(57)【要約】      （修正有）【課題】  グルコースなどの糖類検出能に優れる蛍光モノマー化合物、蛍光センサー物質および該蛍光センサー物質を使用した糖類測定用センサーを提供する。【解決手段】  糖類と結合して蛍光を発する疎水性部位にただ１つの親水性基を導入した蛍光モノマー化合物及び該蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を有する重合性単量体とを共重合することにより得られた蛍光センサー物質である。親水性基の導入により、蛍光センサー物質の糖類結合能が向上する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式１に示す蛍光モノマー化合物。
【化１】
2006036664.tif 000010
（化学式１において、
Ｒ１およびＲ２は同一または異なっていてもよく、置換されていてもよいアルキル基であり、
Ｘは−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＨ２ＮＺ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＮＺＺ’−、−ＮＺＣＯ−、−ＣＯＮＺ−、−ＳＯ２ＮＺ−、−ＮＺＳＯ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＺＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＺ−および−ＣＯ−からなる群より選択される置換基であり、ＺおよびＺ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基を示し、
Ｒ３は、水素または置換されていてもよいアルキル基を示し、
Ｙは置換されていてもよい２価の有機残基であり、
ＱおよびＱ’は同一または異なっていてもよく、水素、水酸基、置換されていてもよいアルキル基、アシル基、オキシアルキル基、ハロゲン、カルボキシル基、カルボキシエステル、カルボキシアミド、シアノ基、ニトロ基、アミノ基およびアミノアルキル基からなる群より選択される置換基であって、ＱとＱ’とは一緒になって縮合環を形成していてもよい。）
【請求項２】
該Ｙが、化学式２または化学式３に示す構造を含む請求項１に記載の蛍光モノマー化合物。
【化２】
2006036664.tif 000011
（化学式２および化学式３において、ｎは２〜５であり、ｐは１〜５であり、ｍは１〜２００である。）
【請求項３】
該Ｙが、原子数１〜５００であり、置換基を有していてもよい直鎖の２価の有機残基である請求項１または２に記載の蛍光モノマー化合物。
【請求項４】
少なくとも以下に記載の（Ｉ）および（ＩＩ）の２種の化合物を共重合してなる糖類測定用の蛍光センサー物質。
（Ｉ）：請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光モノマー化合物
（ＩＩ）：（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体
【請求項５】
該（Ｉ）と該（ＩＩ）との共重合体組成モル比（（Ｉ）：（ＩＩ））が、１：１０〜１：４，０００である請求項４に記載の蛍光センサー物質。
【請求項６】
該（ＩＩ）が、化学式４に示す化合物である請求項４または５に記載の蛍光センサー物質。
【化３】
2006036664.tif 000012
（化学式４において、
Ｒ４は、水素またはメチル基であり、
ＵおよびＵ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基である。）
【請求項７】
化学式５に示す蛍光センサー物質。
【化４】
2006036664.tif 000013
（化学式５において、
Ｒ１およびＲ２は同一または異なっていてもよく、置換されていてもよいアルキル基であり、
Ｘは−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＨ２ＮＺ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＮＺＺ’−、−ＮＺＣＯ−、−ＣＯＮＺ−、−ＳＯ２ＮＺ−、−ＮＺＳＯ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＺＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＺ−および−ＣＯ−からなる群より選択される置換基であり、ＺおよびＺ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基を示し、
Ｒ３は、水素または置換されていてもよいアルキル基を示し、
Ｙは置換されていてもよい２価の有機残基であり、
ＱおよびＱ’は同一または異なっていてもよく、水素、水酸基、置換されていてもよいアルキル基、アシル基、オキシアルキル基、ハロゲン、カルボキシル基、エステル基、アミド基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基およびアミノアルキル基からなる群より選択される置換基であって、ＱとＱ’とは一緒になって縮合環を形成していてもよく、
Ｒ４は、水素またはメチル基であり、
ＵおよびＵ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基である。）
【請求項８】
該Ｙが、化学式２または化学式３に示す構造を含む請求項７に記載の蛍光センサー物質。
【化５】
2006036664.tif 000014
（化学式２および化学式３において、ｎは２〜５であり、ｐは１〜５であり、ｍは１〜２００である。）
【請求項９】
該Ｙが、原子数１〜５００である請求項７または８に記載の蛍光センサー物質。
【請求項１０】
該ｉに対する該ｊのモル比（ｉ：ｊ）が、１：１０〜１：４，０００である請求項７に記載の蛍光センサー物質。
【請求項１１】
該共重合体の少なくとも一部が分子間架橋を形成し、三次元架橋構造を示す請求項４〜１０のいずれかに記載の蛍光センサー物質。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれかに記載の蛍光センサー物質が、基材に固定化されてなる検出層。
【請求項１３】
請求項１２に記載の検出層を有する体内埋め込み用の糖類測定用センサー。
【請求項１４】
請求項１２に記載の検出層と蛍光検出装置とを含む体内埋め込み用の糖類測定用センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類の検出能に優れる蛍光モノマー化合物、蛍光センサー物質、その製造方法およびそれを用いた体内埋め込み用の糖類測定用センサー等に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内埋め込み型センサーは、様々な疾患においてその病状の経過観察や治療効果のモニタなどに有用であり、近年、盛んに研究されている分野の一つである。特に糖尿病治療においては、連続血糖測定による血糖コントロールが、病状の進行遅延や合併症の罹病の低減に貢献すると言われている。
【０００３】
現状の糖尿病患者の多くは、血糖の自己管理のために、指等の穿刺によって血液試料を採取し、血糖計に供給して測定値を読み取ることを行っている。しかし、このような方法は患者への苦痛や簡便性のうえで問題があり、一日に数回の測定が限界で、血糖値変化の動向を頻繁に測定して把握することが難しいのが現状である。このような理由から、埋め込み型連続血糖計の有用性は高いと考えられる。
【０００４】
一方、生体内のグルコース濃度を継続的に測定するための技術開発は古くからなされており、たとえば、可逆的にグルコースと反応して蛍光を発する物質を用いて蛍光量の変化でグルコース濃度を測定するものがある。このような蛍光物質として、発蛍光性原子団と、少なくとも１つのフェニルボロン酸部位と、少なくとも１つのアミン性窒素とを有し、アミン性窒素がフェニルボロン酸部位の近傍に配置されて該フェニルボロン酸と分子内結合する分子構造を有する発蛍光性化合物が開示されている（特許文献１）。発蛍光性原子団としては、ナフチル基やアンスリル基などがある。該化合物は、そのボロン酸部位を介して糖分子と安定なコンプレックスを形成すると蛍光を発する、というものである。
