(57)【要約】【課題】生体内で高いコレステロール低減作用の高い乳酸菌【解決手段】死滅後であってもコレステロールミセル中のコレステロール低減作用の高い乳酸菌を選抜することにより、経口摂取した場合でも高いコレステロール低減作用を発現する【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌のミセル中コレステロールを減少させる能力に優れた株を選択する工程を含む、生体内のコレステロールを低減させる作用を有する乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
レシチンに対する親和性の高い株を選択することを特徴とする請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
生菌および死菌でもミセル中コレステロールを１０％以上減少できる株を選択する工程を含む請求項１または２のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
レシチンに対する親和性が２倍以上高い株を選択することを特徴とする請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により選抜された、生体内のコレステロールを低減させる乳酸菌。
【請求項６】
ミセル中コレステロールを１０％以上減少する能力を有する、請求項５記載のコレステロール低減作用を有するラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属菌株。
【請求項７】
Lactobacillus crispatus JCM 5810またはBifidobacterium bifidum OLB 6026である請求項６記載のコレステロール低減作用を有する菌株。
【請求項８】
請求項５〜７いずれか１項記載の乳酸菌を含有する飲食品。
【請求項９】
請求項５〜７いずれか１項記載の乳酸菌を処理したコレステロール低減作用を有する組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４いずれか１項記載の方法によりスクリーニングされた乳酸菌を含むことを特徴とするコレステロール低減剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内のコレステロール低減作用を有する乳酸菌を含有する食品に係る発明である。
【背景技術】
【０００２】
現在までに、コレステロールを菌体に吸着する乳酸菌、生体内のコレステロール合成酵素を阻害する乳酸菌の存在が示され、コレステロールの生体内収支に直接的に作用することで生体内コレステロール値を低減させる乳酸菌が報告されている。
【０００３】
例えば、特開２０００−１９７４６９号（下記特許文献１）では、二次胆汁酸非生成であり且つ胆汁酸の一つであるタウロコール酸を吸着することが認められたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＴＭＣ０４０９をもちいて血清コレステロール低下を狙っている。
【０００４】
また、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ．１， ４３−５０（１９９９）（下記非特許文献１） では、Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ の分離菌株（Ｌ１）を用い、実際に血中コレステロールを測定し、ヒトの血清中のコレステロール低下作用があることを報告している。
【０００５】
また、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４９， ｎｏ．２， Ｐ．３７７−３８１（１９８５）（下記非特許文献２）には、胆汁の存在下で生育しコレステロールの資化能力がある菌株が、高コレステロール飼料を与えられた豚の血清コレステロールの増加を有意に阻害したことが報告されている。更に、特許第２９９２９４５号（下記特許文献２）においては、乳酸菌のコレステロール低下作用は、コレステロールの吸着及び胆汁酸脱抱合活性等によるものと考えられている。胆汁酸脱抱合能は、遊離のコール酸を生じて抱合胆汁酸のコレステロールの吸収能を阻害すると同時に他の栄養素の吸収も阻害し、また脱抱合された胆汁酸が二次胆汁酸と変換されると大腸癌リスクが高くなることから、胆汁酸脱抱合活性を有しないコレステロール低減作用を有する乳酸菌が開示されている。
さらに最近では、抱合型胆汁酸の吸着作用を有する乳酸菌（下記特許文献３）、脱抱合型胆汁酸の吸着作用を有する乳酸菌が見いだされている（下記特許文献４）。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１９７４６９号公報
