(57)【要約】【課題】  生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、細胞にダメージを与えることなく、かつ、早期に十分に活性を備えた生体組織補填体の出荷判定を可能とする。【解決手段】  生体組織補填体の培養に使用した培地に分泌された塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定するステップＳ２と、測定された塩基性繊維芽細胞成長因子の量が所定値Ａ１以下であるか否かを判断するステップＳ３と、測定された塩基性繊維芽細胞成長因子の量が所定値Ａ１以下である場合に、生体組織補填体の培養終了を判断するステップＳ４とを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織補填体の培養に使用した培地に分泌された塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定するステップと、
測定された塩基性繊維芽細胞成長因子の量が所定値以下であるか否かを判断するステップと、
測定された塩基性繊維芽細胞成長因子の量が所定値以下である場合に、生体組織補填体の培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法。
【請求項２】
生体組織補填体の培養に使用した培地に分泌されたオステオプロテジェリンの量を測定するステップと、
測定されたオステオプロテジェリンの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、
測定されたオステオプロテジェリンの量が所定値以上である場合に、生体組織補填体の培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法。
【請求項３】
生体組織補填体の培養に使用した培地に分泌されたオステオプロテジェリンの量を測定するステップと、
測定されたオステオプロテジェリンの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、
測定された塩基性繊維芽細胞成長因子の量が所定値以下であり、かつ、オステオプロテジェリンの量が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備える請求項１に記載の生体組織補填体の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織補填体の検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
培養されている生体組織、例えば、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化しているか否かを示す指標として、従来、骨芽細胞が分泌するアルカリフォスファターゼおよびオステオカルシンが用いられている（例えば、非特許文献１参照。）。また、骨分化が行われることにより蓄積されるカルシウム量についても、分化の度合を示す指標となる。
アルカリフォスファターゼの量は、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化する過程において経時的に上昇していくが、ある時点でピークを迎え、その後減少していくことが知られている。一方、オステオカルシンは、骨芽細胞が産生すると考えられており、その量は、アルカリフォスファターゼに遅れて増加する。
【非特許文献１】吉川隆章、生体材料、vol.19、27-33、2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、アルカリフォスファターゼおよびオステオカルシンは、培養した生体組織補填体を構成する細胞内部に存在するものであるため、その量を測定するためには、培養された細胞の一部を採取して潰し、測定する必要がある。このため、操作が複雑であり、また、折角培養した細胞の一部を破壊することは貴重な細胞を失うことになるため無駄であり、さらに、測定用の細胞を切り離す際に、残る細胞側にもダメージを与える可能性があるという問題がある。
さらに、オステオカルシンやカルシウム蓄積量は、骨分化の後期に増加する傾向があり、骨分化前半に、生体組織補填体の活性が十分であるか否かを判断することはできないという問題がある。
【０００４】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織補填体の出荷時における簡易な測定により、細胞にダメージを与えることなく、かつ、早期に十分に活性を備えた生体組織補填体の出荷判定を可能とする生体組織補填体の検査方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織補填体の培養に使用した培地に分泌された塩基性繊維芽細胞成長因子の量を測定するステップと、測定された塩基性繊維芽細胞成長因子の量が所定値以下であるか否かを判断するステップと、測定された塩基性繊維芽細胞成長因子の量が所定値以下である場合に、生体組織補填体の培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。
【０００６】
本願発明の発明者は、細胞の培養に使用した培地内に分泌された種々のサイトカインを分析した結果、細胞の分化に伴って、培地内に分泌されているいくつかのサイトカインのレベルが著しく変化していることを見いだした。特に、培地内において細胞の分化とともにレベルの変化しているサイトカインとしては、塩基性繊維芽細胞成長因子(basic  fibroblast  growth  factor：以下、ｂＦＧＦという。)とオステオプロテジェリン（Osteoprotegerin：以下ＯＰＧという。）とに注目した。
【０００７】
