(57)【要約】【課題】            ヌクレオチド除去修復、特に紫外線損傷ＤＮＡの修復において、ＤＮＡ上の損傷部位を認識する機構を解明し、これを調節する因子をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】        哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）候補化合物の存在下でＸＰＣタンパク質と、ＤＤＢ２タンパク質とを接触させる工程、及び（ｂ）前記ＸＰＣタンパク質がＤＤＢ２タンパク質と結合するか否かを検出する工程を含み、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合を阻害するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復阻害剤と推定する。【選択図】          図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）候補化合物の存在下において、ＸＰＣタンパク質と、ＤＤＢ２タンパク質とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記ＸＰＣタンパク質がＤＤＢ２タンパク質と結合するか否かを検出する工程、
を含み、前記候補化合物がＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合を阻害するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復阻害剤と推定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＸＰＣタンパク質がＨＲ２３Ｂと複合体を形成し、及び／又は前記ＤＤＢ２タンパク質がＤＤＢ１タンパク質と複合体を形成した形態にある請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ユビキチン化反応条件下において、ＸＰＣ複合体と、ＵＶ−ＤＤＢ複合体と、候補化合物とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記複合体中のＸＰＣタンパク質、及び／又はＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化反応を検出する工程、
を含み、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質、及び／又は前記ＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化を抑制するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復阻害剤と推定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ＸＰＣ複合体は、少なくともＸＰＣタンパク質と、ＨＲ２３Ａ若しくはＨＲ２３Ｂ、又はこれらの機能的なドメインを含み、任意にセントリン２を含んでもよい請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレオチド除去修復は、紫外線照射により生じたＤＮＡ損傷を修復する機構である請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＵＶ−ＤＤＢ複合体は、ＤＤＢ１及びＤＤＢ２、又はそれらの機能的なドメインからなる請求項３〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ユビキチン付加反応条件は、少なくともＥ１、Ｅ２、Ｅ３、及びユビキチン又はその類似物を含む請求項３〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ３は、キュリン４Ａ、及びＲｏｃ１、又はそれらの機能的なドメインを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の方法によりスクリーニングされた阻害剤と、薬理学的に許容される塩とを含むことを特徴とする抗腫瘍剤との併用薬。
【請求項１０】
前記抗腫瘍剤が白金配位化合物である請求項９に記載の併用薬。
【請求項１１】
哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を促進する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）候補化合物の存在下において、ＸＰＣタンパク質と、ＤＤＢ２タンパク質とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合速度を測定する工程、
を含み、前記候補化合物がＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合を促進するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復促進剤と推定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記ＸＰＣタンパク質がＨＲ２３Ｂと複合体を形成し、及び／又は前記ＤＤＢ２タンパク質がＤＤＢ１タンパク質と複合体を形成した形態にある請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を促進する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）ユビキチン化反応条件下において、ＸＰＣ複合体と、ＵＶ−ＤＤＢ複合体と、候補化合物とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記複合体中のＸＰＣタンパク質、及び／又はＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化反応を検出する工程、
を含み、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質、及び／又は前記ＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化を促進するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復促進剤と推定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記ＸＰＣ複合体は、少なくともＸＰＣタンパク質と、ＨＲ２３Ａ若しくはＨＲ２３Ｂ、又はそれらの機能的なドメインを含み、任意にセントリン２を含んでもよい請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド除去修復は、紫外線照射により生じたＤＮＡ損傷を修復する機構である請求項１１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＵＶ−ＤＤＢ複合体は、ＤＤＢ１及びＤＤＢ２、又はそれらの機能的なドメインからなる請求項１１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ユビキチン付加反応条件は、少なくともＥ１、Ｅ２、Ｅ３、及びユビキチン又はその類似物を含む請求項１３〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｅ３は、キュリン４Ａ、及びＲｏｃ１、又はそれらの機能的なドメインを含む請求１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１〜１８の何れか一項に記載の方法によりスクリーニングされたヌクレオチド除去修復促進剤を含むことを特徴とする紫外線防護用組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物を含むことを特徴とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド除去修復能を調節する因子のスクリーニング方法に関し、さらに詳細には、紫外線によるＤＮＡ損傷を修復する哺乳動物細胞内の機構を抑制又は促進する因子のスクリーニング方法及びその調節因子の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含めたすべての生物は、外的又は内的要因により生じたゲノムＤＮＡ上の構造的異常を見つけて修復する多様な機構を進化の過程で獲得してきた。これらの機構がゲノムに関わる広範な病気の発生を防御している。なかでもヌクレオチド除去修復（Nucleotide excision repair：ＮＥＲ)の機構は、極めて広範なゲノム損傷に対応する重要な経路であり、ＤＮＡの二重らせん構造にひずみを生じる種々の塩基障害、例えば、紫外線誘導シクロブタン型ピリミジン２量体（ＣＰＤ）、（６−４）光産物、及び多くの化学物質によって誘導されるかさ高い付加物などを除去する。このヌクレオチド除去修復能の欠損は、色素性乾皮症（ＸＰ）やコケイン症候群（ＣＳ）等のいくつかのヒト常染色体劣性遺伝疾患と関連している（例えば、非特許文献１及び２参照）。色素性乾皮症の患者は、臨床的に紫外線に対する皮膚の過敏症と、皮膚がんにかかりやすい特徴を有する。ヌクレオチド除去修復に欠損を示す色素性乾皮症の７つの遺伝的相補性群（ＸＰ−Ａ〜Ｇ群）及びコケイン症候群の２つの遺伝的相補性群（ＣＳ−Ａ及びＣＳ−Ｂ群）が同定され、これらに対するすべての責任遺伝子（ＸＰＡ〜ＸＰＧ、ＣＳＡ及びＣＳＢ）はクローン化されている（例えば、総説として非特許文献３参照）。
【０００３】
哺乳動物のヌクレオチド除去修復は、２つの異なる副経路からなる。１つは「ゲノム全体の修復」(global genome NER：ＧＧ−ＮＥＲ)であり、他の１つは「転写と共役したＤＮＡ修復」(transcription-coupled NER：ＴＣ−ＮＥＲ)である。これら２つの副経路の主な違いは、損傷を受けた塩基を検出する機構にあると考えられる。ＴＣ−ＮＥＲにおいては、ＲＮＡポリメラーゼIIが損傷部位で立ち止まり、修復反応の引き金を引く（例えば、非特許文献４参照）。一方、ＧＧ−ＮＥＲにおいては、タンパク質因子が特異的に損傷部位に結合する。ＸＰ−Ｃ群の責任遺伝子産物であるＸＰＣタンパク質は、ＧＧ−ＮＥＲ特異的な損傷認識において不可欠な役割を果たしている（例えば、非特許文献５〜７参照）。
【０００４】
このＸＰＣタンパク質は、細胞内においてセントリン２、及び酵母Ｒａｄ２３ｐに相同な２種類の哺乳類ホモローグのいずれか（ＨＲ２３Ａ，又はＨＲ２３Ｂ）と結合し、ヘテロ３量体複合体として存在している（例えば、非特許文献８〜１０参照）。この複合体は、インビトロにおいて、紫外線誘起（６−４）光産物をはじめ、ヌクレオチド除去修復の対象となる種々の損傷部位に結合する（例えば、非特許文献１１及び１２参照）。しかしながら、生化学的な研究によれば、ＸＰＣ複合体は、損傷そのものよりも、むしろ損傷によりＤＮＡに誘起されたある種の二次的な構造を認識する構造特異的なＤＮＡ結合因子であることが明らかになっている（例えば、非特許文献１３参照）。ＸＰＣ複合体のこれらの生化学的特徴は、ＧＧ−ＮＥＲが構造的に共通性を持たない様々な損傷を検出できることの説明にもなる。また、細胞に紫外線照射するとＸＰＣの一部が損傷特異的な翻訳後修飾を受け、高分子量領域でラダー状のバンドとして検出されることが見出され、その分子量からマルチユビキチン化と考えられている。しかしながら、このＸＰＣタンパク質のユビキチン化がどのような働きをしているかについては未だ明らかではない。
【０００５】
紫外線損傷ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＶ−ＤＤＢ）もまたＧＧ−ＮＥＲによる損傷認識と関係すると思われる。ＵＶ−ＤＤＢは、ＤＤＢ１（ｐ１２７）とＤＤＢ２（ｐ４８）とからなるヘテロ２量体複合体であり、損傷ＤＮＡ、特に紫外線誘発（６−４）光産物に対してＸＰＣよりもはるかに高い結合力を有することが知られている（例えば、非特許文献１１、１４〜１６参照）。正常なＤＤＢ２遺伝子は、色素性乾皮症（ＸＰ）Ｅ群の遺伝的相補性を有し、この群に属する患者は、ＵＶ−ＤＤＢの損傷結合能力を失っている（例えば、非特許文献１７参照）。
【０００６】
ＤＮＡ損傷を検出できる極めて高い感受性にもかかわらず、ＵＶ−ＤＤＢは必ずしも全てのタイプのＧＧ−ＮＥＲにとって必要ではない。例えば、無細胞ＮＥＲ反応は、ＵＶ−ＤＤＢなしでもうまく再構成されるが（例えば、非特許文献１８及び１９参照）、ある条件下では促進効果を有する（例えば、非特許文献２０及び２１参照）。しかしながら、ＵＶ−ＤＤＢ活性を欠失するＸＰ−Ｅ群細胞では、（６−４）光産物のＧＧ−ＮＥＲは中程度に害されるだけであるが、ゲノム全体からのＣＰＤの除去は著しく低下する（例えば、非特許文献２２参照）。さらに、げっ歯類細胞における機能的なヒトＤＤＢ２の異所性発現はＣＰＤのＧＧ−ＮＥＲを増強し、紫外線誘発突然変異を抑制する（例えば、非特許文献２３参照）。これらの知見はＧＧ−ＮＥＲのためのＣＰＤの認識においてＵＶ−ＤＤＢが重要な役割を果たすことを示唆する。核への局所的な紫外線照射において、ＵＶ−ＤＤＢはＸＰＣが存在しなくても損傷領域へ局在する（例えば、非特許文献２４参照）。しかしながら、ＧＧ−ＮＥＲのための損傷認識において、ＸＰＣとＵＶ−ＤＤＢが機能的に関連しているかについては明らかではない。ＵＶ−ＤＤＢが（６−４）光産物に極めて高い結合力を持つことの正確な役割についても不明である。
【０００７】
興味深いことに、ＵＶ−ＤＤＢは、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の構成要素であるキュリン４Ａ、Ｒｏｃ１及びＣＯＰ９シグナロソームと共に大きな複合体を形成することが最近明らかとなった（例えば、非特許文献２５参照）。ＵＶ−ＤＤＢが結合したＥ３は細胞への紫外線照射によって活性化されると思われるが、このユビキチンリガーゼ活性の生理的な基質は未だ知られていない。
【０００８】
【非特許文献１】Friedberg, E.C. (2001). Nat. Rev. Cancer 1, 22-33
【非特許文献２】Hoeijmakers, J.H.J. (2001). Nature 411, 366-367
【非特許文献３】Bootsma, D., Kraemer, K. H., Cleaver, J.E., and Hoeijmakers, J.H.J. (1997). The metabolic basis of inherited disease, C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, and D. Valle, eds. (New York, NY, McGraw-Hill Book Co.), pp.245-274.
