(57)【要約】【課題】本発明は、高空間分解能を用いて、サンプル（４）における蛍光マーカの位置を決定する方法について開示している。【解決手段】このために、サンプル（４）は蛍光ビーム（１１）により照射され、サンプル（４）は粒子ビーム（３）により同時に走査される。走査中、マーカは、粒子ビーム（３）により照射され、照射されたマーカはもはや蛍光放射線を放出しないような方式で損傷を受ける。これは、蛍光放射線束の減少に繋がる。この減少は検出される。サンプルに関して粒子ビーム（３）の位置を認識することにより、マーカが損傷された瞬間が理解され、従って、サンプルにおけるマーカの位置が又、理解される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
調べられるサンプルにおいて放射線により励起されるマーカを局所化する方法であって：
前記サンプルにマーカを与える段階；
第１放射線ビームでサンプルを照射する段階であって、その結果、励起領域がサンプルにおいて形成され、その励起領域においてマーカが励起される、段階；
前記励起に応じてマーカから発せられる蛍光放射線を検出する段階；及び
第２放射線ビームの支援により、前記励起領域の一部において蛍光放射線の検出を抑制する段階；
を有する方法であって、
前記第２放射線ビームは前記サンプルにおいて走査される収束粒子ビームであり；
前記粒子ビームの焦点は前記励起領域の断面より小さい断面を有し；
前記粒子ビームにおける前記粒子のエネルギーは、損傷の結果として、前記粒子により衝突されたマーカから発せられる蛍光放射線束を低下させるに十分であり；そして
前記サンプルに関して前記収束粒子ビームの位置は、前記蛍光放射線束が少なくとも前に決定された閾値により減少する瞬間に登録される；
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記粒子ビームの前記断面は、前記励起領域の前記断面より少なくとも１０倍小さい、ことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、励起は光子ビームを用いて起こる、ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れ一項に記載の方法であって、前記収束粒子ビームは収束イオンビームである、ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至３の何れ一項に記載の方法であって、前記収束粒子ビームは収束電子ビームである、ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れ一項に記載の方法であって、エッチングするように、収束粒子ビームによる照射中にガスが導入される、ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れ一項に記載の方法を実行するための装置であって：
マーカを励起するために第１放射線ビームを生成するための手段；
励起されたマーカから発せられる蛍光放射線束を検出するための検出手段；及び
第２放射線ビームを生成するための手段
を有する装置であって、
前記第２放射線ビームを生成するための前記手段は収束粒子ビームを生成し、前記粒子ビームはサンプルにおいて走査され；そして
登録手段は、検出された蛍光放射線束における所定の減少により前記サンプルに対して前記収束粒子ビームの一部を決定するために存在する；
ことを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調べられるサンプルにおいて放射線により励起可能なマーカを局所化する方法であって：
−  サンプルにマーカを与える段階；
−  第１放射線ビームによりサンプルを照射する段階であって、その結果、励起領域がサンプル中に形成され、その励起領域においてマーカが励起される、段階；
−  励起に応じてマーカから放射される蛍光放射線を検出する段階；及び
−  第２放射線ビームの支援により、励起領域の一部における蛍光放射線の検出を抑制する段階；
を有する方法に関する。
【０００２】
本発明は又、その方法を実行するために実施される装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
そのような方法については、米国特許第６，２５９，１０４号明細書に記載されている。
【０００４】
生物学及び組織学においては、例えば、生物学的サンプル中にどのような特定のプロセルがどこで生じるかに関する洞察を得るために、例えば、生物学的サンプル中の蛋白質、抗体、ヌクレオチド等の特定分子の位置を決定する必要がある。
【０００５】
