(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病の治療薬や予防薬の探査に有効なスクリーニング方法の提供、およびアルツハイマー病の診断やアルツハイマー病の発症の予測に有効な方法を提供すること。【解決手段】被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定し、前記被試験物質がオートタキシンの活性を変化させるか、低下させるか否かを検定することを含むオートタキシンの活性を変化させるか、低下させる被試験物質のスクリーニング方法。オートタキシンの活性を低下させる被試験物質がアルツハイマー病の治療薬あるいは予防薬またはそれらの候補物質である。被検者の体液中に含まれるオートタキシン量を測定することにより、アルツハイマー病を診断する、またはアルツハイマー病発症の危険度を予測する方法。被検者の体液中に含まれるリゾフォスファチジン酸量を測定することにより、アルツハイマー病を診断する、またはアルツハイマー病発症の危険度を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定し、
前記被試験物質がオートタキシンの活性を変化させるか否かを検定することを含む
オートタキシンの活性を変化させる被試験物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定し、
前記被試験物質がオートタキシンの活性を低下させるか否かを検定することを含む
オートタキシンの活性を低下させる被試験物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
オートタキシンの活性を低下させる被試験物質がアルツハイマー病の治療薬あるいは予防薬またはそれらの候補物質である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オートタキシンの活性測定を、オートタキシンが有するリゾフォスフォリパーゼDの活性測定により行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
オートタキシンの活性測定を、オートタキシンによるリゾフォスファチジン酸の合成活性測定により行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
被検者の体液中に含まれるオートタキシン量を測定することにより、アルツハイマー病を診断する、またはアルツハイマー病発症の危険度を予測する方法。
【請求項７】
被検者の体液中に含まれるリゾフォスファチジン酸量を測定することにより、アルツハイマー病を診断する、またはアルツハイマー病発症の危険度を予測する方法。
【請求項８】
被検者の体液が、血液、脳脊髄液、唾液、卵胞液、または精漿である請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートタキシンの活性を変化させる被試験物質のスクリーニング方法、特に、アルツハイマー病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法に関する。さらに本発明は、アルツハイマー病を診断する方法、アルツハイマー病発症の危険度を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病脳においては、コリン作働性神経機能が低下することが知られており、これに基づいてアルツハイマー病治療薬として上記低下を改善するアリセプトをはじめとするコリンエステラーゼ阻害剤が使われている。
【０００３】
アルツハイマー病の病因遺伝子としては、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子、プレセニリン１（ＰＳ１）遺伝子、プレセニリン２（ＰＳ２）遺伝子、およびアポリポプロテインＥのε４アレルが知られている。しかし、家族性アルツハイマー病においてこれら遺伝子の変異により説明可能なケースは１０〜２０％に過ぎないことも知られており、アルツハイマー病を高い確率で検出しうるリスクファクターが必要とされている。これに対して、Ｆｅ６５Ｌ２遺伝子上の、Ｆｅ６５Ｌ２タンパク質の第３１８番目のトレオニン残基をコードするコドンの第３番目のヌクレオチドにおけるＣ／Ｔの一塩基多型が、アルツハイマー病の診断に利用可能であることが報告されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００４−２４０４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかるに、現在知られているアルツハイマー病の診断方法および治療薬や予防薬には不十分な点も多々あり、さらなる研究開発が望まれている。そこで、本発明は、アルツハイマー病の治療薬や予防薬の探査に有効なスクリーニング方法の提供、およびアルツハイマー病の診断やアルツハイマー病の発症の予測に有効な方法を提供することを目的とする。
【０００５】
本発明者らは、アルツハイマー病脳の網羅的発現解析によって、約12000の遺伝子の中から、オートタキシン遺伝子の発現が、アルツハイマー病脳において有為に高発現していることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。
