(57)【要約】      （修正有）【課題】  標的物質の細胞を全血中より捕捉するための、血液処理用基材、血液処理用デバイス、及び血液の処理方法を提供する。【解決手段】  血液中の標的物質を吸着または除去する血液処理用基材であって、（ａ）標的蛋白分子に対し結合親和性を有する分子量１３０ｋＤａ以下の認識分子を基材表面に固定化してなり、（ｂ）認識分子と標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下であり、（ｃ）認識分子に対し、解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる、ことを特徴とする血液処理用基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材であって、
（ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化してなり、
（ｂ）固定化された認識分子と標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）固定化された認識分子に対し、解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする血液処理用基材。
【請求項２】
該認識分子が共有結合を介して基材表面に固定化されている、請求項１に記載の血液処理用基材。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイス。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイスに、標的物質を含有する血液を通液することを特徴とする血液の処理方法。
【請求項５】
血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材表面に固定化された認識分子であって、
（ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の分子であり、
（ｂ）標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする認識分子。
【請求項６】
（ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子であり、且つ（ｂ）分子量が１３０ｋＤａ以下であり、且つ（ｃ）標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下である候補認識分子から、
解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された候補認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、候補認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になるものを選び出すことを含む、
血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材の表面固定化用認識分子を選択する方法。
【請求項７】
血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材の製造方法であって、固定化された認識分子に対し、標的蛋白分子溶液を解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）で、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になるように条件設定し、標的蛋白分子に対して結合親和性を有する分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化することを含む、血液処理用基材の製造方法。
【請求項８】
血液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材であって、
（ａ）細胞表面上のＣＤ４分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化してなり、
（ｂ）固定化された認識分子とＣＤ４分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）固定化された認識分子に対し、解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）のＣＤ４分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする血液処理用基材。
【請求項９】
該認識分子が共有結合を介して基材表面に固定化されている、請求項８に記載の血液処理用基材。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイス。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイスに、標的物質を含有する血液を通液することを特徴とする血液の処理方法。
【請求項１２】
血液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材表面に固定化された認識分子であって、
（ａ）細胞表面上のＣＤ４分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の分子であり、
（ｂ）ＣＤ４分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）のＣＤ４分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする認識分子。
【請求項１３】
（ａ）細胞表面上のＣＤ４分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子であり、且つ（ｂ）分子量が１３０ｋＤａ以下であり、且つ（ｃ）ＣＤ４分子との解離定数が１μＭ以下である候補認識分子から、
解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）のＣＤ４分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された候補認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、候補認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になるものを選び出すことを含む、
血液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材の表面固定化用認識分子を選択する方法。
【請求項１４】
液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材の製造方法であって、固定化された認識分子に対し、ＣＤ４分子溶液を解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）で、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になるように条件設定し、ＣＤ４分子に対して結合親和性を有する分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化することを含む、血液処理用基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液等の生物学的液体より分離対象物を特異的に吸着または除去するための血液処理用基材、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液浄化療法とは、特定疾患の治療のため、その発症や誘発、増悪に関連していると考えられる物質成分を血液中から除去することで生体内の恒常性維持を図ることを目的とした治療であり、アフェレシス治療とも呼ばれる。現在行われている血液浄化療法は、除去対象成分及び除去メカニズムにより大きく４つに分類できる。
