(57)【要約】【課題】より迅速な骨再生を可能にし、臨床応用可能な骨再生技術を提供すること。【解決手段】骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を三次元培養することにより、骨組織を構築する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を三次元培養する工程を含む、骨組織の作製方法。
【請求項２】
前記細胞が間葉系幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が骨芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が脂肪細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が初代培養細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が患者から単離された細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
骨誘導性転写因子がCbfa1、Cbfb、又はosterixである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞を、多孔性ハイドロキシアパタイト、α-ＴＣＰ、β-ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、請求項７に記載の方法。
１）生体から単離した細胞をデキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成蛋白質、及び骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種又は２種以上を用いて分化誘導する、
２）上記細胞に骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子をアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又はレトロウイルスベクターを用いて導入する、
３）上記細胞を多孔性ハイドロキシアパタイト、α-ＴＣＰ、β-ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養する。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって作製された骨組織を含むインプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子導入による骨組織の再生方法、及び再生された組織を利用した骨代替インプラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体から取り出した自己の細胞をin vitroで培養・組織化して限りなく生体に近い組織を再構築するティッシュエンジニアリングの研究が進められている。ティッシュエンジニアリングは、再生能力の限られた骨組織の修復を可能にし、理想的な再生医療を実現する。
【０００３】
骨再生に関する技術としては、細胞の分化誘導をつかさどるサイトカイン(液性因子)を直接細胞に導入する技術が知られている。たとえば、ＴＧＦ−β１を含浸させたコラーゲンスポンジ上で骨髄細胞等を培養する技術（特許文献１）等が公知である。しかしながら、増殖因子そのものを細胞に添加するこれらの技術では、増殖因子活性の十分な持続が望めず、また添加した増殖因子が生体内で速やかに拡散してしまうため、その効果が数時間から１日程度で急激に低下するという問題があった。
【０００４】
これに対し、発明者らは骨誘導性転写因子（Cbfa1）の遺伝子を細胞に導入する方法（特許文献２）や、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）の遺伝子を脂肪細胞に導入する方法（特許文献３）を開発し、効果的な骨再生が得られることを確認した。
【０００５】
【特許文献１】特開2001-316285号
【特許文献２】国際公開WO03011343号パンフレット
【特許文献３】国際公開WO03070291号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、より迅速な骨再生を可能にし、臨床応用可能な骨再生技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、骨誘導性転写因子(Cbfa1)及び血管内皮細胞増殖因子（VEGF）のcDNAを組み込んだウイルスを細胞に同時感染させ、これを適当な足場材料に播種して三次元培養した。さらに、骨再生が最適となる条件を決定し、Cbfa1あるいはVEGFの遺伝子を単独導入した結果に比べて極めて効率のよい骨再生が実現することを確認した。
【０００８】
すなわち、本発明は、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の両遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を三次元培養する工程を含む、骨組織の作製方法に関する。
【０００９】
前記方法において、用いられる細胞としては間葉系幹細胞、骨芽細胞、脂肪細胞が好ましく、特にそれらの初代培養細胞を用いることが好ましい。
【００１０】
ある態様において、前記細胞は患者から単離された細胞である。
本発明の方法で用いられる骨誘導性転写因子としては、Cbfa1、Cbfb、osterix等を挙げることができる。
【００１１】
本発明の方法において、細胞は多孔性ハイドロキシアパタイト、α-ＴＣＰ、β-ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養される。
【００１２】
ある態様において、本発明の方法は以下の工程を含む：
１）生体から単離した細胞をデキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成蛋白質、及び骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種又は２種以上を用いて分化誘導する、
２）上記細胞に骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子をアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又はレトロウイルスベクターを用いて導入する、