【非特許文献４】Tornaletti, S., and Hanawalt, P.C. (1999).  Biochimie 81,   139-146
【非特許文献５】Riedl, T., Hanaoka, F., and Egly, J.-M. (2003). EMBO J. 22, 5293-5303.
【非特許文献６】Sugasawa, K., Ng, J.M.Y., Masutani, C., Iwai, S., van der Spek, P.J., Eker, A.P.M., Hanaoka, F., Bootsma, D., and Hoeijmakers, J.H.J. (1998).  Mol. Cell 2, 223-232.
【非特許文献７】Volker, M., Mone, M.J., Karmakar, P., van Hoffen, A., Schul, W., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J.H.J., van Driel, R., van Zeeland, A.A., and Mullenders, L.H.F. (2001).  Mol. Cell 8, 213-224.
【非特許文献８】Araki, M., Masutani, C., Takemura, M., Uchida, A., Sugasawa, K., Kondoh, J., Ohkuma, Y., and Hanaoka, F. (2001). J. Biol. Chem. 276, 18665-18672.
【非特許文献９】Masutani, C., Sugasawa, K., Yanagisawa, J., Sonoyama, T., Ui, M., Enomoto, T., Takio, K., Tanaka, K., van der Spek, P.J., Bootsma, D., et al., (1994). EMBO J. 13, 1831-1843.
【非特許文献１０】Shivji, M.K.K., Eker, A.P.M., and Wood, R.D. (1994). J. Biol. Chem. 269, 22749-22757.
【非特許文献１１】Batty, D., Rapic'-Otrin, V., Levine, A.S., and Wood,R.D. (2000). J. Mol. Biol. 300, 275-290.
【非特許文献１２】Sugasawa, K., Okamoto, T., Shimizu, Y., Masutani, C., Iwai, S., and Hanaoka, F. (2001). Genes Dev. 15, 507-521.
【非特許文献１３】Sugasawa, K., Shimizu, Y., Iwai, S., and Hanaoka, F. (2002). DNA Repair 1, 95-107.
【非特許文献１４】Fujiwara, Y., Masutani, C., Mizukoshi, T., Kondo, J., Hanaoka, F., and Iwai, S. (1999). J. Biol. Chem. 274, 20027-20033.
【非特許文献１５】Reardon, J.T., Nichols, A.F., Keeney, S., Smith, C.A., Taylor, J.S., Linn, S., and Sancar, A. (1993). J. Biol. Chem. 268, 21301-21308.
【非特許文献１６】Treiber, D.K., Chen, Z., and Essigmann, J.M. (1992). Nucleic Acids Res. 20, 5805-5810.
【非特許文献１７】Chu, G., and Chang, E. (1988). Science 242, 564-567.
【非特許文献１８】Araujo, S.J., Tirode, F., Coin, F., Pospiech, H., Syvaoja, J.E., Stucki, M., Hubscher, U., Egly, J.-M., and Wood, R.D. (2000).  Genes Dev. 14, 349-359.
【非特許文献１９】Mu, D., Park, C.H., Matsunaga, T., Hsu, D.S., Reardon, J.T., and Sancar, A. (1995). J. Biol. Chem. 270, 2415-2418.
【非特許文献２０】Aboussekhra, A., Biggerstaff, M., Shivji, M.K.K., Vilpo, J.A., Moncollin, V., Podust, V.N., Protic, M., Hubscher, U., Egly, J.-M., and Wood, R.D. (1995). Cell 80, 859-868.
【非特許文献２１】Wakasugi, M., Shimizu, M., Morioka, H., Linn, S., Nikaido, O., and Matsunaga, T. (2001).  J.Biol. Chem. 276, 15434-15440.
【非特許文献２２】Hwang, B.J., Ford, J.M., Hanawalt, P.C., and Chu, G. (1999).  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 424-428.
【非特許文献２３】Tang, J.Y., Hwang, B.J., Ford, J.M., Hanawalt, P.C., and Chu, G. (2000).  Mol. Cell 5, 737-744.
【非特許文献２４】Wakasugi, M., Kawashima, A., Morioka, H., Linn, S., Sancar, A., Mori, T., Nikaido, O., and Matsunaga, T. (2002).  J.Biol. Chem. 277, 1637-1640.
【非特許文献２５】Groisman, R., Polanowska, J., Kuraoka, I., Sawada, J., Saijo, M., Drapkin, R., Kisselev, A.F., Tanaka, K., and Nakatani, Y. (2003). Cell  113, 357-367.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、ヌクレオチド除去修復機構、特に紫外線損傷ＤＮＡの修復機構において、ＸＰＣ複合体及びＵＶ−ＤＤＢ複合体が重要な役割を果たしていることが示唆されているが、これらのタンパク質複合体がどのような調節機構によってＤＮＡ上の損傷部位を迅速に認識するかは未だ明らかではない。また、上記ＸＰＣ複合体のユビキチン化が、ＤＮＡ修復機構においてどのような意義を有するかも知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、かかる課題を解決することによってなされたものであり、第一に、ヌクレオチド除去修復機構、特に紫外線によるＤＮＡ損傷が発生した場合において、ＵＶ−ＤＤＢがまずこれを認識して結合し、その後タンパク質間相互作用を介してＸＰＣをリクルートすることを明らかにした。さらに、損傷部位でＵＶ−ＤＤＢがＸＰＣによって置き換えられて修復反応が進行するが、このときユビキチン付加反応が重要な役割を果たすことを見出し、このような損傷ＤＮＡの認識機構の解明に基づいて本発明のスクリーニング方法を完成した。
【００１１】
すなわち、第一の視点において、本発明は、哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）候補化合物の存在下でＸＰＣタンパク質と、ＤＤＢ２タンパク質とを接触させる工程、及び（ｂ）前記ＸＰＣタンパク質がＤＤＢ２タンパク質と結合するか否かを検出する工程を含み、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合を阻害するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復阻害剤と推定することを特徴とする。
【００１２】
別の視点において、本発明は、哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）ユビキチン化反応条件下でＸＰＣ複合体と、ＵＶ−ＤＤＢ複合体と、候補化合物とを接触させる工程、及び（ｂ）前記複合体中のＸＰＣタンパク質、及び／又はＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化反応を検出する工程を含み、前記候補化合物がＸＰＣタンパク質、及び／又は前記ＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化を抑制するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復阻害剤と推定することを特徴とする。
【００１３】
また、異なる視点において、本発明は、哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を促進する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）候補化合物の存在下において、ＸＰＣタンパク質と、ＤＤＢ２タンパク質とを接触させる工程、及び（ｂ）前記ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合速度を検出する工程を含み、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合を促進するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復促進剤と推定することを特徴とする。
【００１４】
