(57)【要約】      （修正有）【課題】新規初乳関連血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパクの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列で示される単離かつ精製された初乳関連血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質、または該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加及び／もしくは欠失されており、かつムチン３（ＭＵＣ−３）産生を刺激できる当該ＳＡＡタンパク質のサイレント変異体であって、当該タンパク質のＮ末端領域に存在する配列ＴＦＬＫをさらに特徴とするタンパク質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離および精製初乳関連血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質であって、前記タンパク質のＮ末端領域に存在する配列ＴＦＬＫをさらに特徴とするタンパク質。
【請求項２】
ウマ初乳から単離および精製される請求項１記載のＳＡＡ。
【請求項３】
（配列番号３）または（配列番号４）、ならびに（配列番号５）、（配列番号６）、（配列番号７）および（配列番号８）から成る群から選択される１つまたはそれ以上の配列を含む請求項２記載のＳＡＡ。
【請求項４】
ウシ初乳から単離および精製される請求項１記載のＳＡＡ。
【請求項５】
アミノ酸（配列番号１）を含む請求項４記載のＳＡＡ。
【請求項６】
ヒツジ初乳から単離および精製される請求項１記載のＳＡＡ。
【請求項７】
アミノ酸（配列番号２）を含む請求項６記載のＳＡＡ。
【請求項８】
請求項１記載の初乳関連ＳＡＡをコードする精製および単離核酸分子。
【請求項９】
（配列番号１２）と93％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む請求項８記載の核酸分子。
【請求項１０】
（配列番号１２）を含む請求項９記載の核酸分子。
【請求項１１】
プロモーター領域と作用可能式に連結される請求項８記載の核酸分子を含む発現カセット。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現カセットを含むクローニングまたは発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載のベクターで形質転換される真核生物または原核生物宿主細胞。
【請求項１４】
１つまたはそれ以上の（配列番号１〜８）あるいはそれらの保存的修飾化変異体をコードする配列を含む請求項８記載の核酸分子。
【請求項１５】
１つまたはそれ以上のアミノ酸配列番号１〜８を逆翻訳することによって得られる配列を有し、初乳ＳＡＡをコードする遺伝子またはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドの集団。
【請求項１６】
請求項１記載の初乳ＳＡＡの１つまたはそれ以上のエピトープに対して免疫学的に特異的な抗体。
【請求項１７】
ポリクローナルである請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
モノクローナルである請求項１６記載の抗体。
【請求項１９】
初乳ＳＡＡを血清ＳＡＡと識別する請求項１記載の初乳ＳＡＡの少なくとも１つのエピトープに対して免疫学的に特異的である請求項１６記載の抗体。
【請求項２０】
哺乳類からの初乳関連ＳＡＡの生成方法であって、以下の：
ａ）哺乳類からの初乳の試料を提供し、そして
ｂ）試料中に含有されるＳＡＡを試料中に含有される他の物質から分離し、それにより哺乳類からのＳＡＡを生成する
過程を包含する方法。
【請求項２１】
哺乳類がウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヒトから成る群から選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０記載の方法により製造されるＳＡＡ。
【請求項２３】
有効量の初乳関連血清アミロイドＡタンパク質であって、Ｎ末端ＴＦＬＫ領域を含むタンパク質、ならびに製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物。
【請求項２４】
前記タンパク質が配列番号１〜８またはそれらの保存的修飾化変異体を含む請求項２３記載の製剤組成物。
【請求項２５】
前記タンパク質が（配列番号１３）を含む請求項２３記載の製剤組成物。
【請求項２６】
前記担体が水である請求項２３記載の製剤組成物。
【請求項２７】
前記担体が食塩水である請求項２３記載の製剤組成物。
【請求項２８】
賦形剤をさらに含む請求項２３記載の製剤組成物。
【請求項２９】
前記賦形剤がラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールから成る群から選択される充填剤である請求項２８記載の製剤組成物。
【請求項３０】
経口投与形態である請求項２３記載の製剤組成物。
【請求項３１】
動物における腸病原体に関連した疾患の治療および予防方法であって、ＴＦＬＫモチーフＮ末端配列を含む有効量のタンパク質であって、ＭＵＣ３上皮細胞を誘導し得るタンパク質、ならびに製薬上許容可能な担体を前記動物に導入することを包含する方法。
【請求項３２】
前記配列が粘膜上皮細胞においてＭＵＣ３産生を刺激し得る請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質が初乳関連血清アミロイドＡタンパク質である請求項31記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質が（配列番号１７）である請求項31記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｎ末端アミノ酸配列が（配列番号３０）またはその保存的修飾化変異体である請求項31記載の方法。
【請求項３６】
前記腸病原体が大腸菌である請求項31記載の方法。
【請求項３７】
前記疾患が旅行者下痢、壊死性腸炎および尿路感染から成る群から選択される請求項31記載の方法。
【請求項３８】
（配列番号３０）またはその保存的修飾化変異体を含む有効量のタンパク質を用いる乳児処方箋を包含する乳児処方箋製剤。
【請求項３９】
初乳関連ＳＡＡタンパク質コードヌクレオチド配列の同定方法であって、ストリンジェント条件下で（配列番号１２）またはその7〜10連続塩基とハイブリダイズする配列に関してＤＮＡの試料を検定することを包含する方法。
【請求項４０】
単離および精製初乳血清アミロイドＡタンパク質であって、初乳中に存在し、ラット抗ＳＡＡ（ヒト）モノクローナル抗体であって、ウシＳＡＡアイソフォームと反応する抗体と反応するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および哺乳類免疫系の分野に関する。特に本発明は、初乳中に見出される血清アミロイドＡの新規のアイソフォームを提供する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの化学的または特許出版物は、本発明が関係する業界の状態を説明するために本特許出願中で参照される。これらの出版物は各々、その記載内容が、参照により本明細書中に含まれる。
【０００３】
哺乳類は、さらなる組織損害を防止し、損害組織の修復を開始し、そして感染生物体を単離および破壊するための努力において複雑な一連の生物学的反応を実行することにより、組織損傷、外傷または感染に応答する。この過程は炎症応答と呼ばれ、その早期および中間段階は急性期応答と呼ばれる。
【０００４】
急性期応答は、広範な種々の媒介物質、例えばサイトカイン、インターロイキンおよび腫瘍壊死因子を包含する。それは、肝臓の生合成プロフィールにおける根本的変化も包含する。正常環境下では、肝臓は一連の血漿タンパク質を定常状態濃度で合成する。これらのタンパク質のいくつか、即ち「急性期」タンパク質は、炎症応答においては、正常条件下で見出されるレベルの何倍ものレベルに誘導される。急性期タンパク質は、Steel & Whitehead(Immunology Today 15: 81-87, 1994)により再検討されている。
【０００５】
大量に誘導される急性期タンパク質の1つが、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）である。ＳＡＡは実際に、多数の哺乳類種における多数の遺伝子によりコードされる多型タンパク質のファミリーを含む。ＳＡＡは累積し、炎症応答の急性期中に高密度リポタンパク質３（ＨＤＬ３）と迅速に会合する小アポリポタンパク質である。ほとんどのＳＡＡアイソフォームは、炎症に応答して誘導される。しかしながら、ある種のＳＡＡ（例えばヒトＳＡＡ４）は、構成的に発現されるかまたは炎症応答に際して最小度に誘導されると考えられる。
【０００６】
肝臓は、ＳＡＡ産生の主要部位であると考えられてきた。しかしながら、肝臓外のＳＡＡ産生が、限定的に見出された。例えばＳＡＡｍＲＮＡの発現は、ヒトアテローム硬化症病変において、ならびにヒト培養平滑筋細胞および単球／マクロファージ細胞株において報告されており（Meek et al., 1994; Urieli-Shoval et al., 1994; Yamada et al., 1996）、そしてＳＡＡの独特のアイソフォーム（ＳＡＡ３）がウサギ滑膜繊維芽細胞により産生される（Mitchell et al., J. Clin. Invest. 87:1177-1185, 1991）。さらに近年、ＳＡＡｍＲＮＡが多数の組織学的に正常な上皮組織、例えば胃、小腸、扁桃、乳房、前立腺、甲状腺、肺、膵臓、腎臓、皮膚および脳ニューロンにおいて広範に発現される、ということが発見された（Urieli-Shoval et al., J. Histochem. Cytochem. 46:1377-1384, 1998）。このような組織におけるＳＡＡの役割は明らかにされておらず、それらの組織中に存在するＳＡＡが血清中に見出されるものと同一アイソフォームであるか否か、あるいはそれらがＳＡＡの付加的アイソフォームを表すか否かは確定されていない。
【０００７】
発明の要約
本発明の一局面によれば、哺乳類初乳から単離および精製され、そして乳腺の管状上皮細胞により産生される血清アミロイド（ＳＡＡ）タンパク質が提供される。一実施態様では、ＳＡＡは、ウマ初乳から単離および精製される。好ましくはウマ初乳ＳＡＡは、（配列番号３）または（配列番号４）、ならびに（配列番号５）、（配列番号６）、（配列番号７）および（配列番号８）から成る群から選択される１つまたはそれ以上の配列を含む（図1参照）。
【０００８】
別の実施態様では、ＳＡＡはウシ初乳から単離および精製され、好ましくは（配列番号１）であるＮ末端アミノ酸配列を含む。
【０００９】
あるいは、ＳＡＡは、ヒツジ初乳から単離および精製され、好ましくは（配列番号２）であるＮ末端アミノ酸配列を含む。さらに初乳ＳＡＡのＮ末端配列からのアミノ酸領域はほとんどの種の間で保存されることが示されており、そして分子の重要な特性のいくつかに関する分子の活性部分を含有する。
【００１０】
本発明の別の局面によれば、哺乳類初乳ＳＡＡをコードする単離核酸分子が提供される。核酸分子は遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであり、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましい実施態様では、核酸分子は１つまたはそれ以上の（配列番号1〜８）をコードする配列、あるいはそれらの保存的修飾化変異体を含む。最も好ましい実施態様では、核酸分子は、（配列番号１２）（図２参照）またはそれらの保存的修飾化変異体、例えばその他の初乳ＳＡＡ配列、同様に同定された配列、あるいは本明細書中の教示に記載されるような初乳関連ＳＡＡをコードする任意のその他の核酸を含む。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列番号１〜８を逆翻訳することにより得られる合成オリゴヌクレオチドの集団が提供される。オリゴヌクレオチドのこの集団の１つまたはそれ以上の成員は、初乳ＳＡＡをコードする遺伝子またはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、初乳ＳＡＡの１つまたはそれ以上のエピトープに対して免疫学的に特異的な抗体が提供される。好ましくは抗体は、初乳ＳＡＡを血清ＳＡＡと識別する初乳ＳＡＡの少なくとも１つのエピトープに対して免疫学的に特異的である。
【００１３】
本発明の別の局面によれば、哺乳類からＳＡＡを生成するための方法が提供される。本方法は、以下の：（１）哺乳類からの初乳の試料を提供し、そして（２）試料中に含有されるＳＡＡを試料中に含有される他の物質から分離し、それにより哺乳類からのＳＡＡを生成するという過程を包含する。この方法により製造されるＳＡＡも提供される。
【００１４】
本発明によれば、新規の初乳関連ＳＡＡ、特に高度保存領域（ＴＦＬＫ）は、ムチン３（ＭＵＣ３）産生を刺激する能力も有する。したがって初乳関連ＳＡＡは、腸感染、あるいはその他のムチン抑制性疾患状態、例えば旅行者下痢、乳児下痢、壊死性腸炎および尿路感染を治療お呼び予防するために、そして家畜動物における下痢の予防のための獣医学に用いられ得る。したがって本発明は、これらのならびに同様の病状を有するその他の疾患を治療するための製薬的有効量の初乳関連ＳＡＡペプチドおよび担体を含む製剤組成物を包含する。最後に、ムチンを産生する粘膜表面のその他の上皮細胞裏張り、例えば鼻咽頭、膀胱等も、それに関連した感染を予防または治療するためのムチン産生を刺激するために、本発明の製剤組成物で治療され得る。
【００１５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の図面、詳細な説明および実施例を参照することによりさらに良く理解される。
【発明の開示】
【００１６】
Ｉ．定義
本発明の組成物および方法に関する種々の用語は、前記の本明細書中で、そして明細書全体および特許請求の範囲でも用いられる。
【００１７】
単位、冠詞および記号は、それらのＳＩ容認形態で示され得る。別記しない限り、それぞれ、核酸は、５‘−３’配向で左から右に記述される。アミノ酸配列は、左から右にアミノ−カルボキシ配向で記述される。数値範囲はその範囲を限定する数を含め、そして限定範囲内の各整数を含む。アミノ酸は、本明細書中では、それらの一般的に既知の3つの文字記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨された一文字記号により示され得る。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に容認された一文字暗号により示され得る。別記しない限り、ソフトウエア、電気および電子用語は、本明細書中で用いる場合、The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms(5th edition, 1993)で定義されたものと同様である。以下で定義される用語は、全体として本明細書を参照することによりさらに詳細に定義される。
【００１８】
「増幅される」とは、鋳型として少なくとも１つの核酸配列を用いた核酸配列の多重コピーまたは核酸配列と相補的な多重コピーの構築を意味する。増幅系としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ、Canteen, Mississauga, Ontario）、Ｑ−βレプリカーゼ系、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）および標準置換増幅（ＳＤＳ）が挙げられる（例えば、Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D.H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C.(1993)参照）。増幅の生成物は、アンプリコンと呼ばれる。
【００１９】
「抗体」という用語は、抗原結合形態の抗体（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）2）への言及を含む。「抗体」という用語はしばしば、単数または複数の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチド、あるいは分析物（抗原）を特異的に結合し、認識するそれらの断片を指す。しかしながら、種々の抗体断片は無傷抗体の消化の点から定義され得るが、一方、このような断片は、化学的にまたは組換えＤＮＡ法を利用することによりde novoで合成され得る、と当業者は理解する。したがって抗体という用語は、本明細書中で用いる場合、抗体断片、例えば一本鎖Ｆｖ、キメラ抗体（即ち、異なる種からの定常部および可変部を含む）、ヒト化抗体（即ち、非ヒト供給源からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）ならびにヘテロ接合抗体（例えば、二重特異性抗体）も含む。
【００２０】
本明細書中で用いる場合、「アンチセンス配向」は、アンチセンス鎖が転写される配向でプロモーターと作用可能式に連結される二重鎖ポリヌクレオチド配列への言及を含む。アンチセンス鎖は、内在性転写産物の翻訳がしばしば抑制されるよう、内在性転写産物と十分に相補的である。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、「初乳関連血清アミロイドＡ」、「初乳関連ＳＡＡ」および／または「初乳ＳＡＡ」は互換的に用いられ、それらの例としては本明細書中に開示された配列、それらの保存的修飾化変異体、供給源とは関係なく任意のその他の、初乳ＳＡＡの生物学的特性を保持する、そして本明細書中に開示された検定により実証されるような変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、「染色体領域」は、それが含む線状セグメントに対する参照により測定され得る染色体の長さへの言及を含む。染色体領域は、２つの独特のＤＮＡ配列、即ちマーカーに対する参照により限定され得る。
【００２３】
「保存的修飾化変異体」という用語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的修飾化変異体は、アミノ酸配列の同一または保存的修飾化変異体をコードする核酸を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定の核酸をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンは、コードポリペプチドを変えることなく、記載された対応するコドンのいずれかに変えられうる。このような核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的修飾化変異のある種を示す。遺伝暗号に対する参照によりポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列は、核酸のすべての考え得るサイレント変異を記載する。核酸中の各コドン（普通はメチオニンに関する唯一のコドンであるＡＵＧ、並びに普通はトリプトファンに関する唯一のコドンであるＵＧＧは除く）は修飾されて、機能的に同一の分子を生じ得る、と当業者は認識する。したがって、本発明のポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の記載されたポリペプチド配列中に含蓄的であり、本発明の範囲内である。
【００２４】
