(57)【要約】【課題】  インターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術において、Ｓ／Ｎ比の向上を達成できる新規かつ有用な技術を提供すること。【解決手段】  プローブ核酸Ｐと標的核酸Ｔの相補鎖部位に結合するインターカレーターＩからの蛍光強度を測定することによってハイブリダイゼーションを検出する方法である。本発明では、前記インターカレーターＩが非特異的に結合するためにノイズ蛍光の発生を誘引してしまう一本鎖の標的核酸Ｔｓ、相補鎖を形成しない一本鎖のプローブ核酸Ｐｓ、標的核酸Ｔの余剰の核酸部分Ｔ１１，Ｔ１２を、核酸分解酵素（nuclease）などのヌクレアーゼ活性を有する酵素によって消化分解し、ノイズ蛍光を低減させる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ核酸と標的核酸の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによってハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
前記インターカレーターが非特異的に結合するためにノイズ蛍光の発生を誘引する一本鎖核酸又は／及び核酸部分を、ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって消化する工程を少なくとも含むハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項２】
前記一本鎖核酸は、次の（１）、（２）のいずれか一方又は両方であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出方法。
（１）ハイブリダイゼーションに関与しなかった一本鎖標的核酸。
（２）ハイブリダイゼーションに関与しなかった一本鎖プローブ核酸。
【請求項３】
前記核酸部分は、次の（ａ）、（ｂ）のいずれか一方又は両方であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出方法。
（ａ）ハイブリダイゼーションによって形成した二本鎖核酸を構成する標的核酸の余剰一本鎖核酸部分。
（ｂ）自己ループ構造を形成する一本鎖核酸部分。
【請求項４】
前記酵素は、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項５】
前記エキソヌクレアーゼは、一本鎖核酸に選択的に作用し、３’→５’方向へ分解することを特徴とする請求項４記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項６】
前記エキソヌクレアーゼは、一本鎖核酸に選択的に作用し、５’→３’方向へ分解することを特徴とする請求項４記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項７】
前記エキソヌクレアーゼは、一本鎖核酸に選択的に作用し、３’→５’方向と５’→３’方向の双方向へ分解することを特徴とする請求項４記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項８】
前記核酸分解酵素は、エンドヌクレアーゼ（endonuclease）であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項９】
前記プローブ核酸は、ハイブリダイゼーションを検出する表面に固定されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターカレーターを用いたハイブリダイゼーション検出の精度向上に寄与する技術に関する。より詳しくは、インターカレーターが非特異的に結合してノイズ蛍光を発する原因となる一本鎖標的核酸などを酵素消化により分解し、Ｓ／Ｎ比の向上を達成する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等のプローブ核酸が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ここで、前記ＤＮＡチップでは、一般に、基板上に固定化されたプローブ核酸に対して、予め蛍光色素を修飾（ラベル）した標的核酸をハイブリダイゼーションさせ、その相互作用の結果を蛍光量（蛍光シグナル）として捉えて検出する。
【０００５】
