(57)【要約】【課題】  光量信号の強度と相対位置との関係をグラフ化したときのピーク形状が平坦な場合でも、合焦位置を正確に検出できる顕微鏡の焦点検出装置を提供する。【解決手段】  対物レンズの位置と光量信号の強度との関係を表すデータ列に基づいて、光量信号の最大強度ＭＡＸに対応する位置Ｚ0を求め、該位置を基準位置に設定する。基準位置から第１間隔Ｄ1だけ離れた位置Ｚ1,Ｚ-1と、基準位置から第１間隔とは異なる第２間隔Ｄ2だけ離れた位置Ｚ2,Ｚ-2を設定する。そして、データ列の各点のうち、位置Ｚ1と位置Ｚ2に対応する２点を結ぶ直線Ｌａと、位置Ｚ-1と位置Ｚ-2に対応する２点を結ぶ直線とＬｂの交点ｋを求め、該交点における位置を合焦位置Ｚfに決定する。【選択図】      図４
2006030304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象物から発生する焦点検出用の光を検知して、前記対象物と対物レンズとの相対位置に応じた光量信号を出力するセンサ部と、
複数の前記相対位置における前記光量信号を前記センサ部から取り込み、前記相対位置と前記光量信号の強度との関係を表すデータ列を生成する生成部と、
前記データ列に基づいて、前記光量信号の最大強度に対応する前記相対位置を求め、該相対位置を基準位置に設定する第１の設定部と、
前記基準位置より前記相対位置が近づく方向において、前記基準位置から第１間隔だけ離れた第１位置と、前記基準位置から前記第１間隔とは異なる第２間隔だけ離れた第２位置とを設定すると共に、前記基準位置より前記相対位置が離れる方向において、前記基準位置から前記第１間隔だけ離れた第３位置と、前記基準位置から前記第２間隔だけ離れた第４位置とを設定する第２の設定部と、
前記データ列の各点のうち、前記第１位置と前記第２位置に対応する２点を結ぶ直線と、前記第３位置と前記第４位置に対応する２点を結ぶ直線との交点を求め、該交点における前記相対位置を合焦位置に決定する決定部とを備えた
ことを特徴とする顕微鏡の焦点検出装置。
【請求項２】
請求項１に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、
前記データ列をグラフ化したときのピーク形状を判断する判断部をさらに備え、
前記第１の設定部と前記第２の設定部と前記決定部とは、前記判断部による判断の結果、前記ピーク形状が平坦なときに、それぞれ、前記基準位置の設定処理と、前記第１位置と前記第２位置と前記第３位置と前記第４位置の設定処理と、前記合焦位置の決定処理とを実行する
ことを特徴とする顕微鏡の焦点検出装置。
【請求項３】
請求項２に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、
前記判断部は、前記データ列の前記光量信号の最大強度ＭＡＸとバックグラウンド成分の強度ＭＩＮとが、次の条件式を満足するときに、前記ピーク形状が平坦と判断する
ＭＡＸ ／ ＭＩＮ ＜ １.０５
ことを特徴とする顕微鏡の焦点検出装置。
【請求項４】
請求項１から請求項３の何れか１項に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、
前記生成部は、前記センサ部から複数の前記相対位置における前記光量信号を取り込み、前記相対位置が隣接する複数の前記光量信号の強度の移動平均処理を行うことにより、前記データ列を生成する
ことを特徴とする顕微鏡の焦点検出装置。
【請求項５】
請求項４に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、
前記生成部は、前記センサ部の感度の設定値に基づいて、前記移動平均処理の実行回数を定める