３）上記細胞を多孔性ハイドロキシアパタイト、α-ＴＣＰ、β-ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒアルロン酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上の生体適合性材料を足場として三次元培養する。
【００１３】
本発明はまた、本発明の方法によって作製された骨組織を含むインプラントを提供する。このインプラントは骨欠損部の再生医療に有用である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体から取り出した細胞を培養・組織化して限りなく生体に近い骨組織を再構築することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を単離された細胞に導入し、該細胞を生体外で分化・増殖させる工程を含む、骨組織の作製方法に関する。
【００１６】
１．骨誘導性転写因子
本発明で用いられる骨誘導性転写因子は、未分化の細胞を骨に分化誘導する、骨誘導性の転写因子で、例えばCbfa1、Cbfb、osterix等を挙げることができる。Cbfa1は1993年京都大学の小川らによってクローニングされ、大阪大学の小守らにより間葉系幹細胞から骨芽細胞に分化誘導するのに必要不可欠であることが確認された転写因子である（Komori, T. et al., (1997) Cell 89, 755-764）。Cbfbは造血に関与する因子として知られてきたが、近年Runx2との相互作用により骨形成に必須の役割を担っていることが確認された。また、Osterixは骨組織特異的に発現するZinc-Finger型転写因子であり、骨芽細胞の分化等、骨形成に重要な役割を担っていることが確認されている。
【００１７】
これらの骨誘導性転写因子をコードする遺伝子の配列は既に公知であり、当該配列に基づき、骨髄由来細胞等から抽出されたRNAを用いて常法に従い調製することができる。例えば、Cbfa1（ヒト：GenBank Accession Number AH005498、マウス：GenBank Accession Number AF010284等）、Cbfb（ヒト：GenBank Accession Number NM_022845, NM_001755、マウス：GenBank Accession Number NM_022309等）、osterix（ヒト：GenBank Accession Number AF466179、マウス：GenBank Accession Number AY803733等）の配列が公開されている。
【００１８】
２．血管内皮細胞増殖因子（VEGF）
本発明で用いられる血管内皮細胞増殖因子（VEGF）は、in vitroでの血管誘導を飛躍的に向上させ、迅速な骨再生を可能にする。VEGFをコードする遺伝子の配列は既に公知（ヒト：GenBank Accession Number AY047581、マウス：GenBank Accession Number NM_009505）であり、当該配列に基づき、細胞から抽出されたRNAを用いて常法に従い調製することができる。
【００１９】
３．細胞
本発明に用いられる細胞は、分化・増殖能力を有する未分化の細胞であり、たとえば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞及び肝臓幹細胞、脂肪細胞等を挙げることができる。特に、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨芽細胞、脂肪細胞が好ましく、脂肪細胞は脂肪前駆細胞を含むものとする。生体、特に脂肪組織から単離された脂肪細胞中には、体性幹細胞を含むfibroblast-like-cellが多く存在し、本発明で用いられる脂肪細胞には、そのような体性幹細胞が含まれていてもよい。
【００２０】
細胞は、市販のものを用いても、常法に従って調製してもよいが、患者の生体から単離された細胞を好適に用いることができる。該細胞は患者から採取された後、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。また、細胞は初代培養細胞を用いることが好ましく、継代して用いてもよいが、継代数は２回以下であることが好ましい。
【００２１】
４．生体適合性材料
本発明に用いられる生体適合性材料は、細胞培養の足場になると同時に、細胞ごと生体内に適用され、骨代替用インプラントとして機能する。ここで、「生体適合性材料」とは、生体に対して親和性が高く、安全性の確認されている材料を意味する。そのような材料としては、SUS316L、バイタリウム及びTi-6Al-4V等の金属材料、超高分子量ポリエチレン、MMA骨セメント、ポリ乳酸やポリグリコール酸、及びそれらの誘導体（例えば、PLLA(poly-l-lactic acid)とPDLA(poly-d-lactic acid)の重合体等）、ポリエチレンテレフタレート及びポリプロピレン等の高分子材料、ハイドロキシアパタイト、β-TCP、α-TCP及びバイオガラス等のセラミックス材料等を挙げることができる。ただし、細胞培養の足場として用いられるという点で、特にハイドロキシアパタイト、β-TCP、α-TCPなどの多孔性セラミックス材料、コラーゲン、ポリ乳酸やポリグリコール酸、及びそれらの誘導体（例えば、PLLA(poly-l-lactic acid)とPDLA(poly-d-lactic acid)の重合体等）、ならびにこれらの複合体、あるいは吸収性合成ポリマーを用いることが好ましい。
【００２２】
前記生体適合性材料は、細胞の均一な播種が可能となるよう、多孔性であることが好ましい。なお、本明細書中において「多孔(性)」とは、気孔率が40%以上を意味するものとする。また、孔の大きさは特に限定されないが、骨再生が起きやすいという点では直径200μm〜500μmが好ましい。
【００２３】
前記生体適合性材料は、インプラントの目的や適用部位により、適宜最適なものを選ぶことが好ましい。たとえば、強度を必要とする移植箇所（あるいは手術法）については、ハイドロキシアパタイトが好ましく、強度を必要としない移植箇所（あるいは手術法）については、生体吸収性のβ-TCPなどが好ましい。
【００２４】
前記生体適合性材料の形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。