この蛍光検出技術では、標的核酸とハイブリダイゼーションしなかった一本鎖プローブ核酸などから発生するバックグラウンドノイズが、検出精度に無視できない程度に影響を及ぼす。即ち、検出される蛍光シグナルから、ハイブリダイゼーションとは本質的に無関係であるノイズ蛍光を排除し、いわゆるＳ／Ｎ比をどの程度向上できるかということが、ハイブリダイゼーション検出の精度向上に直結することになる。
【０００６】
このため、現在では、基板上に存在するノイズ蛍光発生原因となる一本鎖標的核酸を基板上から洗浄除去する工程が一般的に採用されている。あるいは、特許文献１では、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた蛍光検出におけるバックグラウンドノイズを低減するために消光剤を用いる技術が提案されている。また、特許文献２では、ハイブリダイゼーションしていないプローブ核酸をヌクレアーゼで消化することによって基板から除去する方法が提案されている。
【特許文献１】特開２００３−８４００２号公報（特に、請求項１参照）。
【特許文献２】特表２００４−５１９６８９号公報（特に、請求項１参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年、二本鎖核酸の相補鎖の隙間に特異的に結合して蛍光を発する「インターカレーター」が開発され、このインターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術が提案されている。この検出技術では、蛍光標識された標的核酸を調製する必要が無いなどの利点があるので、今後さらに普及していくと考えられる。
【０００８】
しかしながら、このインターカレーターは、その結合量に差はあるものの、反応領域中に遊離している一本鎖核酸、相補鎖を形成している片側核酸の余剰一本鎖部分やループ形成部分などにも非特異的に結合し、蛍光（即ち、ノイズ蛍光）を発する傾向があることが知られている（例えば、H.S.Rye, A.N.Glazer, Nucleic Acid Reserch,1995,Vol.23,No.7,1215-1222）。
【０００９】
このため、インターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出においても、バックグラウンドノイズ蛍光を低減することが重要な技術的課題となる。この課題を、蛍光標識された標的核酸を用いる従来の検出技術と同様に、ハイブリダイゼーションに関与しなかった遊離一本鎖標的核酸などを基板上から洗浄除去する工程により解決しようとすると、アッセイ工程が増えて手間がかかり、洗浄条件の設計も精密に行わなければならない。また、洗浄に晒されたときに、正規にハイブリダイゼーションした二本鎖が解離してしまうなどの悪影響も予想される。
【００１０】
そこで、本発明は、インターカレーターを用いるハイブリダイゼーション検出技術において、Ｓ／Ｎ比の向上を達成できる新規かつ有用な技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、まず、プローブ核酸と標的核酸の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによってハイブリダイゼーションを検出する方法であり、前記インターカレーターが非特異的に結合するためにノイズ蛍光の発生を誘引する一本鎖核酸又は／及び核酸部分を、ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって消化する工程を少なくとも含むハイブリダイゼーション検出方法を提供する。
【００１２】
ここで、前記酵素による消化の対象となる「一本鎖核酸」とは、例えば、ハイブリダイゼーションに関与しなかった一本鎖標的核酸であり、この一本鎖標的核酸は、反応領域の媒質中に遊離しているものや、基板やビーズなどの固相表面に非特異的に吸着している状態のものが含まれる。その他、酵素による消化分解の対象となる「一本鎖核酸」としては、ハイブリダイゼーションに関与することなく、反応領域中に一本鎖状態のままで存在するプローブ核酸を挙げることができる。なお、このプローブ核酸は、基板やビーズなどの固相表面にその末端が固定して用いられるものや反応領域中に遊離した状態で用いられるものの両方が含まれるのであって、狭く解釈されない。
【００１３】
次に、酵素による消化の対象となる「核酸部分」とは、例えば、ハイブリダイゼーションによって形成した二本鎖核酸を構成する標的核酸における、プローブ核酸よりも長鎖の標的核酸の余剰一本鎖核酸部分や自己ループ構造を形成する一本鎖核酸部分を挙げることができる。ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって、これらの核酸部分のいずれか一方又は両方を同時に消化分解する。
