(57)【要約】【課題】            マウスＥＳ細胞を、長期間細胞機能を保持したまま簡単に培養・増殖し得る方法を提供することを課題とする。【解決手段】        マウスＥＳ細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、培養することを特徴とする効率良くマウスＥＳ細胞を培養・増殖させる方法であり、使用する生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場が、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレートまたはポリ無水物からなる群から選択される多孔性ポリマーからなるシート状物であることを特徴とする前記のＥＳ細胞の増殖・培養方法である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＳ細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、培養することを特徴とする効果的なＥＳ細胞の培養・増殖方法。
【請求項２】
生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場が、多孔性ポリマーからなるシート状物であることを特徴とする請求項１に記載のＥＳ細胞の増殖・培養方法。
【請求項３】
多孔性ポリマーの材質が、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレートまたはポリ無水物からなる群から選択されるポリマーであり、多孔性ポリマーにおける孔径が２〜２０μｍであることを特徴とする請求項２に記載のＥＳ細胞の増殖・培養方法。
【請求項４】
ＥＳ細胞が、マウスＥＳ細胞である請求項１、２または３に記載のＥＳ細胞の増殖・培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚性幹細胞（Embryonic Stem Cell：ＥＳ細胞）を効果的に増殖・培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（stem cell）は、自己複製能と分化した細胞をつくる能力を併せもった細胞であり、種々の臓器においてこの幹細胞の存在が知られている。血液、皮膚、腸上皮、生殖器などの細胞は、いったん分化して成熟すると、それぞれ定まった寿命をもって死滅し、個体の寿命と比較すると、極端に短い寿命しか持たないものである。これを補給するために、未分化の幼若細胞が新たに増殖、分化、成熟して定常状態を保っている。このような幼若、未分化の親細胞が幹細胞である。
【０００３】
幹細胞の機能的な特性として、例えば以下のものが挙げられる。（１）未分化状態の維持能（組織特異的分化マーカーの欠失）、（２）増殖能力、（３）集合体としての自己複製能、（４）多くの分化した機能的子孫細胞の産生能、（５）損傷後の組織再性能、及び（６）適用性のある上記機能の選択能等である。
【０００４】
ところで、ＥＳ細胞（Embryonic Stem Cell）とは、この幹細胞（stem cell）の一つであり、動物初期胚の胚盤胞の内部細胞塊より樹立された細胞株で、癌化することなくin vitroで安定的に自己複製して、増殖することが可能な細胞である。胚盤胞内に戻すことで正常な発生過程をたどることから、個体の全ての細胞に分化できる性質（全能性）をもつとされる。
【０００５】
最近に至り、このＥＳ細胞の持つ再性能が注目され、幹細胞を用いた再生医療の可能性が話題になってきている。この現象は、1997年のクローン羊ドリーの誕生、1998年のヒト胚性幹（ＥＳ）細胞株の樹立などに負うところが多い。したがって、ＥＳ細胞は、再生医療の見地から見れば極めて興味深いものであり、効率的にＥＳ細胞を分化・培養する手段が求められていた。
【０００６】
しかしながら、ヒトＥＳ細胞については生命倫理、安全性に関する問題があり、短絡的にヒトＥＳ細胞を用いてその分化・培養を検討することはできない。したがって、これまで検討されているＥＳ細胞は、主としてマウスＥＳ細胞に関するものであり、マウスＥＳ細胞についての研究を基礎にして、生命倫理上問題のない状態で、はじめてヒトＥＳ細胞を用いた再生医療の検討が行われるべきものであるといえる。
そのために、マウスＥＳ細胞を用いた、効率的なＥＳ細胞の分化・培養手段の確立が求められていた。
【０００７】
