(57)【要約】【課題】制限酵素を用いることなく、複数の核酸分子を連結して核酸構築物を作製すること。【解決手段】  本発明は、以下：（ａ）第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得る工程；（ｂ）第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅される、工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた該第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および（ｄ）該（ｃ）の混合物をテンプレートとして用いて核酸増幅反応を行って連結核酸増幅産物を得る工程を包含する方法を提供する。【選択図】  図２
2006296350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた該第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および
（ｄ）該（ｃ）の混合物をテンプレートとして用いて核酸増幅反応を行って連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記第１の核酸分子をテンプレートとして用い、該第１の核酸分子の３’末端部分に核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の逆方向一本鎖核酸分子、および該第１の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に該核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）前記第２の核酸分子をテンプレートとして用い、該第２の核酸分子の３’末端部分に該核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の逆方向一本鎖核酸分子、および該第２の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に該核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、ここで、該第１の順方向一本鎖核酸分子および該第２の逆方向一本鎖核酸分子は、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた該第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および
（ｄ）該（ｃ）の混合物をテンプレートとして用い、該第１の逆方向一本鎖核酸分子と、該第２の順方向一本鎖核酸分子とをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行って、連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、以下：
（ｅ）工程（ｄ）によって得られた二本鎖核酸分子を増幅する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項４】
前記逆方向一本鎖核酸分子および前記順方向一本鎖核酸分子は、特異的にハイブリダイズするために十分であり、かつ、該増幅反応を妨げない配列および長さを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子が前記第２の核酸分子の５’末端部分と、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、または前記第２の逆方向一本鎖核酸分子が前記第１の核酸分子の３’末端部分と、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子が前記第２の核酸分子の５’末端部分と、相補的な配列を有するか、または前記第２の逆方向一本鎖核酸分子が前記第１の核酸分子の３’末端部分と、相補的な配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子と前記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および該タグ配列に前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするタグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子と前記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および該タグ配列に相補的な前記タグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸分子または第２の核酸分子の少なくとも１つが、ベクターの配列の少なくとも一部分または全部を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターは、クローニングベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ  ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される増幅方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸はＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により得られる、核酸構築物。
【請求項１４】
２組の核酸プライマーセットであって、該セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、
該第１の順方向一本鎖核酸分子および該第２の逆方向一本鎖核酸分子は、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、
２組の核酸プライマーセット。
【請求項１５】
２組の核酸プライマーセットを設計するための方法であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、該第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する工程；
Ｂ）該第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、該第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計する工程であって、
該Ａ）工程において、該ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、該ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
該Ａ）工程において、該ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、該内部ハイブリダイズ配列および該内部ハイブリダイズ配列に対して該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは該第１タグ核酸配列および該第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
２組の核酸プライマーセットを生産するための方法であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、該第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する工程；
Ｂ）該第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、該第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計する工程であって、
該Ａ）工程において、該ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、該ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
該Ａ）工程において、該ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、該内部ハイブリダイズ配列および該内部ハイブリダイズ配列に対して該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは該第１タグ核酸配列および該第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、工程；および
Ｃ）該設計されたプライマーの配列を有する核酸分子を生産する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
２組の核酸プライマーセットを設計するためのプログラムであって、
Ａ）核酸配列判定手段に、第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較させて、該第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する手順；
Ｂ）プライマー設計手段に、該第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、該第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計させる手順であって、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、該ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、該内部ハイブリダイズ配列および該内部ハイブリダイズ配列に対して該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは該第１タグ核酸配列および該第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計させる、手順、
を包含する、プログラム。
【請求項１８】
２組の核酸プライマーセットを設計するためのプログラムが格納された記録媒体であって、該プログラムは、
Ａ）核酸配列判定手段に、第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較させて、該第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する手順；
Ｂ）プライマー設計手段に、該第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、該第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計させる手順であって、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、該ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、該内部ハイブリダイズ配列および該内部ハイブリダイズ配列に対して該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは該第１タグ核酸配列および該第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計させる、手順、
を包含する、記録媒体。
【請求項１９】
２組の核酸プライマーセットの設計装置であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、該第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する核酸配列判定手段；
Ｂ）該第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、該第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計するプライマー設計手段であって、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、該ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、該内部ハイブリダイズ配列および該内部ハイブリダイズ配列に対して該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは該第１タグ核酸配列および該第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、プライマー設計手段
を備える、設計装置。
【請求項２０】
２組の核酸プライマーセットの合成装置であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、該第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する核酸配列判定手段；
Ｂ）該第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、該第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計するプライマー設計手段であって、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、該ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
該Ａ）手順において、該ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、該内部ハイブリダイズ配列および該内部ハイブリダイズ配列に対して該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは該第１タグ核酸配列および該第２タグ核酸配列を、それぞれ、該第１の逆方向一本鎖核酸分子および該第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、プライマー設計手段；および
Ｃ）該設計されたプライマーの配列を有する核酸分子を生産する手段
を備える、合成装置。
【請求項２１】
複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製するためのキットであって、
Ａ）２組の核酸プライマーセットであって、該セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、
該第１の順方向一本鎖核酸分子および該第２の逆方向一本鎖核酸分子は、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、
２組の核酸プライマーセット；および
Ｂ）該プライマーセットを用いた増幅反応のための反応試薬
を備える、キット。
【請求項２２】
所望の核酸分子をクローニングするためのキットであって、
Ａ）２組の核酸プライマーセットであって、該セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、
該第１の順方向一本鎖核酸分子および該第２の逆方向一本鎖核酸分子は、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、
２組の核酸プライマーセット；および
Ｂ）クローニングベクターである該第１の核酸分子、
を備え、ここで、該第２の核酸分子は、該所望の核酸分子である、キット。
【請求項２３】
クローニングベクターである第１の核酸分子およびクローニングの標的である第２の核酸分子を用いて、所望の核酸分子をクローニングするための方法であって、該方法において、該第１の核酸分子および該第２の核酸分子を含む複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製され、該方法は、以下：
（ａ）該第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）該第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた該第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、該特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）該（ｃ）の混合物をテンプレートとして用いて核酸増幅反応を行って、該所望の核酸がクローニングされた連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ａ）前記第１の核酸分子をテンプレートとして用い、該第１の核酸分子の３’末端部分に核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の逆方向一本鎖核酸分子、および該第１の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に該核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）前記第２の核酸分子をテンプレートとして用い、該第２の核酸分子の３’末端部分に該核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の逆方向一本鎖核酸分子、および該第２の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に該核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、ここで、該第１の順方向一本鎖核酸分子および該第２の逆方向一本鎖核酸分子は、該第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、該第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた該第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および
（ｄ）該（ｃ）の混合物をテンプレートとして用い、該第１の逆方向一本鎖核酸分子と、該第２の順方向一本鎖核酸分子とをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行って、前記所望の核酸がクローニングされた連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、以下：
（ｅ）工程（ｄ）によって得られた連結核酸増幅産物の配列決定を行って、前記所望の核酸を同定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