【００１４】
本発明で採用可能な「酵素」は、ヌクレオチド鎖の消化分解作用を有する酵素、即ち、ヌクレアーゼ活性を有する酵素であって、一例を挙げれば、一本鎖核酸に選択的に作用して３’→５’方向へ分解するエキソヌクレアーゼ、一本鎖核酸に選択的に作用して５’→３’方向へ分解するエキソヌクレアーゼ、一本鎖核酸に選択的に作用して３’→５’方向と５’→３’方向の双方向へ分解するエキソヌクレアーゼである。あるいは、核酸分子の内側部位から消化分解するエンドヌクレアーゼ（endonuclease）も目的に応じて採用可能であり、場合によっては、エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼを組み合わせて使用してもよい。
【００１５】
エキソヌクレアーゼは、ハイブリダイゼーションに関与せずに一本鎖状態で存在する標的核酸やハイブリダイゼーションによって形成した二本鎖核酸を構成する標的核酸における余剰一本鎖核酸部分の消化分解に好適である。３’→５’方向へ分解するエキソヌクレアーゼを選択するか、５’→３’方向へ分解するエキソヌクレアーゼを選択するかは、消化分解の対象となる一本鎖核酸の遊離末端が３’末端か５’末端のいずれであるかによって決定できる。反応領域中に一本鎖核酸の遊離末端が３’末端のものと５’末端のものが両方存在する場合では、３’→５’方向へ分解するエキソヌクレアーゼと５’→３’方向へ分解するエキソヌクレアーゼを組み合わせて使用し、あるいは３’→５’方向と５’→３’方向の双方向へ分解するエキソヌクレアーゼを採用する。
【００１６】
例えば、反応領域に一本鎖状態で存在する固定化プローブ核酸を消化分解するときを想定すると、５’末端側が固定化されている場合では、３’→５’方向へ分解するエキソヌクレアーゼを選択し、逆に、３’末端側が固定化されている場合では、５’→３’方向へ分解するエキソヌクレアーゼを選択すればよい。
【００１７】
また、反応領域中に遊離３’末端を有する一本鎖核酸、同末端を有する一本鎖核酸部分、遊離５’末端を有する一本鎖核酸、同末端を有する一本鎖核酸部分などが混在するような場合では、３’→５’方向へ分解するエキソヌクレアーゼと５’→３’方向へ分解するエキソヌクレアーゼの両方を併用し、あるいは３’→５’方向と５’→３’方向の双方向へ分解する作用のエキソヌクレアーゼを用いる。
【００１８】
ここで、本発明に関連する主たる技術用語について説明する。
【００１９】
「プローブ核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該分子と特異的に相互作用するターゲット分子を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸分子であって、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域中に遊離状態で存在したり、基板やビーズなどの固相表面にその一端が固定されて存在したりする。例えば、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが代表的である。
【００２０】
「標的核酸」とは、前記プローブ核酸との間で相補的な塩基対を形成するか否かを調べることを目的に、サンプルとして準備された核酸分子である。なお、一般にこの標的核酸のヌクレオチド鎖長は、プローブ核酸のヌクレオチド鎖長に比べて長いため、該プローブ核酸との間で相補鎖を形成すると、標的核酸側には余剰の一本鎖核酸部分が発生する。
【００２１】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２２】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
【００２３】
「ヌクレアーゼ活性」は、核酸を消化分解する酵素活性を意味する。「エキソヌクレアーゼ（exonuclease）」は、核酸分解酵素（nuclease）の一種であり、ＤＮＡ鎖やＲＮＡ鎖などのヌクレオチド鎖の一端から３’，５’-ホスホジエステル結合を順次切断して、モノヌクレオチドを生じる酵素である。「エンドヌクレアーゼ（endonuclease）」は、核酸分解酵素（nuclease）の一種であり、ＤＮＡ鎖やＲＮＡ鎖などのヌクレオチド鎖の内部の３’，５’-ホスホジエステル結合を切断してオリゴポリヌクレオチドを生じる酵素である。
