(57)【要約】【目的】  本発明は特定のメタアクリル酸エステル、重合体および骨形成因子から構成される新規な骨修復機能を有する反応性医療物質に関する。本発明の反応性医療物質は、反応することにより機械的強度を増し、生体内で長期に使用するものである。  本発明の骨修復機能を有する骨誘導支援組成物は、適度な弾性を維持し、使用時に鋏、鋭利な刃物で容易に形成可能である特徴がある。【効果】  本発明の反応性医療物質は、再生膜をメタアクリル酸エステル、重合体、生体吸収材料の混合物からなり、再生膜粘膜の再生上皮形成、移植片の安定化を形成できる。【選択図】図１
2006296465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形態付与性や形態保持性を有する骨誘導を支援する骨誘導支援組成物であって、メタアクリル酸エステル、多官能重合性単量体、メタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤可能である重合体、重合性開始剤及び骨形成因子を有する骨誘導支援組成物。
【請求項２】
メタアクリル酸エステルが、下記一般式〔１〕
ＣH2＝C（CH３）COO-（CH２）ｎ-ＯＣＯ-（ＣＨ２）n-ＣＯＯ−R  ・・・・・・  〔１〕
（式中、ｎは２以上の整数を示しRは水素原子またはメチル基を示す）で示されるメタアクリル酸エステルである請求項１記載の骨誘導支援組成物。
【請求項３】
請求項１記載の骨誘導支援組成物に、メタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤不可能である重合体を配合した骨誘導支援組成物。
【請求項４】
骨形成因子が脱灰動物皮質骨より抽出・部分粗精製物質または分子生物学的に人工合成したものからなる請求項１記載の骨誘導支援組成物。
【請求項５】
請求項１記載の骨誘導支援組成物に生体親和性物質であるゼラチン、ヒアルロン酸、デンプン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の混合物からなる群から選ばれる１種以上のコポリマーを配合された骨誘導支援組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医科、歯科、口腔外科などの医療分野において組織誘導の目的で用いる操作性、安定性に優れた組織再生用の骨修復機能を有する反応性医療物質である。
【背景技術】
【０００２】
医療領域における骨欠損の再建に対しして従来から様々な移植材料の応用がなされてきた。骨の再生には、骨を造る細胞、骨形成因子、それらを維持する足場が必要である。自家骨、他家骨、生体材料などが足場として応用されている。これらの足場は、自家骨は骨量の制限及び健康組織への外科的侵襲、他家骨は感染症及び免疫拒絶反応、生体材料は、生体親和性及び骨誘導量が不安定などの課題がある。
【０００３】
細胞誘導の足場にはこれまで、金属材料、高分子材料、セラミック材料などが応用されているが、これらは生体内での増殖因子の保持能力や特に操作時の形成或いは形態付与に問題がある。
【０００４】
細胞誘導の足場に望まれる性質としては、足場を構成する物質が容易に組織と密着し、生体親和性が良好であり、骨欠損部の治癒速度を高める必要がある。また、治療物は体内である程度の強度を持ち、且つ体内埋入時に適用部位に応じた密着性や形態付与性と形態保持性を持つ必要がある。
【０００５】
特表2001-523999には整形用プレートおよび骨セメントのための生物的に衰退可能な重合性の半ば浸透するネットワークアロイおよびこれを作る方法が示されているが、形態付与性や形態保持性を示すものではなく、医療現場で適用できない症例も多く存在した。更に、骨誘導性も十分で無かった。
【０００６】
