(57)【要約】【課題】エンジンオイルなどの油を油以外の炭素源がたとえ存在しなくても分解することが可能である新規な微生物の提供。【解決手段】アシネトバクター属ｓｐ．に属し、エンジンオイルを分解可能な微生物。例えば、好気性のグラム陰性桿菌であって、ブドウ糖利用能が陰性であるアシネトバクター・バウマニＫＩＭ３０１３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４７５）菌株である。種々の添加剤が含まれているエンジンオイルを分解できるので、排水中などに添加することで、環境中にエンジンオイルが放出されることを効果的に防止できる。また、他の本発明の微生物は油以外の炭素源を必須とせずに油を分解できるので、油を分解するために糖などの炭素源を加える必要がなくなって、環境に与える負荷を小さくすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未使用エンジンオイルに代表される鉱物油資化能を有するアシネトバクター(Acinetobacter)属ｓｐ．に属することを特徴とする微生物。
【請求項２】
使用済みエンジンオイルに代表される鉱物油資化能を有するアシネトバクター属ｓｐ．に属することを特徴とする微生物。
【請求項３】
油以外に炭素源が存在しない条件下で、該油を分解できるアシネトバクター属ｓｐ．に属することを特徴とする微生物。
【請求項４】
アシネトバクター・バウマニ(baumannii)に属する請求項１〜３のいずれかに記載の微生物。
【請求項５】
ブドウ糖利用能を有しない請求項１〜４のいずれかに記載の微生物。
【請求項６】
更に、白糖、Ｄ-マンニトール、イノシット、Ｄ-ソルビトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ-メルビオース、Ｄ−アミグダリン及びＬ−アラビノースの利用能を有しない請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
アシネトバクター・バウマニＫＩＭ３０１３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４７５）菌株である微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の微生物を油と好気条件下で接触させることを特徴とする油分解方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の微生物を有することを特徴とする油分解剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンジンオイルなどの油分に対して高い分解能を有する微生物及びその微生物を用いた油分解方法並びに油分解剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、鉱物油を分解する微生物の存在が確認されており、座礁したタンカーなどからの原油漏出事故などによる海岸汚染に対して原油を分解するなどの有用な作用があることが知られている（特許文献１）。また、工場排水などに含まれる切削油などの廃油成分を分解する微生物が開示されている（特許文献２）。
【０００３】
ところで、エンジンオイルによる汚染を簡便に浄化できる方法が望まれている。具体的には、使用済みのエンジンオイルなどは回収されてリサイクルなどに供されているが、オイル使用時の付着、抜き取り工程での飛散などにより作業現場では幾らかの汚染は不可避である。そのような汚染はウェスによる拭き取りと界面活性剤により洗浄しているが、排水経路を介しての環境中へのエンジンオイルの放出は避けることができず、何らかの効果的な対応が望まれるところである。
【０００４】
エンジンオイルを微生物によって分解除去する方法を検討する場合、エンジンオイルは基材となる油に対して、酸化防止剤、摩耗防止剤、清浄分散剤、粘度指数向上剤、消泡剤、流動点降下剤など様々な添加剤が使用されていることから、これら添加剤が存在することにより、単純に油を分解するだけの場合と比較して微生物に求められる性質が異なってくる。
【０００５】
従来技術のエンジンオイルが分解できる微生物としてはロドコッカス属に属するもの（特許文献３）、コルドニア属に属するもの（特許文献４）などが開示されている。
【特許文献１】特開平６−２９２５６２号公報
【特許文献２】特開２０００−１２５８５１号公報
【特許文献３】特開２００４−１１３１９７号公報
