(57)【要約】【課題】被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく回収することができるレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法、および、レジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを提供すること。【解決手段】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法は、レジオネラ菌を含有する被処理液３中から、レジオネラ菌を濃縮及び溶出する方法である。このレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法では、少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体１に、被処理液３を接触させることにより、担体１にレジオネラ菌を付着させる第１の工程と、レジオネラ菌が付着した担体１に、濃度２５〜５００ｍＭで緩衝剤を含有する緩衝液４を接触させることにより、緩衝液４中にレジオネラ菌を遊離させて濃縮及び溶出（緩衝液４中に回収）する第２の工程とを有している。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レジオネラ菌を含有する被処理液中から、前記レジオネラ菌を濃縮及び溶出する方法であって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に、前記被処理液を接触させることにより、前記担体に前記レジオネラ菌を付着させる第１の工程と、
前記レジオネラ菌が付着した前記担体に、濃度２５〜５００ｍＭで緩衝剤を含有する緩衝液を接触させることにより、前記緩衝液中に前記レジオネラ菌を遊離させて回収する第２の工程とを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項２】
前記被処理液を前記担体に接触させる際の前記被処理液の温度は、７０℃以下である請求項１に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項３】
前記緩衝液の量は、前記被処理液の量より少ない請求項１または２に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項４】
前記緩衝液は、リン酸緩衝液である請求項１ないし３のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項５】
前記緩衝液のｐＨは、６．５〜８．５である請求項１ないし４のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項６】
前記緩衝液を前記担体に接触させる際の前記緩衝液の温度は、７０℃以下である請求項１ないし５のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項７】
前記担体は、粒状のものである請求項１ないし６のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項８】
粒状の前記担体の平均粒径は、２０〜５０００μｍである請求項７に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項９】
前記担体は、その少なくとも表面付近が多孔質なものである請求項１ないし８のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１０】
前記担体は、主として樹脂材料で構成された基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された被覆層とを有するものである請求項１ないし９のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１１】
前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである請求項１０に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１２】
前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである請求項１ないし１１のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１３】
前記担体は、その比表面積が５〜１００ｍ２／ｇである請求項１ないし１２のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１４】
前記被処理液は、浴槽水である請求項１ないし１３のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１５】
前記第１の工程は、前記担体を、管体の内腔部内に充填した状態で、前記内腔部内に、前記被処理液を通液することにより行われる請求項１ないし１４のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１６】
前記第２の工程は、前記被処理液が通液された前記管体の内腔部内に、前記緩衝液を通液することにより行われる請求項１５に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１７】
前記緩衝液を前記内腔部内に通液する際の流速をＡ［ｍＬ／ｍｉｎ］とし、前記被処理液を前記内腔部内に通液する際の流速をＢ［ｍＬ／ｍｉｎ］としたとき、Ａ／Ｂが０．５〜３なる関係を満足する請求項１６に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１８】
前記緩衝液を前記内腔部内に通液する際の流速は、０．７５〜１５ｍＬ／ｍｉｎである請求項１５ないし１７のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項１９】
前記第１の工程は、前記担体を収納した網状の袋を、前記被処理液中に浸漬することにより行われる請求項１ないし１４のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項２０】
前記第１の工程において、前記被処理液中へ前記担体を収納した袋を浸漬する時間は、２．５時間以上である請求項１９に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項２１】
前記第２の工程は、前記担体を収納した網状の袋に、前記緩衝液を液滴として供給することにより行われる請求項１９または２０に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【請求項２２】
請求項１ないし１４のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法に使用するためのレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットであって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体と、
該担体を収納する収納空間と、該収納空間に連通する注入口および排出口とを備える容器と、
前記収納空間内に、前記排出口を塞ぐように設けられたフィルタとを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【請求項２３】
前記容器は、その少なくとも一部が折り畳み可能となっている請求項２２に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【請求項２４】
請求項１５ないし１８のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法に使用するためのレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットであって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体と、
該担体を充填する内腔部と、該内腔部に連通する注入口および排出口とを備える管体と、
前記内腔部内に、前記排出口を塞ぐように設けられたフィルタとを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【請求項２５】
請求項１９ないし２１のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法に使用するためのレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットであって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体と、
該担体を収納する網状の袋とを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【請求項２６】
前記袋は、その目開きが２０〜８５μｍである請求項２５に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラ菌の濃縮及び溶出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば、レジオネラ菌は、呼吸器系の病原細菌であり、元来は土壌中に広く分布するが、人工環境である２４時間浴槽水等からも検出されるようになっている。
【０００３】
そして、これらから空中に飛散し、呼吸器系感染を起こすことによって発症する、レジオネラ肺炎やポンティアック熱等が問題となっている。
