(57)【要約】【課題】本発明は、mC26蛋白質の発現制御領域を用いた異種遺伝子生産のためのトランスジェニック動物の作製方法を提供することを目的とする。【解決手段】mC26蛋白質をコードする構造遺伝子の一部および該遺伝子の発現制御領域を含むDNA断片を発現カセットとして用いて異種遺伝子を該発現カセットに挿入した組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAを大腸菌等の発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いてトランスジェニック動物を作製する技術に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を有するDNA。
【請求項２】
以下の工程：配列番号３ないし６のヌクレオチド配列を有するDNAからなる群から選択される少なくとも１つのDNAプローブとハイブリダイズする約6.7kbのDNA断片をマウスゲノミックDNAライブラリーのEcoRI消化物から得；そして該DNA断片をHindIIIで消化すること；により得られる、請求項１記載のDNA。
【請求項３】
配列番号３のヌクレオチド配列を有するDNAのみをプローブとして用いることにより得られる、請求項２記載のDNA。
【請求項４】
上記配列番号１の第2305ヌクレオチドから第4624ヌクレオチドまでの範囲のいずれか１カ所に異種遺伝子のコード領域が挿入されていることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のDNA。
【請求項５】
図５に示す第１ないし第４エクソンおよび第１ないし第３イントロンのうちの少なくともひとつが欠失していることを特徴とする、請求項４記載のDNA。
【請求項６】
上記異種遺伝子が骨形成誘導蛋白質遺伝子である、請求項４または５記載のDNA。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のDNAを含む発現ベクター。
【請求項８】
大腸菌内で複製可能な請求項７記載の発現ベクター。
【請求項９】
図４に示すヌクレオチド配列を遺伝子発現制御領域として含むDNA。
【請求項１０】
図６に示すヌクレオチド配列を遺伝子発現制御領域として含むDNA。
【請求項１１】
請求項７または８に記載の発現ベクターのDNAを直鎖状にしてヒト以外の哺乳動物の胚の細胞に導入することからなる、トランスジェニックな哺乳動物の生産方法。
【請求項１２】
上記発現ベクター中に存在する、図４に示すヌクレオチド配列を一方の末端とし、図６に示すヌクレオチド配列を他方の末端とし、かつ、mC26構造遺伝子部分および／または異種遺伝子コード領域を内部に含むDNA断片に代えて、マウスゲノミックDNAライブラリーのEcoRI部分消化物であって、かつ、配列番号１のヌクレオチド配列を有するDNA断片とハイブリダイズする約12.7kbのDNA断片を用いることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記約12.7kbのDNA断片が、配列番号３ないし６のヌクレオチド配列を有するDNAからなる群から選択される少なくとも１つのDNAプローブとハイブリダイズするものとして選択されたものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
上記約12.7kbのDNA断片が、配列番号３のヌクレオチド配列を有するDNAのみをDNAプローブとして用いて選択されたものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記約12.7kbのDNA断片中に存在する配列番号１の第2305ヌクレオチドから第4624ヌクレオチドまでの範囲のいずれか１カ所に異種遺伝子のコード領域が挿入されていることを特徴とする、請求項１２ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
上記約12.7kbのDNA断片中、図５に示す第１ないし第４エクソンおよび第１ないし第３イントロンのうちの少なくともひとつが欠失していることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記異種遺伝子が骨形成誘導蛋白質遺伝子である、請求項１５または１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物体内において所望の異種遺伝子を発現させることを可能ならしめる染色体DNA由来の遺伝子の発現制御領域を導入するトランスジェニック生物の生産方法に関する。特定すれば、本発明はmC26蛋白質をコードする構造遺伝子の一部および該構造遺伝子の上流および下流に位置する該遺伝子の発現を制御する制御領域配列からなるDNA断片を用いて大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを用いてmC26遺伝子の遺伝子制御領域を生物体内に導入して遺伝子発現制御実験モデル動物を創造し、所望の物質を哺乳動物の乳腺その他の組織において生産させることを可能ならしめるトランスジェニック技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学により作製した組換え体遺伝子から物質を生産するための宿主系として、大腸菌、枯草菌、酵母をはじめとする微生物および各種の培養動植物細胞が利用されている。さらに、DNAを生物体内に導入し、トランスジェニック生物を作製し、組換え体遺伝子を発現させて組換え体蛋白質を生産させることが可能である（非特許文献１）。
【０００３】
例えば、マイクロインジェクション法により、組換え体DNAを含む溶液を胚（受精卵）に注入し、創造したトランスジェニック動物体内において導入遺伝子を発現させて蛋白質を合成させることが一般的である（非特許文献２）。レトロウィルスを中間ベクターとして利用する方法も開発されている（非特許文献３）が、このようなウイルスの使用は、オンコジーンの活性化または不所望な転写等の危険性を少なからず有する。また、組換え体DNAを直接、動物体内に注射して遺伝子を発現させる方法も開発されているが、発現効率および導入遺伝子の安定性の点で工業的規模の使用における信頼性に欠ける。
【０００４】
トランスジェニック動物の作製において導入する組換え遺伝子は、ゲノミックDNAでもmRNAに相補的なcDNAでもよい。さらに、該DNAの前後に任意のプロモーター、エンハンサーおよび転写終結シグナルなどの遺伝子の発現制御領域を付加した組換え体DNAも用いられる。
【０００５】
プロモーター、エンハンサーには、特定の臓器・組織でのみ発現する性質を備えたもの（組織特異的発現）、生物の成長過程の一定の時期にのみ発現する性質を備えたもの（時期特異的発現）、細胞内外の環境による刺激に反応する性質を備えたもの（刺激反応性）等があるので、所望の遺伝子本来のプロモーターおよびエンハンサーとは異なる性質をもつ、他の生物あるいは他の遺伝子由来の発現制御領域配列を用いて組換え体を作製し、そして生物体内に導入することにより、トランスジェニック生物体内で所望の時期および位置に所望の異種遺伝子を発現させることが可能である（特許文献１）。
【０００６】
