(57)【要約】【課題】本発明は、安価で実用的な高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸とを含有する溶液（Ｉ）に、還元状態にある土壌を作用させて得られる集積物（Ｉ）を、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として１種の有機酸を含有する溶液（ＩＩ）に作用させて、得られる集積物（ＩＩ）を高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を有する系で、嫌気条件下、反応温度３０〜５０℃で撹拌させることを特徴とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸とを含有する溶液（Ｉ）に、還元状態にある土壌を作用させて得られる集積物（Ｉ）を、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として１種の有機酸とを含有する溶液（ＩＩ）に作用させて、得られる集積物（ＩＩ）を高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を有する系で、嫌気条件下、反応温度３０〜５０℃で撹拌させることを特徴とする高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法。
【請求項２】
前記反応温度が３７〜４２℃であることを特徴とする請求項１に記載の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法。
【請求項３】
前記高塩素置換芳香族有機塩素系化合物が、ポリクロロビフェニル、又はヘキサクロルベンゼンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する分解菌の集積方法、及びそれを用いた分解菌の単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
汚染土壌の環境修復技術として、土壌の除去や遺伝子組換え体とした微生物の導入がある。しかし、土壌の除去や遺伝子組換え体の微生物の導入による環境修復は、経済的負担が非常に大きく、更に遺伝子組換え体の微生物の導入は、現状では安全性の面から実現困難である。
【０００３】
一方、圃場に存在している土着の菌を活性化させ、土壌に含まれる汚染物質を分解除去する方法が提案されている。これは経済面および安全面からも実現可能な手法の一つと考えられており、この分野の研究は盛んに行われている。
近年、嫌気性微生物による還元的反応が、酸化分解では分解が困難な有機塩素系化合物を分解するのに有効であることが判明してきている。例えば、極性基を有する有機塩素系化合物を分解する嫌気性細菌として、クロロ安息香酸を分解するデスルホモナイル  ティジェイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ  ｔｉｅｄｅｉ）  ＤＣＢ１株、デスルホマイクロビウム  エスカンビエンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｅｓｃａｍｂｉｅｎｓｅ）、ペンタクロロフェノールを分解するデサルフィトバクテリウム  フラピエリ（Ｄｅｓ  ｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒａｐｐｉｅｒｉ）、クロロフェノールを分解するデサルフィトバクテリウム  デハロゲナンス（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ）等、極性基を有さない有機塩素系化合物を分解する嫌気性細菌としては、テトラクロルエチレンを脱クロル化するデサルフィトバクテリウム（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｐ．ＰＣＥ１株、Ｙ５１株、デハロスピリウム  マルチボランス（Ｄｅｈａｌｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒ  ａｎｓ）、デハロコッコイデス  エセノゲネス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ）１９５株等が分離されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ポリクロロビフェニル（ＰＣＢ）、ヘキサクロルベンゼン（ＨＣＢ）等の高度に塩素化された難分解性有害化学物質を効果的に分解除去する微生物の分離例はない。
従って、上述したいずれの方法によっても、ＰＣＢ、ＨＣＢ等の高度に塩素化された難分解性有害化学物質を環境中で効果的に分解することは困難である。
