(57)【要約】      （修正有）【課題】  極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子の提供。【解決手段】  第６エクソンが特定の配列を有する塩基配列であり、またさらなる特定の配列を有する塩基配列からなる、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子および該原因遺伝子の特定の塩基位置を認識することによる極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子を同定するための方法、また該原因遺伝子の塩基配列によってコードされる蛋白質、さらに該蛋白質に対する抗体を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第６エクソンが配列番号４又は配列番号５の塩基配列である、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子。
【請求項２】
配列番号２又は配列番号３の塩基配列である、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子。
【請求項３】
配列番号２の位置８４４、８４５、８４７及び８４８の塩基、又は配列番号３の位置７５５の塩基を含む連続する１５個以上の塩基を含むヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２の位置８４４、８４５、８４７及び８４８の塩基、又は配列番号３の位置７５５の塩基を認識することによる、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子を同定するための方法。
【請求項５】
配列番号２又は配列番号３の塩基配列によってコードされるタンパク質。
【請求項６】
配列番号２又は配列番号３の塩基配列によってコードされるタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子及びその同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素性乾皮症（xeroderma pigmentosum：ＸＰ）は常染色体劣性の遺伝病であり、紫外線や活性酸素など様々な要因で生じるＤＮＡ損傷を修復する生体システムが遺伝的な原因で正確に作動せず、主として紫外線によるＤＮＡ損傷が修復できなくなることにより発症し、皮膚症状を中心に様々な臨床症状を呈する。また代謝により生ずる内因性の活性酸素により神経細胞内でのＤＮＡ損傷の残存によると考えられる神経障害も３０％の患者で見られる。
【０００３】
ＸＰは遺伝的に異なるＡ〜Ｇ群、バリアントの８種類に分類され、すべての原因遺伝子が同定され、多数の変異が報告されている（非特許文献１）。日本では皮膚症状、神経症状共に重症のＡ群が患者の過半数を占め、その数は１０万人に一人で、ヘテロで変異を持つ保因者は３００人に一人である。典型例では乳幼児期より激しいサンバーンを繰り返したあと、顔面など露光部皮膚が乾燥し、色素沈着が出現する。その後、若年齢にもかかわらず高頻度に露光部皮膚に悪性腫瘍が多発する。進行性の中枢性・末梢性神経障害を伴い、大脳障害（知能低下、精神発達運動障害）、小脳障害（失調、構語障害）などが見られ、腫瘍や神経症状の進行により多くの場合３０歳前後で死に至る。
【０００４】
ＸＰＡ遺伝子（配列番号１に示した。）についても様々な部位の変異が報告されており（非特許文献２）、変異箇所によって症状の程度は異なる。日本人のＸＰＡ群患者のほとんどは以下の３種類の変異
（１）ＸＰＡ遺伝子のイントロン３、３’側のスプライシング受容部位のＧ→Ｃの変異（Ｇ→Ｃ）、
（２）ＸＰＡ遺伝子の開始コドンより６８２番目の塩基ＣのＴへの置換（ｃ６８２Ｃ→Ｔ）、（３）ＸＰＡ遺伝子の開始コドンより３４８番目の塩基ＴのＡへの置換（ｃ３４８Ｔ→Ａ）
が原因となっている（非特許文献３及び４）。
【０００５】
ＸＰの診断には、患者より細胞を分離し、紫外線照射後のＤＮＡ修復能の測定、紫外線感受性試験、遺伝的相補性群の決定、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（制限酵素多型解析）法による遺伝子検査が行われるのが通常である。日本人ＸＰＡ群に限っては上述の如く、ほぼ３種類の変異の何れかに分類されることから、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により迅速な診断が行われている。例えば上記（２）の変異により前後の配列を含めて、制限酵素ＨｐｈIの認識部位が生じているため、この酵素による切断の有無を利用している。
【非特許文献１】Hum. Mutat., 14, p9, 1999
【非特許文献２】Hum. Mutat., 12, p103, 1998
【非特許文献３】Proc. Nat. Acad. Sci., 87, p9908, 1990
【非特許文献４】Mutat. Res., 273, p193, 1992
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
最近、本発明者等は皮膚および神経症状が３０歳後半以降になって初めて顕在化する極めて軽症のＸＰＡ患者から、その原因と考えられる未報告の以下に示す２種類のＸＰＡ遺伝子変異
（４）ＸＰＡ遺伝子の開始コドンより７７８番目（配列番号１の位置８４３）の塩基Ａと７７９番目（配列番号１の位置８４４）の塩基Ｃの間へのＴＴの挿入および７７９番目（配列番号１の位置８４４）の塩基Ｃと７８０番目（配列番号１の位置８４５）の塩基Ｔの間へのＴＴの挿入（７７９ｉｎｓＴＴ、７８０ｉｎｓＴＴ）、及び
