(57)【要約】【課題】電流もしくは電界を用いて、生体の細胞に正常のイオン濃度を回復させることによって、増殖性細胞疾患、心臓血管疾患等の疾患の治療または予防、あるいは、ストレスの影響を改善するための方法と装置を提供する。【解決手段】細胞に含まれる少なくともひとつのＧ−タンパク共役受容体を調節して、細胞のイオン濃度を変化させるために、細胞又は組織上に約０．００１ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する外部電界を印加する。【選択図】図42
2006167476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物あるいはその一部の細胞におけるイオンの異常な集中を引き起こす疾患、あるいはその異常な集中によって引き起こされた疾患を治療または予防する方法であって、
当該細胞に正常のイオン濃度を回復させることによって前記疾患を治療または予防する方法であって、それには、少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体（G-protein-coupled receptors）を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約０.００１ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する外部電界を当該生物又はその一部に印加することが含まれる。
【請求項２】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体（family 3 GPCRs）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記平均誘導電流密度が、約０．３ｍＡ／ｍ２から約２００ｍＡ／ｍ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記平均誘導電流密度が、約０．４ｍＡ／ｍ２から約６０ｍＡ／ｍ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イオンは、カルシウムイオンである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項１５】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約０.１ｍＡ／ｍ２から約２ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する外部電界を当該生物又はその一部に印加することを含む増殖性細胞疾患を治療する方法。
【請求項１６】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記平均誘導電流密度が、約０．２ｍＡ／ｍ２から約１.２ｍＡ／ｍ２である請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記平均誘導電流密度が、約０．２９ｍＡ／ｍ２から約１.１２ｍＡ／ｍ２である請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記増殖性細胞疾患が、線維肉腫、横紋筋肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、脂肪肉腫、悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、結腸癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、気管支癌、精巣癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、血管肉腫、リンパ管肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、膵臓癌、腎細胞癌、ウィルムス腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、腺癌、上皮癌、黒色腫、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、膀胱癌、胎生期癌、嚢胞腺癌、髄様癌、絨毛癌、精上皮腫からなるグループから選ばれる請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項２９】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約０.４ｍＡ／ｍ２から約６.０ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する外部電界を当該生物又はその一部に印加することを含む電解質平衡異常を治療する方法。
【請求項３０】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記平均誘導電流密度が、約０．４ｍＡ／ｍ２から約５．６ｍＡ／ｍ２である請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記平均誘導電流密度が、約０．４３ｍＡ／ｍ２から約５．５５ｍＡ／ｍ２である請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記イオンは、カルシウムイオンである請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２９記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項４３】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約０.３ｍＡ／ｍ２から約０.６ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する外部電界を当該生物又はその一部に印加することを含む血清カルシウム濃度に関連した疾患を治療する方法。
【請求項４４】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記平均誘導電流密度が、約０．３ｍＡ／ｍ２から約５．５５ｍＡ／ｍ２である請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記平均誘導電流密度が、約０．３３ｍＡ／ｍ２から約６０ｍＡ／ｍ２である請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項４３記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項５６】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約０．０３ｍＡ／ｍ２から約１２ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する外部電界を当該生物又はその一部に印加することを含むストレス又はストレス関連疾患、あるいはそれらの症状を治療する方法。
【請求項５７】
前記電界が、前記少なくともひとつＧ-タンパク共役型受容体にＡＣＴＨ濃度を調節させる請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
前記平均誘導電流密度が、約０．３５ｍＡ／ｍ２から約１１．１ｍＡ／ｍ２である請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ストレス関連疾患が、免疫系機能低減、伝染病、高血圧症、粥状動脈硬化症およびインシュリン抵抗性異脂肪血症症候群のから成るグループから選ばれる請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
請求項５６記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項７０】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約１０ｍＡ／ｍ２から約１００ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する電流と当該生物又はその一部を接触させることを含む増殖性細胞疾患を治療する方法。
【請求項７１】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項７０に記載の方法。
【請求項８０】
前記増殖性細胞疾患が、線維肉腫、横紋筋肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、脂肪肉腫、悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、結腸癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、気管支癌、精巣癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、血管肉腫、リンパ管肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、膵臓癌、腎細胞癌、ウィルムス腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、腺癌、上皮癌、黒色腫、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、膀胱癌、胎生期癌、嚢胞腺癌、髄様癌、絨毛癌、精上皮腫からなるグループから選ばれる請求項７０に記載の方法。
【請求項８１】
請求項７０記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項８２】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約６０ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する電流と当該生物又はその一部を接触させることを含むストレス又はストレス関連疾患、あるいはそれらの症状を治療する方法。
【請求項８３】
前記電界が、前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体にＡＣＴＨ濃度を調節させる請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項８２に記載の方法。
【請求項８９】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項８２に記載の方法。
【請求項９１】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項８２に記載の方法。
【請求項９２】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項８２に記載の方法。
【請求項９３】
前記ストレス関連疾患が、免疫系機能低減、伝染病、高血圧症、粥状動脈硬化症およびインシュリン抵抗性異脂肪血症症候群のから成るグループから選ばれる請求項８２に記載の方法。
【請求項９４】
請求項８２記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項９５】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む当該生物又はその一部の細胞又は組織上に約６０ｍＡ／ｍ２から約２０００ｍＡ／ｍ２の平均誘導電流密度を生成する電流と当該生物又はその一部を接触させることを含む血清カルシウム濃度に関連した疾患を治療する方法。
【請求項９６】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項９５に記載の方法。
【請求項１０１】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項９５に記載の方法。
【請求項１０２】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項９５に記載の方法。
【請求項１０３】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項９５に記載の方法。
【請求項１０４】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項９５に記載の方法。
【請求項１０５】
前記平均誘導電流密度が、約１分から約２０分にわたる連続的な時間の間、細胞あるいは組織上に生成される請求項９５に記載の方法。
【請求項１０６】
前記平均誘導電流密度が、約２分から約１０分にわたる連続的な時間の間、細胞あるいは組織上に生成される請求項９５に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項９５記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項１０８】
少なくとも1つのＧ-タンパク共役型受容体を含む細胞又は組織上に電界を印加することを含む、細胞内イオン濃度を調節する方法。
【請求項１０９】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１４】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１６】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１７】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１８】
前記平均誘導電流密度が、約０．００１ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１９】
前記平均誘導電流密度が、約０．３ｍＡ／ｍ２から約２００ｍＡ／ｍ２である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記平均誘導電流密度が、約０．４ｍＡ／ｍ２から約６０ｍＡ／ｍ２である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記イオンが、カルシウムイオンである請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２２】
請求項１０８記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項１２３】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む細胞又は組織上に電界を印加することを含む、ホルモン濃度を調節する方法。
【請求項１２４】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞が、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞から成るグループから選択される請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
前記組織が、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ（Auerbach）神経叢、マイスナー（Meissner）神経叢、コロンおよび膵臓から成るグループから選択される請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２８】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２９】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３０】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３１】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３２】
さらに、前記細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３３】
前記平均誘導電流密度が、約０．００１ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３４】
前記平均誘導電流密度が、約０．３ｍＡ／ｍ２から約２００ｍＡ／ｍ２である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記平均誘導電流密度が、約０．４ｍＡ／ｍ２から約６０ｍＡ／ｍ２である請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ホルモンが、ＡＣＴＨである請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３７】
請求項１２３記載の方法を実行するための装置であって、該装置は電界治療機器であり、
(a)  主電極および対向電極と、
(b)  前記電極対に電圧を印加するための電圧発生器と、
(c)  前記電圧を変化させることによって、あるいは前記対向電極と前記生物あるいはその一部との距離を変化させることによって、前記外部電界を制御する誘導電流発生器と、
(d)  前記電圧発生器を駆動するための電源と
を含む装置。
【請求項１３８】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体を含む細胞であって、当該少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が当該細胞上に印加された電界によって調節されている細胞。
【請求項１３９】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、ファミリー３  Ｇ-タンパク共役型受容体である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４０】
前記少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、カルシウム受容体である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４１】
さらに、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が２５０未満である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４２】
さらに、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が１００未満である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４３】
さらに、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が４０未満である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４４】
さらに、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３８である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４５】
さらに、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が約２０から３０である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４６】
前記平均誘導電流密度が、約０．００１ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４７】
前記平均誘導電流密度が、約０．３ｍＡ／ｍ２から約２００ｍＡ／ｍ２である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４８】
前記平均誘導電流密度が、約０．４ｍＡ／ｍ２から約６０ｍＡ／ｍ２である請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４９】
少なくともひとつのＧ-タンパク共役型受容体が、細胞内カルシウムイオン増加を調節されている請求項１３８に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
様々な電気的治療装置が知られている。通常、その装置の電極は患者に接触され、その場合、その電気的治療装置は印加電流を用いるものであって、電流治療装置と称されることがある。例えば、TENSまたはPENS等がある（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００２】
電極を患者に接触させない場合、その電気的治療装置は外部電界(以下「ＥＦ」という)により患者に電流を誘導するものであって、電界ないしは電位治療装置と称されることがある。ＥＦは、動物または人間のボディーを含む、その内部のすべての導電性ボディー上に表面電荷を生成する。ＥＦが印加されると、正と負の電荷がボディの両側に現われる。その電界が交互に替わると、前記電荷の位置が交互に替わってボディ内で交流になる（非特許文献３）。
【０００３】
１９７２年、日本国厚生省が電気刺激装置(承認番号第１４７００ＢＺＺ００９０４号)を承認した。１９７８年には、ＵＳＦＤＡ（米国食品医薬品局）が、骨疾患を治療するための電気刺激を承認した。しかしながら、その治療の文献は電気刺激に対する種々様々な生体応答を報告している。例えば、外部シヌソイド交番電界(交流ＥＦ)は、とりわけ、細胞形態学、線維芽細胞中のタンパク質合成、必須の膜蛋白の再分配、軟骨細胞中のＤＮＡ合成、細胞内のカルシウムイオン濃度、人間の肝臓癌細胞の微小繊維構造、血液中の電解質レベルを変えることが示されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。幾人かの研究者は、観察された多くの結果はＥＦに直接起因するものではなく、細胞膜受容器複合体およびイオン輸送チャンネルのような主要な細胞組織に対するＥＦの影響の副次的効果である、と考えている。
【０００４】
誘導電流の生物学上の影響は過去25年間に亘って研究されているが、ほとんどの研究は、高圧送電線およびその関連電気装置からの強い電界あるいは磁界に晒された人の安全性に動機づけられたものである。例えば、公益事業会社労働者は、５０〜５００ｋＶ／ｍの電界および５Ｇまでの磁界に日常的に晒されており、また、一般大衆は、通常、１〜１０ｋＶ／ｍの電界および２Ｇまでの磁界に晒されている（非特許文献７）。先行技術は、比較的低い電圧および弱い電界の影響に関する十分な研究を欠くものである。さらに、従来のＥＦ治療装置は高電圧を使用しており、身体の形態学の本質的に異なるエリア中のＥＦ強度の差異を説明するものではない。
【０００５】
要するに、米国特許第5,387,231号でスポラー（Sporer）によって言及されているように、「先行技術は、真に有効な電気療法用電気的パラメータの適切かつ有効なコンビネーションを熟考していない。先行技術の装置は、一般に、高電圧あるいは高電流で作動し、それらいずれも治療されている組織にジアテルミー効果(diathermy effect)があり得る。多くの場合、先行技術は1つあるいは様々な電気的パラメータの別のものに言及しているかもしれないが、他のパラメータの重要性を考慮していない。」（特許文献１）
【０００６】
先行技術は、異種の生体応答を示し、曖昧な測定に依存し、高電圧および高電流の影響に焦点を定めているので、電気的治療用、特に比較的低い電圧および電流を使用する、電気的治療用の特定のパラメータを明らかにする必要がある。
【発明の開示】
【０００７】
発明者等は、特定の疾患を成功裏に治療するＥＦおよび印加電流のパラメータ値を割り出した。そのパラメータには、例えば、周波数(ヘルツ)および電圧(ボルト)、誘導電流密度(ｍＡ/ｍ2)、印加電流密度(ｍＡ/ｍ2)、曝露の個別継続的な時間(分、時間および日数)、曝露全体の時間(曝露の1つの継続的な期間あるいは曝露の複数の継続的な期間の合計のいずれか)がある。ここに使用された「平均」(mean)印加電流密度および「平均」(mean)誘導電流密度とは、例えば人間、動物、植物あるいはその一部又はその細胞の少なくとも1つの組織の細胞膜上に生成された単位面積あたりの平均電流に言及するものである。例えば対象となる生物が人間であり、その一部が人間の手全体である場合、前記平均電流密度は手全体における平均値である。すなわち、前記平均電流密度は、それら面積の総和で割った手の各部分における電流密度の和である。後述する特定の公式および技術は、前記平均印加電流密度および平均誘導電流密度を推定するために用いられる。もし明示的に他の方法で述べられない限り、用語「生物」(organism)は人間および他の生物の両方を意味する。
【０００８】
この発明の1つの実施形態は、印加電流に依存する。好ましくは、前記印加電流密度は、約１０ないし約２，０００ｍＡ/ｍ2の範囲である。
【０００９】
