(57)【要約】【課題】二重構造をとりにくく、目的以外のターゲットとハイブリダイゼーションしにくい配列を持ったコントロールプローブの配列とその設計方法を提供すること、更には、かかる設計方法により設計されたコントロールプローブを用いたプローブ担体を提供すること。【解決手段】所定の塩基配列データベースにおいて頻度の少ない配列を基礎に回文構造の配列を選択してコントロールプローブの配列として用いる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
回文構造をとる塩基配列を有することを特徴とするコントロールプローブ。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列からなる請求項１に記載のコントロールプローブ。
【請求項３】
コントロールプローブに用いる配列の設計方法において、
データベース化された遺伝子の有する配列について、３以上の塩基長の塩基配列のそれぞれの平均頻度数（N）を求める工程と、
前記平均頻度数（Na）が最低である塩基長（Na≠０）を求める工程と、
前記平均頻度数（Na）が最低である塩基長の各配列中から頻度が最低である最低頻度配列を選択する工程と、
最低頻度配列の配列を含む回文構造をとる配列をコントロールプローブ用として選択し、コントロールプローブの配列を決定する工程と、
を有することを特徴とするコントロールプローブ配列の設計方法。
【請求項４】
前記データベースがNCBI UniGeneのゲノム配列データベースである請求項３に記載の設計方法。
【請求項５】
前記平均頻度数が最低である塩基長が９である請求項４に記載の設計方法。
【請求項６】
前記最低頻度配列が、CGTACGATCである請求項５に記載の設計方法。
【請求項７】
前記平均出現度数を算出するに当たりATCGの組み合わせで成り立っているゲノム配列においてATCGのそれぞれを四つの異なる数字に置き換え所定の配列長の配列をこれらの数字の配列で表現し、その数字の配列を集計し、平均頻度数を算出する請求項３〜６のいずれかに記載の設計方法。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれかに記載の設計方法で設計された配列からなるコントロールプローブと、検出用試料に含まれる標的配列を検出するためのプローブと、を固相担体に固定したことを特徴とするプローブ担体。
【請求項９】
標的核酸と、該標的核酸を補足するためのプローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応を用いた標的核酸の検出方法であって、回文構造をとる塩基配列を有するコントロールプローブと、該コントロールプローブに相補的な配列を有する人工核酸と、のハイブリダイゼーション反応を指標として、前記標的核酸と、前記プローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項１０】
前記コントロールプローブと、該コントロールプローブに相補的な配列を有する人工核酸と、前記標的核酸と、前記プローブ核酸と、が共存した状態でハイブリダイゼーション反応条件に供されることを特徴とする請求項１０に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はDNAマイクロアレイ等の固相担体に複数の異なるプローブを各プローブ毎に配列したプローブアレイのダイナミックレンジを測定するためのコントロールプローブに最適な配列を設計する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の検出において、誤った結果の影響を最小化するためにコントロール核酸（コントロールプローブ）がしばしば用いられている（特許文献１参照）。一般に、細菌検出用のDNAマイクロアレイに用いられるコントロールプローブは自然界に存在する細菌由来の配列を参考として設計されたものであった。DNAマイクロアレイ等に用いるコントロールプローブはそのアレイのダイナミックレンジを確認するため等に用いられている。例えば、コントロールプローブの相補的配列一本鎖DNAがターゲットを含む試料中に混入していれば、試料とアレイとのハイブリダイゼーション反応を行なわせることで、この相補的配列一本鎖DNAがアレイに固定したコントロールプローブによって検出され、そのアレイのダイナミックレンジを確認することができる。
【特許文献１】特開２００２−３３５９８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
コントロールプローブに用いる一本鎖DNAが自分自身の配列の中で相補的になる配列を持つ場合、自らの水素結合により高次構造、いわゆる二次構造を成してしまう場合がある。コントロールプローブが二次構造をとった場合、コントロールプローブが、そのターゲット一本鎖DNAとハイブリダイゼーションしにくくなり、コントロールプローブとしての機能を十分発揮できなくなる。また、自然界に存在する配列をもとに自然界になるべく存在しない配列を持つようなコントロールプローブを設計しておかないと目的としないターゲットと結合してしまう不具合を生じる。よって正しくコントロールプローブの機能を発揮するため二次構造をとりにくく、目的以外のターゲットとハイブリダイゼーションをしにくい自然界において特異な配列を持つことがコントロールプローブに求められる配列である。自然界に存在する配列をもとに設計する理由は人工的に作った配列より自然界に存在する配列のほうが配列として安定していると考えられるからである。