【０００６】
オートタキシンは、メラノーマ細胞の運動性を亢進させる分子として同定された分泌蛋白である。PC-1やB-10と呼ばれる分子とともにENPP (Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) ファミリーを形成し、フォスフォジエステラーゼ活性のみならず、細胞外リゾフォスファチジン酸（LPA）やスフィンゴシン1-リン酸（S1P）の合成に関わるリゾフォスフォリパーゼ(LysoPhospholipase) D活性を有している。オートタキシンは、これまでに細胞運動活性化、血管新生、LPA産生に関わる事が知られている。また、オートタキシンにより合成されたLPAによってアルツハイマー病の病理学的特徴である神経軸索の萎縮が起こり、さらにアルツハイマー病で多く認められるタウタンパクのリン酸化が起こることは報告されている（J.Biol.Chem. 274, 37,046-37052,1999）。しかるに、オートタキシン遺伝子の発現が、アルツハイマー病脳において有為に高発現していることは、今回の網羅的発現解析によって初めて見いだされたことである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
[請求項１]被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定し、前記被試験物質がオートタキシンの活性を変化させるか否かを検定することを含むオートタキシンの活性を変化させる被試験物質のスクリーニング方法。
[請求項２]被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定し、前記被試験物質がオートタキシンの活性を低下させるか否かを検定することを含むオートタキシンの活性を低下させる被試験物質のスクリーニング方法。
[請求項３]オートタキシンの活性を低下させる被試験物質がアルツハイマー病の治療薬あるいは予防薬またはそれらの候補物質である請求項２に記載の方法。
[請求項４]オートタキシンの活性測定を、オートタキシンが有するリゾフォスフォリパーゼDの活性測定により行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項５]オートタキシンの活性測定を、オートタキシンによるリゾフォスファチジン酸の合成活性測定により行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項６]被検者の体液中に含まれるオートタキシン量を測定することにより、アルツハイマー病を診断する、またはアルツハイマー病発症の危険度を予測する方法。
[請求項７]被検者の体液中に含まれるリゾフォスファチジン酸量を測定することにより、アルツハイマー病を診断する、またはアルツハイマー病発症の危険度を予測する方法。
[請求項８]被検者の体液が、血液、脳脊髄液、唾液、卵胞液、または精漿である請求項６または７に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アルツハイマー病の治療薬や予防薬の探査に有効なスクリーニング方法を提供することができる。さらに本発明によれば、アルツハイマー病の診断やアルツハイマー病の発症の予測に有効な方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
［被試験物質のスクリーニング方法］
本発明のオートタキシンの活性を変化させる被試験物質のスクリーニング方法は、被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定し、前記被試験物質がオートタキシンの活性を変化させるか否かを検定することを含む。さらに、本発明は、オートタキシンの活性を低下させる被試験物質のスクリーニング方法を包含し、この方法は、被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定し、前記被試験物質がオートタキシンの活性を低下させるか否かを検定することを含む。
【００１０】
オートタキシンは、細胞外分泌タンパクであり、分泌型の分子量は約125キロダルトンである。その前駆体タンパクをコードする遺伝子は８番染色体長腕の 8q24.1 にマップされ、NCBI の遺伝子データベースにGene ID: 5168 として登録されている。  リンパ組織を除く広汎な組織で発現している。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法に使用するオートタキシンは、例えば、以下の方法により入手することができる。オートタキシン前駆体タンパクあるいは分泌型タンパクに対応する相補的DNAにオリゴヒスチジンなどのタグ配列を付加して発現ベクターに組み込み、大腸菌・酵母・昆虫細胞・高等動物細胞などの適切な発現系で発現させ、抽出・精製することでオートタキシンを得ることができる。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法においては、被試験物質の存在下でオートタキシンの活性を測定する。オートタキシンの活性測定は、例えば、オートタキシンが有しているリゾフォスフォリパーゼ(Lysophospholipase) Dの活性測定により行うことができる。