(57)【要約】【課題】  走査条件が変更されても、光検出器の印加電圧を自動的または略自動的に調整することが可能なレーザ走査顕微鏡を提供することである。【解決手段】  走査条件、例えば、波長選択手段により選択する波長範囲が変更された場合には、その変更された波長範囲に対する検出感度（印加電圧値）が、感度設定手段（印加電圧算出部６３）によって感度調整手段（電圧供給指示部６２）に設定される。電圧供給指示部６２は、設定された印加電圧値を光検出器（フォトマルチプライヤ）に供給するようにＨＶ供給部に指示する。【選択図】  図２
2006171028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源と、
前記レーザ光源からのレーザ光を試料上に照射するための照射光学系と、
前記試料から発せられる光を任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択手段と、
前記波長選択手段により選択された波長範囲の光を検出する光検出器と、
前記光検出器の検出感度を調整する感度調整手段と、
前記光検出器の波長感度特性を記憶する記憶手段と、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データに基づいて、当該光検出器の波長感度特性をフラットにするような検出感度を前記感度調整手段に設定する感度設定手段と、を備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【請求項２】
前記感度設定手段は、前記波長選択手段によって選択された波長範囲に含まれる波長の値と前記光検出器の波長感度特性データとに基づいて、その選択された波長範囲に対する感度を算出し、算出された感度に基づいて得られる値を検出感度として前記感度調整手段に設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項３】
前記感度設定手段は、前記波長選択手段によって選択された波長範囲に含まれる各波長について、前記光検出器の波長感度特性データから得られる感度と蛍光出力との積を該波長範囲で積分して、その選択された波長範囲に対する感度を算出し、算出された感度に基づいて得られる値を検出感度として前記感度調整手段に設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項４】
前記感度設定手段は、前記波長選択手段によって選択された波長範囲に対する感度を、基準となる感度と比較することで、当該光検出器の波長感度特性をフラットにするような検出感度を前記感度調整手段に設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項５】
前記感度設定手段は、前記波長選択手段によって選択された波長範囲に対する感度を、検出する蛍光の蛍光試薬に対応する基準となる感度と比較することで、当該光検出器の波長感度特性をフラットにするような検出感度を前記感度調整手段に設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項６】
前記感度設定手段は、光検出器の出力信号が波長に関わらず一定になるように、光検出器の波長感度特性と、検出する蛍光の蛍光波長特性の２つのデータを用いて、検出する光の波長範囲ごとに波長感度特性と蛍光波長特性の積が一定となるように、検出感度を前記感度調整手段に設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項７】
前記感度設定手段は、前記波長選択手段によって選択された波長範囲に含まれる各波長について、前記光検出器の波長感度特性データから得られる感度と検出する蛍光の蛍光波長特性データから得られる感度との積を当該波長範囲で積分して、その選択された波長範囲に対する感度を算出し、算出された感度に基づいて得られる値を検出感度として前記感度調整手段に設定することを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
【請求項８】
レーザ光源と、
前記レーザ光源からのレーザ光を試料上に照射するための照射光学系と、
前記試料から発せられる光を任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択手段と、
前記波長選択手段により選択された波長範囲の光を検出する光検出器と、
前記光検出器の検出感度を調整する感度調整手段と、
前記光検出器の波長感度特性と蛍光の種別ごとの波長強度特性を記憶する記憶手段と、
検出する蛍光の種別を設定する手段と、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データと前記設定された種別の蛍光の前記波長範囲における波長強度特性データとに基づいて、当該波長範囲における当該光検出器の感度と蛍光強度との積が一定になるような検出感度を前記感度調整手段に設定する感度設定手段と、を備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
