(57)【要約】      （修正有）【課題】超小型電子機器、チップアレー及び他の固相空間的にアドレス可能なアレーが診断及び他の用途のため開発されている。現在、ポジティブ結果を検出するための方法は不十分であり、不都合である。改良された、特により迅速な検出方法が要望されており、この目的を達するための検出手段及び方法を提供する。【解決手段】バイオルミネセンスを用いて生物学的媒体、例えば体液中のアナライトを同定するための固相法が提供される。前記方法を実施し、バイオルミネセンスを検出するために設計されたチップも提供される。マトリックス支持体上にシリコンを堆積させるためにバイオミルラル化を用いる方法も提供される。合成シナプスも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超小型電子デバイスであって、
基板と、
前記基板上に規定された複数のミクロ位置であって、各ミクロ位置がマクロ分子を結合するためのものである前記ミクロ位置と、
各ミクロ位置においてまたは各ミクロ位置に隣接して一体化され、且つ各ミクロ位置に光学的に結合している個別の光検出器であって、各光検出器は他のミクロ位置に光学的に結合している光検出器とは独立していて、各光検出器はミクロ位置で発光化学反応が起こったときにその位置で生じた光の光子に応じて検知信号を発生するように構成されている前記光検出器と、および
各光検出器に結合しており、各光検出器より発生した検知信号を読みとり且つ発光化学反応により各ミクロ位置で生じた光を示す出力データ信号を発生させ、それにより前記デバイスが発光化学反応により放出された光の光子を検出するように構成されている電子回路とを含み、各ミクロ位置は表面の一部により規定されている、超小型電子デバイス。
【請求項２】
ミクロ位置がタンパク質、核酸または有機分子を結合するために誘導化されている、請求の範囲第１項に記載のデバイス。
【請求項３】
各ミクロ位置に結合したマクロ分子を更に含む請求の範囲第１項または第２項に記載のデバイス。
【請求項４】
基板上に規定されたミクロ位置の各々が、そのミクロ位置で反応が起こったときに光の光子を放出する化学反応物質を含む請求の範囲第１項に記載のデバイス。
【請求項５】
化学反応物質がバイオルミネセンス発生系の成分である請求の範囲第４項に記載のデバイス。
【請求項６】
基板がマクロ分子を結合させるために適合されている表面を有する半導体基板であり、各ミクロ位置はそのミクロ位置の別個の化学反応物質が結合するように適合されている表面の一部で規定されている請求の範囲第１項に記載のデバイス。
【請求項７】
表面がマクロ分子を結合させるために誘導化された不活性材料で被覆されている、請求の範囲第６項に記載のデバイス。
【請求項８】
デバイスの表面の全部もしくは一部またはデバイスの表面の上に反射性材料の層をさらに含み、それにより発生した光を反射させて光検出器で検出される光信号を強めるために請求の範囲第１項に記載のデバイス。
【請求項９】
上記材料が配向ポリエチレンテレフタレートである請求の範囲第８項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記基板上に規定されたミクロ位置が分析用流体サンプルを受容するためのものであって、各ミクロ位置がマクロ分子が結合する結合層を含む請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記結合層を介して一以上のミクロ位置に結合しており、デバイスが受容した液体サンプル中に存在するアナライトに選択的に結合するマクロ分子と、
各光検出器は、相当するミクロ位置で結合したアナライトが発光反応の１つ以上の成分に結合した他のマクロ分子と反応したときに、光の光子に応じて検知信号を発生する各光検出器とを、さらに含む請求の範囲第１０項に記載のデバイス。
【請求項１２】
各マクロ分子が抗体であり、アナライトが抗原である請求の範囲第１１項に記載のデバイス。
【請求項１３】
分析される流体サンプルを受容するための基板上に規定されたミクロ位置のアレーがデバイスの表面においてウェルを形成している請求の範囲第１０項に記載のデバイス。
【請求項１４】
１つまたは複数のウェルが、光が光検出器に反射されるように、該ウェルの側面に沿って配置されるかまたはウェルを横切って懸架されている反射性材料を含む請求の範囲第１３項に記載のデバイス。
【請求項１５】
サンプル受容手段の全部もしくは一部の上に反射性材料の層を更に含む請求の範囲第１０項または第１１項に記載のデバイス。
【請求項１６】
反射性材料が配向ポリエチレンテレフタレートである請求の範囲第１５項に記載のデバイス。
【請求項１７】
発光反応がルミネセンスである請求の範囲第１１項に記載のデバイス。
【請求項１８】
ルミネセンスがバイオルミネセンスである請求の範囲第１７項に記載のデバイス。
【請求項１９】
マクロ分子を含む各ミクロ位置にバイオルミネセンス発生系の少なくとも１つの成分を更に含む請求の範囲第１０項または第１１項に記載のデバイス。
【請求項２０】
各ミクロ位置に光学的に結合した光検出器が相当ミクロ位置で生じるバイオルミネセンスに応じて検知信号を発生するように構成されている請求の範囲第１項、第１０項または第１１項に記載のデバイス。
【請求項２１】
バイオルミネセンス発生系がルシフェラーゼおよび／またはルシフェリンを含む請求の範囲第５項および第１８項ないし第２０項のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２】
ルシフェラーゼが光タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のデバイス。
【請求項２３】
バイオルミネセンス発生系がＡｅｑｕｏｒｅａ、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｏｂｅｌｉｎ、Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓ、Ｏｄｏｎｔｏｓｙｌｌｉｓ、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、Ｇｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｈａｌｉｓｔｕｒｉａ、チスイイカ、Ｇｌｙｐｈｕｓ、Ｍｙｃｏｔｏｐｈｉｄｓ（魚類）、Ｖｉｎｃｉｇｕｅｒｒｉａ、Ｈｏｗｅｌｌａ、Ｆｌｏｒｅｎｃｉｅｌｌａ、Ｃｈａｕｄｉｏｄｕｓ、Ｍｅｌａｎｏｃｏｓｔｕｓ、Ｐａｒａｃａｎｔｈｕｓ、Ａｔｏｌｌａ、Ｐｅｌａｇｉａ、Ｐｉｔｉｌｏｃａｒｐｕｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｒａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｈｏｒｅ、Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌａ、Ｃａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、Ａｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍ、Ｐａｒａｚｏａｎｔｈｕｓ、ウミエラ（Ｓｔｙｌａｔａ）、Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｗａｔａｓｅｎｉａ、コウイカ、Ｓｅｐｉｏｌｉｎａ、小エビ、深海魚、ホタルおよび細菌系からなる群から選択される請求の範囲第２１項に記載のデバイス。
【請求項２４】
デバイスが複数の異なるマクロ分子を含み、各マクロ分子は異なるアナライトに対して特異的であり、各異なるマクロ分子は異なるミクロ位置に存在する請求の範囲第１０項または第１１項に記載のデバイス。
【請求項２５】
ミクロ位置がアレーの形態であり、ミクロ位置のアレーがそれぞれ第１及び第２サイズからなる第１及び第２の画素素子アレーを含み、第１及び第２サイズが異なる請求の範囲第１０項に記載のデバイス。
【請求項２６】
ミクロ位置がアレーの形態であり、ミクロ位置のアレーがそれぞれ第１及び第２サイズからなる第１及び第２の画素素子アレーを含み、第１及び第２サイズが異なり、および第１画素素子アレーの結合層に結合したレセプター抗体が第１の特定アナライトの結合に対して特異的であり、第２画素素子アレーの結合層に結合したレセプター抗体が第１の特定アナライトとは異なる第２の特定アナライトの結合に対して特異的である請求の範囲第１０項に記載のデバイス。
【請求項２７】
各ミクロ位置が半導体基板の表面上に配置されており、各ミクロ位置の表面が該ミクロ位置に対する結合層を規定している請求の範囲第１０項または第１１項に記載のデバイス。
【請求項２８】
半導体基板の表面が、レセプター抗体の各ミクロ位置における結合層への結合を高めるために誘導化されている請求の範囲第２７項に記載のデバイス。
【請求項２９】
各光検出器が各ミクロ位置の表面に配置されたフォトダイオードを含み、反応は特定アナライトがサンプル中に存在するときフォトダイオードにより光電流に変換される光の光子を生成し、光電流がフォトダイオードが発生する検知信号である請求の範囲第２８項に記載のデバイス。
【請求項３０】
電子回路が各フォトダイオードに結合した画素単位格子回路及びデルタ−シグマＡ／Ｄ変換回路を含み、各画素単位格子回路は各フォトダイオードからの検知信号を積算するように構成されており、Ａ／Ｄ変換回路は積算された検知信号を量化するように構成されている請求の範囲第９項または第２９項に記載のデバイス。
【請求項３１】
各画素単位格子はアドレス可能であり、電子回路は各画素単位格子を順次アドレス指定するためのアドレス制御回路を更に含み、Ａ／Ｄ変換回路はアドレス制御回路によりアドレス指定される画素単位格子回路の積算された検知信号を量化する請求の範囲第３０項に記載のデバイス。
【請求項３２】
各フォトダイオードが化学反応により生じた光の光子を光子の数に依存するマグニチュードを含む光電流に変換し、各画素単位格子回路が光電流のマグニチュードに依存する割合で変化する電荷を含む容量回路を含み、容量回路により検知信号が積算される請求の範囲第３１項に記載のデバイス。
【請求項３３】
各フォトダイオードが化学反応により生じた光の光子を各ミクロ位置に適用されたサンプル中のアナライトの濃度に依存するマグニチュードを含む光電流に変換する請求の範囲第３２項に記載のデバイス。
【請求項３４】
各画素単位格子回路が該画素単位回路がアドレス指定されたとき容量回路の電荷に依存する出力電流を発生し、電子回路はアドレス指定された画素単位格子回路の出力電流を基準電流と比較して、出力電流が基準電流に対して遷移するとき容量回路を初期電荷にリセットするために使用されるフィードバック信号を発生させるための比較器回路をも含む請求の範囲第３２項または第３３項に記載のデバイス。
【請求項３５】
電子回路が出力制御回路を更に含み、前記出力制御回路は各アドレス指定された画素単位格子回路からのフィードバック信号を受け取り、このフィードバック信号に基づく直列出力データ流として出力データ信号を発生し、各ミクロ位置と相関するフィードバック信号遷移の割合がそのミクロ位置で放出されたバイオルミネセンスを示す請求の範囲第３４項に記載のデバイス。
【請求項３６】
ミクロ位置がアレーとして備えられている請求の範囲第１項〜第２４項および第２７項〜第３４項のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３７】
生物学的サンプル中のアナライトを検出し、同定する方法であって、
請求の範囲第１項〜第３６項のいずれか一項に記載の超小型電子デバイスを準備するステップ、
生物学的サンプル中に存在するアナライトへの結合に対して特異的なマクロ分子もしくは複数の異なるマクロ分子をデバイス上の各ミクロ位置の表面に結合させるステップ、
サンプルを超小型電子デバイスの表面と接触させてサンプル中に存在するアナライトを各ミクロ位置で表面に結合したマクロ分子と結合させるステップ、
超小型電子デバイスの表面を、各ミクロ位置でマクロ分子に既に結合しているアナライトに結合させるためのバイオルミネセンス発生系の成分を含む他のマクロ分子もしくは複数の他のマクロ分子に暴露するステップ、
デバイスの表面をバイオルミネセンス発生系の他の成分と接触させることによりバイオルミネセンス発生反応を開始するステップ、
各ミクロ位置に光学的に結合した光検出器を用いてバイオルミネセント反応により発生する光の光子を検出するステップであって、
各光検出器はそれぞれのミクロ位置でバイオルミネセンス発生を表す検知信号を発生するステップを含む前記方法。
【請求項３８】
各光検出器が発生する検知信号を読みとり、各ミクロ位置でルシフェラーゼ−ルシフェリン反応により生じたバイオルミネセンスを示す出力データ信号を発生させることを更に含む請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項３９】
接触ステップと暴露ステップの間に、サンプル中に存在するアナライトが各ミクロ位置で表面に結合したマクロ分子に結合するのに十分な時間待機した後、超小型電子デバイスの表面からサンプルを洗浄することを更に含む請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項４０】
マクロ分子が抗体である請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項４１】
結合ステップが複数の異なるミクロ位置に複数の異なるレセプター抗体を結合させることを含み、異なる抗体の各々が生物学的サンプル中に存在する異なる特定アナライトの結合に対して特異的である請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項４２】
結合ステップが超小型電子デバイスを生物学的サンプルの流体に浸漬させることを含む請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項４３】
ルシフェラーゼ−ルシフェリンバイオルミネセンスを用いて生物学的サンプル中のアナライトを検出し同定するためのシステムであって、請求の範囲第１項〜第３６項のいずれか一項に記載の超小型電子デバイス及び処理機器を含み、前記処理機器は、各ミクロ位置で生じるバイオルミネセンスを示す出力データ信号を受け取るための超小型電子デバイスに結合した入力インターフェース回路と、各ミクロ位置と結合している位置を含むデータ獲得アレーを蓄積するための記憶回路と、出力デバイス信号に応答して目に見える徴候を発生させるための出力デバイスと、および入力インターフェース回路、記憶回路及び出力デバイスに結合している処理回路とを含み、前記処理回路は、入力インターフェース回路が受け取った出力データ信号を読みとり、出力データ信号を相当するミクロ位置に相関させ、各ミクロ位置に相関させた出力データ信号をデータ獲得アレーに出力データ信号を蓄積させることにより所望の時間積算させ、及び出力デバイスに適用したときに出力デバイスによりサンプル中のアナライトの存在に関連する目に見える徴候を発生させる出力デバイス信号を発生させるように構成されている前記システム。
【請求項４４】
超小型電子デバイスが、
分析される生物学的サンプルを受容するための、各ミクロ位置が結合層を含む複数のミクロ位置のアレーと、
各ミクロ位置の結合層に結合した、アレーが受容したサンプル中に存在するアナライトへの結合に対して特異的な別個の抗体と、
各ミクロ位置に光学的に結合した、各々が相当するミクロ位置で生じたバイオルミネセンスに応じた検知信号を発生させるように構成されている光検出器と、
各光検出器に結合しており、該光検出器が発生した検知信号を読みとり、各ミクロ位置でルシフェラーゼ−ルシフェリン反応により生じたバイオルミネセンスを示す出力データ信号を発生させるように構成されている電子回路と
を含む請求の範囲第４３項に記載のシステム。
【請求項４５】
各ミクロ位置が半導体基板の表面上に配置されており、各光検出器は各ミクロ位置で表面上に配置されているフォトダイオードを含み、バイオルミネセント発生反応がアナライトが存在するときフォトダイオードにより光電流に変換される光の光子を発生させ、および光電流はフォトダイオードにより発生される検知信号である請求の範囲第４４項に記載のシステム。
【請求項４６】
超小型電子デバイスの電子回路が出力データ信号を含む直列データ流を発生する出力制御回路を含み、処理機器の入力インターフェース回路は超小型電子デバイスから直列データ流を受け取るように構成された直列インターフェース回路を含む請求の範囲第４４項に記載のシステム。
【請求項４７】
直列データ流が各ミクロ位置でルシフェラーゼ−ルシフェリン反応により生じるバイオルミネセンスを表すデータを含む請求の範囲第４６項に記載のシステム。
【請求項４８】
出力デバイスが電子ディスプレイを含み、目に見える徴候がディスプレイにより発せられる光を含む請求の範囲第４４項に記載のシステム。
【請求項４９】
記憶回路が各ミクロ位置でアナライトを同定するアナライトマップをも蓄積しており、処理回路はサンプル中に存在するアナライトを同定するためにデータ獲得アレー中の積算された出力データ信号をアナライトマップと相関させ、出力デバイス信号が目に見える徴候がサンプル中に存在する特定アナライトを同定するように発生される請求の範囲第４４項に記載のシステム。
【請求項５０】
処理機器が、出力データ信号に対する所望の積算時間を決定すべく処理回路が使用する所望積算時間信号を発生させるために処理回路に結合した入力デバイスを更に含むことを特徴とする請求の範囲第４４項に記載のシステム。
【請求項５１】
バイオルミネセンス発生系が、サンゴ虫類、有櫛動物、腔腸動物、軟体動物、魚、貝虫、昆虫、細菌、甲殻類、環形動物及び地虫類から単離されるバイオルミネセンス発生系からなる群から選択される請求の範囲第４４項に記載のシステム。
【請求項５２】
感染性微生物を検出するための請求の範囲第４３項〜第５０項のいずれか一項に記載のシステム用キットであって、
（ａ）請求の範囲第１項〜第３６項のいずれか一項に記載の超小型電子デバイス、
（ｂ）抗リガンド、
（ｃ）バイオルミネセンス発生系の成分及び感染性微生物の表面上のエピトープと特異的に結合する抗リガンドからなる複合体を含む第１組成物、および
（ｄ）バイオルミネセンス発生系の他の成分を含む第２組成物、
を含む前記キット。
【請求項５３】
バイオルミネセンス発生系の成分がルシフェラーゼおよび／またはルシフェリンである請求の範囲第５２項に記載のキット。
【請求項５４】
バイオルミネセンス発生系が、サンゴ虫類、有櫛動物、腔腸動物、軟体動物、魚、貝虫、昆虫、細菌、甲殻類、環形動物及び地虫から単離されるバイオルミネセンス発生系からなる群から選択される請求の範囲第５２項に記載のキット。
【請求項５５】
バイオルミネセンス発生系の成分が、Ａｅｑｕｏｒｅａ、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｏｂｅｌｉｎ、Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓ、Ｏｄｏｎｔｏｓｙｌｌｉｓ、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、Ｇｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｈａｌｉｓｔｕｒｉａ、チスイイカ、Ｇｌｙｐｈｕｓ、Ｍｙｃｏｔｏｐｈｉｄｓ（魚類）、Ｖｉｎｃｉｇｕｅｒｒｉａ、Ｈｏｗｅｌｌａ、Ｆｌｏｒｅｎｃｉｅｌｌａ、Ｃｈａｕｄｉｏｄｕｓ、Ｍｅｌａｎｏｃｏｓｔｕｓ、Ｐａｒａｃａｎｔｈｕｓ、Ａｔｏｌｌａ、Ｐｅｌａｇｉａ、Ｐｉｔｉｌｏｃａｒｐｕｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｒａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｈｏｒｅ、Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌａ、Ｃａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、Ａｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍ、Ｐａｒａｚｏａｎｔｈｕｓ、ウミエラ（Ｓｔｙｌａｔａ）、Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｗａｔａｓｅｎｉａ、コウイカ、Ｓｅｐｉｏｌｉｎａ、小エビ、深海魚、ホタル、および細菌系からなる群から選択される請求の範囲第５３項に記載のキット。
【請求項５６】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びフィコビリンタンパク質からなる群から好ましくは選択される蛍光タンパク質を含む組成物をさらに含む請求の範囲第５２項〜第５５項のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
検出または同定されるアナライトが感染性物質である請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項５８】
バイオルミネセンス発生系が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びフィコビリンタンパク質からなる群から好ましくは選択される蛍光タンパク質をさらに含む請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項５９】
感染性微生物を検出するための請求の範囲第４３項〜第５０項のいずれか一項に記載のシステム用キットであって、
（ａ）請求の範囲第１項〜第３６項のいずれか一項に記載の超小型電子デバイス、
（ｂ）超小型電子デバイスの表面上に固定した、異なる感染性微生物に特異的に結合する１つの抗リガンドまたは複数の抗リガンド、および
（ｃ）複合体または複数の複合体を含む第１組成物
を含み、各複合体が感染性微生物の表面上のエピトープに特異的に結合する第２の抗リガンドに結合したバイオルミネセンス発生系の成分を含む前記キット。
【請求項６０】
（ｄ）バイオルミネセンス発生系の残りの成分を含む第２組成物をさらに含む請求の範囲第５９項に記載のキット。
【請求項６１】
第１のミクロ位置で結合層に結合した抗体が第１の特定アナライトの結合に対して特異的であり、第２のミクロ位置で結合層に結合した抗体が第１の特定アナライトとは異なる第２の特定アナライトの結合に対して特異的である請求の範囲第４４項に記載のシステム。
【請求項６２】
バイオルミネセンス発生系の成分がルシフェラーゼまたはルシフェリンである請求の範囲第３７項に記載の方法。
【請求項６３】
バイオルミネセンス発生系が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びフィコビリンタンパク質からなる群から好ましくは選択される蛍光タンパク質をさらに含む請求の範囲第５項に記載のデバイス。
【請求項６４】
基板と、
前記基板上に規定された複数のミクロ位置であって、各ミクロ位置がマクロ分子を結合するためのものである前記ミクロ位置と、
各ミクロ位置に光学的に結合している個別の光検出器であって、各光検出器は他のミクロ位置に光学的に結合している光検出器とは独立していて、各光検出器はミクロ位置で発光化学反応が起こったときにその位置で生じた光の光子に応じて検知信号を発生するように構成されている光検出器と、
各光検出器に結合しており、各光検出器より発生した検知信号を読みとり且つ発光化学反応により各ミクロ位置で生じた光を示す出力データ信号を発生させるように構成されている電子回路と、および
デバイスの表面の全部もしくは一部またはデバイスの表面の上に、発生した光を反射させて光検出器で検出される光信号を強めるために反射性材料の層を含む超小型電子デバイス。
【請求項６５】
一体化された各光検出器が、それぞれのミクロ位置において表面の一部に配置されているフォトダイオードを含み、該フォトダイオードは該ミクロ位置で化学反応により生じた光の光子を検知信号を規定する光電流に変換する、請求の範囲第１ないし３６項のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６６】
バイオルミネセンス発生系の成分が、細菌類、きのこ類、双鞭毛藻類、腔腸動物類、有櫛動物類、環形動物類、甲殻類、カイムシ類、カイアシ類、昆虫類、甲虫類、双翅目昆虫類、棘皮動物類、脊索動物類、尾索動物類および魚類のバイオルミネセンス発生系からなる群より選択される、請求の範囲第１ないし２２項および第２４ないし３６項のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６７】
バイオルミネセンス発生系の成分が、蛇尾類、ナマコ類、軟骨魚類類、硬骨魚類、Ｐｏｎｙ魚類（ponyfish）、ヒカリキンメダイ類（flashlight fish）、アンコウ類、バトラコイデス類、Ｍｉｄｗａｔｅｒ魚類、海洋多毛類、発光キノコバエ類、クラゲ類、ヒドロポリプ類、ウミシイタケ類、地虫類、軟体動物類、カサガイ類、深海魚類、二枚貝類、ホタル類、コメツキムシ類、ミバエ類およびイカ類のバイオルミネセンス発生系からなる群より選択される、請求の範囲第６６項に記載のデバイス。
【請求項６８】
バイオルミネセンス発生系の成分が、Ａｅｑｕｏｒｅａ、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｏｂｅｌｉｎ、Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓ、Ｏｄｏｎｔｏｓｙｌｌｉｓ、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、Ｇｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｈａｌｉｓｔｕｒｉａ、チスイイカ、Ｇｌｙｐｈｕｓ、Ｍｙｃｏｔｏｐｈｉｄｓ（魚類）、Ｖｉｎｃｉｇｕｅｒｒｉａ、Ｈｏｗｅｌｌａ、Ｆｌｏｒｅｎｃｉｅｌｌａ、Ｃｈａｕｄｉｏｄｕｓ、Ｍｅｌａｎｏｃｏｓｔｕｓ、Ｐａｒａｃａｎｔｈｕｓ、Ａｔｏｌｌａ、Ｐｅｌａｇｉａ、Ｐｉｔｉｌｏｃａｒｐｕｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｒａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｈｏｒｅ、Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌａ、Ｃａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、Ａｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍ、Ｐａｒａｚｏａｎｔｈｕｓ、ウミエラ、Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｗａｔａｓｅｎｉａ、コウイカおよびＳｅｐｉｏｌｉｎａからなる群から選択される請求の範囲第６７項に記載のデバイス。
【請求項６９】
ルシフェラーゼが、細菌類、きのこ類、双鞭毛藻類、腔腸動物類、有櫛動物類、環形動物類、甲殻類、カイムシ類、カイアシ類、昆虫類、甲虫類、双翅目昆虫類、棘皮動物類、脊索動物類、尾索動物類および魚類のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求の範囲第５２ないし５４項および第５６項のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
ルシフェラーゼが、蛇尾類、ナマコ類、軟骨魚類、硬骨魚類、Ｐｏｎｙ魚類（ponyfish）、ヒカリキンメダイ類（flashlight fish）、アンコウ類、バトラコイデス類、Ｍｉｄｗａｔｅｒ魚類、海洋多毛類、発光キノコバエ類、クラゲ類、ヒドロポリプ類、ウミシイタケ類、地虫類、軟体動物類、カサガイ類、深海魚類、二枚貝類、ホタル類、コメツキムシ類、ミバエ類およびイカ類のルシフェラーゼからなる群より選択される、請求の範囲第６９項に記載のキット。
【請求項７１】
ルシフェラーゼが、Ａｅｑｕｏｒｅａ、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｏｂｅｌｉｎ、Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓ、Ｏｄｏｎｔｏｓｙｌｌｉｓ、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、Ｇｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｈａｌｉｓｔｕｒｉａ、チスイイカ、Ｇｌｙｐｈｕｓ、Ｍｙｃｏｔｏｐｈｉｄｓ（魚類）、Ｖｉｎｃｉｇｕｅｒｒｉａ、Ｈｏｗｅｌｌａ、Ｆｌｏｒｅｎｃｉｅｌｌａ、Ｃｈａｕｄｉｏｄｕｓ、Ｍｅｌａｎｏｃｏｓｔｕｓ、Ｐａｒａｃａｎｔｈｕｓ、Ａｔｏｌｌａ、Ｐｅｌａｇｉａ、Ｐｉｔｉｌｏｃａｒｐｕｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｒａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｈｏｒｅ、Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌａ、Ｃａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、Ａｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍ、Ｐａｒａｚｏａｎｔｈｕｓ、ウミエラ、Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｗａｔａｓｅｎｉａ、コウイカおよびＳｅｐｉｏｌｉｎａのルシフェラーゼからなる群から選択される請求の範囲第７０項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオルミネセンスを用いて生物学的媒体中のアナライトを同定するための方法に関する。より詳しくは、固相方法及びルシフェラーゼ−ルシフェリンバイオルミネセンス発生系を用いて病気を診断する方法が提供される。本発明ではマトリックス支持体上にシリコンを堆積するためにバイオミネラル化を用いる方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
バイオルミネセンス
ルミネセンスは、エネルギーが分子に特異的に向けられて励起状態を生ずる現象である。光子（ｈν）が放出されると低エネルギー状態に戻る。ルミネセンスは蛍光、リン光、ケミカルルミネセンス及びバイオルミネセンスを含む。バイオルミネセンスは、生存生物が他の生物に目に見える光を発する過程である。ルミネセンスは次のように表される。
【０００３】
Ａ＋Ｂ→Ｘ＊＋Ｙ
Ｘ＊→Ｘ＋ｈν
ここで、Ｘ＊は電子的に励起した分子、ｈνはＸ＊が低エネルギー状態に戻ったときに光を発することを示す。ルミネセンスがバイオルミネセンスの場合、励起状態は酵素触媒反応により生ずる。バイオルミネセント（またはケミカルルミネセントまたは他のルミネセント）反応において生じた光の色は励起分子に特有であり、励起ソース及び温度に依存しない。
【０００４】
バイオルミネセンスの必須条件は、ルシフェラーゼの存在下で結合もしくは遊離状態の分子状酸素を使用しなければならないことである。ルシフェラーゼは分子状酸素の存在下で基質であるルシフェリンに対して作用するオキシゲナーゼであり、基質を励起状態に変換する。低エネルギーレベルに戻ると、エネルギーは光の形態で放出される（参考のために、例えばＭｃＥｌｒｏｙら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｙａｓｈｉら編，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｈｉｆｆｓ，ＮＪ，ｐｐ．６３−８０（１９６６）；Ｗａｒｄら，Ｃｈｅｍｉ−ａｎｄ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，７章，Ｂｕｒｒ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ｐｐ．３２１−３５８；Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｏｏｋ，Ｎ．Ｓｐｅｒａｌａｋｉｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．６６５−６８１（１９９５）；Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｎａｒｃｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｅｐ  Ｓｅａ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｖａｎｔａｇｅ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，特にｐｐ．５０−５６参照）。