蛍光顕微鏡（ＦＭ）は、これを可能にする、生物学及び組織学において一般に採用される方法である。このために、所謂、蛍光マーカ（以下、単に“マーカ”と呼ぶ）は重要な分子に付けられる。それらのマーカは、例えば、他の種類の抗体及び他の分子にそれ自体が付けられることなく、特定の種類の抗体に非常に固有的にそれ自体付けられることを特徴とする。更に、それらのマーカは、例えば、光子による励起に応じて、マーカが蛍光放射線を発することを特徴とする。
【０００６】
このようにして、例えば、このような種類の抗体にマーカを付けること、及び、続いて、マーカにより発せられる蛍光放射線によりマーカの位置を決定することにより、サンプル内の特定種類の抗体の位置を決定する可能性が得られる。
【０００７】
ＦＭのために用いられるマーカは、有機マーカと無機マーカとに分類することができることに留意する必要がある。
【０００８】
有機マーカは、一般に、芳香族環を有する。その例としては、ＦＩＴＣ（フルオロセイン−イソシアネート）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン−イソシアネート）及びＤＡＰＩ（ビスベンズイミド）がある。多くの種類の有機マーカが市販されていて、それらの各々はそれら自体の付加特性を有する。そのような有機マーカとしては、今日、例えば、米国オレゴン州ユージン市のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製のものがある。
【０００９】
それらの有機マーカの代表的な特性は、それらが限定された寿命を有することであり、光化学反応の影響下では、そのようなマーカの寿命は、例えば、１０５個の放出される光子に限定される。これは、マーカが励起されることができる時間である。これについては、後に再び説明する。更に、それらのマーカにおける蛍光作用は、それらが位置するサンプルにおいて、例えば、酸性度（ｐＨ）、温度、溶媒の圧力等の環境の影響を受ける。
【００１０】
無機マーカは、例えば、ナノ結晶が蛍光性を示す、数ｎｍ乃至数十ｎｍの範囲内の直径を有するＣｄＳｅのような無機材料のナノ結晶を有する。このようなナノ結晶は、蛋白質のような、マーキングされる分子にマーカを付け、そして、マーカの特定の付けられる挙動を決定する有機反応基に結合する。そのような無機マーカとしては、今日、例えば、米国オハイオ州ＷｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅのＢｉｏｃｒｙｓｔａｌ社製のものがある。
【００１１】
無機マーカは、非常に長い寿命と、有機マーカより環境の影響に対して低い感応性とを有することを特徴とする。
【００１２】
従来のＦＭの場合、蛍光マーカが存在するサンプルは、収束レーザビームのような光ビームを用いて照射される。照射された領域、即ち、所謂、励起領域においてマーカは、結果的に励起され、この励起に応じて、蛍光放射線束を放出する。その励起に応じて蛍光放射線が放出されたかどうかを検出することにより、マーカが励起領域において位置しているかどうかを決定することができる。この方法における空間分解能は、光ビームの焦点サイズにより決定される。一般に、この焦点は、放出される光の波長より小さくない。波長の所定の帯域幅の範囲内の光のみが特定の種類のマーカを励起するとみなされ、用いる波長を自由に選択することができない。結果的に、従来のＦＭの空間分解能は約５００ｎｍに限定される。
【００１３】
ＦＭのユーザ間には、好適には、分子の大きさ、即ち、数ｎｍにＦＭの空間分解能を継続して減少させることが要請されている。
【００１４】
上記引用した特許文献においては、空間分解能が従来のＦＭに対して改善された方法について記載されている。
【００１５】
サンプルは、その結果、第１放射線ビームを用いて短く照射され、その第１放射線ビームはサンプル内に励起領域を生成し、その後、第２放射線ビームが蛍光放射線の検出を抑制する。第１放射線ビームは、マーカを励起するために適切である色付きレーザビームである。第２放射線ビームは、マーカを励起除去（クエンチング）する幾らか異なる（赤みを帯びた）色を有する１つ又はそれ以上のレーザビームを有する。第１放射線ビームの強度プロファイルは中央に最大値を有する必要があり、第２放射線ビームの強度プロファイルは中央に最小値を有する必要がある。無励起は、好適には、励起後、数十ｐｓｅｃ内に生じる必要がある。
【特許文献１】米国特許第６，２５９，１０４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、上記の米国特許の参照文献に記載されている方法を用いて、より良好な空間分解能を達成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
このために、本発明に従った方法は：
−  第２放射線ビームは、サンプルにおいて走査される収束粒子ビームである。
−  その粒子ビームの焦点は、励起領域の断面より小さい断面を有する。
−  粒子ビームにおける粒子のエネルギーは、損傷の結果として、粒子により照射されたマーカから放出される蛍光放射線束を低下させるに十分である。