ことを特徴とする顕微鏡の焦点検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察対象物から発生する微弱な光を取り込んで焦点検出を行う顕微鏡の焦点検出装置に関し、特に、蛍光観察の対象物から発生する微弱な蛍光を取り込んで焦点検出を行う場合に好適な顕微鏡の焦点検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡では、観察対象物の鮮明な蛍光像を所定の結像面（例えばイメージセンサの撮像面）に形成するために、オートフォーカス機構を用いることがある。オートフォーカス機構には焦点検出装置が組み込まれ、顕微鏡の観察光学系によって形成される蛍光像と所定の結像面との位置ずれ（焦点ずれ）の検出が行われる。この検出結果は、オートフォーカス機構において観察光学系の対物レンズと観察対象物との相対位置を調整する際の指標として用いられる。
【０００３】
また、蛍光顕微鏡の焦点検出装置は、センサ部と演算部とで構成され、観察対象物から発生する微弱な蛍光をセンサ部で電気信号（以下「光量信号」）に変換する。そして、対物レンズと観察対象物との相対位置を変更しながら、センサ部による光量信号を演算部に取り込み、光量信号の最大強度に対応する相対位置を合焦位置に決定している（例えば特許文献１を参照）。
【特許文献１】特開２００４−４６３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記した従来の焦点検出装置は、光量信号の強度と相対位置との関係をグラフ化したときに明確なピーク形状が現れることを前提としている。このため、観察対象物の周囲（例えば溶剤や培養液）から発生する蛍光の影響によって、光量信号のバックグラウンド成分の強度が大きくなり、上記のピーク形状が相対的に平坦になると、光量信号の最大強度の特定が難しく、合焦位置を正確に検出できないことがあった。
【０００５】
本発明の目的は、光量信号の強度と相対位置との関係をグラフ化したときのピーク形状が平坦な場合でも、合焦位置を正確に検出できる顕微鏡の焦点検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１に記載の顕微鏡の焦点検出装置は、観察対象物から発生する焦点検出用の光を検知して、前記対象物と対物レンズとの相対位置に応じた光量信号を出力するセンサ部と、複数の前記相対位置における前記光量信号を前記センサ部から取り込み、前記相対位置と前記光量信号の強度との関係を表すデータ列を生成する生成部と、前記データ列に基づいて、前記光量信号の最大強度に対応する前記相対位置を求め、該相対位置を基準位置に設定する第１の設定部と、前記基準位置より前記相対位置が近づく方向において、前記基準位置から第１間隔だけ離れた第１位置と、前記基準位置から前記第１間隔とは異なる第２間隔だけ離れた第２位置とを設定すると共に、前記基準位置より前記相対位置が離れる方向において、前記基準位置から前記第１間隔だけ離れた第３位置と、前記基準位置から前記第２間隔だけ離れた第４位置とを設定する第２の設定部と、前記データ列の各点のうち、前記第１位置と前記第２位置に対応する２点を結ぶ直線と、前記第３位置と前記第４位置に対応する２点を結ぶ直線との交点を求め、該交点における前記相対位置を合焦位置に決定する決定部とを備えたものである。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、前記データ列をグラフ化したときのピーク形状を判断する判断部をさらに備え、前記第１の設定部と前記第２の設定部と前記決定部とは、前記判断部による判断の結果、前記ピーク形状が平坦なときに、それぞれ、前記基準位置の設定処理と、前記第１位置と前記第２位置と前記第３位置と前記第４位置の設定処理と、前記合焦位置の決定処理とを実行するものである。
【０００８】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、前記判断部は、前記データ列の前記光量信号の最大強度ＭＡＸとバックグラウンド成分の強度ＭＩＮとが、次の条件式を満足するときに、前記ピーク形状が平坦と判断するものである。
ＭＡＸ ／ ＭＩＮ ＜ １.０５
請求項４に記載の発明は、請求項１から請求項３の何れか１項に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、前記生成部は、前記センサ部から複数の前記相対位置における前記光量信号を取り込み、前記相対位置が隣接する複数の前記光量信号の強度の移動平均処理を行うことにより、前記データ列を生成するものである。