アミノ酸に関しては、コード配列中の単一アミノ酸または小パーセンテージのアミノ酸を変更し、付加しまたは欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、変更がアミノ酸の化学的に同様のアミノ酸との置換を生じる「保存的修飾化変異体」である、と当業者は認識する。したがって、1〜15から成る整数の群から選択されるアミノ酸残基の任意の数は、そのように変更され得る。したがって、例えば１、２、３、４、５、７または10の変更が成され得る。保存的修飾化変異体は、典型的には、それらが由来する非修飾化ポリペプチド配列と同様の生物学的活性を提供する。例えば、基質特異性酵素活性またはリガンド／受容体結合は一般に、そのネイティブ基質に関するネイティブタンパク質の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％である。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表が、当業界では周知である。
【００２５】
以下の６つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
Creighton (1984) Proteins W.H.Freeman and Companyも参照されたい。
【００２６】
「コードする」または「コードされる」とは、特定の核酸に関して、特定のタンパク質への翻訳に関する情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳化領域内に非翻訳化配列（例えばイントロン）を含み得るか、またはこのような介在非翻訳化配列を欠くことがある（例えば、ｃＤＮＡ中のように）。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用により特定される。典型的には、アミノ酸配列は、「普遍的」遺伝暗号を用いて核酸によりコードされる。しかしながら、普遍的暗号の変異体、例えばいくつかの植物、動物および真菌ミトコンドリア、細菌のマイコプラズマ属のMycoplasma capricolumまたは繊毛虫類大核中に存在するものは、核酸がその中で発現される場合に用いられ得る。
【００２７】
核酸が合成的に調製または変更される場合、利点は、核酸が発現される意図された宿主の既知のコドン選択を採用し得ることである。例えば本発明の核酸配列は単子葉類および双子葉類植物種の両方で発現され得るが、しかし配列は、単子葉類または双子葉類の特定のコドン選択およびＧＣ含量選択は異なることが示されているので、これらの選択を説明するよう修飾され得る（Murray et al., Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)）。したがって、特定のアミノ酸に関するトウモロコシの好ましいコドンは、トウモロコシからの既知の遺伝子配列に由来する。トウモロコシ植物体からの28の遺伝子に関するトウモロコシコドン使用法は、Murray等（上記）の表４に列挙されている。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、特定ポリヌクレオチドまたはそのコードタンパク質と関連した「全長配列」とは、ネイティブ（非合成性）、内生的、生物学的活性形態の特定タンパク質の全アミノ酸配列を有することを意味する。配列が全長であるか否かを確定するための方法は当業界で周知であり、その例としては、ノーザンまたはウエスタンブロット、プライマー伸長、Ｓ１プロテクションおよびリボヌクレアーゼプロテクションといった技法が挙げられる（例えば、Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997)参照）。既知の全長相同（オルトおよび／またはパラ）配列との比較を用いて、本発明の全長配列を同定することもできる。さらに、典型的にはｍＲＮＡの５‘および３’非翻訳化領域に存在するコンセンサス配列は、全長としてのポリヌクレオチドの同定に役立つ。例えばコンセンサス配列ＡＮＮＮＮＡＵＧＧ（ここで、下線を付したコドンはＮ末端メチオニンを表す）は、ポリヌクレオチドが完全５‘末端を有するか否かを確定するのに役立つ。３’末端のコンセンサス配列、例えばポリアデニル化配列は、ポリヌクレオチドが完全３‘末端を有するか否かを確定するのに役立つ。
【００２９】
タンパク質またはペプチドに関して、「単離タンパク質（またはペプチド）」または「単離および精製タンパク質（またはペプチド）」という用語は、時々本明細書中で用いられる。この用語は、「実質的に純粋」形態で存在するように、それが天然で一緒になっている他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を指す。あるいはこの用語は単離核酸分子の発現により生成されるタンパク質を示し得る。
【００３０】
核酸分子に関して、「単離核酸」という用語が時々用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来した生物体の天然ゲノム中でそれが直接隣接する（５‘および３’方向に）配列から分離されるＤＮＡ分子を指す。例えば「単離核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクター中に挿入されるかまたは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれるＤＮＡ分子を含み得る。「単離核酸分子」は、ｃＤＮＡ分子も含み得る。
【００３１】
ＲＮＡ分子に関しては、「単離核酸」という用語は、前記のような単離ＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を主として指す。あるいは、本用語は、それが「実質的に純粋」形態（「実質的に純粋」という用語は、以下で説明する）で存在するように、それがその天然状態で（即ち細胞または組織中で）会合されるＲＮＡ分子から十分に分離されたＲＮＡ分子を示し得る。
【００３２】
本明細書中で用いる場合、核酸と関連して「異種」とは、外来種から生じる核酸、あるいは同一種から生じる場合には、慎重なヒトの介入により組成および／またはゲノム座においてそのネイティブ形態から実質的に修飾される核酸である。例えば、異種構造遺伝子と作用可能式に連結されたプロモーターは、構造遺伝子が由来した種と異なる種からであり、あるいは同一種からの場合には、一方または両方がそのオリジナル形態から実質的に修飾される。異種タンパク質は外来種から生じ得るし、あるいは同一種からである場合には、慎重なヒトの介入によりそのオリジナル形態から実質的に修飾される。
【００３３】
「宿主細胞」とは、ベクターを含有し、ベクターの複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核生物細胞、例えば大腸菌、あるいは真核生物細胞、例えば酵母菌、昆虫、鳥類または哺乳類細胞であり得る。好ましくは宿主細胞は、単子葉または双子葉植物細胞である。特に好ましい単子葉宿主細胞は、トウモロコシ宿主細胞である。
【００３４】
「ハイブリダイゼーション複合体」という用語は、互いに選択的にハイブリダイズされた２つの一本鎖核酸配列により形成される二重鎖核酸構造への言及を含む。
【００３５】
細胞中に核酸を挿入するという情況において「導入される」という用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸が、細胞のゲノム中に組入れられ（例えば染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）、自律性レプリコンに変換され、あるいは一時的に発現され（例えばトランスフェクト化ｍＲＮＡ）得る真核生物または原核生物細胞中への核酸の組入れへの言及を含む。
【００３６】
別記しない限り、「初乳関連ＳＡＡコード核酸」という用語は、本発明の核酸であり、初乳関連ＳＡＡをコードする本発明のポリヌクレオチドを含む核酸を意味する。「初乳関連ＳＡＡ遺伝子」とは本発明の遺伝子であり、異種ゲノム形態の全長初乳関連ＳＡＡポリヌクレオチドを指す。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、特定マーカーに関して「それによりおよびそれを含めて限定される染色体領域内に局在化される」とは、所定のマーカーによりおよびそれを含めて限定される染色体の連続長への言及を含む。
【００３８】
本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、染色体上の独特の位置を同定するのに役立つ染色体上の遺伝子座への言及を含む。「多型マーカー」とは、異なる形態のマーカーが、それらが相同対で存在する場合に、その対の染色体の各々の伝達を追跡得るよう、多重形態（対立遺伝子）で出現するマーカーへの言及を含む。遺伝子型は、１つまたは複数のマーカーの使用により限定され得る。
【００３９】
本明細書中で用いる場合、「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーへの言及を含み、別記しない限り、天然ヌクレオチド（例えばペプチド核酸）と同様の方法で一本鎖核酸とハイブリダイズする天然ヌクレオチドの不可欠な性質を有する既知の類似体を包含する。
【００４０】
「核酸ライブラリー」とは、特定生物体のゲノムの全転写分画を含みそして実質的に示す単離ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の集合を意味する。例示的核酸ライブラリー、例えばゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーの構築は、標準的分子生物学参考文献、例えば、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning-A laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989); およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1994)に教示されている。
【００４１】
本明細書中で用いる場合、「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボポリヌクレオチド、リボポリヌクレオチド、またはストリンジェント下で、天然ヌクレオチドと実質的に同一のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、および／または天然ヌクレオチド（単数または複数）と同一アミノ酸（単数または複数）への翻訳を可能にする天然リボヌクレオチドの不可欠な性質を有するそれらの類似体への言及を含む。ポリヌクレオチドは、ネイティブまたは異種の構造または調節遺伝子の全長または亜配列であり得る。別記しない限り、本用語は、特定の配列ならびにその相補的配列への言及を含む。したがって、安定性のためにまたはその他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書中で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、ちょうど２つの例を挙げると、普通でない塩基、例えばイノシン、または修飾化塩基、例えばトリチル化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本用語が本明細書中で用いられるようなポリヌクレオチドである。当業者に既知の多数の有用な目的に役立つ非常に種々の修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに成されてきた。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書中で用いられる場合、このような化学的、酵素的または代謝的修飾化形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞、例えばとりわけ単一および複合細胞に特徴的である化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００４２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中では互換的に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用する。天然アミノ酸のこのような類似体の不可欠な性質は、タンパク質中に組入れられた場合、そのタンパク質が、同一タンパク質に引き出される抗体と特異的に反応するが、しかし全体的に天然アミノ酸から成るというものである。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は修飾も中に含み、その例としてはリン酸化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＩＤＰ−リボシル化が挙げられるが、これらに限定されない。周知のように、そして前記したように、ポリペプチドはすべて線状というわけではない、と理解される。例えばポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝され、それらは、一般的に翻訳後事象として、例えば天然プロセッシング事象および天然では起きないヒト操作によりもたらされる事象の結果として、分枝を伴うこともある、環状であり得る。環状分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳天然過程により、そして全合成法により同様に合成され得る。さらに本発明は、本発明のタンパク質のメチオニン含有およびメチオニン非含有アミノ末端変異体の両方の使用を意図する。タンパク質にかんして、「Ｎ末端領域」という用語は、タンパク質のアミノ末端に隣接する約50個のアミノ酸を含む。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、「ＴＦＬＫモチーフ」とは、アミノ酸によるにせよ、別の方法にせよ、初乳ＳＡＡのＴＦＬＫ活性部位の構造的完全性および生物学的活性を保持するあらゆる処方物を含む。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、「組換え体」は、異種核酸の導入により修飾された、または細胞がそのように修飾された細胞に由来する細胞またはベクターへの言及を含む。したがって、例えば組換え体細胞は、ネイティブ（非組換え体）形態の細胞内の同一形態に見出されない遺伝子を発現し、あるいはそうでなければ異常に発現されるか、または不完全発現されるかまたは全く発現されないネイティブ遺伝子を、慎重なヒト介入の結果として発現する。「組換え体」という用語は、本明細書中で用いる場合、天然事象（例えば、自発性突然変異、天然形質転換／形質導入／転位）、例えば慎重なヒトの介入を伴わずに生じるものによる細胞またはベクターの変更を包含しない。
【００４５】
本明細書中で用いる場合、「組換え体発現カセット」とは、宿主細胞中での特定の核酸の転写を可能にする一連の特定核酸素子を有する、組換え敵または合成的に生成された核酸構築物である。組換え体発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片中に組入れられ得る。典型的には、発現ベクターの組換え体発現カセット部分としては、他の配列の間で、転写される核酸、およびプロモーターが挙げられる。
【００４６】
「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」という用語は、互換的に用いられて、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（集合的に「タンパク質」）に組入れられるアミノ酸を指す。アミノ酸は天然アミノ酸であり、別記しない限り、天然アミノ酸と同様に機能し得る天然アミノ酸の非天然類似体を包含し得る。
【００４７】
「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブが、他の配列より検出可能的に大きい程度に（例えばバックグラウンドの少なくとも2倍）、その標的配列とハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なる環境では異なり得る。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブと100％相補的である標的配列が同定される（同種プロービング）。あるいはストリンジェンシー条件は、低度の類似性が検出されるよう、配列の多少の不適正性を可能にするように調整され得る（異種プローブ）。一般にプローブは、長さ約1000ヌクレオチド未満、任意に500ヌクレオチド未満である。
【００４８】
典型的にはストリンジェント条件は、塩濃度が約1.5 M未満のＮａイオン、典型的には約0.01〜1.0 MのＮａイオン濃度（または他の塩）で、ｐＨは7.0〜8.3、そして温度は短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）に関しては少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば50ヌクレオチドより大きい）に関しては少なくとも約60℃である。ストリンジェント条件は、不安定剤、例えばホルムアミドの付加によっても達成され得る。低ストリンジェンシー条件の例としては、37℃で30〜35％ホルムアミド、1 MＮａＣｌ、1％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液でのハイブリダイゼーション、ならびに50〜55℃での1ｘ〜2ｘＳＳＣ（20ｘＳＳＣ＝3.0 MＮａＣｌ／0.3 Mクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。中等度ストリンジェンシー条件の例としては、37℃で40〜45％ホルムアミド、1 MＮａＣｌ、1％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、ならびに50〜55℃での0.5ｘ〜1ｘＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、37℃で50％ホルムアミド、1 MＮａＣｌ、1％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、ならびに60〜65℃での0.1ｘＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。
【００４９】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の機能であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関しては、ＴｍはMeinkothとWahl(Anal. Biochem., 138:267-284(1984))の方程式から概算され得る：Ｔｍ＝81.5℃＋16.6（logＭ）＋0.41（％ＧＣ）−0.61（％form）−500/L；式中、Ｍは一価陽イオンのモル数であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは塩基対でのハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の50％が完全適正プローブとハイブリダイズする温度（限定イオン強度およびｐＨ下）である。温度は、各々不適正の1％に対して約1℃低減し、したがってハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調整して所望の同一性の配列とハイブリダイズさせ得る。例えば、≧90％同一性を有する配列を探す場合には、Ｔｍは10℃低減され得る。一般にストリンジェント条件は、限定イオン強度およびｐＨで、特定配列およびその相補体に関して熱融点（Ｔｍ）より低い約5℃であるよう選択される。しかしながら重度ストリンジェント条件は、熱融点（Ｔｍ）より1、2、3または4℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し、中等度ストリンジェント条件は、熱融点（Ｔｍ）より6、7、8、9または10℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し、低ストリンジェント条件は、熱融点（Ｔｍ）より11、12、13、14、15または20℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。方程式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、ならびに所望のＴｍを用いて、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動は固有に説明される、と当業者は理解する。所望程度の不適正が45℃（水性溶液）または32℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍを生じる場合、高温が用いられ得るようＳＳＣ濃度を増大するのが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995)に見出される。
