(57)【要約】      （修正有）【課題】改善されたワクチン、および結核の診断、予防および処置のための改善された方法を提供すること。【解決手段】精製された免疫原性ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有し、かつ、必要に応じてＮ末端におけるヒスチジン残基の伸展を伴わない、特定のアミノ酸配列；または該アミノ酸配列は、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有し、かつ、必要に応じてＮ末端におけるヒスチジン残基の伸展を伴わない、特定のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製された免疫原性ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
配列番号２のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列は、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有し、かつ、必要に応じてＮ末端におけるヒスチジン残基の伸展を伴わない、アミノ酸配列；または
配列番号２４のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列は、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有し、かつ、必要に応じてＮ末端におけるヒスチジン残基の伸展を伴わない、アミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．導入）
本発明は、少なくとも２つのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を含有する融合タンパク質に関する。具体的には、本発明は、２つの個別のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を含有する２−融合タンパク質、３つのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を含有する３−融合タンパク質、４つのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を含有する４−融合タンパク質、および５つのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を含有する５−融合タンパク質、ならびに結核感染における診断、処置および予防におけるその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（２．発明の背景）
結核は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの感染によって生じる慢性感染疾患である。結核は、発展途上国における主要な疾患であり、そして、世界の先進国における増大する問題であり、毎年約８００万件の新症例および３００万件の死亡をともなう。その感染は、長期間、無症候性であり得るが、この疾患は、肺の急性炎症としてもっとも一般的に発現し、発熱および乾性咳を生じる。処置しない場合、代表的には重篤な合併症および死亡を生じる。
【０００３】
結核は、長期間の抗生物質治療を用いて、一般に管理され得るが、そのような処置は、その疾患の伝播を予防するのには十分ではない。感染した個体は、無症候性であり得るが、時として、伝染性であり得る。さらに、処置レジメのコンプライアンスは重要であるが、患者の態度は、モニターするのが困難である。ある患者は、処置の過程を完了せず、このことは、有効でない処置および薬物耐性の発生をもたらし得る。
【０００４】
結核の伝播を管理するために、効果的なワクチン接種および疾患の正確な初期の診断が、最も重要である。現在、生細菌を用いるワクチン接種が、防御免疫を誘導するための最も効果的な方法である。この目的のために使用される最も一般的なＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）（Ｍ．ｂｏｖｉｓの無発病性株）である。しかし、ＢＣＧの安全性および効力は、論争の基となっており、そしていくつかの国（例えば、米国）は、この薬剤を用いて一般公衆にワクチン接種を行わない。
【０００５】
結核の診断は、皮膚試験を使用して一般に達成され。この試験は、ツベルクリンＰＰＤ（タンパク質精製誘導体）に対する皮内の曝露を包含する。抗原特異的Ｔ細胞応答は、注入後の４８〜７２時間までに、注入部位での測定可能な硬化を生じ、このことは、マイコバクテリア抗原への曝露を示す。しかし、感度および特異性は、この試験の問題であり、そしてＢＣＧを用いてワクチン接種された個人は、感染された個人と区別され得ない。
【０００６】
マクロファージがＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫の第１のエフェクターとして作用することが示されているが、Ｔ細胞は、そのような免疫の主なインデューサーである。Ｔ細胞のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に対する防御における本質的な役割は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関連するＣＤ４＋  Ｔ細胞の枯渇に起因する後天性免疫不全症候群患者におけるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの頻繁な発生によって説明される。マイコバクテリア反応性ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の強力な生産者であることが示されており、次にマウスのマクロファージの抗マイコバクテリア効果を誘発することが示されている。ヒトにおけるＩＦＮ−γの役割はさほど明らかではないが、研究が１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３が単独またはＩＦＮ−γもしくは腫瘍壊死因子αとの組み合わせのいずれかがヒトマクロファージを活性化し、そしてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を阻害することを示している。さらに、ＩＦＮ−γがヒトマクロファージを刺激して、１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３を産生するすることが公知である。同様に、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染に対する耐性を刺激することにおいて重要な役割を担うことが示されている。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の免疫学の総説について、非特許文献１を参照のこと。
【非特許文献１】ＣｈａｎおよびＫａｕｆｍａｎｎ、Ｂｌｏｏｍ（編）、”Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ”：Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、１９９４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、改善されたワクチン、および結核の診断、予防および処置のための改善された方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（３．発明の要旨）
本発明によって、以下が提供される。
（項目１）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する精製されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、必要に応じて１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有し得る、ポリペプチド。
（項目２）  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と相補的な第２のポリヌクレオチドに対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる精製されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導する、ポリペプチド。
（項目３）  水溶性ポリペプチドである、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）  組換えＤＮＡ法によって産生される、項目２に記載のポリペプチド。
（項目５）  化学合成法によって生成される、項目２に記載のポリペプチド。
（項目６）  抗体応答を誘導する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）  Ｔ細胞応答を誘導する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目８）  第２の異種ポリペプチドと融合される、項目２に記載のポリペプチド。
（項目９）  被験体に、項目１に記載のポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、結核を予防する方法。
（項目１０）  被験体に、項目２に記載のポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、結核を予防する方法。
（項目１１）  被験体に、項目２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量を投与する工程を包含する、結核を予防する方法。
（項目１２）  項目２に記載のポリペプチドを含有する薬学的組成物。
（項目１３）  項目２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する薬学的組成物。
【０００９】
本発明は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質に関連する。具体的には、本発明は、２つ以上のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を含有する融合ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリペプチドおよびポリヌクレオチドをＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の診断、処置および予防において使用する方法に関する。
【００１０】
本発明は、部分的に、２〜５つのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓコード配列を含有するポリヌクレオチドが、その個々の成分の免疫原性および抗原性を保持する組換え融合タンパク質を産生するという本発明者らの知見に基づく。本明細書において記載される融合タンパク質は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および抗体産生によって測定されるように、Ｔ細胞およびＢ細胞応答の両方を誘導した。さらに、融合タンパク質は、インビボにおいてアジュバントとともに免疫原として使用され、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する細胞媒介性および体液性免疫の両方を誘発した。さらに、融合タンパク質が、融合構築物によって作製され、そして結核の発症に対する、動物における長期の防御を提供するためにアジュバントとともにワクチン処方物中で使用された。この融合タンパク質は、その個々のタンパク質成分の混合物よりもより効果的な免疫原であった。
【００１１】
本発明の特定の実施態様において、本発明の単離されたか、または精製されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓポリペプチドは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の予防および／または処置において被験体中に投与されるための薬学的組成物として処方され得る。融合タンパク質の免疫原性は、アジュバントの含有によって増強され得る。
【００１２】
本発明の別の局面において、その単離されたか、または精製されたポリヌクレオチドが使用されて、インビトロにおいて組換え融合ポリペプチド抗原を産生する。あるいは、そのポリヌクレオチドは、被験体中にＤＮＡワクチンとして直接投与され、被験体における抗原の発現、その後の抗Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫応答の誘導を生じ得る。
【００１３】
このポリヌクレオチドが、感染の診断または疾患の進行のモニターのために、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する体液性抗体または細胞媒介性免疫を検出するためのインビトロアッセイにおいて使用されることもまた本発明の目的である。さらに、このポリペプチドは、皮内皮膚試験の形態におけるインビボ診断薬剤として使用され得る。あるいは、このポリペプチドは、非ヒト動物において、抗Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗体を生成するための免疫原として使用され得る。この抗体は、インビボおよびインビトロにおいて標的抗原を検出するために使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（５．発明の詳細な説明）
本発明は、結核の処置および予防のために有用な抗原、そのような抗原をコードするポリヌクレオチド、およびそれらの使用方法に関する。本発明の抗原は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合ポリペプチドおよびその改変体である。より具体的には、本発明の抗原は、より大きな融合ポリペプチド分子中に融合される少なくとも２つのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓポリペプチドを含有する。本発明の抗原は、抗原に対する免疫性を増強するため、または他の局面（例えば、抗原の一方の末端におけるヒスチジン残基の伸展の付加を介する、これらの抗原の単離）においてこれらの抗原を改善するために、設計された他の成分をさらに含有し得る。
【００１５】
（５．１．Ｍ．ＴＵＢＥＲＣＵＬＯＳＩＳ特異的抗原）