【０００９】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の顕微鏡の焦点検出装置において、前記生成部は、前記センサ部の感度の設定値に基づいて、前記移動平均処理の実行回数を定めるものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の顕微鏡の焦点検出装置によれば、光量信号の強度と相対位置との関係をグラフ化したときのピーク形状が平坦な場合でも、合焦位置を正確に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態の焦点検出装置１０（図１）は、蛍光顕微鏡の焦点検出装置であり、蛍光観察の対象物（標本２１）から発生する微弱な蛍光を取り込んで焦点検出を行う。標本２１は、例えば、蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）である。
本実施形態の焦点検出装置１０は、図１に示す通り、蛍光顕微鏡の筐体２０の内部に配置された光量検出回路１１,駆動回路１２と、筐体２０の外部に配置された記憶回路１３,合焦位置演算回路１４,位置制御回路１５とで構成されている。光量検出回路１１には、不図示の光電子増倍管が設けられる。
【００１２】
筐体２０の内部には、その他、標本２１を支持する固定のステージ２２、可動の対物レンズ２３、これを上下方向に移動させる移動機構２４、光源２５、ダイクロイックミラー２６、ハーフミラー２７が設けられ、さらに不図示の第２対物レンズおよび波長選択フィルタが設けられる。第２対物レンズおよび波長選択フィルタは、ダイクロイックミラー２６およびハーフミラー２７と同様、対物レンズ２３の光軸２３ａ上に配置される。
【００１３】
ちなみに、ダイクロイックミラー２６の光学特性は、光源２５からの照明光（つまり標本２１内の蛍光物質に対する励起光）を選択的に反射すると共に、蛍光物質から発生する蛍光を選択的に透過するような特性である。波長選択フィルタの光学特性は、励起光を選択的に遮断して、蛍光を選択的に透過するような特性である。波長選択フィルタは、例えば、ダイクロイックミラー２６とハーフミラー２７との間に配置される。
【００１４】
本実施形態の焦点検出装置１０は、蛍光顕微鏡の観察光学系（つまり対物レンズ２３と不図示の第２対物レンズ）によって形成される標本２１の蛍光像と所定の結像面２８との位置ずれ（焦点ずれ）を検出する装置である。この検出結果は、対物レンズ２３の位置（つまり対物レンズ２３と標本２１との相対位置）を調整する際の指標として用いられる。対物レンズ２３が合焦位置にあれば、標本２１の鮮明な蛍光像を所定の結像面２８に形成することができる。結像面２８には例えばイメージセンサの撮像面が配置される。
【００１５】
焦点検出時、光源２５からの照明光（標本２１内の蛍光物質に対する励起光）は、ダイクロイックミラー２６と対物レンズ２３とを介して、ステージ２２上の標本２１に照射される。このとき、照明光の照射方向を対物レンズ２３の光軸２３ａに対して斜めの方向とすることが好ましい。このような斜光照明については、例えば特開２００４−４６３４号公報の技術を採用することができる。また、斜光照明に限らず、光軸２３ａに平行な照明光を標本２１に照射してもよい。
【００１６】
上記の照明によって標本２１から発生した焦点検出用の蛍光は、対物レンズ２３とダイクロイックミラー２６とハーフミラー２７と不図示の波長選択フィルタとを介して、光量検出回路１１の光電子増倍管に入射する。光電子増倍管は、微弱光の検知に適したセンサ部であり、ハーフミラー２７からの反射光を効率良く受光面に導くための集光レンズを備えている。上記の斜光照明を採用した場合、光電子増倍管の受光面は、所定の結像面２８と共役な面の後方に配置される。
【００１７】