【００５０】
「実質的に純粋」という用語は、少なくとも50〜60重量％の当該化合物（例えば核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質等）を含む調製物をさす。さらに好ましくは、調製物は少なくとも75重量％、最も好ましくは90〜99重量％の当該化合物を含む。純度は、当該化合物に適した方法（例えばクロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分析等）により測定される。
【００５１】
核酸配列およびアミノ酸配列は、核酸またはアミノ酸の類似配列を並べて、そのようにして差を限定するコンピュータープログラムを用いて比較され得る。ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）およびそこに用いられるパラメーターは、アミノ酸配列断片を並べるために多数の従業者により用いられる。しかしながら等価アラインメントおよび類似性／同一性査定は、任意の標準アラインメントソフトウエアの使用により得られる。例えば、ＧＣＧウィスコンシンパッケージバージョン9.1（Genetics Computer Group in Madison, Wisconsinから入手可能）およびベスト−フィットプログラムにより用いられるデフォルトパラメーター（ギャップ作製ペナルティー＝12、ギャップ延長ペナルティー＝4）も、配列同一性および類似性を比較するために用いられ得る。
【００５２】
「実質的に同一」という用語は、タンパク質の性質（即ち、タンパク質の構造、安定性特徴、基質特異性および／または生物学的活性）に実利的に影響を及ぼさない配列変動を有する核酸またはアミノ酸配列を指す。特に核酸配列に関して、「実質的に同一」という用語は主に、コード領域を、ならびに発現を支配する保存配列を指すよう、そしてコードポリペプチド中の同一アミノ酸をコードする縮重コドンまたは保存的置換アミノ酸をコードする代替的コドンを指すよう意図される。アミノ酸配列に関しては、「実質的に同一」という用語は一般に、構造または機能の決定に関与しないポリペプチドの領域における保存的置換および／または変異を指す。
【００５３】
「同一パーセント」および「類似パーセント」という用語も、アミノ酸および核酸配列間の比較に際して本明細書中で用いられる。アミノ酸配列について言及する場合、「同一パーセント」とは、配列分析プログラムにより比較アミノ酸配列中の同一アミノ酸に対して適合した被験アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを示す。「類似パーセント」とは、同一または保存アミノ酸に対して適合した被験アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。保存アミノ酸は、結果的に生じるタンパク質の三次構造を明らかに変えないよう、構造は異なるがしかし物理的特性は類似するものである。保存的置換は、Taylor(1986, J. Theor. Biol. 119:205)に定義されている。核酸分子に言及する場合、「同一パーセント」とは、配列分析プログラムにより同一ヌクレオチドに適合した被験核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。
【００５４】
抗体に関して、「免疫学的に特異的な」という用語は、当該タンパク質の１つまたはそれ以上のエピトープと結合するが、抗原性生物学的分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識せず且つ結合しない抗体を指す。
【００５５】
オリゴヌクレオチドまたはその他の一本鎖核酸分子に関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当業界で一般的に用いられる予定条件下で、即ちストリンジェント条件下でこのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相補的配列を有する2つの一本鎖核酸分子間の会合を指す（時としては「実質的に相補的である」といわれる）。特に本用語は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含入される実質的相補性配列とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、非相補性配列を有する一本鎖核酸とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの実質的排除を指す。
【００５６】
「コード配列」または「コード領域」とは、配列が発現された場合に、遺伝子産物を産生するのに必要な配列情報を有する核酸分子を指す。
【００５７】
「作用可能式に連結される」または「作用可能式に挿入される」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列がコード配列の発現を可能にするためにコード配列に関して適切な位置で核酸分子中に置かれることを意味する。この同一定義は、時としては、発現ベクター中の他の転写制御素子（例えばエンハンサー）の整列に適用される。
【００５８】
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞中でのコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化信号、ターミネーター等である。
【００５９】
「プロモーター」、「プロモーター領域」または「プロモーター配列」という用語は一般に、コード領域の５‘または３’側に、あるいはコード配列内またはイントロン内に見出され得る遺伝子の転写調節領域を指す。典型的には、プロモーターは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３‘方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。典型的５’プロモーター配列は転写開始部位によりその３‘末端で結合され、そして上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または素子を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ1を用いたマッピングにより便利に限定される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。
【００６０】
「ベクター」とは、セグメントの複製または発現を生じるよう、別の核酸セグメントが作用可能式に挿入され得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージ、コスミドまたはウイルスである。
【００６１】
「核酸構築物」または「ＤＮＡ構築物」という用語は、時としては、コード配列または適切な調節配列に作用可能式に連結され、細胞を形質転換するためにベクター中に素にされる配列を指す。この用語は、「形質転換ＤＮＡ」という用語と互換的に用いられ得る。このような核酸構築物は、当該遺伝子産物のためのコード配列を、選択可能マーカー遺伝子および／またはレポーター遺伝子とともに含有し得る。
【００６２】
「選択可能マーカー遺伝子」という用語は、発現された場合に、選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性を形質転換化細胞に付与する物質をコードする遺伝子を指す。
【００６３】
「レポーター遺伝子」という用語は、標準的方法により、直接的または間接的に容易に検出可能である生成物をコードする遺伝子を指す。
【００６４】
核酸構築物の「異種」領域とは、天然では大型分子に関連して見出されない大型分子内の核酸分子の同定可能なセグメント（単数または複数）である。したがって、異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、遺伝子は通常、供給源生物体のゲノム中の哺乳類ゲノムＤＮＡと側面を接しないＤＮＡと側面を接する。別の例では、異種領域は、コード配列それ自体が天然では見いだされない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するか、または合成配列がネイティブ遺伝子と異なるコドンを有するｃＤＮＡ）。対立遺伝子変異または天然突然変異せい事象は、本明細書中に記載するようなＤＮＡの異種領域を生じない。前記のような「ＤＮＡ構築物」という用語は、異種領域、特に細胞の形質転換に用いるために構築されたものを指すためにも用いられる。
【００６５】
このようなＤＮＡが細胞内部に導入された場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡにより「形質転換され」または「トランスフェクトされ」たという。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれることもある（共有結合）。例えば原核生物、酵母および哺乳類細胞において、形質転換ＤＮＡは、エピソーム素子、例えばプラスミド上に保持され得る。真核生物細胞に関しては、安定的形質転換化細胞は、染色体複製により娘細胞に遺伝されるよう、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれたものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の週だ何からなる細胞株またはクローンを確立する真核生物細胞の能力により実証される。
【００６６】
「クローン」とは、有糸分裂により単一細胞または共通先祖から得られる細胞の集団である。「細胞株」とは、多数の世代でin vitroに安定成長し得る初代細胞のクローンである。
【００６７】
ＩＩ．説明
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）は、肝臓で産生される急性期タンパク質であり、組織損傷または感染に関連した炎症応答の一部として哺乳類の血清中に高レベルで生じる。初乳中に非常に高レベルで生じるＳＡＡの独特のアイソフォームを、本発明人等は発見した。健常ウシにおける初乳ＳＡＡ増大は、仔ウシ出産後4日以内に牛乳中に見出されるバックグラウンドレベルに戻る。初乳中では急性期ＳＡＡ（Ａ−ＳＡＡ）の血中濃度とは無関係に生じるので、初乳ＳＡＡは局所的に（即ち、乳房管状上皮細胞に）産生されると考えられる（5匹の被験ウシから採取した初乳、乳漿および血清の試料中では、血清ＳＡＡは15μg/ml、ｎｏ範囲であることが判明したが、一方初乳では、ＳＡＡは300μg/mlの平均範囲のレベルに増大した）。
【００６８】
初乳中のＳＡＡの独特のアイソフォームは、新生児免疫の発達における初乳の一般的役割に関連した種々の機能を実行している。例えば初乳ＳＡＡは、新生児における腸および／または血管系の内皮膜を横断する脂質および免疫グロブリンの輸送のためのビヒクルとして作用し得る。それは損傷後に血管内皮により局所的に産生され、血管内間隙への免疫グロブリンの輸送のためのビヒクルとして役立つ。概して、初乳ＳＡＡは抗微生物活性（直接または間接的に）有し、そしていくつかの方法で免疫応答を調節すると考えられる。初乳ＳＡＡは、組織修復および分解に関与する酵素を誘導することにより、ならびに粘膜組織中の防御的ムチンの産生を調節することにより、組織リモデリングにも関与し得る。
【００６９】
高レベルのＳＡＡが、ウシ、ウマ、ヒツジおよびブタの初乳で検出された。それは、実施例3に記載したような方法を用いて、ウシ、ヒツジおよびウマ初乳から精製された。これらの供給源からの精製初乳ＳＡＡに、Ｎ末端アミノ酸配列分析を施した。これらの配列を、ウサギ滑膜繊維芽細胞からのＳＡＡ３の対応する配列と比較して、以下に記述する。
【００７０】
初乳：
ウシ（配列番号１）：  MWXTFLKEAGQGAKDMWRAY
ヒツジ（配列番号２）：  WLLTFLKEAG
ウマ（配列番号３）：  RELKTFLKEAGQG
滑膜繊維芽細胞：
ウサギＳＡＡ３（配列番号９の一部）：  REWLTFLKEAGQGAKDMWRAYSDMKEA
初乳由来ＳＡＡは、アミノ末端（またはＮ末端）ＴＦＬＫ（ＴＦＬＫモチーフ）での独特のアミノ酸配列を共有する。ＴＦＬＫモチーフは任意の哺乳類からの血清由来ＳＡＡのいずれからも見出されないが、しかしウサギ滑膜繊維芽細胞により産生されるＳＡＡ３との相同を共有する。ヒトＳＡＡ３偽遺伝子（血清または組織中で発現されない）も、ＴＦＬＫ配列モチーフを含有する推定アミノ酸配列を含む。
【００７１】
しかしながらウマ初乳ＳＡＡのトリプシン消化断片のさらなる分析は、初乳ＳＡＡが、実際、独特のＳＡＡであることを明示した。ウマ初乳ＳＡＡのトリプシン断片を以下に記述する（配列番号４は配列番号３の代替物である）。
【００７２】
（配列番号４）    REWFTFL
（配列番号５）    EANYIGADKYFH
（配列番号６）    GNYDAAQRGPGGA
（配列番号７）    VTDLFK
（配列番号８）    SGKDPNHFRPHGLPDKY
図１では、5つのウマ初乳ＳＡＡトリプシン断片配列（配列番号３〜８）、ならびにウシおよびヒツジからのＮ末端配列、ならびにウマ初乳ＳＡＡ（配列番号１〜３）が、ウサギからの滑膜繊維芽細胞（配列番号９）、ウマ血清ＳＡＡ（配列番号１０）およびミンクからの血清ＳＡＡ１（配列番号１１）の完全アミノ酸配列とともにアラインメントで示されている。アラインメントから判るように、ウマ初乳ＳＡＡは、ウサギ滑膜繊維芽細胞ＳＡＡ３、ウマ血清ＳＡＡおよびミンク血清ＳＡＡ１の各々との類似性の領域を共有し、さらにこれらのタンパク質の各々と互いに異なる。
【００７３】
したがって本発明は、初乳から単離される新規のＳＡＡアイソフォームを提供する．ウマ、ウシおよびヒツジ初乳ＳＡＡが本明細書中に例示されているが、しかし本発明は、本発明人等がいくつかの哺乳類種から初乳ＳＡＡを同定したゆえに、あらゆる哺乳類種からの初乳ＳＡＡアイソフォームを含む。さらに、以下でより詳細に説明するように、初乳ＳＡＡをコードする核酸分子は、この新規のＳＡＡアイソフォームに免疫学的に特異的な抗体であるので、本発明の一部であるとも意図される。
【００７４】
本発明にしたがって、ウシ初乳関連ＳＡＡのｃＤＮＡが確定され、当業界で既知の、そして本明細書中に開示された方法により、組換え体形態のタンパク質の産生を可能にした。（配列番号１２）（図２参照）は、タンパク質に関するｃＤＮＡ配列であり、本発明は、この配列ならびに保存的修飾化変異体を含む。さらに開示されるのは、高度に保存されたタンパク質の活性領域、ならびに乳腺炎に関連した炎症を検出するための検定に、あるいはムチン産生を刺激することにより胃腸障害を治療するための製剤に有用であるようにするタンパク質の特性である。
【００７５】
下記は、本発明の実行に関与する一般手法を記載する。特定の物質が言及される程度まで、それは単に説明のためであって、本発明を限定するものではない。別記しない限り、一般クローニング手法、例えばSambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)（以後、「Sambrook et al.」）またはAusubel, et al.(eds.)Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1999)（以後、「Ausubel, et al.」）が用いられる。
【００７６】
Ａ．初乳ＳＡＡ、初乳ＳＡＡに特異的な抗体および初乳ＳＡＡをコードする核酸分子
１．タンパク質および抗体
初乳ＳＡＡは、血清からＳＡＡを精製するために開発された種々の方法にしたがって、種々の方向で調製され得る。このような方法の１つが、実施例３に記述されている。疎水性クロマトグラフィーマトリックス計および溶離剤の変動、例えばSmith等（Protein Expression & Purification 2: 158-161, 1991）により記載されたものも用いられ得る。
【００７７】
あるいは、（配列番号１〜８）のようなアミノ酸配列情報の利用可能性は、初乳ＳＡＡをコードする核酸分子の単離を可能にする。これは、抗初乳ＳＡＡ抗体を用いて、当業界で周知の方法にしたがって選定種からのｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより成し遂げられ得る。あるいは、（配列番号１〜８）（図１）の一部または全部をコードする一連の縮重オリゴヌクレオチドプローブは、以下で詳細に説明するように、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。
【００７８】
一旦生成されると、ｃＤＮＡまたは遺伝子は、in vitro転写のために適切なin vitro転写ベクター、例えばｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５中でクローン化され、その後、適切な無細胞翻訳系、例えば小麦胚がまたはウサギ網状赤血球中で無細胞翻訳され得る。In vitro転写および翻訳系は、例えばPromega Biotech, Madison, WisconsinまたはBRL, Rockville, Marylandから市販されている。ｐＣＩＴＥin vitro翻訳系（Novagen）も利用され得る。
【００７９】
好ましい実施態様によれば、適切な原核生物または真核生物系での発現により、大量のタンパク質が製造され得る。例えば初乳ＳＡＡコードＤＮＡ分子の一部または全部が、細菌細胞（例えば大腸菌）または酵母細胞（例えばビール酵母菌Saccharomyces cerevisiae）または哺乳類細胞中での発現に適応されたベクター中に挿入され得る。このようなベクターは、宿主細胞中でのＤＮＡの発現を可能にするような方法で位置する、宿主細胞中でのＤＮＡの発現に必要な調節素子を含む。発現に必要とされるこのような調節素子としては、プロモーター配列、転写開始配列、ならびに任意にエンハンサー配列が挙げられる。
【００８０】
組換え体原核生物または真核生物系における遺伝子発現により産生される初乳ＳＡＡは、当業界で既知の方法により精製され得る。好ましい実施態様では、市販の発現／分泌系が用いられ、それにより組換え体タンパク質が発現され、その後、宿主細胞から分泌され、周囲媒質から容易に精製され得る。発現／分泌ベクターが用いられない場合、代替的アプローチは、アフィニティー分離により、例えば組換え体タンパク質と特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用により組換え体タンパク質を精製することを包含する。このような方法は、熟練従業者により一般に用いられる。
【００８１】
