(57)【要約】【課題】  アミド化合物及びニトリル化合物を効率的に分解することができるアミド化合物の分解方法及びニトリル化合物の分解方法を提供する。【解決手段】  アミド化合物の分解方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施す工程を含む。アミダーゼ処理は、アミダーゼ活性を有する微生物の菌体若しくは該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施される。前記微生物は、ロドコッカス・エスピー ＮＩＴＥ Ｐ−７９株であることが好ましい。ニトリル化合物の分解方法は、ニトリル化合物を含む溶液にニトリルヒドラターゼ処理及び前記アミダーゼ処理を施すものである。ニトリルヒドラターゼ処理は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のニトリルヒドラターゼ含有物を用いて実施される。【選択図】      図１
2006263522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド化合物を分解する方法であって、
該方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施す工程を含み、
前記アミダーゼ処理は、アミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施され、
前記アミダーゼ活性を有する微生物は、２Ｍの濃度のアミド化合物を含む溶液中でアミダーゼ活性を発揮することを特徴とするアミド化合物の分解方法。
【請求項２】
アミド化合物を分解する方法であって、
該方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施す工程を含み、
前記アミダーゼ処理は、アミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施され、
前記アミダーゼ活性を有する微生物はロドコッカス属に属し、該微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子は配列番号１で表される塩基配列を含むことを特徴とするアミド化合物の分解方法。
【請求項３】
アミド化合物を分解する方法であって、
該方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施す工程を含み、
前記アミダーゼ処理は、ロドコッカス・エスピー ＮＩＴＥ Ｐ−７９で識別される微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施されることを特徴とするアミド化合物の分解方法。
【請求項４】
ニトリル化合物を分解する方法であって、
該方法は、ニトリル化合物を含む溶液にニトリルヒドラターゼ処理及びアミダーゼ処理を施すものであり、
前記ニトリルヒドラターゼ処理は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のニトリルヒドラターゼ含有物を用いて実施され、
前記アミダーゼ処理は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のアミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施されることを特徴とするニトリル化合物の分解方法。
【請求項５】
前記ニトリル化合物を含む溶液に、前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のニトリルヒドラターゼ含有物を接触させた後、
前記アミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を接触させることを特徴とする請求項４に記載のニトリル化合物の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセトアミドやアクリルアミドなどのアミド化合物を分解する方法、及びアセトニトリルやアクリロニトリルなどのニトリル化合物を分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトニトリルは、化学工業や研究開発における有用な有機溶媒として、医薬品、化成品、染料などの合成や精製、電子部品の洗浄に用いられたり、農薬や医薬品の合成原料に用いられたりするなどの広範な用途を有している。アセトニトリルは、液体クロマトグラフィの主要な分離・分析用溶媒でもあるため、製薬業を始めとする種々の化学工業や研究所でも多用されている。アセトニトリルは、廃棄する際に特別な処理を行う必要のある化合物であり、ＰＲＴＲ（化学物質排出移動量届出制度）において第一種指定化学物質にも指定されている。ＰＲＴＲの集計データによると、国内のアセトニトリルの排出・移動量は年間およそ３，５００トンであり、そのうちの約９２％が廃棄物移動量で占められている。アセトニトリルの廃棄物移動量は、第一種指定化学物質３５４物質中で１６番目に多く、金属化合物を除くと９番目に多い。
【０００３】
