(57)【要約】【課題】診断等に用いられる中空微小球の提供。【解決手段】タンパク質性壁を有する中空微小球であって、微小球の少なくとも９０％が、直径が１．０〜８．０μｍの範囲にあり、微小球の少なくとも９０％の壁厚が４０〜５００ｎｍであり、微小球の壁のタンパク質の少なくとも５０％が架橋して、１％ＨＣｌ中２分間の抽出に耐えるものであり、そして微小球のイン・ビボでのｔ1/2 が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質性壁を有する中空微小球であって、微小球の少なくとも９０％が、直径が１．０〜８．０μｍの範囲にあり、微小球の少なくとも９０％の壁厚が４０〜５００ｎｍであり、微小球の壁のタンパク質の少なくとも５０％が架橋して、１％ＨＣｌ中２分間の抽出に耐えるものであり、そして微小球のイン・ビボでのｔ1/2 が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
【請求項２】
タンパク質の少なくとも９５％が前記のように架橋している、請求項１に記載の中空微小球。
【請求項３】
直径が主として１．０〜１０．０μｍであり、微小球の少なくとも１０％を水に懸濁したとき、２．６６×１０４Ｐａの圧０．２５秒間加えても破裂、崩壊、または水の充満なしに残ることができる中空微小球であって、この微小球がイン・ビボでのｔ1/2 が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
【請求項４】
微小球の３０％以上の直径が２μｍの範囲内であり、少なくとも９０％の直径が１．０〜８．０μｍであり、微小球のイン・ビボでのｔ1/2 が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
【請求項５】
直径の四分位範囲が２μｍ以下であり、メジアン直径が２．０〜８．０μｍであり、そして、微小球のイン・ビボでのｔ1/2 が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
【請求項６】
液体キャリアー中に少なくとも１種の壁形成物質を溶解または分散したものをガス中に噴霧し、液体キャリアーを蒸発させることによってマイクロカプセルを得る工程を含んでなる、マイクロカプセルの製造方法であって、前記壁形成物質がヒアルロン酸を含んでなる製造方法。
【請求項７】
少なくとも９０％以上の直径が１．０〜１０．０μｍであるマイクロカプセルであって、微小球壁がヒアルロン酸を含んでなる、マイクロカプセル。
【請求項８】
請求項７に記載のマイクロカプセル、または請求項６の製造方法により製造されたマイクロカプセルを含んでなる、無菌であって、発熱性物質を含まない製剤。
【請求項９】
医療に使用される、請求項７に記載のマイクロカプセルまたは請求項６に記載の方法により製造されたマイクロカプセル。
【請求項１０】
請求項７に記載のマイクロカプセルまたは請求項６に記載の方法により製造されたマイクロカプセルを含んでなる、診断用コントラスト剤。
【請求項１１】
画像を形成させた後、検査を行う方法であって、（ａ）哺乳類の体内に請求項７に記載のマイクロカプセルまたは請求項６に記載の方法により製造されたマイクロカプセルを注射し、（ｂ）哺乳類またはその一部を適当な超音波で処理し、（ｃ）前記マイクロカプセルによって反射し、伝達し、共鳴し、または振動数変調した超音波を検出する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、超音波画像形成の向上に用いる中空マイクロカプセルを含んでなる診断薬の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内の気泡を超音波心臓検査法に用いることができるという事実は、以前から知られている。この目的のために気泡を含む液体を血流に注射することができ（気泡をコラ−ゲン膜内に安定化させたOphir 等、(1980) "Ultrasonic Imaging" 2,67-77、ＵＳ−Ａ−４，４４６，４４２号明細書(Schering)およびＥＰ−Ａ−１３１，５４０号明細書(Schering)を参照）、ＵＳ−Ａ−４，７１８，４３３号明細書、ＵＳ−Ａ−４，７７４，９５８号明細書およびＵＳ−Ａ−４，８４４，８８２号明細書には、アルブミン溶液を超音波処理することによって調製した気泡の使用が開示されている。しかしながら、気泡のサイズ分布は明らかに制御不可能であり、更にこの気泡は左心室で圧力が加わると消滅してしまう（Shapiro 等、(1990) J. Am. Coll. Cardiology, 16(7), 1603-1607）。
【０００３】
ＥＰ−Ａ−５２，５７５号明細書には、同様の目的で気体が混入されている固形粒子であって、この気体が血流中で粒子から解放されるものが開示されている。
【０００４】
ＥＰ４５８，７４５号明細書(Sintetica) には、ポリラクチドおよびポリグリコリドのような合成ポリマーの界面重合による空気または気体を充填した微小中空球の製造法が開示されている。ＷＯ９１／１２８２３号明細書(Delta Biotechnology) には、アルブミンを用いた同様の方法が開示されている。Wheatley等 (1990) Biomaterials, 11, 713-717 には、アルギン酸塩のイオン移動によるゲル化(ionotropic gelation) による直径３０μｍ以上の微小気泡の形成が開示されている。ＷＯ９１／０９６２９号明細書には、超音波コントラスト剤(contrast agents) として用いられるリポソームが開示されている。本出願人らの同時係属特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９２／００６４３号明細書（本出願の優先日以降ＷＯ９２／１８１６４号明細書として公表）には、必要な強度および厳密に制御されたサイズ分布を有する特に有利な微小球を得る噴霧乾燥法が開示されている。別の目的に用いる他の噴霧乾燥法は、Przyborowski等(1982, Eur. J ．Nucl. Med., 7, 71-72) 、すなわち放射能標識に用いるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）微小球の製造および肺のシンチグラフィー画像形成におけるその使用、に開示されている。
【０００５】
Przyborowski等の文献は、肺のシンチグラフィーに用いるアルブミン粒子を得る方法について開示した２つの文献に言及している。Aldrich & Johnston (1974) Int. J. Appl. Rad. Isot., 25, 15-18 には、回転円盤を用いて直径３〜７０μｍの粒子を生成させ、次いでこれを加熱した油中で変質させることが開示されている。この油を除去し、粒子を放射性同位元素で標識する。Raju等(1978) Isotopenpraxis 14(2), 57-61は、粒子を単に加熱することによりアルブミンを変性させること以外は同じ回転円盤技術を用いた。いずれの場合にも中空の微小球については触れられておらず、調製された粒子は超音波心臓検査法に適していなかった。
【発明の具体的説明】
【０００６】
本出願人らは、本出願人らによる従来の噴霧乾燥法（ＷＯ９２／１８１６４号）を発展させ、これを一層有利な生成物の製造に応用した。
【０００７】
本発明の一つの態様によれば、壁形成（wall-forming）材料の溶液または分散体を微粒化し、(i) 直径１５〜２０μｍの中空微小球、(ii)ヒト血流内で長い半減期を有する中空微小球、または(iii) ヒトまたは動物の体内のある部分に対する選択的に標的設定がなされた中空微小球を得る第一段階を含んで成る方法が提供される。
【０００８】
これら３種類の微小球生成物は、本明細書では各々「大型微小球」、「長寿命微小球」および「標的設定された微小球」と称する。
【０００９】
好ましくは、前記の方法で得られた生成物に、少なくとも前記の微小球の外側の水溶性を減少させる第二段階を施す。
【００１０】
前記二つの段階は１つの工程として行うことができ、或いは第一段階の中間生成物を回収して第二段階で別々に処理することができる。これら２通りの可能性は、以後一段階法および二段階法と称する。
【００１１】
壁形成材料および工程条件は、生成物が使用条件下で十分に無毒性かつ非免疫原性であるように選択されるべきであり、これは明らかに投与量および治療期間に依存する。壁形成材料は、澱粉誘導体、第三ブチルオキシカルボニルメチルポリグルタメートなどの合成ポリマー  （米国特許第４，８８８，３９８号明細書）、またはポリデキストロースもしくは澱粉のような多糖類であってよい。
【００１２】
通常、壁形成材料は、親水性が最も高く生分解性を有する生理学的に適合するポリマーから選択することができる。このようなポリマーの中で、低水溶性の多糖類、ポリラクチド、およびポリグリコリド並びにそれらのコポリマー、ε−カプロラクトン、δ−バレロラクトンなどのラクチドおよびラクトンのコポリマー、ポリペプチド、並びにゼラチン、コラーゲン、グロブリン、およびアルブミンなどのタンパク質を例として挙げることができる。他の好適なポリマーとしては、ポリ（オルト）エステル（例えば、ＵＳ−Ａ−４，０９３，７０９号明細書、ＵＳ−Ａ−４，１３１，６４８号明細書、ＵＳ−Ａ−４，１３８，３４４号明細書、ＵＳ−Ａ−４，１８０，６４６号明細書を参照）、ポリ乳酸およびポリグリコール酸並びにそれらのコポリマー、例えばＤＥＸＯＮ（J.Heller (1980) Biomaterials, 1, 51 を参照）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−δ−カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−δ−バレロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−ｇ−ブチロラクトン）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアミド、ポリヒドロキシブチレート、ポリジオキサノン、ポリ−β−アミノケトン（Polymer, 23 (1982), 1693）、ポリホスファゼン（Science, 193 (1976), 1214 ）、ポリ無水物が挙げられる。生分解性ポリマーについての文献には、R.Langer等（1983）Macromol. Chem. Phys., C23, 61-125が挙げられる。ポリグルタミン酸およびポリアスパラギン酸のようなポリアミノ酸も、その誘導体、すなわち低級アルコールまたはグリコールとの部分エステルと同様に用いることができる。このようなポリマーで有用なものの例は、ポリ（ｔ−ブチル−グルタメート）である。また、メチオニン、ロイシン、バリン、プロリン、グリシン、アラニンなどの他のアミノ酸とのコポリマーも可能である。最近、制御された生分解性を有するポリグルタミン酸およびポリアスパラギン酸の幾つかの新規な誘導体が報告された（ＷＯ８７／０３８９１号明細書、米国特許第４，８８８，３９８号明細書および欧州特許第１３０，９３５号明細書を参照。また、前記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）。これらのポリマー（および他のアミノ酸とのコポリマー）は、下記の型の式：