【０００５】
また、水性環境中での検体の濃度検出のための指示高分子として、親水性モノマーと、アントラセンホウ酸エステル誘導体などのエシキマー形成多環芳香族炭化水素とを有する化合物も開示されている（特許文献２）。該エシキマー形成多環芳香族炭化水素は水への溶解性が充分でないためメタクリルアミドなどの親水性基を導入し、水性環境中でも検体濃度を検出できるようにしたものである。
【０００６】
また、蛍光センサーとして、プラスチックフィルムなどの固相に直接蛍光物質を固定化する方法も開示されている（特許文献３）。特許文献３では発光性、発蛍光性または発色性の原子団にフェニルボロン酸をただ一つ付加したものを用いている。
【特許文献１】特開平８−５３４６７号公報
【特許文献２】特表２００４−５０６０６９号公報
【特許文献３】米国特許第６，３１９，５４０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１記載の化合物は、発蛍光性原子団としてナフチル基やアンスリル基などの嵩高くかつ疎水性の部位を有するため、水溶性の糖類との結合が容易でなく、検出感度の向上が望まれる。また、特許文献２記載の化合物は、親水性基の導入によって水溶性の糖類との結合を容易にしているが、２つの親水性基を導入しているため糖類と結合して蛍光を発する該エシキマー形成多環芳香族炭化水素が自由度を失い、糖類との結合を充分に行えない。
【０００８】
一方、蛍光センサーとして使用するために蛍光物質を基材に固定すると、蛍光物質による被検出物質の検出能が固定前よりも低下する場合がある。
【０００９】
このような状況下、本発明は、グルコースなどの糖類検出能に優れる蛍光モノマー化合物、蛍光センサー物質および該蛍光センサー物質を使用した糖類測定用センサーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、糖類測定用蛍光モノマー化合物における糖類の結合状態を詳細に検討した結果、糖類と結合して蛍光を発する疎水性部位にポリアルキレン等からなるただ１つの親水性基を導入すると、該疎水性部位の自由度を確保しつつ糖類との結合を促進できること、更に該蛍光モノマー化合物を（メタ）アクリルアミドと共重合させると、これを基材に固定した場合であっても血液や体液などの水溶液中でも検出感度を下げることなく、糖類の測定ができることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による、糖類測定用の蛍光モノマー化合物、蛍光センサー物質、および検出層は糖類検出能に優れる。また、体液中の糖類検出能に優れるため、長期間の埋め込みに耐える蛍光センサーとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の第一は、化学式１に示す蛍光モノマー化合物である。
【００１３】
【化１】
2006036664.tif 000002
化学式１において、Ｒ１およびＲ２は同一または異なっていてもよく、置換されていてもよいアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがある。Ｒ１およびＲ２としては、メチル基、エチル基が好ましい。
【００１４】
また、Ｘは−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＨ２ＮＺ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＮＺＺ’−、−ＮＺＣＯ−、−ＣＯＮＺ−、−ＳＯ２ＮＺ−、−ＮＺＳＯ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＺＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＺ−および−ＣＯ−からなる群より選択される置換基であり、ＺおよびＺ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基である。ただし、Ｚが水素の場合にのみ−ＮＺＺ’−は−ＮＺ−となる。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがある。Ｘとしては−ＮＺＣＯ−および−ＣＯＮＺ−が好ましい。
【００１５】
また、Ｒ３は水素または置換されていてもよいアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがある。Ｒ３としては、水素またはメチル基が好ましい。
【００１６】
ＱおよびＱ’は、水素、水酸基、置換されていてもよいアルキル基、アシル基、オキシアルキル基、ハロゲン、カルボキシル基、カルボキシエステル、カルボキシアミド、シアノ基、ニトロ基、アミノ基およびアミノアルキル基からなる群より選択される置換基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがあり；アシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基またはイソブチリル基などがあり；オキシアルキル基としては、メトキシ基、エトキシ基などがあり；ハロゲンとしては、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＩまたはＯＩ−などがあり；アミノアルキル基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基などがある。ＱおよびＱ’は同一または異なっていてもよく、一緒になって縮合環を形成していてもよい。ＱおよびＱ’として、ニトロ基、シアノ基またはアシル基などを導入すると、蛍光の赤色変移または励起波長ピークと蛍光波長ピークとの間隔拡大に寄与する場合がある。本発明では、ＱおよびＱ’として水素、アセチル基またはニトロ基が好ましい。
【００１７】
化学式１において、Ｙは置換されていてもよい２価の有機残基である。また、Ｙは該有機残基中に、下記化学式２または化学式３に示す構造を含むことが好ましく、更に、他の置換基や２価の有機残基を有していてもよい。化学式２および化学式３において、ｎは２〜５が好ましく、より好ましくは２〜３であり、ｐは１〜５が好ましく、より好ましくは２〜３であり、ｍは１〜２００が好ましく、より好ましくは２０〜１００である。
【００１８】
該Ｙは原子数１〜５００のものが好ましく、より好ましくは原子数１〜１２である。
化学式２または化学式３で示す２価の有機残基は、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールなどのアルキレングリコールまたはビニルアルコールなどを重合することで、調製することができる。
【００１９】
【化２】
2006036664.tif 000003
本発明の蛍光モノマー化合物は、アントラセン骨格に上記Ｘを介してＹを導入する点に特徴があり、これによって蛍光モノマー化合物の物理的性質や安定性、検出感度、検出精度、被測定物質である糖類の選択性などを向上させることができる。具体的には、Ｙとして上記化学式２や化学式３で示す親水性基を導入すると、血液や体液などの水溶液中で該蛍光モノマー化合物に含まれるフェニルボロン酸部位の自由度が向上し、糖類と迅速に相互作用することができ、糖類への親和性を高めることで検出感度を向上させることができる。
【００２０】
なお、上記のように、本発明の蛍光モノマー化合物はアントラセン骨格を含むフェニルボロン酸誘導体であり、アントラセン骨格は発蛍光性原子団として作用することが知られている。フェニルボロン酸部位と糖とが安定な複合体を形成すると、発蛍光性原子団の介在によって蛍光を発するが、本発明の蛍光モノマー化合物は２つのフェニルボロン酸を有するため、特に糖類の検出感度に優れている。なお、化学式１においてＹに結合する−ＮＲ３ＣＯＣＨＣＨ２は、該蛍光モノマー化合物が血液などの体液に溶解しないように基材その他と結合させるために導入したものである。