アセトニトリル含有廃液は一般に焼却処理されている。しかしながら、アセトニトリルは窒素原子を含むため、燃焼により窒素酸化物、いわゆるＮＯＸが発生する。従って、アセトニトリル含有廃液の焼却処理では、燃焼後に排ガスの脱硝処理が必要とされる。脱硝処理としては、触媒存在下でアンモニアや尿素を供給することにより、窒素酸化物を還元分解する方法が一般的である。また、水分含量の多いアセトニトリル含有廃液の焼却には、助燃剤として重油などを添加して、燃焼効率を上げる必要がある。このように、アセトニトリル含有廃液の焼却処理は、排ガス処理装置などの設備負担が大きいうえに、化石燃料を含む多くの資源の消費を伴う。
【０００４】
このような背景から、窒素酸化物の発生を抑え得るアセトニトリル含有廃液の焼却技術や、燃焼により発生した排ガスの脱硝技術が開発されている。例えば、特許文献１には廃液の二段階処理により窒素酸化物の発生を抑制する方法、特許文献２にはアセトニトリル含有溶液を気化して焼却炉に供給する焼却方法が開示されている。また、脱硝処理に用いられる種々の脱硝触媒や還元剤についても報告されている。しかしながら、焼却に依存する限り、多大なエネルギー消費と脱硝処理とを免れることはできない。
【０００５】
そこで、焼却に代わる別のアセトニトリル含有廃液の処理技術が研究されている。例えば、特許文献３には酸化剤存在下で溶融塩の中で分解・無害化処理する方法、特許文献４には複合化した化学反応場を利用する分解反応プロセスが開示されている。また、近年では、微生物を利用した処理方法も開発されている。例えば、特許文献５には複合的に誘導された微生物の純粋な培養物を用いてニトリル化合物やアミド化合物を分解する方法、特許文献６には少なくとも３Ｍの濃度のアセトニトリルに耐性を示す微生物を用いてアセトニトリルの廃棄物を除去する方法が開示されている。
【特許文献１】特公昭５５−３９７２５号公報
【特許文献２】特開平８−２１０６１８号公報
【特許文献３】特開２００１−７０４７０号公報
【特許文献４】特開２００３−２９０６２７号公報
【特許文献５】特表２００２−５１３３２４号公報
【特許文献６】特表２００４−５１６８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物を利用してアセトニトリルを分解する場合、該微生物の酵素作用によりアセトニトリルが別の物質に変換される。前記酵素作用には、アセトニトリルを一旦アセトアミドに変換した後に酢酸を生成させる場合と、アセトニトリルから直接的に酢酸を生成させる場合とがある。即ち、微生物が産生する各酵素は、それぞれ高い基質特異性を有するとともに、個別の至適反応条件や反応速度、および基質あるいは生成物に対する耐性を有しているため、工業的に最も効率のよい方法を選択する必要がある。つまり、微生物を利用してニトリル化合物やアミド化合物を工業的に分解処理する場合の効率という観点から、特許文献５，６の方法には、さらなる改良の余地が残されている。
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、アセトニトリルの分解処理には、アセトニトリルをアセトアミドに変換する第１の工程と、該工程によって変換されたアセトアミドを酢酸に変換する第２の工程とを組み合わせることが最も効率がよいことを見出した。さらに、第２の工程がアセトニトリルの分解処理全体における律速段階となっているため、該分解処理全体の効率化を達成するために、第２の工程の反応速度を高めることが可能な微生物についての知見を得た。そして、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の目的とするところは、アミド化合物を効率よく分解することができるアミド化合物の分解方法、及びニトリル化合物を効率的に分解することができるニトリル化合物の分解方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載のアミド化合物の分解方法は、アミド化合物を分解する方法であって、該方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施す工程を含み、前記アミダーゼ処理は、アミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施され、前記アミダーゼ活性を有する微生物は、２Ｍの濃度のアミド化合物を含む溶液中でアミダーゼ活性を発揮することを要旨とする。
【００１０】
請求項２に記載のアミド化合物の分解方法は、アミド化合物を分解する方法であって、該方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施す工程を含み、前記アミダーゼ処理は、アミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施され、前記アミダーゼ活性を有する微生物はロドコッカス属に属し、該微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子は配列番号１で表される塩基配列を含むことを要旨とする。
【００１１】
請求項３に記載のアミド化合物の分解方法は、アミド化合物を分解する方法であって、該方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施す工程を含み、前記アミダーゼ処理は、ロドコッカス・エスピー ＮＩＴＥ Ｐ−７９で識別される微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施されることを要旨とする。
【００１２】