【００２４】
「自己ループ構造」は、一本鎖又は二本鎖のヌクレオチド鎖の一部において、ループ形状を形成するように突出する構造部分であって、相補塩基対部分を持つものと持たないものの両方を含む。
【００２５】
「ノイズ蛍光」は、ハイブリダイゼーションの蛍光検出において、バックグラウンドノイズとなる蛍光を意味する。本発明では、特に、ハイブリダイゼーションの結果得られた相補鎖に対して特異的に結合したインターカレーターが発する正規蛍光に対して、前記相補鎖以外の核酸部位に対して非特異的に結合したインターカレーターが発する蛍光をノイズ蛍光と呼ぶ。
【００２６】
「インターカレーター」は、二本鎖核酸の相補鎖に結合して蛍光を発する物質であって、ハイブリダイゼーション検出に用いられる物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどを挙げることができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、プローブ核酸と標的核酸の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによってハイブリダイゼーションを検出する方法において、ノイズ蛍光を消失させることができるため、ハイブリダイゼーションを良好なＳ／Ｎに基づいて定量検出することができる。また、ハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させた後に、ノイズ蛍光の発生原因となる物質を除去するための水溶液洗浄作業を省略することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる方法の代表的な実施形態を例示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２９】
まず、図１は、本発明に係るハイブリダイゼーション検出方法の基本的な原理及び構成を模式的に示す図である。
【００３０】
この図１には、符号Ｓで示す固相表面（例えば、基板やビーズなど）に対して、その一方の末端（図１では３’末端を例示）が固定された状態のプローブ核酸Ｐと、このプローブ核酸Ｐが存在する反応領域Ｒへ添加された標的核酸Ｔと、の間でハイブリダイゼーションが進行し、相補鎖Ｃが形成されている状態が示されている。
【００３１】
なお、本発明では、プローブ核酸Ｐを固定する末端は３’末端に特に限定されず、５’末端であってもよく（図示せず）、また、プローブ核酸Ｐは、固定された状態で使用される形態に限定されず、プローブ核酸Ｐを反応領域Ｒ内に遊離させた状態で行うアッセイ系においても本発明を適用できる。反応領域Ｒに貯留又は保持される媒質は、特に限定されず、例えば、溶媒、ゲル、溶媒とゲルの混合物など広く採用できる。
【００３２】
次に、図１中の符号Ｉは、ハイブリダイゼーションによって得られた前記相補鎖Ｃ部分に特異的に結合して蛍光を発するインターカレーターを示している。本発明に係わるハイブリダイゼーション検出方法では、図示しない外部光源（例えば、所定波長のレーザ光源）から反応領域Ｒ内へ蛍光励起光Ｑを絞り込んで照射することにより、インターカレーターＩからの励起蛍光Ｆの強度（蛍光量）を公知のフォトディテクターなどの光検出手段Ｄで測定することによって、ハイブリダイゼーションを検出する。
【００３３】
ここで、このインターカレーターＩは、反応領域Ｒ中に遊離している一本鎖核酸、相補鎖を形成している片側の核酸（例えば、プローブ核酸Ｐよりも長鎖の標的核酸）の余剰一本鎖部分や自己ループ構造を形成する核酸部分などにも非特異的に結合してしまうので、この結合によって蛍光（即ち、ノイズ蛍光）を発する。
【００３４】
本発明は、相補鎖へのインターカレーターの結合をそのまま保持して正規蛍光量を低減させないようにしながら、核酸分解酵素などのヌクレアーゼ活性を有する酵素による核酸の切断作用を有効に利用して、ノイズ蛍光の発生源となるヌクレオチド鎖を消化分解する。これにより、前記ノイズ蛍光を反応領域Ｒから低減又は消失させることを重要な目的としている。以下、例を挙げて具体的に説明する。
【００３５】
まず、図２は、基板などの固相表面Ｓの近傍の反応領域Ｒを例として、該反応領域Ｒにおける典型的なハイブリダイゼーションアッセイ状態の一例が模式的に示されている図である。
【００３６】
