(57)【要約】【課題】            肝細胞群の中でも培養・増殖が困難である肝幹細胞、肝実質細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、およびピット細胞を、長期間細胞機能を保持したまま培養・増殖し得る方法を提供すること。【解決手段】        肝臓を構成する肝実質細胞、内皮細胞、星細胞、クッパー細胞、線維芽細胞、ピット細胞および肝幹細胞から選択される肝細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し培養することを特徴とする効率良く肝細胞を培養・増殖させる方法であり、培養足場が、多孔性ポリマーからなるシート状物である肝細胞の増殖・培養方法である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓を構成する肝実質細胞、内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞、ピット細胞および肝幹細胞から選択される肝細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、培養することを特徴とする効果的な肝細胞の増殖・培養方法。
【請求項２】
肝実質細胞を培養する請求項１に記載の肝細胞の増殖・培養方法。
【請求項３】
肝幹細胞を培養する請求項１に記載の肝細胞の増殖・培養方法。
【請求項４】
生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場が、多孔性ポリマーからなるシート状物であることを特徴とする請求項１、２または３に記載の肝細胞の増殖・培養方法。
【請求項５】
多孔性ポリマーの材質が、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレートまたはポリ無水物からなる群から選択されるポリマーである請求項４に記載の肝細胞の増殖・培養方法。
【請求項６】
多孔性ポリマーにおける孔径が２〜２０μｍであることを特徴とする請求項４に記載の増殖・培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓細胞を効果的に増殖・培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物の進化は、微生物との戦いの歴史であり、多くの生物は外敵から身を守るために様々な防御手段を有している。例えば、消化管粘膜を形成する一層の上皮は、宿主にとって外界と接する最大の場であり、生存に必要な栄養素や、水・電解質などを吸収する一方で、外敵である病原体や毒素の侵入を拒む最前線のバリアとして機能している。
【０００３】
一方、かかる考えに立脚すれば、肝臓は身体の中の最前線として、流入した栄養素の再分配と恒常性（ホメオスタシス）の維持を行っている。また、肝臓は多数の複雑な酵素系を持っており、栄養素の代謝、生体に必要な物質の生産、代謝最終産物の処理、有害物質の解毒などを行っている。
【０００４】
すなわち、肝臓の働きは、大きく捉えると、（１）糖新生による血糖の維持、（２）エネルギーの蓄積、（３）血清タンパク質の産生、（４）アンモニア解毒、（５）薬剤の解毒などである。ところで肝臓は、さまざまな種類の細胞で構成される複雑な臓器であり、肝細胞や胆管上皮細胞といった肝臓の機能を代表する肝実質部の細胞以外に、非実質細胞である類同内皮細胞、伊東細胞（星細胞）、クッパー細胞、ピット細胞、神経細胞、血球細胞など、多様な細胞が含まれているが、肝臓としての機能は総細胞数の７０％を占める肝実質細胞（肝細胞）が行っている。
【０００５】
肝細胞については、１つの肝細胞で２０００種類にも及ぶ化学反応を短時間にやってしまう能力を持つものであり、その集合体としての肝臓は、まさに生体における化学コンビナートであるといえる。肝細胞は高度に分化した臓器であると同時に、あまりにも多くの化学反応を行うため最も専門化していない細胞であるともいわれている。高度に分化しつつ最も専門化していないという一見矛盾した肝細胞の特徴は、肝の再生機構にその例を見ることができる。例えば、肝臓を７０％切り取ったときに、急激な細胞分裂が起こるが、もとの大きさになると再生はぴたりと止まる。肝細胞が減って細胞分裂をしている間でも肝臓は肝機能を維持し、むしろいつも以上にその機能を高めている。分化しつつ増殖を行う一見矛盾した現象が肝細胞の特徴であるともいえる。
【０００６】
