(57)【要約】【課題】  細胞が微細なパターン状に配置された移植片であって、迅速な移植が可能であり、かつ移植後除去する必要のない移植片を提供する。【解決手段】  生体吸収性材料からなる支持体と細胞とを含む細胞含有シートであって、支持体がその表面に細胞接着性タンパク質含有層を有し、細胞が支持体上でパターンを形成している、前記細胞含有シート。【選択図】  図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性材料からなる支持体と細胞とを含む細胞含有シートであって、
支持体がその表面に細胞接着性タンパク質含有層を有し、細胞が細胞接着性タンパク質含有層上でパターンを形成している、前記細胞含有シート。
【請求項２】
支持体が羊膜由来である、請求項１記載の細胞含有シート。
【請求項３】
支持体が、生分解性ポリマー材料と該材料表面に付着した細胞接着性タンパク質含有層とを含む、請求項１記載の細胞含有シート。
【請求項４】
細胞が互いに細胞間結合を形成している、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞含有シート。
【請求項５】
細胞が形成するパターンが、３ｍｍ以下の幅のパターンを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の細胞含有シート。
【請求項６】
細胞が形成するパターンが、幅５μｍ〜３ｍｍのライン状に細胞が配置されたパターンを含む、請求項５記載の細胞含有シート。
【請求項７】
その表面に細胞接着性タンパク質含有層を有する生体吸収性材料からなる支持体と細胞とを含む細胞含有シートの製造方法であって、
ａ）細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に細胞を接着させる工程、
ｂ）細胞がパターン状に接着した細胞配列用基材と支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層とを接触させることにより細胞を該支持体に接着させる工程、及び
ｃ）細胞配列用基材を支持体から剥離し、細胞を該支持体に転写する工程、
を含む、前記方法。
【請求項８】
支持体が羊膜由来である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
支持体が、生分解性ポリマー材料と該材料表面に付着した細胞接着性タンパク質含有層とを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
細胞接着性変化パターンが、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層によって形成されたものである、
請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
細胞接着性変化層が、光触媒及び細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞接着性変化層が、光触媒を含有する光触媒処理層と、該光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞接着性変化パターンが、細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層と光触媒を含有する光触媒含有層とを対向するように配置した後、エネルギー照射することにより形成されたものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞含有シートを、哺乳動物に移植する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用移植片として有用な細胞含有シートおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人工代替物や細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植しようという技術が注目されている。その代表的な例として、人工皮膚、人工血管および培養細胞組織等が挙げられる。合成高分子を用いた人工皮膚等は拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用として好ましくない。一方、培養細胞組織は本人の細胞を培養して組織化したものであるため拒絶反応の心配がなく、移植用として好ましい。このような培養細胞組織は、本人から細胞を採取し、これを培養することにより作成される。
【０００３】
多くの動物細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長時間生存することができないため、上記のような細胞組織を作成するための細胞培養においては、例えば表面処理により細胞接着性を高めた改質ポリスチレン等の高分子材料や、又はコラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質をガラスや高分子材料に均一に塗布した培養皿が担体として用いられてきた。このような担体に平面状に接着した細胞は、培養性は良好であるが、通常組織化しにくいため、細胞本来の機能が得られない。例えば組織化していない培養肝細胞のアルブミン産生能は組織化肝細胞(肝スフェロイド)の数分の一に低下するという研究報告がある。
【０００４】
これに対し、細胞の組織化を促進するため、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面パターンを有する基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
【０００５】
例えば、特許文献１では、細胞非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。さらに、特許文献２では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
【０００６】
しかしながら、上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体高分子等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。また、細胞の培養能が高い生体材料等は一般的にプラズマにより分解しにくいため、プラズマエッチング法を用いたパターニングも工業生産性が低く実用的ではない。
【０００７】
さらに、上記のようにパターニングして培養された細胞は、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や化学薬品で処理することにより回収されるため、処理工程が煩雑になり、コンタミネーションの可能性が高くなることや、細胞が変性若しくは損傷し、細胞本来の機能が損なわれる可能性があること等の問題があった。
【０００８】
特許文献３では、基材上に温度応答性ポリマーによるパターンを形成した細胞培養支持体を作成し、該細胞培養支持体上で細胞を培養し、これを高分子膜に密着させて温度を変化させることにより細胞を損傷させることなく高分子膜とともに細胞を剥離して細胞シートを製造する方法を開示している。しかし、ここで開示される方法では、細胞を支持体から高分子膜とともに剥離するときの高分子膜と細胞との密着力は弱く、微細なパターンを有する細胞シートを形成することは困難である。
【０００９】
特許文献４には、基材上に細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面に細胞を接着させ、接着した細胞をパターン化された状態で移植部位に転写して培養することにより、移植部位において微細な細胞パターンを形成する方法が報告されている。しかし、当該方法では、細胞配列用基材上の細胞を移植部位に重ね合わせた後、細胞が移植部位に定着するまで細胞配列用基材を保持したまま培養する必要があり、迅速な移植が困難であった。
【００１０】
一方、スポンジ層と上皮層を除去した羊膜上で、角膜上皮細胞や結膜上皮細胞を培養、組織化させ、その羊膜ごと移植用細胞片とする技術が報告されている（例えば、特許文献５）。羊膜は、十分な膜強度を持っていること、さらには抗原性を持っていないことから、移植用細胞片の支持体として好都合であるが、ここで開示される方法では、細胞を微細なパターン状に配置して培養することができない。
【００１１】
【特許文献１】特開平３−７５７６号公報
【特許文献２】特開平５−１７６７５３号公報
【特許文献３】特開２００３−３８１７０号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／０３８０１１号パンフレット
【特許文献５】特開２００１−１６１３５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、細胞が微細なパターン状に配置された移植片であって、迅速な移植が可能であり、かつ移植後除去する必要のない移植片を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面に細胞をパターン状に接着させ、生体吸収性材料からなる支持体に転写することにより、細胞の微細なパターンを有する移植片を形成できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）生体吸収性材料からなる支持体と細胞とを含む細胞含有シートであって、
支持体がその表面に細胞接着性タンパク質含有層を有し、細胞が細胞接着性タンパク質含有層上でパターンを形成している、前記細胞含有シート。
（２）支持体が羊膜由来である、（１）記載の細胞含有シート。
（３）支持体が、生分解性ポリマー材料と該材料表面に付着した細胞接着性タンパク質含有層とを含む、（１）記載の細胞含有シート。
（４）細胞が互いに細胞間結合を形成している、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞含有シート。
（５）細胞が形成するパターンが、３ｍｍ以下の幅のパターンを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞含有シート。
（６）細胞が形成するパターンが、幅５μｍ〜３ｍｍのライン状に細胞が配置されたパターンを含む、（５）記載の細胞含有シート。
（７）その表面に細胞接着性タンパク質含有層を有する生体吸収性材料からなる支持体と細胞とを含む細胞含有シートの製造方法であって、
ａ）細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に細胞を接着させる工程、
ｂ）細胞がパターン状に接着した細胞配列用基材と支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層とを接触させることにより細胞を該支持体に接着させる工程、及び
ｃ）細胞配列用基材を支持体から剥離し、細胞を該支持体に転写する工程、
を含む、前記方法。
（８）支持体が羊膜由来である、（７）記載の方法。
（９）支持体が、生分解性ポリマー材料と該材料表面に付着した細胞接着性タンパク質含有層とを含む、（７）記載の方法。
（１０）細胞接着性変化パターンが、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層によって形成されたものである、
（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）細胞接着性変化層が、光触媒及び細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層である、（１０）記載の方法。
（１２）細胞接着性変化層が、光触媒を含有する光触媒処理層と、該光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有する、（１０）記載の方法。
（１３）細胞接着性変化パターンが、細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化層と光触媒を含有する光触媒含有層とを対向するように配置した後、エネルギー照射することにより形成されたものである、（１２）記載の方法。
（１４）（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞含有シートを、哺乳動物に移植する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、細胞が微細なパターン状に配置された移植片であって、迅速な移植が可能であり、かつ移植後除去する必要のない移植片が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、生体吸収性材料からなる支持体と細胞とを含む細胞含有シートに関する。本発明の細胞含有シートにおいて、支持体はその表面に細胞接着性タンパク質含有層を有し、細胞が該支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層上でパターン、好ましくは微細なパターンを形成している。
【００１７】
生体吸収性材料からなる支持体は、その表面に細胞接着性タンパク質含有層を有し、生体内において加水分解や酵素分解などにより分解され吸収され、ある程度の機械的強度を有するものであれば特に制限されない。生体由来のものも、合成のものも使用できる。
【００１８】
生体吸収性材料からなる合成の支持体としては、生分解性ポリマー材料と該材料表面に付着した細胞接着性タンパク質含有層とを含むものを使用できる。生分解性ポリマー材料としては、生体内で加水分解、酵素分解などにより分解され吸収され、ある程度の機械的強度を有するものであれば特に制限されず、好適にはポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸と乳酸との共重合体、ポリジオキサノン、グリコール酸とトリメチレンカーボネートの共重合体、ポリグリコール酸とポリ乳酸との混合物などを用いることができる。生分解性ポリマー材料の形態は特に制限されず、目的に応じて適宜設計できるが、例えば、シート、メッシュシート、織布、不織布などとすることができる。細胞を微細なパターン状に配置するためには、シートの形態が好ましい。上記生分解性ポリマーは、プラズマ照射等により親水化処理を行うのが好ましい。
【００１９】
上記生分解性ポリマー材料の表面に細胞接着性タンパク質含有層を付着させることにより、支持体を作成することができる。細胞接着性タンパク質含有層の形成は、例えば、細胞接着性タンパク質を含む溶液を生分解性ポリマー材料の表面に塗布することにより実施できる。例えば、細胞接着性タンパク質の単層の厚さは約２ｎｍであり、生体組織中の基底膜の厚さは約５０ｎｍ〜１００ｎｍであり、羊膜の厚さは約０．１ｍｍであり、角膜の厚さは約０．５ｍｍである。これらのことを考慮し、細胞接着性タンパク質含有層の厚さは、２ｎｍ〜２ｍｍ程度、好ましくは５０ｎｍ〜１ｍｍ程度となるように調整する。
【００２０】
細胞接着性タンパク質は、細胞を接着する機能を有するタンパク質であり、具体的には、各種タイプのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリン、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン及びインテグリン等が挙げられる。本発明における細胞接着性タンパク質含有層としては、細胞接着性が高いという点で、コラーゲンを含む層が好ましい。
【００２１】