【０００５】
総体的な割合であるが、バイオルミネセンスは陸生生物よりも海洋生物においてより一般的である。バイオルミネセンスは３０の進化的に区別される起源で発生し、各種生物におけるバイオルミネセンスに関与する生化学的及び生理学的メカニズムが異なるように各種方法で発現された。バイオルミネセンス種は多くの属にわたり、例えば細菌（主としてＶｉｂｒｉｏ種を含めた海洋細菌）、真菌、藻類及び渦鞭藻類のような極微な生物、節足動物、軟体動物、棘皮動物及び脊索動物を含めた海洋生物、並びに環形動物及び昆虫を含めた陸生生物が含まれる。
【０００６】
バイオルミネセンス及び他のタイプのケミカルルミネセンスは、生物学及び医学において特定物質を定量するために使用される。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子はクローン化され、多くの目的のために各種アッセイにおいてレポーター遺伝子として使用されている。ルシフェラーゼ系の種類により特定要件も異なるので、各種ルシフェラーゼ系が各種物質の検出及び同定のために使用され得る。一般的なバイオルミネセンス用途の多くはホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼに基づく。最初に使用され、なお広く使用されているアッセイの１つでは、ＡＴＰの存在を検出するためにホタルルシフェラーゼを使用する。ホタルルシフェラーゼは反応中の他の物質または補因子を検出及び定量するためにも使用される。直接的または間接的にＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）または長鎖アルデヒドを生成または使用する反応を細菌ルシフェラーゼの発光反応に結合し得る。
【０００７】
分析目的で一般的に使用されている他のルシフェラーゼ系はＡｅｑｕｏｒｉｎ系である。精製クラゲ発光タンパク質のエクオリンは各種実験条件下で細胞内Ｃａ２＋及びその変化を検出及び定量するために使用される。Ａｅｑｕｏｒｉｎ発光タンパク質は比較的小さく（〜２０ｋＤａ）、非毒性であり、広い濃度範囲（３×１０−７〜１０−４Ｍ）でカルシウムを検出するのに十分な量細胞に注入され得る。
【０００８】
その分析用途のために、多くのルシフェラーゼ及び基質が研究され、十分特徴付けられ、市販されている（例えば、ホタルルシフェラーゼはミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ及びインディアナ州インディアナポリスに所在のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されている；組換え産生されたホタルルシフェラーゼ及びこの属に基づくまたはこのタンパク質と共に使用するための他の試薬はウィスコンシン州マジソンに所在のＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている；クラゲ由来のエクオリン発光タンパク質ルシフェラーゼ及びＲｅｎｉｌｌａ由来のルシフェラーゼはジョージア州ボガートに所在のＳｅａｌｉｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている；これらのルシフェラーゼに対する天然基質であるセレンテラジンはオレゴン州ユージーンに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能である）。これらのルシフェラーゼ及び関連試薬は診断、定性コントロール、環境テスト及び他の分析用試薬として使用される。
【０００９】
チップ、アレー及び超小型電子機器
超小型電子機器、チップアレー及び他の固相空間的にアドレス可能なアレーが診断及び他の用途のために開発されている。現在、ポジティブ結果を検出するための方法は不十分であり、不都合である。改良された、特により迅速な検出方法が要望されている。
【００１０】
従って、本発明の目的は検出手段及び方法を提供することである。
【００１１】
（発明の要旨）
チップ及びルシフェラーゼ−ルシフェリン発生系を用いて疾患、特に感染性疾患を診断するための方法を提供する。本発明では前記方法を実施するためのチップデバイスも提供される。前記チップは、バイオルミネセンス発生系より放出される光子を検出する集積光検出系を含む。前記方法は、バイオルミネセンス発生系より生成した光子を検出するために本明細書に記載したように変更した自己アドレス可能及び非自己アドレス可能なフォーマットを含めた適当なチップデバイスを用いて実施され得る。本発明で提供されるチップデバイスは、生物学的サンプル中の感染性物質を検出及び同定するためにアレーフォーマットで使用するのに適している。
【００１２】
チップを製造するために、チップ製造用の適当なマトリックスを選択し、光発生を測定するためのフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＣＤ（電荷結合デバイス）または他の適当な検出器の結合を含めたマクロ分子を結合するためにマトリックスを適当に誘導化し、適当なマクロ分子、例えば生物学的分子または抗リガンド、例えば抗体のようなレセプターをチップに好ましくはその割り当て位置に結合することにより製造される。フォトダイオードが現在好ましい検出器であり、本明細書に特に記載されている。しかしながら、フォトダイオードの代わりに他の適当な検出器も使用され得ることも理解されよう。
【００１３】
１つの実施態様では、チップは光検出器のアレー、例えばＸ−Ｙアレーを有する集積回路を使用して製造される。回路の表面は、チップが意図する診断アッセイの条件に対して不活性となるように処理され、例えば抗体のような分子を結合するために誘導化することにより適合される。１つもしくは複数の特定抗体、例えば特に細菌抗原に対して特異的な抗体を各フォトダイオード上のチップ表面に固定する。チップを試験サンプルと接触させた後、チップを抗原に対して特異的なバイオルミネセンス発生系の成分、例えばルシフェラーゼまたはルシフェリンに結合させた第２抗体と接触させる。バイオルミネセンス発生系の残りの成分を添加し、バイオルミネセンス発生系の成分に結合した抗体がチップ上に存在する場合には光が発生し、その光を隣接の光検出器により検出する。光検出器は、結合抗体を同定する情報をプログラム化し、事象を記録し、それにより試験サンプル中に存在する抗原を同定するコンピュータと作動的に接続している。
【００１４】
チップは、例えば１つまたは複数の抗体を表面に結合し、チップを体液、例えば尿、血液、脊髄液（ＣＦＳ）の試験サンプルとアッセイフォーマットに依存してサンプル中の標的を結合するのに十分な時間接触させ、チップを洗浄し、その後ルシフェラーゼまたは抗体−ルシフェラーゼ融合タンパク質に複合化した第２抗体とインキュベートし、バイオルミネセント反応を開始し、チップ中のフォトダイオードを介して標的に結合した各位置で生じた光を検出し、チップからの電子信号を分析のためにコンピュータに移すことにより感染性疾患または抗生物質感受性のためのアッセイのような所望のアッセイに使用される。
【００１５】
１つの実施態様では、チップは、発光化学反応より生じた光の光子を検出するための非自己アドレス可能な超小型電子デバイスである。このデバイスは、基板と、基板上に規定された位置（本明細書ではミクロ位置と呼ぶ）のアレーと、各ミクロ位置に光学的に結合した独立の光検出器とを含む。各ミクロ位置は、各ミクロ位置で反応が起こったときに光の光子を放出する別個の化学反応物質を保持している。各光検出器は、各ミクロ位置で反応が起こったときに相当するミクロ位置で放出された光子に応じて検知信号を発生し、各光検出器は他の光検出器とは独立である。前記デバイスは、各光検出器より生じた検知信号を読みとり、そこから出力データ信号を発生する電子回路を含む。出力データ信号は各ミクロ位置で生じた光を示す。
【００１６】
別の実施態様では、発光反応を用いて流体サンプル中のアナライトを検出し、同定するための超小型電子デバイスが提供される。このデバイスは、基板と、基板上に規定された分析される流体サンプルを受容するためのミクロ位置のアレーと、各ミクロ位置の結合層に結合した別個の標的剤と、各ミクロ位置に光学的に結合した独立の光検出器とを含む。各標的剤は受容サンプル中に存在する可能性がある特定アナライトの結合に対して特異的であることが好ましい。各光検出器は、結合した特定アナライトを該特定アナライトまたは標的剤−特定アナライト複合体の結合に対して特異的であり、発光反応の１つ以上の成分に結合した第２結合剤に接触させたときに相当するミクロ位置で生ずる光の光子に応じて検知信号を発生する。次いで、チップは残りの成分と反応して、特定アナライトが存在するときには光子を放出する。電子回路は各光検出器より発生した検知信号を読みとり、そこから各ミクロ位置で生じた光を示す出力データ信号を発生する。
【００１７】
更に別の実施態様では、ルシフェラーゼ−ルシフェリンバイオルミネセンスを用いて生物学的流体中のアナライトを検出し、同定するための超小型電子デバイスが提供される。このデバイスは、基板と、基板上に規定された分析するサンプルを受容するためのミクロ位置のアレーと、各ミクロ位置の結合層に結合したレセプター抗体のような別個の抗リガンドと、各ミクロ位置に光学的に結合した独立した光検出器とを含む。各レセプター抗体は受容サンプル中に存在する可能性がある特定アナライトの結合に対して特異的である。各光発生器は、対応するレセプター抗体に結合した特定アナライトを該特定アナライトまたはレセプター−特定アナライト複合体に対して特異的であり、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の１つ以上の成分に結合した第２抗体と接触させ、次いで特定アナライトが存在するときにバイオルミネセンスを発生させるために残りの成分と反応させたときに相当するミクロ位置で生ずるバイオルミネセンスに応じて検知信号を発生する。電子回路は各光検出器より発生した検知信号を読みとり、そこから出力データ信号を発生する。出力データ信号は反応により各ミクロ位置で生ずるバイオルミネセンスを示す。
【００１８】
別の実施態様では、ルシフェラーゼ−ルシフェリンバイオルミネセンスを用いて生物学的流体中に存在するアナライトを検出し、同定する方法を提供する。この方法は、その上に規定されたミクロ位置のアレーを含む表面を有する超小型電子デバイスを用意し、各ミクロ位置で表面への１つもしくは複数のレセプター抗体の結合を強化するために表面を誘導化し、各ミクロ位置で１つもしくは複数の特定レセプター抗体を結合させることを含む。特定抗体はサンプル中に存在する可能性のある特定アナライトに対して特異的である。前記方法は、特定アナライトが各ミクロ位置で表面に結合したレセプター抗体に結合するようにサンプルを表面に適用し、特定アナライトが各ミクロ位置でレセプター抗体と結合するのに十分な時間待機した後サンプルを表面から洗浄し、各ミクロ位置でレセプター抗体に既に結合している特定アナライトの結合に対して特異的であり、特定アナライトが存在するときルシフェラーゼ及びルシフェリンの一方に結合する第２抗体に表面を接触させ、表面にルシフェラーゼ及びルシフェリンの他方を適用することにより反応を開始させることを含む。前記方法はまた、各ミクロ位置で光学的に結合した光検出器を用いて反応により生じた光の光子を検出することをも含む。前記光検出器は各ミクロ位置においてバイオルミネセント活性を示す検知信号を発生し、各光検出器からの検知信号を読みとり、各ミクロ位置で反応により生じたバイオルミネセンスを示す出力データ信号を発生させる。
【００１９】
別の実施態様では、ルシフェラーゼ−ルシフェリンバイオルミネセンスを用いて生物学的サンプル中のアナライトを検出し、同定するためのシステムを提供する。このシステムは、サンプルを受容するためのミクロ位置のアレーを含む超小型デバイスと、各ミクロ位置の結合層に結合させた、受容したサンプル中に存在する可能性のある特定アナライトに対して特異的な別個のレセプター抗体と、対応するレセプター抗体に結合した特定アナライトを該特定アナライトに特異的であり、ルシフェラーゼ及びルシフェリンの一方に結合した第２抗体に接触させ、特定アナライトが存在するときにはバイオルミネセンスを発生させるためにルシフェラーゼ及びルシフェリンの他方と反応させたときに相当するミクロ位置で生ずるバイオルミネセンスに応じて検知信号を発生する光検出器と、各光検出器からの検知信号を読みとり、そこから各ミクロ位置で反応により生じたバイオルミネセンスを示す出力データ信号を発生させる電子回路とを含む。前記システムは、各ミクロ位置で生ずるバイオルミネセンスを示す出力データ信号を受け取るための入力インターフェース回路、各ミクロ位置に関連する位置を有するデータ獲得アレーを保存する記憶回路、出力デバイス信号に応じて目に見える兆候を発生させるための出力デバイス及び処理回路を含む処理機器を含む。前記処理回路は、入力インターフェース回路が受け取った出力データ信号を読みとり、前記信号を対応するミクロ位置と相関させ、相関させた出力データ信号をデータ獲得アレーに蓄積することにより所望の時間前記信号を集積し、出力デバイスに適用したときに出力デバイスにより特定アナライトの存在に関連する目に見える兆候が生ずる出力デバイス信号を発生させる。
【００２０】
他の実施態様では、チップは自己アドレス可能である。本発明の方法に自己アドレス可能なチップを使用するとき、現在好ましいものは、国際特許出願公開第ＷＯ９５／１２８０８号明細書、同第ＷＯ９６／０１８３６号明細書及び同ＷＯ９６／０７９１７号明細書に記載されているような超小型電子自己アドレス可能な自己組立可能なチップ及びシステムに適合し得るもの及び米国特許第５，４５１，６８３号明細書に記載されているようなアレーに適合し得るものである。上記刊行物は援用により本明細書に含まれるとする。自己アドレス可能なチップは、１つのミクロ位置の電荷を変化させた後自由流動電気泳動によりアナライトまたは試薬を全部送ることにより各ウェルがレストの存在下で一度にアドレス指定され得るが、アセンブリはチップが組み立てられた後前記位置でのみ起こるようなものである。これらのデバイスは、記載されている検出手段をルシフェラーゼ／ルシフェリン系で置換することにより本発明の方法で使用するために変更される。
【００２１】
本明細書に記載の別の実施態様では、アノード電極及びカソード電極は、自由流動電気泳動によりアナライト及び試薬を送達するためにそれぞれ各ウェルの底部及び頂部に配置されている。チップを（例えばドット印字装置を用いて）組み立てる前にＭＹＬＡＲ（配向ポリエチレンテレフタレート）層上の各位置に抗体を結合させる。従って、その底部の半導体層に組み入れたフォトダイオードを含有するウェルを複数有する点で非自己アドレス可能である。
【００２２】
実際、例えば特異的抗リガンド、例えば抗体をチップのマトリックスまたは各ウェルの中央に配置した熱安定性ＭＹＬＡＲのような中間反射性支持体マトリックスに直接結合させる。サンプルをチップと接触させ、洗浄し、複数の第２抗体−ルシフェラーゼ複合体またはタンパク質融合物を添加する。ウェルを洗浄し、バイオルミネセント反応の残りの成分を添加して反応を開始させる。ウェルで生じた光を半導体層中の光検出器、光電子増幅管、ＣＣＤ（電荷結合デバイス）または他の適当な検出器により検出し、信号を処理装置、通常はコンピュータに中継する。処理装置はウェルがポジティブであることを表示する。各ウェルは特定のリガンドに対応し、それにより感染性物質が同定される。ステップはすべて自動化される。
【００２３】
バイオルミネセント反応の電磁気放出を検出するために微視的フォーマットで制御されたマルチステップ及びマルチプレックス反応を活性的に実施する非自己アドレス可能でプログラム可能な、自己アドレス可能で自己組立可能な超小形電子システム及びデバイスの設計、製造及び使用が本発明で提供される。前記反応には、核酸及びタンパク質核酸ハイブリダイゼーション、抗体／抗原反応及び関連する臨床診断のような多くの分子生物学的方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
こうしてシリコンマトリックス及び光検出器または他の光検出手段を含むチップが提供される。シリコンは、放散虫類及び珪藻類による酵素堆積と同様の酵素堆積を用いて堆積され得る。シリカまたはその誘導体の吸収を有利には検出手段として使用するチップも提供される。前記シリカは、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓバイオルミネセンス発生系より発生する波長である約７０５ｎｍに最大吸収を有する。シリコンをマトリックスの表面上に堆積させる酵素反応も本発明で提供される。
【００２５】
本発明では合成シナプスも提供される。適当な酵素、特にアセチルコリンエストラーゼを例えば組換え発現によりルシフェラーゼに融合する。ルシフェラーゼは不活性でも活性の配座であってもよい。ルシフェラーゼが本明細書に記載されている適当な配座変化を確実に受け得るためにいずれかのタンパク質における適当な突然変異を選択する。生じた融合物をチップ、例えば本明細書に記載のチップに結合する。リガンドを酵素に結合すると、例えばアセチルコリンをエストラーゼに結合すると、結合したルシフェラーゼは予め不活性の場合には結合により活性化され、また予め活性の場合には結合により不活性となる。バイオルミネセンス発生系の残りの成分の存在下で、光が発生し（または消光し）、その変化がチップに付属させた光検出器により検出される。この検出により、例えばコンピュータにより処理される信号が発生し、信号は適当な手段、例えばファイバにより所望のデバイスまたはエフェクタ、特に筋肉に取り付けた電極に伝送される。信号を受け取ると、筋肉の単収縮のような動きが生ずる。
【００２６】
好ましい実施態様の詳細な記載
内容の表
Ａ．定義
Ｂ．バイオルミネセンス発生系
１．一般的記載
ａ．ルシフェラーゼ
ｂ．ルシフェリン
ｃ．アクチベータ
ｄ．反応
２．有櫛動物及び腔腸動物系
ａ．エクオリン系
（１）エクオリン発光タンパク質
（２）ルシフェリン
ｂ．Ｒｅｎｉｌｌａ系
３．甲殻類、特にＣｙｒｐｉｄｉｎａ（Ｖａｒｇｕｌａ）系
ａ．Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ
（１）Ｃｙｒｐｉｄｉｎａからの精製
（２）組換え法による調製
ｂ．Ｖａｒｇｕｌａルシフェリン
ｃ．反応
４．ホタル、コメツキムシ及び他の昆虫系を含めた昆虫バイオルミネセンス発生系
ａ．ルシフェラーゼ
ｂ．ルシフェリン
ｃ．反応
５．細菌バイオルミネセンス発生系
ａ．ルシフェラーゼ
ｂ．ルシフェリン
ｃ．反応
６．他の系
ａ．渦鞭藻バイオルミネセンス発生系
ｂ．ＬａｔｉａやＰｈｏｌａｓのような軟体動物由来の系
ｃ．地虫及び他の環形動物
ｄ．発光キノコバエ
ｅ．海洋多毛蠕虫系
ｆ．南米線路甲虫
７．蛍光タンパク質
ａ．緑色及び青色蛍光タンパク質
ｂ．フィコビリンタンパク質
Ｃ．チップの設計及び製造
１．非自己アドレス可能チップ
２．自己アドレス可能チップ
ａ．マトリックス材料
ｂ．製造方法
ｉ．ミクロリソグラフィ
ii．微細機械加工
ｃ．チップの自己アドレス化
３．生物学的分子のチップへの結合
ａ．シリカ基板の誘導化
ｂ．生物学的分子の結合
Ｄ．ルシフェラーゼ複合体の形成
１．リンカー
２．ルシフェラーゼ融合タンパク質
３．核酸及びペプチド核酸複合体
Ｅ．マトリックス上へのシリコンの堆積のための放散虫類及び珪藻類
Ｆ．チップの使用方法
【００２７】
Ａ．定義
特記しない限り、本明細書に記載されている技術用語及び科学用語はすべて本発明の属する当業者が通常理解していると同じ意味を有する。本明細書で参照した特許及び刊行物はすべて援用により本明細書に含まれるとする。
【００２８】
本明細書中、ケミカルルミネセンスは、エネルギーが分子に対して特異的に伝達されて該分子が電子的に励起され、その後光子を放出するようになり、それにより目に見える光が発生される化学反応を指す。温度は前記した伝達エネルギーに関与しない。従って、ケミカルルミネセンスでは化学エネルギーが光エネルギーに直接変換される。バイオルミネセンスは、ルシフェリン及びルシフェラーゼ（または発光タンパク質）を含むケミカルルミネセンス反応の一部を指す。本発明のバイオルミネセンスはりん光を含まない。
【００２９】
本明細書中、ケミカルルミネセンスの一種であるバイオルミネセンスは、生物学的分子、特にタンパク質による光の放出を指す。バイオルミネセンスの必須条件は、基質であるルシフェリンに対して作用するオキシゲナーゼのルシフェラーゼの存在下で結合しているかもしくは遊離の分子状酸素である。バイオルミネセンスは、分子状酸素の存在下で基質ルシフェリン（バイオルミネセンス基質）に対して作用し、基質を励起状態に変換するオキシゲナーゼである酵素または他のタンパク質（ルシフェラーゼ）より発生する。基質が低エネルギーレベルに戻ると光の形態のエネルギーを放出する。
【００３０】
本明細書中、バイオルミネセンスを発生させるための基質及び酵素はそれぞれ及びルシフェリン及びルシフェラーゼと総称されている。特定種を参照する場合、明瞭にするために各用語は例えば細菌ルシフェリンまたはホタルルシフェラーゼのように由来となる生物の名前を付けて使用する。
【００３１】
本明細書中、ルシフェラーゼは、発光反応を触媒するオキシゲナーゼを指す。例えば、細菌ルシフェラーゼは、反応して光を発するフラビンモノヌクレオチド分子（ＦＭＮ）及び脂肪族アルデヒドの酸化を触媒する。海洋節足動物の中に見られる他のクラスのルシフェラーゼはＣｙｐｒｉｄｉｎａ（Ｖａｒｇｕｌａ）ルシフェリンの酸化を触媒し、他のクラスのルシフェラーゼはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａルシフェリンの酸化を触媒する。
【００３２】
従って、ルシフェラーゼは、バイオルミネセント反応（バイオルミネセンスを生ずる反応）を触媒する酵素または光タンパク質を指す。ホタルルシフェラーゼやＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのようなルシフェラーゼは、バイオルミネセンス発生反応中触媒的に作用するが変化を受けない酵素を指す。ルシフェリンが非共有的に結合するエクオリンやオベリン発光タンパク質のようなルシフェラーゼ発光タンパク質はバイオルミネセンス発生反応中、例えばルシフェリンの遊離により変化を受ける。ルシフェラーゼは生物中に元々存在するタンパク質またはその変異体もしくは突然変異体、例えば天然に存在するタンパク質とは異なる１つ以上の特性、例えば熱もしくはｐＨ安定性を有する突然変異により産生される変異体である。ルシフェラーゼ、その修飾突然変異体もしくは変異体は公知である。
【００３３】
よって、例えば“Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ”を指すとき、属Ｒｅｎｉｌｌａのメンバーから単離された酵素、または他のソース、例えば他の花虫網から得るかまたは合成した均等分子を指す。
【００３４】
ルシフェラーゼ及びルシフェリン及びそのアクチベータをバイオルミネセンス発生試薬または成分と呼ぶ。通常、これらの試薬の一部がアッセイ中用意されるか、またはチップの表面上の特定位置に固定化されている。チップ表面に他の試薬が接するとバイオルミネセンスが生じ、発生した光が特定標識が固定化抗リガンドにより検出されたアレーの位置でフォトダイオードにより検出される。従って、本明細書中、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及び他の要素、例えばＯ２、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋もバイオルミネセンス発生試薬（または物質または成分）と呼ぶ。
【００３５】
本明細書中、「厳密には触媒的でなく」という表現は、発光タンパク質が基質の酸化を促進するための触媒として作用するが、結合基質が酸化し、結合分子状酸素が反応に使用されるので反応において変化を受けることを意味する。そのような光タンパク質は当業者に公知の適当な条件下で基質及び分子状酸素を添加することにより再生される。
【００３６】
本明細書中、バイオルミネセンス基質は、ルシフェラーゼ及び必要なアクチベータの存在下で酸化されて光を発する化合物を指す。前記基質は、バイオルミネセント反応において酸化を受ける基質であるルシフェリンと呼ばれる。バイオルミネセンス基質には、ルシフェリンまたはそのアナログ、またはルシフェラーゼと相互作用して光を発する合成化合物が含まれる。発光反応においてルシフェラーゼまたはタンパク質の存在下で酸化される基質が好ましい。よって、バイオルミネセンス基質には当業者がルシフェリンと認識している化合物が含まれる。ルシフェリンには例えば、ホタルルシフェリン、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ（Ｖａｒｇｕｌａとしても公知）ルシフェリン（セレンテラジン）、細菌ルシフェリン及びこれらの基質の合成アナログ、または反応中にルシフェラーゼの存在下で酸化されてバイオルミネセンスを発生する他の化合物が含まれる。
【００３７】
本明細書中、「バイオルミネセンス基質に変換し得る」という表現は、酸化または還元のような化学反応を受けやすくバイオルミネセンス基質を生ずることを意味する。例えば、バイオルミネセント細菌のルミネセンス生成反応には、フラビンレダクターゼ酵素によるフラビンモノヌクレオチド基（ＦＭＮ）の還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２）への還元が含まれる。次いで、還元型フラビンモノヌクレオチド（基質）は酸素（アクチベータ）及び細菌ルシフェラーゼと反応して中間体ペルオキシフラビンを形成し、この中間体ペルオキシフラビンは長鎖アルデヒドの存在下で反応を受けると光を発生する。この反応に関して、還元型フラビン及び長鎖アルデヒドは共に基質である。
【００３８】
本明細書中、バイオルミネセンス系（またはバイオルミネセンス発生系）は、バイオルミネセンス発生反応に必要な試薬の組合せを指す。すなわち、特定のルシフェラーゼ、ルシフェリン及び他の基質、溶媒並びにバイオルミネセント反応を完了するのに必要な他の試薬がバイオルミネセンス系を形成する。従って、バイオルミネセンス系（または同義的に、バイオルミネセンス発生系）は、適当な反応条件下でバイオルミネセンスを生ずる試薬の組合せを指す。適当な反応条件とは、バイオルミネセント反応を起こすのに必要な条件、例えばｐＨ、塩濃度及び温度を指す。一般的に、バイオルミネセンス系はバイオルミネセンス基質（ルシフェリン）、酵素ルシフェラーゼ及び発光タンパク質を含めたルシフェラーゼ、及び１つ以上のアクチベータを含む。特定のバイオルミネセンス系はルシフェラーゼの誘導元である特定生物を参照して同定され得る。例えば、Ｖａｒｇｕｌａ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａとも呼ばれる）バイオルミネセンス系（すなわち、Ｖａｒｇｕｌａ系）はＶａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、例えば貝虫Ｖａｒｇｕｌａから単離されたか組換え法により産生されたルシフェラーゼ、及び前記ルシフェラーゼの修飾体を含む。この系はまた、バイオルミネセント反応を完了するのに必要な特定アクチベータ、例えば酸素及び酸素の存在下でルシフェラーゼと反応して光を発生する基質を含む。
【００３９】
本明細書中、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨはそれぞれ、アデノシントリホスフェート、アデノシンモノホスフェート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）を指す。
【００４０】
本明細書中、「組換えＤＮＡ法を用いて組換え手段により産生」という表現は、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の公知の方法を用いることを意味する。
【００４１】
本明細書中、「物質と実質的に同一」という表現は、重要な特性が実質的に同一な物質が当該物質の代わりに使用することができるように殆ど未変化であるほど十分に類似していることを意味する。
【００４２】
本明細書中、「実質的に純粋」とは、純度を評価するために当業者が使用する標準の分析方法、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定したときに容易に検出され得る不純物がないと見えるほどに十分に均質であること、または更に精製しても物質の物理的及び化学的性質、例えば酵素活性及び生物学的活性の変化が検出できないほどに十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を精製するための化合物の精製方法は当業者に公知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体の混合物であってもよい。その場合、更に精製すると化合物の特定活性が上昇し得る。
【００４３】
本明細書中、核酸の２つの配列を指すときに均等とは、当該２つの配列がアミノ酸または均等タンパク質の同じ配列をコードすることを意味する。２つのタンパク質またはペプチドを指すときに「均等」を使用するとき、均等とは、２つのタンパク質またはペプチドがタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させない同類置換（例えば、下記表２参照）のみを有する実質的に同一のアミノ酸配列を有することを意味する。均等を性質について指すとき、性質が同程度である必要はないが（例えば、同一種の酵素活性に関して２つのペプチドは異なる活性度を示し得る）、活性は実質的に同一であることが好ましい。２つのヌクレオチド配列を指すときに「相補的」とは、ヌクレオチドの２つの配列が好ましくは２５％未満で、より好ましくは１５％未満で、更に好ましくは５％未満で、最も好ましくは０％のヌクレンチド間誤対合でハイブリダイズすることができることを意味する。好ましくは、２つの分子は高緊縮条件でハイブリダイズする。
【００４４】
本明細書中、誤対合％を測定するときのハイブリダイゼーションの緊縮度は次の通りである。
１）高緊縮度：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２）中緊縮度：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３）低緊縮度：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
均等の緊縮度は別の緩衝液、塩及び温度を用いても達成され得ることは理解されよう。
【００４５】
本明細書中、ペプチド核酸は、リボース−ホスフェート骨格がアミド結合により保持されている骨格で置換された核酸アナログを指す。
【００４６】
用語「実質的」とは、当業者が理解するように状況により変わり、通常少なくとも７０％、好ましくは少なくと８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を意味する。
【００４７】
本明細書中、生物学的活性は、化合物のインビボ活性、または化合物、組成物または他の混合物を投与したときに生ずる生理学的応答を指す。生物学的活性は該活性を試験または使用するために設計されたインビトロシステムで認められ得る。従って、本発明の目的では、ルシフェラーゼの生物学的活性はそのオキシゲナーゼ活性であり、この活性により基質が酸化すると光を発する。
【００４８】
本明細書中、組成物は任意の混合物を指す。組成物は水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、液体、粉末、ペーストまたはその組合せであり得る。
【００４９】
本明細書中、組合せとは２つもしくはそれ以上のアイテムの結合を指す。
【００５０】
本明細書中、流体は流動することができる任意の組成を指す。従って、流体には半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態の組成物及び他の組成物が含まれる。