【００２５】
５．骨組織再生
本発明の方法は、具体的には次の工程を含む：
１）ヒト細胞をin vitroで骨細胞へ分化誘導する工程
２）上記細胞に、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子をトランスフェクトする工程
３）上記細胞を、生体適合性材料に播種して三次元的に培養、増殖させる工程。
【００２６】
（１）細胞の分化誘導
細胞は適当な薬剤を用いて処理することにより、目的とする組織を構築する細胞に分化誘導をしておくことが必要である。たとえば、デキサメタゾン、FK-506及びシクロスポリン等の免疫抑制剤、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7及びBMP-9等の骨形成タンパク質（BMP: Bone Morphogenic Proteins）、TGFβ等の骨形成液性因子から選ばれる１種又は２種以上を添加することにより細胞を骨系細胞に分化誘導する。
【００２７】
（２）骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子の導入
骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子は、常法に従い、公知の配列を基に調製することができる。たとえば、骨芽細胞からＲＮＡを抽出し、公知の配列を元にプライマーを作製し、PCR法でクローニングすることにより目的とする増殖因子遺伝子のcDNAが調製できる。
【００２８】
本発明において、骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子の細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションに通常用いられる方法、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、レトロウイルスやバキュロウイルスをベクターとして用いる方法等を用いることができるが、アデノウイルス又はレトロウイルスをベクターとして用いる方法が安全性、導入効率の点から好ましく、特にアデノウイルスを用いた方法が最も好ましい。
【００２９】
前記アデノウイルスベクターの調製は、例えばMiyakeらの方法（Miyake, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1320-1324,(1993)）に基づいて行えばよいが、市販のAdenovirus Cre/1oxP Kit(宝酒造社製)を用いることもできる。このキットはP1ファージのCreリコンビナーゼとその認識配列である1oxPを用いた新たな発現制御系（Kanegae Y. et.al., 1995 Nucl. Acids Res. 23,3816）による組換えアデノウイルスベクター作製キットで、転写因子遺伝子を組み込んだ組換えアデノウイルスベクターを簡便に作製することができる。
【００３０】
なお、アデノウイルス感染のMOI（mu1tip1icity of infection）は、組み込んだ遺伝子及び導入する細胞に依存しているため適宜決定する必要がある。ラットの間葉系幹細胞や骨芽細胞、脂肪細胞に遺伝子導入する場合、骨誘導性転写因子（Cbfa1）組換えアデノウイルスはMOI＝200〜1000（より好ましくは500前後）、VEGF組換えアデノウイルスはMOI＝50〜200（より好ましくは100前後）がよい。
【００３１】
（３）細胞培養
骨誘導性転写因子及び血管内皮細胞増殖因子の遺伝子を導入した細胞の培養は、前記した生体適合性材料からなる足場に、該細胞を播種して、通常の方法により行えばよい。
【００３２】
細胞の播種は、足場である生体適合性材料に単に播種するだけでもよく、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、あるいはコラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種してもよい。また、材料によって、細胞が孔の中にスムーズに入らない場合は、引圧条件下で播種してもよい。
【００３３】
播種する細胞の数（播種密度）は細胞の形態を維持して組織再生をより効率よく行わせるため、用いる細胞や足場材料に応じて適宜調整することが望ましい。たとえば、骨芽細胞であれば、播種密度は100万個／ml以上であることが望ましい。
【００３４】
細胞培養は、足場である生体適合性材料のもとで行う。培地としては、MEM培地、α-MEM培地、DMEM培地等、公知の培地を培養する細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。また、該培地には、FBS（Sigma社製）、Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL社製）等の抗生物質等を添加しても良い。培養は、3〜10% CO2、30〜40度、特に5% CO2、37度の条件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも４、好ましくは７日、より好ましくは１０日程度であるとよい。
【００３５】
６．インプラントの利用
本発明の方法によって再生された組織は、足場材料である生体適合性材料とともに、埋入あるいは注入することで、骨代替用インプラントとして利用することができる。
【００３６】
本発明のインプラントの形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。
【００３７】
本発明のインプラントは、その目的と効果を損なわない範囲において、適宜他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血小板分化増殖因子（PDGF）、インスリン、インスリン様増殖因子（IGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、グリア誘導神経栄養因子（GDNF）、神経栄養因子（NF）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（BMP）、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）等の増殖因子、骨形成タンパク質、St、Mg、Ca及びCO3等の無機塩、クエン酸及びリン脂質等の有機物、薬剤等を挙げることができる。
【００３８】