コラーゲンとしては、従来から用いられている各種のコラーゲンを用いることができ、例えば、中性可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲンなどがある。これらのうち、アルカリ可溶化コラーゲン及び酵素可溶化コラーゲンは、不溶性コラーゲンをそれぞれアルカリ処理又はペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、プロナーゼなどの酵素で処理したもので、これらの処理によりコラーゲン分子中の抗原性の強いテロペプチド部分が除去されて抗原性が低減されているので、好適に使用される。
【００２２】
これらコラーゲンの由来は、特に限定されず、一般に、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ネズミ等の哺乳動物の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器などから得られるコラーゲンが用いられる。また、魚類、鳥類などから得られるコラーゲン様タンパク質も用いることができる。
【００２３】
本発明において、生体吸収性材料からなる支持体とは、この細胞接着性タンパク質含有層を含んだ構造を指す。生体由来の支持体の場合、細胞接着性タンパク質含有層は、生体内の組織上にもともと存在する細胞外基質の層でもよい。
【００２４】
生体由来の支持体は、生体内に存在する膜状の組織に由来し、抗原性の低いものであれば特に制限されない。例えば、羊膜に由来する支持体および絨毛膜に由来する支持体が挙げられる。移植片として免疫反応を惹起しないものが好ましいことから、支持体としては、細胞を有しない膜または細胞を除去した膜を用いるのが好ましい。細胞が抗原性を有し免疫反応を惹起する場合があるからである。本発明における生体由来の支持体としては、羊膜由来の支持体が最も好ましい。羊膜は血管成分を含まないため拒絶反応が起こりにくく、移植片の材料として好適である。
【００２５】
羊膜又は絨毛膜の採取は、例えば、特開平５−５６９８７号公報に記載されているように行えばよい。すなわち、分娩直後の一体となった胎児膜、胎盤及び臍帯から１％塩化ベンザルコニウム溶液又は臭化ベンザルコニウム溶液中で、胎児膜のみを分離し、更にこの４層からなる胎児膜から羊膜または絨毛膜を剥離し、残存組織などを物理的及び酵素的に除去した後、超音波洗浄すれば精製羊膜又は絨毛膜が得られる。
【００２６】
生体内の羊膜は、上皮層、基底膜層、緻密層、繊維芽細胞層および海綿層から構成されるが、生体内の羊膜から細胞で構成される層を取り除き、緻密層および基底膜層からなる膜を羊膜由来の支持体として用いるのが好ましい。基底膜層は、コラーゲンを多く含むことから、緻密層および基底膜層からなる生体由来の支持体において、細胞接着性タンパク質含有層として機能する。緻密層もまたコラーゲンを多く含むことから細胞接着性タンパク質含有層として機能しうるとともに、緻密層のみからなる膜を本発明の支持体として用いることもできる。羊膜からの細胞層の除去は、例えば、特開２００１−１６１３５３号公報に記載されているように行えばよい。すなわち、上記のように採取された羊膜を、１０％アンモニア水で前処理することにより上皮層等の細胞層を剥がし易くすることができる。
【００２７】
羊膜に由来する支持体においては、緻密層および基底膜層からなる膜を、さらに上記生分解性ポリマー材料によって支持してもよい。すなわち本発明において、生体分解性材料からなる支持体には、生分解性ポリマー材料に、羊膜などの生体由来膜を付着させたものも包含される。この場合、生体由来膜は、コラーゲン等の細胞接着性タンパク質を接着剤として用いることにより生分解性ポリマー材料へ付着させることができる。
【００２８】
また、支持体が細胞接着性を有する場合、細胞接着性タンパク質含有層を支持体にかねさせることができる。このような支持体としては、例えば、コラーゲン膜、ラミニン膜などが挙げられる。
【００２９】
本発明の細胞含有シートにおいては、上記生体吸収性材料からなる支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層上で細胞がパターンを形成している。好ましくは、細胞接着性タンパク質含有層上には、レジストの印刷やプラズマなどによる表面処理などのパターニング処理が一切施されていない。レジストが細胞接着阻害性だけでなく毒性も示す可能性やプラズマなどによる処理で細胞接着性タンパク質含有層が熱変性する可能性などを回避できるからである。本発明の細胞含有シートに含まれる細胞としては、接着性を有する細胞が好ましい。そのような細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞及び子宮頸部上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、平滑筋細胞及び心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞及び視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。本発明は、血管内皮細胞、神経細胞およびリンパ管細胞などのパターン状に配置されることにより組織化が促進される細胞について特に好適に用いられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものまたは培養下で分化させたものでもよい。すなわち本発明において使用する細胞は、未分化細胞であるＥＳ細胞、多分化能を有する多能性幹細胞、単分化能を有する単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。血管内皮細胞を採取できる血管としては、具体的には頚動脈、臍帯静脈、体網中の血管など大血管から微小血管までを含み、培養下で血管内皮細胞に分化させる細胞としては骨髄および臍帯血や末梢血に存在する血管内皮細胞前駆細胞や脂肪細胞、ＥＳ細胞などが挙げられる。また、複数種の細胞から成る細胞パターンでもよい。
【００３０】
本発明の細胞含有シートにおいて形成されるパターンは、二次元のパターンであれば特に制限されず、例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形及び四角形等の図形の内部全体に細胞が配置されるパターンなどを形成することができる。本発明は特に微細なパターンを形成できる点において有利である。本発明によれば、従来行われていた細胞懸濁液の滴下や散布では形成することができなかった微細なパターンを支持体上に形成することができる。すなわち、本発明の細胞含有シートは、細胞が少なくとも一部に微細なパターンを含み、例えば３ｍｍ以下の幅のパターン、好ましくは幅５μｍ〜３ｍｍ、より好ましくは幅５μｍ〜５００μｍのライン状に細胞が配置されたパターンを含み得る点で、従来の細胞シートとは区別される。ここでラインには、ツリー状、網目状、格子状のパターンに含まれる曲線状および直線状のラインも包含される。本発明により形成されるパターンにおいては、細胞を単に散布した場合と異なり、細胞同士をパターン状に配列させることで相互作用させることができる。細胞は相互作用することにより組織化し、その結果、生存率も高まるため、より効率的に細胞含有シートを製造することができる。
【００３１】
血管内皮細胞、神経細胞およびリンパ管細胞等の場合は、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状又は格子状に配列されることにより組織化が促進され、血管または神経の形成が促される。具体的には、細胞が配置されるライン幅は、通常５μｍ〜５００μｍ、好ましくは２０μｍ〜３００μｍであり、細胞が存在しないスペース幅は通常２０μｍ〜５００μｍ、好ましくは４０μｍ〜３００μｍである。あるいはライン幅は、細胞が１〜５０個、好ましくは２〜３０個収まる程度のものとする。ライン幅を上記の数値範囲とすることにより、血管内皮細胞が効率的に管組織化することができる。このような細胞接着性変化パターンを形成することにより、ライン状に接着され転写された血管内皮細胞は、組織化してライン状の毛細血管を効率的に形成する。複数のラインが交わることなく並ぶような細胞パターンを形成したい場合は、細胞が接着したラインとラインの間のスペース幅を上記のように一定の値以上とすることにより、細胞が組織化する際にラインとライン間で細胞から擬足が伸びてラインにゆがみが生じるのを防ぐことができる。
【００３２】
また、血管内皮細胞を格子状に配置して培養することにより毛細血管を形成する場合は、上記のようにラインとスペースが交互に配置されるとともに、該ラインと交わってさらにライン状に細胞が配置される。この場合、互いに交わるラインのライン幅は上記と同様である。さらなるライン間のスペース幅は、通常０．０３〜５ｃｍ、好ましくは０．０４〜３ｃｍである。
【００３３】
これまでに報告されている人工血管の直径は４ｍｍ以上であり、これより細い毛細血管を人工的に製造することは困難であった。しかし、本発明により微細なパターンで細胞が配置された細胞含有シートが提供され、毛細血管の形成および迅速な移植が可能になる。
【００３４】
本発明はまた、上記細胞含有シートを哺乳動物に移植する方法に関する。本発明の細胞含有シートにおける支持体は生体吸収性の材料からなるため、移植後、生体内で分解および吸収される。従って、従来のように再手術や内視鏡術で抜去する必要はない。本発明の細胞含有シートを移植することができる哺乳動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ネズミ、ウマ、サル等が挙げられる。
【００３５】
本発明の細胞含有シートの移植においては、支持体側または細胞側のいずれの面を移植部位に接触させてもよい。移植部位が基底膜などの細胞接着性タンパク質含有層を有する場合は、本発明の細胞含有シートにおける支持体側を、移植部位に接触させることにより移植を行うのが好ましい。生体吸収性材料からなる支持体の分解および吸収が早まるからである。移植部位が、細胞接着性タンパク質を含む層を有しない場合は、移植部位への細胞含有シートの接着を促す観点から、本発明の細胞含有シートにおける細胞および細胞接着性タンパク質含有層の側を、移植部位に接触させることにより移植を行うのが好ましい。
【００３６】
臓器移植においては、移植後、当該臓器の表面に毛細血管が形成されるが、この毛細血管を移植する臓器の表面に予め形成させてから移植することにより、移植を効果的に行う技術が知られている。しかし、移植前に毛細血管を形成し、これを臓器表面に付着させる従来技術の方法では、毛細血管の形成に時間がかかり迅速な移植が不可能である。さらに、培養用基材で予め形成した血管を基材から剥がして臓器表面に移す際に組織が損傷する。本発明の細胞含有シートはそのまま移植できるため、血管を剥がす必要がなく組織が損傷することがない。また、本発明の細胞含有シートにおいては、支持体上で完全な血管組織が形成される前段階で移植を行っても、細胞含有シート上で細胞がパターン状に配置されていることから、生体内において組織化が促進され血管を形成することができる。従って、迅速な移植が可能となる。
【００３７】
本発明はまた上記細胞含有シートの製造方法に関する。すなわち本発明は、その表面に細胞接着性タンパク質含有層を有する生体吸収性材料からなる支持体と細胞とを含む細胞含有シートの製造方法であって、
ａ）細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材表面の細胞接着性良好領域に細胞を接着させる工程、
ｂ）細胞がパターン状に接着した細胞配列用基材と支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層とを接触させることにより細胞を該支持体に接着させる工程、及び
ｃ）細胞配列用基材を支持体から剥離し、細胞を該支持体に転写する工程、
を含む前記方法に関する。
【００３８】
ａ）の工程において、細胞を、細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材に播種することによりその表面の細胞接着性良好領域に接着させる。目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理などを行っておくことが好ましい。
【００３９】
細胞配列用基材への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養、マイクロキャリヤー培養、多孔性担体内３次元培養などの通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を容器表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器などの表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件などは、通常の単層培養法などに準じて行う。細胞が接着して増殖する容器表面の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲン及びゼラチン等の細胞の接着や増殖が良好に行われる材料を選択したり、ガラスシャーレ、プラスチックシャーレ、スライドガラス、カバーガラス、プラスチックシート及びプラスチックフィルム等の支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。
【００４０】
培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の容器表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、容器表面に接着した生細胞のみを回収できる。容器表面に接着した生細胞の回収には、ＥＤＴＡ−トリプシン処理などの手段が適用できる。
【００４１】
上記のように予備培養した細胞を、図１（ａ）に示すように、培養液中の細胞配列用基材（１５）上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞を細胞配列用基材上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。通常、培養液１ｍｌ当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましく、また、基材１ｃｍ２当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。細胞が凝集すると細胞の組織化が阻害され、細胞培養用基材に転写して培養しても機能が低下するからである。具体的には、４００ｍｍ２あたり２×１０５個程度で播種する。
【００４２】
細胞を播種した細胞配列用基材を培養液中で培養することにより、細胞を細胞接着性良好領域に接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる培地を使用することができ、例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地(Eagle’s Minimum Essential Medium)、ＢＭＥ培地(Eagle’s Basal Medium)、ＤＭＥＭ培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、αＭＥＭ培地(Stanners’ Modified Eagle’s Minimum Essential Medium)、ＩＭＥＭ培地(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、ＥＳ培地(Koyama’s Modified Eagle’s Minimum Essential Medium)、ＤＭ−１６０培地(Katsuta’s Denken Medium 160)、Ｆｉｓｈｅｒ培地(Fisher’s Medium for Leukemic Cells of Mice)、Ｆ１２培地(Ham’s Medium F12)、ＷＥ培地(Williams’ Medium E)及びＲＰＭＩ培地(Roswell Park Memorial Institute’s Medium 1640)等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編 組織培養の技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地を用いることができる。さらに、これらの培地に血清成分（ウシ胎児血清等）等を添加したもの、並びにＧｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。
