(57)【要約】【課題】  形状付与性、操作性、安全性、生体親和性を兼ね備えた硬組織代替性担体材料（人工骨材）を提供する。【解決手段】  本発明の硬組織代替性担体材料は第８リン酸カルシウム（OCP）とコラーゲンとからなる。OCPをコラーゲンとの複合体とすることにより、OCP単独では困難であった形状付与性が具備され、広範囲の骨欠損部などにもOCPを利用することができるようになる。更に当該複合体はOCPの優れた骨形成能を有し、自家骨移植に代わる量的制限のない生体適合性人工材料である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第８リン酸カルシウムとコラーゲンとからなる硬組織代替性担体材料。
【請求項２】
第８リン酸カルシウムとコラーゲンの配合比が、コラーゲン１に対して第８リン酸カルシウムが０．５〜３５（重量比）である請求項１記載の硬組織代替性担体材料。
【請求項３】
熱処理がされている請求項１又は２に記載の硬組織代替性担体材料。
【請求項４】
骨形成能を有するサイトカインを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の硬組織代替性担体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は硬組織代替性担体材料（人工骨材）に関する。より詳細には、第８リン酸カルシウムとコラーゲンからなり、形状付与性に優れた硬組織代替性担体材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害を伴う骨欠損（骨悪性腫瘍の術後や唇顎口蓋裂、骨折等の外傷により生じる）を有する患者に対して、生活の質（ＱＯＬ）の向上を目指して骨移植などの様々な手術療法が適用されている。骨移植には自家骨を使用するのが好ましいが、自家骨には量的な制限があり、また取り出した部位に残る障害の問題もあることから、自家骨移植に代わって量的制限のない人工骨材料の開発が期待されている。
係る人工骨材料としては、ヒドロキシアパタイト（以下、HAという）セラミックス、β-第３リン酸カルシウム（β-TCP）などが提案されている。
本発明者らは、マウス、ラットの研究により、合成第８リン酸カルシウム(Octacalcium
phosphate, Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ、以下、OCPという)は、人工骨として従来より汎用されているバイオセラミックスであるHAセラミックスと比し、骨組織の形成量が多く、また、生体内吸収性として知られるバイオセラミックスである、β-第３リン酸カルシウム（β-TCP）よりも高い材料吸収性を示す材料であることを見出した（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。
【非特許文献１】J Biomed Mater Res 59: 29-34,2002
【特許文献１】特許第３１１５６４２号公報
【０００３】
より詳細には、本発明者らは人工合成した生物学的アパタイトの前駆物質であるOCPを実験的に生体内に埋入し以下のことを解明してきた。 
(1)生体内に埋入されたOCPはHAに転換し（非特許文献２）、また良好な骨形成能を持つ（特許文献１）。
(2)OCPが骨芽細胞やその前駆細胞等に作用し(非特許文献３)、それ自身が骨形成の核となる(非特許文献４)ことで骨修復を促進する(非特許文献５)。
(3)OCPは生体内で破骨細胞類似の多核巨細胞によって吸収される(非特許文献６)とともに新生骨によって置換し、骨修復を促進し、HAやβ-第３リン酸カルシウム(β-TCP)等の既存のリン酸カルシウム系材料に比べてより新生骨に置換され易く吸収され易い(非特許文献１)。
(4)生体内に埋入されたOCPは生体内の糖タンパク質をその表面に特異的に吸着する(非特許文献７)ことが知られているが、一方、骨形成能を有するサイトカイン(bone morphogenetic protein-2, transforming growth factor β１)とOCPを複合化させるとOCPがそれらサイトカインの担体となり生体内での骨再生が更に加速される (非特許文献８及び９)。