【０００３】
（１）血液透析・血液濾過・血液濾過透析療法：急性腎不全、慢性腎不全などが適応である。尿として体外に排出されるべき成分(尿素・窒素などの低分子量成分)を血液中から直接浄化する療法で、主に血液中の低分子成分が対象である。
（２）血漿交換療法：劇症肝炎、急性肝不全、閉塞性動脈硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性硬化症、骨髄腫、薬物中毒、天疱瘡などが適応である。体内に蓄積又は産生された成分を血液中から分離除去する療法で、主にコレステロール、免疫グロブリンなどの血液中のやや大きめの成分が対象である。
【０００４】
血液透析・血液濾過・血液濾過透析と血漿交換との違いは、血液中から除去される物質の大きさであると理解できる。すなわち、血液透析では分子量が数千Ｄａまでの小分子量物質が除去され、また、血液濾過では分子量２〜３万Ｄａ以下の中分子量が除去されるが、血漿交換ではそれよりも分子量の大きい蛋白質や蛋白と結合して血中に存在する有害物質（抗体、炎症性サイトカイン、免疫複合体や中毒物質などの液性因子）が除去される。
【０００５】
（３）吸着式血液浄化療法：エンドトキシンまたはグラム陰性菌感染症による敗血症性ショック、家族性高脂血症、閉塞性動脈硬化症、巣状糸球体硬化症、透析アミロイド症などが適応である。吸着剤に血液や血漿を接触させ、物理化学的現象を利用して病因(関連)物質を除去する療法である。除去対象は、エンドトキシン、ＬＤＬ、β２ミクログロブリンなどの血漿成分である。ここで用いられている吸着剤の代表的な例は活性炭である。また、エンドトキシンの活性中心であるリピドＡと結合し、その活性を中和する作用のあるポリミキシンＢを固定化してエンドトキシンを吸着するものが知られている。
【０００６】
（４）血球成分（白血球）除去療法：吸着式血液浄化療法の一種ではあるが、除去対象物質が血球成分であることから別に分類する。潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、皮膚疾患、免疫疾患などが適応である。血液を接触させ、物理化学的現象あるいは免疫反応を利用して病因(関連)物質である細胞、特に白血球を除去する療法である。現在用いられているものは、酢酸セルロースビーズなどによる顆粒球や単球の選択的吸着、あるいは活性化白血球や血小板を選択的に吸着する表面状態の基材など、基材の物理化学的性質を利用して選択性を実現している。
【０００７】
近年、上記の血球成分除去療法において、免疫反応などの生物学的相互作用を利用して、理論的に病因と推定される標的物質である細胞を特異的に捕捉することで副作用を減らし、安全性と治療効果を高めるための研究が行われている。さらに、こうした血液細胞処理の技術は再生医療における幹細胞採集・輸注領域にも応用できることから、血球成分を分離し処理する全般的な医療技術にまで及ぶと考えられる。
【０００８】
標的物質である細胞をより選択的特異的に捕捉する目的で、特許文献１にＴリンパ球に親和性を有するペプチドまたは脂質を固定化した分離材が報告されているが、少なくとも例示されている胸腺ホルモンを固定化した際のＴリンパ球に対する結合親和性が不十分のため実用上問題がある。また、特許文献２〜特許文献５にはＣＤ４陽性細胞に親和性を有するペプチドを不織布に固定化したＣＤ４陽性細胞捕集材がそれぞれ開示されているが、例示されているような抗体の重鎖または軽鎖可変領域の相補的決定領域部分ペプチドの固定化ではＣＤ４陽性細胞に対する結合親和性が実用上不十分で利用できない。さらに特許文献６では、ＣＤ４分子に結合するキメラ抗体、１本鎖抗体、またはそれらを組み合わせた抗体を用いたＣＤ４陽性細胞分離装置が開示されているが、依然として組換え抗体の生産性向上に課題があり製造にかかる費用が高額である点と、単核球浮遊液ではなく全血中からＣＤ４陽性細胞を再現良く除去するための方法が記載されておらず実用上実施不能である点に問題がある。特許文献７には、腫瘍細胞の表面に発現している物質と親和性のあるリガンドを高分子化合物に化学結合で固定化した吸着材が開示されているが、例示されているリガンドの腫瘍細胞に対する特異性が不十分であり、全血中より選択的特異的に目的細胞を捕捉するための要件が開示されてもいないし実施もされていない。特許文献８には、Ｔヘルパータイプ２細胞の表面抗原と親和性を有する物質が水不溶性担体に固定化されてなる免疫系細胞吸着材料が開示されているが、吸着率が不十分であり、また全血中より選択的特異的に目的細胞を捕捉するための要件が開示されてもいないし実施もない。
【０００９】
標的物質に対して特異的結合親和性を有する認識分子としては、抗体、キメラ抗体、F(ab')2、Fab、Fab'、ペプチド、核酸、糖鎖、低分子化合物などが知られているが、一般に抗体は結合親和性が高く基材に固定化しても結合活性を保持しやすい一方で、製造コストが高く実用上課題がある。１３０ｋＤａ程度以下の認識分子では製造コストが抗体に比べ安価であるというメリットはあるが、基材に固定化した状態で実用上十分な結合活性を保持させるのが難しい。
【００１０】
このように血液中の標的物質である細胞を、特に全血中より直接、特異的に捕捉することが期待されているが、実用上利用可能な技術として確立されていない。
【００１１】
【特許文献１】特開平3-32680号公報
【特許文献２】特開平6-154316号公報
【特許文献３】特開平6-154317号公報
【特許文献４】特開平6-218051号公報
【特許文献５】特開平6-269663号公報
【特許文献６】特開平11-332594号公報
【特許文献７】特開2000-217909号公報
【特許文献８】特開2003-52817号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
血球成分除去療法のみならず、血球成分を分離し処理する全般的な医療技術において、免疫反応などの生物学的相互作用を利用して、理論的に病因と推定される標的物質である細胞をより選択的特異的に捕捉することで副作用を減らし、安全性と治療効果を高めることが期待されているにもかかわらず、血液中の標的物質である細胞を、特に全血中より直接、特異的に捕捉する技術が、実用上利用可能な技術として確立されていない問題がある。本発明が解決しようとする課題は、標的物質である細胞を全血中より直接、特異的に捕捉するための、実用上利用可能な血液処理用基材、血液処理用デバイス、及び血液の処理方法を提供することにある。さらに本発明が解決しようとする別の課題は、所定の条件下で血液処理用基材表面に固定化された認識分子、血液処理用基材の表面固定化用認識分子を選択する方法、及び血液処理用基材の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。まず、当該領域研究者らが通常重要と考える、標的物質と認識分子との結合親和性を定量的に示す指標としての解離定数：ＫD（値が低いほど結合親和性は高い）を測定し、更に認識分子を固定化した基材を作製し、標的物質である細胞を全血中より直接、特異的に捕捉出来るか否か試験したところ、解離定数と細胞の特異的捕捉能には相関が見られない場合が存在することを見出した。続いて本発明者らは、これらのデータを詳細に吟味し、同様な解離定数を持つ認識分子であっても、後述する一定の条件下で測定を行った時に、基材表面に固定化された認識分子中の標的蛋白部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる場合に、標的物質である細胞を全血中より直接、特異的に捕捉可能である、という驚くべき知見を見出した。つまり、固定化された認識分子に対し、標的蛋白分子溶液を解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）で、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になるように条件設定し、標的蛋白分子に対して結合親和性を有する分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化することで、標的物質である細胞を全血中より直接特異的に捕捉するための実用上利用可能な血液処理用基材、血液処理用デバイス、及び血液の処理方法を提供するための更なる必須条件を見出した。上記の必須条件は、換言すると用いる認識分子が固定化状態でどれだけ活性を保っているかを直接的に評価し得る指標となっている。表面に固定化できる認識分子数は表面積により上限があるため、たとえ認識分子の固定化量を増やしても、この値が５０％以下の場合には、細胞表面の標的タンパク質分子を効果的に捕捉することが困難となるため、実用上利用不可能となる。上述のような、実験と詳細な解析を経ることにより、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１４】