前記工程（ｄ）によって得られた連結核酸増幅産物を連結して環状にする工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記環状にする工程は、前記連結核酸増幅産物の末端をリン酸化し、かつ、リガーゼによる連結をおこなうことを包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記環状化された連結核酸増幅産物を宿主細胞に導入し、該連結核酸増幅産物を増幅させる工程をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記逆方向一本鎖核酸分子および前記順方向一本鎖核酸分子は、特異的にハイブリダイズするために十分であり、かつ、該増幅反応を妨げない配列および長さを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子が前記第２の核酸分子の５’末端部分と、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、または前記第２の逆方向一本鎖核酸分子が前記第１の核酸分子の３’末端部分と、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子が前記第２の核酸分子の５’末端部分と、相補的な配列を有するか、または前記第２の逆方向一本鎖核酸分子が前記第１の核酸分子の３’末端部分と、相補的な配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子と前記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および該タグ配列に前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするタグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の順方向一本鎖核酸分子と前記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、前記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および該タグ配列に相補的な前記タグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法により得られる核酸構築物を含む、細胞。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法により得られる核酸構築物によりコードされるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の所望の核酸分子を連結することによって得られる核酸構築物およびその作製方法に関する。より詳細には、制限酵素を用いることなく、核酸の特異的ハイブリダイゼーションおよび核酸の合成を通して、複数の所望の核酸を連結する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学、組織および器官の再生、再生医学および再生医療、遺伝子治療、診断学、ならびに医薬品開発などの分野において、任意の核酸構築物を作製する技術が重要である。任意の遺伝子のクローニングのためにも、核酸構築物の作製は重要である。
【０００３】
複数の核酸分子からの遺伝子構築物の作製は、従来、ＤＮＡの特異的配列を認識する配列特異的ヌクレアーゼである、制限酵素を使用する方法によって行われている。この技術では、核酸分子の所望の部位を切断するが、上記核酸分子のそれ以外の部位を切断しないような制限酵素を選択し、同一の切断面を有するかまたは平滑化した核酸分子断片をＤＮＡリガーゼによってライゲーションすることによって達成される（例えば、図１を参照のこと）。
【０００４】
制限酵素を利用するためには、目的とする核酸配列に特有な制限酵素による切断部位の分布図（すなわち、制限酵素マップ）を作成する必要があり、そのための知識またはソフトウェアが必要である。図１を参酌すると、一般的なPCR法による遺伝子断片Aと遺伝子断片Bの増幅、ならびに、新規遺伝子コンストラクトA+Bの構築法が示されている。ここでは、核酸分子内の適当な位置に制限酵素の切断部位が存在することが必須であるが、連結を所望する核酸の適切な位置に適切な制限酵素切断部位が存在しない場合が少なくない。そのような場合は、適切な切断部位を有する核酸部分を、人為的に挿入する必要がある。また、制限酵素を利用するためには、当該遺伝子に特有な制限酵素による切断部位の分布図(すなわち、制限酵素マップ)の知識が必要である。
【０００５】
人為的な核酸部分の挿入などを含む核酸作製は、しばしばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．、Ｓｃｈａｒｆ  Ｓ．、Ｆａｌｏｏｎａ  Ｆ．、Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．、Ｈｏｒｎ  Ｇ．Ｔ．、Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ．Ａ．、Ａｒｎｈｅｉｍ  Ｎ．、（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０（４７３２）：１３５０〜１３５４頁（非特許文献１）；Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．、Ｆａｌｏｏｎａ  Ｆ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｗｕ．Ｒ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ」、（１９８７年）、１５５頁（非特許文献２）；Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．、Ｆａｌｏｏｎａ，Ｆ．、Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．、Ｈｏｒｎ，Ｇ．、Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．、「Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉａｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ，１０１」、（１９８６年）、２６３頁〜２７３頁（非特許文献３））を利用する方法によって行われる。この方法においては、５’末端に制限酵素の認識配列を含むアダプター（またはリンカー）配列を付加した形のプライマーを作製し、これを用いてＰＣＲを行うことにより、末端部分に所望の挿入部分を含む核酸分子である、増幅産物を得ることができる。
【０００６】
しかし、制限酵素を使用するためのこのような操作は、極めて煩雑な過程を要し、かつ時間もかかっていた。従って、制限酵素を用いることなく、複数の核酸分子を連結して核酸構築物を作製する技術の開発が必要とされていた。
【０００７】
多くの核酸断片を、制限酵素を用いずに連結する公知の方法としては、国際公開第９９／１６９０４号（特許文献１）に記載される、マルチプレックスＰＣＲとリンキングＰＣＲとを組み合わせた方法がある。この方法では、隣接して連結されるべき核酸断片の、第１の核酸のセンス鎖の３’末端部分に相補的な部分およびその３’側に存在する短い尾部部分を含むプライマーおよび第２の核酸のアンチセンス鎖の５’末端部分に相補的な部分およびその５’側に存在する短い尾部部分を含むプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲの後に、この増幅産物をテンプレートとして用いたＰＣＲが行われることにより、所望の核酸が連結される。この方法は、１度のＰＣＲにより多くの核酸断片を作製し、連結工程をまとめて行い得るという利点があるが、尾部部分に含まれる不要な配列が最終的な核酸断片に含まれてしまうという欠点がある。
【０００８】
また、他の公知の方法として、国際公開第０１／０６６７７５号（特許文献２）に記載される、内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡを連結する方法がある。この方法においては、隣接した連結を所望する核酸同士に、互いに重複部分を有するＤＮＡ断片を作製し、これをＤＮＡポリメラーゼの内在性エキソヌクレアーゼ活性を利用して連結する。
【０００９】
国際公開第９８／０４７４６号（特許文献３）は、核酸の分岐増幅法を開示する。しかし、この方法では、常磁性ビーズの使用が必須であり、その工程は非常に煩雑なものである。
【００１０】
特開平８−２６８号（特許文献４）は、連結した２本鎖ＤＮＡの製造法を開示する。ここでは、粘着末端配列の使用を前提としており、その工程は非常に煩雑なものである。
【００１１】
特開２００３−１８９８９０号（特許文献５）は、線状ＤＮＡ断片の製造法を記載する。しかし、複数の連結した核酸を構築する方法は記載されていない。特許文献５では、タンパク質の発現の鋳型を作製する内容にとどまり、毎回、正確さを損なっている可能性のあるPCR反応を用いるので、正確さにかけるという点も指摘される。
【００１２】
国際公開００／６６７６８号（特許文献６）は、核酸の増幅方法を記載する。しかし、複数の連結した核酸を構築する方法は記載されていない。
【００１３】
このように従来の方法では、連結した核酸が増幅できないか、できたとしても、極めて煩雑な過程を要し、かつ時間もかかっていた。
【００１４】
このような背景から、制限酵素を利用せずに任意の遺伝子コンストラクトを作成する技術や遺伝子クローニング技術の出現が待たれている。
【００１５】
また、クローニングに必要なPCRには酵素による配列の読み間違いが０％では無いことが指摘される。
【００１６】
ポストゲノム時代に、種々の遺伝子（全長配列）および遺伝子のドメイン（部分配列）の解析を行う上で正確な塩基配列の情報は重要である。１塩基の間違い（アミノ酸配列にも影響する可能性がある）は重要な問題であり、実際に変異解析等で１塩基の違いによって機能不全になるような遺伝子なども多く存在する。
【００１７】
PCRによって得られた連結した核酸構築物をそのままプローブおよびタンパク質発現の鋳型として使用することは正確な機能解析に用いることは好ましくなく（例えば特許文献５）、ポストゲノム時代での遺伝子解析には使用している核酸構築物が正確な配列情報を有することが必要不可欠である。従って、できる限りＰＣＲなどに起因する不正確な情報を含ませないことが望ましい。
【００１８】
プラスミド等のベクターに標的核酸構築物がクローニングされていれば、そのクローンを調べれば内在する核酸構築物の配列情報の正確さが確認でき、また同じ配列を有する核酸構築物（またそれを利用したプローブやタンパク質発現）がいつでも入手でき得る。以上のことより、連結した核酸構築物をクローニングできることは重要である。従って、そのような技術の登場が待ち望まれている。
【特許文献１】国際公開第９９／１６９０４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０６６７７５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／０４７４６号
【特許文献４】特開平８−２６８号
【特許文献５】特開２００３−１８９８９０号
【特許文献６】国際公開００／６６７６８号
【非特許文献１】Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．、Ｓｃｈａｒｆ  Ｓ．、Ｆａｌｏｏｎａ  Ｆ．、Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．Ｂ．、Ｈｏｒｎ  Ｇ．Ｔ．、Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ．Ａ．、Ａｒｎｈｅｉｍ  Ｎ．、（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０（４７３２）：１３５０〜１３５４頁
【非特許文献２】Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ．、Ｆａｌｏｏｎａ  Ｆ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｗｕ．Ｒ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ」、（１９８７年）、１５５頁
【非特許文献３】Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．、Ｆａｌｏｏｎａ，Ｆ．、Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．、Ｈｏｒｎ，Ｇ．、Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．、「Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉａｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ，１０１」、（１９８６年）、２６３頁〜２７３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
以上の点から、簡便、迅速、正確かつ費用効果の高く、制限酵素を用いることなく、複数の核酸分子を連結して核酸構築物を作製する技術の提供を目的とする。
【００２０】
本発明は、次の課題を解決することを目的とした。すなわち、制限酵素を用いないで、任意の２種の遺伝子断片をつなぎあわせて、核酸構築物を生産すること、制限酵素を用いないで遺伝子クローニングを行うこと、従来の制限酵素を併用したＰＣＲ法を用いた手法と比較して、格段に簡便かつ迅速な手法を提供すること、ならびにあらゆる種類の遺伝子コンストラクトの作成および遺伝子クローニングに対応する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、一部、核酸増幅反応において、ハイブリダイズする配列を２セットのプライマー対の一部に用いることにより、制限酵素を用いずに複数の配列が連結された核酸構築物を作製することに成功したことによって上記課題を解決する。本発明はまた、遺伝子のクローニングを行う方法もまた、提供する。
【００２２】
本発明では、簡便なクローンニングが達成された。連結した核酸構築物にベクターを含めておくことで、特別な作業も無く、分子生物学的手法により容易にクローニングできることも本件の利点であると言える
従って、本発明は、以下を提供する：
（１）複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製する方法であって、上記方法は、以下：
（ａ）第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および
（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用いて核酸増幅反応を行って連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
（２）  項目１に記載の方法であって、上記方法は、以下：
（ａ）第１の核酸分子をテンプレートとして用い、第１の核酸分子の３’末端部分に核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第１の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）第２の核酸分子をテンプレートとして用い、第２の核酸分子の３’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第２の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、ここで、上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および
（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用い、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子と、上記第２の順方向一本鎖核酸分子とをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行って、連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
（３）  項目１に記載の方法であって、以下：
（ｅ）工程（ｄ）によって得られた二本鎖核酸分子を増幅する工程、
をさらに包含する、方法。
（４）上記逆方向一本鎖核酸分子および上記順方向一本鎖核酸分子は、特異的にハイブリダイズするために十分であり、かつ、上記増幅反応を妨げない配列および長さを有する、項目２に記載の方法。
（５）上記第１の順方向一本鎖核酸分子が上記第２の核酸分子の５’末端部分と、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、または上記第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、項目２に記載の方法。
（６）上記第１の順方向一本鎖核酸分子が上記第２の核酸分子の５’末端部分と、相補的な配列を有するか、または上記第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、相補的な配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、項目５に記載の方法。
（７）上記第１の順方向一本鎖核酸分子と上記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および上記タグ配列に上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするタグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、項目２に記載の方法。
（８）上記第１の順方向一本鎖核酸分子と上記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および上記タグ配列に相補的な上記タグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、項目７に記載の方法。
（９）  上記第１の核酸分子または第２の核酸分子の少なくとも１つが、ベクターの配列の少なくとも一部分または全部を有する、項目１に記載の方法。
（１０）  上記ベクターは、クローニングベクターである、項目９に記載の方法。
（１１）  上記核酸の増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ  ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される増幅方法によって行われる、項目１に記載の方法。
（１２）上記核酸はＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（１３）項目１に記載の方法により得られる、核酸構築物。
（１４）２組の核酸プライマーセットであって、上記セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、
上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、
２組の核酸プライマーセット。
（１５）２組の核酸プライマーセットを設計するための方法であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する工程；
Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計する工程であって、
上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、工程、
を包含する、方法。
（１６）２組の核酸プライマーセットを生産するための方法であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する工程；
Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計する工程であって、
上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、工程；および
Ｃ）上記設計されたプライマーの配列を有する核酸分子を生産する工程
を包含する、方法。
（１７）２組の核酸プライマーセットを設計するためのプログラムであって、
Ａ）核酸配列判定手段に、第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較させて、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する手順；
Ｂ）プライマー設計手段に、上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計させる手順であって、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計させる、手順、
を包含する、プログラム。
（１８）２組の核酸プライマーセットを設計するためのプログラムが格納された記録媒体であって、上記プログラムは、
