(57)【要約】【課題】  ＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有する組成物を提供すること。【解決手段】一般式（I）で表されるＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有し、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患の予防および改善のための医薬組成物あるいは飲食品組成物を提供することができる。【化２】2006273741.tif 000003
【特許請求の範囲】
【請求項１】
PPARγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
ロスマリン酸誘導体が、ロスマリン酸メチル、ロスマリン酸エチル、ロスマリン酸プロピルおよびロスマリン酸ブチルからなる群から選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患の予防および治療剤、である請求項１〜２のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項４】
PPARγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有し、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患の予防および改善のために用いられることを特徴とする、飲食品組成物。
【請求項５】
ロスマリン酸誘導体が、ロスマリン酸メチル、ロスマリン酸エチル、ロスマリン酸プロピルおよびロスマリン酸ブチルからなる群から選択される、請求項４記載の飲食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有することを特徴とする組成物に関する。さらに詳細には、内臓脂肪に働きかけ、インスリン抵抗性を改善し、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患などの生活習慣病の予防および治療に役立つＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有することを特徴とする組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の研究で、内臓脂肪の蓄積がインスリン抵抗性、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患などのいわゆる生活習慣病を引き起こすリスクファクターとなることが明らかとなってきた。これまでに肥満、特に内臓脂肪の蓄積によるインスリン抵抗性と、糖尿病、高血圧、高脂血症など複数の疾患が重積し、動脈硬化や冠動脈疾患の危険度が高まった病態であるメタボリックシンドロームの改善には、食事療法、運動療法あるいは禁煙や飲酒量の調整など種々の生活習慣の改善が必須であるとされ、これらを遵守するため患者のＱＯＬの著しい低下は否めなかった。一方、最近の分子生物学的なアプローチにより脂肪細胞に働きかけ、インスリン抵抗性を改善し、ひいては上記に挙げたような生活習慣病全般の予防作用を有する核内レセプターであるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマー（peroxisome proliferators activated receptorγ）が発見され、創薬を目的としたペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマー（ＰＰＡＲγと略する）のリガンドに関する探索研究が盛んに行われるようになった（非特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００３】
ＰＰＡＲγはステロイドホルモン受容体や甲状腺ホルモン受容体に代表される核内ホルモン受容体スーパーファミリーの一つであり、脂肪細胞分化のごく初期にその発現が誘導され、マスターレギュレーターとして脂肪細胞の分化に重要な役割を果している。ＰＰＡＲγはリガンドと結合することによりレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と二量体を形成し、核内で標的遺伝子の応答部位と結合して転写効率を直接制御している。近年、プロスタグランジンＤ２の代謝産物がＰＰＡＲγの内因性リガンドである可能性が示唆され（非特許文献３）、さらにチアゾリジンジオン誘導体などのインスリン感受性増強剤がＰＰＡＲγのリガンド活性を有し、その強さと血糖低下作用あるいは脂肪細胞分化促進作用が平行することが判明した（非特許文献４、非特許文献５参照）。チアゾリジンジオン誘導体はＰＰＡＲγを活性化することにより、インスリン抵抗性を惹起するサイトカインであるＴＮＦ-αや遊離脂肪酸を多く分泌している肥大化した脂肪細胞（特に内臓脂肪細胞）をアポトーシスによって減少させ、前駆脂肪細胞から正常な機能を有する小型脂肪細胞を増加させることでインスリン抵抗性を改善する。またＰＰＡＲγリガンドはメタボリックシンドロームの基盤をなすインスリン抵抗性を改善することから、糖尿病、肥満、高脂血症および動脈硬化といったメタボリックシンドロームのリスクファクターである疾患の予防および改善に有効と考えられる。