リゾフォスフォリパーゼ(Lysophospholipase) D活性の測定は、例えば、Tokumura A. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 39436-39442に記載の方法に従って行うことができる。概説すると、オートタキシンおよび所定量の被試験物質を含有する試料溶液に、基質リゾホスファチジルコリンを加えて、37℃で反応させる（最長24 h）。この反応により、コリンとLPAが生成する。反応生成物であるコリンを定量するために、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびコリンオキシダーゼの存在下、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸と反応させ、励起波長320 nmで波長404 nmの蛍光を測定する。詳細な方法は、実施例2に記載されている。
【００１３】
被試験物質なしの条件で実施した結果と比較して、反応生成物量が減少していれば、オートタキシン活性の阻害剤であり、反応生成物量が増大していれば、オートタキシン活性の促進剤である。
【００１４】
オートタキシンの活性測定は、例えば、オートタキシンが合成したリゾフォスファチジン酸の量を決定することにより行うこともできる。リゾフォスファチジン酸量の測定は、Saulnier-Blache J. S. et al. (2000) J. Lipid Res. 41, 1947-1951 に記載の方法を参照して行うことができる。概説すると、オートタキシンおよび所定量の被試験物質を含有する試料溶液に、基質リゾホスファチジルコリンを加えて、37℃で反応させる（最長24 h）。この反応により、コリンとリゾフォスファチジン酸(LPA)が生成する。反応生成物であるリゾフォスファチジン酸(LPA)を液体シンチレーションカウンターにより定量する。そのために、[14C]オレオイル補酵素A 、LPA-アシルトランスフェラーゼ、オルトバナジン酸ナトリウム、Tween 20を加えて反応させ、反応生成物を溶媒抽出し、抽出物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーガラスプレートで展開し、オートラジオグラフィーを行う。[14C]ホスファチジン酸のスポットを液体シンチレーションカウンターで放射活性を定量する。詳細は、診断方法についての例であるが、実施例3に記載されている。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法において、被試験物質については、特に制限はない。被試験物質は、公知の物質であっても、本発明完成時に未知の物質であっても良く、合成物質、半合成物質、天然物質のいずれであっても良い。
【００１６】
ヒト血漿中のlysophospholipase D活性をになうものとして同定されたオートタキシンタンパクそのものの阻害剤に関する報告は、本発明者らが知る限り、これまでになされていない。しかし、ラット血漿のlysophospholipase D活性がキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、セリン酵素阻害剤であるフッ化フェニルメチルスルホニル (PMSF) およびジイソプロピルフルオロリン酸 (DFP)、チオール基修飾剤である N-エチルマレイミド (NEM) およびジチオビス（2-ニトロ安息香酸）(DTNB) で阻害されるという報告がある(Tokumura A. et al. (1998) Lipids 33, 1009-1015)。従って、これらの情報を基に、被試験物質の候補を決定することはできる。但し、これらの情報に関わらず、被試験物質の候補は適宜選択することができる。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法においては、被試験物質がオートタキシンの活性を変化させるか否かを検定する。被試験物質がオートタキシンの活性を変化させるものである場合、被試験物質は、アルツハイマー病に対して何らかの関連があると判断される。特に、本発明では、被試験物質がオートタキシンの活性を低下させるか否かを検定することを含み、被試験物質がオートタキシンの活性を低下させるものである場合、被試験物質がアルツハイマー病の治療薬あるいは予防薬またはそれらの候補物質であるとすることができる。本発明のスクリーニング方法によって、アルツハイマー病に対して何らかの関連があると判断された被試験物質、および被試験物質がアルツハイマー病の治療薬あるいは予防薬またはそれらの候補物質であると判断された被試験物質は、さらに別の試験に供することができる。例えば、アルツハイマー病の治療薬あるいは予防薬の探査においては、被試験物質は、ADモデル動物での治療試験およびヒトでの臨床試験等の試験に供することができる。
【００１８】
[アルツハイマー病を診断する方法、アルツハイマー病発症の危険度を予測する方法]
本発明のアルツハイマー病を診断する方法、およびアルツハイマー病発症の危険度を予測する方法は、
(1)被検者の体液中に含まれるオートタキシン量を測定することを含む方法、および
(2)被検者の体液中に含まれるリゾフォスファチジン酸量を測定することを含む方法
