(57)【要約】      （修正有）【課題】  効果が優れ、しかも副作用の心配のない発毛剤を開発する。【解決手段】  式（Ｉ）：2006273754.tif 000005［式中、.........は存在しても、存在しなくてもよい結合を表し；  ＸはＳ、ＮＨ、ＯまたはＳｅであり；  Ｙはヒドロキシル基、Ｏ、またはＯ−グリコシドである］で示されるジオスゲニンまたはその誘導体を含有する発毛剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2006273754.tif 000004
［式中、.........は存在しても、存在しなくてもよい結合を表し；
ＸはＳ、ＮＨ、ＯまたはＳｅであり；
ＸがＳまたはＳｅの場合には、同一または異なる構造を有する式（Ｉ）の化合物のＸとの間に結合を生じて二量体となってもよく、二量体を形成する場合の２つの分子のＸは同じものであり；
スピロ環は閉環していてもよく、開環していてもよく；
スピロ環が開環した場合、ＸにＨ、ＣＮ、またはアセチル基が結合してもよく；
Ｙはヒドロキシル基、Ｏ、またはＯ−グリコシドである］
で示される化合物を含有する発毛剤。
【請求項２】
化合物がジオスゲニン、ソラソジン、Ｋ−３、Ｋ−５、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７からなる群より選択されるものである請求項１記載の発毛剤。
【請求項３】
化合物がソラソジン、Ｋ−３、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７からなる群より選択されるものである請求項１記載の発毛剤。
【請求項４】
化合物がＫ−８である請求項１記載の発毛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発毛剤に関する。詳細には、本発明はジオスゲニンとその誘導体を有効成分とする発毛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の発毛剤・育毛剤が開発され、市販されている。これらの発毛剤・育毛剤の有効成分は天然物や合成物など様々であり効果も異なっている。しかしながら、本質的な発毛活性が認められている市販の育毛剤は今のところ、ミノキシジルを有効成分とするものだけである。しかしながら、ミノキシジルは元来血圧効果剤であり、その副作用が心配されるため、その用量に限度がある。このため、現在、製薬会社等でミノキシジルに代わる有効成分を含有する発毛剤・育毛剤の開発に向けた研究が活発に進められている。
【０００３】
最近、多くのヤマノイモ科植物に含まれるジオスゲニンを成分の１つとする育毛剤が販売されているが、ジオスゲニンの育毛効果に関する学術論文は見つかっていない。ジオスゲニンを保湿や抗菌を目的として含むヘアートニックなどの整髪料や化粧品も多数あるが、発毛効果は示されていない。特許文献１にはジオスゲニンが毛再生成分の１つとして挙げられているが、ジオスゲニンの直接的な発毛作用は示されていない。
【０００４】
ジオスゲニンの安全性については、間接的ではあるが、ジオスゲニンを３．５％程度含む、ワイルドヤム（Dioscorea Villosa）エキスに関して詳細な検討がなされている（International journal of toxocology 23, 49-54 (2004)）。この論文で、このエキスには種々の急性毒性、遺伝毒性、ホルモン様作用はなく、化粧品の添加物として用いることに関して、安全性に問題がないと結論づけている。
【特許文献１】特開２００１−５２６２００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
効果が優れ、しかも副作用の心配のない発毛剤を開発することが本発明の解決課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、ヤマノイモ科植物に含まれるジオスゲニンおよびその誘導体が優れた発毛効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、
（１）式（Ｉ）：
【化１】
2006273754.tif 000002
［式中、.........は存在しても、存在しなくてもよい結合を表し；
