(57)【要約】【課題】  アルデヒド化合物の質量分析の感度を高めることが可能なアルデヒド化合物の標識用化合物、及び微量アルデヒド化合物、特に微量の糖鎖の検出・定量が可能となるアルデヒド化合物の分析方法を提供する。【解決手段】  下記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類からなるアルデヒド化合物の標識用化合物。2006036693.tif 000011（式中、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に置換されていても良い炭化水素基を表し、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3の少なくとも２ヶが結合して含窒素複素環を形成していても良い。Ｘ―は対アニオンを表す。ベンゼン環の２−，４−，５−，及び６−位はそれぞれ独立に置換基で置換されていても良い。）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類からなるアルデヒド化合物の標識用化合物。
【化１】
2006036693.tif 000008
（式中、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に置換されていても良い炭化水素基を表し、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3の少なくとも２ヶが結合して含窒素複素環を形成していても良い。Ｘ−は対アニオンを表す。ベンゼン環の２−，４−，５−，及び６−位はそれぞれ独立に置換基で置換されていても良い。）
【請求項２】
一般式（Ｉ）におけるＲ1 、Ｒ2及びＲ3が、それぞれ独立にアルキル基であることを特徴とする請求項１に記載の標識用化合物。
【請求項３】
アルデヒド化合物に、下記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類を還元アミノ化反応にて付加し、得られた反応物を質量分析法にて分析することを特徴とするアルデヒド化合物の分析方法。
【化２】
2006036693.tif 000009
（式中、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に置換されていても良い炭化水素基を表し、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3の少なくとも２ヶが結合して含窒素複素環を形成していても良い。Ｘ―は対アニオンを表す。ベンゼン環の２−，４−，５−，及び６−位はそれぞれ独立に置換基で置換されていても良い。）
【請求項４】
一般式（Ｉ）におけるＲ1 、Ｒ2及びＲ3が、それぞれ独立にアルキル基であることを特徴とする請求項３に記載のアルデヒド化合物の分析方法。
【請求項５】
前記アルデヒド化合物が、糖類であることを特徴とする請求項３又は４に記載の分析方法。
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類が糖類の還元末端に付加してなることを特徴とする３−アミノベンジルアンモニウム塩の標識化糖類。
【化３】
2006036693.tif 000010
（式中、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に置換されていても良い炭化水素基を表し、Ｒ
1 、Ｒ2及びＲ3の少なくとも２ヶが結合して含窒素複素環を形成していても良い。Ｘ―は対アニオンを表す。ベンゼン環の２−，４−，５−，及び６−位はそれぞれ独立に置換基で置換されていても良い。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルデヒド化合物の標識用化合物、それを用いたアルデヒド化合物の分析方法及び標識化糖に関する。より具体的には、診断分野における生体内アルデヒド化合物、特に糖類を高感度に検出するのに適したアルデヒド化合物の標識用化合物、それを用いたアルデヒド化合物の分析方法、及び標識化糖に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質の糖鎖（アルデヒド化合物）は、診断分野、特に癌診断において重要なマーカーとして利用されており、すでにシアリル−ルイスエックス（ＳＬＸ）、シアリルＴｎ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０といった腫瘍マーカーが臨床の場で応用されている。しかしながらこれら腫瘍マーカーは正常人にも微量、また時には高濃度で存在することがあり、これら検査薬のみで癌を判定することは難しかった。
【０００３】
近年、この問題を解決するために、一部の糖鎖官能基のみを認識する抗体検出法ではなく、糖鎖そのものを分離・検出する分析化学的手法による試みが広がっている。
糖タンパク質の糖鎖の分析方法としては、糖鎖を糖タンパク質から切り出した後に蛍光化合物で標識し、それを順相液体クロマトグラフィーおよび逆相液体クロマトグラフィーで分離し、蛍光検出器で検出する分析方法が一般的である（非特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、順相液体クロマトグラフィーおよび逆相液体クロマトグラフィーを組み合わせた方法は、複数の糖鎖を完全に分離することが難しく、定量性に問題があった。
近年、質量分析装置の発達に伴い、生体高分子、特に蛋白質の解析において質量分析法の有効性が認められている。質量分析装置はわずかな質量数の差で複数の分子群を分離することができ、特に生体高分子のような複数の混合物を分離する上で優れた分析法である。しかしながら糖鎖においてはイオン化に難点があり、蛋白質のように高い感度が得られなかった。
【０００５】