本発明の抗原は、図１Ａ〜１３Ｂにおいて例示され、それら抗原のホモログおよび改変体を含有する。これら抗原は、例えば、以下に記載のようなリンカーペプチド配列の付加によって改変され得る。これらのリンカーペプチドは、図１Ａ〜１３Ｂにおいて示される融合タンパク質の各々を作製する１つ以上のポリペプチド間に挿入され得る。本発明の他の抗原は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの公知の抗原（例えば、以前に記載された３８ｋＤ（配列番号２７）抗原（ＡｎｄｅｅｒｓｅｎおよびＨａｎｓｅｎ、１９８９、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：２４８１〜２４８８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第Ｍ３００４６号））と連結した図１Ａ〜１３Ｂにおいて記載される抗原である。
【００１６】
（５．２．免疫原性アッセイ）
本明細書において記載される抗原およびその免疫原性部分は、免疫原性応答を誘導する能力を有する。より具体的には、抗原は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫個体由来のＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、および／またはマクロファージにおいて、増殖および／またはサイトカイン産生（すなわち、インターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−１２産生）を誘導する能力を有する。抗原に対する免疫原性応答の評価における使用のための細胞型の選択は、所望の応答に依存する。例えば、インターロイキン−１２産生は、Ｂ細胞および／またはマクロファージを含有する調製物を使用して最も容易に評価される。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫個体は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する効果的なＴ細胞応答を備えることにより、結核の発症に対して耐性である（すなわち、実質的に疾患症候のない）と考慮される。そのような個体は、結核タンパク質（ＰＰＤ）に対する強力に陽性な皮内皮膚試験応答（すなわち、直径約１０ｍｍを超える硬化）、および結核疾患の徴候または症状が全くないことに基づいて同定され得る。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫個体由来のＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージは、当業者に公知の方法を使用して調製され得る。例えば、ＰＢＭＣ（すなわち、末梢血単核細胞）の調製物が、成分細胞のさらなる分離なしに使用され得る。ＰＢＭＣは、例えば、「フィコール」（Ｗｉｎｔｈｒｏｐ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＮＹ）を通過する密度遠心分離を使用して、一般に調整され得る。本明細書に記載されるアッセイにおける使用のためのＴ細胞はまた、ＰＢＭＣより直接精製され得る。あるいは、マイコバクテリアタンパク質に対して反応性の富化されたＴ細胞株、または個々のマイコバクテリアタンパク質に対して反応性のＴ細胞クローンが、使用され得る。そのようなＴ細胞クローンは、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫個体に由来するＰＢＭＣを２〜４週間マイコバクテリアタンパク質とともに培養することにより、生成され得る。このことは、マイコバクテリアタンパク質特異的Ｔ細胞のみの拡大を可能にし、そのような細胞のみからなる株を生じる。次に、これらの細胞はクローン化され、そして当業者に公知の方法を使用して個々のタンパク質とともに試験され、個々のＴ細胞特異性をより正確に規定し得る。一般に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫個体に由来するＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および／またはマクロファージを使用して行われる、増殖および／またはサイトカイン産生（すなわち、インターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−１２産生）についてのアッセイにおける陽性を試験する抗原は、免疫原性であると考慮される。そのようなアッセイは、例えば、以下に記載の代表的な手順を使用して行われ得る。そのような抗原の免疫原性部分は、類似のアッセイを用いて同定され得、そして本明細書に記載のポリペプチド中に存在し得る。
【００１７】
ポリペプチド（例えば、免疫原性抗原、またはその部分もしくはその他の改変体）が細胞増殖を誘導する能力は、細胞（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）をそのポリペプチドと接触し、そしてその細胞の増殖を測定することによって評価される。一般に、約１０5の細胞の評価に十分なポリペプチドの量は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの範囲であり、そして好ましくは、約１０μｇ／ｍＬである。ポリペプチドと細胞とのインキュベーションは、代表的には、３７℃で、約６日間行われる。ポリペプチドとのインキュベーションに続いて、その細胞を増殖応答についてアッセイし、このアッセイは、当業者に公知の方法（例えば、放射標識したチミジンのパルスに対して細胞を曝露し、そして細胞のＤＮＡ中への標識の取り込みを測定する）によって評価され得る。一般に、増殖においてバックグランド（すなわち、ポリペプチドなしで培養された細胞について観察される増殖）を少なくとも３倍超える増加を生じるポリペプチドが、増殖を誘導し得ると考慮される。
【００１８】
細胞中のインターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−１２の産生を刺激するポリペプチドの能力は、その細胞をそのポリペプチドと接触し、そしてその細胞によって産生されるインターフェロン−γまたはインターロイキン−１２のレベルを測定することによって評価され得る。一般に、約１０5の細胞の評価に十分なポリペプチドの量は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの範囲であり、そして好ましくは、約１０μｇ／ｍＬである。そのポリペプチドは、固体支持体（例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に記載される、ビーズまたは生分解性ミクロスフィア）上に固定化され得るが、固定化される必要はない。そのポリペプチドとその細胞とのインキュベーションは、代表的には、３７℃で、約６日間行われる。ポリペプチドとのインキュベーション後に、その細胞がインターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−１２（またはその１つ以上のサブユニット）についてアッセイされ、このアッセイは、例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはＩＬ−１２  Ｐ７０サブユニットの場合Ｔ細胞の増殖を測定するアッセイのようなバイオアッセイのような、当業者にとって公知の方法によって評価され得る。一般に、培養上清１ｍＬ（１ｍＬあたり１０4〜１０5のＴ細胞を含む）あたり少なくとも５０ｐｇのインターフェロン−γの産生を生じるポリペプチドが、インターフェロン−γの産生を刺激し得ると考慮される。１０5のマクロファージまたはＢ細胞あたり（または３×１０5のＰＢＭＣあたり）、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２  Ｐ７０サブユニット、および／または少なくとも１００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２  Ｐ４０サブユニットの産生を刺激するポリペプチドがＩＬ−１２の産生を刺激し得ると考慮される。
【００１９】
一般に、免疫原性抗原は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫個体の少なくとも約２５％に由来するＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および／またはマクロファージにおいて、増殖および／またはサイトカイン産生（すなわち、インターフェロン−γおよび／またはインターロイキン−１２産生）を刺激する抗原である。これらの免疫原性抗原において、優れた治療的性質を有するポリペプチドが、上記のアッセイにおける応答の大きさに基づき、および応答が観察された個体の割合に基づき、区別され得る。さらに、優れた治療的性質を有する抗原は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫でない個体の約２５％超に由来する細胞においてインビトロでの増殖および／またはサイトカイン産生を刺激せず、それによって、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ応答細胞に特異的に起因しない応答を除去する。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫個体由来のＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞および／またはマクロファージ調製物において高い割合で応答を誘導する抗原は（他の個体に由来する細胞調製物において、応答のより少ない発生をともない）、優れた治療的性質を有する。
【００２０】
優れた治療性質を有する抗原もまた、実験動物において、ワクチンとして投与された場合、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染の重篤度を減少する能力に基づいて同定され得る。実験動物における使用のための適切なワクチン調製物は以下に詳細に記載される。効力は、細菌数において少なくとも約５０％の減少を、および／または実験の感染後の死亡率の少なくとも約４０％の減少を提供する抗原の能力に基づいて決定され得る。適切な実験動物としては、マウス、モルモット、および霊長類が挙げられる。
【００２１】
（５．３．コード配列の単離）
本発明はまた、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの融合ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。下記の第６章中の例示の目的のための特定の実施態様において、１３のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ融合コード配列が構築された。本発明に従って、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列が、コード配列の発現を指向する組換え分子を生成するために使用され得る。
【００２２】
全長コード配列、またはホモログ改変体をクローニングして、融合ポリヌクレオチドを生成するために、本明細書に開示されるヌクレオチド配列の任意の部分またはその相補物から設計される標識されたＤＮＡプローブが使用され、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの種々の株より作製されるゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、各個別の成分のコード配列を同定し得る。コード配列の単離はまた、本明細書において開示されるコード配列に基づいて設計される２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われ得る。
【００２３】
本発明はまた、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５のヌクレオチド配列に相補的な単離されたか、または精製されたポリヌクレオチド、およびそのような相補配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。好ましい実施態様において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５の配列またはその相補配列に対して、低ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし、そして配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６の融合タンパク質の免疫原性を保持するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。例示の目的であるが、限定のためでなく、低ストリンジェンシーの例示的な条件は、以下のとおりである（ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６７８９−６７９２もまた参照のこと）：ＤＮＡを含有するフィルターを、６時間、４０℃で、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＰＶＰ、０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ、１％  ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で前処理する。ハイブリダイゼーションを以下の改変をして、同一の溶液中で行う：０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）硫酸デキストラン、および５〜２０×１０6ｃｐｍ  32Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合液中で１８〜２０時間、４０℃でインキュベートし、次に２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ＳＤＳを含有する溶液中で、５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を、新鮮な溶液で置き換え、そして６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターをブロット乾燥し、そしてオートラジオグラフィーのために露光する。必要な場合、フィルターを、３回目は６５〜６８℃で洗浄し、そしてフィルムに再度露出する。使用され得る他の低ストリンジェンシー条件は、当該分野において周知である（例えば、交差種ハイブリダイゼーションについて使用されるように）。
【００２４】
