイブリダイゼーション反応液に通常添加される塩化ナトリウムのナトリウム陽イオンのように、ハイブリダイゼーションされた遺伝子のリン酸塩陰イオンと静電気的相互作用によりイオン結合する。化学式（１）の化合物由来のトリアルキルアンモニウムイオンがハイブリダイゼーションされたｄｓ−ＤＮＡのリン酸塩の酸素陰イオンに静電気的にイオン結合する様相を図２に示した。また、図３には、前記化学式（１）の化合物の代表的な化合物に該当するトリエチルアンモニウム酢酸塩がハイブリダイゼーションされたｄｓ−ＤＮＡのリン酸塩陰イオンに静電気的にイオン結合する様相を部分的に示した。
【００３３】
このような静電気的相互作用によるイオン結合は、遺伝子のハイブリダイゼーションを妨げるリン酸塩間の斥力を低下させる役割を果たす。このようなリン酸塩によるハイブリダイゼーション結合に対する斥力の低下は、遺伝子のハイブリダイゼーション強度を高める役割を行う。
【００３４】
しかし、前記化学式（１）の化合物が、ＮａＣｌのように単に遺伝子のリン酸塩に対するカウンターイオンの役割のみを行えば、パーフェクトマッチのハイブリダイゼーション強度を高めるだけでなく、ミスマッチのハイブリダイゼーション強度も同時に高める役割を行って、パーフェクトマッチのハイブリダイゼーション強度を高めることはできても、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させることはできないであろう。したがって、前記化学式（１）の化合物は、遺伝子のリン酸塩に対するカウンターイオンとしての役割を果たすだけでなく、遺伝子のハイブリダイゼーションに対する厳しい条件としても作用することができるよう、構造的にＮａＣｌに比べて陽イオンのサイズが十分に大きくなるようにデザインした。
【００３５】
すなわち、本発明の化学式（１）の化合物は、ハイブリダイゼーション反応液内で構造的にサイズの大きいトリアルキルアンモニウム陽イオンを生成させる。このような大きい構造の陽イオンは、リン酸塩と静電気的に結合されてリン酸塩によるハイブリダイゼーションの反撥力を低下させる役割を果たすこともあるが、それと同時にハイブリダイゼーションされたｄｓ−ＤＮＡのリン酸塩と結合したトリアルキルアンモニウム陽イオン間に静電気的な反撥力が生じるため、遺伝子のハイブリダイゼーションにおいて厳しい条件としても作用する。このような厳しい条件は、遺伝子マイクロアレイでのＰＭのハイブリダイゼーション強度よりＭＭのハイブリダイゼーション強度を相対的にさらに低めることによってＰＭ／ＭＭの比率を向上させ得る。また、前述したように、本発明の化学式（１）の化合物は、厳しい条件として作用する以外にも、リン酸塩によるハイブリダイゼーション結合を安定化させる役割を行って、ＰＭのハイブリダイゼーション強度を高める役割を同時に行う。化学式（１）の化合物のこのような二重的な効果は、結果的にＰＭのハイブリダイゼーション強度を同等以上に維持しつつ、ＰＭ／ＭＭの比率を向上させ得る結果をもたらす。
【００３６】
このような化学式（１）の化合物を、遺伝子マイクロアレイに対するハイブリダイゼーション反応液に添加剤として使用する場合、そのハイブリダイゼーション反応液での化学式（１）の化合物の濃度は、使用される化学式（１）の化合物によって変わり、また、ハイブリダイゼーションされる遺伝子の塩基配列によって変わりうる。したがって、ハイブリダイゼーション反応液に使用される化学式（１）の化合物の適切な濃度は、実際に遺伝子マイクロアレイを利用してサンプルに対する遺伝子の分析を行う前に、実験条件の最適化過程により化学式（１）の化合物の適切な濃度を見出した後に行える。例えば、化学式（１）の化合物としてトリエチルアンモニウム酢酸を用いた場合、ハイブリダイゼーション反応液中、０．２５Ｍ〜２．０Ｍであることが好ましく、より好ましくは０．２５Ｍ〜１．０Ｍであり、さらに好ましくは０．５Ｍ〜０．７５Ｍである。更に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウム酢酸を用いた場合、ハイブリダイゼーション反応液中、０．２５Ｍ〜２．０Ｍであることが好ましく、より好ましくは０．２５Ｍ〜１．０Ｍであり、より好ましくは０．５Ｍ〜０．７５Ｍである。
【００３７】