（１）  血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材であって、
（ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化してなり、
（ｂ）固定化された認識分子と標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）固定化された認識分子に対し、解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする血液処理用基材。
【００１５】
（２）  該認識分子が共有結合を介して基材表面に固定化されている、（１）に記載の血液処理用基材。
（３）  （１）又は（２）に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイス。
（４）  （１）又は（２）に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイスに、標的物質を含有する血液を通液することを特徴とする血液の処理方法。
【００１６】
（５）  血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材表面に固定化された認識分子であって、
（ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の分子であり、
（ｂ）標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする認識分子。
【００１７】
（６）  （ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子であり、且つ（ｂ）分子量が１３０ｋＤａ以下であり、且つ（ｃ）標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下である候補認識分子から、
解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された候補認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、候補認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になるものを選び出すことを含む、
血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材の表面固定化用認識分子を選択する方法。
【００１８】
（７）  血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去する血液処理用基材の製造方法であって、固定化された認識分子に対し、標的蛋白分子溶液を解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）で、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になるように条件設定し、標的蛋白分子に対して結合親和性を有する分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化することを含む、血液処理用基材の製造方法。
【００１９】
（８）  血液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材であって、
（ａ）細胞表面上のＣＤ４分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化してなり、
（ｂ）固定化された認識分子とＣＤ４分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）固定化された認識分子に対し、解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）のＣＤ４分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする血液処理用基材。
【００２０】
（９）  該認識分子が共有結合を介して基材表面に固定化されている、（８）に記載の血液処理用基材。
（１０）  （８）又は（９）に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイス。
（１１）  （８）又は（９）に記載の血液処理用基材を、入口と出口を有する容器に充填した血液処理用デバイスに、標的物質を含有する血液を通液することを特徴とする血液の処理方法。
【００２１】
（１２）  血液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材表面に固定化された認識分子であって、
（ａ）細胞表面上のＣＤ４分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の分子であり、
（ｂ）ＣＤ４分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）のＣＤ４分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする認識分子。
【００２２】
（１３）  （ａ）細胞表面上のＣＤ４分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子であり、且つ（ｂ）分子量が１３０ｋＤａ以下であり、且つ（ｃ）ＣＤ４分子との解離定数が１μＭ以下である候補認識分子から、
解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）のＣＤ４分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された候補認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、候補認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になるものを選び出すことを含む、
血液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材の表面固定化用認識分子を選択する方法。
【００２３】