そのため、安価で、安全面にも配慮された実用的な高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する方法の提供が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸とを含有する溶液（Ｉ）に、還元状態にある土壌を作用させて得られる集積物（Ｉ）を、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として１種の有機酸とを含有する溶液（ＩＩ）に作用させて、得られる集積物（ＩＩ）を高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を有する系で、嫌気条件下、反応温度３０〜５０℃で撹拌させることを特徴とする。
また、上記反応温度が３７〜４２℃であることが好ましい。
また、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物が、ポリクロロビフェニル、又はヘキサクロルベンゼンであることが好ましい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法によれば、安価で、効果的に高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解することができる。
また、本発明の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する分解菌の集積方法、及びそれを用いた分解菌の単離方法によれば、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解できる特定の分解菌を効率よく単離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の処理対象となる高塩素置換芳香族有機塩素系化合物としては、ポリクロロビフェニル（以下、ＰＣＢと略す）、ヘキサクロルベンゼン（以下、ＨＣＢと略す）、種々のクロルベンゼン等が挙げられる。これらの中でも、特にＰＣＢ、ＨＣＢ等の高度に塩素化された難分解性の化学物質を効果的に分解することができる。
【０００８】
本発明の実施形態に係る高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸とを含有する溶液（Ｉ）に、還元状態にある土壌を作用させて得られる集積物（Ｉ）を、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として１種の有機酸とを含有する溶液（ＩＩ）に作用させて、得られる集積物（ＩＩ）を高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を有する系で、嫌気条件下、反応温度３０〜５０℃で撹拌させる。
【０００９】
溶液（Ｉ）は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸とを含有するものであって、無機塩溶液（ただし、硫酸を含まない）に、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と複数種類の有機酸とを添加して調製される。高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の具体例としては、ＰＣＢ、ＨＣＢ、種々のクロルベンゼン等が挙げられ、有機酸としては特に制限はないが、酢酸、ギ酸、乳酸、及びそれらの塩が好ましい。
【００１０】
また、溶液（Ｉ）は、微量元素やビタミン等を含有することが好ましい。微量元素としては特に制限はないが、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｍｏ等が挙げられ、ビタミンとしては特に制限はないが、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン等が挙げられる。また、市販品としてＷｏｌｉｎビタミン溶液なども用いることができる。
【００１１】
溶液（Ｉ）のｐＨは中性付近とすることが好ましく、より好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．５である。ｐＨは、例えばＣＯ２の濃度調整することにより容易に調整することができる。
【００１２】
還元状態にある土壌としては、硫酸が集積しやすく、還元状態が極度に発達した海岸近くの低湿地の土壌、肥料成分の硫酸イオンを多く含み、豊富な有機物の影響下で還元状態が発達した水田等が挙げられ、より具体的にはハドソン川低湿汚泥が例示できる。
また、例えば畑土壌にＰＣＢやＨＣＢ等の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を投与して、湛水条件下で長期間（好ましくは２年以上）静置することにより還元状態にある土壌を得ることができる。この際の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の使用量に特に制限はないが、２００ｐｐｍ以下とすることが好ましい。なお、本明細書において、還元状態とは、絶対嫌気性菌が生息可能な酸化還元電位が０ｍＶ以下を意味する。
【００１３】
このように調製された溶液（Ｉ）と、還元状態にある土壌とを嫌気条件下で攪拌しながら作用させることにより、集積物（Ｉ）を得ることができる。このときの温度としては３０〜５０℃が好ましく、より好ましくは３７〜４２℃である。
