(57)【要約】【課題】高親水性高分子を組織の包埋プロセスに応用する際、親水性が高いため組織が膨潤する問題、更に重合速度が早く組織内全域に浸透する前に、表層部などの初期浸透部のみ重合してしまい多くの未浸透部を残存させた欠陥品となる等の問題があり実用化出来なかった。【解決手段】細胞内に水分とラジカルソースを含む組織を包埋標本化するに際して、高親水性高分子に架橋剤と重合開始制御剤を含有させた高親水性高分子モノマー溶液に浸漬し、窒素ガスバブリング後静置して重合させることを特徴とする高親水性高分子による組織包埋方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に水分とラジカルソースを含む組織を包埋標本化するに際して、前記組織を高親水性高分子に架橋剤と重合開始制御剤を含有させた高親水性高分子モノマー溶液に浸漬し、窒素ガスバブリング後静置して重合させることを特徴とする高親水性高分子による組織包埋方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高親水性高分子による組織包埋方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
電子顕微鏡の試料作製の薄切りや、実習教材のプラスチネーション作製などを目的として、従来からも凍結切片作成法や、各種樹脂への包埋等のプロセスが開発され、日常的に用いられている。
主に耐久性確保の観点から開発された各種樹脂への包埋プロセスでは、組織は元来水分を多く含むことから、樹脂材料として一般に親水性の低い高分子材料を使用している。この親水性の低い高分子材料は、組織との親和性が低いため、該包埋プロセスは、組織からの真空脱水や置換といった工程が組み込まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前記従来の包埋プロセスは、低親水性高分子材料を使用するため、多くの特殊設備と処理工程を必要とし、又取扱者は、高分子に対する専門知識が要求され、処理廃液による環境負荷の問題、人体への毒性の問題、組織への重合時の発熱による影響等を厳重に管理し安全を確保しなければない。また製造コストも嵩む。
そこで本発明者等は、取り扱い上比較的安全な、高親水性高分子の応用に着目した。
しかし、この高親水性高分子のみを組織の包埋プロセスに単に応用したのでは、親水性が高いため組織が膨潤する問題、更に重合速度が早く、大きさにもよるが、組織内全域に浸透する前に、表層部などの初期浸透部のみ重合してしまう等の問題があり実用化できない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明はこれらの問題を解決するためになされたものであり、その特徴とする技術条件は、次の（1）にある。
(1)、細胞内に水分とラジカルソースを含む組織を包埋標本化するに際して、高親水性高分子に架橋剤と重合開始制御剤を含有させた、高親水性高分子モノマー溶液に浸漬し、窒素ガスバブリング後静置して重合させることを特徴とする高親水性高分子による組織包埋方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明は、上記簡易な構成により組織を膨潤させることなく組織全域の細胞内水分を高親水性高分子モノマー溶液に置換させ、この後に組織細胞内のラジカルソースによって重合反応を開始させるものであり、これにより、組織全体の重合化を確立したものである。
この方法では、包埋組織についてホルマリン固定等の前処理が必須でないことから、幅広い状態にある組織への応用が可能である。
これにより本発明は、更に次の優れた効果を有する。
(1)、真空ラインなどの実験設備を持たない、医学部等の研究室でも重合が可能である。
(2)、高分子化学の専門知識がなくても、安全に利用できるプロセスである。
(3)、組織への重合による熱の影響のない、低温で重合するプロセスである。
(4)、人体への毒性がほとんど無いため、教材として安全に使用することができる。
(5)、従来プロセスで必要であった、置換溶媒などの処理廃液の排出を激減させ、環境負荷を最小限にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の最良の形態例は、細胞内に水分とラジカルソースを含む組織を、該組織からの吸水量と目標とする重合体の硬度等を基準にした割合で架橋剤と重合開始制御剤を配合した高親水性高分子モノマー溶液に浸漬し、窒素ガスバブリング後静置して重合させ、重合後洗浄する高親水性高分子による組織包埋方法である。
高親水性高分子モノマー溶液は、例えば、生理食塩水で洗浄したブタ肝臓5 mm厚の切片の場合、高親水性高分子としてN-vinyl-2-pyrolidoneをベースにし、架橋剤としてN,N'-Methlenebisacrylamideを2〜4 w％、重合開始制御剤としてN,N'-Di-sec-butyl-p-phenylenediamineを100〜400 ppm用いることにより、組織全域の細胞内水分を高親水性高分子モノマー溶液に置換させた後に組織細胞内のラジカルソースとの重合反応を開始させ組織全体の重合化を実現し、上記目標の包埋組織を得た。
【０００７】