この再生を陰で支えているのが幹細胞（stem cell）と呼ばれる細胞である。旺盛な再性能を有する皮膚や肝臓、骨髄などに幹細胞の存在が確認され、そのなかでも胚性幹細胞（ES細胞）は、近年再生医学の見地から極めて興味のある細胞である。肝臓においても肝臓の分化、再生を司る肝幹細胞（hepatic stem cell）が存在し、肝臓細胞の中で基本的に重要な細胞である。その重要性は、例えば、肝幹細胞は、肝臓細胞の２万個から３万個あたりにたった１個しか存在しない点からも伺える。肝幹細胞は、ガン細胞に匹敵するような高い増殖能、多分化能（すなわち、肝臓を構成する２つの主な細胞である肝細胞と胆管上皮細胞のいずれにも分化できる能力）、長期肝組織再構築能など、肝臓の「種子（たね）」としての性質を兼ね備えた細胞である。
【０００７】
この肝幹細胞は肝臓の組織を再構築するだけでなく、例えば、腸管粘膜下に移植すれば腸管上皮細胞に、膵管内に移植すると膵管上皮細胞へと分化する。このような幹細胞の能力を可塑性と呼ぶが、幹細胞は従来考えられていたよりもかなり広域な組織へと分化できると考えられている。
【０００８】
ところで、これらの肝幹細胞の分離・回収方法としてFACS（Fluorescence Activated Cell Sorting）を用いて肝幹細胞の純化・回収が試みられている（非特許文献１）。しかしながら、この方法では、肝幹細胞に対する抗体を選択する困難性があり、必ずしも効率的な純化・回収方法とはいえない。また、純化・回収した肝幹細胞について効果的な培養・増殖方法が確立していないのが現状である。
【０００９】
とくに肝細胞においては、初代培養肝細胞は、細胞の有する肝機能を高く維持できるものの長期培養が難しいものである。したがって、仮に試験管肝臓と称するようなものが作り出すことが可能であれば、栄養素の代謝など多くの研究が動物を使用しなくてもできるだけでなく、人工肝機能補助装置の開発も可能になると考えられる。しかしながら、いくつかの細胞群から構成される肝細胞を効果的に培養・増殖させる方法はこれまで開発されておらず、その培養方法の確立が強く望まれているのが現状である。
【非特許文献１】Hepatology, 32:1230-1239(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって本発明は、かかる現状に鑑み、肝細胞群の中でも培養・増殖が困難である肝実質細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、およびピット細胞を、長期間細胞機能を保持したまま培養・増殖し得る方法を提供することを課題とする。
さらに本発明は、肝臓の分化、再生を司る肝幹細胞について長期間細胞機能を保持したまま培養・増殖し得る方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明者は、細胞培養系の構築において、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場、すなわち細胞外マトリックス（ECM：Extracellular matrix）の利用に着目した。すなわち、一般に、細胞機能を保つような細胞培養系の構築においては、その培養足場が極めて重要なファクターであることが知られている。
【００１２】
かかる考え方に立脚して本発明者は、哺乳類の肝臓から採取した肝細胞を分離し、肝幹細胞、肝実質細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、およびピット細胞のそれぞれに単離した後、単離した各細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用して培養させることにより、各細胞の細胞機能を有したまま長時間生存させ、かつ効果的に増殖させることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
したがって本発明は、肝臓を構成する肝実質細胞、内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞、ピット細胞および肝幹細胞から選択される肝細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、培養することを特徴とする効率良く肝細胞を培養・増殖させる方法である。
【００１４】
より具体的には、本発明は、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場が、多孔性ポリマーからなるシート状物であることを特徴とする前記の肝細胞の増殖・培養方法である。
【００１５】
最も具体的には、本発明は、多孔性ポリマーの材質が、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレートまたはポリ無水物からなる群から選択されるポリマーであり、多孔性ポリマーにおける孔径が２〜２０μｍであることを特徴とする前記する肝細胞の増殖・培養方法である。
【００１６】