【特許文献２】特許第２９９２９４５号
【特許文献３】特開２００３−２３５５０１号公報
【特許文献４】特開２００４−２０８５７７号公報
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ．１， ４３−５０ （１９９９）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．４９， ｎｏ．２， Ｐ．３７７−３８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、現在までの乳酸菌による、コレステロールの低減作用は、コレステロールの吸着又はコレステロールの吸収阻害など、体外から生体内へ吸収されるコレステロール量、もしくはコレステロールの代謝物を制御しようとするものであった。
【０００８】
ところが、生体内ではコレステロールはコレステロールミセルの状態で消化管から吸収されることが知られている(J. Nutr., 1999, 1725-1730)。したがって、効果的に生体内のコレステロールを下げるためには、コレステロールミセル中のコレステロールも減少させる必要がある。
【０００９】
乳酸菌がミセル中のコレステロールを低減させるとの報告はあるが、その作用は乳酸菌が抱合型胆汁酸を脱抱合型胆汁酸に変換することに起因すると考えられている（食品工業, 2001，26-33）。しかしながら、乳酸菌を経口摂取した場合、多くの乳酸菌は胃の酸により死滅し、菌体中の酵素も失活してしまうという問題があった。したがって、本願発明の解決する課題は、死滅後であってもミセル中のコレステロールを低減する作用を有する乳酸菌を選抜することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では加熱処理によって胆汁酸の脱抱合括性を失活させた乳酸菌でもミセル中コレステロールを減少する現象を見出し、本発明を完成させた。さらに、その作用メカニズムを解明するため、ミセルを形成する主要成分であるコレステロール、胆汁酸、およびレシチンに対する菌体の親和性を調べた。その結果、乳酸菌の中にはレシチンに高い親和性を有する菌が存在すること見出した。コレステロールは疎水性が強いため、レシチンや胆汁酸がミセルの表面に存在することが推測されている。
【００１１】
すなわち、本発明は
[１]  乳酸菌のミセル中コレステロールを減少させる能力に優れた株を選択する工程を含む、生体内のコレステロールを低減させる作用を有する乳酸菌のスクリーニング方法、
[２]  レシチンに対する親和性の高い株を選択することを特徴とする前記[１]記載のスクリーニング方法、
[３]  生菌および死菌でもミセル中コレステロールを１０％以上減少できる株を選択する工程を含む前記[１]または[２]のいずれか記載のスクリーニング方法、
[４]  レシチンに対する親和性が２倍以上高い株を選択することを特徴とする前記[２]記載のスクリーニング方法、
[５]  前記[１]〜[４]のいずれか１つに記載のスクリーニング方法により選抜された、生体内のコレステロールを低減させる乳酸菌、
[６]  ミセル中コレステロールを１０％以上減少する能力を有する、前記[５]記載のコレステロール低減作用を有するラクトバチルス属またはビフィドバクテリウム属菌株、
[７]  Lactobacillus crispatus JCM 5810またはBifidobacterium bifidum OLB 6026である前記[６]記載のコレステロール低減作用を有する菌株、
[８]  前記[５]〜[７]いずれか１つ記載の乳酸菌を含有する飲食品、
[９]  前記[５]〜[７]いずれか１つ記載の乳酸菌を処理したコレステロール低減作用を有する組成物、
[１０]  前記[１]〜[４]いずれか１つ記載の方法によりスクリーニングされた乳酸菌を含むことを特徴とするコレステロール低減剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の乳酸菌は、死滅後であってもミセル中のコレステロール低減作用を有するので、生体内で高いコレステロール低減作用を発揮できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
乳酸菌とは、資化した糖の５０％以上を乳酸に変換する微生物（例えば、ラクトバチルス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、およびストレプトコッカス属）をいうが、本発明では、これら乳酸菌に加え、ビフィドバクテリウム属菌（いわゆるビフィズス菌）も含むが、特にラクトバチルス属および／またはビフィドバクテリウム属菌が好ましい。