まず、固相表面Ｓに３’末端が固定されたプローブ核酸Ｐに対して標的核酸Ｔがハイブリダイゼーションして相補鎖Ｃが形成されている（図２参照）。そして、プローブ核酸Ｐのヌクレオチド鎖長に比べて前記標的核酸Ｔのヌクレオチド鎖長が長いために(図２参照)、該標的核酸Ｔの３’末端側に余剰鎖長の一本鎖核酸部分Ｔ１１、５’末端側に余剰鎖長の一本鎖核酸部分Ｔ１２が発生している状態が示されている（図２参照）。
【００３７】
また、この図２には、反応領域Ｒ中に遊離状態で存在している、ハイブリダイゼーションに関与しなかった（関与できなかった）一本鎖標的核酸Ｔｓ、さらに、一本鎖プローブ核酸Ｐｓも示されている。
【００３８】
この一本鎖標的核酸Ｔｓや一本鎖プローブ核酸Ｐｓがハイブリダイゼーションに関与しない原因としては、これらのヌクレオチド鎖内に相補鎖を形成する塩基配列部分が存在しない場合や相補的な塩基配列部分はあっても、立体障害などの影響によってハイブリダイズできなかった場合などが考えられる。
【００３９】
このような状態にある反応領域ＲへインターカレーターＩが添加されると、相補鎖Ｃ部分に対してインターカレーターＩが特異的に結合すると同時に、その結合量に差はあっても、上記した一本鎖核酸部分Ｔ１１，Ｔ１２、遊離一本鎖標的核酸Ｔｓ、一本鎖プローブ核酸ＰｓなどにもインターカレーターＩが非特異的に結合してしまう。
【００４０】
このような場合では、相補鎖Ｃ部分に結合したインターカレーターＩ由来の蛍光は、ハイブリダイゼーション検出に有用である正規蛍光シグナルを提供するが、一本鎖核酸部分Ｔ１１，Ｔ１２、遊離一本鎖標的核酸Ｔｓ、一本鎖プローブ核酸Ｐｓに対して非特異的に結合したインターカレーターＩ由来の蛍光は、バックグラウンドノイズとなるため、Ｓ／Ｎ比悪化の原因となる。
【００４１】
そこで、本実施形態では、一本鎖核酸を３’→５’方向へ選択的に消化分解する作用を持つエキソヌクレアーゼなどの酵素Ｅを反応領域Ｒへ添加することで、標的核酸Ｙの一本鎖核酸部分Ｔ１１や遊離一本鎖標的核酸Ｔｓを３’末端側から消化分解（切断）してインターカレーターの結合を排除することにより、ノイズ蛍光を消滅させる。
【００４２】
また、一本鎖核酸を５’→３’方向へ選択的に消化分解する作用を持つエキソヌクレアーゼなどの酵素Ｅを反応領域Ｒへ添加することによって、標的核酸Ｙの一本鎖核酸部分Ｔ１２や一本鎖プローブ核酸Ｐｓを５’末端側から消化分解し、ノイズ蛍光を消滅させる。
【００４３】
あるいは、３’→５’方向と５’→３’方向の双方向へ分解する作用を有するエキソヌクレアーゼなどの酵素Ｅを反応領域Ｒへ添加することによって、一本鎖核酸部分Ｔ１１，Ｔ１２、遊離一本鎖標的核酸Ｔｓ、一本鎖プローブ核酸Ｐｓのすべてを３’末端側と５’末端側の両方から消化分解し、ノイズ蛍光を消滅させる。
【００４４】
これらの方法によって、相補鎖Ｃ部分に結合したインターカレーターＩ由来の蛍光量、即ちハイブリダイゼーション検出に有用な蛍光量に対するノイズ蛍光の比、即ちＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００４５】
なお、図２に示す反応領域Ｒの状態では、固相表面に３’末端が固定されたプローブ核酸Ｘを例示しているが、固相表面に５’末端を固定したプローブ核酸Ｘの場合（図示せず）でも同様である。
【００４６】
続いて、図３は、反応領域Ｒにおける別のハイブリダイゼーションアッセイ状態を模式的に示す図である。
【００４７】
この図３には、固相表面Ｓに固定されてプローブ核酸Ｐと、このプローブ核酸Ｐと相補鎖Ｃを形成しているとともに、その一部に自己ループ構造Ｌを形成している標的核酸Ｔが示されている。
【００４８】
また、この図３には、ハイブリダイゼーションに関与せずに、反応領域Ｒ中に遊離して存在し、その一部に自己ループ構造を有する一本鎖標的核酸Ｔｓが示されている。
【００４９】
このような反応領域Ｒの状態においてノイズ蛍光を低減又は消去するために、プローブ核酸Ｐと相補鎖Ｃを形成している標的核酸Ｔの一本鎖核酸部分Ｔ１、該標的核酸Ｔのループ構造部分Ｌ、遊離状態で存在し、ループ構造Ｌを一部に有する一本鎖標的核酸Ｔｓを、ヌクレアーゼ活性を有する酵素で消化分解する。例えば、エキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼを反応領域Ｒへ添加する。
【００５０】
ここで、本発明で採用可能な、ヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、例えば、エキソヌクレアーゼ（Exonuclease）、エンドヌクレアーゼ（Endonuclease）、若しくはポリメラーゼ（Polymerase）、またはこれらの混合物等である。
【００５１】