ところで、ＥＳ細胞の分化能は一方向性ではない。すなわち、ＥＳ細胞の分化・培養によって増殖される細胞群は種々異なるものである。それに比較して体性幹細胞である組織幹細胞は、その分化は一方向性であることから、組織幹細胞の果たす重要性も着目され、発生・分化メカニズムの解明が積極的に行われてきている。
したがって、ＥＳ細胞について、その培養の結果、分化能に一定の方向性が見いだせれば、再生医療の進歩に極めて多大な貢献をするものであり、そのためＥＳ細胞について、効果的な分化・培養手段が求められているのが現状である。
【０００８】
すなわち、ＥＳ細胞の培養に関しては、その全分化能を維持したまま培養することがもっとも重要である。特に、胚発生において生殖系列細胞への分化は非常に初期段階で起こるために、ＥＳ細胞の分化によりこの生殖系列細胞への分化能が失われる恐れがある。また、培養中に染色体異常が起こることによっても、正常な胚発生が進まなくなる。
【０００９】
また、ＥＳ細胞は分化し易いのと同時に、非常に増殖が早いため、培養には十分な栄養が必要であり、その培養条件には特に気を配る必要がある。高密度あるいは低密度での培養は細胞を分化へ導くので、毎日培地交換を行い、二日ごとの植え継ぎが必要である。さらに培養の結果、その培養細胞が所望の機能を維持したまま増殖しているか否かは、実際にマウスに戻してみるまで分からない。しかし、戻してマウスが生まれるまでには約１ヶ月程かかり、戻らない場合もその原因を特定するのは困難であることから、培養にあたっては、可能な限りの細心の注意を払う必要があった。
【００１０】
これまで報告されているＥＳ細胞の培養に関しては、細胞の増殖に必要なタンパク質を合成・分泌し、さらにＥＳ細胞の足場となる、線維芽細胞層（フィーダー細胞：feeder cell）が必要であるとされている。
フィーダー細胞とは、増殖や分化を起こさせようとする目的の細胞の培養条件を整えるために用いる補助役を果たす他の細胞種、すなわち支持細胞種であり、通常フィーダー細胞は増殖しないようにあらかじめガンマ線照射や抗生物質によって処理しておく必要がある。ＥＳ細胞の場合には、マウス胎仔由来の線維芽細胞が用いられるが、実験の目的や細胞によってさまざまな細胞種がフィーダー細胞として用いられている。
【００１１】
また、フィーダー細胞は薬剤処理によりその増殖を停止させてあるが、この細胞の状態によっても、ＥＳ細胞の状態の良否が決まる。フィーダー細胞として、マウス１４〜１５日胚の線維芽細胞初代培養細胞や、線維芽細胞由来細胞株であるＳＴ０細胞等が用いられていた。
このように、ＥＳ細胞の培養・増殖に関しては煩雑なものであり、簡便であり、より確実な培養・増殖方法の確立が求められていた。
【非特許文献１】実験医学 増刊 Vol.19, No.15 (2001)
【非特許文献２】「肝細胞研究の先端」羊土社、２００３年５月発刊
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって本発明は、かかる現状に鑑み、ＥＳ細胞を、長期間細胞機能を保持したまま簡単に培養・増殖し得る方法を提供することを課題とする。
また本発明は、ＥＳ細胞を効率良く分化・培養する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明者は、細胞培養系の構築において、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場、すなわち細胞外マトリックス（ECM：Extracellular matrix）の利用に着目した。すなわち、一般に、細胞機能を保つような細胞培養系の構築においては、その培養足場が極めて重要なファクターであることが知られている。
【００１４】
事実ＥＳ細胞においては、上述したように細胞足場としてのフィーダー細胞としてＳＴ０細胞等が用いられていたが、このようなフィーダー細胞を使用することなく、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用して培養させることにより、ＥＳ細胞についてその細胞機能を有したまま長時間生存させ、かつ効果的に培養・増殖させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
したがって本発明は、ＥＳ細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、培養することを特徴とする効率良くＥＳ細胞を培養・増殖させる方法である。
【００１６】
具体的には、本発明は、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場が、多孔性ポリマーからなるシート状物であることを特徴とする前記のＥＳ細胞の増殖・培養方法である。
