(57)【要約】      （修正有）【課題】抗生物質として有効性の高いナタマイシンの経済的な回収方法の提供。【解決手段】下記工程：(１)固体懸濁ナタマイシン少なくとも２ｇ／ｌを含有するナタマイシン供給流にメタノールを添加して抽出媒体を形成することおよび、抽出媒体の温度を０〜25℃、好ましくは15℃以下に維持すること；(２)0.5〜30時間温度を０〜25℃に維持しながら、ただし好ましくは温度が15〜25℃の場合は0.5時間を超えない時間、抽出媒体のpHを1.0〜4.5に調節すること；(３)抽出媒体から固体を除去して抽出液を形成すること；(４)抽出液のpHを6.0〜9.0に上昇させること；および(５)沈澱したナタマイシンを回収することを包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
(１)  固体ナタマイシンを含有するナタマイシン供給流にメタノールを添加してリットル当たりナタマイシン20〜150ｇを含有する抽出媒体を形成し、０〜25℃の温度で抽出媒体を維持すること；
(２)  0.5〜30時間０〜25℃に温度を維持しながら抽出媒体のpHを1.0〜4.5に調節すること；
(３)  抽出媒体から固体を除去して抽出液を形成すること；
(４)  抽出液のpHを6.0〜9.0に上昇させること；および
(５)  沈澱したナタマイシンを回収すること、
を順次包含するナタマイシンの回収方法。
【請求項２】
供給流が少なくとも50重量％の固体を含有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
抽出媒体の温度を０〜15℃に維持する請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程１および２が工程(１)の前のメタノールへ酸を添加することにより一つの工程となる請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程(３)の後工程(４)の前に、下記工程：
(６)  固体をメタノールで洗浄し、メタノールを抽出液に添加すること、
を更に包含する請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程(４)の前に、下記工程：
(７)  活性炭で抽出液を処理すること、
を更に包含する請求項１記載の方法。
【請求項７】
工程(１)の前に、下記工程：
(８)  ナタマイシン供給流が水10重量％未満を含有するようにナタマイシン供給流から水を除去すること、
を更に包含する請求項１記載の方法。
【請求項８】
抽出媒体がリットル当たりナタマイシン20〜150ｇを含有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
抽出媒体の温度を０〜15℃に維持する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
抽出媒体の温度を0.5〜1.5時間０〜15℃に維持する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程(４)の前に、下記工程：
(７)  活性炭で抽出液を処理すること、
を更に包含する請求項10記載の方法。
【請求項１２】
下記工程：
(１)  固体懸濁ナタマイシン少なくとも２ｇ／ｌを含有するナタマイシン供給流に溶解度増大塩約10〜50ｇ／ｌを含有するメタノールを添加して抽出媒体を形成すること；
(２)  抽出媒体から固体を除去して抽出液を形成すること；
(３)  抽出液に水を添加してナタマイシンを沈澱させること；
および
(４)  沈澱したナタマイシンを回収すること、
を順次包含するナタマイシンの回収方法。
【請求項１３】
溶解度増大塩が塩化カルシウムである請求項12記載の方法。
【請求項１４】
供給流が固体少なくとも50重量％を含有する請求項13記載の方法。
【請求項１５】
工程(３)の前に、下記工程：
(７)  活性炭で抽出液を処理すること、
を更に包含する請求項13記載の方法。
【請求項１６】
工程(１)の前に、下記工程：