−（ＮＨ−ＣＨＡ−ＣＯ）ｘ（ＮＨ−ＣＨＸ−ＣＯ）ｙ
（式中、Ｘは、アミノ酸残基の側鎖であり、Ａは、式−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ１Ｒ２ＯＣＯＲ(II)の基であって、Ｒ１およびＲ２はＨまたは低級アルキルであり、Ｒはアルキルまたはアリールであるか、またはＲおよびＲ１は置換または未置換の結合基と一緒になって結合して５または６員環を提供する）を有する。
【００１３】
Ａは、式
−（ＣＨ２）ｎＣＯＯ−ＣＨＲ１ＣＯＯＲ      (I) 
および
−（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＮＨ−ＣＨＸ−ＣＯ）ｍＮＨ−
ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ    (III) 
を有する基、および対応する無水物を表わすこともできる。これらすべての式において、ｎ、ｍおよびｐは（５以下の）小さい整数であって、ｘおよびｙもまた分子量が５０００を下回らないように選択された整数である。
【００１４】
前記のポリマーは、本発明による微小球を作成するのに好適であり、置換基Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＸの性質に応じて、壁の特性である、例えば、強度、弾性および生分解性を制御することができる。例えば、Ｘは、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、イソブチル（ロイシンおよびイソロイシン）、またはベンジル（フェニルアラニン）であることができる。
【００１５】
好ましくは、壁形成材料は、タンパク質性のものである。例えば、それはコラーゲン、ゼラチン、または（血清）アルブミンであることができ、各々の場合にヒト由来のもの（すなわち、ヒトに由来するか、または構造がヒトタンパク質に対応するもの）であることが好ましい。最も好ましくは、献血に由来するかまたは形質転換もしくはトランスフェクションしてヒト血清アルブミン（ＨＡ）を発現させた微生物（細胞系を含む）の醗酵に由来するＨＡである。
【００１６】
ＨＡ（この用語は、ヒトアルブミンの類似物およびフラグメント、例えばＥＰ−Ａ−３２２０９４号明細書に記載のもの、およびモノマー性アルブミンのポリマーを包含する）を発現させる手法は、例えばＥＰ−Ａ−２０１２３９号明細書およびＥＰ−Ａ−２８６４２４号明細書に開示されている。これら総ての文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。ＨＡの「類似物およびフラグメント」とは、(i) 本発明の方法で微小球を形成させることができるポリペプチド、および(ii)そのアミノ酸配列の少なくとも５０％（好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％または９５％）の連続領域がヒトアルブミンの少なくとも５０％（好ましくは、７５％、８０％、９０％または９５％）の連続領域と少なくとも８０％の配列同一性（好ましくは、少なくとも９０％、９５％または９９％の同一性）を有する総てのポリペプチドを包含する。組換えＤＮＡ技術によって産生されるＨＡが、特に好ましい。従って、ＨＡは酵母または別の微生物のＨＡコードヌクレオチド配列を発現させ、生成物を当該技術分野に知られている方法で精製することによって製造することができる。
【００１７】
好ましい態様についての下記の説明では、「タンパク質」という用語を用いるが、他の生物適合性の壁形成材料を前記のように用いることもできることを理解すべきである。
【００１８】
タンパク質溶液または分散液は、好ましくは０．１〜５０％（重量／容量）であり、更に好ましくは特にタンパク質がアルブミンであるときには約５．０〜２５．０％タンパク質である。約２０％が最適である。前記の最後の二文における割合が壁形成材料の総含量となる場合には、壁形成材料の混合物を用いることができる。
【００１９】
噴霧されるべき製剤は、壁形成材料以外の物質、および溶媒またはキャリヤー液体を含むことができる。例えば、水性相は安定剤として糖およびポリマー、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ゼラチン、ポリグルタミン酸、および澱粉、デキストラン、寒天、キサンタンなどの多糖類のような水溶性の親水性化合物１〜２０重量％を含むことができる。同様な水性相をキャリヤー液体として用いて、使用前に最終的な微小球生成物を懸濁させることができる。ほとんどの生理学的に許容可能な乳化剤、例えば卵レシチンまたは大豆レシチン、または合成レシチン、例えばジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、もしくはジステアロイルホスファチジルコリンのような飽和合成レシチンまたはジオレイルホスファチジルコリンもしくはジリノレイルホスファチジルコリンのような不飽和合成レシチン、を用いることができる（０．１〜５重量％）。乳化剤としては、遊離脂肪酸、脂肪酸とポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールのようなポリオキシアルキレン化合物とのエステル、脂肪族アルコールとポリオキシアルキレングリコールとのエーテル、脂肪酸とポリオキシアルキル化ソルビタンとのエステル、石鹸、グリセロール−ポリアルキレンステアレート、グリセロール−ポリオキシエチレンリシノレエート、ポリアルキレングリコールのホモポリマーおよびコポリマー、ポリエトキシル化大豆油およびヒマシ油並びに水素化誘導体、スクロースまたは他の炭水化物と脂肪酸、脂肪族アルコールとのエーテルおよびエステルであって、場合によってはポリオキシアルキル化されたもの、飽和または不飽和脂肪酸、グリセリドまたは大豆油およびスクロースのモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドのような界面活性剤も挙げられる。
【００２０】
添加剤を微小球の壁に配合して、分散性、弾性および水透過性のような物性を改質することができる。
【００２１】
有用な添加剤の中でも、壁を「疎水化」して水透過性を減少させることができる脂肪、ワックス、および高分子量炭化水素のような化合物を挙げることができる。注入可能な液状キャリヤー中における微小球の分散性を改良する添加剤は、リン脂質のような両親媒性化合物であり、これらの化合物は水透過性および生分解性の速度も増加させる。
【００２２】
壁の弾性を増加させる添加剤は、ミリスチン酸イソプロピルなどの可塑剤である。また、極めて有用な添加剤は、壁自身と類似しているが、比較的低分子量のポリマーによって構成されている。例えば、ポリ乳酸／ポリグリコール酸型のコポリマーを壁形成材料として用いるときには、低分子量（１，０００〜１５，０００ダルトン）のポリグリコリドまたはポリラクチドを添加剤として配合することによって壁の特性を有利に改質することができる（柔軟性および生分解性の増加）。また、中〜低分子量のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２０００）も、有用な柔軟化添加剤である。
【００２３】
壁に配合される添加剤の量は、広範に変わるものであり、必要に応じて変化する。幾つかの場合には、添加剤はまったく用いられず、他の場合には、壁の重量の約２０％に達する添加剤の量を用いることができる。
【００２４】
タンパク質溶液または分散液（好ましくは、溶液）（以下、「タンパク質製剤」と呼ぶ）を、直径が１．００〜５０．０μｍの不連続の微小球を生じる任意の好適な手法によって微粒化し、噴霧乾燥する。これらの数値は微小球の個数の少なくとも９０％を指すものであり、直径はCoulter Master Sizer II で測定したものである。「微小球」という用語は空間を取り囲んでいる中空粒子であって、その空間が気体または蒸気で満たされているが、固形材料は全くないものを意味する。「Ｍａｌｔｅｓｅｒｓ」（登録商標）として英国で発売されている菓子に似た蜂の巣状粒子は形成されない。空間が完全に取り囲まれている必要はなく（この方が好ましいが）、また微小球は通常は球形であるが、完全な球形である必要はない。微小球が球形でなければ、前記の直径は非球形の微小球と同じ質量を有し且つ同じ容積の中空空間を取り囲んでいる対応する球形の微小球の直径と関連する。
【００２５】
微粒化は、例えばタンパク質製剤を温暖空気または他の不活性ガスのチャンバー中に加圧下にて少なくとも１個のオリフィスを通して、または遠心アトマイザーを用いて、製剤のエアゾールを形成することからなっている。チャンバーは理想的な十分な大きさを有し、最大の噴射ドロップが乾燥前に壁に当たらないほどのものである。チャンバー内のガスまたは蒸気は、超音波心臓検査法において微小球の投与と共存する量で血流中に投与するとき、清浄（すなわち、無菌且つ発熱性物質不含）、かつ、無毒性である。タンパク質製剤から液体が蒸発する速度は十分に速く、中空微小球を形成するが微小球が破裂するほどの速さではない。蒸発速度はガス流速、タンパク質製剤中のタンパク質の濃度、液体キャリヤーの性状、溶液の供給速度、および最も重要なことには、エアゾールによって得られるガスの温度を変化させることによって制御することができる。水中のアルブミン濃度が１５〜２５％であれば、少なくとも約１００℃、好ましくは少なくとも１１０℃の送入ガス温度が通常は中空にするのに十分であり、温度はカプセルを破裂させることなく２５０℃程度にすることができる。少なくともアルブミンについては、約１８０〜２４０℃、好ましくは約２１０〜２３０℃、最も好ましくは約２２０℃が最適である。この温度は、本発明の方法の一段階法では、壁形成材料の少なくとも一部（通常は外側）、頻繁には壁形成材料の実質的に総てを不溶化するのに十分である。エアゾールによって得られるガスの温度は、ガスを送る速度およびタンパク質製剤の液体含量によっても変化するので送出温度を監視して、チャンバーを適温にしておくことができる。送出温度は４０〜１５０℃が好適であることが判った。しかしながら、このファクターとは異なり、流速の制御は他のパラメーターほど有用ではないことが判った。