Ａ）核酸配列判定手段に、第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較させて、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する手順；
Ｂ）プライマー設計手段に、上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計させる手順であって、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計させる、手順、
を包含する、記録媒体。
（１９）２組の核酸プライマーセットの設計装置であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する核酸配列判定手段；
Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計するプライマー設計手段であって、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、プライマー設計手段
を備える、設計装置。
（２０）２組の核酸プライマーセットの合成装置であって、
Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する核酸配列判定手段；
Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計するプライマー設計手段であって、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、
上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、プライマー設計手段；および
Ｃ）上記設計されたプライマーの配列を有する核酸分子を生産する手段
を備える、合成装置。
（２１）複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製するためのキットであって、
Ａ）２組の核酸プライマーセットであって、上記セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、
上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、
２組の核酸プライマーセット；および
Ｂ）上記プライマーセットを用いた増幅反応のための反応試薬
を備える、キット。
（２２）所望の核酸分子をクローニングするためのキットであって、
Ａ）２組の核酸プライマーセットであって、上記セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、
上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、
２組の核酸プライマーセット；および
Ｂ）クローニングベクターである上記第１の核酸分子、
を備え、ここで、上記第２の核酸分子は、上記所望の核酸分子である、キット。
（２３）クローニングベクターである第１の核酸分子およびクローニングの標的である第２の核酸分子を用いて、所望の核酸分子をクローニングするための方法であって、上記方法において、上記第１の核酸分子および上記第２の核酸分子を含む複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製され、上記方法は、以下：
（ａ）上記第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）上記第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用いて核酸増幅反応を行って、上記所望の核酸がクローニングされた連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
（２４）  項目２３に記載の方法であって、上記方法は、以下：
（ａ）上記第１の核酸分子をテンプレートとして用い、上記第１の核酸分子の３’末端部分に核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第１の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第１の二本鎖増幅産物を得る工程；
（ｂ）上記第２の核酸分子をテンプレートとして用い、上記第２の核酸分子の３’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第２の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、ここで、上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、工程；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および
（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用い、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子と、上記第２の順方向一本鎖核酸分子とをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行って、上記所望の核酸がクローニングされた連結核酸増幅産物を得る工程
を包含する、方法。
（２５）  項目２３に記載の方法であって、以下：
（ｅ）工程（ｄ）によって得られた連結核酸増幅産物の配列決定を行って、上記所望の核酸を同定する工程、
をさらに包含する、方法。
（２６）  上記工程（ｄ）によって得られた連結核酸増幅産物を連結して環状にする工程を包含する、項目２３に記載の方法。
（２７）上記環状にする工程は、上記連結核酸増幅産物の末端をリン酸化し、かつ、リガーゼによる連結をおこなうことを包含する、項目２６に記載の方法。
（２８）上記環状化された連結核酸増幅産物を宿主細胞に導入し、上記連結核酸増幅産物を増幅させる工程をさらに包含する、項目２６に記載の方法。
（２９）  上記逆方向一本鎖核酸分子および上記順方向一本鎖核酸分子は、特異的にハイブリダイズするために十分であり、かつ、上記増幅反応を妨げない配列および長さを有する、項目２４に記載の方法。
（３０）  上記第１の順方向一本鎖核酸分子が上記第２の核酸分子の５’末端部分と、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、または上記第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、項目２４に記載の方法。
（３１）  上記第１の順方向一本鎖核酸分子が上記第２の核酸分子の５’末端部分と、相補的な配列を有するか、または上記第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、相補的な配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする、項目３０に記載の方法。
（３２）  上記第１の順方向一本鎖核酸分子と上記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および上記タグ配列に上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするタグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、項目２４に記載の方法。
（３３）  上記第１の順方向一本鎖核酸分子と上記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および上記タグ配列に相補的な上記タグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする、項目３２に記載の方法。
（３４）項目１に記載の方法により得られる核酸構築物を含む、細胞。
（３５）項目１に記載の方法により得られる核酸構築物によりコードされるポリペプチド。
【００２３】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に従う方法により、制限酵素を用いることなく、２以上の核酸分子を連結させた構築物を作製し得る。この方法により、従来法より核酸に簡便かつ迅速に核酸構築物を作製し得、ならびに、遺伝子のクローニング技術を改善し得る。
【００２５】
本発明によって提供される方法は、従来法と比較して簡便、迅速、正確かつ費用効果の高い方法であり、あらゆる核酸に適用可能である。本発明法により、制限酵素を用いないで、任意の２種またはそれより多い核酸分子をつなぎあわせて・新しい遺伝子構築物を作出することが可能となった。また、制限酵素を用いないで、任意の遺伝子をクローニングすることも可能になった。従来の制限酵素を利用するＰＣＲ法などの増幅反応を用いた手法と比較して、格段に簡便かつ迅速な手法、がはじめて提供された。
【００２６】
上述のように、特許文献１では、不要な配列が最終的な核酸断片に含まれてしまう。このことを克服する手段は、特許文献１には記載も示唆もされていない。これを解決するために、本発明では、必要な配列で相補的なプライマーを作製するということを見出し解決した。従って、この理論を用いて、クローニングを効率よく行う方法も提供された。
【００２７】
上述のように、特許文献２では、制限酵素が利用されているが、これでは標的の核酸に内在性の制限酵素配列が含まれていた場合には適用できない。この点で制限酵素に依存しない本件は優れているといえる。
【００２８】
上述のように、特許文献３は工程が煩雑である。また、主として標的核酸の効率的な増幅及びその検出等に重きが置かれており、本件での示すように新たな核酸構築物の作製およびクローニングを包含していない。
【００２９】
上述のように、特許文献４は、工程が煩雑である。この工程は、本発明により簡便化される。
【００３０】
上述のように、特許文献５では、タンパク質の発現の鋳型を作製する内容にとどまり、毎回、正確さを損なっている可能性のあるPCR反応を用いた核酸構築物の鋳型作製を行うよりも、本発明のように、ベクターにクローニングされた核酸構築物を用いる方が安価で簡便である。
【００３１】
特許文献６では、核酸増幅の方法が記載されているが、複数の連結した核酸は構築できず、本発明では、その方法を提供した点で注目に値する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００３３】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００３４】
（用語）
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、増幅反応を阻害しない限り「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。
【００３５】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。タンパク質などをコードする遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。
【００３６】
本明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（五炭糖）、リン酸基および含窒素複素環式塩基からなるDNAの単量体単位を指す。塩基は配糖体炭 素（五炭糖の1'炭素）を介して糖部分と結合しており、この塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。ヌクレオシドが五炭糖の3'位または5'位に結合したリン酸基を含む場合、これはヌクレオチドと呼ばれる。機能的に結合したヌクレオチドの配列を、本明細書では一般に「ヌクレオチド配列」およびそれらの 文法的等価物として称し、これは左から右の方向が5'末端から3'末端への通常の向きであるような定則によって表される。
【００３７】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
伸長反応に使用される場合、ヌクレオチドは、三リン酸の形態を採ることができる。ヌクレオシド三リン酸としては、ＤＮＡ構成成分であるデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）などが挙げられるがそれらに限定されない。伸長反応において、反応を停止させるヌクレオチドとしては、ダイデオキシチェインターミネーター法において用いられるような、ジデオキシアデノシン三リン酸（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）、ジデオキシウリジン三リン酸（ｄｄＵＴＰ）、ジデオキシイノシン三リン酸（ｄｄＩＴＰ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。特に言及しない場合、本発明において、「ヌクレオチド」と「ヌクレオチド三リン酸」とは互換可能に使用されることが理解される。
【００３９】
本明細書においてヌクレオチドは、「標識」され得る。そのような標識としては、例えば、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ＤＩＧ、酵素および化学発光を利用した任意の標識を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００４０】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。
【００４１】
本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能（例えば、マウスＩＡＰなどの機能）を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００４２】
本明細書において「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよい。ここで、ヌクレオシドは、塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物をいう。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）を包含する。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。タンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとるが、同様の機能を有する限り、ポリペプチドの改変体であってもよい。特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのフラグメント、同族体、誘導体、改変体を含む。
【００４５】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００４６】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号  １文字記号  意味
Ａｌａ      Ａ          アラニン
Ｃｙｓ      Ｃ          システイン
Ａｓｐ      Ｄ          アスパラギン酸
Ｇｌｕ      Ｅ          グルタミン酸
Ｐｈｅ      Ｆ          フェニルアラニン
Ｇｌｙ      Ｇ          グリシン
Ｈｉｓ      Ｈ          ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｉ          イソロイシン
Ｌｙｓ      Ｋ          リジン
Ｌｅｕ      Ｌ          ロイシン
Ｍｅｔ      Ｍ          メチオニン
Ａｓｎ      Ｎ          アスパラギン
Ｐｒｏ      Ｐ          プロリン
Ｇｌｎ      Ｑ          グルタミン
Ａｒｇ      Ｒ          アルギニン
Ｓｅｒ      Ｓ          セリン
Ｔｈｒ      Ｔ          トレオニン
Ｖａｌ      Ｖ          バリン
Ｔｒｐ      Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｙ          チロシン
Ａｓｘ                  アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ                  グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ                  不明または他のアミノ酸。
塩基
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００４７】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST 2.2.9 (2004.5.12 発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００４８】
本明細書において、「核酸構築物」とは、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む構築物をいう。通常、核酸分子は遺伝子をコードするが、それに限定されない。また、核酸構築物は、遺伝子をコードする核酸配列の他、必要に応じて作動可能に（すなわち、その核酸の発現を制御し得るように）連結された制御配列（例えば、プロモーター）を含む核酸配列、ならびに、必要に応じて制御配列（例えば、プロモーター）と、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含み得る。この構築物は、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
本明細書において「増幅産物」とは、核酸増幅反応によって得られる産物をいい、通常、核酸分子である。ある核酸分子を増幅して得られる増幅産物は、その核酸分子と実質的に同一の配列を含む。増幅産物は、二本鎖であることが多く、本明細書において、二本鎖の形態の場合特に二本鎖増幅産物ともいう。また、２以上の核酸分子が連結された増幅産物をいう場合、「連結核酸増幅産物」ともいう。
【００５０】
本明細書において「タグ配列」とは、目的となる（テンプレートとしての）核酸分子とは実質的に異なる配列であって、プライマーに取り込まれる配列をいう。タグ配列を用いることによって、本発明は、連結を容易にすることを達成した。
【００５１】
本明細書において、「特異的」とは、核酸配列について用いられる場合、ある核酸配列が、一般的な核酸配列よりも高いレベルで基準となる標準核酸配列と相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）することをいう。特異的な配列は、１つまたは複数存在し得る。また、ある特異的な配列存在するとき、それよりも特異性が高い配列が存在していてもよい。好ましくは特異的な配列は、ある部位においてのみ特異的に相互作用することをいう。
【００５２】
本明細書において、「ハイブリダイズする」とは、一定の条件下で、ある核酸分子と別の核酸分子とが特異的に相互作用してハイブリッドを形成することをいう。具体的には、核酸増幅反応において、目的となる核酸またはその等価物と、増幅手段に該当する核酸等価物とがハイブリッドを形成し、その後の増幅反応に続く工程をいう。本明細書において特に言及する場合は、ハイブリダイズは、「アニーリング」ともいう。増幅反応におけるハイブリダイズについては、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ等を参照のこと。
【００５３】
本明細書において「アニーリング」とは、二本鎖の核酸を変性して一本鎖にしたものを再び二本鎖にもどすことをいう。従って、核酸増幅反応では、アニーリングとハイブリダイズとは、同様の意味で用いることができる。例えば、ＤＮＡを加熱またはアルカリ処理などにより一本鎖に解離させた後、徐冷または中和すると再び二本鎖の状態にもどる。この現象をアニーリングといい、この性質を用いて核酸鎖間の塩基配列の相補性を調べることができる。ここでアニーリングする場合は、本発明の増幅方法において使用可能な程度の相補性を有すると判定することができる。