【非特許文献２】Tohoku J Exp Med 164: 37-50, 1991
【非特許文献３】AnatRec 256: 1-6, 1999
【非特許文献４】Oral Dis 7: 259-265, 2001
【非特許文献５】J Dent Res 78:1682-7, 1999
【非特許文献６】J Electron Microsc 46: 397-403,1997
【非特許文献７】Bone Miner 20: 151-166, 1993
【非特許文献８】J Biomed Mater Res 57: 175-182,2001
【非特許文献９】J Biomed Mater Res 71A: 299-307,2004
【０００４】
このようにOCPは人工骨材料としては極めて優れた性状を有しており、周囲を骨組織で囲まれた骨欠損（例えば唇顎口蓋裂児の顎裂部、抜歯窩、開頭手術時に形成される骨欠損等）にはOCP単独での骨形成が期待できる。しかし、硬組織再生材料としてのOCPは無機物であるために形状付与性に乏しい。従って、広範囲骨欠損部や萎縮歯槽堤に対して骨量の増大を企図して行われる歯槽堤増大手術などへの適用には制限があるという問題がある(非特許文献１０参照）。
【非特許文献１０】Arch Oral Biol 41: 1029-1038,1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
骨再生において細胞、成長因子および担体（人工材料）の三要素が重要な役割を演じ、それらの協調によって効率的に骨が修復されることが明らかとなってきている。従って、次世代の硬組織代替性担体材料として(1)骨欠損によって生じた空間を埋める；(2)生体親和性を有する；(3)骨形成性細胞の機能を賦活化する；(4)成長因子を効果的に保持・拡散し、それらの骨再生機能を十分に発揮させる；(5)移植された人工材料自身が最終的には吸収し新生骨によって置換する；といった要件を満たす生体置換型人工材料の開発が望まれる。
本発明者らは、係る特性を有する硬組織代替性担体材料（人工骨材）について種々検討したところ、人工骨材として優れた特性を有するOCPとコラーゲンを複合させると、形状付与性に優れるのみならず、操作性、安全性、生体親和性を兼ね備えた担体材料となり、所期の目的を達成し得る硬組織代替性担体材料となり得ることを見出して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の硬組織代替性担体材料は、OCPとコラーゲンとからなる硬組織代替性担体材料である。当該担体材料は、OCPとコラーゲンの組成がコラーゲン１に対してOCPが０．５〜３５（重量比）であることが好ましく、更に熱処理がされていることがより好ましい。なお、当該担体材料は、骨形成能を有するサイトカイン(例えば、bone morphogenetic protein-2、transforming growth factor β１など)を含有していてもよい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の硬組織代替性担体材料はOCPとコラーゲンとの複合体であり、OCPをコラーゲンとの複合体とすることにより、OCP単独では困難であった形状付与性が具備され、その結果、広範囲の骨欠損部や歯槽堤増大手術などにもOCPを利用することができるようになる。特に熱処理されたOCP−コラーゲン複合体は骨再生を著しく促進する。このように、OCP−コラーゲン複合体はOCPの優れた骨形成能を失うことなく、自家骨移植に代わる量的制限のない生体材料になり得る。
従って、OCP−コラーゲン複合体の臨床応用によって、機能障害を伴う骨欠損への適応のみならず、現時点では機能障害が顕在化せず看過されることが多かった手術に伴って形成される骨欠損の修復（脳外科、整形外科、歯科領域等）や骨吸収を伴う歯周病あるいは義歯の保持を不安定化させる顎堤の低下等の障害を克服し、患者のＱＯＬの向上に寄与し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