−  サンプルに対する収束粒子ビームの位置は、蛍光放射線束が少なくとも前に検出された閾値により減少される瞬間に登録される。
【００１８】
励起に応じて、蛍光放射線束がサンプルから放射される。この蛍光放射線束は、励起領域内に位置しているサンプル内の１つ又はそれ以上のマーカにより生成される。励起により得られる蛍光放射線束が前に決定された閾値により減少される場合、このことは、励起領域内のマーカが損傷を受けたためであるに違いない。
【００１９】
本発明は、マーカに対して人為的に損傷を与えることにより、その損傷の結果として、蛍光放射線束における減少が起こる瞬間に粒子ビームが位置しているところを決定することにより、マーカの位置を決定することができる。そのような意図的な損傷は、収束粒子ビームを用いてマーカ上に照射することにより実現される。
【００２０】
収束粒子ビームの生成は、それ自体、既知の技術であり、例えば、収束イオンビーム（ＦＩＢ）装置、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）装置及び環境型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）装置において採用されている。それらの装置は、例えば、１ｎｍのビーム焦点の断面積を有するサンプルに粒子ビームをフォーカシングすることができ、サンプルにおいてこのビームを走査することができる。それらの種類の装置の粒子ビームにおける粒子のエネルギーは、一般に、２００ｅＶより小さい領域から２０ｋｅＶより大きい領域まで調節される。そのような装置を用いて、それ故、マーカに損傷を与えるに十分である以上のエネルギーを有する粒子を生成することが可能である。
【００２１】
収束粒子ビームにおける粒子とマーカの相互作用のみによっては、所望の損傷は生じないが、相互作用領域においてフォーカシングされるビームによりもたらされる、Ｘ線光子及び二次電子のような二次粒子とマーカとの相互作用により又、生じることとなる。この結果として、マーカは、収束粒子ビームからある距離を置いたところでさえ、損傷を受けることとなり、このことは、正確度の低い位置の決定に繋がることとなる。電子顕微鏡の分野の熟達者に周知であるように、適切な粒子エネルギーの選択により、相互作用領域のサイズを十分小さく維持することができる。
【００２２】
本発明に従った方法の実施形態においては、励起は光子ビームにより起こる。
【００２３】
光子を用いてサンプルを照射することにより、マーカは励起され、その後、そのマーカは、この励起に応じて、光子を放出する。このような照射はフォーカシングされるレーザビームを用いてなされるが又、広帯域のスペクトル（“白色光”）を有する光ビームを用いてなされる。
【００２４】
マーカが、マーカ自体が付く抗体のような種類の分子に関して異なるばかりでなく、それらが励起される光の色及び放出される蛍光放射線の色に関して異なることを考慮すると数種類のマーカを同時に検出する目的で、白色光を用いることは特に魅力的であることに留意する必要がある。数種類のマーカがサンプル内に存在する場合、本発明に従った方法は、マーカの位置ばかりでなく、マーカの種類を決定するために用いられる。このことは、色毎に、換言すれば、マーカの種類毎に、その色（マーカの種類）の蛍光放射線束の減少が判定されるような方式で、蛍光放射線の検出のための検出器が具現化されるとき、マーカの位置ばかりでなく、マーカの種類を決定することが可能である。
【００２５】
本発明に従った方法の他の実施形態においては、収束粒子ビームは収束電子ビームである。
【００２６】
電子は、特に、化学的に変化する有機材料において非常に効果的である。例えば、そのような有機マーカの化学的変化の場合、マーカは、更なる蛍光放射線が放射されない程に著しく損傷されるようになる。
【００２７】
本発明に従った方法の他の実施形態においては、収束粒子ビームはイオンビームである。
【００２８】
当業者に周知であるように、数ｋｅＶのエネルギーを有するイオンは、それらが衝突（スパッタリング）する材料の表面を除去する特性を有する。このスパッタリングは、そこに位置するサンプル及びマーカの両方に対して生じる。それ故、イオンは、マーカに対して所望の損傷をもたらす上で非常に有効である。イオンを用いることの付随する有利点は、サンプル中の深いところに元々位置しているマーカはサンプルの表面にゆっくり現れ、その後、このマーカは損傷を受け、その位置が決定されることである。このようにして、サンプルにおいてマーカの３Ｄ位置決定を実行することが可能である。
【００２９】
本発明に従った方法の他の実施形態においては、エッチングを可能にするように、収束粒子ビームと共に照射中に、ガスを導入する。
【００３０】