また、溶液（Ｉ）と還元状態にある土壌との混合比としては特に制限はないが、還元状態にある土壌が全体の５〜３０％容量比になるように加えることが好ましく、特に好ましくは１０〜２０％容量比である。このような容量比にすると、集積物（Ｉ）の集積が効率的に進行する。
【００１４】
また、本発明において、上述した方法により得られる集積物（Ｉ）を溶液（Ｉ）を用いて希釈し、それを嫌気条件下３０〜５０℃、好ましくは３７〜４２℃で攪拌する操作を複数回繰り返して、集積物（Ｉ）の集積度を高めることが好ましい。
【００１５】
次いで、上記のようにして得られる集積物（Ｉ）を、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として１種の有機酸とを含有する溶液（ＩＩ）に作用させ集積物（ＩＩ）を得る。このとき用いられる高塩素置換芳香族有機塩素系化合物としては、ＰＣＢ、ＨＣＢ、種々のクロルベンゼン等が挙げられ、有機酸としては特に制限はないが、酢酸、ギ酸、乳酸、及びそれらの塩が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、及びそれらの塩である。そして、これらを無機塩溶液（ただし、硫酸を含まない）に添加して溶液（ＩＩ）が調製される。
【００１６】
また、溶液（ＩＩ）は、溶液（Ｉ）と同様に、微量元素やビタミン等を含有することが好ましい。これら微量元素やビタミンとしては、上述したものが適用される。また、溶液（ＩＩ）のｐＨは中性付近とすることが好ましく、より好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．５である。ｐＨは、例えばＣＯ２の濃度調整することにより容易に調整することができる。
【００１７】
上記のように調製された溶液（ＩＩ）と、集積物（Ｉ）とを嫌気条件下で攪拌しながら作用させることにより、集積物（ＩＩ）を得ることができる。このときの温度としては３０〜５０℃が好ましく、より好ましくは３７〜４２℃である。
このように、溶液（Ｉ）及び還元状態にある土壌を用いて得られる集積物（Ｉ）を、溶液（ＩＩ）で処理することにより、後段で説明するように、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を効果的に分解することができる集積物（ＩＩ）を得ることができる。
【００１８】
次に、上記のようにして得られた集積物（ＩＩ）を用いた高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法について説明する。
例えば、アルミシールとブチルゴム栓で密閉された血清瓶に、上記溶液（Ｉ）とアセトンに溶解させたＨＣＢを入れ、そこに集積物（ＩＩ）をシリンジで添加し、嫌気条件下で３０〜５０℃、好ましくは３７〜４２℃で撹拌させる。反応温度が３０℃未満の場合、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解反応は起こらず、５０℃を超えると分解効率が大きく低下する。なお、このときの集積物（ＩＩ）の使用量や反応時間等は適宜決定することができる。
【００１９】
本発明の実施形態に係る高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸と、ブロモエタンスルホン酸とを含有する溶液（ＩＩＩ）に、還元状態にある土壌を作用させて得られる集積物を高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を有する系で、嫌気条件下、反応温度３０〜５０℃で撹拌させる。従って、溶液（ＩＩＩ）を用いて集積物を得る場合の相違点のみを説明し、それ以降の共通部分の説明は省略する。
【００２０】
溶液（ＩＩＩ）は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸と、ブロモエタンスルホン酸とを含有するものであって、これらを無機塩溶液（ただし、硫酸を含まない）に添加して調製される。このとき用いられる高塩素置換芳香族有機塩素系化合物としては、ＰＣＢ、ＨＣＢ、種々のクロルベンゼン等が挙げられ、有機酸としては特に制限はないが、酢酸、ギ酸、乳酸、及びそれらの塩が好ましい。
【００２１】
本発明において、溶液（ＩＩＩ）に含有されるブロモエタンスルホン酸は、集積物の進行を妨げるメタン菌等の生育を抑制するものであるので、ブロモエタンスルホン酸の含有量としては、上記目的を達成できる範囲内であれば、特に制限はないが、終濃度として０．５〜１０ｍＭが好ましく、より好ましくは１〜５ｍＭである。
【００２２】
また、溶液（ＩＩＩ）は、溶液（Ｉ）と同様に、微量元素やビタミン等を含有することが好ましい。これら微量元素やビタミンとしては、上述したものが適用される。また、溶液（ＩＩＩ）のｐＨは中性付近とすることが好ましく、より好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．５である。ｐＨは、例えばＣＯ２の濃度調整することにより容易に調整することができる。
【００２３】