発明の別の実施形態は、細胞膜間のイオンの移動を制御するための特に少量の誘導電流に依存する。生物の細胞中の異常なイオン濃度を引き起こし、あるいはそれによって引き起こされる疾患の治療のために、この誘導電流実施形態は、約０．００１ｍＡ/ｍ2から約１５ｍＡ/ｍ2、好ましくは約０．００１ｍＡ/ｍ2から約１０ｍＡ/ｍ2、より好ましくは約０．０１ｍＡ/ｍ2から約２ｍＡ/ｍ2の平均誘導電流密度を細胞の細胞膜上に生成する外部電界に、生物を晒している。好ましい実施形態では、外部電界(E)は、式Ｅ＝Ｉ/εoωＳによって示される。ここに、Ｓは電界測定センサーの断面、εoは真空中の誘導速度、Iは電流、ωは2πf、fは周波数である。更に、式Ｊ＝Ｉ／Ｂで誘導電流(Ｊ)を測定することが望ましく、ここにＩは測定電流、ＢはＢ＝Ａ2／４πとして表現される円の面積、ＡはＡ＝２πｒとして表現される周囲長、ｒは半径である。本発明の追加の好適実施形態では、前記誘導電流密度は約１０分ないし約２４０分に亘って継続的に細胞膜上に生成される。再印加では、平均誘導電流密度は好ましくは約３０分ないし約９０分の追加継続期間に生成され、好適には約１,５００分未満の全曝露継続時間となる。
【００１０】
本発明の印加電流および誘導電流の実施形態にいずれにおいても、全身あるいはそのほんの一部に適用することができる。その一部には、手足、器官、ある身体の細胞組織、胴体のような身体の部分、身体のシステムあるいはそのサブセクションを含んでも良い。熟練した者であれば、特定の疾患が本発明を全身あるいはその一部に適用することを必要とするかどうかを判断することができる。
【００１１】
本発明では、更に、カルシウム・サプリメント、ビタミンＤサプリメント、レクチン・サプリメントあるいはこれらのサプリメントの組合せを、前記生物に供給するステップを含んでも良い。好ましくは、レクチン・サプリメントとして、コンカナバリン(concanavalin)Ａまたは小麦胚芽凝集素(wheat germ agglutinin)を用いる。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明は、カルシウム、その他のカチオンまたは多価カチオンあるいはCa２+の取り込みに関連する電気的に感受性の高いカルシウム受容体（CaR）に影響する。
【００１３】
ひとつの実施形態では、本発明は、カルシウム受容体、代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)、γ−アミノ酪酸(GABAB)受容体、推定上の味覚受容体(T1R1-3)および推定上のフェロモン受容体(V2Rs)、その他のファミリー３（family 3）GPCRを含むG-タンパク共役型受容体(GPCR)を調節する。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、生物あるいはその一部の細胞中の異常なイオン濃度を引き起こし、あるいは異常なイオン濃度によって引き起こされる疾患は、正常なイオン濃度に細胞を回復させることによって治療され、又は予防される。それは、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約0.001 mA/m2から約600 mA/m2の平均誘導電流密度を生成する外部電界をその生物又はその一部に印加することも含む。
【００１５】
さらに別の実施形態では、増殖性細胞疾患は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約0.1mA/m2から約2mA/m2の平均誘導電流密度を生成する外部電界をその生物又はその一部に印加することによって治療される。さらなる実施形態は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約10mA/m2から約100 mA/m2の平均誘導電流密度を生成する電流と生物又はその一部とを接触させることにより増殖性細胞疾患を治療する。
【００１６】
追加実施形態では、電解質平衡異常は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約0.4mA/m2から約6.0mA/m2の平均誘導電流密度を生成する外部電界をその生物又はその一部に印加することによって治療される。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態では、血清カルシウム濃度に関連した疾患は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約0.3mA/m2から約0.6mA/m2の平均誘導電流密度を生成する外部電界をその生物又はその一部に印加することによって治療される。本発明の追加実施形態は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約60mA/m2から約2,000 mA/m2の平均誘導電流密度を生成する電流と生物又はその一部とを接触させることにより血清カルシウム濃度に関連した疾患を治療する。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、ストレス又はストレス関連疾患、あるいはそれらの症状は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約0.03mA/m2から約12mA/m2の平均誘導電流密度を生成する外部電界をその生物又はその一部に印加することによって治療される。また、本発明の実施形態は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含むその生物又はその一部の細胞又は組織上に約60mA/m2から約600 mA/m2の平均誘導電流密度を生成する電流と生物又はその一部とを接触させることによりストレス又はストレス関連疾患、あるいはそれらの症状を治療する。
【００１９】
さらに別の実施形態では、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含む細胞又は組織上に電界を印加することにより、細胞内イオン濃度は調節される。本発明の追加実施形態は、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含む細胞又は組織上に電界を印加することにより、ホルモンレベルを調節する。
【００２０】
発明のもうひとつの実施形態は少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体を含む細胞で、細胞上に電界を印加することにより、少なくとも1つのG-タンパク共役型受容体が調節される細胞である。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、ＥＦ治療に用られる装置に関する。好ましいＥＦ治療装置は電界治療装置であって、該装置は、主電極および対向電極と、前記電極に電圧を印加するための電圧発生機と、電圧あるいは対向電極と生物又はその一部との間の距離を変えることによって、外部電界を制御する誘導電流発生器と、前記電圧発生器を駆動するための電源とを備えている。好ましくは、前記電圧発生器はブースター・コイルを備えており、該ブースター・コイルの中点あるいは一端でアースされる。
【００２２】
この発明の更に好ましい、１つの主電極とこれに対向する１つの電極を備えたＥＦ治療装置においては、前記対向電極は、人体の頭、肩、腹部、腰部あるいは臀部の近くに配置され、前記対向電極と人間の被験者の胴体領域の表面との間の距離は、約１〜２５ｃｍ、より好ましくは約１〜１５ｃｍである。他の方式においては、前記対向電極は、天井、壁、床、家具あるいは部屋にある他の物体や表面である。
【００２３】
別の他の実施形態は、ＥＦあるいは印加電流治療のための最適のパラメータの決定に関する。ＥＦ治療用の最適パラメータを決定する好ましい方法は次のステップを含んでいる。すなわち、 (i)生物に誘発すべき所望の生体応答を特定するステップと、(ii) 生物における、あるいは生物に由来した細胞組織サンプルあるいは培養組織における細胞の細胞膜上の平均誘導電流密度を選択あるいは測定するステップと、(iii) 生物、サンプルあるいは培養組織からの特定の距離で、前記選択されあるいは測定された誘導電流密度を生成する外部電界を選択あるいは測定するステップと、(iv) 細胞膜上の前記選択されあるいは測定された誘導電流密度を生成するために継続的な期間を選択あるいは測定するステップと、(v) 生物、サンプルあるいは培養組織に前記選択されあるいは測定された電界を適用し、前記選択されあるいは測定された継続的な期間、細胞膜上に前記選択されあるいは測定された誘導電流密度を生成させるステップと、(vi)所望の生体応答が生じる範囲を決定するステップと、(vii)ステップ(ii)〜(vi)のいずれかを選択的に繰り返すステップと、かつ／または(viii)前記選択されあるいは測定された誘導電流密度の値、前記選択されあるいは測定された外部電界の値、あるいは所望の生体応答を最適に誘発する、前記選択されあるいは測定された継続的な期間の値を明らかにするステップとを含む。この実施形態に関して、用語「測定」(measuring)は、実験者がパラメータ値を、意識的、故意あるいは最初に前もって選択しない場合を包含する。例えば用語「測定」は、EF装置がランダムあるいは最初に未知の量の平均誘導電流密度を生成し、その後、研究者が、その量は何か直接あるいは間接的に決める場合を包含する。
【００２４】
本発明の任意の実施形態の単一のパラメータあるいは構成要素への言及、又はここに議論される項目あるいは生体材料は、すべて、等しく多くのそのようなパラメータ、構成要素、項目あるいは生体材料に適用される。
【００２５】
本発明は、後述する図面および詳細な説明によって更に図示される。
【特許文献１】米国特許第5,387,231号
【非特許文献１】アネスセシア．アナルゲシア（Anesth. Analg.）, 88:841-46 (1999)、ゴナメ、イ．エイ．（Ghoname, E.A.）,他著
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バーン・ケア＆リハビリテイション（J Burn Care Rehabil.）, 14:319-335 (1993)、リー、アール．シー．（Lee, R.C.）他著
【非特許文献３】新潟メディカル（Niigata Med.）, 75:265-73 (1961)、原  エイチ．（Hara, H.）他著
【非特許文献４】バイオエレクトロマグネティクス, 19:366-376 (1998)、 キム、ワイ．ブイ．（Kim, Y.V.）他著、
【非特許文献５】フェイセブ  ジェイ（FASEB J.）, 13:677-682 (1999) 、チョー、エム．アール．（Cho, M.R.）他著
【非特許文献６】新潟メディカル, 75:265-73 (1961))、原  エイチ（Hara, H）他著
【非特許文献７】送電線周波数電界および磁界への曝露からの健康効果の評価, NIEHS Publ. No. 98-3981 (国立環境健康科学研究所,1998)、Portier, C.J. およびWolfe,M.S. (eds.)著
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
Ａ．イオン濃度調節の方法
【００２７】
イオンの非均衡は疾患あるいは体調に起因することもあり、あるいは内科療法やサプリメントの副作用であることもある。本発明は、また膜貫通のタンパク質のような細胞膜の構成成分に影響を及ぼすものである。本発明は、細胞のイオンのホメオスタシスを回復させあるいは平衡に保ち、あるいは細胞膜の膜電位を変更することができる。而して、本発明は、カルシウム(Ｃａ２＋)、マグネシウム(Ｍｇ２＋)、ナトリウム(Ｎａ＋)、カリウム(Ｋ＋)および塩素(Ｃｌ−)の濃度のような細胞及び細胞外イオン濃度に関連した疾患の予防あるいは処置のために有用である。
【００２８】
血清カルシウム濃度に関連した疾患の治療には、細胞膜上に生成された平均誘導電流密度は、好ましくは約０．３ｍＡ/ｍ２から約０．６ｍＡ/ｍ２であり、より好ましくは、約０．４ｍＡ/ｍ２〜約０．５ｍＡ/ｍ２、最も好ましくは、約０．４２ｍＡ/ｍ２である。血清カルシウム濃度に関連した疾患を治療するために印加電流を使用する場合、平均印加電流密度は、好ましくは約６０ｍＡ/ｍ２から約２,０００ｍＡ/ｍ２である。この平均印加電流密度は、約１分から約２０分、より好適には約２分から約１０分に亘る連続的な時間、細胞膜上に生成される。
【００２９】
本発明の方法を適用し得る細胞組織には、例えば、筋骨格組織、中枢および末梢神経系組織、胃腸管系組織、生殖系組織(雄性と雌性の両方)、肺系組織、心血管系組織、内分泌系組織、免疫系組織、リンパ系組織、また泌尿生殖系組織が含まれる。
【００３０】
形質膜（原形質膜）のような真核細胞の生体膜は、これらのイオンに選択的に透過性である。選択透過性は、細胞膜を横切る膜電位の確立を可能にする。細胞は、細胞膜を横切る分子の輸送の為に膜電位を利用する。膜電位の生成に関連するイオンの多くは、生体機能を奏する。例えば、筋細胞においてカルシウム・イオンの閾値濃度は収縮を開始させる。膵臓のシステムの外分泌腺の細胞では、カルシウム・イオンの閾値濃度は、消化酵素の分泌を引き起こす。同様に、ナトリウム・イオンとカリウム・イオンの様々な濃度は、神経軸索を通過する電気インパルスの導電にとって必要である。
【００３１】
電位作動性イオンチャネルと呼ばれるタンパク質の広いファミリーは、イオン濃度と膜電位を維持する。電位作動性イオンチャネルは、チャンネルの整合状態に応じてイオンが生体膜を横切って通過することを許容するイオン選択性の細孔を含む膜貫通型のタンパク質である。チャネルの高次構造的な状態は膜電位に反応する帯電したアミノ酸を含む電位感受性の部位によって影響を受ける。チャネルは伝導している（開いている／活性化されている）か伝導していない（閉じられている／非活性されている）かのどちらかである。
【００３２】
特定のイオン(即ちＣａ2+)と心血管の健康との関連に起因して、本発明は、心臓血管疾患の予防又は治療に有用である。これらには例えば、心筋症、拡張鬱血性心筋症、肥大型心筋症、狭心症、異型狭心症、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、腹部大動脈瘤、末梢動脈障害、低血圧と高血圧のような血圧障害、起立性低血圧、慢性心膜炎、不整脈、心房細動および粗動、心臓病、左室肥大、右室肥大、頻脈、心房の頻脈、心室の頻脈および高血圧症が含まれる。
【００３３】
さらに、本発明は、血液疾患の予防あるいは処置のためにも有用である。これらには、低ナトリウム血症と高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、低リン酸塩血症、高リン酸塩血症、血中マグネシウム減少症、高マグネシウム血症、糖尿病のような血糖調節障害、成人発症性糖尿病、若年発症糖尿病が含まれるが、これらに制限されるものではない。
【００３４】
本発明の1つの実施形態では、細胞膜を横切るＣａ２＋フラックスを増大するために、レクチンがＥＦと共同で適用される。本発明に有用なレクチンは、例えば、コンカナバリンA(ConA)および小麦胚芽凝集素を含んでいる。別の実施形態では、本発明によって生成されたイオン・フラックスは、カルシウムサプリメントと共に生成される。別の実施形態では、本発明によって生成されたイオン・フラックスは、ビタミンＤサプリメントと共に、あるいはカルシウムサプリメントおよびビタミンＤサプリメントの両方で生成される。本発明のビタミンＤサプリメントには、例えば、ビタミンＤ２(エルゴカルシフェロール)およびビタミンＤ３(コレカルシフェロール)が含まれる。同様に、本発明の方法は、生体試料あるいは患者の表面へ投与される補助光源と共に実施することができる。光源は、約２２５ナノメーターから約７００ナノメーターまでの範囲における波長を放射するものであっても良い。本発明の1つの実施形態においては、本発明の方法で共同適用された光源は、約２３０ナノメーターから約３１３ナノメーターまでの範囲における波長を放射する。
【００３５】
本発明の追加の実施形態では、別の分子は、本発明によって生成されたイオン・フラックスと同時に細胞膜を横切って移りうる。そのイオン・フラックスと同時に移動する追加の分子は、身体で自然に生産されるかもしれず、あるいはサプリメンテイション（例えばビタミンなどを介して)経由で提供されるかもしれない。細胞のグルコースの取り込みは、例えば、細胞膜を横切るカルシウムイオン・フラックスによって増強されうる。本発明によって生成されたイオン・フラックスと同時に細胞膜を横切って運ばれるうる追加分子は、栄養補助食品（例えば病気および／またはコンディションの予防あるいは治療を援助するために設計され投薬された栄養剤）を含んでいる。さらに、本発明の方法は、高カロリー療法治療（例えば、昏睡、重いやけどや胃腸障害のような障害治療に通常要求される以上の栄養管理)と共に用いてもよい。
【００３６】
実施例１
６０Ｈｚの電界が、レクチンによって刺激されたマウス脾細胞における細胞質ゾル・カルシウム(Ｃａ２＋)レベルをアップレギュレートとする。
【００３７】
この実験に利用されたＥＦ曝露システムは、４つの部分からなる。すなわち、ポリカーボネートからなるＥＦフィールド曝露ディシュと、ファンクション・ジェネレータ(ＳＧ-４１０１、岩通株式会社製、東京、日本)と、デジタル・マルチメーター(ＶＯＡＣ-７４１１岩通株式会社製、東京、日本)と、コントローラー(白寿株式会社製、東京、日本)とで構成されている。図１はＥＦ曝露システムでフィールド曝露ディッシュを示す。フィールド曝露ディッシュは、蓋、ディッシュおよびドーナツ形のインサート（内部直径: １２ｍｍ）からなる。ＥＦは発振器によって、２つの円形白金電極（細胞培養スペース）間で生成され、コントローラーとデジタル・マルチメーターを使って微調整される。６０ＨｚのＥＦの強さは、フィールド曝露ディッシュの細胞培養スペース内で電流密度を測定することにより決定された。
【００３８】
電流密度の計算式は以下のとおりである。電流密度 =Ｉ／Ｓ、ただし、Ｉは、供給された電流(μＡ)、Ｓは細胞培養スペースの面積(０．３６πｃｍ２)である。したがって、電流密度は、電流密度＝０．８８５Ｉ[μＡ/ｃｍ２]で計算できる。
【００３９】
ＥＦ曝露に先立って、約１．５ｍｌのアッセイバッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）を、電極室へ注いだ。細胞と下部電極との接触を回避するために、ポリカーボネート細胞膜（Ｉｓｏｐｏｒｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、マサチューセッツ州  アメリカ）をディッシュとインサートの間に配置した。約１ｍｌの細胞懸濁液を、培養ウエル／スペースに注ぎ、蓋で覆った。
【００４０】
細胞準備
【００４１】
クリーン空気濾過装置を装備した従来の飼育室で飼育されたクレア社(東京、日本)から入手した４〜７ 週の雌のＢＡＬＢ/ｃマウスが麻酔下で脾摘出され、脾細胞の細胞懸濁液を準備した。そして細胞生存率を検査するために、該細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＳＢ）が追加されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修正イーグルの培地（ＳＩＧＭＡ社、ミズーリ州米国）において培養した。該細胞を、細胞準備後４時間以内に実行された[Ｃａ２＋]ｃの検査の間、ハンクス液(ＨＢＳＳ)(ＳＩＧＭＡ社、ミズーリ州米国)中に維持した。細胞は使用に先立って４℃で保管した
【００４２】
ＥＦ曝露細胞の生存率の定量
【００４３】
マウス脾細胞（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、５％ＣＯ２中にて３７°Ｃで、３０分および２４時間、６０Hzの６μＡ／ｃｍ２あるいは６０μＡ／ｃｍ２  ＥＦのいずれかで曝露した。疑似物（対照）細胞を、フィールド曝露ディッシュ上で、ＥＦ曝露することなく、３０分および２４時間放置した。３０分および２４時間の曝露の終わりに電界曝露ディッシュから回収された細胞懸濁液を、４℃で、３０分間、２．５μｇ／ｍｌのプロピディウム（propidium）ヨウ化物で色付けした。また、死細胞率を流動細胞計測法で分析した。
【００４４】
[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞および使用したレクチンの検定のための細胞準備
【００４５】
脾細胞（１０６個の細胞／ｍｌ）を、２．５μM のフルオ-３-アセトキシルメチル(fluo-3-acetoxylmethyl）を含むＨＢＳＳにおいて３７℃で２０分間培養した（モレキュラー  プローブス（Molecular Probes）, 米国） [バンデンベルゲ  他（Vandenberghe et al.）, 1990]。その後、細胞浮遊液を、１％ＦＢＳを含有するＨＢＳＳで５倍に希釈し、３７℃で４０分間培養し、アッセイバッファーで３回洗浄した。そして、その後、細胞を、１ｘ１０６／ｍｌの濃縮でアッセイバッファー中に保持した。細胞準備の全体を通じて、細胞浮遊液を静かに撹拌した。
【００４６】
ＥＭＦとマイトジェン（mitogen)(ウオレチェク（Walleczek）およびリバーディ（Liburdy）、1990年)の間の報告された相乗相互作用を考慮して、コンナバリンＡ(Con-A)(生化学社、東京、日本)およびフィトヘムアグルチニン(ＰＨＡ)(ＳＩＧＭＡ社、ミズーリ州米国)を使用した。
【００４７】
[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞の生成に対する６０Ｈｚ(６μＡ/ｃｍ２)のＥＦの効果を決定する実験計画法
【００４８】
以前に分析した曝露されたネズミ科の脾細胞の生死判別試験の結果を考慮して、我々は、次の５つの実験を実行する際に最適の培養および曝露条件（６０Ｈｚ、６μＡ/ｃｍ２ＥＦ)を使用することにした：
【００４９】
（１）ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＢＳ）+１ｍＭ ＣａＣｌ２においてサスペンドされた細胞を合計４０分ＥＦに曝露した。また、１２．５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡを曝露の最初の８分後に加えた。対照群は、コンカナバリンＡを含むＥＦ非曝露細胞およびコンカナバリンＡを含まないＥＦ曝露細胞とした。パーセント[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞を、ある曝露ポイントでチェックした。
【００５０】
（２）ＨＥＰＥＳ-ＢＳ  ＋  １ｍＭ
ＣａＣｌ２の中の細胞を、合計１２分間曝露した。また、異なる濃縮(１ngないし１２．５μg/ml）のコンカナバリンＡを、曝露の最初の４分後に加えた。対照群は、本質的に実験群の同じであるが、ＥＦ曝露しなかった。
【００５１】
（３）ＨＥＰＥＳ-ＢＳ＋1 ｍＭ ＣａＣｌ２中の細胞を合計８分間曝露し、また５μg/mlのＰＨＡを曝露の最初の４分後に加えた。対照群は、ＰＨＡを含むＥＦ非曝露細胞およびＰＨＡのないＥＦ曝露細胞とした。
【００５２】
（４）ＣａＣｌ２のないＨＥＰＥＳ-ＢＳにサスペンドされた細胞を、合計１２分間曝露し、また、濃度の異なるコンカナバリンＡ（１ｎｇないし５μg/ml）を、曝露の最初の４分後に加えた。対照群は本質的に実験群と同じであるが、ＥＦ曝露なしとした。
【００５３】
（５）ＥＦ曝露の持続効果を評価するために、ＨＥＰＥＳ-ＢＳ  ＋  １ｍｌのＣａＣｌ２にサスペンドされた細胞を、合計４分間曝露し、その後、濃度の異なるコンカナバリンＡ（０．０２５から１２．５μｇ/ｍｌ）を加えた。また、ＥＦ曝露しないで次の８分間 [Ｃａ２＋]ｃ-ｈｉｇｈ細胞の生成を、流動細胞計測法でモニターした。その対照は、本質的に実験群と同じであるが、ＥＦ曝露なしとした。
【００５４】
統計分析
【００５５】
細胞生存率における統計分析はスチューデントｔ検定を用いて決定した。グループ中の[Ｃａ２＋]cにおけるＥＦ曝露による効果用データは、分散分析(ANalysis Of VAriance between groups)、スチューデントt検定およびペアードt検定によって分析した。統計分析のための計算はすべて、ＭＳ-ＥＸＣＥＬ(登録商標)の日本版(マイクロソフト・オフィス・ソフトウェアVer.9.0.1、日本マイクロソフト社、東京、日本)で行った。
【００５６】
結果
【００５７】
図２は、ＥＦ曝露後の生細胞のパーセンテージを示す。３つの複製全てにおいて、細胞の９８％以上が６μＡ/ｃｍ２あるいは６０μＡ/ｃｍ２に曝露された後、生きていた。
【００５８】
[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞の数は、１２．５μｇ/ｍｌコンカナバリンＡ（図３）を含むＥＦ曝露および非曝露の双方の細胞懸濁液中で著しく増加した。図３では、円は、コンカナバリンＡのないサスペンションを示し、三角形は、ＥＦに曝露されたコンカナバリンＡを備えたサスペンションを示す。また、正方形は、ＥＦに曝露されなかったコンカナバリンAを備えたサスペンションを示す。コンカナバリンＡなしのＥＦ曝露細胞懸濁液におけるそれらは、実質的に変わらなかった。コンカナバリンＡ誘導反応はマイトジェンの追加後直ちに表れ、５〜８分以内に飽和点に達した。ＥＦ曝露および非ＥＦ曝露コンカナバリンＡ誘導細胞の差違は些細であった（Ｐ>０．０５）。