【０００４】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、二重構造をとりにくく、目的以外のターゲットとハイブリダイゼーションしにくい配列を持ったコントロールプローブの配列とその設計方法を提供すること、更にはかかる設計方法により設計されたコントロールプローブを用いたプローブ担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明にかかるコントロールプローブは、回文構造をとる塩基配列を有することを特徴とする。
【０００６】
更に、本発明にかかるコントロールプローブ配列の設計方法は、
データベース化された遺伝子の有する配列について、３以上の塩基長の塩基配列のそれぞれの平均頻度数（N）を求める工程と、
前記平均頻度数（Na）が最低である塩基長（Na≠０）を求める工程と、
前記平均頻度数（Na）が最低である塩基長の各配列中から頻度が最低である最低頻度配列を選択する工程と、
最低頻度配列の配列を含む回文構造をとる配列をコントロールプローブ用として選択し、コントロールプローブの配列を決定する工程と、
を有することを特徴とする。
【０００７】
また、本発明のプローブ担体は、上記の設計方法で設計された配列からなるコントロールプローブと、検出用試料に含まれる標的配列を検出するためのプローブと、を固相担体に固定したことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により二次構造をとりにくく、目的以外のターゲットと結合することのない配列を持ち、プローブ担体のダイナミックレンジの確認に好適なコントロールプローブが設計できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のコントロールプローブは、コントロールブローブとして機能するための塩基配列を含む回文構造をとる塩基配列を有する。この回文構造をとる塩基配列の具体例としては、配列番号：１の配列を挙げることができる。この配列番号：１の配列に含まれるCGTACGATCはコントロールプローブとして機能するための配列であり、５’側から１３番目のGを挟んで５’側にcgtacgatcgatの配列が３’側にtagctagcatgcの配列が配置されており、３’側の配列を３’末端から５’方向に並び替えると、５’側の配列となる回文構造によって構成されている。この回文構造により先に述べたコントロールプローブ自体が二次構造を形成しにくくなる。
【００１０】
本発明にかかるコントロールプローブの設計は次の工程（Ａ）〜（Ｄ）に従って行なうことができる。
（Ａ）データベース化された遺伝子の有する配列について、３以上の塩基長の塩基配列のそれぞれの平均頻度数（N）を求める工程。
（Ｂ）前記平均頻度数（Na）が最低である塩基長（Na≠０）を求める工程。
（Ｃ）前記平均頻度数（Na）が最低である塩基長の各配列中から頻度が最低である最低頻度配列を選択する工程。
（Ｄ）最低頻度配列の配列を含む回文構造をとる配列をコントロールプローブ用として選択し、コントロールプローブの配列を決定する工程。
【００１１】
ゲノム塩基配列のデータベースとしては、例えば、NCBI UniGene、などを挙げることができる。データベース化された遺伝子の配列を用いれば、配列の頻度数の集計にコンピュータ処理が利用できるので都合が良い。
【００１２】
まず、集計対象としての遺伝子配列中にある３〜１２の塩基長の配列の平均頻度数を算出する。例えば、ＤＮＡ中の３塩基長の場合の平均頻度数は、５’−ＸＹＺ−３’（Ｘ、Ｙ及びＺは個にＡＴＣＧから選択される）の３塩基長配列の各々について、頻度数を求め、各配列の頻度を、組み合わせとして存在している全配列数（４3個）で割ることで求めることができる。なお、所定の塩基長の各配列の頻度の集計には後述する実施例において記載した方法が有効である。
【００１３】
更に、４以上の各塩基長について同様の操作を行い平均頻度数を求め、得られた平均頻度数の最低の塩基長を特定する。この最低平均頻度数（≠０）の塩基長（Ｌ）は、それよりも１塩基多い塩基長（Ｌ＋１）になると平均頻度数＝０となる塩基長である。このようにして求めた最低平均塩基長の各配列の中からさらき最低頻度（≠０）の配列を特定し、その配列が含まれる回文構造を構成してコントロールプローブとする。
【００１４】
このようにして得られたコントロールプローブは、一番接触長の長くなる配列が中央から二つに折れた場合に水素結合して二次構造をとらないようにするため、回文構造を持つように設計されたものである。これに対して、自分自身の配列の中に相補的になる配列を含む図１のような一本鎖DNAは図２のように二つに折れ二次構造をとりその結合力も強い。それに対して図３のように回文構造を持つ一本鎖DNAはたとえに二つに折れて図４のようになっても相対する塩基が自分と同じ塩基となるため水素結合することはない。一般にその接触長が長くなるほど結合力が強くなる水素結合に置いて、一本鎖DNAが最大接触長となる真中から折れた場合において、回文構造を持つ一本鎖DNAは二重構造をとることを防止するのには有効な手段である。