他の好ましい実施態様において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５のコード配列またはその相補配列に対して、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズし、そして配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６の融合タンパク質の免疫原性を保持するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。例示の目的であるが、限定のためでなく、高ストリンジェンシーの例示的な条件は、以下のとおりである：ＤＮＡを含有するフィルターの、８時間から一晩、６５℃で、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中でのプレハイブリダイゼーションを行う。フィルターを、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０6ｃｐｍ  32Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合液中で、４８時間、６５℃でハイブリダイズする。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％  ＰＶＰ、０．０１％  Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％  ＢＳＡを含有する溶液中で３７℃で行う。次に、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃、４５分間オートラジオグラフィー前に洗浄する。使用され得る他の高ストリンジェンシー条件は、当該分野において周知である。
【００２５】
さらに別の好ましい実施態様において、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５のコード配列またはその相補配列に対して、中程度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、そして配列番号、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６の融合タンパク質の免疫原性を保持するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。中程度のストリンジェンシーの例示的な条件は、以下のとおりである：ＤＮＡを含有するフィルターを、６時間、５５℃で、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で前処理する。ハイブリダイゼーションを、同一の溶液中で行い、そして５〜２０×１０6ｃｐｍ  32Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合液中で、１８〜２０時間、５５℃でインキュベートし、次に１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを含有する溶液中で３０分間、６０℃で２回洗浄する。フィルターを乾燥でブロットし、オートラジオグラフィーのために曝露する。使用され得る他の中程度ストリンジェンシー条件は、当該分野において周知である。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳを含有する溶液中で、３７℃にて１時間行う。
【００２６】
（５．４．コード配列によってコードされるポリペプチド）
本発明に従って、融合タンパク質、そのフラグメント、またはその機能的等価物をコードする本発明のポリヌクレオチドが使用され得、融合タンパク質、そのフラグメント、またはその機能的等価物の適切な宿主細胞中での発現を指向する組換え核酸分子を生成する。そのようなポリヌクレオチドによってコードされる融合ポリペプチド産物は、コード配列の分子操作によって改変され得る。
【００２７】
遺伝子コードの固有の縮重性に起因して、実質的に同一か、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、その融合ポリペプチドの発現のために本発明の実施において使用され得る。そのようなＤＮＡ配列は、本明細書に開示されるコード配列またはその相補物に対して、上記５．３章に記載される、低、中程度、または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る配列を含む。
【００２８】
本発明に従って使用され得る改変されたヌクレオチド配列は、同一または機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列を生じる、異なるヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含む。遺伝子産物自体は、アミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含み得、サイレントな変化を生じ、従って、機能的に等価な抗原エピトープを産生する。そのような保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて成され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる；正に荷電したアミノ酸としては、リジン、ヒスチジンおよびアルギニンが挙げられる；類似の疎水性値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられる；そして非極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニンおよびトリプトファンが挙げられる。
【００２９】
本発明のヌクレオチド配列は、融合タンパク質コード配列を種々の末端に変更する（その遺伝子産物のプロセシングおよび発現を改変する変更を含むが、これらに限定されない）ために操作され得る。例えば、変異を当該分野で周知の技術（例えば、部位特異的変異誘発）を使用して導入し、新たな制限部位を挿入し得、グリコシル化パターン、リン酸化などを変更し得る。
【００３０】
本発明の代替的な実施態様において、融合タンパク質のコード配列を、当該分野で周知の化学的方法を使用して、全体的または部分的に合成し得る。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２１５−２３３；ＣｒｅａおよびＨｏｒｎ，１８０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９（１０）：２３３１；ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒ  ２１：７１９；ならびにＣｈｏｗおよびＫｅｍｐｅ，１９８１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９（１２）：２８０７−２８１７を参照のこと。あるいは、そのポリペプチド自体を化学的方法を使用して生成し、アミノ酸配列を全体的または部分的に合成し得る。例えば、ペプチドを固相技術により合成し、樹脂から切断し、そして分取用高速液体クロマトグラフィーにより精製し得る（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｍ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．５０〜６０頁を参照のこと）。その合成ポリペプチドの組成を、アミノ酸分析または配列決定により確認し得る（例えば、エドマン分解手順；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｍ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．３４〜４９頁を参照のこと）。
【００３１】
さらに、融合タンパク質のコード配列をインビトロまたはインビボで変異させて、翻訳配列、開始配列および／または終結配列を作製および／または破壊し得るか、あるいはコード領域に変化を作製する、および／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか、または既存の制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊して、さらなるインビトロでの改変を容易にし得る。当該分野で公知の任意の変異誘発技術を使用し得、これらの技術には化学的変異誘発、インビトロでの部位特異的変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ら、１８７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５３：６５５１）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などが含まれるが、これらに限定されない。この操作により、その融合ポリペプチドの免疫原性が破壊されないことが重要である。
【００３２】
さらに、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログを、置換または付加として配列内に導入し得る。非古典的アミノ酸としては、以下を含むがこれらに限定されない；通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸）、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、および通常のアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【００３３】
特定の実施態様において、融合タンパク質の各々の抗原のコード配列を、それらのアミノ末端またはカルボキシ末端で任意の順序でペプチド結合を介して結合する。あるいは、ペプチドリンカー配列を使用して、融合ペプチドを構成する個々のペプチドを、各ペプチドが結核を予防および処置するためにその抗原性の有効性を最大化する二次構造および三次構造に折り畳まれることを保証するのに十分な距離に引き離し得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を使用して、融合タンパク質に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）可撓性のある広がったコンフォメーションを取るそれらの能力；（２）第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を取ることができないこと；および（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。他のほぼ中性のアミノ酸（例えばＴｈｒおよびＡｌａ）もまた、リンカー配列中で使用され得る。リンカーとして通常使用され得るアミノ酸配列としては、以下に開示されるアミノ酸配列が挙げられる；Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号。リンカー配列は、１〜約５０アミノ酸長であり得る。ペプチド配列は、第一および第二のポリペプチドが非必須のＮ末端アミノ酸領域を有し、このＮ末端アミノ酸領域を使用して機能性ドメインを分離し、そして立体障害を妨げ得る場合、必要とされない。例えば、融合タンパク質中の抗原を、可撓性ポリリンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（１〜３回繰り返される））により連結し得る（Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）。
【００３４】
１つの実施態様において、このようなタンパク質は、そのタンパク質をコードする核酸の組換え発現により産生される。このような融合産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を当該分野で公知の方法によって互いに、適切なコードフレームで連結し、そして当該分野で公知の方法によってその産物を発現することにより作製され得る。あるいは、このような産物は、タンパク質合成技術（例えば、ペプチド合成器の使用によって）作製され得る。サイトカインまたはアジュバントのような他の分子についてのコード配列を、その融合ポリヌクレオチドに同様に付加し得る。
【００３５】
（５．５  融合タンパク質の産生）
本発明のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ融合タンパク質の産生のために、そのタンパク質または機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）内に挿入する。組換え発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞または宿主細胞株を、種々の目的のために使用し得る。これらは、その融合タンパク質の大規模産生を含むが、これに限定されない。
【００３６】
当業者に周知の方法を使用して、融合コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．に記載される技術を参照のこと）。ポリペプチドをコードし得るＲＮＡもまた、化学的に合成され得る（Ｇａｉｔ編、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
【００３７】
（５．５．１．発現系）
種々の宿主発現ベクター系を利用して、融合タンパク質コード配列を発現し得る。これらとしては、以下を含むがこれらに限定されない；コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系、またはコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）。これらの系の発現エレメントは、それらの強度および特異性で異なる。
【００３８】
利用する宿主／ベクター系に依存して、任意の多くの適切な転写および翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）を、発現ベクターにおいて使用し得る。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター；サイトメガロウイルスプロモーター）などのような誘導性プロモーターを使用し得る；昆虫細胞系におけるクローニングの場合、バキュロウイルスポリヘドロンプロモーターのようなプロモーターを使用し得る；植物細胞系におけるクローニングの場合、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットに対するプロモーター；クロロフィルα／β結合タンパク質に対するプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を使用し得る；哺乳動物細胞系におけるクローニングの場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用し得る；複数のコピーの抗原コード配列を含む細胞株を生成する場合、ＳＶ−４０ベース、ＢＰＶベースおよびＥＢＶベースのベクターを、適切な選択マーカーと共に使用し得る。