【００５９】
図４Ａおよび４Ｂは、1ｍＭのＣａＣｌ２の存在、非存在で異なる濃度のＣｏｎＡを含むＥＦを曝露された細胞培養物での結果をまとめたものである。図４Ａは、１ｍＭのＣａＣｌ２での培養の結果を示す。図４Ａでは、ＥＦ曝露培養（黒棒）と非ＥＦ曝露培養（白棒）の両方は、１ｍＭのＣａＣｌ２を含み、各種濃度のコンカナバリンＡ（０．０１μｇ/ｍｌから５μｇ/ｍｌ)を含む。ＣａＣｌ２（図４Ａ）がある状態では、ＥＦは有意にコンカナバリンＡ依存[Ｃａ２＋]ｃ（Ｐ＜０．０１:ＡＮＯＶＡ）を増強した。[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈの増加は、０．６７５〜５．０μｇ/ｍｌコンカナバリンＡ刺激グループでより一層実質的であったが、１．２５μｇ/ｍｌおよび２．５μｇ/ｍｌコンカナバリンＡ誘導細胞だけが、有意差を示した（Ｐ＜０．０５:ペアードｔ検定）。図４Ｂでは、ＥＦ曝露培養（黒棒)および非ＥＦ曝露対照培養（白棒）双方ともに、各種濃度のコンカナバリンＡを含むが、ＣａＣｌ２は含まない。コンカナバリンＡ依存の[Ｃａ２＋]ｃ上昇は、対照およびＥＦ曝露グループのいずれにおいてもＣａ２＋遊離細胞条件（図４Ｂ）で無視できるものであった。
【００６０】
ＥＦ依存の[Ｃａ２＋]ｃアップレギュレーションがコンカナバリンＡに限定されたかどうかを決定するために、ＰＨＡ刺激細胞も分析した。ＰＨＡ含有ＥＦ曝露および非ＥＦ曝露細胞のいずれも、[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞の有意な増加を登録した（図５）。しかしながら、ＥＦ曝露細胞の増加は、非曝露グループと比べて有意であった（Ｐ＜０．０５:ペアードt検定）。
【００６１】
３．１２５〜１２．５μｇ/ｍｌのコンカナバリンＡをＥＦ非曝露または４分間の初期ＥＦ曝露の細胞懸濁液へ追加すると、０．０２５μｇ/ｍｌのコンカナバリンＡ（図６）で刺激された細胞と比べて[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞が著しい増加を示した。３．１２５および６．２５μｇ/ｍｌのコンカナバリンＡで刺激された細胞は、[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞の継続的な増加を示しコンカナバリンＡ刺激の８分後に横ばいになった。一方、より高い濃度のコンカナバリンＡ（１２．５μｇ/ｍｌ）で刺激された細胞は、コンカナバリンＡ刺激のおよそ４分後に[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞の下落を示した。ＥＦ曝露の増強効果は、コンカナバリンＡが６．２５μｇ/ｍｌ存在する状態でのみ、２〜４分で著しく明確であった（Ｐ＜０．０５:ペアードt検定）。
【００６２】
実施例２
人間の血管内皮細胞における血管作動性物質に誘発された細胞内カルシウム(Ｃａ２＋)応答に関する低周波電界の効果。
【００６３】
人間の血管内皮細胞（以下、ＨＵＶＥＣ）に関するＥＦ効果を評価するために、細胞内のカルシウム・レベルを、ＡＴＰとヒスタミンで刺激されたＨＵＶＥＣで検査した。ＨＵＶＥＣに関するＥＦ効果を評価するために、ＨＵＶＥＣを、５０Ｈｚ（３０，０００Ｖ／ｍ）のＥＦ、３，０００ボルトに曝露した。ＨＵＶＥＣ上のＥＦ誘導電流密度は０．４２ｍＡ/ｍ２だったと推測される。ＨＵＶＥＣを２４時間これらテスト・パラメータに曝露した。
【００６４】
曝露後、細胞質の自由なＣａ２＋濃度をフルオ３流動細胞計測法によって決定した。フルオ３イメージ強度の変化は共焦点形レーザー顕微鏡で確認した。結果は、ＥＦがＨＵＶＥＣ中のカルシウムの濃度を増加させたことを実証している。
【００６５】
実施例３
ＥＦあるいは疑似対照のいずれかの条件に曝露されたラットの行動選択の評価を行う試験実例におけるラットのＥＦへの曝露
【００６６】
材料と方法
【００６７】
図７は、本研究におけるＥＦ試験のための実験計画を示す。ラットはＥＦ曝露のある条件あるいはない条件に曝される種々のグループに分けられた。ＥＦあり又はなしのトレーニング間隔の後、ラットの行動は、９００秒の観察時間内にケージの白い領域に個々のラットの滞留時間を記録することにより測定された。
【００６８】
結果と考察
【００６９】
結果はまとめられ、図８に示される。ラットが全観察時間内に白い領域の範囲内にとどまった時間には重要な相違があった。
【００７０】
これらのデータは、本研究で使用される条件下でのＥＦの強度をラットが感じることができ、嫌わなかったであろうこと、そしてストレスを減少させる手段としての極低周波EFの曝露を示唆する。さらに、これらは、ＥＦがストレス行動に関連するくらいに、ラットの内分泌系に影響を与え得ることを示唆する。最後に、群れることで引き起こされたストレスが生じる得る間隔中にラットのような動物のストレスを軽減する方法として、この方法は有用であるかもしれない。
【００７１】
実施例４
後肢虚血性ラットにおける５０Ｈｚ電界曝露の乳酸塩、グルコース、遊離脂肪酸、トリグリセリドおよびクレアリン・ホスホキナーゼ活性の血漿濃度への影響
【００７２】
電界曝露システム
【００７３】
曝露システム（図９Ａ及び図９Ｂ）は、３つの主要な部分、すなわち高電圧変圧器 (図９Ｂ、株式会社白寿生科学研究所、東京、日本), 定電圧ユニット(図９Ｂ、東京精電株式会社、東京、日本) そして、ＥＦ曝露ケージ(図９Ａ)で構成されており、以前、記述されている(原川  他、2004b)。つまり、ラット又はさらに小さな動物のために設計されている曝露ケージは、筒状のケージの上下に取り付けられたステンレス鋼(１，２００×１，２００ｍｍ)製の２つの電極と筒状のプラスチックのケージ(直径:４００ｍｍ、高さ:４００ｍｍ)で構成される。ケージ中に１７，５００Ｖ／ｍの強度の５０Ｈｚ正弦波ＥＦを形成するために、安定した交流(７，０００Ｖ)は上部の電極に印加された。実験は室温で(２５±０．４℃)行われた。本研究では、我々は4つの装置セットを用いた。:ＥＦ曝露用の２セット及び疑似ＥＦ曝露用の別の２セットである。２匹以上のラットを同時に収容することにより引き起こされるＥＦ分配の不均衡を回避するために、個々の実験のセッションにおいて各曝露ケージには、ラットを１匹だけ収容した。
【００７４】
実験動物
【００７５】
本研究での動物を用いる実験手続きは、日本で行なわれ、確立したガイド指針および規定に従って行なわれた。
【００７６】
雄、８週齢のスプラーグ-ダウレー系(SD)ラット、体重２７０〜３３０gは日本エスエルシー株式会社(東京、日本)から購入され、通常の空調が取り付けられた動物飼育室で飼育された。虚血は、ペントバルビタール麻酔の下、綿結紮糸を使用した腸骨枝近くの腹大動脈の外科的二重血管結紮によって作成された(土井  他、1997年)。疑似虚血ラットは同様の方法で、しかし結紮することなく準備された。
【００７７】
実験計画
【００７８】
４０匹のＳＤラットは４つの１０匹のグループに分けられた: 虚血のみのグループ(虚血+疑似ＥＦ); 二重処置グループ(虚血+ＥＦ;二重疑似グループ(疑似虚血+疑似ＥＦ); そして、ＥＦのみのグループ(疑似虚血+ＥＦ)。すべてのラットは完全に意識のある状態でＥＦまたは疑似ＥＦに曝露された。虚血又は疑似虚血外科手術の６０分以内に、ラットは１５分間、５０Ｈｚ、１７，５００Ｖ／ｍに曝露又は疑似曝露された。
次に、ネズミは１４日間の間、１日に一度ＥＦに曝露された。
【００７９】
血液分析
【００８０】
血液サンプルは血液の特性および乳酸塩の血漿濃度の測定のために、外科手術の直前とＥＦ曝露開始後４日目および７日目の曝露直後に、尾静脈から集められた。また、最初のEF曝露後１４日目に血液の特性および乳酸塩、グルコース、トリグリセリド（ＴＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）およびクレアチン・ホスホキナーゼ（ＣＰＫ)活性の血中濃度を測定するためにペントバルビタール麻酔の下、腹部大動脈から血液サンプルは採取された。血液特性分析のために、集められた血液サンプルのアリコートはＫ２−ＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ）で処理された。
【００８１】
赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）および血小板（ＰＬＴ）は、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）と同様に数えられ、また、ヘモグロビン・レベル（ＨＧＢ）は、多項目自動血球分析装置Ｆ−８００（シスメックス株式会社、兵庫、日本）を使用して測定された。平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）および平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）は、ＲＢＣ、ＨＣＴおよびＨＧＢ値から計算された。ＥＦ曝露の１４日目に、ナトリウム・ヘパリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）で血液サンプルを処理し、４℃、１，６７０×ｇで遠心分離によって血漿を分離した後、乳酸塩、グルコース、トリグリセリド（ＴＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）およびクレアチン・ホスホキナーゼ（ＣＰＫ）活性の血中濃度が検査された。乳酸塩以外の各物質の濃度は自動分析器（７１７０、日立株式会社、東京、日本）で測定された。乳酸塩の濃度は、データマイナー−ＬＡ  (協和メデックス株式会社、東京、日本)を用いて測定された。
【００８２】
統計分析
【００８３】
グループ間の、および／または実験中期間の相違の統計的有意性は、乳酸塩濃度と血液特性のワンウエイ分散分析あるいはツーウエイ分散分析によって計算された。グループ間の相違の統計的有意性は、血漿グルコース、ＴＧ、ＦＦＡおよびＣＰＫ活性のスチューデントt検定、アスピン・ウェルチｔ検定又はワンウエイ分散分析によって計算された。有意水準はＰ＜０．０５と定義した。統計分析のためのすべての計算はプリズム・バージョン４．０ｂ(グラフパッドソフトウエア社、サンディエゴ、カリフォルニア)で実行された。
【００８４】
血液特性
【００８５】
ＥＦ曝露開始後０日目、４日目、７日目、１４日目の白血球（ＷＢＣ）は図１２に示される。処置及び期間の両方の要因に関して、すべてのグループ間で相違が見られた（Ｐ＜０．０１、ツーウェイ分散分析)。２つの虚血のグループの白血球（ＷＢＣ）総数はＥＦ曝露後７日目まで一時的な増加を示し、１４日目に回復を示す（Ｐ＜０．０１、ワンウェイ分散分析）；ＥＦ曝露後７日目では白血球総数は、二重疑似グループとＥＦのみのグループの総数よりも高かった（Ｐ＜０．０５、スチューデントt検定）。すべてのグループ間において、測定された他のパラメータは著しい有意な変化を示さない（データ示さず）。
【００８６】
グルコースと乳酸塩の濃度
【００８７】
ＥＦ曝露開始後１４日目に血漿グルコース濃度が測定された。すべてのグループの値は１７２．９±３．２（平均値±標準誤差（ＳＥＭ）)から１８１．６±２．８ｍｇ／ｄｌ（Ｐ＝０．７１、ワンウェイ分散分析）の間で変動した；すべてのグループ間で有意な相違はなかった。
【００８８】
血漿乳酸塩濃度は、ＥＦ曝露開始後、０日目、４日目、７目及び１４日目に測定され、表１に示される。両方の虚血グループの血漿乳酸塩濃度は、非虚血グループと比較して日にちに依存した変化を示した（Ｐ＜０．０１、ツーウェイ分散分析）。ＥＦに依存した変化はすべての測定ポイントで示されるとは限らなかった。
【００８９】
クレアチン・ホスホキナーゼ（ＣＰＫ）
【００９０】
血漿ＣＰＫ活性濃度はＥＦ曝露開始後１４日目に測定された。４つのグループのワンウエイ分散分析では、処置に依存した変化を示さなかった（データ示さず）。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
トリグリセリド（ＴＧ）と遊離脂肪酸（ＦＦＡ）
【００９３】
ＴＧとＦＦＡの血漿濃度はＥＦ曝露開始後１４日目に測定され、図１１と図１２に示される。血漿ＴＧ濃度は処置に依存した変化を示した（Ｐ＜０．０５、ワンウェイ分散分析）；二重疑似、ＥＦのみ、虚血のみ、および二重処置のグループは、各々１５９．５±１４．４、１４９．３±１２．９、１３９．１±１８．５および１０１±２０．１ｍｇ／ｄｌである(図１１)。スチューデントt検定の結果は、二重処置グループのＴＧ濃度が二重疑似とＥＦのみのグループより著しく低かったことを示す（Ｐ＜０．０５）。二重疑似とＥＦのみのグループ間および虚血のみと二重処置グループ間には統計的に有意な相違がなかった。二重疑似、ＥＦのみ、虚血のみ、および二重処置のグループの血漿ＦＦＡ濃度(図１２)は、各々０．２１±０．０２、０．２０±０．０２、０．１７±０．０１および０．１２±０．０２ｍＥｑ／ｌであった（Ｐ＜０．０１、ワンウェイ分散分析）。二重処置グループのＦＦＡ濃度は、ＥＦのみ（Ｐ＜０．０１、スチューデントt検定)及び二重疑似（Ｐ＜０．０１、スチューデントt検定)のグループのものと比較し、著しく低くかった。二重処置グループを虚血のみのグループと比較すると、スチューデントt検定によるＰ値は０．０６であった。二重疑似とＥＦのみのグループの間のＦＦＡの濃度の相違は、統計的に有意ではなかった。
【００９４】
考察
【００９５】
すべての処置グループにおいて、血漿グルコース濃度は相違を示さなかった。この結果は、実際に虚血またはＥＦが解糖に小さな影響を及ぼしていたとしても、貯蔵グルコースの減少のような厳しい変化が起こらなかったことを示す。ＥＦ曝露開始後、４日目に一時的に増加し１４日目まで減少が続く、虚血に依存した血漿乳酸塩は二つのことを示唆する：１) 虚血は低酸素状態によって乳酸塩新陳代謝の不均衡を引き起こす；そして２) 虚血はミクロのバイパス(土井  他、１９９７年)経由で徐々に常態にされる。しかしながら、虚血のみのグループのものと比較すると、二重処置グループではＥＦが関連する血漿乳酸塩濃度において明白な変化は示されなかった。しかしながら、二重疑似グループのものと比較すると、ＥＦのみのグループではＥＦが関連する乳酸塩濃度において明白な変化は示されなかった。これらの結果は、本研究で適用されたＥＦが血漿乳酸塩濃度に影響を及ぼさなかったことを示す。様々な期間の０．１および２ガウスの磁界（ＭＦ）刺激が新血管新生の著しい増加を示すと初期の研究は示唆するが(ローランド  他、２０００年)、その研究と我々の発明の間にはいくつかの重要な相違が存在する。
【００９６】
現在の結果は、白血球（ＷＢＣ）総数を除く血液の特性において大きな変化を示さなかった。虚血の外科手術の処置をされた２つのグループの白血球総数は、７日後まで著しく上がって見え、１４日後までにベースラインの値に戻った。これは、外科手術によって引き起こされた炎症性の反応に基づくものかもしれない。ＣＰＫ活性は組織損傷の指標としてよく知られているが(ハース、１９９０)、１４日後におけるＣＰＫ活性はすべてのグループで変化しなかった。ラットの術後の組織損傷が１４日後には残らなかったことは明確である。
【００９７】
１４日後、ＴＧ濃度は、二重処置グループ＜虚血のみのグループ＜ＥＦのみグループ＝二重疑似グループ、を示した。同様の傾向がＦＦＡ濃度でも見られた。多くの生物中でのエネルギー源であるトリグリセリドは、肝臓で合成され、そして様々な組織で供給されたリパーゼによって、脂肪酸かグリセロールに消化される。したがって、２つの仮説が考えられる:１）ＴＧ代謝は、ＥＦによって誘発された脂肪の代謝を含むエネルギー代謝の増加によって増強され;そして／または２）ＴＧ合成経路を抑えるために作用する。ストレスを与えられたラットにおける、ＥＦに引き起こされた乳酸塩合成経路抑制効果についての従来の研究（原川  他  ２００４ｂ）は、エネルギー代謝へのＥＦ効果に関する推察を支持するであろう。さらに、ＥＦが食べることの誘因として用いられる状態でのオペラント条件付けの成功が報告されている（スターン  他、１９８５；スターン  他、１９８３）
【００９８】
結論として、解糖パラメータである血漿乳酸塩又はグルコース濃度に対するＥＦ効果は強いストレス状態では現われず、生物の状態によってＥＦ効果が変わったが、本研究の中で用いられるＥＬＦ  ＥＦは後肢虚血ラットの脂質代謝パラメーターに影響を及ぼすことをこれらの結果は示す。さらに、これらの結果は、ＥＦ暴露が脂肪合成又は脂質分解を含むエネルギー代謝に影響を及ぼすかどうかの調査のために虚血ラットモデルが有用であると示唆する。
【００９９】
実施例５
血漿過酸化脂質濃度と抗酸化活性への５０Ｈｚ電界の影響
【０１００】
材料と方法
【０１０１】
本研究での動物を用いる実験手続きは、日本で行なわれ、確立したガイド指針および規定に従って行なわれた。
【０１０２】
実験動物  
【０１０３】
雄、８週令のスプラーグ-ダウレー系（ＳＤ）ラット（Ｎ＝５５）、体重２５２〜２７４グラムは、日本エスエルシー株式会社(東京、日本)から購入され、通常の空調が取り付けられた動物飼育室の中でグループ飼い(１つのケージあたり５匹のラット)で飼育された。
【０１０４】
電界曝露システム
【０１０５】
曝露システム（図９）は、３つの主要な部分、すなわち高電圧変圧ユニット（株式会社白寿生化学研究所、東京、日本)、定電圧ユニット（図９Ｂ、東京精電株式会社、東京、日本)そして、ＥＦ曝露ケージで構成されており、以前、記述されている（原川  他、２００４ｂ）。つまり、ラット又はさらに小さな動物のために設計されている暴露ケージは、筒状のケージの上下に取り付けられたステンレス鋼（１，２００×１，２００ｍｍ）製の２つの電極と筒状のプラスチックのケージ（直径：４００ｍｍ、高さ：４００ｍｍ)で構成される。ケージ中に１７，５００Ｖ／ｍの強度の５０Ｈｚ正弦波ＥＦを形成するために、安定した交流（７，０００Ｖ）は上部の電極に印加された。実験は室温で（２５±０．４℃)行われた。本研究では、我々は４つの装置セットを用いた。：ＥＦ曝露用の２セット及び疑似ＥＦ曝露用の別の２セットである。２匹以上のラットを同時に収容することにより引き起こされるＥＦ分配の不均衡を回避するために、個々の実験のセッションにおいて各曝露ケージには、ラットを１匹だけ収容した。
【０１０６】
ストレスを受けていないラットへの電界曝露
【０１０７】
ストレスを受けていないラットに対するＥＦの効果を調べるために、ラットは５０Ｈｚ１７，５００Ｖ／ｍ強度の正弦波に、１週間、１日当たり１５分間曝露された。３つのグループ（ｎ＝５）の各ラットは、各々、ＥＦあるいは疑似ＥＦで処置され、もしくは処置されなかった。疑似ＥＦ曝露ラットは、システムを切った曝露ケージの内に等期間の間、飼育された。ペントバルビタール（４５ｍｇ／kｇ、腹腔内投与）麻酔の下、ＥＦ曝露後、実験日７日目に、血液は腹部腔静脈から集められ、４℃で１０分間  １，６７０×ｇの遠心分離によって血漿が分離された。試験まで、血漿サンプルは−８０℃で保管された。
【０１０８】
ＡＡＰＨ処置されたラットへの電界曝露
【０１０９】
酸化ストレス中のＥＦ効力の影響を調べるために、ラットは、以下の５つのグループ（ｎ＝８）に分割された：１）未処理；２）実験日７日目、酸化剤ＡＡＰＨ処理；３）ＥＦとＡＡＰＨの共同処理；３）ＡＡＰＨと酸化防止剤アスコルビン酸の共同処理；あるいは５）ＡＡＰＨとスーパーオキシド・ジスムターゼの共同処理。グループ３のラットは５０Ｈｚ１７，５００Ｖ／ｍ強度の正弦波に、１週間、1日当たり１５分間曝露された。さらに、グループ１，２，４そして５は、疑似ＥＦ曝露され、システムの切られた曝露ケージの中に等期間の間、飼育された。ＥＦ開始から７日後、グループ３は、ＡＡＰＨ（１０ｍｇ／kｇ、腹腔内投与)の投与直後にＥＦに曝露された。グループ４では、アスコルビン酸（５００ｍｇ／kｇ、経口投与）はＡＡＰＨ処置の６０分前に投与された。スーパーオキシド・ジスムターゼ（５０ｍｇ／kｇ、皮下注射、ナカライテスク社、東京、日本)は、ＡＡＰＨ処置直前のグループ５に投与された。ペントバルビタール（４５ｍｇ／kｇ、腹腔内投与）麻酔の下、ＡＡＰＨ投与９０分後に、血液は腹部腔静脈から集められ、４℃で１０分間１，６７０×ｇの遠心分離によって血漿が分離された。試験まで、血漿サンプルは−８０℃で保管された。
【０１１０】
抗酸化活性（ＡＯＡ）
【０１１１】
血漿の抗酸化活性（ＡＯＡ）はメチレンブルー誘導体を用いる方法で測定された。簡潔に言えば、０．１ｍｌの血漿又はアスコルビン酸(和光株式会社、大阪、日本) 溶液と０．６５ｍｌの蒸留水を、３，７−ビス-ジメチルアミノ−１０−メチル カルバモイル フェノチアジン（ＭＣＤＰ，４０μＭ，協和メデックス株式会社、東京、日本）とヘモグロビン（６７．５μｇ／ｍｌ）が補われた１％のトリトンＸ−１００を含むｐＨ５．８に調整されたグッド緩衝液（グッド  他、１９６６）１．５ｍｌに加えた。３７℃で１分間の定温放置後に、０．２５ｍｌのｔ-ブチルヒドロペルオキシド（８４μＭ,ＢＨＢ、オルドリッチ)がアルコキシルラジカル重合開始剤として加えられ、１０分間反応させた。さらに、ペルオキシラジカル重合開始剤としてＡＡＰＨ（５０ｍＭ）を用いた反応での抗酸化活性（ＡＯＡ）測定は、３７℃で２０分間ヘモグロビンを除いたグッド緩衝液中で行なわれた。各血漿サンプル中では酸化防止剤に捕捉されなかったラジカル重合剤はＭＣＤＰを酸化するであろう。その後、結果的に生じた青い色の吸光度は、分光光度計（１５０−２０、日立）を使用し、６７５ｎｍでの吸光度で測定された。抗酸化活性（ＡＯＡ）を計算する方程式は以下である：AOA (%)=(1-Abs1/Abs2) ×100、ここでAbs1は血漿サンプルの吸光度であり、Abs2はブランクの値である。
【０１１２】
過酸化脂質
【０１１３】
過酸化脂質の血漿濃度の指標としてチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＲＳ）は、商品キット(過酸化脂質テスト−和光、和光株式会社、大阪、日本、)を使用して測定された。
【０１１４】
統計分析
【０１１５】
結果は、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）で表される。すべてのグループ間の相違の統計的有意性は、ワンウエイ分散分析によって計算された。また、２つのグループ間はスチューデントt検定によって計算された。有意水準はＰ＜０．０５と定義した。統計分析のためのすべての計算はプリズム・バージョン４．０ｂ（グラフパッドソフトウエア社、サンディエゴ、カリフォルニア）で実行された。
【０１１６】
電界曝露の血漿過酸化脂質濃度への影響
【０１１７】
ストレスを受けていないラットの３つのグループ間では、血漿過酸化脂質濃度に有意な相違はなかった（表２）。
【０１１８】
【表２】
2006167476.tif 000004
【０１１９】
表３は、ＥＦ曝露の直前にＡＡＤＨを投与したラットの血漿過酸化脂質濃度を要約している。未処理グループと疑似電界曝露グループ間では有意な相違はなかった。しかしながら、ＥＦ曝露グループの血漿酸化脂質濃度は、それらの２つのグループと比較して、著しい減少を示した（Ｐ＜０．０５）。更に、アスコルビン酸またはスーパーオキシド・ジスムターゼで処理されたラットの血漿過酸化脂質濃度は、疑似ＥＦ曝露グループと比較された場合は低かった。（各々、Ｐ＜０．０５とＰ＜０．０１）
【０１２０】
【表３】
2006167476.tif 000005
【０１２１】
【表４】
2006167476.tif 000006
【０１２２】
電界曝露の血漿の抗酸化活性への影響
【０１２３】
試験管中のＡＡＤＨあるいはＢＨＰに加えられた血漿のＡＯＡは、表４の中で要約されている。７日間ＥＦ曝露されたラットにおいて、ＡＡＤＨに誘発されたペルオキシラジカルに対する血漿の抗酸化活性は、疑似ＥＦ曝露グループと比較された場合、低い傾向があるが、この違いは有意ではない（Ｐ＜０．０５）。同様に、ＢＨＰに誘発されたアルコキシルラジカルに対する抗酸化活性は、３つのグループ間では違いを示さなかった。しかしながら、未処理グループの血漿へのアスコルビン酸の添加は、著しく両方の酸化剤に対するＡＯＡを上げた（Ｐ＜０．０１）。
【０１２４】
ＡＡＤＨとＥＦでとも共同処置したラットの血漿中のＢＨＰあるいはＡＡＤＨに対するＡＯＡは、表５に一覧されている。本研究では、ＡＡＤＨは血漿中にフリーラジカルを生成するために用いられた。疑似ＥＦグループ（Ｐ＜０．０１）、ＥＦ曝露グループ（Ｐ＜０．０１）およびスーパーオキシド・ジスムターゼ処置グループ（Ｐ＜０．０５）の血漿ＡＯＡは、未処置グループのものと比較して、著しく抑えられた。逆に、アスコルビン酸を投与されたラットの血漿ＡＯＡは、他の4つのグループのそれらより著しく高かった（Ｐ＜０．０１）。ＥＦ曝露された又はスーパーオキシド・ジスムターゼで処置されたグループの血漿ＡＯＡは、疑似ＥＦ曝露グループのそれとは相違なかった。一方、他の４つのグループのものと比較された場合、アスコルビン酸の投与はBHPに対するＡＯＡ増加の結果となった。（Ｐ＜０．０１）
【０１２５】
【表５】
2006167476.tif 000007
【０１２６】
考察
【０１２７】