【００２１】
本発明の第二は、少なくとも以下に記載の（Ｉ）および（ＩＩ）の２種の化合物を共重合してなる糖類測定用の蛍光センサー物質である。
（Ｉ）：上記化学式１で示す蛍光モノマー化合物
（ＩＩ）：（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体
上記蛍光モノマー化合物を用いて血液に含まれる糖類を検出するには、該蛍光モノマー化合物が、血液または体液などの水溶液に溶解したり流出したりしないように固定される必要がある。しかしながら、単に蛍光モノマー化合物を基材に固定すると、該蛍光モノマー化合物と糖との接触および結合が阻害され検出感度が低下する。本発明では、該蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体を共重合させ、該蛍光モノマー化合物に親水性のポリ（メタ）アクリルアミド鎖を導入して固定化することで蛍光モノマー化合物を不溶化し、かつ該蛍光モノマー化合物と糖との親和性を確保する。
【００２２】
（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体としては、得られた重合体がその構造中にアクリロイル基とアミドとを有すればよく、（メタ）アクリルアミドやそれらの誘導体が含まれる。例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−ｔｒｉｓ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチルアクリルアミド、Ｎ−（ｎ−ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−アクリルオイルリジンやＮ−アクリルオイルヘキサメチレンジアミンなどの（メタ）アクリルオイルクロライドとアミノ酸または活性アミノ基をもつ化合物との縮合体、および化学式４に示す化合物等がある。
【００２３】
【化３】
2006036664.tif 000004
化学式４において、Ｒ４は、水素またはメチル基であり、ＵおよびＵ’は同一または異なっていてもよく、水素または置換されていてもよいアルキル基である。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基などがある。
【００２４】
（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体からなる重合体は親水性が高いため、蛍光モノマー化合物と結合すると、該蛍光モノマー化合物に存在するフェニルボロン酸を含む疎水性の強い発蛍光性原子団が親水性の高い構造体中に取り込まれる。これによって血液や体液に含まれる糖類を測定する場合であっても、水溶性の糖類が容易に該発蛍光性原子団に接近および結合することができる。
【００２５】
蛍光センサー物質を構成する、該蛍光モノマー化合物（Ｉ）と該アクリルアミド残基を含む重合性単量体（ＩＩ）との共重合体組成モル比（（Ｉ）：（ＩＩ））は１：１０〜１：４，０００であることが好ましく、より好ましくは１：５０〜１：４，０００であり、特に好ましくは１：１００〜１：２，０００である。モル比１：１０よりも蛍光モノマー化合物の割合が大きくなると、該蛍光モノマー化合物の疎水性部位の嵩高さのため自由度が失われ、糖類との相互作用が低下するおそれがある。一方、モル比１：４，０００よりも蛍光モノマー化合物の割合が小さければ、蛍光強度の絶対量を確保できない場合がある。
【００２６】
上記二成分からなる蛍光センサー物質の、重量平均分子量は、ＧＰＣによるポリエチレンオキサイド換算で、５０，０００〜５００，０００が好ましく、より好ましくは１００，０００〜３００，０００である。
【００２７】
一方、本発明の蛍光センサー物質は、上記蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体とに加えて他の成分を併用してもよい。このような成分としては、架橋性単量体、他の架橋性成分、水中で陽イオンとなり得るカチオン性モノマー、水中で陰イオンとなり得るアニオン性モノマー、およびイオンを持たないノニオン系モノマーがある。
【００２８】
架橋性単量体としては、重合性二重結合によって蛍光センサー物質中に三次元架橋構造を導入し得るものを広く含み、使用する蛍光センサー物質の置換基によっても異なるが、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビス（メタ）アクリルアミド、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、グリセリンアクリレートメタクリレート、エチレンオキサイド変性トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレートなどのジビニル化合物がある。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。
【００２９】
他の架橋性成分としては、２個以上の官能基を有する化合物を広く含み、使用する蛍光センサー物質の置換基によっても異なるが、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルホスフェート、トリアリルアミン、ポリ（メタ）アリロキシアルカン、（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエ−テル、グリセロールジグリシジルエーテル、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ペンタエリスリトール、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアヌル酸トリアリル、トリメチロールプロパンジ（メタ）アリルエーテル、テトラアリロキシエタンまたはグリセロールプロポキシトリアクリレートなども挙げることが出来る。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。
【００３０】
水中で陽イオンとなり得るカチオン性モノマーとしては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレートまたは４−ビニルピリジンなどを挙げることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。
【００３１】
水中で陰イオンとなり得るアニオン性モノマーとしては、（メタ）アクリル酸、ビニルプロピオン酸または４−ビニルベンゼンスルホン酸などを挙げることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。
【００３２】
イオンを持たないノニオン系モノマーとしては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、３−メトキシプロピル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−メトキシエチルアクリレートまたは１，４−シクロヘキサンジメタノールモノアクリレートなどを挙げることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。
【００３３】
またこれらの架橋性単量体、他の架橋性成分、カチオン性モノマー、アニオン性モノマーおよびノニオン系モノマーは２種以上併用してもよい。これらの他の成分の配合量は、蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との合計量の０．１〜１０モル％が好ましく、より好ましくは２〜７モル％である。これら他の成分の併用によって、三次元架橋構造を形成させることができ、また、親水性の調節、反応起点の導入などを行うことができる。なお、三次元架橋構造については後述する。
【００３４】
本発明の蛍光センサー物質として、化学式５に示される構造を有していることが好ましい。
【００３５】
【化４】