【００５４】
本明細書において「ハイブリダイズ可能」な核酸またはポリヌクレオチドとは、上記ハイブリダイズ条件下で別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸またはポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能な核酸として具体的には、配列表で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する核酸、好ましくは８０％以上の相同性を有する核酸、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸を挙げることができる。核酸配列の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
【００５５】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、および他の添加剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃などである。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）、同第３版（２００１）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ハイブリダイゼーション：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、他の添加物の存否など）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、ゼラチン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション条件としては、通常、ｐＨ６．８〜７．４が挙げられるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ等を参照のこと。一般的なハイブリダイゼーションについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００５６】
核酸の二本鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二本鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Tm（℃）＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−600／N−0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。なお、核酸増幅においては、ホルムアミドは核酸増幅においては、使用されないことが好ましい。従って、核酸増幅におけるハイブリダイゼーション条件の考慮は、上記一般式から当業者は、使用する増幅反応に応じて改変して用いることができる。
【００５７】
ＲＮＡ、ＰＮＡなどを利用したときは、当業者は、そのヌクレオチドに適切な関係式を利用することができる。ＲＮＡについては、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  Ｓ．Ｍ．  （１９９３）  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｅｄｓ．  Ｇｒｏｏｋｅ  Ｓ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ  Ｂ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ６７−８２  を参照のこと。
【００５８】
当業者は、上述のような関係式を用いて、標識または検出などに適切な条件を見出すことができることが理解される。
【００５９】
ハイブリダイズする核酸分子は、相互に実質的に相補的または完全に相補的であることが多い。
【００６０】
本明細書において、「相補（的）」であるとは、核酸について言及するとき、核酸の塩基配列において，各塩基をワトソン−クリック結合で対になる塩基でおきかえた塩基配列（核酸）をいう。通常、ＡとＴ（Ｕ）と、およびＣとＧとが互いに相補的であるといわれる。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」または「実質的に相補的」とは、別の核酸分子に対して、特異的にハイブリダイズし得る、核酸配列を表す。相補的な核酸配列は、一方の配列をワトソンクリックの塩基対に基づき変換した配列が、他方の配列と比較して、好ましくは７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％、９９％以上または１００％の配列同一性を有し得る。ここで、この配列同一性が１００％である場合、完全に相補的であるともいう。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き交換可能に使用され、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）を指す。本明細書中において、オリゴヌクレオチドは、特に言及しない限り、一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
【００６３】
本明細書において「核酸の分離」とは、ある核酸の集合を別の性質を有する核酸の集合から離すことをいう。そのような分離は、分子量、標識、親和性などを手がかりに行うことができる。分子量を手がかりに分離する場合は、電気泳動を行うことによって分離することができる。分子ふるいを用いても分子量による分離を行うことができる。
【００６４】
本発明では、標識の検出は、直接または間接的に行うことができる。直接行う場合は、例えば、放射能をガイガーカウンターなどで検出したり、蛍光を直接肉眼またはカメラなどで検出することができる。間接的に行う場合は、例えば、別に標識されたものをその標識に結合することによって、その別の標識を検出したり、標識を活性化する因子を付与してその活性化により標識（ビオチン、ストレプトアビジンなどの使用）を検出することなどにより検出を行うことが可能である。
【００６５】
本明細書において使用される「オートラジオグラフ」または「オートラジオグラフィー」とは、Ｘ線写真フィルムあるいは乾板を使って，生体内における放射性物質(トレーサー)の取込みを観察し、生体内物質の分布、移動、代謝を細胞化学、組織化学的に調べる方法をいう。オートラジオグラフには、マクロオートラジオグラフ法（可視オートラジオグラフ法）・ミクロオートラジオグラフ法（光顕オートラジオグラフ法）・ウルトラミクロオートラジオグラフ法（電顕オートラジオグラフ法）などが挙げられ、本発明においては、その目的に応じて任意に選択して使用することができる。
【００６６】
本明細書において使用される核酸増幅法は、核酸分子を増幅させることができる限り、任意の方法を利用することができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｇａｐ  ＬＣＲ、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）；核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；転写媒介増幅（ＴＭＡ）、等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｕｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）などを挙げることができる。
【００６７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、DNA 2 本鎖の解離, オリゴヌクレオチドとのアニーリング (annealing)、プライマーおよびDNA ポリメラーゼを利用しての相補鎖合成の3 反応を繰り返すことにより増幅が起こる増幅反応をいう。その具体的な例は、本明細書において実施例に例示されている。最もよく使用される核酸増幅技術である。Saiki R.K. etal.(1985), Science, vol.230, 1350-1354；Saiki R.K. etal.(1988), Science, vol.239, 487-491；ＵＳ４，６８３，２０２、ＵＳ４，６８３，１９５、ＵＳ４，９６５，１８８を参照。
【００６８】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）とは、リガーゼを用いた核酸増幅反応であり、標的ＤＮＡに相補的な隣接する３０ｎｔ長のプローブ４個を耐熱性ＤＮＡリガーゼの存在した、温度サイクルにかけると、標的ＤＮＡ依存的に隣接するプローブ同士の連結反応が繰り返し起こり、連結プローブが指数関数的に増加する。リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction：LCR）法は、耐熱性のDNAリガーゼを用いて温度サイクリング反応（熱処理と冷却の繰り返し反応）を行うことにより標的遺伝子配列を増幅、検出する方法である。本法では、熱処理により解離したDNAの二重らせんの双方にそれぞれに冷却して結合する２種類の隣りあった遺伝子断片、計４種類の遺伝子断片を用いて反応を行う。具体的には、２本鎖DNAを94−99℃で熱処理して、それぞれを１本鎖に解離させる。続く50−70℃での冷 却操作により、１本鎖に分離した標的DNAに２種類の隣りあった遺伝子断片が結合する。さらに、正常な配列であった場合、耐熱性DNAリガーゼによって隣り合う遺伝子断片が連結するが、１塩基でも異常があった場合は連結しない。この一連の反応を繰り返すことによって、正常DNA配列の場合、遺伝子断片の連結産物が指数関数的に増幅されるが、異常DNA配列は増幅されない。LandegrenU. et al.(1988), Science, vol.241, 1077-1080；Barany F.(1991), Proc. Natl.Acad. Sci. USA, vol.88, 189-193；特表平５−５０８７６４、特開２００１−２６９１８７を参照。
【００６９】
ｇａｐ  ＬＣＲとは、リガーゼを用いる核酸増幅の一つであり、連結末端に数塩基のギャップを導入、プローブ同士の平滑末端連結による偽陽性を防止、結合したプローブ間のギャップをＤＮＡポリメラーゼで埋めリガーゼで連結する。Marshall R.L. et al.(1994), PCR Methods Appl., vol.4, 80-84；特許３３３０５９９号を参照。
【００７０】
鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）とは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ，制限酵素を用いた核酸増幅反応であり、・制限酵素による一本鎖ニックによりＤＮＡポリメラーゼにより伸長しうるプライマーが生じる、置換されたＤＮＡ  鎖が次の複製の鋳型として機能する反応である。Hinc II認識部位をもったターゲットの複製とＳＤＡ反応増幅サイクルの２段階からなっている。ＳＤＡ法は単一温度の下で核酸の増幅を図るので、反応系を高温にさらす必要がなく、同時に複数のターゲットを増幅できることから自動化が容易である。ＳＤＡ法は、検出対象となる病原細菌のＤＮＡに制限酵素で切れ目を入れ、切れ目をもつＤＮＡ断片を順番に置換していくＤＮＡポリメラーゼの作用を用いてＤＮＡを増幅する技術であり、この技術は米国Becton Dickinson（ＢＤ社）によって遺伝子を増幅する方法として開発された。WalkerG.T. et al.(1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.89, 392-396；Walker G.T. etal.(1992), Nucleic Acids Res., vol.20, 1691-1696；特公平７−１１４７１８を参照。
【００７１】
Ｑβレプリカーゼ増幅（Ｑβ  ｒｅｐｌｉｃａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とは、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｑβレプリカーゼ）を用いた核酸増幅反応であり、Ｑβ  レプリカーゼの認識部位を含むＲＮＡプローブを標的にハイブリダイズ、結合していないプローブを除去後、結合したプローブをＱβレプリカーゼで複製増幅する反応である。Miele E.A. etal.(1983), J. Mol. Biol.,vol.171, 281-295；Lizardi P.M. et al.(1988), Biotechnology, vol.6, 1197-1202；US4,786,600、特許2710159、特許3240151を参照。
【００７２】
転写増幅システム（ＴＡＳ）とは、逆転写酵素、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応であり、標的ＲＮＡと同一配列のフォワードプライマー、標的ＲＮＡ  と相補的で５’側にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の付いたリバースプライマーを用い、鋳型ＲＮＡから転写産物を得る工程と、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成する工程を組み合わせる反応である。Kwoh D.Y. etal.(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86 1173-1177；特許２８４３５８６を参照。
【００７３】
自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）とは、ＴＡＳと同様の核酸増幅反応であるが、ＴＡＳ  にＲＮａｓｅＨ  を加えることにより、ｃＤＮＡ  とＲＮＡ  コピーの増幅が起こりともに次の反応の鋳型となる反応である。Guatelli J.C. etal.(1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, 1874-1878；特許３１５２９２７を参照。
【００７４】
核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）とは、逆転写酵素，ＲＮａｓｅ  Ｈ，  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いる反応をいう。標的ＲＮＡ  と同一配列のフォワードプライマー、標的ＲＮＡ  と相補的で５’側にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の付いたリバースプライマーを用い、鋳型ＲＮＡから転写産物を得る工程と、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成する工程を組み合わせる反応である。Compton J.(1991),Nature, vol.350, 91-92；Kievits T.(1991), J. Virol. Methods, vol.35, 273-286；特許２６４８８０２、特許２６５０１５９を参照。
【００７５】
転写媒介増幅（ＴＭＡ）とは、ＲＮａｓｅ  Ｈ  活性を有する逆転写酵素，  ＲＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅反応であり、標的ＲＮＡ  と同一配列のフォワードプライマー、標的ＲＮＡ  と相補的で５’側にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の付いたリバースプライマーを用い、鋳型ＲＮＡ  から転写産物を得る工程と、得られた転写産物を鋳型としてさらに転写産物を合成する工程を組み合わせる反応である。特許3241717、特開平11-46778、特開2000-350592を参照。
【００７６】
等温条件下キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ）とは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ，ＲＮａｓｅ  Ｈを用いた核酸増幅反応であり、ＲＮＡ−ＤＮＡからなるキメラプライマーを用い、鎖置換反応、鋳型交換反応、ニック導入反応により増幅を行う反応である。Notomi T. etal.(2000), Nucleic Acids Res., vol.28, e63；Nagamine K. etal.(2001), Clin. Chem., vol.47, 1742-1743；特許３３１３３５８、特開２００１−３４７９０を参照。
【００７７】
ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）とは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡ  ポリメラーゼを用いた核酸増幅反応であり、合成されたＤＮＡ  の３’末端が常にループを形成して次のＤＮＡ  の合成起点となるようプライマーを設計する反応である。http://www.takara.co.jp/news/2000/07-09/00-i-019.htm；ＷＯ２０００−５６８７７を参照。
【００７８】
本明細書において使用される「核酸増幅条件」とは、使用されるべき核酸増幅法において、核酸増幅が生じる任意の条件をいう。そのような条件は、上記文献を参酌して、当業者は、容易に選択することができる。
【００７９】
本明細書において、プライマー対として使用される核酸分子は、「順方向一本鎖核酸分子」と「逆方向一本鎖核酸分子」とから構成される。通常、ある核酸分子を増幅するために、順方向は、一本鎖またはセンス鎖の５’末端から３’末端向きの方向をいい、逆方向とは、その逆をいう。
【００８０】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。プライマーの長さは、通常１００塩基以下、より好ましくは８塩基〜８０塩基、さらにより好ましくは１０塩基〜４０塩基であるが、これらに限定されない。
【００８１】
遺伝子工学分野において通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と特異的なハイブリダイゼーション条件（通常核酸増幅条件）で標的となる核酸分子とハイブリダイズする、好ましくは実質的に相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。このようなプライマーを用いて本発明に用いる増幅産物を作製することができる。
【００８２】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００８３】
本明細書において「テンプレート」とは、核酸増幅反応において、増幅される対象となる配列を含む核酸分子またはその等価物をいう。
【００８４】
本明細書において遺伝子操作について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００８５】
本明細書において、ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、下記）に記載されている。
【００８６】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００８７】
原核細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
【００８８】
動物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
【００８９】