（１４）  液中のＣＤ４陽性細胞を９０％以上除去する血液処理用基材の製造方法であって、固定化された認識分子に対し、ＣＤ４分子溶液を解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）で、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、ＣＤ４分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つＣＤ４分子結合部位数の５０％以上がＣＤ４分子と結合した状態になるように条件設定し、ＣＤ４分子に対して結合親和性を有する分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化することを含む、血液処理用基材の製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
血球成分除去療法のみならず、血球成分を分離し処理する全般的な医療技術において、免疫反応などの生物学的相互作用を利用して、理論的に病因と推定される標的物質である細胞をより選択的特異的に捕捉することで副作用を減らし、安全性と治療効果を高めることが期待されているにもかかわらず、血液中の標的物質である細胞を、特に全血中より直接、特異的に捕捉する技術が、実用上利用可能な技術として確立していなかった。本発明により、標的物質である細胞を全血中より直接、特異的に捕捉するための、実用上利用可能な分離装置および分離方法を提供出来ることとなり、目的の標的物質のみを処理出来るという意味で、ＥＢＭ（Evidence Based Medicine）時代の医療の質、効率の向上に貢献する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。
本発明で用いられる「標的物質」とは、血液に代表される生物学的液体に含まれる生物由来の物質、細胞、組織などのうち、除去対象となる特定の生物由来物のことを意味しており、有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの物質である。標的物質は血液そのものに含まれる場合の他、血液由来の夾雑物が多く含まれる液体中に含まれる場合もある。
【００２６】
標的物質のうち、有害物質とは、例えば、ＬＤＬ、β２ミクログロブリン、薬物、ビリルビン、胆汁酸、アミノ酸、クレアチニン、エンドトキシン、抗Ａ抗体、抗Ｂ抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体、ＩｇＧ、抗カルジオリピン抗体、抗ＤＮＡ抗体、免疫複合体、昏睡物質、リウマチ因子などの血漿成分である。異常プリオンなども含まれる。また、炎症性サイトカインをはじめとする各種メディエータも病態によっては有害物質となる。炎症性サイトカインとして、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ／ＳＩＳサイトカインファミリーなどが知られている。また炎症に関わるメディエータとしては、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンなど生体内でアラキドン酸から生成される物質や、血小板活性化因子、ヒスタミン、ブラジキニンや補体因子であるC5aなどがある。
【００２７】
病因細胞とは、腫瘍細胞やバクテリア、あるいは、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、又は単球）、血小板などの血球のうち、特定疾患の病因と推定されるものである。例えば、自己免疫疾患において細胞性免疫の亢進が懸念される場合、白血球細胞表面上に発現されている免疫グロブリンスーパーファミリー分子を指標に病因細胞を区別することが望ましい。具体的には、ＣＤ２陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ２８陽性細胞、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）陽性細胞、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）陽性細胞、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）陽性細胞、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）陽性細胞などがある。また、インテグリンファミリー分子で区別するのも有効である。例えば、ＶＬＡ−１（ＣＤ４９ａ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−２（ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−３（ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−５（ＣＤ４９ｅ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＶＬＡ−６（ＣＤ４９ｆ／ＣＤ２９）陽性細胞、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）陽性細胞、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）陽性細胞、ｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）陽性細胞、ｇｐII
ｂ／IIIａ（ＣＤ４１／ＣＤ６１）陽性細胞、ＬＰＡＭ−１陽性細胞などである。
【００２８】
本発明で用いられる「基材」とは、常温の水溶液中で固体状態にあるものをいい、形状としては特に限定されないが、液相中の目的細胞との接触頻度を高めるために表面積が大きいものであることが好ましい。形状を例示すると、球状、立方状、平面状、平膜状、チップ状、繊維状、綿状、布状、糸状、束状、織布状または不織布状などの繊維構造体、スポンジなどの高分子多孔質体、ビーズ状、ゲル状あるいは中空糸等が挙げられる。これらのうち、細密充填のしやすさ、認識分子を均質に表面に保持しやすい点、実有効面積を比較的多く確保できる点、及び血液に代表される生物学的液体の流通面から、球状、粒状及び繊維状のものが望ましい。特に、血液中の細胞を分離または吸着する場合、吸着効率の点から織布状または不織布状が好ましく、さらには、担体の構造制御が容易であるという点から不織布状が最も好ましい。
【００２９】
基材の材質は、少なくとも所定量の認識分子を安定して固定できるものであれば、無機化合物、有機化合物を問わないが、様々な形状に加工でき、認識分子を直接または間接的に化学結合でき、かつ血液に代表される生物学的液体との接触時に溶出物が少ないなど、医療材料として安全に用いることができるものが好ましい。例えば、ガラス、カオリナイトまたはベントナイトなどの無機材料、セルロース等の植物由来の多糖類系化合物、デキストラン、キチン、キトサン、デンプン、アガロース、タンパク質（コラーゲンなど）または天然ゴムなどの天然ポリマー、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール等のビニル系化合物あるいはその誘導体の重合体及び共重合体、ナイロン６あるいは６６等のポリアミド系化合物、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系化合物、またはポリアミノ酸などの合成ポリマーあるいは活性炭等が挙げられる。
【００３０】
不織布状基材を選択する場合、強度、加工性または安全性の点から、不織布状基材を構成する繊維は、セルロース、ポリエステルまたはポリプロピレンであることが好ましい。また、構成繊維の平均繊維直径を適宜選択することで、不織布基材の構造を制御することができる。この基材構成繊維の平均繊維直径は２．５μｍ以上５０μｍ未満であることが好ましい。なぜなら、平均繊維直径が２．５μｍ未満であると、不織布状とした際に目が細かくなる傾向があり、目的細胞以外の細胞を物理的に捕捉する非特異的細胞吸着が起こるため好ましくない。一方、５０μｍ以上の場合、不織布状とした際に目が粗くなる傾向があり、目的細胞との接触頻度が著しく低下し、従って除去効率が下がるので好ましくない。