光量検出回路１１の光電子増倍管は、受光面に入射する焦点検出用の蛍光を一括で検知して、その光量に比例した電圧信号（以下「光量信号」）を後段の記憶回路１３に出力する。記憶回路１３は、光量検出回路１１から出力される光量信号の強度（電圧値）を一時的に記憶する。このような光量検出回路１１と記憶回路１３による一連の処理（つまり光量信号の強度の記憶処理）は、次に説明する位置制御回路１５と駆動回路１２よる対物レンズ２３の移動処理と同期して繰り返し行われる。
【００１８】
位置制御回路１５は、焦点検出時、対物レンズ２３の位置（つまり対物レンズ２３と標本２１との相対位置）を光軸２３ａに沿って上下方向に変化させるために、対物レンズ２３の位置に関する数値情報を生成して、この数値情報に基づく制御信号を後段の駆動回路１２に出力する。駆動回路１２は、位置制御回路１５からの制御信号に基づいて、移動機構２４への駆動信号を生成する。そして、この駆動信号を用いて移動機構２４を駆動し、対物レンズ２３の位置（つまり対物レンズ２３と標本２１との相対位置）を光軸２３ａに沿って変化させる。
【００１９】
本実施形態の焦点検出装置１０では、対物レンズ２３の位置（つまり対物レンズ２３と標本２１との相対位置）を変化させながら、異なる複数の位置の各々で、光量検出回路１１の光電子増倍管から出力される光量信号の強度（電圧値）を記憶回路１３に記憶させていく。そして、このようなスキャン動作が終了すると、多数の光量信号の強度に基づく演算処理（後述）が合焦位置演算回路１４にて行われる。なお、記憶回路１３と合焦位置演算回路１４は総じて請求項の「生成部」に対応する。合焦位置演算回路１４は、請求項の「第１の設定部」「第２の設定部」「決定部」に対応する。
【００２０】
次に、本実施形態の焦点検出装置１０の検出動作について、図２のフローチャートを用いて説明する。
ステップＳ１では、プリスキャンを行い、対物レンズ２３の合焦位置を含むように、対物レンズ２３の移動範囲（次のステップＳ２の本スキャンの範囲）を決定する。本実施形態では、対物レンズ２３の移動範囲の上限端と下限端において、光量検出回路１１の光電子増倍管から出力される光量信号の強度が、バックグラウンド成分の強度と等しい場合を説明する。バックグラウンド成分とは、標本２１から発生する蛍光ではなく、標本２１の周囲（例えば溶剤や培養液）から発生する蛍光に応じた成分である。なお、本実施形態における対物レンズ２３の移動範囲の上限端と下限端との間隔は、少なくとも２４０μｍ以上（例えば３００μｍ程度）である。
【００２１】
ステップＳ２では、上記ステップＳ１で決定した範囲にしたがって本スキャンを行う。つまり、対物レンズ２３の移動範囲の下限端から上限端（または上限端から下限端）まで、対物レンズ２３の位置を変化させながら、異なる複数の位置の各々で、光量検出回路１１の光電子増倍管から出力される光量信号の強度（電圧値）を記憶回路１３に記憶させていく。このとき、対物レンズ２３の移動範囲内において位置が一定の間隔だけ変化するごとに、光電子増倍管から光量信号を取り込むことが好ましい。
【００２２】
対物レンズ２３の位置が終点に到達し、終点における光量信号の取り込みが終了した時点で、記憶回路１３には、対物レンズ２３の位置が異なる複数の光量信号が一時的に記憶されたことになる。各光量信号の強度（電圧値）は、対物レンズ２３の位置に応じて異なる大きさを持つ。これらの各光量信号は、対物レンズ２３の合焦位置を決定するために、後段の合焦位置演算回路１４に出力される。
【００２３】
ステップＳ３において、合焦位置演算回路１４は、対物レンズ２３の位置が異なる複数の光量信号を記憶回路１３から取り込むと、対物レンズ２３の位置と光量信号の強度との関係を表すデータ列を生成し、このデータ列（生データ）をグラフ化する。つまり、マトリクスグラフを作成する。マトリクスグラフの一例を図３(ａ)に示す。図３(ａ)の横軸は対物レンズ２３の位置、縦軸は光量信号の強度（Ｖ）を表す。マトリクスグラフには１つの凸部が現れる。
【００２４】
次に（ステップＳ４）、ステップＳ３で生成したデータ列（生データ）の移動平均処理を行う。つまり、データ列の各点において、対物レンズ２３の位置が隣接する複数の光量信号を用い、その強度の移動平均値Ｖaveを計算する。そして、移動平均値Ｖaveを現在の値と置き換える。移動平均値Ｖaveの計算に用いる光量信号の数をｆとすると、移動平均値Ｖaveは、次の式(１),(２)により計算できる。