【０００４】
このようなレジオネラ菌等の微生物を検出する方法としては、イムノクロマト法が知られている。イムノクロマト法は、抗原抗体反応を利用する測定法であり、検出しようとする抗原（この場合には微生物）に結合する抗体を発色物質で標識しておき、この抗体を局所部分に固定した試験紙を用いて行う。具体的には、試験紙の抗体を固定した部分から離れた部分に、液体状の検体を垂らす。すると、検体が、試験紙上をゆっくりと移動し、検体中に抗原が含まれている場合には、この抗原と抗体とが結合して発色する。これにより、検体中の抗原を検出することができる。
【０００５】
ところで、イムノクロマト法のような微生物の検出方法によって微生物を検出するには、単位体積当りの微生物数が検出限界以上であることが必要となる（例えば、特許文献１参照。）。
【０００６】
したがって、浴槽水等の被処理液中に微生物が生息している場合でも、その数が極めて少ない場合には、微生物を検出できずに見逃してしまう場合がある。
このような場合、被処理液中から微生物を濃縮して検出することが考えられる。
【０００７】
しかしながら、効率よく微生物を濃縮する方法について、有効な方法が見出されていないのが実情である。
【０００８】
【特許文献１】特開平５−３２２８９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができるレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法およびレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような目的は、下記の本発明により達成される。
（１）  レジオネラ菌を含有する被処理液中から、前記レジオネラ菌を濃縮及び溶出する方法であって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体に、前記被処理液を接触させることにより、前記担体に前記レジオネラ菌を付着させる第１の工程と、
前記レジオネラ菌が付着した前記担体に、濃度２５〜５００ｍＭで緩衝剤を含有する緩衝液を接触させることにより、前記緩衝液中に前記レジオネラ菌を遊離させて回収する第２の工程とを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００１１】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００１２】
（２）  前記被処理液を前記担体に接触させる際の前記被処理液の温度は、７０℃以下である上記（１）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００１３】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を、より収率よく担体に付着させることができる。
【００１４】
（３）  前記緩衝液の量は、前記被処理液の量より少ない上記（１）または（２）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００１５】
これにより、緩衝液の単位体積当りのレジオネラ菌の数を、被処理液のそれよりも大きくすることができる。
【００１６】
（４）  前記緩衝液は、リン酸緩衝液である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
これにより、レジオネラ菌の濃縮及び溶出をより短時間で確実に行うことができる。
【００１７】
（５）  前記緩衝液のｐＨは、６．５〜８．５である上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００１８】
これにより、緩衝液中に濃縮及び溶出されたレジオネラ菌を、イムノクロマト法によって検出するに際して、正確な検出結果を得ることができる。
【００１９】
（６）  前記緩衝液を前記担体に接触させる際の前記緩衝液の温度は、７０℃以下である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００２０】
これにより、レジオネラ菌をより効率よく、濃縮及び溶出（緩衝液中に回収）することができる。
【００２１】
（７）  前記担体は、粒状のものである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００２２】
これにより、担体の表面積を増大させることができ、より効率よくレジオネラ菌を付着させることができる。
【００２３】
（８）  粒状の前記担体の平均粒径は、２０〜５０００μｍである上記（７）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００２４】
これにより、担体の表面積を十分に確保することができるので、担体へのレジオネラ菌の付着率をより向上させることができる。
【００２５】
（９）  前記担体は、その少なくとも表面付近が多孔質なものである上記（１）ないし（８）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００２６】
これにより、担体の表面積をより増大させることができ、担体へのレジオネラ菌の付着率をさらに向上させることができる。
【００２７】
（１０）  前記担体は、主として樹脂材料で構成された基材と、該基材の表面を覆うように設けられ、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された被覆層とを有するものである上記（１）ないし（９）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００２８】
これにより、担体の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等の調整が容易となる。
【００２９】
（１１）  前記樹脂材料は、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものである上記（１０）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００３０】
これにより、例えば、基材の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部を貫入させることにより、リン酸カルシウム系化合物層を形成する場合には、基材の硬さ（硬度）を適度なものとすることができるので、前記粒子による被覆を容易かつ確実に行うことができる。
【００３１】
（１２）  前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものである上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
これにより、担体にレジオネラ菌が極めて効率よく付着するようになる。
【００３２】
（１３）  前記担体は、その比表面積が５〜１００ｍ２／ｇである上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００３３】
これにより、担体の機械的強度が低下するのを防止しつつ、レジオネラ菌の担体への付着効率をより向上させることができる。
【００３４】
（１４）  前記被処理液は、浴槽水である上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００３５】
本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法は、浴槽水に含まれるレジオネラ菌の濃縮及び溶出への適用が好適である。
【００３６】
（１５）  前記第１の工程は、前記担体を、管体の内腔部内に充填した状態で、前記内腔部内に、前記被処理液を通液することにより行われる上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００３７】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００３８】
（１６）  前記第２の工程は、前記被処理液が通液された前記管体の内腔部内に、前記緩衝液を通液することにより行われる上記（１５）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００３９】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００４０】
（１７）  前記緩衝液を前記内腔部内に通液する際の流速をＡ［ｍＬ／ｍｉｎ］とし、前記被処理液を前記内腔部内に通液する際の流速をＢ［ｍＬ／ｍｉｎ］としたとき、Ａ／Ｂが０．５〜３なる関係を満足する上記（１６）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００４１】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を担体に確実に付着させることができ、かつ、担体から確実に遊離させて溶出（緩衝液中に回収）することができる。すなわち、レジオネラ菌の濃縮倍率（被処理液中からのレジオネラ菌の回収率）を確実に上昇させることができる。
【００４２】
（１８）  前記緩衝液を前記内腔部内に通液する際の流速は、０．７５〜１５ｍＬ／ｍｉｎである上記（１５）ないし（１７）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
これにより、レジオネラ菌をより確実に溶出することができる。
【００４３】