【００３１】
本発明で用いられる「認識分子」とは、蛋白工学もしくは分子生物学および遺伝子工学的手法を用いて作成した人工的な分子であり、その分子量は１３０ｋＤａ以下である。抗体のF(ab')2部分、Fab部分、Fab'部分、ペプチド、遺伝子組換え蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物などから選択されるが、望ましくは、遺伝子組換え蛋白質または核酸である。人工的な分子であることから、熱安定性の優れたものを大量生産により低価格で供給できるメリットがある。こうした認識分子は対象に対して特異的に結合することから人工抗体と呼ばれることもある。人工抗体は、通常、抗体Ｖ領域の３次構造と類似の構造分子を利用してそのループ形成部分をランダム化もしくは抗体Ｖ遺伝子のＣＤＲ３を組み込むことにより作製する。Protein Aを抗体化したAffibody（K.Nord, O.Nord, M.Uhlen, et al., Eur.J.Biochem, 268, 4269 (2001)）、GFPを抗体化した光る抗体Fluorobody（I.S.Kim, J.H.Shim, Y.T.Suh, et al., Biosci.Biotechnol.Biochem., 66, 1148 (2002)）、fibronectinのdomain 10を抗体化したMinibody（V.Batori, A.Koide, S.Koide, Protein Eng., 15, 1015 (2002)）、ペプチドミミック分子と抗体の融合分子Pepbody（E.Lunde, V.Lauvrak, I.B.Rasmussen, et al., Biochem.Soc.Trans., 30, 500 (2002)）、ラクダ抗体の構造を利用した一本鎖抗体Nanobody（A.Muruganandam, J.Tanha, S.Narang, D.Stanimirovic, The FASEB J. 16, 240 (2002)）などがある。また、核酸構造を持ったAptamerやRNAの光学異性体enatio-RNAを利用したSpiegelmer（B.Wlotzka, S.Leva, B.Eschgfaller, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 99, 8898 (2002)）などがある。
【００３２】
このような人工抗体の一例として、ドイツMorphoSys社のファージディスプレイによるカスタムモノクローナル抗体作製サービスがあり、比較例に示す可溶性ヒトＣＤ４分子に対する人工抗体ＨｕＣＡＬ  F(ab')2を作製したところ、天然モノクローナル抗体に匹敵する特異的結合親和性を示すものが得られた。また、この人工抗体ＨｕＣＡＬ F(ab')2の分子量は、１３０ｋＤａであった。
【００３３】
本発明で用いられる「解離定数」とは、一般にＫDで表され、解離の度合いを表している。数字が小さいほど結合の強さが強い。認識分子に対し、様々な濃度の標的蛋白分子を十分に結合させた後、遊離している標的蛋白分子の量を定量測定することで計算することが出来る。定量方法はＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）による方法、分光学的方法、水晶発振子を用いる方法、Frontal Affinity Chromatography（M.Nishikata, K.Kasai, S.Ishii, J.Biochem. 82, 1475 (1977)）による方法、ＲＩ標識した標的蛋白分子を用いる方法、表面プラズモン共鳴現象を利用した方法などがある。このうち、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサでは、金薄膜を蒸着したガラス表面を処理してセンサチップとし、そこに認識分子を固定化した後、標的蛋白分子溶液を流して認識分子と標的蛋白分子を接触させる。接触の前後で一定の波長の光を金薄膜にあておき反射光の時間変化を観測する。反射光は表面プラズモン共鳴現象によって金薄膜近傍の物質の密度の影響をうけるため、表面密度の変化からリアルタイムの結合量変化がわかり、結合速度定数、解離速度定数が求まることから解離定数を容易に知ることができる。
【００３４】
より具体的には、センサチップ上に基材固定化と同条件で固定化した認識分子に対して、アナライトとして標的物質もしくは標的蛋白分子を流してセンサグラムを取得する。例えば、標的物質が細胞で認識分子が認識する標的が細胞表面上の蛋白分子である場合は、遺伝子工学的に可溶性分子として調製、精製した可溶化標的分子をアナライトとしてもよい。
【００３５】
本発明で用いられる「特異的」とは、抗体抗原結合に代表されるような生物学的相互作用によって、基本的に標的物質もしくは標的蛋白分子に対してのみ、高い結合親和性で結合することを言い、固定化された認識分子と標的蛋白分子（アナライト）との解離定数は１μＭ以下であるべきであるが、好ましくは１０ｎＭ以下、さらに好ましくは１ｎＭ以下である。
【００３６】
センサチップ上に固定化された認識分子は、センサグラム上、質量密度増加として検出できるので、センサチップ上単位面積あたりの認識分子モル数が計算できる。こうしてセンサチップ上の固定化された認識分子に対し、アナライトとして標的物質ないし可溶化標的分子を過剰量充分時間反応させた際に単位面積あたりに結合するアナライトの質量を測定し結合したアナライトのモル数を知ることが出来る。これをＲmax-realとする。
【００３７】
過剰量とは、アナライトを解離定数濃度の５０倍濃度以上５０００倍濃度程度までの濃度で反応させることを言う。十分時間とは、１秒以上１２時間程度までの反応時間を言う。過剰量充分時間反応させたとき、固定化された認識分子に対し、解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。
【００３８】
一方、認識分子１モルに対してアナライトが何モル結合するかは理論的に知ることができるので、センサチップ上単位面積あたりの認識分子モル数から、理論的に結合しうる単位面積あたりのアナライトモル数は計算できる。これをＲmax-theoryとする。
【００３９】
ここで、（Ｒmax-real／Ｒmax-theory）ｘ１００（％）を結合効率と呼ぶことにすると、結合効率が５０％以上になるような固定化条件を設定する。即ち、本発明で言う「認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる」とは、上記の結合効率が５０％以上であることを意味する。この結合効率は、好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上に設定することができる。
【００４０】
この結合効率は、認識分子が基材表面上でどのような状態で固定化されているのかを把握するために非常に重要な情報となる。従来、基材表面上に認識分子を固定化する技術はできる限り多くの分子を反応させて固定化した後に活性が保たれているものを選んでいた。固定化の際に認識分子の結合活性部位が立体的に障害されていたり、固定化反応の際に結合活性部位が破壊されている場合は認識分子の固定化量がいくら高くても必要な結合活性はでない。基材表面上に固定化できる分子数は表面積と活性基の数で決まるので限界があり、固定化量を増やすだけでは目的の活性をもつ基材を製造することはできない。抗体を認識分子に用いる場合は、比較的疎水性が高く結合活性に関与しないＦｃ領域が存在するため、特にコントロールしなくてもＦｃ領域が固定化される確率が高く、結合効率は高くなることが多い。ところが、人工的に作製した分子の場合、大量生産により低価格で供給できることが本来のメリットであるため、なるべく低分子のものが望まれ、Ｆｃ領域に相当する部分は存在しない。こうした抗体よりも比較的低分子量の人工認識分子を、結合活性を保持したまま基材表面に固定化するためには、認識分子側に立体障害が起こらないように工夫したり、結合活性部位には固定化部位が入らないようにすることが大切である。結合効率を指標に固定化状態を制御することで、限られた基材表面上に有効な認識分子を効率よく固定化することができ、非常に高い結合活性が要求される細胞除去に必要な活性を持った基材を製造することができるようになる。