かかる状況において、糖鎖の質量分析感度向上を目的にいくつかの糖鎖誘導体試薬としての標識用化合物が開発され、質量分析への応用が進んでいる。最も広く用いられている標識用化合物としては２−アミノピリジンが知られており、その他に２−アミノベンズアミド、４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）、４−アミノ安息香酸ｎ−ブチルエステル（ＡＢＢＥ）、トリメチルアミノフェニルアンモニウム（ＴＭＡＰＡ）などが知られている（非特許文献２）。特にＴＭＡＰＡはエレクトロスプレーイオン化法において、未標識糖鎖または他の標識用化合物に対し、大幅に感度を向上させることが知られている（非特許文献３）。
【０００６】
しかしながら生体内糖鎖は非常に微量であり、最も感度上昇効果の高いＴＭＡＰＡを使用しても検出できない糖鎖は依然多い。またＴＭＡＰＡは非常に高価であり、また合成が非常に困難であるため、本試薬をそのまま診断等へ応用するには適していなかった。
【非特許文献１】Ｈａｓｅ  Ｓ．，  Ｉｋｅｎａｋａ  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  Ｙ．；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９０，４０７−４１４（１９８１）
【非特許文献２】Ｈａｒｖｅｙ  Ｄ．Ｊ．  ；Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１１，９００−９１５（２０００）
【非特許文献３】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｍ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ．，  Ｄｏｉ  Ｔ．  ；Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，９，６４１−６４３（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたもので、糖タンパク質に由来する糖鎖などのアルデヒド化合物を高感度で分析可能とする標識用化合物を提供し、さらにはそれを用いて感度よく糖鎖等のアルデヒド化合物を検出する分析方法を提供することを目的とする。
更に、アルデヒド化合物の一種である糖の質量分析の標準物質として有用な、上記標識用化合物を用いて標識化された糖を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく検討した結果、特定構造を有す４級アンモニウム塩類をアルデヒド化合物分析のための標識用化合物とすることにより、糖鎖等のアルデヒド化合物の分析感度を著しく高めことを見出し、本発明に到達した。更に、上記標識用化合物を用いて標識化された糖が、糖類の質量分析の標準物質として有用であることを見出し本発明に到達した。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、下記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類からなるアルデヒド化合物の標識用化合物に存する。        
【００１０】
【化４】
2006036693.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に置換されていても良い炭化水素基を表し、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3の少なくとも２ヶが結合して含窒素複素環を形成していても良い。Ｘ―は対アニオンを表す。ベンゼン環の２−，４−，５−，及び６−位はそれぞれ独立に置換基で置換されていても良い。）
他の要旨は、アルデヒド化合物に、前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類を還元アミノ化反応にて付加し、得られた反応物を質量分析法にて分析することを特徴とするアルデヒド化合物の分析方法、に存する。
更に他の要旨は、前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類が糖類の還元末端に付加してなることを特徴とする標識化糖類、に存する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の３−アミノベンジルアンモニウム塩類はアルデヒド化合物の標識用化合物として有効であり、これを還元アミノ化法でアルデヒド化合物に結合させることにより、アルデヒド化合物の質量分析の感度を高めることが可能であり、その結果、微量アルデヒド化合物、特に微量の糖鎖の検出・定量が可能となる。
又、本発明の標識化糖は、未知の糖鎖等の糖類の同定又は定量分析を容易にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜標識用化合物＞
本発明において、アルデヒド化合物の標識用化合物とは、アルデヒド化合物と反応させることにより、微量のアルデヒド化合物の質量分析装置による検出を容易にする用途に用いられるアルデヒドと反応性を有する化合物である。
本発明のアルデヒド化合物の標識用化合物は、下記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類からなる。
【００１４】
【化５】
2006036693.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立に置換されていても良い炭化水素基を表すが、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3の少なくとも２ヶが結合して含窒素複素環を形成していても良い。Ｘ―は対アニオンを表す。ベンゼン環の２−，４−，５−，及び６−位はそれぞれ独立に置換基で置換されていても良い。）
Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3で示される炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基等の炭素数１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロへプチル基等の炭素数５〜７のシクロアルキル基、フェニル基等の炭素数６〜１２のアリール等が挙げられる。