植物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ、ｐＣＧＮ１５４８、ｐＣＧＮ１５４９、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９０】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００９１】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。  そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【００９２】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法が挙げられる。
【００９３】
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、核酸（通常遺伝子をコードするが、それに限定されない）の導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明においては、本発明の核酸分子を細胞に導入する際にこのような遺伝子導入試薬が使用され得る。
【００９４】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部（組織など）をいう。形質転換体としては、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫などの細胞などの生命体の全部または一部（組織など）が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【００９５】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。あるいは、本発明では、天然物から分離した細胞も使用することができる。
【００９６】
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。あるいは、本発明では、初代培養細胞も使用することができる。
【００９７】
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る植物細胞としては、カルスまたはその一部および懸濁培養細胞、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科などの植物の細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
【００９８】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【００９９】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１００】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の方法または核酸構築物を使用することができる。本発明では、任意の核酸構築物を自在に作製することができることから、本発明はスクリーニングにおいても顕著な効果を発揮する。
【０１０１】
（遺伝子治療）
本発明の用途としては、自在に作製された核酸分子を修飾して細胞に遺伝子治療を施す遺伝子を組込むことが挙げられる。遺伝子は組織特異的プロモーターのコントロール下、または構成的プロモーター、またはその遺伝子を必要とする細胞における遺伝子の発現のための１もしくは複数のその他の発現制御領域の制御下に置くことができる。遺伝子治療に使用される遺伝子としては、例えば、嚢胞性線維症のためのＣＦＴＲ遺伝子、肺疾患のためのα−１−アンチトリプシン、免疫系疾患のためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、血液細胞疾患のためのＩＸ因子およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ならびに癌治療のための腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０２】
遺伝子治療に使用することが可能な遺伝子配列は公知のデーターベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等において検索し、入手できる。
【０１０３】
さらに、本発明は、ライブラリーで作業するまたはそれをスクリーニングするための工程の一部として、配列の機能を評価するため、またはタンパク質発現をスクリーニングするため、または特定の細胞タイプに対する特定のタンパク質または特定の発現制御領域に対する効果を評価するために利用することができる。
【０１０４】
本明細書において核酸の「少なくとも一方の先端」とは、その核酸の３’末端または５’末端の少なくとも一方を意味する。
【０１０５】
本明細書において、「複合体」とは、２つ以上の分子が相互作用を介して会合し、あたかも１つの分子のように挙動する状態となったものをいう。したがって、ハイブリダイズした核酸−核酸は複合体である。
【０１０６】
本明細書において「核酸合成酵素」とは、核酸を合成する能力を有する任意の酵素をいう。本明細書では、ポリメラーゼともいう。ヌクレオチドを縮合させてポリヌクレオチドにする反応を触媒する酵素の総称である。このような核酸合成酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１０７】
ポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。また、どちらのポリメラーゼでも、検出するのはＤＮＡ，ＲＮＡを問わないことが理解される。鋳型がどちらか（あるいは両方か）という違いだけである。（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡも鋳型にする。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして売られているものの中にも、ＲＮＡ依存性活性も持つものが有る）。このようなポリメラーゼとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼIクレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１０８】
本明細書において「伸長反応」とは、核酸について言及するとき、その核酸が少なくとも１ヌクレオチド伸びるような任意の反応をいう。ポリメラーゼを用いた伸長反応を行う場合、通常、鋳型に基づいてヌクレオチドが導入されることから、特定の配列が標識対象核酸などの伸長すべき核酸において伸長することになる。
【０１０９】
伸長反応は、（ｉ）標的核酸およびその相補鎖と核酸プライマーおよび核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ii）核酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応及びプローブの分解反応からなりこれら反応（ｉ）および（ii）は、例えばトリス塩酸緩衝液等の適当な緩衝液を含む水溶液中で実施することができる。このハイブリダイゼーション反応は、代表的には、５５〜７５℃で実施することができるがそれに限定されない。酵素反応は、代表的には、３７℃で実施することができるがそれに限定されない。
【０１１０】
プライマー伸長産物の変性は、上記伸長反応で得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理するなどを行うことによって実施することができる。
【０１１１】
標的核酸の増幅は、例えば、その標的核酸（標識対象核酸）が所望の量になるまで、工程上記伸長反応および変性を上記と同様の条件下で複数回繰り返せばよい。上記工程をｎ回行えば、理論的には標的核酸量は当初の２ｎ−１倍にまで増幅されることとなる。
【０１１２】
このような伸長反応は、市販のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから販売されている）を用いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
【０１１３】
混合物からの核酸の取り出しは、当該分野において任意の方法を用いて行うことができる。そのような取り出しとしては、例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、変性、アルコール沈澱、アフィニティー精製、抗体などを用いることができるがそれらに限定されない。
【０１１４】
本発明の方法において用いられる核酸の提供工程は、当該分野において周知の任意の技法（例えば、化学合成、遺伝子工学の利用、生体からの抽出）を利用して行うことができる。
【０１１５】
本発明の方法において用いられる複合体の生成は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。例えば、本明細書において別の場所において説明したような通常使用されるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することによって、複合体生成を行うことができることが理解される。
【０１１６】
本発明の方法において用いられる伸長反応は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。伸長反応には、伸長反応の触媒（例えば、核酸合成酵素）、触媒が反応することができる条件を提供する物質（例えば、緩衝液など）、伸長の際に入るべきヌクレオチド（標識、非標識など）を考慮することができる。また、反応条件をコントロールするために、温度などを調節する装置（例えば、恒温槽）を使用しても良い。
【０１１７】
伸長反応の後、混合物から標識が導入された核酸を取り出す工程もまた、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。そのような取り出す工程は、核酸を精製または分離するために通常使用される技術であれば、どのようなものであっても使用することができる。
【０１１８】
本発明の方法において、標的核酸に対応する伸長産物が存在するか検出する工程では、検出は、当該分野において周知の任意の技法を用いて、標識を直接または間接的に任意の方法で実施することができることが理解される。ここで、伸長産物の存在は、上記標的核酸の存在の指標であることが理解される。伸長産物は、伸長される前の未知核酸が存在しない限り、検出されないからである。ただし、伸長される前の未知核酸は、複数種類存在することが考えられることから、伸長産物の配列を決定することによって、より詳細な検出をすることができる。そのような伸長産物の配列決定は、当該分野において公知の任意の技法を用いて行うことができる。
【０１１９】
ハイブリダイズされるべき核酸分子同士の相補性は、伸長反応が進捗するに十分である程度であることが好ましい。そのような相補性の程度は、長さ、伸長反応条件などによって異なり、また、３’末端付近が伸長反応に適していることが好ましい。特に、３’末端の１〜２ヌクレオチドは、完全な相補性を有していることが好ましくあり得る。あるいは、短い方の核酸を基準として、通常、少なくとも５０％の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有していることがさらに好ましくあり得る。あるいは、標識対象核酸全部と相補的であってもよい。
【０１２０】
本発明の方法に用いうるＤＮＡポリメラーゼには、本発明のＤＮＡ連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、すべてのＤＮＡポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、２つの線状ＤＮＡ分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、ワクシニアウイルスＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片からなる群より選択される。ＤＮＡポリメラーゼの選択に際しては、合成（伸長）反応の正確性を考慮することが特に重要である。従って、特にタグの領域において、３‘→５’エキソヌクレアーゼ活性が強くhigh-fidelityを示すα型酵素（例えば、KOD-plus-：TOYOBO）が望ましい。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼとしては、KOD-plus-：TOYOBOなどの正確性が高い酵素が使用される。各線状ＤＮＡ分子の相補的ヌクレオチド配列の長さは、約５から約１００ヌクレオチドの間、好ましくは約８から約５０ヌクレオチドの間、最も好ましくは約１０から３５ヌクレオチドの間でありうる。インキュベーション混合物に公知の種々の刺激因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の効率を向上させ、かつ所望の反応産物、例えば一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を安定化させる因子が使用され得る。
【０１２１】
反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さまざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激因子には一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一本鎖結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスＩＣＰ８タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインＡ（例えば、ｙＲＰＡおよびｈＲＰＡ）を含むが、これらに限定されないものもある。当業者は、本発明の方法においてＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、他の適した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の１つの実施形態において、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ連結反応の収率を高める。
【０１２２】
線状ＤＮＡ分子の末端間の相補性の程度は、約５から約１００ヌクレオチドの間、好ましくは約８から約５０ヌクレオチドの間、最も好ましくは約１０から３５  ヌクレオチドの間を変動しうる。本発明の方法を用いて連結されうる線状ＤＮＡ分子は、制限酵素切断を用いて、原核生物または真核生物のゲノムのゲノムＤＮＡ、ならびにプラスミド、コスミド、ファージ、ＢＡＣなどを含む種々のベクターから入手してもよい。または、線状ＤＮＡ分子を、例えば自動合成などを用いる化学的手法によって合成してもよい。ＤＮＡ分子は任意の種由来のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡなどのＲＮＡ種に由来してもよく、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（下記）に記載された通りに、まず逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換して増幅することができる。
【０１２３】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１２４】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１２５】
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
【０１２６】
トランスジェニック生物を作り出すための様々な方法は、例えば、Ｍ．Ｍａｒｋｋｕｌａら、Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，９７−１０６（１９９６）；Ｒ．Ｔ．ＷａｌｌらＪ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，８０，２２１３−２２２４（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｄａｌｔｏｎ、ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４１１，４１９−４２８（１９９７）；およびＨ．Ｌｕｂｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，１０，１３１−１４３（１９９６）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの文献の各々は、本明細書において参考として援用される。
【０１２７】
（キット）
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、酵素、鋳型核酸、標準など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、酵素、ヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、伸長反応を止めるヌクレオチドなど（およびその三リン酸）、鋳型核酸、標準など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、試薬成分、緩衝液、塩濃縮液、使用するための補助手段、使用方法を記載した指示書などが含まれる。
【０１２８】
本明細書において「指示書」は、本発明の試薬の使用方法、反応方法などを使用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の酵素反応などの手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１２９】
（プログラム）
以下に本発明が提供するプログラムを説明するが、プログラムの記述は、当該分野において任意の言語（例えば、Ｃ＋言語、Ｐｅｒｌ、Ｂａｓｉｃ、ｈｔｍｌ、ＸＭＬ、Ｐａｓｃａｌ、ＦＯＲＴＲＡＮなど）を挙げることができるがそれらに限定されない。なお、特に限定しない限り、本明細書では、プログラムというとき、コンピュータプログラムを指すことが理解される。
【０１３０】
（記録媒体）
以下に本発明が提供する記録媒体について説明するが、記録媒体としては、プログラムを記録することができる限り、任意の形態（例えば、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードなどのような任意のタイプ）を使用することができることが理解される。
【０１３１】
（システム）
本発明の設計方法を実行するコンピュータ構成あるいはそれを実現するシステムの例を図４を参照して示す。図４は、本発明の方法を実行するコンピュータの５００の構成例を示す。
【０１３２】
コンピュータ５００は、入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４と、バス５０５とを備える。入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４とは、バス５０５によって相互に接続されている。入力部５０１と出力部５０３とは入出力装置５０６に接続されている。
【０１３３】
コンピュータ５００によって実行される本発明の処理の概略を説明する。
【０１３４】
本発明の方法を実行させるプログラムは、例えば、メモリ５０２に格納されている。あるいは、本発明の方法を実行させるプログラムは、それぞれ独立してあるいは一緒に、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＯＭのような任意のタイプの記録媒体に記録され得る。あるいは、アプリケーションサーバに格納されていてもよい。そのような記録媒体に記録された本発明のプログラムは、出入力装置５０６（例えば、ディスクドライブ、ネットワーク（例えば、インターネット））を介してコンピュータ５００のメモリ５０４にロードされる。ＣＰＵ５０２が本発明のプログラムを実行することによって、コンピュータ５００は、本発明の方法の処理を実行する装置として機能する。
【０１３５】
入力部５０１を介して、本発明において利用される系に関する情報などを入力する。また、測定されたディスクリプタのデータも入力される。必要に応じて、既知の情報に関する情報も入力してもよい。
【０１３６】
