(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝的な価値の高い形質転換動物および非形質転換動物の生産に有用な動物胚を再構築する方法の提供。【解決手段】静止状態のドナー細胞由来の核を適当なレシピエント細胞中に転移する。ドナー細胞は、Ｇ１期で成長及び分裂周期から脱し、かつＧ０状態に止まるという点で、静止状態である。核の転移は細胞融合によって行われる。さらに、再構築された胚から一以上の動物が生産される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
静止状態のドナー細胞の核を適当なレシピエント細胞中に移植することを含む、動物胚の再構築方法。
【請求項２】
該動物が有蹄動物種である、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
該動物がメスウシ若しくはオスウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラクダまたはスイギュウである、請求の範囲第２項に記載の方法。
【請求項４】
該ドナー細胞の核が遺伝的に修飾される、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該ドナー細胞が胚の再構築前に遺伝的に修飾される、請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
該レシピエント細胞が卵母細胞である、請求の範囲第５項に記載の方法。
【請求項７】
該卵母細胞が除核される、請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
該ドナー細胞が成体の体細胞である、請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該ドナー細胞が胚の体細胞である、請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該ドナー細胞が胎児の体細胞である、請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
以下を含む、動物の調製方法：
（ａ）請求の範囲第１項から第１０項のいずれかに記載の方法により動物胚を再構築する；
（ｂ）動物を胚から自然に誕生するまで発達させる；および
（ｃ）選択的に、このようにして形成された動物から繁殖させる。
【請求項１２】
該動物胚が、完全に発達する前にさらに操作される、請求の範囲第１１項に記載の方法。
【請求項１３】
一以上の動物が胚由来である、請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
静止状態のドナー細胞の核を適当なレシピエント細胞中に移植することによって調製される再構築された動物胚。
【請求項１５】
該ドナー細胞が成体の体細胞である、請求の範囲第１４項に記載の再構築された胚。
【請求項１６】
該ドナー細胞が胚の体細胞である、請求の範囲第１４項に記載の再構築された胚。
【請求項１７】
該ドナー細胞が胎児の体細胞である、請求の範囲第１４項に記載の再構築された胚。
【請求項１８】
請求の範囲第１項から第１３項のいずれかに記載の方法によって調製された動物。
【請求項１９】
請求の範囲第１４項から第１７項のいずれかに記載の再構築された動物胚から発達させた動物。
【請求項２０】
請求の範囲第１４項から第１７項のいずれかに記載の再構築された動物胚由来の細胞系。
【請求項２１】
請求の範囲第１４項から第１７項のいずれかに記載の再構築された動物胚由来の細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、以下に制限されるものではないが、遺伝的に選択されるおよび／または修飾される動物などの動物の生産に関するものである。
ドナー胚の核を除核された卵母細胞または１細胞接合体に移植(transfer)することによる哺乳動物の胚の再構築は、遺伝学的に同一な固体の生産を可能にする。上記胚の再構築は、研究（即ち、生物学的コントロールとして）に関しておよび商業上の用途（即ち、遺伝的に価値のある家畜の増殖、肉製品の均一性、動物の管理）の点でも明らかに利点を有する。初期胚を核ドナーとして使用する際の一つの問題としては、単一の胚から生産できる子孫の数が細胞の数（３２〜６４細胞分裂期の胚が最も広範に家畜種では使用される）および核の移植プロトコルの効率によって制限されることがある。
【０００２】
胚を核ドナーとして使用することに反して、培養物中に維持できる細胞からの核移植により生存する子孫を生産可能にすることは、動物のブリーダーにとってある期間模索された目的である。培養細胞系からのクローニングされた子孫の生産が可能になるということは、初期胚を使用することに比べて非常に多くの利点がある。これらとしては、以下が挙げられる：長期間にわたる非常に多くの同一の子孫の生産（培養細胞は凍結及び貯蔵できる）および胚の再構築前に目的とする遺伝子型（例えば、性）を有する細胞集団を遺伝的に修飾および／または選択できる。上記方法に使用される一つの可能性のある細胞型としては、胚の幹(Embryonic Stem)（ＥＳ）細胞がある。ＥＳ細胞はすでにマウスで単離されたが、これを核の移植に使用した後自然に誕生するまで発達させた(development to term) 報告は未だ存在しない。現時点では、インビボで生産された胚盤胞の割腔中への注入後の発達に寄与したブタのＥＳ様細胞について一件報告がある（ウィーラー(Wheeler) 、レプロド  ファーティル  デブ(Reprod. Fertil. Dev.)、６：５６３〜５６８（１９９４年））が、他の家畜種におけるキメラ現象に関する報告はなく、また、確立された細胞系由来の哺乳動物種に核を移植後に自然に誕生するまで発達させた(development to term) という報告は何等存在しない。
【０００３】
ＥＳ細胞系を使用する例はほかにいくつかある：これらのうちの一つとしては、核の移植に使用される際の発達を促進できる他の細胞集団に関する研究がある。様々な報告から、始原生殖細胞が適当な候補となることが示唆される：しかしながら、自然に誕生するまで発達させること(development to term) は何等報告されていない。初期胚から確立された細胞系から、以下が示唆された：長期間培養したヒツジの初期通過細胞からの発達は報告された（キャンベル(Campbell)ら、テリオ(Therio)、４３：１８１（１９９５年））が、既知の核の移植プロトコルを用いては何等発達が得られなかった（キャンベル(Campbell)ら、ジェー  アブストラクト  シリーズ（５）(J. Abstract Series(5)) 、３１（１９９５年））。
【０００４】
核を移植した後自然に誕生するまで発達させる(development to term) ためには、移植させた核の発達の時計をリセットする必要がある。これを行うためには、転写を停止させた後、発達が制御された状態で再スタートさせなければならない。従来の報告から、胚盤胞段階までの発達がウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ及びマウスの広範な細胞型から得られることが示された。しかしながら、これらのすべての報告において、自然に誕生するまで発達させること(development to term) は報告されていない。９日目のヒツジ胚の胚盤（ＥＤ）から確立された初期の細胞系（３継代まで）から核を移植した後に生きた子羊が誕生したことはすでに報告された（キャンベル(Campbell)ら、テリオ(Therio)、４３：１８１（１９９５年））。しかしながら、その後の培養では、自然に誕生するまで発達させること(development to term) は既知の核の移植プロトコル（６及び１１継代時）を用いては得られなかった（キャンベル(Campbell)ら、ジェー  レプロド  ファーティル  アブストラクト  シリーズ（５）(J. Reprod. Fertil. Abstract Series(5)) 、３１（１９９５年））。これらの結果は様々に解釈された；第一に、培養初期の間に得られたＥＤ由来細胞はすべて発達を促進できると仮定できる。しかしながら、培養細胞系の確立中に長期間培養すると、これらの細胞は変化するため、上記文献で称されるところの「ユニバーサルレシピエント(Universal Recipient) 」中に核を移植するための核ドナーとして使用される際に発達を制御することができない。または、初期培養期間中に、細胞のサブ集団(sub-population)が発達促進能を維持し、さらにこれにより上記初期継代中の核の移植後の生きた子孫の生産が説明されると仮定するものがある。従来の研究は、核の移植によって再構築された胚の発達におけるドナー核及びレシピエント細胞質の細胞周期の協調の役割を強調するものであった（キャンベル(Campbell)ら、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、４９：９３３〜９４２（１９９３年）およびバイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、５０：１３８５〜１３９３（１９９４年））。