【００２６】
二段階法では、中間の微小球は、典型的には９６〜９８％のモノマー性ＨＡを含み、超音波画像形成にはイン・ビボでの寿命が限定されている。しかしながら、中間の微小球は、（少なくとも本発明の微小球の幾つかの用途では）超音波画像形成に用いることができ、またはこれを保存し、かつ、輸送した後二段階法の第二段階を行うことができる。従って、これらは本発明のもう一つの態様を形成する。
【００２７】
二段階法の第二段階では、第一段階で製造した中間の微小球を固定し、そして水溶性を減少させ、これらが不溶性でかつ不活性であるために生分解性ではなくなることのないようにしながら長時間持続するようにする。また、この段階では、微小球を強化して、投与の苛酷さ、血管での剪断、および心室圧に耐えることができるようにする。微小球が破裂すると、エコーの発生が減少する。Schneider el,al, (1992) Invest. Radiol., 27, 134- 139 は、先行技術での音波処理したアルブミン微小気泡はこの強度を持たず、左心室の典型的な圧を加えられるとそのエコー源性（echogenic）を速やかに喪失することを示している。この方法での第二段階では、熱（例えば、従来のオーブン中でのマイクロ波熱、放射熱または加熱空気）、イオン化照射（例えば、ガンマー線１０．０〜１００．０ｋＧｙ）、または例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エチレンオキシドまたは架橋タンパク質用の他の薬剤を用いる化学的架橋を用いることができ、第一段階で形成された実質的に乾燥した中間の微小球上で、または微小球が不溶性である液体、例えば好適な溶媒中にこれらの微小球を懸濁したもので行うのが好ましい。本発明の方法の一段階法では、グルタルアルデヒドのような架橋剤を噴霧乾燥チャンバーに噴霧することができ、または噴霧手段のちょうど上流にあるタンパク質製剤に導入することができる。或いは、チャンバー内の温度を十分高くして、微小球を不溶化することができる。
【００２８】
「長寿命微小球」および「標的設定された微小球」は、所望ならば直径が０．０５〜５０．０μｍ（中間体微小球と同じ方法で測定）の微小球からなり、０．１〜２０．０μｍ、特に１．０〜８．０μｍの範囲が本発明の方法により得られ、超音波心臓検査法に好ましい。本出願人らは、約０．５〜３．０μｍの範囲が低コントラスト画像の生成およびカラードップラー画像形成用いるのに特に好適であるが、約４．０〜６．０μｍの範囲は鮮明な画像の生成に更に好適な場合があることを見出した。第二段階は、第一段階で生成したサイズの決定において微小球のサイズを変更することができることを考慮する必要がある。
【００２９】
本発明の方法を制御して、所望な特性を有する微小球を得ることができることを見出した。例えば、タンパク質溶液を噴霧ノズルに供給する圧を、例えば１．０〜１０．０×１０５Ｐａ、好ましくは２．０〜６．０×１０５Ｐａ、最も好ましくは約５×１０５Ｐａの範囲で変化させることができる。他のパラメーターは、上記および下記のように変化させることができる。この方法により、新規な微小球を得ることができる。
【００３０】
本発明のもう一つの態様では、大型の、寿命の長い、または標的設定された中空の微小球であって、微小球の３０％以上、好ましくは４０％、５０％または６０％以上の直径が２μｍの範囲内にあり、長寿命または標的設定された微小球の場合には、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または９９％、が直径が１．０〜８．０μｍの範囲内にある微小球を提供する。大型の微小球の場合には、対応する直径の範囲は１２〜２５μｍである。
【００３１】
例えば、四分位数間領域は２μｍであり、（長寿命または標的設定された微小球に対する）メディアン直径は、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０または６．５μｍであることができる。
【００３２】
従って、長寿命または標的設定された微小球の少なくとも３０％、４０％、５０％、または６０％は、１．５〜３．５μｍ、２．０〜４．０μｍ、３．０〜５．０μｍ、４．０〜６．０μｍ、５．０〜７．０μｍ、または６．０〜８．０μｍの範囲内の直径を有することができる。好ましくは、前記割合の微小球は、直径が１．０μｍの範囲内であり、例えば１．５〜２．５μｍ、２．０〜３．０μｍ、３．０〜４．０μｍ、４．０〜５．０μｍ、５．０〜６．０μｍ、６．０〜７．０μｍまたは７．０〜８．０μｍである。
【００３３】
本発明のもう一つの態様では、タンパク質性の壁を有する大型で、長寿命の、または標的設定された中空微小球であって、微小球の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または９９％、の直径が１．０〜８．０μｍ（または大型微小球の場合には１２〜２５μｍ）の範囲であり、微小球の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または９９％、の壁厚が４０〜５００ｎｍ、好ましくは１００〜５００ｎｍであり、微小球の壁中のタンパク質が架橋しているものが提供される。
【００３４】
微小球の走査型電子顕微鏡法によれば、微小球は中空球であって、壁以外には固形物を持たないことが判っている。従って、壁厚は顕微鏡法によって測定することができ、次のようにして計算することもできる。噴霧した液滴のそれぞれにおける壁形成材料の質量は、次式によって与えられる。
【数１】
2006273874.tif 000002
【００３５】
但し、ｒｅは液滴の半径であり、ｃは上記濃度である。  本出願人らが検討したところ、液滴の外寸は溶媒を蒸発させてしまってもほとんど変化しなかった。従って、乾燥したマイクロカプセル中の壁形成材料の質量は、次式によって与えられる。
【数２】
2006273874.tif 000003
【００３６】
但し、ｒｅはマイクロカプセルの外径（液滴の外径と同じ）であり、ｒｉはマイクロカプセルの内径であり、ρは壁形成材料の密度である。従って、壁厚はｒｅ−ｒｉによって表わされる。ｒｅという量はコールター・カウンター（Coulter Counter ）を用いてマイクロカプセルを直接測定することによって得られ、ｒｉは式(III) によって与えられる。
【数３】
2006273874.tif 000004
【００３７】
従って、外径５μｍ（外部半径２．５μｍ）、噴霧した溶液の濃度０．２ｇ／ｍｌ（２０％）、および壁密度１．３１ｇ／ｃｍ３（ヘリウムピクノメトリーによって測定することができる）では、壁厚は１３４ｎｍと計算することができる。
【００３８】
本発明の３種類の微小球のいずれかにおけるタンパク質の少なくとも７５％、９０％、９５％、９８．０％、９８．５％または９９％が十分に架橋しており、１％ＨＣｌ溶液中２分間の抽出に耐えるものが好ましい。抽出されたタンパク質は、Bradfordのクーマジーブルータンパク質分析法を用いて検出される。洗浄液中のタンパク質含量は、マイクロカプセルの最初の質量の百分率として表わされる。
【００３９】
架橋度は、タンパク質の加熱、照射、または化学処理を変化させることによって調節する。架橋工程の際に、下記実施例８に示されるようにゲル透過ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動によって検出されるように、タンパク質モノマーは架橋して、単純な溶解法では急速に利用できなくなる。処理を続けると、既に架橋した材料が更に架橋して、前記のＨＣｌ抽出で抽出されなくなる。１７５℃で加熱を行うと、本発明によるｒＨＡ微小球から２０分間の間にＨＣｌで抽出可能なタンパク質約９９％が失われるが、１５０℃で２０分間の加熱では、ＨＣｌで抽出可能なタンパク質が約５％しか失われず、３０分間では４７．５％、４０分間では８３％、６０分間では９３％、８０分間では９７％、１００分間では９７．８％のＨＣｌで抽出可能なタンパク質が失われる。従って、良好な架橋水準を得るには、微小球を１７５℃で少なくとも１７分間（好ましくは２０〜４０分間、最も好ましくは３５〜４０分間）、１５０℃では少なくとも８０分間、また他の温度ではその温度に対応して長めまたは短めの時間加熱することができる。本出願人らは、血清に由来するアルブミンではｒＨＡより架橋に要する時間が短くてよいことを見出した。
【００４０】
本発明の注射可能な微小球は、添加剤の存在下にてまたは非存在下にて乾燥状態で保存し、保存状態を良好にし且つ凝集を防止することができる。添加剤としては、マンニトール、ガラクトース、ラクトース、またはスクロースのような水溶性の生理学的に許容可能な化合物、またはデキストラン、キサンタン、寒天、澱粉、ＰＶＰ、ポリグルタミン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、およびゼラチンのような親水性ポリマーの０．１〜２５重量％から選択することができる。
【００４１】
微小球の凝集をできるだけ少なくする目的で、０．５ｍｍスクリーンを備えたフィッチ遠心ピンミルまたはグレンクレストンエア衝撃ジェットミルを用いて微小球を適当な不活性な賦形剤と微粉砕することができる。好適な賦形剤は、不活性で静脈内で使用するのに適した微細に粉砕した粉体であって、例えばラクトース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、または塩化ナトリウムである。混合終了後、微小球／賦形剤混合物を水性媒質に懸濁して、非機能性／欠陥微小球の除去を容易にすることができる。水相で再構築する場合には、微量の界面活性剤を加えて凝集を防止するのが望ましい。この目的に適当なアニオン性、カチオン性および非イオン性界面活性剤としては、ポロキサマー、ソルビタンエステル、ポリソルベート、およびレシチンが挙げられる。
