(57)【要約】【課題】骨結合に優れる骨インプラントを提供する。【解決手段】  本発明は、複数の刻み目を有するセラミック層で覆われた生体不活性基材を備えた骨インプラントに関する。刻み目の全表面積は、セラミック層の全表面積の３０％から７０％である。また、本発明は、こうした骨インプラントの製造方法に関する。この方法は、（１）セラミック層を生体不活性基材の表面上に定着し、（２）セラミック層に複数の刻み目を形成し、ここで、刻み目の全表面積はセラミック層の全表面積の３０％から７０％であり、（３）共有結合を介してセラミック層の上にバイオポリマーを固定する、の工程を含む。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の刻み目を有するセラミック層で被覆された生体不活性基材を備え、前記刻み目の全表面積が、前記セラミック層の全表面積の３０％から７０％であることを特徴とする骨インプラント。
【請求項２】
前記刻み目の全表面積が、前記セラミック層の全表面積の５０％から６０％である請求項１記載の骨インプラント。
【請求項３】
前記生体不活性基材の前記表面の第１部分が、１０μｍから３０μｍの幅と、１０μｍから３０μｍの高さと、を有する小さい尾根を備え、前記生体不活性基材の前記表面の第２部分が、６０μｍから１００μｍの幅と、４０μｍから８０μｍの高さと、を有する大きい尾根を備える請求項２記載の骨インプラント。
【請求項４】
前記小さい尾根が、１５μｍから２０μｍの幅と、１５μｍから２０μｍの高さと、を有し、前記大きい尾根が、７０μｍから９０μｍの幅と、５０μｍから７０μｍの高さと、を有する請求項３記載の骨インプラント。
【請求項５】
前記セラミック層が、前記表面の前記第１部分以外の前記表面の前記第２部分を被覆する請求項４記載の骨インプラント。
【請求項６】
前記セラミック層の前記表面に共有結合したバイオポリマーをさらに備える請求項５記載の骨インプラント。
【請求項７】
前記バイオポリマーが、コラーゲンに基づく前記バイオポリマーである請求項６記載の骨インプラント。
【請求項８】
前記生体不活性基材がチタン合金に基づく請求項７記載の骨インプラント。
【請求項９】
前記セラミック層と、前記生体不活性基材と、の間に配置された金属酸化物の層をさらに備える請求項８記載の骨インプラント。
【請求項１０】
前記セラミック層に共有結合した骨生成促進剤をさらに備える請求項９記載の骨インプラント。
【請求項１１】
前記生体不活性基材の前記表面の前記第１部分が、１０μｍから３０μｍの幅と、１０μｍから３０μｍの高さと、を有する小さい尾根を備え、前記生体不活性基材の前記表面の前記第２部分が、６０μｍから１００μｍの幅と、４０μｍから８０μｍの高さと、を有する大きい尾根を備える請求項１記載の骨インプラント。
【請求項１２】
前記小さい尾根が、１５μｍから２０μｍの幅と、１５μｍから２０μｍの高さと、を有し、前記大きい尾根が、７０μｍから９０μｍの幅と、５０μｍから７０μｍの高さと、を有する請求項１１記載の骨インプラント。
【請求項１３】
前記セラミック層が、前記表面の前記第１部分以外の前記表面の前記第２部分を被覆する請求項１２記載の骨インプラント。
【請求項１４】
前記セラミック層の前記表面に共有結合したバイオポリマーをさらに備える請求項１記載の骨インプラント。
【請求項１５】
前記バイオポリマーが、コラーゲンに基づくバイオポリマーである請求項１４記載の骨インプラント。
【請求項１６】
前記セラミック層に共有結合した骨生成促進剤をさらに備える請求項１５記載の骨インプラント。
【請求項１７】
前記生体不活性基材がチタン合金に基づく請求項１記載の骨インプラント。
【請求項１８】
前記セラミック層と、前記生体不活性基材と、の間に配置された金属酸化物の層をさらに備える請求項１７記載の骨インプラント。
【請求項１９】
セラミック層を生体不活性基材の表面上に定着し、
前記セラミック層に複数の刻み目を形成し、前記刻み目の全表面積は、前記セラミック層の全表面積の３０％から７０％であり、
共有結合を介して前記セラミック層の上にバイオポリマーを固定することを含む、骨インプラントの製造方法。
【請求項２０】
前記定着の工程の前に、前記生体不活性基材の前記表面の第１部分に、１０μｍから３０μｍの幅と、１０μｍから３０μｍの高さと、を有する小さい尾根を形成し、前記生体不活性基材の前記表面の第２部分に、６０μｍから１００μｍの幅と、４０μｍから８０μｍの高さと、を有する大きい尾根を形成することをさらに含む、請求項１９記載の骨インプラントの製造方法。
【請求項２１】
前記セラミック層が、前記表面の前記第１部分以外の前記表面の前記第２部分を被覆する請求項１９記載の骨インプラントの製造方法。
【請求項２２】