である。
【００１９】
被検者の体液中に含まれるオートタキシン量の測定は、例えば、被検者の体液中に含まれるオートタキシンタンパク質の含有量を測定することが行うことができる。オートタキシンタンパク質の含有量の測定は、例えば、ELISA、RIAなどで行うことができる。被検者の体液中に含まれるオートタキシン量をELISAで行う場合、例えば以下のような方法（サンドイッチ法）で行うことができる。適切な緩衝液で希釈した被検溶液を、抗オートタキシン抗体を固定したマイクロタイタープレートのウェルに入れて反応させ、オートタキシンを固定化抗体に結合させる。溶液を除き緩衝液で洗浄した後、ペルオキシダーゼまたはアルカリフォスファターゼで標識された別の抗オートタキシン抗体を反応させ、ウェル上に結合しているオートタキシンに結合させる。洗浄して未反応の標識抗体を除いた後、標識酵素に応じた基質溶液をウェルに加えて一定時間発色させ、反応停止液を加えて反応を止める。基質溶液に応じた波長でウェルの吸光度を測定して、標準試料を用いた検量線に当てはめることによりオートタキシンの量を測定することができる。
【００２０】
また、被検者の体液中に含まれるリゾフォスファチジン酸量の測定は、上記スクリーニング方法で説明した、リゾフォスファチジン酸量の測定により行うことだできる。ただし、その場合、オートタキシンおよび所定量の被試験物質を含有する試料溶液の代りに、被検者の体液を試料溶液として用いる。また、被検者の体液を試料溶液として用いる場合、実施例3に記載のように、試料溶液から1-ブタノールを用いて脂質を抽出し、この脂質を定量用の試料として使用する。
【００２１】
何れの方法においても、被検者の体液としては、例えば、血液、脳脊髄液、唾液、卵胞液、または精漿等を挙げることができる。これらの体液は、そのまま、または適当な前処理の後に、各測定に試料として供することができる。
【００２２】
本発明のアルツハイマー病を診断する方法、アルツハイマー病発症の危険度を予測する方法において、上記(1) の方法においてオートタキシン量を測定する場合、測定の結果、体液中のオートタキシン含有量が大きかった場合、被検者はアルツハイマー病である確率が高いと判定される。また、被検者がアルツハイマー病を発症していない場合、測定の結果、体液中のオートタキシン含有量が大きかった場合、被検者はアルツハイマー病発症の危険度は高く、小さかった場合、被検者はアルツハイマー病発症の危険度は低い、と予測される。
【００２３】
上記(2)の方法においてリゾフォスファチジン酸量を測定する場合、測定の結果、体液中の LPA 含有量が大きかった場合、被検者はアルツハイマー病である確率が高いと判定される。また、被検者がアルツハイマー病を発症していない場合、測定の結果、体液中の LPA 含有量が大きかった場合、被検者はアルツハイマー病発症の危険度は高く、小さかった場合、被検者はアルツハイマー病発症の危険度は低い、と予測される。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
［オートタキシンがアルツハイマー病と関連することを示す実験］
アルツハイマー病（以下 AD と表す）患者脳と対照脳（以下 non-AD と表す）の前頭葉皮質において発現量に差のある遺伝子を、DNAマイクロアレイ法と定量 reverse transcription-polymerase chin reaction (RT-PCR) 法を用いて検索した。凍結保存された前頭葉皮質検体から総RNA を抽出して両実験の試料とした。まずAD 7 例と non-AD 3 例についてDNA マイクロアレイによる解析（対象遺伝子数約 12,000）を行い、ADとnon-ADの間で発現量に差のある可能性のある遺伝子17個を同定したが、この中にオートタキシン遺伝子が含まれていた。さらに、これらの遺伝子のそれぞれに対して、AD１６例と non-AD１５例について定量RT-PCRにより発現量を測定して比較することにより、オートタキシン遺伝子の発現量がAD群で有意に高い（平均でnon-AD群の約1.7倍, Mann-Whitney U検定におけるP値は約0.0064）ことが明らかになった。
【００２５】
このことから、オートタキシン遺伝子の発現量、もしくはオートタキシンの産生物であるリゾホスファチジン酸 (LPA) などの量、もしくはそれらの物質の下流のシグナル伝達系の活性を制御することによって、ADの治療もしくは予防が可能であることが考えられる。また、ADの遺伝的危険因子としてアポリポ蛋白E遺伝子のエプシロン４型 (apoEε4) が知られているが、AD１６例の中でもnon-AD１５例の中でも、ε4型を持つ例の方が持たない例よりオートタキシン遺伝子の発現量が高い傾向が見られた。しかし同時に、ε4型を持つ群の中のみならず持たない群の中でもAD例の方がnon-AD例よりオートタキシン遺伝子の発現量が高い傾向も見られた。このこととオートタキシンが分泌される酵素であることから、体液中のオートタキシン蛋白の量、もしくはLPAなどの量、もしくはその下流のシグナル伝達系の活性化の程度を測定することによって、apoEε4の有無にかかわらずADの診断もしくはAD発症の危険度予測が可能であることが考えられる。
【００２６】
実験方法
前頭葉皮質献体からの総RNAの調製