さらに異なる視点において、本発明は、哺乳動物細胞においてヌクレオチド除去修復を促進する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）ユビキチン化反応条件下において、ＸＰＣ複合体と、ＵＶ−ＤＤＢ複合体と、候補化合物とを接触させる工程、及び（ｂ）前記複合体中のＸＰＣタンパク質、及び／又はＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化反応を検出する工程を含み、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質、及び／又は前記ＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化を促進するとき、該候補化合物をヌクレオチド除去修復促進剤と推定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、紫外線照射を受けた哺乳動物細胞内でＸＰＣタンパク質がＵＶ−ＤＤＢ複合体との相互作用を介してユビキチン化されること、そしてこれらの反応がＮＥＲにおける紫外線損傷ＤＮＡの認識に重要な役割を果たしているという発見に基づいてなされたものである。従って、本発明のスクリーニング方法を用いることにより損傷ＤＮＡの認識機構を阻害又は促進するために有効な新規な調節因子を取得することができる。さらに、本発明の方法により得られた調節因子は、ポリユビキチン化されたＸＰＣタンパク質、及び／又はＤＤＢ２タンパク質による細胞内のシグナル伝達機構をも制御できる可能性があり、紫外線照射に対する細胞のＤＮＡ修復機構を理解し、これに関連する病気の予防や治療への応用に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（定義）
本明細書において、用語「ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）」とは、紫外線によって誘起されるピリミジン２量体をはじめ、広範なＤＮＡの塩基損傷を対象とする修復機構をいう。ＮＥＲはさまざまなタイプの損傷をＤＮＡから取り除くことができるが、その中でも生物が日常的に受ける可能性が最も高いものとしてシクロブタン型ピリミジン２量体（ＣＰＤ）や（６−４）光産物といった紫外線による損傷があげられる。この他に、シスプラチンに代表されるＤＮＡ鎖内架橋、アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）などによるかさの大きい塩基付加体などがＮＥＲの対象となることが知られている。ＮＥＲ反応が開始されるためには、まずＤＮＡ損傷の存在が何らかの形で認識される必要がある。ＴＣＲにおいては、損傷によってＲＮＡポリメラーゼの進行が妨害されること自体が、損傷認識であると考えられているが、ＧＧ−ＮＥＲ経路は非転写鎖の損傷も修復することから、ＴＣＲとは異なる損傷認識機構が働いているはずである。ＤＮＡ損傷が認識された後は、ＴＦIIＨなどによって損傷周辺の二本鎖ＤＮＡが一本鎖状態に巻き戻され、続いて２種類のエンドヌクレアーゼＸＰＦ−ＥＲＣＣ１複合体とＸＰＧタンパク質によって損傷の両側で一本鎖切断が起こり、損傷塩基を含むオリゴヌクレオチドが切り出される。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ（δ又はε）、ＰＣＮＡやＲＦ−ＣによるＤＮＡ修復合成及びＤＮＡリガーゼＩによるＤＮＡ鎖の再結合が行われて完了する。
【００１７】
本発明において、この損傷認識の初期過程は、図７に示した紫外線誘起ＵＶ−ＤＤＢ依存性のＸＰＣタンパク質のユビキチン化によって説明される。図７を参照すると、紫外線が照射されない細胞ではＵＶ−ＤＤＢと会合したＥ３はＣＯＰ９シグナロソーム（ＣＳＮ）との相互作用によって不活性化されている。従って、ＸＰＣはＵＶ−ＤＤＢと相互作用してもユビキチン化されない。続いて、紫外線が照射されるとＵＶ−ＤＤＢは、損傷、特に（６−４）光産物に結合することによって傷を受けたクロマチンに移行し、ＣＳＮが解離してキュリン４ＡがＮＥＤＤ８付加(neddylation)を受けることによってＥ３が活性化される。ＵＶ−ＤＤＢの損傷結合はさらにＥ３活性を促進する。活性化されたＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体は、続いてタンパク質−タンパク質相互作用を介してＸＰＣをリクルートし、ＸＰＣ、ＤＤＢ２及びキュリン４Ａを損傷部位でユビキチン化する。ポリユビキチン化されたＵＶ−ＤＤＢは損傷ＤＮＡへの結合能を失うが、ＸＰＣのＤＮＡ結合能はユビキチン化によって増強される。ユビキチン化されたＤＤＢ２はプロテアソームにより分解されるが、ユビキチン化されたＸＰＣは脱ユビキチン化を通じて非修飾型に復帰する。本明細書においてこのような機構を「損傷ＤＮＡの認識」という。
【００１８】
用語「ＸＰＣ］又は「ＸＰＣタンパク質」とは、公知のヒトＸＰＣタンパク質(Masutani C. et al., EMBO J. 13(8):1831-1843, 1994; GenBnk Accession No. NM_004628）又は哺乳動物におけるそのホモローグのことをいう。ヒトＸＰＣタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示すが、この遺伝子配列情報には複数の一塩基多型（ＳＮＰｓ）が知られており、その結果アミノ酸置換の生じた変異体タンパク質も本発明のＸＰＣタンパク質に含まれる。すなわち、配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド除去修復における損傷ＤＮＡの認識能を有するタンパク質である。ＸＰＣタンパク質の損傷ＤＮＡ認識能は、例えば、損傷ＤＮＡとの結合アッセイにより測定することができる。
【００１９】
本明細書において、用語「ＸＰＣ複合体」とは、少なくともＸＰＣタンパク質とＨＲ２３Ａ、又はＨＲ２３Ｂを含み、任意にセントリン２を含んでいてもよい複合体をいう。ＨＲ２３Ａ、及びＨＲ２３Ｂは、酵母のＲａｄ２３のヒトホモローグタンパク質（非特許文献９；GenBnk Accession No. NM_005053、NM_002874）又は哺乳動物におけるそのホモローグのことをいう。セントリン２とは、カルシウム結合タンパク質ファミリーに属し、染色体のセントロソームの構成成分である。藍藻からヒトまで高度に保存されており、染色体の複製や分離に重要な役割を果たすと考えられている。ヒトセントリン２のアミノ酸配列は、例えば、GenBnk Accession No. NM_004344に開示されている。また、本発明においてＸＰＣ複合体は、これらの各タンパク質の一部分であって、その機能的なドメインから構成されてもよい。
【００２０】
用語「ＵＶ−ＤＤＢ］又は「ＵＶ−ＤＤＢ複合体」とは、２つのサブユニットＤＤＢ１及びＤＤＢ２からなるＤＮＡ損傷結合タンパク質複合体をいい、ヒトの場合、大サブユニット（１２７ｋＤａ）のＤＤＢ１タンパク質(GenBnk Accession No. NM_001923)と、小サブユニット（４８ｋＤａ）のＤＤＢ２タンパク質(GenBnk Accession No. NM_000107)からなる。ヒトＤＤＢ２タンパク質は配列番号４に示したアミノ酸配列からなり、直接ＤＮＡ、及びＸＰＣタンパク質との結合に関与すると考えられる。また、ＤＤＢ２遺伝子は癌抑制遺伝子産物であるｐ５３による発現制御を受けていることも知られている。
【００２１】
用語「ユビキチン化」又は「ユビキチン付加反応」とは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）による一連の反応でＡＴＰ依存的にユビキチンを標的タンパク質に付加する反応をいう。ユビキチンは真核細胞中に存在する７６アミノ酸からなる高度に保存されたタンパク質である。ユビキチン化には３種の異なる酵素の作用が必要である。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）がユビキチンに結合し、それをユビキチン結合酵素（Ｅ２）に転移し(Haas and Rose，1982;Pickart and Rose，1985)、この酵素が続いてユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の助けをかりてユビキチン残基を基質のリシン残基に共有結合させる。基質タンパク質のリシン残基に共有結合した各ユビキチンは、ユビキチン配列自体のリシン残基においてさらにユビキチン化される。マルチユビキチン化は、タンパク質分解酵素の複合体であるプロテアソームによる迅速分解のために基質をターゲティングするソーティング（選別）シグナルとして作用する(Chauら，1989)。このユビキチンシステムにおける基質特異性は、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）に依存している。典型的なＲＩＮＧ型Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質、アダプタータンパク質、基質認識サブユニット及びキュリンを含む。最もよく知られているＲＩＮＧ型Ｅ３はＳＣＦ（Ｓｋｐ１、Ｃｄｃ５３／キュリン、Ｆボックスタンパク質）である。哺乳動物のキュリンファミリーは６種類（キュリン１、２、３、４Ａ、４Ｂ及び５）が存在し、ＳＣＦＳｋｐ２の構成要素であるキュリン１が最もよく研究されている。本発明において使用されるユビキチンリガーゼ（Ｅ３）は、ＵＶ−ＤＤＢ複合体と相互作用しＤＤＢ２タンパク質及びＸＰＣタンパク質を基質とするものであれば特に制限されないが、好ましくは、キュリン４Ａ及びＲｏｃ１を用いることができる。
【００２２】
（ヌクレオチド除去修復調節因子のスクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、まず、ＧＧ−ＮＥＲの初期段階、すなわち、損傷ＤＮＡの認識機構において、ＸＰＣタンパク質と、ＵＶ−ＤＤＢ複合体との相互作用が重要な役割を果たし、特にＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質が直接相互作用してこれらを含むタンパク質複合体が損傷を受けたＤＮＡ上で結合することによってＸＰＣタンパク質が損傷部位にリクルートされるという知見に基づくものである。すなわち、まず候補化合物の存在下でＸＰＣタンパク質と、ＤＤＢ２タンパク質とを接触させる。ここで、候補化合物とは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、又はその他の有機化合物若しくは無機化合物でありうる。これらは化学合成された化合物ライブラリー又は細菌、カビ、放線菌などの培養物中の化合物からなる生物学的混合物であってもよい。次に、前記ＸＰＣタンパク質がＤＤＢ２タンパク質と結合するか否かを検出する（結合する場合にはその結合速度を測定する）。この検出手段は、ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との相互作用を調べるようにデザインされた、どのような適切なアッセイ系で実施してもよい。例えば、免疫沈降法若しくはイムノブロット法と呼ばれる特異的な抗体を用いる方法、ファージディスプレイ法(Smith, G.P., Science (1985) Vol.228, pp.1315-1317)、酵母のツーハイブリッド法（米国特許第５２８３１７３号、及びFields, S., Song, O., Nature (1989) Vol. 340, p.245）又はプロテインチップ法（特開２００１−２４２１１６、及び米国特許第６３６５４１８号）などを用いることができる。