【００４１】
なお、この結合効率の上限は原理的に１００％である。１００％を越える場合は想定している結合活性部位以外にも標的蛋白分子が結合していることになり、目的とする結合の特異性が満たされていないことになるため採用すべきではない。
【００４２】
基材表面への認識分子の固定においては、基材表面に認識分子を直接結合していてもよいし、または活性基を介して結合していてもよい。基本的に基材から認識分子または活性基が剥離しない結合状態であれば、いずれの結合状態であってもよい。結合状態としては、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、水素結合または疎水結合の単独またはそれら複数の合力が挙げられる。認識分子の流出を抑制する点から、共有結合、疎水結合がより好ましく、最も好ましくは共有結合である。結合反応は、上記結合効率が５０％以上、好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上になるように結合する反応であれば、公知のいずれの反応も用いることができ、例えば、置換反応、付加反応、縮合反応、重合反応または開環反応等が挙げられる。
【００４３】
基材表面に活性基を介して認識分子を共有結合する場合、認識分子と基材とを共有結合できる構造であれば、該活性基は公知のいずれの官能基であってもよい。活性基としては、例えば、Ｎ‐ヒドロキシメチルハロアセトアミドもしくはＮ‐ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα‐アセトアミノハロゲン基、Ｎ‐ヒドロキシメチルジハロプロピオンアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα，β‐プロピオンアミノハロゲン基、Ｎ‐ヒドロキシメチルジハロアセトアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα，α‐アセトアミノジハロゲン基、またはＮ‐ヒドロキシメチルトリハロアセトアミド等を用いて基材表面を活性化することによって得られるα，α，α‐アセトアミノトリハロゲン基等のハロアセトアミノアルカン化剤を用いて基材表面を活性化することによって得られる活性基、あるいはエピクロロヒドリン等を用いて基材表面の水酸基やアミノ基などの官能基を活性化することによって得られるエポキシ基等が挙げられる。またその他の好適な活性基としては、例えば、カルボキシ基をＮ‐ヒドロキシスクシンイミドで活性化したＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ビニル基、マレイミド基、トシル基、トレシル基またはブロモシアンによる活性基等も挙げられるがこれらに限定されない。認識分子の機能を維持したまま穏和な条件で反応できる点から、ハロアセトアミノアルカン化剤を用いて基材表面を活性化することによって得られる活性基やエポキシ基、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル基、マレイミド基が好ましい。
【００４４】
更に基材表面に活性基を導入する方法として、グラフト重合法や、プラズマ処理、コロナ処理、化学処理やガスへの暴露によって基材表面に官能基や活性基を導入することも好適である。敢えて例示するならば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどにγ線を照射し、酸素を遮断した状態でグリシジルメタクリレートなどのビニル系のモノマー溶液に浸漬することによって容易に固定化に使用できる活性基や官能基が導入された基材を作製可能である。これらのグラフト鎖は、単独のモノマーを用いても良いし、複数のモノマーの混合による共重合体であってもかまわない。もちろんグラフト重合によって水酸基やカルボキシル基、アミノ基などを導入し、更に上述のような方法によって活性化して活性基としても良い。プラズマやコロナ処理では様々なタイプの官能基を基材表面に導入できることが知られているが、敢えて例示するならば、酸素存在下でポリエチレンテレフタレート基材表面に水酸基やカルボキシル基を導入可能であり、これらの表面改質も本発明に応用できる。また、光反応性のアゾ基やジアゾ基を基材表面に導入し、認識分子存在下、光や放射線を照射することによって認識分子を固定化することも可能である。
【００４５】
また、上記のような活性基を含有する重合体を予め重合し、基材表面に適当な溶媒を用いて塗布し、乾燥することによって、基材表面に活性基を導入することも可能である。
【００４６】
上記の通り、本発明の血液処理用基材は、固定化された認識分子に対し、標的蛋白分子溶液を解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）で、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になるように条件設定し、標的蛋白分子に対して結合親和性を有する分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の認識分子を基材表面に固定化することによって製造することができる。このような本発明の血液処理用基材の製造方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００４７】
上記にようにして作製することができる所定の認識分子が表面に固定化されている本発明の血液処理用基材は、入口と出口を有する容器に充填されることによって血液処理用デバイスを構築することができる。ここで用いる入口と出口を有する容器は、血液処理用基材を収納できるものであれば特に限定されず、例えば、カラムやチューブなどを用いることができる。この血液処理用デバイスに、標的物質を含有する血液を通液することによって血液を処理することにより、血液中の有害物質、病因細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞から選択される少なくとも１つの標的物質を吸着または除去することができる。上記した血液処理用デバイス及び血液処理方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００４８】
さらに、本発明の血液処理用基材表面に固定化された認識分子であって、
（ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子量１３０ｋＤａ以下の少なくとも１種類の分子であり、
（ｂ）標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下であり、
（ｃ）解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になる、
ことを特徴とする認識分子も本発明の範囲内に含まれる。
【００４９】
本発明で用いる認識分子は、例えば、（ａ）標的物質表面上に存在する標的蛋白分子に対して結合親和性を有する人工的に作製した分子であり、且つ（ｂ）分子量が１３０ｋＤａ以下であり、且つ（ｃ）標的蛋白分子との解離定数が１μＭ以下である候補認識分子から、
解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された候補認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に、
１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5