【０００５】
公開された核の移植プロトコルを用いて核の移植に対して全能である細胞系の単離によるものに対して２つの可能性のある別の方法は以下のとおりである：
（１）存在する核の移植方法を修飾する；または
（２）核の移植前にドナー細胞の染色質を修飾する。
【０００６】
全能細胞は、全動物に発達させることができる（除核された卵母細胞などの、レシピエント細胞中にドナー細胞由来の核を移植することにより胚を構築すると、全能であるドナー細胞の核となる）。これは、胚体外系列、即ち、胎盤を発達させることを含む。この定義によると、受精接合体および種によっては個々の割球もまた全能である。これに対して、多能性(pluripotent) または多分化能(multipotent) 細胞（即ち、胚の幹細胞(embryonic stem cell) ）型は、割腔中に注入された後に受胎物／子孫においてすべての組織を形成できるものとして定義された。
【０００７】
上記で概説した核移植ストラテジー（１）及び（２）の双方では、移植された核の遺伝子の発現を再プログラミングできる方法が必要である：このような方法は、分化したまたは部分的に分化した細胞を核ドナーとして使用することができ、さらに固有の全能性を「引き出す(bring out) 」であろう。
【０００８】
静止状態の細胞、すなわち、細胞周期によって能動的に増殖しない細胞が、動物胚の再構築に核ドナーとして好ましく使用できることが発見された。このような胚は、次に、自然に誕生するまで発達させる(develop to term) ことができる。胚の再構築後に観察され有効な核の移植に必要であるドナー核の変化が静止状態に入ることによって核ドナーとして使用される前に細胞の核内で誘導されうると考えられる。この事実が本願において利用された。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の第一の概念によると、静止状態のドナー細胞の核を適当なレシピエント細胞中に移植することを含む、動物胚の再構築方法を提供するものである。
【００１０】
原則としては、本発明は、ニワトリ等の鳥類、両生類及び魚類などの、すべての動物に適用できる。しかしながら、実際には、商業上最も有用な利用可能性が現在期待される、非ヒト動物、特に、（非ヒト）哺乳動物であろう。特に、本発明が、動物をクローニングするための手段としておよび形質転換または遺伝的に修飾される動物を生産するための手段として、最も有用であると考えられるのは、有蹄動物、特にウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ラクダ及びブタなどの経済上重要な有蹄動物を用いるものである。本発明は他の経済上重要な動物種、例えば、ウマ、ラマまたはラットやマウス等の齧歯動物、またはウサギ等にも適用できると考えられることに留意すべきである。
【００１１】
本発明は、形質転換、および非形質転換動物の生産に同様に使用できる。形質転換動物は遺伝的に変換されたドナー細胞から生産される。全体としての方法は、形質転換（即ち、遺伝的に修飾された）動物の生産に関する既知の方法に比べて多くの利点を有し、これらを要約すると以下のとおりである：
（１）より少ない数のレシピエントで十分である；
（２）多数の同遺伝子型創始体(founder) がクローンドナー細胞を用いて得られる；
（３）遺伝子のターゲッティング(targeting) による微妙な遺伝子の変換が可能である；
（４）各動物は単一の核由来であるので、本発明によって調製される胚から生産されるすべての動物は生殖系列を介してその関連する遺伝的修飾を遺伝すべきである；これに対して、胚盤胞の注入により修飾された幹細胞集団を封入した後の前核注入またはキメラ現象、または他の方法による形質転換動物の生産は、すべての細胞が修飾を有するものではないモザイク動物が一定の割合で生産され、得られた動物は生殖系列を介して修飾を遺伝しない；および
（５）細胞を、全動物を生産する前に遺伝的修飾（例えば、組み込み）の部位で選択できる。
【００１２】
動物に関して使用される、「形質転換」ということばは、多くの形質転換動物は他の種由来の一以上の遺伝子をその生殖系列内に含むものであるが、そのような一以上の遺伝子をその生殖系列内に含む動物を称するものと限定して解してはならないことに留意すべきである。むしろ、このことばは、組換ＤＮＡ技術による技術的な関与を受けた生殖系列を有する動物を意味するものとしてより広範な意味で使用される。このため、例えば、その生殖系列において内因性の遺伝が欠失、複製、活性化または修飾された動物、さらにはその生殖系列に外因性のＤＮＡ配列が付加された動物は、本発明の目的では形質転換動物である。
【００１３】
動物が形質転換動物である際の本発明の実施態様によると、ドナー核は遺伝的に修飾される。このドナー核は一以上のトランスジーンを含み、遺伝的修飾は核の移植及び胚の再構築の前に起こる。接合体のオスまたはメスの前核中への注入に類似する、マイクロインジェクションが遺伝的修飾方法として使用されるが、本発明は上記方法に限定されるものではない：例えば、エレクトロポレーション、ウィルスのトランスフェクションまたはリポフェクション(lipofection) などの、マストランスフォーメーション(mass transformtion)またはトランスフェクション技術もまた使用できる。
【００１４】
上記本発明の方法によると、核は、静止状態のドナー細胞からレシピエント細胞に移植される。この方法の使用は特定のドナー細胞型に制限されるものではない。静止期に入るまたはインビボで静止状態に存在するように誘導できる、胚、胎児及び成体の体細胞等の、正常な核型を有するすべての細胞が、本技術を用いることにより全能となる。したがって、本発明は、十分に分化した細胞を含む、少なくとも部分的に分化した細胞の使用を包含するものである。ドナー細胞は、以下でなければならないことはないが、培養物中に存在してもよい。培養されたウシの初期線維芽細胞、胚由来のヒツジ細胞系（ＴＮＴ４）、６年齢の成体ヒツジのヒツジ乳腺上皮細胞由来の細胞系（ＯＭＥ）、ヒツジ胎児組織由来の線維芽細胞系（ＢＬＷＦ１）及び９日齢のヒツジ胚由来の上皮様細胞系（ＳＥＣ１）が以下に具体的に挙げられる。また、ＴＮＴ４細胞系などの本発明に使用される胚由来細胞系の一分類が、ＷＯ９６／０７７３２号として公開される、継続ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２０９５号の対象である。
【００１５】
本発明に使用されるにあたって、ドナー細胞は静止状態である、即ち、有糸核分裂細胞周期によって能動的に増殖しない細胞である。有糸核分裂細胞周期は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２及びＭの明瞭な４期からなる。「スタート(start) 」と称される、細胞周期の開始はＧ１期で起こり、独特の機能を有する。他の細胞周期を受けるかの決定または拘束はスタート(start) 時になされる。細胞がいったんスタート(start) を通過すると、プレＤＮＡ(pre-DNA) 合成期である、Ｇ１期の残りを通過する。第二段階である、Ｓ期はＤＮＡ合成が行われる時期である。その後、Ｇ２期があり、ここはＤＮＡ合成と有糸分裂との間の時期である。有糸分裂自体はＭ期で起こる。静止状態の細胞（静止状態が誘導された細胞および十分分化した細胞などの自然に静止状態にある細胞を含む）は、通常、このような周期の４期のいずれにも属さないと見なされる；静止状態の細胞はＧ０状態にあると一般的に説明され、このため、静止状態の細胞は上記周期を正常に進行しないことが示される。静止状態のＧ０細胞の核は２倍のＤＮＡ含量を有する。
【００１６】
培養細胞は、化学的な処理、栄養素の奪取、成長の阻害または遺伝子発現の操作などの様々な方法によって静止状態に入るよう誘導できる。現在、培養液中の血清レベルの抑制が、ヒツジ及びウシの細胞系において静止状態を誘導するのに良好に使用された。このような状況下では、細胞はＧ１期中に成長サイクルを脱し、上記したように、いわゆるＧ０期に止まる。このような細胞は、成長サイクルに再度入る際には再刺激を受けるまで数日間（恐らく、細胞によってはより長い期間）このような状態に止まることができる。