本発明のインプラントにおいて、骨細胞・組織の構築は移植前（in vitro）のみならず、移植後の骨欠損部（in vivo）においても引き続き行われてよい。本発明のインプラントは、骨親和性及び骨形成能が高く、生体適用後すみやかに生体骨と一体化し、骨欠損部の良好な再生を可能にする。特に、大型の骨欠損（1 cm径以上）においては、多孔性材料の中央部まで自然な血管導入が困難なため、大型骨欠損の十分な治療ができなかった。本発明のごとく、VEGFの遺伝子導入を用いれば、中央部までの血管導入を可能にすることができ、大型骨欠損の十分な治療を行うことができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
実施例１：Cbfa1、VEGF 遺伝子導入によるin vitroでの骨再生
[方  法]
（１）アデノウイルス発現ベクターの作製
マウスの骨芽細胞から単離したTotal RNAからAMV reverse transcriptaseを用いてcDNAを合成し、これを鋳型としてCbfa1のcDNA に特異的なプライマー：
sense primer：5’-ATGCTTCATTCGCCTCACAAAC-3’ （配列番号１）
antisense primer：5’-TCTGTTTGGCGGCCATATTGA-3’ （配列番号２）
を用いてPCRによりCbfa1(til-1) cDNA（GenBank Accession Number AF010284）を増幅して得、シークエンスにより配列を確認した。Cbfa1 cDNAはTA cloning vector (pCR II-TOPO, Invitrogen)にクローニングして大量調製した。Cbfa1 cDNAを制限酵素 Spe IとEcoR Vで切り出し、平滑末端に処理した。
【００４１】
マウスVEGFのcDNA（GenBank Accession Number NM_009505）は、東京工業大学 渡辺氏より供与を受けた。VEGF cDNAも同様に大量調製し、制限酵素 EcoRIで切り出した後、平滑末端に処理した。
【００４２】
Cbfa1 cDNA及びVEGF cDNA を、それぞれAdenovirus Cre/loxP kit（宝酒造, 6151）を用いてコスミドベクター pAxCALNLwのSwa Iサイトに挿入し、Kitの説明書に従ってCbfa1組換えアデノウイルス（Adv-Cbfa1）及びVEGF組換えアデノウイルス（Adv-VEGF）を作製した。作製したウイルスの力価は、それぞれ約1011PFU/ml（Adv-Cbfa1）、約2.5×109 PFU/m1（Adv-VEGF）の価を示し、感染効率が非常に高かった。これらのウイルスはE1領域欠失のため、標的細胞内では増殖することはできず、一過性の性質をもつ。また、目的遺伝子の上流にスタッファーをもつため、Creリコンビナーゼ発現ウイルスと共感染のときのみ遺伝子を発現する。Creリコンビナーゼ発現アデノウイルス（Adv-cre）はキットに付属されていたものを用いた。
【００４３】
（２）骨髄細胞の採取及び培養方法
Rat Bone Marrow Osteobrast (RBMO) は６週令のFisherラット（オス）の大腿骨よりManiatopoulosらの方法（Maniatopoulos, C., Sodek, J., and Melcher, A. H. (1988) Cell Tissue Res. 254, 317-330）に従って採取した。15%FBS（Sigma, F-9423）、Antibiotic-Antimycotic (GIBCO BRL, 15240-062) 添加MEM培地 (nacalai tesque, 214-42)でコンフルエントになるまで培養した。直径3.5cmのdishに約40万個の細胞を継代培養後、上述の培地に5 nM Dexamethasone (Sigma, D-8893)、10 mM β-glycerophosphate (Sigma, G-9891)、50 μg/ml ascorbic acid phosphate(Wako, 013-12061)を添加し、翌日、RBMOにCbfa1組換えアデノウイルスとVEGF組換えアデノウイルスを同時に、それぞれmultiplicity of infection (MOI)=500及びMOI=100で、Creリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスと共感染させた。また、上記と同量のCbfa1組換えアデノウイルス、VEGF組換えアデノウイルスをそれぞれ単独で、RMBOにCreリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスと共感染させた。対照として、目的遺伝子を導入していない空のアデノウイルス（Adv-mock）を同様に共感染させた細胞、及び未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。
【００４４】
（３）脂肪細胞の採取及び培養方法
初代培養様脂肪細胞（FAT）は8週令のFisherラット（オス）の腹部皮下脂肪から採取した。皮下脂肪を生理食塩水で洗った後、細断し、0.075%コラゲナーゼを37度で30分間処理し、細胞を分散させた。10% FBS（Sigma, F-9423）添加DMEM 培地（Sigma, D-5796）で中和した後、遠心し、その沈殿物を160 mM 塩化アンモニウム水溶液で10分間処理した。その後遠心して得られた上清を100μmのナイロンメッシュでろ過し、10% FBS、Antibiotic-Antimycotic (GIBCO BRL, 15240-062)添加DMEM 培地でコンフルエントになるまで培養した。直径3.5cmのdishに約40万個の細胞を継代培養後、上述の培地にadipogenic supplement として250 nM Dexamethasone (Sigma, D-8893)、0.5 mM 1-metyl-3-isobutylxanthin (Sigma, I-7018)、10 μg/ml insulin (Sigma, I-5500)を、あるいはOsteogenic supplementとして5 nM Dexamethasone (Sigma, D-8893)、10 mM β-glycerophosphate (Sigma, G-9891)、50 μg/ml ascorbic acid phosphate(Wako, 013-12061)を添加して培養した。
【００４５】