（１９）  前記第１の工程は、前記担体を収納した網状の袋を、前記被処理液中に浸漬することにより行われる上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００４４】
これにより、担体への被処理液の接触をより簡便な操作で行うことができるとともに、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００４５】
（２０）  前記第１の工程において、前記被処理液中へ前記担体を収納した袋を浸漬する時間は、２．５時間以上である上記（１９）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００４６】
これにより、被処理液中に存在するレジオネラ菌の数が比較的少ない場合でも、担体にレジオネラ菌を十分に付着させることができ、被処理液中のレジオネラ菌の検出（濃縮）を確実に行うことができる。
【００４７】
（２１）  前記第２の工程は、前記担体を収納した網状の袋に、前記緩衝液を液滴として供給することにより行われる上記（１９）または（２０）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法。
【００４８】
これにより、比較的少ない緩衝液の使用量で、担体からレジオネラ菌を効率よく遊離させることができる。
【００４９】
（２２）  上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法に使用するためのレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットであって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体と、
該担体を収納する収納空間と、該収納空間に連通する注入口および排出口とを備える容器と、
前記収納空間内に、前記排出口を塞ぐように設けられたフィルタとを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【００５０】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００５１】
（２３）  前記容器は、その少なくとも一部が折り畳み可能となっている上記（２２）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【００５２】
これにより、レジオネラ菌の濃縮及び溶出キットの保管時において、スペースの削減を図ることができる。
【００５３】
（２４）  上記（１５）ないし（１８）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法に使用するためのレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットであって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体と、
該担体を充填する内腔部と、該内腔部に連通する注入口および排出口とを備える管体と、
前記内腔部内に、前記排出口を塞ぐように設けられたフィルタとを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【００５４】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００５５】
（２５）  上記（１９）ないし（２１）のいずれかに記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法に使用するためのレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットであって、
少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された担体と、
該担体を収納する網状の袋とを有することを特徴とするレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【００５６】
これにより、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００５７】
（２６）  前記袋は、その目開きが２０〜８５μｍである上記（２５）に記載のレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット。
【００５８】
これにより、袋内から担体が散逸することや、被処理液中にレジオネラ菌が存在する場合には、そのレジオネラ菌の袋への出入が阻害されること等を確実に防止することができる。
【発明の効果】
【００５９】
本発明によれば、被処理液中のレジオネラ菌を、簡易かつ収率よく濃縮及び溶出することができる。
【００６０】
また、回収液として用いる緩衝液の量を、被処理液の量より少なくすることにより、レジオネラ菌を確実に濃縮することができる。このため、仮に、被処理液中において、レジオネラ菌が少数しか存在せず、その存在が確認できない（検出不能な）場合でも、緩衝液中において、その存在を確認することができるようになる。これにより、被処理液に対する早期の対処（例えば、殺菌等）を行うことができる。
【００６１】
また、緩衝液の濃度を適正範囲に規定していることにより、溶出（緩衝液中に回収）されたレジオネラ菌を、例えばイムノクロマト法によって検出するに際して、緩衝液中に高濃度に存在する緩衝剤によって、抗原抗体反応が阻害されるのが防止される。これにより、正確な検出結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
以下、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法およびレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００６３】
本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法は、レジオネラ菌を含有する被処理液中から、レジオネラ菌を回収する方法であり、担体に被処理液を接触させることにより、この担体にレジオネラ菌を付着させる第１の工程と、レジオネラ菌が付着した担体に、濃度２５〜５００ｍＭで緩衝剤を含有する緩衝液（回収液）を接触させることにより、緩衝液中にレジオネラ菌を遊離させて溶出（緩衝液中に回収）する第２の工程とを有している。
【００６４】
まず、本発明において用いられる担体について説明する。
図１は、本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。
【００６５】
図１に示す担体１は、粒状（ほぼ球状）をなしている。担体１には、ブロック状（塊状）、ペレット状、シート状等の各種形状のものを使用することもできるが、粒状のものを用いることにより、その表面積を増大させることができ、より効率よくレジオネラ菌を付着させることができる。
【００６６】
担体１は、その少なくとも表面付近が、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたものである。リン酸カルシウム系化合物は、各種細胞との親和性（細胞親和性）が高いため、かかる担体１は、その表面にレジオネラ菌を付着させる担体１として好適に使用される。
【００６７】
図１に示す担体１は、主として樹脂材料で構成された基材１１と、基材１１の表面を覆うように設けられ、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたリン酸カルシウム系化合物層１２とを有している。これにより、担体１の形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）等の調整が容易となる。
【００６８】
なお、担体１は、その全体が、リン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されたものであってもよい。全体がリン酸カルシウム系化合物で構成される担体１は、レジオネラ菌を効率よく捕集できる。
【００６９】
また、担体１の比表面積は、５〜１００ｍ２／ｇであるのが好ましく、１５〜８０ｍ２／ｇであるのがより好ましい。下限値を下回った場合、被処理液の量によっては、効率よくレジオネラ菌を付着させることができないおそれがある。また、上限値を上回った場合、担体１の機械的強度が低下することにより担体１が破砕し、後述のレジオネラ菌の濃縮及び溶出の際に、フィルタの目詰まりを引き起こすおそれがある。
【００７０】
基材１１を構成する樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド（例えば、ナイロン６、ナイロン６・６、ナイロン６・１０、ナイロン１２）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００７１】
これらの中でも、基材１１を構成する樹脂材料としては、ポリアミドおよびエポキシ樹脂の少なくとも一方を主成分とするものであるのが好適である。例えば、後述するように、基材１１の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部を貫入させることにより、リン酸カルシウム系化合物層１２を形成する場合には、基材１１を前述した材料で構成することにより、その硬さ（硬度）を適度なものとすることができるので、前記粒子による被覆を容易かつ確実に行うことができる。
【００７２】