【請求項９】
レーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を試料上に照射するための照射光学系と、前記試料から発せられる光を任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択手段と、前記波長選択手段により選択された波長範囲の光を検出する光検出器と、前記光検出器の検出感度を調整する感度調整手段と、を備えるレーザ走査顕微鏡に接続されたコンピュータに前記感度調整手段へ設定する検出感度を算出させるプログラムにおいて、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データを前記コンピュータの記憶手段から取得するステップと、
該取得した光検出器の波長感度特性データに基づいて、当該光検出器の波長感度特性をフラットにするような検出感度を前記感度調整手段に設定するステップと、を前記コンピュータに実行させることを特徴とするレーザ走査顕微鏡の感度設定プログラム。
【請求項１０】
レーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を試料上に照射するための照射光学系と、前記試料から発せられる光を任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択手段と、前記波長選択手段により選択された波長範囲の光を検出する光検出器と、前記光検出器の検出感度を調整する感度調整手段と、検出する蛍光の種別を設定する手段と、を備えるレーザ走査顕微鏡に接続されたコンピュータに前記感度調整手段へ設定する検出感度を算出させるプログラムにおいて、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データと設定された種別の蛍光に対応する波長強度特性を前記コンピュータの記憶手段から取得するステップと、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データと前記設定された種別の蛍光の前記波長範囲における波長強度特性データとに基づいて、当該波長範囲における当該光検出器の感度と蛍光強度との積が一定になるような検出感度を前記感度調整手段に設定するステップと、を前記コンピュータに実行させることを特徴とするレーザ走査顕微鏡の感度設定プログラム。
【請求項１１】
レーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を試料上に照射するための照射光学系と、前記試料から発せられる光を任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択手段と、前記波長選択手段により選択された波長範囲の光を検出する光検出器と、前記光検出器の検出感度を調整する感度調整手段と、を備えるレーザ走査顕微鏡に接続されたコンピュータが該レーザ走査顕微鏡の検出感度を前記感度調整手段へ設定する方法において、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データを前記コンピュータの記憶手段から取得し、
該取得した光検出器の波長感度特性データに基づいて、当該光検出器の波長感度特性をフラットにするような検出感度を前記感度調整手段に設定する、ことを特徴とするレーザ走査顕微鏡の感度設定方法。
【請求項１２】
レーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を試料上に照射するための照射光学系と、前記試料から発せられる光を任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択手段と、前記波長選択手段により選択された波長範囲の光を検出する光検出器と、前記光検出器の検出感度を調整する感度調整手段と、検出する蛍光の種別を設定する手段と、を備えるレーザ走査顕微鏡に接続されたコンピュータが該レーザ走査顕微鏡の検出感度を前記感度調整手段へ設定する方法において、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データと設定された種別の蛍光に対応する波長強度特性を前記コンピュータの記憶手段から取得し、