ＣＰＵ５０２は、入力部５０１で入力された情報をもとに、本発明において生成される情報から表示データを生成し、メモリ５０４に表示データを格納する。その後、ＣＰＵ５０２は、これらの情報をメモリ５０４に格納し得る。その後、出力部５０３は、ＣＰＵ５０２が選択した配列を表示データとして出力する。出力されたデータは、入出力装置５０６から出力され得る。
【０１３７】
（本発明の好ましい実施形態の詳細な説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【０１３８】
１つの局面において、本発明は、複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製する方法であって、上記方法は、以下：（ａ）第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得る工程；（ｂ）第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅される、工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用いて核酸増幅反応を行って連結核酸増幅産物を得る工程を包含する、方法を提供する。ここでは、２つの並行した増幅反応を行うが、第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅されていることが特徴である。このような増幅は、プライマーを特定の配列を有するように設計することによって達成することができる。
【０１３９】
１つの実施形態では、本発明の方法は、（ａ）第１の核酸分子をテンプレートとして用い、第１の核酸分子の３’末端部分に核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第１の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第１の二本鎖増幅産物を得る工程；（ｂ）第２の核酸分子をテンプレートとして用い、第２の核酸分子の３’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第２の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、ここで、上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用い、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子と、上記第２の順方向一本鎖核酸分子とをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行って、連結核酸増幅産物を得る工程を包含する。
【０１４０】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、（ｅ）工程（ｄ）によって得られた二本鎖核酸分子を増幅する工程をさらに包含する。
【０１４１】
１つの実施形態では、逆方向一本鎖核酸分子および順方向一本鎖核酸分子は、特異的にハイブリダイズするために十分であり、かつ、上記増幅反応を妨げない配列および長さを有する。このような長さは、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド長であり得、例えば、４０から８０ヌクレオチド長が好ましい。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明において使用される第１の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とは、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および上記タグ配列に上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするタグ相補配列とを、それぞれ含み得る。
【０１４３】
この実施形態の代表例を、図２から図３を参酌して説明する。
【０１４４】
ここでは、第１の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列およびこのタグ配列に相補的なタグ相補配列とを、それぞれ含むように設計される。
【０１４５】
この実施形態において、二本鎖核酸分子Ａは、核酸分子Ａに相補的な配列に特異的にハイブリダイズし得る順方向プライマーＰＡ（→）および核酸分子Ａに特異的にハイブリダイズし得る逆方向プライマーＰＡ（←）を用いたＰＣＲ反応によって増幅される。また、二本鎖核酸分子Ｂは、核酸分子Ｂに相補的な配列に特異的にハイブリダイズし得る順方向プライマーＰＢ（→）および核酸分子Ｂに特異的にハイブリダイズし得る逆方向プライマーＰＢ（←）を用いたＰＣＲ反応によって増幅される（図２（ａ））。
【０１４６】
ここで、プライマーＰＡ（←）およびプライマーＰＢ（→）は、それぞれ、タグ配列部分（ＴＡ（←）およびＴＢ（→））を有し、ＴＡ（←）およびＴＢ（→）は、実質的に相補的である。
【０１４７】
工程（ａ）および（ｂ）における増幅産物を混合し、熱変性して急冷することにより、相補的な核酸をアニーリングさせる。ここで、図３のように、４種類のハイブリッドが形成される。ここで、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチド塩基を加え、形成されたハイブリッドＩＩＩおよびハイブリッドＩＶにおける一本鎖核酸部分の相補鎖を合成し（図３）、核酸分子Ａ、相補的タグ部分、および核酸分子Ｂが連結した、核酸構築物を得る。
【０１４８】
必要に応じて、この後、プライマーＰＡ（→）およびプライマーＰＢ（→）を用いてさらなるＰＣＲ反応を行い、目的の核酸構築物を増幅する。
【０１４９】
ここで、相補的タグ部分は、最終産物に組み込まれるため、目的に邪魔にならない配列を用いることが重要である。例えば、ある実施形態において、タグ配列部分は、核酸分子Ａまたは核酸分子Ｂの、連結部側の末端部分の配列である。
【０１５０】
また、増幅産物の末端が平滑でない場合、工程（ｄ）を妨げる原因となり得るか、または目的の核酸構築物に所望でない変異を生じる可能性がある。そのため、増幅産物の末端は平滑である（すなわち、二本鎖が全く同じ長さであり、かつ末端が揃っていること）ことが望ましい。例えば、Ｔａｑポリメラーゼは３’末端にＡを付加するため、工程（ａ）のＰＣＲ反応における酵素として望ましくない。工程（ａ）のＰＣＲのために望ましい酵素としては、例えば、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社より入手可能）が挙げられる。
【０１５１】
また、工程（ｃ）において、変性後のアニーリング工程において、充分に混合することが、経験的に重要である。
【０１５２】
別の実施形態では、第１の順方向一本鎖核酸分子が第２の核酸分子の５’末端部分と、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、または第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、あるいはその両方であってもよい。この場合は、タグ配列は必要とされないが、タグ配列を使用してもよい。また、連結されるべき複数の配列の間に外来配列を持ち込ませないためには、このタグ配列を含まない形態を用いることが好ましい。ただし、この実施形態のように、テンプレートとなる核酸分子とプライマーとの間に相補配列がある場合でも、さらなるタグ配列を用いて、特異的な設計（たとえば、制限部位の導入、イントロンの導入、インテイン部位の導入など）を行ってもよい。
【０１５３】
この実施形態では、好ましくは、第１の順方向一本鎖核酸分子が上記第２の核酸分子の５’末端部分と、相補的な配列を有するか、または第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、相補的な配列を有するか、あるいはその両方であり得る。
【０１５４】
代替の実施形態において、本発明に従う方法における増幅工程は、当業者に公知の他の増幅方法を使用し得る。代替の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法（Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８  １８９（１９９１年））、ｇａｐ  ＬＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）法（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２０：１６９１（１９９２年））、Ｑβレプリカーゼ増幅、転写増幅システム（ＴＡＳ）、自己支持配列複製システム（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；３ＳＲ）、等温条件下キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いる核酸配列の増幅（ＩＣＡＮ；Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｕｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）法（日本国特許番号第３４３３９２９号）、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｔｓｕｇｕｎｏｒｉ  Ｎｏｔｏｍｉら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２：ｅ６３）などが挙げられるが、これらに限定されない。しかし、本発明に従う方法において、最も好ましい増幅方法は、ＰＣＲ法である。
【０１５５】
また、代替の実施形態において、核酸分子Ａは、核酸分子Ｂと連結する側の末端部分に、核酸分子Ｂとの重複配列を有し、工程（ｃ）において、この部分によって連結し得る。この場合、プライマーＰＡ（←）およびプライマーＰＢ（→）は、互いに相補的なタグ部分を有する必要はない。このような実施形態は、例えば、スクリーニングによって別々に単離された同一ｃＤＮＡのクローンから、全長ｃＤＮＡを含むクローンを得るためなどに利用可能である。
【０１５６】
本発明に従う代替の実施形態において、連結される核酸分子は、３以上であり得る。
【０１５７】
一実施形態において、本発明は、本発明に従う核酸構築物を作製するための、キットを提供し得る。本発明に従うキットは、工程（ａ）および（ｂ）において順方向および／または逆方向のプライマーとして使用し得る一本鎖核酸分子を含み、必要に応じて他の構成要素を含んでも含まなくても良い。これらの構成要素としては、反応用の緩衝液、酵素、オリゴヌクレオチド、滅菌水、使用説明書などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの構成要素は、必要に応じて、同一の容器で提供され得るか、または別々の容器で提供され得る。
【０１５８】
別の局面において、本発明は、本発明の核酸増幅方法によって得られた核酸構築物を提供する。本発明はまた、本発明によって提供された核酸構築物がコードするポリペプチドを提供する。
【０１５９】
別の局面において、本発明は、本発明の核酸連結方法を実施するために使用される２組の核酸プライマーセットを提供する。このセットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、第１の順方向一本鎖核酸分子および第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される。具体的な条件は、本明細書において上記され、実施例において例示されているとおりである。
【０１６０】
別の局面において、本発明は、２組の核酸プライマーセットを設計するための方法であって、Ａ）第１の核酸分子と第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する工程；Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計する工程であって、上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、工程、を包含する、方法を提供する。ここで、設計されるべき配列の長さおよび配列自体は、プライマー設計における当上記分野における通常の知識を用いて選択することができる。そのような設計は、例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）などを参照のこと。
【０１６１】
別の局面において、本発明は、２組の核酸プライマーセットを生産するための方法であって、Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する工程；Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計する工程であって、上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、上記Ａ）工程において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、工程；およびＣ）上記設計されたプライマーの配列を有する核酸分子を生産する工程を包含する、方法を提供する。ここで、Ａ）およびＢ）の工程は、上記される任意の形態を採ることができる。次に、Ｃ）工程は、当上記分野において周知の任意の核酸分子の増幅・生産方法を利用することができることが当業者に理解される。
【０１６２】
別の実施形態において、本発明はまた、本発明に従う順方向および／または逆方向のプライマーとして使用し得る一本鎖核酸分子を設計するためのコンピューターソフトウェアを含み得る。これらのコンピューターソフトウェアとしては、本発明に適したプライマーを設計する任意のソフトウェアを含み得る。設計されたプライマーを合成するための合成装置もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０１６３】
１つの局面において、本発明は、２組の核酸プライマーセットを設計するためのプログラムであって、Ａ）核酸配列判定手段に、第１の核酸分子と第２の核酸分子の核酸配列とを比較させて、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する手順；Ｂ）プライマー設計手段に、上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計させる手順であって、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計させる、手順、を包含する、プログラムを提供する。ここで各手順の実施は、上記方法において説明されるように、任意の公知の方法を用いてプライマー設計を行うことが可能である。
【０１６４】
従って、別の局面において、本発明は、２組の核酸プライマーセットを設計するためのプログラムが格納された記録媒体であって、上記プログラムは、Ａ）核酸配列判定手段に、第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較させて、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する手順；Ｂ）プライマー設計手段に、上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計させる手順であって、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計させる、手順を包含する、記録媒体を提供する。ここで各手順の実施は、上記方法において説明されるように、任意の公知の方法を用いてプライマー設計を行うことが可能である。
【０１６５】
別の局面において、本発明は、２組の核酸プライマーセットの設計装置であって、Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する核酸配列判定手段；Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計するプライマー設計手段であって、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、プライマー設計手段を備える、設計装置を提供する。ここで各手段は、上記方法において説明されるように、任意の公知の方法を用いてプライマー設計を行うことが可能である。代表的には、これらの手段は、コンピュータ内においてソフトウェアを用いて実現され得る。
【０１６６】
別の局面において、本発明は、２組の核酸プライマーセットの合成装置であって、Ａ）第１の核酸分子および第２の核酸分子の核酸配列とを比較して、上記第１の核酸分子および第２の核酸分子が特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ配列を互いに有するかどうかを判定する核酸配列判定手段；Ｂ）上記第１の核酸分子を増幅するための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、上記第２の核酸分子を増幅するための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットを設計するプライマー設計手段であって、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在しないと判定された場合、上記ハイブリダイズする条件下で互いにハイブリダイズする第１タグ核酸配列および第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計し、上記Ａ）手順において、上記ハイブリダイズ配列が存在すると判定された場合、上記内部ハイブリダイズ配列および上記内部ハイブリダイズ配列に対して上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする内部ハイブリダイズ相補配列、あるいは上記第１タグ核酸配列および上記第２タグ核酸配列を、それぞれ、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子および上記第２の順方向一本鎖核酸分子の５’末端上流に含むように、プライマーを設計する、プライマー設計手段；およびＣ）上記設計されたプライマーの配列を有する核酸分子を生産する手段を備える、合成装置を提供する。ここでＡ）およびＢ）手段は、上記方法において説明されるように、任意の公知の方法を用いてプライマー設計を行うことが可能である。代表的には、これらの手段は、コンピュータ内においてソフトウェアを用いて実現され得る。Ｃ）手段は、代表的には、公知のオリゴヌクレオチド合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）を用いることができる。
【０１６７】
別の局面において、本発明は、複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製するためのキットであって、Ａ）２組の核酸プライマーセットであって、上記セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、２組の核酸プライマーセット；およびＢ）上記プライマーセットを用いた増幅反応のための反応試薬を備える、キットを提供する。このプライマーセットは、本明細書において上記される任意の形態を採ることができる。ここで利用される反応試薬は、当上記分野において公知で、代表的に市販され得る、任意の核酸増幅のための試薬（例えば、ＰＣＲ試薬；ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液など）を採用することができる。
【０１６８】