【００２３】
典型的な１つのアッセイ方法としてＧＳＴ−プルダウンアッセイがあり、例えば、ＧＳＴと融合したＸＰＣタンパク質をコードする遺伝子を動物細胞や大腸菌細胞内で発現し、グルタチオン−アガロースビーズ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。ＵＶ−ＤＤＢ複合体は、精製されたものでも、あるいは細胞のライセートの何れでもよく、また、放射性同位元素で標識されていてもよい。このＧＳＴ融合ＸＰＣタンパク質と、ＵＶ−ＤＤＢ複合体とを、候補化合物の存在下、グルタチオンアガロースビーズと共にインキュベートし、ビーズから回収したＵＶ−ＤＤＢ複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング、オートラジオグラフィー、又はレポータータンパク質の酵素活性等により検出する。
【００２４】
他の１つの方法としては、レポータータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）類似性の蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いるＦＲＥＴ(fluorescence resonance energy transfer)法により、候補化合物の存在下でＸＰＣタンパク質とＵＶ−ＤＤＢ複合体との相互作用を検出することができる。ＦＲＥＴは励起されたフルオロフォア供与体から、その約６０Å以内にある受容体フルオロフォアへのエネルギー移行現象である。第一のフルオロフォアの励起後に、適当なフィルターを用いて第二のフルオロフォアからの発光を検出するか、または供与体の蛍光半減期を変えることで検出できる(Tsien RY, Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509-544)。通常用いられている２つのフルオロフォアは、ＧＦＰの変異体であるシアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein:ＣＦＰ）及び黄色蛍光タンパク質(yellow fluorescent protein:ＹＦＰ）である(Miyawaki, A., Dev. Cell Vol. 4, pp.295-305)。
【００２５】
このようなアッセイ系において、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合を阻害するときは、損傷ＤＮＡの認識機構が阻害されるためＮＥＲの進行が抑制される。その結果、該候補化合物はヌクレオチド除去修復阻害剤と推定される。反対に、前記候補化合物が前記ＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質との結合を促進するときは、該候補化合物をヌクレオチド除去修復促進剤と推定することができる。
【００２６】
１つの実施形態において、前記ＸＰＣタンパク質は、ＨＲ２３Ａ、又はＨＲ２３Ｂと複合体を形成した形態にあるもの、すなわち、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ａ、又はＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ複合体であってもよい。ＸＰＣタンパク質は、好ましくは配列番号２に示したアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するタンパク質であり、かつ損傷ＤＮＡの認識能を有するタンパク質である。また、前記ＤＤＢ２タンパク質はＤＤＢ１タンパク質と複合体を形成した形態にあるもの、すなわち、ＵＶ−ＤＤＢ複合体であってもよい。ＤＤＢ２タンパク質は、好ましくは配列番号４に示したアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するタンパク質であり、かつ損傷ＤＮＡの認識能を有するタンパク質である。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、当該配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定することができる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。
【００２７】
他の実施形態においては、まず、ユビキチン化反応条件下において、ＸＰＣ複合体と、ＵＶ−ＤＤＢ複合体と、候補化合物とを接触させる。次に、前記複合体中のＸＰＣタンパク質、及び／又はＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化反応を検出する。この検出手段は、ＸＰＣタンパク質及びＤＤＢ２タンパク質がユビキチン化されているか否かを検出できるようにデザインされた、どのような適切なアッセイ系で実施してもよい。例えば、インビトロ無細胞系で実施することができ、この系には、前記各タンパク質複合体と候補化合物とユビキチンが、ユビキチン化付加反応に必要とされる他のタンパク質成分や低分子化合物と共に供給される。あるいは、前記タンパク質複合体をユビキチン化しうる哺乳動物細胞抽出液を用いてユビキチン付加反応を行うこともできる。
【００２８】
さらに、このアッセイ系は、ＸＰＣ複合体及びＵＶ−ＤＤＢ複合体中の各タンパク質を発現させることができる発現ベクターを含有する宿主細胞において実施してもよい。
【００２９】
好ましい実施形態において、前記ＸＰＣ複合体は、ＸＰＣタンパク質及びＨＲ２３Ａ、若しくはＨＲ２３Ｂ又はこれらの機能的なドメインを含み、任意にセントリン２を含んでもよい。また、前記ＵＶ−ＤＤＢ複合体は、ＤＤＢ１及びＤＤＢ２からなるか、又はそれらの機能的なドメインから構成されてもよい。前記ユビキチン付加反応条件は、少なくともＥ１、Ｅ２、Ｅ３、及びユビキチン又はその類似物を含み、その他にＡＴＰなどのエネルギー源及び適切な緩衝液成分を含むことができる。前記Ｅ３は、キュリン４Ａ、及びＲｏｃ１を含むことが好ましく、又はそれらのタンパク質は、ユビキチン化反応に必要な機能的なドメインから構成されてもよい。
【００３０】
このようなアッセイ系において、前記候補化合物がＸＰＣタンパク質、及び／又は前記ＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化を抑制するときは、損傷ＤＮＡ認識の初期過程が阻害されるためＮＥＲの進行が抑制される。例えば、ＸＰＣタンパク質のユビキチン化が抑制されると損傷ＤＮＡへの結合性が弱く、一方、ＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化が抑制されるとＤＮＡ上の損傷部位から遊離されず、ＵＶ−ＤＤＢ複合体が損傷部位に留まることによってＮＥＲの進行を阻害すると考えられる。従って、該候補化合物はヌクレオチド除去修復阻害剤と推定される。逆に、前記候補化合物がＸＰＣタンパク質とＤＤＢ２タンパク質のユビキチン化を促進するときは、ユビキチン化されたＸＰＣタンパク質のＤＮＡ結合能が向上する。一方、ユビキチン化されたＤＤＢ２が速やかに分解を受けて損傷ＤＮＡ部位から遊離しＮＥＲの進行速度が向上するため、該候補化合物をヌクレオチド除去修復促進剤と推定することができる。
【００３１】
（ヌクレオチド除去修復阻害剤の利用）
本発明のスクリーニング方法によって得られたヌクレオチド除去修復阻害剤は、細胞のヌクレオチド除去修復機構を阻害することが有効となる種々の用途に使用することができる。例えば、１つの用途として、抗腫瘍剤との併用薬が挙げられる。腫瘍、特に悪性固形腫瘍に対する治療、抑制、予防等の薬剤として、現在種々の化学療法剤が用いられているが、何れの薬剤においても腫瘍の縮小効果は認められるものの、薬剤耐性や再発などの問題があり、また副作用を軽減するために相乗効果を有する併用薬の開発が期待されている。シスプラチンに代表される白金配位化合物はＤＮＡ鎖内架橋作用により抗腫瘍活性を示す化合物として知られており、本発明の方法により得られたヌクレオチド除去修復阻害剤との併用によりその抗腫瘍活性が増強されることが期待される。シスプラチン又はシス−ジクロロジアンミン白金（ＩＩ）は、長年、種々のヒト悪性腫瘍の治療において化学療法剤として使用されてきた。さらに近年、他のジアミノ−白金錯体（例えば、スピロプラチナムやカルボプラチナムなど）も、種々のヒト悪性腫瘍の治療における化学療法剤としての有効性を示している。これらはヒトにおける化学療法剤として広く使用されているが、全ての患者において、また全てのタイプの腫瘍に対して治療学的に有効であるというわけではない。その有効性の増大を期待して他の化学療法剤との併用、例えば、肺癌に対してはシスプラチンとビンデシンの併用（Garalla, R.J.et al., Ann. Intern. Med., 95, 414-420, 1980）、シスプラチンとＶＰ−１６との併用(Congeval, E. et al., Cancer, 51, 2751-2756, 1982)等数多く試みられているが、何れも有効率の改善は認められるものの完全に満足できるものではない。このような白金配位化合物としては、シスプラチン、シス−ジアンミンジコア白金（ＩＩ）−イオン、ジアンミン（１，１−シクロブタンカルボキシラト）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）、スピロプラチン、イソプラチン等を含むがこれらに限定されない。
【００３２】
（ヌクレオチド除去修復促進剤の利用）
一方、本発明のスクリーニング方法によって得られたヌクレオチド除去修復促進剤は、細胞のヌクレオチド除去修復機構を促進することが有効となる種々の用途に使用することができる。例えば、紫外線による障害を予防するための紫外線防護剤として使用することができる。現在種々の紫外線防護効果を持つ製品が開発されているが、これらは主に紫外線を散乱させる紫外線散乱剤や紫外線吸収剤であり、例えばこれらを化粧料中に分散させて使用している。化粧料中に配合される紫外線散乱剤としては、微粒子酸化チタンや微粒子酸化亜鉛等が挙げられる。また、紫外線吸収剤としては、オクチルシンアメート、エチル−４−イソプロピルシンナメート等が挙げられる。これらの紫外線防護剤は皮膚の表面に塗布して紫外線による皮膚の損傷を防護する。本発明の紫外線防護剤は、化粧料に含有させて皮膚細胞の持つヌクレオチド除去修復機能を高めて紫外線障害に対する皮膚の抵抗性を高めると考えられるため、ＸＰやＣＳ等の遺伝的疾患の患者のみならず、一般正常人にとっても有用であろう。