前記バイオポリマーが、コラーゲンに基づくバイオポリマーである請求項１９記載の骨インプラントの製造方法。
【請求項２３】
前記生体不活性基材がチタン合金に基づく請求項１９記載の骨インプラントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、刻み目を有する骨インプラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織からのインプラントの緩みは、再建外科と関節置換における大きな問題である。この原因は、インプラント／骨の接合部分の一体性と機械的安定性を損なう、インプラント周囲に生成する繊維状組織の層に起因している。１９５０年代、現在は骨結合として知られるプロセスによって、チタンが恒久的に骨の中に組み込まれ得ることが実証された。
【０００３】
骨結合されたインプラントは、相対的な動きが欠如し、インプラントと骨の間に軟組織が存在しないことを特徴とする（非特許文献１参照）。インプラントの表面は、骨誘導性の材料でコーティングし、インプラントの骨結合をさらに促進することができる。
【非特許文献１】Ｊ．Ｐｒｏｓｔｈｅｔ．Ｄｅｎｔ．著「Ｂｒａｎｅｍａｒｋ」（１９８３年）  ５０：３９９−４１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、多くの骨インプラントが市販されているが、優れた骨結合をともなうインプラントの開発に対するニーズが依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、骨インプラントの刻み目のあるヒドロキシアパタイトのコーティングが、骨結合を促進するという予期されない発見に基づくものである。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、複数の刻み目を有するセラミック層（例えば、ヒドロキシアパタイト層）で被覆された生体不活性基材を備えた骨インプラントであることを特徴とする。刻み目の全表面積は、セラミック層の全表面積の３０％から７０％（例えば、５０％から６０％）である。刻み目の全表面積とは、全ての刻み目の開口表面積の合計である。セラミック層の全表面積は、刻み目の全表面積と刻み目のない表面積の合計である。
【０００７】
前記生体不活性基材は、金属材料（例えば、チタン又はチタン合金）やセラミック材料（例えば、磁器）などの様々な材料からなることができる。好ましくは、前記生体不活性基材の前記表面の一部は、１０μｍから３０μｍ（例えば、１５μｍから２０μｍ）の幅と、１０μｍから３０μｍ（例えば、１５μｍから２０μｍ）の高さと、を有する小さい尾根を備え、前記表面の別な部分は、６０μｍから１００μｍ（例えば、７０μｍから９０μｍ）の幅と、４０μｍから８０μｍ（例えば、５０μｍから７０μｍ）の高さと、を有する大きい尾根を含む。前記生体不活性材料が金属又は金属合金からなるとき、その表面は酸化されて、１種又は複数種の金属酸化物の層を形成することができる。
【０００８】
前記セラミック層は、好ましくは、小さい尾根を有する表面ではなく、大きい尾根を有する生体不活性基材の表面を被覆する。前記セラミック層は、ヒドロキシアパタイトのような無機材料からなることができる。また、前記セラミック層の前記表面は、共有結合を介してバイオポリマーにより固定することもできる。適切なバイオポリマーの例には、タンパク質（例えば、コラーゲン）やタンパク質含有の高分子（例えば、プロテオグリカン）が挙げられる。こうしたバイオポリマーは、細胞が結合・移動して、新しい骨組織の再生を促進する足場として機能することができる。必要により、骨生成促進剤（例えば、オステオプロテグリン）もまたセラミック層に共有結合させることもできる。骨生成促進剤は、骨組織の成長と骨量の維持を促す。
【０００９】
もう１つの局面において、本発明は、骨インプラントの製造方法であることを特徴とする。この方法は以下の３つの工程を含む。（１）セラミック層を生体不活性基材の表面上に定着し、その表面は前処理しておいてよく、（２）セラミック層に複数の刻み目を形成し、ここで、刻み目の全表面積はセラミック層の全表面積の３０％から７０％であり、（３）共有結合を介してセラミック層の上にバイオポリマーを固定する。
【００１０】
定着工程の前に、前記生体不活性基材に、表面の一部に１０μｍから３０μｍの幅と、１０μｍから３０μｍの高さと、を有する小さい尾根を形成し、表面の別な部分に６０μｍから１００μｍの幅と、４０μｍから８０μｍの高さと、を有する大きい尾根を形成する処理をすることができる。好ましくは、生体不活性基材はチタン合金からなり、その表面は、定着工程の前に酸化され、金属酸化物の層を形成する。
【００１１】