上記のように調製された溶液（ＩＩＩ）と、上記還元状態にある土壌とを嫌気条件下で攪拌しながら作用させることにより、集積物を得ることができる。なお、このときの温度としては３０〜５０℃が好ましく、より好ましくは３７〜４２℃である。
また、溶液（ＩＩＩ）と還元状態にある土壌との混合比としては特に制限はないが、還元状態にある土壌が全体の５〜３０％容量比になるように加えることが好ましく、特に好ましくは１０〜２０％容量比である。このような容量比にすると、集積物の集積が効率的に進行する。
このように、上記溶液（Ｉ）にブロモエタンスルホン酸が添加された溶液（ＩＩＩ）によれば、集積物の進行を妨げるメタン菌等の生育を抑制することができ、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を効果的に分解することができる集積物を効率的に得ることができる。
【００２４】
また、本実施形態において、上述した方法により得られる集積物を溶液（Ｉ）を用いて希釈し、それを嫌気条件下３０〜５０℃、好ましくは３７〜４２℃で攪拌する操作を複数回繰り返して、集積物の集積度を高めることが好ましい。
【００２５】
本発明の実施形態に係る高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸とを含有する溶液（Ｉ）に、還元状態にある土壌を加え、これに加熱処理を施した後に得られる集積物を高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を有する系で、嫌気条件下、反応温度３０〜５０℃で撹拌させる。従って、加熱処理を施して集積物を得る場合の相違点のみを説明し、溶液（Ｉ）の構成や調製方法、及び集積物を用いた高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法などの共通部分の説明は省略する。
【００２６】
本発明は、溶液（Ｉ）に還元状態にある土壌を加え、これに加熱処理した後、嫌気条件下で攪拌することにより集積物を得ることができる。このように、加熱処理を施すことにより、集積物の進行を妨げるメタン菌等の生育を抑制することができ、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を効果的に分解することができる集積物を得ることができる。従って、加熱処理は上記目的を達成できる条件下で行なわれ、加熱温度を６０〜１００℃程度とすることが好ましく、７０〜９０℃で１０〜２０分間処理することがより好ましい。
【００２７】
溶液（Ｉ）と還元状態にある土壌との混合比としては特に制限はないが、還元状態にある土壌が全体の５〜３０％容量比になるように加えることが好ましく、特に好ましくは１０〜２０％容量比である。このような容量比にすると、集積物の集積が効率的に進行する。
【００２８】
また、本実施形態において、上述した方法により得られる集積物を溶液（Ｉ）を用いて希釈し、それを嫌気条件下３０〜５０℃、好ましくは３７〜４２℃で攪拌する操作を複数回繰り返して、集積物の集積度を高めることが好ましい。
【００２９】
本発明による高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解状況は、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣ）等にて容易に確認することができる。例えば、嫌気グローブボックス（酸素分圧０．３％以下）内で、血清瓶の栓を開封し、撹拌後の全液又は底に沈着した集積物を十分攪拌した後の溶液１ｍｌを採取し、エーテル抽出を２度行う。この際に内部標準物質としてペンタクロルベンゼン（ＰＣＢｚ）等を加えて回収率を求めることが好ましい。
エーテル除去後、アセトニトリル、アセトン等に溶解させ、ＨＰＬＣ、電子捕獲検出器（ＥＣＤ）装備のガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解状況を把握することができる。なお、後段の実施例において詳細に説明するが、本発明によるＨＣＢの分解は、ＨＰＬＣによるＨＣＢの分解パターンから、下記の反応式に示す分解経路を経ていること、及び中間体の蓄積が認められなかったことから、ＨＣＢがほぼ完全に分解されることが示唆された。
【００３０】
【化１】
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【００３１】
以上説明したように、本発明の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の分解方法によれば、安価で、効果的に高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解することができるので、産業上の利用価値が非常に高い。
【００３２】
次に、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する特定の分解菌について説明する。
上記分解菌の分解対象となる高塩素置換芳香族有機塩素系化合物としては、ＰＣＢ、ＨＣＢ、種々のクロルベンゼン等が挙げられる。これらの中でも、特にＰＣＢ、ＨＣＢ等の高度に塩素化された難分解性の化学物質を効果的に分解することができる。
【００３３】