【００４２】
次に、微小球懸濁液は、使用時に液体が満たされもはやエコー源性でない表面に欠陥を有する欠陥粒子を浮游させるか、または遠心分離を行って、沈降させることもできる。
【００４３】
次いで、微小球懸濁液を再混合して粒子を均等に分布させ、洗浄し、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ０．０１ｍＭトリスｐＨ７．０のような静脈内注射に好適な緩衝液中で再構築することができる。この懸濁液を小分けして、凍結乾燥した後、ガンマー線照射、乾熱、またはエチレンオキシドなどにより滅菌することができる。
【００４４】
不溶化しまたは固定化した微小球を脱凝集する別の方法は、ポロキサマー、ソルビタンエステル、ポリソルベート、およびレシチンから選択される界面活性剤を含む水性媒質にそれらを直接懸濁させることである。その際に、脱凝集は、適当なホモジナイザーを用いて行うことができる。
【００４５】
次いで、微小球懸濁液は、欠陥粒子を浮游させておくことができ、または上記のように遠心分離を行って沈降させ、更に上記のように処理を行うこともできる。
【００４６】
本発明の微小球は乾燥状態で市販することができるが、特に微小球が注射の後一定の寿命を有するように設計されているときには、既製製剤、すなわち微小球を水性液体に懸濁させて注射の準備のできているものを販売することも望ましいことがある。
【００４７】
しかしながら、生成物は、乾燥粉末として供給されて、保存され、投与の直前に適当な無菌であって発熱性物質を含まない液体に懸濁させるのが通常である。
【００４８】
本発明のもう一つの態様では、大型の、長寿命の、または標的化された中空の微小球であって、この微小球を水に懸濁したとき２．６６×１０４Ｐａの圧を０．２５秒間加えても、少なくとも１０％が残り、破裂、崩壊、または水の充満がないものが提供される。ヒトの左心室での通過最大圧は、約２００ｍｍＨｇ（２．６６×１０４Ｐａ）である。上記のように試験を行い、２．６６×１０４Ｐａの圧を０．２５秒間加えた後に５０％、７５％、９０％または１００％が残っていることが、すなわちエコー源性を有していることが好ましい。イン・ビボでは、心臓の両心室を一回通過する間に、エコー源性を有するものが同じ割合となるのが好ましい。
【００４９】
本発明の「大型の」微小球は、この微小球の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または９９％が１０．１〜１９．９μｍ、好ましくは１３〜１８μｍの範囲内の直径を有することを特徴としている。
【００５０】
これらの微小球は、本出願人らの先行特許出願ＷＯ９２／１８１６４号明細書の好ましい微小球に関しておよび本明細書に開示されている長寿命で、かつ、標的設定された微小球の好ましいサイズに関してのみ「大型」であることに留意すべきであり、先行技術の微小球は２５μｍを上回ることが多かった。
【００５１】
本発明の大型の微小球は、噴霧乾燥工程のパラメーターを調節することによって製造することができる。噴霧される液体中の壁形成材料の濃度は前記小型微小球についてのそれと同じであり、すなわち０．１〜５０．０％（重量／容量）（特に壁形成材料がアルブミンであるときには、約５．０〜２５．０％が好ましい）であり、温暖室の温度（１００〜２５０℃、好ましくは２００〜２５０℃）およびこの工程の第二段階も同じであることができるが、噴霧圧は２バール（２×１０５Ｐａ）未満に減少し、好ましくは１．８×１０５Ｐａ、１．５×１０５Ｐａまたは１．３×１０５Ｐａ以下である。１×１０５Ｐａの最小圧が好ましい。
【００５２】
本発明の大型の微小球は、微小循環の低灌流(underperfusion)部位を描写する沈着エコーコントラスト剤(deposit echocontrast agent)として用いるのが好適である。本出願人らは、平均サイズが１５．０μｍの微小球のエコー源性は、平均サイズが５．０μｍの同様な微小球のエコー源性の約４．６×１０４倍であることを見出した。従って、比較的低投与量を用いて、通常の超音波技術では得られない体内の深部を画像形成することができる。これらの微小球は、これらを肝臓、腎臓または冠状血管の毛細管などに送り込むためのカテーテルを用いて既知の手法によって送り込むことができる。古典的な放射能標識した微小球による検討と比較すると、動脈へ投与し、カテーテルを抜き取り、患者が安定した後、複数の平面画像を撮って、心筋層または同様な毛細血管床の三次元灌流マップを作成することができる点で有利である。冠状動脈疾患を有する患者において、血管造影のときにこの微小球を直接冠状動脈注射した後心臓の画像形成を行うことによって、局部的な心筋層の血流を定量的に測定することができる。これらの微小球は、冠状循環の最初の通過の際に心臓の微細脈管構造に取り込まれる。毛細血管または細動脈のごく一部が塞栓されるだけであるので、検知され得るほどの血流力学または電気生理学的悪影響はないものと考えられる。心筋の損傷部位または閉塞したもしくは重度に狭窄した冠状動脈によって供給される部位において左心室心筋層の部位への栄養血流が減少すると、この部位に送られる微小球の数が減少する。これは、局部的低灌流によって引き起こされる活性の焦点的減少(focal reduction) と認められる。微小球は動脈に導入されるので、肺の毛細血管での微小球の除去は回避されるからである。
【００５３】
血管造影に関しては、カテーテルを大腿動脈に挿入することによって左心室内に入れる。Ｘ線不透明化染料を左心室および大腿動脈自身に注入する。これらの薬剤を注入して三次元情報を二次元平面に投影することによって、直径が１００μｍまでの血管を透視することができる。現在用いられている血管造影法では、主要な冠状動脈の狭窄を同定することができる。
【００５４】
本発明の大型の微小球を超音波技術で用いることによって、多重断層撮影画像を生成させることができ、また画像の三次元構築を行うこともできる。微小球を十分な時間沈着（deposit)させて血管床の断層撮影画像を生成させまたは三次元再構築を行うことができるようにすることにより、灌流床を描写することができる。従って、主要な原因となる損傷を同定するための血管造影法の補助的手段としての本発明の大型微小球によって構成される沈着エコーコントラスト剤により、三次元灌流領域を同定することができる。
【００５５】
好ましい微小球は圧に対して安定であるため、これらの微小球は空気を保持しており、実質的な期間エコー源性を保持している。古典的な微小球による研究と同様な方法でカテーテル投与を行った後、微小球を脈管構造に沈着させて、所定の灌流領域への流量を反映することができる。次に、カテーテルを引き抜いて患者を安定化した後、この領域の画像形成を行うことができ、多重平面での更に最適な画像を収集することができる。ベースラインを強化していない画像と比較することにより、補正作業の後に灌流を評価することができる。
【００５６】
微小球のサイズおよび圧安定性を操作することによるだけでなく、その生分解性の速度によっても、微小球を冠状動脈内用に調製することができる。
【００５７】
冠状動脈内で使用するには、大型（１０〜２０μｍ）のマイクロカプセルを１７５℃で１８〜６０分間架橋するのが好ましく、更に好ましくは２０〜４０分間、最も好ましくは３５〜４０分間架橋させる。これによって、ＷＯ９２／１８１６４号明細書に記載のマイクロカプセルと比較して耐圧性を有するが組織内半減期が短縮され、従って心筋層の微小循環での使用に一層適当なマイクロカプセルが得られる。組織内半減期は、クロラミンＴ法によってマイクロカプセルを125Ｉで標識し、かつ、剖検または125Ｉの尿および糞便への放出により臓器におけるマイクロカプセルの含量を評価することによって測定することができる。
【００５８】
本発明の「標識設定された」微小球は、その壁内または上に、微小球を所望な体内の部位に対して向けまたは標的設定するある材料を有することを特徴とする。
【００５９】
本発明の「標的設定された」微小球は、微小球の壁内または上に、微小球の電荷を変化させる材料を含有させることによって製造することができる。
【００６０】
例えば、正または負電荷は、正または負に帯電した材料をそれぞれ加えることによって付与することができ、または正または負の電荷を減少させまたは除くことによってもできる。これらの効果は、様々な方法で得ることができる。上記の基本的な一または二段階工程によって製造される最終生成物である（すなわち、耐圧性の）微小球を、上記のようにして微粉砕し、正または負に帯電した材料（ポリマー性の場合には１〜３０ｋＤ、好ましくは５〜１５ｋＤ）の０．５〜２０．０％（重量／容量）溶液（好ましくは１．０〜１０．０％（重量／容量）、例えば約５％）中、微小球濃度が１．０〜２５０×１０６／ｍｌで再懸濁させ、５〜３０℃（好ましくは、約２０℃）で５〜６０時間（好ましくは、約８〜２４時間）インキュベートすることができる。正に帯電したポリアミノ酸としては、ポリリジン、ポリアスパルトアミド、ポリアルギネート、およびポリヒスチジンが挙げられる。負に帯電したポリアミノ酸としては、ポリグルタメートおよびアスパルテートが挙げられる。他の負に帯電したポリマーとしては、リン脂質、ヒアルロン酸、およびポリグルコン酸が挙げられる。このようなコーティングを施されたエコーコントラスト剤は、貯留血液のエコー源性を増加させ、ドップラーシグナルのシグナル増強を行うことができる点が有利である。
【００６１】
或いは、更に好ましくは、微小球上の正または負電荷は、この材料を噴霧乾燥供給原料に１〜３０％、好ましくは２〜１０％（重量／容量）の範囲で配合することによって増加させることができる。この後者の方法は、ポリグルタメートおよび一般的には負に帯電した添加剤について特に好ましい。
【００６２】
同様の方法を用いて負電荷を付与することができる他の材料としては、酢酸、フマル酸、およびコハク酸のようなＣ１〜10有機酸の無水物および塩化物が挙げられる。この塩化物または無水物の最終濃度は、ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフランのような非極性溶媒中では一般的には５〜１，０００ｍｇ／ｍｌが好適である。インキュベーション時間は、５〜３０℃、好ましくは約２０℃では０．５〜５時間、好ましくは約１時間が好適であり、その後過剰の水で洗浄する。