人間へのＥＭＦ曝露の安全性に焦点を置いた研究は、生物へのＥＦ曝露のメカニズムの中で、活性酸素種によって引き起こされるような酸化的ストレスの関与を報告している(フィオラニ  他、１９９７年; カトシール  他、１９９８年; モウスタファ  他、２００１年; ライテル  他、１９９８年; シムコ  他、２００１年; ヴァルテンベルグ  他、１９９７年)。しかしながら、この因果関係は論争の的になっており、そしてＭＦなしで構成された純粋なＥＦ曝露が与えうる影響についての議論の大部分は無視された。ＥＬＦ  ＥＦ単独の曝露が酸化的ストレスに対する生物学的反応に影響を及ぼすかどうかは知られていない。本研究は、ストレスを受けていないラットと酸化的ストレスを受けたラットにおいて、ＥＬＦ  ＥＦ曝露が血漿ＡＯＡおよび過酸化脂質濃度を改善するか否かに特に注目した。
【０１２８】
細胞の又は血漿活性酸素種濃度の増加は、ＥＬＦ  ＥＦ曝露によって引き起こされた結果の1つとして以前に報告されている（フィオラニ  他、１９９７年; カトシール  他、１９９８年; シムコ  他、２００１年; ヴァルテンベルグ  他、１９９７年)。脂質過酸化生成物は、生物学的システムでの酸化的ストレスのバイオマーカーとして用いることが認められている(ラヴァル、１９９６年)。もし細胞の又は血漿活性酸素種濃度がＥＬＦ  ＥＦ曝露に影響を受ければ、過酸化脂質の血漿濃度は同様に変化するであろう。５０ＨｚのＥＦに曝露されたストレスを受けていないラットでは、すべての実験のグループ間で有意な相違を示されなかった血漿過酸化脂質濃度は、違っていた。しかしながら、ＡＡＰＨで処置されたラットにおいて、ＥＦ曝露された、あるいはアスコルビン酸又はスーパーオキシド・ジスムターゼいずれかの酸化防止剤で処置された全てのグループの血漿過酸化脂質濃度は、擬似ＥＦ曝露グループのものと比較して、著しく抑えられた。この発見は、酸化した物質あるいは酸化物質を調節する未知の経路を含み得る過酸化脂質代謝でのＥＬＦ  ＥＦ曝露の関与を示す。初期の報告書によって提供されるデータ(木村  他、１９８８年)は、ＥＬＦ  ＥＦ曝露が過酸化脂質の血漿濃度を抑えるであろうとの示唆について矛盾がなかった。この減少の理由は未知である。
【０１２９】
ストレスのないラットでは、血漿ＡＯＡはＥＦ曝露によって増強も阻害もされなかった。また、ＨＰＬＣによって分離された高分子の又は低分子の画分でＡＯＡは研究された(データ示さず)。低分子画分は、アスコルビン酸またはビタミンＥのようなラジカル・スカベンジャーを含むであろう。他方、高分子分画はラジカル除去機能を有するハプトグロビンかトランスフェリンのいずれか、あるいはスーパーオキシド・ジスムターゼ又はカタラーゼのような酵素の抗酸化剤を含んでいる(デビー  他、１９９０年; フリドビッヒ、１９７８年)。どちらの画分も、５０ＨｚのＥＦ曝露と関連するどんな変化も示さなかった。これらの結果は、この研究の中で用いられた５０ＨｚのＥＦ曝露がストレスのないラットの血漿ＡＯＡに大きな影響を及ぼさないことを示す。酸化剤ＡＡＰＨを投与されたストレスを受けたラットは、酸化的ストレスを受けた生物の血漿ＡＯＡ変化におけるＥＬＦ  ＥＦ曝露の効果を調べるために用いられた。ＡＡＰＨで処置されたネズミの血漿は、ＢＨＰに対してはＡＯＡの変化を示さなかったが、ＡＡＰＨに対するＡＯＡの抑制を示した。（１０ｍｇ／kｇの）ＡＡＰＨを投与されたラットでは、５０ＨｚのＥＦ曝露がＡＡＰＨとＢＨＰに対する血漿ＡＯＡに影響しなかったことから、ＥＬＦ範囲にある「純粋な」(即ち帯磁していない)ＥＦである本研究のＥＦ曝露は、ペルオキシ酸化的ストレスに苦しむラットの血漿ＡＯＡの変化には大きく影響を与えないことが示唆される。
【０１３０】
結論として、データは一時的に本研究で使用されるＥＦが過酸化脂質代謝にいくらかの影響があることを示唆するのに十分ある。現在まで、なぜ血漿ＡＯＡが変化しない場合であっても血漿過酸化脂質濃度が減少するかは知られていなかった。
【０１３１】
Ｂ．Ｇタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）の調節方法
【０１３２】
本発明は、さらにＧＰＣＲのような膜内外のタンパク質の調節により疾患を治療し予防する。ＧＰＣＲの９０％はロドプシン様の受容体(ファミリー１)として分類されているが、別の類であるＧＰＣＲ(ファミリー３)は過去数年内に同定された。ファミリー３  ＧＰＣＲは細胞外の陽イオンを感知するＣａ２+受容体（ＣａＲ）、代謝調節型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体、推定上の味覚受容体（Ｔ１Ｒ１−３）および推定上のフェロモン受容体（Ｖ２Ｒｓ）を含んでいる。ファミリー３  ＧＰＣＲのさらなるの詳細は、カウシク・アール、Int. Arch. Biosci., 1027-1035 (2001)で議論され、それは全体としてそっくりそのまま参考文献に取り込まれている。
【０１３３】
例えば、カルシウム受容体は、細胞内のイオンおよびホルモンの濃度に影響すると判明した。カルシウム受容体は信号経路を経由して細胞内のＣａ２+濃度を調節する。(ウォード.D.T、セル・カルシウム、35:217-228(2004) 参照 )。さらに、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）濃度もカルシウム受容体によって変化させられることが示された。(フレイハン・G  他、J. of Clin. Endo. Metab. 81:932-936 (1996)参照)。
【０１３４】
本発明はひとつ以上のＧＰＣＲを調節し、その結果、物質の異常な濃度を引き起こす、または物質の異常な濃度に引き起こされる疾病の治療と予防はＧＰＣＲにより調整される。本発明の１つの実施形態は、ファミリー３  ＧＰＣＲを調節することによりそのような疾病を治療し予防する。本発明の別の実施形態は、ＡＣＴＨ濃度を調整するために１つ以上のカルシウム受容体を調節することで、疾病を治療し予防する。さらに、本発明の別の実施形態は、細胞内のＣａ２+濃度を上げるために1つ以上のカルシウム受容体を調節することで、疾病を治療し予防する。
【０１３５】
ＧＰＣＲの調節のために、ＧＰＣＲを含む細胞又は組織上の平均誘導電流密度は、約０．００１ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２、又は約０．３ｍＡ／ｍ２から約２００ｍＡ／ｍ２、又は約０．３ｍＡ／ｍ２から約１８０ｍＡ／ｍ２、又は約０．４ｍＡ／ｍ２から６０ｍＡ／ｍ２、又は約６ｍＡ／ｍ２から約６０ｍＡ／ｍ２、又は約４００ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２、又は約４２０ｍＡ／ｍ２から約６００ｍＡ／ｍ２である。平均誘導電流密度は、約１分から約４０分あるいは約１０分から約３０分の連続的な時間の間、細胞あるいは組織(それは少なくとも1つのＧＰＣＲを含む)上に生成される。印加電流を用いてＧＰＣＲに調節される物質に関連した疾病を治療するために、平均誘導電流密度は、約６０ｍＡ／ｍ２から約２，０００ｍＡ／ｍ２であり、また、平均誘導電流密度は約１分から約２０分+の、又は約２分から約１０分の連続的な時間の間、ＧＰＣＲを含む細胞あるいは組織上に生成される。
【０１３６】
本発明の別の実施形態において、さらにＧＰＣＲを含む細胞又は組織は、細胞外ナトリウムの細胞外カルシウムに対するモル比が、２５０未満、１００未満、あるいは約２０から約３８、又は３５．７のように４０未満である。
【０１３７】
本発明の方法が使用されてもよい細胞は、例えば、上皮小体細胞、Ｃ細胞、イオン輸送のためのマルティプル尿細管細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、腸上皮細胞、細胞栄養層細胞、脳弓下器官ニューロン、脳弓下器官グリア細胞、嗅球ニューロン、嗅球膠細胞、海馬ニューロン、海馬膠細胞、線条体ニューロン、線条体膠細胞、帯状皮質ニューロン、帯状皮質膠細胞、小脳ニューロン、小脳の膠細胞、脳室の上衣ゾーンからのニューロン、脳室の上衣ゾーンからの膠細胞、大脳動脈を囲む血管周囲神経からのニューロン、大脳動脈を囲む血管周囲神経からの膠細胞、レンズ上皮細胞、脳下垂体および視床下部の細胞、血小板、マクロファージ、単球、血小板の前駆細胞、骨髄中のマクロファージおよび単球、胸部導管細胞、ケラチン生成細胞、及びインシュリンを作り出す膵臓のベータ細胞が含まれる(ブラウン E.M.  他  Physiol.Rev.81, 239-297 (2001)参照)。
【０１３８】
本発明の方法が使用されてもよい組織としては、例えば、上皮小体、腎臓、骨、軟骨、腸、胎盤、脳、レンズ、脳下垂体、胸部、皮膚、食道、胃、オーバッハ神経叢、マイスナー神経叢、コロンおよび膵臓が含まれる。
【０１３９】
心血管の健康状態と特定のイオン(即ちＣａ２+)との関連性の故に、本発明は、心臓血管疾患の予防又は治療に有用である。これらには例えば、心筋症、拡張鬱血性心筋症、肥大型心筋症、狭心症、異型狭心症、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、腹部大動脈瘤、末梢動脈障害、低血圧と高血圧のような血圧障害、起立性低血圧、慢性心膜炎、不整脈、心房細動および粗動、心臓病、左室肥大、右室肥大、頻脈、心房の頻脈、心室の頻脈および高血圧症が含まれる。
【０１４０】
さらに、本発明は血液の疾患の予防又は治療に有用である。これらは糖尿病、成人発症の糖尿病および小児糖尿病のような血糖調節疾患に加え、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、低リン血症、高リン血症、血中マグネシウム減少症、そして高マグネシウム血症を含むが、これに限定されない。
【０１４１】
本発明は、上に挙げられた疾患の治療又は予防には制限されない。前述のように、本発明は、ＧＰＣＲ、特にファミリー３  ＧＰＣＲによって調節される物質の、異常濃度によって引き起こされる疾患、もしくはその異常濃度を引き起こす疾患を広く治療又は予防する。
【０１４２】
実施例６
カルシウム受容体蛋白（ＣａＲ）は多数の魚類の電気感受細胞中に大量に存在する。
【０１４３】
材料と方法
【０１４４】
本実施例に用いられたすべての方法と装置は以前に公表されている。（Nearing, J., et al.,Proc.Nat. Acad. Sci. 99:9231-9236 (2002); Hentschel, H., et al., Am J Physiol
(Renal) 285(3):F430-439 (2003); U.S. Pat. No. 6,481,379 B1;U.S. Pat. No. 6,475,792 B1; U.S. Pat. No. 6,463,883 B 1  参照)。アトランティックサーモン、ツノザメおよび弱い電界を感じることができる３種の電気魚を含む４種の魚類で試験された。(Von Der Emde, G., J. Exp.Biol. 202:1205-1215 (1999); Maclver, M. A., et. al., J. Exp. Biol. 204:543-547
(2001)  参照)。アトランティックサーモン(Salmo salar)およびレインボートラウト(Oncorhynchus mykiss)は淡水タンク中に適切な温度設定と光周期コントロール下で飼育した。成アブラツノザメ(Squalus acanthias)はメイン湾から採集した。サメは、嗅覚管を通して二重脊髄穿刺によって屠殺し、ロレンツィーニ瓶嚢と呼ばれる頭部の電気感受器官を含む皮膚や基本組織を切除し、エタノールとホルマリンとボーインズ液の混合液を酢酸と一緒に用いて2時間固定した。固定した組織は９０％エタノールに移し、次の操作まで４℃で保存した。
【０１４５】
アイゲンマニア、トランスルーセントグラスキャット、ブラックゴーストの3種の電気感受魚は地方のペットショップを介して注文した。魚類は断頭によって屠殺し、電気感受組織を含む部位を切除し、上述のようにサメ組織と同一方法で固定した。
【０１４６】
魚組織内のカルシウム受容体タンパクの免疫学的局在決定を実施するために３種のウサギポリクローナル抗体を使用した。最初にツノザメの腎臓のカルシウム受容体の細胞内カルボキシル末端領域の１７アミノ酸を含むペプチドに対するＳＫＣａＲと名づけられた抗血清を作製した。このＳＫＣａＲ抗血清は広く特徴づけられ、ツノザメのカルシウム受容体を特異的に認識することが示された。２番目に、アトランティックサーモンの腎臓のカルシウム受容体の細胞外領域に存在する１７アミノ酸に対するＳＤＤと名づけた抗血清を作製した。３番目に、アトランティックサーモン(Salmo salar)の腎臓のカルシウム受容体の細胞内カルボキシル末端領域に存在する１５アミノ酸に対するＳＡＬ１と名づけた抗血清を作製した。それぞれの抗血清のための特異的なアミノ酸配列を含むペプチドをタンパクに結合させた。固定組織のパラフィン切片を用いた免疫細胞化学解析もまた前述されたように実施した。代表的な切片は対比染色をした後、オリンパス社ＢＨ２顕微鏡を用いて撮影した。
【０１４７】
結果と考察
【０１４８】
免疫細胞化学解析によりアブラザメ、アイゲンマニア、ブラックゴーストの電気感受性細胞は大量のカルシウム受容体を有することを明らかとなった。図１３はアイゲンマニアとアブラツノザメの電気感受性組織の免疫細胞化学解析を示している。図１３のパネルＡは抗カルシウム受容体抗血清ＳＤＤによるアイゲンマニアの電気感受性組織（小矢印で表示）と鼻板の神経上皮細胞（星印で表示）の両方の陽性免疫染色を示す。サーモンを含む魚の鼻板中の神経上皮細胞は大量のカルシウム受容体タンパクを有していることは以前に証明されている。(Von Der Emde, G.;
Nearing, J. et al.  参照)。パネルＢでは高倍率での同じ組織切片を示しており、アイゲンマニアの皮膚の電気感受性組織中の電気感受性細胞の特異的染色を表している。切片中の、特異的カルシウム受容体抗血清による暗反応生成物によって示されるように、大量のカルシウム受容体が局在している。２番目の抗血清であるＳＡＬ−１は隣接切片中の同じ電気感受性細胞と同様の強さに染色されることを示す（図１３、パネルＣとＤ）。ツノザメはロレンツィーニ瓶嚢と呼ばれる頭の構造部で弱い電界を感じる(Von der Emde, G., The Physiology of Fishes Second Edition Edited by
DH Evands, CRC Press, Boca Raton, Fla. Pg 313-344 (1998)  参照)。図１３のパネルＥとＦはカルシウム受容体抗血清によって検出されたこの器官壁と結合している上皮細胞中の大量のカルシウム受容体を示す。頂端側染色と基底側染色では、その分布は均一に細胞全域である。
【０１４９】
同様の結果はカルシウム受容体抗血清ＳＤＤとＳＡＬ−１を用いた３番目の魚類であるブラックゴーストの免疫細胞学的解析によって得られた。図１４に示されるようにブラックゴーストの電気感受性器官中の細胞はカルシウム受容体抗血清ＳＤＤとＳＡＬ−１によって特異的に標識されたが、それらに対応する免疫される前の血清では標識されなかった。このカルシウム受容体抗血清ＳＡＬ−１による特異的細胞の染色を説明するためにアトランティックサーモンの腎臓からの切片は図１４のパネルＧとＨに示されるように解析した。これらの切片はカルシウム受容体の局在が腎臓内の個々の管中の特異的細胞に限定されていることを示している。ヒト(Brown, E. M., Nature, 366,
575-580 (1993))と魚(Nearing, J., et al.;
Hentschel, H., et al.; U.S. Pat. No. 6,481,379 B1;U.S. Pat. No. 6,475,792 B1; U.S. Pat. No. 6,463,883 B1)に関して例証されているように、特異的細胞タイプの抗カルシウム受容体標識のこのパターンはおそらく即時に周囲の環境を感じることを可能にするために、カルシウム受容体タンパクを特異発現しているためである。要約すると、図１３と図１４に示されたデータは十分特徴のある電気感受能力を有する多種の魚の電気感受性細胞中の大量のカルシウム受容体を明確に示している。
【０１５０】
実施例７
細胞内カルシウム濃度に対する電界（ＥＦ）曝露の効果を証明するための、ヒトカルシウム受容体タンパク（ＨｕＰＣａＲ）を安定的に導入した培養ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞の使用
【０１５１】
材料と方法
【０１５２】
ＨＥＫ細胞における実験を実施するために用いたすべての方法と道具は以前に報告されている。(Gama, L.  他, J. Biol. Chem. 273, 29712-29718(1998);Bai, M.,  他, J. Biol. Chem. 271, 19537-19544(1996);Brown, E. M.,  他, Physiol. Rev. 81, 239-297(2001))。非導入ＨＥＫ細胞，又は代わりにＨｕＰＣａＲタンパクを安定的に導入し、発現している細胞は、７５ｃｍ２フラスコ内に１０％牛胎児血清と１％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地でコンフルエントに達するまで培養された。培地をフラスコから除去し、ＦＵＲＡ−２−ＡＭ（モレキュラ・プローブス社  ユージン、オレゴン州）４．１μＭを含むローディング緩衝液(１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＫＣｌ，１．０Ｍｍ  ＣａＣｌ２，１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｇ／ｌ  牛の血清アルブミン，そして１ｇ／ｌ  グルコース  ｐＨ７．４以下，浸透圧２８５以下)に２時間曝露することによって細胞に取り込ませた。ＨＥＫ細胞あるいはＨｕＰＣａＲ細胞をＥＦに曝露するために次にＥＦ曝露装置へ導入するこれらの細胞からの細胞懸濁液を作製することが必要であった。したがって、緩衝液の曝露後、細胞は標準の細胞スクレーパー(コースター３０１０、コーニング社)を用いてフラスコの表面から剥がし、そしてローディング緩衝液を除去するために低速遠心によって懸濁液から沈殿物にした。細胞外ＦＵＲＡ−２色素を除去するために低速遠心を用いて懸濁、沈殿のステップを2回連続して行い、細胞を2回洗浄した。実験のスタートの直前に細胞を解析のために以下に述べる各実験緩衝液で再懸濁した。多くの試験で使用される標準実験緩衝液は、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＫＣｌ，０．５Ｍｍ  ＣａＣｌ２，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｇ／ｌ  グルコースから成り、ｐＨ７．４以下，浸透圧２８５以下である。他のすべての緩衝液は標準の実験緩衝液中の特定成分を変え、その一方、残りの成分を一定に保持する基本構成のバリエーションである。
【０１５３】
総量３ｍｌで構成される細胞懸濁液を実験緩衝液に曝露後およそ20分以内にＰＴＩフルオリメーター(ＳＣ−５００  シャッター・コントローラーとＰＴＩドライバーと分析ソフトを備えたＰＴＩモデル８１４  光電子増倍管検出システム)で解析した。細胞懸濁液のアリコットを白寿ＥＦ装置に置いて１０分間隔のＥＦに曝露するか、あるいは疑似コントロールとして処理した。そして、ＥＦ曝露の完了後１５分以内にサンプルを解析した。５００あるいは１０００秒間隔の間、１．３秒のデータ収集割合を用いた標準比率画像解析を使ってデータを得た。
【０１５４】
選択された実験の中で、ＦＵＲＡ−２蛍光比率の違いを定量化するためにイオノマイシン（ジメチルスルフォキシドに溶解した1μＭ最終濃度貯蔵液）を添加した。イオノマイシンは定量化を目的としてＦＵＲＡ−２からの最大蛍光シグナルを得るために添加した。
【０１５５】
カルシウム受容体に対するＥＦの効果
【０１５６】
図１５は後述するデータを得るために用いた実験システムの概要を示す。培養ＨＥＫ細胞あるいはＨｕＰＣａＲ細胞はプラスティック組織培養皿上で生育させ、細胞懸濁液にするために培養皿から剥がし、緩衝液で洗浄した後、ＦＵＲＡ−２を取り込ませ、そして、さまざまなアリコットに分割した。選別されたアリコットにＥＦ曝露装置内でＥＦの曝露を行った。ＥＦ曝露あるいは擬似対照（ＥＦなし）処理のいずれかに引き続き、細胞のアリコットは細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定するため、標準比率画像化蛍光分析に使用した。まず、初めに、図１５のマーク１で示されるようにそれぞれの細胞アリコットのための細胞内カルシウムイオン濃度のベースラインを得た。図１５に示されるように細胞内に発現するカルシウム受容体タンパクの制御により、ＨｕＰＣａＲ細胞は細胞内のカルシウムイオンの増加(一つ目のピークの隣に大きな矢で示された１つの増加)に対応して細胞外のカルシウムイオンの徐々の増加(上向きの矢印で示される)に応答する。塩化カルシウムの添加による細胞刺激後、細胞内カルシウムイオンの増加から最大ＦＵＲＡ−２シグナルを得るために選択した実験においてイオノマイシンを添加した。ＨｕＰＣａＲ細胞によって示された反応とは反対に図１５の挿入図に示されるようにＨＥＫ細胞では細胞外カルシウムの添加後、迅速な反応は示さなかった。示されたように、それらの細胞内のカルシウムイオン濃度は、はるかに遅い時間的尺度で穏やかに上昇する。
【０１５７】
培養ＨＥＫ細胞とＨｕＰＣａＲ細胞にＦＵＲＡ−２を取り込ませ、細胞を剥がした後、上述したアッセイシステムを用いて解析を行った。計１７測定を６ヶ月以上の間隔で、多様な日に実施した。特定の日における実験を実施するためにＨＥＫ細胞とＨｕＰＣａＲ細胞の両方を密集増殖させ、細胞培養液を除去し、前述のように細胞にＦＵＲＡ−２を取り込ませた。細胞をフラスコから収集し、アリコットに分割した。細胞のグループの少なくとも１アリコットはＥＦに曝露せずに非ＥＦ処理対照として指定した。この非ＥＦ処理対照はＦＵＲＡ−２値の内部標準を準備するためにＥＦ処理サンプルと同様に分析された。そして、対照サンプルから得られたＦＵＲＡ−２はそれぞれのＥＦ処理サンプルで得られたＦＵＲＡ−２値を標準化するために用いられた。Ｕｎｔｘ−ＨＥＫ細胞とＨｕＰＣａＲ細胞の両者は標準の条件下で維持、収集され、ＥＦ曝露後、すぐに解析された。
【０１５８】
図１６は１０分間さまざまなＥＦ量で曝露した後、ＨｕＰＣａＲ細胞から得られたＦＵＲＡ−２比率測定の最初の５９秒の結果を示している（図１５  ブラケット１参照）。それぞれのデータポイントは細胞を様々なＥＦ量で曝露したときの最初の５９秒においてそれぞれの平均値を非処理対照から得られた値によって割ることにより標準化された平均値を表している。したがって、１を越える値は細胞内カルシウムイオンが増加する場合に起こるＦＵＲＡ−２値の増加に対するＥＦの影響を示している。個々の実験間で特定のＥＦ量に対する反応においてかなりのバラツキがあるものの、このデータセットの外観検査では、ＨｕＰＣａＲ細胞で得られたＦＵＲＡ−２蛍光比率の平均値の増加とＥＦ曝露の間には正の相関性があることが示唆される。
【０１５９】
図１７は同様の実験プロトコルおよびデータ分析を実施したＨＥＫ細胞から得られた対応する結果を示す。ＥＦ曝露後の標準化された平均のＦＵＲＡ−２値もまた、かなりのバラツキがあることに注意する。しかしながら、特に高い曝露量(４００及び６００ｍＡ／ｍ２)のＥＦ曝露後の標準化された平均ＦＵＲＡ−２値は増加の傾向にあるようにも見える。これらのどの実験も次のパラグラフに記述されるようなイオノマイシンでの補正技術を使用しなかった。特異的ＥＦ曝露後、ＨｕＰＣａＲ細胞あるいはＵｎｔｘ−ＨＥＫ細胞の個々のアリコットにおける最初の５９秒の解析から得られた平均標準化ＦＵＲＡ−２比率値は図１８と表６に示されるように結合と平均化し、解析を行った。測定されたすべてのＥＦ曝露については、ＨｕＰＣａＲ細胞に対する平均の標準化ＦＵＲＡ−２比率値が細胞内カルシウムイオンの増加を示して、１以上だったことに注意する。
【０１６０】
しかしながら、細胞反応の大きなバラツキが原因で、ＥＦ曝露量と、テストされたＥＦ曝露の範囲におけるＦＵＲＡ−２比率値の増加の間には、明確な曝露量と反応の相関関係がないように見える。対照的に、高いＥＦ曝露（４００及び６００ｍＡ／ｍ２）における平均ＦＵＲＡ−２比率値の顕著な増加は、ＨＥＫ細胞にのみ見られ、一方、低いＥＦ曝露（０，１００及び２００ｍＡ／ｍ２）においては、平均ＦＵＲＡ−２比率値は極めて変わり易い。ＨｕＰＣａＲ細胞とＨＥＫ細胞の間の顕著な違いはヒトのカルシウム受容体タンパクの存在だけであるので、カルシウム受容体タンパク自身へのＥＦの影響、あるいは細胞の構造か機能において引き起こされた変化、特に、導入されたカルシウム受容体タンパクへのＥＦの影響を、ＨｕＰＣａＲ細胞とＨＥＫ細胞間の平均値の比較は示すであろう。
【０１６１】
【表６】
2006167476.tif 000008
【０１６２】
平均標準化ＦＵＲＡ−２比率値の有意（Ｐ＜０．０５）な増加は６，６０及び６００ｍＡ／ｍ２のＥＦ曝露後のＨｕＰＣａＲ細胞とＨＥＫ細胞に認められる。２００及び４００ｍＡ／ｍ２での平均ＦＵＲＡ−２比率値の同様な増加もまた認められたが、有意なものではなさそうであった。
【０１６３】