サンプルから材料を除去するためにイオンビーム又は電子ビームと組み合わせたガスの使用自体は周知の技術である。この技術は、例えば、ＦＩＢ装置において適用される。収束粒子ビームと共にサンプルの照射中にこの技術を適用することにより、サンプルの表面は、サンプルにおける粒子ビームの走査中にエッチング除去される。このようにして、サンプル中の深いところに元々位置するマーカはサンプルの表面にゆっくりと現れ、その後、このマーカは損傷を受け、その位置が決定される。このようにして、サンプル中のマーカの３Ｄ位置決定を実行することが可能である。
【００３１】
以下、図面に基づいて、本発明について更に明らかにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
図１は、本発明に従った方法の実施のための装置の模式図である。イオンカラムのような粒子光学カラム１は、荷電粒子３の収束粒子ビームを生成する。粒子ビーム３は、サンプル支持台５上に位置付けられたサンプル４にフォーカシングされる。収束粒子ビーム３は、回折ユニット２の支援によりサンプル４において走査される。
【００３３】
サンプルから放出される二次電子のような荷電粒子は、Ｅｖｅｒｈａｒｄｔ−Ｔｈｏｒｎｌｅｙ検出器のような粒子検出器８により検出される。
【００３４】
収束粒子ビーム３のために必要な真空は、シーリング手段６の支援により真空チャンバ７をシーリングすることと、続いて、真空ポンプ（図示せず）を用いて、真空チャンバを真空引きすることとにより達成される。
【００３５】
サンプルが乾燥しないように低い水蒸気の残圧を維持することが、生物学的サンプルの場合に、有利であることに留意する必要がある。この技術自体、周知であり、例えば、ＥＳＥＭ（環境型走査電子顕微鏡）において適用されている。
【００３６】
ガス注入器９は、真空チャンバ７にエッチングガスを導入することを可能にし、それ故、収束粒子ビーム３の影響下でサンプル４から材料を除去することができる。
【００３７】
サンプル支持台５は、ガラスのような透明な材料から成る。サンプル４が収束粒子ビーム３による照射の結果として帯電されることから回避されるように、例えば、導電性材料の透明コーティングを、ガラスに適用することができる。収束粒子ビーム３及び光ビーム１１は、本質的に同じ位置１４においてサンプルに衝突する。サンプル４中のマーカから放出される蛍光放射線は、サンプル支持台５、レンズ１３及び半透過型ミラー１２を経由して検出器１６により検出される。レーザ１０から発せられた光に由来する散乱及び反射光が検出されないように、カラーフィルタ１５が半透過型ミラー１２と光検出器１６との間に置かれ、そのカラーフィルタはレーザの色を有する光が通過しないようにするが、蛍光放射線は通過するようにする。サンプル４から放射されるできるだけ多くの光を検出するために、検出器１６から離れる方向に発せられる光は、ミラー１７により検出器１６の方に反射される。
【００３８】
制御ユニット２０は、粒子ビーム３がサンプル４において走査される検出コイル２に制御信号を送信する。粒子ビームの偏向は、その結果、一般に、検出ユニットに供給される制御信号に比例する。
【００３９】
特定の瞬間に粒子検出器８から発せられる信号は、その瞬間に粒子ビーム３がサンプルに衝突する、サンプル４における位置から発せられる。ここで、サンプル４においてラスタ状に粒子ビーム３を走査すること及びモニタ２１上の画像２２を同期して構築することにより、それ故、輝度が粒子検出器８からの信号に比例し、サンプル４の走査領域の画像２２がモニタ２１上で可視化されるようになる。構築されたこの画像は又、制御ユニット２０によりなされる。
【００４０】
更に、制御ユニット２０はレーザを制御し、それ故、光ビームをオン及びオフに切り換える。
【００４１】
制御ユニット２０は又、光検出器１６から信号を受信し、蛍光放射線束の著しい減少が生じているかどうかを、その信号に基づいて判定する。“著しい減少”は、それ故、少なくとも前に決定された閾値による減少として理解される必要がある。そのような著しい減少が生じる瞬間、粒子ビーム３の位置は、この位置が走査コイル２の駆動により制御されるために、認識される。制御ユニット２０は、ここで、異なる色の輝点のような表示が、スクリーン２１上の対応する位置に現れるようにすることができる。
【００４２】
ビームが走査される領域にマーカが存在する場合、それらのマーカは、走査中、粒子ビームにより衝突される。その結果、マーカへの損傷が生じる。
【００４３】
図２Ａは、サンプルから発せられる蛍光放射線束を示す模式図である。走査の開始、即ち、Ｔ＝Ｔ０の瞬間、多数のマーカが蛍光を発するが、この場合は、６つのマーカを有する。走査中、それらのマーカは各々、損傷を受ける。そのような損傷の結果、蛍光放射線束は減少する。これは、瞬間４０−ｉにおいて図２Ａに模式的に示され、ここで、ｉは損傷されるべきｉ番目のマーカである。粒子検出器８から発せられる信号を描画する画像２２において、蛍光放射線束における変化が生じる瞬間に色が異なる輝点又は点を描画することにより、画像２２は、マーカがサンプル上で位置するところを容易に可視化することができる。