【００１７】
Ｇ０期に止まった静止状態の細胞は２倍体である。Ｇ０状態は細胞が分化できる細胞周期における時期である。静止状態時には、多くの代謝変化が報告されており、これらとしては以下が挙げられる：一リン酸化ヒストン、線毛中心小体(ciliated centriole)、すべてのタンパク質合成における抑制または完全停止、タンパク質分解の促進、転写の抑制および全細胞ＲＮＡの減少を生じるＲＮＡのターンオーバーの促進、ポリリボソームの解離(disaggregation)、不活性８０Ｓリボソームの蓄積、ならびに染色質凝縮（ウィットフィールド(Whitfield) ら、コントロール  オブ  アニマル  セル  プロリフェレーション(Control of Animal Cell Proliferation)、１：３３１〜３６５（１９８５年））。
【００１８】
このような態様の多くは核を除核された卵母細胞に移植した後に起こる必要があるものである。Ｇ０状態が細胞の分化と関連があるという事実から、これによりレシピエント細胞の細胞質によるリモデリング(remodelling) および／またはリプログラミング(reprogramming) を受ける余地がよりある核／染色質構造が形成されることが示唆される。このようにして、核ドナー細胞が静止状態にあることによって、ドナーの核の染色質は、核が発達されることができるように胚を再構成(reconstitution)または再構築(reconstruction)する前に修飾されてもよい。これは、ドナー細胞の染色質が細胞を核ドナーとして使用する前に修飾される点で、従来報告されるすべての核移植方法とは異なる。
【００１９】
ドナー細胞の核を移植するレシピエント細胞は卵母細胞または他の適当細胞であってもよい。
【００２０】
中期Ｉ〜中期ＩＩまでの卵母細胞から接合体及び２細胞胚までの、様々な異なる発達段階のレシピエント細胞が使用される。それぞれ、長所や短所がある。受精卵の使用は有効な活性化をもたらすが、単為生殖の活性化が卵母細胞では必要である（下記参照）。種によっては分割段階の胚を使用することが好ましい他の機構では、遺伝子の発現のリプログラミング(reprogramming) が必要とされる。転写はマウスでは第二細胞周期中に開始し、合成されるタンパク質の性質の主要な変化は胚盤胞段階までは２次元電気泳動では示されない（ハウレット(Howlett) 及びボルトン(Bolton)、ジェー  エンブリオル  エックプ  モルホル(J. Embryol. Exp. Morphol.) 、８７：１７５〜２０６（１９８５年））。しかしながら、ほとんどの場合、レシピエント細胞は卵母細胞である。
【００２１】
レシピエントは除核されることが好ましい。核の移植工程におけるレシピエント卵母細胞の除核は必須であると通常考えられるが、この判断の実験による確認は公表されていない。有蹄動物について記載されたオリジナルな方法は、細胞を２個等分に分割することを伴うが、この際、一方が除核されたと考えられた（ウィラドセン(Willadsen) 、ネーチャー(Nature)、３２０（６）：６３〜６５（１９８６年））。この方法は、他方の不明な半分は中期の器官を有したままであり、細胞質の容積の減少は新たな胚の分化パターンを加速すると考えるという短所を有する（エビスコフ(Eviskov) ら、デベロップメント(Development) 、１０９：３２２〜３２８（１９９０年））。
【００２２】
より近年では、異なる方法が最小限の細胞質で染色体を除去する試みに使用された。第一極体及び付近の細胞質の吸引により、６７％のヒツジの卵母細胞において中期ＩＩ器官が除去されることが分かった（スミス(Smith) 及びウィルマット(Wilmut)、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、４０：１０２７〜１０３５（１９８９年））。除核が細胞質の容積を最小限の減少で行われることによる方法は、ＤＮＡ特異的蛍光色素（ヘキスト３３３４２(Hoechst 33342) ）を用いるもののみであった（ツノダ(Tsunoda) ら、ジェー  レプロド  ファーティル(J. Reprod. Fertil.)、８２：１７３（１９８８年））。家畜種では、これは現在定常的に使用される方法であると考えられる（プラザー(Prather) 及びファースト(First) 、ジェー  レプロド  ファーティル  サプル(J. Reprod. Fertil. Suppl.) 、４１：１２５（１９９０年）、ウェスサシン(Westhusin) ら、バイオル  レプロド  （サプル）(Biol. Reprod. (Suppl.))、４２：１７６（１９９０年））。
【００２３】
哺乳動物の非侵襲による除核方法に関してはほとんど報告がなかったが、両生類では、紫外線の照射が定常的な方法として使用される（ガードン  キュー(Gurdon. Q.)、ジェー  ミクロスク  ソク(J. Microsc. Soc.)、１０１：２９９〜３１１（１９６０年））。ＤＮＡ特異的蛍光色素の使用中にマウスの卵母細胞に３０秒以上紫外線を照射すると細胞の発達可能性が下がることは記載された（ツノダ(Tsunoda) ら、ジェー  レプロド  ファーティル(J. Reprod. Fertil.)、８２：１７３（１９８８年））が、哺乳動物に上記方法を使用する詳細な報告はない。
【００２４】
ドナー細胞核が移植されるレシピエント宿主細胞が除核された中期ＩＩ卵母細胞、除核された不活性化卵母細胞または除核された前活性化(preactivated)卵母細胞であることが好ましい。少なくともレシピエントが除核された中期ＩＩ卵母細胞である際には、活性化は移植時に行われる。または、少なくともレシピエンドが除核された不活性化中期ＩＩ卵母細胞である際には、活性化はその後に行われる。上記したように、除核は、物理的に、核を実際に除去することにより、前核若しくは中期プレート（レシピエント細胞による）、または紫外線の適用若しくは他の除核効果によるなどの機能的に達成される。
【００２５】
３種の適当な細胞質（除核された卵母細胞）レシピエントは以下のとおりである：
１．本日出願された我々の継続ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２０９８号（ＧＢ  ９５１７７７９．６号に基づく優先権を主張）に記載される、「マジックレシピエント(MAGIC Recipient) 」（中期停止Ｇ１／Ｇ０許容細胞質(Metaphase Arrested G1/G0 AcceptIng Cytoplast)）。
２．「ゴート(GOAT)」（Ｇ０／Ｇ１活性化及び移植(G0/G1 Activation and Transfer) −活性化時のＭＩＩ（中期ＩＩ(metaphase II)）卵母細胞（キャンベル(Campbell)ら、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、４９：９３３〜９４２（１９９３年））。
３．「ユニバーサルレシピエント(Universal Recipient) 」（キャンベル(Campbell)ら、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、６４９：９３３〜９４２（１９９３年）、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、５０：１３８５〜１３９３（１９９４年））。
【００２６】
すべてのこれらの３種のレシピエントは、再構築された胚にＧ０期のドナー核を使用すると正常な倍数性となる。しかしながら、最近の報告では、一定の割合の静止状態の細胞の核が核のエンベロープの分解を受けることなくＳ期の細胞質中に置かれるとＤＮＡ合成期に入れないことが示唆される（レノ(Leno)及びムンシ(Munshi)、ジェー  セル  バイオル(J. Cell Biol.) 、１２７（１）：５〜１４（１９９４年））。したがって、一定の割合の胚が「ユニバーサルレシピエント(Universal Recipient) 」を使用すると発達するが、高レベルのＭＰＦ（Ｍ期促進因子(M-phase promoting factor) または成熟促進因子）を含むＭＩＩ卵母細胞を方法１または２によって細胞質レシピエントとして使用することによりより高い発達頻度が得られると仮定される。
【００２７】