本発明のいくつかの態様の詳細を下記の説明に示す。この他の本発明の特徴、目的、及び長所は、これらの説明と特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、複数の刻み目を備える生分解性セラミック層で覆われる生体不活性基材を有する骨インプラントに関する。
【００１３】
生体不活性基材は、金属材料やセラミック材料などの様々な材料から調製することができる。典型的にチタン又はその合金が使用される。チタンは、骨結合を容易にする生体不活性材料である。チタンとその合金は、市販されている又は従来公知の方法によって調製することができる。
【００１４】
生体不活性基材の表面は、特定の粗さのパターンを形成するように処理することができる（例えば、表面の一部に小さい尾根と別な部分に大きい尾根）。表面処理は、機械的方法、化学的方法、電気化学的方法、及び当該技術でよく知られるその他の適切な方法によって行うことができる。典型的に、小さい尾根は化学的エッチング又はプラズマスプレーによって生成させることができる（例えば、Ｒｏｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，著（２００３年）、「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」  ２４：４５５９、Ｊｏｎａｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，著（２００４年）「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」  ２５：１１８７、及びＰｒａｄｏ  ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，著（２０００年）「Ｍａｔ．Ｒｅｓ．」３（３）：６１を参照されたい）。
【００１５】
大きい尾根は、グリットブラスト、研磨用エキシマレーザー処理、ウォータジェットピーニング、及び電気化学的マイクロマシンのような技術によって生成させることができる（例えば、ＧｏｎｚａＡｌｅｚ−ＧａｒｃｏＡａ  ｅｔ  ａｌ．，著（１９９９年）「Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ」  ３５２：４９、Ｍｅｌｌａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，著（１９９６年）「Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」  ８１：２７５、Ｂｅｒｅｚｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，著（２００３年）「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」  ２４：４１９７、Ａｒｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，著（２００２年）「Ｗｅａｒ」  ２４９：９４３、及びＭａｄｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，著（１９９７年）「Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．，」  ７：２７０を参照されたい）。
【００１６】
例えば、先ず、ガス炉内において大気圧で特定の時間にわたって、全体の表面を高温（例えば、約８００℃以上）にてアニールに供した後、室温まで冷却することができる。次いで、室温より若干高い温度で所定の時間にわたり酸性溶液中において表面をエッチングし、１０μｍから３０μｍの幅と、１０μｍから３０μｍの高さと、を有する小さい尾根を形成することができる。その後、先端部分の表面を被覆することができる（例えば、耐腐食性のテープを用いる）。次いで、表面の残りの部分を、より高い温度でより長時間にわたって、より濃厚な酸溶液中でさらにエッチングし、６０μｍから１００μｍの幅と、４０μｍから８０μｍの高さと、を有する大きい尾根を形成することができる。
【００１７】
このようにして得られた基材の表面は、小さい尾根を有する部分（例えば、表面の先端部分）と、大きい尾根を有する残りの部分を備える。使用に際し、小さい尾根を有する部分が外側に配置され（例えば、上皮層に接触する）、大きい尾根を有する部分が内側に配置される（例えば、骨に接触する）ように、基材をインプラント位置に配置することができる。小さい尾根は、線維芽細胞の増殖を促進し、細菌感染を低下させる。大きい尾根は、骨芽細胞の接着を促進する。必要ならば、基材（例えば、Ｔｉ合金）を酸化させて金属酸化物（例えば、ＴｉＯ２）の層（例えば、５μｍから１０μｍ）を形成し、基材の腐食を防止又は遅延させることができる。