上述のように、本発明はOCP−コラーゲン複合体からなる硬組織代替性担体材料である。
本発明で使用されるOCPは既に公知の物質であり、例えば、LeGerosの滴下法(LeGeros RZ, Calcif Tissue Int 37：194-197, 1985)又は特許文献１に開示した合成装置（三流管）を使用した方法などで調製することができる。
【０００９】
また、コラーゲンとしては、その由来、性状などは特に限定されず、種々のコラーゲンを使用することができる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えばペプシン、プロナーゼ等）で可溶化することにより得られ、テロペプチドが除去されている酵素可溶化コラーゲンが使用される。コラーゲンのタイプとしては、原料的な面から、豚、牛などの皮膚、骨、腱などに由来するタイプＩ（又はタイプＩ＋タイプIII）コラーゲンが有利である。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高いという特長を有し、特に酵素可溶化コラーゲンはアレルゲン性も低く好ましい。
上記のコラーゲンとしては、市販の製品を使用してもよい。
【００１０】
本発明の硬組織代替性担体材料の調製方法は特に限定されず、OCPとコラーゲンを含有する複合体の調製方法であれば種々の方法を用いることができるが、好ましい方法としては下記の調製方法が挙げられる。
a)OCPを混合して複合化する方法
適当な濃度のコラーゲン溶液のｐＨをゲル化し得る範囲に調整し、ここにOCPを添加し、十分に混練してOCPとコラーゲンの混合物を作製し、次いで凍結乾燥することにより複合体粉末を得る。当該複合体粉末を適当な型に加えて成型し、成型物を作製し、更に慣用の滅菌法（例えば、電子線照射、高圧蒸気滅菌等）により滅菌する。
【００１１】
b)OCP懸濁液を混合して複合化する方法
適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にpHを5.5〜7.5に調整し、コラーゲンがゲル化する前にOCPを添加して、コラーゲンとOCPの懸濁液を調製する。その後、pHを中性から弱アルカリ性に保持したところで型に流し込んで、形状を付与した後、適当な温度（例えば37℃）でゲル化させ、水洗浄を繰り返して緩衝液の塩などを除去して複合担体とし、上記と同様に滅菌処理する。
また、成型せず、ゲル化・水洗浄したものをそのまま凍結乾燥して、上記と同様に滅菌処理し、無定形の充填材料として患部に適用する。
【００１２】
c)OCPをコラーゲンに析出させて複合化する方法
適当な濃度のコラーゲン酸性溶液を、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）で無菌的にpHを5.5〜7.5に調整し、コラーゲンがゲル化する前に、カルシウム溶液及びリン酸溶液を添加してコラーゲン上にOCPを析出させる。その後、pHを中性から弱アルカリ性に保持したところで型に流し込んで、形状を付与した後、適当な温度（例えば37℃）でゲル化した後、水洗浄を繰り返して緩衝液などの塩を除去して複合担体とし、上記と同様に滅菌処理する。
又は、成型せず、ゲル化したものをそのまま凍結乾燥して、上記と同様に滅菌処理し、無定形の充填材料として患部に適用する。
【００１３】
なお、OCPのコラーゲン上への析出を説明すると、OCPの析出は、Ca２＋, PO4３−, pHなどにより決まる過飽和度（イオン積/溶解度積）に基づく。そこで、OCPに関して過飽和となる条件でCa２＋溶液及びPO4３−溶液を、pHを調節したコラーゲン溶液に注加して析出させる。OCPはコラーゲン間隙に自発的に析出するか、又はコラーゲン線維の表面を核として析出するかのいずれかとなる。OCPは、第２リン酸カルシウム（DCPまたはその２水塩DCPD）又は非晶質リン酸カルシウム（ACP）を経由してOCPに転換し、最終的にはＨＡに成熟することが知られている（非特許文献２）。そこで、OCPの代わりに、リン酸カルシウム溶液の過飽和度を調節して、DCP, DCPD又はACPを析出させても良い。
【００１４】
