(57)【要約】【課題】任意の遺伝子に対し、簡便に転写を調節できるような方法を提供すること。【解決手段】転写調節対象の遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を安定に形成する第一の領域と、所定のＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合する第二の領域とを有する融合ＲＮＡと、そのＲＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとを有する融合ポリペプチドを、転写調節対象の遺伝子のプロモーターに作用させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の転写調節方法であって、
前記遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と、
所定のＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合する第二の領域と、
を有するＲＮＡと、
前記ＲＮＡ結合ドメインと、
転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインと
を有するポリペプチドと、
を、前記遺伝子に作用させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第一の領域が１６塩基以上の長さであり、プリンまたはピリミジンのうち、どちらか一方から成ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の領域が３４塩基以上であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ結合ドメインがＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含み、前記第二の領域がＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合配列を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写活性化ドメインを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
転写調節させる遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と、
所定のＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合する第二の領域と、
を有するＲＮＡ。
【請求項７】
前記第一の領域が１６塩基以上の長さであり、プリンまたはピリミジンのうち、どちらか一方から成ることを特徴とする請求項６に記載のＲＮＡ。
【請求項８】
前記第一の領域が３４塩基以上であることを特徴とする請求項７に記載のＲＮＡ。
【請求項９】
前記第二の領域がＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合配列を含むことを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項１０】
所定のＲＮＡ領域に特異的に結合するＲＮＡ結合ドメインと、
転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインと
を有するポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ結合ドメインがＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含むことを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写活性化ドメインを含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項６〜９のいずれかに記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の転写調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ゲノム解析が進み、多くの生物において、全ゲノムが解析されるようになった。それに伴い、ゲノム上で、それまで未知であった遺伝子が同定されてきたが、多くの場合、その機能については明らかではない。
【０００３】
未知の遺伝子の機能を明らかにする一つの手段は、その遺伝子を細胞や個体で強制発現させ、その表現型を調べることである。従来、遺伝子を強制発現するためには、その遺伝子のｃＤＮＡをクローニングし、構成的プロモーターあるいは条件的プロモーターの下流につないで、細胞あるいは個体に戻し、一過的に発現させたり、形質転換させたりしていた（例えば、非特許文献１参照）。この方法によると、強制発現させたい遺伝子を、逐一クローニングする必要があった。