【００１５】
なお、後述の実施例に示すとおり、NCBI UniGeneのデータベース中にある全ての遺伝子の塩基配列について上記の操作を行なったところ、最低平均頻度数を示す塩基長は９となり、更に、塩基長９の各配列の中で最低頻度の配列CGTACGATCが得られた。この配列を用いて回文構造を構成したのが配列番号：１の配列である。この配列番号：１の配列は、コントロールプローブが目的としないターゲットとのハイブリダイゼーションを防止するのに有効である。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を、実施例に基づき説明する。
（出現頻度数の集計及び分析）
図５に出現度数を求める集計方法のフローチャートを示す。ここで、一例としてATCGATCGという配列における長さ４の配列の出現する方法を例に説明する。最初に長さ４のゲノム配列（ＸＹＺＷ：Ｘ〜Ｗの各々は個々に独立してＡＴＣＧのいずれかをとる）が取りうる全ての組み合わせを数字に置き換えてあらわす（0,0,0,0）〜（3,3,3,3）の配列式をゼロクリアする（この例では、ＡＴＣＧの各々について０〜３から選択した異なる数字を振ことにする）。次に、出現度数を集計する対象となるゲノム配列ATCGATCGについて、各塩基に０〜４から選択した特定の数字を振り、四つの数字に置き換え、数列01230123として表現する。次に置き換えた数列の先頭から四つの数字を取り出しその配列式（0,1,2,3）に1をプラスする。これは（0,1,2,3）つまり（A,T,C,G）のゲノム配列が一回出現したことを表している。次に数列の頭からひとつ右にずらして四つの数字を取り出し、取り出した数字からなる配列式（1,2,3,0）に1をプラスする。これを、数列の末尾まで五回繰り返しカウントをすればATCGATCGのゲノム配列の中における長さ４の各ゲノム配列についてその５桁目に記載した頻度数を表す数字を集計すれば、その数字の配列（すなわち特定の４塩基配列）の頻度が集計でき、各々の出現度数を求めることができる。例えば、上記の例では、最後の４つの配列は（0,1,2,3,2）となり、0123＝ATCGの頻度数が２であることが分かり、各配列について最後に配列式化したデータを認識してその５桁目の数字を頻度数として登録すればよい。
【００１７】
このような手法に基づいて、NCBI UniGeneの配列データベースに登録されている全てのゲノム配列において配列長３から１２までの長さを持つ、取りうる全ての組み合わせのゲノム配列について出現度数を集計した。表１に2003年7月時点におけるNCBI UNIGENE配列DBに登録されている全てのゲノム配列において配列長３から１２までの配列長ごとの平均出現度数と出現度数０の配列数の集計結果を示し、図６に配列長ごとの平均出現度数の分布を示す。表１より配列長が１０になると出現度数０となる配列が存在することがわかる。また、平均出現度数と配列長の関係を示す図６より配列長と出現度数の間に強い相関関係があることがわかる。このことにより長さ９の配列の中から出現度数の低い配列を目的とする配列の回文を構成する元の配列要素としてコントロールプローブを設計することとする。2003年7月時点におけるNCBI UNIGENE配列DBに登録されている全てのゲノム配列において配列長９における取りうる４の９乗個の配列の中で出現度数の一番低かった配列はCGTACGATCであった。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
この配列をもとに必要とされる要求機能のひとつであるTmにあわせた長さを持つコントロールプローブを回文構造を有する形で設計する。今回はTmの要求値を５０℃とし、回文を有する形でコントロールプローブを設計し、次に最近接塩基対法によりTmを計算し要求値である５０℃を満足しているか確認する。このサイクルを繰り返し、Tmを満足しかつ回文構造を有するコントロールプローブを得る。このようにして得られたコントロールプローブがCGTACGATCGATGTAGCTAGCATGC（配列番号：１）である。すなわち、Tm値に基づいて塩基長を９と設定し、両サイドの配列に先の頻度の低いCGTACGATCを用い、更に、中央の配列としてこの配列の後半にあるGATに基づく回文配列を用いて配列番号：１の配列を決定した。図７に要求されるTmを満足するコントロールプローブ配列を設計するための好ましいフローチャートの一例を示す。
【００２０】
（コントロールプローブの設計例および実験例）
次に、図８を用いて、上記実施形態のコントロールプローブ設計方法を用いて設計されたコントロールプローブを用いたDNAマイクロアレイの実験手順について説明する。 ９０１の「サンプル」とは対象としている核酸が含まれているはずの液体や個体である。例えば感染症起炎菌の特定をする場合、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿および糞便のような排出物等、最近が存在すると思われるあらゆるものがサンプルとなる。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体がサンプルとして用いられることもある。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象となる。
