(57)【要約】【課題】高い代謝能やインスリン反応性を有する優れた培養筋細胞を作製する方法を提供し、更に、その細胞を用いる高感度な代謝能の測定方法を提供すること。更に、このような高度発達型培養筋細胞を、そのまま多数の薬剤の活性評価系へとスムースに移行させることが可能な培養系・培養装置を提供すること。【解決手段】筋芽細胞を培養する工程、（２）筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び（３）分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法、及び、該方法で作製された筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）筋芽細胞を培養する工程、（２）筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び（３）分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法。
【請求項２】
高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量が表１に示された範囲にある、請求項１記載の作製方法。
【請求項３】
電気パルス刺激が10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間与えられる、請求項１又は２記載の作製方法。
【請求項４】
電気パルス刺激が20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる、請求項３記載の作製方法。
【請求項５】
少なくとも工程（３）を高酸素分圧状態の培地を用いて行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項６】
高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを培地に溶解させることにより得られるものである、請求項５記載の作製方法。
【請求項７】
工程（１）が１〜６日間、及び工程（２）が３〜１２日間行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項８】
弾性基体上で細胞を培養する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項９】
弾性基体が予め細胞接着因子で処理されている、請求項８に記載の作製方法。
【請求項１０】
細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る底部を有するインサートチャンバー内で細胞を培養し、上下方向に対向して設置された電極によって電気パルス刺激が与えられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の作製方法。
【請求項１１】
下部平板電極、ウェル型培養皿、インサートチャンバー、蓋体、及び、上部電極を有する、上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置。
【請求項１２】
インサートチャンバーの底部が細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る、請求項１１記載の培養装置。
【請求項１３】
請求項１１又は１２記載の培養装置を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載の作製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法で作製された筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。
【請求項１５】
インスリンを含有する培地で５〜２０分間培養し、該培地に更に１０〜５０ｍＭのグルコースを添加して１０〜５０分間培養する、請求項１４記載の測定方法。
【請求項１６】
測定反応に使用する培地及び反応液が高酸素分圧状態にあることを特徴とする、上記１５記載の測定方法。
【請求項１７】
高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを溶液に溶解させることにより得られるものである、請求項１６記載の測定方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の測定方法を利用する筋肉を標的とした薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い収縮能力及び高い代謝能を有する筋管細胞の作製方法、該方法の使用に特に適した培養装置、及び、筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉は運動機能をつかさどるだけでなく、最大のインスリン標的組織として血糖のホメオスタシス維持に必須の役割を果たしている。現在爆発的に増加している２型糖尿病では、インスリン刺激に依存した筋肉への「糖の取り込み」が著しく減弱している。そして、適度な運動刺激は効果的にその病態を改善できることが知られており、臨床の現場でも運動療法は行われているが、その分子機序の詳細は不明である。
