(57)【要約】【課題】心筋及び血管平滑筋への特異的遺伝子発現を提供すること。【解決手段】心筋細胞における遺伝子産物の発現のための方法であって、以下の工程：  ａ）該遺伝子産物をコードするコーディング配列を含むアデノウイルスベクター構築物を、該心筋細胞を灌流する冠動脈または冠静脈洞の血流に注入する工程であって、該ベクターは該筋細胞において該遺伝子産物の発現を駆動する、工程；および  ｂ）該心筋細胞における該遺伝子産物の発現を得る工程、を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞又は血管平滑筋細胞において遺伝子産物の発現を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋及び血管平滑筋における遺伝子転写及び遺伝子産物発現を調節する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、アデノウイルスベクターを媒体として遺伝子を心筋及び冠状血管平滑筋に移入させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
体細胞遺伝子治療は、動物の非生殖系（すなわち、非精子及び非卵）細胞において外来遺伝子の発現をプログラムする能力として定義することができる。体細胞遺伝子治療の方法は、２つのカテゴリーに分類できる。Ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療は宿主生物からの細胞の取り出し、これら細胞への外来遺伝子のトランスフェクション、形質転換細胞又はトランスジェニック細胞を受容体宿主に再移植する工程を含んでいる。これに対して、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療は受容体宿主からこれらの細胞を予め取り出すことなく受容体宿主細胞に直接に外来遺伝子をトランスフェクションする工程を含んでいる。
【０００３】
人の患者に対する遺伝子治療の有用性は、多数の要因によって変化する。第一に、トランスフェクション方法が有効なものであることが必要である。第二に、外来遺伝子の発現が特定の標的組織に局在化することが必要である。第三に、そのトランスフェクション方法が、宿主細胞の変異や、宿主生物の永続的な感染を起こす危険性が最小限であることが必要である。
【０００４】
これまでに体組織に遺伝子を導入するために種々の方法が使用されている（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；Ｗｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。外来遺伝子を細胞に導入する方法としては、直接トランスフェクション（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８６）及びレトロウイルス遺伝子移入（Ｄｉｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８ａ；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８ｂ；Ｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）がある。ときには、遺伝子的に変化させた細胞が動物に再導入されている（Ｄｉｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｙ  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）が、この場合その継続的な機能が経時的に監視されている。
【０００５】
最近、真核細胞及び全動物の体細胞遺伝子治療の手段として、アデノウィルス介在遺伝子移入が研究されている（ｖａｎ  Ｄｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４ａ：ｖａｎ  Ｄｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４ｂ；Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ及びＧｒａｈａｍ，１９８７；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０：Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。アデノウィルス介在遺伝子移入の一つの問題は、標的細胞における遺伝子産物の発現が低レベルであること及び得られた機能効果が不足しているということである。
【０００６】
アデノウィルス介在遺伝子移入は、新生マウスのオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損の治療に使用されたが、ウイルス感染したマウスにおけるオルニチントランスカルバミラーゼ酵素の発現は、正常マウスの発現レベルと同等もしくはそれ以下であり、欠損は一部正常化されただけであった（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。これらのデータをもとにすると、遺伝子産物の過剰発現を必要とする病気の治療に、アデノウィルス介在遺伝子移入が応用できることは期待できない。
【０００７】
嚢胞性繊維症経膜伝導性調節（ＣＦＴＲ）遺伝子のコトンラット肺上皮へのアデノウィルス介在移入が試みられたが、肺気道細胞におけるＣＦＴＲ蛋白質の発現にもかかわらず、遺伝子移入の生理学的効果がないために、移入遺伝子の生物活性を評価することができなかった（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。さらにまだ、α１−アンチトリプシンの肺発現も生理学的効果と関連付けられていない（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。これらのデータを合わせてみても、これらのデータは、アデノウィルスが、細胞に遺伝子を移入することができること、及び生理学的に関連のある効果を達成するのに十分な蛋白質の発現を指向したものであること、を証明するものではない。
【０００８】