ＸはＳ、ＮＨ、ＯまたはＳｅであり；
ＸがＳまたはＳｅの場合には、同一または異なる構造を有する式（Ｉ）の化合物のＸとの間に結合を生じて二量体となってもよく、二量体を形成する場合の２つの分子のＸは同じものであり；
スピロ環は閉環していてもよく、開環していてもよく；
スピロ環が開環した場合、ＸにＨ、ＣＮ、またはアセチル基が結合してもよく；
Ｙはヒドロキシル基、Ｏ、またはＯ−グリコシドである］
で示される化合物を含有する発毛剤；
（２）化合物がジオスゲニン、ソラソジン、Ｋ−３、Ｋ−５、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７からなる群より選択されるものである（１）記載の発毛剤；
（３）化合物がソラソジン、Ｋ−３、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７からなる群より選択されるものである（１）記載の発毛剤；
（４）化合物がＫ−８である（１）記載の発毛剤；
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、優れた発毛効果を有し、副作用の心配のない発毛剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、式（Ｉ）で示されるジオスゲニンまたはその誘導体を含有する発毛剤に関するものである。以下に、本発明の発毛剤の有効成分である式（Ｉ）の化合物について説明する。
【００１０】
式中..........は存在してもよい、あるいは存在しなくてもよい結合を表す。したがって、平行した実線および点線で示された結合は一重結合または二重結合である。
式中ＸはＳ、ＮＨ、ＯまたはＳｅである。ＸがＳまたはＳｅの場合には、同一または異なる構造を有する式（Ｉ）の化合物のＸとの間に結合を生じて二量体となってもよい。二量体を形成する場合の２つの分子のＸは同じものである。Ｘが酸素、ＮＨ、イオウである場合、毛乳頭細胞に対する増殖促進活性（後述）は、この順番で高くなる。したがって、本発明において好ましい式（Ｉ）の化合物はＸがＮＨまたはＳである化合物であり、特に好ましい式（Ｉ）の化合物はＸがＳである化合物である。式（Ｉ）のスピロ環中は開環してもよい。スピロ環が開環した場合において、ＸにＨ、ＣＮ、またはアセチル基が結合してもよい。
【００１１】
式中Ｙはヒドロキシル基、Ｏ、またはＯ−グリコシドであり、Ｏである場合には式（Ｉ）のＡ環に二重結合にて結合する。構造式中に示すようにＡ環とＢ環とＥ環中に二重結合が含まれていてもよい。例えば、環ＡとＹとで共役ケトン構造を形成してもよく、Ａ環がキノイド構造であってもよい。Ａ環がキノイド構造である式（Ｉ）の化合物が本発明において好ましい。
【００１２】
表１に本発明の式（Ｉ）で示される化合物の典型例を示す。
【表１】
2006273754.tif 000003
後述のＷＳＴ−１法により細胞の増殖を調べた。６つの同じ系で実験を行い、平均値を算出した。結果を、対照系における増殖に対する％で表す。
【００１３】
上述のごとく、ジオスゲニンは多くのヤマノイモ科植物に含まれる天然成分である。その誘導体であるソラソジンはジオスゲニンのスピロ環構造中の酸素官能基が窒素官能基に置換した構造をもつナス科の植物（例えば、トマトやナス）に含まれる化合物である。本発明のその他の誘導体は、ジオスゲニンを出発物質として、公知の方法により合成することができる。本発明の式（Ｉ）の化合物は実施例に示す動物実験において、動物に対する悪影響および副作用を示さなかった。
【００１４】
本発明の式（Ｉ）の化合物はヒト毛乳頭細胞に対する顕著な増殖促進活性を有することが認められた。さらに本発明の式（Ｉ）の化合物はＣ３Ｈマウスの同期休止期毛の成長期への移行促進効果が認められた。一方、本発明の式（Ｉ）の化合物はヒト表皮角化細胞に対する増殖促進活性は認められず、その増殖促進活性はヒト毛乳頭細胞に対する選択性を有することがわかった。これらの結果より、本発明の化合物（Ｉ）は高い発毛促進活性を有することが明らかとなった。この活性発現が毛乳頭細胞に対する選択的増殖促進作用に起因することが示唆された。実験の詳細は実施例にて説明する。
【００１５】