請求項４に記載のニトリル化合物の分解方法は、ニトリル化合物を分解する方法であって、該方法は、ニトリル化合物を含む溶液にニトリルヒドラターゼ処理及びアミダーゼ処理を施すものであり、前記ニトリルヒドラターゼ処理は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のニトリルヒドラターゼ含有物を用いて実施され、前記アミダーゼ処理は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のアミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を用いて実施されることを要旨とする。
【００１３】
請求項５に記載のニトリル化合物の分解方法は、請求項４に記載の発明において、前記ニトリル化合物を含む溶液に、前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のニトリルヒドラターゼ含有物を接触させた後、前記アミダーゼ活性を有する微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を接触させることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、アミド化合物を効率よく分解することができるアミド化合物の分解方法、及びニトリル化合物を効率的に分解することができるニトリル化合物の分解方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明のニトリル化合物の分解方法を具体化した一実施形態について説明する。
図１に示すように、ニトリル化合物は、ニトリラーゼにより直接的に有機酸に分解される（以下、第１の経路と記載する）。また、ニトリル化合物の分解は、ニトリルヒドラターゼにより一旦アミド化合物に変換した後、該アミド化合物をアミダーゼにより有機酸に変換することによっても行われる（以下、第２の経路と記載する）。このようなニトリル化合物の分解は、酵素の基質特異性に依存して、上述のような異なる複数の経路で行われる。本実施形態のニトリル化合物の分解方法は、第２の経路で行われるため、用いられる微生物の菌体の性質、特に菌体によって産生される酵素の基質特異性に大きく左右される。
【００１６】
ニトリル化合物としては、アセトニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ブチロニトリル、プロピオニトリル、クロトノニトリル、２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジン、ベンゾニトリル、フルオロベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、スクシノニトリル、フマロニトリルなどが挙げられる。アミド化合物としては、アセトアミド、アクリルアミド、メタクリルアミド、ブチルアミド、プロピオンアミド、クロトンアミド、ピコリンアミド、ニコチンアミド、イソニコチンアミド、ベンズアミド、フルオロベンズアミド、クロロベンズアミド、ブロモベンズアミド、スクシンアミド、フマルアミドなどが挙げられる。有機酸としては、酢酸、アクリル酸、メタクリル酸、プロピオン酸、酪酸、クロトン酸、ピコリン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、安息香酸、フルオロ安息香酸、クロロ安息香酸、ブロモ安息香酸、コハク酸、フマル酸などのカルボン酸が挙げられる。本実施形態のニトリル化合物の分解方法において、アセトニトリルを用いる場合、アミド化合物としてのアセトアミドを経由して、有機酸としての酢酸を生成する。アクリロニトリルを用いる場合には、アクリルアミドを経由してアクリル酸を生成する。
【００１７】
本実施形態のニトリル化合物の分解方法は、ニトリル化合物を含む溶液に、ニトリルヒドラターゼ処理及びアミダーゼ処理を施すことにより行われ、最終生成物としての有機酸を生成させる。
【００１８】
ニトリル化合物を含む溶液としては、上記ニトリル化合物を含むものであれば特に限定されないが、化学工業や電子部品製造業などの工場や研究所などから排出される廃液（以下、ニトリル含有廃液と記載する）が好適に用いられる。このようなニトリル含有廃液には、ニトリル化合物以外の溶媒（例えば水やアルコールなど）や溶質が含まれていてもよい。ニトリル含有廃液中に含まれるニトリル化合物の濃度は、ニトリル化合物の原液の濃度以下（アセトニトリルの場合は１９Ｍ以下）であれば特に限定されないが、好ましくは１０Ｍ以下、より好ましくは６Ｍ以下、さらに好ましくは０．５〜４Ｍ、特に好ましくは０．５〜２Ｍである。ちなみに、ニトリル含有廃液は、濃縮、希釈又はその他の任意の廃液処理に供されたものであっても構わない。
【００１９】
ニトリルヒドラターゼ処理は、ニトリル化合物を含む溶液に、第１の微生物の菌体又は該菌体由来のニトリルヒドラターゼ含有物を接触させて酵素反応させる（インキュベートする）処理であり、ニトリル化合物の分解における中間生成物としてのアミド化合物を生成させる。
【００２０】