【００２１】
次に、「生化学的増幅」方法を用いてサンプル９０１を増幅する（９０２）。例えば感染症起炎菌の特定をする場合、16S rRNA検出用に設計されたPCR反応用プライマを用いてPCR法によって対象核酸を増幅したり、あるいはPCR増幅物を元にさらにPCR反応等を行なって調整したりする。また、PCR以外のLAMP法などの増幅方法により調整してもよい。
【００２２】
その後で、生化学的増幅９０２により増幅されたサンプル、またはサンプル９０１そのものに、可視化のために各種標識方法により標識する（ラベル混入９０３）。この標識物質としては、通常Cy3、Cy5、Rodaminなどの蛍光物質が用いられる。また、生化学的増幅９０２において標識分子を混入することもある。
【００２３】
こうして標識分子が付加された核酸は、DNAマイクロアレイ９０４とハイブリダイゼーション反応（９０５）を行なう。この様子は図９に示したとおりである。例えば感染症起炎菌を特定する場合、DNAマイクロアレイ９０４は菌に特異的なプローブを基板に固定したものとなる。ここで、各菌に対応したプローブの設計方法は、例えば16S rRNAをコーディングしているゲノム部分より、上記で説明した方法で行なう。なお、DNAマイクロアレイ９０４上のプローブを固定する担体(基板)は、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハ等の平面基板が考えられる。また、凹凸のある三次元構造体、ビーズのようなもの、棒状、紐状、糸状のもの等を用いても、本発明の実施形態、効果には影響ない。
【００２４】
通常、基板の表面はプローブDNAの固定化が可能なように処理したものが使用される。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入した物は、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合しているために、再現性の点で好ましい形態である。本実施形態で用いられる固定化方法は、例えば、マレイミド基とチオール(-SH)基との組み合わせを用いる例が挙げられる。すなわち核酸プローブの末端にチオール(-SH)基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基が反応して核酸プローブを固定化する。マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とEMCS試薬(N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide :Dojin社製)との反応によりマレイミド基を導入する。DNAへのチオール(-SH)基の導入は、DNA自動合成機でDNAを合成する際に5'-Thiol-ModifierC6(Glen Research社製)を用いることにより行なうことができる。固定化に利用する官能基の組み合わせ以外にも、例えばエポキシ基(固相上)とアミノ基(核酸プローブ末端)の組み合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も可能である。
【００２５】
ハイブリダイゼーション反応９０５を行なった後、DNAマイクロアレイ９０４の表面を洗浄し、プローブと結合していない核酸を剥がした後で、(通常は)乾燥し、９０５の蛍光量を測定する。ここでは、DNAマイクロアレイ９０４の基板に励起光を照射し、蛍光強度を測定した画像を得る（９０６、９０７）。
【００２６】
以下、図８を用いて説明した実験の流れを感染症の原因菌特定の目的を想定した具体的実験操作として説明する。なお、本発明にかかわる生物種判定方法は、以下に述べる感染症の原因菌特定に限ったものではなく、MHCなどの人間の体質判定や、癌などの疾病に関わるDNA、RNAの解析に用いてもよい。
【００２７】
（1．プローブDNAの準備）
コントロールプローブとして配列番号１、大腸菌検出用プローブとして以下に示す配列番号２〜８に示す核酸配列を設計した。
CTCTTGCCAT CGGATGTGCC CA（配列番号２）
ATACCTTTGC TCATTGACGT TACCCG（配列番号３）
TTTGCTCATT GACGTTACCC GCAG（配列番号４）
ACTGGCAAGC TTGAGTCTCG TAGA（配列番号５）
ATACAAAGAG AAGCGACCTC GCG（配列番号６）
CGGACCTCAT AAAGTGCGTC GTAGT（配列番号７）
GCGGGGAGGA AGGGAGTAAA GTTAAT（配列番号８）
大腸菌検出用プローブについては、16S rRNAをコーディングしているゲノム部分より設計した。 配列番号１〜８に示したプローブは、DNAマイクロアレイに固定するための官能基として合成後、定法に従って核酸の5'末端側にチオール(-SH)基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥したプローブは、-30度の冷凍庫に保存した。
【００２８】
（2．検体増幅用PCR Primerの準備）