【００４３】
図１（ｂ）に示すように、細胞を培養する工程は、細胞配列用基材の細胞接着性良好領域に細胞を接着することを目的とする。培養する時間は細胞を接着させることができれば特に限定されないが、通常１６〜３０時間、好ましくは２０〜２４時間である。適度な時間で培養することによって、洗い流したときに細胞配列用基材の細胞接着性阻害領域の細胞が流されるとともに、細胞接着性良好領域の細胞は適切な接着力で細胞配列用基材上に残るため、残った細胞を細胞培養用基材に容易に転写することが可能になる。
【００４４】
培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、ＣＯ２雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、細胞配列用基材を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞がパターン状に配列される（図１（ｃ））。
【００４５】
細胞配列用基材において、パターン状に配列しようとする細胞ごとに最適な細胞接着性を有する領域が形成された細胞接着性変化パターンとすることにより、複数種の細胞を同一の細胞配列用基材上で目的のパターンで接着させることもできる。
【００４６】
細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材については、後述する。
【００４７】
ｂ）の工程において、細胞がパターン状に接着した細胞配列用基材と支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層とを接触させることにより細胞を該支持体に接着させる。本発明による細胞の転写の手順の概要を図２に示す。
【００４８】
図２（ａ）に示すように、細胞接着性良好領域に細胞が接着している細胞配列用基材を、生体吸収性材料からなる支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層に密着させる。次いで、図２（ｂ）に示すように、細胞を培養することで支持体表面の細胞接着性タンパク質含有層に細胞を接着させる。さらに、細胞の細胞接着性良好領域への接着力は、細胞接着性タンパク質含有層への接着力に比べて小さいことから、図２（ｃ）に示すように、細胞配列用基材を支持体から剥離すると、支持体に細胞が転写される。好ましくは、細胞配列用基材と支持体とを密着させた状態で培養を行う。培養を行う間に細胞の極性が変化し、支持体への細胞の接着が促進される。培養は、通常、ＣＯ２濃度５％、３７℃で、３〜９６時間行う。支持体を剥離後、転写された細胞をさらに培養すると、図２（ｄ）に示すように細胞が組織化および機能化され、血管内皮細胞であれば環状構造が再現される。培養液としては、上記と同様のものを使用することができる。なお、細胞配列用基材と支持体とを密着させた状態で培養している間に、実質的に細胞と細胞配列用基材の相互作用が無くなり、細胞が機能化または組織化される場合もある。
【００４９】
転写した細胞の培養においては、必要に応じて、細胞刺激因子を添加することにより、細胞活性を高めたり、細胞が本来有する機能を発現させ組織化を促進することができる。細胞刺激因子としては、細胞の組織化を促進する活性を有する物質であればいずれも使用でき、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）等が挙げられる。
【００５０】
細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材について以下に詳述する。
I．細胞配列用基材
本発明における細胞配列用基材は、基材上に細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン化された細胞接着性変化パターンを有することを特徴とするものである。
【００５１】
細胞接着性とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。細胞接着性良好領域とは、細胞接着性が良好な領域を意味し、細胞接着性阻害領域とは、細胞の接着性が悪い領域を意味する。従って、細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材上に細胞を播くと、細胞接着性良好領域には細胞が接着するが、細胞接着性阻害領域には細胞が接着しないため、細胞配列用基材表面には細胞がパターン状に配列されることになる。
【００５２】
細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性が良好とは、ある種の細胞に対する細胞接着性が良好であることを意味する。従って、細胞配列用基材上には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性良好領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性良好領域が２水準以上存在する場合もある。
【００５３】
細胞接着性変化パターンとしては、エネルギーの照射に伴い細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含む細胞接着性変化層を基材上に形成し、特定の領域にエネルギー照射することによって細胞接着性を変化させて、細胞接着性の異なる領域をパターン状に形成させたものが挙げられる。細胞の接着性が変化する材料には、エネルギーの照射に伴い細胞接着性を獲得または増加する材料および細胞接着性が減少または消失する材料の双方が含まれる。
【００５４】
本発明の細胞配列用基材に用いられる基材としては、その表面に細胞接着性変化パターンを形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチックで代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の形状が挙げられる。
【００５５】
多孔質膜の孔の平均の大きさは、細胞の種類に依存するが、通常０．１μｍ〜５μｍであることが好ましく、０．２μｍ〜１．５μｍであることがさらに好ましい。孔の大きさを０．１μｍ以上とすることにより栄養や液性因子などを培養細胞へ効率的に供給することができる。また、孔の大きさを５μｍ以下とすることにより、孔の中や膜の裏面まで培養細胞が接着することを防ぎ、培養細胞を効率よく支持体に転写することができる。
【００５６】
細胞接着性変化材料、細胞接着性変化層については、光触媒を用いる実施態様において説明する。
【００５７】
また、細胞接着性変化パターンには、細胞接着性の少ない細胞接着阻害材料を含む細胞接着阻害層とその上に形成された細胞接着性を有する細胞接着材料を含む細胞接着層から形成され、エネルギーの照射に伴い細胞接着層が分解されて消失することにより細胞接着阻害層が露出して、細胞接着性の異なる領域が形成される場合も含まれる。同様に、細胞接着層とその上に形成される細胞接着阻害層から形成され、エネルギー照射に伴い細胞接着阻害層が分解されて消失することにより細胞接着層が露出して、細胞接着性の異なる領域が形成される場合も含まれる。
【００５８】
細胞接着材料としては、各種タイプのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリンなどの細胞外基質、ＲＧＤペプチド、他に細胞接着性付与の為にプラズマ処理、コロナ処理、イオンビーム照射処理、電子線照射処理等の手法によりカルボニル基やカルボキシル基を導入したポリオレフィン樹脂が挙げられ、細胞接着阻害材料としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等のフッ素系材料、ポリイミド、リン脂質等が挙げられる。
【００５９】
また、インクジェット法などの方法を用いることにより、細胞接着阻害層の上に細胞接着材料をパターン状に付着形成する場合、および細胞接着層の上に細胞接着阻害材料をパターン状に付着形成する場合も含まれる。
【００６０】
あるいは付加的に、基材上にエネルギーの照射に伴い細胞接着材料に対する親和性が変化する親和性変化材料を含有する層を形成し、エネルギーを照射することによって細胞接着材料に対する親和性を有する領域と有しない領域からなるパターンを形成し、ここに細胞接着材料を含む溶液を導入した後洗浄することにより、細胞接着材料が存在する領域（細胞接着性良好領域）と細胞接着材料が存在しない領域（細胞接着性阻害領域）を有する細胞接着性変化パターンを形成することもできる。このような態様においては、基材上で直接パターン形成できない細胞接着材料によってパターンを形成することができる。例えば、図３ａに示すように、ガラス等の親水性を有する基材（１）に、撥水性材料を含む層を有する領域（２０）と有しない領域からなるパターンを形成する。ここに撥水性材料に吸着しにくい親水性の細胞接着材料（２１）を導入し、その後洗浄する。これにより親水性の細胞接着材料が存在する領域（細胞接着性良好領域）と撥水性材料が存在する領域（細胞接着性阻害領域）がパターン状に形成される。この場合の親水性の細胞接着材料としては、コラーゲン等の細胞外基質を用いることができる。ここに細胞を播種して洗浄することにより、細部接着性良好領域にのみ細胞が接着する（図３ｂ左）。撥水性材料を除去しただけでは細胞が接着しなかったり、接着しても接着効率や転写効率が悪い（図３ｂ右）。
【００６１】
本発明においては、細胞配列用基材上にパターン状に配列された細胞を細胞接着性タンパク質含有層を有する支持体に転写することから、上記の細胞接着性良好領域の細胞接着力は適度な強度であることが好ましい。適度な接着強度とすることによって、細胞を特定の領域のみに接着して細胞パターンを形成できるが、これを細胞接着性タンパク質含有層に容易に転写することが可能になるからである。従って、細胞配列用基材における細胞接着性良好領域の細胞接着力は、細胞接着性阻害領域の細胞接着力よりも強いが、細胞接着性タンパク質含有層の細胞接着力よりも弱いものであることが好ましい。
【００６２】
このような細胞接着力は、表面の水接触角によって評価することができる。本発明における細胞接着性変化パターンの細胞接着性良好領域における水接触角は、１０〜４０°であることが好ましい。水接触角をこのような範囲とすることにより、細胞を細胞配列用基材に接着させ、更に細胞接着性タンパク質含有層に転写する場合、細胞を細胞配列用基材に単層状に接着できるとともに、細胞配列用基材への接着が弱いことから細胞接着性タンパク質含有層にも容易に転写することができる。接触角とは、静止液体の自由表面が個体壁に接する場所で液面と固体面とのなす角（液の内部にある角をとる）を意味する。
【００６３】
上記の水接触角とは、通常大気圧下で材料表面にシリンジ等の器具を用いて微小な水滴を滴下し、水滴端部の気液界面と固体面との成す角度を拡大鏡などで観察する、静止接触角測定法で測定した値を意味する。
【００６４】
上記のような細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域がパターン状に配置された細胞接着性変化パターンを形成する手段としては、特に制限されないが、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法およびコンタクトプリンティング法などの各種印刷法による方法、各種リソグラフィー法を用いる方法、並びにインクジェット法による方法、他に微細な溝を彫刻等する立体整形の手法などが挙げられる。本発明においては、光触媒を用いたリソグラフィー法、すなわち、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料および光触媒を用い、必要とされるパターンに沿ってエネルギーを照射することによって細胞接着性変化パターンを形成する方法が好ましい。このような態様においては、高精細なパターンを細胞に対して悪影響を及ぼすような処理液を用いることなく、簡便な工程により形成することができる。また、細胞接着性変化材料の変性の必要性がないことから、材料選択の幅を広げることが可能であり、後述するような特異的な接着性を発現するような生物学的細胞接着性変化材料をも問題なく用いることができる。
【００６５】
形成させるパターンは、二次元のパターンであれば特に制限されず、作成しようとする細胞含有シートにおけるパターンに合わせて設計する。ライン状または網目状のパターンを形成する場合、パターンにおける線幅は、通常５〜５００μｍ、好ましくは２０〜３００μｍである。特に、血管内皮細胞をライン状に配置して培養することにより毛細血管を形成する場合は、ライン状の細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域のスペースが交互に配置された細胞接着性変化パターンを形成し、血管内皮細胞をライン状に接着させることが好ましい。このような態様においては、細胞が１〜５０個、好ましくは２〜３０個収まる程度のライン幅で細胞が接着されるようなパターンを形成するのが好ましい。具体的には、細胞接着性良好領域のライン幅は、通常５〜５００μｍ、好ましくは２０〜３００μｍであり、ラインとラインの間にあたる細胞接着性阻害領域のスペース幅は通常２０〜５００μｍ、好ましくは４０〜３００μｍである。ライン幅を上記の数値範囲とすることにより、血管内皮細胞が効率的に管組織化することができる。
【００６６】
細胞接着性良好領域のライン幅が太い場合、例えば１００〜５００μｍの場合、この細胞接着性良好領域の中に、補助パターンを形成してもよい。補助パターンとは、細胞接着性良好領域内に形成される微細なパターンであって、この補助パターンが形成された領域は、微細な細胞接着性阻害領域とされる。なお、補助パターンは、細胞を細胞接着性良好領域に接着させた際、上記補助パターンに対応する微細な細胞接着性阻害領域が、上記細胞接着性良好領域内での細胞間の結合を阻害しない程度、すなわち上記補助パターンに対応する細胞接着性阻害領域上でも細胞どうしが結合し得る程度の大きさとなるよう形成される。
【００６７】
例えば、血管のパターンに対応する細胞接着性良好領域に血管内皮細胞を接着させる際、細胞は細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域の境界付近から細胞接着性良好領域内にかけて徐々に配列する。一般的に組織の形成の際には、個々の細胞が形態変化をして組織化することが必要であり、血管についても血管内皮細胞が血液の流れ方向に配向しているような形態変化をする。このような形態変化が生体外で実現することは好ましいことであるが、細胞接着性良好領域のライン幅が太くなるに従い、細胞接着性良好領域の中心付近の細胞の配列は、細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域の境界付近の細胞の配列と比べて悪くなる傾向がある。また、細胞接着性良好領域の中心付近の接着細胞密度が低くなる傾向がある。これらの悪い傾向を改善するため、上記補助パターンを形成するのである。上記補助パターンがあれば、細胞接着性良好領域のどの位置に接着した細胞でも細胞接着性阻害領域と細胞接着性良好領域の境界と接触できるようになるため、配列した接着細胞の割合が非常に高まる。また、上記補助パターンは補助パターン上で接着細胞どうしが結合できる程度に微細であるから、細胞接着性良好領域の全領域に均一に高い配向度で細胞を接着させることができる。