第１の微生物としては、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が用いられる。このような微生物としては、ロドコッカス（Rhodococcus）属、パントエア（Pantoea）属、ミクロコッカス（Micrococcus）属、バクテリジウム（Bacteridium）属、バチルス（Bacillus）属、アクチノマヅラ（Actinomadura）属、キタサトスポラ（Kitasatospora）属、ピリメリア（Pilimelia）属、アクロモバクター（Achromobacter）属、ベイジェリンキア（Beijerinckia）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、アクチノポリスポラ（Actinopolispora）属、アクチノシンネマ（Actinosynnema）属、アクチノプラネス（Actinopulanes）属、アミコラタ（Amycolata）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ノカルジオイデス（Nocardioides）属、プロビデンシア（Providencia）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドスピリラム（Rhodospirillum）属、カセオバクター（Caseobacter）属、シュードモナス属（Pseudomonas）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノカルジア（Nocardia）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、トルロプシス（Torulopsis）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、アシネトバクター属（Acinetobacter）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、カンジダ（Candida）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、コクリオボラス（Cochliobolus）属、フザリウム（Fusarium）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、エルウィニア（Erwinia）属、シトロバクター（Citrobacter）属、エアロモナス（Aeromonas）属、ゴルドナ（Gordona）属などに属する微生物が使用可能であり、ロドコッカス属の微生物が好適に使用され、ロドコッカス・ピリジニボランス（Rhodococcus pyridinivorans）が特に好適に使用される。
【００２１】
第１の微生物の菌体としては、増殖菌体、休止菌体（静止菌体）及び死菌体のいずれも使用可能であるが、ニトリルヒドラターゼ活性を安定して発揮することができることから休止菌体を使用することが特に好ましい。休止菌体は、ニトリルヒドラターゼ誘導物質を含む培地中で第１の微生物を培養し、該微生物の増殖速度が定常化するまで培養を継続することにより調製される。ニトリルヒドラターゼ誘導物質としては、通常、上記ニトリル化合物あるいはアミド化合物が用いられる。ニトリルヒドラターゼ誘導物質を含む培地中に含まれる該誘導物質の濃度は０．２〜４％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。さらに、ニトリルヒドラターゼ活性を維持するために、塩化コバルト（II）六水和物、硫酸鉄（II）五水和物などの金属塩化合物を培地に添加することが好ましい。金属塩化合物の濃度は０．０００１〜０．０１％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
【００２２】
さらに、第１の微生物の菌体は、少なくとも６Ｍの濃度のニトリル化合物を含む溶液中でニトリルヒドラターゼ活性を発揮する菌体であることが好ましい。このような菌体は、例えば、６Ｍの濃度のニトリル化合物を含む溶液１ｍｌあたりに０．６５ｍｇの乾燥菌体を添加し、２５℃で２４時間インキュベートしたときに、９０％以上のニトリル化合物を分解することを意味する（下記実施例３参照）。
【００２３】
ニトリルヒドラターゼ含有物としては、主に、第１の微生物の菌体処理物が用いられる。このような菌体処理物としては、例えば、菌体の破砕物や凍結乾燥物、或いは菌体からの抽出物や菌体から分離した酵素などが挙げられる。第１の微生物の菌体及びニトリルヒドラターゼ含有物は、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、ポリアクリルアミドなどの担体に固定化されていてもよい。
【００２４】
アミダーゼ処理は、上記中間生成物としてのアミド化合物を含む溶液に、アミダーゼ活性を有する第２の微生物の菌体又は該菌体由来のアミダーゼ含有物を接触させて酵素反応させる（インキュベートする）処理であり、上記最終生成物としての有機酸を生成させる。
【００２５】
第２の微生物の菌体としては、増殖菌体、休止菌体及び死菌体のいずれも使用可能であるが、アミダーゼ活性を安定して発揮することができることから休止菌体を使用することが特に好ましい。休止菌体は、上記第１の微生物の場合と同様に、アミダーゼ誘導物質を含む培地中で第２の微生物を培養し、該微生物の増殖速度が定常化するまで培養を継続することにより調製される。アミダーゼ誘導物質としては、通常、上記ニトリル化合物あるいはアミド化合物が用いられる。アミダーゼ誘導物質を含む培地中に含まれる該誘導物質の濃度は０．２〜４％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。