さらに、初めにさまざまなＥＦ量で曝露し、そして細胞外カルシウムイオンの増加によって繰り返し刺激した後、ＨｕＰＣａＲ細胞におけるＦＵＲＡ−２比率値を解析した。これらのＦＵＲＡ−２値を個々の実験のＦＵＲＡ−２比率値を上で記述されたのと同じＨｕＰＣａＲ細胞の非ＥＦ処理アリコットから得られたＦＵＲＡ−２値で割ることによって標準化した。図１９と表７で示されるように、ＨｕＰＣａＲ細胞をさまざまなＥＦ量で曝露した個々の実験のＦＵＲＡ−２比率値から９％だけの（５８のうちの５）標準化ＦＵＲＡ−２比率値が１未満であることが明らかとなった。代わりに、繰り返しカルシウム刺激後でさえ非ＥＦ処理対照と比較してＥＦ処理ＨｕＰＣａＲ細胞の細胞内カルシウムイオンの上昇を示し、９１％の標準化ＦＵＲＡ−２比率値が１以上であった。ＥＦ曝露の増加と標準化ＦＵＲＡ−２比率値の増加の間に曝露量と反応の関係があるかどうかを調べるために様々なＥＦ量に曝露されたＨｕＰＣａＲ細胞から得られた平均標準化されＦＵＲＡ−２比率値を比較するt検定解析を実施した。この解析（表７）ではＥＦ曝露には顕著な差（６と６００ｍＡ／ｍ２）があるにもかかわらず、平均標準化されＦＵＲＡ−２比率値の大きさには有意な増加は認められなかった。要約すると、これらのデータは、ＥＦ用量依存性ではないが、カルシウムイオンに曝露後も持続するＨｕＰＣａＲ細胞に対するＥＦ効果を立証する証拠を提供する。
【０１６４】
【表７】
2006167476.tif 000009
【０１６５】
ナトリウムとカルシウム比
【０１６６】
培養ＨｕＰＣａＲ細胞の個々のバッチ間でのＦＵＲＡ−２値のバラツキと同様にＨｕＰＣａＲ細胞の個々のアリコットからの平均ＦＵＲＡ−２値の顕著な分散によって図１６〜図１９と表６と表７に示されたデータは複雑にされている。そのようなバラツキはこの実験システム（１−４）を用いる研究者の間では広く受け入れられており、したがって、これらのバラツキをコントロールするためにデータは標準化されるかまたは最大反応の％として表される。
【０１６７】
異なる実験からのデータの比較からも個々の実験内の個々のアリコットからもより定量的なデータを得るために、我々は細胞の各アリコット内での達成可能な最大ＦＵＲＡ−２シグナルを決めるために図１３の中で示されるようなイオノマイシンの使用を組み込んだ。したがって、ＨｕＰＣａＲ細胞の各アリコットの解析後に得られた最大のＦＵＲＡ−２値は、その後、ＨｕＰＣａＲ細胞への塩化カルシウムの徐々の添加中に任意の時間間隔で得られた各々のＦＵＲＡ−２値に分割された。下記で述べるようにＦＵＲＡ−２データのイオノマイシン標準化の利用は、個々のＨｕＰＣａＲ細胞間におけるＦＵＲＡ−２取り込みの準備での違いによって生じるバラツキを大幅に縮小するか除去することによりＦＵＲＡ−２値の直接の比較を可能にする。
【０１６８】
以前の研究において、クインらは塩化カルシウムを添加したＨｕＰＣａＲ細胞の反応に対する細胞外の塩化ナトリウムの影響について特徴づけを行った。一部を図２０として再現される、それらの研究では、著者らはカルシウム受容体が、浸透圧の変化とは無関係にイオン強度とそのイオン強度を変化させるために使われたイオン種の変化を感知することができると結論づけた。これらの研究では著者らはもっぱら細胞外のカルシウムイオン添加後のＨｕＰＣａＲ細胞で観察される「反応」(細胞内のＦＵＲＡ−２値の急激な上昇)だけを研究した。重要なことは、彼らは、図１６〜図１９の中で示されるようなＥＦによって影響されるＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化について調べなかったし、考慮もしなかった。
【０１６９】
図２１は異なる塩化ナトリウム含有量の標準実験緩衝液を添加し、細胞外で塩化カルシウムの徐々の増加にさらされたＨｕＰＣａＲ細胞アリコットの解析を示している。図２１の上のパネルはＨｕＰＣａＲ細胞の急性反応を表すＦＵＲＡ−２値のイオノマイシンで標準化した値を示している。一方、下のパネルは塩化カルシウムを添加した後、同じ細胞でのイオノマイシン標準化ＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化を示している。テストされた異なる塩化ナトリウム濃度（２５−３００ｍＭ）は、大きさおよび特有の用量依存特性の両方の中で変わるＦＵＲＡ−２反応およびベースライン値の変化を引き起こすことに注目する。
【０１７０】
図２２は２５−３００ｍＭの異なった塩化ナトリウム濃度を有する標準実験緩衝液に対して塩化カルシウムを徐々に添加したときに起こるＮａ＋/Ｃａ２＋比率の変化を示している。低濃度（２５ｍＭ）の塩化ナトリウム量を含んでいる標準実験緩衝液においては高濃度（２００−３００ｍＭ）の塩化ナトリウム濃度を含む緩衝液に比べてＮａ＋/Ｃａ２＋比率の変化はより顕著であった。したがって、ＨｕＰＣａＲ細胞のＦＵＲＡ−２ベースラインと反応値の変化はＮａ＋/Ｃａ２＋比のひとつの作用であり、単純な塩化ナトリウムが存在することによって変化させられる標準実験緩衝液中の塩化カルシウム濃度の変化によるものではない。
【０１７１】
図２３は図２１の下のパネルに示されたデータをイオノマイシンで修正されたＦＵＲＡ−２値を様々な標準実験緩衝液濃度中の対数Ｎａ＋/Ｃａ２＋比率の作用としてプロットすることのよって再グラフ化されたデータを示している。細胞の個々のアリコットのデータポイントは大きさと形において異なる、一方、全体的な総合曲線はその中間点が３６．６のＮａ＋/Ｃａ２＋比で一致する良く知られたＳ字型曲線である。その後、この値は、所定のナトリウムイオン濃度でのカルシウムに対するＥＣ５０値の計算を可能にする（例えば、１２５ｍＭ塩化ナトリウムの標準実験緩衝液では、その値は３．５ｍＭカルシウムイオンになる）。カルシウムイオンに対するこのＥＣ５０値は、図２０の中で概説された方法を用いて引き出されたカルシウムイオン３．５のＥＣ５０値にほぼ一致する。
【０１７２】
要約すると、上述するＮａ＋/Ｃａ２＋比率方法を使った解析はＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化量の違いはＨｕＰＣａＲ細胞を浸す細胞外液のＮａ＋/Ｃａ２＋比に依存して起こることを示している。
【０１７３】
白寿ＥＦ装置内でのＥＦ曝露後に生じるＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化の大きさはＨｕＰＣａＲ細胞に対するＥＦ曝露時間での実験緩衝液中に存在するＮａ＋/Ｃａ２＋比によって調節される。ＨｕＰＣａＲのＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化の大きさは浸した細胞の細胞外液のＮａ＋/Ｃａ２＋比に依存するので、我々はＥＦ曝露装置内でＥＦ曝露した後に起こるＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化の大きさが細胞外培養液のＮａ＋/Ｃａ２＋比によっても変化するかどうかを調べた。
【０１７４】
図２４に示されるように、２つの異なるＮａ＋/Ｃａ２＋比の下で同一のＥＦ曝露に対するＨｕＰＣａＲ細胞の単一のプールからの同一アリコットの曝露は、２つの異なる大きさのＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化を引き起こした。図２４の右側のパネルに示されるように、Ｎａ＋/Ｃａ２＋比が２５０（この値は、図１５〜図１９の中で示されるすべての実験測定のために使用された値に相当する）の条件下でのＥＦ曝露はＦＵＲＡ−２ベースライン値の小さな増加を引き起こした。それに反して、３５．７の低いＮａ＋/Ｃａ２＋比のＥＦ曝露では図２４の左側のパネルに示されるようにＦＵＲＡ−２ベースライン値にはるかに大きな変化が引き起こされた。ＦＵＲＡ−２変化を誘導するこれらのＥＦの大きさは細胞外液のＮａ＋/Ｃａ２＋比の変化によって引き起こされる変化の大きさと一致していた。
【０１７５】
図２５は２つの異なるＮａ＋/Ｃａ２＋比で同一のＥＦ曝露（６００ｍＡ／ｍ２で１０分間）へＨｕＰＣａＲ細胞を曝露した後、Ｎａ＋/Ｃａ２＋比の変化を引き起こすために、ＨｕＰＣａＲ細胞の各アリコットへの塩化カルシウムの徐々の添加を行った後の、ＦＵＲＡ−２ベースライン値の大きさを定量化した１２の異なった実験で得られたデータを要約している。１２の異なる実験においては、対応したＨｕＰＣａＲ細胞のアリコットをそれぞれＥＦ処理あるいは擬似対照処理（非ＥＦ）し、そして、上述した方法を使って解析した。図２５と図２６に示されるデータはイオノマイシンで補正されたＦＵＲＡ−２ベースライン値を擬似対照のＦＵＲＡ−２ベースライン値で割った比の形で表している。したがって、１の比率値は、ＥＦが無影響であることを意味しており、一方、１以上の比率値はＥＦ曝露がＦＵＲＡ−２蛍光値を増加させたことを示している。
【０１７６】
ＨｕＰＣａＲ細胞のＦＵＲＡ−２値（反応）の急激な増加におけるＥＦ誘導変化の解析はＥＦ誘導ＦＵＲＡ−２ベースラインの変化の大きさと塩化カルシウムの添加後のＦＵＲＡ−２反応の変化の間に逆の相関関係があることを明らかにした。
【０１７７】
図２６は塩化カルシウムを単一に徐々に添加した後のＨｕＰＣａＲ細胞の反応の大きさの変化を定量化した１０の異なった実験から得られたデータを要約している。これらの１０の予備実験において、上述した方法を使ったそれぞれのＦＵＲＡ−２値の比較は２つの異なるＮａ＋/Ｃａ２＋比でのＥＦ曝露によって誘導されるＦＵＲＡ−２ベースラインの上昇が塩化カルシウムの添加に対するＨｕＰＣａＲ細胞の反応の減少を引き起こすことを示唆する。これら実験の個々のデータポイントは、ベースラインのＥＦ誘導変化が図２６で示されたその後のＦＵＲＡ−２値反応の変化と比較している図２７で示されている。異なったＮａ＋/Ｃａ２＋比の条件下でＥＦの曝露を受けたＨｕＰＣａＲ細胞において大多数のデータポイントはＥＦを曝露していない対応する対照のＨｕＰＣａＲ細胞と比較してＦＵＲＡ−２ベースライン値の上昇とそれに続く反応ＦＵＲＡ−２値の減少に相当する領域に配置される。
【０１７８】
要約すると、ＨｕＰＣａＲ細胞のＦＵＲＡ−２比測定によって示されたように細胞内カルシウムイオンの上昇に対するＥＦの影響の解析はＦＵＲＡ−２ベースライン値の上昇の大きさは細胞が浸される細胞外培地のＮａ＋/Ｃａ２＋比によって変化することを示す。ＨｕＰＣａＲ細胞のＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化は塩化カルシウムあるいは塩化ナトリウムのどちらかの添加によるＮａ＋/Ｃａ２＋比の徐々の変化に反応する。
【０１７９】
図２８はＨｕＰＣａＲ細胞に対するＥＦの明らかな影響を要約している。ＥＦに対するＨｕＰＣａＲ細胞の曝露はＨｕＰＣａＲ細胞を浸した細胞外液への塩化カルシウムの徐々の添加によるＮａ＋/Ｃａ２＋比の増加後に観察されるのと似た影響があるように見える。ＨｕＰＣａＲ細胞におけるＥＦ効果の大きさは細胞が曝露される特定のＮａ＋/Ｃａ２＋比に依存して変化するであろう。ＦＵＲＡ−２ベースライン値のＥＦ誘導による上昇は細胞内カルシウムイオンの同時上昇を引き起こし、その結果、次のカルシウム受容体刺激に対する反応におけるＦＵＲＡ−２値の急激な上昇を減少させる。
【０１８０】
電位活性化型カルシウムイオンチャンネルの阻害薬であるベラパミルのＨｕＰＣａＲ細胞の曝露はＦＵＲＡ−２ベースラインのＥＦ誘導変化に対しては影響を与えなかった。ＥＦ曝露がＦＵＲＡ−２ベースライン比率値を上げることができる可能な1つの手段はＨｕＰＣａＲ細胞の細胞膜中の電位活性化型カルシウムイオンチャンネルの開きによってカルシウムイオンの流入である。このメカニズムがＦＵＲＡ−２比率値のＥＦ誘導上昇に寄与しているかどうかを調べるために、ＨｕＰＣａＲ細胞のペアのアリコットを５〜１０ｍＭのベラパミルかあるいは媒体のみで前もってインキュベートした後、白寿ＥＦ装置内でＥＦあるいは擬似対象条件で曝露し、ＦＵＲＡ−２ベースライン値を測定した。１０の異なった測定の図２９に示されるように、ベラパミルでの前もってのインキュベートは対照（非ＥＦ）およびＥＦ曝露されたＨｕＰＣａＲ細胞のいずれにおいてのＦＵＲＡ−２比率のベースラインに有意な影響を生じなかった。図１５〜図２８に示されるように、これらのデータは電位活性化型カルシウムイオンチャンネルのＥＦ誘導変化がＦＵＲＡ−２比率のベースラインのＥＦ誘導上昇に対して顕著に寄与しないことを示唆する。
【０１８１】
図３０は哺乳動物のカルシウム受容体タンパクを発現する多数の組織をリストする。このリストは、体系的な無機イオンの恒常性に関連した組織とそうでないものに分割される。そのような組織内の最適のＮａ＋/Ｃａ２＋比の局在した領域の存在はこれらの組織に図１５〜図２９で述べられているような電界刺激に反応する能力を与えているのであろう。例えばヒトの角化細胞中の機能的なカルシウム受容体タンパクの存在は、マンニらが述べているように低レベルの電磁界刺激に反応するそれらの能力について説明するかもしれない(Manni,V.  他  Low electromagnetic field (50
Hz) induces differentiation on primary human oral keratinocytes.
Bioelectromagnetics 25:118-126, 2004)。
【０１８２】
Ｃ．増殖細胞性疾患を治療する方法
【０１８３】
増殖細胞性疾患、特に、分化型繊維芽細胞を含む増殖細胞性疾患を治療するために細胞膜上に生成された平均誘導電流密度は約０．１ｍＡ／ｍ２から約２ｍＡ／ｍ２が好ましい。さらに好ましいのは約０．２ｍＡ／ｍ２から約１．２ｍＡ／ｍ２であり、もっと好ましいのは約０．２９ｍＡ／ｍ２から約１．１２ｍＡ／ｍ２である。印加電流については細胞膜上に発生する平均印加電流密度は約１０ｍＡ／ｍ２から約１００ｍＡ／ｍ２が好ましい。
【０１８４】
繊維芽細胞は胚子中胚葉組織に由来するひとつの細胞型である。繊維芽細胞はインビトロでの培養が可能であり、ラミニン、フィブロネクティンおよびコラーゲンのようなマトリックスタンパクを分泌できる。培養繊維芽細胞は通常は組織の繊維芽細胞のように分化はしない。しかし、適当な刺激によって繊維芽細胞は例えば脂肪細胞、結合組織細胞、筋肉細胞、コラーゲン繊維等のような多くのタイプの細胞に分化する能力を持っている。
【０１８５】
繊維芽細胞が結合組織と筋骨格系に関連した多数の細胞タイプへ分化できるとすれば、インビボ、インビトロで分化していない繊維芽細胞の増殖をコントロールする方法は、繊維芽細胞から分化した細胞の増殖をコントロールするのに有用である。例えば、筋骨格系組織の異常増殖性細胞疾患は繊維芽細胞の増殖を抑制する方法によってコントロールされるかあるいは抑制されるかもしれない。我々は、少なくとも約７日間に約２４時間／日の期間で約１０，５０または１００ｍＡ／ｍ２の印加電流密度の細胞膜上の生成によって電流密度依存性に培養繊維芽細胞の増殖が抑制されることを解明した。
【０１８６】
増殖性細胞疾患には、線維肉腫、横紋筋肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、脂肪肉腫のような、結合系、筋骨格系組織の新生物が含まれる。また、抑制、改善あるいは治療できうる追加の異常増殖性細胞疾患には、例えば、以下の部位の悪性新生物の進行、および/または、転移が含まれる。腹部、骨、脳、乳房、結腸、消化器系、内分泌（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頚部、肝臓、リンパ系、神経系（中枢、末梢）、膵臓、骨盤、腹膜、皮膚、軟部組織、脾臓、胸郭、尿生殖路、白血病（急性前骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含む）、多発性骨髄腫、結腸癌、前立腺癌、肺癌、小細胞肺癌、気管支癌、精巣癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、血管肉腫、リンパ管肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、膵臓癌、腎細胞癌、ウィルムス腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、腺癌、上皮癌、黒色腫、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、膀胱癌、胎生期癌、嚢胞腺癌、髄様癌、絨毛癌、精上皮腫。
【０１８７】
実施例８
マウスの脾細胞および３Ｔ３/Ａ３１線維芽細胞細胞のCa2+濃度に関するＥＦ曝露の効果
【０１８８】
マウスの脾細胞への効果
【０１８９】
マウスの脾細胞のカルシウムイオン濃度についてのＥＦ効果を判断するために、６０Ｈｚの特定のＥＦ電界曝露をマウスの脾細胞に適用した。脾臓は麻酔下でマウスから摘出した。６０ｍｍのディッシュで、ひ臓に、ＰＢＳ（０．０８３％ＮＨ４Ｃｌを含む燐酸塩緩衝食塩水）を注入した。細胞を［Ｃａ２＋］ｃの検査中、ハンクス液（ＨＢＳＳ）（ＳＩＧＭＡ社、ミズーリ州、米国）中に再び懸濁し、保持した。それは細胞準備後に４時間以内実行した。細胞は使用に先立って４℃で保管した。
【０１９０】
脾細胞への６０ＨｚのＥＦを印加すると、６、２０、６０および２００μＡ/ｃｍ２の印加電流密度が生成された。脾細胞を、４分間これらの条件で曝露し、その曝露後、脾細胞サンプルをコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激した。ＣｏｎＡで脾細胞を刺激して、細胞質の自由Ｃａ２＋濃度をフルオ３と流動細胞計測法で測定した。
【０１９１】
実験によって、ＣｏｎＡが脾細胞のカルシウム濃度が増加したことが判明した。カルシウムイオン濃度は、６〜２００μＡ/ｃｍ２のＥＦで増加した。より重要なことは、カルシウムイオン濃度の増加は電流密度に依存するということである（図３１参照、Ｙ軸はカルシウム濃度、Ｘ軸は分を示す）。
【０１９２】
ＢＡＬＢ  ３Ｔ３に対する影響
【０１９３】
マウス３Ｔ３／Ａ３１線維芽細胞細胞のカルシウムイオン濃度に対するＥＦ効果を測定するために、３Ｔ３細胞を６０ＨｚでＥＦに曝露した。３Ｔ３細胞株は日本の原虫病研究センターの細胞バンクから入手し、５％ＦＣＳおよび１０ｍＭＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ中で３７℃で成長させた。
【０１９４】
ＥＦは、２００μＡ/ｃｍ２の細胞上の印加電流密度を生成した。２分間曝露した後、細胞質の自由Ｃａ２＋濃度をフルオ３流動細胞計測法で測定した。それは、カルシウム濃度が細胞において増加したことを示した。フルオ３イメージ強度の変化は共焦点形レーザー顕微鏡使用で確認された。
【０１９５】
実施例９
カルシウムイオノホアおよびＢＡＬＢ  ３Ｔ３中の膜電位上のＥＦ効果
【０１９６】
図３２は、カルシウムイオノホアがマウスのＢＡＬＢ  ３Ｔ３／Ａ３１線維芽細胞/胚細胞の膜電位の変化させる事を示す。図３２は、０．４ｍＭ Ａ２３１８７の終末濃度で刺激されたＢＡＬＢ  ３Ｔ３細胞のＤｉＢＡＣ強度の時間的経過変化を表示する。Ａ２３１８７は、可動性キャリヤーのカルシウムイオノホアの役割をするストレプトマイシーズ・チャータユーセンシス（chartreusensis）から抽出されたモノカルボン酸である。ＤｉＢＡＣは、細胞膜の電位が変化するとき、細胞膜に入る蛍光染料である。したがって、ＢＡＬＢ  ３Ｔ３細胞の細胞膜が脱分極する場合、ＤｉＢＡＣはそれらの細胞膜に入り、ＢＡＬＢ  ３Ｔ３細胞におけるＤｉＢＡＣ信号(Ｙ軸)の強度を増加させる。
【０１９７】
図３３は、約２００ｍＡ/ｃｍ２の電流密度を生成する、１００Ｈｚの電界（ＥＦ）の、ＢＡＬＢ  ３Ｔ３における膜電位に対する効果を示す。流動細胞計測法の方法論は以下のとおりである。ＤＭＥＭ中の培養は、５％のＦＣＳ  １０ｍＭ
ＨＥＰＥＳが追加された。その後、０．０２％のトリプシンおよび０．０２５％のＥＤＴＡで触れられた。その後、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ  
Ｎａ２ＨＰＯ４、５ｍＭグルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡおよび１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４において再びサスペンドさせた。その後、２００ｎＭの最終濃度にＤｉＢＡＣ４（３）をロードした。５分以上、３７℃で培養した。その後、流動細胞計測法で測定した。
【０１９８】
図３４も、約２００ｍＡ/ｃｍ２の電流密度を生成する１００Ｈｚの電界のＢＡＬＢ  ３Ｔ３における膜電位に対する効果を示す。
【０１９９】
実施例１０
細胞外電流は滑膜線維芽細胞におけるギャップジャンクション細胞間伝達を変化させる
【０２００】
我々は、コネキシン４３タンパク質が介在するギャップジャンクション細胞間伝達（ＧＪＩＣ）に対する低レベル電流の効果を検討した。滑膜線維芽細胞（ＨＩＧ−８２）および神経芽細胞腫細胞(5Y)のコンフルエントな単層を、０〜７５ｍＡ/ｍ２（０〜５６ｍＶ/ｍ、６０Ｈｚ）の浴溶液において曝露し、シングルチャネルコンダクタンス、細胞膜電流−電圧（I−V）曲線およびＣａ２＋流入を、ナイスタチンタブルおよびシングルパッチ法を使用して測定した。ＨＩＧ−８２細胞のギャップジャンクションチャンネルの閉および開状態の導電はそれぞれ、２０ｍＡ/ｃｍ２（０．７６ｐＡおよび０．３９ｐＡによる)に曝露された細胞において著しく減じた。５Ｙ細胞間のギャップジャンクションチャンネルの導電については効果はなかった。１０ｍＡ/ｍ２の低い電流密度は、著しくＨＩＧ−８２細胞のＣａ２＋流入を増加させたが、５Ｙ細胞には効果がなかった。両タイプの細胞の原形質膜のＩ−Ｖ曲線は、０〜７５ｍＡ/ｍ２、６０Ｈｚの電流に依存しなかった。それは、ＨＩＧ−８２細胞のＧＪＩＣに対する６０Ｈｚの電流の効果が膜電位変化によって介在されなかったことを示している。
【０２０１】
結論は、低レベルの細胞外電流が膜電位の変化に依存しないがＣａ２＋の流入に依存しうるメカニズムによって滑膜細胞におけるＧＪＩＣを変更できたということであった。結果は、ＧＪＩＣが介在する滑膜細胞の応答が、例えばプロ炎症性サイトカインに対する分泌性反応、細胞外の低周波電流の適用によって相殺できたことを示唆している。
【０２０２】
Ｄ．ストレスを減じる方法
【０２０３】
本発明は、低減した免疫系機能、伝染病、高血圧症、粥状動脈硬化症およびインシュリン抵抗性異脂肪血症症候群などのストレスおよびストレス関連疾患の予防あるいは治療に役立つ。ストレス、免疫抑制性疾患を取り扱い、ＡＣＴＨまたはコルチゾールのレベルを低減するためには、細胞膜上に生成される平均誘導電流密度は、約０．０３ｍＡ/ｍ２〜約１２ｍＡ/ｍ２、より好ましくは０．０３５ｍＡ/ｍ２から約１１．１ｍＡ/ｍ２である。印加電流については、平均印加電流密度は、好ましくは約６０ｍＡ/ｍ２から約６００ｍＡ/ｍ２である。
【０２０４】
ストレスは、高血圧症、じゅく状動脈硬化症、インシュリン抵抗性異脂肪血症症候群、および免疫機能（Vanitallie T.B.、代謝、51:40-5(2002)）の特定の障害を含む多数の健康障害に関係している。研究者達は、ストレスがコルチゾールやコルチコステロンのような副腎皮質ホルモンの正常なホメオスタシスに影響を及ぼす場合があるとしている。ホルモン・コルチコステロンは副腎によって生産され、その変化はストレスの一般的な指標である。最大５０kV/m、６０Ｈｚの電界に曝露されたマウスに関する報告書では、血漿コルチコステロン濃度の減少が観察されたが、曝露期間の初期のみであった(ハックマン  アール．エム．（Hackman, R.M.） & グレイブス、エイチ．ビー．（Graves, H.B.）, ベハブ．  ニューラル  ビオロ．（Behav. Neural Biol.） 32:201-213 (1981)。同様に、プロテット（Portet）とキャバネス（Cabanes）は、ラビットとラットが５０kV/m、５０Hzで曝露された時、低下するコルチゾール・レベルは、血中コルチゾール濃度ではなく副腎で見つかった、ことを報告している（プロテット、アール．（Portet, R.） & キャバネス、ジェイ（Cabanes, J.）, バイオ電磁気学9:95-104 (1988))。
【０２０５】
ＡＣＴＨは脳下垂体によって発現されるペプチドで、もっぱらコルチゾールの分泌を抑制する。ＡＣＴＨは、主としてＡＣＴＨがコルチゾール（例えば外傷性イベントに対するストレス反応には主要な抗炎症分子）の分泌を制御するために機能するため、肉体のストレス・レベルの強力な指標として身体機能を一様にする。面白いことに、研究者達は、３０〜１２０日間の電界曝露後にＡＣＴＨレベルの増加を見出さなかった（フリー、エム．ジェイ．他（Free, M.J., et al.）, バイオエレクトロマグネティクス 2:105-121 (1981)）.ラットを１〜３時間、１００ｋＶ／ｍ、６０Ｈｚに曝した研究では、血清ＡＣＴＨの変化は見つからなかった（クイリアン、ダブリュ．ジェイ．（Quinlan, W.J., et al.）, バイオエレクトロマグネティクス 6:381-389 (1985)）。マウスが１０ｋＶ／ｍ、５０Ｈｚで露出された時、血清ＡＣＴＨ濃度は対照群よりも高かった（デブリュン、エル．（deBruyn, L.） & デェジャガ、エル．（deJager, L.）, エンビロン（Environ.） Res. 65:149-160 (1994)）。副腎皮質の領域で脂質は上昇したが、雄のみであった。著者等は、電界がストレッサーであると結論を下した。変化した血中ＡＣＴＨ濃度も、１５ｋＶ／ｍ、３０日間、６０Ｈｚの電界に曝露されたラットにおいて観察された（マリノ、エイ．エイ．他（Marino, A.A., et al.）, Physiol. Chem. Phys.