適当なドナー及びレシピエント細胞が同定されれば、前者の核が後者に移植されることが必要である。最も簡便には、核の移植は融合によってなされる。
【００２８】
融合を誘導するのに使用された３種の確立された方法は以下のとおりである：
（１）細胞をポリエチレングリコール等の融合促進物質と接触させる；
（２）センダイウィルス(Sendai virus)等の非活化ウィルスを使用する；および
（３）電気刺激を使用する。
【００２９】
細胞をポリエチレングリコールまたは他のグリコール類等の融合促進物質と接触させることは、体細胞の融合では一般的な方法であるが、胚と共には広く使用されていなかった。ポリエチレングリコールは毒性があるため、細胞とは最小期間接触させる必要があり、化学物質を迅速に除去可能でなければならないことにより透明帯は除去される必要がある（カンカ(Kanka) ら、モル  レプロド  デブ(Mol. Reprod. Dev.) 、２９：１１０〜１１６（１９９１年））。マウスの胚を用いた実験では、非活化センダイウィルス(Sendai virus)は分割段階の胚由来の細胞の有効な融合手段を提供し（グラハム(Graham)、ウィスター  インスト  シンプ  モノグル(Wistar Inst. Symp. Monogr.)、９：１９（１９６９年））、この際、活性化は誘導されないという実験上の利点がさらにある。有蹄動物では、融合は、単為生殖の活性化を誘導するのに使用される同様の電気刺激によって一般的に達成される（ウィラドセン(Willadsen) 、ネーチャー(Nature)、３２０（６）：６３〜６５（１９８６年）、プラザー(Prather) ら、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、３７：８５９〜８６６（１９８７年））。これらの種では、センダイウィルス(Sendai virus)は一定の割合で融合を誘導するが、定常的に使用するには十分な信頼性がない（ウィラドセン(Willadsen) 、ネーチャー(Nature)、３２０（６）：６３〜６５（１９８６年））。
【００３０】
細胞−細胞融合は核を移植するのに好ましい方法であるが、使用できる唯一の方法ではない。他の適当な技術としては、マイクロインジェクション（リッチー(Ritchie) 及びキャンベル(Campbell)、ジェー  レプロダクション  アンド  ファーティリティー  アブストラクト  シリーズ番号１５(J. Reproduction and Fertility Abstract Series No. 15)、頁６０）が挙げられる。
【００３１】
核の移植の前または（好ましくは）後（または、少なくとも場合によっては、これに付随して）、少なくとも細胞が卵母細胞である際には、通常、単為生殖の活性化によりレシピエント細胞を発達するよう刺激する必要がある。近年の実験により、単為生殖の活性化の必要条件は想像していたより複雑であったことが示された。活性化はすべてか無の現象であり、前核の形成が誘導可能な大多数の処理はすべて「活性化」を引き起こすと考えられた。しかしながら、ウサギの卵母細胞に繰り返し電気パルスをさらすことにより、適当な一連のパルスの選択及びＣａ2+の制御のみが２倍数化卵母細胞の妊娠中期までの発達を促進できることが明らかになった（オジル(Ozil)、デベロップメント(Development) 、１０９：１１７〜１２７（１９９０年））。受精中、細胞内のカルシウム濃度は繰り返し一時的に上昇する（カットバートソン(Cutbertson)及びコボルド(Cobbold) 、ネーチャー(Nature)、３１６：５４１〜５４２（１９８５年））が、電気パルスは同様にしてカルシウム濃度の上昇を引き起こすと考えられる。カルシウム一過性パターンが種によって変化するという証拠があり、最適な電気パルスパターンは同様にして変化すると考えられる。ウサギにおけるパルス間の間隔は約４分であり（オジル(Ozil)、デベロップメント(Development) 、１０９：１１７〜１２７（１９９０年））、マウスでは１０〜２０分である（カットバートソン(Cutbertson)及びコボルド(Cobbold) 、ネーチャー(Nature)、３１６：５４１〜５４２（１９８５年））が、ウシではこの間隔は約２０〜３０分であるという初期の考察がある（ロブル(Robl)ら、シンポジウム  オン  クローニング  マンマルズ  バイ  ヌクレアー  トランスプランテーション(Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation)において（セイデル(Seidel)著）、コロラド  ステート  ユニヴァシティ(Colorado State University) 、２４〜２７（１９９２年））。ほとんどの公開された実験では、活性化は単一の電気パルスで誘導されたが、新たな考察から、発達する再構築された胚の割合は複数のパルスにさらすことにより上昇することが示唆される（コラス(Collas)及びロブル(Robl)、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、４３：８７７〜８８４（１９９０年））。場合によっては、パルス数、場の強度及びパルス期間及び培地のカルシウム濃度を最適化するために、定常的に調節を行う。
【００３２】
本発明の第二のが概念によると、前記方法によって調製される再構築された動物胚が提供される。
【００３３】
本発明の第三のが概念によると、以下を含む、動物の調製方法が提供される：
（ａ）上記したようにして動物胚を再構築する；および
（ｂ）動物を胚から自然に誕生するまで発達させる(develop to term)；および
（ｃ）選択的に、このようにして形成された動物から繁殖させる。
段階（ａ）は上記で詳細に説明された。
【００３４】
本発明の上記概念の方法における、第二段階である、段階（ｂ）は、動物を胚から自然に誕生するまで発達させる(develop to term) ものである。これは、直接あるいは間接的になされてもよい。直接的な発達では、段階（ａ）による再構築された胚を、単に、発達を行わせる必要性のある範囲を越えるような干渉はさらに伴わずに発達させる。しかしながら、間接的な発達では、胚は、完全な発達が起こる前にさらに操作されてもよい。例えば、収率を上げることを目的として、胚を分割(split) させたり、細胞をクローニングにより拡張(clonally expanded) したりしてもよい。
【００３５】
またはあるいは上記に加えて、ドナーのクローニングによる拡張(clonal expansion)による本発明の手段によって生存胚の収率を上げることも可能であるおよび／または使用する際には一連の（核の）移植のプロセスからなる。現在達成される胚盤胞の形成速度の制限は、大部分の胚は「リプログラム(reprogram) 」しない（許容できる数は行うが）という事実によるものであるかもしれない。このような場合には、以下のようにして速度を上げてもよい。それ自身で発達する各胚を、例えば、桑実期または３２〜６４細胞期でなどで、核ドナーとして使用してもよい；または、内細胞塊細胞を胚盤胞段階で使用してもよい。次の移植から誘導される胚は、それ自体、さらに効率を上げる潜在的な核ドナーとして使用される。これらの胚が確かに遺伝子の発現をリプログラムした(reprogram) 胚を示しかつこれらの核が事実リプログラムされる(reprogram) （そうであると考えられる）際には、各発達胚は核移植プロセスの効率によってこのように増殖(multiply)してもよい。得られると考えられる促進の度合いは細胞型によって異なる。ヒツジでは、１６細胞胚の単一の割球を前活性化(preactivated)「ユニバーサルレシピエント(Universal Recipient) 」卵母細胞に移植することにより５５％の胚盤胞段階の胚を得ることが容易に可能である。このため、単一の細胞から発達した各胚が１６細胞段階で８になるという仮説は理にかなっている。これらの図説はおおよそのガイドではあるが、より後半の発達段階では利点の範囲はその段階でのプロセスの有効性によることは明らかである。
また、核ドナー細胞の源として作用する新たな細胞系は前記説明に従って形成される胚または得られる胎児または成体から生産されると考えられる。
【００３６】
場合によっては、再構築された胚を自然に誕生するまで発達させるのに制限が有る際には、自然に形成される胚及び核の移植によって再構築される胚由来の細胞から形成されるキメラ動物を生産することが好ましい。このようなキメラは、一定の割合の天然の胚の細胞及び一定の割合の再構築された胚の細胞を胚盤胞段階までのいずれかの段階で採取し、凝集または注入によって新たな胚を形成することによって形成できる。細胞の割合は、５０：５０の割合または自然に誕生するまで発達する胚の形成を達成するのに適当な他の割合であってもよい。このような環境下での正常な細胞の存在は、再構築された胚を救助するのをおよび良好に自然な誕生及び生きた状態まで発達させるのを補助すると考えられる。