天然のミルク蛋白質遺伝子、例えばアルファ・カゼイン遺伝子は、プロラクチン、インシュリン、グルココルチコイド、プロジェステロン、エストロジェンなどの各種ホルモンの刺激に反応する遺伝子領域すなわちホルモン反応性エレメントを持ち、泌乳期の乳腺において、時期特異的かつ組織特異的に発現するように調節される。ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加した組換え遺伝子は、これを導入したトランスジェニック動物の乳腺において、天然のミルク蛋白質遺伝子と同様に転写および翻訳され、そして組換え遺伝子がコードする蛋白質を分泌させることができる（特許文献２）。また、乳清蛋白質（WAP、βラクトグロブリン）遺伝子を含む発現ベクターを利用した、外来遺伝子産物のミルク中への分泌技術も開示されている（特許文献２、及び３）。
【０００７】
mC26遺伝子産物は、乳腺で泌乳期特異的かつ組織特異的に多量に発現する遺伝子として同定され（非特許文献４）、また、その後、ドーベンコ（Dowbenko）らにより白血球接着分子として同定され（非特許文献５）、GLYCAM-1と呼ばれている分子である。該遺伝子座はマウスにおいてマップされており、該遺伝子の構造遺伝子部分および周辺の一部のヌクレオチド配列は既に決定されている（非特許文献５）。
【０００８】
mC26遺伝子をクローン化してグルココルチコイドレセプターを持つマウス線維芽細胞由来のＬ細胞に導入し、遷移性発現および形質転換細胞中での発現が検討されたが、該遺伝子に対するホルモンの作用が従来の知見とは異なることが明らかとなり、さらに、該遺伝子の転写産物が従来公知のmRNAとは異なる異常なRNAであることが判明した。即ち、mC26遺伝子が従来公知の他のカゼイン遺伝子とは異なった発現制御機構を有することが明らかになった（非特許文献６）。
【０００９】
【特許文献１】特開平03-210187号
【特許文献２】特開昭63-000291号
【特許文献３】特表昭64-500162号
【非特許文献１】パルミッター（Palmiter）らの論文、Cell,Vol 29, 701-710 (1982)
【非特許文献２】ディチュリオ（DiTullio）らの論文、Bio/Technology,Vol 10, 74-77 (1992)
【非特許文献３】ヤニッシュ（Jaenisch）らの論文、Cell,Vol 24, 519 (1981)
【非特許文献４】サトウ（Satow）らの論文、J.Biochem. 99, 1639-1643 (1986)
【非特許文献５】ドーベンコ（Dowbenko）らの論文、Journalof Biological Chemistry, Vol 268, No. 6: 4525-4529 (1993)
【非特許文献６】カワムラ（Kawamura）ら、J.Biochem. 101, 103-110 (1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この事実に基づき、mC26の発現系、特に転写エンハンサー／プロモーター領域の機能を解明し、異種遺伝子の効果的発現を達成してmC26遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝子発現制御実験モデル動物を創造し、さらに、所望の物質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とするトランスジェニック技術を確立すべく研究を行った。即ち、本発明の目的は、mC26の構造遺伝子およびその発現に関与する周辺の制御領域を含むゲノミックDNAを用いて、大腸菌その他の宿主中で増幅するための組換え発現ベクターを作製し、そして該ベクターを利用してmC26遺伝子の発現制御領域を体内に導入した遺伝子発現制御実験モデル動物を創造し、そして所望の物質を哺乳動物の乳腺において生産させることを可能とするトランスジェニック技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために、mC26の構造遺伝子およびその周辺の発現制御領域、特に5'上流領域に位置するエンハンサー／プロモーター領域を含む、ゲノミックDNAの塩基配列を決定し、該DNAを含む組換え発現ベクターを作製した。そして該ベクターを利用してmC26遺伝子の発現制御領域が動物細胞中で発現制御されることを確認し、さらに、該ベクターを導入した動物の乳腺において所望の外来異種遺伝子が導入され、かつ、該遺伝子産物が発現されることを確認して本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明によれば、以下に示すDNA：（ｉ）図４に示す2304bpのmC26遺伝子の5'上流発現制御領域；（ii）図５に示す2320bpのmC26構造遺伝子部分；および（iii）図６に示す770bpのmC26遺伝子の3'下流発現制御領域；を転写方向に順番に含む発現カセットとしてのDNAが提供される。
【００１３】
本発明の一つの態様として、上記（ii）の全部または一部を外来異種遺伝子に置換するか、または（ii）のいずれか１カ所に外来異種遺伝子を挿入した発現カセットが提供される。そのような異種遺伝子は、特に限定されない。
【００１４】
上記発現カセットの作製においては、（１）図５中の第１エクソン（配列番号１中、第2305ヌクレオチド〜第2418ヌクレオチド）を含ませることにより、下流に連結された異種遺伝子蛋白質を細胞外に分泌させるためのシグナル配列を付加すること、および（２）図５中の第２エクソン（配列番号１中、第3145ヌクレオチド〜第3188ヌクレオチド）、第３エクソン（配列番号１中、第3928ヌクレオチド〜第4143ヌクレオチド）、および第４エクソン（配列番号１中、第4372ヌクレオチド〜第4624ヌクレオチド）を分断または削除して、スプライシングに関与すると考えられる第１イントロン（配列番号１中、第2419ヌクレオチド〜第3144ヌクレオチド）、第２イントロン（配列番号１中、第3189ヌクレオチド〜第3927ヌクレオチド）、および第３イントロン（配列番号１中、第4144ヌクレオチド〜第4371ヌクレオチド）を全てまたは一部連結した形で含ませることにより、発現の効率をさらに増加させること；等が好ましいが、異種遺伝子産物の分泌効率、異種遺伝子の種類、および組換えDNAの連結の容易性等を考慮して、各々の場合において、これらのファクターを適宜選択することが好ましい。
【００１５】
本発明は、さらに、上記発現カセットを含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを哺乳動物の胚細胞に導入することからなる、トランスジェニック動物の生産方法に関する。該生産方法において、上記（i）および（iii）の領域に代えて、（ｉ）のさらに5'上流領域、および（iii）のさらに3'下流領域を含むDNA断片も使用することができる。例えば、図１中の約12.7kbのEcoRI断片、または図２中の約6.7kbのEcoRI断片を用いることができる。
【００１６】
本発明の別の側面においては、図４または図６に示す配列を有するDNA断片の全てまたは一部を、それぞれ、従来公知のあらゆる遺伝子を発現するための発現制御領域として用いうることは、当業者であれば認識されるであろう。
【００１７】
本明細書において使用されるベクターなる用語は、プラスミド由来のもの、バクテリオファージ由来のものを含むように意図するものとして使用され、本発明においては大腸菌由来のものが好ましく、特にλファージが好ましいが、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書において、「EcoRI断片」なる記載は、両末端がEcoRI認識配列であるDNA断片を意味し、また、「EcoRI-HindIII断片」なる記載は、一方の末端がEcoRI認識配列であり他方の末端がHindIII認識配列であるDNA断片を意味する。他の制限酵素による同様の表記も、同等の意味をなすものとして用いられる。