【非特許文献１】Annual Review of Physiology vol.66, pp647-63, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、これまで、ゲノム上の任意の遺伝子に対し、その塩基配列だけで強制発現させることができるようなシステムは存在せず、ある遺伝子を強制発現しようとすると、手間のかかる方法しか存在しなかった。
【０００５】
そこで、本発明は、任意の遺伝子に対し、簡便に転写を調節できるような方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかる方法は、遺伝子の転写調節方法であって、前記遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と所定のＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合する第二の領域とを有するＲＮＡと、前記ＲＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインを有するポリペプチドとを、前記遺伝子に作用させることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明にかかるＲＮＡは、転写調節させる遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と、所定のＲＮＡ結合タンパク質に特異的に結合する第二の領域と、を有する。本発明にかかるポリペプチドは、所定のＲＮＡ領域に特異的に結合するＲＮＡ結合ドメインと、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインとを有する。本発明にかかるＤＮＡは、これらをコードしたものである。
【０００８】
なお、前記第一の領域は、１６塩基以上の長さであり、プリンまたはピリミジンのうち、どちらか一方から成るほうが好ましい。前記第一の領域が３４塩基以上であるほうが、さらに好ましい。また、前記ＲＮＡ結合ドメインがＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを含んでもよく、前記第二の領域がＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合配列を含んでもよい。前記転写活性化ドメインが単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写活性化ドメインを含んでもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、任意の遺伝子に対し、簡便に転写を調節できるような方法を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１２】
＝＝三重鎖核酸形成ＲＮＡ＝＝
本発明の転写調節マシーナリーの一つ目の構成分子である三重鎖核酸形成ＲＮＡは、転写調節させる対象遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成する第一の領域と、所定のＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合する第二の領域とを有する。
【００１３】
第一の領域は、対象遺伝子のプロモーター領域と三重鎖核酸を形成するような配列を有し、且つプリンまたはピリミジンのどちらか一方から成ることが好ましい。また、この三重鎖核酸は安定に形成されることが好ましく、例えば、長さの面からは、１６塩基以上であることが好ましく、３４塩基以上であることがより好ましい。塩基配列の並び自体は特に限定されず、以上の条件を満たすようにプロモーターの領域を選択し、その配列に従って、第一の領域の配列を決定すればよい。プロモーターの中で、三重鎖核酸を作る領域の位置は特に限定されず、どこでも構わないが、開始コドンからの翻訳を考慮に入れると、開始コドンから離れている方が好ましい。
【００１４】
第二の領域は、所定のＲＮＡ結合ドメインに特異的に結合する配列を有する。すなわち、この領域は、もう一つの構成分子である転写調節ペプチドの有するＲＮＡ結合ドメインが特異的に結合する配列を有することになる。ここで、ＲＮＡ結合ドメイン及びそれに特異的に結合する配列としては、例えば、ＭＳ２ファージのコート蛋白質のＲＮＡ結合ドメイン及びそれに特異的に結合する配列等を用いることができる。
【００１５】
これら二つの領域間に適宜リンカーとなる配列を挿入してもよく、両端に余分な配列があっても構わない。このＲＮＡは、化学合成しても構わないが、ＲＮＡをコードするプラスミドなどのＤＮＡを遺伝子組換えによって作製し、in vitroで、または細胞内などのin vivoで転写させることにより、合成しても構わない。
【００１６】
＝＝転写調節ペプチド＝＝
本発明の転写調節マシーナリーの二つ目の構成分子である転写調節ペプチドは、上記三重鎖核酸形成ＲＮＡの第二の領域に特異的に結合するＲＮＡ結合ドメインと、転写調節対象である遺伝子の転写を活性化または抑制するための活性化ドメインまたは抑制ドメインを有する。
【００１７】
ＲＮＡ結合ドメインの種類は、三重鎖核酸形成ＲＮＡの第二の領域と共に、ペアで決定する。