心組織に対する標的体細胞遺伝子治療は、心筋細胞の遺伝子異常のような多数の遺伝性及び後天性心疾患の治療に使用できる。例えば、正常なジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）ｃＤＮＡの注入により、デュシェーヌ筋ジストロフィー患者に見られる心収縮性欠陥を正常にすることができる。さらに例えば、組換え血管形成誘導因子をコードするプラスミドの左心室壁への直接注入により、慢性虚血性心筋領域の新しい副行循環を刺激することができる。さらに体細胞遺伝子治療を利用して、心肥大のような種々の異常な生理状態の際並びに心筋原性疾患（ｍｙｏｇｅｎｅｓｅｓ）の際に心筋細胞遺伝子発現を調節する分子機構を直接研究することができる。
【０００９】
米国では毎年１５０万人にも上る患者が心筋梗塞（ＭＩ）に罹っている。さらに、数百万人以上が大小冠状アテローム性動脈硬化による慢性心筋虚血症に罹っている。これらの患者の多くが虚血性心筋領域の副行血管形成を刺激することができる能力によって利益を受けるであろう。アデノウィルス介在遺伝子移入法は、現在の冠状動脈バイパス及び経皮トランスルーミナル（ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ）冠状血管形成に対する別のアプローチを与えるものである。特に、多数の患者がＣＡＢＧ又はＰＴＣＡの候補ではない、尊敬すべきかつ拡散性の（ｒｅｖｅｒｅ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｕｓｅ）アテローム性動脈硬化症に罹っている。このようにこれまでに、虚血性心筋領域における副行血管形成を刺激することに成功したアプローチはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来のアプローチはいずれも、新生児心細胞（ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションプロトコル又はマウスにおけるトランスジェニックアプローチを利用していた。これらの研究は、新生児心細胞がｉｎ  ｖｉｖｏの場合を反映していないかもしれないという事実、及び新生児心細胞が組織培養において極端に制限された寿命を有しており、心臓の中に導入することができないという事実のために複雑なものであった。さらに、トランスジェニックアプローチは長期間（６ヵ月〜１年）を要し、技術的に困難でかつ高価である。本発明の遺伝子移入アプローチはこれらの問題に対する解決手段を提供するものであり、ｉｎ  ｖｉｖｏで心筋細胞中で組み換え遺伝子産物の安定な発現を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の簡単な概要
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかにある心筋又は血管平滑筋細胞の機能を調製する方法に関するものである。遺伝子の転写の変更及びポリヌクレオチド又はポリペプチドのような遺伝子転写産物の製造における変更により筋肉細胞の機能は調節される。このポリヌクレオチド又はポリペプチドは、心筋又は血管平滑筋細胞と相互作用してその細胞の機能を調節する。
【００１２】
従って、本発明の１態様として、ａ）心筋又は血管平滑筋細胞に該遺伝子産物をコード
するコード配列を含有するアデノウイルスベクター構築物を移送し、ここで該ベクターは心筋又は血管平滑筋細胞に遺伝子産物の発現をもたらすものであり、ｂ）該遺伝子産物が心筋又は血管平滑筋細胞で発現するのに十分な生理的な条件下に該心筋又は血管平滑筋細胞を維持する工程を含む、心筋又は血管平滑筋細胞における遺伝子産物の発現を調節する方法を提供する。
【００１３】
本発明の方法で使用するアデノウィルスは、複製−欠陥のものである。好ましくは、複製−欠陥アデノウィルスは、初期遺伝子領域Ｅｌ又は初期遺伝子領域ＥｌとＥ３とを欠いたものである。好ましいアデノウィルスはタイプ５アデノウィルスであり、コード配列は好ましくは両側にアデノウィルスタイプ５配列があるのがよい。
【００１４】
好ましい態様において、コード配列は、アデノウィルスエンハンサー−プロモーター以外のエンハンサー−プロモーターに可動的に結合している。好ましいエンハンサー−プロモーターはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター又はＭＣＫエンハンサーである。より好ましいエンハンサー−プロモーターは組織特異的エンハンサー−プロモーターである。好ましい心筋特異的エンハンサー−プロモーターはｃＴＮＣプロモーターである。好ましい血管平滑筋特異的エンハンサー−プロモーターはエンドセリンプロモーター又は平滑筋α−アクチンプロモーターである。
【００１５】
コード配列は、転写−終了領域に可動的に結合している。好ましい転写−終了領域はＳＶ４０又はプロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナルを含む。他の好ましい態様において、コード配列はｃＤＮＡ挿入物を含む。
【００１６】
好ましい態様において、遺伝子産物はポリヌクレオチドである。好ましいポリヌクレオチドはアンチセンス分子である。好ましいアンチセンス分子はｃ−ｍｙｂに対するアンチセンスポリヌクレオチドである。
【００１７】
他の態様において、遺伝子産物はポリペプチドである。好ましいポリペプチドは成長因子である。このような好ましい成長因子はＦＧＦ−５、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ又はＰＤＧＦである。他の好ましい態様において、ポリペプチドはジストロピン（ｄｙｓｔｒｏｐｉｎ）、ミュータントＦＧＦレセプター、ミュータントＰＤＧＦレセプター、ミュータントＩ−ＣＡＭ又はミュータントＶ−ＣＡＭである。
【００１８】
移送は、アデノウイルスベクター構築物を直接心筋又は血管平滑筋細胞へ注入するのが好ましい。特に好ましい態様において、移送はアデノウイルスベクター構築物を、筋肉細胞を灌流する血管内に注入する。
【００１９】
アデノウイルスベクター構築物は、典型的には、医薬組成物として移送される。このような医薬組成物は、生理的に許容される担体及び有効な発現誘導量のアデノウイルスベクター構築物を含む。
【００２０】
さらに別の態様として、本発明は、ａ）アデノウィルスを堤供し、ｂ）該アデノウィルス内に、心筋又は血管平滑筋細胞に導入するのに望ましい遺伝子産物をコードするコード配列を組み込むことを含む、心筋又は血管平滑筋細胞に導入するのに用いるアデノウイルスベクター構築物の調製方法を提供する。
【００２１】