【００５１】
本明細書中、マクロ分子には、診断アッセイ用固体支持体に結合するすべての分子が包括的に包含される。前記マクロ分子には、タンパク質、有機分子、核酸、ウィルス、ウィルスカプシド、ファージ、細胞もしくはその膜、その一部が含まれるが、これらに限定されない。本発明では重要なアナライトに特異的に結合するマクロ分子が特に興味深い。重要なアナライトは体液及び他の生物学的サンプル中に存在するものである。
【００５２】
本明細書中、レセプターは所与のリガンドに対して親和性を有する分子を指す。レセプターは天然に存在する分子でも合成分子でもよい。レセプターは当業界では抗リガンドとも呼ばれる。本明細書中、レセプター及び抗リガンドは互換可能に使用される。レセプターはその未変化状態でまたは他の種との凝集体として使用され得る。レセプターは結合メンバーに対して直接的にまたは特定結合物質もしくはリンカーを介して間接的に共有的もしくは非共有的に結合し得るか、または物理的に接触し得る。レセプターの例には、抗体、細胞膜レセプター、表面レセプター、内在化レセプター、モノクローナル抗体及び（例えばウィルス、細胞または他の材料上の）特異的抗原決定基と反応性の抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、多糖類、細胞、細胞膜及び細胞小器官が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
レセプター及びそのレセプターを用いる用途の例は次の通りであるが、これらに限定されない。
ａ）酵素：抗生（リガンド）選択のための標的として使用され得る、微生物の生存に必須の特定輸送タンパク質または酵素。
ｂ）抗体：当該抗原のエピトープと結合する抗体分子上のリガンド結合部位の同定が研究され得る。抗原エピトープに模擬の配列が決定されると、免疫原が前記配列の１つ以上に基づくワクチンが開発され得、または自己免疫疾患に対するような治療に有用な関連診断薬または化合物が開発され得る。
ｃ）核酸：例えばタンパク質またはＲＮＡのようなリガンドの結合部位の同定。
ｄ）触媒ポリペプチド：１つ以上の反応物質の１つ以上の生成物への変換を含む化学反応を促進し得るポリマー、好ましくはポリペプチド。前記ポリペプチドは通常少なくとも１つの反応物質または反応中間体に対して特異的な結合部位及び前記結合部位に近い、結合した反応物質を化学的に修飾し得る活性官能基を含む（例えば、米国特許第５，２１５，８９９号明細書参照）。
ｅ）ホルモンレセプター：レセプターに対して高い親和性で結合するリガンドの決定はホルモン置換療法の開発に有用である。例えば、前記レセプターに結合するリガンドが同定されると、血圧をコントロールする薬物が開発され得る。
ｆ）アヘン剤レセプター：脳中のアヘン剤レセプターに結合するリガンドの決定はモルヒネまたは関連薬物にかわる低中毒性薬物の開発に有用である。
【００５４】
本明細書中、抗体は、Ｆａｂ断片のような軽鎖及び重鎖の可変領域を含む抗体断片を含む。
【００５５】
本明細書中、相補性とはレガンド分子及びそのレセプターの表面と相互作用するトポロジー的和合性または対合性を指す。よって、レセプター及びそのリガンドは相補的と記載され、更に接触表面特性は互いに相補的である。
【００５６】
本明細書中、リガンド−レセプター対または複合体は、複合体を形成するために２つのマクロ分子が分子認識を介して結合したときに形成される。
【００５７】
本明細書中、エピトープは、抗体として公知のレセプータのサブクラスとの相互作用領域により規定される抗原分子の部分である。
【００５８】
本明細書中、リガンドは、特定レセプターにより特異的に認識される分子を指す。リガンドの例には、細胞膜レセプターに対するアゴニスト及びアンタゴニスト、毒素及び毒液、ウィルスエピトープ、ホルモン（例えば、ステロイド）、ホルモンレセプター、アヘン剤、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライド、タンパク質及びモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書中、抗リガンド（ＡＬ．ｓｕｂ．ｉ）：抗リガンドは所与リガンドに対する親和性が既知か未知の分子であり、表面の所定領域上に固定化され得る。抗リガンドは天然に存在する分子または合成分子であり得る。また、抗リガンドはその未変化状態でまたは他の種との凝集体として使用され得る。抗リガンドは結合メンバーに対して直接的にまたは特定結合物質を介して共有的もしくは非共有的に可逆的に結合され得る。「可逆的に結合」とは、抗リガンド（または特定の結合メンバーまたはリガンド）の結合が可逆的であり、従って実質的に非ゼロ可逆的、すなわち非結合割合を有することを意味する。前記した可逆的結合は、静電力、ファン・デル・ワールス力、疎水性（すなわち、エントロピー）力等のような非共有相互作用により生じ得る。また、可逆的結合は全てではなく一部は共有結合反応によっても生じ得る。例には、ヘミアセタール、ヘミケタール、イミン、アセタール、ケタール等の形成による結合が含まれる（援用により本明細書に含まれるとするＭｏｒｒｉｓｏｎら，“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第２版，１９章（１９６６）参照）が、これらに限定されない。本発明の方法及びデバイスに使用され得る抗リガンドの例には、細胞膜レセプター、モノクローナル抗体、（例えばウィルス、細胞または他の材料上の）特定抗原決定基と反応性の抗血清、ホルモン、薬物、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド核酸、酵素、基質、補因子、レクチン、糖、オリゴサッカライド、細胞、細胞膜及び細胞器官が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書中、基質は、直接または適当な誘導化後化学合成、アッセイ及び他の方法のための固体支持体として使用されるマトリックスを指す。本発明の好ましい基質はシリコン表面、または抗リガンド、リガンド、及び蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質や他の放射シフト剤を含めた他のマクロ分子の結合のために意図された表面上で誘導化されたシリコン処理基質である。
【００６１】
本明細書中、マトリックスは、重要な分子、典型的には生物学的分子、マクロ分子、有機分子または生物特異的リガンドが結合または接触する固体、半固体もしくは不溶性支持体を指す。通常、マトリックスは剛性または半剛性表面を有する基質材料である。多くの実施態様では基質の少なくとも１表面が実質的に平坦であるが、幾つかの実施態様では例えばウェル、一段高い領域、エッチングされた溝または他のトポロジーを用いて各種ポリマーにする合成領域を物理的に離すことが望ましい場合もある。マトリックス材料には、化学的及び生物学的分子合成のためのアフィニティーマトリックスまたは支持体として使用される材料が含まれる。その例には、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石、ポリテトラフルオロエチレン、アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール(buckyballs)、ポリアクリルアミド、珪そう土−ポリアクリルアミド非共有コンポジット、ポリスチレン−ポリアクリルアミド共有コンポジット、ポリスチレン−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）コンポジット、シリコン、ゴム、及び固相合成、アフィニティー分離及び精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイ及び他の用途のための支持体として使用される他の材料が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書、結合層は分子が結合しているチップデバイスの表面を指す。通常、チップは半導体デバイスであり、分子の結合のために適し且つデバイスがさらされる反応に対して不活性となるように表面の少なくとも一部の上に被覆されている。分子は表面に直接的もしくは間接的に結合し、結合は共有結合、イオン相互作用または他の相互作用を介する吸収または吸着により起こり得る。必要ならば、結合層は例えば分子の結合のために誘導化することにより適合される。
【００６３】
Ｂ．バイオルミネセンス発生系
バイオルミネセンス発生系は、バイオルミネセンスを発生するために必要且つ十分な諸成分を指す。これらの成分にはルシフェラーゼ、ルシフェリン及び必要な補因子または条件が含まれる。実際上当業者に公知のバイオルミネセンス発生系が本発明で提供される装置、システム、組合せ及び方法において使用できる。バイオルミネセンス発生系を選択するときに考慮される因子には、バイオルミネセンスと一緒に使用される所望のアッセイ及び生物学的流体、反応を行う媒体、成分の安定性（例えば、温度またはｐＨ感受性）、成分の貯蔵寿命、連続的または断続的にかかわらず発光の持続性、成分の入手可能性、所望の光度及び他の因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
１．一般的記載
一般に、バイオルミネセンスは特定の化学基質のルシフェリンがルシフェラーゼ酵素により触媒されて酸化を受けるエネルギー生成化学反応を指す。バイオルミネセント反応は、該反応を継続または再開させるために消耗したルシフェリンまたは他の基質、補因子または他のタンパク質を補充するだけで簡単に維持される。バイオルミネセンス発生反応は当業者に公知であり、こうした反応は本発明で提供される装置、システム及び方法で一緒に使用するために適応され得る。
【００６５】
バイオルミネセンス発生系の生物及びソースは多数あり、幾つかの代表的なバイオルミネセンスを示す属及び種を下表に示す（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｏｏｋ，  Ｎ．Ｓｐｅｒｅｌａｋｉｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．６６５−６８１（１９９５）中のＨａｓｔｉｎｇｓから一部複製した）。
【００６６】
【表１】
2006145545.tif 000002
2006145545.tif 000003
【００６７】
本発明のバイオルミネセンス発生系のソースとしての使用が考えられる他のバイオルミネセント生物にはＧｏｎａｄｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｇａｕｓｓｉａ、Ｈａｌｉｓｔｕｒｉａ、Ｖａｍｐｉｒｅイカ、Ｇｌｙｐｈｕｓ、Ｍｙｃｏｔｏｐｈｉｄｓ（魚）、Ｖｉｎｃｉｇｕｅｒｒｉａ、Ｈｏｗｅｌｌａ、Ｆｌｏｒｅｎｃｉｅｌｌａ、Ｃｈａｕｄｉｏｄｕｓ（ホウライエソ）、Ｍａｌａｎｏｃｏｓｔｕｓ、Ｐａｒａｃａｎｔｈｕｓ、Ａｔｏｌｌａ（ムラサキカムリクラゲ）、Ｐｅｌａｇｉａ（オキクラゲ）、Ｐｉｔｉｌｏｃａｒｐｕｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｒａ（トゲノリ）、Ｓｉｐｈｏｎｏｐｈｏｒｅ（ギボシヤスデ）、Ｐｅｒｉｐｈｙｌｌａ（クロカムリクラゲ）及びウミエラ（Ｓｔｙｌａｔａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
バイオルミネセンス発生系は、例えば上表に示したような天然ソースから単離され得るか、または合成され得る。また、本発明で使用するためには、成分はその混合物が適切な条件下でグローを生成するように十分純粋でさえあればよい。従って、幾つかの実施態様では、粗な抽出物または生成物を単に砕いたものでも十分であり得る。しかしながら、実質的に純粋な成分が通常使用され、所要により正確な純度を実験的に求めることができる。また、成分が天然ソースから単離されない合成成分であってもよい。ルシフェラーゼをコードするＤＮＡが利用され得（例えば、配列番号１〜１３参照）、修飾され（例えば、配列番号３及び１０〜１３）、及び合成代替基質が案出された。本明細書には、利用可能なルシフェラーゼをコードするＤＮＡの代表例の一部が記載されているにすぎない。
【００６９】
合成されるかまたは本明細書の表１等に記載または当業者に公知の天然ソースから単離されるかのいずれにせよ、任意のバイオルミネセンス発生系が本発明で提供されるチップデバイス、組合せ、システム及び方法において使用される。オキシゲナーゼ（ルシフェラーゼ）を利用しないケミカルルミネセンス系それ自体は本発明に包含されない。
【００７０】
ａ．ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼは、バイオルミネセンス基質（ルシフェリン）が低エネルギーに戻ったときに発光するような低エネルギー状態〜高エネルギー状態の遊離もしくは結合分子状酸素の存在下での前記基質の酸化を所要のアクチベータの存在下で触媒する化合物を指す。本発明の目的において、ルシフェラーゼは、触媒的に作用して基質の酸化により光を発生する酵素、及び（発光タンパク質が反応中に消耗しないので）厳密には触媒的ではないが酸素の存在下で基質と一緒になって作用して光を発生する発光タンパク質、例えばエクオリンを包含するように広義に使用される。エクオリンのような発光タンパク質を含めたルシフェラーゼが本発明のルシフェラーゼの中に含まれる。上記反応物質には、発光タンパク質を含めた天然に存在するルシフェラーゼ、組換えＤＮＡにより産生されるタンパク質、及び適当な基質、補因子及びアクチベータの存在下で光を発生する能力を保持する前記タンパク質の突然変異体もしくは修飾変異体、または基質を酸化して光を発生させるための触媒として作用する他のタンパク質が含まれる。
【００７１】
包括的に、バイオルミネセント反応を触媒または開始するタンパク質をルシフェラーゼと称し、酸化され得る基質をルシフェランと称する。酸化された反応生成物をオキシルシフェリン、或るルシフェリン前駆体をエチオルシフェリンと称する。従って、本発明の目的のために、バイオルミネセンスには、生物学的タンパク質、またはそのアナログ、誘導体もしくは突然変異体により（酵素的に作用するルシフェラーゼの場合には）触媒され、（反応により再生されない発光タンパク質、例えばエクオリンの場合には）開始される反応により生ずる光が包含される。
【００７２】
明瞭にするために、上記した触媒タンパク質をルシフェラーゼと称し、その中にはルシフェリンの酸化を触媒して光を発し、オキシルシフェリンを放出するルシフェラーゼのような酵素が含まれる。また、ルシフェラーゼの中には、ルシフェリンの酸化を触媒して光を発するが反応中に変化し、再使用するためには再構築されなければならない発光タンパク質も含まれる。ルシフェラーゼは天然に存在するものでも、特定の性質を改良または変更するために例えば遺伝子工学により修飾したものであってもよい。生じた分子がバイオルミネセント反応を触媒する能力を保持している限り、こうした分子も本発明に包含される。
【００７３】
ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質（分子状酸素の存在下での基質の酸化を触媒して本明細書に定義する光を生ずるタンパク質）を本発明で使用することができる。好ましいルシフェラーゼは、本明細書に記載されているものまたはマイナーな配列変化を有するものである。前記したマイナーな配列変化には、マイナー対立遺伝子もしくは種変化、及び残基、特にシステイン残基の挿入もしくは欠失が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸の適当な同類置換は当業者に公知であり、通常生じる分子の生物学的活性を変更することなく実施し得る。当業者は認識しているように、一般的にポリペプチドの非必須領域中の単一アミノ酸置換により生物学的活性は実質的に変化しない（例えば、Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，第４版，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．ｃｏ．（１９８７），ｐ．２２４参照）。前記置換は好ましくは下表２に示す置換に従って実施される。
【００７４】
【表２】
2006145545.tif 000004
【００７５】
他の置換も許容され得、実験的にまたは公知の同族置換に従って決定され得る。前記したポリペプチドの修飾は当業者に公知の方法により実施され得る。
【００７６】
ルシフェラーゼは市販されているか、天然ソースから単離、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを用いて宿主細胞中で発現、または当業者に公知の方法で得ることができる。本発明の目的のために、特定のソース生物を砕いて得られる粗抽出物で十分である。大量のルシフェラーゼが所望されるので、宿主細胞からルシフェラーゼを単離することが好ましい。前記した目的のＤＮＡはその修飾形態と同様に広く利用され得る。
【００７７】
ルシフェラーゼの例には、有櫛動物Ｍｎｅｍｉｏｐｓｉｓ（ムネミンプシン）及びＢｅｒｏｅ  ｏｖａｔａ（ベロビン）から単離されたルシフェラーゼ、腔腸動物Ａｅｑｕｏｒｅａ（エクオリン）、Ｏｂｅｌｉａ（オベリン）、Ｐｅｌａｇｉａから単離されたルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、軟体動物Ｐｈｏｌａｓ（フォラシン）から単離されたルシフェラーゼ、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ及びＰｏｒｉｃｈｔｈｙｓ魚並びに貝虫、例えばＣｙｐｒｉｄｉｎａ（Ｖａｒｇｕｌａとも呼ばれる）から単離されるルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用するための好ましいルシフェラーゼはエクオリンタンパク質、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びＣｙｐｒｉｄｉｎａ（Ｖａｒｇｕｌａとも呼ばれる）ルシフェラーゼ（例えば、配列番号１、２及び４〜１３参照）である。また、反応して赤色光及び／または近赤外光を生じるルシフェラーゼも好ましい。これらには、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ（例えば、Ａ．ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｓ）、Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、Ｍａｌａｃｏｓｔｅｕｓ（例えば、Ｍ．ｎｉｇｅｒ）の種に存在するルシフェラーゼが含まれる。
【００７８】
ｂ．ルシフェリン
前記反応のための基質には、ルシフェラーゼと反応して光を生ずる任意の分子が含まれる。前記分子には、天然に存在する基質、その修飾形態及び合成基質（例えば、米国特許第５，３７４，５３４及び同第５，０９８，８２８号明細書参照）が含まれる。例示のルシフェリンには、本明細書に記載のルシフェリン及びその誘導体、そのアナログ、合成基質、例えばジオキセタン（例えば、米国特許第５，００４，５６５号明細書及び同第５，４５５，３５７号明細書参照）、及び光発生反応においてルシフェラーゼにより酸化される他の化合物（例えば、米国特許第５，３７４，５３４号明細書；同第５，０９８，８２８号明細書及び同第４，９５０，５８８号明細書参照）が含まれる。前記基質は、バイオルミネセント反応において酸化される化合物を選択することにより実験的に同定され得る。
【００７９】
ｃ．アクチベータ
バイオルミネセンス発生系は、本明細書に記載されており、当業者に公知の追加成分をも必要とする。バイオルミネセント反応はすべて溶存もしくは結合酸素形態の分子状酸素を必要とする。従って、水中に溶解しているか、空気中、または発光タンパク質に結合している分子状酸素がバイオルミネセント反応に対するアクチベータである。成分の形態に応じて、他のアクチベータにはＡＴＰ（ホタルルシフェラーゼに対して）、ＦＭＮからＦＭＮＨ２を再生するためのフラビンレダクターゼ（細菌系に対して）、またはＣａ２＋及び他の適当な金属イオン（エクオリン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明で提供される系の多くは、ルシフェラーゼ及びルシフェリンを混合し、空気または水にさらしたときに光を発生する。しかしながら、結合酸素を有する発光タンパク質、例えばエクオリンを使用する系では、カルシウム塩の水性組成物の形態で提供され得るＣａ２＋（または他の適当な金属イオン）に接触させなければならない。これらの場合、ルシフェラーゼ（エクオリン）及びルシフェリン（例えば、セレンテラジン）の混合物にＣａ２＋（または他の適当な金属イオン）を添加すると光が発生する。Ｒｅｎｉｌｌａ系及び他のＡｎｔｈｏｚｏａ系もＣａ２＋（または他の適当な金属イオン）を必要とする。
【００８１】
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ（シュリンプ）を砕いたものまたは粉砕ホタルのような粗調製物を使用する場合には、水のみを添加すればよい。ホタル（またはホタルもしくは甲虫ルシフェラーゼ）を使用する場合には、反応は追加のＡＴＰのみを必要とする。正確な成分は、本明細書の記載にてらして当業者には自明であり、実験で容易に決定され得る。
【００８２】
上記した混合物が反応を進めるために必要な追加の塩、緩衝成分またはイオンをも含むことは理解されよう。上記した反応は十分に特徴付けられているので、当業者は正確な割合及び必要な成分を決定することができる。成分の選択は、チップデバイス及びシステム、実施されるアッセイ及びルシフェラーゼに依存する。各種実施態様が本明細書に記載されており、例示されている。本明細書の記載にてらして、他の実施態様も自明である。
【００８３】
ｄ．反応
全ての実施態様において、バイオルミネセンス発生系の１つの成分以外の全部もしくはそれ未満の成分は、チップの適当な場所に直接もしくは間接的に結合されるか、またはアナライト、好ましくは感染性物質の存在が検出されるアレーの位置に固定化される。バイオルミネセンスが所望される場合、残りの成分はチップの表面に添加され、アレーの上記位置で生じた光はチップのフォトダイオードにより検出される。
【００８４】
一般に、本発明の目的のために達成すべき結果はチップのフォトダイオードにより検出され得るかまたは肉眼で見ることができる光を発生させることであるので、バイオルミネセント反応の成分の正確な比率及び量は厳密に決定または満たされなくてよい。それらは光を生成するのに十分であればよい。通常、容易に検出可能な信号または目に見えるグローを発生するのに十分な量のルシフェリン及びルシフェラーゼを使用する。この量は実験的に容易に決定され得、特定のシステム及び特定の用途に依存する。
【００８５】
本発明の目的のために、前記した量は好ましくは少なくとも当業者が分析目的で使用される濃度及び比率である。グローがチップ中のフォトダイオードにより検出するには十分に明るくないときには、より高濃度またはより長い集積時間が使用される。反応を使用する条件が実験室条件ではなく、成分が貯蔵されるので、活性の損失を解消するためにより高濃度が使用され得る。通常、前記量は反応混合物１リッターあたり１ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ、より好ましくは１００ｍｇのルシフェラーゼである。前記ルシフェラーゼは、各成分を少なくとも約０．０１ｍｇ／ｌ、通常０．１ｍｇ／ｌ、１ｍｇ／ｌ、１０ｍｇ／ｌ以上またはそれ以上含む組成物を乾燥して製造され得る。ルシフェリンの量も、約０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｌである。反応を継続させるために追加のルシフェリンが多くの反応に添加され得る。ルシフェラーゼが触媒的に作用し、再生させる必要がない実施態様では、より低量のルシフェラーゼを使用することができる。ルシフェラーゼが反応中に変化する実施態様では、ルシフェラーゼを補充することもできる。通常、より高濃度が選択される。各成分の濃度範囲（または、前記組成物を接触させて生ずる基板上の被覆量）としては、０．１〜２０ｍｇ／ｌのオーダー、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｌのオーダー、より好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｌのオーダーで十分である。本明細書に記載の被覆基板を使用する場合、より高濃度のルシフェラーゼまたはルシフェリンを含む被覆組成物を大量使用し得る。
【００８６】
従って、例えば、カルシウムの存在下で水１リッター中５ｍｇのルシフェリン、例えばセレンテラジンは、約１０ｍｇのルシフェラーゼ、例えばエクオリン発光タンパク質ルシフェラーゼまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを添加すると水の温度に依存して少なくとも１０〜２０分間明るく輝く。ルシフェラーゼの濃度を例えば１００ｍｇ／ｌまで上昇させると、特に輝く光ディスプレイが提供される。
【００８７】
所望により、バイオルミネセンス発生反応の阻害剤、例えばマグネシウムを添加するとバイオルミネセント反応の開始を遅らすことができる。また、阻害を所望しないときには、十分量のキレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を添加することにより遊離マグネシウムの濃度を低下させることができる。ＥＤＴＡ及びカルシウムの量は、所望のバイオルミネセンスを阻害または防止することなくマグネシウムを適切にキレートするために実験的に決定することができる。
【００８８】
使用される濃度及び量が選択されるルシフェラーゼ、所望の細菌標的、固定化抗リガンドにより吸収される光の濃度及び量、フォトダイオードアレーのサイズに依存し、これらは実験的に容易に決定され得ることは理解されよう。比率、特に実験的測定を始めるときに使用する比率は、通常分析目的に使用される比率であり、量または濃度は少なくとも分析目的に使用される量または濃度であるが、その量を特に持続的且つより明るいグローが所望されるときには増加させることができる。
【００８９】
２．クシクラゲ及び腔腸動物系
クシクラゲ、例えばＭｎｅｍｉｏｐｓｉｓ（ムネミオプシン）及びＢｅｒｏｅ  ｏｖａｔａ（ベロビン）並びに腔腸動物、例えばＡｅｑｕｏｒｅａ（エクオリン）、Ｏｂｅｌｉａ（オベリン）及びＰｅｌａｇｉａは、類似の化学を用いてバイオルミネセント光を生ずる（例えば、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ６７８：６５−７５（１９８１）；Ｈａｒｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２０４−２２１０（１９７９）；米国特許出願第０８／０１７，１１６号に基づく国際出願公開ＷＯ９４／１８３４２号明細書；米国特許第５，４８６，５５号明細書及び本明細書に引用される他の参考資料及び特許参照）。Ａｅｑｕｏｒｉｎ系及びＲｕｎｉｌｌａ系が代表的であり、現在好ましい系の中の例として本明細書に詳細に記載する。Ａｅｑｕｏｒｉｎ及びＲｕｎｉｌｌａ系は同じルシフェリンを使用し得、同じ化学を用いて光を生じ得るが、各ルシフェラーゼは異なる。Ａｅｑｕｏｒｉｎルシフェラーゼのエクオリン及び例えばルシフェラーゼムネミンプシン及びベロビンは、結合酸素及び結合ルシフェリンを含み、反応を誘発させるためにＣａ２＋（または他の適当な金属イオン）を必要とし、繰り返し使用するために再生されなければならない発光タンパク質である。一方、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、反応中に変化を受けず、溶存分子状酸素を必要とするので真の酵素として作用する。
【００９０】
ａ．エクオリン系
エクオリン系は公知である（例えば、Ｔｓｕｊｉら，“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｅｑｕｏｒｉｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１０７−８１１１（１９８６）；Ｐｒａｓｈｅｒら，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  Ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ａｅｑｕｏｒｉｎ，ａ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １２６：１２５９−１２６８（１９８５）；Ｐｒａｓｈｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：２８８−２９７（１９８６）；Ｐｒａｓｈｅｒら，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ａｅｑｕｏｒｉｎ  Ｉｓｏｔｙｐｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２６−１３３２（１９８７）；Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら，“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｅｑｕｏｒｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６７６２−６７７１（１９８５）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，“Ｒｅｓｉｓｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ａｅｑｕｏｒｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  １９９：８２５−８２８（１９８１）；Ｉｎｏｕｙｅら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０５：４７３−４７７（１９８９）；Ｉｎｏｕｙｅら，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｏａｅｑｕｏｒｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：８４２５−８４２９（１９８６）；Ｉｎｏｕｙｅら，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｅｑｕｏｒｉｎ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３１５４−３１５８（１９８５）；Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔら，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｅｑｕｏｒｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｆｏｒｓｋａｌｅｓ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １７：３４４８−３４５３（１９７８）；欧州特許出願公開第０５４００６４号；同第０２２６９７９号；同第０２４５０９３号；欧州特許第０２４５０９３号明細書；米国特許第５，０９３，２４０号明細書；同第５，３６０，７２８号明細書；同第５，１３９，９３７号明細書；同第５，４２２，２６６号明細書；同第５，０２３，１８１号明細書；同第５，１６２，２２７号明細書；及びアポタンパク質をコードするＤＮＡを記載している配列番号５〜１３参照；並びに米国特許第５，１６２，２２７号明細書，欧州特許出願公開第０５４００６４号明細書及びＳｅａｌｉｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．３（１９９４）に記載されている形態はＡＱＵＡＬＩＴＥ（登録商標）としてジョージア州ボガートに所在のＳｅａｌｉｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている）。
【００９１】
