(57)【要約】    【課題】  本発明は、正常細胞が産生する血漿タンパク質に構造や性質が類似するヒト血漿タンパク質の製造方法等を提供することを目的とする。    【解決手段】  本発明は、ＦＬＣ−７細胞を無血清培地で培養する第１工程と、前記培養工程で得られた培養上清から産生物質を回収する第２工程と、を含むヒト血漿糖タンパク質の製造方法を提供するものである。本発明に係る方法によれば、市販される正常ヒト血漿タンパク質によく類似した糖鎖を有するヒト血漿糖タンパク質を得ることができ、医薬品または基礎研究用の標品として有用である。【選択図】    図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＬＣ−７細胞を無血清培地で培養する第１工程と、
前記培養工程で得られた培養上清から産生物質を回収する第２工程と、を含むヒト血漿糖タンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記第２工程は、前記培養上清と前記ヒト血漿糖タンパク質に対する抗体とを接触させ、該抗体に結合した物質を回収することによって行われる、請求項１に記載のヒト血漿糖タンパク質の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の製造方法によって得られるヒト血漿糖タンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載のヒト血漿糖タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項５】
前記ヒト血漿糖タンパク質がトランスフェリンである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＦＬＣ−７細胞を無血清培地で培養することによって得られる培養上清を含む医薬組成物。
【請求項７】
完全無血清無蛋白条件下で培養されたことを特徴とするＦＬＣ−７細胞。
【請求項８】
ＦＬＣ７−ＣＳ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６０３）である、請求項７に記載のＦＬＣ−７細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒト血漿糖タンパク質の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、臨床の場で、輸血をはじめとして患者の病態改善のためにヒト血漿成分を投与する方法が広く用いられている。また、臨床のみならず基礎研究の場においても、ヒト血漿糖タンパク質を使用する場面は少なくない。
【０００３】
血漿には、１００種以上のタンパク質が含まれており、アルブミンを除いてほとんどが糖タンパク質である。これらの糖タンパク質には、特定の物質と結合して運搬する機能を有するもの（トランスフェリン、セルロプラスミン、各種リポタンパク質、ハプトグロビン等）、外来の抗原に対する免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等）、抗原抗体反応に関与する補体系成分、血液の凝固や血栓の溶解に関連する血液凝固因子のほか、酵素活性を示すもの（アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム等）等が含まれる。
【０００４】
糖タンパク質の糖鎖部分は、Ｏ−型とＮ−型に分類されるが、血漿糖タンパク質の大部分は、タンパク質中のアスパラギンのアミノ基の窒素に、Ｎ型アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合し、これにマンノースを含む糖鎖が結合したＮ−グリコシド型である。Ｎ−グリコシド型の糖タンパク質糖鎖には他の構成糖として、ガラクトース、フコース、シアル酸がある。
【０００５】
これまで臨床の場で使用されているヒト血漿成分は、由来が多様であるためＬｏｔ差が生じやすく、厳格な品質管理が行われているにもかかわらず、予期せぬ感染源の混入等による二次感染や副作用が生じる可能性を完全には払拭できない。
【０００６】
免疫グロブリンを除きヒト血漿糖タンパク質の大部分は、肝実質細胞で産生されることが知られている。しかしながら、現在入手および培養が可能な肝実質細胞の機能を維持している肝細胞は癌化したものである。肝細胞は、癌化しても、多くの場合血漿糖タンパク質を産生する性格が保存されるが、産生された糖タンパク質の糖鎖が大きく変異することも知られている。
【０００７】
例えば、特開平５−２０７８９６号公報では、癌患者において、ガラクトース転移酵素の糖鎖構造に変異が生じていることを見出し、ガラクトース転移酵素の糖鎖のシアル酸含量を測定することを特徴とする癌診断法が提案されている。