【非特許文献１】松沢佑次「ＰＰＡＲと疾患」メディカルサイエンスダイジェスト  Ｖｏｌ.３０,１１−１２,２００４
【非特許文献２】島野仁「ＰＰＡＲsの機能と病態」ザ・リピッド  Ｖｏｌ.１３,１２−１３,２００２
【非特許文献３】Ｂ.Ｆｏｒｍａｎ  et  al  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ.８３，８０３−８１２，１９９５
【非特許文献４】Ｊ.Ｌｅｈｍａｎｎ  et  al  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ.２７０，１２９５３−１２９５６，１９９５
【非特許文献５】Ｔ.Ｗｉｌｌｓｏｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ.３９，６６５−６６８，１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明は内臓脂肪に働きかけ、インスリン抵抗性を改善し、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患の予防および治療に役立つＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有することを特徴とする組成物を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ロスマリン酸誘導体が優れたＰＰＡＲγリガンド活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有することを特徴とする、医薬組成物。
（２）ロスマリン酸誘導体が、ロスマリン酸メチル、ロスマリン酸エチル、ロスマリン酸プロピルおよびロスマリン酸ブチルからなる群から選択される、（１）記載の医薬組成物。
（３） インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患の予防および治療剤、である（１）〜（２）のいずれか一項記載の医薬組成物。
（４）ＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有し、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患の予防および改善のために用いられることを特徴とする、飲食品組成物。
（５）ロスマリン酸誘導体が、ロスマリン酸メチル、ロスマリン酸エチル、ロスマリン酸プロピルおよびロスマリン酸ブチルからなる群から選択される、（４）記載の飲食品組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有することを特徴とする組成物は、内臓脂肪に働きかけインスリン抵抗性を改善する有効な物質である。よって、本発明のＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有する医薬組成物ならびに飲食品組成物は、インスリン抵抗性を改善することにより、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患の予防および治療剤のほかに、これらの疾患の予防および改善のための飲食品として利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で、ロスマリン酸誘導体とは、下記の一般式（I)で表されるロスマリン酸誘導体をいう。
【０００９】
【化１】
2006273741.tif 000002
これらのロスマリン酸誘導体の中で、特に、Ｒ1の炭素数が１〜４のアルキル基、具体的には、ロスマリン酸メチル、ロスマリン酸エチル、ロスマリン酸プロピルおよびロスマリン酸ブチルが好ましい。
【００１０】
本発明のＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体は、その薬学的に許容される塩とすることができる。このような塩の好ましい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩のようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、あるいは酸付加塩などが挙げられる。
【００１１】
また、本発明のＰＰＡＲγリガンド活性を有する一般式（I)で表されるロスマリン酸誘導体は溶媒和物とすることができる。このような溶媒和物としては、水和物、アルコール和物およびアセトン和物などが挙げられる。
【００１２】
本発明のＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を製造する方としては、ロスマリン酸を原料として、化学合成的なアルキル化法が挙げられる。