本発明によれば、生体組織補填体の培養に使用した培地中に分泌されたｂＦＧＦの量を測定し、その量が所定値以下であるか否かを判断することで、生体組織補填体の出荷判定を行うことができる。培地中のｂＦＧＦの量は、培養開始とともに細胞により産生され、培地中に溶出するので、アルカリフォスファターゼと相関して上昇するが、細胞の生体組織への分化が開始されると、ｂＦＧＦを産生する細胞が少なくなるため時間とともに減少する。したがって、ｂＦＧＦの量が所定のしきい値以下に下がったことを検出することにより、移植するのに十分に生体組織への分化が行われたと判断でき、出荷許可の判定を行うことができる。
【０００８】
培地中のｂＦＧＦにより出荷判定するので、培養された生体組織補填体や細胞をサンプリングにより損傷することがなく、培養された生体組織補填体を無駄なく健全な状態で出荷することができる。また、培地中のｂＦＧＦを用いて判定を行うので、細胞を無駄にすることなく何度でも判定を行うことができる。さらに、培地中のｂＦＧＦの量は、オステオカルシンやカルシウム蓄積とは異なり、骨分化の初期から増加するので、早期の出荷判定に用いることができる。
【０００９】
また、本発明は、生体組織補填体の培養に使用した培地に分泌されたＯＰＧの量を測定するステップと、測定されたＯＰＧの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、測定されたＯＰＧの量が所定値以上である場合に、生体組織補填体の培養終了を判断するステップとを備える生体組織補填体の検査方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、生体組織補填体の培養に使用した培地中のＯＰＧの量を測定し、その量が所定値以上であるか否かを判断することで、生体組織補填体の出荷判定を行うことができる。培地中のＯＰＧにより出荷判定するので、培養された生体組織補填体や細胞をサンプリングにより損傷することがなく、培養された生体組織補填体を無駄なく健全な状態で出荷することができる。また、培地中のＯＰＧを用いて判定を行うので、細胞を無駄にすることなく何度でも判定を行うことができる。
また、培地中のＯＰＧの量は、オステオカルシンやカルシウム蓄積とは異なり、骨分化の初期から増加するので、早期の出荷判定に用いることができる。
【００１１】
また、上記発明においては、生体組織補填体の培養に使用した培地に分泌されたＯＰＧの量を測定するステップと、測定されたＯＰＧの量が所定値以上であるか否かを判断するステップと、測定されたｂＦＧＦの量が所定値以下であり、かつ、ＯＰＧの量が所定値以上である場合に、培養終了を判断するステップとを備えることが好ましい。
【００１２】
このようにすることで、ｂＦＧＦおよびＯＰＧの両方を出荷判定の指標として使用することができる。上述したように、ｂＦＧＦおよびＯＰＧはいずれも、培養された生体組織補填体に損傷を与えることなく、分化段階の早期から検出することができ、早期に出荷判定を行うことが可能となる。
【００１３】
特に、ＯＰＧの量は、培地中の細胞数にも相関する。したがって、ＯＰＧの量を測定することにより、生体組織補填体中に存在する細胞数をある程度推定することができる。その結果、ｂＦＧＦの量が所定のしきい値を超え、かつ、ＯＰＧの量が所定のしきい値を超えた場合に出荷判定を行うことにより、移植するのに十分な活性を有しかつ十分な細胞数を含む生体組織補填体を出荷することが可能となる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、培養された生体組織補填体や該生体組織補填体に含まれる細胞に損傷を与えることなく、早期に出荷判定を行うことができるという効果を奏する。したがって、培養された生体組織補填体を無駄にすることなく、健全な状態の生体組織補填体を出荷することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る生体組織補填体の検査方法について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法は、例えば、骨髄間葉系幹細胞をリン酸カルシウム多孔体のような生体組織補填材に付着させて所定期間培養した培養骨の出荷時における検査方法である。
【００１６】
この検査方法は、図１に示されるように、培養途中の培養骨が浸漬されている培地を採取するステップ（Ｓ１）と、採取された培地内のｂＦＧＦの量を測定するステップ（Ｓ２）と、測定されたｂＦＧＦの量が所定のしきい値Ａ１以下か否かを判断するステップ（Ｓ３）と、ｂＦＧＦの量がしきい値Ａ１以下であると判断された場合に、出荷を許可するステップ（Ｓ４）と、ｂＦＧＦの量がしきい値Ａ１より大きいと判断された場合に、出荷を禁止するステップ（Ｓ５）とを備えている。
【００１７】
ｂＦＧＦの量は、R&D Systems Inc.製のELISA kitにより測定する。
しきい値Ａ１は、細胞の種類、適用条件等に応じて適宜設定されている。例えば、しきい値Ａ１は,１０ｐｇ／ｗｅｌｌである。
【００１８】
このように構成された本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法によれば、出荷の許可判定が、アルカリフォスファターゼやオステオカルシンのような細胞内に存在する物質の検出により行われるのではなく、培地内に分泌されたサイトカインであるｂＦＧＦにより行われるので、培養された生体組織補填体に損傷を与えることなく、健全な生体組織補填体を出荷することができる。特に、出荷判定検査において細胞を無駄にしないで済むので、必要に応じて何度でも検査を行うことができる。
【００１９】
また、ｂＦＧＦは、オステオカルシンやカルシウムとは異なり、培養開始により産生されて増加し、骨分化段階の早期から培地内における分泌量が低下していくので、早期に測定することができる。したがって、早期の出荷判定を行うことができるという利点がある。
図２に、培地内におけるｂＦＧＦの量の変化を表すグラフを示す。図２においては、骨分化前の間葉系幹細胞が培養日数の経過とともにｂＦＧＦを産生していく様子との対比において、骨分化後における培地内のｂＦＧＦの量の変化を示している。