【特許文献１】特開平５−２０７８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、一般に正常肝細胞が産生する血漿糖タンパク質に比べ肝細胞癌由来の血漿糖タンパク質は糖鎖構造の変異が大きいため、糖鎖を有しないアルブミンを除き、臨床用または基礎研究用として使用できるとは限らない。しかしながら、臨床での患者治療または基礎研究のために、安全な血漿成分の安定供給は重要である。
【０００９】
そこで、本発明は、正常肝細胞が産生する血漿糖タンパク質に構造や性質が類似するヒト糖血漿タンパク質を安定に供給する方法、およびこの方法によって得られるヒト血漿糖タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、ヒト肝細胞癌由来のＦＬＣ−７細胞は完全無血清無蛋白培地での馴化が可能であり、培養上清からアルブミンはもとよりトランスフェリンをはじめとする血漿糖タンパク質も得られることを見出した。そして、肝細胞由来糖蛋白質の代表として糖鎖構造の癌性変化が十分解析されたトランスフェリンの糖鎖を解析した結果、他の癌化肝細胞（ＨｅｐＧ２やＨｕＨ−７）が産生するトランスフェリンの糖鎖に比較して明らかに変異が小さく、市販される精製標品が有する糖鎖構造によく類似した糖鎖を有し、ヒト標品として十分使用可能なものであることを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、
〔１〕ＦＬＣ−７細胞を無血清培地で培養する第１工程と、前記培養工程で得られた培養上清から産生物質を回収する第２工程と、を含むヒト血漿糖タンパク質の製造方法；
〔２〕前記第２工程は、前記培養上清と前記ヒト血漿糖タンパク質に対する抗体とを接触させ、該抗体に結合した物質を回収することによって行われる、上記〔１〕に記載のヒト血漿糖タンパク質の製造方法；
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の製造方法によって得られるヒト血漿糖タンパク質；
〔４〕上記〔３〕に記載のヒト血漿糖タンパク質を含む医薬組成物；
〔５〕前記ヒト血漿糖タンパク質がトランスフェリンである、上記〔４〕に記載の医薬組成物；
〔６〕ＦＬＣ−７細胞を無血清培地で培養することによって得られる培養上清を含む医薬組成物；
〔７〕完全無血清無蛋白条件下で培養されたことを特徴とするＦＬＣ−７細胞；および
〔８〕ＦＬＣ７−ＣＳ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６０３）である、上記〔７〕に記載のＦＬＣ−７細胞、に関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＦＬＣ−７細胞の完全無血清無蛋白培養株の樹立で正常肝細胞と同等の機能を持つ肝細胞を得ることにより、トランスフェリンをはじめとする、市販される正常ヒト血漿糖タンパク質によく類似した糖鎖を有するヒト血漿糖タンパク質を得ることができる。このようなヒト血漿糖タンパク質は、医薬品または基礎研究用の標品等として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本明細書に用いられる用語の意味等を解説し、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。
【００１４】
本発明で用いられるＦＬＣ−７細胞とは、寄託番号ＪＣＲＢ１０３１で表される肝細胞癌由来細胞ＪＨＨ−７細胞（Fujise, K. et al., Hepato-gastroenterol, 37:457-460, 1990; Nagamori, S. et al., Hum. Cell, 1:382-390, 1988）を継代培養したものであり、ＪＨＨ−７細胞の７５代目をＦＬＣ−７細胞と名称変更したものである。
【００１５】
本発明に係るトランスフェリンは、上述したＦＬＣ細胞を無血清培地、好ましくは完全無血清培地で培養することによって、ＦＬＣ細胞が産生するものである。無血清培地とは、動物に由来する血清を含まず、人工的に既知物質のみから作製する培地であり、動物の血清を含む培地に比較して夾雑物が少なく、目的とするタンパク質の分離・精製を行いやすい。無血清培地の成分としては、例えば、インスリン、ソマトメジン類、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、神経成長因子、血小板由来増殖因子、各種ステロイドホルモン、結合タンパク質（トランスフェリン、アルブミン等）、細胞接着因子（フィブロネクチン、ラミニン等）等が挙げられるがこれらに限定されない。本発明で用いられる無血清培地は、ＦＬＣ−７細胞を馴化させることが可能である限り特に制限されないが、既知の化学物質以外ペプチド成分も含まないものが好ましい。