（５）ＸＰＡ遺伝子の開始コドンより６８９番目（配列番号１の位置７５４）の塩基Ｔと６９０番目（配列番号１の位置７５５）の塩基Ａの間へのＴの挿入（６９０ｉｎｓＴ）
を新たに見出した。
【０００８】
また、上記の変異を含むエクソンであるＸＰＡ遺伝子の第６エクソン部分を配列番号４（上記（４）の変異を含む。）及び配列番号５（上記（５）の変異を含む。）に示した。
【０００９】
これらの患者においては片側のアリルに上記（１）の変異が存在し、もう一方のアリルには上述の（４）又は（５）の変異が存在する。（１）の変異ではタンパク質は発現していないことが知られており、新規変異が存在するもう一方のアリルから合成されるＸＰＡタンパク質のみがこれらのＸＰＡ患者で働いており、機能的に野生型のタンパク質に近いことが軽症の所以であると推察される。したがって、変異の存在する頻度は今のところ明らかではないが、２種類の新規変異を何れかの組み合わせで持つ個体では症状はさらに軽くなり、健常人との境界があいまいである可能性が考えられる。
【００１０】
一方、健常人においては同年代でも老化の程度は人によって大きく異なる。その違いは長年の生活環境・様式に多大な影響を受けるものの、根本的には個々人の遺伝的バックグランドにも大きく依存し、原因は不明であるが病気との境界があいまいな老化症状も存在する。このような老化程度のバリエーションの遺伝的要因を、本発明者等が見出したＸＰＡ遺伝子の２種類の新規変異何れかの組み合わせが占めている可能性が考えられる。
【００１１】
したがって本発明は、下記：
１．第６エクソンが配列番号４又は配列番号５の塩基配列である、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子。
２．配列番号２又は配列番号３の塩基配列である、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子。
３．配列番号２の位置８４４、８４５、８４７及び８４８の塩基、又は配列番号３の位置７５５の塩基を含む連続する１５個以上の塩基を含むヌクレオチド。
４．配列番号２の位置８４４、８４５、８４７及び８４８の塩基、又は配列番号３の位置７５５の塩基を認識することによる、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の原因遺伝子を同定するための方法。
５．配列番号２又は配列番号３の塩基配列によってコードされるタンパク質。
６．配列番号２又は配列番号３の塩基配列によってコードされるタンパク質に対する抗体。
に関する。
【００１２】
本発明の遺伝子の所定の位置の塩基を認識するための方法としては、従来公知の塩基認識方法であればあらゆる方法を用いることができる。具体的には、当該塩基を含む塩基配列のダイレクトシークエンス、当該塩基を含むプローブ又は当該塩基を含む領域を増幅するプライマーを用いる方法、インベーダー法、当該塩基を含む配列を認識する制限酵素を用いるＲＦＬＰ法、本発明の塩基配列がコードするタンパク質に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
【００１３】
より具体的には、配列番号２に示す変異は、制限酵素ＨｉｎｆＩまたはそれと同じ配列を認識するイソシゾマーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により、また配列番号３に示す変異は制限酵素ＭｓｅＩまたはそれと同じ配列を認識するイソシゾマー用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により検出することができる。
【００１４】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、たとえば、下記の方法によることができる。
被検者の血液、毛髪、口腔粘膜など何らかの組織由来のゲノムＤＮＡを抽出し、変異箇所を挟む任意のプライマーでＸＰＡ遺伝子の配列をＰＣＲ増幅し、一定の長さのＤＮＡ断片を得る。このＤＮＡ断片を本発明の特定の位置の塩基を認識することができる酵素により消化する。消化物を電気泳動し、ＤＮＡ断片をエチジウムブロマイドなどで染色し可視化、ＤＮＡ断片が切断されているかを調べる。本発明の変異遺伝子が存在すればＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片が切断される。野生型の配列はいずれの酵素でも切断されない。以上を指標として変異の有無を検出することができる。
【００１５】
ＰＣＲ増幅される断片の長さは選択したプライマーによって規定され、その長さは特に定めないが、好ましくは１０塩基対から１０００塩基対、電気泳動および観察のしやすさから特に１００塩基対から４００塩基対が好ましい。またプライマーの配列は変異箇所を含んでいれば制限なく設計することができる。
【００１６】
酵素の反応時間・温度に制限はないが、一般的には３７℃で３時間から一晩反応させる。反応バッファーも制限はないが、市販品の酵素に添付されるものを用いるのが通常である。電気泳動の方法も特に決まったものはなく、スラブゲル型、サブマリン型、キャピラリーなど核酸が電気的に分離できるものであればいずれの方法を用いてもよい。ゲルの材料についてもアガロースやアクリルアミドなどが一般的であるが、特に制限はない。ＤＮＡ断片の検出は電気的、紫外線吸収、染色など種々の方法を用いることができる。