9:433-441 (1977)）。
【０２０６】
これに対して、我々は、試験動物の特別のパラメータで電界の適用がストレスを引き起こしたＡＣＴＨ濃度を減少させたことを測定した。例えば、１７，５００V/mの電界（５０Ｈｚ）、７，０００Ｖの電圧、および６０分間持続の約０．０３５〜０．５ｍＡ/ｍ２の誘導電流密度を印加すると、試験動物においてストレスを引き起こした血清ＡＣＴＨ濃度を減少させた。
【０２０７】
実施例１１
拘束されたラットの血漿ＡＣＴＨ、グルコース、乳酸およびピルビン酸濃度における５０Ｈｚの電界効果
【０２０８】
電界曝露システム
【０２０９】
この実施例において使用されたＥＦ曝露システムは、３つの部分で構成される。すなわち、高電圧装置（ヘルストロン（商標）、最大出力電圧  ９，０００Ｖ、株式会社白寿生科学研究所、東京、日本）、定電圧電源（東京精電、東京、日本）、およびＥＦ曝露ケージ。曝露ケージは、円筒状のプラスチックケージ（直径：４００ｍｍ、高さ：４００ｍｍ）、および前記円筒状のケージの上下に配置されたステンレス鋼からなる２つの電極（１，２００×１，２００ｍｍ）からなる。ケージ中にＥＦ（５０Ｈｚ；１７，５００Ｖ／ｍ）を形成するために、安定した交流（５０Ｈｚ、７，０００Ｖ）を上部電極に印加した。
【０２１０】
実験動物
【０２１１】
雌、７週齡のウィスターラット、体重３００〜３５０gを、チャールス・リバー・ジャパンから購入し、空気浄化装置を装備した通常の動物室で維持した。
【０２１２】
拘束ストレス
【０２１３】
ラットを、薄いポリカーボネート・シートで各々を包んで拘束し、３０分間下部電極上に置いた。
【０２１４】
実験計画
【０２１５】
以下に記述するように、拘束ストレスに対するＥＦ効果を測定した。薄いポリカーボネート・シートを使用した拘束手続きを評価するために、６匹のラットを、拘束だけのグループと、拘束およびジアゼパム治療との、２つのグループに分けた。ＥＦの曝露効果を検証するために、我々は正常で、卵巣を切除したラットを使用した。正常なラットは、拘束しただけのグループと、拘束プラスＥＦとの２つのグループに分けた。更に、卵巣を切除したラットも、以下のように４つのサブグループに分けた。疑似ＥＦ曝露（Ａ１）、拘束を伴う疑似ＥＦ曝露（Ａ２）、拘束を伴うＥＦ曝露（Ａ３）およびジアゼパム治療および拘束を伴う疑似ＥＦ曝露（Ａ４）である。
【０２１６】
卵巣切除は実験作業の４週間前に行なった。この研究で適用したＥＦ曝露および拘束処置は以下のとおりである。ラットを、合計１時間、５０Ｈｚ、１７，５００Ｖ／ｍに晒した。ラットを、ＥＦ曝露期間の後半、薄いポリカーボネート敷布で拘束した。対照群における実験計画は、ＥＦ曝露しなかった点を除いて実験群と同じにした。
【０２１７】
血液サンプルの収集
【０２１８】
血液１ｍｌを、実験開始前に鎖骨下静脈から採取し、４℃で１０分間、１，５００×ｇの遠心分離で血漿を準備した。血漿はホルモン測定に先立って−８０℃で保管した。実験後、各ラットから全血の３ｍｌを、麻酔下での心採血によって９ｍｇのＥＤＴＡを含むガラス管へ収集した。血液の１ｍｌを血液状態を分析するために用いた。他の２ｍｌは遠心分離し（４℃、１０分間、１，５００×ｇ）、上清を、ホルモン、グルコース、乳酸およびピルビン酸の測定まで−８０℃で保管した。
【０２１９】
血液分析
【０２２０】
赤血球数と白血球数、血小板数、ヘマトクリットおよびヘモグロビン濃度を含む血液の分析を、自動マルチ血球計数器を使用して行なった（シスメック  ＣＣ−７８、シスメック社  東京、日本）。血漿グルコース、乳酸およびピルビン酸濃度を自動アナライザーで測定した（７１７０  日立、日立株式会社、東京  日本)。ＡＣＴＨ濃度を、ＡＣＴＨラジオイムノアッセイ・キット（ＡＣＴＨ  ＩＲＭＡ（三菱化学株式会社製））およびガンマ・カウンター(Auto-Gamma 5530 Gamma Counting System, Packard Instrument Co. ltd)を使用して測定した。血漿コルチコステロンレベルは商用キットを使用して測定した(ImmuChem Double Antibody Corticosterone kit, ICN Biomedicals Inc)。
【０２２１】
統計分析
【０２２２】
結果は、平均±標準誤差の平均（Ｓ．Ｅ．）、すなわち中央値、２５パーセンタイル、７５パーセンタイル、最小および最大値としてのデータセットとして表わした。ペアグループ間の違いの統計的意義はスチューデントt検定によって計算し、その有意差はＰ＜０．０５として定義した。統計分析の計算はすべてMS-EXCEL（日本語版（マイクロソフト・オフィス・ソフトウェア Ver.9.0.1、マイクロソフトジャパン  東京、日本））で行った。
【０２２３】
結果
【０２２４】
拘束ストレスによって引き起こされた血漿ＡＣＴＨ濃度の変化
【０２２５】
図３５は、血漿ＡＣＴＨ濃度へのストレスの影響を示す。ラットは、ジアゼパム（黒丸）あるいは食塩水（白抜き四角）の1mg/kgB.W.で腹腔内投与された。ジアゼパム投与を行なった３０分後に、ラットを、ストレス・レスポンス誘発のために拘束した。図１１は、拘束開始後３０分の個々のラットのＡＣＴＨ濃度を示す。拘束前および拘束後の期間の値(平均±S.E.)は、拘束のみのグループでは２３１±１３５および１１７７±３２５ｐｇ/ｍｌ、そして拘束とジアゼパムのグループでは３５８±７３および８１０±１２１ｐｇ/ｍｌであった。各グループにおいて、拘束ストレス前後のＡＣＴＨ濃度を比較すると、３０分の拘束で、拘束だけのグループおよび拘束＋ジアゼバムのグループにおいて、ＡＣＴＨ濃度がそれぞれ５．１倍および２．３倍高くなるように増加した。
【０２２６】
拘束に起因する血漿ＡＣＴＨ濃度変化に対するＥＦ曝露の効果
【０２２７】
図３６Ａおよび３６Ｂは、正常なラット（Ａ）および卵巣切除ラット（Ｂ）における血漿ＡＣＴＨ濃度に対するＥＦ曝露の効果を示す。全てのラットを、ＥＦ曝露期間の後半拘束した。血漿ＡＣＴＨ濃度を、次のグループにおいてＥＦ曝露６０分前および後に測定した：非処置(ｎ＝６)、拘束だけ(疑似、ｎ＝６)、ＥＦ中拘束(ＥＦ、ｎ＝６)、疑似ＥＦ中拘束かつジアゼパム(疑似およびジアゼパム、ｎ＝６)。ジアゼパムの追加は、ＥＦセッションのスタート前３０分に行った。データはボックス箱に表され、各メインボックスを２つの小さな箱に分割するように見える水平線は、中央値を表わし、各メインボックスの底辺を形成する水平線は、２５パーセントを表わし、各メインボックスの上辺を形成する水平線は、７５パーセントを表わし、各メインボックスの上の水平線は極大値を表わし、また、各メインボックスの下に現われる水平線は最小値を表わす。Pre値は示されていない。* pre値からＰ＜０．０５、†:非処置グループからＰ<0.05。
【０２２８】
卵巣切除ラットでは、非拘束グループにおける血漿ＡＣＴＨ濃度は６０分の間変化を示さなかった。他の３つのグループでは、ＡＣＴＨ濃度は拘束期間上昇した(図３６Ｂ)。pre-セッションおよびポスト・セッションの間で比較すると、血漿・濃度は、「拘束のみ」のグループ、「拘束とＥＦ」のグループおよび「拘束とジアゼバム」のグループにおいて、１８．６倍、１３．４倍、および１３.７倍それぞれ上昇した。
【０２２９】
図３７は、正常なラット(ｎ＝６)における血漿ＡＣＴＨ濃度に対するＥＦ曝露の効果を示す。データは、中央値、２５パーセンイタル、７５パーセンタイル、最小および最大値として示した。図３６Ａおよび３７は、正常なラットにおけるＡＣＴＨおよびコルチコステロンの血漿・濃度の変化を示す。「拘束のみ」のグループと、「拘束とＥＦ」のグループにおける、ＡＣＴＨ濃度は、それぞれ１５９５±３６５および１１５２±１８３（ｐｇ／ｍｌ）、およびコルチコステロン・レベルは、それぞれ８４５±４８および７８６±２４（ｐｇ／ｍｌ）であった。
【０２３０】
血漿パラメータに対するＥＦ曝露の効果
【０２３１】
図３８Ａおよび３８Ｂは、正常（Ａ）および卵巣切除ラット（Ｂ）に関する拘束に起因する血漿グルコースレベル変化に対するＥＦ曝露の効果を示す。それらのレベルは、６０分（ｎ＝６）のセッション後に検査された。サンプル数はすべてのグループにおいて６であった。データは、中央値、２５パーセンタイル、７５パーセンタイル、最小および最大値として示した。* :非処置グループからのＰ＜０．０５
【０２３２】
卵巣切除ラットでは、拘束が血漿グルコース濃度を増大させ(Ｐ＜０．０５:スチューデントt検定)、また、ＥＦまたはジアゼパムはこれらの増加を抑える傾向を持っていた（図３８Ｂ）。しかしながら、ＥＦグループにおける血漿グルコース濃度抑制の傾向は、卵巣切除しなかった正常なラットにおいて観察されなかった（図３８Ａ）。
【０２３３】
図３９Ａおよび３９Ｂは、正常(Ａ)および卵巣切除ラット(Ｂ)における拘束に起因する血漿乳酸塩濃度に対するＥＦ曝露効果を示す。レベルは、６０分のセッション(ｎ＝６)の後に測定された。データは、中央値、２５パーセンタイル、７５パーセンタイル、最小および最大値として示された。*:非処置グループからのＰ＜０．０５、†:疑似グループからのＰ＜０．０５、卵巣切除ラットにおいて、拘束のみのグループにおける血漿乳酸塩濃度は、非処置グループと比較して、有意差を示さなかった（図３９Ｂ）。ＥＦ曝露グループとジアゼパム管理グループにおける血漿乳酸レベルは、拘束のみのグループより著しく低かった(Ｐ＜０．０５:スチューデントt検定)(図３９Ｂ)。正常なラットにおいて、ＥＦの存在および不存在時における血漿乳酸塩濃度（平均（(S.E.））は、２８．６±３．６および３８．１±３．７(ｍｇ/ｄｌ)であった（図３９Ａ）。統計分析の結果、ＥＦに曝露された動物における乳酸塩濃度は、拘束だけのグループより著しく低かった(Ｐ＜０．０５:スチューデントt検定)。
【０２３４】
図４０は、卵巣切除ラットにおいて拘束に起因する血漿・ピルビン酸・レベルに対するＥＦ曝露効果を示す。値は、６０分のセッション(ｎ＝６)の後に検査した。データは、中央値、２５パーセンタイル、７５パーセンタイル、最小および最大値として表示した。*:非処置グループからのＰ＜０．０５。卵巣切除ラットにおいて、拘束だけのグループにおけるプラズマ・ピルベート・レベルは、非処置グループのそれとは著しく異なっていなかったが、拘束によって減少する傾向が見られた。ＥＦ曝露あるいはジアゼパム処理のグループにおける値は、疑似ＥＦ曝露グループのそれらより著しく低かった(Ｐ＜０．０５:スチューデントt検定)(図４０）。
【０２３５】
図４１は、卵巣切除ラットにおいて拘束に起因する白血球(WBC)数に対するＥＦ曝露の効果を示す。レベルは、６０分のセッション(ｎ＝６)の後に検査された。データは、中央値、２５パーセンタイル、７５パーセンタイル、最小および最大値として示した。*:非処理グループからのＰ＜０．０５。一般に、観察された拘束依存の変化は、白血球(WBC)の数値に関するものであった。非処理グループ、拘束のみのグループ、ＥＦ曝露グループおよびジアゼパム投与グループにおけるWBC値は、７８、９９、９６および８５(x 102 細胞/μl)(図４１)を示した。統計分析の結果、拘束された動物におけるＷＢＣ値は、卵巣切除ラットにおける非処理グループのそれら(Ｐ＜０．０５:スチューデントt検定)より著しく高かった。ＥＦ曝露グループまたはジアゼパム投与グループにおけるWBC値は、非処理グループより高い傾向があり、拘束のみのグループより低かった。
【０２３６】
実施例１２
脳波図研究
【０２３７】
６匹のラットを、７日間、１日当たり１５分間１７，５００V/mと見積もられた電界に曝露した。動物の電界曝露に使用した装置は、(前述した)ヘルストロン曝露ケージであった。６匹のラットを対照(疑似曝露)として使用した。以下のパラメータ(終了点)が観察された。 脳波異常検出、各ＥＥＧレベル・グループのパーセンテージ(覚醒、休止、徐波軽睡眠、徐波深睡眠、速波睡眠 )、および前頭皮質ＥＥＧパワー・スペクトル・デルタ(１〜３．８７５Hz)、シータ(４〜１５．８７５Hz)、アルファ(８〜１２Hz)、ベータ1(１２．１２５〜１５．８７５Hz)およびベータ２(１６〜２５Hz)のパーセンテージ。７，０００Ｖ(１７，５００Ｖ／ｍ)で１５分間繰り返し曝露したところ、徐波軽睡眠レベルの著しい増加が初日の１〜２時間の間観察された。７日目においては、曝露後０〜３０分の休憩ステージおよび覚醒段階の著しい減少が観察された。覚醒段階の著しい減少および徐波軽睡眠段階の著しい増加は、曝露後０．５〜１時間の間観察された。覚醒段階の著しい減少および徐波深睡眠段階の著しい増加は、曝露後１〜２時間の間に観察された。さらに、徐波軽睡眠段階の著しい増加が、曝露後２〜４時間の間観察された。
【０２３８】
自発的ＥＥＧ波タイプあるいは行動異常は観察されなかった。電界への繰り返しの曝露が、ラットの前頭皮質の周波数解析に関する如何なる神経学上の心配を示すことを示唆するものはなかった。
【０２３９】
Ｅ．追加疾患あるいは病気
【０２４０】
電解質平衡異常の治療のために、細胞膜上に生成される平均誘導電流密度は、好ましくは約０．４ｍＡ/ｍ２〜約６．０ｍＡ/ｍ２、より好ましくは約０．４ｍＡ/ｍ２〜約５．６ｍＡ/ｍ２、更に好ましくは約０．４３ｍＡ/ｍ２から約５．５５ｍＡ/ｍ２である。
【０２４１】
関節炎の治療のためには、細胞膜上に生成される平均誘導電流密度は、好ましくは約０．０２５ｍＡ/ｍ２〜約０．３５ｍＡ/ｍ２、より好ましくは０．０２５ｍＡ/ｍ２ないし０．３５ｍＡ/ｍ２、最も好ましくは約０．０２６ｍＡ/ｍ２から約０．３２ｍＡ/ｍ２である。
【０２４２】
過度な体重の治療のためには、細胞膜上に生成される平均誘導電流密度は、好ましくは約０．０２ｍＡ/ｍ２〜約１．５ｍＡ/ｍ２、より好ましくは０．０２ｍＡ/ｍ２いし１．２ｍＡ/ｍ２、最も好ましくは約０．０２４ｍＡ/ｍ２から約１．１２ｍＡ/ｍ２である。
【０２４３】
また、本発明は、筋骨格および結合組織障害の予防あるいは治療に役立つ。これらの障害には、例えば、骨粗しょう症(老年性、二次的、かつ特発性の若年性を含む)、骨薄障害、セリアック病、熱帯性下痢、粘液嚢炎、硬皮症、クレスト症候群、シャルコー関節、骨折の適切な修理、および断裂した靭帯および軟骨の適切な修復が含まれる。また、本発明は、関節リウマチ、免疫抑制障害、神経痛、不眠症、頭痛、顔面神経麻痺、神経症、関節炎、関節痛、アレルギー性鼻炎、ストレス、慢性膵炎、ディジョージ（DiGeorge）異常、子宮内膜症、尿路閉塞、偽性痛風、甲状腺障害、副甲状腺障害、下垂体前葉機能低下症、胆石、消化性潰瘍、唾液腺障害、食欲障害、悪心、嘔吐、口渇、過度の尿生産、眩暈、良性発作性頭位眩暈、無弛緩症また他の神経の障害、急性腎不全、慢性の腎不全、拡散した食道痙攣、および一過性脳虚血発作(ＴＩＡ)、にも役立つ。また、発明は、浸透圧重量モル濃度およびその維持、また浸透圧アンバランスに関する疾患あるいは障害を含む追加の腎障害の治療に役立つ。
【０２４４】
Ｆ．ＥＦ治療装置
【０２４５】
ＥＦ装置は、個体が置かれる電界を生成するように設計される。図４２に示されるように、電界は対象全体を包含しうる。あるいはこれに代えて、電界を、対象の特定の領域あるいは器官だけを包含するようにしても良い。
【０２４６】
図４３は、本発明の実施形態を示す高電圧発生装置(１)の模式図である。すなわち、この電位治療装置(１)は、電位治療装置(２)、高電圧発生装置(３)および商用電源(４)からなる。電位治療装置(２)は、被治療者(５)が座る肘掛け(６)付き椅子(７)と、椅子の上端に付けられ、被治療者の頭(５)の上部に配置された対向電極としての頭部電極(８)と、被治療者(５)が上面に足を置く主電極であるオットマン電極としての第２電極(９)とを備えている。主電極である第２電極(９)に対向する電極としての頭部電極(８)は、天井、壁、床、家具あるいは部屋の他の物あるいは部分であっても良い。高電圧発生装置(３)は、頭部電極(８)および第２電極(９)に電圧を印加するために高電圧を発生する。高電圧発生装置(３)は、通常、椅子（７）の下で、脚の間で床の上に、あるいは椅子(７)の近辺に配置される。第１すなわち頭部電極(８)と患者の頭の頂部との間の距離(ｄ)は変更可能である。絶縁材料で頭部電極(８)および第２電極(９)が囲まれている。この第２電極(９)は、電気コード(１１)によって、高電圧発生装置(３)の高電圧出力端子(１０)に接続されている。また、頭部電極(８)および第2電極(９)に電圧を印加するために、高電圧出力端子(１０)が備えられている。さらに、椅子(７)および第２電極(９)は、床と接触する部位に絶縁体(１２)(１２)’を有する。
【０２４７】
更に別の構造を備えた電位治療装置(２Ｃ)は、図４４Ａ[斜視図]および図４４Ｂ[黒で描かれた被治療者(5)およびそれぞれの電極の位置関係を図示する側面図]に示されるタイプの椅子を備えている。椅子(７ａ)は、被治療者(５)を覆う正面開放カバー本体(３４)を備えている。このカバー本体(３４)は、被治療者(５)の頭を受け入れる対向電極としての第１電極(８ｃ)、主電極としてのオットマン電極である第２電極(９ｃ)、および座った姿勢で肩から腰の位置に配置され、腰上部位置に配置される対向電極としての別の第１電極(８０ｃ)を備えている。別の第１電極(８０ｃ)は、側面から被治療者(５)の身体をカバーするように複数の側面電極(８０ｃ')を備えている。好ましくは、第１電極(８ｃ)は人体頭部分に沿って配置され、別の第１電極(８０ｃ)は両方の肩から腰まで長手方向に沿う複数の段階に配置される。これら第１電極(８ｃ)、別の第１電極(８０ｃ)、側面電極(８０ｃ')および第２電極(９ｃ)は、絶縁材(３５)内に配置されている。絶縁体で作られていた取り外し可能なクッション・部材が、カバー本体(３４)に取り付けられている。而して、厚さの異なる利用可能なクッション・メンバーを取り付けることによって、人体表面と第１電極(８ｃ)、(８０ｃ)、(８０ｃ')との間の距離を変更することができる。そのような電位治療装置(２ｃ)において、上述したように、誘導電流制御手段は、体表面電界を制御し、対向電極としての第１電極(８)(８０ｃ)(８０ｃ’)および第２電極（９ｃ）に印加される印加電圧および第１電極(８ｃ)(８０ｃ)(８０ｃ’)と人体主要部の表面との間の距離(ｄ)を可変し、あるいは第１電極(８ｃ)(８０ｃ)(８０ｃ')および第２電極（９ｃ）に印加される印加電圧を制御することによって、そしてさらに、第１電極(８ｃ)、(８０ｃ)、(８０ｃ')と人体表面との間の距離(ｄ)を変更することによって、人体の主要部のそれぞれの領域に極微量の誘導電流を流すことができる。
【０２４８】
別の構造を備えた電位治療装置(２Ａ)を、図４５Ａ[斜視図]および図４５Ｂ[側面図]に示す。この電位治療装置(２Ａ)はベッド・タイプである。被治療者(５)を覆うためのボックス(３２)はベッド・ベース(３１)上に配置されている。それぞれの電極がこのボックス(３２)に備えられている。要するに、対向電極としての第1電極(8a)と主電極として人体の脚部分に配置される第２電極(９ａ)を備えている。第２電極(８ａ)は、人体の頭、肩、腹、脚および臀部あるいは他の領域に配置される。また、好ましくは、第１電極(８ａ)は、人体の肩、腹および臀部にほぼ等しい形状、幅および面積を有する。これらの図面における空白の領域は、電極が配置されない地点を示す。電極は絶縁体(３３)内に配置される。絶縁体(図示略)からなるクッションが、ベッド・ベース(３１)上のそれぞれの電極上に配置されている。そこで、異なる厚さのクッションが準備されている。