【０００３】
筋肉の運動すなわち筋細胞の収縮伸展は、メカニカルな刺激に加え、大きなエネルギー消費を伴う。そして、生体内ではこの両者の複合的な刺激が高い糖代謝能を所有する「健康な筋細胞」を作り上げ、その適正なインスリン反応性を維持している。しかしながら、培養系において筋細胞の収縮活動を十分活発に維持することは難しく、生体を模した優れた培養筋細胞系、特に代謝能の研究に適したものは存在しない。そのため、従来、筋細胞に対する薬剤の効果などは、（１）動物実験あるいは動物から採取した筋組織を用いて行うか、又は、（２）十分に発達していない培養筋細胞株を用いて行われてきた。
【０００４】
筋組織は運動することによりその高い代謝能を発揮するため、動物から採取した筋組織を用いる場合には、筋細胞の代謝能におよぼす薬剤の効果を評価するためには、動物をトレッドミル上で無理矢理に走らせたり、水槽の中で長時間泳がせるなどの方法が主であった。また、実験動物から採取した筋組織に電極をつなぎ、電気パルス刺激にて収縮活動させてサンプルを得ていた。これらの動物実験は倫理的な問題点や、多数の薬剤のスクリーニングには不向きであるという問題点がある。
【０００５】
一方、生体を模した優れた培養細胞系は薬剤のスクリーニングに非常に大きな戦力となる。しかしながら、収縮伸展するという筋細胞の特性を考慮した培養筋細胞系は乏しく、通常の培養条件で得られる培養筋細胞はほとんど収縮能力が発達していない。そのため、非特許文献１や非特許文献２にあるように高い代謝能を有するには至らず、生体の筋を模しているとは言い難く、代謝能の研究には全く不適であった。
【０００６】
更に、特許文献１には、筋芽細胞にパルス波による電気刺激を与えて自動収縮能を有する筋細胞を得る方法が記載されている。又、特許文献２には、上下方向の電流を流す細胞培養措置及び細胞培養方法が記載されている。
【０００７】
しかしながら、これらに記載の細胞培養方法でも未だ取り込み測定等の代謝能の研究に適した筋細胞を作製することに成功してはいない。又、従来の代謝能の測定条件は培養筋細胞に適したものではなかった。
【非特許文献１】Biochem. Pharmacol.、2003年、第65巻, 249〜257頁
【非特許文献２】Am. J. Physiol. (Endoclinol Metab)、2002年、第283巻、E514〜524頁
【特許文献１】特開２００５−２７５０１
【特許文献２】特開２００３−２２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高い代謝能やインスリン反応性を有する優れた培養筋細胞を作製する方法を提供し、更に、その細胞を用いる高感度な代謝能の測定方法を提供することである。更に、このような高度発達型培養筋細胞を、そのまま多数の薬剤の活性評価系へとスムースに移行させることが可能な培養系・培養装置を提供すること目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、筋芽細胞の培養において、培養液の状態（栄養素、酸素、及び老廃物の除去等）を最適化し、且つ、適切な電気パルスを負荷しながら分化誘導することにより、代謝能の評価に適した高度発達型培養筋細胞を作製することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
即ち、本発明は以下の態様にかかる。
１．（１）筋芽細胞を培養する工程、（２）筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導させる工程、及び（３）分化誘導した筋管細胞に電気パルス刺激を与える工程、から成る筋管細胞の作製方法。
２．高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量が表１に示された範囲にある、上記１記載の作製方法。
３．電気パルス刺激が10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間与えられる、上記１又は２記載の作製方法。
４．電気パルス刺激が20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる、上記３記載の作製方法。
５．少なくとも工程（３）を高酸素分圧状態の培地を用いて行う、上記１〜４のいずれか一項に記載の作製方法。