2006036664.tif 000005
化学式５において、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｚ、Ｚ’、Ｒ３、Ｙ、ＱおよびＱ’は化学式１に示した蛍光モノマー化合物と同様である。Ｕ、Ｕ’およびＲ４は化学式４に示した（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体と同様である。
【００３６】
また、ｉとｊとのモル比（ｉ：ｊ）は前記（Ｉ）：（ＩＩ）のモル比と同様に、１：１０〜１：４，０００が好ましく、より好ましくは１：５０〜１：４，０００であり、特に好ましくは１：１００〜１：２，０００である。
【００３７】
本発明で使用する蛍光センサー物質は、該共重合体の少なくとも一部が分子間架橋を形成し、三次元架橋構造を示していてもよい。ポリ（メタ）アクリルアミド鎖に三次元架橋を形成させると上記蛍光モノマー化合物が基材に固定され、水溶液中でも蛍光モノマー化合物を溶出させることなく糖類の検出が容易にできる。なお、本発明の蛍光モノマー化合物は上記したように糖類と結合して蛍光を発する疎水性部位を有するが、該疎水性部位はＹで示す二価の有機残基を介してポリ（メタ）アクリルアミド鎖に結合されるために水溶液中で糖類と結合できる自由度が確保されている。従って、三次元架橋構造を形成しても糖類の検出感度を低下させることがない。
【００３８】
本発明の蛍光モノマー化合物や蛍光センサー物質の製造方法および、三次元架橋構造の形成方法には制限がないが、以下の方法で製造することができる。
【００３９】
（１）蛍光モノマー化合物の製造
化学式１で示される蛍光モノマー化合物として、Ｒ１およびＲ２がメチル基、ＱおよびＱ’が水素、Ｘが−ＣＯＮＨ、Ｙが−Ｃ６Ｈ１２−、Ｒ３が水素である化合物（９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸−１−（６−アクリルアミド−ｎ−ヘキシル）アミド）の製造方法の１例として、図１に示す合成スキームに従って説明する。
【００４０】
原料として、メチル−９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボン酸を使用し、これにＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を作用させてメチル−９，１０−ビス（ブロモメチル）アントラセン−２−カルボン酸とし、次いで、メチルアミンを添加するとブロモメチル基がアミノメチル基となる。得られたメチル−９，１０−ビス（アミノメチル）アントラセン−２−カルボン酸に２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボナリンを作用させると、メチル−９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸が得られる。これにアルカリを作用させて脱エステル化すると、９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸が得られる。このカルボン酸に１−アクリルアミド−６−アミノヘキサンを結合させると、上記目的物を得ることができる。
【００４１】
より詳細には、メチル−９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボン酸濃度１〜２０ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜１５ｇ／Ｌの溶液を調製し、これにＮＢＳをメチル−９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボン酸に対するモル比で２〜２．５倍、より好ましくは２．１〜２．２倍となるように配合する。なお、上記目的化合物の合成反応においては対象化合物に好適な溶媒を使用することができ、このような溶媒としてはクロロホルム、四塩化炭素、ｎ−ヘキサン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドがある。これらは２種以上を併用して使用してもよい。例えば、メチル−９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボン酸を溶解するには、クロロホルム、四塩化炭素、アセトニトリルなどを好適に使用することができる。これらは２種以上を併用して混合溶液として使用してもよい。その際の配合割合も任意に設定できる。反応温度は６０〜１２０℃、より好ましくは８０〜１００℃であり、反応時間は０．５〜６時間、より好ましくは２〜４時間である。
【００４２】
次いで、溶媒で濃度１〜３０ｇ／Ｌ、より好ましくは２〜１０ｇ／Ｌに溶解したメチル−９，１０−ビス（ブロモメチル）アントラセン−２−カルボン酸１モルに対し、２〜３０モル倍、より好ましくは６〜２０モル倍のメチルアミンを混合し、反応させる。反応温度は０〜６０℃、より好ましくは２０〜３０℃で、反応時間は１〜１０時間、より好ましくは２〜５時間である。
【００４３】
得られたメチル−９，１０−ビス（アミノメチル）アントラセン−２−カルボン酸と２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボナリンとの反応は、メチル−９，１０−ビス（アミノメチル）アントラセン−２−カルボン酸に対して、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボナリンがモル比で２〜８倍、より好ましくは３〜５倍となるように混合する。なお、メチル−９，１０−ビス（アミノメチル）アントラセン−２−カルボン酸の濃度は１０〜２００ｇ／Ｌ、より好ましくは５０〜１００ｇ／Ｌであることが好ましい。反応温度は０〜８０℃、より好ましくは２０〜４０℃、反応時間は１〜４８時間、より好ましくは２〜２４時間である。
【００４４】
次いで、メチル−９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸をアルカリで加水分解する。使用するアルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどいずれのアルカリ剤を使用してもよい。反応は、温度は０〜１００℃、より好ましくは２０〜６０℃、反応時間は１〜２４時間、より好ましくは２〜６時間である。
【００４５】
次いで、９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸１モルに対して、１−アクリルアミド−６−アミノヘキサンを１．０５〜３．０モル、より好ましくは１．２〜１．４モル、および縮合剤を１．０〜３．０モル、より好ましくは１．１〜２．０モルと混合する。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド等を用いることができる。反応温度は０〜６０℃、より好ましくは２０〜３０℃、反応時間は１〜２４時間、より好ましくは２〜１５時間である。
【００４６】
なお、原料化合物として、アントラセン骨格に化学式１で示すＱ、Ｑ’で示す置換基として上記化合物と異なる原料化合物を使用すると、溶媒、添加剤、反応温度、反応時間および分離方法等を適宜選択することでこれらに相当する化合物を製造することができる。また、カルボン酸メチルに代えてスルホニル基をアントラセン骨格に有する化合物を使用すればＸとして−ＳＯ２ＮＨ−を導入することができる。また、１−アクリルアミド−６−アミノヘキサンに代えてアミノ−（Ｃ２Ｈ６Ｏ）ｍ−アクリルアミドを作用させると、Ｙとして−（Ｃ２Ｈ６Ｏ）ｍ−を導入することができる。
【００４７】
なお、９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸は、特開平８−５３４６７号公報の実施例３において、アンスリルジアミンに代えてアンスリルジアミン−２−カルボン酸を使用することで調製することもできる。
【００４８】
（２）蛍光センサー物質の製造