このような、無血清無蛋白完全化学合成培地として、ISRPMI培地（RPMI1640, 5 mM HEPES, 3 x 10‐8 M Na2SeO3, 3 x 10‐9 M(NH4)6Mo7O24・4H2O, 10‐7 M FeSO4・7H2O, 3 x 10‐10 M MnCl2・4H2O, 10‐8 M NH4VO3, 3 x 10‐9 M linolic acid and oleic acid, 15.5 mM NaHCO3、Nakabayashi,H., et al. Cancer Res.,42,3858-3863,1982)が挙げられる。尚、はじめて無血清培地に馴化する際は、当初インスリン等を添加し、数代目以降で無血清無蛋白完全化学合成培地にするとよい。
このように無血清培地に馴化したＦＬＣ−７細胞としては、例えば、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６０３で表されるＦＬＣ７−ＣＳ細胞が挙げられる。
【００１６】
本発明に係るトランスフェリンは、上述した培地においてＦＬＣ−７細胞を培養した培養上清に含まれる。培養上清は、培養物を適当な条件で遠心分離することによって得られ、すぐに精製しない場合は必要に応じ-20〜-80℃で凍結して保存することが可能である。この培養上清に含まれるトランスフェリン群は、他の癌化肝細胞（例えば、HepG2やHuH7細胞）に比較して、正常ヒト血清トランスフェリン標品（Sigma Cat.No.T-4382）に類似した構造の糖鎖を有する。
【００１７】
トランスフェリンは、血清中の鉄と結合し、細胞膜トランスフェリン受容体を介し細胞内に鉄を輸送する機能タンパク質であり増殖因子としての役割を持ち、種々の疾患においてその糖鎖が変異、欠損することが知られている。本発明者らの解析によれば、市販の正常ヒト血清トランスフェリン標品には、下記式［５］および［６］に示す２種類の糖鎖を有するトランスフェリンが含まれている。
【００１８】
【化１】
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式［５］に示すトランスフェリンはシアル酸が１分子付加されたモノシアロ糖タンパク質、式［６］に示すトランスフェリンはシアル酸が２分子付加されたジシアロ糖タンパク質であって、いずれも糖部分は２本の主鎖からなり、式［６］に示すジシアロ糖タンパク質が多く含まれていた。また、フコースは付加されているものとないものとが存在した。
【００１９】
一方、ＦＬＣ−７細胞の培養上清から得られた本発明に係るトランスフェリンは、下記一般式［１］に示されるトランスフェリン、またはこれらにフコースおよび／またはシアル酸が付加されたトランスフェリンである。
【００２０】
【化２】
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［ただし、Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立に下記式［２］〜［４］のいずれかで示される糖鎖を示しＴｆはトランスフェリンのタンパク質部分を示す（ただし、Ｒ1およびＲ2が式［２］で示される糖鎖であって、シアル酸が付加されているものを除く）。］
【００２１】
【化３】
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ＦＬＣ−７細胞の無血清培養上清中に最も多く含まれていたのは、Ｒ1およびＲ2が式［２］で示される糖鎖であり、シアル酸が付加されていないアシアロ糖タンパク質であったが、上記式［５］で示されるモノシアロ糖タンパク質も含まれていた。通常、癌細胞において糖タンパク質の糖鎖は大きく変異しているが、ＦＬＣ−７細胞から得られたトランスフェリン群は正常標品と比較して変異は大きくない。
【００２２】
なお、本発明に係るトランスフェリンのペプチド部分は、トランスフェリンとしての機能を果たす限り特に限定されず、正常なものであっても、変異を有するものであってもよく、塩であってもよいが、変異を有しない正常なトランスフェリンが好ましい。
【００２３】
本発明に係るヒト血漿糖タンパク質の製造方法においては、ＦＬＣ−７細胞の培養後、得られた培養上清から糖タンパク質を精製する。糖タンパク質の精製は、公知の方法またはそれに準ずる方法を用いることができ、例えば、各種クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、限外ろ過法、塩析等の沈殿法等を用いることが可能である。中でも、試薬として大量精製するには各糖タンパク質に対する抗体を固相表面に固定し、この固相表面と培養上清とを接触させ、固相表面に捕捉されたタンパク質を回収する抗体アフィニティークロマトグラフィー法が好ましい。