の関係が成り立つように供給したとき、候補認識分子が持つ標的蛋白分子結合部位数の５０％以上が標的蛋白分子と結合した状態になるものを選び出すことによって選択することができる。このような認識分子の選択方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
一例として、標的物質をヒト末梢血中のＣＤ４陽性細胞とし、認識分子としてモノクローナル抗体より人工的に作成したF(ab')2、及びFab'、ファージディスプレイにて作成したＨｕＣＡＬ F(ab')2を用いて例示する。
【００５２】
実施例１：マウス抗ヒトCD4抗体の酵素処理によるF(ab')2の作製
元になるマウス抗ヒトCD4抗体は市販品のclone:4H5（（株）医学生物学研究所）を用いた。このマウス抗体を蛋白分解酵素であるペプシンで一定時間消化し、F(ab')2部位とFc部位由来の断片に切断した。これをゲルろ過クロマトグラフィー精製することによって、4H5抗ヒトCD4 F(ab')2 抗体断片（以下単にF(ab')2と表記）を得た。F(ab')2の標的蛋白質分子結合部位数は２価であり、分子量は約100kDであった。
【００５３】
比較例１
実施例１で作製した、F(ab')2を２−メルカプトエタノールを用いて、EDTA存在下温和な条件にて、F(ab')2のヒンジ部位と呼ばれる部分のジスルフィド結合のみを選択的に還元した。次に末端にSH基を有するアルキルチオール分子を反応させることによって、遊離の状態のSH基を塞ぐことによって、標的蛋白質結合部位数が１価の4H5抗ヒトCD4 Fab' 抗体断片（以下単にFab'と表記）を得た。Fab'の分子量は約50kDであった。
【００５４】
比較例２：ヒト抗ヒトCD4 F(ab')2抗体のファージディスプレイ法での作製
特開平11-332594号公報の実施例１と同様にして、ヒト可溶性CD4の生産と精製を行なった。この精製したヒト可溶性CD4を標的蛋白質として、独国Morphosys社が提供するカスタムモノクローナル抗体作製サービスを利用して、ヒト抗ヒトCD4 F(ab')2抗体のファージディスプレイ法での作製を行なった。すなわち、プラスチック基材上に上述のヒト可溶性CD4を標的蛋白質として吸着させ、リン酸緩衝生理的食塩水(以下PBS(-)と表記)にて洗浄後、繊維状ファージのgIII蛋白質の末端に、ヒト抗体Fabをディスプレーしたライブラリー（ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（登録商標））を結合させ、結合の強いものをスクリーニングすることによって、ヒト抗ヒトCD4抗体の可変部位の配列を取得した。これをさらに標的蛋白質分子結合部位数が２価のF(ab')2の形として生産するために、抗体重鎖のCH1領域の後に、自己会合可能なhelix-turn-helix motifを連結、さらに精製用のHisタグ配列の付加などを行い大腸菌用の発現ベクターに組換えた。これらを発現し精製することによって、ヒト抗ヒトCD4 F(ab')2抗体（以下ＨｕＣＡＬ F(ab')2と表記）を得た。ＨｕＣＡＬ F(ab')2の標的蛋白質結合部位数は２価であり、分子量は約130kDであった。
【００５５】
実施例２：解離定数の測定
解離定数および結合効率の測定に使用したヒト可溶性CD4蛋白質（米国Genzyme techne社製）は、細胞外部分全長のヒトCD4cDNAをバキュロウイルスに組み込み、昆虫細胞Sf21に感染させ、その培養上清から精製したものであり、分子量約40kDである。
【００５６】
実施例１のF(ab')2を10μg/mlの濃度になるように20mM酢酸緩衝液pH＝5.0 bufferを用いて希釈し、ビアコア社のBIACORE S51を用いて、予めEDCとNHSで活性化したセンサチップ シリーズS CM5（ビアコア社）の１スポットに5μl/min で送液することによりアミンカップリング法にて、認識分子中のアミノ基を介して共有結合により固定化し、F(ab')2 6536RU固定化センサチップを得た。同様にして比較例１のFab'も固定化し、Fab' 5881RU固定化センサチップを得た。さらに比較例２のＨｕＣＡＬ F(ab')2も20mM酢酸緩衝液pH＝4.5 bufferを用いて希釈した以外は同様にして固定化し、ＨｕＣＡＬ F(ab')2 2502RU固定化センサチップを得た。
【００５７】
上記のセンサチップ上に、それぞれ上述のヒト可溶性CD4の終濃度250nM(10μg/ml) HBS-EP(ビアコア社) buffer溶液を流速30μl/min、200秒間送液して、ヒト可溶性CD4蛋白質を結合せしめ、しかる後にHBS-EP bufferのみに切り替えることにより各認識分子と標的蛋白分子の結合解離挙動を観察した。それぞれ得られたセンサグラムをもとに、BIA Evaluation soft(ビアコア社)を用いてカーブフィッティングを行なった結果から、各速度定数および解離定数を算出した。これらを表１に示す。
【００５８】
【表１】
2006346096.tif 000002
【００５９】
実施例１のF(ab')2、比較例１のFab'および比較例２のHuCAL F(ab')2、の３つを比較しても、結合速度定数 Ka、解離速度定数 Kdおよび解離定数 KDには大きな差異は認められず、３者ともヒトCD4分子に強く結合することが示された。
【００６０】
実施例３：結合効率の測定
実施例２の実験時の各認識分子の固定化量と分子量および、CD4結合部位数、および実験に用いたヒト可溶性CD4の分子量より理論的最大結合量：Ｒmax-theory(RU)が算出可能である。ここで、1RUは1pg/mm2であることが知られている。さらに、各解離定数の５０倍〜５０００倍濃度に当たる250nMのヒト可溶性CD4溶液を流速30μl/min、200秒間送液して実測されたセンサグラムを用いて、実測された最大結合量：Ｒmax-real(RU)を算出した。
【００６１】
ここで結合効率＝（Ｒmax-real／Ｒmax-theory）ｘ１００（％）を算出した。これらを表２に示す。
【００６２】
【表２】
2006346096.tif 000003
【００６３】
実施例１のF(ab')2はアミノ基を介して基材表面に固定化されたときの、結合効率の損失が比較例１および比較例２よりも少ないことがわかる。すなわち実施例１の認識分子のみがアミノ基を介した共有結合による固定化状態で効率的に標的蛋白質分子結合活性を保っていることがわかった。
【００６４】
ここで本実施例が先に説明した測定条件に合致することを示す。固定化された認識分子に対し、解離定数濃度の５０倍及至５０００倍濃度である濃度Ｃ（Ｍ）の標的蛋白分子溶液を、流速ｖ（Ｌ／秒）で時間ｔ（秒）供給する場合、標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）上に固定化された認識分子のモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）との間に１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。本実施例では、固定化された認識分子と標的蛋白質分子であるヒト可溶性CD4との解離定数は実施例２より数百pMオーダーであり、250nMの標的蛋白質分子溶液は５０倍〜５０００倍濃度に当たる。流速30μl/min、200秒間送液しているため、100μl送液となり、Ｃｖｔは2.5×10-11mol程度と算出される。標的蛋白分子が供給される基材表面積Ｓ（ｍｍ2）については、BIACORE社によれば、シリーズS CM5チップは、幅0.9mm、長さ(inlet-outlet間)2.9mmのY字型のフローセルとなっており、referenceの部分も含めて、３つの認識物質固定化部位を持っている、ここで近似のために、フローセルが長方形でその１／３がひとつの認識物質固定化基材表面積とすれば、その面積は最大でも0.87mm2と算出される。
【００６５】