【００１８】
生分解性セラミック層は、ヒドロキシアパタイトのような無機材料からなることができる。骨、エナメル、又は象牙質に生来的に発生するヒドロキシアパタイトは、骨置換材料又はコーティング材料として、多年にわたって使用されている（例えば、Ｆｒａｍｅ著（１９８７年）「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ」  １６：６４２−５５、及びＰａｒｓｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．著（１９８８年）「Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」  ５２３：１９０−２０７を参照されたい）。
【００１９】
ヒドロキシアパタイトは、従来公知の方法によって調製することができ、又は商業的な供給業者から購入することもできる。これは、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の純粋な化合物、あるいは、炭酸塩、フッ化物、塩化物、又はバリウムのような別のイオンを含む組成物である。ヒドロキシアパタイトに基づくセラミック層は、例えば、プラズマスプレー、ゾルゲル処理、イオンビーム又は高周波スパッタリング、パルス式レーザー析出、熱間等方圧プレス、及び電気泳動析出によって、基材の表面上にヒドロキシアパタイトを適用することにより形成することができる（例えば、Ｇｅｅｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，著（１９９０年）「Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．」  ２６１：  ３９−５８、Ｒａｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，著「Ｐｌａｓｍａ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｅｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」  Ｒ．ｄ‘Ａｇｏｓｔｉｎｏ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９０年）、及びＫａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，著（１９９８年）「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」  ３２：３６９−３７３を参照されたい）。
【００２０】
典型的に、ヒドロキシアパタイトに基づくセラミック層の厚さは２５μｍ〜７０μｍの範囲である。骨付加（apposition）を促進するこうした層は、好ましくは、大きい尾根を有する基材の表面に施される。このことを達成するため、ヒドロキシアパタイトに基づくセラミック層を基材上に施す前に、小さい尾根を有する表面を被覆されてよく、そうして、大きい尾根を有する表面のみをセラミック層でコーティングする。
【００２１】
セラミック層の刻み目は、機械的方法（例えば、サンドブラスト又はグリットブラスト）又は他の適切な方法によってセラミック層の一部を除去することにより、形成することができる。これらの刻み目は、典型的に、円筒形状を有し、典型的に、３５０μｍから６５０μｍ（例えば、４００μｍから６００μｍ）の範囲の直径を有する。刻み目において、セラミック材料は一般に完全に除去され、基材が露出する。刻み目は、骨芽細胞の補充と保持を促進する。刻み目は、セラミック層に均等に又はランダムに分布することができる。
【００２２】
セラミック層は、バイオポリマー（例えば、コラーゲンに基づくバイオポリマー）と共有結合し、新しい骨の成長を促進することができる。例えば、セラミック層の表面は、先ず、アミノ又はヒドロキシルのような官能基によって改質することができる。官能基は、プラズマ堆積又は化学的プライミングによって導入することができる。
【００２３】
プラズマ堆積に使用される材料には、アンモニアプラズマ、アリルアミンプラズマ、アリルアルコールプラズマ、並びに、アミノ、ヒドロキシル、又は他の反応基を有する任意のガスのプラズマが挙げられる。
【００２４】