【特許文献１】特表2001-523999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記従来の足場となる材料では不十分であった生体親和性が改善され、骨増殖因子の保持能力が強固であり、新生骨の誘導を促進させ、従来の欠点であった適用部位に応じた密着性や形態付与性と形態保持性などを向上させた骨修復機能を有する骨誘導支援組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
骨修復機能を有する反応性再生医療物質を作製するあたり、化学式〔１〕で示される化合物を含み、重合体の種類や配合比を変え,骨修復機能を有する反応性再生医療物質が有効であることを見出した。
ＣH2＝C（CH３）COO-（CH２）ｎ-ＯＣＯ-（ＣＨ２）n-ＣＯＯ−R  ・・・・・・  〔１〕
【０００９】
本発明は形態付与性や形態保持性を有する骨誘導を支援する骨誘導支援組成物であって、メタアクリル酸エステル、多官能重合性単量体、重合体、重合性開始剤、骨形成因子及び生体親和性物質を有する骨誘導支援組成物である。
【００１０】
本発明はメタアクリル酸エステルが、一般式〔１〕（式中、ｎは２以上の整数を示しRは水素原子またはメチル基を示す）で示されるメタアクリル酸エステルである請求項１記載の骨誘導支援組成物である。
【００１１】
本発明は重合体がメタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤可能である重合体とメタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤不可能である重合体とからなる請求項１記載の骨誘導支援組成物である。
【００１２】
本発明は骨形成因子が脱灰動物皮質骨より抽出・部分粗精製物質または分子生物学的に人工合成したものからなる請求項１記載の骨誘導支援組成物である。
【００１３】
本発明は生体親和性物質が、Ｌ-乳酸、ＤＬ-乳酸、グリコール酸、ε-カプロラクトンのホモポリマー又はコポリマーからなる請求項１記載の骨誘導支援組成物。
【発明の効果】
【００１４】
以上述べた骨修復機能を有する骨誘導支援組成物は、生体内での親和性も良好であり、特に生体内への埋入時の形態付与性、重合後の形態保持性は優れており、骨誘導の足場として極めて有効である。
骨生成が早いことから治療も従来より早く進み、回復も早い。
本発明の骨修復機能を有する骨誘導支援組成物は、適度な弾性を維持し、使用時に鋏、鋭利な刃物で容易に形成可能である特徴がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明では、前記化学式〔１〕で示される代表的な化合物、メタクリロイロキシエチルコハク酸メチル（以下、TAと略称する）、メタクリロイロキシエチルグルタル酸メチル、メタクリロイロキシエチルアジピン酸メチル、である。好ましくはＴＡ、メタクリロイロキシエチルグルタル酸メチルであり、更に好ましくはＴＡである。好ましい配合量は１０．０〜９０．０質量％、好ましくは１０．０〜７５．０質量％である。
TAは本発明を実施する最も好ましい化合物である。
【００１６】
多官能重合性単量体とは、化学式〔１〕で示されるメタアクリル酸エステル化合物とともに、これと共重合可能な多官能重合性単量体である。このような多官能重合性単量体としては一般に歯科材料として用いられる重合性単量体、例えば、エチレン性二重結合を少なくとも２個含有する多官能性モノマー、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、２，２−ビス〔４−フェニル〕プロパンジ（メタ）アクリレート、ジメタクリル酸１，６ヘキサンジオール（以下、「HX」と略称する）、ＵＤＭＡ、Ｂｉｓ−ＧＭＡ等が例示できる。好ましくはＨＸである。
好ましい配合量は５．０〜５０．０質量％、好ましくは１０．０〜４０．０質量％である。
【００１７】
メタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤可能な重合体とはアルキル（メタ）アクリレートの重合体または共重合体であり、好ましくはＭＭＡ、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、プロピルメタクリレート等を主構成成分として得られる単独重合体または共重合体である。好ましくはポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリブチルメタクリレート、ポリプロピルメタクリレートの単独重合体または共重合体である。
メタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤可能な重合体の好ましい配合量は２０．０〜７５．０質量％、好ましくは３０．０〜６５．０質量％である。
【００１８】
メタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤不可能な重合体とはカーボメチルセルロース（以下、CMCと略称する）、アルギン酸ナトリウム（以下、ＡＮａと略称する）、キサンタンガム、セルロース誘導体、糖類、多糖類などのが最適である。好ましくは糖類、多糖類である。
メタアクリル酸エステルまたは多官能重合性単量体の内一方以上に溶解もしくは膨潤不可能な重合体の好ましい配合量は０．５〜２０．０質量％、好ましくは１．０〜１５．０質量％である。
【００１９】
重合体は平均粒子径４から５００μｍの粉体であることが好ましく、より好ましくは１〜８５μｍが最適である。またアルキル（メタ）アクリレート重合体の分子量は１０万〜１００万が最適である。
【００２０】
骨形成因子はUristらの方法に準じて脱灰牛皮質骨より抽出部分精製を行ない、in vivo移植により生理活性の確認を行なったものが量、質共に最適である。牛以外の動物種ならびに歯より抽出精製を行なったものでも問題ない。 また、分子生物学的に人工合成した骨形成因子も適用が可能である。さらに脱灰骨基質そのものも使用する事が可能である。
骨形成因子の好ましい配合量は０．５〜３０．０質量％、好ましくは１．５〜質量２５．０％である。
【００２１】
生体親和性物質が、Ｌ-乳酸、ＤＬ-乳酸、グリコール酸、ε-カプロラクトンのホモポリマー又はコポリマーからなることが好ましい。
生体親和性物質の好ましい配合量は０．５〜４５．０質量％、好ましくは１．５〜３５．０質量％である。
【００２２】
本発明の重合性開始材としては、目的に適した重合形式に応じて任意に選択することが可能である。骨修復機能を有する反応性医療物質を重合させるには６０℃以下の範囲が良く、この際、重合開始材には過酸化物、ＡＩＢＮが有効である。紫外線及び可視光線で重合する場合には、光重合開始材、還元剤をメタクリル酸エステル、多官能重合性単量体の混合物に対して０．２〜０．５重量部を添加する。具体的に、光重合開始材はα−ジケトン化合物、ケタール化合物、アントラキノン系化合物が有効であり、特にα-ジケトン化合物のカンファーキノン（以下、「ＣＱ」と略称する）が好ましい。還元剤としては第１級、第２級アミン又は第３級アミンが有効であり、特に第３級アミンのメタクリル酸ジメチルエチルが好ましい。また、ジブチルチンジラウレートノスズ（以下、「Bu-Tin」と略称する）化合物も好ましい。
【００２３】
骨修復機能を有する反応性医療物質を作製する方法は重合体とＴＡ、多官能重合性、骨形成因子、生体親和性物質、重合性開始材を含む骨誘導支援組成物（混合物）を骨修復機能を有する反応性医療物質作製用金型或いは石膏型に填入し、２０〜５００Ｋｇｆ／ｃｍ２で約１０〜１２０分間予備加圧後、型より取り出し形態修正を行う。骨修復機能を有する反応性医療物質の保存は室温下（35℃以下）、より好ましくは簡易密封容器中、５℃〜２５℃である。特に光重合タイプは、必然的に紫外線、可視光線を避ける為に遮光する必要がある。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例及び比較例により更に具体的に説明する。