一方、本発明が提供する遺伝子マイクロアレイ上に加える遺伝子のハイブリダイゼーション反応液に付加するための添加剤は、前記定義されたような化学式（１）の化合物を含む。このような添加剤は、前記化学式（１）の化合物のみを含んでも良いが、遺伝子マイクロアレイ上に加えるハイブリダイゼーション反応液に通常的に添加される物質をさらに含んでも良い。このような化学式（１）の化合物を含む添加剤は、前記ハイブリダイゼーション方法で説明したような原理により遺伝子マイクロアレイにハイブリダイゼーション反応液を適用するとき、遺伝子チップ中のＰＭに対するサンプル中の遺伝子のハイブリダイゼーション強度を同等以上に維持しつつ、同時にＰＭ／ＭＭの比率を向上させることによって、サンプル中の遺伝子分析をさらに正確に行うのに使用され得る。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
遺伝子マイクロアレイ上でのＰＭおよびＭＭに対するサンプルのハイブリダイゼーション反応の特異性試験
（１）マイクロアレイの製作
アミンウェーハに配列番号１の核酸および配列番号２の核酸（１００μｍｏｌ／Ｌ、１０μｌ）をそれぞれポリエチレングリコール（９ｍｍｏｌ／Ｌ、１０μｌ）、ホルムアミド（１０μｌ）および緩衝溶液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ１０．０、カーボネート１０μｌ）を含む溶液と混合したものを、それぞれ３×３のスポットをし、それぞれを左右に配置した。それをそれぞれ２回繰り返してスポッティングすることによって、図４のように配置した。このようにスポッティングした基板を一定の温度（７０℃）および湿度（４０％）下で１時間固定させた後、スポット以外の他の領域のアミンは、無水コハク酸を利用して反応性を無くした後、洗浄過程および乾燥過程を経てマイクロアレイを製作した。
【００４０】
（２）ハイブリダイゼーション反応液の製造
Ａ．Ｃｙ３が表示されたハイブリダイゼーションターゲット核酸（ターゲットＤＮＡ）の製造
配列番号３の核酸（ターゲットＤＮＡ）および活性化されたＣｙ３を、ｐＨ１２の溶液で常温で１２時間反応させた。高性能の液体クロマトグラフを利用して、Ｃｙ３がラベルされた配列番号３の核酸を分離した。その分離されたものは、濃度補正を行い、ＵＶ−ｖｉｓ測定装置で濃度補正および純度を確認して製造した。
【００４１】
Ｂ．ハイブリダイゼーション反応用の緩衝溶液の製造（４×ＳＳＰＥＴ）
リン酸水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム、エチレンジアミンテトラアセト酸（ＥＤＴＡ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、トリトンＸ−１００を使用して所望の組成の緩衝溶液である４×ＳＳＰＥＴ、ｐＨ７．４の溶液を製造した。
【００４２】
Ｃ．添加剤の製造
ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウム酢酸：ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）溶液の製造
トリエチルアミンを水に４Ｍの濃度で溶かした後、酢酸を添加してｐＨ７．３にした。その溶液を１／４、１／２、３／４に水で希釈して、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍの溶液を製造した。
【００４３】
ＤＩＥＡＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンアンモニウム酢酸：Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）溶液の製造
ＤＩＥＡＡを水に３Ｍの濃度で溶かした後、酢酸を添加してｐＨ７．３にした。その溶液を１／３、２／３に水で希釈して、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍの溶液を製造した。
【００４４】
ＴＭＡＣ（塩化テトラメチルアンモニウムクロリド：ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液の製造
Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製の塩化テトラメチルアンモニウムを水に３Ｍの濃度で溶かして製造した。その溶液を１／３、２／３に水で希釈して、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍの溶液を製造した。
【００４５】
Ｄ．マイクロアレイに対するハイブリダイゼーション反応液の製造