化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合は、溶媒の下で、重合促進剤または重合開始剤を用いることができる。溶媒としては、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、ジエチレングリコールなどのいずれか１種以上が好ましい。該溶媒には水を含めることができ、例えばジメチルスルホキシドやジメチルホルムアミドは水との混合溶液とすると重合の進行を促進することができる。水を混合する場合には、ジメチルスルホキシドおよび／またはジメチルホルムアミドの濃度が４０〜８０（ｖ／ｖ）％のものを用いることが好ましく、より好ましくは５０〜７０（ｖ／ｖ）％である。この範囲で重合の進行を促進し、目的の蛍光センサー物質を高収率で得ることができる。なお、溶媒濃度が４０（ｖ／ｖ）％よりも低いと、蛍光モノマー化合物が重合開始前に析出してくる場合がある。
【００４９】
化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合に際して、更に他の成分を配合することもできる。他の成分を配合する場合、その配合量は、蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との合計量の０．１〜１０モル％が好ましく、より好ましくは２〜７モル％である。他の成分を配合する場合、重合時に、重合開始剤や重合促進剤と同時に添加しておくことが好ましい。
【００５０】
重合開始剤としては、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムまたは過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；過酸化水素；アゾビス−２−メチルプロピオンアミジン塩酸塩またはアゾイソブチロニトリルなどのアゾ化合物；ベンゾイルパーオキシド、ラウロイルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシドまたは酸化ベンゾイルなどのパーオキシド等を挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。この際、重合促進剤として亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、モール塩、ピロ重亜硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドナトリウムスルホキシレートまたはアスコルビン酸などの還元剤；エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、グリシンまたはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどのアミン化合物；などの１種または２種以上を併用することもできる。重合温度は１５〜７５℃が好ましく、より好ましくは２０〜６０℃、重合時間は１〜２０時間、より好ましくは２〜８時間である。なお、重合開始剤として過硫酸塩と重合促進剤としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンとを併用する場合には、室温で重合を行うことができる点で、特に好ましい。
【００５１】
一方、上記化学式５で示す化合物は、化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合によらず製造することができる。化学式１で示す蛍光モノマー化合物は複数の工程で合成されるため、化合物１で示す蛍光モノマー化合物を原料とすることなくその中間産物に他の化合物を作用させても、最終的に化学式５で示す蛍光センサー物質を製造することができる。例えば、図１のスキームで示した９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体の重合物のアミノ化物とをカップリング試薬の存在下で作用させても、化学式５で示す蛍光センサー物質を製造することができる。また別の例として、予め（メタ）アクリルアミド残基を有する重合性単量体を重合した後、重合開始剤や重合促進剤の存在下で上記蛍光モノマー化合物と共重合させても化学式５で示す蛍光センサー物質を製造することができる。
【００５２】
（３）三次元架橋構造の形成
本発明の蛍光センサー物質は、三次元架橋を有していてもよいのであるが、三次元架橋の導入方法も限定されない。本発明の蛍光センサー物質に架橋成分を作用させて、蛍光センサー物質と蛍光センサー物質との少なくとも一部に分子間架橋を形成させる方法がある。
【００５３】
また、前記したように、化学式１で示す蛍光モノマー化合物と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体との共重合に際して、反応溶媒に架橋成分を添加しても三次元架橋を形成させることができる。
【００５４】
一方、蛍光センサー物質を、体内埋め込み用の糖類測定用センサーとして使用する場合には蛍光センサー物質の流出を防止するため、基材に固定されることが一般的であるが、このような基材として、（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体またはその重合体を使用し、化学式１で示す蛍光モノマー化合物に必要に応じて架橋成分を使用し、これらを重合させ、基材への固定と三次元架橋とを同時に行うこともできる。
【００５５】
このような架橋成分としては、前記蛍光センサー物質の配合し得る他の成分の項で記載した架橋性単量体、他の架橋性成分、カチオン性モノマー、アニオン性モノマーおよびノニオン系モノマーを好ましく使用することができ、架橋性単量体および他の架橋性成分をより好ましく用いることができる。本発明では、これらの２種以上を併用してもよい。
【００５６】
本発明の第三は、上記蛍光センサー物質が基材に固定化されてなる検出層である。また、本発明の第四は、上記検出層を有する体内埋め込み用の糖類測定用センサーである。
【００５７】
体内埋め込み用の糖類測定用センサーは、蛍光センサー物質が流出しないように基材などの固定材料に、共有結合や疎水結合によって、または電気的、その他の相互作用によって固定されていることが好ましい。本発明の蛍光センサー物質を使用した糖類検出方法の概略を、図２を用いて説明する。
【００５８】
該センサーは、検出層１０を含み、検出層１０には蛍光センサー物質３０が基材４０を介して固定されている。蛍光センサー物質３０は、少なくとも黒丸で示す蛍光モノマー化合物３３と白丸で示す（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体３５を含む共重合体であり、水溶液中の糖類７０が蛍光モノマー化合物３３と相互作用すると蛍光を発する。検出層１０は、光学分離層２０を有していてもよい。検出層１０に光源５０から波長３５０〜４２０ｎｍの光を当て、反射された蛍光量または波長の変化を検出器６０によって検出すると、蛍光量に依存した糖類の濃度を知ることができる。本発明の検出層に使用する基材としては、例えばガラス、金属などの無機材料、プラスチックフィルムなどの有機材料を広く使用することができる。糖類測定用センサーに用いる検出層の基材としては、透明性に優れ、体液中でも溶解や溶出しない材料であることが好ましく、本発明では、ガラスやプラスチックフィルムの中でもポリ（メタ）アクリルアミド膜、またはポリ（メタ）アクリレート膜などを好ましく使用することができる。なお、上述したようにポリ（メタ）アクリルアミド膜を基材として使用すると、蛍光センサー物質の基材への固定と三次元架橋の形成とが同時に行える点で有利である。なお、架橋性重合体を使用した場合の架橋構造は、図２に示すように、（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５との間、蛍光モノマー物質部位３３と（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５との間、または（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体部位３５と基材４０との間に形成される。