【００１７】
より具体的には、本発明は、多孔性ポリマーの材質が、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレートまたはポリ無水物からなる群から選択されるポリマーであり、多孔性ポリマーにおける孔径が２〜２０μｍであることを特徴とする前記するＥＳ細胞の増殖・培養方法である。
【００１８】
最も具体的には、本発明はマウスＥＳ細胞についても、上記した方法に基づくＥＳ細胞の増殖・培養方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、これまで細胞機能を保持したまま増殖・培養する場合に、細胞足場としてのフィーダー細胞としてＳＴ０細胞等が用いられていたが、このような他の細胞種であるフィーダー細胞を使用することなく、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用するものであり得ことから、極めて簡便な手段によりＥＳ細胞について、その全分化能を維持したまま培養することが可能となった。
したがって、これにより、ＥＳ細胞を用いた再生医療の構築に必要な基礎的事項を解明することが可能となる。
また、ＥＳ細胞についてその全分化能を維持したまま、簡便に培養・増殖し得ることから、ＥＳ細胞の分化の方向性について検討がより簡便に行える利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明が提供する方法により培養・増殖されるＥＳ細胞としては、哺乳動物のＥＳ細胞を挙げることができる。しかしながら、ヒトＥＳ細胞については、生命倫理、安全性の面の確立がいまだ問題とされており、したがって、より好ましくはマウスＥＳ細胞を挙げることができる。なお、ヒトＥＳ細胞に類するサルＥＳ細胞、例えばカニクイザルのＥＳ細胞であってもよい。
本発明は、これらのＥＳ細胞について、その細胞機能、すなわち全分化能を保持したまま培養・増殖することができる。
【００２１】
マウスＥＳ細胞の場合には、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６の雌とＣＢＡの雄のマウスを交配させたＦ１の４日目胚(胚盤胞)の内部細胞塊より樹立されたＴＴ２で、生殖系キメラマウスを効率良く作成することが確かめられている。このほか世界中で多くのＥＳ細胞株が樹立されており、多くは１２９系マウス胚より得られたＥＳ細胞株であり、これらのマウスＥＳ細胞を使用することができる。
【００２２】
上述したように、従来から、マウスＥＳ細胞の増殖・培養については、細胞の増殖に必要なタンパク質を合成・分泌し、さらにＥＳ細胞の足場となる、線維芽細胞層（フィーダー細胞）を用いた方法が知られていた。しかしながら、かかる方法では、非効率的であり、また用いるフィーダー細胞の状態によって、ＥＳ細胞の培養・増殖状態が大きく左右されている。
【００２３】
また、マウスＥＳ細胞の多分化能を維持するために、培養にあたって、LIF（白血病阻害因子：leukemia inhibitory factor）を使うことも提案されており、さらには他のサイトカイン（例えば、IL-6と可溶性IL-6レセプターの組み合わせ、IL-11、Oncostatin M、CNF、Cardiotrophin等）にも同様の効果があることが報告されている。
その点からみれば、マウスＥＳ細胞についてはフィーダー細胞なしの状態で、培養液中で少なくとも数回の継代においてはＥＳ細胞を維持することが可能になっているが、長期にわたるＥＳ細胞の培養・増殖が可能か否かは未だ不明である。
また、操作する人の個人差があり、低精度で効率的にＥＳ細胞を培養・増殖することは困難であり、コストが高い等の問題があった。
【００２４】
本発明の方法は、これらに比して低コストで、操作も簡単なものであって、効率的に精度良くＥＳ細胞を増殖・培養することができる点で特に優れた方法である。かかる方法は、基本的には、ＥＳ細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、効率よく行うことができる。
【００２５】
そのような培養足場として、多孔性ポリマーからなるシート状物を使用するのがよいことが判明した。すなわち、多孔性ポリマーの孔内にＥＳ細胞、あるいはその一部がはまり込み、目的をする細胞を効果的に、その全分化能を維持したまま培養・増殖できるのである。
【００２６】