【００１９】
本明細書において使用されるDNA断片の大きさの表示に関して、下一桁までを明記してある配列を除き、0.1kb単位にて表示されている配列は、電気泳動によるおおよそのサイズを示す。従って、実際のヌクレオチド数と表示塩基対（bp）数には多少の誤差があることは、当業者には認識されるであろう。
【００２０】
mC26遺伝子の5'上流発現制御領域（図４）および3'下流発現制御領域（図６）のヌクレオチド配列は一部公表されているが［ドーベンコ（Dowbenko）ら、上記文献］、本発明において初めて明らかにされた配列を含む上記領域が異種遺伝子の大量発現に必須であることが明らかとなった。
【００２１】
以下の記載において、当業界において常法として用いられる組換えDNA技術は、特筆しない限り以下の文献：Molecular Cloning、サムブルック（Sambrook）、フリッシュ（Fristch）、マニアティス（Maniatis）著、Cold Spring Harbour Press (1989); Basic Methods in Molecular Biology、デービス（Davis）、ディブナー（Dibner）、バッテイ（Battey）著、Elsevier New York (1986)；等に記載されている技術を使用して実施することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（１）DNA断片の調製
本発明のmC26構造遺伝子（図５）、該構造遺伝子の5'上流発現制御領域（図４）、および該構造遺伝子の3'下流発現制御領域（図６）各々のDNA断片は一緒にあるいは別々に、公知の方法を利用してマウスゲノミックDNAライブラリーから取得することができる。
【００２３】
本発明では、従来のオリゴマープローブを用いる方法、またはメッセンジャーRNAからcDNAプローブを作製して用いる２種類の方法［オリゴ（dT）プライマー法およびランダムプライマー法］に加えて、mRNAを直接プローブとする方法を好ましい方法として記載するが、これらの方法に限定されない。
【００２４】
（ｉ）オリゴマーDNAプローブによる方法
オリゴマーDNAプローブ法に用いるプローブは２０塩基前後またはそれ以上の長さであり、かつ、染色体DNA中に高頻度に反復する配列を含まないことが好ましい。
【００２５】
例えば、mC26遺伝子の第１エクソン中の配列、例えば、下記配列番号３、４、５及び６の配列の内の少なくとも一つを用いることが好ましいが、これらに限定されない。
5'GTGCCACCATGAAATTCTTC 3'                  （配列番号３）
5'TGGCTTGCTTCCTGGTCTAA 3'                  （配列番号４）
5'TTGCTTCCTGGTCTAATCTC 3'                  （配列番号５）
5'CTCTGCTTCCCAGGGAAAGC 3'                  （配列番号６）
【００２６】
合成DNAの標識法は特に限定されないが放射性標識による方法が一般的である。標識プローブを用いてマウスゲノミックDNAライブラリーからハイブリダイゼーションによりmC26遺伝子DNAを取得する方法は、公知の方法を用いることができる［Molecular
Cloning、サムブルックら、前記］。ヒトあるいはマウスなどのゲノミックDNAライブラリーは市販品を利用できる。
【００２７】
マウス以外の動物種のmC26に相当する遺伝子を得る場合は、種間の塩基配列の変異を考慮する必要がある。即ち、ハイブリダイゼーションにおける温度または反応溶液の組成を変更することにより選択度を下げることが望ましい。別法としては、コドンの縮重を考慮することが好ましい。上記は全て市販の試薬および機械・装置を利用して、常法に従って実施することができる。
【００２８】
（ii）メッセンジャーRNA法
メッセンジャーRNA法に用いるmRNAは常法に従って単離する。使用する動物は限定されないが、ヒト、ヤギおよびマウスが好ましく、そして組織は特に限定されないが泌乳最盛期の乳腺が好ましい。通常、mRNAからcDNAプローブを作製する際のプライマーは、オリゴdTプライマーおよびランダム（ヘキサマー）プライマーが用いられ、共に市販品を利用することができる。そして、これらプライマーを常法に従って標識する。これら２種類のプライマーを用いて調製されたcDNAプローブに加えて、さらにmRNAのキャップ構造部分を標識したプローブ、即ち、キャップラベル・プローブを作製してスクリーニングに使用することができる。該プローブの標識は市販の放射標識キャップ類縁体、およびグアニリル・トランスフェラーゼ（例えば、ベセスダリサーチ社）などを利用して使用説明書に従って実施することができる。
【００２９】
上記cDNAプローブによるスクリーニングは常法を用いることが可能であるが、エクソンが数十bp程度の長さしかない遺伝子が多数報告されていることを考慮して、プローブの全長は長い方が良いとは限らず、比較的長いプローブ（約500bp）と比較的短いプローブ（約30bp）に分けて結果を比較することが好ましい。
【００３０】
ゲノミックDNAライブラリーの作製に用いる動物は哺乳類が好ましく、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラットおよびマウスが特に好ましい。ヒトおよびマウス等では市販品ゲノミックDNAライブラリーも利用することができる。使用する組織は特に限定されないが肝臓が好ましい。次に、このDNAを制限酵素で完全または部分消化することにより15〜20kbpのDNA断片を分画する。制限酵素は特に限定されないがEcoRIが好ましい。染色体DNAの抽出、制限酵素分解および超遠心分画は、常法により行うことができ、ライブラリー作製に用いるベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、コスミッドの何れを用いてもよいが、λファージが特に好ましく、市販品を利用できる。
【００３１】
比活性の低いプローブを用いる場合、および／またはシグナル／ノイズ比（S／N比）が低い場合は、コロニーの形成またはファージプラークの形成にあたり、高濃度にカザミノ酸を含有するスーパーブロス等、高栄養価の培地を用いる。宿主として大腸菌を用いる場合はLE392またはJM系の菌株が好ましい。ハイブリダイゼーションに用いるフィルターは特に限定されないが、ニトロセルロースフィルター（S&S社製BA85など）が好ましい。
【００３２】
挿入されるべきDNAのサイズによってはベクターが不安定になるために、期待される信号強度が得られない場合がある。このような場合は、１枚のプレートから３枚のフィルターにブロットし、プラークを選別する際、各スポットの信号強度を強度、中度、弱度の３段階にクラス分けすることが好ましい。
【００３３】
得られたクローン遺伝子が乳腺で組織特異的に発現することを確認するためには、乳腺以外の組織、例えば肝臓から上記操作により作製されたプローブを対照とする。
【００３４】
また、得られたクローン遺伝子が、乳腺中で、しかも時期特異的に発現することを確認するためには、泌乳期以外の乳腺、例えば、未経産成熟動物の乳腺から上記操作により作製されたプローブを対照とする。
【００３５】