而して、本発明において、対象とする細胞内に水分とラジカルソースを含む組織としては、各種動物の各種管腔臓器、実質臓器、筋組織等である。
本発明においては、ホルマリン等による前処理は必須ではない。従って、従来から行われてきた、ホルマリン処理を含むあらゆる組織固定法および未処理組織に適用可能である。しかし、以下のような場合、組織を予めホルマリン固定を行う。
感染性や変質が見られる試料の作成において、ホルマリン処理が適切であると判断される場合。
長期保存を前提として、高い防腐性を持たせたい場合。
また既にホルマリン固定がなされている、過去の保存試料に対しても、本発明を適用することが可能である。
【０００８】
本発明において、高親水性高分子としてはN-vinyl-2-pyrolidone、Acrylic acid、2-Hydroxyethylmethacrylate、Vinylalchol polymerなどを適用し、その選定理由は、次の通りである。
入手し易く、比較的安価であること。
化学の専門知識を持たない者でも、安全に扱えること。
著明な毒性がないこと。
環境負荷が小さいこと。
【０００９】
本発明において、高親水性高分子モノマー溶液における架橋剤の含有理由と具体例及びその好ましい含有割合範囲は、次の通りである。
理由：高親水性高分子のみでは、プラスチネーションや切片作製に必要とされる強度が得られない。また、保存時の吸湿による劣化・膨潤や、寸法精度を保つ必要がある。これらを解決する目的で、架橋剤による網目構造の構築が望ましい。
具体例：架橋剤としては、N,N'-Methylenebisacrylamide、Divinylbenzeneなどがある。
架橋剤の具体例個々の含有割合範囲：
1.N,N'-Methylenebisacrylamide:高親水性高分子モノマーに対して0.5〜4.5 wt.%が好ましい。
2.Divinylbenzene: 高親水性高分子モノマーに対して1.0〜6.5 wt.%が好ましい。
【００１０】
本発明において、高親水性高分子モノマー溶液における重合開始制御剤の含有理由と具体例及びその好ましい含有割合範囲は、次の通りである。
理由：組織内にはそのいたるところにラジカルソースが存在する。そのため高親水性高分子モノマーが水と置換された部分から速やかに重合が開始し、表層で重合が進行することで、内部の水分がモノマーに置換されることの障害となる。重合開始制御剤は、組織全体を均等に全量重合化反応させるために、組織全域の細胞内水分が高親水性高分子モノマー溶液に置換されるまでの間、組織表層部等の初期置換部細胞内のラジカルソースによる重合化反応を抑制するために含有させるものである。
具体例：重合開始制御剤としては、N,N'-Di-sec-butyl-p-phenylenediamine、hydroquinone、2,2,6,6-tetramethylpiperidinooxy, freeradical等がある。濃度は高親水性高分子モノマーに対して100〜400 ppmとすることが好ましい。
重合開始制御剤の具体例個々の含有割合（濃度）については、対象とする組織の種類により、水分量やラジカルソース含有率と置換速度が異なり、また同種でも大きさにより完全置換時間が変化するため、これらの要素と重合開始制御剤の種類に応じて実験的、経験的にその最適濃度範囲を設定することができる。組織のラジカル種の同定や定量は、例えばESRによるspin-trap法を用いるなど、臓器・組織別の最適値を求めることで、より広範な用途に応用することができる。
【００１１】
本発明において、前記高親水性高分子モノマー溶液に組織を浸漬して窒素ガスバブリングする理由と好ましい温度範囲や所要時間範囲は、次の通りである。
理由：本発明の基本反応はラジカル重合反応であることから、酸素除去を目的とする。
方法：室温において、窒素ガスを注射針から高親水性高分子モノマー溶液中に導入する。導入時間は浸漬する溶液の量に応じて0.2 l/min.の流量で5〜15分とする。
本発明において、窒素ガスバブリング後静置する理由と好ましい温度や所要時間は、次の通りである。
理由：高親水性高分子モノマー溶液の組織内への浸透、および重合反応を行うため。
【実施例１】
【００１２】
本発明の実施例を、表１〜表５に詳細に紹介する。
【００１３】
【表１】
2006036957.tif 000002
【００１４】
【表２】
2006036957.tif 000003
【００１５】
【表３】
2006036957.tif 000004
但し、NVP:N-vinyl-2-pyrolidone
St:Stylene
MBA:Methlene
DBPD:N,N'-Di-sec-butyl-p-phenylenediamine
HQN:hydroquinone
DVB:Divinylbenzene
【００１６】
【表４】
2006036957.tif 000005
【００１７】
【表５】
2006036957.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明は、前記の効果に詳述のように、人体及び自然環境に優しく、且つ特殊設備を不要とする簡単な処理工程で、誰もが容易に安全に管理し実施することができ、且つ安価な製造方法であり、この種産業の利用可能性は多大なものがある。