この培養足場に利用する多孔性ポリマーの材質としては、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリ無水物等のポリマーが挙げられ、そのなかでも、ポリカーボネートのシートを好適に使用することができる。
このようなシートとしては、例えば、各種の孔径を有する市販のポリカーボネート製シート［例えば、Whatman社製：サイクロポア／Cyclopore（登録商標）やヌクレポア／Nuclepore（登録商標）］などがあり、これらを好適に使用することができる。
【００２７】
多孔性ポリマーにおける孔の孔径は、ＥＳ細胞が吸着し、培養されるために、２μｍ〜２０μｍ程度であることが必要である。この孔径が２μｍ未満であると、培養足場として使用したとしても、ＥＳ細胞を効率的に吸着・培養させることができず、また、２０μｍを超える場合には、培養足場としての機能が低下する。
【００２８】
かくして培養足場に捕獲・吸着したＥＳ細胞を培養・増殖するのであるが、培養に用いる培地としては、ＥＳ細胞を培養し得る培地であればどのようなものでも使用することができるが、未分化の状態を維持するために、培地もＥＳ細胞専用のものを使用するのがよい。
【００２９】
具体的には、培地としてDoulbecco Modified Eagle's Medium（DMEM）のhigh glucoseのものを使用して、添加する血清は分化誘導能がなく高濃度での使用でも毒性のないものを選んで使用するのがよい。また、所望によりLIF（白血病阻害因子：leukemia inhibitory factor）を添加することもできる。そのほかに、増殖補助のための非必須アミノ酸の添加、ヌクレオシドの添加、β−メルカプトエタノールを添加することもできる。
【００３０】
通常培養には通常１〜２週間を要するが、これにより効果的にＥＳ細胞が増殖・培養されていることが判明した。
得られたＥＳ細胞は、再度マウスに戻すことにより、その全分化能が維持されていることが確認された。
【００３１】
なお、これらの操作については、各種の一般成書等に既に発表されているので、それを参照に操作、確認することが可能である。
また、得られたＥＳ細胞に各種サイトカインを添加して培養することにより、種々の細胞、例えば、神経細胞、心筋細胞、β−細胞、赤血球・白血球、骨細胞、筋肉細胞等へ分化を確認することができる。
【実施例】
【００３２】
以下に本発明を、実施例に代わる試験例を記載することにより、更に詳細に説明する。
【００３３】
試験例１：培養足場の検討
生体培養材料としての培養足場における多孔性ポリマーの孔径の違いによるマウスＥＳ細胞の単離・精製に与える影響を検討した。
各種の孔径を有する多孔性ポリマーのシートを細胞培養プレートまたは培養用ペトリ皿の底に敷いて、シート上にマウスＥＳ細胞が乗るような状態とし、ＤＭＥＭのhigh glucose培地（LIFの添加なし）を用いて培養し、細胞のプレートへの捕獲・吸着を検討した。
その結果を、下記表１にまとめた。
【００３４】
【表１】
2006296253.tif 000002
【００３５】
＊１：培養足場プレート上の顕微鏡写真の結果、プレート上にＥＳ細胞の吸着がほんの僅かか、あるいはほとんど認めない。
＊２：培養足場プレート上の顕微鏡写真の結果、プレート上に多数のＥＳ細胞の捕獲・吸着を認める。
【００３６】
表中に記載のように、培養足場を使用することにより効果的にＥＳ細胞を捕獲していることが判明した。
【００３７】
試験例２：培養足場プレート上に捕獲・吸着したＥＳ細胞についての培養・増殖
試験例１で得られた培養足場プレート上に捕獲・吸着した各種細胞を、ＤＭＥＭのhigh glucose培地（LIFの添加なし）を使用して培養し、その細胞の増殖の程度を検討した。その結果、培養後７日目及び１４日目において、培養足場上に捕獲・吸着したＥＳ細胞は、効果的に増殖していることが判明した。
増殖したＥＳ細胞について、実際にマウスに戻してマウスの誕生を検討した結果、正常にマウスが生まれるており、その全分化能を維持していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上記載したように、本発明によりマウスＥＳ細胞について、その細胞が有する全分化能を保持したまま、安定して大量に培養・増殖することが可能となった。
したがって、これらの細胞を本発明方法により大量に培養することができることから、ＥＳ細胞を用いてその分化の方向性をより詳細に検討することができると共に、再生医療への応用を検討することができ、医療上の利用性は多大なものである。