以上の操作によって得られる乳腺特異的に発現する遺伝子クローン群中には、動物種により差異があるが、一般に、α、β、γ、δ、εなどのカゼイン蛋白質遺伝子群［特開昭63-309192］、WAP、αラクトアルブミン、βラクトグロブリン［特開平3-505674］などのホェー蛋白質遺伝子群［特開昭63-291］などの複数の既知のミルク蛋白遺伝子が存在する。これらは、ノーザン・ハイブリダイゼーションによるほか、それぞれの遺伝子のヌクレオチド配列を参考にして作製したオリゴマーDNAプローブを用い、常法を用いてハイブリダイゼーションを行うことにより判別することができる。あるいは、それぞれのクローンDNAの一部の塩基配列を決定することによっても判別できる。特に、βカゼインのmRNAの大きさはmC26蛋白質遺伝子のmRNAの大きさに近いので、塩基配列決定により確認することが好ましい。
【００３６】
（２）構造遺伝子の決定
得られたmC26蛋白質遺伝子の発現制御領域と構造遺伝子部分を決定するためには、以下の方法により実施することができる。
【００３７】
得られたクローンDNAを各種の制限酵素により、それぞれ完全消化あるいは部分消化することにより、制限酵素マップを作製する。このとき、それぞれの分解産物を各々３等分し、３枚のゲルに同時に電気泳動した後、それぞれのゲル中の断片を計３枚のフィルターにサザーン・トランスファーする。クローンのスクリーニングに用いた３種のプローブの各々を上記の３枚のフィルターのうちの一枚にそれぞれ反応させ、サザーン・ハイブリダイゼーションを行う。これにより、構造遺伝子部分のうち、5'末端、中間のエクソン、3'末端を含む断片がそれぞれ決定できる。以上は常法および本発明に記載された方法を用いて行うことができる。
【００３８】
次に、それぞれの制限酵素による消化断片DNAと乳腺から抽出して精製したmRNAあるいは市販されている発現ベクター、例えばpBlueScriptII（プロメガ社）のプロモーターを利用して作製したリボプローブとを用いて、S1マッピング法により、5'末端、中間のエクソン、3'末端の正確な位置をそれぞれ決定することが可能である。正確を期するために、必要に応じてプライマーエクステンション法またはPCR法を併用する。
【００３９】
以上により決定した構造遺伝子の位置に基づき、常法により染色体DNAの塩基配列を決定する。この結果得られた情報に基づき、該塩基配列の一部を含むオリゴマーDNAを合成し、これをプライマーとしてプライマーエクステンション法またはPCR法を行うことにより、遺伝子の構造を再度確認する。
【００４０】
配列番号１は、マウスmC26蛋白質遺伝子の全構造遺伝子とその5'上流域および3'下流域に位置する制御領域DNAを含むEcoRI認識部位からHindIII認識部位までの5394bpの塩基配列を示す（図４、図５および図６をこの順序で連結したものが配列番号１に相当する）。
【００４１】
（３）発現ベクターの構築
最初に、上記方法に従って調製されたmC26構造遺伝子を含むEcoRI断片を、適当なベクターのEcoRI切断部位に挿入し、該ベクターの宿主内でDNAを増幅した後回収する。用いるベクターは特に限定されない。
【００４２】
図５に示すとおり、mC26構造遺伝子は第１ないし第４エクソンおよび第１ないし第３イントロンからなる。第１エクソンは蛋白質の分泌に関与し、各イントロンはスプライシングに関与することが予測されるので、異種遺伝子の種類あるいは組換えDNAの作製容易性等を考慮して、適宜、これらの領域を分断、除去あるいは残して異種遺伝子をmC26構造遺伝子部分のいずれかに挿入することが好ましい。
【００４３】
以下において、mC26構造遺伝子部分を全てまたは一部除去するための方法：簡易な発現ベクター構築法（構築法Ａ）；およびmC26構造遺伝子の転写開始点または第１エクソンから転写終結点までを正確に除去するための方法（構築法Ｂ）；を例示するが、これらの方法に限定されない。
【００４４】
構築法Ａ
（ｉ）制限酵素断片の作製
mC26遺伝子の転写開始点あるいは第１エクソンの終端を切断する制限酵素（酵素Ａ１とする。以下同様）ならびに転写終結点の近傍を切断する制限酵素（酵素Ａ２）により、上記の増幅したDNAを切断する。一方、乳腺中で生産することを希望する遺伝子を含むインサートDNA断片を同様の方法で調製する（酵素Ａ３および酵素Ａ４）。
【００４５】
酵素Ａ１およびＡ３、および酵素Ａ２およびＡ４がそれぞれ同一で、かつ、生じた断片の末端が平滑末端でない場合は、常法によりベクターおよびインサートの２つのDNA断片をそのまま連結でき、DNAリガーゼにより１つの環状DNAとして回収できる。
【００４６】
酵素Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４のそれぞれが相異なる場合および生じた断片の末端が平滑末端である場合は、ベクターおよびインサートの２つの断片を適切に結合するために、後述する合成リンカー法またはブラントエンド法の２つの方法のいずれかを利用する。
【００４７】
（ii）使用に適する制限酵素
上記（ｉ）で使用するのに適する制限酵素の例を下記に示すが、これらに限定されない。
【００４８】
酵素Ａ１（mC26遺伝子の転写開始点の5'末端あるいは第１エクソンの終端の近傍を切断する酵素）
第１群  GsuI、BsmI、ApyI、EcoRII、BstNI、MvaI、ScrFI、BsaJI；
第２群  AluI；
第３群  BsrI、XmnI、MboII；
第４群  ApyI、EcoRII、BstNI、MvaI、ScrFI；
第５群  Alw44I、ApaLI、Bsp1286I、SduI、HgiAI、DdeI、BsmAI；
【００４９】
酵素Ａ２（mC26遺伝子の転写終結点の3'末端の近傍を切断する酵素）
第１群  DdeI、BslI；
第２群  BcnI、CauII、NciI、ScrFI；
第３群  BsaJI、BcnI、CauII、NciI、ScrFI；
第４群  XbaI；
【００５０】
（iii）合成リンカー法
ベクターDNAおよびインサートDNAの両断片中に存在する制限酵素認識部位等を考慮の上、双方のDNAの末端が互いに粘着性末端となるべく設計した合成DNAすなわちリンカーDNAを両DNA断片にそれぞれ共有結合により連結する。
【００５１】
実際に使用されるリンカーDNAの配列および共有結合反応の方法の詳細は、挿入しようとする遺伝子の塩基配列によりそれぞれ異なるが、多くの場合は市販品を利用でき、また、希望する配列のリンカーDNAを設計し、常法により合成することができる。
【００５２】
この結果得られたDNA断片をDNAリガーゼにより連結する。この粘着性末端の結合によって生じる二本鎖DNA部分が、制限酵素の認識部位となるように塩基配列を選ぶことにより、同部位をふたたび制限酵素で正確に切断されるように設計することも可能である。以上は全て常法により行うことができる。
【００５３】
（iv）ブラントエンド法
インサートDNAの制限酵素切断部位が平滑末端であるか、または5'末端あるいは3'末端突出型の切断端でありかつその形状がそのままベクターDNA側の切断端に直接結合できない場合は、突出した一本鎖部分を酵素処理により除去する。用いる酵素は一本鎖DNAを特異的に切断する酵素、例えばS1ヌクレアーゼよびP1ヌクレアーゼなどを利用することができ、別法としては、大腸菌DNAポリメラーゼＩを用いて突出一本鎖部分の相補鎖を合成することも可能である。この後、DNAリガーゼを用いて平滑端同士を結合することができる。DNAリガーゼはT4バクテリオファージ由来のリガーゼが広く用いられている。以上は常法により行うことができ、上記酵素等は市販されているものを使用することができる。