(６)  ナタマイシン供給流が水10重量％未満を含有するようにナタマイシン供給流から水を除去すること、
を更に包含する請求項13記載の方法。
【請求項１７】
抽出媒体がリットル当たりナタマイシン20〜150ｇを含有する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
工程(３)の前に、下記工程：
(７)  活性炭で抽出液を処理すること、
を更に包含する請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は醗酵ブロスからナタマイシンを回収するための迅速で安価な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナタマイシン（ピマリシンまたはテネセチンとしても知られている）はよく知られた抗生物質である（Florey, “Analytical Profiles of Drug Substances”, Vol. 10, 1981; Merck Index, 第８版, “Pimaricin”, p 834）。その価値ある抗生物質としての特性は認識されているものの、製造コストが極めて高いという理由からナタマイシンの研究や市販化は殆どなされていない。種々の液体中に溶解するため、ナタマイシンの回収方法は経済的なものではなかった。経済的なナタマイシン回収方法が望まれている。
【０００３】
ナタマイシンは英国特許846,933号に開示されているとおり、Streptomyces gilvosporeusを用いた醗酵により製造されている。この方法では、メタノール抽出とその後の吸着と溶離の手間のかかる工程によりナタマイシンが回収される。Bridgerの米国特許3,378,441号は、ナタマイシンを醗酵ブロスから塩析し、メタノールで抽出し、固体を除去し、次に液体を蒸発させることによる回収を開示している。Struykの米国特許3,892,850号は、酸性化ブタノールにより抽出し、次いで蒸留および析出することによるナタマイシンの回収を開示している。Struykはまたナタマイシンの溶解度を改善するためにメタノール中に塩化カルシウムを溶解させることを開示している。これらの方法は何れも、吸着および溶離、蒸留または蒸発のような高価な回収工程を必要とする。英国特許844,289号は、水の添加による酢酸からのナタマイシンの沈澱を記載している。MillisのPCT出願公開WO 92/10580は、メタノールを添加し、抽出媒体のpHを1.0〜4.5に調節して沈澱したナタマイシンを溶解させ、固体を除去し、そしてpHを6.0〜9.0に上昇させてナタマイシンを沈澱させることを包含するナタマイシン少なくとも２ｇ／ｌを含有する醗酵ブロスからのナタマイシンの回収方法を開示している。しかしながら、この方法で回収されたナタマイシンは望ましくない副生成物であるナタマイシンメチルエステルを含有している。
【特許文献１】Florey, “Analytical Profiles of Drug Substances”, Vol. 10, 1981; Merck Index, 第８版, “Pimaricin”, p 834
【特許文献２】英国特許846,933号
【特許文献３】米国特許3,892,850号
【特許文献４】英国特許844,289号
【特許文献５】WO 92/10580パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
調節されたpHおよび温度の条件下メタノールで抽出することにより、ナタマイシンを含有する醗酵ブロスから高純度のナタマイシンを回収できる。この方法は、下記工程：
(１)  固体懸濁ナタマイシン少なくとも２ｇ／ｌを含有するナタマイシン供給流にメタノールを添加して抽出媒体を形成し、抽出媒体を０〜25℃、好ましくは15℃以下の温度に維持すること；
(２)  0.5〜30時間０〜25℃に温度を維持しながら、ただし好ましくは温度が15〜25℃の場合は0.5時間を越えない時間、抽出媒体のpHを1.0〜4.5に調節すること；
(３)  抽出媒体から固体を除去して抽出液を形成すること；