【００２５】
Ｖave ＝〔 Ｖ(ｎ−ｆ0)＋…＋Ｖ(ｎ)＋…＋Ｖ(ｎ＋ｆ0) 〕／ｆ  …(１)
ｆ0＝(ｆ−１)／２  …(２)
このような移動平均処理の結果、データ列（生データ）の高周波成分が除去され、ＳＮ比の良好なデータ列が新たに生成される。また、図３(ａ)のマトリクスグラフは、平滑化され、例えば図３(ｂ)の太線のようになる。
【００２６】
次に（ステップＳ５）、移動平均処理を経た後のデータ列のＳＮ判定を行う。この判定には、例えば、光量検出回路１１の光電子増倍管の印加電圧（つまり感度）の設定値を用いればよい。光電子増倍管の感度が低ければノイズの影響は小さく、感度が高ければノイズの影響を受けやすいと考えられるので、感度の設定値に応じてデータ列のＳＮ判定を行うことができる。
【００２７】
そして、ＳＮ判定の結果、さらなるノイズ除去が必要な場合（Ｓ５がＮｏ）、２回目の移動平均処理を行うためにステップＳ４の処理に戻る。処理の方法は１回目と同じである。２回目の移動平均処理の結果、データ列（１回目の移動平均処理後）の高周波成分が除去され、ＳＮ比のさらに良好なデータ列が新たに生成される。図３(ｂ)のマトリクスグラフは、さらに平滑化され、例えば図３(ｃ)の太線のようになる。
【００２８】
ステップＳ４,Ｓ５による移動平均処理の実行回数は、光電子増倍管の感度の設定値に応じて定めればよい。必要な回数（１回以上）の移動平均処理を行った後、ＳＮ判定がＯＫになると（Ｓ５がＹｅｓ）、合焦位置演算回路１４は、最後に生成したデータ列（１回以上の移動平均処理後）を用いて、次のステップＳ６以降の処理を行う。なお、最後に生成したデータ列（以下の説明では単に「データ列」という）は、高周波成分が十分に除去されたＳＮ比の良好なものであり、請求項の「データ列」に対応する。
【００２９】
データ列をグラフ化したときのピーク形状（例えば図３(ｂ),(ｃ)に示すマトリクスグラフのピーク形状）において、対物レンズ２３の移動範囲の両端における光量信号の強度（つまり最小強度ＭＩＮ）は、バックグラウンド成分（標本２１の周囲（例えば溶剤や培養液）から発生する蛍光に応じた成分）の強度と等しい。さらに、データ列の光量信号の最小強度ＭＩＮと最大強度ＭＡＸとの差は、標本２１から発生する蛍光に応じた成分である。
【００３０】
ステップＳ６では、データ列をグラフ化したときのピーク形状（例えば図３(ｂ),(ｃ)に示すマトリクスグラフのピーク形状）の高低（平坦さ）を判断するため、データ列の光量信号の最大強度ＭＡＸと最小強度ＭＩＮとの比率（ＭＡＸ／ＭＩＮ）を計算する。そして、このピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮが次の条件式(３)を満足するときに（Ｓ６がＹｅｓ）、ピーク形状が低い（平坦）と判断し、ステップＳ７の処理（４点式計算）に進む。逆に、ピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮが条件式(３)を満足しないときは、ピーク形状が高いと判断し、ステップＳ８の処理（通常計算）に進む。
【００３１】
ＭＡＸ ／ ＭＩＮ ＜ １.０５  …(３)
ステップＳ７の処理（４点式計算）について説明する。この場合のデータ列は、グラフ化したときのピーク形状が低く、ピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮが１.０５未満となっている。合焦位置演算回路１４は、このようなデータ列（図４）に基づいて、光量信号の最大強度ＭＡＸに対応する対物レンズ２３の位置Ｚ0を求め、この位置Ｚ0を基準位置に設定する。基準位置Ｚ0は、４点式計算の基準であり、対物レンズ２３の合焦位置とは限らない。
【００３２】
次に、基準位置Ｚ0より前ピン側（対物レンズ２３が標本２１に近づく方向）において、基準位置Ｚ0から間隔Ｄ1だけ離れた位置Ｚ1と、基準位置Ｚ0から間隔Ｄ2(＞Ｄ1)だけ離れた位置Ｚ2とを設定する。さらに、基準位置Ｚ0より後ピン側（対物レンズ２３が標本２１に離れる方向）において、基準位置Ｚ0から間隔Ｄ1だけ離れた位置Ｚ-1と、基準位置Ｚ0から間隔Ｄ2だけ離れた位置Ｚ-2とを設定する。