さらに他の態様として、本発明は、この方法によって調製したアデノウイルスベクター構築物を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
心筋及び血管平滑筋への遺伝子の特異的発現が実施された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明
本発明は、心筋又は血管平滑筋細胞における遺伝子産物発現を調節する、アデノウィルス介在方法に関する先行技術の欠点に焦点を置くものである。本発明の方法によれば、アデノウイルスベクター構築物を上記筋肉細胞に遺伝子を移送し、それにより遺伝子産物の発現を行うために使用する。これによる遺伝子産物の発現はこれらの細胞の機能を変更し、生理的に好ましい効果を達成する。本発明の方法は、心筋細胞又は血管平滑筋細胞が生きている組織においてｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ何れかに置かれている場合、該筋肉細胞の発現を調節するのに使用することができる。
Ａ．心筋細胞における遺伝子産物発現の調節方法
１つの態様において、本発明は心臓の筋肉細胞（つまり、心筋細胞又は心臓筋細胞）における遺伝子産物発現を調節する方法を提供する。この方法によると、遺伝子産物をコードするコード配列を含むアデノウィルススベクター構築物は、心筋細胞へ移送される。ついで、心筋細胞を、該遺伝子が心筋又は血管平滑筋細胞に入るのに、該遺伝子が転写されるのに及び該遺伝子の産物が発現されるのに十分な時間で生理的な条件下に維持する。
１．アデノウイルスベクター
細胞トランスフェクションのベクターとしてアデノウィルスを使用することは当業界でよく知られている。アデノウイルスベクター−介在細胞トランスフェクションは種々の細胞についてすでに報告されている（ストラットフォード、ペリコーデットら、１９９２年）。
【００２４】
本発明のアデノウイルスベクターは複製欠陥を有するものである。ウイルスは、ウイルスの初期遺伝子領域１（Ｅ１）を取り除くことにより複製欠陥とする。Ｅ１領域を欠いたアデノウィルスは、人２９３細胞のように、細胞内でのみ複製する能力を有し、それらの細胞質ゲノムからアデノウィルス初期遺伝子領域１遺伝子を発現する。つまり、そのようなアデノウィルスは初期遺伝子産物を発現しない細胞を殺すことができない。
【００２５】
好ましい態様において、本発明で用いるアデノウイルスベクターは、Ｅ１及びＥ３初期遺伝子領域の両方を欠くものである。複製欠陥アデノウィルスを調製する技術は当業界でよく知られている（例えば、マググローリら、１９８８年及びグルツマンら、１９８２年を参照のこと）。
【００２６】
いかなるアデノウイルスベクターも本発明の実施に使用できると思われる。つまり、アデノウイルスベクターは４２の異なった公知のセロタイプ又はサブクループＡ−Ｆのいずれでもあり得る。サブグループＣのアデノウィルスタイプ５は、複製欠陥アデノウイルスベクターを調製するための好ましい出発物質である。
【００２７】
ベクターとして用いるためにコードＤＮＡ配列を含むアデノウィルスを工学的に製造する。そのような再結合アデノウィルスはグルツマン（Ｇｕｌｔｍａｎ）ら（１９８２年）に記載されている。遺伝子生成物をコードするｃＤＮＡのような個々のＤＮＡ配列をアデノウィルスに挿入してベクター構築物を生成する。
【００２８】
よって、好ましい態様として、遺伝子生成物をコードする配列を、Ｅ１コード配列が除去された位置でアデノウィルスに導入するか、又は組み込むのがよい。しかし、アデノウィルス配列への挿入の位置は本発明において重要ではない。カールソン（Ｋａｒｌｓｏｎ）ら（１９８６年）に既述されたように、コード配列を選択されたＥ３領域の代わりに、Ｅ３置換ベクターに挿入してもよい。好ましくは、アデノウィルスのＥ１領域をコードＤ
ＮＡ配列又は遺伝子で置換するのがよい。
【００２９】
得られたアデノウイルスベクターを完全なアデノウィルスゲノムを有するプラスミドと共に２９３細胞に同時トランスフェクションし、アデノウィルスを増殖する。そのようなプラスミドの典型例はｐＪＭ１７である。同時トランスフェクションを先行技術で既知である標準工程により行う。例として、ウシ胎児血清を含むダルベッコの改質イーグル培地で２９３細胞を培養する。プラスミドのリン酸カルシウム同時トランスフェクションする前の日に集密培養物を分離する。ＤＮＡを細胞に添加した後、トランスフェクション効率をあげるために細胞に衝撃を与え（例えば、１５％グリセロールの衝撃）、必要ならばウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン硫酸塩、及び他の抗生物質又は抗真菌性剤を含むＤＭＥＭ中の寒天培地に細胞をかぶせる（ｏｖｅｒｌａｙ）。ウィルスプラークが現れるまで単層を培養する（約５−１５日）。
【００３０】
このプラークを取り上げ、ウシ胎児血清を含む媒体に懸濁し、２９３細胞の新しい層を感染するために用いた。細胞の９０％以上が感染したとき、ウイルス溶解物を冷凍／解凍サイクルに曝し、初期貯蔵物にした。再結合ウイルスの存在は、感染２９３細胞からのウイルスＤＮＡの調製、制限分析、及びサザン法によって確認できる。次に、２９３細胞を感染の多重度０．０１で第１ウイルスに感染させ、溶解するまで培養することにより第２貯蔵物を生じる。
【００３１】
本発明の再結合アデノウィルスを増殖するのに用いた特定の細胞系は本発明では重要ではない。再結合アデノウイルスベクターは、例えばヒト２９３細胞、又は条件複製欠陥アデノウィルス感染が生じる他の細胞系で増殖することができる。例えば条件複製欠陥ベクターの欠陥を補足するようにアデノウィルスＥ１遺伝子生成物「ｉｎ  ｔｒａｎｓ」を表現するものである。また、これらのウイルス貯蔵物を得るために、プラスチック皿上又は懸濁培地で細胞を増殖することができる。
【００３２】
２．コード配列
アデノウイルスベクターのコード配列はいかなる遺伝子生成物をコードすることができる。ある態様として、遺伝子生成物はＤＮＡ又はＲＮＡ分子のようなポリヌクレオチドである。特に好ましい態様として、遺伝子生成物はアンチセンス分子がよく、より好ましくはアンチセンスＲＮＡ分子がよい。特に好ましい態様として、アンチセンスＲＮＡが腫瘍遺伝子へのアンチセンスＲＮＡであるのがよく、好ましくはｃ−ｍｙｂ腫瘍遺伝子へのものがよい。
【００３３】