本発明において好ましい式（Ｉ）の化合物はジオスゲニン、ソラソジン、Ｋ−３、Ｋ−５、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７である。さらに好ましい式（Ｉ）の化合物はＫ−３、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７である。最も好ましい式（Ｉ）の化合物はＫ−８である（実施例参照）。
【００１６】
本発明の発毛剤は、式（Ｉ）の化合物および適切な担体または賦形剤を含む。その剤形は様々なものであってよく、頭皮、特に毛根に送達可能なものであれば特に限定されない。例えば、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアオイルのような液体、ポマード、ヘアスティックまたはヘアクリームのような半固体ないし固体であってもよい。頭皮への送達しやすさから、液体または半固体の処方が好ましい。シャンプーまたはリンスとして用いるものであってもよい。ノズル式のスプレーやエアゾール製品であってもよい。本発明の発毛剤は、式（Ｉ）の化合物のほか、公知の育毛・養毛剤成分である血行促進物質（例えば、ビタミンＥおよびその誘導体、センブリエキス、ニンジンエキス、セファランチンなど）、局所刺激物質（例えば、トウガラシチンキ、ハッカ油、カンフルなど）、代謝賦活物質（例えば、ヒノキチオール、ペンタデカン酸、ビオチン、プラセンタエキスなど）、栄養剤（ビタミン類、アミノ酸類など）、殺菌剤（例えば、四級アンモニウム塩類、塩化アルキルジアミノエチルグリシン、イソプロピルメチルフェノールなど）、保湿剤（例えば、ポリオール類、ヒアルロン酸ナトリウムなど）、皮膚透過性促進剤などが本発明の発毛剤に含まれていてもよい。また、香料や着色料、あるいは保存料などを本発明の発毛剤に適宜添加してもよい。剤形の選択、賦形剤や担体の選択を含め、これらの剤形の製造方法は製薬分野および化粧品分野などでよく知られたものを適用することができる。一般的には、本発明の発毛剤を１日に１回ないし数回、適量を頭皮に適用する。本発明の発毛剤中の式（Ｉ）の化合物の含有量は、個々の患者または使用者の状態および処置すべき症状などにより様々であるが、一般的には約０．１ないし約５％の範囲であろう（％はｗ／ｖ）。
【００１７】
以下に、実施例で用いた実験方法および材料について説明する。
【００１８】
１．試薬類
ジオスゲニンおよびミノキシジルは東京化成工業（日本国、東京）から購入した。ソラソジンはシグマ社（米国ミズーリ州セントルイス）ジオスゲニン誘導体Ｋ−２、Ｋ−３、Ｋ−４、Ｋ−５、Ｋ−６、Ｋ−７、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１０、Ｋ−１６およびＫ−２１はHang-Ji Quan, et al., European Journal of Medicinal Chemistry 37:659-669, 2002に記載されたようにして合成した。ヒト毛乳頭細胞（以下、「ＨＦＤＰＣ」ということがある）、ＨＦＤＰＣ用培地、ヒト表皮角化細胞（以下、「ＨＥＫ」ということがある）、ＨＥＫ用培地、サブカルチャー試薬キットＡ（ＨＢＳＳ、トリプシン−ＥＤＴＡおよびトリプシン中和溶液を含有）およびサブカルチャー試薬キットＢ（ＰＢＳ、トリプシン−ＥＤＴＡおよびトリプシン中和溶液を含有）はＴＯＹＯＢＯ（日本国、大阪）から購入した。Ｉ型コラーゲン被覆フラスコおよび９６ウェルプレートはニッタゼラチン（日本国、大阪）から購入した。細胞計数キットＷＳＴ−１は同仁化学研究所（日本国、熊本）から購入した。
【００１９】
２．細胞培養
ＨＦＤＰＣおよびＨＥＫはそれぞれＨＦＤＰＣ用培地およびＨＥＫ用培地にて培養した。ＨＦＤＰＣの培養にはＩ型コラーゲン被覆フラスコを用い、５％ ＣＯ２インキュベーター中３７℃で細胞を培養した。培養期間中１日おきに培地を置換した。
【００２０】
３．ＷＳＴ−１アッセイ（ＨＦＤＰＣの増殖）
ＷＳＴ−１アッセイによりＨＦＤＰＣの増殖を調べた。ＨＦＤＰＣ用培地中の細胞密度を１ウェルあたり６４０個となるよう細胞をＩ型コラーゲン被覆９６ウェルプレートに撒いた。２４時間前培養を行った後、試験化合物にて細胞を３７℃で４８時間処理した。ＷＳＴ−１試薬２５μｌを各ウェルに添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベーションした。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（参照波長６４０ｎｍ）。対照には試験薬剤不含の培地を用いた。