【００３９】
細菌系が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の発現に好ましい。インビボ送達のために、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎのような細菌を、その細胞表面上に本発明の融合ポリペプチドを発現するように操作し得る。他の多くの細菌発現ベクターを、発現させる産物についての意図される使用に依存して、有利に選択し得る。例えば、大量の融合タンパク質が、薬学的組成物の処方のために産生されるべき場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが、望ましくあり得る。このようなベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）（このベクターにおいて、コード配列はｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター内に連結され得、それによりハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクターもまた使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現し得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、それに引き続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン切断部位または第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されているので、目的のクローン化した融合ポリペプチドをＧＳＴ部分から遊離させ得る。
【００４０】
（５．５．２．タンパク質精製）
一旦組換えタンパク質が発現されると、組換えタンパク質は、その産物の物理的特性または機能的特性に基づくアッセイ（産物の放射性標識に引き続く、ゲル電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイなどによる分析を含む）により同定され得る。
【００４１】
一旦コードタンパク質が同定されると、そのタンパク質は、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、可溶性の差異を含む標準的な方法によって、またはタンパク質精製の他の任意の標準的な技術によって、単離および精製され得る。使用する実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性などのような因子にある程度依存し、そしてこれらは当業者に明らかである。機能的特性は、抗体結合、Ｔ細胞増殖の誘導、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ）の刺激のような、任意の適切なアッセイを使用して評価され得る。本発明の実施のために、各々の融合タンパク質は、他のタンパク質から少なくとも８０％精製されていることが好ましい。各々の融合タンパク質は、少なくとも９０％精製されていることがより好ましい。インビボ投与のためには、それらのタンパク質は、９５％より高度に精製されていることが好ましい。
【００４２】
（５．６．融合タンパク質コード配列の使用）
本発明の融合タンパク質コード配列を使用して、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫応答を誘導および／または増強する免疫原としての使用のためのタンパク質産物をコードし得る。さらに、このようなコード配列を、別の分子（例えば、サイトカインまたはアジュバント）のコード配列と連結し得る。このようなポリヌクレオチドは、インビボでＤＮＡワクチンとして使用され得る（米国特許第５，５８９，４６６号；第５，６７９，６４７号；第５，７０３，０５５号）。本発明のこの実施態様において、そのポリヌクレオチドは、レシピエントにおいてそのコードタンパク質を発現し、免疫応答を直接誘導する。そのポリヌクレオチドを、未処置の（ｎａｉｖｅ）被験体内に注射して、そのコード産物に対する免疫応答を誘発し得るか、あるいは感染した被験体または免疫化された被験体に投与して、二次的な免疫応答を増強し得る。
【００４３】
好ましい実施態様において、治療組成物は、発現ベクターの一部である、融合タンパク質コード配列またはそのフラグメントを含む。特に、このようなポリヌクレオチドは、そのコード領域に作動可能に連結されるプロモーターを含み、そのプロモーターは、誘導性または構成性であり、必要に応じて、組織特異的である。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、ゲノム中の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接するコード配列を含み、従ってそのコード配列の染色体内発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８）。
【００４４】
核酸の被験体への送達は、直接的（この場合、被験体は核酸または核酸運搬ベクターに直接曝露される）であるか、間接的（この場合、細胞を最初に、インビトロでその核酸を用いて形質転換し、次いで被験体内に移植する）のいずれかであり得る。これら２つのアプローチは、インビボ遺伝子移入またはエキソビボ遺伝子移入として、それぞれ公知である。
【００４５】
特定の実施態様において、核酸をインビボで直接的に投与し、ここで、核酸が発現され、そのコードされた融合タンパク質産物を産生する。これは、当該分野で公知の任意の多くの方法によって、例えば、その核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、その核酸が細胞内性になるようにその核酸を投与すること（例えば、欠損レトロウイルスベクターまたは弱毒化レトロウイルスベクターあるいは他のウイルスベクターを使用する感染（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）によって、または裸のＤＮＡの直接注射によって、または微粒子ボンバートメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でのコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル中のカプセル化（米国特許第５，４０７，６０９号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号および５，８２０，８８３号）によって、あるいは核に進入することが公知であるペプチドに連結してその核酸を投与することによって、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）（これは、そのレセプターを特異的に発現する細胞型を標的化するために使用され得る）をうけるリガンドに連結してその核酸を投与することによって、など）によって、達成され得る。別の実施態様において、核酸リガンド複合体を形成し得、ここで、そのリガンドはエンドソームを破壊するための融合促進（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスペプチドを含み、その核酸のリソソーム性分解を回避し得る。さらに別の実施態様において、核酸を、特定のレセプターを標的化することによって、細胞特異的な取り込みおよび発現のためにインビボで標的化し得る（例えば、１９９２年４月１６日付のＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０；１９９２年１２月２３日付のＷＯ９２／２２６３５；１９９２年１１月２６日付のＷＯ９２／２０３１６；１９９３年７月２２日のＷＯ９３／１４１８８；１９９３年１０月１４日付のＷＯ９３／２０２２１を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され、そして相同組換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に取り込まれ得る（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８）。
【００４６】
特定の実施態様において、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターが、使用され得る（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、そのウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要ではないレトロウイルス配列を欠失するよう改変されている。融合体コード配列をそのベクター内にクローン化し、このことは、レシピエント内への核酸の送達を容易にする。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら、１９９４、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２に見出され得、これは、造血幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、造血幹細胞へｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は以下である：Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ，１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４。
【００４７】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、気道上皮への遺伝子の送達のための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、天然で気道上皮に感染し、そこでアデノウイルスは軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系についての他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利点を有する。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）もまた、インビボ遺伝子移入における使用が提唱されている（Ｗａｌｓｈら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００）。
【００４８】
別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法によって、組織培養物中の細胞に構築物を移入することを含む。通常、移入の方法は、その細胞への選択マーカーの移入を含む。次いで、細胞を選択下に配置し、移入された遺伝子を取りこみそして発現する細胞を単離する。次いで、それらの細胞を被験体に送達する。
【００４９】
この実施態様において、その核酸は、生じた組換え細胞のインビボでの投与の前に細胞に導入される。このような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、その核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、マイクロセル媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含むが、これらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって実行され得る。多くの技術が、外来遺伝子の細胞への導入について当該分野で公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８５，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照のこと）、そして本発明に従って使用され得る。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドもまた、結核の診断において、患者中のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに特異的なポリヌクレオチド配列の検出に使用され得る。このような検出は、例えば、その細菌に感染していることが疑われる患者から得られた生物学的サンプルからのポリヌクレオチドを単離することにより、達成され得る。生物学的サンプルからのポリヌクレオチドの単離の際に、１以上のそれらのポリヌクレオチドに相補的である本発明の標識したポリヌクレオチドが、当業者に公知の核酸ハイブリダイゼーションの技術を使用して、その生物学的サンプル中のポリヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。例えば、このようなハイブリダイゼーションは、溶液中で、または固体支持体上の１つのハイブリダイゼーションパートナーを用いて行われ得る。
【００５１】
（５．７．融合タンパク質の治療的および予防的使用）
精製または部分精製された融合タンパク質またはそのフラグメントは、ワクチンまたは治療的組成物として処方され得る。このような組成物は、免疫応答を増強するためにアジュバントを含み得る。さらに、このようなタンパク質は、油乳剤中にさらに懸濁され、注射の際にインビボでそのタンパク質のより穏やかな放出を生じ得る。処方物の各成分の最適な比は、当業者に周知の技術によって決定され得る。
【００５２】
任意の種々のアジュバントが、免疫応答を増強するために本発明のワクチンにおいて使用され得る。ほとんどのアジュバントは、その抗原を迅速な異化から保護するよう設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）、および免疫応答の非特異的刺激剤（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む。適切なアジュバントが市販され、そしてこれらとしては、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ならびにＭｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。他の適切なアジュバントとしては、ミョウバン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドＡ、キルＡ（ｑｕｉｌ  Ａ）、ＳＢＡＳ１ｃ、ＳＢＡＳ２（Ｌｉｎｇら、１９９７、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１５６２−１５６７）、ＳＢＡＳ７およびＡｌ（ＯＨ）3が挙げられる。