本発明の硬組織代替性担体材料であるOCP−コラーゲン複合体におけるOCPとコラーゲンの配合比は、所望する形状付与性、操作性、生体親和性などに応じて適宜調整することができるが、好ましい配合比としては、コラーゲン１に対して、OCPを０．５〜３５（重量比、以下特に明示のない限り同様）、より好ましくは１〜２０、更に好ましくは２〜１０、最も好ましくは３〜５程度に調整される。コラーゲン１に対してOCPが０．５未満であると、得られた複合体の骨再生機能が劣るおそれがあり、また３５を超えると形状付与性が低下するおそれがある。
【００１５】
上述のOCP−コラーゲン複合体は熱処理がされていることがより好ましい。熱処理により、OCP分子構造の一部が崩れて骨形成系細胞の侵入が起こり、骨再生が促進されると共にコラーゲンが架橋して形状保持力が向上する。係るOCP−コラーゲン複合体の熱処理は、減圧条件化に行うのがより好ましい。
上記熱処理の条件としては、温度が５０〜２００℃、好ましくは６０〜１８０℃、より好ましくは９５〜１５０℃、圧力が０〜３０００Ｐａ、好ましくは０〜３００Ｐａを例示でき、処理時間としては０．１〜１０日程度、より好ましくは０．５〜５日程度で行われる。
【００１６】
本発明の硬組織代替性担体材料には、OCP及びコラーゲンの他に、骨形成能を有するサイトカイン(例えば、bone morphogenetic protein-2、transforming growth factor β１など)を含有していてもよく、係るサイトカインを含有させることにより、骨再生速度を速めることができる。当該サイトカインの含量は、所望する骨再生速度などにより適宜調整することができる。
更に、本発明の硬組織代替性担体材料には、この分野で慣用の成分を含ませることができる。係る成分としては、例えば、生体吸収性高分子（例えばポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体等）、生体吸収性リン酸カルシウム（例えばβ−ＴＣＰ等）、生体非吸収性材料（例えばＨＡ、セラミックス等）などを挙げることができる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
なお、使用したOCP及びコラーゲンは以下のとおりである。
(1)OCP
OCPは、特許文献１に開示した合成装置（三流管）に基づいて合成・乾燥凝固させ、破砕した後、300-500μmの範囲にふるいにて整粒して、120℃で2時間乾熱滅菌したものを使用した。詳細には、同文献を参照することができるが、簡単にその製法を述べる。
0.16モルの酢酸カルシウム（Ｃａ（ＣＨ3ＣＯＯ）2・Ｈ2Ｏ）を全量1500mlとした水溶液、0.16モルのリン酸２水素ナトリウム２水塩を全量1500mlとした水溶液、純水1000mlの３液を、70℃に加温し、３本の供給口（三流管）を有する装置を使用して、三流管の各々の供給口から15分で導入した。得られた沈澱物は70℃、15分の熟成後、ろ過し、再び沈澱を純水中に分散し、ろ過した後、整粒し、乾燥させた。
(2)コラーゲン
ブタ皮膚由来ペプシン可溶化コラーゲン凍結乾燥粉末（タイプＩ+タイプIII、中性、架橋あり：NMPコラーゲンPS；日本ハム社製）を使用した。
コラーゲンタブレットは、同コラーゲンを溶解し、終濃度3%、pH7.4になるよう調整し、当該コラーゲン溶液を凍結乾燥し、次いで9mm径、1mm厚に成型し、電子線照射（5kGy）により滅菌した。
【００１８】
実施例１
OCP−コラーゲン複合体の調製
上記コラーゲンを溶解し、終濃度3%、pH7.4になるよう調整し、係るコラーゲン溶液に対し10%（w/w）のOCP（300-500μm径）を添加し十分に混練した。混練したOCP−コラーゲン混合物を凍結乾燥し、9mm径、1mm厚に成型し、電子線照射（5kGy）により滅菌した（得られたOCP−コラーゲン複合体を、以下OCP/Colという）。なお、成型性は極めて良好であり、成型物を容易に調製することが可能であった。
また、当該複合体に含まれるOCPは約10.5mg、コラーゲンは約3.5mgであった。
【００１９】
試験例１