【００１７】
さらに、本発明は、配列番号２の位置８４４、８４５、８４７及び８４８の塩基、又は配列番号３の位置７５５の塩基を含むヌクレオチドに関する。当該ヌクレオチドの長さは、連続する１５個以上の塩基、より好ましくは、連続する２０個以上の塩基である。当該ヌクレオチドは、プローブ又は当該塩基を含む領域を増幅するプライマーとして有用である。
【００１８】
本発明は、配列番号２又は配列番号３の塩基配列によってコードされるタンパク質、及び配列番号２又は配列番号３の塩基配列によってコードされるタンパク質に対する抗体にも関する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができる。この抗体を、例えばＥＬＩＳＡ法に用いることによって、本発明の遺伝子の発現を好都合に検出することができる。
【実施例１】
【００１９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明において検討した患者ら４症例はＸＰ相補性群を決定するテストでＡ群と確定診断されたものの、その皮膚症状および神経症状が、３０歳後半以降になって初めて顕在化する極めて軽度なものであり、紫外線照射後のＤＮＡ修復能の測定テストにおいても健常人と重症患者の中間値を示した。
【００２０】
ＸＰＡ遺伝子の変異箇所を同定するため、分子遺伝子学的解析を行ったところ、患者細胞ゲノムＤＮＡのＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析では、日本人ＸＰＡ患者に高頻度に見られる上述の（１）の変異が全ての症例のおいてヘテロ型で検出された。次にＰＣＲ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅａｑｕｅｎｃｉｎｇ法によりＸＰＡ遺伝子のすべてのエクソン（１〜６）を配列解析したところ、第６エクソン内に３症例では上述（４）の変異を、１症例では上述（５）の変異を認めた。いずれも塩基挿入によりフレームシフト変異が起こり、翻訳終止コドンがわずかに上流に移行していた。
【００２１】
さらにＸＰＡタンパク質のウェスタン解析を行ったところ、それぞれ正常型の約９７％および約９１％の分子量のタンパク質が検出され、ウェスタン解析によって得られた分子量は、アミノ酸配列からの推定分子量とほぼ一致した。これらわずかに短く機能的に野生型に近いタンパク質が発現していることが軽症の所以であると推察される。
【実施例２】
【００２２】
・被験者
ＸＰＡ遺伝子に上述の（４）または（５）の変異を持つ極めて軽症のＸＰＡ群患者および健常人（全て浜松医科大学の倫理委員会に承認された書面でのインフォームドコンセントを得た）。
・細胞
上記の被検者の皮膚生検査時に得た線維芽細胞のプライマリーカルチャーを用いた。
・ＤＮＡ抽出
コンフルエントまで培養した線維芽細胞からQIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
・プライマー
プライマーは以下の配列のものを用いた。
上述の（４）の変異箇所を挟むもの
上流プライマー  ＧＣＡＧＴＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＴＧＴＧ（変異箇所上流９５番目の塩基から７５番目の塩基まで）
下流プライマー  ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＣＣＡＧ（変異箇所下流２３７番目の塩基から２５７番目の塩基まで）
上述の（５）の変異箇所を挟むもの
上流プライマー  ＧＣＴＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（変異箇所上流１６番目の塩基を越え、第５イントロン領域内に入り、さらに上流８１番目の塩基から同じくイントロン領域内の６１番目の塩基まで）
下流プライマー  ＧＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＣＡＴ（変異箇所下流９８番目の塩基から１１８番目の塩基まで）
・ＰＣＲ
各被験者のゲノムＤＮＡおよび上記プライマーを用いＸＰＡ遺伝子領域をＰＣＲ増幅した（TAKARA社 LA Taq kit）。
・酵素反応
ＰＣＲ反応液から一部をとりＨｉｎｆＩまたはＭｓｅＩ用反応バッファーで希釈し、それぞれＨｉｎｆＩまたはＭｓｅＩ（ＮＥＢ社）を加え、３７℃で３時間消化した。
・電気泳動
簡易型泳動装置ミューピッド（アドバンス社）にて３％のアガロースゲルを用いて１００Ｖの電圧で１時間電気泳動し、酵素消化したＤＮＡを分離した。
・ＤＮＡの検出
電気泳動後のゲルを０．１μｇ／mLのエチジウムブロマイド溶液で染色し、ＵＶをあてＤＮＡの断片を観察した。
電気泳動結果を図１および２に示す。上述の（４）または（５）の変異を持つ患者由来のＤＮＡでは健常人由来のＤＮＡにはない切断が見られた。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、極めて軽症なＡ群色素性乾皮症の診断、治療のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】上述の（４）の変異箇所を含む患者についてのＰＣＲ−ＲＦＬＰ結果である。
【図２】上述の（５）の変異箇所を含む患者についてのＰＣＲ−ＲＦＬＰ結果である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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