【００２０】
図２によれば、骨分化前においては、間葉系幹細胞からｂＦＧＦが産生され続け、培地内のｂＦＧＦ量が増加していることがわかる。また、骨分化後の培地内にはｂＦＧＦは全く産生されないことがわかる。したがって、間葉系幹細胞が骨分化誘導されると、培地内のｂＦＧＦ量は破線に示されるように低下し、時間の経過によって所定のしきい値Ａ１を下回るようになる。このとき、培養骨においては十分に骨分化が行われ、移植するのに十分な活性を有していると判断することができる。
【００２１】
次に、本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法について、図３および図４を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００２２】
本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法も、例えば、骨髄間葉系幹細胞をリン酸カルシウム多孔体のような生体組織補填材に付着させて所定期間培養した培養骨の出荷時における検査方法である。
この検査方法は、図３に示されるように、培養途中の培養骨が浸漬されている培地を採取するステップ（Ｓ１）と、採取された培地内のＯＰＧの量を測定するステップ（Ｓ２′）と、測定されたＯＰＧの量が所定のしきい値Ａ２以上か否かを判断するステップ（Ｓ３′）と、ＯＰＧの量がしきい値Ａ２以上であると判断された場合に、出荷を許可するステップ（Ｓ４）と、ＯＰＧの量がしきい値Ａ２より小さいと判断された場合に、出荷を禁止するステップ（Ｓ５）とを備えている。
【００２３】
ＯＰＧの量は、Biomedica社製のELISA kitにより測定する。
しきい値Ａ２は、細胞の種類、適用条件等に応じて適宜設定されている。例えば、しきい値Ａ２は、２００ｐｇ／ｗｅｌｌである。
【００２４】
このように構成された本実施形態に係る生体組織補填体の検査方法によれば、出荷の許可判定が、アルカリフォスファターゼやオステオカルシンのような細胞内に存在する物質の検出により行われるのではなく、培地内に分泌されるサイトカインであるＯＰＧにより行われるので、培養された生体組織補填体に損傷を与えることなく、健全な生体組織補填体を出荷することができる。特に、出荷判定検査において細胞を無駄にしないで済むので、必要に応じて何度でも検査を行うことができる。
【００２５】
また、ＯＰＧは、オステオカルシンやカルシウムとは異なり、骨分化段階の早期から培地内における溶出量が増加していくので、早期に測定することができる。したがって、早期の出荷判定を行うことができるという利点がある。
図４に、培地内におけるＯＰＧの量の変化を表すグラフを示す。図４においては、骨分化前の間葉系幹細胞が、培養日数の経過によってもＯＰＧを全く産生しない様子との対比において、骨分化後における培地内のＯＰＧ量の増加を示している。
【００２６】
図４によれば、骨分化前においては、間葉系幹細胞からは全くＯＰＧが産生されず、培地内のＯＰＧ量が全く増加していないことがわかる。また、骨分化後の培地内にはＯＰＧは培養日数の経過とともに漸次増加していることがわかる。したがって、間葉系幹細胞が骨分化誘導されると、時間の経過によって所定のしきい値Ａ２を上回るようになる。このとき、培養骨においては十分に骨分化が行われ、移植するのに十分な活性を有していると判断することができる。
【００２７】
さらに、ＯＰＧ量は、培養骨内の細胞数とも相関している。したがって、十分なＯＰＧ量を有する培養骨は、十分な数の細胞をも有していると推定することができ、移植後も十分な骨形成作用を生じて骨欠損部を早期に修復することができることを期待できる。
【００２８】
なお、上記実施形態においては、ｂＦＧＦまたはＯＰＧをそれぞれ単独で、出荷判定の指標として使用する場合について説明したが、これに代えて、図５に示されるように、これらｂＦＧＦおよびＯＰＧが同時に一定条件を満たしたときに出荷判定することとしてもよい。
【００２９】
また、上記実施形態においては、生体組織補填体として、リン酸カルシウム多孔体に骨髄間葉系幹細胞を付着させた培養骨を採用したが、細胞を付着させる生体組織補填材としては、βーＴＣＰのようなリン酸カルシウムの他、ハイドロキシアパタイトなどの他のリン酸カルシウム、コラーゲンやキチンなどの天然高分子材料、ポリ乳酸やε−カプロラクタンのような合成高分子材料、チタン合金やステンレス鋼３１６およびタンタル合金のような金属材料や金属繊維およびこれらの材料の少なくとも２種類以上の複合材などを採用してもよい。また、生体組織補填材に生着させる細胞としては骨髄細胞に含まれる間葉系幹細胞の他、末梢血、臍帯血から分離した間葉系幹細胞を用いてもよい。また、間葉系幹細胞に代えて、ＥＳ細胞、体性幹細胞、骨細胞、軟骨細胞あるいは神経細胞等を採用してもよい。
また、自家細胞に限らず他家細胞を採用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の検査方法に用いる培地内におけるｂＦＧＦ量の変化の様子を示すグラフである。
【図３】本発明の第２の実施形態に係る生体組織補填体の検査方法を示すフローチャートである。
【図４】図３の検査方法に用いる培地内におけるＯＰＧ量の変化の様子を示すグラフである。
【図５】図３の検査方法の変形例を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００３１】
Ａ１，Ａ２  しきい値（所定値）
Ｓ２  ｂＦＧＦ量測定ステップ
Ｓ２′  ＯＰＧ量測定ステップ
Ｓ３  ｂＦＧＦ量判断ステップ
Ｓ３′  ＯＰＧ量判断ステップ
Ｓ４  出荷判定ステップ（培養終了判定ステップ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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