【００１４】
ミセル中のコレステロール低減作用は、熱処理等の後でも活性が高いことが望ましく、低減率が１０％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは３０％以上である。
【００１５】
ミセル中のコレステロール低減作用の高い株は、レシチンへの吸着性も高いため、レシチンへの吸着作用でスクリーニングを行ってもよく、対照に比べ２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上である株を選択すればよい。
【００１６】
このようにスクリーニングにより分離された菌は、種々の飲食品に添加することができるほか、コレステロール含有食品を本願発明の乳酸菌で処理すること、又は、コレステロール含有食品を本願発明の乳酸菌で加工することにより、コレステロールを低減させることができる。
【００１７】
例えば、ヨーグルト製品等の乳発酵製品の製造過程において、本願発明にかかる乳酸菌を、単独で又は他の乳酸菌と混合して発酵用乳酸菌として用いることができ、更に発酵過程後に添加することもできる。
又、特定保健用食品等の機能性食品として、これら菌体を、飲食し易い形態、例えば、固形、粉末、粒状に加工して、経口により投与するようにすることもできる。
【００１８】
更に、本件発明の乳酸菌は、菌体を通常の加工手段により加工し、菌体抽出物、菌体破砕物などの形態で利用することもできる。
【実施例】
【００１９】
（供試株および培養方法）
Bifidobacterium bifidum OLB 6026は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに平成１７年２月３日付けで、受領番号NITE AP-74として寄託されている。また、JCM株は理化学研究所微生物株系統保存施設から入手したものであり、MEP株、MH株はそれぞれ、明治乳業株式会社、弘前大学戸羽研究室の保存株である。
Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatusとLactobacillus gasseriは37℃に設定したインキュベーター（EYELA、SLI-600N）内で5ml MRS broth（MERCK、1.10661）で16-18時間静置培養することを3回連続して行った。培養にはネジ口試験管（マルエム、NR-10）を用い、接種菌量は一白金耳とし、培養時、スクリュー栓は密栓した。継代培養して得られた3回目の培養液15ml（3％に相当）を500ml MRS brothに接種して37℃で静置培養した。培養時間は16-18時間とした。培養後、5℃、5,000rpmで20分間遠心分離し、得られた菌体を脱イオン水で洗浄した。平板培養の場合は5ml MRS brothで16-18時間静置培養することを2回連続して行った。2回連続して継代培養して得られた2回目の培養液100μlをMRS寒天平板（φ90mm）培地にコンラージ棒で全面塗抹して37℃で嫌気培養した。培養時間は48時間とした。培養後、MRS平板培地上に脱イオン水1.5ml加えてコンラージ棒で懸濁し、その懸濁液1mlを1.5ml遠沈管に採取して5℃、5,000rpmで10分間遠心分離した。得られた菌体を脱イオン水で洗浄した。菌体洗浄を3回繰り返し、−30℃で冷凍保存後、凍結乾燥機（EYELA、FD-5N）で凍結乾燥して凍結乾燥菌体を得た。凍結乾燥した乳酸菌体を脱イオン水に懸濁し、バクテリアカウンターで菌数を測定した。菌数の計算は下記の式で求めた。
菌数（cells／ml）の計算式＝数えた合計菌数×20×20×50×1000×希釈倍率／数えた画数
Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium infantisおよびBifidobacterium longumは37℃に設定したインキュベーター中で2ml GAM broth（日水製薬、Code 05422）で24時間、アネロパック（三菱ガス化学、A-03）を用いて嫌気的に培養した。培養にはネジ口試験管（マルエム、NT-16）を用い、接種菌量100μlとし、培養時、スクリュー栓は緩めた状態にした。液体培養の場合は3回連続して行った培養液を培養液25ml（5％に相当）を500ml GAM brothに接種して37℃で嫌気培養した。培養時間は24時間とした。平板培養の場合は2回連続して継代培養して得られた2回目の培養液100μlをGAM寒天平板（φ90mm）培地にコンラージ棒で全面塗抹して37℃で嫌気培養した。培養時間は24時間とした。培養後、GAM平板培地上に脱イオン水1.5ml加えてコンラージ棒で懸濁し、その懸濁液1mlを1.5ml遠沈管に採取して5℃、5,000rpmで10分間遠心分離した。得られた菌体を脱イオン水で洗浄した。菌体洗浄を3回繰り返し、−30℃で冷凍保存後、凍結乾燥機で凍結乾燥して凍結乾燥菌体を得た。凍結乾燥後の菌体は乳酸菌体と同様の操作で菌数を測定した。