６．高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを培地に溶解させることにより得られるものである、上記５記載の作製方法。
７．工程（１）が１〜６日間、及び工程（２）が３〜１２日間行われる、上記１〜６のいずれか一項に記載の作製方法。
８．弾性基体上で細胞を培養する、上記１〜７のいずれか一項に記載の作製方法。
９．弾性基体が予め細胞接着因子で処理されている、上記８に記載の作製方法。
１０．細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る底部を有するインサートチャンバー内で細胞を培養し、上下方向に対向して設置された電極によって電気パルス刺激が与えられる、上記１〜９のいずれか一項に記載の作製方法。
１１．下部平板電極、ウェル型培養皿、インサートチャンバー、蓋体、及び、上部電極を有する、上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置。
１２．インサートチャンバーの底部が細胞接着因子で予め処理された弾性半透膜から成る、上記１１記載の培養装置。
１３．上記１１又は１２記載の培養装置を用いて行うことを特徴とする、上記１〜１０のいずれか一項記載の作製方法。
１４．上記１〜１０のいずれか一項に記載の方法で作製された筋管細胞を用いるインスリン依存的な糖取り込み能の測定方法であって、インスリンを含有する培地で培養することによりインスリン刺激を与えた後、該培地に更に糖を添加して培養し、その後に糖取り込み能を測定することを特徴とする、前記測定方法。
１５．インスリンを含有する培地で５〜２０分間培養し、該培地に更に１０〜５０ｍＭのグルコースを添加して１０〜５０分間培養する、上記１４記載の測定方法。
１６．測定反応に使用する培地及び反応液が高酸素分圧状態にあることを特徴とする、上記１５記載の測定方法。
１７．高酸素分圧状態が高酸素濃度ガスを溶液に溶解させることにより得られるものである、上記１６記載の測定方法。
１８．上記１４〜１７のいずれか一項に記載の測定方法を利用する筋肉を標的とした薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明方法で作製された筋管細胞は従来の方法に比べて筋構造が発達した肥大した筋管細胞を形成しており、このような筋構造を持つ細胞の割合も増加している。本発明の測定方法を使用することによって、この糖代謝能の亢進を示す指標である、インスリン刺激に反応した糖の取り込み活性が、本発明によって得られた筋管細胞では、従来の細胞に比べ著しく促進されていることが測定できる。従って、本発明方法によって、収縮能および代謝能の両面において、従来と比較して遙かに高度に発達した培養筋細胞を作製し、且つ、該細胞を用いてその代謝能を高感度で評価できる。
【００１２】
更に、本発明に係る上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置の細胞を含むインサートチェンバー部分の脱着は容易であるため、該培養装置から通常の培養用マルチウェルプレートへと簡便に移動させることができ、自動化も容易である。そのため、本発明による方法を用いて細胞培養を行うことにより、大規模な薬剤の活性評価系へとスムースに移行させることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の筋管細胞の作製方法において「筋芽細胞」は当業者に公知の任意のものを使用することができる。由来する動物の種類又は組織等に特に制限はないが、ヒトを含む霊長類、マウス及びラット等の哺乳類細胞が好ましく、又、骨格筋、平滑筋及び心筋等に由来するもので良い。
【００１４】
更に、「筋芽細胞」として細胞株化された任意の細胞を使用することも出来る。このような細胞株の例として、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２（ATCC No. CRL1772）、ラット骨格筋由来の筋芽細胞株Ｌ６（ATCC No.CRL1458）及びラット心筋芽細胞株Ｈ９Ｃ２（ATCC
No.CRL1446）などを挙げることが出来る。
【００１５】
培養に使用される培地は細胞の種類等に応じて、公知の任意の種類から当業者が適宜選択することが出来る。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）及び最小必須培地（ＭＥＭ培地）等を挙げることが出来る。更にこれらの培地には、細胞の分化誘導を阻害しない範囲で、細胞の増殖を促進する等の目的で、各種因子、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、アルブミン、トランスフェリン、ホルモン、細胞成長因子、ビタミン等を適宜含有させることが出来る。
【００１６】