【００６３】
基本的な噴霧乾燥法で製造した微小球上にある負電荷は、微小球をＮ−エチル−Ｎ′（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）のようなカルボジイミド剤に約５〜１，０００ｍｇ／ｍｌの濃度で５〜３０℃（好ましくは約２０℃）で約５〜３０時間（好ましくは、約１６時間）の時間暴露することによって除去することができる。次いで、更にインキュベーションを行う際に、過剰の試薬を例えばエタノールアミンで等濃度まで消滅させた後、微小球を洗浄する。
【００６４】
微小球の電気泳動の移動度は、マルベルン・ツェーターサイザー（Malvern Zetasizer)またはペン・ケム装置（Pen Kem System）３０００（米国）ミニ電気泳動セル中で、例えばｐＨ４〜１０の緩衝液中で２０個の粒子について評価することができる。電気泳動の移動度は、±０．００１〜５．０×１０-8ｍ／秒／ｖ／ｃｍの範囲であるのが好ましい。これらの範囲では、微小球上の循環挙動は、その電荷によって変化する。更に好ましくは、移動度は±０．０１〜０．５×１０-8ｍ／秒／ｖ／ｃｍの範囲であり、±０．１〜０．５×１０-8ｍ／秒／ｖ／ｃｍの範囲であるのが好適である。
【００６５】
微小球上の電荷を変化させるこれらの総ての方法では、生成する微小球は最終的には、前記のように、例えばマンニトール／Pluronic F68溶液に微小球を懸濁させ、フラッシュ凍結させ、および凍結乾燥させ、保存に適するように処方することができる。
【００６６】
微小球の表面電荷は、イン・ビボでの粒子の代謝経路に影響を及ぼすことにより、生成物の画像形成特性に影響を与えることができる。例えば、静脈内注射の後、負に帯電したポリスチレン粒子は肝臓で高率で吸収されるが、正に電荷を有する粒子は最初に肺に蓄積することが知られている。また、内皮細胞表面は生理学的ｐＨ値では真の負電荷を有するグリコカリックスでコーティングされていることが知られている。従って、内皮の内部表面は真の正電荷を有するコロイド状鉄粒子で染色することができる。それ故、末梢血管系、肝臓、腎臓および心筋層の毛細血管床で見られるような低または緩流の部分では、マイクロカプセルシェルおよび内皮ライニング上の正味の正電荷が増加することにより、微小循環内の通過が妨げられるようになることがある。これにより、静脈内投与の後に微小血管系の分析用の拡大した画像形成ウインドウまたは沈着エコーコントラスト剤が得られる可能性が生じる。
【００６７】
「長寿命」微小球は体内での循環時間が大きく、例えば血清ｔ1/2は少なくとも５分、好ましくは少なくとも１０分であり、最も好ましくは少なくとも１５分である。このように循環時間の増加は、微小球を網状−内皮系から離れさせる材料で微小球をコーティングすることによって得ることができる。
【００６８】
イン・ビボでのｔ1/2 は、公知のクロラミンＴ法を用いてマイクロカプセルを125Ｉで標識し、これを下記の具体例１０に概略説明されているように雄性の成熟したニュージランドウサギの耳静脈に投与することによって評価することができる。 125Ｉの血清中濃度は、ガンマーカウンターによって測定する。
【００６９】
例えば、前記の材料は、「オプソニン作用」、すなわちタンパク質性材料（例えば、フィブリノーゲン）の微小球への沈着を減少させまたは実質的に妨げるものであることができるので、微小球を肝臓および脾臓から離れさせることができる。微小球をコーティングするのに好適な材料としては、ポロキサマー系のブロックコポリマー（すなわち、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシドコポリマー）、例えばポロキサマー３３８、ポロキサマー４０７およびポロキサマー９０８が挙げられる。
【００７０】
耐圧性の高い、空気含有マイクロカプセルの循環半減期を長くすることによって、毛細管床のような流速の極めて低い部位は、強化したドップラー研究よりも検出可能である。肝細胞癌、腎臓癌および乳癌による異常血流はドップラー法を用いることによって検出することができる。通常、大きめの悪性腫瘍ではシグナル変化が極めて大きく、異常ドップラーシグナルは小さめの腫瘍では検出が更に困難になる。例えば、悪性の乳癌では、移動する散乱装置のエコーが定常的な固形組織のエコーによって「希釈」されてシグナル強度が低くなることが、小さな腫瘍の検出を制限している一つの要因である。腫瘍流のドップラー検出のための一つの基準は、新生血管形成の後の血管の空間分布の不均一度である。コントラストを強めることにより、小さな血管を表示することができるので、カラードップラー研究におけるこの基準の有用性が増す。この薬剤は、腫瘍および正常な血管の両方での後方散乱を強めることができる。血液反射率が増加することにより、胸部、肝臓、腎臓、膵臓、および卵巣のような臓器での小さな腫瘍の検出および識別が向上する。
【００７１】
また、超音波コントラスト剤を用いることによって、正常な血管系の部位を腫瘍や壊死の存在により血流が減少しまたはなくなった部分から識別することが容易になる。異常と思われる部位における正常な実質組織の動脈流を表示することによって、正常な実質組織を擬似腫瘍（Bertinの肝または腎柱の焦点脂肪浸潤（focal fatty infiltration) ）から識別することが容易にすることができる。超音波コントラスト剤は、動脈血からのエコーを増強して、虚血または閉塞の検出を行うこともできる。部分的閉塞の場合には、血流はドップラー検出に十分な速さであることが多いが、狭窄を通過する血液量（組織減衰によって、シグナル強度を決定する）は、現在用いられているドップラー装置で検出するのに十分な量ではないことがある。ある種の環境では、反射体の数を増加することによって、狭窄部位を描写することができる。コントラスト剤を用いることにより、閉塞や重度の狭窄によって引き起こされる側副枝を映像化することもできる。
【００７２】
長寿命の微小球は、前記の標的設定された微小球と同様な方法、すなわちコーティング材料を噴霧乾燥した微小球の懸濁液に適用した後、それらを凍結乾燥しまたはスプレー供給原料に混合することによって製造される。
【００７３】
本発明の微小球の懸濁液は、通常は肘静脈または他の血管などの適当な静脈中に約１．０〜１０．０ｍｌを注射することによって投与する。微小球濃度は、約１．０×１０５〜１．０×１０12個／ｍｌが適当であり、約５．０×１０５〜５．０×１０９が好ましい。
【００７４】
超音波画像形成は、様々な動物およびヒト体内の臓器系に適用することができるが、その主要な用途の一つは心筋組織および灌流または血流パターンの画像を得ることにある。
【００７５】
これらの手法では、スキャナーおよび画像形成装置からなる超音波走査装置を用いる。この走査装置により、所定部位、本発明の場合には人体の心臓領域の可視画像が得られる。典型的には、画像形成を行う部位の皮膚に直接トランスデューサーを置く。スキャナーには、超音波トランスデューサーなどの各種の電子素子が収納されている。このトランスデューサーによって超音波が発生し、これが心臓領域のセクタ走査を行うのである。超音波は心臓領域の様々な部分によって反射され、当該技術分野で知られているパルス−エコー法に従って処理される。処理の後、シグナルは画像形成装置（これも当該技術分野で周知である）に送られて、映像化される。
【００７６】
本発明の方法では、患者を「準備」し、スキャナーを所定位置に置いた後、微小球懸濁液を、例えば腕静脈から注射する。コントラスト剤は静脈内を流れて心臓の右静脈側に達し、主肺動脈を通って肺へ達し、毛細血管を通って肺を通過し、肺静脈へ入り、最終的に心臓の左心房および左心室腔へ入る。
【００７７】
本発明の微小球を用いると、血液が肺を通過するのに要する時間、血流パターン、左心房のサイズ、（左心房と左心室を隔てる）僧帽弁の受容能、左心室腔の室の大きさ、および壁の運動の異常に関する観察および診断を行うことができる。左心室からコントラスト剤を放出することにより、大動脈弁の受容能を分析することもでき、また左心室から放出される容積の放出画分または割合を分析することもできる。最後に、組織におけるコントラストパターンによって、どの部分が十分に灌流されていないかが表わされる。
【００７８】
要約すると、このような画像のパターンを用いると、心臓内部の異常な血流特性、弁の受容能、室サイズ、および壁の運動の診断が容易になり、心筋層の灌流の有力なインディケーターが提供される。
【００７９】
この微小球により、静脈内注射からの左心臓の画像形成を行うことができる。アルブミン微小球を末梢静脈に注射することにより、肺動脈通路を画像形成することができる。これにより、左心室（ＬＶ）腔並びに心筋組織の超音波心臓検査法による不透明化（opacification)が生じる。
【００８０】
上記において簡単に説明したスキャナーの外に、他の超音波スキャナーがあり、その例は米国特許第４，１３４，５５４号および第４，３１５，４３５号明細書に開示されており、前記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。基本的には、これらの特許明細書は、運動している器官を動的に映像化するのに十分なフレーム速度の超音波エネルギーによって、動物またはヒトの解剖学的組織の横断面切片の連続した二次元画像を作成する動的横断面エコーグラフィー（ＤＣＥ）などの各種の技術に関する。ＤＣＥに用いられる種類の装置は、一般にＤＣＥスキャナーと呼ばれており、幅の狭いビームまたは線の形態の短い音波のパルスを発信したり、受信したりする。反射したシグナルの強度は時間によって変化し、名目上の音速を用いて所定の位置に転換され、レーダーまたはソナーディスプレイに幾分類似した方法で陰極線管または他の適当な装置に映し出される。ＤＣＥは肝臓、胆嚢、膵臓、および腎臓などの多数の臓器系の画像を形成するのに用いることができるが、これは心臓の組織および主要な血管の映像化に用いられることも多い。
【００８１】