【００６８】
上記補助パターンは、細胞を配向させたい向きに配向させる効果があれば特に限定されず、ライン状、ジグザグ状、凹凸状、ドット状などが考えられるが、ライン状に形成されていることが好ましい。ライン形状は特に限定されるものではなく、例えば直線状、曲線状、点線状、破線状などとすることができる。上記補助パターンのライン幅は、０．５μｍ〜１０μｍ、中でも１μｍ〜５μｍの範囲内が好ましい。ライン幅を上記範囲とすることにより、隣接する細胞同士が補助パターン上で結合することができ、細胞接着性良好領域全体に細胞を接着させることができる。
【００６９】
このような細胞接着性変化パターンを形成することにより、ライン状に接着され転写された血管内皮細胞は、組織化してライン状の毛細血管を効率的に形成する。複数のラインが交わることなく並ぶような細胞パターンを形成したい場合は、細胞が接着したラインとラインの間のスペース幅を上記のように一定の値以上とすることにより、細胞が組織化する際にラインとライン間で細胞から擬足が伸びてラインにゆがみが生じるのを防ぐことができる。
【００７０】
上記の光触媒を用いたリソグラフィー法によって作成される細胞配列用基材として、例えば以下の３つの実施態様が挙げられる。これらについて、それぞれ説明する。
【００７１】
Ａ．第１実施態様
本発明の細胞配列用基材の第１実施態様は、基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層を基板上に有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、光触媒と上記細胞接着性変化材料とを有する光触媒含有細胞接着性変化層である点に特徴を有するものである。
【００７２】
本実施態様においては、このように細胞接着性変化層が、光触媒と上記細胞接着性変化材料とを有する光触媒含有細胞接着性変化層であるので、エネルギーが照射された際に、光触媒含有細胞接着性変化層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【００７３】
このような本実施態様の細胞配列用基材を、用いられる部材に分けてそれぞれ説明する。
【００７４】
１．光触媒含有細胞接着性変化層
本実施態様は、基材上に光触媒含有細胞接着性変化層が形成されている点に特徴を有する。この光触媒含有細胞接着性変化層は、少なくとも光触媒と細胞接着性変化材料とを有するものである。
【００７５】
（１）細胞接着性変化材料
本実施態様に用いられる細胞接着性変化材料は、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する材料であれば特に限定されるものではない。細胞の接着性が変化するとは、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性を獲得または増加する材料および細胞接着性が減少又消失する材料の双方が含まれる。
【００７６】
このような細胞接着性変化材料には、細胞との接着性を制御する態様により、物理化学的特性により細胞と接着する物理化学的細胞接着性変化材料と生物学的特性により細胞と接着する生物学的細胞接着性変化材料との主に二つの態様がある。
【００７７】
ａ．物理化学的細胞接着性変化材料
細胞をその表面に接着させるための物理化学的な因子としては、表面自由エネルギーに関する因子と、疎水性相互作用等による因子等が挙げられる。
【００７８】
このような因子により物理化学的細胞接着性を有する物理化学的細胞接着材料としては、主骨格が光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような有機置換基を有するものが好ましく、例えば、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
【００７９】
上記の（１）の場合、一般式：
ＹｎＳｉＸ（４−ｎ）
（ここで、Ｙはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基を示し、Ｘはアルコキシル基、アセチル基またはハロゲンを示す。ｎは０〜３までの整数である。）で示されるケイ素化合物の１種または２種以上の加水分解縮合物若しくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでＹで示される基の炭素数は１〜２０の範囲内であることが好ましく、また、Ｘで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
【００８０】
また、有機基として、特にフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを好ましく用いることができ、具体的には、下記のフルオロアルキルシランの１種または２種以上の加水分解縮合物、共加水分解縮合物が挙げられ、一般にフッ素系シランカップリング剤として知られたものを使用することができる。
【００８１】
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）４ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）８ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４Ｓｉ（ＯＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）４ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）６ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
（ＣＦ３）２ＣＦ（ＣＦ２）８ＣＨ２ＣＨ２ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）３（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）５（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）７（Ｃ６Ｈ４）Ｃ２Ｈ４ＳｉＣＨ３（ＯＣＨ３）２；
ＣＦ３（ＣＦ２）３ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）５ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）９ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ２ＣＨ３）３；
ＣＦ３（ＣＦ２）７ＳＯ２Ｎ（Ｃ２Ｈ５）Ｃ２Ｈ４ＣＨ２Ｓｉ（ＯＣＨ３）３
【００８２】
上記のようなフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを物理化学的細胞接着材料として用いることにより、光触媒含有細胞接着性変化層のエネルギー未照射部においては、表面にフッ素を有する部分が存在するため細胞接着性を有しない面となるが、エネルギー照射された部分においては、フッ素等が除去されて、表面にＯＨ基等を有する部分が存在するため細胞接着性を有する面となる。従って、エネルギー照射部とエネルギー未照射部とにおいて、細胞の接着性の異なる領域をパターン状に形成することができる。
【００８３】
また、上記の（２）の反応性シリコーンとしては、下記一般式で表される骨格をもつ化合物を挙げることができる。
【００８４】
【化１】
2006346292.tif 000003
【００８５】
ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜１０の置換若しくは非置換のアルキル、アルケニル、アリール基であり、置換基としては、ハロゲン、シアノ、等が挙げられる。Ｒ１、Ｒ２の具体例としては、メチル、エチル、プロピル、ビニル、フェニル、ハロゲン化フェニル、シアノメチル、シアノエチル、シアノプロピル等が挙げられる。ビニル、フェニル、ハロゲン化フェニルは、モル比で全体の４０％以下であることが好ましい。また、Ｒ１、Ｒ２がメチル基のものが表面エネルギーが最も小さくなるので好ましく、モル比でメチル基が６０％以上であることが好ましい。また、鎖末端若しくは側鎖には、分子鎖中に少なくとも１個以上の水酸基等の反応性基を有する。
【００８６】
また、上記のオルガノポリシロキサンとともに、ジメチルポリシロキサンのような架橋反応をしない安定なオルガノシリコン化合物を別途混合してもよい。
【００８７】
一方、分解物質タイプの物理化学的細胞接着材料としては光触媒の作用により分解し、かつ分解されることにより光触媒含有極性変化層表面の極性を変化させる機能を有する界面活性剤を挙げることができる。具体的には、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ  ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のフッ素系あるいはシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることができ、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
【００８８】
なお、このように物理化学的細胞接着材料を分解物質タイプとして用いた場合には、通常別途バインダ成分を用いることが好ましい。この際用いられるバインダ成分としては、主骨格が上記光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであれば特に限定されるものではない。具体的には、有機置換基を有しない、若しくは多少有機置換基を有するポリシロキサンを挙げることができ、これらはテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等を加水分解、重縮合することにより得ることができる。
【００８９】
なお、本実施態様においては、このようなバインダタイプの物理化学的細胞接着材料と分解物質タイプの物理化学的細胞接着材料とを併用するようにしてもよい。
【００９０】
また、静電的相互作用の制御により、細胞との接着性を変化させる物理化学的細胞接着性変化材料もある。このような材料の場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、材料が含有する、正電荷を有する官能基が分解された結果、表面に存在する正電荷量が変化し、これにより細胞との接着性を変化させ、細胞接着性変化パターンを形成するものである。例えば、このような材料としてポリＬリシン等が挙げられる。
【００９１】
ｂ．生物学的細胞接着性変化材料
細胞をその表面に接着させる為の生物学的な因子としては、多くの細胞種に対して被接着性を有することができる材料、特定の細胞種にのみ被接着性を有する材料がある。前者は例えばコラーゲンＩ型であり、後者は例えば肝実質細胞を選択的に接着するポリ（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-Ｄ-ガラクトピラノシル-（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）(以下、ＰＶＬＡ)等がある。ＰＶＬＡの場合、肝実質細胞が特異認識をするガラクトース基を構造中に有する事により、材料−細胞間の選択的かつ特異的な接着が行われるものと推測される。
【００９２】
このような材料と光触媒を混合し、光触媒含有細胞接着性変化層として用いる場合は以下の使用形態が考えられる。コラーゲンＩ型を酵素処理により可溶化した可溶化コラーゲンＩと予め焼成処理、粉砕処理をしたＴｉＯ２粒子等の光触媒を混合し、光触媒含有細胞接着性変化層用材料とする。次に、基材上に光触媒含有細胞接着性変化層用材料を塗布して光触媒含有細胞接着性変化層を形成する。この光触媒含有細胞接着性変化層に、少量のエネルギーを照射した場合には、コラーゲンの側鎖にある細胞接着性ペプチド構造の一部が破壊され、細胞接着性を減少させることができる。また、エネルギー照射量を増やす事により細胞接着性ペプチド構造を徐々に失わせることができ、細胞接着性を更に減少させることができる。
【００９３】
またさらに、過大なエネルギー照射を行う事によりコラーゲンの主鎖構造を破壊することができ、その細胞接着性を完全に失わせることができる。
【００９４】
（２）光触媒
本実施態様に用いられる光触媒としては、光半導体として知られる例えば二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化タングステン（ＷＯ３）、酸化ビスマス（Ｂｉ２Ｏ３）、および酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）を挙げることができ、これらから選択して１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００９５】
本実施態様においては、特に二酸化チタンが、バンドギャップエネルギーが高く、化学的に安定で毒性もなく、入手も容易であることから好適に使用される。二酸化チタンには、アナターゼ型とルチル型があり本態様ではいずれも使用することができるが、アナターゼ型の二酸化チタンが好ましい。アナターゼ型二酸化チタンは励起波長が３８０ｎｍ以下にある。
【００９６】
このようなアナターゼ型二酸化チタンとしては、例えば、塩酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（石原産業（株）製ＳＴＳ−０２（平均粒径７ｎｍ）、石原産業（株）製ＳＴ−Ｋ０１）、硝酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（日産化学（株）製ＴＡ−１５（平均粒径１２ｎｍ））等を挙げることができる。
【００９７】
光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が５０ｎｍ以下であることが好ましく、２０ｎｍ以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
【００９８】
本実施態様に用いられる光触媒含有細胞接着性変化層中の光触媒の含有量は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。
【００９９】
２．基材
本発明の細胞配列用基材に用いられる基材としては、表面に光触媒含有細胞接着性変化層を形成することが可能な材料で形成されたものであれば特に限定されるものではなく、露光処理による表面処理が可能であればその形態は問わない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコン等の無機材料、プラスチックで代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の形状が挙げられる。
【０１００】
３．細胞接着性変化パターン