【００１６】
又、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3の少なくとも２ヶが結合して含窒素複素環を形成していても良く、かかる含窒素複素環としては、ピリジル基、ピペリジル基、ピラジン基、ピリミジン基、ピリダジン基、トリアジン基等の芳香族複素環基、が挙げられる。
本発明の標識用化合物で標識化されたアルデヒド類は質量分析において、イオン化されて検出されるため、上記一般式（Ｉ）で表される標識用化合物は、４級アンモニウム構造部分を有するものである。
【００１７】
上記の中でも、Ｒ1 、Ｒ2及びＲ3は、アルキル基が好ましく、特にメチル基及びエチル基が好ましく、標識用化合物の安定性の点からメチル基が最も好ましい。Ｒ1 、Ｒ2及び
Ｒ3はそれぞれ同一でも異なっても良いが、合成の点から同一であるのが好ましい。
式（Ｉ）において、アミノ基の結合するベンゼン環は、その２−，４−，５−，及び６−位がそれぞれ独立に置換基で置換されていても良い。その置換基としては、後述する一般式（Ｉ）で示される標識用化合物とアルデヒド化合物との反応を妨げず、かつ質量分析の感度を低下させない置換基であり、例えば、アルキル基、ヒドロキシル基、アリール基、ハロゲン等が挙げられる。
またＸ−で示される対アニオンは特に制限がなく、クロルイオン、ブロムイオン、ヨードイオン等のハロゲンイオン、酢酸イオン等のカルボン酸イオン、などが挙げられるが、安定性を高めるためにクロルイオン、ブロムイオン、ヨードイオン等のハロゲンイオンが望ましい。
尚、前記一般式（Ｉ）で示される化合物は公知の方法に準じて、例えば３−ニトロベンジルクロライドに等モルのトリメチルアミン等のアミン化合物を反応させ、３−ニトロベンジルトリメチルアンモニウム塩等の前記一般式（Ｉ）におけるアミノ基がニトロ基である化合物を得、これを鉄等の還元触媒の存在下塩酸中で加熱する等の方法により得ることができる。
【００１８】
＜アルデヒド化合物＞
本発明の一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類からなる標識用化合物は、これとアルデヒド化合物の還元アミノ化反応により標識化されたアルデヒド化合物を得、これを質量分析に供することが可能である。従って、アルデヒド化合物としては、アルデヒド基を有する有機化合物であれば特に限定されないが、糖類が好ましく、糖
類としては、単糖類及び多糖類のいずれでも良い。単糖類としては、グルコース、ガラクトース、フコース、マンノース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸等が、又、多糖類としては、Ｎ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ，  Ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ，  Ｔｅｔｒａａｎｔｅｎｎａｒｙ糖鎖等が挙げられる。又、前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類からなる標識用化合物は、特に糖蛋白質に結合しているＮ結合型糖鎖、またはＯ結合型糖鎖の分析に有効であるため、人体に由来する血液中に含まれる糖タンパク質や、臓器に発現する糖タンパク質などを分析対象とすることができる。またホルモン、抗体等のバイオ医薬における糖鎖解析にも有効である。
【００１９】
尚、アルデヒド化合物が糖タンパク質に由来する糖類である場合、例えば、Ｈａｓｅ  Ｓ．，  Ｉｋｅｎａｋａ  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  Ｙ．；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ９０，４０７−４１４（１９８１）や、Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｋ．，  Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｈ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，  １１２（１），１５５−１６０（１９８３）等の公知の方法に準じて糖タンパク質からヒドラジン分解法、または酵素消化法により得た遊離糖鎖を用いることができる。
＜アルデヒド化合物の分析方法＞
本発明のアルデヒド化合物の分析方法は、アルデヒド化合物に、前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類を還元アミノ化反応にて付加し、得られた反応物を質量分析法にて分析するものである。
【００２０】
還元アミノ化反応は、例えば下記反応式（II）により示され、アルデヒドの還元アミノ化物を得る。
【００２１】
【化６】
2006036693.tif 000004
【００２２】
（上記式に置いて、Ｑはフォルミル基と共にアルデヒド化合物を構成する有機基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＸ―は前記式（Ｉ）におけると同義を示す。）
前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類の使用割合は、アルデヒド化合物に１モルに対して１モル以上、好ましくは５モル以上であり、上限は特に限定されないが、過剰に使用した場合には上記還元アミノ化反応に寄与ぜず分離除去されるため、通常１０モルである。又、上記還元アミノ化反応は、反応の平衡の点から、通常、シアノヒドリドホウ酸ナトリウム、ジメチルアミンボラン等の還元剤の存在下に行うのが好ましい。還元剤の使用割合は、通常アルデヒド化合物１モルに対し、１モル以上であるが、好ましくは５モル以上であり、上限は特に限定されないが通常１０モル程度である。
【００２３】
反応温度は通常、７０℃以上、１００℃以下であり、好ましくは９０℃以上である。反応時間は、通常２０分以上３時間以内であるが、長時間反応すると糖鎖が分解するおそれがあり、３０分以上が好ましく、一方、１時間が好ましい。