起炎菌検出用のための16S rRNA核酸(標的核酸)増幅用PCR Primerとして表２に示す核酸配列を設計した。 具体的には、16S rRNAをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約1500塩基長の16S rRNAコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する16S rRNAコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマを設計した。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
表中に示したプライマは、合成後、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)により精製し、Forward Primerを3種、Reverse Primerを3種混合し、それぞれのPrimer濃度が、最終濃度10 pmol/μlとなるようにTE緩衝液に溶解した。
【００３１】
（3. 大腸菌 Genome DNA(モデル検体)の抽出）
（3-1. 微生物の培養 ＆ Genome DNA 抽出の前処理）
まず、大腸菌標準株を、定法に従って培養した。この微生物培養液を1.5ml容量のマイクロチューブに1.0ml(OD600)採取し、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、5min、4℃)。上精を捨てた後、Enzyme Buffer(500mM Tris-HCl: p.H. 8.0、25mM EDTA)300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収した(8500rpm、5min、4℃)。上精を捨てた後、回収された菌体に、以下の表３に示す酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベータ内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行なった。
【００３４】
（3-2. Genome抽出）
以下に示す微生物のGenome DNA抽出は、核酸精製キット(MagExtractor -Genome-: TOYOBO社製)を用いて行なった。具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液750μlと磁性ビーズ40μlを加え、チューブミキサーを用いて、10分間激しく攪拌した(ステップ1)。次に分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ2)。
【００３５】
次に、分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ4)。ステップ3、4を繰り返して2度目の洗浄(ステップ5)を行なった後、70%エタノール900μlを加え、ミキサーで5sec程度攪拌して再縣濁した(ステップ6)。
次に分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた(ステップ7)。ステップ6、7を繰り返して70%エタノールによる2度目の洗浄(ステップ8)を行なった後、回収された磁性粒子に純粋100μlを加え、チューブミキサーで10分間攪拌を行なった。
【００３６】
次に分離用スタンド(Magical Trapper)にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子を壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を新しいチューブに回収した。
【００３７】
（3-3. 回収したGenome DNAの検査）
回収された微生物(大腸菌標準株)のGenome DNAは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行ない、その品質(低分子核酸の混入量、分解の程度)と回収量を検定した。 本実施例では、約10μgのGenome DNAが回収され、Genome DNAのデグラデーションやrRNAの混入は認められなかった。回収したGenome DNAは、最終濃度50ng/μlとなるようにTE緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。
【００３８】
（4．DNAマイクロアレイの作成）
（4-1. ガラス基板の洗浄）
合成石英ガラス基板(サイズ25mm x 75mm x 1mm、飯山特殊ガラス社製)を耐熱、対アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調整した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行なった。続いて基板を取り出し、軽く純粋ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄を行なった。次に80℃に加熱した1N水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行ない、DNAチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００３９】
（4-2. 表面処理）