【００３３】
本実施形態では、例えば、間隔Ｄ1を６０μｍ、間隔Ｄ2を１２０μｍとする。この場合、上記の基準位置Ｚ0と４つの位置Ｚ-2,Ｚ-1,Ｚ1,Ｚ2とは、互いに６０μｍ間隔で設定されたことになる。両端の位置Ｚ-2と位置Ｚ2との間隔は、２４０μｍである。なお、ステップＳ１で決定される対物レンズ２３の移動範囲（本スキャンの範囲）は、上記の位置Ｚ-2と位置Ｚ2との間隔（２４０μｍ）以上となっている。
【００３４】
４つの位置Ｚ-2,Ｚ-1,Ｚ1,Ｚ2の設定が終わると、合焦位置演算回路１４は、データ列の各点のうち、位置Ｚ1と位置Ｚ2に対応する２点Ｅ1,Ｅ2を選択し、この２点Ｅ1,Ｅ2を結ぶ直線Ｌａを求める。また、位置Ｚ-1と位置Ｚ-2に対応する２点Ｅ-1,Ｅ-2を選択し、この２点Ｅ-1,Ｅ-2を結ぶ直線Ｌｂを求める。そして、直線Ｌａと直線Ｌｂとの交点Ｋを求め、この交点Ｋに対応する対物レンズ２３の位置を“合焦位置（Ｚf）”とする。
【００３５】
具体的な計算は、次の式(４)にしたがって行われる。式(４)に、データ列から選択された４つの点Ｅ1,Ｅ2,Ｅ-1,Ｅ-2に関する情報（つまり位置Ｚ1,Ｚ2,Ｚ-1,Ｚ-2と各位置に対応する光量信号の強度Ｐ1,Ｐ2,Ｐ-1,Ｐ-2）を代入することにより、合焦位置（Ｚf）を得ることができる。
【００３６】
【数１】
2006030304.tif 000003
次に、ステップＳ８の処理（通常計算）について説明する。この場合のデータ列は、グラフ化したときのピーク形状が高く、ピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮが１.０５以上となっている。合焦位置演算回路１４は、このようなデータ列（図５）に基づいて、光量信号の最大強度ＭＡＸより小さい強度Ｑ（＝(１−ｎ％)×ＭＡＸ）に対応する２点ＥQ1,ＥQ2を選択し、この２点ＥQ1,ＥQ2の中点ＥQCを求め、中点ＥQCに対応する対物レンズ２３の位置を“合焦位置（Ｚf）”とする。ｎ＝２〜４％程度が好ましい。なお、ステップＳ８の処理（通常計算）は、２点ＥQ1,ＥQ2のみを計算に用いるので、上記ステップＳ７の処理（４点式計算）と比較して短時間で計算を行える。
【００３７】
このようにして、ピーク形状が低い（平坦な）場合にはステップＳ７の処理（４点式計算）を行い、ピーク形状が高い場合にはステップＳ８の処理（通常計算）を行い、データ列から合焦位置（Ｚf）を算出し終えると、合焦位置演算回路１４は、次のステップＳ９において、その演算結果が適切か否かの判別を行う。この判別は、演算結果（つまり合焦位置（Ｚf））が、対物レンズ２３の移動範囲（本スキャンの範囲）内か否かの判別に相当する。
【００３８】
そして、適切な演算結果を得ることができた場合（Ｓ９がＹｅｓ）、次のステップＳ１０で、その演算結果を“合焦位置（Ｚf）”に決定する。また、演算結果が適切でなかった場合は（Ｓ９がＮｏ）、リトライするためにステップＳ１１の処理に進む。リトライが必要な場合とは、ピーク形状が非常に小さい場合（マトリクスグラフが平坦な場合）や、手違いで標本２１が存在しない場合や、ピーク形状に２つの凸部が含まれる場合などである。２つの凸部のうち一方は標本２１からの蛍光に起因するものであるが、他方は標本２１の周囲（例えば溶剤や培養液）からの蛍光に起因すると考えられる。
【００３９】
ステップＳ１１では、今回のリトライが１回目か否かの判別を行い、１回目のリトライ（Ｓ１１がＹｅｓ）の場合に限り、ステップＳ１２を経て、再びステップＳ２の処理（本スキャン）に戻る。ステップＳ１２では、２回目の本スキャンにおける対物レンズ２３の移動速度の設定を低速に変更する。
このため、ステップＳ２では、１回目と同じ範囲（対物レンズ２３の移動範囲）内において、１回目より細かいサンプリング間隔で、光量検出回路１１の光電子増倍管から光量信号を取り込むことができる。その結果、次のステップＳ３では、１回目よりも高精度なデータ列（生データ）を生成することができる。その後、上記と同様のステップＳ４〜Ｓ６とＳ７(またはＳ８)の処理を繰り返すことにより、１回以上の移動平均処理後の高精度なデータ列に基づいて合焦位置（Ｚf）を算出することができる。