翌日、FATにCbfa1組換えアデノウイルスとVEGF組換えアデノウイルスを同時に、それぞれmultiplicity of infection (MOI)=500及びMOI=100で、Creリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスと共感染させた。また、上記と同量のCbfa1組換えアデノウイルス、VEGF組換えアデノウイルスをそれぞれ単独で、RMBOにCreリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスと共感染させた。対照として、目的遺伝子を導入していない空のアデノウイルス（Adv-mock）を同様に共感染させた細胞、及び未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。これらのアデノウイルス感染細胞はすべて上述のOsteogenic supplementを加えた骨芽細胞分化培地で培養した。また未処理の細胞に関してはOsteogenic supplementを加えた脂肪細胞分化培地及びOsteogenic supplementを加えた骨芽細胞分化培地で培養した。
【００４６】
（４）細胞数の計測法
各細胞（RBMOあるいはFAT）を1% glutalaldehyde in PBSで5分間固定した後、蒸留水で2回洗い、0.1% crystal violetで30分間室温で染色した。蒸留水で3回洗って余分な染料を除いた後、10% acetic acid, 1% Triton X-100で脱色した。脱色液を希釈し吸収波長595nmの吸光度を測定した。検量線は細胞を適当な濃度で播種し（duplicate）、上述の染色の後、トリプシン処理により単離した細胞をカウントすることにより作製した。
【００４７】
（５）アルカリフォスファターゼ活性の測定
各細胞（RBMOあるいはFAT）を100 mM Tris (pH 7.5), 5mM MgCl2で洗った後スクレイパーで集め、500μｌの100 mM Tris (pH 7.5), 5mM MgCl2, 1% Triton X-100に懸濁して超音波破砕した。破砕後6,000gで5分間遠心して上清を回収した。酵素活性は0.056 M 2-amono-2-methyl-1,3-propandiol (pH 9.9), 10 mM p-nitrophenyl phosphate, 2 mM MgCl2 に各上清5μｌを加え、37℃で30分間インキュベートした後、すぐにマイクロプレートリーダーで吸収波長405 nmの吸光度を測定して求めた。検量線はρ-nitrophenolを用いて作製した。
【００４８】
（６）カルシウム量の測定
各細胞（RBMOあるいはFAT)を10%ホルマリン緩衝液で固定し、一昼夜0.6 M HClで脱灰した。脱灰液を希釈しCalcium reagents（Sigma, 587, 360-11）を用い、説明書に従ってカルシウム量を測定した。
【００４９】
（７）アリザリンレッド染色
各細胞（RBMOあるいはFAT)を10%ホルマリン緩衝液で５分間固定し、蒸留水で軽く洗い１%アリザリンレッド水溶液を加えて２分間インキュベートした。その後蒸留水で何度も洗い、結果をスキャナーで取り込んで比較した。
【００５０】
（８）オステオカルシン量の測定
各細胞（FAT）について、感染から1、2、3週間後の培養上清を回収した。RAT OSTEOCALCIN EIA KIT (Biomedical Technologies Inc.,Stoughton, MA, USA)を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってオステオカルシン量を計測した。
【００５１】
（９）グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH）活性の測定
各細胞（FAT）について、感染から3、7、10、14日後のグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH）活性を測定した。測定用サンプルはアルカリフォスファターゼ活性測定用サンプルと同様の方法で調製し、GPDH活性はGPDH活性測定キット（WAKO 309-06141）を用いて測定した。各サンプルの5μlをキットに添付されていた酵素抽出液で10倍希釈し（50μl）、これに100μlの反応溶液を加えてマイクロプレートリーダーで吸収波長340nmの吸光度の減少を測定した。一分間あたりの吸光度の変化量よりGPDH活性ユニットを求めた。
【００５２】
[結  果]
１．間葉系幹細胞（RMBO）
（１）細胞数の変化
Cbfa1及びVEGF遺伝子を単独あるいは同時導入した細胞(RBMO)の細胞増殖曲線を比較した結果を図２に示す。その結果、Cbfa1及びVEGF遺伝子を導入した細胞（Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF）とCbfa1遺伝子を単独導入した細胞（Adv-Cbfa1）では、非感染細胞（Control, Adv-mock）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）に比較して顕著に高い細胞増殖能が確認された。細胞の増殖能力の高さは、アデノウイルス感染による細胞へのダメージが低いことを示唆している。
【００５３】
（２）Cbfa1及びVEGF遺伝子発現の検出
各細胞(RBMO)におけるCbfa1及びVEGF遺伝子の発現量をノーザンハイブリダイゼーションにより検出した結果を図３に示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGFの結果を示す。また上段はfull lengthのCbfa1 cDNA、中段はfull lengthのVEGF cDNAを、下段はinternal standardとしてGAPDHをプローブとして同じメンブレンにハイブリさせた結果である。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞では、感染後3日目において非常に高いCbfa1及びVEGFの発現が認められた。一方、非感染細胞ではCbfa1及びVEGF遺伝子の発現は観察されなかった。
【００５４】
（３）アルカリフォスファターゼ活性の比較