【実施例１】
【００３３】
以下、実施例として、細胞の紫外線照射に応答してＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体がＸＰＣ複合体をユビキチン化することを示す実験例を示す。これらの実施例は、ヌクレオチド除去修復の分子論的機構について、上記２つの認識因子が機能的に関連するという知見を提供し、よって本発明の新規な技術的思想を基礎付けるものであるが、本発明は実施例に記載された具体的な事項によって何ら限定されるものではない。
【００３４】
１  方法
［細胞株及び細胞培養方法］
ＷＩ３８  ＶＡ１３細胞、並びにＸＰ及びＣＳ患者由来のその他のヒト線維芽細胞株は、１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地中、３７℃にて培養した。種々のチャイニーズハムスター細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にＬ−プロリンを添加すること以外は同じ条件下で培養した。ヒトＤＤＢ２を発現する安定な形質転換細胞はＶ７９細胞を親株として確立され（非特許文献２３）、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン社）の存在下で培養した。ＸＰ−Ｅ群患者由来のリンパ芽球腫細胞株（ＧＭ０１６４６）は、コリエル細胞バンク(Coriell Cell Repository)から入手し、１５％非働化牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁培養した。マウス乳癌細胞ＦＭ３Ａ及びその温度感受性変異株ｔｓ８５細胞は１０％牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で浮遊させ３３℃で維持した。
【００３５】
［細胞ライセートの調製］
ヒト線維芽細胞からのＮＥＲ因子のイムノブロット解析のため、６０ｍｍシャーレで培養した細胞を２回リン酸緩衝食塩水で洗浄し、そのままの位置で０．２５ｍｌの０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む氷冷したＮＰ溶解バッファー［２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセリン、１％ノニデットＰ−４０、１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド、０．２５ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート、ロッシュ・ダイアグノスティクス社）］により溶解した。氷上で３０分間インキュベーションした後、細胞溶解液を遠心チューブにかきとり、２００００×ｇで１０分間遠心分離して上清画分を得た。沈殿は同量の０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＮＰ溶解バッファーに超音波処理により溶解した。上清画分のタンパク質濃度は、Schaffner及びWeissmann(1973)の方法(Schaffner, W. and Weissmann, C. (1973) Anal. Biochem. 56, 502-514)によりＢＳＡを標準として決定した。
【００３６】
マウス及びチャイニーズハムスター細胞内のＸＰＣ及びＦＬＡＧ−ＤＤＢ２を検出するために、最初に細胞をＮＰ溶解バッファーで処理した。抗ＸＰＣ抗体（ＦＬ）はマウス及びチャイニーズハムスターの内在ＸＰＣを認識しない。ほとんどのＸＰＣとＦＬＡＧ−ＤＤＢ２はこの抽出条件では可溶化しないことはあらかじめ確認した。イムノブロット解析のために不溶性ペレットを０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＮＰ溶解バッファーに超音波処理により溶解した。
【００３７】
［ＦＬＡＧ−ＸＰＣの安定発現］
ＦＬＡＧ−ＸＰＣをコードするｃＤＮＡは、複数シストロンの発現ベクターであるｐＩＲＥＳｈｙｇ（クロンテック社）に挿入した。得られたＤＮＡ構築物は、直鎖化し、ジーンパルサーＩＩ（バイオラッド社）を用いてエレクトロポレーション法によりＸＰ４ＰＡＳＶ細胞に導入した。安定な形質転換体を最初は２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（インビトロジェン社）の存在下で培養することによって選択した。培養液中のハイグロマイシンＢの濃度を徐々に減少させるとＦＬＡＧ−ＸＰＣの発現レベルも減少した。典型的には、１０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢの存在下で維持した形質転換体は生理的レベルのＦＬＡＧ−ＸＰＣの発現を示した。
【００３８】
［組換えＵＶ−ＤＤＢ複合体の精製］
ｐＦａｓｔＢａｃデュアルベクター（インビトロジェン社）とＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を用いてポリヘドリンプロモータの制御下でＦＬＡＧ−ＤＤＢ１を、及びｐ１０プロモータの制御下でタグなしＤＤＢ２をそれぞれ同時に発現する組換えバキュロウイルスを作製した。感染細胞を２７℃で３日間培養後回収し、８倍容量の氷冷した０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むＮＰ溶解バッファーに再懸濁した。２００００×ｇ、１５分間の遠心分離により可溶性抽出液を取得し、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ［２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセリン、１ｍＭＤＴＴ、０．２５ｍＭのＰＭＳＦ］に対して透析した。抽出液は、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂ［緩衝液Ａに０．０１％トリトンＸ−１００を添加］で平衡化されたＨｉＰｒｅｐ１６／１０ヘパリンＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に負荷した。同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を０．４５Ｍ及び１Ｍ塩化ナトリウムをそれぞれ含む緩衝液Ｂにて段階的に溶出した。ＦＬＡＧ−ＤＤＢ１／ＤＤＢ２ヘテロ２量体は０．４５Ｍ塩化ナトリウム画分に回収され、一方、遊離のＦＬＡＧ−ＤＤＢ１はヘパリンカラムを素通りした。両方の画分を別々に抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースを含むカラムに０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで負荷した。０．３Ｍ及び１Ｍの塩化ナトリウムをそれぞれ含む緩衝液Ｂで引き続き洗浄した後、カラムに保持されたタンパク質を、１Ｍ塩化ナトリウム及び０．１ｍｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドを含む緩衝液Ｂで溶出した。一定量の溶出液を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｃ［２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセリン、０．０１％トリトンＸ−１００、１ｍＭＤＴＴ、０．２５ｍＭのＰＭＳＦ］で平衡化されたＭｉｎｉＱ  ＰＣ３．２／３カラム（アマシャムバイオサイエンス社）にさらに負荷した。同じ緩衝液で洗浄後、タンパク質を０．１〜０．６Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配をつけた緩衝液Ｃで溶出した。ＵＶ−ＤＤＢを含む画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥとＣＢＢ染色で確認し、ＸＰＣとの結合実験に用いた。
【００３９】
ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体を精製するために、タグなしＤＤＢ２の代わりにＨｉｓ６タグ付加ＤＤＢ２を用いた。キュリン４Ａ−ＨＡ及びＴ７−Ｒｏｃ１をそれぞれ発現する２種類の組換えバキュロウイルスもまた作製した。これら３種類のバキュロウイルスでＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を共感染し（m.o.i.約５）、上述した方法にて抽出液を調製した。０．４５Ｍの代わりに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液ＢでＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体を溶出した以外は上述した方法と同様に最初のヘパリンカラムクロマトグラフィーを行った。この画分を０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｄ［２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）、１０％グリセリン、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２５ｍＭのＰＭＳＦ］で平衡化した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロースカラムに負荷した。カラムに保持されたタンパク質を、０．３Ｍ塩化ナトリウム及び０．１ｍｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドを含む緩衝液Ｄで溶出し、あらかじめＮｉ２＋を結合させ、０．１Ｍ塩化ナトリウム及び５ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ｄで平衡化したＨｉＴｒａｐキレートＨＰカラム（１ｍｌ；アマシャムバイオサイエンス社）に負荷した。同じ緩衝液で洗浄後、タンパク質を５〜１００ｍＭイミダゾールの濃度勾配をつけた緩衝液Ｄ＋０．１Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。混在する亜複合体と分離するために、さらに０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで平衡化したＭｏｎｏＳ  ＰＣ１．６／５カラム（アマシャムバイオサイエンス社）に負荷し、結合タンパク質を０．１〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配をつけた緩衝液Ｂで溶出した。４量体のＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体は０．２３Ｍ塩化ナトリウム付近で溶出された。