【００５４】
構築法Ｂ
mC26遺伝子の構造遺伝子部分を転写開始点から転写終結点まで、あるいは、第１エクソンの終端から転写終結点までを正確に切断、除去し、所望の遺伝子のDNAをインサート断片として挿入する方法を記載する。
【００５５】
上記Ａ法で記載した方法により調製したmC26遺伝子ベクターDNAに対し、緩徐な条件下でエキソヌクレアーゼを作用させて一定時間ごとに反応を停止して一連のDNA調製物を得る。これら各々の調製物に対して、図３に記載された各制限酵素の消化の有無を観察することにより、求める長さのDNAが得られたことを確認する。
【００５６】
一度このように工作してベクターDNAを得た後は、前出の合成リンカー法の項で述べたように、制限酵素の認識部位となるべく計画した小DNA断片を上記DNA断片に付加する。以後利用する際には、希望する制限酵素で切断され、さらに付加した小DNA断片をも同時に取り除かれるよう設計することも可能である。このような目的には、平滑末端を生じる制限酵素が望ましく、具体的にはEcoRV、PvuIIなどを挙げることができる。
【００５７】
上記の方法で作製したmC26遺伝子ベクターに、希望する遺伝子のDNA断片をインサートとして結合する。この目的には、上記構築法Ａに記載した、合成リンカー法またはブラントエンド法のいずれかを用いることができる。発現すべき蛋白質をより正確に設計するためにはブラントエンド法が好ましい。
【００５８】
（４）骨形成誘導蛋白質をコードするDNA断片の単離
骨形成誘導蛋白質のcDNAクローンは、その両端が制限酵素EcoRVの切断点となるように設計し、同酵素により一段階操作で切り出せることが好ましい。該クローンを前記したブラントエンド法により、上記mC26遺伝子DNAベクターに挿入する。この際、挿入位置の両端となる部分の塩基配列は、構築法Ａの内、酵素Ａ１ならびに酵素Ａ２として記載した制限酵素の認識部位となるべく設計することにより、ベクター作製の工程を簡略化することができる。
【００５９】
上記工程により作製したDNAをそのまま遺伝子導入生物の作製に用いることができる。また、上記ベクター中に、微生物、例えば、大腸菌内でプラスミドあるいは溶原性ファージとして増殖することができる塩基配列を含むことにより、必要に応じて、常法を用いて大腸菌等により容易にベクターを増幅および回収することができる。
【００６０】
（５）遺伝子導入生物の生産法
上記発現ベクターに挿入した組換え体DNAを制限酵素により切断し、原核細胞内で増殖させるのに用いた大腸菌等の発現ベクター由来のDNAと、mC26遺伝子のDNAおよび発現を希望する遺伝子のDNAとからなる真核生物由来DNAとを分離する。用いる制限酵素は特に限定されないが、プラスミド部分とmC26遺伝子の構造遺伝子部分の5'上流末端および3'下流末端とが接続する部分は何れも制限酵素EcoRIの認識・切断部位になるよう設計して、本酵素を用いることにより上記の工程を簡略化することができる。
【００６１】
制限酵素により切断したDNA断片をアガロースゲル電気泳動法によりそれぞれ単一のバンドとして分離した後、発現を希望する遺伝子DNAのバンドを含む部分のアガロースゲルを切り出してDNAを抽出回収する。
【００６２】
上記の方法により単離精製した真核生物由来DNAをマイクロインジェクション法により、ガラスピペットを用いて受精卵の雄性前核に注入する。この受精卵を、一定時間培養後、あるいは直ちに、予め用意した偽妊娠動物すなわち代理母の子宮に移植する。これらは常法により行うことができる［新生化学実験講座１９、動物実験法（東京化学同人社刊、1991）；ゴードン（Gordon）とラドル（Ruddle）、Methods in Enzymology, 101, 411-442
(1983)；ジオメック（Ziomek）とジョンソン（Johnson）、Cell 21, 935-942 (1980)；ゴードン（Gordon）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77: 7380-7384 (1980)；ゴードン（Gordon）とラドル（Ruddle）、Science
214, 1244-1246 (1981)；ホーガン（Hogan）ら（翻訳：山内ら）、マウス胚の操作マニュアル、近代出版］。用いる生物種は、特に限定されないが、例としてマウスを挙げることができ、特にCD-1マウスが好ましい。
【００６３】
偽妊娠動物の作製方法は動物種により異なるが、各々既に獣医畜産技術として確立している。マウス、ラット、ウサギをはじめとする囓歯類動物は、膣刺激により容易に偽妊娠状態を誘起できる。また、ウシ、ヤギ、ヒツジなど反芻類家畜およびウマ、イヌ、ネコについては、ホルモン剤の投与により、偽妊娠を誘起する。また常法により、必要に応じて、動物にホルモン剤を投与し過排卵を誘起して、採卵数を増加させることができる［実験生物学講座１、生物材料調製法（1982）、江上信雄ら編、哺乳動物の初期発生、丸善出版株式会社］。
【００６４】
代理母により出産された産仔のうち、組換え遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を判別するため、産仔の体組織の一部から抽出したゲノムDNAを分析する。
【００６５】
一般には、導入した組換えDNAをプローブとしてゲノムDNAのサザン・ハイブリダイゼーションにより証明する。また、組換えDNAの塩基配列から設計した合成DNAをプライマーとしてPCR法により微量のDNAからも証明することができる。以上は全て常法に従って行うことができる［ディチュリオら、前記文献］。産仔の体組織としては、マウス、ラットでは尾の先端が、また、ウシ、ヤギなどの中・大動物では耳朶などが、広く用いられるが、口内の粘膜も試料として利用できる。
【００６６】
また、所望の異種遺伝子産物の生産を確認するためには、ウエスタンブロット等により実施することが可能であるが、これに限定されない。
【００６７】
トランスジェニック動物もまた、通常の生物同様に自己増殖能力をもつことが期待できる。このことにより、一度希望するトランスジェニック動物が得られた後は、もはや、以上に述べた操作によらず、トランスジェニックである動物を育成し、他のトランスジェニック動物または非トランスジェニック動物と交配し、新たな子孫を出生せしむることにより、親となるトランスジェニック動物と同等の、あるいは雑種のトランスジェニック動物を得ることができる。
【００６８】
本発明の上記技術は、以下に述べる利点を有する。
【００６９】
（１）乳腺は、組換え遺伝子に由来する物質を大量に生産させる組織として優れている。
乳腺は、本来の性質上、蛋白質等の各種物質を大量生産することのできる器官であり、さらにミルク成分物質の大量生産を指標として育種改良されてきたウシ、ヤギなどの家畜を利用することができる点で有利である。
【００７０】
また、乳腺は外分泌腺であるため、搾乳により極めて短時間のうちに体外に取り出すことができる。したがって、生産物質の細胞内での過剰蓄積による凝集塊の形成およびそれに伴う炎症反応等の悪影響を最小限に抑えることができる。
【００７１】
さらに、ミルクは乳腺においてのみ大量生産されるため組織特異性を考慮する必要がない。動物体内で天然に生産される物質であっても、生産量が過大であったり、生産組織が本来と異なる場合には、動物に疾病を引き起こすことは頻繁に観察されている。よって、生体に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。なお、組織特異性から、ミルク蛋白質遺伝子の発現制御領域を付加した組換え遺伝子を単に受精卵に注入するだけで、所望の生成物が乳腺からミルク中にのみ分泌される点も有利である。