【特許文献４】特開２００４−１２１０６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献３及び４に開示された微生物はオイルに由来する以外に炭素源の添加が必要であり、炭素源の量を適正に制御しないと、場合によっては添加する炭素源による排水の富栄養化やＢＯＤ及びＣＯＤの上昇などが生じる可能性がある。
【０００７】
本発明は上記実情に鑑み完成されたものであり、油を油以外の炭素源がたとえ存在しなくても分解することが可能である新規な微生物、その微生物を利用する油分解方法及び油分解剤を提供することを解決すべき課題とする。
【０００８】
また、一般的には分解が困難なエンジンオイルを分解できる新規な微生物、その微生物を利用する油分解方法及び油分解剤を提供することも解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決する目的で本発明者らは鋭意研究を行った結果、アシネトバクター    (Acinetobacter)属に分類される油分解性に優れた新規な微生物を土壌から発見し、以下の発明に想到した。
【００１０】
すなわち、本発明の微生物は、（１）未使用エンジンオイルに代表される鉱物油資化能を有するアシネトバクター属ｓｐ．に属することを特徴とするもの、（２）使用済みエンジンオイルに代表される鉱物油資化能を有するアシネトバクター属ｓｐ．に属することを特徴とするもの、（３）油以外に炭素源が存在しない条件下で、該油を分化できるアシネトバクター属ｓｐ．に属することを特徴とするもの、（４）アシネトバクター・バウマニＫＩＭ３０１３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４７５）菌株のうちのいずれかである。これらの微生物は油以外の炭素源がなくても油を分解することができる。特に未使用エンジンオイルや、使用済みエンジンオイルなどの添加剤を含む油分を分解できるものである。
【００１１】
そして、上記課題を解決する本発明の油分解方法は上述のいずれかの微生物を油と好気条件下で接触させることを特徴とする。また、上記課題を解決する本発明の油分解剤は、上述のいずれかの微生物を有することを特徴とする。
【００１２】
なお、本明細書において「エンジンオイル」とは、エンジンやギヤの潤滑・冷却用や作動油などとして用いられるものをいい、特性を改善するために、油からなる基材に対して、酸化防止剤、摩耗防止剤、清浄分散剤、粘度指数向上剤、消泡剤、流動点降下剤など様々な添加剤を含有するものをいう。また、それらエンジンオイルが使用その他によって劣化・変性したものをも包含する。
【００１３】
ここで、基材となる油は有機性油状物質をいい、炭化水素（直鎖状炭化水素、分枝状炭化水素のいずれでも良い。）などの鉱物油や、脂肪酸のグリセリンエステル、脂肪酸、及びそれらを含むような合成油、動植物性の油脂を意味する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微生物は、種々の添加剤が含まれているエンジンオイルを分解できるので、排水中などに添加することで、環境中にエンジンオイルが放出されることを効果的に防止できる。また、他の本発明の微生物は油以外の炭素源を必須とせずに油を分解できるので、油を分解するために糖などの炭素源を加える必要がなくなって、環境に与える負荷を小さくすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の微生物、そして、油分解方法及び油分解剤に用いられる（含まれる）微生物としては、アシネトバクター属に属する微生物が例示される。特に好ましい微生物としてはアシネトバクター・バウマニ(baumannii)に属する微生物である。例えば、本発明者らが単離したアシネトバクター・バウマニＫＩＭ３０１３５菌株（本菌は独立行政法人産業技術総合研究所特許性物センターに平成１７年３月２５日に寄託され、その寄託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−２０４７５である。そして、アシネトバクター・バウマニの近縁種であると推定される。以下、単に「ＫＩＭ３０１３５菌株」と称する）が挙げられる。
【００１６】
これらの微生物は、一般的に微生物の生育に好ましくない影響を与える添加剤を多く含有しているエンジンオイルをエンジンオイル以外の炭素源を要求することなく分解することができる。
【００１７】
エンジンオイル中には、酸化防止剤、摩耗防止剤、清浄分散剤、粘度指数向上剤、消泡剤、流動点降下剤などが含有される。これらの添加剤の存在は微生物の生育に好ましいものではないと推察できる。本発明の微生物はこれらの添加剤が存在しても油分を分解することが可能である。
【００１８】