「エキソヌクレアーゼ」としては、例えば、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレーゼVII、ヌクレアーゼBal 31等を挙げることができる。エキソヌクレアーゼＩは、一本鎖ＤＮＡに選択的に作用して３’→５’方向へ分解し５’-モノマーを生じる。エキソヌクレーゼVIIは、一本鎖ＤＮＡに特異的に作用し、二本鎖ＤＮＡの一本鎖末端部分の除去に適している。ヌクレアーゼBal 31は、二本鎖ＤＮＡの３’末端と５’末端の両鎖を同時にエキソヌクレーゼ作用で消化分解してより短い二本鎖ＤＮＡを生じ、一本鎖核酸にはエンドヌクレアーゼとして作用する。
【００５２】
「エンドヌクレアーゼ」としては、例えば、ヌクレアーゼＳ１、ヌクレアーゼＰ１、Mung Bean Nuclease（マングマメのヌクレアーゼ）等を挙げることができる。例えば、ポリメラーゼを利用する方法としては、ヌクレアーゼ活性を有するクレノウ酵素（Klenow Fragment）等を挙げることができる。
【００５３】
なお、ヌクレアーゼＳ１は、一本鎖核酸に作用し、二本鎖核酸又はＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド核酸中の一本鎖部分の除去、相補部分がなく一本鎖のループ構造となって外側にはみ出した部分の切断などに利用できる。ヌクレアーゼＰ１は、一本鎖のＤＮＡやＲＮＡを５’ヌクレオチドに分解するＺｎ２＋依存性エンドヌクレアーゼであり、ヌクレアーゼＳ１同様に一本鎖核酸の選択的分解に有用である。
【００５４】
また、プローブ核酸がＲＮＡ、標的核酸ＴがＤＮＡである場合、もしくはプローブ核酸がＤＮＡ、標的核酸がＲＮＡの場合、プローブ核酸と標的核酸の両方がＲＮＡの場合では、例えば、ＲＮＡに作用するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）やＤＮＡに作用するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）、これらの混合物、ＤＮＡとＲＮＡの両方に作用するヌクレアーゼなどを、目的や必要に応じて使用できる。場合によっては、ＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖を分解するリボヌクレアーゼＨ活性を利用してもよい。
【００５５】
上掲した酵素の選択方法、酵素の量、酵素反応の時間、酵素反応の温度等は、少なくともインターカレーターが結合できない核酸の長さにまで、ヌクレオチド鎖を消化分解（切断）できる条件を選択する。酵素は、（１）該酵素自体にインターカレーターが吸着しないこと、（２）インターカレーター共存下で酵素活性が低下しないこと、（３）インターカレーターの相補鎖Ｃへの結合を阻害しないこと、を条件として選択する。
【００５６】
酵素によるヌクレオチド鎖の消化分解を実施する工程における緩衝液条件は、各酵素の推奨条件である必要はない。例えば、用いるインターカレーターがSYBR Green Iであり、用いる酵素がヌクレアーゼＴ４、もしくはクレノウフラグメント（KlenowFragment）であるときは、pH7.0〜pH8.5のHEPES緩衝液にMgCl2を加えたものでも可能である。
【００５７】
酵素により消化分解するヌクレオチド鎖の鎖長が長く、自己ループ構造を有するような場合には、該消化分解のための酵素と１本鎖特異的に結合するタンパクを同時に投入することも可能である。
【００５８】
また、反応領域Ｒへの酵素の投入タイミングは、特に限定されないが、例えば、インターカレーター添加前、インターカレーター添加と同時、インターカレーター添加後のいずれの段階でもよい。当該酵素の作用に対して、核酸に結合したインターカレーターの影響が懸念される場合は、インターカレーター添加前に酵素によって、一本鎖核酸等の消化分解を行っておくことが望ましい。
【００５９】
また、本発明では、酵素を適宜選択することによって、例えば、図２に示した一本鎖状態のプローブ核酸Ｐｓのみを酵素処理の対象から除外し、その上でインターカレーターＩを反応領域Ｒへ添加することによって、該プローブ核酸Ｐｓ由来のノイズ蛍光量を調べることもできる。
【００６０】
より詳しくは、図２の状態で標的核酸Ｔの５’末端側に余剰の一本鎖核酸部分Ｔ１２がない場合を想定すれば、３’→５’方向へのエキソヌクレアーゼや二本鎖特異的なヌクレアーゼを添加することで、反応領域Ｒ内に存在するヌクレオチド鎖をプローブ核酸Ｐｓのみとすることができる。その上で、インターカレーターを添加すれば、その蛍光は、すべてプローブ核酸Ｐｓ由来の蛍光量を得ることができる。このようなプローブ核酸Ｐｓ由来のノイズ蛍光量を正確に捉えることは、ハイブリダイゼーション測定の有用な基礎データとして利用できる。