この系は本発明で使用するための好ましい系の１つである。自明のようにエクオリン発光タンパク質は非共有結合ルシフェリン及び分子状酸素を含むので、この形態を凍結乾燥粉末または選択送達ベヒクル中のカプセルとして貯蔵するのが適当である。系はペレット、例えばリポソームまたは他の送達ベヒクル中にカプセル化され得るか、または単一チャンバまたは２つもしくはそれ以上のチャンバを有するアンプル中に貯蔵され得る。使用する場合、発光タンパク質は抗リガンドに複合化し、アレーの特定位置に結合し、Ｃａ２＋（または他の適当な金属イオン）を含有する組成物、場合によっては水道水と接触させて、アレーの特定位置で輝く混合物を作成する。光はチップ中のフォトダイオードにより検出され、データ信号は関連コンピュータープロセッサーにより分析される。この系は本明細書の各種実施態様で使用するために好ましい。
【００９２】
（１）エクオリン及び関連発光タンパク質
刺胞動物Ａｅｑｕｏｒｅａから単離された発光タンパク質のエクオリンは、Ｃａ２＋（または他の適当な金属イオン）を添加すると発光する。結合ルシフェリンとＣａ２＋により遊離される結合酸素を含むエクオリン発光タンパク質は溶存酸素を必要としない。ルミネセンスはカルシウムにより誘発され、酸素を遊離し、ルシフェリン基質はアポエクオリンを生成する。
【００９３】
バイオルミネセンス発光タンパク質のエクオリンは刺胞動物Ａｅｑｕｏｒｅａの多数の種から単離される。これは２２キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有するペプチド複合体である（例えば、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５９：２３３−２３８（１９６２）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：３９９１−３９９７（１９６９）；Ｋｏｈａｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０：４１４９−４１５２（１９７１）；及びＳｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１６０２−１６０８（１９７２）参照）。天然タンパク質は酸素及びこの酸素に非共有結合したヘテロ環式化合物セレンテラジンのルシフェリン（以下参照）を含む。このタンパク質は３つのカルシウム結合サイトを含む。発光タンパク質に微量のＣａ２＋（または他の適当な金属イオン）を添加すると、タンパク質結合酸素を用いて結合セレンテラジンの酸化を触媒する立体配座変化を受ける。この酸化からのエネルギーが４６９ｎｍに集中する青色光のフラッシュとして放出される。酸化反応を誘発させるには１０−６Ｍ程度の低濃度のカルシウムイオンで十分である。
【００９４】
天然に存在するアポエクオリンは単一化合物ではなく、むしろミクロ不均一分子種の混合物である。Ａｅｑｕｏｒｉａ刺胞動物抽出物は、１２種ほど多くのタンパク質を含む（例えば、Ｐｒａｓｈｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２６−１３３２（１８７）；Ｂｌｉｎｋｓら，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．  ３４：４７４（１９７５）参照）。多数の形態をコードするＤＮＡが単離された（例えば、配列番号５〜９及び１３参照）。
【００９５】
発光タンパク質は、大腸菌中で組換え技術により産生されたタンパク質のようなアポタンパク質を酸素及び２−メルカプトエタノールのような還元剤（例えば、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：２３６−２３８（１９７５）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊ．  １９９：８２５−８２８（１９８１）参照）の存在下、及び所望するまで酸化反応の誘発を防止するためにＣａ２＋を拘束するＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ（本発明での使用に対しては約５〜約１００ｍＭ、またはそれ以上の濃度）の存在下でセレンテラジン、例えば合成セレンテラジンと組合わせることにより再構築され得る（例えば、米国特許第５，０２３，１８１号明細書）。再構築のために２−メルカプトエタノールを必要としない修飾アポタンパク質をコードするＤＮＡも利用され得る（例えば、米国特許第５，０９３，２４０号明細書）。再構築された発光タンパク質は市販されており（例えば、ＡＱＵＡＬＩＴＥ（登録商標）の商品名で市販されており、米国特許第５，１６２，２２７号明細書に記載されている。
【００９６】
光反応は、キレート剤の影響を解消し、１０−６Ｍ濃度を達成するのに十分な濃度のＣａ２＋を添加することにより誘発される。本発明の方法で使用するためにはこのような低濃度のＣａ２＋が反応を誘発し得るので、高濃度のキレート剤を発光タンパク質の組成物中に含めることができる。従って、カルシウムの形態で添加されるより高濃度のＣａ２＋が必要である。正確な量は実験的に決定され得る。本発明で使用する場合、濃縮組成物の形態または凍結乾燥もしくは粉末形態で提供される発光タンパク質に水を添加するだけで十分である。従って、本発明の目的では、殆どの水道水、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）または他の適当な緩衝液、または皮膚上の水分中に存在するような少量のＣａ２＋を添加してバイオルミネセント反応を誘発すべきである。
【００９７】
多数のイソ型のエクオリンアポタンパク質が単離され、同定された。これらのタンパク質をコードするＤＮＡをクローン化し、タンパク質及びその修飾型を適当な宿主細胞を用いて産生した（例えば、米国特許第５，１６２，２２７号明細書、同第５，３６０，７２８号明細書、同第５，０９３，２４０号明細書参照；またＰｒａｓｈｅｒら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  １２６：１２５９−１２６８（１９８５）；Ｉｎｏｕｙｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：８４２５−８４２９（１９８６）；米国特許第５，０９３，２４０号明細書、同第５，３６０，７２８号明細書、同第５，１３９，９３７号明細書、同第５，２８８，６２３号明細書、同第５，４２２，２６６号明細書、同第５，１６２，２２７号明細書及びアポタンパク質をコードするＤＮＡを記載している配列番号５〜１３も参照；形態はＡＱＵＡＬＩＴＥ（登録商標）としてジョージア州ボガートに所在のＳｅａｌｉｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている）。アポエクアリンをコードするＤＮＡまたはその変異型は高量のアポタンパク質を組換え産生するために有用である。ルシフェリンセレンテラジン、好ましくはその硫酸化誘導体、またはそのアナログ及び分子状酸素を添加すると発光タンパク質が再構築される（例えば、米国特許第５，０２３，１８１号明細書参照）。アポタンパク質と発光タンパク質及びバイオルミネセンス発生反応の他の成分を特性な条件下で混合して、発光タンパク質を再生し、付随して発光タンパク質は光を生ずることができる。下記するような還元剤を必要としないように設計されている変異型を除いて、再構築にはメルカプトエタノールのような還元剤の存在を必要とする（例えば、米国特許第５，０９３，２４０号明細書参照）。
【００９８】
本発明の使用のためには、エクオリンをＤＮＡ、例えば配列番号５〜１３に記載されていたり当業者に公知のＤＮＡまたはその変異型を用いて産生することが好ましい。エクオリンをコードするＤＮＡを大腸菌のような宿主細胞において発現し、単離し、再構築して発光タンパク質を産生する（例えば、米国特許第５，４１８，１５５号明細書、同５，２９２，６５８号明細書、同５，３６０，７２８号明細書、同５，４２２，２６６号明細書、同５，１６２，２２７号明細書参照）。
【００９９】
本発明において興味深いものは、バイオルミネセント活性が未修飾型のアポエクオリンよりも高いように修飾されたアポタンパク質である（例えば、米国特許第５，３６０，７２８号明細書、配列番号１０〜１２参照）。未修飾型アポエクオリンよりも高いバイオルミネセント活性を示す修飾型には、アスパルテート１２４、グルタメート１３５及びグリシン１２９がそれぞれセリン、セリン及びアラニンに変っている配列番号１０〜１２に記載の配列を有するタンパク質が含まれる。高いバイオルミネセンスを有する他の修飾型も入手可能である。
【０１００】
本明細書に記載の特定実施態様において使用するために、アポタンパク質とエクオリンバイオルミネセンス発生系の他の成分を混合物としてパッケージされるかまたは提供され、その混合物は所望のときにアポタンパク質、ルシフェリン及び酸素から発光タンパク質を再構築する条件にかけられる（例えば、米国特許第５，０２３，１８１号明細書及び同５，０９３，２４０号明細書参照）。特に好ましいのは、再構築のために２−メルカプトエタノールのような還元剤を必要としないアポタンパク質の形態である。これらの形態は例えば米国特許第５，０９３，２４０号明細書（例えば、Ｔｓｕｊｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８３：８１０７−８１１１（１９８６）参照）に記載されており、１つ以上、好ましくは全ての３つのシステイン残基を例えばセリンで置換することにより修飾されている。置換は、例えば配列番号５に記載されているようなエクオリンアポタンパク質をコードするＤＮＡを修飾し、シスインコドンをセリンで置換することによりなし得る。
【０１０１】
発光タンパク質及び関連種、例えばＯｂｅｌｉａ由来のルシフェラーゼも本発明のために使用される。ハイドロイドｐｏｌｙｐ  Ｏｂｅｌｉａ  ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ由来のＣａ２＋−活性化オベリンをコードするＤＮＡは公知であり、入手可能である（例えば、Ｉｌｌａｒｉｏｎｏｖら，Ｇｅｎｅ  １５３：２７３−２７４（１９９５）及びＢｏｎｄａｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３１：２９−３２（１９９５）参照）。この発光タンパク質はＭｎ２＋によっても活性化され得る（例えば、Ｖｙｓｏｔｓｋｉら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３１６：９２−９３（１９９５）；Ｖｙｓｏｔｓｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．  ８：３０１−３０５（１９９３）参照）。
【０１０２】
通常、本発明の使用のためにバイオルミネセンス成分は反応を誘発するためには不十分な金属イオンしか存在しないようにパッケージまたは提供される。使用に際し、微量の誘発金属イオン、特にＣａ２＋を他の成分と接触させる。グローをより持続させるためには、エクオリンを連続的に再構築させるか、添加するか、または高過剰で提供することができる。
【０１０３】
（２）ルシフェリン
エクオリンルシフェリンはセレンテラジン及びそのアナログであり、下記構造（式(I)）を有する分子または活性を有する他のアナログが含まれる。
【０１０４】
【化１】
2006145545.tif 000005
上記式中、Ｒ１はＣＨ２Ｃ６Ｈ５またはＣＨ３、Ｒ２はＣ６Ｈ５、Ｒ３はｐ−Ｃ６Ｈ４ＯＨまたはＣＨ３である。好ましいセレンテラジンは、Ｒ１がｐ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ、Ｒ２がＣ６Ｈ５、Ｒ３はｐ−Ｃ６Ｈ４ＯＨの構造を有するものであり、公知の方法により製造され得る（例えば、Ｉｎｏｕｙｅら，Ｊａｐ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｔｔｒｓ．  ｐｐ．１４１−１４４（１９７５）及びＨａｌｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２０４−２２１０（１９７９）参照）。好ましいセレンテラジンは下記構造（式(II)）を有するもの及びその硫酸化誘導体である。
【０１０５】
【化２】
2006145545.tif 000006
【０１０６】
エクオリン発光タンパク質に結合しているセレンテラジンと結合酸素とのＣａ２＋の存在下での反応は、次のように表すことができる。
【０１０７】
【化３】
2006145545.tif 000007
【０１０８】
発光タンパク質エクオリン（セレンテレートルシフェリン分子に結合したアポタンパク質を含む）及び以下に記載するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは同じセレンテレートルシフェリンを使用することができる。エクオリン発光タンパク質はセレンテトレートルシフェリン（セレンテラジン）のオキシルシフェリン（セレンテラミド）への酸化を触媒し、付随して青色光（λｍａｘ＝４６９ｎｍ）を生ずる。
【０１０９】
重要なことは、セレンテレートルシフェリンの硫酸塩誘導体（ラウリル−ルシフェリン）は水中で特に安定であり、よってセレンテレート様バイオルミネセンス発生系において使用できる。この系において、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）及びサルファ−キナーゼがセレンテラジンを硫酸化形態に変換するために使用される。次いで、スルファターゼを使用してラウリル−ルシフェリンを天然のセレンテラジンに再変換する。このように、より安定なラウリル−ルシフェリンがイルミネーションを施すべきアイテムにおいて使用され、イルミネーションが所望されるときにルシフェリン混合物にルシフェラーゼとスルファターゼが添加される。
【０１１０】
従って、Ａｅｑｕｏｒｅａのバイオルミネセンス発生系は本発明の方法及び装置に使用するのに特に適している。特定量及び成分を提供する方法は選択されるアッセイ、ルシフェラーゼ及び抗リガンドに依存する。この系はＣａ２＋を添加すると輝く凍結乾燥形態で提供され得る。この系は好ましくは反応の誘発を防止するために十分量のキレート剤の存在下で、カプセル化されるか、多孔質ガラスのようなマトリックスに結合されるか、または溶液もしくは懸濁液のような組成物であってもよい。エクオリン発光タンパク質の濃度は変わり、実験的に決定され得る。典型的には、少なくとも０．１ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｌ及びそれ以上の濃度が選択される。特定実施態様では、特定容量中に１〜１０ｍｇのルシフェリン／１００ｍｇのルシフェラーゼが使用され、所望の濃度で使用される。
【０１１１】
ｂ．Ｒｅｎｉｌｌａ系
セレンテレート系の代表例がＲｅｎｉｌｌａ系である。ウミシイタケとしても知られるＲｅｎｉｌｌａは腔腸動物の花虫網に属し、この属にはＣａｖａｒｎｕｌａｒｉａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ、Ａｃａｎｔｈｏｐｔｉｌｕｍ及びＰａｒａｚｏａｎｔｈｕｓのような他のバイオルミネセント属が含まれる。花虫網属のバイオルミネセントメンバーは構造的に類似のルシフェリン及びルシフェラーゼを含む（例えば、Ｃｏｒｍｉｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８１：２９１−２９８（１９７３）参照；またＷａｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７２：２５３０−２５３４（１９７５）参照）。これらの花虫網の各々に由来するルシフェラーゼ及びルシフェリンは交差に反応して、特徴的な青色ルミネセンスを生ずる。
【０１１２】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、他のセレンテレート及びエクオリン発光タンパク質のようなクシクラゲルシフェラーゼはイミダゾピラジン基質、特に包括的にセレンテラジンと呼ばれる基質を使用する（例えば、上記式(I)及び(II)参照）。セレンテラジンを使用するルシフェラーゼを有する他の属には、Ｃｈｉｒｏｔｅｕｔｉｓ、Ｅｕｃｌｅｏｔｅｕｔｈｉｓ、Ｏｎｙｃｈｏｔｅｕｔｈｉｓ及びＷａｔａｓｅｎｉａのようなイカ、Ｓｅｐｉｏｌｉｎａのようなコウイカ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ、Ｓｅｒｇｅｓｔｅｓ及びＧｎａｔｈｏｐｈａｕｓｉａのようなシュリンプ、Ａｒｇｙｒｏｐｅｌｅｃｕｓ、Ｙａｒｅｌｌａ、Ｄｉａｐｈｕｓ及びＮｅｏｓｃｏｐｅｌｕｓのような深海魚が含まれる。
【０１１３】
しかしながら、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは結合酸素を有していないので、適当なルシフェリン基質の存在下で光を発するためには溶存酸素が必要である。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは真の酵素（すなわち、更なる使用のために再構築される必要がない）として作用するので、生じたルミネセンスは飽和レベルのルシフェリンの存在下で長く持続し得る。また、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは熱に対して比較的安定である。
【０１１４】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡの組換えルシフェラーゼを産生するための使用、並びに他のセレンテレート由来のルシフェラーゼをコードするＤＮＡは公知であり、入手可能である（例えば、配列番号１，米国特許第５，４１８，１５５号明細書及び同第５，２９２，６５８号明細書参照；またＰｒａｓｈｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  １２６：１２５９−１２６８（１９８５）；Ｃｏｒｍｉｅｒ，“Ｒｅｎｉｌｌａ  ａｎｄ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”，Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ｐｐ．２２５−２３３（１９８１）；Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５４：７６９−７８０（１９７９）；Ｗａｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２５４：７８１−７８８（１９７９）；Ｌｏｒｅｎｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８８：４４３８−４４４２（１９８１）；Ｈｏｒｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７４：４２８５−４２８７（１９７７）；Ｈｏｒｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４：２３７１−２３７６（１９７５）；Ｈｏｒｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７４：４２８５−４２８７（１９７７）；Ｉｎｏｕｙｅら，Ｊａｐ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．  １４１−１４４（１９７５）；及びＭａｔｔｈｅｗｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６：８５−９１（１９７９）参照）。ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む宿主細胞は、大量の酵素を産生するための便利な手段を提供する（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの組換え産生及び前記ＤＮＡの他のルシフェラーゼ、特に関連生物に由来のルシフェラーゼをコードするＤＮＡを単離するための使用を記載している米国特許第５，４１８，１５５号明細書及び同第５，２９２，６５８号明細書参照）。高レベルで組換え酵素を発現できるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの組換え産生方法（米国特許第５，４１８，１５５号明細書及び同第５，２９２，６５８号明細書）の改変方法は本明細書の実施例に記載されている。
【０１１５】
本発明で使用する場合、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを場合によりルシフェリン基質と組合せて、凍結乾燥形態でパッケージするかまたはベヒクル中にカプセル化することができる。使用する前に、混合物を水性組成物、好ましくはリン酸緩衝食塩液または他の適当な緩衝液、例えばｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液（例えば、０．１ｍｍのＴｒｉｓ、０．１ｍｍのＥＤＴＡ）と接触させる。溶存Ｏ２が反応を促進する。グリセロール（約１％）を添加すると光度が高くなる。増殖混合物中のルシフェラーゼの最終濃度は０．０１〜１ｍｇ／ｌまたはそれ以上のオーダーである。ルシフェリンの濃度は少なくとも約１０−８Ｍであるが、長く持続するバイオルミネセンスを生ずるためには１〜１００またはそれ以上のオーダーである。
【０１１６】
本明細書の特定実施態様では、約１〜１００ｍｇ、または好ましくは２〜５ｍｇ、より好ましくは約３ｍｇのセレンテラジンを約１００ｍｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼと共に使用する。正確な量は勿論実験的に決定され得るが、ある程度最終濃度及び用途に依存する。特に、Ｒｅｎｉｌｌａを発現する細菌由来の粗抽出物約０．２５ｍｌの適当なアッセイ緩衝液１００ｍｌ及び約０．００５μｇへの添加が目に見えるグローを長時間発生させるために十分であった（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの組換え産生を記載している米国特許第５，４１８，１５５号明細書及び同第５，２９２，６５８号明細書参照）。
【０１１７】
凍結乾燥混合物及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ含有組成物も提供される。ルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼとルシフェリンの混合物を適当な送達ベヒクル、例えばリポソーム、ガラス粒子、毛細管、薬物送達ベヒクル、ゼラチン、持続性コーティングまたは他のベヒクルにカプセル化することもできる。これらの混合物、組成物またはベヒクルを含むキット、チップデバイス及び生物学的分子をチップの表面に結合させるための試薬も提供する。ルシフェラーゼを本発明の方法で使用するために化学的もしくは組換え手段を用いて抗リガンドに結合させてもよい。
【０１１８】
Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの組換え産生
ファージミドｐＴＺ１８Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、インビトロ転写のために設計され、細菌宿主中で組換えタンパク質を発現させるために使用される多目的ＤＮＡベクターである。このベクターは、アンピシリン耐性により形質転換体を選択できるｂｌａ遺伝子及びｌａｃＺ’遺伝子に隣接するポリリンカー部位を含む。当該異種遺伝子をポリリンカーに挿入し、例えばイソプロピル−β−Ｄ−トリガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導することによりｌａｃプロモータから転写される。
【０１１９】
Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼをコードするＤＮＡはクローン化されている（例えば、米国特許第５，２９２，６５８号明細書及び同第５，４１８，１５５号参照）。プラスミドｐＴＺＥＬｕｃ−１は、ｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩサイトとＳｓｔＩサイトに挿入した２．２ＫｂｐのＥｃｏＲＩからＳｓｔＩＤＮＡ断片のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをコードする（プラスミドの構築は米国特許第５，２９２，６５８号明細書及び同第５，４１８，１５５号明細書に記載されている；またＬｏｒｅｎｚら，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８８：４４３８−４４４２（１９９１）も参照）。ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼｃＤＮＡの転写開始はｌａｃＺ’プロモータの制御下にある。プラスミドｐＴＺＲＬｕｃ−１を持つ大腸菌菌株は、バイオルミネセンスアッセイにおいて機能的であり、天然酵素の特性を保持しているＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現する（例えば、米国特許第５，２９２，６５８号明細書及び同第５，４１８，１５５号明細書参照）。
【０１２０】
ｐＴＺＲＬｕｃ−１の誘導体であるｐＴＺＲＬｕｃ−３．６は、同じ大腸菌宿主に形質転換したときに組換え体ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼをｐＴＺＲＬｕｃ−１に比して約７倍高いレベルで産生する。コンピテント大腸菌菌株ＸＬ−１を製造業者の指示に従って精製ｐＴＺＲＬｕｃ−３．６を用いて形質転換した（ＸＬ−１スーパーコンピテント細胞及びプロトコル；カリフォルニア州ラ・ホーヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）。形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したルリアブロス（ＬＢ）プレートで平板培養することにより選択した。
【０１２１】
単一のアンピシリン耐性コロニーを、細胞増殖が中間ｌｏｇ相（すなわち、細胞培養物がＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．６〜０．８単位に達する）に達するまで室温で連続振盪しながら１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させた。ｌａｃプロモータからの転写は１ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより誘導し、細胞培養物を室温で更に８時間振盪させた。
【０１２２】
細胞を１０，０００×ｇで遠心して収集し、−２０℃で凍結させた。細胞ペレットを融解し、４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）を含有する１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中に１：５の比率（ｗ／ｗ）で再懸濁させた。細胞を２５℃の水浴に３０分間置いた後、氷に１時間移した。細胞をＵｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．細胞破壊装置からの１分パルスを用いて０℃で音波溶解した。
【０１２３】
溶解させた細胞破片を３０，０００×ｇで３時間遠心して除去し、上清をデカントし、残した。ペレットを上記した溶液に１：５の比率で再懸濁させ、その後のインキュベーション、溶解及び遠心ステップを繰り返した。２つの上清を合わせ、−７０℃で保存した。
【０１２４】
得られた清澄化ライゼートを組換え体ルシフェラーゼのソースとして使用した。或いは、ライゼートを追加の精製ステップ（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたはイムノアフィニティークロマトグラフィー）にかけてライゼートを更に精製したりまたは精製酵素の均質ソースを提供してもよい（例えば、米国特許第５，２９２，６５８号明細書及び同第５，４１８，１５５号明細書参照）
【０１２５】
３．甲殻類動物、特にＣｙｒｐｉｄｉｎａ系
Ｖａｒｇｕｌａ  ｓｅｒｒａｔａ、ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ及びｎｏｃｔｉｌｕｃａのような貝虫は、時々ウミホタルと呼ばれる小さな海洋甲殻類動物である。これらのウミホタルは日本の海岸沖の領海で発見され、水中にルシフェリン及びルシフェラーゼをかけると光を発し、そこで明るい青色に輝く雲状物を発生させる反応が起こる。前記反応にはルシフェリン、ルシフェラーゼ及び分子状酸素のみが関与し、よって本発明の用途には非常に適している。
【０１２６】
Ｖａｒｇｕｌａバイオルミネセンス発生系のような系は、乾燥及び粉末化するときに成分が室温で安定であり、たとえ汚染されても反応を続けるので本発明では特に好ましい。更に、バイオルミネセント反応を進行せるには、１：４０ｐｐｂ〜１：１００ｐｐｂほどの低濃度のルシフェリン／ルシフェラーゼ成分、水及び分子状酸素のみが必要である。ルシフェリンを添加することにより消耗した系を再生することができる。
【０１２７】
ａ．Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ
Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼは、Ｖａｒｇｕｌａから単離し、適当な細菌及び哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させることにより組換え技術を用いて産生された５５５アミノ酸ポリペプチドである（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５６７−６５７１（１９８９）；Ｉｎｏｕｙｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：９５４８−９５８７（１９９２）；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ＬＶＩＩ：３３１−３４９（１９７８）；Ｔｓｕｊｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ５７：３６４−７２（１９７８）；Ｔｓｕｊｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：５２０４−５２０９（１９７４）；特開平３−３０６７８号公報（Ｏｓａｋａ）；及び欧州特許出願公開第０３８７３５５号明細書参照）。
【０１２８】
（１）Ｃｙｐｒｉｄｉｎａからの精製
Ｖａｒｇｕｌａ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼの精製方法は公知である。例えば、活性分を含む粗抽出物は、Ｖａｒｇｕｌａシュリンプを砕くかまたは粉砕することにより容易に調製され得る。他の実施態様では、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉルシフェラーゼの調製物を、凍結保存したＣ．ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉを抽出のために０〜３０℃（好ましくは０〜１０℃）で０．５〜５．０Ｍの塩（好ましくは０．５〜２．０Ｍの塩化ナトリウムもしくはカリウム）を含む蒸留水中に１〜４８時間（好ましくは１０〜２４時間）浸した後、疎水性クロマトグラフィー、次いでイオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより調製される（１９９３年９月１４日に公開された特開平４−２５８２８８号公報（ＴＯＲＡＹ）；また他の方法についてはＴｓｕｊｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ５７：３６４−７２（１９７８）参照）。
【０１２９】
ルシフェリンは、ルシフェラーゼを破壊するがルシフェリンは無傷のまま残っている抽出物を加熱することにより粉砕乾燥したＶａｌｇｕｌａから単離され得る（例えば、米国特許第４，８５３，３２７号明細書参照）。
【０１３０】
（２）組換え法による作成