【００５９】
蛍光センサー物質を無機材料表面に固定する場合、無機材料と蛍光センサー物質とを架橋剤などを使用して化学的に結合させることもできる。このような架橋剤としては、化学式６に示すシランカップリング剤がある。
【００６０】
【化５】
2006036664.tif 000006
化学式６において、Ｒ５Ｏは、アルコキシ基を示し、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基など炭素数１〜５のアルコキシ基であり、好ましくはメトキシ基、エトキシ基である。無機材料は、該アルコキシ基と化学結合をすることができる。Ｘは、ビニル基、エポキシ基、アミノ基、メルカプト基、アクリル基、メタクリル基、（メタ）アクリロイル基、またはこれらの誘導体であって、有機材料と化学結することができる官能基である。本発明で好適に使用できるシランカップリング剤としては、ビニルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、および３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシランなどがある。
【００６１】
上記シランカップリング剤のうち、Ｘがビニル基、アクリル基、メタクリル基、（メタ）アクリロイル基などの重合性二重結合を有する置換基である場合には、これをガラス、金属ななどの無機材料の表面に予め塗布しておけば、これら表面でフェニルボロン酸残基とアクリルアミド残基とを含む蛍光モノマー化合物と、（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体とを共重合させつつ直接固定化することもできる。なお、シランカップリング剤で表面処理した無機材料表面に直接蛍光センサー物質を固定することもできる。
【００６２】
一方、プラスチックフィルムなどの有機材料に蛍光センサー物質を固定するには、プラスチックフィルムに反応活性基を有する置換基を導入し、蛍光センサー物質と結合させればよい。このような反応活性基の導入方法としては、例えば、特開平５−２４５１９８号公報に記載の、プラズマ、電子線、放射線などによるグリシジル（メタ）アクリレートのグラフト重合法などがある。
【００６３】
これらシランカップリング処理した無機材料や反応活性基を導入したプラスチックフィルムに蛍光センサー物質をより結合しやすくするには、蛍光センサー物質の合成時に予め反応活性置換基を有する単量体を共重合成分として使用してもよく、蛍光センサー物質合成後に反応活性基を導入してもよい。このような単量体としては、蛍光センサー物質の項で記載したものを使用することができる。このような反応活性基としては、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン化カルボキシル基、スルホニル基、チオール基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、またはエポキシ基等がある。なお、シランカップリング処理した無機材料や有機材料上の反応活性基と蛍光センサー物質との結合は、適当な溶媒、触媒、縮合剤の存在下、非存在下に行うことができる。
【００６４】
本発明の体内埋め込み用の糖類測定用センサーは、少なくとも図２に示すように、蛍光センサー物質を固定した検出層、光源および蛍光検出装置を有すればよく、これらが適当なハウジング内に配置されていればよい。
【００６５】
本発明の検出層が、体内埋め込み用の糖類測定用センサー内に用いられる場合、図２に示すように検出層１０に光学分離層２０が積層されることが好ましい。光学分離層２０がセンサーの外表面側に配置されると、検出層１０に含まれる蛍光センサー物質と体液成分であるラジカル、酸化性物質または還元性物質などとの接触を回避することができ、これらの体液内成分による蛍光センサー物質の劣化を防止することができる。また、光学分離層２０を積層すると、光源５０から発した励起光の反射や散乱による検出能の低下も防止することができる。更に、糖類以外の生体物質が光源からの励起光により励起した場合であっても、光学分離層２０の存在によって光源５０からの励起光外部由来の光を遮蔽し、または生体内の有色物質または蛍光物質の影響を排除することもできる。
【００６６】
このような作用を有する光学分離層２０は、光学分離層基材と不透明物質とからなる。光学分離層基材としては、架橋または化学修飾されていてもよい高分子が選択され、高分子として例えばデキストラン、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリウレタン、これらの混合物、またはこれらの共重合体などがある。また、光学分離層基材にはビタミンＥ、ポリフェノール類または金属キレート類などで修飾したり、またはこれらを担持したりしてもよい。また、不透明物質としては、カーボンブラック、フラーレン、カーボンナノチューブ、または酸化鉄などを用いることができる。
【００６７】
検出層１０と光学分離層２０とは共有結合、イオン結合または疎水結合などにより、化学結合によって積層させることができる。例えば、光学分離層がその基材としてデキストランを、不透明物質としてカーボンブラックを使用する場合には、溶媒にデキストランを溶解させた後にカーボンブラックを添加し、超音波処理により均一化し、これにアルカリ水溶液とエチレングリコールジグリジシルエーテルを更に添加する。ついで、検出層に噴霧器を用いて上記溶液を均一に噴霧し、加熱および乾燥して検出層に光学分離層を積層する。
【００６８】
図３に本発明の体内埋め込み用の糖類測定用センサーの外観の斜視図を示す。該体内埋め込み用の糖類測定用センサーは、その内部を液密に保つハウジング１１０、光学分離層または検出層のみを露出させる窓部１２０および体外のシステムと通信するためのアンテナ部１３０を有する。
【００６９】
図４に該体内埋め込み用の糖類測定用センサーの内部構造を示す。光学分離層２０または検出層１０が内部を液密に保つために窓部１２０を塞ぐように設けられ、励起光を発する光源５０、光源５０からの光を検出層１０まで導く光学導波路１７０、検出層１０からの蛍光を検出する蛍光検出装置６０、蛍光検出装置６０からの信号データを処理する集積回路１４０および内部の電源である電池１５０が搭載されている。なお、アンテナ部１３０には、アンテナ用コイル１６０が配設されている。なお、図３、図４は概念図であり、実施はこれに限定するものではない。必要に応じて各構成物の大きさ、形状、配置を自由に設定できる。
【００７０】
上述の、体内埋め込み用の糖類測定用センサーを用いることにより、糖尿病患者が血糖値を自己制御する際の、煩雑性または血糖値のタイムラグの発生を回避することができる。また、体内埋め込み用の糖類測定用センサーを用いることにより、糖尿病患者以外の人々が、健康管理のための血糖値測定を簡便に行うことも可能となる。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００７２】
（実施例１：９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸−１−（６−アクリルアミド−ｎ−ヘキシル）アミド（以下Ｆ−ＡＡｍと記載）の合成）
Ａ）メチル−９，１０−ビス（ブロモメチル）アントラセン−２−カルボン酸の合成
メチル−９，１０−ジメチルアントラセン−２−カルボン酸３６０ｍｇ、Ｎ−ブロモスクシンイミド５４０ｍｇ、過酸化ベンゾイル５ｍｇを、クロロホルム４ｍＬと四塩化炭素１０ｍＬの混合物に加え、２時間加熱還流を行った。溶媒を除去後、残渣をメタノールで抽出し、目的物４３０ｍｇを得た。
【００７３】
Ｂ）メチル−９，１０−ビス（アミノメチル）アントラセン−２−カルボン酸の合成
上記Ａ）で得たメチル−９，１０−ビス（ブロモメチル）アントラセン−２−カルボン酸４００ｍｇを６０ｍＬのクロロホルムに溶解し、２Ｍのメチルアミンのメタノール溶液８ｍＬを加え、室温で４時間攪拌した。溶媒除去後、メタノール／クロロホルムを溶離液とするシリカゲルカラムで精製し、目的物２３５ｍｇを得た。