前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データと前記設定された種別の蛍光の前記波長範囲における波長強度特性データとに基づいて、当該波長範囲における当該光検出器の感度と蛍光強度との積が一定になるような検出感度を前記感度調整手段に設定する、ことを特徴とするレーザ走査顕微鏡の感度設定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査顕微鏡に関し、特に、フォトマルチプライヤなどの光検出器に設定する印加電圧（設定感度）を算出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザ走査顕微鏡を用いて、観察対象とする試料にレーザ光を照射し、その試料からの戻り光（蛍光）を観察することが行われている。このような場合、観察する蛍光の強度は、用いる試料や使用するレーザの種類によって大きく変化する。そして、解像度よく蛍光を検出するため、レーザ走査顕微鏡の検出素子にフォトマルチプライヤが一般的に採用されている。
【０００３】
フォトマルチプライヤの印加電圧を変化させることで、光電変換効率を変え、受光感度を変更することが可能であり、上述の試料やその試料に照射するレーザ光の変更に伴ってフォトマルチプライヤに入射される多様な強度の蛍光を検出するのに適している。
【０００４】
しかし、フォトマルチプライヤの感度は、検出した試料からの蛍光に応じて変化するので、作業者側で、蛍光の強度が弱いときはフォトマルチプライヤの印加電圧を大きく設定し、蛍光の強度が小さいときはフォトマルチプライヤの印加電圧を小さく設定する、等の画像の輝度レベルを最適なものとするための調整作業が必要になる。
【０００５】
また、フォトマルチプライヤは、受光する蛍光の波長に応じて感度が変化する波長感度特性を持つことが一般に知られている。つまり、最適化のためには、検出する蛍光の強度が一定であったとしても、感度が高い波長域ではフォトマルチプライヤの印加電圧を小さく設定し、感度が低い波長域ではフォトマルチプライヤの印加電圧を大きく設定することが必要である。
【０００６】
下記特許文献１では、レーザ走査顕微鏡において、フォトマルチプライヤの感度の個体差により生じる走査画像の輝度レベルの相違を、フォトマルチプライヤへの印加電圧の基準値を変更することで調整する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００１−５９９３９号公報  「フォトマルチプライヤの感度調整方法、該感度調整方法を採用した走査型レーザ走査顕微鏡および感度調整プログラムを記録した記録媒体」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、同一のフォトマルチプライヤを用いて試料から走査画像を取得する場合でも、使用するレーザ光、観察対象としての試料、検出する波長範囲、等の走査条件を変更すると、フォトマルチプライヤへ入射する蛍光の強度や波長成分が変化し、フォトマルチプライヤからの出力（信号）が変わってしまう。
【０００８】
特に、検出する光の波長を連続的に変化させながら走査画像を取得することが可能な分光検出型のレーザ走査顕微鏡では、その取得時に、波長ごとの輝度レベルがフォトマルチプライヤの感度特性の影響を受けて変化する。このため、一定の輝度レベルで測定を行いたいときや、最適な画像の明るさを確保したいときは印加電圧の再調整を行う必要が生じている。そして、このような再調整作業がユーザにとって負担であるという問題がある。
【０００９】
さらに、調整中は測定を中断しなければならないので、条件を何度も変更しながら測定を行う場合、測定終了までの時間が長くかかるという問題がある。また、調整中は試料へレーザ光を照射し続けながら走査画像を観察する必要があり、観察が終わるまでに試料の蛍光色素が褪色する可能性があるという問題がある。
【００１０】
本発明の課題は、走査条件が変更されても、フォトマルチプライヤなどの光検出器の印加電圧（感度）を自動的または略自動的に調整することが可能なレーザ走査顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１態様のレーザ走査顕微鏡は、レーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を試料上に照射するための照射光学系と、前記試料から発せられる光を任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択手段と、前記波長選択手段により選択された波長範囲の光を検出する光検出器と、前記光検出器の検出感度を調整する感度調整手段と、前記光検出器の波長感度特性を記憶する記憶手段と、前記波長選択手段により選択された波長範囲における前記光検出器の波長感度特性データに基づいて、当該光検出器の波長感度特性をフラットにするような検出感度を前記感度調整手段に設定する感度設定手段と、を備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡である。
【００１２】