他の好ましい態様として、遺伝子生成物はポリペプチドである。本明細書中に用いられるとき、『ポリペプチド』の語は、アミド結合で結合したアミノ酸のポリマーを意味し、アミノ酸残基の数は約５〜約ｌ００万の範囲とすることができる。好ましくは、ポリペプチドは約１０〜約１０００のアミノ酸残基を有するのがよく、より好ましくは約２０〜約５００のアミノ残基を有するのがよい。このように、本明細書中に用いられるとき、ポリペプチドは当業界でオリゴペプチド（アミノ酸残基が５−１０）、ポリペプチド（アミノ酸残基が１１−１００）及びプロテイン（＞１００アミノ酸残基）としばしば呼ばれるものも含んでいる。コード配列によってコードしたポリペプチドは、翻訳後修飾をし、炭水化物、脂質（ｌｉｐｉｄ）、核酸などと抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し、糖ポリペプチド（例えば、糖タンパク質）、リポポリペプチド（リポタンパク質）、及び他の同様な抱合体を形成する。
【００３４】
本発明のアデノウィルスのコード配列によっていかなるポリペプチドもコードすることができる。コード配列がそのポリペプチドを転写、翻訳、及び発現する読み取り枠を少なくとも１つ有する限り、コード配列にはイントロン及びエキソンを有してもよい。このよ
うに、コード配列は遺伝子、分裂遺伝子、又はｃＤＮＡ分子を有することができる。コード配列が分裂遺伝子（１以上のイントロンを含む）を有する場合、その分裂遺伝子を含むＤＮＡ分子で形質転換又はトランスフェクトした細胞は、その遺伝子生成物の発現が所望であれば、そのイントロンを除去し、そのＤＮＡ分子からのＲＮＡ転写中のエキソンをともにスプライシングする手段を有するべきである。
【００３５】
好適な態様として、本発明のアデノウイルスベクター構築物のコード配列によってコードしたポリペプチドは、そのポリペプチドに暴露した心筋又は血管平滑筋細胞の機能を変化させる。典型的かつ好適なポリペプチドとして、内皮成長因子又は血管平滑筋成長因子のような成長因子；成長因子受容体；突然変異Ｉ−ＣＡＭ又はＶ−ＣＡＭ（Ｅｄｅｌｍａｎ、ＧＭ、１９８３年）のようなジストロピン又は細胞接着分子（ＣＡＭ）成長因子が挙げられる。
【００３６】
好適な成長因子には、ＦＧＦ−５、酸性ＦＧＦ及び塩基性ＦＧＦのような繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が挙げられる。
【００３７】
好適な受容体として、突然変異ＰＤＧＦ受容体（例えば、ファンタル（Ｆａｎｔｅｌ）ら（１９８９年）、コーリン（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ）ら（１９９０年）、及びエスコベド（Ｅｓｃｏｂｅｄｏ）ら（１９８８年）を参照のこと）又は突然変異ＦＧＦ受容体（例えば、ペーター（Ｐｅｔｅｒｓ）ら（１９９２年）、ムハマド（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ）ら（１９９２年）、アマヤ（Ａｍａｙａ）ら（１９９１年）、及びベロット（Ｂｅｌｌｏｔ）ら（１９９１年）を参照のこと）が挙げられる。
【００３８】
３．エンハンサー−プロモーター
アデノウイルスベクター構築物のコード配列は、好ましくはアデノウィルスエンハンサー−プロモーター以外のエンハンサー−プロモーターと効率よく結合する。プロモーターは、転写が始まる点（即ち、転写開始サイト）の前（上流）にある、典型的にはヌクレオチド対が約１００以内のＤＮＡ分子の領域である。この領域は、異なる遺伝子では同じ相対位置に存在する、典型的にはいくつかのタイプのＤＮＡ配列要素を含んでいる。本明細書中で用いるとき、『プロモーター」の語は、当業界で上流プロモーター領域、プロモーター領域、又は一般化真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユニットのプロモーターと呼ばれるものを含んでいる。
【００３９】
他のタイプの不連続転写調節配列エレメントにエンハンサーがある。エンハンサーは特定のコード化領域（例えば、遺伝子）に、時間、位置及び発現水準の特異性を与える。エンハンサーの主な機能は、該エンハンサーに結合している１種以上の転写ファクターを含む細胞におけるコード配列転写の水準を向上させることである。プロモーターと異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在する限り、転写開始部位から色々な距離にあっても機能することができる。
【００４０】
本願明細書において、用語「エンハンサー−プロモーター」とは、エンハンサー及びプロモーターエレメントの双方を含む複合単位を意味する。エンハンサー−プロモーターは、少なくとも１種の遺伝子生成物を暗号化したコード化配列と有効にリンクしている。本願明細書において、用語「有効にリンクしている」とは、エンハンサー−プロモーターとコード化配列とが、コード化配列の転写がエンハンサー−プロモーターによって、制御及び調節されるように結合していることを意味する。エンハンサー−プロモーターとコード化配列とを有効にリンクする手段は、当該技術分野において周知である。また、当該技術分野において周知であるように、転写が制御されるコード化配列に関連する正確な方向付け及び位置は、特に、エンハンサー−プロモーターの具体的な性質に依存している。したがって、ＴＡＴＡボックス最小プロモーターは、通常、転写開始部位の上流約２５〜約３０塩基対の位置にあり、上流プロモーターエレメントは、通常、転写開始部位の上流約１００〜約２００塩基対に位置する。これに対し、エンハンサーは、開始部位の下流の位置及び該部位から相当離れた距離に位置することができる。
【００４１】
本発明のベクター構築物に用いるエンハンサー−プロモーターは、心臓又は血管の平滑筋肉細胞で発現を誘導する、いかなるエンハンサー−プロモーターであってもよい。後記する例において、シトメガロウィルス（ＣＭＶ）極早期遺伝子プロモーターを使用して、遺伝子の高水準発現を達成することができる。しかし、当該技術分野で周知の他のウイルス性又は哺乳類細胞のプロモーターも、その発現水準が生理学的な効果を達成するのに十分である限り、遺伝子生成物の発現を行うのに適している。例として挙げることができ、かつ好ましいエンハンサー−プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ロウスサルコマウィルス（ＲＳＶ）プロモーター及び筋肉特異的クリアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサーである（Ｚａｍｂｅｔｔｉらの論文１９９２年、Ｙｉらの論文１９９１年、及びＳｔｅｍｂｅｒｇらの論文１９８８年）。
