(57)【要約】【課題】細胞への外来遺伝子の安定的な導入手段を提供すること。【解決手段】導入対象核酸のインテグレーションを促進するエレメントを保持する核酸、核酸構築物、インテグレーション効率の向上方法、外来遺伝子の導入方法及び該導入方法に用いられるキット並びに形質転換体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号：１に示される塩基配列、又は
（２）個体間の核酸多型により、配列番号：１に示される塩基配列の少なくとも１ヌクレオチドが異なる塩基配列であって、該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
を含有してなる、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸の導入用エレメントを保持する核酸。
【請求項２】
導入対象細胞が、植物又は植物起源の細胞である、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
（１’）配列番号：１の塩基番号：３０〜７８に示される塩基配列、又は
（２’）個体間の核酸多型により、前記（１’）の塩基配列の少なくとも１ヌクレオチドが異なる塩基配列であって、該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
を含有してなる、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸の導入用エレメントを保持する核酸。
【請求項４】
導入対象細胞が、植物又は植物起源の細胞である、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載の核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されてなる核酸構築物。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか１項に記載の核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させることを特徴とする、導入対象核酸のインテグレーション効率の向上方法。
【請求項７】
（Ａ）請求項１〜４いずれか１項に記載の核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させて、核酸構築物を得るステップ、並びに
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた核酸構築物を、導入対象細胞に導入するステップ、
を含む、核酸の導入方法。
【請求項８】
請求項５記載の核酸構築物を導入対象細胞に導入することを特徴とする、形質転換体の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４いずれか１項に記載の核酸を含有してなる、核酸導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグレーションを促進するエレメント、すなわち、外来遺伝子の導入用エレメントを含有する核酸に関する。さらに詳しくは、本発明は、導入対象核酸のインテグレーションを促進する、導入対象核酸の導入用エレメントを保持する核酸、核酸構築物、インテグレーション効率の向上方法、核酸の導入方法及び該導入方法に用いられるキット並びに形質転換体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物に外来遺伝子を導入する方法として、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法〔特許文献１〕、エレクトロポレーション法〔非特許文献１、非特許文献２等〕、パーティクルガンを用いたボンバードメント法〔非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６等〕、マイクロキャピラリーを用いたマイクロインジェクション法〔非特許文献７、非特許文献８等〕が知られている。
【０００３】
しかしながら、前記アグロバクテリウムを用いた方法では、非感染性植物には適用できないという欠点がある。また、前記エレクトロポレーション法、ボンバードメント法、マイクロインジェクション法等による方法では、安定的に外来遺伝子を発現する形質転換体を得ることが困難な場合がある。
【特許文献１】特開平６−１０５６２９号公報
【非特許文献１】デハルイン（Ｋ  Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．，４（１２），１４９５−１５０５（１９９２）
【非特許文献２】ヒデアキ  ハシモト（Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ）ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１，３３６−３３９（１９８５）
【非特許文献３】クレイン（Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３（１９８７）
【非特許文献４】クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．）ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，９５７−９６２（１９９１）
【非特許文献５】イイダ（Ａ．Ｉｉｄａ）ら，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８０，８１３−８１６（１９９０）
【非特許文献６】森川弘道（Ｈｉｒｏｍｉｃｈｉ  Ｍｏｒｉｋａｗａ）ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１，３２０−３２２（１９８９）
【非特許文献７】リン（Ｌｉｎ  ＴＰ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５１（７０８）,３３３−３３７（１９６６）
【非特許文献８】コーヘン（Ｋｏｈｅｎ  Ｅ．），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，４１（１），２２３−２２６（１９６６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の１つの側面は、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入すること、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうこと、形質転換体の収量を向上させること、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく発現させること、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進すること、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させること等の少なくとも１つを解決する、導入対象核酸の導入用エレメントを保持する核酸を提供することにある。
【０００５】
また、本発明の他の側面は、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入すること、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうこと、形質転換体の収量を向上させること、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく安定的に発現させること、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させること等の少なくとも１つを解決する、核酸構築物を提供することにある。
【０００６】
さらに、本発明の別の側面は、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうこと等を解決する、外来遺伝子のインテグレーション効率の向上方法を提供することにある。
【０００７】
