(57)【要約】【課題】  骨芽細胞の活性を促進し、細胞外基質を多く産生させて細胞の増殖および／または分化を促進する生体組織補填材を簡易に製造する。【解決手段】  金属塩水溶液、カルシウム化合物および燐酸化合物を混合し（Ｓ４）、金属含有燐酸カルシウムを共沈させる生体組織補填材の製造方法を提供する。この場合に、金属塩水溶液が、α−ヒドロキシケトンとアルカノールアミン、好ましくは、ヒドロキシアセトンとアミノエタノールとの混合溶液に、金属塩を溶解させたものであることが好ましく、また、金属塩を構成する金属が、ニオブまたはタンタルであることが好ましく、ニオブまたはタンタルの含有量が１％〜１０％であることが好ましい。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属塩水溶液、カルシウム化合物および燐酸化合物を混合し、燐酸カルシウムとともに金属を共沈させる生体組織補填材の製造方法。
【請求項２】
金属塩水溶液と燐酸化合物とを混合した混合物と、カルシウム化合物とを混合し、燐酸カルシウムとともに金属を共沈させる生体組織補填材の製造方法。
【請求項３】
前記金属塩水溶液が、α−ヒドロキシケトンとアルカノールアミンとの混合溶液に、金属塩を溶解させたものである請求項１または請求項２に記載の生体組織補填材の製造法補。
【請求項４】
前記金属塩を構成する金属が、ニオブまたはタンタルである請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体組織補填材の製造方法。
【請求項５】
ニオブまたはタンタルの含有量が、カルシウム含有量に対して１〜１０原子％である請求項４に記載の生体組織補填材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織補填材の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）や燐酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのような燐酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを吸収し、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
一方、燐酸カルシウム多孔体への細胞や組織の初期接着性を向上するために、燐酸カルシウム多孔体の表面にコラーゲンのような高分子を配置する技術が知られている。そして、コラーゲン等の高分子を燐酸カルシウム多孔体の表面に安定的に結合させる結合材として、亜鉛等の金属イオンを化学修飾することが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
また、金属系医用材料としてステンレス鋼、コバルト・クロム合金、チタン合金などが人工骨、人工関節、骨固定材などの埋植医療用具に使用されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【非特許文献２】伊佐間和郎、土屋利江、「金属塩の正常ヒト骨芽細胞の増殖及び分化に及ぼす影響」、第２３回日本バイオマテリアル学会大会予稿集、ｐ１９０
【特許文献１】特開２００１ー１９８２０８号公報（［００１８］等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１および非特許文献２に示されるように、亜鉛を初めとする多くの金属イオンを含有する生体組織補填材および金属からなる埋植医療用具は存在する。
しかしながら、特許文献１に示されている亜鉛を初めとする多くの金属イオンは毒性を有し、その濃度が高くなると、細胞の増殖を阻害する要因となるという不都合がある。このため、毒性が高くならないように非常に低い濃度範囲で使用することが想定されている。
また、非特許文献２は、毒性が低く細胞の増殖を阻害しない金属塩を開示しているが、あくまでも、細胞の増殖を阻害しない人工骨、人工関節、骨固定材など金属製の埋植医療用具を開示するものに過ぎず、積極的に細胞の増殖を促進して生体組織の再生を図る生体組織補填材に何ら言及するものではない。
【０００６】
この発明は、骨芽細胞の活性を促進し、細胞外基質を多く産生させて細胞の増殖および／または分化を促進する生体組織補填材を簡易に製造する生体組織補填材の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、金属塩水溶液、カルシウム化合物および燐酸化合物を混合し、燐酸カルシウムとともに金属を共沈させる生体組織補填材の製造方法を提供する。
本発明によれば、燐酸カルシウムが沈殿する際に金属塩水溶液に含有していた金属が共沈させられるので、金属を含有する生体親和性の燐酸カルシウムからなる生体組織補填材を簡易に製造することができる。
【０００８】
上記発明においては、金属塩水溶液と燐酸化合物とを混合した混合物と、カルシウム化合物とを混合し、燐酸カルシウムとともに金属を共沈させることとしてもよい。
このようにすることで、沈殿を生じる前の状態で、金属塩水溶液と燐酸化合物との均一かつ一定の濃度の混合物を作成できる。したがって、得られる金属含有燐酸カルシウムに含有される金属の濃度を均一かつ一定に分布させることができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記金属塩水溶液が、α−ヒドロキシケトンとアルカノールアミン、好ましくは、ヒドロキシアセトンとアミノエタノールとの混合溶液に、金属塩を溶解させたものであることが好ましい。