【００５３】
本発明のワクチンにおいて、アジュバントはＴｈ１の局面を含む免疫応答を誘導することが好ましい。適切なアジュバント系は、例えば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは、３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＰ））とアルミニウム塩との組み合わせを含む。増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（特に、ＷＯ９４／００１５３に開示されるような３Ｄ−ＭＬＰとサポニンＱＳ２１との組み合わせ）を含むか、ＱＳ２１は、ＷＯ９６／３３７３９に記載のようにコレステロールでクエンチされるより反応生成性の低い（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を含む。以前の実験は、体液性免疫応答およびＴｈ１型細胞性免疫応答の両方の誘導において３Ｄ−ＭＬＰとＱＳ２１との組み合わせの明確な相乗効果を実証した。水中油型乳剤中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＬＰおよびトコフェノールを含む特に強力なアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載され、かつ好ましい処方物である。
【００５４】
本発明の抗原を含む処方物は、それ自体で、または薬学的組成物または治療的組成物の形態で被験体に投与され得る。タンパク質を含む薬学的組成物は、混合、溶解、顆粒化、糖衣化、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造され得る。薬学的組成物は、そのポリペプチドを薬学的に使用され得る調製物に加工することを容易にする、１以上の生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して、従来の様態で処方され得る。適切な処方物は、選択される投与経路に依存する。
【００５５】
局所投与のために、タンパク質は、当該分野で周知であるように、液剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム、懸濁剤などとして処方され得る。
【００５６】
全身性処方物は、注射（例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射または腹腔内注射）による投与のために設計された処方物、ならびに経皮投与、経粘膜投与（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）、経口投与または肺投与のために設計された処方物を含む。
【００５７】
注射のために、タンパク質は、水溶液中で、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液または生理学的食塩水緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液中に処方され得る。その溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含み得る。あるいは、そのタンパク質は、使用前の適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）を用いての構成のために粉末形態であり得る。
【００５８】
経粘膜投与のために、浸透されるべき障壁に対する適切な浸透剤が、処方物に使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野で公知である。
【００５９】
経口投与のために、組成物は、タンパク質を当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと組合せることによって、容易に処方され得る。このようなキャリアは、そのタンパク質が、処置されるべき被験体による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして処方されることを可能にする。経口固体処方物（例えば、散剤、カプセル剤および錠剤のような）のために、適切な賦形剤は、以下のようなフィラー（ｆｉｌｌｅｒ）を含む；糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトール）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））；顆粒化剤；ならびに結合剤。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような、崩壊剤が添加され得る。
【００６０】
所望の場合、固体投薬形態は、標準的な技術を使用して、糖衣または腸溶コーティングされ得る。
【００６１】
経口液体調製物（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤）について、適切なキャリア、賦形剤または希釈剤としては、水、グリコール、油、アルコールなどが挙げられる。さらに、矯味矯臭剤、保存剤、着色剤などが添加され得る。
【００６２】
口腔投与のために、タンパク質は、錠剤、ロゼンジなどの従来の様式で処方される形態を採り得る。
【００６３】
吸入による投与のために、本発明に従う使用のためのタンパク質は、適切なペロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）の使用を伴い、加圧されたパックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で都合良く送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬単位は、測定された容量を送達するためのバルブを提供することにより、決定され得る。吸入器または注入器での使用のための（例えば、ゼラチンの）カプセルおよびカートリッジは、タンパク質と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含んで処方され得る。
【００６４】
タンパク質はまた、例えば、従来の坐薬基剤（例えば、ココアバターまたは他のグリセリド）を含む直腸組成物または膣組成物（例えば、坐薬または保持浣腸剤）で処方され得る。
【００６５】
先に記載された処方物に加えて、タンパク質はまた、デポー調製物として処方され得る。このような長期作用性処方物は、移植（例えば、皮下または筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、タンパク質は、適切なポリマー性材料または疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは低可溶性の誘導体として（例えば、低可溶性の塩として）処方され得る。
【００６６】
あるいは、他の薬学的送達系が使用され得る。リポソームおよび乳剤は、抗原を送達するために使用され得る送達ビヒクルの周知の例である。特定の有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）もまた使用され得るが、通常は、より高い毒性という代償を払うことになる。融合タンパク質もまた、ミクロスフェア中にカプセル化され得る（米国特許第５，４０７，６０９号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号および同第５，８２０，８８３号）。さらに、タンパク質は、治療剤またはワクチン剤を含む固体ポリマーの半透性マトリクスのような、持続放出系を使用して送達され得る。種々の持続放出性の材料が確立され、そして当業者に周知である。持続放出性カプセルは、それらの化学的性質に依存して、数週間から１００日を超えるまでの間、タンパク質を放出し得る。その試薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質の安定化のさらなるストラテジーが使用され得る。
【００６７】
被験体において免疫応答を誘導するための融合タンパク質の有効量の決定は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００６８】
有効用量は、インビトロアッセイから最初に推測され得る。例えば、１用量が、当該分野で周知である技術を使用して免疫応答の誘導を達成するように動物モデルに処方され得る。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化し得る。投薬量および間隔は、個々で調整され得る。例えば、ワクチンとして使用される場合、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、１〜３６週間の期間にわたって約１〜３用量で投与され得る。好ましくは、３用量が、約３〜４ヶ月の間隔で投与され、ブースターワクチン接種が、その後周期的になされ得る。代替的プロトコルは、個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記に記載されるように投与される場合に、免疫された患者において少なくとも１〜２年間、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染からその患者を防御するのに十分な免疫応答を生じ得るポリペプチドまたはＤＮＡの量である。一般に、１用量に存在する（または１用量中のそのＤＮＡによりインサイチュで産生される）ポリペプチドの量は、宿主１ｋｇあたり約１ｐｇ〜約１００ｍｇ、代表的には、約１０ｐｇ〜約１ｍｇ、および好ましくは、約１００ｐｇ〜約１μｇの範囲である。適切な用量の範囲は、その患者の大きさにより変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【００６９】
（５．８  融合タンパク質の診断的使用）
本発明の融合ポリペプチドは、インビトロおよびインビボでの結核感染の診断に有用である。本発明のポリペプチドの細胞増殖誘導能力またはサイトカイン産生誘導能力は、セクション５．２（前出）に開示される方法によってアッセイされ得る。
【００７０】
別の局面において、本発明は、インビボで皮膚試験を使用して結核を診断するための、１以上の融合ポリペプチドの使用のための方法を提供する。本明細書中で使用されるように、皮膚試験は、患者に対して直接的に実施される任意のアッセイであり、ここで、遅延型の過感受性（ＤＴＨ）反応（腫脹、発赤（ｒｅｄｄｅｎｉｎｇ）または皮膚炎のような）が、上記に記載の１以上のポリペプチドの皮内注射後に測定される。このような注射は、そのポリペプチドを患者の皮膚細胞に接触させるのに十分な任意の適切なデバイス（例えば、ツベルクリン注射器または１ｍＬ注射器のような）を使用して達成され得る。好ましくは、反応は、注射後少なくとも約４８時間、より好ましくは注射後約４８〜約７２時間で測定される。
【００７１】
ＤＴＨ反応は、細胞媒介免疫応答であり、これは、試験抗原（すなわち、使用したポリペプチドの免疫原性部分、またはその改変体）に以前に曝露された患者において、より大きい。この応答は、定規を使用して、可視的に測定され得る。一般に、直径約０．５ｃｍ、好ましくは、直径約１．０ｃｍより大きい応答は、結核感染を示す陽性応答であり、これは、活性な疾患として表れるかもしれないし、表れないかもしれない。
【００７２】
本発明の融合ポリペプチドは、皮膚試験での使用のために、ポリペプチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物として、好ましくは処方される。このような組成物は、代表的に、０．１ｍＬの容量中に約１μｇ〜約１００μｇ、好ましくは１０μｇ〜約５０μｇの範囲の量で、１以上の上記ポリペプチドを含む。好ましくは、このような薬学的組成物中で使用されるキャリアは、適切な保存剤（例えば、フェノールおよび／またはＴｗｅｅｎ  ８０TM）を含む生理食塩水溶液である。
【００７３】
別の局面において、本発明は、結核を診断するためにポリペプチドを使用するための方法を提供する。この局面において、その融合ポリペプチドを単独で、または組み合わせて使用して、生物学的サンプル中でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を検出するための方法が提供される。本明細書中で使用される、「生物学的サンプル」は、患者から得られた、抗体を含有する任意のサンプルである。好ましくは、このサンプルは、全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿である。より好ましくは、このサンプルは、患者または献血から得られる血液、血清または血漿のサンプルである。そのポリペプチドは、以下に記載のように、予め決定したカットオフ値と比較してサンプル中のポリペプチドに対する抗体の存在または非存在を決定するためのアッセイにおいて使用される。このような抗体の存在は、結核を示し得るマイコバクテリア抗原に対する、以前の感作を示す。
【００７４】
１より多くの融合ポリペプチドが使用される実施態様において、使用されるポリペプチドは、好ましくは、相補的（すなわち、１つの成分ポリペプチドがサンプル中の感染を検出する傾向にあり、ここで、その感染は、別の成分ポリペプチドによって検出されない）である。相補的なポリペプチドを、一般に、各々のポリペプチドを個々に用いることにより同定して、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染していることが分かっている一連の患者から得られた血清サンプルを評価し得る。各ポリペプチドを用いて（下記のように）、どのサンプルが陽性であると試験されるかを決定した後、２以上の融合ポリペプチドの組合せは、殆どの、または全ての試験されるサンプルにおいて感染を検出し得るように処方され得る。そのようなポリペプチドが相補的である。結核に感染した個体からの血清のうち約２５〜３０％の血清は、任意の単一のタンパク質に対する抗体について陰性である。従って、相補的なポリペプチドは、診断試験の感度を改良することと組み合せて使用され得る。
【００７５】