本発明において化学合成的なアルキル化法としては、ロスマリン酸にアルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなど）および酸性溶液（塩酸、硫酸、酢酸など）を添加することによるアルキル化反応を利用する製造方法が挙げられる。または、植物中、特に赤シソなどシソ科植物から抽出することによってロスマリン酸誘導体を得ることができる。製造されたロスマリン酸誘導体は、一連の反応終了後に、通常公知の分離、精製手段を駆使して単離することができる。例えば、抽出、分配、カラムクロマトグラフィーなどによって、目的とするロスマリン酸誘導体を取得することができる。
【００１３】
本発明のロスマリン酸誘導体は、核内受容体であるＰＰＡＲγのリガンド活性を有し、ロスマリン酸誘導体を、薬学的に許容される担体とともに含んでなる、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、具体的には、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患などの予防および治療剤として適用される。
【００１４】
本発明のロスマリン酸誘導体は、飲食品に添加して前記のような疾患の予防または改善のための飲食品組成物として提供できる。
【００１５】
医薬組成物として用いる場合には、前記のロスマリン酸誘導体は、経口または非経口（例えば、静注、筋注、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、経皮投与など）のいずれかの投与経路で、ヒトおよびヒト以外の動物に投与することができる。
また、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には主として静注、筋注などの注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ錠などの経口剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水性坐剤などのいずれかの製剤形態に調製することができる。
【００１６】
これらの各種製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、崩壊剤としては、例えば澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウムなどが、結合剤としては、例えばメチルセルロースまたはその塩、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、その他の添加剤としては、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどがそれぞれ挙げられる。
【００１７】
飲食品組成物として用いる場合の飲食品の形態としては、栄養ドリンク、清涼飲料水、紅茶、緑茶などの飲料、キャンデー、クッキー、錠菓、チューインガム、ゼリー状などの菓子の他、麺、パン、米飯、ビスケットなどの穀類加工品、ソーセージ、ハム、かまぼこなどの練り製品、バター、ヨーグルトなどの乳製品、ふりかけ、調味料などが挙げられる。
【００１８】
医薬組成物または飲食品組成物中のロスマリン酸誘導体の含量は、その剤形または飲食品の形態により異なるが、通常全組成物中０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９５重量％、程度である。
投与量は、用法、飲食品の形態、患者の年齢、性別、疾患の相違、症状の程度などを考慮して適宜決定されるが、内臓脂肪蓄積抑制、高脂血症、動脈硬化、慢性心疾患などの改善するためには、通常成人1日1人当り１〜４００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇの投与量であり、これを1日1回または数回に分けて投与することができる。
【００１９】
ラットを用いた経口急性毒性試験
本発明の一般式（I)で表されるロスマリン酸メチル、ロスマリン酸エチル、ロスマリン酸プロピルおよびロスマリン酸ブチルをラットに、２００ｍｇ／ｋｇでＳＤ系ラット雄性６匹に経口投与を実施し、死亡または一般状態の異常が認められないことを確認している。
【００２０】
ラットを用いた５０日間経口連続投与試験
本発明の一般式（I)で表されるロスマリン酸メチル、ロスマリン酸エチル、ロスマリン酸プロピルおよびロスマリン酸ブチルをラットに、１００ｍｇ／ｋｇでＳＤ系ラット雄性６匹に５０日間連続経口投与を実施し、一般状態、体重増加、血清生化学に異常が認められないことを確認している。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００２２】
（実施例1）ロスマリン酸メチルの生成
１％ＨＣlを含有するメタノール５Ｌにロスマリン酸１００ｇを溶解し、５０℃で５時間反応した後、エバポレーターで溶媒を除去した。これを３０％メタノールに溶解して、ＭＣＩ−ＧｅＬ  ＣＨＰ２０Ｐ(三菱化学社製)に供し、６０％メタノールで洗浄した後、７０％メタノールフラクションより、目的とするロスマリン酸メチル７０ｇを得た。