リン酸カルシウム系化合物層１２を構成するリン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００７３】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが好適である。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、担体１にレジオネラ菌が極めて効率よく付着するようになる。また、ハイドロキシアパタイトは、レジオネラ菌に対するダメージを与える可能性が特に低いため、レジオネラ菌が崩壊しない（破壊されない）状態で、後述するように溶出（緩衝液中に回収する）ことができる。これにより、レジオネラ菌をより確実に検出することができる。
【００７４】
なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００７５】
また、リン酸カルシウム系化合物層１２は、図１に示すように、基材１１の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子１３（以下、単に「粒子１３」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、リン酸カルシウム系化合物層１２と基材１１との密着性を優れたものとすることができる。このため、リン酸カルシウム系化合物層１２の基材１１の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００７６】
この場合、リン酸カルシウム系化合物層１２は、例えば、基材１１の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子（以下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、リン酸カルシウム系化合物層１２を形成することができる。
【００７７】
この基材１１と多孔質粒子との衝突は、例えば、市販のハイブリダイゼーション装置やメカノフュージョン装置等を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材１１と多孔質粒子との混合比が、重量比で４００：１〜２０：１程度、装置内の温度が、基材１１の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【００７８】
このような担体１は、その密度（比重）が水の密度に近いのものであるのが好ましい。具体的には、担体１の密度は、０．８〜２ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましく、０．９〜１．３５ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。これにより、担体１を、後述する被処理液や緩衝液中でより均一に懸濁させることができる。その結果、これらの液体と担体１とをより確実かつ均一に接触させることができ、担体１へレジオネラ菌が付着する効率や、緩衝液中へのレジオネラ菌の収率をより向上させることができる。
【００７９】
また、担体１の平均粒径は、２０〜５０００μｍ程度であるのが好ましく、４０〜２００μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、担体１の表面積を十分に確保することができるので、担体１へのレジオネラ菌の付着率をより向上させることができる。また、粒径が小さ過ぎると、担体１同士の間を液体が流れにくくなるおそれがある。
【００８０】
また、担体１は、その少なくとも表面付近（本実施形態では、リン酸カルシウム系化合物層１２）が多孔質なものであるのが好ましい。これにより、担体１の表面積をより増大させることができ、担体１へのレジオネラ菌の付着率をさらに向上させることができる。
【００８１】
次に、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法について説明する。
＜第１実施形態＞
まず、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第１実施形態について説明する。
【００８２】
ここで、第１実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キット（以下、単に「キット」と言う。）について説明する。
【００８３】
図２は、第１実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるキットを示す模式図（内部透視図）、図３は、図２に示すキットが折り畳まれた状態を示す模式図である。なお、以下の説明では、図２および図３中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【００８４】
図２に示すキット２は、前述したような担体１と、この担体１を収納する収納空間２０と、収納空間２０に連通する注入口２２および排出口２３とを備える容器２１とを有している。
【００８５】
容器２１内（収納空間２０）に収納する担体１の量は、特に限定されないが、処理する液体（被処理液）の容積５００ｍＬ当り０．３〜５ｇ程度であるのが好ましく、０．５〜３ｇ程度であるのがより好ましい。担体１の量が少な過ぎると、担体１に付着できるレジオネラ菌の数が制限され、レジオネラ菌の濃縮倍率（緩衝液４中への回収率）が低くなるおそれがあり、一方、担体１の量が多過ぎると、担体１が被処理液および緩衝液（溶離液）中で移動し難くなることから、これらの液体と担体１との接触が不十分となり、レジオネラ菌の濃縮倍率が低下するおそれがある。
【００８６】
なお、このようなキット２は、担体１が、予め容器２１に収納された形態のものであってもよく、容器２１とは、個別に担体１が添付され、使用時に担体１を容器２１に投入して使用する形態のものであってもよい。
【００８７】
容器２１は、ほぼ円筒状をなす側壁部２１１と、ほぼ円盤状をなす上壁部２１２および底壁部２１３と有している。
【００８８】
側壁部２１１は、蛇腹状（ベローズ状）をなし、図３に示すように、折り畳み可能となっている。これにより、キット２の保管時において、スペースの削減を図ることができる。
【００８９】
また、上壁部２１２および底壁部２１３には、それぞれ、収納空間２０に連通する注入口２２および排出口２３が設けられている。
【００９０】
これらの注入口２２および排出口２３は、それぞれ、栓２４、２５によって閉塞（封止）可能になっている。
【００９１】
なお、側壁部２１１の形状は、円筒状に限定されず、例えば、立方体、直方体、袋状等のいかなるものであってもよいが、担体１と、被処理液および緩衝液と担体１との接触を均一に行うことができ、また強度に優れることから円筒状であるのが好ましい。
【００９２】
容器２１（側壁部２１１、上壁部２１２および底壁部２１３）の構成材料としては、特に限定されず、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、熱可塑性ポリウレタン、ポリメチルメタクリレート、ポリオキシエチレン、フッ素樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、アセタール樹脂、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレート等の熱可塑性樹脂や、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、不飽和ポリエステル等の熱硬化性樹脂等が挙げられる。また、容器２１の構成材料には、例えば、各種セラミックス材料、各種金属材料等を用いることもできる。
【００９３】
また、収納空間２０内（容器２１の底壁部２１３）には、排出口２３を塞ぐように、フィルタ２６が設けられている。
【００９４】
このフィルタ２６は、担体１の通過を阻止し、かつ、被処理液および緩衝液を通過させ得る開口径を有するものである。この開口径は、担体１の平均粒径の０．１〜９０％程度であるのが好ましく、担体１の平均粒径の１〜５０％程度であるのがより好ましい。開口径が小さ過ぎると、被処理液および緩衝液の組成、粘度等によっては、これらの液体の通過抵抗が大きくなり、処理に要する時間が長くなるおそれがあり、一方、開口径が大き過ぎると、担体１がフィルタ２６を容易に通過してしまうおそれがある。
【００９５】
次に、図２に示すキット２を用いて行うレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法（本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第１実施形態）について説明する。
【００９６】
図４は、レジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第１実施形態を説明するための模式図である。なお、以下の説明では、図４中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【００９７】
［１］被処理液を担体に接触させる工程（第１の工程）
まず、レジオネラ菌（レジオネラ属菌）を含む被処理液３を用意する。
【００９８】
被処理液３としては、特に限定されないが、浴槽水（温泉水）、クーリングタワーの冷却水、加湿用水、温度５０℃以下の貯湯タンク水、河川水、湖沼水、井戸水、プールの水等が挙げられるが、浴槽水（特に、循環式浴槽水）が好適である。近年、浴槽水中でのレジオネラ菌の発生が問題となっている。かかる問題を解決するためには、レジオネラ菌が増殖する前に検出することが重要となる。本発明を用いれば、仮に、浴槽水中に存在するレジオネラ菌の数が少ない場合でも、効率よくレジオネラ菌を濃縮及び溶出でき、確実に検出することができる。このため、浴槽水に対する早期の対処が可能となる。
【００９９】