反応は、通常、アルデヒド化合物及び前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類を溶解する溶媒中で行われ特に限定されないが、水と酢酸の混合溶媒が好ましく、その場合、水に対して酢酸が２容量％以上６０容量％以下であることが好ましいが、５容量％以上２０容量％以下であることが特に望ましい。又、溶媒に対するアルデ
ヒド化合物の濃度は特に限定しないが、通常、１ナノモル／リットル以上１００ミリモル／リットル以下であり、特に１０ミリモル／リットル以下であることが好ましい。
【００２４】
＜分析試料の精製及び質量分析＞
アルデヒドの還元アミノ化物（標識化された糖等）を含む反応液は、通常、分析に先立ち、精製して未反応物を除去する。具体的には、例えば、反応液をグラファイトカーボンカラム等に添加し、酢酸アンモニウム緩衝液でカラムを洗浄することにより、未反応の還元剤および前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類を除去する。カラムに吸着した還元アミノ化物は、例えば、アセトニトリルを含む緩衝液を通液することで回収できる。次に得られたアルデヒドの還元アミノ化物合物（標識化された糖等）をそのまま、または公知の方法に準じてノイラミニダーゼ酵素によるシアル酸消化を行い、常法に従い、質量分析法にて分離・定量する。質量分析法としては、液体クロマトグラフィー・質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析装置または、単に質量分析装置のみでもよいが、液体クロマトグラフィー・質量分析装置が好ましい。質量分析測定法はスキャン法、ＳＩＭ（Ｓｅｌｅｃｔ  Ｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）法のいずれでもよい。
【００２５】
上記質量分析を行うことにより、未知のアルデヒド化合物であれば、スキャン法にてその分子量が明らかになり、構造を推定することができる。また既知の化合物であれば、ＳＩＭ法によりその存在量を定量することができる。特に糖類の分析では、予め測定した標準化合物（標準糖鎖）と液相クロマトグラフィーの保持時間、質量分析のスペクトルを比較することによって同定することができる。
【００２６】
＜標識化糖類＞
本発明の標識化糖類は、前記一般式（Ｉ）で示される３−アミノベンジルアンモニウム塩類（アルデヒド化合物の標識化用化合物）が糖類の還元末端に付加してなるものである。糖類の還元末端に不可してなるとは、前記反応式に示される様に、糖類の末端のアルデヒド基が還元された構造に３−アミノベンジルアンモニウム塩類がアミノ基で付加した構造を有する。上記標識化糖類は、予めその構造を同定しておくことにより、これを糖類の質量分析の標準物質として使用可能であり、未知の糖鎖の構造同定又は定量分析に利用可能である。
【実施例】
【００２７】
次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
グルコースオリゴマー（ホーネン製）１ｍｇを試験管にとり、３−アミノベンジル−トリメチルアンモニウム塩酸塩１２μｍｏｌ，水９０μＬ，酢酸１０μＬを加え、９０℃５分間加熱後、さらに３−アミノベンジル−トリメチルアンモニウム塩酸塩２５μｍｏｌ，シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム１５ｍｇ、水４５０μＬ，酢酸５０μＬを加え、９０℃１時間加熱した。反応後、水を加えて全量を１ｍｌとし、ＬＣ−ＭＳを測定した。グルコースオリゴマー６量体のピーク面積比を表２に示す。
【００２８】
尚、表１にＬＣ−ＭＳ条件を示す。表１のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整するようになっている。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ1分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ2分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、Ｔ2−Ｔ1分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ1
，Ｔ2，ａ，ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１，２において％は体積を基準とした
百分率を表わす。
又、標識用化合物として用いた３−アミノベンジル−トリメチルアンモニウム・塩酸塩
を重水中で９０℃１時間加熱し、加熱後の分解率（残存率）を１Ｈ−ＮＭＲで求めることにより、熱安定性を調べた。結果を表３に示す。
【００２９】
［比較例１］
実施例１と同様にして、標識化グルコースオリゴマーをＬＣ−ＭＳにて分析した。
ただし、標識用化合物として３−アミノベンジル−トリメチルアンモニウム塩酸塩の代わりに等ｍｏｌの２−アミノピリジンを用いた。
［比較例２］
実施例１と同様にして、標識化グルコースオリゴマーをＬＣ−ＭＳで分析した。
ただし、標識用化合物として３−アミノベンジル−トリメチルアンモニウム塩酸塩の代わりに等ｍｏｌのＴＭＡＰＡ（トリメチルアミノフェニルアンモニウム塩酸塩）を用いた。
【００３０】
［比較例３］
グルコースオリゴマー１ｍｇを試験管にとり、２５μＬの水に溶解後、Ｇｉｒａｒｄ‘ｓ
Ｐ試薬（東京化成製）８μｍｏｌ及び水２５μＬを加えた。さらに２．５μＬの酢酸を加え、７５℃で３時間加熱した。反応後、水を加えて全量を１ｍｌとし、ＬＣ−ＭＳを測定した。グルコースオリゴマー６量体のピーク面積比を表２に示す。
【００３１】
【表１】
2006036693.tif 000005
【００３２】
【表２】
2006036693.tif 000006
［比較例４］
４−アミノベンジル−トリメチルアンモニウム・塩酸塩の熱安定性を実施例１と同様に調べた。結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
2006036693.tif 000007