また、本発明のさらに他の側面は、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入すること、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうこと、形質転換体の収量を向上させること、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく発現させること、該産物を安定的に発現させること、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させること等の少なくとも１つを解決する、外来遺伝子の導入方法を提供することにある。
【０００８】
さらに、本発明のさらに別の側面は、形質転換体の収量を向上させること、発現効率を向上させること等の少なくとも１つを解決する、形質転換体の製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに別の側面は、本発明の核酸の導入方法を簡便に行なうことができる、外来遺伝子導入用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  （１）配列番号：１に示される塩基配列、又は
（２）個体間の核酸多型により、配列番号：１に示される塩基配列の少なくとも１ヌクレオチドが異なる塩基配列であって、該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
を含有してなる、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸の導入用エレメントを保持する核酸、
〔２〕  導入対象細胞が、植物又は植物起源の細胞である、前記〔１〕記載の核酸、
〔３〕  （１’）配列番号：１の塩基番号：３０〜７８に示される塩基配列、又は
（２’）個体間の核酸多型により、前記（１’）の塩基配列の少なくとも１ヌクレオチドが異なる塩基配列であって、該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
を含有してなる、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸の導入用エレメントを保持する核酸、
〔４〕  導入対象細胞が、植物又は植物起源の細胞である、前記〔３〕記載の核酸、
〔５〕  前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されてなる核酸構築物、
〔６〕  前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させることを特徴とする、導入対象核酸のインテグレーション効率の向上方法、
〔７〕  （Ａ）前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させて、核酸構築物を得るステップ、並びに
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた核酸構築物を、導入対象細胞に導入するステップ、
を含む、核酸の導入方法、
〔８〕  前記〔５〕記載の核酸構築物を導入対象細胞に導入することを特徴とする、形質転換体の製造方法、並びに
〔９〕  前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の核酸を含有してなる、核酸導入用キット、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸によれば、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入し、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行ない、形質転換体の収量を向上させ、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく安定的に発現させることができ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進することができ、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させることができるという優れた効果を奏する。
【００１２】
また、本発明の核酸構築物によれば、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入し、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行ない、形質転換体の収量を向上させ、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく安定的に発現させることができ、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させることができるという優れた効果を奏する。
【００１３】
さらに、本発明の導入対象核酸のインテグレーション効率の向上方法によれば、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうことができるという優れた効果を奏する。
【００１４】
また、本発明の導入対象核酸の導入方法によれば、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入し、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行ない、形質転換体の収量を向上させ、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく安定的に発現させることができ、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させることができるという優れた効果を奏する。
【００１５】
さらに、本発明の形質転換体の製造方法によれば、形質転換体の収量を向上させることができ、発現効率を向上させることができるという優れた効果を奏する。
【００１６】
また、本発明の核酸導入用キットによれば、本発明の核酸の導入方法を簡便なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、タバコ〔ニコチアナ  タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）  Ｌ．  ｃｖ．  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２〕由来の配列番号：１に示される塩基配列及び該配列番号：１の塩基番号：３０〜７８に示される塩基配列のそれぞれが、核マトリックス結合領域において、ＤＮＡ結合に関与すると考えられるＡ−ｂｏｘ、ｔｏｐｏ−ＩＩ  ｂｏｘ及びｕｎｗｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔを含まないにもかかわらず、該塩基配列を含有した核酸が、ゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを向上させるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
【００１８】
本発明によれば、配列番号：１又はそのバリアントの塩基配列のＤＮＡを発現ベクター（好ましくは、直鎖状）の５’末端及び／又は３’末端側に連結し、得られた産物をアグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、ボンバートメント法、マイクロインジェクション法、超音波遺伝子導入法等で導入することにより、実質的に完全な発現ベクターを安定的にインテグレーションさせる手段が提供されうる。
【００１９】
なお、本明細書において、「導入対象核酸のインテグレーションを向上させる」とは、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの該導入対象核酸のインテグレーションの効率の向上及び該導入対象核酸による導入対象細胞の形質転換効率の上昇のいずれをも含む概念を意味する。
【００２０】
本発明の１つの側面は、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸の導入用エレメントを保持する核酸、すなわち、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進するエレメントを保持する核酸を提供することにある。
【００２１】
本発明の核酸は、（１）配列番号：１に示される塩基配列を含有することに１つの大きな特徴がある。
【００２２】