化学的プライミングに使用される化合物には、アミノシラン、ヒドロキシルシラン、あるいは、アミノ、ヒドロキシル、又は他の反応基を有する他のシランが挙げられる（例えば、Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．著（１９９３年）「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」  １４：８１７−８２２、及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｓｉｕｅ著（１９９３年）「Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｒｔ  Ａ：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」  ３１：２６０１−２６０７を参照されたい）。典型的に、セラミック層の表面と、セラミック層の刻み目によって露出した生体不活性基材の表面の双方は、官能基によって改質される。
【００２５】
コラーゲンは、本発明のインプラントに使用可能なバイオポリマーの例である。コラーゲンの例えば１型コラーゲンは、ヒトや動物の組織、例えば、腱、皮膚、骨、又は靭帯から単離することができる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ著、（１９８２年）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」  ８２：３３−６４を参照されたい）。これは、テロペプチドを保持する方法（例えば、米国特許第３１１４５９３号）、あるいは、テロペプチドを除去する方法（例えば、米国特許第４２３３３６０号）によって精製することができる。また、これは、化学物質を用いた架橋によって（例えば、米国特許第５８７６４４４号、同６１７７５１４号）、又は他の手段によって（例えば、紫外線）再構成することができる。
【００２６】
コラーゲンは、ヒドロキシアパタイトに基づくセラミック層に共有結合することができる。共有結合は、コラーゲンの官能基（例えば、カルボキシレート）と改質ヒドロキシアパタイトの官能基（例えば、アミノ）の間で直接的に形成することができ、あるいは、第３分子の例えば架橋剤を介して間接的に形成することができる。架橋剤は、少なくとも２つの官能基を有する試薬であり、その１つはバイオポリマーとの、もう１つは改質ヒドロキシアパタイトとの結合を形成することができる。架橋剤の例には、グルタルアルデヒド、エピクロロヒドリン、塩化トレシル、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドが挙げられる。
【００２７】
セラミック層は、さらに、オステオプロテグリンのような骨生成促進剤と共有結合することができる。オステオプロテグリンは、米国出願公開第２００３−００４５９４２号とその中で引用の先行文献に記載されている。オステオプロテグリンは、例えば、コラーゲンとオステオプロテグリンの両方を含む溶液中に、適切な時間にわたってセラミック層を有する基材を浸漬することにより、コラーゲンとともにセラミック層に結合させることができる。次いで、基材を溶液から引き上げ、空気乾燥又は凍結乾燥によって乾燥させることができる。あるいは、コラーゲンをセラミック層に固定した後、オステオプロテグリンを含む溶液中にセラミック層を有する基材を浸漬することによって、オステオプロテグリンをセラミック層に結合させることもできる。
【００２８】
一例として、本発明の骨インプラントは、次のようにして調製することができる。先ず、チタン合金の基材の全表面を、ＨＣｌ水溶液中でエッチングし、小さい尾根を形成する。さらに、基材の先端部分を除き、表面をアニールして大きい尾根を形成する。その後、基材の全表面を酸素で研磨（ブラスト）し、金属酸化物の層を形成する。ヒドロキシアパタイトの層を、プラズマスプレーによって、大きい尾根を有する表面の上にコーティングする。
【００２９】
次いで、ヒドロキシアパタイト層の一部をサンドブラスト又はグリットブラストによって除去し、それにより、複数の刻み目を形成する。次いで、その表面をアミノ又はヒドロキシルで官能化する。しかる後、コラーゲン上の官能基とその表面上の官能基を反応させることにより、コラーゲンをその表面上に固定する。同様な方法により、その表面をオステオプロテグリンによってさらに改質することもできる。
【００３０】
本発明の骨インプラントは、以下の標準的な外科措置にしたがって、骨欠損（例えば、歯槽骨の欠損）の修復のために使用することができる。
【００３１】
下記の実施例は、具体例に過ぎないものであり、他の箇所の開示を何ら限定するものではない。さらなる詳述をすることなく、当業者は、本願の記載に基づいて本発明をその最大限まで利用可能なものと考えられる。本願で引用した先行文献は、全体として本願に参照して取り入れられる。
【実施例】
【００３２】
＜実施例１＞
材料の調整
多孔質のヒドロキシアパタイトに基づくマトリックスの調製