また、これらの微生物は、エンジンオイルのように好ましくない添加剤を含む油のほか、そのような好ましくない添加剤を含有しない油分（鉱物油、食用油など。前述した「エンジンオイル」の説明にて挙げた基材そのものなども含む。）を分解できることもできると考えられる。
【００１９】
本発明の微生物は、油以外に炭素源がない条件下でも油を分解できるものであるが、油以外に炭素源を必要としない微生物であるために、例えば、ブドウ糖の利用能を有しないことが望ましい。更に、他の糖などの炭素源の利用能がない微生物、例えば、白糖、Ｄ-マンニトール、イノシット、Ｄ-ソルビトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ-メルビオース、Ｄ−アミグダリン及びＬ−アラビノースの利用能を有しない微生物が望ましい。
【００２０】
これら本発明の微生物をエンジンオイルなどの油（水中に分散した状態が望ましい。例えば、排水中に含有した状態。）と好気条件下で接触させることで含有する油分が効率的に分解できる。接触させる温度は特に限定しないが通常の環境温度（２０〜３０℃程度）にて充分な分解能を発現する。工場排水（機械油などを含有する）や、家庭用排水（食用油などを含有する）なども処理して含有する油分を分解することができる。
【００２１】
本発明の微生物を何らかの担体（おがくず、パルプなどの廃材や、合成高分子材料などが例示できる。環境中に放出された場合に、環境に対する負荷が低いものが望ましい。）に担持させた状態とした油分解剤とし、必要に応じて油分を含む排水などの中に投入することで、排水中の油分を分解することができる。
【実施例】
【００２２】
ここで、本発明の微生物を代表して、ＫＩＭ３０１３５菌株の性状を記載する。
【００２３】
・コロニー形態
色調：白色
形  ：円形
突起形状：半レンズ状
周縁：全縁
表面形状：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：粘稠
グラム染色：陰性
菌体形状；桿菌
運動性：陰性
・生化学的特徴（＋：陽性、−：陰性、かっこ内にはAcinetobactor baumanniiの生化学的特徴を記載した）
α−ガラクトシターゼ：−（−）      アルギニンジヒドラーゼ：−（−）
リジンデカルボキシラーゼ：−（−）  オルニチンデカルボキシラーゼ：−（−）
クエン酸の利用能：−（＋／−）      H2Sの産生能：−（−）
ウレアーゼ：−（−）                トリプトファンデアミナーゼ：−（−）
インドール産生能：−（−）          アセトイン産生能：−（−）
ゼラチナーゼ：陽性（−）            ブドウ糖利用：−（＋）
Ｄ−マンニトール利用：−（−）      イノシット利用：−（−）
Ｄ−ソルビトール利用：−（−）      Ｌ−ラムノース利用：−（−）
白糖利用：−（−）                  Ｄ−メルビオース利用：−（−）
Ｄ−アミグダリン利用：−（−）      Ｌ−アラビノース利用：−（＋）
チトクロムオキシダーゼ：−（−）    NO2産生能：−（−）
N2ガスへの還元：−（−）
酸素に対する態度：好気性
・次に、ＫＩＭ３０１３５菌株を得たスクリーニング方法について説明を行う。
【００２４】
以下のスクリーニング方法により、ＫＩＭ３０１３５菌株を単離した。
【００２５】
１．滅菌した三角フラスコに無機培地（組成は下記２．参照）２０ｍＬに未使用又は使用済みエンジンオイル６０μＬを加えたものをエンジンオイル分解菌スクリーニング用培地とした。
【００２６】
２．無機培地組成（１Ｌ中）：（ＮＨ4）2ＳＯ4が１．１ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4が２．２９ｇ、ＫＨ2ＰＯ4が０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏが０．１ｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏが０．０２５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏが０．００５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸が０．００５ｇ。
【００２７】
３．上記スクリーニング用培地を複数個用意し、幾つかの土壌サンプルから抽出した水溶液２０μＬをそれぞれに加えた。３０℃、１６０ｒｐｍに調節した振盪培養機にて集積培養を行った。
【００２８】
４．培養終了後、１／２ＬＢの寒天培地上に集積培養液の一部をストリークし、３０℃で２４時間静置培養することで、寒天培地上に生育した単独のクローンを得た。