【０２４９】
前述の図４３において、頭上の頭部電極(８)と被治療者(５)の人体主要部表面間の距離(ｄ)は約１〜２５ｃｍにセットされ、図４４Ａにおいて第１電極(８ｃ)(８０ｃ)(８０ｃ')と被治療者(5)人体主要部表面との間の距離(ｄ)は、１〜２５ｃｍ、好ましくは４〜２５ｃｍにセット、そして図４５Ａにおいて、第１電極(８ａ)(８ｂ)と被治療者(5)主要部表面との間の距離(ｄ)は、好ましくは３〜２５ｃｍセットされる。
【０２５０】
図４６の電気的構成のブロックダイヤグラムとして以下に述べるように、高圧発生装置（３）は、商用電源の電圧１００ｖ  ＡＣを例えば１５，０００ｖに昇圧するブースター変圧器（Ｔ）と、個々の電極に流れる電流を制限する電流制限抵抗器（Ｒ）、（Ｒ’）とを有する。高圧発生装置（３）は、ブースター・コイル（Ｔ）の中間点（ｓ）が接地され、接地電圧が昇圧された電圧の半分に設定された構成を有する。この高電圧生成装置(3)は、ブースター・コイル(Ｔ)の中間点(ｓ)がアースされ、接地電圧が昇圧電圧の半分にセットされる構成となっている。図示仮想線によって示されるように、ポイント(s’)を接地しても良い。図４６のブロックダイヤグラムが示すように、高電圧側中間点(ｓ)がブースター変圧器(Ｔ)によって接地された高電圧は、高電圧生成装置(３)の電圧コントローラー(１３)を通過する１００ＶのＡＣ電力源から得られる。また、さらに、それぞれの高電圧は、人体を保護するために電流制限抵抗器(Ｒ)(Ｒ’)を介して頭部電極(８)(８ｃ)等（下記参照）および第２電極(９)、（９ｃ）等（下記参照）に接続される。また、電位治療装置(１)は誘導電流制御手段を備えている。この誘導電流制御手段は、頭部電極(８)および第２電極(９)に印加される印加電圧、頭部電極(８)と人体主要部表面との間の距離(ｄ)を変えることによって、あるいは、頭部電極(８)および第２電極(９)に印加される印加電圧を制御することによって、あるいは頭部電極(８)と人体主要部表面との間の距離(ｄ)を変えることによって、身体主要部電界を制御して極微量の誘導電流を被治療者(５)の人体主要部を構成するそれぞれの領域に流すようにすることができる。人体表面と第１電極(８ａ)との間の距離(ｄ)は、ベッド・ベース(３１)上に厚さの異なるクッションを置くことにより容易に変更できる。
【０２５１】
高電圧が電位治療装置(１)に印加された状態でさえ誘導電流を増加させれば、より高い治療効果が、従来方式と同等の時間で得られる。さらに、その治療は以前より短い時間内に終らせることができる。また、さらに、同じ治療効果を得るために、先行技術と同じ値の誘導電流を、より低い電圧で以前と同じ治療時間で得ることができる。
【０２５２】
本発明の電位治療装置(１)は、高出力電子雑音、ハイ・レベルの無線周波雑音および強磁界を、できるだけ除外するように設計されている。電位治療装置(１)と干渉する電磁界の影響を低減するため、電子部品、半導体、パワーコンポーネント(サイリスター、トライアック等)電子タイマー、あるいはＥＭＩに敏感なマイクロコンピュータで設計・製造するのではなく、機械駆動スイッチ、リレー、および電動モーターあるいは、電気タイマーあるいは他の電気部品を使用することが望ましい。しかしながら、電子機能部品として、発光ダイオード電源用の電子シリアルバス・スイッチングレギュレーターは有効である。また、この発光ダイオードは、本発明の電位治療装置がアクティブ状態であるかインアクティブ状態であるを被治療者やオペレーターへ通知するための光源として使用される。
【０２５３】
上述のとおり、図４７Ａ、図４７Ｂおよび図４７Ｃに示されるように、疑似人体(ｈ)がＥＦと誘導電流を測定するために使用されうる。この疑似人体(ｈ)はPVCで作られており、その表面は銀および塩化銀の混合溶液で被覆されている。これにより実際の人体の抵抗と同等の抵抗（１ＫΩ以下）になっている。疑似人体(ｈ)は、看護シミュレーターとして世界的に使用されており、その寸法は、平均的な人体、例えば身長１７４ｃｍ、に近似している。寸法は、表８に記述されている。
【０２５４】
【表８】
2006167476.tif 000010
【０２５５】
体表面電界は、疑似人体(ｈ)の測定領域へディスク形の電界測定センサー(ｅ)を付けることにより測定される。その測定は、115V/60Hzおよび120V/60Hzの状況下で行う。
【０２５６】
誘導電流の測定方法およびその装置が図４８に示されている。誘導電流測定装置(２０)において、図４７Ａおよび図４７Ｂに示されるように、疑似人体(ｈ)は椅子（７）に通常の座位状態におかれる。対向電極である、頭の上方の頭部電極(８)は、疑似人体(ｈ)の頭の上から１１cmとなるように調節され配置されている。測定は、例えば図４８のｋ−ｋ’線部分のようなそれぞれの部分を測定し、光学トランスファーを介して誘導電流波形を移送し、そして、誘導電流測定装置(２０)の接地側でこの波形を観察することにより達成される。ここに印加電圧は１５，０００Ｖである。この測定法では、疑似人体(ｈ)の各領域のセクションで引き起こされた電流の測定は、２本のリード線を用いて疑似人体(ｈ)のセクションを横切って流れる電流の短絡回路（図示略）を作ることによって誘導電流を得る。測定された誘導電流は、Ｉ／Ｖコンバーター(２３)によって電圧信号に変換される(図４８)。次に、この電圧信号は伝送側で光学アナログデータ・リンクによって光学信号に変換される。
【０２５７】
これら光学信号は光通信ケーブル(２５)によって、受信側の光学アナログデータ・リンク(２６)に運ばれ、電圧信号に変換される。その後、この電圧信号は、波形観察および分析レコーダーによる周波数解析用の周波数分析器(２７)によって処理される。バッファーと加算器は、送信側（図示略）でＩ／Ｖコンバーター(２３)と光学アナログデータリンク(２４)との間に配置される。而して、１１５V/６０Hzおよび１２０V/６０Hzで測定された電界値および誘導電流は、疑似人体(ｈ)のそれぞれの領域の位置で、表９に示される。電界値がこの表９と異なる場合、そこに流れる誘導電流値も異なることが知られている。したがって、懸念される各領域の電界を変更するによって、実際の人体主要部のそれぞれの領域で有効な誘導電流を得ることができることが明白であると思われる。
【０２５８】
【表９】
2006167476.tif 000011
【０２５９】
体表面電界Ｅは、次の式の使用により、図４８において示されるそれぞれの領域の誘導電流の測定法によって得られたそれぞれの領域の誘導電流値から得ることができる。すなわち、Ｅ=Ｉ/ε0ωＳ。ここで、Sは電界測定センサーの断面であり、ε0は真空における誘電率であり、Ｉは誘導電流であり、ωは2πfであり、またfは周波数である。それぞれの領域の誘導電流が前述の方法によって得られる場合、それぞれの領域の誘導電流密度Jは次の式を使用して得ることができる。すなわち、Ａ=2πr、B=πr2、B=A2/4π、J=I/B、ただし、Ａは周囲長であり、Bは円の面積であり、rは半径であり、Ｉは、測定電流であり、また、Jは誘導電流密度である。
【０２６０】
前述の誘導電流制御手段は、電位治療が行なわれるときに、頭部電極(８)の電圧および第２電極（９）への印加電圧をコントロールすることによって、人体主要部のそれぞれの領域で非常に少量の誘導電流を流れさせることができる。表１０は、次のものの中の関係を示す:(１) 鼻、首および胴の誘導電流(μA)、(２)鼻、首および胴の誘導電流密度(ｍＡ/ｍ２)および１２０V/６０Hzの印加電圧(kV)。同一印加電圧の下では、電流密度は、首が最も高く、次に高いのが胴であり、鼻が最も低くなる傾向がある。表１０中の誘導電流密度が１０ｍＡ/ｍ２未満であり、１０ｍＡ/ｍ２以下の電流密度は非電離放射線保護の国際委員会によって安全であることが確立されたものであることにご注意頂きたい。
【０２６１】
【表１０】
2006167476.tif 000012
【０２６２】
図４９は、鼻、首および胴における印加電圧(kV)と誘導電流(μA)の関係を示す。図４９に明らかなように、印加電圧と誘導電流は互いに比例する。
【０２６３】
表１１は、頭部電極(８)と頭の頂部との間の距離(ｄ)の関数としての人間の首における誘導電流および誘導電流密度の変化を示す。
【０２６４】
【表１１】
2006167476.tif 000013
【０２６５】
表１１は、１５cm以上の距離で、誘導電流が３０μAで安定することを示している。従って、距離を変えることにより誘導電流を変えるためには、距離は１５cm以下にしなければならない。図５０は、距離(ｄ)に依存する誘導電流の変化を示す。
【０２６６】
人間の腰痛の３００のケースを含む実験において、我々は、ＥＦが腰痛を治療するのに有効であると判断した。また、我々は以下のように最適のドーズおよびパラメータを判断した。要するに、最適のドーズ量は、人体の胴を構成する領域に流れる誘導電流値および誘導電流流通時間をコントロールすることにより得られる。あるいは、それは、第１電極電圧および第２電極電圧の印加電圧合計と適用時間の乗積をコントロールすることにより得られる。腰痛については、ＥＦ治療効果は、約１０kVから約３０kV、好ましくは１５kVの電圧で約３０分間それを適用することによって最適化される。換言すると、約３００kV/分から約９００kV/分、好ましくは約４５０kV/分である。
【０２６７】
表１２は、表８の疑似人体(ｈ)の次元を考慮して、疑似人体(ｈ)の胴を構成するそれぞれの領域のセクションで１１５V/５０Hzで測定された誘導電流値と、この誘導電流値から計算で得られた誘導電流密度とを示す。表１２から、人体の胴を構成するそれぞれの領域における誘導電流(Ａ)の測定値と、誘導電流密度(ｍＡ/ｍ２)の計算値は、以下のとおりである。目;１８/０．８、鼻;１４／１．３、首;２７／３．１、胸;４４／０．９、胃の穴;８．６／１．６、また胴;９１／２．８。
【０２６８】
【表１２】
2006167476.tif 000014
【０２６９】
さらに、前述の誘導電流および誘導電流密度に基づいて、１２０V/６０Hzでの誘導電流および誘導電流密度は、次の式１および式２によって計算される。
式１：
誘導電流；
Ｉ（６０Ｈｚ）＝Ｉ（５０Ｈｚ）ｘ６０／５０ｘ１２０／１１５
式２：
誘導電流密度；
Ｊ（６０Ｈｚ）＝Ｊ（５０Ｈｚ）ｘ６０／５０ｘ１２０／１１５
【０２７０】
表１３は、１２０V/６０Hzでの人体胴であるそれぞれの領域の誘導電流および誘導電流密度の計算結果を示す。表１３から、人体の胴を構成するそれぞれの領域における誘導電流(Ａ)の測定値および誘導電流密度(ｍＡ/ｍ２)の計算値は以下のとおりである。目;２３／０．９、鼻;３０／１．７、首;３４／３．９、胸;５５／１．２、胃の穴;１１／２．３、また胴;１１４／３．６。
【０２７１】
【表１３】
2006167476.tif 000015
【０２７２】
電極と人体領域の間の距離が固定される場合、前記印加電圧および人体の胴のそれぞれの領域を流れる前記誘導電流は比例関係にある。したがって、人体が椅子で治療される場合、最適のドーズ量は印加電圧と適用時間の乗積をコントロールすることにより得ることができる。というのは、もし電極と人体の間の距離が、最大公約数的な方法で決定されるなら、人体のそれぞれの領域の電界強度は印加電圧によってほとんど決定されるからである。
【０２７３】
熟練した者であれば、印加電圧の大きさ、および電流密度もまた、ヘルストロン（Healthtron） HES-30TM装置(白寿社)のような、適切な電界装置を使用してコントロールされうる、ということを理解するであろう。例えば、生体試料がある状態で生成された誘導電流は、ＥＦが印加される電極のポテンシャルを上げることにより増加しうる。他の適切な装置は熟練した者に知られており、００２９８装置(白寿社)、ＨＥＦーＫ９０００装置(白寿社)、ＨＥＳ-１５Ａ装置(白寿社)、ＨＥＳ−３０装置(白寿社)、ＡＣ／ＤＣ発電機(三協社)および関数発生器SG4101(岩通社)が含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的な装置のいくつかの特徴はそれらの装置用の仕様書と共に表１４において示す。
【０２７４】
本発明の方法に有用な追加の電界装置には、、米国特許第４，０９４，３２２号に開示された電界発生装置があり、上記特許の開示内容はそっくりそのまま参照としてこの明細書の開示内容として組み込まれる。この治療の装置は、装置上に横たわる患者の希望部位に電界を直接的に適用することが可能である。他の電界装置は、米国特許第４，０３３，３５６号、米国特許第４，２９２，９８０号、米国特許第４，８０２，４７０号およびどれが各々の参照によってその全体にここに組み入れられるかというイギリス特許第GB ２，２７４，５９３号に開示されており、上記特許の開示内容はそっくりそのまま参照としてこの明細書の開示内容として組み込まれる。
【０２７５】
表１４は、本発明の方法と共に使用されうる選択されたＥＦ装置の特記仕様書を提供する。
【０２７６】
【表１４】
2006167476.tif 000016
【０２７７】
均質だが不規則な形に作られた人間モデルにおける６０Hzの電界によって引き起こされた電流密度分布は、２段階有限差分手続きを使用して計算された(ハート、エフ．エックス．（Hart, F.X.）, バイオエレクトロマグネティクス 11:213-228 (1990))。１０kV/mの電界に曝露された非接地の人間のモデルの場合については、背中の下部の高さの胴を通る平面における誘導電流密度は、１．１４ｍＡ／ｍ２であった(図５１)。他の位置での電流密度は０．８〜３．５ｍＡ／ｍ２の範囲であった。正確な値は、モデルと接地の間の容量結合に依存したが、結合条件の合理的な範囲は、計算された電流密度の2のファクター未満の変化に帰着した。同様の結果は他の者によって見い出された(ガンディ、オー．ピー．（Gandhi, O.P.） & チェン、ジェイ．ワイ．（Chen, J.Y.）, バイオエレクトロマグネティクス  サプリメント（Bioelectromagnetics Suppl.） 1:43-60 (1992); キング、アール．ダブリュ．ピー．（King, R.W.P.）, IEEE Trans. Biomed. Eng. 45:520-530 (1998))。
【０２７８】
有限差分時間領域方法は人体の解剖学的に基づいたモデルにおける誘導電流を計算するために使用された(ファーセ、シー．エム．（Furse, C.M.） & ガンディ、オー．ピー．（Gandhi, O.P.）、 バイオエレクロトマグネティクス19:293-299 (1998))。その計算は以前に可能であったなよりはるかに大きな分解能を可能にした、スーパー・コンピューター上で行なわれた。モデルにおける特定の組織で引き起こされた電流密度のために得られた結果は、表１５に示される。比較可能な結果は太った筋肉(バイオ医学のチャン、エイチ．アール．（Chuang, H.-R.） & チェン、ケー、エム．（Chen, K.-M.）, IEEE Trans.。Eng。36:628-634(1989))およびまた骨頭脳(ハート、エフ．エックス．（Hart, F.X.） & マリノ、エイ．エイ．（Marino, A.A.）, Med. Biol. Eng. Comp. 24:105-108 (1986))を含む組織の合成模型を使用する他のものによって見つかった。
【０２７９】
【表１５】
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【０２８０】
実施例１３
電場(EF)への曝露:  人間患者中のいくつかの臨床症状に対する緩和効果
【０２８１】
電界曝露装置(ヘルストロン(モデルHES、株式会社白寿生科学研究所、東京、日本))が使用された。ヘルストロンは昇圧器(回路における電圧を制御するための装置)、腰掛および電極を含む。２つの対向する電極のうちの1つに高電圧を印加して、２つの電極間のスペースに一定の電位差を形成しＥＦを形成する。
【０２８２】
ユーザは、曝露期間中、快適に着席し、本を読んだり眠ることができた。電流の形成に起因する偶然の電気ショックを防ぐために、被治療者は、治療中、床あるいは誰か（オペレーターや電気に曝された他の人）との肉体の接触のどんな形式も認められなかった。絶縁体被覆電極は、足を乗せることを許された床および各患者の頭に置かれた。３０，０００ボルト(５０あるいは６０HzのＥＬＦ（超低周波数）)の初期電力が、足に置かれた電極に印加され、足および頭に位置する電極間にＥＦを生成した。電気への曝露は１セッション当たり３０分間続き、曝露の頻度は、１日１回から１週間１回にばらついた。
【０２８３】
ヘルストロンの効能は、Yuichi Ishikawa医師の直接の監督の下で、東京港区の虎ノ門クリニックにて１９９４年８月１日から１９９７年６月３０日までのアンケート処理から得られた結果に基づいて評価された。合計１，２５３人の患者(４８９人の男性;７６４人の女性)がその装置を用い、そのうち５０５人(２０８人の男性、２９７人の女性)がクリニックを訪れて、ヘルストロン装置を使用し、少なくとも２回その装置を使用した。他のものは２度以上装置を使用したかもしれない。アンケートにおけるエントリーの主観性の範囲を減じるために、ヘルストロンの緩和効果の評価はこれらの505人の患者に制限された。
【０２８４】
すべてのヘルストロン・ユーザは医師によって世話され、以前の訪問中の装置の緩和効果についてインタビューされた。そのインタビューは、主な肉体の病訴(=徴候)、過去の病歴および治療、ヘルストロンの利用頻度およびその緩和効果を含む使用後の印象およびユーザがヘルストロンを個人的に持っているか、に関する問題を含んでいた。最初の病院受診時の徴候の厳しさを３とし、ヘルストロン治療の後の厳しさを５等級に分類された:すなわち、非常によい(５);よい(４);不変(３);悪化した(２);そして、高度に悪化した(１)。非常に良いおよび良いは、「軽減される」に分類された。また、曝露の頻度/間隔にかかわらず緩和の日数も、同様に記録された。
【０２８５】
結果
【０２８６】
患者の年齢は２０〜９０歳の間で、４０歳以上が８５．３％であった(表１６)。２０８人の(４１%)男性および２９７人の(５９%)女性がいた。異なる５５の徴候が識別された。また、ヘルストロン治療で徴候毎の緩和を報告した患者の割合は、表１６において要約される。少なくとも１０人の患者によって識別された徴候は、手足の冷え、疲労、頭痛、高血圧症、不眠症、関節痛、低腰背痛、手足の痛み、皮膚そう痒症、手足におけるしびれ感、肩/頸痛、およびこり。ヘルストロン治療の緩和効果は、熱を伴うことのない、また蜘蛛膜下あるいは脳出血の為の療法を用いていない、あるいは炎症の無い頭痛(９１．７％)、関節痛(６６．７％)、腰痛(５７．３％)、肩/頸痛およびこり(５６．０〜５７．８％)、疲労(５５．０%)の緩和、で明白だった。面白いことは、運動器官(頭、関節、肩、首、手足および腹)に影響する、痛みに関連する徴候に対する緩和効果は、２９９のケースのうちの１７５(５８．５％)を記録した。痛みに関連する徴候は、外傷に帰せられなかった。皮膚そう痒症を持った１０人の患者中、４人が軽減されたと主張したが、臨床徴候は最初の治療後に１人の患者において悪化した。