(４)  抽出液のpHを6.0〜9.0に上昇させること；および
(５)  沈澱したナタマイシンを回収すること、
を包含する。
【０００５】
別の実施態様において、この方法は、下記工程：
(１)  固体懸濁ナタマイシン少なくとも２ｇ／ｌを含有するナタマイシン供給流に溶解度増大塩約10〜50ｇ／ｌを含有するメタノールを添加して抽出媒体を形成すること；
(２)  抽出媒体から固体を除去して抽出液を形成すること；
(３)  抽出液に水を添加してナタマイシンを沈澱させること；および
(４)  沈澱したナタマイシンを回収すること、
を含有する。
【０００６】
何れの実施態様においても、(１)水で最終工程に回収された沈澱ナタマイシンを洗浄することにより、(２)ナタマイシンの沈澱より前に活性炭で抽出液を処理することにより、または(３)これらの工程の組み合わせにより、高純度ナタマイシンを得ることができる。好ましい溶解度増大塩は塩化カルシウムである。
（図面の簡単な説明）
図１は制御されたpHおよび温度の条件下の回収方法を示す模式図である。図２は可溶化塩を用いた回収方法を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
[メタノール抽出]
【０００８】
ナタマイシン醗酵ブロス供給流：醗酵によるナタマイシンの製造はEisenschinkの米国特許5,231,014号、英国特許846,933号、および共に1991年８月５日に出願された米国特許出願07/740,545号および07/740,536号に記載されている。これらの醗酵で製造される醗酵ブロスは固体懸濁ナタマイシン、バイオマスおよび水を含有する。例えばEisenschinkの開示した方法は、典型的には約７〜12ｇ／ｌのナタマイシンを含有するブロスを製造する。
【０００９】
ブロスは直接または水の一部またはほとんど全部を除去することにより濃縮した後に、回収工程のための供給流として用いられる。供給流はリットル当たり少なくとも２ｇのナタマイシンを含有しなければならないが、より高い濃度が好ましい。ブロスは水、固体懸濁ナタマイシン、およびバイオマス固体を含有するため、一部または実質的に全ての水を遠心分離、濾過、またはデカンテーションのような何らかの従来の好都合な固／液分離方法で除去することができる（濾過を例示している実施例１参照）。所望により、温風を用いるか、噴霧乾燥によるか、または機械的手段で水を加圧除去するような従来の方法で固体を更に乾燥させることができる。固体を加熱により乾燥させる場合は、約20〜80℃の温度を用いなければならない。95℃を超える温度は避けなければならない。
【００１０】
抽出媒体（供給流およびメタノール）中のナタマイシンの溶解度は水が増大するに従って低下する。抽出媒体の含水量は供給流中の水の量に応じて変化するため、工程１の前に供給流から可能な限り多量の水を除去することが望ましい。供給流が約70容量％の水を含有する場合、実質的に乾燥した供給流を出発原料とする場合と比較して、約３倍の量のメタノールが必要になる。供給流が約40容量％の水を含有する場合は、約２倍の量のメタノールが必要になる。
【００１１】
供給流の固体含有量は、水を殆どまたは全く除去しない場合は約20重量％もの低値となり、あるいは、水を除去する場合は、約98重量％もの高値となる。高い回収率のために必要とされるナタマイシン濃度を得るためには、メタノールの添加前にブロスを濃縮することが必要である。特にメタノール回収のために利用できる装置に応じて、メタノールの添加前にブロスから実質的に全ての水を除去することが望ましい。これにより、回収に必要なメタノールの量を最小限にできる。経済性を考えた場合、水の大部分をブロスから回収しなければならない。これにより過剰な副生成物の形成を伴うことなく高いpHでこの方法を実施できる。好ましい実施態様では、水の除去により少なくとも50重量％の固体を含有する供給流が得られる。
【００１２】