【００７２】
そして、乳腺におけるミルクの大量生産は時期特異的、即ち、動物が妊娠して分娩した時にのみおこり、成長期にはおこらないため、トランスジェニック動物の正常な成長に害をもたらさない。一方、幼若または成体トランスジェニック動物のミルクの合成は、ホルモンを外部から投与して人為的にミルク蛋白質の合成を開始させて維持させる誘起泌乳も可能なため、人為的に制御することもできる。このことを利用して、メタロチオネイン遺伝子のように、所望の時期に組換え遺伝子のスイッチ・オン／オフを行えるトランスジェニック生物を創製し、生物学研究の実験モデル生物として利用することが可能である。
【００７３】
（２）哺乳動物細胞の蛋白質生産機構を利用するため、哺乳動物由来の外来遺伝子の発現において利点を有する。
蛋白質への糖鎖の付加、リン酸基あるいはイオウ等が結合する複雑な修飾、およびジスルフィド結合の形成の仕方等は哺乳動物に特有な様式による場合が多く、例えば大腸菌等の細菌を用いた場合に本来の生理活性が認められる蛋白質が生産されることは稀である。このような欠点の解決策として培養動物細胞の利用が挙げられるが、費用および労力がかかるにもかかわらず成功例は少なく、信頼性に欠ける。
【００７４】
（３）トランスジェニック動物は自己複製能力をもち、生産システムの更新、規模拡大が極めて容易かつ安価である。
交配により新たな子孫を出生せしめ、親となるトランスジェニック動物と同等あるいは雑種のトランスジェニック動物を得ることができる。この際、当初のトランスジェニック動物を創製するにあたって行った遺伝子工学を初めとする人為的操作は何ら必要ない。生産設備の拡大をきわめて安価かつ容易に行うことが可能である。このことは、培養細胞プラントまたは化学工場には望み得ない点である。
【００７５】
また、トランスジェニック動物は、安全かつ低廉に維持できる。大腸菌をはじめとする微生物のDNA複製機構は高等動物に比して原始的で精度が低いため、菌株を一定の性状に維持することが困難であり、醸造業などで製品の品質を維持するために高度の技術を必要とする。培養細胞についても、組換えDNAを導入した場合、長期間その遺伝子発現の性状を維持することが困難である。これに対し、高等動物個体は、きわめて安定といえる。物質生産能力についても、ウシでは１０年程度まで経済性良く一定の品質のミルク生産を維持、あるいは産次に従ってむしろ増大することは公知である。トランスジェニック動物についても、同様の結果が期待できる。
【００７６】
さらに、動物個体は、免疫系をはじめとする生体防御機構を備えており、微生物や動物細胞の培養に必須である無菌的環境設備は必要としない。反対に、感染、すなわち人体内部への侵襲による危害は発生し得ず、バイオハザードの点で極めて有利である。
【００７７】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するように意図するものではない。
【００７８】
以下において、異種遺伝子として骨形成誘導蛋白質遺伝子（ハムスター−ヒトの融合遺伝子：haBIP）を用いて本発明を例示するが、これらに限定されるものではなく、他の異種遺伝子も使用可能なことは当業者であれば認識されるであろう。
【００７９】
なお、以下に記載する発現ベクターは何れも微生物中において増幅可能なベクターであり、例として大腸菌ベクターを示すが、これらに限定されるものではない。また、これら発現ベクターの増幅は常法にしたがって実施することが可能である［前記文献：Molecular CloningおよびBasic Methods in
Molecular Biology等を参照せよ］。
【実施例】
【００８０】
（実施例１）  mC26構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の単離
（ｉ）プローブの作製
マウスの必乳最盛期の乳腺を用いて、常法に従い［サトウ（Satow）ら、J. Biochem. 99, 1639-1643 (1986)］、全mRNAをポリ（Ａ）RNA画分として単離した。10μgの全mRNAに関して、オリゴ（dT）プライマー（バイオテックインターナショナル（Biotech International）社／コスモバイオ社）およびランダムヘキサマー（バイオテックインターナショナル）をプライマーとして、アマシャム社またはNEN社の標識キットを用いて３２Ｐ標識した。
【００８１】
mRNAのキャップ部分を標識するに際しては、常法［ミズモト（Mizumoto）とリップマン（Lipmann）、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76,
4961 (1979)］に従い、オリゴ（dT）セルロースカラム（ベセスダリサーチ（Bethesda Research）社、米国／コスモバイオ社）を用いてmRNAをポリ（Ａ）RNA画分として精製し、ワクシニアウイルスのグアリニルトランスフェラーゼ（ベセスダリサーチ社）により標識した。標識後、そのまま、またはRNaseA（シグマ社、米国）を用いて部分消化し（10〜100ng/mlのRNaseAを加え、１分間、37℃処理後、等容のホルムアミドを加えて反応停止）、６Ｍ〜８Ｍの尿素を含む６％アクリルアミドゲル電気泳動に供し、大きさを確認した。
【００８２】
（ii）ライブラリーの作製
Balb/cマウスのゲノミックDNAライブラリー（クローンテック社）を制限酵素EcoRIで部分消化または完全消化したのち、部分消化物に関しては消化物をλCharon4Aに、また完全消化物に関してはpSP64（プロメガバイオテック（Promega Biotech）社、米国）に連結してライブラリーを作製した。
【００８３】
ウシ、ニワトリ、イヌ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ヒト、カンガルー、サル、マウス、ハト、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物種については、λ由来のファージベクター、例えばλgt10、λgt11、EMBL3またはλCharon4Aの各ベクターに挿入されたcDNAおよびゲノミックDNAのライブラリーが市販品として購入可能である（クロンテック（Clontech）社／TOYOBO社）。なお、pSP64（プロメガ社）および市販ゲノミックDNA（クローンテック社）の組み合わせによっても、これらと同等のライブラリーを作製することは、当業者であれば容易に可能であろう。
【００８４】
（iii）陽性クローンのスクリーニング
このライブラリーの中から、上記（ｉ）において作製したプローブを用いてスクリーニングを行った。
【００８５】
その結果、λCharon4AのライブラリーからはλMC26が、そして、pSP64のライブラリーからはpSmC26が乳腺特異的に発現する陽性クローンとして同定された。これら構築物のマップを、それぞれ図１および図２に示す。
【００８６】
（実施例２）  mC26構造遺伝子および該遺伝子の発現制御領域の特徴
（ｉ）陽性クローンの特徴
λMC26クローンおよびpSmC26クローンの制限酵素地図を作製して比較したところ、λMC26は約12.7kbの挿入断片（EcoRI断片）を、そしてpSmC26は約6.7kbの挿入断片（EcoRI断片）を含むことがわかった。そして、約6.7kbの断片は約12.7kbの断片内に含まれるものであることが、制限酵素マッピングにより明らかとなった。これらの結果は図１および図２の制限酵素認識部位の比較から明らかである。