【００４０】
［種々のタンパク質因子の精製］
ヒトＸＰＣタンパク質及びＨｉｓ６タグ付加ＨＲ２３Ｂ（ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ）タンパク質はそれぞれ別々に発現させ精製し、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂヘテロ２量体として再構成した（非特許文献１２参照）。セントリン２(Centrin2)は、大腸菌で発現し、精製した(非特許文献８参照)。ＴＦIIＨを除くその他のＮＥＲ因子はバキュロウイルスシステムを用いて昆虫細胞で発現させた。ヒトＴＦIIＨ複合体はプロテインワン(ProteinOne)社から購入した。ウサギＥ１及びヒトＵｂｃＨ５ａ（Ｅ２）酵素、並びにユビキチン（野生型、リジン欠損型、又はＧＳＴ−タグ型）はボストンバイオケム(Boston Biochem)社から購入すると共に野生型ユビキチンはシグマ社からも購入した。
【００４１】
［インビトロにおけるユビキチン化アッセイ］
標準的な反応混合物（１５μｌ）は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．２ｍＭ塩化カルシウム、４ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；１．５μｇ）、Ｅ１（０．１μｇ）、Ｅ２（０．４μｇ）、ユビキチン（５μｇ）、精製ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３（２０ｎｇ）及びＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓを含む。この反応溶液を３７℃、１時間インキュベートした後、０．５ＭのＥＤＴＡを１μｌ添加して反応を停止し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、適切な抗体を用いてイムノブロット解析を行った。
【００４２】
［損傷ＤＮＡ結合アッセイ］
単一の紫外線誘起損傷（ＣＰＤ又は（６−４）光産物）部位を含む３０塩基長のオリゴヌクレオチドは文献（非特許文献１２）記載の方法に従って調製した。これらの損傷オリゴヌクレオチド及び非損傷対照オリゴヌクレオチド（各２００ｐｍｏｌ）を、相補的なオリゴヌクレオチド(5'-GAGCACTGACTGTATGATGAAGATGCTGAC-3'：配列番号５)とアニールし、各５’末端が３塩基突出した二重鎖ＤＮＡを調製した。このＤＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）により５’末端をリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）により直列に連結した。その後、ビオチン−１４−ｄＣＴＰ（インビトロジェン社製）存在下でクレノーフラグメント（宝酒造社製）により３’末端を充填して平滑末端とした。このビオチン化ＤＮＡは、次いでダイナビーズキロベースバインダーキット（ダイナルバイオテック社）を用いてストレプチアビジン被覆磁気ビーズに固定化した。ビーズに固定化されたＤＮＡ量を定量するために、このＤＮＡビーズの一定量をマイクロコッカスヌクレアーゼ（宝酒造社製）で完全に処理し、ビーズから遊離されたヌクレオチドの２６０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４３】
このようにして調製したＤＮＡビーズを用いて結合反応を３０℃で３０分間行った。反応混合物（１５μｌ）は、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．２ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ＢＳＡ（１．５μｇ）、変動量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ（モル比で４倍量のセントリン２と共に）、及び１ｐｍｏｌの紫外線誘起損傷を含むＤＮＡ磁気ビーズ（又は対照として同量の非損傷ＤＮＡビーズ）を含む。表示された場合にはＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３（２０ｎｇ）、Ｅ１（０．１μｇ）、Ｅ２（０．５μｇ）、及びユビキチン（野生型又はメチル化体；１０μｇ）もまた反応液中に含まれる。０．５ＭのＥＤＴＡを１μｌ加えて反応を停止させた後、上清画分を「非結合」画分として保存した。その後、ビーズを５０μｌの氷冷したバッファー［５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．２ｍＭ塩化カルシウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＤＴＴ］で２回洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー中に懸濁した。一定量の非結合及び結合画分を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、イムノブロット解析を行った。
【００４４】
［ＮＥＲ二重切断アッセイ］
単一の部位特異的（６−４）光産物又はＣＰＤを含み、３２Ｐで内部標識された環状二重鎖ＤＮＡ基質、及びＸＰ−Ｅ群患者由来のリンパ芽球腫細胞（ＧＭ０１６４６）の全細胞抽出液は、文献記載の方法により調製した。標準的な反応混合溶液（２５μｌ）は、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＤＴＴ、７０ｍＭ塩化ナトリウム、５％グリセリン、ＢＳＡ（５．４μｇ）、ＸＰ−Ｅ群細胞抽出液（１００μｇタンパク質）、２２．５ｍＭクレアチンリン酸（シグマ）、クレアチンリン酸キナーゼ（０．５μｇ；シグマ、タイプＩ）及び３２Ｐ標識ＤＮＡ基質（（６−４）光産物について約１×１０５ｃｐｍ、ＣＰＤについて約４×１０５ｃｐｍ）を含む。再構成ＮＥＲのためには、反応液容量を１５μｌに低減し、ＸＰ−Ｅ群細胞抽出液を精製したＦＬＡＧ−ＸＰＡ（２５ｎｇ）、ＲＰＡ（１００ｎｇ）、ＸＰＦ−ＥＲＣＣ１−Ｈｉｓ（１２ｎｇ）、ＸＰＧ（１２ｎｇ）、ＴＦIIＨ（１３４ｎｇ）、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ（２０ｎｇ）及びセントリン２（５ｎｇ）に置換し、さらに塩化ナトリウム濃度を１００ｍＭに調整した。表示した場合には、Ｅ１（０．１μｇ）、Ｅ２（０．５μｇ）、ユビキチン（野生型、リジン欠損型、又はメチル化型）及び変動量のＵＶ−ＤＤＢ又はＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体もまた含んだ。３０℃にて１時間インキュベーションした後、ＤＮＡを精製し、１０％変性ＰＡＧＥにて分離しオートラジオグラフィーにて検出した。
【００４５】
２  結果
［紫外線によるＸＰＣタンパク質の翻訳後修飾と生体内ユビキチン化］
紫外線照射に対するＸＰＣ複合体の生体内での応答を調べるため、一連のイムノブロット解析を行った。ＳＶ４０で形質転換された正常ヒト線維芽細胞株ＷＩ３８  ＶＡ１３を紫外線照射（１０Ｊ／ｍ２）又は偽照射し、３７℃で１時間インキュベートした後、０．３Ｍ塩化ナトリウム及び１％ノニデットＰ−４０を含むバッファーで溶解した。この可溶化された画分（３μｇタンパク質）又は不溶化画分を、抗ＸＰＣ抗体を用いてイムノブロット解析したところ、移動度の遅い不均一なバンド（１５０〜３００ｋＤａ）が紫外線照射した細胞から得られた可溶性画分に認められた（図１Ａのレーン２参照）。移動度の小さいこれらのバンドは、異なる特異性を有する２つの抗ＸＰＣ抗体で検出されたが、ＸＰＣ欠損細胞株であるＸＰ４ＰＡＳＶからの同様の画分（図１Ａのレーン５〜８）には認められなかった。これらの知見は、細胞の紫外線照射への応答としてＸＰＣタンパク質が翻訳後の修飾を受けることを示している。
【００４６】
このＸＰＣバンドの変化の時間経過を調べるために、ＷＩ３８  ＶＡ１３細胞を紫外線照射し、次いで細胞分画まで種々の時間インキュベートした。この実験では、紫外線照射後のデノボ(de novo)タンパク質合成を阻害するために０．１ｍＭシクロヘキシミド存在下において細胞を培養した。０．１ｍＭのシクロヘキシミドで細胞を処理後１時間以内にほとんど完全にトリチウム標識ロイシンの取り込みが阻害されることが確認されている。図１Ｂに示したように、移動度の遅いＸＰＣ分子種は照射５分後には早くも現れ、６０分程度経過後にピークに達し、その後減少した。同様の細胞抽出液中で、ＨＲ２３Ｂ、ＸＰＡ、ＸＰＢ又はＤＤＢ１（図１Ｂ）又はセントリン２のバンドのシフトは認められなかった。
【００４７】
紫外線以外の種々のＤＮＡ損傷薬剤で処理された細胞のＸＰＣ応答についても調べた。Ｘ線や、しばしば紫外線類似薬剤と称される４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）などの薬剤で処理した時のＸＰＣの分子量変動は、紫外線により誘発された場合と比べて検出できないか又は極めて弱いものであった。従って、上記で認められたＸＰＣの修飾は紫外線照射に特異的なものであることが分かった。
【００４８】
紫外線照射により観察されたＸＰＣの移動度変化は見かけ上２０〜１００ｋＤａの大きさの変化で不均一であった。このパターンは、バンドの変化にユビキチン化が関与している可能性を示唆した。この可能性を検証するために、紫外線誘導ＸＰＣ修飾をユビキチン活性化酵素Ｅ１の温度感受性型を発現するマウスＦＭ３Ａｔｓ８５変異体細胞(Finley et al., (1984) Cell 37, 43-55; Matsumoto et al., (1983) FEBS Lett. 151, 139-142)を用いて調べた。この細胞を３３℃又は３９．５℃で１６時間培養し、図１Ｄに示した各線量で紫外線照射した後、同一の温度でさらに培養した。細胞抽出液をイムノブロットし、抗ＸＰＣ抗体（ＣＴ）で検出した。同じ抽出液についてラミンＢ１及びモノユビキチン化ヒストンＨ２Ａ（ｕＨ２Ａ）についてもイムノブロットで解析した。３９℃以上の非許容温度で培養すると、この細胞内では新規の(de novo)ユビキチン化は著しく減少する。これに一致して３９．５℃で培養したｔｓ８５細胞ではモノユビキチン化されたヒストンＨ２Ａ（ｕＨ２Ａ）の量が大きく減少する（図１Ｄ、レーン１０〜１２）が、許容温度（３３℃）で維持した変異体細胞（レーン７〜９）又は両方の温度で培養した野生型親株のＦＭ３Ａ細胞（レーン１〜６）では減少しない。紫外線で誘起されたＸＰＣバンドの移動は、３９．５℃で培養したｔｓ８５細胞では認められなかった。従って、紫外線で誘起されたＸＰＣの修飾は、Ｅ１活性に依存している。