メタノール添加：図１に示すとおり、工程１では、メタノールを供給流に添加する。適切な条件下では、ナタマイシンはこの安価な溶媒中で優れた溶解性を示し、メタノール回収のための簡単な方法が利用できる。ナタマイシン回収を最適に行なうためには、十分な量のメタノールを供給流に添加してリットル当たりナタマイシン約20〜150ｇを含有する抽出媒体を製造する。ナタマイシンは高濃度で酸性抽出媒体から析出する傾向を有するため(工程２)、抽出媒体リットル当たり20〜120ｇのナタマイシンの濃度が好ましい。
【００１３】
酸添加：工程２では、酸を添加することにより抽出媒体のpHを約1.0〜4.5に調節する。これにより抽出媒体中でナタマイシンは高度に溶解するようになる。従来の適合する酸性物質の何れを用いてもよいが、塩酸が優れた酸である。好ましい方法ではないが、工程１および２はメタノールへ直接酸を添加して一つの工程とすることもできる。
【００１４】
望ましくない副生成物であるナタマイシンメチルエステルの形成は、pH、ナタマイシン−メタノール接触時間、および温度に応じて変化する（表１参照）。この工程は、ナタマイシンメチルエステルおよびその他の望ましくない副生成物の形成が最小限にされるという理由から約０〜25℃の温度で実施することが重要である。温度が高いほど、あるいは、接触時間が長いほど、あるpHにおける副生成物の生産は増大する。15〜25℃において過剰なナタマイシンメチルエステルの形成を回避するためには、短い接触時間、即ち0.5時間以下でなければならない。約15℃では、抽出時間は約1.5時間を超えてはならない。約０〜15℃の抽出温度が好ましい。
【００１５】
一般的に、２付近のpHおよび約０℃の温度では、過剰な副生成物の形成を伴うことなく、約12時間抽出を継続できる。約25℃では、約0.5時間後には抽出を中止しなければならない。pHが4.5に向けて上昇するに従って、より長い時間が可能になる。４近pHおよび約４℃の温度では、時間は約30時間であることができる。
【００１６】
【表１】
2006296430.tif 000002
【００１７】
商業レベルの製造のためには、メチルエステルの含有量を総生成物（ナタマイシン、メチルエステルおよび全ての不純物）の約5重量％未満、好ましくは３重量％未満に維持することが望ましい。抽出媒体が酸添加時点で低い温度範囲にあるように流れおよび／またはメタノールを冷却することにより必要な低温でメタノール抽出を行なうことが可能になる。
【００１８】
抽出のための適切な時間／温度／pHの関係は、試験的実施、特定のpHで所望の生成物純度を与えるような時間と温度を記録すること、そして使用する特定の装置に関する最適な経済性を念頭に置くことにより、容易に確認できる。
【００１９】
pHは抽出媒体の含水量および所望の収率にある程度依存している。約90％以上の沈澱収率を得るためには、抽出媒体中のナタマイシン濃度は約40ｇ／ｌであることが必要である。水の非存在下では、これには約4.5のpHが必要となる。約30％／70％の水／メタノール体積比では、約2.5のpHが必要となる (表２)。
【００２０】
【表２】
2006296430.tif 000003
【００２１】
懸濁固体の除去：工程３では、濾過または遠心分離のような何れかの好都合な固／液分離法により残存懸濁固体を除去して、抽出液を得る。抽出媒体から除去した後、固体はなおかなりの量のナタマイシンを含有している場合がある。従って、好ましい実施態様では、固体をメタノールまたはメタノールと水の混合物で洗浄して固体中に含まれるナタマイシンの少なくとも一部を回収する。洗液は抽出液に加える。
【００２２】
ナタマイシンの沈澱と回収：工程４では、何らかの適合性のある塩基性の物質を用いて抽出液のpHを約6.0〜9.0に上昇させる。これにより高純度ナタマイシンの沈澱が得られ、これを採取して乾燥させる。典型的な有用で安価で適合性のある塩基性の物質は水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムである。所望により、工程４で水も添加してナタマイシン沈澱を容易にしてもよい。これは供給流が高濃度のナタマイシンおよび少量の水を含有する場合に好ましい。価値あるナタマイシン、醗酵残存物、メタノール、無機塩および水を含有する残存液体副生成物（残存液体）はメタノール回収に供する。溶媒回収のための従来の蒸留方法によりメタノールを回収できる。