好ましくは、ルシフェラーゼはルシフェラーゼをコードするクローン化ＤＮＡを発現することにより産生される（欧州特許出願公開第０３８７３５５号明細書；国際特許出願公開第ＷＯ９０／０１５４２号明細書；また特開平３−３０６７８号公報からの配列を記載している配列番号５、及びＴｈｏｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５６７−６５７１参照）。ルシフェラーゼをコードするＤＮＡまたはその突然変異体を適当なベクターを用いて大腸菌に導入し、標準的な方法を用いて単離する。
【０１３１】
ｂ．Ｖａｒｇｕｌａラシフェラーゼ
下記式(III)の化合物のような置換イミダゾピラジン核中の天然ルシフェリン
【０１３２】
【化４】
2006145545.tif 000008
【０１３３】
そのアナログ及び光発生反応においてルシフェラーゼと反応する他の化合物をも使用することができる。
【０１３４】
Ｖａｒｇｕｌａルシフェリンと反応し得るルシフェラーゼを有する他のバイオルミネセント生物にはＡｐｏｇｏｎ属、Ｐａｒａｐｒｉａｃａｎｔｈｕｓ属及びＰｏｒｉｃｈｔｈｙｓ属が含まれる。
【０１３５】
ｃ．反応
酸素と反応するとルシフェリンはジオキセタノン中間体（ホタル環式ペルオキシド分子中間体と類似の環式ペルキシドを含む）を形成する。バイオルミネセント反応の最終ステップで、ペルオキシドは分解してＣＯ２及び励起カルボニルを形成する。次いで、励起分子は青色〜青緑色の光を発する。
【０１３６】
反応の最適ｐＨは約７である。本発明の目的のためには、反応が起こる任意のｐＨを使用することができる。試薬の濃度は分析反応のために通常使用される濃度またはそれ以上である（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｇｅｎｅ  ９６：２５７−２６２（１９９０）参照）。通常、０．１〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは０．５〜２．５ｍｇ／ｌのルシフェラーゼ濃度を使用する。類似濃度またはより高濃度のルシフェリンを使用してもよい。
【０１３７】
４．ホタル、コメツキムシ及び他の昆虫系を含めた昆虫バイオルミネセンス発生系
ホタルバイオルミネセンスの生化学は最初に特徴付けられたバイオルミネセンス発生系であり（例えば、Ｗｉｅｎｈａｕｓｅｎら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４２：６０９−６１１（１９８５）；ＭｃＥｌｒｏｙら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｈａｙａｓｈｉら編，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ，ｐｐ．６３−８０（１９６６）参照）、市販されている（例えば、ウィスコンシン州マジソンに所在のＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販；例えばＬｅａｃｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：５１−７０，特に表１参照）。別の種のホタル由来のルシフェラーゼは抗原的に類似である。これらの種には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属、Ｐｈｏｔｕｒｉｎｓ属及びＬｕｃｉｏｌａ属のメンバーが含まれる。更に、バイオルミネセント反応は２０℃よりも３０℃でより多くの光を生じ、ルシフェラーゼは少量のウシ血清アルブミンにより安定化され、反応をトリシンにより緩衝させ得る。
【０１３８】
ａ．ルシフェラーゼ
各種昆虫由来のルシフェラーゼをコードするＤＮＡクローン及びコード化ルシフェラーゼを産生するための使用は公知である。例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ由来のルシフェラーゼをコードするＤＮＡクローン（例えば、ｄｅＷｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２：７８７０−７８７３（１９８５）；ｄｅＷｅｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：３（１９８６）；米国特許第４，９６８，６１３号明細書参照；また配列番号３も参照）が入手可能である。前記ＤＮＡはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、１９８８年１２月２６日に公開された特開昭６３−３１７０７９号公報（ＫＩＫＫＯＭＡＮ  ＣＯＲＰ）参照）及びタバコで発現された。
【０１３９】
野生型ルシフェラーゼの他に、修飾昆虫ルシフェラーゼも産生された。例えば、ルシフェラーゼを産生するための熱安定性ルシフェラーゼ突然変異体、該突然変異体をコードするＤＮＡ、ベクター及び形質転換細胞が入手可能である。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌ．ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬ．ｌａｔｅｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼと６０％のアミノ酸相同性を有し、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質が入手可能である（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９５／２５７９８号明細書参照）。このタンパク質は３０℃を越える温度で天然の昆虫ルシフェラーゼよりも安定であり、３７℃またはそれ以上の温度でより高い収率で産生され得る。
【０１４０】
修飾ルシフェラーゼは（天然ルシフェラーゼと比較して）異なる波長で光を発し、よって発色特性に関して選択され得る。例えば、野生型ルシフェラーゼとは異なる波長でバイオルミネセンスを生ずる合成突然変異体甲虫ルシフェラーゼ及び該ルシフェラーゼをコードするＤＮＡは公知である（米国特許出願第０８／１７７，０８１号（１／３／９４）に基づく国際特許出願公開第ＷＯ９５／１８８５３，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）。突然変異体甲虫ルシフェラーゼは、１つもしくは２つの位置が置換されていることにより対応する野生型Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａとは異なるアミノ酸配列を有する（例えば、米国特許第５，１８２，２０２号明細書、同第５，２１９，７３７号明細書、同第５，３５２，５９８号明細書参照）。突然変異体ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼが産生するものとは少なくとも１ｎｍだけ異なるピーク強度の波長を有するバイオルミネセンスを生ずる。
【０１４１】
他の突然変異体ルシフェラーゼも産生された。野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列を有するが２３３のバリンがイソロイシンに、２３９のバリンがイソロイシンに、２８６のセリンがアスパラギンに、３２６のグリシンがセレンに、４３３のヒスチジンがチロシンに、または４５２のプロリンがセリンに置換されているという少なくとも１つの突然変異を有する突然変異型ルシフェラーゼが公知である（例えば、米国特許第５，２１９，７３７号明細書及び同第５，３３０，９０６号明細書参照）。前記ルシフェラーゼは、各突然変異体ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを大腸菌中で発現し、タンパク質を単離することにより産生される。これらのルシフェラーゼは、野生型とは異なる色を有する光を生ずる。突然変異体ルシフェラーゼはルシフェリンを触媒して赤色（λ６０９ｎｍ及び６１２ｎｍ）、橙色（λ５９５ｎｍ及び６０７ｎｍ）または緑色（λ５５８ｎｍ）の光を生ずる。突然変異体ルシフェラーゼの他の物理的及び化学的特性は天然の野生型ルシフェラーゼと実質的に同一である。突然変異体のルシフェラーゼは、Ｓｅｒ２８６のＡｓｎによる置換、Ｇｌｙ３２６のＳｅｒによる置換、Ｈｉｓ４３３のＴｙｒによる置換またはＰｒｏ４５２のＳｅｒによる置換から選択される変更を含む以外、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａルシフェラーゼアミノ酸配列を有する。熱安定性ルシフェラーゼは入手可能である（例えば、米国特許第５，２２９，２８５号明細書参照；また３５４のグルタメートがリシンで置換されているＰｈｏｔｉｎｕｓルシフェラーゼ及び３５６のグルタメートがリシンで置換されているＬｕｃｉｏｌａルシフェラーゼを提供している国際特許出願第９５／２５７９８号明細書参照）。
【０１４２】
本発明において、特に様々な色が所望されるときまたはより高温度の安定性が所望されるときに好ましいルシフェラーゼの中には、上記した突然変異体ルシフェラーゼ及び野生型ルシフェラーゼが含まれる。ホタルルシフェラーゼがアルカリｐＨ最適値（７．５〜９．５）を有し、よってアルカリｐＨで実施される診断アッセイで使用するのに好適であることは注目に値する。
【０１４３】
ｂ．ルシフェリン
ホタルルシフェラーゼはベンゾチアゾールである。
【０１４４】
【化５】
2006145545.tif 000009
このルシフェリンのアナログ及び合成ホタルルシフェリンも当業者に公知である（例えば、米国特許第５，３７４，５３４号明細書及び同第５，０９８，８２８号明細書参照）。これらには、式(V)の化合物が含まれる（例えば、米国特許第５，０９８，８２８号明細書参照）。
【０１４５】
【化６】
2006145545.tif 000010
上記式中、
Ｒ１はヒドロキシ、アミノ、直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ２０アルコキシ、Ｃ２−Ｃ２０アルケニルオキシ、α−アミノ基を介して結合したＬ−アミノ酸基、最高１０個のＬ−アミノ酸単位が末端単位のα−アミノ基を介して結合したオリゴペプチド基であり、
Ｒ２は水素、Ｈ２ＰＯ３、ＨＳＯ３、任意にフェニル置換された直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ２０アルコキシまたはＣ２−Ｃ２０アルケニル、６〜１８個の炭素を含有するアリールまたはＲ３−Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ３は任意にフェニル置換された直鎖もしくは分枝鎖Ｃ１−Ｃ２０アルコキシまたはＣ２−Ｃ２０アルケニル、６〜１８個の炭素を含有するアリール、１〜３個のリン酸基を有するヌクレオチドまたはグリコシド結合したモノ−もしくはジ−サッカライドであり、ただし式(IV)がＤ−ルシフェリンまたはＤ−ルシフェリンメチルエステルである場合を除く。
【０１４６】
ｃ．反応
反応はホタルルシフェラーゼにより触媒され、関連昆虫ルシフェラーゼはＡＴＰ、Ｍｇ２＋及び分子状酸素を必要とする。ルシフェリンは外部から添加されなければならない。ホタルルシフェラーゼはホタルルシフェリン活性化及び励起生成物へのその後のステップを触媒する。ルシフェリンはＡＴＰと反応してルシフェリルアデニレート中間体を形成する。次いで、この中間体は酸素と反応して、セレンテレート中間体の環式ペルオキシドと類似の環式ルシフェリルペルオキシ種を形成し、この環式ルシフェリルペルオキシ種は分解してＣＯ２及び励起状態のカルボニル産物を生ずる。その後、励起分子は黄色の光を発する。しかしながら、色はｐＨによって変わる。ｐＨが低くなると、バイオルミネセンスの色は黄緑色から赤色に変わる。
【０１４７】
異なる種のホタルは、反応の色はルシフェラーゼのソースである種に依存するように異なる色のバイオルミネセンスを発する。反応の最適ｐＨは７．８である。
【０１４８】
消耗した反応にＡＴＰ及びルシフェリンを添加すると更に発光する。このようにいったん確立された系は比較的簡単に維持される。従って、前記系はグローの持続が望まれるかアイテムの再使用が意図される実施態様において使用するために特に適している。ホタル系の成分はチップと一緒にパッケージされ得る。
【０１４９】
５．細菌系
発光細菌は通常青−緑色の連続光を発する。強く発現させたとき、１つの細菌は１秒あたり１０４〜１０５の光子を放出し得る。細菌バイオルミネセンス発生系には、特にＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｖｉｂｒｉｏ属及びＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ属のバイオルミネセント種に見られる系が含まれる。これらの系は公知であり、十分特徴付けられている（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７（１９８４）；Ｎｉｃｏｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２４９：２３９３−２３９６（１９７４）；Ｗｅｌｃｈｅｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：５１２−５１７（１９８１）；Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：８３−９９（１９８６）；Ｆｒａｃｋｍａｎら，Ｊ．  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７２：５７６７−５７７３（１９９０）；Ｍｉｙａｍｏｔｏら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３３：７０（１９８６）；米国特許第４，５８１，３３５号明細書参照）。
【０１５０】
ａ．ルシフェラーゼ
Ｖｉｖｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ（ＥＣ  １．１４．１４．３，アルカノール還元−ＦＭＮ−酸素オキシドレダクターゼ１−ヒドロキシル化，ルミネッシング）由来のルシフェラーゼにより例示されるような細菌ルシフェラーゼは、２つの異なるタンパク質サブユニットα及びβが結合して形成される混合機能オキシダーゼである。α−サブユニットは約４２，０００ｋＤの見かけ分子量を有し、β−サブユニットは約３７，０００ｋＤの見かけ分子量を有する（例えば、Ｃｏｈｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：１０２−１２３（１９８９）参照）。これらのサブユニットは結合して、バイオルミネセント細菌、例えばＶｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ（米国特許第４，５８１，３３５号明細書；Ｂｅｌａｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８：７９１−７９３（１９８２））、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ（Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら，Ｃｅｌｌ  ３２：７７３−７８１（１９８３）；Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：４１５４−４１５８（１９８４））及び他の海洋細菌の発光反応を触媒する２鎖複合体ルシフェラーゼ酵素を形成する。
【０１５１】
細菌ルシフェラーゼ遺伝子はクローン化されている（例えば、米国特許第５，２２１，６２３号明細書、同第４，５８１，３３５号明細書；欧州特許出願公開第３８６６９１号明細書参照）。Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉのような細菌ルシフェラーゼを発現させるためのプラスミドには、ｐＦＩＴ００１（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８０８０）、ｐＰＡＬＥ００１（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８０８２）及びｐＭＲ１９（ＮＲＲＬ  Ｂ−１８０８１）が含まれ、公知である。例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来の全ｌｕｘレギュロンの配列は決定されている（Ｂａｌｄｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７（１９８４）；Ｂａｌｄｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０：５１２−５１７（１９８１）；Ｂａｌｄｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３：３６６３−３６６７（１９８４）；また米国特許第５，１９６，３１８号明細書、同第５，２２１，６２３号明細書及び同第４，５８１，３３５号明細書参照）。このレギュロンは、自己誘導合成のために必要なタンパク質をコードするｌｕｘＩ遺伝子（例えば、Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：４１５４−４１５８（１９８４）参照）、アルデヒド基質と共にルシフェラーゼを与える酵素をコードするｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ及びｌｕｘＥ遺伝子、並びにルシフェラーゼのα及びβサブユニットをコードするｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ遺伝子を含む。
【０１５２】
他の細菌に由来するｌｕｘ遺伝子もクローン化されており、入手可能である（例えば、Ｃｏｈｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６０：６１３９−６１４６（１９８５）；Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ由来のｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ遺伝子の融合を提供している米国特許第５，１９６，５２４号明細書参照）。よって、ルシフェラーゼα及びβサブユニットをコードするＤＮＡが提供され、ルシフェラーゼを産生するために使用することができる。α（１０６５ｂｐ）及びβ（９８４ｂｐ）サブユニットをコードするＤＮＡ、２１２４ｂｐのルシフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ、α及びβサブユニットをコードするＤＮＡ、両サブユニットをコードするＤＮＡを含有する組換えベクター、並びにコードされたルシフェラーゼの発現及び産生のための形質転換された大腸菌及び他の細菌宿主は入手可能である。更に、細菌ルシフェラーゼも市販されている。
【０１５３】
ｂ．ルシフェリン
細菌ルシフェリンは以下を含む。
【０１５４】
【化７】
2006145545.tif 000011
Ｒは例えば
【０１５５】
【化８】
2006145545.tif 000012
である。
ここでは、テトラデカナール及び還元フラビンモノヌクレオチドがルシフェリンと考えられる。なぜならば、両者が発光反応中に酸化されるからである。
【０１５６】
ｃ．反応
細菌系は、バイオルミネセント反応を完結するために還元フラビンに加えて５つのポリペプチド、すなわち細菌ルシフェリンのα及びβの２つのサブユニットとテトラデカナールを供給する脂肪酸レダクターゼ系複合体の３つのユニットを必要とする。本発明で提供される装置及び方法において有用な細菌バイオルミネセンス発生系の例には、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉ及びＶｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ由来のものが含まれる。この系の１つの利点は、低温で操作する能力である。従って、この系は好冷生物の抗生感受性を検出及び監視するためにチップを用いる方法に特に適している。細菌系の全ての成分は氷結させたり０℃以下で保存される溶液中に入れたりすることができる。０℃近い温度でインキュベーション後、チップをより温かい温度に移すことができ、反応は進行し、それにより持続的なグローが提供される。
【０１５７】
細菌ルシフェラーゼは長鎖アルデヒドのフラビン仲介ヒドロキシル化を触媒して、カルボン酸及び励起フラビンを生ずる。フラビンは基底状態に崩壊し、同時に青緑色の光（λｍａｘ＝４９０ｎｍ；例えば、Ｌｅｇｏｃｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：９０８０（１９８６）参照；米国特許第５，１９６，８２４号参照）を発する。
【０１５８】
【化９】
2006145545.tif 000013
反応は、還元フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２）を細菌ルシフェラーゼ、酸素及び長鎖アルデヒド、通常ｎ−デシルアルデヒドの混合物と接触させることにより開始され得る。
【０１５９】
蛍光性細菌Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｎｅｄａｉ由来のルシフェラーゼをコードするＤＮＡは公知である（１９９５年８月２２日に公開された特開平７−２２２５９０号公報，ＣＨＩＳＳＯ  ＣＯＲＰ参照）。還元フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２；ルシフェリン）は細菌ルシフェラーゼの存在下で酸素と反応して、中間体ペルオキシフラビンを生成する。この中間体は長鎖アルデヒド（テトラデカナール）と反応して、酸及び励起状態のルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンを形成する。次いで、励起状態のルシフェラーゼ結合ヒドロキシフラビンは光を発し、ルシフェラーゼから酸化フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及び水として解離する。インビボにおいてＦＭＮは再び還元され、再循環され、アルデヒドは酸から再生される。
【０１６０】
フラビンレダクターゼはクローン化されている（例えば、米国特許第５，４８４，７２３号参照；この特許に記載されている代表的な配列について配列番号１４参照）。前記フラビンレダクターゼ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、細菌ルシフェラーゼ及び長鎖アルデヒドとの反応用にＦＭＮＨ２を再生するための反応に含めることができる。フラビンレダクターゼは、ルシフェラーゼ反応であるＦＭＮのＦＭＮＨ２への反応を触媒する。従って、仮にルシフェラーゼ及びレダクターゼを反応系に含めた場合、バイオルミネセント反応を維持することができる。すなわち、細菌ルシフェラーゼは何回も代謝回転するので、バイオルミネセンスは長鎖アルデヒドが反応系に存在する限り継続する。
【０１６１】
バイオルミネセント細菌により生ずる光の色はバイオルミネセント反応に青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が関与することから生ずる。このタンパク質は公知であるが（例えば、Ｌｅｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ＬＶＩＩ：２２６−２３４（１９７８）参照）、色を変えるために細菌バイオルミネセント反応に添加してもよい。
【０１６２】
６．他の系
ａ．渦鞭藻バイオルミネセンス発生系
渦鞭藻では、バイオルミネセンスはシンチロンと呼ばれる細胞小器官で生ずる。これらの細胞小器官は細胞質の細胞液胞へのポケット状突出である。シンチロンは渦鞭藻ルシフェラーゼ及びルシフェリン（その結合タンパク質と共に）のみを含み、他の細胞質成分はどういうわけか含まれていない。渦鞭藻ルシフェリンはクロロフィルに関連するテトラピロールまたはそのアナログである。
【０１６３】
【化１０】
2006145545.tif 000014
【０１６４】
ルシフェラーゼは、ｐＨ６．５で活性であるがｐＨ８では不活性の１３５ｋＤ短鎖タンパク質である（例えば、Ｈａｓｔｉｎｇｓ，Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＤｅＬｕｃａら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．３４３−３６０（１９８１）参照）。ルミネセント活性はｐＨ８で調製された抽出物中でｐＨを８から６に変化させることにより得ることができる。これは可溶性及び粒状画分中で起こる。無傷のシンチロン内で、ルミネセントフラッシュはインビボでのフラッシュ期間である〜１００ｍｓｅｃの間生ずる。溶液中では、酵素反応の場合のようにキネティックは希釈に依存する。ｐＨ８ではルシフェリンはタンパク質（ルシフェリン結合タンパク質）に結合しており、ルシフェリンとルシフェラーゼの反応が防止されている。しかしながら、ｐＨ６ではルシフェリンは放出され、遊離となって酵素と反応する。
【０１６５】
ｂ．ＬａｔｉａやＰｈｏｌａｓのような軟体動物由来の系
軟体動物のＬａｔｉａ  ｎｅｒｉｔｏｉｄｅｓ及びＰｈｏｌａｓの種はバイオルミネセント動物である。ルシフェリンは以下の構造を有し、
【０１６６】
【化１１】
2006145545.tif 000015
【０１６７】
合成されている（例えば、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：１７３４−１７３８（１９６８）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ６９：２０８６−２０８９（１９７２）参照）。反応はルシフェラーゼ及びルシフェリンの他に第３の成分“紫色タンパク質”を有する。外部から還元剤を添加することにより開始され得る反応は以下のように表される。
【０１６８】
【化１２】
2006145545.tif 000016
ここで、ＸＨ２は還元剤である。
【０１６９】
本発明を実施するためには、反応は紫色タンパク質と還元剤を必要とする。
【０１７０】
ｃ．地虫及び他の環形動物
Ｄｉｐｌｏｃａｒｄｉａ  ｌｏｎｇａ、Ｃｈａｅｔｏｐｔｅｒｕｓ及びＨａｒｍｏｎｔｈｏｅのような地虫種はバイオルミネセンスを示す。ルシフェリンは以下の構造を有する。
【０１７１】
【化１３】
2006145545.tif 000017
反応はルシフェリン及びルシフェラーゼの他に過酸化水素を必要とする。ルシフェラーゼは発光タンパク質である。
ｄ．グロー蠕虫
ニュージーランド洞窟、オーストラリア及び英国で発見されたグロー蠕虫(glow worms)由来のルシフェラーゼ／ルシフェリン系も本発明で使用され得る。
【０１７２】
ｅ．海洋多毛類蠕虫系
Ｐｈｙｘｏｔｒｉｘ及びＣｈａｅｔｏｐｔｅｒｕｓのような海洋多毛類蠕虫バイオルミネセンス発生系も本発明で使用され得る。
【０１７３】
ｆ．南米線路甲虫
南米線路甲虫(South American railway beetle)由来のルシフェラーゼ／ルシフェリン系も本発明で使用され得る。
【０１７４】
ｇ．魚
本発明において興味深いものは、赤色光を生ずるルシフェラーゼ及びバイオルミネセンス発生系である。これらには、Ａｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｓ（例えば、Ｏ’Ｄａｙら，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．  １４：５４５−５５０（１９７４）参照）のようなＡｒｉｓｔｏｓｔｏｍｉａｓ、Ｐａｃｈｙｓｔｏｍｉａｓ、Ｍａｌａｃｏｓｔｅｕｓ  ｎｉｇｅｒのようなＭａｌａｃｏｓｔｅｕｓの種で発見されたルシフェラーゼが含まれる。
【０１７５】
７．蛍光タンパク質
ａ．緑色及び青色蛍光タンパク質
本明細書に記載されているように、青色光はＣａ２＋及びセレンテラジンルシフェリンまたはそのアナログの存在下でＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたはＡｅｑｕｏｒｅａ発光タンパク質を用いて生ずる。この光は、反応に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を添加すると緑色光に変換され得る。精製され（例えば、Ｐｒａｓｈｅｒら，Ｇｅｎｅ  １１１：２２９−２３３（１９９２）参照）、クローン化もされている（例えば、援用により本明細書に含まれるとする米国特許出願第０８／１１９，６７８号及び同第０８／１９２，２７４号に基づく国際特許出願公開第ＷＯ９５／０７４６３号明細書参照）緑色蛍光タンパク質はエネルギー変換アクセプタとして腔腸動物により使用される。インビボにおいてＧＦＰはルシフェラーゼ−オキシルシフェリン励起状態複合体またはＣａ２＋活性化発光タンパク質からエネルギーを受けると蛍光発光する。発色団はポリペプチド内のアミノ残基を修飾する。最も特徴付けられているＧＰＦは、Ａｅｑｕｏｒｅａ及びＲｅｎｉｌｌａのＧＰＦである（例えば、Ｐｒａｓｈｅｒら，Ｇｅｎｅ  １１１：２２９−２３３（１９９２）；Ｈａｒｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：２２０４−２２１０（１９７９）参照）。例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は２３８アミノ酸を含み、青色光を吸収し、緑色光を発する。従って、このタンパク質をセレンテラジン及び酸素を充填したエクオリン発光タンパク質含有組成物中に含めると、カルシウムの存在下で緑色光を生成させ得る。従って、ＧＦＰは、生じたバイオルミネセンスの色を強くしたりまたは変更するためにエクオリンまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたは他の適当なルシフェラーゼを用いるバイオルミネセンス発生系に含有させることができる。
【０１７６】
ＧＦＰは青色光により活性化されて緑色光を発し、よってルシフェラーゼの非存在下、本明細書に記載の新規アイテムと外部光源と共に使用することができる。同様に、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉまたはＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍのような青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）は、青色光を生ずるために適切な波長を有する外部光源と共に使用することができる（例えば、Ｋａｒａｔａｎｉら，“Ａ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｙｅｌｌｏｗ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｌｕｍｉｎｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ”，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  ５５（２）：２９３−２９９（１９９２）；Ｌｅｅら，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｌｕｅ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．）５７：２２６−２３４（１９７８）；及びＧａｓｔら，“Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ８０（１）：１４−２１（１９７８）参照、これらの文献はそれぞれ援用により本明細書に含まれるとする）。特に、ＧＦＰ及び／またはＢＦＰまたは他の蛍光タンパク質は、アナライトを複数位置で１つ以上の抗リガンド−ＧＦＰコンジュゲートに結合させ、蛍光タンパク質を蛍光発光させるために適当な波長を有する光をチップに照射して、生じた蛍光をチップ中のフォトダイオードにより検出することにより感染性物質を検出するための本発明の方法に使用され得る。
【０１７７】