ここで実施例１のF(ab')2は100kDで6536RU固定化されているため、1RUは1pg/mm2よりモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）は、6.54×10-14mol/mm2であり、Ｓｄは5.7×10-14mol程度と算出される。ゆえに、Ｃｖｔ／Ｓｄ＝2.5×10-11mol／5.7×10-14mol＝４３９となり、１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。
【００６６】
同様に、比較例１のFab' は50kDで 5881RU固定化されているため、1RUは1pg/mm2よりモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）は、1.18×10-13mol/mm2であり、Ｓｄは1.0×10-13mol程度と算出される。ゆえに、Ｃｖｔ／Ｓｄ＝2.5×10-11mol／1.0×10-13mol＝２５０となり、１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。
【００６７】
更に比較例２のＨｕＣＡＬ F(ab')2は130kDで 2502RU固定化されているため、1RUは1pg/mm2よりモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）は、1.92×10-14mol/mm2であり、Ｓｄは1.7×10-14mol程度と算出される。ゆえに、Ｃｖｔ／Ｓｄ＝2.5×10-11mol／1.7×10-14mol＝１４７１となり、１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。
【００６８】
一方、シリーズS CM5チップのSPRシグナル測定のために検出している面積を認識物質固定化基材表面積Sの最小の面積とすれば、BIACORE社によると、長さ0.065mm、幅0.125mmであるため、8.13×10-3 mm2と算出される。
【００６９】
この最小の認識物質固定化基材表面積Sの値を用いて、実施例１のF(ab')2Ｃｖｔ／Ｓｄを算出すると、100kDで6536RU固定化されているため、1RUは1pg/mm2よりモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）は、6.54×10-14mol/mm2であり、Ｓｄは5.3×10-16mol程度と算出される。ゆえに、Ｃｖｔ／Ｓｄ＝2.5×10-11mol／5.3×10-16mol＝4.7×104となり、１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。
【００７０】
同様に、比較例１のFab' は50kDで 5881RU固定化されているため、1RUは1pg/mm2よりモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）は、1.18×10-13mol/mm2であり、Ｓｄは9.6×10-16mol程度と算出される。ゆえに、Ｃｖｔ／Ｓｄ＝2.5×10-11mol／9.6×10-16mol＝2.6×104となり、１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。
【００７１】
更に比較例２のＨｕＣＡＬ F(ab')2は130kDで 2502RU固定化されているため、1RUは1pg/mm2よりモル表面密度ｄ（ｍｏｌ／ｍｍ2）は、1.92×10-14mol/mm2であり、Ｓｄは1.6×10-16mol程度と算出される。ゆえに、Ｃｖｔ／Ｓｄ＝2.5×10-11mol／1.6×10-16mol＝1.6×105となり、１００＜Ｃｖｔ／Ｓｄ＜２ｘ１０5の関係が成り立つ。
【００７２】
実施例４：活性化不織布の作製
特開平11-332594号公報の実施例１０と同様にして、不織布の活性基であるＮ‐ヒドロキシメチルヨードアセトアミドを作製した。ガラス製のフラスコにＮ‐ヒドロキシメチルヨードアセトアミド０．６ｇ、濃硫酸５．７ｍｌ及びニトロベンゼン７．２ｍｌを加えて常温にて撹拌溶解し、更にパラホルムアルデヒド０．０３６ｇを加え、撹拌した。これにポリプロピレンからなる不織布P080HW-00F（東燃TAPYRUS社製、平均繊維直径３．５μｍ）０．３ｇを入れ常温にて２４時間遮光反応した。２４時間反応後不織布を取り出し，エタノール及び純水にて洗浄し、これを真空乾燥して活性化不織布を得た。
【００７３】
この活性化不織布を直径０．６８ｃｍの円に切断したもの４枚を、カルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝液（以下ＰＢＳ（−））に溶解した各認識分子溶液４００μＬ（１６μｇ／４００μＬ）に常温で一晩浸し、固定後、ＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄した。次に０．２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート／ＰＢＳ（−）溶液（以下Ｔｗｅｅｎ２０溶液）を加えリンスした後、ＰＢＳ（−）２ｍｌで洗浄し、目的の細胞吸着材を得た。上記の操作により、実施例１、比較例１および比較例２の各認識分子は上記活性化不織布表面に、各認識分子中のアミノ基を介して共有結合されている。
【００７４】
入口と出口を有する容量１ｍｌの容器(モビコールカラム：フナコシ製)に上記各細胞吸着材４枚とＰＢＳ（−）溶液を充填し細胞吸着器を作成した。
【００７５】
実施例５：細胞吸着性の評価
実験開始直前に、上記カラムのエアを通過させることによって、PBS(-)液を切り、ＡＣＤ−Ａ(川澄化学株式会社)添加ヒト健常人新鮮血液５．０ｍｌ（血液：ＡＣＤ−Ａ＝６．７：１）をシリンジポンプにて細胞吸着器の入口より流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで送液し最初の５滴を捨てた後に、カラム出口より処理後の血液を回収した。
【００７６】
このときのＣＤ４陽性細胞の除去率を、コールターカウンターを用いた、白血球数の変化と、フローサイトメーター（FACS Calibur：ベックトンディッキンソン社）を用いてフローサイトメトリー法で測定した、回収細胞中のＣＤ４陽性細胞の割合の変化から算出した。細胞の染色は、回収した血液100μlに対して、anti-CD4-PE液(clone SK3、ベックトンディッキンソン社製)10μl、およびanti-CD45-PerCP液(ベックトンディッキンソン社製)10μlを添加し、室温で30min染色後、FACS Lysing solution(ベックトンディッキンソン社製)1mlを添加し溶血したものを使用した。CD45が陽性の細胞を白血球としてゲートをかけ、その中のＣＤ４陽性細胞の割合を解析した。
これらの結果を表３に示す。
【００７７】
【表３】
2006346096.tif 000004
【００７８】
この結果と、表１および表２を比較すると、結合親和性の指標である解離定数のみでは、細胞の分離挙動と相関が十分ではなく、本発明で定義した結合効率が重要なことが判る。すなわち基材表面に固定化された認識分子を、大過剰の標的蛋白質分子と反応させた場合、認識分子の標的蛋白質分子結合部位数が５０％以上結合した状態の場合に、実質的に利用できる細胞分離基材となることが判る。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明を利用することにより、血球成分除去療法のみならず、血球成分を分離し処理する全般的な医療技術において、免疫反応などの生物学的相互作用を利用して、理論的に病因と推定される標的物質である細胞をより特異的に捕捉することで副作用を減らし、安全性と治療効果を高めることができる。特に全血中より直接、選択的特異的に捕捉する実用上利用可能な技術として有用な血液処理装置および分離方法に利用できる。