本発明の核酸は、前記塩基配列を含有しているため、インテグレーションが促進されるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸は、前記塩基配列を含有しているため、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子の５’末端及び／又は３’末端側に配置した場合、該導入対象核酸を効率よく導入することができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の核酸は、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子の５’末端及び／又は３’末端側に配置した場合、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうことができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の核酸は、形質転換体の収量を向上させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸によれば、導入対象核酸をインテグレーションさせることができるため、本発明の核酸は、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく安定的に発現させることができるという優れた効果を発揮する。本発明の核酸によれば、導入対象核酸をインテグレーションさせることができるため、本発明の核酸は、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させることができるという優れた効果を発揮する。
【００２３】
本明細書において、導入対象細胞としては、植物起源の細胞、動物起源の細胞又は個体等が挙げられる。
【００２４】
前記「植物」としては、例えば、裸子植物であってもよく、あるいは被子植物であってもよく、具体的には、特に限定されないが、例えば、タバコ、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、サツマイモ、トマト、ホウレンソウ、ダイズ、エンドウマメ、ユーカリノキ、ポプラ、ヤナギ、ユリノキ、マツ、スギ、トウヒ、ペチュニア、バラ、チューリップ、カーネーション、トルコギキョウ、ミヤコグサ等が挙げられる。
【００２５】
前記「植物起源の細胞」としては、例えば、培養細胞、苗条原基、成長点（シュート頂等、胚、葉や茎の外植片、花粉等が挙げられる。
【００２６】
また、前記培養細胞としては、具体的には、例えば、タバコ培養細胞（例えば、ＢＹ−２等）等が挙げられる。前記培養細胞の培養に用いうる培地としては、例えば、ＭＳ培地〔ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５：４７３，（１９６２）〕、ＬＳ培地〔リンスマイヤー（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ＥＭ）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１８：１００，（１９６５）〕、ＷＰＭ（Ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）〔ルロイド（Ｌｌｏｙｄ  ＧＢ．）ら、Ｃｏｍｂ．Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｐａｇａｔｏｒｓ  Ｓｏｃ．，３０：４２１，（１９８０）〕等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、導入対象核酸としては、種々の生物起源の核酸であればよく、例えば、外来遺伝子、例えば、ポリペプチドをコードする核酸、ポリペプチドをコードしない核酸（例えば、ＲＮＡ干渉を発揮する核酸等）、各種エレメントを保持する核酸等が挙げられる。
【００２８】
なお、本発明の核酸は、配列番号：１に示される配列を包含する配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸、具体的には、配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸であってもよい。
【００２９】
また、より大きなサイズの導入対象遺伝子を導入する場合、核酸として安定であり、優れた汎用性を示す観点から、（１’）配列番号：１の塩基番号：３０〜７８に示される塩基配列（４９ｂｐ）を含有した核酸がより有利である。前記配列番号：１の塩基番号：３０〜７８に示される塩基配列を含有した核酸（４９ｂｐ）は、高いＭＡＲポテンシャルを示す領域を実質的に含まない核酸であるにもかかわらず、配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸と実質的に同等のインテグレーション効率を得ることができる。
【００３０】
本発明においては、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進するものであれば、前記（１）のバリアントの塩基配列を含有したエレメントを保持する核酸又は前記（１’）の塩基配列のバリアントの塩基配列を含有したエレメントを保持する核酸であってもよい。
【００３１】
前記（１）の塩基配列のバリアントの塩基配列を含有したエレメントとしては、
（２）個体間の核酸多型により、配列番号：１に示される塩基配列の少なくとも１ヌクレオチドが異なる塩基配列であって、該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
が挙げられる。
【００３２】
前記（１’）の塩基配列のバリアントの塩基配列を含有したエレメントとしては、
（２’）個体間の核酸多型により、前記（１’）の塩基配列の少なくとも１ヌクレオチドが異なる塩基配列であって、該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
が挙げられる
【００３３】
本明細書において、前記「核酸多型」とは、具体的には、該核酸多型により異なる塩基配列を含有した核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置した場合、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進する機能を発揮する構造等を維持する範囲の多型をいう。
【００３４】
本明細書において、「少なくとも１ヌクレオチド」とは、１個以上、１個又は複数個、１個又は数個のヌクレオチドを意味する。
【００３５】
なお、前記バリアントは、天然由来の核酸であってもよく、個体間の核酸多型により前記塩基配列と異なる塩基配列に基づき、人為的に、例えば、慣用の部位特異的変異導入方法等により作製された核酸であってもよい。
【００３６】
前記（２）の塩基配列としては、例えば、（ａ）配列番号：１において、少なくとも１ヌクレオチドの変異（置換、欠失、挿入、付加等）を有する塩基配列であって、かつ該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列；
（ｂ）配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸とストリンジェント、好ましくは高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸のアンチセンス鎖の核酸の塩基配列であって、かつ該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列；
（ｃ）配列番号：１に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは、８５％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、よりさらに好ましくは、９８％以上である塩基配列であって、かつ該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
等が挙げられる。
【００３７】
また、前記（２’）の塩基配列としては、例えば、（ａ’）前記（１’）の塩基配列において、少なくとも１ヌクレオチドの変異（置換、欠失、挿入、付加等）を有する塩基配列であって、かつ該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列；