【００２６】
さらに、第２の微生物の菌体は、少なくとも２Ｍの濃度のアミド化合物を含む溶液中でアミダーゼ活性を発揮する菌体である。このような菌体は、例えば、２Ｍの濃度のアミド化合物を含む溶液１ｍｌあたりに５．６ｍｇの乾燥菌体を添加し、２５℃で２４時間インキュベートしたときに、９０％以上のアミド化合物を分解することを意味する（下記実施例４参照）。特に好ましくは、第２の微生物の菌体は、６Ｍの濃度のアミド化合物を含む溶液中でアミダーゼ活性を発揮する菌体である。このような菌体は、例えば、６Ｍの濃度のアミド化合物を含む溶液１ｍｌあたりに５．６ｍｇの乾燥菌体を添加し、２５℃で２４時間インキュベートしたときに、９０％以上のアミド化合物を分解することを意味する（下記実施例２参照）。
【００２７】
アミダーゼ含有物としては、主に、第２の微生物の菌体処理物が用いられる。このような菌体処理物としては、例えば、菌体の破砕物や凍結乾燥物、或いは菌体からの抽出物や菌体から分離した酵素などが挙げられる。第２の微生物の菌体及びアミダーゼ含有物は、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、ポリアクリルアミドなどの担体に固定化されていてもよい。
【００２８】
このような第２の微生物としては、ロドコッカス属の微生物が好適に用いられ、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）Ｐ６−１株、又はロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.） ＮＩＴＥ Ｐ−７９株が特に好適に用いられる。Ｐ６−１株及びＮＩＴＥ Ｐ−７９株は、いずれも本発明者らによって単離・同定された微生物である。
【００２９】
ＮＩＴＥ Ｐ−７９株は、本発明者らにより岐阜県美濃加茂市の土壌から単離・同定された菌株であり、配列番号１で表される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する。配列番号１で表される塩基配列は、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）の対応する遺伝子の塩基配列に対して９９．２％、ロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）の対応する遺伝子の塩基配列に対して９７．４％の相同性を示す。ＮＩＴＥ Ｐ−７９株の細胞形態は桿菌であり、コロニー形態は、円形、レンズ状、表面スムーズ、淡いオレンジ色である。
【００３０】
このＮＩＴＥ Ｐ−７９株は、炭素源、窒素源、その他の養分などを含む適切な液体培地、例えば公知のＬＢ培地や下記表１に示す培地などを用いて培養することが可能である。また、このような液体培地には、硫酸鉄、塩化コバルトなどの無機塩、微量金属塩、ビタミン類などの通常の培養に用いられる栄養源が適宜添加されていることが好ましい。液体培地には、必要に応じて、微生物の増殖を促進する因子、上記アミダーゼ誘導物質、又は酵素の活性や安定性を高める因子を添加することも可能である。ＮＩＴＥ Ｐ−７９株の菌体の培養は、通常、２０〜５０℃（好ましくは２８℃前後）、ｐＨ５〜８、好気性の条件下で行われる。培養時間は、通常、１２〜９６時間程度、好ましくは４８時間前後である。Ｐ６−１株の培養条件についても同様である。
【００３１】
【表１】
2006263522.tif 000003
本実施形態におけるニトリルヒドラターゼ処理及びアミダーゼ処理は、いずれも該処理に用いられる微生物によって産生される酵素の至適条件（至適温度、至適ｐＨなど）で行われることが好ましい。至適温度は、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃、さらに好ましくは２５〜４５℃である。至適ｐＨは、好ましくは４〜１０、より好ましくは５〜９である。ここで、酵素の反応を効率よく進行させるために、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中性付近に緩衝能を有する緩衝液を使用することも可能であり、さらにはニトリル化合物を含む溶液のｐＨを至適ｐＨ付近にするために、酸又はアルカリを添加することも可能である。
【００３２】
本実施形態のニトリル化合物の分解方法では、ニトリルヒドラターゼ処理（酵素反応）を開始した後にアミダーゼ処理を開始することが好ましく、ニトリル化合物を迅速に分解するために、ニトリルヒドラターゼ処理の途中又は該処理の後（インキュベート中又はインキュベート後）にアミダーゼ処理（酵素反応）を開始することがさら好ましい。特に、ニトリルヒドラターゼ処理により、ニトリル化合物を含む溶液中に最初に含まれていたニトリル化合物の９０％以上がアミド化合物に変換された後で、アミダーゼ処理を開始することが好ましい。なお、本実施形態のニトリル化合物の分解方法において、ニトリルヒドラターゼ処理とアミダーゼ処理とを同時に開始しても構わない。
【００３３】
本実施形態のニトリル化合物の分解方法によって得られる有機酸を含む処理液は、再生資源として利用することが可能である。さらに、前記処理液は、必要に応じて、脱塩、目的物の分離・精製などを行った後に再生資源として利用することもできる。例えば、処理液を遠心分離して得られる上清に石灰を加えて反応させることにより有機酸のカルシウム塩を生成させたり、処理液から得られる有機酸又はそのアンモニウム塩を排ガスの脱硝や脱硫のために利用したりすることが可能である。