【実施例１】
【００６１】
液相中での一本鎖ＤＮＡに対するインターカレーター（SYBR Green I）の非特異的結合に関する検証試験を行なった。
【００６２】
実験方法。ｐＨ７．４の0.1M phosphate buffer(NaCl 200mM)中に、オリゴヌクレオチド１種を１０ｎＭとなるように添加した。これにより得られたサンプル溶液を１０℃のインキュベーター中に入れ、該サンプル溶液の液温が１０℃となるようにした。次に、このサンプル溶液に１万倍希釈となるようにSYBR Green Iを添加し、１０℃のインキュベーター中でサンプル溶液を１０分間放置した後、蛍光測定（日立製作所製F-4500,励起波長497nm）を行った。
【００６３】
本実験で使用したプローブＤＮＡ、標的ＤＮＡ、オリゴＤＮＡの濃度、インターカレーターの希釈率に関する設定条件は、次の「表１」に示すとおりであり、本実験の結果は、図４に示す。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
添付した図４に示された結果からわかるように、１０ｍｅｒ（表１中のＳ１〜Ｓ９）、２０ｍｅｒ（表１中のＭ１〜Ｍ５）の一本鎖ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）からのインターカレーター蛍光値から判断すると、インターカレーターであるSYBR Green Iは、一本鎖標的ＤＮＡに対して非特異的に結合してノイズ蛍光を発生し得ることが明らかになった。なお、蛍光値は、１０ｍｅｒに比して、２０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡの方が高かった。
【００６６】
したがって、一本鎖標的ＤＮＡに対するSYBR Green Iの非特異的結合を防止する必要があることを確認することができた。
【実施例２】
【００６７】
固相表面（基板）に固定されたプローブ・オリゴＤＮＡに対して鎖長の異なる標的ＤＮＡ１、２を用いてハイブリダイゼーションを進行させ、蛍光値の差を検証する実験を行った。
【００６８】
実験方法。水晶発振子原理のＱＣＭ装置（株式会社イニシアム製ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ）用のセンサーチップのＡｕ電極に、同装置の推奨方法に従って、アビジン（Avidin）を固定した。次に、５’末端をビオチン（biotin）で修飾したプローブＤＮＡを前記センサーチップ上にアビジン-ビオチン結合を介して固定した。続いて、センサーチップを洗浄し、反応領域に固定されずに存在する遊離状態のプローブＤＮＡを除去した。続いて、標的ＮＡを添加し、ハイブリダイゼーションを進行させた後、再び洗浄し、反応領域にハイブリダイゼーションせずに存在する遊離状態の標的・オリゴＤＮＡを除去した。この除去工程後、インターカレーターであるSYBR Green Iを添加し、二本鎖にインターカレートさせた。
【００６９】
本実験で使用したプローブＤＮＡ、標的ＤＮＡ、オリゴＤＮＡの濃度、インターカレーターの希釈率に関する設定条件は、次の「表２」に示すとおりであり、本実験の結果は、次の「表３」に示すとおりである。
【００７０】
【表２】
2006296279.tif 000004
【００７１】
【表３】
2006296279.tif 000005
【００７２】
前掲した「表３」に示された結果より、鎖長が標的ＤＮＡ＞プローブＤＮＡであるとき、標的ＤＮＡの余剰一本鎖部分には、SYBR Green Iが結合して、バックグラウンドとなる蛍光を発することを確認できた。従って、ハイブリダイゼーション検出の精度を高めるためには、相補鎖を形成している標的ＤＮＡの余剰一本鎖部分に対するSYBR Green Iの結合を排除することが必要であることがわかった。
【実施例３】
【００７３】
エキソヌクレアーゼVIIによる一本鎖ＤＮＡの消化分解による蛍光量の変化を検証する実験を行った。
【００７４】
実験方法。ｐＨ７．４の0.1M phosphate buffer(NaCl 200mM)中にプローブＤＮＡ及び標的ＤＮＡ１若しくは標的ＤＮＡ２を１００ｎＭとなるように添加した。また、プローブＤＮＡのみを１００ｎＭとなるように添加した系も準備した。次に、アニーリング（95℃、5分後冷却）を行った後、エキソヌクレアーゼVIを添加し、３７℃で１時間インキュベートし酵素反応を進行させた。次に、得られたサンプル溶液に１万倍希釈となるようにSYBR Green Iを添加し、１０℃のインキュベーター中でサンプル溶液を１０分間放置した後、蛍光測定（日立製作所製F-4500,励起波長497nm）を行った。