【００４９】
ＸＰＣタンパク質のユビキチン化をさらに直接的に立証するために、ＦＬＡＧ−タグ付加ＸＰＣを発現するＸＰＣ欠損細胞株ＸＰ４ＰＡＳＶの安定な形質転換体を樹立した。このＦＬＡＧ−ＸＰＣタンパク質は、紫外線照射したＷＩ３８  ＶＡ１３細胞内の内因性ＸＰＣと同様な紫外線照射後の分子量変動を示した。さらに、（６−４）光産物のＧＧ−ＮＥＲは、この形質転換体において正常細胞レベルに回復しており、この細胞内で発現するＦＬＡＧ−ＸＰＣが正常に機能することを確認した。ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ付加ユビキチンをこの形質転換体内で一過性過剰発現させ、ＦＬＡＧ−ＸＰＣタンパク質を免疫沈降させた。沈殿したサンプルを抗ＨＡ抗体によりイムノブロッティング解析したところユビキチン化されたＦＬＡＧ−ＸＰＣタンパク質が検出された。特に、抽出液を調製する前に紫外線照射した形質転換細胞では顕著であった（図１Ｅ、レーン８）。紫外線照射なしの細胞においても低レベルのユビキチン化が起こっていたが（レーン７）、これはＨＡ−ユビキチンの過剰発現による非特異的なユビキチン化と思われる。これらの結果より、紫外線照射はＸＰＣタンパク質のユビキチン化を誘起することが分かった。
【００５０】
新規の(de novo)タンパク合成を阻害した条件下でも紫外線照射後のＸＰＣタンパク質の全量は有意に減少しなかった（図１Ｂ）。図１Ｂにおいて正常な１２５ｋＤａのＸＰＣタンパク質のバンドの量をｈＨＲ２３Ｂの量と比較して測定すると、紫外線照射によって一度減少するが、その後シフトしたバンドが消失するに伴って元に戻ることが分かった（図１Ｃ）。従って、ＸＰＣタンパク質のユビキチン化は可逆的であり、分解シグナルとはならないと思われる。
【００５１】
［ＸＰＣ修飾におけるＵＶ−ＤＤＢ要求性］
ＸＰＣ修飾とＮＥＲプロセスとの関係を探索するために、ＸＰ及びＣＳの異なる遺伝的相補性群に属するヒト細胞株におけるＸＰＣの紫外線誘導分子量変化について調べた。図２Ａは、種々のＸＰ及びＣＳの遺伝的相補性群由来の細胞を紫外線照射（１０Ｊ／ｍ２）し、３７℃で０．１ｍＭシクロヘキシミド存在下にて種々の時間培養した。細胞抽出液の可溶化画分（３μｇタンパク質）を抗ＸＰＣ（ＦＬ）抗体を用いてイムノブロット解析した。図２Ａに示したように、ほとんどの変異体細胞は紫外線照射に対して正常なＸＰＣバンドの移動を示した。しかしながら、興味深いことに、２つの独立したＸＰ−Ｅ群細胞株ではＸＰＣバンドの移動が起こらなかった（図２Ａ）。これらの両方の細胞は何れもＤＤＢ２遺伝子に変異を有し、ＵＶ−ＤＤＢ活性を消失している(Nichols et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 24317-24320)。さらにＸＰＣ修飾におけるＵＶ−ＤＤＢの関与を調べるために、チャイニーズハムスター細胞株を用いた。チャイニーズハムスター由来の多くの株化細胞及び初代リンパ系細胞はＵＶ−ＤＤＢ活性を欠損している(Hwang et al., (1998) Mol. Cell. Biol. 18, 4391-4399; 非特許文献２３参照)。図２Ｂに示したように、２つの細胞株Ｖ７９とＣＨＯ−Ｋ１は、ＸＰＣの紫外線誘起分子量変化を示さなかった。ヒトＤＤＢ２遺伝子を安定発現させるとＶ７９細胞にＵＶ−ＤＤＢ活性が付与される(非特許文献２３参照)。面白いことに、ヒトＤＤＢ２（タグなし、又はＦＬＡＧ−タグ付き）をＶ７９細胞で発現させると紫外線照射に際してもＸＰＣ修飾が回復した（図２Ｃ）。また、野生型ヒトＤＤＢ２の一過性発現はＸＰ２ＲＯＳＶ細胞における紫外線誘起ＸＰＣバンドの移動を起こさせたが、ＸＰ−Ｅ群患者で同定された２種の変異体（Ｋ２４４Ｅ及びＲ２７３Ｈ）では起こらなかった。これらの結果は、ＵＶ−ＤＤＢ活性が紫外線誘起ＸＰＣ修飾に必須であることを示す。
【００５２】
［ＵＶ−ＤＤＢ複合体とＸＰＣ複合体との物理的結合］
ＸＰＣとＵＶ−ＤＤＢとの間の何らかの機能的相互作用を示す上記知見は、これらのタンパク質複合体が物理的に相互作用するかどうかという強い疑問を呈した。そこで、ＦＬＡＧ−ＤＤＢ２を発現するＶ７９細胞に紫外線を照射し、３７℃、１時間培養後、細胞抽出液を調製してイムノブロット解析を行った（図３Ａ、レーン２〜４）。安定なＶ７９形質転換体におけるＦＬＡＧ−ＤＤＢ２を可溶性細胞抽出液から免疫沈降させると、ＤＤＢ１だけでなく内因性ＸＰＣも同時に共沈殿した（図３Ａ）。これは、ＵＶ−ＤＤＢが生体内でＸＰＣと相互作用することを示唆する。この相互作用は紫外線照射及び非照射の両方の細胞で起こるが、紫外線照射は沈殿したＵＶ−ＤＤＢ及びＸＰＣの量を有意に減少させた。これは、おそらくＵＶ−ＤＤＢが紫外線誘起損傷に強く結合し、抽出操作によって可溶化しなかったためと考えられる(Otrin et al., (1997) J. Cell. Sci. 110, 1159-1168)。
【００５３】
ＸＰＣとＵＶ−ＤＤＢとの間の直接的な相互作用を示すために、精製した組換えタンパク質を用いて結合実験を行った。ＦＬＡＧ−ＤＤＢ１及びＤＤＢ２タンパク質をバキュロウイルスシステムを用いて昆虫細胞内で共発現させた。この系ではＦＬＡＧ−ＤＤＢ１がＤＤＢ２よりも大量に発現するのでＦＬＡＧ−ＤＤＢ１／ＤＤＢ２複合体と遊離ＦＬＡＧ−ＤＤＢ１を同一の感染細胞抽出液から分離して精製することができた（図３Ｂ）。精製したＵＶ−ＤＤＢ複合体又はＦＬＡＧ−ＤＤＢ１を抗ＦＬＡＧ抗体ビーズに結合させ、精製したＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ複合体とインキュベートした。具体的には、抗ＦＬＡＧ抗体結合ビーズ（２０μｌ）にあらかじめＦＬＡＧ−ＤＤＢ１（１．３μｇ）又はＦＬＡＧ−ＤＤＢ１／ＤＤＢ２（１．８μｇ）を結合させ、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ（１５０ｎｇ）、ＸＰＣ単独（１０３ｎｇ）、又はＨＲ２３Ｂ単独（４７ｎｇ）とインキュベートした。非結合成分を洗浄後、ビーズに結合したタンパク質を図３Ｃに表示した抗体を用いてイムノブロット解析した。有意な量のＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−ＨｉｓがＵＶ−ＤＤＢ複合体と共に沈殿したが、ＦＬＡＧ−ＤＤＢ１単独に対する結合はバックグラウンドに近いレベルであった（図３Ｃレーン６とレーン４及び５を比較せよ）。ＸＰＣとＨＲ２３Ｂを別々にＵＶ−ＤＤＢヘテロ２量体に添加すると、ＸＰＣのみが結合画分に見出された（レーン７と８）。これらのデータはＸＰＣタンパク質とＵＶ−ＤＤＢとの間の直接的な物理的結合を証明する。
【００５４】
［ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体によるＸＰＣのインビトロでのユビキチン化］
ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体がＸＰＣのユビキチン化反応を担っているかどうか調べるために無細胞ユビキチン化アッセイを行った。４つのサブユニット（ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、キュリン４Ａ及びＲｏｃ１）を同時に昆虫細胞内で発現させ、ヘテロ４量体複合体を精製した（図４Ａ参照）。図４Ａは精製したＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％グラジエントゲル）で分離し、銀染色したものである。図４Ｂに示したタンパク質成分のセットを用いて無細胞ユビキチン化反応を行ったところ、Ｅ１、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ａ）、ユビキチン及びＡＴＰの存在下においてＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−ＨｉｓをＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体とインキュベートしたとき、ＸＰＣの分子量変化が検出された（図４Ｂ）。この変化は、各タンパク質成分に依存していた（レーン２〜７参照）。正常なユビキチンの代わりにＧＳＴタグ付ユビキチンを使用すると移動したＸＰＣバンドのパターンが変化し（レーン９）、観察されたバンドの移動がユビキチンとの接合のためであることを強く示唆した。さらに、全てのリジン残基がアルギニンに置換された変異体ユビキチン（リジン欠損型と表示）を反応に使用したときは、バンドの移動は有意に減少し（レーン８）、レーン７で認められた遅い移動度の分子種がポリユビキチン鎖の生成の結果であることを示唆した。同じ反応において、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓの存在の有無にかかわらず、ＤＤＢ２及びキュリン４Ａもまた高度にユビキチン化されることが分かった（図４Ｂ、レーン２及び７）。
【００５５】
このインビトロでのユビキチン化の特異性を調べるために、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ及びＦＬＡＧ−ＸＰＡを共存させて反応を行った。ＸＰＣ及びＤＤＢ２が高度にユビキチン化されるのに対し、同じ反応液中におけるＦＬＡＧ−ＸＰＡ（図４Ｃ）及びＤＤＢ１のバンドの移動はほとんど認められなかった。低い割合でＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓが１又は２分子のユビキチンと結合すると思われる（図４Ｃのドットで示されたバンド参照）が、このバンドの移動はＸＰＣやＤＤＢ２よりもはるかに少量であった。従って、インビトロでのユビキチン化システムは、紫外線照射細胞内で見られたのと同様な基質特異性（図１Ｂ）を有すると思われる。
【００５６】
ＸＰＣとＤＤＢ２はインビトロでＥ３複合体によってユビキチン化されるので、紫外線照射後の２つのタンパク質の生細胞内での運命を比較した。このため、ＦＬＡＧ−ＤＤＢ２を発現するＶ７９形質転換体を使用した。この細胞を紫外線照射し、シクロヘキシミド存在下においてインキュベートしたところ、ＷＩ３８  ＶＡ１３細胞内で観察されたのと全く同様に、ＸＰＣは可逆的な修飾を受けた。一方、ＦＬＡＧ−ＤＤＢ２のバンドは経時的に減少し、照射後４時間でほとんど完全に消失した。このＦＬＡＧ−ＤＤＢ２の消失は、細胞をプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２で同時に処理するとブロックされた（レーン７〜１２）。従って、ＤＤＢ２は紫外線照射後、ユビキチン／プロテアソームシステムによって分解されることが分かった。