【００２０】
[試験例１]ミセル中コレステロール減少活性の評価法
1  コレステロールミセルの作成
0.5mM コレステロール（SIGMA、C-8667）を酢酸エチル（関東化学、Cat.No.14029-01）に溶解し、0.6mMホスファチジルコリン（SIGMA、P-7443）をメタノール（関東化学、Cat.No.25183-71）に溶解したものをネジ付試験管（IWAKI、8422CTF）中で混合した。15mM NaH2PO4・2H2O（関東化学、Cat.No.37239）と15mM Na2HPO4・12H2O（関東化学、Cat.No.37240-01）でリン酸緩衝液（pH7.4）を調製し、6.6mMタウロコール酸ナトリウム（SIGMA、T-9034）、132mM NaCl（関東化学、Cat.No.37144-01）を溶解させ、先のネジ付試験管に加えた。ネジ付試験管中の溶液に超音波発生機（TOMY、LD-120、発振棒径3mm）で超音波を照射後、37℃、24時間インキュベートした。ミセル調製時の試薬採取量の具体例を表１に示した。
【００２１】
【表１】
2006217879.tif 000002
【００２２】
2  コレステロールミセルと菌体あるいは菌体成分との混合振盪
ネジ口試験管（マルエム、NR-10）に凍結乾燥した検体50mg、1で作成したミセル溶液2.5mlを加えた。37℃の恒温水槽中に5分間静置した後、37℃に設定した低温恒温器（IWAKI、ICB-151LN）内でシェーカー（IWAKI、SHK-320N、旋回振盪120rpm）を用いて2時間振盪した。振盪時、試験管は横置きとした。振盪後、2,400rpm、10分間遠心分離（KOKUSAI、H-108m2）した。上清を0.2μmのフィルター（Whatman、Cat.No.6900-2502）で濾過し、pHメーターで濾液のpHを測定した。そして、濾液はコレステロールを抽出するまで冷凍保存（−4℃）した。
【００２３】
3  ミセル中コレステロールの抽出法
ネジ口試験管に濾液1ml、クロロホルム（関東化学、Cat.No.07278-01）8ml、メタノール4ml加えて、40℃に設定した恒温水槽で5分間静置後、40℃に設定した低温恒温器内でシェーカーを用いて30分間振盪した。振盪時、試験管は横置きとした。振盪後、試験管に脱イオン水2mlを加えて2,400rpm、10分間遠心分離した。上層をパスツールピペットで除去し、得られた下層に窒素ガスを吹き付け溶媒を留去した。残渣にヘキサン（関東化学、Cat.No.18041-01）5ml、脱イオン水5mlを加えてよく振盪し、2,400rpm、5分間遠心分離して上層のヘキサン層を採取した。ヘキサン抽出を3回繰り返し、ヘキサン抽出画分に窒素ガスを吹き付け、ヘキサンを留去した。残渣にHPLC用ヘキサン（関東化学、Cat.No.18041-2B）1mlを加えて溶解させ、0.5μmのフィルター（ADVANTEC、03JP050AN）で濾過し、濾液はHPLCによる測定まで−30℃で保存した。
【００２４】
4  HPLCによるコレステロールの定量
コレステロールの分析はHPLC（JASCO、PU-980）、検出器（JASCO、UV-975）、レコーダー（SHIMAZU、C-R6A）を使用し、カラムはDevelosil 100-5（NOMURA CHEMICAL、内径4.6mm×長さ150mm、1406240）、移動相はヘキサン：2-プロパノール（関東化学、Cat.No.32435-1B）（96:4、v／v）、検出波長は205nmとした。流速は1.0ml/min、カラム温度は室温、注入量は10μlで測定した。
抽出したコレステロール濃度を求めるために、あらかじめコレステロールの検量線を作成した。そして、この検量線と抽出液中のコレステロールのピーク高からコレステロール濃度を求めた。この値と、菌体を添加しないで振盪したミセル中のコレステロール濃度との差をコレステロール減少率（％）とした。
コレステロール減少作用を示すポジティブコントロールとして水溶性大豆繊維(不二製油)50mgをミセル溶液2.5mlに添加し、菌体と同様の操作方法で実験を行った。
【００２５】
5  コレステロールの検量線の作成
コレステロール10mgをヘキサン10mlで溶解した。この溶液をヘキサンで段階希釈し、コレステロール濃度が10、50、100、200、500μg／mlであるように溶液を調製した。そして、この溶液を0.5μmのフィルターで濾過後、4の条件でコレステロールのピーク高さを測定し、検量線を作成した。
【００２６】