通常、播種細胞数１〜５ｘ１０５個／ウェル程度、湿度１００％、培養温度３７℃、培地のｐＨ7.2〜7.4程度で培養を実施するが、その他の培養条件は通常の範囲で当業者が適宜決めることが出来る。
【００１７】
本発明の筋管細胞の作製方法において、第一段階の筋芽細胞を培養する段階は、通常、１〜６日間程度、好ましくは、筋芽細胞が増殖してコンフルエント（培養容器表面全体に密になった状態）になるまで実施する。例えば、筋芽細胞株を１〜６日程度、10〜20%ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地にて密になるまで培養する。
【００１８】
第ニ工程及び第三工程で使用する培地は高アミノ酸含有培地である。その結果、分化誘導が促進され、電気パルス刺激による収縮活動に伴う培養細胞の疲労を除去することが出来る。高アミノ酸含有培地に含まれる各アミノ酸の含量(mg/l)は、通常の培地に含まれる量の約２〜５倍の必須アミノ酸ならびに、通常の培地に含まれない非必須アミノ酸（L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-プロリン）を添加したものに相当し、代表的な例を以下の表１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
筋芽細胞の分化誘導効果を促進するために、少なくとも第三工程で使用する培地を高酸素分圧状態にすることが好ましい。更に、全ての工程で使用する培地を高酸素分圧状態にすることがより好ましい。かかる高酸素分圧状態は、例えば、使用する前に、培地に高酸素濃度ガス（９５％酸素、５％二酸化炭素）を適当時間吹き込むことによって、酸素を十分に溶解させることにより得ることが出来る。或いは、本発明方法を高酸素濃度ガス雰囲気下で実施することによっても培地の高酸素分圧状態を達成することが出来る。又、筋管形成を促進させるための栄養源の補給及び老廃物の除去を目的とした培地交換は適当な間隔（例えば、１２〜２４時間おき）に実施することが好ましい。
【００２１】
又、第二工程及び第三工程で使用する培地に添加されるウシ血清濃度は比較的低いことが好ましく、例えば、1〜5%の範囲である。更に、栄養補強の目的で適当量（0.5〜10 g/l）のグルコース等の糖を添加することが出来る。又、筋細胞の分化およびインスリン反応性に大きく影響を与える各種物質、例えば、アスコルビン酸、レチノイン酸、K252a(チロシンキナーゼの活性を修飾する薬剤)、PPAR(peroxisome proliferater-activated receptors)群のアゴニスト・アンタゴニスト等も添加することが出来る。
【００２２】
第二工程は、通常、３〜１２日間行われ、筋芽細胞を筋菅細胞に分化誘導させる。第三工程は、分化誘導した筋菅細胞に電気パルス刺激を与える段階であり、かかる電気パルス刺激は、好ましくは、10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間、更に好ましくは、20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる。この電気刺激により、細胞の膜電位依存性チャンネルを活性化し、筋細胞のサルコメア構造を発達させる。さらに、同時に収縮活動を促進させてエネルギー消費量を高める。尚、このような電気パルスを発生させる装置自体は当業者に公知である。尚、電気刺激は水平方向又は垂直方向にかけることができるが、電気刺激を垂直方向にかける本発明の上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置を用いることによって、得られた筋菅細胞をその後のシステム、例えば、薬剤の活性評価系等へと簡便に移行させることが可能となる。
【００２３】
分化誘導の過程で筋細胞の収縮力が増加するために、培養中に自らの収縮活動により細胞が培養面から剥離する可能性がある。そこで、これを防ぐ為に、弾性基体上で細胞を培養することが好ましい。この基体は、筋細胞の増殖に悪影響を与えないようなものであれば当業者に公知の任意の材質、例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)、ポリエチレンテレフタレート、及び、マトリゲル等を使用することが出来る。更に、培養後の操作性を考慮して、基体は半透膜のような液体成分が透過できるような形態とすることが好ましい。
【００２４】
更に、筋細胞の分化誘導と細胞接着を促進させるために、コラーゲン、フィブロネクチン、及びエラスチン等の当業者に公知の細胞接着因子（細胞外基質）、徐放性の分化誘導促進因子、薬剤、および栄養素等で基体を予め処理することが好ましい。これは、当業者に公知の任意の手段、例えば、該基体をこのような各物質を含む溶液に浸すことでこれらの物質を基体表面へと予め吸着させる等の手段によって実施することが出来る。尚、この溶液に含まれる上記各物質の割合及び濃度等は、培養細胞の種類、培地の種類、弾性基体の材質等の応じて当業者が適宜選択することが出来、その結果、細胞が接着する基体表面に適度な弾性を持たせることができる。