次に、被処理液３を、担体１に接触させることにより、担体１にレジオネラ菌を付着させる。
【０１００】
具体的には、まず、前述したようなキット２を用意し、容器２１の排出口２３を栓２５で閉塞し、注入口２２を開放しておく。なお、容器２１（収納空間２０）内には、担体１が収納された状態とする。
【０１０１】
次いで、この収納空間２０内に、注入口２２を介して被処理液３を注入（供給）する（図４中（ａ）参照）。
【０１０２】
次いで、注入口２２を栓２４で閉塞し、容器２１を振盪（揺動）、攪拌、超音波の付与等することにより、被処理液３中に担体１を懸濁させる（図４中（ｂ）参照）。これにより、担体１に被処理液３を接触させ、担体１の表面にレジオネラ菌を付着させる。
【０１０３】
ここで、担体１は、少なくとも表面付近がレジオネラ菌に対して親和性の高いリン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されているので、レジオネラ菌が効率よく付着する。
【０１０４】
本実施形態では、この被処理液３を担体１に接触させる時間は、５００ｍＬ当り１〜２４０分程度であるのが好ましく、１０〜１８０分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、担体１に付着するレジオネラ菌の数が少なくなり、十分にレジオネラ菌を回収できないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、レジオネラ菌が崩壊してしまい、後述する工程においてレジオネラ菌の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。
【０１０５】
また、この際（処理時）の被処理液３の温度は、７０℃以下であるのが好ましく、５０℃以下であるのがより好ましく、５〜５０℃程度であるのがさらに好ましい。処理時の被処理液３の温度が低く過ぎると、レジオネラ菌の種類等によっては、担体１にレジオネラ菌を効率よく付着させることができないおそれがあり、一方、処理時の被処理液３の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、レジオネラ菌が崩壊して（破壊されて）しまい、後述する工程においてレジオネラ菌の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。
【０１０６】
次いで、栓２５を取り外して、容器２１の排出口２３を開放する。これにより、容器２１内の被処理液３を排出口２３を介して排出する。
【０１０７】
なお、担体１はフィルタ２６を通過することができないため、収納空間２０には、レジオネラ菌が付着した担体１が残存することとなる（図４中（ｃ）参照）。
次いで、排出口２３を栓２５で閉塞する。
【０１０８】
［２］緩衝液を担体に接触させる工程（第２の工程）
次に、レジオネラ菌が付着した担体１に、濃度２５〜５００ｍＭ（特に、５０〜３００ｍＭ）で緩衝剤を含有する緩衝液４を接触させ、担体１に付着したレジオネラ菌を緩衝液４中に遊離させて溶出する。
【０１０９】
具体的には、まず、栓２４を取り外して、容器２１の注入口２２を開放する。
次いで、収納空間２０内に、注入口２２を介して緩衝液４を注入（供給）する（図４（ｄ）参照。）。
【０１１０】
次いで、注入口２２を栓２４で閉塞し、容器２１を振盪（揺動）、攪拌、超音波の付与等することにより、緩衝液４中に担体１を懸濁させる（図４中（ｅ）参照）。これにより、担体１に緩衝液４を接触させ、担体１の表面からレジオネラ菌を遊離させる（剥がす）。
【０１１１】
担体１に緩衝液４を接触させると、例えば、担体１の表面の荷電状態が変化すること等が一要因となり、担体１に付着していたレジオネラ菌が担体１から効率よく遊離する。
【０１１２】
ここで、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法では、緩衝液４の緩衝剤の濃度が２５〜５００ｍＭとされていることが重要である。担体１に付着したレジオネラ菌は、緩衝液４が高濃度である程、効率よく担体１から遊離する。そして、緩衝液４の緩衝剤の濃度が低過ぎると、担体１から遊離するレジオネラ菌の数が少なく、十分にレジオネラ菌を溶出（緩衝液４中に回収）できない。一方、緩衝液４の緩衝剤の濃度が高過ぎると、溶出されたレジオネラ菌を検出する際に、緩衝剤が検出系（測定系）に影響を及ぼし、正確な検出結果が得られなかったり、検出結果の再現性が低くなる。
【０１１３】
用いる緩衝液４のｐＨは、６．５〜８．５であるのが好ましく、７〜８であるのがより好ましい。緩衝液４のｐＨが、前記範囲から外れる場合、すなわち緩衝液４の液性がアルカリ性または酸性である場合には、溶出されたレジオネラ菌を検出する際に、検出系の種類等によっては、正確な検出結果が得られないおそれがある。特に、検出法としてイムノクロマト法を用いる場合には、抗原抗体反応が阻害され、正確な測定結果が得られない可能性が高くなる傾向にある。
【０１１４】
また、緩衝液４は、等張液（レジオネラ菌の細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体）であるのが好ましい。これにより、浸透圧の違いによるレジオネラ菌の崩壊を防止することもできる。
【０１１５】
このような緩衝液４としては、例えば、トリエタノールアミン塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ベロナ−ル（５，５−ジエチルバルビツル酸ナトリウム）−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール−塩酸緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム−リン酸ニナトリウム緩衝液、リン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等の各種緩衝液（緩衝剤を含有する液体）が挙げられる。これにより、レジオネラ菌をより確実に担体１から遊離させることができるとともに、レジオネラ菌の崩壊をより確実に防止することができる。その結果、レジオネラ菌の検出をより確実に行うことができる。
【０１１６】
また、これらの緩衝液４の中でも、特に、リン酸緩衝液を用いるのが好ましい。これにより、レジオネラ菌の濃縮及び溶出をより短時間で確実に行うことができる。
【０１１７】
また、緩衝液４中に遊離するレジオネラ菌を生存した状態で溶出（緩衝液４中に回収）する場合には、緩衝液４中には、レジオネラ菌の成育に必要な各種添加物を添加するようにしてもよい。これにより、レジオネラ菌の生存数が低減するのを効果的に防止することができる。
【０１１８】
このような添加物としては、例えば、グルコース、各種ビタミン類、グルタミン等のようなアミノ酸類、ＮａＣｌ、ＫＣｌのような電解質等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１１９】
本実施形態では、この緩衝液４を担体１に接触させる時間は、２．５ｍＬ当り０．１秒〜５分程度であるのが好ましく、１秒〜１分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、緩衝液４中に十分にレジオネラ菌を溶出できないおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、レジオネラ菌が崩壊して（破壊されて）しまい、後述する工程においてレジオネラ菌の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。
【０１２０】
また、この際（処理時）の緩衝液４の温度は、７０℃以下であるのが好ましく、５０℃以下であるのがより好ましく、５〜５０℃程度であるのがさらに好ましい。処理時の緩衝液４の温度が低く過ぎると、レジオネラ菌の種類等によっては、レジオネラ菌を担体１から効率よく遊離させることができないおそれがあり、一方、処理時の緩衝液４の温度を前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増大が見込めないばかりか、レジオネラ菌が崩壊して（破壊されて）しまい、後述する工程においてレジオネラ菌の検出を行う場合には、その検出を正確に行うことが困難となるおそれがある。
【０１２１】
次いで、栓２５を取り外して、容器２１の排出口２３を開放する。これにより、容器２１内の緩衝液４を、排出口２３を介して排出して回収する（図４中（ｆ）参照）。
【０１２２】
ここで、本工程［２］において用いる緩衝液４の量を、前記工程［１］の被処理液３の量よりも少ない量とすることにより、緩衝液４の単位体積当りのレジオネラ菌の数を、被処理液３のそれよりも大きくすることができる。すなわち、レジオネラ菌の濃縮を確実に行うことができる。このため、仮に被処理液３中のレジオネラ菌の数が少なく、その存在を確認（検出）できない場合でも、緩衝液４の容量を適宜設定することにより、緩衝液４中において、レジオネラ菌の存在を確認できるようになる。
【０１２３】
なお、このような緩衝液４による処理は、複数回に分けて行ってもよい。これにより、緩衝液４中に回収されるレジオネラ菌の収率をより高くすることができる。
【０１２４】
＜第２実施形態＞
次に、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第２実施形態について説明する。
【０１２５】
以下、第２実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法について、前記第１実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１２６】