本発明のOCP/Colを骨欠損部に埋入し、その機能を試験した。具体的方法、結果などは以下のとおりである。
（１）材料及び方法
(1)実験動物：
雄性Wistar系ラット(12週齢)を用いた。
(2)手術操作
ペントバルビタール(50mg/kg) を腹腔内に注射後、ラット頭蓋冠に自然治癒の望めない約9mm径の規格化した全層の骨欠損を作製し、OCP/Col（9mm径、1mm厚）埋入した。その際、一端剥離した骨膜は復位し縫合した。
なお比較対照として、(a)OCP群：OCP顆粒(300-500μm径：15mg)のみを埋入、(b)Col群：コラーゲンタブレット(9mm径、1mm厚：約3.5mg)のみを埋入したものを用いた。
(3)実験期間
試料の埋入期間は2及び4週間とし、実験動物は各群・各期間５匹を用いた。
(4)標本作製法
ペントバルビタール(50mg/kg) を腹腔内に注射後、0.1Mリン酸緩衝液（PBS）(pH7.4)にて左心室より前灌流の後、0.1Mリン酸緩衝4%パラホルムアルデヒド(pH7.4)にて灌流固定し、頭蓋冠および周囲組織を採取、同固定液に浸漬固定した。軟Ｘ線写真を撮影（20KV, 5mA,１min.）後、欠損内のX線不透過度(%opacity)を画像解析ソフト (NIH Image 1.63)を用いて計測した。その後、10% EDTAで脱灰し組織切片を作製しヘマトキシリン・エオジン染色で組織学的に検索した。
【００２０】
（２）結果
(1)軟Ｘ線所見
OCP/Col群：埋入２週後より欠損全域に綿花状および顆粒状の不透過像が観察され、埋入４週では不透過度は亢進した（図１a参照）。%opacityは4週で98.7±0.70%であった。不透過度の亢進は、骨形成及び石灰化の促進を意味する。
Col群：埋入２週後では欠損内に綿花状の不透過像がわずかに観察された。埋入４週では不透過度を増すとともに欠損内に広がっていった（図１b参照）。% opacityは4週で49.2±14.6%であった。
OCP群：埋入２及び４週後では欠損内に顆粒状で孤立性の不透過像が点在して観察された（図１c参照）。%opacityは4週で48.7±16.7%であった。
【００２１】
(2)組織学的所見
OCP/Col群：埋入２週後において骨欠損辺縁、脳硬膜側よりの骨形成に加え、OCP/Colへ高密度に骨形成性細胞等が浸潤し、それらは深部に及んでいた。そして骨形成性細胞によるコラーゲンスポンジの網目構造を足場とした旺盛な骨形成が観察された。OCP周囲の多核巨細胞は目立たなかった。
埋入４週後では、骨形成は更に進み、欠損全域にわたって確認された。コラーゲンスポンジの網目構造を埋めるように新生骨が形成され（図１d参照）、血管の侵入も認められた。形成された骨の一部はリモデリングされ、コラーゲンが目立たなくなっていた。
Col群：埋入２週後では骨欠損辺縁よりの骨形成に加え、コラーゲンスポンジの網目構造内には細胞が侵入していたが、密度は低かった。また、脳硬膜側からの骨形成が認められたが、それらは小範囲に限局していた。炎症性細胞浸潤は目立たなかった。
埋入４週後では、骨芽細胞は目立たなくなっている。コラーゲンスポンジの網目構造内に細胞の侵入は認められるが、一部多核巨細胞によるコラーゲンの吸収が観察された（図１e参照）。炎症性細胞浸潤は目立たなかった。
OCP群：埋入２週では新生骨は欠損辺縁に沿って限局していた。炎症性細胞浸潤が認められ、OCPは多核細胞に囲まれていた。埋入４週では新生骨は欠損辺縁および埋入されたOCP周囲に限局していた（図１f参照）。炎症性細胞浸潤は減少した。一部のOCPは多核細胞に囲まれていた。
【００２２】
（３）評価
X線撮影および組織化学的に骨形成能を調べたところ、OCP/Col群では、従来の材料では発現し得なかった、
１）複合材料内部深層への細胞の生着、
２）複合材料上へ骨の無機成分であるリン酸カルシウムの沈着の促進（石灰化の促進）、
３）OCP単独よりも早い時期での骨形成、
が認められ、本発明のOCP−コラーゲン複合体は優れた硬組織代替性担体材料となり得ることが明らかとなった。
このように、OCPとコラーゲンを複合化させた本発明の硬組織代替性担体材料は硬組織の成長過程を模倣した材料であり、前述した生体置換型人工材料の要件を満たし、OCP又はコラーゲン単独ではなし得なかった広範囲の骨欠損部位の修復を可能にするので、優れた硬組織代替性担体材料である。