死後脳献体の前頭葉皮質部分をスライスして液体窒素により冷凍後-80℃保存して、総RNAの調製に供した。凍結組織の小片をTRIZOL Reagent (Invitrogen Corporation, California) に投入してPolytron ホモジナイザー (KINEMATICA, Switzerland) で直ちにホモジナイズした後、10,000×g, 4℃, 10 min 遠心沈降して上清を得た。これにクロロホルム 1.7 ml を加えて激しく振り混ぜた後 2 min 静置してから10,000×g, 4℃, 15 min 遠心沈降して上清を得た。これに2-プロパノール 4.3 mlを加えて激しく振り混ぜた後10 min 静置してから10,000×g, 4℃, 10 min 遠心沈降して上清を捨てた。75% エタノール9 mlを加えて沈殿を洗浄した後 6,500×g, 4℃, 5 min 遠心沈降して上清を除いた。沈殿物を風乾後、diethylpyrocarbonate で処理した水100μlを加えて60℃, 10 min 加熱して溶解させた。この粗抽出RNA溶液からRNeasy Mini Kit (QIAGEN, Germany) を用いて精製総RNA溶液を調製した。方法はQIAGEN社の使用説明書の通り。
【００２７】
DNAマイクロアレイによる解析
DNAマイクロアレイ(GeneChip system, Affymetrix, California) の実験をおこなった。方法はAffymetrix社の使用説明書の通り。簡略に記すと、精製総RNA 8ないし10μgを使い二本鎖の相補的DNAを合成し、さらにビオチン標識アンチセンスRNAを合成した。それを断片化したものをHuman Genome U95Av2 アレイ (Affymetrix) とハイブリダイズさせた。そのアレイをビオチン化抗ストレプトアビジン抗体およびストレプトアビジン-フィコエリスリン複合体と反応させた後、共焦点レーザースキャナーで蛍光シグナルを測定し、解析ソフトウェアMicroarray Suite ver 5.0 および Data Mining Tool ver 3.0 (以上Affymetrix)でデータを解析した。
【００２８】
定量RT-PCR
TaqMan Gold RT-PCR Kit (Applied Biosystems, California) を用いて精製総RNAから一本鎖の相補的DNAを合成した。方法は同キットの使用説明書の通りで、反応液40μl に対して精製総RNA 0.4ないし0.8μg を使用した。さらにその反応液を使って、TaqMan Universal PCR Master Mix およびPRISM 7700 Sequence Detection System (以上Applied Biosystems) を用いて目的の遺伝子および β-アクチン遺伝子に対する定量PCRを行った。方法はUniversal PCR Master Mixの使用説明書の通りで、RT反応液の使用量は適当になるように遺伝子ごとに調節した。プライマー及びTaqManプローブのDNA塩基配列は Primer Express version 1.5ソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて設計した。β-アクチン遺伝子および オートタキシン 遺伝子に対する配列を以下に記す。
【００２９】
β-アクチン遺伝子用TaqManプローブ (FAM標識）
5’-CAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCC-3’(配列番号1)
β-アクチン遺伝子用Forwardプライマー
5’-AAAACTGGAACGGTGAAGGTGA-3’ (配列番号2)
β-アクチン遺伝子用Reverseプライマー
5’-CGGCCACATTGTGAACTTTG-3’ (配列番号3)
オートタキシン遺伝子用TaqManプローブ (FAM標識）
5’-CCTCTCTCTGTGTCCTC-3’ (配列番号4)
オートタキシン遺伝子用Forwardプライマー
5’-TGCCGACAAGTGTGACGG-3’ (配列番号5)
オートタキシン遺伝子用Reverseプライマー
5’-CCGGTGAGGCAGGATGAA-3’ (配列番号6)
【００３０】
オートタキシン 遺伝子を含む目的遺伝子の定量は以下のようにおこなった。任意の一検体を校正用の標準検体と定めて鋳型たるRT反応液の使用量を様々に変えて定量PCRを行い、増幅の臨界サイクル数 (threshould cycle, CT) の検量線を作成する。全ての反応のCTをこの検量線に当てはめて、標準検体に対する相対的鋳型量を求める。この値をまず対数に変換しておき、全検体についての平均値に対する変位として各検体の定量値を求める。β-アクチン遺伝子および オートタキシン 遺伝子に対して少なくとも３回の独立の実験を行い、得られた変位値を平均した。オートタキシン 遺伝子についての平均変位値からβ-アクチン遺伝子についてのそれを差し引くことによって標準化して、最終的な定量値（対数変換されている）とした。この値を統計検定などの解析に用いた。２検体群間の差の有意性の検定はMann-WhitneyのU検定に依った。
【００３１】