【０２８７】
【表１６】
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【０２８８】
表１７は、５０５人の患者において５５の識別された臨床症状の緩和割合を示す。
【０２８９】
【表１７】
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【０２９０】
図５２は、５０５人の患者において、ヘルストロン治療の頻度／間隔に関係なく1つの徴候当たりの緩和平均期間を示す。識別された徴候の多くの中の小サンプルサイズ、研究者がアンケートから生成されたデータに単に依存した本研究の固有の制限を考慮して、我々は、50%を越える緩和割合を示す少なくとも１０人の患者によって識別された徴候にのみ治療の緩和効果の持続性が正当に記述され得ると信じる。約５０日間続いた疲労の緩和；関節、背中下部および肩／頚部硬直は、１００日弱間軽減された。他の多くの徴候に記された緩和のより長い平均期間は、治療の真の効果ではなくサンプル・サイズの反映でありえる。
【０２９１】
Ｇ．電気的治療パラメータを最適化する方法
【０２９２】
使用に起因しうる望まれない副作用を回避しながら、発明のパラメータ範囲の選択および選択は治療のツールとしてのＥＦの利用を可能にする。従って、その発明は、特定の生物学の結果を達成し、かつ望まれない副作用を回避する治療のツールとして、訓練された個人がＥＦを使用できるパラメータおよびそれらの使用の範囲を提供する。
【０２９３】
ＥＦ治療用の最適のパラメータを決定する好ましい方法は次のステップを含んでいる:
(ｉ)生体物に誘発するべき所定の生体応答を識別すること;
(ｉｉ)生体物における、あるいは生体物に由来した組織サンプルあるいは培養における細胞の細胞膜上の平均の誘導電流密度の選択あるいは測定;
(ｉｉｉ)生体物、サンプルあるいは培養からの特定の距離で選択され、測定された誘導電流密度を生成する外部電界の選択あるいは測定;
(ｉｖ)細胞膜上の選択されあるいは測定された誘導電流密度を生成する連続的期間の選択あるいは測定;
(ｖ)生体物、サンプルあるいは培養に、選択されあるいは測定された連続的な期間の細胞膜上の選択されあるいは測定された誘導電流密度を生成するために選択されあるいは測定された電界を適用すること;
(ｖｉ)所定の生体応答が起こる範囲を測定すること;
(ｖｉｉ)  (ｉｉ)から（ｖｉ）のいずれかのステップを任意に繰り返すこと;
(ｖｉｉｉ)選択されあるいは測定された外部電界のために、あるいは最良に希望の生体応答を誘発する選択されたか測定された連続的な期間、選択されあるいは測定された誘導電流密度に対する値を識別すること。
【０２９４】
好ましくは、当該方法はさらに、ステップ(ｖｉｉｉ)の前に、選択されあるいは測定された誘導電流密度、選択されあるいは測定された外部電界、選択されあるいは測定された連続的な期間のいずれかの関数としての用量反応曲線を生成するステップを含む。さらに好ましくは、当該方法は、ステップ(ｖｉｉｉ)の前に、下記を選択あるいは測定するステップをさらに含む:ステップ(ｖ)が繰り返される回数、ステップ(v)の反復の間隔、および選択されあるいは測定された誘導電流密度が細胞膜上に生成される全時間。
【０２９５】
より好ましい実施形態は、次の特徴の１つ以上を含む。選択されあるいは測定された誘導電流密度が、約０．００１ｍＡ/ｍ２から約１５ｍＡ/ｍ２である、誘導電流密度は、生体物あるいはその部分の所定のセクションに流れる誘導電流を測定することによって、測定電流を電圧信号に変換することによって、電圧信号を光学の信号を変換し、ついで光学信号を電圧信号に再変換し波形と周波数を分析することによって、選択されあるいは測定される、および／または、外部電界(Ｅ)は式Ｅ＝Ｉ／ε0ωＳで選択されあるいは測定される。ただし、Sは電界測定センサーの断面積、oは真空の誘電率、Ｉは電流、ωは２πｆ、ｆは周波数である。
【０２９６】
印加電流処置の最適パラメータを決定する好ましい方法は次のステップを含む。
(ｉ)それの生体物あるいその部分に誘発すべき所定の生体応答を識別すること;
(ｉｉ)生体物における、あるいは組織サンプルあるいは培養における細胞の細胞膜上の平均印加電流密度の選択しあるいは測定すること、平均印加電流密度は、約１０ｍＡ/ｍ２から約２，０００ｍＡ/ｍ２である;
(ｉｉｉ)選択されあるいは測定された印加電流密度を生成する電流の選択あるいは測定、
(ｉｖ)選択されあるいは測定された印加電流密度を生成するために連続的な期間の選択しあるいは測定すること、
(ｖ)選択されあるいは測定された連続的な期間用の選択されあるいは測定された印加電流密度を生成するために選択されあるいは測定された電流を適用すること;
(ｖｉ)所定の生体応答が起こる範囲を測定すること;
(ｖｉｉ)選択されあるいは測定された電流、選択されあるいは測定された印加電流密度、あるいは選択されあるいは測定された連続的な期間の関数としてのドーズ-反応曲線を生成するためにステップ(ｉｉ)〜ステップ(ｖｉ)のいずれかを繰り返すこと、
(ｖｉｉｉ)選択されあるいは測定された印加電流密度のために、あるいは最良に所定の生体応答を誘発する選択されあるいは測定された連続的な期間のために、選択されあるいは測定された電流に対する値を識別すること。
好ましくは、当該方法はさらに、ステップ(ｖｉｉｉ)の前に以下を選択しあるいは測定する。ステップ(ｖ)が繰り返される回数、ステップ(ｖ)の反復時間の間隔、および印加電流密度が細胞膜上に生成される時の全面的な期間。
【０２９７】
発明者は、ある疾患を最適に治療するパラメータを割り出した。大まかにいうと、ＥＦ電圧(外因的)は、約５０kVと約３０kVの間の範囲において印加されうる。誘導電流密度は約０．００１ｍＡ/ｍ２から約１５ｍＡ/ｍ２の間の範囲において生成されうる。好ましくは、ＥＦ誘導電流密度は、約０．０１２から約１１．１ｍＡ/ｍ２、より好ましくは約０．０２６から約５．５５ｍＡ/ｍ２の範囲において生成される。
【０２９８】
印加電流密度は、約１０から約２，０００ｍＡ/ｍ２までの間の範囲において利用されうる。発明の別の実施形態では、印加電流約５０から６００ｍＡ/ｍ２の間の範囲において生成される。発明の更に別の実施形態では、ＥＦ印加電流は約６０から約１００ｍＡ/ｍ２の範囲において生成される。 
【０２９９】
表１８は疾患と病気の治療に好ましいパラメータ・セットを提供する。表１８は、パラメータ・セットが適用される特別の疾患、病気、器官あるいはシステムを提供する。値は近似であり、等価な範囲は発明によって予期されると理解されるが、表１８もまた特別のパラメータ値を提供する。
【０３００】
【表１８】
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【０３０１】
本発明は、また、ＥＦ特性、曝露の誘導電流密度、印加電流密度および期間のような、パラメータの所定のセットを決定する方法に関し、最大の望ましい効果が動物実験主題中で得られる。
【０３０２】
本発明の好ましい実施形態では、最適化の方法は次のステップを含む。生体物あるいはその部分に誘発される所望の生物学の効果(例えば、筋細胞における内部のカルシウムイオン・フラックスを引き起こす効果)の同定、平均の印加電流密度に対する、あるいは生体物あるいはその部分の細胞膜の誘導電流密度に対する値の選択であって、該値は、好ましくは、印加電流の場合、１０ｍＡ/ｍ２から約２，０００ｍＡ/ｍ２の範囲内に、誘導電流の場合、約０．００１ｍＡ/ｍ２から約１５ｍＡ/ｍ２の範囲内にある、選択された電流密度を生成する印加電流あるいはＥＦに対する値(周波数およびEF電圧のような)の決定、印加電流密度を生成する個別の期間の選択であり、該期間は、約２分から連続あるいは不連続の１０，０８０分の範囲内にある、選択された電流密度を生成する印加電流あるいはＥＦの適用、所望の生物学的効果が起こる範囲の決定、および前記ステップのうちのいずれかの反復。好ましくは、最適化手続きは、選択された値の関数としてのドーズ-反応曲線の生成を引き起こす。別の好ましい実施形態では、印加電流あるいはＥＦに対する値は、生体物の身体形態学、重量、体脂肪率、および細胞膜上の電流の誘導に関連する他の要因を考慮して、決められる。
【０３０３】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞性膜を横切ってイオン・フラックスの生体内の調整に使用されたパラメータは、表１９において示されたコンビネーションによって例証される。本発明の他の実施形態では、細胞性膜を横切ってイオン・フラックスの生体外の調整に使用されたパラメータは、表２０において示されたコンビネーションによって例証される。
【０３０４】
【表１９】
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【０３０５】
【表２０】
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【０３０６】
代替実施形態では、本発明は、個体が特定の疾患あるいは症状を被っているかどうか決定する為の診断のツールとして有用である。疾患あるいは症状の予防、改善および治療に関連した特定のパラメータは、同じ疾患あるいは症状の存在を検知するのに役立ちうる。それらパラメータは、症候、および反応性のためにモニターされた効果として適用できる。患者が、疾患に関連したパラメータの与えられたセットに反応しなければ、レスポンスの欠如は患者が特別の疾患あるいは症状を被っていないことを示唆する。あるいは、患者が、(疾病に関係した)パラメータの与えられたセットに反応すれば、レスポンスの存在は、特にその疾患および／または症状の存在を示す。本発明の診断の実施形態は、ＥＦパラメータの特定のセットが割り出されたすべての疾患および／または症状に使用されうる。
【０３０７】
前述の説明および実施例に特に記載されたことの他にも、本発明を実施しうること明らかである。本発明の多数の改良および変更は、上述の教示に照らして可能であり、したがって、特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
【図１】図１はＥＦ曝露システムにおけるフィールド曝露ディシュを示す。
【図２】図２は、ＥＦ曝露直後の生存細胞のパーセンテージを示す。
【図３】図３は、[１２．５μｇ/ml Con-Aを含むＥＦを曝露されたおよびされていない細胞浮遊液における[Ｃａ２＋]ｃ−ｈｉｇｈ細胞の数の著しい増加を示す。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ＣａＣｌ２の１ｍＭとあるいはそれなしで、Con-Ａの異なる濃度を含むＥＦ曝露された細胞における結果を要約する。
【図５】図５は、フィトヘムアグルチニン(ＰＨＡ)を含むＥＦ曝露されたあるいはされていない細胞において[Ｃａ２＋]Ｃ−ｈｉｇｈ細胞が著しく増加していることを示す。
【図６】図６は、０．０２５μｇ/ｍｌのCon-Aで刺激された細胞と比較した時、３．１２５〜１２．５μｇ/ｍｌのCon-Aを追加された時、ＥＦを曝露した細胞あるいは曝露されない細胞のいずれの[Ｃａ２＋]Ｃ−ｈｉｇｈ細胞は著しく増加していることを示す。
【図７】図７は、ラットに対するＥＦ曝露の効果をテストするためのＥＦ実験のための実験計画の概略図を示す。
【図８】図８は、５０ＨｚのＥＦ曝露がウィスターラットにおいてオペラント条件付けの誘因となることを示す。
【図９】図９は、電界（ＥＦ）曝露システムを示す。
【図１０】図１０は、４グループ間の血液学的な相違を示す。
【図１１】図１１は、ＥＦ曝露を始めて１４日後の血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度を示す。
【図１２】図１２は、ＥＦ曝露を始めて１４日後の血漿遊離脂肪酸（ＦＦＡ）濃度を示す。
【図１３】図１３は、カルシウム受容体抗血清を用いたときのアイゲンマニア（パネルＥ、Ｆ）およびアブラツノザメ（パネルＡ〜Ｄ）の電気受容器中のカルシウム受容体タンパクの局在を示す。
【図１４】図１４は、カルシウム受容体抗血清を用いたときのブラックゴースト（パネルＡ〜Ｆ）の電気受容器中およびアトランティックサーモン(Salmo salar)の腎臓中のカルシウム受容体タンパクの局在を示す。
【図１５】図１５は、単一の組織培養細胞プールから得られたＨＵＰＣａＲ細胞の６つの同一アリコットから得られたＦＵＲＡ−２比率をトレースしたときの複合図を示す。
【図１６】図１６は、１７回の異なった実験において、様々なＥＦ曝露あるいは擬似対照に供与されたＨｕＰＣａＲ細胞の基準値の比較から得られたＦＵＲＡ−２値の差異の概要を示す。
【図１７】図１７は、様々なＥＦ量に１０分間曝露した後のＵｎｔｘ−ＨＥＫ細胞より得られた標準化ＦＵＲＡ−２ベースライン値の概要を示す。
【図１８】図１８は、図１６および図１７の中で示されたＵｎｔｘ−ＨＥＫ細胞、ＨＵＰＣＡＲ細胞を用いた個々の実験におけるＦＵＲＡ−２比率解析の初期の５９秒間の平均標準化ＦＵＲＡ−２比率値の比較を示す。
【図１９】図１９は、前もって様々なＥＦ量に曝露させたＨｕＰＣａＲ細胞に対し、カルシウムイオンで繰り返し刺激を与えた後の平均標準化ＦＵＲＡ−２比率値の差異の概要を示す。
【図２０】図２０  文献  Quinn, S. et al. Sodium and ionic strength sensing by the calciumreceptor. J. Bil. Chem. 273:19579-19586 (1998)からの図２の複製
【図２１】図２１は、細胞外カルシウムイオン濃度を徐々に増加させたときにＨｕＰＣａＲ細胞の個々のプールのアリコットから得られた急速な増加（上のパネル）あるいはベースライン（下のパネル）のどちらかの数量化を示す。
【図２２】図２２は、図２１に示されるように様々な濃度のＮａＣｌを含む標準実験緩衝液に徐々にＣａＣｌ２を加えたときに生じるNa+/Ca2+比率の変化を示す。
【図２３】図２３は、イオノマイシンで標準化されたＦＵＲＡ−２値対Ｌｏｇ Na+/Ca2+ 比率として表示された図21からのＦＵＲＡ−２ベースラインデータの変化を示す。
【図２４】図２４は、ＥＦ曝露によってＨｕＰＣａＲ細胞に生じるＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化の大きさは細胞外液のNa+/Ca2+によって調節されることを示す。
【図２５】図２５は、２つの異なるNa+/Ca2+比率でのＥＦ曝露によって生じたＦＵＲＡ−２値のベースラインの変化で引き起こされるＥＦの概要を示す。
【図２６】図２６は、Na+/Ca2+比率を変えるために細胞外液へ塩化カルシウムを徐々に加えた後にＥＦが引き起こすＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化と反応の変化と間の関係の比較
【図２７】図２７は、塩化カルシウムを添加したときのＥＦが引き起こしたＦＵＲＡ−２ベースライン値とその結果引き起こされる反応の変化との関係の分散ダイヤグラムを示す。
【図２８】図２８は、ＨｕＰＣａＲ細胞内のＦＵＲＡ−２ベースライン値に対するＥＦ曝露の効果の概要を示す。
【図２９】図２９は、ベラパミルに曝露されたＨｕＰＣａＲ細胞ではＥＦが引き起こす細胞内のＦＵＲＡ−２ベースライン値の変化が起こらないことを示している。
【図３０】図３０は、カルシウム受容体タンパクを発現する哺乳動物組織の部分的なリストを示す。
【図３１】図３１は、脾細胞においてCon-Aが引き起こすカルシウムイオンの増加が上昇させた事を示す。
【図３２】図３２は、最終濃度０．４μＭのＡ２３１８７で刺激されたＢＡＬＢ  ３Ｔ３マウス胚細胞のＤｉＢＡＣ染色強度の経時変化を示す。
【図３３】図３３は、およそ２００μＡ/ｃｍ２の電流密度を生成する１００Ｈｚでの電場(ＥＦ)のＢＡＬＢ  ３Ｔ３における膜電位に対する影響を示す。
【図３４】図３４もまた、およそ２００μＡ/ｃｍ２の電流密度を生成する１００Ｈｚでの電場(ＥＦ)のＢＡＬＢ  ３Ｔ３における膜電位に対する影響を示す。
【図３５】図３５は、血漿副腎皮質刺激ホルモン(以下「ＡＣＴＨ」)におけるストレスの影響を示す。
【図３６】図３６Ａおよび図３６Ｂは、正常な(Ａ)および卵巣が切除されたラット(Ｂ)における血漿ＡＣＴＨレベルでのＥＦの曝露の効果を示す。
【図３７】図３７は、正常なラット(n=6)における血漿ＡＣＴＨレベルのＥＦ曝露の効果を示す。
【図３８】図３８Ａおよび図３８Ｂは、正常な(A)および卵巣が切除されたラット(Ｂ)についての制約に引き起こされた血漿グルコースレベル変化に対するＥＦ曝露の効果を示す。
【図３９】図３９Ａおよび図３９Ｂは、正常な(Ａ)および卵巣が切除されたラット(Ｂ)において拘束によって引き起こされた血漿乳酸レベルについてのＥＦ曝露の効果を示す。
【図４０】図４０は、卵巣が切除されたラットにおける拘束に引き起こされた血漿ピルビン酸レベルに対するＥＦ曝露の効果を示す。
【図４１】図４１は、卵巣が切除されたラットにおける拘束に引き起こされた白血球(ＷＢＣ)数に対するＥＦ曝露の効果を示す。
【図４２】図４２は、ＥＦ治療装置を用いて生成された電界の概念的輪郭を示すものであり、ここでは白寿生科学研究所から提供されたバイオニトロン（BioniTron）椅子を用いている。
【図４３】図４３は、本発明の好ましいＥＦ治療装置の概略図である。
【図４４】図４４Ａおよび図４４Ｂは別の好ましいＥＦ治療装置を示す。
【図４５】図４５Ａおよび図４５Ｂは別の好ましいＥＦ治療装置を示す。
【図４６】図４６は、ＥＦ治療装置の好ましい電気的構成図である。
【図４７】図４７Ａは模擬人体の正面図、図４７Ｂは斜視図、図４７Ｃは、ボディのネックに付けられたＥＦ測定センサーを示す図である。
【図４８】図４８は、ＥＦ治療装置によって生成された誘導電流の測定装置を示す。
【図４９】図４９は、印加電圧と誘導電流の関係を示す。
【図５０】図５０は、頭部電極の位置とネックに誘導された電流との関係を示す。
【図５１】図５１は、非接地状態にある人体の様々な位置における誘導電流密度(ｍＡ／ｍ２)を示す。
【図５２】図５２は、人間における各種徴候に対するＥＦ曝露の緩和効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２５】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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