シランカップリング剤KBM-603(信越シリコーン社製)を、1%の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を120℃に加熱したオーブン中で1時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のN-マレイミドカプロイロキシスクシイミド(N-6(-Maleimidocaproyloxy)succinimido)(以下EMCSと略す)を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したEMCS溶液を用意した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とEMCSのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。EMCS溶液から引き上げたガラス基板を、先述のEMCSを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００４０】
（4-3. プローブDNA）
上記の１の「プローブDNAの準備」で作成したプローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度(インク溶解時)10μlとなるように分注した後、凍結乾燥を行ない、水分を除いた。
【００４１】
（4-4. BJプリンタによるDNA吐出、および基板への結合）
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH(川研ファインケミカル社製)1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に（１）で用意した８種類のプローブ(配列表)を上記の混合溶媒に規定濃度となるように溶解した。得られたDNA溶液をバブルジェットプリンタ(商品名: BJF-850 キヤノン社製)用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。なおここで用いたバブルジェットプリンタは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンタは、所定のファイル作成方法に従って印字パタンを入力することにより、約5ピコリットルのDNA溶液を約120マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能になっている。続いて、この改造バブルジェットプリンタを用いて、1枚のガラス基板に対して、印字操作を行ない、アレイを作成した。形成されるスポットの配置は、同一プローブの１０個のスポットを１２０マイクロメートル間隔で直線状に１行として配置し、８種のプローブスポット８行を等間隔（120マイクロメートル）にならべた８行１０列の配置パターンとした。印字が確実に行なわれていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００４２】
（4-5. 洗浄）
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH 7.0)により表面に残ったNDA溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖DNAが固定したDNAマイクロアレイを得た。
【００４３】
（5．検体の増幅と標識化(PCR増幅＆蛍光標識の取り込み)
（5-1.検体）
検体となる微生物DNAの増幅、および、標識化反応を以下の表４に示す。
【００４４】
【表４】
2006217897.tif 000006
【００４５】
上記組成の反応液を以下に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行なった。
【００４６】
【表５】
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【００４７】
反応終了後、精製用カラム(QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit)を用いてPrimerを除去した後、増幅産物の定量を行ない、標識化検体とした。
【００４８】
（5-2.コントロールプローブ）
コントロールプローブの相補鎖配列をもつターゲットに蛍光標識をつけたものをコントロールプローブターゲットとした。
【００４９】
（6．ハイブリダイゼーション）
上記4の「DNAマイクロアレイの作成」で作成したDNAマイクロアレイと上記５の「検体の増幅と標識化(PCR増幅＆蛍光標識の取り込み)」で作成した標識化検体とコントロールプローブターゲットを用いて検出反応を行なった。
【００５０】
（6-1. DNAマイクロアレイのブロッキング）
BSA(牛血清アルブミンFraction V: Sigma社製)を1wt%となるように100nM NaCl / 10mM Phospate Bufferに溶解し、この溶液に＜4．DNAマイクロアレイの作成＞で作成したDNAマイクロアレイを室温で2時間浸し、ブロッキングを行なった。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む2ｘSSC溶液(NaCl 300mM、Sodium Citrate(trisodium citrate dihydrate, C6H6Na3・2H2O) 30mM、p.H. 7.0)で洗浄を行なった後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行なった。