【００２３】
この方法により、ナタマイシンは少なくとも約80重量％の純度、そして、しばしば少なくとも約90重量％の純度で生産される。好ましい実施態様においては、工程５で回収したナタマイシン沈澱を水で洗浄し、次に乾燥させて少なくとも約90重量％の純度でナタマイシンを得る。
【００２４】
方法はバッチ抽出により効率的に実施できる。しかしながら、より大規模の商業レベルの抽出のためには、連続工程が望ましい。１つの方法では、ナタマイシン醗酵ブロス、好ましくは低い含水量まで濃縮したものを、連続的に混合器に供給し、低温でメタノールと十分混合する。酸の添加によりpHを制御し、ナタマイシンを急速に溶解させる。次に得られた抽出媒体をフィルターに供給して細胞塊およびその他の固体を抽出液から分離する。抽出液をより高いpHで運転されている結晶化装置に供給し、ナタマイシンを沈澱させる。沈澱したナタマイシンおよび残存液を連続的に結晶化装置から除去する。抽出時間、含水量、温度およびpHはナタマイシンの経済的な製造のため調節できる。
【００２５】
[溶解度増大塩の添加]
【００２６】
pHを低下させるための酸の添加、次いでpHを上昇させナタマイシンを沈澱させるための塩基の添加を行なうことなく、ナタマイシンを迅速に高い収率で得ることもできる。この方法では、メタノールおよび溶解度増大塩の混合物を（濃縮を伴うか伴うことなく）ナタマイシン醗酵ブロス供給流と混合する。得られた抽出媒体を濾過して細胞塊およびその他の固体を除去し、抽出液を得る。水を抽出液に添加してナタマイシンを沈澱させる。
【００２７】
抽出条件下でメタノール中ナタマイシンの溶解度を上昇させるが、反応したりせず、あるいはナタマイシン抽出、回収または生成物の純度に影響することの無いようなどのような塩も使用してよい。塩化カルシウム(CaCl2) が好ましい溶解度増大塩である。これはメタノールリットル当たり約10〜50ｇ／ｌの量において最も効果的である。
【００２８】
最適なナタマイシン回収のためには、上記したとおり供給流から水を除去するのが典型的である。供給流は、抽出液（メタノール／塩溶液）が供給流に添加された後に得られる抽出媒体が少なくとも２ｇ／ｌのナタマイシンを含有するように十分なナタマイシンを含有しなければならない。ナタマイシンの濃度が２ｇ／ｌ未満である場合は、水を添加することによりナタマイシンを沈澱させるのは困難である。
【００２９】
高い比率のナタマイシンを沈澱させるためには、抽出液の含水量を少なくとも50容量％に上昇させることが必要である。表３は含水量の関数としてメタノール／水／塩化カルシウム溶液中のナタマイシンの溶解度を示すものである。
【００３０】
【表３】
2006296430.tif 000004
【００３１】
この方法はpH２〜９、好ましくはpH６〜８で行なうことができる。pHが低い場合は、酸性条件がナタマイシンメチルエステルの形成を促進するため、より短い抽出時間を用いなければならない（表４参照）。pHが６より高い場合は、エステル形成はより遅くなる。いかなる合理的な温度も使用してよい（即ち20〜30℃）。
【００３２】
【表４】
2006296430.tif 000005
【００３３】
工程(a)では、メタノール／塩溶液を供給流に添加する。工程(ｂ）では、残存する懸濁固体を濾過または遠心分離のような好都合な固／液分離方法により抽出媒体から除去して抽出液を得る。固体はなおかなりの量のナタマイシンを含有している場合があり、メタノールまたはメタノールと水の混合物で洗浄することにより固体中に含有されるナタマイシンの少なくとも一部を回収してよい。メタノール洗液を抽出液に加える。工程(ｃ)では、水を抽出液に添加してナタマイシンを沈澱させる。工程(ｄ)では、沈澱したナタマイシンを回収する。回収した沈澱は少なくとも80重量％のナタマイシンを含有しており、通常は少なくとも85重量％のナタマイシンを含有している。少なくとも90重量％までのナタマイシンであるようなより高純度の生成物は、水で工程(ｄ)において回収された沈澱を洗浄することにより、または工程(ｃ)の前に活性炭で抽出液を処理することにより、または、これらの工程の組み合わせにより得ることができる。