（ｂ’）前記（１’）の塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖とストリンジェント、好ましくは高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の塩基配列であって、かつ該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列；
（ｃ’）前記（１’）の塩基配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは、８５％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、よりさらに好ましくは、９８％以上である塩基配列であって、かつ該塩基配列を有する核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されることにより、該塩基配列からなる核酸の非存在下に比べ、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進しうるものである塩基配列
等が挙げられる。
【００３８】
本発明において、前記（２）又は（２’）の塩基配列を含有した核酸が、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを起こすことは、例えば、
１）  慣用のレポーター遺伝子の５’末端及び／又は３’末端側に配置されるように、評価対象の核酸を連結させて、核酸構築物を得るステップ、
２）  タバコ培養細胞ＢＹ−２に、前記ステップ１）で得られた核酸構築物をパーティクルガンを用いたボンバードメント法で導入するステップ、
３）  前記ステップ２）で得られた細胞におけるレポーター遺伝子の発現及び該細胞から抽出したゲノムＤＮＡ中におけるレポーター遺伝子の組込みを検出するステップ、並びに
４）  前記ステップ３）の結果と、評価対象の核酸を用いずに前記ステップ１）〜３）を行なった場合の結果とを比較するステップ
を行ない、評価対象の核酸の存在により、レポーター遺伝子の産物の発現が向上し、かつゲノムＤＮＡへの該レポーター遺伝子の組込みが促進された場合、該評価対象の核酸が、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸のインテグレーションを促進することの指標として評価されうる。
【００３９】
前記レポーター遺伝子としては、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子等が挙げられる。
【００４０】
本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％  ホルムアミドを含む溶液中、前記塩基配列からなる核酸のアンチセンス鎖の核酸と、評価対象の核酸とを４２℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なうことにより、バックグラウンドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる条件をいう。
【００４１】
前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、ウェブページアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／において、ＢＬＡＳＴＮとして一般に利用可能である。前記ＢＬＡＳＴＮの際のパラメーターは、例えば、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ５、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ２、Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  −３、ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ  １１が挙げられる。
【００４２】
本発明の核酸は、例えば、形質転換体の収量の向上、導入遺伝子の発現の向上、導入遺伝子のインテグレーションの向上、形質の改変（例えば、重金属集積能力の向上、有機汚染物質の分解能力の向上、花色の改良、アレルゲンの低減等）等に利用されうる。
【００４３】
本発明の他の側面は、核酸構築物を提供することにある。
【００４４】
本発明の核酸構築物は、本発明の核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されていることに１つの大きな特徴がある。
【００４５】
本発明の核酸構築物は、本発明の核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されているため、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入対象細胞に導入することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸構築物によれば、本発明の核酸が、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に配置されているため、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうことができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の核酸構築物は、形質転換体の収量を向上させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸構築物によれば、導入対象核酸をインテグレーションさせることができるため、本発明の核酸構築物は、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく安定的に発現させることができるという優れた効果を発揮する。本発明の核酸構築物によれば、導入対象核酸をインテグレーションさせることができるため、本発明の核酸構築物は、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４６】
本発明の核酸構築物において、導入対象核酸の両端に配置される本発明の核酸の向きは、配列番号：１又は配列番号：１の塩基番号：３０〜７８の５’末端側から３’末端側への向きを正方向とし、導入対象核酸のセンス鎖の５’末端側から３’末端側への向きを正方向とした場合に、５’末端側から順に、
Ａ  本発明の核酸（正方向）−導入対象核酸（正方向）−本発明の核酸（正方向）、
Ｂ  本発明の核酸（正方向）−導入対象核酸（正方向）−本発明の核酸（逆方向）、
Ｃ  本発明の核酸（逆方向）−導入対象核酸（正方向）−本発明の核酸（正方向）、及び
Ｄ  本発明の核酸（逆方向）−導入対象核酸（正方向）−本発明の核酸（逆方向）、
のいずれであってもよい。本発明においては、良好なインテグレーション効率を得る観点から、好ましくは、前記Ａ、Ｂ及びＣが望ましい。なお、５’末端及び３’末端側のいずれか一方に本発明の核酸を配置する場合、上記配置を参照して、適宜設定されうる。
【００４７】
また、本発明の核酸構築物において、導入対象核酸と本発明の核酸との連結は、慣用の方法で行なわれ得る。本発明においては、例えば、本発明の核酸を、１個又は複数個（好ましくは、数個、例えば、２個若しくはそれ以上）となるように連結させることが望ましい。
【００４８】
本発明の核酸構築物は、慣用のベクターの骨格をさらに含有してもよい。ここで、「慣用のベクターの骨格」とは、例えば、慣用のベクターをユニークな認識部位を有する制限酵素で切断することにより得られた直鎖状の核酸、慣用のベクターの誘導体等を意味する。前記「慣用のベクター」としては、例えば、ｐＵＣ誘導体ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、ｐＧＥＭ（登録商標）誘導体ベクター、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔTM誘導体ベクター等が挙げられる。
【００４９】
また、本発明の核酸構築物は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
【００５０】
本発明の核酸構築物は、例えば、金粒子、タングステン粒子、ＤＥＡＥデキストラン等の担体に保持させてもよい。本発明においては、導入効率のさらなる向上及び形質転換体の収量のさらなる向上の観点から、好ましくは、金粒子が望ましい。
【００５１】