本発明の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する分解菌の集積方法は、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として複数種類の有機酸とを含有する培地（Ｉ）に、還元状態にある土壌を加えて、嫌気条件下３０〜５０℃で攪拌して分解菌を集積することを特徴とする。
【００３４】
培地（Ｉ）は、微生物の培養に一般的に用いられる無機塩培地（ただし、硫酸を含まない）に、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と複数種類の有機酸とを添加して調製される。添加される高塩素置換芳香族有機塩素系化合物としては、ＰＣＢ、ＨＣＢ、種々のクロルベンゼン等が挙げられ、有機酸としては特に制限はないが、酢酸、ギ酸、乳酸及びそれらの塩などが好ましい。
【００３５】
また、上記培地（Ｉ）は、微量元素やビタミン等を含有することが好ましい。
微量元素としては特に制限はないが、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｍｏ等が挙げられ、ビタミンとしては特に制限はないが、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン等が挙げられる。また、市販品としてＷｏｌｉｎビタミン溶液なども用いることができる。
【００３６】
上記培地（Ｉ）のｐＨは中性付近とすることが好ましく、より好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．５である。ｐＨは、例えばＣＯ２の濃度調整をすることにより容易に調整することができる。
【００３７】
本発明における還元状態にある土壌は、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する特定の分解菌の採取源であって、例えば、硫酸が集積しやすく、還元状態が極度に発達した海岸近くの低湿地の土壌、肥料成分の硫酸イオンを多く含み、豊富な有機物の影響下で還元状態が発達した水田等が挙げられ、より具体的にはハドソン川低湿汚泥が例示できる。また、例えば畑土壌にＰＣＢやＨＣＢ等の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を投与して、湛水条件下で長期間（好ましくは２年以上）静置することにより還元状態にある土壌を得ることができる。この際の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物の使用量に特に制限はないが、２００ｐｐｍ以下とすることが好ましい。
【００３８】
このようにして調製された培地（Ｉ）中に、還元状態にある土壌を加えて、嫌気条件下３０〜５０℃で、好ましくは３７〜４２℃で攪拌する。
また、培地（Ｉ）と還元状態にある土壌との混合比としては特に制限はないが、還元状態にある土壌が全体の５〜３０％容量比になるように加えることが好ましく、特に好ましくは１０〜２０％容量比である。このような容量比にすると、分解菌の集積が効率的に進行する。
【００３９】
本発明において、上述した方法により得られる分解菌を培地（Ｉ）を用いて希釈し、それを嫌気条件下３０〜５０℃、好ましくは３７〜４２℃で攪拌する操作を複数回、好ましくは２〜３回程度繰り返して、分解菌の集積度を高めることが好ましい。また、希釈率としては特に制限はないが１〜２０％が好ましく、より好ましくは１〜１０％である。
【００４０】
本発明の分解菌の単離方法は、上述した分解菌の集積方法を利用して分解菌を単離する方法であって、分解菌を集積済みの培養液を、唯一の末端電子受容体として高塩素置換芳香族有機塩素系化合物と、電子供与体として１種の有機酸とを含有する培地（ＩＩ）に作用させて得られる。このとき用いられる高塩素置換芳香族有機塩素系化合物としては、ＰＣＢ、ＨＣＢ、種々のクロルベンゼン等が挙げられ、有機酸としては特に制限はないが、酢酸、ギ酸、乳酸、及びそれらの塩が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、及びそれらの塩である。そして、これらを無機塩溶液（ただし、硫酸を含まない）に添加して培地（ＩＩ）が調製される。
【００４１】
また、培地（ＩＩ）は、培地（Ｉ）と同様に、微量元素やビタミン等を含有することが好ましい。これら微量元素やビタミンとしては、上述したものが適用される。
また、培地（ＩＩ）のｐＨは中性付近とすることが好ましく、より好ましくはｐＨ７．３〜ｐＨ７．５である。ｐＨは、例えばＣＯ２の濃度調整することにより容易に調整することができる。
【００４２】
上記のように調製された培地（ＩＩ）と、分解菌を集積済みの培養液とを嫌気条件下で攪拌しながら作用させることにより、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物に対して分解活性を有する培養液を調製することができる。このような培養液を用いることにより、嫌気平板法等で効率良く分解菌を単離することができる。
【００４３】