【実施例１】
【００３４】
本実施例はpHおよび温度の制御された条件を用いたナタマイシンの回収を説明するものである。Eisenschinkの米国特許5,231,014号に記載の通り製造したナタマイシン、バイオマス、水および少量の栄養および不純物を含有する醗酵ブロスをブフナー漏斗での濾過により約45重量％の固形分まで濃縮した。セライト（Celite)（登録商標）545を添加して濾過速度を増大した。フィルターケーキには約7.5重量％のナタマイシンが含有されていた。
【００３５】
フィルターケーキ約74gをメタノール約96mlと混合し、抽出媒体スラリーを形成し、スラリーの温度を氷浴ジャケットで約４℃に低下させた。塩酸をスラリーに添加してpHを約2.4に低下させ、スラリーを約3時間この温度とpHに維持した。
【００３６】
スラリーをブフナー漏斗で濾過し、ナタマイシン約40ｇ／ｌを含有する透明な液体(抽出液) 約105mlを得た。５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を添加することにより抽出液のpHを約７まで上昇させ、このpHで約１時間穏やかに撹拌しながら維持した。この間濃厚な白色の沈澱が形成した。
【００３７】
沈澱を濾過して単離し、真空下約40℃で乾燥した。乾燥生成物約4.1ｇを得た。生成物はナタマイシン(無水として)約92重量％およびメチルエステル1.7重量％であった。
【実施例２】
【００３８】
本実施例は制御されたpHおよび温度の条件を用いたナタマイシンの回収を説明するものである。抽出媒体の温度を約４℃ではなく約22℃とした以外は実施例１の方法を反復した。乾燥後、乾燥生成物約3.9ｇを得た。生成物はナタマイシン(無水として)約83重量％およびメチルエステル10重量％であった。
【実施例３】
【００３９】
本実施例は溶解度増大塩を用いたナタマイシンの回収を説明するものである。醗酵ブロスをブフナー漏斗で濾過により固形分45重量％となるまで濃縮した。セライト（登録商標）545 を添加して濾過速度を増大させた。フィルターケーキを流動床乾燥機中60℃で固形分98重量％となるまで更に乾燥させた。乾燥ケーキのナタマイシン含有量は18重量％であった。
【００４０】
乾燥ケーキ40ｇをメタノール150ml中の塩化カルシウム３ｇの溶液に添加し、スラリーを30分間混合した。スラリーをブフナー漏斗で濾過し、透明な濾液（抽出液）を採取した。
【００４１】
撹拌しながら水をゆっくり添加することにより濾液の含水量を30容量％まで増加させた。濃厚なオフホワイトの沈澱が形成した。沈澱を濾過して分離し水で洗浄し、真空下30℃で乾燥した。沈澱はナタマイシン（無水として）88重量％であった。
【実施例４】
【００４２】
本実施例は溶解度増大塩を用いたナタマイシンの回収を説明するものである。醗酵ブロス（１ｌ）を15分間70℃に加熱し、室温に冷却し、放置して沈降させた。上層500mlをデカンテーションにより棄てた。残りの固体をブフナー漏斗での濾過により濃縮した。セライト（登録商標）545 20ｇを添加して濾過速度を増大させた。フィルターケーキをメタノール50mlで２回洗浄し、水の大部分を除去し、水約10重量％が残存するようにした。フィルターケーキはナタマイシン９重量％であった。フィルターケーキ40ｇをメタノール50ml中の塩化カルシウム２ｇの溶液に添加し、0.5時間混合した。スラリーをブフナー漏斗で濾過し、透明な濾液（抽出液）を採取した。活性炭３ｇを濾液に添加し、混合物を１時間撹拌した。活性炭を濾過して除去し、透明な濾液を採取した。
【００４３】
撹拌しながらゆっくり水を添加することにより濾液の含水量を50容量％まで増大させた。濃厚な白色沈澱が形成し、これを濾過し、水で洗浄し、真空下30℃で乾燥した。沈澱はナタマイシン（無水として）95重量％であった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本方法は、醗酵ブロスから、特に２ｇ／ｌより遥かに多いナタマイシンを含有するブロスから、ナタマイシンを回収するための迅速で安価な方法である。