本発明は、１つまたはそれ以上の選定種からの初乳と結合し得る抗体も提供する。選定初乳ＳＡＡの一部または全部に向けられるポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、標準的方法により調製され得る。モノクローナル抗体は、KohlerとMilsteinの一般的方法とその後の標準プロトコールにしたがって調製され得る。好ましい実施態様では、それを他のＳＡＡから識別する初乳ＳＡＡの選定エピトープと免疫特異的に反応する抗体が調製される。
【００８２】
２．核酸分子
一旦配列情報が得られれば、初乳ＳＡＡをコードする核酸分子は、２つの一般的方法により調製され得る：即ち、（１）それらは適切なヌクレオチド三リン酸塩から合成され得る、または（２）それらは生物学的供給源から単離され得る。両方法は、当業界で周知のプロトコールを利用する。
【００８３】
核酸配列情報の利用可能性は、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子の調製を可能にする。合成オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 38A ＤＮＡ合成機または同様の装置で用いられるホスホロアミダイト法により調製され得る。その結果生じる構築物は、当業界で既知の方法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製され得る。長い二本鎖ポリヌクレオチド、例えば本発明のＤＮＡ分子は、一般オリゴヌクレオチド合成法に固有のサイズ制限のために、段階的に合成されねばならない。したがって、例えば長い二本鎖分子は、適切な相補性を有するいくつかの小型セグメントとして合成され得る。このように生成された相補的セグメントは、各セグメントが隣接セグメントの結合のための適切な付着末端を保有するよう、アニーリングされ得る。隣接セグメントは、ＤＮＡリガーゼの存在下で付着末端をアニーリングすることにより結繋されて、全長二本鎖分子を構築し得る。そのように構築された合成ＤＮＡ分子は次に、クローン化され、適切なベクター中で増幅され得る。
【００８４】
初乳ＳＡＡをコードする核酸分子は、当業界で周知の方法を用いて、当該哺乳類種からも単離され得る。選定種からの核酸分子は、初乳ＳＡＡコード遺伝子に特異的な核酸配列に適合するよう設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。ある種からの遺伝子が望ましい場合には、ゲノムライブラリーがスクリーニングされる。あるいは、タンパク質コード配列が特定当該物を有する場合には、ｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされる。１つより多くの核酸残基が適切なアミノ酸残基をコードするために用いられ得る縮重の位置では、すべての適切な核酸残基が組入れられて、混合オリゴヌクレオチド集団を作製するか、または中性塩基、例えばイノシンが用いられ得る。オリゴヌクレオチド設計の戦略は、当業界で周知である（Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor NYも参照）。
【００８５】
あるいは、初乳ＳＡＡタンパク質の一部をコードするために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーが前記の方法により設計され得る。これらのプライマーは、単離ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから核酸を増幅するために用いられる。好ましい実施態様では、血清ＳＡＡと対照したものとして初乳ＳＡＡに独特の配列をコードするために、初乳ＳＡＡコード核酸を単離するために用いられるオリゴヌクレオチドが設計される。
【００８６】
本発明によれば、適切なストリンジェントを有するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることにより、初乳ＳＡＡコード核酸分子と適切な配列相同性を有する核酸が同定され得る。例えばハイブリダイゼーションは、Sambrook et al.(1989、上記)の方法にしたがって、５ｘＳＳＣ，５ｘデンハード試薬、1.0％ＳＤＳ、100μg/ml変性断片化サケ精子ＤＮＡ、0.05％ピロリンサンナトリウムおよび50％までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて実施され得る。ハイブリダイゼーションは、37〜42℃で少なくとも6時間実行される。ハイブリダイゼーション後、フィルターを以下のように洗浄する：（１）２ｘＳＳＣおよび1％ＳＤＳ中で室温で5分間、（２）２ｘＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳ中で室温で15分間、（３）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で37℃で30分〜1時間、（４）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で65℃で2時間。
【００８７】
特定配列相同を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェント条件を算定するため一一般式（Sambrook et al.,1989）：
Ｔｍ＝81.5℃＋16.6Log[Na+]＋0.4（G+C％）−0.63（ホルムアミド％）−600／二重鎖中bp数
前式の説明のように，［Ｎ＋］＝［0.368］および50％ホルムアミドを用いて、42％のＧＣ含量および200塩基の平均プローブサイズで、Ｔｍは57℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％低減する毎に1〜1.5℃低減する。したがって約75％より大きい配列同一性を有する標的が、42℃のハイブリダイゼーション温度を用いて観察される。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは37℃で、最終洗浄は42℃であり、さらに好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは42℃で、最終洗浄は50℃であり、最も好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは42℃で、最終洗浄は65℃であって、前記のハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液を用いる。
【００８８】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシー度は、主に溶液の塩濃度および温度によっている。概して、その標的とのプローブのアニーリングの速度を最大にするために、ハイブリダイゼーションは通常は、ハイブリッドの算定Ｔｍより20〜25℃低い塩および温度条件で実行される。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性の程度に関して考え得るのと同様にストリンジェントであるべきである。概して、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍより約12〜20℃低くなるように選定される。本発明の核酸に関しては、中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ，５ｘデンハード溶液、0.5％ＳＤＳおよび100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ中で42℃でのハイブリダイゼーション、ならびに２ｘＳＳＣおよび0.5％ＳＤＳ中で55℃で15分の洗浄と定義される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ，５ｘデンハード溶液、0.5％ＳＤＳおよび100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ中で42℃でのハイブリダイゼーション、ならびに１ｘＳＳＣおよび0.5％ＳＤＳ中で65℃で15分の洗浄と定義される。極高ストリンジェントハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ，５ｘデンハード溶液、0.5％ＳＤＳおよび100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ中で42℃でのハイブリダイゼーション、ならびに0.1ｘＳＳＣおよび0.5％ＳＤＳ中で65℃で15分の洗浄と定義される。
【００８９】
本発明の核酸は、任意の便利なクローニングベクター中にＤＮＡとして保持され得る。好ましい実施態様では、クローンはプラスミドクローニング／発現ベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ（Promega Biotech, Madison, WI）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene, La Jolla CA）中に保持され、いずれも適切な大腸菌宿主中で増殖される。
【００９０】
本発明の初乳ＳＡＡコード核酸分子としては、一本鎖または二本鎖であり得るｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの断片が挙げられる。したがって本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリダイズし得る配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖）を提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲ増幅により、被験試料中の初乳ＳＡＡコード遺伝子またはｍＲＮＡを検出するためのプローブとして有用である。
【００９１】
Ｂ．初乳ＳＡＡタンパク質、抗体および核酸の使用
１．タンパク質および抗体
精製初乳ＳＡＡまたはその断片を用いて、培養細胞または組織中および無傷生物体中のタンパク質の存在および蓄積に関する高感度検出試薬として役立ち得るポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成し得る。組換え技術は、選定初乳ＳＡＡの一部または全部を含有する融合タンパク質の発現を可能にする。全長タンパク質またはタンパク質の断片を用いて、タンパク質の種々のエピトープに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体のアレイを生成するのを促し、それによりタンパク質の検出のためのより大きい感度をさえ提供し得る。好ましい実施態様では、初乳ＳＡＡを血清ＳＡＡと識別する初乳ＳＡＡの断片は、エピトープ特異的抗体を生成するために利用される。
【００９２】
初乳ＳＡＡに免疫学的に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、タンパク質を検出および定量するよう意図された種々の検定に用いられ得る。このような検定としては、（１）免疫沈降とその後のタンパク質定量、（２）イムノブロット分析（例えばドットブロット、ウエスタンブロット）、（３）ラジオイムノアッセイ、（４）比濁分析、濁度測定または免疫クロマトグラフィー（側方流）検定、および（５）酵素結合検定、例えばＥＬＩＳＡ、ならびに種々の定性的迅速検定（例えばディップスティックおよび同様の試験）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
初乳ＳＡＡと免疫特異的に相互作用するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が、このようなタンパク質を同定および精製するために用いられ得る。例えば抗体は、それらが免疫特異的に相互作用するタンパク質のアフィニティー分離のために利用され得る。抗体は、タンパク質およびその他の生物学的分子の混合物を含有する試料からタンパク質を免疫沈降するためにも用いられ得る。
【００９４】
２．核酸
初乳ＳＡＡコード核酸は、本発明にしたがって種々の目的のために用いられ得る。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの断片は、遺伝子の存在および／または発現を検出するためのプローブとして用いられ得る。初乳ＳＡＡコード核酸がこのような検定のためのプローブとして利用され得る方法としては、（１）in situハイブリダイゼーション、（２）サザンハイブリダイゼーション、（３）ノーザンハイブリダイゼーション、ならびに（４）類別（アソーティド）増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の例示された初乳ＳＡＡコード核酸（例えばウシ、ヒツジ、ウマ）も、ヒトを含めた他の種から関連遺伝子を同定するためのプローブとして利用され得る。当業界で周知であり且つ前記したように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー度を調整して、種々の程度の相同性を有する相補的配列との核酸プローブのハイブリダイゼーションを可能にし得る。
【００９６】
初乳ＳＡＡコード核酸の前記の使用のほかに、それらは、トランスジェニック細胞、組織および生物体の作製における用途を有すると予測される。
【００９７】
本発明は、ウシ初乳関連ＳＡＡタンパク質をコードする新規の精製および単離核酸配列を提供する。本発明の好ましい形態では、ＤＮＡ配列は新規のＳＡＡをコードするｃＤＮＡ配列を含み、あるいは初乳中に存在するその保存的修飾化変異体は、活性ＴＦＬＫ領域を含み、本明細書中に開示したタンパク質の生物学的活性を保有する。さらに好ましくは実施態様では、核酸配列は、（配列番号１２）と少なくとも約93％の同一性を、または92％同一のコードアミノ酸配列を含む。特に、単離された配列は、（配列番号１２）に示されている。代替的ＤＮＡ形態、例えばゲノムＤＮＡ、および核酸からの部分的または全体的化学合成により調製されたＤＮＡ、ならびに欠失または突然変異を有するＤＮＡも本発明の意図された範囲内である。
【００９８】
本発明により提供されたＤＮＡ配列の、同種または異種発現制御ＤＮＡ配列、例えばプロモーター、オペレーター、レギュレーターなどとの会合は、ｍＲＮＡからのin vivoおよびin vitro転写を可能にし、これは次に翻訳を受け易くなって、本発明の新規のナトリウムチャンネルタンパク質、ならびに関連ポリ−およびオリゴ−ペプチドを大量に提供する。本発明の目下の好ましいＤＮＡ発現系において、初乳関連ＳＡＡコードＤＮＡは調節プロモーターＤＮＡ配列と作用可能式に連結されて、タンパク質のin vitro転写および翻訳を可能にする。
【００９９】
恐らくは適切なウイルスおよび環状ＤＮＡプラスミドベクターを包含する標準形質転換およびトランスフェクション法による原核生物および真核生物宿主細胞中へのＤＮＡ配列の組入れも、本発明の意図内であり、今までは天然供給源から利用可能でなかった量で有用なタンパク質を提供すると予測される。以後さらに詳細に記述するように、本発明の組換え体発現産物に最適生物学的活性を付与するのに必要であり得るので、哺乳類宿主細胞の使用は、このような翻訳後修飾（例えば、切頭化、グリコシル化、ならびにチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を提供すると予測される。
【０１００】
細胞を形質転換し、ベクターを構築し、メッセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを調製するなどのために用いられる技法のほとんどは、当業界で広範に実行されており、ほとんどの従事者が特定の条件および手順を説明する標準資源物質に精通している。しかしながら便宜上、以下の語句は指針として役立ち得る。
【０１０１】
宿主および制御配列
原核生物および真核生物系はともに、初乳関連ＳＡＡコード配列を発現するために用いられ得る。原核生物宿主は、もちろん、クローニング手法には最も便利である。原核生物は最も高頻度に、大腸菌の種々の菌株により代表される。しかしながらその他の微生物株も用いられ得る。複製部位、選択可能マーカーおよび宿主と比較可能な種に由来する対象配列を含有するプラスミドベクターが用いられる。例えば大腸菌は、典型的には、Bolivar, et al., Gene (1977) 2:95により大腸菌種から得られたプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含有し、したがって所望のベクターの構築に際して保持または破壊され得る多重選択可能マーカーを提供する。転写開始のためのプロモーターを含み、任意にオペレーターを、リボソーム結合部位配列と共に含むよう本明細書中で定義された一般的に用いられる原核生物制御配列としては、β−ラクターゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトーゼ（ｌａｃ）プロモーター系（Chang, et al., Nature(1977)）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel, et al., Nucleic Acids Res(1980) 8:4057）、ならびにラムダ由来ＰLプロモーターおよびＮ−遺伝子リボース結合部位（Shimatake, et al., Nature (1981) 292:128）といったような一般的に用いられるプロモーターが挙げられる。
【０１０２】
細菌のほかに、真核生物微生物、例えば酵母も宿主として用いられ得る。ビール酵母菌Saccharomyces cerevisiaeの実験室菌株であるベーカー酵母が最も用いられるが、しかし多数のその他の菌株または種が市販されている。例えばBroach, J.R., Meth Enz (1983) 101:307の2μ複製起点、またはその他の酵母適合性複製起点（例えば、Stinchcomb, et al., Nature (1979) 282:39、Tschumper, G., et al., Gene (1980) 10:157およびClarke, L, et al., Meth Enx (1983) 101:300参照）を用いるベクターが用いられ得る。酵母ベクターのための制御配列としては、解糖酵素の合成のためのプロモーターが挙げられる（Hess, et al., J Adv Enzyme Reg(1968) 7:149; Holland, et al., Biochemistry(1978) 17:4900）。当業界で既知のさらに別のプロモーターとしては、３−ホスホグリセレートキナーゼが挙げられる（Hitzeman, et al., J Biol Chem (1980) 255:2073）。増殖条件および／または遺伝的背景により制御される転写のさらに別の利点を有するその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、α因子系、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域である。ターミネーター配列は、コード配列の３‘末端で望ましい、ということも考えられる。このようなターミネーターは、酵母由来遺伝子中のコード配列後の３’非翻訳化領域に見出される。
【０１０３】