【００１８】
また、転写活性化ドメインまたは抑制ドメインは、例えば、ＶＰ１６及びＧＡＬ４活性化ドメインまたはＣｙｃ８及びＴｕｐ１抑制ドメイン等を用いることができるが、特にこれらに限らない。
【００１９】
これら二つのドメイン間に適宜リンカーがあってもよく、ドメインの両端に余分なアミノ酸が付加されていても構わない。このペプチドは、化学合成しても構わないが、ペプチドをコードするプラスミドなどのＤＮＡを遺伝子組換えによって作製し、in vitroで、または細胞内などのin vivoで発現させることにより、合成しても構わない。
【００２０】
＝＝転写調節方法＝＝
上記三重鎖核酸形成ＲＮＡ及び上記転写調節ペプチドを、調節対象となる遺伝子のプロモーターに作用させる（図１参照）。作用させる場所は、in vivoでもin  vitroでも構わない。
【００２１】
作用させる場所がin vivoの場合、例えば、転写調節対象の遺伝子がゲノム上にあるとき、三重鎖核酸形成ＲＮＡ及び転写調節ペプチドをそれぞれコードするプラスミドなどの発現ベクターを作製し、トランスフェクションなどの常法により、細胞内に導入すればよい。転写調節対象の遺伝子を外来遺伝子として、転写調節マシーナリーをコードするＤＮＡとともに、細胞内に導入してもよい。その際、転写調節対象の遺伝子は、プラスミドなどのベクター上に組み込んでおく。また、三重鎖核酸形成ＲＮＡ及び転写調節ペプチドを発現させる発現ベクター上のプロモーターは、目的に合わせて、構成的（constitutive）であっても条件的（conditional）であってもよい。すなわち、両方のプロモーターに構成的なプロモーターを用いれば、細胞の環境に関わらず目的の遺伝子を強制発現させることができるし、どちらか一方でも条件的なプロモーターを用いれば、例えば時期特異的あるいは組織特異的に、目的の遺伝子を発現させることができる。
【００２２】
作用させる場所がin vitroの場合、例えば、核抽出液（extract）に、転写調節対象の遺伝子を有するベクター及び転写調節マシーナリーを添加することにより、対象となる遺伝子の転写を調節することができる。転写調節マシーナリーに関しては、予めin vitroで三重鎖核酸形成ＲＮＡ及び調節ペプチドを合成しておくのが好ましい。
【実施例】
【００２３】
＝＝ＶＰ１６−ＭＳ２融合タンパク質発現用プラスミドの構築＝＝
ＭＳ２ファージのコートタンパク質（MS2 coat protein）は、配列特異的に１９塩基長のＲＮＡ（5'-ACAUGAGGAUUACCCAUGU-3'）に高親和性をもって結合することが知られている（RNA. 7: 1616-27, 2001）。そこで、  本実施例では、転写調節ペプチドとして、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６の転写活性化ドメインとＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインを融合させたＶＰ１６−ＭＳ２融合タンパク質を用いた。
【００２４】
このＶＰ１６−ＭＳ２融合タンパク質を細胞内で発現させるため、ＶＰ１６−ＭＳ２融合タンパク質をコードする発現ベクターを以下のように構築した。
【００２５】
pHybLex/Zeo-MS2（InVitrogen社）から、ＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むBamHI-MunI断片を切り出し、pYESTrp3ベクター（InVitrogen社）のBamHI-EcoRI部位に導入し、ＶＰ１６−ＭＳ２融合タンパク質をコードする発現ベクターpVP16-MS2を作製した。
【００２６】
なお、コントロールのベクターとして、pYESTrp3ベクターをSacIで消化し、セルフ・ライゲーションすることによって、ＶＰ１６転写活性化ドメインを除去したベクターpYESTrp3(VP16-)を作製した。
【００２７】
＝＝ＴＦＯ−ＭＳ２ＲＮＡ融合ＲＮＡ発現用プラスミドの構築＝＝
本実施例では、三重鎖核酸形成ＲＮＡとして、酵母ＡＤＨプロモーター配列に対し三重鎖核酸を形成し得ると考えられた配列であるＴＦＯの配列と、ＭＳ２ファージのコートタンパク質のＲＮＡ結合配列を融合させた融合ＲＮＡである「ＴＦＯ−ＭＳ２ＲＮＡ」を用いた。ＴＦＯの配列としては、以下に示すＴＦＯ１〜５までの配列を用いた。図２に、酵母ＡＤＨプロモーター上で、各ＴＦＯ配列の基になったプロモーター領域を示す。
【００２８】
ＴＦＯ１：5'-GAAGAAAAGAAAAAAAAAGAAAAGAGAGAGGGGG-3'（配列番号１、３４ｂ）
ＴＦＯ２：5'-AAAAAAGGAAA-3'（配列番号２、１１ｂ）
ＴＦＯ３：5'-GAAAAAGGAAGGAAG-3'（配列番号３、１５ｂ）
ＴＦＯ４：5'-GGAAGGAAGG-3'（配列番号４：１０ｂ）
ＴＦＯ５：5'-AAGGGAAAGAAGGAATAAAGAAAAAGA-3'（配列番号５、２７ｂ）
これらのＴＦＯ−ＭＳ２ＲＮＡを細胞内で発現させるため、ＴＦＯ−ＭＳ２ＲＮＡをコードする発現ベクターを以下のように構築した。
【００２９】