[実施例１]ミセル中コレステロール減少作用の強い共試株のスクリーニング
液体培養および平板培養で得られた乳酸桿菌5菌株、ビフィズス菌9菌株の凍結乾燥菌体を用いて試験例１の方法でミセル中コレステロール減少作用の強い菌株のスクリーニングを行った。
乳酸桿菌およびビフィズス菌の添加がミセル中コレステロールの濃度に与える影響を調べた結果を図１に示した。その結果、供試したすべての菌株にコレステロール減少作用が認められ、15菌株中13菌株でポジティブコントロールとして用いた水溶性大豆繊維よりも強いコレステロール減少作用が認められた。
菌体を添加して振盪したミセル溶液のpHはすべての場合でpH5.8以上であった。
【００２７】
[実施例２]熱処理菌体によるコレステロール減少作用
凍結乾燥したL. crispatus JCM 5810、B. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204の4菌株をそれぞれ約1×1010／mlになるようPBSに懸濁し、100℃、5分間熱処理し菌体を死滅させた。熱処理後の菌体を脱イオン水で3回菌体洗浄後、凍結乾燥した。凍結乾燥菌体菌体を用いて試験例１の方法でミセル中コレステロールに与える影響を検討した。
強いコレステロール減少作用が認められたL. crispatus JCM 5810、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204、B. bifidum OLB 6026の4菌株を選び、熱処理がコレステロール減少作用に与える影響を調べた。その結果、図２に示したように、供試したすべての菌体で熱処理後もコレステロール減少作用が認められた。そのなかで、L. crispatus JCM 5810、B. bifidum OLB 6026の2菌株は熱処理菌体でも生菌体と同じ程度のコレステロール減少作用が認められたが、B. breve MEP171204、B. breve MEP171203の2菌株では熱処理を行うことでコレステロール減少作用が大きく減少した。
【００２８】
[実施例３]  胆汁酸の分解および吸着活性の測定
１  供試株
強いコレステロール減少作用が認められたL. crispatus JCM 5810、B. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204の4菌株を用いた。
【００２９】
２  タウロコール酸あるいはコール酸と菌体の混合振盪
15mMリン酸緩衝液（pH7.4）に6.6mMタウロコール酸ナトリウムまたは6.6mMコール酸ナトリウム（半井化学薬品、Lot.M3B5596）を溶解させた。試薬採取の具体例を表２および表３に示した。この溶液1mlに凍結乾燥菌体20mgを添加後、37℃の恒温水槽中に5分間静置後、37℃に設定した恒温器（IWAKI、ICB-151LN）内でシェーカーを用いて2時間振盪（120rpm、旋回振盪）した。振盪時、試験管は横置きとした。振盪後、2,400rpm、10分間遠心分離後、上清を0.45μmのフィルター（ADVANTEC、03CP045AN）で濾過して、濾液はHPLCで測定するまで−30℃で保存した。
【００３０】
【表２】
2006217879.tif 000003
【００３１】
【表３】
2006217879.tif 000004
【００３２】
３  HPLCによる胆汁酸の定量
胆汁酸の分析はHPLC、検出器（JASCO、UV-970）、レコーダーを使用し、カラムはCOSMOSIL 5C18-AR-300（nacalai tesque、内径4.6mm×長さ150mm、37913-81）、移動相はメタノール：0.05M酢酸緩衝液(pH4.3)（70：30）、流速は1.0ml/min、カラム温度は室温、注入量は5μlで測定した。酢酸緩衝液の作成方法は酢酸（関東化学Cat.No.01021-71）0.58mlにミリQ水を加えて200mlにメスアップし、最終濃度を0.05Mにしたものと酢酸ナトリウム（関東化学、Cat.No.37093-01）0.82gをミリQ水溶解させて200mlにメスアップして最終濃度を0.05Mにしたものとを混合して最終pHを4.3に調製した。
胆汁酸濃度を求めるために、あらかじめ胆汁酸の検量線を作成した。そして、この検量線とHPLCのピーク高から胆汁酸濃度を求めた。
【００３３】
４  タウロコール酸およびコール酸の検量線の作成
タウロコール酸ナトリウムあるいはコール酸ナトリウム50mgをミリQ水10mlに溶解した。この溶液をミリQ水で段階希釈し、最終濃度が0.5、1.0、2.0、4.0mg／mlである溶液を調製した。そして、0.45μmのフィルターで濾過後、2の条件で胆汁酸のピークの高さをHPLCで測定し、検量線を作成した。
【００３４】
５  無処理菌体を使った試験 