また、上記以外の方法としては、ブロモエタンスルホン酸（終濃度として０．５〜１０ｍＭ）を添加した培地（Ｉ）と、還元状態にある土壌とを作用させ、それを嫌気条件下で攪拌したり、培地（Ｉ）に還元状態にある土壌を加え、加熱処理（６０〜１００℃程度）した後、嫌気条件下で攪拌することにより、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物に対して分解活性を有する培養液を調製することもできる。
【００４４】
本発明の高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を分解する分解菌の集積方法、及びそれを用いた分解菌の単離方法によって得られる特定の分解菌は、嫌気的な脱ハロゲン化呼吸によって、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物を効果的に分解することができる。また、上記分解菌によれば、高塩素置換芳香族有機塩素系化合物によって汚染された土壌、水等を環境中で効果的に分解することが可能なため、有用な環境修復技術となり得る。
【実施例】
【００４５】
（溶液（ｉ）〜（ｖ）の調製）
以下の組成を有する硫酸を含まない無機塩溶液（ＮａＣｌ  ８．４ｇ／ｌ；ＫＣｌ  ０．２７ｇ／ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．６ｇ／ｌ  ；ＮＨ４Ｃｌ  ０．５ｇ／ｌ；ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ／ｌ；ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  ０．００１ｇ／ｌ  ）を投入し、更に１％容量の微量元素溶液（ｎｉｔｒｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  １．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４  ３．０ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４  ０．５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ  １．０ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４  ０．１ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２  ０．１ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ２  ０．１ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４  ０．１ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４  ０．０１ｇ／ｌ；ＡｌＫ（ＳＯ４）２  ０．０１ｇ／ｌ；ＨＢＯ３  ０．０１ｇ／ｌ；Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．０１ｇ／ｌ）を丸底フラスコに投入して、脱気のため窒素気流下で沸騰させた。１０分後、Ｎ２−ＣＯ２（９５：５）気流下でＮａＳ・９Ｈ２Ｏ（０．２５ｇ／ｌ）とＮａＨＣＯ３（２．５３ＮａＨＣＯ３（２．５３））を加えた後に、ＣＯ２の濃度を調整しｐＨを７．３〜７．５の間に合わせた。これをＮ２−ＣＯ２（９５：５）気流下で１６０ｍｌの血清瓶に分注した。
次いで、この溶液にアセトンに溶解させたＨＣＢを終濃度２００ｐｐｍになるように添加し、ブチルゴム栓とアルミシールで密封した。これを１２０℃で１時間のオートクレーブを３日間繰り返した後、この血清瓶に、別途ろ過滅菌し嫌気条件としたＷｏｌｉｎビタミン溶液（ｂｉｏｔｉｎ  ２ｍｇ／ｌ  ；ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ２ｍｇ／ｌ  ；ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ５ｍｇ／ｌ  ；ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ５ｍｇ／ｌ  ；ｔｈｉａｍｉｎｅ  ５ｍｇ／ｌ  ；ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ５ｍｇ／ｌ  ；ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ  ａｃｉｄ  ５ｍｇ／ｌ  ；ｖｉｔａｍｉｎｅ  Ｂ１２  ０．１ｍｇ／ｌ  ；ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ５ｍｇ／ｌ  ；ｔｈｉｏｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ５ｍｇ／ｌ）１ｍｌと、１２０℃で１時間のオートクレーブを３日間繰り返したＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（３．９５ｇ／ｌ）とＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０５ｇ／ｌ）溶液とをシリンジで加えた（溶液（ｉ））。