上記実験の結果を図1に「箱ヒゲ図」(Box-whisker plot) の形式で示す。図1の縦軸は「最終的な定量値（対数変換されている）」である。「n=16」等は、図示されている分布が 16 個の検体についての 16 個の数値の分布であることを表す。「p=0.0064」は、２つの数値群をMann-Whitney U 検定の方法で比較した場合の有意確率である。箱の内部の水平線は中央値を、箱の上・下端はそれぞれ 75% 点と25% 点を表す。ヒゲの上・下端はそれぞれ、 75% 点プラス（箱の幅×1.5）と25% 点マイナス（箱の幅×1.5）の間に入っているデータのうち最大のものと最小のものを表す。
【００３２】
実施例２
オートタキシン活性阻害を利用したアルツハイマー病の治療薬または予防薬のスクリーニング方法として、Lysophospholipase D活性（オートタキシン の活性）測定方法について説明する。
【００３３】
Tokumura A. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 39436-39442に記載の方法に従って行うことができる。
オートタキシンおよび所定量の被試験物質を含有する試料溶液100μlに、0.05% の脂肪酸不含牛血清アルブミンを含んだ生理食塩水に懸濁した基質リゾホスファチジルコリン50 μlを加えて、37℃で様々な時間（最長24 h）反応させる。酵素（オートタキシン）量としていくらが適当であるかは、用いる酵素標品の純度や比活性、検出ステップの定量範囲、観察したい阻害度などによって適宜決定することができる。得られた反応液の100 μlに0.1M トリスヒドロキシメチルアミノメタン (Tris) -塩酸緩衝液 (pH 8.5) 2.6 ml, 7.5 mM 3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸 200 μl, 2 units/ml 西洋ワサビペルオキシダーゼ 100 μl, 300 units/ml コリンオキシダーゼ10 μlを加えて37℃, 15 min 反応させた後、励起波長320 nmで波長404 nmの蛍光を測定する。
【００３４】
蛍光の測定結果から、Lysophospholipase D活性（オートタキシン の活性）を求めるには、予備実験として阻害物質（被検物質）無しで酵素量を色々に変えて蛍光を測定し、酵素量対蛍光強度の検量線を作成しておき、酵素量に対して蛍光強度が充分変化する条件（酵素量）で被検物質存在下の本実験を行い、得られた蛍光強度を検量線に当てはめれば、残存酵素活性がわかり、被検物質による阻害率も求めることができる。
【００３５】
実施例２
オートタキシン活性測定を利用したアルツハイマー病の診断、またはアルツハイマー病発症の危険度予測の方法として、LPAの測定方法について説明する。
【００３６】
Saulnier-Blache J. S. et al. (2000) J. Lipid Res. 41, 1947-1951に記載の方法に従って実施することができる。被検者から採取した血漿等の検体に等容の1-ブタノールを加えてよく振とう後、3,000×g, 5 min 遠心分離する。上層を回収して窒素中50℃で蒸発乾固することで脂質を抽出回収する。これに反応溶剤200 μl（[14C]オレオイル補酵素A (55 mCi/mmol) 1 μl, 200 mM Tris-塩酸緩衝液 (pH 7.5) 20 μl, LPA-アシルトランスフェラーゼ10 μl, 500 μM オルトバナジン酸ナトリウム8 μl, 1 mg/ml Tween 20 161 μl）を加えて 15 min ごとに撹拌しながら20℃, 120 min 反応させる。クロロホルム-メタノール-12 M塩酸混液 (40:40:0.26) 400 μlを加えて激しく振り混ぜて反応を停止させ、3,000×g, 10 min 遠心分離する。下層（クロロホルム層）を窒素中で蒸発させ、クロロホルム-メタノール等容混液20 μlに溶解させる。シリカゲル薄層クロマトグラフィーガラスプレートにスポットし、クロロホルム-メタノール-濃アンモニア水-水混合溶媒 (65:25:0.9:3) で展開し、オートラジオグラフィーを行う。[14C]ホスファチジン酸のスポットを掻き取って液体シンチレーションカウンターで放射活性を定量する。
LPA量を求めるには、標準の LPA 標品の量を変化させて描いた検量線に当てはめることによって、放射活性から LPA 量を求めることができる。ただし実験原理から、理論的には放射活性は LPA 量に比例するはずなので、それを前提とすれば検量線を描かなくても適当な一点の LPA 標品量について放射活性を求めておくことでも、LPA量を求めることはできる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明は、アルツハイマー病の治療薬や予防薬の探査に有効なスクリーニング方法の提供、およびアルツハイマー病の診断やアルツハイマー病の発症の予測に有効な方法の提供を可能とし、医療および医薬の分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実験結果を「箱ヒゲ図」(Box-whisker plot) の形式で示す。
【図１】
2006217859.tif 000002
【配列表】
2006217859000001.app