微小球は、抹消静脈に注射したときでも、広汎な部位を画像形成するのに用いることができる。これらの部位としては（下記のものに限定されないが）、(1) 心臓への静脈ドレナージ系、(2) 運動踏み車試験などの際の心筋組織および灌流特性、および(3) 組織への血流を増加させるように設計された薬剤を経口摂取または静脈内注射した後の心筋組織が挙げられる。また、微小球は、(1) 冠状動脈性静脈の移植、(2) 冠状動脈の血管形成（狭められた動脈のバルーンによる拡張）、(3) 冠状動脈中の血栓を溶解するための血栓崩壊剤（例えば、ストレプトキナーゼ）、または(4) 最近の心臓発作による潅流の欠陥または変化などの介在（intervention) による心筋組織の灌流における変化を描写するのに用いることもできる。
【００８２】
更に、冠状血管造影（またはデジタルサブストラクション血管造影）を得る場合には、微小球を注入すると、血管の構造だけを明らかにする血管造影図の方法から得られるデーターを増強しかつ補う組織灌流特性に関するデーターを得ることができる。
【００８３】
本発明の微小球を用いることにより、超音波技術によって現在画像形成される肝臓、脾臓、および腎臓などの他の心臓以外の臓器系は、現在得られる画像を増強することおよび／または先行技術による超音波画像形成法を用いて画像形成され難かった灌流および流動特性を示す新たな画像を得ることに好適な場合がある。
【実施例】
【００８４】
本発明の好ましい態様を、実施例および図面により説明する。
【００８５】
一般製造例１
適当な噴霧乾燥装置（第１図）は、Niro Atomizer 株式会社、ゼーボルグ、デンマーク、から「ＭｏｂｉｌｅＭｉｎｏｒ」という商品名で発売されている。その構造の詳細については、請求の範囲の直前に示されている。これは、遠心アトマイザー（Ｍ−０２／Ｂ  Ｍｉｎｏｒ型）からなり、最小４バールから最大６バールまでの空気圧で空気タービンによって駆動される。６バールでは、アトマイザーのホイール速度は約３３，０００ｒｐｍに達する。アトマイザーへの圧縮空気の送り込みおよび停止は、計器パネルに置かれた弁によって行う。圧縮空気のアトマイザーへの最大消費量は、６バールの圧では１７Ｎｍ３／時である。液体供給材料および粉体と接触する総ての部品は、高遠心力に耐えるように作られているステンレス鋼ＡＩＳＩ３２９製ポンプ供給管およびアトマイザーホイール以外は、ステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製である。ステンレス鋼を相互に連結するパイプ装置４は、簡単に取り外して洗浄することができる。
【００８６】
乾燥室の内側はステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６から作られており、ロックウールで十分に絶縁されており、外側は軟鋼板で被覆されている。乾燥室は、操作中に監視を行うための側窓および観察窓および乾燥室の最上部へ近付くための踏段５を備えている。乾燥室の屋根は、内側がステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製であり、外側がＡＩＳＩ３０４製である。乾燥室の蓋を持ち上げるときには、空気リフト装置を活性化するための空気弁のスイッチ６がある。
【００８７】
ステンレス鋼ＡＩＳＩ３０４製の空気分散装置２を用いて乾燥室の空気を分布させ、最良の乾燥効果が得られるようにする。渦巻空気は、羽根の着いたディスクアトマイザーの回りに向けられる。ステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製の空気ダクトは排気および粉体をＡＩＳＩ３１６製で粉体および空気を分離するように設計されたサイクロン７に横方向に輸送する。
【００８８】
ステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製であってシリコーンゴムのガスケットを有する蝶形弁の閉鎖弁を用いて、サイクロン下でばね装置によってサイクロンの下にしっかりと設置された粉体収集ガラスジャー８に粉体を排出する。
【００８９】
シルミン製であり、０．２５ｋＷの３相籠型モーターとベルトガードを有するＶベルトドライブとを備えた遠心排気ファン１０により、乾燥室およびサイクロンを通って空気と粉体とが引かれる。ダンパーを介して気流調節を行うためのスイッチ１１がある。
【００９０】
空気加熱装置１２は電流（総消費量７．５ｋＷｈ／ｈ、無限可変）によって乾燥空気を加熱し、取入空気温度を約３５０℃まで加熱することができるが、この温度は通常は本発明の微小球を製造するには高すぎる。
【００９１】
蒸発容量は下記の通りである。
【表１】
2006273874.tif 000005
【００９２】
ステンレス鋼ＡＩＳＩ３１６製で、ノズルホルダーとノズルを有する入口パイプからなり、乾燥室の天井に配置される二流体ノズル噴霧を行う装置を加えることができる。この装置は、油／水分離装置、二流体ノズルに対する圧縮空気の減圧弁および圧ゲージを有する。圧縮空気の消費量：０．５〜２．０バール（０．５〜２．０×１０５Ｐａ）の圧で８〜１５ｋｇ／時。
【００９３】
壁形成材料を貯蔵装置１からアトマイザーノズル３への輸送するのに好適な供給ポンプは、蠕動ポンプである。このポンプはモーター（１×２２０Ｖ、５０Ｈｚ、０．１８ｋＷ）と手動調整用の連続可変ギアを備えている。シリコーンホース製の供給パイプは、供給タンク（局所供給）１から供給ポンプを通ってロータリーまたはノズルアトマイザー装置３へと続いている。
【００９４】
プレフィルター、ステンレス鋼のフィルター本体、および絶対エアーフィルターからなる絶対エアーフィルターを用いて流入乾燥空気を処理して、これを完全に清浄にする。装置全体は、計器板９で制御される。
【００９５】
無菌の発熱性物質を含まないｒＨＡを発熱性物質を含まない水（注射用に好適）に溶解した２０％溶液を、前記の市販の噴霧乾燥装置に配設した二流体ノズルアトマイザーのノズルに送液した。蠕動ポンプ速度を約１０ｍｌ／分の速度に保持して、入口空気温度が２２０℃では出口空気温度が９５℃に保持されるようにした。
【００９６】
圧縮空気を、２．０〜６．０バール（２．０〜６．０×１０５Ｐａ）で２種類の流体噴霧ノズルに供給した。この範囲では、平均サイズが４．２５〜６．２μｍの微小球が得られた。
【００９７】
典型的には、平均粒子サイズ（換算噴霧圧による）が増加すると、サイズが１０μｍを上回る微小球の量が増加する（第１表を参照）。
【表２】
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【００９８】
本発明の方法の第二段階では、微小球５ｇをGallen- kampファンオーブンを用いてガラスビーカー中で加熱した。１７５℃で１時間は、ＨＰＬＣで測定したところ、１００％固定された微小球を生成させるのに十分であった。この熱固定の効果は、イン・ビトロでのエコー源性半減期を数秒から３０分を超過するまで増加させることであった。インキュベーションの温度および長さを変化させることによって、固定度を約５％と１００％の間で変化させることが可能である。様々な温度での熱固定曲線の例を、第２図に示す。
【００９９】
熱固定の後に、微小球を２つの方法の一方で水に解凝集し、分散させた。方法１は、最初に熱固定した球を、等重量の微細に粉砕したラクトース（平均直径５μｍ）と混合することを含んでいた。次に、混合物を０．５ｍｍのスクリーンと１２個の歯を有するローターを有するFritscn 遠心ミルを通過させた。微粉砕した球を集め、ミルを２回目に通過させ完全に混合するようにした。次に、微粉砕した粉体を１ｍｇ・ｍｌ-1のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含む水に再懸濁させた。典型的には、微小球およびラクトース１０ｇを、水およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  １００ｍｌに加えた。解凝集の方法２は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  １００ｍｇを含む水１００ｍｌに熱固定した微小球５ｇを加えることを含んでいる。微小球を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモゲナイザー（２．５４ｃｍの管状の均質化用プローブと高剪断スクリーンとを有するモデルＬ４Ｒ）を用い、６０秒間ホモゲナイズして分散させた。
【０１００】
再懸濁した球を、浮游技術を用いて完全な（ガスを含む）球と、破壊された球とに分割した。ガスを含む球は、表面に１時間以上浮游することが認められ、所要なガスを含まない沈降した画分から傾瀉によって分離した。
【０１０１】
分離法は、遠心分離によって促進することができる。５，０００×ｇで３０秒間の遠心分離は、２つの画分を分離するのに十分である。
【０１０２】
分離の後、完全な微小球をラクトースおよびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の存在下にて凍結乾燥した。凍結乾燥の最適条件は、微小球３０ｍｇを、ラクトース５０ｍｇとＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８  ５ｍｇとを含む水５ｍｌに再懸濁することを含んでいた。凍結乾燥した微小球を液体（例えば、水、食塩水）に再分散させて、単分散分布を得ることができる。
【０１０３】
一般製造例２
第一段階で下記の差異を有することを除き、一般製造例１の方法を繰り返した。すなわち、二流体ノズルの代わりに遠心噴霧装置を用い、入口温度は１５０℃であり（出口空気温度は、１０５℃に保持されたまま）、圧縮空気を１．０〜６．０×１０５Ｐａでノズルに供給した。ホイールは２０〜４０，０００ｒｐｍで回転し、液滴、続いて数平均直径が１．０〜８．０μｍの範囲の微小球を送り出した。
【０１０４】
一般製造例３
一般製造例１または２の方法の第二段階を下記のように変えた。微小球の少量（０．５ｇ）を短波オーブン中で加熱して、微小球が２５００ｍＨｚで３００〜３５０ワット時の短波を受けるようにした。これにより、モノマー性のｒＨＡの９０〜９５％が不溶性である（ゲル透過クロマトグラフィにより測定）微小球を生じ、この熱固定の結果としてイン・ビトロでのエコー源性の半減期は数秒から３０分を上回るまで増加した。
【０１０５】
一般製造例４
一般製造例１または２の方法の第二段階を下記のように変えた。微小球の少量（０．５ｇ）を、ガラスバイアル瓶中でアルゴン下でシールした。バイアル瓶を４℃まで冷却した後、60Ｃｏガンマー線源で照射し、ガンマー線１５．０ｋＧｙの線量を照射した。照射の結果、モノマー性アルブミンの１０〜１５％が不溶性である微小球が形成された。