ここで、第２実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットについて説明する。
【０１２７】
図５は、第２実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを示す模式図（内部透視図）である。なお、以下の説明では、図５中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【０１２８】
図５に示すカラム（キット）２’は、ほぼ円筒状をなすカラム本体（管体）２１’の内腔部内に、２枚のフィルタ２６ａ’、２６ｂ’が設けられ、カラム本体２１’およびフィルタ２６ａ’、２６ｂ’により、前記担体１を充填（収納）する充填空間２０’が画成されている。
【０１２９】
このカラム２’では、カラム本体２１’の図５中上側の端部が注入口２２’を構成し、下側の端部が排出口２３’を構成する。
【０１３０】
また、フィルタ２６ａ’、２６ｂ’には、それぞれ、前記第１実施形態で説明したフィルタ２６と同様のものを用いることができる。
【０１３１】
次に、図５に示すカラム２’を用いて行うレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法（本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第２実施形態）について説明する。
【０１３２】
図６は、レジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第２実施形態を説明するための模式図である。なお、以下の説明では、図６中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【０１３３】
［１］被処理液を担体に接触させる工程（第１の工程）
まず、前述したようなカラム２’を用意する。なお、カラム本体２１’（充填空間２０’）内には、担体１を収納した状態とする。
【０１３４】
次に、カラム２’の充填空間２０’を、緩衝液によって満たす。
具体的には、充填空間２０’内に、注入口２２’を介して緩衝液を注入（供給）する。
【０１３５】
注入口２２’から注入された緩衝液は、自重によりフィルタ２６ｂ’を通過して、充填空間２０’内に供給され、充填空間２０’内を下方に向かって通過する。そして、充填空間２０’の下端に到達した緩衝液は、フィルタ２６ａ’を通過して、徐々に排出口２３’から排出される。
そして、充填空間２０’内が緩衝液により満たされると、緩衝液の注入を停止する。
【０１３６】
この緩衝液には、次工程［２］で用いる緩衝液４と同じものを用いてもよいし、異なるものを用いてもよい。
【０１３７】
次に、前記第１実施形態と同様のレジオネラ菌を含む被処理液３を、担体１に接触させることにより、担体１にレジオネラ菌を付着させる。
【０１３８】
具体的には、まず、排出口２３’の下方に、排出口２３’から排出される液体を回収するための回収用容器２７ａ’を配置する。
【０１３９】
次に、充填空間２０’内に、注入口２２’を介して被処理液３を注入（供給）する（図６（ａ）参照）。
【０１４０】
注入口２２’から注入された被処理液３は、自重により、フィルタ２６ｂ’を通過して、充填空間２０’内に供給される。充填空間２０’内に供給された被処理液３は、この充填空間２０’内を下方に向かって通過しながら担体１と接触し、担体１の表面にレジオネラ菌が付着する。
【０１４１】
そして、担体１に付着しなかった被処理液３の成分は、充填空間２０’の下端に到達し、フィルタ２６ａ’を通過して、徐々に排出口２３’から排出され、回収用容器２７ａ’に回収される。
【０１４２】
そして、所望量の被処理液３を収納空間２０内に通液したところで、被処理液３の注入を停止する。
【０１４３】
ここで、担体１は、少なくとも表面付近がレジオネラ菌に対して親和性の高いリン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されているので、レジオネラ菌が効率よく付着する。
【０１４４】
また、この際（処理時）の被処理液３の温度は、前記第１実施形態と同様とするのが好ましい。
【０１４５】
［２］緩衝液を担体に接触させる工程（第２の工程）
次に、レジオネラ菌が付着した担体１に、前記第１実施形態と同様の緩衝液４を接触させ、担体１に付着したレジオネラ菌を緩衝液４中に遊離させて回収する。
具体的には、まず、回収用容器２７ａ’を、空の回収用容器２７ｂ’と交換する。
【０１４６】
次に、緩衝液４を、注入口２２’を介して充填空間２０’内に注入（供給）する（図６（ｂ）参照）。
【０１４７】
注入口２２’から注入された緩衝液４は、自重により、フィルタ２６ｂ’を通過して、充填空間２０’内に供給される。充填空間２０’内に供給された緩衝液４は、この充填空間２０’内を下方に向かって通過しながら担体１と接触する。
【０１４８】
担体１に緩衝液４が接触すると、例えば、担体１の表面の荷電状態が変化すること等が一要因となり、担体１に付着していたレジオネラ菌が担体１から効率よく遊離する。
【０１４９】
そして、レジオネラ菌が浮遊する緩衝液４は、充填空間２０’の下端に到達した後、フィルタ２６ａ’を通過して徐々に排出口２３’から排出され、回収用容器２７ｂ’に回収される。
【０１５０】
そして、所望量の緩衝液４が充填空間２０’を通過したところで、緩衝液４の注入を停止する。
【０１５１】
ここで、緩衝液４の種類、浸透圧、温度、添加物の種類は、前記第１実施形態と同様とするのが好ましい。
【０１５２】
このような第２実施形態のキット（カラム２’）によっても、前記第１実施形態と同様の効果が得られる。
【０１５３】
＜第３実施形態＞
次に、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第３実施形態について説明する。
【０１５４】
以下、第３実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法について、前記第１および第２実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１５５】
ここで、第３実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットについて説明する。
【０１５６】
図７は、第３実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを示す模式図（内部透視図）である。なお、以下の説明では、図７中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【０１５７】
第３実施形態では、カラム本体２１’の構成（形状）が異なる以外は、前記第２実施形態と同様である。
【０１５８】
すなわち、図７に示すカラム２’では、カラム本体２１’の図中上側の端部の内径および外径が縮径しており、当該部分が注入口２２’を構成している。
【０１５９】
そして、注入口２２’のサイズ（内径）が、通常のシリンジ１００の先端部（口部）１１０を装着し得るように設定されている。
【０１６０】
シリンジ１００をカラム本体２１’に装着（接続）し、シリンジ１００を押圧操作することにより、シリンジ１００内に収納された液体をカラム本体２１’内に注入することができる。これにより、液体をカラム本体２１’（充填空間２０’）内に通液する際の流速（速度）を、調整することができる。
【０１６１】
この場合、緩衝液４を充填空間２０’（内腔部）内に通液する際の流速と、被処理液３を充填空間２０’（内腔部）内に通液する際の流速とは、次の関係を満足するように設定するのが好ましい。
【０１６２】
すなわち、緩衝液４を充填空間２０’内に通液する際の流速Ａ［ｍＬ／ｍｉｎ］とし、被処理液３を充填空間２０’内に通液する際の流速をＢ［ｍＬ／ｍｉｎ］としたとき、Ａ／Ｂが０．５〜３程度なる関係を満足するのが好ましく、０．５〜１．５程度なる関係を満足するのがより好ましい。これにより、レジオネラ菌を担体１に確実に付着させることができ、かつ、担体１から確実に遊離させて溶出（緩衝液４中に回収）することができる。すなわち、被処理液３中からのレジオネラ菌の濃縮倍率（回収率）を確実に上昇させることができる。なお、Ａ／Ｂを前記下限値を下回るように設定しても、すなわち、緩衝液４を充填空間２０’内に通液する際の流速を必要以上に遅くしても、レジオネラ菌の濃縮及び溶出に長時間を要するだけで、それ以上のレジオネラ菌の濃縮倍率の上昇は期待できない。
【０１６３】
具体的には、被処理液３を充填空間２０’内に通液する際の流速は、１．５〜５ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのが好ましく、２〜４ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのがより好ましい。一方、緩衝液４を充填空間２０’内に通液する際の流速は、０．７５〜１５ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのが好ましく、１〜６ｍＬ／ｍｉｎ程度であるのがより好ましく、１〜５ｍＬ／ｍｉｎ程度あるのがさらに好ましい。これにより、レジオネラ菌を確実に溶出することができる。
【０１６４】
また、この場合、カラム本体２１’内を通過した被処理液３および緩衝液４を溶出した後、空気等の気体を吸引したシリンジ１００をカラム２’に装着し、シリンジ１００内の気体をカラム本体２１’内に注入するようにしてもよい。この気体の注入により生じる圧力によって、カラム本体２１’内に残存する液体が排出口２３’から押し出され、回収用容器２７ｂ’に回収される。これにより、レジオネラ菌の濃縮倍率（回収率）をより上昇させることができる。
【０１６５】