【００３４】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  実施形態のニトリル化合物の分解方法は、微生物を利用した方法であるため、従来の焼却処理とは異なり、エネルギーの消費が少ないうえ脱硝処理を行う必要もない。特に、化石燃料の消費量、窒素酸化物の発生量、地球温暖化ガス（炭酸ガス）の排出量が少ないうえ、常温、常圧などの穏和な条件下で処理することが可能であるため、環境への負荷を低減させることが極めて容易である。さらに、この分解方法では、酢酸などの工業的に幅広い用途のある有用な有機酸が最終生成物として生成されることから、資源の有効利用を図ることを容易にする。
【００３５】
・  実施形態のニトリル化合物の分解方法は、第１の微生物の菌体又はニトリルヒドラターゼ含有物を用いてニトリル化合物をアミド化合物に変換した後、変換されたアミド化合物を第２の微生物の菌体又はアミダーゼ含有物により有機酸に変換する方法である。この方法は、上記第２の経路で行われるため、ニトリラーゼにより直接的に有機酸を生成させる第１の経路で行われる場合よりも、全体の反応速度を容易に高めることができる。従って、ニトリル化合物を極めて効率的に分解することができるため、ニトリル化合物の工業的な処理に適している。さらに、高濃度のニトリル化合物を含む溶液を希釈することなく、そのまま分解することが可能である点も重要である。
【００３６】
さらに、この分解方法において、ニトリル化合物を含む溶液に、第１の微生物の菌体又はニトリルヒドラターゼ含有物を接触させた後、第２の微生物の菌体又はアミダーゼ含有物を接触させることにより、ニトリル化合物から有機酸を生成させる反応を極めて効率的に行うことが可能となる。即ち、アミダーゼの基質が十分に存在した溶液に対してアミダーゼ処理を開始することにより、第２の微生物の菌体又はアミダーゼ含有物中のアミダーゼ活性の低下を容易に抑えることができるため、ニトリル化合物の分解にかかる時間を容易に短縮することができる。
【００３７】
なお、上記実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
上記実施形態はニトリル化合物を分解する方法について記載されているが、該方法の後半部分の反応のみを利用することによって、アミド化合物の分解方法を提供することが可能となる。即ち、アミド化合物の分解方法は、アミド化合物を含む溶液にアミダーゼ処理を施すことにより行われる。そして、このアミド化合物の分解方法によって得られる処理液には、最終生成物としての有機酸が生成される。
【００３８】
なお、このアミド化合物の分解方法で用いられる出発原料は、上記実施形態のアミド化合物そのものを含む溶液に加えて、該アミド化合物を生成可能な溶液を用いることも可能である。アミド化合物を生成可能な溶液とは、化学的又は生物学的な反応によりアミド化合物を生成する組成物を含んでなる溶液を意味し、該溶液を上記第２の微生物の菌体又はアミダーゼ含有物と接触させた後でも、前記反応の進行とともにアミド化合物を継続的に生成することが可能である。
【実施例１】
【００３９】
＜微生物の単離及び同定＞
２００１年６月〜２００２年３月に岐阜県内各地の山林、田畑、川や池の底、道路沿いなど数百地点から土壌を採取した。これらの土壌を別個に培地に添加し、２８℃で７〜１０日間培養することにより、各土壌由来の培養物を得た。前記培地は、１〜３重量％のアセトニトリルを含有する基礎培地（０．１重量％のリン酸二カリウム、０．０５重量％の硫酸マグネシウム七水和物、１％（ｖ／ｖ）のビタミン混合物及び１％（ｖ／ｖ）のメタル混合物、ｐＨ７．０）である。
【００４０】
次に、前記基礎培地を含む寒天培地上に前記各培養物を塗末し、２８℃で３〜５日間培養することにより、数百株の微生物のコロニーを得た。これら数百株のコロニーのうちの３つのコロニーを形成する菌株をＳ８５−２株、Ｐ６−１株及びＳ１３−４株と命名した。ちなみに、Ｓ８５−２株は２００１年８月に加茂郡川辺町の道路沿い、Ｐ６−１株は２００２年１月に岐阜市の畑、Ｓ１３−４株は２００１年６月に美濃加茂市の山から採取した土壌からそれぞれ分離されたものである。
【００４１】
次に、Ｓ８５−２株、Ｐ６−１株及びＳ１３−４株を含む各菌体からそれぞれ休止菌体を調製した。休止菌体の調製では、まず、２重量％のアセトニトリルを含有するＹＰ培地（０．１重量％のリン酸二カリウム、０．０５重量％の硫酸マグネシウム七水和物、１重量％の酵母抽出物、０．５重量％のポリペプトン及び１％（ｖ／ｖ）のメタル混合物、ｐＨ７．０）に、各コロニーを形成する菌体を接種し、２８℃で２日間それぞれ振盪培養した。次に、遠心分離により各培地から菌体を沈殿させて回収した後、各菌体を０．８５重量％の塩化ナトリウムで洗浄し、続いて０．８５重量％の塩化ナトリウム２ｍｌに再懸濁することにより、それぞれ休止菌体の懸濁液を得た。
【００４２】
調製された各休止菌体について、高濃度アセトニトリル溶液中におけるアセトニトリル分解作用を調べた。まず、各休止菌体を０．１Ｍのリン酸緩衝液中に懸濁して２５℃で５分間予備インキュベートを行った後、該リン酸緩衝液中に終濃度が６Ｍとなるようにアセトニトリルを添加して２５℃で６時間インキュベートした。インキュベート後の溶液に、終濃度が０．４Ｎとなるように塩酸を加えて酵素反応を停止させた後、遠心して上清を得た。得られた各上清をガスクロマトグラフィにかけ、アセトニトリル濃度、アセトアミド濃度及び酢酸濃度をそれぞれ定量した。また、前記リン酸緩衝液に終濃度が６Ｍとなるようにアセトニトリルを添加する代わりに、終濃度が６Ｍとなるようにアセトアミドを添加した場合についても同様に、アセトアミド濃度及び酢酸濃度を定量した。定量を実施する際の条件を下記表２に示す。