【００２３】
試験例２
加熱処理されたOCP−コラーゲン複合体の試験を以下の方法で行った。
（１）材料及び方法
(1)試験試料
前記実施例１で成型・調製したOCP/Colを、真空乾燥機内で、１５０℃、２４時間処理した後、電子線照射(5kGy)により滅菌したもの（以下、便宜上、架橋OCP/Colという）を使用した。なお、比較として、上記OCP/Colを熱処理することなく、同様に電子線滅菌したもの（便宜上、未架橋OCP/Colという）を使用した。
(2)実験動物、実験操作及び標本作製は、試験例１と同様である。実験期間に関し、試料の埋入期間は４及び１２週間とし、実験動物は各群・各期間５匹を用いた。
【００２４】
（２）結果
(1)軟Ｘ線所見
架橋OCP/Col群：埋入４週後より欠損全域に綿花状および顆粒状の不透過像が混在し（図２a）、埋入12週では欠損部の不透過度は更に亢進し、より密になっていった（図２b）。
未架橋OCP/Col群：埋入４週後では欠損内に顆粒状で孤立性の不透過像が点在し（図２c）、埋入12週では欠損部の不透過像は融合傾向を示すものの架橋OCP/Col群に比べて欠損内の不透過像は著しく少ない（図２d）。
【００２５】
(2)組織学的所見
架橋OCP/Col群：埋入4週では骨欠損辺縁よりの骨形成に加え、架橋OCP/Colを足場とし、それらの網目構造を埋めるように旺盛な骨形成が観察された（図２e）。OCP周囲の多核巨細胞は目立たなかった。埋入12週後では、骨形成は更に欠損全域に亢進し、血管の侵入や形成された骨のリモデリングも観察された（図２f）。また、埋入された架橋OCP/Colは吸収傾向にあり目立たなくなっていた。
未架橋OCP/Col群：埋入４週では新生骨は欠損辺縁および埋入されたOCP周囲に限局し（図２g）、一部のOCPは多核細胞に囲まれていた。架橋OCP/Col内のCollagenに相当する構造は不明確でそれらの吸収傾向が示唆された。埋入12週では骨形成は亢進したものの新生骨は欠損辺縁および埋入されたOCP周囲に限局し（図２h）、一部のOCPは多核細胞に囲まれていた。
【００２６】
(3)組織定量学的所見
両群間の欠損内における新生骨の割合(n-Bone%)を統計学的に検討した結果を図３に示す。埋入4週では架橋OCP/Col群 22.0±7.80%、未架橋OCP/Col群4.56±3.19%であり、両群間に有意な骨形成の差を認めた。また埋入12週では架橋OCP/Col群52.5±13.7%、未架橋OCP/Col群15.4±13.7%であり、これらも両群間には有意な骨形成の差を認めた。
【００２７】
架橋OCP/Colの性能
架橋OCP/Col群の作用を以下に纏める。
１）架橋OCP/Col群は、未架橋OCP/Col群よりも有意に骨再生を促進する。
２）架橋OCP/Col群は再生される骨と置換していく傾向がある。
３）架橋OCP/Col群による良好な骨再生は、OCPとcollagenの相乗効果によるものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】４週におけるOCP/Col群（a, d）、Col群（b, e）、OCP群（c, f）の軟X線所見（a-c）及び組織学的所見（d-f）を示す図である。なお、図中、a−cのバーは4mm、d−fのバーは100μmを示す。
【図２】４週における架橋OCP/Col群（a, e）、１２週における架橋OCP/Col群（b, f）、４週における未架橋OCP/Col群（c, g）、１２週における未架橋OCP/Col群（d, h）の軟X線所見（a-d）および組織学的所見（e-h）を示す図である。なお、図中、a-dのバーは4mm、e-hのバーは200μmを示す。
【図３】組織定量学的評価による欠損内における新生骨の割合（n-Bone%）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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