【００５７】
［ＸＰＣ及びＵＶ−ＤＤＢのユビキチン化によるＤＮＡ結合性変化］
ＮＥＲにおけるユビキチン化の役割を解明するために、ユビキチン化されたＸＰＣ及びＵＶ−ＤＤＢのＤＮＡ結合性を調べた。このため、単一の紫外線損傷部位（ＣＰＤ又は（６−４）光産物）を含むか、又は対照として非損傷配列を含む合成オリゴヌクレオチドを相補鎖とアニールし、直列に連結し、そして常磁性ビーズに固定化した。これらのＤＮＡビーズの１つの存在下において、無細胞ユビキチン化反応を行った。非結合画分を保存した後、ビーズを洗浄し、ＤＮＡによって保持されたタンパク質をイムノブロット解析した（図５Ａ参照）。図５Ａは、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓ（８ｎｇ）を非損傷ＤＮＡ（Ｎ）又はＣＰＤ（Ｃ）若しくは（６−４）光産物（６）を含む磁性ビーズと共にインキュベートした。ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３（２０ｎｇ）及びユビキチン化反応に必要な他の因子も、表示に従って添加した。ＤＮＡに結合しなかったタンパク質（非結合）及びＤＮＡに保持されたタンパク質（結合）をそれぞれイムノブロットにより表示された抗体を用いて解析した。
【００５８】
ＸＰＣ単独でＤＮＡビーズとインキュベートした時は、投入したタンパク質の一部のみが結合画分に検出された（レーン１〜３）が、非損傷ＤＮＡと損傷ＤＮＡの間で結合量に顕著な差は認められなかった。ＸＰＣタンパク質は（６−４）光産物に特異的に結合することが知られているが、この特異的結合を検出するためには損傷ＤＮＡに対して過剰量のＸＰＣタンパク質を添加し、かつ競合ＤＮＡ(competitor DNA)を加えて非特異的結合を吸収する必要がある(非特許文献１２)。ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体の存在は、ユビキチン化が起こらないときはＸＰＣのＤＮＡ結合性に影響を与えなかった（レーン４〜６）。同じ反応において、ＤＤＢ１及びＤＤＢ２は共にほぼ定量的に（６−４）光産物ビーズに結合した（レーン６）が、非損傷ＤＮＡビーズには少し結合しただけである（レーン４）。（６−４）光産物に対するＵＶ−ＤＤＢの結合の親和性及び特異性は何れもＸＰＣのそれよりもはるかに大きいと思われる。ＣＰＤに対するＵＶ−ＤＤＢの結合も認められたが、（６−４）光産物に対する結合に比べるとはるかに低かった。さらに、（６−４）光産物ビーズの存在下においても有意な量のキュリン４Ａが非結合画分に残存した（レーン６）ことはＵＶ−ＤＤＢコアとＥ３サブユニットとの相互作用の不安定性を示唆する。
【００５９】
興味深いことに、ユビキチン化に必要な全ての因子が存在したときは、非結合画分に依然として有意な量のＸＰＣが修飾されずに残存していた（レーン７〜９）にもかかわらず、ユビキチン化されたＸＰＣのみがＤＮＡ結合画分に検出された。ＸＰＣ及びキュリン４Ａのバンドが、非損傷ＤＮＡ又はＣＰＤビーズを用いた時と比べて（６−４）光産物の存在下においてより高分子量領域に移動したことも注目すべき結果である（レーン９とレーン７、８を比較せよ）。従って、ＤＮＡの添加はＥ３活性に必須ではない（図４）が、（６−４）光産物の存在はＵＶ−ＤＤＢ依存性ユビキチン化を促進するように思われる。これらの反応において、ＤＤＢ２は顕著にユビキチン化され、何れのＤＮＡビーズとの結合画分にもＤＤＢ１又はＤＤＢ２は殆ど検出されなかった（レーン７〜９）。このことはＵＶ−ＤＤＢがユビキチン化されるとＤＮＡ結合能をほとんど完全に失うことを意味する。対照的に、正常なユビキチンの代わりにメチル化ユビキチンが含まれると、ＤＤＢ２は有意なバンドの移動を示すが、ＵＶ−ＤＤＢはなおＤＮＡ結合能及びＵＶ損傷への特異性を保持していた（レーン１０〜１２）。ユビキチンのリジン残基の還元的メチル化はポリユビキチン鎖の伸長を阻止する（レーン７〜９のバンド移動パターンとレーン１０〜１２のそれを比較せよ）。これらのデータは、ある長さ以上のポリユビキチン鎖の形成がＵＶ−ＤＤＢの損傷結合活性を抑止するが、ポリユビキチン化されたＸＰＣはそのＤＮＡ結合能を維持することを示している。
【００６０】
ＸＰＣのＤＮＡ結合に対するユビキチン化の効果を定量的に調べるために、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−Ｈｉｓの含量を（２．４、８及び２４ｎｇに）変化させて、ユビキチン化反応を行い、非損傷ＤＮＡビーズ（ＮＤ）又は（６−４）光産物ビーズ（６−４ＰＰ）との結合反応を行った（図５Ｂ参照）。すべてのＸＰＣ含量において、ＤＮＡビーズに保持されたＸＰＣはユビキチン化によって約２倍に増加した。しかしながら、この効果は、（６−４）光産物やＣＰＤビーズを用いた場合だけでなく非損傷ＤＮＡビーズを用いた場合にも認められた（図５Ｃの定量データ参照）。従って、ユビキチン化はＸＰＣのＤＮＡに対する損傷特異性よりも結合力を増大させると思われる。
【００６１】
［無細胞ＮＥＲ切断におけるユビキチン化の役割］
最後に、無細胞ＮＥＲ切断反応に対するＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体によるユビキチン化の影響を調べるため、ＸＰ−Ｅ群患者由来のヒトリンパ芽球腫細胞株ＧＭ０１６４６から全細胞抽出液を調製した。単一の（６−４）光産物を含み、３２Ｐで内部標識された環状二重鎖ＤＮＡ基質を、まず種々の量（１０、２０及び４０ｎｇ）のＵＶ−ＤＤＢ（ＦＬＡＧ−ＤＤＢ１／ＤＤＢ２ヘテロ２量体）と３０℃で１０分間プレインキュベーションした。この混合物を次にＸＰ−Ｅ群細胞抽出液（１００μｇタンパク質）とインキュベートし、損傷部位を含む二重切断標識産物を変性ＰＡＧＥによって分離及び検出した。図６Ａに示したように、ＵＶ−ＤＤＢとのプレインキュベーションは被験条件下（レーン１〜４）細胞抽出液中の（６−４）光産物周辺の二重切り込みにほとんど影響を与えなかった。しかしながら、２０μｇのメチル化ユビキチンを添加すると、ＵＶ−ＤＤＢは（６−４）光産物の修復を用量依存的に阻害した（レーン９〜１２、図６Ｂの定量データ参照）。この阻害作用は、同量の野生型ユビキチン存在下ではほとんど認められないが（レーン５〜８）、メチル化ユビキチンに代えてリジン欠損ユビキチンを用いたときは同様に阻害が見られた。定量的イムノブロット解析から、０．５μｇ以上の内因性非結合ユビキチンが反応に含まれる抽出液中に存在していないと推定された。従って、このような大量のリジン欠損又はメチル化ユビキチンの添加は、ポリユビキチン鎖の伸長を競争的に阻害するであろう。この結果は、ＵＶ−ＤＤＢが（６−４）光産物に結合したとき、比較的長いポリユビキチン鎖の生成が、ＮＥＲによる損傷のその後の処理に重要であることを示唆する。（６−４）光産物の代わりにＣＰＤを含むＤＮＡ基質を用いて同様の実験を行った。ＵＶ−ＤＤＢと共にＣＰＤ基質を前処理した場合は、かなり大量のＵＶ−ＤＤＢを必要としたが、ＸＰ−Ｅ群細胞抽出液による二重切断反応について、弱いが検出可能な促進が起こった。
【００６２】
ＮＥＲにおけるユビキチン化の直接的な関与を調べるために、精製したタンパク質を用いた再構成ＮＥＲ反応系を構築した。６種類の精製されたＮＥＲ必須因子（すなわち、ＸＰＣ−ＨＲ２３Ｂ−セントリン２、ＸＰＡ、ＸＰＦ−ＥＲＣＣ１、ＸＰＧ、転写因子IIＨ［ＴＦIIＨ］及び複製タンパク質Ａ［ＲＰＡ］）を用いることにより、内部放射性標識（６−４）光産物の二重切り込み反応が有意なレベルで検出できた（図６Ｃ、レーン２）。ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体の添加は、他のユビキチン化因子（Ｅ１、Ｅ２及びユビキチン）非存在下では用量依存的に二重切り込み反応を阻害する結果となった。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】各種細胞内においてＸＰＣタンパク質が紫外線照射に応答してユビキチン化されることをイムノブロットにより解析した結果である。図Ａ、Ｂ及びＣの星印は、抗ＸＰＣ抗体と交差反応する非特異的なバンドを示し、図Ａ、Ｄ、Ｅの矢印は標準非修飾ＸＰＣタンパク質のバンドを示す。図Ｂの矢印は標準非修飾ＮＥＲタンパク質を示す。図Ｂ、Ｄ及びＥの括弧（］）はＸＰＣタンパク質の修飾されたタイプを示す。なお、抗ＸＰＣ抗体は、全長タンパク質に対する抗体（ＦＬ）とＣ末端に対応する合成ペプチドに対する抗体（ＣＴ）の２種類を用いた。
【図２】各種細胞内において紫外線によるＸＰＣタンパク質の修飾は、機能的なＵＶ−ＤＤＢ複合体の存在に依存していることをイムノブロットにより解析した結果である。星印は、抗ＸＰＣ抗体と交差反応する非特異的なバンドを示し、矢印及び括弧は、それぞれ非修飾型及び修飾型のＸＰＣタンパク質を示す。
【図３】ＸＰＣタンパク質がＵＶ−ＤＤＢ複合体と物理的に結合することを、表示したそれぞれの抗体を用いてイムノブロットにより解析した結果（Ａ及びＣ）である。ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥを銀染色したものである。
【図４】ＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体によるＸＰＣタンパク質のユビキチン化を無細胞ＮＥＲ反応によって解析した結果である。Ａは精製したＵＶ−ＤＤＢ−Ｅ３複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し銀染色した結果を示し、Ｂ及びＣは表示されたそれぞれの抗体を用いてイムノブロット解析した結果である。
【図５】ＸＰＣ及びＵＶ−ＤＤＢのユビキチン化によるＤＮＡ結合性変化損傷ＤＮＡ結合アッセイにより解析した結果である。
【図６】無細胞ＮＥＲ切断反応に対するユビキチン化の影響をイムノブロットにより『解析した結果である。＋ｎｏＵｂ：ユビキチン無添加、＋ｗｔＵｂ：野生型ユビキチン添加、＋ＭｅＵｂ：メチル化ユビキチン添加
【図７】ヌクレオチド除去修復反応の初期段階において、損傷ＤＮＡの認識に紫外線誘起ＵＶ−ＤＤＢ複合体依存性のＸＰＣタンパク質のユビキチン化が関与していることを示すモデル図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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