本実施態様においては、上記基材上に上述した光触媒含有細胞接着性変化層を形成し、さらにエネルギーをパターン状に照射することにより、細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
【０１０１】
このような細胞接着性変化パターンは、通常は細胞接着性の良好な細胞接着性良好領域と細胞接着性の悪い細胞接着性阻害領域とから形成される。そして、この細胞接着性良好領域に細胞が接着されることにより、高精細なパターン状に細胞を接着させることができる。このような細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域とは、用いる細胞接着性変化材料の種類に応じて決定されるものである。
【０１０２】
例えば、細胞接着性変化材料が表面自由エネルギーを変化させて細胞の接着性を変化させる物理化学的細胞接着性変化材料である場合、細胞の接着性は所定の範囲内の表面自由エネルギーであると良好であり、その範囲を外れると細胞との接着性が低下する傾向にある。このような表面自由エネルギーによる細胞の接着性の変化としては例えば、ＣＭＣ出版バイオマテリアルの最先端  筏  義人(監修) p.109下部に示されるような実験結果が知られている。
【０１０３】
また、上記材料の表面自由エネルギーだけでなく、どのような細胞種をどのような材料種に接触させるか等によっても、細胞の接着性を決定することができる。
【０１０４】
ここで、この細胞接着性変化パターンは、上述したような細胞接着性良好領域と細胞接着性阻害領域を含むパターンであるが、用途によっては細胞接着性変化パターンが、表面の細胞接着性が少なくとも３水準以上異なる領域を有する細胞接着性変化パターンである場合も含まれる。
【０１０５】
例えば、生物学的細胞接着性変化材料を用いた光触媒含有細胞接着性変化層を用いている場合であって、細胞の接着性の良好な状態が未確定である場合等においては、連続的に光触媒含有細胞接着性変化層の表面状態を変化させることにより、接着性に最適な状態を見出すことができる等の利点を有する場合があるからである。
【０１０６】
このように、本発明においては、３水準以上とは連続的に細胞の接着性が変化した状態を含むものであり、どの程度の水準とするかは、状況に応じて適宜選択されて決定される。
【０１０７】
このような多水準の接着性の異なる領域を形成する場合は、光触媒含有細胞接着性変化層に対するエネルギーの照射量を変化させることにより行うことができる。具体的には、透過率の異なるハーフトーンのフォトマスクを用いる、遮光部のパターンが異なる複数のフォトマスクを用い、複数回の重ね露光を行う等の方法を挙げることができる。
【０１０８】
さらに、本実施態様においては、エネルギーの照射された部分と未照射の部分との光触媒活性の差を利用した、細胞接着性変化パターンを用いることができる。すなわち、例えば分解物質として光触媒含有細胞接着性変化層内に導入された生物学的細胞接着性変化材料を用いた場合、光触媒含有細胞接着性変化層表面にエネルギーをパターン状に照射すると、照射部分の表面に滲出した生物学的細胞接着性変化材料は分解され、未照射の部分の生物学的細胞接着性変化材料は残存する。したがって、この生物学的細胞接着性変化材料が特定の細胞と接着性が良好な材料、若しくは多くの細胞と接着性が良好な細胞である場合、未照射部分が細胞接着性良好領域となるが、エネルギーが照射された部分は、細胞との接着性が良好な生物学的細胞接着性変化材料が存在しないばかりでなく、エネルギー照射により活性化された滅菌性を有する光触媒が露出した領域となる。したがって、エネルギー照射部分が細胞接着性阻害領域となる場合は、特に本実施態様の細胞配列用基材を用いて所定の期間培養した場合、パターンが太くなる等の不具合が生じることが無いという利点を有するものである。
【０１０９】
Ｂ．第２実施態様
本発明の細胞配列用基材の第２実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層とを有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、光触媒を有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、上記細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有することを特徴とするものである。
【０１１０】
本実施態様においては、このように細胞接着性変化層が、基材上に形成された光触媒処理層と、この光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料層とを有するものであるので、エネルギーが照射された際に、光触媒処理層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料層内の細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【０１１１】
このような本実施態様の細胞配列用基材を、用いられる部材に分けてそれぞれ説明する。
【０１１２】
１．細胞接着性変化材料層
本実施態様の細胞配列用基材は、基材上に形成された光触媒処理層上に細胞接着性変化材料層が形成される。この細胞接着性変化材料層は、上記第１実施態様で説明した細胞接着性変化材料を用いることにより形成される層を用いることができる。以下、物理化学的細胞接着性変化材料を用いた細胞接着性変化材料層と生物学的細胞接着性変化材料を用いた細胞接着性変化材料層とに分けて説明する。
【０１１３】
（１）物理化学的細胞接着性変化材料を用いた場合
本実施態様において、物理化学的細胞接着性変化材料により形成される細胞接着性変化材料層は、上記第１実施態様で説明した材料と同様の材料を用いた層とすることができる。このような材料を用いた場合は、光触媒の有無を除き上述したものと同様である。なお、本実施態様においては、原則的には細胞接着性変化材料層内に光触媒を含有する必要性は無いが、感度等の関係で少量含有されたものであってもよい。
【０１１４】
また、本実施態様においては、光触媒処理層上に光触媒の作用により分解除去される分解除去層として細胞接着性変化材料層を形成し、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性変化材料層が分解された領域、すなわち光触媒処理層が露出した領域と、細胞接着性変化材料層が残存する領域とを形成し、これにより細胞接着性変化パターンとするようなタイプの細胞接着性変化材料層を用いることができる。
【０１１５】
具体的には、表面自由エネルギーにより細胞の接着性を制御する場合は、表面自由エネルギーが細胞接着性に適当である物理化学的細胞接着性変化材料を用い、この材料を全面に塗布して細胞接着性変化材料層を形成し、その後エネルギーをパターン照射して細胞接着性変化材料層の有無のパターンを形成し、これにより細胞接着性変化パターンとするものである。
【０１１６】
このような分解除去層としての物理化学的細胞接着性変化材料層であって、表面自由エネルギーにより細胞の接着性を制御する場合に用いることができる材料としては、例えば、再生セルロース、ナイロン１１等が挙げられる。
【０１１７】
また、静電的相互作用により細胞の接着性を制御する場合は、正電荷を有する物理化学的細胞接着性変化材料を用い、上記と同様の方法により細胞接着性変化パターンとすることができる。
【０１１８】
このような分解除去層としての物理化学的細胞接着性変化材料層であって、静電的相互作用により細胞の接着性を制御する場合に用いることができる材料としては、ポリアミングラフトポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）（ＨＡ−ｘ）等を挙げることができる。
【０１１９】
これらの樹脂は、溶媒に溶解させ、例としてスピンコート法等の一般的な成膜方法により形成することが可能である。また、本発明においては、機能性薄膜、すなわち、自己組織化単分子膜、ラングミュア−ブロケット膜、および交互吸着膜等を用いることにより、欠陥のない膜を形成することが可能であることから、このような成膜方法を用いることがより好ましいといえる。
【０１２０】
このような分解除去層としての細胞接着性変化材料層を用いて細胞接着性変化パターンを形成した場合は、分解除去された領域は後述する光触媒処理層が露出していることから、細胞の培養が大きく阻害される領域となる。したがって、このような方法により得られる細胞配列用基材は、長期間細胞を保持しても高精細なパターンを維持することができるといった利点を有するものである。
【０１２１】
（２）生物学的細胞接着性変化材料を用いた場合
本実施態様において、生物学的細胞接着性変化材料により形成される細胞接着性変化材料層は、第１実施態様で説明したものと同様のものを使用することができ、例えばコラーゲンＩ型等を挙げることができる。
【０１２２】
２．光触媒処理層
次に、本発明に用いられる光触媒処理層について説明する。本発明に用いられる光触媒処理層は、光触媒処理層中の光触媒がその上に形成された細胞接着性変化材料層の細胞接着特性を変化させるような構成であれば、特に限定されるものではなく、光触媒とバインダとから構成されているものであってもよいし、光触媒単体で製膜されたものであってもよい。また、その表面の特性は特に親液性であっても撥液性であってもよいが、この光触媒処理層上に、細胞接着性変化材料層等を形成する都合上、親液性であることが好ましい。
【０１２３】
この光触媒処理層における、後述するような酸化チタンに代表される光触媒の作用機構は、必ずしも明確なものではないが、光の照射によって生成したキャリアが、近傍の化合物との直接反応、あるいは、酸素、水の存在下で生じた活性酸素種によって、有機物の化学構造に変化を及ぼすものと考えられている。本発明においては、このキャリアが光触媒処理層上に形成された細胞接着性変化材料層中の化合物に作用を及ぼすものであると思われる。このような光触媒としては、第１実施態様で詳述したものと同様である。
【０１２４】
本実施態様における光触媒処理層は、上述したように光触媒単独で形成されたものであってもよく、またバインダと混合して形成されたものであってもよい。
【０１２５】
光触媒のみからなる光触媒処理層の場合は、細胞接着性変化材料層の細胞接着特性の変化に対する効率が向上し、処理時間の短縮化等のコスト面で有利である。一方、光触媒とバインダとからなる光触媒処理層の場合は、光触媒処理層の形成が容易であるという利点を有する。
【０１２６】
光触媒のみからなる光触媒処理層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。真空製膜法により光触媒処理層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒処理層とすることが可能であり、これにより細胞接着性変化材料層の特性を均一に変化させることが可能であり、かつ光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に細胞接着性変化層の細胞接着性を変化させることが可能となる。
【０１２７】
また、光触媒のみからなる光触媒処理層の形成方法の他の例としては、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基材上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。ここで用いられる無定形チタニアとしては、例えば四塩化チタン、硫酸チタン等のチタンの無機塩の加水分解、脱水縮合、テトラエトキシチタン、テトライソプロポキシチタン、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトラブトキシチタン、テトラメトキシチタン等の有機チタン化合物を酸存在下において加水分解、脱水縮合によって得ることができる。次いで、４００℃〜５００℃における焼成によってアナターゼ型チタニアに変性し、６００℃〜７００℃の焼成によってルチル型チタニアに変性することができる。
【０１２８】
また、バインダを用いる場合は、バインダの主骨格が上記の光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものが好ましく、例えばこのようなバインダとしては、上述したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
【０１２９】
このようにオルガノポリシロキサンをバインダとして用いた場合は、上記光触媒処理層は、光触媒とバインダであるオルガノポリシロキサンとを必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を透明基材上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒処理層を形成することかできる。
【０１３０】
また、バインダとして無定形シリカ前駆体を用いることができる。この無定形シリカ前駆体は、一般式ＳｉＸ４で表され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
【０１３１】
具体的には、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、テトラ−ｎ−プロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラメトキシシラン等が挙げられる。また、この場合には、無定形シリカの前駆体と光触媒の粒子とを非水性溶媒中に均一に分散させ、透明基材上に空気中の水分により加水分解させてシラノールを形成させた後、常温で脱水縮重合することにより光触媒処理層を形成できる。シラノールの脱水縮重合を１００℃以上で行えば、シラノールの重合度が増し、膜表面の強度を向上できる。また、これらの結着剤は、単独あるいは２種以上を混合して用いることができる。
【０１３２】
バインダを用いた場合の光触媒処理層中の光触媒の含有量は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。また、光触媒処理層の厚みは、０．０５〜１０μｍの範囲内が好ましい。
【０１３３】
また、光触媒処理層には上記の光触媒、バインダの他に、界面活性剤を含有させることができる。具体的には、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ  ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のフッ素系あるいはシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることかでき、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
【０１３４】
さらに、光触媒処理層には上記の界面活性剤の他にも、ポリビニルアルコール、不飽和ポリエステル、アクリル樹脂、ポリエチレン、ジアリルフタレート、エチレンプロピレンジエンモノマー、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、メラミン樹脂、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、スチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリエステル、ポリブタジエン、ポリベンズイミダゾール、ポリアクリルニトリル、エピクロルヒドリン、ポリサルファイド、ポリイソプレン等のオリゴマー、ポリマー等を含有させることができる。
【０１３５】
３．基材