【００３７】
収率を向上させる便利性があるのとは別に、再構築された胚は、胚盤胞まで、インビボまたはインビトロで培養されてもよい。
【００３８】
経験から、核の移植により誘導される胚は正常な胚とは異なり、場合によっては胚が（少なくともインビボで）一般的に培養される条件以外のインビボでの培養条件から利益を得るまたはこのような培養条件を必要とすることが示唆される。上記に関する理由は不明である。定常的なウシの胚の処置では、再構築された胚（一度にこれらの多く）を５〜６日間ヒツジの卵管内で培養した（ウィラドセン(Willadsen) 、イン  マンマリアン  エッグ  トランスファー(In Mammalian Egg Transfer) （アダムス  イーイー(Adams, E.E.) 著）、１８５  シーアールシー  プレス、ボカ  レイトン、フロリダ(185 CRC Press, Boca Raton, Florida)（１９８２年）に記載されるのと同様にして）。しかしながら、本発明を実施するにあたっては、胚を保護するために、移植前に寒天等の保護培地内に胚を埋め込んだ後、一時的なレシピエントから回収した後寒天から取り出すことが好ましい。保護寒天または他の培地の機能は以下の２点である：第一に、透明帯を一緒に保持することにより胚にとって構造上の助けとして作用する；および第二に、レシピエント動物の免疫システムの細胞に対してバリアーとして作用する。この方法は胚盤胞を形成する胚の割合を上げるが、多くの胚が失われてしまうという短所がある。
【００３９】
インビトロの条件を使用する際には、当該分野において定常的に使用される条件が非常に好ましい。
【００４０】
胚盤胞段階では、胚は、自然に誕生するまで発達するための適切性に関してスクリーニングされる。具体的には、胚を形質転換し、安定した組込体(integrant) に関するスクリーニング及び選択が行われた際になされるであろう。非形質転換遺伝子マーカーに関するスクリーニングもまたこの段階で行われてもよい。しかしながら、本発明の方法はより初期段階でドナーをスクリーニングすることが可能であるので、これは通常好ましい。
【００４１】
スクリーニングが行われた際には、スクリーニング後に、胚盤胞胚を自然に誕生するまで発達させる。これは、通常、インビボで行われる。胚盤胞までの発達をインビトロで行った際には、最終のレシピエント動物への移植はこの段階で行われる。胚盤胞までの発達がインビボで行われた際には、原則としては胚盤胞は胚盤胞前宿主(pre-blastocyst host)中で自然に誕生するまで発達させる(development to term) ことができるが、実際には、胚盤胞は一般的に（一時的な）胚盤胞前(pre-blastocyst)レシピエントから除去され、保護培地から取り出した後、（永久）胚盤胞後(post-blastocyst) レシピエントに移植される。
【００４２】
本発明の上記概念の最適な段階（ｃ）では、動物を前記段階によって調製された動物から繁殖させてもよい。このようにして、動物は、目的とする遺伝特性を有する動物の群れ(herd)またはフロック(flock) を確立するのに使用される。
【００４３】
遺伝的に同一の細胞の源由来の核を移植した後に生産される動物は同一の核を共有するが、これらの動物は異なる卵母細胞由来であるので厳密な意味では同一ではない。上記異なるオリジンの意味は明確ではないが、商業上の特性に影響を及ぼす。アイオワステートユニヴァシティブリーディングハード(Iowa State University Breeding Herd) における乳牛のミトコンドリアＤＮＡの近年の分析から、ミルク及び生殖行動と関連があることが明らかになった（フリーマン(Freeman) 及びバイツ(Beitz)、シンポジウム  オン  クローニング  マンマルズ  バイ  ヌクレアー  トランスプランテーション(Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation) （セイデル  ジーイー  ジュニア(Seidel, G.E. Jr.)著）、１７〜２０、コロラドステートユニヴァシティ(Colorado State University)、コロラド（１９９２年））。同様の効果がウシ集団を通して存在することが確認され、特定の状況では卵母細胞の選択を考慮することが可能であるまたは必要であるかどうかを考えられ続けている。ウシを飼育する地域では、遺伝的なメリットの高いドナーから大多数の胚を生産できることは、全国的な群れに遺伝的な改良を普及させる上でかなり有益であると考えられる。用途のスケールは各胚のコスト及び自然に誕生するまで発達することが可能な移植された胚の割合によって異なる。
【００４４】
詳細な説明および要約により、以下のスキームにより、形質転換及び非形質転換動物の具体的な調製方法を説明する。この方法は以下の７段階を含むと考えられる：
（１）核型の評価、休止状態の誘導（Ｇ０での引き留め）および／または発達の誘導を含む、適当なドナー細胞の選択および単離；
（２）遺伝的に修飾された細胞集団の生産に適する分子生物学的技術の適用。このような技術としては、遺伝子の付加、遺伝子のノックアウト(knock-out) 、遺伝子のノックイン(knock-in)、及び他の遺伝子の修飾が挙げられる。選択的に、トランスジェネシス(transgenesis)をまた、選択マーカーを使用してまたは使用せずに、適当な構築物によるトランスフェクションによって使用してもよい；
（３）選択的に、目的の遺伝子型／表現型について修飾された細胞集団またはクローン（即ち、安定した組込体）のスクリーニング及び選択；
（４）修飾された細胞集団における静止状態の誘導；
（５）核の移植による胚の再構築；
（６）胚盤胞までの、インビボまたはインビトロでの、培養；
（６ａ）選択的に、安定した組込体−（３）で行われる際には省略−または他の目的とする特性に関するスクリーニング及び選択；
（７）必要であれば、最終レシピエントへの移植。
【００４５】
本発明の第四の概念によると、上記で調製された動物を提供するものである。
【００４６】
本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて(mutatis mutandis)、他の各概念と同様である。
【００４７】
本発明を下記実施例を参照しながら説明するが、下記実施例は詳細に説明するためのものであり、本発明を制限するものではないと考えられる。
【００４８】
実施例
実施例１：ドナー細胞における静止状態の誘導
接触阻害または血清欠乏などの、培養細胞系において静止状態を誘導する様々な方法が示された（ウィットフィールド(Whitfield) ら、コントロール  オブ  アニマル  セル  プロリフェレーション(Control of Animal Cell Proliferation)、１：３３１〜３６５（１９８５年））。休止状態の誘導方法は重要であるとは考えられず、細胞が成長周期から脱し、２倍のＤＮＡ含量でＧ０状態に引き止められ、生存し続けることが重要な段階である。実施例３及び４では、ウシの初期線維芽細胞、７日目のインビボで生産された胚盤胞の内細胞塊から確立されたウシ細胞系、および胚由来のヒツジ細胞系（ＴＮＴ４）を用いて、静止状態を誘導し、細胞周期のＧ０期に細胞を引き止めた。血清欠乏を同様にして用いて、実施例５に記載されるドナー細胞の静止状態を誘導した。
【００４９】
実施例２：卵母細胞の単離及び核の移植