強いコレステロール減少作用が認められたL. crispatus JCM 5810、B. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204の4菌株の凍結乾燥菌体を用いて試験例１の方法でタウロコール酸およびコール酸の分解・吸着活性を測定した。１菌株につき3回試験を行い、結果は3回の平均値±標準偏差で表した。
【００３５】
６  熱処理菌体を使った試験
凍結乾燥したL. crispatus JCM 5810、B. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204の4菌株の菌体をそれぞれ40mg／mlになるようPBSに懸濁し、100℃、5分、10分間熱処理した。熱処理後の菌体を脱イオン水で3回洗浄後、凍結乾燥した。凍結乾燥菌体を使って2の方法でタウロコール酸およびコール酸の分解・吸着活性を検討した。１菌株につき3回試験を行い、結果は3回の平均値±標準偏差で表した。
実施例１で強いコレステロール減少作用が認められた菌株の中から4株を用いてタウロコール酸の分解および吸着活性を調べた。その結果、図３に示したように、供試したすべての菌株でコール酸を生成した。L. crispatus JCM5810はタウロコール酸を約7％脱抱合したのに対し、B. bifidum OLB6026、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204の3菌株では100％の脱抱合活性が認められた。加熱処理後の菌体ではタウロコール酸の分解活性は認められなかった。
強いコレステロール減少作用が認められたL. crispatus JCM 5810、B. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204の4菌株すべては、タウロコール酸溶液に添加し、37℃２時間振盪すると、上清中のタウロコール酸を消失または減少させた。消失あるいは減少したタウロコール酸と当モルのコール酸が生成したことから、これらの菌株にはタウロコール酸を結合する能力はなく、脱抱合活性のみが存在することが認められた。特に、ビフィズス菌3菌株には100％の脱抱合活性が認められた。しかし、熱処理を行うことですべての菌株で脱抱合活性が消失した。
また、コール酸に関してはすべての供試株で、生菌体および熱処理菌体のいずれを添加し37℃２時間振盪しても、上清中のコール酸の減少は認められなかった。
【００３６】
[実施例４]熱処理菌体による固定化コレステロール、ホスファチジルコリン、タウロコール酸への付着の評価
１  供試株
強いコレステロール減少作用が認められたL. crispatus JCM 5810、B. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203、B. breve MEP171204の4菌株を用いた。菌体は凍結乾燥後に滅菌PBSに懸濁し、100℃、5分間の熱処理を行い、バクテリアカウンターを使用して菌数を計測し、菌濃度が5×108cells／mlになるように滅菌PBSに懸濁させた。
【００３７】
２  熱処理菌体の固定化コレステロールへの付着試験
コレステロール4.2mgを酢酸エチル1mlで溶解した（42×102μg／ml）。この溶液を酢酸エチルで段階希釈し、コレステロール濃度が2.5（42×10-3μg／ml）、25（42×10-2μg／ml）、250（42×10-1μg／ml）、2500（42μg／ml）pMになるように溶液を調製した。また、コントロールとして0pM（酢酸エチルのみ）を用いた。
滅菌したPBSにBSA（Sigma、A-9647）を、0.1％および2％となるように溶解し、0.1％ BSA-PBS、2％ BSA-PBSを調製した。
テフロンプリントスライドガラス（フナコシ、ER-208L）の各ウェルにコレステロール溶液をマイクロシリンジで23μlずつ滴下し、室温で乾燥させた。コレステロールの各濃度につき2ウェルずつ滴下した。スライドガラスを染色槽に入れ、裏側から2％ BSA-PBSを注ぎ、2時間室温で静置した。2時間後、スライドガラスを染色槽から取り出し、立てかけて自然乾燥させた。乾燥後、スライドガラス上のウェルに触れないようにウェルの周囲をキムワイプで拭き取った。1で調整した各菌懸濁液を23μlずつ、各ウェルに滴下し、スライドガラスを水蒸気で飽和させたタイトボックス中に室温で2時間静置した。2時間後、スライドガラスを染色槽に入れ、裏側から0.1％ BSA-PBSを注ぎ、マイルドミキサー上で5分間穏やかに振盪した。振盪後、別の染色槽にスライドガラスを移し、同様の操作を3回行った。スライドガラスを染色槽から取り出して自然乾燥させ、火炎固定してグラム・クリスタルバイオレット溶液（MERCK、1.09218）で1分間染色した。染色後、裏から脱イオン水で洗浄して自然乾燥させた。そして、顕微鏡観察し、異なる視野を3箇所プリントし、1枚を4分して、1／4区画内（4.38×103μm2）の菌数を測定した。結果はプリント3枚分（12区画）の菌数の平均値±標準偏差で求めた。