【００２４】
また、本発明は、上述した本発明に係るヒト血漿糖タンパク質の製造方法によって製造されたヒト血漿糖タンパク質をも包含する。かかるヒト血漿糖タンパク質は、癌化肝細胞から得られたにもかかわらず、ヒト正常細胞が産生する糖タンパク質とその糖鎖において良く類似している。細胞の癌化による産生糖蛋白質糖鎖の変異は、関連糖転移酵素の癌性変異によるクローン化された細胞株固有ものと考えられる。したがって、既に糖鎖構造を確認したトランスフェリン以外にも、FLC-7が産生する多くの糖タンパク質が、ヒト正常肝細胞が産生する糖タンパク質と良く類似した糖鎖を有することが容易に推測される。
【００２５】
従って、このような糖タンパク質は、医薬品として、また試薬としても有用である。尚、医薬品として使用する場合は、抗体由来生物蛋白質の混入を徹底的に排除するため抗体アフィニティークロマトグラフィー法以外の方法を駆使して各糖タンパク質を精製してから用いてもよいし、得られた培養上清を部分精製後投与することも適時可能である。完全無血清無蛋白化学合成培地を用いているため、夾雑物が少なく、品質管理もしやすい。
【実施例１】
【００２６】
＜細胞の改変＞
HLC-7は、これまで低タンパク質培地ASF104で通常の培養条件で維持されていた（Kawada,M.,et al., In vitro Cell.Dev.Biol.,Aminal,34,109-115,1998.）。上記条件下培養されたFLC-7は0.25%トリプシンで剥離し、集細胞後、冷PBS(-)洗浄、RPMI1640を基礎にした亜セレン酸ナトリウム添加完全無血清無蛋白合成培地（ISRPMI, IRPMI-based completely chemically defined synthetic medium）内で、106/mlで培養した。より具体的にはISRPMI （RPMI1640, 5 mM HEPES, 3 x 10‐8 M Na2SeO3, 3 x 10‐9 M (NH4)6Mo7O24・4H2O, 10‐7 M FeSO4・7H2O, 3 x 10‐10 M MnCl2・4H2O, 10‐8 M NH4VO3, 3 x 10‐9 M linolic acid and oleic acid, 15.5 mM NaHCO3、Nakabayashi,H., et al. Cancer Res.,42,3858-3863,1982)に0.01ｍU/ml  insulinとFLC-5細胞のASF104 conditioned mediaを5.0％添加で初代培養を開始し、3代目よりISRPMIで継代した。
【００２７】
週１回の培地交換を行い、ISRPMI馴化FLC7-CS（受託番号FERM P-20603）を作成した。FLC7-CS細胞は、ISRPMIにおいて順調に生育し、そのplating efficiencyは30％であった。継代は、20％FLC-7 conditioned medium（CM）含有ISRPMIに105/mlの細胞濃度で行った。継代3代目からCMは株取後、10000rpm、10分、4℃で遠心後、上清を使用時まで-80℃で保存した。
【００２８】
＜アルブミン、トランスフェリンのELISA＞
既に報告した方法によりサンドイッチ法で測定した。簡単に示すとヤギ抗ヒトアルブミンまたはトランスフェリンIgG（0.1mg/ml in 0.1M NaHCO3)を固相化した96穴マイクロプレート上でのHRP標識ヤギ抗ヒトアルブミンまたはトランスフェリンIgGを用いた酵素免疫化学的測定であり精製ヒトアルブミン、トランスフェリンを標準品とした。
【００２９】
得られたCM中のアルブミン濃度は、30-300μg/ml、トランスフェリンは80-200ng/mlであった。
【００３０】
＜タンパク精製＞
アルブミンの精製は、Cohnの分画を用いた。トランスフェリンの精製は以下の通りの方法で４℃下で行った。CMは、10mM Tris/HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 0.01% Tween 20, protease inhibitor cocktailを含む緩衝液で充分透析した後、同緩衝液で平衡化した抗ヒトトランスフェリン抗体結合カラムを通し、次いで、同緩衝液に8M尿素を添加した溶液を用いて溶出し、直ちに50mM Tris/HCl, pH8.6で充分透析した。ついでPL-10で濃縮後、標品は、陰イオン交換カラムMonoQ HR5/5を用いたFPLCを通し、50mM Tris/HCl, pH8.6, 0-1M NaClでの直線グラディエント溶出を行った。目的画分は、FPLC Superdex75 HR10/30でゲルろ過した。得られたアルブミン、トランスフェリンは純度検定のため一部SDS-PAGE、銀染に供した。SDS-PAGEの結果を図１に示す。