卵母細胞は、（ｉ）畜殺場材料のインビトロの成熟、または経膣卵胞穿刺から；（ｉｉ）インビボの成熟及び外科的な回収；または（ｉｉｉ）他の適当な方法によって得られる。すべてのインビボで成熟させた卵母細胞は、１．０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むカルシウムマグネシウム非含有リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で卵管から洗い流す(flush) することによって集められなければならない。インビトロで成熟させた卵母細胞は、収集され、１．０％ＦＣＳを含むカルシウム非含有Ｍ２（ウィッティングハム(Wittingham)及びウェールズ(Wales) 、オウスト  ジェー  バイオル  サイ(Aust. J. Biol. Sci.) 、２２：１０６５〜１０６８（１９６９年））に移される。卵母細胞は、カルシウム非含有培地をすべての工程で使用する以外は前述（キャンベル(Campbell)ら、バイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、４９：９３３〜９４２（１９９３年）およびバイオル  レプロド(Biol. Reprod.) 、５０：１３８５〜１３９３（１９９４年））したのと同様にして、卵丘細胞の表皮を剥離し(denude)、除核する。融合工程は、前述（キャンベル(Campbell)ら、１９９３年、１９９４年、上記引用）した工程を修飾したものであり、以下の関連セクションに記載されるのと同様である、または核をドナー細胞を除核卵母細胞中に注入することによって導入してもよい（リッチー(Ritchie) 及びキャンベル(Campbell)、ジェー  レプロド  ファーティル  アブストラクト  シリーズ（５）(J. Reprod. Fertil. Abstract Series(5)) 、６０（１９９５年））。これらの事項を行う時期は種によって異なり、下記２種のプロトコルによりインビボで成熟させたヒツジ及びインビトロで成熟させたウシの卵母細胞を使用した際の概要を説明する。
【００５０】
実施例３：ヒツジの核の移植
３．１  ドナーメスヒツジの過剰刺激(superstimulation)および卵母細胞の回収
スコティッシュブラックフェイス(Scottish Blackface)のメスヒツジを１４日間黄体ホルモン物質スポンジ（ベラミックス（商標）(VeramixTM) 、アップジョン(Upjohn)、英国）で同調させ、２日間続いて３．０ｍｇ／日（全量６．０ｍｇ）のヒツジの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）（オバゲン（商標）(OvagenTM)、イムノ−ケミカル  プロダクツ  リミテッド(Immuno-chemical Products Ltd)、ニュージーランド）を１回収入して過剰排卵を誘導した。ＦＳＨを２回目に注入してから２４時間後に、１回量が８ｍｇのゴナドトロピン放出ホルモン類似体（ＧｎＲＨレセプタル（商標）(GnRH ReceptalTM) 、ヘキスト(Hoechst) 、英国）を用いて排卵を誘発した。
未受精の中期ＩＩ卵母細胞を、使用するまで、３７℃に維持された１．０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコのリン酸緩衝溶液を用いてＧｎＲＨを注入してから２４〜２９時間後に卵管から洗い流す(flush) することによって回収した。
【００５１】
３．２  卵母細胞の処置
回収された卵母細胞は、３７℃に維持され、１．０％ＦＣＳ含有ＰＢＳで洗浄され、３７℃の１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むカルシウム非含有Ｍ２培地に移した。染色体を除去するために、（除核）卵母細胞を、３７℃で２０分間、１０％ＦＣＳ、７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（シグマ(Sigma)）及び５．０μｇ／ｍｌヘキスト３３３４２(Hoechst 33342)（シグマ(Sigma)）を含むカルシウム非含有Ｍ２中に置いた。次に、少量のすぐ下の第一極体由来の細胞質を２０μＭガラスピペットを用いて吸引した。細胞質の吸引部分にＵＶ光を照射し、赤道板の存在を調べることによって、除核を確認した。
【００５２】
３．３  胚の再構築
１０〜２０個の卵母細胞のグループを除核し、鉱油（シグマ(SIGMA)）下で３７℃、５％ＣＯ2 で２０μｌのカルシウム非含有Ｍ２培地滴中に置いた。以下の３プロトコル（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）をそれぞれ用いて、胚の再構築を行った。
【００５３】
（ａ）「マジック(MAGIC) 」（中期停止Ｇ１／Ｇ０許容細胞質(Metaphase Arrested G1/G0 Accepting Cytoplast)）
除核後可能な限り迅速に、ガラスピペットを用いて単細胞を卵母細胞と接触させ、予め透明帯中に作製された穴を介して細胞を移動させた。次に、細胞質体／細胞カプレット(couplet) を、融合チャンバーの蒸留水における０．３Ｍマンニトール２００μｌ中に移し、電極間に手で並べた。５ＶのＡＣパルスを３秒間印加した後、１．２５ｋＶ／ｃｍの３ＤＣパルスを８０μ秒間印加した。さらに、このカプレットを３７℃で１０％ＦＣＳ含有カルシウム非含有Ｍ２中で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2 で油下で同様の培地中でインキュベートした。活性化する３０分前に、カプレットを５μＭノコダゾール(nocodazole)を含む１０％ＦＣＳ含有カルシウム非含有Ｍ２培地に移した。活性化は、以下のようにして、ｈＣＧ注入後３２〜３４時間で誘導された。活性化後、再構築された接合体を、さらに３時間、３７℃、５％ＣＯ2 で、１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９培地(medium TC199)（ギブコ(Gibco) ）中でインキュベートした。次に、接合体をノコダゾール(nocodazole)を含まない以外は同様の培地で３７℃で５分間、３回、洗浄し、一時的なレシピエントメスヒツジに移す前に、さらに１２〜１５時間培養した。
【００５４】
（ｂ）「ゴート(GOAT)」（Ｇ０／Ｇ１活性化及び移植(G0/G1 Activation and Transfer) ）
ｈＣＧを注入してから３２〜３４時間後に、単細胞を除核卵母細胞と接触させた。カプレットを、融合チャンバー（下記参照）の０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ  ＭｇＳＯ4 、０．００１ｍＭ  ＣａＣｌ2 が溶解される蒸留水２００μｌ中に移した。融合及び活性化を、３ＶのＡＣパルスを５秒間、さらに１．２５ｋＶ／ｃｍの３ＤＣパルスを８０μ秒間印加することによって誘導した。次に、カプレットを、７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含む１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2 で、１時間上記培地中でインキュベートした。さらに、カプレットを１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2 で、さらに１２〜１５時間１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中で培養した。
【００５５】
（ｃ）「ユニバーサルレシピエント(Universal Recipient) 」
除核卵母細胞をｈＣＧ注入してから３２〜３４時間後に活性化（下記と同様）し、さらに３７℃、５％ＣＯ2 で、４〜６時間１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中で培養した。次に、単細胞を卵母細胞と接触させて、融合を下記したのと同様にして誘導した。さらに、カプレットを３７℃、５％ＣＯ2 で、１時間、１０％ＦＣＳ及び７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを含むＴＣ１９９中でインキュベートした。続いて、カプレットを洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2 で、さらに８〜１１時間１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中で培養した。
【００５６】
３．４  融合および活性化
活性化を目的として、卵母細胞を、０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ  ＭｇＳＯ4 、０．００１ｍＭ  ＣａＣｌ2 が溶解される蒸留水２００μｌにおいて、２個の平行電極間に置いた（ウィラドセン(Willadsen) 、ネーチャー(Nature)、３２０（６）：６３〜６５（１９８６年））。活性化を、１．２５ｋＶ／ｃｍの１ＤＣパルスを８０μ秒間印加することによって誘導した。融合を目的としては、操作された胚を、除核された卵母細胞と細胞との接触面を電極に対して平行に並べることを付加する以外は同様にして、処理した。融合は、３ＶのＡＣ電流を５秒間、さらに１．２５ｋＶ／ｃｍの３ＤＣパルスを８０μ秒間印加することによって誘導された。
【００５７】