【００４２】
周知の特性を有するエンハンサー−プロモーターを採用することにより、遺伝子生成物発現の水準及びパターンを最適化することができる。例えば、心臓の細胞で特異的に活性なエンハンサー−プロモーターを選択することにより、遺伝子生成物の組織特異的発現が可能になる。好ましい心筋特異性エンハンサー−プロモーターには、心臓アイソフォームトロポニンＣ（ｃＴＮＣ）プロモーターがある（参照：Ｐａｒｍａｃｅｋらの論文１９９２年、及びＰａｒｍａｃｅｋらの論文１９９０年）。さらに、特定の生理学的シグナルに対する応答を調節するエンハンサー−プロモーターの選択は、誘導性遺伝子生成物発現を可能にする。
【００４３】
４．転写終結領域
アデノウイルスベクター構築物のコード化配列は、転写終結領域と有効にリンクしている。ＲＮＡポリメラーゼは、ポリアデニレーションが起こる部位を介して、コード化ＤＮＡ配列を転写する。通常、ポリアデニレーション部位から２００〜３００塩基対下流に位置するＤＮＡ配列は、終結領域としての役割を果たす。これらのＤＮＡ配列は転写終結領域として本願明細書に述べられている。これらの領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の効率的なポリアデニレーションのために必要とされる。
【００４４】
転写終結領域は当該技術分野において周知である。本発明のアデノウイルスベクター構築物に用いられている好ましい転写終結領域は、ＳＶ４０又はプロタミン遺伝子のポリアデチレーションシグナルを含むものである。
【００４５】
５．移送
アデノウイルスベクター構築物を心筋細胞に移送する手段は、心筋細胞がインビトロ、本来の位置又はインビボのいずれに位置するかによって決まる。心筋細胞がインビトロにある場合、アデノウィルス構築物の移送は、（１）該細胞をアデノウィルスを含む培地に晒す、又は（２）アデノウィルスベクター構築物を該心筋細胞に注入することにより行われる。好ましい実施態様では、この移送はアデノウイルスベクター構築物を心筋細胞に注入することである。心筋細胞が本来の位置にある場合（例えば、完全な心臓）、移送は、（１）アデノウイルスベクター構築物を含む溶液を本来の位置に還流する、又は（２）このような構築物を筋肉（例えば、心室壁、心房壁）に注入することにより行うのが好ましい。心筋に組み換えＤＮＡ分子を注入することにより、該分子にコード化されている遺伝子生成物の発現を行うことができる（米国特許出願第０７／７８９，９３３号）。
【００４６】
該特許出願に記載されているように、ロウスサルコマウィルスプロモーターで制御されている組み換え細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、精製プラスミドＤＮＡを生きている
心室壁に直接注入することにより、インビボにおける成熟ラット心房筋肉に注入し、かつ発現することができた。心筋発現組み換えβ−ガラクトシダーゼの活性を、組み換えβ−ガラクトシダーゼ遺伝子注入後少なくとも６月間、ラットの心臓で組織化学的に測定した。
【００４７】
心筋だけが該ベクターを取り込み、β−ガラクトシダーゼを発現しているのが見い出された。このβ−ガラクトシダーゼの発現は、繊維芽細胞又は心臓の血管構成細胞のような心臓の他の細胞には見い出されなかった。ＤＮＡ注入を受けた心臓の約７５％以上が外来の遺伝子を発現し、かつ該発現は少なくとも６月間安定であった。
【００４８】
さらに例を挙げると、繊維芽細胞生育フブクター５（血管形成ファクター遺伝子）の遺伝子を直接注入すると、注入を受けた心臓の毛細血管数が増加した。続いて、ＦＧＦ−５ＤＮＡを含む組み換えプラスミドを注入すると、コントロールＤＮＡ溶液を注入した心臓と比べ、心臓壁で毛細血管の数が３０〜４０％増加したのが観察された。顕微鏡を用いて検査したが、注入を受けた心臓の毛細血管の構造は正常であった。
【００４９】
ラットにプラスミドをコードするヒトフィブロブラスト成長因子−５（ｈＦＧＦ−５）を注射して、成体ラットの心臓中の血管形成又は側副血液流を刺激した。注射から３週間経過後にラットを殺し、コンピュータ化した光学顕微鏡でキャピラリー密度を測定した。コントロールベクターを注射したラットは、約２３００キャピラリー／ｍｍ2（ｐ＜０．
００１）を示した。従って、フィブロブラスト成長因子−５発現ベクターを直接注射することにより、注射した心筋部分での側副管形成が刺激される。
【００５０】
心筋細胞がインビボにある場合には、（１）心臓を環流する血管中へのアデノウイルスベクター構築物の注入により、又は（２）心室又は心房壁等の心筋へのアデノウイルスベクター構築物の直接注射により、供給を行うことが好ましい。特に好ましいインビボ実施態様においては、生物の首の血管中にカテーテルを挿入し、Ｘ線透視誘導を用いて心筋部分を環流する冠状動脈又は冠状静脈洞の位置まで留置カテーテルの先端を進める。移入されるべき心臓細胞を含む心臓部分の付近に留置カテーテルの先端を位置させることが好ましい。従って、好ましい１の態様においては、外部頸静脈又は頸動脈のいずれかに留置カテーテルを挿入し、カテーテルの先端が冠状静脈口又は左冠状動脈に位置するまでカテーテルを進める。例えば、左冠状動脈又は冠状静脈口に位置するカテーテルを通してアデノウイルスベクター構築物を注入することにより、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）についてのコード配列を含むアデノウイルスベクター構築物と伴に心筋細胞を移入する場合、心筋細胞はβ−ｇａｌを発現する（以下の実施例１及び２参照）。
【００５１】
アデノウイルスベクター構築物を心筋細胞に供給した後、該細胞を生理学的条件の下に、アデノウイルスベクター構築物が心筋細胞を感染するに十分な時間であって該構築物中に含まれるコード配列の細胞発現に十分な時間維持する。
【００５２】
生理学的条件は心筋細胞の生存可能性に必要なものであって、温度、ｐＨ、モル浸透圧濃度等を含む。好ましい態様においては、温度は約２０℃〜約５０℃、更に好ましくは約３０℃〜約４０℃であり、更に一層好ましくは約３７℃である。
【００５３】
ｐＨの値は好ましくは６．０〜約８．０、更に好ましくは６．８〜約７．８であり、最も好ましくは約７．４である。モル浸透圧濃度は好ましくは約２００ミリオスモル毎リットル（ｍｏｓｍ／Ｌ）〜約４００ｍｏｓｍ／Ｌであり、更に好ましくは２９０ｍｏｓｍ／Ｌ〜３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。心筋細胞の生存可能性に必要なその他の生理学的条件は、当業界で周知である。