【００３１】
CMを蛋白由来源とした精製によりアルブミン、トランスフェリンとも極めて高い純度での精製標品が得られたことが確認された。また、精製トランスフェリンのペプチド解析により変異が無いことがわかった。
【００３２】
＜N型複合糖鎖の解析＞
精製したトランスフェリンと正常ヒト血清トランスフェリン標品（Sigma社）のタンパク質部分の同定、およびPA糖鎖解析をLC-ESI MSで行った。工程の概略を図２に示す。
【００３３】
尚、糖鎖の解析は、例えば、Dell, A. et al.; Science 2001 Mar 23;291(5521):2351-6、Joshi, HJ et al.; Proteomics 2004 June;4(6):1650-64、Kameyama, A. et al.; Tanpakushitsu Kakusan Koso (蛋白質、核酸、酵素) 2003 June;48(8 Suppl):1190-3. Review、Suzuki, M. et al.; Tanpakushitsu Kakusan Koso (蛋白質、核酸、酵素) 2003 Jun;48(8 Supple):1194-9、三善英知、谷口直之「プロテオミクスから機能グライコミクスへ：糖鎖の解析解明の重要性」生化学2004;46(10);1337-1343等に従って行うことができる。
【００３４】
図３および４に、FLC-7由来トランスフェリンの同定結果を、また、図５および６にSigma社のヒトトランスフェリン標品の同定結果を示す。精製したFLC-7由来トランスフェリンは、限定分解後のHPLC分取ペプチド配列から、Sigma社のヒトトランスフェリン標品と同様に、ヒトトランスフェリンであることが確認された。図３、図５に示すアミノ酸配列にうち、下線を付した部分が既知のトランスフェリンのアミノ酸配列と一致した箇所である。
【００３５】
図７〜９は、PA糖鎖分析の結果である。
N型複合糖鎖解析の結果、図９に示されるように、FLC-7由来のトランスフェリンの培養上清から得られたトランスフェリンからは、２から５のアンテナを持つ４種類の糖鎖と、このうち２または３のアンテナを持つ糖鎖にシアル基が一つ結合したモノシアロ糖鎖と、それらにAsn基部のGlcNAcにα1→６でフコースが結合したものからなる１１種類の糖鎖が検出された。尚、同図における糖鎖は、図２のAbbreviationに示す記号を使用して図示されている。
【００３６】
FLC-7の培養上清から精製されたトランスフェリンは、正常ヒト血清トランスフェリン標品に比較して、３から５のアンテナを持つ糖鎖が多い点で、N型複合糖鎖の変異は強いといえる。しかしながら、その程度はHepG2、HuH-7よりは小さく、ヒト標品として充分使用可能と判断された。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】トランスフェリンの精製およびSDS-PAGEの作業工程を示す説明図である。
【図２】LC-ESI MSによるPA糖鎖分析の工程を示す説明図である。
【図３】LC-ESI MSによるトランスフェリン（培養上清から）の同定の結果である。
【図４】LC-ESI MSによるトランスフェリン（培養上清から）の同定の結果である。
【図５】LC-ESI MSによるトランスフェリン（Sigma社標品）の同定の結果である。
【図６】LC-ESI MSによるトランスフェリン（Sigma社標品）の同定の結果である。
【図７】蛍光HPLCによるPA糖鎖分析の結果を示す。
【図８】蛍光HPLCによるPA糖鎖分析の結果を示す模式図である。
【図９】蛍光HPLCによるPA糖鎖分析の結果を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
2006296413.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006296413.tif 000012
【図８】
2006296413.tif 000013
【図９】
2006296413.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月25日(2006.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
図３および４に、FLC-7由来トランスフェリンの同定結果を、また、図５および６にSigma社のヒトトランスフェリン標品の同定結果を示す。精製したFLC-7由来トランスフェリンは、限定分解後のHPLC分取ペプチド配列から、Sigma社のヒトトランスフェリン標品と同様に、ヒトトランスフェリンであることが確認された。図３、図５に示すアミノ酸配列（配列番号：１）のうち、下線を付した部分が既知のトランスフェリンのアミノ酸配列と一致した箇所である。