【００４３】
【表２】
2006263522.tif 000004
その結果、データは示さないが、Ｓ８５−２株に強いアセトニトリル分解作用があり、Ｐ６−１株及びＳ１３−４株に強いアセトアミド分解作用があった。特に、Ｓ１３−４株は、Ｐ６−１株よりも強いアセトアミド分解作用を有していた。
【００４４】
次に、Ｓ８５−２株、Ｐ６−１株及びＳ１３−４株の種を同定した。種の同定は、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を解析（ｃＤＮＡを作製して配列を決定）し、データベース上で相同性検索を行うことにより行った。その結果、Ｓ８５−２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はロドコッカス・ピリジニボランス ＰＤＢ９（ＤＳＭ４４５５５）と１００％一致し、Ｐ６−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はロドコッカス・エリスロポリスＤＳＭ４３１８８と１００％一致した。Ｓ１３−４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列を含み、該配列はロドコッカス・ロドクロウス ＤＳＭ４３２７４の対応する遺伝子の塩基配列に対して９９．２％、ロドコッカス・ルバー ＤＳＭ４３３３８の対応する遺伝子の塩基配列に対して９７．４％の相同性を示した。従って、Ｓ１３−４株はロドコッカス・エスピーであると同定された。なお、Ｓ１３−４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−７９にて寄託されている。
【実施例２】
【００４５】
＜Ｐ６−１株及びＳ１３−４株によるアセトアミドの分解＞
（Ｐ６−１休止菌体の調製）
保存斜面培地に保存されているＰ６−１株を白金耳にすくい取り、２００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中の前培養培地（表１参照）２０ｍｌに接種した後、該三角フラスコを２８℃で３日間振盪培養した。３日間培養した培養液のうち４ｍｌを、アミダーゼ誘導物質（１．０重量％のアセトニトリル）を含む４０ｍｌの本培養培地（表１参照）に移し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中で２８℃、２日間振盪培養した。２日間培養した培養液を遠心分離し、沈殿した菌体を１０ｍｌの生理的食塩水で洗浄した後、２ｍｌの生理的食塩水に懸濁することにより、Ｐ６−１休止菌体の懸濁液（乾燥菌体５６ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
【００４６】
（Ｓ１３−４休止菌体の調製）
Ｓ１３−４株について、前記Ｐ６−１株の場合と同様に、前培養培地を用いて３日間振盪培養した。この培養液のうち４ｍｌを、アミダーゼ誘導物質（１．５重量％のアセトアミド）を含む４０ｍｌの本培養培地（表１参照）に移し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中で２８℃、２日間振盪培養した。この培養液をＰ６−１株の場合と同様に処理することにより、Ｓ１３−４休止菌体の懸濁液（乾燥菌体５６ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
【００４７】
（休止菌体によるアセトアミドの分解）
Ｐ６−１休止菌体及びＳ１３−４休止菌体の懸濁液０．１８ｍｌ（いずれも乾燥菌体１０．１ｍｇ）をそれぞれ０．３６ｍｌの蒸留水と混和した後、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１８ｍｌを加えた。ここに１．０８ｍｌの１０Ｍアセトアミド（終濃度６Ｍ）を添加することにより、アミダーゼ処理を開始した。該アミダーゼ処理は２５℃で行い、所定時間毎に処理液を少量ずつ採取するとともに、採取直後の処理液中の酵素反応を停止させた。採取した各処理液に含まれる酢酸の濃度を、上記表２の条件でガスクロマトグラフィにて定量した。結果を図２に示す。
【００４８】
図２に示すように、Ｐ６−１株及びＳ１３−４株ともに、高濃度のアセトアミドを含む溶液中で高いアミダーゼ活性を発揮した。特に、Ｓ１３−４株は、Ｐ６−１株よりも顕著に高いアミダーゼ活性を発揮した。
【実施例３】
【００４９】
＜アセトニトリルの分解＞
（Ｓ８５−２休止菌体の調製）
Ｓ８５−２株について、前記Ｐ６−１株の場合と同様に、前培養培地を用いて３日間振盪培養した。この培養液のうち４ｍｌを、ニトリルヒドラターゼ誘導物質（０．５重量％のアセトアミド）を含む４０ｍｌの本培養培地（表１参照）に移し、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中で２８℃、２日間振盪培養した。この培養液をＰ６−１株の場合と同様に処理することにより、Ｓ８５−２休止菌体の懸濁液（乾燥菌体６５ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