ここで、走査条件、例えば、波長選択手段により選択する波長範囲が変更された場合には、その変更された波長範囲に対する検出感度が、感度設定手段によって感度調整手段に設定されるので、走査条件が変更されても、フォトマルチプライヤの印加電圧を自動的または略自動的に調整することが可能となる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、レーザ走査顕微鏡において、走査条件が変更された場合でも、フォトマルチプライヤ（光検出器）の印加電圧（感度）を自動的または略自動的に調整することが可能となる。よって、フォトマルチプライヤの印加電圧を調整する作業を走査条件が変更される毎にユーザが行う必要がなくなり、ユーザの負担が軽減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
図１は、本発明の第１実施形態のレーザ走査顕微鏡の構成を示す図である。
図１において、レーザ走査顕微鏡は、複数、もしくは単一の波長の光を選択的に試料に照射することが可能なレーザ光源１、試料からの蛍光を、任意の波長範囲で選択することが可能な波長選択部７、選択された波長範囲の光を検出するフォトマルチプライヤ８、フォトマルチプライヤへ電圧を供給するＨＶ供給部１２、それらレーザ光源１、波長選択部７、フォトマルチプライヤ８に接続され、それら各部に対して必要な指示を行うコンピュータ１０、コンピュータ１０からアクセスが可能な記憶部１１、からその主要部が構成される。
【００１５】
レーザ光源１は、複数の波長を同時に発振する光源、例えば４５８ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍの３波長を同時に発振するマルチラインＡｒレーザー２１と、それぞれの発振波長について照射制御可能なＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ）２２とから構成される。レーザ光源１のＯＮ／ＯＦＦ、レーザ光源１から照射するレーザ波長の選択、波長ごとの透過率は、コンピュータ１０を介してユーザによって制御可能である。
【００１６】
波長選択部７は、入射した光をスペクトルに分光するグレーティング３１と、スペクトルのうちの検出波長範囲以外の波長の光を遮断するスリット３２とから構成される。グレーティング３１は角度の変更が可能であり、また、スリット３２は、長波長側のみ移動可能であるが、いずれも、例えばコンピュータ１０を介してユーザによって制御可能である。
【００１７】
なお、グレーティング３１を操作することにより検出する光の検出開始波長を設定し、また、スリット３２を操作することにより検出する光の波長幅（波長範囲）を設定している。
【００１８】
図２は、図１のコンピュータ１０、および、記憶部１１のより詳細な構成を示すブロック図である。
図２に示されるように、記憶部１１は、フォトマルチプライヤ８の波長感度特性を記憶する波長感度特性記憶部７１と、試料に塗布された蛍光試薬について、該蛍光試薬の種類と、その蛍光試薬に対する測定を行うに際しての基準値としての印加電圧値と、該基準値としての印加電圧値を決める際に用いた波長範囲とを関連付けて記憶する基準値記憶部７２と、フォトマルチプライヤ８における印加電圧、感度間で成り立つべき条件を記憶する印加電圧・感度間条件記憶部７３と、を備える。
【００１９】
また、コンピュータ１０は、波長選択部７によって選択された波長範囲を印加電圧算出部６３に通知する波長範囲通知部６１と、通知された波長範囲、基準値としての印加電圧値、該印加電圧値を決める際に用いた波長範囲、前記フォトマルチプライヤの波長感度特性、および、前記印加電圧・感度間条件に基づいて、その通知された波長範囲に対する印加電圧値を算出する印加電圧算出部６３と、その算出された印加電圧をフォトマルチプライヤ８に供給するように図１のＨＶ供給部１２に指示する電圧供給指示部６２と、を備える。
【００２０】
再び図１に戻り、そのレーザ走査顕微鏡の動作について説明する。
まず、レーザ光源１から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー２によって反射され、偏向光学系３と、瞳投影レンズ４１、結像レンズ４２、対物レンズ４３から構成される照射光学系４とを通過し、例えば試料５内に調整された焦点位置に集光される。
【００２１】
試料５からの反射光・蛍光は、再び対物レンズ系４、偏向光学系３を通過し、ダイクロイックミラーを透過して共焦点光学系６、波長検出部７を経由し、フォトマルチプライヤ８に入射し検出される。
【００２２】
図３は、試料に塗布された蛍光試薬（ＦＩＴＣ）からの蛍光の波長特性の一例である。
この蛍光試薬は、４８８ｎｍにて励起可能であり、図に示されるように、蛍光ピーク波長が５２０ｎｍとなっている。
【００２３】
以下、第１実施形態におけるフォトマルチプライヤの印加電圧の設定処理について説明するが、その蛍光試薬（ＦＩＴＣ）の蛍光プロファイルを測定するに先立って、ユーザによってレーザ光源１が操作され、その蛍光試薬の励起波長４８８ｎｍの光だけが試料に照射される。
【００２４】