【００２１】
４．ＷＳＴ−１アッセイ（ＨＥＫの増殖）
ＷＳＴ−１アッセイによりＨＥＫの増殖を調べた。ＨＥＫ用培地３００μｌ中２０００個となるよう細胞を９６ウェルプレートに撒き、４８時間前培養を行った。次いで、試験化合物を含む培地に置換し、３７℃で１２０時間培養した。ＷＳＴ−１試薬２５μｌを各ウェルに添加し、３７℃で４時間培養した後４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（参照波長６４０ｎｍ）。対照には試験薬剤不含の培地を用いた。
【００２２】
５．マウスにおける成長期誘導発毛活性の試験
試験薬剤をエタノールに溶解し、マウスに適用した。対照としてエタノール（担体）を用いた。M. Hattori and H. Ogawa, Journal of Dermatology 10:45-54, 1983に紹介された方法に従ってマウスにおける成長期誘導発毛活性を測定した。この試験において、同期休止期毛の状態の７週齢のオスのＣ３Ｈ／ＨｅＳｌｃマウス（Japan SLC, Inc., 日本国、静岡）を用いた。マウスの皮膚に傷をつけないよう、そして刺激を与えないように、電気バリカンでマウスの背中の毛を剃った。剃った部位に２００μｌの試験試料を１日１回適用した。試験４０日目にマウスの背中の皮膚を観察し、写真をとった。
【００２３】
以下に、実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２４】
式（Ｉ）の化合物の毛乳頭細胞増殖促進活性
ジオスゲニンおよびその誘導体である式（Ｉ）の化合物（以下、「式（Ｉ）の化合物」ということがある）のＨＦＤＰＣ増殖促進効果についてＷＳＴ−１アッセイにより調べた。式（Ｉ）の化合物の一例としてジオスゲニンを用いて試験した。実験は６つの同じ系で行った。対照はジオスゲニン不含の系とした。図１に示すようにジオスゲニンは用量依存的にＨＦＤＰＣの増殖を促進した。約０．１ないし約４μＭの濃度範囲で増殖促進活性が高く、約０．５ないし約３μＭの濃度範囲でさらに増殖促進活性が高かった。ジオスゲニンは２μＭの濃度で最大の増殖促進活性を示した（対照の１５６％）。
【００２５】
種々のジオスゲニン誘導体（濃度１μＭ）のＨＦＤＰＣ増殖促進効果についてもＷＳＴ−１アッセイにより調べた。実験は６つの同じ系で行った。対照はジオスゲニン不含の系とした。表１に示すように試験化合物はすべて対照を上回る増殖促進活性を示した。なかでもジオスゲニン、ソラソジン、Ｋ−３、Ｋ−５、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７の増殖促進活性が高く、ソラソジン、Ｋ−３、Ｋ−８、Ｋ−９、Ｋ−１６およびＫ−１７の増殖促進活性が特に高かった。Ｋ−８は最大の増殖促進活性を示した（対照の２０８％）。なお、本試験におけるミノキシジルの増殖促進活性は１１０％であった（今回の実験で用いた培地の添加剤である、アミノグリコシド系の抗生物質の影響によりミノキシジルの活性がある程度阻害されている可能性がある）。
式（Ｉ）の化合物について構造活性相関を調べた。ジオスゲニン、ソラソジン、Ｋ−３は式（Ｉ）のスピロケタール構造中のヘテロ原子Ｘがそれぞれ酸素、窒素、イオウで構成されており、ＨＦＤＰＣに対する増殖促進活性は、この順番で高くなった。ジオスゲニン、ソラソジン、Ｋ−３のＡ環とＢ環の構造を変化させて、共役ケトン構造にすると（それぞれ、Ｋ−２、Ｋ−１７、Ｋ−４）、いずれも活性が減少した。さらに、Ｋ−２とＫ−４を酸化してＡ環をキノイド構造にしたところ、Ｋ−８において最高の増殖促進活性（２０８％）が示された。
【実施例２】
【００２６】
式（Ｉ）の化合物のヒト表皮角化細胞増殖促進活性
ジオスゲニンおよびその誘導体である式（Ｉ）の化合物（以下、「式（Ｉ）の化合物」ということがある）のＨＥＫ増殖促進効果についてＷＳＴ−１アッセイにより調べた。式（Ｉ）の化合物の一例としてジオスゲニンを用いて試験した。実験は６つの同じ系で行った。対照はジオスゲニン不含の系とした。ジオスゲニンはＨＥＫに対する増殖促進活性は認められなかった（データ示さず）。この結果から、本発明の式（Ｉ）の化合物の増殖促進活性はヒトＨＦＤＰＣに対する選択性を有することがわかった。