別の局面において、本発明は、所望の核酸分子をクローニングするためのキットであって、Ａ）２組の核酸プライマーセットであって、上記セットは、第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得るための、第１の順方向一本鎖核酸分子と第１の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第１プライマーセットと、第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得るための、第２の順方向一本鎖核酸分子と第２の逆方向一本鎖核酸分子とを含む第２プライマーセットとを含み、上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、２組の核酸プライマーセット；およびＢ）クローニングベクターである上記第１の核酸分子を備え、ここで、上記第２の核酸分子は、上記所望の核酸分子である、キットを提供する。ここで、プライマーセットは、本明細書において上記されている通りであり、任意の形態を使用することができる。このキットにおいて使用されるクローニングベクターは、任意の形態を用いることができ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどから市販されているベクターを利用することも可能である。
【０１６９】
従って、別の局面において、本発明は、クローニングベクターである第１の核酸分子およびクローニングの標的である第２の核酸分子を用いて、所望の核酸分子をクローニングするための方法を提供する。この方法では、上記第１の核酸分子および上記第２の核酸分子を含む複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製される。本発明のこのクローニング方法は（ａ）上記第１の核酸分子を増幅して第１の二本鎖増幅産物を得る工程；（ｂ）上記第２の核酸分子を増幅して第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするような配列を有するように増幅される、工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用いて核酸増幅反応を行って、上記所望の核酸がクローニングされた連結核酸増幅産物を得る工程を包含する。ここで、各増幅工程およびハイブリダイズ工程は、本明細書において上述される複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製する方法において採用され得る任意の形態を利用することが可能であることが理解される。
【０１７０】
１つの好ましい実施形態では、本発明のクローニング方法は、以下の工程：（ａ）上記第１の核酸分子をテンプレートとして用い、上記第１の核酸分子の３’末端部分に核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第１の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第１の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第１の二本鎖増幅産物を得る工程；（ｂ）上記第２の核酸分子をテンプレートとして用い、上記第２の核酸分子の３’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の逆方向一本鎖核酸分子、および上記第２の核酸分子の相補鎖の５’末端部分に上記核酸増幅条件においてハイブリダイズ可能な第２の順方向一本鎖核酸分子をプライマーとして用いて、核酸増幅反応を行って第２の二本鎖増幅産物を得る工程であって、ここで、上記第１の順方向一本鎖核酸分子および上記第２の逆方向一本鎖核酸分子は、上記第１の二本鎖増幅産物の３’末端部分と、上記第２の二本鎖増幅産物の５’末端部分とが、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするように設計される、工程；（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）によって得られた上記第１および第２の二本鎖増幅産物を混合し、一本鎖に変性して、特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズさせる工程；および（ｄ）上記（ｃ）の混合物をテンプレートとして用い、上記第１の逆方向一本鎖核酸分子と上記第２の順方向一本鎖核酸分子とをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行って、上記所望の核酸がクローニングされた連結核酸増幅産物を得る工程を包含する。ここで、各増幅工程およびハイブリダイズ工程は、本明細書において上述される複数の核酸分子を連結した核酸構築物を作製する方法において採用され得る任意の形態を利用することが可能であることが理解される。
【０１７１】
特許文献１では、不要な配列が最終的な核酸断片に含まれてしまうという欠点があり、そのままでは、クローニングに首尾よく利用することが困難であった。本発明では、必要な配列で相補的なプライマーを作製することを見出したことから、特に、本発明のクローニング方法の１つの有利な利点であると考えられる。
【０１７２】
１つの実施形態では、本発明のクローニング方法は、以下の工程：（ｅ）工程（ｄ）によって得られた連結核酸増幅産物の配列決定を行って、上記所望の核酸を同定する工程、をさらに包含する。
【０１７３】
１つの好ましい実施形態では、本発明の方法では、上記工程（ｄ）によって得られた連結核酸増幅産物を連結して環状にする工程を包含する。環状にすることにより、ベクターは、通常プラスミドの形態となり、適切な宿主細胞に導入され得るようになるからである。宿主細胞に導入されることにより、タンパク質の発現または増幅などを簡便に行うことが可能になり、選択も容易になる。
【０１７４】
ここで、好ましくは、環状化工程は、上記連結核酸増幅産物の末端をリン酸化し、かつ、リガーゼによる連結をおこなうことを包含する。リン酸化には、当該分野において公知の通常のキナーゼを利用することができ、連結は、当該分野において公知の通常のリガーゼを利用することができる。
【０１７５】
別の実施形態において、本発明の方法は、上記環状化された連結核酸増幅産物を宿主細胞に導入し、上記連結核酸増幅産物を増幅させる工程をさらに包含する。増幅は、当該分野において公知の任意の条件下で行うことができる。適切な条件は、宿主細胞が一旦与えられると、当業者は容易に決定することができることに留意すべきである。
【０１７６】
本発明のクローニング方法の好ましい実施形態では、上記逆方向一本鎖核酸分子および上記順方向一本鎖核酸分子は、特異的にハイブリダイズするために十分であり、かつ、上記増幅反応を妨げない配列および長さを有する。
【０１７７】
別の実施形態において、本発明のクローニング方法は、上記第１の順方向一本鎖核酸分子が上記第２の核酸分子の５’末端部分と、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、または上記第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズする配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする。両方がハイブリダイズする配列である場合は、環状化が簡便になることが予期される。
【０１７８】
本発明のクローニング方法の好ましい実施形態では、上記第１の順方向一本鎖核酸分子が上記第２の核酸分子の５’末端部分と、相補的な配列を有するか、または上記第２の逆方向一本鎖核酸分子が上記第１の核酸分子の３’末端部分と、相補的な配列を有するか、あるいはその両方であることを特徴とする。両方がハイブリダイズする配列である場合は、環状化が簡便になることが予期される。
【０１７９】
本発明のクローニング方法の好ましい実施形態では、上記第１の順方向一本鎖核酸分子と上記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および上記タグ配列に上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズするタグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする。
【０１８０】
本発明のクローニング方法の好ましい実施形態では、上記第１の順方向一本鎖核酸分子と上記第２の逆方向一本鎖核酸分子とが、第１の核酸分子とも第２の核酸分子とも、上記特異的配列のみがハイブリダイズする条件下でハイブリダイズしないタグ配列および上記タグ配列に相補的な上記タグ相補配列とを、それぞれ含むことを特徴とする。
【０１８１】
本発明の方法の一部または全体を自動化するための装置もまた、本発明の範囲内である。
【０１８２】
本発明の１つの実施形態において、連結される所望の核酸分子の少なくとも１つは、ベクターの配列を有する。本発明に好適なベクターとしては、プラスミド、およびウイルスが挙げられる。核酸分子の１つとしてベクター（特にクローニングベクター）を用いる場合、本発明は、遺伝子クローニング技術として用いられ得る。
【０１８３】
クローニングベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１１８／１１９  タイプベクター、ｐＵＣ１８／１９  タイプベクター、ｐＴＷＶ２２８／２２９  ＤＮＡ、ｐＢＲ３２２  ＤＮＡなどを挙げることができ、それらは、例えば、Ｒｏｃｈｅ，ＴａＫａＲａなどから入手可能である。
【０１８４】
本発明の１つの実施形態において、本発明によって構築された核酸構築物を導入された細胞もまた、本発明に含まれ得る。これらの細胞としては、細菌（例えば、大腸菌）、真菌（例えば、酵母）、動物細胞（例えば、ヒト、類人猿、ウシ、ウマ、ブタおよびげっ歯類などの哺乳動物細胞ならびに非哺乳動物細胞）、植物細胞（例えば、被子植物および裸子植物）の細胞が、挙げられる。細胞に核酸構築物を導入する方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
本発明に従う核酸構築物またはこれにコードされるペプチドは、薬学的組成物中に組み込まれ得、ヒトまたは他の動物に投与され得る。これらの薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、丸剤、錠剤、シロップ剤、カプセルなどの経口薬、注射または輸液（皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内など）によって投与される滅菌の溶液剤、鼻腔内投与されるエアロゾル剤、座剤などであり得るが、これらに限定されない。
【０１８６】
また、本発明に従う核酸構築物を導入された細胞をヒトまたは他の動物に投与することによる、遺伝子治療の方法が、本発明によって提供され得る。
【０１８７】
また、本発明によって、本発明に従う方法によって構築された核酸構築物を導入された細胞を移植された動物または植物もまた、提供される。本発明に従う核酸構築物を導入した動物または植物の利用方法としては、例えば、本発明に従う核酸構築物または本発明に従う核酸構築物によってコードされるペプチドを乳として分泌するウシ、ウマ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳動物、本発明に従う核酸構築物または本発明に従う核酸構築物または本発明に従う核酸構築物によってコードされるペプチドを可食部分（例えば、実、地下茎、葉など）に蓄える食用の植物（例えば、芋類、果物類、野菜類など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１８９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】
【０１９０】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、和光純薬、Ｓｉｇｍａ、東洋紡、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、アマシャム、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、フナコシ、ニッポンジーンなどから市販されているものを使用した。合成ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに生産を依頼したが、当業者は当該分野において周知の技法を用いてそのようなＤＮＡおよびＲＮＡを合成することができることが理解される。
【０１９１】
（実施例１：ＣＴＡ−ＰＣＲ法による遺伝子断片Ａと遺伝子断片Ｂからの新規遺伝子コンストラクトＡ＋Ｂの構築法の具体例〜タグを利用した方法〜）
（初回ＰＣＲ）
遺伝子断片Ａと遺伝子断片Ｂとを別々に増幅させる。
【０１９２】
遺伝子断片Ａの増幅のために、５’側末端のプライマーと３’側末端のプライマー（これは、プライマーにタグ配列が結合したものである）を用いて、増幅反応をさせた。
【０１９３】
まず、遺伝子断片Ａを構成する二本鎖核酸分子を熱により一本鎖に解離させた。
【０１９４】
次いで、上記のプライマーセットと解離した後の一本鎖核酸分子とを混合し、その混合物にＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＴＯＹＯＢＯから提供されるKOD-Plus-）を加える。
【０１９５】
次に、増幅反応を以下の条件で行うと、２種類の相補鎖（もとの遺伝子断片Ａと同じ長さとそのものにタグを付加したもの）が合成される。
【０１９６】
これは、本来の遺伝子断片Ａが１分子、および新たな遺伝子断片Ａ＋タグ配列ＴＡの２種類である。
【０１９７】
次に、遺伝子断片Ｂの増幅のために、５’側末端のプライマー（これは、遺伝子断片Ａの増幅に使用したタグ配列に実質的に相補的であるタグ配列がプライマーに結合したものである）と３’側末端のプライマーを用いて、増幅反応をさせた。
【０１９８】
まず、遺伝子断片Ｂを構成する二本鎖核酸分子を熱により一本鎖に解離させた。
【０１９９】
次いで、上記のプライマーセットと解離した後の一本鎖核酸分子とを混合し、その混合物にＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯから入手可能）を加える。
【０２００】
次に、増幅反応を以下の条件で行うと、２種類の相補鎖（もとの遺伝子断片Ｂと同じ長さとそのものにタグを付加したもの）が合成される。
PCR反応条件
温度  時間
94 ℃  2分                 一次熱変性
94 ℃  15秒                熱変性        -----|
55 ℃  30秒                アニーリング  〜20サイクル
68 ℃  2分                 伸長反応      -----|
68 ℃  6分                 最終伸長反応
これは、本来の遺伝子断片Ｂが１分子、および新たな遺伝子断片Ｂ＋タグ配列ＴＢの２種類である。
【０２０１】
次いで、上記合成反応の後、ＰＣＲ増幅をｎサイクル行うと、新たな遺伝子断片Ａ＋ＴＡおよびＢ＋ＴＢが大量（２ｎ−１分子）に生産され、そしてもとの遺伝子断片ＡまたはＢは、１分子生産されるだけである。このようにして、タグ配列が結合した遺伝子断片を構成する一本鎖核酸分子が大量に合成される。
PCR反応液の組成
KOD-Plus-(1U/μl)               0.4 μl
10Xbuffer                         2 μl
25 mM MgSO4                     0.8 μl
2 mMdNTP                          2 μl
PCR断片A                        0.5 μl
PCR断片B                        0.5 μl
水（滅菌水）                   13.8 μl。
【０２０２】
PCR反応条件
温度  時間
94 ℃  3分                 熱変性
氷中   1分                 この時にピペッティングで溶液を良く混合する
68 ℃  10分                伸長反応。
【０２０３】
次に、二次ＰＣＲを行う。これは、段階１における生産物を混合したものを試料とするＰＣＲであり、タグ部分のアニーリングと伸長反応とを含む。
【０２０４】
この模式図は、図２〜３に示す。
【０２０５】
混合し、変性し、アニーリングすると、以下の四種類のハイブリッドが形成される。
ハイブリッドＩ：Ａ＋ＴＡの二本鎖
ハイブリッドＩＩ：Ｂ＋ＴＢの二本鎖
ハイブリッドＩＩＩ：Ａ＋ＴＡとＢ＋ＴＢとが、それぞれの３'末端側におけるＴＡとＴＢとのハイブリッド形成により二本鎖を形成するもの
ハイブリッドＩＶ：Ａ＋ＴＡとＢ＋ＴＢとが、それぞれの５'末端側におけるＴＡとＴＢとのハイブリッド形成により二本鎖を形成するもの。
【０２０６】
なお、もとの遺伝子断片はそれぞれ１分子ずつ存在するが、これらは、ハイブリッド形成に関与しないので、無視できる。
【０２０７】
次に、アニーリングが終わったら、A+TA（→）/B+TB（←）を増幅させるためのプライマーを用てPCRによる伸長反応を1度だけ行う。この時、4種のハイブリッドのなかで、ハイブリッドIII（すなわち、A+TA（→）/B+TB（←））だけが次の1回だけのPCRのテンプレートとなる。
【０２０８】
段階3．3次PCR
この反応では、ハイブリッドIIIだけが新規遺伝子コンストラクトの唯一のテンプレートとなり、プライマーPA（→）、PB（←）を用いたPCRを行うことによって新規遺伝子コンストラクトA+Bだけが純粋に増幅できる。
【０２０９】
PCR反応液の組成
KOD-Plus-(1U/μl)                  2 μl
10倍buffer                        10 μl
25 mM MgSO4                        4 μl
2 mMdNTP                          10 μl
プライマー1 (PA((R)):50 μM)     0.5 μl
プライマー2 (PB(¬):50 μM)      0.5 μl
PCR断片A+B                       0.5 μl
水（滅菌水）                    72.5 μl。
【０２１０】
PCR反応条件
温度  時間
94 ℃  2分                一次熱変性
94 ℃  15秒               熱変性      -----|
55 ℃  30秒               アニーリング  〜20サイクル
68 ℃  4分                伸長反応    -----|
熱変性〜伸長反応までは２０サイクル程度繰り返す。
68 ℃  8分                最終伸長反応。
【０２１１】
この実施例で実施されるＣＴＡ−ＰＣＲにおいては、例えば、ＣＴＡ−ＰＣＲでの相補的タグは、最終的には新規遺伝子の中に取り込まれるので、相補的タグは内部の適切な配列を使って設計されることが好ましい。あるいは、そのような配列を用いて、変異を入れることも可能である。段階２の産物は、熱変性→アニーリングの急冷過程において十分に混合することが経験的に重要であるようである。従って、理論に束縛されることは望まないが、この急冷過程での混合が経験的に重要であるようである。また、ＰＣＲ産物の末端は平滑であること（すなわち、２本鎖がまったく同じ長さであり、かつ末端がそろっていること）が望ましい。例えば、用いるＤＮＡ  ポリメラーゼがＴａｑの場合には、末端にＡが付加されるので、このようなポリメラーゼの使用は避けるのがよい。そのようなポリメラーゼとしては、例えば、ＡＣＣＵＺＹＭＥ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （フナコシ）、ＡｃｃｕＳｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（フナコシ）、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）ＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）等を挙げることができる。
【０２１２】
同じようにＣＴＡ−ＰＣＲを行うことにより、新規遺伝子コンストラクトＡ＋Ｂ＋ＣやＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄなども同様に作出することができる。
【０２１３】
上述のように、図３されるハイブリッドＩＩＩが最終伸長反応後に得られるが、この３次ＰＣＲ反応後に次の工程を行う。