【００７４】
Ｃ）９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸の合成
上記Ｂ）で得たメチル−９，１０−ビス（アミノメチル）アントラセン−２−カルボン酸２００ｍｇ、２−（２−ブロモメチルフェニル）−１，３−ジオキサボナリン７００ｍｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．３５ｍＬを３ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解し、室温で１６時間攪拌した。溶媒除去後、メタノール／クロロホルムを溶離液とするシリカゲルカラムで精製し、目的物のメチルエステル１９４ｍｇを得た。これを５ｍＬのメタノールに溶解し、４Ｎの水酸化ナトリウム１ｍＬを加えて室温で１０時間攪拌した。塩酸で中和し、ゲル濾過によって無機塩を除去し、目的物１８０ｍｇを得た。生成物の融点は１２１℃、ＤＭＳＯ−ｄ６中の１Ｈ−ＮＭＲデータは以下の通りであった。２．１５ｐｐｍ（ｄ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），４．１０ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ２−ｂｅｎｚｅｎｅ），４．４５ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ），７．５５−８．９０ｐｐｍ（ｍ，１５Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ）。
【００７５】
Ｄ）Ｆ−ＡＡｍの合成
上記Ｃ）で得た９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸７０ｍｇ、１−アクリルアミド−６−アミノヘキサン２２ｍｇ、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド５０ｍｇを５０μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含むジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、６０℃で１８時間攪拌した。反応混合物をクロロホルム５０ｍＬに溶解し、蒸留水で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾固し、目的物８５ｍｇを得た。
【００７６】
（実施例２：９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸−（末端アクリルアミド−ＰＥＧ３４００）アミドの合成）
実施例１−Ｃ）で得た９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸１０ｍｇ、アミノ−ＰＥＧ３４００−アクリルアミド（ネクター社製）５０ｍｇ、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド２２ｍｇを３ｍＬ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）に溶解し、６０℃で２４時間攪拌した。反応混合物をゲル濾過に供し蛍光高分子画分を採取し、目的物３６ｍｇを得た。
【００７７】
（実施例３〜９）
Ｆ−ＡＡｍ濃度が１０質量％であるジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）溶液、アクリルアミド（以下ＡＡｍと記載）濃度が３０質量％の８０質量％ＤＭＳＯ−水混合溶液、過硫酸ナトリウム（以下ＳＰＳ）濃度が３質量％の５０質量％ＤＭＳＯ−水混合溶液、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルメエチレンジアミン（以下ＴＥＭＥＤ）濃度が２質量％のＤＭＳＯ溶液を調製した。これら試薬溶液、ＤＭＳＯおよび水を用いて最終濃度が表１の組成となるよう反応溶液を調製した。調製した該反応溶液を室温で２時間重合させＦ−ＡＡｍとＡＡｍとの共重合体を得た。これらを実施例３〜９とする。得られた共重合体を、アセトンに析出・分取し、水への溶解、アセトンへの再析出を２回繰り返し精製した。精製後、得られた蛍光センサー物質を真空乾燥した。
【００７８】
【表１】
2006036664.tif 000007
（実施例１０：９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸−（末端アクリルアミド−ＰＥＧ３４００）アミド／ＡＡｍ共重合体の作製）
９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸−（末端アクリルアミド−ＰＥＧ３４００）アミドが１０質量％である水溶液、ＡＡｍが３０質量％である水溶液、ＳＰＳが３質量％である水混合溶液、およびＴＥＭＥＤが２質量％である水溶液を調製した。これら試薬溶液、ＤＭＳＯおよび水を用いて最終濃度で実施例２で合成した蛍光モノマー化合物が０．６質量％、ＡＡｍが４．５質量％、ＳＰＳが０．３質量％、ＴＥＭＥＤが０．０８質量％反応溶液を調製（仕込みモル比で１／４２７）し、室温で８時間重合させ共重合体を得た。精製は、アセトンに析出・分取し、水への溶解、アセトンへの再析出を１０回繰り返し精製した。精製後、得られた蛍光センサー物質を真空乾燥した。
【００７９】
（実施例１１）
実施例３〜１０で得た共重合体をメタノール／リン酸緩衝液＝１／２（ｖ／ｖ）溶液に０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう溶解し、分光光度計を用いて２６５ｎｍにおける吸光度を測定した。アクリルアミドホモポリマー（分子量１５０，０００）についても同様に吸光度を測定し、これをＢＬＡＮＫ値として各実施例の値から差し引いた。
予め作成した蛍光モノマー化合物の検量線から蛍光センサー物質中の蛍光モノマー化合物／ＡＡｍ組成比を求めた結果を表２に示す。
【００８０】
表２から、実施例３〜９では仕込みＦ−ＡＡｍ含量に比例して吸光度が増加しており、Ｆ−ＡＡｍが一定割合で各蛍光センサー物質成分として取り込まれていることがわかる。
【００８１】
【表２】
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（実施例１２）
実施例３〜１０で合成した共重合体中の蛍光モノマー化合物の濃度を揃えて蛍光強度のグルコース濃度に対する応答性を調べるため、共重合体をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し、２６５ｎｍにおける吸光度が０．０５となるように濃度調製した。グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬにおける各蛍光センサー物質溶液の相対蛍光強度（Ｅｘ＝４０５ｎｍ、Ｅｍ＝４４２ｎｍ）は図５に示すように、吸光度一定、すなわち共重合体溶液中の蛍光モノマー化合物濃度一定の条件下において、実施例３（Ｆ−ＡＡｍ／ＡＡｍ＝１／１４）の蛍光センサー物質の相対蛍光比強度は、同じＦ−ＡＡｍ／ＡＡｍ共重合体系蛍光センサー物質のなかで低かった。一方、蛍光モノマー化合物の「Ｙ」部分を長くした実施例１０は非常に高い相対蛍光比強度を示した。
【００８２】
（実施例１３）
実施例３〜９で合成した共重合体の濃度を１０μｇ／ｍＬと一定にする以外は実施例１２と同様にして、グルコース濃度５００ｍｇ／ｄＬに対する応答性を調べた。結果を図６に示す。
【００８３】
（実施例１４）
最終濃度として、ＡＡｍ濃度が１５質量％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（以下ＢＩＳと記載）濃度が０．１５質量％、ＳＰＳ濃度が０．３質量％、ＴＥＭＥＤ濃度が０．０８質量％およびＦ−ＡＡｍ濃度が０．５０質量％（仕込みモル比でＦ−ＡＡｍ／ＡＡｍ＝１／３００）となるよう８０質量％ＤＭＳＯ水溶液に溶解・混合して溶液を調製した。
【００８４】