Ｃｙ３がラベルされたハイブリダイゼーションターゲット核酸を４ｎＭ  １５μｌ（最終ハイブリダイゼーションの反応時に濃度を１ｎＭにするためである）、３次蒸溜水  １５μｌ、ハイブリダイゼーション反応用の緩衝溶液（４×ＳＳＰＥＴ）  １５μｌ（最終ハイブリダイゼーションの反応時に濃度を１×ＳＳＰＥＴにするためである）、および下記表１に表した添加剤  １５μｌを混合して、それぞれハイブリダイゼーション反応溶液  ６０μｌを製造した。
【００４６】
【表１】
2006212031.tif 000005
【００４７】
（３）ハイブリダイゼーション反応後の洗浄用緩衝液の製造（３×ＳＳＰＥＴ，１×ＳＳＰＥＴ）
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮａＯＨおよびトリトンＸ−１００を使用して、所望の３×、１×濃度の洗浄用緩衝溶液であるそれぞれ３×ＳＳＰＥＴ、１×ＳＳＰＥＴ  ｐＨ７．４の溶液を製造した。
【００４８】
（４）遺伝子マイクロアレイに対するハイブリダイゼーションの反応
Ａ．ハイブリダイゼーション反応の過程
図５に示すように、前記製作されたマイクロアレイに適切なパッチを付着した。あらかじめ製造したハイブリダイゼーション反応溶液６０μＬを一側の孔に投入させ、発生した気泡を除去した後、ハイブリダイゼーション反応容器に入れて４２℃で１時間反応させた。
【００４９】
Ｂ．ハイブリダイゼーション反応後の洗浄および乾燥
ハイブリダイゼーション反応が完了した遺伝子マイクロアレイを洗浄用の３×ＳＳＰＥＴ、１×ＳＳＰＥＴ緩衝溶液でそれぞれ５分間洗浄した。そのマイクロアレイを遠心分離機を利用して乾燥した（３００ｒｐｍ、５秒）。
【００５０】
（５）遺伝子マイクロアレイに対するハイブリダイゼーション反応の結果
前記ハイブリダイゼーション反応が完了したマイクロアレイをＡｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを利用して波長５３２ｎｍ、ＰＭＴ  ５００でスキャンした。それぞれの添加剤に該当するスキャン結果を、図６Ａ〜図６Ｅに示した。
【００５１】
図６Ａには、対照群のスキャン結果およびＴＥＡＡを０．７５Ｍで処理した場合のスキャン結果を示した。対照群およびＴＥＡＡ  ０．７５Ｍは、それぞれ２回実験してそれぞれ２個のスキャン結果が示された。図６Ａには、スキャン結果をＡｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒの運用プログラムを利用して分析した結果として示されたＰＭおよびＭＭのそれぞれのハイブリダイゼーション強度をそれぞれのスポット下に記録し、それを基にそれぞれのＰＭ／ＭＭの比率を計算した数値をボックス内に示した。
【００５２】
図６Ｂには、ＴＥＡＡを０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍで処理した場合の結果を示した。図６Ｃには、さらに他の化学式（１）の化合物に該当するＤＩＥＡＡを０．５Ｍ、０．７５Ｍで処理した場合の結果を示した。図６Ｄには、従来の添加剤として使用されたＴＭＡＣをそれぞれ０．５Ｍおよび０．７５Ｍで使用した場合の結果を示した。図６Ｅには、ＮａＣｌを１．０Ｍで追加した場合、ホルムアミドをそれぞれ５％および２５％の濃度で使用した場合の結果を示した。
【００５３】
このような図６Ａ〜図６Ｅのそれぞれの添加剤を多様な濃度で使用した場合のスキャンした結果を、Ａｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒの運用プログラムを利用してそれぞれのハイブリダイゼーション強度を分析した。その後、それぞれの添加剤を利用した場合に対するＰＭのハイブリダイゼーション強度、ＭＭのハイブリダイゼーション強度およびＰＭ／ＭＭの比率を図７にグラフおよび表として総合的に示した。
【００５４】
（６）結果
図７に示すグラフおよび表から分かるように、本発明の化合物であるＴＥＡＡを０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、ＤＩＥＡＡを０．５Ｍ、０．７５Ｍで使用した場合に、ＰＭのハイブリダイゼーション強度が対照群より高まり、ＰＭ／ＭＭの比率が対照群より向上して、ＰＭのハイブリダイゼーション特異性のために添加剤として使用されうると示され、そのうち、特に、ＴＥＡＡを０．７５Ｍで使用した場合とＤＩＥＡＡを０．７５Ｍで使用した場合とに、ＰＭのハイブリダイゼーション強度およびＰＭ／ＭＭの比率が対照群に比べて著しく向上して、添加剤として使用するのにさらに好ましいことが判明した。
【００５５】