【０２１４】
（ハイブリッドＩＩＩにおいて片方（ＡもしくはＢ）がベクター（プラスミド）の場合）
最終産物（ハイブリッドＩＩＩ）を精製しプライマー等を除く
・ＱＩＡＧＥＮのＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて行う
（詳細はＱＩＡＧＥＮ社のプロトコールに従う）
↓
精製されたハイブリッドＩＩＩ末端のリン酸化
（ＴＡＫＡＲＡ社のＫｉｎａｓｅを用いたリン酸化を行う。製造業者のプロトコールに従う）
↓
リン酸化されたハイブリッドＩＩＩの精製
（ＱＩＡＧＥＮのＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用する）
↓
精製されたハイブリッドＩＩＩの環状連結
（ＴＡＫＡＲＡ社のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いた連結を行う。製造業者のプロトコールに従う）
↓
大腸菌への形質転換→ハイブリッドＩＩＩのクローン化が完了する。
【０２１５】
（実施例２：アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のある一つのｃＤＮＡの領域Ａに下流の領域Ｂを結合させた新規遺伝子コンストラクトＡ＋Ｂの作成）
以下に、特定のアフリカツメガエルのｃＤＮＡの上流部分の核酸分子Ａに、同ｃＤＮＡの下流部分の核酸分子Ｂを連結した遺伝子Ａ＋Ｂの構築物を得た実施例を示す。
【０２１６】
本実施例では、プライマー自体にタグ（重複部分）を設計せずに、領域Ａと領域ＢのＰＣＲによって得られた２つの断片（断片Aの3’末端部分と断片Bの5’末端部分）の中に見出された重複配列をそのままタグとして利用する。
【０２１７】
この場合にも、実施例１に示されるような、その重複部分を同等の長さになるように相補的タグ配列を挿入したプライマーを用いた場合とまったく同じ結果を得ることができる。
【０２１８】
領域A断片を作成するために、領域Aに対して
PA(→):5’-TGAACTCGAGCAGCAAATTTACTGCAAACC-3’（配列番号１）
PA(←):3’-ATGGACGACACAAACAGCGAGCAGCAGTT-5’（配列番号２）
というプライマーを使用した。
【０２１９】
また、領域B断片を作成するために、領域Bに対して
PB(→):5’-TGGTATCCTCTGAAGATACCATCAGAGAGC-3’（配列番号３）
PB(←):3’-AGTTTGCCATTCAGTCTCTGCTCGAGTGCT-5’（配列番号４）
というプライマーを使用した。
【０２２０】
プライマーP(→)とP(←)で増幅されたPCRフラグメントA(1537b)の配列を、図５に示す（配列番号５）。注：太字かつ下線は使用したプライマー部分を示す（図５参照）。
【０２２１】
プライマーP(→)およびPB(←)で増幅されたPCRフラグメントB(1434b)の配列を、図６に示す（配列番号６）注：太字かつ下線は使用したプライマー部分を示し、斜体部分はフラグメントAの3’末端とフラグメントBの5’末端での重複配列である67 bpを示す（図６下側参照）（配列番号７）。
【０２２２】
段階１：１次PCR（領域A断片および領域B断片の作成）
PCR反応液の組成
KOD-Plus-(1U/μl)                                  2 μl
10Xbuffer                                         10 μl
25 mM MgSO4                                        4 μl
2 mMdNTP                                          10 μl
プライマー1 (PA((R))またはPA(¬):50 μM)         0.5 μl
プライマー2 (PB(¬)またはPB((R)):50μM)          0.5 μl
テンプレートDNA(断片Aまたは断片B：200 ng/μl)    0.5 μl
水（滅菌水）                                     72.5μl。
【０２２３】
PCR反応条件
温度  時間
94 ℃  2分                 一次熱変性
94 ℃  15秒                熱変性     -----|
55 ℃  30秒                アニーリング  〜20サイクル
68 ℃  2分                 伸長反応   -----|
68 ℃  6分                 最終伸長反応
ここで、KOD-Plus-はTOYOBO社の商品、buffer（10倍液）、MgSO4溶液、およびdNTP溶液はKOD-Plus-の添付品、そして、プライマーはInvitrogen社に特別発注したものである（以下同様）。
【０２２４】
段階2．2次PCR(タグ部分のアニーリングと伸長反応)
PCR反応液の組成
KOD-Plus-(1U/μl)           0.4 μl
10Xbuffer                     2 μl
25 mM MgSO4                 0.8 μl
2 mMdNTP                      2 μl
PCR断片A                    0.5 μl
PCR断片B                    0.5 μl
水（滅菌水）               13.8 μl。
【０２２５】
PCR反応条件
温度  時間
94 ℃  3分                 熱変性
氷中   1分                 この時にピペッティングで溶液を良く混合する
68 ℃  10分                伸長反応。
【０２２６】
段階3．3次PCR（PCR断片AとPCR断片Bが結合した新たなコンストラクトA+Bの作成）
PCR反応液の組成
KOD-Plus-(1U/μl)                2 μl
10倍buffer                      10 μl
25 mM MgSO4                      4 μl
2 mMdNTP                        10 μl
プライマー1 (PA((R)):50 μM)   0.5 μl
プライマー2 (PB(¬):50 μM)    0.5 μl
PCR断片A+B                     0.5 μl
水（滅菌水）                  72.5 μl。
【０２２７】
PCR反応条件
温度  時間
94 ℃  2分                 一次熱変性
94 ℃  15秒                熱変性     -----|
55 ℃  30秒                アニーリング  〜20サイクル
68 ℃  4分                 伸長反応   -----|
熱変性〜伸長反応までは２０サイクル程度繰り返す。
68 ℃  8分                 最終伸長反応。
【０２２８】
最終的に得られた遺伝子A+B（2,904 bp）の配列を、図７に示す（配列番号８）。注：太字かつ下線は使用した重複配列を示す。
【０２２９】
実施例１とは異なり、本実施例では、プライマー自体にタグ（重複部分）を設計せずに、領域Ａ、領域ＢのＰＣＲによって得られた２つの断片（断片Ａの３’末端部分と断片Ｂの５’末端部分）の中に見出された重複配列をそのままタグとして利用している。この場合にも、「発明の概略」に示したように、その重複部分を同等の長さになるように相補的タグ配列を挿入したプライマーを用いた場合とまったく同じ結果を得ることができる。
【０２３０】
本実施例において、核酸分子Ａおよび核酸分子Ｂは、重複部分（図２Ｂにおける斜体で示した領域）を有するため、プライマー設計において、相補的タグ部分を考慮する必要はなかった。
【０２３１】
このように、本発明は、制限酵素を用いないで、任意の２種の遺伝子断片をつなぎあわせて、新しい核酸構築物を作成すること、制限酵素を用いないで、任意の遺伝子をクローニングすること、従来の制限酵素を利用するＰＣＲ法を用いた手法と比較して、格段に簡便かつ迅速な手法がはじめて提供された。特に、Ａ配列としてベクターを使用すれば、新規クローニング法として活用することができる。
【０２３２】
（実施例３：タグ配列を利用したクローニング例）
次に、タグ配列を利用した遺伝子増幅によるクローニング例を実施した。
【０２３３】
（１．遺伝子断片ＡおよびＢのＰＣＲによる増幅）
実施例１に記載される遺伝子増幅法に基づき、一方にクローニングベクターを採用して、それぞれの断片に対して下記の試薬を調整し、以下の反応条件でＰＣＲを行った。
94℃         2分
94℃         15秒   -----|
57℃         30秒   15サイクル
68℃         3分    -----|
68℃         6分。
【０２３４】
遺伝子断片AとしてSTRATAGENE社のプラスミドpBluescriptIISK(+)（配列番号９）を用いた。
KOD-Plus-(1U/μl)                  0.4μl
10×buffer                         2.0μl
25mM MgSO4                         0.8μl
2mMdNTP                            2.0μl
Primer1      (10μM)               0.5μl
Primer2      (10μM)               0.5μl
遺伝子断片A（100ng）               1.0μl
水（滅菌水）                      12.8μl。
【０２３５】
遺伝子断片BとしてクローニングしたいDNA（配列番号１０）を用いた。
KOD-Plus-(1U/μl)                  0.4μl
10×buffer                         2.0μl
25mM MgSO4                         0.8μl
2mMdNTP                            2.0μl
Primer3      (10μM)               0.5μl
Primer4      (10μM)               0.5μl
遺伝子断片B（100ng）               1.0μl
水（滅菌水）                      12.8μl
・PCRによって増幅された遺伝子断片A,B混合液を用いた伸長反応遺伝子断片A,BそれぞれのPCR産物を用いて下記の試薬を調製し以下の反応条件で伸長反応を行った。
94℃         2分
氷冷         1分（この時点で反応液をピペッティングによりよく混ぜる）
68℃         10分。
KOD-Plus-(1U/μl)                  0.4μl
10×buffer                         2.0μl
25mM MgSO4                         0.8μl
2mM dNTP                           2.0μl
PCR産物（遺伝子断片A由来）         0.5μl
PCR産物（遺伝子断片B由来）         0.5μl
水（滅菌水）                      13.8μl。
【０２３６】
遺伝子断片Ａ、Ｂが連結されたＡ＋Ｂを増幅するＰＣＲ反応伸長反応産物を用いて下記の試薬を調製し、以下の反応条件でＰＣＲを行った。
94℃         2分
94℃         15秒 -----|
57℃         30秒   20サイクル
68℃         3分  -----|
68℃         6分。
KOD-Plus-(1U/μl)                  0.4μl
10×buffer                         2.0μl
25mM MgSO4                         0.8μl
2mMdNTP                            2.0μl
伸長反応産物                       0.5μl
Primer1      (10μM)               0.5μl
Primer4      (10μM)               0.5μl
水（滅菌水）                      13.3μl。
【０２３７】
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、１０×ｂｕｆｆｅｒ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭ  ｄＮＴＰはＴＯＹＯＢＯ社の試薬を用いた。
【０２３８】
各プライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成された物を利用した。pBluescriptII SK(+)、全長2961bpを、図８に示す（配列番号９、下線がPrimerに用いた配列）。
Primer1      GGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATC（配列番号１１）
Primer2      GGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGG（配列番号１２）。
【０２３９】
遺伝子断片B、全長592bp、クローニングしたい塩基配列を、図９に示す（配列番号１０、下線がPrimerに用いた配列）。ただしPrimer3の太字の配列のみが遺伝子断片B（図８）に帰属しており、Primer3の斜体字の配列はタグ配列でありPrimer2の相補的配列となっている。
Primer3      CCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGAAGAAAAACAACTGGAACT（配列番号１３）
Primer4      TCTCGAATTCTCAGAGATTAGTGCCGGAAA（配列番号１４）。
【０２４０】
遺伝子断片A、遺伝子断片Bおよび遺伝子断片タグ連結部の模式図を図１０に示す。
【０２４１】
（ＰＣＲ反応終了後の処理）
ＰＣＲ産物の精製
ＰＣＲ産物を精製してプライマーを除去するためにＱＩＡＧＥＮのＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用した。
【０２４２】
精製されたＰＣＲ産物末端のリン酸化
精製されたＰＣＲ産物をＴＡＫＡＲＡ社のキナーゼを用いて遺伝子断片末端のリン酸化を行った。キナーゼ処理後にキナーゼを熱変成により失活させておいた。
【０２４３】
ＰＣＲ産物のリガーゼ反応
ＴＡＫＡＲＡ社のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてリン酸化された遺伝子断片Ａ＋Ｂを環状に連結させた。
【０２４４】
形質転換
リガーゼ反応液をＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のコンピーテントセルを用いて遺伝子断片Ａ＋Ｂ（Ｂが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋））を大腸菌株に形質転換した。形質転換された各々の単一大腸菌株をもとにプラスミドを精製したところ、遺伝子断片Ａ＋Ｂ（Ｂが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋））がすべてのプラスミドで確認された（図１１）。
【０２４５】
このように、本発明は、制限酵素を用いない簡便なクローニング手法として機能することが明らかになった。
【０２４６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２４７】
本発明によって提供される方法は、従来法と比較して簡便、迅速、正確かつ費用効果の高い方法であり、あらゆる核酸に適用可能である。一局面において、本発明の方法は、従来法より格段に簡便かつ迅速なスクリーニング方法に使用され得る。また、本発明の方法は、分子生物学、組織および器官の再生、再生医学および再生医療、遺伝子治療、診断学、ならびに医薬品開発などの分野で幅広く活用可能である。本発明の方法によって構築される核酸構築物は、医薬品の製造、遺伝子治療などに幅広く使用され得る。従って、本発明は、産業上の利用可能性が極めて高いといえる。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１】図１は、発明の実施形態の解説。依頼書３〜４頁。（ａ）が一次ＰＣＲ工程、（ｂ）が一次ＰＣＲ産物のハイブリッド４種類を得るところまで、（ｃ）が相補鎖合成工程を示す。
【図２】図２Ａは、実施例の核酸分子Ａの配列の増幅を示し、図２Ｂは、実施例の核酸分子Ａの配列の増幅を示す。
【図３】図３は、実施例１での核酸連結の具体的な連結を示す。
【図４】図４は、本発明のプログラムを実行するコンピュータである。
【図５】図５は、実施例２においてプライマーP(→)とP(←)で増幅されたPCRフラグメントA(1537b)の配列構成図である。
【図６】図６は、実施例２においてプライマーP(→)およびPB(←)で増幅されたPCRフラグメントB(1434b)の配列構成図である。
【図７】図７は、実施例２においてプライマーP(→)およびPB(←)で増幅されたPCRフラグメントB
【図８】図８は、本発明において用いられたpBluescriptII SK(+)（全長２９６１ｂｐ）およびその増幅に用いるプライマーの配列構成図である。
【図９】図９は、本発明において用いられた遺伝子断片B、全長592bp、クローニングしたい塩基配列ならびにそれを増幅する際に用いたプライマーの配列構成図である。
【図１０】図１０は、本発明において用いられた遺伝子断片A、遺伝子断片Ｂおよび遺伝子断片タグ連結部の配列構成図である。
【図１１】図１１は、実施例３における増幅結果である。レーン１：ＤＮＡ分子量マーカー；レーン２：遺伝子断片Ａ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋））のＰＣＲ産物、２９６１  ｂｐ；レーン３：遺伝子断片ＢのＰＣＲ産物、５９２  ｂｐ；レーン４：連結された遺伝子断片Ａ＋ＢのＰＣＲ産物、３５５３  ｂｐである。
【配列表フリーテキスト】
【０２４９】
配列番号１：領域Ａ断片を作製するためのフォワード配列
配列番号２：領域Ａ断片を作製するためのリバース配列
配列番号３：領域Ｂ断片を作製するためのフォワード配列
配列番号４：領域Ｂ断片を作製するためのリバース配列
配列番号５：実施例２においてプライマーP(→)とP(←)で増幅されたPCRフラグメントA(1537b)の配列
配列番号６：実施例２におけるプライマーP(→)およびPB(←)で増幅されたPCRフラグメントB1434b)の配列
配列番号７：フラグメントAの3’末端とフラグメントBの5’末端での重複配列である67 bpの配列
配列番号８：実施例２における最終的に得られた遺伝子A+B（2,904 bp）の配列
配列番号９：プラスミドpBluescriptII SK(+)の配列
配列番号１０：実施例３において用いられた所望の配列
配列番号１１：実施例３において用いられたプライマー１
配列番号１２：実施例３において用いられたプライマー２
配列番号１３：実施例３において用いられたプライマー３
配列番号１４：実施例３において用いられたプライマー４
【図５】
2006296350.tif 000003
【図６】
2006296350.tif 000004
【図８】
2006296350.tif 000005
【図９】
2006296350.tif 000006
【図１０】
2006296350.tif 000007
【図１】
2006296350.tif 000008
【図２】
2006296350.tif 000009
【図３】
2006296350.tif 000010
【図４】
2006296350.tif 000011
【図７】
2006296350.tif 000012
【図１１】
2006296350.tif 000013
【配列表】
2006296350000001.app