各ＴＦＯの配列の相補配列の３’末端にＣＴＣＧＡＧを付加したオリゴヌクレオチド、及び各ＴＦＯの配列の３’末端にＡＣＧＴを、５’末端にＣＴＣＧＡＧを付加したオリゴヌクレオチドを合成し、それぞれアニーリングして、ＴＦＯインサートを作製する。発現ベクターpRH3'及びpRH5'（両方ともInVitrogen社）のPmeI-AatII部位に、各ＴＦＯインサートを挿入し、p3'TFO1-MS2RNA〜p3'TFO5-MS2RNA及びp5'MS2RNA-TFO1〜p5'MS2RNA-TFO5の１０種類の発現ベクターを作製した。なお、各領域は、p3'シリーズのベクターでは、ＴＦＯ−ＭＳ２ＲＮＡ、p5'シリーズのベクターでは、ＭＳ２ＲＮＡ−ＴＦＯという順序になるように設計されている。また、コントロールのベクターとして、pRH3'をEcoRIで消化しセルフ・ライゲーションすることによりＲＮＡ結合配列を除去したベクターpURAを作製した。
【００３０】
＝＝LacZ発現用プラスミドの構築＝＝
レポーターとして、酵母ＡＤＨプロモーターの下流にLacZマーカーを有するプラスミドを以下のように構築した。
【００３１】
大腸菌Ｗ３１１０株より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、以下のプライマー１及び２を用いて、ＰＣＲにてLacZ遺伝子全長を増幅させた。反応は９６℃  １分−５５℃  ２分−７２℃  ４分のサイクルを２５回繰り返し、酵素には、Pfu Turbo DNA polymerase（Stratagene社）を用いた。ＰＣＲ産物をKpnI-PstIで切断し、pAD-GAL4-2.1（Stratagene社）のKpnI-PstI部位に挿入し、LacZレポーターであるpADH-LacZを作製した。
【００３２】
プライマー１：5'-CGGGGTACCGCCATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCG-3'（配列番号６）
プライマー２：5'-AAAACTGCAGTTATTATTATTTTTGACACCAGACCAACTGGTAATGG-3'（配列番号７）
【００３３】
＝＝転写調節マシーナリーの構築＝＝
Ura-Trp-Leu要求性である酵母ＦＹ２３株に、表１のような組み合わせで、上記プラスミドを導入した。選択培地プレートでコロニーを選択し、成長したシングルコロニーをピックアップして選択液体培地で培養した。培地の濁度ＯＤ６００が1程度になったら集菌し、ｐＨ調整用リン酸バッファーに懸濁した。これをクロロホルムとＳＤＳで処理し、β-Galの基質であるＯＮＰＧを添加し、１０分後に１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を加え、反応を停止させた。これを遠心して上清を回収し、ＯＤ４２０を測定し、以下のミラーの式よりβ-Gal活性（unit/ml）とした。
【００３４】
β-Gal activity＝OD420ｘ1000／OD600 ｘ 反応時間（min） x 反応容積（ml）
結果を表１に示す。
【表１】
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【００３５】
ＴＦＯ１〜５のうち、開始コドンから最も離れた（４４２−４７５ｂｐ）位置にあるＴＦＯ１が、もっとも顕著な活性を示した。なお、p3'シリーズ及びp5'シリーズ両方において、この活性を、レポーターのみのコントロール（表では、「（レポーターのみ）」と表記）、レポーター＋pVP16-MS2（表では、「VP16MS2」と表記）、レポーター＋p3'TFO1-MS2RNA（表では、「3’TFO1 (VP16MS2無し)」と表記）、またはレポーター＋p5'MS2RNA-TFO1（表では、「5’TFO1 (VP16MS2無し)」と表記）で得られた活性に対し、マン・ホィットニーのＵ検定を行ったところ、いずれの組み合わせにおいても、危険率１％で有意差が認められた。
【００３６】
このＴＦＯ１は、使用した中で最も長い配列を有するため（３４ｂ）、配列が長いほど安定した三重鎖核酸が構成され、転写が顕著に活性化すると考えられる。また、ＴＦＯ５は、連続したプリン塩基の配列が途中でＴによって１５塩基と１１塩基に分断されており、連続性が必要であることも示唆された。これらの結果から、ＴＦＯ２〜５は、少なくとも下流の転写を活性化できるほど安定にはＡＤＨプロモーターに結合しない可能性が示唆された。このように、本研究において、三重鎖核酸が安定して形成されることが転写調節の成功に重要であることが明らかとなった。
【００３７】
本実施例では、転写調節ペプチドの転写活性化ドメインとしてＶＰ１６の転写活性化ドメインを用いたが、その代わりに転写抑制ドメインを用いることで、もともと転写活性のあるプロモーターに対し、効率よく転写抑制できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の転写調節マシーナリーの概念図を表す図である。
【図２】本発明にかかる一実施例において用いた各ＴＦＯが結合し得ると考えられたＡＤＨプロモーター内の位置を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
2006217871000001.app