ヒドロキシアパタイトの粉末を反応１０Ｃａ（ＮＯ３）２＋６（ＮＨ４）３ＰＯ４＋２ＮＨ３Ｈ２Ｏ＝Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２＋２０ＮＨ４ＮＯ３を伴う湿式の化学的方法によって調製した。多孔質のヒドロキシアパタイトに基づくマトリックスを以下の工程によって調製した（１）ヒドロキシアパタイト粉末、炭化ケイ素、マグネシア、及び水を含むスラリーを調製し、（２）網状構造の基材（例えば、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、又はポリエチレングリコール）を所望の形状に成形し、（３）スラリーをその網状構造の基材の上にコーティングし、（４）遠心分離によって余剰のスラリーを除去した。必要により、工程（１）〜（４）を繰り返した。
【００３３】
このようにして得られたヒドロキシアパタイトを含有する基材を、１２００℃の温度で焼成した後、冷却した。網状構造の基材が徐々に分解してクラックが発生しないように、温度をゆっくりと高めた。このようにして、２００μｍから３５０μｍの平均気孔サイズを有する多孔質のヒドロキシアパタイトに基づくマトリックスが得られた。洗浄の後、γ線の照射（２０ｋＧｙ）によってマトリックスを殺菌した。
【００３４】
１型コラーゲンの抽出と精製
ニュージーランド産の白ウサギ又は他の適切な哺乳類の腱から１型コラーゲンを抽出・精製した。腱を切取り、スライスし、冷たい蒸留水で数回洗浄し、血漿タンパクを除去した。その後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌの溶液で、４℃にて一晩中一定した撹拌によって抽出した。上清を静かに除去し、残留物を冷たい蒸留水で数回洗浄して塩を除去した後、０．５ＭのＨＯＡｃ、ｐＨ２．５の溶液で、一晩中４℃にて培養し、水抽出物を得た。塩の溶液（０．９Ｍ  ＮａＣｌ）をその抽出物に添加し、沈殿を生じさせた。１３０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって沈殿を回収し、０．０５ＭのＨＯＡｃに溶解させ、コラーゲン含有の溶液を作成した。
【００３５】
もう１つの塩の溶液（０．０２ＭのＮａ２ＨＰＯ４）を２回、コラーゲン含有の溶液に２４〜４８時間かけて添加し、沈殿を生じさせた。沈殿を遠心分離によって回収し、５０ｍＭのＨＯＡｃに溶かし、もう１つのコラーゲン含有の溶液を得た。このコラーゲン含有の溶液を５ｍＭのＨＯＡｃに対して透析し、最終的に凍結乾燥した。
【００３６】
＜実施例２＞
骨インプラントの調製
Ｃｒｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製（ピッツバーグ、ＰＡ、ＵＳ）から、筋状の基材を購入した。基材はチタン合金（Ｔｉ６Ａ１４Ｖ）からなり、３．２５ｍｍから５．０ｍｍの直径と８ｍｍから１８ｍｍの長さを有した。先ず、基材の表面を、ガス炉内の大気圧下で８７０から１０５０℃にて１から３時間にわたってアニールした後、室温まで冷却した。
【００３７】
次いで、その表面を、１から３ＭのＨＣｌ水溶液中で３０℃から５０℃にて１時間から３時間かけてエッチングし、小さい尾根（即ち、１０μｍから３０μｍの幅を有し、１０μｍから３０μｍの高さを有する）を形成した。先端２ｍｍから３ｍｍの部分の表面を耐腐食性テープで被覆した。
【００３８】
次いで、さらに、残りの表面を１から６ＭのＨＣｌ水溶液中で５０℃から９０℃にて３時間から６時間かけてエッチングし、大きい尾根（即ち、６０μｍから１００μｍの幅と４０μｍから８０μｍの高さを有する）を形成した。
【００３９】
次いで、その表面を酸素にて研磨（ブラスト）し、５μｍから１０μｍの厚さを有する金属酸化物の層を形成した。このようにして得られた基材に、プラズマスプレー法を用い、ヒドロキシアパタイトの層をコーティングした。ヒドロキシアパタイト層の厚さは約４０μｍから５０μｍであった。
【００４０】
次いで、サンドブラストによってヒドロキシアパタイト層の一部を除去し、それにより、複数の刻み目を形成した。刻み目の直径は４００μｍから６００μｍであった。このようにして得られた基材をアミノで官能化した後、コラーゲンを結合させた。
【００４１】
＜実施例３＞
石灰化物の評価
次の６つのディスクを石灰化物について試験した。
（１）ＲＴ、未処理のチタン合金ディスク、
（２）ＲＴ−ＨＣｌ、ＨＣｌでエッチングして小さい尾根を形成したチタン合金ディスク、（３）ＲＴ−９５０−ＨＣｌ、９５０℃でアニールし、かつＨＣｌでエッチングして大きい尾根を形成したチタン合金ディスク、