細胞誘導成因子のうち骨形成因子、Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）は Ｕｒｉｓｔらの方法に準じて、ブタ皮質骨を出発原料として作製した。すなわち、皮質骨を６規定の塩酸により脱灰し、脱灰後の脱灰骨基質をＥＤＴＡ, 塩化カルシウムにより連続処理した。この骨基質よりグアニジン塩酸あるいは尿素などのタンパク質溶解材を用いて可溶化を行ない、蒸溜水を透析外液として半透膜により脱塩処理を行なって非水溶性分画を回収した。この分画を再度タンパク質溶解材に溶解後、クエン酸透析、水透析により高分子成分を除去し、有機溶媒により脂質成分を除去後乾燥を行ない、部分精製骨形成因子を作製した。液体クロマトグラフィーによりさらに精製度を上昇することも可能である。得られた骨形成因子はその生理活性を調べるため、雄性マウス4週齢の大腿部 筋肉間空隙に約３ｍｇを移植し、移植後３週間後における軟Ｘ線写真像、ならび に病理組織像から新生骨の誘導を確認した。通常骨形成因子１ｍｇあたり軟Ｘ線 写真像上で約１平方ｍｍの大きさの新生骨が誘導された。
【００２５】
実施例１
３．６ｇのＴＡ、２．４ｇのＨＸ、０．０３６ｇのＣＱと０．１８ｇのBu-Tin化合物からなる混合液と１０ｇのＰＥＭＡ−１（平均分子量２５万、平均粒径子径２５ミクロンＰＥＭＡ）を混合した。混合液とＰＥＭＡ−１の混合方法は、１）乳鉢混合  ２）容器混合  ３）ボールミル混合等の方法で可能であるが今回は、「実験用遊星型ボールミル  Ｐ−５」（フリッチュ・ジャパン株式会社製）を用いて行った。混合条件は室温下、回転数１１０回／分、混合時間１０分間、玉石量５個（直径１０ｍｍ）とした。
【００２６】
重合体が混合液で膨潤した後、金型中（直径６０ｍｍ、厚み０．５ｍｍ）に２０〜８０Ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力下で、１０〜２５分間圧をかけ骨修復機能を有する反応性医療物質を作製した。表１に得られた骨修復機能を有する反応性医療物質の形成特性と重合後の硬度と曲げ特性を示した。鋏みによる形態形成は良好であり、且つ形態維持は安定していた。可視光重合器「ソリディライト」（株式会社松風製）により3分間光重合した骨修復機能を有する反応性医療物質は、良好な重合性を示した。結果を表１に示した。
【００２７】
実施例２
３．６ｇのＴＡ、２．４ｇのＨＸ、０．０３６ｇのＣＱと０．１８ｇのBu-Tin化合物からなる混合液と９．０ｇのＰＥＭＡ−１と１．０ｇのＤＬポリ乳酸「ＰＬＡ−００２０」（京都和光純薬株式会社製）からなる混合物とを混合した。ポリ乳酸を用いる以外は実施例１と同様にして骨修復機能を有する反応性医療物質を作製して評価した。鋏みによる形態形成は良好であり、且つ形態維持は安定していた。可視光重合器「ソリディライト」（株式会社松風製）により3分間光重合した骨修復機能を有する反応性医療物質は、良好な重合性を示した。結果を表１に示した。
【００２８】
実施例３
３．６ｇのＴＡ、２．４ｇのＨＸ、０．０３６ｇのＣＱと０．１８ｇのBu-Tin化合物からなる混合液と８．０ｇのＰＥＭＡ−１と２．０ｇのＤＬポリ乳酸「ＰＬＡ−００２０」（京都和光純薬株式会社製）を混合した。ポリ乳酸を用いる以外は実施例１と同様にして骨修復機能を有する反応性医療物質を作製して評価した。鋏みによる形態形成は良好であり、且つ形態維持は安定していた。可視光重合器「ソリディライト」（株式会社松風製）により３分間光重合した骨修復機能を有する反応性医療物質は、良好な重合性を示した。結果を表１に示した。
【００２９】
実施例４