ＧＦＰ及び／またはＢＦＰまたは他の蛍光タンパク質は、本明細書に記載のチップまたはデバイスと一緒に使用され得る。前記蛍光タンパク質は色のアレーを生成するために単独でまたはバイオルミネセンス発生系と組み合わせて使用され得る。前記蛍光タンパク質は、チップのフォトダイオードによる検出のために使用される光の量を最大にすべく生じた光の例えば色を変更できるように組み合わせることができる。
【０１７８】
ｂ．フィコビリンタンパク質
フィコビリンタンパク質はシアノバクテリア及び真核藻類由来の水溶性蛍光タンパク質である（例えば、Ａｐｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２３８：７９−９６（１９９５）；Ｇｌａｚｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３６：１７３−１９８（１９８２）；及びＦａｉｒｃｈｉｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６９：８６８６−８６９４（１９９４）参照）。前記タンパク質はイムノアッセイにおいて蛍光標識として使用された（例えば、Ｋｒｏｎｉｃｋ，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈ．  ９２：１−１３（１９８６）参照）。前記タンパク質は単離され、該タンパク質をコードするＤＮＡも入手可能である（例えば、Ｐｉｌｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：６９８３−６９８７（１９８４）；Ｌｕｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０３：２９３−２９４（１９９３）；及びＨｏｕｍａｒｄら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０：５５１２−５５２１（１９８８）参照）。前記タンパク質は例えばカリフォルニア州サンリアンドロに所在のＰｒｏＺｙｍｅ  Ｉｎｃ．から市販されている。
【０１７９】
これらの生物において、フィコビリンタンパク質はフィコビリソームと呼ばれる細胞下構造に配列されており、可視光線を吸収し、誘導エネルギーを直接蛍光エネルギー伝達メカニズムによりクロロフィルに移動することにより光合成反応に関与する補助色素として機能する。
【０１８０】
その色に基づいて、それぞれ４９０〜５７０ｎｍ及び６１０〜６６５ｎｍの吸収極大を有すると報告されているフィコエリトリン（赤色）及びフィコシアニン（青色）の２種のフィコビリンタンパク質が公知である。フィコエリトリン及びフィコシアニンは、１種以上の線状テトラピロール発色団が共有結合しているα及びβモノマーを異なる比率で含む不均質複合体である。特定のフィコビリンタンパク質はしばしば（αβ）６凝集タンパク質と結合している第３のγサブユニットをも含む。
【０１８１】
フィコビリンタンパク質はすべてフィコトロンビリンまたはフィコエリトビリン発色団を含み、フィコウロビリン、クリプトビオリンまたは６９７ｎｍビリンのような他のビリンをも含み得る。γサブユニットはフィコウロビリンと共有結合して、Ｂ−及びＲ−フィコエリトリンの４９０〜５００ｎｍ吸収ピークが生ずる。従って、フィコビリンタンパク質は、フィコビリンタンパク質の３次及び４次構造に影響を及ぼす異なる発色団、アポフィコビリンタンパク質のサブユニット組成及び／または局部的環境の組合せにより影響され得る。
【０１８２】
ＧＦＰ及びＢＦＰについて上記したように、フィコビリンタンパク質も適当な波長を有する可視光により活性化され、よってフィコビリンタンパク質はルシフェラーゼの非存在下、アナライトを検出した複数位置でチップに結合したフィコビリンタンパク質を照射するための外部光源と一緒に使用され得る。特に、フィコビリンタンパク質は標的アナライトに対して特異的な１つ以上の抗リガンドに共有結合し、適当な波長の光を照射して蛍光タンパク質を蛍光発光させることができ、蛍光をアレーの特定位置でチップのフォトダイオードにより測定する。データ信号をコンピュータプロセッサに送り、分析する。上記したように、前記タンパク質は複数の色のアレーを生成するためまたはチップのフォトダイオードにより検出可能な経時的に異なる色を与えるために他の蛍光タンパク質及び／またはバイオルミネセンス発生系と組み合わせて使用することができる。
【０１８３】
フィコビリンタンパク質の固体支持体マトリックスへの結合は公知である（例えば、米国特許第４，７１４，６８２号明細書、同第４，７６７，２０６号明細書、同第４，７７４，１８９号明細書及び同第４，８６７，９０８号明細書参照）。従って、フィコビリンタンパク質は、バイオルミネセント反応から生じた光の波長を変えるためにバイオルミネセント反応の１つ以上の成分、好ましくはルシフェラーゼに結合したミクロ担体に結合させることができる。１つ以上のフィコビリンタンパク質に結合したミクロ担体は、本発明の方法に使用される抗リガンドまたはチップに結合させるときに使用され得る。
【０１８４】
Ｃ．チップの設計、製造及び使用
本発明では診断デバイスとして使用されるチップが提供される。このチップは非自己アドレス可能または自己アドレス可能であり得、通常９６メンバーまたはそれ以上に密なアレーまたは本明細書に記載されているようなアレーの形態を有する。
【０１８５】
１．非自己アドレス可能チップ
図１を参照すると、バイオルミネセンスを用いて生物学的サンプル中のアナライトを検出し、同定するための非自己アドレス可能な超小型電子デバイス１００は、アドレス制御回路１０２、光検出器アレー１０４、アナログマルチプレクサー１０６、比較器１０８、基準回路１１０、フィードバック制御回路１１２及び出力制御回路１１４を含む。アドレス制御回路１０２は外部発振器からのクロック入力信号１１６を受け取り、出力制御回路１１４はデータ出力信号１１８を発生する。デバイス１００はまた、外部電源（例えば、ＡＣ−ＤＣコンバータ）からそれぞれ電力及び接地を受けるための電気接続１２０及び１２２をも含む。従って、デバイス１００は４つの電気接続、すなわちクロック入力信号１１６、データ出力信号１１８、電力１２０及び接地１２２のみを必要とする。
【０１８６】
アドレス制御回路１０２はクロック入力信号１１６を受け取り、バス１２４−１２８上でアドレス信号を発生させ、前記バスはアドレス信号に応じてアレー１０４内の各画素素子を順次アドレス指定する。各画素素子は、画素をアドレスするために使用される行及び列アドレスを有する。アドレス制御回路１０２は、バス１２４上に表明された行アドレスを用いてアレー１０４内の画素素子の各行を順次アドレス指定する。各行について、アドレス制御回路１０２はバス１２６上にアナログマルチプレクサー１０６により選択信号として使用されるアドレス信号を発生し、またバス１２８上に下記するように画素素子に対してフィードバック信号を発生させるためにフィードバック制御回路１１２により使用されるアドレス信号をも発生する。アドレス制御回路１０２は、アドレス制御回路１０２、アレー１０４、マルチプレクサー１０６及び／またはフィードバック制御回路１１２に配置されている１つ以上のアドレスデコード回路により個々の行及び列アドレス許可信号にデコードされる二値アドレス信号を発生する。電子回路におけるアレーのアドレス指定は当業者に公知である。
【０１８７】
アレー１０４はアドレス制御回路１０２からの行アドレス信号１２４及びフィードバック制御回路１１２からのフィードバック信号１３０を受け取る。アレー１０４内の各素子は光検出器を含み、この光検出器は該光検出器に光学的に結合した化学反応からの光の光子を受け取る。これらの入力に基づいて、アレー１０４はアナログマルチプレクサー１０６に加えられるアナログ列出力信号１３２を発生する。アレーは、画素素子の各行をアドレス指定するために行アドレス信号１２４を使用し、下記する各画素素子でデルタ−シグマ−アナログ・デジタル（Ａ／Ｄ）変換を実施するときにはフィードバック信号１３０を使用し、デルタ−シグマＡ／Ｄ変換でも使用される列出力信号１３２を発生する。
【０１８８】
アナログマルチプレクサー１０６は、列出力信号１３２を多重化アナログ出力信号１３４に多重化するためにアドレス信号１２６を使用する。比較器１０８は多重化出力信号１３４を基準回路１１０が発生した基準信号１３６（例えば、基準電流）と比較し、比較の結果に基づいて量子化出力信号１３８を発生する。量子化出力信号１３８及びアドレス信号１２８はフィードバック制御回路１１２により使用されると、下記するようにアレー１０４に加えられるフィードバック信号１３０を発生する。また、アレー１０４中の各素子で検出される光の光子を示す量子化出力信号１３８が出力制御信号１１４により使用されると、データ出力信号１１８が発生する。
【０１８９】
１つの実施態様では、出力制御回路１１４は量子化出力信号１３８をアレー１０４中の各画素素子で検出される光を示すＲＳ−２３２直列データストリームにフォーマットする。外部機器またはコンピュータで、受領したＲＳ−２３２直列データストリームをアレー１０４中の特定画素素子と相関させるために、出力制御回路１１４は直列データストリームを同期信号（ｓｙｎｃ）により分離されたフレームに伝送する。各フレームはアレー１０４中の各画素素子に対する出力データ信号を含み、ｓｙｎｃ信号は各データフレームの開始を同定するためのコントロール信号として使用される任意の値（例えば、バイトは０．２５５の値を有する）である。外部コンピュータは、受領したフレームデータをアレー１０４中の適当な画素素子に相関させる前にｓｙｎｃ信号を待つ。或いは、出力制御回路１１４は画素素子を同定する直列データストリームに標識を含み得る。並列データインターフェースを使用することもできる。
【０１９０】
以下の記載から明らかとなるように、アレー１０４は、デバイス１００のために使用される半導体基板の表面上の複数のミクロ位置のアレーに配置された画素素子を含む。各素子は、各ミクロ位置で光学的に結合した化学反応により発せられる光の光子を受け取るため且つ受け取った光子を電荷に変換するための光検出器を含む。各素子は電荷を積算するために容量性回路を有する画素単位格子回路をも含む。積算された電荷はデルタ−シグマＡ／Ｄ変換方法を用いて量子化され、デジタル信号は外部コンピュータに連動する直列データ出力ストリームに多重化される。コンピュータはコントロールプログラムを実行して、所望の分解能に応じて数秒から数時間に亘る所望積算期間デルタ−シグマ信号を積算する。１つの実施態様では、デルタ−シグマＡ／Ｄ変換は５６Ｋボーインターフェースに対して計測し、約１０秒の積算時間では１２ビット分解能、約３分の時間では１６ビット分解能を達成する。
【０１９１】
図２を参照すると、デバイス１００はその表面上に規定されたアレー１０４を有する半導体基板またはダイ１４０を含む。アレー１０４は複数のミクロ位置１４２のアレー及び各ミクロ位置に光学的に結合した独立光検出器１４４を含む。（明瞭にするために図２には各行の最左のミクロ位置１４２及び光検出器１４４のみをラベルしている。）アレー１０４は、サイズが異なる３つのミクロ位置１４２を有する３つのサブアレー１４６、１４８及び１５０を含む。サブアレー１４６は５０ミクロン平方画素の４×１６アレー、サブアレー１４８は１００ミクロン平方画素の２×８アレー、及びサブアレー１５０は２００ミクロン平方画素の１×４アレーを含む。光検出器１４４は各ミクロ位置１４２でダイ１４０の表面の一部の上に配置されている。光検出器１４４が占める部分は大きな画素素子の場合表面の約９０％、より小さい画素素子の場合約５０％である。１つの実施態様では、光検出器は１４４はその表面に入射する光の光子を光電流に変換するシリコン光検出器である。この変換の量子効率は５００〜８００ｎｍの波長で約４０％である（すなわち、受容した光の１００光子につき４０電子の光電流が発生する）。すなわち、フォトダイオード１４４は低光子レベルを測定可能な信号に変換することができる。基板１４０の表面は、デバイス１００に適用される流体サンプルの収容を助けるために各ミクロ位置１４２でわずかに（例えば、１ミクロン）凹んでいる。
【０１９２】
アレー１０４は、デバイス１００を低コストで製造するために比較的小さいダイ１４０（例えば、２．４×２．４ｍｍ）で形成される。ダイ１４０は、その上に形成されたデバイス１００の電子回路（図２には図示せず）をも有し、ダイ１４０の外周辺はダイ上に形成されたトレースを介して電子回路に接続するボンディングパッド１５２を含む。パッド１５２は図３に示すようにワイヤーボンドまたは他のコンダクタによりダイ１４０の超小型電子パッケージの外部リードまたはコンダクタに結合している。パッド１５２はクロック入力信号１１６、データ出力信号１１８、電力１２０、接地１２２及び所望により各種試験信号のためのパッドを含む。１つの実施態様では、超小型電子デバイス１００は当業者に公知の標準ＣＭＯＳ方法を用いて製造される一体化回路デバイスである。
【０１９３】
アレー１０４中の大きな（例えば、２００ｕｍ）画素素子は小さな（例えば、５０ｕｍ）画素素子に比して低濃度アナライトの検出に対してより高い感度を有する。なぜならば、本明細書で説明するように化学反応が各ミクロ位置で起こったときにより多くの光子が放出されるように多数の受容体抗体が広い表面積に結合し得るからである。より多くのアッセイを同時に実施し得るように所与のダイサイズで大きなマトリックスを形成するためにより小さな画素を使用することができる。特定のアナライトを検出するための最適画素サイズは実験的に決定され得る。デバイス１００上にサイズの異なる画素素子を使用することには２つの利点がある。第１は、高感受性を必要とするアナライトを検出するためにはより大きな画素素子を使用することができ、低感受性を有するアナライトのためにマトリックス中の画素素子の数を多くするためにはより小さな画素素子を使用することができる。第２に、特定アナライトに対する最適サイズを実験的に決定するために異なるサイズを使用することができ、最適サイズを他の実施態様のアレー１０４に対して使用される。
【０１９４】
アレー１０４の代替配置は当業者には明らかである。例えば、アレー１０４は（図２に示すように）サイズの異なる画素素子のサブアレーを含み得、またはアレーは単一の画素サイズ（例えば、５０ミクロン画素の１２×１６アレー）を有する。各画素のサイズ（例えば、図２では５０、１００、２００ミクロン）は変更可能である（例えば、４００ミクロンの画素を使用し得る）。また、アレーまたはサブアレー（例えば、図２には４×１６、２×８または１×１６）中の画素の数は、ｎ行及びｍ列（ｎ及びｍは整数）を有するｎ×ｍアレーまたはサブアレーを含むように変更させ得る。更に、各画素素子に対して正方形以外の形状（例えば、長方形または円形）を使用し得る。より大きなダイを使用するとデバイス１００のコストは高くなるが、ダイ１４０のサイズは異なる配置のアレー１０４を収容するように変更し得る。クロック入力信号１１６、データ出力信号１１８、電力１２０及び接地１２２のための別個のパッドがあるが（図１）、ダイ１４０はより多くもしくはより少ないボンディングパッド１５２を含めることができる。
【０１９５】
図３及び３Ａを参照すると、ダイ１４０は４０ピンまたはリード１５６を有するセラミック製デュアルインラインパッケージ（ＤＩＰ）１５４に収容されている。４つのピン１５６がクロック入力信号１１６、データ出力信号１１８、電力１２０及び接地１２２のためである。他のピン１５６はテスト信号のために使用される。他の超小型電子パッケージ、例えば４つの必須コンダクタを含めたより多いもしくはより少ないコンダクタを有するプラスチック製パッケージも使用することができる。
【０１９６】
パッケージ１５４は、上表面１６０を有する上層１５８、上表面１６４を有する中間層１６２及び上表面１６８を有する下層１６６を有する。層１５８及び１６２は非導電性誘電材料（セラミック）から製造され、下層１６６はパッケージ１５４の接地ピン１５６に電気的に結合した導電性接地プレーン１７０を形成する。上層１５８の上表面１６０は第１の四角開口１７２を有する。上表面１６０上に形成された接地コンダクタトレース１７４は開口１７２を包囲し、パッケージ１５４の外周辺に形成されたカット１８０を通過して接地プレーン１７０に結合している、同じく上表面１６０上に形成された接地トレース１７６により接地に電気的に結合している。開口１７２は、第２四角開口１８２を有する中間層１６２の四角い部分を示す。第２開口１８２の大きさは、中間層１６２の上表面１６４の一部がパッケージ１５４の上から見えるように第１開口１７２の大きさよりも小さい。上表面１６４の目に見える部分は導電性パッド１８４を有し、この導電性パッド１８４は層１５８と１６２の間を通過するトレース（部分的に示す）を介してパッケージ１５４のピン１５６に電気的に接続している。開口１８２は、適当な接着剤１８６を用いて接着させたダイ１４０を有する接地プレーン１７０の四角い部分を示す。ダイ１４０の各ボンディングパッド１５２は結合ワイヤー１８８により１つの導電性パッド１８４に電気的に接続している。
【０１９７】
結合ワイヤー１８８は分析すべき流体サンプルに対して不浸透性の材料（例えば、エポキシ）で被覆されている。ピン１５６を除くパッケージ１５４の他の導電性構成部分も流体サンプルとの直接接触を防止するために前記材料で被覆してよい。パッケージ１５４のピン１５６は、パッケージ１５４を外部コンピュータまたは機器で読みとるときに該外部コンピュータまたは機器とピン１５６が電気的に接触するように前記材料で被覆しない。
【０１９８】
アッセイを実施する場合、分析すべき流体サンプルは開口１７２及び１８２を介してパッケージ内に収容されたダイ１４０（及びその上に形成されたミクロ位置）に適用される。流体サンプルをピペットを用いて開口１７２及び１８２により形成された試験ウェルに移すかまたは簡単にはサンプルが充填されている容器（図示せず）中にパッケージ１５４を浸すことにより流体サンプルは適用される。デバイス１００の各電気構成部分は、パッケージ１５４それ自体の材料またはエポキシコーティングによりサンプルから保護されている。流体サンプルを適用後、ミクロ位置１４２に光学的に結合させた発光反応を生じさせるのに必要な残りの成分も開口１７２及び１８２を介してダイ１４０の表面に適用される。次いで、生じた発光反応を図４に関連して以下に記載する光検出器１４４を用いて検出する。
【０１９９】
図４を参照すると、アレー１０４中の各画素素子の光検出器１４４は関連する画素単位格子回路２００を含む。好ましくは、各光検出器１４４はその表面に入射する光２０２の光子に応じて検知信号（すなわち、光電流）を発生するフォトダイオードである。各画素単位格子回路２００はこの検知信号を積算し、積算した信号をデルタ−シグマＡ／Ｄ変換方法を用いて量子化する。回路２００は図番２０４−２１２で示される５つのＭＯＳＦＥＴトランジスタＴ１−Ｔ５を含み、各トランジスタはゲート端子Ｇ、ソース端子Ｓ（矢印は酸化層に対する方向を示す）、ドレーン端子Ｄ及びベース端子（ラベルなし）を有する。トランジスタＴ１のゲートＧは２１４で示す行許可入力信号Ｒｅｎに接続しており、そのソースＳは電力供給電圧ＶＤＤに接続しており、そのドレインＤはＴ２のソースＳに接続している。トランジスタＴ２のゲートＧは２１６で示すフィードバック許可信号Ｆｅｎに接続しており、そのソースＳはＴ１のドレインＤに接続しており、そのドレインＤはノード３においてＴ３のソースＳに接続している。トランジスタＴ３のゲートＧは２１８で示す次の行許可信号Ｒｅｎ１に接続しており、そのソースＳはノード３に接続しており、そのドレインＤはノード１においてＴ４のゲートＧに接続している。フォトダイオード１４４のカソードもノード１に接続しており、そのアノードは接地に接続している。トランジスタＴ４のゲートＧはノード１に接続しており、そのソースＳはＶＤＤに接続しており、そのドレインＤはノード２においてＴ５のソースＳに接続している。トランジスタＴ５のゲートＧはＲｅｎ（２１４）に接続しており、そのソースＳはノード２に接続しており、そのドレインＤは出力端子２２０に接続している。各トランジスタＴ１−Ｔ５のベースはＶＤＤに接続している。トランジスタＴ２はトランジスタ間の僅かに狭い間隔を置いてそのゲートＧに対してポリシリコンの第２層を使用し、トランジスタＴ１及びＴ３−Ｔ５はポリシリコンの第１層のみを使用する。
【０２００】
ＩＤで示されるフォトダイオード１４４を流れる電流は２つの成分を含む。第１成分は、フォトダイオード１４４を流れる一定値を有する漏れ電流である。第２成分は、フォトダイオードの量子効率を考慮して場合により各ミクロ位置１４２に光学的に結合した、発光化学反応のためにフォトダイオード１４４に入射する光子０２により生ずる電流である。電流ＩＤは、漏れ電流及びフォトダイオード１４４に入射する光子の数に依存する割合でノード１を接地に対して放電する。ノード１は大量の光を受け取ったときには比較的素早く、光が殆どもしくは全く存在しないときには比較的ゆっくり放電する。光が存在しないときでも、ノード１はＩＤの漏れ成分のために放電する。ＩＤの光電流成分は、発光反応が起こらないときには暗読みとり値を取り、反応が起こるときには試験読みとり値を取り、暗読みとり値を用いて試験読みとり値を補正することにより（例えば、試験読みとり値から暗読みとり値を引くことにより）漏れ電流成分から分離することができる。暗読みとり値を実際の試験を実施する前及び／またはその後に得ることができる。
【０２０１】
少しの間図１に戻ると、出力端子２２０から流れる出力電流ＩＯＵＴは、アナログマルチプレクサ１０６により多重化されて比較器１０８に入力される多重化出力信号１３４を形成する列出力信号１３２である。比較器１０８は検知信号が電流であるのでＩＯＵＴを一定電圧に維持し、信号１３４と基準電流１３６との比較に基づいて量子化出力信号１３８を発生する。フィードバック制御回路１１２は量子化出力信号１３８及びアドレス信号１２８に基づいてフィードバック信号１３０を発生し、この信号１３０は許可信号Ｆｅｎ（２１６）を形成する。各画素素子のＦｅｎは、次の画素素子がアドレス指定される間発生する。アドレス制御回路１０２が次の行の画素素子をアドレス指定して、Ｒｅｎ（２１４）をその行に対して表明させると、次の行許可信号Ｒｅｎ１（２１８）も当業界で公知のアドレスデコード回路を用いて前の列の画素素子に対して表明される。
【０２０２】
図４に戻ると、画素単位格子回路２００は以下のように作動する。フォトダイオード１４４に入射した光子２０２は、受け取った光の光子の数、フォトダイオードの量子効率及び一定の漏れ電流に依存する割合でノード１を放電する電流ＩＤを発生する。この画素素子がアドレス制御回路１０２によりアドレス指定される（すなわち、Ｒｅｎが活性化される）と、トランジスタＴ１及びＴ５が作動する（すなわち、導電性になる）。Ｔ５が導電性で、出力端子２２０が比較器１０８によりＶＤＤ未満の一定電圧に保持される場合、トランジスタＴ４はＶＤＤ−ＶＴ間の差及びノード１における電圧に比例して電流を生ずる。ＶＴはトランジスタしきい値電圧（例えば、約１Ｖ）である。この電流はＩＯＵＴとしてトランジスタＴ５を流れる。マルチプレクサ１０６を通過した後、ＩＯＵＴを差動電流増幅器を含む比較器を用いて基準電流１３６と比較する。量子化出力信号１３８は、ＩＯＵＴが基準電流１３６未満のときには比較器１０８により０にリセットされ、ＩＯＵＴが基準電流１３６より大きいときには１にセットされる。
【０２０３】
ＩＯＵＴが基準電流１３６未満（すなわち、量子化出力信号１３８＝０）のとき、フィードバック制御回路１１２はフィードバック信号１３０（すなわち、Ｆｅｎ＝０）の割り込みを抑制して、トランジスタＴ２を非導電性状態に維持する。従って、ノード３における電圧は変化を受けず、ＩＤはノード１を放電し続ける。ＩＯＵＴが基準電流１３６を越えるとき（すなわち、量子化出力信号１３８＝１）、フィードバック制御回路１１２はフィード信号１３０（すなわち、Ｆｅｎ＝１）を作動させて、Ｔ１をＲｅｎによりなお作動させながらＴ２を作動させる。これにより、ノード３における静電容量（すなわち、ＭＯＳＦＥＴの固有ソース及びドレイン−バルク静電容量）はＶＤＤにセットされる。Ｔ１及びＴ２のトランジスタはその直線領域に入り、電流が流れないので、Ｔ１またはＴ２を横切る明白な電圧低下はない。次の行をアドレス指定する（Ｒｅｎ１を１にセットする）と、容量性回路上の電荷がノード１に移り、ノード１における電圧が上昇する。従って、ＩＯＵＴが基準電流１３６を越えて遷移するときにはいつでも容量性回路は初期電圧にリセットされる。この電荷移動は切換容量性回路において一般的であり、当業者に公知である。ノード１の放電が比較器１０８をトリップさせるに十分になる前の期間ＩＤは静電容量を放電するので、静電容量はフォトダイオード１４４を流れるＩＤを効果的に積算する。
【０２０４】
初期値にリセットされた後、ＩＯＵＴが再び基準電流１３６を越え、ノード１が再び再充電されるまでノード１における静電容量も再びＩＤの大きさに依存する割合でフォトダイオード１４４により放電される。従って、ノード１は、基準電流１３６を生成するためにＴ４が必要とする電圧値に近い電圧に維持される。比較器１０８が超過した基準電流１３６を検知する回数（すなわち、比較器ポジティブ遷移“comparator positive transitions”）はフォトダイオード１４４を流れた総電荷に比例する。上記したように、ＩＤは一定漏れ電流と検知した光子２０２による電流の和である。よって、ある期間中の比較器ポジティブ遷移の数をフォトダイオード１４４を流れる漏れ電流に対して暗読みとり値を引くことにより調節した後その数をａｃｃ放出反応のために使用することができる。上記したように、量子化出力信号１３８は、データ出力信号１１８として外部コンピュータに伝送されるＲＳ−２３２直列データストリームにフォーマットされる。
【０２０５】
図５を参照すると、デバイス１００の操作中のノード１、２及び３の電圧が示されている。ノード１、２及び３の電圧をそれぞれ曲線２２２、２２４及び２２６で示す。ｘ軸は時間（ｍｓｅｃ）、ｙ軸は電圧（Ｖ）を示す。ノード１及び３における電圧は、曲線２２２及び２２６の下向き勾配部分の殆どの間本質的に等しく、違いは図５に示す通りである。各サイクルの開始時（すなわち、ノード３で電圧が大きくスパイクする度に生ずる各比較器ポジティブ遷移時）、ノード１の電圧はノード３がＶＤＤにセットされるときの初期値に再充電される。その後、ノード１は、フォトダイオード１４４により検出される光の量に依存する割合でＩＤにより放電される。フォトダイオード１４４が比較的大量の光を受け取るときには曲線２２２の勾配は急激に減少し、フォトダイオード１４４が光を殆どもしくは全く受け取らないときには勾配は緩やかに減少する。ノード１における電圧とＶＤＤ−ＶＴの差により生ずる電流ＩＯＵＴを画素をアドレス指定する度に（約０．１ｍｓｅｃ毎に）基準電流１３６と比較する。ＩＯＵＴが基準電流１３６未満のときには、回路２００はノード１を放電し続けることによりフォトダイオード１４４からの検知信号を積算し、ノード１の電圧は曲線２２２に示すように低下する。ＩＯＵＴが基準電流１３６を越えるときには、Ｆｅｎによりノード３における静電容量がＶＤＤにリセットされる。その後、次の行がアドレス指定されると（すなわち、Ｒｅｎ１がセットされる）、この容量性回路上の電荷がノード１に移され、それによりノード１の電圧が高まる。このサイクルは積算期間中繰り返される。外部コンピュータは、データ出力信号１１８を用いて積算期間中に生じる比較器ポジティブ遷移の数を計数する。積算が完了したら、コンピュータは暗読みとり値を用いて漏れ電流を補正する。補正した計数が流体サンプル中のアナライトの濃度に比例する。
【０２０６】
図６を参照すると、発光反応を用いて流体サンプル中のアナライトを検出・同定するためのシステム３００はアダプタ回路ボード３０２、コンピュータ３０４，入力デバイス３０６及び出力デバイス３０８を含む、システム３００は試験機器を形成する。ボード３０２は分析すべき流体サンプルに浸漬させ、次いで発光化学反応の残りの成分に接触させた後、パッケージ１５４内に収容されているデバイス１００を受容するための無挿入力（ＺＩＦ）ソケット（図示せず）を含む。ボード３０２はクロック入力信号１１６を発生させるための発振器回路３１０及び外部ＡＣ電源３１４からのＡＣ電力を受け取り、そこからＤＣ電力信号を発生させるためのＡＣ−ＤＣ電源３１２をも含む。ＲＳ−２３２直列データケーブル３１６は、ボード３０２からの直列データ出力信号をコンピュータ３０４に運ぶ。
【０２０７】
コンピュータ３０４は処理回路３１８，記憶回路３２０及び直列インターフェース回路３２２を含む。処理回路３１８は、入力デバイス３０６からの入力信号３２４を受け取り、出力信号３２６をＩ／Ｏインターフェース回路（図示せず）を介して出力デバイス３０８に伝送するマイクロプロセッサまたはマイクロコントローラのような中央処理装置を含む。記憶回路３２０は、揮発性メモリ及び非揮発性メモリを含めた３つの記憶領域３２８−３３２を含む。記憶領域３２８は処理回路３１８により実行される制御プログラム及び実行中に必要な固定及び可変データ（例えば校正及び実験テストデータ）を蓄積している。任意の記憶領域３３０はアレー１０４中の各ミクロ位置で試験される特定アナライトを同定するために処理回路３１８により使用されるアナライトマップを蓄積している。マップがあるとき、処理回路３１８は、受け取ったデータ出力信号１１８をマップ中の同定されるアナライトと相関させることにより流体サンプル中で検出されたアナライトを同定し、出力信号３２６を発生して出力デバイス３０８で検出したアナライトを同定するためのプログラムを組み込むことができる。記憶領域３３２は、積算期間中に各画素素子に対する比較器ポジティブ遷移を蓄積させるために処理回路３１８により使用されるデータ獲得アレーを蓄積する。この期間に受け取った比較器ポジティブ遷移の数が各画素素子で光検出器１４４が受け取った光の数を示す。
【０２０８】
入力デバイス３０６は、例えばキーボード、マウス、タッチスクリーンまたはシステム３００の動作を制御するために使用される入力信号３２４を発生させるための他の入力デバイスを含む、デバイス３０６からの入力信号３２４により、使用者は例えばシステム３００の動作のスタート・ストップ、アナライトマップデータの入力、所望積算時間の入力、及び分析すべき流体サンプル中のアナライトを検出及び同定するために処理回路３１８が必要な他のデータまたはコマンドの入力を行うことができる。入力信号３２４は、所定の配置のアレー１０４を有する特定デバイス１００を読みとるべくコンピュータ３０４を構成するために使用することもできる。出力デバイス３０８は、出力信号３２６に応じて分析される流体サンプル中の存在及び／または濃度を表示するための電子ディスプレイを含み得る。出力デバイス３０８は前記データを表示するためのプリンタをも含み得る。
【０２０９】
１つの実施態様において、使用者は試験を始める前に所望の積算時間を入力デバイス３０６を用いてコンピュータ３０４に入力する。例えば、使用者は１２ビット分解能の場合１０秒、１６ビット分解能の場合３分を入力する。次いで、使用者は分析すべき流体サンプルを（例えば、サンプルを保持している容器中にパッケージ１５４を浸すことにより）デバイス１００に適用し、発光反応の残りの成分を添加し、パッケージ１５４をボード３０２上のＺＩＦソケットに挿入する。その後、デバイス１００はケーブル上の複数のデータフレームをコンピュータ３０４に伝送する。各フレームはアレー１０４中の各画素素子につき量子化デルタ−シグマＡ／Ｄ変換データを含む。処理回路３１８はデータフレームの開始を決定するためにｓｙｎｃバイトを待機する。いったんフレームが開始すると、処理回路３１８は（アレー１０４の公知の配置に基づいて）各フレームで受け取ったデータをアレー１０４中のミクロ位置１４２と相関させ、各ミクロ位置１４２と相関させた出力データ信号をデータ獲得アレー３３２中のそれぞれの位置の比較器ポジティブ遷移を蓄積することにより積算する。遷移は所望の積算期間蓄積される。積算期間が終了したら、処理回路３１８は積算データを補正して、（発光反応を始める前にボード３０２にパッケージ１５４を挿入することにより）既に得た暗読みとり値に基づいて光検出器１４４により漏れ電流を補正する。この時点で、アレー３３２の各位置における補正データは試験される流体サンプル中のアナライトの存在に関連している。次いで、処理回路３１８は出力信号３２６を発生し、この出力信号３２６が出力デバイス３０８に適用されると出力デバイス３０８が補正データを表示する。この補正データは、公知濃度のアナライトを用いて実験的に求めた関係により試験した各アナライトの存在及び／または濃度と相関している。
【０２１０】
別の実施態様では、試験を始める前に、アレー１０４中の各ミクロ位置１４２において試験されるアナライトの身元を含む任意のアナライトマップを（恐らく入力デバイス３０６を用いて）記憶領域３３０に組み入れた。次いで、出力デバイス３０８上に表示するために補正データを簡便に出力する代わりに、処理回路３１８はアナライトを同定するためにデータ獲得アレー３３２中の位置をアナライトマップと相関させる別のステップを実施し、補正データが示すアナライトを同定するために出力信号３２６を発生する。