【００８７】
（ii）塩基配列決定
pSmC26の約6.7kbのEcoRI断片を切り出し、さらにHindIIIで消化することにより約5.4kbpのEcoRI-HindIII断片をpBlueScriptIISK+（プロメガ社）に挿入してサブクローン化した。このサブクローンに関して、デリーションキット（TaKaRa社）を用いて欠失変異体のシリーズを作製した。約5.4kbの断片の制限酵素マップを図３に示す。これらのシリーズの配列は、ジデオキシ法［サンガー（Sanger, F.）ら、Proc. Matl. Acad. Sci., USA,
74, 5463 (1977)］により、DNA塩基配列決定機（ABI社、モデル373A、およびファルマシア社、A. L. F.モデル）を使用して決定された。決定された塩基配列を配列番号１とする。
【００８８】
配列番号１中、ヌクレオチド番号2305〜2307のAGCから始まり、ヌクレオチド番号4622〜4624のCCTで終わる構造遺伝子部分が存在する（図５）。
【００８９】
図５に示すとおり、mC26構造遺伝子内には第１ないし第３イントロンが存在しており、スプライシングに関与していることが予測されるので、異種遺伝子発現のためのカセットとして用いる場合は、これらの配列を含ませることが好ましい。しかし、下記実施例から明らかなとおり、異種遺伝子の種類によってはこれらは必要でない場合もある。よって、発現カセットを作製するための連結の複雑さも考慮して、これらの配列を含ませるか否かを検討する必要がある。
【００９０】
該構造遺伝子部分の上流および下流領域のヌクレオチド配列には、公知のカゼイン遺伝子との間で相同性は認められない。また、上記文献［ドーベンコら、前記］において開示されていない部分、即ち、配列番号１中の第1439ヌクレオチド〜第1522に存在するGAAトリプレットの連続重複配列部分（以下、MboIIリピートと称する）は、いわゆるトリプルリピートと称される発現制御配列と同等のものと考えられ、この部分が発現制御に関与している可能性は高い（図４、下線部分）。マウスIgH遺伝子においてもMboIIリピートが発見されており、発現制御エンハンサーとして機能していると考えられている。
【００９１】
配列番号１のヌクレオチド配列は、一方の末端がEcoRI認識部位であり、そして他方の末端がHindIIIの認識部位であるDNA断片として、λMC26クローンおよびpSmC26クローンから容易に分離され、発現カセットとして以後の実験に使用された。
【００９２】
（実施例３）  マウス骨形成誘導蛋白質を発現するトランスジェニック動物の作製
実施例１において単離したpSmC26の約6.7kb断片のうち配列を決定した5394bpのDNA断片を発現カセットとして用いて、mC26構造遺伝子部分に、外来異種遺伝子を連結した組換えDNAを作製した。以下にその概要を記載する。
【００９３】
（ｉ）組換えDNAの作製
最初に、pSmC26から約6.7kb断片のEcoRI断片を切り出し、さらにHindIIIにより部分消化し、ゲル電気泳動法により5394bpのDNA断片を回収した。該断片をpBlueScriptSK+のEcoRI／HindIII二重消化物に連結してpBmC26EHを作製した。pBmC26EHのマップを図７に示す。
【００９４】
一方、外来異種遺伝子としては、ハムスター−ヒトの融合遺伝子である骨形成誘導蛋白質遺伝子を用いた。このヌクレオチド配列を配列番号２として示す。
【００９５】
該融合遺伝子は、以下の工程により取得した：
ヒト骨形成誘導蛋白質（BIP）遺伝子の一部の配列（配列番号７）を有するDNAを5'側プライマーとし、そして、配列番号８の配列 を有するDNAを3'側（逆のストランド）プライマーとした。
GACGAGAAGACGATGCAGA                      （配列番号７）
GCACAGGTGTCCACGGACA                      （配列番号８）
【００９６】
これらのプライマーを用いて、ハムスター由来のBaby Hamster kidney（BHK）細胞株から常法（チオシアン酸グアニジン法：前記のMolecular Cloning、サムブルックらを参照）により抽出したRNA（10μg）から逆転写酵素RAV-2（TaKaRa社）およびrTthDNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社／TaKaRa社）を用い、添付の緩衝液によりパーキンエルマー社の装置（Perkin
Elmer Cetus DNA Thermal Cycler480）を用いて添付の使用説明書に従ってRT-PCR反応を実施し、ハムスターBIPに相補的な二本鎖を得た。該二本鎖DNAを電気泳動により確認後（図８、レーン３〜５）、ゲルから回収し、pBlueScriptIIベクターのEcoRV切断部位に挿入してDNAを増幅し、ファルマシア社ALF自動シークエンサーにより塩基配列を決定した。上記操作により、該DNAは、ヒトBIP  DNA（配列番号７および８）および新規遺伝子であるハムスターBIPのヒト遺伝子に相似する部分のDNAが結合したヒト−ハムスター融合遺伝子DNAとして得られた。
【００９７】
pBmC26EH中の配列番号１の第2305ヌクレオチドから第4624ヌクレオチドまでを除去したDNAに、T4DNAリガーゼ（TaKaRa社）を用いて上記DNAを連結して得た組換えDNAを、大腸菌JM109株にトランスフェクションして増幅した。増幅された該組換えDNAの塩基配列を決定して確認し、制限酵素BssHII（TaKaRa社）で切断して直鎖状DNAとしてアガロースゲル電気泳動によりpBlueScriptII由来のDNA部分と、haBIPを挿入されたmC26発現カセット部分を分離してゲルから回収した。このDNAの1〜5μg/ml溶液を以下の実施例に用いた。
【００９８】
（ii）受精卵の採取
マウスの性周期（４日間）を考慮して、毎日、メスのマウス膣内をガラスピペットにより水で洗浄し、細胞診により性周期を調べた（スメアチェック）。マウスを同調群に分けて、群飼し、オスのマウスと交配後、翌朝の膣栓（プラグ）形成を確認して妊娠マウスを得た。母群頭数が少ない場合は、ゴナドトロピン腹腔内注射により過排卵処置を行った。塩酸ケタミンまたはペントバルビタールの５０倍希釈液を腹腔内注射して導入麻酔し、エーテル麻酔下に手術を行い、輸卵管ないし子宮角を移動中の卵を回収した。
用いたマウスはチャールズリバー（Chirles River）社のCD-1マウスを用いた。
【００９９】
（iii）受精卵へのDNAの注入
上記（ｉ）において作製したpBmC26EHを大腸菌JM109株内で増幅後、制限酵素EcoRIおよびKpnIの認識部位において切断して直鎖状にし、該直鎖状DNAをマウスの受精卵前核に注入した。上記DNAを1〜5μg/mlの濃度に溶解した溶液をマイクロインジェクションした。この方法により操作された胚を子宮頸管刺激により偽妊娠させたメスまたは性周期同調群より選択した代理母（受容メス）の卵管腹腔口に適切な大きさのシリコンチューブカテーテルを挿入して移し、妊娠へと進展させた。
【０１００】
マイクロインジェクション後の卵の１時間生存率は52％であった。
【０１０１】
上記遺伝子導入卵を１頭につき２０個ずつ４０頭の代理母に移入したところ、５４頭の産子を得た。
【０１０２】