３．６ｇのＴＡ、２．４ｇのＨＸ、０．０３６ｇのＣＱと０．１８ｇのBu-Tin化合物からなる混合液と７．０ｇのＰＥＭＡ−１と３．０ｇのＤＬポリ乳酸「ＰＬＡ−００２０」（京都和光純薬株式会社製）を混合した。ポリ乳酸を用いる以外は実施例１と同様にして骨修復機能を有する反応性医療物質を作製して評価した。鋏みによる形態形成は良好であり、且つ形態維持は安定していた。可視光重合器「ソリディライト」（株式会社松風製）により３分間光重合した骨修復機能を有する反応性医療物質は、良好な重合性を示した。結果を表１に示した。
【００３０】
実施例５
３．６ｇのＴＡ、２．４ｇのＨＸ、０．０３６ｇのＣＱと０．１８ｇのBu-Tin化合物からなる混合液と５．０ｇのＰＥＭＡ−１と５．０ｇのＤＬポリ乳酸「ＰＬＡ−００２０」（京都和光純薬株式会社製）を混合した。ポリ乳酸を用いる以外は実施例１と同様にして骨修復機能を有する反応性医療物質を作製して評価した。鋏みによる形態形成は良好であり、且つ形態維持は安定していた。可視光重合器「ソリディライト」（株式会社松風製）により３分間光重合した骨修復機能を有する反応性医療物質は、良好な重合性を示した。結果を表１に示した。
【００３１】
実施例６
３．６ｇのＴＡ、２．４ｇのＨＸ、０．０３６ｇのＣＱと０．１８ｇのBu-Tin化合物からなる混合液と８．０ｇのＰＥＭＡ−１と２．０ｇのＣＭＣを混合した。ＣＭＣを用いる以外は実施例１と同様にして骨修復機能を有する反応性医療物質を作製して評価した。鋏による形態形成は良好であり、且つ形態維持は安定していた。可視光重合器「ソリディライト」（株式会社松風製）により３分間光重合した骨修復機能を有する反応性医療物質は、良好な重合性を示した。結果を表１に示した。
【００３２】
実施例７
３．６ｇのＴＡ、２．４ｇのＨＸ、０．０３６ｇのＣＱと０．１８ｇのBu-Tin化合物からなる混合液と８．０ｇのＰＥＭＡ−１と２．０ｇのＡＮａを混合した。ＡＮａを用いる以外は実施例１と同様にして骨修復機能を有する反応性医療物質を作製して評価した。鋏による形態形成は良好であり、且つ形態維持は安定していた。可視光重合器「ソリディライト」（株式会社松風製）により３分間光重合した骨修復機能を有する反応性医療物質は、良好な重合性を示した。結果を表１に示した。
【００３３】
（比較例）
再生医療膜「ＤＥＸＯＮ  ＭＥＳＨ」（ＤＡＶＩＳ＆ＧＥＣＫ社製）を用い実施例２〜７と同様にして、鋏による形成及び光重合性を評価した。鋏による形成は弾性がなく形態保持が不可能であり、光重合性はなかった。結果を表１に示した。数値の括弧内は標準偏差である。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
〔重合成型体の評価方法〕
以上の実施例および比較例において重合成型した硬化体の物性評価は以下の方法に従って行った。
曲げ強度
「オートグラフＡＧ５０００Ｂ」（株式会社島津製作所製）を用い、試験体寸法が幅（２ｍｍ）、厚さ（２ｍｍ）及び長さ（２５ｍｍ）の試料を作製し５０℃の水中に２４時間、７日、１４日間保存後の曲げ特性（最大応力、ヤング率）を測定した。試験体数は５ヶ。測定条件は、支点間距離２０ｍｍ、クロスヘッドスピード１ｍｍ／ｍｉｎとした。
【００３６】
実施例８
実施例２で作製した骨修復機能を有する反応性医療物質表面（縦８ｍｍ、横５ｍｍ）に３ｍｇのＢＭＰを均一分散させ、４週齢のマウスを用い、大腿部筋膜空隙に移植し、移植後４週間後にジエチルエーテルにて屠殺した後、移植部の軟Ｘ線写真による画像診断と組織学的観察を行った。また、生体親和性は、周囲の線維性結合組織による被包化と炎症性細胞の有無により評価した。軟Ｘ線写真及び組織像においては、新生骨が骨修復機能を有する反応性医療物質の形状にそって誘導された。生体親和性は良好であった。結果を表２に示した。移植部の軟Ｘ線写真による新生骨の画像診断を図１に示した。
【００３７】
実施例９〜１３