また、上記発明においては、前記金属塩を構成する金属が、ニオブまたはタンタルであることが好ましい。さらに、ニオブまたはタンタルの含有量は、カルシウム含有量に対して１〜１０原子％であることが好ましい。
【００１０】
ニオブおよびタンタルは、いずれも、細胞の増殖を阻害しないばかりか、骨芽細胞の活性を促進し、細胞外基質の産生量を増加させる機能を有するという知見が得られている。本発明によれば、生体組織補填材を生体組織の欠損部に補填することにより、周囲に配されている骨芽細胞が活性化されて細胞外基質が多く産生されるので、欠損部を迅速に修復することができる生体組織補填材を簡易に製造することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、骨芽細胞を活性化して細胞外基質の産生量を増大させ、補填された生体組織を迅速に修復することができる金属含有燐酸カルシウムからなる生体組織補填材を簡易に製造することができるという効果を奏する。
したがって、本発明により製造された生体組織補填材は、骨芽細胞の培養基材として用いることにより、骨芽細胞を高い活性状態で培養することができる。また、培養骨の基材として使用することにより、骨芽細胞の活性が高い培養骨を得ることができ、また、細胞外基質が豊富な培養骨を得ることができる。さらに、骨補填材として使用することにより、骨芽細胞を活性化させ、欠損部等の迅速な修復を図ることができる。また、骨粗鬆症の治療薬として用いることにより、骨芽細胞を活性化し、細胞外基質による再石灰化効果により骨粗鬆症を治療することが可能となる。また、人工関節等の金属表面にコーティングすることにより、骨との摩擦による移植部分の骨融解を生ずることがなく摩擦部分の骨の再石灰化が期待でき、骨融解による人工関節の交換やコーティング材の再調整を施す期間を延長もしくは不要とする効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の一実施形態に係る生体組織補填材の製造方法について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填材の製造方法は、例えば、β−ＴＣＰ多孔体のような燐酸カルシウム多孔体に、ニオブの金属塩（例えば、五塩化ニオブ：ＮｂＣｌ５）またはタンタルの金属塩（例えば、五塩化タンタル：ＴａＣｌ５）の少なくともいずれかを含有してなるもの生体組織補填材を製造するものである。
【００１３】
本実施形態に係る製造方法は、図１に示されるように、カルシウム化合物の水溶液として、例えば、０．２Ｍの硝酸カルシウム水溶液を用意し、燐酸化合物の水溶液として、例えば、０．２Ｍの燐酸アンモニウム水溶液を用意する。また、金属塩水溶液として、例えば、０．０１Ｍの五塩化ニオブの水溶液を用意する。
【００１４】
０．０１Ｍの五塩化ニオブの水溶液は、図２に示されるように、０．００１ｍｏｌの五塩化ニオブと、５ｍｌのヒドロキシアセトンと、５ｍｌのアミノエタノールとを混合し（Ｓ１）、９０ｍｌの蒸留水を加えて２４時間攪拌する（Ｓ２）ことにより構成される。
【００１５】
次いで、０．２Ｍの燐酸アンモニウムと０．０１Ｍの五塩化ニオブ水溶液とを混合して（Ｓ３）構成された混合物と、０．２Ｍの硝酸カルシウム水溶液とを混合する（Ｓ４）。このとき、温度を室温に維持し、１基底の水酸化ナトリウムを添加して水溶液のｐＨを１０に維持する。そして、この状態で２４時間放置する（Ｓ５）ことにより、沈殿する燐酸カルシウム内に、ニオブを共沈させることが可能となり、ニオブを含有し、カルシウムＣａとリンＰとの比がＣａ／Ｐ＝１．５０のカルシウム欠損型のハイドロキシアパタイトを製造することができる。これを焼成することによりニオブを含有したβ−ＴＣＰを製造することができる。
【００１６】
また、用いるカルシウム化合物の水溶液や燐酸化合物の水溶液の濃度あるいは量を調節することにより、あるいは、水溶液の温度を調節することにより、カルシウムＣａとリンＰとの比がＣａ／Ｐ＝１．６７のニオブを含有するハイドロキシアパタイトを製造することができる。
【００１７】
沈殿したニオブ含有の燐酸カルシウムは、３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し（Ｓ６）、蒸留水で洗浄する作業（Ｓ７）を２回繰り返した後に、５０℃で乾燥させ（Ｓ８）、５００℃〜８００℃に１分間に５℃の割合で昇温し、８００℃に２時間保持した後、徐冷するアニーリング処理を施す（Ｓ９）ことにより、粉末状のニオブ含有ハイドロキシアパタイトあるいはニオブ含有β−ＴＣＰあるいはニオブ含有ハイドロキシアパタイト／β−ＴＣＰ複合燐酸カルシウム多孔体が得られる。
【００１８】
次に、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填材の作用について説明する。