多細胞生物由来の真核生物宿主細胞培養中でポリペプチドをコードする遺伝子を発現することも、もちろん考えられる（例えば、米国特許第4,399,216号（Axel等）参照）。これらの系は、イントロンをスプライスアウトする能力というさらなる利点を有し、したがってゲノム断片を発現するために直接用いられ得る。有用な宿主細胞株としては、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。このような細胞のための発現ベクターとしては、普通は、哺乳類細胞に適合可能なプロモーターおよび制御配列、例えばサルウイルス４０（ＳＶ４０）からの一般的に用いられる初期および後期プロモーター（Fiers, et al., Nature (1978) 273:113）、あるいはその他のウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルスまたは鳥肉腫ウイルスに由来するものが挙げられる。制御可能プロモーターｈＭＴ１Ｉ（Karin, M., et al., Nature (1982) 299:797-802）も用いられ得る。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的局面は、Axel（上記）により記載されている。「エンハンサー」領域が発現を最適にするのに重要である、ということも個々で明らかである。これらは一般に、非コードＤＮＡ領域のプロモーター領域の上流または下流に見出される配列である。複製起点は、必要な場合には、ウイルス供給源から得られる。しかしながら染色体中への組込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製のための一般的メカニズムである。
【０１０４】
形質転換
用いられる宿主細胞によって、このような細胞に適切な標準技法を用いて形質転換が実行される。Cohen, S.N., Pro. Natl. Acad. Sci. (USA) 1972, 69: 2110により記載されたような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、あるいはManiatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Press, p.254およびHanahan, D., J Mol Biol (1983) 166: 557-580に記載されたｒｂＣ１２法が、原核生物または実質的細胞壁バリアを含有するその他の細胞のために用いられ得る。このような細胞壁を有さない哺乳類細胞に関しては、任意にWigler, M., et al., Cell (1979) 16: 777-785により修正されるようなGraham and van der Eb, Virology (1978) 52:546のリン酸カルシウム沈降法が用いられ得る。酵母中での形質転換は、Beggs, J.D. Nature (1978) 275:104-109またはHinnen, A., et al., Pro. Natl. Acad. Sci.(USA)(1978) 75:1929の方法にしたがって実行され得る。
【０１０５】
ベクター構築
所望のコードおよび制御配列を含有する適切なベクターの構築は、当業界で十分理解されている標準結繋および制限技法を用いる。単離プラスミド、ＤＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチドは、切断され、仕立てられ、そして所望の形態に再結繋される。
【０１０６】
ベクターを構成するＤＮＡ配列は、多数の供給源から利用可能である。主鎖ベクターおよび制御系は一般に、構築に際して配列の嵩のために用いられる利用可能「宿主」ベクター上に見出される。典型的配列は、前記されている。関連コード配列に関しては、初期構築は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから適切な配列を取り戻すという課題であり得るし、通常はそうである。しかしながら配列が一旦開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から出発してin vitroで全遺伝子配列を合成することができる。相当の大きさの長さ、例えば500〜1000 bpの遺伝子またはｃＤＮＡに関する全配列は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩の存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて、個々の重複相補的オリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖化非重複部分に充填することにより調製され得る。このアプローチは、既知の配列のいくつかの遺伝子の構築に首尾よく用いられてきた（例えば、Edge, M.D., Nature (1981) 292: 756; Nambair, K.P., et al., Science(1984) 223:1299; Jay, Ernest J Biol Chem (1984) 259:6311参照）。
【０１０７】
合成オリゴヌクレオチドは、Edge, M.D., Nature (上記)およびDuckworth, et al., Nucleic Acids Res (1981) 9:1691により記載されたようなホスホトリエステル法により、またはBeaucage, S.L., and Caruthers, M.H., Tet Letts (1981) 22:1859およびMatteucci, M.D., and Caruthers, M.H., J Am Chem Soc (1981) 103:3185に記載されているようなホスホロアミダイト法により調製され、そして市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得る。アニーリング前のまたはラベリングのための一本鎖のキナーゼ処理は、50mMのトリス、ｐＨ7.6、10mMのＭｇＣｌ2、5mMのジチオトレイトール、1〜2mMのＡＴＰ、1.7y pmolのγ32Ｐ−ＡＴＰ（2.9 mCi/mmol）、0.1mMのスペルミジン、0.1mMのＥＤＴＡの存在下で、余分量の、例えば1 nmolの基質に対して約10単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いて成し遂げられる。
【０１０８】
所望のベクターの構成成分が利用可能になれば、標準制限および結繋手法を用いて、それらは切り取られ、結繋され得る。
【０１０９】
部位特異的ＤＮＡ切断は、当業界で一般に理解されている条件下で、適切な制限酵素（単数または複数）で処理することにより実施され、それらのうちの特殊なものは、これらの市販の制限酵素の製造により特定される（例えば、New England Biolabs, Product Catalog参照）。概して、約20μlの緩衝液中の1単位の酵素により、約1μgのプラスミドまたはＤＮＡ配列が切断される。本明細書中の実施例では、典型的には余分量の制限酵素を用いて、ＤＮＡ基質の完全消化を保証する。37℃で約1時間〜2時間のインキュベーション時間が実行可能であるが、しかし変動は耐容され得る。各インキュベーション後、フェノール／クロロホルムを用いた抽出によりタンパク質は除去され、その後エーテル抽出されて、エタノールを用いた沈降により水性分画から核酸が回収される。所望により、標準技法を用いたポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により、切断断片のサイズ分離が実施され得る。サイズ分離の一般的説明は、Methods in Enzymology(1980) 65: 499-560に見出される。
【０１１０】
制限切断断片は、50mMのトリス、ｐＨ7.6、6mMのＮａＣｌ、6mMのＭｇＣｌ2、6 mMのＤＴＴおよび0.1〜1.0 mMのｄＮＴＰ中で20℃〜25℃で約15〜25分のインキュベーション時間を用いて、４デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの大型断片（Klenow）で処理することにより平滑末端化され得る。クレノウ断片は５‘一本鎖オーバーハングを埋めるが、しかし４ｄＮＴＰが存在しても、突出３’一本鎖はバラバラにする。所望により、選択的修復は、オーバーハングの性質により決定される制約内でｄＮＴＰのうちの1つだけまたは選定ｄＮＴＰを供給することにより実施され得る。クレノウによる処理後、混合物はフェノール／クロロホルムで抽出され、そしてエタノール沈降される。Ｓ1ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−31を用いた適切な条件下での処理は、任意の一本鎖化部分の加水分解を引き起こす。
【０１１１】
結繋は、以下の標準条件および温度下で、15〜50μl容積中で実施される：例えば、20mMのトリス−Ｃｌ、ｐＨ7.5、10mMのＭｇＣｌ2、10mMのＤＴＴ、33μg/mlのＢＳＡ、10mM〜50mMのＮａＣｌおよび0℃で40μMのＡＴＰ、0.01〜0.02（Weiss）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」結繋用）あるいは14℃で1 mMのＡＴＰ、0.3〜0.6（Weiss）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」結繋用）。分子間「付着末端」結繋は、通常は33〜100μg/mlの総ＤＮＡ濃度（5〜100 Nmの総最終濃度）で実施される。分子間平滑末端結繋は、1μM総最終濃度で実施される。
【０１１２】
「ベクター断片」を用いるベクター構築において、ベクター断片は普通は、５‘ホスフェートを除去し、ベクターの自己結繋を防止するために、細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）または仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）を用いて処理される。消化は、約1単位のＢＡＰまたはＣＩＰ／ベクター1μgを用いて、60℃で約1時間、約10mMのトリス−ＨＣｌ、1mMのＥＤＴＡ中でｐＨ8で実行される。核酸断片を回収するために、調製物はフェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈降される。あるいは、再結繋は、付加的制限酵素消化および／または望ましくない断片の分離により二重消化されるベクターにおいて防止される。
【０１１３】
配列修飾を要するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のベクターの部分に関しては、部位特異的プライマー指示突然変異誘発が用いられ得る（Zoller, M.J., and Smith, M. Nucleic Acids Res (1982) 10:6487-6500およびAdelman, J.P., et al., DNA (1983)2:183-193）。これは、突然変異化される一本鎖ファージＤＮＡと相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて実行されるが、但し、限定不適正は所望の突然変異を表す。要するに、合成オリゴヌクレオチドは、ファージと相補的な鎖の合成を指図するためのプライマーとして用いられ、その結果生じる部分的または完全二本鎖ＤＮＡはファージ支持宿主細菌中で形質転換される。形質転換化細菌の培養は、上部寒天中でプレート化されて、ファージを保有する単一細胞からのプラーク形成を可能にする。
【０１１４】
理論的には、新しいプラークの50％が、一本鎖として、突然変異化形態を有するファージを含有する。50％はオリジナル配列を有する。その結果生じるプラークは、抽出物の結合を適正にさせるが、しかしオリジナル鎖との不適正は結合を防止するのに十分である洗浄温度でのキナーゼ処理合成プライマーとのハイブリダイゼーション後に洗浄される。プローブとハイブリダイズするプラークは次に摘み取られ、培養され、そしてＤＮＡが回収される。
【０１１５】
構築の確認
プラスミド構築のための的確な結繋は、M.Casadaban博士(Casadaban, M., et al., J Mol Biol (1980) 138:179-207)から入手した大腸菌ＭＣ1061株またはその他の適切な宿主を結繋混合物で先ず形質転換することにより確証され得る。当業界で理解されているように、プラスミド構築の様式によって、その他のマーカーを用いることにより、アンピシリン、テトラサイクリンまたはその他の抗生物質により、うまくいった形質転換体を選択する。次に、形質転換体からのプラスミドを、Clewell, D.B., et al., Pro. Natl. Acad. Sci.(USA) (1969) 62:1159の方法により、任意にクロラムフェニコール増幅（Clewell, D.B. J Bacteriol (1972) 110:667）後に、調製する。いくつかのミニＤＮＡ標本は、一般的に用いられる（例えば、Holmes, D.S., et al., Anal Biochem Acids Res (1979)7:1513-1523）。単離ＤＮＡは、制限により分析されおよび／または、Messing, et al., Nucleic Acids Res (1981) 9:309によりさらに記載されているようにSanger, F., et al., Pro. Natl. Acad. Sci.(USA) (1977) 74:5463のジデオキシヌクレオチド法により、あるいはMaxam, et al., Methods in Enzymology (1980) 65:499の方法により、シーケンシングされる。
【０１１６】
宿主例
本明細書中のクローニングおよび原核生物発現に用いられる宿主下部は、以下の通りである：
クローニングおよびシーケンシングのために、およびほとんどの細菌プロモーターの制御下での構築の発現のために、大腸菌株、例えばＭＣ1061、ＤＨ１、ＲＲ１、Ｃ600ｈｆｌ、Ｋ803、ＨＢ101、ＪＡ221およびＪＭ101が用いられ得る。
【０１１７】
３．初乳中のＳＡＡの発見に基づいた検定
初乳中の特定の構成的発現形態のＳＡＡの発見は、生物学的流体（例えば初乳および乳）の混合物を含有する試料中の初乳の存在を検出する新規の方法を可能にする。例えばＳＡＡは、正常乳腺組織からの初乳中では上昇し、乳中では上昇しないため、乳試料中の測定初乳ＳＡＡを用いて、乳から初乳を弁別し得る。したがって、初乳を含有する乳を有するのが望ましくない場合（いくつかの国はこの実行のための法律を有する）、前記のような免疫学的またはハイブリダイゼーション検定を用いて、初乳汚染乳を検出し得る。したがって、初乳を含有する乳を有するのが望ましくない場合には、前記のような免疫学的またはハイブリダイゼーション検定を用いて、初乳汚染乳を検出し得る。
【０１１８】
初乳ＳＡＡは、種々のその他の目的のためにも用いられ得る。これらの例としては、（１）腸または血管系を通り抜ける分子の送達のための担体、（２）新生児における腸粘膜の発達のための影響供給、ならびに（３）免疫応答のレギュレーター（注射または経口投与による）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
４．医薬製剤
本発明によって、本発明の初乳関連ＳＡＡ、特にその活性部位（ＴＦＬＫモチーフ）が小腸におけるムチン産生を刺激することを、出願人は発見した。これは、ムチンが腸感染の予防および治療に重要な役割を有することが示されているので有意であり、そして多数の共生物質がムチン産生の誘導により作用する（Mack et al., “Probiotics inhibit enteropathogenic Esherechia coli adherence in vitro by induding intestinal mucin gene expression”, 1999, Am J Physiol, 4Part 1 G941-950参照）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。したがって本発明は、初乳関連ＳＡＡを含む動物のための医薬製剤も包含する。製剤組成物の用量および投与スケジュールが投薬等よりむしろ動物の年齢、健康状態、性別および体重によって変化する、と医学業界の当業者は容易に理解する。これらのパラメーターは、十分確立された手法および例えばＩ、ＩＩおよびＩＩＩ期における分析により各系に関して確定され得る。
【０１２０】
投薬のために、初乳関連ＳＡＡは製薬上許容可能な担体、例えば適切な液体ビヒクルまたは賦形剤、ならびに単数または複数の任意の補助添加剤と併合され得る。液体ビヒクルおよび賦形剤が慣用的であり、市販されている。それらの実例は、蒸留水、生理食塩水、デキストロースの水性溶液等である。
【０１２１】
概して、活性化合物のほかに、本発明の製剤組成物は、製薬的に用いられ得る調製物中への活性化合物の加工を促す適切な賦形剤および助剤を含有し得る。直腸的に投与され得る調製物としては、座薬が上げられる。その他の投薬形態としては、非経口的または経口的投与に適した溶液、および頬または舌下に投与され得る組成物が挙げられる。
【０１２２】
本発明の医薬製剤は、それ自体当業界で周知の方法で製造される。例えば医薬製剤は、慣用的混合、造粒、糖衣錠製造、溶解、凍結乾燥法により製造され得る。用いられる方法は、最終的には用いられる活性成分の物理的特性によっている。
【０１２３】
適切な賦形剤は、特に充填剤、例えば糖、例えばラクトースまたはスクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、ならびに結合剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプンを用いたデンプンペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドンである。所望により、崩壊剤、例えば前記のデンプン、ならびにカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天あるいはアルギニン酸またはその塩、例えばアルギニン酸ナトリウムが付加され得る。助剤は、流動調節剤および滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムおよび／またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、所望により胃液に耐性であり得る適切なコーティングとともに提供される。
【０１２４】
この目的のために、任意にアラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含有し得る濃縮糖溶液が用いられ得る。胃液に耐性のコーティングを生成するために、適切なセルロース調製物、例えばアセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、染料および顔料の溶液が、例えば同定のために、あるいは化合物用量の異なる組合せを特性化するために、糖衣錠に付加され得る。
【０１２５】
経口的に用いられ得るその他の医薬製剤としては、ゼラチン製のプッシュ−フィットカプセル、ならびにゼラチン製の軟質密封カプセルおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトールが挙げられる。プッシュ−フィットカプセルは、充填剤、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプンおよび／または滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、そして任意に安定剤と混合され得る顆粒形態の活性化合物を含有し得る。軟質カプセル中では、活性化合物は好ましくは適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁される。さらに安定剤が付加され得る。直腸的に用いられ得る考えられる医薬製剤としては、例えば座薬が挙げられるが、これは活性化合物と座薬基剤の組合せから成る。適切な座薬基剤は、例えば天然または合成トリグリセリド、パラフィン炭化水素，ポリエチレングリコールまたは高級アルコールである。さらに、活性化合物と基剤の組合せから成るゼラチン直腸カプセルの使用も考えられる。考え得る基剤材料としては、例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコールまたはパラフィン炭化水素が挙げられる。