続いてユーザによって、コンピュータ１０を介して、スリット３２の幅がその検出波長範囲内でのフォトマルチプライヤ８の波長感度特性を無視できる程度に狭い幅、例えば、１ｎｍに固定される。
【００２５】
その後、ユーザは、検出開始波長位置が蛍光試薬の蛍光出力ピーク波長５２０ｎｍになるようにグレーティング３１を設定して走査画像を取得する。この際、走査画像の輝度が飽和しない範囲でなるべく明るい画像が得られるようにユーザはフォトマルチプライヤ８の印加電圧を手動にて調整する。
【００２６】
この調整作業を経て、印加電圧の最適値または略最適値が確定すると、ユーザからの指示によって、その最適値または略最適値は、図２の基準値格納部７２に、その蛍光試薬の種類と、その最適値または略最適値を決める際に用いた波長範囲と関連付けられて格納される。なお、上記最適値または略最適値は、蛍光試薬に対する測定を行うに際しての基準値となる。
【００２７】
このような準備を経て、ユーザは、レーザ走査顕微鏡を用いて、試料の蛍光プロファイルを測定する。すなわち、波長選択部７内のスリット３２を固定したままで、検出開始波長を例えば、４８０ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲で変化させるようにグレーティング３１を回転させながら、フォトマルチプライヤ８の出力を測定する。
【００２８】
波長選択部７によって、検出開始波長が変更される毎に、その変更された検出開始波長（波長範囲）は、図２の波長範囲通知部６１を介して今回の分光データの取得を行う波長範囲として印加電圧算出部６３に通知される。この波長範囲（検出開始波長）を通知された印加電圧算出部６３では、図４のフローチャートに示すような処理を行って、その通知された波長範囲に対する印加電圧を算出する。
【００２９】
図４は、第１実施形態におけるフォトマルチプライヤの印加電圧の設定処理を示すフローチャートである。
図４において、まず、ステップＳ１０１において、蛍光試薬に対する測定を行うに際しての基準値としての印加電圧値と、その印加電圧値を決める際に用いた波長範囲とが、図２の基準値記憶部７２から取得される。例えば、図３に示す蛍光試薬では、蛍光ピーク波長５２０ｎｍを含む１ｎｍの幅の波長範囲が、印加電圧値を決める際に用いた波長範囲に対応する。
【００３０】
続いて、ステップＳ１０２で、フォトマルチプライヤ８の波長感度特性が図２の波長感度特性記憶部７１から取得される。そして、この波長感度特性と、ステップＳ１０１で取得された波長範囲とから、その取得された波長範囲に対応する感度が求められる。なお、上述したように、本第１実施形態では、１回の測定で取得する波長範囲の幅は、その波長範囲内での波長感度特性を無視できる程度に狭い幅（１ｎｍ）に固定されているので、その波長範囲内の値、例えば５２０ｎｍによってその波長範囲を代表させ、その５２０ｎｍに対する感度をフォトマルチプライヤ８の波長感度特性から求め、基準値記憶部７２から取得された波長範囲に対する感度としている。
【００３１】
ステップＳ１０３では、波長範囲通知部６１から通知される波長範囲（検出開始波長）を取得する。ステップＳ１０４では、取得した検出開始波長に対するフォトマルチプライヤ８の感度を波長感度特性記憶部７１から取得する。
【００３２】
ステップＳ１０５では、以上のようにして得られた、基準値としての印加電圧値ＶS、その基準値としての印加電圧値に対応する波長範囲から得られたフォトマルチプライヤの感度αS、検出開始波長でのフォトマルチプライヤの感度αを以下の印加電圧・感度間に成り立つ条件式（Ａ）に代入することにより、検出開始波長に対するフォトマルチプライヤの印加電圧値Ｖを算出する。
Ｖ＝（αS／α）1/kn×ＶS  ・・・（Ａ）
ここで、ｋ：フォトマルチプライヤの材質による定数、ｎ：フォトマルチプライヤのダイノード段数であり、いずれもフォトマルチプライヤ毎に定まった値を持つ定数である。
【００３３】
そして、ステップＳ１０６において、ステップＳ１０５で算出された検出開始波長に対する印加電圧値Ｖが図２の印加電圧算出部６３から電圧供給指示部６２を介してＨＶ供給部１２に設定される。
【００３４】
このように、第１実施形態においては、フォトマルチプライヤの波長感度特性をフラットにするように検出する波長範囲に合わせて、フォトマルチプライヤの印加電圧値を算出しているので、同じ強さの光をフォトマルチプライヤが受光したときに、波長によらず同じレベルの出力を得ることができる。
【００３５】
なお、以上の説明では、１回の分光データの取得範囲（波長範囲）の幅は、十分に狭く、かつ、固定されていた。分光データの取得範囲（波長範囲）が十分に狭くない場合や、その取得範囲（波長範囲）として固定長を用いない場合には、その波長範囲に含まれる各波長について、フォトマルチプライヤ８の感度を波長感度特性記憶部７１から取得し、それら取得した感度をその波長範囲で積分して得た値を上記（Ａ）式の感度αとしたり、または、各波長範囲の中心波長について、フォトマルチプライヤ８の感度を波長感度特性記憶部７１から取得し、上記（Ａ）式の感度αとしたりする。