本実施態様に用いられる基材は、上記光触媒処理層を形成可能であれば、特に限定されるものではなく、第１実施態様で説明したものと同様のものを用いることが可能である。
【０１３６】
４．細胞接着性変化パターン
本実施態様においては、上述した細胞接着性変化材料層に、パターン状にエネルギーを照射することにより、光触媒処理層中の光触媒の作用によって、細胞接着性変化材料層表面の細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
【０１３７】
Ｃ．第３実施態様
本実施態様の細胞配列用基材は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を有する細胞接着性変化層とを有し、上記細胞接着性変化層には、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成されている細胞配列用基材であって、上記細胞接着性変化層が、上記細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層であり、上記接着性変化パターンが、光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞接着性変化材料層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギーを照射することにより形成されたものであることを特徴とするものである。
【０１３８】
本実施態様においては、このように細胞接着性変化層が、細胞接着性変化材料層であり、上記接着性変化パターンが、光触媒を含有する光触媒含有層と上記細胞接着性変化材料層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギーを照射することにより形成されたものであるので、エネルギーが照射された際に、光触媒含有層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料層内の細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【０１３９】
このような本実施態様の細胞配列用基材を、用いられる部材に分けてそれぞれ説明する。
【０１４０】
１．細胞接着性変化材料層
本実施態様の細胞配列用基材は、基材上に細胞接着性変化材料層が形成される。この細胞接着性変化材料層は、上記第２実施態様で説明した材料を用いることにより形成される層と同様である。なお、本実施態様においては、原則的には細胞接着性変化材料層内に光触媒を含有する必要性は無いが、感度等の関係で少量含有されたものであってもよい。
【０１４１】
また、本実施態様においては、上述した第２実施態様と同様に、基材上に光触媒の作用により分解除去される分解除去層として細胞接着性変化材料層を形成してもよい。この場合、細胞接着性変化材料層は、光触媒含有層側基板を用いてエネルギー照射することにより、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性変化材料層が分解された領域、すなわち基材が露出した領域と、細胞接着性変化材料層が残存する領域とを形成し、これにより細胞接着性変化パターンとするようなタイプのものが用いられる。
【０１４２】
２．基材
本実施態様に用いられる基材は、上述した細胞接着性変化材料層が形成可能なものであれば、特に限定されるものではなく、第１実施態様で説明したものと同様のものを用いることが可能である。
【０１４３】
３．光触媒含有層
次に、本実施態様に用いられる光触媒含有層について説明する。本実施態様に用いられる光触媒含有層は、光触媒を含有する層であり、通常はガラス等の基体上に形成されて用いられる。本実施態様においては、このような光触媒含有層を、上述した細胞接着性変化材料層と対向させて配置し、エネルギー照射を行うことにより、光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着性変化材料層の細胞接着性を変化させることができるのである。本実施態様においては、この光触媒含有層を、エネルギー照射の際に所定の位置に配置し、細胞接着性変化パターンを形成することが可能であることから、上記細胞接着性変化材料層中に光触媒を含有させる必要がなく、細胞接着性変化材料層が、経時的に光触媒の作用を受けることのないものとすることができる、という利点を有する。
【０１４４】
このような光触媒含有層としては、上記第２実施態様で光触媒処理層について説明した層と同様である。
【０１４５】
４．細胞接着性変化パターン
本実施態様においては、上述した細胞接着性変化材料層に、上記光触媒含有層を用いて、パターン状にエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中の光触媒の作用によって、細胞接着性変化材料層表面の細胞との接着性が変化したパターンである細胞接着性変化パターンが形成されている。
【０１４６】
II．細胞配列用基材の製造方法
次に、本発明の細胞配列用基材の製造方法について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法には、例えば、上記のような３つの実施態様があるが、いずれの実施態様においても、基材と、その基材上に形成され、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する層とを有するパターン形成体用基材を形成し、このパターン形成体用基材にエネルギーを照射することにより、光触媒を作用させて、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成することを特徴とするものである。
【０１４７】
本発明の細胞配列用基材の製造方法によれば、上記エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する層を形成することから、この層に必要とされるパターン上にエネルギーを照射することにより、容易に高精細なパターン状に細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンが形成された細胞配列用基材を製造することが可能となる。したがって、高精細なパターンを細胞に対して悪影響を及ぼすような処理液を用いることなく、簡便な工程により細胞配列用基材を製造することができる。また、細胞接着性変化材料の変性の必要性がないことから、材料選択の幅を広げることが可能であり、後述するような特異的な接着性を発現するような生物学的細胞接着性変化材料をも問題なく用いることができるのである。
【０１４８】
以下、本発明の細胞配列用基材の製造方法を上記の１〜３の実施態様ごとに説明する。
【０１４９】
Ａ．第１実施態様
まず、本発明の細胞配列用基材の第１実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法の第１実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、かつ光触媒およびエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記光触媒含有細胞接着性変化層にエネルギーを照射し、上記光触媒含有細胞接着性変化層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
【０１５０】
本実施態様の細胞配列用基材の製造方法は、例えば図４に示すように、まず、基材１と、その基材１上に形成された光触媒含有細胞接着性変化層２とを有するパターン形成体用基材３を形成する（パターン形成体用基材形成工程（図４（ａ））。次に、上記光触媒含有細胞接着性変化層２に、例えばフォトマスク４を用いてエネルギー５を照射し（図４（ｂ））、光触媒含有細胞接着性変化層２の細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターン６を形成する（図４（ｃ））細胞接着性変化パターン形成工程を行うものである。
【０１５１】
本実施態様においては、光触媒と上記細胞接着性変化材料とを有する光触媒含有細胞接着性変化層を形成することから、細胞接着性変化パターン形成工程において、エネルギーを照射することにより、光触媒含有細胞接着性変化層内の光触媒の作用により細胞接着性変化材料の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。以下、本実施態様の各工程について説明する。
【０１５２】
１．パターン形成体用基材形成工程
まず、本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程は、基材と、上記基材上に形成され、かつ光触媒およびエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する光触媒含有細胞接着性変化層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
【０１５３】
本工程は、基材上に、光触媒および細胞接着性変化材料を含有する塗工液を、例えば、スピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により塗布し、光触媒含有細胞接着性変化層を形成することにより行うことができる。またバインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。
【０１５４】
２．細胞接着性変化パターン形成工程
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程は、上記光触媒含有細胞接着性変化層にエネルギーを照射し、上記光触媒含有細胞接着性変化層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
【０１５５】
本工程により、目的とするパターン状にエネルギーを照射することにより、エネルギー照射された領域のみの光触媒含有細胞接着性変化層の細胞の接着性を変化させることができ、高精細な細胞接着性の良好な領域と悪い領域とのパターンである、細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。
【０１５６】
ここで、本実施態様でいうエネルギー照射（露光）とは、光触媒含有細胞接着性変化層表面の細胞接着性を変化させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、可視光の照射に限定されるものではない。
【０１５７】
通常このようなエネルギー照射に用いる光の波長は、４００ｎｍ以下の範囲、好ましくは３８０ｎｍ以下の範囲から設定される。これは、上述したように光触媒含有細胞接着性変化層に用いられる好ましい光触媒が二酸化チタンであり、この二酸化チタンにより光触媒作用を活性化させるエネルギーとして、上述した波長の光が好ましいからである。
【０１５８】
このようなエネルギー照射に用いることができる光源としては、水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、エキシマランプ、その他種々の光源を挙げることができる。
【０１５９】
上述したような光源を用い、フォトマスクを介したパターン照射により行う方法の他、エキシマ、ＹＡＧ等のレーザを用いてパターン状に描画照射する方法を用いることも可能である。
【０１６０】
また、エネルギー照射に際してのエネルギーの照射量は、光触媒含有細胞接着性変化層中の光触媒の作用により、光触媒含有細胞接着性変化層表面の細胞の接着性の変化が行われるのに必要な照射量とする。
【０１６１】
光触媒含有細胞接着性変化層表面の細胞の接着性の変化は、エネルギーの照射量に依存して変化するため、例えばエネルギー照射時間を調節することによって接着性を調整することができる。そうすることによって、適度な接着性を有する表面とすることができる。細胞接着性については、既に述べたとおり表面の水接触角で評価することができるので、適した水接触角を有する表面が得られるようエネルギー照射時間を調節することにより、適度な接着性を有する表面とすることができる。例えば、細胞接着性変化材料としてフルオロアルキルシランを用い、３６５ｎｍの紫外線を強度２５．０ｍＷ／秒で照射する場合、フォトマスクの基材に石英を用いた例では、通常１２０〜６００秒、好ましくは２４０〜４８０秒照射することにより好適な接着性を有する表面とすることができる。エネルギー照射時間および照射強度等については、使用する基材の材料や細胞接着性変化材料等によって適宜調節することができる。
【０１６２】
この際、光触媒含有細胞接着性変化層を加熱しながらエネルギー照射することにより、感度を上昇させることが可能となり、効率的な細胞の接着性の変化を行うことができる点で好ましい。具体的には３０℃〜８０℃の範囲内で加熱することが好ましい。
【０１６３】
本実施態様におけるエネルギー照射方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および光触媒含有細胞接着性変化層側のいずれの方向からフォトマスクを介したパターンエネルギー照射若しくはレーザの描画照射を行ってもよい。一方、基材が不透明な場合は、光触媒含有細胞接着性変化層側からエネルギー照射を行う必要がある。
【０１６４】
Ｂ．第２実施態様
次に、本発明の細胞配列用基材の製造方法の第２実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の第２実施態様は、基材と、上記基材上に形成された光触媒を含有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、かつエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記細胞接着性変化材料層にエネルギーを照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
【０１６５】
本実施態様の細胞配列用基材の製造方法は、例えば図５に示すように、まず、基材１と、その基材１上に形成された光触媒処理層７と、その光触媒処理層７上に形成された細胞接着性変化材料層８とを有するパターン形成体用基材３を形成する（パターン形成体用基材形成工程（図５（ａ））。次に、上記細胞接着性変化材料層８に、例えばフォトマスク４を用いてエネルギー５を照射し（図５（ｂ））、細胞接着性変化材料層８の細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターン６を形成する（図５（ｃ））細胞接着性変化パターン形成工程を行うものである。
【０１６６】
本実施態様においては、光触媒処理層と、上記細胞接着性変化材料層を形成することから、細胞接着性変化パターン形成工程において、エネルギーを照射することにより、光触媒処理層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着性変化材料層内の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。以下、本実施態様の各工程について説明する。
【０１６７】
１．パターン形成体用基材形成工程
まず、本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本実施態様におけるパターン形成体用基材形成工程は、上記基材上に形成された光触媒を含有する光触媒処理層と、上記光触媒処理層上に形成され、かつエネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
【０１６８】