次いで、溶液（ｉ）に、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、及び乳酸ナトリウムを終濃度２．５ｍＭになるようにシリンジで加えた（溶液（ｉｉ））。
また、溶液（ｉ）に、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、または乳酸ナトリウムを単独で終濃度２．５ｍＭになるようにシリンジで加えたものをそれぞれ溶液（ｉｉｉ）、溶液（ｉｖ）、溶液（ｖ）とした。
【００４６】
（比較例）
２０ｐｐｍのＰＣＢを投与し４０ヶ月間湛水条件下においた畑土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約５ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を４回行い（２０００年１１月１４日、１２月２日、２００１年１月１８日、２００１年３月５日）、下記の評価試験を行った（２００１年３月１６日）。
【００４７】
（試験例１）
２０ｐｐｍのＰＣＢを投与し４０ヶ月間湛水条件下においた畑土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約５ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を３回（２０００年１１月１４日、１２月２日、２００１年１月１８日）、溶液（ｉｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を１回行い（２００１年３月５日）、下記の評価試験を行った（２００１年３月１６日）。
【００４８】
（評価試験）
アルミシールとブチルゴム栓で密閉した血清瓶に溶液（ｉｉ）を加え、そこにアセトンに溶かしたＨＣＢ（終濃度２００ｐｐｍ、アセトン濃度５％）をシリンジで加えた。これに試験例１または比較例で得られた集積物（液）をシリンジで添加し、嫌気条件下（レサズリンを還元度の指示薬として使用）、３７℃で５３日間攪拌して撹拌を停止した。
撹拌停止後、嫌気グローブボックス（酸素分圧０．３％以下）内で、血清瓶の栓を開封し、底に沈着した固形物を十分攪拌した後、内容物１ｍｌを採取し、エーテル抽出を２度行った。この際に内部標準物質としてペンタクロルベンゼン（ＰＣＢｚ）を加えて回収率を求めた。
エーテル除去後、ＨＰＬＣ分析用にはアセトニトリルに溶解させ、ＨＰＬＣ（日立製作所）（逆相分配カラム：１５０ｍｍ×４ｍｍ、カラム温度：５０℃、流出溶媒：アセトニトリル／脱イオン水＝８０／２０、流出速度：１ｍＬ／分）と、ＥＣＤ装備のＧＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ社製）（キャピラリーカラム（商品名Ｕｌｔｒａｂａｎｄ１、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ社製）：２５ｍｍ×０．２ｍｍ）を用いてＨＣＢ分解パターンを求めた。比較例のＨＣＢ分解パターンを図１、試験例１のＨＣＢ分解パターンを図２に示す。
【００４９】
図１から明らかなように、比較例の集積物（液）を用いたほうは、ＨＣＢが分解されず残存した。一方、図２から明らかなように、試験例１の集積物（液）を用いたほうは、ＨＣＢの残存量が１．６％（ＨＣＢ分解率９８．４％）であり、大部分のＨＣＢが分解されたことが判明した。
また、試験例１において、１，２，３，４−テトラクロルベンゼン、１，２，４，５−テトラクロルベンゼン及び１，２，３，５−テトラクロルベンゼンが微量ではあるが認められたため、これらは中間生成物であると考えられる（ただし、１，２，３，４−テトラクロルベンゼン、１，２，４，５−テトラクロルベンゼンが主に生成される）。従って、下記の反応式に示す分解経路を経てＨＣＢが分解されることが示唆された。更に、分解されたＨＣＢ量に対して、中間生成物の蓄積が認められないことから、ＨＣＢがほぼ完全に分解されたことが示唆された。
【００５０】
【化２】
2006247655.tif 000004
【００５１】
（試験例２）
水田土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約５ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を３回（２０００年１１月１４日、１２月２日、２００１年１月１８日）、溶液（ｉｉｉ）を用いて希釈（希釈率１％）（２００１年３月５日）を行った後、上述した評価試験を行い（２００１年３月１６日）、残存したＨＣＢの割合（％）及び生成した１，２，３，４−テトラクロルベンゼンと１，２，４，５−テトラクロルベンゼン量（ｐｐｍ）を求めた。この結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2006247655.tif 000005
【００５３】
（試験例３）