【００３６】
以下に説明する第２実施形態では、走査画像の明るさを一定に保つために、分光データの取得範囲（波長範囲）に含まれる各波長について、対応するフォトマルチプライヤの感度と入射する光の波長強度とを乗じて、該波長範囲で積分している。すなわち、第２実施形態においては、観察する試料の蛍光波長特性を用いて、入射する光の波長成分を推測している。なお、走査画像の明るさを一定に保つためには、その波長範囲が十分狭いか否か、その波長範囲が固定長であるか否かを問わず、その波長範囲で積分する構成は必須である。
【００３７】
なお、第２実施形態においても、図１の構成が基本的に採用される。
図５は、第２実施形態における図１のコンピュータ１０、および、記憶部１１のより詳細な構成を示すブロック図である。図２と重複する構成については説明は省略される。
【００３８】
図５において、基準値記憶部７２は、第１実施形態とは異なり、複数の蛍光試薬について、該蛍光試薬の種類と、その蛍光試薬に対する測定を行うに際しての基準値としての印加電圧値と、該印加電圧値を決める際に用いた波長範囲とを関連付けて記憶している。また、蛍光波長特性記憶部７４は、複数の蛍光試薬のそれぞれについての蛍光波長特性データを記憶している。
【００３９】
まず、ユーザによって、試薬選択部６４を介して、基準値記憶部７２に記憶された複数の蛍光試薬からこれから観察を行うものが選択され、その選択結果は印加電圧算出部６３に通知される。
【００４０】
以下、第２実施形態におけるフォトマルチプライヤの印加電圧の設定処理について説明する。上述のように、複数の蛍光試薬から今回測定を行うことになった蛍光試薬がユーザによって試薬選択部６４を介して選択されている。その選択された蛍光試薬（例えばＦＩＴＣ）の蛍光プロファイルを測定するに先立って、ユーザによってレーザ光源１が操作され、その選択された蛍光試薬の励起波長、例えば４８８ｎｍの光だけが試料に照射される。
【００４１】
続いてユーザによって、コンピュータ１０を介して、波長範囲が５００〜５２０ｎｍとなるようにグレーティング３１、スリット３２が調整される。
その後、ユーザは、この波長範囲に対する走査画像を取得しながら、その走査画像の輝度が飽和しない範囲でなるべく明るい画像が得られるようにフォトマルチプライヤ８の印加電圧を手動にて調整する。
【００４２】
この調整作業を経て、印加電圧の最適値または略最適値が確定すると、ユーザからの指示によって、その最適値または略最適値は、図５の基準値格納部７２に、その蛍光試薬の種類と、その最適値または略最適値を決める際に用いた波長範囲と関連付けられて格納される。なお、上記最適値または略最適値は、蛍光試薬に対する測定を行うに際しての基準値となる。
【００４３】
このような準備を経て、ユーザは、レーザ走査顕微鏡を用いて、試料の蛍光プロファイルを測定する。
第２実施形態においては、この後、ユーザによって、波長範囲が変更される。この波長範囲の変更は波長選択部７を介してなされるが、その波長選択部７によって、波長範囲が変更される毎に、その変更された波長範囲は、図５の波長範囲通知部６１を介して今回の分光データの取得を行う波長範囲として印加電圧算出部６３に通知される。この波長範囲を通知された印加電圧算出部６３では、図６のフローチャートに示すような処理を行って、その通知された波長範囲に対する印加電圧を算出する。
【００４４】
図６は、第２実施形態におけるフォトマルチプライヤの印加電圧の設定処理を示すフローチャートである。
図６において、まず、ステップＳ２０１において、観察する蛍光試薬の種類（についての情報）が試薬選択部６４を介して通知され取得される。そして、ステップＳ２０２において、蛍光波長特性記憶部７４からその観察する蛍光試薬の蛍光波長特性が取得される。なお、ステップＳ２０１およびＳ２０２の処理は、ユーザが  試薬を設定した時点で行ってもよいし、（例えば図６のフローに示されるように）印加電圧の計算の際にその都度行ってもよい。
【００４５】
続くステップＳ２０３では、印加電圧算出部６３を介して、複数の蛍光試薬から今回測定することになった種類の蛍光試薬に対応する、測定を行うに際しての基準値としての印加電圧値と、その印加電圧値を決める際に用いた波長範囲（５００〜５２０ｎｍ）とが、図５の基準値記憶部７２から取得される。また、フォトマルチプライヤ８の波長感度特性が図５の波長感度特性記憶部７１から取得される。
【００４６】
そして、ステップＳ２０４において、この波長感度特性と、基準値記憶部７２から取得された波長範囲とから、その取得された波長範囲に対応する感度が求められる。すなわち、その波長範囲に含まれる各波長について、フォトマルチプライヤの波長感度特性から得られる感度と選択された蛍光試薬の蛍光波長特性と乗算したものがその取得された波長範囲で積分され、その取得された波長範囲に対する感度として算出される。