本工程で形成される光触媒処理層は、光触媒のみからなるものであってもよく、またバインダと混合して形成されるものであってもよい。
【０１６９】
光触媒のみからなる光触媒処理層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法や、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基材上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。真空製膜法により光触媒処理層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒処理層とすることが可能であり、これにより細胞接着性変化材料層上の細胞接着性を均一に変化させることが可能であり、かつ光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に細胞接着性変化材料層上の細胞接着性を変化させることが可能となる。
【０１７０】
また、光触媒処理層が、光触媒とバインダとを混合させたものである場合には、光触媒とバインダとを、必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を透明基材上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒処理層を形成することができる。
【０１７１】
続いて、上記光触媒処理層上に、上述した細胞接着性変化材料を含有する塗工液を、例えば、スピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により塗布し、細胞接着性変化材料層を形成することができる。またバインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒処理層を形成することができる。
【０１７２】
ここで、本工程に用いられる基材や光触媒処理層、および細胞接着性変化材料層については、上述した「Ｉ．細胞配列用基材」の第２実施態様の項で説明したものと同様である。
【０１７３】
２．細胞接着性変化パターン形成工程
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程は、上記細胞接着性変化材料層にエネルギーを照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
【０１７４】
本工程により、目的とするパターン状にエネルギーを照射することにより、エネルギー照射された領域のみの細胞接着性変化材料層の細胞の接着性を変化させることができ、高精細な細胞接着性の良好な領域と悪い領域とのパターンである、細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。
【０１７５】
本工程におけるエネルギー照射方法や、照射するエネルギー、エネルギー照射量については、上述した第１実施態様と同様である。
【０１７６】
Ｃ．第３実施態様
次に、本発明の細胞配列用基材の第３実施態様について説明する。本発明の細胞配列用基材の製造方法の第３実施態様は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成するパターン形成体用基材形成工程と、上記パターン形成体用基材と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着性変化材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する細胞接着性変化パターン形成工程とを有するものである。
【０１７７】
本実施態様の細胞配列用基材の製造方法は、例えば図６に示すように、まず、基材１と、その基材１上に形成された細胞接着性変化材料層８とを有するパターン形成体用基材３を形成する（パターン形成体用基材形成工程（図６（ａ））。次に、基体１１と、その基体１１上に形成された光触媒含有層１２とを有する光触媒含有層側基板１３を用意する。この光触媒含有層側基板１３における光触媒含有層１２と上記細胞接着性変化材料層８とが対向するように配置し、例えばフォトマスク４を用いてエネルギー５を照射し（図６（ｂ））、細胞接着性変化材料層８の細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターン６を形成する（図６（ｃ））細胞接着性変化パターン形成工程を行うものである。
【０１７８】
本実施態様においては、上記細胞接着性変化材料層を形成することから、細胞接着性変化パターン形成工程において、光触媒含有層側基板を用いてエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着性変化材料層内の細胞接着性が変化し、エネルギーが照射された部分と照射されない部分とで細胞との接着性が異なる細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。以下、本実施態様の各工程について説明する。
【０１７９】
１．パターン形成体用基材形成工程
まず、本発明におけるパターン形成体用基材形成工程について説明する。本発明におけるパターン形成体用基材形成工程は、基材と、上記基材上に形成され、エネルギーの照射に伴う光触媒の作用により細胞の接着性が変化する細胞接着性変化材料を含有する細胞接着性変化材料層とを有するパターン形成体用基材を形成する工程である。
【０１８０】
本工程は、基材上に、細胞接着性変化材料を含有する塗工液を、例えば、スピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により塗布し、細胞接着性変化材料層を形成することにより行うことができる。またバインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。
【０１８１】
ここで、本工程に用いられる基材および細胞接着性変化材料については、上述した「Ｉ．細胞配列用基材」の第１実施態様の項で説明したものと同様のものを用いることができる。
【０１８２】
２．細胞接着性変化パターン形成工程
次に、本実施態様における細胞接着性変化パターン形成工程について説明する。本実施態様における接着性変化パターン形成工程は、上記パターン形成体用基材と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着性変化材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着性変化材料層の、細胞の接着性が変化した細胞接着性変化パターンを形成する工程である。
【０１８３】
本工程において、光触媒含有層側基板における光触媒含有層および細胞接着性変化材料層を対向するように配置し、目的とするパターン状にエネルギーを照射することにより、エネルギー照射された領域のみの細胞接着性変化材料層の細胞の接着性を変化させることができ、高精細な細胞接着性の良好な領域と悪い領域とのパターンである、細胞接着性変化パターンを形成することができるのである。
【０１８４】
以下、本工程に用いられる光触媒含有層側基板、およびエネルギー照射についてそれぞれ説明する。
【０１８５】
（１）光触媒含有層側基板
まず、本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板について説明する。
【０１８６】
本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板は、少なくとも光触媒含有層と基体とを有するものであり、通常は基体上に所定の方法で形成された薄膜状の光触媒含有層が形成されてなるものである。また、この光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部やプライマー層が形成されたものも用いることができる。
【０１８７】
本実施態様においては、エネルギーを照射する際に、上記細胞接着性変化材料層と、上記光触媒含有層側基板における光触媒含有層とを所定の間隙をおいて対向させ、光触媒含有層側基板の光触媒含有層の作用により、細胞接着性変化材料層の細胞接着性を変化させ、エネルギー照射後、光触媒含有層側基板を取り外すことにより細胞接着性変化パターンが形成されるのである。以下、この光触媒含有層側基板の各構成について説明する。
【０１８８】
ａ．光触媒含有層
本実施態様に用いられる光触媒含有層は、少なくとも光触媒を含有するものであり、バインダを有していても、有していなくてもよく、上述した第２実施態様の光触媒処理層と同様である。
【０１８９】
ここで、本実施態様において用いられる光触媒含有層は、例えば図６に示すように、基体１１上に全面に形成されたものであってもよいが、例えば図７に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２がパターン状に形成されたものであってもよい。
【０１９０】
このように光触媒含有層をパターン状に形成することにより、エネルギーを照射する際に、フォトマスク等を用いてパターン照射をする必要がなく、全面に照射することにより、細胞接着性変化材料層上に細胞接着性変化パターンを形成することができる。
【０１９１】
この光触媒含有層のパターニング方法は、特に限定されるものではないが、例えばフォトリソグラフィー法等により行うことが可能である。
【０１９２】
また、光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを例えば密着させてエネルギー照射を行う場合には、実際に光触媒含有層の形成された部分のみの特性が変化するものであるので、エネルギーの照射方向は上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とが対向する部分にエネルギーが照射されるものであれば、いかなる方向から照射されてもよく、さらには、照射されるエネルギーも特に平行光等の平行なものに限定されないという利点を有するものとなる。
【０１９３】
ｂ．基体
本実施態様においては、図６に示すように、光触媒含有層側基板１３は、少なくとも基体１１とこの基体１１上に形成された光触媒含有層１２とを有するものである。この際、用いられる基体を構成する材料は、後述するエネルギーの照射方向や、得られる細胞配列用基材が透明性を必要とするか等により適宜選択される。
【０１９４】
また本実施態様に用いられる基体は、可撓性を有するもの、例えば樹脂製フィルム等であってもよいし、可撓性を有しないもの、例えばガラス基材等であってもよい。さらには、別の形態の基体として、光ファイバ等の光導波路を用いることもできる。これらは、エネルギー照射方法により適宜選択されるものである。
【０１９５】
なお、基体表面と光触媒含有層との密着性を向上させるために、基体上にアンカー層を形成するようにしてもよい。このようなアンカー層としては、例えば、シラン系、チタン系のカップリング剤等を挙げることができる。
【０１９６】
ｃ．光触媒含有層側遮光部
本実施態様に用いられる光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部が形成されたものを用いてもよい。このように光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板を用いることにより、エネルギー照射に際して、フォトマスクを用いたり、レーザ光による描画照射を行う必要がない。したがって、光触媒含有層側基板とフォトマスクとの位置合わせが不要であることから、簡便な工程とすることが可能であり、また描画照射に必要な高価な装置も不必要であることから、コスト的に有利となるという利点を有する。
【０１９７】
このような光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板は、光触媒含有層側遮光部の形成位置により、下記の二つの態様とすることができる。
【０１９８】
一つが、例えば図８に示すように、基体１１上に光触媒含有層側遮光部１４を形成し、この光触媒含有層側遮光部１４上に光触媒含有層１２を形成して、光触媒含有層側基板とする態様である。もう一つは、例えば図９に示すように、基体１１上に光触媒含有層１２を形成し、その上に光触媒含有層側遮光部１４を形成して光触媒含有層側基板とする態様である。
【０１９９】
いずれの態様においても、フォトマスクを用いる場合と比較すると、光触媒含有層側遮光部が、上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層との配置部分の近傍に配置されることになるので、基体内等におけるエネルギーの散乱の影響を少なくすることができることから、エネルギーのパターン照射を極めて正確に行うことが可能となる。
【０２００】
さらに、上記光触媒含有層上に光触媒含有層側遮光部を形成する態様においては、光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを所定の位置に配置する際に、この光触媒含有層側遮光部の膜厚をこの間隙の幅と一致させておくことにより、上記光触媒含有層側遮光部を上記間隙を一定のものとするためのスペーサとしても用いることができるという利点を有する。また、スペーサとしての高さが不足する場合、遮光部に別途スペーサを設けてもよい。
【０２０１】
すなわち、所定の間隙をおいて上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを対向させた状態で配置する際に、上記光触媒含有層側遮光部と細胞接着性変化材料層とを密着させた状態で配置することにより、上記所定の間隙を正確とすることが可能となり、そしてこの状態で光触媒含有層側基板からエネルギーを照射することにより、細胞接着性変化材料層上に細胞接着性変化パターンを精度良く形成することが可能となるのである。
【０２０２】
このような光触媒含有層側遮光部の形成方法は、特に限定されるものではなく、光触媒含有層側遮光部の形成面の特性や、必要とするエネルギーに対する遮蔽性等に応じて適宜選択されて用いられる。
【０２０３】
例えば、スパッタリング法、真空蒸着法等により厚み１０００〜２０００Å程度のクロム等の金属薄膜を形成し、この薄膜をパターニングすることにより形成されてもよい。このパターニングの方法としては、スパッタ等の通常のパターニング方法を用いることができる。
【０２０４】
また、樹脂バインダ中にカーボン微粒子、金属酸化物、無機顔料、有機顔料等の遮光性粒子を含有させた層をパターン状に形成する方法であってもよい。用いられる樹脂バインダとしては、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ゼラチン、カゼイン、セルロース等の樹脂を１種または２種以上混合したものや、感光性樹脂、さらにはＯ／Ｗエマルジョン型の樹脂組成物、例えば、反応性シリコーンをエマルジョン化したもの等を用いることができる。このような樹脂製遮光部の厚みとしては、０．５〜１０μｍの範囲内で設定することができる。このよう樹脂製遮光部のパターニングの方法は、フォトリソ法、印刷法等一般的に用いられている方法を用いることができる。
【０２０５】
なお、上記説明においては、光触媒含有層側遮光部の形成位置として、基体と光触媒含有層との間、および光触媒含有層表面の二つの場合について説明したが、その他、基体の光触媒含有層が形成されていない側の表面に光触媒含有層側遮光部を形成する態様も採ることが可能である。この態様においては、例えばフォトマスクをこの表面に着脱可能な程度に密着させる場合等が考えられ、細胞接着性変化パターンを小ロットで変更するような場合に好適に用いることができる。
【０２０６】
ｄ．プライマー層