各細胞(RBMO)におけるアルカリフォスファターゼ活性（ALP activity）の測定結果を図４に示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、Adv-mockの結果を示す。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞では、Cbfa1を単独導入した細胞よりも、骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性が顕著に誘導された。一方、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）ではアルカリフォスファターゼ活性はほとんど確認されなかった。Osteogenic supplementによっても、アルカリフォスファターゼ活性は誘導されたが、Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞に比べると非常に低い値であった。
【００５５】
（４）カルシウム量の測定
各細胞(RBMO)の、感染後1、2、3週間後におけるカルシウム量の測定結果を図５に示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGFの結果を示す。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞と、Cbfa1を単独導入した細胞では、顕著なカルシウムの分泌誘導が確認された。一方、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）ではカルシウムの分泌はほとんど認められなかった。
【００５６】
（５）石灰化の観察
各細胞（RBMO）を感染後1、2、3週間後にアリザリンレッド染色した結果を図６に示す。Cbfa1とVEGF遺伝子を同時導入した細胞と、Cbfa1を単独導入した細胞では、石灰化の進行が確認されたが、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）では石灰化はほとんど認められなかった。
【００５７】
２．脂肪細胞（FAT）
（１）細胞数の変化
Cbfa1及びVEGF遺伝子を単独あるいは同時導入した細胞(FAT)の細胞増殖曲線を比較した結果を図７に示す。その結果、Cbfa1及びVEGF遺伝子を導入した細胞（Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF）とCbfa1遺伝子を単独導入した細胞（Adv-Cbfa1）では、非感染細胞（Control, Adv-mock）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）に比較して顕著に高い細胞増殖能が確認された。細胞の増殖能力の高さは、アデノウイルス感染による細胞へのダメージが低いこと、及び脂肪細胞が脱分化して骨芽細胞様細胞へと分化誘導されていることを示唆している。
【００５８】
（２）アルカリフォスファターゼ活性の比較
各細胞(FAT)におけるアルカリフォスファターゼ活性（ALP activity）の測定結果を図８に示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、Adv-mockの結果を示す。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞では、Cbfa1を単独導入した細胞よりも、骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性が顕著に誘導された。一方、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）ではアルカリフォスファターゼ活性はほとんど確認されなかった。Osteogenic supplementによっても、アルカリフォスファターゼ活性は誘導されたが、Cbfa1及びVEGF遺伝子導入細胞に比べると非常に低い値であった。
【００５９】
（３）オステオカルシン量の測定
各細胞(FAT)の、感染後1、2、3週間後における培地中に分泌されたオステオカルシン量の測定結果を図９に示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGFの結果を示す。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞と、Cbfa1を単独導入した細胞では、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）に比較して、顕著なオステオカルシンの分泌誘導が確認された。また。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞では、Cbfa1を単独導入した細胞よりも、早期に顕著なオステオカルシンの分泌が誘導された。
【００６０】
（４）カルシウム量の測定
各細胞(FAT)の、感染後1、2、3週間後におけるカルシウム量の測定結果を図１０に示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGFの結果を示す。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞と、Cbfa1を単独導入した細胞では、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）に比較して、顕著なカルシウムの分泌誘導が確認された。
【００６１】
（５）石灰化の観察
各細胞（RBMO）を感染後1、2、3週間後にアリザリンレッド染色した結果を図１１に示す。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞と、Cbfa1を単独導入した細胞では、石灰化の進行が確認されたが、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）では石灰化はほとんど認められなかった。
【００６２】
（６）グリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の比較
各細胞(FAT)におけるGPDH活性の測定結果を図１２に示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、Adv-mockの結果を示す。非感染コントロール（Control）、あるいは空ベクター感染コントロール（Adv-mock）の細胞にのみ、脂肪代謝系の酵素であり、脂肪細胞のマーカーでもあるGPDH活性が認められた。本実施例に用いた細胞が、脂肪への分化能を維持していることを示す。