サンプル中の抗体を検出するための１以上のポリペプチドを用いるための、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと（これは、本明細書において参考として援用される）。好ましい実施態様において、このアッセイは、そのサンプルからの抗体に結合しそして除去するための固体支持体上に固定したポリペプチドの使用を包含する。次いで、この結合した抗体は、レポーター基を含む検出試薬を用いて検出され得る。適切な検出試薬としては、抗体／ポリペプチド複合体に結合し、そしてレポーター基を用いて標識されるポリペプチドを遊離する抗体が挙げられる（例えば、半競合的アッセイ）。適切な検出試薬は、抗体／ポリペプチド複合体に結合する抗体およびレポーター基で標識された遊離のポリペプチド（例えば、半競合的なアッセイにおける）を含む。あるいは、競合的アッセイが利用され得る。ここでは、ポリペプチドに結合する抗体は、レポーター基で標識され、そしてそのサンプルとのその抗原のインキュベーション後に、その抗体を、固定された抗原へ結合させる。そのサンプルの成分がポリペプチドへの標識抗体の結合を阻害する程度は、固定されたポリペプチドとそのサンプルとの反応性の指標である。
【００７６】
固体支持体は、当業者に公知の任意の固体材料であり得る。この材料には、その抗原が付着されてい得る。例えば、その固体支持体は、マイクロタイタープレート内の試験ウェルまたはニトロセルロースあるいは他の安定な膜であり得る。あるいは、この支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックスまたはプラスチック材料（例えば、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル））であり得る。この支持体はまた、磁気粒子または光ファイバセンサ（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号において開示されるもの）であり得る。
【００７７】
このポリペプチドは、当業者に公知の種々の技術を用いて固体支持体に結合され得る。本発明の状況において、用語「結合（されている）」とは、吸着のような非共有的会合、および共有結合的付着（これは、抗原と支持体上の官能基との直接の結合であり得、または架橋剤を介する結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレート内のウェルまたは膜への吸着による結合が好ましい。そのような場合には、吸着は、そのポリペプチドを、適切な緩衝液において、適切な長さの時間の間固体支持体と接触させることによって達成され得る。接触時間は温度により変動するが、代表的には、約１時間と約１日との間である。一般に、プラスチックマイクロタイタープレートのウェル（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）を、約１０ｎｇ〜約１μｇの範囲、および好ましくは約１００ｎｇの量のポリペプチドと接触させることが、適切な抗原量と結合するに充分である。
【００７８】
ポリペプチドの固体支持体への共有結合的付着は、一般に、まずその支持体を、その支持体およびそのポリペプチド上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬とともに反応させることによって達成され得る。例えば、そのポリペプチドは、ベンゾキノンを用いるか、またはそのポリペプチド上のアミンおよび活性水素と、その支持体上のアルデヒド基との縮合によって適切なポリマーコーティングを有する支持体に結合され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２〜Ａ１３を参照のこと）。
【００７９】
特定の実施態様において、そのアッセイは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイは、まず、固体支持体（通常マイクロタイターのウェル）上に固定された融合ポリペプチド抗原を、そのサンプルと接触させ、その結果、そのサンプル内のポリペプチドに対する抗体を、その固定されたポリペプチドに結合させることによって行われ得る。次いで、結合していないサンプルは、固定されたポリペプチドから除去され、そしてその固定された抗体−ポリペプチド複合体に結合し得る検出試薬が加えられる。次いで、この固体支持体に結合したままの検出試薬の量は、特異的な検出試薬について適切な方法を用いて決定される。
【００８０】
より詳細には、一旦そのポリペプチドが、上記のようにその支持体上に固定されると、その支持体上の残りのタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。当業者に公知の任意の適切なブロック試薬（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０TM（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が使用され得る。次いで、固定されたポリペプチドは、そのサンプルとインキュベートされ、そして抗体は、その抗原と結合させられる。このサンプルは、インキュベーションの前に適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））を用いて希釈され得る。一般に、適切な接触時間は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染サンプルにおける抗体の存在を検出するために充分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡に達したもののうち、少なくとも９５％が結合しているレベルを達成するに充分である。当業者は、平衡を達成するために必要な時間は、経時的に、生ずる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを認識する。室温では、約３０分間のインキュベーション時間が一般に充分である。
【００８１】
次いで、結合していないサンプルを、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０TMを含むＰＢＳ）を用いてその固体支持体を洗浄することによって除去し得る。次いで、検出試薬をその固体支持体に添加し得る。適切な検出試薬は、固定した抗体ポリペプチド複合体に結合し、そして当業者に公知の種々の手段のいずれかにより検出され得る任意の化合物である。好ましくは、その検出試薬は、レポーター基と結合体化された結合剤（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチンまたは遊離抗原）を含む。好ましいレポーター基としては、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種、発光基、蛍光基、ビオチンおよびコロイド粒子（例えば、コロイド金およびコロイドセレン）が挙げられる。結合剤のレポーター基への結合体化は、当業者に公知の標準的な方法を用いて達成され得る。一般的な結合剤はまた、多くの商業的供給源（例えば、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡおよびＰｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から種々のレポーター基に結合体化されたものが購入され得る
次いで、検出試薬を、固定された抗体ペプチド複合体とともに、結合した抗体を検出するに充分な長さの時間インキュベートする。適切な長さの時間は、一般的に、製造業者の指示書から、または経時的に発生する結合レベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合していない検出試薬を除去し、そして結合した検出試薬を、レポーター基を用いて検出する。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、シンチレーション計数またはオートラジオグラフ方法が一般的に適切である。分光光度学的な方法は、色素、発光基、および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般には、放射性基または蛍光基あるいは酵素）に結合したアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般に、特定の時間の間）、続いてその反応産物の分光光度学的分析または他の分析によって検出され得る。
【００８２】
そのサンプルにおける抗Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗体の存在または非存在を決定するために、一般に、その固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルを、所定のカットオフ値に対応するシグナルと比較する。１つの好ましい実施態様において、そのカットオフ値は、固定した抗原を感染していない患者からのサンプルとともにインキュベートした場合に得られる平均の中間シグナルである。一般に、所定のカットオフ値から３つ分の標準偏差分上回るシグナルを生成するサンプルを、結核について陽性とみなす。別の好ましい実施態様において、そのカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、１９８５、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ
Ｃｏ．１０６〜１０７頁の方法に従って、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅを用いて決定される。手短には、この実施態様において、そのカットオフ値は、真の陽性の割合（すなわち、感受性）と、擬陽性の割合（１００％特異性）（これは、診断試験結果についての各々可能なカットオフ値に対応する）との対のプロットから決定され得る。左上のコーナーに最も近いプロットにおけるカットオフ値（すなわち、最大領域を包含する値）は、最も正確なカットオフ値であり、そしてこの方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルは、陽性とみなされ得る。あるいは、このカットオフ値は、プロットに沿って左に移動されて、擬陽性の割合を最小限にし得るか、または右へ移動させて、擬陰性の割合を最小限にし得る。一般に、この方法によって決定されるカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルは、結核について陽性とみなされる。
【００８３】
関連する実施態様において、このアッセイは、迅速なフロースルー試験形式またはストリップ試験形式において行われる。ここで、その抗原を、メンブレン（例えば、ニトロセルロース）に固定する。フロースルー試験において、サンプル内の抗体は、そのサンプルがそのメンブレンを通過すると固定したポリペプチドに結合する。次いで、検出試薬（例えば、プロテインＡ−コロイド金）は、その検出試薬を含む溶液がメンブレンを通過して流れると、その抗体−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した検出試薬の検出を、上記のように行い得る。ストリップ試験形式において、ポリペプチドが結合するメンブレンの一端を、そのサンプルを含む溶液に浸す。このサンプルは、検出試薬を含む領域を通過してメンブレンに沿って、および固定したポリペプチドの領域へと移動する。そのポリペプチドでの検出試薬の濃度は、そのサンプルにおける抗Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗体の存在を示す。代表的には、その部位での検出試薬の濃縮は、線のようなパターンを生成し、このパターンは、可視的に読み取られ得る。そのようなパターンの非存在は、陰性の結果を示す。一般に、そのメンブレンに固定されるポリペプチドの量を選択して、その生物学的サンプルが、上記のように、ＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルを生成するに充分である抗体レベルを含む場合に、可視的に認識可能なパターンを生成する。好ましくは、そのメンブレンに固定されるポリペプチドの量は、約５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。そのような試験は、代表的に、極微量（例えば、一滴）の患者の血清または血液を用いて行われ得る。
【００８４】
本発明を説明してきたが、以下の実施例は、例示の目的にのみ提供され、そして限定のためではない。
【実施例】
【００８５】
（６：実施例：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質は、個々の成分の免疫原性を保持する）
（６．１．材料および方法）
（６．１．１．融合タンパク質の構築）
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原のコード配列を、その融合およびその後の融合タンパク質の発現を容易にするために、ＰＣＲにより改変した。ＤＮＡ増幅を、１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌの各々のＰＣＲプライマー（濃度１０μＭ）、８１．５μｌの水、１．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）および１μｌのＤＮＡ（７０ｎｇ／μｌ（ＴｂＲａ３抗原について）または５０ｎｇ／μｌ（３８ｋＤ抗原およびＴｂ３８−１抗原について）のいずれか）を用いて行った。ＴｂＲａ３抗原について、９４℃での変性を２分間行い、続いて９６℃で１５秒間および７２℃で１分間を４０サイクル、および最後に７２℃で４分間行った。３８ｋＤ抗原について、９６℃での変性を２分間行い、続いて９６℃で３０秒間、６８℃で１５秒間および７２℃で３分間を４０サイクル、および最後に７２℃で４分間行った。Ｔｂ３８−１抗原について、９４℃での変性を２分間行い、続いて９６℃で１５秒間、６８℃で１５秒間および７２℃で１．５分間を１０サイクル、９６℃で１５秒間、６４℃で１５秒間および７２℃で１．５分間を３０サイクル、および最後に７２℃で４分間行った。
【００８６】
制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して所望の付着末端または平滑末端を得た後に、各融合ポリペプチドについて特異的なポリヌクレオチドを発現プラスミドに連結した。各々得られたプラスミドは、各融合ポリペプチドの個々の抗原のコード配列を含んでいた。使用した発現ベクターは、ｐＥＴ−１２ｂおよびｐＴ７＾Ｌ２  ＩＬ１であった。
【００８７】