湛水条件下ＰＣＢを２０ｐｐｍ加え、２年間静置した畑土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約５ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を３回（２０００年１１月１４日、１２月２日、２００１年１月１８日）、次いで、溶液（ｉｖ）を用いて希釈（希釈率５％）（２００１年３月５日）を行った後、上述した評価試験を行い（２００１年３月１６日）、残存したＨＣＢの割合（％）及び生成した１，２，３，４−テトラクロルベンゼンと１，２，４，５−テトラクロルベンゼン量（ｐｐｍ）を求めた。この結果を表１に示す。
【００５４】
（試験例４）
湛水条件下ＰＣＢを２０ｐｐｍ加え、２年間静置した畑土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約５ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を３回（２０００年１１月１４日、１２月２日、２００１年１月１８日）、次いで、溶液（ｖ）を用いて希釈（希釈率５％）（２００１年３月５日）を行った後、上述した評価試験を行い（２００１年３月１６日）、残存したＨＣＢの割合（％）及び生成した１，２，３，４−テトラクロルベンゼンと１，２，４，５−テトラクロルベンゼン量（ｐｐｍ）を求めた。この結果を表１に示す。
【００５５】
（試験例５）
湛水条件下ＰＣＢを２０ｐｐｍ加え、２年間静置した畑土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約５ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を３回（２０００年１１月１４日、１２月２日、２００１年１月１８日）、次いで、溶液（ｉｉｉ）を用いて希釈（希釈率５％）（２００１年３月５日）を行った後、上述した評価試験を行い（２００１年３月１６日）、残存したＨＣＢの割合（％）及び生成した１，２，３，４−テトラクロルベンゼンと１，２，４，５−テトラクロルベンゼン量（ｐｐｍ）を求めた。この結果を表１に示す。
【００５６】
（試験例６）
湛水条件下ＰＣＢを２０ｐｐｍ加え、２年間静置した畑土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約５ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて希釈（希釈率１０％）を３回（２０００年１１月１４日、１２月２日、２００１年１月１８日）、次いで、溶液（ｉｖ）を用いて希釈（希釈率５％）（２００１年３月５日）を行った後、上述した評価試験を行い（２００１年３月１６日）、残存したＨＣＢの割合（％）及び生成した１，２，３，４−テトラクロルベンゼンと１，２，４，５−テトラクロルベンゼン量（ｐｐｍ）を求めた。この結果を表１に示す。
【００５７】
（試験例７）
水田土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように、ブロモエタンスルホン酸（終濃度として３ｍＭ）を添加した溶液（ｉｉ）を加えた。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約３ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて２回希釈（希釈率１０％）を行い（２０００年１１月１４日、１２月２日）、集積を完了した（２００１年１月１８日）。
このようにして得られた集積物（液）を用いて、上述した評価試験を行い、残存したＨＣＢの割合（％）及び生成した１，２，３，４−テトラクロルベンゼンと１，２，４，５−テトラクロルベンゼン量（ｐｐｍ）を求めた。この結果を表１に示す。
【００５８】
（試験例８）
２０ｐｐｍのＰＣＢを投与し４０ヶ月間湛水条件下においた畑土壌（九州沖縄農業研究センター内）を採取後（２０００年１０月２０日）、土壌の容量が全体の２０％容量比となるように溶液（ｉｉ）に加えて、８０℃で２０分間加熱処理を施した。これを嫌気条件下、３７℃で縦に攪拌させながら約３ヶ月間集積物の集積を行った。この間、溶液（ｉｉ）を用いて２回希釈（希釈率１０％）を行い（２０００年１１月１４日、１２月２日）、集積を完了した（２００１年１月１８日）。
このようにして得られた集積物（液）を用いて、上述した評価試験を行い、残存したＨＣＢの割合（％）及び生成した１，２，３，４−テトラクロルベンゼンと１，２，４，５−テトラクロルベンゼン量（ｐｐｍ）を求めた。この結果を表１に示す。
【００５９】
表１の結果から明らかなように、試験例２〜８のいずれにおいても、大部分のＨＣＢが分解されたことが判明した。特に、試験例２、３、６、８では、残存したＨＣＢの割合（％）が５％未満と非常に低く、ＨＣＢの分解効率が非常に優れていることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＨＰＬＣによる比較例のＨＣＢ分解パターンを示す。
【図２】ＨＰＬＣによる試験例１のＨＣＢ分解パターンを示す。
【図１】
2006247655.tif 000006
【図２】
2006247655.tif 000007