【００６３】
実施例２：ラット生体内移植後の骨再生
[方  法]
（１）ラット背上皮皮下移植
実施例１の方法に従い、コンフルエントになった細胞（RBMOあるいはFAT）にCbfa1組換えアデノウイルス及び/又はVEGF組換えアデノウイルスとCreリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスを共感染させた。対照として未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。各細胞を円柱形のOPLAコンポジット(BD Biosciences, 直径5 mm×高さ3 mm)に細胞濃度100万個/mlで減圧下（100 mHg）で吸着させ、翌日ラットの背上皮皮下に移植した。移植後にコンポジットを摘出し、ヘマトキシリン／エオジン染色して観察した。
【００６４】
（２）ラット大腿骨欠損部移植
実施例１の方法に従い、コンフルエントになった細胞（RBMOあるいはFAT）にCbfa1組換えアデノウイルス及び/又はVEGF組換えアデノウイルスとCreリコンビナーゼ遺伝子組換えアデノウイルスを共感染させた。対照として未処理の細胞を同様に後述の実験に供した。各細胞を円柱形のOPLAコンポジット(BD Biosciences, 直径5 mm×高さ3 mm)に細胞濃度100万個/mlで減圧下（100 mHg）で吸着させ、翌日ラットの大腿骨欠損部位に移植した。欠損部位はラットの大腿骨にドリルで2.5 mm立方の穴を開けて作製し、そこに上記のコンポジットを移植し、数週間後に摘出した。
【００６５】
（３）組織切片作製、染色法
摘出したコンポジットを4% paraformaldehyde, 0.05% glutaraldehydeでマイクロウェーブ固定した後、翌日10% EDTA, 100 mM Tris (pH7.4)中で約２週間脱灰した。脱灰後、エタノールで脱水し、レモゾールで透徹し、パラフィンに包埋した。5μｍの厚さで切片を作製し、脱パラフィン後、ヘマトキシリン続いてエオジンで染色した。サンプルは光学顕微鏡(IX-70, Olympus, Tokyo, Japan)で観察し、CCDカメラ(CoolSNAP cf, ROPER Scientific)により取り込んだデジタルイメージは MetaMorph softwareで解析した。
【００６６】
[結  果]
１．間葉系幹細胞（RMBO）
（１）ラット背上皮皮下移植（移植後8週間目）
ラット背上皮皮下移植8週間目におけるコンポジットのヘマトキシリン/エオジン染色像を図１３に示す。新生骨のポア（孔）に対して占める割合は、画像解析から、非感染細胞（コントロール）で18%、Cbfa1遺伝子導入細胞で51%、Cbfa1, VEGF同時遺伝子導入細胞で84%であった。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF）を吸着したコンポジットは、非感染細胞（Control）やVEGF遺伝子を単独導入した細胞（Adv-VEGF）に比較して顕著に高い骨再生が認められる。また、Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF）を吸着したコンポジットは、Cbfa1を単独導入した細胞（Adv-Cbfa1）を吸着したコンポジットと比較して、より多くかつ広範囲な骨再生が観察できる（写真、矢印）。
【００６７】
（２）ラット大腿骨欠損部移植（移植後5週間目）
ラット大腿骨欠損部移植5週間目におけるコンポジットのヘマトキシリン/エオジン染色像を図１４に示す。非感染細胞（Control）に比べてCbfa1遺伝子を単独導入した細胞（Adv-Cbfa1）を吸着したコンポジットの方が、皮質骨の部分の骨再生が進行しており、皮質骨の欠損部位の大きさが小さくなってきている様子が観察される。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF）を吸着したコンポジットは、移植したコンポジットの溶解及び順調な骨再生が観察され、さらに移植したコンポジットと皮質骨の融合が観察できる。
【００６８】
２．脂肪細胞（FAT）
（１）ラット背上皮皮下移植（移植後8週間目）
ラット背上皮皮下移植8週間目におけるコンポジットのヘマトキシリン/エオジン染色像を図１５に示す。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF）を吸着したコンポジットは、Cbfa1を単独導入した細胞（Adv-Cbfa1）を吸着したコンポジットよりも、より多くかつ広範囲な骨再生が観察される（写真、矢印）。
【００６９】
（２）ラット大腿骨欠損部移植（移植後5週間目）
ラット大腿骨欠損部移植5週間目におけるコンポジットのヘマトキシリン/エオジン染色像を図１６に示す。新生骨のポア（孔）に対して占める割合は、画像解析から、非感染細胞（コントロール）で7%、Cbfa1遺伝子導入細胞で20%、Cbfa1, VEGF同時遺伝子導入細胞で35%であった。非感染細胞（Control）に比べてCbfa1遺伝子を単独導入した細胞（Adv-Cbfa1）を吸着したコンポジットの方が、皮質骨の部分の骨再生が進行しており、皮質骨の欠損部位の大きさが小さくなってきている様子が観察される。Cbfa1及びVEGF遺伝子を同時導入した細胞（Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF）を吸着したコンポジットは、移植したコンポジットの溶解及び順調な骨再生が観察され、さらに移植したコンポジットと皮質骨の完全な融合が観察できた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、生体から取り出した細胞を培養・組織化して限りなく生体に近い骨組織を再構築することができる。本発明の方法は、再生医療の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子組替えアデノウイルスベクターの構造を示す。
【図２】図２は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(RBMO)の細胞増殖曲線を示す。図中、◆：Control、■：Adv-VEGF、▲：Adv-Cbfa1、×：Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、＊：Adv-mock。