抗原Ｒａ１２、ＴｂＨ９およびＲａ３５についての３つのコード配列を連結して、１つの融合タンパク質（配列番号１および２）をコードさせた（図１Ａおよび図２Ｂ）。抗原Ｅｒｄ１４、ＤＰＶおよびＭＴＩの別の３つのコード配列を連結して、第二の融合タンパク質をコードさせた（配列番号３および４）（図２）。抗原ＴｂＲａ３、３８ｋＤおよびＴｂ３８−１の３つのコード配列を連結して、１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号５および６）（図３Ａ〜３Ｄ）。抗原ＴｂＨ９およびＴｂ３８−１の２つのコード配列を連結して、１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号７および８）（図４Ａ〜４Ｄ）。抗原ＴｂＲａ３、３８ｋＤ、Ｔｂ３８−１およびＤＰＥＰの４つのコード配列を連結して、１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号９および１０）（図５Ａ〜５Ｊ）。抗原Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、およびＭＴＣＣ２の５つのコード配列を連結して１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号１１および１２）（図６Ａおよび６Ｂ）。抗原Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩおよびＭＳＬの４つのコード配列を連結して１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号１３および１４）（図７Ａおよび７Ｂ）。抗原ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬおよびＭＴＣＣ２の４つのコード配列を連結して、１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号１５および１６）（図８Ａおよび８Ｂ）。抗原ＤＰＶ、ＭＴＩおよびＭＳＬの３つのコード配列を連結して、１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号１７および１８）（図９Ａおよび９Ｂ）。抗原ＴｂＨ９、ＤＰＶおよびＭＴＩの３つのコード配列を連結して、１つのコード配列をコードさせた（配列番号１９および２０）（図１０Ａおよび１０Ｂ）。抗原Ｅｒｄ１４、ＤＰＶおよびＭＴＩの３つのコード配列を連結して、１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号２１および２２）（図１１Ａおよび１１Ｂ）。抗原Ｔｂ９ＨおよびＲａ３５の２つのコード配列を連結して１つのコード配列をコードさせた（配列番号２３および２４）（図１２Ａおよび１２Ｂ）。抗原Ｒａ１２ａおよびＤＰＰＤの２つのコード配列を連結して１つの融合タンパク質をコードさせた（配列番号２５および２６）（図１３Ａおよび１３Ｂ）。
【００８８】
組換えタンパク質を、ｐＥＴプラスミドベクター（ｐＥＴ−１７ｂ）およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてアミノ末端部分の６つのヒスチジン残基とともにＥ．ｃｏｌｉ内で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を高レベル発現のために用いた。組換え（Ｈｉｓタグ）融合タンパク質を、５００ｍｌのＩＰＴＧ誘発したバッチ培養物由来の可溶性上清からまたは不溶性の封入体から、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅマトリクス（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、８Ｍ尿素の存在下で精製した。手短には、２０ｍｌの一晩飽和させた、ｐＥＴ構築物を含むＢＬ２１の培養物を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む５００ｍｌの２×ＹＴ培地に加え、３７℃で振盪しながら増殖させた。細菌培養物を、２ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、０．３のＯＤ５６０にて誘発し、そしてさらに３時間（ＯＤ＝１．３〜１．９）増殖させた。細胞を、５００ｍｌのバッチ培養物から、遠心分離によって採取し、そして２ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび２５ｍｌあたり１つの完全なプロテアーゼインヒビター錠剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む２０ｍｌの結合緩衝液（０．１Ｍ  リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。Ｅ．ｃｏｌｉを、凍結融解に続き短い超音波処理によって溶解し、次いで、１２ｋ  ｒｐｍにて３０分間スピンしてその封入体をペレット化した。
【００８９】
この封入体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中にて１％ＣＨＡＰＳにおいて３回洗浄した。この工程は、ＬＰＳの夾雑レベルを大幅に減少させた。この封入体を、最終的に、２０ｍｌの８Ｍ尿素を含む結合緩衝液中に可溶化したか、または可溶性上清へ直接８Ｍ尿素を添加した。Ｈｉｓタグ残基を有する組換え融合タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂に、１時間室温にて振盪することによってバッチ結合させ（５００ｍｌ誘発物あたり５ｍｌの樹脂）、そしてその複合体をカラムに通過させた。フロースルーを、同じカラムに２回通過させ、そしてそのカラムを各回３０ｍｌの洗浄緩衝液（０．１Ｍ  リン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．３；これもまた、８Ｍ尿素を含む）で３回洗浄した。結合タンパク質を、３０ｍｌの洗浄緩衝液中の１５０ｍＭイミダゾ−ルで溶出し、そして５ｍｌの画分を収集した。各々の組換え融合タンパク質を含む画分をプールし、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析し、Ｎｉ−ＮＴＡマトリクスに１回より多く結合させ、そして、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中で溶出および透析した。組換えタンパク質の収率は、９８％より高い純度で、１Ｌの誘発細菌培養物あたり、２５〜１５０ｍｇの間を変動した。組換えタンパク質を、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いてエンドトキシン夾雑物についてアッセイし、そして＜１０Ｅ．Ｕ．Ｉｍｇを含むことが示された。
【００９０】
（６．１．２：Ｔ細胞増殖アッセイ）
精製した融合ポリペプチドを、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）調製物中におけるＴ細胞増殖を誘発する能力について試験した。ＰＰＤ皮膚試験で陽性であることが知られ、そしてそのＴ細胞がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのＰＰＤおよび粗可溶性タンパク質に応答して増殖することが示されているドナーからのＰＢＭＣを、１０％のプールしたヒト血清および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。精製したポリペプチドを、二連で、０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。２００μｌの容量中で９６ウェルの丸底プレートにおける６日間の培養後、５０μｌの培地を、以下の６．１．３節において記載するようにＩＦＮ−γレベルの決定のために各ウェルから取り出した。次いで、このプレートを、１μＣｉ／ウェルのトリチウム標識したチミジンを用いて、さらに１８時間パルス刺激し、採集し、そしてトリチウム取り込みを、ガスシンチレーションカウンターを用いて決定した。両方の複製物において、培地単独において培養した細胞において観察される増殖の３倍を超える増殖をもたらした画分を、陽性とみなした。
【００９１】
（６．１．３．：インターフェロンγアッセイ）
マウス由来の脾臓を無菌的に取り出し、そして完全なＲＰＭＩ中で、単一の細胞懸濁物を調製し、次いで赤血球細胞溶解を行った。１００μｌの細胞（２×１０-5細胞）を、９６ウェルの平底マイクロタイタープレート中で１ウェルごとにプレートした。培養物を、示された組換えタンパク質を用いて、２４時間刺激し、そしてその上清をＩＦＮ−γについてアッセイした。
【００９２】
上清ＩＦＮ−γのレベルを、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから利用可能な抗体の対および手順を用いて、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって分析した。標準的な曲線を、組換えマウスサイトカインを用いて生成した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、５０μｌ／ウェル（１μｇ／ｍｌ、０．１Ｍ重炭酸コーティング緩衝液中、ｐＨ９．６）のサイトカイン捕捉ｍＡｂ（ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ；カタログ番号１８１８１Ｄ））を用いてコーティングし、そして４時間室温にてインキュベートした。プレートの中身を完全に振盪し、そしてＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、１．０％  ＢＳＡ（２００μｌ／ウェル）を用いて、一晩４℃にてブロッキングし、そしてＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ中で６回洗浄した。次いで、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％
ＢＳＡ中に希釈した標準（マウスＩＦＮ−γ）および上清のサンプルを、室温で２時間加えた。このプレートを上記のように洗浄し、次いで、１００μｌ／ウェルの第二のＡｂ（ビオチンラットαマウスＩＦＮ−γ（カタログ番号１８１１２Ｄ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）をＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％ＢＳＡ中で０．５μｇ／ｍｌに希釈して用いて、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ）を、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％  ＢＳＡ中で１：２５００希釈にて用いて、室温にて１時間インキュベートした。このプレートを、最後の回に洗浄し、そして１００μｌ／ウェルＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて発色し、そしてこの反応を、発色した後に、Ｈ2ＳＯ4、５０μｌ／ウェルを用いて終結させた。吸光度（ＯＤ）を、５７０ｎｍを参照波長として用いて４５０ｎｍにて決定し、そしてサイトカイン濃度を、標準曲線を用いて評価した。
【００９３】
（６．２．結果）
（６．２．１．：３連融合タンパク質は、免疫応答を誘発した）
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原をコードする３つの配列を、融合タンパク質の産生のための発現ベクター中へと挿入した。Ｒａ１２、ＴｂＨ９およびＲａ３５と命名されたこの抗原を、１つの組換え融合タンパク質として作製した（図１Ａおよび１Ｂ）。抗原Ｅｒｄ１４、ＤＰＶおよびＭＴＩを、第二の融合タンパク質として作製した（図２）。この２つの融合タンパク質を、インビトロおよびインビボでのアッセイにおいて使用するためにアフィニティー精製した。
【００９４】
これらの２つの融合タンパク質を、６つのＰＰＤ＋被験体由来のＴ細胞応答を刺激する能力について試験した。Ｔ細胞増殖を測定した場合、両方の融合タンパク質は、その個々の成分に類似する反応性パターンを示した（図１４Ａ〜図１４Ｆ）。類似の結果が、ＩＦＮ−γ産生を測定した場合にも得られた（図１５Ａ〜図１５Ｆ）。例えば、被験体Ｄ１６０は、抗原ＴｂＨ９およびＭＴＩに個々に応答した。被験体Ｄ１６０はまた、これらの抗原を含む融合タンパク質に応答した（図１４Ｂおよび図１５Ｂ）。対照的に、Ｄ１６０からのＴ細胞応答は、他の抗原個々に対しては観察されなかった。別の被験体であるＤ２０１（この被験体は、抗原Ｅｒｄ１４にも、ＤＰＶにも、ＭＴＩにも、個々には反応しなかった）は、これらの抗原を含む融合タンパク質に対してもまた非応答性であった。２つの融合タンパク質の個々の成分に対するＴ細胞応答が特に強力ではない場合、その融合タンパク質は、殆どの場合、個々の抗原によって誘導される応答以上の応答を刺激したことに留意すべきである。
【００９５】
Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５の３連融合タンパク質をまた、インビボでの免疫原として試験した。これらの実験において、この融合タンパク質を、免疫のためにマウスの足蹠に注射した。各群３匹のマウスに、異なるアジュバント処方物におけるタンパク質を与えた：ＳＢＡＳ１ｃ、ＳＢＡＳ２（Ｌｉｎｇら、１９９７、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１５６２−１５６７）、ＳＢＡＳ７およびＡＬ（ＯＨ）3。３週間の間隔での２回の皮下免疫の後、その動物を、１週間後に屠殺し、そしてそれらの排出リンパ節を、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン増殖アッセイにおける応答細胞として使用するために採集した。
【００９６】
どのアジュバントをその免疫において使用したかに拘らず、強力なＴ細胞増殖が、ＴｂＨ９が個々の抗原として用いられたときにＴｂＨ９において誘導された（図１６Ａ）。より弱い応答がＲａ３５およびＲａ１２に対して誘発された（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５融合タンパク質を免疫原として使用した場合、個々の成分に対する応答と類似の応答が観察された。
【００９７】
サイトカイン産生を測定した場合、アジュバントＳＢＡＳ１ｃおよびＳＢＡＳ２は、類似のＩＦＮ−γ応答（図１７）およびＩＬ−４応答（図１８）をもたらした。しかし、ＳＢＡＳ７および水酸化アルミニウムの組合せが、３つすべての抗原について、最も強力なＩＦＮ−γ刺激をもたらし、そして最低のレベルのＩＬ−４産生をもたらした。インビボでの体液性抗体応答について、図１９Ａ〜図１９Ｆは、この融合タンパク質が、３つのアジュバントのいずれかと共に使用される場合、ＩｇＧ1およびＩｇＧ2aの両方の抗原特異的な応答を惹起したことを示す。
【００９８】