【００２３】
ロスマリン酸メチルの1H−核磁気共鳴スペクトラム(CD3OD、400MHz)
7.12（2H, d）,6.87（5H, d）,7.02（6H,ｄｄ）7.58（7H,d）,6.31（8H, d）, 6.78(2’H, d),6.78(5’H,d),6.63(6’H,dd),3.07(7’H,dd), 5.22(8’H, dd),3.74(10’H、s)
【００２４】
ロスマリン酸メチルの13C−核磁気共鳴スペクトラム (CD3OD、100MHz)
127.5(C1),115.5(C2),146.3(C3), 149.4(C4), 116.8(C5), 123.6(C6), 148.2(C7), 113.9(C8), 168.9(C9), 128.8(C1’), 117.7(C2’), 145.7(C3’), 144.8(C4’), 116.6(C5’), 122.1(C6’),37.5(C7’), 74.7(C8’), 172.7(C9’),53.3(C10’)
LC-MS(M-H=373)
【００２５】
（実施例２）ロスマリン酸エチルの生成
１％ＨＣlを含有するエタノール５Ｌにロスマリン酸１００ｇを溶解し、５０℃で５時間反応した後、エバポレーターで溶媒を除去した。これを３０％メタノールに溶解して、ＭＣＩ−ＧｅＬ  ＣＨＰ２０Ｐに供し、６０％メタノールで洗浄した後、７０％メタノールフラクションより、目的とするロスマリン酸エチル６８ｇを得た。
【００２６】
ロスマリン酸エチルの1H−核磁気共鳴スペクトラム(CD3OD、400MHz)
7.12（2H, d）,6.87(5H, d)))),7.03(6H,dd), 7.59(7H,d), 6.32(8H, d), 6.78(2’H, d), 6.78(5’H,d), 6.64(6’H,dd), 3.07(7’H,dd), 5.19(8’H, dd), 4.18(10’H, q), 1.22(11’H, t)
【００２７】
ロスマリン酸エチルの13C−核磁気共鳴スペクトラム(CD3OD、100MHz)
127.5(C1),115.4(C2),146.3(C3), 149.5(C4), 116.8(C5), 123.6(C6), 148.2(C7), 113.9(C8), 168.9(C9), 128.8(C1’), 117.8(C2’), 146.7(C3’), 144.8(C4’), 116.6(C5’), 122.1(C6’),37.5(C7’), 74.8(C8’),172.2(C9’),63.0(C10’),14.3(C11’)
LC-MS（M-H=403）
【００２８】
（実施例３）ロスマリン酸プロピルの生成
１％ＨＣlを含有するプロパノール５Ｌにロスマリン酸１００ｇを溶解し、５０℃で５時間反応した後、エバポレーターで溶媒を除去した。これを３０％メタノールに溶解して、東ソー社製の分取ＨＰＬＤシステムで下記条件により分取を実施した。ＨＰＬＣ条件  溶離液  ６５％メタノール、４０／ｍｉｎ、ＵＶ２８０ｎｍ、カラム：ＯＤＳ８０Ｔ  φ５５ラ３００ｍｍ。分取によって、目的とするロスマリン酸プロピル４２．９ｇを得た。
【００２９】
ロスマリン酸プロピルの1H−核磁気共鳴スペクトラム(CD3OD、400MHz)
7.04(1H, d), 6.74(5H, d), 6.95(6H,dd), 7.55(7H,d), 6.26(8H, d), 6.70(2’H, d), 6.66(5’H,d), 6.57(6’H,dd), 3.03(7’H,d), 5.16(8’H, dd), 4.04(10’H,t), 1.59(11’H, m), 1.62(12’H, t)
【００３０】
ロスマリン酸プロピルの13C−核磁気共鳴スペクトラム(CD3OD、100MHz)
127.5(C1),115.2(C2),146.9(C3), 150.0(C4), 116.5(C5), 123.2(C6), 147.9(C7), 114.1(C8), 168.4(C9), 128.7(C1’), 117.6(C2’), 146.2(C3’), 145.4(C4’), 116.3(C5’), 121.8(C6’),38.0(C7’), 74.8(C8’), 171.9(C10’), 67.9(C10’), 22.9(C11’), 10.6(C12’) 
LC-MS(M-H=417)
【００３１】
（実施例４）
ロスマリン酸ブチルの生成
１％ＨＣlを含有するｎ-ブタノール５Ｌにロスマリン酸１００ｇを溶解し、５０℃で５時間反応し、エバポレーターで溶媒を除去した。これを３０％メタノールに溶解して、東ソー社製の分取ＨＰＬＤシステムで下記条件により分取を実施した。ＨＰＬＣ条件  溶離液  ６５％メタノール、４０ｍｌ／ｍｉｎ、ＵＶ２８０ｎｍ、カラム：ＯＤＳ８０Ｔ  φ５５ラ３００ｍｍ。分取によって、目的とするロスマリン酸ブチル７４．５ｇを得た。
【００３２】
ロスマリン酸ブチルの1H−核磁気共鳴スペクトラム(CD3OD、400MHz)