３．５  胚の培養および評価（すべてのグループ）
培養終了後、融合カプレットを、ＰＢＳにおける１％及び１．２％寒天（ディフコ(DIFCO) ）中に二重包埋し、非同調メスヒツジの結紮された卵管に移した。カプレットは、レシピエントメスヒツジによる胚の免疫拒絶反応を防止するまたは抑制するためにおよびカプレットを一緒に保持するのを補助するために寒天中に包埋した。６日後、レシピエントメスヒツジを殺し、胚を１０％ＦＣＳ含有ＰＢＳを用いて卵管から洗い流すことによって回収した。胚を２本の針を用いて寒天チップから取り出し、発達を顕微鏡で評価した。桑実胚／胚盤胞段階まで発達したすべての胚を、即座に、同調した最終のレシピエントメスヒツジの子宮角に移した。
インビトロ技術を、胚盤胞段階まで胚を発達させるために、一時的なレシピエントメスヒツジの代わりに使用してもよい。
【００５８】
実施例４：ウシの核の移植
４．１  インビトロの卵母細胞の成熟
卵巣を地方の畜殺場から得て、実験室まで移動する間２８〜３２℃に維持した。卵丘細胞卵母細胞複合体(cumulus oocyte complex)（ＣＯＣ’ｓ）を、皮下針（１．２ｍｍ内径）を用いて直径３〜１０ｍｍの卵胞から吸引し、滅菌プラスチック製万能容器(universal container) に置いた。この万能容器を加温チャンバー（３５℃）中に置き、卵胞材料を１０〜１５分間静置した後、上清の３／４を注ぎ出した。残りの卵胞材料を１０％ウシ血清を補足した等容の解離用培地(dissection medium) （イーグル塩(Eagles salts)（ギブコ(Gibco) ）、７５．０ｍｇ／ｌ  カナマイシン、３０．０ｍＭ  ヘペス(Hepes) を含むＴＣＭ１９９、ｐＨ７．４、浸透圧  ２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ  Ｈ2 Ｏ）で希釈し、８５ｍｍペトリ皿に移し、解剖顕微鏡でＣＯＣ’ｓを調べた。卵丘細胞の少なくとも２〜３ｍｍの緻密層を有する複合体を選択し、解離用培地で３回洗浄し、１０％ウシ血清及び１×１０6 顆粒膜細胞／ｍｌを補足した成熟用培地（イーグル塩(Eagles salts)（ギブコ(Gibco) ）、７５ｍｇ／ｌ  カナマイシン、３０ｍＭ  ヘペス(Hepes) 、７．６９ｍＭ  ＮａＨＣＯ3 を含むＴＣ培地１９９、ｐＨ７．８、浸透圧  ２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ  Ｈ2 Ｏ）に移し、必要になるまで、空気における５％ＣＯ2 雰囲気中で３９℃でロッキングテーブル(rocking table) 上で培養した。
【００５９】
４．２  卵母細胞の処置
成熟した卵母細胞は、成熟を始めてから１８時間後に卵丘細胞の表皮を剥離した。次に、表皮を剥離(denude)された卵母細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むカルシウム非含有Ｍ２培地中で洗浄し、３７℃で上記培地中で維持した。染色体を除去するために、（除核）卵母細胞を、３７℃で２０分間、１０％ＦＣＳ、７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（シグマ(Sigma)）及び５．０μｇ／ｍｌヘキスト３３３４２(Hoechst 33342)（シグマ(Sigma)）を含むカルシウム非含有Ｍ２中に置いた。次に、少量のすぐ下の第一極体由来の細胞質を２０μＭガラスピペットを用いて吸引した。細胞質の吸引部分にＵＶ光を照射し、赤道板の存在を調べることによって、除核を確認した。
【００６０】
４．３  胚の再構築
さらに、除核された卵母細胞を以下に詳細に説明した３再構築方法（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のそれぞれで使用した。
（ａ）「マジック(MAGIC) 」（中期停止Ｇ１／Ｇ０許容細胞質(Metaphase Arrested G1/G0 AcceptIng Cytoplast)）
【００６１】
除核された卵母細胞を、除核後可能な限り迅速に、３９℃で１０％ＦＣＳ含有カルシウム非含有Ｍ２中に維持し、ガラスピペットを用いて単細胞を卵母細胞と接触させ、予め透明帯中に作製された穴を介して細胞を移動させた。次に、細胞質体／細胞カプレットを、融合チャンバーの蒸留水における０．３Ｍマンニトール２００μｌ中に移した。カプレットを電極間に手で並べた。３ＶのＡＣパルスを５秒間印加した後、１．２５ｋＶ／ｃｍの３ＤＣパルスを８０μ秒間印加した。さらに、このカプレットを３７℃で１０％ＦＣＳ含有カルシウム非含有Ｍ２で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2 で、油下で同様の培地中でインキュベートした。活性化する３０分前に、カプレットを５μＭノコダゾール(nocodazole)を含む１０％ＦＣＳ含有カルシウム非含有Ｍ２培地に移した。活性化を、以下のようにして、誘導し、活性化後、再構築された接合体を、さらに３時間、３７℃、５％ＣＯ2 で、１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９培地中でインキュベートした。次に、接合体をノコダゾールを含まない以外は同様の培地で３７℃で５分間、３回、洗浄し、一時的なレシピエントメスヒツジ（メスヒツジは再構築された胚の一時的なレシピエントとしてより低価格の代替品である）に移す前に、さらに１２〜１５時間培養した。
【００６２】
（ｂ）「ゴート(GOAT)」（Ｇ０／Ｇ１活性化及び移植(G0/G1 Activation and Transfer) ）
除核された卵母細胞を成熟用培地に戻した。成熟を始めてから３０または４２時間後に、単細胞を除核された卵母細胞と接触させた。カプレットを、融合チャンバー（下記参照）の０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ  ＭｇＳＯ4 、０．００１ｍＭ  ＣａＣｌ2 が溶解される蒸留水２００μｌ中に移した。融合及び活性化を、３ＶのＡＣパルスを５秒間、さらに１．２５ｋＶ／ｃｍの３ＤＣパルスを８０μ秒間印加することによって誘導した。次に、カプレットを、１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ2 で、１５〜２０時間（３０ｈｍｐ群）または４〜８時間（４２ｈｍｐ群）、インキュベートした［「ｈｐｍ」という略称は、「成熟後時間(hours post-maturation) 」に関する標準である］。
【００６３】
（ｃ）「ユニバーサルレシピエント(Universal Recipient) 」
除核された卵母細胞を成熟を始めてから３０または４２時間後に活性化し（下記のとおり）、３７℃、５％ＣＯ2 で、８〜１０時間（３０ｈｍｐ群）または４〜６時間（４２ｈｍｐ群）、１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中でインキュベートした。次に、単細胞を卵母細胞と接触させ、融合を下記に記載されるようにして誘導した。さらに、カプレットを、３７℃、５％ＣＯ2 で、さらに１２〜１６時間（３０ｈｍｐ群）または４〜６時間（４２ｈｍｐ群）、１０％ＦＣＳ含有ＴＣ１９９中で培養した。
【００６４】
４．４  融合および活性化
活性化を目的として、卵母細胞を、０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ  ＭｇＳＯ4 、０．００１ｍＭ  ＣａＣｌ2 が溶解される蒸留水２００μｌにおいて、２個の平行電極間に置いた（ウィラドセン(Willadsen) 、ネーチャー(Nature)、３２０（６）：６３〜６５（１９８６年））。活性化を、１．２５ｋＶ／ｃｍの１ＤＣパルスを８０μ秒間印加することによって誘導した。融合を目的としては、操作された胚を、除核された卵母細胞と細胞との接触面を電極に対して平行に並べることを付加する以外は同様にして、処理した。融合は、３ＶのＡＣ電流を５秒間、さらに１．２５ｋＶ／ｃｍの３ＤＣパルスを８０μ秒間印加することによって誘導された。
【００６５】
４．５  胚の培養および評価（すべてのグループ）
培養終了後、融合カプレットを、ＰＢＳにおける１％及び１．２％寒天（ディフコ(DIFCO) ）中に二重包埋し、非同調メスヒツジの結紮された卵管に移した（メスヒツジは再構築された胚の一時的なレシピエントとしてより低価格の代替品である）。カプレットは、レシピエントメスヒツジによる胚の免疫拒絶反応を防止するまたは抑制するためにおよびカプレットを一緒に保持するのを補助するために寒天中に包埋した。６日後、レシピエントメスヒツジを殺し、胚を１０％ＦＣＳ含有ＰＢＳを用いて卵管から洗い流すことによって回収した。胚を２本の針を用いて寒天チップから取り出し、発達を顕微鏡で評価した。