【００２５】
本発明の筋管細胞の作製方法に使用する培養装置に特に制限は特にないが、好適な構成例として、例えば、下部平板電極、ウェル型培養皿、インサートチャンバー、蓋体、及び、上部電極を有する、本発明の上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置を挙げることが出来る。ここで、上下電極間に挿入されるインサートチャンバーの底部は細胞接着因子で予め処理された弾性の半透膜のような基体から成ることが好ましい。このような半透膜自体は、例えば、ポリエチレンテレフタレートやヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)等の素材から成っている。本発明装置には、電気パルス発生装置等のその他の任意の構成要素を含むことが出来る。
【００２６】
本発明装置の概略構成を図１に示す。図１の装置では、電気伝導性電極板（１）を底面に設置したウエル型培養皿（２）を用いており、このウエル型培養皿上に筋細胞培養用培地を添加する。その上部のインサートチャンバー（３）内に底部に設置された処理済半透膜（５）上で細胞を培養する。蓋体（４）に設置された上部電極と下部平板電極との間で垂直方向の適当な電気パルス刺激を加える。
【００２７】
筋細胞の代謝能、特に、糖の取り込み活性は、培養液中の糖の濃度に依存して敏感に変化してしまう、という問題点がある。本発明の測定方法においては、筋管細胞の代謝能の評価を行う際に、従来の反応液（Krebs-Ringer Phosphate Buffer HEPES:KRPH）に適当量（例えば、1〜1000nM程度）のインスリンを含有する培地で適当な時間（例えば、５〜２０分間）培養することによりインスリン刺激を与えた後、適当量（例えば、１０〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３５ｍＭ、特に２５ｍＭ前後）の糖（例えば、グルコース）を添加し、更に一定時間（１０〜５０分間程度）培養し、その後に測定することにより、上記問題点が解決される。即ち、本発明の測定方法は、基底状態の糖取り込み量が減少し、インスリン依存的な糖取り込みが極めてよく評価できる系であることが確認された。即ち、生体の筋で観察されるインスリン反応性が、本発明の測定方法によって再現できることが示された。更に、代謝反応に必須である酸素を十分に供給するため、測定段階において、既に記載の方法によって富酸素状態にした培地及び反応液を用いることが好ましい。従って、代謝能の評価は、従来の２−デオキシグルコースの取り込み方法（Kanzaki
M and Pessin JE, J Biol Chem, 2001年、第276巻（45号）, 42436-42444頁）に上記の点を改変したものを用いる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例に則して本発明を更に説明するが、これはあくまで本発明の一例であり、本発明の技術的範囲はこれらによって限定されるものではなく、本明細書の記載に基き、当業者が容易に想到し得る任意の変型・修飾法も本発明の範囲である。尚、以下の各実験は図１に記載の上下対向電極型電気パルス刺激負荷培養装置を用いて実施した。尚、以下の作製例等においては、高アミノ酸含有培地として、表１に記載される範囲の最高値のアミノ酸を含有する培地を使用したが、これは、高アミノ酸含有による効果をより明確に示す目的で行ったものであり、これらの値より少量のアミノ酸含量の場合でも、本発明の所定の効果を奏効することができる。
【００２９】
作製例１：
上記装置のインサートチェンバー内の多孔性の半透膜上にコラーゲン（0.1〜100 μg/ml）、フィブロネクチン（1〜100
μg/ml）、及びエラスチン（1〜100 μg/ml）の細胞外基質と筋細胞の分化を促す薬剤（K252a=100 nM）の混合液を添加し、室温にて数時間放置した。その後、こうして特殊処理したインサートチェンバーから混合液を除去し、ダルベッコ改変リン酸生理食塩緩衝液にて数回洗浄したものに、マウス筋芽細胞株C2C12細胞を1 x 105個/ウェル（４ウェルプレート）となるように播種した。
【００３０】
その後、C2C12筋芽細胞がコンフルエントとなるまで3日間ダルベッコ改変イーグル培地＋10%牛胎児血清を用いて培養した。その後、ダルベッコ改変イーグル培地＋2%牛血清に置換して８日間の培養を行い、筋管細胞へと分化誘導させた。なお、分化誘導培地は、均一な筋管形成を促進し肥大した筋管を形成するために、各アミノ酸（表１に示した範囲の最高値の含量）を添加したものを用い、更に、95% O2 + 5% CO2混合ガスを直接培地に吹き込んで供給することによる高酸素分圧状態にした。また、栄養源の供給ならびに老廃物の除去を目的に培地交換は分化誘導後、24時間おきに行った。その結果、図２に示されるように、高アミノ酸含有培地（表１に記載される範囲の最高値のアミノ酸含量）を使用することによって筋管細胞が著しく肥大していることがわかる。