実施例３で作製した骨修復機能を有する反応性医療物質表面（縦８ｍｍ、横５ｍｍ）に所定ののＢＭＰを均一分散させ、４週齢のマウスを用い、大腿部筋膜空隙に移植し、移植後４週間後にジエチルエーテルにて屠殺した後、移植部の軟Ｘ線写真による画像診断と組織学的観察を行った。また、生体親和性は、周囲の線維性結合組織による被包化と炎症性細胞の有無により評価した。軟Ｘ線写真及び組織像においては、新生骨が骨修復機能を有する反応性医療物質の形状にそって誘導された。生体親和性は良好であった。結果を表２に示した。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
（ＢＭＰの作製）
Ｕｒｉｓｔ法を基本として、抽出精製を行なった。すなわち、牛皮質骨を出発原料として軟組織を除去し骨溝組織を粉砕脱灰後、タンパク質可溶化剤を使用して抽出し、その後多段処理により特に高分子成分の除去を行ない、１０Ｋ〜４０ｋＤａ 付近のＢＭＰ(骨形成因子)の抽出精製を行なった。
（ＢＭＰの抽出）
牛皮質骨由来部分精製ＢＭＰ作成用材料牛の新鮮なキヤノンボーンを屠殺場から入手しＢＭＰを抽出した。抽出の概要は脱灰、中和、たんぱく質抽出の３工程から行った。
【００４０】
（ＢＭＰ抽出の手順）
（１）新鮮骨の入手屠殺後１〜２時間以内の新鮮な牛足下骨を屠殺場から入手する。新鮮骨を入手できるかどうかは、後のＢＭＰの活性に大きな影響を与えるため、業者に新鮮骨入手の重要性をあらかじめ理解してもらい、また、輸送時間の最も短い業者を選択する。気温が高い季節は内在性のＢＭＰ分解酵素の働きで抽出蛋白質の活性が著しく低下するため、抽出操作は主として１１月〜４月の時期に行ない、冬季においても極力牛足下骨の温度が上昇しないよう冷蔵保存に心掛ける。（２）牛皮、軟組織の除去まず関節部分にメスを入れ、ひずめを切り離してから、牛足下骨の牛皮並び肉組織を除去した。（３）骨端の除去骨膜のみを残した足下骨の両端を電動丸ノコ切で切断する。（４）骨膜の除去軍手など滑り止めとなる手袋で骨をしっかりと掴み、メスで長軸方向に短冊状に切れ込みを入れ、骨膜をはぎ取った。（５）骨髄組織の除去硬めのハブラシ等で骨髄を除去し、よく水洗した。（６）牛骨の粉砕大きめの発泡スチロールに液体窒素を入れ、皮質骨部分のみとなった牛骨を投入し凍結した。粉砕機により、１ｍｍ程度の大きさに粉砕した。（７）粉砕骨の脱脂粉砕した骨をただちに、４０Ｌ程度のクロロホルムーメタノール１：１溶液に入れ、４〜５時間十分に攪拌した。途中１回液を交換した。(8)粉砕脱脂骨の乾燥クロロホルムーメタノール溶液をガーゼによって十分に絞りきり、シーツ大の新しいガーゼに粉砕脱脂骨を広げ一晩乾燥した。
【００４１】
（ＢＭＰの脱灰と中和）
脱灰０．６Ｎ塩酸水溶液５０Ｌ中に粉砕脱脂乾燥骨を投入し、４℃冷蔵室中で攪拌しながら３日間脱灰を行なう。１日２回の塩酸交換を行った。塩酸が蒸散すると冷蔵用機器に障害を与えるので脱灰糟は密閉構造とする。脱灰終了後１時間蒸留水で攪拌洗浄を行った。連続処理特にＤｒ．Ｕｒｉｓｔが提唱する段階である。処理が煩雑であるうえに、その効果に対する理論的裏付けが明確ではないため、省略して次の操作に移ることがあるが、部分精製ＢＭＰの骨誘導能は、処理を行なった場合の方が上昇している。最終的に脱灰骨のｐＨが中性付近に上昇することなどから処理は有効であると考えられる。凍結乾燥連続処理終了後の脱灰骨を良く蒸留水により水洗し、ガーゼを使用して水分を切る。―８０℃にて凍結後、凍結乾燥を行った。
【００４２】
（ＢＭＰの抽出）
骨蛋白質の抽出６Ｍ尿素、２Ｍ塩化カルシウム溶液(酵素阻害剤含)３０Ｌ中に脱灰凍結乾燥骨を浸漬し、緩やかに２４時間攪拌して骨内蛋白質を抽出した。なお、２Ｍ塩化カルシウムの添加は脱灰骨基質中の蛋白質抽出を著しく向上するが、尿素と同様試薬特級であっても不良製品が混在することがあるので注意が必要である。
（ＢＭＰの精製の手順）
ＢＭＰ抽出液の精製は、濃縮、透析、遠心分離、クエン酸透析、脱脂、凍結乾燥の工程を経て行った。
（濃縮）