【００５４】
心臓細胞中のコード配列の発現に十分な時間は、当業界で周知であるように、とりわけ使用するアデノウイルスベクター及び供給方法により変わりうる。アデノウイルスベクターが５型アデノウィルスから供給され、かつ該ウィルスベクターが冠状動脈に注入された場合、発現は注入から３〜５日後に観察された（以下の実施例２参照）。
【００５５】
アデノウイルスベクターは複製欠陥に寄与するため、完全に感染した細胞中では複製が不可能であることに注意すべきである。更に、アデノウィルスのゲノミック組込み頻度は通常かなり低いことが見出されている。従って、継続的治療が必要な場合には、６か月〜１年ごとに再投与が必要である。従ってこのような状況においては、特定の間隔をおいて発現レベルを監視する長期治療が必要となろう。
【００５６】
薬理学的に許容されうるキャリヤー及びアデノウイルスベクター構築物を含む医薬組成物の形でアデノウイルスベクター構築物を供給するのが一般的である。有効発現誘導量のアデノウイルスベクター構築物を供給する。ここでは、「有効発現誘導量」という用語は、ベクター中に含まれるコード配列によりコードされた遺伝子産物の発現を有効とするのに必要なウィルスベクター粒子の数を意味する。アデノウイルスベクター構築物の有効発現誘導量の決定方法は、当業界で周知である。有効発現誘導量は、一般には約１０7プラーク形成単位（ｐｆｕ）〜約１０15ｐｆｕ、好ましくは１０8ｐｆｕ〜１０14ｐｆｕであ
り、更に好ましくは１０9ｐｆｕ〜１０12ｐｆｕである。
【００５７】
当業界で周知のように、任意の特定の被験者に対する具体的な投与レベルは、アデノウイルスベクターの感染性、年齢、体重、健康状態、性別、投与の食餌時間、投与経路、排出速度及び治療中の特定の病気の発病度を含む様々な因子に依存する。
【００５８】
アデノウィルスはヒトに感染するウイルスであるため、ある個人は特定のアデノウィルスタンパク質に対し抗体を形成することもありうる。このような状況においては、かかる個人はウイルスに対して抗体反応を起こすこともある。従って、免疫反応が起こる可能性があると考えられる場合には、被験者に対しまず抗体の存在を確認する試験をすることができる。そのような試験は、例えば簡単な皮膚試験を通じて、又はアデノウィルス中和抗体の循環血液レベルの試験を通じて、様々な許容しうる方法により行うことができる。実際、そのような状況の下では、Ｘ１０6桁〜１Ｘｌ０6程度のウイルス粒子の試験投与を行うことが望ましい。その後、不適当な反応が認められない場合には、ほぼ投与量の桁まで投与量を増量する等のように、所望の投与量まである期間に渡って投与量を増加させる。Ｂ．血管平滑筋細胞において遺伝子産物発現を調節する方法
別の観点において、本発明は血管平滑筋細胞（例えば、動脈平滑筋細胞）における遺伝子産物発現を調節する方法を提供する。該方法によれば、その遺伝子産物をコードしているコード配列を含むアデノウイルスベクター構築物が血管平滑筋細胞へ運ばれる。その血管平滑筋細胞はその後、生理学的条件下で、その遺伝子が血管平滑筋細胞へ入り、該遺伝子が転写され及び該遺伝子の産物が発現するのに十分な時間保持される。好ましい血管平滑筋細胞は冠状動脈平滑筋細胞である。
【００５９】
血管平滑筋細胞における遺伝子産物の発現を調節する方法において使用されるアデノウイルスベクター構築物は、心筋に関して上記に論じた構築物と同じである。同様に、エンハンサー−プロモーター、翻訳終了領域及びコード配列は、血管平滑筋とともに使用するのに好ましいエンハンサー−プロモーターがエンドセリンプロモーター（例えばＬｅｅ等，１９９０年及びＢｌｏｃｈ等，１９９８年を参照）あるいは平滑筋α−アクチンプロモーター（例えば、Ｆｏｓｔｅｒ等，１９９２年及びＢｌａｎｋ等，１９９２年を参照）のような血管平滑筋に特異的なエンハンサー−プロモーターであることを除いて、上記に述べたのと同様である。
【００６０】
運搬は、好ましくは心筋に関して上記に述べたのと同様であり、血管平滑筋細部がｉｎ
ｓｉｔｕ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏに置かれているかに依存する。
Ｃ．医薬組成物
別の観点では、本発明は、アデノウイルスベクター遺伝子構築物が生理学的に許容される溶液またはバッファー中に分散している医薬組成物に関する。
【００６１】
本発明の組成物は典型的には、所望により一般的な公知の無毒性で生理学的に許容される担体、佐剤及びビヒクルを含む投薬量単位の調剤で非経口的に投与される。ここで使用される非経口的という用語は、静脈内、筋肉内、動脈内注射、または点滴技術を含む。
【００６２】
注射可能な調剤、例えば、無菌注射可能な水性または油性懸濁液が、適当な分散または湿潤剤及び懸濁剤を使用して公知の技術によって調製される。無菌注射可能な調剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液といった、無毒性で非経口的に許容される稀釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液でもよい。
【００６３】
使用してもよい許容され得るビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液などである。加えて、無菌の固定油は、慣用的に溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のためにいかなるブランドの固定油も使用でき、合成モノ−またはジ−グリセライドが挙げられる。加えて、オレイン酸のような脂肪酸が注射可能な調剤中に使用できる。
【００６４】
好ましい担体は、リン酸塩、乳酸塩、トリスなどで緩衝化された中性の塩性溶液を含む。もちろん、ベクターを、例えば欠陥のある干渉性アデノウィルス粒子あるいはエンドトキシン及びその他の発熱物質などの望ましくない汚染物を本質的に含まないようにするために十分に精製し、ベクター構築物を受ける個体においてベクターがいかなる不都合な反応をも起こさないようにする。ベクターを精製するための好ましい手段として、塩化セシウム勾配遠心分離のような浮遊密度勾配の使用が挙げられる。
Ｄ．アデノウィルス構築物の調製方法
別の観点として、本発明は、心筋または血管平滑筋細胞における遺伝子産物発現を調節するのに使用されるアデノウイルスベクター構築物の調製方法を提供する。そのような方法は