【００３１】
上記の高アミノ酸含有培地で分化誘導した筋管細胞に、電気パルス発生装置に接続した本発明装置によって電気パルス刺激（40V, 1Hz, 2ms）を１８時間負荷し、α−アクチニン抗体を用いた免疫染色を行い、サルコメア構造の発達をコンフォーカル顕微鏡で観察した。従来の方法（通常DMEM +に2%牛血清よる分化誘導、電気パルス刺激なし）で分化誘導させた細胞と比較して、本発明方法によって分化誘導した細胞においては電気パルス刺激によってサルコメア構造が発達していること（図３）、及び、サルコメア構造を持つ細胞の割合が増加していること（図４）が確認され、高度分化筋管細胞が著しく増加していることがわかる。
【００３２】
作製例２：
次に、種々の条件で電気パルス刺激を行った際のC2C12細胞の糖取り込み量（エネルギー消費量）の変化を調べた。作製例１と同様にコンフルエント状態にしたC2C12筋芽細胞をDMEM + 2%牛血清で8日間培養した後、図５（Ａ）に示した様々な条件で電気パルス刺激を行った。電気パルス刺激終了後、細胞を氷上に静置して代謝反応を停止させ、その後トリチウムで放射性標識した2-デオキシグルコース（0.1mM, 0.5uCi/ml）を4分間細胞に取り込ませ、その取り込み量の総和を液体シンチレーションカウンターを用いて細胞の糖取り込み量（糖代謝能）を測定した。その結果、ある一定の電気パルス刺激条件下で、電気パルス刺激依存的に細胞の糖取り込み量、すなわちエネルギー消費量が増大したことが示された（図５Ａ）。更に、分化誘導培地として高アミノ酸含有培地（表１に記載される範囲の最高値のアミノ酸含量）を使用した場合に、電気パルス刺激を与えた後の2-デオキシグルコース取り込み量に影響を与えることが示された（図５Ｂ）。
【００３３】
比較例１：
次に、分化誘導方法に電気パルス刺激のみを組み合わせた場合のインスリン依存的糖取り込みの変化を調べた。作製例に従い、C2C12細胞を4ウェルプレートに播種し、3日間通常培地（DMEM + 10%牛胎児血清）でコンフルエントとなるまで培養し、その後、通常の分化誘導培地（DMEM + 2%牛血清）で引き続き8日間培養を行い、分化誘導を行った。次に、電気パルス刺激（40V, 1Hz, 24ms, 18h）を負荷した後、インスリンで60分間処理し、その後、上記の方法で2-デオキシグルコース取り込み量を測定して細胞の糖取り込み量（糖代謝能）を評価した。その結果、電気パルス刺激はインスリン依存的な糖取り込み量を増加させるが、基底状態の糖取り込み量をも増加させてしまうため、生体では観察できるインスリン依存性の糖代謝亢進能を、既存の測定系で観察することは困難であることが判明した（図６）。
【００３４】
比較例２：
比較例１と同様にC2C12細胞を分化誘導した。次に、無血清培地（低グルコース（5 mM）あるいは、高グルコース（25 mM）を含むDMEM）で4時間培養した後、インスリンで5分間処理した。その後、細胞抽出液を調製、ウェスタンブロット解析を行い、インスリンシグナル（AktやErkのリン酸化）を観察した。高グルコースDMEMで4時間前処理することによって、インスリンシグナルが減弱していることが明らかとなった（図７）。
【００３５】
測定例１：
作製例１に従って、C2C12筋芽細胞から分化誘導して得られた筋管細胞を4時間無血清培地（DMEM）で培養して血清中のホルモンの影響を除去した後、KRPH（10mM phosphate buffer, pH7.6, 1mM MgSO4, 1mM CaCl2, 136mM NaCl, 4.7mM KCl, 10mM HEPES (pH7.6)に溶解させた終濃度100nMインスリンで15分間刺激し、その後、100nMインスリンと所定濃度のグルコースを含有するKRPHに培地交換し、さらに45分間処理を継続した。処理後、氷上に細胞培養チャンバーを静置することによって代謝反応を停止させ、富酸素状態のKRPHで3回洗浄を行った。筋管細胞の糖取り込み能は、放射性標識した2-デオキシグルコース（0.1mM, 0.5uCi/ml）を細胞に4分間取り込ませ、どの程度の放射線量が細胞に取り込まれたかを測定することで評価した。インスリン処理15分後に適当な濃度（25 mM）のグルコースを添加することによって、基底状態の糖取り込み量が減少し、インスリン依存的な糖取り込みが極めてよく評価できる系になっていることが確認された。即ち、生体の筋で観察されるインスリン反応性が、本発明の測定方法によって再現できることが示された（図８）。
測定比較例１：