【０１０６】
一般製造例５
一般製造例１または２の方法の第二段階を下記のように変えた。微小球の少量（０．５ｇ）を、ガラスバイアル瓶中でアルゴン下でシールした。バイアル瓶を４℃まで冷却した後、60Ｃｏガンマー線源で照射し、ガンマー線の線量１５．０ｋＧｙを微小球に照射した。照射の後、微小球を５０℃で酸素中で６時間インキュベーションした。照射の結果、モノマー性ｒＨＡの５０〜６０％が不溶性である微小球が形成された。
【０１０７】
一般製造例６
一般製造例１または２の方法の第二段階を下記のように変えた。
【０１０８】
微小球の少量（０．５ｇ）を、ａ）１．５％グルタルアルデヒド、ｂ）２．０％塩化ジフタロイル、またはｃ）５．０％ホルムアルデヒドを含むエタノール、クロロフェン、または塩化メチレン５ｍｌに再懸濁した。微小球を１０分〜３時間の様々な時間撹拌した。微小球を濾過によって取り出し、５％エタノールアミンを含む最初の有機緩衝液で十分に洗浄し、過剰の架橋剤を除去した。最後に、微小球を有機溶媒で洗浄して、真空乾燥して、残りの溶媒を除去した。この方法により不溶化の程度を５から１００％まで変化させることができ、イン・ビトロでのエコー源性の半減期を１〜２分から１時間以上まで延長させることができる。
【０１０９】
一般製造例７
微小球形成およびシェルの不溶化の２つの独立した段階を単一工程にまとめることができる。この製造例では、微小球の形成とポリマー性材料の不溶化を噴霧乾燥工程の際に同時に行った。
【０１１０】
ｒＨＡの溶液を小さな反応室に蠕動ポンプによって供給し、別の供給ラインでグルタルアルデヒド、塩化ジフタロイル、またはホルムアルデヒドのような適当な架橋剤の５％溶液を供給した。反応室での滞留時間を調整して、架橋剤と胆汁酸との間の最初の付加生成物が形成されるがタンパク質内の架橋は妨げられるようにした。反応容器の出口を、揮発性溶媒を扱うことができる特に適合した噴霧乾燥装置に配設した二流体ノズルアトマイザーに直接送り込んだ。噴霧乾燥の条件は、一般製造例１に記載した場合と同じであった。微小球を室温で乾燥状態でインキュベーションして、タンパク質内架橋生成物を形成させた後、５％エタノールアミンを含むエタノールに再懸濁して、残っている架橋剤を不活性化した。微小球を十分に洗浄し、最後に微小球を真空乾燥して、残りの溶媒を除去した。
【０１１１】
一般製造例８：  微小球における遊離のモノマー性ｒＨＡの分析
エタノール１ｍｌを２０ｍｌガラスボトル中で微小球１００ｍｇに加え、３０秒間音波処理した。この懸濁液にＨ２Ｏ１９ｍｌを加えた。
【０１１２】
混合物をベンチトップ型微量遠心分離機(microfuge) (Gilson)中で２０秒間遠心分離し、透明な画分を分析した。分析は、この画分５０ｍｌをＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ６Ａ  ＨＰＬＣ上に自動的にのせ、ＴＳＫゲル透過カラム上でリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて１ｍｌ・分-1の流速でクロマトグラフィ処理を行うことによって行った。
【０１１３】
ｒＨＡモノマーを現すピーク高さを記録して、これを用いて、１〜１０ｍｇｍｌ-1のモノマー性ｒＨＡの標準曲線を用いてモノマーの濃度を測定した。遊離のモノマー性ｒＨＡの比率を、固定した微小球中のモノマー濃度を測定し、この数値を未固定の微小球のモノマー濃度の比率として表すことによって算出した。結果を、第２図に示す。
【０１１４】
（一般製造例１で記載したのと同じ）オーブン中で噴霧乾燥した微小球を加熱したところ、検出することができるモノマーの量が減少した（第２図参照）。検出可能なモノマー性ｒＨＡの減少はモノマー性ｒＨＡが変性および架橋により不溶性ポリマーとなり、これを前記ＨＰＬＣ法により分析することができない。
【０１１５】
ＨＰＬＣ法を用いてｒＨＡモニター濃度を測定すると、第２図から、１５分間インキュベーションを行った後ではｒＨＡ微小球中に遊離のモノマー性ｒＨＡは含まれないことは明らかである。しかしながら、ｒＨＡ微小球を更に長時間加熱することによって架橋することも可能である。
【０１１６】
この長時間の加熱により、微小球の架橋度が増加し、これにより更に耐圧性である強度が増した微小球が生成する。
【０１１７】
インキュベーションの温度および時間を慎重に制御することによって、架橋（従って、耐圧性および生分解性）の範囲が制御された微小球を製造することが可能である。
【０１１８】
一般製造例９：  １７５℃でのインキュベーション時間のｒＨＡ微小球の耐圧性に対する効果
本発明の方法の最初の噴霧乾燥段階からのｒＨＡ微小球のバッチを５ｇずつに小分けし、第３図に示されるように様々な長さの時間１７５℃で加熱した。
【０１１９】
熱固定の後、遊離モノマーの量を一般製造例８に記載したのと同様に測定した。示されたインキュベーションのそれぞれについて、モノマー性ｒＨＡは検出されなかった。
【０１２０】
熱固定した微小球を（前記と同様の）Ｆｒｉｔｃｈ遠心ミルを用いて離解させ、前記の浮游法によって完全な空気を含む微小球を回収した。回収した微小球を、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（１ｍｇｍｌ-1）を０．５×１０８カプセル・ｍｌ-1の濃度で含むＨ２Ｏに懸濁させた。
【０１２１】
再懸濁した空気を含む微小球を、この懸濁液を密封容器（２５ｍｌポリスチレン容器）に入れたまま５０ｍｌ注射器で加圧することによって大気圧を増加させた。
【０１２２】
測定した圧のそれぞれに対して、個々の微小球懸濁液を選択した圧に加圧し、この圧に５秒間保持した後圧を解放した。分析したそれぞれの懸濁液について、圧増加は３回とした。密封容器の圧は、ＲＳ型の手に持ったマノメーターで測定した。
【０１２３】
加圧の後、微小球懸濁液を光学顕微鏡法および画像分析で測定し、空気を含む微小球の空気を含まない微小球に対する比率を測定した。空気を含む微小球だけが超音波エコーコントラストの増加で機能的であるので、この分析を行った。
【０１２４】
第３図に示すことができるように、一般製造例１に記載したような１７５℃で６０分間固定した微小球は、この実験で加えた総ての圧で安定である。
【０１２５】
この特定の温度（１７５℃）でインキュベーションの長さを慎重に制御することによって、様々な架橋度を有し、様々な圧増加度にも耐える微小球のバッチを生成することができる。
【０１２６】
インキュベーションの長さおよび温度を調節することによって架橋を慎重に制御すると、所定の圧増加に耐えるように具体的に設計された空気を含む微小球のバッチを生成することができる。
【０１２７】
微小球を架橋するのに用いた温度は、インキュベーション時間の長さを無限に変化させることができるのと同様に、無限に変化させることができる。
【０１２８】
一般製造例１０：  微小球の分類
本発明の方法の利点は、微小球のメジアンサイズおよびサイズ分布を制御することができることである。しかしながら、所望であれば、例えば浮游により更に所望なサイズを選択することができる。微小球の均質な分散液では、大きな粒子は密度が低い（空気を多く取り込んでいる）ので、小さな粒子より速やかに表面に上昇する。従って、分散液を放置することによって、粒子サイズ分布は任意の水準の溶液で時間により変化する。
【０１２９】
微小球を、約１６５ｍｍの液体カラムを与えるガラスボトルに６％（重量／容量）塩化ナトリウムおよび０．１％（重量／容量）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含む水溶液２０００ｍｌ中に分散させた。試験管を上部液体表面の５０ｍｍ下に置き、所定の時間間隔で試料を採取することができるようにした。
【０１３０】
放置時間および塩化ナトリウム濃度を変化させることによって各種の粒子サイズ分布を生成させ、２μｍまでの微小球を分類することができた。
【０１３１】
他の湿式分類法としては、水力学的クロマトグラフィおよびフィールド・フロー(field flow)分画法が挙げられる。傾瀉およびクロス・フロー(cross flow)分離の原理を用いる「乾式」法は、Ｍｉｃｒｏｓｐｌｉｔ(British Rem.)、Ｚｉｇ−ｚａｇ(Alpine)、およびＴｕｒｂｏ(Nissuin) 分類装置の形態で市販されている。Nittetsu Mining Co製のエルボー・ジェット分類装置(elbow jet classifier)では異なる原理（コアンダ効果）を用いており、この方法でも微小球の分類について良好な結果を得ることができた。
【０１３２】
具体例１
ヒトアルブミンの溶液（５％（重量／容量））を、一般製造例１と同様にして２２０℃の入口温度および１．５バールの空気圧で噴霧乾燥する。生成する粒子を、空気オーブン中で１７５℃で２０分間熱固定する。試料をマンニトールと共に混練することによって脱凝集化し、粒子を１０ｍｇ／ｍｌのマンニトールおよび０．０６ｍｇ／ｍｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８の溶液に再懸濁する。完全な粒子を選別し、微小球懸濁液を凍結乾燥する。
【０１３３】
空気を含みかつ実質的に耐圧性である主として１０〜２０μｍの粒子が得られる。
【０１３４】
具体例２
５％（重量／容量）の濃度のポリリジンを一般製造例２の微小球（１００×１０６個／ｍｌ）と共に再懸濁して、２０℃で一晩インキュベーションした。マンニトールとＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を具体例１に記載の濃度で加えた後、懸濁液を瞬間凍結して、凍結乾燥した。
【０１３５】
具体例３
５％（重量／容量）の濃度のヒアルロン酸を、２０℃で一般製造例１と同様に製造した再懸濁した微小球（１００×１０６微小球／ｍｌ）と一晩インキュベーションした。マンニトールおよびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８をそれぞれ１０および０．０６ｍｇ／ｍｌの濃度まで加えた後、懸濁液を瞬間凍結して、凍結乾燥した。
【０１３６】
具体例４