【０１２６】
非経口投与のための適切な処方物としては、水溶性または水分散性形態の活性化合物の水性溶液が挙げられる。さらに適切な油状注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、あるいは合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートまたは採りグリセリドが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大する物質を含有し、その例としては、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられ、任意に懸濁液は安定剤も含有し得る。
【０１２７】
慣用的担体を伴う投与のほかに、活性成分は、当業者に既知の種々の特殊送達薬技法により投与され得る。以下の実施例は説明のためだけに示されており、どの点においても本発明を限定するものではない。
【０１２８】
本明細書中で用いる場合、「有効量」とは、本明細書中に開示した方法およびプロトコールにより測定した場合に粘膜細胞への病原体の付着が低減されるよう、ムチン産生を増大するのに十分な初乳関連ＳＡＡの量を意味する。
【０１２９】
本発明によれば、新規の初乳関連ＳＡＡ、ならびに特にそのＴＦＬＫモチーフ活性部位は、ムチン産生を、特にＭＵＣ３を刺激することが示されている。ムチン産生は大腸菌の付着を抑制することが示されており、それを実行する共生作因は、ムチンの刺激により作用することが示されている。初乳関連ＳＡＡおよび／またはペプチドは、共生物質として用いられ得る。
【０１３０】
腸感染におけるムチンの意義は、感染生物体が疾患を引き起こすのに必要な事象を防止するそれらの能力にある。
【０１３１】
ムチンは小腸上皮細胞により産生され、それらの表面に分泌される。したがってムチンは戦略的に腸の上皮細胞と、腸管中に摂取された攻撃作因（即ち感染作因、有害物質）との間に位置する。
【０１３２】
ムチンは腸管の上皮細胞への細菌の付着も抑制する。腸の生細胞との細菌の結合は、侵襲、毒素送達および下痢性疾患の発症の第一段階である。腸病原体の結合が抑制される場合には、疾患は発症しない。
【０１３３】
ムチンはウイルスの複製を抑制することが示されている。
【０１３４】
ムチンは、腸の固有の免疫および塩基性防御系の一部である。したがって抗体／Ｔ細胞駆動後天性免疫系との比較に際して、ムチンは以下のような利点を提供する：攻撃作因に対する間接的または迅速誘導可能応答、広範囲の作用、局所的有効性、動物界全体で無傷。
【０１３５】
ムチン産生増大は、小腸細胞の外側に影響を及ぼすことにより可能である。
【０１３６】
感染作因によるムチン分泌増大は、周知の臨床的現象である。ムチンは感染性腸細菌が小腸細胞に付着するのを抑制し、したがって感染を防止する。これは、普通は細胞に付着するのに用いられる細菌の壁上の構造へのムチン付着により成し遂げられる。共生細菌（非感染性細菌）は腸管を裏打ちする上皮細胞への感染性腸細菌の付着を防止する。共生細菌からの分泌物質は、より多くのムチンを腸細胞に産生させる。これが、共生作因が感染を防止するメカニズムである。
【０１３７】
初乳関連ＳＡＡは哺乳類種の初乳中に存在し、乳腺の管状上皮細胞により産生される、ということを出願人は実証した。さらにアミノ酸配列分析により、初乳関連ＳＡＡの一部が多数の動物種の間に保存されることが明示された。出願人は、分子の保存領域であるＴＦＬＫモチーフを含有するウシ初乳関連ＳＡＡから10アミノ酸ペプチドを合成した。このペプチドは、ムチン産生に関与する遺伝子を活性化することにより、小腸から単離された細胞中のＭＵＣ３の産生を増大する。小腸ムチン遺伝子はこのペプチドにより非常に迅速に（30分以内）作動される、ということを出願人は示した。さらにこのペプチドによるムチン産生の増大は、小腸細胞周囲のその濃度に関連する。実験は、低濃度の初乳関連ＳＡＡペプチドはムチン産生の増大を生じないが、一方多すぎる初乳関連ＳＡＡペプチドはムチンの遺伝子駆動性産生を低減することを示す。この現象は生物学的系においては非常に一般的であり、それが特定用量依存性作用であることを示す。初乳関連ＳＡＡペプチド内の４つのアミノ酸領域「ＴＦＬＫ」および４つのアミノ酸の特定順序は、ムチン産生刺激に関与する。独特の初乳関連ＳＡＡ領域に無関係なアミロイド分子のその他のペプチドはムチン産生を刺激しない、ということが示されている。
【０１３８】
これは、多数の腸病変、例えば旅行者下痢に対するこのペプチドの製薬的適用を実証する。多数の感染生物体は実際地理学的であり、それら自体の領域外の旅行者は、通常はこれらの生物体にそれまで曝露されたことがなく、したがってそれらに対する免疫が発達していない。多数の人々は旅行前に抗生物質を摂取するが、しかしいくつかの抗生物質は有害副作用を有し、さらに生物は多数の抗生物質に対して耐性になる。
【０１３９】
もうひとつのその他の考え得る用途は、特に軍隊のための赤痢およびその他の感染性疾患の予防である。ワクチン開発は、例えば新兵のワクチン接種の失敗（炭疽菌ワクチン）ならびにワクチンの市場からの除去をもたらしているワクチン接種により引き起こされた疾患（ロタウイルスワクチン）といった問題を提示している。初乳関連ＳＡＡは、腸関連感染を低減または防止するための迅速、安全且つ有効な手段である。
【０１４０】
別の例としては、乳児下痢の予防または治療が挙げられる。母乳乳児は調合乳乳児よりはるかに感染が少ない。初乳は乳児に有益な天然物質であり、初乳関連ＳＡＡは初乳の構成成分であるため、それは調合乳へのきわめて大切な天然付加物である。このような調合乳は一般に、例えばインファメルTM、シミラックTM、カーネーショングッドスタートTMおよびベルベルTMとして市販されている。共生物質は、ウイルス性下痢の重症度を低減し、回復時間を単種つくすることが示されている。したがって、初乳関連ＳＡＡに関するもうひとつの用途は、この症状を有する小児に対してであり、これは入院日数および経費を低減することにより経済的影響も有する。
【０１４１】
さらに別の例としては、壊死性腸炎（ＮＥＣ）の予防または治療が挙げられる。これは、未熟児に起こる重篤合併症である。目下用いられている種々の生殖技術により、未熟児数が急増した。ＮＥＣのための治療は、この20〜30年間、旧態依然としている。未熟児の腸内の細菌はＮＥＣの発症に大きな役割を有しているため、この症状の治療は、乳児を栄養補給、強力な抗生物質の投与から遠ざけて、そして腸が穿孔しないよう願うことである。
【０１４２】
別の例としては、溶血性尿毒症症候群による死を引き起こし得る大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７発生の発生領域における下痢の予防が挙げられる。ムチン産生が上皮細胞への大腸菌の付着を防止し、したがってこの感染を防止する、ということをわれわれは示した。
【０１４３】
さらに別の例としては、尿路感染の治療および予防が挙げられる。膀胱上皮細胞は小腸上皮細胞と非常によく似ており、ムチンを産生し得る。したがって、尿カテーテルを有する入院患者を含めた尿路感染の予防も、本発明の製剤組成物の一用途である。
【０１４４】
さらに別の例としては、飼料からの抗生物質の除去を可能にするための家畜動物における感染性下痢の予防のための獣医学が挙げられる。
【０１４５】
本開示は小腸ムチン上向き調節を含むが、他の粘膜表面（例えば鼻咽頭、膀胱等）を裏張りする上皮細胞もムチンを産生する。これらのムチンは小腸ムチンと同様に感染を防止するよう機能し、本発明の治療のための有効な標的である。
【０１４６】
本発明をさらに詳細に説明するために、以下の実施例を提供する。それらは説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。
【０１４７】
実施例１
血清、初乳および乳漿中のＳＡＡの比較分析
この試験の目的は、乳腺炎無症候性および症候性ウシにおいて、初乳および乳漿中のＳＡＡレベルが血清ＳＡＡレベルに対応するか否かを確定することであった。
【０１４８】
初乳、乳漿および血清試料は、蓄牛にグラム陽性生物に対するワクチン接種を施した試験モデル研究から得た。２組の試料を用いた：一方の組（4頭）は乳腺炎の臨床症状を示すワクチン接種動物からで、他方の組（5頭）は臨床症状を示さないワクチン接種動物からであった。試料名を以下に示す：
ワクチン接種−無臨床症状（ＮＣ）
ＮＣウシＡ
ＮＣウシＢ
ＮＣウシＣ
ＮＣウシＤ
ＮＣウシＥ
ワクチン接種−臨床症状（Ｃ）
ＣウシＡ
ＣウシＢ
ＣウシＣ
ＣウシＤ
乳漿／初乳試料は、臨床症状を示す1/4から得た。
【０１４９】
ウシＳＡＡアイソフォームと交差反応するラット抗ＳＡＡ（ヒト）モノクロナール抗体を用いて、例えばMcDonald等（J. Immunol. Meth. 144: 149-155, 1991）による記載と同様に標準プロトコールにしたがってＥＬＩＳＡ検定を実行した。結果を表１に示す：
表１：ウシ乳腺炎血清、乳漿および初乳ＳＡＡ値の比較
【０１５０】
【表１】
2006296431.tif 000002
【０１５１】
【表２】
2006296431.tif 000003
【０１５２】
表１に記載した結果からわかるように、試験した動物の80％において、出産時に、ＳＡＡは高レベルでウシの初乳中に存在した。14日後のほとんどの臨床的に健常なウシの乳漿試料中では、ＳＡＡは検出されなかった。初乳および乳漿中のＳＡＡレベルは、ＳＡＡの血清レベルとは無関係であった。対照ウシの出産時のＳＡＡの血清レベルは正常であった（15μg/ml）が、一方、出産時の初乳中の平均レベルは約300 μg/mlであった。1頭のウシでは、初乳ＳＡＡは1100μg/mlと高かった。乳腺炎試験ワクチン接種ウシＣＣは、非常に高レベルのＳＡＡを示したが、しかし乳漿試料中のＳＡＡはほぼ正常であった。ワクチン接種試験ウシＣＤは、血清中および乳漿中で高レベルのＳＡＡを示した。
【０１５３】
実施例２
初乳およびその後の連続牛乳サンプリング中のＳＡＡの評価
この試験の目的は、初乳およびその後の連続牛乳サンプリングを評価して、ＳＡＡ含量を確定することであった。試料は、ネブラスカ大学Lincoln Dairy Research Facilityのホルスタイン酪農牛から得た。出産時に初乳の試料を採取し、その後の牛乳試料は週２回、３週間採取した。乳房四分円の４つすべてからの試料をプールした。結果を表２に示す。
【０１５４】
表２：初乳および牛乳試料中のＳＡＡレベル
【０１５５】
【表３】
2006296431.tif 000004
【０１５６】
結果は、ＳＡＡは正常動物の初乳中で高かったが、しかし初乳がなくなった後の正常牛乳試料中では非常に低レベルであるかまたは検出されなかった。
【０１５７】
実施例３
初乳からのＳＡＡの精製
下記の手法は、任意の動物種からの血清、血漿、乳または初乳からのＳＡＡの精製のために用い得る。本手法は、２つの基本段階からなる：疎水性クロマトグラフィーによりＳＡＡを約20％純度に精製する。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電子ブロッティングにより、さらに約95％純度に精製する。
【０１５８】
約10容積（300 ml）の水でそれを洗浄して、約30 mlのオクチルセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia #17-0790-01）を調製して、あらゆる微量エタノールを除去した。これは、焼結ガラス漏斗（粗製、漏斗容積600 ml）中でのゲル洗浄により、またはビーカー中のゲルへの水の付加と、その後、ゲルを沈降させた後、水を注ぎだしてゲルを再洗浄することにより、実行し得る。
【０１５９】
ゲルの最終洗浄（2ｘ4 ml）は、0.5 M硫酸アンモニウムの溶液を用いた。
【０１６０】
脂質部分は精製手法を妨げると思われたため、使用前に、初乳を4℃で放置して、脂質層を水性相から分離させた。硫酸アンモニウムを注ぎだした後、高レベルのＳＡＡ（好ましくは＞1μg/ml）を含有する20 mlの4℃冷蔵初乳をゲル（ビーカー中）に付加した。初乳とゲルの懸濁液を室温での1時間インキュベーション中数回書きませて、ＳＡＡをゲルと結合させた。
【０１６１】
次にゲルを600 mlの焼結ガラス漏斗（粗製）に注ぎ入れて、非結合分画を収集した。この非結合分画を、ＳＡＡに関して試験して、結合効率を確定し得る。
【０１６２】
ゲルを50 mlの50 mMトリス、10 mMＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ7.6で5回洗浄した。最終洗浄液は透明になる必要がある。
【０１６３】
カラムを、トリス／ＮａＣｌ中の2ｘ50 mlの30％イソプロパノールでさらに洗浄した。これらの洗浄は、10ゲージ針を用いた注射器を用いてイソプロパノール／緩衝液をゲル上に射出した場合はほぼ完全であった。この手法を後に用いた場合、ゲルは完全に混合された。
【０１６４】
トリス／ＮａＣｌ中の60％イソプロパノールの溶液を用いて、ゲルからＳＡＡを溶離した。一般に、これは各々10 mlの4つの溶離液中で実行した。
【０１６５】
溶出液は種々のタンパク質を含有下。そのうち約20％がＳＡＡであった。ＳＡＡが薄すぎる試料では、遠心分離濃縮機（RC 1010, Jouan Inc.）でイソプロパノールを蒸発させて、それを濃縮した。
【０１６６】
シーケンシングまたはアミノ酸分析のためにさらに精製するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶出液中のタンパク質を分離して、電子ブロッティングによりＰＶＤＦ膜に移した。
【０１６７】
ＳＡＡ特異的抗体によりＳＡＡと同定された帯域を次に切り出して、シーケンシングのために用いた。
【０１６８】
実施例４
初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡの単離
ＲＮＡ単離：メーカー推奨にしたがってＴＲＩＺＯＬ（Gibco BRL）を用いて、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）用の全ＲＮＡを哺乳類乳腺上皮細胞から単離した。1％（重量／容量）アガロースゲル上での分別およびその後の臭化Ｈ時有無染色により、ＲＮＡの完全性を調べた。
【０１６９】
一次鎖ｃＤＮＡ合成：本質的にメーカーが記載したとおりにスーパースクリプトＩＩ  ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（Gibco BRL）を用いて、一次鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。要するに，5μgの総ＲＮＡをＲＮアーゼ無含有滅菌水および20μMのＣＤＮＡ１−Ｔ１４プライマー（5’-GTTGTCGACTGTAGTGGAGT14-3’）（配列番号１４）と一緒に混合して、12μLの最終容積を得た。反応混合物を75℃で10分間インキュベートした後、室温で10分間インキュベートした。次に混合物を氷上に載せながら、4 μLの5ｘ一時標準緩衝液（Gibco BRL）、2Μlの0.1 MＤＴＴおよび1Μlの10mMｄＮＴＰミックス（10mMｄＡＴＰ、10mMｄＧＴＰ、10mMｄＣＴＰおよび10mMｄＴＴＰ、中性ｐＨ）を付加した。反応内容物を静かに混合し、42℃で2分間インキュベートした。スーパースクリプトＩＩ  ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（200単位）を反応に付加した。静かに混合後、反応物を42℃で1時間インキュベートした。混合物を70℃で15分間加熱することにより、逆転写酵素を不活性化した。ｃＤＮＡと相補性のＲＮＡを除去するために、2単位の大腸菌ＲＮアーゼＨ（Gibco BRL）を付加し、混合物を37℃で20分間インキュベートした。反応混合物を、二次ｃＤＮＡ合成のために必要とされるまで、−20℃で保存した。
【０１７０】
二次鎖ｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ連鎖反応：それぞれのＤＮＡポリメラーゼに関して各々メーカーの推奨にしたがって、プラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（Gibco BRL）またはＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems）を用いて、二本鎖ｃＤＮＡの二次鎖ｃＤＮＡ合成および増幅を実施した。プラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ高忠実度とのＰＣＲ反応物（50μL）は、前記の5μgのｃＤＮＡ、20μMの前方プライマー、20μMの逆プライマー、5μLの10ｘ高忠実度ＰＣＲ緩衝液（Gibco BRL）、1μLの10mMｄＮＴＰミックス、2μLの50mM硫酸マグネシウム、1単位のプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（Gibco BRL）、ならびに最終容積を50μLにするための滅菌水を含有した。プラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ高忠実度（Gibco BRL）による熱循環パラメーターは、40サイクルで94℃で30分間、45〜56℃で25〜30秒，ならびに50℃で1〜4分であった。
【０１７１】
ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems）を用いたＰＣＲ反応（50μL）は、前記の5μgのｃＤＮＡ、20μMの前方プライマー、20μMの逆プライマー、15mMの塩化マグネシウムを含有する5μLの10ｘＧｅｎｅＡｍｐ緩衝液（PE Applied Biosystems）、1μLの10mMｄＮＴＰミックス、1.3単位のＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems）、ならびに最終容積を50μLにするための滅菌水を含有した。ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems）による熱循環パラメーターは、熱スタートで開始して、40サイクルで95℃で1分間、50℃で30秒，ならびに72℃で1分、次に72℃で15分を1サイクルであった。
【０１７２】
初乳関連ＳＡＡアミの末端およびトリプシン消化断片から得たアミノ酸配列を逆翻訳することにより、初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に適した初期オリゴヌクレオチドプライマーを設計した（図2参照）。前方縮重プライマーＦ１Ｃ（5’-ACNTTYCTNAARGARGCNGGNCA-3’）（配列番号１５）および逆縮重プライマーＲ３Ｂ（5’-GAAGTGRTTGGGTCTTTGCCACT-3’）（配列番号１６）（これらは成熟初乳関連ＳＡＡタンパク質中のそれぞれアミの末端残基ＴＦＬＫＥＡＧＱ（配列番号１７）およびカルボキシ末端残基ＳＧＫＤＰＮＦ（配列番号１８）に対応する）を、初乳関連ＳＡＡに関する300 bp中間ｃＤＮＡ配列の初期増幅のためのＰＣＲに用いた。初乳関連ＳＡＡに関する５‘ｃＤＮＡ配列は、ＰＣＲとその後の前方プライマーＭ５ＲＴ２（5’-AGCACAGGCAGCTCAGCTTCACCAGGA-3’）（配列番号１９）および逆プライマーＭ５ＧＷ２（5’-GAAGTATTTGTCTGCACCCCTGTAGTTGGCTTCTT-3’）（配列番号２０）を用いたＤＮＡシーケンシングにより得た。Ｍ５ＲＴ２プライマーは、GenBankに寄託したＳＡＡｃＤＮＡ配列を基礎にし、Ｍ５ＧＷ２は前記の300 bp初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡ配列を基礎にした（図２参照）。初乳関連ＳＡＡに関する３‘ｃＤＮＡ配列は、ＰＣＲとその後の前方プライマーＭ３ＧＷ２（5’-CTGTTTAAGGGTATGACCAGGGACCAGGTACG-3’）（配列番号２１）および逆プライマーＣＤＮＡ１（5’-GTTGTCGACTGTAGTGGAG-3’）（配列番号２２）を用いたＤＮＡシーケンシングにより得た。Ｍ３ＧＷ２プライマーは、前記の300 bp初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡ配列を基礎にし（図２参照）、ＣＤＮＡ１プライマーは、一次鎖ｃＤＮＡ合成に用いたプライマーＣＤＮＡ１−Ｔ１４の最初の19ヌクレオチドと同一であった（ＣＤＮＡ１−Ｔ１４に関する前記参照）。