本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填材によれば、この生体組織補填材が、例えば、骨組織に形成された腫瘍を掻爬して形成された骨欠損部に充填されることにより、含有されているニオブまたはタンタルの金属塩が、ニオブイオンまたはタンタルイオンとなって周囲の骨芽細胞に作用する。骨芽細胞は、これら金属イオンの作用により活性化され、多量の細胞外基質を産生することになる。その結果、産生された細胞外基質の作用により、骨芽細胞の成長がさらに促進され、分化および増殖が繰り返されることにより、迅速に骨組織を再生することができる。
【００１９】
ここで、燐酸カルシウム粉体に含有されるニオブの含有量と骨芽細胞の活性との関係について図３および図４を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る製造方法により製造される生体組織補填材として、カルシウムに対して１原子％および１０原子％のニオブを含有する燐酸カルシウム粉体を用意した。燐酸カルシウムとしては、ハイドロキシアパタイトとβ−ＴＣＰとを用意した。また、比較例として、上記製造方法において五塩化ニオブ水溶液を混合することなく製造したニオブを含有しない（０原子％）燐酸カルシウム粉体（ハイドロキシアパタイトおよびβ−ＴＣＰ）を用意した。
【００２０】
そして、これらの燐酸カルシウム粉体に骨芽細胞を播種して培養した後に、細胞から産生されるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の量を測定した。
具体的には、５×１０４cells/ml/wellの正常ヒト骨芽細胞を２４ウェルディッシュに播種し、α−ＭＥＭ（最小必須培地：Eagle's Minimum
Essential Medium）、１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）および１０ｍＭのβグリセロフォスフェートを含む培地内で１週間にわたり培養した。また、ＡＬＰの測定は、培地を抜いた後に、４ｍＭのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛および０．１Ｍグリシンバッファの混合液を１ｍＭ添加して、波長４０５ｎｍの吸光度を測定することにより行われた。
【００２１】
その結果、図３に示されるように、ハイドロキシアパタイトからなる燐酸カルシウム粉体においては、ニオブが１０原子％含有されている場合に、ニオブが含有されていないものと比較して優位なＡＬＰ活性が確認された。また、図４に示されるように、β−ＴＣＰからなる燐酸カルシウム多孔体においては、ニオブが含有されているいずれの場合（１原子％および１０原子％）においても、ニオブが含有されていないものと比較して優位なＡＬＰ活性が確認された。
【００２２】
このように、本実施形態に係る生体組織補填材の製造方法によれば、骨芽細胞を活性化させて迅速に生体組織欠損部の修復を図ることができる生体組織補填材を簡易に製造することができるという利点を有する。
【００２３】
なお、本実施形態においては、金属塩水溶液として、５塩化ニオブの水溶液を例示したが、これに代えて、五塩化タンタル（ＴａＣｌ５）の水溶液を用いることにしてもよい。
タンタルもニオブ同様、毒性が少なくあるいは全くなく、高濃度になっても増殖度をさほど低下させることなく、さらには増殖度を増加させるよう機能することが予想される。
【００２４】
また、カルシウム化合物水溶液として、硝酸カルシウム水溶液を採用したが、これに代えて、塩化カルシウム水溶液を用いることにしてもよい。
また、ニオブ含有燐酸カルシウム粉体からなる骨補填材について例示したが、これに代えて、骨芽細胞の培養基材として用いてもよい。また、骨粗鬆症の治療薬として用いることにより、骨芽細胞を活性化し、細胞外基質による再石灰化効果により骨粗鬆症を治療することが可能となる。また、人工関節等の金属表面にコーティングすることにより、骨との摩擦による移植部分の骨融解を生ずることがなく摩擦部分の骨の再石灰化が期待でき、骨融解による人工関節の交換やコーティング材の再調整を施す期間を延長もしくは不要とする効果が期待できる。また、骨組織以外の生体組織に適用しても効果的である。
【００２５】
また、本実施形態に係る製造方法により製造された生体組織補填材を基材として間葉系幹細胞を播種して培養することにより、骨芽細胞の活性が高い生体組織補填体を得ることができる。また、このような生体組織補填体によれば、細胞外基質を豊富に含み、生体組織欠損部への移植後の修復をさらに迅速にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織補填材の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法において、五塩化ニオブの水溶液を調整する方法を示すフローチャートである。
【図３】図１の製造方法により製造された五塩化ニオブ含有ハイドロキシアパタイトによるニオブ濃度とアルカリフォスファターゼ活性との関係を示すグラフである。
【図４】図１の製造方法により製造された五塩化ニオブ含有β−ＴＣＰによるニオブ濃度とアルカリフォスファターゼ活性との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２７】
Ｓ３  混合ステップ
Ｓ４  共沈ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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