さらに、Ｃ５７ＢＬ／６のマウスを、各々Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５（Ｍｔｂ３２Ａ）またはＥｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ（Ｍｔｂ３９Ａ）をコードする配列をを含む２つの発現構築物の組合せをＤＮＡワクチンとして用いて免疫した。免疫した動物は、引き続く生細菌のエアゾールチャレンジの際に、結核に対する有意な保護を示した。これらの結果に基づいて、Ｍｔｂ３２ＡおよびＭｔｂ３９Ａをコードする配列の融合構築物を作製し、そしてそのコード産物を、モルモットの長期間の保護モデルにおいて試験した。これらの研究において、モルモットを、アジュバントを含む処方物中の単独の組換え融合タンパク質またはＭｔｂ３２ＡおよびＭｒｂ３９Ａのタンパク質の混合物を用いて免疫した。図２０Ａ〜図２０Ｃは、ＳＢＡＳ１ｃまたはＳＢＡＳ２における融合タンパク質を用いて免疫したモルモットが、同じアジュバント処方物中の２つの抗原の混合物を用いて免疫した動物に比較して、引き続くチャレンジの際の結核の発生に対してより良好に保護したことを示す。ＳＢＡＳ２処方物におけるこの融合タンパク質は、その動物における最大の保護を可能にした。従って、種々のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質は、個々の成分の混合物よりもワクチン処方物においてより有効な免疫原として使用され得る。
【００９９】
（６．２．２．２−融合（ｂｉｆｕｓｉｏｎ）タンパク質は免疫応答を誘発した）
ヒンジ配列のないＴｂＨ−９抗原およびＴｂ３８−１抗原を含む２−融合タンパク質を、組換え方法によって産生した。ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１融合タンパク質がＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生を誘発する能力を試験した。三つのドナーからのＰＢＭＣを使用した：一つのドナーは、以前にＴｂＨ９には応答するが、Ｔｂ３８−１には反応しないことが示されている（ドナー１３１）；一つのドナーは、Ｔｂ３８−１に応答するが、ＴｂＨ９には応答しないことが示されている（ドナー１８４）；そして１つは、両方の抗原に応答することが示されている（ドナー２０１）。これらの研究の結果は、融合タンパク質における両方の抗原の機能的活性を実証する（図２１Ａおよび２１Ｂ、２２Ａおよび２２Ｂ、ならびに２３Ａおよび２３Ｂ）。
【０１００】
（６．２．３．：４−融合タンパク質は、結核患者の血清と反応した。）
ＴｂＲａ３、３８ＫＤ抗原、ＴＢ３８−１およびＤＰＥＰを含む融合タンパク質を、組換え方法によって産生した。ＴｂＦ−２と呼ばれるこの４−融合タンパク質のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染患者からの血清との反応性をＥＬＩＳＡによって試験した。これらの研究の結果（表１）は、４つすべての抗原が、融合タンパク質において独立して機能することを実証する。
【０１０１】
当業者は、各融合タンパク質内の個々の抗原の順番が変更され得、そしてそれらのエピトープの各々がなお、機能的に利用可能である限り、匹敵する活性が予測されることを理解する。さらに、活性エピトープを含有する短縮された形態のタンパク質は、融合タンパク質の構築において使用され得る。
【０１０２】
本発明は、例示される実施態様によって範囲が限定されない。この実施態様は、本発明の単なる局面の例示を意図し、機能的に等価である任意のクローン、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列は本発明の範囲内にある。実際、本明細書において記載したものに加えて本発明の種々の改変が、上記の説明および添付の図面から当業者には明白である。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。ヌクレオチドについて与えられる全ての塩基対のサイズはおおよそであり、そして説明の目的で使用されることもまた理解されるべきである。
【０１０３】
本明細書において引用されるすべての刊行物は、その全体が、参考として本明細書において引用される。
【０１０４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】３−融合タンパク質Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５（Ｍｔｂ３２Ａと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。
【図１Ｂ】３−融合タンパク質Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５（Ｍｔｂ３２Ａと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）。
【図２】３−融合タンパク質Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ（Ｍｔｂ３９Ａと称する）のヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）。
【図３Ａ】３−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）。
【図３Ｂ】３−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）。
【図３Ｃ】３−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）。
【図３Ｄ】３−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）。
【図４Ａ】２−融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）。
【図４Ｂ】２−融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）。
【図４Ｃ】２−融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）。
【図４Ｄ】２−融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１のヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）。
【図５Ａ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｂ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｃ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｄ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｅ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｆ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｇ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｈ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｉ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図５Ｊ】４−融合タンパク質ＴｂＲａ３−３８ｋＤ−Ｔｂ３８−１−ＤＰＥＰ（ＴｂＦ−２と称する）のヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）。
【図６Ａ】５−融合タンパク質Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ＭＴＣＣ２（Ｍｔｂ８８ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）。
【図６Ｂ】５−融合タンパク質Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ＭＴＣＣ２（Ｍｔｂ８８ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）。
【図７Ａ】４−融合タンパク質Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ（Ｍｔｂ４６ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図７Ｂ】４−融合タンパク質Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ（Ｍｔｂ４６ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）。
【図８Ａ】４−融合タンパク質ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ＭＴＣＣ２（Ｍｔｂ７１ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）。
【図８Ｂ】４−融合タンパク質ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ＭＴＣＣ２（Ｍｔｂ７１ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）。
【図９Ａ】３−融合タンパク質ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ（Ｍｔｂ３１ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）。
【図９Ｂ】３−融合タンパク質ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ（Ｍｔｂ３１ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）。
【図１０Ａ】３−融合タンパク質ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩ（Ｍｔｂ６１ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１９）およびアミノ酸配列（配列番号２０）。
【図１０Ｂ】３−融合タンパク質ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩ（Ｍｔｂ６１ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号１９）およびアミノ酸配列（配列番号２０）。
【図１１Ａ】３−融合タンパク質Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ（Ｍｔｂ３６ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列（配列番号２２）。
【図１１Ｂ】３−融合タンパク質Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ（Ｍｔｂ３６ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列（配列番号２２）。
【図１２Ａ】２−融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｒａ３５（Ｍｔｂ５９ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号２３）およびアミノ酸配列（配列番号２４）。
【図１２Ｂ】２−融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｒａ３５（Ｍｔｂ５９ｆと称する）のヌクレオチド配列（配列番号２３）およびアミノ酸配列（配列番号２４）。
【図１３Ａ】２−融合タンパク質Ｒａ１２−ＤＰＰＤ（Ｍｔｂ２４と称する）のヌクレオチド配列（配列番号２５）およびアミノ酸配列（配列番号２６）。
【図１３Ｂ】２−融合タンパク質Ｒａ１２−ＤＰＰＤ（Ｍｔｂ２４と称する）のヌクレオチド配列（配列番号２５）およびアミノ酸配列（配列番号２６）。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｆ：２つの融合タンパク質およびその個別の成分を用いて刺激した場合の６人のＰＰＤ＋被験体のＴ細胞増殖応答。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｆ：２つの融合タンパク質およびその個別の成分を用いて刺激した場合の６人のＰＰＤ＋被験体のＩＦＮ−γ産生。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｆ：融合タンパク質またはその個別の成分およびアジュバントを用いて免疫したマウスのＴ細胞増殖。
【図１７】融合タンパク質またはその個別の成分およびアジュバントを用いて免疫したマウスのＩＦＮ−γ産生。
【図１８】融合タンパク質またはその個別の成分およびアジュバントを用いて免疫したマウスのＩＬ−４産生。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｆ：融合タンパク質またはその個別の成分およびアジュバントを用いて免疫したマウスの血清抗体濃度。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｃ：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのエアロゾルチャレンジ後のモルモットの生存。融合タンパク質、Ｍｔｂ３２ＡおよびＭｔｂ３９ＡをアジュバントＳＢＡＳ１ｃ（２０Ａ）、ＳＢＡＳ２（２０Ｂ）またはＳＢＡＳ７（２０Ｃ）中に処方し、そして細菌でのチャレンジ前にモルモットにおいて免疫原として使用した。ＢＣＧは陽性コントロールである。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂ：融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１によるＴｂＨ９−特異的Ｔ細胞における増殖およびＩＦＮ−γ産生の刺激。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂ：融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１によるＴｂ３８−１−特異的Ｔ細胞における増殖およびＩＦＮ−γ産生の刺激。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂ：融合タンパク質ＴｂＨ９−Ｔｂ３８−１によるＴｂＨ９およびＴｂ３８−１抗原の両方に対する応答を以前に示したＴ細胞における増殖およびＩＦＮ−γ産生の刺激。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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