【００４４】
今日のコンピュータ技術を用いて、蛍光マーカの位置を示す、十字印、矩形印等の他の形のシンボルを画像２２に適用することが可能である。
【００４５】
図２Ｂは、粒子検出器８及び光検出器１６の両方から由来する情報を有する画像を模式的に示している。
【００４６】
粒子検出器８（Ｅｖｅｒｈａｒｄｔ  Ｔｈｏｒｎｌｅｙ検出器）は、異なる二次粒子の生成を伴う領域が異なる輝度（３１、３２）を用いて画像化される画像２２を生成することを可能にする。この画像２２においては、粒子ビームの位置３０−ｉにおいて、蛍光放射線束の著しい減少が判定され、換言すれば、その位置で、マーカが位置していることが又、示される。このようにして、サンプルにおいてマーカが位置しているところを簡単な方法でみることが可能である。
【００４７】
上記の実施形態が可能であり、それ故、光検出器は、異なる蛍光色により特徴付けられる異なるマーカを区別し、異なるマーカからの光を個別に処理することができることに留意する必要がある。
【００４８】
このように、異なる種類のマーカを区別することができるように、異なる種類のマーカを同時に検出すること、及び、例えば、画像２２においてシンボルの異なる色が付けられた輝点を用いることが可能である。
【００４９】
荷電粒子ビーム３により損傷を受ける結果以外の理由で、マーカが光子の放出を停止する必要があり、これは不正確な位置におけるそのマーカの描画に繋がることに又、留意する必要がある。このことは、蛍光放射線の品質が低下することを光検出器１６が検出するためであり、ビーム位置がその位置にマーカの存在との関連性を有していないとしても、その瞬間に粒子ビーム３に対応する位置において画像２２上に制御ユニット２０がマーカを描画するためである。
【００５０】
それ故、粒子ビーム３により照射された結果以外の何れの理由のために、マーカが蛍光を発することを停止することは、非常に好ましくない。
【００５１】
一部のマーカであって、特に、一部の有機マーカの寿命は、例えば、１０５個の放射光子に限定される。それ故、マーカが１０５個の光子を放出するタイムフレーム内に全体の励起領域を走査することは好ましい。
【００５２】
励起領域と走査領域を互いに関して中心合わせすることが重要であることに留意する必要がある。それらの２つの領域が互いに中心合わせされているとき、それらは、一般に、急速に中心合わせから外れるようにならない。そのような中心合わせは、それ故、周期的な調節として実行されることができる。そのような中心合わせを決定することができる種々の方法を考案することができる。
【００５３】
１つの可能な調節は、粒子ビームと粒子検出器の支援を有するスライド可能なダイヤフラム板における孔を画像化することを有し、それ故、その孔は、レーザビームの焦点の直径に略等しい直径を有する。ここでは、粒子ビームにより走査される領域に関して中心合わせされるまで、ダイヤフラム板をスライドさせることができる。続いて、ダイヤフラム板に対してレーザを方向付け、光の最大量がその孔に収容されて通過するようにすることにより、両方の領域は互いに中心合わせされる。その収容された光の量の決定は、例えば、真空チャンバ中で光検出器（図示せず）の支援によりなされる。
【００５４】
上記方法を実行するために説明した装置の実施形態において、粒子ビーム３及び光ビーム１１は反対方向からサンプル４に照射されるが、実際には同じ方向からサンプル４にそえらのビーム３、１１を照射するような方式でその装置を具現化することが又、可能である。このことは、特に、比較的厚いサンプルに対して有利であり、それにより、励起レーザビームはサンプル全体を貫通することはない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明に従った方法を実行するための装置の模式図である。
【図２】図２Ａは、本発明の方法の実行中にサンプルから発せられる蛍光放射線束における傾向を示す模式図であり、図２Ｂは、粒子検出器と光検出器の両方から由来する情報が存在する画像の模式図である。
【符号の説明】
【００５６】
１      粒子光学カラム
２      回折ユニット
３      荷電粒子ビーム
４      サンプル
５      サンプル支持台
６      シーリング手段
７      真空チャンバ
８      粒子検出器
９      ガス注入器
１０    レーザ
１１    光ビーム
１２    半透過型ミラー
１３    レンズ
１４    位置
１５    カラーフィルタ
１６    検出器
１７    ミラー
２０    制御ユニット
２１    モニタ
２２    画像
【図１】
2006145526.tif 000003
【図２】
2006145526.tif 000004