【００４０】
次のステップＳ９では、このようなリトライによる演算結果（つまり合焦位置（Ｚf））が適切か否かの判別を行い、適切な場合には（Ｓ９がＹｅｓ）、その演算結果を“合焦位置（Ｚf）”に決定する（Ｓ１０）。通常、ピーク形状が非常に小さい場合（マトリクスグラフが平坦な場合）には、この段階で、合焦位置（Ｚf）を決定することができる。
しかし、手違いで標本２１が存在しない場合や、ピーク形状に２つの凸部が含まれる場合には、１回目のリトライを行っても、適切な演算結果を得ることができない（Ｓ９がＮｏ）。この場合、ステップＳ１１の処理に進み、２回目のリトライ（Ｓ１１がＮｏ）であるため、検出不能のエラー処理（ステップＳ１３）を行う。
【００４１】
上記のように、本実施形態の焦点検出装置１０では、光量信号の強度と対物レンズ２３の位置との関係をグラフ化したときのピーク形状（例えば図３(ｂ),(ｃ)に示すマトリクスグラフのピーク形状）が低い場合に、ステップＳ７の処理（４点式計算）を行うため、ピーク形状が低い場合でも、合焦位置（Ｚf）を正確に検出することができる。また、ステップＳ７の処理（４点式計算）によれば、基準位置Ｚ0（図４）を挟んで前ピン側と後ピン側との各々で傾きの異なる直線Ｌａ,Ｌｂを求めるため、ピーク形状が左右非対称な場合であっても、正確に合焦位置（Ｚf）を検出できる。
【００４２】
さらに、本実施形態の焦点検出装置１０では、ピーク形状が高い場合には、簡略化したステップＳ８の処理（通常計算）を行うことにより、短時間で正確に合焦位置（Ｚf）を検出することができる。ここで、ピーク形状が高い場合に、ステップＳ７の処理（４点式計算）を行って合焦位置（Ｚf）を検出することも可能である。しかし、ピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮが１.０５以上の場合には、ステップＳ７の処理（４点式計算）を行っても、ステップＳ８の処理（通常計算）を行っても、ほぼ同じ正確さで合焦位置（Ｚf）を検出可能である。検出誤差は１０〜２０μｍ程度であり、標本２１の厚みより小さい。したがって、ピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮが１.０５以上の場合に、ステップＳ８の処理（通常計算）を行うことにより、短時間で正確に合焦位置（Ｚf）を検出できる。
【００４３】
また、本実施形態の焦点検出装置１０では、１回以上の移動平均処理後のデータ列（高周波成分が十分に除去されたＳＮ比の良好なもの）を用いるため、ピーク形状の高低を判断するための指標（ピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮ）を簡単に算出することができる。さらに、合焦位置（Ｚf）の算出も簡単に行える。また、光電子増倍管の印加電圧（センサ部の感度）の設定値を用いることにより、移動平均処理の実行回数を簡単かつ適切に定めることができる。
【００４４】
さらに、本実施形態の焦点検出装置１０では、ステップＳ７の処理（４点式計算）において、間隔Ｄ1を６０μｍ、間隔Ｄ2を１２０μｍとするため、基準位置Ｚ0（図４）を挟んで前ピン側と後ピン側との各々で、適切な傾きの直線Ｌａ,Ｌｂを求めることができる。また、ステップＳ１で決定される対物レンズ２３の移動範囲（本スキャンの範囲）も適切な間隔（少なくとも２４０μｍ以上（例えば３００μｍ程度））となる。したがって、焦点検出に要する時間を適切に保ちながら、ピーク形状が低い場合でも、正確に合焦位置（Ｚf）を検出できる。
【００４５】
そして、本実施形態の焦点検出装置１０では、合焦位置演算回路１４から位置制御回路１５に焦点検出の結果（ステップＳ１１で決定した合焦位置（Ｚf））を出力し、位置制御回路１５と駆動回路１２と移動機構２４を介して対物レンズ２３を実際に移動させることで、標本２１からの微弱な蛍光による高精度なオートフォーカスが実現する。