一般製造例３による微小球を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）の溶液に１００×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。無水酢酸を加えて、無水酢酸の最終濃度を１００ｍｇ／ｍｌとした。微小球混合物を２０℃で１時間インキュベーションした後水で希釈し、濾過し、過剰量の水で１時間洗浄した。微小球を、前記のマンニトールおよびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８で処方した。この方法により、負に電荷が与えられた。
【０１３７】
具体例５
一般製造例１による微小球を１００×１０６個／ｍｌの濃度で、水溶液に再懸濁した。カルボジイミドの水性溶液を、微小球懸濁液に加えて、最終濃度を１００ｍｇ／ｍｌとした。２０℃で１６時間インキュベーションした後、過剰の試薬をグリシンを等濃度まで加えて反応停止し、２０℃で１６時間インキュベーションした。微小球を水で洗浄した後、前記と同様に処方した。この手続きにより負の電荷が除かれる。
【０１３８】
具体例６
一般製造例２の微小球をポラキサマー４０７およびマンニトールをそれぞれ０．１および１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いて処方した。懸濁液を前記実施例に記載したのと同様にして瞬間凍結して、凍結乾燥した。
【０１３９】
具体例７
ポリ−Ｌ−リジン（１５〜２５ｋＤａ）をｒＨＡ供給原料（２０％（重量／容量））に最終濃度０．５％（重量／容量）まで加えた後、噴霧乾燥した。一般例２の方法に従って、シェル上の正電荷が増加した微小球を得た。
【０１４０】
具体例８
ポリ−Ｌ−グルタメート（１５〜３０ｋＤａ）をｒＨＡ供給原料（２０％（重量／容量））に最終濃度０．５％（重量／容量）まで加えた後、噴霧乾燥した。一般製造例２の方法に従って、シェル上の負電荷が増加した微小球を得た。
【０１４１】
具体例９
具体例１の微小球をイン・ビボ分析に用いて、ブタ心臓の心筋層の灌流領域を描写する可能性を確立した。２５ｋｇのヨークシャー種のブタを麻酔して、Ten Cateら（１９９２年）Cardiovascular Research, 26,32-39 に記載の方法に従って完全に酸素補給する。Ａ５フレンチカテーテルを大腿動脈、上行大動脈および大動脈根を通って左心室へ挿入する。具体例１の４，０００，０００の微小球を注入し、３．５ＭＨｚトランスデューサーを備えたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ｓｏｎｏ′ｓ  １０００を用いた短軸平面での二次元的な経胸腔超音波心臓検査法を用いて、領域灌流を測定する。心筋層の強い不透明化が観察され（第５図を参照）、中空マイクロカプセルの再分布が２時間以上起こらないことを示していた。次いで、微小球を左心室に注入したところ、心筋層が連続的に投与量によって明るくなった。血流力学的パラメーターを観察したところ、これらの低濃度のマイクロカプセルの注入による悪影響は認められなかった。
【０１４２】
具体例１０
具体例６のマイクロカプセルを軽く鎮静剤を注射したニュージーランド種ウサギ（４．５ｋｇ）の耳静脈に３×１０８個／ｍｌの濃度で注入した。大腿動脈のドップラーシグナルを、１０ＭＨｚトランスデューサーを備えたＩｎｔｅｒｓｐｅｃｔ  ７０００型を用いて測定した。コントラスト注射の前のベースラインシグナルを得て、コントラスト注射の前後のドップラーシグナルと比較することができた。ベースラインシグナルが得られたならば、この計器の時間強度利得コントロールは変化しなかった。
【０１４３】
コントラスト注射の後に、心筋層の目に見える長時間のドップラーが増加し、投与したコントラスト剤の投与量によって数拍または数分間継続した。
【０１４４】
Ｔ1/2 を、下記のスペクトルドップラーシグナルのビデオデンシトメトリーによって測定した。利得の設定値を調節して、コントラスト注射の前に僅かに目に見えるシグナルが得られるようにした。コントラストが大腿動脈に入ると、シグナルが増加して、ピークに達した後、減衰した。ビデオデンシトメトリーは、プロットした血流および時間強度の個々のピークで行った。Ｔ1/2 は、そのピーク値の半分まで減少するためのコントラスト効果について要した時間として計算した。スペクトルドップラーシグナルのビデオデンシトメトリーでは、マイクロカプセルの静脈内注射の後に再現性のあるコントラスト効果が見られ、これはＰＣＴ／ＧＢ９２／００６４３に従って処方したマイクロカプセルによって生じたシグナルと比較してかなり長かった。
【０１４５】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）微小球の３０％以上の直径が２μｍの範囲内であり、かつ、微小球の少なくとも９０％の直径が１０．１〜１９．９μｍの範囲内である、中空微小球。
（２）直径の四分位範囲が２μｍ以下であり、メジアン直径が１０．１〜１９．９μｍである、中空微小球。
（３）タンパク質性壁を有する中空微小球であって、微小球の少なくとも９０％が、直径が１．０〜８．０μｍの範囲にあり、微小球の少なくとも９０％の壁厚が４０〜５００ｎｍであり、微小球の壁のタンパク質の少なくとも５０％が架橋して、１％ＨＣｌ中２分間の抽出に耐えるものであり、そして微小球のイン・ビボでのｔ1/2が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
（４）タンパク質の少なくとも９５％が前記のように架橋している、前記（３）に記載の中空微小球。
（５）直径が主として１．０〜１０．０μｍであり、微小球の少なくとも１０％を水に懸濁したとき、２．６６×１０４Ｐａの圧０．２５秒間加えても破裂、崩壊、または水の充満なしに残ることができる中空微小球であって、この微小球がイン・ビボでのｔ1/2が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
（６）微小球の３０％以上の直径が２μｍの範囲内であり、少なくとも９０％の直径が１．０〜８．０μｍであり、微小球のイン・ビボでのｔ1/2が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
（７）直径の四分位範囲が２μｍ以下であり、メジアン直径が２．０〜８．０μｍであり、そして、微小球のイン・ビボでのｔ1/2 が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、中空微小球。
（８）画像を形成させた後、検査を行う方法であって、(a) 哺乳類の体内に前記（１）〜（７）のいずれか一項に記載の微小球を注射し、(b) 哺乳類またはその一部を適当な超音波で処理し、(c) 前記微小球によって反射し、伝達し、共鳴し、または振動数変調した超音波を検出することからなる、方法。
（９）動脈内投与に好適な医薬組成物であって、中空微小球の直径が主として１０．１〜１９．９μｍであることを特徴とする、医薬組成物。
（１０）画像を形成させた後、検査を行う方法であって、(a) 哺乳類の体内に主として直径が１０．１〜１９．９μｍの微小球を注射し、(b) 哺乳類またはその一部を適当な超音波で処理し、(c) 前記微小球によって反射し、伝達し、共鳴し、または振動数変調した超音波を検出することからなる、方法。
（１１）液体キャリヤー中に壁形成材料を溶解または分散したものをガス中に噴霧し、液体キャリヤーを蒸発させることによって中空微小球を得る段階を含んでなる方法であって、微小球の直径が１０．１〜１９．９μｍであり、または微小球のヒト循環ｔ1/2 が少なくとも５分であるかまたは微小球がヒトもしくは動物の体内のある部位に対して選択的に標的設定されてなる、方法。
（１２）得られた生成物を、少なくとも微小球の外側の水溶性を減少させる段階に付す、（１１）に記載の方法。
（１３）壁形成材料がタンパク質である、前記（１１）または（１２）に記載の方法。
（１４）タンパク質がコラーゲン、ゼラチン、または血清アルブミンである、前記（１３）に記載の方法。
（１５）タンパク質がヒト血清アルブミンであるか、または血清に由来した若しくは組換えＤＮＡ技術によって調製したその類似物またはフラグメントである、前記（１４）に記載の方法。
（１６）タンパク質溶液または分散液が１０．０〜３０．０％のタンパク質を含む、前記（１３）〜（１５）のいずれか一項に記載の方法。
（１７）前記（１１）に記載の生成物が９６〜９８％のモノマー性タンパク質を含むものである、前記（１３）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（１８）前記（１２）に記載される段階の生成物のモノマー性タンパク質が５％以下である、前記（１３）〜（１７）のいずれか一項に記載の方法。
（１９）前記（１１）に記載の段階の条件が前記（１２）に記載の段階を実質的に同時に行うようにするものである、前記（１２）〜（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（２０）前記（１１）〜（１９）のいずれか一項に記載の方法によって得られる微小球。
（２１）前記（１１）〜（１９）のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる微小球。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明の方法の第一段階に適当な噴霧乾燥装置の正面および一側面からの一部切欠きのある斜視図である。
【図２】本発明の方法の第二段階での温度および加熱時間を変化させることによって微小球壁（この場合にはアルブミン）の固定度がどのように調節されるかを示す図である。
【図３】本発明の方法の第二段階での加熱時間の長さを変化させることによって微小球の耐圧性がどのように変化するかを示す図である。
【図４】本発明の方法の第二段階における加熱時間の長さを変化させることによってイン・ビトロでの生分解速度がどのように変化するかを示す図であり、マイクロカプセルの消失の測定を濁度測定によって評価した。
【図５ａ】大型のマイクロカプセル４，０００，０００の左心室への注射の前後のブタ心筋層の様子を示すビデオテープからのコピーである。
【図５ｂ】大型のマイクロカプセル４，０００，０００の左心室への注射の前後のブタ心筋層の様子を示すビデオテープからのコピーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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