熱処理菌体の固定化コレステロールへの付着性を、固定化するコレステロールの濃度を変化させて調べた。その結果、いずれの菌株でも、固定化するコレステロール濃度を高くしても熱処理菌体の付着菌数は増加しないことが認められた（図４）。
【００３８】
3  熱処理菌体の固定化ホスファチジルコリンへの付着試験
ホスファチジルコリン9.3mgをメタノール1mlで溶解した（93×102μg／ml）。この溶液をメタノールで段階希釈し、ホスファチジルコリン濃度が2.5（93×10-3μg／ml）、25（93×10-2μg／ml）、250（93×10-1μg／ml）、2500（93μg／ml）pMになるように溶液を調製した。また、コントロールとして0pM（メタノールのみ）を用いた。
そして、2と同様な方法でホスファチジルコリンを固定化し、付着性を評価した。
熱処理菌体の固定化ホスファチジルコリンへの付着性を、固定化するホスファチジルコリン濃度を変化させて調べた。その結果、ホスファチジルコリン濃度が250pM以上でL. crispatus JCM 5810およびB. bifidum OLB 6026の2菌株はコントロールに比較して２倍以上の付着の菌数が認められ、その効果が顕著であることが確かめられた（図５）。
【００３９】
4  熱処理菌体の固定化タウロコール酸への付着試験
タウロコール酸ナトリウム5.8mgをメタノール1mlで溶解した（58×102μg／ml）。この溶液をメタノールで段階希釈し、タウロコール酸濃度が2.5（58×10-3μg／ml）、25（58×10-2μg／ml）、250（58×10-1μg／ml）、2500（58μg／ml）pMになるように溶液を調製した。また、コントロールとして0pM（メタノールのみ）を用いた。
そして、2と同様な方法でタウロコール酸を固定化し、付着性を評価した。
【００４０】
熱処理菌体の固定化タウロコール酸への付着性を、固定化するタウロコール酸の濃度を変化させて調べた。その結果、固定化するタウロコール酸濃度を高くしても熱処理菌体の付着菌数は増加しないことが認められた（図６）。
実施例４では小腸からのコレステロール吸収のin vitroモデルとしてコレステロールミセルを人工的に調製している。ミセルの構成成分はコレステロール、ホスファチジルコリンおよびタウロコール酸である。B. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203およびB. breve MEP171204の生菌体ではミセルを構成しているタウロコール酸を脱抱合することにより、ミセルが不安定化することが、ミセル中コレステロールが減少する機構と考えられる。しかし、熱処理菌体ではタウロコール酸の脱抱合酵素が失活しているため、熱処理後もコレステロール減少活性があるB. bifidum OLB 6026、B. breve MEP171203およびL. crispatus JCM 5810では他のメカニズムによりミセルを不安定化し、ミセル中のコレステロールを減少させていると推定される。そこで、ミセル構成成分の菌体への結合を、より高感度で検出する方法として、ミセルを構成する各成分への付着試験を用いた。すなわち、ミセル構成成分をガラスウェル上に固定化し、熱処理菌体のそれぞれの成分に対する付着性を評価した。供試した4菌株のうちB. breve MEP171204のみは熱処理することで、他の3菌株よりもコレステロール減少作用が著しく低下したため、今回の実験ではネガティブコントロールとした。
コレステロールとタウロコール酸に対しては供試したすべての菌株で付着が認められなかった。しかし、ホスファチジルコリンに対しては、ホスファチジルコリン濃度が250pM以上の場合、L. crispatus JCM 5810とB. bifidum OLB 6026で顕著な付着が見られた。一方、ネガティブコントロールとして用いたB. breve MEP171204は付着しなかった。また、L. crispatus JCM 5810とB. bifidum OLB 6026と同程度のミセル中コレステロールを減少させたB. breve MEP171203はホスファチジルコリン濃度が250pM以上で若干の付着が見られた。