ａ）アデノウィルスを容易する工程；及び
ｂ）該アデノウィルスヘ、心筋や血管平滑筋細胞への導入に望まれる遺伝子産物をコードしているコード配列を組み込む工程
を含む。
【００６５】
コード配列は当分野で公知の一般的な技術を使用してアデノウィルスへ組み込まれて、アデノウイルスベクター構築物で感染された筋肉細胞中で該配列によってコードされる遺伝子産物が発現する。好ましい実施態様において、コード配列は操作により、非−アデノウィルスエンハンサー−プロモーターに結合される。具体的で好ましい、そのようなエンハンサー−プロモーターは上記にのべたとおりである。
【００６６】
心筋または血管平滑筋細胞への導入に望ましい遺伝子産物は好ましくは、それらの細胞において遺伝子産物発現を調節する方法に関連して上記に述べたのと同様である。
【００６７】
さらに別の観点では、本発明は、そのような方法により製造されたアデノウイルスベクター構築物を提供する。
【００６８】
下記の実施例は本発明の具体的な実施態様を説明し、いかなる面でも明細書及び請求の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例１：アデノウイルスベクター構築物の作成
この例はコードＤＮＡ配列を含むウィルスベクター構築物の調製における組み換え複製欠陥アデノウィルスの使用を記載する。
【００７０】
特定のｃＤＮＡｓ（ＡｄＣＭＶ−ｃＤＮＡ）を含む組み換えアデノウィルス（Ｇｌｕｚｍａｎ等、１９８２年）を当技術分野で公知の一般的な技術により調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをもつＳＶ４０Ｔ抗原核標的シグナル（ＳＶ４０Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ，Ｂｏｎｎｅｒｏｔ等，１９８７年）をｐＡｄＣＭＶに挿入し、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のプロモーター、該β−ＧａｌｃＤＮＡ、及びＳＶ４０ウイルスまたはマウス  プロタミン遺伝子のいずれかからの且つアデノウィルスタイプ５の配列と接したポリアデニレーションシグナルを含む特定の構築物を作成した。この構築物においては、アデノウィルスのＥ１及びＥ３領域は除かれて、Ｅ１領域が該β−Ｇａｌをコードする配列に置き変わった。
【００７１】
得られたプラスミドは、ＡｄＣＭＶβ−ｇａｌと名付けられ、２９３細胞ヘコートランスフェクトされる。コートランスフェクションは次のように実施された：２９３の細胞を２％の胎児牛血清を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変性イーグルの（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ｐＡｄＣＭＶβ−ｇａｌでのコートランスフェクションの前日に、コンフルエントなディッシュを非−コンフルエントなフラスコに分配した。ウィルスプラークが出現するまで単一層をインキュベートした。
【００７２】
これらのプラークを取り上げ、２％の胎児性幼獣血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）を含有するＤＭＥＭ中に懸濁させ、２９３細胞の新たな単一層の感染に使用した。細胞の９０％以上の感染が示された時、ウイルス性の溶解物は、凍結／融解サイクルに掛けられ、プライマリーストックとして表示された。正確な構造を持つ再結合ウイルスは、生産性感染２９３細胞からのウイルス性ＤＮＡの調製、限定分析及びＳｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによって検証された。セカンダリーストックは、プライマリーウィルスストックで２９３細胞を感染させ、溶解までの培養によって順次発生させた。再結合アデノウィルスの大量生産は、２９３細胞中で行われた。感染細胞は、４８時間ポスト感染で溶解した。ウイルス含有抽出物は、ウイルスを沈殿する前に残骸を除去する為に遠心分離に掛けられた。ウイルスは、遠心分離で集められ、等張性媒体に再懸濁され、精製、殺菌された。
【００７３】
必要に応じて、沈殿ウイルスは、ＣｓＣｌ（ｄ＝１．１０ｇ／ｍｌ）を含有するｐＨ７．８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ中に再懸濁出来、２ｍｌのＣｓＣｌ（ｄ＝１．４０）と３ｍｌのＣｓＣｌ（ｄ＝１．３０）の形成する段階勾配で層を形成出来、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＴＨ６４１ローターで、１０℃、２０，０００ｒｐｍで２時間遠心分離出来る。ウイルスは、低部の界面から集められ、等張含塩物に対し、４０℃で一昼夜透析した。
実施例２：      ＡｄＣＭＶ  β−ｇａｌの機能発現
成体の兎を麻酔に掛け、カテーテルを、右頸動脈又は内側頸静脈に挿入した。カテーテルの先端を、左冠動脈又は冠湾曲卵管口に向けて、Ｘ線透視のもとに進めた。ＡｄＣＭＶ
β−ｇａｌを構成する約１０００μｇ〜１５００μｇのアデノウィルスベクターが、実施例１の方法で調製され、生理的に緩衝された含塩物中に懸濁された。約２Ｘ１０9のｐ
ＡｄＣＭＶ  β−ｇａｌのプラーク形成単位（ｐｆｕ）が、挿入カテーテル中に注入された。カテーテルを取り除き、全ての切開部分を閉じ、兎を蘇生させた。兎は、注射後約２１日迄に５匹が殺された。その心臓と、一緒の脈管構造を取り除き、以下に示す様に、β−ｇａｌ活性を組織化学的に試験した。
【００７４】
左心室の３ｍｍ断面を、１．２５％のグルタルアルデヒドと共にＰＢＳ中に室温で５分間置き、ＰＢＳ中で室温で３回洗浄し、ナーベル等［Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，（１９８９）］の記述の様に４−６時間、Ｘ−ｇａｌ（Ｂｉｏｒａｄ）で、β−ガラクトシダーゼ活性の為に染色した。この３ｍｍ断面を、グリコメトシルレートで埋封し、４−７μｍの断面をカットし、前述（Ｎａｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）の様にヘマトキシリンとエオシンで逆染色した。コダックエクタクローム２００ファイルとライツラボルラックスＤ（Ｌｅｉｔｚ  Ｌａｂｏｒｌｕｘ  Ｄ）及びワイルドＭ８顕微鏡（Ｗｉｌｄ  Ｍ８  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して顕微鏡写真を撮った。β−ｇａｌ活性は、冠血管平滑筋及び心筋細胞で観察された。