抽出液の濃縮大型の限外濾過機を使用した。抽出溶液をガーゼ濾過し、さらに濾紙を使用して吸引濾過した。固形成分が混入すると限外濾過機のフィルターの目詰まりを生じ濾過効率が減少するのみならず、ポンプのすり合わせ部分に致命的な損傷を与えることがある。３０Ｌを２Ｌ程度まで濃縮するのに約６時間かかるが、この間溶液の温度が上昇しないようポンプ冷却用ジャケットに水道水を導入し、溶液溜めも氷により冷却した。
【００４３】
（透析）
透析カットオフ５０００の透析膜を使用して脱塩を行った。４℃の低温室中で７２時間透析を行ない、１２時間毎に蒸留水を交換した。６Ｍ尿素を使用した場合には透析チューブ内部がゲル状に凝固するので下、透析液交換の度に温水で凝固を溶かし、透析した。
【００４４】
（遠心分離）
非水溶性部分にＢＭＰが存在するので、大型遠心分離機によって沈査を回収した。遠心分離前にゲルを溶かし、1回目の遠心分離は３７℃／ ５０００ｇ ／ ２０ｍｉｎで行った。２回目、３回目の遠心分離は蒸留水で沈殿を懸濁してから４℃／ ５０００ｇ ／ ２０ｍｉｎで行った。
【００４５】
（クエン酸透析）
回収した沈査を抽出溶液３Ｌに再溶解し、非溶解成分を遠心分離により除去した後、透析膜内液の１１倍量の０．２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．１）を透析外液として２４時間透析を行なう。３７℃／ ５０００ｇ ／２０ｍｉｎにて遠心分離を行った。生じた沈殿を回収し２回目、３回目の遠心分離は４℃／ ５０００ｇ／ ２０ｍｉｎで行ない沈殿を洗浄した。
【００４６】
（脱脂）
遠心管を倒立させて十分に水分を切った後、クロロホルムーメタノール１：１溶液２Ｌに懸濁し、脱脂を行なう。脱脂のみならず水分もこの段階で十分に除去しないと回収物が黒変してしまう。３時間脱脂後吸引濾過により濾紙上に部分精製ＢＭＰを回収した。吸引デシケータ中に保管しアスピレータにより一晩吸引乾燥した。透析終了後透析外液を十分な量の蒸留水に変え、さらに３日間透析を行った。１日２回蒸留水を交換した。
【００４７】
（凍結乾燥）
４℃／ ５０００ｇ ／ ２０ｍｉｎにて遠心分離を３回行った。沈査を回収し凍結乾燥した。なお、第１回目の脱脂操作を行なうまでの一連の処理は、温度の影響をきわめて受けやすいため、新鮮な骨を入手してから低温環境で一気に処理を終了することが重要である。後半の処理では透析を行なう過程で失活することが多く、雑菌の混入を防ぐよう可及的清潔な環境で操作を行なう必要がある。
【００４８】
（異所性骨形成能の活性試験）
実験に使用するＢＭＰの新生骨誘導能を調べるため、各ＢＭＰ５ｍｇを軽量し、ゼラチンカプセル(日本薬局方#５)に封入後,凍結乾燥した。この試料を４週齡雄性ｄｄＹ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｍｏｕｓｅの左側大腿部筋膜間空隙内に移植した.移植３週間後ジエチルエーテル麻酔下で屠殺し、移植部の軟X線写真を撮影(３０ｋｖ、４ｍＡ、４０ｓｅｃ)した。移植部位に骨梁構造を示す不透過構造が観察された。さらに病理組織学的観察では、骨組織、軟骨組織および骨髄組織が観察された。ＢＭＰをマウス大腿部軟組織内に移植し、３週間で同部の軟X線写真を撮影したところ、移植部周辺にＸ線不透過像が確認された。また、移植部周辺の病理組織切片を作製しＨＥ染色した後、光学顕微鏡下にて観察したところ、弱拡大像および強拡大像において新生骨組織が確認できた。ＢＭＰの存在においてはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した。１８ｋＤａおよび３８ｋＤａ付近にＢＭＰの存在を確認した。６．考察ゼラチンカプセルでＢＭＰを封入し局所貯留性を高めることで、その活性をより明瞭に確認した。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】移植部の軟Ｘ線写真
【符号の説明】
【００５０】
１    新生骨の誘導部分
【図１】
2006296465.tif 000005