これらの結果より、L. crispatus JCM 5810とB. bifidum OLB 6026の熱処理菌体によるミセル中コレステロール減少作用のメカニズムとして、コレステロールミセルの外側に存在するホスファチジルコリンに結合することによりミセルを不安定化させることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本願発明は、コレステロール低減作用を有する乳酸菌を含有した飲食品を提供するものであり、コレステロールの過剰摂取の防止に役立つだけではなく、高脂血症患者用飲食品としても極めて優れている。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】乳酸菌のミセル中のコレステロール低減作用を示す図である。
【図２】乳酸菌の加熱処理前後のミセル中コレステロール低減作用を示す図である。
【図３】乳酸菌の加熱処理前後のタウロコール酸脱抱合活性を示す図である。
【図４】加熱菌体のコレステロールに対する親和性を示す図である。
【図５】加熱菌体のホスファチジルコリンに対する親和性を示す図である。
【図６】加熱菌体のタウロコール酸に対する親和性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月23日(2005.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
（供試株および培養方法）
Bifidobacterium bifidum OLB 6026は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに平成１７年２月３日付けで、受託番号NITE P-74として寄託されている。また、JCM株は理化学研究所微生物株系統保存施設から入手したものであり、MEP株、MH株はそれぞれ、明治乳業株式会社、弘前大学戸羽研究室の保存株である。
Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatusとLactobacillus gasseriは37℃に設定したインキュベーター（EYELA、SLI-600N）内で5ml MRS broth（MERCK、1.10661）で16-18時間静置培養することを3回連続して行った。培養にはネジ口試験管（マルエム、NR-10）を用い、接種菌量は一白金耳とし、培養時、スクリュー栓は密栓した。継代培養して得られた3回目の培養液15ml（3％に相当）を500ml MRS brothに接種して37℃で静置培養した。培養時間は16-18時間とした。培養後、5℃、5,000rpmで20分間遠心分離し、得られた菌体を脱イオン水で洗浄した。平板培養の場合は5ml MRS brothで16-18時間静置培養することを2回連続して行った。2回連続して継代培養して得られた2回目の培養液100μlをMRS寒天平板（φ90mm）培地にコンラージ棒で全面塗抹して37℃で嫌気培養した。培養時間は48時間とした。培養後、MRS平板培地上に脱イオン水1.5ml加えてコンラージ棒で懸濁し、その懸濁液1mlを1.5ml遠沈管に採取して5℃、5,000rpmで10分間遠心分離した。得られた菌体を脱イオン水で洗浄した。菌体洗浄を3回繰り返し、−30℃で冷凍保存後、凍結乾燥機（EYELA、FD-5N）で凍結乾燥して凍結乾燥菌体を得た。凍結乾燥した乳酸菌体を脱イオン水に懸濁し、バクテリアカウンターで菌数を測定した。菌数の計算は下記の式で求めた。
菌数（cells／ml）の計算式＝数えた合計菌数×20×20×50×1000×希釈倍率／数えた画数
Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium infantisおよびBifidobacterium longumは37℃に設定したインキュベーター中で2ml GAM broth（日水製薬、Code 05422）で24時間、アネロパック（三菱ガス化学、A-03）を用いて嫌気的に培養した。培養にはネジ口試験管（マルエム、NT-16）を用い、接種菌量100μlとし、培養時、スクリュー栓は緩めた状態にした。液体培養の場合は3回連続して行った培養液を培養液25ml（5％に相当）を500ml GAM brothに接種して37℃で嫌気培養した。培養時間は24時間とした。平板培養の場合は2回連続して継代培養して得られた2回目の培養液100μlをGAM寒天平板（φ90mm）培地にコンラージ棒で全面塗抹して37℃で嫌気培養した。培養時間は24時間とした。培養後、GAM平板培地上に脱イオン水1.5ml加えてコンラージ棒で懸濁し、その懸濁液1mlを1.5ml遠沈管に採取して5℃、5,000rpmで10分間遠心分離した。得られた菌体を脱イオン水で洗浄した。菌体洗浄を3回繰り返し、−30℃で冷凍保存後、凍結乾燥機で凍結乾燥して凍結乾燥菌体を得た。凍結乾燥後の菌体は乳酸菌体と同様の操作で菌数を測定した。