実施例３：      ダッチェン（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ）の筋ジストロフィーを
伴う患者の心筋細胞でのジストロピン発現の調整
本発明の方法は、抗原療法、例えばダッチェン（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ）の筋ジストロフィー治療を介して人間の病気治療に使用出来る。
【００７５】
ダッチェン（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ）の筋ジストロフィーを伴う人間の患者は、まず初めに、アデノウイルスベクター構成体を調製するのに使用されたアデノウィルスに対する抗体の存在が試験される。抗体が存在するか、又はその患者が他の物質に対してアレルギーの経験がある場合は、その患者は、試験投与量として約１０3〜約１０6の再結合アデノウィルス錠剤が与えられる。
【００７６】
ジストロピンのコード配列を含む再結合アデノウィルスは、ＦＤＡ（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）に認可され、人体の使用に十分な効能と純度を有する事が証明されている方法によって調製、精製される。
【００７７】
アデノウィルスは、適当な薬理組成物、丸薬或いは時間をかけての注入物の何れかで、静脈投与によって患者に投与される。アデノウィルスは、効果的発現を誘引する量で投与される。一般的に、その様な効果的な量は、約１０8〜約５Ｘ１０12のウイルス錠剤又は
ｐｆｕである。
【００７８】
患者は、激烈で、遅効性の拒絶反応を観察する為の試用期間中は病院に置かれる。
【００７９】
本発明の組成物及び方法は、好適な実施態様で述べられたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱する事無く、ここで述べられた組成物、方法及び方法の工程又は工程の順序に対して、種々の変更が適用できる事は、当業者にとって明らかであろう。
【００８０】
【表１】
2006212034.tif 000002
【００８１】
【表２】
2006212034.tif 000003
【００８２】
【表３】
2006212034.tif 000004
【００８３】
従って、本発明は、以下を提供する。
１．心筋細胞又は血管平滑筋細胞において遺伝子産物の発現を制御する方法であって、以下の工程：
（１）前記遺伝子産物をコードするコード配列を含有するアデノウイルスベクターであって、前記筋細胞における前記遺伝子産物の発現を駆動するアデノウイルスベクター構築物を前記筋細胞に送達する工程；及び
（２）前記遺伝子産物を前記筋細胞において発現するに充分な生理的条件において前記筋細胞を維持する工程；
を含むことを特徴とする方法。
２．前記アデノウィルスが、アデノウィルス５型である、１に記載の方法。
３．前記アデノウィルスが、初期遺伝子領域Ｅ１を有さない、１に記載の方法。
４．前記アデノウィルスが、初期遺伝子領域Ｅ１及びＥ３を有さない、１に記載の方法。５．前記コード配列が、アデノウィルスエンハンサー−プロモーター以外のエンハンサー−プロモーターに機能しうるように結合している、１に記載の方法。
６．前記エンハンサー−プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、又はＭＣＫエンハンサーを含有する、５に記載の方法。
７．前記エンハンサー−プロモーターが、心筋特異的エンハンサー−プロモーターである、５に記載の方法。
８．前記心筋特異的エンハンサー−プロモーターが、ｃＴＮＣプロモーターである、７に記載の方法。
９．前記エンハンサー−プロモーターが、血管平滑筋に特異的である、５に記載の方法。１０．前記血管平滑筋特異的エンハンサー−プロモーターが、エンドセリンプロモーター又は平滑筋α−アクチンプロモーターである、９に記載の方法。
１１．前記コード配列が、転写終結領域に機能し得るように結合している、１に記載の方法。
１２．前記転写終結領域が、ＳＶ４０又はプロタミン遺伝子ポリアデニレーション信号を有する、１１に記載の方法。
１３．前記コード配列が、ｃＤＮＡ挿入物を有する、１に記載の方法。
１４．前記遺伝子産物が、ポリヌクレオチドである、１に記載の方法。
１５．前記ポリヌクレオチドが、ｃ−ｍｙｂに対するアンチセンス配列を含有する、１４に記載の方法。
１６．前記遺伝子産物が、ポリペプチドである、１に記載の方法。
１７．前記ポリペプチドが、成長因子である、１６に記載の方法。
１８．前記成長因子が、フィブロブラスト成長因子−５、酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラスト成長因子、又は血小板由来成長因子である、１７に記載の方法。
１９．前記ポリペプチドが、成長因子受容体である、１６に記載の方法。
２０．前記成長因子受容体が、変異フィブロブラスト成長因子受容体又は変異血小板由来成長因子受容体である、１９に記載の方法。
２１．前記ポリペプチドが、ジストロピン又は細胞接着分子である、１６に記載の方法。２２．前記細胞接着分子が、変異Ｉ−ＣＡＭ又変異Ｖ−ＣＡＭである、２１に記載の方法。
２３．送達が、前記アデノウイルスベクター構築物を前記心筋細胞に注射することである、１に記載の方法。
２４．送達が、前記アデノウイルスベクター構築物を、筋細胞を灌流する血管に注ぐことである、１に記載の方法。
２５．前記血管が、冠状動脈又は冠状静脈洞である、２４に記載の方法。
２６．心筋細胞又は血管平滑筋細胞において遺伝子産物の発現を誘導する医薬組成物であって、生理的に許容し得るキャリヤーと、前記遺伝子産物をコードするコード配列を含みかつ前記筋細胞において前記遺伝子産物の発現を駆動することができる、効果的に発現を誘導する量のアデノウイルスベクター構造物と、を含有することを特徴とする医薬組成物。
２７．心筋又は血管平滑筋細胞において遺伝子産物の発現を制御するのに使用されるアデノウイルスベクター構築物を調製する方法であって、以下の工程：
（１）アデノウィルスを提供する工程、及び
（２）心筋又は血管平滑筋細胞に導入するのに望ましい遺伝子産物をコードするコード配列を前記アデノウィルスに導入する工程、
を含むことを特徴とする方法。
２８．２７に記載の方法によって調製したアデノウイルスベクター構築物。