注入する気体は、空気や、窒素、アルゴンガス等の不活性ガスであるのが好ましい。これにより、気体との接触によって、担体やレジオネラ菌がダメージを受けるのが防止される。
【０１６６】
このような第３実施形態のキット（カラム２’）によっても、前記第１および第２実施形態と同様の効果が得られる。
【０１６７】
＜第４実施形態＞
次に、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第４実施形態について説明する。
【０１６８】
以下、第４実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法について、前記第１実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１６９】
ここで、第４実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットについて説明する。
【０１７０】
図８は、第４実施形態のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを示す模式図である。なお、以下の説明では、図８中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【０１７１】
図８に示すバッグ（キット）２”は、前記担体１と、網状の袋２１”とを有し、この袋２１”内に担体１を収納して使用するものである。
【０１７２】
また、袋２１”は、直方体状をなし、その一方の長辺部のほぼ中央には、バッグ２”を用いて処理操作を行う際に、手指等で把持する紐（線状体または帯状体）２２”が固定されている。なお、袋２１”の全体形状は、直方体状に限らず、例えば、立方体状、三角錐状（角錐状）、円錐状など如何なるものであってもよい。
【０１７３】
この袋２１”の目開きは、担体１の平均粒径より小さく設定されていればよく、特に限定されないが、２０〜８５μｍ程度であるのが好ましく、４０〜８０μｍ程度であるのがより好ましい。袋２１”の目開きを前記範囲とすることにより、袋２１”内から担体１が散逸することや、被処理液中にレジオネラ菌が存在する場合には、そのレジオネラ菌の袋２１”への出入が阻害されること等を確実に防止することができる。なお、レジオネラ菌の長さは、２〜５μｍ程度である。
【０１７４】
また、袋２１”の構成材料には、前記第１実施形態において容器２１で挙げた樹脂材料と同様のものを用いることができる。
【０１７５】
次に、図８に示すキット２”を用いて行うレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法（本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第４実施形態）について説明する。
【０１７６】
図９は、レジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第４実施形態を説明するための模式図である。なお、以下の説明では、図９中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
【０１７７】
［１］被処理液を担体に接触させる工程（第１の工程）
まず、前述したようなバッグ２”を用意する。なお、袋２１”内には、担体１を収納した状態とする。
【０１７８】
次に、前記第１実施形態と同様のレジオネラ菌を含む被処理液３を、担体１に接触させることにより、担体１にレジオネラ菌を付着させる。
【０１７９】
具体的には、まず、被処理液３を収納した容器２７ａ”を用意し、被処理液３中にバッグ２”を浸漬する（図９（ａ）参照）。
【０１８０】
これにより、被処理液３は、袋２１”の開口を通過して袋２１”内に浸入して、担体１と接触し、担体１の表面にレジオネラ菌が付着する。
【０１８１】
そして、被処理液３中にバッグ２”を所定時間浸漬した後、被処理液３中からバッグ２”を取り出す。
【０１８２】
ここで、担体１は、少なくとも表面付近がレジオネラ菌に対して親和性の高いリン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されているので、レジオネラ菌が効率よく付着する。
【０１８３】
被処理液３中へバッグ２”を浸漬する時間は、２．５時間以上であるのが好ましく、７．５時間以上であるのがより好ましい。前記範囲の浸漬時間とすることにより、被処理液３中に存在するレジオネラ菌の数が比較的少ない場合でも、担体１にレジオネラ菌を十分に付着させることができ、被処理液３中のレジオネラ菌の検出（濃縮）を確実に行うことができる。なお、浸漬時間の上限値は、特に限定されないが、２５時間以下とするのが好ましい。上限値を超えて浸漬時間を長くしても、担体１に付着するレジオネラ菌の菌数のそれ以上の増大が期待できない。
【０１８４】
また、この際（処理時）の被処理液３の温度は、前記第１実施形態と同様とするのが好ましい。
【０１８５】
また、この浸漬は、バッグ２”および被処理液３の少なくとも一方に、振動または揺動を与えつつ行うのが好ましい。これにより、効率よくレジオネラ菌を担体１に付着させることができる。
【０１８６】
なお、本工程［１］は、被処理液３中にバッグ２”を浸漬する方法に代えて、バッグ２”に被処理液３を液滴として供給（噴霧またはシャワー）する方法を用いてもよい。ただし、前者の方法を用いることにより、担体１への被処理液３の接触をより簡便な操作で行うことができるという利点がある。
【０１８７】
［２］緩衝液を担体に接触させる工程（第２の工程）
次に、レジオネラ菌が付着した担体１に、緩衝液４を接触させ、担体１に付着したレジオネラ菌を緩衝液４中に遊離させて回収する。
【０１８８】
具体的には、まず、空の回収用容器（例えば、シャーレ等）２７ｂ”内に、バッグ２”を配置（載置）し、このバッグ２”に緩衝液４を液滴として供給（噴霧またはシャワー）する（図９（ｂ）参照）。
【０１８９】
これにより、供給された緩衝液４は、袋２１”の開口を通過して袋２１”内に浸入して、担体１と接触する。
【０１９０】
担体１に緩衝液４が接触すると、例えば、担体１の表面の荷電状態が変化すること等が一要因となり、担体１に付着していたレジオネラ菌が担体１から効率よく遊離する。
【０１９１】
そして、レジオネラ菌が浮遊する緩衝液４が、袋２１”の開口を通過して袋２１”外に流出して回収用容器２７ｂ”内に徐々に貯留する。
【０１９２】
ここで、緩衝液４の種類、浸透圧、温度、添加物の種類は、前記第１実施形態と同様とするのが好ましい。また、緩衝液４の使用量も、前記第１実施形態と同様とするか、それ以下の比較的少ない緩衝液の量が好ましい。具体的な緩衝液の量としては、５００〜１２００μＬ程度が好ましく、７００〜９００μＬ程度がより好ましい。
【０１９３】
なお、本工程［２］は、バッグ２”に緩衝液４を液滴として供給（噴霧またはシャワー）する方法に代えて、緩衝液４中にバッグ２”を浸漬する方法を用いてもよい。ただし、前者の方法を用いることにより、比較的少ない緩衝液４の使用量で、担体１からレジオネラ菌を効率よく遊離させることができるという利点がある。
【０１９４】
このような第４実施形態のキット（バッグ２”）によっても、前記第１実施形態と同様の効果が得られる。
【０１９５】
以上、本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法およびレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットについて説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、必要に応じて任意の工程が追加されてもよい。
【０１９６】
なお、本発明は、レジオネラ菌のみならず、例えば、大腸菌Ｏ１５７、黄色ぶどう球菌、コレラ菌、炭疽菌等の微生物を被処理液中から濃縮して溶出する場合に適用することができる。
【０１９７】
また、レジオネラ菌を濃縮及び溶出する目的は、レジオネラ菌を検出する目的に限定されるものではない。例えば、前記第２実施形態のキットは、公衆浴場やプール等の水を循環して使用する施設において、循環ラインの途中に設置し、循環水中からレジオネラ菌を除去する用途として用いることができる。また、前記第４実施形態のキットは、前記施設において、浴槽内やプール内に貯留される水中に浸漬しておけば、同様に、貯留水からレジオネラ菌を除去する用途として用いることができる。なお、いずれのキットにおいても、前記第２の工程においてレジオネラ菌を遊離させることにより、繰り返して利用することが可能となる。
【０１９８】
また、本発明を用いれば、被処理液中からレジオネラ菌を濃縮及び溶出する目的に限らず、単に、被処理液中からレジオネラ菌を回収する場合にも適用することができる。
【実施例】
【０１９９】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１−１．キットの作製
平均粒径８０μｍのハイドロキシアパタイト多孔質粒子１ｇ（比表面積４０ｍ２／ｇ、容積：約１．６ｍＬ）を、容量：２０ｍＬのエコノパックカラム（バイオラッド社製）に充填して、図７に示すようなカラム（キット）を作製した。なお、２枚のフィルタ開口径は、それぞれ、１０μｍである。
【０２００】
１−２．レジオネラ菌の濃縮
レジオネラ菌を含有する浴槽水（被処理液）を用意した。
【０２０１】
（実施例１）
まず、２５±１℃、ｐＨ７．５、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４）を、キットの容器内を通過させ、カラム本体内をリン酸緩衝液で満たした。
【０２０２】
次に、２５±１℃の浴槽水（原液）：５００ｍＬを、注入口からカラム本体内に供給し、排出口から流出する浴槽水を回収した。このとき、浴槽水の通過時間は、約１８０分であり、通液の流速は、約２．７ｍＬ／ｍｉｎである。