予め、シランカップリング剤による表面処理を行ったガラスプレートと無処理のガラスプレートを隙間を設けて設置し、隙間に上記溶液を流し込み、窒素雰囲気下室温で２時間重合させた。重合終了後ガラスプレートを純水につけて、無処理のガラスプレートのみを剥がして、ガラス基材上にＦ−ＡＡｍ／ＡＡｍの共重合体が固定されたゲルシートを得た。得られたゲルシートを、メタノールと５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）とに５分間交互に浸漬を３回繰り返した後、リン酸緩衝液に１０時間以上浸漬洗浄し、検出層を得た。
【００８５】
（実施例１５）
実施例１−Ｃ）で合成した９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルト−ボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸３５０ｍｇ、メチル−６−アミノヘキサネート２００ｍｇ、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド２２０ｍｇを０．２ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含むジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、室温で４時間攪拌した。反応混合物をクロロホルム１００ｍＬに溶解し、蒸留水で３回、飽和食塩水で１回洗浄し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾固し、中間体であるメチルエステル３６０ｍｇを得た。さらにこの中間体をメタノール１０ｍＬに溶解し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬを加えて室温で１５時間反応させた。反応混合物をイオン交換カラムに供し、アルカリを除去し、濃縮乾固して９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸−１−（６’−カルボン酸−ｎ−ヘキシル）アミド３１０ｍｇを得た。
【００８６】
（実施例１６）
８ｇの過塩素酸水溶液（有効塩素濃度５質量％）と３０ｍＬの６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１０ｃｍ×１０ｃｍの浅い角型ステンレス容器に取り、０℃に冷却した。１０ｃｍ四方に切断したポリアクリルアミド膜を静かに浸し、０℃で２時間反応させた。反応液を除去し、４０ｍＬの蒸留水で４回、２０ｍＬのジメチルホルムアミドで２回静かに洗浄を行い活性化ポリアクリルアミド膜を得た。
【００８７】
実施例１５で合成した、蛍光モノマー化合物である９，１０−ビス［［Ｎ−メチル−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン−２−カルボン酸−１−（６’−カルボン酸−ｎ−ヘキシル）アミド２０ｍｇ、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド１２ｍｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール８ｍｇを、ジメチルホルムアミド１０ｍＬ溶解して１０ｃｍ×１０ｃｍの浅い角型ステンレス容器に入れ、上記反応で作製した活性化ポリアクリルアミド膜を浸した。室温で１７時間反応させた後、２０ｍＬのジメチルホルムアミドで３回、４０ｍＬの０．０１Ｎ塩酸で２回、４０ｍＬの蒸留水で３回洗浄し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で１０時間以上浸漬洗浄し、前記蛍光モノマー化合物がポリアクリルアミド膜に固定された検出層を得た。
【００８８】
デキストラン７ｇを１７５ｍＬの蒸留水に５０℃で攪拌溶解させ、さらにカーボンブラック５ｇを加えた後、均一に分散するまで超音波処理を行った。そこに、５０質量％水酸化ナトリウム水溶液３．５ｍＬとエチレングリコールジグリジシルエーテル６．５ｇを加え、４５℃で３０分間攪拌を行った。更に２３０ｍＬの蒸留水を加えて、この混合溶液を噴霧器に入れた。前工程で作製した検出層を平らなガラス板に固定し、上記混合溶液を均一に噴霧し、さらに４５℃のオーブンで３０分乾燥を行って光学分離層を積層した検出層を得た。
【００８９】
（比較例）
最終濃度としてＡＡｍモノマー濃度が１５質量％、ＢＩＳ濃度が０．１５質量％、ＳＰＳ濃度が０．３質量％、ＴＥＭＥＤ濃度が０．０８質量％および化学式７に示す９，１０−ビス［Ｎ−（６−アクリルアミド）ヘキシル［−Ｎ−（オルトボロノベンジル）アミノ］メチル］アントラセン（以下、比較化合物と記載。）濃度が０．５０質量％（仕込みモル比で比較化合物／ＡＡｍ＝１／３００）となるよう８０質量％ＤＭＳＯ水溶液に溶解・混合した。
【００９０】
予め、シランカップリング剤による表面処理を行ったガラスプレートと無処理のガラスプレートとを隙間を設けて設置し、隙間に該溶液を流し込み、窒素雰囲気下室温で２時間重合させた。重合終了後、ガラスプレートを純水につけて、無処理のガラスプレートのみを剥がして、ガラス基材上に比較化合物とＡＡｍとの共重合体であるゲルシートを得た。得られたゲルシートを、メタノールと５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）とに５分間交互に浸漬を３回繰り返した後、リン酸緩衝液に１０時間以上浸漬洗浄し、検出層を得た。これに、実施例１６と同様にして、光学分離層を積層して、検出層とした。
【００９１】
【化６】
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（実施例１７）
実施例１６および比較例で得られた光学分離層を積層した検出層を評価装置に固定し、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）下で各濃度のグルコース応答性を蛍光強度で評価した結果を図７に示す。
【００９２】
評価装置は、検出層を固定し内部に液体を循環することのできるセルと、セルの裏面に末端が固定された光学ファイバーの束、そしてその光学ファイバーの他方末端が蛍光分光光度計へ接続された構造になっている。光学ファイバーの束の一部は励起光をセルに送るために、残りは蛍光放射光をセルから返すために用いられる構造となっている。
【００９３】
本発明の１つの結合部位を持つ蛍光指示薬を標識したセンサーは、２つの結合部位を持つ蛍光指示薬を標識したセンサーに比較して、グルコースに応答性が大幅に改善されていることが明らかとなった。
【００９４】
また、糖類検出能に関しても、４００ｎｍの励起で比較例では極大蛍光波長が４３０ｎｍなのに対し、実施例１６では４５０ｎｍと長波長にシフトしており、有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の蛍光モノマー化合物の一例の合成スキームである。
【図２】光学分離層の概念図である。
【図３】本発明の体内埋め込み用の糖類測定用センサーの外観の斜視図である。
【図４】本発明の体内埋め込み用の糖類測定用センサーの内部構造を示す図である。
【図５】実施例３〜１０の蛍光センサー物質のグルコース応答性を示す図である。
【図６】実施例３〜１０の蛍光センサー物質のグルコース応答性を示す図である。
【図７】本発明の蛍光センサー物質および比較例のグルコース応答性を示す図である。
【符号の説明】
【００９６】
１０…検出層、２０…光学分離層、３０…蛍光センサー物質、３３…蛍光モノマー化合物、３５…（メタ）アクリルアミド残基を含む重合性単量体、４０…基材、５０…光源、６０…蛍光検出装置、７０…糖類、１１０…ハウジング、１２０…窓部、１３０…アンテナ部、１４０…集積回路、１５０…電池、１６０…アンテナ用コイル、１７０…光学導波路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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