なお、本発明において、本発明の核酸構築物の形態は、使用目的、手段、例えば、導入対象細胞、導入手段等に応じて、適宜選択されうる。例えば、アグロバクテリウム  チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）が感染しうる植物、例えば、タバコ、ユーカリノキ等起源の細胞を導入対象細胞とし、アグロバクテリウム  チュメファシエンスを用いて、本発明の核酸構築物を導入する場合、該核酸構築物は、Ｔｉプラスミド、バイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＮ１９、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１）等の骨格を有するように設計されうる。また、エレクトロポレーションにより導入対象細胞に、本発明の核酸構築物を導入する場合、該核酸構築物は、ベクターの骨格として、例えば、ｐＵＣ誘導体ベクター、ｐＢＩ１２１、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔTM誘導体ベクター等の骨格を有するように設計されうる。また、パーティクルガンを用いたボンバードメント法により、導入対象細胞に、本発明の核酸構築物を導入する場合、該核酸構築物は、例えば、金粒子、タングステン粒子に担持させるように設計されうる。また、本発明の核酸構築物は、超音波処理による遺伝子導入法〔トリック（Ｈ．Ｎ．Ｔｒｉｃｋ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１７，４８２−４８８（１９９８）〕、マイクロインジェクションによる遺伝子導入法等にも用いうる。
【００５２】
本発明の核酸構築物は、例えば、遺伝子導入効率の向上、形質転換体の収量の向上、導入遺伝子の発現の向上、導入遺伝子のインテグレーションの向上、形質の改変（例えば、重金属集積能力の向上、有機汚染物質の分解能力の向上、花色の改良、アレルゲンの低減等）等に利用されうる。
【００５３】
本発明の別の側面は、導入対象核酸のインテグレーション効率の向上方法を提供することにある。
【００５４】
本発明において、前記インテグレーション効率は、本発明の核酸を用いた場合において、例えば、ＧＦＰ遺伝子等の該導入対象核酸の発現を測定し、本発明の核酸の非存在下に、前記導入対象核酸を導入した場合の該導入対象核酸の発現を対照として比較することにより評価されうる。
【００５５】
本発明の導入対象核酸のインテグレーション効率の向上方法は、本発明の核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させることを１つの大きな特徴とする。
【００５６】
したがって、本発明のインテグレーション効率の向上方法によれば、本発明の核酸が用いられ、本発明の核酸を導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させるステップを行なっているため、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうことができるという優れた効果が発揮される。
【００５７】
また、本発明のインテグレーション効率の向上方法を行なうことにより、導入対象核酸の種類により異なるが、本発明の核酸を用いない場合、すなわち、本発明のインテグレーション効率の向上方法を行なわない場合に比べ、インテグレーション効率を、ＧＦＰ遺伝子を導入対象核酸としてＧＦＰの発現により評価して、少なくとも約２倍、具体的には、２倍以上向上させることが期待される。
【００５８】
本明細書において、「作動可能」とは、導入対象核酸によりコードされるポリペプチドの本来の機能、導入対象核酸自体の本来の機能等を実質的に発現させる状態であることをいう。
【００５９】
本発明のインテグレーション効率の向上方法における導入対象核酸としては、前記と同様のものが挙げられる。
【００６０】
本発明のインテグレーション効率の向上方法において、導入対象核酸の両端に配置される本発明の核酸の向きは、本発明の核酸構築物と同様である。
【００６１】
また、本発明のインテグレーション効率の向上方法において、導入対象核酸と本発明の核酸との作動可能な連結は、本発明の核酸構築物の場合と同様に行なわれうる。
【００６２】
本発明のインテグレーション効率の向上方法においては、本発明の核酸を導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させて得られた構築物を、導入対象細胞に導入すればよい。
【００６３】
なお、前記構築物は、導入対象細胞及び導入手段に応じて、前記ベクターの骨格等を有するように、適宜設計されうる。
【００６４】
本発明のインテグレーション効率の向上方法は、例えば、外来遺伝子の機能を発現しうる形質転換体、例えば、形質転換細胞、形質転換植物等の作製、具体的には、安定的に導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を保持し、安定的に形質を発現する形質転換体の作製、機能解析、発現解析等に利用されうる。また、本発明のインテグレーション効率の向上方法は、導入対象細胞が、植物起源の細胞に有利である。
【００６５】
本発明の他の側面は、核酸の導入方法を提供することにある。
【００６６】
本発明の核酸の導入方法は、（Ａ）本発明の核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させて、核酸構築物を得るステップ、並びに
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた核酸構築物を、導入対象細胞に導入するステップ、
を含む方法である。
【００６７】
本発明の核酸の導入方法は、本発明の核酸を用いることに１つの大きな特徴がある。本発明の核酸の導入方法によれば、本発明の核酸が用いられているため、導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を効率よく導入することができるという優れた効果を発揮する。
【００６８】
また、本発明の核酸の導入方法によれば、本発明の核酸を、導入対象核酸の５’末端及び／又は３’末端側に作動可能に連結させるため、導入対象細胞のゲノムＤＮＡへの導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子のインテグレーションを効率よく行なうことができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の核酸の導入方法によれば、形質転換体の収量を向上させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸の導入方法によれば、導入対象核酸をインテグレーションさせることができるため、本発明の核酸の導入方法によれば、導入対象核酸によりコードされる産物を効率よく安定的に発現させることができるという優れた効果を発揮する。本発明の核酸の導入方法によれば、導入対象核酸をインテグレーションさせることができるため、導入対象細胞内で導入対象核酸を安定的に維持させることができるという優れた効果を発揮する。
【００６９】
前記ステップ（Ａ）は、前記インテグレーション効率の向上方法と同様である。
【００７０】
前記ステップ（Ｂ）において、導入対象細胞への核酸構築物の導入手段としては、アグロバクテリウムを用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法、マイクロキャピラリーを用いたマイクロインジェクション法〔等が挙げられる。前記アグロバクテリウムを用いる方法は、アグロバクテリウムが感染する植物起源の細胞を導入対照細胞とする場合に有利である。また、前記エレクトロポレーション法は、アグロバクテリウムが感染しにくい植物起源の細胞を導入対照細胞とする場合、プロトプラストに直接核酸構築物を導入する際に有利である。前記パーティクルガンを用いたボンバードメント法は、細胞への負担が少なく、導入効率のさらなる向上及び形質転換体の収量のさらなる向上を図る場合、プロトプラストの作出、プロトプラストからの植物体の再生が困難である場合等に有利である。導入効率のさらなる向上、形質転換体の収量のさらなる向上等の観点から、好ましくは、パーティクルガンを用いたボンバードメント法が望ましい。
【００７１】