一方、従来にハイブリダイゼーション反応の添加剤として使用されていたＴＭＡＣは、ＰＭのハイブリダイゼーション強度は著しく高まったが、ＰＭ／ＭＭの比率は、化学式（１）の化合物のＰＭ／ＭＭに比べて著しく低下した。従来に厳しい条件として使用されていたホルムアミドの場合には、ＰＭ／ＭＭの比率は、対照群に比べて著しく向上したが、ＰＭのハイブリダイゼーション強度が非常に低かった。ＮａＣｌをさらに付加した場合には、ＰＭ／ＭＭの比率が対照群と同様であった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、遺伝子分析に関連した技術分野に好適に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ナトリウム陽イオンがハイブリダイゼーションされたｄｓ−ＤＮＡのリン酸塩陰イオンと静電気的相互作用により結合される様相を示す図面である。
【図２】化学式（１）の化合物由来のトリアルキルアンモニウムイオンがハイブリダイゼーションされたｄｓ−ＤＮＡのリン酸塩陰イオンに静電気的相互作用により結合される様相を示す図面である。
【図３】化学式（１）の化合物に該当するトリエチルアンモニウム酢酸塩がハイブリダイゼーションされたｄｓ−ＤＮＡのリン酸塩陰イオンに静電気的相互作用により結合される様相を局所的に示す図面である。
【図４】実施例（１）で遺伝子マイクロアレイの製作時の、遺伝子のスポッティング配列を示す図面である。
【図５】遺伝子マイクロアレイ上でハイブリダイゼーション反応溶液を加えてハイブリダイゼーション反応を行うために、マイクロアレイ上に適切なパッチを付着させた形態と、そのパッチを通じてハイブリダイゼーション反応溶液を加える様相とを示す図面である。
【図６Ａ】添加剤を付加したハイブリダイゼーション反応溶液を利用して、ハイブリダイゼーション反応が完了したマイクロアレイをＡｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを利用してスキャンした結果を示すものであって、対照群のスキャン結果およびＴＥＡＡを０．７５Ｍで処理した場合のスキャン結果を示す図面である。
【図６Ｂ】添加剤を付加したハイブリダイゼーション反応溶液を利用して、ハイブリダイゼーション反応が完了したマイクロアレイをＡｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを利用してスキャンした結果を示すものであって、ＴＥＡＡを０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍで処理した場合の結果を示す図面である、
【図６Ｃ】添加剤を付加したハイブリダイゼーション反応溶液を利用して、ハイブリダイゼーション反応が完了したマイクロアレイをＡｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを利用してスキャンした結果を示すものであって、ＤＩＥＡＡを０．５Ｍ、０．７５Ｍで処理した場合の結果を示す図面である、
【図６Ｄ】添加剤を付加したハイブリダイゼーション反応溶液を利用して、ハイブリダイゼーション反応が完了したマイクロアレイをＡｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを利用してスキャンした結果を示すものであって、ＴＭＡＣを０．５Ｍ、０．７５Ｍで処理した場合の結果を示す図面である、
【図６Ｅ】添加剤を付加したハイブリダイゼーション反応溶液を利用して、ハイブリダイゼーション反応が完了したマイクロアレイをＡｘｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを利用してスキャンした結果を示すものであって、ＮａＣｌを１．０Ｍで追加した場合、ホルムアミドをそれぞれ５％および２５％の濃度で使用した場合の結果を示す図面である。
【図７】図６Ａ〜図６Ｅのそれぞれの結果からＰＭのハイブリダイゼーション強度、ＭＭのハイブリダイゼーション強度およびＰＭ／ＭＭの比率をグラフおよび表として総合的に示す図面である。
【符号の説明】
【００５８】
ＰＭ    ハイブリダイゼーション反応溶液中の核酸とＰＭとのハイブリダイゼーション強度、
ＭＭ    ハイブリダイゼーション反応溶液中の核酸とＭＭとのハイブリダイゼーション強度、
ＮＭ    ハイブリダイゼーション反応溶液中の核酸とＰＭ以外のプローブのうち最もハイブリダイゼーション強度の強いプローブとのハイブリダイゼーション強度。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【配列表】
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