【００５０】
（Ｓ８５−２休止菌体によるアセトニトリルの分解）
Ｓ８５−２休止菌体の懸濁液１８μｌ（乾燥菌体１．１７ｍｇ）を１．０３２ｍｌの蒸留水と混和した後、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１８ｍｌを加えた。ここに０．５７ｍｌのアセトニトリル（終濃度６Ｍ）を添加することにより、ニトリルヒドラターゼ処理を開始した。該ニトリルヒドラターゼ処理は２５℃で行い、所定時間毎に処理液を少量ずつ採取するとともに、採取直後の処理液中の酵素反応を停止させた。採取した各処理液に含まれるアセトニトリル、アセトアミド及び酢酸の濃度を、上記表２の条件でガスクロマトグラフィにて定量した。結果を図３（ａ）に示す。
【００５１】
（Ｓ８５−２及びＳ１３−４休止菌体によるアセトニトリルの分解）
前記（Ｓ８５−２休止菌体によるアセトニトリルの分解）において、ニトリルヒドラターゼ処理を開始してから４時間後の処理液中に、上記実施例２で調製したＳ１３−４休止菌体の懸濁液０．１８ｍｌ（乾燥菌体１０．１ｍｇ）を添加することにより、アミダーゼ処理を開始した。全ての処理は２５℃で行い、所定時間毎に処理液を少量ずつ採取するとともに、採取直後の処理液中の酵素反応を停止させた。採取した各処理液に含まれるアセトニトリル、アセトアミド及び酢酸の濃度を、上記表２の条件でガスクロマトグラフィにて定量した。結果を図３（ｂ）に示す。
【００５２】
図３（ａ）に示すように、アセトニトリルは、Ｓ８５−２休止菌体の添加から４時間でほぼ完全に分解された。アセトニトリルの分解によって生成されたアセトアミドは、Ｓ８５−２株が有するアミダーゼの作用によりごく一部が酢酸に分解されたが、休止菌体の添加から１０時間経過してもほとんどは分解されずにアセトアミドのまま残存した。一方、図３（ｂ）に示すように、Ｓ８５−２休止菌体の添加から４時間経過した後、Ｓ１３−４休止菌体を添加したところ、Ｓ８５−２休止菌体によって生成したアセトアミドは速やかに酢酸に分解された。
【実施例４】
【００５３】
＜アクリルアミドの分解＞
上記実施例２で調製したＳ１３−４休止菌体の懸濁液０．１８ｍｌ（乾燥菌体１０．１ｍｇ）を０．９９ｍｌの蒸留水と混和した後、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１８ｍｌを加えた。ここに０．４５ｍｌの８Ｍアクリルアミド（終濃度２Ｍ）を添加することにより、アミダーゼ処理を開始した。該アミダーゼ処理は２５℃で行い、所定時間毎に処理液を少量ずつ採取するとともに、採取直後の処理液中の酵素反応を停止させた。採取した各処理液に含まれるアクリルアミド及びアクリル酸の濃度を、上記表２の（アセトアミド及び酢酸の定量）と同じ条件でガスクロマトグラフィにて定量した。結果を図４に示す。
【００５４】
図４に示すように、Ｓ１３−４株は、２Ｍのアクリルアミドを含む溶液中でも高いアミダーゼ活性を発揮した。なお、データは示さないが、Ｓ１３−４株は、６Ｍのアクリルアミドを含む溶液中ではアミダーゼ活性をほとんど発揮しなかった。
【００５５】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  前記アミダーゼ活性を有する微生物は、６Ｍの濃度のアミド化合物を含む溶液中でアミダーゼ活性を発揮することを特徴とする請求項１に記載のアミド化合物の分解方法。前記アミダーゼ活性を有する微生物は、ロドコッカス属に属することを特徴とする請求項１に記載のアミド化合物の分解方法。
【００５６】
・  前記ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物は、ロドコッカス・ピリジニボランスであることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載のニトリル化合物の分解方法。
・  請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のアミド化合物の分解方法によって得られる処理液。請求項４又は請求項５に記載のニトリル化合物の分解方法によって得られる処理液。これらの処理液は、再生資源として工業的に幅広い用途に利用することができる。
【００５７】
本発明を応用した技術として、以下の技術が提供され得る。
ロドコッカス・エスピー ＮＩＴＥ Ｐ−７９株は、上記実施形態のアミド化合物の分解方法及びニトリル化合物の分解方法以外の用途にも利用することが可能である。即ち、ロドコッカス・エスピー ＮＩＴＥ Ｐ−７９で識別される新規微生物。この新規な微生物は、アミド化合物に作用してカルボン酸を生成させることができる。また、その他の任意の用途に利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ニトリル化合物の分解に関わる酵素、並びにその分解物及び分解経路を模式的に示す図。
【図２】実施例２の結果を示すグラフ。
【図３】（ａ）及び（ｂ）はいずれも実施例３の結果を示すグラフ。
【図４】実施例４の結果を示すグラフ。
【図１】
2006263522.tif 000005
【図２】
2006263522.tif 000006
【図３】
2006263522.tif 000007
【図４】
2006263522.tif 000008
【配列表】
2006263522000001.app