【００３６】
又、従来の方法（通常DMEM +に2%牛血清よる分化誘導、電気刺激なし、測定はグルコース無添加のKRPH中で行う）で得られた培養筋細胞のインスリン依存的糖取り込みと本発明方法（アミノ酸増強富酸素化DMEM + 2%牛血清による分化誘導、電気刺激あり（40V, 1Hz, 2ms, 18h）、測定はインスリン処理15分後に25 mMグルコースを加えたKRPH中で行う）で得られた筋管細胞におけるインスリン依存的糖取り込みを比較すると、従来の方法に比べて本発明の作製方法で得られた筋管細胞はインスリンに反応して糖取り込みが顕著に増えていることが示され、これを用いた本発明の測定方法によって、該筋管細胞の高いインスリン依存的糖取り込み能を測定すること可能であることが確認された（図９）。
【００３７】
尚、上記測定例及び測定比較例において、培養液ならびに反応液は、全て酸素ボンベ(95%O2 + 5%CO2)から2時間2時間酸素を直接溶解させたものを用いた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明方法により、培養系において、高い代謝能やインスリン反応性を有する優れた培養筋細胞、即ち、生体により近似な高度発達型筋細胞を作製することが可能になった。本発明の測定方法を利用することにより、筋肉を標的とした様々な薬剤（糖尿病治療薬、インスリン抵抗性改善薬、糖の取り込み亢進薬、代謝能改善薬、分化誘導促進薬、収縮増強薬など）のスクリーニングをハイスループット化することが可能になり、該スクリーニングが非常に簡便になる。このようなスクリーニング方法は当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。例えば、試験対象となる薬剤の存在下または非存在下で本発明の測定方法を実施し、得られるインスリン依存的糖取り込み量を比較すること等により行うことが出来る。
【００３９】
更に、本発明方法において、電気パルス刺激と培養条件を適切に調節することにより、培養筋細胞の分化度と発達度をコントロールすることが可能である。そのため、移植医療に適した分化度・発達度（収縮力や収縮パターン、代謝能）の培養筋細胞を任意に作製することが可能である。
【００４０】
又、作製された培養筋細胞の収縮活動は人為的にコントロールすることができるため、生体の筋肉の運動活動を模倣した状態を培養系において作り出すことが可能になった。本発明を利用することにより、生体における運動（筋肉の収縮伸展活動）刺激がいかにしてインスリン抵抗性を改善しているのか等の培養細胞の利点を生かした研究（例えば、分子生物学、細胞生物学、生化学、遺伝子工学的手法を用いた研究）が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の実施の形態による細胞培養電気刺激装置の概略構成である。
【図２】通常の分化誘導培地（DMEM + 2%牛血清）で得られた培養筋細胞と本発明方法で得られた筋細胞の比較を示す顕微鏡写真（ｘ２０）である。
【図３】従来の方法で得られた培養筋細胞と本発明方法で得られた筋細胞のα−アクチニン分子を染色してコンフォーカル顕微鏡で撮影した写真（ｘ６０）である。
【図４】従来の方法で得られた培養筋細胞と本発明方法で得られた筋細胞における横紋構造を持つ筋細胞の割合を示すグラフである。
【図５】ある一定の電気パルス刺激条件下で、電気パルス刺激依存的に細胞の糖取り込み量、すなわちエネルギー消費量の増大したことを示すグラフ（A）である。また、分化誘導培地として高アミノ酸含有培地（表１に記載される範囲の最高値のアミノ酸含量）を使用した場合、さらにそのエネルギー消費量を増大させることができることも明らかとなった（B）。
【図６】分化誘導方法に電気パルス刺激のみを組み合わせた場合のインスリン依存的糖取り込みの変化を示すグラフである。
【図７】高グルコース処理によるインスリン初期シグナル（AktやErkのリン酸化）が抑制されることを示すウェスタンブロット解析の電気泳動の写真である。
【図８】本発明による方法で分化誘導を行ったC2C12筋管細胞について、アッセイ中に存在するグルコース濃度を変更した際の基底状態、ならびにインスリン依存的な糖取り込み量の変化を示すグラフである。
【図９】従来の方法で得られた培養筋細胞と本発明方法で得られた筋細胞におけるインスリン依存的糖取り込みの比較を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４２】
（１）下部平板電極
（２）ウェル型培養皿
（３）インサートチャンバー
（４）蓋体
（５）特殊処理済み半透膜
（６）上部電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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