【００２９】
５．得られたクローンを再度スクリーニング用培地にてスクリーニング同様の条件にて培養を行い、単独の菌体でも油分の分解活性を有することを確認した。
【００３０】
（得られたＫＩＭ３０１３５菌株の遺伝学的同定）
以下の操作により、ＫＩＭ３０１３５菌株（以下、「被検菌」と称する）の菌種の同定を行った。
【００３１】
１．被検菌の１／２ＬＢによる終夜培養液を遠心（５０００ｇ×５分）により集菌し、上清を除いた。
【００３２】
２．その後、滅菌した１％食塩水にて被検菌を洗浄し、懸濁液を遠心（５０００ｇ×５分）により集菌し上清を取り除く操作を２回繰り返した。
【００３３】
３．得られた被検菌を４０μＬの滅菌蒸留水に懸濁し得られた懸濁液に、反応バッファ（組成：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１％  ｔｗｉｎ２０、０．５％  ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０μＬ及び１ｍｇ／ｍＬプロティナーゼＫ溶液１０μＬを添加し、６０℃で１時間インキュベートした。その後、９５℃５分間の処理によりプロティナーゼＫを失活させた。
【００３４】
４．プロティナーゼＫ処理後の溶液に遠心（１２０００ｇ×１０分）を行い、上清を分離して、被検菌ゲノム溶液とした。
【００３５】
５．被検菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子について、被検菌ゲノム溶液を鋳型とした増幅（ＰＣＲ法）を行い、約１５００ｂｐの増幅配列を得た。
【００３６】
６．得られた増幅配列は、フォワード３種、リバース３種の計６種類の内部プライマにてシークエンスを行い、被検菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００３７】
７．得られた塩基配列をデータベース（16SrDNAデータベース：The Ribosomal        Database Project II）から検索した結果、Acinetobactor baumannii   subgroupと９３．３〜９７．６％、Acinetobactor loffii subgroupと９２．２〜９２．４％の相同性を示した。特に、Acinetobactor baumannii subgroupとの高い相同性からAcinetobactor   baumannii subgroupに近縁乃至は含まれる微生物であると推定された。
【００３８】
・エンジンオイルなどの油分分解活性の測定
１．１／２ＬＢにて終夜培養を行ったＫＩＭ３０１３５菌液５０μＬ及び未使用エンジンオイル（トヨタ純正エンジンオイルＳＬ５ｗ−３０）５０μＬ（１％：実施例１−１）又は１５μＬ（０．３％：実施例１−２及び１−３）を前記無機培地（５ｍＬ）に加え、３０℃、１６０ｒｐｍの振盪培養機にて７２時間（実施例１−１及び１−２）又は２４時間（実施例１−３）培養を行い、各実施例の試験試料とした。
【００３９】
２．１／２ＬＢにて終夜培養を行ったＫＩＭ３０１３５菌液５０μＬ及び使用済みエンジンオイル（トヨタ純正エンジンオイルＳＬ５ｗ−３０：使用条件１５万ｋｍ以上走行したトヨタソアラ４．０ＧＴ−Ｌを用いて５千ｋｍ走行したもの）５０μＬ（１％：実施例２−１）又は１５μＬ（０．３％：実施例２−２及び２−３）を前記無機培地（５ｍＬ）に加え、３０℃、１６０ｒｐｍの振盪培養機にて７２時間（実施例２−１及び２−２）又は２４時間（実施例２−３）培養を行い、各実施例の試験試料とした。
【００４０】
３．１／２ＬＢにて終夜培養を行ったＫＩＭ３０１３５菌液５０μＬ及び食用サラダオイル（昭和産業株式会社製）１５μＬ（０．３％）を前記無機培地（５ｍＬ）に加え、３０℃、１６０ｒｐｍの振盪培養機にて２４時間培養を行い、実施例３の試験試料とした。
【００４１】
４．未使用エンジンオイル（トヨタ純正エンジンオイルＳＬ５ｗ−３０）５０μＬを前記無機培地（５ｍＬ）に加え、３０℃、１６０ｒｐｍの振盪培養機にて７２時間培養を行い。比較例の試験試料とした。
【００４２】
５．実施例１〜３及び比較例の試験試料について、それぞれ油分をｎ−ヘキサンで抽出して、残存する油分の量を測定した。油分分解活性は、（油分分解率％）＝（１−各実施例の試験試料中の油分残存量（ｇ）÷比較例の油分残存量（ｇ））×１００（％）から算出した。
【００４３】
６．分解率は、実施例１−１が３４．６％、実施例２−１が５０．４％、実施例３が８１．３％であった。また、実施例１−２が４８．６％、実施例１−３が１０．６％、実施例２−２が６２．５％、実施例２−３が４１．６％であった。