【００７５】
本実験で使用したプローブＤＮＡ、標的ＤＮＡ、オリゴＤＮＡの濃度、インターカレーターの希釈率に関する設定条件は、次の「表４」に示すとおりであり、本実験の結果は、次の「表５」に示すとおりである。
【００７６】
【表４】
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【００７７】
【表５】
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【００７８】
前掲する「表５」に示された結果からわかるように、完全相補鎖である二本鎖ＤＮＡについては、酵素処理前後で、蛍光値はほぼ同じであった。これは、エキソヌクレアーゼVIIは一本鎖ＤＮＡに特異的に作用し、完全相補鎖である二本鎖ＤＮＡに対する消化分解作用がないことを示している。
【００７９】
一方、プローブＤＮＡ／標的ＤＮＡ２（20mer／40mer）では、酵素消化実施後に、蛍光値がプローブＤＮＡ／標的ＤＮＡ２（20mer／40mer）の場合とほぼ同じになった（表５参照）。これは、酵素処理により、標的ＤＮＡ２の余剰の一本鎖標的ＤＮＡ部分が切断され、これにより放出されたSYBR Green Iが相補鎖に結合して蛍光量を増加させたことによるものと思われる。
【００８０】
また、一本鎖の標的ＤＮＡに対して、エキソヌクレアーゼVIIの処理を行ったところ、蛍光値がほぼゼロとなった（「表５」参照）。これは、一本鎖の標的ＤＮＡがより短い鎖長のオリゴＤＮＡに消化分解されて、SYBR Green Iが非特異的に結合しなくなったからであると考えられる。
【００８１】
なお、本実験は、酵素処理を行った後で、SYBR Green Iを添加し、蛍光値を測定している。すなわち、酵素処理を行った後のオリゴＤＮＡの消化分解物、酵素、SYBR Green Iが混在する系において蛍光測定を実施している。このことにより、酵素とSYBR Green I、オリゴＤＮＡの消化分解物が混在しても適切な蛍光測定が可能であることが証明できた。
【００８２】
また、補足の実験により、エキソヌクレアーゼVIIによる処理時において、SYBR Green Iを混在させた場合において、当該酵素により消化分解作用の阻害がないことを確かめた。したがって、SYBR Green Iは、酵素活性の阻害剤にならないことから、エキソヌクレアーゼVIIと同時に添加することによって、工程数を削減することが可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、プローブ核酸と標的核酸の相補鎖部位に結合するインターカレーターからの蛍光強度を測定することによってハイブリダイゼーションを検出する技術に利用できる。特に、前記技術において、ノイズ蛍光を低減又は消失させ、Ｓ／Ｎを向上させる技術として利用できる。また、従来採用されているノイズ蛍光原因分子を水溶液洗浄する工程を行わなくてもよいハイブリダイゼーション検出技術、即ち、洗浄フリーのハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明に係るハイブリダイゼーション検出方法の基本的な原理及び構成を模式的に示す図である。
【図２】基板などの固相表面（Ｓ）の近傍の反応領域（Ｒ）における典型的なハイブリダイゼーションアッセイ状態の一例が模式的に示されている図である。
【図３】同反応領域（Ｒ）における別のハイブリダイゼーションアッセイ状態を模式的に示す図である。
【図４】実施例１の結果を示す図面代用グラフ及び蛍光値データ表である。
【符号の説明】
【００８５】
Ｃ  相補鎖
Ｅ  酵素（ヌクレアーゼ活性を有する酵素）
Ｉ  インターカレーター
Ｌ  自己ループ構造
Ｐ  プローブ核酸
Ｐｓ  相補鎖を形成していないプローブ核酸
Ｒ  反応領域
Ｓ  固相表面
Ｔ  標的核酸
Ｔ１１  標的核酸の余剰一本鎖核酸部分（３’末端側）
Ｔ１２  標的核酸の余剰一本鎖核酸部分（５’末端側）
Ｔｓ  遊離して存在する一本鎖標的核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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