本発明の核酸の導入方法によれば、前記インテグレーション効率の向上方法の場合と同様に、例えば、外来遺伝子の機能を発現しうる形質転換体、例えば、形質転換細胞、形質転換植物等の作製、具体的には、安定的に導入対象核酸、すなわち、外来遺伝子を保持し、安定的に形質を発現する形質転換体の作製、機能解析、発現解析等に利用されうる。また、本発明の核酸の導入方法は、導入対象細胞が、植物起源の細胞に有利である。
【００７２】
本発明の別の側面は、形質転換体の製造方法を提供することにある。
【００７３】
本発明の形質転換体の製造方法は、核酸構築物を導入対象細胞に導入することを特徴とすることに１つの大きな特徴がある。
【００７４】
本発明の形質転換体の製造方法は、具体的には、前記外来遺伝子の導入方法のステップ（Ａ）及び（Ｂ）の後、得られた細胞を、（Ｃ）導入対象細胞に適した培養条件下、導入対象核酸によりコードされるポリペプチド若しくはその機能の発現に適した培養条件下、導入対象核酸自体の機能の発現に適した培養条件下等に培養するステップを行なえばよい。
【００７５】
前記「導入対象細胞に適した培養条件」は、導入対象細胞の種類により適宜設定されうる。例えば、タバコ培養細胞ＢＹ−２の場合、ＭＳ培地〔ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５：４７３，（１９６２）〕中、２５℃で培養する条件等が挙げられる。イネ培養細胞の場合、ババ（Ｂａｂａ，Ａ．）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７，４６３−４７２（１９８６）等に記載の培養条件、シロイヌナズナ懸濁培養細胞の場合、アクセロス（Ａｘｃｅｌｏｓ，Ｍ．）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０，１２３−１２８（１９９２）等に記載の培養条件等が挙げられる。
【００７６】
なお、導入対象細胞が、プロトプラストやカルスの場合、葉、根等に再分化させ、植物体を再生してもよい。
【００７７】
具体的には、葉への再分化は、例えば、プロトプラストの場合、該プロトプラストを固体栄養培地で培養して、細胞壁を合成させ、ついで、液体培地中で、激しく攪拌させながら、培養し、カルスを得、得られたカルスをオーキシンおよびサイトカイニンの存在下に培養することにより行なわれうる。なお、カルスから葉への再分化は、例えば、低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行われうる。リーフディスクから葉の再分化は、例えば、リーフディスクを低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行われうる。
【００７８】
前記葉への再分化の際に用いられる培地としては、例えば、カルス誘導培地（１ｍｇ／ｌ  インドール酢酸と１ｍｇ／ｌ  ベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）、シュート誘導培地（０．１ｍｇ／ｌ  インドール酢酸と１ｍｇ／ｌ  ベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）等が挙げられる。
【００７９】
本発明の形質転換体の製造方法によれば、安定的に導入対象核酸を保持し、安定的に形質を発現する形質転換体の作製、形質転換植物の開発、機能解析、発現解析等に利用されうる。また、本発明の形質転換体の製造方法は、導入対象細胞が、植物起源の細胞に有利である。
【００８０】
本発明のさらに別の側面では、本発明の核酸の導入方法に適した核酸導入用キットを提供することにある。
【００８１】
本発明の核酸導入用キットは、本発明の核酸を含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の核酸子導入用キットによれば、本発明の核酸の導入方法を簡便に行なうことができる。
【００８２】
本発明の核酸導入用キットには、本発明の核酸を導入対象核酸に連結するための酵素、リンカー、核酸を安定に保持するための緩衝液、該キットを用いて、本発明の核酸の導入方法を行なうための手順が示された説明書等をさらに含有してもよい。また、本発明の核酸導入用キットには、各種機能解析用核酸、各種導入対象核酸等と連結した構築物として提供する態様も含まれる。
【００８３】
以下、本発明を、実施例により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、下記実施例において、特に明記しない限り、遺伝子操作は、用いたキットに添付の説明書、慣用のプロトコール〔例えば、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第２版、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル  第３版等〕に従い、必要に応じ種々の改変を施して行なわれた。
【実施例１】
【００８４】
パーティクルガンを用いて、プラスミドｐＣａＭＶＮＥＯをタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）  Ｌ．  ｃｖ．  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２の培養細胞ＢＹ−２に導入した。
【００８５】
導入後の培養細胞ＢＹ−２は、改良ＬＳ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ）培地〔ナガタ（Ｎａｇａｔａ，Ｔ．）ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１８４，１６１−１６５（１９８１）〕中、２５℃±１℃、暗所下、１３０ｒｐｍで振盪培養した。
【００８６】
得られたＢＹ−２形質転換細胞のゲノムＤＮＡをＭｅｔｔｌｅｒらの方法〔メットラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ，Ｉ．Ｊ），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ，５，３４６−３４９（１９８７）〕により抽出した。得られたゲノムＤＮＡのトランスジーンジャンクションをクローニングするため、ゲノムＤＮＡをＳｔｕＩで切断し、ショ糖密度勾配遠心分離法で分画した。得られたＤＮＡフラクションを、ゲル電気泳動法で分離し、その後、ゲル上のＤＮＡ断片をナイロン膜に移した。ついで、ｎｐｔＩＩをプローブとしてハイブリダイゼーションを行なった。得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩメチラーゼでメチル化後、リンカーに連結した。その後、λＩＦＩＸ  ＩＩベクターにクローン化し、ｎｐｔＩＩを有する１２．５ｋｂ断片を得た。ついで、得られた断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMＩＩ  ＳＫ＋ベクターにサブクローン化し、塩基配列を決定した。
【００８７】
その結果、核マトリックスと結合すると考えられる核マトリックス結合領域の塩基配列に類似性を有する塩基配列を有するエレメント（以下、ＴＪ１）が見出された。また、前記ＴＪ１が、核マトリックス結合領域ＤＮＡ配列であることは、タバコＢＹ−２細胞から単離した核マトリックス結合領域標品との結合能解析からも証明された。
【００８８】
ついで、前記ＴＪ１を、レポーター遺伝子ｎｐｔＩＩ発現カセット（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ｎｐｔＩＩ−ＮＯＳターミネーター）の両側に付加し、得られた産物を、パーティクルガンによりＢＹ−２に導入した。なお、対照として、ＴＪ１を含まないレポーター遺伝子ｎｐｔＩＩ発現カセットを用いた。得られた形質転換細胞について、ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを用いて、イイダ（Ｉｉｄａ，Ａ．）らの方法〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３，５６０−５６３（１９９０）〕で選択し、評価した。その結果、ＴＪ１を持たないものに比べ、トランスジーン  １コピーあたりの遺伝子発現効率の上昇が確認された。それと同時に形質転換体の収量の増加も見られた。
【００８９】
しかしながら、薬剤で形質転換体を選抜する実験では、遺伝子発現効率の上昇が直接的に形質転換体の収量を増加させる可能性もあるため、かかる形質転換体の収量の増加が、ＴＪ１付加により、外来遺伝子のインテグレーション効率が上昇したために起こったものなのか、遺伝子発現効率が上昇したために起こったものなのか、またはその相乗効果によるものか不明である。