次に、本実施態様の光触媒含有層側基板に用いられるプライマー層について説明する。本実施態様において、上述したように基体上に光触媒含有層側遮光部をパターン状に形成して、その上に光触媒含有層を形成して光触媒含有層側基板とする場合においては、上記光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成してもよい。
【０２０７】
このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成することにより、プライマー層は光触媒の作用による細胞接着性変化材料層の細胞接着性変化を阻害する要因となる光触媒含有層側遮光部および光触媒含有層側遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、光触媒含有層側遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、高感度で細胞接着性変化の処理が進行し、その結果、高解像度のパターンを得ることが可能となるのである。
【０２０８】
なお、本実施態様においてプライマー層は、光触媒含有層側遮光部のみならず光触媒含有層側遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた光触媒含有層側遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。
【０２０９】
本実施態様におけるプライマー層は、光触媒含有層側基板の光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。
【０２１０】
このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
【０２１１】
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。
【０２１２】
（２）エネルギー照射
次に、本工程におけるエネルギー照射について説明する。本実施態様においては、上記細胞接着性変化材料層と、上記光触媒含有層側基板における光触媒含有層とを、対向するように配置し、所定の方向からエネルギーを照射することにより、細胞接着性変化材料層の細胞接着性が変化したパターンを形成することができる。
【０２１３】
上記の配置とは、実質的に光触媒の作用が細胞接着性変化材料層表面に及ぶような状態で配置された状態をいうこととし、実際に物理的に接触している状態の他、所定の間隔を隔てて上記光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とが配置された状態とする。この間隙は、２００μｍ以下であることが好ましい。
【０２１４】
本実施態様において上記間隙は、パターン精度が極めて良好であり、光触媒の感度も高く、したがって細胞接着性変化材料層の細胞接着性変化の効率が良好である点を考慮すると特に０．２μｍ〜１０μｍの範囲内、好ましくは１μｍ〜５μｍの範囲内とすることが好ましい。このような間隙の範囲は、特に間隙を高い精度で制御することが可能である小面積の細胞接着性変化材料層に対して特に有効である。
【０２１５】
一方、例えば３００ｍｍ×３００ｍｍ以上といった大面積の細胞接着性変化材料層に対して処理を行う場合は、接触することなく、かつ上述したような微細な間隙を光触媒含有層側基板と細胞接着性変化材料層との間に形成することは極めて困難である。したがって、細胞接着性変化材料層が比較的大面積である場合は、上記間隙は、１０〜１００μｍの範囲内、特に１０〜２０μｍの範囲内とすることが好ましい。間隙をこのような範囲内とすることにより、パターンがぼやける等のパターン精度の低下の問題や、光触媒の感度が悪化して細胞接着性変化の効率が悪化する等の問題が生じることなく、さらに細胞接着性変化材料層上の細胞接着性変化にムラが発生しないといった効果を有するからである。
【０２１６】
このように比較的大面積の細胞接着性変化材料層をエネルギー照射する際には、エネルギー照射装置内の光触媒含有層側基板と細胞接着性変化材料層との位置決め装置における間隙の設定を、１０μｍ〜２００μｍの範囲内、特に１０μｍ〜２０μｍの範囲内に設定することが好ましい。設定値をこのような範囲内とすることにより、パターン精度の大幅な低下や光触媒の感度の大幅な悪化を招くことなく、かつ光触媒含有層側基板と細胞接着性変化材料層とが接触することなく配置することが可能となるからである。
【０２１７】
このように光触媒含有層と細胞接着性変化材料層表面とを所定の間隔で離して配置することにより、酸素と水および光触媒作用により生じた活性酸素種が脱着しやすくなる。すなわち、上記範囲より光触媒含有層と細胞接着性変化材料層との間隔を狭くした場合は、上記活性酸素種の脱着がしにくくなり、結果的に細胞接着性変化速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。また、上記範囲より間隔を離して配置した場合は、生じた活性酸素種が細胞接着性変化材料層に届き難くなり、この場合も細胞接着性変化の速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。
【０２１８】
このような極めて狭い間隙を均一に形成して光触媒含有層と細胞接着性変化材料層とを配置する方法としては、例えばスペーサを用いる方法を挙げることができる。そして、このようにスペーサを用いることにより、均一な間隙を形成することができると共に、このスペーサが接触する部分は、光触媒の作用が細胞接着性変化材料層表面に及ばないことから、このスペーサを上述した細胞接着性変化パターンと同様のパターンを有するものとすることにより、細胞接着性変化材料層上に所定の細胞接着性変化パターンを形成することが可能となる。
【０２１９】
本実施態様においては、このような配置状態は、少なくともエネルギー照射の間だけ維持されればよい。
【０２２０】
ここで、照射されるエネルギーの種類や、照射方法、照射量等については、上述した第１実施態様で説明したものと同様である。
【０２２１】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【０２２２】
（実施例１）羊膜由来の支持体を用いた細胞含有シート
１−１．細胞配列用基材の作成
フルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン）１．５ｇ、テトラメトキシシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）５．０ｇ、５．０×１０−３ＮＨＣｌ  ２．４ｇを１２時間混合し、これをイソプロピルアルコールで１０倍希釈した。
【０２２３】
次に、この溶液２．０ｇを１０００ｒｐｍ、５秒でスピンコーターにより１０ｃｍ×１０ｃｍ、厚さ１５０μｍのポリエステルフィルム基材に塗布し、その基材を１５０℃の温度で１０分間乾燥させた。
【０２２４】
次に、イソプロピルアルコールで３倍希釈した酸化チタンゾル液（石原産業ＳＴＫ−０３）３．０ｇを光触媒含有層用組成物とした。
【０２２５】
前記光触媒含有層用組成物を、幅６０μｍのライン部および幅３００μｍのスペース部が交互に配置されたライン＆スペースのネガ型フォトマスク（石英）のパターン面上にスピンコーターにより７００ｒｐｍ、３秒で塗布し、１５０℃で１０分間の乾燥処理を行うことにより、透明な光触媒含有層を有するフォトマスクを形成した。
【０２２６】
前記フォトマスクの光触媒含有層面と前記基材の細胞接着性変化材料層面とを１０μｍの間隙で配置し、フォトマスク側から水銀ランプ（波長３６５ｎｍ）により２５．０ｍＷ／ｃｍ２の照度で所定の時間紫外線露光を行い、幅６０μｍのライン状の細胞接着性良好領域および幅３００μｍの細胞接着性阻害領域のスペースが交互に配置された細胞接着性変化パターンを有する細胞配列用基材を得た。
【０２２７】
１−２．羊膜由来の支持体の作成
ヘルシンキ宣言に基づいて胎児付属物の提供についてインフォームドコンセントの得られた母体・胎児合併症の無い羊膜を無菌的に採取した。１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ）を添加した滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）にて２回洗浄した。２×３ｃｍに切り分け、ＤＭＥＭと滅菌グリセロールを１：１で混合した保存溶液を用い−８０℃にて保存した。凍結された羊膜は、使用時に２７℃の恒温層にて解凍した。滅菌ＰＢＳにて３回洗浄し、０．０２％ＥＤＴＡを添加したＰＢＳ溶液に入れ、ＣＯ２インキュベータにて１時間インキュベートした。その後、滅菌ＰＢＳにて洗浄し、ｃｅｌｌ  ｓｃｒａｐｅｒにて絨網膜と細胞層を除去した。
【０２２８】
１−３．細胞培養
培養細胞として、ウシ頚動脈由来血管内皮細胞（Ｐｒｏｓｔａｇ  Ｌｅｕｋｏｔｒｅｓｓ，ｖｏｌ．６２，１６１，２０００）で継代数１０代から１９代のものを用いた。１０ｃｍディッシュでコンフルエント状態になったウシ頚動脈由来血管内皮細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理して剥がした。浮遊状態のままＰＫＨ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔｓ（ＰＫＨ２６  ｒｅｄ／Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＰＫＨ２６−ＧＬ，Ｓｉｇｍａ）により細胞膜を染色し、コールターカウンターＴＭ  ＺＭ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）で細胞数を調べ、１０６個／ｍｌに調製した。
【０２２９】
１−１で作成した細胞配列用基材をオートクレーブで滅菌した。この基材を培養ディッシュ（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＱｕａｄｒｉｐｅｒｍＴＭ，１ウェルのサイズ：７６×２６ｍｍ，１９７６ｍｍ２）に入れ、上記内皮細胞を１ウェルあたり１０６個／５ｍｌになるよう培地で希釈調製してディッシュに播き、１６時間ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞がパターン状に接着したことを確認した後、培養上清を吸引し、０．３％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地に置き換え、シーソーシェーカー（ＮＩＳＳＩＮ）にて細胞パターンの長軸方向に１時間振とうした。
【０２３０】
１−４．細胞転写
１−２で作成した羊膜由来の支持体の上に、上記細胞パターンが形成された細胞配列用基材を、細胞と羊膜が接するように配置し、２分間クリーンベンチ内で保持した後、５ｍｌの培養液（０．３％ウシ胎児血清含有ＭＥＭ培地）を入れ、２４時間培養した。
【０２３１】
ウシ血管内皮細胞が、管腔形成したことを確認し、基材を剥離した。これにより、羊膜上にウシ血管内皮細胞の管腔パターンが形成された細胞含有シートを得た。管腔パターンの線幅は、およそ２５μｍ〜３５μｍであった。
【０２３２】
１−５．移植
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６週齢）をネンブタール３０μｇ／ｋｇにて麻酔した。無菌操作にて以下の移植手術を行った。
【０２３３】
マウス腹部をイソジンにて消毒した。皮膚（表皮、真皮、および皮下組織）を下方皮弁状に切開した。皮下組織をｍｉｃｒｏ  ｃｕｒｅｔｔｅｓ（Ｆ．Ｓ．Ｔ）にて掻爬し菲薄化する。内皮細胞が転写された羊膜を皮下に移植した。４−０絹糸（ネスコスーチャー）にて閉創し、イソジンで創部を消毒した。その後、滅菌ゲージにてマウスを７日間飼育した。
【０２３４】
飼育後、エーテルにて安楽死させ、直ちに移植部分から腹膜までの組織を摘出し、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄにて凍結包埋した。ミクロトーム（ＪＵＮＧ  ＦＲＩＧＯＴ，Ｌｅｉｃａ）にて凍結切片を作製し、４％ＰＦＡにて固定後、封入した。一部はＨ−Ｅ染色を施した。
【０２３５】
１−６．結果
顕微鏡にて観察を行うと、細胞が羊膜上で管腔形成したことが確認された（図１０および図１１）。また飼育後に摘出したサンプルから作製した切片をレーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ，  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）で観察したところ、ＰＫＨ２６ｒｅｄで赤く染色された細胞が管腔を形成していることが確認された（図１１）。このことは、移植された管腔組織は、移植後も潰れることなく保持されていたことを示している。さらにＨ−Ｅ染色切片から、その血管に血球が認められた。このことは、移植された管腔組織に血流があったことを示している。
【０２３６】
（実施例２）生分解性ポリマー材料にコラーゲンを塗布した支持体を用いた細胞含有シート
実施例１と同様にして、細胞含有シートを作成した。ただし、支持体として、ポリ乳酸フィルム上にコラーゲンが付着した支持体を用いた。該支持体は、ポリ乳酸フィルムの上に、ブタ由来組織培養用コラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  ＴｙｐｅＩ−Ａ、新田ゼラチン）をコートすることにより作成した。これにより、ポリ乳酸フィルムで支持されたコラーゲン層上に血管内皮細胞から成る管腔パターンが形成された細胞含有シートを得た。
【産業上の利用可能性】
【０２３７】
本発明の細胞含有シートは、人工器官、人工臓器、創傷カバー材、創傷補填材、創傷治癒材などの種々の医用材料の原料として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】本発明において細胞配列用基材に細胞を接着させる手順を示す。
【図２】本発明において細胞を支持体に転写して培養する手順を示す。
【図３】本発明において細胞配列用基材に細胞を接着させる手順を示す。
【図４】本発明の細胞配列用基材の製造方法の一例を示す工程図である。
【図５】本発明の細胞配列用基材の製造方法の他の例を示す工程図である。
【図６】本発明の細胞配列用基材の製造方法の他の例を示す工程図である。
【図７】本発明における光触媒含有層側基板の一例を示す概略断面図である。
【図８】本発明における光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。
【図９】本発明における光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。
【図１０】本発明の細胞含有シートの写真である。
【図１１】本発明の細胞含有シートの蛍光顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【０２３９】
1…基材、2…光触媒含有細胞接着性変化層、3…パターン形成体用基材、4…フォトマスク、5…エネルギー、6…細胞接着性変化パターン、7…光触媒処理層、8…細胞接着性変化材料層、11…基体、12…光触媒含有層、13…光触媒含有層側基板、14…光触媒含有層側遮光部、15…細胞配列用基材、16…細胞接着性タンパク質含有層、17…細胞接着性良好領域、18…細胞接着性阻害領域、19…細胞、20…撥水性材料、21…細胞接着材料、23…生体吸収性材料からなる支持体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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