【００５１】
（6-2. ハイブリダイゼーション）
水切りしたDNAマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置(Genomic Solutions Inc. Hybridization Station)にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行なった。
・ハイブリダイゼーション溶液
6 ｘ SSPE / 10% Form amide / Target (2nd PCR Products 全量)
(6ｘSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4) 
・ハイブリダイゼーション条件
65℃ 3min → 92℃ 2min → 45℃ 3hr → Wash 2ｘSSC / 0.1% SDS at 25℃ → Wash 2ｘSSC at 20℃ → (Rinse with H2O：Manual) → Spin dry (65℃で3分、92℃de2分、45℃で3時間ハイブリダイゼーション反応させた後、2ｘSSC/0.1% SDS、25℃で洗浄、2ｘSSC、20℃で洗浄後、純水でリンスしスピンドライした)。
【００５２】
（7．微生物の検出(蛍光測定)）
ハイブリダイゼーション反応終了後のDNAマイクロアレイをDNAマイクロアレイ用蛍光検出装置(Axon社製、GenePix 4000B)を用いて蛍光測定を行なった。このとき本コントロールプローブスポットの輝度値を確認することによりハイブリダイゼーション反応が正常に終了したか確認することができる。
【００５３】
このハイブリダイゼーション反応成否の判断を行なう処理の例を図１０のフロー図を用いて述べる。図１１は蛍光測定装置の構成を示すブロック図である。まず、図１１の蛍光検出部１に接続されている制御部２（コンピュータ）により、蛍光検出データ（２次元スキャン画像）の読込を行なう（Ｓ２１）。次に、読込まれたスキャン画像におけるコントロールプローブスポットの位置をアレイパターンに基づいて特定する（Ｓ２２）。次に、特定されたコントロールプローブスポットの輝度計測を行い（Ｓ２３）、予め設定された設定輝度値と比較を行なう（Ｓ２４）。比較の結果、コントロールプローブの位置における輝度が設定輝度値の範囲内である場合は正常として画像の分析を行うステップに進み、範囲外であれば異常であることを表示手段などで表示し、後の分析ステップには進まないようにする。上記の処理により、ハイブリダイゼーション反応が成功したデータのみが画像分析処理されるため、無駄な作業が省略される。また、特定されたコントロールプローブスポットの位置を基準位置として、検出用のプローブスポットが存在する位置を特定することもできる。蛍光発光が生じるスポットのアドレス（番地）が予め特定されていることにより、スキャン画像の解析がより容易になる。
【００５４】
さらに、本コントロールプローブスポットの蛍光輝度は、複数のスポット間でほぼ一定の値を示したため、コントロールプローブの平均輝度を最大輝度（基準輝度）として明確なダイナミックレンジが得られた。
【００５５】
また、同様に処理した複数枚のＤＮＡチップの検出結果においても、それぞれ輝度値の安定が見られたため、コントロールプローブスポットの輝度値データに基づき、得られた各スポットの輝度値の規格化に利用できる。この場合、複数のＤＮＡマイクロアレイ同士を比較分析する際の基準として用いることができるため、より精度の高い（例えば標的核酸の定量解析などの）検出が可能となる。
【００５６】
以上で説明したように、本実施形態によれば、DNAマイクロアレイシステムに最適なコントロールプローブの設計が実現できる。このことにより、より確かな生物種、個体識別情報が得られるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】二次構造をとり易いプローブ配列の一例を示す図である。
【図２】図１のプローブ配列が中心から二つに折れた例を示す図である。
【図３】二次構造をとりにくい回文構造を持つプローブ配列の一例を示す図である。
【図４】図３のプローブ配列が中心から二つに折れた例を示す図である。
【図５】配列の出現度数を集計するフローチャートの一例を示す図である。
【図６】出現度数分布図を示す図である。
【図７】Tmを満足するコントロールプローブ配列を設計するフローチャートの一例を示す図である。
【図８】実施形態のプローブ設計方法で設計したプローブを用いて核酸解析を行う手順を説明する図である。
【図９】ハイブリダイゼーション反応を説明する図である。
【図１０】ハイブリダイゼーション反応成否の判断フローを示す図である。
【図１１】蛍光検出装置のブロック図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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