【実施例２】
【００９０】
実施例１で得られたＴＪ１による形質転換体の収量の増加をもたらす要因が、遺伝子発現効率の上昇及びインテグレーション効率の上昇のいずれであるかを調べた。
【００９１】
導入対象細胞に対し、選択圧の影響を及ぼさないマーカーである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をレポーター遺伝子として用いた。
【００９２】
ＧＦＰ遺伝子発現カセット〔チウ（Ｃｈｉｕ，Ｗ．）ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，６，３２５−３３０（１９９６）〕の５’側及び３’側にＴＪ１を連結し、ベクターｐＴＪ１ＡＴＨを得た。また、対照として、コントロールベクター〔３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）〕を用いた。図１に、前記ベクターｐＴＪ１ＡＴＨ及びコントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）の模式図を示す。
【００９３】
前記ベクターｐＴＪ１ＡＴＨ又はコントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を用い、シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）らの方法〔Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２６（４），３７５−３８４（２００１）〕に従い、パーティクルガンにより、金粒子（直径１μｍ、Ｔｏｋｕｒｉｋｉ  Ｈｏｎｔｅｎ  Ｃｏ．製）で、タバコ培養細胞ＢＹ−２（１００ｍｇ  ｆ，ｗｔ，５×１０5細胞）への遺伝子導入を行なった。
【００９４】
遺伝子導入３日後に、細胞の４分の１を新たなシャーレにうつし、遺伝子導入後５日目、１０日目、２０日目及び３０日目にＧＦＰを発現した細胞塊の大きさ及び数を測定した。結果を図２及び図３に示す。
【００９５】
その結果、図３に示されるように、遺伝子導入後５日目のＧＦＰ発現細胞塊数は、ＴＪ１の有無に関わらず１００個前後であったが、５日目から１０日目の間で、ＧＦＰ発現細胞塊数は著しく減少し、それ以降、ほとんど変化が無かった。すなわち、遺伝子導入後５〜１０日目に一過的な発現を示さなくなり、安定的な発現を示した。したがって、トランスジーンのゲノムへのインテグレーションは、１０日目までにほぼ終了していることが示唆された。
【００９６】
ついで、トランスジーンがゲノムにインテグレーションされていることを確認するため、以下のように、遺伝子導入３０日後にＧＦＰを発現していた１５系統の細胞塊について、サザンハイブリダイゼーションを行なった。
【００９７】
１５系統の細胞塊のそれぞれから、ドイル（Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｊ．）ら，Ｆｏｃｕｓ，１２，１３−１５（１９９０）記載の方法で、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００９８】
得られた各ゲノムＤＮＡ  ２０μｇ相当量を、ＥｃｏＲＩで消化し、得られた各産物を、０．８重量％  アガロースゲルによる電気泳動に供した。
【００９９】
泳動後のゲルを慣用の方法により、ナイロンメンブラン〔Ｐａｌｌ社製、商品名：バイオダインＢ〕に転写した。
【０１００】
転写後のナイロンメンブランを用い、ＧＦＰ遺伝子をプローブとし、アマシャム社製、商品名：Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓキットを用いて、ハイブリダイゼーションを行なった。結果を図４に示す。
【０１０１】
その結果、図４に示されるように、プローブのハイブリダイゼーションに起因するシグナルが、全ての系統のゲノムＤＮＡに検出された。したがって、遺伝子導入３０日後にＧＦＰを発現している全ての細胞塊において、インテグレーションが完了していることがわかった。
【０１０２】
かかる結果より、遺伝子導入３０日後にＧＦＰを発現している細胞塊の数がインテグレーション効率を反映しているものとして、その後の実験に用いた。
【０１０３】
ついで、インテグレーションが、ＴＪ１に起因するものであるかどうかを調べた。
【０１０４】
コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）のＧＦＰ遺伝子発現カセットの５’側及び３’側に前記ＴＪ１と同じ長さの他の塩基配列からなるＤＮＡ〔５００ｂｐのＤＮＡ〕を連結した。
【０１０５】
得られたベクター〔以下、＋５００という〕、前記コントロールベクター及び前記ｐＴＪ１ＡＴＨのそれぞれを用い、前記と同様に、パーティクルガンにより、タバコ培養細胞ＢＹ−２への遺伝子導入を行なった。結果を図５に示す。なお、図５中、レーン１は、コントロールベクター、レーン２は、＋５００、レーン３は、ｐＴＪ１ＡＴＨを用いた結果である。また、結果は、各実験において、コントロールベクターを導入して得られたＧＦＰ発現細胞塊の数を１００とし、＋５００及びｐＴＪ１ＡＴＨそれぞれを導入して得られた細胞塊の数との比として示す。
【０１０６】
その結果、図５に示されるように、ｐＴＪ１ＡＴＨを導入した系統では、コントロールベクターを導入した系統と比べ、ＧＦＰ発現細胞塊の数は、約２倍に増加した。一方、コントロールベクターを導入した系統及び＋５００を導入した系統では、得られたＧＦＰ発現細胞塊の数に違いは見られなかった。このことから、インテグレーション効率は、ＴＪ１の挿入によって増加することが示された。
【０１０７】
また、これらの結果より、形質転換体の収量の増加が、ＴＪ１付加により、外来遺伝子のインテグレーション効率が上昇したために起こったものであることが示唆された。
【０１０８】
ついで、ＴＪ１を、ＧＦＰ遺伝子発現カセットの５’側及び３’側にそれぞれ向きを変えて連結し、図６に示されるベクターを得た。
【０１０９】
これらのベクターのそれぞれを用い、前記と同様に、パーティクルガンにより、タバコ培養細胞ＢＹ−２への遺伝子導入を行なった。
【０１１０】
ついで、遺伝子導入３０日後のＧＦＰ発現細胞塊について、前記と同様に、ＧＦＰ遺伝子を用いて、サザンブロットハイブリダイゼーションを行なった。また、遺伝子導入３０日後のＧＦＰ発現細胞塊の数を測定した。結果を図７に示す。
【０１１１】
その結果、トランスジーンがゲノムにインテグレーションされていることが確認され、図７に示されるように、ＧＦＰ発現細胞塊数は、ＴＪ１の存在下により、ＴＪ１の向きが異なっても、非存在下に比べ、約２倍に上昇した。このことから、ＴＪ１配列の付加によりトランスジーンのゲノムへのインテグレーションが促進されることが示唆される。すなわち、ＧＦＰ遺伝子発現カセットの上流及び下流それぞれのＴＪ１の向きが異なっても、インテグレーション効率の増加は維持されることが示唆された。
【実施例３】
【０１１２】
ＴＪ１におけるインテグレーション効率を向上させる能力を発揮する領域を調べた。
【０１１３】
ＴＪ１の配列の一部を含む種々の変異体を作製し、得られた産物を、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）のＧＦＰ遺伝子発現カセットの５’側及び３’側にそれぞれ向きを変えて連結し、各種ベクターを得た。対照として、コントロールベクターを用いた。
【０１１４】
これらのベクターのそれぞれを用い、前記実施例２と同様に、パーティクルガンにより、タバコ培養細胞ＢＹ−２への遺伝子導入を行なった。遺伝子導入３０日後、ＧＦＰ発現細胞塊の数を測定した。
【０１１５】
図８に示される変異体、すなわち、ＴＪ１の５’末端側を欠失させた３４０ｂｐのΔ５’、ＴＪ１の３’末端側を欠失させた３６３ｂｐのΔ３’、及び前記Δ５’とΔ３’とに共通する中央の領域１９６ｂｐのΔ５’３’を用いた結果について、図９に示す。
【０１１６】
その結果、図９に示されるように、形質転換体の収量は、Δ３’、Δ５’、Δ３’５’とＴＪ１との違いはなく、いずれもコントロールベクターに比べ約２倍上昇した。このことから、ＴＪ１のインテグレーション効率の上昇に働く領域は、少なくともＴＪ１の中央部分の１９６ｂｐ（配列番号：２）中に存在するものと推定される。
【０１１７】