【０１７３】
初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡのクローニング：縮重オリゴヌクレオチドＦ１ＣおよびＲ３Ｂを使用して、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（PE Applied Biosystems）を用いて結果的に生じた300bpＲＴ−ＰＣＲ産物を、メーカーの推奨にしたがって、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いてアガロースゲル精製し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）中でクローン化した。Invitrogenの推奨どおりに、ＴＯＰＯクローニング反応物を大腸菌ＴＯＰ１０中で形質転換させて、50μg/mLカナマイシンおよびＸ−Ｇａｌを含有するLuria-Bertani上でプレート化した。ＰＣＲでＭ１３前方（−20）およびＭ１３逆プライマーを用いて、推定陽性コロニーをスクリーニングした。2％（重量／容量）アガロースゲル中で再増幅挿入物を分別し、適切なＤＮＡサイズマーカーとともに臭化Ｈ時有無染色により可視化した。
【０１７４】
初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡのＤＮＡスクリーニングおよびコンピューター分析：クローン化300bp初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡ配列を、高忠実度ＰＣＲでＭ１３前方（−20）およびＭ１３逆プライマーを用いて再増幅した。Ｍ５ＲＴ２／Ｍ５ＧＷ２およびＭ３ＧＷ２／ＣＤＮＡ１プライマー対をそれぞれ用いて、高忠実度ＲＴ−ＰＣＲで、初乳関連ＳＡＡ配列の５‘および３’領域を再増幅した。その結果生じたアンプリコンを、QIAquickＰＣＲ精製系（Qiagen）を用いて精製し、自動ＡＢＩ377ＤＮＡシーケンサーでアイオワ州立大学（Ames, IA）のＤＮＡシーケンス施設により、両方向にシーケンシングした。ＳＰ６およびＴ７−２プライマーを、クローン化300bp初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡのシーケンシングに用いた。プライマーＭ５ＲＴ２およびＭ５ＧＷ２は、初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡの５‘領域のシーケンシングのために、そしてプライマーＭ３ＧＷ２およびＣＤＮＡ１は初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡの３‘領域のシーケンシングのために用いた。Wisconsin Genetics Computer Group (GCG) Package Version 10.1(Madison, WI) SeqEd、PileUpおよびBLASTXプログラムを用いて、ＤＮＡ配列を分析した。SignalP（バージョン1.1）プログラム（Nielsen et al., 1997）を用いて、網の末端信号ペプチド切断部位を同定した。
【０１７５】
ウシ乳腺上皮細胞による初乳関連ＳＡＡおよび急性期ＳＡＡｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ検出：前記で詳述したように、存在するｍＲＮＡからの一次鎖合成のためにプライマーＣＤＮＡ１を用いて、その後、二次鎖合成および増幅のためにプライマーＦ１ＣおよびＲ３Ｂを用いて、ウシ乳腺上皮細胞から300bpＲＴ−ＰＣＲ産物を得た。図は、この300bpＲＴ−ＰＣＲ産物から得たヌクレオチド配列を示す。このヌクレオチド配列は、初乳関連およびウシ乳腺関連ＳＡＡアイソフォームから得たペプチドシーケンシングデータと相関した（図２参照）。
【０１７６】
前方縮重プライマーＦ２（5’-GACATGTGGMGAGCCTACTCYGACATG-3’）（配列番号２３）および逆縮重プライマーＲ３Ｂ（前記）を、Ａ−ＳＡＡｃＤＮＡの増幅のためのＲＴ−ＰＣＲに用いた。前方プライマーＦ２は、急性期ＳＡＡ（Ａ−ＳＡＡ）タンパク質（SWISS-PROT寄託番号Ｐ35541）中のアミの末端残基DMWRAYSDM（配列番号２４）に対応し、そして逆プライマーＲ３Ｂは、Ａ−ＳＡＡタンパク質および初乳関連ＳＡＡタンパク質の両方におけるカルボキシ末端残基SGKDPNHF（配列番号２５）に対応する。その結果生じた267bpｃＤＮＡ配列のその後のクローニングおよびヌクレオチドシーケンシングは、初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡと相関したが、これは、初乳関連ＳＡＡおよび非Ａ−ＳＡＡ転写体が存在したことを示唆する。
【０１７７】
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ部位は、ウシＡ−ＳＡＡのｃＤＮＡ配列中に存在することが判明した（データは示されない）が、ウシ初乳関連ＳＡＡのｃＤＮＡ中には見出されなかった。前記の300bpおよび267bpｃＤＮＡ配列のＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ消化は、これら２つのＲＴ−ＰＣＲ産物のいずれも切断しなかった。この結果はＳらに、初乳関連ＳＡＡおよび非Ａ−ＳＡＡｍＲＮＡのみがウシ乳腺上皮細胞により転写されることを示唆した。
【０１７８】
初乳関連ＳＡＡおよび非Ａ−ＳＡＡｍＲＮＡがウシ乳腺上皮細胞により発現されたことをさらに立証するために、前方初乳関連ＳＡＡ特異的プライマーＭ３ＧＷ２（前記および図２）および逆ＣＤＮＡ１プライマー（前記）を再びＲＴ−ＰＣＲに用いた。さらに成熟Ａ−ＳＡＡ中の残基FKGTTSGQGQ（配列番号２７）に対応する前方Ａ−ＳＡＡ特異的プライマーＳ３ＧＷ１（5’-TAAGGGTACGACCAGTGGCCAGGGTCA-3’）（配列番号２６）および逆ＣＤＮＡ１プライマー（前記）をＲＴ−ＰＣＲに用いた。しかしながら、前方Ａ−ＳＡＡ特異的プライマーおよび逆ＣＤＮＡ１プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物は観察されず、ウシ乳腺上皮細胞による発現は認められないかまたは低量のＡ−ＳＡＡｍＲＮＡ発現が生じることを確証した。
【０１７９】
実施例５
ウシＭＡＣ−Ｔ乳腺上皮細胞による初乳ＳＡＡ産生
ウシＭＡＣ−Ｔ乳腺上皮細胞をＡＴＣＣ（CRL-10274）から入手して、推奨条件にしたがって培養した（Turner, JD and Huynh H.Immortalized bovine mammary epithelial cell line。米国特許第5,227,301号（1993年7月13日））。10％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、5μg/mlインスリン、1μg/mlヒドロコルチゾンおよびフンジゾンを補充したダルベッコの変法培地（ＤＭＥＭ）上で、ＭＡＣ−Ｔ細胞を培養した。5％ＣＯ2を用いて37℃で細胞をインキュベートした。初乳ＳＡＡ産生のために、細胞をＩ型コラーゲン被覆プレート上に植え付けた。14時間インキュベーション後、細胞をダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄し、初乳ＳＡＡ産生刺激のためにヒツジ上皮小体からのプロラクチン（5μg/ml）を補充した培地（ＤＭＥＭ，5μg/mlインスリン、1μg/mlヒドロコルチゾンおよび2.5％ＦＣＳ）中でインキュベートした。およそ半分の培地を毎日プロラクチン補充培地と取り替えた。ＳＡＡの定量のための標準ＥＬＩＳＡ（図３）を用いて、初乳ＳＡＡの存在に関して、異なる日に収集した増殖培地のアリコートを検定した。
【０１８０】
プロラクチンを補充した培地中に細胞を41日間保持した。初乳ＳＡＡ産生レベルは、ほぼ3000 ng/mlの最大に達した。
【０１８１】
細胞培養液からの初乳関連ＳＡＡの精製    アフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養液から初乳ＳＡＡを精製した。要するに、ＳＡＡに対する特異性を有するモノクローナル抗体を臭化シアン活性化セファロース４Ｂと結合させることにより、アフィニティーカラムを調製した。カラムを50mMのトリス、0.1ＮａＣｌ、0.2 Mグリシン、ｐＨ8、緩衝液で処理して、ゲル上の残留活性基をブロッキングした。次にカラムを50Mmトリス、0.1 MＮａＣｌ、ｐＨ7.2緩衝液で洗浄して、余分の非結合タンパク質を除去した。約50 mlの培養液をカラムに通した。カラムをトリス−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄して、カラム中に閉じ込められていたあらゆる非結合タンパク質を除去した。次に、0.1 Mグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ2.8を用いてカラムからタンパク質を溶離した。分画を直ちに中和した。ＥＬＩＳＡにより全分画を検定して、最大量の初乳関連ＳＡＡを含有する分画を確定し、ウエスタンブロットにより分画の総タンパク質含量も査定した（図４）。
【０１８２】
精製タンパク質のアミノ酸配列の確定    最大量の初乳ＳＡＡを含有する分画を12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付して、ミニトランスブロット系（Bio-Rad Laboratories）によりＰＶＤＦ膜上で電気泳動的転写を実行した。膜上の一レーンの切片を切り出して、ＳＡＡに対するモノクローナル抗体で染色して、初乳ＳＡＡの存在を立証した。残りの膜は、0.5％（重量／容量）ブロムフェノールブルーを含有するメタノール：水（40：60）の溶液中で５分間染色し、メタノール：水（50：50）の溶液中で脱色した。初乳ＳＡＡタンパク質（モノクローナル抗体染色により同定）を膜から切り出した。ｐｆｕピログルタメートアミノペプチダーゼ（TaKaRa Biochemicals）を用いて脱ブロッキングし、その後、エドマン分解を用いてＮ末端シーケンシングを実行した。シーケンシングは、プロサイス４９（University of Nebraska Medical Center’s Protein Core FacilityによるPE-Biosystems製）上で実施した。初乳ＳＡＡに関するＮ末端配列が認められた（図５）。
【０１８３】
血清、初乳および細胞培養液からのＳＡＡの等電点電気泳動（ＩＥＦ）    種々のＳＡＡ調製物の等電点電気泳動のために、プロテインＩＥＦセル（BioRad）を用いた。ＩＥＦのためには、3〜10のｐＨ範囲を有するReady Strip IPG Strip（BioRad Laboratories）を用いた。ＩＰＧストリップを12％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付し、ＰＶＤＦ膜上で電気泳動的転写を実施することにより、二次元タンパク質分析を実行した。ストリップおよびブロットは、ブロットの一方がタンパク質染色、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色され、ＳＡＡタンパク質アイソフォームの同定のために他方が抗ＳＡＡモノクローナル抗体で染色されるよう、２通りに実行した。各ＳＡＡアイソフォームの等電点（ｐＩ）が確定され得るよう、試料は内部ＩＥＦ標準（BioRad Laboratories）も含有した。抗体染色スポットとＣＢＢで染色された標準のスポットを比較することにより、ＳＡＡアイソフォームの見かけのｐＩを確定し得る。これらの手法はすべて、メーカー推奨のプロトコールにしたがって実行した。
【０１８４】
ＩＥＦおよび２−Ｄ分析を施したタンパク質を、細胞培養液に関して前記されているようにアフィニティー精製し、あるいは血清の場合には、疎水性クロマトグラフィーにより半精製しただけであった。ＳＡＡは高疎水性分子であり、オクチルセファロースビーズと容易に結合し、次に適切な条件下でマトリックスから溶離され得る。要するに、高ＳＡＡレベルの血清を等量のオクチルセファロースＣＬ−４Ｂゲルと1時間混ぜ合わせて、血清からのタンパク質とゲルとの疎水性結合を可能にした。ゲルをトリス−ＨＣｌ緩衝液で洗浄して、マトリックス内に閉じ込められていたあらゆるタンパク質を除去した。トリス−ＮａＣｌ緩衝液中の60％イソプロパノールにより、ゲルと結合したタンパク質を溶離した。これらの溶出液は、種々のタンパク質を含有し、その約20％がＳＡＡである。この調製物のアリコート、あるいは細胞培養液または初乳からのアフィニティー精製初乳ＳＡＡをＩＰＧストリップ上に載せて、次に標準手法でＩＥＦおよび２−Ｄに関して追跡調査した。
【０１８５】
染色ゲルを分析後、初乳およびＭＡＣ−Ｔ細胞培養液の両方からの初乳ＳＡＡが８より大きいｐＩを有することを確定し、9.4〜9.6の見かけのｐＩを有すると概算した。血清からのＳＡＡは、約7.0１、5.8および5.5の見かけのｐＩ地を有する３つのアイソフォームを含有した。初乳ＳＡＡのｐＩに適合するアイソフォームは血清中には認められなかった（図６）。
【０１８６】
実施例６
初乳ＳＡＡの機能的役割
ヒトの生理学の顕著な特徴は、腸管を裏打ちする粘膜上皮細胞が膨大な数の微生物を接触し、さらに感染および炎症性合併症の発症率が低いということである。これは、局所的宿主防御メカニズムが非常に有効な、広範囲の非炎症性抗菌防御を包含することを示唆する。後天性免疫系が有効応答を生じ、それは数日または数週間という期間に亘っているが、乳児においては、後天性免疫系は未熟で、十分に機能しない。対照して、腸管の固有の免疫系は継続的であり、あるいは腸管に導入される多数の考え得る病原体に対して直ちに誘導可能であって、粘膜上皮細胞と出生時の機能の非常に密接な近似性に気づかされる。腸固有免疫としては、単一無機分子、例えば一酸化窒素からナチュラルキラー細胞までの範囲の最前線宿主防御素子が挙げられる。固有免疫系のエフェクターアームを含む上皮細胞により産生される多数の分子も存在する。これらの例としては、相対的に小型の抗菌性ペプチドおよびより複雑な糖タンパク質分子、例えばムチンが挙げられる。
【０１８７】
腸管を含めた多数の器官系の上皮細胞により、ムチンが分泌され、細胞表面高分子量糖タンパク質が合成される。腸管の腸管腔と下層の粘膜上皮細胞との間の戦略的介入は、ムチンが多数の重要な生物学的機能を有することを示唆した。腸管において、ムチンは、ウイルス複製を抑制し、腸管からのウイルス清掃を強化することによりウイルス感染に対して防御する。細菌性病原体は、腸上皮に付着するのを妨げられる。腸内病原体の付着は、その後の侵襲、コロニー形成または毒素送達の重要な第一段階である。ムチンによる腸上皮細胞への腸病原体の付着抑制は、立体的妨害によるものである。出願人の過去の研究および他の人々の研究も、特定のムチン−細菌相互作用が、ムチンが宿主に有益に作用する重要なメカニズムであることを示している。しかしながらそのメカニズムにかかわらず、粘膜感染の予防はムチンの重要な機能である。
【０１８８】
異なるムチン遺伝子が同定されており、今日までに、12のヒトムチン遺伝子が同定されている。しかしながらＭＵＣ３ムチンは、優性腸ムチンである。ＭＵＣ３ムチンは、腸内病原体大腸菌（ＥＰＥＣ）の腸上皮細胞への付着を防止するのに有効である、ということがこれまで示されてきた。普通は腸管内でコロニー化する非有害細菌のような作因（即ち共生菌）はＥＰＥＣ上皮細胞付着を抑制し、腸ムチン遺伝子の上向き調節によりそのようにする、ということも出願人は示した。母乳栄養乳児は調合乳栄養乳児よりはるかに感染性下痢に罹りにくい、ということも周知である。これがなぜそうなのかについての多数の理論が存在するが、しかし乳関連アミロイド（初乳ＳＡＡ）がＭＵＣ３遺伝子発現の重要な誘導物質であり得ると仮定されている。In vitroヒト細胞培養検定系を用いて、ＭＵＣ３ｍＲＮＡ発現を出願人は評価した。この系では、初乳ＳＡＡのＮ末端ペプチド配列とともにインキュベートした腸細胞が、細胞培地への初乳ＳＡＡの付加なしで増殖させた対照細胞と比較した場合、ＭＵＣ３ｍＲＮＡ発現増大を示した。この知見をさらに調べるために、無作為に増殖させた初乳ＳＡＡＮ末端ペプチド配列ならびにＮ末端配列の下流の初乳ＳＡＡペプチド配列を用いた、同一in vitro検定におけるＭＵＣ３発現の評価により、初乳ＳＡＡのＮ末端ペプチド配列の機能的特異性を出願人は評価した。ＭＵＣ３の発現が増大した場合には、初乳ＳＡＡの存在下で増殖した腸細胞は細菌病原体の付着を抑制するさらに大きな能力を有するに違いない。細胞培養中で初乳ＳＡＡで予備インキュベートしたin vitro検定系で、ＥＰＥＣを用いて、これを調べた。腸内病原体大腸菌は、第三世界における、そして先進国におけるデイケア環境における下痢の有意の原因であることが認識されている非侵襲性、非毒素産生性病原体である。さらに別の研究は、in vivo試験における初乳ＳＡＡの利点を評価し，ヒトＥＰＥＣと等価の動物ＥＰＥＣを特性化した。初乳関連ＳＡＡは、ヒト腸の固有の防御メカニズムを天然に上向き調節するための手段を提供し、第三世界で高頻度に生じすぎて乳児の死をもたらし、先進国では有意の罹患率と経費をもたらす共通の問題に対する新規の治療形態を提供する。さらに、旅行者または衛生習慣が変化する状態で生活しなければならない人々のための腸感染の予防も罹患率を低減する。したがって、この両方は、有効、天然、非薬剤／化学療法を提供する。
【０１８９】
初乳ＳＡＡの考え得る機能的役割を取り扱うために、出願人は、標準アミノ酸合成機で、保存ＴＦＬＫを含有する成熟タンパク質のＮ末端部分を示すウシからの分子の１０アミノ酸領域を合成した。ペプチドは、以下のアミノ酸で構成されていた：MWGTFLKEAG（配列番号３０）（「Ｎ末端」と呼ぶ）。ＴＦＬＫアミノ酸はペプチドの重要な素子であると思われたため、それら４つのアミノ酸をそれらの順にMWGLTKFEAG（配列番号２８）中でスクランブルさせたペプチドも構築した（「限定スクランブル」と呼ぶ）。対照のために、２つのペプチドを合成した。その一方は全Ｎ−末端ペプチド中のアミノ酸が無作為順GKFAWEGMTL（配列番号２９）（「全スクランブル」呼ぶ）に整列されており、１０アミノ酸ペプチドは、最初の７つがウシＳＡＡDAAQRGPQQAの残基62〜69からであった（配列番号３０）（「Ｃ末端」と呼ぶ）。
【０１９０】
これら４つのペプチドを、Mack等（Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: 1012-1018, 1994 and Am J Physiol. Vol. 4, part 1, pg, G841-950, 1999）が記載した方法にしたがって、ＭＵＣ３またはＭＵＣ２であるムチン（ＭＵＣ）ｍＲＮＡ産生を誘導するそれらの特性に関してそれらを評価する容易とされた細胞培養検定に用いた。
【０１９１】
Ｎ末端ペプチド滴定ＭＵＣ３    小腸上皮細胞（Mack et al., 1994, 1999）を、種々の濃度で37℃で30分間のインキュベーション中にＮ末端10アミノ酸ウシ初乳ＳＡＡペプチド（配列番号３０）に曝露した。試験培地を、ペプチドを含有しない新鮮な培地と取り替えた後、細胞をさらに１時間インキュベートし、次に全細胞ｍＲＮＡを単離して、ＭＵＣ３特異的ｍＲＮＡに関して分析した。図７は、ＴＦＬＫモチーフを含有するウシ初乳ＳＡＡ「Ｎ末端」ペプチドであるＮ末端10アミノ酸が、ベースライン対照レベルの１〜1/2倍までＭＵＣ３ｍＲＮＡの産生を刺激したことを示す（Ｐ-.0002有意）。最適濃度は50μg/ml培地であった（図７参照）。