7.12(2H, d), 6.77(5H, d), 6.95(6H, dd), 7.55(7H,d), 6.26(8H, d), 6.71(2’H,d), 6.69(5’H,d), 6.57(6’H,dd), 3.03(7’H,d), 5.15(8’H, dd), 4.08(10’H, s), 1.54(11’H, m), 1.30(12’H, m), 0.89(13’H, t)
【００３３】
ロスマリン酸ブチルの13C−核磁気共鳴スペクトラム(CD3OD、100MHz)
127.5(C1), 115.1(C2), 146.9(C3), 150.0(C4), 116.5(C5), 123.2(C6), 147.9(C7), 114.1(C8), 168.4(C9), 128.7(C1’), 117.6(C2’), 146.2(C3’), 145.4(C4’), 116.3(C5’), 121.8(C6’), 37.9(C7’), 74.8(C8’), 171.9(C9’), 66.1(C10’), 31.6(C11’), 20.0(C12’), 13.9(C13’)
LC-MS(M-H=431)  
【００３４】
（実施例5）  ロスマリン酸誘導体入りキャンデーの調製
下記の配合で常法に従いキャンデーを製造した。
砂糖                                    50.0
水飴                                    33.0
クエン酸                                2.0
香料                                    0.2
ロスマリン酸メチル                      0.1
脱イオン水                              残部
計                                  100.0
【００３５】
（実施例6）  ロスマリン酸誘導体入り清涼飲料の調製
下記の配合で常法に従い清涼飲料を製造した。
砂糖                                    16.0
クエン酸                                0.3
アスコルビン酸                          0.1
フレーバー                              0.05
ロスマリン酸ブチル                      0.1
脱イオン水                              残部    
計                                      100.0
【００３６】
（実施例7）ロスマリン酸誘導体含有の錠剤の調製
下記の配合で常法に従い錠剤を製造した。
ロスマリン酸プロピル                      0.1
結晶セルロース                           98.9
ショ糖脂肪酸エステル                      1.0
計                                  100.0
【００３７】
（試験例1）ロスマリン酸誘導体のＰＰＡＲγリガンド活性測定
レポータージーンアッセイを用いてＰＰＡＲγリガンド活性を測定した。ヒトＰＰＡＲγのリガンド結合部位配列を酵母の転写因子であるＧＡＬ-４のＤＮＡ結合タンパク質配列の下流に組み換えたレポータープラスミドを作製し（ｐＢＩＮＤ−ＰＰＡＲγ）、これらとＧＡＬ−４のＤＮＡ結合配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだプラスミド(ｐＧ５−luc)とを、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＶ−１細胞）にＦｕＧｅｎｅ６(Ｒｏｃｈｅ社)を用いて一過性にトランスフェクションした。ロスマリン酸およびロスマリン酸誘導体をジメチルスルフォキシドに溶解して、トランスフェクションした細胞に添加し、２４時間後にルシフェラーゼの発光を測定してリガンド活性を求めた。測定の結果は図１に示すように、対照としてジメチルスルフォキシドのみを添加した際の活性を１とした時に、ロスマリン酸は５０μＭの濃度で１．７倍のリガンド活性を示したのに対し、ロスマリン酸メチルは２．２倍、ロスマリン酸エチルは３．３倍、ロスマリン酸プロピルは５．８倍、ロスマリン酸ブチルは５．３倍のリガンド活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のＰＰＡＲγリガンド活性を有するロスマリン酸誘導体を含有することを特徴とする組成物は、内臓脂肪に働きかけ、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満、高脂血症、動脈硬化および冠動脈疾患などの予防および治療剤、あるいはこれらの疾患の予防および改善のための飲食品として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ロスマリン酸およびロスマリン酸誘導体のＰＰＡＲγリガンド活性を表すグラフである。
【図１】
2006273741.tif 000004