【０２１１】
更に別の実施態様では、記憶領域３２８に蓄積されているデータは分析する流体サンプル中の各アナライトの存在を示すしきい値データを含む。各アナライトに関するしきい値データは、既知の最小濃度のアナライトを含む流体サンプルを用いて実験的に決定され得るか、または単に暗読みとり値からのオフセットとして蓄積され得る。その後、処理回路３１８はしきい値に対して補正データ（またはオフセットを使用するときには暗読みとり値に対して未補正データ）を比較して、分析される流体サンプル中にアナライトが存在するかを調べる。その後、流体サンプル中に存在するアナライトが表示または印刷されるように出力信号３２６を発生させる。この実施態様では、アナライトマップを使用して処理回路３１８によりサンプル流体中の存在を検出するアナライトを同定することができる。
【０２１２】
更に別の実施態様では、記憶領域３２８内のデータは補正データと試験されるアナライトの濃度との関係を示す実験的に求めた方程式、曲線または表を含む。前記方程式、曲線または表を求める方法は当業界で公知であり、その方法にはコンピュータ曲線のあてはめ法が含まれ得る。処理回路３１８はサンプル中の各アナライトの濃度を決定するために補正データを上記方程式、曲線または表に対する入力データとして使用する。サンプル中に存在するアナライトの濃度を表示または印刷するように出力信号３２６が発生する。この実施態様でも、処理回路３１８によりサンプル流体中の濃度を決定したアナライトを同定するためにアナライトマップを含むことができる。
【０２１３】
システム３００はデバイス１００を評価するために有用なキットを提供する。このシステムでは使用者がパッケージ１５４を直接取り扱う必要があり、そのためピン１５６が機械的に損傷したり、回路１００が静電放電により損傷する恐れがある。使用者が直接取り扱う必要がなくなるように、デバイス１００を図７に示すように使い捨て試験回路ボード４００上に載置させることができる。デバイス１００をセラミックＤＩＰパッケージ１５４にパツケージしたり、またはボード４００上に載置される別の形式の超小型電子パッケージ４０２（例えば、リードレスチップ担体）にパツケージすることができる。多種多様の超小型電子パッケージが当業界で公知である。使用者がボード４００を取り扱うだけで十分であり、パッケージ４０２を直接取り扱う必要がないようにパッケージ４０２をボード４００に接着（例えば蝋接）させる。
【０２１４】
パッケージ４０２は、それぞれクロック入力信号、データ出力信号、電力及び接地のためのボード上４００に形成されたトレース１１６−１２２に電気的に結合されるリードまたはピン１５６を含む。パッケージ４０２が高圧用途のコストを下げるために上記した４つのピンのみを使用することができる。トレース１１６−１２２はコネクタ４０６に連結しているケーブル４０４に電気的に結合しており、コネクタ４０６は試験機器またはコンピュータ上の合わせコネクタに結合している。パッケージ４０２、トレース１１６−１２２及びボード４００の表面の導線はエポキシコーティング４０８により分析すべき流体サンプルから保護されている。コーティング４０８は、流体サンプル及び発光反応の残りの成分をデバイス１００に適用させ得るように開口１７２及び１８２またはダイ１４０には適用されない。
【０２１５】
また、マルチウェルチップは３層から構成される（例えば、図８〜１１）。下層は各ウェルの下部部分を形成し、半導体層、各ウェルの底部にフォトダイオード及びアノード電極、すなわち各ウェルを包囲している金属ワイヤーを組み込んでいる。中間層は下層の溝に嵌合しており、反射性金属層、絶縁層、好ましくはＭＹＬＡＲ（Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．から市販されている配向ポリエチレンテレフタレート）のような誘導化プラスチックまたはシリコンからなり、絶縁層に各ウェルにつき特異的抗体またはリガンドが結合している（例えば、ＭＹＬＡＲに結合した抗体、図１０参照）。上部キャップ層は各ウェルの残りの上部を形成しており、カソード電極を含んでいる。アナライトまたは試薬は、直流を供給するかまたは電流の極性を反転させることによる自由電解電気泳動により上部カソード及び下部アノードを介してウェル内またはその中に輸送され得る（例えば、図１１参照）。
【０２１６】
使用する場合、チップをサンプルと接触させ、十分洗浄する。レベルがカソード位置よりも上になるまで緩衝液または他の適当な組成物を各ウェルに添加する。次いで、チップを、抗体またはその抗体結合部分に複合化、融合または他の方法で結合させたルシフェリンまたは好ましくはルシフェラーゼ、または前記した複数の融合物を含む組成物と接触させる。抗体またはその一部のそれぞれは当該抗原に対して特異的である。バイオルミネセンス発生系の残りの成分を添加し、チップをワイヤーハーネスを用いて電源に接続する（例えば、図１１の下参照）。生じた光は各ウェル内に含まれ、各ウェルの底部に配置されているフォトダイオードにより検出される。反射性表面により信号は強化される。検出された信号は本質的に上記したコンピュータ処理装置に中継し、コンピュータは検出したウェルを同定し、その後検出された特定の感染性物質を付属モニターまたはプリントアウト上に表示する（例えば、図２０参照）。
【０２１７】
２．自己アドレス可能なチップ
自己アドレス可能なチップ（例えば、図１２〜１６参照）はマトリックス、絶縁層及び金属層を含み、この金属層に結合層及び透過層が固定されている。チップは放出された光を検出する光検出器を含む。
【０２１８】
ａ．マトリックス材料
マトリックスまたはチップは、本発明で提供されるデバイスを製造するための基板として使用され得る。前記基板は粒子、ステランド、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、薄片、フィルム、プレート、スライド等として存在する生物学的もしくは非生物学的で有機もしくは無機材料またはその組合せからなり得る。前記基板は円板、四角、球及び円形のような任意の形状をとり得る。基板及びその表面は好ましくは、その上で本明細書に記載の反応を実施する剛性支持体を形成する。基板及びその表面は、適切な光吸収特性を与えるように選択されなければならない。例えば、基板は重合Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、修飾シリコン、（ポリ）テトラフルオロエチレンや（ポリ）ビニリデンジフルオリド、またはその組合せのような各種ポリマーであり得る。他の基板材料は本明細書の記載から当業者に自明である。現在好ましくは、シリカ基板が超小型電子チップデバイスを製造するために使用される。
【０２１９】
ｂ．製造方法
ｉ．ミクロリソグラフィ
国際特許出願公開第ＷＯ９５／１２８０８号明細書及び同第ＷＯ９６／０７９１７号明細書には、小さなミクロ位置を多数有する複雑な“チップ”型デバイスの製造のために使用され得る一般的なミクロリソグラフィまたはフォトリソグラフィが記載されている。デバイスの製造には複雑なフォトリソグラフィを必要としないが、材料の選択及び電子デバイスが水溶液中で実際機能する要件を特に考慮する必要がない。
【０２２０】
国際特許出願公開第ＷＯ９５／１２８０８号明細書の図１４に示されている６４ミクロ位置デバイスは、比較的簡単なマスクデザイン及び標準的なミクロリソグラフィを用いて製造され得る。通常、ベース基板材料は１〜２ｃｍ２シリコンウェハまたは約０．５ｍｍ厚さのチップである。シリコンチップをまず、プラズマ強化化学蒸着方法（ＰＥＣＶＤ）により１〜２μｍ厚さの二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）絶縁コートで被覆する。
【０２２１】
好ましくは、チップは、半導体層に組み込まれ、導波管または他の手段のような光学パスによりチップの他の光学パスに結合した検出器素子、例えば光検出器を含むように設計される。好ましい実施態様では、検出器素子は１〜５ミクロン、好ましくは１〜２ミクロンの概略分解能を有するフォトダイオードの直線アレーからなる。チップを有して配置された検出器を用いて、試験サンプル中の標的は生物学的分子または抗リガンドの結合部位で同定され得る。
【０２２２】
次のステップでは、０．２〜０．５μｍの金属層（例えば、アルミニウム）を真空蒸発により蒸着させる。アルミニウムの他に、電子回路のために適当な金属には、金、銀、スズ、銅、白金、パラジウム、炭素及び各種金属の組合せが含まれる。異なる金属を用いて絶縁基板材料（ＳｉＯ２）への適切な結合を確実にするための特別な方法が使用される。
【０２２３】
次に、チップをポジティブホトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ  ＡＺ  １３５０  Ｊ）で被覆し、電子回路パターンでマスクし（光照射野）、露光し、現像する。光溶解したレジストを除去し、露出したアルミニウムをエッチングして除去する。レジスト島を除去するとチップ上にアルミニウム回路パターンが残る。これには、金属接触パッドの外周辺、接続回路（ワイヤー）、及びアドレス可能なミクロ位置の基層として作用するミクロ電極の中央アレーが含まれている。
【０２２４】
ＰＥＣＶＤを用いて、チップにまず０．２〜０．４ミクロンのＳｉＯ２層、次に０．１〜０．２ミクロンの窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）層を被覆する。次いで、チップをポジティブレジストで被覆し、接触パッド及びミクロ電極位置をマスクし、露光し、現像する。光溶解したレジストを除去し、ＳｉＯ２層及びＳｉ３Ｎ４層をエッチングして除去してアルミニウム接触パッド及びミクロ電極を露出させる。その後、周囲の島レジステを除去し、接触パッド及びミクロ電極間の接続ワイヤーがＳｉＯ２層及びＳｉ３Ｎ４層により絶縁されて残る。
【０２２５】
ＳｉＯ２層及びＳｉ３Ｎ４層はデバイスの機能のために重要な特性を与える。第１に、ＳｉＯ２層はアルミニウム回路とのより良好な接触及び改良されたシール特性を有する。絶縁しシールするためにレジスト材料を使用することも可能である。これにより、ミクロ電極が作動しているときに電解効果のために回路が浸食されるのが防止される。Ｓｉ３Ｎ４の最終表面層コーティングは、特定結合物(specific binding entities)の結合のためのミクロ電極表面を修飾するためにその後使用される試薬との反応性が非常に低いので使用される。
【０２２６】
この時点で、デバイス上のミクロ電極位置は、デバイスの活性機能のために必要な重要な素子である特別の透過・結合層で修飾されている。その目的は、ミクロ電極上に選択的な拡散特性を有する中間透過層及び最適の結合特性を有する結合表面層を生成させることにある。結合層は特定結合物を最適に結合させるために１０５〜１０７官能化位置／μｍ２を有することが好ましい。特定結合物の結合は下層のミクロ電極の機能を妨げるように表面を被覆または絶縁してはならない。機能デバイスは、溶媒（Ｈ２Ｏ）分子が接近でき、対イオン（例えば、Ｎａ＋及びＣｌ−）及び電解ガス（例えば、Ｏ２及びＨ２）が拡散できるように実際の金属電子−電極表面の一部（〜５％〜２５％）を必要とする。
【０２２７】
中間の透過層は拡散を生じ得るものでなければならない。また、透過層は、大きな結合物、反応物質及びアナライトがミクロ電極表面と物理的に接触するのを防止または妨害する細孔限界特性を有していなければならない。透過層により活性ミクロ電極表面はミクロ位置の結合物層から物理的に離れている。
【０２２８】
主要なデバイス機能に関して、この設計により電気泳動輸送に必要な電解反応がミクロ電極表面上で起こるが、結合物、反応物質及びアナライトに対する好ましくない電気化学的影響を避けることができる。
【０２２９】
金属のミクロ電極表面を誘導化させるための１つの好ましい方法はアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）を使用する。ＡＰＳは迅速に金属及びシリコン表面上のオキシド及び／またはヒドロキシル基と反応する。ＡＰＳにより、その後結合物を共有結合するための第１級アミン基で浸透層及び結合層が合体される。表面結合部位に関して、ＡＰＳはわずかに酸化したアルミニウム表面に対しては比較的高レベルの官能化（すなわち、多数の第１級アミン基）、ＳｉＯ２表面に対しては中間レベルの官能化及びＳｉ３Ｎ４表面に対しては非常に低い官能化を生ずる。
【０２３０】
ＡＰＳ反応は、デバイス（例えば、チップ）の全表面を１０％−ＡＰＳのトルエン溶液と５０℃で３０分間処理することにより実施される。次いで、チップをトルエン、エタノールで洗浄し、５０℃で１時間乾燥する。ミクロ電極の金属表面は多数の第１級アミン基（１０５〜１０６／μ２）で官能化される。結合物を誘導化したミクロ電極表面に共有結合させることができる。
【０２３１】
ｉｉ．微細機械加工
国際特許出願公開第ＷＯ９５／１２８０８号明細書及び同ＷＯ９６／０７９１７号明細書には、デバイスを製造するための微細機械加工方法（例えば、ドリリング、ミリング等）及び非リソグラフィ方法が記載されている。通常、ミクロリソグラフィで製造されるデバイスよりも比較的大きなミクロ位置（＞１００ミクロン）を有するデバイスが得られる。得られたデバイスは分析用途及びバイオポリマー合成のような製造用途に使用することができる。大きなアドレス可能位置が、多量の結合物を担持するために３次元フォーマット（例えば、チューブまたはシリンダー）で製造され得る。前記デバイスは各種材料を用いて製造され得、その材料にはプラスチック、ゴム、シリコン、ガラス（例えば、ミクロチャネル、ミクロキャピラリー等）、セラミックスが含まれるが、これらに限定されない。微細機械加工されるデバイスの場合、接続回路及び大きな電極構造物は当業界で公知の一般的な回路ボード印刷法を用いて材料の上に印刷することができる。
【０２３２】
本発明の用途では、半導体層に組み込まれ、例えば導波管または他の手段を用いて光学パスを介してチップの他の光学パスに結合させた検出素子、例えばフォトダイオードを含むようにチップを設計することが好ましい。好ましい実施態様では、検出素子は１〜５ミクロン、好ましくは１〜２ミクロンの概略分解能を有するフォトダイオードの直線アレーからなる。チップと配置された検出器を用いて、試験サンプル中の標的は生物学的分子または抗リガンドの結合部位で同定され得る。
【０２３３】
アドレス可能なミクロ位置デバイスは、微細機械加工方法を用いて比較的簡単に製造され得る。ＷＯ９５／１２８０８の図１５には、代表的な９６ミクロ位置デバイスの概略図が示されている。このミクロ位置デバイスは適当な材料ストック（２ｃｍ×４ｃｍ×１ｃｍ）から、材料に９６個のバランスよく離れた穴（直径１ｍｍ）をあけることにより製造される。プラスチック材料ストックの薄シート上に電極回路ボードを形成し、この回路ボードをミクロ位置の構成成分の上部の上に正確に取り付ける。回路ボードの下側は各ミクロ位置に対して個々のワイヤー（印刷回路）を含む。短い白金電極構造物（〜３〜３４ｍｍ）が各ミクロ位置のチャンバに延びるように設計されている。印刷回路配線を適当な防水性絶縁材料で被覆する。印刷回路配線を、多重スイッチコントローラ及びＤＣ電源に接続するソケットに集中させる。デバイスを一般的な緩衝液リザーバ中に部分的に浸漬し、作動させる。
【０２３４】
デザインは違うが、微細機械加工方法及びミクロリソグラフィ方法により製造されたデバイス中のミクロ位置の主要機能は同じである。ミクロリソグラフィ法により製造されたデバイスでは、透過層及び結合層は下層の金属ミクロ電極上に直接形成される。微細機械加工方法により製造したデバイスでは、透過層及び結合層はそれぞれの金属電極構造物から各リザーバの各チャンバ中の緩衝溶液により物理的に離れている。微細機械加工されたデバイスでは、透過層及び結合層は官能化親水性ゲル、膜または他の適当な多孔性材料を用いて形成され得る。
【０２３５】
一般に、合体された透過層及び結合層の厚みは１０μｍ〜１０ｍｍの範囲である。例えば、デバイス中の各ミクロ位置チャンバを部分的に（〜０．５ｍｍ）充填するために２６％〜３５％ポリアクリルアミド（０．１％ポリリシンと一緒に）の変性親水性ゲルを使用することができる。ゲルのこの濃度は２ｎｍ〜３ｍｍの細孔限界を有する理想的な透過層を形成する。ゲル中に含まれるポリシランにより、その後の特定結合物の結合のための第１級アミン官能基が与えられる。このタイプのゲル透過層により、電極はＤＣモードで活性的に機能し得る。電極が活性化されると、小さな対イオンはゲル透過層を通過できるが大きな特定結合物分子は外表面に集中する。この大きな特定結合物分子は第１級アミンの外層に共有結合するようになり、効果的に結合層になる。
【０２３６】
透過層及び結合層を形成するための別の方法では、各ミクロ位置チャンバのベースに多孔性膜材料を含有させる。次いで、膜の外表面を化学官能基で誘導化して結合層を形成する。この方法を実施するための適当な方法及び材料は当業者に公知である。
【０２３７】
デバイスの設計及び製造に関する上記記載は基本デバイスの他の変形または形態を限定するものと考えるべきではない。各種分析及び製造用途のためにアドレス可能なミクロ位置の数がより多いもしくは少ないデバイスの多く変更が考えられる。より多くのアドレス可能位置を有するデバイスの変更はバイオポリマー合成用に考えられる。変更例は、ミクロリソグラフィ法で製造されるデバイスを含めた他のデバイスと共に使用される電気的にアドレス可能で制御可能な試薬デイスペンサとしても考えられる。
【０２３８】
ｃ．チップの自己アドレス化
国際特許出願公開第ＷＯ９５／１２８０８号明細書及び同ＷＯ９６／０７９１７号明細書に記載されているチップ及びデバイスは、特定結合物を有する各ミクロ位置を電子的にアドレスし得る。このデバイスそれ自体が、特定結合物の特定ミクロ位置への輸送及び結合に直接作用したり生起させる。このデバイスそれ自体は、特定結合物を特定ミクロ位置に物理的に方向付けたり、位置づけたりまたは配置するために必要な外部方法、機構または装置がない点で自己組立される。この自己アドレス方法は迅速で特異的であり、連続もしくは並行方法で実施され得る。
【０２３９】
デバイスは、特定ミクロ位置をＤＣモード及び特定結合物とは反対の電荷（ポテンシャル）で維持することにより特定結合物で連続的にアドレス指定され得る。他のミクロ位置は全て特定結合物と同じ電荷で維持される。結合物がミクロ位置の結合部位を越えないときには、特定ミクロ位置への静電輸送に作用するためにたった１つの他のミクロ電極を活性化する必要がある。特定結合物は溶液中を迅速に（数秒で、好ましくは１秒未満で）輸送され、特定ミクロ位置に直接集中し、そのミクロ位置で直ちに特定表面に共有結合するようになる。特定ミクロ位置（７２）上に反応物質またはアナライト（７０）が電子的に集中する能力は上記特許の図７に記載されている。他のミクロ位置はすべて特定結合物による影響を受けずそのままである。未反応結合物は、特定ミクロ位置の極性を逆転させ、廃棄位置に電気泳動することにより除去される。所望のミクロ位置がすべてその特定結合物でアドレス指定されるまで上記サイクルは繰り返される。上記特許の図８には、特定のミクロ位置（８１、８３、８５）が特定のオリゴヌクレオチド結合物（８２、８４、８６）でアドレス指定するための一連の方法が示されている。
【０２４０】
ミクロ位置をアドレス指定するための並行方法は、同じ特定結合物が輸送され、集中し、１つ以上の特定ミクロ位置と反応するように多数（特定のグループ及びライン）のミクロ電極を同時に活性化することを含む。
【０２４１】
使用する場合、チップを体液（特に、尿、唾液、血液）のようなサンプルと接触させる。次いで、チップを抗体またはその抗体結合部分に複合化、結合または融合したルシフェリン、好ましくはルシフェラーゼまたはその融合物の組合せを含む組成物と接触させる。抗体及びその一部はそれぞれ当該抗原に対して特異的である。検出は、チップをフォトダイオードにより検出される光を発生するバイオルミネセンス発生系と反応させて実施される。
【０２４２】
３．チップ表面への生物学的分子の結合
タンパク質、核酸及びペプチド核酸を含めた生物学的分子を固体支持体に結合させるために多種多様の方法が公知である（例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｐａｒｔ  Ｂ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．３４，Ｂ．Ｊａｋｏｂｙ，Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｋ編，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４）及びＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４２，Ｒ．Ｄｕｎｌａｐ編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎ．Ｙ．（１９７４）；米国特許第５，４５１，６８３号明細書参照；また米国特許第５，６２４，７１１号明細書、同第５，４１２，０８７号明細書、同第５，６７９，７７３号明細書、同第５，１４３，８５４号明細書参照）。特にシリコンチップは公知である。
【０２４３】
これらの方法は通常、固体支持体表面上に反応性基の均一層を形成するための固体支持体の誘導化及びその後の反応性基と生物学的分子上に存在する反応性部分との共有結合を介する誘導化された表面への生物学的分子の結合を含む。現在好ましい方法は、誘導化及びシリカ基板に対する生物学的分子の結合のために適用され得る方法、特に超小型電子チップデバイスのシリカ表面を誘導化するための方法である。
【０２４４】
ａ．シリカ基板の誘導化
シリカ表面を誘導化する方法または表面をシリカで被覆した後その表面を誘導化する方法は多く公知である。シリカ表面を誘導化するために多数の試薬が使用され得る。例えば、米国特許第４，６８１，８７０号明細書は遊離のアミノまたはカルボキシル基をシリカマトリックスに導入する方法を記載している。或いは、遊離アミノ基またはカルボキシル基の層はアミノ−及びカルボキシメチルシラン誘導体、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、４−アミノブチルトリエトキシシラン、（アミノエチルアミノメチル）フェネチルトリメトキシシラン、２−（カルボメトキシ）カチルトリクロロシラン、（１０−カルボメトキシデシル）ジメチルクロロシラン及び２−（カルボメトキシ）エチルメチルジクロロシラン（例えば、Ｈｕｌｌｓカタログ参照）を用いて導入され得る。
【０２４５】
シリカ表面をアルキル−及びアルコキシアルキルハロゲン化シラン誘導体を用いて誘導化してヒドロキシ基の層を導入することもできる。トリアルコキシシランのアルコキシ基はその対応シラノール種に加水分解されるが、この加水分解は水溶液を型どおりに調製中にまたはシランとシリカ基板上の吸収水分との反応中に生じ得る。シラノールは通常相互にまたはアルコキシシランと縮合してシロキサンを形成する。シラノール含有物質はシリカ表面上のヒドロキシル基と反応する非常に反応性の中間体である（例えば、Ｍｏｈｓｅｎら，Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｒｅｈａｂｉｌ．  ２２：２１３−２２０（１９９５）参照）。更に、シリカマトリックスはアルカリ条件下でハロゲン化シアンで処理しても活性化され得る。抗リガンドは、活性化表面に添加すると表面に共有結合される。
【０２４６】
適当な誘導化試薬の選択及び使用は当業者の技能の範囲内である。例えば、適当なシラン誘導体は、予想されるカテゴリーに含まれるシランを実験的に評価することにより選択され得る。シラン基板を製造する際、基板の全表面を適当なシラン誘導体で誘導化するか、または表面をばらばらのアレーを形成するための複数の位置のみを誘導化することができる。生物学的分子を含有する試薬及び溶液はシリカ表面に手動でまたはタンパーまたはこの目的のために当業者に公知の他の道具を用いて添加され得る。
【０２４７】
ｂ．生物学的分子の結合
生物学的分子のシリカ基板の表面への結合は、当業界で公知であり本明細書に記載されている手順または方法により実施され得る。生物学的分子の結合は、リンカー分子（例えば、以下のセクションＤ１参照）の存在下または非存在下でも実施され得る。当業者に公知のリンカーが本発明で使用され得る。
【０２４８】
遊離アミノもしくはカルボキシル基または他の適当な基の層を含む誘導化シリカ基板はその後、カルボジイミドの存在下でヘテロ二官能性リンカーまたは生物学的分子、例えばタンパク質、タンパク質核酸または他の抗リガンド上の遊離カルボキシルもしくはアミノ基に共有結合され得る。カップリング剤としてカルボジイミド（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ’−（γ−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を使用することは当業者に公知である（例えば、Ｂｏｄａｎｓｋｙら，“Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ベルリン（１９８４）参照）。
【０２４９】
生物学的分子を結合させるための別の方法はビオチンの層、アビジンの層及び増量剤の層を順次適用してシリカ表面を修飾することを含む（例えば、米国特許第４，２８２，２８７号明細書参照）。他の方法は、ポリペプチド鎖に感光性非天然アミノ基を導入し、生成物を低エネルギー紫外光に露光することにより固体基板にポリペプチド鎖を結合させる光活性化を含む（例えば、米国特許第４，５４２，１０２号明細書参照）。オリゴヌクレンチドは光化学的に活性な試薬、例えばプソラレンと前記光試薬を基板に結合させるカップリング剤を用いて結合させた（例えば、米国特許第４，７６２，８８１号明細書及び同第４，５６２，１５７号明細書参照）。同様の方法がペプチド核酸に適用され得る。光試薬の光活性化により核酸分子またはペプチド核酸分子は基板に結合して、表面結合プローブが生ずる。ある実施態様では、核酸を光活性化し固定するのに十分に適当な発光波長を有する適当なバイオルミネセンス発生系を選択することにより光活性化を現場で起こすことができる。
【０２５０】
更に、米国特許第５，４５１，６８３号明細書は光活性化可能なビオチン誘導体を結合させることにより生化学的リガンドをマトリックスの表面に結合させる方法を記載している。ビオチン誘導体を光分解活性化するとアビジンまたはストレプトアビジンに対して強い結合親和性を有するビオチンアナログが得られる。ビオチニル化リガンドを、予めアビジンまたはストレプトアビジンで処理した活性化領域上に固定化される。
【０２５１】
抗リガンドのマトリックス材料への結合は電子的にも実施され得る。特定結合物のマトリックス上の特定ミクロ位置への輸送及び結合を電子的に制御するための自己アドレス可能で自己組立可能な超小型電子システム及びデバイス（例えば、国際特許出願第ＷＯ９５／１２８０８号明細書；ＷＯ９６／０１８３６号明細書及びＷＯ９６／０７９１７号明細書；米国特許第５，６３２，９５７号明細書；同第５，６０５，６６２号明細書参照）。各ミクロ位置が電子的に制御され得、それにより電流または電圧が制御される。１つの性質を設定するとき他の性質をモニターすることができる。例えば、電圧を設定するとき電流をモニターすることができる。或いは、電流を設定するとき電圧をモニターすることができる。電圧及び／または電流は直流モードで適用することも、また経時的に変化させることもできる。
【０２５２】
上記した方法により与えられる空間アドレス可能性により、予備設定された反応性を有するパターン化表面を形成し得る。例えば、半導体業界で公知のリソグラフィ方法を用いることにより、光を表面上の比較的小さく正確に公知の位置に向けることができる。従って、抗リガンドを結合させるために表面上のばらばらの所定位置を活性化することができる。生じた表面は各種用途を有する。例えば、表面に結合した異なる抗リガンドでリガンドの親和性を同時に試験することができる直接結合アッセイを実施することができる。
【０２５３】
例えば、生物学的分子をアルコキシシランを用いて非自己アドレス可能なチップのシリカ表面に結合させるために、通常表面を予備加水分解する。ほこり、有機粒子及び他の粒状物で汚染されるのを避けるために操作はすべて層流フード／クリーン環境中で実施しなければならない。通常、適当なアルコキシシランをエタノール−水（３：１）溶液中に室温で１２時間溶解させる。チップの特定表面をシラン−アルコール溶液の新鮮アリコートを用いて繰り返し冠水させることによりチップを処理する。この処理後、チップを大量の無水エタノールで洗浄し、次いでＴＨＦ、ジオキサンまたはヘキサン（超高純度）、最後にペンタンで洗浄し、乾燥窒素流下で蒸発させる。
【０２５４】
チップ表面の誘導化の効率は、チップ表面に対して適当な蛍光アミン（誘導化カルボキシル）または蛍光カルボン酸（誘導化アミノ）を結合し、結合分子の蛍光を適当な波長を有するレーザーを用いて励起させることにより測定され得る。この目的のための適当な化合物はフルオレセイン、ローダミンまたはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄのアミノ、カルボキシルまたは他の反応性誘導体であり得、これらは当業者に公知であり、市販もされている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．参照）。
【０２５５】
フルオレセイン、ローダミンまたはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄのイソチオシアネートは、例えばシリカ表面上の遊離アミノ基と非可逆的な共有結合方法で反応する。アセトンまたはジオキサン中に有効濃度（約１０ｍＭ）のフルオレセインイソチオシアネート（混合異性体）を含む溶液をチップのアミン誘導化シリカ上に十分時間、例えば約３０分間室温でおく。未反応物質をすべて除去するために、チップをアセトン、ヘキサン及びペンタンまたは他の適当な溶媒の熱（すなわち、６０℃）溶液で洗浄する。同じチップの化学的に誘導化されなかった領域を対照としてフルオレセインイソチオシアネートと同様に処理する。ガラスとの直接共有結合反応が少量可能であり、よって対照はバックグラウンドレベルを示すために実施されるべきである。結合したフルオレセインの蛍光は適当なソース、例えばアルゴンイオンレーザー（例えば、４８８ｎｍ）を用いて、好ましくは４５゜ジオメトリーで励起させることができる。アルゴンレーザーは更に、約５２０ｎｍで発した蛍光信号を検出するために１０ｎｍ帯域フィルターを備えた光電子増倍管を含むことができる。検出された蛍光の量は誘導化の程度及び効率の関数である。
【０２５６】
本明細書に記載の別の実施態様では、抗リガンドが反射性金属層の上の活性化された保護外面、例えば誘導化シラン層に直接固定化され得るように反射性表面（例えば、ＭＹＬＡＲ）を上記したように誘導化し得る。この実施態様では、バイオルミネセンス発生系により発生した光は抗リガンドにより散乱または吸収されない。なぜならば、フォトダイオードが結合抗リガンドにより点滅されないからである。
【０２５７】
Ｄ．ルシフェラーゼ複合体の形成
１．リンカー
ルシフェラーゼは、当業界で公知の方法を用いてリンカー配列の存在下もしくは非存在下で抗リガンド、例えば抗体、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸に対して複合体化され得る。当業界で公知のリンカーを本発明で使用することができる。ルシフェラーゼを抗体に結合させる方法は米国特許第４，６５７，８５３号明細書、同第５，４８６，４５５号明細書及び国際特許出願公開第ＷＯ９６／０７１００号明細書に記載されている。
【０２５８】
他のリンカーも化学的に結合したタンパク質に含有させるために適している。前記リンカーにはジスルフィド結合、チオエーテル結合、ヒンダードジスルフィド結合、及びアミンやチオール基のような遊離反応性基間の共有結合が含まれるが、これらに限定されない。これらの結合は１方もしくは両方のポリペプチド上に反応性チオール基を生成するためにヘテロ二官能性試薬を用い、次いで１つのポリペプチド上のチオール基を他のポリペプチド上に反応性マレイミド基またはチオール基が結合され得る反応性チオール基またはアミン基と反応させることにより生成される。他のリンカーには酸開裂性リンカー（例えば、ビスマレイミドエトキシプロパン）、ＵＶまたは可視光に露光されると開裂するクロスリンカーが含まれる。幾つかの実施態様では、各リンカーの所望特性を利用するために数種のリンカーを含めることができる。