【０２０３】
次に、２５±１℃、ｐＨ７．５、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４）：２．５ｍＬを、注入口からカラム本体内に注入し、排出口から流出するリン酸緩衝液（回収液）を回収した。このとき、リン酸緩衝液の通過時間は、約５０秒であり、リン酸緩衝液の流速は、約２ｍＬ／ｍｉｎである。
【０２０４】
（実施例２〜４）
リン酸緩衝液の濃度を、表１に示すように変更した以外は、前記実施例１と同様にして、レジオネラ菌を濃縮した。
【０２０５】
（実施例５〜８）
リン酸緩衝液の濃度および流速を、表１に示すように変更した以外は、前記実施例１と同様にして、レジオネラ菌を濃縮した。
【０２０６】
（比較例１、２）
リン酸緩衝液の濃度を、表１に示すように変更した以外は、前記実施例１と同様にして、レジオネラ菌を濃縮した。
【０２０７】
１−３．評価
原液および回収液の一部を、それぞれ採取し、各サンプルに対して、それぞれレジオネラ菌の菌数測定を培養法により行った。また、回収液の一部について、イムノクロマト法により菌体の検出を行った。
【０２０８】
培養法による菌数の測定結果を図１０に、イムノクロマト法による菌体の検出結果を表１に示す。また、流速と、濃縮倍率の関係を図１１に示す。ここで、図１１においてグラフの縦軸の数値は、単位体積あたり、回収液中の菌数が、原液中の菌数の何倍になったかを表し、数値が大きい程、濃縮の程度が大きいことを示す。
【０２０９】
【表１】
2006296417.tif 000003
【０２１０】
なお、イムノクロマト法による菌体の検出結果において、「＋」は陽性、「±」は弱陽性（疑陽性）、「−」は陰性を示す。
【０２１１】
図１０および表１に示すように、各実施例の回収液中には、培養法およびイムノクロマト法のいずれの方法によっても、レジオネラ菌が検出された。
【０２１２】
これに対して、比較例１の回収液中には、培養法およびイムノクロマト法のいずれの方法によっても、レジオネラ属菌がほとんど検出されなかった。
【０２１３】
また、比較例２の回収液中には、培養法ではレジオネラ菌が検出されたものの、イムノクロマト法ではレジオネラ菌が検出されなかった。これは、イムノクロマト法では、回収液中に高濃度に存在する緩衝剤により抗原抗体反応が阻害され、これにより菌の検出が阻害されたからと考えられる。
【０２１４】
また、各実施例では、それぞれ、原液単位体積当りのレジオネラ菌の菌数に対して、回収液単位体積当りのレジオネラ菌の菌数は、明らかに多かった。
【０２１５】
このことから、濃度２５〜５００ｍＭで緩衝剤を含有する緩衝液を用いること（本発明）により、レジオネラ菌が担体から効率よく遊離し、緩衝液（回収液）中に濃縮及び溶出できること、また、濃縮された菌をイムノクロマ法により検出可能であることが明らかとなった。
【０２１６】
また、図１１に示すように、レジオネラ菌の濃縮倍率は、緩衝液の流速が速くなる程、低くなる傾向が見られる。
【０２１７】
そして、緩衝液の流速を被処理液の流速の０．５〜３倍（特に、０．５〜１．５倍）とすることにより、レジオネラ菌の濃縮倍率が上昇することが明らかとなった。
【０２１８】
また、ナイロン粒子（基材）とハイドロキシアパタイト粒子とを用意し、これらをＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、４５℃で５分間稼動させた。これにより、図１に示すような担体を得た。なお、得られた担体は、その表面付近が多孔質なものであった。
【０２１９】
そして、この担体を用いて、前記実施例１〜８および比較例１、２と同様にして、浴槽水からレジオネラ菌の濃縮を行ったところ、前記と同様の結果が得られた。
【０２２０】
２−１．キットの作製
平均粒径１００μｍのハイドロキシアパタイト多孔質粒子１ｇ（比表面積４０ｍ２／ｇ）を、目開き７６μｍのナイロン（ポリアミド）製の袋に収納して、図８に示すようなバッグ（キット）Ａを作製した。なお、キットＡは、６個作製した。
また、目開き４２μｍ、２０μｍのナイロン製の袋を用いて、それぞれ、キットＢおよびＣを作製した。
【０２２１】
２−２．レジオネラ菌の濃縮
レジオネラ菌液を、ｐＨ６．８、１ｍＭのリン酸緩衝液で１０００倍に希釈して、被処理液とした。
【０２２２】
（実施例１１）
まず、ビーカー内に被処理液５００ｍＬを収納し、この被処理液（２５±１℃）にキットＡを振盪しつつ浸漬した。
次に、２．５時間経過後、被処理液からキットＡを取り出し、余分な水分を除去した。
次に、シャーレ内にキットＡを配置し、２５±１℃、ｐＨ７．５、２５０ｍＭのリン酸緩衝液８００μＬをシャワー状に供給した後、３分間放置した。その後、シャーレからキットＡを取り出した。
【０２２３】
（実施例１２〜１６）
被処理液へのキットＡの浸漬時間を、表２に示すように変更した以外は、前記実施例１１と同様にして、レジオネラ菌を濃縮した。
【０２２４】
（実施例１７）
キットＢを用い、被処理液へのキットＢの浸漬時間を、表２に示すようにした以外は、前記実施例１１と同様にして、レジオネラ菌を濃縮した。
【０２２５】
（実施例１８）
キットＣを用い、被処理液へのキットＣの浸漬時間を、表２に示すようにした以外は、前記実施例１１と同様にして、レジオネラ菌を濃縮した。
【０２２６】
２−３．評価
各シャーレ内のリン酸緩衝液（回収液）を１００μＬ採取して、それぞれイムノクロマト法により菌体の検出を行った。
イムノクロマト法による菌体の検出結果を表２に示す。
【０２２７】
【表２】
2006296417.tif 000004
【０２２８】
なお、イムノクロマト法による菌体の検出結果において、「＋」は陽性、「±」は弱陽性（疑陽性）、「−」は陰性を示す。
【０２２９】
表２に示すように、同一のキットＡを用いた場合、浸漬時間を７．５時間以上にすることにより、より正確にレジオネラ菌の濃縮（検出）を行い得ることが確認された。
【０２３０】
また、袋の目開き２０〜８５μｍの範囲では、レジオネラ菌の濃縮（検出）結果に差異は確認されなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】本発明で用いられる担体の一例を示す断面図である。
【図２】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第１実施形態で使用されるキットを示す模式図（内部透視図）である。
【図３】図２に示すキットが折り畳まれた状態を示す模式図である。
【図４】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第１実施形態を説明するための模式図である。
【図５】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第２実施形態で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを示す模式図（内部透視図）である。
【図６】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第２実施形態を説明するための模式図である。
【図７】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第３実施形態で使用されるキットを示す模式図（内部透視図）である。
【図８】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第４実施形態で使用されるレジオネラ菌の濃縮及び溶出キットを示す模式図である。
【図９】本発明のレジオネラ菌の濃縮及び溶出方法の第４実施形態を説明するための模式図である。
【図１０】各液体中のレジオネラ菌の菌数を示すグラフである。
【図１１】リン酸緩衝液の流速と、濃縮倍率の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０２３２】
１            担体
１１          基材
１２          リン酸カルシウム系化合物層
１３          粒子
２            キット
２０          収納空間
２１          容器
２１１        側壁部
２１２        上壁部
２１３        底壁部
２２          注入口
２３          排出口
２４、２５    栓
２６          フィルタ
２’          カラム
２０’        充填空間
２１’        カラム本体
２２’        注入口
２３’        排出口
２６ａ’、２６ｂ’  フィルタ
２７ａ’、２７ｂ’  回収用容器
２”          バッグ
２１”        袋
２２”        紐
２７ａ”      容器
２７ｂ”      回収用容器
３            被処理液
４            緩衝液
１００        シリンジ
１１０        先端部
【図１】
2006296417.tif 000005
【図２】
2006296417.tif 000006
【図３】
2006296417.tif 000007
【図４】
2006296417.tif 000008
【図５】
2006296417.tif 000009
【図６】
2006296417.tif 000010
【図７】
2006296417.tif 000011
【図８】
2006296417.tif 000012
【図９】
2006296417.tif 000013
【図１０】
2006296417.tif 000014
【図１１】
2006296417.tif 000015