【図３】図３は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(RBMO)のノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。また上段はfull lengthのCbfa1 cDNA、中段はfull lengthのVEGF cDNAを、下段はinternal standardとしてGAPDHをプローブとして同じメンブレンにハイブリさせた結果。
【図４】図４は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(RBMO)におけるアルカリフォスファターゼ活性（ALP activity）の測定結果を示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、Adv-mock。
【図５】図５は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(RBMO)におけるカルシウム量を示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。
【図６】図６は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(RBMO)の、感染後1、2、3週間後のアリザリンレッド染色像を示す。
【図７】図７は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)の細胞増殖曲線を示す。図中、◆：Control、■：Adv-VEGF、▲：Adv-Cbfa1、×：Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、＊：Adv-mock。
【図８】図８は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)におけるアルカリフォスファターゼ活性（ALP activity）の測定結果を示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、Adv-mock。
【図９】図９は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)の、感染後1、2、3週間後におけるオステオカルシン量の測定結果を示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。
【図１０】図１０は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)におけるカルシウム量を示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。
【図１１】図１１は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)の、感染後1、2、3週間後のアリザリンレッド染色像を示す。
【図１２】図１２は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)におけるグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定結果を示す。図中、左からControl、Adv-VEGF、Adv-Cbfa1、Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF、Adv-mock。
【図１３】図１３は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(RMBO)を吸着させたコンポジットのラット背上皮皮下移植8週間目のヘマトキシリン/エオジン染色像を示す。図中、左上:Control、左下：Adv-Cbfa1、右上：Adv-VEGF、右下：Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。
【図１４】図１４は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(RMBO)を吸着させたコンポジットのラット大腿骨欠損部移植5週間目のヘマトキシリン/エオジン染色像を示す。図中、左上:Control、左下：Adv-Cbfa1、右上：Adv-VEGF、右下：Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。
【図１５】図１５は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)を吸着させたコンポジットのラット背上皮皮下移植8週間目のヘマトキシリン/エオジン染色像を示す。図中、右上:Control、左下：Adv-Cbfa1、右下：Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。
【図１６】図１６は、Cbfa1及び/又はVEGF遺伝子を導入した細胞(FAT)を吸着させたコンポジットのラット大腿骨欠損部移植5週間目のヘマトキシリン/エオジン染色像を示す。図中、右上:Control、左下：Adv-Cbfa1、右下：Adv-Cbfa1＋Adv-VEGF。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号１−人工配列の説明：プライマー
配列番号２−人工配列の説明：プライマー
【図１】
2006263459.tif 000002
【図２】
2006263459.tif 000003
【図３】
2006263459.tif 000004
【図４】
2006263459.tif 000005
【図５】
2006263459.tif 000006
【図６】
2006263459.tif 000007
【図７】
2006263459.tif 000008
【図８】
2006263459.tif 000009
【図９】
2006263459.tif 000010
【図１０】
2006263459.tif 000011
【図１１】
2006263459.tif 000012
【図１２】
2006263459.tif 000013
【図１３】
2006263459.tif 000014
【図１４】
2006263459.tif 000015
【図１５】
2006263459.tif 000016
【図１６】
2006263459.tif 000017
【配列表】
2006263459000001.app