【０１９２】
ＭＵＣ３／２８ｓＲＮＡ比に関するＡＮＯＶＡ表
【０１９３】
【表４】
2006296431.tif 000005
【０１９４】
ＭＵＣ３／２８ｓＲＮＡ比に関する平均表
作用：初乳ＳＡＡ濃度
【０１９５】
【表５】
2006296431.tif 000006
【０１９６】
ＭＵＣ3刺激    Ｎ末端10アミノ酸ウシ初乳ＳＡＡペプチドのＭＵＣ３刺激活性を、「限定スクランブル」、「全スクランブル」および「Ｃ末端ペプチド」の活性と比較した。インキュベーションの最適時間および温度、ならびにペプチドの濃度は、それぞれ37℃で30分間、50μg/mlであった。図８のデータは、オリジナルＮ末端ペプチドが、対照値より統計学的に有意に上回ってＭＵＣ３ｍＲＮＡを刺激する唯一のペプチドであったことを示す（ｐ-.008）。新規のＴＦＬＫ配列が再整列されたにすぎない「限定スクランブル」ペプチドによる刺激の欠如は、このモチーフが生物学的活性を付与する場合の重要な素子であり、そして恐らくは種間で保存されている理由であることを強く示唆する（図８参照）。
【０１９７】
ＭＵＣ２ｍＲＮＡ／２８ｓＲＮＡ比に関するＡＮＯＶＡ表
【０１９８】
【表６】
2006296431.tif 000007
【０１９９】
ＭＵＣ２ｍＲＮＡ／２８ｓＲＮＡ比に関する平均表
作用：初乳ＳＡＡペプチド
【０２００】
【表７】
2006296431.tif 000008
【０２０１】
ＭＵＣ２刺激    Ｎ末端10アミノ酸ウシ初乳ＳＡＡペプチドがＭＵＣ２産生に関するｍＲＮＡ合成を刺激するか否かを考えるために、ＭＵＣ３よりむしろＭＵＣ2発現に好ましい条件下で、腸上皮細胞を培養した。ＭＵＣ3刺激のために前に最適化した濃度および条件で、すべてのペプチドを用いた。図９に示すように、ペプチドはいずれもＭＵＣ２ｍＲＮＡの産生を刺激しなかった。ＭＵＣ３を刺激したＮ末端10アミノ酸ペプチドを対照ベースライン値と比較した場合、値は有意に異ならなかった。ＭＵＣ２刺激の欠如が培養条件のためではないことを示すために、細胞をＮ末端10アミノ酸ウシ初乳ＳＡＡペプチドに、ＭＵＣ3に関する最適レベル（それぞれ100および500μg/ml）の2倍および5倍で曝露した。さらに、条件を最適ＭＵＣ３インキュベーション時間（1時間）の2倍に変えた。これらの変更は、ＭＵＣ2ｍＲＮＡが対照値より増大させなかった。本証拠は、主として小腸において産生されるムチン（ＭＵＣ３）の産生が、大腸で主に産生されるもの（ＭＵＣ２）より大きく刺激するという機能の特異性を強く示している（図９参照）。
【０２０２】
ＭＵＣ３ｍＲＮＡ／２８ｓＲＮＡ比に関するＡＮＯＶＡ表
【０２０３】
【表８】
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【０２０４】
ＭＵＣ３ｍＲＮＡ／２８ｓＲＮＡ比に関する平均表
作用：初乳ＳＡＡペプチド
【０２０５】
【表９】
2006296431.tif 000010
【０２０６】
本発明は前記の実施耐用に限定されないが、しかし添付の特許請求の範囲内での修正は可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】ウシ（配列番号１）、ヒツジ（配列番号２）およびウマ（配列番号３）初乳ＳＡＡのトリプシン断片、ウマ初乳ＳＡＡ（配列番号4〜８）、ウサギ滑膜繊維芽細胞ＳＡＡ（配列番号９）、ウマ血清ＳＡＡ（配列番号１０）、およびミンク血清ＳＡＡ1（配列番号１１）のトリプシン断片のＮ末端アミノ酸配列アラインメント。
【図２】ウシ初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡのヌクレオチドおよび完全推定アミノ酸配列。ヌクレオチド位置を右側に示す。予測アミノ酸配列はコード配列上の一文字暗号で示し、停止コドンは星印を付して示し、そしてリーダー配列を除去するための推測信号ペプチド切断部位を逆三角形で示す。精製初乳関連ＳＡＡタンパク質のエドマン分解により確定された配列には、二重下線を付す。初乳関連ＳＡＡ300 bpｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に用いられる初期変性オリゴヌクレオチドプライマーに関して逆翻訳された残基をイタリック体で示す。それぞれ初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡ配列の５‘および３’領域のＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーＭ５ＧＷ２およびＭ３ＧＷ２には下線を付す。
【図３】プロラクチンによる刺激後8日間のＭＡＣ−Ｔウシ上皮細胞による初乳ＳＡＡの産生を示すグラフである。測定可能量の初乳ＳＡＡが２日目に検出された。
【図４】初乳ＳＡＡのアフィニティー精製で生成された異なる分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ12％ゲル。分画は以下の通りである：オリジナル培養液（レーン１）、非結合（レーン２）、洗浄分画（レーン３〜８）および溶離分画（レーン９〜１５）。ブロット（ａ．）はＣＣＢで染色したものであり、（ｂ．）はビオチニルか抗ＳＡＡモノクローナル抗体で染色した同一ブロットである。レーン１１は、モノクローナル抗体で同定されたのと同様の初乳ＳＡＡを含有する。これは、アミノ酸分裂分析用およびＩＥＦ用に用いた分画である。
【図５】配列分析により確定した場合のアミノ酸の一覧である。主配列は、初乳ＳＡＡに関するＮ末端配列を含有する。
【図６ａ】図６ａ乃至ｄのブロットは、ＭＡＣ−Ｔ細胞液（Ａ．およびＢ．）、ウシ血清（Ｃ．）、ならびにウシ初乳（Ｄ．）の等電点電気泳動からの２−Ｄゲルを表す。図6Ａは、アフィニティー精製ＭＡＣ−Ｔ細胞液の等電点電気泳動のために標準とともに用いたｐＨ3〜10ＩＰＧストリップから二次元として得た２−Ｄゲルのブロットを表す。すべてのタンパク質が染色されるように、ブロットはＣＢＢで染色した。市販標準のいくつかの等電点（ｐＩ）ならびに初乳ＳＡＡのおよその見かけのｐＩ（ｐＩは9.4〜9.6の範囲）を図に示した。これは、Swiss Institute of BioinformaticsのExPASy Proteomic Serverの計算ｐＩ／Ｍｗツールを用いた初乳ＳＡＡに関する9.6という予測ｐＩと一致する。
【図６ｂ】同一ブロットであるが、これはＳＡＡに対する特異性を有するモノクローナル抗体で染色した。染まる唯一のスポットは初乳ＳＡＡに対応するものであり、このスポットはＣＢＢ染色ブロットで観察されたスポットに適合する。
【図６ｃ】半精製ウシ血清の分析からのモノクローナル抗体染色ブロットである。7.0、5.8および5.5というおよその見かけのｐＩ値を有する３つのアイソフォームは、ＳＡＡに対する特異性を有するモノクローナル抗体で染まる。
【図６ｄ】アフィニティー精製ウシ初乳からの２−Ｄゲルのモノクローナル抗体染色ブロットである。約9.4〜9.6の範囲でのおよその見かけのｐＩで初乳ＳＡＡに対応するスポットのみが、モノクローナル抗体に染まる。ＭＡＣ−Ｔ生成ＳＡＡは、9.4〜9.6のｐＩを有する。したがって、モノクローナル抗体で同定されたスポットは同一ｐＩおよび分子量（12 Kda）を有し、そしてこの値は血清中に見いだされるアイソフォームのいずれのｐＩとも有意に異なるため、ＭＡＣ−Ｔ培地および初乳はともに初乳ＳＡＡを含有する。
【図７】（Ｎ末端ペプチド滴定ムチン３（ＭＵＣ３））ＭＵＣ３特異的ｍＲＮＡを測定する検定の結果を示す。Ｎ末端の10個のアミノ酸のウシ初乳ＳＡＡペプチド含有ＴＦＬＫは、ベースライン対照レベルの1〜1/2倍までＭＵＣ３ｍＲＮＡの産生を刺激した（有意Ｐ−．0002）。理想濃度は50μg/培地1 mlであった。
【図８】ムチン３（ＭＵＣ３）刺激）Ｎ末端10アミノ酸ウシ初乳ＳＡＡペプチドのＭＵＣ３刺激活性を、細胞に及ぼす「限定スクランブル」、「全体的スクランブル」および「Ｃ末端ペプチド」の活性との比較を示すグラフである。図８は、オリジナルＮ末端ペプチドが対照値を統計学的に有意に（ｐ−.008）上回ってＭＵＣ３ｍＲＮＡを刺激した唯一のペプチドであったことを示す。
【図９】（ムチン２（ＭＵＣ２）刺激）ＭＵＣ2発現に好都合な培養条件下でのＭＵＣ２産生のグラフであって、ペプチドはいずれも、ＭＵＣ３産生を刺激したＮ末端10アミノ酸ペプチドを含めたＭＵＣ２ｍＲＮＡの産生を刺激しなかった。実験地はいずれも、対照値と有意に異ならなかった。
【図１】
2006296431.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
2006296431.tif 000017
【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
2006296431.tif 000020
【図８】
2006296431.tif 000021
【図９】
2006296431.tif 000022
【配列表】
2006296431000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月5日(2006.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３で示される単離かつ精製された初乳関連血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質、または配列番号１３の配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加及び／もしくは欠失されており、かつムチン３（ＭＵＣ−３）産生を刺激できる当該ＳＡＡタンパク質のサイレント変異体であって、当該タンパク質のＮ末端領域に存在する配列ＴＦＬＫをさらに特徴とするタンパク質。
【請求項２】
ウシ初乳から単離かつ精製された請求項１記載のＳＡＡ。
【請求項３】
配列番号３と、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から成る群から選択される１つまたはそれ以上の配列とを含み、ＭＵＣ−３産生を刺激できる、単離かつ精製された初乳関連血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質。
【請求項４】
ウシ初乳から単離かつ精製された請求項３記載のＳＡＡタンパク質。
【請求項５】
ヒツジ初乳から単離かつ精製された請求項３記載のＳＡＡタンパク質。
【請求項６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む請求項５記載のＳＡＡタンパク質。
【請求項７】
請求項３記載の初乳関連ＳＡＡタンパク質をコードする単離かつ精製された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１２の配列と高ストリンジェント条件においてハイブリダイズすることができる配列を含む請求項７記載の核酸分子。
【請求項９】
配列番号１２で示される核酸配列を含む請求項８記載の核酸分子。
【請求項１０】
プロモーター領域と作用可能式に連結された請求項７記載の核酸分子を含む発現カセット。
【請求項１１】
請求項１０記載の発現カセットを含むクローニングまたは発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターで形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞。
【請求項１３】
１つまたはそれ以上の配列番号２、４〜８あるいはそれらのサイレント変異体をコードする配列を含む請求項７記載の核酸分子。
【請求項１４】
哺乳類からのＴＦＬＫアミノ酸配列を含む請求項１〜１３のいずれか１項記載の初乳関連ＳＡＡの獲得方法であって、以下の：
ａ）哺乳類からの初乳の試料を提供し、そして
ｂ）試料中に含有されるＳＡＡタンパク質を試料中に含有される他の物質から分離し、
ｃ）分離したタンパク質を配列決定して、ＴＦＬＫアミノ酸配列の存在を確認する
過程を包含する方法。
【請求項１５】
哺乳類がウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヒトから成る群から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法により製造されるＳＡＡタンパク質。
【請求項１７】
有効量の請求項１〜１３のいずれか１項記載の初乳関連血清アミロイドＡタンパク質及びに製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物。
【請求項１８】
前記タンパク質が配列番号１３で示される配列を含む請求項１７記載の製剤組成物。
【請求項１９】
前記担体が水である請求項１７記載の製剤組成物。
【請求項２０】
前記担体が食塩水である請求項１７記載の製剤組成物。
【請求項２１】
賦形剤をさらに含む請求項１７記載の製剤組成物。
【請求項２２】
前記賦形剤がラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールから成る群から選択される充填剤である請求項２１記載の製剤組成物。
【請求項２３】
経口投与形態である請求項１７記載の製剤組成物。
【請求項２４】
ヒトを除く動物における腸病原体に関連した疾患の治療および予防方法であって、有効量の請求項１〜１３のいずれか１項記載のタンパク質ならびに製薬上許容可能な担体を前記動物に導入することを包含する方法。
【請求項２５】
前記配列が粘膜上皮細胞においてＭＵＣ３産生を刺激し得る請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質が初乳関連血清アミロイドＡタンパク質である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が配列番号１７で示される配列から成る請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｎ末端アミノ酸配列が配列番号３０で示される配列またはそのサイレント変異体から成る請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記腸病原体が大腸菌である請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患が旅行者下痢、壊死性腸炎および尿路感染から成る群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の初乳関連ＳＡＡタンパク質コードヌクレオチド配列の同定方法であって、ストリンジェント条件下で配列番号１２とハイブリダイズする配列に関してＤＮＡの試料を検定することを包含する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
【図１】ウシ（配列番号１）、ヒツジ（配列番号２）およびウマ（配列番号３）初乳ＳＡＡのトリプシン断片、ウマ初乳ＳＡＡ（配列番号4〜８）、ウサギ滑膜繊維芽細胞ＳＡＡ（配列番号９）、ウマ血清ＳＡＡ（配列番号１０）、およびミンク血清ＳＡＡ1（配列番号１１）のトリプシン断片のＮ末端アミノ酸配列アラインメント。
【図２】ウシ初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡのヌクレオチドおよび完全推定アミノ酸配列。ヌクレオチド位置を右側に示す。予測アミノ酸配列はコード配列上の一文字暗号で示し、停止コドンは星印を付して示し、そしてリーダー配列を除去するための推測信号ペプチド切断部位を逆三角形で示す。精製初乳関連ＳＡＡタンパク質のエドマン分解により確定された配列には、二重下線を付す。初乳関連ＳＡＡ300 bpｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅に用いられる初期変性オリゴヌクレオチドプライマーに関して逆翻訳された残基をイタリック体で示す。それぞれ初乳関連ＳＡＡｃＤＮＡ配列の５‘および３’領域のＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーＭ５ＧＷ２およびＭ３ＧＷ２には下線を付す。
【図３】プロラクチンによる刺激後8日間のＭＡＣ−Ｔウシ上皮細胞による初乳ＳＡＡの産生を示すグラフである。測定可能量の初乳ＳＡＡが２日目に検出された。
【図４】初乳ＳＡＡのアフィニティー精製で生成された異なる分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ12％ゲル。分画は以下の通りである：オリジナル培養液（レーン１）、非結合（レーン２）、洗浄分画（レーン３〜８）および溶離分画（レーン９〜１５）。ブロット（ａ．）はＣＣＢで染色したものであり、（ｂ．）はビオチニルか抗ＳＡＡモノクローナル抗体で染色した同一ブロットである。レーン１１は、モノクローナル抗体で同定されたのと同様の初乳ＳＡＡを含有する。これは、アミノ酸分裂分析用およびＩＥＦ用に用いた分画である。
【図５】配列分析により確定した場合のアミノ酸の一覧である。主配列は、初乳ＳＡＡに関するＮ末端配列を含有する。
【図６ａ】図６ａ乃至ｄのブロットは、ＭＡＣ−Ｔ細胞液（ａ．およびｂ．）、ウシ血清（ｃ．）、ならびにウシ初乳（ｄ．）の等電点電気泳動からの２−Ｄゲルを表す。図6Ａは、アフィニティー精製ＭＡＣ−Ｔ細胞液の等電点電気泳動のために標準とともに用いたｐＨ3〜10ＩＰＧストリップから二次元として得た２−Ｄゲルのブロットを表す。すべてのタンパク質が染色されるように、ブロットはＣＢＢで染色した。市販標準のいくつかの等電点（ｐＩ）ならびに初乳ＳＡＡのおよその見かけのｐＩ（ｐＩは9.4〜9.6の範囲）を図に示した。これは、Swiss Institute of BioinformaticsのExPASy Proteomic Serverの計算ｐＩ／Ｍｗツールを用いた初乳ＳＡＡに関する9.6という予測ｐＩと一致する。
【図６ｂ】同一ブロットであるが、これはＳＡＡに対する特異性を有するモノクローナル抗体で染色した。染まる唯一のスポットは初乳ＳＡＡに対応するものであり、このスポットはＣＢＢ染色ブロットで観察されたスポットに適合する。
【図６ｃ】半精製ウシ血清の分析からのモノクローナル抗体染色ブロットである。7.0、5.8および5.5というおよその見かけのｐＩ値を有する３つのアイソフォームは、ＳＡＡに対する特異性を有するモノクローナル抗体で染まる。
【図６ｄ】アフィニティー精製ウシ初乳からの２−Ｄゲルのモノクローナル抗体染色ブロットである。約9.4〜9.6の範囲でのおよその見かけのｐＩで初乳ＳＡＡに対応するスポットのみが、モノクローナル抗体に染まる。ＭＡＣ−Ｔ生成ＳＡＡは、9.4〜9.6のｐＩを有する。したがって、モノクローナル抗体で同定されたスポットは同一ｐＩおよび分子量（12 Kda）を有し、そしてこの値は血清中に見いだされるアイソフォームのいずれのｐＩとも有意に異なるため、ＭＡＣ−Ｔ培地および初乳はともに初乳ＳＡＡを含有する。
【図７】（Ｎ末端ペプチド滴定ムチン３（ＭＵＣ３））ＭＵＣ３特異的ｍＲＮＡを測定する検定の結果を示す。Ｎ末端の10個のアミノ酸のウシ初乳ＳＡＡペプチド含有ＴＦＬＫは、ベースライン対照レベルの1〜1/2倍までＭＵＣ３ｍＲＮＡの産生を刺激した（有意Ｐ−．0002）。理想濃度は50μg/培地1 mlであった。
【図８】ムチン３（ＭＵＣ３）刺激）Ｎ末端10アミノ酸ウシ初乳ＳＡＡペプチドのＭＵＣ３刺激活性を、細胞に及ぼす「限定スクランブル」、「全体的スクランブル」および「Ｃ末端ペプチド」の活性との比較を示すグラフである。図８は、オリジナルＮ末端ペプチドが対照値を統計学的に有意に（ｐ−.008）上回ってＭＵＣ３ｍＲＮＡを刺激した唯一のペプチドであったことを示す。
【図９】（ムチン２（ＭＵＣ２）刺激）ＭＵＣ2発現に好都合な培養条件下でのＭＵＣ２産生のグラフであって、ペプチドはいずれも、ＭＵＣ３産生を刺激したＮ末端10アミノ酸ペプチドを含めたＭＵＣ２ｍＲＮＡの産生を刺激しなかった。実験地はいずれも、対照値と有意に異ならなかった。