本発明はそのなかでも特に細胞の有する肝機能を高く維持できるものの長期培養が難しいとされている肝実質細胞を効果的に培養・増殖させる方法である。
【００１７】
さらに本発明は、肝臓の分化、再生を司る肝幹細胞を効果的に培養・増殖させる方法でもある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、これまで細胞機能を保持したまま増殖・培養することが困難であった肝細胞群を構成する細胞について、これらの細胞群の細胞機能を温存したまま培養・増殖できる方法を見出した点に特徴がある。したがって、これにより、栄養素、医薬品の代謝機構について、動物を使用しなくても簡単に基礎的事項を解明することが可能となり、また、人工肝機能補助装置の開発も可能になる。
さらに、本発明が提供する肝細胞群の細胞機能を温存したまま効率良く培養・増殖できることから、難治性の肝機能障害の患者への治療方法の開発することができると共に、本技術は再生医療に応用されうる利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明が提供する方法により培養・増殖される肝細胞としては、肝臓を構成する種々の細胞の中でも、肝細胞や胆管上皮細胞といった肝臓の機能を代表する肝実質部の細胞以外に、類同内皮細胞、伊東細胞（星細胞）、クッパー細胞、ピット細胞、神経細胞、血球細胞などの非実質細胞を挙げることができる。そのなかでも本発明は、特に、肝実質細胞、内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞およびピット細胞について、その細胞機能を保持したまま培養・増殖することができる。
さらに本発明は、肝臓の分化・増殖を司る肝幹細胞についてその細胞機能を保持したまま培養・増殖することができる。
【００２０】
従来から、肝臓細胞については、増殖するものの分化の程度が低いものであり、また、初代培養肝細胞は、細胞の有する肝機能を高く維持できるものの長期培養が難しいものであり、この肝臓細胞の培養を行う場合に必要となる各種肝臓細胞の単離・精製に際しては、プラスチック付着法あるいは磁石抗体ネガティブ分離法があった。しかしながら、プラスチック付着法では、非効率的であり、また操作する人の個人差があり、低精度で効率的に単球の単離・精製することは困難であった。また、磁石抗体ネガティブ分離法は、ある程度の精度が得られるが、コストが高い等の問題があった。
【００２１】
本発明の方法は、これらに比して低コストで、操作も簡単なものであって、効率的に精度良く肝臓細胞を単離・精製・増殖することができる点で特に優れた方法である。かかる方法は、基本的には、肝臓細胞を、生体マトリックス機能を補う材料としての培養足場を使用し、効率よく肝臓を構成する各種細胞に単離させることができる。
【００２２】
そのような培養足場として、多孔性ポリマーからなるシート状物を使用するのがよいことが判明した。すなわち、多孔性ポリマーの孔内に肝臓を構成する各種肝臓細胞、具体的には、肝幹細胞、肝実質細胞、内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞およびピット細胞等がはまり込み、目的をする細胞を効率的に単離させることが可能となる。なお、この単離は目的とする細胞がある程度得られる程度でよく、完全に目的細胞のみに単離する必要はない。
【００２３】
この培養足場に利用する多孔性ポリマーの材質としては、ポリカーボネート、ポリアクリレート、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブチレート、ポリ無水物等のポリマーが挙げられ、そのなかでも、ポリカーボネートのシートを好適に使用することができる。
このようなシートとしては、例えば、各種の孔径を有する市販のポリカーボネート製シート［例えば、Whatman社製：サイクロポア／Cyclopore（登録商標）やヌクレポア／Nuclepore（登録商標）］などがあり、これらを好適に使用することができる。
【００２４】
多孔性ポリマーにおける孔の孔径は、各種肝臓細胞が吸着し、培養されるために、２μｍ〜２０μｍ程度であることが必要である。この孔径が２μｍ未満であると、培養足場として使用したとしても、細胞を効率的に吸着・培養させることができず、また、２０μｍを超える場合には、培養足場としての機能が低下する。
【００２５】
かくして培養足場に捕獲・吸着した細胞を培養・増殖するのであるが、培養に用いる培地としては、肝臓細胞を培養し得る培地であればどのようなものでも使用することができるが、ＲＰＭＩ−１６４０液体培地シリーズが好ましく使用される。
【００２６】