ついで、前記１９６ｂｐのＤＮＡについて、慣用の方法により欠失変異体を作製し、得られた産物を、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）のＧＦＰ遺伝子発現カセットの５’側及び３’側に同じ向きで連結した。得られたベクターのそれぞれを用い、シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）らの方法〔Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２６（４），３７５−３８４（２００１）〕に従い、パーティクルガンにより、金粒子（直径１μｍ、Ｔｏｋｕｒｉｋｉ  Ｈｏｎｔｅｎ  Ｃｏ．製）で、タバコ培養細胞ＢＹ−２（１００ｍｇ  ｆ，ｗｔ，５×１０5細胞）への遺伝子導入を行なった。遺伝子導入３０日後、ＧＦＰ発現細胞塊の数を測定した。対照としてコントロールベクターを用いた。結果を図１０に示す。
【０１１８】
その結果、予想外にも、通常、インテグレーションが起こる際のＤＮＡ結合に役割を果たすと考えられているＡ−ｂｏｘ〔ガッサー（Ｇａｓｓｅｒ，Ｓ．Ｍ．）ら、Ｃｅｌｌ，４６，５２１−５３０（１９８６）〕、ｔｏｐｏ−ＩＩ  ｂｏｘ〔サンダー（Ｓａｎｄｅｒ，Ｍ．）ら，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１３，１０５７−１０７２（１９８５）〕及びｕｎｗｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔが見出されなかったにもかかわらず、配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡであっても、ＴＪ１のインテグレーション効率を向上させるに十分であることがわかる。
【０１１９】
また、ＴＪ１の場合に比べ、前記配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡの使用により、より高いインテグレーション効率を示したことから、ＴＪ１の塩基配列中には、インテグレーションを抑制する配列も存在する可能性が示唆される。
【実施例４】
【０１２０】
前記ＴＪ１について、解析ソフト〔商品名：Ｍａｒ-Ｗｉｚ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５（ＦＵＴＵＲＥ  ＳＯＦＴ社製）〕を用いて、Ｓｌｉｄｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅ：１、Ｗｉｎｄｏｗ-ｗｉｄｔｈ：１．０、全てのＭＡＲ  ＲｕｌｅｓをＯＮ、Ｒｕｎ−ｌｅｎｇｔｈ：３の条件下に解析を行なうことにより、ＭＡＲポテンシャルを調べた。その結果を図１１に示す。
【０１２１】
その結果、図１１に示されるように、前記１９６ｂｐのＤＮＡ及び前記配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ（１０７ｂｐ）は、共に、ＴＪ１中で最も高いＭＡＲポテンシャルを示す領域を含むことがわかる。また、かかる結果より、前記１９６ｂｐのＤＮＡ及び前記配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡ（１０７ｂｐ）は、ＡＴ含量、トポイソメラーゼＩＩ認識部位等の多くのＭＡＲに見られる配列のパターンが集中する領域を有し、核マトリックスタンパク質に対し、高い結合能を示す領域を含むことが示唆される。
【０１２２】
ついで、前記配列番号：１に示される塩基配列からなるＤＮＡについて、インテグレーション効率に影響を与える領域の検討をさらに行なった。ＴＪ１及びその欠失変異体を、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）のＧＦＰ遺伝子発現カセットの５’側及び３’側に同じ向きで連結した。得られたベクターのそれぞれを用い、シミズ（Ｓｈｉｍｉｚｕ）らの方法〔Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２６（４），３７５−３８４（２００１）〕に従い、パーティクルガンにより、金粒子（直径１μｍ、Ｔｏｋｕｒｉｋｉ  Ｈｏｎｔｅｎ  Ｃｏ．製）で、タバコ培養細胞ＢＹ−２（１００ｍｇ  ｆ，ｗｔ，５×１０5細胞）への遺伝子導入を行なった。遺伝子導入３０日後、ＧＦＰ発現細胞塊の数を測定した。
【０１２３】
コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を導入した場合を、１００とし、各欠失変異体を用いた場合のインテグレーション効率を算出した。結果を図１２に示す。
【０１２４】
その結果、図１１の結果に基づく予想に反し、高いＭＡＲポテンシャルを示す領域を実質的に含まない４９ｂｐのＤＮＡであっても、１９６ｂｐのＤＮＡとほぼ同等のインテグレーション活性を示すことがわかる。かかる４９ｂｐのＤＮＡは、配列番号：１の塩基番号：３０〜７８からなるＤＮＡ（４９ｂｐ）であり、配列番号：１に示される塩基配列（１０７ｂｐ）からなるＤＮＡよりも短いＤＮＡであるため、より大きなサイズの導入対象遺伝子を導入する場合に、核酸としての安定性の観点から有用であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明によれば、外来遺伝子の機能を発現しうる、安定的に導入対象核酸を保持し、安定的に形質を発現する形質転換体の作製、機能解析、発現解析等が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）及びベクターｐＴＪ１ＡＴＨの模式図を示す。
【０１２７】
【図２】図２は、遺伝子導入後、ＧＦＰを発現した細胞塊の大きさ及び数を測定した結果を示す。
【０１２８】
【図３】図３は、遺伝子導入後、ＧＦＰを発現した細胞塊の数を測定した結果を示す。図３中、丸印は、ｐＴＪ１ＡＴＨを用いた結果、四角印は、対照の結果を示す。
【０１２９】
【図４】図４は、ゲノムＤＮＡへのＧＦＰ遺伝子のインテグレーションを調べた結果を示す図である。
【０１３０】
【図５】図５は、インテグレーションが、ＴＪ１に起因するものであるかどうかを調べた結果を示す。図中、レーン１は、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、レーン２は、該コントロールベクターのＧＦＰ遺伝子発現カセットの５’側及び３’側にＴＪ１と同じ長さの他の塩基配列からなるＤＮＡを連結したベクター＋５００、レーン３は、ｐＴＪ１ＡＴＨを用いた結果を示す。各実験において、コントロールベクターを導入して得られたＧＦＰ発現細胞塊の数を１００とし、＋５００及びｐＴＪ１ＡＴＨそれぞれを導入して得られた細胞塊の数との比として示す。
【０１３１】
【図６】図６は、ＴＪ１をＧＦＰ遺伝子発現カセットの５’側及び３’側にそれぞれ向きを変えて連結したベクターの模式図を示す。
【０１３２】
【図７】図７は、遺伝子導入３０日後のＧＦＰ発現細胞塊のＧＦＰ発現細胞塊の数を測定した結果を示す。
【０１３３】
【図８】図８は、ＴＪ１の配列の一部を含む種々の変異体の模式図を示す。
【０１３４】
【図９】図９は、ＴＪ１におけるインテグレーション効率向上の機能に関与する部位を調べた結果を示す。図中、レーン１は、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、レーン２は、ベクターｐＴＪ１ＡＴＨ、レーン３は、ＴＪ１の５’末端側を欠失させた３４０ｂｐのΔ５’、レーン４は、ＴＪ１の３’末端側を欠失させた３６３ｂｐのΔ３’、レーン５は、前記Δ５’とΔ３’とに共通する中央の領域１９６ｂｐのΔ５’３’を用いた結果である。
【０１３５】
【図１０】図１０は、ＴＪ１におけるインテグレーション効率向上の機能に関与する部位を調べた結果を示す。図中、レーン１は、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、レーン２は、ベクターｐＴＪ１ＡＴＨ、レーン３は、１０７ｂｐ（配列番号：１）を用いた結果である。
【０１３６】
【図１１】図１１は、ＴＪ１の塩基配列のＭＡＲポテンシャルを示す。
【０１３７】
【図１２】図１２は、インテグレーション効率に影響を与える領域を調べた結果を示す。図中、インテグレーション効率は、コントロールベクター３５Ω−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）を導入した場合を、１００とし、各欠失変異体を用いた場合のインテグレーション効率を算出した数値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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