インビトロ技術を、胚盤胞段階まで胚を発達させるために、一時的なレシピエントメスヒツジの代わりに使用してもよい。
【００６６】
実施例３（ヒツジ細胞）および実施例４（ウシ細胞）の結果
本発明の技術は、ヒツジ及びウシ双方の胚の再構築に適用された。現時点では、胚盤胞段階の胚がウシで得られた；しかしながら、これらの胚を最終的なレシピエントに移植させることはなされていなかった。ヒツジでは、７匹のレシピエントメスヒツジが妊娠して、５匹の生きた子羊を出産した（うち２匹は出産後まもなく死亡した）。上記実験の結果を表１〜３に要約する。
【００６７】
表１は、静止ＴＮＴ４細胞集団及び３種の異なる細胞質体レシピエントを用いて再構築されたヒツジ胚の胚盤胞段階までの発達の結果を示すものである。再構築された胚は、再構築してから７日目まで、一時的なレシピエントメスヒツジの結紮された卵管中で培養された。結果は、回収された全胚数に対する桑実胚／胚盤胞段階の胚の割合（％）として表される。
【００６８】
【表１】
2006217913.tif 000002
【００６９】
表２は、同調された最終のレシピエントブラックフェイス(blackface)メスヒツジの子宮角へのすべての桑実胚／胚盤胞段階の再構築された胚の移植後の妊娠の誘導の結果を示すものである。この表は、移植された各群の全胚数ならびにメスヒツジ及び胚に関する妊娠頻度を示すものである（多くの場合、２個の胚を各メスヒツジに移植した）。「マジック(MAGIC) 」細胞質体を用いた際に、１回双子の妊娠があった。
【００７０】
【表２】
2006217913.tif 000003
【００７１】
表３は、最終のレシピエントメスヒツジに桑実胚／胚盤胞段階の胚を移植した後に確立された妊娠の結果を示すものである。
【００７２】
【表３】
2006217913.tif 000004
【００７３】
実施例５：ＯＭＥ、ＢＬＷＦ１及びＳＥＣ１細胞を用いたヒツジ核移植および胚の再構築
核の移植を、ＯＭＥ、ＢＬＷＦ１及びＳＥＣ１と称する、３種の新たな細胞型を用いて行った。ＯＭＥ（ヒツジの乳腺上皮）細胞は、フィンチ(Finch) らの方法（バイオケム  ソク  トランス(Biochem. Soc. Trans.)、２４：３６９Ｓ（１９９６年））に従って、６年齢のフィン−ドーセット(Fin-DOrset)の成体メスヒツジの乳腺から取られた生検材料から確立された上皮細胞系である。ＢＬＷＦ１（ブラックウェルシュ(Black Welsh) 線維芽）細胞は、ブラックウェルシュ(Black Welsh) のメスヒツジとブラックウェルシュ(Black Welsh) のオスヒツジとを自然に交配させて得られた２６日齢のブラックウェルシュ(Black Welsh) の胎児を取り出して培養することによって得られた線維芽細胞系である。初期胎児線維芽細胞の単離方法は、ロバートソン  イージェー(Robertoson, E.J.)、テラトカルシノマズ  アンド  エンブリオニック  ステム  セルズ：ア  プラクティカル  アプローチ(Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach) 、７１〜１１２、アイアールエル  プレス  オックスフォード(IRL Press Oxford)（１９８７年）に従う。ＳＥＣ１（ヒツジ胚細胞）は、過剰排卵させたポル−ドーセット(Pol-Dorset)のメスヒツジをポル−ドーセット(Pol-Dorset)のオスヒツジと交配させることから得られた９日齢の胚由来の上皮様細胞系である。ＳＥＣ１細胞は、以下の理由により、ＷＯ  ９６／０７７３２号として公開された継続ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２０９５号に記載されるＴＮＴ細胞とは異なるものである。第一に、上記２種の細胞系の細胞の形態が完全に異なる。第二に、細胞系を単離するために使用された方法が異なる。ＳＥＣ１細胞系は単一の胚から確立されたが、ＴＮＴ細胞系は細胞群由来である。
【００７４】
すべての細胞系は核型化(karyotype) され、５４（２ｎ）の形式染色体数(modal chromosome number) を示した。胚の再構築用の核ドナーとして使用する前に、血清レベルを０．５％に減少させた後の静止状態の誘導を、従来記載（キャンベル(Campbell)ら、ネーチャー(Nature)、３８０：６４〜６６（１９９６年））されたのと同様にしてモニターした。再構築された胚の調製は、上記実施例に記載されたのと同様であった。
【００７５】
表４は、異なる細胞型から再構築された核移植胚の発達の要約を示すものである。この表は、３種の細胞型のそれぞれに関する再構築された胚の数、胚盤胞段階までの発達および妊娠の数を示す。すべての細胞系は、胚の再構築に使用される前に核型化(karyotype) された。これらの細胞系は、５４の染色体の形式上の数(modal number)を有していた。１〜３個の胚盤胞段階の胚を各同調された最終のレシピエントメスヒツジに移植した。インビトロで培養された再構築された胚を、１０％ヒト血清を含むＳＯＦＭ（合成卵管液培地(synthetic oviduct fluid medium)）を１０μｌ（４胚）中に置き、３９℃で、５％Ｏ2 、５％ＣＯ2 及び９０％Ｎ2 の湿潤雰囲気中で培養した。培養胚を２日毎に新たな培地に移した。ＳＯＦＭ培地は、ガードナー(Gardner) ら、バイオロジー  オブ  レプロダクション(Biology of Reproduction) 、５０：３９０〜４００（１９９４年）およびトンプソン(Thompson)ら、バイオロジー  オブ  レプロダクション(Biology of Reproduction) 、５３：１３８５〜１３９１（１９９５年）に従って調製された。
【００７６】
表５は、１９９６年６月２４日に妊娠し続けていたレシピエントメスヒツジの同定、胚の再構築に使用された細胞型および予想される子羊が生まれる日を示す。妊娠は、１〜３個の桑実胚／胚盤胞段階の胚（再構築後７日目）を同調された最終のレシピエントメスヒツジに移植することによって確立した。再構築された数は、表４に詳細に示される。略称は下記のとおりである：ＰＤ＝ポル−ドーセット(Pol-Dorset)、ＢＷ＝ブラックウェルシュ(Black Welsh) 、ＦＤ＝フィン−ドーセット(Fin-DOrset)、＊＝胚盤胞段階までインビトロで培養された胚。
【００７７】
【表４】
2006217913.tif 000005
【００７８】
【表５】
2006217913.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月27日(2005.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）静止状態の分化した哺乳動物細胞の核を、除核された哺乳動物卵母細胞に導入して、胚を再構築する工程；
（ｉｉ）該再構築胚を培養する工程；ならびに
（ｉｉｉ）該培養された再構築胚から得られた内細胞塊細胞を単離および培養して、培養された内細胞塊細胞を得る工程
を含む、核移植による培養された哺乳動物内細胞塊細胞の産生方法。
【請求項２】
前記分化した哺乳動物細胞が線維芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記活性化された再構築胚を培養して、胚盤胞を形成する工程、および該胚盤胞から得られた内細胞塊細胞を培養して、培養された内細胞塊細胞系を産生する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記核が遺伝的に修飾される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝的に修飾された核のゲノムが、挿入、欠失または修飾を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝的に修飾された核が、外因性ＤＮＡを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記分化した哺乳動物細胞が、工程（ｉ）の前にインビトロで拡張される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記培養された哺乳動物内細胞塊細胞から細胞系を作製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物が有胎盤類である、請求項１記載の方法。