【実施例３】
【００２７】
マウスモデルにおける式（Ｉ）の化合物の発毛活性
Ｃ３Ｈマウスの背中の毛は同期サイクル（time-synchronized hair cycle）を有することが知られている。生後約１８〜２１日目および４７〜９５日目の毛周期は休止期にあたる。試験化合物（１％（ｗ／ｖ）溶液を２００μｌ）を第２休止期の間に４０日間マウスの背中の毛を剃った部分に１日１回塗布し、４０日目の発毛の様子を観察し写真を撮った。このアッセイ系において、ミノキシジルを陽性対照とした。陰性対照にはエタノール（担体）を用いた。各群の動物数は４匹とした。結果を図２に示す。
【００２８】
４０日目に、ミノキシジル適用群は、毛を剃った部分の９２％が毛に覆われていた。担体（エタノール）適用群は、毛を剃った部分の１１％の部分しか発毛しなかった。ジオスゲニン適用群は、毛を剃った部分の９５％が毛に覆われており、ミノキシジル適用群を上回った。また、このアッセイにおいて、実験動物の皮膚その他に異常は認められなかった。これらの結果から、式（Ｉ）の化合物がin vivoにおいて強力な成長期誘導発毛活性を発揮し、しかも安全性が高いことが確認された。
【実施例４】
【００２９】
下記配合にてヘアトニックを処方した（％はｗ／ｖ）。
ジオスゲニン                                  ２％
酢酸ｄｌ−α−トコフェロール                  適量
セファランチン                                ０．００２％
イソプロピエルメチルフェノール                ０．１％
プラセンタエキス                              適量
ヒアルロン酸ナトリウム                        ０．１５％
グリセリン                                    １５％
香料                                          適量
防腐剤                                        適量
エタノール                                    ２５％
精製水                                        全量１００とする
エタノール可溶成分をエタノールに溶解した。水可溶成分を精製水に溶解した。エタノール相と水相を混合し、ろ過した。
【実施例５】
【００３０】
下記配合にてヘアトニックを処方した（％はｗ／ｖ）。
Ｋ−８                                                      １％
ポリオキシプロピレンブチルエーテル（４０Ｐ．Ｏ．）        ２０％
エタノール                                                ５０％
香料                                                      適量
色素、エデト酸塩                                          適量
精製水                                                    全量１００とする
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、優れた発毛効果を有し、副作用の心配のない発毛剤を提供するものであり、医薬品、化粧品、特に育毛・発毛剤の分野で利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、式（Ｉ）の化合物の濃度とＨＦＤＰＣの増殖促進活性の関係を示すグラフである。各プロット上のバーは標準偏差を示す。
【図２】図２は、式（Ｉ）の化合物のインビボにおける発毛活性を示す写真である。ａは対照系、ｂはミノキシジル適用系、ｃはジオスゲニン適用系を示す。
【図１】
2006273754.tif 000006
【図２】
2006273754.tif 000007