（４）ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２、９５０℃でアニールし、ＨＣｌでエッチングして大きい尾根を形成し、かつ酸化して金属酸化物の層を形成したチタン合金ディスク、（５）ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＦ、９５０℃でアニールし、ＨＣｌでエッチングして大きい尾根を形成し、酸化して金属酸化物の層を形成し、かつヒドロキシアパタイトの層で全体的にコーティングしたチタン合金ディスク、
（６）ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＰ、９５０℃でアニールし、ＨＣｌでエッチングして大きい尾根を形成し、酸化して金属酸化物の層を形成し、かつヒドロキシアパタイトの層で部分的にコーティングしたチタン合金ディスク。ディスクは、２ｃｍから３ｃｍの直径と３ｍｍから５ｍｍの厚さを有した。
【００４２】
ヒトの骨肉腫からＵ２骨芽細胞を採取し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と５％の抗生物質を含む３７℃のＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地の中の６ウェルプレートに配置した上記の各ディスクに植えた。４日間の培養の後、培地を交換した。さらに４日間の培養の後、培地の中のカルシウム分を各ディスクについて測定した。
【００４３】
ＲＴ、ＲＴ−ＨＣｌ、及びＲＴ−９５０−ＨＣｌの培地におけるよりも、ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＰ、ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＦ、ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２の培地において、より多くの石灰化物が認められた。この結果は、ＲＴ、ＲＴ−ＨＣｌ、及びＲＴ−９５０−ＨＣｌの表面に析出するよりも、多くのカルシウムがＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＰ、ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＦ、ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２の表面に析出したことを示唆するものである。
【００４４】
＜実施例４＞
骨芽細胞の評価
実施例３で説明した６つのディスクを、骨芽細胞の析出評価においても試験した。ヒトの骨肉腫から採取したＵ２骨芽細胞を、１０％のＦＢＳと５％の抗生物質を含む３７℃のＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地の中の６ウェルプレートに配置した各ディスクに植えた。４日間の培養の後、培地を取り出した。電子顕微鏡によって各ディスクの表面を観察した。
【００４５】
ＲＴの表面上には骨芽細胞はほとんど観察されなかった。多くの骨芽細胞は、培地を取り出した後、ＲＴの表面から取り除かれたためである。少しの骨芽細胞がＲＴ−ＨＣｌの表面上に観察された。ＲＴと同様に、培地を取り出した後、ＲＴ−ＨＣｌの表面の殆どの骨芽細胞は取り除かれた。
【００４６】
かなりの量の骨芽細胞が、ＲＴ−９５０−ＨＣｌの表面の大きい尾根の上に付着した。また、かなりの量の骨芽細胞がＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２の金属酸化物層の大きい尾根に付着した。ＲＴ−９５０−ＨＣｌとＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２に比較して、より多くの骨芽細胞が、ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＦの金属酸化物層の大きめの尾根の上に付着した。ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＦに比較して、より多くの骨芽細胞が、ＲＴ−９５０−ＨＣｌ−ＴｉＯ２−ＨＡＰの金属酸化物層の大きい尾根の上に付着した。
【００４７】
＜その他の態様＞
本願明細書に開示の全ての特徴は、任意の組み合わせで結合させることができる。本願明細書に開示の各々の特徴は、同一、均等、又は類似の目的を果たす代替的特徴によって置き換えることができる。したがって、特段の記載がない限り、開示の各々の特徴は、均等又は類似の特徴における一般的体系の例に過ぎない。
【００４８】
上記の説明から、当業者は、本発明の基本的な特徴が、本発明の技術的思想とその範囲を逸脱することなく、本発明に種々の変化や変更を加えて種々の用途や条件に適用させ得ることを、容易に確認することができる。したがって、その他の態様もまた、本願の特許請求の範囲の中に含まれるものである。