本発明の肝臓細胞の培養・増殖においては、培養足場として使用する多孔性ポリマーの孔径の大きさにより効率的に培養される肝臓細胞の種類に差異があることが判明した。例えば、肝幹細胞および肝実質細胞は、他の肝臓細胞である内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞およびピット細胞よりその細胞が大きいものであることから、培養足場として使用する多孔性ポリマーの孔径がある程度大きなものを使用するのがよく、逆に肝実質細胞以外の細胞、例えば、内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞およびピット細胞等を培養・増殖する場合には、培養足場として孔径の小さな多孔性ポリマーを使用するのがよい。
【００２７】
肝臓より効率良く単離した肝臓細胞、すなわち肝幹細胞、肝実質細胞、内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞およびピット細胞を効率良く培養・増殖することができ、これら培養・増殖された細胞は、栄養素あるいは医薬品の代謝機構の解明に、また、人工肝機能補助装置の開発、さらには、難治性の肝機能障害の患者への治療方法の開発に使用することが可能となる。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明を、実施例に代わる試験例を記載することにより、更に詳細に説明する。
【００２９】
試験例１：培養足場の検討
生体培養材料としての培養足場における多孔性ポリマーの孔径の違いによるヒト肝臓組織からの肝臓細胞の単離・精製に与える影響を検討した。
各種の孔径を有する多孔性ポリマーのシートを細胞培養プレートまたは培養用ペトリ皿の底に敷いて、シート上にヒト肝臓組織からえた肝臓細胞が乗るような状態とし、ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて培養し、細胞の捕獲・吸着を検討した。
その結果を、下記表１にまとめた。
【００３０】
【表１】
2006296252.tif 000002
【００３１】
＊１：培養足場プレート上の顕微鏡写真の結果、プレート上に細胞の吸着がほんの僅かか、あるいはほとんど認めない。
＊２：培養足場プレート上の顕微鏡写真の結果、プレート上に多数の細胞の捕獲・吸着を認める。
【００３２】
表中に記載のように、培養足場を使用することにより効果的に肝臓細胞を捕獲していることが判明した。
【００３３】
試験例２：培養足場プレート上に捕獲・吸着した細胞についての培養・増殖
試験例１で得られた培養足場プレート上に捕獲・吸着した各種細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して培養し、その細胞の増殖の程度を検討した。その結果、培養後７日目において、培養足場上に捕獲・吸着した細胞は、効果的に増殖していることが判明した。
増殖した細胞は、それぞれの細胞が有している肝機能を保持したものであった。
【００３４】
試験例３：培養足場プレート上に捕獲・吸着した肝幹細胞についての分化培養・増殖
試験例１で得られた培養足場プレート上に捕獲・吸着した肝幹細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用して培養し、その肝幹細胞からの分化・増殖を、免疫染色とRT-PCRを用いて肝細胞および胆管上皮細胞特異的マーカーの発現を検討した。その免疫染色の結果、培養細胞において（1）肝細胞マーカーを発現する細胞、（2）胆管上皮細胞マーカーを発現する細胞、（3）それらを共に発現する細胞、（4）それらを共に発現しない細胞の４種類の細胞が観察された。
また、RT-PCRの結果においても同様に、肝細胞および胆管上皮細胞に特異的な複数のマーカーの発現が観察された。
このマーカーの発現の結果を表２に示した。
【００３５】
【表２】
2006296252.tif 000003
＋：マーカーの発現があるもの
−：マーカーの発現がみられないもの
【００３６】
上記表に示した結果からも判明するように、培養開始後２１日（３週間）を経過した時点で、マーカー遺伝子の発現の増強が観察され、肝幹細胞は、効果的に分化・増殖していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上記載したように、本発明によりこれまで効率的に大量に分化・培養ができなかった肝幹細胞、肝臓細胞、特に肝実質細胞、内皮細胞、星細胞（伊東細胞）、クッパー細胞、線維芽細胞およびピット細胞について、その細胞が有する肝機能を保持したまま、安定して大量に培養・増殖することが可能となった。
したがって、これらの細胞を本発明方法により大量に培養することができることから、肝実質細胞を用いて難治性の肝疾患に対する治療方法の確立、再生医療への応用を検討することができる。
また、医薬品の生体、特に肝臓における代謝機構を簡便に解明することが可能となり、医療上の利用性は多大なものである。