（変形例）
なお、上記した実施形態では、ピーク形状の高低を判断し、ピーク形状が低いときに、ステップＳ７の処理（４点式計算）を行ったが、本発明はこれに限定されない。ピーク形状の高低に拘わらず、ステップＳ７の処理（４点式計算）を行う場合にも、本発明を適用できる。
【００４６】
また、上記した実施形態では、ピーク形状の高低の判断指標としてピーク比率ＭＡＸ／ＭＩＮを用い、判断基準を「１.０５」としたが、本発明はこれに限定されない。判断基準は「１.０５」以外の値でも構わない。判断基準を決めるに当たっては、標本２１の厚さと許容できる検出誤差を考慮することが好ましい。
さらに、上記した実施形態では、ピーク形状が高いときに、ステップＳ６の処理（通常計算）を行ったが、本発明はこれに限定されない。ステップＳ６の処理に代えて、例えば、光量信号の最大強度ＭＡＸに対応する対物レンズ２３の位置を合焦位置に決定する場合にも、本発明を適用できる。
【００４７】
また、上記した実施形態では、ステップＳ８の処理（通常計算）の後にステップＳ９の処理に進む例を説明したが、本発明はこれに限定されない。ステップＳ８の演算結果は常に適切であるため、ステップＳ８の後にステップＳ１０の処理に進んでも構わない。
さらに、上記した実施形態では、対物レンズ２３の移動範囲の上限端と下限端において、光量検出回路１１の光電子増倍管から出力される光量信号の強度（最小強度ＭＩＮ）が、バックグラウンド成分の強度と等しい場合を説明したが、本発明はこれに限定されない。対物レンズ２３の移動範囲を上記より狭く設定する場合（最小強度ＭＩＮ＞バックグラウンド成分の強度）にも、本発明を適用できる。このとき、ピーク形状の高低の判断基準は上記の値（１.０５）より小さくなる。
【００４８】
また、上記した実施形態では、ステップＳ７の処理（４点式計算）において、間隔Ｄ1を６０μｍ、間隔Ｄ2を１２０μｍとしたが、本発明はこれに限定されない。間隔Ｄ1と間隔Ｄ2が異なる値であれば、本発明を適用できる。間隔Ｄ1と間隔Ｄ2の値を標本２１に応じて変更可能としても構わない。
さらに、上記した実施形態では、受光面に入射する光量を一括で検知する光電子増倍管の例で説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、光量を分割して検知し、後段の信号処理系で総和を取る構成などが考えられる。
【００４９】
また、上記した実施形態では、標本２１のステージ２２を固定して対物レンズ２３を上下方向に移動させる構成を例に説明したが、本発明はこれに限定されない。対物レンズ２３を固定してステージ２２を上下方向に移動させる場合にも本発明を適用できる。
さらに、上記した実施形態では、蛍光観察の対象物（標本２１）から発生する微弱な蛍光を取り込んで焦点検出を行う場合について説明したが、本発明はこれに限定されない。観察対象物の標本から発生する微弱な光（例えば標本自体の化学発光など）を取り込んで焦点検出を行う場合にも本発明を適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本実施形態の焦点検出装置１０の構成を示すブロック図である。
【図２】焦点検出装置１０の検出動作の手順を示すフローチャートである。
【図３】マトリクスグラフの一例と移動平均処理を説明する図である。
【図４】ピーク形状が低い場合の４点式計算を説明する図である。
【図５】ピーク形状が高い場合の通常計算を説明する図である。
【符号の説明】
【００５１】
１０  焦点検出装置
１１  光量検出回路
１２  駆動回路
１３  記憶回路
１４  合焦位置演算回路
１５  位置制御回路
２０  筐体
２１  標本
２２  ステージ
２３  対物レンズ
２４  移動機構
２５  光源
２６  ダイクロイックミラー
２７  ハーフミラー
２８  所定の結像面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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