上記５４頭の産仔のうち、DNA診断によりトランスジェニックと判明したものは７頭（13％）であった。
【０１０３】
（iv）DNA診断
トランスジェニックマウスの口内粘膜細胞または培養白血球細胞から常法により得たDNAに関して、PCR法のキット（Perkin Elmer社の使用説明書に従った）を用いて実施した。結果を図８に示す。
【０１０４】
図８は、培養細胞株および組換え動物細胞により抽出した各RNA  10μgについて、ヒト−ハムスター融合遺伝子であるhaBIPのmRNAの発現の有無をRT-PCR法により確認した。レーン４、５および６は、ハムスター由来のBHK細胞から抽出したRNA；レーン２は、ヒト由来細胞株であるNamalwa細胞RNA；レーン１は、組換え動物細胞から抽出したRNA；に対するRT-PCRの結果を示す。5'および3'のプライマーはヒトBIP遺伝子DNAの構造遺伝子部分の配列からオリゴマー一本鎖DNAを合成して使用したものであり、各PCR反応産物のDNA配列は同一となると予想される。図８は、PCR反応後、２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロミド染色した結果を示すが、各バンドのアガロース部分を切り出してNaIにより溶解後、DNAをガラスパウダーに吸着させて回収し、全塩基配列を決定したところ、同一の配列を有することが確認された。
【０１０５】
（配列表の説明）
本明細書に添付した配列表について以下説明する。
（配列番号：１）
配列の長さ：5394
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mus musculus
株名：Balb/c
組織の種類：liver
配列の特徴
特徴を表す記号：CAAT signal
存在位置：2234-2243
特徴を決定した方法：S
【０１０６】
配列の特徴
特徴を表す記号：TATA signal
存在位置：2275-2281
特徴を決定した方法：S
【０１０７】
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：2305-4624
特徴を決定した方法：P
【０１０８】
配列の特徴
特徴を表す記号：polyA signal
存在位置：4607-4612
特徴を決定した方法：S
【０１０９】
（配列番号：２）
配列の長さ：357
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..357
特徴を決定した方法：E
【０１１０】
（配列番号：３）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
【０１１１】
（配列番号：４）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
【０１１２】
（配列番号：５）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
【０１１３】
（配列番号：６）
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：unsure 
存在位置：1..20
特徴を決定した方法：S
【０１１４】
（配列番号：７）
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..19
特徴を決定した方法：E
【０１１５】
（配列番号：８）
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成DNA
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：1..19
特徴を決定した方法：E
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、λMC26の制限酵素マップを示す。実線部分はλCharon4Aに由来する。実線以外の部分、即ち、EcoRI（#1−3.4kbp）からEcoRI（#1＋10.6kbp）までの太枠で示された部分が約12.7kb  EcoRI断片に相当する。＃１は配列番号１のヌクレオチド番号１に相当する。5'および3'の表示は、mC26構造遺伝子に対するものである。
【図２】図２は、pSmC26の制限酵素マップを示す。pSP64由来のEcoRI-EcoRI部分以外の太枠部分が約6.7kb  EcoRI断片に相当し、図１のEcoRI（#＜）からEcoRI（#1＋6.7kbp）の太枠部分に対応する。5'および3'の表示は、mC26構造遺伝子に対するものである。
【図３】図３は、配列番号１の制限酵素マップを示す。Ｅは制限酵素EcoRIを、Ｘは制限酵素XbaIを、Ｐは制限酵素PstIを、そしてＨは制限酵素HindIIIを示す。太枠はエクソンを示す。
【図４】図４は、mC26遺伝子の5'上流発現制御領域である。下線部はMobIIリピートを示す。
【図５】図５は、mC26遺伝子の構造遺伝子部分を示す。ヌクレオチド番号は、図４からの通し番号を示し、配列番号１のヌクレオチド番号に対応する。
【図６】図６は、mC26遺伝子の3'下流発現制御領域である。ヌクレオチド番号は、図４および図５からの通し番号を示し、配列番号１のヌクレオチド番号に対応する。
【図７】図７は、pBmC26EHの制限酵素マップを示す。実線部分がpBlueScriptII SK+に由来する。実線部分以外のEcoRI-HindIII断片が配列番号１の5394bpのDNAである。
【図８】図８は、PCR法によるDNA診断の結果であり、PCR反応後、２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロミド染色した結果を示す。Ｍは分子量マーカーを示す。レーン１は組換え動物細胞（ヒト−ハムスター組換え体BIP）を示し、レーン２はヒトNamalwa細胞（ネガティブコントロール）を示し、レーン３はBHK細胞株１を示し、レーン４はBHK細胞株２を示し、そしてレーン５はBHK細胞株３を示す。
【図１】
2006217919.tif 000003
【図２】
2006217919.tif 000004
【図３】
2006217919.tif 000005
【図４】
2006217919.tif 000006
【図５】
2006217919.tif 000007
【図６】
2006217919.tif 000008
【図７】
2006217919.tif 000009
【図８】
2006217919.tif 000010
【配列表】
2006217919000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月6日(2006.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むDNAであって、該ヌクレオチド配列の第2305ヌクレオチドから第4624ヌクレオチド領域のいずれか１カ所に異種遺伝子コード領域が挿入されている、前記DNA。
【請求項２】
図５に示されている、配列番号１のヌクレオチド配列の第１ないし第４エクソン、及び第１ないし第３イントロンの少なくともひとつが欠失している、請求項１記載のDNA。
【請求項３】
前記異種遺伝子が、骨形成誘導蛋白質(BIP)をコードする遺伝子を含む、請求項１記載のDNA。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のDNAを含む発現ベクター。
【請求項５】
大腸菌内で複製可能な請求項５記載の発現ベクター。