【０２５９】
化学リンカー及びペプチドリンカーは、リンカーを抗リガンド及びチップの表面に共有結合させることにより挿入され得る。下記するようなヘテロ二官能性物質を前記共有結合を行うために使用され得る。ペプチドリンカーはリンカー及び抗リガンド（例えば、抗体）をコードするＤＮＡを発現させることにより融合タンパク質として結合され得る。
【０２６０】
アミノ基とチオール基間に共有結合を形成し、チオール基をタンパク質を導入するために使用される多数のヘテロ二官能性架橋剤が当業者に公知である（例えば、上記架橋剤の製造及び使用を記載しており、架橋剤の市販ソースを記載しているＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴＡＬＯＧ，ＩｍｍｕｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９２−１９９３参照；また、例えばＣｕｍｂｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：３９７−４０１（１９９２）；Ｔｈｏｒｐｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７：５９２４−５９３１（１９８７）；Ｇｏｒｄｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８４：３０８−３１２（１９８７）；Ｗａｌｄｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：１９１−１９７（１９８６）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  １７３：７２３−７３７（１９７８）；Ｍａｈａｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６２：１６３−１７０（１９８７）；Ｗａｗｒｙｚｎａｃｚａｋら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：３６１−３６６（１９９２）；Ｆａｔｔｏｍら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎ．  ６０：５８４−５８９（１９９２）参照）。これらの架橋剤は抗リガンドとルシフェラーゼ分子間に共有結合を形成するために使用され得る。前記架橋剤には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー）、スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェート（ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー）、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー）、スルホスクシンイミジル２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）、スルホ−スクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート（ＳＡＭＣＡ）、スルホスクシンイミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、１，４’−ジ［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ；ヒンダードジスルフェートリンカー）、スルホスクシンイミジル６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）、アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６１】
酸開裂性リンカー、光開裂性リンカー及び感熱性リンカーも、特に標的剤を開裂して反応により容易に接近し得る必要がある場合に使用することもできる。酸開裂性リンカーには、ビスマレイミドエトキシプロパン及びアジピン酸ジヒドラジドリンカー（例えば、Ｆａｔｔｏｍら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎ．  ６０：５８４−５８９（１９９２）参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６２】
２．ルシフェラーゼ融合タンパク質
抗体−ルシフェラーゼ複合体の他に、抗リガンド、例えば抗体またはそのＦ（ＡＢ）２抗原結合断片に対する組換えルシフェラーゼタンパク質の融合物も本発明で使用される。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡをルシフェラーゼをコードするＤＮＡに連結したり、ルシフェラーゼを抗体に連結することができる（例えば、抗体／ルシフェラーゼ複合体及びその使用を記載している米国特許第４，４７８，８１７号明細書参照）。
【０２６３】
３．核酸及びペプチド核酸複合体
本明細書に記載のルシフェラーゼ分子を核酸またはペプチド核酸に複合化させることができる。カップリングはリンカーの存在下もしくは非存在下で実施され得る。タンパク質中のアミノ及びカルボキシル末端及び他の部位に対して５’末端、３’末端等で核酸を複合化する方法は当業者に公知である（参考のために、例えばＧｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅａｒｓ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．７７−９９（１９９３）参照）。例えば、タンパク質は紫外線照射により（Ｓｐｅｒｌｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ５：２７５５−２７７３（１９７８）；Ｆｉｓｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５２：２８１−２８３（１９７５））、二官能性化学物質を用いて（Ｂａｕｍｅｒｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ８９：３５３−３５９（１９７８）；Ｏｓｔｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．  １６８：８１−８６（１９７９））、光化学架橋剤を用いて（Ｖａｎｉｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １２４：８９−９２（１９８１）；Ｒｉｎｋｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １３７：３０１−３１４（１９８０）；Ｍｉｌｌｏｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１０：４８５−４５４（１９８０））核酸に結合された。
【０２６４】
更に、ルシフェラーゼのカルボキシル末端をペプチド核酸の遊離アミノ基の１つに標準のカルボジイミドペプチド化学を用いて複合化することができる（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９０）；Ｐｅｆｆｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：１０６４８−１０６５２（１９９３）参照）。
【０２６５】
複合化のための追加部位を、１つ以上の位置を化学的に修飾するかまたは核酸分子の５’もしくは３’末端に共有結合した小さな抗原決定基を導入することにより核酸分子に導入することもできる。多数の小さな抗原決定基（例えば、Ｈｉｓ  Ｔａｇｓ、ｆｌｇ抗原、Ｓ−Ｔａｇｓ、ジオキシゲニン等）は当業者に公知であり、市販もされている（例えば、インディアナ州インディアナポリスに所在のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ；ウィスコンシン州マジソンに所在のＮｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）。修飾核酸及びペプチド核酸アナログも標準ホスホルアミダイト化学及び市販されている修飾ヌクレオシドトリホスフェートアナログ（例えば、５’−チオール化ヌクレオシドトリホスフェート及びオリゴヌクレオチド）を用いて直接化学合成により製造され得る。５’及び３’−チオール化オリゴヌクレオチドは市販もされている（例えば、カリフォルニア州アラメダに所在のＯｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０２６６】
Ｅ．マトリックス上にシリカを堆積するための放散虫類及び珪藻類
本発明はマトリックス材料上にシリカを堆積するためにバイオミネラル化を使用する方法も提供する。この方法は、マトリックスの界面領域に沿って二酸化ケイ素を重合してマトリックス−シリケートメソ構造を形成するために珪藻類及び放散虫類及び細胞壁タンパク質を使用する。この方法は各種の最終用途を有するシリケートチップを製造するために半導体業界で使用され得る。
【０２６７】
珪藻類及び放散虫類のような生物は、１μｍ未満〜数ｍｍのスケールでパターン化された階層構造を示す被殻／珪殻または外骨格とも呼ばれる精巧なバイオミネラルシリカを主成分とする細胞壁を合成する（例えば、一般的にＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒａｄｉｏｌａｒｉａ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．  １２１：５９−８９（１９８６）参照）。珪藻類細胞壁における構造中の２つの主要成分は放射状対称を有する細胞壁（中心珪藻類；例えばＣｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｃｒｙｐｔａ）及び左右対称を有する細胞壁（翼状珪藻類；例えばＮａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｉｃｕｌｏｓａ及びＣ．ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【０２６８】
珪藻類細胞壁は上殻及び下殻の２つの部分を含む。各殻は、無定形の水和シリカと他の有機成分からなる弁、複数のシリカストリップ及び環帯からなる（例えば、Ｖｏｌｃａｎｉ，Ｓｉｌｉｃｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｉｍｐｓｏｎ及びＶｏｌｃａｃｎｉ編，ｐｐ．１５７−２００，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８１）；Ｋｒｏｇｅｒら，ＥＭＢＯ  １３：４６７６−４６８３（１９９６）参照）。前記細胞壁の主要有機タンパク質成分はフラストリン(frustulins)として公知のタンパク質である（例えば、Ｋｒｏｇｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３９：２５４−２６４（１９９６）参照）。海洋珪藻類では、母プロトプラストの細胞分裂及び細胞質分裂後新しい弁が生成される。生じた娘プロトプラストは特殊化細胞内細胞小器官のシリカ堆積小胞に新しい弁を生ずる。シリカは、Ｓｉモノマーの核生成及びエピタキシャル成長がテンプレート上で起こるかより複雑なシリカの重合が小胞内で起こるシリカ核に輸送される（例えば、Ｐｉｃｋｅｔｔ−Ｈｅａｐｓら，Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ．  ３５：１９９−２０３（１９７９）；Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．  １２１：５９−８９（１９８６）；Ｐｉｃｋｅｔｔ−Ｈｅａｐｓら，Ｐｒｏｇ．Ｐｈｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．  ７：１−１８６（１９９０）参照）。
【０２６９】
放散虫類では、シリケート骨格の堆積は、細胞泡層(cytokalymma)と呼ばれる骨格を包囲し、成形し、堆積させる細胞質鞘と関連している。骨格の厚さは生物の生理学的状態に影響され得る。細胞泡層は、珪藻類のシリカ堆積におけるシリカ殻と同様に機能し得る。
【０２７０】
珪藻類及び放散虫類外骨格に模擬した人工無機アセンブリが記載されている（例えば、Ｏｌｉｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：４７−５０（１９９５）；米国特許第５，０５７，２９６号明細書、同第５，１０８，７２５号明細書、同第５，３６４，７９７号明細書参照）。幾つかの構造のメソフェース、例えばラメラ、六角形及び立方体メソ構造が選択された出発材料及び使用条件に依存して形成される。しかしながら、これらの結晶質メソ構造はあるマトリックス材料では使用に適さないより高温でしか形成され得ない。
【０２７１】
バイオミネラル化方法及び界面活性剤−シリケートメソ構造の形成及び構造を説明するためのモデルが提案されている（例えば、サリバン（Ｍｏｎｎｉｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１２９９−１３０３参照）。例えば、シリケート壁の厚さの調節が二重層ポテンシャルに関連していると仮定される。シリケート種のみが表面界面で蓄積して壁が厚くなったりまたは無定形バルクＳｉＯ２が生じ、シリケート種が形成される高いｐＨ、例えばｐＨ１２以上ではシリケート種上の高い負電荷により強い静電気反発が生ずるので起こらない（例えば、Ｉｌｉｅｒ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ，ｐ．１８２，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９）参照）。
【０２７２】
Ｍ４１Ｓを含有するメソ細孔結晶性材料の人工アセンブリはバイオセンサーを含めたセンサーサービス中に組み込まれた（例えば、米国特許第５，３６４，７９７号明細書参照）。バイオセンサーでは各対の一方の生物学的アナライトが結晶性材料中のシラノールに対して共有結合により非常に大きい孔を有する結晶性基板に固定されている（例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｇｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。アナライト、例えば抗体が結合され、固定されたアナライトと試験サンプルとの相互作用を監視する。
【０２７３】
珪藻類のシリカを主成分とする細胞壁は構造上上記した人工アセンブリと類似している。従って、これらのシリカ堆積物は、バイオセンサーや他の分子生物学的装置において有用なＭ４１Ｓ人工アセンブリに対して光ファイバセンサーと同じ形態及び光学的特性を有する（例えば、米国特許第５，３６４，７９７号明細書参照）。
【０２７４】
本発明で提供される、チップのマトリックス材料の表面上にシリカを堆積するために珪藻類のシリカ殻及び／またはシリカ堆積小胞の細胞壁タンパク質及び酵素を用いるバイオミネラル化の使用方法では、珪藻類から単離されたシリカ殻を用いてＳｉテンプレートの均一コーティングで結合したマトリックス材料上にシリカが堆積され得る。堆積したシリカは別の適当なリンカー、例えば糖または他のジオール含有化合物を用いてマトリックスに結合され得る。或いは、シリカ殻の成分はタンパク質化学の当業者に公知の方法を用いて更に精製され得る。
【０２７５】
Ｆ．使用方法
１．イムノアッセイ
本明細書に記載のチップは診断アッセイに使用され得る。例えば、チップは感染性微生物、例えば細菌、ウィルス、原生動物及び他の低級真核生物に対する抗体を用いて感染性物質を検出するためのイムノアッセイに使用される（例えば、図２０参照）。複数の抗リガンド、例えば抗体をチップの各位置もしくはミクロ位置に結合するか、特定微生物に対する抗体のパネルを形成するマルチウェルチップの反射性中間層の適当な層に結合させる。抗体結合チップを患者から得た体液、例えば尿、唾液または血液のサンプルに直接入れる。
【０２７６】
十分な時間放置して抗体−抗原複合体を形成し、チップを取り出し、十分濯ぐ。ルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ融合タンパ質に複合化した公知の発光体のパネルに対する第２抗体を複数含む溶液を添加して、標的種上に存在する同一抗原または別の抗原に対して指向させ得る。或いは、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含有するように遺伝子操作したファージまたはウィルスを使用してもよい。広い特異性を有するウィルスまたはファージが好ましい。
【０２７７】
チップまたは各ウェルを洗浄し、バイオルミネセンス発生系の残りの成分、例えばルシフェリン及び必要なアクチベータを添加する。抗原が検出されている場合、結合ルシフェラーゼから光が発せられ、その光が付属チップの半導体層内に配置されているフォトダイオードにより検出される。マルチウェルチップシステムでは、バイオルミネセント反応の出力信号が、反応から直接生じた光と中間層（例えば、図１０及び１１）の反射した光を検出することにより高められる。出力信号をデータ分析のためにコンピュータ処理装置に送る前に出力信号を任意に増幅及び／または多重化してもよい。
【０２７８】
アッセイは既知量のルシフェリンをウェルに添加し、ルシフェリンの利用率を測定することにより定量的に使用され得る（すなわち、経時的な光発生の低下は対照と比較したサンプル中に存在する量に比例する）。
【０２７９】
２．核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
本明細書に記載のチップは核酸ハイブリダイゼーションにも使用することができる。例えば、所望の核酸もしくはペプチド核酸プローブまたは結合ペプチドを有する核酸はチップの誘導化シリカ表面に直接またはリンカー基を介して共有結合される。核酸はチップの全表面に結合されるか、またはアレーフォーマットのチップ上の１つ以上のミクロ位置に添加され得る。
【０２８０】
生物学的サンプル中に存在する感染性物質は化学的、酵素的または物理的手段により溶解され、核酸、好ましくはＤＮＡは当業者に公知の標準的な方法を用いてサンプルから単離される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）参照）。或いは、核酸種を精製することなくサンプルを分析することができる。
【０２８１】
核酸をハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁し、サンプルをチップの表面に添加し、所望のハイブリダイゼーション温度でインキュベートする。ハイブリダイゼーションのために十分な時間放置後、チップを十分に洗浄後、本明細書に記載の適当な緊縮条件、すなわち高い、中間または低い緊縮条件で洗浄する。チップに固定化した相補性核酸は、バイオルミネセンス発生系の成分、好ましくはルシフェラーゼに複合化した抗リガンドを添加することにより検出される。現在好ましい抗リガンドは二重鎖核酸または関連する小さな抗原決定基を優先的に認識する抗体またはそのＦ（ＡＢ）２断片である。二重鎖ＤＮＡを認識する抗体は多数の自己免疫疾患に関連している（例えば、Ｔｓｕｚａｋａら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：５０４−５０８（１９９６）；Ｋａｎｄａら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｍ．  ４０：１７０３−１７１１（１９９７）参照）。
【０２８２】
チップまたは各ウェルを洗浄して未結合抗体−ルシフェラーゼ複合体を除去し、バイオルミネセンス発生系の残りの成分、例えばルシフェリン及び必要なアクチベータを添加する。相補性核酸またはペプチド核酸が検出された場合、結合ルシフェラーゼから光が発せられ、その光は付属チップの半導体層内に配置されているフォトダイオードにより検出される。
【０２８３】
アッセイは既知量のルシフェリンをウェルに添加し、ルシフェリンの利用率を測定することにより定量的に使用され得る（すなわち、経時的な光発生の低下は対照と比較したサンプル中に存在する量に比例する）。
【０２８４】
３．抗体感受性の検出
チップは、公知抗生物質に対する臨床単離物の感受性の試験にまたは抗菌物質をスクリーニングするためのデバイスとして使用される。例えば、標的ウェルからの発光を検出したら、適当な増殖培地（例えば、Ｌ−ブロスまたは他の未同定培地）を添加し、次いで適当な環境条件、例えば２０〜４２℃の温度及び嫌気性もしくは好気性雰囲気でインキュベートすることにより単離物を短時間でウェルにおいて直接増殖させ得る。
【０２８５】
次いで、増殖細菌に、補因子として入手可能なＡＴＰを必要とする、ホタルルシフェラーゼをコードするように遺伝子操作した腸内細菌のラムダまたはＰ２２のようなバクテリオファージを感染させる（例えば、セクションＢ．４参照）。前記細菌においてＡＴＰの存在下で細胞内ルシフェラーゼを発現させると、光が生ずる。
【０２８６】
抗生物質治療の有効性は、細菌を有効濃度の抗生物質とインキュベートし、その後の光を発生させることにより前記システムにおいて直接監視することができる。抗生物質により細胞が死滅すると、細胞内ＡＴＰプールが枯渇し、それによりバイオルミネセント反応が抑制される。光が減少することで、特定抗生物質または化合物が有効であることが示唆される。他の実施態様では、細菌を試験化合物とインキュベートし、試験化合物の抗菌活性を評価する。
【０２８７】
４．合成シナプス
本発明で提供される各種チップは合成ニューロンシナプスを生成するためにも使用され得る（例えば、図１７〜１９参照）。適当な酵素、特にアセチルコリンエストラーゼを例えば組換え発現によりルシフェラーゼに融合させる。ルシフェラーゼは不活性もしくは活性配座のいずれでもよい。いずれかのタンパク質における適当な突然変異は、ルシフェラーゼが本明細書に記載のような適当な配座変化を確実に受けることができるように選択され得る。生じた融合物を本発明のチップのようなチップに結合する。局所ニューライト生長を促進し維持するためにミクロポートを介してチップの位置の近くにニューロン増殖因子、例えばＥＧＦまたはＮＧＦを配置することにより、ニューロンまたはニューロン束をチップに結合した融合タンパク質の近くに保持する（図１７参照）。
【０２８８】
シリコン−シナプス電極を、ＭＲＩ位置決定により脊髄の適当な定位脳位置に挿入することにより罹患患者に永久的に埋め込むことができる（図１９参照）。電極を埋め込むために、脊髄に適当なレーザー、例えばＣＯ２レーザーを用いて小さな穴をあけ、電極を既知の神経線維または束の近くに配置する。シリコン−シナプスは、表面から既知のニューロン経路に沿って脊髄内の深部まで配置され得る。必須ではないが、適当なニューロンを正確にトレーシングすることが好ましい。なぜならば、ヒトの脳は適切な信号を伝達するニューロンに沿って信号を送るためにプログラムを作り直すからである。
【０２８９】
ニューロンインパルスの伝達はシナプスに放出される各種神経伝達物質、例えばアセチルコリンを含む。リガンドが酵素に結合すると、例えばアセチルコリンがエステラーゼに結合すると、予め不活性である場合には結合ルシフェラーゼは結合により活性化され、予め活性の場合には結合により不活性になる（図１８参照）。バイオルミネセンス発生系の残りの成分の存在下で、光が発生し（消光し）、その変化がチップと付属したフォトダイオードにより検出される。この検出により、ベルトに取り付けられた小形コンピュータのような情報を処理するコンピュータに繋がる１つ以上のワイヤーを介して送られる１つ以上の電気信号が発生する。処理された情報は適当な手段、例えばファイバにより所望のデバイスまたはエフェクタ、好ましくは筋肉に取り付けられた１つ以上の電極に伝送される。信号を受け取ると、例えば筋肉単収縮のような動作が起こり、身体が運動し始める。デバイスは脊髄の病巣域をバイパスする方法で挿入される（例えば、図１９参照）。
【０２９０】
或いは、アセチルコリンエストラーゼのアセチルコリン結合領域を蛍光色素またはフィコビリンタンパク質に融合し、レーザーと一緒に使用され得る。この実施態様では、既知の波長を有する単色光が蛍光体を励起するためのレーザーにより発生し、発生した蛍光はパラボラミラーによりチップのフォトダイオード表面に向けられ（例えば、図１７及び１８参照）、発生した光はバイオルミネセンスに関して記載したように検出、使用される。
【０２９１】
改変は当業者に自明であるので、本発明は添付の請求の範囲の範囲によってのみ限定されると意図される。
【０２９２】
配列表に記載した代表的なルシフェラーゼ及びレダクターゼの配列の要約
１．配列番号１  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｉｎｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ（米国特許第５，４１８，１５５号明細書）
２．配列番号２  Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉルシフェラーゼ（欧州特許第０  ３８７  ３５５号明細書）
３．配列番号３  修飾Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａルシフェラーゼ（ホタル；米国特許第４，９６８，６１３号明細書）
４．配列番号４  Ｖａｒｇｕｌａ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５６７−６５７１（１９８９）及び特開平３−３０６７８号公報（Ｏｓａｋａ）］
５．配列番号５  アポエクオリンをコードする遺伝子（米国特許第５，０９３，２４０号明細書，ｐＡＱ４４０）
６．配列番号６  組換えＡｅｑｕｏｒｉｎ  ＡＥＱ１［Ｐｒａｓｈｅｒら，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  Ｅｎｃｏｄｉｄｎｇ  ｆｏｒ  Ａｅｑｕｏｒｉｎ  Ｉｓｏｔｙｐｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２６−１３３２（１９８７）］
７．配列番号７  組換えＡｅｑｕｏｒｉｎ  ＡＥＱ２［Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８７）］
８．配列番号８  組換えＡｅｑｕｏｒｉｎ  ＡＥＱ３［Ｐｒａｓｈｅｒら（１９８７）］
９．配列番号９  Ａｅｑｕｏｒｉｎ発光タンパク質［Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら，“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｅｑｕｏｒｉｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６７６２−６７７１（１９８５）］
１０．配列番号１０  向上したバイオルミネセンス活性を有するＡｅｑｕｏｒｉｎ突然変異体（米国特許第５，３６０，７２８号明細書；Ａｓｐ１２４がＳｅｒに変化）
１１．配列番号１１  向上したバイオルミネセンス活性を有するＡｅｑｕｏｒｉｎ突然変異体（米国特許第５，３６０，７２８号明細書；Ｇｌｕ１３５がＳｅｒに変化）
１２．配列番号１２  向上したバイオルミネセンス活性を有するＡｅｑｕｏｒｉｎ突然変異体（米国特許第５，３６０，７２８号明細書；Ｇｌｙ１２９がＡｌａに変化）
１３．配列番号１３  組換えアポエクオリン［ジョージア州ボガートに所在のＳｅａｌｉｔｅ，ＳｃｉｅｎｃｅｓからＡＱＵＡＬＩＴＥ（登録商標）として販売されている；再構築されたときエクオリンを形成する］
１４．配列番号１４  Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉフラビンレダクターゼ（米国特許第５，４８４，７２３号明細書）
【０２９３】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】図１は、バイオルミネセンスを用いて生物学的サンプル中のアナライトを検出、同定するための、ミクロ位置のアレー及び相当するミクロ位置で放出されたバイオルミネセンスを検出するために各ミクロ位置に光学的に結合している光検出器を含む超小型電子デバイスの概略ブロック図である。
【図２】図２は、半導体基板上に備えた光検出器アレーを示す図１の超小型電子デバイス用ダイの平面図である。
【図３】図３は、セラミック製ジュアルインラインパッケージ（ＤＩＰ）に収容した図２のダイを含む図１の超小型デバイスの斜視図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＤＩＰ中に形成された試験ウェルを詳細に示す拡大図である。
【図４】図４は、アレー中の各ミクロ位置で発生したバイオルミネセンスを検出するための画素単位格子回路を示す概略図である。
【図５】図５は、デバイスの操作中の時間を関数として図４の画素単位格子回路の３ノードにおける電圧を示すグラフである。
【図６】図６は、アダプタ回路ボードに載置され、直列出力データ流を読みとり、出力データをミクロ位置のアレーに相関させ、入力デバイスを用いてセットした所定時間にわたり各ミクロ位置に相関させたデータを集積し、アナライトマップを参照して生物学的流体中に存在するアナライトを同定し、結果を出力デバイス上に表示するためのプログラムを組み入れたコンピュータに直列的に連係させた図１の超小型電子デバイスのシステムブロック図である。
【図７】図７は、使用者が直接パッケージを取り扱い必要のない回路ボード上に収容した図１の超小型電子デバイスを示す。
【図８】図８は、３層マルチウェルＣＣＤチップ（フォトダイオード／ＣＣＤ含有チップ）の概略断面図である。
【図９Ａ】図９は、マルチウェルＣＣＤチップの下層及び中間反射性層の拡大概略図及び各ウェルの概略図である。
【図９Ｂ】図９は、マルチウェルＣＣＤチップの下層及び中間反射性層の拡大概略図及び各ウェルの概略図である。
【図９Ｃ】図９は、マルチウェルＣＣＤチップの下層及び中間反射性層の拡大概略図及び各ウェルの概略図である。
【図１０Ａ】図１０は、図８のマルチウェルＣＣＤチップの中間反射性層に結合した特定抗体の拡大概略図である。
【図１０Ｂ】図１０は、図８のマルチウェルＣＣＤチップの中間反射性層に結合した特定抗体の拡大概略図である。
【図１１】図１１は、ＣＣＤ、反射性ミラー層、カソード及びアノードの相対位置を示す各ウェルの断面図である。中間反射性層に結合した抗体はフォトダイオードの上に逆にかかっている。結合抗原は抗体−ルシフェラーゼ融合タンパク質であり、バイオルミネセント反応から生じた光はフォトダイオードで検出され、同定するための処理装置に中継される。
【図１２】図１２は、ミクロリソグラフィ法（国際特許出願第ＷＯ９６／０１８３６号明細書）により製造された３つの自己アドレス可能なミクロ位置の断面図である。光電極の位置を示す矢印も記載されている。
【図１３】図１３は、ミクロリソグラフィ法により製造されたミクロ位置の断面図である。抗体または他のレセプターが結合層に結合されている。
【図１４】図１４は、実際に製造され、オリゴヌクレオチドでアドレス指定され、試験された自己アドレス可能な６４ミクロ位置チップの概略図である。
【図１５】図１５は、微細機械加工された９６ミクロ位置デバイスの拡大概略図である。
【図１６】図１６は、微細機械加工されたデバイスの断面図である。
【図１７】図１７は、人工シリコン−シナプスの概略図である。
【図１８】図１８は、シリコン−シナプスに使用されるアセチルコリンエストラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質及びアセチルコリンエステラーゼ−蛍光色素複合体の詳細概略図である。
【図１９】図１９は、永久的脊髄病巣をバイパスするためにヒト脊髄にシリコン−シナプス及び電極を配置する方法を示す。
【図２０】図２０は、本明細書に記載のチップの感染性微生物を検出するための診断アッセイにおける操作についての概略を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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