【００４７】
続く、ステップＳ２０５では、図５の波長範囲通知部６１を介して通知された今回の波長範囲について、上述の波長感度特性と、その通知された波長範囲とから、その通知された波長範囲に対応する感度が求められる。すなわち、その通知された波長範囲に含まれる各波長について、フォトマルチプライヤの波長感度特性から得られる感度と選択された蛍光試薬の蛍光波長特性との積がその波長範囲で積分され、通知された今回の波長範囲に対する感度として算出される。
【００４８】
そして、ステップＳ２０６で、以上のようにして得られた、基準値としての印加電圧値ＶS、その基準値としての印加電圧値に対応する波長範囲に対する積分値としてのフォトマルチプライヤの感度αS、今回の波長範囲に対する積分値としてのフォトマルチプライヤの感度αを以下の印加電圧・感度間に成り立つ条件式（Ａ）に代入することにより、今回の波長範囲に対するフォトマルチプライヤの印加電圧値Ｖを算出する。
Ｖ＝（αS／α）1/kn×ＶS  ・・・（Ａ）
ここで、ｋ：フォトマルチプライヤの材質による定数、ｎ：フォトマルチプライヤのダイノード段数であり、いずれもフォトマルチプライヤ毎に定まった値を持つ定数である。
【００４９】
そして、ステップＳ２０７において、ステップＳ２０６で算出された今回の波長範囲に対する印加電圧値Ｖが図５の印加電圧算出部６３から電圧供給指示部６２を介してＨＶ供給部１２に設定される。
【００５０】
このように、第２実施形態においては、測定の毎に波長範囲を変更する場合（幅固定で開始位置のみ変更、幅・開始位置ともに変更、等）に、走査画像の明るさを一定に保つために、フォトマルチプライヤの波長感度特性と検出する蛍光の波長特性とを考慮して、フォトマルチプライヤの印加電圧値を算出しているので、検出する波長範囲によらず同じレベルの出力を得ることができる。
【００５１】
なお、印加電圧値（設定感度）として、上記第１および第２実施形態以外の設定感度を用いることも可能である。例えば、入射する光の波長成分は、観察している試薬の種類だけでなく、光路上にあるフィルタの特性によっても変化する。この場合、フォトマルチプライヤの波長感度特性にフィルタの透過特性をさらに乗じることで設定感度を算出することができる。この場合には、フィルタの波長特性の変化を補正することが可能となる。
【００５２】
また、入射する光の強度は試料に照射するレーザ光の強度によって変化する。この場合、レーザの出力を監視し、その出力が大きくなれば印加電圧を上げ、その出力が小さくなれば印加電圧を下げることによって、走査画像の明るさを一定に保つことが可能となる。
【００５３】
図７は、本実施形態における各処理をコンピュータに実行させるプログラムが格納される記憶媒体例を示す図である。
図７に示すように、上記記憶媒体には、ＣＤ−ＲＯＭ、フレキシブルディスク（ＭＯ、ＤＶＤ、リムーバブルハードディスク等であってもよい）等の媒体駆動装置９７に脱着可能な可搬記憶媒体９６、ネットワーク回線９３経由でプログラムが送信される外部の装置（サーバ等）内の記憶手段（データベース等）９２、情報処理装置９１の本体９４内のメモリ（ＲＡＭまたはハードディスク等）９５、が含まれる。本実施形態の各処理を行うプログラムは、上記記憶媒体から本体９４内のメモリ９５にロードされ実行される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の第１実施形態のレーザ走査顕微鏡の構成を示す図である。
【図２】図１のコンピュータ１０、および、記憶部１１のより詳細な構成を示すブロック図である。
【図３】試料に塗布された蛍光試薬（ＦＩＴＣ）からの蛍光の波長特性の一例である。
【図４】第１実施形態におけるフォトマルチプライヤの印加電圧の設定処理を示すフローチャートである。
【図５】第２実施形態における図１のコンピュータ１０、および、記憶部１１のより詳細な構成を示すブロック図である。
【図６】第２実施形態におけるフォトマルチプライヤの印加電圧の設定処理を示すフローチャートである。
【図７】記憶媒体例を示す図である。
【符号の説明】
【００５５】
１  レーザ光源
２  ダイクロイックミラー
３  偏向光学系
４  対物レンズ系
５  試料
６  共焦点光学系
７  波長選択部
８  フォトマルチプライヤ
１０  コンピュータ
１１  記憶部
１２  ＨＶ供給部
２１  マルチラインＡｒレーザ
２２  ＡＯＴＦ
３１  グレーティング
３２  スリット
６１  波長範囲通知部
６２  電圧供給指示部
６３  印加電圧算出部
６４  試薬選択部
７１  波長感度特性記憶部
７２  基準値記憶部
７３  印加電圧・感度間条件記憶部
７４  蛍光波長特性記憶部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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